CN115916833B - 靶向b7h3的抗原结合多肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种特异性结合B7H3的抗原结合多肽，其包含抗体重链可变区(VH)的至少一个互补决定区(CDR)，所述VH包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。本申请还涉及包含所述抗原结合多肽的嵌合抗原受体，以及包含所述嵌合抗原受体的通用型CAR‑T细胞，识别肿瘤细胞表面抗原的同时，敲除细胞表达的TCR和HLA‑A基因，从而降低异体CAR‑T治疗引起的免疫排斥反应，延长细胞存活时间，提高抗肿瘤效果。

Description

靶向B7H3的抗原结合多肽及其应用
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种靶向B7H3的抗原结合多肽及其应用。
背景技术
胶质母细胞瘤占所有脑肿瘤的15％，可起源于普通脑细胞，或由低级星形细胞瘤发展而来。通常诊断后的生存期为12至15个月，患者五年以上生存期只有3％至7％。在不加以治疗的情况下，生存期通常为3个月。每年每10万人中约有3人患胶质母细胞瘤，是最常见的脑起源癌症，是仅次于脑膜瘤的第二常见脑肿瘤。
随着肿瘤免疫理论的发展与技术的进步，细胞免疫治疗肿瘤吸引越来越多的关注。CAR-T细胞技术是一种基于细胞的治疗手段，已经在肿瘤免疫治疗尤其是血液肿瘤的治疗中产生极佳的效果。CAR-T免疫治疗使用基因改造的T细胞，可特异性地识别并杀死表达特定抗原的肿瘤细胞，而不受MHC限制性影响。CAR-T免疫疗法在各种B细胞恶性肿瘤的治疗中取得良好效果，如靶向CD19的CAR-T细胞治疗急性淋巴白血病(ALL)，慢性淋巴白血病(CLL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)。同时，CAR-T细胞对多发性骨髓瘤和复发/难治多发性骨髓瘤的临床应用正在进行中，并显示出令人鼓舞的结果。
B7H3，也称为CD276，属于免疫调节蛋白B7家族，是一种I型膜蛋白，其胞外结构域序列与其他B7家族成员相似。B7H3基因位于人类的15号染色体上，该基因由十个外显子组成，其中外显子4至7编码细胞外IgV-IgC结构域。B7H3的mRNA在多种正常组织和一些肿瘤细胞系中表达，在外周血单个核细胞(PBMC)中则无法检测到，但是通过炎症细胞因子(IFNγ)以及PMA和ionomycin组合物，可在树突细胞和单核细胞上诱导B7H3表达。虽然B7H3 mRNA在正常组织中广泛表达，但是B7H3蛋白表达水平在正常组织中极低或缺失，表明B7H3的蛋白表达受到严格的转录后调控。与之相对的是，B7H3蛋白在多种恶性肿瘤中过表达，且与不良预后、较高的肿瘤分级和肿瘤转移、耐药及整体生存率低相关。
B7H3在肿瘤与健康组织间的差异表达使其非常适合作为治疗靶点，因为靶向该抗原导致的副作用会非常有限。已开展的临床前研究结果表明，在肿瘤细胞中抑制或降低B7H3蛋白表达，可降低细胞增殖和糖酵解，并增加肿瘤细胞的药物敏感性。
以B7H3为靶点的CAR-T细胞疗法已经展开研究。一项临床前研究证明，anti-B7H3CAR-T细胞在体内表现出显著的抗肿瘤活性，可使多种异体移植模型(包括骨肉瘤，髓母细胞瘤和尤因肉瘤)中已建立的实体肉瘤消退。
然而，病人自体T细胞在体外扩增困难或功能降低，导致制备的CAR-T细胞产品数量不足或质量差。通用型CAR T细胞是从健康供体分离获得T细胞，制备的CAR-T细胞不但扩增效率高、活力强，而且感染阳性率也有提高，但是通用型CAR-T也面临着移植物抗宿主疾病(GVHD)和免疫排斥的问题。CRISPR/Cas9系统是最常用的基因编辑方法，可用于产生TCR缺陷和HLAI类分子缺陷的T细胞，降低同种异体细胞治疗引起的免疫排斥免疫反应。
发明内容
本发明的目的在于制备一种靶向B7H3的通用型CAR-T细胞，识别肿瘤细胞表面抗原的同时，敲除细胞表达的TCR和HLA-A基因，从而降低异体CAR-T治疗引起的免疫排斥反应，延长细胞存活时间，提高抗肿瘤效果。
一方面，本申请提供一种抗原结合多肽，其结合B7H3，所述抗原结合多肽包含抗体重链可变区(VH)的至少一个互补决定区(CDR)，所述VH包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述VH包含SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的抗原结合多肽包含VH，所述VH包含重链互补决定区1(HCDR1)、重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)，所述HCDR3包含SEQ IDNO:7所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HCDR3包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HCDR2包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HCDR2包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HCDR1包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述VH包含：包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的HCDR3。
在某些实施方式中，所述VH包含：
i)包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:5示的氨基酸序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的HCDR3；或
ii)包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的HCDR3。
在某些实施方式中，所述VH包含重链框架区1(HFR1)、重链框架区2(HFR2)、重链框架区3(HFR3)和重链框架区4(HFR4)，所述HFR1包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HFR1包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HFR2包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HFR2包含SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HFR3包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HFR3包含SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HFR4包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HFR4包含SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述VH包含HFR1、HFR2、HFR3和HFR4，且所述HFR1、HFR2、HFR3和HFR4选自：
i)包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的HFR1，包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的HFR2，包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的HFR3，包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列的HFR4；
ii)包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的HFR1，包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的HFR2，包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的HFR3，包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的HFR4；
iii)包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的HFR1，包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列的HFR2，包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列的HFR3，包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列的HFR4；
vi)包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的HFR1，包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列的HFR2，包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的HFR3，包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的HFR4。
在某些实施方式中，所述VH包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述VH包含SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗原结合多肽包括抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，所述抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体、完整抗体、抗体片段、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
在某些实施方式中，所述抗原结合片段包括Fab片段，Fv片段，F(ab’)2，单链Fv(scFv)或单域抗体(VHH)。
另一方面，本申请提供一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含靶向部分，其中所述靶向部分包含前述的抗原结合多肽。
在某些实施方式中，其中所述靶向部分包括VHH。
在某些实施方式中，所述的嵌合抗原受体包括跨膜域，所述跨膜域包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的跨膜域：CD8A、CD8B、CD28、CD3ε(CD3e)、4-1BB、CD4、CD27、CD7、PD-1、TRAC、TRBC、CD3ζ、CTLA-4、LAG-3、CD5、ICOS、OX40、NKG2D、2B4(CD244)、FcεRIγ、BTLA、CD30、GITR、HVEM、DAP10、CD2、NKG2C、LIGHT、DAP12，CD40L(CD154)、TIM1、CD226、DR3、CD45、CD80、CD86、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64和SLAM。
在某些实施方式中，其中所述跨膜域包含源自CD8A的跨膜域。
在某些实施方式中，其中所述跨膜域包含SEQ ID NO:42至SEQ ID NO:90中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的嵌合抗原受体包括胞内共刺激信号传导结构域，所述胞内共刺激信号传导结构域包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的胞内共刺激信号传导结构域：CD28、CD137、CD27、CD2、CD7、CD8A、CD8B、OX40、CD226、DR3、SLAM、CDS、ICAM-1、NKG2D、NKG2C、B7H3、2B4、FcεRIγ、BTLA、GITR、HVEM、DAP10、DAP12、CD30、CD40、CD40L、TIM1、PD-1、LFA-1、LIGHT、JAML、CD244、CD100、ICOS、CD40和MyD88。
在某些实施方式中，其中所述胞内共刺激信号传导结构域源自4-1BB的共刺激信号传导结构域。
在某些实施方式中，其中所述胞内共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:91至SEQ ID NO:123中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体包括胞内信号转导结构域，所述胞内信号转导结构域包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的胞内信号转导结构域：CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、CD79a、CD79b、FceRIγ、FceRIβ、FcγRIIa、牛白血病病毒gp30、Epstein-Barr病毒(EBV)LMP2A、猿免疫缺陷病毒PBj14 Nef、DAP10、DAP-12和至少包含一个ITAM的结构域。
在某些实施方式中，其中所述胞内信号转导结构域包含源自CD3ζ的信号传导结构域。
在某些实施方式中，其中所述胞内信号转导结构域包含SEQ ID NO:107、SEQ IDNO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:124至SEQ ID NO:134中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的嵌合抗原受体在靶向部分和跨膜域之间包括铰链区，所述铰链区包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的铰链区：CD28、IgG1、IgG4、IgD、4-1BB、CD4、CD27、CD7、CD8A、PD-1、ICOS、OX40、NKG2D、NKG2C、FcεRIγ、BTLA、GITR、DAP10、TIM1、SLAM、CD30和LIGHT。
在某些实施方式中，所述铰链区包含源自CD8A的铰链区。
在某些实施方式中，所述铰链区包含SEQ ID NO:135至SEQ ID NO:156中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体的非靶向部分包含CD8A分子跨膜域、CD8A的铰链区、4-1BB的胞内共刺激信号传导结构域和CD3ζ胞内信号传导结构域。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体的非靶向部分包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的嵌合抗原受体还包含信号肽片段，所述信号肽片段的C端与所述靶向部分的N端连接。
在某些实施方式中，所述信号肽片段包括CD8A信号肽片段。
在某些实施方式中，所述信号肽片段包含如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的嵌合抗原受体包含SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:33，SEQID NO:34和SEQ ID NO:35中任一项所示的氨基酸序列。
另一方面，本申请提供一种或多种分离的核酸分子，其编码前述的抗原结合多肽或前述的嵌合抗原受体。
在某些实施方式中，所述的分离的核酸分子包含SEQ ID NO:36，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39中任一项所示的核苷酸序列。
另一方面，本申请提供一种载体，其包含前述的分离的核酸分子。
在某些实施方式中，其中所述载体是表达载体。
在某些实施方式中，其中所述载体选自DNA载体、RNA载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和逆转录病毒载体。
另一方面，本申请提供一种细胞，其i)包含前述的分离的核酸分子或前述的载体；和/或ii)表达前述的抗原结合多肽或嵌合抗原受体。
另一方面，本申请提供一种免疫效应细胞，其包含前述的核酸分子或前述的载体，和/或表达前述的CAR。
在某些实施方式中，所述的免疫效应细胞包括人细胞。
在某些实施方式中，所述免疫效应细胞包括T细胞、B细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、NKT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。
在某些实施方式中，所述免疫效应细胞包括自体或非自体的免疫效应细胞。
在某些实施方式中，所述的免疫效应细胞包括经修饰的免疫效应细胞。
在某些实施方式中，其中所述经修饰的免疫效应细胞包括降低同种异体细胞治疗引起的免疫排斥反应的细胞。
在某些实施方式中，其中所述经修饰的免疫效应细胞中的T细胞抗原受体(TCR)和主要组织相容性复合体(MHCI，MHCII)在T细胞中的功能受到抑制。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括与免疫排斥相关基因中的一个或多个的表达和/或活性被下调。
在某些实施方式中，其中所述与免疫排斥相关基因选自下组中的一种或多种基因：TRAC、TRBC、HLA-A、HLA-B、B2M和CIITA。
在某些实施方式中，所述经修饰的免疫效应细胞与未经修饰的相应细胞相比，TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性被下调。
在某些实施方式中，其中所述经修饰的免疫效应细胞与未经所述修饰的相应细胞相比，CIITA基因的表达和/或活性未被下调。
在某些实施方式中，其中所述经修饰的免疫效应细胞与未经所述修饰的相应细胞相比，B2M基因的表达和/或活性未被下调。
在某些实施方式中，其中所述经修饰的免疫效应细胞与相应的野生型细胞相比，TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性被下调。
在某些实施方式中，其中所述经修饰的免疫效应细胞与相应的野生型细胞相比，B2M基因的表达和/或活性未被下调。
在某些实施方式中，其中所述经修饰的免疫效应细胞与相应的野生型细胞相比，CIITA基因的表达和/或活性未被下调。
在某些实施方式中，其中所述基因的表达水平和/或活性被下调包括使编码所述基因的核酸分子的表达和/或活性下调；和/或使所述基因编码的蛋白质产物的表达和/或活性被下调。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括：基因敲除、基因突变和/或基因沉默。
在某些实施方式中，所述修饰包括所述免疫效应细胞中两个TRAC等位基因中的任意一个被敲除并且两个HLA-A等位基因中的任意一个被敲除。
在某些实施方式中，所述修饰包括所述免疫细胞中两个TRAC等位基因被敲除并且两个HLA-A等位基因中的任意一个被敲除。
在某些实施方式中，所述修饰包括所述免疫细胞中TRAC基因外显子被敲除并且HLA-A基因外显子被敲除。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用一种或多种选自下组的物质：反义RNA、siRNA、shRNA和CRISPR/Cas9系统。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用CRISPR/Cas9系统。
在某些实施方式中，其中所述修饰还包括向所述免疫效应细胞施用靶向所述TRAC基因外显子部分的sgRNA。
在某些实施方式中，其中所述靶向所述TRAC基因外显子部分的sgRNA包含SEQ IDNO:157至SEQ ID NO:171中任一项所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用靶向所述HLA-A基因外显子部分的sgRNA。
在某些实施方式中，其中所述靶向所述HLA-A基因外显子部分的sgRNA包含SEQ IDNO:172至SEQ ID NO:212中任一项所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，其中所述修饰还包括向所述细胞施用Cas酶。
在某些实施方式中，其中Cas酶包括Cas9蛋白。
在某些实施方式中，其中所述反义RNA包含SEQ ID NO:213至SEQ ID NO:216中任一项所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，其中所述免疫效应细胞为HLA-B纯合子细胞。
在某些实施方式中，其中所述HLA-B纯合子包括HLA-B*40纯合子，HLA-B*15纯合子，HLA-B*46纯合子，HLA-B*13纯合子，HLA-B*51纯合子，HLA-B*58纯合子，HLA-B*07纯合子，HLA-B*35纯合子，HLA-B*44纯合子，HLA-B*52纯合子，HLA-B*57纯合子，HLA-B*54纯合子，HLA-B*55纯合子。
在某些实施方式中，其中所述免疫效应细胞为HLA-A纯合子或杂合子细胞。
在某些实施方式中，其中所述HLA-A纯合子或杂合子包括HLA-A*02纯合子，HLA-A*11纯合子，HLA-A*02/A*11杂合子或HLA-A*24纯合子。
另一方面，本申请提供一种制备免疫效应细胞的方法，其包括向免疫效应细胞中引入前述的核酸分子或前述的载体。
在某些实施方式中，所述的方法还包括：在向免疫效应细胞中引入本申请所述的核酸分子或本申请所述的载体之前/之后，修饰所述免疫效应细胞，所述修饰包括与免疫排斥相关基因中的一个或多个的表达和/或活性被下调。
在某些实施方式中，其中所述与免疫排斥相关基因选自下组中的一种或多种基因：TRAC、TRBC、HLA-A、HLA-B、B2M和CIITA。
在某些实施方式中，与未经所述修饰的相应细胞中相应基因的表达和/或活性相比，下调所述免疫效应细胞中TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性。
在某些实施方式中，与未经所述修饰的相应细胞中相应基因的表达和/或活性相比，CIITA基因的表达和/或活性未被下调。
在某些实施方式中，与未经所述修饰的相应细胞中相应基因的表达和/或活性相比，B2M基因的表达和/或活性未被下调。
在某些实施方式中，与相应的野生型细胞相比，所述免疫效应细胞的TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性被下调。
在某些实施方式中，与相应的野生型细胞相比，CIITA基因的表达和/或活性未被下调。
在某些实施方式中，与相应的野生型细胞相比，B2M基因的表达和/或活性未被下调。
在某些实施方式中，其中所述基因的表达水平和/或活性被下调包括使编码所述基因的核酸分子的表达和/或活性下调；和/或使所述基因编码的蛋白质产物的表达和/或活性被下调。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括：基因敲除、基因突变和/或基因沉默。
在某些实施方式中，所述修饰包括所述免疫效应细胞中两个TRAC等位基因中的任意一个被敲除并且两个HLA-A等位基因中的任意一个被敲除。
在某些实施方式中，所述修饰包括所述免疫细胞中两个TRAC等位基因被敲除并且两个HLA-A等位基因中的任意一个被敲除。
在某些实施方式中，所述修饰包括所述免疫细胞中TRAC基因外显子被敲除并且HLA-A基因外显子被敲除。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用一种或多种选自下组的物质：反义RNA、siRNA、shRNA和CRISPR/Cas9系统。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用CRISPR/Cas9系统。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用靶向所述TRAC基因外显子部分的sgRNA。
在某些实施方式中，其中所述靶向所述TRAC基因外显子部分的sgRNA包含SEQ IDNO:157至SEQ ID NO:171中任一项所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用靶向所述HLA-A基因外显子部分的sgRNA。
在某些实施方式中，其中所述靶向所述HLA-A基因外显子部分的sgRNA包含SEQ IDNO:172至SEQ ID NO:212中任一项所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，其中所述修饰还包括向所述细胞施用Cas酶。
在某些实施方式中，其中Cas酶包括Cas9蛋白。
在某些实施方式中，其中所述反义RNA包含SEQ ID NO:213至SEQ ID NO:216中任一项所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，其中所述免疫效应细胞包括人细胞。
在某些实施方式中，所述免疫效应细胞包括T细胞、B细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、NKT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。
在某些实施方式中，所述免疫效应细胞包括自体或非自体的免疫效应细胞。
在某些实施方式中，其中所述细胞为HLA-B纯合子细胞。
在某些实施方式中，其中所述HLA-B纯合子包括HLA-B*40纯合子，HLA-B*15纯合子，HLA-B*46纯合子，HLA-B*13纯合子，HLA-B*51纯合子，HLA-B*58纯合子，HLA-B*07纯合子，HLA-B*35纯合子，HLA-B*44纯合子，HLA-B*52纯合子，HLA-B*57纯合子，HLA-B*54纯合子，HLA-B*55纯合子。
在某些实施方式中，其中所述细胞为HLA-A纯合子或杂合子细胞。
在某些实施方式中，其中所述HLA-A纯合子或杂合子包括HLA-A*02纯合子，HLA-A*11纯合子，HLA-A*02/A*11杂合子或HLA-A*24纯合子。
另一方面，本申请提供前述的嵌合抗原受体，前述的分离的核酸分子，前述的载体，前述的细胞，或前述的免疫效应细胞在制备CAR-T细胞中的应用。
另一方面，本申请提供一种药物组合物，其包含前述的抗原结合多肽，前述的嵌合抗原受体，前述的分离的核酸分子，前述的载体，前述的细胞，和/或前述的免疫效应细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。
另一方面，本申请提供前述的抗原结合多肽，前述的抗原嵌合受体，前述的分离的核酸分子，前述的载体，前述的细胞，前述的免疫效应细胞，和/或前述的药物组合物，其用于治疗与B7H3的表达相关的疾病或病症。
在某些实施方式中，其中所述与B7H3的表达相关的疾病或病症包括与B7H3的表达上调相关的疾病或病症。
在某些实施方式中，其中所述与B7H3的表达相关的疾病或病症包括癌症。
在某些实施方式中，其中所述癌症包括肾上腺皮质癌，膀胱癌，乳腺癌，胆管癌，结直肠癌，淋巴瘤，食管癌，脑胶质瘤，头颈鳞癌，肾癌，肝癌，肺癌，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，肉瘤，黑色素瘤，胃癌，胸腺癌或子宫内膜癌。
另一方面，本申请提供前述的抗原结合多肽，前述的抗原嵌合受体，前述的分离的核酸分子，前述的载体，前述的细胞，前述的免疫效应细胞，和/或前述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗癌症。
在某些实施方式中，其中所述癌症包括B7H3阳性的癌症。
在某些实施方式中，其中所述癌症包括肾上腺皮质癌，膀胱癌，乳腺癌，胆管癌，结直肠癌，淋巴瘤，食管癌，脑胶质瘤，头颈鳞癌，肾癌，肝癌，肺癌，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，肉瘤，黑色素瘤，胃癌，胸腺癌或子宫内膜癌。
另一方面，本申请提供一种预防或治疗与B7H3的表达相关的疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的前述的抗原结合多肽，前述的抗原嵌合受体，前述的分离的核酸分子，前述的载体，前述的细胞，前述的免疫效应细胞，和/或前述的药物组合物。
在某些实施方式中，其中所述与B7H3的表达相关的疾病或病症包括与B7H3的表达上调相关的疾病或病症。
在某些实施方式中，其中所述与B7H3的表达相关的疾病或病症包括癌症。
在某些实施方式中，其中所述癌症包括肾上腺皮质癌，膀胱癌，乳腺癌，胆管癌，结直肠癌，淋巴瘤，食管癌，脑胶质瘤，头颈鳞癌，肾癌，肝癌，肺癌，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，肉瘤，黑色素瘤，胃癌，胸腺癌或子宫内膜癌。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：
图1A显示的是本申请所述anti-B7H3 CAR基因慢病毒表达载体；
图1B显示的是本申请所述anti-B7H3 UCAR-T细胞的构建策略；
图2显示的是本申请所述anti-B7H3 VHH抗体的亲和曲线；
图3显示的是本申请所述anti-B7H3 VHH抗体的ADCC功能检测结果；
图4A-4C显示的是本申请所述anti-B7H3 UCAR-T细胞的细胞表型检测结果；
图5显示的是本申请所述anti-B7H3 UCAR-T细胞对靶细胞的杀伤结果；
图6A-6C显示的是本申请所述anti-B7H3 UCAR-T细胞与靶细胞共培养细胞因子分泌检测结果；
图7显示的是本申请所述显示的是本申请所述anti-B7H3 UCAR-T细胞体内抗肿瘤效果；
图8A-8B显示的是本申请所述靶向anti-B7H3 UCAR-T细胞体内GVHD和排异反应结果；
图9显示的是本申请所述anti-B7H3 UCAR-T细胞脱靶分析；
图10显示的是本申请所述anti-B7H3 UCAR-T细胞染色体易位分析；
图11显示的是本申请所述anti-B7H3 UCAR-T细胞核型分析；
图12显示的是本申请所述anti-B7H3 UCAR-T细胞Cas9残留分析；
图13显示的是本申请中TRAC基因在Sg9RNA编辑后Sanger测序的结果；
图14显示的是本申请中TRAC基因在Sg9RNA编辑后TA克隆检测的结果；
图15显示的是本申请中TRAC基因在Sg9RNA编辑后流式细胞检测的结果；
图16显示的是本申请中HLA-A02基因在Sg2RNA编辑后Sanger测序的结果；
图17显示的是本申请中HLA-A02基因在Sg5RNA编辑后Sanger测序的结果；
图18显示的是本申请中HLA-A11基因在Sg21RNA编辑后Sanger测序的结果；
图19显示的是本申请中HLA-A11基因在Rsg2RNA编辑后Sanger测序的结果；
图20A-20B显示的是本申请的经修饰的免疫效应细胞中同时敲除HLA-A02和TRAC的结果；
图21A-21B显示的是本申请的经修饰的免疫效应细胞中HLA-A02和TRAC的蛋白水平；
图22显示的是本申请的经修饰的免疫效应细胞中TRAC、HLA-A、B2M和CIITA的mRNA水平；
图23A-23B显示的是本申请的经修饰的免疫效应细胞中B2M和CIITA的蛋白水平；
图24A-24D显示的是本申请的经修饰的免疫效应细胞中TRAC、HLA-A、B2M和CIITA的蛋白水平；
图25A-25B显示的是本申请的经修饰的免疫效应细胞中TRAC和HLA-A mRNA水平的敲除情况；
图26A-26B显示的是本申请的经修饰的免疫效应细胞中CD69和CD137的蛋白水平；
图27显示的是本申请的经修饰的免疫效应细胞与NK细胞共培养的情况；
图28显示的是本申请的经修饰的免疫效应细胞表达IFN-γ的水平；
图29A-29D显示的是本申请的经修饰的免疫效应细胞中TRAC、HLA-A、B2M和CIITA的蛋白水平；
图30显示的是本申请的经修饰的免疫效应细胞对CAR的感染效率；
图31显示的是本申请的经修饰的免疫效应细胞的扩增倍数；
图32显示的是本申请的经修饰的免疫效应细胞对CD19阳性靶细胞的杀伤效果；
图33显示的是施用本申请的经修饰的免疫效应细胞的给药方案；
图34显示的是本申请的经修饰的免疫效应细胞对小鼠体内肿瘤的杀伤效果。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”通常是指一组多肽，在最简单的实施方案中通常有两种，其当在免疫效应细胞中时，提供细胞对靶细胞(通常为癌细胞)的特异性，并产生细胞内信号。在一些实施方案中，CAR包含至少一个细胞外抗原结合结构域(如VHH、scFv或其部分)，跨膜结构域和胞质信号传导结构域(本文中也称为“胞内信号传导结构域”)，其包含衍生自如下所定义的刺激分子和/或共刺激分子的功能性信号传导结构域。在一些实施方案中，该组多肽在相同的多肽链中(例如，包含嵌合融合蛋白)。在一些实施方案中，该组多肽彼此不连续，例如在不同的多肽链中。在一些方面，该组多肽包括二聚化开关，其在二聚化分子的存在下可将多肽彼此偶联，例如可将抗原结合结构域偶联至胞内信号传导结构域。一方面，CAR的刺激分子是与T细胞受体复合物相关的ζ链。在一个方面，细胞质信号传导结构域包含一级信号传导结构域(例如，CD3-ζ的一级信号传导结构域)。在一个方面，细胞质信号传导结构域还包含一个或多个衍生自如下定义的至少一种共刺激分子的功能性信号传导结构域。一方面，共刺激分子可以选自4-1BB(即CD137)，CD27，ICOS和/或CD28。一方面，CAR包含嵌合融合蛋白，其可以包含细胞外抗原识别结构域，跨膜结构域和包含衍生自刺激分子的功能性信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。一方面，CAR包含嵌合融合蛋白，其可以包含细胞外抗原识别结构域，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，细胞内信号传导结构域包含衍生自共刺激分子的功能性信号传导结构域和衍生自刺激分子的功能性信号传导结构域。一方面，CAR包含嵌合融合蛋白，其可以包含细胞外抗原识别结构域，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，细胞内信号传导结构域包含衍生自一个或多个共刺激分子的功能性信号传导结构域和衍生自刺激分子的功能性信号传导结构域。一方面，CAR包括嵌合融合蛋白，其可以包含细胞外抗原识别结构域，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，细胞内信号传导结构域包含至少两个衍生自一个或多个共刺激分子的功能性信号传导结构域和衍生自刺激分子的功能性信号传导结构域。在一个方面，CAR包含CAR融合蛋白的氨基末端(N-ter)上任选的前导序列。在一个方面，CAR进一步包含在细胞外抗原识别结构域的N末端的前导序列，其中前导序列任选地在细胞加工过程中从抗原识别结构域(例如VHH)切除，并将CAR定位于细胞膜。
在本申请中，术语“抗体”通常是指在最广泛的意义上加以使用并且具体地涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们显示所期望的生物活性(Milleretal(2003)Jour.ofImmunology170:4854-4861)。抗体可以是鼠、人、人源化、嵌合抗体，或源于其它物种。
全长抗体典型地是指由两条“全长抗体重链”和两条“全长抗体轻链”组成的抗体。“全长抗体重链”通常是这样的多肽，其在N端到C端方向由抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定重链结构域1(CH1)，抗体铰链区(HR)，抗体重链恒定结构域2(CH2)，和抗体重链恒定结构域3(CH3)组成，缩写为VH-CH1-HR-CH2-CH3；并且在IgE亚类的抗体的情形中，任选地还包括抗体重链恒定结构域4(CH4)。在一些实施方式中，“全长抗体重链”是在N端到C端方向由VH，CH1，HR，CH2和CH3组成的多肽。“全长抗体轻链”通常是在N端到C端方向由抗体轻链可变结构域(VL)，和抗体轻链恒定结构域(CL)组成的多肽，缩写为VL-CL。所述抗体轻链恒定结构域(CL)可以是κ(kappa)或λ(lambda)。两条全长抗体链通过在CL结构域和CH1结构域之间的多肽间二硫键和全长抗体重链的铰链区之间的多肽间二硫键连接在一起。典型的全长抗体的实例是天然抗体如IgG(例如，IgG1和IgG2)，IgM，IgA，IgD，和IgE)。
在本申请中，术语“抗原结合片段”(在本文中也被称作“靶向部分”或“抗原结合部分”)通常是指抗体分子的一部分，其包含负责抗体与抗原之间的特异性结合的氨基酸。抗原中由抗体特异性地识别和结合的部分是称作如上文所述的“表位”。抗原结合结构域可典型地包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)；然而，其并非必须包含两者。Fd片段例如具有两个VH区并且通常保留完整抗原结合结构域的一些抗原结合功能。抗体的抗原结合片段的实例包括(1)Fab片段，具有VL、VH、恒定轻链(CL)和CH1结构域的单价片段；(2)F(ab’)2片段，具有由铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(3)具有两个VH和CH1结构域的Fd片段；(4)具有抗体单臂的VL和VH结构域的Fv片段，(5)dAb片段(Ward等人,“Binding Activities of a Repertoire of Single Immunoglobulin Variable DomainsSecreted From Escherichia coli,”Nature 341:544-546(1989)，其以引用的方式整体并入本申请)，其具有VH结构域；(6)分离的互补决定区(CDR)；(7)单链Fv(scFv)，例如源于scFV-文库。尽管Fv片段的两个结构域VL和VH是由独立基因编码，但其可通过合成连接子使用重组方法接合，合成连接子使得其被制备为其中VL和VH区配对以形成单价分子的单一蛋白链(称为单链Fv(scFv))(可参见例如Huston等人,“Protein Engineering of AntibodyBinding Sites:Recovery of Specific Activity in an Anti-Digoxin Single-ChainFv Analogue Produced in Escherichia coli,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988))；和(8)VHH，“VHH”涉及来自骆驼科(骆驼、单峰骆驼、美洲驼、羊驼等)重链抗体的可变抗原结合结构域(参见Nguyen V.K.等人，2000，The EMBO Journal，19，921-930；Muyldermans S.，2001，J Biotechnol.，74，277-302以及综述Vanlandschoot P.等人，2011，Antiviral Research 92，389-407)。VHH也可称为纳米抗体(Nanobody)(Nb)和/或单域抗体。这些抗体片段使用所属领域的技术人员已知的常规技术获得，且以与完整抗体相同的方式评估所述片段的功能。靶向IL13Rα2的抗原结合片段还记载于国际专利申请公开WO2014072888Al和WO2021041725A1，其中的每一个以全文引用的方式并入本申请。
在本申请中，术语“单域抗体”或“VHH”通常是指缺失抗体轻链而只有重链可变区的一类抗体。在某些情形中，单域抗体可以来自双峰驼、单峰驼、羊驼、美洲驼、护士鲨、大星鲨或鳐鱼(例如，可参见康晓圳等，生物工程学报，2018，34(12):1974-1984)。例如，单域抗体可以来自羊驼。单域抗体可由重链可变区(VH)构成。术语“重链可变区”通常是指抗原结合片段的重链的氨基末端结构域。重链可变区可进一步被区分为称为互补决定区(CDR)的高变区，它们散布在成为框架区(FR)的更保守的区域中。每个重链可变区可由三个CDR和四个FR区构成，它们从氨基端至羧基端可按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。
在本申请中，术语“互补决定区”(CDR)通常是指在抗原结合片段可变区内的互补性决定区。在本申请中，所述重链可变区存在3个CDRs，所述CDRs对于每个可变区命名为HCDR1、HCDR2和HCDR3。这些CDRs的确切边界已根据不同系统不同地限定。由Kabat(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes ofHealth，Bethesda，Md.(1987)和(1991))描述的系统，不仅提供了可应用于抗原结合片段的任何可变区的明确残基编号系统，还提供了限定3个CDRs的精确残基边界。这些CDRs可以被称为Kabat CDRs。Chothia和同事(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)以及Chothia等人，Nature 342：877-883(1989))发现尽管在氨基酸序列水平上具有大的多样性，但是Kabat CDRs内的某些亚部分采取几乎相同的肽主链构象。这些亚部分命名为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别指轻链和重链区域。这些区域可以被称为ChothiaCDRs，所述Chothia CDRs具有与Kabat CDRs重叠的边界。与Kabat CDRs重叠的限定CDRs的其他边界已由Padlan(FASEB J.9：133-139(1995))和MacCallum(J Mol Biol 262(5)：732-45(1996))描述。另外，其他的CDR边界定义可能不严格地遵循上述系统之一，但仍将与Kabat CDRs重叠，尽管按照特定残基或残基组或甚至整个CDRs并不显著影响抗原结合的预测或实验发现，它们可以缩短或加长。在本申请中，使用的是IMGT编号系统。
在本申请中，术语“FR”通常是指抗体可变结构域的更高度保守的部分，其被称为框架区。例如，天然重链和轻链的可变结构域各自可以包含四个FR区，即在VH中四个(H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4)，和在VL中四个(L-FR1，L-FR2，L-FR3和L-FR4)。“框架区”通常是指本领域识别的抗体可变区中存在于分歧性更高的(即高变)CDR之间的部分。此类框架区典型地称为框架1至4(FR1、FR2、FR3和FR4)且提供用于在三维空间中呈现六个CDR(三个来自重链且三个来自轻链)的骨架，以形成抗原结合表面。
在本申请中，术语“同源性”通常可以等同于序列“同一性”。同源序列可以包括可以与主题序列是至少80％、85％、90％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％相同的氨基酸序列。通常，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等。同源性可以根据相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)来考虑，也可以在序列同一性方面表达同源性。在本申请中，提及的氨基酸序列或核苷酸序列的SEQID NO中的任一项具有百分比同一性的序列是指在所提及的SEQ ID NO的整个长度上具有所述百分比同一性的序列。为了确定序列同一性，可进行序列比对，其可通过本领域技术人员了解的各种方式进行，例如，使用BLAST、BLAST-2、ALIGN、NEEDLE或Megalign(DNASTAR)软件等。本领域技术人员能够确定用于比对的适当参数，包括在所比较的全长序列中实现最优比对所需要的任何算法。
在本申请中，术语“特异性结合”在提及结合分子(例如抗体)与其结合配偶体(例如抗原)的相互作用时，通常是指该相互作用取决于结合配偶体上特定结构(例如抗原决定簇或表位)的存在。换言之，即使在结合配偶体存在于其他分子或有机体的混合物中时，抗体仍会优先结合或识别结合配偶体。结合可通过共价或非共价相互作用或二者的组合介导。换言之，术语“特异性结合”通常是指免疫特异性结合抗原决定簇或表位且不免疫特异性结合其他抗原决定簇或表位。免疫特异性结合抗原的结合分子可以较低亲和力结合其他肽或多肽，如通过(例如)放射免疫分析(RIA)、酶联免疫吸附分析(ELISA)、BIACORE或本领域中已知的其他分析所测定。免疫特异性结合抗原的结合分子或其片段可与带有相同表位的相关抗原交叉反应。在某些情形中，免疫特异性结合抗原的结合分子或其片段不与其他抗原交叉反应。
在本申请中，术语“KD”可与“KD”互换使用，通常是指特定的抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，单位为M(mol/L)。KD可通过物质AB和其解离得到的物质A和物质B的浓度来计算：KD＝c(A)*c(B)/c(AB)。由该公式可知，KD值越大，说明解离越多，代表物质A、B之间的亲和力越弱；反之，KD值越小，说明解离越少，代表物质A、B之间的亲和力越强。
在本申请中，术语“分离的核酸分子”通常是指从其天然环境中分离的或人工合成的任何长度的分离形式的核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。
在本申请中，术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。
在本申请中，术语“病毒载体”广泛用于指核酸分子(例如转移质粒)或介导核酸转移的病毒颗粒，核酸分子包括病毒衍生的通常促进核酸分子转移或整合到细胞基因组中的核酸元件。病毒颗粒通常包括各种病毒组件，有时还包括除核酸外的宿主细胞组件。病毒载体可以指能够将核酸转移到细胞中的病毒或病毒颗粒，或被转移的核酸本身。
在本申请中，术语“慢病毒”通常是指复杂逆转录病毒的组(或属)。示例性慢病毒包括但不限于：HIV(人免疫缺陷病毒；包括HIV 1型和HIV 2型)；维斯那-梅迪病毒(visna-maedivirus，VMV)病毒；山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)；马传染性贫血病毒(EIAV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。在一种实施方式中，基于HIV的载体骨架(即HIV顺式作用序列元件)是优选的。在特别的实施方式中，慢病毒用于将包含CAR的多核苷酸递送至细胞。
在本申请中，术语“宿主细胞”或“细胞”通常是指可以或已经含有包括本申请所述分离的核酸分子的载体，或者能够表达本申请所述分离的抗原结合片段的个体细胞，细胞系或细胞培养物。所述宿主细胞可以包括单个宿主细胞的子代。由于天然的，意外的或故意的突变，子代细胞与原始亲本细胞在形态上或在基因组上可能不一定完全相同，但能够表达本申请所述分离的抗原结合片段即可。所述宿主细胞可以通过使用本申请所述的载体体外转染细胞而得到。所述宿主细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌)，也可以是真核细胞(例如酵母细胞，例如COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，HeLa细胞，HEK293细胞，COS-1细胞，NS0细胞或骨髓瘤细胞)。例如，所述的宿主细胞可以是大肠杆菌细胞。例如，所述的宿主细胞可以是酵母细胞。例如，所述的宿主细胞可以是哺乳动物细胞。例如，所述哺乳动物细胞可以是CHO-K1细胞。
在本申请中，术语“T细胞”或“T淋巴细胞”可以是任何T细胞，如培养T细胞，例如原代T细胞，或来自培养T细胞系的T细胞，或获自哺乳动物的T细胞(优选灵长类动物，物种，包括猴、狗或人)。如果获自哺乳动物，那么T细胞可以获自诸多来源，包括但不限于血液、骨髓、淋巴结、胸腺或其它组织或流体。T细胞还可以被富集或被化。T细胞可以通过在体外或体内将造血干细胞成熟化成T细胞而获得。在示范性方面中，T细胞是人类T细胞。在示范性方面中，T细胞是从人类中分离的T细胞。T细胞可以是任何类型的T细胞，包括NKT细胞，并且可以具有任何发育阶段，包括但不限于CD4+/CD8+双阳性T细胞；CDA+辅助T细胞；例如Th1和Th2细胞，CD8+T细胞(例如细胞毒性T细胞)；外周血液单核细胞(PBMC)；外周血液白细胞(PBL)；肿瘤浸润细胞(TIL)；记忆T细胞；未处理T细胞等等。优选地，T细胞是CD8+T细胞或CD4+T细胞。在一些替代方式中，T细胞与接受细胞或待接受细胞(例如所述细胞处于治疗组合物的形式)的接受受试者是同种异体的(来自相同物种的不同供体)；在一些替代方式中，T细胞是自体的(供体和接受者相同)；在一些替代方式中，T细胞是同基因的(syngeneic)(供体和接受者不同，但为同卵双胞胎)。
在本申请中，术语“免疫效应细胞”通常是指参与免疫应答，行使效应功能的免疫细胞。例如所述行使效应功能可以包括清除异物抗原或促进免疫效应子应答等。免疫效应细胞可以包括浆细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞和骨髓源性吞噬细胞。
本申请的免疫效应细胞可以是自体/自身的(autologous/autogeneic)(“自己的”)或非自体的(“非自己的”，例如同种异体的、同基因的或异基因的)。在本申请中，术语“自体的”通常是指来自相同受试者的细胞。“同种异体的”通常是指与相比较的为相同物种但在遗传上不同的细胞。“同基因的”通常是指在遗传上与相比较的细胞相同的不同受试者的细胞。“异基因的”通常是指物种与相比较的细胞不同的细胞。在一些实施方式中，本申请的细胞是自体的或同种异体的。
在本申请中，术语“修饰”通常是指改变细胞的状态或结构和/或细胞的状态或结构的改变。所述改变通常是与相应未经所述修饰的细胞的状态或结构相比，所述改变可以包括内源基因表达水平或功能的变化，例如通过基因工程手段使得细胞内源基因表达水平下调、上调或不表达，所述基因工程手段可以包括同源重组、CRISPR/Cas9系统基因编辑等；所述改变还可以包括细胞蛋白质表达、结构或功能的变化，例如通过所述内源基因表达水平或功能的变化而实现的相应蛋白质表达的变化、结构或功能的变化，例如通过调节蛋白质翻译、翻译后修饰而实现的蛋白质表达的变化、结构或功能的变化；所述改变还可以包括引入外源基因、表达外源蛋白质等。
在本申请中，术语“TRAC”通常是指T细胞受体α链恒定区(T cell receptor alphacon-stant)。T细胞受体(TCR)通常是指位于T细胞表面的特异性受体，能够识别与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的抗原。TCR通常由两条不同的蛋白质链组成(即异源二聚体)。在人类中，多数T细胞中的TCR由一条α链和一个β链(分别由TRA和TRB编码)组成，这一类T细胞被称为αβT细胞，少数的的T细胞中，TCR由γ链和δ链(分别由TRG和TRD编码)组成，这一类T细胞被称为γδT细胞。通常情况下，αβT细胞约占T细胞总数的95％，γδT细胞约占T细胞总数的5％，该比率在个体发育过程中和患病状态(例如白血病)中发生变化，物种之间也有所不同。组成TCR的每一条链都含有可变区与恒定区，在人类中，编码α链的基因(TRA，例如HGNC:12027所示的信息)位于14号染色体，由多基因片段构成，包括可变段(V)、连接段(J)以及恒定区(C)，TRAC基因通常是指编码T细胞受体α链恒定区(C)的基因序列(例如HGNC:12029所示的信息)，其位于14号染色体(14q11.2；14：22,547,505-22,552,131)。通常编码N段抗原识别域的可变段(V)基因中的1个与连接段(J)中的一个重排产生一个功能性V区外显子，该外显子被转录并通过剪接与恒定区(C)连接，从而形成T细胞受体α链编码序列。
在本申请中，术语“主要组织相容性复合物抗原”(“MHC”，在人类的情况下也称为“人类白细胞抗原”(“HLA”))通常是指在细胞表面上表达的赋予细胞独特抗原身份的蛋白质。MHC/HLA抗原是被T细胞和NK细胞识别为源自于与免疫效应细胞相同的造血干细胞来源(“自身”)或识别为源自于另一种造血重建细胞来源(“非自身”)的靶分子。识别了两种主要类别的HLA抗原：HLAI类和HLAII类。HLAI类抗原(人类中的A、B、C)使每个细胞都可被识别为“自身”，而HLAII类抗原(人类中的DR、DP和DQ)参与淋巴细胞和抗原呈递细胞之间的反应。两者都已经与移植器官的排斥有牵涉。HLA基因系统的一个重要方面是其多态性。每个基因，MHC I类(A、B和C)和MHC II类(DP、DQ和DR)存在着不同的等位基因。HLA等位基因由数字和下标表示。例如，两个不相关的个体可能分别携带I类HLA-B基因B5和Bw41。等位基因产物在α和/或β结构域的一个或更多个氨基酸中有差异。大量的特异性抗体或核酸试剂被用于使用表达I类和II类分子的白细胞对个体的HLA单倍型进行分型。通常用于HLA分型的基因是六种MHC I类和II类蛋白，即HLA-A；HLA-B和HLA-DR各自有两个等位基因。HLA基因簇集在存在于染色体位置6p21上的“超级基因座”中，所述“超级基因座”编码在免疫系统以及一些其他的基本分子和细胞过程的调控中具有重要作用的6个经典的移植HLA基因和至少132个蛋白质编码基因。完整的基因座粗略度量为3.6Mb，具有至少224个基因座。这种簇集的一个效果是“单倍型”，即存在于单条染色体上的一组等位基因，是从一个亲本遗传来的，倾向于作为一组进行遗传。从每个亲本遗传来的一组等位基因形成一个单倍型，其中一些等位基因倾向于关联在一起。鉴定患者的单倍型可以帮助预测找到匹配供体的概率，并且帮助制定搜索策略，因为一些等位基因和单倍型比其他等位基因和单倍型更常见，而且它们在不同种族和民族中分布的频率不同。
在本申请中，“HLA-A”通常是指一类人类白细胞抗原(human leukocyteantigens)多肽链，由位于人类染色体6p21.3的HLA-A基因(例如HGNC:4931所示的信息)编码。HLA-A是构成人类细胞表面I类MHC分子的三种主要多肽类型之一，其他还包括HLA-B和HLA-C。由HLA-A基因编码的α链和B2M基因编码的β链(β2-微球蛋白)组成的异二聚体即为HLA-A类MHC I分子。所述由HLA-A基因编码的α链可以包含α1结构域、α2结构域域、α3结构域、跨膜区以及胞质区，其中α1结构域、α2结构域可以与肽段结合从而由MHC I分子(例如HLA-A类)将所述肽段呈递给免疫系细胞。在人类中，与大多数哺乳动物相似，MHC I分子的α链为多态性的，其一级结构有较多变化，截至2013年12月，共有2432个已知的HLA-A等位基因，编码1740个活性蛋白和117个无效蛋白。在本申请中，HLA-A等位基因可以包括IMGT/HLA数据库3.38.0版(https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/)收录的由WHO HLA因子命名委员会命名的不同HLA-A等位基因的序列信息。
在本申请中，术语“HLA-B”通常是指人类白细胞抗原(HLA)复合物的基因家族的一部分。HLA是主要组织相容性复合体(MHC)的人类版本，MHC是一个存在于许多物种中的基因家族。在这个复杂的基因被分为三个基本组：I类，II类和III类。在人类中，HLA-B基因和两个相关基因HLA-A和HLA-C是MHC I类的主要基因。HLA-B基因位于6号染色体短(p)臂的细胞带21.3，从碱基对31,353,871到31,357,211。HLA-B是供者和受者之间应匹配的三个主要HLA之一。它们是HLA-A、HLA-B(均为I类MHC)和HLA-DR(II类MHC)。如果这两种组织具有编码这三种HLA的相同基因，那么排斥的可能性和严重程度就会降到最低。HLA-B的数百个版本(等位基因)是已知的，每个版本都有一个特定的编号(例如HLA-B27)。密切相关的等位基因被归类在一起；例如，至少有28个非常相似的等位基因是HLA-B27的亚型。这些亚型被指定为HLA-B*2701至HLA-B*2728。
在本申请中，术语“HLA匹配的”是指其中供体和受体之间HLA抗原没有不匹配的供体-受体对，所述供体诸如向需要造血干细胞移植疗法的受体提供造血干细胞移植物的供体。HLA匹配的(即其中所有6个等位基因都是匹配的)供体-受体对具有降低的移植物排斥的风险，原因是内源性T细胞和NK细胞不太可能将进入的移植物识别为外来的，并且因此不太可能产生针对移植物的免疫应答。
在本申请中，术语“HLA不匹配的”是指其中供体和受体之间至少一种HLA抗原(特别是对于HLA-A、HLA-B和HLA-DR)是不匹配的供体-受体对，所述供体诸如向需要造血干细胞移植疗法的受体提供造血干细胞移植物的供体。在一些实施方案中，一个单倍型是匹配的，而另一个是不匹配的。HLA不匹配的供体-受体对相对于HLA匹配的供体-受体对可能具有增加的移植物排斥的风险，原因是在HLA不匹配的供体-受体对的情况下，内源性T细胞和NK细胞更可能将进入的移植物识别为外来的，并且这样的T细胞和NK细胞因此更可能产生针对移植物的免疫应答。
在本申请中，术语“B2M”通常是指是β2微球蛋白(β2-microglobulin)，是MHC I类分子的组成部分之一。β2微球蛋白(也称为β链)可以与HLA编码的α链组成MHC I类的分子。B2M通常在所有有核的细胞中都有表达。在人类中，β2微球蛋白由位于15q21.1的B2M基因(例如HGNC:914所示的信息)所编码。
在本申请中，术语“CIITA”通常是指Ⅱ类主要组织相容性复合体(MHCⅡ)的反式激活因子。所述反式激活因子可以是具有酸性转录激活结构域、4个LRR(富含亮氨酸的重复序列)和GTP结合结构域的蛋白质。所述蛋白质可位于细胞核中，作为II类主要组织相容性复合体(MHCⅡ)基因转录的正向调节剂，被称为表达这些基因的“主控制因子”。该蛋白质还可结合GTP，并利用与GTP结合来使其自身转运到细胞核中，在细胞核中，其通常使通过乙酰转移酶(AT)活性以类似共激活剂的方式起作用。在人类中，所述蛋白质由位于16p13.13的基因(例如HGNC:7067所示的信息)编码，能够产生几种编码不同同工型的转录物变体。
在本申请中，术语“野生型细胞”通常是指自然存在的或者自然来源的细胞。
在本申请中，术语“核酸”或“多核苷酸”或“核酸分子”通常时指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其单链形式或双链形式的聚合物。除非特别限定，否则该术语可以包括含天然核苷酸的类似物的核酸，所述核酸具有与参考核酸(例如示出了序列信息)相似的结合特性并且按照与天然存在核苷酸相似的方式代谢。除非另外说明，核酸的序列可以包括其保守方式修饰的变体，例如简并密码子置换、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列，以及明确指出的序列。
在本申请中，术语“表达”通常是指特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
在本申请中，术语“基因突变”通常是指基因在结构上发生的碱基对组成或排列顺序的改变。例如单个碱基改变所引起的点突变，或多个碱基的缺失、重复和插入等。
在本申请中，术语“基因沉默”通常是指通过调节机制阻止某些基因的表达。主要可以包括两种：一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等因素引起的转录水平上的基因沉默(transcriptional gene silencing,TGS)，另一种是转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS)，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性干预而影响基因的表达。通常情况下当基因沉默时，相应基因表达下调/减少。而当基因被敲除时则通常表现为不表达，例如在细胞中，某种特定基因的所有等位基因均被敲除后则表现为该基因的表达消失。基因沉默通常被认为是一种基因敲低机制，通用于沉默基因的方法可以如RNAi等。
在本申请中，术语“内源”指来自生物、细胞、组织或系统或在其内部产生的任何物质。
在本申请中，术语“外源”指从生物、细胞、组织或系统外部引入或在其外部产生的任何物质。
在本申请中，术语“反义RNA”通常是指一种与转录产物mRNA(信使RNA)互补的单链RNA。反义RNA可通过与mRNA的结合抑制基因的表达。例如，反义RNA与靶mRNA结合后引起该双链RNA分子对RNA酶Ⅲ的敏感性增加，使其降解；例如，反义RNA与mRNA的上游非编码区结合，从而直接抑制靶mRNA的翻译。
在本申请中，术语“siRNA”通常是指Small interfering RNA(小干扰RNA)或shortin-terfering RNA(短干扰RNA)的缩写。siRNA是一类双链非编码RNA分子，长度约为18-28个碱基对，可通过与mRNA的互补结合引起mRNA的降解从而干扰特定基因的表达。在某些实施方式中，siRNA可以是长双链RNA或shRNA经Dicer酶处理得到的产物。在某些实施方式中，siRNA进入细胞与其他蛋白质形成RNA诱导沉默复合体(RISC)，有义链发生降解，反义链可与互补的靶向序列结合，从而实现基因沉默。
在本申请中，术语“shRNA”通常是指short hairpin RNA的缩写，即“短发夹RNA”。shRNA通常包括两个短反向重复序列，中间由一茎环(loop)序列分隔，组成发夹结构。通常还可以包括5-6个T碱基作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。在某些实施方式中，shRNA可经由病毒载体或质粒进入细胞中，在聚合酶Ⅱ或聚合酶Ⅲ的作用下进行转录，转录产物自细胞核输出(通常可经由Exportin 5)后经Dicer处理后输送至RISC，有义链发生降解，反义链可与互补的靶向序列结合，从而实现基因沉默。
在本申请中，术语“CRISPR/Cas系统”通常是指包含RNA引导的核酸酶或其他效应分子和gRNA分子的一组分子，所述分子能够指引和实现由RNA引导的核酸酶或其他效应分子在靶序列处修饰核酸，例如引起靶序列降解。在某些实施方式中，CRISPR系统包含gRNA和Cas蛋白，例如，Cas9蛋白。包含Cas9或其功能性突变体的系统在本申请中称作“Cas9系统”或“CRISPR/Cas9系统”。在某些实施方式中，gRNA分子和Cas分子可以复合，以形成核糖核蛋白(RNP)复合体。
在本申请中，术语“gRNA分子”或“向导RNA”、“指导RNA”、“指引RNA”、“向导RNA分子”、“gRNA”可互换使用，通常是指能够促进特异性指引RNA引导的核酸酶或其他效应分子(一般与gRNA分子复合)至靶序列上的核酸分子。在某些实施方案中，通过gRNA的一部分与DNA(例如，通过gRNA导引结构域)杂交并且通过gRNA分子的一部分与RNA指导的核酸酶或其他效应分子结合(例如，至少通过gRNAtracr)实现所述引导。在某些实施方案中，gRNA分子由单一的连续多核苷酸分子组成，在本文中称作“单一向导RNA”或“sgRNA”等。在其他实施方案中，gRNA分子由本身能够缔合(一般通过杂交)的多个(例如二个)多核苷酸分子组成，在本文中称作“双重向导RNA”或“dgRNA”等。
在本申请中，术语“Cas蛋白”通常是指CRISPR/Cas系统中负责剪切DNA的酶。可以包括来自Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型CRISPR/Cas系统的酶。例如，Cas3、Cas9、Cas10。
在本申请中，术语“Cas9蛋白”通常是指负责剪切DNA的来自细菌II型CRISPR/Cas系统的酶。Cas9可以包括野生型蛋白及其有功能性突变体。
在本申请中，“等位基因”通常是指基因座上的基因序列可能具有的不同变化的形式。基因座也称作基因位点或位点，是指染色体上的固定位置，例如某个基因所在。基因座在基因组中的排列位置称为基因图谱(genetic map)。
在本申请中，术语“纯合子”通常是指同源染色体在同一基因座上的两个等位基因相同的基因型个体。一对相对基因可以有AA和aa两种基因型的个体。
在本申请中，术语“杂合子”通常是指二倍体中同源染色体同一位点上的两个等位基因不相同的基因型个体，如Aa。杂合基因型一般比纯合显性或纯合隐性基因型的适应性都要高，这种现象被称为杂合子优势。
在本申请中，术语“肿瘤”和“癌症”可以互换地使用，通常是指以异常细胞快速且失控生长为特征的疾病。癌细胞可以局部地或通过血流和淋巴系统扩散到身体其他部分。本文中描述了各种癌症的例子并且它们包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。术语“癌症”或“肿瘤”包括恶变前以及恶性癌症和肿瘤，还涵盖实体瘤和非实体肿瘤。
在本申请中，术语“药学上可接受的”通常是指代与合理的益处/风险比相称、在合理医学判断范围内适合用于与人类和动物的组织接触而不具有过度毒性、刺激、过敏应答或其它问题或并发症的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
在本申请中，术语“药学上可接受的载剂”通常是指常规使用的那些载剂中的任一种，并且仅受到物理-化学考虑因素(如溶解性和与活性结合剂的反应性的缺乏)限制，并且受给药途径限制。本文所描述的药学上可接受的载剂，例如媒剂、佐剂、赋形剂和稀释剂为所属领域的技术人员所熟知并且公众可容易获得。在一个方面中，药学上可接受的载剂是对医药组合物的活性成分具有化学惰性的载剂，并且是在使用条件下不具有不利的副作用或毒性的载剂。在一些实施例中，当向动物或人类给予时，载剂不产生不良、过敏或其它不适当的反应。在一些方面中，医药组合物不含热原质以及会对人类或动物有害的其它杂质。药学上可接受的载剂包括任何和所有溶剂、分散介质、涂料、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等等；其用途在所属领域中是众所周知。
可接受的载剂、赋形剂或稳定剂对接受者无毒性并且优选在所采用的剂量和浓度下是惰性的，并且包括缓冲夜，如磷酸盐、柠檬酸盐或其它有机酸；抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露糖醇或山梨糖醇；盐形成抗衡离子，如钠；和/或非离子表面活性剂，如Tween、Pluronics或聚乙二醇(PEG)。
在本申请中，术语“有效量”或“有效剂量”通常是指足以实现或至少部分实现所需效果的量。药物或治疗剂的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”通常是当单独使用或与另一种治疗剂组合使用时促进疾病消退(这通过疾病症状严重程度的降低、疾病无症状期的频度和持续时间的增加、或者由于罹患疾病而引起的损害或残疾的预防来证明)的任何药物量。
anti-B7H3 CAR-T细胞的“治疗有效量”或“有效量”也是治疗有益效果超过anti-B7H3CAR-T细胞的任何毒性或有害作用例如CRS的量或剂量。术语“治疗有效量”包含有效“治疗”受试者(例如，患者)的量。在一个实施例中，治疗有效剂量是用于治疗受试者的多发性骨髓瘤的anti-B7H3 CAR-T细胞的最小有效剂量(MED)。在一个实施例中，治疗有效剂量是不会导致受试者有无法解决的CRS的anti-B7H3 CAR-T细胞的最大耐受剂量(MTD)。
在本申请中，术语“包括”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由……组成”的含义。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
在本申请中，术语“受试者”通常是指人类或非人类动物，包括但不限于猫、狗、马、猪、奶牛、羊、兔、小鼠、大鼠或猴等。
发明详述
抗原结合多肽
一方面，本申请提供一种抗原结合多肽，其包含抗体重链可变区(VH)的至少一个互补决定区(CDR)，所述VH包含与SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述VH包含与SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的抗原结合多肽包含VH，所述VH包含重链互补决定区1(HCDR1)、重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)，所述HCDR3包含与SEQ IDNO:7所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。例如，所述HCDR3可以包含SEQ IDNO:7所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HCDR3包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。例如，所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HCDR2包含与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。例如，所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HCDR2包含与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。例如，所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HCDR1包含与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。例如，所述HCDR1可以包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HCDR1包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。例如，所述HCDR1可以包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述VH包含：包含与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列的HCDR1、包含与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列的HCDR2和包含与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列的HCDR3。
例如，所述VH可以包含：包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的HCDR3。
在某些实施方式中，所述VH包含：
i)包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:5示的氨基酸序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的HCDR3；或
ii)包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的HCDR3。
在某些实施方式中，所述VH包含重链框架区1(HFR1)、重链框架区2(HFR2)、重链框架区3(HFR3)和重链框架区4(HFR4)，所述HFR1包含与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。例如，所述HFR1可以包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HFR1包含与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。例如，所述HFR1包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HFR2包含与SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。例如，所述HFR2可以包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HFR2包含与SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。例如，所述HFR2可以包含SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HFR3包含与SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。例如，所述HFR3可以包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HFR3包含与SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。例如，所述HFR3可以包含SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HFR4包含与SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。例如，所述HFR4可以包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HFR4包含与SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。例如，所述HFR4可以包含SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述VH包含HFR1、HFR2、HFR3和HFR4，且所述HFR1、HFR2、HFR3和HFR4选自：
i)包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的HFR1，包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的HFR2，包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的HFR3，包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列的HFR4；
ii)包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的HFR1，包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的HFR2，包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的HFR3，包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的HFR4；
iii)包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的HFR1，包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列的HFR2，包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列的HFR3，包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列的HFR4；
vi)包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的HFR1，包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列的HFR2，包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的HFR3，包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的HFR4。
在某些实施方式中，所述VH包含与SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。例如，所述VH可以包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述VH包含与SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。例如，所述VH可以包含SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗原结合多肽包括抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，所述抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体、完整抗体、抗体片段、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
在某些实施方式中，所述抗原结合片段包括Fab片段，Fv片段，F(ab’)2，单链Fv(scFv)或单域抗体(VHH)。
嵌合抗原受体
一方面，本申请提供一种靶向B7H3的嵌合抗原受体(CAR)，其包含靶向部分，其中所述靶向部分包含前述的抗原结合多肽。
在某些实施方式中，其中所述靶向部分包括VHH。
例如，所述靶向部分包含VHH，所述VHH可以包含：包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的HCDR2和包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的HCDR3。
又例如，所述靶向部分包含VHH，所述VHH可以包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其包括跨膜域，所述跨膜域包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的跨膜域：CD8A、CD8B、CD28、CD3ε(CD3e)、4-1BB、CD4、CD27、CD7、PD-1、TRAC、TRBC、CD3ζ、CTLA-4、LAG-3、CD5、ICOS、OX40、NKG2D、2B4(CD244)、FcεRIγ、BTLA、CD30、GITR、HVEM、DAP10、CD2、NKG2C、LIGHT、DAP12，CD40L(CD154)、TIM1、CD226、DR3、CD45、CD80、CD86、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64和SLAM。
在某些实施方式中，其中所述跨膜域包含源自CD8A的跨膜域。
在某些实施方式中，其中所述跨膜域包含与SEQ ID NO:42至SEQ ID NO:90中任一项所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其包括胞内共刺激信号传导结构域，所述胞内共刺激信号传导结构域包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的胞内共刺激信号传导结构域：CD28、CD137、CD27、CD2、CD7、CD8A、CD8B、OX40、CD226、DR3、SLAM、CDS、ICAM-1、NKG2D、NKG2C、B7H3、2B4、FcεRIγ、BTLA、GITR、HVEM、DAP10、DAP12、CD30、CD40、CD40L、TIM1、PD-1、LFA-1、LIGHT、JAML、CD244、CD100、ICOS、CD40和MyD88。
在某些实施方式中，其中所述胞内共刺激信号传导结构域源自4-1BB的共刺激信号传导结构域。
在某些实施方式中，其中所述胞内共刺激信号传导结构域包含与SEQ ID NO:91至SEQ ID NO:123中任一项所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其包括胞内信号转导结构域，所述胞内信号转导结构域包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的胞内信号转导结构域：CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、CD79a、CD79b、FceRIγ、FceRIβ、FcγRIIa、牛白血病病毒gp30、Epstein-Barr病毒(EBV)LMP2A、猿免疫缺陷病毒PBj14 Nef、DAP10、DAP-12和至少包含一个ITAM的结构域。
在某些实施方式中，其中所述胞内信号转导结构域包含源自CD3ζ的信号传导结构域。
在某些实施方式中，其中所述胞内信号转导结构域包含与SEQ ID NO:107、SEQ IDNO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:124至SEQ ID NO:134中任一项所示的氨基酸序列中任一项所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其在靶向部分和跨膜域之间包括铰链区，所述铰链区包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的铰链区：CD28、IgG1、IgG4、IgD、4-1BB、CD4、CD27、CD7、CD8A、PD-1、ICOS、OX40、NKG2D、NKG2C、FcεRIγ、BTLA、GITR、DAP10、TIM1、SLAM、CD30和LIGHT。
在某些实施方式中，所述铰链区包含源自CD8A的铰链区。
在某些实施方式中，所述铰链区包含与SEQ ID NO:135至SEQ ID NO:156中任一项所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体的非靶向部分包括铰链区，跨膜域，胞内共刺激信号传导结构域与胞内信号转导结构域。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体的非靶向部分包含CD8A分子跨膜域、CD8A的铰链区、4-1BB的胞内共刺激信号传导结构域和CD3ζ胞内信号传导结构域。
例如，所述嵌合抗原受体以抗B7H3单域抗体为胞外抗原结合结构域，通过CD8A分子铰链区和跨膜域与胞内信号传导结构域相连接，胞内信号传导结构域由4-1BB胞内共刺激信号传导结构域与CD3ζ胞内信号转导结构域组成。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体的非靶向部分包含与SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的嵌合抗原受体还包含信号肽片段，所述信号肽片段的C端与所述靶向部分的N端连接。例如，所述嵌合抗原受体可以包括CAR包括信号肽、抗B7H3VHH、CD8A铰链结构域、CD8A跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ主信号传导结构域。
在某些实施方式中，所述信号肽片段包括CD8A信号肽片段。
在某些实施方式中，所述的嵌合抗原受体，所述信号肽片段包含与SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。
核酸分子、载体、细胞
另一方面，本申请提供一种或多种分离的核酸分子，其编码前述的抗原结合多肽或前述的嵌合抗原受体。
在某些实施方式中，所述的分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:36，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39中任一项所示的核苷酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。
另一方面，本申请提供一种载体，其包含前述的分离的核酸分子。
在某些实施方式中，其中所述载体是表达载体。
在某些实施方式中，其中所述载体选自DNA载体、RNA载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和逆转录病毒载体。例如，所述载体可以是慢病毒载体。
另一方面，本申请提供一种细胞，i)包含前述的分离的核酸分子或前述的载体；和/或ii)表达前述的抗原结合多肽或嵌合抗原受体。
免疫效应细胞
另一方面，本申请提供一种免疫效应细胞，其包含前述的所述的核酸分子或前述的载体，和/或表达前述的CAR。
在某些实施方式中，所述的免疫效应细胞包括人细胞。
在某些实施方式中，所述免疫效应细胞包括T细胞、B细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、NKT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。例如，所述免疫效应细胞可以是T细胞。又例如，所述免疫效应细胞可以是人T细胞。
在某些实施方式中，所述免疫效应细胞包括自体或非自体的免疫效应细胞。
在某些实施方式中，所述的免疫效应细胞包括经修饰的免疫效应细胞。
在某些实施方式中，其中所述经修饰的免疫效应细胞包括降低同种异体细胞治疗引起的免疫排斥反应的细胞。
在某些实施方式中，其中所述经修饰的免疫效应细胞中的T细胞抗原受体(TCR)和主要组织相容性复合体(MHCI，MHCII)在T细胞中的功能受到抑制。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括与免疫排斥相关基因中的一个或多个的表达和/或活性被下调。
在某些实施方式中，其中所述与免疫排斥相关基因选自下组中的一种或多种基因：TRAC、TRBC、HLA-A、HLA-B、B2M和CIITA。
在某些实施方式中，其中所述与免疫排斥相关基因选自下组中的一种或多种基因：TRAC、TRBC、HLA-A和HLA-B。
在某些实施方式中，其中所述与免疫排斥相关基因选自下组中的一种或多种基因：TRAC、TRBC和HLA-A。
在某些实施方式中，其中所述与免疫排斥相关基因选自下组中的一种或多种基因：TRAC和HLA-A。
在某些实施方式中，所述经修饰的免疫效应细胞与未经修饰的相应细胞相比，TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性被下调。
在某些实施方式中，其中所述经修饰的免疫效应细胞与未经所述修饰的相应细胞相比，CIITA基因的表达和/或活性未被下调。
在某些实施方式中，其中所述经修饰的免疫效应细胞与未经所述修饰的相应细胞相比，B2M基因的表达和/或活性未被下调。
在某些实施方式中，其中所述经修饰的免疫效应细胞与相应的野生型细胞相比，TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性被下调。
在某些实施方式中，其中所述经修饰的免疫效应细胞与相应的野生型细胞相比，B2M基因的表达和/或活性未被下调。
在某些实施方式中，其中所述经修饰的免疫效应细胞与相应的野生型细胞相比，CIITA基因的表达和/或活性未被下调。
在某些实施方式中，其中所述基因的表达水平和/或活性被下调包括使编码所述基因的核酸分子的表达和/或活性下调；和/或使所述基因编码的蛋白质产物的表达和/或活性被下调。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括：基因敲除、基因突变和/或基因沉默。
在某些实施方式中，所述修饰包括所述免疫效应细胞中两个TRAC等位基因中的任意一个被敲除并且两个HLA-A等位基因中的任意一个被敲除。
在某些实施方式中，所述修饰包括所述免疫细胞中两个TRAC等位基因被敲除并且两个HLA-A等位基因中的任意一个被敲除。
在某些实施方式中，所述修饰包括所述免疫细胞中TRAC基因外显子被敲除并且HLA-A基因外显子被敲除。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用一种或多种选自下组的物质：反义RNA、siRNA、shRNA和CRISPR/Cas9系统。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用CRISPR/Cas9系统。
在某些实施方式中，其中所述修饰还包括向所述免疫效应细胞施用靶向所述TRAC基因外显子部分的sgRNA。
在某些实施方式中，其中所述靶向所述TRAC基因外显子部分的sgRNA包含与SEQID NO:157至SEQ ID NO:171中任一项所示的核苷酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用靶向所述HLA-A基因外显子部分的sgRNA。
在某些实施方式中，其中所述靶向所述HLA-A基因外显子部分的sgRNA包含与SEQID NO:172至SEQ ID NO:212中任一项所示的核苷酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述修饰还包括向所述细胞施用Cas酶。
在某些实施方式中，其中Cas酶包括Cas9蛋白。
在某些实施方式中，其中所述反义RNA包含与SEQ ID NO:213至SEQ ID NO:216中任一项所示的核苷酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述免疫效应细胞为HLA-B纯合子细胞。
在某些实施方式中，其中所述HLA-B纯合子包括HLA-B*40纯合子，HLA-B*15纯合子，HLA-B*46纯合子，HLA-B*13纯合子，HLA-B*51纯合子，HLA-B*58纯合子，HLA-B*07纯合子，HLA-B*35纯合子，HLA-B*44纯合子，HLA-B*52纯合子，HLA-B*57纯合子，HLA-B*54纯合子，HLA-B*55纯合子。
在某些实施方式中，其中所述免疫效应细胞为HLA-A纯合子或杂合子细胞。
在某些实施方式中，其中所述HLA-A纯合子或杂合子包括HLA-A*02纯合子，HLA-A*11纯合子，HLA-A*02/A*11杂合子或HLA-A*24纯合子。
另一方面，本申请提供一种制备免疫效应细胞的方法，其包括向免疫效应细胞中引入前述的核酸分子或前述的载体。
在某些实施方式中，所述的方法还包括：在向免疫效应细胞中引入前述的核酸分子或前述的载体之前/之后，修饰所述免疫效应细胞，所述修饰包括与免疫排斥相关基因中的一个或多个的表达和/或活性被下调。
在某些实施方式中，所述的方法包括：在向免疫效应细胞中引入前述的核酸分子或前述的载体之后，修饰所述免疫效应细胞，所述修饰包括与免疫排斥相关基因中的一个或多个的表达和/或活性被下调。
例如，所述制备免疫效应细胞的方法可以包括：
(1)向免疫效应细胞中引入前述的核酸分子或前述的载体；
(2)修饰所述免疫效应细胞，所述修饰包括与免疫排斥相关基因中的一个或多个的表达和/或活性被下调。
在某些实施方式中，其中所述与免疫排斥相关基因选自下组中的一种或多种基因：TRAC、TRBC、HLA-A、HLA-B、B2M和CIITA。
在某些实施方式中，与未经所述修饰的相应细胞中相应基因的表达和/或活性相比，下调所述免疫效应细胞中TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性。
在某些实施方式中，与未经所述修饰的相应细胞中相应基因的表达和/或活性相比，CIITA基因的表达和/或活性未被下调。
在某些实施方式中，与未经所述修饰的相应细胞中相应基因的表达和/或活性相比，B2M基因的表达和/或活性未被下调。
在某些实施方式中，与相应的野生型细胞相比，所述免疫效应细胞的TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性被下调。
在某些实施方式中，与相应的野生型细胞相比，CIITA基因的表达和/或活性未被下调。
在某些实施方式中，与相应的野生型细胞相比，B2M基因的表达和/或活性未被下调。
在某些实施方式中，其中所述基因的表达水平和/或活性被下调包括使编码所述基因的核酸分子的表达和/或活性下调；和/或使所述基因编码的蛋白质产物的表达和/或活性被下调。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括：基因敲除、基因突变和/或基因沉默。
在某些实施方式中，所述修饰包括所述免疫效应细胞中两个TRAC等位基因中的任意一个被敲除并且两个HLA-A等位基因中的任意一个被敲除。
在某些实施方式中，所述修饰包括所述免疫细胞中两个TRAC等位基因被敲除并且两个HLA-A等位基因中的任意一个被敲除。
在某些实施方式中，所述修饰包括所述免疫细胞中TRAC基因外显子被敲除并且HLA-A基因外显子被敲除。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用一种或多种选自下组的物质：反义RNA、siRNA、shRNA和CRISPR/Cas9系统。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用CRISPR/Cas9系统。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用靶向所述TRAC基因外显子部分的sgRNA。
在某些实施方式中，其中所述靶向所述TRAC基因外显子部分的sgRNA包含SEQ IDNO:157至SEQ ID NO:171中任一项所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用靶向所述HLA-A基因外显子部分的sgRNA。
在某些实施方式中，其中所述靶向所述HLA-A基因外显子部分的sgRNA包含与SEQID NO:172至SEQ ID NO:212中任一项所示的核苷酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述修饰还包括向所述细胞施用Cas酶。
在某些实施方式中，其中Cas酶包括Cas9蛋白。
在某些实施方式中，其中所述反义RNA包含与SEQ ID NO:213至SEQ ID NO:216中任一项所示的核苷酸序列具有至少约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，约99.5％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述免疫效应细胞包括人细胞。
在某些实施方式中，所述免疫效应细胞包括T细胞、B细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、NKT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。例如，所述免疫效应细胞可以是T细胞。
在某些实施方式中，所述免疫效应细胞包括自体或非自体的免疫效应细胞。
在某些实施方式中，其中所述细胞为HLA-B纯合子细胞。
在某些实施方式中，其中所述HLA-B纯合子包括HLA-B*40纯合子，HLA-B*15纯合子，HLA-B*46纯合子，HLA-B*13纯合子，HLA-B*51纯合子，HLA-B*58纯合子，HLA-B*07纯合子，HLA-B*35纯合子，HLA-B*44纯合子，HLA-B*52纯合子，HLA-B*57纯合子，HLA-B*54纯合子，HLA-B*55纯合子。
在某些实施方式中，其中所述细胞为HLA-A纯合子或杂合子细胞。
在某些实施方式中，其中所述HLA-A纯合子或杂合子包括HLA-A*02纯合子，HLA-A*11纯合子，HLA-A*02/A*11杂合子或HLA-A*24纯合子。
例如，所述制备免疫效应细胞的方法可以包括：
(1)采集健康人的外周血，进行HLA分型检测，选取符合我们需要的分型，进行PBMC的分离，按照比例加入CD3磁珠孵育，进行CD3+T细胞分选；将CD3/CD28抗体偶联磁珠混匀，按计算的量取出适量磁珠悬液加入到T细胞培养体系中，激活T细胞，过夜培养；
(2)根据anti-B7H3 CAR病毒的滴度感染T细胞；
(3)同时敲除TRAC和HLA-A基因；
(4)CD3阴性T细胞分选：按照比例加入CD3磁珠，收集CD3-T细胞(磁珠未结合的细胞)。
用途、药物组合物与治疗方法
另一方面，本申请提供前述的嵌合抗原受体，前述的分离的核酸分子，前述的载体，前述的细胞，或前述的免疫效应细胞在制备CAR-T细胞中的应用。
另一方面，本申请提供一种药物组合物，其包含前述的抗原结合多肽，前述的嵌合抗原受体，前述的分离的核酸分子，前述的载体，前述的细胞，和/或前述的免疫效应细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。
例如，药物组合物可以包括：缓冲液，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；糖类，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或如甘氨酸等氨基酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；以及防腐剂。
例如，所述药物组合物包括前述的免疫效应细胞以及任选地药学上可接受的载剂。
另一方面，本申请提供前述的抗原结合多肽，前述的抗原嵌合受体，前述的分离的核酸分子，前述的载体，前述的细胞，前述的免疫效应细胞，和/或前述的药物组合物，其用于治疗与B7H3的表达相关的疾病或病症。
在某些实施方式中，其中所述与B7H3的表达相关的疾病或病症包括与B7H3的表达上调相关的疾病或病症。
在某些实施方式中，其中所述与B7H3的表达相关的疾病或病症包括癌症。
在某些实施方式中，其中所述癌症包括肾上腺皮质癌，膀胱癌，乳腺癌，胆管癌，结直肠癌，淋巴瘤，食管癌，脑胶质瘤，头颈鳞癌，肾癌，肝癌，肺癌，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，肉瘤，黑色素瘤，胃癌，胸腺癌或子宫内膜癌。
另一方面，本申请提供前述的抗原结合多肽，前述的抗原嵌合受体，前述的分离的核酸分子，前述的载体，前述的细胞，前述的免疫效应细胞，和/或前述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗与B7H3的表达相关的疾病或病症。
在某些实施方式中，其中所述与B7H3的表达相关的疾病或病症包括与B7H3的表达上调相关的疾病或病症。
在某些实施方式中，其中所述与B7H3的表达相关的疾病或病症包括癌症。
在某些实施方式中，其中所述癌症包括肾上腺皮质癌，膀胱癌，乳腺癌，胆管癌，结直肠癌，淋巴瘤，食管癌，脑胶质瘤，头颈鳞癌，肾癌，肝癌，肺癌，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，肉瘤，黑色素瘤，胃癌，胸腺癌或子宫内膜癌。
另一方面，本申请提供一种预防或治疗与B7H3的表达相关的疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的前述的抗原结合多肽，前述的抗原嵌合受体，前述的分离的核酸分子，前述的载体，前述的细胞，前述的免疫效应细胞，和/或前述的药物组合物。
在某些实施方式中，其中所述与B7H3的表达相关的疾病或病症包括与B7H3的表达上调相关的疾病或病症。
在某些实施方式中，其中所述与B7H3的表达相关的疾病或病症包括癌症。
在某些实施方式中，其中所述癌症包括肾上腺皮质癌，膀胱癌，乳腺癌，胆管癌，结直肠癌，淋巴瘤，食管癌，脑胶质瘤，头颈鳞癌，肾癌，肝癌，肺癌，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，肉瘤，黑色素瘤，胃癌，胸腺癌或子宫内膜癌。
经修饰的免疫效应细胞
另一方面，本申请提供一种经修饰的免疫效应细胞，其中与未经所述修饰的相应细胞中相应基因的表达和/或活性相比，TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性被下调，B2M基因的表达和/或活性未被下调，且CIITA基因的表达和/或活性未被下调；且所述经修饰的免疫效应细胞的HLA-B分型与受试者的HLA-B分型是匹配的。
在某些实施方式中，其中所述经修饰的免疫效应细胞为HLA-B杂合子且与受试者的HLA-B的两个等位基因均一致，或所述经修饰的免疫效应细胞为HLA-B纯合子且与受试者的HLA-B的其中一个等位基因一致。
在某些实施方式中，其中所述HLA-B纯合子包括HLA-B*40纯合子，HLA-B*15纯合子，HLA-B*46纯合子，HLA-B*13纯合子，HLA-B*51纯合子，HLA-B*58纯合子，HLA-B*07纯合子，HLA-B*35纯合子，HLA-B*44纯合子，HLA-B*52纯合子，HLA-B*57纯合子，HLA-B*54纯合子，HLA-B*55纯合子。
在某些实施方式中，其中所述修饰使得两种基因的表达和/或活性被下调，其中所述两种基因由TRAC基因和HLA-A基因组成。
在某些实施方式中，其中与相应的野生型细胞相比，TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性被下调，B2M基因的表达和/或活性未被下调，且CIITA基因的表达和/或活性未被下调。
在某些实施方式中，其中与相应的野生型细胞相比，两种基因的表达和/或活性被下调，其中所述两种基因由TRAC基因和HLA-A基因组成。
在某些实施方式中，其中所述基因的表达水平和/或活性被下调包括使编码所述基因的核酸分子的表达和/或活性下调；和/或使所述基因编码的蛋白质产物的表达和/或活性被下调。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括：基因突变和/或基因沉默。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用一种或多种选自下组的物质：反义RNA、siRNA、shRNA和CRISPR/Cas9系统。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用CRISPR/Cas9系统。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用靶向所述HLA-A基因外显子部分的sgRNA。
在某些实施方式中，其中所述靶向所述HLA-A基因外显子部分的sgRNA包含SEQ IDNO:172至SEQ ID NO:212中任一项所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，其中所述修饰还包括向所述免疫效应细胞施用靶向所述TRAC基因外显子部分的sgRNA。
在某些实施方式中，其中所述靶向所述TRAC基因外显子部分的sgRNA包含SEQ IDNO:157至SEQ ID NO:171中任一项所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，其中所述修饰还包括向所述细胞施用Cas酶。
在某些实施方式中，其中Cas酶包括Cas9蛋白。
在某些实施方式中，其中所述反义RNA包含SEQ ID NO:213至SEQ ID NO:216中任一项所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述的经修饰的免疫效应细胞表达CAR。
在某些实施方式中，其中所述CAR包括抗原结合结构域、铰链区、跨膜域、胞内共刺激信号传导结构域和胞内信号转导结构域。
在某些实施方式中，其中所述抗原结合结构域特异性地结合肿瘤抗原。
在某些实施方式中，其中所述肿瘤抗原选自以下组：CD19，CD20，CD22，CD33，BCMA，IL13Ra2，EGFR，Her2，GD2和B7H3。
在某些实施方式中，其中所述抗原结合结构域选自以下组：单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体、完整抗体、抗体片段、人抗体、人源化抗体，嵌合抗体，Fv片段，F(ab’)2，单链Fv(scFv)和单域抗体(VHH)。
在某些实施方式中，所述跨膜域包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的跨膜域：CD8A、CD8B、CD28、CD3ε(CD3e)、4-1BB、CD4、CD27、CD7、PD-1、TRAC、TRBC、CD3ζ、CTLA-4、LAG-3、CD5、ICOS、OX40、NKG2D、2B4(CD244)、FcεRIγ、BTLA、CD30、GITR、HVEM、DAP10、CD2、NKG2C、LIGHT、DAP12，CD40L(CD154)、TIM1、CD226、DR3、CD45、CD80、CD86、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64和SLAM。
在某些实施方式中，所述胞内共刺激信号传导结构域包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的胞内共刺激信号传导结构域：CD28、CD137、CD27、CD2、CD7、CD8A、CD8B、OX40、CD226、DR3、SLAM、CDS、ICAM-1、NKG2D、NKG2C、B7H3、2B4、FcεRIγ、BTLA、GITR、HVEM、DAP10、DAP12、CD30、CD40、CD40L、TIM1、PD-1、LFA-1、LIGHT、JAML、CD244、CD100、ICOS、CD40和MyD88。
在某些实施方式中，所述胞内信号转导结构域包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的胞内信号转导结构域：CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、CD79a、CD79b、FceRIγ、FceRIβ、FcγRIIa、牛白血病病毒gp30、Epstein-Barr病毒(EBV)LMP2A、猿免疫缺陷病毒PBj14 Nef、DAP10、DAP-12和至少包含一个ITAM的结构域。
在某些实施方式中，所述铰链区包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的铰链区：CD28、IgG1、IgG4、IgD、4-1BB、CD4、CD27、CD7、CD8A、PD-1、ICOS、OX40、NKG2D、NKG2C、FcεRIγ、BTLA、GITR、DAP10、TIM1、SLAM、CD30和LIGHT。
在某些实施方式中，所述CAR还包含信号肽片段，所述信号肽片段的C端与所述靶向部分的N端连接。
在某些实施方式中，所述信号肽片段包括CD8A信号肽片段。
在某些实施方式中，其中所述免疫效应细胞包括人细胞。
在某些实施方式中，所述免疫效应细胞包括T细胞、B细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、NKT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。
在某些实施方式中，所述免疫效应细胞包括非自体的免疫效应细胞。
另一方面，本申请提供一种制备前述的经修饰的免疫效应细胞的方法，其包括以下的步骤：
1)选择与受试者HLA-B分型匹配的免疫效应细胞；
2)与未经所述修饰的相应细胞中相应基因的表达和/或活性相比，下调所述免疫效应细胞中TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性；不下调B2M基因的表达和/或活性，且不下调CIITA基因的表达和/或活性。
在某些实施方式中，其中所述经修饰的免疫效应细胞为HLA-B杂合子且与受试者的HLA-B的两个等位基因均一致，或所述经修饰的免疫效应细胞为HLA-B纯合子且与受试者的HLA-B的其中一个等位基因一致。
在某些实施方式中，其中所述HLA-B纯合子包括HLA-B*40纯合子，HLA-B*15纯合子，HLA-B*46纯合子，HLA-B*13纯合子，HLA-B*51纯合子，HLA-B*58纯合子，HLA-B*07纯合子，HLA-B*35纯合子，HLA-B*44纯合子，HLA-B*52纯合子，HLA-B*57纯合子，HLA-B*54纯合子，HLA-B*55纯合子。
在某些实施方式中，其中所述修饰使得两种基因的表达和/或活性被下调，其中所述两种基因由TRAC基因和HLA-A基因组成。
在某些实施方式中，与相应的野生型细胞相比，TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性被下调，B2M基因的表达和/或活性未被下调，且CIITA基因的表达和/或活性未被下调。
在某些实施方式中，与相应的野生型细胞相比，两种基因的表达和/或活性被下调，其中所述两种基因由TRAC基因和HLA-A基因组成。
在某些实施方式中，其中所述下调基因的表达水平和/或活性包括使编码所述基因的核酸分子的表达和/或活性下调；和/或使所述基因编码的蛋白质产物的表达和/或活性被下调。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括：基因突变和/或基因沉默。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用一种或多种选自下组的物质：反义RNA、siRNA、shRNA和CRISPR/Cas9系统。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用CRISPR/Cas9系统。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用靶向所述HLA-A基因外显子部分的sgRNA。
在某些实施方式中，其中所述靶向所述HLA-A基因外显子部分的sgRNA包含SEQ IDNO:172至SEQ ID NO:212中任一项所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用靶向所述TRAC基因外显子部分的sgRNA。
在某些实施方式中，其中所述靶向所述TRAC基因外显子部分的sgRNA包含SEQ IDNO:157至SEQ ID NO:171中任一项所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，其中所述修饰还包括向所述细胞施用Cas酶。
在某些实施方式中，其中Cas酶包括Cas9蛋白。
在某些实施方式中，其中所述反义RNA包含SEQ ID NO:213至SEQ ID NO:216中任一项所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，其中所述免疫效应细胞包括人细胞。
在某些实施方式中，所述免疫效应细胞包括T细胞、B细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、NKT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。
在某些实施方式中，所述免疫效应细胞包括非自体的免疫效应细胞。
另一方面本申请提供一种组合物，其包括前述的经修饰的免疫效应细胞和药学上可接受的载剂。
另一方面本申请提供前述的经修饰的免疫效应细胞在制备CAR-T细胞中的应用。
另一方面本申请提供前述经修饰的免疫效应细胞在制备药物中的应用，所述药物用于异体治疗。
另一方面本申请提供前述经修饰的免疫效应细胞在制备药物中的应用，所述药物用于治疗肿瘤。
在某些实施方式中，其中所述肿瘤包括实体瘤和非实体瘤。
在某些实施方式中，其中所述肿瘤选自以下组：肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、B淋巴细胞瘤、霍奇金淋巴瘤、胶质瘤、慢性髓性白血病和急性髓样白血病。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的嵌合抗原受体、免疫效应细胞、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1
1.1单域抗体亲和力测定
将B7H3-Fc重组蛋白使用10mM醋酸盐缓冲液固定在CM5芯片上，分别以上述制备的单域抗体作为流动相，检测筛选获得的单域抗体与B7H3-Fc重组蛋白的结合能力。
(1)试剂配制
运行试剂：含10mM N-(2-羟乙基)哌嗪-N-2磺酸(HEPES)，150mM氯化钠(NaCl)，3mM乙二胺四乙酸(EDTA)，0.005％吐温-20(Tween-20)，pH调节至7.4。
人IgG(Fc)捕获试剂盒，其中包括：鼠抗人IgG(Fc)抗体，固定试剂(醋酸钠，pH5.0)，再生试剂(氯化镁)。
氨基偶联试剂盒，包括：N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和乙醇胺(pH8.5)。每管EDC和NHS分别加入10mL去离子水，分装保存到-18℃至更低温度，保质期两个月。
(2)芯片制备
将鼠抗人IgG(Fc)抗体用固定试剂(醋酸钠，pH 5.0)稀释，950μL固定试剂加入50μL鼠抗人IgG(Fc)抗体用于固定八个通道。首先，CM5芯片的表面用EDC和NHS以10μL/min的流速进行360s的活化。其次，将鼠抗人IgG(Fc)抗体以10μL/min的流速注入到通道(channel1-8,Fc1,2)约360s，固定量约为7000至14000RU。最后，芯片用乙醇胺以10μL/min进行420s封闭。
(3)缓冲液置换
使用脱盐柱及相应运行试剂将人B7H3蛋白进行缓冲液置换，置换后的样品进行浓度测定。
(4)捕获配体
将抗体用运行试剂稀释至10μg/mL并以10μL/min的流速注入到人IgG(Fc)捕获实验通道(Fc2)约300RU。参比通道(Fc1)不需要进行配体的捕获。
(5)分析物多循环分析
将人B7H3蛋白用运行试剂进行2倍倍比稀释。将稀释后的人B7H3蛋白依次以30μL/min的流速注入到实验通道与参比通道，结合和解离相应时间。结合解离步骤均在运行试剂中进行。每一个浓度分析后，芯片需要用氯化镁以20μL/min的流速再生30s，洗掉配体以及未解离的分析物。进行下一个浓度分析时，实验通道需要重新捕获相同量的配体。
(6)数据分析
使用Biacore 8K分析软件Biacore Insight Evaluation Software计算每个样品的KD值。参比通道(Fc1)用于背景的扣减。
结果表1所示，本申请的B7H3单域抗体1A5和1G7及其人源化抗体均与人B7H3蛋白具有较高亲和力。
表1单域抗体与B7H3-Fc重组蛋白的结合结果
Ka(M-1s-1) Kd(s-1) KD(M)
1A5 6.09×105 0.004503 7.394×10-9
1G7 1.150×106 0.006182 5.375×10-9
1.2抗体亲和曲线
分别将不同浓度的重组抗体与U251细胞(表达B7H3)进行孵育，后通过细胞平均荧光强度(MFI)检测细胞表面抗体的结合情况，从图2中结果可知，1A5与1G7抗体及其人源化抗体均能有效结合于U251细胞表面。
1.3抗体ADCC功能
将等量NK细胞与U251-MG细胞共培养，向其中加入200ng/ul的重组抗体，共培养24h后检测抗体介导的细胞毒性作用，从图3中结果可知，1A5与1G7抗体及其人源化抗体均能有效通过ADCC作用杀伤U251-MG肿瘤细胞。
1.4抗B7H3嵌合抗原受体(CAR)的设计
anti-B7H3 CAR结构包括:一个B7H3抗原结合区(来源于抗B7H3的单域抗体1A5，其氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示)，一个CD8A胞外铰链区，一个CD8A跨膜区，一个4-1BB胞内共刺激域和一个CD3ζ激活信号域。anti-B7H3 CAR的非抗原结合域的氨基酸序列如SEQ IDNO:34所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示。
1.5anti-B7H3 CAR的慢病毒载体构建
根据B7H3序列信息及CAR载体结构，构建anti-B7H3 CAR慢病毒表达载体，载体示意图(见图1)。进行优化：选择商业化慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP为骨架，在此载体基础上进行元件改造。首先，将载体的氨苄抗性基因β-内酰胺酶替换为源自Tn5的氨基糖苷磷酸转移酶，使载体具有卡那霉素抗性。其次，我们删除了在体内应用中具有潜在威胁性的CMV启动子及其临近的下游多克隆位点。最后，将原载体中由EF1启动子启动表达的copGFP基因删除，保留SalI酶切位点，并在SalI 5’端加入SmaI酶切位点供载体构建用，形成最终目的载体。加入的SmaI酶切位点是最终目的载体的单一酶切位点，载体的其他序列部分不具有该酶切位点。优化后构建嵌合抗原受体慢病毒表达载体，经sanger测序确证序列无误后，进行慢病毒包装。
实施例2
2.1设计导向RNA
通过网站https://www.ncbi.nlm.nih.gov/，查找并下载相应基因序列，使用SnapGene软件打开基因序列，可在目的基因的不同外显子上设计sgRNA。在本实施例中采用的CRISPR/Cas9系统的sgRNA非限制性的设计原则为：5’-NNN(20)-NGG-3’，NGG被称为原间隔子相邻基序(PAM)，其中，N表示A、T、C或G。由于在同一外显子上可以设计出较多sgRNA，并且由20个核苷酸序列组成的sgRNA可能会在基因组中重复出现，所以利用网站http://crispr.cos.uni-heidelberg.de来进行sgRNA的设计与评估，将外显子序列粘贴至该网站，网站设计出sgRNA并进行预测评估，在评估中得分越高，则说明可能存在较高的编辑效率和较低的脱靶风险，从中选择得分较高的sgRNA进行试验。靶向TRAC基因的sgRNA如SEQ IDNO:157至SEQ ID NO:171所示，靶向HLA-A02基因的sgRNA如SEQ ID NO:172至SEQ ID NO:193所示，靶向HLA-A11基因的sgRNA如SEQ ID NO:194至SEQ ID NO:204所示，靶向HLA-A24基因的sgRNA如SEQ ID NO:205至SEQ ID NO:212所示，由金斯瑞生物科技公司合成。
2.2供体筛选
根据受体的HLA-B分型，选择与受体HLA-B分型匹配的HLA-B纯合子。
首先供者来源基于人群中的HLA-B纯合子，患者HLA-B的其中一个等位基因和供者HLA-B纯合子一致即可，来源于这些供者的细胞能覆盖高数量的患者人群。降低HLA-B亚型不一致引起的排异反应。HLA-B主要选择人群中频率较高的B*40纯合子，B*15纯合子，B*46纯合子，B*13纯合子，B*51纯合子，B*58纯合子，B*07纯合子，B*35纯合子，B*44纯合子，B*52纯合子，B*57纯合子，B*54纯合子，B*55纯合子。HLA-A选择人群中频率较高的A*02纯合子，A*11纯合子及A*02/A11杂合子。
2.3CD3+T细胞制备
(1)从外周血中分离PBMC
从健康捐献者中采集外周血，用PBS缓冲液按照1：1进行外周血稀释。在新的50mL离心管中先加入稀释后血量1/3的细胞分离液(Ficoll)，然后沿着管壁非常缓慢加入血细胞稀释液，800g常温离心20min(离心机设置升速1、降速0)。离心后离心管中的液体自上而下分为PBS与血清层、白细胞层、淋巴细胞分离液、红细胞层。去除PBS与血清层，将白细胞层移至新的50ml离心管中，加入PBS至40ml清洗细胞，450g离心10min。离心后弃上清，即得到外周血单个核细胞。细胞重悬后进行细胞计数。
(2)复苏冻存的健康人PBMC
将冻存的健康人PBMC细胞在37℃水浴锅中进行复苏，完全融化后将细胞吸到含有10ml含10％ FBS的X-VIVO15培养基(购自LONZA)的15ml离心管中，400g离心8min；去上清，加入2ml X-VIVO15培养基(含10％ FBS和终浓度100μg/ml的DNase I)室温孵育15min，孵育的过程中不断振荡；将孵育结束后的溶液用40μm的滤网进行过滤，并吸取10ml PBS缓冲液重悬底部的细胞再加到滤网上，过虑后400g离心8min，离心后弃上清，细胞重悬后进行细胞计数。
(3)CD3+T细胞分选
使用EasySepTM人T细胞分选试剂盒(购自StemCell Technologies，货号：17951)提取外周血单个核细胞(PBMC)中的T细胞。将PBMC密度调整至5×107细胞/ml，PBS缓冲液的添加范围在0.25-2ml；先加cocktail混匀再按照50μl/ml加入isolation cocktail，混匀后室温放置5min；将RapidSpheres用旋涡振荡仪涡旋30s后加按照40μl/ml加入至细胞中混匀；补加缓冲液至2.5ml的倍数，上下轻轻吹打2-3次；按照每管2.5ml分别加到冻存管中，将冻存管置于磁力架上，室温放置3min；轻轻打开冻存管盖，小心持两边拿起磁力架，倒置保持2-3s，将细胞液一次性倒入新的离心管中；用10-20ml缓冲液(视细胞量)重悬细胞后，300g离心10min，弃掉上清，得到CD3+T细胞。
(4)T细胞激活
激活试剂按培养基:Transact＝99:1体积比进行配置，培养基为X-VIVO15培养基(含5％FBS、200U/ml IL2、10ng/ml IL7和5ng/ml IL15)、Transact购自美天旎。T细胞按每1×106个细胞用1ml激活试剂(含有10μl Transact)充分重悬后，放置于37℃、5％ CO2培养箱中孵育1天。
实施例3
3.1转病毒
按照实施例2的方式获得CD3+T细胞(D0天)，并用CD3/CD28抗体磁珠激活，激活后于D1天进行慢病毒载体(实施例1制备的anti-B7H3 CAR慢病毒表达载体)转染，D2天洗去慢病毒载体，D3天进行电转。
3.2基因敲除
使用电转试剂盒(购自LONZA，货号V4XXP-3024)通过电转方式将RNP复合体转入3.1制备的激活后T细胞(取D3天的CAR-T细胞为初始细胞)。取样计数后收集细胞离心，用PBS重悬细胞沉淀。提前30min在孔板中预热培养基(X-VIVO15培养基+10％FBS+IL2(200U/ml)+IL7(10n g/ml)+IL15(5ng/ml))。准备电转缓冲液：Nucleofector Solution：Supplement按照82:18进行配置；根据每个电转体系使用1x107的细胞进行分配RNP复合物(Cas9:sgRNA＝2:1)，先将10μgsgRNA加入到PCR管(无RNA酶)中，再加入20μg Cas9蛋白(购自thermo，货号A36499)，轻轻混匀后，室温孵育12min。将上述细胞进行计数，300g离心8min弃上清，加入PBS重悬细胞，吸取1E7个细胞重新300g离心8min，弃上清后用100μl配置好的电转缓冲液重悬细胞。将孵育好的RNP复合体加入上述细胞悬液中，轻柔混匀，然后将混合物轻轻地转移到电转杯中。将电转杯放在Lonza-4D电转仪上，选用EO-115电转程序进行电转。往电转杯中加入预热的培养基，然后用配套吸管将细胞转入孔板中预热的培养基中，然后放置于37℃、5％ CO2培养箱中培养48小时后收细胞，sanger测序检测编辑效率，同时收细胞FACS检测敲除效率。
其中sgRNA序列TRAC sgRNA：AGAGTCTCTCAGCTGGTACA(SEQ ID NO:157)，A02sgRNA：CTGACCATGAAGCCACCCTG(SEQ ID NO:174)，A11 sgRNA：GGCCCCTCCTGCTCTATCCA(SEQID NO:204)。
3.3CD3阴性T细胞分选
进行CD3阴性T细胞分选，细胞计数后离心，弃上清；用buffer重悬细胞并混匀，按20ul CD3磁珠/107的细胞加CD3磁珠，混合均匀后放4度冰箱孵育，加buffer洗涤细胞离心后进行磁珠分离，首先将column放在磁极上，下面对应放离心管，用buffer浸润column(LD)，将细胞加到column上，不要产生气泡，用buffer清洗column 2次，收集清洗下来的液体(CD3-T)于15ml离心管中，取部分细胞进行细胞计数。
3.4细胞培养
镜下观察细胞状态，取细胞进行稀释计数，补充全培养基维持细胞密度在3x10^5-1x10^6个/ml，中间补/换液，放入37℃、5％CO2培养。细胞收获：收集到细胞离心管中离心后弃上，用生理盐水再次洗涤细胞，离心，配制冻存液，冻存液重悬离心后的细胞，用注射器吸取细胞悬液至终制品用细胞冻存袋中，在细胞冻存袋上贴好标签，进行下一步冻存。
3.5基因敲除效率检测
(1)Sanger测序检测
细胞计数，取3～5×104细胞，2000r/min离心5min，尽量去干净上清，然后每管加20μlDE裂解液，细胞裂解后加到PCR管中，瞬时离心后上PCR仪，上机条件：65℃30min，4℃30s、95℃2min、16℃无限。使用引物对TRAC-For/TRAC-Rev，或HLA-A For/HLA-A Rev，将裂解产物作为模板进行PCR，将PCR产物交送金唯智进行Sanger测序。得到sanger测序结果后，使用网站：https://moriaritylab.shinyapps.io/editr_v10/中的EditR编辑器预测编辑发生的位置以及编辑效率。
(2)流式检测细胞计数
取10E5至10E8细胞，2000rpm离心5min，去上清，然后每管加100μl的PBS缓冲液重悬细胞，再加入anti-human AB TCR-APC(购自eBioscience)抗体5μl，HLA-A02 MonoclonalAntibody(BB7.2)，APC，eBioscinceTM(购自invitrogen)抗体5μl，混合均匀后于室温孵育10min。2000rpm离心5min后再以PBS缓冲液洗2遍，重悬细胞并通过BD FACSAria流式细胞仪进行检测，可得细胞表面TCR、HLA-A02表达阳性率。敲除效率＝(A-B)/A×100％；A为对照组表达阳性率；B为敲除组表达阳性率。
结果如图4A-4C所示，anti-B7H3 UCAR-T细胞CAR阳性率可达30％以上(图4A)，anti-B7H3 UCAR-T细胞中心记忆比例达50％左右(图4B)，anti-B7H3 UCAR-T细胞双敲效率高达90％以上(图4C)。
实施例4anti-B7H3 UCAR-T细胞体外细胞毒性分析
4.1anti-B7H3 UCAR-T细胞对靶细胞的杀伤
(1)B7H3靶细胞：PANC-1-Luciferase；调整靶细胞状态至对数生长期，在进行实验前需连续传代2次；
(2)制备anti-B7H3 UCAR-T细胞及对照组anti-B7H3 CAR-T，T细胞，流式检测敲除效率，转染效率，CD3-T分选效率及记忆T细胞的比例，统计扩增倍数；
(3)离心收集制备的几组细胞，每组6x10^6的细胞；
(4)将靶细胞重悬于1640+10％FBS中，每个靶点取3块24孔板，按照2x10^5/孔的量接种靶细胞。(靶细胞和效应细胞都是2x10^6/ml的密度接种)。然后按照E/T(效靶比，效应细胞：靶细胞)比例，加入效应细胞。每孔补液到最大体积(如600ul)。对照接种同样数量的靶细胞，不加效应细胞(600ul)。将孔板置于5％ CO2、37℃培养箱中，培养24小时。E/T：1:2，1:1，2:1，5:1，10:1铺板，重复三次。
(5)培养24小时，将孔板从培养箱中取出，收集200ul上清。然后通过检测Luciferase活性反映重组CAR-T细胞对靶细胞的裂解能力。
靶细胞裂解百分数计算公式：
结果分析：anti-B7H3 CAR-T细胞与anti-B7H3 UCAR-T对PANC-1-Luciferase细胞有显著的杀伤作用。anti-B7H3 UCAR-T细胞在效靶比10:1时即可达到90％以上的杀伤效率(见图5)。
4.2anti-B7H3 UCAR-T细胞与靶细胞共培养细胞因子分泌检测
收集上述共培养体系的上清，检测细胞因子分泌水平。结果分析(图6A-6C)：anti-B7H3CAR-T和anti-B7H3 UCAR-T均能够显著激活，大量分泌IL-2，IFN-γ和TNF-α细胞因子。
实施例5anti-B7H3 UCAR-T细胞体内抗肿瘤效果
8-10周大的NSG小鼠皮下注射肿瘤细胞PANC-1-Luciferase-GFP(5x10^6)，小鼠分成三组，每组5只，成瘤时间一般2-4周。分别向每组小鼠瘤内注射anti-B7H3 UCAR-T细胞，anti-B7H3 CAR-T细胞，无基因敲除的T细胞5E6，单点注射，注射体积50ul。通过荧光素酶监测小鼠肿瘤消退情况。
结果分析(图7)：回输anti-B7H3 UCAR-T细胞的小鼠，肿瘤生长速度明显减缓，anti-B7H3 CAR-T和anti-B7H3 UCAR-T均表现出卓越的抗肿瘤效果。
实施例6anti-B7H3 UCAR-T细胞体内半衰期检测
准备人源化免疫系统小鼠(hHSC-NCG)15只，分成3组。制备细胞，实验组anti-B7H3UCAR-T细胞(敲除TRAC+HLA-A02)；对照组1：anti-B7H3 CAR-T；对照组2：anti-B7H3UCAR-T细胞(敲除TRAC+B2M)；每只小鼠注射1x10^7细胞，不同的时间点采血D0，2h，D3，D7，D14，D21，D28，D35，D42，D49，D56，D60。提取不同时间点血样中基因组，用QPCR绝对定量的方法计算copy/ng genome DNA,阳性对照用第14天收获的UCAR-T细胞，阴性对照用DEPC水。
结果分析：anti-B7H3 UCAR-T细胞(敲除TRAC+HLA-A02)在小鼠体内存活时间最久。
实施例7通用型T细胞的体外安全性验证
(1)GVHD反应：制备TRAC，HLA-A双敲T细胞，无基因敲除的T细胞，辐照同种异体PBMC，分别刺激制备的2组细胞，检测IFN-r的水平。
结果分析：TRAC，HLA-A双敲T细胞组IFN-γ分泌水平很低，表明TRAC敲除降低了GVHD反应。
(2)同种异体反应：同种异体PBMC刺激辐照后的2组细胞，检测IFN-r的水平。
结果分析：TRAC，HLA-A双敲T细胞组IFN-γ分泌水平很低，表明HLA-A的敲除降低了同种异体反应。
实施例8通用型T细胞的体内安全性验证
实验组：共同注射5×106TCR-HLA-A-双阴anti-B7H3 UCAR-T细胞和5×106同种异体T细胞到NSG小鼠体内。
对照组：注射5×106TCR-B7H3 UCAR-T细胞和5×106同种异型T细胞到NSG小鼠体内。
每组5只NSG小鼠。
(1)GVHD反应：通过临床指标：存活率，皮毛纹理和皮肤完整性等，观察移植物抗宿主反应。细胞因子检测：取外周血血清，检测IL6、IL-2、TNF-α、IFN-γ等细胞因子的水平。取血时间点：回输前，24h，D3，D7，D14，D28，2M。脏器病变检测：观察期结束时(2个月左右)，取小鼠的脾脏，肝脏，皮肤、胃肠道，肺，肾脏进行HE切片染色分析。
结果分析：注射未经处理的T细胞的5只小鼠中，有4只在注入后2个月内发生了致死性异种移植物抗宿主病(GVHD)。而接受TRAC，HLA-A双敲细胞的小鼠中没有一个出现GVHD；TRAC，HLA-A双敲T细胞组细胞因子IL6、IL-2、TNF-α、IFN-γ分泌水平很低；并且小鼠不同器官形态正常。说明TRAC，HLA-A双敲T细胞组很大程度上降低了GVHD反应。
(2)同种异体反应：制备TRAC，HLA-A双敲CAR-T细胞，共同注射1x10^7TCR-HLA-A-双敲CAR-T细胞和2x10^6同种异型T细胞到NSG小鼠体内。对照组：注射1x10^7TCR-CAR-T细胞到NSG小鼠体内。
不同时间点取血测CAR拷贝数。比较两组CAR的拷贝数变化。时间点：D1，D5，D7，D10，D14，D21，D28。
结论：D21天，对照组小鼠排异反应明显，基本检测不到拷贝数；而实验组拷贝数仍处在相对稳定水平，说明排异反应明显减弱，实验组细胞在小鼠体内存活时间延长。说明TRAC，HLA-A双敲CAR-T细胞组很大程度上降低了排异反应(见图8A-8B)。
实施例9基因编辑的安全性分析
制备TRAC，HLA-A双敲T细胞，无基因敲除的T细胞，检测敲除效率后，进行以下分析：
(1)脱靶：
对照组：转CAS9+ODN标签
实验组：转CAS9+sgRNA(TRAC+HLA-A)+ODN标签
On-target and off-target-WGS:(Whole genome sequencing)：D14分别取无基因敲除的T细胞、TRAC，HLA-A双敲的T细胞各1×10^6送苏州金维智生物科技有限公司检测。
结果分析：实验组脱靶率很低，而且脱靶主要集中在基因之间和内含子上，对基因功能的影响不大(见图9)。
(2)染色体易位：采用qPCR方法对同时编辑TRAC和HLA基因座时可能发生的重排进行了定量。两个易位被标记为TRAC:HLA，HLA:TRAC。合成的模板质粒中的阳性参考样品作为检测对照进行评估。以HLA基因组靶区两侧的扩增片段作为内对照。提取基因组DNA进行实时定量PCR，根据标准曲线和Cq值计算基因组DNA的基因拷贝数。
结果分析：双敲T细胞(TRAC+HLA-A)在D14(收获)检测是否发生染色体易位，检测结果：两种易位方式检测值都接近零检值，提示基因座没有发生重排(见图10)。
(3)核型分型：分别取铺满度在70-80％的无基因敲除的T细胞、TRAC，HLA-A双敲的T细胞各1×10^6装于2个T25瓶中，加满培养液，盖上全密封盖子，缠上封口膜，寄送至浙江如耀生物科技有限公司检测。
结果分析：和对照组比，实验组核型正常(见图11)。
(4)Cas9蛋白残留：细胞制备时，取敲除前、敲除后以及收获前三个时间点的细胞各1×10^6进行裂解，随后用蛋白定量试剂盒(NOVATEINBIO，货号NB-E1372PR)进行定量，将各组样品调整至相同上样量2μg，根据说明书用CRISPR/Cas9蛋白ELISA试剂盒进行检测。样品中的Cas9蛋白被牢固稳定地点在试纸孔上。然后使用检测抗体识别被绑定的Cas9蛋白，然后显影剂进行显影。Cas9比值与吸光度成正比，通过与Cas9对照品比较来定量Cas9蛋白的绝对量。
结果分析：双敲T细胞(TRAC+HLA-A)分别在电转前(D3)、电转后换液前(D5)、D9、D14(收获)四个时间点检测spCas9的残留，除了电转后换液前(D5)检测到微量残留，其余三个时间点均未检出。(见图12)。
实施例10制备单基因敲除的T细胞
使用电转试剂盒(购自LONZA，货号V4XXP-3024)通过电转方式将RNP复合体转入实施例2制备的激活后T细胞。提前30min在孔板中预热培养基(X-VIVO15培养基+10％FBS+IL2(200U/ml)+IL7(10n g/ml)+IL15(5ng/ml))。电转缓冲液按照Nucleofector Solution：Supplement＝82:18进行配置。准备RNP复合体：TRAC的sgRNA序列为sg9(如SEQ ID NO:157所示)，HLA-A的sgRNA序列为HLA-A02 Sg2(如SEQ ID NO:173所示)或HLA-A02Sg5(如SEQ IDNO:174所示)或HLA-A11 sg21(如SEQ ID NO:204所示)或HLA-A11Rsg2(如SEQ ID NO:203所示)，先将20μg sgRNA加入到PCR管(无RNA酶)中，再加入10μg Cas9蛋白(购自thermo，货号A36499)，轻轻混匀后，室温孵育12min。将实施例2培养的激活后T细胞进行计数，300g离心8min弃上清，加入PBS重悬细胞，吸取1E7个细胞重新300g离心8min，弃上清后用100μl配置好的电转缓冲液重悬细胞。将孵育好的RNP复合体加入上述细胞悬液中，轻柔混匀，然后将混合物轻轻地转移到电转杯中。将电转杯放在Lonza-4D电转仪上，选用EO-115电转程序进行电转。往电转杯中加入预热的培养基，然后用配套吸管将细胞转入孔板中预热的培养基中，然后放置于37℃、5％ CO2培养箱中培养。
实施例11基因敲除效率检测方法的比较
(1)Sanger测序检测
细胞计数，取3～5×104细胞，2000r/min离心5min，尽量去干净上清，然后每管加20μlDE裂解液，细胞裂解后加到PCR管中，瞬时离心后上PCR仪，上机条件：65℃30min，4℃30s、95℃2min、16℃无限。使用引物对TRAC-For/TRAC-Rev，或HLA-AFor/HLA-A Rev，将裂解产物作为模板进行PCR，将PCR产物交送金唯智进行Sanger测序。得到sanger测序结果后，使用网站：https://moriaritylab.shinyapps.io/editr_v10/中的EditR编辑器预测编辑发生的位置以及编辑效率。
(2)TA克隆测序检测
利用AxyPrepTM PCR产物清洁试剂盒(购自AXYGEN)，将PCR产物纯化，随后用试剂盒(DNA A-Tailing Kit，购自TaKaRa)将纯化后的PCR产物加粘性末端，通过DNA LigationKit Ver2.1(购自TaKaRa)将产物连接至T载体(pMDTM19-T Vector Cloning Kit购自TaKaRa)，连接产物转化感受态细胞(DH5 alpha)，然后涂布于含氨苄抗性的LB板，在37℃培养箱培养约12小时后挑单菌落，并将单菌落菌液交由金维智进行测序。敲除效率＝突变克隆数/总克隆数。
(3)流式检测细胞计数
取10E5至10E8细胞，2000rpm离心5min，去上清，然后每管加100μl的PBS缓冲液重悬细胞，再加入anti-human AB TCR-APC(购自eBioscience)抗体5μl，HLA-A02 MonoclonalAntibody(BB7.2)，APC，eBioscinceTM(购自invitrogen)抗体5μl，混合均匀后于室温孵育10min。2000rpm离心5min后再以PBS缓冲液洗2遍，重悬细胞并通过BD FACSAria流式细胞仪进行检测，可得细胞表面TCR、HLA-A02表达阳性率。敲除效率＝(A-B)/A×100％；A为对照组表达阳性率；B为敲除组表达阳性率。
TRAC单基因敲除的三种检测结果如图13至图15所示，敲除效率计算结果如表2所示，三种检测方法基本相同，后续试验仅采用Sanger测序方法检测编辑效率。
表2基因敲除效率检测方法结果
针对HLA-A02基因编辑的Sanger测序方法结果如图16-17所示，编辑效率均为90％；针对HLA-A11基因编辑的Sanger测序方法结果如图18-19所示。
实施例12制备TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的T细胞
使用电转试剂盒(购自LONZA，货号：V4XXP-3024)通过电转方式将RNP复合体转入实施例2制备的激活后T细胞。提前30min在孔板中预热培养基(X-VIVO15培养基+10％FBS+IL2(200U/ml)+IL7(10ng/ml)+IL15(5ng/ml))。电转缓冲液按照Nucleofector Solution：Supplement＝82:18进行配置。准备RNP复合体：分别将20μg TRAC sgRNA(TRAC Sg9)，20μgHLA-A sgRNA(HLA-A02 Sg2或HLA-A02 Sg5或HLA-A11 sg21或者靶向HLA-A*24:02:01、HLA-A*30:01:01:01、HLA-A*33:01:01:01、HLA-A*03:01:01:01、HLA-A*01:01:01:01或HLA-A*26:01:01:01的sgRNA)加入到PCR管(无RNA)中，再各自加入10μg Cas9蛋白(购自thermo，货号A36499)，轻轻混匀后，室温孵育12min。将实施例2培养的激活后T细胞进行计数，300g离心8min弃上清，加入PBS重悬细胞，吸取1E7个细胞重新300g离心8min，弃上清后用100μl配置好的电转缓冲液重悬细胞。将孵育好的TRAC与HLA-A的RNP复合体加入上述细胞悬液中，轻柔混匀，然后将混合物轻轻地转移到电转杯中。将电转杯放在Lonza-4D电转仪上，选用EO-115电转程序进行电转。往电转杯中加入预热的培养基，然后用配套吸管将细胞转入孔板中预热的培养基中，然后放置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
通过测序检测双基因敲除效率，可得到双基因敲除效率均不低于80％的TRAC阴性、HLA-A阴性的T细胞。结果如图20-21所示。其中图20A显示的是利用HLA-A02 Sg5敲除HLA-A02的结果，其中上一行显示的是对照组结果(即没有使用HLA-A02 Sg5进行敲除)；下一行显示的是同时敲除HLA-A02和TRAC的结果；其中图20B显示的是利用TRAC Sg9敲除TRAC的结果，其中上一行显示的是对照组结果(即没有使用TRAC Sg9进行敲除)；下一行显示的是同时敲除HLA-A02和TRAC的结果。图21A-21B显示了敲除HLA-A02和TRAC蛋白水平的敲除情况，其中NEG指阴性对照，WT指没有经任何敲除处理的情况，TRAC+HLA-A双敲指同时敲除HLA-A02和TRAC的结果。
实施例13双基因敲除的T细胞中TRAC基因，HLA-A基因，B2M基因和CIITA基因与相应细胞中的相应基因的表达区别
(1)利用实施例2制备的激活后T细胞，分为两组，一组作为对照，另一组按照实施例5的方法制备TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的T细胞，按照实施例4步骤(1)的方式进行Sanger测序。依据测序结果获得TRAC和HLA-A双基因敲除的细胞。将制备的双基因敲除T细胞与相应TRAC和HLA-A抗体孵育，通过流式分选或磁珠分选，可以得到双基因敲除的细胞株。
(2)检测双基因敲除的T细胞与对照组相比mRNA表达水平的变化。使用RNA提取试剂盒(购自QIAGEN，货号：74004)提取RNA，使用逆转录试剂盒(购自Applied Biosystems，货号：4368814)对RNA进行逆转录得到cDNA，以cDNA为模板进行定量PCR检测。
(3)检测双基因敲除的T细胞与对照组相比蛋白表达水平的变化。使用全蛋白提取试剂(购自Thermo Scientific，货号：87787)提取蛋白，通过Western Blot方法或流式方法检测蛋白表达水平，使用的抗体分别为TRAC抗体(购自eBioscience货号：17-9986-42)、HLA-A抗体(购自Merck货号：17-9876-41)、B2M抗体(购自Invitrogen货号：A15770)和CIITA抗体(购自OriGene货号：CF812200)。
Sanger测序检测双基因敲除的T细胞中TRAC和/或HLA-A基因的核苷酸序列相对于对照组发生了变化；定量PCR显示双基因敲除的T细胞中TRAC和/或HLA-A基因mRNA表达量下调，而B2M和/或CIITA基因的mRNA表达量没有下调。FACS和Western Blot结果显示双基因敲除的T细胞中蛋白表量下调，B2M和/或CIITA蛋白表达量没有下调。
结果如图22-23所示。其中，图22显示的是基因表达的mRNA水平测定，其中图22显示了TRAC、HLA-A、B2M和CIITA的mRNA水平；其中WT指没有经任何敲除处理的情况，双敲组指TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的T细胞的结果。图23显示的是基因表达的蛋白水平测定，其中图23A-23B分别显示了B2M和CIITA的蛋白表达水平；其中NEG指阴性对照，WT指没有经任何敲除处理的情况，TRAC+HLA-A双敲指TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的T细胞的结果。
实施例14制备TRAC基因、HLA-A/B2M基因和CIITA基因三基因敲除的T细胞并验证其中相应三种基因的表达变化
(1)按照实施例13步骤(1)的方式准备对照组和TRAC基因、HLA-A基因和CIITA基因三基因敲除的细胞，以及TRAC基因、B2M基因和CIITA基因三基因敲除的细胞。
(2)按照实施例13步骤(3)的方式通过FACS和Western Blot方法检测蛋白表达水平变化。
相对于对照组细胞，TRAC、HLA-A和CIITA三基因敲除的T细胞中TRAC、HLA-A和CIITA基因的蛋白表达量下调；相对于对照组细胞，TRAC、B2M和CIITA三基因敲除的T细胞中TRAC、HLA-A和CIITA基因的蛋白表达量下调。
(3)使用TRAC(购自eBioscience，货号：17-9986-42)、HLA-A(购自Merck，货号：17-9876-41)、B2M(购自：Invitrogen，货号：A15770)抗体通过流式细胞术检测实施例13中的双基因敲除细胞和本实施例中的两种三基因敲除细胞的敲除效率，结果显示在单细胞水平同时实现多基因敲除的效率，双基因敲除明显高于三基因敲除。
结果如图24A-24D所示。其中图24A-24C依次为TRAC、HLA-A和B2M蛋白质水平的敲除情况。其中，WT指没有经任何敲除处理的情况，TRAC+HLA-A双敲指TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的T细胞的结果；TRAC+HLA-A+CIITA三敲指TRAC、HLA-A和CIITA三基因敲除的T细胞的结果；其中TRAC+B2M+CIITA三敲指B2M、CIITA和TRAC三基因敲除的T细胞的结果；TRAC+HLA-A敲低指实施例16制备的TRAC基因和HLA-A基因敲低的T细胞的结果。图24D显示了CIITA蛋白质水平的敲除情况。
图24的结果显示，和WT对照组相比，TRAC、HLA-A、CIITA和B2M的蛋白质水平下调。同时，与TRAC+HLA-A+CIITA三敲或TRAC+B2M+CIITA三敲相比，TRAC+HLA-A双敲的敲除效率更高。
实施例15设计反义RNA序列
通过数据库https://www.ncbi.nlm.nih.gov/或www.ensembl.org/，获得相应基因(TRAC基因和HLA-A基因)的转录RNA序列，参考如下原则设计siRNA：
尽量避免起始密码子下游50-100个核苷酸与终止密码子上游100个核苷酸的序列；选择长度小于30个核苷酸的序列；避免4个或以上的连续相同碱基；避免内含子区域；避免重复序列；避免单核苷酸多态性(SNP)位点；序列GC含量30％-60％之间，优先选择序列模式AA(N<sub>19)、NA(N<sub>21)或NAR(N<sub>17)YNN，A为腺苷酸；T为胸腺苷酸；R为腺苷酸或鸟苷酸(嘌呤类)；Y为胸腺苷酸或胞苷酸(嘧啶类)；N为腺苷酸、胸腺苷酸、鸟苷酸或胞苷酸；对选择的序列进行同源性比较分析，避免反义RNA与其他基因或序列具有显著的同源性，由此造成脱靶效应。同源性分析利用NCBI Blast tool:Nucleotide-nucleotide BLAST(blastn)，UCSC Blat tool或Ensembl Blast进行。
设计获得的反义RNA序列包括HLA-A-homo-551；HLA-A-homo-NEG；TRAC-homo-375；TRAC-homo-NEG。
实施例16制备TRAC基因和HLA-A基因敲低的T细胞
利用通过实施例15设计的反义RNA进行双基因敲低。公司制备TRAC基因和HLA-A基因反义RNA序列的慢病毒(吉玛)。按照实施例2的方式制备CD3+T细胞(D0天)，并用CD3/CD28抗体磁珠激活，将携带TRAC基因和HLA-A基因的反义RNA序列的慢病毒转染激活的T细胞(D1天)，D2天洗去慢病毒载体，继续培养至D5天。收集培养至D5天的T细胞，通过定量PCR或Western Blot等方法对基因敲低效率进行检测。对获得的T细胞进行相应TRAC和HLA-A抗体标记，通过流式分选或磁珠分选的方式可以得到TRAC基因和HLA-A基因敲低的T细胞。结果显示，TRAC和HLA-A基因敲低组中TRAC和HLA-A的mRNA和蛋白表达水平均下调。其中，图25A-25B依次为TRAC和HLA-A mRNA水平的敲除情况。其中，WT指没有经任何敲除处理的情况，TRAC+HLA-A双敲指TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的T细胞的结果。其中，为TRAC和HLA-A蛋白质水平的敲除水平可以参见图24的结果。
实施例17不同T细胞活性的区别
制备实施例2、12、14和16中的无基因敲除、双基因敲除、三种基因敲除和双基因敲低的T细胞，比较几种T细胞活性各组细胞计数并分别各取1*106细胞接种24孔板中，每孔加入PHA(0.3μg/ml)(离子霉素+)或5ng/ml的PMA和50ng/ml的ionomycin于细胞中，继续培养5小时后，使用CD69(早期活化)(购自BD Biosciences，货号：FN50)、CD137(偏晚期)(购自BDBiosciences，货号：4B4-1)抗体，流式检测细胞的活化状态。结果表明，双基因敲除、双基因敲低的T细胞活性优于三基因敲除的T细胞。
CD69和CD137的蛋白质水平表达情况分别参见图26A-26B。其中，WT指没有经任何敲除处理的情况，TRAC+HLA-A双敲指TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的T细胞的结果；TRAC+HLA-A+CIITA三敲指TRAC、HLA-A和CIITA三基因敲除的T细胞的结果；其中TRAC+B2M+CIITA三敲指B2M、CIITA和TRAC三基因敲除的T细胞的结果；TRAC+HLA-A敲低指实施例16制备的TRAC基因和HLA-A基因敲低的T细胞的结果。
实施例18不同T细胞对异体NK细胞反应性的区别
对实施例2、12、14和16中的无基因敲除、双基因敲除、三种基因敲除和双基因敲低的T细胞进行CFSE(invitrogen，C34554)标记，细胞计数，分别取1*106细胞并以1：1比例与NK细胞(NK92MI)进行共培养，24小时后收集共培养的各组细胞，流式细胞检测混合细胞中CFSE阳性细胞的比率。
结果表明，NK细胞对双基因敲除、双基因敲低的T细胞的杀伤毒性低于三基因敲除的T细胞。结果如图27所示。其中，NK+T指将NK细胞与没有经任何敲除处理的T细胞共培养的情况；NK+TRAC+HLA-A敲低指将NK细胞与实施例16制备的TRAC基因和HLA-A基因敲低的T细胞的结果共培养的情况；NK+TRAC+HLA-A双敲指将NK细胞与TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的T细胞共培养的情况；NK+TRAC+HLA-A+CIITA三敲指将NK细胞与TRAC、HLA-A和CIITA三基因敲除的T细胞共培养的情况；NK+TRAC+B2M+CIITA三敲指将NK细胞与B2M、CIITA和TRAC三基因敲除的T细胞共培养的情况。
实施例19不同的T细胞异体免疫排斥反应的区别
供者1来源的外周血制备实施例2、12、14和16中的无基因敲除、双基因敲除、三种基因敲除和双基因敲低的T细胞。供者2来源的外周血制备CD3+T细胞。将供者1外周血制备的各组细胞分别与供者2外周血按照实施例2制备的CD3+T细胞等比例混合，24小时后检测细胞混合体系中的IFN-γ的表达水平。结果显示，双基因敲除的T细胞组IFN-γ的表达水平低于三基因敲除的T细胞组。
结果如图28所示，WT指没有经任何敲除处理的情况，TRAC+HLA-A双敲指TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的T细胞的结果；TRAC+HLA-A+CIITA三敲指TRAC、HLA-A和CIITA三基因敲除的T细胞的结果；其中TRAC+B2M+CIITA三敲指B2M、CIITA和TRAC三基因敲除的T细胞的结果；TRAC+HLA-A敲低指实施例16制备的TRAC基因和HLA-A基因敲低的T细胞的结果。
实施例20制备TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的CAR-T细胞，TRAC基因，HLA-A基因和CIITA基因三基因敲除的CAR-T细胞以及TRAC基因，B2M基因和CIITA基因敲除的CAR-T细胞
(1)按照实施例2的方式获得CD3+T细胞(D0天)，并用CD3/CD28抗体磁珠激活，激活后于D1天进行慢病毒载体(包含CD19-CAR、CD20-CAR或BCMA-CAR等的慢病毒)转染，D2天洗去慢病毒载体，D3天对CAR阳性的T细胞进行分选并继续培养至D5天。
(2)取D5天的CAR-T细胞为初始细胞，分别按照实施例12和实施例14中的方式制备TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的细胞，TRAC基因、HLA-A基因和CIITA基因以及TRAC基因、B2M基因和CIITA基因三基因敲除的CAR-T细胞。
(3)通过流式细胞技术检测可得到上述双基因敲除和三基因敲除的CAR-T细胞，其中双基因敲除CAR-T细胞的得率高于三基因敲除CAR-T细胞。
结果如图29A-29D所示。其中，图29A-29C依次为TRAC、HLA-A和B2M蛋白质水平的敲除情况。图29D显示了CIITA蛋白质水平的敲除情况。其中，WT指没有经任何敲除处理的情况，TRAC+HLA-A双敲指TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的CAR-T细胞的结果；TRAC+HLA-A+CIITA三敲指TRAC、HLA-A和CIITA三基因敲除的CAR-T细胞的结果；其中TRAC+B2M+CIITA三敲指B2M、CIITA和TRAC三基因敲除的CAR-T细胞的结果。
其中，CD19CAR的转染效率如图30A-30B所示。其中，CAR30％+即代表CD19 CAR的转染效率。
图31显示了不同细胞的扩增倍数。其中，TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的CAR-T细胞扩增倍数最高。
实施例21TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的CAR-T细胞抗肿瘤效果
制备实施例21中的TRAC基因和HLA-A基因双敲除的CAR-T细胞(靶向CD19、CD20或BCMA)，接种表达荧光素酶基因的靶细胞(靶基因阳性的白血病或淋巴瘤细胞系，如Raji、Jurkat、MM1S等)至孔板中，再分别以不同效靶比(1∶2.5，1∶1，5：1，10：1)加入双基因敲除的CAR-T细胞、三基因敲除的CAR-T细胞或无基因敲除的T细胞，共培养24小时后将细胞转移至检测孔板中，加入荧光素酶底物，酶标仪检测荧光值。杀伤效率＝1-靶细胞T细胞共培养荧光值/单独培养的靶细胞荧光值。
结果显示TRAC基因和HLA-A基因双敲除的CAR-T细胞对肿瘤细胞有显著的杀伤效果。
图32显示了对CD19靶细胞Raji-Luciferase的杀伤效果，其中TRAC基因和HLA-A基因双敲除的CAR-T细胞的杀伤效果最为显著。其中每个E/T比下从左到右依次是A-D的图注所对应的结果。
实施例22TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的CAR-T细胞抗肿瘤效果
NSG小鼠静脉注射肿瘤细胞，肿瘤成功建立后向小鼠体内回输TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的CAR-T细胞、三基因敲除的CAR-T细胞或无基因敲除的T细胞，监测小鼠肿瘤体积。
回输双基因敲除CAR-T细胞的小鼠，肿瘤生长速度明显减缓。
结果如图33-34所示。其中，图33显示了对小鼠的给药方式，i.v.表示静脉注射，CAR-T细胞代表表达CD19 CAR的双基因敲除的CAR-T细胞、三基因敲除的CAR-T细胞。图34显示了小鼠在施用CAR-T细胞后体内肿瘤的体积情况。其中，图34从左至右列依次显示了分别施用生理盐水、未改造的T细胞、TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的CD19 CAR-T细胞、TRAC、HLA-A和CIITA三基因敲除的CD19 CAR-T细胞、B2M、CIITA和TRAC三基因敲除的CD19CAR-T细胞后，小鼠体内肿瘤的体积情况。结果发现回输TRAC基因和HLA-A基因双基因敲除的CAR-T细胞的小鼠，肿瘤生长的速度明显减缓。
综上，
1.本申请制备了一种靶向B7H3的嵌合抗原受体，该重组受体的抗原结合域来自纳米抗体，具有分子量小、结构稳定的特点。
2.本申请提供了一种慢病毒表达载体。以pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP为骨架，将载体的氨苄抗性基因β-内酰胺酶替换为源自Tn5的氨基糖苷磷酸转移酶，使载体具有卡那霉素抗性；删除了在体内应用中具有潜在威胁性的CMV启动子及其临近的下游多克隆位点；将原载体中由EF1启动子启动表达的copGFP基因删除，保留SalI酶切位点，并在SalI 5’端加入SmaI酶切位点供载体构建用，形成最终目的载体。
3.本申请优化了蛋白质RNA复合体电转染技术。获得了原代T细胞中90％以上的双基因敲除效率。
4.本申请供者来源基于人群中高频出现的HLA-B纯合子，患者HLA-B其中一个等位基因和供者纯合子一致即可，来源于这些供者的细胞能覆盖高数量的患者人群，且能够降低HLA-B引起的排异反应。
5.本申请筛选出了与排异高度相关的HLA-A分子进行敲除，而保留了其他HLA-I类分子，既减少了异体细胞的排异，也避免了HLA分子完全敲除被NK细胞清除的发生，大大延长了同种异体CAR-T细胞在体内的半衰期。
6.本申请首次构建了高效率双敲除TCR，HLA-A的anti-B7H3-UCAR-T细胞，做到一种安全型货架式即用型治疗剂，提高抗肿瘤效果，用于包括肾上腺皮质癌，膀胱癌，乳腺癌，胆管癌，结直肠癌，淋巴瘤，食管癌，脑胶质瘤，头颈鳞癌，肾癌，肝癌，肺癌，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，肉瘤，黑色素瘤，胃癌，胸腺癌，子宫内膜癌等疾病的治疗。
序列表
<110> 宁波茂行生物医药科技有限公司
<120> 靶向B7H3的抗原结合多肽及其应用
<130> 0131-PA-025CN
<160> 216
<170> PatentIn version 3.5
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<212> PRT
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
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Ala
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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Xaa Xaa Ala Asp Xaa Xaa Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
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Xaa Lys Asn Thr Xaa Xaa Leu Gln Met Asn Ser Leu Xaa Xaa Glu Asp
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Thr Ala Xaa Tyr Tyr Cys
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<220>
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Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
20 25 30
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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20 25 30
Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
35
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 1G7 HFR4；1A5 HFR4; hu1G7 HFR4；hu1A5 HFR4
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa = Leu或Gln
<400> 22
Trp Gly Gln Gly Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 23
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 1G7 HFR4；1A5 HFR4
<400> 23
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 24
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> hu1G7 HFR4；hu1A5 HFR4
<400> 24
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 25
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 1G7（抗体可变区）; hu1G7（抗体可变区）; 1A5（抗体可变区）; hu1A5（抗体可变区）
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = Ala或Gln
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa = Ala或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> Xaa = Pro或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> Xaa = Ala或Asp
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> Xaa = Ala或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(34)
<223> Xaa = Met或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(53)
<223> Xaa = Gly或Trp
<220>
<221> misc_feature
<222> (58)..(58)
<223> Xaa = Thr或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(59)
<223> Xaa = Asn或Tyr
<220>
<221> misc_feature
<222> (60)..(60)
<223> Xaa = Leu或Tyr
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(63)
<223> Xaa = Pro或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (64)..(64)
<223> Xaa = Met或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (75)..(75)
<223> Xaa = Ala或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (79)..(79)
<223> Xaa = Leu或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (80)..(80)
<223> Xaa = Val或Tyr
<220>
<221> misc_feature
<222> (87)..(87)
<223> Xaa = Lys或Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (88)..(88)
<223> Xaa = Ala或Pro
<220>
<221> misc_feature
<222> (93)..(93)
<223> Xaa = Ile或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (101)..(101)
<223> Xaa = Lys或Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (113)..(113)
<223> Xaa = Gly或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (120)..(120)
<223> Xaa = Leu或Gln
<400> 25
Xaa Xaa Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Xaa Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Xaa Ser Gly Arg Ile Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Xaa Xaa Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ile Xaa Ser Thr Gly Thr Xaa Xaa Xaa Ala Asp Xaa Xaa
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Xaa Lys Asn Thr Xaa Xaa
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Xaa Xaa Glu Asp Thr Ala Xaa Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Phe Xaa Tyr Ser Gly Ile Tyr Gly Arg Glu Ala Asp Phe
100 105 110
Xaa Ser Trp Gly Gln Gly Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 26
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 1G7（抗体可变区）
<400> 26
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Asp Ser Gly Arg Ile Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ile Gly Ser Thr Gly Thr Val Asn Tyr Ala Asp Ser Met
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Val
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Phe Arg Tyr Ser Gly Ile Tyr Gly Arg Glu Ala Asp Phe
100 105 110
Val Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 27
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> hu1G7（抗体可变区）
<400> 27
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ile Gly Ser Thr Gly Thr Val Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Phe Arg Tyr Ser Gly Ile Tyr Gly Arg Glu Ala Asp Phe
100 105 110
Val Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 28
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 1A5（抗体可变区）
<400> 28
Gln Ala Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ser Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ile Trp Ser Thr Gly Thr Thr Asn Leu Ala Asp Pro Met
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Val
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Phe Lys Tyr Ser Gly Ile Tyr Gly Arg Glu Ala Asp Phe
100 105 110
Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 29
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> hu1A5（抗体可变区）
<400> 29
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ser Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ile Trp Ser Thr Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Phe Lys Tyr Ser Gly Ile Tyr Gly Arg Glu Ala Asp Phe
100 105 110
Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 30
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CAR非抗原结合域的氨基酸序列
<400> 30
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
1 5 10 15
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
20 25 30
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
35 40 45
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
50 55 60
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn
65 70 75 80
His Arg Asn Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
85 90 95
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
100 105 110
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
115 120 125
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
130 135 140
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
145 150 155 160
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
165 170 175
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
180 185 190
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
195 200 205
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
210 215 220
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
225 230 235
<210> 31
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD8A信号肽氨基酸序列
<400> 31
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 32
<211> 383
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 1G7 CAR VHH
<400> 32
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Thr Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Asp Ser Gly Arg
35 40 45
Ile Phe Ser Asn Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50 55 60
Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Ile Gly Ser Thr Gly Thr Val Asn
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Met Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
85 90 95
Lys Asn Thr Val Val Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Phe Arg Tyr Ser Gly Ile Tyr Gly
115 120 125
Arg Glu Ala Asp Phe Val Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
130 135 140
Ser Ser Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro
145 150 155 160
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
165 170 175
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
180 185 190
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
195 200 205
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
210 215 220
Cys Asn His Arg Asn Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
225 230 235 240
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
245 250 255
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
260 265 270
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
275 280 285
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
290 295 300
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
305 310 315 320
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
325 330 335
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
340 345 350
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
355 360 365
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
370 375 380
<210> 33
<211> 383
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Hu1G7 CAR VHH
<400> 33
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg
35 40 45
Ile Phe Ser Asn Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50 55 60
Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Ile Gly Ser Thr Gly Thr Val Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
85 90 95
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Phe Arg Tyr Ser Gly Ile Tyr Gly
115 120 125
Arg Glu Ala Asp Phe Val Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
130 135 140
Ser Ser Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro
145 150 155 160
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
165 170 175
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
180 185 190
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
195 200 205
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
210 215 220
Cys Asn His Arg Asn Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
225 230 235 240
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
245 250 255
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
260 265 270
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
275 280 285
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
290 295 300
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
305 310 315 320
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
325 330 335
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
340 345 350
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
355 360 365
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
370 375 380
<210> 34
<211> 383
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 1A5 CAR VHH
<400> 34
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Ala Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Thr Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg
35 40 45
Ile Phe Ser Asn Tyr Ser Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50 55 60
Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Ile Trp Ser Thr Gly Thr Thr Asn
65 70 75 80
Leu Ala Asp Pro Met Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
85 90 95
Lys Asn Thr Val Val Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Phe Lys Tyr Ser Gly Ile Tyr Gly
115 120 125
Arg Glu Ala Asp Phe Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
130 135 140
Ser Ser Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro
145 150 155 160
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
165 170 175
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
180 185 190
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
195 200 205
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
210 215 220
Cys Asn His Arg Asn Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
225 230 235 240
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
245 250 255
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
260 265 270
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
275 280 285
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
290 295 300
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
305 310 315 320
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
325 330 335
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
340 345 350
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
355 360 365
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
370 375 380
<210> 35
<211> 383
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Hu1A5 CAR VHH
<400> 35
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg
35 40 45
Ile Phe Ser Asn Tyr Ser Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50 55 60
Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Ile Trp Ser Thr Gly Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
85 90 95
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Phe Lys Tyr Ser Gly Ile Tyr Gly
115 120 125
Arg Glu Ala Asp Phe Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
130 135 140
Ser Ser Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro
145 150 155 160
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
165 170 175
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
180 185 190
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
195 200 205
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
210 215 220
Cys Asn His Arg Asn Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
225 230 235 240
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
245 250 255
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
260 265 270
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
275 280 285
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
290 295 300
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
305 310 315 320
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
325 330 335
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
340 345 350
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
355 360 365
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
370 375 380
<210> 36
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 1G7（抗体可变区）核苷酸序列
<400> 36
gctgtccagc ttgtggagtc tggggggggc ctcgtccaga caggcggttc tctccgcctc 60
tcctgtgctg attctggcag aatcttttca aactacgcaa tgggctggtt caggcaggca 120
ccaggcaagg agcgggagtt cgtggctgct atcattggat ctactggcac cgttaactac 180
gcagacagca tgaaaggcag atttaccatc tcaagagata acgccaaaaa tactgtagtc 240
ctccagatga actctctgaa gcctgaggat accgctatat attattgtgc ggcgtcattc 300
aggtacagcg gcatctatgg ccgcgaagcg gattttgtta gttggggaca agggacccaa 360
gtgacagtgt cttca 375
<210> 37
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> hu1G7（抗体可变区）核苷酸序列
<400> 37
gctgttcagc tggtggagtc tggtggcggg ctcgttcagc cgggcggcag cctcagactg 60
agctgtgcag cctccggaag gatcttttca aattacgcaa tggggtggtt taggcaggca 120
ccaggaaagg agcgagagtt tgtggcagca ataatcggtt ctaccggcac agtgtattac 180
gctgatagcg tgaaaggcag gttcaccatt tcaagggata acagtaaaaa cacactatac 240
ttacagatga actccttacg agccgaagac acggcggtgt actactgtgc cgcatccttt 300
agatactctg gaatttacgg acgcgaggcc gactttgtca gctggggtca ggggactctt 360
gttaccgtat cctct 375
<210> 38
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 1A5（抗体可变区）核苷酸序列
<400> 38
caggctcaac tggtggagtc gggaggtggc ttggtgcaga caggagggag cctgcgactc 60
tcctgtgcgg cttccggaag gattttctct aattattctg tcggatggtt ccggcaggcc 120
ccaggcaaag agcgtgaatt cgttgcggcg ataatctggt cgaccggaac aacgaatctg 180
gccgatccca tgaaggggag attcaccatt agtagagaca acgcaaaaaa cacagtagtc 240
ctgcagatga acagcctcaa acccgaggat acagctatct attactgcgc agcttccttt 300
aaatattctg gcatatatgg cagagaagca gattttggga gttgggggca gggcacccag 360
gtgacagtca gttct 375
<210> 39
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> hu1A5（抗体可变区）核苷酸序列
<400> 39
caggtccaat tagtggaaag tggtggggga ttagtgcaac cgggcggctc cctccgcctt 60
tcctgcgccg cttctggcag aatcttctcc aactactccg ttggatggtt tcgtcaggcc 120
ccaggaaaag agagagaatt cgtggctgct atcatatgga gcacggggac cacctactat 180
gccgatagcg tcaaaggcag gttcactatc agcagggata atagcaagaa tacactatac 240
ttgcaaatga actcgctgcg agccgaagac acagccgtct actactgtgc ggcgtcattt 300
aaatacagcg gcatttacgg ccgagaggca gatttcggaa gttgggggca gggaaccttg 360
gtgacagtct cctcg 375
<210> 40
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CAR非抗原结合域的DNA序列
<400> 40
ttcgtccccg tgttcctgcc tgccaagcca acaactaccc ctgctccacg accacctact 60
ccagcaccta ccatcgcaag tcagcccctg tcactgcgac ctgaggcttg ccggccagca 120
gctggaggag cagtgcacac ccgaggcctg gacttcgcat gcgatatcta catttgggca 180
ccactggctg gaacctgtgg ggtcctgctg ctgagcctgg tcatcaccct gtattgtaac 240
cacagaaata aaagggggcg caagaaactg ctgtacatct tcaagcagcc ttttatgcgc 300
ccagtgcaga caactcagga ggaagacgga tgctcttgtc ggttcccaga ggaggaggaa 360
ggaggctgcg agctgagagt gaagttcagc cggagcgccg atgcaccagc atatcagcag 420
ggacagaatc agctgtacaa cgagctgaat ctgggcaggc gcgaggaata tgacgtgctg 480
gataagcgac gaggacggga ccccgaaatg ggaggaaaac ccagaaggaa gaaccctcag 540
gaggggctgt ataatgaact gcagaaagac aagatggctg aggcatacag cgaaattgga 600
atgaaaggag agcgccgacg ggggaaggga cacgatgggc tgtaccaggg actgtcaacc 660
gccactaaag atacctacga cgcactgcac atgcaggctc tgcccccaag a 711
<210> 41
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD8A信号肽核酸序列
<400> 41
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccg 63
<210> 42
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD8A跨膜域
<400> 42
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr
20
<210> 43
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD8B跨膜域
<400> 43
Ile Thr Leu Gly Leu Leu Val Ala Gly Val Leu Val Leu Leu Val Ser
1 5 10 15
Leu Gly Val Ala Ile
20
<210> 44
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD28跨膜域
<400> 44
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 45
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-1BB跨膜域
<400> 45
Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu
1 5 10 15
Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val
20 25
<210> 46
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD4跨膜域
<400> 46
Met Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile
1 5 10 15
Gly Leu Gly Ile Phe Phe
20
<210> 47
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD27跨膜域
<400> 47
Ile Leu Val Ile Phe Ser Gly Met Phe Leu Val Phe Thr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Ala Leu Phe Leu His
20
<210> 48
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD7跨膜域
<400> 48
Ala Ala Leu Ala Val Ile Ser Phe Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Val
1 5 10 15
Ala Cys Val Leu Ala
20
<210> 49
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-1跨膜域
<400> 49
Val Gly Val Val Gly Gly Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp
1 5 10 15
Val Leu Ala Val Ile
20
<210> 50
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TRAC跨膜域
<400> 50
Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu
1 5 10 15
Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp
20
<210> 51
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TRBC跨膜域
<400> 51
Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu
1 5 10 15
Val Leu Met Ala Met
20
<210> 52
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD3ε跨膜域
<400> 52
Val Met Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly
1 5 10 15
Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser
20 25
<210> 53
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD3ζ跨膜域
<400> 53
Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu
1 5 10 15
Thr Ala Leu Phe Leu
20
<210> 54
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CTLA-4跨膜域
<400> 54
Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe Tyr
1 5 10 15
Ser Phe Leu Leu Thr
20
<210> 55
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LAG-3跨膜域
<400> 55
Leu Leu Phe Leu Ile Leu Gly Val Leu Ser Leu Leu Leu Leu Val Thr
1 5 10 15
Gly Ala Phe Gly Phe
20
<210> 56
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD5跨膜域
<400> 56
Ala Gly Leu Ala Ala Gly Thr Val Ala Ser Ile Ile Leu Ala Leu Val
1 5 10 15
Leu Leu Val Val Leu Leu Val Val Cys Gly Pro Leu Ala Tyr
20 25 30
<210> 57
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> ICOS跨膜域
<400> 57
Phe Trp Leu Pro Ile Gly Cys Ala Ala Phe Val Val Val Cys Ile Leu
1 5 10 15
Gly Cys Ile Leu Ile
20
<210> 58
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40跨膜域
<400> 58
Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val Leu Gly Leu Leu Gly Pro
1 5 10 15
Leu Ala Ile Leu Leu
20
<210> 59
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> NKG2D跨膜域
<400> 59
Pro Phe Phe Phe Cys Cys Phe Ile Ala Val Ala Met Gly Ile Arg Phe
1 5 10 15
Ile Ile Met Val Ala
20
<210> 60
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 2B4跨膜域
<400> 60
Phe Leu Val Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu Phe Leu Gly Thr Leu
1 5 10 15
Ala Cys Phe Cys Val
20
<210> 61
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> FcεRIγ跨膜域
<400> 61
Leu Cys Tyr Ile Leu Asp Ala Ile Leu Phe Leu Tyr Gly Ile Val Leu
1 5 10 15
Thr Leu Leu Tyr Cys
20
<210> 62
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BTLA跨膜域
<400> 62
Leu Leu Pro Leu Gly Gly Leu Pro Leu Leu Ile Thr Thr Cys Phe Cys
1 5 10 15
Leu Phe Cys Cys Leu
20
<210> 63
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD30跨膜域
<400> 63
Pro Val Leu Phe Trp Val Ile Leu Val Leu Val Val Val Val Gly Ser
1 5 10 15
Ser Ala Phe Leu Leu
20
<210> 64
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GITR跨膜域
<400> 64
Leu Gly Trp Leu Thr Val Val Leu Leu Ala Val Ala Ala Cys Val Leu
1 5 10 15
Leu Leu Thr Ser Ala
20
<210> 65
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HVEM跨膜域
<400> 65
Trp Trp Phe Leu Ser Gly Ser Leu Val Ile Val Ile Val Cys Ser Thr
1 5 10 15
Val Gly Leu Ile Ile
20
<210> 66
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> DAP10跨膜域
<400> 66
Leu Leu Ala Gly Leu Val Ala Ala Asp Ala Val Ala Ser Leu Leu Ile
1 5 10 15
Val Gly Ala Val Phe
20
<210> 67
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD2跨膜域
<400> 67
Ile Tyr Leu Ile Ile Gly Ile Cys Gly Gly Gly Ser Leu Leu Met Val
1 5 10 15
Phe Val Ala Leu Leu Val Phe Tyr Ile Thr
20 25
<210> 68
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> NKG2C跨膜域
<400> 68
Leu Thr Ala Glu Val Leu Gly Ile Ile Cys Ile Val Leu Met Ala Thr
1 5 10 15
Val Leu Lys Thr Ile Val Leu
20
<210> 69
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LIGHT跨膜域
<400> 69
Val Gly Leu Gly Leu Leu Leu Leu Leu Met Gly Ala Gly Leu Ala Val
1 5 10 15
Gln Gly Trp Phe Leu
20
<210> 70
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> DAP12跨膜域
<400> 70
Gly Val Leu Ala Gly Ile Val Met Gly Asp Leu Val Leu Thr Val Leu
1 5 10 15
Ile Ala Leu Ala Val
20
<210> 71
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD40L跨膜域
<400> 71
Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu Ile Thr Gln Met Ile Gly
1 5 10 15
Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu
20
<210> 72
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TIM1跨膜域
<400> 72
Ile Tyr Ala Gly Val Cys Ile Ser Val Leu Val Leu Leu Ala Leu Leu
1 5 10 15
Gly Val Ile Ile Ala
20
<210> 73
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD226跨膜域
<400> 73
Gly Gly Thr Val Leu Leu Leu Leu Phe Val Ile Ser Ile Thr Thr Ile
1 5 10 15
Ile Val Ile Phe Leu
20
<210> 74
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> DR3跨膜域
<400> 74
Met Phe Trp Val Gln Val Leu Leu Ala Gly Leu Val Val Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Gly Ala Thr Leu
20
<210> 75
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD45跨膜域
<400> 75
Ala Leu Ile Ala Phe Leu Ala Phe Leu Ile Ile Val Thr Ser Ile Ala
1 5 10 15
Leu Leu Val Val Leu
20
<210> 76
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD80跨膜域
<400> 76
Leu Leu Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly Ile Phe
1 5 10 15
Val Ile Cys Cys Leu
20
<210> 77
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD86跨膜域
<400> 77
Trp Ile Thr Ala Val Leu Pro Thr Val Ile Ile Cys Val Met Val Phe
1 5 10 15
Cys Leu Ile Leu Trp
20
<210> 78
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD9跨膜域1
<400> 78
Leu Leu Phe Gly Phe Asn Phe Ile Phe Trp Leu Ala Gly Ile Ala Val
1 5 10 15
Leu Ala Ile Gly Leu
20
<210> 79
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD9跨膜域2
<400> 79
Phe Tyr Thr Gly Val Tyr Ile Leu Ile Gly Ala Gly Ala Leu Met Met
1 5 10 15
Leu Val Gly Phe Leu
20
<210> 80
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD9跨膜域3
<400> 80
Met Leu Gly Leu Phe Phe Gly Phe Leu Leu Val Ile Phe Ala Ile Glu
1 5 10 15
Ile Ala Ala Ala Ile Trp Gly Tyr
20
<210> 81
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD9跨膜域4
<400> 81
Ile Gly Ala Val Gly Ile Gly Ile Ala Val Val Met Ile Phe Gly Met
1 5 10 15
Ile Phe Ser Met Ile Leu Cys Cys Ala Ile
20 25
<210> 82
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD16跨膜域
<400> 82
Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly
1 5 10 15
Leu Tyr Phe Ser Val
20
<210> 83
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD22跨膜域
<400> 83
Val Ala Val Gly Leu Gly Ser Cys Leu Ala Ile Leu Ile Leu Ala Ile
1 5 10 15
Cys Gly Leu
<210> 84
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD33跨膜域
<400> 84
Gly Ala Ile Gly Gly Ala Gly Val Thr Ala Leu Leu Ala Leu Cys Leu
1 5 10 15
Cys Leu Ile Phe Phe Ile Val
20
<210> 85
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD37跨膜域1
<400> 85
Phe Asn Leu Phe Phe Phe Val Leu Gly Ser Leu Ile Phe Cys Phe Gly
1 5 10 15
Ile Trp Ile Leu Ile
20
<210> 86
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD37跨膜域2
<400> 86
Val Leu Ala Ile Ser Gly Ile Phe Thr Met Gly Ile Ala Leu Leu
1 5 10 15
<210> 87
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD37跨膜域3
<400> 87
Leu Leu Gly Leu Tyr Phe Gly Met Leu Leu Leu Leu Phe Ala Thr Gln
1 5 10 15
Ile Thr Leu Gly Ile Leu Ile Ser Thr Gln
20 25
<210> 88
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD37跨膜域4
<400> 88
Leu Ile Ser Ile Val Gly Ile Cys Leu Gly Val Gly Leu Leu Glu Leu
1 5 10 15
Gly Phe Met Thr Leu Ser Ile Phe Leu
20 25
<210> 89
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD64跨膜域
<400> 89
Val Leu Phe Tyr Leu Ala Val Gly Ile Met Phe Leu Val Asn Thr Val
1 5 10 15
Leu Trp Val Thr Ile
20
<210> 90
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SLAM跨膜域
<400> 90
Trp Ala Val Tyr Ala Gly Leu Leu Gly Gly Val Ile Met Ile Leu Ile
1 5 10 15
Met Val Val Ile Leu
20
<210> 91
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD28胞内共刺激信号传导结构域
<400> 91
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 92
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD137胞内共刺激信号传导结构域
<400> 92
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 93
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD27胞内共刺激信号传导结构域
<400> 93
Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro
1 5 10 15
Ala Glu Pro Cys His Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr
20 25 30
Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro
35 40 45
<210> 94
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD2胞内共刺激信号传导结构域
<400> 94
Lys Arg Lys Lys Gln Arg Ser Arg Arg Asn Asp Glu Glu Leu Glu Thr
1 5 10 15
Arg Ala His Arg Val Ala Thr Glu Glu Arg Gly Arg Lys Pro His Gln
20 25 30
Ile Pro Ala Ser Thr Pro Gln Asn Pro Ala Thr Ser Gln His Pro Pro
35 40 45
Pro Pro Pro Gly His Arg Ser Gln Ala Pro Ser His Arg Pro Pro Pro
50 55 60
Pro Gly His Arg Val Gln His Gln Pro Gln Lys Arg Pro Pro Ala Pro
65 70 75 80
Ser Gly Thr Gln Val His Gln Gln Lys Gly Pro Pro Leu Pro Arg Pro
85 90 95
Arg Val Gln Pro Lys Pro Pro His Gly Ala Ala Glu Asn Ser Leu Ser
100 105 110
Pro Ser Ser Asn
115
<210> 95
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD7胞内共刺激信号传导结构域
<400> 95
Arg Thr Gln Ile Lys Lys Leu Cys Ser Trp Arg Asp Lys Asn Ser Ala
1 5 10 15
Ala Cys Val Val Tyr Glu Asp Met Ser His Ser Arg Cys Asn Thr Leu
20 25 30
Ser Ser Pro Asn Gln Tyr Gln
35
<210> 96
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD8A胞内共刺激信号传导结构域
<400> 96
Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg
1 5 10 15
Pro Val Val Lys Ser Gly Asp Lys Pro Ser Leu Ser Ala Arg Tyr Val
20 25 30
<210> 97
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD8B胞内共刺激信号传导结构域
<400> 97
His Leu Cys Cys Arg Arg Arg Arg Ala Arg Leu Arg Phe Met Lys Gln
1 5 10 15
Phe Tyr Lys
<210> 98
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40胞内共刺激信号传导结构域
<400> 98
Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His
1 5 10 15
Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln
20 25 30
Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile
35 40
<210> 99
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD226胞内共刺激信号传导结构域
<400> 99
Asn Arg Arg Arg Arg Arg Glu Arg Arg Asp Leu Phe Thr Glu Ser Trp
1 5 10 15
Asp Thr Gln Lys Ala Pro Asn Asn Tyr Arg Ser Pro Ile Ser Thr Ser
20 25 30
Gln Pro Thr Asn Gln Ser Met Asp Asp Thr Arg Glu Asp Ile Tyr Val
35 40 45
Asn Tyr Pro Thr Phe Ser Arg Arg Pro Lys Thr Arg Val
50 55 60
<210> 100
<211> 197
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> DR3胞内共刺激信号传导结构域
<400> 100
Thr Tyr Thr Tyr Arg His Cys Trp Pro His Lys Pro Leu Val Thr Ala
1 5 10 15
Asp Glu Ala Gly Met Glu Ala Leu Thr Pro Pro Pro Ala Thr His Leu
20 25 30
Ser Pro Leu Asp Ser Ala His Thr Leu Leu Ala Pro Pro Asp Ser Ser
35 40 45
Glu Lys Ile Cys Thr Val Gln Leu Val Gly Asn Ser Trp Thr Pro Gly
50 55 60
Tyr Pro Glu Thr Gln Glu Ala Leu Cys Pro Gln Val Thr Trp Ser Trp
65 70 75 80
Asp Gln Leu Pro Ser Arg Ala Leu Gly Pro Ala Ala Ala Pro Thr Leu
85 90 95
Ser Pro Glu Ser Pro Ala Gly Ser Pro Ala Met Met Leu Gln Pro Gly
100 105 110
Pro Gln Leu Tyr Asp Val Met Asp Ala Val Pro Ala Arg Arg Trp Lys
115 120 125
Glu Phe Val Arg Thr Leu Gly Leu Arg Glu Ala Glu Ile Glu Ala Val
130 135 140
Glu Val Glu Ile Gly Arg Phe Arg Asp Gln Gln Tyr Glu Met Leu Lys
145 150 155 160
Arg Trp Arg Gln Gln Gln Pro Ala Gly Leu Gly Ala Val Tyr Ala Ala
165 170 175
Leu Glu Arg Met Gly Leu Asp Gly Cys Val Glu Asp Leu Arg Ser Arg
180 185 190
Leu Gln Arg Gly Pro
195
<210> 101
<211> 77
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SLAM胞内共刺激信号传导结构域
<400> 101
Gln Leu Arg Arg Arg Gly Lys Thr Asn His Tyr Gln Thr Thr Val Glu
1 5 10 15
Lys Lys Ser Leu Thr Ile Tyr Ala Gln Val Gln Lys Pro Gly Pro Leu
20 25 30
Gln Lys Lys Leu Asp Ser Phe Pro Ala Gln Asp Pro Cys Thr Thr Ile
35 40 45
Tyr Val Ala Ala Thr Glu Pro Val Pro Glu Ser Val Gln Glu Thr Asn
50 55 60
Ser Ile Thr Val Tyr Ala Ser Val Thr Leu Pro Glu Ser
65 70 75
<210> 102
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> ICAM-1胞内共刺激信号传导结构域
<400> 102
Asn Arg Gln Arg Lys Ile Lys Lys Tyr Arg Leu Gln Gln Ala Gln Lys
1 5 10 15
Gly Thr Pro Met Lys Pro Asn Thr Gln Ala Thr Pro Pro
20 25
<210> 103
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> NKG2D胞内共刺激信号传导结构域
<400> 103
Met Gly Trp Ile Arg Gly Arg Arg Ser Arg His Ser Trp Glu Met Ser
1 5 10 15
Glu Phe His Asn Tyr Asn Leu Asp Leu Lys Lys Ser Asp Phe Ser Thr
20 25 30
Arg Trp Gln Lys Gln Arg Cys Pro Val Val Lys Ser Lys Cys Arg Glu
35 40 45
Asn Ala Ser
50
<210> 104
<211> 70
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> NKG2C胞内共刺激信号传导结构域
<400> 104
Met Ser Lys Gln Arg Gly Thr Phe Ser Glu Val Ser Leu Ala Gln Asp
1 5 10 15
Pro Lys Arg Gln Gln Arg Lys Pro Lys Gly Asn Lys Ser Ser Ile Ser
20 25 30
Gly Thr Glu Gln Glu Ile Phe Gln Val Glu Leu Asn Leu Gln Asn Pro
35 40 45
Ser Leu Asn His Gln Gly Ile Asp Lys Ile Tyr Asp Cys Gln Gly Leu
50 55 60
Leu Pro Pro Pro Glu Lys
65 70
<210> 105
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> B7-H3胞内共刺激信号传导结构域
<400> 105
Cys Trp Arg Lys Ile Lys Gln Ser Cys Glu Glu Glu Asn Ala Gly Ala
1 5 10 15
Glu Asp Gln Asp Gly Glu Gly Glu Gly Ser Lys Thr Ala Leu Gln Pro
20 25 30
Leu Lys His Ser Asp Ser Lys Glu Asp Asp Gly Gln Glu Ile Ala
35 40 45
<210> 106
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 2B4胞内共刺激信号传导结构域
<400> 106
Trp Arg Arg Lys Arg Lys Glu Lys Gln Ser Glu Thr Ser Pro Lys Glu
1 5 10 15
Phe Leu Thr Ile Tyr Glu Asp Val Lys Asp Leu Lys Thr Arg Arg Asn
20 25 30
His Glu Gln Glu Gln Thr Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ser
35 40 45
Met Ile Gln Ser Gln Ser Ser Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro Ala Tyr
50 55 60
Thr Leu Tyr Ser Leu Ile Gln Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg Lys
65 70 75 80
Arg Asn His Ser Pro Ser Phe Asn Ser Thr Ile Tyr Glu Val Ile Gly
85 90 95
Lys Ser Gln Pro Lys Ala Gln Asn Pro Ala Arg Leu Ser Arg Lys Glu
100 105 110
Leu Glu Asn Phe Asp Val Tyr Ser
115 120
<210> 107
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> FcεRIγ胞内共刺激信号传导结构域；FcεRIγ胞内信号转导结构域
<400> 107
Arg Leu Lys Ile Gln Val Arg Lys Ala Ala Ile Thr Ser Tyr Glu Lys
1 5 10 15
Ser Asp Gly Val Tyr Thr Gly Leu Ser Thr Arg Asn Gln Glu Thr Tyr
20 25 30
Glu Thr Leu Lys His Glu Lys Pro Pro Gln
35 40
<210> 108
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BTLA胞内共刺激信号传导结构域
<400> 108
Arg Arg His Gln Gly Lys Gln Asn Glu Leu Ser Asp Thr Ala Gly Arg
1 5 10 15
Glu Ile Asn Leu Val Asp Ala His Leu Lys Ser Glu Gln Thr Glu Ala
20 25 30
Ser Thr Arg Gln Asn Ser Gln Val Leu Leu Ser Glu Thr Gly Ile Tyr
35 40 45
Asp Asn Asp Pro Asp Leu Cys Phe Arg Met Gln Glu Gly Ser Glu Val
50 55 60
Tyr Ser Asn Pro Cys Leu Glu Glu Asn Lys Pro Gly Ile Val Tyr Ala
65 70 75 80
Ser Leu Asn His Ser Val Ile Gly Pro Asn Ser Arg Leu Ala Arg Asn
85 90 95
Val Lys Glu Ala Pro Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Cys Val Arg Ser
100 105 110
<210> 109
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GITR胞内共刺激信号传导结构域
<400> 109
Gln Leu Gly Leu His Ile Trp Gln Leu Arg Ser Gln Cys Met Trp Pro
1 5 10 15
Arg Glu Thr Gln Leu Leu Leu Glu Val Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala
20 25 30
Arg Ser Cys Gln Phe Pro Glu Glu Glu Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu
35 40 45
Glu Lys Gly Arg Leu Gly Asp Leu Trp Val
50 55
<210> 110
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HVEM胞内共刺激信号传导结构域
<400> 110
Cys Val Lys Arg Arg Lys Pro Arg Gly Asp Val Val Lys Val Ile Val
1 5 10 15
Ser Val Gln Arg Lys Arg Gln Glu Ala Glu Gly Glu Ala Thr Val Ile
20 25 30
Glu Ala Leu Gln Ala Pro Pro Asp Val Thr Thr Val Ala Val Glu Glu
35 40 45
Thr Ile Pro Ser Phe Thr Gly Arg Ser Pro Asn His
50 55 60
<210> 111
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> DAP10胞内共刺激信号传导结构域；DAP10胞内信号转导结构域
<400> 111
Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln Glu Asp Gly Lys Val
1 5 10 15
Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly
20
<210> 112
<211> 52
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> DAP12胞内共刺激信号传导结构域；DAP-12胞内信号转导结构域
<400> 112
Tyr Phe Leu Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala
1 5 10 15
Ala Thr Arg Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu
20 25 30
Leu Gln Gly Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln Arg
35 40 45
Pro Tyr Tyr Lys
50
<210> 113
<211> 189
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD30胞内共刺激信号传导结构域
<400> 113
Cys His Arg Arg Ala Cys Arg Lys Arg Ile Arg Gln Lys Leu His Leu
1 5 10 15
Cys Tyr Pro Val Gln Thr Ser Gln Pro Lys Leu Glu Leu Val Asp Ser
20 25 30
Arg Pro Arg Arg Ser Ser Thr Gln Leu Arg Ser Gly Ala Ser Val Thr
35 40 45
Glu Pro Val Ala Glu Glu Arg Gly Leu Met Ser Gln Pro Leu Met Glu
50 55 60
Thr Cys His Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu Glu Ser Leu Pro Leu Gln
65 70 75 80
Asp Ala Ser Pro Ala Gly Gly Pro Ser Ser Pro Arg Asp Leu Pro Glu
85 90 95
Pro Arg Val Ser Thr Glu His Thr Asn Asn Lys Ile Glu Lys Ile Tyr
100 105 110
Ile Met Lys Ala Asp Thr Val Ile Val Gly Thr Val Lys Ala Glu Leu
115 120 125
Pro Glu Gly Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ala Glu Pro Glu Leu Glu Glu
130 135 140
Glu Leu Glu Ala Asp His Thr Pro His Tyr Pro Glu Gln Glu Thr Glu
145 150 155 160
Pro Pro Leu Gly Ser Cys Ser Asp Val Met Leu Ser Val Glu Glu Glu
165 170 175
Gly Lys Glu Asp Pro Leu Pro Thr Ala Ala Ser Gly Lys
180 185
<210> 114
<211> 62
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD40胞内共刺激信号传导结构域
<400> 114
Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn Lys Ala Pro His Pro Lys Gln
1 5 10 15
Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr
20 25 30
Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln
35 40 45
Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser Val Gln Glu Arg Gln
50 55 60
<210> 115
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD40L胞内共刺激信号传导结构域
<400> 115
Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Leu Pro Ile Ser Met Lys
20
<210> 116
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TIM1胞内共刺激信号传导结构域
<400> 116
Lys Lys Tyr Phe Phe Lys Lys Glu Val Gln Gln Leu Ser Val Ser Phe
1 5 10 15
Ser Ser Leu Gln Ile Lys Ala Leu Gln Asn Ala Val Glu Lys Glu Val
20 25 30
Gln Ala Glu Asp Asn Ile Tyr Ile Glu Asn Ser Leu Tyr Ala Thr Asp
35 40 45
<210> 117
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-1胞内共刺激信号传导结构域
<400> 117
Cys Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln
1 5 10 15
Pro Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr
20 25 30
Gly Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val
35 40 45
Pro Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser
50 55 60
Gly Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro
65 70 75 80
Arg Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro
85 90 95
Leu
<210> 118
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LFA-1胞内共刺激信号传导结构域
<400> 118
Tyr Lys Val Gly Phe Phe Lys Arg Asn Leu Lys Glu Lys Met Glu Ala
1 5 10 15
Gly Arg Gly Val Pro Asn Gly Ile Pro Ala Glu Asp Ser Glu Gln Leu
20 25 30
Ala Ser Gly Gln Glu Ala Gly Asp Pro Gly Cys Leu Lys Pro Leu His
35 40 45
Glu Lys Asp Ser Glu Ser Gly Gly Gly Lys Asp
50 55
<210> 119
<211> 182
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LIGHT胞内共刺激信号传导结构域
<400> 119
Leu Gln Leu His Trp Arg Leu Gly Glu Met Val Thr Arg Leu Pro Asp
1 5 10 15
Gly Pro Ala Gly Ser Trp Glu Gln Leu Ile Gln Glu Arg Arg Ser His
20 25 30
Glu Val Asn Pro Ala Ala His Leu Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu Thr
35 40 45
Gly Ser Gly Gly Pro Leu Leu Trp Glu Thr Gln Leu Gly Leu Ala Phe
50 55 60
Leu Arg Gly Leu Ser Tyr His Asp Gly Ala Leu Val Val Thr Lys Ala
65 70 75 80
Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr Ser Lys Val Gln Leu Gly Gly Val Gly Cys
85 90 95
Pro Leu Gly Leu Ala Ser Thr Ile Thr His Gly Leu Tyr Lys Arg Thr
100 105 110
Pro Arg Tyr Pro Glu Glu Leu Glu Leu Leu Val Ser Gln Gln Ser Pro
115 120 125
Cys Gly Arg Ala Thr Ser Ser Ser Arg Val Trp Trp Asp Ser Ser Phe
130 135 140
Leu Gly Gly Val Val His Leu Glu Ala Gly Glu Lys Val Val Val Arg
145 150 155 160
Val Leu Asp Glu Arg Leu Val Arg Leu Arg Asp Gly Thr Arg Ser Tyr
165 170 175
Phe Gly Ala Phe Met Val
180
<210> 120
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> JAML胞内共刺激信号传导结构域
<400> 120
Lys Lys Thr Cys Gly Asn Lys Ser Ser Val Asn Ser Thr Val Leu Val
1 5 10 15
Lys Asn Thr Lys Lys Thr Asn Pro Glu Ile Lys Glu Lys Pro Cys His
20 25 30
Phe Glu Arg Cys Glu Gly Glu Lys His Ile Tyr Ser Pro Ile Ile Val
35 40 45
Arg Glu Val Ile Glu Glu Glu Glu Pro Ser Glu Lys Ser Glu Ala Thr
50 55 60
Tyr Met Thr Met His Pro Val Trp Pro Ser Leu Arg Ser Asp Arg Asn
65 70 75 80
Asn Ser Leu Glu Lys Lys Ser Gly Gly Gly Met Pro Lys Thr Gln Gln
85 90 95
Ala Phe
<210> 121
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD100胞内共刺激信号传导结构域
<400> 121
Tyr Lys Gly Tyr Leu Pro Arg Gln Cys Leu Lys Phe Arg Ser Ala Leu
1 5 10 15
Leu Ile Gly Lys Lys Lys Pro Lys Ser Asp Phe Cys Asp Arg Glu Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Glu Thr Leu Val Glu Pro Gly Ser Phe Ser Gln Gln Asn
35 40 45
Gly Glu His Pro Lys Pro Ala Leu Asp Thr Gly Tyr Glu Thr Glu Gln
50 55 60
Asp Thr Ile Thr Ser Lys Val Pro Thr Asp Arg Glu Asp Ser Gln Arg
65 70 75 80
Ile Asp Asp Leu Ser Ala Arg Asp Lys Pro Phe Asp Val Lys Cys Glu
85 90 95
Leu Lys Phe Ala Asp Ser Asp Ala Asp Gly Asp
100 105
<210> 122
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> ICOS胞内共刺激信号传导结构域
<400> 122
Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn
1 5 10 15
Gly Glu Tyr Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg
20 25 30
Leu Thr Asp Val Thr Leu
35
<210> 123
<211> 296
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> MyD88胞内共刺激信号传导结构域
<400> 123
Met Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Ala Ala Pro Val Ser Ser
1 5 10 15
Thr Ser Ser Leu Pro Leu Ala Ala Leu Asn Met Arg Val Arg Arg Arg
20 25 30
Leu Ser Leu Phe Leu Asn Val Arg Thr Gln Val Ala Ala Asp Trp Thr
35 40 45
Ala Leu Ala Glu Glu Met Asp Phe Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gln Leu
50 55 60
Glu Thr Gln Ala Asp Pro Thr Gly Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gln Gly
65 70 75 80
Arg Pro Gly Ala Ser Val Gly Arg Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu
85 90 95
Gly Arg Asp Asp Val Leu Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ile Glu Glu Asp
100 105 110
Cys Gln Lys Tyr Ile Leu Lys Gln Gln Gln Glu Glu Ala Glu Lys Pro
115 120 125
Leu Gln Val Ala Ala Val Asp Ser Ser Val Pro Arg Thr Ala Glu Leu
130 135 140
Ala Gly Ile Thr Thr Leu Asp Asp Pro Leu Gly His Met Pro Glu Arg
145 150 155 160
Phe Asp Ala Phe Ile Cys Tyr Cys Pro Ser Asp Ile Gln Phe Val Gln
165 170 175
Glu Met Ile Arg Gln Leu Glu Gln Thr Asn Tyr Arg Leu Lys Leu Cys
180 185 190
Val Ser Asp Arg Asp Val Leu Pro Gly Thr Cys Val Trp Ser Ile Ala
195 200 205
Ser Glu Leu Ile Glu Lys Arg Cys Arg Arg Met Val Val Val Val Ser
210 215 220
Asp Asp Tyr Leu Gln Ser Lys Glu Cys Asp Phe Gln Thr Lys Phe Ala
225 230 235 240
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala His Gln Lys Arg Leu Ile Pro Ile Lys
245 250 255
Tyr Lys Ala Met Lys Lys Glu Phe Pro Ser Ile Leu Arg Phe Ile Thr
260 265 270
Val Cys Asp Tyr Thr Asn Pro Cys Thr Lys Ser Trp Phe Trp Thr Arg
275 280 285
Leu Ala Lys Ala Leu Ser Leu Pro
290 295
<210> 124
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD3ζ胞内信号转导结构域
<400> 124
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
50 55 60
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
85 90 95
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
100 105 110
Arg
<210> 125
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD3δ胞内信号转导结构域
<400> 125
Gly His Glu Thr Gly Arg Leu Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Ala Leu
1 5 10 15
Leu Arg Asn Asp Gln Val Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Asp Asp Ala
20 25 30
Gln Tyr Ser His Leu Gly Gly Asn Trp Ala Arg Asn Lys
35 40 45
<210> 126
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD3γ胞内信号转导结构域
<400> 126
Gly Gln Asp Gly Val Arg Gln Ser Arg Ala Ser Asp Lys Gln Thr Leu
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gln Leu Tyr Gln Pro Leu Lys Asp Arg Glu Asp Asp
20 25 30
Gln Tyr Ser His Leu Gln Gly Asn Gln Leu Arg Arg Asn
35 40 45
<210> 127
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD3ε胞内信号转导结构域
<400> 127
Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala
1 5 10 15
Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro
20 25 30
Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser
35 40 45
Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile
50 55
<210> 128
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD79a胞内信号转导结构域
<400> 128
Arg Lys Arg Trp Gln Asn Glu Lys Leu Gly Leu Asp Ala Gly Asp Glu
1 5 10 15
Tyr Glu Asp Glu Asn Leu Tyr Glu Gly Leu Asn Leu Asp Asp Cys Ser
20 25 30
Met Tyr Glu Asp Ile Ser Arg Gly Leu Gln Gly Thr Tyr Gln Asp Val
35 40 45
Gly Ser Leu Asn Ile Gly Asp Val Gln Leu Glu Lys Pro
50 55 60
<210> 129
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD79b胞内信号转导结构域
<400> 129
Leu Asp Lys Asp Asp Ser Lys Ala Gly Met Glu Glu Asp His Thr Tyr
1 5 10 15
Glu Gly Leu Asp Ile Asp Gln Thr Ala Thr Tyr Glu Asp Ile Val Thr
20 25 30
Leu Arg Thr Gly Glu Val Lys Trp Ser Val Gly Glu His Pro Gly Gln
35 40 45
Glu
<210> 130
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> FceRIβ胞内信号转导结构域
<400> 130
Ile Cys Gly Ala Gly Glu Glu Leu Lys Gly Asn Lys Val Pro Glu Asp
1 5 10 15
Arg Val Tyr Glu Glu Leu Asn Ile Tyr Ser Ala Thr Tyr Ser Glu Leu
20 25 30
Glu Asp Pro Gly Glu Met Ser Pro Pro Ile Asp Leu
35 40
<210> 131
<211> 77
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> FcγRIIa胞内信号转导结构域
<400> 131
Cys Arg Lys Lys Arg Ile Ser Ala Asn Ser Thr Asp Pro Val Lys Ala
1 5 10 15
Ala Gln Phe Glu Pro Pro Gly Arg Gln Met Ile Ala Ile Arg Lys Arg
20 25 30
Gln Leu Glu Glu Thr Asn Asn Asp Tyr Glu Thr Ala Asp Gly Gly Tyr
35 40 45
Met Thr Leu Asn Pro Arg Ala Pro Thr Asp Asp Asp Lys Asn Ile Tyr
50 55 60
Leu Thr Leu Pro Pro Asn Asp His Val Asn Ser Asn Asn
65 70 75
<210> 132
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 牛白血病病毒gp30胞内信号转导结构域
<400> 132
Lys Cys Leu Thr Ser Arg Leu Leu Lys Leu Leu Arg Gln Ala Pro His
1 5 10 15
Phe Pro Glu Ile Ser Phe Pro Pro Lys Pro Asp Ser Asp Tyr Gln Ala
20 25 30
Leu Leu Pro Ser Ala Pro Glu Ile Tyr Ser His Leu Ser Pro Thr Lys
35 40 45
Pro Asp Tyr Ile Asn Leu Arg Pro Cys Pro
50 55
<210> 133
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Epstein-Barr病毒(EBV)LMP2A胞内信号转导结构域
<400> 133
Met Gly Ser Leu Glu Met Val Pro Met Gly Ala Gly Pro Pro Ser Pro
1 5 10 15
Gly Gly Asp Pro Asp Gly Tyr Asp Gly Gly Asn Asn Ser Gln Tyr Pro
20 25 30
Ser Ala Ser Gly Ser Ser Gly Asn Thr Pro Thr Pro Pro Asn Asp Glu
35 40 45
Glu Arg Glu Ser Asn Glu Glu Pro Pro Pro Pro Tyr Glu Asp Pro Tyr
50 55 60
Trp Gly Asn Gly Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln
65 70 75 80
Asp Gln Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu
85 90 95
Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr
100 105 110
Glu Glu Ala Gly Arg Gly Ser Met Asn Pro Val
115 120
<210> 134
<211> 260
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 猿免疫缺陷病毒PBj14 Nef胞内信号转导结构域
<400> 134
Gly Gly Val Thr Ser Lys Lys Gln Arg Arg Arg Gly Gly Asn Leu Tyr
1 5 10 15
Glu Arg Leu Leu Gln Ala Arg Gly Glu Thr Tyr Gly Arg Leu Trp Glu
20 25 30
Gly Leu Glu Gly Glu Tyr Ser Gln Ser Gln Asp Ala Ser Gly Lys Gly
35 40 45
Leu Ser Ser Leu Ser Cys Glu Pro Gln Lys Tyr Cys Glu Gly Gln Phe
50 55 60
Met Asn Thr Pro Trp Arg Asn Pro Ala Thr Glu Arg Ala Lys Leu Asp
65 70 75 80
Tyr Arg Gln Gln Asn Met Asp Asp Val Asp Ser Ala Asp Leu Val Gly
85 90 95
Cys Pro Val Ser Pro Arg Val Pro Val Arg Ile Met Thr Tyr Lys Leu
100 105 110
Ala Ile Asp Met Ser His Phe Ile Lys Glu Lys Gly Gly Leu Glu Gly
115 120 125
Ile Tyr Tyr Ser Asp Arg Arg His Lys Ile Leu Asp Leu Tyr Leu Glu
130 135 140
Lys Glu Glu Gly Ile Ile Pro Asp Trp Gln Asn Tyr Thr Ala Gly Pro
145 150 155 160
Gly Ile Arg Tyr Pro Met Phe Phe Gly Trp Leu Trp Lys Leu Val Pro
165 170 175
Val Asn Val Ser Asp Glu Ala Gln Glu Asp Glu Thr His Tyr Leu Met
180 185 190
His Pro Ala Gln Thr Ser Gln Trp Asp Asp Pro Trp Gly Glu Val Leu
195 200 205
Ala Trp Lys Phe Asp Pro Lys Leu Ala Tyr Asn Tyr Lys Ala Phe Val
210 215 220
Glu His Pro Glu Glu Phe Gly Ser Gln Ser Gly Leu Ser Lys Glu Glu
225 230 235 240
Val Gln Arg Arg Leu Thr Ala Arg Gly Leu Leu Lys Met Ala Asp Lys
245 250 255
Lys Lys Thr Ser
260
<210> 135
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD28 铰链区
<400> 135
Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr Asp Asn
1 5 10 15
Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser Arg Glu
20 25 30
Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu Val Cys
35 40 45
Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser Lys Thr
50 55 60
Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr Phe Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys Lys Ile
85 90 95
Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly
100 105 110
Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe
115 120 125
Pro Gly Pro Ser Lys Pro
130
<210> 136
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IgG1铰链区
<400> 136
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
115 120 125
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
130 135 140
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
145 150 155 160
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
165 170 175
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
180 185 190
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
195 200 205
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 137
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IgG4铰链区
<400> 137
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
210 215
<210> 138
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IgD铰链区
<400> 138
Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala
1 5 10 15
Val Gln Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val
20 25 30
Val Gly Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly
35 40 45
Lys Val Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser
50 55 60
Asn Gly Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu
65 70 75 80
Trp Asn Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu
85 90 95
Pro Pro Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Gln Ala Pro Val
100 105 110
Lys Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala
115 120 125
Ser Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu
130 135 140
Leu Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala
145 150 155 160
Pro Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Arg Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp
165 170 175
Ser Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr
180 185 190
Thr Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser
195 200 205
Arg Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His Gly Pro Met Lys
210 215 220
<210> 139
<211> 163
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-1BB铰链区
<400> 139
Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn
1 5 10 15
Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser
20 25 30
Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val
35 40 45
Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp
50 55 60
Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu
65 70 75 80
Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp
85 90 95
Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro
100 105 110
Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro
130 135 140
Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His
145 150 155 160
Ser Pro Gln
<210> 140
<211> 371
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD4铰链区
<400> 140
Lys Lys Val Val Leu Gly Lys Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr Cys
1 5 10 15
Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser Ile Gln Phe His Trp Lys Asn Ser Asn
20 25 30
Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro
35 40 45
Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gln
50 55 60
Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp
65 70 75 80
Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln Leu Leu
85 90 95
Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn Ser Asp Thr His Leu Leu Gln Gly Gln
100 105 110
Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Val
115 120 125
Gln Cys Arg Ser Pro Arg Gly Lys Asn Ile Gln Gly Gly Lys Thr Leu
130 135 140
Ser Val Ser Gln Leu Glu Leu Gln Asp Ser Gly Thr Trp Thr Cys Thr
145 150 155 160
Val Leu Gln Asn Gln Lys Lys Val Glu Phe Lys Ile Asp Ile Val Val
165 170 175
Leu Ala Phe Gln Lys Ala Ser Ser Ile Val Tyr Lys Lys Glu Gly Glu
180 185 190
Gln Val Glu Phe Ser Phe Pro Leu Ala Phe Thr Val Glu Lys Leu Thr
195 200 205
Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp Gln Ala Glu Arg Ala Ser Ser Ser Lys
210 215 220
Ser Trp Ile Thr Phe Asp Leu Lys Asn Lys Glu Val Ser Val Lys Arg
225 230 235 240
Val Thr Gln Asp Pro Lys Leu Gln Met Gly Lys Lys Leu Pro Leu His
245 250 255
Leu Thr Leu Pro Gln Ala Leu Pro Gln Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Leu
260 265 270
Thr Leu Ala Leu Glu Ala Lys Thr Gly Lys Leu His Gln Glu Val Asn
275 280 285
Leu Val Val Met Arg Ala Thr Gln Leu Gln Lys Asn Leu Thr Cys Glu
290 295 300
Val Trp Gly Pro Thr Ser Pro Lys Leu Met Leu Ser Leu Lys Leu Glu
305 310 315 320
Asn Lys Glu Ala Lys Val Ser Lys Arg Glu Lys Ala Val Trp Val Leu
325 330 335
Asn Pro Glu Ala Gly Met Trp Gln Cys Leu Leu Ser Asp Ser Gly Gln
340 345 350
Val Leu Leu Glu Ser Asn Ile Lys Val Leu Pro Thr Trp Ser Thr Pro
355 360 365
Val Gln Pro
370
<210> 141
<211> 172
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD27铰链区
<400> 141
Ala Thr Pro Ala Pro Lys Ser Cys Pro Glu Arg His Tyr Trp Ala Gln
1 5 10 15
Gly Lys Leu Cys Cys Gln Met Cys Glu Pro Gly Thr Phe Leu Val Lys
20 25 30
Asp Cys Asp Gln His Arg Lys Ala Ala Gln Cys Asp Pro Cys Ile Pro
35 40 45
Gly Val Ser Phe Ser Pro Asp His His Thr Arg Pro His Cys Glu Ser
50 55 60
Cys Arg His Cys Asn Ser Gly Leu Leu Val Arg Asn Cys Thr Ile Thr
65 70 75 80
Ala Asn Ala Glu Cys Ala Cys Arg Asn Gly Trp Gln Cys Arg Asp Lys
85 90 95
Glu Cys Thr Glu Cys Asp Pro Leu Pro Asn Pro Ser Leu Thr Ala Arg
100 105 110
Ser Ser Gln Ala Leu Ser Pro His Pro Gln Pro Thr His Leu Pro Tyr
115 120 125
Val Ser Glu Met Leu Glu Ala Arg Thr Ala Gly His Met Gln Thr Leu
130 135 140
Ala Asp Phe Arg Gln Leu Pro Ala Arg Thr Leu Ser Thr His Trp Pro
145 150 155 160
Pro Gln Arg Ser Leu Cys Ser Ser Asp Phe Ile Arg
165 170
<210> 142
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD7铰链区
<400> 142
Ala Gln Glu Val Gln Gln Ser Pro His Cys Thr Thr Val Pro Val Gly
1 5 10 15
Ala Ser Val Asn Ile Thr Cys Ser Thr Ser Gly Gly Leu Arg Gly Ile
20 25 30
Tyr Leu Arg Gln Leu Gly Pro Gln Pro Gln Asp Ile Ile Tyr Tyr Glu
35 40 45
Asp Gly Val Val Pro Thr Thr Asp Arg Arg Phe Arg Gly Arg Ile Asp
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gln Asp Asn Leu Thr Ile Thr Met His Arg Leu Gln
65 70 75 80
Leu Ser Asp Thr Gly Thr Tyr Thr Cys Gln Ala Ile Thr Glu Val Asn
85 90 95
Val Tyr Gly Ser Gly Thr Leu Val Leu Val Thr Glu Glu Gln Ser Gln
100 105 110
Gly Trp His Arg Cys Ser Asp Ala Pro Pro Arg Ala Ser Ala Leu Pro
115 120 125
Ala Pro Pro Thr Gly Ser Ala Leu Pro Asp Pro Gln Thr Ala Ser Ala
130 135 140
Leu Pro Asp Pro Pro Ala Ala Ser Ala Leu Pro
145 150 155
<210> 143
<211> 161
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD8A铰链区
<400> 143
Ser Gln Phe Arg Val Ser Pro Leu Asp Arg Thr Trp Asn Leu Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Glu Leu Lys Cys Gln Val Leu Leu Ser Asn Pro Thr Ser Gly
20 25 30
Cys Ser Trp Leu Phe Gln Pro Arg Gly Ala Ala Ala Ser Pro Thr Phe
35 40 45
Leu Leu Tyr Leu Ser Gln Asn Lys Pro Lys Ala Ala Glu Gly Leu Asp
50 55 60
Thr Gln Arg Phe Ser Gly Lys Arg Leu Gly Asp Thr Phe Val Leu Thr
65 70 75 80
Leu Ser Asp Phe Arg Arg Glu Asn Glu Gly Tyr Tyr Phe Cys Ser Ala
85 90 95
Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val Phe Leu
100 105 110
Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
115 120 125
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg
130 135 140
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys
145 150 155 160
Asp
<210> 144
<211> 147
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD-1铰链区
<400> 144
Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro
1 5 10 15
Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser
20 25 30
Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser
35 40 45
Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser
50 55 60
Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly
65 70 75 80
Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly
85 90 95
Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys
100 105 110
Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val
115 120 125
Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln
130 135 140
Thr Leu Val
145
<210> 145
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> ICOS铰链区
<400> 145
Glu Ile Asn Gly Ser Ala Asn Tyr Glu Met Phe Ile Phe His Asn Gly
1 5 10 15
Gly Val Gln Ile Leu Cys Lys Tyr Pro Asp Ile Val Gln Gln Phe Lys
20 25 30
Met Gln Leu Leu Lys Gly Gly Gln Ile Leu Cys Asp Leu Thr Lys Thr
35 40 45
Lys Gly Ser Gly Asn Thr Val Ser Ile Lys Ser Leu Lys Phe Cys His
50 55 60
Ser Gln Leu Ser Asn Asn Ser Val Ser Phe Phe Leu Tyr Asn Leu Asp
65 70 75 80
His Ser His Ala Asn Tyr Tyr Phe Cys Asn Leu Ser Ile Phe Asp Pro
85 90 95
Pro Pro Phe Lys Val Thr Leu Thr Gly Gly Tyr Leu His Ile Tyr Glu
100 105 110
Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu Lys
115 120
<210> 146
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40铰链区
<400> 146
Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe
1 5 10 15
Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu
20 25 30
Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp
35 40 45
Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn
50 55 60
Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys
65 70 75 80
Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys
85 90 95
Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp
100 105 110
Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly
115 120 125
Glu Phe Cys Val Leu
130
<210> 147
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> NKG2D铰链区
<400> 147
Ile Trp Ser Ala Val Phe Leu Asn Ser Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln
1 5 10 15
Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile
20 25 30
Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp
35 40 45
Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys
50 55 60
Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr
65 70 75 80
His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp
85 90 95
Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met
100 105 110
Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile
115 120 125
Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val
130 135 140
<210> 148
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> NKG2C铰链区
<400> 148
Ile Pro Phe Leu Glu Gln Asn Asn Ser Ser Pro Asn Thr Arg Thr Gln
1 5 10 15
Lys Ala Arg His Cys Gly His Cys Pro Glu Glu Trp Ile Thr Tyr Ser
20 25 30
Asn Ser Cys Tyr Tyr Ile Gly Lys Glu Arg Arg Thr Trp Glu Glu Ser
35 40 45
Leu Leu Ala Cys Thr Ser Lys Asn Ser Ser Leu Leu Ser Ile Asp Asn
50 55 60
Glu Glu Glu Met Lys Phe Leu Ala Ser Ile Leu Pro Ser Ser Trp Ile
65 70 75 80
Gly Val Phe Arg Asn Ser Ser His His Pro Trp Val Thr Ile Asn Gly
85 90 95
Leu Ala Phe Lys His Lys Ile Lys Asp Ser Asp Asn Ala Glu Leu Asn
100 105 110
Cys Ala Val Leu Gln Val Asn Arg Leu Lys Ser Ala Gln Cys Gly Ser
115 120 125
Ser Met Ile Tyr His Cys Lys His Lys Leu
130 135
<210> 149
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> FcεRIγ铰链区
<400> 149
Leu Gly Glu Pro Gln
1 5
<210> 150
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BTLA铰链区
<400> 150
Lys Glu Ser Cys Asp Val Gln Leu Tyr Ile Lys Arg Gln Ser Glu His
1 5 10 15
Ser Ile Leu Ala Gly Asp Pro Phe Glu Leu Glu Cys Pro Val Lys Tyr
20 25 30
Cys Ala Asn Arg Pro His Val Thr Trp Cys Lys Leu Asn Gly Thr Thr
35 40 45
Cys Val Lys Leu Glu Asp Arg Gln Thr Ser Trp Lys Glu Glu Lys Asn
50 55 60
Ile Ser Phe Phe Ile Leu His Phe Glu Pro Val Leu Pro Asn Asp Asn
65 70 75 80
Gly Ser Tyr Arg Cys Ser Ala Asn Phe Gln Ser Asn Leu Ile Glu Ser
85 90 95
His Ser Thr Thr Leu Tyr Val Thr Asp Val Lys Ser Ala Ser Glu Arg
100 105 110
Pro Ser Lys Asp Glu Met Ala Ser Arg Pro Trp Leu Leu Tyr Arg
115 120 125
<210> 151
<211> 137
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GITR铰链区
<400> 151
Gln Arg Pro Thr Gly Gly Pro Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu
1 5 10 15
Gly Thr Gly Thr Asp Ala Arg Cys Cys Arg Val His Thr Thr Arg Cys
20 25 30
Cys Arg Asp Tyr Pro Gly Glu Glu Cys Cys Ser Glu Trp Asp Cys Met
35 40 45
Cys Val Gln Pro Glu Phe His Cys Gly Asp Pro Cys Cys Thr Thr Cys
50 55 60
Arg His His Pro Cys Pro Pro Gly Gln Gly Val Gln Ser Gln Gly Lys
65 70 75 80
Phe Ser Phe Gly Phe Gln Cys Ile Asp Cys Ala Ser Gly Thr Phe Ser
85 90 95
Gly Gly His Glu Gly His Cys Lys Pro Trp Thr Asp Cys Thr Gln Phe
100 105 110
Gly Phe Leu Thr Val Phe Pro Gly Asn Lys Thr His Asn Ala Val Cys
115 120 125
Val Pro Gly Ser Pro Pro Ala Glu Pro
130 135
<210> 152
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> DAP10铰链区
<400> 152
Gln Thr Thr Pro Gly Glu Arg Ser Ser Leu Pro Ala Phe Tyr Pro Gly
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Cys Ser Gly Cys Gly Ser Leu Ser Leu Pro
20 25 30
<210> 153
<211> 275
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TIM1铰链区
<400> 153
Ser Val Lys Val Gly Gly Glu Ala Gly Pro Ser Val Thr Leu Pro Cys
1 5 10 15
His Tyr Ser Gly Ala Val Thr Ser Met Cys Trp Asn Arg Gly Ser Cys
20 25 30
Ser Leu Phe Thr Cys Gln Asn Gly Ile Val Trp Thr Asn Gly Thr His
35 40 45
Val Thr Tyr Arg Lys Asp Thr Arg Tyr Lys Leu Leu Gly Asp Leu Ser
50 55 60
Arg Arg Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu Asn Thr Ala Val Ser Asp Ser
65 70 75 80
Gly Val Tyr Cys Cys Arg Val Glu His Arg Gly Trp Phe Asn Asp Met
85 90 95
Lys Ile Thr Val Ser Leu Glu Ile Val Pro Pro Lys Val Thr Thr Thr
100 105 110
Pro Ile Val Thr Thr Val Pro Thr Val Thr Thr Val Arg Thr Ser Thr
115 120 125
Thr Val Pro Thr Thr Thr Thr Val Pro Met Thr Thr Val Pro Thr Thr
130 135 140
Thr Val Pro Thr Thr Met Ser Ile Pro Thr Thr Thr Thr Val Leu Thr
145 150 155 160
Thr Met Thr Val Ser Thr Thr Thr Ser Val Pro Thr Thr Thr Ser Ile
165 170 175
Pro Thr Thr Thr Ser Val Pro Val Thr Thr Thr Val Ser Thr Phe Val
180 185 190
Pro Pro Met Pro Leu Pro Arg Gln Asn His Glu Pro Val Ala Thr Ser
195 200 205
Pro Ser Ser Pro Gln Pro Ala Glu Thr His Pro Thr Thr Leu Gln Gly
210 215 220
Ala Ile Arg Arg Glu Pro Thr Ser Ser Pro Leu Tyr Ser Tyr Thr Thr
225 230 235 240
Asp Gly Asn Asp Thr Val Thr Glu Ser Ser Asp Gly Leu Trp Asn Asn
245 250 255
Asn Gln Thr Gln Leu Phe Leu Glu His Ser Leu Leu Thr Ala Asn Thr
260 265 270
Thr Lys Gly
275
<210> 154
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SLAM铰链区
<400> 154
Ala Ser Tyr Gly Thr Gly Gly Arg Met Met Asn Cys Pro Lys Ile Leu
1 5 10 15
Arg Gln Leu Gly Ser Lys Val Leu Leu Pro Leu Thr Tyr Glu Arg Ile
20 25 30
Asn Lys Ser Met Asn Lys Ser Ile His Ile Val Val Thr Met Ala Lys
35 40 45
Ser Leu Glu Asn Ser Val Glu Asn Lys Ile Val Ser Leu Asp Pro Ser
50 55 60
Glu Ala Gly Pro Pro Arg Tyr Leu Gly Asp Arg Tyr Lys Phe Tyr Leu
65 70 75 80
Glu Asn Leu Thr Leu Gly Ile Arg Glu Ser Arg Lys Glu Asp Glu Gly
85 90 95
Trp Tyr Leu Met Thr Leu Glu Lys Asn Val Ser Val Gln Arg Phe Cys
100 105 110
Leu Gln Leu Arg Leu Tyr Glu Gln Val Ser Thr Pro Glu Ile Lys Val
115 120 125
Leu Asn Lys Thr Gln Glu Asn Gly Thr Cys Thr Leu Ile Leu Gly Cys
130 135 140
Thr Val Glu Lys Gly Asp His Val Ala Tyr Ser Trp Ser Glu Lys Ala
145 150 155 160
Gly Thr His Pro Leu Asn Pro Ala Asn Ser Ser His Leu Leu Ser Leu
165 170 175
Thr Leu Gly Pro Gln His Ala Asp Asn Ile Tyr Ile Cys Thr Val Ser
180 185 190
Asn Pro Ile Ser Asn Asn Ser Gln Thr Phe Ser Pro Trp Pro Gly Cys
195 200 205
Arg Thr Asp Pro Ser Glu Thr Lys Pro
210 215
<210> 155
<211> 367
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD30铰链区
<400> 155
Phe Pro Gln Asp Arg Pro Phe Glu Asp Thr Cys His Gly Asn Pro Ser
1 5 10 15
His Tyr Tyr Asp Lys Ala Val Arg Arg Cys Cys Tyr Arg Cys Pro Met
20 25 30
Gly Leu Phe Pro Thr Gln Gln Cys Pro Gln Arg Pro Thr Asp Cys Arg
35 40 45
Lys Gln Cys Glu Pro Asp Tyr Tyr Leu Asp Glu Ala Asp Arg Cys Thr
50 55 60
Ala Cys Val Thr Cys Ser Arg Asp Asp Leu Val Glu Lys Thr Pro Cys
65 70 75 80
Ala Trp Asn Ser Ser Arg Val Cys Glu Cys Arg Pro Gly Met Phe Cys
85 90 95
Ser Thr Ser Ala Val Asn Ser Cys Ala Arg Cys Phe Phe His Ser Val
100 105 110
Cys Pro Ala Gly Met Ile Val Lys Phe Pro Gly Thr Ala Gln Lys Asn
115 120 125
Thr Val Cys Glu Pro Ala Ser Pro Gly Val Ser Pro Ala Cys Ala Ser
130 135 140
Pro Glu Asn Cys Lys Glu Pro Ser Ser Gly Thr Ile Pro Gln Ala Lys
145 150 155 160
Pro Thr Pro Val Ser Pro Ala Thr Ser Ser Ala Ser Thr Met Pro Val
165 170 175
Arg Gly Gly Thr Arg Leu Ala Gln Glu Ala Ala Ser Lys Leu Thr Arg
180 185 190
Ala Pro Asp Ser Pro Ser Ser Val Gly Arg Pro Ser Ser Asp Pro Gly
195 200 205
Leu Ser Pro Thr Gln Pro Cys Pro Glu Gly Ser Gly Asp Cys Arg Lys
210 215 220
Gln Cys Glu Pro Asp Tyr Tyr Leu Asp Glu Ala Gly Arg Cys Thr Ala
225 230 235 240
Cys Val Ser Cys Ser Arg Asp Asp Leu Val Glu Lys Thr Pro Cys Ala
245 250 255
Trp Asn Ser Ser Arg Thr Cys Glu Cys Arg Pro Gly Met Ile Cys Ala
260 265 270
Thr Ser Ala Thr Asn Ser Cys Ala Arg Cys Val Pro Tyr Pro Ile Cys
275 280 285
Ala Ala Glu Thr Val Thr Lys Pro Gln Asp Met Ala Glu Lys Asp Thr
290 295 300
Thr Phe Glu Ala Pro Pro Leu Gly Thr Gln Pro Asp Cys Asn Pro Thr
305 310 315 320
Pro Glu Asn Gly Glu Ala Pro Ala Ser Thr Ser Pro Thr Gln Ser Leu
325 330 335
Leu Val Asp Ser Gln Ala Ser Lys Thr Leu Pro Ile Pro Thr Ser Ala
340 345 350
Pro Val Ala Leu Ser Ser Thr Gly Lys Pro Val Leu Asp Ala Gly
355 360 365
<210> 156
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LIGHT铰链区
<400> 156
Met Glu Glu Ser Val Val Arg Pro Ser Val Phe Val Val Asp Gly Gln
1 5 10 15
Thr Asp Ile Pro Phe Thr Arg Leu Gly Arg Ser His Arg Arg Gln Ser
20 25 30
Cys Ser Val Ala Arg
35
<210> 157
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TRAC sg9
<400> 157
agagucucuc agcugguaca 20
<210> 158
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TRAC sg10
<400> 158
ugugcuagac augaggucua 20
<210> 159
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TRAC sg11
<400> 159
cucucagcug guacacggca 20
<210> 160
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TRAC sg12
<400> 160
acacggcagg gucaggguuc 20
<210> 161
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TRAC sg13
<400> 161
agcugguaca cggcaggguc 20
<210> 162
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TRAC sg14
<400> 162
gagaaucaaa aucggugaau 20
<210> 163
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TRAC sg15
<400> 163
gacaccuucu uccccagccc 20
<210> 164
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TRAC sg16
<400> 164
ucucucagcu gguacacggc 20
<210> 165
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TRAC sg17
<400> 165
gcugguacac ggcaggguca 20
<210> 166
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TRAC sg18
<400> 166
aaagucagau uuguugcucc 20
<210> 167
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TRAC sg19
<400> 167
cuggggaaga aggugucuuc 20
<210> 168
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TRAC sg20
<400> 168
uggauuuaga gucucucagc 20
<210> 169
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TRAC sg21
<400> 169
agagcaacag ugcuguggcc 20
<210> 170
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TRAC sg22
<400> 170
cuucaagagc aacagugcug 20
<210> 171
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TRAC sg23
<400> 171
auuuguuuga gaaucaaaau 20
<210> 172
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A02 sg10
<400> 172
cccucguccu gcuacucucg 20
<210> 173
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A02 sg2
<400> 173
cguacuggug guacccgcgg 20
<210> 174
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A02 sg5
<400> 174
cugaccauga agccacccug 20
<210> 175
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A02 sg14
<400> 175
agacucaccg aguggaccug 20
<210> 176
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A02 sg21
<400> 176
ggacccuccu gcucuaucca 20
<210> 177
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A02 sg23
<400> 177
gauguaaucc uugccgucgu 20
<210> 178
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A02 sg26
<400> 178
ccugcgcucu uggaccgcgg 20
<210> 179
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A02 sg29
<400> 179
ccucguccug cuacucucgg 20
<210> 180
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A02 sg30
<400> 180
aacccucguc cugcuacucu 20
<210> 181
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A02 sg31
<400> 181
gaggguucgg ggcgccauga 20
<210> 182
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A02 sg32
<400> 182
ccugcuacuc ucgggggcuc 20
<210> 183
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A02 sg33
<400> 183
cugguuguag uagccgcgca 20
<210> 184
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A02 sg34
<400> 184
uagcccacug cgaugaagcg 20
<210> 185
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A02 sg35
<400> 185
guggaccugg ggacccugcg 20
<210> 186
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A02 sg36
<400> 186
uggacgacac gcaguucgug 20
<210> 187
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A02 sg37
<400> 187
acagacucac cgaguggacc 20
<210> 188
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A02 sg38
<400> 188
gcaggagggu ccggaguauu 20
<210> 189
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A02 sg39
<400> 189
aguauuggga cggggagaca 20
<210> 190
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A02 sg40
<400> 190
cucagaccac caagcacaag 20
<210> 191
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A02 sg41
<400> 191
ccgccgcggu ccaagagcgc 20
<210> 192
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A02 sg42
<400> 192
cucuuggacc gcggcggaca 20
<210> 193
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A02 sg43
<400> 193
ggauuacauc gcccugaaag 20
<210> 194
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A11 sg8-3
<400> 194
cccccgagag uagcaggagg 20
<210> 195
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A11 sg9-3
<400> 195
aguagcagga ggaggguucg 20
<210> 196
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A11 sg10-3
<400> 196
cccuccuccu gcuacucucg 20
<210> 197
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A11 sg11-3
<400> 197
ccccgagagu agcaggagga 20
<210> 198
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A11 sg14-3
<400> 198
agacugaccg aguggaccug 20
<210> 199
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A11 sg16-3
<400> 199
ggggccggag uauugggacc 20
<210> 200
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A11 sg20-3
<400> 200
ccacucgguc agucugugac 20
<210> 201
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A11 sg21-3
<400> 201
uggauagagc aggaggggcc 20
<210> 202
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A11 sg28-3
<400> 202
ugccgucgua ggcguccugc 20
<210> 203
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A11 Rsg2
<400> 203
cguccugccg guacccgcgg 20
<210> 204
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A11 sg21
<400> 204
ggccccuccu gcucuaucca 20
<210> 205
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A24 sg12-2
<400> 205
ccuggcccug acccagaccu 20
<210> 206
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A24 sg13-2
<400> 206
cccuggcccu gacccagacc 20
<210> 207
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A24 sg14-2
<400> 207
agacugaccg agagaaccug 20
<210> 208
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A24 sg16-2
<400> 208
ggggccggag uauugggacg 20
<210> 209
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A24 sg20-2
<400> 209
ucucucgguc agucugugag 20
<210> 210
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A24 sg21-2
<400> 210
ggccccuccu gcucuaucca 20
<210> 211
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A24 sg22-2
<400> 211
aggcguacug gugguacccg 20
<210> 212
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A24 sg25-2
<400> 212
cugagccgcc auguccgccg 20
<210> 213
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A-homo-551
<400> 213
gcggagcagu ugagagccua c 21
<210> 214
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HLA-A-homo-NEG
<400> 214
gcucagauca ccaagcgcaa g 21
<210> 215
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TRAC-homo-375
<400> 215
gaaaguggcc ggguuuaauc u 21
<210> 216
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TRAC-homo-NEG
<400> 216
gaaacagaua cgaaccuaaa c 21

Claims (97)

1.抗原结合多肽，其结合B7H3，其包含抗体重链可变区(VH)，所述VH包含：
i)如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的HCDR1、如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的HCDR2和如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的HCDR3；或
ii)如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的HCDR1、如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的HCDR2和如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的HCDR3。
2.根据权利要求1所述的抗原结合多肽，所述VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29所示。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包括抗体或其抗原结合片段。
4.根据权利要求3所述的抗原结合多肽，所述抗体为人源化抗体或嵌合抗体。
5.根据权利要求3所述的抗原结合多肽，所述抗体为单域抗体(VHH)。
6.嵌合抗原受体(CAR)，其包含B7H3靶向部分，其中所述B7H3靶向部分包含权利要求1-5中任一项所述的抗原结合多肽。
7.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体，其中所述B7H3靶向部分包括VHH。
8.根据权利要求6-7中任一项所述的嵌合抗原受体，其包括跨膜域，所述跨膜域包含源自下组中的一种或多种蛋白的跨膜域：CD8A、CD8B、CD28、CD3ε(CD3e)、4-1BB、
CD4、CD27、CD7、PD-1、TRAC、TRBC、CD3ζ、CTLA-4、LAG-3、CD5、ICOS、OX40、NKG2D、2B4(CD244)、FcεRIγ、BTLA、CD30、GITR、HVEM、DAP10、
CD2、NKG2C、LIGHT、DAP12，CD40L(CD154)、TIM1、CD226、DR3、CD45、
CD80、CD86、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64和SLAM。
9.根据权利要求8所述的嵌合抗原受体，其中所述跨膜域包含源自CD8A的跨膜域。
10.根据权利要求8所述的嵌合抗原受体，其中所述跨膜域的氨基酸序列如SEQ ID NO:42
至SEQ ID NO:90中任一项所示。
11.根据权利要求6-7中任一项所述的嵌合抗原受体，其包括胞内共刺激信号传导结构域，所述胞内共刺激信号传导结构域包含源自下组中的一种或多种蛋白的胞内共刺激信号传导结构域：CD28、CD137、CD27、CD2、CD7、CD8A、CD8B、OX40、CD226、DR3、SLAM、CDS、ICAM-1、NKG2D、NKG2C、B7H3、2B4、FcεRIγ、BTLA、GITR、HVEM、DAP10、DAP12、CD30、CD40、CD40L、TIM1、PD-1、LFA-1、LIGHT、JAML、CD244、CD100、ICOS、CD40和MyD88。
12.根据权利要求11所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内共刺激信号传导结构域源自4-1BB的共刺激信号传导结构域。
13.根据权利要求11所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内共刺激信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:91至SEQ ID NO:123中任一项所示。
14.根据权利要求6-7中任一项所述的嵌合抗原受体，其包括胞内信号转导结构域，所述胞内信号转导结构域包含源自下组中的一种或多种蛋白的胞内信号转导结构域：CD3ζ、
CD3δ、CD3γ、CD3ε、CD79a、CD79b、FceRIγ、FceRIβ、FcγRIIa、牛白血病病毒gp30、Epstein-Barr病毒LMP2A、猿免疫缺陷病毒PBj14 Nef、DAP10、DAP-12和至少包含一个ITAM的结构域。
15.根据权利要求14所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内信号转导结构域包含源自CD3ζ的信号传导结构域。
16.根据权利要求14所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内信号转导结构域的氨基酸序列如SEQID NO:107、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:124至SEQ ID NO:134中任一项所示。
17.根据权利要求8所述的嵌合抗原受体，其在靶向部分和跨膜域之间包括铰链区，所述铰链区包含源自下组中的一种或多种蛋白的铰链区：CD28、IgG1、IgG4、IgD、4-1BB、CD4、CD27、CD7、CD8A、PD-1、ICOS、OX40、NKG2D、NKG2C、FcεRIγ、
BTLA、GITR、DAP10、TIM1、SLAM、CD30和LIGHT。
18.根据权利要求17所述的嵌合抗原受体，所述铰链区包含源自CD8A的铰链区。
19.根据权利要求17所述的嵌合抗原受体，所述铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:135至SEQ ID NO:156中任一项所示。
20.根据权利要求6-7中任一项所述的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体的非靶向部分包含CD8A分子跨膜域、CD8A的铰链区、4-1BB的胞内共刺激信号传导结构域和CD3ζ胞内信号传导结构域。
21.根据权利要求20所述的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体的非靶向部分的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示。
22.根据权利要求20所述的嵌合抗原受体，其还包含信号肽片段，所述信号肽片段的C端与所述靶向部分的N端连接。
23.根据权利要求22所述的嵌合抗原受体，所述信号肽片段包括CD8A信号肽片段。
24.根据权利要求22所述的嵌合抗原受体，所述信号肽片段的氨基酸序列如SEQ IDNO:31所示。
25.根据权利要求6-7中任一项所述的嵌合抗原受体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:32，SEQID NO:33，SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35中任一项所示。
26.一种或多种分离的核酸分子，其编码权利要求1-5中任一项所述的抗原结合多肽，或权利要求6-25中任一项所述的嵌合抗原受体。
27.根据权利要求26中所述的分离的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:36，SEQ ID
NO:37，SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39中任一项所示。
28.载体，其包含权利要求26-27中任一项所述的分离的核酸分子。
29.根据权利要求28所述的载体，其中所述载体是表达载体。
30.根据权利要求29所述的载体，其中所述载体选自DNA载体、RNA载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和逆转录病毒载体。
31.细胞，其i)包含权利要求26-27中任一项所述的分离的核酸分子或权利要求28-30中任一项所述的载体；和/或ii)表达权利要求1-5中任一项所述的抗原结合多肽或权利要求6-25中任一项所述的嵌合抗原受体。
32.免疫效应细胞，其包含权利要求26-27中任一项所述的核酸分子或权利要求28-30中任一项所述的载体，和/或表达权利要求6-25中任一项所述的CAR。
33.根据权利要求32所述的免疫效应细胞，所述的免疫效应细胞包括人细胞。
34.根据权利要求32所述的免疫效应细胞，所述免疫效应细胞包括T细胞、B细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、NKT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。
35.根据权利要求32所述的免疫效应细胞，所述免疫效应细胞包括自体或非自体的免疫效应细胞。
36.根据权利要求32-35中任一项所述的免疫效应细胞，所述的免疫效应细胞包括经修饰的免疫效应细胞。
37.根据权利要求36所述的免疫效应细胞，其中所述经修饰的免疫效应细胞包括降低同种异体细胞治疗引起的免疫排斥反应的细胞。
38.根据权利要求36所述的免疫效应细胞，其中所述经修饰的免疫效应细胞中的T细胞抗原受体(TCR)和主要组织相容性复合体在T细胞中的功能受到抑制。
39.根据权利要求36所述的免疫效应细胞，其中所述修饰包括与免疫排斥相关基因中的一个或多个的表达和/或活性被下调。
40.根据权利要求39所述的免疫效应细胞，其中所述与免疫排斥相关基因选自下组中的一种或多种基因：TRAC、TRBC、HLA-A、HLA-B、B2M和CIITA。
41.根据权利要求40所述的免疫效应细胞，所述经修饰的免疫效应细胞与未经修饰的相应细胞相比，TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性被下调。
42.根据权利要求41所述的免疫效应细胞，其中所述经修饰的免疫效应细胞与未经所述修饰的相应细胞相比，CIITA基因的表达和/或活性未被下调。
43.根据权利要求42所述的免疫效应细胞，其中所述经修饰的免疫效应细胞与未经所述修饰的相应细胞相比，B2M基因的表达和/或活性未被下调。
44.根据权利要求40所述的免疫效应细胞，其中所述经修饰的免疫效应细胞与相应的野生型细胞相比，TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性被下调。
45.根据权利要求41所述的免疫效应细胞，其中所述经修饰的免疫效应细胞与相应的野生型细胞相比，B2M基因的表达和/或活性未被下调。
46.根据权利要求42所述的免疫效应细胞，其中所述经修饰的免疫效应细胞与相应的野生型细胞相比，CIITA基因的表达和/或活性未被下调。
47.根据权利要求40所述的免疫效应细胞，其中所述基因的表达水平和/或活性被下调包括使所述基因编码的蛋白质产物的表达和/或活性被下调。
48.根据权利要求47所述的免疫效应细胞，其中所述修饰包括：基因敲除、基因突变和/或基因沉默。
49.根据权利要求48所述的免疫效应细胞，所述修饰包括所述免疫效应细胞中两个TRAC等位基因中的任意一个被敲除并且两个HLA-A等位基因中的任意一个被敲除。
50.根据权利要求48所述的免疫效应细胞，所述修饰包括所述免疫效应细胞中两个TRAC等位基因被敲除并且两个HLA-A等位基因中的任意一个被敲除。
51.根据权利要求48所述的免疫效应细胞，所述修饰包括所述免疫效应细胞中TRAC基因外显子被敲除并且HLA-A基因外显子被敲除。
52.根据权利要求37-51中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用一种或多种选自下组的物质：反义RNA、siRNA、shRNA和CRISPR/Cas9系统。
53.根据权利要求52所述的免疫效应细胞，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用CRISPR/Cas9系统。
54.根据权利要求53所述的免疫效应细胞，其中所述修饰还包括向所述免疫效应细胞施用靶向所述TRAC基因外显子部分的sgRNA。
55.根据权利要求54所述的免疫效应细胞，其中所述靶向所述TRAC基因外显子部分的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:157至SEQ ID NO:171中任一项所示。
56.根据权利要求53所述的免疫效应细胞，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用靶向所述HLA-A基因外显子部分的sgRNA。
57.根据权利要求56所述的免疫效应细胞，其中所述靶向所述HLA-A基因外显子部分的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:172至SEQ ID NO:212中任一项所示。
58.根据权利要求53-57中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述修饰还包括向所述细胞施用Cas酶。
59.根据权利要求58所述的免疫效应细胞，其中Cas酶包括Cas9蛋白。
60.根据权利要求52所述的免疫效应细胞，其中所述反义RNA的核苷酸序列如SEQ IDNO:213至SEQ ID NO:216中任一项所示。
61.根据权利要求32-35中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述免疫效应细胞为HLA-B纯合子细胞。
62.根据权利要求61所述的免疫效应细胞，其中所述HLA-B纯合子包括HLA-B*40纯合子，HLA-B*15纯合子，HLA-B*46纯合子，HLA-B*13纯合子，HLA-B*51纯合子，HLA-B*58纯合子，HLA-B*07纯合子，HLA-B*35纯合子，HLA-B*44纯合子，HLA-B*52纯合子，
HLA-B*57纯合子，HLA-B*54纯合子，HLA-B*55纯合子。
63.根据权利要求32-35中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述免疫效应细胞为HLA-A纯合子或杂合子细胞。
64.根据权利要求63所述的免疫效应细胞，其中所述HLA-A纯合子或杂合子包括HLA-
A*02纯合子，HLA-A*11纯合子，HLA-A*02/A*11杂合子或HLA-A*24纯合子。
65.一种制备免疫效应细胞的方法，其包括向免疫效应细胞中引入权利要求26-27中任一项所述的核酸分子或权利要求28-30中任一项所述的载体。
66.根据权利要求65所述的方法，其还包括：在向免疫效应细胞中引入权利要求26-27中任一项所述的核酸分子或权利要求28-30中任一项所述的载体之前/之后，修饰所述免疫效应细胞，所述修饰包括与免疫排斥相关基因中的一个或多个的表达和/或活性被下调。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述与免疫排斥相关基因选自下组中的一种或多种基因：TRAC、TRBC、HLA-A、HLA-B、B2M和CIITA。
68.根据权利要求67所述的方法，与未经所述修饰的相应细胞中相应基因的表达和/或活性相比，下调所述免疫效应细胞中TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性。
69.根据权利要求68所述的方法，与未经所述修饰的相应细胞中相应基因的表达和/或活性相比，所述免疫效应细胞中CIITA基因的表达和/或活性未被下调。
70.根据权利要求69所述的方法，与未经所述修饰的相应细胞中相应基因的表达和/或活性相比，所述免疫效应细胞中B2M基因的表达和/或活性未被下调。
71.根据权利要求67所述的方法，与相应的野生型细胞相比，所述免疫效应细胞的TRAC基因和HLA-A基因的表达和/或活性被下调。
72.根据权利要求68所述的方法，与相应的野生型细胞相比，所述免疫效应细胞的CIITA基因的表达和/或活性未被下调。
73.根据权利要求69所述的方法，与相应的野生型细胞相比，所述免疫效应细胞的B2M基因的表达和/或活性未被下调。
74.根据权利要求66所述的方法，其中所述基因的表达水平和/或活性被下调包括使所述基因编码的蛋白质产物的表达和/或活性被下调。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述修饰包括：基因敲除、基因突变和/或基因沉默。
76.根据权利要求75所述的方法，所述修饰包括所述免疫效应细胞中两个TRAC等位基因中的任意一个被敲除并且两个HLA-A等位基因中的任意一个被敲除。
77.根据权利要求75所述的方法，所述修饰包括所述免疫细胞中两个TRAC等位基因被敲除并且两个HLA-A等位基因中的任意一个被敲除。
78.根据权利要求75所述的方法，所述修饰包括所述免疫细胞中TRAC基因外显子被敲除并且HLA-A基因外显子被敲除。
79.根据权利要求66-78中任一项所述的方法，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用一种或多种选自下组的物质：反义RNA、siRNA、shRNA和CRISPR/Cas9系统。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用CRISPR/Cas9系统。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用靶向所述TRAC基因外显子部分的sgRNA。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述靶向所述TRAC基因外显子部分的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:157至SEQ ID NO:171中任一项所示。
83.根据权利要求80所述的方法，其中所述修饰包括向所述免疫效应细胞施用靶向所述HLA-A基因外显子部分的sgRNA。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述靶向所述HLA-A基因外显子部分的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:172至SEQ ID NO:212中任一项所示。
85.根据权利要求80-84中任一项所述的方法，其中所述修饰还包括向所述细胞施用Cas酶。
86.根据权利要求85所述的方法，其中Cas酶包括Cas9蛋白。
87.根据权利要求79所述的方法，其中所述反义RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:213至SEQ ID NO:216中任一项所示。
88.根据权利要求65-78中任一项所述的方法，其中所述免疫效应细胞包括人细胞。
89.根据权利要求65-78中任一项所述的方法，所述免疫效应细胞包括T细胞、B细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、NKT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。
90.根据权利要求65-78中任一项所述的方法，所述免疫效应细胞包括自体或非自体的免疫效应细胞。
91.根据权利要求65-78中任一项所述的方法，其中所述细胞为HLA-B纯合子细胞。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述HLA-B纯合子包括HLA-B*40纯合子，HLA-B*15纯合子，HLA-B*46纯合子，HLA-B*13纯合子，HLA-B*51纯合子，HLA-B*58纯合子，HLA-B*07纯合子，HLA-B*35纯合子，HLA-B*44纯合子，HLA-B*52纯合子，HLA-B*57纯合子，HLA-B*54纯合子，HLA-B*55纯合子。
93.根据权利要求65-78中任一项所述的方法，其中所述细胞为HLA-A纯合子或杂合子细胞。
94.根据权利要求93所述的方法，其中所述HLA-A纯合子或杂合子包括HLA-A*02纯合子，HLA-A*11纯合子，HLA-A*02/A*11杂合子或HLA-A*24纯合子。
95.权利要求6-25中任一项所述的嵌合抗原受体，权利要求26-27中任一项所述的分离的核酸分子，权利要求28-30中任一项所述的载体，权利要求31所述的细胞，或权利要求32-64中任一项所述的免疫效应细胞在制备CAR-T细胞中的应用。
96.药物组合物，其包含权利要求1-5中任一项所述的抗原结合多肽，权利要求6-25中任一项所述的嵌合抗原受体，权利要求26-27中任一项所述的分离的核酸分子，权利要求28-30中任一项所述的载体，权利要求31所述的细胞，和/或权利要求32-64中任一项所述的免疫效应细胞，以及药学上可接受的载剂。
97.权利要求1-5中任一项所述的抗原结合多肽，权利要求6-25中任一项所述的嵌合抗原受体，权利要求26-27中任一项所述的分离的核酸分子，权利要求28-30中任一项所述的载体，权利要求31所述的细胞，权利要求32-64中任一项所述的免疫效应细胞，和/或权利要求96中所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗癌症，所述癌症为胶质瘤、胰腺癌或淋巴瘤。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009068631A1 (en) * 2007-11-27 2009-06-04 Ablynx N.V. Method for obtaining polypeptide constructs comprising two or more single domain antibodies
WO2020076970A1 (en) * 2018-10-11 2020-04-16 Inhibrx, Inc. B7h3 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2002229639A1 (en) * 2000-12-13 2002-06-24 De Haard, Johannes Joseph Wilhelmus Camelidae antibody arrays
US9828428B2 (en) 2012-11-07 2017-11-28 Pfizer Inc. Anti-IL-13 receptor alpha 2 antibodies and antibody-drug conjugates
CA3149543A1 (en) 2019-08-27 2021-03-04 Donald M. O'rourke Synthetic cars to treat il13r.alpha.2 positive human and canine tumors
EP4031250A1 (en) * 2019-10-22 2022-07-27 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services High affinity nanobodies targeting b7h3 (cd276) for treating multiple solid tumors
CA3163304A1 (en) * 2020-01-02 2021-07-08 Xiaoyun SHANG Modified immune effector cell and preparation method therefor

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009068631A1 (en) * 2007-11-27 2009-06-04 Ablynx N.V. Method for obtaining polypeptide constructs comprising two or more single domain antibodies
WO2020076970A1 (en) * 2018-10-11 2020-04-16 Inhibrx, Inc. B7h3 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof

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