JP2023516008A - キメラ抗原受容体発現細胞を作製する方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、キメラ抗原受容体(CAR)を発現する免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞、NK細胞)を作製する方法及びそうした方法によって生成される組成物を提供する。
Description
関連出願
本願は、2020年2月27日に提出された米国仮特許出願第62/982,665号明細書(その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる)に対する優先権を主張する。
本願は、2020年2月27日に提出された米国仮特許出願第62/982,665号明細書(その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる)に対する優先権を主張する。
配列表
本願は、ASCIIフォーマットで電子出願されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。前記ASCIIコピーは、2021年2月25日に作成され、名称がN2067-7170WO_SL.txtであり、サイズが653,029バイトである。
本願は、ASCIIフォーマットで電子出願されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。前記ASCIIコピーは、2021年2月25日に作成され、名称がN2067-7170WO_SL.txtであり、サイズが653,029バイトである。
本発明は、概して、キメラ抗原受容体(CAR)を発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞又はNK細胞)を作製する方法及びそれを含む組成物に関する。
T細胞、特にキメラ抗原受容体(CAR)を形質導入したT細胞での養子細胞移入(ACT)療法は、いくつかの血液癌の試験で有望性が示されている。遺伝子改変T細胞の製造は、現在、複雑なプロセスである。CAR発現細胞療法製品の生産を改善し、製品の品質を高めると共に製品の治療効果を最大化する方法及びプロセスが必要とされている。
本開示は、CARを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞又はNK細胞)を作製する方法及びそうした方法を使用して生成される組成物に関する。また、対象の疾患、例えば癌を処置するためにそのような組成物を使用する方法も開示される。
いくつかの態様では、本開示は、キメラ抗原受容体(CAR)を発現する細胞(例えば、T細胞)の集団を作製する方法を提供する。この方法は、(i)細胞(例えば、T細胞、例えば凍結された又は新鮮な白血球アフェレーシス産物から単離されたT細胞)の集団を、(A)抗CD3結合ドメイン、及び(B)共刺激分子結合ドメイン(例えば、抗CD2結合ドメイン又は抗CD28結合ドメイン)を含む多重特異性結合分子と接触させる(例えば、結合させる)ステップ;(ii)細胞(例えば、T細胞)の集団を、CARをコードする核酸分子(例えば、DNA又はRNA分子)と接触させ、それにより核酸分子を含む細胞(例えば、T細胞)の集団を提供するステップ、及び(iii)保存(例えば、凍結保存培地中で細胞の集団を再製剤化すること)又は投与のために細胞(例えば、T細胞)の集団を採取するステップを含み、(a)ステップ(ii)は、ステップ(i)と一緒に、又はステップ(i)の開始後の20時間以内、例えばステップ(i)の開始後の12、13、14、15、16、17若しくは18時間以内、例えばステップ(i)の開始後の18時間以内に実施され、及びステップ(iii)は、ステップ(i)の開始後の26時間以内、例えばステップ(i)の開始後の22、23、24又は25時間以内、例えばステップ(i)の開始後の24時間以内に実施されるか;(b)ステップ(ii)は、ステップ(i)と一緒に、又はステップ(i)の開始後の20時間以内、例えばステップ(i)の開始後の12、13、14、15、16、17若しくは18時間以内、例えばステップ(i)の開始後の18時間以内に実施され、及びステップ(iii)は、ステップ(ii)の開始後の30、36又は48時間以内、例えばステップ(ii)の開始後の22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48時間以内に実施されるか;又は(c)ステップ(iii)からの細胞の集団は、例えば、ステップ(i)の開始時の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて増殖されないか、又は5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35若しくは40%以下、例えば10%以下だけ増殖される。一部の実施形態では、ステップ(ii)における核酸分子は、DNA分子である。一部の実施形態では、ステップ(ii)における核酸分子は、RNA分子である。一部の実施形態では、ステップ(ii)における核酸分子は、ウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はレトロウイルスベクターから選択されるウイルスベクター上にある。一部の実施形態では、ステップ(ii)における核酸分子は、非ウイルスベクター上にある。一部の実施形態では、ステップ(ii)における核酸分子は、プラスミド上にある。一部の実施形態では、ステップ(ii)における核酸分子は、いずれのベクター上にも存在しない。一部の実施形態では、ステップ(ii)は、CARをコードする核酸分子を含むウイルスベクターで細胞(例えば、T細胞)の集団を形質導入することを含む。
いくつかの態様では、本開示は、(A)抗CD3結合ドメイン、及び(B)共刺激分子結合ドメイン(例えば、抗CD2結合ドメイン又は抗CD28結合ドメイン)を含む多重特異性結合分子を提供する。
一部の実施形態では、抗CD3結合ドメイン、例えば抗CD3scFvは、共刺激分子結合ドメイン、例えば抗CD2Fab若しくは抗CD28FabのN末端に位置するか;又は抗CD3結合ドメイン、例えば抗CD3scFvは、共刺激分子結合ドメイン、例えば抗CD2Fab若しくは抗CD28FabのC末端に位置し、任意選択で、Fc領域は、抗CD3結合ドメインと共刺激分子結合ドメインとの間に位置するか;又は多重特異性結合分子は、CH2を含み、及び抗CD3結合ドメインは、CH2のN末端に位置する。
本明細書の組成物及び方法のいくつかの実施形態において、多重特異性結合分子は、(i)N末端からC末端に、抗CD3結合ドメインのVH、抗CD3結合ドメインのVL、共刺激分子結合ドメインのVH、CH1、CH2及びCH3を含む第1のポリペプチド;及び(ii)N末端からC末端に、共刺激分子結合ドメインのVL及びCLを含む第2のポリペプチドを含む。一部の実施形態では、多重特異性結合分子は、(i)N末端からC末端に、共刺激分子結合ドメインのVH、CH1、CH2、CH3、抗CD3結合ドメインのVH及び抗CD3結合ドメインのVLを含む第1のポリペプチド;及び(ii)N末端からC末端に、共刺激分子結合ドメインのVL及びCLを含む第2のポリペプチドを含む。一部の実施形態では、多重特異性結合分子は、(i)N末端からC末端に、共刺激分子結合ドメインのVH、CH1、抗CD3結合ドメインのVH、抗CD3結合ドメインのVL、CH2及びCH3を含む第1のポリペプチド;及び(ii)N末端からC末端に、共刺激分子結合ドメインのVL及びCLを含む第2のポリペプチドを含む。一部の実施形態では、抗CD3結合ドメインは、scFvを含み、及び共刺激分子結合ドメインは、Fabフラグメントの一部である。
一部の実施形態では、抗CD3結合ドメインは、(i)表27の抗CD3抗体分子(例えば、抗CD3(1)、抗CD3(2)、抗CD3(3)又は抗CD3(4))の重鎖相補性決定領域1(HCDR1)、HCDR2及びHCDR3を含む可変重鎖領域(VH)並びに軽鎖相補性決定領域1(LCDR1)、LCDR2及びLCDR3を含む軽鎖可変領域(VL);及び/又は(ii)表27に提供される抗CD3抗体分子(例えば、抗CD3(1)、抗CD3(2)、抗CD3(3)又は抗CD3(4))のVH及び/若しくはVL領域のいずれか1つのアミノ酸配列又はそれと少なくとも95%同一のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、共刺激分子結合ドメインは、抗CD2抗原結合ドメインである。一部の実施形態では、抗CD2抗原結合ドメインは、(i)表27の抗CD2抗体分子(例えば、抗CD2(1))のHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含むVH並びにLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含むVL;及び/又は(ii)表27に提供される抗CD2抗体分子(例えば、抗CD2(1))のVH及び/若しくはVL領域のいずれか1つのアミノ酸配列又はそれと少なくとも95%同一のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、共刺激分子結合ドメインは、抗CD28抗原結合ドメインである。一部の実施形態では、抗CD28抗原結合ドメインは、(i)表27の抗CD28抗体分子(例えば、抗CD28(1)又は抗CD28(2))のHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含むVH並びにLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含むVL;及び/又は(ii)表27に提供される抗CD28抗体分子(例えば、抗CD28(1)又は抗CD28(2))のVH及び/若しくはVL領域のいずれか1つのアミノ酸配列又はそれと少なくとも95%同一のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、抗CD3結合ドメインは、scFvを含む。一部の実施形態では、抗CD3結合ドメインは、ペプチドリンカー、例えばグリシン-セリンリンカー、例えば(G4S)4リンカーによってVLに連結されたVHを含む。一部の実施形態では、抗CD3結合ドメインは、VH及びVLを含み、VHは、VLのN末端である。
一部の実施形態では、共刺激分子結合ドメインは、Fabフラグメントの一部、例えばFcドメインを含むポリペプチド配列の一部であるFabフラグメントであり、任意選択で、Fcドメインは、表28に提供されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含む。
一部の実施形態では、抗CD3結合ドメインは、共刺激分子結合ドメインのN末端に位置する。一部の実施形態では、抗CD3結合ドメインは、ペプチドリンカー、例えばグリシン-セリンリンカー、例えば(G4S)4リンカーによって共刺激分子結合ドメインに連結されている。
一部の実施形態では、抗CD3結合ドメインは、共刺激分子結合ドメインのC末端に位置し、任意選択で、Fc領域は、抗CD3結合ドメインと共刺激分子結合ドメインとの間に位置する。
一部の実施形態では、多重特異性結合分子は、CH1を含む。一部の実施形態では、CH1は、共刺激分子結合ドメインのVHのC末端である。
一部の実施形態では、多重特異性結合分子は、CH2及びCH3の一方又は両方を含む。
一部の実施形態では、抗CD3結合ドメインは、ペプチドリンカー、例えばグリシン-セリンリンカー、例えば(G4S)4リンカーによってCH3に連結されている。一部の実施形態では、抗CD3結合ドメインは、CH1のC末端に位置する。一部の実施形態では、構築物は、CH2を含み、抗CD3結合ドメインは、CH2のN末端に位置する。一部の実施形態では、抗CD3結合ドメインは、ペプチドリンカー、例えばグリシン-セリンリンカー、例えば(G4S)2リンカーによってCH1に連結されている。一部の実施形態では、抗CD3結合ドメインは、ペプチドリンカー、例えばグリシン-セリンリンカー例えば、(G4S)4リンカーによってCH2に連結されている。
一部の実施形態では、多重特異性結合分子は、CLをさらに含む。一部の実施形態では、CLは、共刺激分子結合ドメインのVLのC末端である。一部の実施形態では、CLドメインは、例えば、ジスルフィド架橋を介してCH1に連結されている。
一部の実施形態では、多重特異性結合分子は、(i)表28に提供されるいずれかの重鎖のアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列;及び/又は(ii)表28に提供されるいずれかの軽鎖のアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、本発明は、キメラ抗原受容体(CAR)を発現する細胞(例えば、T細胞)の集団を作製する方法を特徴とし、本方法は、(i)細胞(例えば、T細胞、例えば凍結された又は新鮮な白血球アフェレーシス産物から単離されたT細胞)の集団を、(A)CD3/TCR複合体を刺激する薬剤、及び/又は(B)細胞の表面上の共刺激分子及び/又は増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させる(例えば、結合させる)ステップ;(ii)細胞(例えば、T細胞)の集団を、CARをコードする核酸分子(例えば、DNA又はRNA分子)と接触させ、それにより核酸分子を含む細胞(例えば、T細胞)の集団を提供するステップ、及び(iii)保存(例えば、凍結保存培地中の細胞の集団を再製剤化すること)又は投与のために細胞(例えば、T細胞)の集団を採取するステップを含み、(a)ステップ(ii)は、ステップ(i)と一緒に、又はステップ(i)の開始後の20時間以内、例えばステップ(i)の開始後の12、13、14、15、16、17若しくは18時間以内、例えばステップ(i)の開始後の18時間以内に実施され、及びステップ(iii)は、ステップ(i)の開始後の26時間以内、例えばステップ(i)の開始後の22、23、24又は25時間以内、例えばステップ(i)の開始後の24時間以内に実施されるか;(b)ステップ(ii)は、ステップ(i)と一緒に、又はステップ(i)の開始後の20時間以内、例えばステップ(i)の開始後の12、13、14、15、16、17若しくは18時間以内、例えばステップ(i)の開始後の18時間以内に実施され、及びステップ(iii)は、ステップ(ii)の開始後の30、36又は48時間以内、例えばステップ(ii)の開始後の22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48時間以内に実施されるか;又は(c)ステップ(iii)からの細胞の集団は、例えば、ステップ(i)の開始時の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて増殖されないか、又は5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35若しくは40%以下、例えば10%以下だけ増殖される。一部の実施形態では、ステップ(ii)における核酸分子は、DNA分子である。一部の実施形態では、ステップ(ii)における核酸分子は、RNA分子である。一部の実施形態では、ステップ(ii)における核酸分子は、ウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はレトロウイルスベクターから選択されるウイルスベクター上にある。一部の実施形態では、ステップ(ii)における核酸分子は、非ウイルスベクター上にある。一部の実施形態では、ステップ(ii)における核酸分子は、プラスミド上にある。一部の実施形態では、ステップ(ii)における核酸分子は、いずれのベクター上にもない。一部の実施形態では、ステップ(ii)は、細胞(例えば、T細胞)の集団を、CARをコードする核酸分子を含むウイルスベクターで形質導入することを含む。一部の実施形態では、ステップ(ii)は、細胞(例えば、T細胞)の集団を、(A)Tet2標的配列を含むセンス鎖、及び(B)センス鎖と全部若しくは一部が相補的なアンチセンス鎖を含む、Tet2を標的とするshRNA又はshRNAをコードするベクターと接触させることをさらに含む。一部の実施形態では、センス鎖は、Tet2標的配列GGGTAAGCCAAGAAAGAAA(配列番号418)を含む。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、その逆相補鎖、即ちTTTCTTTCTTGGCTTACCC(配列番号419)を含む。一部の実施形態では、shRNAをコードするベクターは、CARをコードするベクターと同一であるか又は異なる。一部の実施形態では、shRNA配列をコードするベクターは、プロモーター(限定されないが、U6プロモーターなど)、Tet2標的配列を含むセンス鎖、ループ、センス鎖と全部又は一部が相補的なアンチセンス鎖及び任意選択でポリTテール、例えば表29の配列を含む。一部の実施形態では、ステップ(ii)は、ステップ(i)と一緒に実施される。一部の実施形態では、ステップ(ii)は、ステップ(i)の開始後の20時間以内に実施される。一部の実施形態では、ステップ(ii)は、ステップ(i)の開始後の12、13、14、15、16、17又は18時間以内に実施される。一部の実施形態では、ステップ(ii)は、ステップ(i)の開始後の18時間以内に実施される。一部の実施形態では、ステップ(iii)は、ステップ(i)の開始後の26時間以内に実施される。一部の実施形態では、ステップ(iii)は、ステップ(i)の開始後の22、23、24又は25時間以内に実施される。一部の実施形態では、ステップ(iii)は、ステップ(i)の開始後の24時間以内に実施される。一部の実施形態では、ステップ(iii)は、ステップ(ii)の開始後の30、36又は48時間以内に実施される。一部の実施形態では、ステップ(iii)は、ステップ(ii)の開始後の22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48時間以内に実施される。
一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団は、増殖されない。一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団は、例えば、ステップ(i)の開始時の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35又は40%以下だけ増殖される。一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団は、例えば、ステップ(i)の開始時の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて10%以下だけ増殖される。
一部の実施形態では、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤は、CD3を刺激する薬剤である。一部の実施形態では、共刺激分子及び/又は増殖因子受容体を刺激する薬剤は、CD28、ICOS、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD226又はそれらの任意の組み合わせを刺激する薬剤である。一部の実施形態では、共刺激分子及び/又は増殖因子受容体を刺激する薬剤は、CD28を刺激する薬剤である。一部の実施形態では、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤は、抗体(例えば、単一ドメイン抗体(例えば、重鎖可変ドメイン抗体)、ペプチボディ、Fabフラグメント若しくはscFv)、小分子又はリガンド(例えば、天然に存在するリガンド、組換えリガンド若しくはキメラリガンド)から選択される。一部の実施形態では、共刺激分子及び/又は増殖因子受容体を刺激する薬剤は、抗体(例えば、単一ドメイン抗体(例えば、重鎖可変ドメイン抗体)、ペプチボディ、Fabフラグメント若しくはscFv)、小分子又はリガンド(例えば、天然に存在するリガンド、組換えリガンド若しくはキメラリガンド)から選択される。一部の実施形態では、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤は、ビーズを含まない。一部の実施形態では、共刺激分子及び/又は増殖因子受容体を刺激する薬剤は、ビーズを含まない。一部の実施形態では、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤は、抗CD3抗体を含む。一部の実施形態では、共刺激分子及び/又は増殖因子受容体を刺激する薬剤は、抗CD28抗体を含む。一部の実施形態では、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤は、コロイドポリマーナノマトリックスに共有結合された抗CD28抗体を含む。一部の実施形態では、共刺激分子及び/又は増殖因子受容体を刺激する薬剤は、CD28、ICOS、CD27、CD25、4-1BB、IL6RA、IL6RB又はCD2を刺激する薬剤である。一部の実施形態では、共刺激分子及び/又は増殖因子受容体を刺激する薬剤は、CD28、ICOS、CD27、CD25、4-1BB、IL6RB及び/又はCD2抗原結合ドメイン、例えば、限定されないが、抗CD28、抗ICOS、抗CD27、抗CD25、抗4-1BB、抗IL6RA、抗IL6RB若しくは抗CD2抗体又は1つ以上のCDR、重鎖及び/若しくは軽鎖を含むそれらの抗体フラグメント、例えば、限定はしないが、表27に提供される抗CD28、抗ICOS、抗CD27、抗CD25、抗4-1BB、抗IL6RA、抗IL6RB若しくは抗CD2抗体の1つ以上を含む。一部の実施形態では、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤と、共刺激分子及び/又は増殖因子受容体を刺激する薬剤は、T細胞TransAct(商標)を含む。一部の実施形態では、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤と、共刺激分子及び/又は増殖因子受容体を刺激する薬剤は、多重特異性結合分子に含まれる。一部の実施形態では、多重特異性結合分子は、CD3抗原結合ドメインと、CD28又はCD2抗原結合ドメインを含む。一部の実施形態では、多重特異性結合分子は、1つ以上の重鎖及び/又は軽鎖、例えば、限定はされないが、表28に提供される重鎖及び/又は軽鎖を含む。一部の実施形態では、多重特異性結合分子は、二重特異性抗体を含む。一部の実施形態では、二重特異性抗体は、図50Aに提供されるスキームのいずれか1つに立体配置される。一部の実施形態では、二重特異性抗体は、一価又は二価である。一部の実施形態では、二重特異性抗体は、Fc領域を含む。一部の実施形態では、二重特異性抗体のFc領域は、サイレンシングされる。一部の実施形態では、多重特異性結合分子は、複数の二重特異性抗体を含む。一部の実施形態では、複数の二重特異性抗体の1つ以上は一価である。一部の実施形態では、複数の二重特異性抗体の1つ以上は、Fc領域を含む。一部の実施形態では、複数の二重特異性抗体の1つ以上のFc領域は、サイレンシングされる。一部の実施形態では、複数の二重特異性抗体の1つ以上は、多量体に一緒にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、多量体は、図50Bに提供されるスキームのいずれか1つにおいて形成される。
一部の実施形態では、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤は、ハイドロゲルを含まない。一部の実施形態では、共刺激分子及び/又は増殖因子受容体を刺激する薬剤は、ハイドロゲルを含まない。一部の実施形態では、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤は、アルギン酸塩を含まない。一部の実施形態では、共刺激分子及び/又は増殖因子受容体を刺激する薬剤は、アルギン酸塩を含まない。
一部の実施形態では、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤は、ハイドロゲルを含む。一部の実施形態では、共刺激分子及び/又は増殖因子受容体を刺激する薬剤は、ハイドロゲルを含む。一部の実施形態では、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤は、アルギン酸塩を含む。一部の実施形態では、共刺激分子及び/又は増殖因子受容体を刺激する薬剤は、アルギン酸塩を含む。一部の実施形態では、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤又は共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤は、Quad Technologies製のMagCloudz(商標)を含む。
一部の実施形態では、ステップ(i)は、ステップ(iii)からの細胞の集団中のCAR発現細胞のパーセンテージを増加させ、例えば、ステップ(iii)からの細胞の集団は、ステップ(i)なしである以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、CAR発現細胞のより高いパーセンテージ(例えば、少なくとも10、20、30、40、50又は60%高い)を示す。
一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージは、ステップ(i)の開始時の細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+細胞のパーセンテージと同じである。一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージは、ステップ(i)の開始時の細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+細胞のパーセンテージと3、4、5、6、7、8、9、10、11又は12%以下だけ異なる。一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージは、ステップ(i)の開始時の細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+細胞のパーセンテージと5又は10%以下だけ異なる。
一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団は、ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、ナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のより高いパーセンテージ(例えば、少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35又は40%高い)を示す。一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団は、ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、ナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のより高いパーセンテージ(例えば、少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35又は40%高い)を示す。
一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCD95+セントラルメモリーT細胞のパーセンテージは、ステップ(i)の開始時の細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCD95+セントラルメモリーT細胞のパーセンテージと同じである。一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCD95+セントラルメモリーT細胞のパーセンテージは、ステップ(i)の開始時の細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCD95+セントラルメモリーT細胞のパーセンテージと3、4、5、6、7、8、9、10、11又は12%以下だけ異なる。一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCD95+セントラルメモリーT細胞のパーセンテージは、ステップ(i)の開始時の細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCD95+セントラルメモリーT細胞のパーセンテージと5又は10%以下だけ異なる。
一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団は、ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、セントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCD95+セントラルメモリーT細胞のより低いパーセンテージ(例えば、少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35又は40%低い)を示す。一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団は、ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、セントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCD95+セントラルメモリーT細胞のより低いパーセンテージ(例えば、少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35又は40%低い)を示す。
一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団中のステムメモリーT細胞、例えばCD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージは、ステップ(i)の開始時の細胞の集団中のステムメモリーT細胞、例えばCD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージと比べて増加される。一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団中のCAR発現ステムメモリーT細胞、例えばCAR発現CD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージは、ステップ(i)の開始時の細胞の集団中のCAR発現ステムメモリーT細胞、例えばCAR発現CD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージと比べて増加される。一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団中のステムメモリーT細胞、例えばCD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージは、ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞の集団中のステムメモリーT細胞、例えばCD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージより高い。一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団中のCAR発現ステムメモリーT細胞、例えばCAR発現CD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージは、ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞中のCAR発現ステムメモリーT細胞、例えばCAR発現CD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージより高い。一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団中のステムメモリーT細胞、例えばCD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージは、ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞の集団中のステムメモリーT細胞、例えばCD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージより高い。一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団中のCAR発現ステムメモリーT細胞、例えばCAR発現CD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージは、ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞の集団中のCAR発現ステムメモリーT細胞、例えばCAR発現CD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージより高い。
一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up TEM vs.Down TSCM)は、ステップ(i)の開始時の細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up TEM vs.Down TSCM)とほぼ同じであるか又は約25、50、75、100若しくは125%以下だけ異なる(例えば、それ以下だけ増加される)。一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up TEM vs.Down TSCM)は、ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up TEM vs.Down TSCM)より低い(例えば、少なくとも約100、150、200、250又は300%低い)。一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up TEM vs.Down TSCM)は、ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up TEM vs.Down TSCM)より低い(例えば、少なくとも約100、150、200、250又は300%低い)。一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up Treg vs.Down Teff)は、ステップ(i)の開始時の細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up Treg vs.Down Teff)とほぼ同じであるか又は約25、50、100、150若しくは200%以下だけ異なる(例えば、それ以下だけ増加される)。一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up Treg vs.Down Teff)は、ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up Treg vs.Down Teff)より低い(例えば、少なくとも約50、100、125、150又は175%低い)。一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up Treg vs.Down Teff)は、ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up Treg vs.Down Teff)より低い(例えば、少なくとも約50、100、150又は175%低い)。一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団のGeneSetScore中央値(Down stemness)は、ステップ(i)の開始時の細胞の集団のGeneSetScore中央値(Down stemness)とほぼ同じであるか又は約25、50、100、150、200若しくは250%以下だけ異なる(例えば、それ以下だけ増加される)。一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団のGeneSetScore中央値(Down stemness)は、ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞の集団のGeneSetScore中央値(Down stemness)より低い(例えば、少なくとも約50、100又は125%低い)。一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団のGeneSetScore中央値(Down stemness)は、ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞の集団のGeneSetScore中央値(Down stemness)より低い(例えば、少なくとも約50、100又は125%低い)。一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up hypoxia)は、ステップ(i)の開始時の細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up hypoxia)とほぼ同じであるか又は約125、150、175若しくは200%以下だけ異なる(例えば、それ以下だけ増加される)。一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up hypoxia)は、ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up hypoxia)より低い(例えば、少なくとも約40、50、60、70又は80%低い)。一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up hypoxia)は、ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up hypoxia)より低い(例えば、少なくとも約40、50、60、70又は80%低い)。一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up autophagy)は、ステップ(i)の開始時の細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up autophagy)とほぼ同じであるか又は約180、190、200若しくは210%以下だけ異なる(例えば、それ以下だけ増加される)。一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up autophagy)は、ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up autophagy)より低い(例えば、少なくとも約20、30又は40%低い)。一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up autophagy)は、ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up autophagy)より低い(例えば、少なくとも約20、30又は40%低い)。
一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団は、CARによって認識される抗原を発現する細胞と一緒にインキュベートされた後、例えば図29C~29Dに関して実施例8に記載される方法を用いて評価されるように、ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11若しくは12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞又はステップ(ii)後且つステップ(iii)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8若しくは9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞よりも高いレベル(例えば、少なくとも2、4、6、8、10、12又は14倍高い)でIL-2を分泌する。
一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団は、インビボで投与された後、ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞と比べてより長く持続するか又はより高い(例えば、少なくとも20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85若しくは90%高い)レベルで増殖する(例えば、図4Cを参照にして実施例1に記載される方法を用いて評価されるように)。一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団は、インビボで投与された後、ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞と比べてより長く持続するか又はより高い(例えば、少なくとも20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85若しくは90%高い)レベルで増殖する(例えば、図4Cを参照にして実施例1に記載される方法を用いて評価されるように)。
一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団は、インビボで投与された後、ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11若しくは12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞又はステップ(ii)後且つステップ(iii)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8若しくは9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞よりも強力な抗腫瘍活性(例えば、低用量、例えば0.15×106、0.2×106、0.25×106又は0.3×106個の生存CAR発現細胞でより強力な抗腫瘍活性)を示す。
一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団は、ステップ(i)の開始時の細胞の集団と比べて、例えば生存細胞の数によって評価されて増殖されない。一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団は、例えば、生存細胞の数によって評価されて、ステップ(i)の開始時の細胞の集団中の生存細胞の数から減少する。一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団は、ステップ(i)の開始時の細胞の集団と比べて、例えば生存細胞の数によって評価されて5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35又は40%以下だけ増殖される。一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団は、ステップ(i)の開始時の細胞の集団と比べて増殖されないか、又は0.5、1、1.5若しくは2時間未満、例えば1若しくは1.5時間未満だけ増殖される。
一部の実施形態では、ステップ(i)及び(ii)は、IL-2、IL-15(例えば、hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-6(例えば、IL-6/sIL-6Ra))、LSD1阻害剤又はMALT1阻害剤を含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態では、ステップ(i)及び(ii)は、IL-7、IL-21又はそれらの組み合わせを含む細胞培地(例えば、無血清培地)中で実施される。一部の実施形態では、ステップ(i)及び(ii)は、IL-2、IL-15(例えば、hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-21、IL-7、IL-6(例えば、IL-6/sIL-6Ra)、LSD1阻害剤、MALT1阻害剤又はそれらの組み合わせを含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態では、ステップ(i)は、IL-2、IL-15(例えば、hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-6(例えば、IL-6/sIL-6Ra)、LSD1阻害剤又はMALT1阻害剤を含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態では、ステップ(ii)は、IL-2、IL-15(例えば、hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-6(例えば、IL-6/sIL-6Ra)、LSD1阻害剤又はMALT1阻害剤を含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態では、ステップ(i)は、IL-7、IL-21又はそれらの組み合わせを含む細胞培地(例えば、無血清培地)中で実施される。一部の実施形態では、ステップ(ii)は、IL-7、IL-21又はそれらの組み合わせを含む細胞培地(例えば、無血清培地)中で実施される。一部の実施形態では、ステップ(i)は、IL-2、IL-15(例えば、hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-21、IL-7、IL-6(例えば、IL-6/sIL-6Ra)、LSD1阻害剤、MALT1阻害剤又はそれらの組み合わせを含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態では、ステップ(ii)は、IL-2、IL-15(例えば、hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-21、IL-7、IL-6(例えば、IL-6/sIL-6Ra)、LSD1阻害剤、MALT1阻害剤又はそれらの組み合わせを含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態では、細胞培地は、血清代替品を含む無血清培地である。一部の実施形態では、血清代替品は、CTS(商標)Immune Cell Serum Replacement(ICSR)である。
一部の実施形態では、前述の方法は、ステップ(i)前に、(iv)実体、例えば研究室、病院又は医療提供者から新鮮な白血球アフェレーシス産物(或いは新鮮な全血液産物、新鮮な骨髄産物又は新鮮な腫瘍若しくは臓器生検若しくは切除(例えば、胸腺除去からの新鮮な産物)などの造血組織の代替供給源)を受け取るステップをさらに含む。
一部の実施形態では、前述の方法は、ステップ(i)前に、(v)新鮮な白血球アフェレーシス産物(或いは新鮮な全血液産物、新鮮な骨髄産物又は新鮮な腫瘍若しくは臓器生検若しくは切除(例えば、胸腺除去からの新鮮な産物)などの代替供給源)から、ステップ(i)で接触された細胞(例えば、T細胞、例えばCD8+及び/又はCD4+T細胞)の集団を単離するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ステップ(iii)は、ステップ(v)の開始後の35、36又は48時間以内、例えばステップ(v)の開始後の27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47又は48時間以内、例えばステップ(v)の開始後の30、36又は48時間以内に実施される。一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団は、ステップ(v)の終了時の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて増殖されないか、又は5、10、15、20、25、30、35若しくは40%以下、例えば10%以下だけ増殖される。
一部の実施形態では、前述の方法は、ステップ(i)前に、実体、例えば研究室、病院又は医療提供者から、白血球アフェレーシス産物(或いは全血液、骨髄又は腫瘍若しくは臓器生検若しくは切除(例えば、胸腺除去)から単離された凍結保存T細胞などの造血組織の代替供給源)から単離された凍結保存T細胞を受け取るステップをさらに含む。
一部の実施形態では、前述の方法は、ステップ(i)前に、(iv)実体、例えば研究室、病院又は医療提供者から凍結保存白血球アフェレーシス産物(或いは凍結保存全血液産物、凍結保存骨髄産物又は凍結保存腫瘍若しくは臓器生検若しくは切除(例えば、胸腺除去からの凍結保存産物)などの造血組織の代替供給源)を受け取るステップをさらに含む。
一部の実施形態では、前述の方法は、ステップ(i)前に、(v)凍結保存白血球アフェレーシス産物(或いは凍結保存全血液産物、凍結保存骨髄産物又は凍結保存腫瘍若しくは臓器生検若しくは切除(例えば、胸腺除去からの凍結保存産物)などの造血組織の代替供給源)から、ステップ(i)で接触された細胞(例えば、T細胞、例えばCD8+及び/又はCD4+T細胞)の集団を単離するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ステップ(iii)は、ステップ(v)の開始後の35、36又は48時間以内、例えばステップ(v)の開始後の27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47又は48時間以内、例えばステップ(v)の開始後の30、36又は38時間以内に実施される。一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団は、ステップ(v)の終了時の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて増殖されないか、又は5、10、15、20、25、30、35若しくは40%以下、例えば10%以下だけ増殖される。
一部の実施形態では、本発明は、キメラ抗原受容体(CAR)を発現する細胞(例えば、T細胞)の集団を作製する方法を特徴とし、本方法は、(1)細胞(例えば、T細胞、例えば凍結白血球アフェレーシス産物から単離されたT細胞)の集団を、IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、IL-6又はそれらの組み合わせから選択されるサイトカインと接触させるステップ、(2)細胞(例えば、T細胞)の集団を、CARをコードする核酸分子(例えば、DNA又はRNA分子)と接触させ、それにより核酸分子を含む細胞(例えば、T細胞)の集団を提供するステップ、及び(3)保存(例えば、凍結保存培地中の細胞の集団を再製剤化すること)又は投与のために細胞(例えば、T細胞)の集団を採取するステップを含み、(a)ステップ(2)は、ステップ(1)と一緒に、又はステップ(1)の開始後の5時間以内、例えばステップ(1)の開始後の1、2、3、4又は5時間以内に実施され;及びステップ(3)は、ステップ(1)の開始後の26時間以内、例えばステップ(1)の開始後の22、23、24又は25時間以内、例えばステップ(1)の開始後の24時間以内に実施されるか;又は(b)ステップ(3)からの細胞の集団は、例えば、ステップ(1)の開始時の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて増殖されないか、又は5、10、15、20、25、30、35若しくは40%以下、例えば10%以下だけ増殖される。一部の実施形態では、ステップ(2)における核酸分子は、DNA分子である。一部の実施形態では、ステップ(2)における核酸分子は、RNA分子である。一部の実施形態では、ステップ(2)における核酸分子は、ウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はレトロウイルスベクターから選択されるウイルスベクター上にある。一部の実施形態では、ステップ(2)における核酸分子は、非ウイルスベクター上にある。一部の実施形態では、ステップ(2)における核酸分子は、プラスミド上にある。一部の実施形態では、ステップ(2)における核酸分子は、いずれのベクター上にもない。一部の実施形態では、ステップ(2)は、CARをコードする核酸分子を含むウイルスベクターと細胞(例えば、T細胞)の集団とを接触させ、任意選択で集団を形質導入することを含む。一部の実施形態では、ステップ(2)は、(A)Tet2標的配列を含むセンス鎖、及び(B)センス鎖と全部若しくは一部が相補的なアンチセンス鎖を含む、Tet2を標的とするshRNA又はshRNAをコードするベクターと、細胞(例えば、T細胞)の集団を接触させることをさらに含む。一部の実施形態では、センス鎖は、Tet2標的配列GGGTAAGCCAAGAAAGAAA(配列番号418)を含む。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、その逆相補鎖、即ちTTTCTTTCTTGGCTTACCC(配列番号419)を含む。一部の実施形態では、shRNAをコードするベクターは、CARをコードするベクターと同じであるか又は異なる。一部の実施形態では、shRNA配列をコードするベクターは、プロモーター(例えば、限定されないが、U6プロモーターなど)、Tet2標的配列を含むセンス鎖、ループ、センス鎖と全部若しくは一部が相補的なアンチセンス鎖及び任意選択でポリTテール、例えば表29の配列を含む。
一部の実施形態では、ステップ(2)は、ステップ(1)と一緒に実施される。一部の実施形態では、ステップ(2)は、ステップ(1)の開始後の5時間以内に実施される。一部の実施形態では、ステップ(2)は、ステップ(1)の開始後の1、2、3、4又は5時間以内に実施される。一部の実施形態では、ステップ(3)は、ステップ(1)の開始後の26時間以内に実施される。一部の実施形態では、ステップ(3)は、ステップ(1)の開始後の22、23、24又は25時間以内に実施される。一部の実施形態では、ステップ(3)は、ステップ(1)の開始後の24時間以内に実施される。
一部の実施形態では、ステップ(3)からの細胞の集団は、例えば、ステップ(1)の開始時の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて増殖されない。一部の実施形態では、ステップ(3)からの細胞の集団は、例えば、ステップ(1)の開始時の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35又は40%以下だけ増殖される。一部の実施形態では、ステップ(3)からの細胞の集団は、例えば、ステップ(1)の開始時の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて10%以下だけ増殖される。
一部の実施形態では、ステップ(1)は、細胞(例えば、T細胞)の集団をIL-2と接触させることを含む。一部の実施形態では、ステップ(1)は、細胞(例えば、T細胞)の集団をIL-7と接触させることを含む。一部の実施形態では、ステップ(1)は、細胞(例えば、T細胞)の集団をIL-15(例えば、hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))と接触させることを含む。一部の実施形態では、ステップ(1)は、細胞(例えば、T細胞)の集団をIL-21と接触させることを含む。一部の実施形態では、ステップ(1)は、細胞(例えば、T細胞)の集団をIL-6(例えば、IL-6/sIL-6Ra)と接触させることを含む。一部の実施形態では、ステップ(1)は、細胞(例えば、T細胞)の集団をIL-2及びIL-7と接触させることを含む。一部の実施形態では、ステップ(1)は、細胞(例えば、T細胞)の集団をIL-2及びIL15(例えば、hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))と接触させることを含む。一部の実施形態では、ステップ(1)は、細胞(例えば、T細胞)の集団をIL-2及びIL-21と接触させることを含む。一部の実施形態では、ステップ(1)は、細胞(例えば、T細胞)の集団をIL-2及びIL-6(例えば、IL-6/sIL-6Ra)と接触させることを含む。一部の実施形態では、ステップ(1)は、細胞(例えば、T細胞)の集団をIL-7及びIL-15(例えば、hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))と接触させることを含む。一部の実施形態では、ステップ(1)は、細胞(例えば、T細胞)の集団をIL-7及びIL-21と接触させることを含む。一部の実施形態では、ステップ(1)は、細胞(例えば、T細胞)の集団をIL-7及びIL-6(例えば、IL-6/sIL-6Ra)と接触させることを含む。一部の実施形態では、ステップ(1)は、細胞(例えば、T細胞)の集団をIL-15(例えば、hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))及びIL-21と接触させることを含む。一部の実施形態では、ステップ(1)は、細胞(例えば、T細胞)の集団をIL-15(例えば、hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))及びIL-6(例えば、IL-6/sIL-6Ra)と接触させることを含む。一部の実施形態では、ステップ(1)は、細胞(例えば、T細胞)の集団をIL-21及びIL-6(例えば、IL-6/sIL-6Ra)と接触させることを含む。一部の実施形態では、ステップ(1)は、細胞(例えば、T細胞)の集団をIL-7、IL15(例えば、hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))及びIL-21と接触させることを含む。
一部の実施形態では、ステップ(3)からの細胞の集団は、細胞の集団を例えば抗CD3抗体と接触させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、CAR発現細胞の中でナイーブ細胞のより高いパーセンテージ(例えば、少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35又は40%高い)を示す。
一部の実施形態では、ステップ(3)からの細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージは、ステップ(1)の開始時の細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+細胞のパーセンテージと同じである。一部の実施形態では、ステップ(3)からの細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージは、ステップ(1)の開始時の細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+細胞のパーセンテージと3、4、5、6、7、8、9、10、11又は12%以下だけ異なる。一部の実施形態では、ステップ(3)からの細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージは、ステップ(1)の開始時の細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+細胞のパーセンテージと5又は10%以下だけ異なる。一部の実施形態では、ステップ(3)からの細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージは、ステップ(1)の開始時の細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+細胞のパーセンテージと比べて増加される。一部の実施形態では、ステップ(3)からの細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージは、ステップ(1)の開始時の細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+細胞のパーセンテージと比べて少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20%だけ増加される。一部の実施形態では、ステップ(3)からの細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージは、ステップ(1)の開始時の細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+細胞のパーセンテージと比べて少なくとも10又は20%だけ増加される。
一部の実施形態では、ステップ(3)からの細胞の集団は、ステップ(3)が、ステップ(1)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(1)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、ナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のより高いパーセンテージ(例えば、少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35又は40%高い)を示す。一部の実施形態では、ステップ(3)からの細胞の集団は、ステップ(2)後且つステップ(3)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、ナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のより高いパーセンテージ(例えば、少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35又は40%高い)を示す。
一部の実施形態では、ステップ(3)からの細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCD95+セントラルメモリーT細胞のパーセンテージは、ステップ(i)の開始時の細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCD95+セントラルメモリーT細胞のパーセンテージと同じである。一部の実施形態では、ステップ(3)からの細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCD95+セントラルメモリーT細胞のパーセンテージは、ステップ(i)の開始時の細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCD95+セントラルメモリーT細胞のパーセンテージと3、4、5、6、7、8、9、10、11又は12%以下だけ異なる。一部の実施形態では、ステップ(3)からの細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCD95+セントラルメモリーT細胞のパーセンテージは、ステップ(i)の開始時の細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCD95+セントラルメモリーT細胞のパーセンテージと5又は10%以下だけ異なる。一部の実施形態では、ステップ(3)からの細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCD95+セントラルメモリーT細胞のパーセンテージは、ステップ(1)の開始時の細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCD95+セントラルメモリーT細胞のパーセンテージと比べて減少される。一部の実施形態では、ステップ(3)からの細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCD95+セントラルメモリーT細胞のパーセンテージは、ステップ(1)の開始時の細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCD95+セントラルメモリーT細胞のパーセンテージと比べて少なくとも10又は20%だけ減少される。一部の実施形態では、ステップ(3)からの細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCD95+セントラルメモリーT細胞のパーセンテージは、ステップ(1)の開始時の細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCD95+セントラルメモリーT細胞のパーセンテージと比べて少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20%だけ減少される。
一部の実施形態では、ステップ(3)からの細胞の集団は、ステップ(3)が、ステップ(1)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(1)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、セントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCD95+セントラルメモリーT細胞のより低いパーセンテージ(例えば、少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35又は40%低い)を示す。一部の実施形態では、ステップ(3)からの細胞の集団は、ステップ(2)後且つステップ(3)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、セントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCD95+セントラルメモリーT細胞のより低いパーセンテージ(例えば、少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35又は40%低い)を示す。
一部の実施形態では、ステップ(3)からの細胞の集団は、インビボで投与された後、ステップ(3)が、ステップ(1)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(1)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、より長く持続するか又はより高い(例えば、少なくとも20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85若しくは90%高い)レベルで増殖する(例えば、図4Cに関して実施例1に記載される方法を用いて評価されるように)。一部の実施形態では、ステップ(3)からの細胞の集団は、インビボで投与された後、ステップ(2)後且つステップ(3)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、より長く持続するか又はより高い(例えば、少なくとも20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85若しくは90%高い)レベルで増殖する(例えば、図4Cに関して実施例1に記載される方法を用いて評価されるように)。
一部の実施形態では、ステップ(3)からの細胞の集団は、ステップ(1)の開始時の細胞の集団と比べて、例えば生存細胞の数によって評価されて増殖されない。一部の実施形態では、ステップ(3)からの細胞の集団は、ステップ(1)の開始時の細胞の集団と比べて、例えば生存細胞の数によって評価されて5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35又は40%以下だけ増殖される。一部の実施形態では、ステップ(3)からの細胞の集団は、ステップ(1)の開始時の細胞の集団と比べて、例えば生存細胞の数によって評価されて10%以下だけ増殖される。一部の実施形態では、ステップ(3)からの細胞の集団中の生存細胞の数は、例えば、生存細胞の数によって評価されて、ステップ(1)の開始時の細胞中の生存細胞の数から減少する。
一部の実施形態では、ステップ(3)からの細胞の集団は、ステップ(1)の開始時の細胞の集団と比べて、例えば生存細胞の数によって評価されて増殖されない。一部の実施形態では、ステップ(3)からの細胞の集団は、ステップ(1)の開始時の細胞の集団と比べて、0.5、1、1.5又は2時間未満、例えば1又は1.5時間未満だけ増殖される。
一部の実施形態では、細胞の集団は、(A)CD3/TCR複合体を刺激する薬剤、及び/又は(B)それらの細胞の表面上の共刺激分子及び/又は増殖因子受容体を刺激する薬剤とインビトロで接触されないか、又は接触される場合、接触させるステップは、2時間未満、例えば1若しくは1.5時間以下である。一部の実施形態では、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤は、CD3(例えば、抗CD3抗体)を刺激する薬剤である。一部の実施形態では、共刺激分子及び/又は増殖因子受容体を刺激する薬剤は、CD28、ICOS、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD226又はそれらの任意の組み合わせを刺激する薬剤である。一部の実施形態では、共刺激分子及び/又は増殖因子受容体を刺激する薬剤は、CD28を刺激する薬剤である。一部の実施形態では、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤又は共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤は、抗体(例えば、単一ドメイン抗体(例えば、重鎖可変ドメイン抗体)、ペプチボディ、Fabフラグメント若しくはscFv)、小分子又はリガンド(例えば、天然に存在するリガンド、組換えリガンド若しくはキメラリガンド)から選択される。
一部の実施形態では、ステップ(1)及び/又は(2)は、5、4、3、2、1又は0%以下の血清を含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態では、ステップ(1)及び/又は(2)は、2%以下の血清を含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態では、ステップ(1)及び/又は(2)は、約2%の血清を含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態では、ステップ(1)及び/又は(2)は、LSD1阻害剤又はMALT1阻害剤を含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態では、ステップ(1)は、5、4、3、2、1又は0%以下の血清を含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態では、ステップ(1)は、2%以下の血清を含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態では、ステップ(1)は、約2%の血清を含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態では、ステップ(2)は、5、4、3、2、1又は0%以下の血清を含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態では、ステップ(2)は、2%以下の血清を含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態では、ステップ(2)は、約2%の血清を含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態では、ステップ(1)は、LSD1阻害剤又はMALT1阻害剤を含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態では、ステップ(2)は、LSD1阻害剤又はMALT1阻害剤を含む細胞培地中で実施される。
一部の実施形態では、前述の方法は、ステップ(i)前に、(iv)実体、例えば研究室、病院又は医療提供者から新鮮な白血球アフェレーシス産物(或いは新鮮な全血液産物、新鮮な骨髄産物又は新鮮な腫瘍若しくは臓器生検若しくは切除(例えば、胸腺除去からの新鮮な産物)などの造血組織の代替供給源)を受け取るステップをさらに含む。
一部の実施形態では、前述の方法は、ステップ(i)前に、(v)新鮮な白血球アフェレーシス産物(或いは新鮮な全血液産物、新鮮な骨髄産物又は新鮮な腫瘍若しくは臓器生検若しくは切除(例えば、胸腺除去からの新鮮な産物)などの造血組織の代替供給源)から、ステップ(i)で接触された細胞(例えば、T細胞、例えばCD8+及び/又はCD4+T細胞)の集団を単離するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ステップ(iii)は、ステップ(v)の開始後の35、36又は48時間以内、例えばステップ(v)の開始後の27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47又は48時間以内、例えばステップ(v)の開始後の30、36又は48時間以内に実施される。一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団は、ステップ(v)の終了時の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて増殖されないか、又は5、10、15、20、25、30、35若しくは40%以下、例えば10%以下だけ増殖される。
一部の実施形態では、前述の方法は、ステップ(i)前に、実体、例えば研究室、病院又は医療提供者から、白血球アフェレーシス産物(或いは全血液、骨髄又は腫瘍若しくは臓器生検若しくは切除(例えば、胸腺除去)から単離された凍結保存T細胞などの代替供給源)から単離された凍結保存T細胞を受け取るステップをさらに含む。
一部の実施形態では、前述の方法は、ステップ(i)前に、(iv)実体、例えば研究室、病院又は医療提供者から凍結保存白血球アフェレーシス産物(或いは凍結保存全血液産物、凍結保存骨髄産物又は凍結保存腫瘍若しくは臓器生検若しくは切除(例えば、胸腺除去からの凍結保存産物)などの造血組織の代替供給源)を受け取るステップをさらに含む。
一部の実施形態では、前述の方法は、ステップ(i)前に、(v)凍結保存白血球アフェレーシス産物(或いは凍結保存全血液産物、凍結保存骨髄産物又は凍結保存腫瘍若しくは臓器生検若しくは切除(例えば、胸腺除去からの凍結保存産物)などの造血組織の代替供給源)から、ステップ(i)で接触された細胞(例えば、T細胞、例えばCD8+及び/又はCD4+T細胞)の集団を単離するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ステップ(iii)は、ステップ(v)の開始後の35、36又は48時間以内、例えばステップ(v)の開始後の27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47又は48時間以内、例えばステップ(v)の開始後の30、36又は48時間以内に実施される。一部の実施形態では、ステップ(iii)からの細胞の集団は、ステップ(v)の終了時の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて増殖されないか、又は5、10、15、20、25、30、35若しくは40%以下、例えば10%以下だけ増殖される。
一部の実施形態では、ステップ(i)又はステップ(1)の開始時の細胞の集団は、IL6R発現細胞(例えば、IL6Rα及び/又はIL6Rβについて陽性の細胞)について濃縮されている。一部の実施形態では、ステップ(i)又はステップ(1)の開始時の細胞の集団は、40、45、50、55、60、65若しくは70%以上のIL6R発現細胞(例えば、IL6Rα及び/又はIL6Rβについて陽性の細胞)を含む。
一部の実施形態では、ステップ(i)及び(ii)又はステップ(1)及び(2)は、IL-15(例えば、hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))を含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態では、IL-15は、細胞の集団が例えば10、15、20又は25日後に増殖する能力を増加させる。一部の実施形態では、IL-15は、細胞の集団中のIL6Rβ発現細胞のパーセンテージを増加させる。
前述した方法の一部の実施形態では、本方法は、閉鎖系において実施される。一部の実施形態では、T細胞分離、活性化、形質導入、インキュベーション及び洗浄は、全て閉鎖系において実施される。前述した方法の一部の実施形態では、本方法は、個別の装置内で実施される。一部の実施形態では、T細胞分離、活性化及び形質導入、インキュベーション及び洗浄は、個別の装置内で実施される。
前述した方法の一部の実施形態では、本方法は、形質導入効率を高めるためにアジュバント又は形質導入促進試薬を細胞培地に添加するステップをさらに含む。一部の実施形態では、アジュバント又は形質導入試薬は、カチオン性ポリマーを含む。一部の実施形態では、アジュバント又は形質導入増強試薬は、LentiBOOST(商標)(Sirion Biotech)、ベクトフスシン-1、F108(ポロキサマー338又はPluronic(登録商標)F-38)、硫酸プロタミン、臭化ヘキサジメトリン(ポリブレン)、PEA、Pluronic F68、Pluronic F127、Synperonic又はLentiTrans(商標)から選択される。一部の実施形態では、形質導入増強試薬は、LentiBOOST(商標)(Sirion Biotech)である。一部の実施形態では、形質導入増強試薬は、F108(ポロキサマー338又はPluronic(登録商標)F-38)である。
前述した方法の一部の実施形態では、細胞(例えば、T細胞)の集団をウイルスベクターで形質導入するステップは、形質導入効率が高められるような条件下で細胞の集団及びウイルスベクターを遠心力に付すことを含む。一実施形態では、細胞は、スピノキュレーションによって形質導入される。
前述した方法の一部の実施形態では、細胞(例えば、T細胞)は、底部にガス透過膜を含む細胞培養フラスコ内で活性化され、形質導入され、このガス透過膜は、ガス交換を実質的に損なうことなく大きい培地量を支持する。一部の実施形態では、細胞増殖は、対流による栄養素へのアクセス、例えば中断しないアクセスによって達成される。
前述した方法の一部の実施形態では、CARは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、CD19、CD20、CD22、BCMA、メソテリン、EGFRvIII、GD2、Tn抗原、sTn抗原、Tn-O-グリコペプチド、sTn-O-グリコペプチド、PSMA、CD97、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、レグマン、GD3、CD171、IL-11Ra、PSCA、MAD-CT-1、MAD-CT-2、VEGFR2、ルイスY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、葉酸受容体α、ERBB(例えば、ERBB2)、Her2/neu、MUC1、EGFR、NCAM、エフリンB2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、o-アセチル-GD2、葉酸受容体β、TEM1/CD248、TEM7R、FAP、レグマイン、HPV E6若しくはE7、ML-IAP、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、ポリシアル酸、Fos関連抗原、好中球エラスターゼ、TRP-2、CYP1B1、精子タンパク質17、βヒト絨毛性ゴナドトロピン、AFP、チログロブリン、PLAC1、グロボH、RAGE1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、腸カルボキシエステラーゼ、mut hsp 70-2、NA-17、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、NY-ESO-1、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP、GFRα4又はMHCに提示されるこれらの抗原のいずれかのペプチドから選択される抗原に結合する。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、本明細書に開示されるCDR、VH、VL、scFv又はCAR配列を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、VH及びVLを含み、VH及びVLは、リンカーによって連結され、任意選択で、リンカーは、配列番号63又は104のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、T細胞受容体のα、β又はζ鎖、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及びCD154から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、CD8の膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号6のアミノ酸配列又はそれと少なくとも約85%、90%、95%若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、膜貫通ドメインをコードする核酸配列を含み、核酸配列は、配列番号17の核酸配列又はそれと少なくとも約85%、90%、95%若しくは99%の配列同一性を有する核酸配列を含む。
一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ヒンジ領域によって膜貫通ドメインに連結されている。一部の実施形態では、ヒンジ領域は、配列番号2、3若しくは4のアミノ酸配列又はそれと少なくとも約85%、90%、95%若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、ヒンジ領域をコードする核酸配列を含み、核酸配列は、配列番号13、14若しくは15の核酸配列又はそれと少なくとも約85%、90%、95%若しくは99%の配列同一性を有する核酸配列を含む。
一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、CD3ζ、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(ICOS)、FcεRI、DAP10、DAP12又はCD66dに由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、CD3ζに由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、配列番号9又は10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも約85%、90%、95%若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、一次シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列を含み、核酸配列は、配列番号20若しくは21の核酸配列又はそれと少なくとも約85%、90%、95%若しくは99%の配列同一性を有する核酸配列を含む。
一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、MHCクラスI分子、TNF受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子(SLAMタンパク質)、活性化NK細胞受容体、BTLA、Tollリガンド受容体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、4-1BB(CD137)、B7-H3、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD28-OX40、CD28-4-1BB又はCD83と特異的に結合するリガンドを含む。一部の実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、4-1BBに由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号7のアミノ酸配列又はそれと少なくとも約85%、90%、95%若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、共刺激シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列を含み、核酸配列は、配列番号18の核酸配列又はそれと少なくとも約85%、90%、95%若しくは99%の配列同一性を有する核酸配列を含む。
一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、4-1BBに由来する機能性シグナル伝達ドメインと、CD3ζに由来する機能性シグナル伝達ドメインとを含む。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号7のアミノ酸配列(又はそれと少なくとも約85%、90%、95%若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列)と、配列番号9若しくは10のアミノ酸配列(又はそれと少なくとも約85%、90%、95%若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列)とを含む。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号7のアミノ酸配列と、配列番号9又は10のアミノ酸配列とを含む。
一部の実施形態では、CARは、配列番号1のアミノ酸配列を含むリーダー配列をさらに含む。
一部の実施形態では、本発明は、前述した方法のいずれか又は本明細書に開示されるいずれか他の方法によって作製されるCAR発現細胞(例えば、自家又は同種異系CAR発現T細胞又はNK細胞)の集団を特徴とする。一部の実施形態では、本明細書に開示のCAR発現細胞の集団と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が本明細書において提供される。
一部の実施形態では、本明細書記載の方法を用いて製造される最終CAR細胞産物において、ビーズ(例えば、CD4ビーズ、CD8ビーズ及び/又はTransACTビーズ)の総量は、製造プロセス中に添加されるビーズの総量の0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4又は0.5%以下である。
一部の実施形態では、本発明は、以下の特徴の1つ以上を含むCAR発現細胞(例えば、自家又は同種異系CAR発現T細胞又はNK細胞)の集団を特徴とする:(a)CARを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RO-CCR7+細胞のパーセンテージと比べて、ほぼ同じパーセンテージのナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RO-CCR7+細胞;(b)CARを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RO-CCR7+細胞のパーセンテージと比べて、ナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RO-CCR7+細胞の約5%~約10%以内の変化;(c)CARを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RO-CCR7+細胞のパーセンテージと比べて、増加された、例えば少なくとも1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8又は3倍増加されたパーセンテージのナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RO-CCR7+細胞;(d)CARを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージと比べて、ほぼ同じパーセンテージのセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCCR7+CD45RO+T細胞;(e)CARを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージと比べて、セントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCCR7+CD45RO+T細胞の約5%~約10%以内の変化;(f)CARを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージと比べて、減少された、例えば少なくとも20、25、30、35、40、45又は50%減少されたパーセンテージのセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCCR7+CD45RO+T細胞;(g)CARを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のステムメモリーT細胞、例えばCD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージと比べて、ほぼ同じパーセンテージのステムメモリーT細胞、例えばCD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞;(h)CARを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のステムメモリーT細胞、例えばCD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージと比べて、ステムメモリーT細胞、例えばCD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞の約5%~約10%以内の変化;又は(i)CARを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のステムメモリーT細胞、例えばCD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージと比べて、増加されたパーセンテージのステムメモリーT細胞、例えばCD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞。
一部の実施形態では、本発明は、CAR発現細胞(例えば、自家又は同種異系CAR発現T細胞又はNK細胞)の集団を特徴とし、ここで、(a)細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up TEM vs.Down TSCM)は、CARを発現するように操作される前の同じ細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up TEM vs.Down TSCM)とほぼ同じであるか又は約25、50、75、100若しくは125%以下だけ異なる(例えば、それ以下だけ増加される)か;(b)細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up Treg vs.Down Teff)は、CARを発現するように操作される前の細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up Treg vs.Down Teff)とほぼ同じであるか又は約25、50、100、150若しくは200%以下だけ異なる(例えば、それ以下だけ増加される)か;(c)細胞の集団のGeneSetScore中央値(Down stemness)は、CARを発現するように操作される前の細胞の集団のGeneSetScore中央値(Down stemness)とほぼ同じであるか又は約25、50、100、150、200若しくは250%以下だけ異なる(例えば、それ以下だけ増加される)か;(d)細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up hypoxia)は、CARを発現するように操作される前の細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up hypoxia)とほぼ同じであるか又は約125、150、175若しくは200%以下だけ異なる(例えば、それ以下だけ増加される)か;又は(e)細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up autophagy)は、CARを発現するように操作される前の細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up autophagy)とほぼ同じであるか又は約180、190、200若しくは210%以下だけ異なる(例えば、それ以下だけ増加される)。
一部の実施形態では、本発明は、対象の免疫応答を増加させる方法を特徴とし、これは、本明細書に開示されるCAR発現細胞の集団又は本明細書に開示される医薬組成物を対象に投与し、それにより対象の免疫応答を増加させるステップを含む。
一部の実施形態では、対象の癌を処置する方法が開示され、これは、本明細書に開示されるCAR発現細胞の集団又は本明細書に開示される医薬組成物を対象に投与し、それにより対象の癌を処置するステップを含む。一部の実施形態では、癌は、例えば、中皮腫、悪性胸膜中皮腫、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、扁平上皮癌、大細胞肺癌、膵臓癌、膵管腺癌、食道腺癌、乳癌、膠芽腫、卵巣癌、大腸癌、前立腺癌、子宮頸癌、皮膚癌、黒色腫、腎癌、肝臓癌、脳腫瘍、胸腺腫、肉腫、癌腫、子宮癌、腎臓癌、消化管癌、尿路上皮癌、咽頭癌、頭部及び頸部癌、直腸癌、食道癌若しくは膀胱癌の1つ以上から選択される固形癌又はその転移である。一部の実施形態では、癌は、例えば、慢性リンパ性白血病(CLL)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、多発性骨髄腫、急性リンパ性白血病(ALL)、ホジキンリンパ腫、B細胞急性リンパ性白血病(BALL)、T細胞急性リンパ性白血病(TALL)、小リンパ球性白血病(SLL)、B細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、慢性炎症を伴うDLBCL、慢性骨髄性白血病、骨髄増殖性腫瘍、濾胞性リンパ腫、小児性濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞型若しくは大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖性病態、MALTリンパ腫(粘膜関連リンパ組織型節外性濾胞辺縁帯リンパ腫)、辺縁帯リンパ腫、骨髄形成異常、骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、脾辺縁帯リンパ腫、脾リンパ腫/白血病、脾臓びまん性赤脾髄小細胞型B細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病-変異型、リンパ形質細胞性リンパ腫、H鎖病、プラズマ細胞骨髄腫、孤立性骨形質細胞腫、骨外性形質細胞腫、節性辺縁帯リンパ腫、小児性節性辺縁帯リンパ腫、原発性皮膚濾胞中心リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、原発性縦隔(胸腺)大細胞型B細胞リンパ腫、血管内大細胞型B細胞リンパ腫、ALK+大細胞型B細胞リンパ腫、HHV8関連多中心性キャッスルマン病に発生する大細胞型B細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、B細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病(AML)又は分類不能なリンパ腫から選択される液性癌である。
一部の実施形態では、本方法は、第2の治療薬を対象に投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、第2の治療薬は、抗癌治療薬、例えば化学療法薬、放射線療法又は免疫調節療法である。一部の実施形態では、第2の治療薬は、IL-15(例えば、hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))である。
いくつかの態様では、本開示は、CD28に結合する抗体分子を特徴とし、これは、重鎖相補性決定領域1(HCDR1)、HCDR2及びHCDR3を含む重鎖可変領域(VH)と、軽鎖相補性決定領域1(LCDR1)、LCDR2及びLCDR3を含む軽鎖可変領域(VL)とを含み、(i)HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3は、それぞれ配列番号538、539、540、530、531及び532のアミノ酸配列を含むか;(ii)HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3は、それぞれ配列番号541、539、540、530、531及び532のアミノ酸配列を含むか;(iii)HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3は、それぞれ配列番号542、543、540、533、534及び535のアミノ酸配列を含むか;又は(iv)HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3は、それぞれ配列番号544、545、546、536、534及び532のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の抗CD28抗体分子は、(i)配列番号547若しくは548のアミノ酸配列又は配列番号547若しくは548に対して少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含むVH;及び/又は(ii)配列番号537のアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含むVLを含む。一部の実施形態では、抗CD28抗体分子は、(i)配列番号547のアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含むVH及び配列番号537のアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含むVL;又は(ii)配列番号548のアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含むVH及び配列番号537のアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含むVLを含む。一部の実施形態では、抗CD28抗体分子は、ヒト抗体、完全長抗体、二重特異性抗体、Fab、F(ab’)2、Fv又は単鎖Fvフラグメント(scFv)である。一部の実施形態では、抗体分子は、IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4から選択される重鎖定常領域と、κ又はλの軽鎖定常領域から選択される軽鎖定常領域とを含む。
いくつかの態様では、本開示は、(i)CD28に対する結合について、本明細書に記載の抗CD28抗体分子と競合し;及び/又は(ii)本明細書に記載の抗CD28抗体分子のエピトープと同じエピトープ、実質的に同じエピトープ、それと重複するエピトープ又はそれと実質的に重複するエピトープに結合する抗体分子を特徴とする。
いくつかの態様では、本開示は、(i)抗CD3結合ドメイン、及び(ii)本明細書に記載の抗CD28抗体分子を含むCD28抗原結合ドメインを含む多重特異性結合分子を特徴とする。一部の実施形態では、抗CD3結合ドメインは、(i)表27の抗CD3抗体分子(例えば、抗CD3(1)、抗CD3(2)、抗CD3(3)又は抗CD3(4))のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3;(ii)表27に提供される抗CD3抗体分子(例えば、抗CD3(1)、抗CD3(2)、抗CD3(3)又は抗CD3(4))のVH及び/若しくはVL領域のいずれか1つのアミノ酸配列又はそれと少なくとも95%同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、本開示は、第1の結合ドメイン及び第2の結合ドメイン:(i)N末端からC末端に、第1の結合ドメインのVH、第1の結合ドメインのVL、第2の結合ドメインのVH、CH1、CH2及びCH3を含む第1のポリペプチド;及び(ii)N末端からC末端に、第2の結合ドメインのVL及びCLを含む第2のポリペプチドを含む多重特異性結合分子を特徴とする。一部の実施形態では、第1の結合ドメインは、抗CD3結合ドメインを含み、及び第2の結合ドメインは、共刺激分子結合ドメインを含む。一部の実施形態では、第1の結合ドメインは、共刺激分子結合ドメインを含み、及び第2の結合ドメインは、抗CD3結合ドメインを含む。一部の実施形態では、共刺激分子結合ドメインは、抗CD2結合ドメイン又は抗CD28結合ドメインを含む。
いくつかの態様では、本開示は、第1の結合ドメイン及び第2の結合ドメイン:(i)N末端からC末端に、第2の結合ドメインのVH、CH1、CH2、CH3、第1の結合ドメインのVH及び第1の結合ドメインのVLを含む第1のポリペプチド;及び(ii)N末端からC末端に、第2の結合ドメインのVL及びCLを含む第2のポリペプチドを含む多重特異性結合分子を特徴とする。
一部の実施形態では、第1の結合ドメインは、抗CD3結合ドメインを含み、及び第2の結合ドメインは、共刺激分子結合ドメインを含む。一部の実施形態では、第1の結合ドメインは、共刺激分子結合ドメインを含み、及び第2の結合ドメインは、抗CD3結合ドメインを含む。一部の実施形態では、共刺激分子結合ドメインは、抗CD2結合ドメイン又は抗CD28結合ドメインを含む。
いくつかの態様では、本開示は、第1の結合ドメイン及び第2の結合ドメイン:(i)N末端からC末端に、第2の結合ドメインのVH、CH1、第1の結合ドメインのVH、第1の結合ドメインのVL、CH2及びCH3を含む第1のポリペプチド;及び(ii)N末端からC末端に、第2の結合ドメインのVL及びCLを含む第2のポリペプチドを含む多重特異性結合分子を特徴とする。一部の実施形態では、第1の結合ドメインは、抗CD3結合ドメインを含み、及び第2の結合ドメインは、共刺激分子結合ドメインを含む。一部の実施形態では、第1の結合ドメインは、共刺激分子結合ドメインを含み、及び第2の結合ドメインは、抗CD3結合ドメインを含む。一部の実施形態では、共刺激分子結合ドメインは、抗CD2結合ドメイン又は抗CD28結合ドメインを含む。
いくつかの態様では、本開示は、細胞(例えば、免疫エフェクター細胞、例えばT細胞)を活性化する方法を特徴とし、これは、細胞(例えば、T細胞、例えば凍結された又は新鮮な白血球アフェレーシス産物から単離されたT細胞)の集団を、本明細書に記載の多重特異性結合分子と接触させる(例えば、結合させる)ことを含む。
いくつかの態様では、本開示は、細胞(例えば、免疫エフェクター細胞、例えばT細胞)を形質導入する方法を特徴とし、これは、細胞(例えば、T細胞、例えば凍結された又は新鮮な白血球アフェレーシス産物から単離されたT細胞)の集団を、(i)本明細書に記載の多重特異性結合分子、及び(ii)核酸分子、例えばCARをコードする核酸分子と接触させる(例えば、結合させる)ことを含む。
当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識し、日常的な実験を用いるのみでそれらを確認することができるであろう。このような均等物は、以下に列挙する実施形態に包含されることが意図される。
実施形態の列挙
1.キメラ抗原受容体(CAR)を発現する細胞(例えば、T細胞)の集団を作製する方法であって、
(i)細胞(例えば、T細胞、例えば凍結された又は新鮮な白血球アフェレーシス産物から単離されたT細胞)の集団を、(A)CD3/TCR複合体を刺激する薬剤、及び/又は(B)細胞の表面上の共刺激分子結合ドメイン及び/又は増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させる(例えば、結合させる)ステップ;
(ii)細胞(例えば、T細胞)の集団を、CARをコードする核酸分子(例えば、DNA又はRNA分子)と接触させ、それにより核酸分子を含む細胞(例えば、T細胞)の集団を提供するステップ、及び
(iii)保存(例えば、凍結保存培地中で細胞の集団を再製剤化すること)又は投与のために細胞(例えば、T細胞)の集団を採取するステップ
を含み、
(a)ステップ(ii)は、ステップ(i)と一緒に、又はステップ(i)の開始後の20時間以内、例えばステップ(i)の開始後の12、13、14、15、16、17若しくは18時間以内、例えばステップ(i)の開始後の18時間以内に実施され、及び
ステップ(iii)は、ステップ(i)の開始後の30時間(例えば、26時間)以内、例えばステップ(i)の開始後の22、23、24、25、26、27、28、29又は30時間以内、例えばステップ(i)の開始後の24時間以内に実施されるか、
(b)ステップ(ii)は、ステップ(i)と一緒に、又はステップ(i)の開始後の20時間以内、例えばステップ(i)の開始後の12、13、14、15、16、17若しくは18時間以内、例えばステップ(i)の開始後の18時間以内に実施され、及び
ステップ(iii)は、ステップ(ii)の開始後の30時間以内、例えばステップ(ii)の開始後の22、23、24、25、26、27、28、29又は30時間以内に実施されるか、又は
(c)ステップ(iii)からの細胞の集団は、例えば、ステップ(i)の開始時の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて増殖されないか、又は5、10、15、20、25、30、35若しくは40%以下、例えば10%以下だけ増殖され、
任意選択で、ステップ(ii)における核酸分子は、ウイルスベクター上にあり、任意選択で、ステップ(ii)における核酸分子は、ウイルスベクター上のRNA分子であり、任意選択で、ステップ(ii)は、CARをコードする核酸分子を含むウイルスベクターで細胞(例えば、T細胞)の集団を形質導入することを含み、任意選択で、ステップ(ii)は、形質導入中にアジュバントとしてF108を添加すること及び/又は細胞(例えば、T細胞)の集団を、Tet2を標的とするshRNAと接触させることをさらに含む、方法。
1.キメラ抗原受容体(CAR)を発現する細胞(例えば、T細胞)の集団を作製する方法であって、
(i)細胞(例えば、T細胞、例えば凍結された又は新鮮な白血球アフェレーシス産物から単離されたT細胞)の集団を、(A)CD3/TCR複合体を刺激する薬剤、及び/又は(B)細胞の表面上の共刺激分子結合ドメイン及び/又は増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させる(例えば、結合させる)ステップ;
(ii)細胞(例えば、T細胞)の集団を、CARをコードする核酸分子(例えば、DNA又はRNA分子)と接触させ、それにより核酸分子を含む細胞(例えば、T細胞)の集団を提供するステップ、及び
(iii)保存(例えば、凍結保存培地中で細胞の集団を再製剤化すること)又は投与のために細胞(例えば、T細胞)の集団を採取するステップ
を含み、
(a)ステップ(ii)は、ステップ(i)と一緒に、又はステップ(i)の開始後の20時間以内、例えばステップ(i)の開始後の12、13、14、15、16、17若しくは18時間以内、例えばステップ(i)の開始後の18時間以内に実施され、及び
ステップ(iii)は、ステップ(i)の開始後の30時間(例えば、26時間)以内、例えばステップ(i)の開始後の22、23、24、25、26、27、28、29又は30時間以内、例えばステップ(i)の開始後の24時間以内に実施されるか、
(b)ステップ(ii)は、ステップ(i)と一緒に、又はステップ(i)の開始後の20時間以内、例えばステップ(i)の開始後の12、13、14、15、16、17若しくは18時間以内、例えばステップ(i)の開始後の18時間以内に実施され、及び
ステップ(iii)は、ステップ(ii)の開始後の30時間以内、例えばステップ(ii)の開始後の22、23、24、25、26、27、28、29又は30時間以内に実施されるか、又は
(c)ステップ(iii)からの細胞の集団は、例えば、ステップ(i)の開始時の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて増殖されないか、又は5、10、15、20、25、30、35若しくは40%以下、例えば10%以下だけ増殖され、
任意選択で、ステップ(ii)における核酸分子は、ウイルスベクター上にあり、任意選択で、ステップ(ii)における核酸分子は、ウイルスベクター上のRNA分子であり、任意選択で、ステップ(ii)は、CARをコードする核酸分子を含むウイルスベクターで細胞(例えば、T細胞)の集団を形質導入することを含み、任意選択で、ステップ(ii)は、形質導入中にアジュバントとしてF108を添加すること及び/又は細胞(例えば、T細胞)の集団を、Tet2を標的とするshRNAと接触させることをさらに含む、方法。
2.CD3/TCR複合体を刺激する薬剤は、CD3を刺激する薬剤(例えば、表27に提供されるそれぞれのCDRを含む抗CD3又は抗TCR抗体フラグメント)であり、共刺激分子及び/又は増殖因子受容体を刺激する薬剤は、CD28若しくはCD2を刺激する薬剤(例えば、例えば、表27に提供されるそれぞれのCDRを含む抗CD28若しくは抗CD2抗体フラグメント)又はその任意の組合せであり、任意選択で、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤は、CD3を刺激する薬剤であり、共刺激分子及び/又は増殖因子受容体を刺激する薬剤は、多重特異性結合分子、任意選択で、図50Aに提供されるスキームのいずれか1つにおいて立体配置される二重特異性分子に含まれる、実施形態1に記載の方法。
3.ステップ(i)は、ステップ(iii)からの細胞の集団中のCAR発現細胞を増加させ、例えば、ステップ(iii)からの細胞の集団は、ステップ(i)を含まないこと以外には同様の方法により作製された細胞と比べて、高いパーセンテージ(例えば、少なくとも10、20、30、40、50若しくは60%高い)のCAR発現細胞を示す、実施形態1又は2に記載の方法。
4.(a)ステップ(iii)からの細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージは、ステップ(i)の開始時の細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+細胞のパーセンテージと同じであるか又は5若しくは10%以下だけ異なるか;
(b)ステップ(iii)からの細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージは、例えば、ステップ(i)の開始時の細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+細胞のパーセンテージと比べて少なくとも1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8又は3倍だけ増加されるか;
(c)細胞の集団中のCAR発現ナイーブT細胞、例えばCAR発現CD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージは、ステップ(ii)の期間中に増加し、例えばステップ(ii)の開始後18~24時間で少なくとも30、35、40、45、50、55又は60%だけ増加するか;又は
(d)ステップ(iii)からの細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージは、ステップ(i)の開始時の細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+細胞のパーセンテージと比べて減少しないか又は5若しくは10%以下だけ減少する、実施形態1~3のいずれか1つに記載の方法。
(b)ステップ(iii)からの細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージは、例えば、ステップ(i)の開始時の細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+細胞のパーセンテージと比べて少なくとも1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8又は3倍だけ増加されるか;
(c)細胞の集団中のCAR発現ナイーブT細胞、例えばCAR発現CD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージは、ステップ(ii)の期間中に増加し、例えばステップ(ii)の開始後18~24時間で少なくとも30、35、40、45、50、55又は60%だけ増加するか;又は
(d)ステップ(iii)からの細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージは、ステップ(i)の開始時の細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+細胞のパーセンテージと比べて減少しないか又は5若しくは10%以下だけ減少する、実施形態1~3のいずれか1つに記載の方法。
5.(a)ステップ(iii)からの細胞の集団は、ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、ナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のより高いパーセンテージ(例えば、少なくとも10、20、30若しくは40%高い)を示すか;
(b)ステップ(iii)からの細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージは、ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージより高い(例えば、少なくとも1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8若しくは3倍高い)か;
(c)ステップ(iii)からの細胞の集団中のCAR発現ナイーブT細胞、例えばCAR発現CD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージは、ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞中のCAR発現ナイーブT細胞、例えばCAR発現CD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージより高い(例えば、少なくとも4、6、8、10又は12倍高い)か;
(d)ステップ(iii)からの細胞の集団は、ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、ナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のより高いパーセンテージ(例えば、少なくとも10、20、30若しくは40%高い)を示すか;
(e)ステップ(iii)からの細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージは、ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージより高い(例えば、少なくとも1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8若しくは3倍高い)か;又は
(f)ステップ(iii)からの細胞の集団中のCAR発現ナイーブT細胞、例えばCAR発現CD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージは、ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞中のCAR発現ナイーブT細胞、例えばCAR発現CD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージより高い(例えば、少なくとも4、6、8、10又は12倍高い)、実施形態1~4のいずれか1つに記載の方法。
(b)ステップ(iii)からの細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージは、ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージより高い(例えば、少なくとも1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8若しくは3倍高い)か;
(c)ステップ(iii)からの細胞の集団中のCAR発現ナイーブT細胞、例えばCAR発現CD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージは、ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞中のCAR発現ナイーブT細胞、例えばCAR発現CD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージより高い(例えば、少なくとも4、6、8、10又は12倍高い)か;
(d)ステップ(iii)からの細胞の集団は、ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、ナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のより高いパーセンテージ(例えば、少なくとも10、20、30若しくは40%高い)を示すか;
(e)ステップ(iii)からの細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージは、ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージより高い(例えば、少なくとも1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8若しくは3倍高い)か;又は
(f)ステップ(iii)からの細胞の集団中のCAR発現ナイーブT細胞、例えばCAR発現CD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージは、ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞中のCAR発現ナイーブT細胞、例えばCAR発現CD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージより高い(例えば、少なくとも4、6、8、10又は12倍高い)、実施形態1~4のいずれか1つに記載の方法。
6.(a)ステップ(iii)からの細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCD95+セントラルメモリーT細胞のパーセンテージは、ステップ(i)の開始時の細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCD95+セントラルメモリーT細胞のパーセンテージと同じであるか又は5若しくは10%以下だけ異なるか;
(b)ステップ(iii)からの細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージは、ステップ(i)の開始時の細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージと比べて少なくとも20、25、30、35、40、45又は50%だけ低下されるか;
(c)CAR発現セントラルメモリーT細胞、例えばCAR発現CCR7+CD45RO+細胞のパーセンテージは、ステップ(ii)の期間中に減少し、例えばステップ(ii)の開始後の18~24時間で少なくとも8、10、12、14、16、18又は20%だけ減少するか;又は
(d)ステップ(iii)からの細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージは、ステップ(i)の開始時の細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージと比べて増加しないか又は5若しくは10%以下だけ増加する、実施形態1~5のいずれか1つに記載の方法。
(b)ステップ(iii)からの細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージは、ステップ(i)の開始時の細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージと比べて少なくとも20、25、30、35、40、45又は50%だけ低下されるか;
(c)CAR発現セントラルメモリーT細胞、例えばCAR発現CCR7+CD45RO+細胞のパーセンテージは、ステップ(ii)の期間中に減少し、例えばステップ(ii)の開始後の18~24時間で少なくとも8、10、12、14、16、18又は20%だけ減少するか;又は
(d)ステップ(iii)からの細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージは、ステップ(i)の開始時の細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージと比べて増加しないか又は5若しくは10%以下だけ増加する、実施形態1~5のいずれか1つに記載の方法。
7.(a)ステップ(iii)からの細胞の集団は、ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、セントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCD95+セントラルメモリーT細胞のより低いパーセンテージ(例えば、少なくとも10、20、30若しくは40%低い)を示すか;
(b)ステップ(iii)からの細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージは、ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージより低い(例えば、少なくとも20、30、40若しくは50%低い)か;
(c)ステップ(iii)からの細胞の集団中のCAR発現セントラルメモリーT細胞、例えばCAR発現CCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージは、ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞中のCAR発現セントラルメモリーT細胞、例えばCAR発現CCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージより低い(例えば、少なくとも10、20、30若しくは40%低い)か;
(d)ステップ(iii)からの細胞の集団は、ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、セントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCD95+セントラルメモリーT細胞のより低いパーセンテージ(例えば、少なくとも10、20、30若しくは40%低い)を示すか;
(e)ステップ(iii)からの細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージは、ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージより低い(例えば、少なくとも20、30、40若しくは50%低い)か;又は
(f)ステップ(iii)からの細胞の集団中のCAR発現セントラルメモリーT細胞、例えばCAR発現CCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージは、ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞中のCAR発現セントラルメモリーT細胞、例えばCAR発現CCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージより低い(例えば、少なくとも10、20、30若しくは40%低い)、実施形態1~6のいずれか1つに記載の方法。
(b)ステップ(iii)からの細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージは、ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージより低い(例えば、少なくとも20、30、40若しくは50%低い)か;
(c)ステップ(iii)からの細胞の集団中のCAR発現セントラルメモリーT細胞、例えばCAR発現CCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージは、ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞中のCAR発現セントラルメモリーT細胞、例えばCAR発現CCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージより低い(例えば、少なくとも10、20、30若しくは40%低い)か;
(d)ステップ(iii)からの細胞の集団は、ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、セントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCD95+セントラルメモリーT細胞のより低いパーセンテージ(例えば、少なくとも10、20、30若しくは40%低い)を示すか;
(e)ステップ(iii)からの細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージは、ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージより低い(例えば、少なくとも20、30、40若しくは50%低い)か;又は
(f)ステップ(iii)からの細胞の集団中のCAR発現セントラルメモリーT細胞、例えばCAR発現CCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージは、ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞中のCAR発現セントラルメモリーT細胞、例えばCAR発現CCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージより低い(例えば、少なくとも10、20、30若しくは40%低い)、実施形態1~6のいずれか1つに記載の方法。
8.(a)ステップ(iii)からの細胞の集団中のステムメモリーT細胞、例えばCD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージは、ステップ(i)の開始時の細胞の集団中のステムメモリーT細胞、例えばCD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージと比べて増加されるか;
(b)ステップ(iii)からの細胞の集団中のCAR発現ステムメモリーT細胞、例えばCAR発現CD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージは、ステップ(i)の開始時の細胞の集団中のCAR発現ステムメモリーT細胞、例えばCAR発現CD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージと比べて増加されるか;
(c)ステップ(iii)からの細胞の集団中のステムメモリーT細胞、例えばCD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージは、ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞中のステムメモリーT細胞、例えばCD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージより高いか;又は
(d)ステップ(iii)からの細胞の集団中のCAR発現ステムメモリーT細胞、例えばCAR発現CD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージは、ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞中のCAR発現ステムメモリーT細胞、例えばCAR発現CD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージより高いか;
(e)ステップ(iii)からの細胞の集団中のステムメモリーT細胞、例えばCD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージは、ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞中のステムメモリーT細胞、例えばCD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージより高いか;又は
(f)ステップ(iii)からの細胞の集団中のCAR発現ステムメモリーT細胞、例えばCAR発現CD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージは、ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞中のCAR発現ステムメモリーT細胞、例えばCAR発現CD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージより高い、実施形態1~7のいずれか1つに記載の方法。
(b)ステップ(iii)からの細胞の集団中のCAR発現ステムメモリーT細胞、例えばCAR発現CD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージは、ステップ(i)の開始時の細胞の集団中のCAR発現ステムメモリーT細胞、例えばCAR発現CD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージと比べて増加されるか;
(c)ステップ(iii)からの細胞の集団中のステムメモリーT細胞、例えばCD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージは、ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞中のステムメモリーT細胞、例えばCD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージより高いか;又は
(d)ステップ(iii)からの細胞の集団中のCAR発現ステムメモリーT細胞、例えばCAR発現CD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージは、ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞中のCAR発現ステムメモリーT細胞、例えばCAR発現CD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージより高いか;
(e)ステップ(iii)からの細胞の集団中のステムメモリーT細胞、例えばCD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージは、ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞中のステムメモリーT細胞、例えばCD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージより高いか;又は
(f)ステップ(iii)からの細胞の集団中のCAR発現ステムメモリーT細胞、例えばCAR発現CD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージは、ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞中のCAR発現ステムメモリーT細胞、例えばCAR発現CD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージより高い、実施形態1~7のいずれか1つに記載の方法。
9.(a)ステップ(iii)からの細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up TEM vs.Down TSCM)は、ステップ(i)の開始時の細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up TEM vs.Down TSCM)とほぼ同じであるか又は約25、50、75、100若しくは125%以下だけ異なる(例えば、それ以下だけ増加される)か;
(b)ステップ(iii)からの細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up TEM vs.Down TSCM)は、
ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11若しくは12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞、又は
ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8若しくは9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞
のGeneSetScore中央値(Up TEM vs.Down TSCM)より低い(例えば、少なくとも約100、150、200、250若しくは300%低い)か;
(c)ステップ(iii)からの細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up Treg vs.Down Teff)は、ステップ(i)の開始時の細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up Treg vs.Down Teff)とほぼ同じであるか又は約25、50、100、150若しくは200%以下だけ異なる(例えば、それ以下だけ増加される)か;
(d)ステップ(iii)からの細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up Treg vs.Down Teff)は、
ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11若しくは12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞、又は
ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8若しくは9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞
のGeneSetScore中央値(Up Treg vs.Down Teff)より低い(例えば、少なくとも約50、100、125、150又は175%低い)か;
(e)ステップ(iii)からの細胞の集団のGeneSetScore中央値(Down stemness)は、ステップ(i)の開始時の細胞の集団のGeneSetScore中央値(Down stemness)とほぼ同じであるか又は約25、50、100、150、200若しくは250%以下だけ異なる(例えば、それ以下だけ増加される)か;
(f)ステップ(iii)からの細胞の集団のGeneSetScore中央値(Down stemness)は、
ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11若しくは12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞、又は
ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又若しくは9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞
のGeneSetScore中央値(Down stemness)より低い(例えば、少なくとも約50、100又は125%低い)か;
(g)ステップ(iii)からの細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up hypoxia)は、ステップ(i)の開始時の細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up hypoxia)とほぼ同じであるか又は約125、150、175若しくは200%以下だけ異なる(例えば、それ以下だけ増加される)か;
(h)ステップ(iii)からの細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up hypoxia)は、
ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11若しくは12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞、又は
ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8若しくは9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞
のGeneSetScore中央値(Up hypoxia)より低い(例えば、少なくとも約40、50、60、70又は80%低い)か;
(j)ステップ(iii)からの細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up autophagy)は、ステップ(i)の開始時の細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up autophagy)とほぼ同じであるか又は約180、190、200若しくは210%以下だけ異なる(例えば、それ以下だけ増加される)か;又は
(k)ステップ(iii)からの細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up autophagy)は、
ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞、又は
ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8若しくは9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞
のGeneSetScore中央値(Up autophagy)より低い(例えば、少なくとも約20、30又は40%低い)、実施形態1~8のいずれか1つに記載の方法。
(b)ステップ(iii)からの細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up TEM vs.Down TSCM)は、
ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11若しくは12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞、又は
ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8若しくは9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞
のGeneSetScore中央値(Up TEM vs.Down TSCM)より低い(例えば、少なくとも約100、150、200、250若しくは300%低い)か;
(c)ステップ(iii)からの細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up Treg vs.Down Teff)は、ステップ(i)の開始時の細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up Treg vs.Down Teff)とほぼ同じであるか又は約25、50、100、150若しくは200%以下だけ異なる(例えば、それ以下だけ増加される)か;
(d)ステップ(iii)からの細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up Treg vs.Down Teff)は、
ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11若しくは12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞、又は
ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8若しくは9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞
のGeneSetScore中央値(Up Treg vs.Down Teff)より低い(例えば、少なくとも約50、100、125、150又は175%低い)か;
(e)ステップ(iii)からの細胞の集団のGeneSetScore中央値(Down stemness)は、ステップ(i)の開始時の細胞の集団のGeneSetScore中央値(Down stemness)とほぼ同じであるか又は約25、50、100、150、200若しくは250%以下だけ異なる(例えば、それ以下だけ増加される)か;
(f)ステップ(iii)からの細胞の集団のGeneSetScore中央値(Down stemness)は、
ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11若しくは12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞、又は
ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又若しくは9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞
のGeneSetScore中央値(Down stemness)より低い(例えば、少なくとも約50、100又は125%低い)か;
(g)ステップ(iii)からの細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up hypoxia)は、ステップ(i)の開始時の細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up hypoxia)とほぼ同じであるか又は約125、150、175若しくは200%以下だけ異なる(例えば、それ以下だけ増加される)か;
(h)ステップ(iii)からの細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up hypoxia)は、
ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11若しくは12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞、又は
ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8若しくは9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞
のGeneSetScore中央値(Up hypoxia)より低い(例えば、少なくとも約40、50、60、70又は80%低い)か;
(j)ステップ(iii)からの細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up autophagy)は、ステップ(i)の開始時の細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up autophagy)とほぼ同じであるか又は約180、190、200若しくは210%以下だけ異なる(例えば、それ以下だけ増加される)か;又は
(k)ステップ(iii)からの細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up autophagy)は、
ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞、又は
ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8若しくは9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞
のGeneSetScore中央値(Up autophagy)より低い(例えば、少なくとも約20、30又は40%低い)、実施形態1~8のいずれか1つに記載の方法。
10.ステップ(iii)からの細胞の集団は、CARによって認識される抗原を発現する細胞と一緒にインキュベートされた後、例えば図29C~29Dに関して実施例8に記載される方法を用いて評価されるように、ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11若しくは12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞又はステップ(ii)後且つステップ(iii)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8若しくは9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞よりも高いレベル(例えば、少なくとも2、4、6、8、10、12又は14倍高い)でIL-2を分泌する、実施形態1~9のいずれか1つに記載の方法。
11.ステップ(iii)からの細胞の集団は、インビボで投与された後、ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11若しくは12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、又はステップ(ii)後且つステップ(iii)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8若しくは9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞と比べてより長く持続するか又はより高いレベルで増殖する(例えば、図4Cに関して実施例1に記載される方法を用いて評価されるように)、実施形態1~10のいずれか1つに記載の方法。
12.ステップ(iii)からの細胞の集団は、インビボで投与された後、ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11若しくは12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞又はステップ(ii)後且つステップ(iii)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8若しくは9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞よりも強力な抗腫瘍活性(例えば、低用量、例えば0.15×106、0.2×106、0.25×106若しくは0.3×106個の生存CAR発現細胞でより強力な抗腫瘍活性)を示す、実施形態1~11のいずれか1つに記載の方法。
13.ステップ(iii)からの細胞の集団は、ステップ(i)の開始時の細胞の集団と比べて、例えば生存細胞の数によって評価されて増殖されないか、又は5、10、15、20、25、30、35若しくは40%以下だけ増殖され、任意選択で、ステップ(iii)からの細胞の集団中の生存細胞の数は、ステップ(i)の開始時の細胞の集団中の生存細胞の数から減少する、実施形態1~12のいずれか1つに記載の方法。
14.ステップ(iii)からの細胞の集団は、ステップ(i)の開始時の細胞の集団と比べて増殖されないか、又は2時間未満、例えば1若しくは1.5時間未満だけ増殖される、実施形態1~13のいずれか1つに記載の方法。
15.ステップ(i)及び/又は(ii)は、IL-2、IL-15(例えば、hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-7、IL-21、IL-6(例えば、IL-6/sIL-6Ra)、LSD1阻害剤、MALT1阻害剤又はそれらの組合せを含む細胞培地(例えば、無血清培地)中で実施される、実施形態1~14のいずれか1つに記載の方法。
16.ステップ(i)及び/又は(ii)は、血清代替品を含む無血清細胞培地中で実施される、実施形態1~15のいずれか1つに記載の方法。
17.血清代替品は、CTS(商標)Immune Cell Serum Replacement(ICSR)である、実施形態16に記載の方法。
18.ステップ(i)前に、
(iv)(任意選択で)実体、例えば研究室、病院又は医療提供者から新鮮な白血球アフェレーシス産物(或いは新鮮な全血液産物、新鮮な骨髄産物又は新鮮な腫瘍若しくは臓器生検若しくは切除(例えば、胸腺除去からの新鮮な産物)などの造血組織の代替供給源)を受け取るステップ、及び
(v)新鮮な白血球アフェレーシス産物(或いは新鮮な全血液産物、新鮮な骨髄産物又は新鮮な腫瘍若しくは臓器生検若しくは切除(例えば、胸腺除去からの新鮮な産物)などの造血組織の代替供給源)から、ステップ(i)で接触させた細胞(例えば、T細胞、例えばCD8+及び/又はCD4+T細胞)の集団を単離するステップ
をさらに含み、任意選択で、
ステップ(iii)は、ステップ(v)の開始後の35時間以内、例えばステップ(v)の開始後の27、28、29、30、31、32、33、34若しくは35時間以内、例えばステップ(v)の開始後の30時間以内に実施されるか、又は
ステップ(iii)からの細胞の集団は、ステップ(v)の終了時の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて増殖されないか、又は5、10、15、20、25、30、35若しくは40%以下、例えば10%以下だけ増殖される、実施形態1~17のいずれか1つに記載の方法。
(iv)(任意選択で)実体、例えば研究室、病院又は医療提供者から新鮮な白血球アフェレーシス産物(或いは新鮮な全血液産物、新鮮な骨髄産物又は新鮮な腫瘍若しくは臓器生検若しくは切除(例えば、胸腺除去からの新鮮な産物)などの造血組織の代替供給源)を受け取るステップ、及び
(v)新鮮な白血球アフェレーシス産物(或いは新鮮な全血液産物、新鮮な骨髄産物又は新鮮な腫瘍若しくは臓器生検若しくは切除(例えば、胸腺除去からの新鮮な産物)などの造血組織の代替供給源)から、ステップ(i)で接触させた細胞(例えば、T細胞、例えばCD8+及び/又はCD4+T細胞)の集団を単離するステップ
をさらに含み、任意選択で、
ステップ(iii)は、ステップ(v)の開始後の35時間以内、例えばステップ(v)の開始後の27、28、29、30、31、32、33、34若しくは35時間以内、例えばステップ(v)の開始後の30時間以内に実施されるか、又は
ステップ(iii)からの細胞の集団は、ステップ(v)の終了時の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて増殖されないか、又は5、10、15、20、25、30、35若しくは40%以下、例えば10%以下だけ増殖される、実施形態1~17のいずれか1つに記載の方法。
19.ステップ(i)前に、実体、例えば研究室、病院又は医療提供者から、白血球アフェレーシス産物(又は全血液、骨髄又は腫瘍若しくは臓器生検若しくは切除(例えば、胸腺除去)から単離された凍結保存T細胞などの造血組織の代替供給源)から単離された凍結保存T細胞を受け取るステップをさらに含む、実施形態1~17のいずれか1つに記載の方法。
20.ステップ(i)前に、
(iv)(任意選択で)実体、例えば研究室、病院又は医療提供者から凍結保存白血球アフェレーシス産物(又は凍結保存全血液産物、凍結保存骨髄産物又は凍結保存腫瘍若しくは臓器生検若しくは切除(例えば、胸腺除去からの凍結保存産物)などの造血組織の代替供給源)を受け取るステップ、及び
(v)凍結保存白血球アフェレーシス産物(又は凍結保存全血液産物、凍結保存骨髄産物又は凍結保存腫瘍若しくは臓器生検若しくは切除(例えば、胸腺除去からの凍結保存産物)などの造血組織の代替供給源)から、ステップ(i)で接触させた細胞(例えば、T細胞、例えばCD8+及び/又はCD4+T細胞)の集団を単離するステップ
をさらに含み、任意選択で、
ステップ(iii)は、ステップ(v)の開始後の35時間以内、例えばステップ(v)の開始後の27、28、29、30、31、32、33、34若しくは35時間以内、例えばステップ(v)の開始後の30時間以内に実施されるか、又は
ステップ(iii)からの細胞の集団は、ステップ(v)の終了時の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて増殖されないか、又は5、10、15、20、25、30、35若しくは40%以下、例えば10%以下だけ増殖される、実施形態1~17のいずれか1つに記載の方法。
(iv)(任意選択で)実体、例えば研究室、病院又は医療提供者から凍結保存白血球アフェレーシス産物(又は凍結保存全血液産物、凍結保存骨髄産物又は凍結保存腫瘍若しくは臓器生検若しくは切除(例えば、胸腺除去からの凍結保存産物)などの造血組織の代替供給源)を受け取るステップ、及び
(v)凍結保存白血球アフェレーシス産物(又は凍結保存全血液産物、凍結保存骨髄産物又は凍結保存腫瘍若しくは臓器生検若しくは切除(例えば、胸腺除去からの凍結保存産物)などの造血組織の代替供給源)から、ステップ(i)で接触させた細胞(例えば、T細胞、例えばCD8+及び/又はCD4+T細胞)の集団を単離するステップ
をさらに含み、任意選択で、
ステップ(iii)は、ステップ(v)の開始後の35時間以内、例えばステップ(v)の開始後の27、28、29、30、31、32、33、34若しくは35時間以内、例えばステップ(v)の開始後の30時間以内に実施されるか、又は
ステップ(iii)からの細胞の集団は、ステップ(v)の終了時の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて増殖されないか、又は5、10、15、20、25、30、35若しくは40%以下、例えば10%以下だけ増殖される、実施形態1~17のいずれか1つに記載の方法。
21.ステップ(vi):ステップ(iii)からの細胞の集団の一部を少なくとも2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5又は7日、例えば少なくとも2日且つ7日以下にわたって培養し、且つ一部中のCAR発現レベルを測定する(例えば、一部中の生存CAR発現細胞のパーセンテージを測定する)ステップ
をさらに含み、任意選択で、
ステップ(iii)は、細胞(例えば、T細胞)の集団を採取及び凍結することを含み、且つステップ(vi)は、ステップ(iii)からの細胞の集団の一部を解凍し、部分を少なくとも2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5又は7日、例えば少なくとも2日且つ7日以下にわたって培養し、且つ一部中のCAR発現レベルを測定する(例えば、一部中の生存CAR発現細胞のパーセンテージを測定する)ことを含む、実施形態1~20のいずれか1つに記載の方法。
をさらに含み、任意選択で、
ステップ(iii)は、細胞(例えば、T細胞)の集団を採取及び凍結することを含み、且つステップ(vi)は、ステップ(iii)からの細胞の集団の一部を解凍し、部分を少なくとも2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5又は7日、例えば少なくとも2日且つ7日以下にわたって培養し、且つ一部中のCAR発現レベルを測定する(例えば、一部中の生存CAR発現細胞のパーセンテージを測定する)ことを含む、実施形態1~20のいずれか1つに記載の方法。
22.キメラ抗原受容体(CAR)を発現する細胞(例えば、T細胞)の集団を作製する方法であって、
(1)細胞(例えば、T細胞、例えば凍結白血球アフェレーシス産物から単離されたT細胞)の集団を、IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、IL-6又はそれらの組合せから選択されるサイトカインと接触させるステップ、
(2)細胞(例えば、T細胞)の集団を、CARをコードする核酸分子(例えば、DNA又はRNA分子)と接触させ、それにより核酸分子を含む細胞(例えば、T細胞)の集団を提供するステップ、及び
(3)保存(例えば、凍結保存培地中で細胞の集団を再製剤化)又は投与のために細胞(例えば、T細胞)の集団を採取するステップ
を含み、
(a)ステップ(2)は、ステップ(1)と一緒に、又はステップ(1)の開始後の5時間以内、例えばステップ(1)の開始後の1、2、3、4若しくは5時間以内に実施され、及び
ステップ(3)は、ステップ(1)の開始後の26時間以内、例えばステップ(1)の開始後の22、23若しくは24時間以内、例えばステップ(1)の開始後の24時間以内に実施されるか、又は
(b)ステップ(3)からの細胞の集団は、例えば、ステップ(1)の開始時の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて増殖されないか、又は5、10、15、20、25、30、35若しくは40%以下、例えば10%以下だけ増殖され、
任意選択で、ステップ(2)における核酸分子は、ウイルスベクター上にあり、任意選択で、ステップ(2)における核酸分子は、ウイルスベクター上のRNA分子であり、任意選択で、ステップ(2)は、細胞(例えば、T細胞)の集団を、CARをコードする核酸分子を含むウイルスベクターで形質導入することを含み、任意選択で、ステップ(2)は、形質導入中にアジュバントとしてF108を添加すること及び/又は細胞(例えば、T細胞)の集団を、Tet2を標的とするshRNAと接触させることをさらに含む、方法。
(1)細胞(例えば、T細胞、例えば凍結白血球アフェレーシス産物から単離されたT細胞)の集団を、IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、IL-6又はそれらの組合せから選択されるサイトカインと接触させるステップ、
(2)細胞(例えば、T細胞)の集団を、CARをコードする核酸分子(例えば、DNA又はRNA分子)と接触させ、それにより核酸分子を含む細胞(例えば、T細胞)の集団を提供するステップ、及び
(3)保存(例えば、凍結保存培地中で細胞の集団を再製剤化)又は投与のために細胞(例えば、T細胞)の集団を採取するステップ
を含み、
(a)ステップ(2)は、ステップ(1)と一緒に、又はステップ(1)の開始後の5時間以内、例えばステップ(1)の開始後の1、2、3、4若しくは5時間以内に実施され、及び
ステップ(3)は、ステップ(1)の開始後の26時間以内、例えばステップ(1)の開始後の22、23若しくは24時間以内、例えばステップ(1)の開始後の24時間以内に実施されるか、又は
(b)ステップ(3)からの細胞の集団は、例えば、ステップ(1)の開始時の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて増殖されないか、又は5、10、15、20、25、30、35若しくは40%以下、例えば10%以下だけ増殖され、
任意選択で、ステップ(2)における核酸分子は、ウイルスベクター上にあり、任意選択で、ステップ(2)における核酸分子は、ウイルスベクター上のRNA分子であり、任意選択で、ステップ(2)は、細胞(例えば、T細胞)の集団を、CARをコードする核酸分子を含むウイルスベクターで形質導入することを含み、任意選択で、ステップ(2)は、形質導入中にアジュバントとしてF108を添加すること及び/又は細胞(例えば、T細胞)の集団を、Tet2を標的とするshRNAと接触させることをさらに含む、方法。
23.ステップ(1)は、細胞(例えば、T細胞)の集団をIL-2と接触させることを含む、実施形態22に記載の方法。
24.ステップ(1)は、細胞(例えば、T細胞)の集団をIL-7と接触させることを含む、実施形態22に記載の方法。
25.ステップ(1)は、細胞(例えば、T細胞)の集団をIL-15(例えば、hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))と接触させることを含む、実施形態22に記載の方法。
26.ステップ(1)は、細胞(例えば、T細胞)の集団をIL-21と接触させることを含む、実施形態22に記載の方法。
27.ステップ(1)は、細胞(例えば、T細胞)の集団をIL-6(例えば、IL-6/sIL-6Ra)と接触させることを含む、実施形態22に記載の方法。
28.ステップ(1)は、細胞(例えば、T細胞)の集団をIL-7及びIL-15(例えば、hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))と接触させることを含む、実施形態22に記載の方法。
29.ステップ(1)は、細胞(例えば、T細胞)の集団をIL-7及びIL-21と接触させることを含む、実施形態22に記載の方法。
30.ステップ(1)は、細胞(例えば、T細胞)の集団をIL-15(例えば、hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))及びIL-21と接触させることを含む、実施形態22に記載の方法。
31.ステップ(1)は、細胞(例えば、T細胞)の集団をIL-7、IL-15(例えば、hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))及びIL-21と接触させることを含む、実施形態22に記載の方法。
32.ステップ(1)は、細胞(例えば、T細胞)の集団をIL-6(例えば、IL-6/sIL-6Ra)及びIL-15(例えば、hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))と接触させることを含む、実施形態22に記載の方法。
33.ステップ(1)は、細胞(例えば、T細胞)の集団をIL-2及びIL-6(例えば、IL-6/sIL-6Ra)と接触させることを含む、実施形態22に記載の方法。
34.ステップ(3)からの細胞の集団は、細胞の集団を、例えば抗CD3抗体と接触させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、CAR発現細胞の中でナイーブ細胞のより高いパーセンテージ(例えば、少なくとも10、15、20、25、30、35又は40%高い)を示す、実施形態22~33のいずれか1つに記載の方法。
35.ステップ(3)からの細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージは、
(a)ステップ(1)の開始時の細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+細胞のパーセンテージと同じであるか又は5若しくは10%以下だけ異なるか、又は
(b)ステップ(1)の開始時の細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+細胞のパーセンテージと比べて増加される、例えば少なくとも10又は20%だけ増加される、実施形態22~34のいずれか1つに記載の方法。
(a)ステップ(1)の開始時の細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+細胞のパーセンテージと同じであるか又は5若しくは10%以下だけ異なるか、又は
(b)ステップ(1)の開始時の細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+細胞のパーセンテージと比べて増加される、例えば少なくとも10又は20%だけ増加される、実施形態22~34のいずれか1つに記載の方法。
36.ステップ(3)からの細胞の集団は、ステップ(3)が、ステップ(1)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(1)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、ナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のより高いパーセンテージ(例えば、少なくとも10、20、30又は40%高い)を示す、実施形態22~35のいずれか1つに記載の方法。
37.ステップ(3)からの細胞の集団は、ステップ(2)後且つステップ(3)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、ナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のより高いパーセンテージ(例えば、少なくとも10、20、30又は40%高い)を示す、実施形態22~36のいずれか1つに記載の方法。
38.ステップ(3)からの細胞の集団は、インビボで投与された後、ステップ(3)が、ステップ(1)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(1)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、より長く持続するか又はより高いレベルで増殖する(例えば、図4Cに関して実施例1に記載される方法を用いて評価されるように)、実施形態22~37のいずれか1つに記載の方法。
39.ステップ(3)からの細胞の集団は、インビボで投与された後、ステップ(2)後且つステップ(3)前に細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、より長く持続するか又はより高いレベルで増殖する(例えば、図4Cに関して実施例1に記載される方法を用いて評価されるように)、実施形態22~38のいずれか1つに記載の方法。
40.ステップ(3)からの細胞の集団は、ステップ(1)の開始時の細胞の集団と比べて、例えば生存細胞の数によって評価されて増殖されないか、又は5、10、15、20、25、30、35若しくは40%以下、例えば10%以下だけ増殖され、任意選択で、ステップ(3)からの細胞の集団中の生存細胞の数は、ステップ(1)の開始時の細胞の集団中の生存細胞の数から減少する、実施形態22~39のいずれか1つに記載の方法。
41.ステップ(3)からの細胞の集団は、ステップ(1)の開始時の細胞の集団と比べて増殖されないか、又は2時間未満、例えば1若しくは1.5時間未満だけ増殖される、実施形態22~40のいずれか1つに記載の方法。
42.細胞の集団は、(A)CD3/TCR複合体を刺激する薬剤並びに/又は(B)細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤とインビトロで接触させないか、又は接触させる場合、接触ステップは、2時間未満、例えば1若しくは1.5時間以下である、実施形態22~41のいずれか1つに記載の方法。
43.CD3/TCR複合体を刺激する薬剤は、CD3を刺激する薬剤(例えば、表27に提供されるそれぞれのCDRを含む抗CD3若しくは抗TCR抗体フラグメント)であり、共刺激分子及び/又は増殖因子受容体を刺激する薬剤は、CD28若しくはCD2を刺激する薬剤(例えば、例えば、表27に提供されるそれぞれのCDRを含む抗CD28若しくは抗CD2抗体フラグメント)又はその任意の組合せであり、任意選択で、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤は、CD3を刺激する薬剤であり、共刺激分子及び/又は増殖因子受容体を刺激する薬剤は、多重特異性結合分子、任意選択で、図50Aに提供されるスキームのいずれか1つにおいて立体配置される二重特異性分子に含まれる、実施形態42に記載の方法。
44.ステップ(1)及び/又は(2)は、
5、4、3、2、1又は0%以下の血清(任意選択で、ステップ(1)及び/又は(2)は、約2%の血清を含む細胞培地中で実施される)又は
LSD1阻害剤又はMALT1阻害剤
を含む細胞培地中で実施される、実施形態22~43のいずれか1つに記載の方法。
5、4、3、2、1又は0%以下の血清(任意選択で、ステップ(1)及び/又は(2)は、約2%の血清を含む細胞培地中で実施される)又は
LSD1阻害剤又はMALT1阻害剤
を含む細胞培地中で実施される、実施形態22~43のいずれか1つに記載の方法。
45.実体、例えば研究室、病院又は医療提供者から凍結保存白血球アフェレーシス産物(又は凍結保存全血液産物、凍結保存骨髄産物又は凍結保存腫瘍若しくは臓器生検若しくは切除(例えば、胸腺除去からの凍結保存産物)などの造血組織の代替供給源)を受け取るステップをさらに含む、実施形態22~44のいずれか1つに記載の方法。
46.ステップ(i)又はステップ(1)の開始時の細胞の集団は、IL6R発現細胞(例えば、IL6Rα及び/又はIL6Rβについて陽性の細胞)について濃縮されている、実施形態1~45のいずれか1つに記載の方法。
47.ステップ(i)又はステップ(1)の開始時の細胞の集団は、少なくとも50、60若しくは70%のIL6R発現細胞(例えば、IL6Rα及び/又はIL6Rβについて陽性の細胞)を含む、実施形態1~46のいずれか1つに記載の方法。
48.ステップ(i)及び(ii)又はステップ(1)及び(2)は、IL-15(例えば、hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))を含む細胞培地中で実施される、実施形態1~47のいずれか1つに記載の方法。
49.IL-15は、細胞の集団が例えば10、15、20又は25日後に増殖する能力を増加させる、実施形態48に記載の方法。
50.IL-15は、細胞の集団中のIL6Rβ発現細胞のパーセンテージを増加させる、実施形態48に記載の方法。
51.CARは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、実施形態1~50のいずれか1つに記載の方法。
52.抗原結合ドメインは、CD19、CD20、CD22、BCMA、メソテリン、EGFRvIII、GD2、Tn抗原、sTn抗原、Tn-O-グリコペプチド、sTn-O-グリコペプチド、PSMA、CD97、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、レグマン、GD3、CD171、IL-11Ra、PSCA、MAD-CT-1、MAD-CT-2、VEGFR2、ルイスY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、葉酸受容体α、ERBB(例えば、ERBB2)、Her2/neu、MUC1、EGFR、NCAM、エフリンB2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、o-アセチル-GD2、葉酸受容体β、TEM1/CD248、TEM7R、FAP、レグマイン、HPV E6若しくはE7、ML-IAP、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、ポリシアル酸、Fos関連抗原、好中球エラスターゼ、TRP-2、CYP1B1、精子タンパク質17、βヒト絨毛性ゴナドトロピン、AFP、チログロブリン、PLAC1、グロボH、RAGE1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、腸カルボキシエステラーゼ、mut hsp 70-2、NA-17、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、NY-ESO-1、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP、GFRα4又はMHCに提示されるこれらの抗原のいずれかのペプチドから選択される抗原に結合する、実施形態51に記載の方法。
53.抗原結合ドメインは、本明細書に開示されるCDR、VH、VL、scFv又はCAR配列を含み、任意選択で、
(a)抗原結合ドメインは、BCMAに結合し、且つ表3~15に開示されるCDR、VH、VL、scFv若しくはCAR配列又はそれと少なくとも80%、85%、90%、95%若しくは99%の同一性を有する配列を含むか;
(b)抗原結合ドメインは、CD19に結合し、且つ表2に開示されるCDR、VH、VL、scFv若しくはCAR配列又はそれと少なくとも80%、85%、90%、95%若しくは99%の同一性を有する配列を含むか;
(c)抗原結合ドメインは、CD20に結合し、且つ本明細書に開示されるCDR、VH、VL、scFv若しくはCAR配列又はそれと少なくとも80%、85%、90%、95%若しくは99%の同一性を有する配列を含むか;又は
(d)抗原結合ドメインは、CD22に結合し、且つ本明細書に開示されるCDR、VH、VL、scFv若しくはCAR配列又はそれと少なくとも80%、85%、90%、95%若しくは99%の同一性を有する配列を含む、実施形態51又は52に記載の方法。
(a)抗原結合ドメインは、BCMAに結合し、且つ表3~15に開示されるCDR、VH、VL、scFv若しくはCAR配列又はそれと少なくとも80%、85%、90%、95%若しくは99%の同一性を有する配列を含むか;
(b)抗原結合ドメインは、CD19に結合し、且つ表2に開示されるCDR、VH、VL、scFv若しくはCAR配列又はそれと少なくとも80%、85%、90%、95%若しくは99%の同一性を有する配列を含むか;
(c)抗原結合ドメインは、CD20に結合し、且つ本明細書に開示されるCDR、VH、VL、scFv若しくはCAR配列又はそれと少なくとも80%、85%、90%、95%若しくは99%の同一性を有する配列を含むか;又は
(d)抗原結合ドメインは、CD22に結合し、且つ本明細書に開示されるCDR、VH、VL、scFv若しくはCAR配列又はそれと少なくとも80%、85%、90%、95%若しくは99%の同一性を有する配列を含む、実施形態51又は52に記載の方法。
54.抗原結合ドメインは、VH及びVLを含み、VH及びVLは、リンカーによって連結され、任意選択で、リンカーは、配列番号63又は104のアミノ酸配列を含む、実施形態51~53のいずれか1つに記載の方法。
55.(a)膜貫通ドメインは、T細胞受容体のα、β又はζ鎖、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及びCD154から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含むか、
(b)膜貫通ドメインは、CD8の膜貫通ドメインを含むか、
(c)膜貫通ドメインは、配列番号6のアミノ酸配列又はそれと少なくとも約85%、90%、95%若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は
(d)核酸分子は、膜貫通ドメインをコードする核酸配列を含み、核酸配列は、配列番号17の核酸配列又はそれと少なくとも約85%、90%、95%若しくは99%の配列同一性を有する核酸配列を含む、実施形態51~54のいずれか1つに記載の方法。
(b)膜貫通ドメインは、CD8の膜貫通ドメインを含むか、
(c)膜貫通ドメインは、配列番号6のアミノ酸配列又はそれと少なくとも約85%、90%、95%若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は
(d)核酸分子は、膜貫通ドメインをコードする核酸配列を含み、核酸配列は、配列番号17の核酸配列又はそれと少なくとも約85%、90%、95%若しくは99%の配列同一性を有する核酸配列を含む、実施形態51~54のいずれか1つに記載の方法。
56.抗原結合ドメインは、ヒンジ領域によって膜貫通ドメインに連結され、任意選択で、
(a)ヒンジ領域は、配列番号2、3若しくは4のアミノ酸配列又はそれと少なくとも約85%、90%、95%若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は
(b)核酸分子は、ヒンジ領域をコードする核酸配列を含み、核酸配列は、配列番号13、14若しくは15の核酸配列又はそれと少なくとも約85%、90%、95%若しくは99%の配列同一性を有する核酸配列を含む、実施形態51~55のいずれか1つに記載の方法。
(a)ヒンジ領域は、配列番号2、3若しくは4のアミノ酸配列又はそれと少なくとも約85%、90%、95%若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は
(b)核酸分子は、ヒンジ領域をコードする核酸配列を含み、核酸配列は、配列番号13、14若しくは15の核酸配列又はそれと少なくとも約85%、90%、95%若しくは99%の配列同一性を有する核酸配列を含む、実施形態51~55のいずれか1つに記載の方法。
57.細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインを含み、任意選択で、一次シグナル伝達ドメインは、CD3ζ、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(ICOS)、FcεRI、DAP10、DAP12又はCD66dに由来する機能性シグナル伝達ドメインを含み、任意選択で、
(a)一次シグナル伝達ドメインは、CD3ζに由来する機能性シグナル伝達ドメインを含むか、
(b)一次シグナル伝達ドメインは、配列番号9若しくは10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも約85%、90%、95%若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は
(c)核酸分子は、一次シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列を含み、核酸配列は、配列番号20若しくは21の核酸配列又はそれと少なくとも約85%、90%、95%若しくは99%の配列同一性を有する核酸配列を含む、実施形態51~56のいずれか1つに記載の方法。
(a)一次シグナル伝達ドメインは、CD3ζに由来する機能性シグナル伝達ドメインを含むか、
(b)一次シグナル伝達ドメインは、配列番号9若しくは10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも約85%、90%、95%若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は
(c)核酸分子は、一次シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列を含み、核酸配列は、配列番号20若しくは21の核酸配列又はそれと少なくとも約85%、90%、95%若しくは99%の配列同一性を有する核酸配列を含む、実施形態51~56のいずれか1つに記載の方法。
58.細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含み、任意選択で、共刺激シグナル伝達ドメインは、MHCクラスI分子、TNF受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子(SLAMタンパク質)、活性化NK細胞受容体、BTLA、Tollリガンド受容体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、4-1BB(CD137)、B7-H3、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD28-OX40、CD28-4-1BB又はCD83と特異的に結合するリガンドを含み、任意選択で、
(a)共刺激シグナル伝達ドメインは、4-1BBに由来する機能性シグナル伝達ドメインを含むか、
(b)共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号7のアミノ酸配列又はそれと少なくとも約85%、90%、95%若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は
(c)核酸分子は、共刺激シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列を含み、核酸配列は、配列番号18の核酸配列又はそれと少なくとも約85%、90%、95%若しくは99%の配列同一性を有する核酸配列を含む、実施形態51~57のいずれか1つに記載の方法。
(a)共刺激シグナル伝達ドメインは、4-1BBに由来する機能性シグナル伝達ドメインを含むか、
(b)共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号7のアミノ酸配列又はそれと少なくとも約85%、90%、95%若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は
(c)核酸分子は、共刺激シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列を含み、核酸配列は、配列番号18の核酸配列又はそれと少なくとも約85%、90%、95%若しくは99%の配列同一性を有する核酸配列を含む、実施形態51~57のいずれか1つに記載の方法。
59.細胞内シグナル伝達ドメインは、4-1BBに由来する機能性シグナル伝達ドメインと、CD3ζに由来する機能性シグナル伝達ドメインとを含み、任意選択で、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号7のアミノ酸配列(又はそれと少なくとも約85%、90%、95%若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列)と、配列番号9若しくは10のアミノ酸配列(又はそれと少なくとも約85%、90%、95%若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列)とを含み、任意選択で、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号7のアミノ酸配列と、配列番号9又は10のアミノ酸配列とを含む、実施形態51~58のいずれか1つに記載の方法。
60.CARは、配列番号1のアミノ酸配列を含むリーダー配列をさらに含む、実施形態51~59のいずれか1つに記載の方法。
61.実施形態1~60のいずれか1つに記載の方法によって作製されるCAR発現細胞(例えば、自家若しくは同種異系CAR発現T細胞又はNK細胞)の集団。
62.CARを発現するように操作された細胞の集団(「CAR発現細胞の集団」)であって、
(a)CARを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RO-CCR7+細胞のパーセンテージと比べて、ほぼ同じパーセンテージのナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RO-CCR7+細胞;
(b)CARを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RO-CCR7+細胞のパーセンテージと比べて、ナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RO-CCR7+細胞の約5%~約10%以内の変化;
(c)CARを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RO-CCR7+細胞のパーセンテージと比べて、増加された、例えば少なくとも1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8又は3倍増加されたパーセンテージのナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RO-CCR7+細胞;
(d)CARを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージと比べて、ほぼ同じパーセンテージのセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCCR7+CD45RO+T細胞;
(e)CARを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージと比べて、セントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCCR7+CD45RO+T細胞の約5%~約10%以内の変化;
(f)CARを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージと比べて、減少された、例えば少なくとも20、25、30、35、40、45又は50%減少されたパーセンテージのセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCCR7+CD45RO+T細胞;
(g)CARを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のステムメモリーT細胞、例えばCD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージと比べて、ほぼ同じパーセンテージのステムメモリーT細胞、例えばCD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞;
(h)CARを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のステムメモリーT細胞、例えばCD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージと比べて、ステムメモリーT細胞、例えばCD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞の約5%~約10%以内の変化;又は
(i)CARを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のステムメモリーT細胞、例えばCD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージと比べて、増加されたパーセンテージのステムメモリーT細胞、例えばCD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞
を含む細胞の集団。
(a)CARを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RO-CCR7+細胞のパーセンテージと比べて、ほぼ同じパーセンテージのナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RO-CCR7+細胞;
(b)CARを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RO-CCR7+細胞のパーセンテージと比べて、ナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RO-CCR7+細胞の約5%~約10%以内の変化;
(c)CARを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RO-CCR7+細胞のパーセンテージと比べて、増加された、例えば少なくとも1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8又は3倍増加されたパーセンテージのナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RO-CCR7+細胞;
(d)CARを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージと比べて、ほぼ同じパーセンテージのセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCCR7+CD45RO+T細胞;
(e)CARを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージと比べて、セントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCCR7+CD45RO+T細胞の約5%~約10%以内の変化;
(f)CARを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージと比べて、減少された、例えば少なくとも20、25、30、35、40、45又は50%減少されたパーセンテージのセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCCR7+CD45RO+T細胞;
(g)CARを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のステムメモリーT細胞、例えばCD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージと比べて、ほぼ同じパーセンテージのステムメモリーT細胞、例えばCD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞;
(h)CARを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のステムメモリーT細胞、例えばCD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージと比べて、ステムメモリーT細胞、例えばCD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞の約5%~約10%以内の変化;又は
(i)CARを発現するように操作される前の同じ細胞の集団中のステムメモリーT細胞、例えばCD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージと比べて、増加されたパーセンテージのステムメモリーT細胞、例えばCD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞
を含む細胞の集団。
63.CARを発現するように操作された細胞の集団(「CAR発現細胞の集団」)であって、
(a)細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up TEM vs.Down TSCM)は、CARを発現するように操作される前の同じ細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up TEM vs.Down TSCM)とほぼ同じであるか、又は約25、50、75、100若しくは125%以下だけ異なる(例えば、それ以下だけ増加される)か;
(b)細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up Treg vs.Down Teff)は、CARを発現するように操作される前の細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up Treg vs.Down Teff)とほぼ同じであるか、又は約25、50、100、150若しくは200%以下だけ異なる(例えば、それ以下だけ増加される)か;
(c)細胞の集団のGeneSetScore中央値(Down stemness)は、CARを発現するように操作される前の細胞の集団のGeneSetScore中央値(Down stemness)とほぼ同じであるか、又は約25、50、100、150、200若しくは250%以下だけ異なる(例えば、それ以下だけ増加される)か;
(d)細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up hypoxia)は、CARを発現するように操作される前の細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up hypoxia)とほぼ同じであるか、又は約125、150、175若しくは200%以下だけ異なる(例えば、それ以下だけ増加される)か;又は
(e)細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up autophagy)は、CARを発現するように操作される前の細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up autophagy)とほぼ同じであるか、又は約180、190、200若しくは210%以下だけ異なる(例えば、それ以下だけ増加される)、細胞の集団。
(a)細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up TEM vs.Down TSCM)は、CARを発現するように操作される前の同じ細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up TEM vs.Down TSCM)とほぼ同じであるか、又は約25、50、75、100若しくは125%以下だけ異なる(例えば、それ以下だけ増加される)か;
(b)細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up Treg vs.Down Teff)は、CARを発現するように操作される前の細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up Treg vs.Down Teff)とほぼ同じであるか、又は約25、50、100、150若しくは200%以下だけ異なる(例えば、それ以下だけ増加される)か;
(c)細胞の集団のGeneSetScore中央値(Down stemness)は、CARを発現するように操作される前の細胞の集団のGeneSetScore中央値(Down stemness)とほぼ同じであるか、又は約25、50、100、150、200若しくは250%以下だけ異なる(例えば、それ以下だけ増加される)か;
(d)細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up hypoxia)は、CARを発現するように操作される前の細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up hypoxia)とほぼ同じであるか、又は約125、150、175若しくは200%以下だけ異なる(例えば、それ以下だけ増加される)か;又は
(e)細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up autophagy)は、CARを発現するように操作される前の細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up autophagy)とほぼ同じであるか、又は約180、190、200若しくは210%以下だけ異なる(例えば、それ以下だけ増加される)、細胞の集団。
64.実施形態61~63のいずれか1つに記載のCAR発現細胞の集団と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
65.対象の免疫応答を増加させる方法であって、実施形態61~63のいずれか1つに記載のCAR発現細胞の集団又は実施形態64に記載の医薬組成物を対象に投与し、それにより対象の免疫応答を増加させるステップを含む方法。
66.対象の癌を処置する方法であって、実施形態61~63のいずれか1つに記載のCAR発現細胞の集団又は実施形態64に記載の医薬組成物を対象に投与し、それにより対象の癌を処置するステップを含む方法。
67.癌は、例えば、中皮腫、悪性胸膜中皮腫、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、扁平上皮癌、大細胞肺癌、膵臓癌、膵管腺癌、食道腺癌、乳癌、膠芽腫、卵巣癌、大腸癌、前立腺癌、子宮頸癌、皮膚癌、黒色腫、腎癌、肝臓癌、脳腫瘍、胸腺腫、肉腫、癌腫、子宮癌、腎臓癌、消化管癌、尿路上皮癌、咽頭癌、頭部及び頸部癌、直腸癌、食道癌若しくは膀胱癌の1つ以上から選択される固形癌又はその転移である、実施形態66に記載の方法。
68.癌は、例えば、慢性リンパ性白血病(CLL)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、多発性骨髄腫、急性リンパ性白血病(ALL)、ホジキンリンパ腫、B細胞急性リンパ性白血病(BALL)、T細胞急性リンパ性白血病(TALL)、小リンパ球性白血病(SLL)、B細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、慢性炎症を伴うDLBCL、慢性骨髄性白血病、骨髄増殖性腫瘍、濾胞性リンパ腫、小児性濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞型若しくは大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖性病態、MALTリンパ腫(粘膜関連リンパ組織型節外性濾胞辺縁帯リンパ腫)、辺縁帯リンパ腫、骨髄形成異常、骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、脾辺縁帯リンパ腫、脾リンパ腫/白血病、脾臓びまん性赤脾髄小細胞型B細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病-変異型、リンパ形質細胞性リンパ腫、H鎖病、プラズマ細胞骨髄腫、孤立性骨形質細胞腫、骨外性形質細胞腫、節性辺縁帯リンパ腫、小児性節性辺縁帯リンパ腫、原発性皮膚濾胞中心リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、原発性縦隔(胸腺)大細胞型B細胞リンパ腫、血管内大細胞型B細胞リンパ腫、ALK+大細胞型B細胞リンパ腫、HHV8関連多中心性キャッスルマン病に発生する大細胞型B細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、B細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病(AML)又は分類不能なリンパ腫から選択される液性癌である、実施形態66に記載の方法。
69.第2の治療薬を対象に投与するステップをさらに含む、実施形態65~68のいずれか1つに記載の方法。
70.第2の治療薬は、IL-15(例えば、hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))である、実施形態69に記載の方法。
71.第2の治療薬は、イブルチニブである、実施形態69に記載の方法。
72.イブルチニブは、約600mg、約550mg、約500mg、約480mg、約460mg、約440mg、約420mg、約400mg、約350mg、約300mg、約280mg、約250mg、約200mg、約190mg、約180mg、約170mg、約160mg、約150mg、約140mg、約130mg、約120mg又は100mgの用量で毎日1回投与される、実施形態71に記載の方法。
73.イブルチニブは、420mg、280mg又は140mgの用量で毎日1回投与される、実施形態71に記載の方法。
74.イブルチニブは、CAR発現細胞の集団の投与前、それと同時又はその後に投与される、実施形態71~73のいずれか1つに記載の方法。
75.CAR発現細胞の集団は、実施形態21において測定されるCAR発現細胞のパーセンテージに基づいて決定された用量で投与される、実施形態65~74のいずれか1つに記載の方法。
76.CAR発現細胞(例えば、CD19CAR発現細胞)の集団は、約0.5×106~50×106個の生存CAR発現細胞、例えば約5×106個の生存CAR発現細胞の用量で投与され、任意選択で、CAR発現細胞(例えば、CD19CAR発現細胞)の集団は、5×106個の生存CAR発現細胞の用量で投与される、実施形態65~75のいずれか1つに記載の方法。
77.CAR発現細胞(例えば、CD19CAR発現細胞)の集団は、約2.5×106~2.5×108個の生存CAR発現細胞、例えば約2.5×107個の生存CAR発現細胞の用量で投与され、任意選択で、CAR発現細胞(例えば、CD19CAR発現細胞)の集団は、2.5×107個の生存CAR発現細胞の用量で投与される、実施形態65~75のいずれか1つに記載の方法。
78.CAR発現細胞(例えば、CD19CAR発現細胞)の集団は、約1.25×107~1.25×109個の生存CAR発現細胞、例えば約1.25×108個の生存CAR発現細胞の用量で投与され、任意選択で、CAR発現細胞(例えば、CD19CAR発現細胞)の集団は、1.25×108個の生存CAR発現細胞の用量で投与される、実施形態65~75のいずれか1つに記載の方法。
79.CAR発現細胞(例えば、BCMA CAR発現細胞)の集団は、約2.5×106~2.5×108個の生存CAR発現細胞、例えば約1×107又は5×107個の生存CAR発現細胞の用量で投与される、実施形態65~75のいずれか1つに記載の方法。
80.対象は、CLL又はSLLを有する、実施形態66~79のいずれか1つに記載の方法。
81.対象は、DLBCL、例えば再発性及び/又は難治性DLBCLを有する、実施形態66~79のいずれか1つに記載の方法。
82.対象は、例えば、少なくとも2、2.5、3、3.5又は4日、例えば約3日にわたってサイトカイン放出症候群の兆候についてモニターされる、実施形態65~81のいずれか1つに記載の方法。
83.対象の免疫応答を増加させる方法に使用するための、実施形態61~63のいずれか1つに記載のCAR発現細胞の集団又は実施形態64に記載の医薬組成物であって、前記方法は、有効量のCAR発現細胞の集団又は有効量の医薬組成物を対象に投与するステップを含む、CAR発現細胞の集団又は医薬組成物。
84.対象の癌を処置する方法に使用するための、実施形態61~63のいずれか1つに記載のCAR発現細胞の集団又は実施形態64に記載の医薬組成物であって、前記方法は、有効量のCAR発現細胞の集団又は有効量の医薬組成物を対象に投与するステップを含む、CAR発現細胞の集団又は医薬組成物。
本明細書に記載のものと同様の又は均等な方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、適切な方法及び材料を以下に記載する。本明細書に記載の全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参照文献(例えば、配列データベース参照番号)は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、本明細書で(例えば、本明細書の任意の表において)言及される全てのGenBank、Unigene及びEntrez配列は、参照により組み込まれる。1つの遺伝子又はタンパク質が複数の配列受託番号を参照する場合、全ての配列変異体が包含される。
さらに、材料、方法及び例は、単なる例示であり、限定を意図するものではない。見出し、副見出し又は番号若しくは文字が振られた要素、例えば(a)、(b)、(i)等は、単に読み易いように提供される。本明細書で見出し又は番号若しくは文字が振られた要素を使用しても、ステップ若しくは要素がアルファベット順に実施される必要はないか、又はステップ若しくは要素が必ず互いに別個のものである必要はない。本発明の他の特徴、目的及び利点は、説明及び図面並びに特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
定義
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が関係する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が関係する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。
用語「1つの(a)」及び「1つの(an)」は、その冠詞の文法上の指示対象の1つ又は1つより多い(即ち少なくとも1つ)を指す。例として、「要素」は、1つの要素又は1つより多い要素を意味する。
用語「約」は、量、時間的な継続期間などの計測可能な値を参照するとき、指定される値から±20%又は一部の例では±10%、又は一部の例では±5%、又は一部の例では±1%、又は一部の例では±0.1%の変動が、かかる変動が本開示の方法の実施に適切であるものとして包含されることを意味する。
本発明の組成物及び方法は、指定された配列を有するポリペプチド及び核酸又はそれと実質的に同一若しくは類似の配列、例えば指定された配列と少なくとも85%、90%若しくは95%以上同一の配列を包含する。アミノ酸配列に関連して、用語「実質的に同一の」は、本明細書において、第1及び第2アミノ酸配列が共通の構造ドメイン及び/若しくは共通の機能活性を有し得るように、第2アミノ酸配列内のアラインメントされたアミノ酸残基とi)同一であるか、又はii)その保存的置換である十分な若しくは最小数のアミノ酸残基を含有する第1アミノ酸配列、例えば参照配列、例えば本明細書に記載の配列に対して少なくとも約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有する共通の構造ドメインを含有するアミノ酸配列を指すために使用される。
ヌクレオチド配列に関連して、用語「実質的に同一の」は、本明細書において、第1及び第2ヌクレオチド配列が共通の機能活性を有するポリペプチドをコードするか、又は共通の構造ポリペプチドドメイン若しくは共通の機能性ポリペプチド活性をコードするように、第2核酸配列内のアラインメントされたヌクレオチドと同一である十分な若しくは最小数のヌクレオチドを含有する第1核酸配列、例えば参照配列、例えば本明細書に記載の配列に対して少なくとも約75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するヌクレオチド配列を指すために使用される。
用語「変異体」は、参照アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するか、又は実質的に同一のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを指す。一部の実施形態では、変異体は、機能性変異体である。
用語「機能性変異体」は、参照アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するか、又は実質的に同一のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドで、参照アミノ酸配列の1つ以上の活性を有し得るポリペプチドを指す。
用語サイトカイン(例えば、IL-2、IL-7、IL-15、IL-21又はIL-6)は、完全長の天然に存在するサイトカイン、断片又は変異体、例えば機能性変異体(天然に存在するサイトカインの活性、例えば免疫調節活性の少なくとも10%、30%、50%若しくは80%を有するその断片及び機能性変異体を含む)を包含する。一部の実施形態では、サイトカインは、天然に存在するサイトカインと実質的に同一(例えば、少なくとも約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性)であるか、又はサイトカインをコードする天然に存在するヌクレオチド配列と実質的に同一(例えば、少なくとも約75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性)であるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、文脈から理解される通り、サイトカインは、受容体ドメイン、例えばサイトカイン受容体ドメイン(例えば、IL-15/IL-15R)をさらに含む。
用語「キメラ抗原受容体」又は代替的に「CAR」は、下に定義されるような、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び刺激性分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン(本明細書では「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも称する)を含む組換えポリペプチド構築物を指す。一部の実施形態では、CARポリペプチド構築物中のドメインは、同じポリペプチド鎖内に例えばキメラ融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、CARポリペプチド構築物内のドメインは、互いに隣接しておらず、例えば異なるポリペプチド鎖内、例えば本明細書に記載される通りRCAR内に提供される。
一部の実施形態において、細胞質シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン(例えば、CD3ζの一次シグナル伝達ドメイン)を含む。一部の実施形態では、細胞質シグナル伝達ドメインは、下に定義するような少なくとも1つの共刺激分子由来の1つ以上の機能的シグナル伝達ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、共刺激分子は、41BB(即ちCD137)、CD27、ICOS及び/又はCD28から選択される。一部の実施形態では、CARは、細胞外抗原認識ドメインを含むキメラ融合タンパク質、膜貫通ドメイン及び刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、CARは、細胞外抗原認識ドメインを含むキメラ融合タンパク質、膜貫通ドメイン並びに共刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメイン及び刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、CARは、細胞外抗原認識ドメインを含むキメラ融合タンパク質、膜貫通ドメイン並びに1つ以上の共刺激分子由来の2つの機能的シグナル伝達ドメイン及び刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、CARは、細胞外抗原認識ドメインを含むキメラ融合タンパク質、膜貫通ドメイン並びに1つ以上の共刺激分子由来の少なくとも2つの機能的シグナル伝達ドメイン及び刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、CARは、CAR融合タンパク質のアミノ末端(N末端)に任意選択のリーダー配列を含む。一部の実施形態では、CARは、細胞外抗原認識ドメインのN末端のリーダー配列をさらに含み、このリーダー配列は、細胞プロセシング及びCARの細胞膜への局在化中に抗原認識ドメイン(例えば、scFv)から任意選択により切断される。
本明細書に記載のものなどの特定の腫瘍抗原X(Xは、本明細書に記載されるような腫瘍マーカーであり得る)を標的とする抗原結合ドメイン(例えば、scFv、単一ドメイン抗体又はTCR(例えば、TCRα結合ドメイン若しくはTCRβ結合ドメイン))を含むCARは、XCARとも称される。例えば、BCMAを標的とする抗原結合ドメインを含むCARは、BCMA CARと称される。CARは、任意の細胞、例えば本明細書に記載される免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞若しくはNK細胞)に発現され得る。
「シグナル伝達ドメイン」という用語は、セカンドメッセンジャーを生成することにより、又はそのようなメッセンジャーに応答することによりエフェクターとして機能することにより、特定されたシグナル伝達経路を介して細胞活性を調節するために細胞内で情報を伝達することにより作用するタンパク質の機能的部分を指す。
用語「抗体」は、本明細書で使用されるとき、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子に由来するタンパク質又はポリペプチド配列を指す。抗体は、ポリクローナル又はモノクローナル、多重鎖又は単鎖又はインタクトな免疫グロブリンであり得、及び天然の供給源又は組換え供給源に由来し得る。抗体は、免疫グロブリン分子の四量体であり得る。
用語「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の少なくとも一部又はその組換え変異体を指し、また標的、例えば抗原に対し、抗体フラグメントの認識及び特異的結合を付与する上で十分な抗原結合ドメイン、例えばインタクトな抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体フラグメントの例は、Fab、Fab’、F(ab’)2及びFvフラグメント、scFv抗体フラグメント、線形抗体、sdAbなどの単一ドメイン抗体(VL又はVHのいずれか)、ラクダ科VHHドメイン並びにヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された2つ以上、例えば2つのFabフラグメント又は連結された抗体の2つ以上、例えば2つの単離CDR若しくは他のエピトープフラグメントを含む二価フラグメントなどの抗体フラグメントから形成される多特異性抗体を含むが、これらに限定されない。抗体フラグメントは、シングルドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、v-NAR及びビス-scFvにも取り込まれ得る(例えば、Hollinger and Hudson,Nature Biotechnology 23:1126-1136,2005を参照されたい)。抗体フラグメントは、フィブロネクチンIII型(Fn3)などのポリペプチドをベースとする足場にもグラフトされ得る(フィブロネクチンポリペプチドミニボディについて記載している米国特許第6,703,199号明細書を参照されたい)。用語「scFv」は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも1つの抗体フラグメントと、重鎖の可変領域を含む少なくとも1つの抗体フラグメントとを含む融合タンパク質を指し、軽鎖及び重鎖可変領域は、短い可動性ポリペプチドリンカーによって近接して連結されており、単鎖ポリペプチドとして発現することが可能であり、及びscFvは、その由来であるインタクトな抗体の特異性を保持している。指定されない限り、本明細書で使用されるとき、scFvは、VL及びVH可変領域を例えばポリペプチドのN端側及びC端側末端に対していずれの順序でも有し得、scFvは、VL-リンカー-VHを含み得るか又はVH-リンカー-VLを含み得る。
一部の実施形態では、scFvは、NH2-VL-リンカー-VH-COOH又はNH2-VH-リンカー-VL-COOHの構造を含み得る。
本明細書で使用される「相補性決定領域」又は「CDR」という用語は、抗原特異性及び結合親和性を与える抗体可変領域内のアミノ酸の配列を指す。例えば、一般に、各重鎖可変領域(例えば、HCDR1、HCDR2及びHCDR3)には3つのCDRがあり、各軽鎖可変領域(LCDR1、LCDR2及びLCDR3)には3つのCDRがある。ある所与のCDRの厳密なアミノ酸配列境界は、Kabat et al.(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest”,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(「Kabat」番号付けスキーム)、Al-Lazikani et al.,(1997)JMB 273,927-948(「Chothia」番号付けスキーム)により記載のもの又はその組み合わせを含む、多くの周知のスキームのいずれかを使用して決定できる。KabatとChothiaを組み合わせた番号付けスキームでは、一部の実施形態において、CDRは、Kabat CDRの一部、Chothia CDRの一部又はその両方であるアミノ酸残基に対応する。
抗体又はその抗体フラグメントを含む本発明のCAR組成物の部分は、種々の形態で存在し得、例えば、ここで、抗原結合ドメインは、例えば、単一ドメイン抗体フラグメント(sdAb)、単鎖抗体(scFv)又は例えばヒト型若しくはヒト化抗体を含め、ポリペプチド鎖の一部として発現する(Harlow et al.,1999,Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY;Harlow et al.,1989,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York;Houston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883;Bird et al.,1988,Science 242:423-426)。一部の実施形態では、本発明のCARの抗原結合ドメインは、抗体フラグメントを含む。一部の実施形態では、CARは、scFvを含む抗体フラグメントを含む。
本明細書で使用されるとき、用語「結合ドメイン」又は「抗体分子」(本明細書では「抗標的結合ドメイン」とも称される)は、少なくとも1つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質、例えば免疫グロブリン鎖又はそのフラグメントを指す。用語「結合ドメイン」又は「抗体分子」は、抗体及び抗体フラグメントを包含する。一部の実施形態では、抗体分子は、多重特異性抗体分子であり、例えば、これは、複数個の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、ここで、複数のうちの第1の免疫グロブリン可変ドメイン配列が第1のエピトープに対する結合特異性を有し、複数のうちの第2の免疫グロブリン可変ドメイン配列が第2のエピトープに対する結合特異性を有する。ある実施形態において、多重特異性抗体分子は、二重特異性抗体分子である。二重特異性抗体は、2つ以下の抗原に対して特異性を有する。二重特異性抗体分子は、第1のエピトープに対して結合特異性を有する第1の免疫グロブリン可変ドメイン配列と、第2のエピトープに対して結合特異性を有する第2の免疫グロブリン可変ドメイン配列を特徴とする。
用語「二重特異性抗体」及び「複数の二重特異性抗体」は、単一分子内の2つの抗体の抗原結合部位を結合させる分子を指す。従って、二重特異性抗体は、同時又は順次2つの異なる抗体に結合することができる。二重特異性抗体を作製する方法は、当技術分野で公知である。2つの抗体を結合させる様々なフォーマットも当技術分野で公知である。本発明の二重特異性抗体の形態としては、当業者には周知のように、ダイアボディ、単鎖抗体、Fab二量体化(Fab-Fab)、Fab-scFv及びタンデム抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「抗体重鎖」は、その天然に存在するコンホメーションで抗体分子に存在する2種類のポリペプチド鎖の大きい方を指し、通常、これが抗体の属するクラスを決定する。
用語「抗体軽鎖」は、その天然に存在するコンホメーションで抗体分子に存在する2種類のポリペプチド鎖の小さい方を指す。カッパ(κ)及びラムダ(λ)軽鎖が2つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
用語「組換え抗体」は、例えば、バクテリオファージ又は酵母発現システムによって発現される抗体など、組換えDNA技術を用いて作成される抗体を指す。この用語は、抗体をコードするDNA分子であって、抗体タンパク質を発現するDNA分子又はその抗体を指定するアミノ酸配列の合成によって作成された抗体を意味するとも解釈されるべきであり、DNA又はアミノ酸配列は、当技術分野において利用可能な周知の組換えDNA又はアミノ酸配列技術を用いて得られたものである。
用語「抗原」又は「Ag」は、免疫応答を引き起こす分子を指す。この免疫応答には、抗体産生又は特異的免疫適格細胞の活性化のいずれか又は両方が含まれ得る。当業者は、任意の巨大分子が、事実上あらゆるタンパク質又はペプチドを含め、抗原となり得ることを理解するであろう。さらに、抗原は、組換えDNA又はゲノムDNAに由来し得る。当業者は、従って、免疫応答を生じさせるタンパク質をコードするヌクレオチド配列又は部分的ヌクレオチド配列を含む任意のDNAが、その用語が本明細書において使用される通りの「抗原」をコードすることを理解するであろう。さらに、当業者は、抗原がある遺伝子の完全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要はないことを理解するであろう。本発明には、限定されないが、2つ以上の遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用が含まれること、及びそれらのヌクレオチド配列が所望の免疫応答を生じさせるポリペプチドをコードするように様々な組み合わせで配列されることが容易に明らかである。さらに、当業者は、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要は全くないことを理解するであろう。抗原は、合成して作成され得るか、又は生体試料から得られ得るか、又はポリペプチド以外の巨大分子である可能性もあることが容易に明らかである。かかる生体試料には、限定されないが、組織試料、腫瘍試料、細胞又は体液が他の生物学的成分と共に含まれ得る。
用語「多重特異性結合分子」は、少なくとも2つの抗原に特異的に結合し、2つ以上の抗原結合ドメインを含む分子を指す。抗原結合ドメインは、各々独立して、抗体フラグメント(例えば、scFv、Fab、ナノボディ)、リガンド又は非抗体由来結合剤(例えば、フィブロネクチン、フィノマー(Fynomer)、DARPin)であり得る。
多重特異性結合分子、抗体(例えば、二重特異性抗体)又は抗体フラグメントに関連して本明細書で使用される用語「一価」は、多重特異性結合分子、抗体(例えば、二重特異性抗体)又は抗体フラグメントが結合する各抗原に対して単一の抗原結合ドメインが存在する多重特異性結合分子、抗体(例えば、二重特異性抗体)又は抗体フラグメントを指す。
多重特異性結合分子、抗体(例えば、二重特異性抗体)又は抗体フラグメントに関連して本明細書で使用される用語「二価」は、多重特異性結合分子、抗体(例えば、二重特異性抗体)又は抗体フラグメントが結合する各抗原に対して2つの抗原結合ドメインが存在する多重特異性結合分子、抗体(例えば、二重特異性抗体)又は抗体フラグメントを指す。
用語「多量体」は、複数の分子(例えば、限定されないが、抗体(例えば二重特異性抗体))の集合体を指し、これらは、任意選択で、互いに共役している。
用語「に共役した」は、1つ以上の分子が、任意選択で、直接又はリンカーを介して、共有結合若しくは非共有結合で互いに共役していることを指す。
用語「Fcサイレント」は、エフェクター細胞と最小限の相互作用を有するように改変されたFcメインを指す。サイレンシングされたエフェクター機能は、抗体のFc領域の変異によって得ることができ、それらは当技術分野に記載されており、例えば、限定されないが、下記のものがある:LALA及びN297A(Strohl,W.,2009,Curr.Opin.Biotechnol.vol.20(6):685-691);並びにD265A(Baudino et al.,2008,J.Immunol.181:6664-69)、またHeusser et al.の国際公開第2012065950号パンフレットも参照されたい。Fcサイレンシング変異の例としては、IgG1 Fcアミノ酸配列にL234A及びL235A変異を含むLALA変異体、DAPA(D265A、P329A)(例えば、米国特許第6,737,056号明細書を参照されたい)、N297A、DANAPA(D265A、N297A及びP329A)並びに/又はLALADANAPS(L234A、L235A、D265A、N297A及びP331S)が挙げられる。
用語「CD3/TCR複合体」は、TCRα鎖及びTCRβ鎖を含むTCRと;1つのCD3γ鎖、1つのCD3δ鎖及び2つのCD3ε鎖を含むCD3と;ζドメインとを含むT細胞表面上の複合体を指す。UniProtアクセッション番号P01848(TCRα、定常ドメイン)、P01850(TCRβ、定常ドメイン1)、A0A5B9(TCRβ、定常ドメイン2)、P09693(CD3γ)、P04234(CD3δ)、P07766(CD3ε)は、ζ鎖を除いて、細胞内シグナル伝達を担うこうした鎖の例示的なヒト配列を提供し、これについては、以下でさらに詳細に論じられる。さらに別の関連アクセッション番号としては、A0A075B662(マウスTCRα、定常ドメイン)、A0A0A6YWV4及び/又はA0A075B5J3(マウスTCRβ、定常ドメイン1)、A0A075B5J4(マウスTCRβ、定常ドメイン2)、P11942(マウスCD3γ)、P04235(マウスCD3δ)、P22646(マウスCD3ε)が挙げられる。
用語「CD28」は、Tp44とも呼ばれるT細胞特異的糖タンパク質CD28並びにそれらの全ての別名を指し、これは共刺激分子として機能する。UniProtアクセッション番号P10747は、例示的なヒトCD28アミノ酸配列を提供する(HGNC:1653、Entrez Gene:940、Ensembl:ENSG00000178562及びOMIM:186760も参照されたい)。さらに別の関連CD28配列には、UniProtアクセッション番号P21041(マウスCD28)が含まれる。
用語「ICOS」は、AILIM、CVID1、CD278とも呼ばれる誘導性T細胞共刺激因子並びにそれらの全ての別名を指し、これは共刺激分子として機能する。UniProtアクセッション番号Q9Y6W8は、例示的なヒトICOSアミノ酸配列を提供する(HGNC:5351、Entrez Gene:29851、Ensembl:ENSG00000163600及びOMIM:604558も参照されたい)。さらに別の関連ICOS配列には、UniProtアクセッション番号Q9WVS0(マウスICOS)が含まれる。
用語「CD27」は、T細胞活性化抗原CD27、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー7、T14、T細胞活性化抗原S152、Tp55並びにそれらの別名を指し、これは、共刺激分子として機能する。UniProtアクセッション番号P26842は、例示的なヒトCD27アミノ酸配列を提供する(HGNC:11922、Entrez Gene:939、Ensembl:ENSG00000139193及びOMIM:186711も参照されたい)。さらに別の関連CD27配列には、UniProtアクセッション番号P41272(マウスCD27)が含まれる。
用語「CD25」は、IL-2サブユニットα、TAC抗原、p55、インスリン依存性糖尿病10、IMD21、P55、TCGFR並びにそれらの別名を指し、これは、増殖因子受容体として機能する。UniProtアクセッション番号P01589は、例示的なヒトCD25アミノ酸配列を提供する(HGNC:6008、Entrez Gene:3559、Ensembl:ENSG00000134460及びOMIM:147730も参照されたい)。さらに、関連CD25配列には、UniProtアクセッション番号P01590(マウスCD25)が含まれる。
用語「4-1BB」は、CD137又は腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー9並びにそれらの別名を指し、これは、共刺激分子として機能する。UniProtアクセッション番号Q07011は、例示的なヒト4-1BBアミノ酸配列を提供する(HGNC:11924、Entrez Gene:3604、Ensembl:ENSG00000049249及びOMIM:602250も参照されたい)。さらに別の関連4-1BB配列には、UniProtアクセッション番号P20334(マウス4-1BB)が含まれる。
用語「IL6RA」は、IL-6受容体サブユニットα又はCD126並びにそれらの別名を指し、これは、増殖因子受容体として機能する。UniProtアクセッション番号P08887は、例示的なヒトIL6RAアミノ酸配列を提供する(HGNC:6019、Entrez Gene:3570、Ensembl:ENSG00000160712及びOMIM:147880も参照されたい)。さらに別の関連IL6RA配列には、UniProtアクセッション番号P22272(マウスIL6RA)が含まれる。
用語「IL6RB」は、IL-6受容体サブユニットβ又はCD130並びにそれらの別名を指し、これは、増殖因子受容体として機能する。UniProtアクセッション番号P40189は、例示的なヒトIL6RBアミノ酸配列を提供する。さらに別の関連IL6RB配列には、UniProt アクセッション番号Q00560(マウスIL6RB)が含まれる。
用語「CD2」は、T細胞表面抗原T11/Leu-5/CD2、リンパ球機能抗原2、T11又は赤血球/ロゼット/LFA-3受容体並びにそれらの別名を指し、これらは増殖因子受容体として機能する。UniProtアクセッション番号P06729は、例示的なヒトCD2アミノ酸配列を提供する(HGNC:1639、Entrez Gene:914、Ensembl:ENSG00000116824及びOMIM:186990も参照されたい)。さらに別の関連CD2配列には、UniProtアクセッション番号P08920(マウスCD2)が含まれる。
用語「抗腫瘍効果」及び「抗癌効果」は、互換的に使用され、限定されないが、例えば腫瘍体積若しくは癌体積の減少、腫瘍細胞若しくは癌細胞の数の減少、転移の数の減少、平均余命の増加、腫瘍細胞増殖若しくは癌細胞増殖の低減、腫瘍細胞生存若しくは癌細胞生存の低減又は癌性病態に関連する多様な生理学的症状の改善を含む様々な手段によって現れ得る生物学的効果を指す。「抗腫瘍効果」又は「抗癌効果」は、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞及び抗体が腫瘍又は癌の発生を予防する能力によってもまず現れ得る。
用語「自己」は、同じ個体に由来する任意の材料であって、後にその個体に再導入されることになる材料を指す。
用語「同種異系」は、材料が導入される個体と同じ種の異なる動物に由来する任意の材料を指す。2つ以上の個体は、1つ以上の遺伝子座の遺伝子が同一でないとき、互いに同種異系であると言われる。一部の実施形態において、同じ種の個体からの同種異系材料は、抗原的に相互作用するのに十分に遺伝的に異なり得る。
用語「異種」は、異なる種の動物に由来するグラフトを指す。
本明細書で使用される用語「アフェレーシス」は、ドナー又は患者の血液をドナー又は患者から採取して、選択した特定の成分を分離する装置に通過させた後、例えば再輸血によって残りをドナー又は患者に戻すという、当技術分野で承認されている体外処置を指す。従って、「アフェレーシスサンプル」に関連して、アフェレーシスを用いて得られたサンプルを指す。
用語「癌」は、異常細胞の急速且つ無制御の成長によって特徴付けられる疾患を指す。癌細胞は、局所的に又は血流及びリンパ系を通じて体の他の部位に広がり得る。様々な癌の例が本明細書に記載され、限定されないが、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌などが挙げられる。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法で処置される癌は、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫又は非ホジキンリンパ腫を含む。
用語「腫瘍」及び「癌」は、本明細書では同義的に使用され、例えば、両方の用語とも固形及び液性、例えばびまん性又は循環性腫瘍を包含する。本明細書で使用されるとき、用語「癌」又は「腫瘍」は、前癌性並びに悪性の癌及び腫瘍を含む。
「由来する」は、この用語が本明細書で使用される場合、第1の分子と第2の分子との間の関係を指す。これは、概して、第1の分子と第2の分子との間の構造的類似性に言及するものであり、第2の分子に由来する第1の分子に関する方法又は供給源を限定することを含意又は包含しない。例えば、CD3ζ分子に由来する細胞内シグナル伝達ドメインの場合、細胞内シグナル伝達ドメインは、求められる機能、即ち適切な条件下でシグナルを生成する能力を有するような十分なCD3ζ構造を保持している。これは、細胞内シグナル伝達ドメインの特定の作製方法に限定することを含意又は包含せず、例えば細胞内シグナル伝達ドメインを提供するためにCD3ζ配列で開始して不要な配列を欠失させるか、又は変異を付与して細胞内シグナル伝達ドメインに至らせなければならないことを意味しない。
用語「保存的配列改変」は、そのアミノ酸配列を含む抗体又は抗体フラグメントの結合特性が大きい影響又は変化を被ることのないアミノ酸改変を指す。かかる保存的改変には、アミノ酸置換、付加及び欠失が含まれる。改変は、部位特異的突然変異誘発及びPCR媒介性突然変異誘発など、当技術分野において公知の標準技法によって本発明の抗体又は抗体フラグメントに導入することができる。保存的置換は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられるものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、β分枝側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)及び芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸が含まれる。従って、本発明のCAR内の1つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基に置き換えることができ、及び変化したCARは、本明細書に記載される機能アッセイを用いて試験することができる。
刺激及び/又は共刺激分子による刺激に関連して、用語「刺激」は、刺激性分子(例えば、TCR/CD3複合体)及び/又は共刺激分子(例えば、C28若しくは4-1BB)とその同族のリガンドとの結合によって誘導される応答、例えば一次若しくは二次応答を指し、それにより、限定されないが、TCR/CD3複合体を介したシグナル伝達などのシグナル伝達事象を媒介する。刺激は、特定の分子の発現変化及び/又は細胞骨格構造の再組織化などを媒介することができる。
用語「刺激性分子」は、T細胞によって発現され、T細胞シグナル伝達経路の少なくともいくつかの態様について、TCR複合体の一次活性化を調節する一次細胞質シグナル伝達配列を提供する分子を指す。一部の実施形態では、CAR内のITAM含有ドメインは、内因性TCR複合体とは独立に一次TCRのシグナル伝達を反復する。一部の実施形態では、一次シグナルは、例えば、TCR/CD3複合体と、ペプチドを載せたMHC分子との結合により開始される一次シグナルであり、これは、限定されないが、増殖、活性化、分化などを含むT細胞応答の媒介をもたらす。刺激性様式で作用する初代細胞質シグナル伝達配列(「一次シグナル伝達ドメイン」とも称される)は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ又はITAMとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。本発明において特に有用であるITAM含有初代細胞質シグナル伝達配列の例としては、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(「ICOS」としても知られる)、FcεRI及びCD66d、DAP10及びDAP12由来のものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。本発明の具体的なCARにおいて、本発明の任意の1つ以上のCARSの細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞内シグナル伝達配列、例えばCD3-ζの一次シグナル伝達配列を含む。用語「抗原提示細胞」又は「APC」は、その表面上に主要組織適合遺伝子複合体(MHC)と複合体化した外来抗原を提示するアクセサリー細胞などの免疫系細胞(例えば、B細胞、樹状細胞など)を指す。T細胞は、そのT細胞受容体(TCR)を用いてこうした複合体を認識し得る。APCは、抗原をプロセシングしてそれをT細胞に提示する。
「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、この用語が本明細書で使用されるとき、分子の細胞内部分を指す。実施形態において、細胞内シグナルドメインは、エフェクター機能シグナルを形質導入し、細胞に特殊な機能を果たすよう指示する。細胞内シグナル伝達ドメイン全体を用いることができるが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断された一部を使用する範囲内で、このような切断された一部を、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限り、完全鎖の代わりに使用し得る。用語細胞内シグナル伝達ドメインは、そのため、エフェクター機能シグナルの伝達に十分な細胞内シグナル伝達ドメインのあらゆる切断された一部を含むことを意図する。
細胞内シグナル伝達ドメインは、CAR含有細胞、例えばCART細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。例えば、CART細胞の免疫エフェクター機能の例として、細胞溶解活性及びサイトカインの分泌を含めたヘルパー活性が挙げられる。
一部の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。例示的一次細胞内シグナル伝達ドメインには、一次刺激又は抗原依存性刺激に関与する分子に由来するものが含まれる。一部の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激細胞内ドメインを含み得る。例示的共刺激細胞内シグナル伝達ドメインには、共刺激シグナル又は抗原非依存性刺激に関与する分子に由来するものが含まれる。例えば、CARTの場合、一次細胞内シグナル伝達ドメインがT細胞受容体の細胞質配列を含むことができ、及び共刺激細胞内シグナル伝達ドメインが共受容体又は共刺激分子からの細胞質配列を含むことができる。
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容活性化チロシンモチーフ又はITAMとして知られるシグナル伝達モチーフを含むことができる。ITAMを含む一次細胞質シグナル伝達配列の例には、限定されないが、CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(「ICOS」としても知られる)、FcεRI、CD66d、DAP10及びDAP12に由来するものが含まれる。
用語「ζ」若しくは代替的に「ζ鎖」、「CD3-ζ」又は「TCR-ζ」は、CD247を指す。Swiss-Prot受託番号P20963は、例示的なヒトCD3ζアミノ酸配列を提供する。「ζ刺激ドメイン」若しくは代替的に「CD3-ζ刺激ドメイン」又は「TCR-ζ刺激ドメイン」は、CD3ζ又はその変異体(例えば、突然変異、例えば点突然変異、フラグメント、挿入若しくは欠失を有する分子)の刺激ドメインを指す。一部の実施形態では、ζの細胞質ドメインは、GenBank受託番号BAG36664.1の残基52~164又はその変異体(例えば、突然変異、例えば点突然変異、フラグメント、挿入若しくは欠失を有する分子)を含む。一部の実施形態では、「ζ刺激ドメイン」又は「CD3-ζ刺激ドメイン」は、配列番号9若しくは10として提供される配列又はその変異体(例えば、突然変異、例えば点突然変異、フラグメント、挿入若しくは欠失を有する分子)である。
「共刺激分子」という用語は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それにより、T細胞の、限定されないが、増殖などによる共刺激応答を媒介する、T細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子は、効率的な免疫応答に必要な抗原受容体又はそのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子は、MHCクラスI分子、TNF受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ性活性化分子(SLAMタンパク質)、活性化NK細胞受容体、BTLA、Tollリガンド受容体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD28-OX40、CD28-4-1BB及びCD83と特異的に結合するリガンドを含むが、これらに限定されるものではない。
共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分を指す。
細胞内シグナル伝達ドメインは、それが由来する分子の細胞内部分全体若しくは天然の細胞内シグナル伝達ドメイン全体又はその機能的フラグメントを含み得る。
「4-1BB共刺激ドメイン」は、4-1BBの共刺激ドメイン又はその変異体(例えば、突然変異、例えば点突然変異、フラグメント、挿入若しくは欠失を有する分子)を指す。一部の実施形態では、「4-1BB共刺激ドメイン」は、配列番号7として提供される配列又はその変異体(例えば、突然変異、例えば点突然変異、フラグメント、挿入若しくは欠失を有する分子)である。
「免疫エフェクター細胞」は、その用語が本明細書で使用される場合、免疫応答、例えば、免疫エフェクター応答の促進に関与する細胞を指す。免疫エフェクター細胞の例には、T細胞、例えばα/βT細胞及びγ/δT細胞、B細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、ナチュラルキラーT(NKT)細胞、肥満細胞及び骨髄球由来食細胞が含まれる。
「免疫エフェクター機能又は免疫エフェクター応答」は、この用語が本明細書で使用されるとき、標的細胞の免疫攻撃を亢進させる又は促進する例えば免疫エフェクター細胞の機能又は応答を指す。例えば、免疫エフェクター機能又は応答は、標的細胞の死滅又は成長若しくは増殖阻害を促進するT細胞又はNK細胞の特性を指す。T細胞の場合、一次刺激及び共刺激が免疫エフェクター機能又は応答の例である。
用語「エフェクター機能」は、細胞の特殊化された機能を指す。T細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性又はサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。
用語「コードする」は、定義付けられたヌクレオチド配列(例えば、rRNA、tRNA及びmRNA)又は定義付けられたアミノ酸配列のいずれかを有する生物学的過程における他のポリマー及び巨大分子の合成の鋳型としての役割を果たす、遺伝子、cDNA又はmRNAなど、ポリヌクレオチド内の特異的ヌクレオチド配列の固有の特性及びそれによってもたらされる生物学的特性を指す。従って、遺伝子、cDNA又はRNAは、その遺伝子に対応するmRNAの転写及び翻訳によって細胞又は他の生体系のタンパク質が産生される場合にタンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列がmRNA配列と同一の且つ通常配列表に提供されるものであるコード鎖及び遺伝子又はcDNAの転写鋳型として使用される非コード鎖の両方は、その遺伝子のcDNAのタンパク質又は他の産物をコードすると称することができる。
特記されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の全てを含む。タンパク質又はRNAをコードするヌクレオチド配列という語句には、そのタンパク質をコードするヌクレオチド配列が何らかのバージョンで1つ又は複数のイントロンを含み得る限りにおいて、イントロンも含まれ得る。
用語「有効量」又は「治療有効量」は、本明細書において互換的に使用され、特定の生物学的結果を達成する上で有効である、本明細書に記載の化合物、製剤、材料若しくは組成物の量を指す。
「内因性」という用語は、生物体、細胞、組織若しくは系からの又はその内部で生成された任意の物質を指す。
用語「外因性」は、生物、細胞、組織又は系の外側から導入されるか又はその外側で産生される任意の材料を指す。
用語「発現」は、特定のヌクレオチド配列の転写及び/又は翻訳を指す。一部の実施形態では、発現は、細胞に導入されたmRNAの翻訳を含む。
用語「トランスファーベクター」は、単離核酸を含む組成物であって、細胞内部への単離核酸の送達に使用し得る組成物を指す。当技術分野では、限定されないが、線状ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミド及びウイルスを含め、多くのベクターが公知である。従って、用語「トランスファーベクター」には自己複製プラスミド又はウイルスが含まれる。この用語は、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなど、細胞への核酸のトランスファーを促進する非プラスミド及び非ウイルス化合物もさらに含むものと解釈されなければならない。ウイルストランスファーベクターの例としては、限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられる。
用語「発現ベクター」は、発現させるヌクレオチド配列に作動可能に連結した発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現に十分なシス作用エレメントを含み、他の発現用エレメントは、宿主細胞によって供給されるか、又はインビトロ発現系に供給され得る。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み込むコスミド、プラスミド(例えば、ネイキッド又はリポソームに含まれる)及びウイルス(例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス)を含め、当技術分野において公知のもの全てが含まれる。
用語「レンチウイルス」は、レトロウイルス科(Retroviridae)の属を指す。レンチウイルスは、非分裂細胞を感染させることができる点でレトロウイルスの中でユニークであり、レンチウイルスは、宿主細胞のDNAに多量の遺伝情報を送達することができ、そのため、遺伝子デリバリーベクターの最も効率的な方法の1つである。HIV、SIV及びFIVは、全てレンチウイルスの例である。
用語「レンチウイルスベクター」は、特に、Milone et al.,Mol.Ther.17(8):1453-1464(2009)に提供される通りの自己不活性化レンチウイルスベクターを含め、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部分に由来するベクターを指す。臨床で使用し得るレンチウイルスベクターの他の例としては、限定されないが、例えばOxford BioMedicaからのLENTIVECTOR(登録商標)遺伝子デリバリー技術、LentigenからのLENTIMAX(商標)ベクターシステムなどが挙げられる。非臨床タイプのレンチウイルスベクターも利用可能であり、当業者に公知であろう。
用語「相同」又は「同一性」は、2つのポリマー分子間、例えば2つのDNA分子又は2つのRNA分子など、2つの核酸分子間又は2つのポリペプチド分子間におけるサブユニット配列同一性を指す。2つの分子の両方におけるサブユニット位置が同じ単量体サブユニットによって占有されるとき、例えば、2つのDNA分子の各々の位置がアデニンによって占有される場合、それらは、その位置で相同又は同一である。2つの配列間の相同性は、一致する位置又は相同な位置の数の直接の関数である。例えば、2つの配列における位置の半分(例えば、10サブユニット長のポリマーにおける5個の位置)が相同である場合、それらの2つの配列は、50%相同である。位置の90%(例えば、10個中9個)が一致するか又は相同である場合、それらの2つの配列は、90%相同である。
「ヒト化」形態の非ヒト(例えば、マウス)抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はそのフラグメント(抗体のFv、Fab、Fab’、F(ab’)2又は他の抗原結合部分配列など)である。ほとんどの場合、ヒト化抗体及びその抗体フラグメントは、ヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体又は抗体フラグメント)においてレシピエントの相補決定領域(CDR)からの残基が所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット又はウサギなどの非ヒト種(ドナー抗体)のCDRからの残基に置き換えられているものである。一部の例では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基が対応する非ヒト残基に置き換えられる。さらに、ヒト化抗体/抗体フラグメントは、レシピエント抗体にも、移入されるCDR又はフレームワーク配列にも見られない残基を含むことができる。これらの改変は抗体又は抗体フラグメントの性能をさらに精緻化及び最適化し得る。一般に、ヒト化抗体又はその抗体フラグメントは、少なくとも1つ及び典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになり、CDR領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、及びFR領域の全て又は大部分がヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体又は抗体フラグメントは、免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒト免疫グロブリンのFcの少なくとも一部分も含むことができる。さらなる詳細については、Jones et al.,Nature,321:522-525,1986;Reichmann et al.,Nature,332:323-329,1988;Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596,1992を参照されたい。
「完全にヒト」は、分子全体がヒト起源であるか、又はヒト形態の抗体又は免疫グロブリンと同一のアミノ酸配列からなる抗体又は抗体フラグメントなどの免疫グロブリンを指す。
用語「単離されている」は、自然状態から改変されているか又は取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸又はペプチドは、「単離されている」のではないが、その自然状態の共存する材料から部分的又は完全に分離された同じ核酸又はペプチドは、「単離されている」。単離核酸又はタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することができるか、又は例えば宿主細胞など、非天然環境中に存在することができる。
本発明との関連において、一般的に存在する核酸塩基に関して以下の略称が使用される。「A」は、アデノシンを指し、「C」は、シトシンを指し、「G」は、グアノシンを指し、「T」は、チミジンを指し、及び「U」は、ウリジンを指す。
用語「作動可能に連結された」又は「転写制御」は、調節配列と異種核酸配列との間における後者の発現をもたらす機能的な連結を指す。例えば、第1の核酸配列が第2の核酸配列と機能的に関係した状態に置かれているとき、第1の核酸配列は、第2の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写又は発現に影響を及ぼす場合、プロモーターは、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されるDNA配列は、互いに連続し得、例えば2つのタンパク質コード領域をつなぎ合わせる必要がある場合、同じリーディングフレーム内にある。
免疫原性組成物の「非経口」投与という用語は、例えば、皮下(s.c.)、静脈内(i.v.)、筋肉内(i.m.)、又は胸骨内注射、腫瘍内、又は輸注技法を含む。
用語「核酸」、「核酸分子」、「ポリペプチド」又は「ポリヌクレオチド分子」は、一本鎖又は二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボ核酸(DNA)又はリボ核酸(RNA)及びそれらのポリマーを指す。具体的に限定しない限り、この用語には、参照核酸と同様の結合特性を有し、且つ天然に存在するヌクレオチドと同じように代謝される、天然ヌクレオチドの公知の類似体を含む核酸が包含される。一部の実施形態では、「核酸」、「核酸分子」、「ポリペプチド」又は「ポリヌクレオチド分子」は、ヌクレオチド/ヌクレオシド誘導体又は類似体を含む。別に指示のない限り、特定の核酸配列は、黙示的に、その保存的に改変された変異体(例えば、縮重コドン置換、例えば保存的置換)、アレル、オルソログ、SNP及び相補配列並びに明示的に指示される配列も包含する。具体的には、縮重コドン置換、例えば保存的置換は、1つ以上の選択された(又は全ての)コドンの3番目の位置が、混合塩基及び/又はデオキシイノシン残基で置換されている配列を作製することによって達成し得る(Batzer et al.,Nucleic Acid Res.19:5081(1991);Ohtsuka et al.,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985);及びRossolini et al.,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、同義的に使用され、ペプチド結合によって共有結合的に連結したアミノ酸残基で構成される化合物を指す。タンパク質又はペプチドは、少なくとも2つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質の配列又はペプチドの配列を含むことのできるアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドは、互いにペプチド結合によってつなぎ合わされた2つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質を含む。本明細書で使用されるとき、この用語は、当技術分野では一般に例えばペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーとも称される短鎖と、当技術分野では概してタンパク質と称される、多数の種類があるより長い鎖との両方を指す。「ポリペプチド」には、例えば、生物学的に活性なフラグメント、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が特に含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチド又はこれらの組み合わせが含まれる。
用語「プロモーター」は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始させるのに必要である、細胞の合成機構又は導入された合成機構によって認識されるDNA配列を指す。
用語「プロモーター/調節配列」は、そのプロモーター/調節配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現に必要な核酸配列を指す。一部の例では、この配列は、コアプロモーター配列であり得、他の例では、この配列は、エンハンサー配列及び遺伝子産物の発現に必要な他の調節エレメントも含み得る。プロモーター/調節配列は、例えば、遺伝子産物を組織特異的に発現するものであり得る。
用語「構成的」プロモーターは、遺伝子産物をコードするか又はそれを指定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されているとき、細胞のほとんど又は全ての生理条件下で細胞において遺伝子産物の産生を生じさせるヌクレオチド配列を指す。
用語「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコードするか又はそれを指定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されているとき、実質的にプロモーターに対応する誘発物質が細胞に存在する場合に限り細胞において遺伝子産物の産生を生じさせるヌクレオチド配列を指す。
用語「組織特異的」プロモーターは、遺伝子をコードするか又はそれによって指定されるポリヌクレオチドと作動可能に連結されているとき、実質的に細胞がプロモーターに対応する組織型の細胞である場合に限り細胞において遺伝子産物の産生を生じさせるヌクレオチド配列を指す。
用語「癌関連抗原」、「腫瘍抗原」、「過剰増殖性障害抗原」及び「過剰増殖性障害に関連する抗原」は、互換的に、特定の過剰増殖性障害に共通の抗原を指す。一部の実施形態では、これらの用語は、癌細胞の表面上に、完全に又はフラグメント(例えば、MHC/ペプチド)として、発現する分子(典型的にはタンパク質、炭水化物若しくは脂質)であって、癌細胞に対する薬理学的薬剤の優先的な標的化に有用な分子を指す。一部の実施形態において、腫瘍抗原は、正常細胞及び癌細胞の両方が発現するマーカー、例えば系列マーカー、例えばB細胞上のCD19である。一部の実施形態では、腫瘍抗原は、正常細胞と比べて癌細胞で過剰発現(例えば、正常細胞と比べて1倍の過剰発現、2倍の過剰発現、3倍以上の過剰発現)する細胞表面分子である。一部の実施形態では、腫瘍抗原は、癌細胞で不適切に合成される細胞表面分子、例えば正常細胞に発現する分子と比べて欠失、付加又は変異を含む分子である。一部の実施形態では、腫瘍抗原は、癌細胞の細胞表面にのみ、完全に又はフラグメント(例えば、MHC/ペプチド)として発現することになり、正常細胞の表面には合成されないか又は発現しない。一部の実施形態では、本発明の過剰増殖性障害抗原は、原発性若しくは転移性黒色腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎臓癌並びに乳癌、前立腺癌(例えば、去勢抵抗性若しくは治療抵抗性前立腺癌又は転移性前立腺癌)、卵巣癌、膵臓癌など、又は形質細胞増殖性障害、例えば無症候性骨髄腫(くすぶり型多発性骨髄腫若しくは無症候性骨髄腫)、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症(MGUS)、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、形質細胞腫(例えば、プラズマ細胞増殖症、孤立性骨髄腫、孤立性形質細胞腫、髄外性形質細胞腫及び多発性形質細胞腫)、全身性軽鎖アミロイドーシス及びPOEMS症候群(また、クロウ・深瀬症候群、高月病(Takatsuki disease)及びPEP症候群としても知られる)に由来する。一部の実施形態では、本発明のCARは、MHC提示ペプチドに結合する抗原結合ドメイン(例えば、抗体又は抗体フラグメント)を含むCARを含む。通常、内因性タンパク質に由来するペプチドは、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスI分子のポケットに嵌まり、CD8+Tリンパ球上のT細胞受容体(TCR)によって認識される。MHCクラスI複合体は、あらゆる有核細胞によって構成的に発現される。癌では、ウイルス特異的及び/又は腫瘍特異的ペプチド/MHC複合体が免疫療法用のユニークなクラスの細胞表面標的となる。ヒト白血球抗原(HLA)-A1又はHLA-A2のコンテクストでウイルス又は腫瘍抗原由来のペプチドを標的とするTCR様抗体が記載されている(例えば、Sastry et al.,J Virol.2011 85(5):1935-1942;Sergeeva et al.,Blood,2011 117(16):4262-4272;Verma et al.,J Immunol 2010 184(4):2156-2165;Willemsen et al.,Gene Ther 2001 8(21):1601-1608;Dao et al.,Sci Transl Med 2013 5(176):176ra33;Tassev et al.,Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100を参照されたい)。例えば、TCR様抗体は、ヒトscFvファージディスプレイライブラリなど、ライブラリーのスクリーニングによって同定することができる。
用語「腫瘍支持抗原」又は「癌支持抗原」は、互換的に、それ自体癌性ではない細胞の表面に発現するが、例えばそれらの増殖若しくは生存、例えば免疫細胞に対する抵抗性を促進することによって癌細胞を支持する分子(典型的にはタンパク質、炭水化物若しくは脂質)を指す。このタイプの例示的な細胞として、間質細胞及び骨髄由来免疫抑制細胞(MDSC)が挙げられる。腫瘍支持抗原自体は、癌細胞を支持する細胞に抗原が存在する限り、腫瘍細胞を支持する役割を果たす必要はない。
用語「可動性ポリペプチドリンカー」又は「リンカー」は、scFvとの関連で使用されるとき、可変重鎖領域と可変軽鎖領域とを共に連結するために単独又は組み合わせで使用されるグリシン及び/又はセリン残基などのアミノ酸からなるペプチドリンカーを指す。一部の実施形態において、可動性ポリペプチドリンカーは、Gly/Serリンカーであり、アミノ酸配列(Gly-Gly-Gly-Ser)n(式中、nは、1以上の正の整数、例えばn=1、n=2、n=3、n=4、n=5及びn=6、n=7、n=8、n=9及びn=10である)(配列番号41)を含む。一部の実施形態において、可動性ポリペプチドリンカーには、限定されないが、(Gly4 Ser)4(配列番号27)又は(Gly4 Ser)3(配列番号28)が含まれる。一部の実施形態において、リンカーは、(Gly2Ser)、(GlySer)又は(Gly3Ser)(配列番号29)の複数の繰り返しを含む。また、国際公開第2012/138475号パンフレット(参照により本明細書に援用される)に記載されるリンカーも本発明の範囲内に含まれる。
本明細書で使用されるとき、5’キャップ(RNAキャップ、RNA7-メチルグアノシンキャップ又はRNA m7Gキャップとも称される)は、転写開始直後に真核生物メッセンジャーRNAの「前」又は5’末端に付加された修飾グアニンヌクレオチドである。5’キャップは、1番目の転写ヌクレオチドに連結される末端基からなる。その存在は、リボソームによる認識及びRNアーゼからの保護に重要である。キャップ付加は転写と結び付いており、それぞれが他方に影響を与えるようにして同時転写的に起こる。転写開始直後、合成されているmRNAの5’末端に、RNAポリメラーゼに関連するキャップ合成複合体が結合する。この酵素複合体は、mRNAキャッピングに必要な化学反応を触媒する。合成は、多段階生化学反応として進行する。キャッピング部分は、mRNAのその安定性又は翻訳効率などの機能を調整するために改変することができる。
本明細書で使用されるとき、「インビトロ転写RNA」は、インビトロ合成されたRNAを指す。一部の実施形態では、RNAは、mRNAである。概して、インビトロ転写RNAは、インビトロ転写ベクターから作成される。インビトロ転写ベクターは、インビトロ転写RNAの作成に使用される鋳型を含む。
本明細書で使用されるとき、「ポリ(A)」は、ポリアデニル化によってmRNAに結合される一連のアデノシンである。一過性発現用の構築物の一部の実施形態において、ポリ(A)は、50~5000(配列番号30)である。一部の実施形態では、ポリ(A)は、64より多い。一部の実施形態では、ポリ(A)は、100より多い。一部の実施形態では、ポリ(A)は、300より多い。一部の実施形態では、ポリ(A)は、400より多い。ポリ(A)配列は、局在性、安定性又は翻訳効率などのmRNA機能を調整するために化学的又は酵素的に改変することができる。
本明細書で使用されるとき、「ポリアデニル化」は、メッセンジャーRNA分子へのポリアデニリル部分又はその改変変異体の共有結合を指す。真核生物では、ほとんどのメッセンジャーRNA(mRNA)分子が3’末端でポリアデニル化される。3’ポリ(A)テールは、酵素、ポリアデニル酸ポリメラーゼの作用によってmRNA前駆体に付加されるアデニンヌクレオチドの長い配列(多くの場合に数百個)である。高等真核生物では、ポリ(A)テールは、特異的配列、ポリアデニル化シグナルを含む転写物に付加される。ポリ(A)テール及びそれに結合したタンパク質は、mRNAをエキソヌクレアーゼによる分解から保護するのに役立つ。ポリアデニル化は、転写終結、mRNAの核外移行及び翻訳にも重要である。ポリアデニル化は、DNAからRNAへの転写直後に核内で起こるが、さらに後に細胞質でも起こり得る。転写が終結した後、RNAポリメラーゼに関連するエンドヌクレアーゼ複合体の作用によってmRNA鎖が切断される。切断部位は、通常、切断部位近傍の塩基配列AAUAAAの存在によって特徴付けられる。mRNAが切断された後、切断部位の遊離3’末端にアデノシン残基が付加される。
本明細書で使用されるとき、「一過性」は、数時間、数日間又は数週間の期間にわたる組み込まれないトランス遺伝子の発現を指し、この発現期間は、宿主細胞においてゲノムに組み込まれた場合又は安定プラスミドレプリコン中に含まれている場合の遺伝子の発現期間よりも短い。
本明細書で使用される場合、用語「処置する」、「処置」及び「処置している」は、1つ以上の療法(例えば、本発明のCARなどの1つ以上の療法剤)の投与によってもたらされる増殖性障害の進行、重症度及び/若しくは持続期間の低減若しくは改善又は増殖性障害の1つ以上の症状(好ましくは1つ以上の認識し得る症状)の改善を指す。具体的な実施形態において、用語「処置する」、「処置」及び「処置している」は、患者には必ずしも認識できない、腫瘍の増殖などの増殖性障害の少なくとも1つの計測可能な理学的パラメーターの改善を指す。他の実施形態において、用語「処置する」、「処置」及び「処置している」は、増殖性障害の進行の物理的な、例えば認識し得る症状の安定化による阻害、生理学的な、例えば理学的パラメーターの安定化による阻害のいずれか又は両方を指す。他の実施形態において、用語「処置する」、「処置」及び「処置している」は、腫瘍サイズ又は癌性細胞数の低減又は安定化を指す。
用語「シグナル伝達経路」は、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達において役割を果たす種々のシグナル伝達分子間の生化学的関係を指す。語句「細胞表面受容体」は、シグナルを受け取り、且つ細胞の膜を越えてシグナルを伝える能力を有する分子及び分子複合体を含む。
用語「対象」は、免疫応答を生じさせることのできる生きている生物(例えば、哺乳類、例えばヒト)を含むことが意図される。
用語の「実質的に精製された」細胞は、他の細胞型を本質的に含まない細胞を指す。実質的に精製された細胞とは、その天然に存在する状態でそれが通常結び付いている他の細胞型と分離されている細胞も指す。一部の例では、実質的に精製された細胞集団とは、均質な細胞集団を指す。他の例では、この用語は、単に、その自然状態でそれが天然に結び付いている細胞から分離されている細胞を指す。一部の実施形態において、これらの細胞は、インビトロで培養される。一部の実施形態において、これら細胞は、インビトロで培養されない。
本明細書で使用される用語「治療的」とは、処置を意味する。治療効果は、病態の低減、抑制、寛解又は根絶によって達成される。
本明細書で使用される用語「予防」とは、疾患若しくは病態の予防又は予防的処置を意味する。
用語「トランスフェクトされた」、又は「形質転換された」、又は「形質導入された」は、外因性核酸を宿主細胞に移入させるか又は導入するプロセスを指す。「トランスフェクトされた」、又は「形質転換された」、又は「形質導入された」細胞は、外因性核酸をトランスフェクト、形質転換又は形質導入されたものである。細胞には初代対象細胞及びその子孫が含まれる。
用語「特異的に結合する」は、試料中に存在するコグネイト結合パートナー(例えば、T細胞に存在する刺激及び/若しくは共刺激分子)タンパク質を認識して、それと結合するが、試料中の他の分子は実質的に認識しないか又はそれらに結合しない抗体又はリガンドを指す。
本明細書で使用される「調節可能なキメラ抗原受容体(RCAR)」という用語は、免疫エフェクター細胞中にあるとき、標的細胞、典型的には癌細胞に対する特異性及び細胞内シグナル生成を細胞に賦与する一連のポリペプチド、典型的には最も単純な実施形態では2つのポリペプチドを指す。一部の実施形態では、RCARは、少なくとも1つの細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン並びにCAR分子に関連して本明細書で定義されるような刺激分子及び/又は共刺激分子由来の機能性シグナル伝達ドメインを含む細胞腫シグナル伝達ドメイン(また、本明細書では「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも称される)を含む。一部の実施形態では、RCAR中のこれら一連のポリペプチドは、互いに隣接しておらず、例えば異なるポリペプチド鎖内にある。一部の実施形態では、RCARは、二量体化スイッチを含み、これは、二量体化分子が存在すると、ポリペプチドを互いに結合させることができ、例えば細胞内シグナル伝達ドメインに抗原結合ドメインを結合させることができる。一部の実施形態では、RCARは、本明細書に記載される細胞(例えば、免疫エフェクター細胞)、例えばRCAR発現細胞(また、「RCARX細胞」とも称される)に発現される。一部の実施形態では、RCARX細胞は、T細胞であり、RCART細胞と称される。一部の実施形態では、RCARXは、NK細胞であり、RCARN細胞と称される。RCARは、RCAR発現細胞に、標的細胞、典型的には癌細胞に対する特異性及び調節可能な細胞内シグナル生成若しくは増殖を賦与することができ、これらは、RCAR発現細胞の免疫エフェクター特性を最適化し得る。複数の実施形態では、RCAR細胞は、抗原結合ドメインに結合した抗原を含む標的細胞に対する特異性を取得するために、少なくとも部分的に、抗原結合ドメインに依存する。
「膜アンカー」又は「膜テザリングドメイン」は、この用語が本明細書で使用されるとき、細胞外若しくは細胞内ドメインを原形質膜に結合させる上で十分なポリペプチド若しくは部分、例えばミリストイル基を指す。
「スイッチドメイン」は、この用語が本明細書で例えばRCARを指す場合に使用されるとき、二量体化分子の存在下で別のスイッチドメインと結合する実体、典型的には、ポリペプチドベースの実体を指す。この結合により、第1のスイッチドメインに連結、例えば融合した第1の実体と、第2のスイッチドメインに連結、例えば融合した第2の実体との機能性カップリングが起こる。第1及び第2のスイッチドメインは、集合的に二量体化スイッチと呼ばれる。複数の実施形態において、第1及び第2のスイッチドメインは、互いに同じであり、例えば、両者は、同じ一次アミノ酸配列を有するポリペプチドであり、集合的にホモ二量体化スイッチと呼ばれる。複数の実施形態において、第1及び第2のスイッチドメインは、互いに異なり、例えば、それらは、異なる一次アミノ酸配列を有するポリペプチドであり、集合的にヘテロ二量体化スイッチと呼ばれる。複数の実施形態において、スイッチは、細胞内である。複数の実施形態では、スイッチは、細胞外である。複数の実施形態において、スイッチドメインは、ポリペプチドベースの実体、例えばFKBP又はFRBベースであり、二量体化分子は、小分子、例えばラパログである。複数の実施形態において、スイッチドメインは、ポリペプチドベースの実体、例えばmycペプチドに結合するscFvであり、二量体化分子は、ポリペプチド、その断片又はポリペプチドの多量体、例えばmycリガンド若しくは1つ以上のmyc scFvに結合するmycリガンドの多量体である。複数の実施形態において、スイッチドメインは、ポリペプチドベースの実体、例えばmyc受容体であり、二量体化分子は、抗体又はその断片、例えばmyc抗体である。
「二量体化分子」という用語は、この用語が本明細書で例えばRCARを指す場合に使用されるとき、第1のスイッチドメインと第2のスイッチドメインの結合を促進する分子を指す。複数の実施形態において、二量体化分子は、対象に天然に存在しないか、又は有意な二量体化を起こす濃度では存在しない。複数の実施形態では、二量体化分子は、小分子、例えばラパマイシン若しくはラパログ、例えばRAD001である。
用量「低い免疫増強用量」は、mTOR阻害剤、例えばアロステリックmTOR阻害剤、例えばRAD001若しくはラパマイシン又は触媒mTOR阻害剤と一緒に使用されるとき、例えばP70 S6キナーゼ活性の阻害により測定される通り、mTOR活性を部分的に、しかし完全にではなく、阻害するmTOR阻害剤の用量を指す。例えば、P70 S6キナーゼ活性の阻害によりmTOR活性を評価する方法は、本明細書に詳述される。この用量は、完全な免疫抑制をもたらすのに不十分であるが、免疫応答を増強するには十分である。一部の実施形態では、mTOR阻害剤の低い免疫増強用量は、PD-1陽性T細胞の数の減少及び/若しくはPD-1陰性T細胞の数の増加又はPD-1陰性T細胞/PD-1陽性T細胞の比の増加をもたらす。一部の実施形態では、mTOR阻害剤の低い免疫増強用量は、ナイーブT細胞の数の増加をもたらす。一部の実施形態では、mTOR阻害剤の低い免疫増強用量は、
例えば、メモリーT細胞、例えばメモリーT細胞前駆体での下記マーカー:CD62Lhigh、CD127high、CD27+及びBCL2の1つ以上の発現の増大;
例えば、メモリーT細胞、例えばメモリーT細胞前駆体でのKLRG1の発現の減少;並びに
例えば、下記の特徴:CD62Lhighの増加、CD127highの増加、CD27+の増加、KLRG1の減少及びBCL2の増加のいずれか1つ又はそれらの組み合わせを備えるメモリーT細胞前駆体の数の増加
の1つ以上をもたらし、ここで、前述した変化のいずれかは、例えば、非処置対象と比較して、少なくとも一時的に起こる。
例えば、メモリーT細胞、例えばメモリーT細胞前駆体での下記マーカー:CD62Lhigh、CD127high、CD27+及びBCL2の1つ以上の発現の増大;
例えば、メモリーT細胞、例えばメモリーT細胞前駆体でのKLRG1の発現の減少;並びに
例えば、下記の特徴:CD62Lhighの増加、CD127highの増加、CD27+の増加、KLRG1の減少及びBCL2の増加のいずれか1つ又はそれらの組み合わせを備えるメモリーT細胞前駆体の数の増加
の1つ以上をもたらし、ここで、前述した変化のいずれかは、例えば、非処置対象と比較して、少なくとも一時的に起こる。
「難治性」は、本明細書で使用される場合、処置に応答しない疾患、例えば癌を指す。複数の実施形態において、難治性癌は、処置の開始前又は開始時点で処置に抵抗性であり得る。他の実施形態において、難治性癌は、処置中に抵抗性になり得る。難治性癌は、抵抗性癌とも称される。
本明細書で使用される「再発した」又は「再発」は、改善若しくは応答性期間後、例えばある治療(例えば、癌治療)による以前の処置後の疾患(例えば、癌)の又は癌などの疾患の兆候及び症状の再発又は再出現を指す。初期の応答性期間は、癌細胞のレベルの、ある閾値未満、例えば20%、1%、10%、5%、4%、3%、2%又は1%未満への低下を含み得る。再出現は、癌細胞のレベルの、ある閾値を越える、例えば20%、1%、10%、5%、4%、3%、2%又は1%を超える増加を含み得る。例えば、再出現は、例えば、B-ALLに関連して、完全応答後の、例えば血液、骨髄(>5%)又は任意の髄外部位における芽球の再出現を含み得る。これに関連して、完全応答は、<5%のBM芽球を含み得る。より一般的には、一部の実施形態において、応答(例えば、完全応答又は部分応答)は、検出可能なMRD(微小残存病変)の非存在を含み得る。一実施形態において、応答性の初期期間は、少なくとも1、2、3、4、5又は6日間;少なくとも1、2、3又は4週間;少なくとも1、2、3、4、6、8、10又は12ヶ月間;又は少なくとも1、2、3、4又は5年間続く。
範囲:本開示全体を通じて、本発明の様々な実施形態が範囲の形式で提示され得る。範囲の形式での記載は、単に便宜上及び簡潔にするためのものであり、本発明の範囲に対する確固たる限定と解釈されてはならないことが理解されるべきである。従って、範囲の記載は、具体的に開示される全ての可能な部分範囲並びにその範囲内にある個々の数値を有すると考えられなければならない。例えば、1~6などの範囲の記載は、1~3、1~4、1~5、2~4、2~6、3~6などの具体的に開示される部分範囲並びにその範囲内にある個々の数値、例えば1、2、2.7、3、4、5、5.3及び6を有すると考えられなければならない。別の例として、95~99%の同一性などの範囲は、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有するものを含み、及び96~99%、96~98%、96~97%、97~99%、97~98%及び98~99%の同一性などの部分範囲を含む。これは、範囲の幅に関わらず適用される。
「遺伝子編集システム」は、この用語が本明細書で使用されるとき、前記システムにより標的化されるゲノムDNAの部位若しくはその付近の1つ以上の核酸の改変、例えば欠失を指令し、実行するシステム、例えば1つ以上の分子を指す。遺伝子編集システムは、当技術分野では公知であり、以下により詳しく記載する。
「組み合わせて」投与されるは、本明細書で使用される場合、疾患による対象の苦痛が継続する過程において2種(以上の)異なる処置が対象に送達されることを意味し、例えば対象が疾患を有すると診断された後且つ疾患が治癒若しくは排除されるか、又は処置が他の理由で中止される前に、2種以上の処置が送達される。一部の実施形態では、1つの処置の送達は、第2の処置の送達が開始するとき依然として続いており、これにより、投与に関して重複が存在する。これは、本明細書において、「同時」又は「同時送達」と呼ばれる場合がある。他の実施形態では、1つの処置の送達は、他の処置の送達が開始する前に終了する。いずれかの場合の一部の実施形態において、処置は、併用投与によってより有効である。例えば、第2の処置の方が有効であり、例えばより少ない第2の処置で同等の効果がみられるか、又は第2の処置は、第1の処置を行わずに第2の処置が投与される場合にみられるものより優れた程度まで症状を軽減するか若しくは第1の処置と類似の状況がみられる。一部の実施形態では、送達は、症状の軽減又は障害に関する他のパラメーターが、一方が他方なしで送達された場合に認められるものより高くなるようにする。2つの処置の効果は、部分的に相加的、完全に相加的であるか又は相加的を上回り得る。送達は、送達される第1の処置の効果が、第2の処置が送達されるときにも依然として検出可能であるようにすることができる。
本明細書で互換的に使用される「枯渇(欠失)」又は「枯渇する(欠失させる)こと」という用語は、プロセス、例えば選択ステップ、例えばネガティブ選択が実施された後の、サンプル中の細胞、タンパク質若しくは高分子のレベル又は量の減少又は低下を指す。枯渇は、細胞、タンパク質若しくは高分子の完全又は部分的な枯渇であり得る。一部の実施形態において、枯渇は、プロセスが実施される前のサンプル中の細胞、タンパク質若しくは高分子のレベル又は量と比べて、細胞、タンパク質若しくは高分子のレベル又は量の少なくとも1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%若しくは99%の減少又は低下である。
本明細書で使用される場合、「ナイーブT細胞」は、抗原未経験のT細胞を指す。一部の実施形態では、抗原未経験T細胞は、胸腺中でそのコグネイト抗原に遭遇しているが、末梢では遭遇していない。一部の実施形態では、ナイーブT細胞は、メモリーT細胞の前駆体である。一部の実施形態では、ナイーブT細胞は、CD45RA及びCCR7の両方を発現するが、CD45ROを発現しない。一部の実施形態では、ナイーブT細胞は、CD62L、CD27、CCR7、CD45RA、CD28及びCD127の発現並びにCD95又はCD45ROアイソフォームの非存在を特徴とし得る。一部の実施形態では、ナイーブT細胞は、CD62L、IL-7受容体α、IL-6受容体及びCD132を発現するが、CD25、CD44、CD69又はCD45ROを発現しない。一部の実施形態では、ナイーブT細胞は、CD45RA、CCR7及びCD62Lを発現するが、CD95又はIL-2受容体βを発現しない。一部の実施形態では、マーカーの表面発現レベルは、フローサイトメトリーを用いて評価される。
用語「セントラルメモリーT細胞」は、ヒトにおいてCD45RO陽性であり、CCR7を発現するT細胞のサブセットを指す。一部の実施形態では、セントラルメモリーT細胞は、CD95を発現する。一部の実施形態では、セントラルメモリーT細胞は、IL-2R、IL-7R及び/又はIL-15Rを発現する。一部の実施形態では、セントラルメモリーT細胞は、CD45RO、CD95、IL-2受容体β、CCR7及びCD62Lを発現する。一部の実施形態では、マーカーの表面発現レベルは、フローサイトメトリーを用いて評価される。
用語「ステムメモリーT細胞」、「幹細胞メモリーT細胞」、「幹細胞様メモリーT細胞」、「メモリーステムT細胞」、「Tメモリー幹細胞」、「Tステムセルメモリー細胞」又は「TSCM細胞」は、幹細胞様能力、例えば自己再生する能力並びに/又はメモリー及び/若しくはエフェクターT細胞サブセットを再構成する多分化能を備えたメモリーT細胞のサブセットを指す。一部の実施形態では、ステムメモリーT細胞は、CD45RA、CD95、IL-2受容体β、CCR7及びCD62Lを発現する。一部の実施形態では、マーカーの表面発現レベルは、フローサイトメトリーを用いて評価される。一部の実施形態では、例示的なステムメモリーT細胞は、Gattinoni et al.,Nat Med.2017 January 06;23(1):18-27に開示されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
明瞭化の目的で、別に注記されない限り、特定のマーカーを「発現しない」又は「それが存在しない」又は「それについて陰性である」ものとして細胞若しくは細胞の集団を分類するのは、必ずしもマーカーの非存在を意味するわけではない。当業者は、容易に、陽性及び/若しくは陰性対照に対して細胞を比較し、及び/又は所定の閾値を設定し、且つ従来の検出方法を用いて、例えばフローサイトメトリーを用いて、例えば本明細書の実施例に記載されるように、細胞が、所定の閾値に満たない発現レベルを有するか、又は細胞の集団が、所定の閾値に満たない過剰発現レベルを有するとき、マーカーを発現しないか、若しくはマーカーについて陰性であるものとして細胞若しくは細胞の集団を分類することができる。例えば、代表的なゲーティング戦略を図1に示す。例えば、CCR7陽性、CD45RO陰性細胞は、図1Gの左上象限に示される。
本明細書で使用される場合、細胞の「GeneSetScore(Up TEM vs.Down TSCM)」という用語は、細胞が、幹細胞メモリーT細胞(TSCM)表現型に対してエフェクターメモリーT細胞(TEM)表現型を示す程度を表すスコアを指す。より高いGeneSetScore(Up TEM vs.Down TSCM)は、TEM表現型の増加を示すのに対し、より低いGeneSetScore(Up TEM vs.Down TSCM)は、TSCM表現型の増加を示す。一部の実施形態では、GeneSetScore(Up TEM vs.Down TSCM)は、TEM細胞で上方制御される及び/又はTSCMで下方制御される1つ以上の遺伝子、例えばMXRA7、CLIC1、NAT13、TBC1D2B、GLCCI1、DUSP10、APOBEC3D、CACNB3、ANXA2P2、TPRG1、EOMES、MATK、ARHGAP10、ADAM8、MAN1A1、SLFN12L、SH2D2A、EIF2C4、CD58、MYO1F、RAB27B、ERN1、NPC1、NBEAL2、APOBEC3G、SYTL2、SLC4A4、PIK3AP1、PTGDR、MAF、PLEKHA5、ADRB2、PLXND1、GNAO1、THBS1、PPP2R2B、CYTH3、KLRF1、FLJ16686、AUTS2、PTPRM、GNLY及びGFPT2からなる群から選択される1つ以上の遺伝子の発現を測定することによって決定される。一部の実施形態では、GeneSetScore(Up TEM vs.Down TSCM)は、例えば、図39Aを参照にして実施例10に例示される通り、RNA-seq、例えば単一細胞RNA-seq(scRNA-seq)を用いて、各細胞について決定される。一部の実施形態では、GeneSetScore(Up TEM vs.Down TSCM)は、遺伝子セット中の遺伝子全ての平均log正規化遺伝子発現値を取得することにより計算される。
本明細書で使用されるとき、細胞の「GeneSetScore(Up Treg vs.Down Teff)」という用語は、細胞が、エフェクターT細胞(Teff)表現型に対して調節T細胞(Treg)を示す程度を表すスコアを指す。より高いGeneSetScore(Up Treg vs.Down Teff)は、Treg表現型の増加を示すのに対し、より低いGeneSetScore(Up Treg vs.Down Teff)は、Teff表現型の増加を示す。一部の実施形態では、GeneSetScore(Up Treg vs.Down Teff)は、Treg細胞で上方制御される及び/又はTeff細胞で下方制御される1つ以上の遺伝子、例えばC12orf75、SELPLG、SWAP70、RGS1、PRR11、SPATS2L、SPATS2L、TSHR、C14orf145、CASP8、SYT11、ACTN4、ANXA5、GLRX、HLA-DMB、PMCH、RAB11FIP1、IL32、FAM160B1、SHMT2、FRMD4B、CCR3、TNFRSF13B、NTNG2、CLDND1、BARD1、FCER1G、TYMS、ATP1B1、GJB6、FGL2、TK1、SLC2A8、CDKN2A、SKAP2、GPR55、CDCA7、S100A4、GDPD5、PMAIP1、ACOT9、CEP55、SGMS1、ADPRH、AKAP2、HDAC9、IKZF4、CARD17、VAV3、OBFC2A、ITGB1、CIITA、SETD7、HLA-DMA、CCR10、KIAA0101、SLC14A1、PTTG3P、DUSP10、FAM164A、PYHIN1、MYO1F、SLC1A4、MYBL2、PTTG1、RRM2、TP53INP1、CCR5、ST8SIA6、TOX、BFSP2、ITPRIPL1、NCAPH、HLA-DPB2、SYT4、NINJ2、FAM46C、CCR4、GBP5、C15orf53、LMCD1、MKI67、NUSAP1、PDE4A、E2F2、CD58、ARHGEF12、LOC100188949、FAS、HLA-DPB1、SELP、WEE1、HLA-DPA1、FCRL1、ICA1、CNTNAP1、OAS1、METTL7A、CCR6、HLA-DRB4、ANXA2P3、STAM、HLA-DQB2、LGALS1、ANXA2、PI16、DUSP4、LAYN、ANXA2P2、PTPLA、ANXA2P1、ZNF365、LAIR2、LOC541471、RASGRP4、BCAS1、UTS2、MIAT、PRDM1、SEMA3G、FAM129A、HPGD、NCF4、LGALS3、CEACAM4、JAKMIP1、TIGIT、HLA-DRA、IKZF2、HLA-DRB1、FANK1、RTKN2、TRIB1、FCRL3及びFOXP3からなる群から選択される1つ以上の遺伝子の発現を測定することによって決定される。一部の実施形態において、GeneSetScore(Up Treg vs.Down Teff)は、例えば、図39Bを参照にして実施例10に例示される通り、RNA-seq、例えば単一細胞RNA-seq(scRNA-seq)を用いて決定される。一部の実施形態では、GeneSetScore(Up Treg vs.Down Teff)は、遺伝子セット中の遺伝子全ての平均log正規化遺伝子発現値を取得することにより計算される。
本明細書で使用されるとき、細胞の「GeneSetScore(Down stemness)」という用語は、細胞が、幹細胞性表現型を示す程度を表すスコアを指す。より低いGeneSetScore(Down stemness)は、幹細胞性表現型の増加を示す。一部の実施形態では、GeneSetScore(Down stemness)は、造血幹細胞中で下方制御されるのに対して、分化幹細胞中で上方制御される1つ以上の遺伝子、例えばACE、BATF、CDK6、CHD2、ERCC2、HOXB4、MEOX1、SFRP1、SP7、SRF、TAL1及びXRCC5からなる群から選択される1つ以上の遺伝子の発現を測定することにより測定される。一部の実施形態では、GeneSetScore(Down stemness)は、例えば、図39Cを参照にして実施例10に例示される通り、RNA-seq、例えば単一細胞RNA-seq(scRNA-seq)を用いて決定される。一部の実施形態では、GeneSetScore(Down stemness)は、遺伝子セット中の遺伝子全ての平均log正規化遺伝子発現値を取得することにより計算される。
本明細書で使用されるとき、細胞の「GeneSetScore(UP hypoxia)」という用語は、細胞が低酸素表現型を示す程度を表すスコアを示す。より高いGeneSetScore(UP hypoxia)は、低酸素表現型の増加を示す。一部の実施形態では、GeneSetScore(UP hypoxia)は、低酸素を被っている細胞において上方制御される1つ以上の遺伝子、例えばABCB1、ACAT1、ADM、ADORA2B、AK2、AK3、ALDH1A1、ALDH1A3、ALDOA、ALDOC、ANGPT2、ANGPTL4、ANXA1、ANXA2、ANXA5、ARHGAP5、ARSE、ART1、BACE2、BATF3、BCL2L1、BCL2L2、BHLHE40、BHLHE41、BIK、BIRC2、BNIP3、BNIP3L、BPI、BTG1、C11orf2、C7orf68、CA12、CA9、CALD1、CCNG2、CCT6A、CD99、CDK1、CDKN1A、CDKN1B、CITED2、CLK1、CNOT7、COL4A5、COL5A1、COL5A2、COL5A3、CP、CTSD、CXCR4、D4S234E、DDIT3、DDIT4、1-Dec、DKC1、DR1、EDN1、EDN2、EFNA1、EGF、EGR1、EIF4A3、ELF3、ELL2、ENG、ENO1、ENO3、ENPEP、EPO、ERRFI1、ETS1、F3、FABP5、FGF3、FKBP4、FLT1、FN1、FOS、FTL、GAPDH、GBE1、GLRX、GPI、GPRC5A、HAP1、HBP1、HDAC1、HDAC9、HERC3、HERPUD1、HGF、HIF1A、HK1、HK2、HLA-DQB1、HMOX1、HMOX2、HSPA5、HSPD1、HSPH1、HYOU1、ICAM1、ID2、IFI27、IGF2、IGFBP1、IGFBP2、IGFBP3、IGFBP5、IL6、IL8、INSIG1、IRF6、ITGA5、JUN、KDR、KRT14、KRT18、KRT19、LDHA、LDHB、LEP、LGALS1、LONP1、LOX、LRP1、MAP4、MET、MIF、MMP13、MMP2、MMP7、MPI、MT1L、MTL3P、MUC1、MXI1、NDRG1、NFIL3、NFKB1、NFKB2、NOS1、NOS2、NOS2P1、NOS2P2、NOS3、NR3C1、NR4A1、NT5E、ODC1、P4HA1、P4HA2、PAICS、PDGFB、PDK3、PFKFB1、PFKFB3、PFKFB4、PFKL、PGAM1、PGF、PGK1、PGK2、PGM1、PIM1、PIM2、PKM2、PLAU、PLAUR、PLIN2、PLOD2、PNN、PNP、POLM、PPARA、PPAT、PROK1、PSMA3、PSMD9、PTGS1、PTGS2、QSOX1、RBPJ、RELA、RIOK3、RNASEL、RPL36A、RRP9、SAT1、SERPINB2、SERPINE1、SGSM2、SIAH2、SIN3A、SIRPA、SLC16A1、SLC16A2、SLC20A1、SLC2A1、SLC2A3、SLC3A2、SLC6A10P、SLC6A16、SLC6A6、SLC6A8、SORL1、SPP1、SRSF6、SSSCA1、STC2、STRA13、SYT7、TBPL1、TCEAL1、TEK、TF、TFF3、TFRC、TGFA、TGFB1、TGFB3、TGFBI、TGM2、TH、THBS1、THBS2、TIMM17A、TNFAIP3、TP53、TPBG、TPD52、TPI1、TXN、TXNIP、UMPS、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VIM、VPS11及びXRCC6からなる群から選択される1つ以上の遺伝子の発現を測定することにより決定される。一部の実施形態では、GeneSetScore(UP hypoxia)は、例えば、図39Dを参照にして実施例10に例示される通り、RNA-seq、例えば単一細胞RNA-seq(scRNA-seq)を用いて決定される。一部の実施形態では、GeneSetScore(UP hypoxia)は、遺伝子セット中の遺伝子全ての平均log正規化遺伝子発現値を取得することにより計算される。
本明細書で使用されるとき、細胞の「GeneSetScore(UP autophagy)」という用語は、細胞がオートファジー表現型を示す程度を表すスコアを示す。より高いGeneSetScore(UP autophagy)は、オートファジー表現型の増加を示す。一部の実施形態では、GeneSetScore(UP autophagy)は、オートファジーを被っている細胞において上方制御される1つ以上の遺伝子、例えばABL1、ACBD5、ACIN1、ACTRT1、ADAMTS7、AKR1E2、ALKBH5、ALPK1、AMBRA1、ANXA5、ANXA7、ARSB、ASB2、ATG10、ATG12、ATG13、ATG14、ATG16L1、ATG16L2、ATG2A、ATG2B、ATG3、ATG4A、ATG4B、ATG4C、ATG4D、ATG5、ATG7、ATG9A、ATG9B、ATP13A2、ATP1B1、ATPAF1-AS1、ATPIF1、BECN1、BECN1P1、BLOC1S1、BMP2KL、BNIP1、BNIP3、BOC、C11orf2、C11orf41、C12orf44、C12orf5、C14orf133、C1orf210、C5、C6orf106、C7orf59、C7orf68、C8orf59、C9orf72、CA7、CALCB、CALCOCO2、CAPS、CCDC36、CD163L1、CD93、CDC37、CDKN2A、CHAF1B、CHMP2A、CHMP2B、CHMP3、CHMP4A、CHMP4B、CHMP4C、CHMP6、CHST3、CISD2、CLDN7、CLEC16A、CLN3、CLVS1、COX8A、CPA3、CRNKL1、CSPG5、CTSA、CTSB、CTSD、CXCR7、DAP、DKKL1、DNAAF2、DPF3、DRAM1、DRAM2、DYNLL1、DYNLL2、DZANK1、EI24、EIF2S1、EPG5、EPM2A、FABP1、FAM125A、FAM131B、FAM134B、FAM13B、FAM176A、FAM176B、FAM48A、FANCC、FANCF、FANCL、FBXO7、FCGR3B、FGF14、FGF7、FGFBP1、FIS1、FNBP1L、FOXO1、FUNDC1、FUNDC2、FXR2、GABARAP、GABARAPL1、GABARAPL2、GABARAPL3、GABRA5、GDF5、GMIP、HAP1、HAPLN1、HBXIP、HCAR1、HDAC6、HGS、HIST1H3A、HIST1H3B、HIST1H3C、HIST1H3D、HIST1H3E、HIST1H3F、HIST1H3G、HIST1H3H、HIST1H3I、HIST1H3J、HK2、HMGB1、HPR、HSF2BP、HSP90AA1、HSPA8、IFI16、IPPK、IRGM、IST1、ITGB4、ITPKC、KCNK3、KCNQ1、KIAA0226、KIAA1324、KRCC1、KRT15、KRT73、LAMP1、LAMP2、LAMTOR1、LAMTOR2、LAMTOR3、LARP1B、LENG9、LGALS8、LIX1、LIX1L、LMCD1、LRRK2、LRSAM1、LSM4、MAP1A、MAP1LC3A、MAP1LC3B、MAP1LC3B2、MAP1LC3C、MAP1S、MAP2K1、MAP3K12、MARK2、MBD5、MDH1、MEX3C、MFN1、MFN2、MLST8、MRPS10、MRPS2、MSTN、MTERFD1、MTMR14、MTMR3、MTOR、MTSS1、MYH11、MYLK、MYOM1、NBR1、NDUFB9、NEFM、NHLRC1、NME2、NPC1、NR2C2、NRBF2、NTHL1、NUP93、OBSCN、OPTN、P2RX5、PACS2、PARK2、PARK7、PDK1、PDK4、PEX13、PEX3、PFKP、PGK2、PHF23、PHYHIP、PI4K2A、PIK3C3、PIK3CA、PIK3CB、PIK3R4、PINK1、PLEKHM1、PLOD2、PNPO、PPARGC1A、PPY、PRKAA1、PRKAA2、PRKAB1、PRKAB2、PRKAG1、PRKAG2、PRKAG3、PRKD2、PRKG1、PSEN1、PTPN22、RAB12、RAB1A、RAB1B、RAB23、RAB24、RAB33B、RAB39、RAB7A、RB1CC1、RBM18、REEP2、REP15、RFWD3、RGS19、RHEB、RIMS3、RNF185、RNF41、RPS27A、RPTOR、RRAGA、RRAGB、RRAGC、RRAGD、S100A8、S100A9、SCN1A、SERPINB10、SESN2、SFRP4、SH3GLB1、SIRT2、SLC1A3、SLC1A4、SLC22A3、SLC25A19、SLC35B3、SLC35C1、SLC37A4、SLC6A1、SLCO1A2、SMURF1、SNAP29、SNAPIN、SNF8、SNRPB、SNRPB2、SNRPD1、SNRPF、SNTG1、SNX14、SPATA18、SQSTM1、SRPX、STAM、STAM2、STAT2、STBD1、STK11、STK32A、STOM、STX12、STX17、SUPT3H、TBC1D17、TBC1D25、TBC1D5、TCIRG1、TEAD4、TECPR1、TECPR2、TFEB、TM9SF1、TMBIM6、TMEM203、TMEM208、TMEM39A、TMEM39B、TMEM59、TMEM74、TMEM93、TNIK、TOLLIP、TOMM20、TOMM22、TOMM40、TOMM5、TOMM6、TOMM7、TOMM70A、TP53INP1、TP53INP2、TRAPPC8、TREM1、TRIM17、TRIM5、TSG101、TXLNA、UBA52、UBB、UBC、UBQLN1、UBQLN2、UBQLN4、ULK1、ULK2、ULK3、USP10、USP13、USP30、UVRAG、VAMP7、VAMP8、VDAC1、VMP1、VPS11、VPS16、VPS18、VPS25、VPS28、VPS33A、VPS33B、VPS36、VPS37A、VPS37B、VPS37C、VPS37D、VPS39、VPS41、VPS4A、VPS4B、VTA1、VTI1A、VTI1B、WDFY3、WDR45、WDR45L、WIPI1、WIPI2、XBP1、YIPF1、ZCCHC17、ZFYVE1、ZKSCAN3、ZNF189、ZNF593及びZNF681からなる群から選択される1つ以上の遺伝子の発現を測定することにより決定される。一部の実施形態では、GeneSetScore(UP autophagy)は、例えば、図39Eを参照にして実施例10に例示される通り、RNA-seq、例えば単一細胞RNA-seq(scRNA-seq)を用いて決定される。一部の実施形態では、GeneSetScore(UP autophagy)は、遺伝子セット中の遺伝子全ての平均log正規化遺伝子発現値を取得することにより計算される。
本明細書で使用されるとき、細胞の「GeneSetScore(Up resting vs.Down activated)」という用語は、細胞が、活性化T細胞表現型に対して休止T細胞表現型を示す程度を表すスコアを指す。より高いGeneSetScore(Up resting vs.Down activated)は、休止T細胞表現型の増加を示すのに対し、より低いGeneSetScore(Up resting vs.Down activated)は、活性化T細胞表現型の増加を示す。一部の実施形態では、GeneSetScore(Up resting vs.Down activated)は、休止T細胞で上方制御され、且つ/又は活性化T細胞で下方制御される1つ以上の遺伝子、例えばABCA7、ABCF3、ACAP2、AMT、ANKH、ATF7IP2、ATG14、ATP1A1、ATXN7、ATXN7L3B、BCL7A、BEX4、BSDC1、BTG1、BTG2、BTN3A1、C11orf21、C19orf22、C21orf2、CAMK2G、CARS2、CCNL2、CD248、CD5、CD55、CEP164、CHKB、CLK1、CLK4、CTSL1、DBP、DCUN1D2、DENND1C、DGKD、DLG1、DUSP1、EAPP、ECE1、ECHDC2、ERBB2IP、FAM117A、FAM134B、FAM134C、FAM169A、FAM190B、FAU、FLJ10038、FOXJ2、FOXJ3、FOXL1、FOXO1、FXYD5、FYB、HLA-E、HSPA1L、HYAL2、ICAM2、IFIT5、IFITM1、IKBKB、IQSEC1、IRS4、KIAA0664L3、KIAA0748、KLF3、KLF9、KRT18、LEF1、LINC00342、LIPA、LIPT1、LLGL2、LMBR1L、LPAR2、LTBP3、LYPD3、LZTFL1、MANBA、MAP2K6、MAP3K1、MARCH8、MAU2、MGEA5、MMP8、MPO、MSL1、MSL3、MYH3、MYLIP、NAGPA、NDST2、NISCH、NKTR、NLRP1、NOSIP、NPIP、NUMA1、PAIP2B、PAPD7、PBXIP1、PCIF1、PI4KA、PLCL2、PLEKHA1、PLEKHF2、PNISR、PPFIBP2、PRKCA、PRKCZ、PRKD3、PRMT2、PTP4A3、PXN、RASA2、RASA3、RASGRP2、RBM38、REPIN1、RNF38、RNF44、ROR1、RPL30、RPL32、RPLP1、RPS20、RPS24、RPS27、RPS6、RPS9、RXRA、RYK、SCAND2、SEMA4C、SETD1B、SETD6、SETX、SF3B1、SH2B1、SLC2A4RG、SLC35E2B、SLC46A3、SMAGP、SMARCE1、SMPD1、SNPH、SP140L、SPATA6、SPG7、SREK1IP1、SRSF5、STAT5B、SVIL、SYF2、SYNJ2BP、TAF1C、TBC1D4、TCF20、TECTA、TES、TMEM127、TMEM159、TMEM30B、TMEM66、TMEM8B、TP53TG1、TPCN1、TRIM22、TRIM44、TSC1、TSC22D1、TSC22D3、TSPYL2、TTC9、TTN、UBE2G2、USP33、USP34、VAMP1、VILL、VIPR1、VPS13C、ZBED5、ZBTB25、ZBTB40、ZC3H3、ZFP161、ZFP36L1、ZFP36L2、ZHX2、ZMYM5、ZNF136、ZNF148、ZNF318、ZNF350、ZNF512B、ZNF609、ZNF652、ZNF83、ZNF862及びZNF91からなる群から選択される1つ以上の遺伝子の発現を測定することにより決定される。一部の実施形態では、GeneSetScore(Up resting vs.Down activated)は、例えば、図38Dを参照にして実施例10に例示される通り、RNA-seq、例えば単一細胞RNA-seq(scRNA-seq)を用いて決定される。一部の実施形態では、GeneSetScore(Up resting vs.Down activated)は、遺伝子セット中の遺伝子全ての平均log正規化遺伝子発現値を取得することにより計算される。
本明細書で使用されるとき、細胞の「GeneSetScore(Progressively up in memory differentiation)」は、メモリー分化における細胞の段階を表すスコアを指す。より高いGeneSetScore(Progressively up in memory differentiation)は、後期メモリーT細胞表現型の増加を示すのに対し、より低いGeneSetScore(Progressively up in memory differentiation)は、早期メモリーT細胞表現型の増加を示す。一部の実施形態では、GeneSetScore(UP autophagy)は、メモリー分化中に上方制御される1つ以上の遺伝子、例えばMTCH2、RAB6C、KIAA0195、SETD2、C2orf24、NRD1、GNA13、COPA、SELT、TNIP1、CBFA2T2、LRP10、PRKCI、BRE、ANKS1A、PNPLA6、ARL6IP1、WDFY1、MAPK1、GPR153、SHKBP1、MAP1LC3B2、PIP4K2A、HCN3、GTPBP1、TLN1、C4orf34、KIF3B、TCIRG1、PPP3CA、ATG4D、TYMP、TRAF6、C17orf76、WIPF1、FAM108A1、MYL6、NRM、SPCS2、GGT3P、GALK1、CLIP4、ARL4C、YWHAQ、LPCAT4、ATG2A、IDS、TBC1D5、DMPK、ST6GALNAC6、REEP5、ABHD6、KIAA0247、EMB、TSEN54、SPIRE2、PIWIL4、ZSCAN22、ICAM1、CHD9、LPIN2、SETD8、ZC3H12A、ULBP3、IL15RA、HLA-DQB2、LCP1、CHP、RUNX3、TMEM43、REEP4、MEF2D、ABL1、TMEM39A、PCBP4、PLCD1、CHST12、RASGRP1、C1orf58、C11orf63、C6orf129、FHOD1、DKFZp434F142、PIK3CG、ITPR3、BTG3、C4orf50、CNNM3、IFI16、AK1、CDK2AP1、REL、BCL2L1、MVD、TTC39C、PLEKHA2、FKBP11、EML4、FANCA、CDCA4、FUCA2、MFSD10、TBCD、CAPN2、IQGAP1、CHST11、PIK3R1、MYO5A、KIR2DL3、DLG3、MXD4、RALGDS、S1PR5、WSB2、CCR3、TIPARP、SP140、CD151、SOX13、KRTAP5-2、NF1、PEA15、PARP8、RNF166、UEVLD、LIMK1、CACNB1、TMX4、SLC6A6、LBA1、SV2A、LLGL2、IRF1、PPP2R5C、CD99、RAPGEF1、PPP4R1、OSBPL7、FOXP4、SLA2、TBC1D2B、ST7、JAZF1、GGA2、PI4K2A、CD68、LPGAT1、STX11、ZAK、FAM160B1、RORA、C8orf80、APOBEC3F、TGFBI、DNAJC1、GPR114、LRP8、CD69、CMIP、NAT13、TGFB1、FLJ00049、ANTXR2、NR4A3、IL12RB1、NTNG2、RDX、MLLT4、GPRIN3、ADCY9、CD300A、SCD5、ABI3、PTPN22、LGALS1、SYTL3、BMPR1A、TBK1、PMAIP1、RASGEF1A、GCNT1、GABARAPL1、STOM、CALHM2、ABCA2、PPP1R16B、SYNE2、PAM、C12orf75、CLCF1、MXRA7、APOBEC3C、CLSTN3、ACOT9、HIP1、LAG3、TNFAIP3、DCBLD1、KLF6、CACNB3、RNF19A、RAB27A、FADS3、DLG5、APOBEC3D、TNFRSF1B、ACTN4、TBKBP1、ATXN1、ARAP2、ARHGEF12、FAM53B、MAN1A1、FAM38A、PLXNC1、GRLF1、SRGN、HLA-DRB5、B4GALT5、WIPI1、PTPRJ、SLFN11、DUSP2、ANXA5、AHNAK、NEO1、CLIC1、EIF2C4、MAP3K5、IL2RB、PLEKHG1、MYO6、GTDC1、EDARADD、GALM、TARP、ADAM8、MSC、HNRPLL、SYT11、ATP2B4、NHSL2、MATK、ARHGAP18、SLFN12L、SPATS2L、RAB27B、PIK3R3、TP53INP1、MBOAT1、GYG1、KATNAL1、FAM46C、ZC3HAV1L、ANXA2P2、CTNNA1、NPC1、C3AR1、CRIM1、SH2D2A、ERN1、YPEL1、TBX21、SLC1A4、FASLG、PHACTR2、GALNT3、ADRB2、PIK3AP1、TLR3、PLEKHA5、DUSP10、GNAO1、PTGDR、FRMD4B、ANXA2、EOMES、CADM1、MAF、TPRG1、NBEAL2、PPP2R2B、PELO、SLC4A4、KLRF1、FOSL2、RGS2、TGFBR3、PRF1、MYO1F、GAB3、C17orf66、MICAL2、CYTH3、TOX、HLA-DRA、SYNE1、WEE1、PYHIN1、F2R、PLD1、THBS1、CD58、FAS、NETO2、CXCR6、ST6GALNAC2、DUSP4、AUTS2、C1orf21、KLRG1、TNIP3、GZMA、PRR5L、PRDM1、ST8SIA6、PLXND1、PTPRM、GFPT2、MYBL1、SLAMF7、FLJ16686、GNLY、ZEB2、CST7、IL18RAP、CCL5、KLRD1及びKLRB1からなる群から選択される1つ以上の遺伝子の発現を測定することにより決定される。一部の実施形態では、GeneSetScore(Progressively up in memory differentiation)は、例えば、図40Bを参照にして実施例10に例示される通り、RNA-seq、例えば単一細胞RNA-seq(scRNA-seq)を用いて決定される。一部の実施形態では、GeneSetScore(Progressively up in memory differentiation)は、遺伝子セット中の遺伝子全ての平均log正規化遺伝子発現値を取得することにより計算される。
本明細書で使用されるとき、細胞の「GeneSetScore(Up TEM vs.Down TN)」という用語は、細胞が、ナイーブT細胞(TN)表現型に対してエフェクターメモリーT細胞(TEM)表現型を示す程度を表すスコアを指す。より高いGeneSetScore(Up TEM vs.Down TN)は、TEM表現型の増加を示すのに対し、より低いGeneSetScore(Up TEM vs.Down TN)は、TN表現型の増加を示す。一部の実施形態では、GeneSetScore(Up TEM vs.Down TN)は、TEM細胞で上方制御され、且つ/又はTN細胞で下方制御される1つ以上の遺伝子、例えばMYO5A、MXD4、STK3、S1PR5、GLCCI1、CCR3、SOX13、KRTAP5-2、PEA15、PARP8、RNF166、UEVLD、LIMK1、SLC6A6、SV2A、KPNA2、OSBPL7、ST7、GGA2、PI4K2A、CD68、ZAK、RORA、TGFBI、DNAJC1、JOSD1、ZFYVE28、LRP8、OSBPL3、CMIP、NAT13、TGFB1、ANTXR2、NR4A3、RDX、ADCY9、CHN1、CD300A、SCD5、PTPN22、LGALS1、RASGEF1A、GCNT1、GLUL、ABCA2、CLDND1、PAM、CLCF1、MXRA7、CLSTN3、ACOT9、METRNL、BMPR1A、LRIG1、APOBEC3G、CACNB3、RNF19A、RAB27A、FADS3、ACTN4、TBKBP1、FAM53B、MAN1A1、FAM38A、GRLF1、B4GALT5、WIPI1、DUSP2、ANXA5、AHNAK、CLIC1、MAP3K5、ST8SIA1、TARP、ADAM8、MATK、SLFN12L、PIK3R3、FAM46C、ANXA2P2、CTNNA1、NPC1、SH2D2A、ERN1、YPEL1、TBX21、STOM、PHACTR2、GBP5、ADRB2、PIK3AP1、DUSP10、PTGDR、EOMES、MAF、TPRG1、NBEAL2、NCAPH、SLC4A4、FOSL2、RGS2、TGFBR3、MYO1F、C17orf66、CYTH3、WEE1、PYHIN1、F2R、THBS1、CD58、AUTS2、FAM129A、TNIP3、GZMA、PRR5L、PRDM1、PLXND1、PTPRM、GFPT2、MYBL1、SLAMF7、ZEB2、CST7、CCL5、GZMK及びKLRB1からなる群から選択される1つ以上の遺伝子の発現を測定することにより決定される。一部の実施形態では、GeneSetScore(Up TEM vs.Down TN)は、例えば、図40Cを参照にして実施例10に例示される通り、RNA-seq、例えば単一細胞RNA-seq(scRNA-seq)を用いて決定される。一部の実施形態では、GeneSetScore(Up TEM vs.Down TN)は、遺伝子セット中の遺伝子全ての平均log正規化遺伝子発現値を取得することにより計算される。
GeneSetScore値(例えば、GeneSetScore中央値)に関連して、正のGeneSetScoreが100%減少するとき、この値は0になる。負のGeneSetScoreが100%増加するとき、この値は0になる。例えば、図39Aにおいて、第1日サンプルのGeneSetScore中央値は、-0.084であり;第9日サンプルのGeneSetScore中央値は、0.035であり;入力サンプルのGeneSetScore中央値は、-0.1である。図39Aにおいて、入力サンプルのGeneSetScore中央値の100%の増加により、0のGeneSetScore値が得られ;入力サンプルのGeneSetScore中央値の200%の増加により、0.1のGeneSetScore値が得られる。図39Aにおいて、第9日サンプルのGeneSetScore中央値の100%の減少により、0のGeneSetScore値が得られ;第9日サンプルのGeneSetScore中央値の200%の減少により、-0.035のGeneSetScore値が得られる。
本明細書で使用されるとき、用語「ビーズ」は、直径約0.1μm~数ミリメートルのサイズの固体表面を備える個別の粒子を指す。ビーズは、球形(例えば、ミクロスフィア)であり得るか、又は不規則な形状を有し得る。ビーズは、限定されないが、常磁性材料、セラミック、プラスチック、ガラス、ポリスチレン、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、Sepharose(商標)、セルロース、ナイロンなどを含め、多様な材料を含み得る。一部の実施形態では、ビーズは、比較的均一で、直径約4.5μmの、球形、超常磁性ポリスチレンビーズであり、例えばCD3(例えば、CD3ε)及びCD28に対する抗体の混合物でコーティングされている、例えばそれと結合している。一部の実施形態では、ビーズは、Dynabeads(登録商標)である。一部の実施形態では、抗CD3及び抗CD28抗体の双方が同じビーズに結合されて、抗原提示細胞によるT細胞の刺激を模倣する。Dynabeads(登録商標)の特性並びに細胞単離及び増殖のためのDynabeads(登録商標)の使用は当技術分野で公知であり、例えばNeurauter et al.,Cell isolation and expansion using Dynabeads,Adv Biochem Eng Biotechnol 2007;106:41-73を参照されたく、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用されるとき、用語「ナノマトリックス」は、可動性ポリマー鎖のマトリックスを含むナノ構造を指す。ナノマトリックスは、1~500nm、例えば10~200nmのサイズである。一部の実施形態では、可動性ポリマー鎖のマトリックスは、T細胞に活性化シグナルを提供する1つ以上のアゴニスト、例えばアゴニスト抗CD3及び/又は抗CD28抗体に結合される。一部の実施形態では、ナノマトリックスは、1つ以上の刺激分子のアゴニスト及び/又は1つ以上の共刺激分子のアゴニストに結合、例えば共有結合したコロイドポリマーナノマトリックスを含む。一部の実施形態では、1つ以上の刺激分子のアゴニストは、CD3アゴニスト(例えば、抗CD3アゴニスト抗体)である。一部の実施形態では、1つ以上の刺激分子のアゴニストは、CD28アゴニスト(例えば、抗CD28アゴニスト抗体)である。一部の実施形態では、ナノマトリックスは、例えば、抗CD3及び/又は抗CD28抗体などのアゴニストの結合点として、固体表面の非存在を特徴とする。一部の実施形態では、ナノマトリックスは、国際公開第2014/048920A1号パンフレットに開示されるナノマトリックス又はMiltenyi Biotcc GmbH製のMACS(登録商標)GMP T Cell TransAct(商標)キットに提供されるようなナノマトリックスであり、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。MACS(登録商標)GMP T Cell TransAct(商標)は、ヒトCD3及びCD28に対するヒト化組換えアゴニスト抗体に共有結合されたコロイドポリマーナノマトリックスから構成される。
本明細書に記載の組成物及び方法の様々な実施形態について以下でさらに詳細に説明する。追加的定義は、本明細書全体を通して記載される。
本明細書には、CAR、例えば本明細書に記載のCARを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞若しくはNK細胞)を製造する方法、そうした細胞を含む組成物及び対象の疾患、例えば癌を処置するためのそうした細胞の使用方法が提供される。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、24時間未満でCARを発現するように操作された免疫エフェクター細胞を製造することができる。理論に縛られることを意図しないが、本明細書に記載の方法は、製造プロセス中、ナイーブT細胞などのT細胞の未分化表現型を保存する。未分化表現型を有するこれらのCAR発現細胞は、注入後にインビボで、より長く持続し、且つ/又はより良く増殖し得る。一部の実施形態では、本明細書に記載の製造方法により生産されるCART細胞は、例えば、scRNA-seqを用いて測定される通り(例えば、図39Aを参照にして実施例10に記載される方法を用いて測定される通り)、伝統的な製造プロセスにより生産されるCART細胞と比べて、より高いパーセンテージの幹細胞メモリーT細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の製造方法により生産されるCART細胞は、例えば、scRNA-seqを用いて測定される通り(例えば、図39Bを参照にして実施例10に記載される方法を用いて測定される通り)、伝統的な製造プロセスにより生産されるCART細胞と比べて、より高いパーセンテージのエフェクターT細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の製造方法により生産されるCART細胞は、例えば、scRNA-seqを用いて測定される通り(例えば、図39Cを参照にして実施例10に記載される方法を用いて測定される通り)、伝統的な製造プロセスにより生産されるCART細胞と比べて、T細胞の幹細胞性をより良く保存する。一部の実施形態では、本明細書に記載の製造方法により生産されるCART細胞は、例えば、scRNA-seqを用いて測定される通り(例えば、図39Dを参照にして実施例10に記載される方法を用いて測定される通り)、伝統的な製造プロセスにより生産されるCART細胞と比べて、低いレベルの低酸素を示す。一部の実施形態では、本明細書に記載の製造方法により生産されるCART細胞は、例えば、scRNA-seqを用いて測定される通り(例えば、図39Eを参照にして実施例10に記載される方法を用いて測定される通り)、伝統的な製造プロセスにより生産されるCART細胞と比べて、低いレベルのオートファジーを示す。
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、Dynabeads(登録商標)(例えば、CD3/CD28Dynabeads(登録商標))などのビーズの使用を含まず、脱ビーズステップも含まない。一部の実施形態では、本明細書に開示の方法により製造されるCART細胞は、最小エクスビボ拡大、例えば1日未満、12時間未満、8時間未満、6時間未満、4時間未満、3時間未満、2時間未満、1時間未満又はエクスビボ拡大なしで対象に投与することができる。従って、本明細書に記載の方法は、対象の疾患の処置に使用するための改善されたCAR発現細胞産物を作製する高速製造プロセスを提供する。
サイトカインプロセス
一部の実施形態では、本開示は、キメラ抗原受容体(CAR)を発現する細胞(例えば、T細胞)の集団を作製する方法を提供し、これは、(1)細胞の集団を、IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、IL-6又はそれらの組み合わせから選択されるサイトカインと接触させるステップ、(2)細胞(例えば、T細胞)の集団を、CARをコードする核酸分子(例えば、DNA又はRNA分子)と接触させ、それにより核酸分子を含む細胞(例えば、T細胞)の集団を取得するステップ、及び(3)保存(例えば、凍結保存媒体中で細胞の集団の再製剤化すること)又は投与のために細胞(例えば、T細胞)の集団を採取するステップを含み、(a)ステップ(2)は、ステップ(1)と一緒に、又はステップ(1)の開始後の5時間以内、例えばステップ(1)の開始後の1、2、3、4又は5時間以内に実施し、ステップ(3)は、ステップ(1)の開始後の26時間以内、例えばステップ(1)の開始後の22、23又は24時間以内、例えばステップ(1)の開始後の24時間以内に実施するか、又は(b)ステップ(3)からの細胞の集団は、増殖されないか、又は例えばステップ(1)の開始時の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて5、10、15、20、25、30、35又は40%以下、例えば10%以下だけ増殖される。一部の実施形態では、ステップ(2)における核酸分子は、DNA分子である。一部の実施形態では、ステップ(2)における核酸分子は、RNA分子である。一部の実施形態では、ステップ(2)における核酸分子は、ウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はレトロウイルスベクターから選択されるウイルスベクター上にある。一部の実施形態では、ステップ(2)における核酸分子は、非ウイルスベクター上にある。一部の実施形態では、ステップ(2)における核酸分子は、プラスミド上にある。一部の実施形態では、ステップ(2)における核酸分子は、いずれのベクター上にもない。一部の実施形態では、ステップ(2)は、細胞(例えば、T細胞)の集団を、CARをコードする核酸分子を含むウイルスベクターで形質導入することを含む。一部の実施形態では、ステップ(2)は、(A)Tet2標的配列を含むセンス鎖、及び(B)センス鎖と全部又は一部が相補的なアンチセンス鎖を含むTet2を標的とするshRNA又はshRNAをコードするベクターと、細胞(例えば、T細胞)の集団を接触させることをさらに含む。一部の実施形態では、センス鎖は、Tet2標的配列GGGTAAGCCAAGAAAGAAA(配列番号418)を含む。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、その逆相補鎖、即ちTTTCTTTCTTGGCTTACCC(配列番号419)を含む。一部の実施形態では、shRNAをコードするベクターは、CARをコードするベクターと同じであるか又は異なる。一部の実施形態では、shRNA配列をコードするベクターは、プロモーター(例えば、限定されないが、U6プロモーター)、Tet2標的配列を含むセンス鎖、ループ、センス鎖と全部又は一部が相補的なアンチセンス鎖及び任意選択でポリTテール、例えば表29に示す配列を含む。
一部の実施形態では、本開示は、キメラ抗原受容体(CAR)を発現する細胞(例えば、T細胞)の集団を作製する方法を提供し、これは、(1)細胞の集団を、IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、IL-6又はそれらの組み合わせから選択されるサイトカインと接触させるステップ、(2)細胞(例えば、T細胞)の集団を、CARをコードする核酸分子(例えば、DNA又はRNA分子)と接触させ、それにより核酸分子を含む細胞(例えば、T細胞)の集団を取得するステップ、及び(3)保存(例えば、凍結保存媒体中で細胞の集団の再製剤化すること)又は投与のために細胞(例えば、T細胞)の集団を採取するステップを含み、(a)ステップ(2)は、ステップ(1)と一緒に、又はステップ(1)の開始後の5時間以内、例えばステップ(1)の開始後の1、2、3、4又は5時間以内に実施し、ステップ(3)は、ステップ(1)の開始後の26時間以内、例えばステップ(1)の開始後の22、23又は24時間以内、例えばステップ(1)の開始後の24時間以内に実施するか、又は(b)ステップ(3)からの細胞の集団は、増殖されないか、又は例えばステップ(1)の開始時の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて5、10、15、20、25、30、35又は40%以下、例えば10%以下だけ増殖される。一部の実施形態では、ステップ(2)における核酸分子は、DNA分子である。一部の実施形態では、ステップ(2)における核酸分子は、RNA分子である。一部の実施形態では、ステップ(2)における核酸分子は、ウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はレトロウイルスベクターから選択されるウイルスベクター上にある。一部の実施形態では、ステップ(2)における核酸分子は、非ウイルスベクター上にある。一部の実施形態では、ステップ(2)における核酸分子は、プラスミド上にある。一部の実施形態では、ステップ(2)における核酸分子は、いずれのベクター上にもない。一部の実施形態では、ステップ(2)は、細胞(例えば、T細胞)の集団を、CARをコードする核酸分子を含むウイルスベクターで形質導入することを含む。一部の実施形態では、ステップ(2)は、(A)Tet2標的配列を含むセンス鎖、及び(B)センス鎖と全部又は一部が相補的なアンチセンス鎖を含むTet2を標的とするshRNA又はshRNAをコードするベクターと、細胞(例えば、T細胞)の集団を接触させることをさらに含む。一部の実施形態では、センス鎖は、Tet2標的配列GGGTAAGCCAAGAAAGAAA(配列番号418)を含む。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、その逆相補鎖、即ちTTTCTTTCTTGGCTTACCC(配列番号419)を含む。一部の実施形態では、shRNAをコードするベクターは、CARをコードするベクターと同じであるか又は異なる。一部の実施形態では、shRNA配列をコードするベクターは、プロモーター(例えば、限定されないが、U6プロモーター)、Tet2標的配列を含むセンス鎖、ループ、センス鎖と全部又は一部が相補的なアンチセンス鎖及び任意選択でポリTテール、例えば表29に示す配列を含む。
一部の実施形態では、細胞(例えば、T細胞)の集団は、対象からのアフェレーシスサンプル(例えば、白血球アフェレーシスサンプル)から収集される。
一部の実施形態では、アフェレーシスサンプル(例えば、白血球アフェレーシスサンプル)を対象から採取し、凍結サンプル(例えば、凍結保存サンプル)として細胞製造施設に輸送する。次に、凍結アフェレーシスサンプルを解凍した後、例えばセルソーティング機(例えば、CliniMACS(登録商標)Prodigy(登録商標)装置)を用いて、アフェレーシスサンプルからT細胞(例えば、CD4+T細胞及び/又はCD8+T細胞)を選択する。続いて、選択されたT細胞(例えば、CD4+T細胞及び/又はCD8+T細胞)を、本明細書に記載のサイトカインプロセスを用いるCART製造のために接種する。一部の実施形態では、サイトカインプロセスの終了時、CART細胞を凍結保存し、後に解凍して、対象に投与する。一部の実施形態では、選択されたT細胞(例えば、CD4+T細胞及び/又はCD8+T細胞)は、CART製造のために接種する前に、1ラウンド以上の凍結-解凍に付す。
一部の実施形態では、アフェレーシスサンプル(例えば、白血球アフェレーシスサンプル)を対象から採取し、新鮮な産物(例えば、凍結していない産物)として細胞製造施設に輸送する。例えば、セルソーティング機(例えば、CliniMACS(登録商標)Prodigy(登録商標)装置)を用いて、アフェレーシスサンプルからT細胞(例えば、CD4+T細胞及び/又はCD8+T細胞)を選択する。続いて、選択されたT細胞(例えば、CD4+T細胞及び/又はCD8+T細胞)を、本明細書に記載のサイトカインプロセスを用いるCART製造のために接種する。一部の実施形態では、選択されたT細胞(例えば、CD4+T細胞及び/又はCD8+T細胞)は、CART製造のために接種する前に、1ラウンド以上の凍結-解凍に付す。
一部の実施形態では、アフェレーシスサンプル(例えば、白血球アフェレーシスサンプル)を対象から採取する。例えば、セルソーティング機(例えば、CliniMACS(登録商標)Prodigy(登録商標)装置)を用いて、アフェレーシスサンプルからT細胞(例えば、CD4+T細胞及び/又はCD8+T細胞)を選択する。続いて、選択されたT細胞(例えば、CD4+T細胞及び/又はCD8+T細胞)を凍結サンプル(例えば、凍結保存サンプル)として細胞製造施設に輸送する。選択されたT細胞(例えば、CD4+T細胞及び/又はCD8+T細胞)を後に解凍し、本明細書に記載のサイトカインプロセスを用いるCART製造のために接種する。
一部の実施形態では、細胞(例えば、T細胞)を接種し、1つ以上のサイトカイン(例えば、IL-2、IL-7、IL-15(例えば、hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-21若しくはIL-6(例えば、IL-6/sIL-6R)から選択される1つ以上のサイトカイン)並びにCARをコードするベクター(例えば、レンチウイルスベクター)を細胞に添加する。20~24時間のインキュベーション後、細胞を洗浄してから、保存又は投与のために製剤化する。
伝統的なCART製造アプローチと異なり、本明細書に提供されるサイトカインプロセスは、CD3及び/又はCD28刺激又はエクスビボT細胞拡大を伴わない。抗CD3及び抗CD28抗体と接触させて、エクスビボで広範囲に増殖するT細胞は、セントラルメモリー表現型に向かう分化を示す傾向がある。理論に縛られることを意図しないが、本明細書に提供されるサイトカインプロセスは、CART製造中、T細胞の未分化表現型を保存するか又は増加させて、対象に注入された後長期に持続し得るCART産物を生成する。
一部の実施形態では、細胞の集団を1つ以上のサイトカイン(例えば、IL-2、IL-7、IL-15(例えば、hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-21又はIL-6(例えば、IL-6/sIL-6Ra)から選択される1つ以上のサイトカイン)と接触させる。
一部の実施形態では、細胞の集団をIL-2と接触させる。一部の実施形態では、細胞の集団をIL-7と接触させる。一部の実施形態では、細胞の集団をIL-15(例えば、hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))と接触させる。一部の実施形態では、細胞の集団をIL-21と接触させる。一部の実施形態では、細胞の集団をIL-6(例えば、IL-6/sIL-6Ra)と接触させる。一部の実施形態では、細胞の集団をIL-2及びIL-7と接触させる。一部の実施形態では、細胞の集団をIL-2及びIL-15(例えば、hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))と接触させる。一部の実施形態では、細胞の集団をIL-2及びIL-21と接触させる。一部の実施形態では、細胞の集団をIL-2及びIL-6(例えば、IL-6/sIL-6Ra)と接触させる。一部の実施形態では、細胞の集団をIL-7及びIL-15(例えば、hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))と接触させる。一部の実施形態では、細胞の集団をIL-7及びIL-21と接触させる。一部の実施形態では、細胞の集団をIL-7及びIL-6(例えば、IL-6/sIL-6Ra)と接触させる。一部の実施形態では、細胞の集団をIL-15(例えば、hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))及びIL-21と接触させる。一部の実施形態では、細胞の集団をIL-15(例えば、hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))及びIL-6(例えば、IL-6/sIL-6Ra)と接触させる。一部の実施形態では、細胞の集団をIL-21及びIL-6(例えば、IL-6/sIL-6Ra)と接触させる。一部の実施形態では、細胞の集団をIL-7、IL-15(例えば、hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))及びIL-21と接触させる。一部の実施形態では、細胞の集団をLSD1阻害剤とさらに接触させる。一部の実施形態では、細胞の集団をMALT1阻害剤とさらに接触させる。
一部の実施形態では、細胞の集団を20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290又は300U/mlのIL-2と接触させる。一部の実施形態では、細胞の集団を1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20ng/mlのIL-7と接触させる。一部の実施形態では、細胞の集団を1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20ng/mlのIL-15と接触させる。
一部の実施形態では、細胞の集団を、CARをコードする核酸分子と接触させる。一部の実施形態では、細胞の集団を、CARをコードするDNA分子で形質導入する。
一部の実施形態において、細胞の集団を、CARをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を前述した1つ以上のサイトカインと接触させるステップと同時に行う。一部の実施形態では、細胞の集団を、CARをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を前述した1つ以上のサイトカインと接触させるステップの開始後の1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5又は10時間以内に行う。一部の実施形態では、細胞の集団を、CARをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を前述した1つ以上のサイトカインと接触させるステップの開始後の5時間以内に行う。一部の実施形態では、細胞の集団を、CARをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を前述した1つ以上のサイトカインと接触させるステップの開始後の4時間以内に行う。一部の実施形態では、細胞の集団を、CARをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を前述した1つ以上のサイトカインと接触させるステップの開始後の3時間以内に行う。一部の実施形態では、細胞の集団を、CARをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を前述した1つ以上のサイトカインと接触させるステップの開始後の2時間以内に行う。一部の実施形態では、細胞の集団を、CARをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を前述した1つ以上のサイトカインと接触させるステップの開始後の1時間以内に行う。
一部の実施形態では、細胞の集団を保存又は投与のために採取する。
一部の実施形態では、細胞の集団を前述した1つ以上のサイトカインと接触させるステップの開始後の72、60、48、36、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19又は18時間以内に細胞の集団を保存又は投与のために採取する。一部の実施形態では、細胞の集団を前述した1つ以上のサイトカインと接触させるステップの開始後の26時間以内に細胞の集団を保存又は投与のために採取する。一部の実施形態では、細胞の集団を前述した1つ以上のサイトカインと接触させるステップの開始後の25時間以内に細胞の集団を保存又は投与のために採取する。一部の実施形態では、細胞の集団を前述した1つ以上のサイトカインと接触させるステップの開始後の24時間以内に細胞の集団を保存又は投与のために採取する。一部の実施形態では、細胞の集団を前述した1つ以上のサイトカインと接触させるステップの開始後の23時間以内に細胞の集団を保存又は投与のために採取する。一部の実施形態では、細胞の集団を前述した1つ以上のサイトカインと接触させるステップの開始後の22時間以内に細胞の集団を保存又は投与のために採取する。
一部の実施形態では、細胞の集団は、エクスビボで増殖されない。
一部の実施形態では、細胞の集団は、例えば、前述した1つ以上のサイトカインと接触させる前の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55又は60%以下だけ増殖される。一部の実施形態では、細胞の集団は、例えば、前述した1つ以上のサイトカインと接触させる前の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて5%以下だけ増殖される。一部の実施形態では、細胞の集団は、例えば、前述した1つ以上のサイトカインと接触させる前の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて10%以下だけ増殖される。一部の実施形態では、細胞の集団は、例えば、前述した1つ以上のサイトカインと接触させる前の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて15%以下だけ増殖される。一部の実施形態では、細胞の集団は、例えば、前述した1つ以上のサイトカインと接触させる前の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて20%以下だけ増殖される。一部の実施形態では、細胞の集団は、例えば、前述した1つ以上のサイトカインと接触させる前の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて25%以下だけ増殖される。一部の実施形態では、細胞の集団は、例えば、前述した1つ以上のサイトカインと接触させる前の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて30%以下だけ増殖される。一部の実施形態では、細胞の集団は、例えば、前述した1つ以上のサイトカインと接触させる前の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて35%以下だけ増殖される。一部の実施形態では、細胞の集団は、例えば、前述した1つ以上のサイトカインと接触させる前の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて40%以下だけ増殖される。
一部の実施形態において、細胞の集団は、例えば、前述した1つ以上のサイトカインと接触させる前の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、16、20、24、36又は48時間以下だけ増殖される。
一部の実施形態において、細胞の集団は、CD3/TCR複合体(例えば、抗CD3抗体)を刺激する薬剤及び/又は細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体(例えば、抗CD28抗体)を刺激する薬剤とインビトロで接触されないか、又は接触される場合、接触させるステップは、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5若しくは5時間未満である。
一部の実施形態において、細胞の集団は、CD3/TCR複合体(例えば、抗CD3抗体)を刺激する薬剤及び/又は細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体(例えば、抗CD28抗体)を刺激する薬剤と20、21、22、23、24、25、26、27又は28時間インビトロで接触される。
一部の実施形態において、本明細書に記載のサイトカインプロセスを用いて製造される細胞の集団は、細胞の集団を、例えばCD3/TCR複合体(例えば、抗CD3抗体)と結合する薬剤及び/又は細胞の表面上の共刺激分子(例えば、抗CD28抗体)と結合する薬剤と接触させるステップをさらに含む以外には類似の方法によって作製された細胞と比べて、CAR発現細胞の中でナイーブ細胞のより高いパーセンテージ(例えば、少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55又は60%高い)を示す。
一部の実施形態において、本明細書に記載のサイトカインプロセスは、0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5又は8%以下の血清を含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載のサイトカインプロセスは、LSD1阻害剤、MALT1阻害剤又はそれらの組み合わせを含む細胞培地中で実施される。
活性化プロセス
一部の実施形態において、本開示は、キメラ抗原受容体(CAR)を発現する細胞(例えば、T細胞)の集団を作製する方法を提供し、これは、(i)細胞(例えば、T細胞、例えば凍結された又は新鮮な白血球アフェレーシス産物から単離されたT細胞)の集団を、(A)CD3/TCR複合体を刺激する薬剤、及び/又は(B)細胞の表面上の共刺激分子及び/又は増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させるステップ;(ii)細胞(例えば、T細胞)の集団を、CARをコードする核酸分子(例えば、DNA又はRNA分子)と接触させ、それにより核酸分子を含む細胞(例えば、T細胞)の集団を提供するステップ、及び(iii)保存(例えば、凍結保存培地中の細胞の集団を再製剤化すること)又は投与のために細胞(例えば、T細胞)の集団を採取するステップを含み、(a)ステップ(ii)は、ステップ(i)と一緒に、又はステップ(i)の開始後の20時間以内、例えばステップ(i)の開始後の12、13、14、15、16、17若しくは18時間以内、例えばステップ(i)の開始後の18時間以内に実施され、及びステップ(iii)は、ステップ(i)の開始後の26時間以内、例えばステップ(i)の開始後の22、23又は24時間以内、例えばステップ(i)の開始後の24時間以内に実施されるか;(b)ステップ(ii)は、ステップ(i)と一緒に、又はステップ(i)の開始後の20時間以内、例えばステップ(i)の開始後の12、13、14、15、16、17若しくは18時間以内、例えばステップ(i)の開始後の18時間後に実施され、及びステップ(iii)は、ステップ(ii)の開始後の30、36又は48時間以内、例えばステップ(ii)の開始後の22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47又は48時間以内に実施されるか;又は(c)ステップ(iii)からの細胞の集団は、例えば、ステップ(i)の開始時の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて増殖されないか、又は5、10、15、20、25、30、35若しくは40%以下、例えば10%以下だけ増殖される。一部の実施形態では、ステップ(ii)における核酸分子は、DNA分子である。一部の実施形態では、ステップ(ii)における核酸分子は、RNA分子である。一部の実施形態では、ステップ(ii)における核酸分子は、ウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はレトロウイルスベクターから選択されるウイルスベクター上にある。一部の実施形態では、ステップ(ii)における核酸分子は、非ウイルスベクター上にある。一部の実施形態では、ステップ(ii)における核酸分子は、プラスミド上にある。一部の実施形態では、ステップ(ii)における核酸分子は、いずれのベクター上にもない。一部の実施形態では、ステップ(ii)は、細胞(例えば、T細胞)の集団を、CARをコードする核酸分子を含むウイルスベクターで形質導入することを含む。一部の実施形態では、ステップ(2)は、(A)Tet2標的配列を含むセンス鎖、及び(B)センス鎖と全部又は一部が相補的なアンチセンス鎖を含むTet2を標的とするshRNA又はshRNAをコードするベクターと、細胞(例えば、T細胞)の集団を接触させることをさらに含む。一部の実施形態では、センス鎖は、Tet2標的配列GGGTAAGCCAAGAAAGAAAを含む。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、その逆相補鎖、即ちTTTCTTTCTTGGCTTACCCを含む。一部の実施形態では、shRNAをコードするベクターは、CARをコードするベクターと同じであるか又は異なる。一部の実施形態では、shRNA配列をコードするベクターは、プロモーター(例えば、限定されないが、U6プロモーター)、Tet2標的配列を含むセンス鎖、ループ、センス鎖と全部又は一部が相補的なアンチセンス鎖、また任意選択で、ポリTテール、例えば表29に示す配列を含む。
一部の実施形態において、本開示は、キメラ抗原受容体(CAR)を発現する細胞(例えば、T細胞)の集団を作製する方法を提供し、これは、(i)細胞(例えば、T細胞、例えば凍結された又は新鮮な白血球アフェレーシス産物から単離されたT細胞)の集団を、(A)CD3/TCR複合体を刺激する薬剤、及び/又は(B)細胞の表面上の共刺激分子及び/又は増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させるステップ;(ii)細胞(例えば、T細胞)の集団を、CARをコードする核酸分子(例えば、DNA又はRNA分子)と接触させ、それにより核酸分子を含む細胞(例えば、T細胞)の集団を提供するステップ、及び(iii)保存(例えば、凍結保存培地中の細胞の集団を再製剤化すること)又は投与のために細胞(例えば、T細胞)の集団を採取するステップを含み、(a)ステップ(ii)は、ステップ(i)と一緒に、又はステップ(i)の開始後の20時間以内、例えばステップ(i)の開始後の12、13、14、15、16、17若しくは18時間以内、例えばステップ(i)の開始後の18時間以内に実施され、及びステップ(iii)は、ステップ(i)の開始後の26時間以内、例えばステップ(i)の開始後の22、23又は24時間以内、例えばステップ(i)の開始後の24時間以内に実施されるか;(b)ステップ(ii)は、ステップ(i)と一緒に、又はステップ(i)の開始後の20時間以内、例えばステップ(i)の開始後の12、13、14、15、16、17若しくは18時間以内、例えばステップ(i)の開始後の18時間後に実施され、及びステップ(iii)は、ステップ(ii)の開始後の30、36又は48時間以内、例えばステップ(ii)の開始後の22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47又は48時間以内に実施されるか;又は(c)ステップ(iii)からの細胞の集団は、例えば、ステップ(i)の開始時の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて増殖されないか、又は5、10、15、20、25、30、35若しくは40%以下、例えば10%以下だけ増殖される。一部の実施形態では、ステップ(ii)における核酸分子は、DNA分子である。一部の実施形態では、ステップ(ii)における核酸分子は、RNA分子である。一部の実施形態では、ステップ(ii)における核酸分子は、ウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はレトロウイルスベクターから選択されるウイルスベクター上にある。一部の実施形態では、ステップ(ii)における核酸分子は、非ウイルスベクター上にある。一部の実施形態では、ステップ(ii)における核酸分子は、プラスミド上にある。一部の実施形態では、ステップ(ii)における核酸分子は、いずれのベクター上にもない。一部の実施形態では、ステップ(ii)は、細胞(例えば、T細胞)の集団を、CARをコードする核酸分子を含むウイルスベクターで形質導入することを含む。一部の実施形態では、ステップ(2)は、(A)Tet2標的配列を含むセンス鎖、及び(B)センス鎖と全部又は一部が相補的なアンチセンス鎖を含むTet2を標的とするshRNA又はshRNAをコードするベクターと、細胞(例えば、T細胞)の集団を接触させることをさらに含む。一部の実施形態では、センス鎖は、Tet2標的配列GGGTAAGCCAAGAAAGAAAを含む。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、その逆相補鎖、即ちTTTCTTTCTTGGCTTACCCを含む。一部の実施形態では、shRNAをコードするベクターは、CARをコードするベクターと同じであるか又は異なる。一部の実施形態では、shRNA配列をコードするベクターは、プロモーター(例えば、限定されないが、U6プロモーター)、Tet2標的配列を含むセンス鎖、ループ、センス鎖と全部又は一部が相補的なアンチセンス鎖、また任意選択で、ポリTテール、例えば表29に示す配列を含む。
一部の実施形態において、細胞(例えば、T細胞)の集団は、対象からのアフェレーシスサンプル(例えば、白血球アフェレーシスサンプル)から収集される。
一部の実施形態では、アフェレーシスサンプル(例えば、白血球アフェレーシスサンプル)を対象から採取し、凍結サンプル(例えば、凍結保存サンプル)として細胞製造施設に輸送する。次に、凍結アフェレーシスサンプルを解凍した後、例えばセルソーティング機(例えば、CliniMACS(登録商標)Prodigy(登録商標)装置)を用いて、アフェレーシスサンプルからT細胞(例えば、CD4+T細胞及び/又はCD8+T細胞)を選択する。続いて、選択されたT細胞(例えば、CD4+T細胞及び/又はCD8+T細胞)を、本明細書に記載の活性化プロセスを用いるCART製造のために接種する。一部の実施形態では、選択されたT細胞(例えば、CD4+T細胞及び/又はCD8+T細胞)は、CART製造のために接種する前に、1ラウンド以上の凍結-解凍に付す。
一部の実施形態では、アフェレーシスサンプル(例えば、白血球アフェレーシスサンプル)を対象から採取し、新鮮な産物(例えば、凍結していない産物)として細胞製造施設に輸送する。例えば、セルソーティング機(例えば、CliniMACS(登録商標)Prodigy(登録商標)装置)を用いて、アフェレーシスサンプルからT細胞(例えば、CD4+T細胞及び/又はCD8+T細胞)を選択する。続いて、選択されたT細胞(例えば、CD4+T細胞及び/又はCD8+T細胞)を、本明細書に記載の活性化プロセスを用いるCART製造のために接種する。一部の実施形態では、選択されたT細胞(例えば、CD4+T細胞及び/又はCD8+T細胞)は、CART製造のために接種する前に、1ラウンド以上の凍結-解凍に付す。
一部の実施形態では、アフェレーシスサンプル(例えば、白血球アフェレーシスサンプル)を対象から採取する。例えば、セルソーティング機(例えば、CliniMACS(登録商標)Prodigy(登録商標)装置)を用いて、アフェレーシスサンプルからT細胞(例えば、CD4+T細胞及び/又はCD8+T細胞)を選択する。続いて、選択されたT細胞(例えば、CD4+T細胞及び/又はCD8+T細胞)を凍結サンプル(例えば、凍結保存サンプル)として細胞製造施設に輸送する。選択されたT細胞(例えば、CD4+T細胞及び/又はCD8+T細胞)を後に解凍し、本明細書に記載の活性化プロセスを用いるCART製造のために接種する。
一部の実施形態では、細胞(例えば、T細胞)を抗CD3及び抗CD28抗体と例えば12時間接触させた後、CARをコードするベクター(例えば、レンチウイルスベクター)による形質導入を実施する。培養開始から24時間後、細胞を洗浄し、保存又は投与のために製剤化する。
理論に縛られることを意図しないが、短時間のCD3及び抗CD28刺激によって自己再生T細胞の効率的な形質導入が促進され得る。伝統的なCART製造アプローチと比較して、本明細書に提供される活性化プロセスは、長時間のエクスビボ増殖を伴わない。サイトカインプロセスと同様に、本明細書に提供される活性化プロセスも、CART製造中、未分化T細胞を保存する。
一部の実施形態では、細胞の集団を、(A)CD3/TCR複合体を刺激する薬剤、及び/又は(B)細胞の表面上の共刺激分子及び/又は増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させる。
一部の実施形態において、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤は、CD3を刺激する薬剤である。一部の実施形態において、共刺激分子及び/又は増殖因子受容体を刺激する薬剤は、CD28、ICOS、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD226又はそれらの任意の組み合わせを刺激する薬剤である。一部の実施形態では、共刺激分子及び/又は増殖因子受容体を刺激する薬剤は、CD28を刺激する薬剤である。一部の実施形態では、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤は、抗体(例えば、単一ドメイン抗体(例えば、重鎖可変ドメイン抗体)、ペプチボディ、Fabフラグメント若しくはscFv)、小分子又はリガンド(例えば、天然に存在するリガンド、組換えリガンド若しくはキメラリガンド)から選択される。一部の実施形態では、共刺激分子及び/又は増殖因子受容体を刺激する薬剤は、抗体(例えば、単一ドメイン抗体(例えば、重鎖可変ドメイン抗体)、ペプチボディ、Fabフラグメント若しくはscFv)、小分子又はリガンド(例えば、天然に存在するリガンド、組換えリガンド若しくはキメラリガンド)から選択される。一部の実施形態では、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤は、ビーズを含まない。一部の実施形態では、共刺激分子及び/又は増殖因子受容体を刺激する薬剤は、ビーズを含まない。一部の実施形態では、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤は、抗CD3抗体を含む。一部の実施形態では、共刺激分子及び/又は増殖因子受容体を刺激する薬剤は、抗CD28抗体を含む。一部の実施形態では、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤は、コロイド状ポリマーナノマトリックスに共有結合した抗CD3抗体を含む。一部の実施形態では、CD3を刺激する薬剤は、CD3又はTCR抗原結合ドメイン、例えば、限定されないが、1つ以上のCDR、重鎖及び/又はその軽鎖を含む抗CD3若しくは抗TCR抗体又は抗体フラグメント、例えば、表27に提供される抗CD3若しくは抗TCR抗体などの1つ以上を含む。一部の実施形態では、共刺激分子及び/又は増殖因子受容体を刺激する薬剤は、コロイド状ポリマーナノマトリックスに共有結合した抗CD28抗体を含む。一部の実施形態では、共刺激分子及び/又は増殖因子受容体を刺激する薬剤は、CD28、ICOS、CD27、CD25、4-1BB、IL6RA、IL6RB又はCD2を刺激する薬剤である。一部の実施形態では、共刺激分子及び/又は増殖因子受容体を刺激する薬剤は、CD28、ICOS、CD27、CD25、4-1BB、IL6RB及び/又はCD2抗原結合ドメイン、例えば抗CD28、抗ICOS、抗CD27、抗CD25、抗4-1BB、抗IL6RA、抗IL6RB若しくは抗CD2抗体又は1つ以上のCDR、重鎖及び/又は軽鎖を含むそれらの抗体フラグメント、例えば、表27に提供される抗CD28、抗ICOS、抗CD27、抗CD25、抗4-1BB、抗IL6RA、抗IL6RB若しくは抗CD2抗体などの1つ以上を含む。一部の実施形態では、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び共刺激分子及び/又は増殖因子受容体を刺激する薬剤は、T細胞TransAct(商標)を含む。一部の実施形態では、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び共刺激分子及び/又は増殖因子受容体を刺激する薬剤は、多重特異性結合分子に含まれる。一部の実施形態では、多重特異性結合分子は、CD3抗原結合ドメイン及びCD28又はCD2抗原結合ドメインを含む。一部の実施形態では、多重特異性結合分子は、1つ以上の重鎖及び/又は軽鎖、例えば、限定されないが、表28に提供される重鎖及び/又は軽鎖を含む。一部の実施形態では、多重特異性結合分子は、二重特異性抗体を含む。一部の実施形態では、二重特異性抗体は、図50Aに提供されるスキームのいずれか1つにおいて形成される。一部の実施形態では、二重特異性抗体は、一価又は二価である。一部の実施形態では、二重特異性抗体は、Fc領域を含む。一部の実施形態では、二重特異性抗体のFc領域はサイレンシングされる。一部の実施形態では、多重特異性結合分子は、複数の二重特異性抗体を含む。一部の実施形態では、複数の二重特異性抗体の1つ以上が一価である。一部の実施形態では、複数の二重特異性抗体の1つ以上がFc領域を含む。一部の実施形態では、上記複数の二重特異性抗体の1つ以上のFc領域は、サイレンシングされる。一部の実施形態では、上記複数の二重特異性抗体の1つ以上が、一緒に多量体に共役される。一部の実施形態では、多量体は、図50Bに提供されるスキームのいずれか1つにおいて形成される。
一部の実施形態において、マトリックスは、例えば、細胞に対して非毒性であるポリマー、例えば生分解性若しくは生体適合性の不活性材料を含むか又はそれから構成される。一部の実施形態では、マトリックスは、親水性ポリマー鎖から構成され、これは、鎖の水和によって水溶液中で最大可動性を取得する。一部の実施形態において、可動性マトリックスは、コラーゲン、精製タンパク質、精製ペプチド、多糖、グリコサミノグリカン又は細胞外マトリックス組成物からなるものであり得る。多糖としては、例えば、セルロースエーテル、デンプン、アラビアガム、アガロース、デキストラン、キトサン、ヒアルロン酸、ペクチン、キサンタン、グアーガム又はアルギン酸塩を挙げることができる。他のポリマーとしては、ポリエステル、ポリエーテル、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリアミン、ポリエチレンイミン、ポリクオタニウムポリマー、ポリホスファゼン、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルピロリドン、ブロックコポリマー又はポリウレタンが挙げられる。一部の実施形態において、可動性マトリックスは、デキストランのポリマーである。
一部の実施形態では、細胞の集団を、CARをコードする核酸分子と接触させる。一部の実施形態では、細胞の集団を、CARをコードするDNAで形質導入する。
一部の実施形態において、細胞の集団を、CARをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び/又は上記細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させるステップと同時に行う。一部の実施形態において、細胞の集団を、CARをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び/又は上記細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1又は0.5時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、CARをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び/又は上記細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の20時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、CARをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び/又は上記細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の19時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、CARをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び/又は上記細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の18時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、CARをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び/又は上記細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の17時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、CARをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び/又は上記細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の16時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、CARをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び/又は上記細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の15時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、CARをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び/又は上記細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の14時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、CARをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び/又は上記細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の14時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、CARをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び/又は上記細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の13時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、CARをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び/又は上記細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の12時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、CARをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び/又は上記細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の11時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、CARをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び/又は上記細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の10時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、CARをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び/又は上記細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の9時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、CARをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び/又は上記細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の8時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、CARをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び/又は上記細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の7時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、CARをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び/又は上記細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の6時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、CARをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び/又は上記細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の5時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、CARをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び/又は上記細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の4時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、CARをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び/又は上記細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の3時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、CARをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び/又は上記細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の2時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、CARをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び/又は上記細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の1時間以内に実施する。一部の実施形態において、細胞の集団を、CARをコードする核酸分子と接触させるステップは、細胞の集団を、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び/又は上記細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の30分以内に実施する。
一部の実施形態では、保存又は投与のために細胞の集団を採取する。
一部の実施形態において、細胞の集団を、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び/又は上記細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の72、60、48、36、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19又は18時間以内に保存又は投与の目的で細胞の集団を採取する。一部の実施形態において、細胞の集団を、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び/又は上記細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の26時間以内に保存又は投与の目的で細胞の集団を採取する。一部の実施形態において、細胞の集団を、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び/又は上記細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の25時間以内に保存又は投与の目的で細胞の集団を採取する。一部の実施形態において、細胞の集団を、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び/又は上記細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の24時間以内に保存又は投与の目的で細胞の集団を採取する。一部の実施形態において、細胞の集団を、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び/又は上記細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の23時間以内に保存又は投与の目的で細胞の集団を採取する。一部の実施形態において、細胞の集団を、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び/又は上記細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させるステップの開始後の22時間以内に保存又は投与の目的で細胞の集団を採取する。
一部の実施形態において、細胞の集団はエクスビボで増殖されない。
一部の実施形態において、細胞の集団は、例えば、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び/又は上記細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させる前の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55又は60%以下だけ増殖される。一部の実施形態では、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び/又は上記細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させる前の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて5%以下だけ増殖される。一部の実施形態では、細胞の集団は、例えば、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び/又は上記細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させる前の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて10%以下だけ増殖される。一部の実施形態では、細胞の集団は、例えば、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び/又は上記細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させる前の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて15%以下だけ増殖される。一部の実施形態では、細胞の集団は、例えば、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び/又は上記細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させる前の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて20%以下だけ増殖される。一部の実施形態では、細胞の集団は、例えば、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び/又は上記細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させる前の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて25%以下だけ増殖される。一部の実施形態では、細胞の集団は、例えば、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び/又は上記細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させる前の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて30%以下だけ増殖される。一部の実施形態では、細胞の集団は、例えば、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び/又は上記細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させる前の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて35%以下だけ増殖される。一部の実施形態では、細胞の集団は、例えば、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び/又は上記細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させる前の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて40%以下だけ増殖される。
一部の実施形態において、細胞の集団は、例えば、前述した1つ以上のサイトカインと接触させる前の細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、16、20、24、36又は48時間以下だけ増殖される。
一部の実施形態において、活性化プロセスは、無血清細胞培地中で実施される。一部の実施形態において、活性化プロセスは、IL-2、IL-15(例えば、hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))又はIL-6(例えば、IL-6/sIL-6Ra))から選択される1つ以上のサイトカインを含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態において、hetIL-15は、
のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、hetIL-15は、配列番号309と少なくとも約70、75、80、85、90、95又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、活性化プロセスは、LSD1阻害剤を含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態において、活性化プロセスは、MALT1阻害剤を含む細胞培地中で実施される。一部の実施形態において、無血清細胞培地は、血性代替品を含む。一部の実施形態において、血清代替品は、CTS(商標)Immune Cell Serum Replacement(ICSR)である。一部の実施形態において、ICSRのレベルは、例えば、最大5%、例えば約1%、2%、3%、4%又は5%であり得る。理論に縛られることを意図しないが、ICSR、例えば2%ICSRを含有する細胞培地、例えば表21若しくは表25に示すラピッドメディア(Rapid Media)を使用すれば、本明細書に記載の製造プロセス中の細胞生存能力を向上させることができる。
一部の実施形態において、本開示は、キメラ抗原受容体(CAR)を発現する細胞(例えば、T細胞)の集団を作製する方法を提供し、これは、(a)対象から採取したアフェレーシスサンプル(例えば、新鮮な又は凍結保存された白血球アフェレーシスサンプル)を用意するステップ;(b)アフェレーシスサンプルからT細胞を選択する(例えば、ネガティブ選択、ポジティブ選択又はビーズなしの選択を用いて)ステップ;(c)単離したT細胞を例えば1×106~1×107細胞/mLで接種するステップ;(d)T細胞を、T細胞を刺激する薬剤、例えばCD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び/又は細胞の表面上の共刺激分子及び/若しくは増殖因子受容体を刺激する薬剤と接触させる(例えば、T細胞を抗CD3及び/又は抗CD28抗体と接触させる、例えばT細胞をTransActと接触させる)ステップ;(e)T細胞を、CARをコードする核酸分子(例えば、DNA又はRNA分子)と例えば6~48時間、例えば20~28時間接触させる(例えば、T細胞を、CARをコードする核酸分子を含むウイルスと接触させる)ステップ;及び(f)保存(例えば、凍結保存培地中でT細胞を製剤化すること)又は投与のためにT細胞を洗浄及び採取するステップを含む。一部の実施形態において、ステップ(f)は、ステップ(d)又は(e)の開始後の30、36又は48時間以内、例えばステップ(d)又は(e)の開始後の22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47又は48時間以内に実施される。
前述した方法のいくつかの実施形態では、本方法は、閉鎖系で実施される。一部の実施形態では、T細胞の分離、活性化、形質導入、インキュベーション及び洗浄は全て、閉鎖系で行われる。前述した方法のいくつかの実施形態では、これらの方法は、個別の装置において実施される。一部の実施形態では、T細胞の分離、活性化及び形質導入、インキュベーション及び洗浄は、個別の装置において行われる。
前述した方法のいくつかの実施形態では、本方法は、形質導入効率を高めるために、細胞培養培地にアジュバント又は形質導入増強試薬を添加することをさらに含む。一部の実施形態では、アジュバント又は形質導入増強試薬は、カチオン性ポリマーを含む。一部の実施形態では、アジュバント又は形質導入増強試薬は、LentiBOOST(商標)(Sirion Biotech)、ベクトフシン-1、F108(Poloxamer 338又はPluronic(登録商標)F-38)、硫酸プロタミン、臭化ヘキサジメトリン(Polybrene)、PEA、Pluronic F68、Pluronic F127、Synperonic又はLentiTrans(商標)から選択される。一部の実施形態では、形質導入増強試薬は、LentiBOOST(商標)(Sirion Biotech)である。一部の実施形態では、形質導入増強試薬は、F108(Poloxamer 338又はPluronic(登録商標)F-38)である。
前述した方法のいくつかの実施形態では、細胞(例えば、T細胞)の集団をウイルスベクターで形質導入することは、細胞の集団とウイルスベクターを、形質導入効率が増強されるような条件下で遠心力に供することを含む。一実施形態において、細胞は、スピノキュレーションによって形質導入される。
前述した方法の一部の実施形態では、細胞(例えば、T細胞)は、ガス交換を実質的に損なうことなく、基部にガス透過膜を備え、大きい培地体積を支持する細胞培養フラスコ中で活性化及び形質導入される。一部の実施形態では、細胞増殖は、対流を介して栄養素へのアクセス、例えば、実質的に中断されないアクセスを提供することによって達成される。
抗CD28抗体分子
一部の実施形態では、抗CD28抗体、例えば、本明細書に記載の多重特異性結合分子に使用される抗CD28抗体は、表27に記載される抗CD28(2)由来の少なくとも1つの抗原結合領域、例えば可変領域又はその抗原結合フラグメントを含む。一部の実施形態では、抗CD28抗体分子は、表27に記載されるように、抗CD28(2)からの1つ又は2つの可変領域を含む。一部の実施形態では、抗CD28抗体は、重鎖相補性決定領域1(HCDR1)、HCDR2及びHCDR3を含む重鎖可変領域(VH)と、軽鎖相補性決定領域1(LCDR1)、LCDR2及びLCDR3を含む軽鎖可変領域(VL)とを含み、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3は、それぞれ配列番号538、539、540、530、531及び532のアミノ酸配列を含むか;HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3は、それぞれ配列番号541、539、540、530、531及び532のアミノ酸配列を含むか;HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3は、それぞれ配列番号542、543、540、533、534及び535のアミノ酸配列を含むか;又はHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3は、それぞれ配列番号544、545、546、536、534及び532のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、抗CD28抗体、例えば、本明細書に記載の多重特異性結合分子に使用される抗CD28抗体は、表27に記載される抗CD28(2)由来の少なくとも1つの抗原結合領域、例えば可変領域又はその抗原結合フラグメントを含む。一部の実施形態では、抗CD28抗体分子は、表27に記載されるように、抗CD28(2)からの1つ又は2つの可変領域を含む。一部の実施形態では、抗CD28抗体は、重鎖相補性決定領域1(HCDR1)、HCDR2及びHCDR3を含む重鎖可変領域(VH)と、軽鎖相補性決定領域1(LCDR1)、LCDR2及びLCDR3を含む軽鎖可変領域(VL)とを含み、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3は、それぞれ配列番号538、539、540、530、531及び532のアミノ酸配列を含むか;HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3は、それぞれ配列番号541、539、540、530、531及び532のアミノ酸配列を含むか;HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3は、それぞれ配列番号542、543、540、533、534及び535のアミノ酸配列を含むか;又はHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3は、それぞれ配列番号544、545、546、536、534及び532のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、抗CD28抗体分子は、配列番号547若しくは548のアミノ酸配列又は配列番号547若しくは548に対して少なくとも約80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%若しくは99%の配列同一性を有する配列を含むVHを含む。一部の実施形態では、抗CD28抗体は、配列番号537のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも約80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%若しくは99%の配列同一性を有する配列を含むVLを含む。一部の実施形態では、抗CD28抗体は、配列番号547及び537のアミノ酸配列をそれぞれ含むVH及びVL又は前述の配列のいずれかに対して少なくとも約80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%若しくは99%の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、抗CD28抗体は、配列番号548及び537のアミノ酸配列をそれぞれ含むVH及びVL又は前述の配列のいずれかに対して少なくとも約80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%若しくは99%の配列同一性を有する配列を含む。
本明細書に記載の抗CD28抗体は、多重特異性結合分子に関連して、例えば、追加の結合ドメイン、例えば、本明細書に記載の抗CD3結合ドメインと共に使用され得ることが理解される。また、本明細書に記載の抗CD28抗体は、他の状況で、例えば、単一特異性抗体として使用され得ることも理解される。
多重特異性結合分子試薬
一部の実施形態では、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤は、CD3を刺激する薬剤である。一部の実施形態では、CD3を刺激する薬剤は、CD3又はTCR抗原結合ドメイン、例えば、限定されないが、抗CD3若しくは抗TCR抗体又は1つ以上のCDR、VH、重鎖、VL及び/若しくは軽鎖を含むそれらの抗体フラグメントなどの1つ以上を含む。
一部の実施形態では、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤は、CD3を刺激する薬剤である。一部の実施形態では、CD3を刺激する薬剤は、CD3又はTCR抗原結合ドメイン、例えば、限定されないが、抗CD3若しくは抗TCR抗体又は1つ以上のCDR、VH、重鎖、VL及び/若しくは軽鎖を含むそれらの抗体フラグメントなどの1つ以上を含む。
抗CD3抗体配列及びそのような抗体を作製する方法は、当技術分野において公知である。抗CD3抗体配列の非限定的な例を、関連するCDR、VH及びVL配列と共に、表27に提供する。一部の実施形態では、抗CD3結合ドメインは、配列番号437及び427のアミノ酸配列をそれぞれ含むVH及びVLを含む。一部の実施形態では、抗CD3結合ドメインは、配列番号456及び445のアミノ酸配列をそれぞれ含むVH及びVLを含む。一部の実施形態では、抗CD3結合ドメインは、配列番号457及び446のアミノ酸配列をそれぞれ含むVH及びVLを含む。一部の実施形態では、抗CD3結合ドメインは、配列番号475及び467のアミノ酸配列をそれぞれ含むVH及びVLを含む。一部の実施形態では、抗CD3結合ドメインは、配列番号476及び468のアミノ酸配列をそれぞれ含むVH及びVLを含む。一部の実施形態では、抗CD3結合ドメインは、配列番号494及び484のアミノ酸配列をそれぞれ含むVH及びVLを含む。
抗TCR抗体配列及びそのような抗体を作製する方法は、当技術分野において公知である。抗TCR抗体配列の非限定的な例を、関連するCDR、VH及びVL配列と共に、表27に提供する。
一部の実施形態では、共刺激分子及び/又は増殖因子受容体を刺激する薬剤は、CD28、ICOS、CD27、CD25、4-1BB、IL6RA、IL6RB又はCD2を刺激する薬剤である。一部の実施形態では、共刺激分子及び/又は増殖因子受容体を刺激する薬剤は、CD28、ICOS、CD27、CD25、4-1BB、IL6RB及び/又はCD2抗原結合ドメイン、例えば、限定されないが、抗CD28、抗ICOS、抗CD27、抗CD25、抗4-1BB、抗IL6RA、抗IL6RB若しくは抗CD2抗体又は1つ以上のCDR、重鎖及び/又は軽鎖を含むそれらの抗体フラグメントなどの1つ以上を含む。
抗CD28抗体配列及びそのような抗体を作製する方法は、当技術分野において公知である。抗CD28抗体配列の非限定的な例を、関連するCDR、VH、VL、HC及びLC配列と共に、表27に提供する。抗ICOS抗体配列及びそのような抗体を作製する方法は、当技術分野において公知である。抗ICOS抗体配列の非限定的な例を、関連するCDR、VH、VL及びLC配列と共に、表27に提供する。
抗CD27抗体配列及びそのような抗体を作製する方法は、当技術分野において公知である。抗CD27抗体配列の非限定的な例を、関連するCDR、VH及びVL配列と共に、表27に提供する。
抗CD25抗体配列及びそのような抗体を作製する方法は、当技術分野において公知である。抗CD25抗体配列の非限定的な例を、関連するCDR、VH、VL、HC及びLC配列と共に、表27に提供する。
抗4-1BB抗体配列及びそのような抗体を作製する方法は、当技術分野において公知である。抗4-IBB抗体配列の非限定的な例を、関連するCDR、VH及びVL配列と共に、表27に提供する。
抗IL6RA抗体配列及びそのような抗体を作製する方法は、当技術分野において公知である。IL6RA抗体配列の非限定的な例を、関連するCDR、VH及びVL配列と共に、表27に提供する。
抗IL6RB抗体配列及びそのような抗体を作製する方法は、当技術分野において公知である。IL6RB抗体配列の非限定的な例を、関連するCDR、VH及びVL配列と共に、表27に提供する。
抗CD2抗体配列及びそのような抗体を作製する方法は、当技術分野において公知である。抗CD2抗体配列の非限定的な例を、関連するCDR、VH、VL、HC及びLC配列と共に、表27に提供する。
一部の実施形態では、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤及び共刺激分子及び/又は増殖因子受容体を刺激する薬剤は、多重特異性結合分子に含まれる。従って、本明細書で企図されるのは、CD3/TCR複合体を刺激する薬剤と、共刺激分子及び/又は増殖因子受容体を刺激する薬剤を含む多重特異性結合分子、例えば、限定されないが、CD3抗原結合ドメインと、CD28、ICOS、CD27、CD25、4-1BB、IL6RA、IL6RB及び/又はCD2抗原結合ドメインの1つ以上とを含む多重特異性結合分子である。このような結合ドメインの非限定的な例は、前述したように、例えば、表27並びに本明細書に参照として組み込まれる刊行物において、上に提供される。
一部の実施形態では、多重特異性結合分子は、CD3抗原結合ドメイン及びCD28又はCD2抗原結合ドメインを含む。一部の実施形態では、CD3抗原結合ドメインは、抗CD3抗体であり、任意選択で、表27に提供される抗CD3(1)、抗CD3(2)、抗CD3(3)又は抗CD3(4)又は1つ以上のCDR、VH及び/若しくはVLを含むその抗体フラグメントである。一部の実施形態では、CD28抗原結合ドメインは、抗CD28抗体、任意選択で表27に提供される抗CD28(1)又は抗CD28(2)又は1つ以上のCDR、VH、重鎖、VL及び/若しくは軽鎖を含むその抗体フラグメントである。一部の実施形態では、CD2抗原結合ドメインは、抗CD2抗体、任意選択で表27に提供される抗CD2(1)又は1つ以上のCDR、VH、重鎖、VL及び/若しくは軽鎖を含むその抗体フラグメントである。
一部の実施形態では、多重特異性結合分子は、1つ以上の重鎖及び/又は軽鎖を含む。これらの多重特異性結合分子中に含まれ得る非限定的な例示的重鎖配列及び軽鎖配列を、以下の表28に提供する。それらの非限定的な例示的組合せは、構築物内にある通り、列挙される重鎖及び/又は軽鎖の分類に基づいて表28に示す。この構築物の構成は、重鎖及び/又は軽鎖の配置の例を提供するが、それらのさらなる組合せ及び置換も可能である。
一部の実施形態では、多重特異性結合分子は、二重特異性抗体を含む。一部の実施形態では、二重特異性抗体は、図50A、図51A~51B及び図61A~61B及び図63A~63Bに提供されるスキームのいずれか1つにおいて構成される。一部の実施形態では、二重特異性抗体は、一価又は二価である。一部の実施形態では、二重特異性抗体は、Fc領域を含む。一部の実施形態では、二重特異性抗体のFc領域は、サイレンシングされる。
一部の実施形態では、多重特異性結合分子は、複数の二重特異性抗体を含む。一部の実施形態では、複数の二重特異性抗体の1つ以上が一価である。一部の実施形態では、複数の二重特異性抗体の1つ以上がFc領域を含む。一部の実施形態では、複数の二重特異性抗体の1つ以上のFc領域は、サイレンシングされている。一部の実施形態では、複数の二重特異性抗体の1つ以上が一緒に、多量体に共役される。一部の実施形態では、多量体は、図50B及び図51Bに提供されるスキームのいずれか1つにおいて構成される。
一部の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性結合分子は、Fc領域を含み、Fc領域は、Fcサイレントである。一部の実施形態では、Fc領域は、D265、N297及びP329の1つ以上(例えば、その全て)に変異を含む。一部の実施形態では、Fc領域は、変異D265A、N297A及びP329A(DANAPA)を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性結合分子は、第1の結合ドメイン及び第2の結合ドメインを含む。例えば、第1の結合ドメインは、抗CD3結合ドメインであり得、第2の結合ドメインは、共刺激分子結合ドメインであり得るか、又は第1の結合ドメインは、共刺激分子結合ドメインであり得、第2の結合ドメインは、抗CD3結合ドメインであり得る。一部の実施形態では、共刺激分子結合ドメインは、CD2、CD28、CD25、CD27、IL6Rb、ICOS又は41BBに結合する。一部の実施形態では、共刺激分子結合ドメインは、CD2、CD28、CD25、CD27、IL6Rb、ICOS又は41BBを活性化する。一部の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性結合分子は、Fc受容体への結合の低減又はADCC、ADCP若しくはCDC活性の低減を有するように変異されたFc領域、例えば、変異D265A、N297A及びP329A(DANAPA)を含有するFc領域を含む。
一部の実施形態では、第1の結合ドメイン(例えば、scFv)は、第2の結合ドメイン(例えば、Fabフラグメント)のVHのN末端に、例えば、ペプチドリンカーを介して連結されている。一部の実施形態では、多重特異性結合分子は、例えば、N末端からC末端へ順に、CH1、CH2及びCH3の1つ以上(例えば、その全て)をさらに含む。一部の実施形態では、多重特異性結合分子のポリペプチドは、N末端からC末端に、以下の配列:第1の結合ドメインのVH、第1のペプチドリンカー(例えば、(G4S)4リンカー)の、第1の結合ドメインのVL、第2のペプチドリンカー(例えば、(G4S)4リンカー)、第2の結合ドメインのVH、CH1、CH2及びCH3を含む。一部の実施形態では、多重特異性結合分子のポリペプチドは、N末端からC末端に、以下の配列:第2の結合ドメインのVL及びCLを含む。一部の実施形態では、多重特異性結合分子は、Fc受容体に対する結合の低減又はADCC、ADCP若しくはCDC活性の低減を有するように変異されたFc領域、例えば、変異D265A、N297A及びP329A(DANAPA)を含有するFc領域を含む。一部の実施形態では、第1の結合断片は、抗CD3結合ドメイン、例えば抗CD3scFvを含み、例えば、表27に開示される抗CD3配列を含む。一部の実施形態では、第2の結合ドメインは、共刺激分子結合ドメイン、例えば抗CD2結合ドメイン、例えば抗CD2Fabを含み、例えば、表27に開示される抗CD2配列を含む。一部の実施形態では、第2の結合ドメインは、共刺激分子結合ドメイン、例えば抗CD28結合ドメイン、例えば抗CD28Fabを含み、例えば、表27に開示される抗CD28配列を含む。一部の実施形態では、第1の結合断片は、共刺激分子結合ドメイン、例えば抗CD2又は抗CD28結合ドメイン、例えば抗CD2又は抗CD28scFvを含み、例えば、表27に開示される抗CD2又は抗CD28配列を含む。一部の実施形態では、第2の結合ドメインは、抗CD3結合ドメイン、例えば抗CD3Fabを含み、例えば、表27に開示される抗CD3配列を含む。このような多重特異性結合分子の例は、図50Aの左上の構築物;図51Aの構築物1又は構築物2;及び表28の構築物1又は構築物2として描かれる。
一部の実施形態では、第1の結合ドメイン(例えば、Fabフラグメント)は、第2の結合ドメイン(例えば、scFv)に対してN末端であり、例えば、Fc領域は、第1の結合ドメインと第2の結合ドメインとの間に位置する。一部の実施形態では、Fc領域は、Fc受容体に対する結合の低減又はADCC、ADCP若しくはCDC活性の低減を有するように変異され、例えば、変異D265A、N297A及びP329A(DANAPA)を含むFc領域である。一部の実施形態では、多重特異性結合分子は、例えば、N末端からC末端へ順に、CH1、CH2及びCH3の1つ以上(例えば、その全て)をさらに含む。一部の実施形態では、多重特異性結合分子のポリペプチドは、N末端からC末端に、以下の配列:第1の結合ドメインのVH、CH1、CH2、CH3、第1のペプチドリンカー(例えば、(G4S)4リンカー)、第2の結合ドメインのVH、第2のペプチドリンカー(例えば、(G4S)4リンカー)及び第2の結合ドメインのVLを含む。一部の実施形態では、多重特異性結合分子のポリペプチドはN末端からC末端に、以下の配列:第1の結合ドメインのVL及びCLを含む。一部の実施形態では、第1の結合ドメインは、共刺激分子結合ドメイン、例えば抗CD2結合ドメイン、例えば抗CD2Fabを含み、例えば、表27に開示される抗CD2配列を含む。一部の実施形態では、第1の結合ドメインは、共刺激分子結合ドメイン、例えば抗CD28結合ドメイン、例えば抗CD28Fabを含み、例えば、表27に開示される抗CD28配列、例えば、抗CD28(1)又は抗CD28(2)を含む。一部の実施形態では、第2の結合ドメインは、抗CD3結合ドメイン、例えば抗CD3scFvを含み、例えば、表27に開示される抗CD3配列、例えば、抗CD3(1)、抗CD3(2)、抗CD3(3)又は抗CD3(4)を含む。一部の実施形態では、第1の結合ドメインは、抗CD3結合ドメイン、例えば抗CD3Fabを含み、例えば、表27に開示される抗CD3配列、例えば、抗CD3(1)、抗CD3(2)、抗CD3(3)又は抗CD3(4)を含む。一部の実施形態では、第2の結合ドメインは、共刺激分子結合ドメイン、例えば抗CD2又は抗CD28結合ドメイン、例えば抗CD2又は抗CD28scFvを含み、例えば、表27に開示される抗CD2又は抗CD28配列を含む。このような多重特異性結合分子の例は、図50Aの上段の左から2番目の構築物;図51Aの構築物3又は構築物4;並びに表28の構築物3又は構築物4として描かれている。
一部の実施形態では、第1の結合ドメイン(例えば、Fabフラグメント)は、例えば、ペプチドリンカーを介して、第2の結合ドメイン(例えば、scFv)のN末端側にある。一部の実施形態では、多重特異性結合分子は、例えば、N末端からC末端の順に、CH1、CH2及びCH3の1つ以上(例えば、その全て)をさらに含む。一部の実施形態では、多重特異性結合分子のポリペプチドは、N末端からC末端に、以下の配列:第1の結合ドメインのVH、CH1、第1のペプチドリンカー(例えば、(G4S)2リンカー)、第2の結合ドメインのVH、第2のペプチドリンカー(例えば、(G4S)4リンカー)、第2の結合ドメインのVL、第3のペプチドリンカー(例えば、(G4S)4リンカー)、CH2及びCH3を含む。一部の実施形態では、多重特異性結合分子のポリペプチドは、N末端からC末端に、以下の配列:第1の結合ドメインのVL及びCLを含む。一部の実施形態では、多重特異性結合分子は、Fc受容体に対する結合の低減又はADCC、ADCP若しくはCDC活性の低減を有するように変異されたFc領域、例えば、変異:D265A、N297A及びP329A(DANAPA)を含有するFc領域を含む。一部の実施形態では、第1の結合ドメインは、共刺激分子結合ドメイン、例えば抗CD2結合ドメイン、例えば抗CD2Fabを含み、例えば、表27に開示される抗CD2配列を含む。一部の実施形態では、第1の結合ドメインは、共刺激分子結合ドメイン、例えば抗CD28結合ドメイン、例えば抗CD28Fabを含み、例えば、表27に開示される抗CD28配列、例えば、抗CD28(1)又は抗CD28(2)を含む。一部の実施形態では、第1の結合ドメインは、共刺激分子結合ドメイン、例えば抗CD25結合ドメイン(例えば、抗CD25Fab)、抗CD27結合ドメイン(例えば、抗CD27Fab)、抗IL6Rb結合ドメイン(例えば、抗IL6RbFab)、抗ICOS結合ドメイン(例えば、抗ICOSFab)又は抗41BB結合ドメイン(例えば、抗41BBFab)を含む。一部の実施形態では、第2の結合ドメインは、抗CD3結合ドメイン、例えば抗CD3scFvを含み、例えば、表27に開示される抗CD3配列、例えば、抗CD3(1)、抗CD3(2)、抗CD3(3)又は抗CD3(4)を含む。一部の実施形態では、第1の結合ドメインは、抗CD3結合ドメイン、例えば抗CD3Fabを含み、例えば、表27に開示される抗CD3配列、例えば、抗CD3(1)、抗CD3(2)、抗CD3(3)又は抗CD3(4)を含む。一部の実施形態では、第2の結合ドメインは、共刺激分子結合ドメイン、例えば抗CD2結合ドメイン(例えば、抗CD2scFv)、抗CD28結合ドメイン(例えば、抗CD28scFv)、抗CD25結合ドメイン(例えば、抗CD25scFv)、抗CD27結合ドメイン(例えば、抗CD27scFv)、抗IL6Rb結合ドメイン(例えば、抗IL6RbscFv)、抗ICOS結合ドメイン(例えば、抗ICOSscFv)又は抗41BB結合ドメイン(例えば、抗41BBscFv)を含む。このような多重特異性結合分子の例は、図50Aの上段の左から3番目の構築物;図51Aの構築物5又は構築物6;並びに表28の構築物5又は構築物6として描かれる。
一部の実施形態では、第1の結合ドメイン(例えば、scFv)は、第2の結合ドメイン(例えば、Fabフラグメント)のN末端であり、例えば、Fc領域は、第1の結合ドメインと第2の結合ドメインとの間に位置する。一部の実施形態では、Fc領域は、Fc受容体に対する結合の低減又はADCC、ADCP若しくはCDC活性の低減を有するように変異されており、例えば、変異:D265A、N297A及びP329A(DANAPA)を含むFc領域である。一部の実施形態では、多重特異性結合分子は、例えば、N末端からC末端の順に、CH2、CH3及びCH1の1つ以上(例えば、その全て)をさらに含む。一部の実施形態では、多重特異性結合分子のポリペプチドは、N末端からC末端に、以下の配列:第1の結合ドメインのVH、第1のペプチドリンカー(例えば、(G4S)4リンカー)、第1の結合ドメインのVL、第2のペプチドリンカー(例えば、(G4S)リンカー)、CH2、CH3、第3のペプチドリンカー(例えば、(G4S)4リンカー)、第2の結合ドメインのVH及びCH1を含む。一部の実施形態では、多重特異性結合分子のポリペプチドは、N末端からC末端に、以下の配列:第2の結合ドメインのVL及びCLを含む。一部の実施形態では、第1の結合ドメインは、抗CD3結合ドメイン、例えば抗CD3scFvを含み、例えば、表27に開示される抗CD3配列を含む。一部の実施形態では、第2の結合ドメインは、共刺激分子結合ドメイン、例えば抗CD2結合ドメイン、例えば抗CD2Fabを含み、例えば、表27に開示される抗CD2配列を含む。一部の実施形態では、第2の結合ドメインは、共刺激分子結合ドメイン、例えば抗CD28結合ドメイン、例えば抗CD28Fabを含み、例えば、表27に開示される抗CD28配列を含む。一部の実施形態では、第1の結合ドメインは、共刺激分子結合ドメイン、例えば抗CD2又は抗CD28結合ドメイン、例えば抗CD2又は抗CD28scFvを含み、例えば、表27に開示される抗CD2又は抗CD28配列を含む。一部の実施形態では、第2の結合ドメインは、抗CD3結合ドメイン、例えば抗CD3Fabを含み、例えば、表27に開示される抗CD3配列を含む。こうした多重特異性結合分子の例は、図50Aの上段の右端の構築物;図51Aの構築物7又は構築物8;並びに表28の構築物7又は構築物8として描かれる。
一部の実施形態では、第1の結合ドメイン(例えば、Fabフラグメント)は、第1のFc領域のN末端に位置する。一部の実施形態では、多重特異性結合分子は、例えば、N末端からC末端の順に、第1のCH1、第1のCH2及び第1のCH3の1つ以上(例えば、その全て)を含む。一部の実施形態では、第2の結合ドメイン(例えば、scFv)は、例えば、第2のポリペプチド鎖中の、第2のFc領域のN末端に位置する。一部の実施形態では、多重特異性結合分子は、例えば、第2のポリペプチド鎖中に、例えば、N末端からC末端の順で、第2のCH2及び第2のCH3の1つ以上(例えば、その両方)を含む。一部の実施形態では、多重特異性結合分子は、ヘテロ二量体抗体分子を含み、例えば、第1及び第2のFc領域は、ノブ・イント・ホール(knobs-into-hole)変異を含む。一部の実施形態では、第1のFc領域は、それが第1のFc領域の別のコピーに結合するよりも強く第2のFc領域に結合する。一部の実施形態では、多重特異性結合分子の第1のポリペプチドは、N末端からC末端に、以下の配列:第1の結合ドメインのVH、第1のCH1、第1のCH2及び第1のCH3を含む。一部の実施形態では、多重特異性結合分子の第2のポリペプチドは、N末端からC末端に、以下の配列:第2の結合ドメインのVH、第1のペプチドリンカー(例えば、(G4S)リンカー)、第2の結合ドメインのVL、第2のCH2及び第2のCH3を含む。一部の実施形態では、多重特異性結合分子の第3のポリペプチドは、N末端からC末端に、以下の配列:第1の結合ドメインのVL及びCLを含む。一部の実施形態では、多重特異性結合分子の第2のポリペプチドは、第2のCH3のC末端側に、例えば、ペプチドリンカー(例えば、(G4S)4リンカー、(G4S)リンカー又は(G4S)3リンカー)を介して、ホモ多量体化ドメイン、例えば、軟骨オリゴマー基質タンパク質(COMPcc)のマトリリン(Matrilin)1タンパク質又はコイルドコイルドメインをさらに含む。一部の実施形態では、多重特異性結合分子は、例えば、図50Bに描かれるように、第1の結合ドメインの2つ、3つ、4つ又は5つのコピーと、第2の結合ドメインの同数のコピーとを含む。一部の実施形態では、第1の結合ドメインは、共刺激分子結合ドメイン、例えば抗CD2結合ドメイン(例えば、抗CD2Fab)を含む。一部の実施形態では、第1の結合ドメインは、共刺激分子結合ドメイン、例えば抗CD28結合ドメイン(例えば、抗CD28Fab)を含む。一部の実施形態では、第2の結合ドメインは、抗CD3結合ドメイン、例えば抗CD3scFvを含む。このような多重特異性結合分子の例は、図50Aの下段左端の構築物;図50Bの構築物、図51Bの構築物9、構築物10、構築物12、構築物13、構築物15及び構築物16;並びに表28に示す構築物9、構築物10、構築物12、構築物13、構築物15及び構築物16として描かれる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の結合分子は、結合ドメインを含む。一部の実施形態では、結合ドメイン(例えば、scFv)は、Fc領域のN末端に位置する。一部の実施形態では、結合分子は、ヘテロ二量体抗体分子を含み、例えば、第1及び第2のFc領域は、ノブ・イント・ホール(knob-into-hole)変異を含む。一部の実施形態では、第1のFc領域は、それが第1のFc領域の別のコピーに結合するよりも強く第2のFc領域に結合する。一部の実施形態では、結合分子は、例えば、N末端からC末端の順に、CH2及びCH3の1つ以上(例えば、その全て)を含む。一部の実施形態では、結合分子の第2のポリペプチドは、N末端からC末端に、以下の配列:結合ドメインのVH、第1のペプチドリンカー(例えば、(G4S)4リンカー)、結合ドメインのVL、第2のペプチドリンカー(例えば、(G4S)4リンカー又は(G4S)リンカー)、CH2及びCH3を含む。一部の実施形態では、結合分子の第2のポリペプチドは、第2のCH3のC末端側に、例えば、ペプチドリンカー(例えば、(G4S)4リンカー、(G4S)3リンカー又は(G4S)リンカー)を介して、ホモ多量体化ドメイン、例えば、軟骨オリゴマー基質タンパク質(COMPcc)のマトリリン(Matrilin)1タンパク質又はコイルドコイルドメインをさらに含む。一部の実施形態では、結合分子は、例えば、図50Bに描かれているように、結合の2つ、3つ、4つ又は5つのコピーを含む。一部の実施形態では、結合ドメインは、抗CD3結合ドメイン、例えば抗CD3scFvを含む。一部の実施形態では、共刺激分子結合ドメインは存在しない。こうした結合分子の例は、図50Aの下段右端の構築物;図51Bの構築物11、構築物14及び構築物17;並びに表28の構築物11、構築物14及び構築物17として描かれる。
本明細書の多くの実施形態において、多重特異性結合分子は、例えば、ジスルフィド架橋を介して、互いに共有結合で連結された2つ以上のポリペプチド鎖を含むことが理解される。しかし、一部の実施形態では、多重特異性結合分子の2つ以上のポリペプチド鎖は、互いに非共有結合で結合される場合もある。
Fabフラグメントは、より大きいタンパク質の一部として存在することもでき、例えば、Fabフラグメントは、CH2及びCH3と融合させ得、従って完全長抗体の一部であり得ることも理解される。
本明細書に開示されるCD3/TCR複合体を刺激する薬剤並びに共刺激分子及び/又は増殖因子受容体を刺激する薬剤を含む多重特異性結合分子は、本明細書に開示される製造実施形態、例えば、伝統的な製造又は活性化高速製造における使用のために企図される。
Fc変異体
一部の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性結合分子は、例えば、本明細書に記載されるようなFc領域を含む。一部の実施形態では、Fc領域は、野生型Fc領域、例えば、野生型ヒトFc領域である。一部の実施形態では、Fc領域は、変異体、例えば、Fc領域に少なくとも1つのアミノ酸残基の付加、置換又は欠失(これは、例えば、少なくとも1つのFc受容体に対する親和性の低減若しくは除去をもたらす)を含むFc領域を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性結合分子は、例えば、本明細書に記載されるようなFc領域を含む。一部の実施形態では、Fc領域は、野生型Fc領域、例えば、野生型ヒトFc領域である。一部の実施形態では、Fc領域は、変異体、例えば、Fc領域に少なくとも1つのアミノ酸残基の付加、置換又は欠失(これは、例えば、少なくとも1つのFc受容体に対する親和性の低減若しくは除去をもたらす)を含むFc領域を含む。
一部の実施形態では、抗体のFc領域は、Fc受容体(例えば、FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA)、補体タンパク質CIq並びにタンパク質A及びGなどの他の分子を含むいくつかの受容体又はリガンドと相互作用する。これらの相互作用は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)、抗体依存性細胞貪食作用(ADCP)及び補体依存性細胞傷害(CDC)を含む様々なエフェクター機能及び下流シグナル伝達事象を促進する。
一部の実施形態では、変異型Fc領域を含む本明細書に記載の多重特異性結合分子は、例えば、Fc受容体、例えば、本明細書に記載のFc受容体に対する親和性が低減し、例えば、除去されている。一部の実施形態では、低減した親和性は、野生型Fc領域を有すること以外には類似した抗体と比較される。
一部の実施形態では、変異体Fc領域を含む本明細書に記載の多重特異性結合分子は、以下の特性の1つ以上を有する:(1)エフェクター機能の低下(例えば、ADCC、ADCP及び/若しくはCDCの低下);(2)1つ以上のFc受容体に対する結合の低減;並びに/又は(3)C1q補体に対する結合の低減。一部の実施形態では、(1)~(3)の特性のいずれか1つ又は全ての低下は、野生型Fc領域を有すること以外には類似した抗体と比較される。
例示的なFc領域変異体は、表34に提供され、Saunders O,(2019)Frontiers in Immunology;vol 10,article1296にも開示されており、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性結合分子は、表34に開示されたFc領域変異体、例えば、突然変異のいずれか1つ若しくは全て又は任意の組合せを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性結合分子は、IgG1 Fcアミノ酸配列におけるL234、例えば、L234A及び又はL235、例えば、L234A突然変異(LALA);D265、例えば、D265A及び/又はP329、例えば、P329A(DAPA);N297、例えば、N297A;DANAPA(D265A、N297A及びP329A);及び/又はL234、例えば、L234A、L235、例えば、L235A、D265、例えば、D265A、N297、例えば、N297A及びP331、例えば、P331S(LALADANAPS)を含む変異体のいずれか1つ若しくは全て又は任意の組合せを含む。
本明細書に開示されるプロセスにより製造されるCAR発現細胞の集団
一部の実施形態において、本開示は、例えば、本明細書に記載の製造方法のいずれかにより作製され、CARを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞又はNK細胞)を特徴とし、ここで、操作された免疫エフェクター細胞は、抗腫瘍特性を呈示する。一部の実施形態において、CARは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。例示的な抗原は、本明細書に記載の癌関連抗原である。一部の実施形態において、細胞(例えば、T細胞又はNK細胞)は、CARで形質転換され、CARは、細胞表面に発現される。一部の実施形態において、細胞(例えば、T細胞又はNK細胞)は、CARをコードするウイルスベクターで形質導入される。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。一部の実施形態において、細胞は、CARを安定して発現することができる。一部の実施形態において、細胞(例えば、T細胞又はNK細胞)は、CARをコードする核酸、例えばmRNA、cDNA又はDNAでトランスフェクトされる。一部のこうした実施形態において、細胞は、CARを一過性発現し得る。
一部の実施形態において、本開示は、例えば、本明細書に記載の製造方法のいずれかにより作製され、CARを発現するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞又はNK細胞)を特徴とし、ここで、操作された免疫エフェクター細胞は、抗腫瘍特性を呈示する。一部の実施形態において、CARは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。例示的な抗原は、本明細書に記載の癌関連抗原である。一部の実施形態において、細胞(例えば、T細胞又はNK細胞)は、CARで形質転換され、CARは、細胞表面に発現される。一部の実施形態において、細胞(例えば、T細胞又はNK細胞)は、CARをコードするウイルスベクターで形質導入される。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。一部の実施形態において、細胞は、CARを安定して発現することができる。一部の実施形態において、細胞(例えば、T細胞又はNK細胞)は、CARをコードする核酸、例えばmRNA、cDNA又はDNAでトランスフェクトされる。一部のこうした実施形態において、細胞は、CARを一過性発現し得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載される製造方法(例えば、本明細書に記載のサイトカインプロセス又は活性化プロセス)のいずれかにより作製され、CARを発現するように操作された細胞(例えば、免疫エフェクター細胞、例えばT細胞又はNK細胞)の集団が提供される。
一部の実施形態において、製造プロセスの終了時(例えば、本明細書に記載のサイトカインプロセス又は活性化プロセスの終了時)の細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージは、製造プロセスの開始時(例えば、本明細書に記載のサイトカインプロセス又は活性化プロセスの開始時)の細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージと比べて、(1)同じであるか、(2)例えば4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14若しくは15%以下だけ異なるか、又は(3)少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24若しくは25%だけ増加される。一部の実施形態において、製造プロセスの終了時(例えば、本明細書に記載のサイトカインプロセス又は活性化プロセスの終了時)の細胞の集団は、26時間超継続する(例えば、5、6、7、8、9、10、11若しくは12日超継続する)か、又は3日超(例えば、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14若しくは15日にわたりインビトロで細胞の集団を増殖させるステップを含む以外には類似の方法によって作製された細胞と比べて、ナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のより高いパーセンテージ(例えば、少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45又は50%高い)を示す。
一部の実施形態において、製造プロセスの終了時(例えば、本明細書に記載のサイトカインプロセス又は活性化プロセスの終了時)の細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージは、20、25、30、35、40、45、50、55若しくは60%以上である。
一部の実施形態において、製造プロセスの終了時(例えば、本明細書に記載のサイトカインプロセス又は活性化プロセスの終了時)の細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCD95+セントラルメモリーT細胞のパーセンテージは、製造プロセスの開始時(例えば、本明細書に記載のサイトカインプロセス又は活性化プロセスの開始時)の細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCD95+セントラルメモリーT細胞のパーセンテージと比べて、(1)同じであるか、(2)例えば4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14若しくは15%以下だけ異なるか、又は(3)少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24若しくは25%だけ減少される。一部の実施形態において、製造プロセスの終了時(例えば、本明細書に記載のサイトカインプロセス又は活性化プロセスの終了時)の細胞の集団は、例えば26時間超持続する(例えば、5、6、7、8、9、10、11若しくは12日超持続する)か、又は例えば3日超にわたりインビトロで細胞の集団を増殖させる(例えば、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14若しくは15日にわたりインビトロで細胞の集団を増殖させる)ステップを含む以外には類似の方法によって作製された細胞と比べて、ナイーブ細胞、例えばセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCD95+セントラルメモリーT細胞のより低いパーセンテージ(例えば、少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45又は50%低い)を示す。
一部の実施形態において、製造プロセスの終了時(例えば、本明細書に記載のサイトカインプロセス又は活性化プロセスの終了時)の細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCD95+セントラルメモリーT細胞のパーセンテージは、40、45、50、55、60、65、70、75又は80%以下である。
一部の実施形態において、製造プロセスの終了時(例えば、本明細書に記載のサイトカインプロセス又は活性化プロセスの終了時)の細胞の集団は、インビボで投与された後、例えば26時間超持続する(例えば、5、6、7、8、9、10、11若しくは12日超持続する)か、又は例えば3日超にわたりインビトロで細胞の集団を増殖させる(例えば、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14若しくは15日にわたりインビトロで細胞の集団を増殖させる)ステップを含む以外には類似の方法によって作製された細胞と比べて、長時間持続するか又は高い(例えば、少なくとも20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、75、80、85若しくは90%高い)レベルで増殖する(例えば、図4Cを参照にして実施例1に記載される方法を用いて評価されるように)。
一部の実施形態において、細胞の集団は、製造プロセスの開始前(例えば、本明細書に記載のサイトカインプロセス又は活性化プロセスの開始前)にIL6R発現細胞(例えば、IL6Rα及び/又はIL6Rβ)について濃縮されている。一部の実施形態において、細胞の集団は、例えば、製造プロセスの開始時(例えば、本明細書に記載のサイトカインプロセス又は活性化プロセスの開始時)に、例えば30、35、40、45、50、55、60、65、70、75又は80%以下のIL6R発現細胞(例えば、IL6Rα及び/又はIL6Rβについて陽性の細胞)を含む。
医薬組成物
さらに、本開示は、CAR発現細胞組成物並びに疾患の中でも、とりわけ癌又は本明細書に記載の腫瘍抗原を発現する細胞若しくは組織を含むあらゆる悪性若しくは自己免疫疾患を処置するための薬剤又は方法でのそれらの使用を提供する。一部の実施形態では、1種以上の薬学的に又は生理的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤と組み合わせて、本明細書に記載の製造プロセス(例えば、本明細書に記載のサイトカインプロセス又は活性化プロセス)により作製される、CAR発現細胞、例えば複数のCAR発現細胞を含む医薬組成物が提供される。
さらに、本開示は、CAR発現細胞組成物並びに疾患の中でも、とりわけ癌又は本明細書に記載の腫瘍抗原を発現する細胞若しくは組織を含むあらゆる悪性若しくは自己免疫疾患を処置するための薬剤又は方法でのそれらの使用を提供する。一部の実施形態では、1種以上の薬学的に又は生理的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤と組み合わせて、本明細書に記載の製造プロセス(例えば、本明細書に記載のサイトカインプロセス又は活性化プロセス)により作製される、CAR発現細胞、例えば複数のCAR発現細胞を含む医薬組成物が提供される。
キメラ抗原受容体(CAR)
本発明は、免疫エフェクター細胞を、癌に指向させる、1つ以上のCARを含有するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞又はNK細胞)を提供する。これは、癌関連抗原に対して特異的であるCAR上の抗原結合ドメインを通して達成される。本明細書に記載のCARにより標的化され得る2つのクラスの癌関連抗原(腫瘍抗原)が存在する:(1)癌細胞の表面に発現される癌関連抗原;及び(2)それ自体は細胞内であるが、そのような抗原のフラグメント(ペプチド)がMHC(主要組織適合複合体)により癌細胞の表面に提示される、癌関連抗原。
本発明は、免疫エフェクター細胞を、癌に指向させる、1つ以上のCARを含有するように操作された免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞又はNK細胞)を提供する。これは、癌関連抗原に対して特異的であるCAR上の抗原結合ドメインを通して達成される。本明細書に記載のCARにより標的化され得る2つのクラスの癌関連抗原(腫瘍抗原)が存在する:(1)癌細胞の表面に発現される癌関連抗原;及び(2)それ自体は細胞内であるが、そのような抗原のフラグメント(ペプチド)がMHC(主要組織適合複合体)により癌細胞の表面に提示される、癌関連抗原。
従って、免疫エフェクター細胞(例えば、本明細書に記載の方法によって得られるもの)は、以下の癌関連抗原(腫瘍抗原)の1つを標的とするCARを含有するように操作することができる:CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、メソテリン、IL-11Ra、PSCA、VEGFR2、ルイスY、CD24、PDGFR-β、PRSS21、SSEA-4、CD20、葉酸受容体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、Prostase、PAP、ELF2M、エフリンB2、IGF-I受容体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、チロシナーゼ、EphA2、フコシルGM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-アセチル-GD2、葉酸受容体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、TSHR、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、ポリシアル酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、レグマイン、HPV E6、E7、MAGE-A1、MAGE A1、ETV6-AML、精子タンパク質17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos関連抗原1、p53、p53変異体、プロステイン、サバイビン及びテロメラーゼ、PCTA-1/ガレクチン8、MelanA/MART1、Ras変異体、hTERT、肉腫転座切断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合遺伝子)、NA17、PAX3、アンドロゲン受容体、サイクリンB1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2、腸カルボキシルエステラーゼ及びmut hsp70-2。
本明細書に記載されるCAR分子の一部となり得る様々な成分の非限定的な例の配列を表1に列挙し、ここで、「aa」は、アミノ酸を表し、「na」は、対応するペプチドをコードする核酸を表す。
二特異性CAR
一部の実施形態において、多特異性抗体分子は二特異性抗体分子である。二特異性抗体は、2以下の抗原に特異性を有する。二特異性抗体分子は、第1のエピトープに対する結合特異性を有する第1の免疫グロブリン可変ドメイン配列及び第2のエピトープに対する結合特異性を有する第2の免疫グロブリン可変ドメイン配列により特徴付けられる。一部の実施形態において、第1及び第2のエピトープは同じ抗原、例えば、同じタンパク質(又は多量体タンパク質のサブユニット)である。一部の実施形態において、第1及び第2のエピトープは重複する。一部の実施形態において、第1及び第2のエピトープは重複しない。一部の実施形態において、第1及び第2のエピトープは、異なる抗原、例えば、異なるタンパク質(又は多量体タンパク質の異なるサブユニット)にある。一部の実施形態において、二特異性抗体分子は、第1のエピトープに結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列並びに第2のエピトープに結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列を含む。一部の実施形態において、二特異性抗体分子は、第1のエピトープに結合特異性を有する半抗体及び第2のエピトープに結合特異性を有する半抗体を含む。一部の実施形態において、二特異性抗体分子は、第1のエピトープに結合特異性を有する半抗体又はそのフラグメント及び第2のエピトープに結合特異性を有する半抗体又はそのフラグメントを含む。一部の実施形態において、二特異性抗体分子は、第1のエピトープに結合特異性を有するscFv又はそのフラグメント及び第2のエピトープに結合特異性を有するscFv又はそのフラグメントを含む。
一部の実施形態において、多特異性抗体分子は二特異性抗体分子である。二特異性抗体は、2以下の抗原に特異性を有する。二特異性抗体分子は、第1のエピトープに対する結合特異性を有する第1の免疫グロブリン可変ドメイン配列及び第2のエピトープに対する結合特異性を有する第2の免疫グロブリン可変ドメイン配列により特徴付けられる。一部の実施形態において、第1及び第2のエピトープは同じ抗原、例えば、同じタンパク質(又は多量体タンパク質のサブユニット)である。一部の実施形態において、第1及び第2のエピトープは重複する。一部の実施形態において、第1及び第2のエピトープは重複しない。一部の実施形態において、第1及び第2のエピトープは、異なる抗原、例えば、異なるタンパク質(又は多量体タンパク質の異なるサブユニット)にある。一部の実施形態において、二特異性抗体分子は、第1のエピトープに結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列並びに第2のエピトープに結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列を含む。一部の実施形態において、二特異性抗体分子は、第1のエピトープに結合特異性を有する半抗体及び第2のエピトープに結合特異性を有する半抗体を含む。一部の実施形態において、二特異性抗体分子は、第1のエピトープに結合特異性を有する半抗体又はそのフラグメント及び第2のエピトープに結合特異性を有する半抗体又はそのフラグメントを含む。一部の実施形態において、二特異性抗体分子は、第1のエピトープに結合特異性を有するscFv又はそのフラグメント及び第2のエピトープに結合特異性を有するscFv又はそのフラグメントを含む。
特定の実施形態において、抗体分子は、多特異性(例えば、二特異性又は三特異性)抗体分子である。二重特異性又はヘテロ二量体性抗体分子を産生するためのプロトコル及び二重特異性抗体分子の様々な構成は、例えば、2015年3月13日に出願された国際公開第2015/142675号パンフレットの段落455~458に記載されており、その全体が参照により組み込まれる。
一部の実施形態において、二特異性抗体分子は、第1の免疫グロブリン可変ドメイン配列、例えば、scFvにより特徴付けられ、これは、CD19に結合特異性を有し、例えば、本明細書に記載されるようなscFvを含むか、又は本明細書に記載のscFvからの軽鎖CDR及び/又は重鎖CDR及び第2のエピトープに対する結合特異性を有する第2の免疫グロブリン可変ドメイン配列を異なる抗原に含む。
キメラTCR
一部の実施形態において、本発明の抗原及び抗原フラグメント(例えば、CD19抗体及びフラグメント)を、キメラTCRを作るために、T細胞受容体(「TCR」)鎖の1つ以上の定常ドメイン、例えばTCRα又はTCRβ鎖に移植できる。理論に縛られないが、キメラTCRは、抗原結合によりTCR複合体を経てシグナル伝達すると考えられる。例えば、本明細書に記載するようなscFvを、TCR鎖、例えばTCRα鎖及び/又はTCRβ鎖の定常ドメイン、例えば、少なくとも細胞外定常ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインの部分に移植できる。別の例として、抗体フラグメント、例えば本明細書に記載されるようなVLドメインを、TCRα鎖の定常ドメインに移植でき、抗体フラグメント、例えば本明細書に記載されるようなVHドメインを、TCRβ鎖の定常ドメインに移植できる(又は代わりにVLドメインをTCRβ鎖の定常ドメインに移植し得、VHドメインを、TCRα鎖に移植し得る)。別の例として、抗体又は抗体フラグメントのCDRは、キメラTCRを作るために、TCRα鎖及び/又はβ鎖に移植され得る。例えば、本明細書に記載のLCDRをTCRα鎖の可変ドメインに移植し得、本明細書に記載のHCDRをTCRβ鎖の可変ドメインに移植し得るか又はその逆も可能である。このようなキメラTCRは、例えば、当技術分野で公知の方法により産生し得る(例えば、Willemsen RA et al,Gene Therapy 2000;7:1369-1377;Zhang T et al,Cancer Gene Ther 2004;11:487-496;Aggen et al,Gene Ther.2012 Apr;19(4):365-74)。
一部の実施形態において、本発明の抗原及び抗原フラグメント(例えば、CD19抗体及びフラグメント)を、キメラTCRを作るために、T細胞受容体(「TCR」)鎖の1つ以上の定常ドメイン、例えばTCRα又はTCRβ鎖に移植できる。理論に縛られないが、キメラTCRは、抗原結合によりTCR複合体を経てシグナル伝達すると考えられる。例えば、本明細書に記載するようなscFvを、TCR鎖、例えばTCRα鎖及び/又はTCRβ鎖の定常ドメイン、例えば、少なくとも細胞外定常ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインの部分に移植できる。別の例として、抗体フラグメント、例えば本明細書に記載されるようなVLドメインを、TCRα鎖の定常ドメインに移植でき、抗体フラグメント、例えば本明細書に記載されるようなVHドメインを、TCRβ鎖の定常ドメインに移植できる(又は代わりにVLドメインをTCRβ鎖の定常ドメインに移植し得、VHドメインを、TCRα鎖に移植し得る)。別の例として、抗体又は抗体フラグメントのCDRは、キメラTCRを作るために、TCRα鎖及び/又はβ鎖に移植され得る。例えば、本明細書に記載のLCDRをTCRα鎖の可変ドメインに移植し得、本明細書に記載のHCDRをTCRβ鎖の可変ドメインに移植し得るか又はその逆も可能である。このようなキメラTCRは、例えば、当技術分野で公知の方法により産生し得る(例えば、Willemsen RA et al,Gene Therapy 2000;7:1369-1377;Zhang T et al,Cancer Gene Ther 2004;11:487-496;Aggen et al,Gene Ther.2012 Apr;19(4):365-74)。
非抗体足場
実施形態において、抗原結合ドメインは、非抗体足場、例えば、フィブロネクチン、アンキリン、ドメイン抗体、リポカリン、小モジュラー免疫医薬品、マキシボディ、プロテインA又はアフィリンを含む。非抗体足場は、細胞上の標的抗原に結合する能力を有する。実施形態において、抗原結合ドメインは、細胞上で発現される天然に存在するタンパク質のポリペプチド又はそのフラグメントである。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、非抗体足場を含む。得られるポリペプチドが標的細胞上の標的抗原に特異的に結合する少なくとも1つの結合領域を含む限り、多様な非抗体足場を使用することができる。
実施形態において、抗原結合ドメインは、非抗体足場、例えば、フィブロネクチン、アンキリン、ドメイン抗体、リポカリン、小モジュラー免疫医薬品、マキシボディ、プロテインA又はアフィリンを含む。非抗体足場は、細胞上の標的抗原に結合する能力を有する。実施形態において、抗原結合ドメインは、細胞上で発現される天然に存在するタンパク質のポリペプチド又はそのフラグメントである。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、非抗体足場を含む。得られるポリペプチドが標的細胞上の標的抗原に特異的に結合する少なくとも1つの結合領域を含む限り、多様な非抗体足場を使用することができる。
非抗体足場は、フィブロネクチン(Novartis、MA)、アンキリン(Molecular Partners AG、Zurich、スイス)、ドメイン抗体(Domantis,Ltd.、Cambridge、MA及びAblynx nv、Zwijnaarde、ベルギー)、リポカリン(Pieris Proteolab AG、Freising、ドイツ)、小モジュラー免疫医薬品(Trubion Pharmaceuticals Inc.、Seattle、WA)、マキシボディ(Avidia,Inc.、Mountain View、CA)、プロテインA(Affibody AG、スウェーデン)及びアフィリン(γクリスタリン又はユビキチン)(Scil Proteins GmbH、Halle、ドイツ)を含む。
一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、標的細胞の表面上の対リガンドに結合する分子の細胞外ドメイン又はその対リガンド結合フラグメントを含む。
免疫エフェクター細胞は、CARをコードする配列を含む組換えDNA構築物を含むことができ、CARは、腫瘍抗原、例えば本明細書に記載の腫瘍抗原及び細胞内シグナル伝達ドメインに特異的に結合する抗原結合ドメイン(例えば、抗体又は抗体フラグメント、TCR又はTCRフラグメント)を含む。細胞内シグナル伝達ドメインは共刺激シグナル伝達ドメイン及び/又は一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ζ鎖を含み得る。他の箇所に記載されるように、本明細書に記載される方法は、細胞(例えば、T制御性枯渇細胞の集団からのもの)を、CAR、例えば、本明細書に記載されるCARをコードする核酸で形質導入することを含み得る。
一部の実施形態において、CARはscFvドメインを含み、scFvの前には、配列番号1に提供されるような任意選択のリーダー配列があり得、後ろには、配列番号2又は配列番号36又は配列番号38に提供されるような任意選択のヒンジ配列、配列番号6に提供されるような膜貫通領域、配列番号7又は配列番号16を含む細胞内シグナル伝達ドメイン及び配列番号9又は配列番号10を含むCD3ζ配列があり得、例えば、これらのドメインは、連続しており、同じリーディングフレーム内にあり、単一の融合タンパク質を形成する。
一部の実施形態において、例示的CAR構築物は、任意選択のリーダー配列(例えば、本明細書に記載されるリーダー配列)、細胞外抗原結合ドメイン(例えば、本明細書に記載される抗原結合ドメイン)、ヒンジ(例えば、本明細書に記載されるヒンジ領域)、膜貫通ドメイン(例えば、本明細書に記載される膜貫通ドメイン)及び細胞内刺激ドメイン(例えば、本明細書に記載される細胞内刺激ドメイン)を含む。一部の実施形態において、例示的CAR構築物は、任意選択のリーダー配列(例えば、本明細書に記載されるリーダー配列)、細胞外抗原結合ドメイン(例えば、本明細書に記載される抗原結合ドメイン)、ヒンジ(例えば、本明細書に記載されるヒンジ領域)、膜貫通ドメイン(例えば、本明細書に記載される膜貫通ドメイン)、細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン(例えば、本明細書に記載される共刺激シグナル伝達ドメイン)及び/又は細胞内一次シグナル伝達ドメイン(例えば、本明細書に記載される一次シグナル伝達ドメイン)を含む。
例示的なリーダー配列は、配列番号1として提供される。ヒンジ/スペーサー配列の例は、配列番号2又は配列番号36又は配列番号38として提供される。例示的な膜貫通ドメイン配列は、配列番号6として提供される。例示的な4-1BBタンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインの配列は、配列番号7として提供される。例示的なCD27の細胞内シグナル伝達ドメインの配列の例は、配列番号16として提供される。例示的なCD3ζドメイン配列は、配列番号9又は配列番号10として提供される。
一部の実施形態において、免疫エフェクター細胞は、CARをコードする核酸分子を含む組換え核酸構築物を含み、核酸分子は、抗原結合ドメインをコードする核酸配列を含み、この配列は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列に連続しており、それと同じリーディングフレーム内にある。CARに使用し得る例示的細胞内シグナル伝達ドメインには、限定されないが、例えばCD3-ζ、CD28、4-1BBなどの1つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインが含まれる。一部の例では、CARは、CD3-ζ、CD28、CD27、4-1BBなどの任意の組み合わせを含み得る。
所望の分子をコードする核酸配列は、標準的な技法を用いて、例えば核酸分子を発現する細胞からのライブラリーをスクリーニングすることによるか、それを含むことが知られるベクターから核酸分子を誘導することによるか、又はそれを含む細胞及び組織から直接単離することによるなど、当技術分野において公知の組換え方法を用いて得ることができる。代わりに、目的の核酸はクローニングでなく、むしろ合成的に作製することができる。
CARをコードする核酸は、例えばレトロウイルス又はレンチウイルスベクター構築物を使用して、免疫エフェクター細胞に導入することができる。
CARをコードする核酸は、例えば、細胞に直接トランスフェクトされ得るRNA構築物を使用しても免疫エフェクター細胞に導入され得る。トランスフェクションに使用するためのmRNAの作成方法には、特別に設計したプライマーによるテンプレートのインビトロ転写(IVT)と、続くポリ(A)付加が含まれ、それにより、3’及び5’非翻訳配列(「UTR」)(例えば、本明細書に記載の3’及び/又は5’UTR)、5’キャップ(例えば、本明細書に記載の5’キャップ)及び/又は配列内リボソーム進入部位(IRES)(例えば、本明細書に記載のIRES)、発現させようとする核酸及びポリ(A)テールを含む構築物、典型的には50~2000塩基長(例えば、実施例に記載されるもの、例えば、配列番号35)が産生される。このように産生されたRNAは、異なる種の細胞において効率的にトランスフェクトされ得る。一部の実施形態において、テンプレートは、CARの配列を含む。一部の実施形態において、RNA CARベクターは、電気穿孔によって細胞、例えばT細胞に、形質導入される。
抗原結合ドメイン
一部の実施形態において、複数の免疫エフェクター細胞、例えばT制御性枯渇細胞の集団は、抗原結合ドメインとも称される標的特異的結合要素を含むCARをコードする核酸を含む。結合要素の選択は、標的細胞の表面を定義するリガンドのタイプ及び数に依存する。例えば、抗原結合ドメインは、特定の病状に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択され得る。従って、本明細書に記載のCARにおいて抗原結合ドメインのリガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例には、ウイルス、細菌及び寄生虫感染、自己免疫疾患並びに癌細胞に関連するものが含まれる。
一部の実施形態において、複数の免疫エフェクター細胞、例えばT制御性枯渇細胞の集団は、抗原結合ドメインとも称される標的特異的結合要素を含むCARをコードする核酸を含む。結合要素の選択は、標的細胞の表面を定義するリガンドのタイプ及び数に依存する。例えば、抗原結合ドメインは、特定の病状に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択され得る。従って、本明細書に記載のCARにおいて抗原結合ドメインのリガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例には、ウイルス、細菌及び寄生虫感染、自己免疫疾患並びに癌細胞に関連するものが含まれる。
一部の実施形態において、抗原結合ドメインを含むCARの一部分は、腫瘍抗原、例えば本明細書に記載される腫瘍抗原を標的とする抗原結合ドメインを含む。
抗原結合ドメインは、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体及びその機能性フラグメント、例えば、限定されないが、重鎖可変ドメイン(VH)、軽鎖可変ドメイン(VL)及びラクダ科動物由来ナノボディの可変ドメイン(VHH)などのシングルドメイン抗体及び組換えフィブロネクチンドメイン、T細胞受容体(TCR)又はそのフラグメント、例えば、単鎖TCRなど、抗原結合ドメインとして機能することが当技術分野において公知の代替的足場を含め、抗原に結合する任意のドメインであり得る。一部の例において、抗原結合ドメインは、CARが最終的に使用されることになる同じ種に由来することが有益である。例えば、ヒトでの使用には、CARの抗原結合ドメインが抗体又は抗体フラグメントの抗原結合ドメインにヒト又はヒト化残基を含むことが有益であり得る。
CD19CAR
一部の実施形態において、本明細書に記載されるCAR発現細胞は、CD19CAR発現細胞(例えば、ヒトCD19に結合するCARを発現する細胞)である。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるCAR発現細胞は、CD19CAR発現細胞(例えば、ヒトCD19に結合するCARを発現する細胞)である。
一部の実施形態において、CD19CARの抗原結合ドメインは、Nicholson et al.Mol.Immun.34(16-17):1157-1165(1997)に記載されるFMC63scFvフラグメントと同じであるか又は類似の結合特異性を有する。一部の実施形態において、CD19CARの抗原結合ドメインは、Nicholson et al.Mol.Immun.34(16-17):1157-1165(1997)に記載されるscFvフラグメントを含む。
一部の実施形態において、CD19CARは、国際公開第2014/153270号パンフレット(参照により本明細書に組み込まれる)の表3に従う抗原結合ドメイン(例えば、ヒト化抗原結合ドメイン)を含む。国際公開第2014/153270号パンフレットは、様々なCAR構築物の結合及び有効性をアッセイする方法も記載する。
一部の実施形態において、親マウスscFv配列は、国際公開第2012/079000号パンフレット(参照により本明細書に組み込まれる)に記載されるCAR19構築物である。一部の実施形態において、抗CD19結合ドメインは、国際公開第2012/079000号パンフレットに記載されるscFvである。
一部の実施形態において、CAR分子は、国際公開第2012/079000号パンフレットの配列番号12に記載される融合ポリペプチド配列を含み、これは、ヒトCD19に特異的に結合するマウス由来のscFvフラグメントを提供する。
一部の実施形態において、CD19CARは、国際公開第2012/079000号パンフレットの配列番号12に記載されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、CD19CARは、USAN名TISAGENLECLEUCEL-Tを有する。実施形態において、CTL019は、T細胞の遺伝子改変によって作製され、この改変は、EF-1αプロモーターの制御下のCTL019導入遺伝子を含有する自己不活性化、複製欠損レンチウイルス(LV)ベクターでの形質導入による安定的挿入によって媒介される。CTL019は、パーセント導入遺伝子陽性T細胞に基づいて対象に送達される導入遺伝子陽性T細胞と導入遺伝子陰性T細胞の混合物であり得る。
他の実施形態において、CD19CARは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2014/153270号パンフレットの表3に記載の抗原結合ドメイン(例えば、ヒト化抗原結合ドメイン)を含む。
マウスCD19抗体のヒト化は、マウス特異的残基が、CART19処置、即ちCAR19構築物で形質導入されたT細胞による処置を受ける患者にヒト-抗-マウス抗原(HAMA)応答を誘導し得る臨床現場において望ましい。ヒト化CD19CAR配列の生成、特性決定及び有効性について、国際公開第2014/153270号パンフレット(その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる)に、実施例1~5(p.115~159)を含め、記載されている。
いずれか既知のCD19CAR、例えばいずれか既知のCD19CARのCD19抗原結合ドメインを当技術分野において本開示に従って使用することができる。例えば、LG-740;米国特許第8,399,645号明細書;米国特許第7,446,190号明細書;Xu et al.,Leuk Lymphoma.2013 54(2):255-260(2012);Cruz et al.,Blood 122(17):2965-2973(2013);Brentjens et al.,Blood,118(18):4817-4828(2011);Kochenderfer et al.,Blood 116(20):4099-102(2010);Kochenderfer et al.,Blood 122(25):4129-39(2013);及び16th Annu Meet Am Soc Gen Cell Ther(ASGCT)(May 15-18,Salt Lake City)2013,Abst 10に記載のCD19CARである。
例示的なCD19CARは、本明細書に記載されるCD19CAR又はXu et al.Blood 123.24(2014):3750-9;Kochenderfer et al.Blood 122.25(2013):4129-39,Cruz et al.Blood 122.17(2013):2965-73、NCT00586391、NCT01087294、NCT02456350、NCT00840853、NCT02659943、NCT02650999、NCT02640209、NCT01747486、NCT02546739、NCT02656147、NCT02772198、NCT00709033、NCT02081937、NCT00924326、NCT02735083、NCT02794246、NCT02746952、NCT01593696、NCT02134262、NCT01853631、NCT02443831、NCT02277522、NCT02348216、NCT02614066、NCT02030834、NCT02624258、NCT02625480、NCT02030847、NCT02644655、NCT02349698、NCT02813837、NCT02050347、NCT01683279、NCT02529813、NCT02537977、NCT02799550、NCT02672501、NCT02819583、NCT02028455、NCT01840566、NCT01318317、NCT01864889、NCT02706405、NCT01475058、NCT01430390、NCT02146924、NCT02051257、NCT02431988、NCT01815749、NCT02153580、NCT01865617、NCT02208362、NCT02685670、NCT02535364、NCT02631044、NCT02728882、NCT02735291、NCT01860937、NCT02822326、NCT02737085、NCT02465983、NCT02132624、NCT02782351、NCT01493453、NCT02652910、NCT02247609、NCT01029366、NCT01626495、NCT02721407、NCT01044069、NCT00422383、NCT01680991、NCT02794961又はNCT02456207に記載される抗CD19CARを含み、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態において、CD19CARは、例えば、表2に開示されるCDR、VH、VL、scFv若しくは完全CAR配列又はそれと少なくとも80%、85%、90%、95%若しくは99%の同一性を有する配列を含む。
BCMA CAR
一部の実施形態において、本明細書に記載されるCAR発現細胞は、BCMA CAR発現細胞(例えば、ヒトBCMAに結合するCARを発現する細胞)である。例示的なBCMA CARは、国際公開第2016/014565号パンフレット(参照により本明細書に組み込まれる)の表1又は16に開示される配列を含み得る。BCMA CAR構築物は、任意選択のリーダー配列;任意選択ヒンジドメイン、例えばCD8ヒンジドメイン;膜貫通ドメイン、例えばCD8膜貫通ドメイン;細胞内ドメイン、例えば4-1BB細胞内ドメイン;並びに機能的シグナル伝達ドメイン、例えばCD3ζドメインを含み得る。特定の実施形態において、ドメインは、隣接しており、同じリーディングフレーム内で単一の融合タンパク質を形成する。他の実施形態において、ドメインは、例えば、本明細書に記載されるRCAR分子と同様に、個別のポリペプチド内に存在する。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるCAR発現細胞は、BCMA CAR発現細胞(例えば、ヒトBCMAに結合するCARを発現する細胞)である。例示的なBCMA CARは、国際公開第2016/014565号パンフレット(参照により本明細書に組み込まれる)の表1又は16に開示される配列を含み得る。BCMA CAR構築物は、任意選択のリーダー配列;任意選択ヒンジドメイン、例えばCD8ヒンジドメイン;膜貫通ドメイン、例えばCD8膜貫通ドメイン;細胞内ドメイン、例えば4-1BB細胞内ドメイン;並びに機能的シグナル伝達ドメイン、例えばCD3ζドメインを含み得る。特定の実施形態において、ドメインは、隣接しており、同じリーディングフレーム内で単一の融合タンパク質を形成する。他の実施形態において、ドメインは、例えば、本明細書に記載されるRCAR分子と同様に、個別のポリペプチド内に存在する。
一部の実施形態において、BCMA CAR分子は、1つ以上のCDR、VH、VL、scFv又は国際公開第2016/014565号パンフレットに開示されるBCMA-1、BCMA-2、BCMA-3、BCMA-4、BCMA-5、BCMA-6、BCMA-7、BCMA-8、BCMA-9、BCMA-10、BCMA-11、BCMA-12、BCMA-13、BCMA-14、BCMA-15、149362、149363、149364、149365、149366、149367、149368、149369、BCMA_EBB-C1978-A4、BCMA_EBB-C1978-G1、BCMA_EBB-C1979-C1、BCMA_EBB-C1978-C7、BCMA_EBB-C1978-D10、BCMA_EBB-C1979-C12、BCMA_EBB-C1980-G4、BCMA_EBB-C1980-D2、BCMA_EBB-C1978-A10、BCMA_EBB-C1978-D4、BCMA_EBB-C1980-A2、BCMA_EBB-C1981-C3、BCMA_EBB-C1978-G4、A7D12.2、C11D5.3、C12A3.2若しくはC13F12.1の完全長配列又はそれと実質的に(例えば、95~99%)同一の配列を含む。
抗BCMA CAR構築物に使用することができる別の例示的なBCMA標的化配列は、国際公開第2017/021450号、同第2017/011804号、同第2017/025038号、同第2016/090327号、同第2016/130598号、同第2016/210293号、同第2016/090320号、同第2016/014789号、同第2016/094304号、同第2016/154055号、同第2015/166073号、同第2015/188119号、同第2015/158671号パンフレット、米国特許第9,243,058号、同第8,920,776号、同第9,273,141号、同第7,083,785号、同第9,034,324号明細書、米国特許出願第2007/0049735号、同第2015/0284467号、同第2015/0051266号、同第2015/0344844号、同第2016/0131655号、同第2016/0297884号、同第2016/0297885号、同第2017/0051308号、同第2017/0051252号、同第2017/0051252号、同第2016/020332号、同第2016/087531号明細書、国際公開第2016/079177号、同第2015/172800号、同第2017/008169号パンフレット、米国特許第9,340,621号、米国特許出願第2013/0273055号、同第2016/0176973号、同第2015/0368351号、同第2017/0051068号、同第2016/0368988号及び同第2015/0232557号明細書に開示されており、これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態において、別の例示的なBCMA CAR構築物は、国際公開第2012/0163805号パンフレット(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)からのVH及びVL配列を用いて作製される。
一部の実施形態において、BCMA CARは、配列、例えば表3~15に開示されるCDR、VH、VL、scFv若しくは完全CAR配列又はそれに対して少なくとも80%、85%、90%、95%若しくは99%の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、ヒト抗体又はヒト抗体フラグメントを含む。一部の実施形態において、ヒト抗BCMA結合ドメインは、本明細書に(例えば、表3~10及び12~15に)記載されるヒト抗BCMA結合ドメインの1つ以上(例えば、全3つ)のLC CDR1、LC、CDR2及びLC CDR3並びに/又は本明細書に(例えば、表3~10及び12~15に)記載されるヒト抗BCMA結合ドメインの1つ以上(例えば、全3つ)のHC CDR1、HC、CDR2及びHC CDR3を含む。一部の実施形態において、ヒト抗BCMA結合ドメインは、本明細書に(例えば、表3、7及び12)に記載のヒトVL並びに/又は本明細書に(例えば、表3、7及び12)に記載のヒトVHを含む。一部の実施形態において、抗BCMA結合ドメインは、表3、7及び12のアミノ酸配列のVL及びVHを含むscFvである。一部の実施形態において、抗BCMA結合ドメイン(例えば、scFv)は、以下を含む:表3、7及び12に記載のアミノ酸配列の少なくとも1つ、2つ若しくは3つの修飾(例えば、置換、例えば保存的置換)、しかし30、20若しくは10以下の修飾(例えば、置換、例えば保存的置換)を有するアミノ酸配列又は表3、7及び12のアミノ酸配列と95~99%の同一性を有する配列を含むVL並びに/或いは表3、7及び12に記載のアミノ酸配列の少なくとも1つ、2つ若しくは3つの修飾(例えば、置換、例えば保存的置換)、しかし30、20若しくは10以下の修飾(例えば、置換、例えば保存的置換)を有するアミノ酸配列又は表3、7及び12のアミノ酸配列と95~99%の同一性を有する配列を含むVH。
一部の実施形態において、ヒト抗BCMA結合ドメインは、HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2及びLC CDR3を含む。
特定の実施形態において、本明細書に記載のCAR分子又は本明細書に記載の抗BCMA結合ドメインは、以下を含む:
(1)以下から選択される1つ、2つ若しくは3つの軽鎖(LC)CDR:
(i)配列番号54のLC CDR1、配列番号55のLC CDR2及び配列番号56のLC CDR3;及び/又は
(2)以下の1つからの1つ、2つ若しくは3つの重鎖(HC)CDR:
(i)配列番号44のHC CDR1、配列番号45のHC CDR2及び配列番号84のHC CDR3;(ii)配列番号44のHC CDR1、配列番号45のHC CDR2及び配列番号46のHC CDR3;(iii)配列番号44のHC CDR1、配列番号45のHC CDR2及び配列番号68のHC CDR3;又は(iv)配列番号44のHC CDR1、配列番号45のHC CDR2及び配列番号76のHC CDR3。
(1)以下から選択される1つ、2つ若しくは3つの軽鎖(LC)CDR:
(i)配列番号54のLC CDR1、配列番号55のLC CDR2及び配列番号56のLC CDR3;及び/又は
(2)以下の1つからの1つ、2つ若しくは3つの重鎖(HC)CDR:
(i)配列番号44のHC CDR1、配列番号45のHC CDR2及び配列番号84のHC CDR3;(ii)配列番号44のHC CDR1、配列番号45のHC CDR2及び配列番号46のHC CDR3;(iii)配列番号44のHC CDR1、配列番号45のHC CDR2及び配列番号68のHC CDR3;又は(iv)配列番号44のHC CDR1、配列番号45のHC CDR2及び配列番号76のHC CDR3。
特定の実施形態において、本明細書に記載のCAR分子又は本明細書に記載の抗BCMA結合ドメインは、以下を含む:
(1)以下の1つからの1つ、2つ若しくは3つの軽鎖(LC)CDR:
(i)配列番号95のLC CDR1、配列番号131のLC CDR2及び配列番号132のLC CDR3;(ii)配列番号95のLC CDR1、配列番号96のLC CDR2及び配列番号97のLC CDR3;(iii)配列番号95のLC CDR1、配列番号114のLC CDR2及び配列番号115のLC CDR3;又は(iv)配列番号95のLC CDR1、配列番号114のLC CDR2及び配列番号97のLC CDR3;並びに/又は
(2)以下の1つからの1つ、2つ若しくは3つの重鎖(HC)CDR:
(i)配列番号86のHC CDR1、配列番号130のHC CDR2及び配列番号88のHC CDR3;(ii)配列番号86のHC CDR1、配列番号87のHC CDR2及び配列番号88のHC CDR3;又は(iii)配列番号86のHC CDR1、配列番号109のHC CDR2及び配列番号88のHC CDR3。
(1)以下の1つからの1つ、2つ若しくは3つの軽鎖(LC)CDR:
(i)配列番号95のLC CDR1、配列番号131のLC CDR2及び配列番号132のLC CDR3;(ii)配列番号95のLC CDR1、配列番号96のLC CDR2及び配列番号97のLC CDR3;(iii)配列番号95のLC CDR1、配列番号114のLC CDR2及び配列番号115のLC CDR3;又は(iv)配列番号95のLC CDR1、配列番号114のLC CDR2及び配列番号97のLC CDR3;並びに/又は
(2)以下の1つからの1つ、2つ若しくは3つの重鎖(HC)CDR:
(i)配列番号86のHC CDR1、配列番号130のHC CDR2及び配列番号88のHC CDR3;(ii)配列番号86のHC CDR1、配列番号87のHC CDR2及び配列番号88のHC CDR3;又は(iii)配列番号86のHC CDR1、配列番号109のHC CDR2及び配列番号88のHC CDR3。
特定の実施形態において、本明細書に記載のCAR分子又は本明細書に記載の抗BCMA結合ドメインは、以下を含む:
(1)以下の1つからの1つ、2つ若しくは3つの軽鎖(LC)CDR:
(i)配列番号147のLC CDR1、配列番号182のLC CDR2及び配列番号183のLC CDR3;(ii)配列番号147のLC CDR1、配列番号148のLC CDR2及び配列番号149のLC CDR3;又は(iii)配列番号147のLC CDR1、配列番号170のLC CDR2及び配列番号171のLC CDR3;並びに/又は
(2)以下の1つからの1つ、2つ若しくは3つの重鎖(HC)CDR:
(i)配列番号179のHC CDR1、配列番号180のHC CDR2及び配列番号181のHC CDR3;(ii)配列番号137のHC CDR1、配列番号138のHC CDR2及び配列番号139のHC CDR3;又は(iii)配列番号160のHC CDR1、配列番号161のHC CDR2及び配列番号162のHC CDR3。
(1)以下の1つからの1つ、2つ若しくは3つの軽鎖(LC)CDR:
(i)配列番号147のLC CDR1、配列番号182のLC CDR2及び配列番号183のLC CDR3;(ii)配列番号147のLC CDR1、配列番号148のLC CDR2及び配列番号149のLC CDR3;又は(iii)配列番号147のLC CDR1、配列番号170のLC CDR2及び配列番号171のLC CDR3;並びに/又は
(2)以下の1つからの1つ、2つ若しくは3つの重鎖(HC)CDR:
(i)配列番号179のHC CDR1、配列番号180のHC CDR2及び配列番号181のHC CDR3;(ii)配列番号137のHC CDR1、配列番号138のHC CDR2及び配列番号139のHC CDR3;又は(iii)配列番号160のHC CDR1、配列番号161のHC CDR2及び配列番号162のHC CDR3。
一部の実施形態において、HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2及びLC CDR3は、それぞれ配列番号44、45、84、54、55及び56のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2及びLC CDR3は、それぞれ配列番号44、45、46、54、55及び56のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2及びLC CDR3は、それぞれ配列番号44、45、68、54、55及び56のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2及びLC CDR3は、それぞれ配列番号44、45、76、54、55及び56のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2及びLC CDR3は、それぞれ配列番号47、48、84、57、58及び59のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2及びLC CDR3は、それぞれ配列番号47、48、46、57、58及び59のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2及びLC CDR3は、それぞれ配列番号47、48、68、57、58及び59のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2及びLC CDR3は、それぞれ配列番号47、48、76、57、58及び59のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2及びLC CDR3は、それぞれ配列番号49、50、85、60、58及び56のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2及びLC CDR3は、それぞれ配列番号49、50、51、60、58及び56のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2及びLC CDR3は、それぞれ配列番号49、50、69、60、58及び56のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2及びLC CDR3は、それぞれ配列番号49、50、77、60、58及び56のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、ヒト抗BCMA結合ドメインは、VH(例えば、本明細書に記載のVH)及びVL(例えば、本明細書に記載のVL)を含むscFvを含む。一部の実施形態では、VHは、リンカー、例えば本明細書に記載されるリンカー、例えば表1に記載のリンカーを介してVLに結合される。一部の実施形態において、ヒト抗BCMA結合ドメインは、(Gly4-Ser)nリンカーを含み、ここで、nは、1、2、3、4、5若しくは6、好ましくは3又は4である(配列番号26)。scFvの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、例えば、以下の配向:軽鎖可変領域-リンカー-重鎖可変領域又は重鎖可変領域-リンカー-軽鎖可変領域のいずれでもあり得る。
一部の実施形態では、抗BCMA結合ドメインは、断片、例えば単鎖可変フラグメント(scFv)である。一部の実施形態では、抗BCMA結合ドメインは、Fv、Fab、(Fab’)2又は二機能性(例えば、二重特異性)ハイブリッドである(例えば、Lanzavecchia et al.,Eur.J.Immunol.17,105(1987))。一部の実施形態では、本発明の抗体及びその断片は、野生型又は増大した親和性でBCMAタンパク質と結合する。
一部の実施形態では、scFvは、当技術分野で公知の方法に従って調製することができる(例えば、Bird et al.,(1988)Science 242:423-426及びHuston et al.,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883を参照)。scFv分子は、柔軟なポリペプチドリンカーを用いてVH及びVL領域を互いに連結することによって生成することができる。scFv分子は、最適化された長さ及び/又はアミノ酸組成物を備えるリンカー(例えば、Ser-Glyリンカー)を含む。リンカー長さは、どのようにscFv分子の可変領域がフォールドし、相互作用するかに大きく影響し得る。実際、短いポリペプチドリンカー(例えば、5~10アミノ酸)を使用すると、鎖内フォールディングが妨げられる。また、鎖間フォールディングも、2つの可変領域を一緒にして、機能性エピトープ結合部位を形成するために必要である。例えば、リンカー配向及びサイズについて、例えばHollinger et al.1993 Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.90:6444-6448、米国特許出願第2005/0100543号、同第2005/0175606号、同第2007/0014794号明細書並びに国際公開第2006/020258号パンフレット及び同第2007/024715号パンフレット(参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
scFvは、そのVL及びVH領域間に少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50若しくはそれを超えるアミノ酸残基のリンカーを含み得る。リンカー配列は、いずれの天然に存在するアミノ酸を含み得る。一部の実施形態では、リンカー配列は、アミノ酸グリシン及びセリンを含む。一部の実施形態では、リンカー配列は、一連のグリシン及びセリン反復、例えば(Gly4Ser)n(ここで、nは、1以上の正の整数である)(配列番号25)を含む。一部の実施形態では、リンカーは、(Gly4Ser)4(配列番号27)又は(Gly4Ser)3(配列番号28)であり得る。リンカー長さの変化は、活性を保持又は増大して、活性試験で優れた有効性をもたらし得る。
CD20 CAR
一部の実施形態において、本明細書に記載のCAR発現細胞は、CD20 CAR発現細胞(例えば、ヒトCD20に結合するCARを発現する細胞)である。一部の実施形態では、CD20 CAR発現細胞は、本明細書に参照により組み込まれる国際公開第2016164731号パンフレット及び同第2018067992号パンフレットに従う抗原結合ドメインを含む。例示的なCD20結合配列又はCD20 CAR配列は、例えば、国際公開第2018067992号パンフレットの表1~5に開示されている。一部の実施形態では、CD20 CARは、国際公開第2018067992号パンフレット又は同第2016164731号パンフレットに開示されるCDR、可変領域、scFv又は完全長配列を含む。
一部の実施形態において、本明細書に記載のCAR発現細胞は、CD20 CAR発現細胞(例えば、ヒトCD20に結合するCARを発現する細胞)である。一部の実施形態では、CD20 CAR発現細胞は、本明細書に参照により組み込まれる国際公開第2016164731号パンフレット及び同第2018067992号パンフレットに従う抗原結合ドメインを含む。例示的なCD20結合配列又はCD20 CAR配列は、例えば、国際公開第2018067992号パンフレットの表1~5に開示されている。一部の実施形態では、CD20 CARは、国際公開第2018067992号パンフレット又は同第2016164731号パンフレットに開示されるCDR、可変領域、scFv又は完全長配列を含む。
CD22 CAR
一部の実施形態において、本明細書に記載のCAR発現細胞は、CD22 CAR発現細胞(例えば、ヒトCD20に結合するCARを発現する細胞)である。一部の実施形態では、CD22 CAR発現細胞は、本明細書に参照により組み込まれる国際公開第2016164731号パンフレット及び同第2018067992号パンフレットに従う抗原結合ドメインを含む。例示的なCD22結合配列又はCD22 CAR配列は、例えば、国際公開第2016164731号パンフレットの表6A、6B、7A、7B、7C、8A、8B、9A、9B、10A及び10B並びに国際公開第2018067992号パンフレットの表6~10に開示されている。一部の実施形態では、国際公開第2018067992号パンフレット又は同第2016164731号パンフレットに開示されるCD22 CARは、CDR、可変領域、scFv又は完全長配列を含む。
一部の実施形態において、本明細書に記載のCAR発現細胞は、CD22 CAR発現細胞(例えば、ヒトCD20に結合するCARを発現する細胞)である。一部の実施形態では、CD22 CAR発現細胞は、本明細書に参照により組み込まれる国際公開第2016164731号パンフレット及び同第2018067992号パンフレットに従う抗原結合ドメインを含む。例示的なCD22結合配列又はCD22 CAR配列は、例えば、国際公開第2016164731号パンフレットの表6A、6B、7A、7B、7C、8A、8B、9A、9B、10A及び10B並びに国際公開第2018067992号パンフレットの表6~10に開示されている。一部の実施形態では、国際公開第2018067992号パンフレット又は同第2016164731号パンフレットに開示されるCD22 CARは、CDR、可変領域、scFv又は完全長配列を含む。
一部の実施形態において、CAR分子は、CD22に結合する抗原を含む(CD22 CAR)。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ヒトCD22を標的にする。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、本明細書に記載の単鎖Fv配列を含む。
ヒトCD CARの配列を以下に記載する。一部の実施形態では、ヒトCD22 CARは、CAR22-65である。
ヒトCD22 CAR軽鎖可変領域
QSALTQPASASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGTGTQLTVL(配列番号287)
QSALTQPASASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGTGTQLTVL(配列番号287)
一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、表16に挙げる任意の重鎖結合ドメインアミノ酸配列のHC CDR1、HC CDR2及びHC CDR3を含む。複数の実施形態では、抗原結合ドメインは、LC CDR1、LC CDR2及びLC CDR3をさらに含む。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、表17に挙げるLC CDR1、LC CDR2及びLC CDR3アミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、表17に挙げる任意の重鎖結合ドメインアミノ酸配列のLC CDR1、LC CDR2及びLC CDR3の1つ、2つ若しくは全部と、表16に挙げる任意の重鎖結合ドメインアミノ酸配列のHC CDR1、HC CDR2及びHC CDR3の1つ、2つ若しくは全部を含む。
一部の実施形態において、CDRは、Kabatナンバーリングスキーム、Chothiaナンバーリングスキーム又はそれらの組み合わせに従って定義される。
VL及びVHドメインがscFv内に出現する順序は変動する可能性があり(即ちVL-VH若しくはVH-VL配向)、また各サブユニットが配列GGGGS(配列番号25)(例えば、(G4S)3(配列番号28)又は(G4S)4(配列番号27)を含む「G4S」サブユニット(配列番号25)の1つ、2つ、3つ若しくは4つのコピーのいずれかは、可変ドメインを連結して、完全なscFvドメインを形成することができる。代わりに、CAR構築物は、例えば、配列GSTSGSGKPGSGEGSTKG(配列番号43)を含むリンカーを含み得る。代わりに、CAR構築物は、例えば、配列LAEAAAK(配列番号308)を含むリンカーを含み得る。一部の実施形態では、CAR構築物は、VL及びVHドメイン間にリンカーを含まない。
これらのクローン、全てCD3ζ鎖由来の共刺激ドメインのシグナルドメインにQ/K残基変化を含んだ。
EGFR CAR
一部の実施形態では、本明細書に記載されるCAR発現細胞は、EGFR CAR発現細胞(例えば、ヒトEGFRに結合するCARを発現する細胞)である。一部の実施形態では、本明細書に記載のCAR発現細胞は、EGFRvIII CAR発現細胞(例えば、ヒトEGFRvIIIに結合するCARを発現する細胞)である。例示的なEGFRvIII CARは、本明細書に参照により組み込まれる国際公開第2014/130657号パンフレット、例えば国際公開第2014/130657号パンフレットの表2に開示される配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるCAR発現細胞は、EGFR CAR発現細胞(例えば、ヒトEGFRに結合するCARを発現する細胞)である。一部の実施形態では、本明細書に記載のCAR発現細胞は、EGFRvIII CAR発現細胞(例えば、ヒトEGFRvIIIに結合するCARを発現する細胞)である。例示的なEGFRvIII CARは、本明細書に参照により組み込まれる国際公開第2014/130657号パンフレット、例えば国際公開第2014/130657号パンフレットの表2に開示される配列を含む。
例示的なEGFRvIII結合配列又はEGFR CAR配列は、国際公開第2014/130657号パンフレットに開示されるEGFR CARのCDR、可変領域、scFv又は完全長CAR配列を含み得る。
メソテリンCAR
一部の実施形態では、本明細書に記載されるCAR発現細胞は、メソテリンCAR発現細胞(例えば、ヒトメソテリンに結合するCARを発現する細胞)である。例示的なメソテリンCARは、本明細書に参照により組み込まれる国際公開第2015090230号パンフレット及び同第2017112741号パンフレット、例えば国際公開第2017112741号パンフレットの表2、3、4及び5に開示される配列を含み得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるCAR発現細胞は、メソテリンCAR発現細胞(例えば、ヒトメソテリンに結合するCARを発現する細胞)である。例示的なメソテリンCARは、本明細書に参照により組み込まれる国際公開第2015090230号パンフレット及び同第2017112741号パンフレット、例えば国際公開第2017112741号パンフレットの表2、3、4及び5に開示される配列を含み得る。
他の例示的なCAR
他の実施形態では、CAR発現細胞は、CD123に特異的に結合することができ、例えば本明細書に参照により組み込まれる国際公開第2014/130635号パンフレットの表1~2のCAR分子(例えば、CAR1~CAR8)又は抗原結合ドメインを含み得る。CD123 CAR分子及び抗原結合ドメイン(例えば、Kabat若しくはChothiaに従う1つ、2つ、3つのVH CDR;及び1つ、2つ、3つのVL CDR)をコードするアミノ酸及びヌクレオチド配列は、国際公開第2014/130635号パンフレットに明示されている。他の実施形態では、CAR発現細胞は、CD123に特異的に結合することができ、例えば本明細書に参照により組み込まれる国際公開第2016/028896号パンフレットの表2、6及び9に従うCAR分子(例えば、CAR123-1~CAR123-4及びhzCAR123-1~hzCAR123-32のいずれか)又は抗原結合ドメインを含み得る。CD123 CAR分子及び抗原結合ドメイン(例えば、Kabat若しくはChothiaに従う1つ、2つ、3つのVH CDR;及び1つ、2つ、3つのVL CDR)をコードするアミノ酸及びヌクレオチド配列は、国際公開第2016/028896号パンフレットに明示されている。
他の実施形態では、CAR発現細胞は、CD123に特異的に結合することができ、例えば本明細書に参照により組み込まれる国際公開第2014/130635号パンフレットの表1~2のCAR分子(例えば、CAR1~CAR8)又は抗原結合ドメインを含み得る。CD123 CAR分子及び抗原結合ドメイン(例えば、Kabat若しくはChothiaに従う1つ、2つ、3つのVH CDR;及び1つ、2つ、3つのVL CDR)をコードするアミノ酸及びヌクレオチド配列は、国際公開第2014/130635号パンフレットに明示されている。他の実施形態では、CAR発現細胞は、CD123に特異的に結合することができ、例えば本明細書に参照により組み込まれる国際公開第2016/028896号パンフレットの表2、6及び9に従うCAR分子(例えば、CAR123-1~CAR123-4及びhzCAR123-1~hzCAR123-32のいずれか)又は抗原結合ドメインを含み得る。CD123 CAR分子及び抗原結合ドメイン(例えば、Kabat若しくはChothiaに従う1つ、2つ、3つのVH CDR;及び1つ、2つ、3つのVL CDR)をコードするアミノ酸及びヌクレオチド配列は、国際公開第2016/028896号パンフレットに明示されている。
一部の実施形態において、CAR分子は、本明細書に記載のCLL1 CAR、例えば本明細書に参照により組み込まれる米国特許出願第2016/0051651A1号明細書に記載されるCLL1 CARを含む。複数の実施形態では、CLL1 CARは、アミノ酸を含むか、又は本明細書に参照により組み込まれる米国特許出願第2016/0051651A1号明細書に表示されるヌクレオチド配列を有する。他の実施形態では、CAR発現細胞は、CLL-1に特異的に結合し、例えば本明細書に参照により組み込まれる国際公開第2016/014535号パンフレットの表2に従うCAR分子又は抗原結合ドメインを含み得る。CLL-1 CAR分子及び抗原結合ドメイン(例えば、Kabat若しくはChothiaに従う1つ、2つ、3つのVH CDR;及び1つ、2つ、3つのVL CDR)をコードするアミノ酸及びヌクレオチド配列は、国際公開第2016/014535号パンフレットに明示されている。
一部の実施形態において、CAR分子は、本明細書に記載のCD33 CAR、例えば本明細書に参照により組み込まれる米国特許出願第2016/0096892A1号明細書に記載されるCD33 CARを含む。複数の実施形態では、CD33 CARは、アミノ酸を含むか、又は本明細書に参照により組み込まれる米国特許出願第2016/0096892A1号明細書に表示されるヌクレオチド配列を有する。他の実施形態では、CAR発現細胞は、CD33に特異的に結合し、例えば本明細書に参照により組み込まれる国際公開第2016/014576号パンフレットの表2若しくは9に従うCAR分子(例えば、CAR33-1~CD33-9のいずれか)又は抗原結合ドメインを含み得る。CD33 CAR分子及び抗原結合ドメイン(例えば、Kabat若しくはChothiaに従う1つ、2つ、3つのVH CDR;及び1つ、2つ、3つのVL CDR)をコードするアミノ酸及びヌクレオチド配列は、国際公開第2016/014576号パンフレットに明示されている。
一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、本明細書に記載の抗体からの1つ、2つ、3つ(例えば、3つ全て)の重鎖CDR、HC CDR1、HC CDR2及びHC CDR3(例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2015/142675号パンフレット、米国特許出願公開第2015-0283178-A1号明細書、2016-0046724-A1号明細書、米国特許出願公開第2014/0322212A1号明細書、米国特許出願公開第2016/0068601A1号明細書、米国特許出願公開第2016/0051651A1号明細書、米国特許出願公開第2016/0096892A1号明細書、米国特許出願公開第2014/0322275A1号明細書又は国際公開第2015/090230号パンフレットに記載の抗体)及び/又は本明細書に記載の抗体からの1つ、2つ、3つ(例えば、3つ全て)の軽鎖CDR、LC CDR1、LC CDR2及びLC CDR3(例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2015/142675号パンフレット、米国特許出願公開第2015-0283178-A1号明細書、2016-0046724-A1号明細書、米国特許出願公開第2014/0322212A1号明細書、米国特許出願公開第2016/0068601A1号明細書、米国特許出願公開第2016/0051651A1号明細書、米国特許出願公開第2016/0096892A1号明細書、米国特許出願公開第2014/0322275A1号明細書又は国際公開第2015/090230号パンフレットに記載の抗体)を含む。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、上に列挙した抗体の重鎖可変領域及び/又は軽鎖可変領域を含む。
実施形態において、抗原結合ドメインは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2015/142675号パンフレット、米国特許出願公開第2015-0283178-A1号明細書、2016-0046724-A1号明細書、米国特許出願公開第2014/0322212A1号明細書、米国特許出願公開第2016/0068601A1号明細書、米国特許出願公開第2016/0051651A1号明細書、米国特許出願公開第2016/0096892A1号明細書、米国特許出願公開第2014/0322275A1号明細書又は国際公開第2015/090230号パンフレットに記載の抗原結合ドメインである。
実施形態において、抗原結合ドメインはBCMAを標的とし、米国特許出願公開第2016-0046724-A1号明細書に記載されている。実施形態において、抗原結合ドメインはCD19を標的とし、米国特許出願公開第2015-0283178-A1号明細書に記載されている。実施形態において、抗原結合ドメインはCD123を標的とし、米国特許出願公開第2014/0322212A1号明細書、米国特許出願公開第2016/0068601A1号明細書に記載されている。実施形態において、抗原結合ドメインはCLL1を標的とし、米国特許出願公開第2016/0051651A1号明細書に記載されている。実施形態において、抗原結合ドメインはCD33を標的とし、米国特許出願公開第2016/0096892A1号明細書に記載されている。
CAR発現細胞を使用して標的とすることができる例示的な標的抗原には、例えば、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第2014/153270号パンフレット、国際公開第2014/130635号パンフレット、国際公開第2016/028896号パンフレット、国際公開第2014/130657号パンフレット、国際公開第2016/014576号パンフレット、国際公開第2015/090230号パンフレット、国際公開第2016/014565号パンフレット、国際公開第2016/014535号パンフレット及び国際公開第2016/025880号パンフレットに記載されるように、とりわけ、CD19、CD123、EGFRvIII、CD33、メソテリン、BCMA及びGFR ALPHA-4が含まれるが、これらに限定されるものではない。
他の実施形態において、CAR発現細胞は、GFR ALPHA-4に特異的に結合することができ、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2016/025880号パンフレットの表2に記載のCAR分子又は抗原結合ドメインを含み得る。GFR ALPHA-4 CAR分子及び抗原結合ドメインをコードするアミノ酸及びヌクレオチド配列(例えば、1つ、2つ、3つのVH CDR及びKabat又はChothiaによる1つ、2つ、3つのVL CDRを含む)は、国際公開第2016/025880号パンフレットで特定されている。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるCAR分子のいずれかの抗原結合ドメイン(例えば、CD19、CD123、EGFRvIII、CD33、メソテリン、BCMA及びGFR ALPHA-4)は、上に挙げた抗体由来の1つ、2つ、3つ(例えば、全3つの)重鎖CDR、HC CDR1、HC CDR2及びHC CDR3及び/又は上に挙げた抗原結合ドメイン由来の1つ、2つ、3つ(例えば、全3つの)軽鎖CDR、LC CDR1、LC CDR2及びLC CDR3を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、上に列挙若しくは記載した抗体の重鎖可変領域及び/又は可変軽鎖領域を含む。
一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、上に挙げた抗体由来の1つ、2つ、3つ(例えば、全3つの)重鎖CDR、HC CDR1、HC CDR2及びHC CDR3及び/又は上に挙げた抗原結合ドメイン由来の1つ、2つ、3つ(例えば、全3つの)軽鎖CDR、LC CDR1、LC CDR2及びLC CDR3を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、上に列挙若しくは記載した抗体の重鎖可変領域及び/又は可変軽鎖領域を含む。
一部の実施形態において、腫瘍抗原は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる2015年3月13日出願の国際公開第2015/142675号パンフレットに記載の腫瘍抗原である。一部の実施形態において、腫瘍抗原は、CD19;CD123;CD22;CD30;CD171;CS-1(CD2サブセット1、CRACC、SLAMF7、CD319、19A24とも称される);C型レクチン様分子1(CLL-1又はCLECL1);CD33;上皮増殖因子受容体変異体III(EGFRvIII);ガングリオシドG2(GD2);ガングリオシドGD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer);TNF受容体ファミリーメンバーB細胞成熟(BCMA);Tn抗原((Tn Ag)又は(GalNAcα-Ser/Thr));前立腺特異的膜抗原(PSMA);受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1);Fms様チロシンキナーゼ3(FLT3);腫瘍関連糖タンパク質72(TAG72);CD38;CD44v6;癌胎児性抗原(CEA);上皮細胞接着分子(EPCAM);B7H3(CD276);KIT(CD117);インターロイキン13受容体サブユニットα2(IL-13Ra2又はCD213A2);メソテリン;インターロイキン11受容体α(IL-11Ra);前立腺幹細胞抗原(PSCA);プロテアーゼセリン21(テスティシン又はPRSS21);血管内皮増殖因子受容体2(VEGFR2);ルイス(Y)抗原;CD24;血小板由来増殖因子受容体β(PDGFR-β);ステージ特異的胚性抗原-4(SSEA-4);CD20;葉酸受容体α;受容体チロシンタンパク質キナーゼERBB2(Her2/neu);ムチン1、細胞表面関連(MUC1);上皮増殖因子受容体(EGFR);神経細胞接着分子(NCAM);プロテアーゼ;前立腺酸性ホスファターゼ(PAP);伸長因子2変異体(ELF2M);エフリンB2;線維芽細胞活性化タンパク質α(FAP);インスリン様増殖因子1受容体(IGF-I受容体)、炭酸脱水酵素IX(CAIX);プロテアソーム(プロソーム、マクロペイン)サブユニット、βタイプ、9(LMP2);糖タンパク質100(gp100);切断点クラスター領域(BCR)及びアベルソンマウス白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ1(Abl)(bcr-abl);チロシナーゼ;エフリンA型受容体2(EphA2);フコシルGM1;シアリルルイス接着分子(sLe);ガングリオシドGM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer);トランスグルタミナーゼ5(TGS5);高分子量黒色腫関連抗原(HMWMAA);o-アセチル-GD2ガングリオシド(OAcGD2);葉酸受容体β;腫瘍内皮マーカー1(TEM1/CD248);腫瘍内皮マーカー7関連(TEM7R);クローディン6(CLDN6);甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR);Gタンパク質共役受容体クラスCグループ5、メンバーD(GPRC5D);染色体Xオープンリーディングフレーム61(CXORF61);CD97;CD179a;未分化リンパ腫キナーゼ(ALK);ポリシアル酸;胎盤特異的1(PLAC1);globoHグリコセラミド(GloboH)の六糖部分;乳腺分化抗原(NY-BR-1);ウロプラキン2(UPK2);A型肝炎ウイルス細胞受容体1(HAVCR1);アドレナリン受容体β3(ADRB3);パネキシン3(PANX3);Gタンパク質共役受容体20(GPR20);リンパ球抗原6複合体、遺伝子座K9(LY6K);嗅覚受容体51E2(OR51E2);TCRγ代替オープンリーディングフレームタンパク質(TARP);ウィルムス腫瘍タンパク質(WT1);癌/精巣抗原1(NY-ESO-1);癌/精巣抗原2(LAGE-1a);黒色腫関連抗原1(MAGE-A1);染色体12p上に位置するETS転座変異体遺伝子6(ETV6-AML);精子タンパク質17(SPA17);X抗原ファミリー、メンバー1A(XAGE1);アンジオポエチン結合細胞表面受容体2(Tie2);黒色腫癌精巣抗原-1(MAD-CT-1);黒色腫癌精巣抗原-2(MAD-CT-2);Fos関連抗原1;腫瘍タンパク質p53(p53);p53変異体;プロステイン(prostein);生存;テロメラーゼ;前立腺癌腫瘍抗原-1(PCTA-1又はガレクチン8)、T細胞によって認識される黒色腫抗原1(MelanA又はMART1);ラット肉腫(Ras)変異体;ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT);肉腫転座切断点;黒色腫由来アポトーシス阻害剤(ML-IAP);ERG(膜貫通型プロテーゼ、セリン2(TMPRSS2)ETS融合遺伝子);N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼV(NA17);ペアードボックスタンパク質Pax-3(PAX3);アンドロゲン受容体;サイクリンB1;v-mycトリ骨髄球症ウイルス癌遺伝子神経芽腫由来ホモログ(MYCN);RasホモログファミリーメンバーC(RhoC);チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP-2);チトクロムP450 1B1(CYP1B1);CCCTC結合因子(ジンクフィンガータンパク質)様(BORIS、即ちBrother of the Regulator of Imprinted Sites);T細胞により認識される扁平上皮癌抗原3(SART3);ペアードボックスタンパク質Pax-5(PAX5);プロアクロシン結合タンパク質sp32(OY-TES1);リンパ球特異的プロテインチロシンキナーゼ(LCK);Aキナーゼアンカータンパク質4(AKAP-4);滑膜肉腫、X染色体切断点2(SSX2);終末糖化産物受容体(RAGE-1);腎ユビキタス1(RU1);腎ユビキタス2(RU2);レグマイン;ヒトパピローマウイルスE6(HPV E6);ヒトパピローマウイルスE7(HPV E7);腸カルボキシルエステラーゼ;熱ショックタンパク質70-2変異体(mut hsp70-2);CD79a;CD79b;CD72;白血球関連免疫グロブリン様受容体1(LAIR1);IgA受容体のFcフラグメント(FCAR又はCD89);白血球関連免疫グロブリン様受容体サブファミリーAメンバー2(LILRA2);CD300分子様ファミリーメンバーf(CD300LF);C型レクチンドメインファミリー12メンバーA(CLEC12A);骨髄間質細胞抗原2(BST2);EGF様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様2(EMR2);リンパ球抗原75(LY75);グリピカン3(GPC3);Fc受容体様5(FCRL5);並びに免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド1(IGLL1)の1つ以上から選択される。
一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、上に列挙した抗体からの1つ、2つ、3つ(例えば、3つ全て)の重鎖CDR、HC CDR1、HC CDR2及びHC CDR3並びに/又は上に列挙した抗体からの1つ、2つ、3つ(例えば、3つ全て)の軽鎖CDR、LC CDR1、LC CDR2及びLC CDR3を含む。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、上に列挙又は記載した抗体の重鎖可変領域及び/又は軽鎖可変領域を含む。
一部の実施形態において、抗腫瘍抗原結合ドメインは、フラグメント、例えば、単鎖可変フラグメント(scFv)である。一部の実施形態において、本明細書に記載されるような抗癌関連抗原結合ドメインは、Fv、Fab、(Fab’)2又は二機能性(例えば、二特異性)ハイブリッド抗体(例えば、Lanzavecchia et al.,Eur.J.Immunol.17,105(1987))である。一部の実施形態において、本発明の抗体及びそのフラグメントは、野生型又は増強した親和性で本明細書に記載されるような癌関連抗原に結合する。
ある例において、scFvsは、当技術分野で公知の方法により製造できる(例えば、Bird et al.,(1988)Science 242:423-426及びHuston et al.,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883を参照されたい)。ScFv分子は、可動性ポリペプチドリンカーを使用して、VH領域とVL領域を一緒に連結することにより産生できる。scFv分子は、最適長及び/又はアミノ酸組成を有するリンカー(例えば、Ser-Glyリンカー)を含む。リンカー長は、scFvの可変領域がどのように折りたたまれ、相互作用するかに大きく影響し得る。実際、短ポリペプチドリンカーを用いる場合、(例えば、5~10アミノ酸)、鎖内折りたたみは阻止される。鎖内折りたたみは、2可変領域が一体となって機能的エピトープ結合部位を形成させるためにも必要である。リンカー方向及びサイズの例は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Hollinger et al.1993 Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.90:6444-6448、米国特許出願公開第2005/0100543号、同第2005/0175606号、同第2007/0014794号明細書及び国際公開第2006/020258号パンフレット及び国際公開第2007/024715号パンフレットを参照されたい。
scFvは、そのVL領域とVH領域との間に少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50又はそれを超えるアミノ酸残基のリンカーを含み得る。リンカー配列は、あらゆる天然に存在するアミノ酸を含み得る。一実施形態において、リンカー配列は、アミノ酸グリシン及びセリンを含む。一部の実施形態において、リンカー配列は、(Gly4Ser)n(ここで、nは1つ以上の正の整数である)など、一連のグリシン及びセリン反復を含む(配列番号25)。一部の実施形態において、リンカーは(Gly4Ser)4(配列番号27)又は(Gly4Ser)3(配列番号28)であり得る。リンカー長の変動は、活性を維持又は増強し、活性試験において優れた有効性を生じ得る。
一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、T細胞受容体(「TCR」)又はそのフラグメント、例えば単鎖TCR(scTCR)である。そのようなTCRを作製する方法は当技術分野で公知である。例えば、illemsen RA et al,Gene Therapy 7:1369-1377(2000);Zhang T et al,Cancer Gene Ther 11:487-496(2004);Aggen et al,Gene Ther.19(4):365-74(2012)(参考文献はその全体が本明細書に組み込まれる)を参照されたい。例えば、リンカー(例えば、柔軟なペプチド)によって連結されたT細胞クローン由来のVα及びVβ遺伝子を含むscTCRを操作することができる。このアプローチは、それ自体が細胞内にある癌関連標的にとって非常に有用であるが、そのような抗原(ペプチド)のフラグメントは、MHCによって癌細胞の表面に提示される。
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインに関して、種々の実施形態において、CARは、CARの細胞外ドメインに結合する膜貫通ドメインを含むように設計できる。膜貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接した1つ以上のさらなるアミノ酸、例えば膜貫通が由来するタンパク質の細胞外領域と関係する1つ以上のアミノ酸(例えば、細胞外領域の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10~最大で15のアミノ酸)及び/又は膜貫通タンパク質が由来するタンパク質の細胞内領域と関係する1つ以上のアミノ酸(例えば、細胞内領域の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10~最大で15のアミノ酸)を含み得る。一部の実施形態において、膜貫通ドメインは、CARの他のドメインの1つに関連して使用されるものである。ある例において、膜貫通ドメインは、このようなドメインが、同一又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインと結合するのを避けるように、例えば受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化するように選択され又はアミノ酸置換による改変ができる。一部の実施形態において、膜貫通ドメインは、CAR発現細胞、例えばCART細胞表面上の別のCARとホモ二量体化できる。一部の実施形態において、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、同じCAR発現細胞、例えばCARTに存在する天然結合パートナーの結合ドメインとの相互作用を最小化するように改変又は置換され得る。
膜貫通ドメインに関して、種々の実施形態において、CARは、CARの細胞外ドメインに結合する膜貫通ドメインを含むように設計できる。膜貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接した1つ以上のさらなるアミノ酸、例えば膜貫通が由来するタンパク質の細胞外領域と関係する1つ以上のアミノ酸(例えば、細胞外領域の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10~最大で15のアミノ酸)及び/又は膜貫通タンパク質が由来するタンパク質の細胞内領域と関係する1つ以上のアミノ酸(例えば、細胞内領域の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10~最大で15のアミノ酸)を含み得る。一部の実施形態において、膜貫通ドメインは、CARの他のドメインの1つに関連して使用されるものである。ある例において、膜貫通ドメインは、このようなドメインが、同一又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインと結合するのを避けるように、例えば受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化するように選択され又はアミノ酸置換による改変ができる。一部の実施形態において、膜貫通ドメインは、CAR発現細胞、例えばCART細胞表面上の別のCARとホモ二量体化できる。一部の実施形態において、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、同じCAR発現細胞、例えばCARTに存在する天然結合パートナーの結合ドメインとの相互作用を最小化するように改変又は置換され得る。
膜貫通ドメインは、天然由来又は組換え源由来であり得る。源が天然であるとき、ドメインは、あらゆる膜結合又は膜貫通タンパク質由来であり得る。一部の実施形態において、膜貫通ドメインは、CARが標的に結合したときは常に細胞内ドメインにシグナル伝達できる。本発明において特に有用な膜貫通ドメインは、例えば、T細胞受容体のα、β又はζ鎖、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8(例えば、CD8α、CD8β)、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154の少なくとも膜貫通領域を含み得る。一部の実施形態において、膜貫通ドメインは、少なくとも、共刺激分子、例えばMHCクラスI分子、TNF受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子(SLAMタンパク質)、活性化NK細胞受容体、BTLA、Tollリガンド受容体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1 (CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a及びCD83と特異的に結合するリガンドの膜貫通領域を含み得る。
一部の事例において、膜貫通ドメインは、ヒンジ、例えばヒトタンパク質からのヒンジを介して、CARの細胞外領域、例えばCARの抗原結合ドメインに結合することができる。例えば、一部の実施形態において、ヒンジは、ヒトIg(免疫グロブリン)ヒンジ、例えばIgG4ヒンジ又はCD8aヒンジであり得る。一部の実施形態において、ヒンジ又はスペーサーは、配列番号2のアミノ酸配列を含む(例えば、これから構成される)。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号6の膜貫通ドメインを含む(例えば、これから構成される)。
一部の実施形態において、ヒンジ又はスペーサーは、IgG4ヒンジを含む。例えば、一部の実施形態において、ヒンジ又はスペーサーは、配列番号3のヒンジを含む。一部の実施形態において、ヒンジ又はスペーサーは、配列番号14のヌクレオチド配列によってコードされるヒンジを含む。
一部の実施形態において、ヒンジ又はスペーサーは、IgDヒンジを含む。例えば、一部の実施形態において、ヒンジ又はスペーサーは、配列番号4のアミノ酸配列のヒンジを含む。一部の実施形態において、ヒンジ又はスペーサーは、配列番号15のヌクレオチド配列によってコードされるヒンジを含む。
一部の実施形態において、膜貫通ドメインは組換えであり得、その場合、ロイシン及びバリンなどの疎水性残基を優勢に含む。一部の実施形態において、フェニルアラニン、トリプトファン及びバリンのトリプレットを、組換え膜貫通ドメインの各末端に見ることができる。
任意選択により、2~10アミノ酸長の短オリゴ又はポリペプチドリンカーが、CARの膜貫通ドメインと細胞質領域との間に結合を形成し得る。グリシン-セリンダブレットは特に適当なリンカーを提供する。例えば、一部の実施形態において、リンカーは、配列番号5のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、リンカーは、配列番号16のヌクレオチド配列によりコードされる。
一部の実施形態において、ヒンジ又はスペーサーは、KIR2DS2ヒンジを含む。
細胞質ドメイン
本発明のCARの細胞質ドメイン又は領域は、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、一般的に、CARが導入されている免疫細胞の正常エフェクター機能の少なくとも1つの活性化を担う。
本発明のCARの細胞質ドメイン又は領域は、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、一般的に、CARが導入されている免疫細胞の正常エフェクター機能の少なくとも1つの活性化を担う。
本発明のCARにおいて使用する細胞内シグナル伝達ドメインの例は、T細胞受容体(TCR)及び抗原受容体結合後にシグナル伝達を開始するために協調して機能する共受容体の細胞質配列並びにこれらのあらゆる誘導体又はバリアント及び同じ機能的能力を有するあらゆる組換え配列を含む。
TCR単独により産生されたシグナルはT細胞の完全活性化には不十分であり、二次及び/又は共刺激シグナルも必要であることが知られている。そのため、T細胞活性化は、2つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列が介在するということができる:TCR(初代細胞内シグナル伝達ドメイン)を介して抗原依存性一次活性化を開始するもの及び二次又は共刺激シグナル(二次細胞質ドメイン、例えば共刺激ドメイン)を提供するように抗原非依存的方法で作用するもの。
一次シグナル伝達ドメインは、TCR複合体の一次活性化を刺激性方向又は阻害性方向のいずれかで制御する。刺激性方向で作用する初代細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ又はITAMとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。
本発明において特に有用であるITAM含有初代細胞内シグナル伝達ドメインの例は、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(「ICOS」としても知られる)、FcεRI、DAP10、DAP12及びCD66dのものを含む。一部の実施形態において、本発明のCARは、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えばCD3ζの一次シグナル伝達ドメインを含む。
一部の実施形態において、一次シグナル伝達ドメインは、天然ITAMドメインと比較して改変された(例えば、増加又は減少した)活性を有する、修飾ITAMドメイン、例えば変異ITAMドメインを含む。一部の実施形態において、一次シグナル伝達ドメインは、修飾ITAM含有初代細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば最適化及び/又は切断されたITAM含有初代細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態において、一次シグナル伝達ドメインは、1つ、2つ、3つ、4つ又はそれを超えるITAMモチーフを含む。
本発明で特に有用な一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む分子のさらに別の例としては、DAP10、DAP12及びCD32の分子が挙げられる。
CARの細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン、例えばCD3-ζシグナル伝達ドメインをそれ自体で含み得るか、又は本発明のCARに関連して有用ないずれか他の所望の細胞内シグナル伝達ドメインと組み合わされ得る。例えば、CARの細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン、例えばCD3ζ鎖部分並びに共刺激分子伝達ドメインを含み得る。共刺激分子シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを含むCARの一部を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要な抗原受容体又はそのリガンド以外の細胞表面分子である。こうした分子の例として、MHCクラスI分子、TNF受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子(SLAMタンパク質)、活性化NK細胞受容体、BTLA、Tollリガンド受容体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a及びCD83と特異的に結合するリガンドなどを含む。例えば、CD27共刺激は、インビトロでヒトCART細胞の拡大、エフェクター機能及び生存を増大し、ヒトT細胞持続性及び抗腫瘍活性をインビボで高めることが実証されている(Song et al.Blood.2012;119(3):696-706)。本発明のCARの細胞質部分内の細胞内シグナル伝達配列を、ランダムに又は指定された順序で互いに連結させることもできる。任意選択で、2~10アミノ酸(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10アミノ酸)長の短いオリゴ又はポリペプチドリンカーは、細胞内シグナル伝達配列同士の連結を形成し得る。一部の実施形態では、グリシン-セリンダブレットを好適なリンカーとして使用することができる。一部の実施形態では、単一アミノ酸、例えばアラニン、グリシンを好適なリンカーとして使用することができる。
一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、2つ以上、例えば2、3、4、5つ又はそれを超える共刺激シグナル伝達ドメインを含むように設計される。一部の実施形態では、2つ以上、例えば2、3、4、5つ又はそれを超える共刺激シグナル伝達ドメインは、リンカー分子、例えば本明細書に記載のリンカー分子によって隔てられている。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、2つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、リンカー分子は、グリシン残基である。一部の実施形態では、リンカーは、アラニン残基である。
一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ζのシグナル伝達ドメインとCD28のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ζのシグナル伝達ドメインと4-1BBのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。一部の実施形態では、4-1BBのシグナル伝達ドメインは、配列番号7のシグナル伝達ドメインである。一部の実施形態では、CD3ζのシグナル伝達ドメインは、配列番号9(突然変異型CD3ζ)又は配列番号10(野生型ヒトCD3ζ)のシグナル伝達ドメインである。
一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ζのシグナル伝達ドメインとCD27のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。一部の実施形態では、CD27のシグナル伝達ドメインは、配列番号8のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、CD27のシグナル伝達ドメインは、配列番号19の核酸配列によってコードされる。
一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ζのシグナル伝達ドメインとCD28のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。一部の実施形態では、CD28のシグナル伝達ドメインは、配列番号36のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、CD28のシグナル伝達ドメインは、配列番号37の核酸配列によってコードされる。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ζのシグナル伝達ドメインとICOSのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。一部の実施形態では、ICOSのシグナル伝達ドメインは、配列番号38のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ICOSのシグナル伝達ドメインは、配列番号39の核酸配列によってコードされる。
CARと他の分子又は薬剤との共発現
第2のCARの共発現
一部の実施形態において、本明細書に記載のCAR発現細胞は、第2のCAR、例えば同じ標的(例えば、CD19)又は異なる標的(例えば、CD19以外の標的、例えば、本明細書に記載の標的)に対する、例えば第2のCARの異なる抗原結合ドメインをさらに含み得る。
第2のCARの共発現
一部の実施形態において、本明細書に記載のCAR発現細胞は、第2のCAR、例えば同じ標的(例えば、CD19)又は異なる標的(例えば、CD19以外の標的、例えば、本明細書に記載の標的)に対する、例えば第2のCARの異なる抗原結合ドメインをさらに含み得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載のCAR発現細胞、例えば、本明細書に記載の方法を用いて作製されるCAR発現細胞は、(i)BCMAに結合する第1のCARをコードする第1核酸分子及び(ii)CD19に結合する第2のCARをコードする第2の核酸分子を含む。一部の実施形態では、第1のCARは、抗BCMA結合ドメイン、第1膜貫通ドメイン及び第1細胞内シグナル伝達ドメインを含み、抗BCMA結合ドメインは、重鎖相補性決定領域1(HC CDR1)、重鎖相補性決定領域2(HC CDR2)及び重鎖相補性決定領域3(HC CDR3)を含む重鎖可変領域(VH)と、軽鎖相補性決定領域1(LC CDR1)、軽鎖相補性決定領域2(LC CDR2)及び軽鎖相補性決定領域3(LC CDR3)を含む軽鎖可変領域(VL)とを含み、HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2及びLC CDR3は、それぞれ配列番号86、87、88、95、96及び97のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第2のCARは、抗CD19結合ドメイン、第2膜貫通ドメイン及び第2の細胞内シグナル伝達ドメインを含み、抗CD19結合ドメインは、HC CDR1、HC CDR2及びHC CDR3を含むVHと、LC CDR1、LC CDR2及びLC CDR3を含むVLとを含み、HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2及びLC CDR3は、それぞれ配列番号295、304及び297~300のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、(i)抗BCMA結合ドメインのVH及びVLは、それぞれ配列番号93及び102のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗CD19結合ドメインのVH及びVLは、それぞれ配列番号250及び251のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗BCMA結合ドメインは、配列番号105のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗CD19結合ドメインは、配列番号293のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第1のCARは、配列番号107のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第2のCARは、配列番号225のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載のCAR発現細胞、例えば、本明細書に記載の方法を用いて製造されたCAR発現細胞は、(i)CD22に結合する第1のCARをコードする第1の核酸分子及び(ii)CD19に結合する第2のCARをコードする第2の核酸分子を含む。一部の実施形態では、CD22CARは、CD22抗原結合ドメイン並びに第1膜貫通ドメイン;第1共刺激シグナル伝達ドメイン;及び/又は第1一次シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、CD19CARは、CD19抗原結合ドメイン並びに第2膜貫通ドメイン;第2共刺激シグナル伝達ドメイン;及び/又は第2一次シグナル伝達ドメインを含む。
一部の実施形態では、CD22抗原結合ドメインは、本明細書、例えば、表16、17、30、31若しくは32に記載のCD22結合ドメインの1つ以上(例えば、3つ全て)の軽鎖相補性決定領域1(LC CDR1)、軽鎖相補性決定領域2(LC CDR2)及び軽鎖相補性決定領域3(LC CDR3);並びに/又は本明細書、例えば、表16、17、30、31若しくは32に記載のCD22結合ドメインの1つ以上(例えば、3つ全て)の重鎖相補性決定領域1(HC CDR1)、重鎖相補性決定領域2(HC CDR2)及び重鎖相補性決定領域3(HC CDR3)を含む。一実施形態において、CD22抗原結合ドメインは、本明細書、例えば、表16、17、30、31若しくは33に記載のCD22結合ドメインのLC CDR1、LC CDR2及びLC CDR3;並びに/又は本明細書、例えば、表16、17、30、31若しくは33に記載のCD22結合ドメインのHC CDR1、HC CDR2及びHC CDR3を含む。一部の実施形態では、CD19抗原結合ドメインは、本明細書、例えば、表2、30、31若しくは32に記載のCD19結合ドメインの1つ以上(例えば、3つ全て)のLC CDR1、LC CDR2及びLC CDR3;並びに/又は本明細書、例えば、表2、30、31及び32に記載のCD19結合ドメインの1つ以上(例えば、3つ全て)のHC CDR1、HC CDR2及びHC CDR3を含む。一部の実施形態では、CD19抗原結合ドメインは、本明細書、例えば、表2、30、31及び32に記載のCD19結合ドメインのLC CDR1、LC CDR2及びLC CDR3;並びに/又は本明細書、例えば、表2、30、31及び32に記載のCD19結合ドメインのHC CDR1、HC CDR2及びHC CDR3を含む。
一部の実施形態では、CD22抗原結合ドメイン(例えば、scFv)は、本明細書、例えば、表30若しくは32に記載のCD22結合ドメインの軽鎖可変(VL)領域;及び/又は本明細書、例えば表30若しくは32に記載のCD22結合ドメインの重鎖可変(VH)領域を含む。一部の実施形態では、CD22抗原結合ドメインは、表30又は32に提供されるCD22 VL領域配列の少なくとも1つ、2つ若しくは3つの修飾(例えば、置換)、但し30、20又は10以下の修飾(例えば、置換)を有するアミノ酸配列を含むVL領域を含む。一部の実施形態では、CD22抗原結合ドメインは、表30又は32に提供されるアミノ酸配列又は上記配列のいずれかに対して少なくとも約80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%若しくは99%の配列同一性を有する配列を含むVL領域を含む。一部の実施形態では、CD22抗原結合ドメインは、表30若しくは32に提供されるCD22 VH領域配列の少なくとも1つ、2つ又は3つの修飾(例えば、置換)、但し30、20又は10以下の修飾(例えば、置換)を有するアミノ酸配列を含むVH領域を含む。一部の実施形態では、CD22抗原結合ドメインは、表30若しくは32に提供されるCD22 VH領域配列のアミノ酸配列又は上記配列のいずれかに対して少なくとも約80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%若しくは99%の配列同一性を有する配列を含むVH領域を含む。一部の実施形態では、CD19抗原結合ドメイン(例えば、scFv)は、本明細書、例えば、表2、30若しくは32に記載のCD19結合ドメインのVL領域;及び/又は本明細書、例えば、表2、30若しくは32に記載のCD19結合ドメインのVH領域を含む。一部の実施形態では、CD19抗原結合ドメインは、表2、30若しくは32に提供されるCD19 VL領域配列の少なくとも1つ、2つ又は3つの修飾(例えば、置換)、但し30、20又は10以下の修飾(例えば、置換)を有するアミノ酸配列を含むVL領域を含む。一部の実施形態では、CD19抗原結合ドメインは、表2、30若しくは32に提供されるCD19 VL領域配列のアミノ酸配列又は上記配列のいずれかに対して少なくとも約80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%若しくは99%の配列同一性を有する配列を含むVL領域を含む。一部の実施形態では、CD19抗原結合ドメインは、表2、30若しくは32に提供されるCD19 VH領域配列の少なくとも1つ、2つ又は3つの修飾(例えば、置換)、但し30、20又は10以下の修飾(例えば、置換)を有するアミノ酸配列を含むVH領域を含む。一部の実施形態では、CD19抗原結合ドメインは、表2、30若しくは32に提供されるCD19 VH領域配列のアミノ酸配列又は上記配列のいずれかに対して少なくとも約80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%若しくは99%の配列同一性を有する配列を含むVH領域を含む。
一部の実施形態では、CD22抗原結合は、表30又は32に提供されるCD22scFv配列の少なくとも1つ、2つ又は3つの修飾(例えば、置換)、但し30、20又は10以下の修飾(例えば、置換)を有するアミノ酸配列を含むscFvを含む。一部の実施形態では、CD22抗原結合は、表30若しくは32に提供されるCD22scFv配列のアミノ酸配列又は上記配列のいずれかに対して少なくとも約80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%若しくは99%の配列同一性を有する配列を含むscFvを含む。一部の実施形態では、CD19抗原結合ドメインは、表2、30若しくは32に提供されるCD19 scFv配列の少なくとも1つ、2つ又は3つの修飾(例えば、置換)、但し30、20又は10以下の修飾(例えば、置換)を有するアミノ酸配列を含むscFvを含む。一部の実施形態では、CD19抗原結合ドメインは、表2、30若しくは32に提供されるCD19 scFv配列のアミノ酸配列又は上記配列のいずれかに対して少なくとも約80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%若しくは99%の配列同一性を有する配列を含むscFvを含む。
一部の実施形態では、CD22 CAR分子及び/又はCD19CAR分子は、表33に提供されるアミノ酸配列又は上記配列のいずれかに対して少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%若しくは99%の配列同一性を有する配列を含む、追加の成分、例えば、シグナルペプチド、ヒンジ、膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン及び/又は第1一次シグナル伝達ドメイン、P2A部位及び/又はリンカーを含むか;又は表33に提供されるヌクレオチド配列又は上記配列のいずれかに対して少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%若しくは99%の配列同一性を有する配列によってコードされる。
CAR分子の例示的なヌクレオチド及びアミノ酸配列、例えば、(i)CD22に結合する第1のCAR及び(ii)本明細書に開示されるCD19に結合する第2のCARを含むデュアルCAR分子を表30に提供する。
本開示のデュアルCARのCD22及びCD19CDR(例えば、(i)CD22に結合する第1のCAR及び(ii)CD19に結合する第2のCARを含むデュアルCAR分子)を表31に記載する。
表32は、本明細書に開示されるデュアルCAR又はタンデムCAR、例えば、(i)CD22に結合する第1のCAR及び(ii)CD19に結合する第2のCARを含むデュアルCAR又はタンデムCARのCD19及びCD22結合ドメインについてのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。
表33は、CAR分子、例えば、本明細書に記載のデュアルCAR分子(例えば、(i)CD22に結合する第1のCARと、(ii)CD19に結合する第2のCARを含むデュアルCAR分子)に使用することができる追加のCAR成分、例えば、シグナルペプチド、リンカー及びP2A部位についてのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。
一部の実施形態において、CAR発現細胞は、第1の抗原を標的とし、共刺激シグナル伝達ドメインを有するが、一次シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第1のCAR及び第2の、異なる、抗原を標的とし、一次シグナル伝達ドメインを有するが、共刺激シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第2のCARを含む。第1のCARへの共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば4-1BB、CD28、CD27、OX-40又はICOS及び一次シグナル伝達ドメイン、例えばCD3ζの第2のCARへの配置は、両標的が発現される細胞に対してCAR活性を制限する。一部の実施形態において、CAR発現細胞は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び共刺激ドメインを含む第1のCAR及び他の抗原を標的とし、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第2のCARを含む。一部の実施形態において、CAR発現細胞は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第1のCAR及び他の抗原を標的とし、抗原に対する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び共刺激シグナル伝達ドメインを含む第2のCARを含む。
一部の実施形態において、CAR発現細胞は、本明細書に記載のXCAR及び阻害性CARを含む。一部の実施形態において、阻害性CARは、正常細胞、例えばXも発現する正常細胞で見られるが、癌細胞で見られない抗原と結合する抗原結合ドメインを含む。一部の実施形態において、阻害性CARは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び阻害分子の細胞内ドメインを含む。例えば、阻害性CARの細胞内ドメインは、PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3及び/又はCEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14又はCD270)、KIR、A2aR、MHCクラスI、MHCクラスII、GAL9、アデノシン及びTGF(例えば、TGFβ)の細胞内ドメインであり得る。
一部の実施形態において、CAR発現細胞が2以上の異なるCARを含むとき、異なるCARの抗原結合ドメインは、抗原結合ドメインが互いに相互作用しないようなものである。例えば、第1及び第2のCARを発現する細胞は、第2のCARの抗原結合ドメイン、例えばVHHである第2のCARの抗原結合ドメインと結合を形成しない、例えばフラグメント、例えばscFvとしての第1のCARの抗原結合ドメインを有し得る。
一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、単一ドメイン抗原結合(SDAB)分子を含み、相補的決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である分子を含む。例は、重鎖可変ドメイン、軽鎖を天然に欠く結合分子、慣用の4鎖抗体由来の単一ドメイン、操作されたドメイン及び抗体由来のもの以外の単一ドメインスキャフォールドを含むが、これらに限定されない。SDAB分子は、当技術分野の又は将来的な単一ドメイン分子であり得る。SDAB分子は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤツメウナギ、魚類、サメ、ヤギ、ウサギ及びウシを含むが、これらに限定されない任意の種由来であり得る。この用語は、ラクダ科(Camelidae)及びサメ以外の種由来の天然に存在する単一ドメイン抗体分子も含む。
一部の実施形態において、SDAB分子は、例えば、サメの血清に見られる新規抗原受容体(NAR)として知られる免疫グロブリンアイソタイプ由来であるような、魚類で見られる免疫グロブリンの可変領域に由来し得る。NAR(「IgNAR」)の可変領域由来の単一ドメイン分子を製造する方法は、国際公開第03/014161号パンフレット及びStreltsov(2005)Protein Sci.14:2901-2909に記載されている。
一部の実施形態において、SDAB分子は、軽鎖を欠く重鎖として知られる天然に存在する単一ドメイン抗原結合分子である。このような単一ドメイン分子は、例えば、国際公開第9404678号パンフレット及びHamers-Casterman,C.et al.(1993)Nature 363:446-448に記載されている。明確化するために、天然に軽鎖を欠く重鎖分子由来のこの可変ドメインは、ここでは、4鎖免疫グロブリンの慣用のVHと区別するためにVHH又はナノボディとして知られている。このようなVHH分子は、ラクダ科(Camelidae)種、例えばラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカ及びグアナコ由来であり得る。ラクダ科(Camelidae)以外の他の種は、天然に軽鎖を欠く重鎖分子を産生し得、このようなVHHは、本発明の範囲内である。
SDAB分子は、組換え、CDR移植、ヒト化、ラクダ化、脱免疫化及び/又はインビトロ産生され得る(例えば、ファージディスプレイにより選択)。
受容体の抗原結合ドメイン間を相互作用する抗原結合ドメインを含む複数のキメラ膜包埋受容体を有する細胞は、例えば、抗原結合ドメインの1つ以上がその同族抗原に結合することを阻止するため、望ましくない可能性があることも判明した。従って、本明細書に開示されるのは、このような相互作用を最小化する、抗原結合ドメインを含む第1及び第2の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体を有する細胞である。また、本明細書に開示されるのは、このような相互作用を最小化する抗原結合ドメインを含む第1及び第2の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体をコードする核酸並びにこのような細胞及び核酸を製造及び使用する方法である。一部の実施形態において、第1及び第2の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体の抗原結合ドメインの一方は、scFvを含み、他方は、単一VHドメイン、例えばラクダ科、サメ若しくはヤツメウナギ単一VHドメイン又はヒト若しくはマウス配列由来の単一VHドメインを含む。
一部の実施形態において、本明細書における組成物は、第1及び第2のCARを含み、ここで、第1及び第2のCARの一方の抗原結合ドメインは、可変軽ドメイン及び可変重ドメインを含まない。一実施形態において、第1及び第2のCARの一方の抗原結合ドメインは、scFvであり、他方は、scFvではない。一実施形態において、第1及び第2のCARの一方の抗原結合ドメインは、単一VHドメイン、例えばラクダ科、サメ若しくはヤツメウナギ単一VHドメイン又はヒト若しくはマウス配列由来の単一VHドメインを含む。一実施形態において、第1及び第2のCARの一方の抗原結合ドメインは、ナノボディを含む。一実施形態において、第1及び第2のCARの一方の抗原結合ドメインは、ラクダ科VHHドメインを含む。
一実施形態において、第1及び第2のCARの一方の抗原結合ドメインは、scFvを含み、他方は、単一VHドメイン、例えばラクダ科、サメ若しくはヤツメウナギ単一VHドメイン又はヒト若しくはマウス配列由来の単一VHドメインを含む。一実施形態において、第1及び第2のCARの一方の抗原結合ドメインは、scFvを含み、他方は、ナノボディを含む。一実施形態において、第1及び第2のCARの一方の抗原結合ドメインは、scFvを含み、他方は、ラクダ科VHHドメインを含む。
一実施形態において、細胞の表面上に存在するとき、第1のCARの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合は、第2のCARの存在により実質的に低減されない。一実施形態において、第2のCARの存在下の第1のCARの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合は、第2のCARの非存在下の第1のCARの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合の少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%、例えば85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%である。
一実施形態において、細胞の表面上に存在するとき、第1及び第2のCARの抗原結合ドメインは、両方がscFv抗原結合ドメインである場合より少なく互いに結合する。一実施形態において、第1及び第2のCARの抗原結合ドメインは、両方がscFv抗原結合ドメインである場合より少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%少なく、例えば85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%少なく互いに結合する。
CAR活性を強化する薬剤の共発現
一部の実施形態において、本明細書に記載のCAR発現細胞は、別の薬剤、例えば、CAR発現細胞の活性又は適応度を増強する薬剤をさらに発現できる。
一部の実施形態において、本明細書に記載のCAR発現細胞は、別の薬剤、例えば、CAR発現細胞の活性又は適応度を増強する薬剤をさらに発現できる。
例えば、一部の実施形態において、薬剤は、T細胞機能を調節又は制御する、例えば、阻害する分子を阻害する薬剤であり得る。一部の実施形態において、T細胞機能を調節又は制御する分子は、阻害分子である。阻害分子、例えば、PD1は、一部の実施形態において、CAR発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を減少させ得る。阻害分子の例は、PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14又はCD270)、KIR、A2aR、MHCクラスI、MHCクラスII、GAL9、アデノシン又はTGFβを含む。
一部の実施形態において、例えば、本明細書に記載されるような、薬剤、例えば阻害性核酸、例えばdsRNA、例えばsiRNA若しくはshRNA;又は例えば阻害性タンパク質若しくはシステム、例えば群生性等間隔短回文反復配列(CRISPR)、転写-アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)又は亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ZFN)を使用して、CAR発現細胞においてT細胞の機能を調節又は制御する、例えば阻害する、分子の発現を阻害することができる。一部の実施形態において、薬剤は、shRNA、例えば本明細書に記載のshRNAである。一部の実施形態において、T細胞機能を調節又は制御する、例えば阻害する薬剤は、CAR発現細胞内で阻害される。例えば、T細胞機能を調節又は制御する、例えば阻害する分子の発現を阻害するdsRNA分子は、CARの成分、例えば全ての成分をコードする核酸に連結されている。
一部の実施形態において、薬剤は、例えば、PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14又はCD270)、KIR、A2aR、MHCクラスI、MHCクラスII、GAL9、アデノシン若しくはTGFβ又はこれらのいずれかのフラグメント(例えば、これらのいずれかの少なくとも細胞外ドメインの部分)などの阻害分子の第1のポリペプチド及び本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメインである第2のポリペプチド(例えば、共刺激ドメイン(例えば、本明細書に記載のような例えば41BB、CD27又はCD28)及び/又は一次シグナル伝達ドメイン(例えば、本明細書に記載のCD3ζシグナル伝達ドメインを含む)である第2のポリペプチドを含む。一部の実施形態において、薬剤は、PD1又はそのフラグメント(例えば、PD1の少なくとも細胞外ドメインの部分)の第1のポリペプチド並びに本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、本明細書に記載のCD28シグナル伝達ドメイン及び/又は本明細書に記載のCD3ζシグナル伝達ドメイン)の第2のポリペプチドを含む。PD1は、CD28、CTLA-4、ICOS及びBTLAも含む受容体のCD28ファミリーの阻害性メンバーである。PD-1は、活性化B細胞、T細胞及び骨髄細胞に発現される(Agata et al.1996 Int.Immunol 8:765-75)。PD1に対する2リガンド、PD-L1及びPD-L2は、PD1への結合によりT細胞活性化を下方制御することが示されている(Freeman et al.2000 J Exp Med 192:1027-34;Latchman et al.2001 Nat Immunol 2:261-8;Carter et al.2002 Eur J Immunol 32:634-43)。PD-L1は、ヒト癌において豊富である(Dong et al.2003 J Mol Med 81:281-7;Blank et al.2005 Cancer Immunol.Immunother 54:307-314;Konishi et al.2004 Clin Cancer Res 10:5094)。免疫抑制は、PD1とPD-L1との局所相互作用の阻害により逆転できる。
一部の実施形態において、薬剤は、阻害分子、例えばプログラム細胞死1(PD1)(本明細書ではPD1 CARと称する)の細胞外ドメイン(ECD)を含み、膜貫通ドメイン及び41BB及びCD3ζなどの細胞内シグナル伝達ドメインに融合され得る。一部の実施形態において、PD1 CARは、本明細書に記載のXCARと組み合わせで使用したとき、T細胞の残留性を改善する。一部の実施形態において、CARは、配列番号24において下線で示すPD1の細胞外ドメインを含むPD1 CARである。一部の実施形態において、PD1 CARは、配列番号24のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、PD1 CARは、配列番号22のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、薬剤は、PD1 CAR、例えば本明細書に記載のPD1 CARをコードする核酸配列を含む。一部の実施形態において、PD1 CARの核酸配列は、PD1 ECDに下線を施した配列番号23として提示される。
別の例において、一部の実施形態において、CAR発現細胞の活性を増強する薬剤は、共刺激分子又は共刺激分子リガンドであり得る。共刺激分子の例には、MHCクラスI分子、BTLA及びTollリガンド受容体並びにOX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)及び4-1BB(CD137)が含まれる。そのような共刺激分子のさらなる例は、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a及びCD83と特異的に結合するリガンド、例えば本明細書に記載されるようなものを含む。共刺激分子リガンドの例には、CD80、CD86、CD40L、ICOSL、CD70、OX40L、4-1BBL、GITRL及びLIGHTが含まれる。実施形態において、共刺激分子リガンドは、CARの共刺激分子ドメインと異なる共刺激分子のリガンドである。実施形態において、共刺激分子リガンドは、CARの共刺激分子ドメインと同一の共刺激分子のリガンドである。一部の実施形態において、共刺激分子リガンドは4-1BBLである。一部の実施形態において、共刺激リガンドは、CD80又はCD86である。一部の実施形態において、共刺激分子リガンドはCD70である。実施形態において、本明細書に記載されるCAR発現免疫エフェクター細胞は、1つ以上の追加の共刺激分子又は共刺激分子リガンドを発現するようにさらに操作され得る。
TET2shRNA
例えば、一部の実施形態では、薬剤は、例えば、(i)増殖を増強し、且つ/又は(ii)サイトカイン産生及び/又は脱顆粒の調節を介してエフェクター機能を調節することにより、CAR-T細胞機能を増強する標的の発現を阻害する薬剤であり得る。一部の実施形態では、薬剤、例えば、阻害性核酸、例えばdsRNA、例えばsiRNA若しくはshRNA;又は例えば、本明細書に記載のように、阻害性タンパク質又はシステム、例えば、クラスター化され、規則的に間隔があいた短い回文反復(CRISPR)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)又はジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ(ZFN)を用いて、CAR T細胞機能を増強する標的の発現を阻害することができる。一部の実施形態では、標的は、Tet2である。一部の実施形態では、薬剤はshRNA、例えばTet2を標的とするshRNAであり、これは、Tet2標的配列を含むセンス鎖と、センス鎖と全部又は一部が相補的なアンチセンス鎖とを含む。一部の実施形態では、shRNAは、ベクター内でコードされ;このベクターは、本明細書に開示されるCARをコードするベクターと同一であるか又は異なり得る。一部の実施形態では、shRNAをコードするベクターは、プロモーター、Tet2標的配列を含むセンス鎖、ループ、センス鎖と全部又は一部が相補的なアンチセンス鎖及び任意選択でポリTテールを含む。一部の実施形態では、プロモーターは、U6プロモーター、任意選択で、ヒトU6プロモーターである。shRNAのU6プロモーターの配列及びそれを使用する方法は、当技術分野において公知であり、例えば、Gao et al.Transcription,8(5):275-287,2017;Kunkel & Pederson,Genes & Dev 2:196-204,1988;Goomer & Kunkel Nucleic Acid Res.20:4903-4912,1992;及びMa et al Molecular Therapy-Nucleic Acids 3:e161,2014において見出され、これらは全て、本明細書に参照により組み込まれる。U6プロモーター配列の非限定的な例(TATAボックスには下線が引かれている)としては、
が挙げられる。
例えば、一部の実施形態では、薬剤は、例えば、(i)増殖を増強し、且つ/又は(ii)サイトカイン産生及び/又は脱顆粒の調節を介してエフェクター機能を調節することにより、CAR-T細胞機能を増強する標的の発現を阻害する薬剤であり得る。一部の実施形態では、薬剤、例えば、阻害性核酸、例えばdsRNA、例えばsiRNA若しくはshRNA;又は例えば、本明細書に記載のように、阻害性タンパク質又はシステム、例えば、クラスター化され、規則的に間隔があいた短い回文反復(CRISPR)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)又はジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ(ZFN)を用いて、CAR T細胞機能を増強する標的の発現を阻害することができる。一部の実施形態では、標的は、Tet2である。一部の実施形態では、薬剤はshRNA、例えばTet2を標的とするshRNAであり、これは、Tet2標的配列を含むセンス鎖と、センス鎖と全部又は一部が相補的なアンチセンス鎖とを含む。一部の実施形態では、shRNAは、ベクター内でコードされ;このベクターは、本明細書に開示されるCARをコードするベクターと同一であるか又は異なり得る。一部の実施形態では、shRNAをコードするベクターは、プロモーター、Tet2標的配列を含むセンス鎖、ループ、センス鎖と全部又は一部が相補的なアンチセンス鎖及び任意選択でポリTテールを含む。一部の実施形態では、プロモーターは、U6プロモーター、任意選択で、ヒトU6プロモーターである。shRNAのU6プロモーターの配列及びそれを使用する方法は、当技術分野において公知であり、例えば、Gao et al.Transcription,8(5):275-287,2017;Kunkel & Pederson,Genes & Dev 2:196-204,1988;Goomer & Kunkel Nucleic Acid Res.20:4903-4912,1992;及びMa et al Molecular Therapy-Nucleic Acids 3:e161,2014において見出され、これらは全て、本明細書に参照により組み込まれる。U6プロモーター配列の非限定的な例(TATAボックスには下線が引かれている)としては、
一部の実施形態では、Tet2標的配列を含むセンス鎖は、19、20又は21ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、センス鎖と全部又は一部が相補的なアンチセンス鎖は、19、20又は21ヌクレオチド、任意選択で、センス鎖と同じ長さを含む。一部の実施形態では、相補的なアンチセンス鎖は、Tet2標的配列を含むセンス鎖と一部が、例えば、少なくとも、2位から18位又は1位から9位及び11位から19位、20位若しくは21位までが相補的である(3’から5’まで読み取られた場合)。一部の実施形態では、Tet2標的配列を含むセンス鎖に相補的なアンチセンス鎖は、Tet2標的配列を含むセンス鎖に全体が、即ちTet2標的配列を含むセンス鎖の全長にわたって、例えば、1位から19位、1位から20位又は1位から21位までが相補的である(3’から5’まで読み取られた場合)。一部の実施形態では、センス鎖は、本明細書に参照として組み込まれる国際公開第2017/049166号パンフレットの表4に記載されるTet2標的配列の1つ以上を含む。非限定的な例示的Tet2標的配列として、
GGGTAAGCCAAGAAAGAAA(配列番号418)
TTTCTTTCTTGGCTTACCC(配列番号419)
が挙げられる。
GGGTAAGCCAAGAAAGAAA(配列番号418)
TTTCTTTCTTGGCTTACCC(配列番号419)
が挙げられる。
アンチセンス鎖は、配列番号418の逆相補鎖であり、配列番号419として上に記載されるが、その決定は、当技術分野(例えば、bioinformations.org/sms2/rev_comp.htmlで入手可能なSequence Manipulation Siteを用いて)に基づいて容易に行うことができることに留意されたい。一部の実施形態では、ループは、例えば、限定はされないが、Bofill-De Ros & Gu,Methods 103:157-166,2016;Gu et al.Cell 151(4):900-911,2012;Cullen,Gene Ther.13:503-508,2006;及びSchopman et al Antiviral Res.86:204-211,2014(これらは全て、本明細書に参照として組み込まれる)に開示されるものなど、当技術分野で公知の配列から選択される。非限定的な例示的なループ配列は、以下を含む:
GTTAATATTCATAGC(配列番号792)
CCTGACCCA(配列番号793)
GTTAATATTCATAGC(配列番号792)
CCTGACCCA(配列番号793)
一部の実施形態では、shRNAをコードするベクターは、配列中にポリTテール、即ち2、3、4、5、6又はそれ以上のTヌクレオチド、例えばTT、TTT、TTTT、TTTTT、TTTTTT、TTTTTT、TTTTTTT、TTTTTTTTT、TTTTTTTTT等を含む。このパラグラフに記載されるベクターエレメントを全て含む非限定的な例示的配列として、以下が挙げられる:
当業者は、shRNAをコードするベクターに関するものとして、本明細書に開示されるDNA配列を、「T」を「U」で置換することにより、RNAに容易に転写する(このようにして、shRNA配列を取得する)ことができることが理解される。一部の実施形態では、shRNA又はshRNAをコードするベクターは、本明細書の上文に開示されるキメラ抗原受容体(CAR)を発現する細胞(例えばT細胞)の集団を作製する方法のステップ(ii)(即ち接触ステップ)で使用される。従って、ステップ(ii)は、細胞(例えば、T細胞)の集団をshRNA、任意選択で、本明細書に記載のshRNAをコードするベクターと接触させることをさらに含み得る。一部の実施形態では、shRNAをコードするベクターは、検出可能なタグ、即ちベクターと接触させた細胞中に検出することができ、形質導入の成功を示すタグをさらに含む。このような検出可能なタグの非限定的な例は、限定するものではないが、蛍光タグ及び/又は人工表面マーカーなど、公知であり、任意選択で、市販の抗体又は他の分子によって検出可能である。さらなる非限定的な例として、切断型EGFR又はビオチン/ストレプトアビジンなどの人工表面マーカーがあり;このようなタグは、当技術分野において周知である。一部の実施形態では、shRNAをコードするベクターは、本明細書の上文に開示されるCARをコードする核酸を含み、本明細書の上文に開示されたキメラ抗原レセプター(CAR)を発現する細胞(例えばT細胞)の集団を作製する方法のステップ(ii)(即ち接触ステップ)で使用される。
CARとケモカイン受容体の共発現
実施形態において、本明細書に記載のCAR発現細胞、例えばCD19CAR発現細胞は、さらに、ケモカイン受容体分子を含む。T細胞におけるケモカイン受容体CCR2b又はCXCR2のトランスジェニック発現は、黒色腫及び神経芽腫を含むCCL2-又はCXCL1分泌固形腫瘍への輸送を促進する(Craddock et al.,J Immunother.2010 Oct;33(8):780-8及びKershaw et al.,Hum Gene Ther.2002 Nov 1;13(16):1971-80)。そのため、理論に拘束されることを望むものではないが、腫瘍、例えば、固形腫瘍により分泌されるケモカインを認識するCAR発現細胞で発現されるケモカイン受容体は、CAR発現細胞の腫瘍への帰巣を改善し、CAR発現細胞の腫瘍への浸潤を促進し、及びCAR発現細胞の抗腫瘍効果を増強すると考えられる。ケモカイン受容体分子は、天然に存在する又は組換えケモカイン受容体又はそのケモカイン結合フラグメントを含み得る。本明細書に記載のCAR発現細胞(例えば、CAR-Tx)における発現に適するケモカイン受容体分子は、CXCケモカイン受容体(例えば、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6又はCXCR7)、CCケモカイン受容体(例えば、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10又はCCR11)、CX3Cケモカイン受容体(例えば、CX3CR1)、XCケモカイン受容体(例えば、XCR1)又はそのケモカイン結合フラグメントを含む。一部の実施形態において、本明細書に記載のCARと共に発現するケモカイン受容体分子は、腫瘍により分泌されるケモカインに基づき選択する。一部の実施形態において、本明細書に記載のCAR発現細胞は、さらに、CCR2b受容体又はCXCR2受容体を含む、例えば、発現する。一部の実施形態において、本明細書に記載のCAR及びケモカイン受容体分子は、同じベクターにある又は2つの異なるベクターにある。本明細書に記載のCAR及びケモカイン受容体分子が同じベクターに実施形態において、CAR及びケモカイン受容体分子は、各々、2つの異なるプロモーターの制御下にあるか又は同じプロモーターの制御下にある。
実施形態において、本明細書に記載のCAR発現細胞、例えばCD19CAR発現細胞は、さらに、ケモカイン受容体分子を含む。T細胞におけるケモカイン受容体CCR2b又はCXCR2のトランスジェニック発現は、黒色腫及び神経芽腫を含むCCL2-又はCXCL1分泌固形腫瘍への輸送を促進する(Craddock et al.,J Immunother.2010 Oct;33(8):780-8及びKershaw et al.,Hum Gene Ther.2002 Nov 1;13(16):1971-80)。そのため、理論に拘束されることを望むものではないが、腫瘍、例えば、固形腫瘍により分泌されるケモカインを認識するCAR発現細胞で発現されるケモカイン受容体は、CAR発現細胞の腫瘍への帰巣を改善し、CAR発現細胞の腫瘍への浸潤を促進し、及びCAR発現細胞の抗腫瘍効果を増強すると考えられる。ケモカイン受容体分子は、天然に存在する又は組換えケモカイン受容体又はそのケモカイン結合フラグメントを含み得る。本明細書に記載のCAR発現細胞(例えば、CAR-Tx)における発現に適するケモカイン受容体分子は、CXCケモカイン受容体(例えば、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6又はCXCR7)、CCケモカイン受容体(例えば、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10又はCCR11)、CX3Cケモカイン受容体(例えば、CX3CR1)、XCケモカイン受容体(例えば、XCR1)又はそのケモカイン結合フラグメントを含む。一部の実施形態において、本明細書に記載のCARと共に発現するケモカイン受容体分子は、腫瘍により分泌されるケモカインに基づき選択する。一部の実施形態において、本明細書に記載のCAR発現細胞は、さらに、CCR2b受容体又はCXCR2受容体を含む、例えば、発現する。一部の実施形態において、本明細書に記載のCAR及びケモカイン受容体分子は、同じベクターにある又は2つの異なるベクターにある。本明細書に記載のCAR及びケモカイン受容体分子が同じベクターに実施形態において、CAR及びケモカイン受容体分子は、各々、2つの異なるプロモーターの制御下にあるか又は同じプロモーターの制御下にある。
CARをコードする核酸構築物
本発明は、本明細書に記載される1つ以上のCAR構築物をコードする核酸分子を含む免疫エフェクター細胞、例えば本明細書に記載の方法によって作製されたものも提供する。一部の実施形態において、核酸分子は、メッセンジャーRNA転写物として提供される。一部の実施形態において、核酸分子は、DNA構築物として提供される。
本発明は、本明細書に記載される1つ以上のCAR構築物をコードする核酸分子を含む免疫エフェクター細胞、例えば本明細書に記載の方法によって作製されたものも提供する。一部の実施形態において、核酸分子は、メッセンジャーRNA転写物として提供される。一部の実施形態において、核酸分子は、DNA構築物として提供される。
本明細書に記載される核酸分子は、DNA分子、RNA分子又はそれらの組み合わせであり得る。一部の実施形態において、核酸分子は、本明細書に記載されるようなCARポリペプチドをコードするmRNAである。他の実施形態において、核酸分子は、前述の核酸分子のいずれかを含むベクターである。
一部の実施形態において、本発明のCARの抗原結合ドメイン(例えば、scFv)は、その配列が哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されている核酸分子によってコードされる。一部の実施形態において、本発明のCAR構築物全体は、その配列全体が哺乳動物細胞での発現のためにコドン最適化されている核酸分子によってコードされる。コドン最適化とは、コーディングDNAにおける同義コドン(即ち同じアミノ酸をコードするコドン)の出現頻度が異なる種に偏っているという発見を指す。そのようなコドン縮重は、同一のポリペプチドが様々なヌクレオチド配列によってコードされることを可能にする。様々なコドン最適化方法が当技術分野で知られており、例えば、少なくとも米国特許第5,786,464号明細書及び同第6,114,148号明細書に開示される方法が含まれる。
従って、一部の実施形態において、免疫エフェクター細胞、例えば本発明の方法により作製されたものは、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする核酸分子を含み、CARは、本明細書に記載の腫瘍抗原に結合する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン(例えば、本明細書に記載の膜貫通ドメイン)並びに刺激ドメイン、例えば、共刺激シグナル伝達ドメイン(例えば、本明細書に記載の共刺激シグナル伝達ドメイン)及び/又は一次シグナル伝達ドメイン(例えば、本明細書に記載の一次シグナル伝達ドメイン、例えば、本明細書に記載のζ鎖)を含む細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメイン)を含む。
本発明は、CARをコードする核酸分子、例えば、本明細書に記載の核酸分子が挿入されているベクターも提供する。レンチウイルスなどのレトロウイルス由来のベクターは、それらが導入遺伝子の長期の安定した組み込み及び娘細胞への伝播を可能にするため、長期遺伝子導入を達成するのに適するツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖細胞を形質導入できる点で、マウス白血病ウイルスなどのオンコ-レトロウイルス由来のベクターを超えるさらなる利点を有する。さらに、それらは、低免疫原性であるという付加的利点も有する。レトロウイルスベクターは、例えば、γレトロウイルスベクターでもあり得る。γレトロウイルスベクターは、例えば、プロモーター、パッケージングシグナル(ψ)、プライマー結合部位(PBS)、1つ以上の(例えば、2)末端反復配列(LTR)及び目的の導入遺伝子、例えばCARをコードする遺伝子を含み得る。γレトロウイルスベクターは、gag、pol及びenvなどのウイルス構造的遺伝子を欠き得る。例示的なγレトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス(MLV)、脾フォーカス形成ウイルス(SFFV)及び骨髄増殖性肉腫ウイルス(MPSV)及びそれら由来のベクターを含む。他のγレトロウイルスベクターは、例えば、Tobias Maetzig et al.,“Gammaretroviral Vectors:Biology,Technology and Application”Viruses.2011 Jun;3(6):677-713に記載される。
一部の実施形態において、所望のCARをコードする核酸を含むベクターは、アデノウイルスベクター(A5/35)である。一部の実施形態において、CARをコードする核酸の発現は、sleeping beauty、crisper、CAS9及び亜鉛フィンガーヌクレアーゼなどのトランスポゾンを使用して達成できる。参照により本明細書に包含される下記のJune et al.2009 Nature Reviews Immunology 9.10:704-716を参照されたい。
概説すると、CARをコードする天然又は合成核酸の発現は、典型的には、CARポリペプチドをコードする核酸又はその一部をプロモーターに操作可能に連結させ、その構築物を発現ベクターに取り込むことにより達成される。ベクターは、真核生物での複製及び組込みに適し得る。典型的クローニングベクターは、所望の核酸配列の発現の制御に有用な転写及び翻訳ターミネーター、開始配列及びプロモーターを含む。
核酸は、多数のタイプのベクターにクローン化できる。例えば、核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス及びコスミドを含むが、これらに限定されないベクターにクローン化できる。特に興味深いベクターは、発現ベクター、複製ベクター、プローブ産生ベクター及びシークエンシングベクターを含む。
さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形で細胞に提供され得る。ウイルスベクターテクノロジーは当分野で周知であり、例えば、Sambrook et al.,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,volumes 1 -4,Cold Spring Harbor Press,NY及び他のウイルス学及び分子生物学マニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス及びレンチウイルスを含むが、これらに限定されない。一般に、適当なベクターは、少なくとも1生物で機能的な複製起点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位及び1つ以上の選択可能マーカーを含む(例えば、国際公開第01/96584号パンフレット;国際公開第01/29058号パンフレット;及び米国特許第6,326,193号明細書)。
多数のウイルスベースの系が、哺乳動物細胞への遺伝子移入のために開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための簡便なプラットフォームを提供する。選択した遺伝子を、当分野で知られる技術を使用して、ベクターに挿入し、レトロウイルス粒子に包装できる。次いで、組換えウイルスが単離され、対象の細胞にインビボ又はエクスビボで送達され得る。多数のレトロウイルス系が当分野で知られる。一実施形態において、アデノウイルスベクターを使用する。多数のアデノウイルスベクターが当分野で知られる。一部の実施形態において、レンチウイルスベクターを使用する。
さらなるプロモーター要素、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を制御する。典型的には、これらは、開始部位の上流30~110bpの領域に位置するが、多数のプロモーターが、同様に開始部位の下流に機能的要素を含むことが示されている。プロモーター要素間の空間はしばしば可動性であり、そのため、要素が互いに逆になったとき又は移動したときにプロモーター機能が保持される。チミジンキナーゼ(tk)プロモーターにおいて、プロモーター要素間の空間は、活性が落ち始める前、50bp離れるまで増加し得る。プロモーターにより、個々の要素は、転写を活性化するために協調的又は独立的に機能できるように見える。代表的プロモーターは、CMV IE遺伝子、EF-1α、ユビキチンC又はホスホグリセロキナーゼ(PGK)プロモーターを含む。
哺乳動物T細胞においてCARコード核酸分子を発現することができるプロモーターの例は、EF1aプロモーターである。天然EF1aプロモーターは、アミノアシルtRNAのリボソームへの酵素送達を担う伸長因子-1複合体のαサブユニットの発現を駆動する。EF1aプロモーターは、哺乳動物発現プラスミドで広く使用されており、レンチウイルスベクターにクローン化された核酸分子からCAR発現を駆動するのに有効であることが示されている。例えば、Milone et al.,Mol.Ther.17(8):1453-1464(2009)を参照されたい。一部の実施形態において、EF1aプロモーターは、実施例で提供される配列を含む。
プロモーターの別の例は、最初期サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに操作可能に連結したあらゆるポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動できる、強い構成的プロモーター配列である。しかしながら、サルウイルス40(SV40)初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス(MMTV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)末端反復配列(LTR)プロモーター、MoMuLVプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン-バーウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーターを含むが、これらに限定されない他の構成的プロモーター配列並びにアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子-1αプロモーター、ヘモグロビンプロモーター及びクレアチンキナーゼプロモーターなど、しかし、これらに限定されないヒト遺伝子プロモーターも使用し得る。さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定すべきではない。誘導性プロモーターも本発明の一部であるとして意図される。誘導性プロモーターの使用は、操作可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現を、発現が望まれるときに発現を活性化し、発現が望まれないときに発現を遮断することができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例は、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター及びテトラサイクリンプロモーターを含むが、これらに限定されない。
プロモーターの別の例は、ホスホグリセラートキナーゼ(PGK)プロモーターである。実施形態において、切断PGKプロモーター(例えば、野生型PGKプロモーター配列と比較したとき、1つ以上の、例えば、1、2、5、10、100、200、300又は400ヌクレオチド欠失を有するPGKプロモーター)が望ましいことがある。
ベクターは、例えば、分泌を促進するためのシグナル配列、ポリアデニル化シグナル及び転写ターミネーター(例えば、ウシ成長ホルモン(BGH)遺伝子から)、エピソーム複製及び原核生物における複製を可能にする要素(例えばSV40起源及びColE1又は当分野で知られるその他)及び/又は選択を可能にする要素(例えば、アンピシリン耐性遺伝子及び/又はゼオシンマーカー)も含み得る。
CARポリペプチド又はその一部の発現を評価するために、細胞に導入する発現ベクター遺伝子導入又はウイルスベクターによる感染が探求される細胞の集団から発現細胞から発現細胞の同定及び選択を容易にするために、選択可能マーカー遺伝子又はレポーター遺伝子又は両者も含み得る。一部の実施形態において、選択可能マーカーは、DNAの別の断面に担持され、共トランスフェクション法において使用される。選択可能マーカー及びレポーター遺伝子のいずれも、宿主細胞における発現が可能であるように、適切な制御配列が隣接し得る。有用な選択可能マーカーは、例えば、neoなどの抗生物質耐性遺伝子を含む。
レポーター遺伝子は、恐らく遺伝子導入されている細胞を同定し、制御配列の機能性を評価するために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物又は組織に存在又は発現されず、発現がある容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性により顕在化されるポリペプチドをコードする、遺伝子である。レポーター遺伝子の発現を、DNAがレシピエント細胞に導入されてから適当な時間後にアッセイする。適当なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ又は緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子を含み得る(例えば、Ui-Tei et al.,2000 FEBS Letters 479:79-82)。適当な発現系は周知であり、既知技術により製造でき又は商業的に入手できる。一般に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小5’フランキング領域を有する構築物をプロモーターとして同定する。このようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結し、プロモーター駆動転写を調節する能力について薬剤を評価するのに使用し得る。
実施形態において、ベクターは、CAR、例えば本明細書に記載のCAR、例えばCD19CAR及び第2のCAR、例えば阻害性CAR又はCD19以外の抗原に特異的に結合するCARをコードする2つ以上の核酸配列を含み得る。このような実施形態において、2以上のCARをコードする核酸配列は、同じフレームにおいて単一核分子により且つ単一ポリペプチド鎖としてコード化される。一部の実施形態において、2以上のCARは、例えば、1つ以上のペプチド開裂部位により分けられ得る(例えば、自己開裂部位又は細胞内プロテアーゼのための基質)。ペプチド切断部位の例には、T2A、P2A、E2A又はF2A部位が含まれる。
細胞に遺伝子を導入し、発現させる方法は当分野で知られる。発現ベクターに関連して、ベクターは、任意の方法、例えば当技術分野で知られたものにより、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母又は昆虫細胞に容易に導入できる。例えば、例えば、発現ベクターは、物理的、化学的又は生物学的手段により、宿主細胞に移入される。
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための物理的方法は、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、微量注入、エレクトロポレーションなどを含む。ベクター及び/又は外来性核酸を含む細胞を産生する方法は、当分野で周知である。例えば、Sambrook et al.,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,volumes 1 -4,Cold Spring Harbor Press,NYを参照されたい)。宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入するための適切な方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
宿主細胞に目的のポリヌクレオチドを導入するための生物学的方法は、DNA及びRNAベクターの使用を含む。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えば、ヒト細胞への遺伝子挿入に最も広く使用される方法となってきている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスI、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許第5,350,674号明細書及び同第5,585,362号明細書を参照されたい。
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための化学的手段は、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ及び水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む脂質ベースの系などのコロイド分散体系を含む。インビトロ及びインビボで送達媒体として使用するための代表的コロイド系は、リポソーム(例えば、人工膜小胞)である。標的化ナノ粒子又は他の適当なサブミクロンサイズの送達系を用いるポリヌクレオチドの送達など、最新式の核酸の標的化送達の他の方法が利用可能である。
非ウイルス送達系を利用する場合、代表的送達媒体はリポソームである。脂質製剤の使用は、宿主細胞への核酸の導入のために意図される(インビトロ、エクスビボ又はインビボ)。一部の実施形態において、核酸は、脂質と結合され得る。脂質と結合した核酸は、リポソームの水性内部への被包、リポソームの脂質二重層内への分散、リポソームとオリゴヌクレオチドの両者と結合する連結分子を介するリポソームへの結合、リポソームへの封入、リポソームとの複合体化、脂質含有溶液への分散、脂質との混合、脂質との組み合わせ、脂質中の懸濁液としての包含、ミセル内への包含又は複合体化又は他の方法で脂質と結合する。脂質、脂質/DNA又は脂質/発現ベクター結合組成物は、溶液中の何らかの特定の構造に限定されない。例えば、それらは、二重層構造において、ミセルとして又は「崩壊」構造を有して存在し得る。それらはまた、単に溶液に分散され、恐らくサイズ又は形が均一ではない凝集体を形成し得る。脂質は、天然に存在する又は合成脂質であり得る脂肪物質である。例えば、脂質は、細胞質に天然に生じる脂肪滴並びに脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール及びアルデヒドなどの長鎖脂肪族炭化水素を含む化合物群及びその誘導体を含む。
使用に適する脂質は、商業的供給源から得ることができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン(「DMPC」)は、Sigma,St.Louis,MOから得ることができ、リン酸ジセチル(「DCP」)はK&K Laboratories(Plainview,NY)から得ることができ;コレステロール(「Choi」)はCalbiochem-Behringから得ることができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロール(「DMPG」)及び他の脂質は、Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,AL.)から得ることができる。クロロホルム又はクロロホルム/メタノール中の脂質の原液を、約-20℃で保存できる。クロロホルムを、メタノールよりも容易に揮発するために、唯一の溶媒として使用する。「リポソーム」は、封入された脂質二重層又は凝集体の産生により形成される多様な単及び多層状脂質媒体を包含する一般的用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜及び内部水性媒体を伴う小胞構造を有することにより特徴付けられる。多層状リポソームは、水性媒体により分離された、複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水溶液に懸濁されたときに自然に形成される。脂質要素は、閉構造形成前に自己凝集し、水及び溶解した溶質を脂質二重層間に封入する(Ghosh et al.,1991 Glycobiology 5:505-10)。しかしながら、通常の小胞構造と異なる構造を溶液で有する組成物も包含される。例えば、脂質は、ミセル構造であるか又は単に脂質分子の不均一凝集体として存在すると考えられ得る。リポフェクタミン-核酸複合体も考慮される。
外来性核酸を宿主細胞に導入する又はそうでなければ細胞を本発明の阻害剤に曝す方法に関係なく、宿主細胞における組換え核酸配列の存在を確認するために、多様なアッセイを行い得る。このようなアッセイは、例えば、サザン及びノーザンブロッティング、RT-PCR及びPCRなどの当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ、薬剤の同定に使用するための、例えば、免疫学的手段(ELISA及びウェスタンブロット)により、特定のペプチドの存在又は不在を検出するような「生化学的」アッセイ又は本発明の範囲内に入る本明細書に記載のアッセイを含む。
ナチュラルキラー細胞受容体(NKR)CAR
一部の実施形態において、本明細書に記載のCAR分子はナチュラルキラー細胞受容体(NKR)の1つ以上の成分を含み、それによりNKR-CARを形成する。NKR成分は、次のナチュラルキラー細胞受容体のいずれか由来の膜貫通ドメイン、ヒンジドメイン又は細胞質ドメインであり得る:キラー細胞免疫グロブリン様受容体(KIR)、例えば、KIR2DL1、KIR2DL2/L3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、DIR2DS5、KIR3DL1/S1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR2DP1及びKIR3DP1;天然細胞傷害性受容体(NCR)、例えば、NKp30、NKp44、NKp46;免疫細胞受容体のシグナル伝達リンパ球活性化分子(SLAM)ファミリー、例えばCD48、CD229、2B4、CD84、NTB-A、CRACC、BLAME及びCD2F-10;Fc受容体(FcR)、例えばCD16及びCD64;及びLy49受容体、例えばLY49A、LY49C。本明細書に記載のNKR-CAR分子は、アダプター分子又は細胞内シグナル伝達ドメイン、例えばDAP12と相互作用し得る。NKR要素を含むCAR分子の例示的な配置及び配列は、国際公開第2014/145252号パンフレットに記載され、その内容が参照により本明細書に援用される。
一部の実施形態において、本明細書に記載のCAR分子はナチュラルキラー細胞受容体(NKR)の1つ以上の成分を含み、それによりNKR-CARを形成する。NKR成分は、次のナチュラルキラー細胞受容体のいずれか由来の膜貫通ドメイン、ヒンジドメイン又は細胞質ドメインであり得る:キラー細胞免疫グロブリン様受容体(KIR)、例えば、KIR2DL1、KIR2DL2/L3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、DIR2DS5、KIR3DL1/S1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR2DP1及びKIR3DP1;天然細胞傷害性受容体(NCR)、例えば、NKp30、NKp44、NKp46;免疫細胞受容体のシグナル伝達リンパ球活性化分子(SLAM)ファミリー、例えばCD48、CD229、2B4、CD84、NTB-A、CRACC、BLAME及びCD2F-10;Fc受容体(FcR)、例えばCD16及びCD64;及びLy49受容体、例えばLY49A、LY49C。本明細書に記載のNKR-CAR分子は、アダプター分子又は細胞内シグナル伝達ドメイン、例えばDAP12と相互作用し得る。NKR要素を含むCAR分子の例示的な配置及び配列は、国際公開第2014/145252号パンフレットに記載され、その内容が参照により本明細書に援用される。
スプリットCAR
一実施形態において、CAR発現細胞は、スプリットCARを使用する。スプリットCARアプローチは、国際公開第2014/055442号パンフレット及び国際公開第2014/055657号パンフレットにより詳細に記載されている。簡潔には、スプリットCAR系は、第1の抗原結合ドメイン及び共刺激ドメイン(例えば、41BB)を有する第1のCARを発現する細胞を含み、細胞は、第2の抗原結合ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、CD3ζ)を有する第2のCARも発現する。細胞が第1の抗原に遭遇したとき、共刺激ドメインが活性化され、細胞が増殖する。細胞が第2の抗原に遭遇したとき、細胞内シグナル伝達ドメインが活性化され、殺細胞活性が開始される。そのため、CAR発現細胞は、両方の抗原の存在下でのみ完全活性化される。
一実施形態において、CAR発現細胞は、スプリットCARを使用する。スプリットCARアプローチは、国際公開第2014/055442号パンフレット及び国際公開第2014/055657号パンフレットにより詳細に記載されている。簡潔には、スプリットCAR系は、第1の抗原結合ドメイン及び共刺激ドメイン(例えば、41BB)を有する第1のCARを発現する細胞を含み、細胞は、第2の抗原結合ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、CD3ζ)を有する第2のCARも発現する。細胞が第1の抗原に遭遇したとき、共刺激ドメインが活性化され、細胞が増殖する。細胞が第2の抗原に遭遇したとき、細胞内シグナル伝達ドメインが活性化され、殺細胞活性が開始される。そのため、CAR発現細胞は、両方の抗原の存在下でのみ完全活性化される。
キメラ抗原受容体を制御するための戦略
一部の実施形態において、CAR活性が制御できる制御可能CAR(RCAR)は、CAR治療の安全性及び有効性を最適化するために望ましい。CAR活性が制御され得る多くの方法がある。例えば、誘導性アポトーシス(例えば二量体化ドメインに融合したカスパーゼを使用するもの)(例えば、Di Stasa et al.,N Engl.J.Med.2011 Nov.3;365(18):1673-1683を参照されたい)を本発明のCAR治療における安全スイッチとして使用できる。一部の実施形態において、本発明のCARを発現する細胞(例えば、T細胞又はNK細胞)は、誘導性アポトーシススイッチをさらに含み、ヒトカスパーゼ(例えば、カスパーゼ9)又は改変バージョンは、条件付き二量体化を可能にするヒトFKBタンパク質の改変に融合される。ラパログ(例えば、AP1903、AP20187)などの小分子の存在下では、誘導性カスパーゼ(例えば、カスパーゼ9)が活性化され、本発明のCARを発現する細胞(例えば、T細胞又はNK細胞)の急速なアポトーシス及び死をもたらす。カスパーゼベースの誘導性アポトーシススイッチ(又はそのようなスイッチの1つ以上の態様)の例は、例えば、米国特許出願公開第2004040047号明細書;米国特許出願公開第20110286980号明細書;米国特許出願公開第20140255360号明細書;国際公開第1997031899号パンフレット;国際公開第2014151960号パンフレット;国際公開第2014164348号パンフレット;国際公開第2014197638号パンフレット;国際公開第2014197638号パンフレットに記載され、参照により全て本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態において、CAR活性が制御できる制御可能CAR(RCAR)は、CAR治療の安全性及び有効性を最適化するために望ましい。CAR活性が制御され得る多くの方法がある。例えば、誘導性アポトーシス(例えば二量体化ドメインに融合したカスパーゼを使用するもの)(例えば、Di Stasa et al.,N Engl.J.Med.2011 Nov.3;365(18):1673-1683を参照されたい)を本発明のCAR治療における安全スイッチとして使用できる。一部の実施形態において、本発明のCARを発現する細胞(例えば、T細胞又はNK細胞)は、誘導性アポトーシススイッチをさらに含み、ヒトカスパーゼ(例えば、カスパーゼ9)又は改変バージョンは、条件付き二量体化を可能にするヒトFKBタンパク質の改変に融合される。ラパログ(例えば、AP1903、AP20187)などの小分子の存在下では、誘導性カスパーゼ(例えば、カスパーゼ9)が活性化され、本発明のCARを発現する細胞(例えば、T細胞又はNK細胞)の急速なアポトーシス及び死をもたらす。カスパーゼベースの誘導性アポトーシススイッチ(又はそのようなスイッチの1つ以上の態様)の例は、例えば、米国特許出願公開第2004040047号明細書;米国特許出願公開第20110286980号明細書;米国特許出願公開第20140255360号明細書;国際公開第1997031899号パンフレット;国際公開第2014151960号パンフレット;国際公開第2014164348号パンフレット;国際公開第2014197638号パンフレット;国際公開第2014197638号パンフレットに記載され、参照により全て本明細書に組み込まれる。
別の例において、CAR発現細胞は、誘導性カスパーゼ-9(iCaspase-9)分子も発現でき、これは、二量体化因子薬物(例えば、rimiducid(AP1903(Bellicum Pharmaceuticals)又はAP20187(Ariad)とも呼ばれる)の投与により、細胞のカスパーゼ-9活性化及びアポトーシスに至る。iCaspase-9分子は、二量体化(CID)結合ドメインの化学誘導因子を含み、これは、CIDの存在下で二量体化に介在する。これは、CAR発現細胞の誘導的及び選択的枯渇に至る。ある場合、iCaspase-9分子は、CARコードベクターと別の核酸分子によりコードされる。ある場合、iCaspase-9分子は、CARコードベクターと同じ核酸分子によりコードされる。iCaspase-9は、CAR発現細胞の何らかの毒性を避けるための安全スイッチを提供できる。例えば、Song et al.Cancer Gene Ther.2008;15(10):667-75;Clinical Trial Id.No.NCT02107963;及びDi Stasi et al.N.Engl.J.Med.2011;365:1673-83を参照されたい。
本発明のCAR治療を制御するための代替的戦略は、例えば、抗体依存性細胞傷害(ADCC)の誘発により、例えばCAR発現細胞を消失させることにより、CAR活性の脱活性化又は遮断する小分子又は抗体の利用を含む。例えば、本明細書に記載のCAR発現細胞は、細胞死、例えばADCC又は補体誘導性細胞死を誘発できる分子により認識される抗原も発現し得る。例えば、本明細書に記載のCAR発現細胞は、抗体又は抗体フラグメントにより標的化され得る受容体も発現し得る。このような受容体の例は、EpCAM、VEGFR、インテグリン(例えば、インテグリンανβ3、α4、αΙ3/4β3、α4β7、α5β1、ανβ3、αν)、TNF受容体スーパーファミリーのメンバー(例えば、TRAIL-R1、TRAIL-R2)、PDGF受容体、インターフェロン受容体、葉酸受容体、GPNMB、ICAM-1、HLA-DR、CEA、CA-125、MUC1、TAG-72、IL-6受容体、5T4、GD2、GD3、CD2、CD3、CD4、CD5、CD11、CD11a/LFA-1、CD15、CD18/ITGB2、CD19、CD20、CD22、CD23/lgE受容体、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD62L、CD74、CD80、CD125、CD147/ベイシジン、CD152/CTLA-4、CD154/CD40L、CD195/CCR5、CD319/SLAMF7及びEGFR並びにその切断バージョン(例えば、1つ以上の細胞外エピトープを保持するが、細胞質ドメイン内の1つ以上の領域を欠くバージョン)を含む。
例えば、本明細書に記載のCAR発現細胞は、シグナル伝達能力を欠くが、ADCCを誘発できる分子、例えばセツキシマブ(アービタックス(登録商標))により認識されるエピトープを保持する切断型上皮細胞増殖因子受容体(EGFR)も発現し、その結果、セツキシマブの投与がADCC及び続くCAR発現細胞の枯渇を誘発する(例えば、国際公開第2011/056894号パンフレット及びJonnalagadda et al.,Gene Ther.2013;20(8)853-860を参照されたい)。別の戦略は、例えば、ADCCによりCAR発現細胞の選択的枯渇をもたらす、リツキシマブに結合する、本明細書に記載のCAR発現細胞におけるCD32及びCD20抗原の両方からの標的エピトープをあわせる、高度に小型のマーカー/自殺遺伝子の発現を含む(例えば、Philip et al.,Blood.2014;124(8)1277-1287を参照されたい)。本明細書に記載のCAR発現細胞を枯渇させる他の方法は、例えば、ADCC誘発により、破壊するために成熟リンパ球、例えばCAR発現細胞に選択的に結合し、標的とするモノクローナル抗CD52抗体であるCAMPATH(登録商標)の投与を含む。他の実施形態において、CAR発現細胞は、CARリガンド、例えば抗イディオタイプ抗体を使用して選択的に標的化され得る。一実施形態において、抗イディオタイプ抗体は、エフェクター細胞活性、例えばADCC又はADC活性を引き起こし、それによりCAR発現細胞数を減らすことができる。他の実施形態において、CARリガンド、例えば抗イディオタイプ抗体は、細胞致死を誘発する薬剤、例えばトキシンに結合させ、それによりCAR発現細胞数を減らすことができる。代わりに、CAR分子自体、下記のように、活性が制御され得る、例えば活性化又は遮断され得るように配置できる。
他の実施形態において、本明細書に記載のCAR発現細胞は、T細胞除去剤により認識される標的タンパク質も発現し得る。一部の実施形態において、標的タンパク質は、CD20であり、T細胞除去剤は、抗CD20抗体、例えばリツキシマブである。一部の実施形態において、CAR発現細胞を減少又は除去する、例えばCAR誘発毒性を軽減することが望まれるときにT細胞除去剤を投与する。他の実施形態において、T細胞除去剤は、本明細書の実施例に記載されるように、抗CD52抗体、例えばアレムツズマブである。
他の実施形態において、RCARは、本明細書に記載の標準的CARの要素、例えば抗原結合ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインが個別のポリペプチド又はメンバーに配置された、一連の典型的には最も単純な実施形態において2つのポリペプチドを含む。一部の実施形態において、一連のポリペプチドは、二量体化分子の存在下で互いにポリペプチドを結合できる、例えば抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに結合できる二量体化スイッチを含む。一部の実施形態において、本発明のCARは、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2014127261号パンフレットに記載されるような二量体化スイッチを利用する。このような制御可能CARのさらなる記載及び例示定期配置は、本明細書及び2015年3月13日に出願された国際公開第2015/090229号パンフレット(例えば、段落527~551)に提供され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態において、RCARは、スイッチドメイン、例えば、配列番号275に記載されるようなFKBPスイッチドメインを含むか、又は例えば配列番号276に示されるような、FRBと結合する能力を有するFKBPのフラグメントを含む。一部の実施形態において、RCARは、例えば配列番号277に示されるような、FRB配列を含むスイッチドメイン又は例えば配列番号278~283のいずれかに記載されるような、変異型FRB配列を含む。
VQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLETS(配列番号276)
ILWHEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLTQAWDLYYHVFRRISK(配列番号277)
ILWHEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLTQAWDLYYHVFRRISK(配列番号277)
RNAトランスフェクション
インビトロで転写されたRNA CARを産生する方法が本明細書に開示される。RNA CAR及びそれを使用する方法は、例えば、2015年3月13日に出願された国際公開第2015/142675号パンフレットの段落553~570に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
インビトロで転写されたRNA CARを産生する方法が本明細書に開示される。RNA CAR及びそれを使用する方法は、例えば、2015年3月13日に出願された国際公開第2015/142675号パンフレットの段落553~570に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
免疫エフェクター細胞は、メッセンジャーRNA(mRNA)によってコードされたCARを含み得る。一部の実施形態において、本明細書に記載のCARをコードするmRNAは、CAR発現細胞の産生のために、例えば本明細書に記載される方法により作製される、免疫エフェクター細胞に導入される。
一部の実施形態において、インビトロ転写RNA CARを一過性トランスフェクションの形態として細胞に導入できる。RNAは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)産生鋳型を使用するインビトロ転写により産生される。任意の供給源からの目的のDNAを、適切なプライマー及びRNAポリメラーゼを使用してインビトロmRNA合成のための鋳型にPCRにより直接変換できる。DNAの供給源は、例えば、ゲノムDNA、プラスミドDNA、ファージDNA、cDNA、合成DNA配列又はDNAのあらゆる他の適切な供給源であり得る。インビトロ転写のための所望の鋳型は本明細書中に記載されるCARである。例えば、RNA CARの鋳型は、本明細書に記載の腫瘍関連抗原に対する抗体の単鎖可変ドメインを含む細胞外領域;ヒンジ領域(例えば、本明細書に記載のヒンジ領域)、膜貫通ドメイン(例えば、CD8aの膜貫通ドメインなどの本明細書に記載の膜貫通ドメイン);及び細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメイン、例えばCD3-ζのシグナル伝達ドメイン及び4-1BBのシグナル伝達ドメインを含むものを含む細胞質領域を含む。
一部の実施形態において、PCRに使用するDNAは、オープンリーディングフレームを含む。DNAは、生物のゲノムからの天然に存在するDNA配列由来であり得る。一部の実施形態において、核酸は、5’及び/又は3’非翻訳領域(UTR)のいくらか又は全てを含み得る。核酸は、エクソン及びイントロンを含み得る。一部の実施形態において、PCRに使用するDNAは、ヒト核酸配列である。一部の実施形態において、PCRに使用するDNAは、5’及び3’UTRを含むヒト核酸配列である。DNAは、代わりに、天然に存在する生物で通常発現されない人工DNA配列であり得る。例示的な人工DNA配列は、融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを形成するようにライゲートされた遺伝子の部分を含むものである。ライゲートされたDNAの部分は、単一生物由来又は1つを超える生物由来であり得る。
PCRを使用して、トランスフェクションに使用するmRNAのインビトロ転写のための鋳型を産生する。PCRを実施する方法は、当技術分野で周知である。PCRにおいて使用するプライマーは、PCRのための鋳型として使用するDNAの領域に実質的に相補的である領域を有するように設計する。本明細書で使用する「実質的に相補的」は、プライマー配列の残基の大部分又は全てが相補的であるか又は1つ以上の塩基が非相補的又はミスマッチである、ヌクレオチドの配列を指す。実質的に相補的な配列は、PCRに使用するアニーリング条件下においてDNA標的とアニール又はハイブリダイズできる。プライマーは、DNA鋳型の任意の部分と実質的に相補的であるように設計できる。例えば、プライマーは、5’及び3’UTRを含む、細胞において通常転写される(オープンリーディングフレーム)核酸の部分を増幅するように設計できる。プライマーは、目的の特定のドメインをコードする核酸の部分を増幅するようにも設計できる。一部の実施形態において、プライマーは、5’及び3’UTRの全て又は一部を含む、ヒトcDNAのコーディング領域を増幅するように設計される。PCRに有用なプライマーは、当技術分野で周知の合成法により産生できる。「順方向プライマー」は、増幅するDNA配列の上流であるDNA鋳型上にヌクレオチドに対して実質的に相補的であるヌクレオチドの領域を含むプライマーである。「上流」は、コード鎖に対して、増幅するDNA配列に対する5位を指すために本明細書で使用する。「逆方向プライマー」は、増幅するDNA配列の下流である、二本鎖DNA鋳型に対して実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含むプライマーである。「下流」は、コード鎖に対して、増幅するDNA配列に対する3’位を指すために本明細書で使用する。
PCRに有用なあらゆるDNAポリメラーゼを本明細書に開示する方法で使用できる。試薬及びポリメラーゼは、多数の供給元から市販されている。
安定性及び/又は翻訳効率を促進する能力を有する化学構造も使用し得る。実施形態において、RNAは、5’及び3’UTRを有する。一部の実施形態において、5’UTRは、1~3000ヌクレオチド長である。コーディング領域に付加する5’及び3’UTR配列の長さは、UTRの異なる領域をアニールするPCRのためのプライマーの設計を含むが、これに限定されない異なる方法により変わり得る。このアプローチを使用して、当業者は、転写RNAのトランスフェクション後、最適翻訳効率を達成するのに必要な5’及び3’UTR長を修飾できる。
5’及び3’UTRは、目的の核酸のための天然に存在する内在性5’及び3’UTRであり得る。代わりに、目的の核酸に対して内在性ではないUTR配列を順方向及び逆方向プライマーへのUTR配列の取り込みにより又は鋳型の任意の他の修飾により付加できる。目的の核酸に対して内在性ではないUTR配列の使用は、RNAの安定性及び/又は翻訳効率の修飾のために有用であり得る。例えば、3’UTR配列のAUリッチ要素は、mRNAの安定性を低下させ得ることが知られる。従って、3’UTRを、当技術分野で周知であるUTRの特性に基づき、転写されたRNAの安定性を増加するように選択及び設計できる。
一部の実施形態において、5’UTRは、内在性核酸のKozak配列を含み得る。代わりに、目的の核酸に対して内在性ではない5’UTRを上記のようにPCRにより付加するとき、コンセンサスKozak配列を5’UTR配列の付加により再設計できる。Kozak配列は、あるRNA転写物の翻訳効率を上げることができるが、効率的翻訳を可能とするために全RNAで必要であるように見えない。多くのmRNAについてのKozak配列に対する必要性は、当技術分野で公知である。他の実施形態において、5’UTRは、RNAゲノムが細胞で安定であるRNAウイルスの5’UTRであり得る。他の実施形態において、種々のヌクレオチドアナログを、mRNAのエキソヌクレアーゼ分解を妨害するために3’又は5’UTRにおいて使用できる。
遺伝子クローニングの必要性なしにDNA鋳型からのRNAの合成を可能にするために、転写のプロモーターは、転写する配列の上流のDNA鋳型に結合すべきである。RNAポリメラーゼのプロモーターとして機能する配列が順方向プライマーの5’末端に追加されるとき、RNAポリメラーゼプロモーターは、転写されるオープンリーディングフレームの上流のPCR産物に取り込まれる。一部の実施形態において、プロモーターは、本明細書の他の箇所に記載するような、T7ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターは、T3及びSP6 RNAポリメラーゼプロモーターを含むが、これらに限定されない。T7、T3及びSP6プロモーターのコンセンサスヌクレオチド配列が当技術分野で公知である。
一部の実施形態において、mRNAは、リボソーム結合、翻訳開始及び細胞におけるmRNAの安定性を決定する、5’末端及び3’ポリ(A)テールの両者にキャップを有する。環状DNA鋳型、例えばプラスミドDNA上において、RNAポリメラーゼは、真核細胞における発現に適しない長いコンカテマー産物を産生する。3’UTRの末端で直線化されたプラスミドDNAの転写は、転写後ポリアデニル化されても、真核トランスフェクションに有効ではない正常サイズのmRNAを生じる。
直鎖状DNA鋳型で、ファージT7 RNAポリメラーゼは、鋳型の最後の塩基を越えて転写物の3’末端を伸長できる(Schenborn and Mierendorf,Nuc Acids Res.,13:6223-36(1985);Nacheva and Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.,270:1485-65(2003))。
DNA鋳型に伸びるポリ(A)/Tの組込みの慣用法は、分子クローニングである。しかしながら、プラスミドDNAに統合されたポリ(A)/T配列は、プラスミド不安定性を生じ得、これは、細菌細胞から得たプラスミドDNA鋳型が多くの場合に欠失及び他の異常で高度に汚染されている理由である。これにより、クローニング手順は、困難で時間がかかるだけでなく、多くの場合に信頼できないものとなる。これが、クローニングを伴わないポリ(A)/T 3’ストレッチを有するDNA鋳型の産生を可能にする方法が非常に望ましい理由である。
転写DNA鋳型のポリ(A)/Tセグメントは、100Tテール(配列番号31)などのポリTテールを含む逆方向プライマーを使用するPCR中(サイズは、50~5000Tであり得る(配列番号32))又はDNAライゲーション若しくはインビトロ組換えを含むが、これらに限定されない任意の他の方法によりPCR後に産生できる。ポリ(A)テールはまた、RNAに安定性を提供し、その分解を減らす。一般に、ポリ(A)テールの長さは、転写されたRNAの安定性と正に相関する。一部の実施形態において、ポリ(A)テールは、100~5000アデノシンである(例えば、配列番号33)。
RNAのポリ(A)テールは、大腸菌(E.coli)ポリ(A)ポリメラーゼ(E-PAP)のなどのポリ(A)ポリメラーゼの使用により、インビトロ転写後にさらに伸長できる。一部の実施形態において、ポリ(A)テールの100ヌクレオチドから300~400ヌクレオチドへの長さの延長(配列番号34)は、RNAの翻訳効率の約2倍増加を生じる。さらに、3’末端への異なる化学基の付加は、mRNA安定性を増加させ得る。このような結合は、修飾/人工ヌクレオチド、アプタマー及び他の化合物を含み得る。例えば、ATPアナログは、ポリ(A)ポリメラーゼを使用してポリ(A)テールに取り込まれ得る。ATPアナログは、RNAの安定性をさらに高め得る。
5’キャップもRNA分子に安定性を提供する。一部の実施形態において、本明細書に開示する方法により産生されたRNAは、5’キャップを含む。5’キャップは、当技術分野で公知であり、本明細書に記載の技術を使用して提供される(Cougot,et al.,Trends in Biochem.Sci.,29:436-444(2001);Stepinski,et al.,RNA,7:1468-95(2001);Elango,et al.,Biochim.Biophys.Res.Commun.,330:958-966(2005))。
本明細書に開示する方法により産生されたRNAは、配列内リボソーム進入部位(IRES)配列も含み得る。IRES配列は、mRNAへのキャップ非依存的リボソーム結合を開始し、翻訳開始を促進するあらゆるイルス、染色体又は人工設計配列であり得る。糖、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化剤及び界面活性剤などの細胞透過性及び生存能を促進する因子を含有し得る、細胞電気穿孔に適した任意の溶質が含まれ得る。
RNAを、多数の異なる方法、例えば商業的に利用可能な方法のいずれかを使用して標的細胞に導入でき、これは、電気穿孔(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems,Cologne,Germany))、(ECM 830(BTX)(Harvard Instruments,Boston,Mass.)又はGene Pulser II(BioRad,Denver,Colo.)、Multiporator(Eppendort,Hamburg Germany)、リポフェクションを使用するカチオン性リポソーム介在トランスフェクション、ポリマー封入、ペプチド介在トランスフェクション又は「遺伝子銃」などの微粒子銃粒子送達系(例えば、Nishikawa,et al.Hum Gene Ther.,12(8):861-70(2001)を参照されたい)を含むが、これらに限定されない。
非ウイルス送達方法
一部の実施形態において、非ウイルス方法を使用して、本明細書に記載のCARをコードする核酸を細胞又は組織又は対象に送達できる。
一部の実施形態において、非ウイルス方法を使用して、本明細書に記載のCARをコードする核酸を細胞又は組織又は対象に送達できる。
一部の実施形態において、非ウイルス方法は、トランスポゾン(転位因子とも呼ばれる)の使用を含む。一部の実施形態において、トランスポゾンは、ゲノムの位置にそれ自体挿入できるDNAのフラグメント、例えば自己複製性であり、そのコピーをゲノムに挿入することができるDNAのフラグメント又は長い核酸の外にスプライシングされ、ゲノムの別の場所に挿入されることができるDNAのフラグメントである。例えば、トランスポゾンは、転位のための逆位反復フランキング遺伝子からなるDNA配列を含む。
例示的なトランスポゾンを使用する核酸送達法は、Sleeping Beautyトランスポゾン系(SBTS)及びpiggyBac(商標)(PB)トランスポゾン系を含む。例えば、Aronovich et al.Hum.Mol.Genet.20.R1(2011):R14-20;Singh et al.Cancer Res.15(2008):2961-2971;Huang et al.Mol.Ther.16(2008):580-589;Grabundzija et al.Mol.Ther.18(2010):1200-1209;Kebriaei et al.Blood.122.21(2013):166;Williams.Molecular Therapy 16.9(2008):1515-16;Bell et al.Nat.Protoc.2.12(2007):3153-65;及びDing et al.Cell.122.3(2005):473-83(これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
SBTSは2つの成分:1)導入遺伝子を含むトランスポゾン、及び2)トランスポサーゼ酵素の供給源を含む。トランスポサーゼは、担体プラスミド(又は他のドナーDNA)から、宿主細胞染色体/ゲノムなどの標的DNAにトランスポゾンを転位できる。例えば、トランスポサーゼは、担体プラスミド/ドナーDNAに結合し、トランスポゾン(導入遺伝子含有)をプラスミドの外に切り出し、宿主細胞のゲノムに入れる。例えば、Aronovich et al.上掲を参照されたい。
例示的なトランスポゾンは、pT2ベースのトランスポゾンを含む。例えば、全て参照により本明細書に組み込まれるGrabundzija et al.Nucleic Acids Res.41.3(2013):1829-47;及びSingh et al.Cancer Res.68.8(2008):2961-2971を参照されたい。例示的なトランスポサーゼは、Tc1/mariner型トランスポサーゼ、例えばSB10トランスポサーゼ又はSB11トランスポサーゼを含む(例えば、サイトメガロウイルスプロモーターから発現できる機能亢進トランスポサーゼ)。例えば、全て参照により本明細書に組み込まれるAronovich et al.;Kebriaei et al.;及びGrabundzija et al.を参照されたい。
SBTSの使用は、導入遺伝子、例えば本明細書に記載のCARをコードする核酸の効率的組込み及び発現を可能にする。例えば、SBTSなどのトランスポゾン系を使用する、本明細書に記載のCARを安定に発現する細胞、例えばT細胞又はNK細胞を産生する方法が本明細書に提供される。
本明細書に記載の方法により、一部の実施形態において、SBTS成分を含む1つ以上の核酸、例えばプラスミドが細胞に送達される(例えば、T細胞又はNK細胞)。例えば、核酸は、核酸(例えば、プラスミドDNA)送達の標準法、例えば本明細書に記載の方法、例えば電気穿孔、トランスフェクション又はリポフェクションにより送達される。一部の実施形態において、核酸は、導入遺伝子、例えば本明細書に記載のCARをコードする核酸を含むトランスポゾンを含む。一部の実施形態において、核酸は、導入遺伝子(例えば、本明細書に記載のCARをコードする核酸)を含むトランスポゾン並びにトランスポサーゼ酵素をコードする核酸配列を含む。他の実施形態において、例えば、デュアルプラスミド系、例えば第1のプラスミドが導入遺伝子を含むトランスポゾンを含み、第2のプラスミドがトランスポサーゼ酵素をコードする核酸配列を含む、2核酸の系が提供される。例えば、第1及び第2の核酸は、宿主細胞に共送達される。
一部の実施形態において、本明細書に記載のCARを発現する細胞、例えばT細胞又はNK細胞は、ヌクレアーゼ(例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、CRISPR/Cas系又は操作されたメガヌクレアーゼ再操作ホーミングエンドヌクレアーゼ)を使用するSBTS及び遺伝子編集の遺伝子挿入の組み合わせを使用して産生される。
一部の実施形態において、非ウイルス送達方法の使用は、細胞、例えばT細胞又はNK細胞の再プログラミング及び対照への細胞の直接注入を可能にする。非ウイルスベクターの利点は、患者集団に見合うために必要な十分量の産生が容易且つ比較的安価であること、保存中の安定性及び免疫原性の欠如を含むが、これらに限定されない。
製造/生産の方法
一部の実施形態において、本明細書に開示される方法は、細胞(例えば、本明細書に記載されるような免疫エフェクター細胞)での処置後にT細胞枯渇剤を投与すること、それにより、CAR発現細胞(例えば、CD19CAR発現細胞)を減少させる(例えば、枯渇させる)ことをさらに含む。そのようなT細胞枯渇剤は、CAR発現細胞(例えば、CD19CAR発現細胞)を効果的に枯渇させて、毒性を緩和するために使用することができる。一部の実施形態において、CAR発現細胞は、本明細書の方法に従って製造され、例えば、本明細書の方法に従ってアッセイされた(例えば、トランスフェクション又は形質導入前又は後)。
一部の実施形態において、本明細書に開示される方法は、細胞(例えば、本明細書に記載されるような免疫エフェクター細胞)での処置後にT細胞枯渇剤を投与すること、それにより、CAR発現細胞(例えば、CD19CAR発現細胞)を減少させる(例えば、枯渇させる)ことをさらに含む。そのようなT細胞枯渇剤は、CAR発現細胞(例えば、CD19CAR発現細胞)を効果的に枯渇させて、毒性を緩和するために使用することができる。一部の実施形態において、CAR発現細胞は、本明細書の方法に従って製造され、例えば、本明細書の方法に従ってアッセイされた(例えば、トランスフェクション又は形質導入前又は後)。
一部の実施形態において、T細胞枯渇剤は、本明細書に記載の細胞、例えば免疫エフェクター細胞の集団の投与の1、2、3、4又は5週間後に投与される。
一部の実施形態において、T細胞枯渇剤は、例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性(ADCC)及び/又は補体誘導性細胞死を誘導することにより、CAR発現細胞を枯渇させる薬剤である。例えば、本明細書に記載のCAR発現細胞は、細胞死、例えば、ADCC又は補体誘導性細胞死を誘発できる分子により認識される抗原(例えば、標的抗原)も発現し得る。例えば、本明細書に記載のCAR発現細胞は、抗体又は抗体フラグメントにより標的化され得る標的タンパク質(例えば、受容体)も発現し得る。このような標的タンパク質の例は、EpCAM、VEGFR、インテグリン(例えば、インテグリンανβ3、α4、αΙ3/4β3、α4β7、α5β1、ανβ3、αν)、TNF受容体スーパーファミリーのメンバー(例えば、TRAIL-R1、TRAIL-R2)、PDGF受容体、インターフェロン受容体、葉酸受容体、GPNMB、ICAM-1、HLA-DR、CEA、CA-125、MUC1、TAG-72、IL-6受容体、5T4、GD2、GD3、CD2、CD3、CD4、CD5、CD11、CD11a/LFA-1、CD15、CD18/ITGB2、CD19、CD20、CD22、CD23/lgE受容体、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD62L、CD74、CD80、CD125、CD147/ベイシジン、CD152/CTLA-4、CD154/CD40L、CD195/CCR5、CD319/SLAMF7及びEGFR及びその切断バージョン(例えば、1つ以上の細胞外エピトープを保持するが、細胞質ドメイン内の1つ以上の領域を欠くバージョン)を含むが、これらに限定されるものではない。
一部の実施形態において、CAR発現細胞は、CAR及び標的タンパク質を共発現し、例えば、天然で標的タンパク質を発現するか、又は標的タンパク質を発現するように操作される。例えば、細胞、例えば、免疫エフェクター細胞の集団は、CAR核酸(例えば、本明細書に記載されるようなCAR核酸)及び標的タンパク質をコードする核酸を含む核酸(例えば、ベクター)を含み得る。
一部の実施形態において、T細胞枯渇剤は、CD52阻害剤、例えば、抗CD52抗体分子、例えば、アレムツズマブである。
他の実施形態において、細胞、例えば、免疫エフェクター細胞の集団は、本明細書に記載されるようなCAR分子(例えば、CD19CAR)及びT細胞枯渇剤によって認識される標的タンパク質を発現する。一部の実施形態において、標的タンパク質はCD20である。標的タンパク質がCD20である実施形態において、T細胞除去剤は抗CD20抗体、例えば、リツキシマブである。
前述の方法のいずれかのさらなる実施形態において、方法は、細胞、例えば造血幹細胞又は骨髄を、哺乳動物に移植することをさらに含む。
一部の実施形態において、本発明は、細胞移植前に哺乳動物をコンディショニングする方法を特徴とする。方法は、哺乳動物に、CAR核酸又はポリペプチド、例えば、CD19CAR核酸又はポリペプチドを含む、有効量の細胞を投与することを含む。一部の実施形態において、細胞移植は、幹細胞移植、例えば、造血幹細胞移植又は骨髄移植である。他の実施形態において、細胞移植前に対象をコンディショニングすることは、対象における標的発現細胞、例えば、CD19発現正常細胞又はCD19発現癌細胞の数を減少させることを含む。
水簸
一部の実施形態において、本明細書に記載の方法は、不要な細胞、例えば単球及び芽細胞を除去し、これにより、CAR発現に好適な所望の免疫エフェクター細胞の濃縮改善を達成する水簸法を特徴とする。一部の実施形態では、本明細書に記載の水簸法は、事前に凍結したサンプル、例えば解凍サンプルからのCAR発現に好適な所望の免疫エフェクター細胞の濃縮のために最適化される。一部の実施形態では、本明細書に記載の水簸法は、当技術分野で公知の水簸プロトコルから収集される細胞の調製物と比較して、純度が向上した細胞の調製物を提供する。一部の実施形態では、本明細書に記載の水簸法は、特定の等張液(例えば、PBS)を用いた希釈による出発サンプル、例えば細胞サンプル、例えば解凍した細胞サンプルの最適化された粘度の使用並びに水簸装置により収集される各画分の流量及び収集量の最適化された組み合わせの使用を含む。本発明に適用することができる例示的な水簸法は、国際公開第2017/117112号パンフレット(その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる)の48~51ページに記載されている。
一部の実施形態において、本明細書に記載の方法は、不要な細胞、例えば単球及び芽細胞を除去し、これにより、CAR発現に好適な所望の免疫エフェクター細胞の濃縮改善を達成する水簸法を特徴とする。一部の実施形態では、本明細書に記載の水簸法は、事前に凍結したサンプル、例えば解凍サンプルからのCAR発現に好適な所望の免疫エフェクター細胞の濃縮のために最適化される。一部の実施形態では、本明細書に記載の水簸法は、当技術分野で公知の水簸プロトコルから収集される細胞の調製物と比較して、純度が向上した細胞の調製物を提供する。一部の実施形態では、本明細書に記載の水簸法は、特定の等張液(例えば、PBS)を用いた希釈による出発サンプル、例えば細胞サンプル、例えば解凍した細胞サンプルの最適化された粘度の使用並びに水簸装置により収集される各画分の流量及び収集量の最適化された組み合わせの使用を含む。本発明に適用することができる例示的な水簸法は、国際公開第2017/117112号パンフレット(その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる)の48~51ページに記載されている。
密度勾配遠心分離
養子細胞治療製品の製造は、末梢血アフェレーシス出発材料中に存在する血液細胞及び血液成分の複合混合物から離れて、所望の細胞、例えば免疫エフェクター細胞をプロセシングすることを必要とする。末梢血由来のリンパ球サンプルは、フィコール溶液による密度勾配遠心分離を用いた分離に成功している。しかし、フィコールは、臨床使用に適格ではないため、フィコールは、治療用途で細胞を分離するのに好ましい試薬ではない。さらに、フィコールは、グリコールを含有し、これは、細胞に対して毒性を有する可能性がある。さらに、凍結保存後の解凍アフェレーシス産物のフィコール密度勾配遠心分離は、例えば、本明細書の実施例に記載されるように、準最適なT細胞産物をもたらす。例えば、フィコール溶液による密度勾配遠心分離によって分離された細胞調製物では、非T細胞、特に望ましくないB細胞、芽細胞及び単球の相対的な増加と共に、最終産物でのT細胞の喪失が観察された。
養子細胞治療製品の製造は、末梢血アフェレーシス出発材料中に存在する血液細胞及び血液成分の複合混合物から離れて、所望の細胞、例えば免疫エフェクター細胞をプロセシングすることを必要とする。末梢血由来のリンパ球サンプルは、フィコール溶液による密度勾配遠心分離を用いた分離に成功している。しかし、フィコールは、臨床使用に適格ではないため、フィコールは、治療用途で細胞を分離するのに好ましい試薬ではない。さらに、フィコールは、グリコールを含有し、これは、細胞に対して毒性を有する可能性がある。さらに、凍結保存後の解凍アフェレーシス産物のフィコール密度勾配遠心分離は、例えば、本明細書の実施例に記載されるように、準最適なT細胞産物をもたらす。例えば、フィコール溶液による密度勾配遠心分離によって分離された細胞調製物では、非T細胞、特に望ましくないB細胞、芽細胞及び単球の相対的な増加と共に、最終産物でのT細胞の喪失が観察された。
理論に縛られることを意図しないが、免疫エフェクター細胞、例えばT細胞は、凍結保存中に脱水して、新鮮な細胞よりも密度が高くなると考えられる。理論に縛られることを意図しないが、免疫エフェクター細胞、例えばT細胞は、他の血液細胞よりも長い間密度が高いままであるため、他の細胞よりも容易にフィコール密度勾配分離中に失われることも考えられる。従って、理論に縛られることを意図しないが、フィコールより大きい密度の培地は、フィコール又はフィコールと同じ密度、例えば1.077g/mLを有する他の培地と比較して、所望の免疫エフェクター細胞の分離の改善を提供すると考えられる。
一部の実施形態において、本明細書に記載の密度勾配遠心分離法は、イオジキサノールを含む密度勾配媒体の使用を含む。一部の実施形態において、密度勾配媒体は、水中に約60%のイオジキサノールを含む。
一部の実施形態において、本明細書に記載の密度勾配遠心分離法は、フィコールより大きい密度を有する密度勾配媒体の使用を含む。一部の実施形態において、本明細書に記載の密度勾配遠心分離法は、1.077g/mL超、例えば1.077g/mL超、1.1g/mL超、1.15g/mL超、1.2g/mL超、1.25g/mL超、1.3g/mL超、1.31g/mL超の密度を有する密度勾配媒体の使用を含む。一部の実施形態では、密度勾配媒体は、約1.32g/mLの密度を有する。
密度勾配遠心分離の別の実施形態は、国際公開第2017/117112号パンフレット(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)の51~53ページに記載されている。
選択による濃縮
CAR発現に適した所望の免疫エフェクター細胞の濃縮を改善するための特定の細胞の選択方法が本明細書に提供される。一部の実施形態において、選択は、ポジティブ選択、例えば所望の免疫エフェクター細胞の選択を含む。一部の実施形態では、選択は、ネガティブ選択、例えば望ましくない細胞の選択、例えば望ましくない細胞の除去を含む。複数の実施形態において、本明細書に記載されるポジティブ又はネガティブ選択方法は、例えば、フロースルー装置、例えば本明細書に記載のフロースルー装置の使用により、流動条件下で実施される。例示的なポジティブ及びネガティブ選択は、国際公開第2017/117112号パンフレット(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)の53~57ページに記載されている。選択方法は、細胞プロセシングシステムとも呼ばれるフロースルー装置を使用することにより流動条件下で実施して、CAR発現に好適な所望の免疫エフェクター細胞、例えばT細胞の細胞調製物をさらに濃縮することができる。例示的なフロースルー装置は、国際公開第2017/117112号パンフレット(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)の57~70ページに記載されている。例示的な細胞分離及び脱ビーズ(debeading)方法は、国際公開第2017/117112号パンフレット(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)の70~78ページに記載されている。
CAR発現に適した所望の免疫エフェクター細胞の濃縮を改善するための特定の細胞の選択方法が本明細書に提供される。一部の実施形態において、選択は、ポジティブ選択、例えば所望の免疫エフェクター細胞の選択を含む。一部の実施形態では、選択は、ネガティブ選択、例えば望ましくない細胞の選択、例えば望ましくない細胞の除去を含む。複数の実施形態において、本明細書に記載されるポジティブ又はネガティブ選択方法は、例えば、フロースルー装置、例えば本明細書に記載のフロースルー装置の使用により、流動条件下で実施される。例示的なポジティブ及びネガティブ選択は、国際公開第2017/117112号パンフレット(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)の53~57ページに記載されている。選択方法は、細胞プロセシングシステムとも呼ばれるフロースルー装置を使用することにより流動条件下で実施して、CAR発現に好適な所望の免疫エフェクター細胞、例えばT細胞の細胞調製物をさらに濃縮することができる。例示的なフロースルー装置は、国際公開第2017/117112号パンフレット(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)の57~70ページに記載されている。例示的な細胞分離及び脱ビーズ(debeading)方法は、国際公開第2017/117112号パンフレット(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)の70~78ページに記載されている。
選択手順は、国際公開第2017/117112号パンフレットの57~70ページに記載されているものに限定されない。カラム技術(CliniMACS(登録商標)Plus又はCliniMACS(登録商標)Prodigy(登録商標))と組み合わせてCD19、CD14及びCD26 Miltenyiビーズを用いる不要な細胞の除去によるネガティブT細胞選択又はCD4及びCD8 Miltenyiビーズ及びカラム技術(CliniMACS(登録商標)Plus又はCliniMACS(登録商標)Prodigy(登録商標))の組み合わせを用いたポジティブT細胞選択を使用することができる。代わりに、放出可能なCD3ビーズ(GE Healthcare)を用いたカラムフリー技術を使用することもできる。
加えて、ThermoGenesis X-シリーズ装置などのビーズフリー技術も使用することができる。
臨床用途
本明細書に記載のプロセス、全て臨床医薬品製造(cGMP)基準に従って実施することができる。
本明細書に記載のプロセス、全て臨床医薬品製造(cGMP)基準に従って実施することができる。
これらのプロセスは、特に製造プロセス開始時の未処理の出発材料(特に細胞)の収集並びに細胞療法用の細胞の選択若しくは拡大のための製造プロセス中の細胞精製、富化、採取、洗浄、濃縮又は細胞培地交換のために使用され得る。
細胞は、任意の複数の細胞を含み得る。細胞は、同じ細胞型又は混合された細胞型のものであり得る。加えて、細胞は、一人のドナー、例えば細胞療法のための自己ドナー又は単一同種異系ドナーに由来するものであり得る。細胞は、患者から、例えば白血球アフェレーシス又はアフェレーシスから取得され得る。細胞は、T細胞を含み得、例えば50%超のT細胞、60%超のT細胞、70%超のT細胞、80%超のT細胞又は90%超のT細胞を有する集団を含み得る。
選択プロセスは、培養及び拡大前に、細胞を選択する上で特に有用となり得る。例えば、抗CD3及び/又は抗CD28でコーティングされた常磁性粒子を使用して、キメラ抗原受容体(CAR)若しくは他のタンパク質をコードする核酸の伸長又は導入のためにT細胞を選択することができる。こうしたプロセスを使用して、急性リンパ性白血病(ALL)の治療のためにCTL019 T細胞を生産する。
本明細書に開示される脱ビーズプロセス及びモジュールは、特に、細胞療法用の細胞の製造、例えば培養及び増殖前又は後の細胞の精製に有用であり得る。例えば、抗CD3及び/又は抗CD28抗体でコーティングされた常磁性粒子を使用して、T細胞、例えばキメラ抗原受容体(CAR)又は他のタンパク質をコードする核酸の導入によって修飾された若しくは修飾されるであろうT細胞を、CARがT細胞により発現されるように、選択的に増殖させることができる。こうしたT細胞の製造中、脱ビーズプロセス又はモジュールを用いて、T細胞を常磁性粒子から分離することができる。このような脱ビーズプロセス又はモジュールを用いて、例えば急性リンパ芽球性白血病(ALL)の処置のためのCTL019 T細胞を生産する。
例として示される1つのこうしたプロセスでは、細胞、例えばT細胞をドナー(例えば、自己キメラ抗原受容体T細胞産物で処置しようとする患者)からアフェレーシス(例えば、白血球アフェレーシス)により収集する。続いて、収集した細胞を任意選択で例えば水簸ステップ又は標的細胞(例えば、T細胞)のポジティブ若しくはネガティブ選択によって精製し得る。次に、常磁性粒子、例えば抗CD3/抗CD28コーティング常磁性粒子を細胞集団に添加して、T細胞を増殖させることができる。このプロセスは、形質導入ステップも含み得、このステップにおいて、1つ以上の所望のタンパク質、例えばCAR、例えばCD19を標的化するCARをコードする核酸が細胞に導入される。核酸は、レンチウイルスベクター中に導入され得る。細胞、例えばレンチウイルスにより形質導入された細胞を例えば好適な培地の存在下で例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10若しくはそれを超える日数の期間にわたって増殖することができる。増殖の後、本明細書に開示される脱ビーズプロセス/モジュールを用いて、常磁性粒子から所望のT細胞を分離することができる。このプロセスは、本開示のプロセスに従う1つ以上の脱ビーズステップを含み得る。次に、脱ビーズした細胞を、患者への投与のために製剤化することができる。CAR T細胞及びそれらの製造の例は、例えば、国際公開第2012/079000号パンフレット(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)にさらに記載されている。本開示のシステム及び方法は、国際公開第2012/079000号パンフレットに記載されるか又はそれに関連する任意の細胞分離/精製/脱ビーズプロセスに使用され得る。別のCAR T製造プロセスは、例えば、国際公開第2016109410号パンフレット及び同第2017117112号パンフレット(それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。
本明細書に記載のシステム及び方法は、従来のシステム及び方法と比較して、化学物質との曝露が少ないか又は曝露せずに、望ましい細胞の無駄を少なくし、細胞外傷を低減すると共に、細胞からの磁気及びあらゆる非常磁性粒子をより確実に除去することにより、他の細胞療法製品にも同様に利益をもたらし得る。
上には本開示の例示的な実施形態のみが具体的に記載されているが、これらの例の修正及び変更は、本開示の趣旨及び意図される範囲から逸脱することなく、可能であることは理解されよう。例えば、磁気モジュール及びそれらを含むシステムは、記載されるものに加えて様々な配置に構成及び使用され得る。それ以外にも、非磁気モジュールを同様に使用することができる。加えて、システム及び方法は、本明細書に具体的に記載されていない別の成分及びステップを含み得る。例えば、方法は、プライミングを含み得、この場合、流体をまず1成分に導入して、気泡を除去し、細胞懸濁液又はバッファー運動に対する抵抗を低減する。さらに、複数の実施形態は、本明細書に記載の方法で使用するための本明細書に記載のシステムの一部のみを含む場合もある。例えば、複数の実施形態は、細胞を分離若しくは脱ビーズして細胞産物を生産することができる完全なシステムを形成するために、非使い捨て装置内で使用可能な使い捨てモジュール、ホースなどに関連し得る。
本発明と組み合わせることができる追加の製造方法及びプロセスは、当技術分野で記載されている。例えば、国際公開第2017/117112号パンフレットの86~91ページには、改善された洗浄ステップ及び改善された製造プロセスが記載されている。
免疫エフェクター細胞の供給源
この項では、所望の免疫エフェクター細胞を含むインプットサンプルを取得し、所望の免疫エフェクター細胞、例えばT細胞を分離及びプロセシングし、且つ不要な物質、例えば不要な細胞を除去するための追加の方法又はステップを提供する。この項に記載される追加の方法又はステップは、先行項に記載される水簸、密度勾配遠心分離、流動条件下での選択又は改善された洗浄ステップのいずれかと組み合わせて使用することができる。
この項では、所望の免疫エフェクター細胞を含むインプットサンプルを取得し、所望の免疫エフェクター細胞、例えばT細胞を分離及びプロセシングし、且つ不要な物質、例えば不要な細胞を除去するための追加の方法又はステップを提供する。この項に記載される追加の方法又はステップは、先行項に記載される水簸、密度勾配遠心分離、流動条件下での選択又は改善された洗浄ステップのいずれかと組み合わせて使用することができる。
細胞の供給源、例えばT細胞若しくはナチュラルキラー(NK)細胞は、対象から取得することができる。対象の例として、ヒト、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、マウス、ラット及びそれらのトランスジェニック種が挙げられる。T細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織及び腫瘍を含む、多数の供給源から得ることができる。
本開示の一部の実施形態において、免疫エフェクター細胞、例えばT細胞は、当業者に周知の任意の数の技術及び本明細書に開示される方法のいずれかを使用して、それらのステップの任意の組み合わせで、対象から収集した血液の単位から得ることができる。一部の実施形態では、個体の循環血液からの細胞をアフェレーシスにより取得する。アフェレーシス産物は、典型的にはT細胞、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球を含めたリンパ球、赤血球及び血小板を含む。一部の実施形態では、アフェレーシスにより収集された細胞は、血漿画分を除去するために洗浄し、任意選択で、続くプロセシングステップのために細胞を適切なバッファー又は培地に入れ得る。一部の実施形態では、細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄する。一部の実施形態では、洗浄溶液はカルシウムを欠き、マグネシウムを欠き得るか、又は全てではないとしても多くの二価カチオンを欠き得る。一部の実施形態において、細胞は、本明細書に記載の改善された洗浄ステップを使用して洗浄される。
カルシウム非存在下での初期活性化ステップは、活性化の増強をもたらすことができる。当業者には容易に認識されるように、洗浄ステップは、当業者に公知の方法により、例えば製造業者の指示に従う半自動化「フロースルー」遠心分離(例えば、Cobe 2991細胞処理装置、Baxter CytoMate(商標)又はHaemonetics Cell Saver 5)、Haemonetics Cell Saver Elite(GE Healthcare Sepax若しくはSefia)又はスピニングメンブレンろ過技術を利用する装置(Fresenius Kabi LOVO)を使用することにより達成され得る。洗浄後、細胞を、例えば無Ca、無Mg PBS、PlasmaLyte A、ヒト血清アルブミン(HSA)を補充したPBS-EDTA又はバッファーを含む又は含まない他の食塩水溶液など、多様な生体適合性バッファーに再懸濁し得る。代わりに、アフェレーシスサンプルの望ましくない成分を除去した後、細胞を培養培地に直接再懸濁し得る。
一部の実施形態において、所望の免疫エフェクター細胞、例えばT細胞は、赤血球を溶解し、例えばPERCOLL(商標)勾配による遠心分離又は向流遠心水簸により単球を枯渇させることにより、末梢血リンパ球から単離する。
本明細書に記載の方法は、例えば、本明細書に記載の、例えばネガティブ選択技術を使用する、例えばT制御性細胞枯渇集団、例えばCD25+枯渇細胞又はCD25high枯渇細胞である、免疫エフェクター細胞、例えばT細胞の、例えば特定の亜集団の選択を含み得る。一部の実施形態において、T制御性枯渇細胞の集団は、30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、1%未満のCD25+細胞又はCD25high細胞を含む。
一部の実施形態において、T制御性細胞、例えばCD25+T細胞又はCD25highT細胞を、抗CD25抗体若しくはそのフラグメント又はCD25結合リガンド、例えばIL-2を使用して集団から除去する。一部の実施形態では、抗CD25抗体若しくはそのフラグメント又はCD25結合リガンドを基質、例えばビーズにコンジュゲートするか、或いはそうでなければ基質、例えばビーズ上に被覆する。一部の実施形態では、抗CD25抗体又はそのフラグメントを、本明細書に記載されるような基質にコンジュゲートさせる。
一部の実施形態において、T制御性細胞、例えばCD25+T細胞又はCD25highT細胞は、Miltenyi(商標)からのCD25枯渇剤を使用して集団から除去する。一部の実施形態では、細胞対CD25枯渇剤の比は1e7細胞対20μL、又は1e7細胞対15μL、又は1e7細胞対10μL、又は1e7細胞対5μL、又は1e7細胞対2.5μL、又は1e7細胞対1.25μLである。一部の実施形態では、例えばT制御性細胞の場合、5億細胞/ml超を使用する。一部の実施形態では、6億、7億、8億又は9億細胞/mlの細胞濃度を使用する。
一部の実施形態において、枯渇させようとする免疫エフェクター細胞の集団は、約6×109のCD25+T細胞を含む。一部の実施形態では、枯渇させようとする免疫エフェクター細胞の集団は、約1×109~1×1010(及びその間の任意の整数値)のCD25+T細胞を含む。一部の実施形態では、得られるT制御性枯渇細胞集団は、2×109のT制御性細胞、例えばCD25+細胞若しくはCD25high細胞以下(例えば、1×109、5×108、1×108、5×107、1×107以下のT制御性細胞)を有する。
一部の実施形態において、T制御性細胞、例えばCD25+細胞又はCD25high細胞を、例えばチュービング162-01など、枯渇チュービングセットと共にCliniMAC系を使用して集団から除去する。一部の実施形態では、CliniMAC系を例えばDEPLETION2.1などの枯渇設定で作動させる。
特定の理論に縛られることを意図しないが、アフェレーシス前又はCAR発現細胞産物の製造工程中の対象における免疫細胞の負のレギュレーターのレベルの減少(例えば、不要な免疫細胞、例えばTreg細胞の数の減少)は、対象の再発リスクを有意に低下させる。例えば、Treg細胞を枯渇させる方法は当技術分野で知られている。Treg細胞を減少させる方法は、シクロホスファミド、抗GITR抗体(本明細書に記載の抗GITR抗体)、CD25枯渇及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
一部の実施形態において、製造方法は、CAR発現細胞の製造前のTreg細胞の数の減少(例えば、枯渇)を含む。例えば、製造方法は、例えば、サンプル、例えばアフェレーシスサンプルと、抗GITR抗体及び/又は抗CD25抗体(若しくはそのフラグメント又はCD25結合リガンド)を接触させ、CAR発現細胞(例えば、T細胞、NK細胞)産物の製造前にTreg細胞を枯渇させることを含む。
理論に縛られることを意図しないが、アフェレーシス前又はCAR発現細胞産物の製造工程中の対象における免疫細胞の負のレギュレーターのレベルの減少(例えば、不要な免疫細胞、例えばTreg細胞の数の減少)は、対象の再発リスクを低下させることができる。一部の実施形態において、対象は、CAR発現細胞産物製造のための細胞採取前にTreg細胞を減らす1つ以上の治療で前処置されており、それにより対象がCAR発現細胞処置を再び必要とするリスクを低減する。一部の実施形態では、Treg細胞を減少させる方法は、シクロホスファミド、抗GITR抗体、CD25枯渇又はそれらの組み合わせの1つ以上の対象への投与を含むが、これに限定されない。一部の実施形態では、Treg細胞を減少させる方法は、シクロホスファミド、抗GITR抗体、CD25枯渇又はそれらの組み合わせの1つ以上の対象への投与を含むが、これに限定されない。シクロホスファミド、抗GITR抗体、CD25枯渇又はそれらの組み合わせの1つ以上の投与は、CAR発現細胞産物注入前、注入中又は注入後に行うことができる。シクロホスファミド、抗GITR抗体、CD25枯渇又はそれらの組み合わせの1つ以上の投与は、CAR発現細胞産物注入前、注入中又は注入後に行うことができる。
一部の実施形態において、製造方法は、CAR発現細胞製造前のTreg細胞の数の減少(例えば、枯渇)を含む。例えば、製造方法は、例えば、サンプル、例えばアフェレーシスサンプルと抗GITR抗体及び/又は抗CD25抗体(若しくはそのフラグメント又はCD25結合リガンド)を接触させ、CAR発現細胞(例えば、T細胞、NK細胞)産物の製造前にTreg細胞を枯渇させることを含む。
一部の実施形態において、対象は、CAR発現細胞産物製造のための細胞の採取前にシクロホスファミドで前処置され、それにより対象がCAR発現細胞処置(例えば、CTL019処置)を再び必要とするリスクを低減する。一部の実施形態では、対象は、CAR発現細胞(例えば、T細胞又はNK細胞)産物製造のための細胞の採取前に抗GITR抗体で前処置され、それにより対象がCAR発現細胞処置を再び必要とするリスクを低減する。
一部の実施形態において、CAR発現細胞(例えば、T細胞、NK細胞)製造プロセスは、CAR発現細胞(例えば、T細胞、NK細胞)産物(例えば、CTL019産物)の製造前にTreg細胞を枯渇させるように修飾される。一部の実施形態では、CD25枯渇を使用して、CAR発現細胞(例えば、T細胞、NK細胞)産物(例えば、CTL019産物)の製造前に、Treg細胞を枯渇させる。
一部の実施形態において、除去すべき細胞の集団は、制御性T細胞又は腫瘍細胞ではなく、CART細胞の増殖及び/又は機能に他にマイナスに影響する細胞、例えばCD14、CD11b、CD33、CD15又は潜在的免疫抑制性細胞により発現される他のマーカーを発現する細胞である。一部の実施形態では、このような細胞は、制御性T細胞及び/若しくは腫瘍細胞と同時に、又は前記枯渇後、又は別の順番で除去することが意図される。
本明細書に記載の方法は、2つ以上の選択ステップ、例えば2つ以上の枯渇ステップを含み得る。ネガティブ選択によるT細胞集団の濃縮は、例えば、ネガティブ選択される細胞に独特な表面マーカーを指向する抗体の組み合わせにより達成することができる。1つの方法は、ネガティブ選択される細胞に存在する細胞表面マーカーを指向するモノクローナル抗体のカクテルを使用する陰性磁気免疫粘着又はフローサイトメトリーによる細胞選別及び/又は選択である。例えば、ネガティブ選択によりCD4+細胞を富化するために、モノクローナル抗体カクテルは、CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR及びCD8に対する抗体を含み得る。
本明細書に記載の方法は、腫瘍抗原、例えばCD25を含まない腫瘍抗原、例えばCD19、CD30、CD38、CD123、CD20、CD14又はCD11bを発現する細胞の集団からの除去をさらに含み、それによりCAR、例えば本明細書に記載のCARの発現に好適なT制御性枯渇、例えばCD25+枯渇又はCD25high枯渇及び腫瘍抗原枯渇細胞の集団を提供する。一部の実施形態では、腫瘍抗原発現細胞は、T制御性、例えばCD25+細胞又はCD25high細胞と同時に除去される。例えば、抗CD25抗体又はそのフラグメント及び抗腫瘍抗原抗体又はそのフラグメントを同じ基質、例えばビーズに結合することができ、これを細胞の除去に使用することができるか、或いは抗CD25抗体若しくはそのフラグメント又は抗腫瘍抗原抗体若しくはそのフラグメントを別のビーズに結合することができ、その混合物を細胞の除去に使用することができる。他の実施形態では、T制御性細胞、例えばCD25+細胞又はCD25high細胞の除去及び腫瘍抗原発現細胞の除去は逐次的であり、例えばいずれの順番でも起こり得る。
チェックポイント阻害剤、例えば本明細書に記載のチェックポイント阻害剤を発現する細胞、例えばPD1+細胞、LAG3+細胞及びTIM3+細胞の1つ以上の集団からの除去を含み、それによりT制御性枯渇、例えばCD25+枯渇細胞及びチェックポイント阻害剤枯渇細胞、例えばPD1+、LAG3+及び/又はTIM3+枯渇細胞の集団を提供する方法も提供される。例示的なチェックポイント阻害剤としては、PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例えば、CEACAM-1、CEACAM-3及び/又はCEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14又はCD270)、KIR、A2aR、MHCクラスI、MHCクラスII、GAL9、アデノシン及びTGF(例えば、TGFβ)、例えば本明細書に記載されるようなものが挙げられる。一実施形態において、チェックポイント阻害剤発現細胞は、T制御性、例えばCD25+細胞又はCD25high細胞と同時に除去される。例えば、抗CD25抗体又はそのフラグメント及び抗チェックポイント阻害剤抗体又はそのフラグメントを同じビーズに結合することができ、それを細胞の除去に使用することができるか、又は抗CD25抗体若しくはそのフラグメント及び抗チェックポイント阻害剤抗体若しくはそのフラグメントを別のビーズに結合することができ、その混合物を細胞の除去に使用することができる。他の実施形態では、T制御性細胞、例えばCD25+細胞又はCD25high細胞の除去及びチェックポイント阻害剤発現細胞の除去は逐次的であり、例えばいずれの順番でも起こり得る。
本明細書に記載の方法は、ポジティブ選択ステップを含み得る。例えば、T細胞を、所望のT細胞のポジティブ選択に十分な時間、Dynabeads(登録商標)M-450 CD3/CD28 Tなどの抗CD3/抗CD28(例えば、3x28)コンジュゲートビーズと一緒にインキュベーションすることにより単離することができる。一部の実施形態では、時間は、約30分である。一部の実施形態では、時間は、30分~36時間又はそれより長い範囲及びその間の全部の整数値である。一部の実施形態では、時間は、少なくとも1時間、2時間、3時間、4時間、5時間又は6時間である。一部の実施形態では、時間は、10~24時間、例えば24時間である。腫瘍組織又は免疫不全状態の個体から腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)を単離する場合のように、他の細胞型と比較してT細胞が少ないあらゆる状況において、T細胞を単離するために長いインキュベーション時間が使用され得る。さらに、長いインキュベーション時間の使用は、CD8+T細胞の捕獲効率を高め得る。そのため、単にT細胞をCD3/CD28ビーズと結合させる時間を短縮若しくは延長し、且つ/又はビーズ対T細胞比を増加又は減少させる(本明細書に詳しく記載される通り)ことにより、培養開始時又はプロセス中の他の時点でT細胞の亜集団を優先的に又はその反対に選択することができる。加えて、ビーズ若しくは他の表面上の抗CD3及び/又は抗CD28抗体比を増加又は減少させることにより、培養開始時又は他の所望の時点でT細胞の亜集団を優先的に又はその反対に選択することができる。
一実施形態において、IFN-γ、TNFα、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、グランザイムB及びパーフォリン又は他の適切な分子、例えば他のサイトカインの1つ以上を発現するT細胞集団を選択することができる。細胞発現についてスクリーニングする方法は、例えば、国際公開第2013/126712号パンフレットに記載される方法により決定することができる。
ポジティブ又はネガティブ選択により所望の細胞の集団を単離するために、細胞及び表面(例えば、ビーズなどの粒子)の濃度は変わり得る。一部の実施形態において、細胞とビーズの最大接触を確実にするために、ビーズと細胞を一緒に混合する体積を有意に低下させる(例えば、細胞の濃度を増加させる)ことが望ましい場合もある。例えば、一部の実施形態では、100億細胞/ml、90億/ml、80億/ml、70億/ml、60億/ml又は50億/mlの濃度が使用される。一部の実施形態では、10億細胞/mlの濃度が使用される。一部の実施形態では、7500万、8000万、8500万、9000万、9500万又は1億細胞/mlの細胞濃度が使用される。一部の実施形態では、1億2500万又は1億5000万細胞/mlの濃度が使用され得る。
高濃度を使用して、細胞収率、細胞活性化及び細胞増殖を増加することができる。さらに、高細胞濃度の使用は、CD28陰性T細胞などの目的の標的抗原を弱く発現し得る細胞の又は多くの腫瘍細胞が存在するサンプル(例えば、白血病性血液、腫瘍組織など)からのより効率的な捕獲を可能にする。このような細胞集団は、治療価値を有し得るため、取得することが望ましい。例えば、高濃度細胞の使用は、通常CD28発現が弱いCD8+T細胞のより効率的な選択を可能にする。
一部の実施形態において、低濃度の細胞を使用することが望ましい場合がある。T細胞と表面(例えば、ビーズなどの粒子)の混合物を有意に希釈することにより、粒子と細胞の相互作用が最小化される。これは、粒子に結合する所望の抗原を高量で発現する細胞について選択する。例えば、CD4+T細胞は、高レベルのCD28を発現し、希釈濃度でCD8+T細胞より効率的に捕獲される。一部の実施形態では、使用する細胞の濃度は、5×106/mlである。一部の実施形態では、使用する濃度は、約1×105/ml~1×106/ml及びその間の任意の整数値であり得る。
一部の実施形態において、2~10℃又は室温のいずれかにおいて様々な長さの時間にわたり様々な速度のローテータ上で細胞をインキュベートし得る。
一部の実施形態において、集団の複数の免疫エフェクター細胞は、ジアグリセロールキナーゼ(DGK)を発現せず、例えばDGK欠損性である。一部の実施形態では、集団の複数の免疫エフェクター細胞は、Ikarosを発現せず、例えばIkaros欠損性である。一部の実施形態では、集団の複数の免疫エフェクター細胞は、DGK及びIkarosを発現せず、例えばDGK及びIkaros両方の欠損性である。
刺激のためのT細胞は、洗浄ステップ後に凍結させることもできる。理論に縛られることを意図しないが、凍結及びそれに続く解凍ステップは、細胞集団から顆粒球を、またある程度まで単球を除去することにより、より均一な産物を取得する。血漿及び血小板を除去する洗浄ステップ後、細胞を凍結溶液に懸濁することができる。多くの凍結溶液及びパラメーターが当技術分野で知られ、これに関連して有用であり、ある方法は、20%DMSO及び8%ヒト血清アルブミンを含むPBS又は10%Dextran 40及び5%デキストロース、20%ヒト血清アルブミン及び7.5%DMSO又は31.25%Plasmalyte-A、31.25%デキストロース5%、0.45%NaCl、10%Dextran 40及び5%デキストロース、20%ヒト血清アルブミン及び7.5%DMSOを含む培養培地又は例えばHespan及びPlasmaLyte Aを含む他の適当な細胞凍結媒体を使用することを伴い、次いで細胞を1°/分の速度で-80℃に凍結し、液体窒素貯蔵タンクの気相に保存する。制御凍結の他の方法も、直ちに-20℃又は液体窒素の非制御凍結と同様に使用することができる。
一部の実施形態において、凍結保存細胞を本明細書に記載されるように解凍し、洗浄し、本発明の方法を使用する活性化前に室温で1時間休息させる。
本発明に関連して、本明細書に記載されるような増殖細胞が必要となり得る時点前の期間における、対象からの血液サンプル又はアフェレーシス産物の採取も企図されている。従って、増殖させようとする細胞の供給源は、必要な任意の時点で採取することができ、T細胞などの所望の細胞は、本明細書に記載のものなど、免疫エフェクター細胞治療からの利益があるであろう任意の数の疾患又は状態について、免疫エフェクター細胞治療におけるその後の使用のために単離及び凍結することができる。一部の実施形態では、血液サンプル又はアフェレーシスは、概して健常な対象から採取する。一部の実施形態では、血液サンプル又はアフェレーシスは、疾患を発症するリスクにあるが、依然として疾患を発症していない、概して健常な対象から採取し、目的の細胞をその後の使用のために単離及び凍結する。一部の実施形態では、T細胞を増殖、凍結し、後の時点で使用することができる。一部の実施形態では、サンプルは、本明細書に記載されるような特定の疾患の診断の直後且つ何らかの処置前に患者から採取する。一部の実施形態では、任意の数の関連する処置モダリティー前に対象からの血液サンプル又はアフェレーシスから細胞を単離し、こうした処置モダリティーとして、限定されないが、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法剤、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレート及びFK506などの免疫抑制剤、抗体又は他の免疫除去剤、例えばCAMPATH、抗CD3抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228及び照射などの薬剤による処置が挙げられる。
本発明の一部の実施形態において、T細胞は、対象に機能的T細胞を残す処置後、患者から直接取得する。この点について、特定の癌処置、特に免疫系を損傷させる薬物での処置後、処置後間もなく、患者が通常その処置から回復するまでの間、得られるT細胞の品質がエクスビボで増殖する能力について最適であるか又は改善され得ることが観察されている。同様に、本明細書に記載の方法を使用するエクスビボ操作後、これらの細胞は、生着及びインビボ増殖増強について好ましい状態であり得る。このように、本発明に関連して、T細胞、樹状細胞又は造血細胞系統の他の細胞を含む血液細胞をこの回復期に採取することが企図される。さらに、一部の実施形態では、可動化(例えば、GM-CSFでの可動化)及びコンディショニングレジメンを使用して、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生及び/又は増殖に好都合である条件を、特に、治療後の定められた時間枠中に対象において形成することができる。細胞型の例としては、T細胞、B細胞、樹状細胞及び免疫系の他の細胞が挙げられる。
一部の実施形態において、CAR分子、例えば本明細書に記載のCAR分子を発現する免疫エフェクター細胞は、低い、免疫増強用量のmTOR阻害剤を受けた対象から取得する。一部の実施形態において、CARを発現するように操作しようとする免疫エフェクター細胞の集団、例えばT細胞は、対象中の又は対象から採取したPD1陰性免疫エフェクター細胞、例えばT細胞のレベル又はPD1陰性免疫エフェクター細胞、例えばT細胞/PD1陽性免疫エフェクター細胞、例えばT細胞の比が少なくとも一過性に増加するように、低い、免疫増強用量のmTOR阻害剤の投薬から十分な時間後又は十分な投薬後に採取する。
他の実施形態では、CARを発現するように操作されているか又は操作される免疫エフェクター細胞、例えばT細胞の集団を、PD1陰性免疫エフェクター細胞、例えばT細胞の数を増加させるか、又はPD1陰性免疫エフェクター細胞、例えばT細胞/PD1陽性免疫エフェクター細胞、例えばT細胞の比を増大する量のmTOR阻害剤と接触させることにより、エクスビボで処理することができる。
本願の方法は、5%以下、例えば2%の、ヒトAB血清を含む培養培地条件を利用することができ、既知培養培地条件及び組成物、例えばSmith et al.,“Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS(商標)Immune Cell Serum Replacement”Clinical&Translational Immunology(2015)4,e31;doi:10.1038/cti.2014.31に記載のものを用いることができることは認識される。
一部の実施形態において、本願の方法は、少なくとも約0.1%、0.5%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、6%、7%、8%、9%又は10%の血清を含む培地条件を利用することができる。一部の実施形態では、培地は、約0.5%~5%、約0.5%~4.5%、約0.5%~4%、約0.5%~3.5%、約0.5%~3%、約0.5%~2.5%、約0.5%~2%、約0.5%~1.5%、約0.5%~1.0%、約1.0%~5%、約1.5%~5%、約2%~5%、約2.5%~5%、約3%~5%、約3.5%~5%、約4%~5%又は約4.5%~5%の血清を含む。一部の実施形態では、培地は、約0.5%の血清を含む。一部の実施形態では、培地は、約0.5%の血清を含む。一部の実施形態では、培地は、約1%の血清を含む。一部の実施形態では、培地は、約1.5%の血清を含む。一部の実施形態では、培地は、約2%の血清を含む。一部の実施形態では、培地は、約2.5%の血清を含む。一部の実施形態では、培地は、約3%の血清を含む。一部の実施形態では、培地は、約3.5%の血清を含む。一部の実施形態では、培地は、約4%の血清を含む。一部の実施形態では、培地は、約4.5%の血清を含む。一部の実施形態では、培地は、約5%の血清を含む。一部の実施形態では、血清は、ヒト血清、例えばヒトAB血清を含む。一部の実施形態では、血清は、採取後に自然凝固させたヒト血清、例えばoff-the-clot(OTC)血清である。一部の実施形態では、血清は、血漿由来血清ヒト血清である。血漿由来血清は、抗凝固剤、例えばクエン酸ナトリウムの存在下で採取されて、プールされたヒト血漿の脱線維によって生成することができる。
一部の実施形態において、本願の方法は、無血清培地を含む培地条件を利用することができる。一部の実施形態において、無血清培地は、OpTmizer(商標)CTS(商標)(LifeTech)、Immunocult(商標)XF(Stemcell technologies)、CellGro(商標)(CellGenix)、TexMacs(商標)(Miltenyi)、Stemline(商標)(Sigma)、Xvivo15(商標)(Lonza)、PrimeXV(商標登録)(Irvine Scientific)又はStemXVivo(商標登録)(RandD systems)である。無血清培地には、LifeTechのICSR(免疫細胞血清代替品)などの血清代替品を添加することができる。血清代替品(例えば、ICSR)のレベルは、例えば、最大5%、例えば約1%、2%、3%、4%又は5%であり得る。一部の実施形態において、無血清培地は、血清、例えばヒト血清、例えばヒトAB血清を添加し得る。一部の実施形態では、血清は、採取後に自然凝固させたヒト血清、例えばoff-the-clot(OTC)血清である。一部の実施形態では、血清は、血漿由来ヒト血清である。血漿由来血清は、抗凝固剤、例えばクエン酸ナトリウムの存在下で採取されて、プールされたヒト血漿の脱線維によって生成することができる。
一部の実施形態において、T細胞集団は、ジアグリセロールキナーゼ(DGK)欠損である。DGK欠損細胞は、DGK RNA又はタンパク質を発現しないか、又はDGK活性が低減若しくは阻害された細胞を含む。DGK欠損細胞は、DGK発現を低減又は阻止するための遺伝的手法、例えばRNA干渉剤、例えばsiRNA、shRNA、miRNAの投与により作製することができる。代わりに、DGK欠損細胞は、本明細書に記載のDGK阻害剤での処理により作製することもできる。
一部の実施形態において、T細胞集団は、イカロス欠損である。イカロス欠損細胞は、イカロスRNA又はタンパク質を発現しないか、又はイカロス活性が低下した又は阻害された細胞を含み、イカロス欠損細胞は、イカロス発現を低減又は阻止するための遺伝的手法、例えばRNA干渉剤、例えばsiRNA、shRNA、miRNAの投与により作製することができる。代わりに、イカロス欠損細胞は、イカロス阻害剤、例えばレナリドマイドでの処理により作製することができる。
複数の実施形態において、T細胞集団は、DGK欠損及びイカロス欠損であり、例えばDGK及びイカロスを発現しないか、又はDGK及びイカロス活性が低減若しくは阻害されている。このようなDGK及びイカロス欠損細胞は、本明細書に記載の方法のいずれかにより作製することができる。
一部の実施形態では、NK細胞を対象から取得する。一部の実施形態では、NK細胞は、NK細胞株、例えばNK-92細胞株(Conkwest)である。
同種CAR発現細胞
本明細書に記載の複数の実施形態において、免疫エフェクター細胞は、同種免疫エフェクター細胞、例えばT細胞又はNK細胞であり得る。例えば、細胞は、同種T細胞、例えば機能的T細胞受容体(TCR)及び/又はヒト白血球抗原(HLA)、例えばHLAクラスI及び/又はHLAクラスIIの発現を欠く同種T細胞であり得る。
本明細書に記載の複数の実施形態において、免疫エフェクター細胞は、同種免疫エフェクター細胞、例えばT細胞又はNK細胞であり得る。例えば、細胞は、同種T細胞、例えば機能的T細胞受容体(TCR)及び/又はヒト白血球抗原(HLA)、例えばHLAクラスI及び/又はHLAクラスIIの発現を欠く同種T細胞であり得る。
機能的TCRを欠くT細胞は、例えば、その表面に何ら機能的TCRを発現しないように操作され、機能的TCRを含む1つ以上のサブユニットを発現しないように操作される(例えば、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、TCRε及び/又はTCRζの発現がない(又は発現の減少を示す)ように操作される)か、又はその表面にごくわずかな機能的TCRを産生するように操作され得る。代わりに、T細胞は、例えば、TCRのサブユニットの1つ以上の変異型又は切断型の発現により、実質的に障害されたTCRを発現し得る。用語「実質的に障害されたTCR」とは、このTCRが、宿主で有害な免疫反応を惹起しないことを意味する。
本明細書に記載のT細胞は、例えば、その表面に機能的HLAを発現しないように操作され得る。例えば、本明細書に記載のT細胞は、細胞表面発現HLA、例えばHLAクラス1及び/又はHLAクラスIIが下方制御されるように操作され得る。一部の実施形態において、HLAの下方制御は、β-2ミクログロブリン(B2M)の発現の減少又は排除を伴い得る。
一部の実施形態において、T細胞は、機能的TCR及び機能的HLA、例えばHLAクラスI及び/又はHLAクラスIIを欠き得る。
機能的TCR及び/又はHLAの発現を欠く修飾T細胞は、TCR又はHLAの1つ以上のサブユニットのノックアウト又はノックダウンを含む、任意の適当な手段により得ることができる。例えば、T細胞は、siRNA、shRNA、群生性等間隔短回文反復配列(CRISPR)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)又は亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ZFN)を使用して、TCR及び/又はHLAのノックダウンを含み得る。
一部の実施形態において、同種細胞は、例えば、本明細書に記載の方法のいずれかにより、阻害性分子を発現しないか、又は低レベルで発現する細胞であり得る。例えば、細胞は、例えば、CAR発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を低下し得る、阻害分子を発現しないか、又は低レベルで発現する細胞であり得る。阻害分子の例は、PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例えば、CEACAM-1、CEACAM-3及び/又はCEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14又はCD270)、KIR、A2aR、MHCクラスI、MHCクラスII、GAL9、アデノシン及びTGF(例えば、TGFβ)を含む。例えば、DNA、RNA又はタンパク質レベルでの阻害による、阻害分子の阻害は、CAR発現細胞性能を最適化できる。複数の実施形態において、例えば本明細書に記載されるような、阻害性核酸、例えば阻害性核酸、例えばdsRNA、例えばsiRNA若しくはshRNA、群生性等間隔短回文反復配列(CRISPR)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)又は亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ZFN)を使用することができる。
TCR又はHLAを阻害するためのsiRNA及びshRNA
一部の実施形態において、TCR発現及び/又はHLA発現を、細胞、例えばT細胞における、TCR及び/若しくはHLA並びに/又は本明細書に記載の阻害分子(例えば、PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例えば、CEACAM-1、CEACAM-3及び/又はCEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14又はCD270)、KIR、A2aR、MHCクラスI、MHCクラスII、GAL9、アデノシン及びTGFβ)をコードする核酸を標的とするsiRNA又はshRNAを使用して、阻害することができる。
一部の実施形態において、TCR発現及び/又はHLA発現を、細胞、例えばT細胞における、TCR及び/若しくはHLA並びに/又は本明細書に記載の阻害分子(例えば、PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例えば、CEACAM-1、CEACAM-3及び/又はCEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14又はCD270)、KIR、A2aR、MHCクラスI、MHCクラスII、GAL9、アデノシン及びTGFβ)をコードする核酸を標的とするsiRNA又はshRNAを使用して、阻害することができる。
siRNA及びshRNAの発現系及び例示的なshRNAのための発現系は、例えば、2015年3月13日に出願された国際公開第2015/142675号パンフレットの段落649及び650に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
TCR又はHLAを阻害するためのCRISPR
本明細書で使用する「CRISPR」又は「TCR及び/又はHLAに対するCRISPR」又は「TCR及び/又はHLAを阻害するためのCRISPR」は、一連の群生性等間隔短回文反復配列又はこのような一連の反復を含む系を指す。本明細書で使用する「Cas」は、CRISPR関連タンパク質を指す。「CRISPR/Cas」系は、細胞、例えばT細胞における、TCR及び/若しくはHLA遺伝子並びに/又は本明細書に記載の阻害分子(例えば、PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例えば、CEACAM-1、CEACAM-3及び/又はCEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14又はCD270)、KIR、A2aR、MHCクラスI、MHCクラスII、GAL9、アデノシン及びTGFβ)の発現抑制又は変異に使用することができる、CRISPR及びCas由来の系を指す。
本明細書で使用する「CRISPR」又は「TCR及び/又はHLAに対するCRISPR」又は「TCR及び/又はHLAを阻害するためのCRISPR」は、一連の群生性等間隔短回文反復配列又はこのような一連の反復を含む系を指す。本明細書で使用する「Cas」は、CRISPR関連タンパク質を指す。「CRISPR/Cas」系は、細胞、例えばT細胞における、TCR及び/若しくはHLA遺伝子並びに/又は本明細書に記載の阻害分子(例えば、PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例えば、CEACAM-1、CEACAM-3及び/又はCEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14又はCD270)、KIR、A2aR、MHCクラスI、MHCクラスII、GAL9、アデノシン及びTGFβ)の発現抑制又は変異に使用することができる、CRISPR及びCas由来の系を指す。
CRISPR/Casシステム及びその使用は、例えば、2015年3月13日に出願された国際公開第2015/142675号パンフレットの段落651~658に記載され、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
TCR及び/又はHLAを阻害するためのTALEN
「TALEN」又は「HLA及び/又はTCRに対するTALEN」又は「HLA及び/又はTCRを阻害するためのTALEN」は、細胞、例えばT細胞における、HLA及び/若しくはTCR遺伝子並びに/又は本明細書に記載の阻害分子(例えば、PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例えば、CEACAM-1、CEACAM-3及び/又はCEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14又はCD270)、KIR、A2aR、MHCクラスI、MHCクラスII、GAL9、アデノシン及びTGFβ)の編集に使用することができる人工ヌクレアーゼである、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼを指す。
「TALEN」又は「HLA及び/又はTCRに対するTALEN」又は「HLA及び/又はTCRを阻害するためのTALEN」は、細胞、例えばT細胞における、HLA及び/若しくはTCR遺伝子並びに/又は本明細書に記載の阻害分子(例えば、PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例えば、CEACAM-1、CEACAM-3及び/又はCEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14又はCD270)、KIR、A2aR、MHCクラスI、MHCクラスII、GAL9、アデノシン及びTGFβ)の編集に使用することができる人工ヌクレアーゼである、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼを指す。
TALEN及びその使用は、例えば、2015年3月13日に出願された国際公開第2015/142675号パンフレットの段落659~665に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
HLA及び/又はTCRを阻害するための亜鉛フィンガーヌクレアーゼ
「ZFN」又は「亜鉛フィンガーヌクレアーゼ」又は「HLA及び/又はTCRに対するZFN」又は「HLA及び/又はTCRを阻害するためのZFN」は、細胞、例えばT細胞における、HLA及び/若しくはTCR遺伝子並びに/又は本明細書に記載の阻害分子(例えば、PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例えば、CEACAM-1、CEACAM-3及び/又はCEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14又はCD270)、KIR、A2aR、MHCクラスI、MHCクラスII、GAL9、アデノシン及びTGFβ)の編集に使用することができる人工ヌクレアーゼである、亜鉛フィンガーヌクレアーゼを指す。
「ZFN」又は「亜鉛フィンガーヌクレアーゼ」又は「HLA及び/又はTCRに対するZFN」又は「HLA及び/又はTCRを阻害するためのZFN」は、細胞、例えばT細胞における、HLA及び/若しくはTCR遺伝子並びに/又は本明細書に記載の阻害分子(例えば、PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例えば、CEACAM-1、CEACAM-3及び/又はCEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14又はCD270)、KIR、A2aR、MHCクラスI、MHCクラスII、GAL9、アデノシン及びTGFβ)の編集に使用することができる人工ヌクレアーゼである、亜鉛フィンガーヌクレアーゼを指す。
ZFN及びその使用は、例えば、2015年3月13日に出願された国際公開第2015/142675号パンフレットの段落666~671に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
テロメラーゼ発現
テロメアは、体細胞の持続に重要な役割を果たし、その長さはテロメラーゼ(TERT)によって維持される。CLL細胞のテロメア長は非常に短い可能性があり(Roth et al.,“Significantly shorter telomeres in T-cells of patients with ZAP-70+/CD38 chronic lymphocytic leukaemia”British Journal of Haematology,143,383-386.,August 28 2008)、製造されたCAR発現細胞、例えばCART19細胞ではさらに短くなる可能性があるため、患者への養子移入後にそれが増殖する可能性が制限される。テロメラーゼの発現は、CAR発現細胞を複製疲弊から救済することができる。
テロメアは、体細胞の持続に重要な役割を果たし、その長さはテロメラーゼ(TERT)によって維持される。CLL細胞のテロメア長は非常に短い可能性があり(Roth et al.,“Significantly shorter telomeres in T-cells of patients with ZAP-70+/CD38 chronic lymphocytic leukaemia”British Journal of Haematology,143,383-386.,August 28 2008)、製造されたCAR発現細胞、例えばCART19細胞ではさらに短くなる可能性があるため、患者への養子移入後にそれが増殖する可能性が制限される。テロメラーゼの発現は、CAR発現細胞を複製疲弊から救済することができる。
いずれか特定の理論に縛られることを意図しないが、一部の実施形態において、治療用T細胞は、T細胞中の短縮されたテロメアのために、患者における持続性が短期であり;従って、テロメラーゼ遺伝子を用いたトランスフェクションにより、T細胞のテロメアを延長し、患者におけるT細胞の持続性を改善することができる。Carl June,“Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic”,Journal of Clinical Investigation,117:1466-1476(2007)を参照されたい。そのため、一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞、例えばT細胞は、異所性にテロメラーゼサブユニットを、例えばテロメラーゼの触媒的サブユニット、例えばTERT、例えばhTERTを発現する。一部の実施形態では、本開示は、細胞と、テロメラーゼサブユニット、例えばテロメラーゼの触媒的サブユニット、例えばTERT、例えばhTERTをコードする核酸を接触させることを含む、CAR発現細胞を生産する方法を提供する。細胞は、CARをコードする構築物と接触させる前、それと同時又はその後に核酸と接触させることができる。
テロメラーゼの発現は安定しているか(例えば、核酸が細胞のゲノムに組み込まれ得る)又は一過性である(例えば、核酸が組み込まれず、一定の時間、例えば数日後に発現が低下する)可能性がある。安定した発現は、テロメラーゼサブユニット及び選択可能なマーカーをコードするDNAで細胞をトランスフェクト又は形質導入し、安定な組み込み体を選択することによって達成され得る。これに代わり又はこれと組み合わせて、安定した発現は、例えば、Cre/Lox又はFLP/FRTシステムを使用した、部位特異的組換えによって達成され得る。
一過性の発現は、核酸、例えばDNA又はmRNAなどのRNAによるトランスフェクション又は形質導入を含み得る。一部の実施形態において、一過性のmRNAトランスフェクションは、TERTによる安定したトランスフェクションに関連する場合のある遺伝的不安定性を回避する。外因性テロメラーゼ活性の一過性発現は、例えば、国際公開第2014/130909号パンフレットに記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。複数の実施形態において、テロメラーゼサブユニットのmRNAベースのトランスフェクションは、Moderna Therapeuticsによって商品化されたメッセンジャーRNA Therapeutics(商標)プラットフォームに従って実施される。例えば、この方法は、米国特許第8710200号明細書、同第8822663号明細書、同第8680069号明細書、同第8754062号明細書、同第8664194号明細書又は同第8680069号明細書に記載の方法であり得る。
一部の実施形態において、hTERTは、GenBankタンパク質ID AAC51724.1のアミノ酸配列を有する(Meyerson et al.,“hEST2,the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene,Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization”Cell Volume 90,Issue 4,22 August 1997,Pages 785-795)。
一部の実施形態において、hTERTは、配列番号284の配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一の配列を有する。一部の実施形態において、hTERTは、配列番号284の配列を有する。一実施形態において、hTERTは、N末端、C末端又は両方に欠失(例えば、5、10、15、20又は30アミノ酸以下)を含む。一部の実施形態において、hTERTは、N末端、C末端又は両方にトランスジェニックアミノ酸配列(例えば、5、10、15、20又は30アミノ酸以下)を含む。
一部の実施形態において、hTERTは、GenBank受託番号AF018167の核酸配列によりコードされる(Meyerson et al.,“hEST2,the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene,Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization”Cell Volume 90,Issue 4,22 August 1997,Pages 785-795)。
免疫エフェクター細胞(例えばT細胞)の活性化及び増殖
本明細書に記載の方法により生成又は濃縮されたT細胞などの免疫エフェクター細胞は、例えば、米国特許第6,352,694号明細書;同第6,534,055号明細書;同第6,905,680号明細書;同第6,692,964号明細書;同第5,858,358号明細書;同第6,887,466号明細書;同第6,905,681号明細書;同第7,144,575号明細書;同第7,067,318号明細書;同第7,172,869号明細書;同第7,232,566号明細書;同第7,175,843号明細書;同第5,883,223号明細書;同第6,905,874号明細書;同第6,797,514号明細書;同第6,867,041号明細書;及び米国特許出願公開第20060121005号明細書に記載する方法を使用して、一般的に活性化及び増殖され得る。
本明細書に記載の方法により生成又は濃縮されたT細胞などの免疫エフェクター細胞は、例えば、米国特許第6,352,694号明細書;同第6,534,055号明細書;同第6,905,680号明細書;同第6,692,964号明細書;同第5,858,358号明細書;同第6,887,466号明細書;同第6,905,681号明細書;同第7,144,575号明細書;同第7,067,318号明細書;同第7,172,869号明細書;同第7,232,566号明細書;同第7,175,843号明細書;同第5,883,223号明細書;同第6,905,874号明細書;同第6,797,514号明細書;同第6,867,041号明細書;及び米国特許出願公開第20060121005号明細書に記載する方法を使用して、一般的に活性化及び増殖され得る。
一般に、免疫エフェクター細胞の集団を、CD3/TCR複合体結合シグナルを刺激する薬剤が結合したその表面と、T細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドを接触させることにより増殖できる。特に、T細胞集団は、表面上に固定された抗CD3抗体若しくはその抗原結合フラグメント又は抗CD2抗体との接触又はカルシウムイオノフォアと組み合わせたタンパク質キナーゼCアクティベーター(例えば、ブリオスタチン)との接触により、本明細書に記載のように刺激し得る。T細胞表面上のアクセサリー分子の共刺激のために、アクセサリー分子と結合するリガンドである。例えば、T細胞集団を、T細胞の増殖刺激に適する条件下で抗CD3抗体及び抗CD28抗体と接触させ得る。CD4+T細胞又はCD8+T細胞の増殖を刺激するために、抗CD3抗体及び抗CD28抗体を使用できる。抗CD28抗体の例は、9.3、B-T3、XR-CD28を含み(Diaclone,Besancon,France)、当技術分野で一般に知られる他の方法のように使用できる(Berg et al.,Transplant Proc.30(8):3975-3977,1998;Haanen et al.,J.Exp.Med.190(9):13191328,1999;Garland et al.,J.Immunol Meth.227(1-2):53-63,1999)。
一部の実施形態において、T細胞のための一次刺激シグナル及び共刺激シグナルは、異なるプロトコルにより提供され得る。例えば、各シグナルを提供する薬剤は、溶液中でも表面と結合し得る。表面に結合しているとき、薬剤は、同じ表面(即ち「シス」形態)又は別の表面(即ち「トランス」形態)に結合し得る。代わりに、一方の薬剤が表面に結合し、他方が溶液にあり得る。一部の実施形態において、共刺激シグナルを提供する薬剤は、細胞表面に結合し、一次活性化シグナルを提供する薬剤は、溶液中であるか又は表面と結合する。一部の実施形態において、両剤は、溶液中にあり得る。一部の実施形態において、薬剤は、不溶性形態であり、Fc受容体又は抗体又は薬剤と結合する他の結合剤を発現する細胞などの表面に架橋され得る。この点に関して、例えば本発明におけるT細胞の活性化及び増殖のために意図される人工抗原提示細胞(aAPC)について、米国特許出願公開第20040101519号明細書及び同第20060034810号明細書を参照されたい。
一部の実施形態において、2剤は、ビーズに、同じビーズ、即ち「シス」又は別のビーズ、即ち「トランス」で固定化される。例として、一次活性化シグナルを提供する薬剤は、抗CD3抗体又はその抗原結合フラグメントであり、共刺激シグナルを提供する薬剤は、抗CD28抗体又はその抗原結合フラグメントであり、両剤は、均等な分子量で同じビーズに共固定化される。一部の実施形態において、CD4+T細胞増殖及びT細胞増殖のためのビーズに結合した1:1比の各抗体を使用する。本発明の一部の実施形態において、1:1比を使用して観察された増殖と比較して、T細胞増殖の増殖が観察されるように、ビーズに結合した抗CD3:CD28抗体の比を使用する。一部の実施形態において、1:1比を使用して観察された増殖と比較して約1~約3倍増加が観察される。一部の実施形態において、ビーズに結合したCD3:CD28抗体比は、100:1~1:100及びその間の全ての整数値の範囲である。一部の実施形態において、抗CD3抗体より多くの抗CD28抗体が粒子に結合しており、即ちCD3:CD28比が1未満である。一部の実施形態において、ビーズに結合した抗CD28抗体対抗CD3抗体比は、2:1より大きい。一部の実施形態において、ビーズに結合した1:100 CD3:CD28比の抗体を使用する。一部の実施形態において、ビーズに結合した1:75 CD3:CD28比の抗体を使用する。一部の実施形態において、ビーズに結合した1:50 CD3:CD28比の抗体を使用する。一部の実施形態において、ビーズに結合した1:30 CD3:CD28比の抗体を使用する。一部の実施形態において、ビーズに結合した1:10 CD3:CD28比の抗体を使用する。一部の実施形態において、ビーズに結合した1:3 CD3:CD28比の抗体を使用する。一部の実施形態において、ビーズに結合した3:1 CD3:CD28比の抗体を使用する。
1:500~500:1及びその間の任意の整数値の粒子対細胞比をT細胞又は他の標的細胞の刺激のために使用し得る。当業者に容易に認識され得るように、粒子対細胞比は、標的細胞に対する粒子径に依存し得る。例えば、小さいサイズのビーズは、少ない細胞にのみ結合でき、大きいビーズは、多く結合できる。一部の実施形態において、細胞対粒子比は、1:100~100:1及びその間の任意の整数値の範囲であり、一部の実施形態において1:9~9:1及びその間の任意の整数値からなる比をT細胞刺激に使用し得る。T細胞刺激をもたらす抗CD3及び抗CD28結合粒子対T細胞の比は、上記のように変わり得るが、しかしながら、ある好適な値は、1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1及び15:1を含み、1つの好適な比は少なくとも1:1粒子対T細胞である。一部の実施形態において、1:1以下の粒子対細胞比を使用する。一部の実施形態において、好適な粒子:細胞比は、1:5である。一部の実施形態において、粒子対細胞比は、刺激の日により変わり得る。例えば、一部の実施形態において、粒子対細胞比は、1日目は1:1~10:1であり、さらなる粒子をその後10日目まで連日又は隔日で細胞に添加し、最終比1:1~1:10である(添加の比の細胞数に基づく)。一部の実施形態において、粒子対細胞比は、刺激1日目に1:1であり、刺激3日目及び5日目に1:5に調節する。一部の実施形態において、粒子を、1日目の1:1及び刺激3日目及び5日目の1:5の最終比に基づき、連日又は隔日で添加する。一部の実施形態において、粒子対細胞比は、刺激1日目は2:1であり、刺激3日目及び5日目に1:10に調節する。一部の実施形態において、粒子を、1日目の1:1及び3日目及び5日目の1:10の最終比に基づき、連日又は隔日で添加する。当業者は、多様な他の比が本発明における使用に適し得ることを認識する。特に、比は、粒子径並びに細胞サイズ及びタイプによる。一部の実施形態において、使用するための最も典型的な比は、1日目の1:1、2:1及び3:1付近である。
一部の実施形態において、T細胞などの細胞を薬剤被覆ビーズと組み合わせ、ビーズ及び細胞をその後分離し、次いで細胞を培養する。一部の実施形態において、培養前に薬剤被覆ビーズ及び細胞を分離するが、一緒に培養する。一部の実施形態において、ビーズ及び細胞を磁気力などの力の適用によりまず濃縮し、細胞表面マーカーのライゲーションを増加させ、それにより細胞刺激を誘導する。
例として、細胞表面タンパク質を、抗CD3及び抗CD28が結合した常磁性ビーズ(3x28ビーズ)とT細胞を接触させることにより、ライゲートし得る。一部の実施形態において、細胞(例えば、104~109T細胞)及びビーズ(例えば、DynaビーズS(登録商標)M-450 CD3/CD28 T常磁性ビーズを1:1比)を緩衝液、例えばPBS(カルシウム及びマグネシウムなどの二価カチオンなし)中で合わせる。再び、任意の細胞濃度を使用し得ることが当業者に容易に認識され得る。例えば、標的細胞は、試料中で極めて稀であり、試料の0.01%のみが含まれるか又は試料全体(即ち100%)が目的の標的細胞で構成され得る。従って、あらゆる細胞数が本発明に関連して一体となる。一部の実施形態において、細胞と粒子との最大接触を確実にするために、粒子及び細胞を混合する体積を有意に減少させる(即ち細胞の濃度を高める)ことが望ましいことがある。例えば、一部の実施形態において、約100億細胞/ml、90億細胞/ml、80億細胞/ml、70億細胞/ml、60億細胞/ml、50億細胞/ml又は20億細胞/mlの濃度を使用する。一部の実施形態において、1億細胞/ml超を使用する。一部の実施形態において、1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万又は5000万細胞/mlの細胞濃度を使用する。一部の実施形態において、細胞の7500万、8000万、8500万、9000万、9500万又は1億細胞/mlの濃度を使用する。一部の実施形態において、1億2500万又は1億5000万細胞/mlの濃度を使用できる。高濃度を使用して、細胞収率、細胞活性化及び細胞増殖を増加できる。さらに、高細胞濃度の使用は、CD28陰性T細胞などの目的の標的抗原を弱く発現し得る細胞のより効率的な捕獲を可能にする。このような細胞集団は、治療的価値を有し得、及び特定の態様では得ることが望ましいであろう。例えば、高濃度細胞の使用は、通常、CD28発現が弱いCD8+T細胞のより効率的な選択を可能にする。
一部の実施形態において、CAR、例えば本明細書に記載のCAR、例えば本明細書に記載のCD19CARをコードする核酸が形質導入された細胞を例えば本明細書に記載の方法により増殖する。一部の実施形態において、細胞を数時間(例えば、約2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、15時間、18時間、21時間)~約14日(例えば、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日又は14日)の期間の培養により増殖する。一部の実施形態において、細胞は、4~9日の期間増殖される。一部の実施形態において、細胞は、8日以下、例えば7日、6日又は5日の期間増殖される。一部の実施形態において、細胞は、5日の培養により増殖され、得られた細胞は、同じ培養条件において9日間培養で増殖された同じ細胞よりも強力である。効力は、例えば、多様なT細胞機能、例えば増殖、標的細胞死、サイトカイン産生、活性化、遊走、表面CAR発現、CAR定量的PCR又はそれらの組み合わせにより規定され得る。一部の実施形態において、5日増殖された細胞、例えば本明細書に記載のCD19CAR細胞は、同じ培養条件下において9日間培養で増殖された同じ細胞と比較して、抗原刺激による細胞倍加の少なくとも1倍、2倍、3倍又は4倍増加を示す。一部の実施形態において、細胞、例えば本明細書に記載のCD19CAR発現細胞を発現する細胞は、5日の培養により増殖され、得られた細胞は、同じ培養条件下において9日間培養で増殖された同じ細胞と比較して、高い炎症誘発性サイトカイン産生、例えばIFN-γ及び/又はGM-CSFレベルを示す。一部の実施形態において、5日増殖された細胞、例えば本明細書に記載のCD19CAR細胞は、同じ培養条件下において9日間培養で増殖された同じ細胞と比較して、炎症誘発性サイトカイン産生、例えばIFN-γ及び/又はGM-CSFレベルのpg/mlで少なくとも1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍又はそれを超えて増加する。
T細胞の培養期間が60日以上となり得るような数サイクルの刺激も望まれ得る。T細胞培養に適する条件は、血清(例えば、胎児ウシ又はヒト血清)、インターロイキン-2(IL-2)、インスリン、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ及びTNF-α又は当業者に知られる細胞増殖のための任意の他の添加剤を含む、増殖及び生存能に必要な因子を含み得る、適切な培地(例えば、最小必須培地、α-MEM、RPMI培地1640、AIM-V、DMEM、F-12又はX-vivo15(Lonza)、X-Vivo20、OpTmizer及びIMDM)を含む。細胞の増殖のための他の添加剤は、界面活性剤、プラスマネート、及びN-アセチル-システイン、及び2-メルカプトエタノールなどの還元剤を含むが、これらに限定されない。培地は、限定されないが、無血清又は適切な量の血清(又は血漿)が添加されたか、又は規定されたセットのホルモン及び/又はT細胞の増殖及び拡大に十分な量のサイトカインが添加されたRPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo15、X-Vivo20、OpTmizer及びIMDMを含み得る。抗生物質、例えばペニシリン及びストレプトマイシンは、実験的培養においてのみ包含され、対象に注入すべき細胞の培養に含まれない。標的細胞は、増殖を支持するのに必要な条件、例えば適切な温度(例えば、37℃)及び雰囲気(例えば、空気+5%CO2)で維持される。
一部の実施形態において、細胞は、例えば、フローサイトメトリーなどの本明細書に記載の方法により測定して、14日の増殖期間にわたり、細胞の少なくとも200倍(例えば、200倍、250倍、300倍、350倍)増加をもたらす1つ以上のインターロイキンを含む適切な培地(例えば、本明細書に記載の培地)で増殖させる。一部の実施形態において、細胞は、IL-15及び/又はIL-7(例えば、IL-15及びIL-7)の存在下で増殖させる。
実施形態において、本明細書に記載の方法、例えばCAR発現細胞製造法は、T制御性細胞、例えばCD25+T細胞又はCD25highT細胞を、例えば抗CD25抗体又はそのフラグメント又はCD25結合リガンド、IL-2を使用して細胞集団から除去することを含む。細胞集団からT制御性細胞、例えばCD25+T細胞又はCD25highT細胞を除去する方法は、本明細書に記載される。実施形態において、方法、例えば製造法は、細胞集団(例えば、CD25+T細胞又はCD25highT細胞などのT制御性細胞が枯渇されている細胞集団;又は抗CD25抗体、そのフラグメント又はCD25結合リガンドと前に接触された細胞集団)とIL-15及び/又はIL-7との接触をさらに含む。例えば、細胞集団(例えば、抗CD25抗体、そのフラグメント又はCD25結合リガンドと先に接触されている)をIL-15及び/又はIL-7の存在下で増殖させる。
一部の実施形態において、本明細書に記載のCAR発現細胞を、インターロイキン-15(IL-15)ポリペプチド、インターロイキン-15受容体α(IL-15Ra)ポリペプチド又はIL-15ポリペプチドとIL-15Raポリペプチドの組み合わせ、例えばhetIL-15を含む組成物とCAR発現細胞の製造中に例えばエクスビボで接触させることを含む。実施形態において、本明細書に記載のCAR発現細胞をCAR発現細胞の製造中に例えばエクスビボで、IL-15ポリペプチドを含む組成物と接触させる。実施形態において、本明細書に記載のCAR発現細胞をCAR発現細胞の製造中に例えばエクスビボで、IL-15ポリペプチド及びIL-15Raポリペプチドの両方の組み合わせを含む組成物と接触させる。実施形態において、本明細書に記載のCAR発現細胞をCAR発現細胞の製造中に例えばエクスビボで、hetIL-15を含む組成物と接触させる。
一部の実施形態において、本明細書に記載のCAR発現細胞を、エクスビボ増殖中、hetIL-15を含む組成物と接触させる。一部の実施形態において、本明細書に記載のCAR発現細胞を、エクスビボ増殖中、IL-15ポリペプチドを含む組成物と接触させる。一部の実施形態において、本明細書に記載のCAR発現細胞を、エクスビボ増殖中、IL-15ポリペプチド及びIL-15Raポリペプチドの両方を含む組成物と接触させる。一部の実施形態において、接触は、リンパ球亜集団、例えばCD8+T細胞の生存及び増殖をもたらす。
種々の刺激時間に曝されているT細胞は、異なる特徴を示し得る。例えば、典型的な血液又はアフェレーシスした末梢血単核細胞産物は、細胞毒性又はサプレッサーT細胞集団(TC、CD8+)より大きいヘルパーT細胞集団(TH、CD4+)を有する。CD3及びCD28受容体での刺激によるT細胞のエクスビボ増殖は、約8~9日目前まで主にTH細胞からなるT細胞集団を産生するが、約8~9日目後、T細胞集団は、徐々に大きくなるTC細胞集団を含む。従って、処置の目的により、主にTH細胞を含むT細胞集団を対象に注入することは有利であり得る。同様に、TC細胞の抗原特異的サブセットが単離されている場合、このサブセットを大きい程度まで増殖させることが有利であり得る。
さらに、CD4及びCD8マーカーに加えて、他の表現型マーカーは、細胞増殖過程の経過中、有意に、しかし、主に再現性よく変化する。そうして、このような再現性は、特定の目的のために活性化T細胞産物をもたらす能力を可能とする。
本明細書に記載のCARが構築されると、適切なインビトロ及び動物モデルにおける抗原刺激後にT細胞を増殖させる能力、再刺激の非存在下でのT細胞増殖の持続及び抗癌活性など、しかし、これらに限定されない分子の活性を評価するために種々のアッセイが使用され得る。本発明のCARの効果を評価するためのアッセイは、以下にさらに詳細に記載される。
初代T細胞におけるCAR発現のウェスタンブロット分析は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる2015年3月13日に出願された国際公開第2015/142675号パンフレットの段落695に記載されるように、単量体及び二量体の存在を検出するために使用できる。
抗原刺激後のCAR+T細胞のインビトロ増殖をフローサイトメトリーにより測定できる。例えば、CD4+及びCD8+T細胞の混合物をαCD3/αCD28 aAPCで刺激し、続いて分析すべきプロモーターの制御下において、GFPを発現するレンチウイルスベクターで形質導入する。代表的プロモーターは、CMV IE遺伝子、EF-1α、ユビキチンC又はホスホグリセロキナーゼ(PGK)プロモーターを含む。GFP蛍光を、CD4+及び/又はCD8+T細胞サブセットの培養6日目にフローサイトメトリーによって評価する。例えば、Milone et al.,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)を参照されたい。代わりに、CD4+とCD8+T細胞の混合物を、0日目にαCD3/αCD28被覆磁気ビーズで刺激し、2Aリボソームスキッピング配列を使用するCARとeGFPを発現するバイシストロニックレンチウイルスベクターを使用して、1日目にCARを形質導入する。培養物を本明細書に記載されるような癌関連抗原+K562細胞(本明細書に記載されるような癌関連抗原を発現するK562)、野生型K562細胞(K562野生型)又は抗CD3及び抗CD28抗体存在下でhCD32及び4-1BBLを発現するK562細胞(K562-BBL-3/28)でのいずれかで再刺激する。外来性IL-2を、100IU/mlを隔日で培養物に添加する。GFP+T細胞を、ビーズベースの計数を使用するフローサイトメトリーにより数える。例えば、Milone et al.,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)を参照されたい。
再刺激非存在下の持続するCAR+T細胞増殖も測定できる。例えば、Milone et al.,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)を参照されたい。簡潔には、平均T細胞体積(fl)を、0日目のαCD3/αCD28被覆磁気ビーズでの刺激及び1日目の記載するCARの形質導入後、培養8日目にCoulter Multisizer III粒子カウンター若しくはより高いバージョン、Nexcelom Cellometer Vision、Millipore Scepter又は他の細胞カウンターを使用して測定する。
動物モデルも、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる2015年3月13日に出願された国際公開第2015/142675号パンフレットの段落698に記載されるように、CAR発現細胞活性の測定に使用できる。
用量依存的CAR処置応答は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる2015年3月13日に出願された国際公開第2015/142675号パンフレットの段落699に記載されるように、評価できる。
細胞増殖及びサイトカイン産生の評価は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる2015年3月13日に出願された国際公開第2015/142675号パンフレットの段落700に記載されるように、以前に説明されている。
細胞毒性は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる2015年3月13日に出願された国際公開第2015/142675号パンフレットの段落701に記載されるように、標準的51Cr放出アッセイによって評価できる。代替的な非放射性方法も利用することができる。
細胞毒性は、例えば、xCELLigenceリアルタイム細胞アナライザー(RTCA)を使用して、付着細胞の電気インピーダンスの変化を測定することによっても評価できる。一部の実施形態において、細胞毒性は複数の時点で測定される。
造影テクノロジーは、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる2015年3月13日に出願された国際公開第2015/142675号パンフレットの段落702に記載されるように、腫瘍担持動物モデルにおけるCARの特異的輸送及び増殖を評価するために使用することができる。
本明細書の実施例部分に記載のもの並びに当分野で知られるものを含む、他のアッセイも、本明細書に記載のCARの評価に使用できる。
ここに開示する方法の代わりに又はこれと組み合わせて、CARリガンドの使用を含む、CAR発現細胞(例えば、インビトロ又はインビボ(例えば、臨床モニタリング))、免疫細胞増殖及び/又は活性化及び/又はCAR特異的選択の1つ以上の検出及び/又は定量のための方法及び組成物が開示される。一部の実施形態において、CARリガンドは、CAR分子に結合する、例えば、CARの細胞外抗原結合ドメインに結合する抗体である(例えば、抗原結合ドメインに結合する抗体、例えば、抗イディオタイプ抗体;又は細胞外結合ドメインの定常領域に結合する抗体)。他の実施形態において、CARリガンドは、CAR抗原分子である(例えば、本明細書に記載されるようなCAR抗原分子)。
一部の実施形態において、CAR発現細胞を検出及び/又は定量する方法が開示される。例えば、CARリガンドは、インビトロ又はインビボでCAR発現細胞の検出及び/又は定量に使用できる(例えば、患者におけるCAR発現細胞の臨床モニタリング又は患者への投薬)。方法は、
CARリガンド(任意選択により、標識CARリガンド、例えば、タグ、ビーズ、放射活性又は蛍光標識を含むCARリガンド)を提供し;
CAR発現細胞を獲得し(例えば、製造サンプル又は臨床サンプルなどのCAR発現細胞含有サンプルの獲得);
CAR発現細胞とCARリガンドを、結合が生じる条件下で接触させ、それにより、存在するCAR発現細胞のレベル(例えば、量)を検出することを含む。CAR発現細胞とCARリガンドの結合は、FACS、ELISAなどのような標準技術を使用して検出できる。
CARリガンド(任意選択により、標識CARリガンド、例えば、タグ、ビーズ、放射活性又は蛍光標識を含むCARリガンド)を提供し;
CAR発現細胞を獲得し(例えば、製造サンプル又は臨床サンプルなどのCAR発現細胞含有サンプルの獲得);
CAR発現細胞とCARリガンドを、結合が生じる条件下で接触させ、それにより、存在するCAR発現細胞のレベル(例えば、量)を検出することを含む。CAR発現細胞とCARリガンドの結合は、FACS、ELISAなどのような標準技術を使用して検出できる。
一部の実施形態において、増殖及び/又は活性化細胞(例えば、免疫エフェクター細胞)を増殖する方法が開示される。方法は、
CAR発現細胞(例えば、第1のCAR発現細胞又は一過性に発現されるCAR細胞)を提供し);
前記CAR発現細胞とCARリガンド、例えば、本明細書に記載されるようなCARリガンドを、免疫細胞増殖及び/又は増殖が生じる条件下で接触させ、それにより、活性化及び/又は増殖集団を産生することを含む。
CAR発現細胞(例えば、第1のCAR発現細胞又は一過性に発現されるCAR細胞)を提供し);
前記CAR発現細胞とCARリガンド、例えば、本明細書に記載されるようなCARリガンドを、免疫細胞増殖及び/又は増殖が生じる条件下で接触させ、それにより、活性化及び/又は増殖集団を産生することを含む。
特定の実施形態において、CARリガンドは基質上に存在する(例えば、基質、例えば、天然に存在しない基質に固定化又は結合される)。一部の実施形態において、基質は、非細胞基質である。非細胞基質は、例えば、プレート(例えば、マイクロタイタープレート)、膜(例えば、ニトロセルロース膜)、マトリックス、チップ又はビーズから選択される固体支持体であり得る。実施形態において、CARリガンドは、基質に存在する(例えば、基質表面上)。CARリガンドを、基質に共有又は非共有(例えば、架橋)により固定、結合又は会合させ得る。一部の実施形態において、CARリガンドは、ビーズに結合(例えば、共有結合)する。前記実施形態において、免疫細胞集団をインビトロ又はエクスビボで増殖できる。方法は、例えば、本明細書に記載の方法のいずれかを使用して、CAR分子のリガンド存在下、免疫細胞の集団を培養することをさらに含む。
他の実施形態において、細胞を増殖及び/又は活性化する方法は、さらに第2の刺激性分子、例えばCD28の添加を含む。例えば、CARリガンド及び第2の刺激性分子を基質、例えば、1つ以上のビーズに固定し、それにより細胞増殖及び/又は活性化を増加させ得る。
一部の実施形態において、CAR発現細胞を選択又は富化する方法を提供する。方法は、CAR発現細胞と本明細書に記載されるようなCARリガンドを接触させ、CARリガンドの結合に基づき細胞を選択することを含む。
さらに他の実施形態において、CAR発現細胞を枯渇、減少及び/又は死滅する方法が提供される。方法は、CAR発現細胞と本明細書に記載されるようなCARリガンドを接触させ;及び細胞を、CARリガンドの結合に基づき標的化し、それによりCAR発現細胞の数を減らす及び/又は殺傷することを含む。一部の実施形態において、CARリガンドは、毒性剤と結合する(例えば、トキシン又は細胞除去剤)。一部の実施形態において、抗イディオタイプ抗体は、エフェクター細胞活性、例えば、ADCC又はADC活性を生じ得る。
本明細書に開示する方法において使用できる例示的な抗CAR抗体は、例えば、国際公開第2014/190273号パンフレット及びJena et al.,“Chimeric Antigen Receptor(CAR)-Specific Monoclonal Antibody to Detect CD19-Specific T cells in Clinical Trials”,PLOS March 2013 8:3 e57838に記載され、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態において、本明細書における組成物及び方法は、例えば、その内容が全体として参照により本明細書に組み込まれる、2015年7月31日出願の米国特許出願PCT/米国特許出願公開第2015/043219号明細書に記載のような、T細胞の特定のサブセットのために最適化される。一部の実施形態において、T細胞の最適化サブセットは、対照T細胞、例えば、同じ構築物を発現する異なるタイプ(例えば、CD8+又はCD4+)のT細胞と比較して、残留性の増強を示す。
一部の実施形態において、CD4+T細胞は、本明細書に記載のCARを含み、そのCARは、CD4+T細胞に適する(例えば、最適化、例えば、残留性の増強に至る)細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ICOSドメインを含む。一部の実施形態において、CD8+T細胞は、本明細書に記載のCARを含み、そのCARは、CD8+T細胞に適する(例えば、最適化、例えば、残留性の増強に至る)細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、4-1BBドメイン、CD28ドメイン又はICOSドメイン以外の共刺激ドメインを含む。一部の実施形態において、本明細書に記載のCARは、本明細書に記載の抗原結合ドメイン、例えば抗原結合ドメインを含むCARを含む。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるのは、対象、例えば、癌を有する対象を処置する方法である。方法は、前記対象に、有効量の:
1)抗原結合ドメイン、例えば、本明細書に記載の抗原結合ドメイン;
膜貫通ドメイン;及び
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば第1の共刺激ドメイン、例えばICOSドメイン
を含む、CARを含むCD4+T細胞(CARCD4+);並びに
2)CARを含むCD8+T細胞(CARCD8+)であって、
抗原結合ドメイン、例えば、本明細書に記載の抗原結合ドメイン;
膜貫通ドメイン;及び
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば第2の共刺激ドメイン、例えば4-1BBドメイン、CD28ドメイン又はICOSドメイン以外の別の共刺激ドメイン
を含むもの
を投与することを含み、ここで、CARCD4+とCARCD8+は互いに異なる。任意選択により、方法は、さらに、
3)CARを含む第2のCD8+T細胞(第2のCARCD8+)であって、
抗原結合ドメイン、例えば、本明細書に記載の抗原結合ドメイン;
膜貫通ドメイン;及び
第2のCARCD8+が、CARCD8+上に存在しない細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば共刺激シグナル伝達ドメインを含み、任意選択により、ICOSシグナル伝達ドメインを含まない、細胞内シグナル伝達ドメイン
を含む。
1)抗原結合ドメイン、例えば、本明細書に記載の抗原結合ドメイン;
膜貫通ドメイン;及び
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば第1の共刺激ドメイン、例えばICOSドメイン
を含む、CARを含むCD4+T細胞(CARCD4+);並びに
2)CARを含むCD8+T細胞(CARCD8+)であって、
抗原結合ドメイン、例えば、本明細書に記載の抗原結合ドメイン;
膜貫通ドメイン;及び
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば第2の共刺激ドメイン、例えば4-1BBドメイン、CD28ドメイン又はICOSドメイン以外の別の共刺激ドメイン
を含むもの
を投与することを含み、ここで、CARCD4+とCARCD8+は互いに異なる。任意選択により、方法は、さらに、
3)CARを含む第2のCD8+T細胞(第2のCARCD8+)であって、
抗原結合ドメイン、例えば、本明細書に記載の抗原結合ドメイン;
膜貫通ドメイン;及び
第2のCARCD8+が、CARCD8+上に存在しない細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば共刺激シグナル伝達ドメインを含み、任意選択により、ICOSシグナル伝達ドメインを含まない、細胞内シグナル伝達ドメイン
を含む。
バイオポリマー送達方法
一部の実施形態において、本明細書に開示する1つ以上のCAR発現細胞を、バイオポリマー足場、例えば、バイオポリマーインプラントにより対象に投与又は送達し得る。バイオポリマー足場は、本明細書に記載のCAR発現細胞の送達、増殖及び/分散を支持又は強化することができる。バイオポリマー足場は、生体適合性(例えば、炎症性又は免疫応答を実質的に誘発しない)及び/又は天然に存在し得るか又は合成である生分解性ポリマーを含む。例示的なバイオポリマーは、例えば、2015年3月13日に出願された国際公開第2015/142675号パンフレットの段落1004~1006に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態において、本明細書に開示する1つ以上のCAR発現細胞を、バイオポリマー足場、例えば、バイオポリマーインプラントにより対象に投与又は送達し得る。バイオポリマー足場は、本明細書に記載のCAR発現細胞の送達、増殖及び/分散を支持又は強化することができる。バイオポリマー足場は、生体適合性(例えば、炎症性又は免疫応答を実質的に誘発しない)及び/又は天然に存在し得るか又は合成である生分解性ポリマーを含む。例示的なバイオポリマーは、例えば、2015年3月13日に出願された国際公開第2015/142675号パンフレットの段落1004~1006に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
医薬組成物及び処置
一部の実施形態において、本開示は、本明細書に記載されるように産生されたCAR発現細胞を、任意選択により1つ以上の他の治療と組み合わせて、投与することを含む、患者を処置する方法を提供する。一部の実施形態において、本開示は、本明細書に記載されるようなCAR発現細胞を含む反応混合物を、任意選択により1つ以上の他の治療と組み合わせて、投与することを含む、患者を処置する方法を提供する。一部の実施形態において、本開示は、本明細書に記載されるようなCAR発現細胞を含む反応混合物を発送又は受領する方法を提供する。一部の実施形態において、本開示は、本明細書に記載されるように産生されたCAR発現細胞を受領することを含み、CAR発現細胞を、任意選択により1つ以上の他の治療と組み合わせて、患者に投与することをさらに含む、患者を処置する方法を提供する。一部の実施形態において、本開示は、本明細書に記載されるようなCAR発現細胞を産生することを含み、CAR発現細胞を、任意選択により1つ以上の他の治療と組み合わせて、患者に投与することをさらに含む、患者を処置する方法を提供する。他の療法は、例えば、化学療法などの癌療法であり得る。
一部の実施形態において、本開示は、本明細書に記載されるように産生されたCAR発現細胞を、任意選択により1つ以上の他の治療と組み合わせて、投与することを含む、患者を処置する方法を提供する。一部の実施形態において、本開示は、本明細書に記載されるようなCAR発現細胞を含む反応混合物を、任意選択により1つ以上の他の治療と組み合わせて、投与することを含む、患者を処置する方法を提供する。一部の実施形態において、本開示は、本明細書に記載されるようなCAR発現細胞を含む反応混合物を発送又は受領する方法を提供する。一部の実施形態において、本開示は、本明細書に記載されるように産生されたCAR発現細胞を受領することを含み、CAR発現細胞を、任意選択により1つ以上の他の治療と組み合わせて、患者に投与することをさらに含む、患者を処置する方法を提供する。一部の実施形態において、本開示は、本明細書に記載されるようなCAR発現細胞を産生することを含み、CAR発現細胞を、任意選択により1つ以上の他の治療と組み合わせて、患者に投与することをさらに含む、患者を処置する方法を提供する。他の療法は、例えば、化学療法などの癌療法であり得る。
一部の実施形態において、本明細書に記載のCARを発現する細胞を、Treg細胞集団を減少させる分子と組み合わせて対象に投与する。Treg細胞数を減らす(例えば、枯渇させる)方法は当分野で知られ、例えば、CD25枯渇、シクロホスファミド投与、GITR機能修飾を含む。理論に拘束されることを望むものではないが、アフェレーシス前又は本明細書に記載のCAR発現細胞投与前に対象におけるTreg細胞数を減らすことは、腫瘍微小環境における望まない免疫細胞(例えば、Treg)の数を減らし、対象の再発のリスクを減らすと考えられる。
一部の実施形態において、本明細書に記載の治療、例えば、CAR発現細胞は、制御性T細胞(Treg)を枯渇させるGITRアゴニスト及び/又はGITR抗体などのGITRを標的とする及び/又はGITR機能を調節する分子と組み合わせて対象に投与される。実施形態において、本明細書に記載のCARを発現する細胞を、対象にシクロホスファミドと組み合わせて投与する。一部の実施形態において、GITR結合分子及び/又はGITR機能を調節する分子(例えば、GITRアゴニスト及び/又はTreg枯渇GITR抗体)を、CAR発現細胞の前に投与する。例えば、一部の実施形態において、GITRアゴニストを細胞のアフェレーシス前に投与できる。実施形態において、シクロホスファミドを、対象にCAR発現細胞の投与(例えば、注入又は再注入)前又は細胞のアフェレーシス前に投与する。実施形態において、シクロホスファミド及び抗GITR抗体を、対象にCAR発現細胞の投与(例えば、注入又は再注入)前又は細胞のアフェレーシス前に投与する。一部の実施形態において、対象は癌(例えば、固形癌又はALL又はCLLなどの血液癌)を有する。一部の実施形態において、対象は、CLLを有する。実施形態において、対象はALLを有する。実施形態において、対象は固形癌、例えば、本明細書に記載の固形癌を有する。例示的なGITRアゴニストは、例えば、米国特許第6,111,090号明細書、欧州特許第090505B1号明細書、米国特許第8,586,023号明細書、国際公開第2010/003118号パンフレット及び同2011/090754号パンフレットに記載のGITR融合タンパク質又は例えば米国特許第7,025,962号明細書、欧州特許第1947183B1号明細書、米国特許第7,812,135号明細書、米国特許第8,388,967号明細書、米国特許第8,591,886号明細書、欧州特許出願公開第EP1866339号明細書、国際公開第2011/028683号パンフレット、国際公開第2013/039954号パンフレット、国際公開第2005/007190号パンフレット、国際公開第2007/133822号パンフレット、国際公開第2005/055808号パンフレット、国際公開第99/40196号パンフレット、国際公開第2001/03720号パンフレット、国際公開第99/20758号パンフレット、国際公開第2006/083289号パンフレット、国際公開第2005/115451号パンフレット、米国特許第7,618,632号明細書及び国際公開第2011/051726号パンフレットに記載される抗GITR抗体など、例えば、GITR融合タンパク質及び抗GITR抗体(例えば、二価抗GITR抗体)を含む。
一部の実施形態において、本明細書に記載のCAR発現細胞を、GITRアゴニスト、例えば、本明細書に記載のGITRアゴニストと組み合わせて対象に投与する。一部の実施形態において、GITRアゴニストを、CAR発現細胞の前に投与する。例えば、一部の実施形態において、GITRアゴニストを細胞のアフェレーシス前に投与できる。一部の実施形態において、対象は、CLLを有する。
本明細書に記載の方法は、医薬組成物中にCAR発現細胞を製剤化することをさらに含み得る。医薬組成物は、本明細書に記載のように、CAR発現細胞、例えば複数のCAR発現細胞を1つ以上の薬学的に又は生理学的に許容される担体、希釈剤又は添加物と組み合わせて含む。このような組成物は、中性緩衝化食塩水、リン酸緩衝化食塩水などの緩衝液;グルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン、マンニトールなどの炭水化物;タンパク質;グリシンなどのポリペプチド又はアミノ酸;抗酸化剤;EDTA又はグルタチオンなどのキレート剤;アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム);及び防腐剤を含み得る。組成物は、例えば静脈内投与のために製剤化することができる。
一部の実施形態において、医薬組成物は、例えば、エンドトキシン、マイコプラズマ、複製可能レンチウイルス(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIV gag、残留抗CD3/抗CD28被覆ビーズ、マウス抗体、貯留ヒト血清、ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培養培地要素、ベクターパッケージング細胞又はプラスミド成分、細菌及び真菌からなる群から選択される汚染物が実質的になく、例えば検出可能なレベルで存在しない。一部の実施形態において、細菌は、アルガリゲネス・フェカリス(Alcaligenes faecalis)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenza)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitides)、シュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumonia)及びストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)A群からなる群から選択される少なくとも1つである。
「免疫学的に有効量」、「抗癌有効量」、「癌阻害有効量」又は「治療量」が示されるとき、組成物の投与すべき正確な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染の程度又は転移及び患者(対象)の状態の個体差を考慮して医師が決定できる。本明細書に記載の免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞、NK細胞)を含む医薬組成物を、104~109細胞/kg体重、いくつかの例において105~106細胞/kg体重の範囲の用量(これらの範囲内の全整数値を含む)で投与し得ると一般に述べることができる。T細胞組成物をまたこの用量で複数回投与し得る。細胞を、免疫療法において一般に知られる注入技術を使用して投与できる(例えば、Rosenberg et al.,New Eng.J.of Med.319:1676,1988を参照されたい)。
一部の実施形態において、CAR細胞(例えば、CD19CAR細胞)の用量は、約1×106、1.1×106、2×106、3.6×106、5×106、1×107、1.8×107、2×107、5×107、1×108、2×108又は5×108細胞/kgを含む。一部の実施形態において、CAR細胞(例えば、CD19CAR細胞)の用量は、少なくとも約1×106、1.1×106、2×106、3.6×106、5×106、1×107、1.8×107、2×107、5×107、1×108、2×108又は5×108細胞/kgを含む。一部の実施形態において、CAR細胞(例えば、CD19CAR細胞)の用量は、最大約1×106、1.1×106、2×106、3.6×106、5×106、1×107、1.8×107、2×107、5×107、1×108、2×108又は5×108細胞/kgを含む。一部の実施形態において、CAR細胞(例えば、CD19CAR細胞)の用量は、約1.1×106~1.8×107細胞/kgを含む。一部の実施形態において、CAR細胞(例えば、CD19CAR細胞)の用量は、約1×107、2×107、5×107、1×108、2×108、5×108、1×109、2×109又は5×109細胞を含む。一部の実施形態において、CAR細胞(例えば、CD19CAR細胞)の用量は、少なくとも約1×107、2×107、5×107、1×108、2×108、5×108、1×109、2×109又は5×109細胞を含む。一部の実施形態において、CAR細胞(例えば、CD19CAR細胞)の用量は、最大約1×107、2×107、5×107、1×108、2×108、5×108、1×109、2×109又は5×109細胞を含む。
一部の実施形態において、活性化された免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞、NK細胞)を対象に投与し、その後、血液を再採取し(又はアフェレーシスを実施し)、そこから免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞、NK細胞)を活性化し、これらの活性化及び増殖した免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞、NK細胞)を患者に再注入することが望ましい場合がある。この過程を数週間毎に複数回実施できる。一部の実施形態において、免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞、NK細胞)は、10cc~400ccの採血した血液から活性化することができる。一部の実施形態において、免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞、NK細胞)は、20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc又は100ccの採血した血液から活性化される。
対象組成物の投与は、任意の簡便な方法により実施し得る。本明細書に記載の組成物は、経動脈的に、皮下に、皮内に、腫瘍内に、節内に、髄内に、筋肉内に、静脈内(i.v.)注射により又は腹腔内に、例えば、皮内又は皮下注射により患者に投与し得る。免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞、NK細胞)の組成物を、腫瘍、リンパ節又は感染部位に直接注射し得る。
投薬レジメン
一部の実施形態では、1用量の生存CAR発現細胞(例えば、生存CD19、BCMA、CD20又はCD22 CAR発現細胞)は、約0.5×106個の生存CAR発現細胞~約1.25×109個の生存CAR発現細胞(例えば、0.5×106個の生存CAR発現細胞~1.25×109個の生存CAR発現細胞)を含む。一部の実施形態では、1用量の生存CAR発現細胞(例えば、生存CD19、BCMA、CD20又はCD22 CAR発現細胞)は、約1×106、約2.5×106、約5×106、約1.25×107、約2.5×107、約5×107、約5.75×107又は約8×107個の生存CAR発現細胞を含む。
一部の実施形態では、1用量の生存CAR発現細胞(例えば、生存CD19、BCMA、CD20又はCD22 CAR発現細胞)は、約0.5×106個の生存CAR発現細胞~約1.25×109個の生存CAR発現細胞(例えば、0.5×106個の生存CAR発現細胞~1.25×109個の生存CAR発現細胞)を含む。一部の実施形態では、1用量の生存CAR発現細胞(例えば、生存CD19、BCMA、CD20又はCD22 CAR発現細胞)は、約1×106、約2.5×106、約5×106、約1.25×107、約2.5×107、約5×107、約5.75×107又は約8×107個の生存CAR発現細胞を含む。
患者の選択
対象を処置する方法又は本明細書に開示される使用のための組成物のいずれかの一部の実施形態では、対象は、癌、例えば血液癌を有する。一部の実施形態では、癌は、リンパ性白血病(CLL)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、多発性骨髄腫、急性リンパ性白血病(ALL)、ホジキンリンパ腫、B細胞急性リンパ性白血病(BALL)、T細胞急性リンパ性白血病(TALL)、小リンパ球性白血病(SLL)、B細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、慢性炎症を伴うDLBCL、慢性骨髄性白血病、骨髄増殖性腫瘍、濾胞性リンパ腫、小児性濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞型又は大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖性病態、MALTリンパ腫(粘膜関連リンパ組織型節外性濾胞辺縁帯リンパ腫)、辺縁帯リンパ腫、骨髄形成異常、骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、脾辺縁帯リンパ腫、脾リンパ腫/白血病、脾臓びまん性赤脾髄小細胞型B細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病-変異型、リンパ形質細胞性リンパ腫、H鎖病、プラズマ細胞骨髄腫、孤立性骨形質細胞腫、骨外性形質細胞腫、節性辺縁帯リンパ腫、小児性節性辺縁帯リンパ腫、原発性皮膚濾胞中心リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、原発性縦隔(胸腺)大細胞型B細胞リンパ腫、血管内大細胞型B細胞リンパ腫、ALK+大細胞型B細胞リンパ腫、HHV8関連多中心性キャッスルマン病に発生する大細胞型B細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、B細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病(AML)又は分類不能なリンパ腫から選択される。一部の実施形態では、癌は、再発及び/又は難治性癌である。
対象を処置する方法又は本明細書に開示される使用のための組成物のいずれかの一部の実施形態では、対象は、癌、例えば血液癌を有する。一部の実施形態では、癌は、リンパ性白血病(CLL)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、多発性骨髄腫、急性リンパ性白血病(ALL)、ホジキンリンパ腫、B細胞急性リンパ性白血病(BALL)、T細胞急性リンパ性白血病(TALL)、小リンパ球性白血病(SLL)、B細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、慢性炎症を伴うDLBCL、慢性骨髄性白血病、骨髄増殖性腫瘍、濾胞性リンパ腫、小児性濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞型又は大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖性病態、MALTリンパ腫(粘膜関連リンパ組織型節外性濾胞辺縁帯リンパ腫)、辺縁帯リンパ腫、骨髄形成異常、骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、脾辺縁帯リンパ腫、脾リンパ腫/白血病、脾臓びまん性赤脾髄小細胞型B細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病-変異型、リンパ形質細胞性リンパ腫、H鎖病、プラズマ細胞骨髄腫、孤立性骨形質細胞腫、骨外性形質細胞腫、節性辺縁帯リンパ腫、小児性節性辺縁帯リンパ腫、原発性皮膚濾胞中心リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、原発性縦隔(胸腺)大細胞型B細胞リンパ腫、血管内大細胞型B細胞リンパ腫、ALK+大細胞型B細胞リンパ腫、HHV8関連多中心性キャッスルマン病に発生する大細胞型B細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、B細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病(AML)又は分類不能なリンパ腫から選択される。一部の実施形態では、癌は、再発及び/又は難治性癌である。
対象を処置する方法又は本明細書に開示される使用のための組成物のいずれかの一部の実施形態では、対象は、CLL又はSLLを有する。一部の実施形態では、CLL又はSLLを有する対象は、以前、BTK阻害剤療法、例えばイブルチニブを少なくとも1~12ヶ月、例えば6カ月にわたって投与されている。一部の実施形態では、BTK阻害剤療法、例えばイブルチニブ療法は、第二選択療法である。一部の実施形態では、対象は、部分的応答を有したか、又はBTK阻害剤療法に対する応答が安定した疾患を有した。一部の実施形態では、対象は、BTK阻害剤療法に対して応答しなかった。一部の実施形態では、対象は、耐性を発生し、例えばイブルチニブ耐性突然変異を発生した。一部の実施形態では、イブルチニブ耐性突然変異は、BTKをコードする遺伝子及び/又はPLCg2をコードする遺伝子の突然変異を含む。一部の実施形態では、対象は、成人、例えば少なくとも18歳である。
対象を処置する方法又は本明細書に開示される使用のための組成物のいずれかの一部の実施形態では、対象は、DLBCL、例えば再発及び/又は難治性DLBCLを有する。一部の実施形態では、DLBCL、例えば再発及び/又は難治性DLBCLを有する対象は、以前、少なくとも2つの選択化学療法、例えば抗CD20療法及び/又はアントラリンに基づく化学療法を実施されている。一部の実施形態では、対象は、以前、幹細胞療法、例えば自己幹細胞療法を受けており、前記幹細胞療法に対して応答しなかった。一部の実施形態では、対象は、幹細胞療法、例えば自己幹細胞療法に適格ではない。一部の実施形態では、対象は、成人、例えば少なくとも18歳である。
CAR有効性を評価するためのバイオマーカー
一部の実施形態では、対象(例えば、癌、例えば血液癌を有する対象)において、CAR発現細胞療法(例えば、CD19若しくはBCMA CAR療法)の有効性を評価又はモニターする方法が本明細書に開示される。この方法は、CAR療法に対する有効性の値を取得することを含み、ここで、前記値は、CAR発現細胞療法の有効性又は適合性を示す。
一部の実施形態では、対象(例えば、癌、例えば血液癌を有する対象)において、CAR発現細胞療法(例えば、CD19若しくはBCMA CAR療法)の有効性を評価又はモニターする方法が本明細書に開示される。この方法は、CAR療法に対する有効性の値を取得することを含み、ここで、前記値は、CAR発現細胞療法の有効性又は適合性を示す。
複数の実施形態では、CLL若しくはSLLを有する対象におけるCAR療法に対する有効性の値は、下記パラメーターの1つ、2つ、3つ若しくは全部の尺度を含む:
(i)サンプル(例えば、アフェレーシスサンプル若しくは製造されたCAR発現細胞産物サンプル)中のBTKをコードする遺伝子の突然変異;
(ii)サンプル(例えば、アフェレーシスサンプル若しくは製造されたCAR発現細胞産物サンプル)中のPLCg2をコードする遺伝子の突然変異;
(iii)サンプル(例えば、対象からのアフェレーシスサンプル若しくは腫瘍サンプル)中の;例えばCD8、CD4、CD3、CD5、CD19、CD20、CD22、CD43、CD79b、CD27、CD45RO、CD45RA、CCR7、CD95、Lag3、PD-1、Tim-3及び/若しくはCD81のレベル及び/若しくは活性によって評価される;又は免疫グロブリンディープシーケンシングによって評価されるような微小残存病変;又は
(iv)サンプル、例えば対象からのアフェレーシスサンプル中の、IFN-g、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、TNF-a、IP-10、MCP1、MIP1aから選択される1、2、3、4、5、6、7、8、9、10若しくは全部のレベル又は活性。
(i)サンプル(例えば、アフェレーシスサンプル若しくは製造されたCAR発現細胞産物サンプル)中のBTKをコードする遺伝子の突然変異;
(ii)サンプル(例えば、アフェレーシスサンプル若しくは製造されたCAR発現細胞産物サンプル)中のPLCg2をコードする遺伝子の突然変異;
(iii)サンプル(例えば、対象からのアフェレーシスサンプル若しくは腫瘍サンプル)中の;例えばCD8、CD4、CD3、CD5、CD19、CD20、CD22、CD43、CD79b、CD27、CD45RO、CD45RA、CCR7、CD95、Lag3、PD-1、Tim-3及び/若しくはCD81のレベル及び/若しくは活性によって評価される;又は免疫グロブリンディープシーケンシングによって評価されるような微小残存病変;又は
(iv)サンプル、例えば対象からのアフェレーシスサンプル中の、IFN-g、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、TNF-a、IP-10、MCP1、MIP1aから選択される1、2、3、4、5、6、7、8、9、10若しくは全部のレベル又は活性。
複数の実施形態では、DLBCL、例えば再発及び/又は難治性DLBCLを有する対象のCAR療法に対する有効性の値は、下記パラメーターの1つ又は両方の尺度を含む:
(i)サンプル(例えば、対象からのアフェレーシスサンプル若しくは腫瘍サンプル)中の;例えばCD8、CD4、CD19、CD3、CD27、CD45RO、CD45RA、CCR7、CD95、Lag3、PD-1及び/若しくはTim-3のレベル及び/若しくは活性によって評価される;又は免疫グロブリンディープシーケンシングによって評価されるような微小残存病変;又は
(ii)サンプル(例えば、対象からアフェレーシスサンプル)中の、IFN-g、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、TNF-a、IP-10、MCP1,MIP1aから選択される1、2、3、4、5、6、7、8、9、10若しくは全部のレベル又は活性。
(i)サンプル(例えば、対象からのアフェレーシスサンプル若しくは腫瘍サンプル)中の;例えばCD8、CD4、CD19、CD3、CD27、CD45RO、CD45RA、CCR7、CD95、Lag3、PD-1及び/若しくはTim-3のレベル及び/若しくは活性によって評価される;又は免疫グロブリンディープシーケンシングによって評価されるような微小残存病変;又は
(ii)サンプル(例えば、対象からアフェレーシスサンプル)中の、IFN-g、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、TNF-a、IP-10、MCP1,MIP1aから選択される1、2、3、4、5、6、7、8、9、10若しくは全部のレベル又は活性。
他の実施形態では、CAR療法に対する有効性の値は、下記パラメーターの1、2、3、4、5、6つ若しくはそれを超える(全部)の尺度をさらに含む:
(i)サンプル(例えば、アフェレーシスサンプル若しくは製造されたCAR発現細胞産物サンプル)中の、休止TEFF細胞、休止TREG細胞、より若いT細胞(例えば、ナイーブT細胞(例えば、ナイーブCD4若しくはCD8 T細胞、ナイーブγ/δ T細胞)、若しくはステムメモリーT細胞(例えば、ステムメモリーCD4若しくはCD8T細胞若しくはステムメモリーγ/δ T細胞)、若しくは早期メモリーT細胞又はそれらの組み合わせの1、2、3つ若しくはそれを超えるもの(例えば、全部)のレベル又は活性;
(ii)サンプル(例えば、アフェレーシスサンプル若しくは製造されたCAR発現細胞産物サンプル)中の、活性化TEFF細胞、活性化TREG細胞、より経時的なT細胞(例えば、より経時的なCD4若しくはCD8細胞)若しくは後期メモリーT細胞又はそれらの組み合わせの1、2、3つ若しくはそれを超えるもの(例えば、全部)のレベル又は活性;
(iii)サンプル(例えば、アフェレーシスサンプル若しくは製造されたCAR発現細胞産物サンプル)中の、免疫細胞疲弊マーカー、例えば1、2つ若しくはそれを超えるものの免疫チェックポイント阻害因子(例えば、PD-1、PD-L1、TIM-3、TIGIT及び/又はLAG-3)のレベル又は活性。一部の実施形態において、免疫細胞は、疲弊表現型を有し、例えば少なくとも2つの疲弊マーカー、例えばPD-1及びTIM-3を同時発現する。他の実施形態では、免疫細胞は、疲弊表現型を有し、例えば少なくとも2つの疲弊マーカー、例えばPD-1及びLAG-3を同時発現する;
(iv)サンプル(例えば、アフェレーシスサンプル若しくは製造されたCAR発現細胞産物サンプル)中の、例えばCD4+若しくはCD8+T細胞集団における、CD27及び/又はCD45RO-(例えば、CD27+CD45RO-)免疫エフェクター細胞のレベル又は活性;
(v)CCL20、IL-17a、IL-6、PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3、CD57、CD27、CD122、CD62L、KLRG1から選択されるバイオマーカーの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11若しくは全部のレベル又は活性;
(vi)CAR発現細胞産物サンプル、例えばCLL-1発現細胞産物サンプル中のサイトカインレベル又は活性(例えば、サイトカインレパトアの品質);又は
(vii)製造されたCAR発現細胞産物サンプル中のCAR発現細胞の形質導入効率。
(i)サンプル(例えば、アフェレーシスサンプル若しくは製造されたCAR発現細胞産物サンプル)中の、休止TEFF細胞、休止TREG細胞、より若いT細胞(例えば、ナイーブT細胞(例えば、ナイーブCD4若しくはCD8 T細胞、ナイーブγ/δ T細胞)、若しくはステムメモリーT細胞(例えば、ステムメモリーCD4若しくはCD8T細胞若しくはステムメモリーγ/δ T細胞)、若しくは早期メモリーT細胞又はそれらの組み合わせの1、2、3つ若しくはそれを超えるもの(例えば、全部)のレベル又は活性;
(ii)サンプル(例えば、アフェレーシスサンプル若しくは製造されたCAR発現細胞産物サンプル)中の、活性化TEFF細胞、活性化TREG細胞、より経時的なT細胞(例えば、より経時的なCD4若しくはCD8細胞)若しくは後期メモリーT細胞又はそれらの組み合わせの1、2、3つ若しくはそれを超えるもの(例えば、全部)のレベル又は活性;
(iii)サンプル(例えば、アフェレーシスサンプル若しくは製造されたCAR発現細胞産物サンプル)中の、免疫細胞疲弊マーカー、例えば1、2つ若しくはそれを超えるものの免疫チェックポイント阻害因子(例えば、PD-1、PD-L1、TIM-3、TIGIT及び/又はLAG-3)のレベル又は活性。一部の実施形態において、免疫細胞は、疲弊表現型を有し、例えば少なくとも2つの疲弊マーカー、例えばPD-1及びTIM-3を同時発現する。他の実施形態では、免疫細胞は、疲弊表現型を有し、例えば少なくとも2つの疲弊マーカー、例えばPD-1及びLAG-3を同時発現する;
(iv)サンプル(例えば、アフェレーシスサンプル若しくは製造されたCAR発現細胞産物サンプル)中の、例えばCD4+若しくはCD8+T細胞集団における、CD27及び/又はCD45RO-(例えば、CD27+CD45RO-)免疫エフェクター細胞のレベル又は活性;
(v)CCL20、IL-17a、IL-6、PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3、CD57、CD27、CD122、CD62L、KLRG1から選択されるバイオマーカーの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11若しくは全部のレベル又は活性;
(vi)CAR発現細胞産物サンプル、例えばCLL-1発現細胞産物サンプル中のサイトカインレベル又は活性(例えば、サイトカインレパトアの品質);又は
(vii)製造されたCAR発現細胞産物サンプル中のCAR発現細胞の形質導入効率。
本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態において、CAR発現細胞療法は、複数のCAR発現免疫エフェクター細胞(例えば、その集団)、例えば複数のT細胞若しくはNK細胞(例えば、その集団)又はそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態において、CAR発現細胞療法は、CD19CAR療法である。
本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態において、本明細書に開示される1つ以上のパラメーターの尺度は、対象から得たアフェレーシスサンプルから取得される。アフェレーシスサンプルは、注入又は再注入前に評価することができる。
本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態において、本明細書に開示される1つ以上のパラメーターの尺度は、対象から得た腫瘍サンプルから取得される。
本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態において、本明細書に開示される1つ以上のパラメーターの尺度は、製造されたCAR発現細胞産物サンプル、例えばCD19CAR発現細胞産物サンプルから取得される。製造されたCAR発現細胞産物は、注入又は再注入前に評価することができる。
本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態において、対象は、CAR発現細胞療法を受ける前、療法の過程で又はそれを受けた後に評価される。
本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態において、本明細書に開示される1つ以上のパラメーターの尺度により、1つ以上の遺伝子発現、フローサイトメトリー又はタンパク質発現についてのプロフィールを評価する。
本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態において、本方法は、本明細書に開示される1つ以上のパラメーターの尺度に基づいて、対象を応答者、非応答者、再発者又は非再発者として識別することをさらに含む。
本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態において、応答者、例えば完全応答者は、参照値、例えばCD8+T細胞の非応答者パーセンテージと比べて、高い、例えば統計的に有意に高いパーセンテージのCD8+T細胞を有するか又は有する者として識別される。
本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態において、応答者、例えば完全応答者は、参照値、例えばCD27+CD45RO-免疫エフェクター細胞の非応答者数と比べて、例えばCD8+集団において、高いパーセンテージのCD27+CD45RO-免疫エフェクター細胞を有するか又は有する者として識別される。
本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態において、応答者、例えば完全応答者若しくは部分応答者は、参照値、例えばCD4+T細胞の非応答者パーセンテージと比べて、高い、例えば統計的に有意に高いパーセンテージのCD4+T細胞を有するか又は有する者として識別される。
本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態において、応答者、例えば完全応答者は、参照値、例えば休止TEFF細胞、休止TREG細胞、より若いT細胞若しくは早期メモリーT細胞の非応答者数と比べて、高いパーセンテージで休止TEFF細胞、休止TREG細胞、より若いT細胞若しくは早期メモリーT細胞又はそれらの組み合わせの1、2、3つ若しくはそれを超えるもの(例えば、全部)を有するか又は有する者として識別される。
本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態において、非応答者は、参照値、例えば活性化TEFF細胞、活性化TREG細胞、より経時的なT細胞(例えば、より経時的なCD4若しくはCD8細胞)又は後期メモリーT細胞の応答者数と比べて、高いパーセンテージで、活性化TEFF細胞、活性化TREG細胞、より経時的なT細胞(例えば、より経時的なCD4若しくはCD8細胞)若しくは後期メモリーT細胞又はそれらの組み合わせの1、2、3つ若しくはそれを超えるもの(例えば、全部)を有するか又は有する者として識別される。
本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態において、非応答者は、より高いパーセンテージの免疫細胞疲弊マーカー、例えば1、2つ又はそれを超える免疫チェックポイント阻害因子(例えば、PD-1、PD-L1、TIM-3、TIGIT及び/若しくはLAG-3)を有するか又は有する者として識別される。一部の実施形態では、非応答者は、応答者からのPD-1若しくはLAG-3発現免疫エフェクター細胞パーセンテージと比べて、高いパーセンテージのPD-1、PD-L1若しくはLAG-3発現免疫エフェクター細胞(例えば、CD4+T細胞及び/若しくはCD8+T細胞)(例えば、CAR発現CD4+T細胞及び/若しくはCD8+T細胞)を有するか又は有する者として識別される。
一部の実施形態では、非応答者は、より高いパーセンテージで、疲弊表現型を有する免疫細胞、例えば少なくとも2つの疲弊マーカーを同時発現する、例えばPD-1、PD-L1及び/若しくはTIM-3を同時発現する免疫細胞を有するか又は有する者として識別される。他の実施形態では、非応答者は、より高いパーセンテージで、疲弊表現型を有する免疫細胞、例えば少なくとも2つの疲弊マーカーを同時発現する、例えばPD-1及びLAG-3を同時発現する免疫細胞を有するか又は有する者として識別される。
本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態において、非応答者は、CAR発現細胞療法に対する応答者(例えば、完全応答者)と比べて、高いパーセンテージで、CAR発現細胞集団(例えば、CLL-1 CAR+細胞集団)中にPD-1/PD-L1+/LAG-3+細胞を有するか又は有する者として識別される。
本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態において、応答者(例えば、完全又は部分応答者)は、下記プロフィールの1、2、3つ若しくはそれを超えるもの(又は全部)を有する:
(i)参照値、例えばCD27+免疫エフェクター細胞の非応答者数と比べて、高い数のCD27+免疫エフェクター細胞を有する;
(ii)参照値、例えばCD8+T細胞の非応答者数と比べて、高い数のCD8+T細胞を有する;
(iii)参照値、例えば1つ以上のチェックポイント阻害因子を発現する細胞の非応答者数と比べて、少数の、1つ以上のチェックポイント阻害因子、例えばPD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3若しくはKLRG-1又はそれらの組み合わせから選択されるチェックポイント阻害因子を発現する免疫細胞を有する;又は
(iv)参照値、例えば休止TEFF細胞、休止TREG細胞、ナイーブCD4細胞、非刺激メモリーT細胞若しくは早期メモリーT細胞の非応答者数と比べて、高い数で、休止TEFF細胞、休止TREG細胞、ナイーブCD4細胞、非刺激メモリーT細胞若しくは早期メモリーT細胞又はそれらの組み合わせの1つ、2つ、3つ、4つ若しくはそれを超えるもの(全部)を有する。
(i)参照値、例えばCD27+免疫エフェクター細胞の非応答者数と比べて、高い数のCD27+免疫エフェクター細胞を有する;
(ii)参照値、例えばCD8+T細胞の非応答者数と比べて、高い数のCD8+T細胞を有する;
(iii)参照値、例えば1つ以上のチェックポイント阻害因子を発現する細胞の非応答者数と比べて、少数の、1つ以上のチェックポイント阻害因子、例えばPD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3若しくはKLRG-1又はそれらの組み合わせから選択されるチェックポイント阻害因子を発現する免疫細胞を有する;又は
(iv)参照値、例えば休止TEFF細胞、休止TREG細胞、ナイーブCD4細胞、非刺激メモリーT細胞若しくは早期メモリーT細胞の非応答者数と比べて、高い数で、休止TEFF細胞、休止TREG細胞、ナイーブCD4細胞、非刺激メモリーT細胞若しくは早期メモリーT細胞又はそれらの組み合わせの1つ、2つ、3つ、4つ若しくはそれを超えるもの(全部)を有する。
複数の実施形態では、本明細書の方法によって特定された応答者、非応答者、再発者又は非再発者である対象は、臨床基準に従ってさらに評価することができる。例えば、完全応答者は、疾患、例えば癌を有するか又は有する者で、処置に対して完全応答、例えば完全寛解を呈示する対象として識別される。完全応答は、例えば、NCCN Guidelines(登録商標)又はその全体が参照により本明細書に組み込まれるHallek M et al.,Blood(2018)131:2745-2760“iwCLL guidelines for diagnosis,indications for treatment,response assessment,and supportive management of CLL,”に開示される通りのInternational Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia(iwCLL)2018を用いて識別され得る。部分応答者は、疾患、例えば癌を有するか又は有する者で、処置に対して部分応答、例えば部分寛解を呈示する対象として識別される。部分応答は、例えば、NCCN Guidelines(登録商標)又は本明細書に記載される通りのiwCLL 2018基準を用いて識別され得る。非応答者は、疾患、例えば癌を有するか又は有する者として識別され、その対象は、処置に対して応答を呈示せず、例えば、患者は、安定又は進行性疾患を有する。非応答者は、例えば、NCCN Guidelines(登録商標)又は本明細書に記載される通りのiwCLL 2018基準を用いて識別され得る。
上記に代わり又は本明細書に開示の方法と組み合わせて、前記の値に応答して、以下のステップの1つ、2つ、3つ、4つ若しくはそれを超えるものを実施する:
例えば、応答者又は非応答者に、CAR発現細胞療法を投与する;
変更された用量設定のCAR発現細胞療法を投与する;
CAR発現細胞療法のスケジュール又はタイムコースを変更する;
例えば、非応答者又は部分応答者に、CAR発現細胞療法と組み合わせて、追加薬剤、例えばチェックポイント阻害因子、例えば本明細書に記載のチェックポイント阻害因子を投与する;
非応答者又は部分応答者に、CAR発現細胞療法による処置前に対象中の若いT細胞の数を増加させる療法を実施する;
例えば、非応答者又は部分応答者として識別された対象の場合、CAR発現細胞療法の製造プロセスを改変する、例えばCARをコードする核酸の導入前に若いT細胞を濃縮するか又は形質導入効率を高める;
例えば、非応答者若しくは部分応答者又は再発者の場合、代替療法を実施する;又は
対象が、非応答者又は再発者であるか又はそれとして識別される場合、例えばCD25枯渇、シクロホスファミド、抗GITR抗体の投与の1つ以上又はそれらの組み合わせにより、TREG細胞集団及び/又はTREG遺伝子シグネチャーを低減する。
例えば、応答者又は非応答者に、CAR発現細胞療法を投与する;
変更された用量設定のCAR発現細胞療法を投与する;
CAR発現細胞療法のスケジュール又はタイムコースを変更する;
例えば、非応答者又は部分応答者に、CAR発現細胞療法と組み合わせて、追加薬剤、例えばチェックポイント阻害因子、例えば本明細書に記載のチェックポイント阻害因子を投与する;
非応答者又は部分応答者に、CAR発現細胞療法による処置前に対象中の若いT細胞の数を増加させる療法を実施する;
例えば、非応答者又は部分応答者として識別された対象の場合、CAR発現細胞療法の製造プロセスを改変する、例えばCARをコードする核酸の導入前に若いT細胞を濃縮するか又は形質導入効率を高める;
例えば、非応答者若しくは部分応答者又は再発者の場合、代替療法を実施する;又は
対象が、非応答者又は再発者であるか又はそれとして識別される場合、例えばCD25枯渇、シクロホスファミド、抗GITR抗体の投与の1つ以上又はそれらの組み合わせにより、TREG細胞集団及び/又はTREG遺伝子シグネチャーを低減する。
本発明を、次の実験的実施例を参照してさらに詳細に記載する。これらの実施例は、説明のみを目的として提供し、特に断らない限り限定を意図しない。従って、本発明は、決して次の実施例に限定されると解釈してはならず、むしろ本明細書に提供する教示の結果として明らかとなる任意且つ全ての変形形態を含むと解釈すべきである。
実施例1:サイトカイン刺激によるCARTの産生
概要
この実施例では、「サイトカインプロセス」と呼ばれるCART製造プロセスを説明する。一部の実施形態では、細胞(例えば、T細胞)を培地(例えば、血清含有培地、例えば2%血清を含有する培地)に接種する。例えば、IL-2、IL-7、IL-15(例えば、hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-21又はIL-6(例えば、IL-6/sIL-6Ra)から選択される1つ以上のサイトカイン並びにCARをコードするベクター(例えば、レンチウイルスベクター)を細胞に添加する。20~24時間のインキュベーション後、細胞を洗浄し、製剤化した後、凍結保存する。例示的なサイトカインプロセスを図1Aに示す。
概要
この実施例では、「サイトカインプロセス」と呼ばれるCART製造プロセスを説明する。一部の実施形態では、細胞(例えば、T細胞)を培地(例えば、血清含有培地、例えば2%血清を含有する培地)に接種する。例えば、IL-2、IL-7、IL-15(例えば、hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-21又はIL-6(例えば、IL-6/sIL-6Ra)から選択される1つ以上のサイトカイン並びにCARをコードするベクター(例えば、レンチウイルスベクター)を細胞に添加する。20~24時間のインキュベーション後、細胞を洗浄し、製剤化した後、凍結保存する。例示的なサイトカインプロセスを図1Aに示す。
伝統的なCART製造プロセスと比較して、この修正プロセスは、CD3/CD28刺激並びにエクスビボT細胞増殖を排除する。理論に縛られることを意図しないが、抗CD3/抗CD28ビーズは、セントラルメモリーT細胞への分化を駆動し;これと対照的に、IL-15、IL-21及びIL-7などのサイトカインは、形質導入されたCD3+T細胞の未分化表現型の保存を助け得る。結論として、CD3/CD28活性化を伴わないサイトカインプロセスは、伝統的な手法を用いて作製されるCART細胞と比べて、高いパーセンテージのナイーブ/ステムT細胞を含むCART細胞を作製することができる。
方法
採取から24時間以内にアフェレーシスを取得した後、T細胞を精製し、得られたT細胞の純度をフローサイトメトリーで評価する。T細胞を凍結した後、使用の必要があるまで液体窒素中に配置する。
採取から24時間以内にアフェレーシスを取得した後、T細胞を精製し、得られたT細胞の純度をフローサイトメトリーで評価する。T細胞を凍結した後、使用の必要があるまで液体窒素中に配置する。
代わりに、凍結保存アフェレーシスサンプルを調製した後、Prodigy(登録商標)機を用いて、CD4+T細胞及び/又はCD8+T細胞について濃縮する。
必要な最終濃度の1,000倍で、IL-7及びIL-15を調製した。IL-2は、培地中での10倍希釈により調製した。
エキスパンダービーズ刺激条件では、計算を実施して、ビーズ対細胞比が3:1の最終濃度で細胞を平板培養した。Dynamag(登録商標)を用いて、Dynabeads(登録商標)磁気ビーズを洗浄し、実験に必要な量の培地中に再懸濁させた。洗浄したビーズを、特定のサイトカイン及び細胞の入ったチューブに添加した。
平板培養時、1の多重感染度(MOI)で、レンチウイルスベクターにより細胞を形質導入した。形質導入しようとするベクターの具体的な量は、使用中のベクターロットの多重感染度(MOI)及び濃度(力価)に基づいて計算した。力価及びMOIは、初代T細胞株に基づいて測定した。
刺激のためにサイトカインのみを使用する条件では、細胞を洗浄後1E7/mlの濃度で再懸濁させ、条件(表19)に応じてサイトカインを既に含有するコニカルチューブに添加した。細胞及びサイトカインを添加した後、レンチウイルスベクター、次いで培地を添加した。
全ての条件において、細胞を混合し、24ウェルプレートの14ウェルに1mlを平板培養した。細胞をインキュベーター内に配置したが、これは37℃及び5%CO2であった。
翌日、細胞を採取し、細胞の濃度及び生存性を記録した。それらの機能は、細胞毒性及び増殖(EDU)合同アッセイを用いて測定した。これらの細胞は、「第1日CART」と称される。
T細胞分化状態について細胞の免疫表現型を決定した後、フローサイトメトリーを用いてCARの形質導入を評価した。細胞を洗浄し、生死判定試薬、続いて抗体カクテルを添加し(表20)、プレートを室温で20分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を2回洗浄し、固定した後、BD fortessaで解析した。
第1日CARTが、採取後に増殖する能力を依然として維持しているか否かを決定するために、T25フラスコにおいて、3:1(ビーズ対細胞)の比でCD3/CD28ビーズを用いて、5e6細胞/条件を増殖させた。Dynabeads(登録商標)磁気ビーズを前述のように洗浄した。培地は、サイトカインを含まなかった。37℃及び5%CO2のインキュベーター内に細胞を配置した。
2日毎にCD3/CD28ビーズを用いて増殖させるT細胞の場合、最大10日の培養で細胞をカウントし、溢流(spilt)させた。第10日に、細胞を回収し、カウントしてから、分化パネル(表20)を用いて免疫表現型を決定した後、Cryostor 10(商標)を用いて凍結した。機能性アッセイのために細胞を解凍したが、これらのアッセイは、細胞毒性アッセイ、増殖アッセイ及びサイトカイン分泌アッセイを含んだ。
CD3/CD28ビーズの存在下、インビトロで10日間増殖させた細胞は、「第10日CART」と称される。
精製T細胞を他の活性化刺激の非存在下でサイトカインと一緒にインキュベートしたとき、第1日から第4日まで形質導入の増加があった(図1B)。時点及びサイトカイン条件とは独立に、CAR陽性集団内で優勢な集団は、ナイーブであった(図1D、1E及び1F)。活性化因子の排除により、初期集団による形質導入の増強が起こった。特に、IL-2又はIL-15に対する曝露は、インビトロでの自己再生T細胞を維持した(図1G)。試験した他のサイトカイン処理(IL-7;IL2+IL7;IL-7+IL-15;及びIL2+IL-15)でも、同様の現象が観察された(データは示していない)。サイトカインプロセス(この具体的な実施例では、IL2又はIL-15を用いた)は、CD45RO-CCR7+細胞のパーセンテージを維持するか又はやや増加した(図1G)。IL-2、IL-15及びIL-7とIL-15の組み合わせについて、類似のデータを図1H及び1Iに示す。表示のサイトカインと一緒にT細胞を24時間培養すると、CD3+T細胞のナイーブ表現型が維持されると共に、セントラルメモリーT細胞のパーセンテージが低下した(図1H及び1I)。
24時間以内に観察された形質導入が安定していることを確実にするために、24時間以内に産生されたCARTを洗浄して、残留ウイルスを全て除去してから、CD3/D28増殖ビーズを用いて10日にわたって増殖させた。増殖した細胞は、第1日CARTとほぼ同等の形質導入を示し、これは、形質導入が安定していることを示した(図2A)。
細胞毒性、サイトカイン放出及び増殖アッセイを用いて、第1日CART及び第10日CARTの機能性を検定した。標的細胞は、Nalm6細胞、即ちCD19を発現するB細胞ALL細胞であった。細胞毒性アッセイから、増殖後第1日CARTは、第1日CARTがはるかに少ない形質導入細胞を含有したとしても、第10日CART(図2B)と比較して、殺傷では同等であることが証明された。増殖させた同じ第1日CARTをIFN-γの分泌について比較すると、第10日CART(図2C)と比較して、低いIFN-γ分泌を有することが判明し、これは、恐らく形質導入細胞の数の差によるものであろう。第1日CARTが、より高レベルの形質導入を有する別の試験では、それらは、より高レベルのIFN-γを分泌した(データは示していない)。さらに、IL7単独の条件を除く全ての処理条件からの第1日CARTは、第10日CARTと同等であるか又はそれより高い増殖を示した(図2D)。図2Dに示すデータは、形質導入レベルについて正規化していない。
第10日CARTには安定な形質導入が観察されたが、効率は一貫して低かった。レンチウイルスベクターの多重感染度(MOI)増加の力価測定を4つのサイトカイン条件で検定したところ、試験した全ての条件で、形質導入との線形関係が観察された(図3A)。
さらに、様々な培地組成物(主として、5%から2%、2%から無血清までの血清濃度の低減)を比較して、それらが形質導入効率に影響を及ぼすか否かを決定した。2%ヒト血清までの血清の低減は、最も高い形質導入効率をもたらした(図3B)。グルタマックス(Glutamax)のみの添加も、形質導入効率に有意な影響を及ぼすと考えられた。
次に、第1日CART及び第10日CARTを、インビボでのそれらの抗腫瘍活性について、マウスALLモデルを用いて検定した。手短には、80%を超える生存率で、前述のように第1日CART及び第10日CARTを製造した(図4A及び4B)。CARTを腫瘍担持マウスに投与し、インビボでの増殖についてモニターした。図4Cに示す通り、第1日CARTは、それらの第10日CART対応物よりも高いレベルのインビボ増殖を示した。特に、IL-2の存在下で製造されたCARTが、最も高いレベルのインビボ増殖を示した(図4C)。試験したCART、全てインビボで腫瘍増殖を阻害したが、第1日CARTは、第10日CARTと比較して動態の遅れを示した(図4D)。この特定のドナーにおいて、IL2条件は、インビボで腫瘍を排除する最も高い能力を明らかにした(図4D)。
さらに、この製造プロセスがスケーラブルであるかどうかも調べた。IL2又はhetIL-15(IL15/sIL-15Ra)いずれかの存在下、24ウェルプレート又は濃縮後のPL30バッグのいずれかにおいて、凍結アフェレーシスサンプルからの精製T細胞を抗CD19CARで形質導入した。hetIL-15は、国際公開第2014/066527号パンフレット(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)に記載されており、これは、ヒトIL-15Raの可溶性形態と複合体化したヒトIL-15を含む。細胞を24時間後に回収し、CARの発現について検定した。図5Bに示すように、プロセスを、IL2又はhetIL-15の存在下において、24ウェルプレートからPL30バッグにスケーリングしたとき、観察される形質導入に影響はなかった。
実施例2:TCR刺激によるCARTの産生
概要
この実施例では、「活性化プロセス」と呼ばれるCART製造プロセスを説明する。一部の実施形態では、細胞(例えば、T細胞)を、IL-2を含有する培地(例えば、無血清培地、例えばOpTmizer(商標)培地)(例えば、OpTmizer(商標)サプリメント、Glutamax及び100IU/mlのIL-2を含有するOpTmizer(商標)培地)に接種し、細胞培養装置内に配置して、抗CD3/抗CD28(例えば、TransAct)と接触させる。12時間後、CARをコードするベクター(例えば、レンチウイルスベクター)を細胞に添加し、細胞をインキュベーターに戻す。細胞培養の開始から24hで、細胞を採取し、サンプリングした後、製剤化した。理論に縛られることを意図しないが、例えば抗CD3/抗CD28(例えば、TransAct)を用いた短時間のCD3及びCD28活性化により、自己再生T細胞の効率的な形質導入を促進する。
概要
この実施例では、「活性化プロセス」と呼ばれるCART製造プロセスを説明する。一部の実施形態では、細胞(例えば、T細胞)を、IL-2を含有する培地(例えば、無血清培地、例えばOpTmizer(商標)培地)(例えば、OpTmizer(商標)サプリメント、Glutamax及び100IU/mlのIL-2を含有するOpTmizer(商標)培地)に接種し、細胞培養装置内に配置して、抗CD3/抗CD28(例えば、TransAct)と接触させる。12時間後、CARをコードするベクター(例えば、レンチウイルスベクター)を細胞に添加し、細胞をインキュベーターに戻す。細胞培養の開始から24hで、細胞を採取し、サンプリングした後、製剤化した。理論に縛られることを意図しないが、例えば抗CD3/抗CD28(例えば、TransAct)を用いた短時間のCD3及びCD28活性化により、自己再生T細胞の効率的な形質導入を促進する。
この実施例及び他の実施例では、「伝統的製造(TM)」プロセスと呼ばれるCART製造プロセスを対照として使用した。一部の実施形態では、T細胞を新鮮な又は凍結保存された白血球アフェレーシスサンプルから選択し(例えば、ポジティブ又はネガティブ選択を用いて)、活性化し(例えば、抗CD3/抗CD28抗体被覆Dynabeads(登録商標)を用いて)、CAR分子をコードする核酸分子と接触させて(例えば、CAR分子をコードする核酸分子を含むレンチウイルスベクターで形質導入する)、例えば7、8、9、10又は11日間インビトロで増殖させた。例示的なTMプロセスは、d9対照アームからのCAR細胞を製造するために使用される方法としてこの実施例に提供される。
方法
一部の実施形態では、本明細書に提供される活性化プロセスは、凍結された又は新鮮な白血球アフェレーシス産物で開始する。カウント及びQCのためのサンプルを取得した後、産物を細胞分別機(例えば、取り付けたCliniMACS(登録商標)Prodigy(登録商標)デバイスキット)に付着させると、プログラムが開始する。細胞を洗浄し、1つ又は複数の所望の表面マーカー(例えば、CD3、CD4、CD8、CD27、CD28、CD45RO、CCR7、CD62L、CD14、CD34、CD95、CD19、CD20、CD22及び/又はCD56)に結合するマイクロビーズと一緒にインキュベートする。ビーズ標識細胞は、細胞を磁気カラムに通過させることによって選択する。所望であれば、第2セットの表面マーカー(例えば、CD3、CD4、CD8、CD27、CD28、CD45RO、CCR7、CD62L、CD14、CD34、CD95、CD19、CD20、CD22及び/又はCD56)に結合するビーズと一緒に陰性画分をインキュベートした後、細胞を磁気分離カラムに再度通過させることにより、細胞をさらに分離することもできる。単離した細胞を再度洗浄してから、分離バッファーを細胞培地と交換する。次に、精製した細胞を培養に進めるか又は後の使用のために凍結保存する。凍結保存した細胞は、解凍し、予め温めた細胞培地で洗浄した後、細胞培地に再懸濁させることができる。新鮮な細胞を培養物に直接添加することができる。細胞を0.4~1.2e6細胞/cm2膜で膜分離バイオリアクターに接種し、抗CD3/抗CD28ビーズ/ポリマー、ナノ粒子又はナノコロイド(及び/又は下記共活性化因子の単独若しくは組み合わせのいずれか:ICOS、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2若しくはCD226を刺激する試薬)などの活性化試薬を添加した後、細胞培地を0.25~2ml/cm2膜の最終量まで添加する。CARをコードするベクター(例えば、レンチウイルスベクター)を培養開始直後又は18時間以内に添加する。培養開始から計24時間にわたって、ベクター及び前述の活性化試薬と一緒に細胞をインキュベートする。培養を24時間進行させたら、回転若しくはピペット操作又は他の攪拌によって機械的に細胞を再懸濁させてから、刺激試薬スカホールドを適切なバッファーと一緒に溶解させる。細胞を洗浄して、不必要な試薬を除去し、凍結保存培地中に再配合する。細胞は、投与のために必要になるまで凍結保存する。
一部の実施形態では、本明細書に提供される活性化プロセスは、凍結された又は新鮮な白血球アフェレーシス産物で開始する。カウント及びQCのためのサンプルを取得した後、産物を細胞分別機(例えば、取り付けたCliniMACS(登録商標)Prodigy(登録商標)デバイスキット)に付着させると、プログラムが開始する。細胞を洗浄し、1つ又は複数の所望の表面マーカー(例えば、CD3、CD4、CD8、CD27、CD28、CD45RO、CCR7、CD62L、CD14、CD34、CD95、CD19、CD20、CD22及び/又はCD56)に結合するマイクロビーズと一緒にインキュベートする。ビーズ標識細胞は、細胞を磁気カラムに通過させることによって選択する。所望であれば、第2セットの表面マーカー(例えば、CD3、CD4、CD8、CD27、CD28、CD45RO、CCR7、CD62L、CD14、CD34、CD95、CD19、CD20、CD22及び/又はCD56)に結合するビーズと一緒に陰性画分をインキュベートした後、細胞を磁気分離カラムに再度通過させることにより、細胞をさらに分離することもできる。単離した細胞を再度洗浄してから、分離バッファーを細胞培地と交換する。次に、精製した細胞を培養に進めるか又は後の使用のために凍結保存する。凍結保存した細胞は、解凍し、予め温めた細胞培地で洗浄した後、細胞培地に再懸濁させることができる。新鮮な細胞を培養物に直接添加することができる。細胞を0.4~1.2e6細胞/cm2膜で膜分離バイオリアクターに接種し、抗CD3/抗CD28ビーズ/ポリマー、ナノ粒子又はナノコロイド(及び/又は下記共活性化因子の単独若しくは組み合わせのいずれか:ICOS、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2若しくはCD226を刺激する試薬)などの活性化試薬を添加した後、細胞培地を0.25~2ml/cm2膜の最終量まで添加する。CARをコードするベクター(例えば、レンチウイルスベクター)を培養開始直後又は18時間以内に添加する。培養開始から計24時間にわたって、ベクター及び前述の活性化試薬と一緒に細胞をインキュベートする。培養を24時間進行させたら、回転若しくはピペット操作又は他の攪拌によって機械的に細胞を再懸濁させてから、刺激試薬スカホールドを適切なバッファーと一緒に溶解させる。細胞を洗浄して、不必要な試薬を除去し、凍結保存培地中に再配合する。細胞は、投与のために必要になるまで凍結保存する。
図6A~6Cに関連する試験のために、以下のプロトコルを使用した。
自動フィコール(Sepax 2、BioSafe)を用いて、新鮮な1/4ロイコパック(leukopack)から細胞を精製して、末梢血単核細胞(PBMC)を作製した。これらのPBMCを、免疫磁気ネガティブ選択(PanT Negative Selection Kit,Miltenyi)を用いてさらに精製することにより、高純度(98~100%)のCD3 T細胞を生成した。これらの細胞を、膜分離バイオリアクター内の、OpTmizer(商標)(Thermo)完全培地(添付文書に従って配合され、100IU/mlのIL-2(Proleukin,Prometheus)が添加されている)及び推奨用量の抗CD3/CD28活性化試薬(TransAct,Milenyi)と一緒に培養させた。次に、細胞を活性化のために37℃、5%CO2で12時間インキュベートした。細胞をインキュベーターから取り出し、新しく解凍したレンチウイルスベクターを2.5tu/細胞の多重感染度(MOI)で培養物に添加した。細胞を形質導入のためにさらに12時間インキュベーターに戻した。細胞を回収し、培地で2回洗浄してから、滅菌PBS(Invitrogen)に直接配合した後、NSGマウスに尾静脈から注射した。d9対照アームからの細胞を、10%ウシ胎仔血清(Seradigm)(完全培地、別名「R10」)及びT細胞当たり3ビーズの抗CD3/28Expander Dynabeads(登録商標)(Thermo)を添加したRPMI培地(Thermo)を用いて、フラスコ内(T25-T225,Corning)で増殖させた。次に、活性化のために、細胞を37℃、5%CO2で24時間インキュベートした。細胞をインキュベーターから取り出し、新しく解凍したレンチウイルスベクターを2.5tu/細胞のMOIで培養物に添加した。細胞をさらに7日間インキュベーターに戻すが、5e5細胞/mlの濃度を維持するために2日毎に分割した。増殖した細胞を50ml遠心分離管(Corning)に移し、自立型磁石(Dynamag-50、Thermo)を用いて、2ラウンドのビーズ除去に付した。次に、脱ビーズした細胞を培地で2回洗浄し、CryoStor10 cryomedia(STEMCELL Technologies)に配合し、CoolCell device(BioCision)を用いて凍結保存した後、少なくとも48時間にわたって気相液体窒素中で維持した。細胞を予め温めたR10培地中で解凍し、培地で2回洗浄してから、滅菌PBS(Invitrogen)に配合した後、NSGマウスに尾静脈から注射した。
6~8週齢のNSGマウス(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJl,Jackson Labs)に、前準備なしでCART注射の4日前に、1e6細胞/マウスでルシフェラーゼ処理NALM6腫瘍細胞(ATCC CRL-3273,ATCC)を注射した。PBS配合CART細胞を、NSG一匹当たり2e6、5e5若しくは2e5CAR+細胞又は対応用量の非形質導入増殖T細胞若しくはPBSビヒクル対照を注射した。マウスは、毎週の採血、2週間毎のルシフェラーゼイメージング(Xenogen IVIS,PerkinElmer)及び2週間毎の体重測定によりモニターした。動物、全て毒性の兆候(体重減少、瀕死)についてモニターし、症候が現れたら安楽死させた。全ての生存マウスを試験終了時(第5週)に安楽死させて、終末血液、骨髄及び脾臓サンプルを取得した。試験は、IACUC及びその他全ての適用可能なガイドラインに従って実施した。
結果
前述の活性化プロセスを用いて、CART細胞を作製し、マウスALLモデルにおけるそれらのインビボ抗腫瘍活性について特性決定した。図6A~6Cに示す通り、活性化プロセスを用いて製造したCART細胞は、インビボで強力な抗腫瘍活性を示した。
前述の活性化プロセスを用いて、CART細胞を作製し、マウスALLモデルにおけるそれらのインビボ抗腫瘍活性について特性決定した。図6A~6Cに示す通り、活性化プロセスを用いて製造したCART細胞は、インビボで強力な抗腫瘍活性を示した。
実施例3:T細胞でのIL6R発現及びT細胞増殖に対するサイトカインの作用
材料及び方法
T細胞培養
以前凍結したT細胞を解凍し、第0日に、表示のサイトカインの存在下でαCD3/αCD28 dynalビーズ(1:3の細胞:ビーズ比)と接触させた。第3日から、第3、5、6、9、12、15及び18日に、2倍のT細胞増殖培地(RPMI1640、10%FBS、2mM L-グルタミン、100μM非必須アミノ酸、1mMピルビン酸ナトリウム、10mM Hepes、55μMβ-メルカプトエタノール、10%FBS及び100U/mlのペニシリン-ストレプトマイシン)を、表示のサイトカイン(サイトカインなし、rhIL2(50IU/ml、Novartis)、IL6(10ng/ml、R&D Systems)、IL7(10ng/ml、Peprotech)、IL15(10ng/ml、Peprotech)及びIL21(10ng/ml、Peprotech))を含むプレートに添加した。サイトカイン、IL6又はIL21なしで処理した細胞は、第18日まで培養し、IL2、IL7又はIL15で処理した細胞は、第25日まで培養した。
材料及び方法
T細胞培養
以前凍結したT細胞を解凍し、第0日に、表示のサイトカインの存在下でαCD3/αCD28 dynalビーズ(1:3の細胞:ビーズ比)と接触させた。第3日から、第3、5、6、9、12、15及び18日に、2倍のT細胞増殖培地(RPMI1640、10%FBS、2mM L-グルタミン、100μM非必須アミノ酸、1mMピルビン酸ナトリウム、10mM Hepes、55μMβ-メルカプトエタノール、10%FBS及び100U/mlのペニシリン-ストレプトマイシン)を、表示のサイトカイン(サイトカインなし、rhIL2(50IU/ml、Novartis)、IL6(10ng/ml、R&D Systems)、IL7(10ng/ml、Peprotech)、IL15(10ng/ml、Peprotech)及びIL21(10ng/ml、Peprotech))を含むプレートに添加した。サイトカイン、IL6又はIL21なしで処理した細胞は、第18日まで培養し、IL2、IL7又はIL15で処理した細胞は、第25日まで培養した。
細胞表面染色
細胞を表示時点で回収してから、生死判定試薬(eFluro780,eBioscience)、CD3(BioLegend、クローン♯:OKT3)、CD4(BioLegend、クローン♯:OKT4)、CD8(BD Bioscience、クローン♯:RPA-T8)、CD45RO(BioLegend、クローン♯:UCHL1)、CCR7(BioLegend、クローン♯:G043H7)、CD27(BD Horizon、クローン♯:L128)、CD127(BioLegend、クローン♯:A019D5)、CD57(BioLegend、クローン♯:HCD57)、CD126(BioLegend、クローン♯:UV4)及びCD130(R&D Systems、クローン♯:28126)抗体で染色した。細胞をFACS Fortessaにより取得した後、FlowJoプログラムを使用して、データ解析を実施した。
細胞を表示時点で回収してから、生死判定試薬(eFluro780,eBioscience)、CD3(BioLegend、クローン♯:OKT3)、CD4(BioLegend、クローン♯:OKT4)、CD8(BD Bioscience、クローン♯:RPA-T8)、CD45RO(BioLegend、クローン♯:UCHL1)、CCR7(BioLegend、クローン♯:G043H7)、CD27(BD Horizon、クローン♯:L128)、CD127(BioLegend、クローン♯:A019D5)、CD57(BioLegend、クローン♯:HCD57)、CD126(BioLegend、クローン♯:UV4)及びCD130(R&D Systems、クローン♯:28126)抗体で染色した。細胞をFACS Fortessaにより取得した後、FlowJoプログラムを使用して、データ解析を実施した。
細胞内サイトカイン染色
第25日に、サイトカイン産生細胞の割合(%)を調べるために、T細胞を採取し、37℃のインキュベーターにおいてBrefeldin A(BioLegend)の存在下、PMA(50ng/ml、Sigma-Aldrich)及びイオノマイシン(1μM、Sigma-Aldrich)で4時間簡単に活性化させた。次に、T細胞を生死判定試薬(eFluro780,eBioscience)、CD3(BioLegend、クローン♯:OKT3)、CD4(BioLegend、クローン♯:OKT4)、CD8(BD Bioscience、クローン♯:RPA-T8)抗体で染色した後、固定及び透過処理した。続いて、T細胞をIFN-γ(BioLegend、クローン♯:4S.B3)、IL-2(BioLegend、MQ1-17H12)及びTNF-a(BioLegend、Mab11)に対する抗体でさらに染色した。細胞をFACS Fortessaにより取得した後、FlowJoプログラムを使用して、データ解析を実施した。
第25日に、サイトカイン産生細胞の割合(%)を調べるために、T細胞を採取し、37℃のインキュベーターにおいてBrefeldin A(BioLegend)の存在下、PMA(50ng/ml、Sigma-Aldrich)及びイオノマイシン(1μM、Sigma-Aldrich)で4時間簡単に活性化させた。次に、T細胞を生死判定試薬(eFluro780,eBioscience)、CD3(BioLegend、クローン♯:OKT3)、CD4(BioLegend、クローン♯:OKT4)、CD8(BD Bioscience、クローン♯:RPA-T8)抗体で染色した後、固定及び透過処理した。続いて、T細胞をIFN-γ(BioLegend、クローン♯:4S.B3)、IL-2(BioLegend、MQ1-17H12)及びTNF-a(BioLegend、Mab11)に対する抗体でさらに染色した。細胞をFACS Fortessaにより取得した後、FlowJoプログラムを使用して、データ解析を実施した。
結果
IL6Rα及び/又はIL6Rβ発現細胞を、CD4及びCD8T細胞の双方で、より低い分化T細胞サブセット中で濃縮した。図7A及び7Bに示す通り、ナイーブCD4及びCD8T細胞は、対応するメモリーT細胞よりも高いレベルのIL6Rα及びIL6Rβを発現した。IL6Rα及びIL6Rβを発現したT細胞は、主としてCD45RA+CD45RO-CD27+CD28+細胞であった(図8A及び8B)。TCR刺激時、IL6Rα発現が下方制御されたが、IL6Rβ発現はそうではなかった(図11)。
IL6Rα及び/又はIL6Rβ発現細胞を、CD4及びCD8T細胞の双方で、より低い分化T細胞サブセット中で濃縮した。図7A及び7Bに示す通り、ナイーブCD4及びCD8T細胞は、対応するメモリーT細胞よりも高いレベルのIL6Rα及びIL6Rβを発現した。IL6Rα及びIL6Rβを発現したT細胞は、主としてCD45RA+CD45RO-CD27+CD28+細胞であった(図8A及び8B)。TCR刺激時、IL6Rα発現が下方制御されたが、IL6Rβ発現はそうではなかった(図11)。
次に、様々なサイトカインを、T細胞増殖に対するそれらの影響について比較した。試験したサイトカインのうち、IL15、IL2及びIL7は、T細胞増殖を増大し、IL15が最大の増大を示した(図12)。サイトカイン処置は、細胞のサイズ(図13A)又は生存率(図13B)に影響しなかった。IL15処理は、IL6Rβ発現細胞の増殖も増大した(図14)。IL6Rβ発現細胞は、主に、TCR結合後15日のCD4及びCD8の双方で、CD27+(図16)又はCD57-(図17)T細胞サブセットに存在し、TCR活性化後25日で、IL2、IFNγ及びTNFαサイトカインを産生した(図18)。
実施例4:前臨床試験のためのTCR刺激によるCARTの産生
前臨床試験のためのエンジニアリングランの第0日単位操作は、第0日に使用する培地ラピッドバッファー(Rapid Buffer)及びラピッドメディア(表21)の製造から開始した。ラピッドバッファー(RB)は、0.5%HSAと共にCliniMACS(登録商標)バッファー(Miltenyi)を含有した。ラビットメディア(表21)は、製造第0日に調製され、基本培地は、OpTmizer(商標)と呼ばれる既製品培地を含むが、この培地は、Glutamax、IL-2、CTS(商標)サプリメント及びICSRを含有する。Prodigy(登録商標)機を第0日での使用のためにプライミングした。
前臨床試験のためのエンジニアリングランの第0日単位操作は、第0日に使用する培地ラピッドバッファー(Rapid Buffer)及びラピッドメディア(表21)の製造から開始した。ラピッドバッファー(RB)は、0.5%HSAと共にCliniMACS(登録商標)バッファー(Miltenyi)を含有した。ラビットメディア(表21)は、製造第0日に調製され、基本培地は、OpTmizer(商標)と呼ばれる既製品培地を含むが、この培地は、Glutamax、IL-2、CTS(商標)サプリメント及びICSRを含有する。Prodigy(登録商標)機を第0日での使用のためにプライミングした。
Prodigy(登録商標)機は、第0日にプライミングし、健常なドナー白血球アフェレーシス材料を解凍し、アフェレーシス材料を合わせて600mLトランスファーバッグに導入したが、これは後にProdigy(登録商標)に密着させることができる。IPCサンプルを600mLトランスファーバッグから抽出し、NC200により測定して、出発アフェレーシス材料について生存細胞数及び生存率パーセンテージを取得した。Prodigy(登録商標)のプライミングを終了した後、アフェレーシス材料をアプリケーションバッグに移した。TCTプログラムの開始後にアフェレーシスがProdigy(登録商標)機に進入すると、それがどの程度多くのポジティブ選択分離を実施したかに応じて、プログラムは3時間45分から4時間15分まで作動した。第0日のTCTプログラムは、ラピッドバッファーによりCentricult中のDMSOを洗い流し、血小板洗浄、減容、Centricult中でのCD4及びCD8マイクロビーズとアフェレーシスのインキュベーションに続いて、Prodigy(登録商標)上の磁石を用いたポジティブ選択により、マイクロビーズでのT細胞の選択を実施する。CD4及びCD8試薬で選択されたT細胞を、ラピッドメディアを含むリアプリケーションバッグ中に溶出した。インプロセスコントロール(IPC)サンプルをリアプリケーションバッグから取得して、培養容器(G-Rex500MCS)中の接種に利用可能な総生存細胞数を決定した。
G-Rex培養装置をまず、ラピッドメディアでプライミングした後、リアプリケーションバッグからの標的細胞容量を培養容器に添加した。次に、活性化試薬(TransACT)を培養容器に添加した。続いて、TransACTの導入後にレンチウイルスベクターを培養容器に添加し、1.0のMOIを用いてベクター添加を実施した。次に、G-Rex500MCS培養容器を、250mLの最終培地容量までのラピッドメディア、さらにそのベクター添加容量でフラッシングした。続いて、G-Rex培養容器をインキュベーター中に配置して、20~28時間の範囲の目標24hにわたって培養物をインキュベートした。
標的24hインキュベーション後、CART培養物をインキュベーターから取り出し、サンプルを抽出して、ハーベストウォッシュ(Harvest Wash)前の細胞培養物の生存細胞数及び生存率を取得した。プレハーベスト(Pre-Harvest)に取得したサンプルはIPCであり、LOVO洗浄装置へのインプットとして使用することにより、回転濾過膜への細胞の流量を決定した。LOVOは、IPCとして生存WBC濃度を使用した。CART製造プロセスのために使用されるプログラムは、1溶液による4回の洗浄(Wash)として記載され、ハーベストバッファー(PBS+2.0%HSA)を使用した。LOVO洗浄中、減容及びハーベストバッファーによる細胞の洗浄の双方にIPCバッグを使用した後、それを最終的にアウトプットバッグ中に溶出した。次に、LOVO洗浄からのアウトプットバッグをサンプリングして、sanisureボトルを用いた手動の遠心分離の実施と共に、凍結培地を用いた最終製剤化の最終ステップを実施するために、生存細胞数及び生存率を取得した。
実施例5:活性化高速製造(ARM)プロセスを用いたBCMA CARTの産生
概要
この実施例では、「活性化高速製造(ARM)」と呼ばれるCART製造プロセスを説明する。一部の実施形態では、細胞(例えば、T細胞)を、培地(例えば、無血清培地、例えばOpTmizer(商標)培地)、組換えヒトIL-2培地(例えば、OpTmizer(商標)サプリメント、Glutamax及び100IU/mlのIL-2を含有するOpTmizer(商標)培地)、抗CD3/抗CD28(例えば、TransACT)及びBCMA CARをコードするベクター(例えば、レンチウイルスベクター)を含有する細胞培養装置中で培養する。24時間後、「第1日CART産物」と称される細胞を採取し、サンプリングした後、製剤化した。理論に縛られることを意図しないが、抗CD3/抗CD28(例えば、TransACT)を用いた簡単なCD3及びCD28の活性化は、自己再生T細胞の効率的な形質導入を促進する。一部の事例では、培養から48h、72h及び96h又は7日後にいくつかの細胞を採取して、インビトロでのBCMA CAR発現動態を測定する。第1日CART応答は、限定されないが、インビボ細胞溶解活性及び増殖を含む。
概要
この実施例では、「活性化高速製造(ARM)」と呼ばれるCART製造プロセスを説明する。一部の実施形態では、細胞(例えば、T細胞)を、培地(例えば、無血清培地、例えばOpTmizer(商標)培地)、組換えヒトIL-2培地(例えば、OpTmizer(商標)サプリメント、Glutamax及び100IU/mlのIL-2を含有するOpTmizer(商標)培地)、抗CD3/抗CD28(例えば、TransACT)及びBCMA CARをコードするベクター(例えば、レンチウイルスベクター)を含有する細胞培養装置中で培養する。24時間後、「第1日CART産物」と称される細胞を採取し、サンプリングした後、製剤化した。理論に縛られることを意図しないが、抗CD3/抗CD28(例えば、TransACT)を用いた簡単なCD3及びCD28の活性化は、自己再生T細胞の効率的な形質導入を促進する。一部の事例では、培養から48h、72h及び96h又は7日後にいくつかの細胞を採取して、インビトロでのBCMA CAR発現動態を測定する。第1日CART応答は、限定されないが、インビボ細胞溶解活性及び増殖を含む。
ARMプロセスを用いた第1日BCMA CARTの産生
一部の実施形態では、本明細書に提供される活性化プロセスは、凍結された又は新鮮な白血球アフェレーシス産物で開始する。カウント及びQCのためのサンプルを取得した後、産物を細胞分別機(例えば、取り付けたCliniMACS(登録商標)Prodigy(登録商標)デバイスキット)に付着させると、プログラムが開始する。細胞を洗浄し、所望の表面マーカー、例えばCD4及びCD8などに結合するマイクロビーズと一緒にインキュベートする。ビーズ標識細胞は、細胞を磁気カラムに通過させることによって選択する。単離した細胞を再度洗浄してから、分離バッファーを細胞培地と交換する。次に、精製したT細胞を培養に進めるか又は後の使用のために凍結保存する。単離したT細胞の純度は、フローサイトメトリー評価によるQCステップを通過することになる。凍結保存した細胞は、解凍し、予め温めた細胞培地で洗浄し、細胞培地に再懸濁させることができる。新鮮な細胞を培養物に直接添加することができる。細胞を0.4~1.2e6細胞/cm2膜で膜分離バイオリアクターに接種し、抗CD3/抗CD28ビーズ/ポリマー、ナノ粒子又はナノコロイドなどの活性化試薬を添加した後、細胞培地を0.25~2ml/cm2膜の最終量まで添加する。平板培養時、様々な多重感染度(MOI)の、BCMA CARをコードするレンチウイルスベクターで細胞を形質導入する。SupT1などの細胞株に基づいて力価及びMOIを測定する。24時間の時点で、細胞を洗浄して不要な試薬を除去した後、染色して、フローサイトメトリーによりCAR発現を測定し、インビボ試験のための「第1日CART産物」として凍結保存培地に再製剤化する。
一部の実施形態では、本明細書に提供される活性化プロセスは、凍結された又は新鮮な白血球アフェレーシス産物で開始する。カウント及びQCのためのサンプルを取得した後、産物を細胞分別機(例えば、取り付けたCliniMACS(登録商標)Prodigy(登録商標)デバイスキット)に付着させると、プログラムが開始する。細胞を洗浄し、所望の表面マーカー、例えばCD4及びCD8などに結合するマイクロビーズと一緒にインキュベートする。ビーズ標識細胞は、細胞を磁気カラムに通過させることによって選択する。単離した細胞を再度洗浄してから、分離バッファーを細胞培地と交換する。次に、精製したT細胞を培養に進めるか又は後の使用のために凍結保存する。単離したT細胞の純度は、フローサイトメトリー評価によるQCステップを通過することになる。凍結保存した細胞は、解凍し、予め温めた細胞培地で洗浄し、細胞培地に再懸濁させることができる。新鮮な細胞を培養物に直接添加することができる。細胞を0.4~1.2e6細胞/cm2膜で膜分離バイオリアクターに接種し、抗CD3/抗CD28ビーズ/ポリマー、ナノ粒子又はナノコロイドなどの活性化試薬を添加した後、細胞培地を0.25~2ml/cm2膜の最終量まで添加する。平板培養時、様々な多重感染度(MOI)の、BCMA CARをコードするレンチウイルスベクターで細胞を形質導入する。SupT1などの細胞株に基づいて力価及びMOIを測定する。24時間の時点で、細胞を洗浄して不要な試薬を除去した後、染色して、フローサイトメトリーによりCAR発現を測定し、インビボ試験のための「第1日CART産物」として凍結保存培地に再製剤化する。
この実施例には、ARMプロセスを用いて製造される、BCMA CAR R1B6、R1F2、R1G5、PI61、B61-02、B61-10又はHy03を発現するT細胞の産生及び特性決定が記載される。R1B6、R1F2及びR1G5の配列は表3~6に開示する。PI61、B61-02及びB61-10の配列は、表7~11に開示する。Hy03の配列は、表12~15に開示する。
2.5のMOIでBCMA CARをコードするレンチウイルスベクターを用いて、T細胞を形質導入してから24時間後、rBCMA_Fcを用いたフローサイトメトリーによりCARの発現を測定した。図19Aに示すように、生存CD3+T細胞の集団全体が異なる度合いで右にシフトしたことが認められた。R1G5、R1B6又はPI61を発現するように形質導入された細胞が、最も高いCAR発現を示した(図19A)。フローサイトメトリーにより測定されるこの発現のパターンは、CARを発現するように形質導入された細胞の典型的なフローサイトメトリーヒストグラム(この場合、CAR陽性集団は、陰性集団から明瞭に分離される)と異なっていた。図19Aは、rBCMA_Fcにより検出される「偽形質導入又は一過性発現」が存在し得ることを示しており、これは、必ずしも実際の遺伝子発現を示すわけではない。レンチウイルス偽形質導入が観察され、これはベクターの添加時点から開始し、CD34+細胞では最大24時間及び293細胞では最大72時間持続することがこれまでに報告されている(Haas DL,et Al.Mol Ther.2000.291:71-80)。インテグラーゼ欠損型レンチウイルスベクターは、CD34+細胞において最大10日及び293細胞では、最大14日にわたって一過性eGFP発現を引き起こした。レンチウイルス偽形質導入はT細胞において広範に研究されていないが、こうした短時間での一過性発現の可能性は、無視することができない。そのため、インビトロ動態試験を実施して、以下に示すようにARMを用いて製造した細胞のCAR発現を測定した。
ARMプロセスを用いて製造した細胞のインビトロCAR発現動態試験
本明細書に記載の試験により、ARMプロセスを用いて製造した細胞が、どのようにしてCAR分子を経時的に発現するかを調べる。手短には、健常なドナーからのT細胞を、1のMOIのARMプロセスを用いてBCMA CARを発現するように製造し、様々な時間にわたって培養を維持し、24h、48h、72h、96h及び7日に採取して、AF647標識rBCMA_Fcを用いたフローサイトメトリーによりCAR発現動態を評価した。CAR発現動態を理解することは、インビボでトリアージ又は臨床用量設定戦略のためのリアル且つ安定な発現のための代替時点を見出す上で役立つ。
本明細書に記載の試験により、ARMプロセスを用いて製造した細胞が、どのようにしてCAR分子を経時的に発現するかを調べる。手短には、健常なドナーからのT細胞を、1のMOIのARMプロセスを用いてBCMA CARを発現するように製造し、様々な時間にわたって培養を維持し、24h、48h、72h、96h及び7日に採取して、AF647標識rBCMA_Fcを用いたフローサイトメトリーによりCAR発現動態を評価した。CAR発現動態を理解することは、インビボでトリアージ又は臨床用量設定戦略のためのリアル且つ安定な発現のための代替時点を見出す上で役立つ。
第1日に、1のMOIで形質導入された細胞のCAR発現パターン(図20A)は、2.5のMOIで形質導入された細胞のそれと類似している(図19A)。いずれのMOI条件も、第1日に偽又は一過性発現パターンを示した(図19A及び20A)。しかし、第2日に、rBCMA_Fc陽性集団は、UTD陰性対照群から分離し始めた(図20A)。第3及び第4日に、rBCMA_Fc陽性集団(BCMA CAR発現細胞を呈示し、UTD群には存在しない)が、細胞がBCMA CARを発現するように形質導入された全ての群に明確に現れた。第3日から第4日まで、CAR+%は、各CAR構築物について比較的安定しており(図20B)、最も高いMFIは第3日に観察された(図20C)(細胞は、この時点で最大であった)。図19Aに示すデータと一致して、PI61、R1G5及びR1B6を発現するように形質導入された細胞は、最も高いCAR発現細胞であった(図20A)。特に、R1F2又はHy03をコードするベクターで形質導入された細胞は、第1日に一過性CAR発現を示さなかったが、第3日及び第4日後にBCMA CAR分子を明らかに発現した(図20A)。結論として、様々なCARをコードするベクターは、経時的に様々なCAR発現動態を有すると考えられ、CAR発現の代替時点として、第3日が選択された。
インビボでの第1日のARMで処理したBCMA CARTの機能性の評価
播種性KMS-11-luc多発性骨髄腫異種移植マウスモデルを用いて、第1日CARTをそれらのインビボでの抗腫瘍活性について調べた。ルシフェラーゼリポーターは、定量的生物発光イメージング(BLI)により疾患負荷のモニタリングを可能にする。手短には、前述のように製造した第1日CARTを腫瘍担持マウスに投与した。最初のインビボ試験(図21A及び21B)において、各マウスは、1.5E6細胞の用量で最終CART産物を受けた。CAR発現を第1日及び第7日に分析した(図21A)。インビボ有効性試験では、PI61、R1G5又はR1B6を発現する細胞は、強力な抗腫瘍活性を示した(図21B)。R1F2を発現する細胞は、有効性の遅延を示した(図21B)。UTD群も、CART注射から14日後に部分的抗腫瘍活性を示したが、これはアロ反応によるものと考えられる(図21B)。2回目のインビボ試験では、CAR+T細胞の用量漸増法を試験した。CAR+T細胞の用量は、第3日のCAR+%に基づいて決定した(図22A)。腫瘍取込み動態をBLI測定により週2回モニターした。図22Aは、第1日及び第3日に検出されたCAR発現を示す。インビボ結果は、図22Bに示すように、1.5e5 CAR+T細胞及び5e4 CAR+T細胞の両用量で3つのクローンPI61、R1B6及びR1G5の全てが、腫瘍を拒絶し、排除できたことを示す。図22Cは、この試験の過程での体重変化を示すが、GVHDの前兆を呈示していない。
播種性KMS-11-luc多発性骨髄腫異種移植マウスモデルを用いて、第1日CARTをそれらのインビボでの抗腫瘍活性について調べた。ルシフェラーゼリポーターは、定量的生物発光イメージング(BLI)により疾患負荷のモニタリングを可能にする。手短には、前述のように製造した第1日CARTを腫瘍担持マウスに投与した。最初のインビボ試験(図21A及び21B)において、各マウスは、1.5E6細胞の用量で最終CART産物を受けた。CAR発現を第1日及び第7日に分析した(図21A)。インビボ有効性試験では、PI61、R1G5又はR1B6を発現する細胞は、強力な抗腫瘍活性を示した(図21B)。R1F2を発現する細胞は、有効性の遅延を示した(図21B)。UTD群も、CART注射から14日後に部分的抗腫瘍活性を示したが、これはアロ反応によるものと考えられる(図21B)。2回目のインビボ試験では、CAR+T細胞の用量漸増法を試験した。CAR+T細胞の用量は、第3日のCAR+%に基づいて決定した(図22A)。腫瘍取込み動態をBLI測定により週2回モニターした。図22Aは、第1日及び第3日に検出されたCAR発現を示す。インビボ結果は、図22Bに示すように、1.5e5 CAR+T細胞及び5e4 CAR+T細胞の両用量で3つのクローンPI61、R1B6及びR1G5の全てが、腫瘍を拒絶し、排除できたことを示す。図22Cは、この試験の過程での体重変化を示すが、GVHDの前兆を呈示していない。
実施例6:12~24時間で採取される高速CARTの動態
概論
高速CART産物を24時間未満で産生できるか否かを決定するために、培養物で12~24時間後に生成された高速CARTの採取についての動態を特性決定した。この評価は、凍結保存した健常なドナーフェレーシスから濃縮したT細胞と、接種時のTransACT活性化試薬及び技術グレードCTL019ベクターの同時添加とを使用して、スモールスケールで実施した。一次読出しは、新しく採取したCART産物についての生存率、増殖後の生存細胞回収、白血球及びT細胞サブセット組成並びに形質導入効率(表面免疫表現型決定により決定される通り)であった。
概論
高速CART産物を24時間未満で産生できるか否かを決定するために、培養物で12~24時間後に生成された高速CARTの採取についての動態を特性決定した。この評価は、凍結保存した健常なドナーフェレーシスから濃縮したT細胞と、接種時のTransACT活性化試薬及び技術グレードCTL019ベクターの同時添加とを使用して、スモールスケールで実施した。一次読出しは、新しく採取したCART産物についての生存率、増殖後の生存細胞回収、白血球及びT細胞サブセット組成並びに形質導入効率(表面免疫表現型決定により決定される通り)であった。
方法
レンチウイルス産生及び力価決定:4.7×107TU/mLのHEK293TベースqPCR力価及び1.88×107TU/mLの概算T細胞ベース力価を用いて、CTL019をコードするレンチウイルスベクターを調製した。
レンチウイルス産生及び力価決定:4.7×107TU/mLのHEK293TベースqPCR力価及び1.88×107TU/mLの概算T細胞ベース力価を用いて、CTL019をコードするレンチウイルスベクターを調製した。
T細胞単離:健常なドナーフェレーシスの凍結保存ロイコパック(LKPK)をHemacareから取得し、必要になるまで液体窒素中で保存した。第0日に、アフェレーシスを小さい氷の結晶が残るまで解凍した後、Prodigy(登録商標)プロセスバッファーで希釈した。次に、TS 520チュービングセット及びT細胞形質導入(TCT)プログラムソフトウエアバージョン1.0を備えるCliniMACS(登録商標)Prodigy(登録商標)で、自動化CD4/CD8ポジティブ選択を実施した。最終的Prodigy(登録商標)産物をOpTmizer(商標)完全T細胞培地中に溶出し、Cellometer Vision(Nexcelom)により列挙されるように、AO/PI染色により細胞濃度及び生存率を決定した。
培養開始及び形質導入:Prodigy(登録商標)産物からの細胞を計7つの容器(形質導入培養物用の5つの容器と、非形質導入(UTD)培養物用の2つの容器)に直ちに接種した。時点0で、各容器に膜1cm2当たり0.6×106生存細胞の密度で、GMPグレードTransActと共に接種してから、IL-2を含有するOpTmizer(商標)完全T細胞培地で1.2×106生存細胞/mLの最終濃度に到達させた。ベクターを室温で解凍し、概算T細胞力価に基づく0.45のMOIで各形質導入培養物に添加した。UTD対照にはウイルスを添加しなかった。一旦接種したら、採取の準備ができるまで、培養物を37℃及び5%CO2でインキュベートした。
採取:培養開始から12~24時間の各時点で、採取のために1つの形質導入培養物を選択した。容器を回転させて、膜から離して細胞を穏やかに再懸濁させることにより細胞を採取し、次に、全培養容量を再懸濁させた後、セロロジカルピペットによりコニカルチューブに移した。洗浄前カウント、生存率決定及びフロー染色のために、小さいアリコートを取り出した。各培養物の残りを50mLで2回(UTD容器の場合、100mLで2回)洗浄し、再懸濁させてから、洗浄後アリコートを取り出して、カウント及び生存率を検定した。
CART製造中の白血球組成及びCD19-CAR発現のフローサイトメトリー:白血球組成、T細胞表現型及び必要に応じてCAR発現について、培養前後のインプロセスサンプルを染色した。特別注文の蛍光色素標識抗イディオタイプ抗体(eBioscience)を用いて、形質導入細胞でのCTL019-CAR発現を評価した。各採取時点で、培養物のアリコートを生死判定試薬(Biolegend)で直ちに染色し、洗浄した後、いずれもCD3染色及び抗イディオタイプ抗体を含有する2つのフローパネルで染色し、獲得のためにパラホルムアルデヒド中に固定した。サンプルをフローサイトメーター(BD LSRFortessa;補正のために単一色の対照を使用した)で測定し、データをFlowJoソフトウエアで解析した。解析のために、白血球組成について染色したサンプル、全て生存CD45+一重項事象に基づいてプリゲートし、T細胞サブセットについて染色したサンプル、全て生存CD3+一重項事象に基づいてプリゲートした。CD45RO及びCCR7についてのゲートは、蛍光マイナスワン(FMO)対照を用いて設定した。
結果
LKPKの白血球組成、培養前のProdigy(登録商標)産物及び培養後のCART産物を第0日及び各採取時点でフローサイトメトリーにより特性決定した。同定された細胞型は、T細胞(CD3+)、単球(CD14+)、B細胞(CD19+)、ナチュラルキラー(NK)細胞(CD3-56+)及び他の細胞であった(表22)。Prodigy(登録商標)濃縮により、生存率が高く(92.9%)且つT細胞について濃縮された(48%から92%に)第0日出発材料が産生されたのに対し、混入B細胞(6%から0.10%に)並びに単球及びNK細胞は各々4%未満まで減少した。12~24時間の培養後、生存細胞の純度はさらに3~4.4%増加し、これは、12時間時点までの単球及びB細胞の即時減少並びに12から24時間時点までのNK細胞の漸減と対応する。フローサイトメトリーにより細胞外CARを発現する白血球のうち、3%未満が混入細胞(即ちT細胞ではない)であり、接種後15時間~19時間でCAR純度の最大の上昇(96.6%から99.2%に)がみられた。
LKPKの白血球組成、培養前のProdigy(登録商標)産物及び培養後のCART産物を第0日及び各採取時点でフローサイトメトリーにより特性決定した。同定された細胞型は、T細胞(CD3+)、単球(CD14+)、B細胞(CD19+)、ナチュラルキラー(NK)細胞(CD3-56+)及び他の細胞であった(表22)。Prodigy(登録商標)濃縮により、生存率が高く(92.9%)且つT細胞について濃縮された(48%から92%に)第0日出発材料が産生されたのに対し、混入B細胞(6%から0.10%に)並びに単球及びNK細胞は各々4%未満まで減少した。12~24時間の培養後、生存細胞の純度はさらに3~4.4%増加し、これは、12時間時点までの単球及びB細胞の即時減少並びに12から24時間時点までのNK細胞の漸減と対応する。フローサイトメトリーにより細胞外CARを発現する白血球のうち、3%未満が混入細胞(即ちT細胞ではない)であり、接種後15時間~19時間でCAR純度の最大の上昇(96.6%から99.2%に)がみられた。
培養して18時間後のCAR発現細胞の純度の上昇(表22)は、CAR表面発現を有するT細胞のパーセンテージの増加と一致する(図22A及び23C)。24時間の培養後にフローサイトメトリーによって評価した高速CART産物で上に観察された通り(実施例5を参照)、CAR表面発現は、明確な陽性及び陰性集団をもたらさなかった。従って、CAR陽性についてのゲーティングは、下限としてのUTDサンプルを用いて設定した。細胞外CARを発現するCD3+細胞の割合は、接種から15時間後まで1%未満のままであり;その後、CAR発現は、3時間毎に3~4%ずつ増加し、飽和することなく最大11.8%に達した(図23A)。MFIにより測定されるCAR発現の強度も、>18時間の培養後やや増加したが、24時間を通して弱いままであった(図23B)。
さらに、CD4、CD8、CD45RO及びCCR7の組み合わせを用いて各時点(表24A及び24B)でT細胞サブセット(CD4:CD8比及びメモリーサブセット組成)も評価し;ここで、非分化ネイティブ様T細胞はCCR7+CD45RO-として、セントラルメモリー細胞はCCR7+CD45RO+として、エフェクターメモリー細胞はCCR7-CD45RO+として、且つ高度分化エフェクターT細胞はCCR7-CD45RO-として定義された。UTDを含め、評価した全ての時点で、培養物は、初期出発材料(それぞれ23%及び52%)よりも、高い割合のナイーブ細胞(40~47%)及び低い割合のセントラルメモリー細胞(33~39%)を含有した。興味深いことに、バルク組成物中のナイーブ又はセントラルメモリーT細胞の頻度は、12~24時間で変化しなかったが、その後の採取物は、より高い頻度の細胞外CAR発現細胞(ナイーブであった)及びより低い頻度の細胞外CAR発現細胞(セントラルメモリー細胞であった)と相関した(18時間時点でのCAR発現細胞中16%ナイーブ/63%セントラルメモリー細胞及び24時間時点でのCAR発現細胞中24%ナイーブ/54%セントラルメモリー細胞)。同様に、バルクCD4:CD8比は有意に変化しなかったが、CAR+細胞のCD4画分は、18~24時間で10%減少した(66%から56%)。総細胞数へのこれらの頻度の変換(図25)から、CARを最も早期に発現するとみられたT細胞のサブセットは、培養の15~18時間にわたり、大部分がナイーブCD4細胞であり;その後、ナイーブCD8 CAR及びセントラルメモリー細胞CD8 CARの頻度が急速に増加することが明らかである。
生存細胞回復(又は増殖倍率)並びに洗浄前及び洗浄後生存率を各採取時点で決定した(図26及び27)。生存細胞の回復は、接種から18時間後(最低46%、細胞外CAR発現の速度増加と一致)まで13%低下し、その後の時点で採取した培養物について52%までやや増加した(図26)。産物生存率は、洗浄後71~77%まで増加し、採取について、生存率は、5~24時間で低下した(図27)。
結論
12~24時間に試験した時点のうち、TransAct及び技術グレードCTL019ベクターで同時に接種した高速CARTは、24時間の時点で最も高いCAR表面発現を示す。非常に少数の細胞は、接種後15時間までCAR+(採取の時間に測定)であり、その後、%CARはより急速に増加する。CAR発現の強度は弱いが、接種から18時間後にゆっくりと増加する。
12~24時間に試験した時点のうち、TransAct及び技術グレードCTL019ベクターで同時に接種した高速CARTは、24時間の時点で最も高いCAR表面発現を示す。非常に少数の細胞は、接種後15時間までCAR+(採取の時間に測定)であり、その後、%CARはより急速に増加する。CAR発現の強度は弱いが、接種から18時間後にゆっくりと増加する。
高速CART産物は、接種後12~24時間の全ての時点で、最初の12時間での単球減少のために出発材料より純度が高くなり(より高い%T細胞)、続いてNK細胞がわずかに減少し、残留B細胞はProdigy(登録商標)濃縮により全く除去されなかった。
接種後18時間で採取したとき、全体的な細胞回復は最も低かった(24時間までにやや改善する)が、全体的なT細胞組成は、接種後12~24時間で変化しない。細胞外CARを最初に発現するT細胞は、接種後15~18時間にわたり、大部分がセントラルメモリーCD4であり、その後、ナイーブ及びセントラルメモリーCD8がCAR発現を示す。
実施例7:活性化高速製造(ARM)プロセスの説明
一部の実施形態では、連続的活性化高速製造(ARM)プロセスを用いて、約2日かけてCART細胞を製造するが、これにより恐らくより多数の低分化T細胞(Tナイーブ及びTSCM(ステムセントラルメモリーT)細胞)をインビボ細胞増殖のために患者に戻すことが可能になるであろう。短い製造期間により、早期分化T細胞プロフィールは、その所望の最終分化状態に向けて、エクスビボ培養容器内ではなく、体内で増殖することが可能になる。
一部の実施形態では、連続的活性化高速製造(ARM)プロセスを用いて、約2日かけてCART細胞を製造するが、これにより恐らくより多数の低分化T細胞(Tナイーブ及びTSCM(ステムセントラルメモリーT)細胞)をインビボ細胞増殖のために患者に戻すことが可能になるであろう。短い製造期間により、早期分化T細胞プロフィールは、その所望の最終分化状態に向けて、エクスビボ培養容器内ではなく、体内で増殖することが可能になる。
一部の実施形態では、CART細胞は、凍結保存白血球アフェレーシス源材料、例えば非動員自己末梢血白血球アフェレーシス(LKPK)材料を用いて製造される。凍結保存材料は、抗CD4/抗CD8免疫磁気システムを用いて、生産の1日目(第0日)にT細胞濃縮のためのプロセシングステップに付す。次に、陽性画分をG-rex培養容器に接種し、抗CD3/CD28系(TransACT)で活性化し、同じ日に、CARをコードするレンチウイルスベクター(LV)で形質導入する。翌日、形質導入の20~28時間後、T細胞を採取し、4回洗浄し、凍結培地に製剤化した後、コントロールレートフリーザー(Controlled Rate Freezer)(CRF)により凍結する。第0日のプロセスの開始から翌日の採取の開始まで、第0日の接種後24時間を目標にして、細胞を20~28時間培養する。
第0日の培地を表21に従って調製した。凍結白血球アフェレーシス材料を解凍する。解凍した細胞をラピッドバッファー(表21)で希釈し、CliniMACS(登録商標)Prodigy(登録商標)装置で洗浄する。T細胞をCliniMACS(登録商標)CD4及びCD8マイクロビーズにより選択する。T細胞選択(約3時間40分~4時間40分)のためのプログラムが終了したら、ラピッドメディア(表21)に懸濁させた細胞を含むリアプリケーションバッグをトランスファーパックに移す。生存率及び細胞カウントのためにサンプルを取得した。培養容器を活性化及びベクター形質導入に接種する際、陽性画分バッグからの細胞数及び生存率データを用いて、細胞濃度を決定する。
CliniMACS(登録商標)マイクロビーズ(CD4及びCD8)を用いたT細胞のポジティブ選択後、細胞を培養容器、G-Rexに接種する。細胞を接種したら、活性化試薬(TransACT)を培養容器に添加する。次に、1.0(0.8~1.2)の目標MOIで、CARをコードするレンチウイルスベクターにより細胞を形質導入する。ベクター添加後、培養容器をインキュベーターに移し、そこで、公称5%CO2(作動範囲4.5~5.5%)、37℃の公称温度(作動範囲36~38℃)で目標の24時間にわたり(作動範囲20~28時間)それをインキュベートする。インキュベーション後、細胞をハーベスト洗浄液(Harvest Wash Solution)(表21)で4回洗浄して、非組込みベクター及び残留ウイルス粒子並びに他のプロセス関連不純物を全て除去する。次に、細胞を溶出し、細胞数及び生存率のためのサンプルを取得して試験し、それらの結果を用いて、CryoStor(登録商標)CS10を用いた最終製剤化のために、細胞を再懸濁させるのに必要な量を決定する。続いて、細胞を遠心分離して、ハーベスト洗浄液を除去し、凍結保存を実施する。
一部の実施形態では、CART細胞中に発現したCARがCD19に結合する。一部の実施形態では、ラピッドメディア(RM)(表21)に使用したIL-2の代わりに、IL-15、hetIL-15(IL-15/sIL-15Ra)、IL-6又はIL-6/sIL-6Raを使用することができる。
一部の実施形態では、CART細胞中に発現したCARはBCMAに結合する。一部の実施形態では、ラピッドメディア(RM)(表21)に使用したIL-2の代わりに、IL-15、hetIL-15(IL-15/sIL-15Ra)、IL-6又はIL-6/sIL-6Raを使用することができる。
実施例8:活性化高速製造(ARM)プロセスを用いて製造されるCD19CART細胞の特性決定
本明細書には、活性化高速製造(ARM)プロセスを用いて製造される抗CD19CAR-T細胞産物が開示される。ARMプロセスは、伝統的製造(TM)プロセスと比較して、ターンアラウンドタイムを短縮し、先を見越して、患者に対する抗CD19CAR-T細胞産物の適時注入を可能にする。さらに、ARMプロセスは、改善した抗腫瘍効果に関連する細胞サブセットである推定ステムメモリーT(Tstem)細胞も保存する。製造の主な違いは、TMプロセスが、抗CD19CART細胞を、製剤化前にインターロイキン(IL-)2と一緒に9日間インビトロで培養する増殖期を含むのに対し、ARMプロセスは、わずか24時間の培養後に製剤化を可能にする点である。これは、CD3及びCD28に対するアゴニスト活性を有するモノクローナル抗体(mAb)と結合した完全に生体適合性のナノマトリックスの使用により可能になるものであり、こうしたビーズは、TMプロセスで使用されるCD3/CD28常磁性ビーズと異なり、形質導入の直後に残留レンチウイルスベクターと一緒に洗い流すことができる。異種移植マウスモデルからの結果並びにTstem細胞の最終産物濃縮、持続性が増加し、且つ長期抗腫瘍効果に関連する亜集団は、TMプロセスを用いて製造される抗CD19CART細胞と比較して、ARMプロセスを用いて製造される抗CD19CART細胞の治療可能性の全体的向上を示唆している。異種移植マウスモデルにより明らかにされた別の重要な相違は、TMプロセスを用いて製造される対応物と比較して、ARMプロセスを用いて製造される抗CD19CART細胞増殖の細胞動態の約1週間の遅延の可能性である。この遅延は、約1週間であると推定され、これにより、TMプロセスで製造される抗CD19CART細胞を用いた場合の3週間という潜在的毒性の慎重なモニタリング枠から4週間への相応延期がもたらされる。これに対し、インビトロサイトカイン放出モデルからの非臨床安全性データは、ARMプロセスを用いて製造される抗CD19CART細胞とTMプロセスを用いて製造されるものが、IL-6産生をインビボで誘導する同様の可能性を有し、従って、同様のサイトカイン放出症候群(CRS)リスクを保有し得ることを示している。このエビデンスに基づき、ARMプロセスを用いて製造される抗CD19CART細胞は、進行性小リンパ球性リンパ腫(SLL)/慢性リンパ球性白血病(CLL)を有する患者の第I相、オープンラベル臨床試験で、この適用で既に承認された薬剤であるブルトン型キナーゼ阻害剤(BTKi)イブルチニブ(Imbruvica)と併用して且つDLBCLでの単剤として調査されることになる。
本明細書には、活性化高速製造(ARM)プロセスを用いて製造される抗CD19CAR-T細胞産物が開示される。ARMプロセスは、伝統的製造(TM)プロセスと比較して、ターンアラウンドタイムを短縮し、先を見越して、患者に対する抗CD19CAR-T細胞産物の適時注入を可能にする。さらに、ARMプロセスは、改善した抗腫瘍効果に関連する細胞サブセットである推定ステムメモリーT(Tstem)細胞も保存する。製造の主な違いは、TMプロセスが、抗CD19CART細胞を、製剤化前にインターロイキン(IL-)2と一緒に9日間インビトロで培養する増殖期を含むのに対し、ARMプロセスは、わずか24時間の培養後に製剤化を可能にする点である。これは、CD3及びCD28に対するアゴニスト活性を有するモノクローナル抗体(mAb)と結合した完全に生体適合性のナノマトリックスの使用により可能になるものであり、こうしたビーズは、TMプロセスで使用されるCD3/CD28常磁性ビーズと異なり、形質導入の直後に残留レンチウイルスベクターと一緒に洗い流すことができる。異種移植マウスモデルからの結果並びにTstem細胞の最終産物濃縮、持続性が増加し、且つ長期抗腫瘍効果に関連する亜集団は、TMプロセスを用いて製造される抗CD19CART細胞と比較して、ARMプロセスを用いて製造される抗CD19CART細胞の治療可能性の全体的向上を示唆している。異種移植マウスモデルにより明らかにされた別の重要な相違は、TMプロセスを用いて製造される対応物と比較して、ARMプロセスを用いて製造される抗CD19CART細胞増殖の細胞動態の約1週間の遅延の可能性である。この遅延は、約1週間であると推定され、これにより、TMプロセスで製造される抗CD19CART細胞を用いた場合の3週間という潜在的毒性の慎重なモニタリング枠から4週間への相応延期がもたらされる。これに対し、インビトロサイトカイン放出モデルからの非臨床安全性データは、ARMプロセスを用いて製造される抗CD19CART細胞とTMプロセスを用いて製造されるものが、IL-6産生をインビボで誘導する同様の可能性を有し、従って、同様のサイトカイン放出症候群(CRS)リスクを保有し得ることを示している。このエビデンスに基づき、ARMプロセスを用いて製造される抗CD19CART細胞は、進行性小リンパ球性リンパ腫(SLL)/慢性リンパ球性白血病(CLL)を有する患者の第I相、オープンラベル臨床試験で、この適用で既に承認された薬剤であるブルトン型キナーゼ阻害剤(BTKi)イブルチニブ(Imbruvica)と併用して且つDLBCLでの単剤として調査されることになる。
作製及びインビトロ分析
臨床スケールでの抗CD19CART細胞製造を目的とするARMプロセスを試験するために、代表的な例として、図28Aに記載する出発材料として、凍結した健常なドナー白血球アフェレーシス産物(Leukopak,LKPK)を使用した。LKPKは、37%T細胞、4%NK細胞、37%単球及び15%B細胞を含有した(図28A)。解凍後、抗CD4及び抗CD8マイクロビーズを用いて、T細胞をポジティブ選択した。陽性T細胞選択後の産物の組成は、95.4%T細胞、1.9%NK細胞、1.7%単球及び0.1%B細胞であった(図28A)。
臨床スケールでの抗CD19CART細胞製造を目的とするARMプロセスを試験するために、代表的な例として、図28Aに記載する出発材料として、凍結した健常なドナー白血球アフェレーシス産物(Leukopak,LKPK)を使用した。LKPKは、37%T細胞、4%NK細胞、37%単球及び15%B細胞を含有した(図28A)。解凍後、抗CD4及び抗CD8マイクロビーズを用いて、T細胞をポジティブ選択した。陽性T細胞選択後の産物の組成は、95.4%T細胞、1.9%NK細胞、1.7%単球及び0.1%B細胞であった(図28A)。
ポジティブ選択されたT細胞は、抗CD3及び抗CD28アゴニストモノクローナル抗体に共役したポリマーナノマトリックスを用いて活性化してから、抗CD19CARをコードするレンチウイルスベクターで形質導入した。24時間の培養後、細胞を採取し、凍結保存した(こうした細胞をこの実施例では「ARM-CD19CAR」と称する)。並行して、同じドナーT細胞及びレンチウイルスベクターを使用し、伝統的製造(TM)プロセスを用いてCAR-T細胞を作製した(こうした細胞をこの実施例では「TM-CD19CAR」と称する)。TMプロセスは、抗CD3及び抗CD28抗体に結合させた常磁性ビーズを使用し、組織培養フラスコ内の9日培養期間の後、同じ採取及び凍結手順を行った。各プロセスにより作製したCAR-T細胞をフローサイトメトリーにより分析して、解凍後のCAR発現並びにT細胞表現型を評価した(図28B~28D)。T細胞表現型の分析から、ARMプロセスは、CD8及びCD4コンパートメントの両方でナイーブ様T細胞を保持した(45.1%CD45RO-/CCR7+)のに対し、TMプロセスは、主としてセントラルメモリーT(TCM)細胞をもたらした(ARM-CD19CARの43.6%に対して68.6%CD45RO+/CCR7+)ことが明らかとなった(図28C及び図28D)。重要なことには、ARMプロセスは、TMプロセスと比較して、CAR+集団でも、初期ナイーブ様CD45RO-/CCR7+T細胞集団を良好に維持した(出発材料中28.6%、ARM-CD19CARで37.5%及びTM-CD19CARで4.5%)(図28C及び図28D)。このT細胞集団は、Fraietta,et al(2018)Nat Med,24(5);563-571により記載され、且つCLL第I相臨床試験で持続的寛解を伴うCD45RO-/CD27+Tstem細胞と大きく重なっている。
その表現型以外に、最終ARM-CD19CAR細胞産物をインビトロでのその機能についても評価した。ARM-CD19CAR及びTM-CD19CARを解凍し、CD19発現細胞株:NALM6(ALL)又はTMD-8(DLBCL)と一緒に共培養した。共培養から48時間後の上清中のサイトカインレベルの比較から、刺激癌細胞(NALM6又はTMD-8、図29A及び29C)に応じて、TM-CD19CARと比較して、ARM-CD19CARにより分泌されるIFN-γの11~17倍の増加及びIL-2のレベルの3.5~10倍の増加が明らかにされた。ARM若しくはTMプロセスを経た非形質導入(UTD)細胞(図29C)又はCD19陰性NALM6(NALM6-19KO)標的細胞(図29D)を用いた実験により、ARM-CD19CAR及びTM-CD19CARによるCD19特異的認識を確認した。CD19特異刺激の非存在下でのARM-UTD及びARM-CD19CAR(それぞれ図29A及び29B)によるIFN-γ分泌のより高いバックグラウンドは、これらの産物の活性化された性質に起因する可能性がある。このバックグラウンド分泌は、48時間の共培養によち減少した(図28B及び29D)。標的細胞との最初の24時間の共培養後の細胞の中間洗浄後、さらに24時間(24h+24h)共培養すると、バックグラウンドとCD19特異的サイトカイン分泌の差はさらに増大した。24h+24h条件は、ARM-CD19CARによるバックグラウンドIFN-γ分泌が最初の24時間後に衰えることを明示している。
要約すると、ARM-CD19CARを作製するために用いたARMプロセスは、TM-CD19CARのそれと同等若しくはそれより高いCAR発現を有するT細胞をもたらす。重要なことには、ARMプロセスは、インプット材料と同様のT細胞表現型を維持する。ARM-CD19CARは、インビトロでのCD19特異的活性化を証明し、TM-CD19CARと比較して、より高いレベルのIL-2を分泌し、これは、そのTstem表現型と相関する。
インビボ有効性
インビボでの有効性試験を用いて、ARMプロセスの開発の指針とし、最終的に、臨床抗CD19CART細胞製造に使用されるプロセスが得られた。本明細書に記載の実験のために、ARM-CD19CARを臨床スケールで作製した。並行して、同じレンチウイルスベクター及び同じドナーからのT細胞を用いて、TM-CD19CARを作製した。異なるプロセスを用いて作製されたCAR-T細胞の有効性を、プレB ALL細胞株NALM6と一緒に接種した免疫欠損型NSGマウス(NOD-scid IL2Rg-ヌル)で評価した。この腫瘍細胞株は骨髄中に生着するが、高い腫瘍負荷の場合、循環中でも検出され得る。白血病接種から7日後、マウスのコホートは、CAR+T細胞の1回の注入を受けた(図30A)。第0日にTM-CD19CAR及びARM-CD19CARの解凍後フローアッセイに基づいて、0.2×106、0.5×106及び2×106生存CAR+T細胞という計画用量を決定した。
インビボでの有効性試験を用いて、ARMプロセスの開発の指針とし、最終的に、臨床抗CD19CART細胞製造に使用されるプロセスが得られた。本明細書に記載の実験のために、ARM-CD19CARを臨床スケールで作製した。並行して、同じレンチウイルスベクター及び同じドナーからのT細胞を用いて、TM-CD19CARを作製した。異なるプロセスを用いて作製されたCAR-T細胞の有効性を、プレB ALL細胞株NALM6と一緒に接種した免疫欠損型NSGマウス(NOD-scid IL2Rg-ヌル)で評価した。この腫瘍細胞株は骨髄中に生着するが、高い腫瘍負荷の場合、循環中でも検出され得る。白血病接種から7日後、マウスのコホートは、CAR+T細胞の1回の注入を受けた(図30A)。第0日にTM-CD19CAR及びARM-CD19CARの解凍後フローアッセイに基づいて、0.2×106、0.5×106及び2×106生存CAR+T細胞という計画用量を決定した。
解凍後0日に、ARM-CD19CARの偽形質導入の懸念の理由で、センチネルバイアルを解凍し、最大5日間培養した後、様々な時点でフローサイトメトリーによりCAR発現(パーセンテージ及び平均蛍光強度)を分析した(図30B)。その後の時点での陽性細胞のパーセンテージは、解凍後0日サンプルと比較して低かった。同時に、CAR平均蛍光強度は、各細胞で高く、これは、安定に形質導入されたCAR-T細胞を表している。第3日の測定を用いて、ARM-CD19CARの実際用量を決定したところ、0.1×106、0.25×106及び1×106生存CAR+T細胞であることが判明した。休止させ、完全に組み込まれたCART細胞に対して解凍後サンプルのフロー分析を実施したため、TM-CD19CAR用量は不変のままであった(0.2×106、0.5×106及び2×106生存CAR+T細胞)。
ARM-CD19CAR及びTM-CD19CARは、用量依存的に腫瘍退縮を誘導した(図30C)。0.5×106若しくは2×106TM-CD19CAR細胞又は0.25×106及び1×106ARM-CD19CAR細胞で処置したマウスは、持続的な腫瘍退縮を経験した。興味深いことに、試験した各々の最低用量(2×106TM-CD19CAR細胞又は0.1×106ARM-CD19CAR細胞)で、TM-CD19CARに対する応答は持続せず、初期の部分的白血病制御後、全てのマウスが最終的に再発した。対照的に、最低用量(0.1×106)ARM-CD19CAR処置マウスは、腫瘍負荷の安定的減少を示し、これは試験終了まで持続した。腫瘍退縮の動態は、約1週間のARM-CD19CARの活性化遅延を示し、これは、Tstem細胞が、その抗腫瘍活性を及ぼすために、増殖して、エフェクターメモリー細胞に分化する必要があることを示唆している。
2つの製造プロセスにより作製されたCAR-T細胞及びUTD細胞で処置したマウスは、週2回採血して、サイトカインレベルを測定した(図31A~31D)。ARM-CD19CAR又はTM-CD19CARいずれかのCAR-T細胞を注入したマウスの循環IFN-γレベルは、二相パターンを示した(図31A)。CAR-T細胞注入から4~7日後に早期IFN-γピークが観察され、これは、TM-UTD又はARM-UTDを注入したマウスでは明瞭でなかったことから、腫瘍認識後のCD19特異的活性化に関連する可能性がある。早期CD19媒介活性化は、インビボIL-2レベルの同時上昇(図31C)により確認されたが、これは、後の時点で衰えた。
インビボ細胞動態
NSGマウスにおけるARM-CD19CARの有効性を評価するための薬理学試験の一環として、CAR+T細胞の増殖をインビボで評価した(図32)。注入から最大4週間後、CD3+/CAR+T細胞の血中濃度をフローサイトメトリーにより解析した。CAR-T細胞増殖は推定することができる。しかし、X-GVHDの発症に影響される試験時間の制限のために、長期持続性は評価することができない。0.2×106細胞の最低用量のTM-CD19CARを除いて、ARM-CD19CAR及びTM-CD19CARの両方について細胞増殖を全ての用量で観察した。曝露(細胞注射後21日以内のCmax及びAUC)は、TM-CD19CAR及びARM-CD19CARのいずれについても用量の増加と共に増大した。同じ用量レベルのTM-CD19CARに対してARM-CD19CAR及びの増殖を比較するために、TM-CD19CARの曝露を、同等用量のARM-CD19CAR(0.25×106及び1×106細胞)に対して内挿した。0.25×106及び1×106細胞の用量のTM-CD19CARと比較して、Cmaxは、24~46倍高く、AUV0-21dは、18~33倍高かった。ARM-CD19CARピーク増殖までの時間(Tmax)は、TM-CD19CARと比較して、少なくとも1週間遅れた。
NSGマウスにおけるARM-CD19CARの有効性を評価するための薬理学試験の一環として、CAR+T細胞の増殖をインビボで評価した(図32)。注入から最大4週間後、CD3+/CAR+T細胞の血中濃度をフローサイトメトリーにより解析した。CAR-T細胞増殖は推定することができる。しかし、X-GVHDの発症に影響される試験時間の制限のために、長期持続性は評価することができない。0.2×106細胞の最低用量のTM-CD19CARを除いて、ARM-CD19CAR及びTM-CD19CARの両方について細胞増殖を全ての用量で観察した。曝露(細胞注射後21日以内のCmax及びAUC)は、TM-CD19CAR及びARM-CD19CARのいずれについても用量の増加と共に増大した。同じ用量レベルのTM-CD19CARに対してARM-CD19CAR及びの増殖を比較するために、TM-CD19CARの曝露を、同等用量のARM-CD19CAR(0.25×106及び1×106細胞)に対して内挿した。0.25×106及び1×106細胞の用量のTM-CD19CARと比較して、Cmaxは、24~46倍高く、AUV0-21dは、18~33倍高かった。ARM-CD19CARピーク増殖までの時間(Tmax)は、TM-CD19CARと比較して、少なくとも1週間遅れた。
要約すると、ARM-CD19CARをインビトロで評価する薬理学試験は、ARM-CD19CARが、早期分化表現型を有し、IFN-γ及びIL-2をより分泌する可能性を有することを示す。インビボで、ARM-CD19CARは、TM-CD19CARと比較して、遅れるが、より高い細胞増殖を示し、より多くのIL-2分泌を誘導すると共に、より低用量で腫瘍増殖を制御した。記述されるARM-CD19CARの他の特徴、例えばより遅い時点での高レベルの血漿IFN-γ及びより早期のX-GVHDの発生が、ARM-CD19CAR並びにARM-UTDの両方で認められ、これらは、ここで使用される異種移植マウスモデルの制限について根拠を示している。総合すると、これらの結果は、ARM-CD19CARが、より多くの幹細胞性特徴を備えるT細胞を含有し、それによりARM-CD19CARが効果的に生着し、増殖して、腫瘍を拒絶することができるという仮定を支持するものである。
インビトロIL-6放出アッセイ
CART細胞によるIL-6誘導可能性のインビトロ検証のための三者(three party)共培養モデルは、Norelli,et al(2018)Nat Med.,Jun;24(6);739-748により最初に公開されており、一部を改変して本明細書において適用した。このモデルは、最大化IL-6産生のための骨髄細胞供給源として、CAR-T細胞、白血病標的細胞及びバイスタンダーTHP-1単球細胞から構成される。このインビトロ細胞モデルでは、CD19発現標的及びTHP-1細胞との共培養により、ARM-CD19CAR又はTM-CD19CARのいずれか単独によるIL-6分泌が増加された(図33A及び33B)。重要なことには、ARM-CD19CARにより誘導された時間依存性CD19特異的IL-6分泌は、TM-CD19CARにより誘導されたものと重ね合わせることができた。同じインビトロ細胞モデルにおいて、ARM-CD19CAR条件でのCD19特異的IFN-γ分泌は、TM-CD19CAR条件よりも10倍高かった(データは示していない)。
CART細胞によるIL-6誘導可能性のインビトロ検証のための三者(three party)共培養モデルは、Norelli,et al(2018)Nat Med.,Jun;24(6);739-748により最初に公開されており、一部を改変して本明細書において適用した。このモデルは、最大化IL-6産生のための骨髄細胞供給源として、CAR-T細胞、白血病標的細胞及びバイスタンダーTHP-1単球細胞から構成される。このインビトロ細胞モデルでは、CD19発現標的及びTHP-1細胞との共培養により、ARM-CD19CAR又はTM-CD19CARのいずれか単独によるIL-6分泌が増加された(図33A及び33B)。重要なことには、ARM-CD19CARにより誘導された時間依存性CD19特異的IL-6分泌は、TM-CD19CARにより誘導されたものと重ね合わせることができた。同じインビトロ細胞モデルにおいて、ARM-CD19CAR条件でのCD19特異的IFN-γ分泌は、TM-CD19CAR条件よりも10倍高かった(データは示していない)。
まとめ
これらの結果は、ARM-CD19CARが、TM-CD19CARと比較して、優れた抗腫瘍能力と、類似の安全性プロフィールを有し得ることを示唆するものである。最も低い試験用量での優れた腫瘍制御と、高いインビボ細胞増殖とによって優れた抗腫瘍能力が推測される。しかしながら、こうした計算は、ARM-CD19CARが初めに検証されることになる2つの疾患適用(CLL及びDLBCL)よりも攻撃的なALLモデル(NALM6)でそれが検定されたことから、ARM-CD19CARの全体的治療能力の過小評価である可能性がある。CLLでは、とりわけ、インビボCAR-T細胞増殖が、腫瘍退縮と頑健に相関する場合(Mueller, et al(2017)Blood.130(21);2317-2325;Fraietta,et al(2018)Nat Med,24(5);563-571)、ARM-CD19CARの有意に高い増殖能(最大20倍)により、TM-CD19CARに比べ有意義に優れた有効性をもたらし得る。
これらの結果は、ARM-CD19CARが、TM-CD19CARと比較して、優れた抗腫瘍能力と、類似の安全性プロフィールを有し得ることを示唆するものである。最も低い試験用量での優れた腫瘍制御と、高いインビボ細胞増殖とによって優れた抗腫瘍能力が推測される。しかしながら、こうした計算は、ARM-CD19CARが初めに検証されることになる2つの疾患適用(CLL及びDLBCL)よりも攻撃的なALLモデル(NALM6)でそれが検定されたことから、ARM-CD19CARの全体的治療能力の過小評価である可能性がある。CLLでは、とりわけ、インビボCAR-T細胞増殖が、腫瘍退縮と頑健に相関する場合(Mueller, et al(2017)Blood.130(21);2317-2325;Fraietta,et al(2018)Nat Med,24(5);563-571)、ARM-CD19CARの有意に高い増殖能(最大20倍)により、TM-CD19CARに比べ有意義に優れた有効性をもたらし得る。
マウスでは、CAR媒介性腫瘍退縮と関連するARM-CD19CARによるIFN-γ及びIL-2の早期全身放出は、伝統的に製造されたCAR-T細胞により誘導される放出のそれぞれ3倍及び10倍であった。この株では、機能性骨髄細胞の欠如によって炎症性サイトカインを産生することができないため、IL-6レベルはインビボで検定されなかった(Norelli,et al(2018)Nat Med.,Jun;24(6);739-748;Giavridis,et al(2018)Nat Med.,Jun;24(6);731-738)。これを回避し、ARM-CD19CARにより誘導されるインビボIL-6放出の可能性を評価するために、インビトロ三者共培養系を使用したが、この場合、バイスタンダー単球細胞を炎症性サイトカインの供給源として添加した(Norelli,et al(2018)Nat Med.,Jun;24(6);739-748)。この系では、IL-6産生は、ARM-CD19CARと、伝統的に製造されたCAR-T細胞との間で類似しており、これは、CRSに対する同様のリスクを示唆している。反対に、ARM-CD19CAR細胞増殖の動態遅延により、TM-CD19CARに典型的な3週間から、4週間へのCRSモニタリング期間の延長が必要となる。ARM-CD19CARを用いたインビトロ実験から、解凍後最初の3日間の培養中のARM-CD19CARによる一過性、非CAR媒介性IFN-γ及びIL-2分泌の可能性も明らかにされた。組換えヒトIL-2(Proleukin)及び組換えヒトIFN-γ(ACTIMMUNE)を受ける患者からのデータに基づく包括的リスク評価により、さらにARM-CD19CAR注入後に予測される曝露を考慮に入れて、これらの患者に、記載されるような全身症状(熱、悪寒、紅斑)のリスクが非常に低くなることを示す。このリスクをさらに軽減するために、ARM-CD19CARを受ける患者は、細胞産物の注入から少なくとも72時間にわたって入院することになる。
最終的に、非GLP準拠毒性試験では、ARM-CD19CARを移植したNSGマウスは、血液又はリンパ器官免疫表現型決定並びに関連する一連の器官の組織学的評価によって評価したところ、伝統的に製造されたCAR-T細胞及びARMプロセスを経た非形質導入細胞と比較して予想外の挙動を示さなかった。
実施例9:ARMプロセスを用いて製造されるBCMA CART細胞
方法
T細胞単離
健常なドナーアフェレーシスの新鮮なロイコパックをHemacareから取得し、必要になるまで気相液体窒素(LN2)中で保存した。第0日に、2/4ロイコパックをLN2から取り出し、Plasmatherm(Barkey,Leopoldshoehe,Germany)内で小さい氷の結晶が残るまで解凍した後、Prodigy(登録商標)プロセスバッファーで希釈した。次に、TS 520チュービングセット及びT細胞形質導入(TCT)プログラムソフトウエアバージョン1.0を備えるCliniMACS(登録商標)Prodigy(登録商標)で、自動化CD4/CD8ポジティブ選択を実施した。各Prodigy(登録商標)アウトプット(産物、廃棄物及び非標的細胞)の細胞数及び生存率を、Cellometer Vision(Nexcelom,Lawrence,MA)により列挙されるように、AO/PI染色により決定して、総細胞回復及びT細胞回復を評価した。CD4/CD8濃縮産物をOpTmizer(商標)完全T細胞培地中に溶出し、24h又は伝統的9日プロセス(TM)のいずれかを用いたさらなる培養のために分割した。残ったT細胞はLNタンク内で凍結した。T細胞純度はフローサイトメトリー解析によって評価した。
方法
T細胞単離
健常なドナーアフェレーシスの新鮮なロイコパックをHemacareから取得し、必要になるまで気相液体窒素(LN2)中で保存した。第0日に、2/4ロイコパックをLN2から取り出し、Plasmatherm(Barkey,Leopoldshoehe,Germany)内で小さい氷の結晶が残るまで解凍した後、Prodigy(登録商標)プロセスバッファーで希釈した。次に、TS 520チュービングセット及びT細胞形質導入(TCT)プログラムソフトウエアバージョン1.0を備えるCliniMACS(登録商標)Prodigy(登録商標)で、自動化CD4/CD8ポジティブ選択を実施した。各Prodigy(登録商標)アウトプット(産物、廃棄物及び非標的細胞)の細胞数及び生存率を、Cellometer Vision(Nexcelom,Lawrence,MA)により列挙されるように、AO/PI染色により決定して、総細胞回復及びT細胞回復を評価した。CD4/CD8濃縮産物をOpTmizer(商標)完全T細胞培地中に溶出し、24h又は伝統的9日プロセス(TM)のいずれかを用いたさらなる培養のために分割した。残ったT細胞はLNタンク内で凍結した。T細胞純度はフローサイトメトリー解析によって評価した。
ARMプロセスを用いたCAR-T細胞産生
Prodigy(登録商標)により精製したT細胞をプレート、フラスコ、G-REX容器などの様々なスケールの容器又は本格的な臨床スケールのcentricultに接種した。接種時、臨床グレードレンチウイルスベクターに加えて、TransAct(Miltenyi Biotec)、抗CD3及び抗CD28アゴニストと共役したポリマーナノマトリックスを添加した。100IU/mLのヒト組換えIL-2(Prometheus,San Diego,CA)、2%ICRS(Life Technologies)を含有するOpTmizer(商標)完全T細胞培地中で細胞を24時間インキュベートして、採取及び凍結保存した。
Prodigy(登録商標)により精製したT細胞をプレート、フラスコ、G-REX容器などの様々なスケールの容器又は本格的な臨床スケールのcentricultに接種した。接種時、臨床グレードレンチウイルスベクターに加えて、TransAct(Miltenyi Biotec)、抗CD3及び抗CD28アゴニストと共役したポリマーナノマトリックスを添加した。100IU/mLのヒト組換えIL-2(Prometheus,San Diego,CA)、2%ICRS(Life Technologies)を含有するOpTmizer(商標)完全T細胞培地中で細胞を24時間インキュベートして、採取及び凍結保存した。
凍結保存CAR-T細胞のアリコートを予め温めたOpTmizer(商標)完全培地中で解凍し、20×容量の予め温めた培地で2回洗浄した後、培養し、フローサイトメトリー解析に付して、解凍後の様々な時点でBCMA-CAR発現及び幹細胞性特徴を評価した。細胞産物のアリコートを標的細胞株と共培養して、特定の抗原刺激に応答するサイトカイン放出を評価した。
TMプロセスを用いたCAR-T細胞産生
Prodigy(登録商標)処理T細胞を温かいRPMI完全T細胞培地に再懸濁させてから、24ウェルプレート内で平板培養した。3:1のビーズ:細胞比で、ヒトT-エキスパンダーCD3/CD28ビーズと一緒にT細胞を37℃で一晩インキュベートした。
Prodigy(登録商標)処理T細胞を温かいRPMI完全T細胞培地に再懸濁させてから、24ウェルプレート内で平板培養した。3:1のビーズ:細胞比で、ヒトT-エキスパンダーCD3/CD28ビーズと一緒にT細胞を37℃で一晩インキュベートした。
第1日に、SUP-T1力価に基づき、2のMOIでレンチウイルスを添加した。非形質導入対照(UTD)にはウイルスを添加しなかった。T細胞を37℃で一晩インキュベートした後、1ウェル当たり1mLの完全T細胞培地をさらに添加してから、37℃で一晩インキュベートした。残る7日間の培養物増殖のために、T細胞を組織培養フラスコに移し、2日毎に完全T細胞培地で希釈した。
第8日~9日において、T細胞を脱ビーズし、採取した後、CryoStor CS10凍結保存溶液中に凍結保存し、CoolCell Cell Freezing Containers(Biocision)内に-80℃で凍結し、翌日LN2に移した。T細胞の小アリコートをCAR発現について染色した。補正のために単色対照を加えた。サンプルをフローサイトメーター(BD LSRFortessa)で測定し、データをFlowJoソフトウエアで解析した。
標的細胞株及び培養
Nalm6細胞をレンチウイルスホタルルシフェラーゼリポーター構築物でトランスフェクトして、Nalm6-luc細胞株を作製した。細胞を37℃、5%CO2のインキュベーター内で増殖させた。使用前の腫瘍抗原BCMA発現の検出のために、細胞のアリコートを使用した。
Nalm6細胞をレンチウイルスホタルルシフェラーゼリポーター構築物でトランスフェクトして、Nalm6-luc細胞株を作製した。細胞を37℃、5%CO2のインキュベーター内で増殖させた。使用前の腫瘍抗原BCMA発現の検出のために、細胞のアリコートを使用した。
インビトロサイトカイン分泌アッセイ
BCMA発現標的細胞に応答する抗BCMA CAR-T(エフェクター細胞と称する)のサイトカイン分泌を、96ウェル平底プレート内でCAR-T細胞を標的細胞と2.5倍E:T比で20hインキュベートすることによって評価した。エフェクター細胞は、ARM又はTMプロセスのいずれかを用いて作製されるPI61、R1G5及びBCMA10CART細胞であった。ARMプロセスを用いて製造されたCART細胞を、細胞の休止及び非特異的活性の最小化を可能にする24hウォッシュアウト条件で平板培養した。標的細胞は、BCMA陽性KMS11-luc又はBCMA陰性NALM6-lucを含む。これらの標的細胞は、新しく平板培養したT細胞又は24hウォッシュアウト条件(ARM細胞のみ)からのT細胞に添加した。このアッセイのために、BCMA CAR-TへのUTDの添加によりCAR-T細胞の%形質導入を正規化した。これにより、各サンプル中の同じ数のCAR-T細胞と同じ総T細胞数の比較が可能になった。標的に対するエフェクターの20時間共培養時点からの上清を各ウェルから回収し、MSDサイトカイン分析に使用するために-20℃で凍結した。カスタムMSD V-PLEX Human IFN-γ、IL-2Kit(♯K151A0H-4A)を使用して、各々の上清サンプル中の分泌サイトカインを定量した。
BCMA発現標的細胞に応答する抗BCMA CAR-T(エフェクター細胞と称する)のサイトカイン分泌を、96ウェル平底プレート内でCAR-T細胞を標的細胞と2.5倍E:T比で20hインキュベートすることによって評価した。エフェクター細胞は、ARM又はTMプロセスのいずれかを用いて作製されるPI61、R1G5及びBCMA10CART細胞であった。ARMプロセスを用いて製造されたCART細胞を、細胞の休止及び非特異的活性の最小化を可能にする24hウォッシュアウト条件で平板培養した。標的細胞は、BCMA陽性KMS11-luc又はBCMA陰性NALM6-lucを含む。これらの標的細胞は、新しく平板培養したT細胞又は24hウォッシュアウト条件(ARM細胞のみ)からのT細胞に添加した。このアッセイのために、BCMA CAR-TへのUTDの添加によりCAR-T細胞の%形質導入を正規化した。これにより、各サンプル中の同じ数のCAR-T細胞と同じ総T細胞数の比較が可能になった。標的に対するエフェクターの20時間共培養時点からの上清を各ウェルから回収し、MSDサイトカイン分析に使用するために-20℃で凍結した。カスタムMSD V-PLEX Human IFN-γ、IL-2Kit(♯K151A0H-4A)を使用して、各々の上清サンプル中の分泌サイトカインを定量した。
結果
ARMプロセスは、T細胞の幹細胞性を保存する
ARMプロセスを用いて製造されるCAR-T細胞をフローサイトメトリーにより分析して、解凍時及び解凍後48h時点のそれらのCAR発現並びにT細胞表現型を評価した(図34A、34B及び34C)。TMプロセスを用いて製造されるCAR-T細胞の場合、CAR発現を採取の9日前に評価した(図35A)。BCMA-CARは、図34Aに示す解凍時にほとんど検出不能であった。しかし、解凍後48hの時点で、BCMA-CARは、PI61で32.9%、R1G5で35.9%及びBCMA10で17.4%のように明確に発現された。TMプロセスを用いて作製された第9日細胞は、PI61で36%、R1G5で40%及びBCMA10で7%のBCMA-CAR発現を示す(図35A)。CAR+T細胞表現型の解析から、ARMプロセスは、ナイーブ様T細胞(PI61及びR1G5について約60%のCD45RO-/CCR7+、BCMA10について32%のCD45RO-/CCR7+)を保持したことが明らかとなった(図34C)。TMプロセスは、主としてセントラルメモリーT細胞(TCM)(全3つのBCMA CAR-Tについて72~81%のCD45RO+/CCR7+)をもたらしたが、TMプロセスを用いて製造されたCAR+T細胞ではナイーブ様T細胞集団がほぼ消失した(図35B)。全体として、ナイーブT細胞集団は、以前の報告(Cohen AD,et al(2019).J Clin Invest.130.pii:126397.doi:10.1172/JCI126397;Fraietta,JA,et al(2018).Nat Med,24(5);563-571)に記載されているCD45RO-/CD27+Tstem細胞と大きく重なり、応答及びCAR-T発現と関連する。
ARMプロセスは、T細胞の幹細胞性を保存する
ARMプロセスを用いて製造されるCAR-T細胞をフローサイトメトリーにより分析して、解凍時及び解凍後48h時点のそれらのCAR発現並びにT細胞表現型を評価した(図34A、34B及び34C)。TMプロセスを用いて製造されるCAR-T細胞の場合、CAR発現を採取の9日前に評価した(図35A)。BCMA-CARは、図34Aに示す解凍時にほとんど検出不能であった。しかし、解凍後48hの時点で、BCMA-CARは、PI61で32.9%、R1G5で35.9%及びBCMA10で17.4%のように明確に発現された。TMプロセスを用いて作製された第9日細胞は、PI61で36%、R1G5で40%及びBCMA10で7%のBCMA-CAR発現を示す(図35A)。CAR+T細胞表現型の解析から、ARMプロセスは、ナイーブ様T細胞(PI61及びR1G5について約60%のCD45RO-/CCR7+、BCMA10について32%のCD45RO-/CCR7+)を保持したことが明らかとなった(図34C)。TMプロセスは、主としてセントラルメモリーT細胞(TCM)(全3つのBCMA CAR-Tについて72~81%のCD45RO+/CCR7+)をもたらしたが、TMプロセスを用いて製造されたCAR+T細胞ではナイーブ様T細胞集団がほぼ消失した(図35B)。全体として、ナイーブT細胞集団は、以前の報告(Cohen AD,et al(2019).J Clin Invest.130.pii:126397.doi:10.1172/JCI126397;Fraietta,JA,et al(2018).Nat Med,24(5);563-571)に記載されているCD45RO-/CD27+Tstem細胞と大きく重なり、応答及びCAR-T発現と関連する。
その表現型に加えて、最終的PI61、R1G5及びBCMA10CART細胞産物をそれらの機能についてもインビトロで評価した。PI61、R1G5及びBCMA10細胞産物を解凍し、1:1比でBCMA発現細胞株KMS-11と一緒に共培養した。解凍後のARM処理細胞は、共培養を確立する前に24h休止させた。共培養後24時間の上清中のサイトカインレベルを比較すると、図36A~36Dに示す通り、TM産物と比較して、ARM産物により分泌されるIL-2の約5~25倍の増加及びIFN-γの約3~7倍のレベル増加が明らかにされた。ARM又はTMプロセスを経た非形質導入(UTD)細胞による実験で、PI61、R1G5及びBCMA10によるBCMA特異的認識が確認された。
要約すると、ARMプロセスを用いて産生されたPI61、R1G5及びBCMA10CART細胞は、インビトロでのBCMA特異的活性化を示し、TM処理産物と比較して、高いレベルのIL-2及びIFN-γを分泌するが、これは、ARMプロセスを用いて産生されるCART細胞のTstem表現型と相関する。
実施例10:ARMプロセスを用いて製造されるCART細胞の遺伝子シグネチャー分析
方法
単一細胞RNAseq
10X Genomics Chromium Controller instrument及び支持ライブラリー構築キットを用いて、単一細胞RNAseqライブラリーを作製した。
方法
単一細胞RNAseq
10X Genomics Chromium Controller instrument及び支持ライブラリー構築キットを用いて、単一細胞RNAseqライブラリーを作製した。
凍結保存細胞を解凍し、カウント及びフロー分別(試験課題の必要に応じて)した後、10X Genomics Instrumentにロードした。個別の細胞を液滴にロードし、GemCodeビーズによって個別の液滴中のRNAにバーコードを付けた。バーコード付きRNAを液滴から放出させ、全トランスクリプトームIllumina適合性シーケンシングライブラリーに変換した。
作製したライブラリーをIllumina HiSeq Instrumentで配列決定し、10X Genomics解析パイプライン及びLoupe Cell Browserソフトウエアを用いて解析した。
単一細胞免疫細胞プロファイリング
全トランスクリプトーム10X Genomics単一細胞ライブラリーを鋳型材料として使用して、免疫細胞プロファイリング及びレパトア解析を作成した。T細胞受容体配列をChromium Single Cell 5‘LibrariesからPCR増幅した後、Illuminaシーケンシング装置で解析した。
全トランスクリプトーム10X Genomics単一細胞ライブラリーを鋳型材料として使用して、免疫細胞プロファイリング及びレパトア解析を作成した。T細胞受容体配列をChromium Single Cell 5‘LibrariesからPCR増幅した後、Illuminaシーケンシング装置で解析した。
解析パイプライン
単一細胞RNAseqデータを、FASTQファイルで開始するCell Ranger解析パイプラインで処理した。Cell Ranger解析パイプラインの詳細な説明は、https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-rangerに見出すことができる。一般的パイプラインは、アラインメント、フィルタリング、バーコードカウント及びUMIカウントを含んだ。細胞バーコードを用いて、遺伝子バーコードマトリックスを作成し、クラスターを決定して、遺伝子発現解析を実施した。遺伝子発現カウントデータは、Seurat Bioconductorパッケージを用いて正規化した。200未満の発現遺伝子を有する細胞を解析から廃棄した。2つ以下の細胞にのみ発現された遺伝子を解析から廃棄した。残ったデータを、10,000のスケール因子を用いてSeurat log正規化法により正規化した。1細胞当たりの検出分子の数に対する回帰によりデータをスケーリングした。遺伝子セット内の全遺伝子の平均log正規化遺伝子発現値を取得することにより、遺伝子セットスコア(GeneSetScore)を算出した。各遺伝子は、サンプル全体の遺伝子の平均発現が0であり、標準偏差が1であるように正規化されたz-スコアである。次に、遺伝子セットスコアを、遺伝子セット内の遺伝子の正規化値の平均として計算する。遺伝子セットスコア計算例を以下に説明する。
単一細胞RNAseqデータを、FASTQファイルで開始するCell Ranger解析パイプラインで処理した。Cell Ranger解析パイプラインの詳細な説明は、https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-rangerに見出すことができる。一般的パイプラインは、アラインメント、フィルタリング、バーコードカウント及びUMIカウントを含んだ。細胞バーコードを用いて、遺伝子バーコードマトリックスを作成し、クラスターを決定して、遺伝子発現解析を実施した。遺伝子発現カウントデータは、Seurat Bioconductorパッケージを用いて正規化した。200未満の発現遺伝子を有する細胞を解析から廃棄した。2つ以下の細胞にのみ発現された遺伝子を解析から廃棄した。残ったデータを、10,000のスケール因子を用いてSeurat log正規化法により正規化した。1細胞当たりの検出分子の数に対する回帰によりデータをスケーリングした。遺伝子セット内の全遺伝子の平均log正規化遺伝子発現値を取得することにより、遺伝子セットスコア(GeneSetScore)を算出した。各遺伝子は、サンプル全体の遺伝子の平均発現が0であり、標準偏差が1であるように正規化されたz-スコアである。次に、遺伝子セットスコアを、遺伝子セット内の遺伝子の正規化値の平均として計算する。遺伝子セットスコア計算例を以下に説明する。
本実施例の遺伝子セットスコア計算の場合、6つの遺伝子についての2つのサンプルの正規化遺伝子発現を表23に記載する。この計算例を目的として、遺伝子セットは、遺伝子1~4から構成される。従って、サンプル1及び2の両方が、0の遺伝子セットスコアを有する。
遺伝子セット「Up TEM vs.Down TSCM」は、以下の遺伝子:MXRA7、CLIC1、NAT13、TBC1D2B、GLCCI1、DUSP10、APOBEC3D、CACNB3、ANXA2P2、TPRG1、EOMES、MATK、ARHGAP10、ADAM8、MAN1A1、SLFN12L、SH2D2A、EIF2C4、CD58、MYO1F、RAB27B、ERN1、NPC1、NBEAL2、APOBEC3G、SYTL2、SLC4A4、PIK3AP1、PTGDR、MAF、PLEKHA5、ADRB2、PLXND1、GNAO1、THBS1、PPP2R2B、CYTH3、KLRF1、FLJ16686、AUTS2、PTPRM、GNLY及びGFPT2を含む。
遺伝子セット「Up Treg vs.Down Teff」は、以下の遺伝子:C12orf75、SELPLG、SWAP70、RGS1、PRR11、SPATS2L、SPATS2L、TSHR、C14orf145、CASP8、SYT11、ACTN4、ANXA5、GLRX、HLA-DMB、PMCH、RAB11FIP1、IL32、FAM160B1、SHMT2、FRMD4B、CCR3、TNFRSF13B、NTNG2、CLDND1、BARD1、FCER1G、TYMS、ATP1B1、GJB6、FGL2、TK1、SLC2A8、CDKN2A、SKAP2、GPR55、CDCA7、S100A4、GDPD5、PMAIP1、ACOT9、CEP55、SGMS1、ADPRH、AKAP2、HDAC9、IKZF4、CARD17、VAV3、OBFC2A、ITGB1、CIITA、SETD7、HLA-DMA、CCR10、KIAA0101、SLC14A1、PTTG3P、DUSP10、FAM164A、PYHIN1、MYO1F、SLC1A4、MYBL2、PTTG1、RRM2、TP53INP1、CCR5、ST8SIA6、TOX、BFSP2、ITPRIPL1、NCAPH、HLA-DPB2、SYT4、NINJ2、FAM46C、CCR4、GBP5、C15orf53、LMCD1、MKI67、NUSAP1、PDE4A、E2F2、CD58、ARHGEF12、LOC100188949、FAS、HLA-DPB1、SELP、WEE1、HLA-DPA1、FCRL1、ICA1、CNTNAP1、OAS1、METTL7A、CCR6、HLA-DRB4、ANXA2P3、STAM、HLA-DQB2、LGALS1、ANXA2、PI16、DUSP4、LAYN、ANXA2P2、PTPLA、ANXA2P1、ZNF365、LAIR2、LOC541471、RASGRP4、BCAS1、UTS2、MIAT、PRDM1、SEMA3G、FAM129A、HPGD、NCF4、LGALS3、CEACAM4、JAKMIP1、TIGIT、HLA-DRA、IKZF2、HLA-DRB1、FANK1、RTKN2、TRIB1、FCRL3及びFOXP3を含む。
遺伝子セット「Down stemness」は、以下の遺伝子:ACE、BATF、CDK6、CHD2、ERCC2、HOXB4、MEOX1、SFRP1、SP7、SRF、TAL1及びXRCC5を含む。
遺伝子セット「Up hypoxia」は、以下の遺伝子:ABCB1、ACAT1、ADM、ADORA2B、AK2、AK3、ALDH1A1、ALDH1A3、ALDOA、ALDOC、ANGPT2、ANGPTL4、ANXA1、ANXA2、ANXA5、ARHGAP5、ARSE、ART1、BACE2、BATF3、BCL2L1、BCL2L2、BHLHE40、BHLHE41、BIK、BIRC2、BNIP3、BNIP3L、BPI、BTG1、C11orf2、C7orf68、CA12、CA9、CALD1、CCNG2、CCT6A、CD99、CDK1、CDKN1A、CDKN1B、CITED2、CLK1、CNOT7、COL4A5、COL5A1、COL5A2、COL5A3、CP、CTSD、CXCR4、D4S234E、DDIT3、DDIT4、1-Dec、DKC1、DR1、EDN1、EDN2、EFNA1、EGF、EGR1、EIF4A3、ELF3、ELL2、ENG、ENO1、ENO3、ENPEP、EPO、ERRFI1、ETS1、F3、FABP5、FGF3、FKBP4、FLT1、FN1、FOS、FTL、GAPDH、GBE1、GLRX、GPI、GPRC5A、HAP1、HBP1、HDAC1、HDAC9、HERC3、HERPUD1、HGF、HIF1A、HK1、HK2、HLA-DQB1、HMOX1、HMOX2、HSPA5、HSPD1、HSPH1、HYOU1、ICAM1、ID2、IFI27、IGF2、IGFBP1、IGFBP2、IGFBP3、IGFBP5、IL6、IL8、INSIG1、IRF6、ITGA5、JUN、KDR、KRT14、KRT18、KRT19、LDHA、LDHB、LEP、LGALS1、LONP1、LOX、LRP1、MAP4、MET、MIF、MMP13、MMP2、MMP7、MPI、MT1L、MTL3P、MUC1、MXI1、NDRG1、NFIL3、NFKB1、NFKB2、NOS1、NOS2、NOS2P1、NOS2P2、NOS3、NR3C1、NR4A1、NT5E、ODC1、P4HA1、P4HA2、PAICS、PDGFB、PDK3、PFKFB1、PFKFB3、PFKFB4、PFKL、PGAM1、PGF、PGK1、PGK2、PGM1、PIM1、PIM2、PKM2、PLAU、PLAUR、PLIN2、PLOD2、PNN、PNP、POLM、PPARA、PPAT、PROK1、PSMA3、PSMD9、PTGS1、PTGS2、QSOX1、RBPJ、RELA、RIOK3、RNASEL、RPL36A、RRP9、SAT1、SERPINB2、SERPINE1、SGSM2、SIAH2、SIN3A、SIRPA、SLC16A1、SLC16A2、SLC20A1、SLC2A1、SLC2A3、SLC3A2、SLC6A10P、SLC6A16、SLC6A6、SLC6A8、SORL1、SPP1、SRSF6、SSSCA1、STC2、STRA13、SYT7、TBPL1、TCEAL1、TEK、TF、TFF3、TFRC、TGFA、TGFB1、TGFB3、TGFBI、TGM2、TH、THBS1、THBS2、TIMM17A、TNFAIP3、TP53、TPBG、TPD52、TPI1、TXN、TXNIP、UMPS、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VIM、VPS11及びXRCC6を含む。
遺伝子セット「Up autophagy」は、以下の遺伝子:ABL1、ACBD5、ACIN1、ACTRT1、ADAMTS7、AKR1E2、ALKBH5、ALPK1、AMBRA1、ANXA5、ANXA7、ARSB、ASB2、ATG10、ATG12、ATG13、ATG14、ATG16L1、ATG16L2、ATG2A、ATG2B、ATG3、ATG4A、ATG4B、ATG4C、ATG4D、ATG5、ATG7、ATG9A、ATG9B、ATP13A2、ATP1B1、ATPAF1-AS1、ATPIF1、BECN1、BECN1P1、BLOC1S1、BMP2KL、BNIP1、BNIP3、BOC、C11orf2、C11orf41、C12orf44、C12orf5、C14orf133、C1orf210、C5、C6orf106、C7orf59、C7orf68、C8orf59、C9orf72、CA7、CALCB、CALCOCO2、CAPS、CCDC36、CD163L1、CD93、CDC37、CDKN2A、CHAF1B、CHMP2A、CHMP2B、CHMP3、CHMP4A、CHMP4B、CHMP4C、CHMP6、CHST3、CISD2、CLDN7、CLEC16A、CLN3、CLVS1、COX8A、CPA3、CRNKL1、CSPG5、CTSA、CTSB、CTSD、CXCR7、DAP、DKKL1、DNAAF2、DPF3、DRAM1、DRAM2、DYNLL1、DYNLL2、DZANK1、EI24、EIF2S1、EPG5、EPM2A、FABP1、FAM125A、FAM131B、FAM134B、FAM13B、FAM176A、FAM176B、FAM48A、FANCC、FANCF、FANCL、FBXO7、FCGR3B、FGF14、FGF7、FGFBP1、FIS1、FNBP1L、FOXO1、FUNDC1、FUNDC2、FXR2、GABARAP、GABARAPL1、GABARAPL2、GABARAPL3、GABRA5、GDF5、GMIP、HAP1、HAPLN1、HBXIP、HCAR1、HDAC6、HGS、HIST1H3A、HIST1H3B、HIST1H3C、HIST1H3D、HIST1H3E、HIST1H3F、HIST1H3G、HIST1H3H、HIST1H3I、HIST1H3J、HK2、HMGB1、HPR、HSF2BP、HSP90AA1、HSPA8、IFI16、IPPK、IRGM、IST1、ITGB4、ITPKC、KCNK3、KCNQ1、KIAA0226、KIAA1324、KRCC1、KRT15、KRT73、LAMP1、LAMP2、LAMTOR1、LAMTOR2、LAMTOR3、LARP1B、LENG9、LGALS8、LIX1、LIX1L、LMCD1、LRRK2、LRSAM1、LSM4、MAP1A、MAP1LC3A、MAP1LC3B、MAP1LC3B2、MAP1LC3C、MAP1S、MAP2K1、MAP3K12、MARK2、MBD5、MDH1、MEX3C、MFN1、MFN2、MLST8、MRPS10、MRPS2、MSTN、MTERFD1、MTMR14、MTMR3、MTOR、MTSS1、MYH11、MYLK、MYOM1、NBR1、NDUFB9、NEFM、NHLRC1、NME2、NPC1、NR2C2、NRBF2、NTHL1、NUP93、OBSCN、OPTN、P2RX5、PACS2、PARK2、PARK7、PDK1、PDK4、PEX13、PEX3、PFKP、PGK2、PHF23、PHYHIP、PI4K2A、PIK3C3、PIK3CA、PIK3CB、PIK3R4、PINK1、PLEKHM1、PLOD2、PNPO、PPARGC1A、PPY、PRKAA1、PRKAA2、PRKAB1、PRKAB2、PRKAG1、PRKAG2、PRKAG3、PRKD2、PRKG1、PSEN1、PTPN22、RAB12、RAB1A、RAB1B、RAB23、RAB24、RAB33B、RAB39、RAB7A、RB1CC1、RBM18、REEP2、REP15、RFWD3、RGS19、RHEB、RIMS3、RNF185、RNF41、RPS27A、RPTOR、RRAGA、RRAGB、RRAGC、RRAGD、S100A8、S100A9、SCN1A、SERPINB10、SESN2、SFRP4、SH3GLB1、SIRT2、SLC1A3、SLC1A4、SLC22A3、SLC25A19、SLC35B3、SLC35C1、SLC37A4、SLC6A1、SLCO1A2、SMURF1、SNAP29、SNAPIN、SNF8、SNRPB、SNRPB2、SNRPD1、SNRPF、SNTG1、SNX14、SPATA18、SQSTM1、SRPX、STAM、STAM2、STAT2、STBD1、STK11、STK32A、STOM、STX12、STX17、SUPT3H、TBC1D17、TBC1D25、TBC1D5、TCIRG1、TEAD4、TECPR1、TECPR2、TFEB、TM9SF1、TMBIM6、TMEM203、TMEM208、TMEM39A、TMEM39B、TMEM59、TMEM74、TMEM93、TNIK、TOLLIP、TOMM20、TOMM22、TOMM40、TOMM5、TOMM6、TOMM7、TOMM70A、TP53INP1、TP53INP2、TRAPPC8、TREM1、TRIM17、TRIM5、TSG101、TXLNA、UBA52、UBB、UBC、UBQLN1、UBQLN2、UBQLN4、ULK1、ULK2、ULK3、USP10、USP13、USP30、UVRAG、VAMP7、VAMP8、VDAC1、VMP1、VPS11、VPS16、VPS18、VPS25、VPS28、VPS33A、VPS33B、VPS36、VPS37A、VPS37B、VPS37C、VPS37D、VPS39、VPS41、VPS4A、VPS4B、VTA1、VTI1A、VTI1B、WDFY3、WDR45、WDR45L、WIPI1、WIPI2、XBP1、YIPF1、ZCCHC17、ZFYVE1、ZKSCAN3、ZNF189、ZNF593及びZNF681を含む。
遺伝子セット「Up resting vs.Down activated」は、以下の遺伝子:ABCA7、ABCF3、ACAP2、AMT、ANKH、ATF7IP2、ATG14、ATP1A1、ATXN7、ATXN7L3B、BCL7A、BEX4、BSDC1、BTG1、BTG2、BTN3A1、C11orf21、C19orf22、C21orf2、CAMK2G、CARS2、CCNL2、CD248、CD5、CD55、CEP164、CHKB、CLK1、CLK4、CTSL1、DBP、DCUN1D2、DENND1C、DGKD、DLG1、DUSP1、EAPP、ECE1、ECHDC2、ERBB2IP、FAM117A、FAM134B、FAM134C、FAM169A、FAM190B、FAU、FLJ10038、FOXJ2、FOXJ3、FOXL1、FOXO1、FXYD5、FYB、HLA-E、HSPA1L、HYAL2、ICAM2、IFIT5、IFITM1、IKBKB、IQSEC1、IRS4、KIAA0664L3、KIAA0748、KLF3、KLF9、KRT18、LEF1、LINC00342、LIPA、LIPT1、LLGL2、LMBR1L、LPAR2、LTBP3、LYPD3、LZTFL1、MANBA、MAP2K6、MAP3K1、MARCH8、MAU2、MGEA5、MMP8、MPO、MSL1、MSL3、MYH3、MYLIP、NAGPA、NDST2、NISCH、NKTR、NLRP1、NOSIP、NPIP、NUMA1、PAIP2B、PAPD7、PBXIP1、PCIF1、PI4KA、PLCL2、PLEKHA1、PLEKHF2、PNISR、PPFIBP2、PRKCA、PRKCZ、PRKD3、PRMT2、PTP4A3、PXN、RASA2、RASA3、RASGRP2、RBM38、REPIN1、RNF38、RNF44、ROR1、RPL30、RPL32、RPLP1、RPS20、RPS24、RPS27、RPS6、RPS9、RXRA、RYK、SCAND2、SEMA4C、SETD1B、SETD6、SETX、SF3B1、SH2B1、SLC2A4RG、SLC35E2B、SLC46A3、SMAGP、SMARCE1、SMPD1、SNPH、SP140L、SPATA6、SPG7、SREK1IP1、SRSF5、STAT5B、SVIL、SYF2、SYNJ2BP、TAF1C、TBC1D4、TCF20、TECTA、TES、TMEM127、TMEM159、TMEM30B、TMEM66、TMEM8B、TP53TG1、TPCN1、TRIM22、TRIM44、TSC1、TSC22D1、TSC22D3、TSPYL2、TTC9、TTN、UBE2G2、USP33、USP34、VAMP1、VILL、VIPR1、VPS13C、ZBED5、ZBTB25、ZBTB40、ZC3H3、ZFP161、ZFP36L1、ZFP36L2、ZHX2、ZMYM5、ZNF136、ZNF148、ZNF318、ZNF350、ZNF512B、ZNF609、ZNF652、ZNF83、ZNF862及びZNF91を含む。
遺伝子セット「Progressively up in memory differentiation」は、以下の遺伝子:MTCH2、RAB6C、KIAA0195、SETD2、C2orf24、NRD1、GNA13、COPA、SELT、TNIP1、CBFA2T2、LRP10、PRKCI、BRE、ANKS1A、PNPLA6、ARL6IP1、WDFY1、MAPK1、GPR153、SHKBP1、MAP1LC3B2、PIP4K2A、HCN3、GTPBP1、TLN1、C4orf34、KIF3B、TCIRG1、PPP3CA、ATG4D、TYMP、TRAF6、C17orf76、WIPF1、FAM108A1、MYL6、NRM、SPCS2、GGT3P、GALK1、CLIP4、ARL4C、YWHAQ、LPCAT4、ATG2A、IDS、TBC1D5、DMPK、ST6GALNAC6、REEP5、ABHD6、KIAA0247、EMB、TSEN54、SPIRE2、PIWIL4、ZSCAN22、ICAM1、CHD9、LPIN2、SETD8、ZC3H12A、ULBP3、IL15RA、HLA-DQB2、LCP1、CHP、RUNX3、TMEM43、REEP4、MEF2D、ABL1、TMEM39A、PCBP4、PLCD1、CHST12、RASGRP1、C1orf58、C11orf63、C6orf129、FHOD1、DKFZp434F142、PIK3CG、ITPR3、BTG3、C4orf50、CNNM3、IFI16、AK1、CDK2AP1、REL、BCL2L1、MVD、TTC39C、PLEKHA2、FKBP11、EML4、FANCA、CDCA4、FUCA2、MFSD10、TBCD、CAPN2、IQGAP1、CHST11、PIK3R1、MYO5A、KIR2DL3、DLG3、MXD4、RALGDS、S1PR5、WSB2、CCR3、TIPARP、SP140、CD151、SOX13、KRTAP5-2、NF1、PEA15、PARP8、RNF166、UEVLD、LIMK1、CACNB1、TMX4、SLC6A6、LBA1、SV2A、LLGL2、IRF1、PPP2R5C、CD99、RAPGEF1、PPP4R1、OSBPL7、FOXP4、SLA2、TBC1D2B、ST7、JAZF1、GGA2、PI4K2A、CD68、LPGAT1、STX11、ZAK、FAM160B1、RORA、C8orf80、APOBEC3F、TGFBI、DNAJC1、GPR114、LRP8、CD69、CMIP、NAT13、TGFB1、FLJ00049、ANTXR2、NR4A3、IL12RB1、NTNG2、RDX、MLLT4、GPRIN3、ADCY9、CD300A、SCD5、ABI3、PTPN22、LGALS1、SYTL3、BMPR1A、TBK1、PMAIP1、RASGEF1A、GCNT1、GABARAPL1、STOM、CALHM2、ABCA2、PPP1R16B、SYNE2、PAM、C12orf75、CLCF1、MXRA7、APOBEC3C、CLSTN3、ACOT9、HIP1、LAG3、TNFAIP3、DCBLD1、KLF6、CACNB3、RNF19A、RAB27A、FADS3、DLG5、APOBEC3D、TNFRSF1B、ACTN4、TBKBP1、ATXN1、ARAP2、ARHGEF12、FAM53B、MAN1A1、FAM38A、PLXNC1、GRLF1、SRGN、HLA-DRB5、B4GALT5、WIPI1、PTPRJ、SLFN11、DUSP2、ANXA5、AHNAK、NEO1、CLIC1、EIF2C4、MAP3K5、IL2RB、PLEKHG1、MYO6、GTDC1、EDARADD、GALM、TARP、ADAM8、MSC、HNRPLL、SYT11、ATP2B4、NHSL2、MATK、ARHGAP18、SLFN12L、SPATS2L、RAB27B、PIK3R3、TP53INP1、MBOAT1、GYG1、KATNAL1、FAM46C、ZC3HAV1L、ANXA2P2、CTNNA1、NPC1、C3AR1、CRIM1、SH2D2A、ERN1、YPEL1、TBX21、SLC1A4、FASLG、PHACTR2、GALNT3、ADRB2、PIK3AP1、TLR3、PLEKHA5、DUSP10、GNAO1、PTGDR、FRMD4B、ANXA2、EOMES、CADM1、MAF、TPRG1、NBEAL2、PPP2R2B、PELO、SLC4A4、KLRF1、FOSL2、RGS2、TGFBR3、PRF1、MYO1F、GAB3、C17orf66、MICAL2、CYTH3、TOX、HLA-DRA、SYNE1、WEE1、PYHIN1、F2R、PLD1、THBS1、CD58、FAS、NETO2、CXCR6、ST6GALNAC2、DUSP4、AUTS2、C1orf21、KLRG1、TNIP3、GZMA、PRR5L、PRDM1、ST8SIA6、PLXND1、PTPRM、GFPT2、MYBL1、SLAMF7、FLJ16686、GNLY、ZEB2、CST7、IL18RAP、CCL5、KLRD1及びKLRB1を含む。
遺伝子セット「Up TEM vs.Down TN」は、以下の遺伝子:MYO5A、MXD4、STK3、S1PR5、GLCCI1、CCR3、SOX13、KRTAP5-2、PEA15、PARP8、RNF166、UEVLD、LIMK1、SLC6A6、SV2A、KPNA2、OSBPL7、ST7、GGA2、PI4K2A、CD68、ZAK、RORA、TGFBI、DNAJC1、JOSD1、ZFYVE28、LRP8、OSBPL3、CMIP、NAT13、TGFB1、ANTXR2、NR4A3、RDX、ADCY9、CHN1、CD300A、SCD5、PTPN22、LGALS1、RASGEF1A、GCNT1、GLUL、ABCA2、CLDND1、PAM、CLCF1、MXRA7、CLSTN3、ACOT9、METRNL、BMPR1A、LRIG1、APOBEC3G、CACNB3、RNF19A、RAB27A、FADS3、ACTN4、TBKBP1、FAM53B、MAN1A1、FAM38A、GRLF1、B4GALT5、WIPI1、DUSP2、ANXA5、AHNAK、CLIC1、MAP3K5、ST8SIA1、TARP、ADAM8、MATK、SLFN12L、PIK3R3、FAM46C、ANXA2P2、CTNNA1、NPC1、SH2D2A、ERN1、YPEL1、TBX21、STOM、PHACTR2、GBP5、ADRB2、PIK3AP1、DUSP10、PTGDR、EOMES、MAF、TPRG1、NBEAL2、NCAPH、SLC4A4、FOSL2、RGS2、TGFBR3、MYO1F、C17orf66、CYTH3、WEE1、PYHIN1、F2R、THBS1、CD58、AUTS2、FAM129A、TNIP3、GZMA、PRR5L、PRDM1、PLXND1、PTPRM、GFPT2、MYBL1、SLAMF7、ZEB2、CST7、CCL5、GZMK及びKLRB1を含む。
また、類似のプロセス及び/又は特徴を記述する他の遺伝子セットを用いて、前述した細胞表現型を特性決定することもできる。
Cell Ranger VDJを使用して、単一細胞VDJ配列及び各単一細胞5‘ライブラリーのアノテーションを作成した。データ解析及び視覚化のために、Loupe Cell Browserソフトウエア及びBioconductorパッケージを用いた。
結果
この実施例は、インプット細胞として使用される精製T細胞、ARMプロセスを用いて製造されるCART細胞(「第1日」細胞と標識される)及びTMプロセスを用いて製造されるCART細胞(「第9日」細胞と標識される)間のT細胞状態を単一細胞RNA-seq(scRNA-seq)により比較することを目標とする。加えて、単一細胞TCR-seq(scTCR-seq)を実施して、クローン性を調べ、インプットから製造後材料への細胞分化を追跡する。
この実施例は、インプット細胞として使用される精製T細胞、ARMプロセスを用いて製造されるCART細胞(「第1日」細胞と標識される)及びTMプロセスを用いて製造されるCART細胞(「第9日」細胞と標識される)間のT細胞状態を単一細胞RNA-seq(scRNA-seq)により比較することを目標とする。加えて、単一細胞TCR-seq(scTCR-seq)を実施して、クローン性を調べ、インプットから製造後材料への細胞分化を追跡する。
図37A~37Cに示すように、インプット細胞は、最も少ない発現遺伝子及びUMIを有したが、これは、これらの細胞が、転写的に活性ではなく、休止状態であることを示唆している。第1日及び第9日細胞は、より多くの遺伝子を発現し、第9日細胞が転写的に最も活性であった。同様の結果を図38A~38Dに示す。インプット細胞は、増殖遺伝子を発現していない(図38A及び38D)。
追加の遺伝子セット解析を図39A~39Eに示す。メディアン遺伝子セットスコア中央値を用いて、様々な細胞集団を比較した。第1日細胞及びインプット細胞は、より若く、よりステム様メモリー状態であった(図39A~39C)。図39Aでは、第1日細胞、第9日細胞及びインプット細胞のGeneSetScore(Up TEM vs.Down TSCM)中央値は、それぞれ-0.084、0.035及び-0.1である。図39Bでは、第1日細胞、第9日細胞及びインプット細胞のGeneSetScore(Up TEM vs.Down TSCM)中央値は、それぞれ-0.082、0.087及び-0.071である。図39Cでは、第1日細胞、第9日細胞及びインプット細胞のGeneSetScore(Down Stemness)中央値は、それぞれ-0.062、0.14及び-0.081である。
加えて、第1日細胞は、第9日細胞と比較して、より理想的代謝状態にあった(図39D及び39E)。図39Dでは、第1日細胞、第9日細胞及びインプット細胞のGeneSetScore(Up hypoxia)中央値は、それぞれ0.019、0.11及び-0.096である。図39Eでは、第1日細胞、第9日細胞及びインプット細胞のGeneSetScore(Up autophagy)中央値は、それぞれ0.066、0.11及び-0.09である。
遺伝子発現に基づいて、インプット細胞は、4つのクラスターを含有する。クラスター0は、LMNA、S100A4などの高度発現を特徴とする。クラスター1は、RP913、PRKCQ-AS1などの高度発現を特徴とする。クラスター2は、PR11-291B21.2、CD8Bなどの高度発現を特徴とする。クラスター3は、NKG7、GZMH、CCL5、CST7、GNLY、FGFBP2、GZMA、CCL4、CTSW、CD8Aなどの高度発現を特徴とする。インプット細胞のT分布型確率的近傍埋め込み法(T-Distributed Stochastic Neighbor Embedding)(TSNE)プロットにおいて、クラスター3は他の細胞から突出しており、クラスター1及び2は、識別するのが難しい。
図40A~40Cに示す遺伝子セット解析によれば、クラスター0及びクラスター3は、Tエフェクター表現型が濃縮されたクラスター1及びクラスター2と比較して、T調節表現型が濃縮されていた。クラスター3は、後期メモリー/エフェクターメモリー(TEM)細胞により占められ、クラスター1及びクラスター2は、早期メモリー及びナイーブ細胞であり、クラスター0は、中間にある。インプット細胞の大部分は、早期メモリー、ナイーブ状態にあった。理論に縛られることを意図しないが、これらの細胞が、製造工程中、最良に機能し得る。
第1日細胞及び第9日細胞に、より低い転写不均一性が認められた(データは示していない)。
インプット集団と同様に、第1日細胞は、インプット細胞のクラスター3にみられるものと類似して、TSNEプロットにおいて早期メモリー細胞の大きいクラスターと、後期メモリー細胞のより小さいクラスターを示した。対照的に、第9日細胞は、TSNEプロットに早期メモリー細胞の明確なクラスターは示さなかった。これは、第9日までに、細胞がより均質になったことを意味する。
TCRを配列決定し、クロノタイプ多様性を測定した。全体として、3つのクロノタイププロフィールは、非常に平坦であった(ほとんどのクローンは、1回のみ選び出された)(図41A~41C及び表24)。表24のシャノンエントロピーは、分布の平坦性を測定する。インプット細胞中の優勢なクローンは、後期メモリー細胞であった。第1日細胞は、インプット細胞と類似しているようにみえたが、均一になり始めた。9日までに、優勢なクローンは実質的に均一になり、分布がはるかに平坦になった。多様性測定は、インプット細胞又は第1日細胞よりも第9日にはるかに均一且つ平坦な分布が存在したため、第9日で最も高かった。
まとめ
第1日及び第9日産物間に有意なT細胞状態の差があった。第1日細胞は、インプット細胞とはるかによく類似し、幹細胞性シグネチャーが豊富であったが、これは、より有効な産物を示す。
第1日及び第9日産物間に有意なT細胞状態の差があった。第1日細胞は、インプット細胞とはるかによく類似し、幹細胞性シグネチャーが豊富であったが、これは、より有効な産物を示す。
実施例11:再発性及び/又は難治性多発性骨髄腫(MM)を有する成人患者におけるB細胞成熟抗原(BCMA)指向性CAR-T細胞の第I相、オープンラベル試験。
この試験では、利用可能であれば、IMiD(例えば、レナリドミド若しくはポマリドミド)、プロテアソーム阻害剤(例えば、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ)及び承認された抗CD38抗体(ダラツムマブ)を含め、少なくとも2種の過去の治療レジメンに対して再発性及び/又は難治性であり、且つ疾患進行のエビデンス(IMWG基準)が記録されている成人MM対象における抗BCMA CAR-T細胞療法の安全性及び耐容性を評価する。
この試験では、利用可能であれば、IMiD(例えば、レナリドミド若しくはポマリドミド)、プロテアソーム阻害剤(例えば、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ)及び承認された抗CD38抗体(ダラツムマブ)を含め、少なくとも2種の過去の治療レジメンに対して再発性及び/又は難治性であり、且つ疾患進行のエビデンス(IMWG基準)が記録されている成人MM対象における抗BCMA CAR-T細胞療法の安全性及び耐容性を評価する。
抗BCMA CARは、PI61抗BCMA scFv、CD8ヒンジ及び膜貫通領域、4-1BB共刺激ドメイン及びCD3ζシグナル伝達ドメインを含む。この試験では、活性化高速製造(ARM)プロセスを用いて、抗BCMA
CAR-T細胞産物を製造する。こうした細胞は、「ARM-BCMA CAR」と呼ばれる。具体的に、T細胞表面上のCD4及びCD8共受容体を捕獲する市販の磁気ビーズを用いて、被験者の白血球アフェレーシス単位からT細胞を濃縮する。次に、濃縮したT細胞を、ヒトCD3及びCD8に対するヒト化組換えアゴニスト抗体に共有結合したコロイドポリマーナノマトリックスで刺激する。接種、活性化及び形質導入から24時間後、CAR-T細胞を採取し、洗浄して、残留する非組込みベクター及び非結合活性化マトリックスを除去する。洗浄後、BCMA CART細胞療法薬を濃縮及び凍結保存する。投与用の産物の放出前に放出試験手順の結果が必要となる。
CAR-T細胞産物を製造する。こうした細胞は、「ARM-BCMA CAR」と呼ばれる。具体的に、T細胞表面上のCD4及びCD8共受容体を捕獲する市販の磁気ビーズを用いて、被験者の白血球アフェレーシス単位からT細胞を濃縮する。次に、濃縮したT細胞を、ヒトCD3及びCD8に対するヒト化組換えアゴニスト抗体に共有結合したコロイドポリマーナノマトリックスで刺激する。接種、活性化及び形質導入から24時間後、CAR-T細胞を採取し、洗浄して、残留する非組込みベクター及び非結合活性化マトリックスを除去する。洗浄後、BCMA CART細胞療法薬を濃縮及び凍結保存する。投与用の産物の放出前に放出試験手順の結果が必要となる。
レンチウイルスベクターによる形質導入後7~8日持続するエクスビボT細胞増殖に依存するCAR-T細胞のTMプロセスと比較して、ARMプロセスは、エクスビボT細胞増殖を含まない。対照的に、ARMで生産されたT細胞は、遺伝子移入から24時間後に採取されるため、それらを患者内でインビボ増殖させることができる。ARMプロセスで達成される優れたインビボT細胞増殖は、低分化T細胞表現型をもたらし、最終細胞産物中により大きい画分のメモリーステムT細胞を保存することが予測される。低分化のメモリーCAR-T細胞の存在は、臨床試験で改善された抗腫瘍効果に関連している(Fraietta JA,et al.,(2018)Nat Med 24(5);563-71)。理論に縛られることを意図しないが、より大きい画分のメモリーT細胞を含むBCMA CART細胞は、患者内でCAR-T細胞増殖の増大をもたらし、これによりエフェクターT細胞枯渇を克服して、伝統的な製造プロセスにより生産されたBCMA CART細胞と比較して、MM患者により持続的な有効性を達成する。
ARMプロセスは、伝統的製造(TM)プロセスを用いて製造されるCART細胞と比較して、産物全体及びCAR-陽性画分の両方において、有意に高い割合のナイーブ様メモリーT細胞(CCR7+/CD45RO-)を含むCAR-T細胞を生産する。ARM-BCMA CAR細胞は、用量応答性様式で、前臨床MMモデルにおける腫瘍根絶を証明している。ARM-BCMA CARは、TMプロセスによって産生されたBCMA CAR-T細胞と比較して、少なくとも5倍強力であり、より高レベルの全身性サイトカインと共に、インビボで持続的なCAR-T細胞増殖をもたらす。総合すると、これらの結果は、ARMプロセスを用いて製造される抗BCMA CAR-T細胞産物が、顕著なメモリー幹細胞表現型を有するT細胞を含み、その結果、増強された生着、増殖及び抗MM特性を備えたBCMA CAR-T細胞産物が達成されるという仮定を支持する。
この第I相試験では、まず、スクリーニング中に各対象を臨床適格性について評価する。本試験への参加に適格である対象は、以下の基準を満たさなければならない:(1)ICF署名時の年齢≧18歳;(2)スクリーニング時のECOGパフォーマンスステータスが0又は1いずれかである;(3)MMを有する対象であって、IMiD(例えば、レナリドミド若しくはポマリドミド)、プロテアソーム阻害剤(例えば、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ)及び承認済抗CD38抗体(例えば、ダラツムマブ)(利用可能であれば)を含め、少なくとも2種の過去の治療レジメンに対して再発性及び/又は難治性であり、且つ疾患進行のエビデンス(IMWG基準)が記録されている者;(4)対象は、次の3つの測定値の少なくとも1つにより確定される測定可能な疾患を有していなければならない:血清M-タンパク質≧1.0g/dL、尿M-タンパク質≧200mg/24時間又は血清遊離軽鎖(sFLC)>100mg/L関連FLC;(5)全ての患者は、施設のガイドラインに従い連続的骨髄生検及び/又は吸引採取について適性であり、且つ本試験について記載の通り、反復手順を受ける意思がなければならない;(6)対象は、スクリーニング時に次の血液学的値を満たさなければならない:試験の7日以内に増殖因子支持なしで、絶対好中球数(ANC)≧1,000/mm3(≧1×109/L)、7日以内の輸血サポートなしのCD3+T細胞の絶対数>150/mm3(>0.15×109/L)、血小板≧50,000/mm3(≧50×109/L)及びヘモグロビン≧8.0g/dl(≧4.9mmol/L);(7)患者は、臨床責任医師により、フルダラビン/シクロホスファミドLDレジメンを受けるのに適性であるとみなされなければならない;及び(8)製造が承認される非動員細胞の白血球アフェレーシス材料を有していなければならない。適合性であれば、対象は、白血球アフェレーシス産物を採取され、CAR-T製造に付される。対象は、それらの白血球アフェレーシス産物の製造開始の承認と共に登録される。
対象は、最終産物が利用可能であることが確認されて初めて、リンパ球枯渇(LD)化学療法を受ける。LD化学療法の後、解凍から90分以内に、抗BCMA CAR-T細胞産物を静脈内(i.v.)注射により患者に投与する(図42)。ARM-BCMA CARの出発用量は、1×107生存CAR陽性T細胞である。また、5×107生存CAR陽性T細胞も試験する。各対象は各々、抗BCMA CAR-T細胞投与から最初の72時間入院する。
薬物動態分析のために、異なる時点で、連続的血液サンプルを採取して、フローサイトメトリー及びqPCRにより末梢血中の、またフローサイトメトリー及びqPCRにより骨髄中のARM-BCMA CAR細胞動態を測定し、ELISAにより末梢血中のsBCMA、BAFF及びAPRILといった潜在的薬力学マーカーを測定する。特に、対象は、末梢血、骨髄又は他の関連組織中のCARトランスジーンの量;末梢血又は骨髄中のCAR陽性T細胞の表面発現;血清中の抗mCAR抗体;PBMC中のIFN-γ陽性CD4/CD8T細胞のパーセンテージ;免疫細胞活性化のマーカー;可溶性免疫因子及びサイトカイン(例えば、sBCMA、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、TNF-α)、CAR-Tクローナリティ;並びに血清中の可溶性BCMA、APRIL及びBAFFについて分析される。
実施例12:活性化高速製造(ARM)プロセスを用いるBCMA CART細胞の製造
BCMA CART細胞のARMプロセスは、表25に概略を示すように、培地の調製から開始する。
BCMA CART細胞のARMプロセスは、表25に概略を示すように、培地の調製から開始する。
凍結保存した白血球アフェレーシス産物を出発材料として使用し、これをT細胞濃縮のために処理する。利用可能であれば、アフェレーシスペーパーワークを利用して、T細胞パーセンテージを決定する。アフェレーシスペーパーワークに基づくT細胞パーセンテージデータがない場合、到着した凍結保存白血球アフェレーシス産物にセンチネルバイアル試験を実施して、アフェレーシスのT細胞パーセンテージ目標を取得する。T細胞パーセンテージについての結果により、ARMプロセスの第0日にどの程度の個数のバッグを解凍するかを決定する。
凍結保存白血球アフェレーシスを解凍、洗浄した後、CliniMACS(登録商標)マイクロビーズ技術を用いて、T細胞選択及び濃縮を実施する。生存核細胞(VNC)をTransACT(Miltenyi)で活性化し、CARをコードするレンチウイルスベクターで形質導入する。Miltenyiマイクロビーズで選択された生存細胞を、非加湿インキュベーションチャンバーであるProdigy(登録商標)上のcentricult中に接種する。培養中、CTS(商標)サプリメント(ThermoFisher)、グルタマックス(Glutamax)、IL-2及び2%免疫細胞血清代替品をその成分として含むOpTmizer(商標)CTS(商標)基材の培地であるラピッドメディアに細胞を懸濁させて、T細胞活性化及び形質導入を促進する。レンチウイルス形質導入は、TransACTを培地中の希釈された細胞に添加した後、接種の日に1回実施する。レンチウイルスベクターは、接種日の使用直前に、室温で最大30分かけて解凍する。
第0日のプロセス開始から、培養物洗浄及び採取の開始まで、BCMA CART細胞を接種から20~28時間培養する。培養後、細胞懸濁液をcentricultチャンバー(Miltenyi Biotech)中で2回の培地洗浄及び1回の採取物洗浄に付す。
第1日のCliniMACS(登録商標)Prodigy(登録商標)での採取物洗浄後、細胞懸濁液をサンプリングして、生存細胞数及び生存率を決定する。次に、細胞懸濁液を遠心分離機に移し、手動でペレット化する。上清を除去し、細胞ペレットをCS10(BioLife Solution)に再懸濁させることにより、約10.0%の最終DMSO濃度を有する産物製剤が得られる。生存細胞数は、用量設定のために採取後に公式化する。次に、用量を個別のクライオバッグに分配し、クライオバイアル中での分析サンプリングを行う。
凍結保存産物は、安全な進入制限エリア内のモニター付きLN2保存タンク内に最終出荷及び発送まで保存する。
実施例13:活性化高速製造(ARM)プロセスを用いて製造されたBCMA CART細胞の特性決定
まとめ
この実施例では、ARMプロセスを用いて製造されるBCMA CART細胞の特性決定を説明する。ARMプロセスは、伝統的製造(TM)産物と比較して、有意に高い割合のナイーブ様メモリーT細胞(CCR7+/CD45RO-)から構成されるCAR-T細胞を生産する。多発性骨髄腫(MM)の前臨床モデルにおいて、ARMプロセスを用いて製造されたBCMA CART細胞は、用量依存的に腫瘍退縮を誘導し、これは、TMプロセスを用いて製造されるBCMA CART細胞と比較して、腫瘍殺傷が最大5倍有効であった。さらに、ARM製造細胞は、TM製造細胞と比較して、インビボで長期のCART増殖(最大3倍高いCmax及びAUC0-21d)を示し、より高い全身性サイトカイン(IFN-γ、約3.5倍)を誘導した。総合すると、これらの結果は、ARMプロセスを用いて製造されるBCMA CART細胞が、顕著なメモリー幹細胞表現型及びインビボで増大した増殖能力を備えたT細胞を有するという仮定を支持するものである。
まとめ
この実施例では、ARMプロセスを用いて製造されるBCMA CART細胞の特性決定を説明する。ARMプロセスは、伝統的製造(TM)産物と比較して、有意に高い割合のナイーブ様メモリーT細胞(CCR7+/CD45RO-)から構成されるCAR-T細胞を生産する。多発性骨髄腫(MM)の前臨床モデルにおいて、ARMプロセスを用いて製造されたBCMA CART細胞は、用量依存的に腫瘍退縮を誘導し、これは、TMプロセスを用いて製造されるBCMA CART細胞と比較して、腫瘍殺傷が最大5倍有効であった。さらに、ARM製造細胞は、TM製造細胞と比較して、インビボで長期のCART増殖(最大3倍高いCmax及びAUC0-21d)を示し、より高い全身性サイトカイン(IFN-γ、約3.5倍)を誘導した。総合すると、これらの結果は、ARMプロセスを用いて製造されるBCMA CART細胞が、顕著なメモリー幹細胞表現型及びインビボで増大した増殖能力を備えたT細胞を有するという仮定を支持するものである。
ARMプロセスを用いて、CARは、ウイルス添加後96h(また、産物の解凍後72hとも称される)で、安定して発現させることができた。従って、ウイルス添加後96h又は解凍後72hは、インビトロ及びインビボ活性のためのCAR発現の代替時点と考えられる。ARMプロセスを用いて製造されたBCMA CART細胞は、TMプロセスで製造されたBCMA CART細胞と比較して、低分化細胞集団を保存し、インビトロでより高い標的特異的サイトカイン産生を示す。
ARMプロセスを用いて製造されたBCMA CART細胞は、市販のヒト血漿膜タンパク質アレイを用いてBCMAに対する高い特異性を示した。このアッセイでは、BCMA(TNFRSF17)との結合は検出されたが、他の強度、中度若しくは弱い結合は検出されなかった。スクリーンは、BCMA CART産物に発現される抗ヒトBCMA単鎖抗体可変フラグメント(scFv)(PI61)の交差反応タンパク質の存在を高い信頼性で見出さなかった。標的分布試験を実施して、潜在的なオフ腫瘍オンターゲット(off-tumor on-target)毒性を決定した。免疫組織化学(IHC)、インサイチュハイブリダイゼーション(ISH)及びポリメラーゼ連鎖反応(PCR)アッセイを使用して、正常ヒト組織中のBCMAの分布を調べた。これらの分析から、二次リンパ器官、骨髄及び粘膜関連リンパ組織などの正常形質細胞(PC)を含有する部位に限定されたことが示された。中枢神経系(CNS)神経毒性は、他の細胞療法に関して懸念事項であったため、脳での発現を調べた。BCMAに特異的であることが証明された市販の抗体を用いる免疫組織化学によっても、またBCMAターゲティングscFvを含有するヒト-ウサギキメラツール抗体を用いた結合アッセイによっても、CNS中に染色は、観察されなかった。これらの知見は、インサイチュハイブリダイゼーション及びPCRに基づくスプライス変異体解析によって測定されるように、上記の組織中にBCMA mRNAが存在しないことにより確認された。正常PC及びBCMA発現形質細胞容樹状細胞のBCMA CART標的化は、それらの枯渇を起こすと考えられるが;他の細胞型の標的化は、予想されない。
結果
以下に記載する試験では、ARMプロセスを用いて製造されたBCMA CART細胞(「ARM-BCMA CAR」と称される)を、TMプロセスを用いて製造されたBCMA CART細胞(「TM-BCMA CAR」又は「TM-BCMA CAR*」と称される)と比較した。ARM-BCMA CARに発現されたCAR及びTM-BCMA CAR*に発現されたCARは、PI61 scFv、CD8ヒンジ及び膜貫通領域、4-1BB共刺激ドメイン並びにCD3ζシグナル伝達ドメインを含む同じ配列を有する。TM-BCMA CARに発現されたCARは、BCMA10 scFv、CD8ヒンジ及び膜貫通領域、4-1BB共刺激ドメイン及びCD3ζシグナル伝達ドメインを含む。
以下に記載する試験では、ARMプロセスを用いて製造されたBCMA CART細胞(「ARM-BCMA CAR」と称される)を、TMプロセスを用いて製造されたBCMA CART細胞(「TM-BCMA CAR」又は「TM-BCMA CAR*」と称される)と比較した。ARM-BCMA CARに発現されたCAR及びTM-BCMA CAR*に発現されたCARは、PI61 scFv、CD8ヒンジ及び膜貫通領域、4-1BB共刺激ドメイン並びにCD3ζシグナル伝達ドメインを含む同じ配列を有する。TM-BCMA CARに発現されたCARは、BCMA10 scFv、CD8ヒンジ及び膜貫通領域、4-1BB共刺激ドメイン及びCD3ζシグナル伝達ドメインを含む。
インビトロでのARM-BCMA CAR発現動態
8~9日後にCARトランスジーンのレンチウイルス組込みを測定するTMとは対照的に、ARMプロセスでは、レンチウイルス偽形質導入が起こり得ることから、レンチウイルス添加後24h以内にレンチウイルストランスジーンが完全に組み込まれ、真に発現されてはいない可能性がある(Haas DL,et al.,(2000)Mol Ther;2(1):71-80;Galla M,et al.,(2004)Mol Cell;16(2):309-15)。そのため、3’-アジド-3’-デオキシチミジン(AZT)の存在又は非存在下において、ARM-BCMA CARの長期培養により、BCMA-CAR発現パターンを経時的に評価して、CARトランスジーンの安定した組込み及び発現に対して偽形質導入の可能性を評価した。流量サイトメトリー(FACS)解析を実施して、T細胞活性化及びレンチウイルスによる形質導入後24h、48h、72h、96h及び168hでのCAR表面発現を検出した。一部の事例では、ARM-BCMA CAR及びこの産物のアリコートを、他のアッセイでのさらに別の特性決定のために、採取後直接凍結した。
8~9日後にCARトランスジーンのレンチウイルス組込みを測定するTMとは対照的に、ARMプロセスでは、レンチウイルス偽形質導入が起こり得ることから、レンチウイルス添加後24h以内にレンチウイルストランスジーンが完全に組み込まれ、真に発現されてはいない可能性がある(Haas DL,et al.,(2000)Mol Ther;2(1):71-80;Galla M,et al.,(2004)Mol Cell;16(2):309-15)。そのため、3’-アジド-3’-デオキシチミジン(AZT)の存在又は非存在下において、ARM-BCMA CARの長期培養により、BCMA-CAR発現パターンを経時的に評価して、CARトランスジーンの安定した組込み及び発現に対して偽形質導入の可能性を評価した。流量サイトメトリー(FACS)解析を実施して、T細胞活性化及びレンチウイルスによる形質導入後24h、48h、72h、96h及び168hでのCAR表面発現を検出した。一部の事例では、ARM-BCMA CAR及びこの産物のアリコートを、他のアッセイでのさらに別の特性決定のために、採取後直接凍結した。
図43に示すように、FACS解析は、レンチウイルスベクターの添加後24hで、BCMA-CARが、実際に発現を明らかにしなかったことを示している。しかし、CAR+集団は、初め、48hで出現した。CAR+集団は、ウイルス添加後48h~168hの各時点でやや増加した。CARは、96hから安定して発現されるとみられた。これは、非形質導入(UTD)及びAZT処理サンプルとは対照的であり、これらは、48hからのいずれの時点でもCAR+集団を示さなかった(図43)。AZTは、30μM及び100μM用量の双方でCAR+集団を有効に阻害することができ、これは、BCMA CAR発現が宿主細胞ゲノムへのウイルス遺伝子組込みによるものであり、レンチウイルス偽形質導入に起因するものではないようであることを示唆している。
ARM-BCMA CARは、T細胞幹細胞性を保存する
ARM-BCMA CAR及びTM-BCMA CARをFACSにより解析して、解凍時のCAR発現並びに解凍後48hのT細胞表現型を評価した(図44A及び44B)。BCMA-CARは、二人のドナーにみられる解凍時にほとんど検出不能であった(図44A)が、これは、図43に示されるCAR発現動態試験の観察と一致する。しかし、解凍後48hで、BCMA-CAR発現は、ARM-BCMA CARについて32.9%であった。対照的に、TM-BCMA CARは、7%のBCMA-CAR発現を明らかにした(図44B)。CAR+T細胞表現型の解析から、ARMプロセスは、ナイーブ様T細胞(60%CD45RO-/CCR7+)を保持することが明らかにされ、ナイーブ様T細胞は、エフェクターT細胞集団(CD45RO+/CCR7-)の26倍であることが判明した。TMプロセスは、主として、CAR+T細胞内にセントラルメモリーT細胞(81%CD45RO+/CCR7+)もたらした。TMプロセスでは、ナイーブ様T細胞集団は、ほとんど存在しなかった。このナイーブT細胞集団は、CD45RO-/CCR7+Tstem細胞(Cohen AD,et al(2019)J Clin Invest;129(6):2210-21;及びFraietta,et al(2018).Nat Med,24(5);563-571により記載)と大きく重なり、増大したCAR-T発現及び臨床応答と関連する。
ARM-BCMA CAR及びTM-BCMA CARをFACSにより解析して、解凍時のCAR発現並びに解凍後48hのT細胞表現型を評価した(図44A及び44B)。BCMA-CARは、二人のドナーにみられる解凍時にほとんど検出不能であった(図44A)が、これは、図43に示されるCAR発現動態試験の観察と一致する。しかし、解凍後48hで、BCMA-CAR発現は、ARM-BCMA CARについて32.9%であった。対照的に、TM-BCMA CARは、7%のBCMA-CAR発現を明らかにした(図44B)。CAR+T細胞表現型の解析から、ARMプロセスは、ナイーブ様T細胞(60%CD45RO-/CCR7+)を保持することが明らかにされ、ナイーブ様T細胞は、エフェクターT細胞集団(CD45RO+/CCR7-)の26倍であることが判明した。TMプロセスは、主として、CAR+T細胞内にセントラルメモリーT細胞(81%CD45RO+/CCR7+)もたらした。TMプロセスでは、ナイーブ様T細胞集団は、ほとんど存在しなかった。このナイーブT細胞集団は、CD45RO-/CCR7+Tstem細胞(Cohen AD,et al(2019)J Clin Invest;129(6):2210-21;及びFraietta,et al(2018).Nat Med,24(5);563-571により記載)と大きく重なり、増大したCAR-T発現及び臨床応答と関連する。
その表現型に加えて、最終的ARM-BCMA CAR細胞産物をインビトロでのその活性化についても評価した。ARM-BCMA CAR及びTM-BCMA CARを解凍し、BCMA発現細胞株KMS-11と一緒に共培養した。解凍後のARM-BCMA CAR細胞は、共培養を確立する前に24h休ませた。共培養から24時間後の上清中のサイトカインレベルを比較すると、図45A及び45Bに示す通り、TM-BCMA CARと比較して、ARM-BCMA CARにより分泌されるIL-2の5倍の増加及びIFN-γの2倍のレベル増加が明らかにされた。ARM又はTMプロセスを経たUTD細胞による実験で、ARM-BCMA CAR及びTM-BCMA CARによるBCMA特異的認識が確認された。しかし、BCMA特異的刺激(図45B)の非存在下でのARM-UTDによるIFN-γ分泌のバッググランドが高いのは、ARM産物の活性化された性質に起因する可能性がある。
要約すると、BCMA CART細胞を作製するために用いられるARMプロセスは、TMプロセスのそれよりも高いCAR発現を伴うT細胞をもたらす。ARM-BCMA CARは、インビトロでBCMA特異的活性化を示し、TM-BCMA CARと比較して、高いレベルのIL-2を分泌するが、これは、そのTstem表現型と相関する。
異種移植モデルにおけるARM-BCMA CAR及びTM-BCMA CARの有効性
インビボでの薬理学試験をARM-BCMA CARの開発の指針として使用した。図46に記載する実験では、GMP材料を用いてARM-BCMA CARを作製した。並行して、TM-BCMA CARは、同じバッチのT細胞を用いるが、TMにより作製した。ARM-BCMA CARを用いる用量計算には、産物の解凍後72hのCAR+(%)の測定を用いて、用量を計算し;TM-BCMA CARの場合、第9日TM産物のCAR+(%)の測定を用いて、用量を計算した。異なるプロセスを用いて製造されたCAR-T細胞の有効性を、MM細胞株KMS-11-Lucを接種した免疫欠損型NSGマウス(NOD-scid IL2Rg-ヌル)で評価した。この腫瘍細胞株は、骨髄に生着する。MM接種から8日後、マウスのコホートは、CAR+T細胞の単回注入を受けた。対応用量群の総CAR+T細胞に対して用量を正規化した。UTD T細胞を同様に調製し、これは、腫瘍に対する同種免疫反応について照合するための独立した群として提供された。UTD用量は、TM及びARMの両方について達成することができたそれぞれのプロセスの最も高い総T細胞用量を表すものであった。
インビボでの薬理学試験をARM-BCMA CARの開発の指針として使用した。図46に記載する実験では、GMP材料を用いてARM-BCMA CARを作製した。並行して、TM-BCMA CARは、同じバッチのT細胞を用いるが、TMにより作製した。ARM-BCMA CARを用いる用量計算には、産物の解凍後72hのCAR+(%)の測定を用いて、用量を計算し;TM-BCMA CARの場合、第9日TM産物のCAR+(%)の測定を用いて、用量を計算した。異なるプロセスを用いて製造されたCAR-T細胞の有効性を、MM細胞株KMS-11-Lucを接種した免疫欠損型NSGマウス(NOD-scid IL2Rg-ヌル)で評価した。この腫瘍細胞株は、骨髄に生着する。MM接種から8日後、マウスのコホートは、CAR+T細胞の単回注入を受けた。対応用量群の総CAR+T細胞に対して用量を正規化した。UTD T細胞を同様に調製し、これは、腫瘍に対する同種免疫反応について照合するための独立した群として提供された。UTD用量は、TM及びARMの両方について達成することができたそれぞれのプロセスの最も高い総T細胞用量を表すものであった。
図47は、全ての群の腫瘍退縮曲線である。両BCMA CAR+T産物(ARM-BCMA CAR及びTM-BCMA CAR)共に、試験した用量レベルで、最も低い用量群でも、腫瘍を排除することができた。腫瘍退縮は、用量依存的に誘導された。腫瘍殺傷効果の開始は、高い用量群に比べて低い用量群で約1週間遅れた。ARM-BCMA CARは、TM-BCMA CARの3~5倍の用量で同様の退縮を誘導し、ARM-BCMA CARが、TM-BCMA CARに比べて3~5倍強力であることを示している。
さらに、この試験では、TM-BCMA CAR*の有効性も評価した。TM-BCMA CAR*及びARM-BCMA CARは、同じ抗BCMA CARを発現したが、これらは、異なるプロセス:それぞれTMプロセス及びARMプロセスを用いて製造された。これらの結果から、ARM-BCMA CARが、TM-BCMA CAR*より1~5倍低い用量で類似の腫瘍退縮を誘導することが実証された。
マウス、全てCAR+T療法後2、7、14及び21日に採血して、血漿IFN-γを測定した(図48A~48C)。早期ピークは観察されず、全ての群が、2日時点で非常に低レベルの循環IFN-γ(<10pg/ml)を示した。全ての群についてピークは、CAR+T用量後14日以内に観察された。しかし、IFN-γレベルは、TM-BCMA CARと比較して、ARM-BCMA CARの方が3.5倍高かった。ARM-UTD群は、試験終了の2日前及び7日前IFN-γをほとんど又は全く産生していない。IFN-γは、ARM-BCMA CAR 1e4及びTM-BCMA CAR 5e4群と比較すると、これら2つの群ではCAR+T細胞が依然として増殖し、腫瘍阻害が遅れるため、第21日に、より高い用量群で下降した。
インビトロARM-BCMA CAR細胞動態
NSGマウスにおける有効性を評価するためのこの薬理学試験の一環として、注入後最大3週間まで末梢血CAR-T細胞の増殖をFACSにより解析した。CD3+T細胞及びCAR+T細胞増殖のいずれも、全CAR-T細胞処理群に観察された。Cmax及びAUC-21dに関して、ARM-BCMA CAR又はTM-BCMA CARの明らかな用量依存性増殖はなかった。ARM-BCMA CAR又はMTV273の細胞増殖のピークは、21日以内に達成されなかった。しかし、5e5の用量群のTM-BCMA CAR及び0.5e5の用量群のARM-BCMA CARは、第14日に明らかなピーク増殖を達成した(図49)。21日でのARM-BCMA CARの発現とTM-BCMA CARのそれとを比較すると、ARM-BCMA CARのCmax及びAUC0-21dはいずれも2~3倍高かった。
NSGマウスにおける有効性を評価するためのこの薬理学試験の一環として、注入後最大3週間まで末梢血CAR-T細胞の増殖をFACSにより解析した。CD3+T細胞及びCAR+T細胞増殖のいずれも、全CAR-T細胞処理群に観察された。Cmax及びAUC-21dに関して、ARM-BCMA CAR又はTM-BCMA CARの明らかな用量依存性増殖はなかった。ARM-BCMA CAR又はMTV273の細胞増殖のピークは、21日以内に達成されなかった。しかし、5e5の用量群のTM-BCMA CAR及び0.5e5の用量群のARM-BCMA CARは、第14日に明らかなピーク増殖を達成した(図49)。21日でのARM-BCMA CARの発現とTM-BCMA CARのそれとを比較すると、ARM-BCMA CARのCmax及びAUC0-21dはいずれも2~3倍高かった。
実施例14:IL-15又はhetIL-15(IL-15/sIL-15Ra)を使用する活性化高速製造(ARM)プロセスを用いたBCMA CART細胞の製造
BCMA CART細胞のARMプロセスは、表25に概略を示すような培地の調製で開始する。
BCMA CART細胞のARMプロセスは、表25に概略を示すような培地の調製で開始する。
凍結保存した白血球アフェレーシス産物を出発材料として使用し、これをT細胞濃縮のために処理する。利用可能であれば、アフェレーシスペーパーワークを利用して、T細胞パーセンテージを決定する。アフェレーシスペーパーワークに基づくT細胞パーセンテージデータがない場合、到着した凍結保存白血球アフェレーシス産物にセンチネルバイアル試験を実施して、アフェレーシスのT細胞パーセンテージ目標を取得する。T細胞パーセンテージについての結果により、ARMプロセスの第0日にどの程度の個数のバッグを解凍するかを決定する。
凍結保存白血球アフェレーシスを解凍、洗浄した後、CliniMACS(登録商標)マイクロビーズ技術を用いて、T細胞選択及び濃縮を実施する。生存核細胞(VNC)をTransACT(Miltenyi)で活性化し、CARをコードするレンチウイルスベクターで形質導入する。Miltenyiマイクロビーズで選択された生存細胞を、非加湿インキュベーションチャンバーであるProdigy(登録商標)上のcentricult中に接種する。培養中、CTS(商標)サプリメント(ThermoFisher)、グルタマックス(Glutamax)、IL-15又はhetIL-15(IL-15/sIL-15Ra)及び2%免疫細胞血清代替品をその成分として含むOpTmizer(商標)CTS(商標)基材の培地であるラピッドメディアに細胞を懸濁させて、T細胞活性化及び形質導入を促進する。レンチウイルス形質導入は、TransACTを培地中の希釈された細胞に添加した後、接種の日に1回実施する。レンチウイルスベクターは、接種日の使用直前に、室温で最大30分かけて解凍する。
第0日のプロセス開始から、培養物洗浄及び採取の開始まで、BCMA CART細胞を接種から20~28時間培養する。培養後、細胞懸濁液をcentricultチャンバー(Miltenyi Biotech)中で2回の培養物洗浄及び1回の採取物洗浄に付す。
第1日のCliniMACS(登録商標)Prodigy(登録商標)での採取物洗浄後、細胞懸濁液をサンプリングして、生存細胞数及び生存率を決定する。次に、細胞懸濁液を遠心分離機に移し、手動でペレット化する。上清を除去し、細胞ペレットをCS10(BioLife Solution)に再懸濁させることにより、約10.0%の最終DMSO濃度を有する産物製剤が得られる。生存細胞数は、用量設定のために採取後に公式化する。次に、用量を個別のクライオバッグに分配し、クライオバイアル中での分析サンプリングを行う。
凍結保存産物は、安全な進入制限エリア内のモニター付きLN2保存タンク中に最終出荷及び発送まで保存する。
一部の実施形態では、OpTmizer(商標)CTS(商標)基材の培地に使用したIL-15又はhetIL-15の代わりにIL-6又はIL-6/sIL-6Raを使用することができる。
実施例15:活性化高速製造(ARM)プロセスを用いたCD19CART細胞の製造
CD19CART細胞のARMプロセスは、表25に概略を示すような培地の調製で開始する。
CD19CART細胞のARMプロセスは、表25に概略を示すような培地の調製で開始する。
凍結保存した白血球アフェレーシス産物を出発材料として使用し、これをT細胞濃縮のために処理する。利用可能であれば、アフェレーシスペーパーワークを利用して、T細胞パーセンテージを決定する。アフェレーシスペーパーワークに基づくT細胞パーセンテージデータがない場合、到着した凍結保存白血球アフェレーシス産物にセンチネルバイアル試験を実施して、アフェレーシスのT細胞パーセンテージ目標を取得する。T細胞パーセンテージについての結果により、ARMプロセスの第0日にどの程度の個数のバッグを解凍するかを決定する。
凍結保存白血球アフェレーシスを解凍、洗浄した後、CliniMACS(登録商標)マイクロビーズ技術を用いて、T細胞選択及び濃縮を実施する。生存核細胞(VNC)をTransACT(Miltenyi)で活性化し、CARをコードするレンチウイルスベクターで形質導入する。Miltenyiマイクロビーズで選択された生存細胞を、非加湿インキュベーションチャンバーであるProdigy(登録商標)上のcentricult中に接種する。培養中、CTS(商標)サプリメント(ThermoFisher)、グルタマックス(Glutamax)、IL-2及び2%免疫細胞血清代替品をその成分として含むOpTmizer(商標)CTS(商標)基材の培地であるラピッドメディアに細胞を懸濁させて、T細胞活性化及び形質導入を促進する。レンチウイルス形質導入は、TransACTを培地中の希釈された細胞に添加した後、接種の日に1回実施する。レンチウイルスベクターは、接種日の使用直前に、室温で最大30分かけて解凍する。
第0日のプロセス開始から、培養物洗浄及び採取の開始まで、CD19CART細胞を接種から20~28時間培養する。培養後、細胞懸濁液をcentricultチャンバー(Miltenyi Biotech)中で2回の培養物洗浄及び1回の採取物洗浄に付す。
第1日のCliniMACS(登録商標)Prodigy(登録商標)での採取物洗浄後、細胞懸濁液をサンプリングして、生存細胞数及び生存率を決定する。次に、細胞懸濁液を遠心分離機に移し、手動でペレット化する。上清を除去し、細胞ペレットをCS10(BioLife Solution)に再懸濁させることにより、約10.0%の最終DMSO濃度を有する産物製剤が得られる。生存細胞数は、用量設定のために採取後に公式化する。次に、用量を個別のクライオバッグに分配し、クライオバイアルへの分析サンプリングを行う。
凍結保存産物は、安全な進入制限エリア内のモニター付きLN2保存タンク中に最終出荷及び発送まで保存する。
一部の実施形態では、OpTmizer(商標)CTS(商標)基材の培地に使用したL-2の代わりに、IL-15、hetIL-15(IL-15/sIL-15Ra)、IL-6又はIL-6/sIL-16Raを使用することができる。
実施例16-多重特異性結合分子によるCAR T細胞活性化
様々な構成の二重特異性抗体及びそれらの多量体コンジュゲートを作製した。これらのコンジュゲートのスキームを、図51A~51Bに記載する(構築物1~17、F1~F17とも呼ばれる)。
様々な構成の二重特異性抗体及びそれらの多量体コンジュゲートを作製した。これらのコンジュゲートのスキームを、図51A~51Bに記載する(構築物1~17、F1~F17とも呼ばれる)。
T細胞活性化及びレンチウイルス形質導入を特性決定するために、T細胞を、96ウェルプレート中の補充培地に様々な濃度で接種した。図51A~51Bの構築物1~17を様々な濃度で含む試薬を用いて、T細胞を30分間刺激した。最適な滴定濃度のMiltenyi TransActを陽性対照として使用した。次に、刺激したT細胞を、20%形質導入を目標とするMOIで、CD19CARをコードするベクターを含むレンチウイルスにより処理した。細胞を培養した後、培養物の75%をFACS分析のために取り出した。残りの25%を培養し、FACSによって再度分析した。Celigoイメージング、上清のIFNγ及びIL-2分析並びにFACSにより、細胞を分析して、成功したCD19CAR形質導入を評価した。図52は、得られたT細胞クラスター形成を示す。
実施例17-多重特異性結合分子で活性化されたCAR T細胞の特性決定
3つの異なるドナーから単離されたT細胞を、96ウェルプレート中の補充培地に接種した。図51A~51Bの構築物1~17を様々な濃度で含む試薬を用いて、T細胞を刺激した。最適な滴定濃度のMiltenyi TransActを陽性対照として用いた。次に、刺激したT細胞を、20%形質導入を目標とするMOIで、CD19CARをコードするベクターを含むレンチウイルスにより処理した。上清は、Meso Scale Discovery (MSD)のために、刺激から24時間後に取り出した。CAR発現測定のために、ウイルス添加から3.5日後に細胞を採取した。Celigoイメージング、上清の10-plexサイトカイン分析及びFACSにより細胞を分析して、成功したCD19CAR形質導入を評価した。
3つの異なるドナーから単離されたT細胞を、96ウェルプレート中の補充培地に接種した。図51A~51Bの構築物1~17を様々な濃度で含む試薬を用いて、T細胞を刺激した。最適な滴定濃度のMiltenyi TransActを陽性対照として用いた。次に、刺激したT細胞を、20%形質導入を目標とするMOIで、CD19CARをコードするベクターを含むレンチウイルスにより処理した。上清は、Meso Scale Discovery (MSD)のために、刺激から24時間後に取り出した。CAR発現測定のために、ウイルス添加から3.5日後に細胞を採取した。Celigoイメージング、上清の10-plexサイトカイン分析及びFACSにより細胞を分析して、成功したCD19CAR形質導入を評価した。
70%を超える細胞生存率が大多数の構築物で見られたが、フォーマット1及び10は、いくつかの条件下で生存率の低下を示した。構築物1~5、7、12、13、15及び16は、3つのドナーの間で平均して、20%を超えるCAR形質導入を示した(図54)。多量体構築物は、釣鐘形の形質導入を示した。CD3のみの構築物、構築物14及び17で刺激したT細胞において、低い形質導入が認められた。第1日のMSDデータを図53に記載する。
実施例18-多重特異性結合分子で製造したCAR T細胞のインビトロ評価
T細胞を、様々な濃度の構築物1、2、3、4、5、7、12、13、15、16又はTransActを含む試薬で活性化し、20%形質導入を目標とするMOIで、CD19CARをコードするベクターを含むレンチウイルスで24時間にわたり形質導入した。細胞を洗浄し、表現型決定した後、凍結した。後にT細胞を解凍し、解凍後の同じ日に回収率及び生存率について評価した。解凍後、T細胞を表現型及びCAR形質導入について分析し、Nalm6 WT及びNalm6 CD19 KOにおけるサイトカインプロファイル及び殺傷アッセイの読出しを取得した。
T細胞を、様々な濃度の構築物1、2、3、4、5、7、12、13、15、16又はTransActを含む試薬で活性化し、20%形質導入を目標とするMOIで、CD19CARをコードするベクターを含むレンチウイルスで24時間にわたり形質導入した。細胞を洗浄し、表現型決定した後、凍結した。後にT細胞を解凍し、解凍後の同じ日に回収率及び生存率について評価した。解凍後、T細胞を表現型及びCAR形質導入について分析し、Nalm6 WT及びNalm6 CD19 KOにおけるサイトカインプロファイル及び殺傷アッセイの読出しを取得した。
一試験では、細胞を洗浄し、細胞の半分をフロー染色のために採取し、細胞の半分を再度播種して3日間インキュベートした。CAR発現のために細胞を第4日に染色した。他の試験では、細胞を後に解凍し、0.6:1~5:1の間のCART細胞:標的細胞比でルシフェラーゼ処理した標的細胞と一緒に24時間平板培養した。図57A~57Bに示す試験のために、2.5:1のCART細胞:標的細胞比を使用した。24時間後、ルシフェラーゼシグナルを標的細胞生存率に代わるものとして測定した。これを、CAR T細胞の効果的な殺傷能力を計算するために使用した。
図55に示すように、F1、F3、F5及びF4(全て、2のリガンド価を有する)は、多量体構築物よりも高い活性を示した。CD-2ターゲティング構築物は、0.1~10μg/mLの濃度で増強された形質導入を示した。図56A~56Dは、得られたCAR T細胞がCD19+細胞の特異的な殺傷を示すことをさらに実証している。図57A~57Bによれば、得られたCAR T細胞は、抗原特異的にサイトカインも分泌する。
実施例19-多重特異性結合分子で製造したCAR T細胞のインビボ評価
2つのドナーからのT細胞を、構築物3及び4又はTransActを含む試薬で活性化し、24時間で20%形質導入を目標として、1のMOIで、CARをコードするベクターを含むレンチウイルスにより形質導入した。細胞を洗浄し、表現型決定し、サイトカイン産生について評価し、凍結した。後にT細胞を解凍し、解凍後の同じ日に回収率及び生存率について評価した。解凍後、T細胞をさらに3日間培養し、CAR形質導入について分析した。
2つのドナーからのT細胞を、構築物3及び4又はTransActを含む試薬で活性化し、24時間で20%形質導入を目標として、1のMOIで、CARをコードするベクターを含むレンチウイルスにより形質導入した。細胞を洗浄し、表現型決定し、サイトカイン産生について評価し、凍結した。後にT細胞を解凍し、解凍後の同じ日に回収率及び生存率について評価した。解凍後、T細胞をさらに3日間培養し、CAR形質導入について分析した。
構築物3、4又はTransActで活性化した一連のCD19ターゲティングCAR T細胞の抗腫瘍活性も、NALM6異種移植片モデルにおいてインビボで評価した。
モデル及びプロトコルの詳細を以下に示す。
細胞株-Nalm6(RRID:CVCL_0092)は、ヒト急性リンパ芽球性白血病(ALL)細胞株である。細胞を懸濁液中の10%ウシ胎児血清含有RPMI培地中で増殖させた。これらの細胞は、静脈内移植されると、マウスにおいて持続及び増殖する。基質ルシフェリンを注射した後のマウスをイメージングすることにより、腫瘍細胞の増殖もモニターすることができるように、細胞を修飾して、ルシフェラーゼを発現させた。
マウス-6週齢のNSG(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)マウスをJackson Laboratoryから受け取った。
プロトコル-Nalm6細胞をマウスに注射した。Nalm6細胞は、CD19を内因的に発現することから、これを使用して、CD19特異的CAR T細胞の有効性をインビボで検証する。
細胞株-Nalm6(RRID:CVCL_0092)は、ヒト急性リンパ芽球性白血病(ALL)細胞株である。細胞を懸濁液中の10%ウシ胎児血清含有RPMI培地中で増殖させた。これらの細胞は、静脈内移植されると、マウスにおいて持続及び増殖する。基質ルシフェリンを注射した後のマウスをイメージングすることにより、腫瘍細胞の増殖もモニターすることができるように、細胞を修飾して、ルシフェラーゼを発現させた。
マウス-6週齢のNSG(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)マウスをJackson Laboratoryから受け取った。
プロトコル-Nalm6細胞をマウスに注射した。Nalm6細胞は、CD19を内因的に発現することから、これを使用して、CD19特異的CAR T細胞の有効性をインビボで検証する。
腫瘍移植後、Nalm6の処置のためにCAR T細胞をマウスに投与した。CARTをマウスに注射した。1群当たり5匹のマウスをPBS単独(PBS)、TransActで処理した非形質導入T細胞、F3若しくはF4 STARTERS又はF3、F4若しくはTransActを用いて作製したCAR T細胞で処置した。全ての細胞は、並行して調製した。
マウスの健康状態を、週2回の体重測定を含めて毎日モニターした。体重の変化率は、(現在BW-初期BW)/(初期BW)×100%として計算した。腫瘍は、マウスをイメージングすることにより週2回モニターした。
図58に示すように、得られたCD19CAR T細胞は、高いインビボ腫瘍負荷を除去することができ、構築物3(F3)及び4(F4)の両方がTransActと同等であった。構築物3(F3)及び4(F4)を用いて作製されたCD19CAR T細胞は、インビボで増殖を経ることも判明した(図59)。
一試験では、凍結保存されたドナー細胞をopTmizer培地に解凍し、平板培養した。ベクター及び刺激試薬を添加し、24時間インキュベートした。細胞を洗浄し、細胞の50%を凍結保存し、25%をフローのために染色し、25%の細胞を再度播種した後、3日間インキュベートした。CAR発現のために細胞を第4日に染色した。細胞の凍結保存された部分を、後に培地中に解凍し、計数した。次に、それらをPBSに再懸濁させ、事前にルシフェラーゼ処理済腫瘍を注射しておいたマウスに注射した。有効性について、末梢血中のルシフェラーゼシグナル及びCART細胞の数を毎週測定した。
図60A~60Dに示すように、構築物F3又はF4を用いて作製したCART細胞は、抗腫瘍活性及びインビボ増殖を示した。
実施例20-Tet2 shRNAを用いて製造したCAR T細胞のインビボ有効性
本明細書に記載される拡大製造又は拡大なし製造プロセスのいずれかを用いて、CAR T細胞を作製する(Tet2 shRNAの導入あり又はなしで)。いくつかの反復処理では、Tet2 shRNAは、CARと同じベクターで提供される。いくつかの反復処理において、Tet2 shRNAは、CARとは異なるベクターで提供される;これらの場合、Tet2 shRNAベクターは、検出可能なタグをさらに含む。いくつかの反復処理において、CARは、CD19、BCMA、CD20、CD22、CLL-1又はEGFRvIII特異的である。続いて、CAR T細胞を凍結する。CAR T細胞を解凍し、TMD8マウスモデルに投与する。マウスを測定し、腫瘍移植後に週に2回計量する。マウスからの血漿サンプルをFACSにより分析する。骨髄、脾臓及び腫瘍をT細胞表現型決定のために収集し、サイトカイン産生を測定する。Tet2 shRNAを用いて製造されたCAR T細胞は、対照と比較して、より優れた抗腫瘍効果及び増殖を有することが判明している。
本明細書に記載される拡大製造又は拡大なし製造プロセスのいずれかを用いて、CAR T細胞を作製する(Tet2 shRNAの導入あり又はなしで)。いくつかの反復処理では、Tet2 shRNAは、CARと同じベクターで提供される。いくつかの反復処理において、Tet2 shRNAは、CARとは異なるベクターで提供される;これらの場合、Tet2 shRNAベクターは、検出可能なタグをさらに含む。いくつかの反復処理において、CARは、CD19、BCMA、CD20、CD22、CLL-1又はEGFRvIII特異的である。続いて、CAR T細胞を凍結する。CAR T細胞を解凍し、TMD8マウスモデルに投与する。マウスを測定し、腫瘍移植後に週に2回計量する。マウスからの血漿サンプルをFACSにより分析する。骨髄、脾臓及び腫瘍をT細胞表現型決定のために収集し、サイトカイン産生を測定する。Tet2 shRNAを用いて製造されたCAR T細胞は、対照と比較して、より優れた抗腫瘍効果及び増殖を有することが判明している。
実施例21-形質導入の増強
本明細書に記載される拡大なし製造プロセスを使用し、形質導入中にベクトフスシン-1、F108又はレンチブースト(lentiboost)をさらに添加して、CART細胞を作製し、様々な濃度及び時点での%形質導入について分析した。F108は、レンチウイルス形質導入を増強することが判明した。追加の試薬F68、F127、硫酸プロタミン及びポリブレンを同じプロセスで試験する。いくつかの反復処理において、形質導入のためのベクターにコードされるCARは、CD19、BCMA、CD20、CD22、CLL-1又はEGFRvIII特異的である。
本明細書に記載される拡大なし製造プロセスを使用し、形質導入中にベクトフスシン-1、F108又はレンチブースト(lentiboost)をさらに添加して、CART細胞を作製し、様々な濃度及び時点での%形質導入について分析した。F108は、レンチウイルス形質導入を増強することが判明した。追加の試薬F68、F127、硫酸プロタミン及びポリブレンを同じプロセスで試験する。いくつかの反復処理において、形質導入のためのベクターにコードされるCARは、CD19、BCMA、CD20、CD22、CLL-1又はEGFRvIII特異的である。
実施例22-第2世代刺激構築物
この実施例は、第2世代刺激構築物の特性決定について説明する。図61Aに示すように、構築物を作製して、異なる共刺激分子(例えば、CD25、IL6Rb、CD27、41BB、ICOS又はCD2)を標的とする結合剤を試験した。さらに、異なる抗CD3結合剤(ANTI-CD3(1)又はANTI-CD3(2)に基づく結合剤)も比較した。全ての第2世代刺激構築物は、図61Bに示す立体配置を有する。本実施例で試験した異なる結合剤の配列は、表27に見出すことができる。
この実施例は、第2世代刺激構築物の特性決定について説明する。図61Aに示すように、構築物を作製して、異なる共刺激分子(例えば、CD25、IL6Rb、CD27、41BB、ICOS又はCD2)を標的とする結合剤を試験した。さらに、異なる抗CD3結合剤(ANTI-CD3(1)又はANTI-CD3(2)に基づく結合剤)も比較した。全ての第2世代刺激構築物は、図61Bに示す立体配置を有する。本実施例で試験した異なる結合剤の配列は、表27に見出すことができる。
一試験では、第2世代構築物を形質導入効率について比較した。TransActを対照として使用した。手短には、凍結保存されたドナー細胞をオプティマイザ(optimizer)培地中に解凍し、平板培養した。ベクター及び刺激試薬を添加し、24時間インキュベートした。細胞を洗浄し、細胞の50%をフロー染色のために採取し、細胞の50%を再度播種した後、3日間インキュベートした。第4日に、CAR発現のために細胞を染色した。
図62に示すように、F5 ICOSは、0.01μg/mLで非常に効果的であり、F5 ICOS濃度を増加するとその形質導入効率が低下した。F5(ANTI-CD3(1)ベースの抗CD3結合剤を有する構築物)は、F5 ANTI-CD3(2)(ANTI-CD3(2)ベースの抗CD3結合剤を有する構築物)よりも強力であった。
実施例23-第3世代刺激構築物
理論に束縛されることは望まないが、FcRへの刺激構築物の結合を低減すれば、T細胞によるFcR発現細胞の不要な殺傷を低減又は防止することができると考えられる。第3世代刺激構築物は、D265A/N297A/P329A置換(KabatによるEU番号付け)(「DANAPA」)を刺激構築物のIgG1 Fc領域に導入することによって作製した。さらに、異なる抗CD3結合剤(ANTI-CD3(1)、ANTI-CD3(2)又はANTI-CD3(3)に基づく結合剤)及び異なる抗CD28結合剤(ANTI-CD28(1)又はANTI-CD28(2)に基づく結合剤)も比較した(図63A)。第3世代刺激構築物は全て、図63Bに示す立体配置を有する。本実施例で試験した様々な結合剤の配列は表27に見出すことができる。
理論に束縛されることは望まないが、FcRへの刺激構築物の結合を低減すれば、T細胞によるFcR発現細胞の不要な殺傷を低減又は防止することができると考えられる。第3世代刺激構築物は、D265A/N297A/P329A置換(KabatによるEU番号付け)(「DANAPA」)を刺激構築物のIgG1 Fc領域に導入することによって作製した。さらに、異なる抗CD3結合剤(ANTI-CD3(1)、ANTI-CD3(2)又はANTI-CD3(3)に基づく結合剤)及び異なる抗CD28結合剤(ANTI-CD28(1)又はANTI-CD28(2)に基づく結合剤)も比較した(図63A)。第3世代刺激構築物は全て、図63Bに示す立体配置を有する。本実施例で試験した様々な結合剤の配列は表27に見出すことができる。
一試験では、第3世代の構築物を形質導入効率について比較した。手短には、凍結保存されたドナー細胞をopTmizer培地中に解凍し、平板培養した。ベクター及び刺激試薬を添加し、24時間インキュベートした。細胞を洗浄し、細胞の50%をフロー染色のために採取し、細胞の50%を再度播種した後、3日間インキュベートした。第4日に、CAR発現のために細胞を染色した。
図64に示すように、試験した抗CD3/CD28又は抗CD3/CD2構築物は全て、CAR形質導入を促進した。
別の試験では、第3世代構築物を特異的殺傷と非特異的殺傷について比較した。手短には、凍結保存されたドナー細胞をopTmizer培地中に解凍し、平板培養した。ベクター及び刺激試薬を添加し、24時間インキュベートした。細胞を洗浄し、細胞の50%を凍結保存し、細胞の25%をフローサイトメトリーのために染色し、25%の細胞を再度播種した後、3日間インキュベートした。第4日にCAR発現のために細胞を染色した。その後、凍結保存細胞を解凍し、0.6:1~5:1、例えば1:5のCART細胞:腫瘍細胞比で、ルシフェラーゼ処理標的腫瘍細胞及び非標的腫瘍細胞と一緒に24時間平板培養した。24時間後、ルシフェラーゼシグナルを、標的細胞生存率に代わるものとして測定した。これを用いて、CAR T細胞の特異的及び非特異的殺傷能力を計算した。
F3及びF4のサイレンシングされたフォーマット(Fc領域にDANAPA置換を有するF3及びF4)である、NEG2042及びNEG2043は、標的細胞の同等の殺傷を示した(図65A)が、非標的細胞の非特異的殺傷を示さなかった(図65B)。対照的に、野生型Fc領域を有するF3及びF4は、FcγR発現細胞の非特異的な殺傷を示した(図65B)。
別の試験では、第3世代構築物NEG2043を用いて、2つのCARを発現する細胞を作製した。第1の試験では、凍結保存されたドナーT細胞をOpTmizer培地中に解凍し、刺激試薬及び2つのベクター(即ちCD19ターゲティングCARをコードする第1ベクター及びBCMAターゲティングCARをコードする第2ベクター)と一緒に24時間共培養した。24時間後、細胞を洗浄し;細胞の50%をフローサイトメトリーのために染色し、細胞の50%を再度播種した後、さらに3日間インキュベートした。第4日に、細胞をCAR発現のために染色した。第2の試験では、凍結保存されたドナー白血球アフェレーシスを、解凍、洗浄した後、CliniMACS Prodigyを用いてT細胞について富化させた。富化した細胞をOpTmizer培地中に溶出した。富化した細胞を、刺激試薬並びにCD19ターゲティングCAR及びCD22ターゲティングCARの両方をコードするベクターと一緒に24時間共培養した。24時間後、細胞を洗浄し;細胞の50%をフローサイトメトリーのために染色し、細胞の50%を再度播種した後、さらに3~6日間インキュベートした。第4日及び第7日に、細胞をCAR発現について染色した。
T細胞を、(1)2つのCARコードベクターと一緒に共形質導入したとき、又は(2)2つのCARをコードする単一のベクターで形質導入したとき、F4及びF4のサイレンシングされたフォーマット(NEG2043)は、一方又は両方のCARを発現することができた。図66Aは、CD19ターゲティングCARをコードする第1のベクターと、BCMAターゲティングCARをコードする第2のベクターとの共形質導入を示す。図66Bは、CD19ターゲティングCAR及びCD22ターゲティングCARの両方をコードする単一のベクターの形質導入を示す。
均等物
本明細書に引用するそれぞれの及び全ての特許、特許出願及び刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に援用される。本発明は、特定の実施形態を参照して開示しているが、本発明のさらなる実施形態及び変形形態は、本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく他の当業者によって考案され得ることが明らかである。下記の特許請求の範囲は、全てのこのような実施形態及び均等な変形形態を含むと解釈されることを意図する。
本明細書に引用するそれぞれの及び全ての特許、特許出願及び刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に援用される。本発明は、特定の実施形態を参照して開示しているが、本発明のさらなる実施形態及び変形形態は、本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく他の当業者によって考案され得ることが明らかである。下記の特許請求の範囲は、全てのこのような実施形態及び均等な変形形態を含むと解釈されることを意図する。
Claims (77)
- キメラ抗原受容体(CAR)を発現する細胞(例えば、T細胞)の集団を作製する方法であって、
(i)細胞(例えば、T細胞、例えば凍結された又は新鮮な白血球アフェレーシス産物から単離されたT細胞)の集団を、(A)抗CD3結合ドメイン、及び(B)共刺激分子結合ドメイン(例えば、抗CD2結合ドメイン又は抗CD28結合ドメイン)を含む多重特異性結合分子と接触させる(例えば、結合させる)ステップ;
(ii)前記細胞(例えば、T細胞)の集団を、前記CARをコードする核酸分子(例えば、DNA又はRNA分子)と接触させ、それにより前記核酸分子を含む細胞(例えば、T細胞)の集団を提供するステップ、及び
(iii)保存(例えば、凍結保存培地中で前記細胞の集団を再製剤化すること)又は投与のために前記細胞(例えば、T細胞)の集団を採取するステップ
を含み、
(a)ステップ(ii)は、ステップ(i)と一緒に、又はステップ(i)の開始後の20時間以内、例えばステップ(i)の開始後の12、13、14、15、16、17若しくは18時間以内、例えばステップ(i)の開始後の18時間以内に実施され、及び
ステップ(iii)は、ステップ(i)の開始後の30(例えば、26)時間以内、例えばステップ(i)の開始後の22、23、24、25、26、27、28、29又は30時間以内、例えばステップ(i)の開始後の24時間以内に実施されるか、
(b)ステップ(ii)は、ステップ(i)と一緒に、又はステップ(i)の開始後の20時間以内、例えばステップ(i)の開始後の12、13、14、15、16、17若しくは18時間以内、例えばステップ(i)の開始後の18時間以内に実施され、及び
ステップ(iii)は、ステップ(ii)の開始後の30時間以内、例えばステップ(ii)の開始後の22、23、24、25、26、27、28、29又は30時間以内に実施されるか、又は
(c)ステップ(iii)からの前記細胞の集団は、例えば、ステップ(i)の開始時の前記細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて増殖されないか、又は5、10、15、20、25、30、35若しくは40%以下、例えば10%以下だけ増殖され、
任意選択で、ステップ(ii)における前記核酸分子は、ウイルスベクター上にあり、任意選択で、ステップ(ii)における前記核酸分子は、ウイルスベクター上のRNA分子であり、任意選択で、ステップ(ii)は、前記CARをコードする核酸分子を含むウイルスベクターで前記細胞(例えば、T細胞)の集団を形質導入することを含む、方法。 - (i)前記抗CD3結合ドメイン、例えば抗CD3scFvは、前記共刺激分子結合ドメイン、例えば抗CD2Fab若しくは抗CD28FabのN末端に位置するか;又は
(ii)前記抗CD3結合ドメイン、例えば抗CD3scFvは、前記共刺激分子結合ドメイン、例えば抗CD2Fab若しくは抗CD28FabのC末端に位置し、任意選択で、
Fc領域は、前記抗CD3結合ドメインと前記共刺激分子結合ドメインとの間に位置するか;又は
前記多重特異性結合分子は、CH2を含み、及び前記抗CD3結合ドメインは、前記CH2のN末端に位置する、請求項1に記載の方法。 - 前記多重特異性結合分子は、
(i)N末端からC末端に、前記抗CD3結合ドメインのVH、前記抗CD3結合ドメインのVL、前記共刺激分子結合ドメインのVH、CH1、CH2及びCH3を含む第1のポリペプチドと;
(ii)N末端からC末端に、前記共刺激分子結合ドメインのVL及びCLを含む第2のポリペプチドと
を含む、請求項1又は2に記載の方法。 - 前記多重特異性結合分子は、
(i)N末端からC末端に、前記共刺激分子結合ドメインのVH、CH1、CH2、CH3、前記抗CD3結合ドメインのVH及び前記抗CD3結合ドメインのVLを含む第1のポリペプチドと;
(ii)N末端からC末端に、前記共刺激分子結合ドメインのVL及びCLを含む第2のポリペプチドと
を含む、請求項1又は2に記載の方法。 - 前記多重特異性結合分子は、
(i)N末端からC末端に、前記共刺激分子結合ドメインのVH、CH1、前記抗CD3結合ドメインのVH、前記抗CD3結合ドメインのVL、CH2及びCH3を含む第1のポリペプチドと;
(ii)N末端からC末端に、前記共刺激分子結合ドメインのVL及びCLを含む第2のポリペプチドと
を含む、請求項1又は2に記載の方法。 - 前記抗CD3結合ドメインは、scFvを含み、及び前記共刺激分子結合ドメインは、Fabフラグメントの一部である、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗CD3結合ドメインは、
(i)表27の抗CD3抗体分子(例えば、抗CD3(1)、抗CD3(2)、抗CD3(3)又は抗CD3(4))の重鎖相補性決定領域1(HCDR1)、HCDR2及びHCDR3を含む可変重鎖領域(VH)並びに軽鎖相補性決定領域1(LCDR1)、LCDR2及びLCDR3を含む軽鎖可変領域(VL);及び/又は
(ii)表27に提供される抗CD3抗体分子(例えば、抗CD3(1)、抗CD3(2)、抗CD3(3)又は抗CD3(4))のいずれかのVH及び/若しくはVL領域のアミノ酸配列又はそれと少なくとも95%同一のアミノ酸配列
を含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。 - 前記共刺激分子結合ドメインは、抗CD2結合ドメインであり、任意選択で、前記抗CD2結合ドメインは、
(i)表27の抗CD2抗体分子(例えば、抗CD2(1))のHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含むVH並びにLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含むVL;及び/又は
(ii)表27に提供される抗CD2抗体分子(例えば、抗CD2(1))のいずれかのVH及び/若しくはVL領域のアミノ酸配列又はそれと少なくとも95%同一のアミノ酸配列
を含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。 - 前記共刺激分子結合ドメインは、抗CD28結合ドメインであり、任意選択で、前記抗CD28結合ドメインは、
(i)表27の抗CD28抗体分子(例えば、抗CD28(1)又は抗CD28(2))のHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含むVH並びにLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含むVL;及び/又は
(ii)表27に提供される抗CD28抗体分子(例えば、抗CD28(1)又は抗CD28(2))のいずれかのVH及び/若しくはVL領域のアミノ酸配列又はそれと少なくとも95%同一のアミノ酸配列
を含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。 - 前記抗CD3結合ドメインは、
(i)scFv;
(ii)ペプチドリンカー、例えばグリシン-セリンリンカー、例えば(G4S)4リンカーによってVLに連結されたVH;又は
(iii)VH及びVLであって、前記VHは、前記VLのN末端である、VH及びVL
を含む、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。 - 前記共刺激分子結合ドメインは、Fabフラグメントの一部、例えばFcドメインを含むポリペプチド配列の一部であるFabフラグメントであり、任意選択で、前記Fcドメインは、表28に提供されるアミノ酸配列又は表28に提供されるFcドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含む、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗CD3結合ドメインは、前記共刺激分子結合ドメインのN末端に位置し、任意選択で、前記抗CD3結合ドメインは、ペプチドリンカー、例えばグリシン-セリンリンカー、例えば(G4S)4リンカーによって前記共刺激分子結合ドメインに連結されている、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗CD3結合ドメインは、前記共刺激分子結合ドメインのC末端に位置する、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。
- (i)Fc領域は、前記抗CD3結合ドメインと前記共刺激分子結合ドメインとの間に位置し;及び/又は
(ii)前記多重特異性結合分子は、CH2及びCH3の一方又は両方を含み、任意選択で、前記抗CD3結合ドメインは、ペプチドリンカー、例えばグリシン-セリンリンカー、例えば(G4S)4リンカーによって前記CH3に連結されている、請求項13に記載の方法。 - (i)前記多重特異性結合分子は、CH2を含み、及び前記抗CD3結合ドメインは、前記CH2のN末端に位置し;
(ii)前記抗CD3結合ドメインは、ペプチドリンカー、例えばグリシン-セリンリンカー、例えば(G4S)2リンカーによってCH1に連結されており;及び/又は
(iii)前記抗CD3結合ドメインは、ペプチドリンカー、例えばグリシン-セリンリンカー、例えば(G4S)4リンカーによってCH2に連結されている、請求項13に記載の方法。 - 前記多重特異性結合分子は、
(i)表28に提供されるいずれかの重鎖のアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列;及び/又は
(ii)表28に提供されるいずれかの軽鎖のアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項1~15のいずれか一項に記載の方法。 - ステップ(i)は、ステップ(iii)からの前記細胞の集団中のCAR発現細胞のパーセンテージを増加させ、例えば、ステップ(iii)からの前記細胞の集団は、ステップ(i)なしである以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、CAR発現細胞のより高いパーセンテージ(例えば、少なくとも10、20、30、40、50又は60%高い)を示す、請求項1~16のいずれか一項に記載の方法。
- (a)ステップ(iii)からの前記細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージは、ステップ(i)の開始時の前記細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+細胞のパーセンテージと同じであるか又は5若しくは10%以下だけ異なるか;
(b)ステップ(iii)からの前記細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージは、例えば、ステップ(i)の開始時の前記細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+細胞のパーセンテージと比べて少なくとも1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8又は3倍だけ増加されるか;
(c)前記細胞の集団中のCAR発現ナイーブT細胞、例えばCAR発現CD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージは、ステップ(ii)の期間中に増加し、例えばステップ(ii)の開始後の18~24時間で少なくとも30、35、40、45、50、55又は60%だけ増加するか;又は
(d)ステップ(iii)からの前記細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージは、ステップ(i)の開始時の前記細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+細胞のパーセンテージと比べて減少しないか又は5若しくは10%以下だけ減少する、請求項1~17のいずれか一項に記載の方法。 - (a)ステップ(iii)からの前記細胞の集団は、ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、ナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のより高いパーセンテージ(例えば、少なくとも10、20、30又は40%高い)を示すか;
(b)ステップ(iii)からの前記細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージは、ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージより高い(例えば、少なくとも1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8又は3倍高い)か;
(c)ステップ(iii)からの前記細胞の集団中のCAR発現ナイーブT細胞、例えばCAR発現CD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージは、ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞中のCAR発現ナイーブT細胞、例えばCAR発現CD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージより高い(例えば、少なくとも4、6、8、10又は12倍高い)か;
(d)ステップ(iii)からの前記細胞の集団は、ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に前記細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、ナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のより高いパーセンテージ(例えば、少なくとも10、20、30又は40%高い)を示すか;
(e)ステップ(iii)からの前記細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージは、ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に前記細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞中のナイーブ細胞、例えばナイーブT細胞、例えばCD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージより高い(例えば、少なくとも1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8又は3倍高い)か;又は
(f)ステップ(iii)からの前記細胞の集団中のCAR発現ナイーブT細胞、例えばCAR発現CD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージは、ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に前記細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞中のCAR発現ナイーブT細胞、例えばCAR発現CD45RA+CD45RO-CCR7+T細胞のパーセンテージより高い(例えば、少なくとも4、6、8、10又は12倍高い)、請求項1~18のいずれか一項に記載の方法。 - (a)ステップ(iii)からの前記細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCD95+セントラルメモリーT細胞のパーセンテージは、ステップ(i)の開始時の前記細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCD95+セントラルメモリーT細胞のパーセンテージと同じであるか又は5若しくは10%以下だけ異なるか;
(b)ステップ(iii)からの前記細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージは、ステップ(i)の開始時の前記細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージと比べて少なくとも20、25、30、35、40、45又は50%だけ低下されるか;
(c)CAR発現セントラルメモリーT細胞、例えばCAR発現CCR7+CD45RO+細胞のパーセンテージは、ステップ(ii)の期間中に減少し、例えばステップ(ii)の開始後の18~24時間で少なくとも8、10、12、14、16又は20%だけ減少するか;又は
(d)ステップ(iii)からの前記細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージは、ステップ(i)の開始時の前記細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージと比べて増加しないか又は5若しくは10%以下だけ増加する、請求項1~19のいずれか一項に記載の方法。 - (a)ステップ(iii)からの前記細胞の集団は、ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、セントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCD95+セントラルメモリーT細胞のより低いパーセンテージ(例えば、少なくとも10、20、30又は40%低い)を示すか;
(b)ステップ(iii)からの前記細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージは、ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージより低い(例えば、少なくとも20、30、40又は50%低い)か;
(c)ステップ(iii)からの前記細胞の集団中のCAR発現セントラルメモリーT細胞、例えばCAR発現CCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージは、ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞中のCAR発現セントラルメモリーT細胞、例えばCAR発現CCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージより低い(例えば、少なくとも10、20、30又は40%低い)か;
(d)ステップ(iii)からの前記細胞の集団は、ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に前記細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、セントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCD95+セントラルメモリーT細胞のより低いパーセンテージ(例えば、少なくとも10、20、30又は40%低い)を示すか;
(e)ステップ(iii)からの前記細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージは、ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に前記細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、例えばCCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージより低い(例えば、少なくとも20、30、40又は50%低い)か;又は
(f)ステップ(iii)からの前記細胞の集団中のCAR発現セントラルメモリーT細胞、例えばCAR発現CCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージは、ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に前記細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞中のCAR発現セントラルメモリーT細胞、例えばCAR発現CCR7+CD45RO+T細胞のパーセンテージより低い(例えば、少なくとも10、20、30又は40%低い)、請求項1~20のいずれか一項に記載の方法。 - (a)ステップ(iii)からの前記細胞の集団中のステムメモリーT細胞、例えばCD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージは、ステップ(i)の開始時の前記細胞の集団中のステムメモリーT細胞、例えばCD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージと比べて増加されるか;
(b)ステップ(iii)からの前記細胞の集団中のCAR発現ステムメモリーT細胞、例えばCAR発現CD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージは、ステップ(i)の開始時の前記細胞の集団中のCAR発現ステムメモリーT細胞、例えばCAR発現CD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージと比べて増加されるか;
(c)ステップ(iii)からの前記細胞の集団中のステムメモリーT細胞、例えばCD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージは、ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞中のステムメモリーT細胞、例えばCD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージより高いか;又は
(d)ステップ(iii)からの前記細胞の集団中のCAR発現ステムメモリーT細胞、例えばCAR発現CD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージは、ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞中のCAR発現ステムメモリーT細胞、例えばCAR発現CD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージより高いか;
(e)ステップ(iii)からの前記細胞の集団中のステムメモリーT細胞、例えばCD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージは、ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に前記細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞中のステムメモリーT細胞、例えばCD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージより高いか;又は
(f)ステップ(iii)からの前記細胞の集団中のCAR発現ステムメモリーT細胞、例えばCAR発現CD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージは、ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に前記細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞中のCAR発現ステムメモリーT細胞、例えばCAR発現CD45RA+CD95+IL-2受容体β+CCR7+CD62L+T細胞のパーセンテージより高い、請求項1~21のいずれか一項に記載の方法。 - (a)ステップ(iii)からの前記細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up TEM vs.Down TSCM)は、ステップ(i)の開始時の前記細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up TEM vs.Down TSCM)とほぼ同じであるか又は約25、50、75、100若しくは125%以下だけ異なる(例えば、それ以下だけ増加される)か;
(b)ステップ(iii)からの前記細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up TEM vs.Down TSCM)は、
ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞、又は
ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に前記細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞
のGeneSetScore中央値(Up TEM vs.Down TSCM)より低い(例えば、少なくとも約100、150、200、250又は300%低い)か;
(c)ステップ(iii)からの前記細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up Treg vs.Down Teff)は、ステップ(i)の開始時の前記細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up Treg vs.Down Teff)とほぼ同じであるか又は約25、50、100、150若しくは200%以下だけ異なる(例えば、それ以下だけ増加される)か;
(d)ステップ(iii)からの前記細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up Treg vs.Down Teff)は、
ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞、又は
ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に前記細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞
のGeneSetScore中央値(Up Treg vs.Down Teff)より低い(例えば、少なくとも約50、100、125、150又は175%低い)か;
(e)ステップ(iii)からの前記細胞の集団のGeneSetScore中央値(Down stemness)は、ステップ(i)の開始時の前記細胞の集団のGeneSetScore中央値(Down stemness)とほぼ同じであるか又は約25、50、100、150、200若しくは250%以下だけ異なる(例えば、それ以下だけ増加される)か;
(f)ステップ(iii)からの前記細胞の集団のGeneSetScore中央値(Down stemness)は、
ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞、又は
ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に前記細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞
のGeneSetScore中央値(Down stemness)より低い(例えば、少なくとも約50、100又は125%低い)か;
(g)ステップ(iii)からの前記細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up hypoxia)は、ステップ(i)の開始時の前記細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up hypoxia)とほぼ同じであるか又は約125、150、175若しくは200%以下だけ異なる(例えば、それ以下だけ増加される)か;
(h)ステップ(iii)からの前記細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up hypoxia)は、
ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞、又は
ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に前記細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞
のGeneSetScore中央値(Up hypoxia)より低い(例えば、少なくとも約40、50、60、70又は80%低い)か;
(j)ステップ(iii)からの前記細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up autophagy)は、ステップ(i)の開始時の前記細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up autophagy)とほぼ同じであるか又は約180、190、200若しくは210%以下だけ異なる(例えば、それ以下だけ増加される)か;又は
(k)ステップ(iii)からの前記細胞の集団のGeneSetScore中央値(Up autophagy)は、
ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11又は12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞、又は
ステップ(ii)後且つステップ(iii)前に前記細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8又は9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞
のGeneSetScore中央値(Up autophagy)より低い(例えば、少なくとも約20、30又は40%低い)、請求項1~22のいずれか一項に記載の方法。 - ステップ(iii)からの前記細胞の集団は、前記CARによって認識される抗原を発現する細胞と一緒にインキュベートされた後、例えば図29C~29Dに関して実施例8に記載される方法を用いて評価されるように、ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11若しくは12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞又はステップ(ii)後且つステップ(iii)前に前記細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8若しくは9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞よりも高いレベル(例えば、少なくとも2、4、6、8、10、12又は14倍高い)でIL-2を分泌する、請求項1~23のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(iii)からの前記細胞の集団は、インビボで投与された後、ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11若しくは12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞と比べて、又はステップ(ii)後且つステップ(iii)前に前記細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8若しくは9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞と比べてより長く持続するか又はより高いレベルで増殖する(例えば、図4Cに関して実施例1に記載される方法を用いて評価されるように)、請求項1~24のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(iii)からの前記細胞の集団は、インビボで投与された後、ステップ(iii)が、ステップ(i)の開始後、26時間を超えて、例えばステップ(i)の開始後、5、6、7、8、9、10、11若しくは12日を超えてから実施される以外には同様の方法によって作製された細胞又はステップ(ii)後且つステップ(iii)前に前記細胞(例えば、T細胞)の集団をインビトロで3日超、例えば5、6、7、8若しくは9日にわたって増殖させるステップをさらに含む以外には同様の方法によって作製された細胞よりも強力な抗腫瘍活性(例えば、低用量、例えば0.15×106、0.2×106、0.25×106又は0.3×106個の生存CAR発現細胞でより強力な抗腫瘍活性)を示す、請求項1~25のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(iii)からの前記細胞の集団は、ステップ(i)の開始時の前記細胞の集団と比べて、例えば生存細胞の数によって評価されて増殖されないか、又は5、10、15、20、25、30、35若しくは40%以下だけ増殖され、任意選択で、ステップ(iii)からの前記細胞の集団中の生存細胞の数は、ステップ(i)の開始時の前記細胞の集団中の生存細胞の数から減少する、請求項1~26のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(iii)からの前記細胞の集団は、ステップ(i)の開始時の前記細胞の集団と比べて増殖されないか、又は2時間未満、例えば1若しくは1.5時間未満だけ増殖される、請求項1~27のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(i)及び/又は(ii)は、IL-2、IL-15(例えば、hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、IL-7、IL-21、IL-6(例えば、IL-6/sIL-6Ra)、LSD1阻害剤、MALT1阻害剤又はそれらの組み合わせを含む細胞培地(例えば、無血清培地)中で実施される、請求項1~28のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(i)及び/又は(ii)は、血清代替品を含む無血清細胞培地中で実施される、請求項1~29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記血清代替品は、CTS(商標)Immune Cell Serum Replacement(ICSR)である、請求項30に記載の方法。
- ステップ(i)前に、
(iv)(任意選択で)実体、例えば研究室、病院又は医療提供者から新鮮な白血球アフェレーシス産物(或いは新鮮な全血液産物、新鮮な骨髄産物又は新鮮な腫瘍若しくは臓器生検若しくは切除(例えば、胸腺除去からの新鮮な産物)などの造血組織の代替供給源)を受け取るステップ、及び
(v)新鮮な白血球アフェレーシス産物(或いは新鮮な全血液産物、新鮮な骨髄産物又は新鮮な腫瘍若しくは臓器生検若しくは切除(例えば、胸腺除去からの新鮮な産物)などの造血組織の代替供給源)から、ステップ(i)で接触された前記細胞(例えば、T細胞、例えばCD8+及び/又はCD4+T細胞)の集団を単離するステップ
をさらに含み、任意選択で、
ステップ(iii)は、ステップ(v)の開始後の35時間以内、例えばステップ(v)の開始後の27、28、29、30、31、32、33、34又は35時間以内、例えばステップ(v)の開始後の30時間以内に実施されるか、又は
ステップ(iii)からの前記細胞の集団は、ステップ(v)の終了時の前記細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて増殖されないか、又は5、10、15、20、25、30、35若しくは40%以下、例えば10%以下だけ増殖される、請求項1~31のいずれか一項に記載の方法。 - ステップ(i)前に、実体、例えば研究室、病院又は医療提供者から、白血球アフェレーシス産物(或いは全血液、骨髄又は腫瘍若しくは臓器生検若しくは切除(例えば、胸腺除去)から単離された凍結保存T細胞などの造血組織の代替供給源)から単離された凍結保存T細胞を受け取るステップをさらに含む、請求項1~31のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(i)前に、
(iv)(任意選択で)実体、例えば研究室、病院又は医療提供者から凍結保存白血球アフェレーシス産物(或いは凍結保存全血液産物、凍結保存骨髄産物又は凍結保存腫瘍若しくは臓器生検若しくは切除(例えば、胸腺除去からの凍結保存産物)などの造血組織の代替供給源)を受け取るステップ、及び
(v)凍結保存白血球アフェレーシス産物(或いは凍結保存全血液産物、凍結保存骨髄産物又は凍結保存腫瘍若しくは臓器生検若しくは切除(例えば、胸腺除去からの凍結保存産物)などの造血組織の代替供給源)から、ステップ(i)で接触された前記細胞(例えば、T細胞、例えばCD8+及び/又はCD4+T細胞)の集団を単離するステップ
をさらに含み、任意選択で、
ステップ(iii)は、ステップ(v)の開始後の35時間以内、例えばステップ(v)の開始後の27、28、29、30、31、32、33、34又は35時間以内、例えばステップ(v)の開始後の30時間以内に実施されるか、又は
ステップ(iii)からの前記細胞の集団は、ステップ(v)の終了時の前記細胞の集団と比べて、生存細胞の数によって評価されて増殖されないか、又は5、10、15、20、25、30、35若しくは40%以下、例えば10%以下だけ増殖される、請求項1~31のいずれか一項に記載の方法。 - ステップ(vi):ステップ(iii)からの前記細胞の集団の一部を少なくとも2、2.5、3、3.5、4、4.5、5.5.6、6.5又は7日、例えば少なくとも2日且つ7日以下にわたって培養し、及び前記一部中のCAR発現レベルを測定する(例えば、前記一部中の生存CAR発現細胞のパーセンテージを測定する)ステップ
をさらに含み、任意選択で、
ステップ(iii)は、前記細胞(例えば、T細胞)の集団を採取及び凍結することを含み、且つステップ(vi)は、ステップ(iii)からの前記細胞の集団の一部を解凍し、前記部分を少なくとも2、2.5、3、3.5、4、4.5、5.5、6、6.5又は7日、例えば少なくとも2日且つ7日以下にわたって培養し、及び前記一部中のCAR発現レベルを測定する(例えば、前記一部中の生存CAR発現細胞のパーセンテージを測定する)ことを含む、請求項1~34のいずれか一項に記載の方法。 - ステップ(ii)は、形質導入中にF108を添加すること及び/又は前記細胞(例えば、T細胞)の集団を、Tet2を標的とするshRNAと接触させることをさらに含む、請求項1~35のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(i)又はステップ(1)の開始時の前記細胞の集団は、IL6R発現細胞(例えば、IL6Rα及び/又はIL6Rβについて陽性の細胞)について濃縮されている、請求項1~36のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(i)又はステップ(1)の開始時の前記細胞の集団は、50、60又は70%以上のIL6R発現細胞(例えば、IL6Rα及び/又はIL6Rβについて陽性の細胞)を含む、請求項1~37のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(i)及び(ii)又はステップ(1)及び(2)は、IL-15(例えば、hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))を含む細胞培地中で実施される、請求項1~38のいずれか一項に記載の方法。
- IL-15は、前記細胞の集団が例えば10、15、20又は25日後に増殖する能力を増加させる、請求項39に記載の方法。
- IL-15は、前記細胞の集団中のIL6Rβ発現細胞のパーセンテージを増加させる、請求項39に記載の方法。
- 前記CARは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項1~41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗原結合ドメインは、CD19、CD20、CD22、BCMA、メソテリン、EGFRvIII、GD2、Tn抗原、sTn抗原、Tn-O-グリコペプチド、sTn-O-グリコペプチド、PSMA、CD97、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、レグマン、GD3、CD171、IL-11Ra、PSCA、MAD-CT-1、MAD-CT-2、VEGFR2、ルイスY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、葉酸受容体α、ERBB(例えば、ERBB2)、Her2/neu、MUC1、EGFR、NCAM、エフリンB2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、o-アセチル-GD2、葉酸受容体β、TEM1/CD248、TEM7R、FAP、レグマイン、HPV E6若しくはE7、ML-IAP、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、ポリシアル酸、Fos関連抗原、好中球エラスターゼ、TRP-2、CYP1B1、精子タンパク質17、βヒト絨毛性ゴナドトロピン、AFP、チログロブリン、PLAC1、グロボH、RAGE1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、腸カルボキシエステラーゼ、mut hsp 70-2、NA-17、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、NY-ESO-1、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP、GFRα4又はMHCに提示される前記抗原のいずれかのペプチドから選択される抗原に結合する、請求項42に記載の方法。
- 前記抗原結合ドメインは、本明細書に開示されるCDR、VH、VL、scFv又はCAR配列を含み、任意選択で、
(a)前記抗原結合ドメインは、BCMAに結合し、且つ表3~15に開示されるCDR、VH、VL、scFv若しくはCAR配列又はそれと少なくとも80%、85%、90%、95%若しくは99%の同一性を有する配列を含むか;
(b)前記抗原結合ドメインは、CD19に結合し、且つ表2に開示されるCDR、VH、VL、scFv若しくはCAR配列又はそれと少なくとも80%、85%、90%、95%若しくは99%の同一性を有する配列を含むか;
(c)前記抗原結合ドメインは、CD20に結合し、且つ本明細書に開示されるCDR、VH、VL、scFv若しくはCAR配列又はそれと少なくとも80%、85%、90%、95%若しくは99%の同一性を有する配列を含むか;又は
(d)前記抗原結合ドメインは、CD22に結合し、且つ本明細書に開示されるCDR、VH、VL、scFv若しくはCAR配列又はそれと少なくとも80%、85%、90%、95%若しくは99%の同一性を有する配列を含む、請求項42又は43に記載の方法。 - 前記抗原結合ドメインは、VH及びVLを含み、前記VH及びVLは、リンカーによって連結され、任意選択で、前記リンカーは、配列番号63又は104のアミノ酸配列を含む、請求項42~44のいずれか一項に記載の方法。
- (a)前記膜貫通ドメインは、T細胞受容体のα、β又はζ鎖、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及びCD154から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含むか、
(b)前記膜貫通ドメインは、CD8の膜貫通ドメインを含むか、
(c)前記膜貫通ドメインは、配列番号6のアミノ酸配列又はそれと少なくとも約85%、90%、95%若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は
(d)前記核酸分子は、前記膜貫通ドメインをコードする核酸配列を含み、前記核酸配列は、配列番号17の核酸配列又はそれと少なくとも約85%、90%、95%若しくは99%の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項42~45のいずれか一項に記載の方法。 - 前記抗原結合ドメインは、ヒンジ領域によって前記膜貫通ドメインに連結され、任意選択で、
(a)前記ヒンジ領域は、配列番号2、3若しくは4のアミノ酸配列又はそれと少なくとも約85%、90%、95%若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は
(b)前記核酸分子は、前記ヒンジ領域をコードする核酸配列を含み、前記核酸配列は、配列番号13、14若しくは15の核酸配列又はそれと少なくとも約85%、90%、95%若しくは99%の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項42~46のいずれか一項に記載の方法。 - 前記細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインを含み、任意選択で、前記一次シグナル伝達ドメインは、CD3ζ、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(ICOS)、FcεRI、DAP10、DAP12又はCD66dに由来する機能性シグナル伝達ドメインを含み、任意選択で、
(a)前記一次シグナル伝達ドメインは、CD3ζに由来する機能性シグナル伝達ドメインを含むか、
(b)前記一次シグナル伝達ドメインは、配列番号9若しくは10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも約85%、90%、95%若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は
(c)前記核酸分子は、前記一次シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列を含み、前記核酸配列は、配列番号20若しくは21の核酸配列又はそれと少なくとも約85%、90%、95%若しくは99%の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項42~47のいずれか一項に記載の方法。 - 前記細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含み、任意選択で、前記共刺激シグナル伝達ドメインは、MHCクラスI分子、TNF受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子(SLAMタンパク質)、活性化NK細胞受容体、BTLA、Tollリガンド受容体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、4-1BB(CD137)、B7-H3、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD28-OX40、CD28-4-1BB又はCD83と特異的に結合するリガンドを含み、任意選択で、
(a)前記共刺激シグナル伝達ドメインは、4-1BBに由来する機能性シグナル伝達ドメインを含むか、
(b)前記共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号7のアミノ酸配列又はそれと少なくとも約85%、90%、95%若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は
(c)前記核酸分子は、前記共刺激シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列を含み、前記核酸配列は、配列番号18の核酸配列又はそれと少なくとも約85%、90%、95%若しくは99%の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項42~48のいずれか一項に記載の方法。 - 前記細胞内シグナル伝達ドメインは、4-1BBに由来する機能性シグナル伝達ドメインと、CD3ζに由来する機能性シグナル伝達ドメインとを含み、任意選択で、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号7のアミノ酸配列(又はそれと少なくとも約85%、90%、95%若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列)と、配列番号9若しくは10のアミノ酸配列(又はそれと少なくとも約85%、90%、95%若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列)とを含み、任意選択で、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号7のアミノ酸配列と、配列番号9又は10のアミノ酸配列とを含む、請求項42~49のいずれか一項に記載の方法。
- 前記CARは、配列番号1のアミノ酸配列を含むリーダー配列をさらに含む、請求項42~50のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1~51のいずれか一項に記載の方法によって作製されるCAR発現細胞(例えば、自家又は同種異系CAR発現T細胞又はNK細胞)の集団。
- 請求項52に記載のCAR発現細胞の集団と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
- 対象の免疫応答を増加させる方法であって、請求項52に記載のCAR発現細胞の集団又は請求項53に記載の医薬組成物を前記対象に投与し、それにより前記対象の免疫応答を増加させるステップを含む方法。
- 対象の癌を処置する方法であって、請求項52に記載のCAR発現細胞の集団又は請求項53に記載の医薬組成物を前記対象に投与し、それにより前記対象の前記癌を処置するステップを含む方法。
- 前記癌は、例えば、中皮腫、悪性胸膜中皮腫、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、扁平上皮癌、大細胞肺癌、膵臓癌、膵管腺癌、食道腺癌、乳癌、膠芽腫、卵巣癌、大腸癌、前立腺癌、子宮頸癌、皮膚癌、黒色腫、腎癌、肝臓癌、脳腫瘍、胸腺腫、肉腫、癌腫、子宮癌、腎臓癌、消化管癌、尿路上皮癌、咽頭癌、頭部及び頸部癌、直腸癌、食道癌若しくは膀胱癌の1つ以上から選択される固形癌又はその転移である、請求項55に記載の方法。
- 前記癌は、例えば、慢性リンパ性白血病(CLL)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、多発性骨髄腫、急性リンパ性白血病(ALL)、ホジキンリンパ腫、B細胞急性リンパ性白血病(BALL)、T細胞急性リンパ性白血病(TALL)、小リンパ球性白血病(SLL)、B細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、慢性炎症を伴うDLBCL、慢性骨髄性白血病、骨髄増殖性腫瘍、濾胞性リンパ腫、小児性濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞型若しくは大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖性病態、MALTリンパ腫(粘膜関連リンパ組織型節外性濾胞辺縁帯リンパ腫)、辺縁帯リンパ腫、骨髄形成異常、骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、脾辺縁帯リンパ腫、脾リンパ腫/白血病、脾臓びまん性赤脾髄小細胞型B細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病-変異型、リンパ形質細胞性リンパ腫、H鎖病、プラズマ細胞骨髄腫、孤立性骨形質細胞腫、骨外性形質細胞腫、節性辺縁帯リンパ腫、小児性節性辺縁帯リンパ腫、原発性皮膚濾胞中心リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、原発性縦隔(胸腺)大細胞型B細胞リンパ腫、血管内大細胞型B細胞リンパ腫、ALK+大細胞型B細胞リンパ腫、HHV8関連多中心性キャッスルマン病に発生する大細胞型B細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、B細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病(AML)又は分類不能なリンパ腫から選択される液性癌である、請求項55に記載の方法。
- 第2の治療薬を前記対象に投与するステップをさらに含む、請求項54~57のいずれか一項に記載の方法。
- 前記CAR発現細胞の集団は、請求項35において測定されるCAR発現細胞のパーセンテージに基づいて決定された用量で投与される、請求項54~58のいずれか一項に記載の方法。
- 対象の免疫応答を増加させる方法に使用するためのものであり、前記方法は、有効量の前記CAR発現細胞の集団又は有効量の前記医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む、請求項52に記載のCAR発現細胞の集団又は請求項53に記載の医薬組成物。
- 対象の癌を処置する方法に使用するためのものであり、前記方法は、有効量の前記CAR発現細胞の集団又は有効量の前記医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む、請求項52に記載のCAR発現細胞の集団又は請求項53に記載の医薬組成物。
- 重鎖相補性決定領域1(HCDR1)、HCDR2及びHCDR3を含む重鎖可変領域(VH)と、軽鎖相補性決定領域1(LCDR1)、LCDR2及びLCDR3を含む軽鎖可変領域(VL)とを含む、CD28に結合する抗体分子であって、
(i)前記HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3は、それぞれ配列番号538、539、540、530、531及び532のアミノ酸配列を含むか;
(ii)前記HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3は、それぞれ配列番号541、539、540、530、531及び532のアミノ酸配列を含むか;
(iii)前記HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3は、それぞれ配列番号542、543、540、533、534及び535のアミノ酸配列を含むか;又は
(iv)前記HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3は、それぞれ配列番号544、545、546、536、534及び532のアミノ酸配列を含む、抗体分子。 - (i)配列番号547若しくは548のアミノ酸配列又は配列番号547若しくは548に対して少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含むVH;
(ii)配列番号537のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含むVL;
(iii)配列番号547のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含むVH及び配列番号537のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含むVL;又は
(iv)配列番号548のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含むVH及び配列番号537のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含むVL
を含む、請求項62に記載の抗体分子。 - 完全長抗体、二重特異性抗体、Fab、F(ab’)2、Fv又は単鎖Fvフラグメント(scFv)である、請求項62又は63に記載の抗体分子。
- IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4から選択される重鎖定常領域と、κ又はλの軽鎖定常領域から選択される軽鎖定常領域とを含む、請求項62~64のいずれか一項に記載の抗体分子。
- (i)CD28に対する結合について、請求項62~65のいずれか一項に記載の抗体分子と競合し;及び/又は
(ii)請求項62~65のいずれか一項に記載の抗体分子のエピトープと同じエピトープ、実質的に同じエピトープ、それと重複するエピトープ又はそれと実質的に重複するエピトープに結合する、抗体分子。 - 請求項62~66のいずれか一項に記載の抗体分子をコードする単離された核酸分子。
- (i)抗CD3結合ドメイン、及び
(ii)請求項62~66のいずれか一項に記載の抗体分子を含む抗CD28結合ドメイン
を含む多重特異性結合分子。 - 前記抗CD3結合ドメインは、
(i)表27の抗CD3抗体分子(例えば、抗CD3(1)、抗CD3(2)、抗CD3(3)又は抗CD3(4))のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3;又は
(ii)表27に提供される抗CD3抗体分子(例えば、抗CD3(1)、抗CD3(2)、抗CD3(3)又は抗CD3(4))のいずれかのVH及び/若しくはVL領域のアミノ酸配列又はそれと少なくとも95%同一のアミノ酸配列
を含む、請求項68に記載の多重特異性結合分子。 - 第1の結合ドメイン及び第2の結合ドメインを含む多重特異性結合分子であって、
(i)N末端からC末端に、前記第1の結合ドメインのVH、前記第1の結合ドメインのVL、前記第2の結合ドメインのVH、CH1、CH2及びCH3を含む第1のポリペプチド;及び
(ii)N末端からC末端に、前記第2の結合ドメインのVL及びCLを含む第2のポリペプチド
を含む多重特異性結合分子。 - 第1の結合ドメイン及び第2の結合ドメインを含む多重特異性結合分子であって、
(i)N末端からC末端に、前記第2の結合ドメインのVH、CH1、CH2、CH3、前記第1の結合ドメインのVH及び前記第1の結合ドメインのVLを含む第1のポリペプチド;及び
(ii)N末端からC末端に、前記第2の結合ドメインのVL及びCLを含む第2のポリペプチド
を含む多重特異性結合分子。 - 第1の結合ドメイン及び第2の結合ドメインを含む多重特異性結合分子であって、
(i)N末端からC末端に、前記第2の結合ドメインのVH、CH1、前記第1の結合ドメインのVH、前記第1の結合ドメインのVL、CH2及びCH3を含む第1のポリペプチド;及び
(ii)N末端からC末端に、前記第2の結合ドメインのVL及びCLを含む第2のポリペプチド
を含む多重特異性結合分子。 - 前記第1の結合ドメインは、抗CD3結合ドメインを含み、及び前記第2の結合ドメインは、共刺激分子結合ドメインを含む、請求項70~72のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子。
- 前記第1の結合ドメインは、共刺激分子結合ドメインを含み、及び前記第2の結合ドメインは、抗CD3結合ドメインを含む、請求項70~72のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子。
- 前記共刺激分子結合ドメインは、抗CD2結合ドメイン又は抗CD28結合ドメインを含む、請求項73又は74に記載の多重特異性結合分子。
- 細胞(例えば、免疫エフェクター細胞、例えばT細胞)を活性化する方法であって、細胞(例えば、T細胞、例えば凍結された又は新鮮な白血球アフェレーシス産物から単離されたT細胞)の集団を、請求項68~75のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子又は請求項62~66のいずれか一項に記載の抗体分子と接触させる(例えば、結合させる)ステップを含む方法。
- 細胞(例えば、免疫エフェクター細胞、例えばT細胞)を形質導入する方法であって、細胞(例えば、T細胞、例えば凍結された又は新鮮な白血球アフェレーシス産物から単離されたT細胞)の集団を、(i)請求項68~75のいずれか一項に記載の多重特異性結合分子又は請求項62~66のいずれか一項に記載の抗体分子、及び(ii)核酸分子、例えばCARをコードする核酸分子と接触させる(例えば、結合させる)ステップを含む方法。
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