KR20220146530A - 키메라 항원 수용체-발현 세포의 제조 방법 - Google Patents

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제니퍼 브로그돈
글렌 드라노프
마이클 알. 그린
애니에사 해크
올자 코드라시
엘리자베스 도로시 프라티코
앤드류 프라이스
앤드류 마크 스테인
에이미 라요
제니퍼 양
브라이언 월터 그란다
아틸리오 본단차
보리스 엥겔스
형욱 림
아카시 소호니
루이스 트래노
슈 주
카를라 길마레스
시야말리 자야산카르
샌디프 타리안 코시
레지스 세브
미하엘 바르드로프
산드라 밀러
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노파르티스 아게
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Abstract

본 발명은 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 면역 이펙터 세포(예를 들어, T세포, NK세포)의 제조 방법, 및 이러한 방법에 의해 생성된 조성물을 제공한다.

Description

키메라 항원 수용체-발현 세포의 제조 방법
관련 출원
본 출원은 2020년 2월 27일에 출원된 미국 가출원 62/982,665에 대한 우선권을 주장하며, 그 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원에는 ASCII 형식으로 전자 제출되었고 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 서열 목록이 포함된다. 2021년 2월 25일자로 생성된 상기 ASCII 사본의 파일명은 N2067-7170WO_SL.txt이고 크기는 653,029 바이트이다.
기술분야
본 발명은 일반적으로, 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T세포 또는 NK세포)의 제조 방법, 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
T세포, 특히 키메라 항원 수용체(CAR)로 형질도입된 T세포를 이용한 입양 세포 이식(ACT) 요법은 여러 혈액암 시험에서 가능성을 보여주었다. 유전자 변형 T세포의 제조는 현재 복잡한 프로세스이다. CAR-발현 세포 요법 제품의 생산을 개선하고, 제품의 품질을 향상시키며, 제품의 치료 효능을 최대화하는 방법 및 프로세스가 필요하다.
본 개시는 CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T세포 또는 NK세포)의 제조 방법, 및 이러한 방법을 이용하여 생성된 조성물에 관한 것이다. 또한, 대상체에서 질환, 예를 들어 암을 치료하기 위해 이러한 조성물을 사용하는 방법이 개시된다.
일부 양태에서, 본 개시는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (i) 세포(예를 들어, T세포, 예를 들어 동결된 또는 신선한 백혈구 성분채집 생성물로부터 단리된 T세포)의 집단을 (A) 항-CD3 결합 도메인 및 (B) 공동자극 분자 결합 도메인(예를 들어, 항-CD2 결합 도메인 또는 항-CD28 결합 도메인)을 포함하는 다중특이적 결합 분자와 접촉(예를 들어, 결합)시키는 단계; (ii) 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 CAR을 암호화하는 핵산 분자(예를 들어, DNA 또는 RNA 분자)와 접촉시켜, 핵산 분자를 포함하는 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 제공하는 단계; 및 (iii) 보관(예를 들어, 동결보존 배지에 세포의 집단을 재제형화) 또는 투여하기 위해 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 수확하는 단계를 포함하며, (a) 단계 (ii)는 단계 (i)과 함께 또는 단계 (i)의 시작 후 20시간 이내, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18시간 이내, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 18시간 이내에 수행되고, 단계 (iii)은 단계 (i)의 시작 후 26시간 이내에, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 22, 23, 24, 또는 25시간 이내에, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 24시간 이내에 수행되거나; (b) 단계 (ii)는 단계 (i)과 함께 또는 단계 (i)의 시작 후 20시간 이내, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18시간 이내, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 18시간 이내에 수행되고, 단계 (iii)은 단계 (ii)의 시작 후 30, 36, 또는 48시간 이내에, 예를 들어 단계 (ii)의 시작 후 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48시간 이내에 수행되거나; (c) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 증식되지 않거나, 예를 들어 단계 (i)의 시작시의 세포 집단과 비교하여, 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 또는 40% 이하, 예를 들어 10% 이하만큼 증식된다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)의 핵산 분자는 DNA 분자이다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)의 핵산 분자는 RNA 분자이다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)의 핵산 분자는 바이러스 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 또는 레트로바이러스 벡터로부터 선택된 바이러스 벡터 상에 있다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)의 핵산 분자는 비바이러스 벡터 상에 있다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)의 핵산 분자는 플라스미드 상에 있다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)의 핵산 분자는 어떠한 벡터 상에도 있지 않다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 CAR을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 바이러스 벡터로 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 형질도입시키는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시는 (A) 항-CD3 결합 도메인 및 (B) 공동자극 분자 결합 도메인(예를 들어, 항-CD2 결합 도메인 또는 항-CD28 결합 도메인)을 포함하는 다중특이적 결합 분자를 제공한다.
일부 구현예에서, 항-CD3 결합 도메인, 예를 들어 항-CD3 scFv는 공동자극 분자 결합 도메인, 예를 들어 항-CD2 Fab 또는 항-CD28 Fab의 N-말단에 위치하거나; 항-CD3 결합 도메인, 예를 들어 항-CD3 scFv는 공동자극 분자 결합 도메인, 예를 들어 항-CD2 Fab 또는 항-CD28 Fab의 C-말단에 위치하고, 임의로, Fc 영역은 항-CD3 결합 도메인과 공동자극 분자 결합 도메인 사이에 위치하거나; 다중특이적 결합 분자는 CH2를 포함하고, 항-CD3 결합 도메인은 CH2의 N-말단에 위치한다.
본원의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 (i) N-말단에서 C-말단 방향으로, 항-CD3 결합 도메인의 VH, 항-CD3 결합 도메인의 VL, 공동자극 분자 결합 도메인의 VH, CH1, CH2, 및 CH3을 포함하는 제1 폴리펩티드; 및 (ii) N-말단에서 C-말단 방향으로, 공동자극 분자 결합 도메인의 VL 및 CL을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 (i) N-말단에서 C-말단 방향으로, 공동자극 분자 결합 도메인의 VH, CH1, CH2, CH3, 항-CD3 결합 도메인의 VH, 및 항-CD3 결합 도메인의 VL을 포함하는 제1 폴리펩티드; 및 (ii) N-말단에서 C-말단 방향으로, 공동자극 분자 결합 도메인의 VL 및 CL을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 (i) N-말단에서 C-말단 방향으로, 공동자극 분자 결합 도메인의 VH, CH1, 항-CD3 결합 도메인의 VH, 항-CD3 결합 도메인의 VL, CH2, 및 CH3을 포함하는 제1 폴리펩티드; 및 (ii) N-말단에서 C-말단 방향으로, 공동자극 분자 결합 도메인의 VL 및 CL을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 결합 도메인은 scFv를 포함하고 공동자극 분자 결합 도메인은 Fab 단편의 일부이다.
일부 구현예에서, 항-CD3 결합 도메인은 (i) 표 27의 항-CD3 항체 분자(예를 들어, 항-CD3 (1), 항-CD3 (2), 항-CD3 (3), 또는 항-CD3 (4))의 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR1), HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 가변 중쇄 영역(VH), 및 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR1), LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 및/또는 (ii) 표 27에 제공된 항-CD3 항체 분자(예를 들어, 항-CD3 (1), 항-CD3 (2), 항-CD3 (3), 또는 항-CD3 (4))의 VH 및/또는 VL 영역 중 임의의 하나의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 공동자극 분자 결합 도메인은 항-CD2 항원 결합 도메인이다. 일부 구현예에서, 항-CD2 항원 결합 도메인은 (i) 표 27의 항-CD2 항체 분자(예를 들어, 항-CD2 (1))의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 VH, 및 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 VL; 및/또는 (ii) 표 27에 제공된 항-CD2 항체 분자(예를 들어, 항-CD2 (1))의 VH 및/또는 VL 영역 중 임의의 하나의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 공동자극 분자 결합 도메인은 항-CD28 항원 결합 도메인이다. 일부 구현예에서, 항-CD28 항원 결합 도메인은 (i) 표 27의 항-CD28 항체 분자(예를 들어, 항-CD28 (1) 또는 항-CD28 (2))의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 VH, 및 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 VL; 및/또는 (ii) 표 27에 제공된 항-CD28 항체 분자(예를 들어, 항-CD28 (1) 또는 항-CD28 (2))의 VH 및/또는 VL 영역 중 임의의 하나의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD3 결합 도메인은 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 결합 도메인은 펩티드 링커, 예를 들어 글리신-세린 링커, 예를 들어 (G4S)4 링커에 의해 VL에 연결된 VH를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 결합 도메인은 VH 및 VL을 포함하고, VH는 VL의 N-말단이다.
일부 구현예에서, 공동자극 분자 결합 도메인은 Fab 단편, 예를 들어 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩티드 서열의 일부인 Fab 단편의 일부이고, 임의로 Fc 도메인은 표 28에 제공된 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD3 결합 도메인은 공동자극 분자 결합 도메인의 N-말단에 위치한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 결합 도메인은 펩티드 링커, 예를 들어 글리신-세린 링커, 예를 들어 (G4S)4 링커에 의해 공동자극 분자 결합 도메인에 연결된다.
일부 구현예에서, 항-CD3 결합 도메인은 공동자극 분자 결합 도메인의 C-말단에 위치하고, 임의로 Fc 영역은 항-CD3 결합 도메인과 공동자극 분자 결합 도메인 사이에 위치한다.
일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 CH1을 포함한다. 일부 구현예에서, CH1은 공동자극 분자 결합 도메인의 VH의 C-말단이다.
일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 CH2 및 CH3 중 하나 또는 둘 다를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD3 결합 도메인은 펩티드 링커, 예를 들어 글리신-세린 링커, 예를 들어 (G4S)4 링커에 의해 CH3에 연결된다. 일부 구현예에서, 항-CD3 결합 도메인은 CH1의 C-말단에 위치한다. 일부 구현예에서, 구성체는 CH2를 포함하고, 항-CD3 결합 도메인은 CH2의 N-말단에 위치한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 결합 도메인은 펩티드 링커, 예를 들어 글리신-세린 링커, 예를 들어 (G4S)2 링커에 의해 CH1에 연결된다. 일부 구현예에서, 항-CD3 결합 도메인은 펩티드 링커, 예를 들어 글리신-세린 링커, 예를 들어 (G4S)4 링커에 의해 CH2에 연결된다.
일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 CL을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, CL은 공동자극 분자 결합 도메인의 VL의 C-말단이다. 일부 구현예에서, CL 도메인은 예를 들어 이황화 가교를 통해 CH1에 연결된다.
일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 (i) 표 28에 제공된 임의의 중쇄의 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및/또는 (ii) 표 28에 제공된 임의의 경쇄의 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 제조하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 (i) 세포(예를 들어, T세포, 예를 들어 동결된 또는 신선한 백혈구 성분채집 생성물로부터 단리된 T세포)의 집단을 (A) CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 (B) 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉(예를 들어, 결합)시키는 단계; (ii) 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 CAR을 암호화하는 핵산 분자(예를 들어, DNA 또는 RNA 분자)와 접촉시켜, 핵산 분자를 포함하는 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 제공하는 단계; 및 (iii) 보관(예를 들어, 동결보존 배지에 세포의 집단을 재제형화) 또는 투여하기 위해 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 수확하는 단계를 포함하고, (a) 단계 (ii)는 단계 (i)과 함께 또는 단계 (i)의 시작 후 20시간 이내, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18시간 이내, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 18시간 이내에 수행되고, 단계 (iii)은 단계 (i)의 시작 후 26시간 이내에, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 22, 23, 24, 또는 25시간 이내에, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 24시간 이내에 수행되거나; (b) 단계 (ii)는 단계 (i)과 함께 또는 단계 (i)의 시작 후 20시간 이내, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18시간 이내, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 18시간 이내에 수행되고, 단계 (iii)은 단계 (ii)의 시작 후 30, 36, 또는 48시간 이내에, 예를 들어 단계 (ii)의 시작 후 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48시간 이내에 수행되거나; (c) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 증식되지 않거나, 예를 들어 단계 (i)의 시작시의 세포 집단과 비교하여, 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 또는 40% 이하, 예를 들어 10% 이하만큼 증식된다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)의 핵산 분자는 DNA 분자이다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)의 핵산 분자는 RNA 분자이다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)의 핵산 분자는 바이러스 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 또는 레트로바이러스 벡터로부터 선택된 바이러스 벡터 상에 있다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)의 핵산 분자는 비바이러스 벡터 상에 있다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)의 핵산 분자는 플라스미드 상에 있다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)의 핵산 분자는 어떠한 벡터 상에도 있지 않다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 CAR을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 바이러스 벡터로 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 형질도입시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 (A) Tet2 표적 서열을 포함하는 센스 가닥 및 (B) 전체적으로 또는 부분적으로 센스 가닥에 상보적인 안티센스 가닥을 포함하는, Tet2를 표적화하는 shRNA, 또는 shRNA를 암호화하는 벡터와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 센스 가닥은 Tet2 표적 서열 GGGTAAGCCAAGAAAGAAA(서열번호 418)를 포함한다. 일부 구현예에서, 안티센스 가닥은 이의 역보체, 즉 TTTCTTTCTTGGCTTACCC(서열번호 419)를 포함한다. 일부 구현예에서, shRNA를 암호화하는 벡터는 CAR을 암호화하는 벡터와 동일하거나 상이하다. 일부 구현예에서, shRNA 서열을 암호화하는 벡터는 프로모터(예를 들어, U6 프로모터(이에 한정되지 않음)), Tet2 표적 서열을 포함하는 센스 가닥, 루프, 전체적으로 또는 부분적으로 센스 가닥에 상보적인 안티센스 가닥, 및 임의로 폴리T 테일, 예를 들어 표 29의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 단계 (i)과 함께 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 단계 (i)의 시작 후 20시간 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 단계 (i)의 시작 후 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18시간 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 단계 (i)의 시작 후 18시간 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (iii)은 단계 (i)의 시작 후 26시간 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (iii)은 단계 (i)의 시작 후 22, 23, 24, 또는 25시간 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (iii)은 단계 (i)의 시작 후 24시간 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (iii)은 단계 (ii)의 시작 후 30, 36, 또는 48시간 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (iii)은 단계 (ii)의 시작 후 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48시간 이내에 수행된다.
일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 증식되지 않는다. 일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 또는 40% 이하만큼 증식된다. 일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 10% 이하만큼 증식된다.
일부 구현예에서, CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제는 CD3을 자극하는 제제이다. 일부 구현예에서, 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제는 CD28, ICOS, CD27, HVEM, LIGHT, CD40, 4-1BB, OX40, DR3, GITR, CD30, TIM1, CD2, CD226, 또는 이의 임의의 조합을 자극하는 제제이다. 일부 구현예에서, 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제는 CD28을 자극하는 제제이다. 일부 구현예에서, CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제는 항체(예를 들어, 단일 도메인 항체(예를 들어, 중쇄 가변 도메인 항체), 펩티바디, Fab 단편, 또는 scFv), 소분자, 또는 리간드(예를 들어, 천연, 재조합, 또는 키메라 리간드)로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제는 항체(예를 들어, 단일 도메인 항체(예를 들어, 중쇄 가변 도메인 항체), 펩티바디, Fab 단편, 또는 scFv), 소분자, 또는 리간드(예를 들어, 천연, 재조합, 또는 키메라 리간드)로부터 선택된다. 일부 구현예에서, CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제는 비드를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제는 비드를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제는 항-CD3 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제는 항-CD28 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제는 콜로이드 고분자 나노매트릭스에 공유 부착된 항-CD3 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, CD3을 자극하는 제제는, 표 27에 제공된 항-CD3 또는 항-TCR 항체와 같은(이에 한정되지 않음), 항-CD3 또는 항-TCR 항체 또는 이의 하나 이상의 CDR, 중쇄, 및/또는 경쇄를 포함하는 항체 단편과 같은(이에 한정되지 않음) CD3 또는 TCR 항원 결합 도메인 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제는 콜로이드 고분자 나노매트릭스에 공유 부착된 항-CD28 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제는 CD28, ICOS, CD27, CD25, 4-1BB, IL6RA, IL6RB, 또는 CD2를 자극하는 제제이다. 일부 구현예에서, 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제는, 표 27에 제공된 항-CD28, 항-ICOS, 항-CD27, 항-CD25, 항-4-1BB, 항-IL6RA, 항-IL6RB, 또는 항-CD2 항체와 같은(이에 한정되지 않음), 항-CD28, 항-ICOS, 항-CD27, 항-CD25, 항-4-1BB, 항-IL6RA, 항-IL6RB, 또는 항-CD2 항체 또는 이의 하나 이상의 CDR, 중쇄, 및/또는 경쇄를 포함하는 항체 단편과 같은(이에 한정되지 않음) CD28, ICOS, CD27, CD25, 4-1BB, IL6RB, 및/또는 CD2 항원 결합 도메인 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제, 및 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제는 T Cell TransActTM를 포함한다. 일부 구현예에서, CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제, 및 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제는 다중특이적 결합 분자에 포함된다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 CD3 항원 결합 도메인 및 CD28 또는 CD2 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 표 28에 제공된 중쇄 및/또는 경쇄와 같은(이에 한정되지 않음) 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 이중특이적 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 도 50a에 제공된 도식 중 임의의 하나로 구성된다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 1가 또는 2가이다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 Fc 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체의 Fc 영역은 침묵화된다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 복수의 이중특이적 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 이중특이적 항체 중 하나 이상은 1가이다. 일부 구현예에서, 복수의 이중특이적 항체 중 하나 이상은 Fc 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 이중특이적 항체 중 하나 이상의 Fc 영역은 침묵화된다. 일부 구현예에서, 복수의 이중특이적 항체 중 하나 이상은 함께 다량체로 접합된다. 일부 구현예에서, 다량체는 도 50b에 제공된 도식 중 임의의 하나로 구성된다.
일부 구현예에서, CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제는 하이드로겔을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제는 하이드로겔을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제는 알긴산염을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제는 알긴산염을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제는 하이드로겔을 포함한다. 일부 구현예에서, 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제는 하이드로겔을 포함한다. 일부 구현예에서, CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제는 알긴산염을 포함한다. 일부 구현예에서, 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제는 알긴산염을 포함한다. 일부 구현예에서, CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제, 또는 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제는 Quad Technologies의 MagCloudz™를 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (i)은 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 CAR-발현 세포의 백분율을 증가시키며, 예를 들어 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 단계 (i)이 없는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포와 비교하여, CAR-발현 세포의 더 높은(예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 또는 60% 더 높은) 백분율을 나타낸다.
일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 백분율은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ 세포의 백분율과 동일하다. 일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 백분율은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ 세포의 백분율과 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12% 이하만큼 상이하다. 일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 백분율은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ 세포의 백분율과 5 또는 10% 이하만큼 상이하다.
일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포와 비교하여, 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 더 높은(예를 들어, 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 또는 40% 더 높은) 백분율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포와 비교하여, 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 더 높은(예를 들어, 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 또는 40% 더 높은) 백분율을 나타낸다.
일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CD95+ 중심 기억 T세포의 백분율은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CD95+ 중심 기억 T세포의 백분율과 동일하다. 일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CD95+ 중심 기억 T세포의 백분율은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CD95+ 중심 기억 T세포의 백분율과 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12% 이하만큼 상이하다. 일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CD95+ 중심 기억 T세포의 백분율은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CD95+ 중심 기억 T세포의 백분율과 5 또는 10% 이하만큼 상이하다.
일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포와 비교하여, 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CD95+ 중심 기억 T세포의 더 낮은(예를 들어, 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 또는 40% 더 낮은) 백분율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포와 비교하여, 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CD95+ 중심 기억 T세포의 더 낮은(예를 들어, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 또는 40% 더 낮은) 백분율을 나타낸다.
일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 백분율은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단 중 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 백분율과 비교하여 증가된다. 일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 CAR-발현 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CAR-발현 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 백분율은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단 중 CAR-발현 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CAR-발현 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 백분율과 비교하여 증가된다. 일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 백분율은 단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포 중 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 백분율보다 높다. 일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 CAR-발현 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CAR-발현 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 백분율은 단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포 중 CAR-발현 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CAR-발현 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 백분율보다 높다. 일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 백분율은 단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포 중 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 백분율보다 높다. 일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 CAR-발현 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CAR-발현 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 백분율은 단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포 중 CAR-발현 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CAR-발현 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 백분율보다 높다.
일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단의 유전자 세트 점수(GeneSetScore) 중앙값(위 TEM 대 아래 TSCM)은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 TEM 대 아래 TSCM)과 거의 동일하거나 약 25, 50, 75, 100, 또는 125% 이하만큼 상이하다(예를 들어, 증가된다). 일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 TEM 대 아래 TSCM)은 단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포의 유전자 세트 점수 중앙값(위 TEM 대 아래 TSCM)보다 낮다(예를 들어, 적어도 약 100, 150, 200, 250, 또는 300% 더 낮다). 일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 TEM 대 아래 TSCM)은 단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포의 유전자 세트 점수 중앙값(위 TEM 대 아래 TSCM)보다 낮다(예를 들어, 적어도 약 100, 150, 200, 250, 또는 300% 더 낮다). 일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 Treg 대 아래 Teff)은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 Treg 대 아래 Teff)과 거의 동일하거나 약 25, 50, 100, 150, 또는 200% 이하만큼 상이하다(예를 들어, 증가된다). 일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 Treg 대 아래 Teff)은 단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포의 유전자 세트 점수 중앙값(위 Treg 대 아래 Teff)보다 낮다(예를 들어, 적어도 약 50, 100, 125, 150, 또는 175% 더 낮다). 일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 Treg 대 아래 Teff)은 단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포의 유전자 세트 점수 중앙값(위 Treg 대 아래 Teff)보다 낮다(예를 들어, 적어도 약 50, 100, 125, 150, 또는 175% 더 낮다). 일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(아래 줄기세포능)은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(아래 줄기세포능)과 거의 동일하거나 약 25, 50, 100, 150, 200, 또는 250% 이하만큼 상이하다(예를 들어, 증가된다). 일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(아래 줄기세포능)은 단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포의 유전자 세트 점수 중앙값(아래 줄기세포능)보다 낮다(예를 들어, 적어도 약 50, 100, 또는 125% 더 낮다). 일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(아래 줄기세포능)은 단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포의 유전자 세트 점수 중앙값(아래 줄기세포능)보다 낮다(예를 들어, 적어도 약 50, 100, 또는 125% 더 낮다). 일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 저산소증)은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 저산소증)과 거의 동일하거나 약 125, 150, 175, 또는 200% 이하만큼 상이하다(예를 들어, 증가된다). 일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 저산소증)은 단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포의 유전자 세트 점수 중앙값(위 저산소증)보다 낮다(예를 들어, 적어도 약 40, 50, 60, 70, 또는 80% 더 낮다). 일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 저산소증)은 단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포의 유전자 세트 점수 중앙값(위 저산소증)보다 낮다(예를 들어, 적어도 약 40, 50, 60, 70, 또는 80% 더 낮다). 일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 자가포식)은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 자가포식)과 거의 동일하거나 약 180, 190, 200, 또는 210% 이하만큼 상이하다(예를 들어, 증가된다). 일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 자가포식)은 단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포의 유전자 세트 점수 중앙값(위 자가포식)보다 낮다(예를 들어, 적어도 20, 30, 또는 40% 더 낮다). 일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 자가포식)은 단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포의 유전자 세트 점수 중앙값(위 자가포식)보다 낮다(예를 들어, 적어도 20, 30, 또는 40% 더 낮다).
일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 CAR에 의해 인식되는 항원을 발현하는 세포와 함께 인큐베이션된 후, 예를 들어 도 29c 및 도 29d와 관련하여 실시예 8에 기술된 방법을 이용하여 평가할 때, 단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포, 또는 단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포보다 더 높은(예를 들어, 적어도 2, 4, 6, 8, 10, 12, 또는 14배 더 높은) 수준으로 IL-2를 분비한다.
일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 생체 내에 투여된 후, 단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포와 비교하여, (예를 들어, 도 4c와 관련하여 실시예 1에 기술된 방법을 이용하여 평가할 때) 더 오래 존속하거나 더 높은(예를 들어, 적어도 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 또는 90% 더 높은) 수준으로 증식된다. 일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 생체 내에 투여된 후, 단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포와 비교하여, (예를 들어, 도 4c와 관련하여 실시예 1에 기술된 방법을 이용하여 평가할 때) 더 오래 존속하거나 더 높은(예를 들어, 적어도 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 또는 90% 더 높은) 수준으로 증식된다.
일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 생체 내에 투여된 후, 단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포, 또는 단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포보다 더 강한 항종양 활성(예를 들어, 낮은 용량, 예를 들어 0.15 x 106, 0.2 x 106, 0.25 x 106, 또는 0.3 x 106개 이하의 생존 가능한 CAR-발현 세포의 용량에서 더 강한 항종양 활성)을 나타낸다.
일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 증식되지 않는다. 일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 단계 (i)의 시작시의 세포 집단 중 살아있는 세포의 수로부터 감소된다. 일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 또는 40% 이하, 예를 들어 10% 이하만큼 증식된다. 일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단과 비교하여 증식되지 않거나, 0.5, 1, 1.5, 또는 2시간 미만, 예를 들어 1 또는 1.5시간 미만까지 증식된다.
일부 구현예에서, 단계 (i) 및 (ii)는 IL-2, IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)), IL-6(예를 들어, IL-6/sIL-6Ra), LSD1 억제제, 또는 MALT1 억제제를 포함하는 세포 배지(예를 들어, 무혈청 배지)에서 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (i) 및 (ii)는 IL-7, IL-21, 또는 이의 조합을 포함하는 세포 배지(예를 들어, 무혈청 배지)에서 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (i) 및 (ii)는 IL-2, IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)), IL-21, IL-7, IL-6(예를 들어, IL-6/sIL-6Ra), LSD1 억제제, MALT1 억제제, 또는 이의 조합을 포함하는 세포 배지(예를 들어, 무혈청 배지)에서 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (i)은 IL-2, IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)), IL-6(예를 들어, IL-6/sIL-6Ra), LSD1 억제제, 또는 MALT1 억제제를 포함하는 세포 배지(예를 들어, 무혈청 배지)에서 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 IL-2, IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)), IL-6(예를 들어, IL-6/sIL-6Ra), LSD1 억제제, 또는 MALT1 억제제를 포함하는 세포 배지(예를 들어, 무혈청 배지)에서 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (i)은 IL-7, IL-21, 또는 이의 조합을 포함하는 세포 배지(예를 들어, 무혈청 배지)에서 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 IL-7, IL-21, 또는 이의 조합을 포함하는 세포 배지(예를 들어, 무혈청 배지)에서 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (i)은 IL-2, IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)), IL-21, IL-7, IL-6(예를 들어, IL-6/sIL-6Ra), LSD1 억제제, MALT1 억제제, 또는 이의 조합을 포함하는 세포 배지(예를 들어, 무혈청 배지)에서 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 IL-2, IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)), IL-21, IL-7, IL-6(예를 들어, IL-6/sIL-6Ra), LSD1 억제제, MALT1 억제제, 또는 이의 조합을 포함하는 세포 배지(예를 들어, 무혈청 배지)에서 수행된다. 일부 구현예에서, 세포 배지는 혈청 대체물을 포함하는 무혈청 배지이다. 일부 구현예에서, 혈청 대체물은 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물(ICSR)이다.
일부 구현예에서, 전술한 방법은 단계 (i) 전에 다음 단계를 추가로 포함한다: (iv) 독립체, 예를 들어 실험실, 병원, 또는 의료인으로부터 신선한 백혈구 성분채집 생성물(또는 조혈 조직의 대체 공급원, 예컨대 신선한 전혈 생성물, 신선한 골수 생성물, 또는 신선한 종양 또는 기관 생검물 또는 제거물(예를 들어, 흉선 절제술로부터의 신선한 생성물))을 받는 단계.
일부 구현예에서, 전술한 방법은 단계 (i) 전에 다음 단계를 추가로 포함한다: (v) 신선한 백혈구 성분채집 생성물(또는 조혈 조직의 대체 공급원, 예컨대 신선한 전혈 생성물, 신선한 골수 생성물, 또는 신선한 종양 또는 기관 생검물 또는 제거물(예를 들어, 흉선 절제술로부터의 신선한 생성물))로부터 단계 (i)에서 접촉된 세포(예를 들어, T세포, 예를 들어 CD8+ 및/또는 CD4+ T세포)의 집단을 단리하는 단계. 일부 구현예에서, 단계 (iii)은 단계 (v)의 시작 후 35, 36, 또는 48시간 이내, 예를 들어 단계 (v)의 시작 후 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 또는 48시간 이내, 예를 들어 단계 (v)의 시작 후 30, 36, 또는 48시간 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 단계 (v)의 종료시의 세포 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 증식되지 않거나, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40% 이하, 예를 들어 10% 이하만큼 증식된다.
일부 구현예에서, 전술한 방법은 단계 (i) 전에 다음 단계를 추가로 포함한다: 독립체, 예를 들어 실험실, 병원, 또는 의료인으로부터 백혈구 성분채집 생성물로부터 단리된 동결보존된 T세포(또는 조혈 조직의 대체 공급원, 예컨대 전혈, 골수, 또는 종양 또는 기관 생검 또는 제거(예를 들어, 흉선 절제술)로부터 단리된 동결보존된 T세포)를 받는 단계.
일부 구현예에서, 전술한 방법은 단계 (i) 전에 다음 단계를 추가로 포함한다: (iv) 독립체, 예를 들어 실험실, 병원, 또는 의료인으로부터, 동결보존된 백혈구 성분채집 생성물(또는 조혈 조직의 대체 공급원, 예컨대 동결보존된 전혈 생성물, 동결보존된 골수 생성물, 또는 동결보존된 종양 또는 기관 생검물 또는 제거물(예를 들어, 흉선 절제술로부터의 동결보존된 생성물))을 받는 단계.
일부 구현예에서, 전술한 방법은 단계 (i) 전에 다음 단계를 추가로 포함한다: (v) 동결보존된 백혈구 성분채집 생성물(또는 조혈 조직의 대체 공급원, 예컨대 동결보존된 전혈 생성물, 동결보존된 골수 생성물, 또는 동결보존된 종양 또는 기관 생검물 또는 제거물(예를 들어, 흉선 절제술로부터의 동결보존된 생성물))로부터 단계 (i)에서 접촉된 세포(예를 들어, T세포, 예를 들어 CD8+ 및/또는 CD4+ T세포)의 집단을 단리하는 단계. 일부 구현예에서, 단계 (iii)은 단계 (v)의 시작 후 35, 36, 또는 48시간 이내, 예를 들어 단계 (v)의 시작 후 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 또는 48시간 이내, 예를 들어 단계 (v)의 시작 후 30, 36, 또는 38시간 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 단계 (v)의 종료시의 세포 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 증식되지 않거나, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40% 이하, 예를 들어 10% 이하만큼 증식된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 제조하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 (1) 세포(예를 들어, T세포, 예를 들어 동결된 백혈구 성분채집 생성물로부터 단리된 T세포)의 집단을 IL-2, IL-7, IL-15, IL-21, IL-6, 또는 이의 조합으로부터 선택된 사이토카인과 접촉시키는 단계; (2) 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 CAR을 암호화하는 핵산 분자(예를 들어, DNA 또는 RNA 분자)와 접촉시켜, 핵산 분자를 포함하는 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 제공하는 단계; 및 (3) 보관(예를 들어, 동결보존 배지에 세포의 집단을 재제형화) 또는 투여하기 위해 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 수확하는 단계를 포함하고, (a) 단계 (2)는 단계 (1)과 함께 또는 단계 (1)의 시작 후 5시간 이내, 예를 들어 단계 (1)의 시작 후 1, 2, 3, 4, 또는 5시간 이내에 수행되고, 단계 (3)은 단계 (1)의 시작 후 26시간 이내, 예를 들어 단계 (1)의 시작 후 22, 23, 24, 또는 25시간 이내, 예를 들어 단계 (1)의 시작 후 24시간 이내에 수행되거나, (b) 단계 (3)으로부터의 세포 집단은 단계 (1)의 시작시의 세포 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 증식되지 않거나, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40% 이하, 예를 들어 10% 이하만큼 증식된다. 일부 구현예에서, 단계 (2)의 핵산 분자는 DNA 분자이다. 일부 구현예에서, 단계 (2)의 핵산 분자는 RNA 분자이다. 일부 구현예에서, 단계 (2)의 핵산 분자는 바이러스 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 또는 레트로바이러스 벡터로부터 선택된 바이러스 벡터 상에 있다. 일부 구현예에서, 단계 (2)의 핵산 분자는 비바이러스 벡터 상에 있다. 일부 구현예에서, 단계 (2)의 핵산 분자는 플라스미드 상에 있다. 일부 구현예에서, 단계 (2)의 핵산 분자는 어떠한 벡터 상에도 있지 않다. 일부 구현예에서, 단계 (2)는 CAR을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 바이러스 벡터로 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 접촉시키는, 필요에 따라 형질도입시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (2)는 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 (A) Tet2 표적 서열을 포함하는 센스 가닥 및 (B) 전체적으로 또는 부분적으로 센스 가닥에 상보적인 안티센스 가닥을 포함하는, Tet2를 표적화하는 shRNA, 또는 shRNA를 암호화하는 벡터와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 센스 가닥은 Tet2 표적 서열 GGGTAAGCCAAGAAAGAAA(서열번호 418)를 포함한다. 일부 구현예에서, 안티센스 가닥은 이의 역보체, 즉 TTTCTTTCTTGGCTTACCC(서열번호 419)를 포함한다. 일부 구현예에서, shRNA를 암호화하는 벡터는 CAR을 암호화하는 벡터와 동일하거나 상이하다. 일부 구현예에서, shRNA 서열을 암호화하는 벡터는 프로모터(예를 들어, U6 프로모터(이에 한정되지 않음)), Tet2 표적 서열을 포함하는 센스 가닥, 루프, 전체적으로 또는 부분적으로 센스 가닥에 상보적인 안티센스 가닥, 및 임의로 폴리T 테일, 예를 들어 표 29의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (2)는 단계 (1)과 함께 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (2)는 단계 (1)의 시작 후 5시간 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (2)는 단계 (1)의 시작 후 1, 2, 3, 4, 또는 5시간 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (3)은 단계 (1)의 시작 후 26시간 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (3)은 단계 (1)의 시작 후 22, 23, 24, 또는 25시간 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (3)은 단계 (1)의 시작 후 24시간 이내에 수행된다.
일부 구현예에서, 단계 (3)으로부터의 세포 집단은 단계 (1)의 시작시의 세포 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 증식되지 않는다. 일부 구현예에서, 단계 (3)으로부터의 세포 집단은 단계 (1)의 시작시의 세포 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 또는 40% 이하만큼 증식된다. 일부 구현예에서, 단계 (3)으로부터의 세포 집단은 단계 (1)의 시작시의 세포 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 10% 이하만큼 증식된다.
일부 구현예에서, 단계 (1)은 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 IL-2와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (1)은 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 IL-7과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (1)은 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (1)은 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 IL-21과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (1)은 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 IL-6(예를 들어, IL-6/sIL-6Ra)과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (1)은 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 IL-2 및 IL-7과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (1)은 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 IL-2 및 IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (1)은 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 IL-2 및 IL-21과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (1)은 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 IL-2 및 IL-6(예를 들어, IL-6/sIL-6Ra)과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (1)은 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 IL-7 및 IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (1)은 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 IL-7 및 IL-21과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (1)은 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 IL-7 및 IL-6(예를 들어, IL-6/sIL-6Ra)과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (1)은 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)) 및 IL-21과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (1)은 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)) 및 IL-6(예를 들어, IL-6/sIL-6Ra)과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (1)은 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 IL-21 및 IL-6(예를 들어, IL-6/sIL-6Ra)과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (1)은 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 IL-7, IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)), 및 IL-21과 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (3)으로부터의 세포 집단은 세포 집단을 예를 들어, 항-CD3 항체와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포와 비교하여, CAR-발현 세포 중 나이브 세포의 더 높은(예를 들어, 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 또는 40% 더 높은) 백분율을 나타낸다.
일부 구현예에서, 단계 (3)으로부터의 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 백분율은 단계 (1)의 시작시의 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ 세포의 백분율과 동일하다. 일부 구현예에서, 단계 (3)으로부터의 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 백분율은 단계 (1)의 시작시의 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ 세포의 백분율과 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12% 이하만큼 상이하다. 일부 구현예에서, 단계 (3)으로부터의 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 백분율은 단계 (1)의 시작시의 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ 세포의 백분율과 5 또는 10% 이하만큼 상이하다. 일부 구현예에서, 단계 (3)으로부터의 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 백분율은 단계 (1)의 시작시의 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ 세포의 백분율에 비해 증가된다. 일부 구현예에서, 단계 (3)으로부터의 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 백분율은 단계 (1)의 시작시의 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ 세포의 백분율에 비해 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20%만큼 증가된다. 일부 구현예에서, 단계 (3)으로부터의 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 백분율은 단계 (1)의 시작시의 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ 세포의 백분율에 비해 적어도 10 또는 20%만큼 증가된다.
일부 구현예에서, 단계 (3)으로부터의 세포 집단은 단계 (3)이 단계 (1)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (1)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포와 비교하여, 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 더 높은(예를 들어, 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 또는 40% 더 높은) 백분율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 단계 (3)으로부터의 세포 집단은 단계 (2) 이후 및 단계 (3) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포와 비교하여, 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 더 높은(예를 들어, 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 또는 40% 더 높은) 백분율을 나타낸다.
일부 구현예에서, 단계 (3)으로부터의 세포 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CD95+ 중심 기억 T세포의 백분율은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CD95+ 중심 기억 T세포의 백분율과 동일하다. 일부 구현예에서, 단계 (3)으로부터의 세포 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CD95+ 중심 기억 T세포의 백분율은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CD95+ 중심 기억 T세포의 백분율과 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12% 이하만큼 상이하다. 일부 구현예에서, 단계 (3)으로부터의 세포 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CD95+ 중심 기억 T세포의 백분율은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CD95+ 중심 기억 T세포의 백분율과 5 또는 10% 이하만큼 상이하다. 일부 구현예에서, 단계 (3)으로부터의 세포 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CD95+ 중심 기억 T세포의 백분율은 단계 (1)의 시작시의 세포 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CD95+ 중심 기억 T세포의 백분율에 비해 감소된다. 일부 구현예에서, 단계 (3)으로부터의 세포 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CD95+ 중심 기억 T세포의 백분율은 단계 (1)의 시작시의 세포 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CD95+ 중심 기억 T세포의 백분율에 비해 적어도 10 또는 20%만큼 감소된다. 일부 구현예에서, 단계 (3)으로부터의 세포 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CD95+ 중심 기억 T세포의 백분율은 단계 (1)의 시작시의 세포 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CD95+ 중심 기억 T세포의 백분율에 비해 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20%만큼 감소된다.
일부 구현예에서, 단계 (3)으로부터의 세포 집단은 단계 (3)이 단계 (1)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (1)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포와 비교하여, 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CD95+ 중심 기억 T세포의 더 낮은(예를 들어, 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 또는 40% 더 낮은) 백분율을 나타낸다. 일부 구현예에서, 단계 (3)으로부터의 세포 집단은 단계 (2) 이후 및 단계 (3) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포와 비교하여, 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CD95+ 중심 기억 T세포의 더 낮은(예를 들어, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 또는 40% 더 낮은) 백분율을 나타낸다.
일부 구현예에서, 단계 (3)으로부터의 세포 집단은 생체 내에 투여된 후, 단계 (3)이 단계 (1)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (1)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포와 비교하여, (예를 들어, 도 4c와 관련하여 실시예 1에 기술된 방법을 이용하여 평가할 때) 더 오래 존속하거나 더 높은(예를 들어, 적어도 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 또는 90% 더 높은) 수준으로 증식된다. 일부 구현예에서, 단계 (3)으로부터의 세포 집단은 생체 내에 투여된 후, 단계 (2) 이후 및 단계 (3) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포와 비교하여, (예를 들어, 도 4c와 관련하여 실시예 1에 기술된 방법을 이용하여 평가할 때) 더 오래 존속하거나 더 높은(예를 들어, 적어도 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 또는 90% 더 높은) 수준으로 증식된다.
일부 구현예에서, 단계 (3)으로부터의 세포 집단은 단계 (1)의 시작시의 세포 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 증식되지 않는다. 일부 구현예에서, 단계 (3)으로부터의 세포 집단은 단계 (1)의 시작시의 세포 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 또는 40% 이하만큼 증식된다. 일부 구현예에서, 단계 (3)으로부터의 세포 집단은 단계 (1)의 시작시의 세포 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 10% 이하만큼 증식된다. 일부 구현예에서, 단계 (3)으로부터의 세포 집단 중 살아있는 세포의 수는, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 단계 (1)의 시작시의 세포 집단 중 살아있는 세포의 수로부터 감소된다.
일부 구현예에서, 단계 (3)으로부터의 세포 집단은, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 단계 (1)의 시작시의 세포 집단과 비교하여 증식되지 않는다. 일부 구현예에서, 단계 (3)으로부터의 세포 집단은 단계 (1)의 시작시의 세포 집단과 비교하여 0.5, 1, 1.5, 또는 2시간 미만, 예를 들어 1 또는 1.5시간 미만까지 증식된다.
일부 구현예에서, 세포 집단은 (A) CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 (B) 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 시험관 내에서 접촉되지 않거나, 또는 접촉되는 경우 접촉 단계는 2시간 미만, 예를 들어 1 또는 1.5시간 이하이다. 일부 구현예에서, CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제는 CD3을 자극하는 제제(예를 들어, 항-CD3 항체)이다. 일부 구현예에서, 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제는 CD28, ICOS, CD27, HVEM, LIGHT, CD40, 4-1BB, OX40, DR3, GITR, CD30, TIM1, CD2, CD226, 또는 이의 임의의 조합을 자극하는 제제이다. 일부 구현예에서, 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제는 CD28을 자극하는 제제이다. 일부 구현예에서, CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제, 또는 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제는 항체(예를 들어, 단일 도메인 항체(예를 들어, 중쇄 가변 도메인 항체), 펩티바디, Fab 단편, 또는 scFv), 소분자, 또는 리간드(예를 들어, 천연, 재조합, 또는 키메라 리간드)로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 단계 (1) 및/또는 (2)는 5, 4, 3, 2, 1 이하, 또는 0%의 혈청을 포함하는 세포 배지에서 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (1) 및/또는 (2)는 2% 이하의 혈청을 포함하는 세포 배지에서 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (1) 및/또는 (2)는 약 2%의 혈청을 포함하는 세포 배지에서 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (1) 및/또는 (2)는 LSD1 억제제 또는 MALT1 억제제를 포함하는 세포 배지에서 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (1)은 5, 4, 3, 2, 1 이하, 또는 0%의 혈청을 포함하는 세포 배지에서 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (1)은 2% 이하의 혈청을 포함하는 세포 배지에서 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (1)은 약 2%의 혈청을 포함하는 세포 배지에서 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (2)는 5, 4, 3, 2, 1 이하, 또는 0%의 혈청을 포함하는 세포 배지에서 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (2)는 2% 이하의 혈청을 포함하는 세포 배지에서 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (2)는 약 2%의 혈청을 포함하는 세포 배지에서 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (1)은 LSD1 억제제 또는 MALT1 억제제를 포함하는 세포 배지에서 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (2)는 LSD1 억제제 또는 MALT1 억제제를 포함하는 세포 배지에서 수행된다.
일부 구현예에서, 전술한 방법은 단계 (i) 전에 다음 단계를 추가로 포함한다: (iv) 독립체, 예를 들어 실험실, 병원, 또는 의료인으로부터 신선한 백혈구 성분채집 생성물(또는 조혈 조직의 대체 공급원, 예컨대 신선한 전혈 생성물, 신선한 골수 생성물, 또는 신선한 종양 또는 기관 생검물 또는 제거물(예를 들어, 흉선 절제술로부터의 신선한 생성물))을 받는 단계.
일부 구현예에서, 전술한 방법은 단계 (i) 전에 다음 단계를 추가로 포함한다: (v) 신선한 백혈구 성분채집 생성물(또는 조혈 조직의 대체 공급원, 예컨대 신선한 전혈 생성물, 신선한 골수 생성물, 또는 신선한 종양 또는 기관 생검물 또는 제거물(예를 들어, 흉선 절제술로부터의 신선한 생성물))로부터 단계 (i)에서 접촉된 세포(예를 들어, T세포, 예를 들어 CD8+ 및/또는 CD4+ T세포)의 집단을 단리하는 단계. 일부 구현예에서, 단계 (iii)은 단계 (v)의 시작 후 35, 36, 또는 48시간 이내, 예를 들어 단계 (v)의 시작 후 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 또는 48시간 이내, 예를 들어 단계 (v)의 시작 후 30, 36, 또는 48시간 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 단계 (v)의 종료시의 세포 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 증식되지 않거나, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40% 이하, 예를 들어 10% 이하만큼 증식된다.
일부 구현예에서, 전술한 방법은 단계 (i) 전에 다음 단계를 추가로 포함한다: 독립체, 예를 들어 실험실, 병원, 또는 의료인으로부터 백혈구 성분채집 생성물로부터 단리된 동결보존된 T세포(또는 조혈 조직의 대체 공급원, 예컨대 전혈, 골수, 또는 종양 또는 기관 생검 또는 제거(예를 들어, 흉선 절제술)로부터 단리된 동결보존된 T세포)를 받는 단계.
일부 구현예에서, 전술한 방법은 단계 (i) 전에 다음 단계를 추가로 포함한다: (iv) 독립체, 예를 들어 실험실, 병원, 또는 의료인으로부터, 동결보존된 백혈구 성분채집 생성물(또는 조혈 조직의 대체 공급원, 예컨대 동결보존된 전혈 생성물, 동결보존된 골수 생성물, 또는 동결보존된 종양 또는 기관 생검물 또는 제거물(예를 들어, 흉선 절제술로부터의 동결보존된 생성물))을 받는 단계.
일부 구현예에서, 전술한 방법은 단계 (i) 전에 다음 단계를 추가로 포함한다: (v) 동결보존된 백혈구 성분채집 생성물(또는 조혈 조직의 대체 공급원, 예컨대 동결보존된 전혈 생성물, 동결보존된 골수 생성물, 또는 동결보존된 종양 또는 기관 생검물 또는 제거물(예를 들어, 흉선 절제술로부터의 동결보존된 생성물))로부터 단계 (i)에서 접촉된 세포(예를 들어, T세포, 예를 들어 CD8+ 및/또는 CD4+ T세포)의 집단을 단리하는 단계. 일부 구현예에서, 단계 (iii)은 단계 (v)의 시작 후 35, 36, 또는 48시간 이내, 예를 들어 단계 (v)의 시작 후 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 또는 48시간 이내, 예를 들어 단계 (v)의 시작 후 30, 36, 또는 48시간 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 단계 (v)의 종료시의 세포 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 증식되지 않거나, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40% 이하, 예를 들어 10% 이하만큼 증식된다.
일부 구현예에서, 단계 (i) 또는 단계 (1)의 시작시의 세포 집단은 IL6R-발현 세포(예를 들어, IL6Rα 및/또는 IL6Rβ에 대해 양성인 세포)가 강화되었다. 일부 구현예에서, 단계 (i) 또는 단계 (1)의 시작시의 세포 집단은 40, 45, 50, 55, 60, 65, 또는 70% 이상의 IL6R-발현 세포(예를 들어, IL6Rα 및/또는 IL6Rβ에 대해 양성인 세포)를 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (i) 및 (ii) 또는 단계 (1) 및 (2)는 IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))를 포함하는 세포 배지에서 수행된다. 일부 구현예에서, IL-15는 예를 들어 10, 15, 20, 또는 25일 후에 세포 집단이 증식하는 능력을 증가시킨다. 일부 구현예에서, IL-15는 세포 집단 중 IL6Rβ-발현 세포의 백분율을 증가시킨다.
전술한 방법의 일부 구현예에서, 방법은 폐쇄 시스템에서 수행된다. 일부 구현예에서, T세포 분리, 활성화, 형질도입, 인큐베이션, 및 세척은 모두 폐쇄 시스템에서 수행된다. 전술한 방법의 일부 구현예에서, 방법은 별개의 장치에서 수행된다. 일부 구현예에서, T세포 분리, 활성화 및 형질도입, 인큐베이션, 및 세척은 별개의 장치에서 수행된다.
전술한 방법의 일부 구현예에서, 방법은 형질도입 효율을 향상시키기 위해 세포 배양 배지에 보조제 또는 형질도입 강화 시약을 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 보조제 또는 형질도입 강화 시약은 양이온성 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 보조제 또는 형질도입 강화 시약은 LentiBOOSTTM(Sirion Biotech), 벡토퓨신(vectofusin)-1, F108(폴록사머(Poloxamer) 338 또는 Pluronic® F-38), 프로타민 설페이트, 헥사디메트린 브로마이드(Polybrene), PEA, Pluronic F68, Pluronic F127, Synperonic 또는 LentiTrans™로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 형질도입 강화 시약은 LentiBOOSTTM(Sirion Biotech)이다. 일부 구현예에서, 형질도입 강화 시약은 F108(폴록사머 338 또는 Pluronic® F-38)이다.
전술한 방법의 일부 구현예에서, 바이러스 벡터로 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 형질도입시키는 단계는 형질도입 효율이 향상되는 조건하에서 세포 집단 및 바이러스 벡터에 원심력을 가하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 세포는 스핀접종(spinoculation)에 의해 형질도입된다.
전술한 방법의 일부 구현예에서, 세포(예를 들어, T세포)는 기체 교환을 실질적으로 손상시키지 않으면서 큰 배지 부피를 지지하는 기체 투과성 막을 맨 아래 부분에 포함하는 세포 배양 플라스크에서 활성화되고 형질도입된다. 일부 구현예에서, 세포 성장은 대류를 통해 영양분에 대한 접근, 예를 들어 실질적으로 연속된 접근을 제공함으로써 달성된다.
전술한 방법의 일부 구현예에서, CAR은 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 CD19, CD20, CD22, BCMA, 메소텔린, EGFRvIII, GD2, Tn 항원, sTn 항원, Tn-O-글리코펩티드, sTn-O-글리코펩티드, PSMA, CD97, TAG72, CD44v6, CEA, EPCAM, KIT, IL-13Ra2, 레구만(leguman), GD3, CD171, IL-11Ra, PSCA, MAD-CT-1, MAD-CT-2, VEGFR2, LewisY, CD24, PDGFR-베타, SSEA-4, 엽산 수용체 알파, ERBB(예: ERBB2), Her2/neu, MUC1, EGFR, NCAM, 에프린 B2, CAIX, LMP2, sLe, HMWMAA, o-아세틸-GD2, 엽산 수용체 베타, TEM1/CD248, TEM7R, FAP, 레구마인(Legumain), HPV E6 또는 E7, ML-IAP, CLDN6, TSHR, GPRC5D, ALK, 폴리시알산, Fos-관련 항원, 호중구 엘라스타제, TRP-2, CYP1B1, 정자 단백질 17, 베타 인간 융모막 성선자극호르몬, AFP, 티로글로불린, PLAC1, globoH, RAGE1, MN-CA IX, 인간 텔로머라제 역전사효소, 장내 카복실 에스테라제, mut hsp 70-2, NA-17, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, NY-ESO-1, GPR20, Ly6k, OR51E2, TARP, GFRα4, 또는 MHC에 제시된 임의의 이들 항원의 펩티드로부터 선택되는 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 본원에 개시된 CDR, VH, VL, scFv 또는 CAR 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 VH 및 VL을 포함하고, VH 및 VL은 링커에 의해 연결되고, 임의로 링커는 서열번호 63 또는 104의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 막관통 도메인은 T세포 수용체의 알파, 베타, 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, 및 CD154로부터 선택되는 단백질의 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 CD8의 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 서열번호 6의 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 막관통 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 핵산 서열은 서열번호 17의 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 힌지 영역에 의해 막관통 도메인에 연결된다. 일부 구현예에서, 힌지 영역은 서열번호 2, 3, 또는 4의 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 힌지 영역을 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 핵산 서열은 서열번호 13, 14, 또는 15의 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 일차 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 일차 신호전달 도메인은 CD3 제타, TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278(ICOS), FcεRI, DAP10, DAP12, 또는 CD66d로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 일차 신호전달 도메인은 CD3 제타로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 일차 신호전달 도메인은 서열번호 9 또는 10의 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 일차 신호전달 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 핵산 서열은 서열번호 20 또는 21의 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 공동자극 신호전달 도메인은 MHC 클래스 I 분자, TNF 수용체 단백질, 면역글로불린-유사 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구 활성화 분자(SLAM 단백질), 활성화 NK세포 수용체, BTLA, 톨 리간드 수용체, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, 4-1BB(CD137), B7-H3, ICOS(CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM(LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD28-OX40, CD28-4-1BB, 또는 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 공동자극 신호전달 도메인은 4-1BB로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 공동자극 신호전달 도메인은 서열번호 7의 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 공동자극 신호전달 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 핵산 서열은 서열번호 18의 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인 및 CD3 제타로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 7의 아미노산 서열(또는 이에 대해 적어도 약 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열) 및 서열번호 9 또는 10의 아미노산 서열(또는 이에 대해 적어도 약 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열)을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 7의 아미노산 서열 및 서열번호 9 또는 10의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 리더 서열을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 임의의 전술한 방법 또는 본원에 개시된 임의의 기타 방법에 의해 제조된 CAR-발현 세포(예를 들어, 자가 또는 동종이계 CAR-발현 T세포 또는 NK세포)의 집단을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 CAR-발현 세포의 집단 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물이 본원에 개시된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법을 이용하여 제조된 최종 CAR 세포 생성물에서, 비드(예를 들어, CD4 비드, CD8 비드, 및/또는 TransACT 비드)의 총량은 제조 프로세스 중에 첨가된 비드의 총량의 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 또는 0.5% 이하이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 다음 특징 중 하나 이상을 포함하는 CAR-발현 세포(예를 들어, 자가 또는 동종이계 CAR-발현 T세포 또는 NK세포)의 집단을 특징으로 한다: (a) CAR을 발현하도록 조작되기 전의 동일한 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RO- CCR7+ 세포의 백분율과 비교하여 거의 동일한 백분율의 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RO- CCR7+ T세포; (b) 예를 들어, CAR을 발현하도록 조작되기 전의 동일한 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RO- CCR7+ 세포의 백분율과 비교하여 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RO- CCR7+ T세포의 약 5% 내지 약 10% 이내의 변화; (c) CAR을 발현하도록 조작되기 전의 동일한 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RO- CCR7+ 세포의 백분율과 비교하여 증가된, 예를 들어 적어도 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.0, 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 또는 3배만큼 증가된 백분율의 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RO- CCR7+ T세포; (d) CAR을 발현하도록 조작되기 전의 동일한 세포 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CCR7+CD45RO+ T세포의 백분율과 비교하여 거의 동일한 백분율의 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CCR7+CD45RO+ T세포; (e) CAR을 발현하도록 조작되기 전의 동일한 세포 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CCR7+CD45RO+ T세포의 백분율과 비교하여 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CCR7+CD45RO+ T세포의 약 5% 내지 약 10% 이내의 변화; (f) CAR을 발현하도록 조작되기 전의 동일한 세포 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CCR7+CD45RO+ T세포의 백분율과 비교하여 감소된, 예를 들어 적어도 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50%만큼 감소된 백분율의 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CCR7+CD45RO+ T세포; (g) CAR을 발현하도록 조작되기 전의 동일한 세포 집단 중 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 백분율과 비교하여 거의 동일한 백분율의 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포; (h) CAR을 발현하도록 조작되기 전의 동일한 세포 집단 중 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 백분율과 비교하여 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 약 5% 내지 약 10% 이내의 변화; 또는 (i) CAR을 발현하도록 조작되기 전의 동일한 세포 집단 중 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 백분율과 비교하여 증가된 백분율의 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포.
일부 구현예에서, 본 발명은 CAR-발현 세포(예를 들어, 자가 또는 동종이계 CAR-발현 T세포 또는 NK세포)의 집단을 특징으로 하고, (a) 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 TEM 대 아래 TSCM)은 CAR을 발현하도록 조작되기 전의 동일한 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 TEM 대 아래 TSCM)과 거의 동일하거나 약 25, 50, 75, 100, 또는 125% 이하만큼 상이하거나(예를 들어, 증가되거나); (b) 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 Treg 대 아래 Teff)은 CAR을 발현하도록 조작되기 전의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 Treg 대 아래 Teff)과 거의 동일하거나 약 25, 50, 100, 150, 또는 200% 이하만큼 상이하거나(예를 들어, 증가되거나); (c) 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(아래 줄기세포능)은 CAR을 발현하도록 조작되기 전의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(아래 줄기세포능)과 거의 동일하거나 약 25, 50, 100, 150, 200, 또는 250% 이하만큼 상이하거나(예를 들어, 증가되거나); (d) 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 저산소증)은 CAR을 발현하도록 조작되기 전의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 저산소증)과 거의 동일하거나 약 125, 150, 175, 또는 200% 이하만큼 상이하거나(예를 들어, 증가되거나); (e) 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 자가포식)은 CAR을 발현하도록 조작되기 전의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 자가포식)과 거의 동일하거나 약 180, 190, 200, 또는 210% 이하만큼 상이하다(예를 들어, 증가된다).
일부 구현예에서, 본 발명은 대상체의 면역 반응을 증가시키는 방법으로서, 본원에 개시된 CAR-발현 세포의 집단 또는 본원에 개시된 약학적 조성물을 대상체에게 투여하여 대상체의 면역 반응을 증가시키는 단계를 포함하는 방법을 특징으로 한다.
일부 구현예에서, 대상체의 암을 치료하는 방법으로서, 본원에 개시된 CAR-발현 세포의 집단 또는 본원에 개시된 약학적 조성물을 대상체에게 투여하여 대상체의 암을 치료하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 암은 예를 들어, 중피종, 악성 흉막 중피종, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 편평세포 폐암, 대세포 폐암, 췌장암, 췌관 선암종, 식도 선암종, 유방암, 교모세포종, 난소암, 결장직장암, 전립선암, 자궁경부암, 피부암, 흑색종, 신장암, 간암, 뇌암, 흉선종, 육종, 암종, 자궁암, 신장암, 위장암, 요로상피암, 인두암, 두경부암, 직장암, 식도암, 또는 방광암 중 하나 이상, 또는 이의 전이로부터 선택되는 고형암이다. 일부 구현예에서, 암은 예를 들어, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 맨틀세포 림프종(MCL), 다발성 골수종, 급성 림프성 백혈병(ALL), 호지킨 림프종, B세포 급성 림프성 백혈병(BALL), T세포 급성 림프성 백혈병(TALL), 소림프구성 백혈병(SLL), B세포 전림프구성 백혈병, 모세포성 형질세포양 수지상세포 신생물, 버킷 림프종, 확산성 거대 B세포 림프종(DLBCL), 만성 염증과 관련된 DLBCL, 만성 골수성 백혈병, 골수증식성 신생물, 소포 림프종, 소아 소포 림프종, 모발상세포 백혈병, 소세포- 또는 대세포-소포 림프종, 악성 림프증식성 병태, MALT 림프종(점막-관련 림프 조직의 외연 변연부 림프종), 변연부 림프종, 골수이형성증, 골수이형성 증후군, 비호지킨 림프종, 형질모세포성 림프종, 형질세포양 수지상세포 신생물, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 비장 변연부 림프종, 비장 림프종/백혈병, 비장 확산성 적색 속질 소 B세포 림프종, 모발상세포 백혈병-변이체, 림프형질세포성 림프종, 중쇄병, 형질세포 골수종, 뼈의 고립성 형질세포종, 골외 형질세포종, 결절 변연부 림프종, 소아 결절 변연부 림프종, 원발성 피부 소포중심 림프종, 림프종양 육아종증, 원발성 종격동(흉선) 거대 B세포 림프종, 혈관내 거대 B세포 림프종, ALK+ 거대 B세포 림프종, HHV8-관련 다심성 캐슬맨 질환에서 발생하는 거대 B세포 림프종, 원발성 삼출 림프종, B세포 림프종, 급성 골수성 백혈병(AML), 또는 미분류 림프종으로부터 선택되는 액상암이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 제2 치료제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 치료제는 항암 치료제, 예를 들어 화학요법, 방사선요법, 또는 면역조절요법이다. 일부 구현예에서, 제2 치료제는 IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))이다.
일부 양태에서, 본 개시는 CD28에 결합하는 항체 분자로서, 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR1), HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR1), LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, (i) HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 각각 서열번호 538, 539, 540, 530, 531, 및 532의 아미노산 서열을 포함하거나; (ii) HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 각각 서열번호 541, 539, 540, 530, 531, 및 532의 아미노산 서열을 포함하거나; (iii) HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 각각 서열번호 542, 543, 540, 533, 534, 및 535의 아미노산 서열을 포함하거나; (iv) HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 각각 서열번호 544, 545, 546, 536, 534, 및 532의 아미노산 서열을 포함하는. 항체 분자를 특징으로 한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 항-CD28 항체 분자는 (i) 서열번호 547 또는 548의 아미노산 서열, 또는 서열번호 547 또는 548에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH; 및/또는 (ii) 서열번호 537의 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD28 항체 분자는 (i) 서열번호 547의 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 537의 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL; 또는 (ii) 서열번호 548의 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 537의 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD28 항체 분자는 인간 항체, 전장 항체, 이중특이적 항체, Fab, F(ab')2, Fv, 또는 단일쇄 Fv 단편(scFv)이다. 일부 구현예에서, 항체 분자는 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로부터 선택되는 중쇄 불변 영역, 및 카파 또는 람다 경쇄 불변 영역으로부터 선택되는 경쇄 불변 영역을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시는 (i) CD28에 대한 결합을 위해 본원에 기술된 항-CD28 항체 분자와 경쟁하고/하거나; (ii) 본원에 기술된 항-CD28 항체 분자의 에피토프와 동일한 에피토프, 실질적으로 동일한 에피토프, 중첩되는 에피토프, 또는 실질적으로 중첩되는 에피토프에 결합하는 항체 분자를 특징으로 한다.
일부 양태에서, 본 개시는 (i) 항-CD3 결합 도메인 및 (ii) 본원에 기술된 항-CD28 항체 분자를 포함하는 CD28 항원 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 결합 분자를 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 결합 도메인은 (i) 표 27의 항-CD3 항체 분자(예를 들어, 항-CD3 (1), 항-CD3 (2), 항-CD3 (3), 또는 항-CD3 (4))의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3; (ii) 표 27에 제공된 항-CD3 항체 분자(예를 들어, 항-CD3 (1), 항-CD3 (2), 항-CD3 (3), 또는 항-CD3 (4))의 VH 및/또는 VL 영역 중 임의의 하나의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시는 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인을 포함하고, (i) N-말단에서 C-말단 방향으로, 제1 결합 도메인의 VH, 제1 결합 도메인의 VL, 제2 결합 도메인의 VH, CH1, CH2, 및 CH3을 포함하는 제1 폴리펩티드; 및 (ii) N-말단에서 C-말단 방향으로, 제2 결합 도메인의 VL 및 CL을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 다중특이적 결합 분자를 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 제1 결합 도메인은 항-CD3 결합 도메인을 포함하고 제2 결합 도메인은 공동자극 분자 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 결합 도메인은 공동자극 분자 결합 도메인을 포함하고 제2 결합 도메인은 항-CD3 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 공동자극 분자 결합 도메인은 항-CD2 결합 도메인 또는 항-CD28 결합 도메인을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시는 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인을 포함하고, (i) N-말단에서 C-말단 방향으로, 제2 결합 도메인의 VH, CH1, CH2, CH3, 제1 결합 도메인의 VH, 및 제1 결합 도메인의 VL을 포함하는 제1 폴리펩티드; 및 (ii) N-말단에서 C-말단 방향으로, 제2 결합 도메인의 VL 및 CL을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 다중특이적 결합 분자를 특징으로 한다.
일부 구현예에서, 제1 결합 도메인은 항-CD3 결합 도메인을 포함하고 제2 결합 도메인은 공동자극 분자 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 결합 도메인은 공동자극 분자 결합 도메인을 포함하고 제2 결합 도메인은 항-CD3 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 공동자극 분자 결합 도메인은 항-CD2 결합 도메인 또는 항-CD28 결합 도메인을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시는 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인을 포함하고, (i) N-말단에서 C-말단 방향으로, 제2 결합 도메인의 VH, CH1, 제1 결합 도메인의 VH, 제1 결합 도메인의 VL, CH2, 및 CH3을 포함하는 제1 폴리펩티드; 및 (ii) N-말단에서 C-말단 방향으로, 제2 결합 도메인의 VL 및 CL을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 다중특이적 결합 분자를 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 제1 결합 도메인은 항-CD3 결합 도메인을 포함하고 제2 결합 도메인은 공동자극 분자 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 결합 도메인은 공동자극 분자 결합 도메인을 포함하고 제2 결합 도메인은 항-CD3 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 공동자극 분자 결합 도메인은 항-CD2 결합 도메인 또는 항-CD28 결합 도메인을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시는 세포(예를 들어, 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T세포)를 활성화하는 방법으로서, 세포(예를 들어, T세포, 예를 들어 동결된 또는 신선한 백혈구 성분채집 생성물로부터 단리된 T세포)의 집단을 본원에 기술된 다중특이적 결합 분자와 접촉(예를 들어, 결합)시키는 단계를 포함하는 방법을 특징으로 한다.
일부 양태에서, 본 개시는 세포(예를 들어, 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T세포)를 형질도입시키는 방법으로서, 세포(예를 들어, T세포, 예를 들어 동결된 또는 신선한 백혈구 성분채집 생성물로부터 단리된 T세포)의 집단을 (i) 본원에 기술된 다중특이적 결합 분자 및 (ii) 핵산 분자, 예를 들어 CAR을 암호화하는 핵산 분자와 접촉(예를 들어, 결합)시키는 단계를 포함하는 방법을 특징으로 한다.
당업자는 단지 통상적인 실험을 사용하여 본원에 기술된 발명의 특정 구현예에 대한 다수의 균등물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 하기 열거된 구현예에 포함되는 것으로 의도된다.
열거 구현예
1. 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 제조하는 방법으로서,
(i) 세포(예를 들어, T세포, 예를 들어 동결된 또는 신선한 백혈구 성분채집 생성물로부터 단리된 T세포)의 집단을 (A) CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 (B) 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉(예를 들어, 결합)시키는 단계;
(ii) 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 CAR을 암호화하는 핵산 분자(예를 들어, DNA 또는 RNA 분자)와 접촉시켜, 핵산 분자를 포함하는 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 제공하는 단계; 및
(iii) 보관(예를 들어, 동결보존 배지에 세포의 집단을 재제형화) 또는 투여하기 위해 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 수확하는 단계를 포함하고,
(a) 단계 (ii)는 단계 (i)과 함께 또는 단계 (i)의 시작 후 20시간 이내, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18시간 이내, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 18시간 이내에 수행되고,
단계 (iii)은 단계 (i)의 시작 후 30시간 이내(예를 들어, 26시간), 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30시간 이내, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 24시간 이내에 수행되거나,
(b) 단계 (ii)는 단계 (i)과 함께 또는 단계 (i)의 시작 후 20시간 이내, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18시간 이내, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 18시간 이내에 수행되고,
단계 (iii)은 단계 (ii)의 시작 후 30시간 이내, 예를 들어 단계 (ii)의 시작 후 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30시간 이내에 수행되거나,
(c) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 증식되지 않거나, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40% 이하, 예를 들어 10% 이하만큼 증식되고,
임의로 단계 (ii)의 핵산 분자는 바이러스 벡터 상에 있고, 임의로 단계 (ii)의 핵산 분자는 바이러스 벡터 상의 RNA 분자이고, 임의로 단계 (ii)는 CAR을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 바이러스 벡터로 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 형질도입시키는 단계를 포함하고, 임의로 단계 (ii)는 형질도입 중에 보조제로서 F108을 추가하고/하거나 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 Tet2를 표적화하는 shRNA와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
2. 구현예 1에 있어서, CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제는 CD3을 자극하는 제제(예를 들어, 표 27에 제공된 각각의 CDR을 포함하는 항-CD3 또는 항-TCR 항체 단편)이고, 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제는 CD28 또는 CD2, 또는 이들의 임의의 조합을 자극하는 제제(예를 들어, 표 27에 제공된 각각의 CDR을 포함하는 항-CD28 또는 항-CD2 항체 단편)이고, 임의로, CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제는 CD3을 자극하는 제제이고 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제는 다중특이적 결합 분자, 임의로, 도 50a에 제공된 도식 중 임의의 하나로 구성된 이중특이적 항체에 포함되는, 방법.
3. 구현예 1 또는 2에 있어서, 단계 (i)은 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 CAR-발현 세포의 백분율을 증가시키며, 예를 들어 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 단계 (i)이 없는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포와 비교하여, CAR-발현 세포의 더 높은(예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 또는 60% 더 높은) 백분율을 나타내는, 방법.
4. 구현예 1 내지 3 중 어느 한 구현예에 있어서,
(a) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 백분율은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ 세포의 백분율과 동일하거나 5 또는 10% 이하만큼 상이하거나;
(b) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 백분율은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ 세포의 백분율과 비교하여, 예를 들어 적어도 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.0, 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 또는 3배만큼 증가되거나;
(c) 세포 집단 중 CAR-발현 나이브 T세포, 예를 들어 CAR-발현 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 백분율은 단계 (ii)의 기간 중에 증가(예를 들어, 단계 (ii)의 시작 후 18 내지 24시간 사이에 예를 들어, 적어도 30, 35, 40, 45, 50, 55, 또는 60%만큼 증가)하거나;
(d) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 백분율은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ 세포의 백분율과 비교하여 감소하지 않거나, 5 또는 10% 이하만큼 감소하는, 방법.
5. 구현예 1 내지 4 중 어느 한 구현예에 있어서,
(a) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포와 비교하여, 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 더 높은(예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 또는 40% 더 높은) 백분율을 나타내거나;
(b) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 백분율은 단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 백분율보다 높거나(예를 들어, 적어도 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.0, 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 또는 3배 더 높거나);
(c) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 CAR-발현 나이브 T세포, 예를 들어 CAR-발현 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 백분율은 단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포 중 CAR-발현 나이브 T세포, 예를 들어 CAR-발현 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 백분율보다 높거나(예를 들어, 적어도 4, 6, 8, 10, 또는 12배 더 높거나);
(d) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포와 비교하여, 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 더 높은(예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 또는 40% 더 높은) 백분율을 나타내거나;
(e) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 백분율은 단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 백분율보다 높거나(예를 들어, 적어도 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.0, 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 또는 3배 더 높거나);
(f) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 CAR-발현 나이브 T세포, 예를 들어 CAR-발현 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 백분율은 단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포 중 CAR-발현 나이브 T세포, 예를 들어 CAR-발현 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 백분율보다 높은(예를 들어, 적어도 4, 6, 8, 10, 또는 12배 더 높은), 방법.
6. 구현예 1 내지 5 중 어느 한 구현예에 있어서,
(a) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CD95+ 중심 기억 T세포의 백분율은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CD95+ 중심 기억 T세포의 백분율과 동일하거나 5 또는 10% 이하만큼 상이하거나;
(b) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CCR7+CD45RO+ T세포의 백분율은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CCR7+CD45RO+ T세포의 백분율과 비교하여 적어도 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50%만큼 감소되거나;
(c) CAR-발현 중심 기억 T세포, 예를 들어 CAR-발현 CCR7+CD45RO+ 세포의 백분율은 단계 (ii)의 기간 중에 감소(예를 들어, 단계 (ii)의 시작 후 18 내지 24시간 사이에 예를 들어, 적어도 8, 10, 12, 14, 16, 18, 또는 20%만큼 감소)하거나;
(d) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CCR7+CD45RO+ T세포의 백분율은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CCR7+CD45RO+ T세포의 백분율과 비교하여 증가하지 않거나, 5 또는 10% 이하만큼 증가하는, 방법.
7. 구현예 1 내지 6 중 어느 한 구현예에 있어서,
(a) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포와 비교하여, 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CD95+ 중심 기억 T세포의 더 낮은(예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 또는 40% 더 낮은) 백분율을 나타내거나;
(b) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CCR7+CD45RO+ T세포의 백분율은 단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CCR7+CD45RO+ T세포의 백분율보다 낮거나(예를 들어, 적어도 20, 30, 40, 또는 50% 더 낮거나);
(c) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 CAR-발현 중심 기억 T세포, 예를 들어 CAR-발현 CCR7+CD45RO+ T세포의 백분율은 단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포 중 CAR-발현 중심 기억 T세포, 예를 들어 CAR-발현 CCR7+CD45RO+ T세포의 백분율보다 낮거나(예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 또는 40% 더 낮거나);
(d) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포와 비교하여, 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CD95+ 중심 기억 T세포의 더 낮은(예를 들어, 10, 20, 30, 또는 40% 더 낮은) 백분율을 나타내거나;
(e) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CCR7+CD45RO+ T세포의 백분율은 단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CCR7+CD45RO+ T세포의 백분율보다 낮거나(예를 들어, 적어도 20, 30, 40, 또는 50% 더 낮거나);
(f) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 CAR-발현 중심 기억 T세포, 예를 들어 CAR-발현 CCR7+CD45RO+ T세포의 백분율은 단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포 중 CAR-발현 중심 기억 T세포, 예를 들어 CAR-발현 CCR7+CD45RO+ T세포의 백분율보다 낮은(예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 또는 40% 더 낮은), 방법.
8. 구현예 1 내지 7 중 어느 한 구현예에 있어서,
(a) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 백분율은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단 중 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 백분율과 비교하여 증가되거나;
(b) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 CAR-발현 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CAR-발현 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 백분율은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단 중 CAR-발현 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CAR-발현 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 백분율과 비교하여 증가되거나;
(c) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 백분율은 단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포 중 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 백분율보다 높거나;
(d) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 CAR-발현 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CAR-발현 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 백분율은 단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포 중 CAR-발현 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CAR-발현 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 백분율보다 높거나;
(e) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 백분율은 단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포 중 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 백분율보다 높거나;
(f) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 CAR-발현 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CAR-발현 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 백분율은 단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포 중 CAR-발현 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CAR-발현 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 백분율보다 높은, 방법.
9. 구현예 1 내지 8 중 어느 한 구현예에 있어서,
(a) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 TEM 대 아래 TSCM)은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 TEM 대 아래 TSCM)과 거의 동일하거나 약 25, 50, 75, 100, 또는 125% 이하만큼 상이하거나(예를 들어, 증가되거나);
(b) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 TEM 대 아래 TSCM)은
단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포, 또는
단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포
의 유전자 세트 점수 중앙값(위 TEM 대 아래 TSCM)보다 낮거나(예를 들어, 적어도 약 100, 150, 200, 250, 또는 300% 더 낮거나);
(c) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 Treg 대 아래 Teff)은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 Treg 대 아래 Teff)과 거의 동일하거나 약 25, 50, 100, 150, 또는 200% 이하만큼 상이하거나(예를 들어, 증가되거나);
(d) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 Treg 대 아래 Teff)은
단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포, 또는
단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포
의 유전자 세트 점수 중앙값(위 Treg 대 아래 Teff)보다 낮거나(예를 들어, 적어도 약 50, 100, 125, 150, 또는 175% 더 낮거나);
(e) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(아래 줄기세포능)은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(아래 줄기세포능)과 거의 동일하거나 약 25, 50, 100, 150, 200, 또는 250% 이하만큼 상이하거나(예를 들어, 증가되거나);
(f) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(아래 줄기세포능)은
단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포, 또는
단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포
의 유전자 세트 점수 중앙값(아래 줄기세포능)보다 낮거나(예를 들어, 적어도 약 50, 100, 또는 125% 더 낮거나);
(g) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 저산소증)은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 저산소증)과 거의 동일하거나 약 125, 150, 175, 또는 200% 이하만큼 상이하거나(예를 들어, 증가되거나);
(h) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 저산소증)은
단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포, 또는
단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포
의 유전자 세트 점수 중앙값(위 저산소증)보다 낮거나(예를 들어, 적어도 약 40, 50, 60, 70, 또는 80% 더 낮거나);
(j) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 자가포식)은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 자가포식)과 거의 동일하거나 약 180, 190, 200, 또는 210% 이하만큼 상이하거나(예를 들어, 증가되거나);
(k) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 자가포식)은
단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포, 또는
단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포
의 유전자 세트 점수 중앙값(위 자가포식)보다 낮은(예를 들어, 적어도 20, 30, 또는 40% 더 낮은), 방법.
10. 구현예 1 내지 9 중 어느 한 구현예에 있어서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 CAR에 의해 인식되는 항원을 발현하는 세포와 함께 인큐베이션된 후, 예를 들어 도 29c 및 도 29d와 관련하여 실시예 8에 기술된 방법을 이용하여 평가할 때, 단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포, 또는 단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포보다 더 높은(예를 들어, 적어도 2, 4, 6, 8, 10, 12, 또는 14배 더 높은) 수준으로 IL-2를 분비하는, 방법.
11. 구현예 1 내지 10 중 어느 한 구현예에 있어서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 생체 내에 투여된 후, 단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포와 비교하여, 또는 단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포와 비교하여, (예를 들어, 도 4c와 관련하여 실시예 1에 기술된 방법을 이용하여 평가할 때) 더 오래 존속하거나 더 높은 수준으로 증식되는, 방법.
12. 구현예 1 내지 11 중 어느 한 구현예에 있어서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 생체 내에 투여된 후, 단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포, 또는 단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포보다 더 강한 항종양 활성(예를 들어, 낮은 용량, 예를 들어 0.15 x 106, 0.2 x 106, 0.25 x 106, 또는 0.3 x 106개 이하의 생존 가능한 CAR-발현 세포의 용량에서 더 강한 항종양 활성)을 나타내는, 방법.
13. 구현예 1 내지 12 중 어느 한 구현예에 있어서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 증식되지 않거나, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40% 이하만큼 증식되고, 임의로 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 살아있는 세포의 수는 단계 (i)의 시작시의 세포 집단 중 살아있는 세포의 수로부터 감소하는, 방법.
14. 구현예 1 내지 13 중 어느 한 구현예에 있어서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단과 비교하여 증식되지 않거나, 2시간 미만, 예를 들어 1시간 또는 1.5시간 미만까지 증식되는, 방법.
15. 구현예 1 내지 14 중 어느 한 구현예에 있어서, 단계 (i) 및/또는 (ii)는 IL-2, IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)), IL-7, IL-21, IL-6(예를 들어, IL-6/sIL-6Ra), LSD1 억제제, MALT1 억제제, 또는 이의 조합을 포함하는 세포 배지(예를 들어, 무혈청 배지)에서 수행되는, 방법.
16. 구현예 1 내지 15 중 어느 한 구현예에 있어서, 단계 (i) 및/또는 (ii)는 혈청 대체물을 포함하는 무혈청 세포 배지에서 수행되는, 방법.
17. 구현예 16에 있어서, 혈청 대체물은 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물(ICSR)인, 방법.
18. 구현예 1 내지 17 중 어느 한 구현예에 있어서, 단계 (i) 이전에
(iv) (임의로) 독립체, 예를 들어 실험실, 병원, 또는 의료인으로부터 신선한 백혈구 성분채집 생성물(또는 조혈 조직의 대체 공급원, 예컨대 신선한 전혈 생성물, 신선한 골수 생성물, 또는 신선한 종양 또는 기관 생검물 또는 제거물(예를 들어, 흉선 절제술로부터의 신선한 생성물))을 받는 단계, 및
(v) 신선한 백혈구 성분채집 생성물(또는 조혈 조직의 대체 공급원, 예컨대 신선한 전혈 생성물, 신선한 골수 생성물, 또는 신선한 종양 또는 기관 생검물 또는 제거물(예를 들어, 흉선 절제술로부터의 신선한 생성물))로부터 단계 (i)에서 접촉된 세포(예를 들어, T세포, 예를 들어 CD8+ 및/또는 CD4+ T세포)의 집단을 단리하는 단계를 추가로 포함하고, 임의로
단계 (iii)은 단계 (v)의 시작 후 35시간 이내, 예를 들어 단계 (v)의 시작 후 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 또는 35시간 이내, 예를 들어 단계 (v)의 시작 후 30시간 이내에 수행되거나,
단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 단계 (v)의 종료시의 세포 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 증식되지 않거나, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40% 이하, 예를 들어 10% 이하만큼 증식되는, 방법.
19. 구현예 1 내지 17 중 어느 한 구현예에 있어서, 단계 (i) 이전에 독립체, 예를 들어 실험실, 병원, 또는 의료인으로부터 백혈구 성분채집 생성물로부터 단리된 동결보존된 T세포(또는 조혈 조직의 대체 공급원, 예컨대 전혈, 골수, 또는 종양 또는 기관 생검 또는 제거(예를 들어, 흉선 절제술)로부터 단리된 동결보존된 T세포)를 받는 단계를 추가로 포함하는 방법.
20. 구현예 1 내지 17 중 어느 한 구현예에 있어서, 단계 (i) 이전에
(iv) (임의로) 독립체, 예를 들어 실험실, 병원, 또는 의료인으로부터, 동결보존된 백혈구 성분채집 생성물(또는 조혈 조직의 대체 공급원, 예컨대 동결보존된 전혈 생성물, 동결보존된 골수 생성물, 또는 동결보존된 종양 또는 기관 생검물 또는 제거물(예를 들어, 흉선 절제술로부터의 동결보존된 생성물))을 받는 단계, 및
(v) 동결보존된 백혈구 성분채집 생성물(또는 조혈 조직의 대체 공급원, 예컨대 동결보존된 전혈 생성물, 동결보존된 골수 생성물, 또는 동결보존된 종양 또는 기관 생검물 또는 제거물(예를 들어, 흉선 절제술로부터의 동결보존된 생성물))로부터 단계 (i)에서 접촉된 세포(예를 들어, T세포, 예를 들어 CD8+ 및/또는 CD4+ T세포)의 집단을 단리하는 단계를 추가로 포함하고, 임의로
단계 (iii)은 단계 (v)의 시작 후 35시간 이내, 예를 들어 단계 (v)의 시작 후 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 또는 35시간 이내, 예를 들어 단계 (v)의 시작 후 30시간 이내에 수행되거나,
단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 단계 (v)의 종료시의 세포 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 증식되지 않거나, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40% 이하, 예를 들어 10% 이하만큼 증식되는, 방법.
21. 구현예 1 내지 20 중 어느 한 구현예에 있어서,
단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 일부를 적어도 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 또는 7일 동안, 예를 들어 2일 이상 7일 이하 동안 배양하고, 이 일부에서 CAR 발현 수준을 측정하는(예를 들어, 이 일부에서 생존 가능한 CAR-발현 세포의 백분율을 측정하는) 단계 (vi)를 추가로 포함하고, 임의로
단계 (iii)은 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 수확하고 동결시키는 단계를 포함하고 단계 (vi)은 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 일부를 해동시키고, 이 일부를 적어도 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 또는 7일 동안, 예를 들어 2일 이상 7일 이하 동안 배양하고, 이 일부에서 CAR 발현 수준을 측정하는(예를 들어, 이 일부에서 생존 가능한 CAR-발현 세포의 백분율을 측정하는) 단계를 포함하는, 방법.
22. 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 제조하는 방법으로서,
(1) 세포(예를 들어, T세포, 예를 들어 동결된 백혈구 성분채집 생성물로부터 단리된 T세포)의 집단을 IL-2, IL-7, IL-15, IL-21, IL-6, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 사이토카인과 접촉시키는 단계,
(2) 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 CAR을 암호화하는 핵산 분자(예를 들어, DNA 또는 RNA 분자)와 접촉시켜, 핵산 분자를 포함하는 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 제공하는 단계; 및
(3) 보관(예를 들어, 동결보존 배지에 세포의 집단을 재제형화) 또는 투여하기 위해 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 수확하는 단계를 포함하고,
(a) 단계 (2)는 단계 (1)과 함께 또는 단계 (1)의 시작 후 5시간 이내, 예를 들어 단계 (1)의 시작 후 1, 2, 3, 4, 또는 5시간 이내에 수행되고,
단계 (3)은 단계 (1)의 시작 후 26시간 이내, 예를 들어 단계 (1)의 시작 후 22, 23, 또는 24시간 이내, 예를 들어 단계 (1)의 시작 후 24시간 이내에 수행되거나,
(b) 단계 (3)으로부터의 세포 집단은 단계 (1)의 시작시의 세포 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 증식되지 않거나, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40% 이하, 예를 들어 10% 이하만큼 증식되고,
임의로 단계 (2)의 핵산 분자는 바이러스 벡터 상에 있고, 임의로 단계 (2)의 핵산 분자는 바이러스 벡터 상의 RNA 분자이고, 임의로 단계 (2)는 CAR을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 바이러스 벡터로 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 형질도입시키는 단계를 포함하고, 임의로 단계 (2)는 형질도입 중에 보조제로서 F108을 추가하고/하거나 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 Tet2를 표적화하는 shRNA와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
23. 구현예 22에 있어서, 단계 (1)은 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 IL-2와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
24. 구현예 22에 있어서, 단계 (1)은 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 IL-7과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
25. 구현예 22에 있어서, 단계 (1)은 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
26. 구현예 22에 있어서, 단계 (1)은 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 IL-21과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
27. 구현예 22에 있어서, 단계 (1)은 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 IL-6(예를 들어, IL-6/sIL-6Ra)과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
28. 구현예 22에 있어서, 단계 (1)은 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 IL-7 및 IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
29. 구현예 22에 있어서, 단계 (1)은 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 IL-7 및 IL-21과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
30. 구현예 22에 있어서, 단계 (1)은 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)) 및 IL-21과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
31. 구현예 22에 있어서, 단계 (1)은 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 IL-7, IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)), 및 IL-21과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
32. 구현예 22에 있어서, 단계 (1)은 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 IL-6(예를 들어, IL-6/sIL-6Ra) 및 IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
33. 구현예 22에 있어서, 단계 (1)은 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 IL-2 및 IL-6(예를 들어, IL-6/sIL-6Ra)과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
34. 구현예 22 내지 33 중 어느 한 구현예에 있어서, 단계 (3)으로부터의 세포 집단은 세포 집단을 예를 들어, 항-CD3 항체와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포와 비교하여, CAR-발현 세포 중 나이브 세포의 더 높은(예를 들어, 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40% 더 높은) 백분율을 나타내는, 방법.
35. 구현예 22 내지 34 중 어느 한 구현예에 있어서, 단계 (3)으로부터의 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 백분율은
(a) 단계 (1)의 시작시의 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ 세포의 백분율과 동일하거나 5 또는 10% 이하만큼 상이하거나,
(b) 단계 (1)의 시작시의 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ 세포의 백분율과 비교하여 증가되는, 예를 들어 적어도 10 또는 20%만큼 증가되는, 방법.
36. 구현예 22 내지 35 중 어느 한 구현예에 있어서, 단계 (3)으로부터의 세포 집단은 단계 (3)이 단계 (1)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (1)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포와 비교하여, 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 더 높은(예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 또는 40% 더 높은) 백분율을 나타내는, 방법.
37. 구현예 22 내지 36 중 어느 한 구현예에 있어서, 단계 (3)으로부터의 세포 집단은 단계 (2) 이후 및 단계 (3) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포와 비교하여, 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 더 높은(예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 또는 40% 더 높은) 백분율을 나타내는, 방법.
38. 구현예 22 내지 37 중 어느 한 구현예에 있어서, 단계 (3)으로부터의 세포 집단은 생체 내에 투여된 후, 단계 (3)이 단계 (1)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (1)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포와 비교하여, (예를 들어, 도 4c와 관련하여 실시예 1에 기술된 방법을 이용하여 평가할 때) 더 오래 존속하거나 더 높은 수준으로 증식되는, 방법.
39. 구현예 22 내지 38 중 어느 한 구현예에 있어서, 단계 (3)으로부터의 세포 집단은 생체 내에 투여된 후, 단계 (2) 이후 및 단계 (3) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포와 비교하여, (예를 들어, 도 4c와 관련하여 실시예 1에 기술된 방법을 이용하여 평가할 때) 더 오래 존속하거나 더 높은 수준으로 증식되는, 방법.
40. 구현예 22 내지 39 중 어느 한 구현예에 있어서, 단계 (3)으로부터의 세포 집단은 단계 (1)의 시작시의 세포 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 증식되지 않거나, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40% 이하만큼 증식되고, 임의로 단계 (3)으로부터의 세포 집단 중 살아있는 세포의 수는 단계 (1)의 시작시의 세포 집단 중 살아있는 세포의 수로부터 감소하는, 방법.
41. 구현예 22 내지 40 중 어느 한 구현예에 있어서, 단계 (3)으로부터의 세포 집단은 단계 (1)의 시작시의 세포 집단과 비교하여 증식되지 않거나, 2시간 미만, 예를 들어 1시간 또는 1.5시간 미만까지 증식되는, 방법.
42. 구현예 22 내지 41 중 어느 한 구현예에 있어서, 세포 집단은 (A) CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 (B) 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 시험관 내에서 접촉되지 않거나, 또는 접촉되는 경우 접촉 단계는 2시간 미만, 예를 들어 1 또는 1.5시간 이하인, 방법.
43. 구현예 42에 있어서, CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제는 CD3을 자극하는 제제(예를 들어, 표 27에 제공된 각각의 CDR을 포함하는 항-CD3 또는 항-TCR 항체 단편)이고, 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제는 CD28 또는 CD2, 또는 이들의 임의의 조합을 자극하는 제제(예를 들어, 표 27에 제공된 각각의 CDR을 포함하는 항-CD28 또는 항-CD2 항체 단편)이고, 임의로, CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제는 CD3을 자극하는 제제이고 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제는 다중특이적 결합 분자, 임의로, 도 50a에 제공된 도식 중 임의의 하나로 구성된 이중특이적 항체에 포함되는, 방법.
44. 구현예 22 내지 43 중 어느 한 구현예에 있어서, 단계 (1) 및/또는 (2)는
5, 4, 3, 2, 1 이하, 또는 0%의 혈청(임의로 단계 (1) 및/또는 (2)는 약 2%의 혈청을 포함하는 세포 배지에서 수행됨), 또는
LSD1 억제제 또는 MALT1 억제제
를 포함하는 세포 배지에서 수행되는, 방법.
45. 구현예 22 내지 44 중 어느 한 구현예에 있어서, 독립체, 예를 들어 실험실, 병원, 또는 의료인으로부터, 동결보존된 백혈구 성분채집 생성물(또는 조혈 조직의 대체 공급원, 예컨대 동결보존된 전혈 생성물, 동결보존된 골수 생성물, 또는 동결보존된 종양 또는 기관 생검물 또는 제거물(예를 들어, 흉선 절제술로부터의 동결보존된 생성물))을 받는 단계를 추가로 포함하는 방법.
46. 구현예 1 내지 45 중 어느 한 구현예에 있어서, 단계 (i) 또는 단계 (1)의 시작시의 세포 집단은 IL6R-발현 세포(예를 들어, IL6Rα 및/또는 IL6Rβ에 대해 양성인 세포)가 강화된, 방법.
47. 구현예 1 내지 46 중 어느 한 구현예에 있어서, 단계 (i) 또는 단계 (1)의 시작시의 세포 집단은 50, 60, 또는 70% 이상의 IL6R-발현 세포(예를 들어, IL6Rα 및/또는 IL6Rβ에 대해 양성인 세포)를 포함하는, 방법.
48. 구현예 1 내지 47 중 어느 한 구현예에 있어서, 단계 (i) 및 (ii) 또는 단계 (1) 및 (2)는 IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))를 포함하는 세포 배지에서 수행되는, 방법.
49. 구현예 48에 있어서, IL-15는 예를 들어 10, 15, 20, 또는 25일 후에 세포 집단이 증식하는 능력을 증가시키는, 방법.
50. 구현예 48에 있어서, IL-15는 세포 집단 중 IL6Rβ-발현 세포의 백분율을 증가시키는, 방법.
51. 구현예 1 내지 50 중 어느 한 구현예에 있어서, CAR은 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 방법.
52. 구현예 51에 있어서, 항원 결합 도메인은 CD19, CD20, CD22, BCMA, 메소텔린, EGFRvIII, GD2, Tn 항원, sTn 항원, Tn-O-글리코펩티드, sTn-O-글리코펩티드, PSMA, CD97, TAG72, CD44v6, CEA, EPCAM, KIT, IL-13Ra2, 레구만(leguman), GD3, CD171, IL-11Ra, PSCA, MAD-CT-1, MAD-CT-2, VEGFR2, LewisY, CD24, PDGFR-베타, SSEA-4, 엽산 수용체 알파, ERBB(예: ERBB2), Her2/neu, MUC1, EGFR, NCAM, 에프린 B2, CAIX, LMP2, sLe, HMWMAA, o-아세틸-GD2, 엽산 수용체 베타, TEM1/CD248, TEM7R, FAP, 레구마인(Legumain), HPV E6 또는 E7, ML-IAP, CLDN6, TSHR, GPRC5D, ALK, 폴리시알산, Fos-관련 항원, 호중구 엘라스타제, TRP-2, CYP1B1, 정자 단백질 17, 베타 인간 융모막 성선자극호르몬, AFP, 티로글로불린, PLAC1, globoH, RAGE1, MN-CA IX, 인간 텔로머라제 역전사효소, 장내 카복실 에스테라제, mut hsp 70-2, NA-17, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, NY-ESO-1, GPR20, Ly6k, OR51E2, TARP, GFRα4, 또는 MHC에 제시된 임의의 이들 항원의 펩티드로부터 선택되는 항원에 결합하는, 방법.
53. 구현예 51 또는 52에 있어서, 항원 결합 도메인은 본원에 개시된 CDR, VH, VL, scFv, 또는 CAR 서열을 포함하고, 임의로
(a) 항원 결합 도메인은 BCMA에 결합하고, 표 3 내지 15에 개시된 CDR, VH, VL, scFv, 또는 CAR 서열, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
(b) 항원 결합 도메인은 CD19에 결합하고, 표 2에 개시된 CDR, VH, VL, scFv, 또는 CAR 서열, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
(c) 항원 결합 도메인은 CD20에 결합하고, 본원에 개시된 CDR, VH, VL, scFv, 또는 CAR 서열, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
(d) 항원 결합 도메인은 CD22에 결합하고, 본원에 개시된 CDR, VH, VL, scFv, 또는 CAR 서열, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 방법.
54. 구현예 51 내지 53 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원 결합 도메인은 VH 및 VL을 포함하고, VH와 VL은 링커에 의해 연결되고, 임의로 링커는 서열번호 63 또는 104의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
55. 구현예 51 내지 54 중 어느 한 구현예에 있어서,
(a) 막관통 도메인은 T세포 수용체의 알파, 베타, 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, 및 CD154로부터 선택되는 단백질의 막관통 도메인을 포함하거나,
(b) 막관통 도메인은 CD8의 막관통 도메인을 포함하거나,
(c) 막관통 도메인은 서열번호 6의 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나,
(d) 핵산 분자는 막관통 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 핵산 서열은 서열번호 17의 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 방법.
56. 구현예 51 내지 55 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원 결합 도메인은 힌지 영역에 의해 막관통 도메인에 연결되고, 임의로
(a) 힌지 영역은 서열번호 2, 3, 또는 4의 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나,
(b) 핵산 분자는 힌지 영역을 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 핵산 서열은 서열번호 13, 14, 또는 15의 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 방법.
57. 구현예 51 내지 56 중 어느 한 구현예에 있어서, 세포내 신호전달 도메인은 일차 신호전달 도메인을 포함하고, 임의로 일차 신호전달 도메인은 CD3 제타, TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278(ICOS), FcεRI, DAP10, DAP12, 또는 CD66d로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하고, 임의로
(a) 일차 신호전달 도메인은 CD3 제타로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하거나,
(b) 일차 신호전달 도메인은 서열번호 9 또는 10의 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나,
(c) 핵산 분자는 일차 신호전달 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 핵산 서열은 서열번호 20 또는 21의 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 방법.
58. 구현예 51 내지 57 중 어느 한 구현예에 있어서, 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 신호전달 도메인을 포함하고, 임의로 공동자극 신호전달 도메인은 MHC 클래스 I 분자, TNF 수용체 단백질, 면역글로불린-유사 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구 활성화 분자(SLAM 단백질), 활성화 NK세포 수용체, BTLA, 톨 리간드 수용체, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, 4-1BB(CD137), B7-H3, ICOS(CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM(LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD28-OX40, CD28-4-1BB, 또는 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하고, 임의로
(a) 공동자극 신호전달 도메인은 4-1BB로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하거나,
(b) 공동자극 신호전달 도메인은 서열번호 7의 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나,
(c) 핵산 분자는 공동자극 신호전달 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 핵산 서열은 서열번호 18의 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 방법.
59. 구현예 51 내지 58 중 어느 한 구현예에 있어서, 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인 및 CD3 제타로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하고, 임의로 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 7의 아미노산 서열(또는 이에 대해 적어도 약 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열) 및 서열번호 9 또는 10의 아미노산 서열(또는 이에 대해 적어도 약 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열)을 포함하고, 임의로 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 7의 아미노산 서열 및 서열번호 9 또는 10의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
60. 구현예 51 내지 59 중 어느 한 구현예에 있어서, CAR은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 리더 서열을 추가로 포함하는, 방법.
61. 구현예 1 내지 60 중 어느 한 구현예의 방법에 의해 제조된 CAR-발현 세포(예를 들어, 자가 또는 동종이계 CAR-발현 T세포 또는 NK세포)의 집단.
62. CAR을 발현하도록 조작된 세포의 집단("CAR-발현 세포의 집단")으로서,
(a) CAR을 발현하도록 조작되기 전의 동일한 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RO- CCR7+ 세포의 백분율과 비교하여 거의 동일한 백분율의 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RO- CCR7+ T세포;
(b) 예를 들어, CAR을 발현하도록 조작되기 전의 동일한 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RO- CCR7+ 세포의 백분율과 비교하여 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RO- CCR7+ T세포의 약 5% 내지 약 10% 이내의 변화;
(c) CAR을 발현하도록 조작되기 전의 동일한 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RO- CCR7+ 세포의 백분율과 비교하여 증가된, 예를 들어 적어도 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.0, 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 또는 3배만큼 증가된 백분율의 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RO- CCR7+ T세포;
(d) CAR을 발현하도록 조작되기 전의 동일한 세포 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CCR7+CD45RO+ T세포의 백분율과 비교하여 거의 동일한 백분율의 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CCR7+CD45RO+ T세포;
(e) CAR을 발현하도록 조작되기 전의 동일한 세포 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CCR7+CD45RO+ T세포의 백분율과 비교하여 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CCR7+CD45RO+ T세포의 약 5% 내지 약 10% 이내의 변화;
(f) CAR을 발현하도록 조작되기 전의 동일한 세포 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CCR7+CD45RO+ T세포의 백분율과 비교하여 감소된, 예를 들어 적어도 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50%만큼 감소된 백분율의 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CCR7+CD45RO+ T세포;
(g) CAR을 발현하도록 조작되기 전의 동일한 세포 집단 중 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 백분율과 비교하여 거의 동일한 백분율의 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포;
(h) CAR을 발현하도록 조작되기 전의 동일한 세포 집단 중 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 백분율과 비교하여 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 약 5% 내지 약 10% 이내의 변화; 또는
(i) CAR을 발현하도록 조작되기 전의 동일한 세포 집단 중 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 백분율과 비교하여 증가된 백분율의 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포
를 포함하는 집단.
63. CAR을 발현하도록 조작된 세포의 집단("CAR-발현 세포의 집단")으로서,
(a) 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 TEM 대 아래 TSCM)은 CAR을 발현하도록 조작되기 전의 동일한 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 TEM 대 아래 TSCM)과 거의 동일하거나 약 25, 50, 75, 100, 또는 125% 이하만큼 상이하거나(예를 들어, 증가되거나);
(b) 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 Treg 대 아래 Teff)은 CAR을 발현하도록 조작되기 전의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 Treg 대 아래 Teff)과 거의 동일하거나 약 25, 50, 100, 150, 또는 200% 이하만큼 상이하거나(예를 들어, 증가되거나);
(c) 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(아래 줄기세포능)은 CAR을 발현하도록 조작되기 전의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(아래 줄기세포능)과 거의 동일하거나 약 25, 50, 100, 150, 200, 또는 250% 이하만큼 상이하거나(예를 들어, 증가되거나);
(d) 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 저산소증)은 CAR을 발현하도록 조작되기 전의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 저산소증)과 거의 동일하거나 약 125, 150, 175, 또는 200% 이하만큼 상이하거나(예를 들어, 증가되거나);
(e) 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 자가포식)은 CAR을 발현하도록 조작되기 전의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 자가포식)과 거의 동일하거나 약 180, 190, 200, 또는 210% 이하만큼 상이한(예를 들어, 증가된), 집단.
64. 구현예 61 내지 63 중 어느 한 구현예의 CAR-발현 세포의 집단 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
65. 대상체의 면역 반응을 증가시키는 방법으로서, 구현예 61 내지 63 중 어느 한 구현예의 CAR-발현 세포의 집단 또는 구현예 64의 약학적 조성물을 대상체에게 투여하여 대상체의 면역 반응을 증가시키는 단계를 포함하는 방법.
66. 대상체의 암을 치료하는 방법으로서, 구현예 61 내지 63 중 어느 한 구현예의 CAR-발현 세포의 집단 또는 구현예 64의 약학적 조성물을 대상체에게 투여하여 대상체의 암을 치료하는 단계를 포함하는 방법.
67. 구현예 66에 있어서, 암은 예를 들어, 중피종, 악성 흉막 중피종, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 편평세포 폐암, 대세포 폐암, 췌장암, 췌관 선암종, 식도 선암종, 유방암, 교모세포종, 난소암, 결장직장암, 전립선암, 자궁경부암, 피부암, 흑색종, 신장암, 간암, 뇌암, 흉선종, 육종, 암종, 자궁암, 신장암, 위장암, 요로상피암, 인두암, 두경부암, 직장암, 식도암, 또는 방광암 중 하나 이상, 또는 이의 전이로부터 선택되는 고형암인, 방법.
68. 구현예 66에 있어서, 암은 예를 들어, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 맨틀세포 림프종(MCL), 다발성 골수종, 급성 림프성 백혈병(ALL), 호지킨 림프종, B세포 급성 림프성 백혈병(BALL), T세포 급성 림프성 백혈병(TALL), 소림프구성 백혈병(SLL), B세포 전림프구성 백혈병, 모세포성 형질세포양 수지상세포 신생물, 버킷 림프종, 확산성 거대 B세포 림프종(DLBCL), 만성 염증과 관련된 DLBCL, 만성 골수성 백혈병, 골수증식성 신생물, 소포 림프종, 소아 소포 림프종, 모발상세포 백혈병, 소세포- 또는 대세포-소포 림프종, 악성 림프증식성 병태, MALT 림프종(점막-관련 림프 조직의 외연 변연부 림프종), 변연부 림프종, 골수이형성증, 골수이형성 증후군, 비호지킨 림프종, 형질모세포성 림프종, 형질세포양 수지상세포 신생물, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 비장 변연부 림프종, 비장 림프종/백혈병, 비장 확산성 적색 속질 소 B세포 림프종, 모발상세포 백혈병-변이체, 림프형질세포성 림프종, 중쇄병, 형질세포 골수종, 뼈의 고립성 형질세포종, 골외 형질세포종, 결절 변연부 림프종, 소아 결절 변연부 림프종, 원발성 피부 소포중심 림프종, 림프종양 육아종증, 원발성 종격동(흉선) 거대 B세포 림프종, 혈관내 거대 B세포 림프종, ALK+ 거대 B세포 림프종, HHV8-관련 다심성 캐슬맨 질환에서 발생하는 거대 B세포 림프종, 원발성 삼출 림프종, B세포 림프종, 급성 골수성 백혈병(AML), 또는 미분류 림프종으로부터 선택되는 액상암인, 방법.
69. 구현예 65 내지 68 중 어느 한 구현예에 있어서, 제2 치료제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
70. 구현예 69에 있어서, 제2 치료제는 IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))인, 방법.
71. 구현예 69에 있어서, 제2 치료제는 이브루티닙인, 방법.
72. 구현예 71에 있어서, 이브루티닙은 약 600 mg, 약 550 mg, 약 500 mg, 약 480 mg, 약 460 mg, 약 440 mg, 약 420 mg, 약 400 mg, 약 350 mg, 약 300 mg, 약 280 mg, 약 250 mg, 약 200 mg, 약 190 mg, 약 180 mg, 약 170 mg, 약 160 mg, 약 150 mg, 약 140 mg, 약 130 mg, 약 120 mg, 또는 100 mg의 용량으로 1일 1회 투여되는, 방법.
73. 구현예 71에 있어서, 이브루티닙은 420 mg, 280 mg, 또는 140 mg의 용량으로 1일 1회 투여되는, 방법.
74. 구현예 71 내지 73 중 어느 한 구현예에 있어서, 이브루티닙은 CAR-발현 세포의 집단의 투여 전에, 투여와 동시에, 또는 투여 후에 투여되는, 방법.
75. 구현예 65 내지 74 중 어느 한 구현예에 있어서, CAR-발현 세포의 집단은 구현예 21에서 측정된 CAR-발현 세포의 백분율에 기초하여 결정된 용량으로 투여되는, 방법.
76. 구현예 65 내지 75 중 어느 한 구현예에 있어서, CAR-발현 세포(예를 들어, CD19 CAR-발현 세포)의 집단은 약 0.5 x 106 내지 50 x 106개의 생존 가능한 CAR-발현 세포, 예를 들어 약 5 x 106개의 생존 가능한 CAR-발현 세포의 용량으로 투여되고, 임의로 CAR-발현 세포(예를 들어, CD19 CAR-발현 세포)의 집단은 5 x 106개의 생존 가능한 CAR-발현 세포의 용량으로 투여되는, 방법.
77. 구현예 65 내지 75 중 어느 한 구현예에 있어서, CAR-발현 세포(예를 들어, CD19 CAR-발현 세포)의 집단은 약 2.5 x 106 내지 2.5 x 108개의 생존 가능한 CAR-발현 세포, 예를 들어 약 2.5 x 107개의 생존 가능한 CAR-발현 세포의 용량으로 투여되고, 임의로 CAR-발현 세포(예를 들어, CD19 CAR-발현 세포)의 집단은 2.5 x 107개의 생존 가능한 CAR-발현 세포의 용량으로 투여되는, 방법.
78. 구현예 65 내지 75 중 어느 한 구현예에 있어서, CAR-발현 세포(예를 들어, CD19 CAR-발현 세포)의 집단은 약 1.25 x 107 내지 1.25 x 109개의 생존 가능한 CAR-발현 세포, 예를 들어 약 1.25 x 108개의 생존 가능한 CAR-발현 세포의 용량으로 투여되고, 임의로 CAR-발현 세포(예를 들어, CD19 CAR-발현 세포)의 집단은 1.25 x 108개의 생존 가능한 CAR-발현 세포의 용량으로 투여되는, 방법.
79. 구현예 65 내지 75 중 어느 한 구현예에 있어서, CAR-발현 세포(예를 들어, BCMA CAR-발현 세포)의 집단은 약 2.5 x 106 내지 2.5 x 108개의 생존 가능한 CAR-발현 세포, 예를 들어 약 1 x 107 또는 5 x 107개의 생존 가능한 CAR-발현 세포의 용량으로 투여되는, 방법.
80. 구현예 66 내지 79 중 어느 한 구현예에 있어서, 대상체는 CLL 또는 SLL이 있는, 방법.
81. 구현예 66 내지 79 중 어느 한 구현예에 있어서, 대상체는 DLBCL, 예를 들어 재발성 및/또는 불응성 DLBCL이 있는, 방법.
82. 구현예 65 내지 81 중 어느 한 구현예에 있어서, 대상체는 사이토카인 방출 증후군의 징후에 대해, 예를 들어 적어도 2, 2.5, 3, 3.5, 또는 4일 동안, 예를 들어 약 3일 동안 모니터링되는, 방법.
83. 구현예 61 내지 63 중 어느 한 구현예 또는 구현예 64에 있어서, CAR-발현 세포의 집단의 유효량 또는 약학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체의 면역 반응을 증가시키는 방법에 사용하기 위한 CAR-발현 세포의 집단 또는 약학적 조성물.
84. 구현예 61 내지 63 중 어느 한 구현예 또는 구현예 64에 있어서, CAR-발현 세포의 집단의 유효량 또는 약학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체의 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 CAR-발현 세포의 집단 또는 약학적 조성물.
본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 아래에 기술되어 있다. 본원에 언급된 모든 공개문헌, 특허 출원, 특허, 및 기타 참고문헌(예컨대, 서열 데이터베이스 참조 번호)은 그 전문이 참조로 포함된다. 예를 들어, 본 명세서(예를 들어, 본 명세서의 임의의 표)에서 언급된 모든 GenBank, Unigene, 및 Entrez 서열은 참조로 포함된다. 하나의 유전자 또는 단백질이 복수의 서열 수탁번호를 참조하는 경우, 모든 서열 변이체가 포함된다.
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도 1a 내지 도 1i: 정제된 T세포를 사이토카인과 인큐베이션시킬 때, 나이브 세포가 형질도입된 우세한 집단이었다. 도 1a는 예시적인 사이토카인 프로세스를 보여주는 그래프이다. 도 1b는 형질도입 후 각각의 표시된 시점에서의 CD3+ CAR+ 세포의 백분율을 보여주는 한 쌍의 그래프이다. 도 1c는 두 독립 공여체에서의 사이토카인 단독 집단(우)과 비교한 CD3/CD28 비드 자극 집단(좌)의 CD3+CCR7+CD45RO- 집단 내에서의 형질도입을 보여주는 그래프 세트이다. 도 1c에서 "Short stim IL7+IL15"로 나타낸 샘플의 경우, 세포를 2일 동안 비드로 자극한 다음, IL7 및 IL15의 존재하에 세포를 제거하였다. 도 1d, 도 1e, 및 도 1f는 3일의 기간에 걸쳐 IL2(도 1d), IL15(도 1e), 및 IL7+IL15(도 1f)와 함께 배양된 T세포 서브세트의 형질도입을 보여주는 유세포 분석 그래프 세트이다. 도 1g는 IL2(우측 상단 패널) 또는 IL-15(우측 하단 패널)로 자극한 후의 CCR7 및 CD45RO에 대한 0일차(좌) 및 1일차(우) T세포 분화를 보여주는 유세포 분석 그래프 세트이다. 도 1h 및 도 1i는 0일차 또는 표시된 사이토카인과의 24시간 인큐베이션 후의 CD3+CCR7+RO-, CD3+CCR7+RO+, CD3+CCR7-RO+, 및 CD3+CCR7-RO- 세포의 백분율을 보여주는 그래프 세트이다.
도 2a 내지 도 2d: 1일의 사이토카인 자극으로 생성된 CART는 기능적이었다. 도 2a: 정제된 T세포를 1의 MOI로 형질도입시켰고, 테스트된 모든 사이토카인 조건에서, 1일차 및 10일차에 관찰된 CAR-발현 세포의 백분율은 유사하였다. CART는 1일 이내에 생성되었고, 생체내 환경을 모방하기 위해 9일 동안 수확 후에 CD3/CD28 비드를 통해 증식시켰다. 도 2a는 1일차 CART(좌) 및 10일차 CART(우)에 대한 각각의 조건하에서 CD3+ CAR+ 세포의 평균 백분율을 보여주는 한 쌍의 그래프이다. 도 2b: Nalm6을 표적 세포로 사용하여 증식 후 1일차 CART의 세포독성 능력을 측정하였다. 도 2b는 각 조건으로부터의 CART에 의한 CD19 양성 Nalm6 세포의 사멸 %를 보여주는 그래프이다. CD3/CD28 비드를 사용하여 증식된 10일차 CART를 "10일차"로 표시하였다. 다른 모든 샘플은 1일차 CART였다. 도 2c: Nalm6 표적 세포에 대한 반응으로 증식된 1일차 CART의 IFNg의 분비를 테스트하였다. 도 2c는 CD19 양성 또는 CD19 음성 표적 세포의 존재하에 각 조건으로부터의 CART에 의한 IFN-감마 분비량을 보여주는 그래프이다. 도 2d: EDU의 통합을 측정하여 1일차 CART의 증식 능력을 테스트하였다. 도 2d는 각 조건에 대한 EDU 양성 세포의 평균 백분율을 보여주는 그래프이다. 도 2b와 유사하게, 10일차 CART를 "10일차"로 표시하였고, 다른 모든 샘플은 1일차 CART였다.
도 3a 및 도 3b: 0일차 형질도입에 미치는 MOI 및 배지 조성의 영향. 도 3a: 정제된 T세포를 IL15, IL2+IL15, IL2+IL7, 또는 IL7+IL15의 존재하에 1 내지 10의 MOI 범위로 형질도입시켰다. 사용된 사이토카인과 관계없이, 형질도입의 선형 증가가 관찰되었다. 도 3a는 각 테스트 조건에 대한 CD3+ CAR+ 세포의 백분율을 MOI에 대해 도식화한 그래프 세트이다. 도 3b: 배지의 조성은 사이토카인 프로세스의 형질도입에 영향을 미쳤다. 도 3b는 각 테스트 조건에 대한 1일차(좌) 또는 8일차(우) CD3+ CAR+ 세포의 백분율을 보여주는 한 쌍의 그래프이다. "2.50"은 2.50의 MOI를 나타낸다. "5.00"은 5.00의 MOI를 나타낸다.
도 4a 내지 도 4d: 24시간 이내에 생성된 CAR T세포는 종양을 제거할 수 있다. 도 4a: 정제된 T세포를 항-CD19 CAR로 형질도입시키고, 24시간 후에 수확하였다. 도 4a는 IL2, IL15, 및 IL7+IL15와 함께 배양된 항-CD19 CAR을 사용한 T세포의 형질도입을 보여주는 유세포 분석 플롯 세트로서, 각 사이토카인 조건에 따른 형질도입을 예시한다. 도 4b: 모든 테스트 조건에서 80% 초과의 평균 생존능을 보여주는 그래프. 도 4c: 말초혈액에서 1일차 CART의 증식은 10일차 대응물과 비교하여 생체 내에서 증가된다. 각 테스트 조건에 대한 주입 후 표시된 시점에서의 살아있는 CD45+CD11b-CD3+CAR+ 세포의 백분율. 10일차 CART를 "D10 1e6" 또는 "D10 5e6"으로 표시하였고, 다른 모든 샘플은 1일차 CART였다. 도 4d: 1일차 CART는 10일차 CART와 비교하여 지연된 동역학을 나타내지만 생체 내에서 종양을 제거할 수 있었다. 도 4d는 각 테스트 조건에 대한 종양 접종 후 표시된 시점에서의 총 플럭스를 보여주는 그래프이다. CART는 종양 접종 후 4일 후에 투여되었다. 10일차 CART를 "5e6 d. 10"으로 표시하였고, 다른 모든 샘플은 1일차 CART였다.
도 5a 및 도 5b: 사이토카인 프로세스는 확장성이 있었다. 도 5a: T세포는 CliniMACS® Prodigy® 상에서 강화되었고, B세포 구획은 1% 미만으로 감소되었다. 도 5a는 류코팩(leukopak) 세포(위) 또는 CD4+CD8+ 강화 후 세포(아래)에 대한 항-CD3 항체(좌) 또는 항-CD19 항체 및 항-CD14 항체(우)를 사용한 세포 염색을 보여주는 유세포 분석 플롯 세트이다. 도 5b: 동결된 성분채집으로부터의 정제된 T세포를 강화 후 24웰 플레이트 또는 PL30 백에서 항-CD19 CAR로 형질도입시켰다. 24시간 후에 CART를 수확하였다. 도 5b는 IL2 또는 hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)의 존재하에 제조된 세포의 CAR 및 CD3에 대한 염색을 보여주는 유세포 분석 플롯 세트이다.
도 6a 내지 도 6c: 활성화 프로세스에 의해 제조된 CART는 생체 내에서 우수한 항종양 효능을 나타냈다. 도 6a 및 도 6b는 종양 이식 후 표시된 시점에 대한 종양 부담을 도식화한 그래프이다. "d.1"은 활성화 프로세스를 이용하여 제조된 CART를 나타낸다. "d.9"는 이 연구에서 양성 대조군으로 사용되는, 종래의 9일 증식 프로토콜로 제조된 CART를 나타낸다. 도 6c는 마우스로부터의 생체발광을 보여주는 대표적인 이미지 세트이다.
도 7a 및 도 7b: IL6Rα 및 IL6Rβ 발현 세포는 덜 분화된 T세포 집단에서 강화되었다. 신선한 T세포를 표시된 표면 항원에 대해 염색하고, CD4(도 7a) 및 CD8(도 7b) T세포 서브세트 상에서의 IL6Rα 및 IL6Rβ의 발현 수준을 조사하였다.
도 8a 및 도 8b: IL6Rα 및 IL6Rβ 발현 세포는 둘 다 덜 분화된 T세포 집단에서 강화되었다. 신선한 T세포를 표시된 표면 항원에 대해 염색하고, CD4(도 8a) 및 CD8(도 8b) T세포 서브세트 상에서의 표시된 표면 항원의 발현 수준을 조사하였다.
도 9: IL6Rα 발현 세포는 덜 분화된 T세포의 표면 마커를 발현하였다. 신선한 T세포를 표시된 표면 항원에 대해 염색하고, IL6Rα 고, 중, 저 발현 세포 서브세트 상에서의 다양한 표면 항원의 발현 수준을 조사하였다.
도 10: IL6Rβ 발현 세포는 덜 분화된 T세포의 표면 마커를 발현하였다. 신선한 T세포를 표시된 표면 항원에 대해 염색하고, IL6Rβ 고, 중, 저 발현 세포 서브세트 상에서의 다양한 표면 항원의 발현 수준을 조사하였다.
도 11: IL6Rα 발현은 TCR 결합 후 하향 조절되었으나, IL6Rβ 발현은 그렇지 않았다. 0일차에 αCD3αCD28 비드로 T세포를 활성화한 다음, 표시된 시점에서 IL6Rα 및 IL6Rβ의 발현 수준을 조사하였다.
도 12: TCR 결합 후 사이토카인 처치된 T세포의 증식 배수. 표시된 사이토카인의 존재하에 0일차에 αCD3αCD28 비드로 T세포를 활성화한 다음, 표시된 시점에서 세포 수를 모니터링하였다.
도 13a 및 도 13b: IL2, IL7, 및 IL15 처치는 TCR 결합 후 세포 크기 및 생존능에 영향을 미치지 않았다. 표시된 사이토카인의 존재하에 0일차에 αCD3αCD28 비드로 T세포를 활성화한 다음, 표시된 시점에서 세포 크기(도 13a) 및 생존능(도 13b)을 모니터링하였다.
도 14: 사이토카인 처치 후 CD4 T세포에서의 다양한 표면 분자의 발현 동역학. 표시된 사이토카인의 존재하에 0일차에 αCD3αCD28 비드로 T세포를 활성화한 다음, 표시된 시점에서 유세포 분석에 의해 다양한 표면 분자의 발현을 조사하였다.
도 15: 사이토카인 처치 후 CD8 T세포에서의 다양한 표면 분자의 발현 동역학. 표시된 사이토카인의 존재하에 0일차에 αCD3αCD28 비드로 T세포를 활성화한 다음, 표시된 시점에서 유세포 분석에 의해 다양한 표면 분자의 발현을 조사하였다.
도 16: IL6Rβ 발현은 TCR 결합 후 주로 CD27 발현 T세포 서브세트로 제한되었다. 표시된 사이토카인의 존재하에 0일차에 αCD3αCD28 비드로 T세포를 활성화한 다음, 15일차에 유세포 분석에 의해 IL6Rβ의 발현을 조사하였다.
도 17: IL6Rβ 발현은 TCR 결합 후 주로 CD57 비발현 T세포 서브세트로 제한되었다. 표시된 사이토카인의 존재하에 0일차에 αCD3αCD28 비드로 T세포를 활성화한 다음, 25일차에 유세포 분석에 의해 IL6Rβ의 발현을 조사하였다.
도 18: 일반적인 γ-쇄 사이토카인으로 처치된 T세포는 25일차에 기능적 사이토카인을 생성하였다. 표시된 사이토카인의 존재하에 0일차에 αCD3αCD28 비드로 T세포를 활성화한 다음, 25일차에 유세포 분석에 의해 IL2, IFNγ, 및 TNFα 생성 T세포의 백분율을 조사하였다.
도 19a 및 도 19b: 건강한 두 공여체의 T세포에서 MOI=2.5의 ARM을 이용한 1일차 BCMA CAR 발현. 도 19a는 유세포 분석에 의해 측정된 BCMA CAR 발현을 보여주는 히스토그램 패널이다. 도 19b는 유세포 분석에 사용된 시약/조건을 열거하는 표이다.
도 20a, 도 20b, 및 도 20c: ARM 프로세스를 이용하여 제조된 세포의 1일차에서 4일차까지의 시험관내 CAR 발현 동역학. CAR은 3일차에 안정적으로 발현되었다. 도 20a는 유세포 분석에 의해 측정된 표시된 시점에서의 CAR 발현을 보여주는 히스토그램 패널이다. 도 20b 및 도 20c는 각각 시간 경과에 따른 CAR+% 및 MFI 값을 보여주는 그래프이다.
도 21a 및 도 21b: KMS-11-luc 다발성 골수종 이종이식 마우스 모델에서 생체내 분류. 각각의 마우스에 1.5E6의 1일차 CART 생성물을 투여하였다. 도 21a는 CART 세포에서의 1일차 및 7일차 CAR 발현을 보여주는 히스토그램 패널이다. 도 21b는 CART 처치 후의 종양 동역학(BLI 수준)을 보여주는 그래프이다.
도 22a, 도 22b, 및 도 22c: KMS-11-luc 다발성 골수종 이종이식 마우스 모델에서 용량 적정을 이용한 BCMA CAR의 생체내 분류. 도 22a는 1일차 및 3일차 CAR 발현을 보여주는 히스토그램 패널이다. 도 22b는 2가지 상이한 용량, 1.5e5 CAR+ T세포의 용량 및 5e4 CAR+ T세포의 용량을 사용한 CART 처치 후 종양 흡수 동역학을 보여주는 그래프이다. CAR+ 세포의 용량을 3일차 CAR 발현에 기초하여 정규화하였다. 도 22c는 이 연구 과정에 걸친 체중 동역학을 보여주는 그래프이다.
도 23a, 도 23b, 및 도 23c. 도 23a 및 도 23b는 시간 경과에 따라 관찰된, 세포 표면에서 CAR을 발현하는 T세포의 백분율(도 23a) 및 CD3+CAR+ 세포의 평균 형광 강도(MFI)(도 23b)를 보여주는 그래프이다(도 23c에 나타낸 2개의 플로우 패널로부터 반복 효율의 평균을 낸다). 도 23c는 UTD 샘플을 기반으로 하여, 생존 가능한 CD3+ 세포에서의 표면 CAR 발현에 대한 게이팅 전략을 보여주는 유세포 분석 플롯의 패널이다. 플롯의 숫자는 CAR 양성 백분율을 나타낸다.
도 24a 및 도 24b. 도 24a는 배양 개시 후 다양한 시점에서 출발물질(Prodigy® 생성물) 및 수확시의 종단간 조성을 보여주는 그래프이다. 나이브(n), 중심 기억(cm), 이펙터 기억(em), 및 이펙터(eff) 서브세트를 CD4, CD8, CCR7, 및 CD45RO의 표면 발현 또는 이의 결여로 규정하였다. CD4의 조성이 표시되어 있다. 각 시점에 대해, 좌측 막대는 전체 CD3+ 집단(벌크)의 세포 조성을 보여주고, 우측 막대는 CAR+ 분획의 세포 조성을 보여준다. 도 24b는 전체 CD3+ 집단(벌크) 및 CAR+ 분획 내의 전체 형질도입 효율(윗줄), CD4/CD8 조성(가운데 줄), 및 기억 서브세트(아랫줄)를 결정하기 위해 살아있는 CD3+ 이벤트에 적용된 게이팅 전략을 보여주는 유세포 분석 플롯 패널이다.
도 25. 각각의 서브세트 내의 생존 가능한 세포의 수로 표현된, 시간 경과에 따른 표면 CAR을 발현하는 T세포 서브세트의 동역학.
도 26. 세척 전의 수로부터 결정한, 배양 개시 후 12 내지 24시간 후의 생존 가능한 세포 회수율(시딩된 생존 가능한 세포의 수에 대한 수확시 회수된 생존 가능한 세포의 수).
도 27. 수확시 세척 전 및 세척 후 결정한, 배양 개시 후 12 내지 24시간 후에 수확된 신속 CART의 생존능.
도 28a, 도 28b, 도 28c, 및 도 28d. 도 28a는 유세포 분석에 의해 분석한 출발물질(건강한 공여체 류코팩; LKPK) 및 T세포 강화 생성물의 조성을 보여주는 그래프이다. 숫자는 모체(살아있는, 단일 세포)의 %를 나타낸다. T: T세포; 모노: 단핵구; B: B세포; CD56(NK): NK세포. 도 28b는 형질도입율(전방 산란 FSC 대 CAR) 및 T세포 서브세트(CD4 대 CD8 및 CCR7 대 CD45RO)를 결정하는 데 사용된 살아있는 CD3+ 이벤트에 대한 게이팅 전략을 보여주는 유세포 분석 플롯 패널이다. ARM-CD19 CAR(활성화된 신속 제조(Activated Rapid Manufacturing, ARM) 프로세스를 이용하여 제조된 CD19 CART 세포) 및 TM-CD19 CAR(종래의 제조(traditional manufacturing, TM) 프로세스를 이용하여 제조된 CD19 CART 세포)에 대해, 좌측 하단의 패널은 벌크 배양물을 나타내고, 우측 패널은 CAR+ T세포를 나타낸다. "ARM-UTD" 및 "TM-UTD"는 각각 ARM 및 TM 프로세스 따라 제조된 비형질도입 T세포(UTD)를 지칭한다. 사분면의 숫자는 모체 집단의 %를 나타낸다. TM-UTD 및 TM-CD19 CAR 플롯의 박스는 TM 프로세스에 대한 TCM 표현형으로의 편향을 나타낸다. ARM-UTD 및 ARM-CD19 CAR 플롯의 박스는 ARM 프로세스에 의한 나이브-유사 세포의 유지를 나타낸다. NA: 해당 없음. 도 28c는 ARM-CD19 CAR 및 TM-CD19 CAR의 종단간 T세포 조성을 보여주는 그래프이다. 해당되는 경우 "벌크" 및 "CAR+" 집단에 대한 조성이 표시되어 있다. 각 집단의 백분율은 해당되는 경우 CD3+ 또는 CAR+CD3+인 모체의 %를 나타낸다. 각각의 벌크 또는 CAR+ 집단의 CD4 세포의 %가 표시되어 있다. LKPK: 류코팩 출발물질; 4 및 8: 각각 CD4+ 및 CD8+; eff: 이펙터; em: 이펙터 기억; cm: 중심 기억; n: 나이브-유사. 데이터는 3개의 다른 건강한 공여체(n=3)에 대한 3회의 전체 규모의 실행 및 프로세스를 최적화하는 데 사용된 몇몇 소규모 실행을 대표한다. 도 28d는 도 28c에 표시된 백분율을 나타내는 표이다.
도 29a, 도 29b, 도 29c, 및 도 29d. 세포 배양 상청액의 사이토카인 농도. IFN-γ(도 29a 및 도 29b) 및 IL-2(도 29c 및 도 29d). 도 29a 및 도 29c: TM-CD19 CAR, ARM-CD19 CAR, 및 각각의 UTD를 NALM6-WT(ALL), TMD-8(DLBCL)과 함께, 또는 암세포 없이(T세포 단독) 공동배양하였다. 48시간 후에 상청액을 수집하였다. 도 29b 및 도 29d: ARM-CD19 CAR을 NALM6-WT, NALM6-19KO(CD19-음성)와 함께 또는 단독으로 공동배양하였다. 24시간 또는 48시간 후에 상청액을 수집하였다. 항원-특이적 사이토카인 분비를 추가로 평가하기 위해, ARM-CD19 CAR을 24시간 동안 단독으로 배양하고 세척한 다음, 표적 세포와 함께 24시간 동안 공동배양하였다. 표시된 데이터는 2개의 건강한 공여체 T세포로부터 유래한 것으로, 총 3개의 공여체를 사용한 2개의 실험을 대표한다.
도 30a, 도 30b, 및 도 30c. 도 30a는 ARM-CD19 CAR의 항종양 활성을 연구하기 위한 이종이식 마우스 모델의 개요를 나타내는 그래프이다. 도 30b는 센티넬 바이알로부터의 ARM-CD19 CAR 세포에서의 CAR 발현의 결정을 보여주는 유세포 분석 플롯 패널이다. 유세포 분석 전에 ARM-CD19 CAR 세포를 도면에 기재된 기간 동안 배양하였다. CAR 발현에 대한 게이팅은 이소형 대조군(Iso) 염색을 기초로 하였다. 도 30c는 이종이식 마우스 모델에서 ARM-CD19 CAR의 생체내 효능을 보여주는 그래프이다. 루시퍼라제 리포터 유전자를 발현하는 pre-B ALL 세포주 NALM6을 NSG 마우스에 주사하였다. 종양 부담은 전체 신체 발광(p/s)으로 표현되며, 95% 신뢰 구간과 함께 평균 종양 부담으로 나타냈다. 종양 접종 후 7일차에, 마우스를 각각의 용량(생존 가능한 CAR+ T세포의 수)의 ARM-CD19 CAR 또는 TM-CD19 CAR로 처치하였다. 고용량 ARM-CD19 CAR군은 X-GVHD의 발병으로 인해 33일차에 종료되었다. 비히클(PBS) 및 비형질도입 T세포(UTD)는 음성 대조군으로 사용되었다. ARM-UTD 1×106 용량 및 모든 TM-CD19 CAR 용량군에 대해 n=4인 것을 제외하고, 모든 군에 대한 마우스 수 n=5. 5개의 다른 건강한 공여체로부터 생성된 CAR-T세포로 5개의 이종이식 연구를 실행하였으며, 그중 3개는 TM-CD19 CAR과의 비교를 포함하였다.
도 31의 A, B, C, 및 D. 각각의 CAR-T 세포 용량의 ARM-CD19 CAR 또는 TM-CD19 CAR로 처치된 NALM6 종양 보유 마우스의 혈장 사이토카인 수준. 마우스를 채혈하고, MSD 분석에 의해 혈장 사이토카인을 측정하였다. CAR-T(도 31의 A 및 C) 또는 ARM- 및 TM-UTD 세포(도 31의 B 및 D)로 처치된 마우스에 대해 IFN-γ(도 31의 A 및 B) 및 IL-2(도 31의 C 및 D)를 나타냈다. 각 용량 내의 막대는 상이한 시점에서의 군 내의 평균 사이토카인 수준을 나타낸다(좌측으로부터: 4, 7, 10, 12, 16, 19, 23, 26일차). 수평 막대 및 숫자는 본문에 기재된 ARM-CD19 CAR(1×106 용량군) 및 TM-CD19 CAR(0.5×106 용량군) 간의 배수 변화 비교를 나타낸다: IFN-γ의 경우 3배; IL-2의 경우 10배. 종양 부담 또는 체중 감소로 인해 제외된 군은 마지막 시점을 나타내지 않는다. 2개의 연구에 대해 혈장 사이토카인 수준을 측정하였다. no tum: 종양 없음.
도 32. PBS 비히클, UTD, TM-CD19 CAR, 또는 ARM-CD19 CAR로 처치된 NALM6 종양 보유 마우스의 전체 및 CAR+ T세포 농도의 시간적 추이. CAR-T 세포 주사 후 4, 7, 14, 21, 및 28일 후에 혈액 샘플을 채취하였다. 전체 T세포(CD3+, 위) 및 CAR+ T세포(CD3+CAR+, 아래) 농도를 지정된 시점에 유세포 분석에 의해 분석하고, 95% 신뢰 구간과 함께 평균 세포로 나타냈다.
도 33a 및 도 33b. 3자 공동배양 상청액의 IL-6 단백질 수준(pg/mL). ARM-CD19 CAR/K562 공동배양 세포(도 33a) 또는 TM-CD19 CAR/K562 공동배양 세포(도 33b)를 상이한 비율(1:1 및 1:2.5)로 6시간 또는 24시간 동안 인큐베이션시킨 다음, PMA 분화된 THP-1 세포에 첨가하여 24시간 더 인큐베이션시켰다. K562-CD19 세포와 공동배양된 CAR-T 세포, K562-메소텔린 세포와 공동배양된 CAR-T 세포, 및 CAR-T 세포 단독으로부터의 결과를 나타냈다. 명확성을 위해 1:5 비율은 표시하지 않았다. ARM-CD19 CAR 단독 및 TM-CD19 CAR 단독 표시된 막대는 표적 세포가 없는 CAR-T 세포 배양물(6시간, 24시간)을 나타낸다. 평균 + SEM, n= 1(TM-CD19 CAR) 및 n= 3(ARM-CD19 CAR)의 2반복.
도 34의 A, B, 및 C. ARM 프로세스는 BCMA CAR+T세포의 줄기세포능을 보존한다. ARM 프로세스를 이용하여 제조된 PI61, R1G5, 및 BCMA10 CART 세포를 대상으로 해동시(도 34의 A) 및 해동 48시간 후(도 34의 B)의 CAR 발현을 평가하였다. 해동 48시간 후 생성물에 대해 CCR7/CD45RO 마커를 또한 평가하였다(도 34의 C). 표시된 데이터는 2개의 공여체 T세포를 사용하여 수행된 2개의 실험으로부터 대표되는 한 가지이다.
도 35의 A 및 B. TM 프로세스는 주로 중심 기억 T세포(TCM)(CD45RO+/CCR7+)를 생성한 반면, 나이브-유사 T세포 집단은 TM 프로세스를 통해 CAR+ T세포에서 거의 사라졌다. TM 프로세스를 이용하여 제조된 PI61, R1G5, 및 BCMA10 CART 세포를 대상으로 9일차 CAR 발현을 평가하였다(도 35의 A). 9일차 해동 후 생성물에 대해 CCR7/CD45RO 마커를 또한 평가하였다(도 35의 B). 표시된 데이터는 2개의 공여체 T세포를 사용하여 수행된 2개의 실험으로부터 대표되는 한 가지이다.
도 36의 A, B, C, 및 D. ARM 처리된 BCMA CAR-T 세포는 BCMA 특이적 활성화를 나타내고, 더 높은 수준의 IL2 및 IFN-γ를 분비한다. 세포 배양 상청액의 IL-2 및 IFN-γ 농도. ARM 또는 TM 프로세스를 이용하여 제조된 PI61, R1G5, 및 BCMA10 CART 세포, 및 각각의 UTD를 2.5:1의 비율로 KMS-11과 공동배양하였다. 20시간 후에 상청액을 수집하였다. ARM 생성물의 경우, IFN-γ 농도를 도 36의 A에 나타냈고, IL-2 농도를 도 36의 B에 나타냈다. TM 생성물의 경우, IFN-γ 농도를 도 36의 C에 나타냈고, IL-2 농도를 도 36의 D에 나타냈다. 표시된 데이터는 2개의 공여체 T세포를 사용하여 수행된 2개의 실험으로부터 대표되는 한 가지이다.
도 37의 A, B, 및 C. 투입 세포(도 37의 A), 1일차 세포(도 37의 B), 및 9일차 세포(도 37의 C)에 대한 단일 세포 RNA-seq 데이터. "nGene" 그래프는 세포당 발현된 유전자의 수를 보여준다. "nUMI" 그래프는 세포당 고유 분자 식별자(unique molecular identifier)의 수를 보여준다.
도 38a, 도 38b, 도 38c, 및 도 38d. 유전자 CCNB1, CCND1, CCNE1, PLK1, 및 MKI67의 발현을 기초로 결정한, 증식 표지에 대한 투입 세포(도 38a), 1일차 세포(도 38b), 및 9일차 세포(도 38c)를 비교하는 T-분산 확률적 이웃 임베딩(T-Distributed Stochastic Neighbor Embedding, TSNE) 플롯. 각각의 점은 해당 샘플에서의 세포를 나타낸다. 연회색으로 표시된 세포는 증식 유전자를 발현하지 않는 반면, 어두운 음영의 세포는 증식 유전자 중 하나 이상을 발현한다. 도 38d는 1일차 세포, 9일차 세포, 및 투입 세포에 대한 휴면 대 활성화 T세포 상태를 특성화하는 유전자로 구성된 유전자 세트에 대한 유전자 세트 점수의 분포를 보여주는 바이올린 플롯이다. 도 38d에서, 더 높은 유전자 세트 점수(위 휴면 대 아래 활성화)는 증가하는 휴면 T세포 표현형을 나타내는 반면, 더 낮은 유전자 세트 점수(위 휴면 대 아래 활성화)는 증가하는 활성화 T세포 표현형을 나타낸다. 투입 세포는 9일차 및 1일차 세포와 비교하여 전반적으로 휴면 상태가 더 많이 있었다. 1일차 세포는 가장 큰 활성화 유전자 세트 점수를 보여준다.
도 39a, 도 39b, 도 39c, 도 39d, 및 도 39e. 투입 세포, 1일차 세포, 및 9일차 세포에 대한 유전자 세트 분석. 도 39a에서, "위 TEM 대 아래 TSCM" 유전자 세트에 대한 더 높은 유전자 세트 점수는 해당 샘플의 세포 중 증가하는 이펙터 기억 T세포(TEM) 표현형을 나타내는 반면, 더 낮은 유전자 세트 점수는 증가하는 줄기세포 기억 T세포(TSCM) 표현형을 나타낸다. 도 39b에서, "위 Treg 대 아래 Teff" 유전자 세트에 대한 더 높은 유전자 세트 점수는 증가하는 조절 T세포(Treg) 표현형을 나타내는 반면, 더 낮은 유전자 세트 점수는 증가하는 이펙터 T세포(Teff) 표현형을 나타낸다. 도 39c에서, "아래 줄기세포능" 유전자 세트에 대한 더 낮은 유전자 세트 점수는 증가하는 줄기세포능 표현형을 나타낸다. 도 39d에서, "위 저산소증" 유전자 세트에 대한 더 높은 유전자 세트 점수는 증가하는 저산소증 표현형을 나타낸다. 도 39e에서, "위 자가포식" 유전자 세트에 대한 더 높은 유전자 세트 점수는 증가하는 자가포식 표현형을 나타낸다. 1일차 세포는 기억, 줄기-유사, 및 분화 표지의 측면에서 투입 세포와 유사해 보였다. 반대로, 9일차 세포는 대사 스트레스에 대해 더 높은 강화를 보여준다.
도 40의 A, B, 및 C. 투입 세포에 대한 유전자 클러스터 분석. 도 40의 A 내지 C는 투입 세포의 4개 클러스터의 유전자 세트 분석으로부터의 유전자 세트 점수를 보여주는 바이올린 플롯이다. 도 40의 A 내지 C의 바이올린 플롯을 덮는 각각의 점은 세포의 유전자 세트 점수를 나타낸다. 도 40의 A에서, "위 Treg 대 아래 Teff" 유전자 세트의 더 높은 유전자 세트 점수는 증가하는 Treg 세포 표현형을 나타내는 반면, "위 Treg 대 아래 Teff" 유전자 세트의 더 낮은 유전자 세트 점수는 증가하는 Teff 세포 표현형을 나타낸다. 도 40의 B에서, "기억 분화에서 점진적으로 증가" 유전자 세트의 더 높은 유전자 세트 점수는 증가하는 후기 기억 T세포 표현형을 나타내는 반면, "기억 분화에서 점진적으로 증가" 유전자 세트의 더 낮은 유전자 세트 점수는 증가하는 초기 기억 T세포 표현형을 나타낸다. 도 40의 C에서, "위 TEM 대 아래 TN" 유전자 세트의 더 높은 유전자 세트 점수는 증가하는 이펙터 기억 T세포 표현형을 나타내는 반면, "위 TEM 대 아래 TN" 유전자 세트의 더 낮은 유전자 세트 점수는 증가하는 나이브 T세포 표현형을 나타낸다. 클러스터 3의 세포는, 초기 기억, 덜 분화된 T세포 상태에 있는 클러스터 1 및 클러스터 2의 세포와 비교하여, 후기 기억, 더 분화된 T세포 상태에 있는 것으로 나타났다. 클러스터 0은 중간 T세포 상태에 있는 것으로 보인다. 종합하면, 이 데이터는 투입 세포 내에 상당한 수준의 이질성이 존재함을 보여준다.
도 41의 A, B, 및 C. TCR 시퀀싱 및 클로노타입 다양성 측정. 9일차 세포는 더 평평한 분포의 클로노타입 빈도(더 높은 다양성)를 갖는다.
도 42는 재발성 및/또는 불응성 다발성 골수종 성인 환자를 대상으로 ARM 프로세스를 이용하여 제조된 BCMA CART 세포를 테스트하는 I상 임상 시험의 설계를 보여주는 흐름도이다.
도 43은 2가지 농도(30 μM 및 100 μM)의 AZT의 존재 또는 부재하에 바이러스 첨가 후 상이한 수집 시점에서의 ARM-BCMA CAR 발현에 대한 FACS 분석을 보여주는 그래프이다. 렌티바이러스 벡터는 활성화 및 세포 시딩시 AZT 처리 전 1시간 후에 첨가되었다.
도 44a 및 도 44b는 해동시 CAR 발현에 대한 ARM-BCMA CAR의 평가(도 44a), 및 해동 48시간 후 CAR 발현에 대한 ARM-BCMA CAR의 평가 및 해동 48시간 후 생성물과 9일차 TM-BCMA CAR에서의 CCR7/CD45RO 마커의 평가(도 44b)를 보여주는 그래프이다. 표시된 데이터는 두 공여체의 T세포를 사용하여 수행된 2개의 실험으로부터 대표되는 한 가지이다.
도 45a 및 도 45b는 세포 배양 상청액의 사이토카인 농도를 보여주는 그래프이다. ARM-BCMA CAR 및 TM-BCMA CAR, 및 각각의 UTD를 KMS-11과 공동배양하였다. 24시간 후에 상청액을 수집하였다. 표시된 데이터는 두 공여체의 T세포를 사용하여 수행된 2개의 실험으로부터 대표되는 한 가지이다.
도 46은 ARM-BCMA를 테스트하는 이종이식 효능 연구의 개요를 보여주는 그래프이다.
도 47은 이종이식 모델에서 TM-BCMA CAR의 효능과 ARM-BCMA CAR의 효능을 비교하는 그래프이다. 루시퍼라제 리포터 유전자를 발현하는 MM 세포주 KMS11을 NSG 마우스에 주사하였다. 종양 부담은 전체 신체 발광(p/s)으로 표현되며, 평균 종양 부담 +SEM으로 나타냈다. 종양 접종 후 8일차에, 마우스를 각각의 용량(생존 가능한 CAR+ T세포의 수)의 ARM-BCMA CAR 또는 TM-BCMA CAR로 처치하였다. 비히클(PBS) 및 UTD T세포는 음성 대조군으로 사용되었다. ARM-BCMA CAR(1e4 세포), PBS, 및 UTD군에 대해 N=4인 것을 제외하고, 모든 군에 대한 마우스 수 N=5.
도 48a, 도 48b, 및 도 48c는 ARM-BCMA CAR 또는 TM-BCMA CAR로 처치된 마우스의 혈장 IFN-γ 동역학을 보여주는 그래프이다. 각각의 CAR-T 용량의 UTD, ARM-BCMA CAR, 또는 TM-BCMA CAR로 처치된 KMS11-luc 종양 보유 마우스의 혈장 IFN-γ 수준. 모든 IFN-γ 수준을 평균 ± SEM으로 표시하였다. 마우스를 채혈하고, MSD(Meso Scale Discovery) 분석에 의해 혈장 사이토카인을 측정하였다.
도 49는 생체내 ARM-BCMA CAR 및 TM-BCMA CAR의 세포 동역학을 보여주는 그래프이다. 상이한 용량의 TM UTD, ARM UTD, ARM-BCMA CAR, 및 TM-BCMA CAR로 처치된 KMS11 종양 보유 마우스의 말초혈액에서의 세포 동역학. 세포 수를 평균 세포 수 +SD로 나타냈다. 종양 접종 후 8일차에, 마우스를 각각의 용량(생존 가능한 CAR+ T세포의 수)의 ARM-BCMA CAR 또는 TM-BCMA CAR로 처치하였다. 비히클(PBS) 및 UTD T세포는 음성 대조군으로 사용되었다. CAR-T 주사 후 7, 14, 및 21일 후에 혈액 샘플을 채취하여, 지정된 시점에 유세포 분석으로 분석하였다. ARM-BCMA CAR(1e4 세포), PBS, 및 UTD군에 대해 N=4인 것을 제외하고, 모든 군에 대한 마우스 수 N=5.
도 50a 내지 50c는 단일 이중특이적 항체 도식(도 50a), 다량체 이중특이적 항체 도식(도 50b), 및 도 범례(도 50c)를 포함하여 이중특이적 항체에 대한 예시적인 도식을 제공한다.
도 51a 및 도 51b는 항-CD3 항체로부터 유래된 중쇄 및 경쇄를 포함하는 CD3 항원 결합 도메인, 및 언급된 바와 같이 항-CD28 또는 CD2 항체로부터 유래된 중쇄 및 경쇄를 포함하는 CD28 또는 CD2 항원 결합 도메인(대조 구성체 11, 14, 및 17을 제외한 모두에서)을 포함하는 17개의 상이한 구성체의 도식을 도시한다.
구성체 1은 Fc 영역에 추가로 융합된, 항-CD2 Fab에 융합된 항-CD3 scFv를 포함한다. 구성체 1은 제1 쇄 및 제2 쇄를 포함한다. 제1 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 항-CD2 VL 및 CL을 포함한다. 제2 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 항-CD3 VH, (G4S)4 링커(서열번호 63), 항-CD3 VL, (G4S)4 링커(서열번호 63), 항-CD2 VH, CH1, CH2, 및 CH3을 포함한다. 구성체 2는 Fc 영역에 추가로 융합된, 항-CD28 Fab에 융합된 항-CD3 scFv를 포함한다. 구성체 2는 제1 쇄 및 제2 쇄를 포함한다. 제1 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 항-CD28 VL 및 CL을 포함한다. 제2 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 항-CD3 VH, (G4S)4 링커(서열번호 63), 항-CD3 VL, (G4S)4 링커(서열번호 63), 항-CD28 VH, CH1, CH2, 및 CH3을 포함한다.
구성체 3은 항-CD3 scFv에 추가로 융합된, Fc 영역에 융합된 항-CD2 Fab를 포함한다. 구성체 3은 제1 쇄 및 제2 쇄를 포함한다. 제1 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 항-CD2 VL 및 CL을 포함한다. 제2 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 항-CD2 VH, CH1, CH2, CH3, (G4S)4 링커(서열번호 63), 항-CD3 VH, (G4S)4 링커(서열번호 63), 항-CD3 VL을 포함한다. 구성체 4는 항-CD3 scFv에 추가로 융합된, Fc 영역에 융합된 항-CD28 Fab를 포함한다. 구성체 4는 제1 쇄 및 제2 쇄를 포함한다. 제1 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 항-CD28 VL 및 CL을 포함한다. 제2 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 항-CD28 VH, CH1, CH2, CH3, (G4S)4 링커(서열번호 63), 항-CD3 VH, (G4S)4 링커(서열번호 63), 항-CD3 VL을 포함한다.
구성체 5는 Fc 영역에 추가로 융합된, 항-CD3 scFv에 융합된 항-CD2 Fab를 포함한다. 구성체 5는 제1 쇄 및 제2 쇄를 포함한다. 제1 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 항-CD2 VL 및 CL을 포함한다. 제2 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 항-CD2 VH, CH1, (G4S)2 링커(서열번호 5), 항-CD3 VH, (G4S)4 링커(서열번호 63), 항-CD3 VL, (G4S)4 링커(서열번호 63), CH2, 및 CH3을 포함한다. 구성체 6은 Fc 영역에 추가로 융합된, 항-CD3 scFv에 융합된 항-CD28 Fab를 포함한다. 구성체 6은 제1 쇄 및 제2 쇄를 포함한다. 제1 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 항-CD28 VL 및 CL을 포함한다. 제2 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 항-CD28 VH, CH1, (G4S)2 링커(서열번호 5), 항-CD3 VH, (G4S)4 링커(서열번호 63), 항-CD3 VL, (G4S)4 링커(서열번호 63), CH2, 및 CH3을 포함한다.
구성체 7은 항-CD2 Fab에 추가로 융합된, Fc 영역에 융합된 항-CD3 scFv를 포함한다. 구성체 7은 제1 쇄 및 제2 쇄를 포함한다. 제1 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 항-CD2 VL 및 CL을 포함한다. 제2 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 항-CD3 VH, (G4S)4 링커(서열번호 63), 항-CD3 VL, (G4S) 링커(서열번호 25), CH2, CH3, (G4S)4 링커(서열번호 63), 항-CD2 VH, 및 CH1을 포함한다. 구성체 8은 항-CD28 Fab에 추가로 융합된, Fc 영역에 융합된 항-CD3 scFv를 포함한다. 구성체 8은 제1 쇄 및 제2 쇄를 포함한다. 제1 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 항-CD28 VL 및 CL을 포함한다. 제2 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 항-CD3 VH, (G4S)4 링커(서열번호 63), 항-CD3 VL, (G4S) 링커(서열번호 25), CH2, CH3, (G4S)4 링커(서열번호 63), 항-CD28 VH, 및 CH1을 포함한다.
구성체 9는 제1 Fc 영역에 융합된 항-CD2 Fab 및 제2 Fc 영역에 융합된 항-CD3 scFv를 포함한다. 구성체 9는 제1 쇄, 제2 쇄, 및 제3 쇄를 포함한다. 제1 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 항-CD2 VL 및 CL을 포함한다. 제2 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 항-CD2 VH, CH1, CH2, 및 CH3을 포함한다. 제3 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 항-CD3 VH, (G4S)4 링커(서열번호 63), 항-CD3 VL, (G4S) 링커(서열번호 25), CH2, 및 CH3을 포함한다. 구성체 10은 제1 Fc 영역에 융합된 항-CD28 Fab 및 제2 Fc 영역에 융합된 항-CD3 scFv를 포함한다. 구성체 10은 제1 쇄, 제2 쇄, 및 제3 쇄를 포함한다. 제1 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 항-CD28 VL 및 CL을 포함한다. 제2 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 항-CD28 VH, CH1, CH2, 및 CH3을 포함한다. 제3 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 항-CD3 VH, (G4S)4 링커(서열번호 63), 항-CD3 VL, (G4S) 링커(서열번호 25), CH2, 및 CH3을 포함한다.
구성체 11은 Fc 영역에 융합된 항-CD3 scFv를 포함한다. 구성체 11은 제1 쇄 및 제2 쇄를 포함한다. 제1 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, CH2 및 CH3을 포함한다. 제2 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 항-CD3 VH, (G4S)4 링커(서열번호 63), 항-CD3 VL, (G4S) 링커(서열번호 25), CH2, 및 CH3을 포함한다.
구성체 12는 제1 Fc 영역에 융합된 항-CD2 Fab 및 제2 Fc 영역에 융합된 항-CD3 scFv를 포함한다. 구성체 12는 제1 쇄, 제2 쇄, 및 제3 쇄를 포함한다. 제1 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 항-CD2 VL 및 CL을 포함한다. 제2 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 항-CD2 VH, CH1, CH2, 및 CH3을 포함한다. 제3 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 항-CD3 VH, (G4S)4 링커(서열번호 63), 항-CD3 VL, (G4S) 링커(서열번호 25), CH2, CH3, (G4S)3 링커(서열번호 104), 및 Matrilin1을 포함한다. 구성체 13은 제1 Fc 영역에 융합된 항-CD28 Fab 및 제2 Fc 영역에 융합된 항-CD3 scFv를 포함한다. 구성체 13은 제1 쇄, 제2 쇄, 및 제3 쇄를 포함한다. 제1 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 항-CD28 VL 및 CL을 포함한다. 제2 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 항-CD28 VH, CH1, CH2, 및 CH3을 포함한다. 제3 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 항-CD3 VH, (G4S)4 링커(서열번호 63), 항-CD3 VL, (G4S) 링커(서열번호 25), CH2, CH3, (G4S)3 링커(서열번호 104), 및 Matrilin1을 포함한다.
구성체 14는 Fc 영역에 융합된 항-CD3 scFv를 포함한다. 구성체 14는 제1 쇄 및 제2 쇄를 포함한다. 제1 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, CH2 및 CH3을 포함한다. 제2 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 항-CD3 VH, (G4S)4(서열번호 63), 링커, 항-CD3 VL, (G4S) 링커(서열번호 25), CH2, CH3, (G4S)3 링커(서열번호 104), 및 Matrilin1을 포함한다.
구성체 15는 제1 Fc 영역에 융합된 항-CD2 Fab 및 제2 Fc 영역에 융합된 항-CD3 scFv를 포함한다. 구성체 15는 제1 쇄, 제2 쇄, 및 제3 쇄를 포함한다. 제1 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 항-CD2 VL 및 CL을 포함한다. 제2 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 항-CD2 VH, CH1, CH2, 및 CH3을 포함한다. 제3 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 항-CD3 VH, (G4S)4 링커(서열번호 63), 항-CD3 VL, (G4S) 링커(서열번호 25), CH2, CH3, (G4S) 링커(서열번호 25), 및 연골 올리고머 매트릭스 단백질의 코일드 코일 도메인(COMPcc)을 포함한다. 구성체 16은 제1 Fc 영역에 융합된 항-CD28 Fab 및 제2 Fc 영역에 융합된 항-CD3 scFv를 포함한다. 구성체 16은 제1 쇄, 제2 쇄, 및 제3 쇄를 포함한다. 제1 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 항-CD28 VL 및 CL을 포함한다. 제2 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 항-CD28 VH, CH1, CH2, 및 CH3을 포함한다. 제3 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 항-CD3 VH, (G4S)4 링커(서열번호 63), 항-CD3 VL, (G4S) 링커(서열번호 25), CH2, CH3, (G4S) 링커(서열번호 25), 및 COMPcc를 포함한다.
구성체 17은 Fc 영역에 융합된 항-CD3 scFv를 포함한다. 구성체 17은 제1 쇄 및 제2 쇄를 포함한다. 제1 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, CH2 및 CH3을 포함한다. 제2 쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로, 항-CD3 VH, (G4S)4 링커(서열번호 63), 항-CD3 VL, (G4S) 링커(서열번호 25), CH2, CH3, (G4S) 링커(서열번호 25), 및 COMPcc를 포함한다.
도 52는 10 μg/mL의 구성체 및 양성 대조군의 사용 후, 4일차 T세포의 명시야 현미경 이미지를 제공한다. 각 이미지의 왼쪽 상단 모서리에 있는 숫자는 테스트 구성체의 이름을 나타낸다. 예를 들어, "1"은 구성체 1을 나타내고, "2"는 구성체 2를 나타내고, 나머지도 이와 마찬가지이다. "TA"는 TransAct를 나타낸다.
도 53은 17개 구성체 각각 및 TransAct에 대한 MSD의 IFN 감마 및 IL-2 판독 결과를 보여준다. x축의 숫자는 테스트 구성체의 이름을 나타낸다. 예를 들어, "1"은 구성체 1을 나타내고, "2"는 구성체 2를 나타내고, 나머지도 이와 마찬가지이다. "TA"는 TransAct를 나타낸다.
도 54는 17개 구성체 각각 및 TransAct에 대한 항-CD19 CAR의 형질도입 백분율을 보여준다. x축의 숫자는 테스트 구성체의 이름을 나타낸다. 예를 들어, "1"은 구성체 1을 나타내고, "2"는 구성체 2를 나타내고, 나머지도 이와 마찬가지이다. "TA"는 TransAct를 나타낸다.
도 55는 CAR 형질도입을 원자가 또는 공동자극 분자 표적(CD2/CD28)의 함수로서 도시한다. 도 55에서, F1, F2, F3, F4, F5, 및 F7은 2의 리간드 원자가를 갖고, F12 및 F13은 3의 리간드 원자가를 갖고, F15 및 F16은 5의 리간드 원자가를 갖는다. F1, F3, F5, F7, F12, 및 F15는 CD2에 결합하는 반면, F2, F4, F13, 및 F16은 CD28에 결합한다.
도 56a 내지 도 56d는 구성체 1(F1), 3(F3), 4(F4), 5(F5) 대 TransAct("TA")를 사용하여 생성된 CAR T세포에 대한 종양세포의 특이적 사멸(Nalm6 WT 세포의 평균 사멸 %에서 Nalm6 CD19KO 세포의 평균 사멸 %를 빼서 계산)을 보여준다. ("3H" 및 "5H"의) "H"는 10 μg/mL의 항체 농도를 나타내고; ("1M," "3M," "4M," 및 "5M"의) "M"은 1 μg/mL의 항체 농도를 나타내고; ("1L", "3L", "4L", 및 "5L"의) "L"은 0.1 μg/mL의 항체 농도를 나타낸다.
도 57a 및 도 57b는 Nalm6 WT 세포("ARM 대 Nalm6 WT") 또는 Nalm6 CD19 녹아웃 세포("ARM 대 Nalm6 CD19 KO")와 공동배양시, 구성체 1(F1), 3(F3), 4(F4), 또는 5(F5) 또는 TransAct를 사용하여 생성된 CAR T세포의 분비된 사이토카인 수준을 보여준다.
도 58은 두 공여체로부터의 CAR 형질도입된 또는 형질도입되지 않은 세포로 처치된 Nalm6 이종이식 마우스 모델에서 종양 부담을 시간의 함수로 보여준다.
도 59는 두 공여체로부터의 CAR 형질도입된 또는 형질도입되지 않은 세포로 처치된 마우스의 (20 μL당) CAR+ 및 CD3+ 수를 보여준다. 이 수치는 FACS 분석을 거친 2주차 혈액 샘플로부터 얻었다.
도 60a 내지 도 60d는 공여체별 항종양 활성(도 60a 및 도 60b) 및 생체내 CAR 증식(도 60c 및 도 60d)을 보여준다.
도 61a 및 도 61b는 2세대 자극 구성체의 결합 정보(도 61a) 및 구성(도 61b)을 보여준다. "F5 항-CD3 (2)"는 항-CD3 (2)에 기초한 항-CD3 결합제를 갖는 F5 구성체를 나타낸다.
도 62는 도 61a에 나타낸 것들을 포함하여, 다양한 자극 구성체의 형질도입 효율을 보여준다. "TA"는 TransAct를 나타낸다. TransAct는 0.1 부피%(배양물 1000 μL당 1 μL)로 사용되었다.
도 63a 및 도 63b는 3세대 자극 구성체의 결합제 정보(도 63a) 및 구성(도 63b)을 보여준다.
도 64는 도 63a에 나타낸 것들을 포함하여, 다양한 자극 구성체의 형질도입 효율을 보여준다. "TA"는 TransAct를 나타낸다.
도 65a 및 도 65b는 Nalm6 세포의 특이적 사멸(도 65a) 및 FcγR 보유 PL21 세포의 비특이적 사멸(도 65b)을 보여준다. "F3 Fc-silent"는 표 63a의 NEG2042를 지칭하고 "F4 Fc-silent"는 NEG2043을 지칭한다.
도 66a 및 도 66b. 도 66a는 두 벡터를 이용한 공동형질도입 후 항-CD19 CAR을 발현하는 T세포("CAR19+"; 위), 항-BCMA CAR을 발현하는 T세포("BCMA+"; 중간), 또는 두 CAR을 공동발현하는 T세포("BCMA+CAR19+"; 아래)의 백분율을 보여준다. 도 66b는 제조 후 상이한 두 시점에 결정된, 이중 CAR-암호화 벡터를 이용한 형질도입 후 항-CD22 CAR을 발현하는 T세포("CAR22+") 또는 항-CD19 CAR과 항-CD22 CAR을 공동발현하는 T세포("CAR19+22+")의 백분율을 보여준다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
단수 명사는 하나 이상(예를 들어, 적어도 하나)의 해당 대상물을 나타낸다. 예를 들어, "요소"는 하나 이상의 요소를 의미한다.
측정 가능한 값, 예컨대 양, 기간 등을 지칭할 때, 용어 "약"은, 명시된 값으로부터 ±20%, 또는 일부 경우에 ±10%, 또는 일부 경우에 ±5%, 또는 일부 경우에 ±1%, 또는 일부 경우에 ±0.1%의 편차를 포괄하는 의미이며, 이러한 편차는 개시된 방법의 수행에 적절하다.
본 발명의 조성물 및 방법은 특정된 서열, 또는 이와 실질적으로 동일하거나 유사한 서열, 예를 들어 특정된 서열과 적어도 85%, 90%, 또는 95% 이상 동일한 서열을 갖는 폴리펩티드 및 핵산을 포괄한다. 아미노산 서열과 관련하여, 용어 "실질적으로 동일"은 제1 및 제2 아미노산 서열이 공통 구조적 도메인 및/또는 공통 기능 활성을 가질 수 있도록 제2 아미노산 서열 내 정렬된 아미노산 잔기와 i) 동일하거나 ii) 이의 보존적 치환인 아미노산 잔기의 충분한 수 또는 최소 수를 함유하는 제1 아미노산 서열, 예를 들어 기준 서열, 예를 들어 본원에 제공된 서열에 대해 적어도 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 공통 구조적 도메인을 함유하는 아미노산 서열을 나타내는 데 사용된다.
뉴클레오티드 서열과 관련하여, 용어 "실질적으로 동일"은 제1 및 제2 뉴클레오티드 서열이 공통 기능적 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하거나, 공통 구조적 폴리펩티드 도메인 또는 공통 기능적 폴리펩티드 활성을 암호화하도록 제2 핵산 서열 내 정렬된 뉴클레오티드와 동일한 뉴클레오티드의 충분한 수 또는 최소 수를 함유하는 제1 핵산 서열, 예를 들어 기준 서열, 예를 들어 본원에 제공된 서열에 대해 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 나타내는 데 사용된다.
용어 "변이체"는 기준 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖거나 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 변이체는 기능적 변이체이다.
용어 "기능적 변이체"는 기준 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖거나 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되고 기준 아미노산 서열의 하나 이상의 활성을 가질 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다.
용어 사이토카인(예를 들어, IL-2, IL-7, IL-15, IL-21, 또는 IL-6)은 천연 사이토카인의 전장, 단편 또는 변이체, 예를 들어 기능적 변이체(천연 사이토카인의 활성, 예를 들어 면역조절 활성의 적어도 10%, 30%, 50%, 또는 80%를 갖는 단편 및 이의 기능적 변이체 포함)를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 천연 사이토카인과 실질적으로 동일(예를 들어, 적어도 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일)하거나, 사이토카인을 암호화하는 천연 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 동일(예를 들어, 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일)한 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 맥락에서 이해되는 바와 같이, 사이토카인은 수용체 도메인, 예를 들어 사이토카인 수용체 도메인(예를 들어, IL-15/IL-15R)을 추가로 포함한다.
용어 "키메라 항원 수용체" 또는 대안적으로 "CAR"은 적어도 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 하기 정의된 바와 같은 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 신호전달 도메인(본원에서 "세포내 신호전달 도메인"으로도 지칭됨)을 포함하는 재조합 폴리펩티드 구성체를 지칭한다. 일부 구현예에서, CAR 폴리펩티드 구성체 내의 도메인들은 동일한 폴리펩티드 쇄에 존재하며, 예를 들어 키메라 융합 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR 폴리펩티드 구성체 내의 도메인들은 서로 인접하지 않고, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 RCAR에 제공된 바와 같이, 예를 들어 상이한 폴리펩티드 쇄에 존재한다.
일부 구현예에서, 세포질 신호전달 도메인은 일차 신호전달 도메인(예를 들어, CD3-제타의 일차 신호전달 도메인)을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포질 신호전달 도메인은 하기 정의된 바와 같은 적어도 하나의 공동자극 분자로부터 유래된 하나 이상의 기능적 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 공동자극 분자는 41BB(즉, CD137), CD27, ICOS, 및/또는 CD28로부터 선택된다. 일부 구현예에서, CAR은 세포외 항원 인식 도메인, 막관통 도메인, 및 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 세포외 항원 인식 도메인, 막관통 도메인, 및 공동자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인 및 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 세포외 항원 인식 도메인, 막관통 도메인, 및 하나 이상의 공동자극 분자로부터 유래된 2개의 기능적 신호전달 도메인 및 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 세포외 항원 인식 도메인, 막관통 도메인, 및 하나 이상의 공동자극 분자로부터 유래된 적어도 2개의 기능적 신호전달 도메인 및 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 CAR 융합 단백질의 아미노 말단(N-말단)에 선택적 리더 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 세포외 항원 인식 도메인의 N-말단에 리더 서열을 추가로 포함하고, 리더 서열은 임의로 세포 프로세싱 및 CAR의 세포막으로의 국재화 중에 항원 인식 도메인(예를 들어, scFv)으로부터 절단된다.
특정 종양 마커 X(X는 본원에 기술된 바와 같은 종양 마커일 수 있음)를 표적화하는 항원 결합 도메인(예를 들어, scFv, 단일 도메인 항체, 또는 TCR(예를 들어, TCR 알파 결합 도메인 또는 TCR 베타 결합 도메인))을 포함하는 CAR은 XCAR로도 지칭된다. 예를 들어, BCMA를 표적화하는 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR은 BCMA CAR로 지칭된다. CAR은 임의의 세포, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 면역 이펙터 세포(예를 들어, T세포 또는 NK세포)에서 발현될 수 있다.
용어 "신호전달 도메인"은 제2 메신저를 생성하거나 또는 이러한 메신저에 반응하여 이펙터로서 기능함으로써 규정된 신호전달 경로를 통해 세포 활성을 조절하도록 세포 내에서 정보를 전달함으로써 작용하는 단백질의 기능적 부분을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자로부터 유래된 단백질, 또는 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 항체는 다클론 또는 단클론, 다중 또는 단일 쇄, 또는 온전한 면역글로불린일 수 있고, 천연 공급원으로부터 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 항체는 면역글로불린 분자의 사량체일 수 있다.
용어 "항체 단편"은 온전한 항체 또는 이의 재조합 변이체의 적어도 하나의 부분을 지칭하며, 예를 들어 항원과 같은 표적에 대한 항체 단편의 인식 및 특이적 결합을 부여하기에 충분한 온전한 항체의 항원 결합 도메인, 예를 들어 항원 결정 가변 영역을 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, scFv 항체 단편, 선형 항체, 단일 도메인 항체, 예컨대 sdAb(VL 또는 VH), 낙타과 VHH 도메인, 및 항체 단편으로부터 형성되는 다중특이적 분자, 예컨대 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개 이상의, 예를 들어 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편, 또는 2개 이상의, 예를 들어 2개의 단리된 CDR 또는 연결된 항체의 다른 에피토프 결합 단편을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 항체 단편은 또한 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 나노바디, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR, 및 비스-scFv 내에 통합될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005] 참조). 항체 단편은 또한 피브로넥틴 III형(Fn3)과 같은 폴리펩티드를 기반으로 한 스캐폴드에 그래프트될 수 있다(피브로넥틴 폴리펩티드 미니바디를 기술한 미국 특허 6,703,199호 참조).
용어 "scFv"는 경쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 하나의 항체 단편 및 중쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 하나의 항체 단편을 포함하는 융합 단백질을 지칭하며, 여기서 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 짧은 유연성 폴리펩티드 링커를 통해 인접하여 연결되고, 단일쇄 폴리펩티드로서 발현될 수 있고, scFv는 그것이 유래된 온전한 항체의 특이성을 유지한다. 명시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 scFv는 예를 들어 폴리펩티드의 N-말단 및 C-말단과 관련하여, VL 및 VH 가변 영역을 어느 순서로든 가질 수 있고, scFv는 VL-링커-VH를 포함하거나 VH-링커-VL을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, scFv는 NH2-VL-링커-VH-COOH 또는 NH2-VH-링커-VL-COOH의 구조를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 항원 특이성 및 결합 친화성을 부여하는 항체 가변 영역 내의 아미노산의 서열을 지칭한다. 예를 들어, 일반적으로 각각의 중쇄 가변 영역 내에 3개의 CDR(예를 들어, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3)이 존재하고 각각의 경쇄 가변 영역 내에 3개의 CDR(LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3)이 존재한다. 주어진 CDR의 정확한 아미노산 서열 경계는 문헌[Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD ("Kabat" 넘버링 체계), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 "Chothia" 넘버링 체계)]에 기재된 것들을 비롯하여, 다수의 잘 알려진 체계 중 임의의 것, 또는 이의 조합을 이용해 결정될 수 있다. 조합된 Kabat 및 Chothia 넘버링 체계에서, 일부 구현예에서, CDR은 Kabat CDR, Chothia CDR, 또는 둘 다의 일부인 아미노산 잔기에 상응한다.
항체 또는 이의 항체 단편을 포함하는 본 발명의 CAR 조성물의 부분은 다양한 형태로 존재할 수 있으며, 예를 들어 항원 결합 도메인은 예를 들어 단일 도메인 항체 단편(sdAb), 단일쇄 항체(scFv), 또는 예를 들어, 인간 또는 인간화 항체를 포함하는, 폴리펩티드 쇄의 일부로서 발현된다(문헌[Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426]). 일부 구현예에서, 본 발명의 CAR 조성물의 항원 결합 도메인은 항체 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 scFv를 포함하는 항체 단편을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "결합 도메인" 또는 "항체 분자"(본원에서 "항-표적 결합 도메인으로도 지칭됨)는 적어도 하나의 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하는 단백질, 예를 들어 면역글로불린 쇄 또는 이의 단편을 지칭한다. 용어 "결합 도메인" 또는 "항체 분자"는 항체 및 항체 단편을 포괄한다. 일부 구현예에서, 항체 분자는 다중특이적 항체 분자로서, 예를 들어 복수의 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하며, 복수의 면역글로불린 가변 도메인 서열 중 제1 면역글로불린 가변 도메인 서열은 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖고, 복수의 면역글로불린 가변 도메인 서열 중 제2 면역글로불린 가변 도메인 서열은 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는다. 일부 구현예에서, 다중특이적 항체 분자는 이중특이적 항체 분자이다. 이중특이적 항체는 2개 이하의 항원에 대해 특이성을 갖는다. 이중특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 제1 면역글로불린 가변 도메인 서열, 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 제2 면역글로불린 가변 도메인 서열을 특징으로 한다.
용어 "이중특이적 항체"는 단일 분자 내에 2개의 항체의 항원 결합 부위를 겸비한 분자를 지칭한다. 따라서, 이중특이적 항체는 2개의 상이한 항원에 동시에 또는 순차적으로 결합할 수 있다. 이중특이적 항체의 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 2개의 항체를 결합하는 다양한 형태 또한 당업계에 알려져 있다. 본 발명의 이중특이적 항체의 형태는 당업자에게 알려진 바와 같이, 디아바디, 단일쇄 디아바디, Fab 이량체화(Fab-Fab), Fab-scFv, 및 탠덤 항체를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
용어 "항체 중쇄"는 천연 형태로 항체 분자에 존재하는 두 가지 유형의 폴리펩티드 쇄 중 더 큰 것을 지칭하며 일반적으로 항체가 속하는 클래스를 결정한다.
용어 "항체 경쇄"는 천연 형태로 항체 분자에 존재하는 두 가지 유형의 폴리펩티드 쇄 중 더 작은 것을 지칭한다. 카파(κ) 및 람다(λ) 경쇄는 2개의 주요 항체 경쇄 이소형을 지칭한다.
용어 "재조합 항체"는 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성된 항체, 예를 들어 박테리오파지 또는 효모 발현 시스템에 의해 발현된 항체를 지칭한다. 이 용어는 또한 항체를 암호화하는 DNA 분자의 합성에 의해 생성된 항체로서, DNA 분자가 항체 단백질, 또는 항체를 특정하는 아미노산 서열을 발현하며, DNA 또는 아미노산 서열이 당업계에서 이용 가능한 잘 알려진 재조합 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 사용하여 수득된, 항체를 의미하는 것으로 해석되어야 한다.
용어 "항원" 또는 "Ag"는 면역 반응을 유발하는 분자를 지칭한다. 이러한 면역 반응은 항체 생성, 또는 특정 면역세포의 활성화, 또는 둘 다를 수반할 수 있다. 당업자는 사실상 모든 단백질 또는 펩티드를 포함하는 임의의 마크로분자가 항원으로서의 역할을 할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 항원은 재조합 또는 게놈 DNA로부터 유래될 수 있다. 따라서, 당업자는 면역 반응을 유도하는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 DNA가, 본원에서 사용되는 용어 "항원"을 암호화함을 이해할 것이다. 또한, 당업자는 항원이 유전자의 전장 뉴클레오티드 서열에 의해서만 암호화될 필요는 없음을 이해할 것이다. 본 발명은 1개 초과의 유전자의 부분적인 뉴클레오티드 서열의 사용을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니고, 이들 뉴클레오티드 서열은 목적하는 면역 반응을 유도하는 폴리펩티드를 암호화하도록 다양한 조합으로 배열됨이 분명하다. 또한, 당업자는 항원이 "유전자"에 의해 암호화될 필요가 전혀 없음을 이해할 것이다. 항원은 합성되어 생성될 수 있거나 또는 생물학적 샘플로부터 유래될 수 있거나, 또는 폴리펩티드 이외의 마크로분자일 수 있음이 분명하다. 이러한 생물학적 샘플은 조직 샘플, 종양 샘플, 세포 또는 다른 생물학적 성분을 갖는 유체를 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
용어 "다중특이적 결합 분자"는 적어도 2개의 항원에 특이적으로 결합하고 2개 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 분자를 지칭한다. 항원 결합 도메인은 각각 독립적으로 항체 단편(예를 들어, scFv, Fab, 나노바디), 리간드, 또는 비항체 유래 결합제(예를 들어, 피브로넥틴, 파이노머(Fynomer), DARPin)일 수 있다.
다중특이적 결합 분자, 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 또는 항체 단편과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "1가"는 다중특이적 결합 분자, 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 또는 항체 단편이 결합하는 각각의 항원에 대해 단일 항원 결합 도메인이 존재하는 다중특이적 결합 분자, 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 또는 항체 단편을 지칭한다.
다중특이적 결합 분자, 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 또는 항체 단편과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "2가"는 다중특이적 결합 분자, 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 또는 항체 단편이 결합하는 각각의 항원에 대해 2개의 항원 결합 도메인이 존재하는 다중특이적 결합 분자, 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 또는 항체 단편을 지칭한다.
용어 "다량체"는 복수의, 임의로 서로 접합된, 분자(비제한적인 예로서 항체(예를 들어, 이중특이적 항체))의 집합체를 지칭한다.
"~에 접합된"이라는 용어는 공유적 또는 비공유적으로 함께, 임의로 직접 또는 링커를 통해, 결합된 하나 이상의 분자를 나타낸다.
용어 "Fc 침묵"은 이펙터 세포와 최소의 상호작용을 갖도록 변형된 Fc 도메인을 나타낸다. 침묵화된 이펙터 기능은 항체의 Fc 영역의 돌연변이에 의해 얻을 수 있고, 당업계에 기술되어 있다(비제한적인 예로서 LALA 및 N297A(문헌[Strohl, W., 2009, Curr. Opin. Biotechnol. vol. 20(6):685-691]); 및 D265A(문헌[Baudino et al., 2008, J. Immunol. 181: 6664-69]), 또한 문헌[Heusser et al., WO2012065950] 참조). Fc 침묵 돌연변이의 예는 IgG1 Fc 아미노산 서열에 L234A 및 L235A 돌연변이를 포함하는 LALA 돌연변이체, DAPA(D265A, P329A)(예를 들어, US 6,737,056 참조), N297A, DANAPA(D265A, N297A, 및 P329A), 및/또는 LALADANAPS(L234A, L235A, D265A, N297A, 및 P331S)를 포함한다.
용어 "CD3/TCR 복합체"는 TCR 알파 및 TCR 베타 쇄를 포함하는 TCR; 1개의 CD3 감마 쇄, 1개의 CD3 델타 쇄, 및 2개의 CD3 엡실론 쇄를 포함하는 CD3; 및 제타 도메인을 포함하는 T세포 표면 상의 복합체를 지칭한다. UniProt 수탁번호 P01848(TCR 알파, 불변 도메인), P01850(TCR 베타, 불변 도메인 1), A0A5B9(TCR 베타, 불변 도메인 2), P09693(CD3 감마), P04234(CD3 델타), P07766(CD3 엡실론)은 세포내 신호전달을 담당하는, 이러한 쇄(제타 쇄는 제외)에 대한 예시적인 인간 서열을 제공하며, 이는 이하 더 자세히 논의된다. 추가 관련 수탁번호는 A0A075B662(뮤린 TCR 알파, 불변 도메인), A0A0A6YWV4 및/또는 A0A075B5J3(뮤린 TCR 베타, 불변 도메인 1), A0A075B5J4(뮤린 TCR 베타, 불변 도메인 2), P11942(뮤린 CD3 감마), P04235(뮤린 CD3 델타), P22646(뮤린 CD3 엡실론)을 포함한다.
용어 "CD28"은 공동자극 분자로서 기능하는 T세포 특이적 당단백질 CD28(Tp44로도 지칭됨) 및 이의 모든 대체 명칭을 지칭한다. UniProt 수탁번호 P10747은 예시적인 인간 CD28 아미노산 서열을 제공한다(또한 HGNC: 1653, Entrez Gene: 940, Ensembl: ENSG00000178562, 및 OMIM: 186760 참조). 추가 관련 CD28 서열은 UniProt 수탁번호 P21041(뮤린 CD28)을 포함한다.
용어 "ICOS"는 공동자극 분자로서 기능하는 유도성 T세포 공동자극제(AILIM, CVID1, CD278로도 지칭됨) 및 이의 모든 대체 명칭을 지칭한다. UniProt 수탁번호 Q9Y6W8은 예시적인 인간 ICOS 아미노산 서열을 제공한다(또한 HGNC: 5351, Entrez Gene: 29851, Ensembl: ENSG00000163600, 및 OMIM: 604558 참조). 추가 관련 ICOS 서열은 UniProt 수탁번호 Q9WVS0(뮤린 ICOS)을 포함한다.
용어 "CD27"은 공동자극 분자로서 기능하는 T세포 활성화 항원 CD27, 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 7, T14, T세포 활성화 항원 S152, Tp55, 및 이의 대체 명칭을 지칭한다. UniProt 수탁번호 P26842는 예시적인 인간 CD27 아미노산 서열을 제공한다(또한 HGNC: 11922, Entrez Gene: 939, Ensembl: ENSG00000139193, 및 OMIM: 186711 참조). 추가 관련 CD27 서열은 UniProt 수탁번호 P41272(뮤린 CD27)를 포함한다.
용어 "CD25"는 성장인자 수용체로서 기능하는 IL-2 서브유닛 알파, TAC 항원, p55, 인슐린 의존성 당뇨병 10, IMD21, P55, TCGFR, 및 이의 대체 명칭을 지칭한다. UniProt 수탁번호 P01589는 예시적인 인간 CD25 아미노산 서열을 제공한다(또한 HGNC: 6008, Entrez Gene: 3559, Ensembl: ENSG00000134460, 및 OMIM: 147730 참조). 추가 관련 CD25 서열은 UniProt 수탁번호 P01590(뮤린 CD25)을 포함한다.
용어 "4-1BB"는 공동자극 분자로서 기능하는 CD137 또는 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 9, 및 이의 대체 명칭을 지칭한다. UniProt 수탁번호 Q07011은 예시적인 인간 4-1BB 아미노산 서열을 제공한다(또한 HGNC: 11924, Entrez Gene: 3604, Ensembl: ENSG00000049249, 및 OMIM: 602250 참조). 추가 관련 4-1BB 서열은 UniProt 수탁번호 P20334(뮤린 4-1BB)를 포함한다.
용어 "IL6RA"는 성장인자 수용체로서 기능하는 IL-6 수용체 서브유닛 알파 또는 CD126, 및 이의 대체 명칭을 지칭한다. UniProt 수탁번호 P08887은 예시적인 인간 IL6RA 아미노산 서열을 제공한다(또한 HGNC: 6019, Entrez Gene: 3570, Ensembl: ENSG00000160712, 및 OMIM: 147880 참조). 추가 관련 IL6RA 서열은 UniProt 수탁번호 P22272(뮤린 IL6RA)를 포함한다.
용어 "IL6RB"는 성장인자 수용체로서 기능하는 IL-6 수용체 서브유닛 베타 또는 CD130, 및 이의 대체 명칭을 지칭한다. UniProt 수탁번호 P40189은 예시적인 인간 IL6RB 아미노산 서열을 제공한다. 추가 관련 IL6RB 서열은 UniProt 수탁번호 Q00560(뮤린 IL6RB)을 포함한다.
용어 "CD2"는 성장인자 수용체로서 기능하는 T세포 항원 T11/Leu-5/CD2, 림프구 기능 항원 2, T11, 또는 적혈구/로제트/LFA-3 수용체, 및 이의 대체 명칭을 지칭한다. UniProt 수탁번호 P06729는 예시적인 인간 CD2 아미노산 서열을 제공한다(또한 HGNC: 1639, Entrez Gene: 914, Ensembl: ENSG00000116824, 및 OMIM: 186990 참조). 추가 관련 CD2 서열은 UniProt 수탁번호 P08920(뮤린 CD2)을 포함한다.
용어 "항종양 효과" 및 "항암 효과"는 상호교환적으로 사용되며, 예를 들어 종양 부피 또는 암 부피의 감소, 종양세포 또는 암세포 수의 감소, 전이 수의 감소, 기대 수명의 증가, 종양세포 증식 또는 암세포 증식의 감소, 종양세포 생존 또는 암세포 생존의 감소, 또는 암성 병태와 관련된 다양한 생리학적 증상의 개선을 포함하는(이에 한정되지 않음), 다양한 수단에 의해 나타날 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다. "항종양 효과" 또는 "항암 효과"는 또한 먼저 종양 또는 암 발생의 예방에서의 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 세포 및 항체의 능력에 의해 나타날 수 있다.
용어 "자가"는 이후에 개체에게 재도입될, 동일한 개체로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다.
용어 "동종이계"는 물질이 도입되는 개체와 동일한 종의 상이한 동물로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다. 하나 이상의 유전자좌에서의 유전자가 동일하지 않은 경우 둘 이상의 개체는 서로 동종이계라 한다. 일부 구현예에서, 동일한 종의 개체로부터의 동종이계 물질은 항원과 관련하여 상호작용하기에 유전적으로 충분히 다를 수 있다.
용어 "이종"은 상이한 종의 동물로부터 유래된 이식편을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "성분채집"은 공여체 또는 환자의 혈액을 공여체 또는 환자로부터 제거하여 선택된 특정 성분(들)을 분리하고 나머지를 예를 들어, 재수혈에 의해, 공여체 또는 환자의 순환기로 돌려보내는 장치를 통과시키는 당업계에서 인정되는 체외 과정을 지칭한다. 따라서, "성분채집 샘플"은 성분채집을 이용하여 수득한 샘플을 지칭한다.
용어 "암"은 비정상 세포의 급속하고 제어되지 않은 성장을 특징으로 하는 질환을 지칭한다. 암세포는 국소적으로 또는 혈류 및 림프계를 통해 신체의 다른 부분으로 확산될 수 있다. 다양한 암의 예는 본원에 기재되어 있으며, 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 신장암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 폐암 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서 본원에 기술된 방법에 의해 치료되는 암은 다발성 골수종, 호지킨 림프종, 또는 비호지킨 림프종을 포함한다.
용어 "종양" 및 "암"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 예를 들어 두 용어는 모두 고형 및 액형, 예를 들어 확산성 또는 순환성 종양을 포괄한다. 본원에서 사용되는 용어 "암" 또는 "종양"은 악성, 뿐만 아니라 전암성 암 및 종양을 포함한다.
본원에서 사용되는 "~로부터 유래된"이란 용어는 제1 분자와 제2 분자 간의 관계를 나타낸다. 이는 일반적으로 제1 분자와 제2 분자 간의 구조적 유사성을 나타내며, 제2 분자로부터 유래되는 제1 분자에 대한 프로세스 또는 공급원 상의 제한은 내포하지 않거나 포함하지 않는다. 예를 들어, CD3제타 분자로부터 유래되는 세포내 신호전달 도메인의 경우, 세포내 신호전달 도메인은 요구되는 기능, 즉 적절한 조건하에 신호를 생성하는 능력을 갖도록 하기에 충분한 CD3제타 구조를 유지한다. 이는 세포내 신호전달 도메인의 특정한 생성 방법에 대한 제한을 내포하지 않거나 포함하지 않으며, 예를 들어 이는 세포내 신호전달 도메인을 제공하기 위해 CD3제타 서열로 시작하여 원하지 않는 서열을 결실시키거나 돌연변이를 일으켜 세포내 신호전달 도메인에 도달해야 함을 의미하는 것이 아니다.
용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편의 결합 특성에 대한 영향이나 변경이 크지 않은 아미노산 변형을 지칭한다. 이러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 변형은 당업계에 알려진 표준 기술, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발 및 PCR 매개 돌연변이유발에 의해 본 발명의 항체 또는 항체 단편 내에 도입될 수 있다. 보존적 치환은 아미노산 잔기가 유사 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당해 분야에 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타 분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신), 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 본 발명의 CAR 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고, 변경된 CAR은 본원에 기술된 기능적 분석을 이용하여 테스트될 수 있다.
자극 및/또는 공동자극 분자에 의한 자극과 관련하여 용어 "자극"은 자극 분자(예를 들어, TCR/CD3 복합체) 및/또는 공동자극 분자(예를 들어, CD28 또는 4-1BB)와 이의 동족 리간드의 결합에 의해 유도되어 TCR/CD3 복합체를 통한 신호 전달과 같은(이에 한정되지 않음) 신호 전달 이벤트를 매개하는 반응, 예를 들어 일차 또는 이차 반응을 지칭한다. 자극은 특정 분자의 변경된 발현 및/또는 세포골격 구조의 재조직화 등을 매개할 수 있다.
용어 "자극 분자"는 적어도 일부 양태의 T세포 신호전달 경로에 대해 자극 방식으로 TCR 복합체의 일차 활성화를 조절하는 일차 세포질 신호전달 서열(들)을 제공하는, T세포에 의해 발현되는 분자를 지칭한다. 일부 구현예에서, CAR 내의 ITAM 함유 도메인은 내인성 TCR 복합체와 관계없이 일차 TCR의 신호전달을 재현한다. 일부 구현예에서, 일차 신호는 예를 들어 펩티드가 로딩된 MHC 분자와 TCR/CD3 복합체의 결합에 의해 개시되고, 증식, 활성화, 분화 등을 포함하는(이에 한정되지 않음) T세포 반응의 매개를 야기한다. 자극 방식으로 작용하는 일차 세포질 신호전달 서열("일차 신호전달 도메인"으로도 지칭됨)은 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 알려진 신호전달 모티프를 포함할 수 있다. 본 발명에 특히 유용한 ITAM 함유 일차 세포질 신호전달 서열의 예는 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278("ICOS"로도 알려짐), FcεRI 및 CD66d, DAP10 및 DAP12로부터 유래된 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 특정 CAR에서, 본 발명의 임의의 하나 이상의 CAR 내의 세포내 신호전달 도메인은 세포내 신호전달 서열, 예를 들어 CD3-제타의 일차 신호전달 서열을 포함한다. 용어 "항원 제시 세포" 또는 "APC"는 표면에 주요 조직적합성 복합체(MHC)와 복합체화된 외래 항원을 표시하는 면역계 세포, 예컨대 보조 세포(예를 들어, B세포, 수지상세포 등)를 지칭한다. T세포는 T세포 수용체(TCR)를 사용하여 이러한 복합체를 인식할 수 있다. APC는 항원을 프로세싱하여 T세포에 제시한다.
본원에서 사용되는 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 분자의 세포내 부분을 지칭한다. 구현예에서, 세포내 신호 도메인은 이펙터 기능 신호를 전달하고 세포가 특수 기능을 수행하도록 유도한다. 전체 세포내 신호전달 도메인이 사용될 수 있지만, 많은 경우에 전체 쇄를 사용할 필요는 없다. 세포내 신호전달 도메인의 절단된 부분이 사용되는 경우에, 이펙터 기능 신호를 전달하는 한, 온전한 쇄 대신 이러한 절단된 부분이 사용될 수 있다. 따라서, 용어 세포내 신호전달 도메인은 이펙터 기능 신호를 전달하기에 충분한 세포내 신호전달 도메인의 임의의 절단된 부분을 포함하는 의미이다.
세포내 신호전달 도메인은 CAR 함유 세포, 예를 들어 CART 세포의 면역 이펙터 기능을 촉진하는 신호를 생성한다. 예를 들어 CART 세포에서 면역 이펙터 기능의 예는 사이토카인의 분비를 비롯하여 세포용해 활성 및 헬퍼 활성을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 일차 세포내 신호전달 도메인은 일차 자극, 또는 항원 의존적 자극을 담당하는 분자로부터 유래된 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 세포내 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 공동자극 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 신호, 또는 항원 독립적 자극을 담당하는 분자로부터 유래된 것을 포함한다. 예를 들어 CART의 경우, 일차 세포내 신호전달 도메인은 T세포 수용체의 세포질 서열을 포함할 수 있고, 공동자극 세포내 신호전달 도메인은 공동수용체 또는 공동자극 분자로부터의 세포질 서열을 포함할 수 있다.
일차 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 알려진 신호전달 모티프를 포함할 수 있다. ITAM 함유 일차 세포질 신호전달 서열의 예는 CD3 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278("ICOS"로도 알려짐), FcεRI, CD66d, DAP10, 및 DAP12로부터 유래된 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
용어 "제타" 또는 대안적으로 "제타 쇄", "CD3-제타" 또는 "TCR-제타"는 CD247을 지칭한다. Swiss-Prot 수탁번호 P20963은 예시적인 인간 CD3 제타 아미노산 서열을 제공한다. "제타 자극 도메인" 또는 대안적으로 "CD3-제타 자극 도메인" 또는 "TCR-제타 자극 도메인"은 CD3-제타의 자극 도메인 또는 이의 변이체(예를 들어, 돌연변이, 예를 들어 점 돌연변이, 단편, 삽입, 또는 결실을 갖는 분자)를 지칭한다. 일부 구현예에서, 제타의 세포질 도메인은 GenBank 수탁번호 BAG36664.1의 잔기 52 내지 164 또는 이의 변이체(예를 들어, 돌연변이, 예를 들어 점 돌연변이, 단편, 삽입, 또는 결실을 갖는 분자)를 포함한다. 일부 구현예에서, "제타 자극 도메인" 또는 "CD3-제타 자극 도메인"은 서열번호 9 또는 10으로서 제공된 서열 또는 이의 변이체(예를 들어, 돌연변이, 예를 들어 점 돌연변이, 단편, 삽입, 또는 결실을 갖는 분자)이다.
용어 "공동자극 분자"는 공동자극 리간드와 특이적으로 결합하여, T세포에 의한 공동자극 반응, 예컨대 증식(이에 한정되지 않음)을 매개하는 T세포 상의 동족 결합 파트너를 지칭한다. 공동자극 분자는 효율적인 면역 반응에 필요한 항원 수용체 이외의 세포 표면 분자 또는 이의 리간드이다. 공동자극 분자는 MHC 클래스 I 분자, TNF 수용체 단백질, 면역글로불린-유사 단백질, 사이토카인수용체, 인테그린, 신호전달 림프구 활성화 분자(SLAM 단백질), 활성화 NK세포 수용체, BTLA, 톨 리간드 수용체, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), 4-1BB(CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS(CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM(LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD28-OX40, CD28-4-1BB, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
공동자극 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 분자의 세포내 부분을 지칭한다.
세포내 신호전달 도메인은 그것이 유래된 분자의 전체 세포내 부분, 또는 전체 고유의 세포내 신호전달 도메인, 또는 이의 기능적 단편을 포함할 수 있다.
"4-1BB 공동자극 도메인"은 4-1BB의 공동자극 도메인 또는 이의 변이체(예를 들어, 돌연변이, 예를 들어 점 돌연변이, 단편, 삽입, 또는 결실을 갖는 분자)를 지칭한다. 일부 구현예에서, "4-1BB 공동자극 도메인"은 서열번호 7로서 제공된 서열 또는 이의 변이체(예를 들어, 돌연변이, 예를 들어 점 돌연변이, 단편, 삽입, 또는 결실을 갖는 분자)이다.
본원에서 사용되는 용어 "면역 이펙터 세포"는 면역 반응, 예를 들어 면역 이펙터 반응의 촉진에 관여하는 세포를 지칭한다. 면역 이펙터 세포의 예는 T세포, 예를 들어 알파/베타 T세포 및 감마/델타 T세포, B세포, 자연살해(NK) 세포, 자연살해 T(NKT) 세포, 비만세포, 및 골수-유래 식세포를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "면역 이펙터 기능 또는 면역 이펙터 반응"은, 예를 들어 표적 세포의 면역 공격을 강화하거나 촉진하는 면역 이펙터 세포의 기능 또는 반응을 의미한다. 예를 들어, 면역 이펙터 기능 또는 반응은 표적 세포의 사멸, 또는 이의 성장 또는 증식의 억제를 촉진하는 T세포 또는 NK세포의 특성을 의미한다. T세포의 경우, 일차 자극 및 공동자극은 면역 이펙터 기능 또는 반응의 예이다.
용어 "이펙터 기능"은 세포의 특수 기능을 의미한다. T세포의 이펙터 기능은 예를 들어 사이토카인의 분비를 포함하는 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다.
용어 "암호화"는 뉴클레오티드(예를 들어, rRNA, tRNA, 및 mRNA)의 규정된 서열 또는 아미노산의 규정된 서열을 갖는 생물학적 프로세스에서 다른 중합체 및 마크로분자의 합성을 위한 주형 역할을 하는, 유전자, cDNA, 또는 mRNA와 같은 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드의 특정 서열의 고유 특성 및 이로부터 발생하는 생물학적 특성을 의미한다. 따라서, 유전자, cDNA, 또는 RNA는 해당 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물계에서 단백질을 생성하는 경우 단백질을 암호화한다. 뉴클레오티드 서열이 mRNA 서열과 동일하고 통상적으로 서열 목록에서 제공되는 암호화 가닥, 및 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로 사용되는 비암호화 가닥 둘 다는 해당 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 기타 생성물을 암호화하는 것으로서 언급될 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열"은, 서로 축중성 버전이고 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 또는 RNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이란 어구는 또한 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 일부 버전에서 인트론(들)을 함유할 수 있는 정도까지 인트론을 포함할 수 있다.
용어 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 특정 생물학적 결과를 달성하는 데 유효한 본원에 기재된 바와 같은 화합물, 제형, 물질, 또는 조성물의 양을 의미한다.
용어 "내인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로부터의, 또는 그 내부에서 생성된 임의의 물질을 의미한다.
용어 "외인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템의 외부로부터 도입되거나 외부에서 생성된 임의의 물질을 의미한다.
용어 "발현"은 특정 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역을 의미한다. 일부 구현예에서, 발현은 세포 내로 도입된 mRNA의 번역을 포함한다.
용어 "전달 벡터"는 단리된 핵산을 포함하고 단리된 핵산을 세포의 내부로 전달하는 데 사용될 수 있는 물질의 조성물을 의미한다. 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 관련된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 및 바이러스를 비롯한(이에 한정되지 않음) 많은 벡터가 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 용어 "전달 벡터"는 자가 복제 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 이 용어는 또한 핵산의 세포 내로의 전달을 용이하게 하는, 예를 들어 폴리리신 화합물, 리포솜 등과 같은 비플라스미드 및 비바이러스 화합물을 추가로 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 전달 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
용어 "발현 벡터"는 발현될 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현에 충분한 시스-작용 요소를 포함하며, 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포에 의해 또는 시험관내 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코스미드, 플라스미드(예를 들어, 네이키드이거나 또는 리포솜 내에 포함됨) 및 바이러스(예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스)를 비롯하여, 당업계에 알려진 모든 것을 포함한다.
용어 "렌티바이러스"는 레트로바이러스과의 속을 지칭한다. 렌티바이러스는 비분열 세포를 감염시킬 수 있다는 점에서 레트로바이러스 중에서 독특한 것이고; 렌티바이러스는 유의한 양의 유전 정보를 숙주 세포의 DNA 내로 전달할 수 있어, 유전자 전달 벡터의 가장 효율적인 방법 중 하나가 된다. HIV, SIV, 및 FIV는 모두 렌티바이러스의 예이다.
용어 "렌티바이러스 벡터"는 특히, 문헌[Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)]에 제공된 바와 같은 자가-비활성화 렌티바이러스 벡터를 비롯하여, 렌티바이러스 게놈의 적어도 일부로부터 유래된 벡터를 지칭한다. 임상에서 사용될 수 있는 렌티바이러스 벡터의 다른 예는, 예를 들어 Oxford BioMedica의 LENTIVECTOR® 유전자 전달 기술, Lentigen의 LENTIMAX™ 벡터 시스템 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 비임상 유형의 렌티바이러스 벡터도 이용 가능하고, 당업자에게 공지되어 있을 것이다.
용어 "상동성" 또는 "동일성"은 2개의 중합체 분자 사이, 예를 들어 2개의 핵산 분자, 예컨대 2개의 DNA 분자 또는 2개의 RNA 분자 사이, 또는 2개의 폴리펩티드 분자 사이의 서브유닛 서열 동일성을 의미한다. 두 분자 모두에서 서브유닛 위치가 동일한 단량체 서브유닛에 의해 점유될 때, 예를 들어 2개의 DNA 분자 각각에서 하나의 위치가 아데닌에 의해 점유되는 경우, 이들은 그 위치에서 상동성이거나 동일하다. 두 서열 사이의 상동성은 매칭되거나 상동성인 위치의 수의 직접적인 함수이다; 예를 들어, 두 서열에서의 위치의 절반(예를 들어, 길이가 10개 서브유닛인 중합체에서 5개의 위치)이 상동성일 경우, 두 서열은 50% 상동성이고; 위치의 90%(예를 들어, 10개 중 9개)가 매칭되거나 상동성일 경우, 두 서열은 90% 상동성이다.
비인간(예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 이의 단편(예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')2, 또는 항체의 다른 항원 결합 하위서열)이다. 대개, 인간화 항체 및 이의 항체 단편은 수여체의 상보성 결정 영역(CDR)으로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 비인간 종(공여체 항체), 예컨대 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린(수여체 항체 또는 항체 단편)이다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체/항체 단편은 수여체 항체나 도입 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 또는 항체 단편 성능을 추가로 개선하고 최적화할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체 또는 이의 항체 단편은 적어도 1개, 일반적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, CDR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 비인간 면역글로불린의 것에 상응하고, FR 영역의 전부 또는 상당 부분은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체 또는 항체 단편은 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc), 일반적으로 인간 면역글로불린의 것의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 자세한 내용은 문헌[Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992] 참조.
"완전 인간"은 전체 분자가 인간 기원이거나 항체 또는 면역글로불린의 인간 형태와 동일한 아미노산 서열로 이루어진 면역글로불린, 예컨대 항체 또는 항체 단편을 지칭한다.
용어 "단리된"은 천연 상태로부터 변경되거나 제거된 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 천연적으로 존재하는 핵산 또는 펩티드는 "단리된" 것이 아니지만, 이의 천연 상태의 공존 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 동일한 핵산 또는 펩티드는 "단리된" 것이다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 예를 들어 숙주 세포와 같은 비천연 환경에 존재할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 통상적으로 발생하는 핵산 염기에 대해 다음의 약어가 사용된다. "A"는 아데노신을 지칭하고, "C"는 시토신을 지칭하고, "G"는 구아노신을 지칭하고, "T"는 티미딘을 지칭하고, "U"는 우리딘을 지칭한다.
용어 "작동 가능하게 연결된" 또는 "전사 제어"는 조절 서열과 이종 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 지칭하며, 이는 후자의 발현을 초래한다. 예를 들어, 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적으로 관련되어 배치되는 경우, 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 작동 가능하게 연결된 것이다. 예를 들어, 프로모터가 암호화 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우, 프로모터는 해당 암호화 서열에 작동 가능하게 연결된 것이다. 작동 가능하게 연결된 DNA 서열은 서로 인접할 수 있고, 예를 들어 2개의 단백질 암호화 영역을 연결하는 것이 필요한 경우, 동일 리딩 프레임 내에 존재한다.
면역원성 조성물의 "비경구" 투여라는 용어는, 예를 들어 피하(s.c.), 정맥내(i.v.), 근육내(i.m.), 또는 흉골내 주사, 종양내, 또는 주입 기술을 포함한다.
용어 "핵산", "핵산 분자", "폴리뉴클레오티드", 또는 "폴리뉴클레오티드 분자"는 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 및 이의 중합체를 지칭한다. 구체적으로 제한되지 않는 한, 이 용어는 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고 천연 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 알려져 있는 유사체를 함유하는 핵산을 포괄한다. 일부 구현예에서, "핵산", "핵산 분자", "폴리뉴클레오티드", 또는 "폴리뉴클레오티드 분자"는 뉴클레오티드/뉴클레오시드 유도체 또는 유사체를 포함한다. 달리 나타내지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 명시적으로 나타낸 서열뿐만 아니라 이의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들어, 축중성 코돈 치환, 예를 들어 보존적 치환), 대립유전자, 동원체, SNP, 및 상보성 서열을 함축적으로 포함한다. 구체적으로, 축중성 코돈 치환, 예를 들어 보존적 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(문헌[Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); 및 Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)]).
용어 "펩티드", "폴리펩티드", 및 "단백질"은 상호교환적으로 사용되고, 펩티드 결합에 의해 공유적으로 연결된 아미노산 잔기로 구성된 화합물을 의미한다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 함유하여야 하고, 단백질 또는 펩티드 서열에 포함될 수 있는 아미노산의 최대 수에 대한 제한은 존재하지 않는다. 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 이 용어는 당업계에서 예를 들어 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머로도 통상적으로 지칭되는 짧은 쇄, 및 많은 유형이 존재하는, 일반적으로 당업계에서 단백질로 지칭되는 더 긴 쇄 둘 다를 지칭한다. "폴리펩티드"는 특히, 예를 들어 생물학적 활성 단편, 실질적으로 상동성인 폴리펩티드, 올리고펩티드, 동종이량체, 이종이량체, 폴리펩티드의 변이체, 변형된 폴리펩티드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 포함한다. 폴리펩티드는 천연 펩티드, 재조합 펩티드, 또는 이의 조합을 포함한다.
용어 "프로모터"는 폴리뉴클레오티드 서열의 특정 전사를 개시하는 데 필요한, 세포의 합성 기구 또는 도입된 합성 기구에 의해 인식되는 DNA 서열을 지칭한다.
용어 "프로모터/조절 서열"은 프로모터/조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자 산물의 발현에 필요한 핵산 서열을 지칭한다. 일부 예에서, 이 서열은 코어 프로모터 서열일 수 있고, 다른 예에서 이 서열은 또한 인핸서 서열, 및 유전자 산물의 발현에 필요한 다른 조절 요소를 포함할 수 있다. 프로모터/조절 서열은 예를 들어 조직 특이적 방식으로 유전자 산물을 발현하는 것일 수 있다.
용어 "항시적" 프로모터는, 유전자 산물을 암호화하거나 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결된 경우 세포의 대부분의 또는 모든 생리학적 조건하에 세포에서 유전자 산물이 생성되도록 하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
용어 "유도성" 프로모터는, 유전자 산물을 암호화하거나 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결된 경우 실질적으로 프로모터에 상응하는 유도인자가 세포에 존재할 때에만 세포에서 유전자 산물이 생성되도록 하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
용어 "조직 특이적" 프로모터는, 유전자를 암호화하거나 유전자에 의해 특정되는 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결된 경우 실질적으로 세포가 프로모터에 상응하는 조직 유형의 세포인 경우에만 세포에서 유전자 산물이 생성되도록 하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
용어 "암 관련 항원", "종양 항원", "과다증식성 장애 항원", 및 "과다증식성 장애와 관련된 항원"은 상호교환적으로, 특정 과다증식성 장애에 공통적인 항원을 지칭한다. 일부 구현예에서, 이러한 용어들은 상호교환적으로, 암세포 표면에서 전체적으로 또는 단편(예를 들어, MHC/펩티드)으로서 발현되고 암세포에 대한 약리학적 제제의 우선적 표적화에 유용한 분자(일반적으로 단백질, 탄수화물, 또는 지질)를 지칭한다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 정상 세포 및 암세포 둘 다에 의해 발현되는 마커, 예를 들어 계통 마커, 예를 들어 B세포 상의 CD19이다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 정상 세포와 비교하여 암세포에서 과발현, 예를 들어 정상 세포와 비교하여 1배 과발현, 2배 과발현, 3배 과발현, 또는 그 이상으로 과발현되는 세포 표면 분자이다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 암세포에서 부적절하게 합성된 세포 표면 분자, 예를 들어 정상 세포 상에서 발현되는 분자와 비교하여 결실, 부가, 또는 돌연변이를 함유하는 분자이다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 암세포의 세포 표면에서만 전체적으로 또는 단편(예를 들어, MHC/펩티드)으로서 발현될 것이고, 정상 세포의 표면에서는 합성되거나 발현되지 않을 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 과다증식성 장애 항원은 원발성 또는 전이성 흑색종, 흉선종, 림프종, 육종, 폐암, 간암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 백혈병, 자궁암, 자궁경부암, 방광암, 신장암 및 선암종, 예컨대 유방암, 전립선암(예를 들어, 거세-저항성 또는 요법-저항성 전립선 암 또는 전이성 전립선 암), 난소암, 췌장암 등, 또는 형질세포 증식 장애, 예를 들어 무증상 골수종(연쇄 다발성 골수종 또는 무증상 골수종), 의미불명 단클론 감마글로불린병증(MGUS), 발덴스트롬의 마크로글로불린혈증, 형질세포종(예를 들어, 형질세포 이형성증, 고립성 골수종, 고립성 형질세포종, 골수외 형질세포종, 및 다발성 형질세포종), 전신 아밀로이드 경쇄 아밀로이드증, 및 POEMS 증후군(크로우·후카세 증후군(Crow-Fukase syndrome), 타카츠키병(Takatsuki disease), 및 PEP 증후군으로도 알려져 있음)을 비롯한(이에 한정되지 않음) 암으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 CAR은 MHC 제시 펩티드에 결합하는 항원 결합 도메인(예를 들어, 항체 또는 항체 단편)을 포함하는 CAR을 포함한다. 통상적으로, 내인성 단백질로부터 유래된 펩티드는 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I 분자의 포켓을 채우고, CD8+ T 림프구 상의 T세포 수용체(TCR)에 의해 인식된다. MHC 클래스 I 복합체는 모든 유핵 세포에 의해 항시적으로 발현된다. 암에서, 바이러스 특이적 및/또는 종양 특이적 펩티드/MHC 복합체는 면역요법을 위한 고유한 부류의 세포 표면 표적을 나타낸다. 인간 백혈구 항원(HLA)-A1 또는 HLA-A2와 관련하여 바이러스 또는 종양 항원으로부터 유래된 펩티드를 표적화하는 TCR-유사 항체가 기술된 바 있다(예를 들어, 문헌[Sastry et al., J Virol. 2011 85(5):1935-1942; Sergeeva et al., Blood, 2011 117(16):4262-4272; Verma et al., J Immunol 2010 184(4):2156-2165; Willemsen et al., Gene Ther 2001 8(21) :1601-1608; Dao et al., Sci Transl Med 2013 5(176) :176ra33 ; Tassev et al., Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100] 참조). 예를 들어, TCR-유사 항체는 인간 scFv 파지 디스플레이 라이브러리와 같은 라이브러리의 스크리닝으로부터 확인될 수 있다.
용어 "종양-지지 항원" 또는 "암-지지 항원"은 상호교환적으로, 그 자체가 암성은 아니지만, 예를 들어 암세포의 성장 또는 생존, 예를 들어 면역 세포에 대한 저항성을 촉진함으로써 암세포를 지지하는 세포의 표면에서 발현되는 분자(일반적으로 단백질, 탄수화물, 또는 지질)를 지칭한다. 이러한 유형의 예시적인 세포는 기질세포 및 골수 유래 억제 세포(MDSC)를 포함한다. 종양-지지 항원은 암세포를 지지하는 세포 상에 항원이 존재하는 한, 그 자체가 종양세포를 지지하는 역할을 할 필요는 없다.
scFv와 관련하여 사용되는 용어 "유연성 폴리펩티드 링커" 또는 "링커"는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 영역을 함께 연결하기 위해 단독으로 또는 조합하여 사용되는 글리신 및/또는 세린 잔기와 같은 아미노산으로 이루어진 펩티드 링커를 지칭한다. 일부 구현예에서, 유연성 폴리펩티드 링커는 Gly/Ser 링커이고, 아미노산 서열 (Gly-Gly-Gly-Ser)n을 포함하며, 여기서 n은 1 이상의 양의 정수이다(서열번호 41). 예를 들어 n=1, n=2, n=3. n=4, n=5, n=6, n=7, n=8, n=9, n=10이다. 일부 구현예에서, 유연성 폴리펩티드 링커는 (Gly4 Ser)4(서열번호 27) 또는 (Gly4 Ser)3(서열번호 28)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 링커는 (Gly2Ser), (GlySer), 또는 (Gly3Ser)(서열번호 29)의 다중 반복부를 포함한다. 본원에 참조로 포함되는 WO2012/138475에 기술된 링커도 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본원에서 사용되는 5' 캡(RNA 캡, RNA 7-메틸구아노신 캡, 또는 RNA m7G 캡으로도 지칭됨)은 전사 개시 직후에 진핵 메신저 RNA의 "앞쪽" 또는 5' 말단에 부가된 변형된 구아닌 뉴클레오티드이다. 5' 캡은 제1 전사 뉴클레오티드에 연결되는 말단 기로 이루어진다. 이의 존재는 리보솜에 의한 인식 및 RNase로부터의 보호에 중요하다. 캡 부가는 전사와 커플링되고, 전사와 동시에 일어나서, 각각은 서로 영향을 미치게 된다. 전사 개시 직후에, 합성 중인 mRNA의 5' 말단에는 RNA 폴리머라제와 회합된 캡-합성 복합체가 결합된다. 이러한 효소 복합체는 mRNA 캡핑에 필요한 화학 반응을 촉매한다. 합성은 다단계 생화학 반응으로서 진행된다. 캡핑 모이어티는 mRNA의 기능성, 예컨대 이의 안정성 또는 번역 효율을 조정하기 위해 변형될 수 있다.
본원에서 사용되는 "시험관내 전사 RNA"는 시험관 내에서 합성된 RNA를 지칭한다. 일부 구현예에서 RNA는 mRNA이다. 일반적으로, 시험관내 전사 RNA는 시험관내 전사 벡터로부터 생성된다. 시험관내 전사 벡터는 시험관내 전사 RNA를 생성하는 데 사용되는 주형을 포함한다.
본원에서 사용되는 "폴리(A)"는 폴리아데닐화에 의해 mRNA에 부착된 일련의 아데노신이다. 일시적 발현을 위한 구성체의 일부 구현예에서, 폴리(A)는 50 내지 5000개(서열번호 30)이다. 일부 구현예에서 폴리(A)는 64개보다 많다. 일부 구현예에서 폴리(A)는 100개보다 많다. 일부 구현예에서 폴리(A)는 300개보다 많다. 일부 구현예에서 폴리(A)는 400개보다 많다. 폴리(A) 서열은 mRNA 기능성, 예컨대 국소화, 안정성 또는 번역 효율을 조정하기 위해 화학적으로 또는 효소적으로 변형될 수 있다.
본원에서 사용되는 "폴리아데닐화"는 폴리아데닐릴 모이어티, 또는 이의 변형된 변이체의 메신저 RNA 분자에 대한 공유 결합을 지칭한다. 진핵 유기체에서, 대부분의 메신저 RNA(mRNA) 분자는 3' 말단에서 폴리아데닐화된다. 3' 폴리(A) 테일은 효소, 폴리아데닐레이트 폴리머라제의 작용을 통해 pre-mRNA에 부가된 아데닌 뉴클레오티드(대개 수백 개)의 긴 서열이다. 고등 진핵생물에서, 폴리(A) 테일은 특정 서열, 폴리아데닐화 신호를 함유하는 전사체 상에 부가된다. 폴리(A) 테일 및 이에 결합된 단백질은 엑소뉴클레아제에 의한 분해로부터 mRNA를 보호하는 데 도움이 된다. 폴리아데닐화는 또한 전사 종결, 핵으로부터 mRNA의 방출, 및 번역에 중요하다. 폴리아데닐화는 DNA가 RNA로 전사된 직후 핵에서 일어나지만, 추가적으로 이후에 세포질에서도 일어날 수 있다. 전사가 종결된 후, mRNA 쇄는 RNA 폴리머라제와 회합된 엔도뉴클레아제 복합체의 작용을 통해 절단된다. 절단 부위는 통상적으로 절단 부위 근처의 염기 서열 AAUAAA의 존재를 특징으로 한다. mRNA가 절단된 후, 아데노신 잔기는 절단 부위의 자유 3' 말단에 부가된다.
본원에서 사용되는 "일시적"은 수 시간, 수일 또는 수주의 기간 동안의 통합되지 않은 이식유전자의 발현을 지칭하고, 여기서 발현 기간은 게놈 내로 통합되거나 숙주 세포에서 안정한 플라스미드 레플리콘 내에 포함되는 경우 유전자의 발현 기간보다 짧다.
본원에서 사용되는 용어 "치료"는 하나 이상의 요법제(예를 들어, 본 발명의 CAR과 같은 하나 이상의 치료제)의 투여로 인해 발생하는, 증식성 장애의 진행, 중증도 및/또는 지속기간의 감소 또는 개선, 또는 이의 하나 이상의 증상(바람직하게는, 하나 이상의 식별 가능한 증상)의 개선을 지칭한다. 특정 구현예에서, 용어 "치료"는 환자에 의해 반드시 식별 가능할 필요는 없는, 종양의 성장과 같은, 증식성 장애의 적어도 하나의 측정 가능한 물리적 파라미터의 개선을 지칭한다. 다른 구현예에서, 용어 "치료"는, 예를 들어 식별 가능한 증상의 안정화에 의해 물리적으로, 예를 들어 물리적 파라미터의 안정화에 의해 생리학적으로, 또는 둘 다에 의해, 증식성 장애의 진행을 억제하는 것을 지칭한다. 다른 구현예에서, 용어 "치료"는 종양 크기 또는 암성 세포 수의 감소 또는 안정화를 지칭한다.
용어 "신호 전달 경로"는 세포의 한 부분으로부터 세포의 다른 부분으로 신호를 전달하는 데 역할을 하는 다양한 신호 전달 분자들 사이의 생화학적 관계를 지칭한다. 어구 "세포 표면 수용체"는 신호를 수신하고 세포막을 가로질러 신호를 전달할 수 있는 분자 및 분자의 복합체를 포함한다.
용어 "대상체"는 면역 반응이 유도될 수 있는 살아있는 유기체(예를 들어, 포유류, 예를 들어 인간)를 포함하는 것으로 의도된다.
"실질적으로 정제된" 세포라는 용어는 다른 세포 유형이 본질적으로 없는 세포를 지칭한다. 실질적으로 정제된 세포는 또한 이의 천연 상태에서 보통 회합되어 있는 다른 세포 유형으로부터 분리된 세포를 지칭한다. 일부 예에서, 실질적으로 정제된 세포의 집단은 균질한 세포 집단을 지칭한다. 다른 예에서, 이 용어는 단순히, 천연 상태에서 자연적으로 회합되어 있는 세포로부터 분리된 세포를 지칭한다. 일부 구현예에서, 세포는 시험관 내에서 배양된다. 일부 구현예에서, 세포는 시험관 내에서 배양되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "치료적"은 치료를 의미한다. 치료적 효과는 질환 상태의 감소, 억제, 관해, 또는 근절에 의해 얻어진다.
본원에서 사용되는 용어 "예방"은 질환 또는 질환 상태의 방지 또는 보호적 처치를 의미한다.
용어 "형질감염" 또는 "형질전환" 또는 "형질도입"은 외인성 핵산이 숙주 세포 내로 전달되거나 도입되는 프로세스를 지칭한다. "형질감염" 또는 "형질전환" 또는 "형질도입"된 세포는 외인성 핵산으로 형질감염, 형질전환, 또는 형질도입된 세포이다. 세포는 일차 대상체 세포 및 그 자손을 포함한다.
"특이적 결합"이라는 용어는 샘플에 존재하는 동족 결합 파트너(예를 들어, T세포 상에 존재하는 자극 및/또는 공동자극 분자) 단백질을 인식하고 이와 결합하지만, 샘플 내의 다른 분자에 대한 인식 또는 결합은 실질적으로 없는 항체 또는 리간드를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "조절 가능한 키메라 항원 수용체(RCAR)"는 면역 이펙터 세포 내에 존재할 때 표적 세포(일반적으로, 암세포)에 대한 특이성 및 세포내 신호 생성을 세포에 제공하는 폴리펩티드(가장 단순한 구현예에서 일반적으로 2개의 폴리펩티드)의 세트를 지칭한다. 일부 구현예에서, RCAR은 적어도 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 CAR 분자와 관련하여 본원에 정의된 바와 같은 자극 분자 및/또는 공동자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 신호전달 도메인(본원에서 "세포내 신호전달 도메인"으로도 지칭됨)을 포함한다. 일부 구현예에서, RCAR에서 폴리펩티드의 세트는 서로 인접하지 않고, 예를 들어 상이한 폴리펩티드 쇄 내에 존재한다. 일부 구현예에서, RCAR은 이량체화 분자의 존재시 폴리펩티드를 서로 커플링시킬 수 있는, 예를 들어 항원 결합 도메인을 세포내 신호전달 도메인에 커플링시킬 수 있는 이량체화 스위치를 포함한다. 일부 구현예에서, RCAR은 본원에 기술된 바와 같은 세포(예를 들어, 면역 이펙터 세포), 예를 들어 RCAR-발현 세포(본원에서 "RCARX 세포"로도 지칭됨)에서 발현된다. 일부 구현예에서 RCARX 세포는 T세포이고, RCART 세포로서 지칭된다. 일부 구현예에서, RCARX 세포는 NK세포이고, RCARN 세포로서 지칭된다. RCAR은 RCAR-발현 세포에게 표적 세포, 일반적으로 암세포에 대한 특이성, 및 조절 가능한 세포내 신호 생성 또는 증식을 제공할 수 있고, 이는 RCAR-발현 세포의 면역 이펙터 특성을 최적화할 수 있다. 구현예에서, RCAR 세포는 적어도 부분적으로, 항원 결합 도메인에 의존하여, 항원 결합 도메인에 의해 결합된 항원을 포함하는 표적 세포에 대한 특이성을 제공한다.
본원에서 사용되는 용어 "막 앵커" 또는 "막 테더링 도메인"은 세포외 또는 세포내 도메인을 원형질막에 고정시키기에 충분한 폴리펩티드 또는 모이어티, 예를 들어 미리스토일 기를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "스위치 도메인"은, 예를 들어 RCAR을 언급하는 경우, 이량체화 분자의 존재하에 또 다른 스위치 도메인과 회합하는 개체, 일반적으로 폴리펩티드 기반 개체를 지칭한다. 회합은 제1 스위치 도메인에 연결된, 예를 들어 융합된 제1 개체, 및 제2 스위치 도메인에 연결된, 예를 들어 융합된 제2 개체의 기능적 커플링을 생성한다. 제1 및 제2 스위치 도메인은 이량체화 스위치로 총칭된다. 구현예에서, 제1 및 제2 스위치 도메인은 서로 동일하고, 예를 들어 동일한 일차 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이고, 동종이량체화 스위치로 총칭된다. 구현예에서, 제1 및 제2 스위치 도메인은 서로 상이하고, 예를 들어 서로 다른 일차 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이고, 이종이량체화 스위치로 총칭된다. 구현예에서, 스위치는 세포 내에 존재한다. 구현예에서, 스위치는 세포 외에 존재한다. 구현예에서, 스위치 도메인은 폴리펩티드 기반의 개체, 예를 들어 FKBP 또는 FRB 기반의 것이고, 이량체화 분자는 소분자, 예를 들어 라파로그(rapalogue)이다. 구현예에서, 스위치 도메인은 폴리펩티드 기반의 개체, 예를 들어 myc 펩티드에 결합하는 scFv이고, 이량체화 분자는 폴리펩티드, 이의 단편, 또는 폴리펩티드의 다량체, 예를 들어 myc 리간드 또는 하나 이상의 myc scFv에 결합하는 myc 리간드의 다량체이다. 구현예에서, 스위치 도메인은 폴리펩티드 기반의 개체, 예를 들어 myc 수용체이고, 이량체화 분자는 항체 또는 이의 단편, 예를 들어 myc 항체이다.
본원에서 사용되는 용어 "이량체화 분자"는, 예를 들어 RCAR을 언급하는 경우, 제1 스위치 도메인과 제2 스위치 도메인의 회합을 촉진하는 분자를 지칭한다. 구현예에서, 이량체화 분자는 대상체에서 자연 발생되지 않거나, 또는 유의미한 이량체화를 초래할 농도로 발생되지 않는다. 구현예에서, 이량체화 분자는 소분자, 예를 들어 라파마이신 또는 라파로그, 예를 들어 RAD001이다.
용어 "낮은, 면역 강화 용량"은, mTOR 억제제, 예를 들어 알로스테릭 mTOR 억제제, 예를 들어 RAD001 또는 라파마이신, 또는 촉매적 mTOR 억제제와 함께 사용된 경우, 예를 들어 P70 S6 키나제 활성의 억제에 의해 측정시, mTOR 활성을 부분적으로 억제하지만 완전히 억제하지는 않는 mTOR 억제제의 용량을 지칭한다. 예를 들어 P70 S6 키나제의 억제에 의해 mTOR 활성을 평가하는 방법이 본원에서 논의된다. 상기 용량은 완전한 면역 억제를 초래하기에는 불충분하지만, 면역 반응을 강화하기에는 충분하다. 일부 구현예에서, 낮은, 면역 강화 용량의 mTOR 억제제는 PD-1 양성 T세포의 수의 감소 및/또는 PD-1 음성 T세포의 수의 증가, 또는 PD-1 음성 T세포/PD-1 양성 T세포의 비의 증가를 초래한다. 일부 구현예에서, 낮은, 면역 강화 용량의 mTOR 억제제는 나이브 T세포 수의 증가를 초래한다. 일부 구현예에서, 낮은, 면역 강화 용량의 mTOR 억제제는
예를 들어 기억 T세포, 예를 들어 기억 T세포 전구체 상의 마커: CD62Lhigh, CD127high, CD27+, 및 BCL2 중 하나 이상의 발현의 증가;
예를 들어 기억 T세포, 예를 들어 기억 T세포 전구체 상의 KLRG1의 발현의 감소; 및
기억 T세포 전구체, 예를 들어 CD62Lhigh의 증가, CD127high의 증가, CD27+의 증가, KLRG1의 감소, 및 BCL2의 증가 특성의 임의의 하나 또는 조합을 나타내는 세포 수의 증가
중 하나 이상을 초래하고,
상기 임의의 변화는, 예를 들어 비치료 대상체와 비교하여, 예를 들어 적어도 일시적으로 발생한다.
본원에서 사용되는 "불응성"은 치료에 반응하지 않는 질환, 예를 들어 암을 지칭한다. 구현예에서, 불응성 암은 치료 전 또는 치료 시작시에 치료에 저항성일 수 있다. 다른 구현예에서, 불응성 암은 치료 중에 저항성이 될 수 있다. 불응성 암은 저항성 암이라고도 한다.
본원에서 사용되는 "재발성" 또는 "재발"은 개선 또는 반응성의 기간 후, 예를 들어 요법, 예를 들어 암 요법의 선행 치료 후, 질환(예를 들어, 암) 또는 암과 같은 질환의 징후 및 증상의 복귀 또는 재출현을 지칭한다. 초기 반응성 기간은 특정 역치 미만, 예를 들어 20%, 1%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만으로 떨어진 암세포 수준을 수반할 수 있다. 재출현은 특정 역치 초과, 예를 들어 20%, 1%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 초과로 상승한 암세포 수준을 수반할 수 있다. 예를 들어 B-ALL과 관련하여, 재출현은 완전 반응 후 혈액, 골수(5% 초과), 또는 임의의 골수외 부위에서 예를 들어 모세포의 재출현을 수반할 수 있다. 이와 관련하여, 완전 반응은 5% 미만의 BM 모세포를 수반할 수 있다. 보다 일반적으로, 일부 구현예에서, 반응(예를 들어, 완전 반응 또는 부분 반응)은 검출 가능한 MRD(최소 잔류 질환)의 부재를 수반할 수 있다. 일부 구현예에서, 초기 반응성 기간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6일; 적어도 1, 2, 3, 또는 4주; 적어도 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 또는 12개월; 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5년 지속된다.
범위: 본 개시내용 전반에 걸쳐, 본 발명의 다양한 구현예는 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 기재는 단지 편의와 간결함을 위한 것이며 본 발명의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로 해석되어서는 안 된다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 범위의 기재는 모든 가능한 하위범위와, 그 범위 내의 개별 수치를 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 기재는 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 하위범위와, 그 범위 내의 개별 숫자, 예를 들어 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, 및 6을 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 또 다른 예로서, 95~99% 동일성과 같은 범위는 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 것을 포함하고, 96~99%, 96~98%, 96~97%, 97~99%, 97~98%, 및 98~99% 동일성과 같은 하위범위를 포함한다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
본원에서 사용되는 용어 "유전자 편집 시스템"은 표적으로 하는 게놈 DNA의 부위에서 또는 그 근처에서 하나 이상의 핵산의 변경, 예를 들어 결실을 유도하고 초래하는 시스템, 예를 들어 하나 이상의 분자를 지칭한다. 유전자 편집 시스템은 본 기술 분야에 공지되어 있으며, 하기에 더 상세하게 기술된다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "조합하여" 투여된다는 것은 대상체가 장애를 앓는 동안 2가지(또는 그 이상)의 상이한 치료가 대상체에게 전달된다는 것, 예를 들어 대상체가 장애로 진단된 후 및 장애가 치유 또는 제거되거나 다른 이유로 치료가 중단되기 전에 2가지 이상의 치료가 전달된다는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 2차 치료가 시작될 때 1차 치료의 전달이 여전히 일어나고 있어 투여 면에서 중복되는 부분이 있다. 본원에서 이를 "동시" 또는 "병행 전달"이라고도 한다. 다른 구현예에서, 하나의 치료의 전달은 다른 치료의 전달이 시작되기 전에 종료된다. 어느 경우든 일부 구현예에서, 치료는 병용투여로 인해 더 효과적이다. 예를 들어 제2 치료가 보다 효과적이고, 예를 들어 더 적은 제2 치료에 의해 등가의 효과가 관찰되거나, 또는 제1 치료의 부재하에 제2 치료가 투여된 경우에 관찰되는 것보다 더 큰 정도로 제2 치료가 증상을 감소시키거나, 또는 제1 치료에 의해 유사한 상황이 관찰된다. 일부 구현예에서, 전달은 증상의 감소, 또는 장애와 관련된 다른 파라미터가 다른 치료의 부재하에 전달된 하나의 치료에서 관찰되는 것보다 더 크도록 이루어진다. 상기 2가지 치료의 효과는 부분적으로 상가적이거나, 완전히 상가적이거나, 상가적인 것보다 클 수 있다. 전달은 제2 치료가 전달될 때 전달된 제1 치료의 효과가 여전히 검출 가능하도록 이루어질 수 있다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 "고갈" 또는 "고갈시키는"이라는 용어는 프로세스, 예를 들어 선택 단계, 예를 들어 음성 선택이 수행된 후, 샘플 내 세포, 단백질, 또는 마크로분자의 수준 또는 양의 저하 또는 감소를 지칭한다. 고갈은 세포, 단백질, 또는 마크로분자의 완전 또는 부분 고갈일 수 있다. 일부 구현예에서, 고갈은 프로세스가 수행되기 전의 샘플 내 세포, 단백질, 또는 마크로분자의 수준 또는 양과 비교하여, 세포, 단백질, 또는 마크로분자의 수준 또는 양의 적어도 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 저하 또는 감소이다.
본원에서 사용되는 "나이브 T세포"는 항원 미경험 T세포를 지칭한다. 일부 구현예에서, 항원 미경험 T세포는 흉선에서 이의 동족 항원을 접촉하였으나, 말초에서는 그렇지 않았다. 일부 구현예에서, 나이브 T세포는 기억 세포의 전구체이다. 일부 구현예에서, 나이브 T세포는 CD45RA 및 CCR7을 모두 발현하지만, CD45RO를 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 나이브 T세포는 CD62L, CD27, CCR7, CD45RA, CD28, 및 CD127의 발현, 및 CD95 또는 CD45RO 이소형의 부재를 특징으로 할 수 있다. 일부 구현예에서, 나이브 T세포는 CD62L, IL-7 수용체-α, IL-6 수용체, 및 CD132를 발현하지만, CD25, CD44, CD69, 또는 CD45RO를 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 나이브 T세포는 CD45RA, CCR7, 및 CD62L을 발현하지만, CD95 또는 IL-2 수용체 β를 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 마커의 표면 발현 수준은 유세포 분석을 이용하여 평가된다.
용어 "중심 기억 T세포"는 인간에서 CD45RO 양성이고 CCR7을 발현하는 T세포의 서브세트를 지칭한다. 일부 구현예에서, 중심 기억 T세포는 CD95를 발현한다. 일부 구현예에서, 중심 기억 T세포는 IL-2R, IL-7R, 및/또는 IL-15R을 발현한다. 일부 구현예에서, 중심 기억 T세포는 CD45RO, CD95, IL-2 수용체 β, CCR7, 및 CD62L을 발현한다. 일부 구현예에서, 마커의 표면 발현 수준은 유세포 분석을 이용하여 평가된다.
용어 "줄기 기억 T세포", "줄기세포 기억 T세포", "줄기세포-유사 기억 T세포", "기억 줄기 T세포", "T 기억 줄기세포", "T 줄기세포 기억 세포", 또는 "TSCM 세포"는 줄기세포-유사 능력, 예를 들어 자가 재개 능력 및/또는 기억 및/또는 이펙터 T세포 서브세트를 재구성하는 다분화능을 갖는 기억 T세포의 서브세트를 지칭한다. 일부 구현예에서, 줄기 기억 T세포는 CD45RA, CD95, IL-2 수용체 β, CCR7, 및 CD62L을 발현한다. 일부 구현예에서, 마커의 표면 발현 수준은 유세포 분석을 이용하여 평가된다. 일부 구현예에서, 예시적인 줄기 기억 T세포는 문헌[Gattinoni et al., Nat Med. 2017 January 06; 23(1): 18-27]에 개시되어 있으며 그 전문은 본원에 참조로 포함된다.
명확성을 위해, 달리 언급되지 않는 한, 세포 또는 세포의 집단을 "발현하지 않는" 것으로 분류하거나 특정 마커의 "부재" 또는 특정 마커에 대해 "음성"인 것으로 분류하는 것은 반드시 마커의 절대 부재를 의미하는 것은 아닐 수 있다. 당업자는 용이하게 세포를 양성 및/또는 음성 대조군과 비교하고/하거나 소정의 역치를 설정하고, 통상적인 검출 방법을 이용하여, 예를 들어 본원의 실시예에 기술된 바와 같이, 예를 들어 유세포 분석을 이용하여, 세포가 소정의 역치 미만의 발현 수준을 갖거나 세포 집단이 소정의 역치 미만의 전체 발현 수준을 갖는 경우, 세포 또는 세포 집단이 이러한 마커를 발현하지 않거나 마커에 대해 음성인 것으로 분류할 수 있다. 예를 들어, 대표적인 게이팅 전략을 도 1g에 도시하였다. 예를 들어, CCR7 양성, CD45RO 음성 세포는 도 1g의 좌측 상단 사분면에 표시된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 세포의 "유전자 세트 점수(위 TEM 대 아래 TSCM)"이라는 용어는 세포가 줄기세포 기억 T세포(TSCM) 표현형 대비 이펙터 기억 T세포(TEM) 표현형을 나타내는 정도를 반영하는 점수를 의미한다. 더 높은 유전자 세트 점수(위 TEM 대 아래 TSCM)은 증가하는 TEM 표현형을 나타내는 반면, 더 낮은 유전자 세트 점수(위 TEM 대 아래 TSCM)은 증가하는 TSCM 표현형을 나타낸다. 일부 구현예에서, 유전자 세트 점수(위 TEM 대 아래 TSCM)은 TEM 세포에서 상향 조절되고/되거나 TSCM 세포에서 하향 조절되는 하나 이상의 유전자, 예를 들어 MXRA7, CLIC1, NAT13, TBC1D2B, GLCCI1, DUSP10, APOBEC3D, CACNB3, ANXA2P2, TPRG1, EOMES, MATK, ARHGAP10, ADAM8, MAN1A1, SLFN12L, SH2D2A, EIF2C4, CD58, MYO1F, RAB27B, ERN1, NPC1, NBEAL2, APOBEC3G, SYTL2, SLC4A4, PIK3AP1, PTGDR, MAF, PLEKHA5, ADRB2, PLXND1, GNAO1, THBS1, PPP2R2B, CYTH3, KLRF1, FLJ16686, AUTS2, PTPRM, GNLY, 및 GFPT2로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 측정하여 결정된다. 일부 구현예에서, 유전자 세트 점수(위 TEM 대 아래 TSCM)은 예를 들어, 도 39a와 관련하여 실시예 10에서 예시된 바와 같이, RNA-seq, 예를 들어 단일 세포 RNA-seq(scRNA-seq)를 이용하여 각각의 세포에 대해 결정된다. 일부 구현예에서, 유전자 세트 점수(위 TEM 대 아래 TSCM)은 유전자 세트의 모든 유전자의 평균 로그 정규화 유전자 발현 값을 취하여 계산된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 세포의 "유전자 세트 점수(위 Treg 대 아래 Teff)"라는 용어는 세포가 이펙터 T세포(Teff) 표현형 대비 조절 T세포(Treg) 표현형을 나타내는 정도를 반영하는 점수를 의미한다. 더 높은 유전자 세트 점수(위 Treg 대 아래 Teff)는 증가하는 Treg 표현형을 나타내는 반면, 더 낮은 유전자 세트 점수(위 Treg 대 아래 Teff)는 증가하는 Teff 표현형을 나타낸다. 일부 구현예에서, 유전자 세트 점수(위 Treg 대 아래 Teff)는 Treg 세포에서 상향 조절되고/되거나 Teff 세포에서 하향 조절되는 하나 이상의 유전자, 예를 들어 C12orf75, SELPLG, SWAP70, RGS1, PRR11, SPATS2L, SPATS2L, TSHR, C14orf145, CASP8, SYT11, ACTN4, ANXA5, GLRX, HLA-DMB, PMCH, RAB11FIP1, IL32, FAM160B1, SHMT2, FRMD4B, CCR3, TNFRSF13B, NTNG2, CLDND1, BARD1, FCER1G, TYMS, ATP1B1, GJB6, FGL2, TK1, SLC2A8, CDKN2A, SKAP2, GPR55, CDCA7, S100A4, GDPD5, PMAIP1, ACOT9, CEP55, SGMS1, ADPRH, AKAP2, HDAC9, IKZF4, CARD17, VAV3, OBFC2A, ITGB1, CIITA, SETD7, HLA-DMA, CCR10, KIAA0101, SLC14A1, PTTG3P, DUSP10, FAM164A, PYHIN1, MYO1F, SLC1A4, MYBL2, PTTG1, RRM2, TP53INP1, CCR5, ST8SIA6, TOX, BFSP2, ITPRIPL1, NCAPH, HLA-DPB2, SYT4, NINJ2, FAM46C, CCR4, GBP5, C15orf53, LMCD1, MKI67, NUSAP1, PDE4A, E2F2, CD58, ARHGEF12, LOC100188949, FAS, HLA-DPB1, SELP, WEE1, HLA-DPA1, FCRL1, ICA1, CNTNAP1, OAS1, METTL7A, CCR6, HLA-DRB4, ANXA2P3, STAM, HLA-DQB2, LGALS1, ANXA2, PI16, DUSP4, LAYN, ANXA2P2, PTPLA, ANXA2P1, ZNF365, LAIR2, LOC541471, RASGRP4, BCAS1, UTS2, MIAT, PRDM1, SEMA3G, FAM129A, HPGD, NCF4, LGALS3, CEACAM4, JAKMIP1, TIGIT, HLA-DRA, IKZF2, HLA-DRB1, FANK1, RTKN2, TRIB1, FCRL3, 및 FOXP3으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 측정하여 결정된다. 일부 구현예에서, 유전자 세트 점수(위 Treg 대 아래 Teff)는 예를 들어, 도 39b와 관련하여 실시예 10에서 예시된 바와 같이, RNA-seq, 예를 들어 단일 세포 RNA-seq(scRNA-seq)를 이용하여 결정된다. 일부 구현예에서, 유전자 세트 점수(위 Treg 대 아래 Teff)는 유전자 세트의 모든 유전자의 평균 로그 정규화 유전자 발현 값을 취하여 계산된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 세포의 "유전자 세트 점수(아래 줄기세포능)"이라는 용어는 세포가 줄기세포능 표현형을 나타내는 정도를 반영하는 점수를 의미한다. 더 낮은 유전자 세트 점수(아래 줄기세포능)은 증가하는 줄기세포능 표현형을 나타낸다. 일부 구현예에서, 유전자 세트 점수(아래 줄기세포능)은 조혈 줄기세포에서 하향 조절되는 것에 비해 분화하는 줄기세포에서 상향 조절되는 하나 이상의 유전자, 예를 들어 ACE, BATF, CDK6, CHD2, ERCC2, HOXB4, MEOX1, SFRP1, SP7, SRF, TAL1, 및 XRCC5로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 측정하여 결정된다. 일부 구현예에서, 유전자 세트 점수(아래 줄기세포능)은 예를 들어, 도 39c와 관련하여 실시예 10에서 예시된 바와 같이, RNA-seq, 예를 들어 단일 세포 RNA-seq(scRNA-seq)를 이용하여 결정된다. 일부 구현예에서, 유전자 세트 점수(아래 줄기세포능)은 유전자 세트의 모든 유전자의 평균 로그 정규화 유전자 발현 값을 취하여 계산된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 세포의 "유전자 세트 점수(위 저산소증)"이라는 용어는 세포가 저산소증 표현형을 나타내는 정도를 반영하는 점수를 의미한다. 더 높은 유전자 세트 점수(위 저산소증)은 증가하는 저산소증 표현형을 나타낸다. 일부 구현예에서, 유전자 세트 점수(위 저산소증)은 저산소증을 겪는 세포에서 상향 조절되는 하나 이상의 유전자, 예를 들어 ABCB1, ACAT1, ADM, ADORA2B, AK2, AK3, ALDH1A1, ALDH1A3, ALDOA, ALDOC, ANGPT2, ANGPTL4, ANXA1, ANXA2, ANXA5, ARHGAP5, ARSE, ART1, BACE2, BATF3, BCL2L1, BCL2L2, BHLHE40, BHLHE41, BIK, BIRC2, BNIP3, BNIP3L, BPI, BTG1, C11orf2, C7orf68, CA12, CA9, CALD1, CCNG2, CCT6A, CD99, CDK1, CDKN1A, CDKN1B, CITED2, CLK1, CNOT7, COL4A5, COL5A1, COL5A2, COL5A3, CP, CTSD, CXCR4, D4S234E, DDIT3, DDIT4, 1-Dec, DKC1, DR1, EDN1, EDN2, EFNA1, EGF, EGR1, EIF4A3, ELF3, ELL2, ENG, ENO1, ENO3, ENPEP, EPO, ERRFI1, ETS1, F3, FABP5, FGF3, FKBP4, FLT1, FN1, FOS, FTL, GAPDH, GBE1, GLRX, GPI, GPRC5A, HAP1, HBP1, HDAC1, HDAC9, HERC3, HERPUD1, HGF, HIF1A, HK1, HK2, HLA-DQB1, HMOX1, HMOX2, HSPA5, HSPD1, HSPH1, HYOU1, ICAM1, ID2, IFI27, IGF2, IGFBP1, IGFBP2, IGFBP3, IGFBP5, IL6, IL8, INSIG1, IRF6, ITGA5, JUN, KDR, KRT14, KRT18, KRT19, LDHA, LDHB, LEP, LGALS1, LONP1, LOX, LRP1, MAP4, MET, MIF, MMP13, MMP2, MMP7, MPI, MT1L, MTL3P, MUC1, MXI1, NDRG1, NFIL3, NFKB1, NFKB2, NOS1, NOS2, NOS2P1, NOS2P2, NOS3, NR3C1, NR4A1, NT5E, ODC1, P4HA1, P4HA2, PAICS, PDGFB, PDK3, PFKFB1, PFKFB3, PFKFB4, PFKL, PGAM1, PGF, PGK1, PGK2, PGM1, PIM1, PIM2, PKM2, PLAU, PLAUR, PLIN2, PLOD2, PNN, PNP, POLM, PPARA, PPAT, PROK1, PSMA3, PSMD9, PTGS1, PTGS2, QSOX1, RBPJ, RELA, RIOK3, RNASEL, RPL36A, RRP9, SAT1, SERPINB2, SERPINE1, SGSM2, SIAH2, SIN3A, SIRPA, SLC16A1, SLC16A2, SLC20A1, SLC2A1, SLC2A3, SLC3A2, SLC6A10P, SLC6A16, SLC6A6, SLC6A8, SORL1, SPP1, SRSF6, SSSCA1, STC2, STRA13, SYT7, TBPL1, TCEAL1, TEK, TF, TFF3, TFRC, TGFA, TGFB1, TGFB3, TGFBI, TGM2, TH, THBS1, THBS2, TIMM17A, TNFAIP3, TP53, TPBG, TPD52, TPI1, TXN, TXNIP, UMPS, VEGFA, VEGFB, VEGFC, VIM, VPS11, 및 XRCC6으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 측정하여 결정된다. 일부 구현예에서, 유전자 세트 점수(위 저산소증)은 예를 들어, 도 39d와 관련하여 실시예 10에서 예시된 바와 같이, RNA-seq, 예를 들어 단일 세포 RNA-seq(scRNA-seq)를 이용하여 결정된다. 일부 구현예에서, 유전자 세트 점수(위 저산소증)은 유전자 세트의 모든 유전자의 평균 로그 정규화 유전자 발현 값을 취하여 계산된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 세포의 "유전자 세트 점수(위 자가포식)"이라는 용어는 세포가 자가포식 표현형을 나타내는 정도를 반영하는 점수를 의미한다. 더 높은 유전자 세트 점수(위 자가포식)은 증가하는 자가포식 표현형을 나타낸다. 일부 구현예에서, 유전자 세트 점수(위 자가포식)은 자가포식을 겪는 세포에서 상향 조절되는 하나 이상의 유전자, 예를 들어 ABL1, ACBD5, ACIN1, ACTRT1, ADAMTS7, AKR1E2, ALKBH5, ALPK1, AMBRA1, ANXA5, ANXA7, ARSB, ASB2, ATG10, ATG12, ATG13, ATG14, ATG16L1, ATG16L2, ATG2A, ATG2B, ATG3, ATG4A, ATG4B, ATG4C, ATG4D, ATG5, ATG7, ATG9A, ATG9B, ATP13A2, ATP1B1, ATPAF1-AS1, ATPIF1, BECN1, BECN1P1, BLOC1S1, BMP2KL, BNIP1, BNIP3, BOC, C11orf2, C11orf41, C12orf44, C12orf5, C14orf133, C1orf210, C5, C6orf106, C7orf59, C7orf68, C8orf59, C9orf72, CA7, CALCB, CALCOCO2, CAPS, CCDC36, CD163L1, CD93, CDC37, CDKN2A, CHAF1B, CHMP2A, CHMP2B, CHMP3, CHMP4A, CHMP4B, CHMP4C, CHMP6, CHST3, CISD2, CLDN7, CLEC16A, CLN3, CLVS1, COX8A, CPA3, CRNKL1, CSPG5, CTSA, CTSB, CTSD, CXCR7, DAP, DKKL1, DNAAF2, DPF3, DRAM1, DRAM2, DYNLL1, DYNLL2, DZANK1, EI24, EIF2S1, EPG5, EPM2A, FABP1, FAM125A, FAM131B, FAM134B, FAM13B, FAM176A, FAM176B, FAM48A, FANCC, FANCF, FANCL, FBXO7, FCGR3B, FGF14, FGF7, FGFBP1, FIS1, FNBP1L, FOXO1, FUNDC1, FUNDC2, FXR2, GABARAP, GABARAPL1, GABARAPL2, GABARAPL3, GABRA5, GDF5, GMIP, HAP1, HAPLN1, HBXIP, HCAR1, HDAC6, HGS, HIST1H3A, HIST1H3B, HIST1H3C, HIST1H3D, HIST1H3E, HIST1H3F, HIST1H3G, HIST1H3H, HIST1H3I, HIST1H3J, HK2, HMGB1, HPR, HSF2BP, HSP90AA1, HSPA8, IFI16, IPPK, IRGM, IST1, ITGB4, ITPKC, KCNK3, KCNQ1, KIAA0226, KIAA1324, KRCC1, KRT15, KRT73, LAMP1, LAMP2, LAMTOR1, LAMTOR2, LAMTOR3, LARP1B, LENG9, LGALS8, LIX1, LIX1L, LMCD1, LRRK2, LRSAM1, LSM4, MAP1A, MAP1LC3A, MAP1LC3B, MAP1LC3B2, MAP1LC3C, MAP1S, MAP2K1, MAP3K12, MARK2, MBD5, MDH1, MEX3C, MFN1, MFN2, MLST8, MRPS10, MRPS2, MSTN, MTERFD1, MTMR14, MTMR3, MTOR, MTSS1, MYH11, MYLK, MYOM1, NBR1, NDUFB9, NEFM, NHLRC1, NME2, NPC1, NR2C2, NRBF2, NTHL1, NUP93, OBSCN, OPTN, P2RX5, PACS2, PARK2, PARK7, PDK1, PDK4, PEX13, PEX3, PFKP, PGK2, PHF23, PHYHIP, PI4K2A, PIK3C3, PIK3CA, PIK3CB, PIK3R4, PINK1, PLEKHM1, PLOD2, PNPO, PPARGC1A, PPY, PRKAA1, PRKAA2, PRKAB1, PRKAB2, PRKAG1, PRKAG2, PRKAG3, PRKD2, PRKG1, PSEN1, PTPN22, RAB12, RAB1A, RAB1B, RAB23, RAB24, RAB33B, RAB39, RAB7A, RB1CC1, RBM18, REEP2, REP15, RFWD3, RGS19, RHEB, RIMS3, RNF185, RNF41, RPS27A, RPTOR, RRAGA, RRAGB, RRAGC, RRAGD, S100A8, S100A9, SCN1A, SERPINB10, SESN2, SFRP4, SH3GLB1, SIRT2, SLC1A3, SLC1A4, SLC22A3, SLC25A19, SLC35B3, SLC35C1, SLC37A4, SLC6A1, SLCO1A2, SMURF1, SNAP29, SNAPIN, SNF8, SNRPB, SNRPB2, SNRPD1, SNRPF, SNTG1, SNX14, SPATA18, SQSTM1, SRPX, STAM, STAM2, STAT2, STBD1, STK11, STK32A, STOM, STX12, STX17, SUPT3H, TBC1D17, TBC1D25, TBC1D5, TCIRG1, TEAD4, TECPR1, TECPR2, TFEB, TM9SF1, TMBIM6, TMEM203, TMEM208, TMEM39A, TMEM39B, TMEM59, TMEM74, TMEM93, TNIK, TOLLIP, TOMM20, TOMM22, TOMM40, TOMM5, TOMM6, TOMM7, TOMM70A, TP53INP1, TP53INP2, TRAPPC8, TREM1, TRIM17, TRIM5, TSG101, TXLNA, UBA52, UBB, UBC, UBQLN1, UBQLN2, UBQLN4, ULK1, ULK2, ULK3, USP10, USP13, USP30, UVRAG, VAMP7, VAMP8, VDAC1, VMP1, VPS11, VPS16, VPS18, VPS25, VPS28, VPS33A, VPS33B, VPS36, VPS37A, VPS37B, VPS37C, VPS37D, VPS39, VPS41, VPS4A, VPS4B, VTA1, VTI1A, VTI1B, WDFY3, WDR45, WDR45L, WIPI1, WIPI2, XBP1, YIPF1, ZCCHC17, ZFYVE1, ZKSCAN3, ZNF189, ZNF593, 및 ZNF681로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현을 측정하여 결정된다. 일부 구현예에서, 유전자 세트 점수(위 자가포식)은 예를 들어, 도 39e와 관련하여 실시예 10에서 예시된 바와 같이, RNA-seq, 예를 들어 단일 세포 RNA-seq(scRNA-seq)를 이용하여 결정된다. 일부 구현예에서, 유전자 세트 점수(위 자가포식)은 유전자 세트의 모든 유전자의 평균 로그 정규화 유전자 발현 값을 취하여 계산된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 세포의 "유전자 세트 점수(위 휴면 대 아래 활성화)"라는 용어는 세포가 활성화 T세포 표현형 대비 휴면 T세포 표현형을 나타내는 정도를 반영하는 점수를 의미한다. 더 높은 유전자 세트 점수(위 휴면 대 아래 활성화)는 증가하는 휴면 T세포 표현형을 나타내는 반면, 더 낮은 유전자 세트 점수(위 휴면 대 아래 활성화)는 증가하는 활성화 T세포 표현형을 나타낸다. 일부 구현예에서, 유전자 세트 점수(위 휴면 대 아래 활성화)는 휴면 T세포에서 상향 조절되고/되거나 활성화 T세포에서 하향 조절되는 하나 이상의 유전자, 예를 들어 ABCA7, ABCF3, ACAP2, AMT, ANKH, ATF7IP2, ATG14, ATP1A1, ATXN7, ATXN7L3B, BCL7A, BEX4, BSDC1, BTG1, BTG2, BTN3A1, C11orf21, C19orf22, C21orf2, CAMK2G, CARS2, CCNL2, CD248, CD5, CD55, CEP164, CHKB, CLK1, CLK4, CTSL1, DBP, DCUN1D2, DENND1C, DGKD, DLG1, DUSP1, EAPP, ECE1, ECHDC2, ERBB2IP, FAM117A, FAM134B, FAM134C, FAM169A, FAM190B, FAU, FLJ10038, FOXJ2, FOXJ3, FOXL1, FOXO1, FXYD5, FYB, HLA-E, HSPA1L, HYAL2, ICAM2, IFIT5, IFITM1, IKBKB, IQSEC1, IRS4, KIAA0664L3, KIAA0748, KLF3, KLF9, KRT18, LEF1, LINC00342, LIPA, LIPT1, LLGL2, LMBR1L, LPAR2, LTBP3, LYPD3, LZTFL1, MANBA, MAP2K6, MAP3K1, MARCH8, MAU2, MGEA5, MMP8, MPO, MSL1, MSL3, MYH3, MYLIP, NAGPA, NDST2, NISCH, NKTR, NLRP1, NOSIP, NPIP, NUMA1, PAIP2B, PAPD7, PBXIP1, PCIF1, PI4KA, PLCL2, PLEKHA1, PLEKHF2, PNISR, PPFIBP2, PRKCA, PRKCZ, PRKD3, PRMT2, PTP4A3, PXN, RASA2, RASA3, RASGRP2, RBM38, REPIN1, RNF38, RNF44, ROR1, RPL30, RPL32, RPLP1, RPS20, RPS24, RPS27, RPS6, RPS9, RXRA, RYK, SCAND2, SEMA4C, SETD1B, SETD6, SETX, SF3B1, SH2B1, SLC2A4RG, SLC35E2B, SLC46A3, SMAGP, SMARCE1, SMPD1, SNPH, SP140L, SPATA6, SPG7, SREK1IP1, SRSF5, STAT5B, SVIL, SYF2, SYNJ2BP, TAF1C, TBC1D4, TCF20, TECTA, TES, TMEM127, TMEM159, TMEM30B, TMEM66, TMEM8B, TP53TG1, TPCN1, TRIM22, TRIM44, TSC1, TSC22D1, TSC22D3, TSPYL2, TTC9, TTN, UBE2G2, USP33, USP34, VAMP1, VILL, VIPR1, VPS13C, ZBED5, ZBTB25, ZBTB40, ZC3H3, ZFP161, ZFP36L1, ZFP36L2, ZHX2, ZMYM5, ZNF136, ZNF148, ZNF318, ZNF350, ZNF512B, ZNF609, ZNF652, ZNF83, ZNF862, 및 ZNF91로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 측정하여 결정된다. 일부 구현예에서, 유전자 세트 점수(위 휴면 대 아래 활성화)는 예를 들어, 도 38d와 관련하여 실시예 10에서 예시된 바와 같이, RNA-seq, 예를 들어 단일 세포 RNA-seq(scRNA-seq)를 이용하여 결정된다. 일부 구현예에서, 유전자 세트 점수(위 휴면 대 아래 활성화)는 유전자 세트의 모든 유전자의 평균 로그 정규화 유전자 발현 값을 취하여 계산된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 세포의 "유전자 세트 점수(기억 분화에서 점진적으로 증가)"라는 용어는 기억 분화에서 세포의 단계를 반영하는 점수를 의미한다. 더 높은 유전자 세트 점수(기억 분화에서 점진적으로 증가)는 증가하는 후기 기억 T세포 표현형을 나타내는 반면, 더 낮은 유전자 세트 점수(기억 분화에서 점진적으로 증가)는 증가하는 초기 기억 T세포 표현형을 나타낸다. 일부 구현예에서, 유전자 세트 점수(위 자가포식)은 기억 분화 중에 상향 조절되는 하나 이상의 유전자, 예를 들어 MTCH2, RAB6C, KIAA0195, SETD2, C2orf24, NRD1, GNA13, COPA, SELT, TNIP1, CBFA2T2, LRP10, PRKCI, BRE, ANKS1A, PNPLA6, ARL6IP1, WDFY1, MAPK1, GPR153, SHKBP1, MAP1LC3B2, PIP4K2A, HCN3, GTPBP1, TLN1, C4orf34, KIF3B, TCIRG1, PPP3CA, ATG4D, TYMP, TRAF6, C17orf76, WIPF1, FAM108A1, MYL6, NRM, SPCS2, GGT3P, GALK1, CLIP4, ARL4C, YWHAQ, LPCAT4, ATG2A, IDS, TBC1D5, DMPK, ST6GALNAC6, REEP5, ABHD6, KIAA0247, EMB, TSEN54, SPIRE2, PIWIL4, ZSCAN22, ICAM1, CHD9, LPIN2, SETD8, ZC3H12A, ULBP3, IL15RA, HLA-DQB2, LCP1, CHP, RUNX3, TMEM43, REEP4, MEF2D, ABL1, TMEM39A, PCBP4, PLCD1, CHST12, RASGRP1, C1orf58, C11orf63, C6orf129, FHOD1, DKFZp434F142, PIK3CG, ITPR3, BTG3, C4orf50, CNNM3, IFI16, AK1, CDK2AP1, REL, BCL2L1, MVD, TTC39C, PLEKHA2, FKBP11, EML4, FANCA, CDCA4, FUCA2, MFSD10, TBCD, CAPN2, IQGAP1, CHST11, PIK3R1, MYO5A, KIR2DL3, DLG3, MXD4, RALGDS, S1PR5, WSB2, CCR3, TIPARP, SP140, CD151, SOX13, KRTAP5-2, NF1, PEA15, PARP8, RNF166, UEVLD, LIMK1, CACNB1, TMX4, SLC6A6, LBA1, SV2A, LLGL2, IRF1, PPP2R5C, CD99, RAPGEF1, PPP4R1, OSBPL7, FOXP4, SLA2, TBC1D2B, ST7, JAZF1, GGA2, PI4K2A, CD68, LPGAT1, STX11, ZAK, FAM160B1, RORA, C8orf80, APOBEC3F, TGFBI, DNAJC1, GPR114, LRP8, CD69, CMIP, NAT13, TGFB1, FLJ00049, ANTXR2, NR4A3, IL12RB1, NTNG2, RDX, MLLT4, GPRIN3, ADCY9, CD300A, SCD5, ABI3, PTPN22, LGALS1, SYTL3, BMPR1A, TBK1, PMAIP1, RASGEF1A, GCNT1, GABARAPL1, STOM, CALHM2, ABCA2, PPP1R16B, SYNE2, PAM, C12orf75, CLCF1, MXRA7, APOBEC3C, CLSTN3, ACOT9, HIP1, LAG3, TNFAIP3, DCBLD1, KLF6, CACNB3, RNF19A, RAB27A, FADS3, DLG5, APOBEC3D, TNFRSF1B, ACTN4, TBKBP1, ATXN1, ARAP2, ARHGEF12, FAM53B, MAN1A1, FAM38A, PLXNC1, GRLF1, SRGN, HLA-DRB5, B4GALT5, WIPI1, PTPRJ, SLFN11, DUSP2, ANXA5, AHNAK, NEO1, CLIC1, EIF2C4, MAP3K5, IL2RB, PLEKHG1, MYO6, GTDC1, EDARADD, GALM, TARP, ADAM8, MSC, HNRPLL, SYT11, ATP2B4, NHSL2, MATK, ARHGAP18, SLFN12L, SPATS2L, RAB27B, PIK3R3, TP53INP1, MBOAT1, GYG1, KATNAL1, FAM46C, ZC3HAV1L, ANXA2P2, CTNNA1, NPC1, C3AR1, CRIM1, SH2D2A, ERN1, YPEL1, TBX21, SLC1A4, FASLG, PHACTR2, GALNT3, ADRB2, PIK3AP1, TLR3, PLEKHA5, DUSP10, GNAO1, PTGDR, FRMD4B, ANXA2, EOMES, CADM1, MAF, TPRG1, NBEAL2, PPP2R2B, PELO, SLC4A4, KLRF1, FOSL2, RGS2, TGFBR3, PRF1, MYO1F, GAB3, C17orf66, MICAL2, CYTH3, TOX, HLA-DRA, SYNE1, WEE1, PYHIN1, F2R, PLD1, THBS1, CD58, FAS, NETO2, CXCR6, ST6GALNAC2, DUSP4, AUTS2, C1orf21, KLRG1, TNIP3, GZMA, PRR5L, PRDM1, ST8SIA6, PLXND1, PTPRM, GFPT2, MYBL1, SLAMF7, FLJ16686, GNLY, ZEB2, CST7, IL18RAP, CCL5, KLRD1, 및 KLRB1로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 측정하여 결정된다. 일부 구현예에서, 유전자 세트 점수(기억 분화에서 점진적으로 증가)는 예를 들어, 도 40b와 관련하여 실시예 10에서 예시된 바와 같이, RNA-seq, 예를 들어 단일 세포 RNA-seq(scRNA-seq)를 이용하여 결정된다. 일부 구현예에서, 유전자 세트 점수(기억 분화에서 점진적으로 증가)는 유전자 세트의 모든 유전자의 평균 로그 정규화 유전자 발현 값을 취하여 계산된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 세포의 "유전자 세트 점수(위 TEM 대 아래 TN)"이라는 용어는 세포가 나이브 T세포(TN) 표현형 대비 이펙터 기억 T세포(TEM) 표현형을 나타내는 정도를 반영하는 점수를 의미한다. 더 높은 유전자 세트 점수(위 TEM 대 아래 TN)은 증가하는 TEM 표현형을 나타내는 반면, 더 낮은 유전자 세트 점수(위 TEM 대 아래 TN)은 증가하는 TN 표현형을 나타낸다. 일부 구현예에서, 유전자 세트 점수(위 TEM 대 아래 TN)은 TEM 세포에서 상향 조절되고/되거나 TN 세포에서 하향 조절되는 하나 이상의 유전자, 예를 들어 MYO5A, MXD4, STK3, S1PR5, GLCCI1, CCR3, SOX13, KRTAP5-2, PEA15, PARP8, RNF166, UEVLD, LIMK1, SLC6A6, SV2A, KPNA2, OSBPL7, ST7, GGA2, PI4K2A, CD68, ZAK, RORA, TGFBI, DNAJC1, JOSD1, ZFYVE28, LRP8, OSBPL3, CMIP, NAT13, TGFB1, ANTXR2, NR4A3, RDX, ADCY9, CHN1, CD300A, SCD5, PTPN22, LGALS1, RASGEF1A, GCNT1, GLUL, ABCA2, CLDND1, PAM, CLCF1, MXRA7, CLSTN3, ACOT9, METRNL, BMPR1A, LRIG1, APOBEC3G, CACNB3, RNF19A, RAB27A, FADS3, ACTN4, TBKBP1, FAM53B, MAN1A1, FAM38A, GRLF1, B4GALT5, WIPI1, DUSP2, ANXA5, AHNAK, CLIC1, MAP3K5, ST8SIA1, TARP, ADAM8, MATK, SLFN12L, PIK3R3, FAM46C, ANXA2P2, CTNNA1, NPC1, SH2D2A, ERN1, YPEL1, TBX21, STOM, PHACTR2, GBP5, ADRB2, PIK3AP1, DUSP10, PTGDR, EOMES, MAF, TPRG1, NBEAL2, NCAPH, SLC4A4, FOSL2, RGS2, TGFBR3, MYO1F, C17orf66, CYTH3, WEE1, PYHIN1, F2R, THBS1, CD58, AUTS2, FAM129A, TNIP3, GZMA, PRR5L, PRDM1, PLXND1, PTPRM, GFPT2, MYBL1, SLAMF7, ZEB2, CST7, CCL5, GZMK, 및 KLRB1로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 측정하여 결정된다. 일부 구현예에서, 유전자 세트 점수(위 TEM 대 아래 TN)은 예를 들어, 도 40c와 관련하여 실시예 10에서 예시된 바와 같이, RNA-seq, 예를 들어 단일 세포 RNA-seq(scRNA-seq)를 이용하여 결정된다. 일부 구현예에서, 유전자 세트 점수(위 TEM 대 아래 TN)은 유전자 세트의 모든 유전자의 평균 로그 정규화 유전자 발현 값을 취하여 계산된다.
유전자 세트 점수 값(예를 들어, 유전자 세트 점수 값의 중앙값)과 관련하여, 양의 유전자 세트 점수가 100% 감소되면, 이 값은 0이 된다. 음의 유전자 세트 점수가 100% 증가되면, 이 값은 0이 된다. 예를 들어, 도 39a에서, 1일차 샘플의 유전자 세트 점수 중앙값은 -0.084이고, 9일차 샘플의 유전자 세트 점수 중앙값은 0.035이고, 투입 샘플의 유전자 세트 점수 중앙값은 -0.1이다. 도 39a에서, 투입 샘플의 유전자 세트 점수 중앙값을 100% 증가시키면 유전자 세트 점수 값은 0이 되고, 투입 샘플의 유전자 세트 점수 중앙값을 200% 증가시키면 유전자 세트 점수 값은 0.1이 된다. 도 39a에서, 9일차 샘플의 유전자 세트 점수 중앙값을 100% 감소시키면 유전자 세트 점수 값은 0이 되고, 9일차 샘플의 유전자 세트 점수 중앙값을 200% 감소시키면 유전자 세트 점수 값은 -0.035가 된다.
본원에서 사용되는 용어 "비드"는 직경이 대략 0.1 μm 내지 수 밀리미터 크기 범위인 고체 표면을 갖는 개별 입자를 지칭한다. 비드는 구형(예를 들어, 미소구체)이거나 불규칙 불규칙한 형상을 가질 수 있다. 비드는 상자성 물질, 세라믹, 플라스틱, 유리, 폴리스테린, 메틸스티렌, 아크릴 중합체, 티타늄, 라텍스, Sepharose™, 셀룰로스, 나일론 등을 비롯한(이에 한정되지 않음) 다양한 물질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 비드는 예를 들어, CD3(예를 들어, CD3 엡실론) 및 CD28에 대한 항체의 혼합물로 코팅된, 예를 들어 공유적으로 커플링된, 비교적 균일한 약 4.5 μm 직경의 구형 초상자성 폴리스티렌 비드이다. 일부 구현예에서, 비드는 Dynabeads®이다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체 둘 모두가 동일한 비드에 커플링되어, 항원 제시 세포에 의한 T세포의 자극을 모방한다. Dynabeads®의 특성 및 세포 단리 및 증식을 위한 Dynabeads®의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Neurauter et al., Cell isolation and expansion using Dynabeads, Adv Biochem Eng Biotechnol. 2007;106:41-73] 참조.
본원에서 사용되는 용어 "나노매트릭스"는 이동성 고분자 사슬의 매트릭스를 포함하는 나노구조를 지칭한다. 나노매트릭스는 크기가 1 내지 500 nm, 예를 들어 10 내지 200 nm이다. 일부 구현예에서, 이동성 고분자 사슬의 매트릭스는 T세포에 활성화 신호를 제공하는 하나 이상의 작용제, 예를 들어 작용제인 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체에 부착된다. 일부 구현예에서, 나노매트릭스는 하나 이상의 자극 분자의 작용제 및/또는 하나 이상의 공동자극 분자의 작용제에 부착된, 예를 들어 공유적으로 부착된 콜로이드 고분자 나노매트릭스를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 자극 분자의 작용제는 CD3 작용제(예를 들어, 항-CD3 작용성 항체)이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 공동자극 분자의 작용제는 CD28 작용제(예를 들어, 항-CD28 작용성 항체)이다. 일부 구현예에서, 나노매트릭스는 예를 들어 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체와 같은 작용제에 대한 부착점으로서의 고체 표면의 부재를 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 나노매트릭스는 WO2014/048920A1에 개시된 나노매트릭스 또는 Miltenyi Biotcc GmbH의 MACS® GMP T세포 TransAct™ 키트에 제공되는 나노매트릭스이며, 그 전체는 본원에 참조로 포함된다. MACS® GMP T세포 TransAct™는 인간 CD3 및 CD28에 대한 인간화 재조합 작용제 항체에 공유적으로 부착된 콜로이드 고분자 나노매트릭스로 구성된다.
본원의 조성물 및 방법의 다양한 구현예를 아래에 더욱 상세히 기술한다. 추가 정의는 명세서 전체에 걸쳐 명시되어 있다.
설명
CAR, 예를 들어 본원에 기술된 CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T세포 또는 NK세포)의 제조 방법, 이러한 세포를 포함하는 조성물, 및 대상체의 질환, 예컨대 암을 치료하기 위해 이러한 세포를 이용하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 24시간 미만 내에 CAR을 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포를 제조할 수 있다. 이론에 구애되고자 함이 없이, 본원에 제공된 방법은 제조 프로세스 중에 나이브 T세포와 같은 T세포의 미분화 표현형을 보존한다. 미분화 표현형을 가진 이러한 CAR-발현 세포는 주입 후 생체 내에서 더 오래 존속하고/하거나 증식될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 제조 방법에 의해 생성된 CART 세포는 예를 들어, scRNA-seq를 이용하여 측정시(예를 들어, 도 39a와 관련하여 실시예 10에 기술된 방법을 이용하여 측정시), 종래의 제조 프로세스에 의해 생성된 CART 세포와 비교하여, 더 높은 백분율의 줄기세포 기억 T세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 제조 방법에 의해 생성된 CART 세포는 예를 들어, scRNA-seq를 이용하여 측정시(예를 들어, 도 39b와 관련하여 실시예 10에 기술된 방법을 이용하여 측정시), 종래의 제조 프로세스에 의해 생성된 CART 세포와 비교하여, 더 높은 백분율의 이펙터 T세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 제조 방법에 의해 생성된 CART 세포는 예를 들어, scRNA-seq를 이용하여 측정시(예를 들어, 도 39c와 관련하여 실시예 10에 기술된 방법을 이용하여 측정시), 종래의 제조 프로세스에 의해 생성된 CART 세포와 비교하여, T세포의 줄기세포능을 더 잘 보존한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 제조 방법에 의해 생성된 CART 세포는 예를 들어, scRNA-seq를 이용하여 측정시(예를 들어, 도 39d와 관련하여 실시예 10에 기술된 방법을 이용하여 측정시), 종래의 제조 프로세스에 의해 생성된 CART 세포와 비교하여, 더 낮은 수준의 저산소증을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 제조 방법에 의해 생성된 CART 세포는 예를 들어, scRNA-seq를 이용하여 측정시(예를 들어, 도 39e와 관련하여 실시예 10에 기술된 방법을 이용하여 측정시), 종래의 제조 프로세스에 의해 생성된 CART 세포와 비교하여, 더 낮은 수준의 자가포식을 나타낸다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 Dynabeads®(예를 들어, CD3/CD28 Dynabeads®)와 같은 비드를 사용하는 단계를 포함하지 않고, 비드제거(de-beading) 단계를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 CART세포는 예를 들어 1일 미만, 12시간 미만, 8시간 미만, 6시간 미만, 4시간 미만, 3시간 미만, 2시간 미만, 1시간 미만의 최소한의 생체외 증식과 함께 또는 생체외 증식 없이 대상체에게 투여될 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 방법은 대상체의 질환 치료에 사용하기 위한 개선된 CAR-발현 세포 생성물을 제조하는 신속 제조 프로세스를 제공한다.
사이토카인 프로세스
일부 구현예에서, 본 개시는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 제조하는 방법으로서, (1) 세포의 집단을 IL-2, IL-7, IL-15, IL-21, IL-6, 또는 이의 조합으로부터 선택된 사이토카인과 접촉시키는 단계; (2) 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 CAR을 암호화하는 핵산 분자(예를 들어, DNA 또는 RNA 분자)와 접촉시켜, 핵산 분자를 포함하는 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 제공하는 단계; 및 (3) 보관(예를 들어, 동결보존 배지에 세포의 집단을 재제형화) 또는 투여하기 위해 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 수확하는 단계를 포함하고, (a) 단계 (2)는 단계 (1)과 함께 또는 단계 (1)의 시작 후 5시간 이내, 예를 들어 단계 (1)의 시작 후 1, 2, 3, 4, 또는 5시간 이내에 수행되고, 단계 (3)은 단계 (1)의 시작 후 26시간 이내, 예를 들어 단계 (1)의 시작 후 22, 23, 또는 24시간 이내, 예를 들어 단계 (1)의 시작 후 24시간 이내에 수행되거나, (b) 단계 (3)으로부터의 세포 집단은 단계 (1)의 시작시의 세포 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 증식되지 않거나, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40% 이하, 예를 들어 10% 이하만큼 증식되는, 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 단계 (2)의 핵산 분자는 DNA 분자이다. 일부 구현예에서, 단계 (2)의 핵산 분자는 RNA 분자이다. 일부 구현예에서, 단계 (2)의 핵산 분자는 바이러스 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 또는 레트로바이러스 벡터로부터 선택된 바이러스 벡터 상에 있다. 일부 구현예에서, 단계 (2)의 핵산 분자는 비바이러스 벡터 상에 있다. 일부 구현예에서, 단계 (2)의 핵산 분자는 플라스미드 상에 있다. 일부 구현예에서, 단계 (2)의 핵산 분자는 어떠한 벡터 상에도 있지 않다. 일부 구현예에서, 단계 (2)는 CAR을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 바이러스 벡터로 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 형질도입시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (2)는 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 (A) Tet2 표적 서열을 포함하는 센스 가닥 및 (B) 전체적으로 또는 부분적으로 센스 가닥에 상보적인 안티센스 가닥을 포함하는, Tet2를 표적화하는 shRNA, 또는 shRNA를 암호화하는 벡터와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 센스 가닥은 Tet2 표적 서열 GGGTAAGCCAAGAAAGAAA(서열번호 418)를 포함한다. 일부 구현예에서, 안티센스 가닥은 이의 역보체, 즉 TTTCTTTCTTGGCTTACCC(서열번호 419)를 포함한다. 일부 구현예에서, shRNA를 암호화하는 벡터는 CAR을 암호화하는 벡터와 동일하거나 상이하다. 일부 구현예에서, shRNA 서열을 암호화하는 벡터는 프로모터(예를 들어, U6 프로모터(이에 한정되지 않음)), Tet2 표적 서열을 포함하는 센스 가닥, 루프, 전체적으로 또는 부분적으로 센스 가닥에 상보적인 안티센스 가닥, 및 임의로 폴리T 테일, 예를 들어 표 29의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포(예를 들어, T세포)의 집단은 대상체의 성분채집 샘플(예를 들어, 백혈구 성분채집 샘플)로부터 수집된다.
일부 구현예에서, 성분채집 샘플(예를 들어, 백혈구 성분채집 샘플)은 대상체로부터 수집되어, 동결된 샘플(예를 들어, 동결보존된 샘플)로서 세포 제조 시설로 운송된다. 동결된 성분채집 샘플은 이후 해동되고, 예를 들어 세포 분류기(예를 들어, CliniMACS® Prodigy® 장치)를 이용해 성분채집 샘플로부터 T세포(예를 들어, CD4+ T세포 및/또는 CD8+ T세포)가 선택된다. 선택된 T세포(예를 들어, CD4+ T세포 및/또는 CD8+ T세포)는 이후, 본원에 기술된 사이토카인 프로세스를 이용해 CART 제조를 위해 시딩된다. 일부 구현예에서, 사이토카인 프로세스의 종료시, CAR T세포는 동결보존되고, 후에 해동되어 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 선택된 T세포(예를 들어, CD4+ T세포 및/또는 CD8+ T세포)는 CART 제조를 위해 시딩되기 전에 1회 이상의 동결-해동을 거친다.
일부 구현예에서, 성분채집 샘플(예를 들어, 백혈구 성분채집 샘플)은 대상체로부터 수집되어 신선한 제품(예를 들어, 동결되지 않은 제품)으로서 세포 제조 시설로 운송된다. 예를 들어 세포 분류기(예를 들어, CliniMACS® Prodigy® 장치)를 이용해 성분채집 샘플로부터 T세포(예를 들어, CD4+ T세포 및/또는 CD8+ T세포)가 선택된다. 선택된 T세포(예를 들어, CD4+ T세포 및/또는 CD8+ T세포)는 이후, 본원에 기술된 사이토카인 프로세스를 이용해 CART 제조를 위해 시딩된다. 일부 구현예에서, 선택된 T세포(예를 들어, CD4+ T세포 및/또는 CD8+ T세포)는 CART 제조를 위해 시딩되기 전에 1회 이상의 동결-해동을 거친다.
일부 구현예에서, 성분채집 샘플(예를 들어, 백혈구술 성분채집 샘플)은 대상체로부터 수집된다. 예를 들어 세포 분류기(예를 들어, CliniMACS® Prodigy® 장치)를 이용해 성분채집 샘플로부터 T세포(예를 들어, CD4+ T세포 및/또는 CD8+ T세포)가 선택된다. 선택된 T세포(예를 들어, CD4+ T세포 및/또는 CD8+ T세포)는 이후, 동결된 샘플(예를 들어, 동결보존된 샘플)로서 세포 제조 시설로 운송된다. 선택된 T세포(예를 들어, CD4+ T세포 및/또는 CD8+ T세포)는 이후 해동되어, 본원에 기술된 사이토카인 프로세스를 이용해 CART 제조를 위해 시딩된다.
일부 구현예에서, 세포(예를 들어, T세포)가 시딩된 후, 하나 이상의 사이토카인(예를 들어, IL-2, IL-7, IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)), IL-21, 또는 IL-6(예를 들어, IL-6/sIL-6R)으로부터 선택된 하나 이상의 사이토카인) 및 CAR을 암호화하는 벡터(예를 들어, 렌티바이러스 벡터)가 세포에 첨가된다. 20~24시간 동안의 인큐베이션 후, 세포는 세척되고 보관 또는 투여를 위해 제형화된다.
종래의 CART 제조 접근법과 달리, 본원에 제공된 사이토카인 프로세스는 CD3 및/또는 CD28 자극, 또는 생체외 T세포 증식을 포함하지 않는다. 항-CD3 및 항-CD28 항체와 접촉되고 생체 외에서 광범위하게 증식되는 T세포는 중심 기억 표현형으로의 분화를 보이는 경향이 있다. 이론에 구애되고자 함이 없이, 본원에 제공된 사이토카인 프로세스는 CART 제조 중에 T세포의 미분화된 표현형을 보존하거나 증가시켜 대상체에 주입된 후에 더 오래 존속할 수 있는 CART 생성물을 생성한다.
일부 구현예에서, 세포의 집단은 하나 이상의 사이토카인(예를 들어, IL-2, IL-7, IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)), IL-21, 또는 IL-6(예를 들어, IL-6/sIL-6Ra)으로부터 선택된 하나 이상의 사이토카인)과 접촉된다.
일부 구현예에서, 세포의 집단은 IL-2와 접촉된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 IL-7과 접촉된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))와 접촉된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 IL-21과 접촉된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 IL-6(예를 들어, IL-6/sIL-6Ra)과 접촉된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 IL-2 및 IL-7과 접촉된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 IL-2 및 IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))와 접촉된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 IL-2 및 IL-21과 접촉된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 IL-2 및 IL-6(예를 들어, IL-6/sIL-6Ra)과 접촉된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 IL-7 및 IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))와 접촉된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 IL-7 및 IL-21과 접촉된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 IL-7 및 IL-6(예를 들어, IL-6/sIL-6Ra)과 접촉된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)) 및 IL-21과 접촉된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)) 및 IL-6(예를 들어, IL-6/sIL-6Ra)과 접촉된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 IL-21 및 IL-6(예를 들어, IL-6/sIL-6Ra)과 접촉된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 IL-7, IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)), 및 IL-21과 접촉된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 LSD1 억제제와 추가로 접촉된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 MALT1 억제제와 추가로 접촉된다.
일부 구현예에서, 세포의 집단은 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 또는 300 U/ml의 IL-2와 접촉된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 ng/ml의 IL-7과 접촉된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 ng/ml의 IL-15와 접촉된다.
일부 구현예에서, 세포의 집단은 CAR을 암호화하는 핵산 분자와 접촉된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 CAR을 암호화하는 DNA 분자로 형질도입된다.
일부 구현예에서, 세포의 집단을 CAR을 암호화하는 핵산 분자와 접촉시키는 단계는 세포의 집단을 전술한 하나 이상의 사이토카인과 접촉시키는 단계와 동시에 일어난다. 일부 구현예에서, 세포의 집단을 CAR을 암호화하는 핵산 분자와 접촉시키는 단계는 세포의 집단을 전술한 하나 이상의 사이토카인과 접촉시키는 단계의 시작 후 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 또는 10시간 이내에 일어난다. 일부 구현예에서, 세포의 집단을 CAR을 암호화하는 핵산 분자와 접촉시키는 단계는 세포의 집단을 전술한 하나 이상의 사이토카인과 접촉시키는 단계의 시작 후 5시간 이내에 일어난다. 일부 구현예에서, 세포의 집단을 CAR을 암호화하는 핵산 분자와 접촉시키는 단계는 세포의 집단을 전술한 하나 이상의 사이토카인과 접촉시키는 단계의 시작 후 4시간 이내에 일어난다. 일부 구현예에서, 세포의 집단을 CAR을 암호화하는 핵산 분자와 접촉시키는 단계는 세포의 집단을 전술한 하나 이상의 사이토카인과 접촉시키는 단계의 시작 후 3시간 이내에 일어난다. 일부 구현예에서, 세포의 집단을 CAR을 암호화하는 핵산 분자와 접촉시키는 단계는 세포의 집단을 전술한 하나 이상의 사이토카인과 접촉시키는 단계의 시작 후 2시간 이내에 일어난다. 일부 구현예에서, 세포의 집단을 CAR을 암호화하는 핵산 분자와 접촉시키는 단계는 세포의 집단을 전술한 하나 이상의 사이토카인과 접촉시키는 단계의 시작 후 1시간 이내에 일어난다.
일부 구현예에서, 세포의 집단은 보관 또는 투여를 위해 수확된다.
일부 구현예에서, 세포의 집단은 세포의 집단을 전술한 하나 이상의 사이토카인과 접촉시키는 단계의 시작 후 72, 60, 48, 36, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 또는 18시간 이내에 보관 또는 투여를 위해 수확된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 세포의 집단을 전술한 하나 이상의 사이토카인과 접촉시키는 단계의 시작 후 26시간 이내에 보관 또는 투여를 위해 수확된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 세포의 집단을 전술한 하나 이상의 사이토카인과 접촉시키는 단계의 시작 후 25시간 이내에 보관 또는 투여를 위해 수확된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 세포의 집단을 전술한 하나 이상의 사이토카인과 접촉시키는 단계의 시작 후 24시간 이내에 보관 또는 투여를 위해 수확된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 세포의 집단을 전술한 하나 이상의 사이토카인과 접촉시키는 단계의 시작 후 23시간 이내에 보관 또는 투여를 위해 수확된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 세포의 집단을 전술한 하나 이상의 사이토카인과 접촉시키는 단계의 시작 후 22시간 이내에 보관 또는 투여를 위해 수확된다.
일부 구현예에서, 세포의 집단은 생체 외에서 증식되지 않는다.
일부 구현예에서, 세포의 집단은 전술한 하나 이상의 사이토카인과 접촉되기 전의 세포 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 또는 60% 이하만큼 증식된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 전술한 하나 이상의 사이토카인과 접촉되기 전의 세포 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 5% 이하만큼 증식된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 전술한 하나 이상의 사이토카인과 접촉되기 전의 세포 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 10% 이하만큼 증식된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 전술한 하나 이상의 사이토카인과 접촉되기 전의 세포 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 15% 이하만큼 증식된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 전술한 하나 이상의 사이토카인과 접촉되기 전의 세포 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 20% 이하만큼 증식된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 전술한 하나 이상의 사이토카인과 접촉되기 전의 세포 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 25% 이하만큼 증식된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 전술한 하나 이상의 사이토카인과 접촉되기 전의 세포 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 30% 이하만큼 증식된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 전술한 하나 이상의 사이토카인과 접촉되기 전의 세포 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 35% 이하만큼 증식된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 전술한 하나 이상의 사이토카인과 접촉되기 전의 세포 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 40% 이하만큼 증식된다.
일부 구현예에서, 세포의 집단은 전술한 하나 이상의 사이토카인과 접촉되기 전의 세포 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 16, 20, 24, 36, 또는 48시간 이내에 증식된다.
일부 구현예에서, 세포의 집단은 CD3/TCR 복합체(예를 들어, 항-CD3 항체)를 자극하는 제제 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제(예를 들어, 항-CD28 항체)와 시험관 내에서 접촉되지 않거나, 또는 접촉되는 경우 접촉 단계는 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 또는 5시간 미만이다.
일부 구현예에서, 세포의 집단은 CD3/TCR 복합체(예를 들어, 항-CD3 항체)를 자극하는 제제 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제(예를 들어, 항-CD28 항체)와 시험관 내에서 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28시간 동안 접촉된다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 사이토카인 프로세스를 이용하여 제조된 세포의 집단은, 세포의 집단을 예를 들어, CD3/TCR 복합체에 결합하는 제제(예를 들어, 항-CD3 항체) 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자에 결합하는 제제(예를 들어, 항-CD28 항체)와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포와 비교하여, CAR-발현 세포 중 나이브 세포의 더 높은(예를 들어, 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 또는 60% 더 높은) 백분율을 나타낸다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 사이토카인 프로세스는 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 또는 8% 이하의 혈청을 포함하는 세포 배지에서 수행된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 사이토카인 프로세스는 LSD1 억제제, MALT1 억제제, 또는 이의 조합을 포함하는 세포 배지에서 수행된다.
활성화 프로세스
일부 구현예에서, 본 개시는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 제조하는 방법으로서, (i) 세포(예를 들어, T세포, 예를 들어 동결된 또는 신선한 백혈구 성분채집 생성물로부터 단리된 T세포)의 집단을 (A) CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 (B) 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉시키는 단계; (ii) 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 CAR을 암호화하는 핵산 분자(예를 들어, DNA 또는 RNA 분자)와 접촉시켜, 핵산 분자를 포함하는 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 제공하는 단계; 및 (iii) 보관(예를 들어, 동결보존 배지에 세포의 집단을 재제형화) 또는 투여하기 위해 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 수확하는 단계를 포함하고, (a) 단계 (ii)는 단계 (i)과 함께 또는 단계 (i)의 시작 후 20시간 이내, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18시간 이내, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 18시간 이내에 수행되고, 단계 (iii)은 단계 (i)의 시작 후 26시간 이내에, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 22, 23, 또는 24시간 이내에, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 24시간 이내에 수행되거나; (b) 단계 (ii)는 단계 (i)과 함께 또는 단계 (i)의 시작 후 20시간 이내, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18시간 이내, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 18시간 이내에 수행되고, 단계 (iii)은 단계 (ii)의 시작 후 30, 36, 또는 48시간 이내에, 예를 들어 단계 (ii)의 시작 후 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 또는 48시간 이내에 수행되거나; (c) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 증식되지 않거나, 예를 들어 단계 (i)의 시작시의 세포 집단과 비교하여, 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40% 이하, 예를 들어 10% 이하만큼 증식되는, 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)의 핵산 분자는 DNA 분자이다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)의 핵산 분자는 RNA 분자이다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)의 핵산 분자는 바이러스 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 또는 레트로바이러스 벡터로부터 선택된 바이러스 벡터 상에 있다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)의 핵산 분자는 비바이러스 벡터 상에 있다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)의 핵산 분자는 플라스미드 상에 있다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)의 핵산 분자는 어떠한 벡터 상에도 있지 않다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)는 CAR을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 바이러스 벡터로 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 형질도입시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (2)는 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 (A) Tet2 표적 서열을 포함하는 센스 가닥 및 (B) 전체적으로 또는 부분적으로 센스 가닥에 상보적인 안티센스 가닥을 포함하는, Tet2를 표적화하는 shRNA, 또는 shRNA를 암호화하는 벡터와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 센스 가닥은 Tet2 표적 서열 GGGTAAGCCAAGAAAGAAA를 포함한다. 일부 구현예에서, 안티센스 가닥은 이의 역보체, 즉 TTTCTTTCTTGGCTTACCC를 포함한다. 일부 구현예에서, shRNA를 암호화하는 벡터는 CAR을 암호화하는 벡터와 동일하거나 상이하다. 일부 구현예에서, shRNA 서열을 암호화하는 벡터는 프로모터(예를 들어, U6 프로모터(이에 한정되지 않음)), Tet2 표적 서열을 포함하는 센스 가닥, 루프, 전체적으로 또는 부분적으로 센스 가닥에 상보적인 안티센스 가닥, 및 임의로 폴리T 테일, 예를 들어 표 29의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포(예를 들어, T세포)의 집단은 대상체의 성분채집 샘플(예를 들어, 백혈구 성분채집 샘플)로부터 수집된다.
일부 구현예에서, 성분채집 샘플(예를 들어, 백혈구 성분채집 샘플)은 대상체로부터 수집되어, 동결된 샘플(예를 들어, 동결보존된 샘플)로서 세포 제조 시설로 운송된다. 동결된 성분채집 샘플은 이후 해동되고, 예를 들어 세포 분류기(예를 들어, CliniMACS® Prodigy® 장치)를 이용해 성분채집 샘플로부터 T세포(예를 들어, CD4+ T세포 및/또는 CD8+ T세포)가 선택된다. 선택된 T세포(예를 들어, CD4+ T세포 및/또는 CD8+ T세포)는 이후, 본원에 기술된 활성화 프로세스를 이용해 CART 제조를 위해 시딩된다. 일부 구현예에서, 선택된 T세포(예를 들어, CD4+ T세포 및/또는 CD8+ T세포)는 CART 제조를 위해 시딩되기 전에 1회 이상의 동결-해동을 거친다.
일부 구현예에서, 성분채집 샘플(예를 들어, 백혈구 성분채집 샘플)은 대상체로부터 수집되어 신선한 제품(예를 들어, 동결되지 않은 제품)으로서 세포 제조 시설로 운송된다. 예를 들어 세포 분류기(예를 들어, CliniMACS® Prodigy® 장치)를 이용해 성분채집 샘플로부터 T세포(예를 들어, CD4+ T세포 및/또는 CD8+ T세포)가 선택된다. 선택된 T세포(예를 들어, CD4+ T세포 및/또는 CD8+ T세포)는 이후, 본원에 기술된 활성화 프로세스를 이용해 CART 제조를 위해 시딩된다. 일부 구현예에서, 선택된 T세포(예를 들어, CD4+ T세포 및/또는 CD8+ T세포)는 CART 제조를 위해 시딩되기 전에 1회 이상의 동결-해동을 거친다.
일부 구현예에서, 성분채집 샘플(예를 들어, 백혈구술 성분채집 샘플)은 대상체로부터 수집된다. 예를 들어 세포 분류기(예를 들어, CliniMACS® Prodigy® 장치)를 이용해 성분채집 샘플로부터 T세포(예를 들어, CD4+ T세포 및/또는 CD8+ T세포)가 선택된다. 선택된 T세포(예를 들어, CD4+ T세포 및/또는 CD8+ T세포)는 이후, 동결된 샘플(예를 들어, 동결보존된 샘플)로서 세포 제조 시설로 운송된다. 선택된 T세포(예를 들어, CD4+ T세포 및/또는 CD8+ T세포)는 이후 해동되어, 본원에 기술된 활성화 프로세스를 이용해 CART 제조를 위해 시딩된다.
일부 구현예에서, 세포(예를 들어, T세포)는 항-CD3 및 항-CD28 항체와 예를 들어 12시간 동안 접촉된 후, CAR을 암호화하는 벡터(예를 들어, 렌티바이러스 벡터)로 형질도입된다. 배양 개시 24시간 후, 세포는 세척되고, 보관 또는 투여를 위해 제형화된다.
이론에 구애되고자 함이 없이, 짧은 CD3 및 CD28 자극은 자가재생 T세포의 효율적인 형질도입을 촉진할 수 있다. 종래의 CART 제조 접근법과 비교하여, 본원에 제공된 활성화 프로세스는 장기간의 생체외 증식을 포함하지 않는다. 사이토카인 프로세스와 유사하게, 본원에 제공된 활성화 프로세스는 또한 CART 제조 중에 미분화된 T세포를 보존한다.
일부 구현예에서, 세포의 집단은 (A) CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 (B) 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉된다.
일부 구현예에서, CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제는 CD3을 자극하는 제제이다. 일부 구현예에서, 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제는 CD28, ICOS, CD27, HVEM, LIGHT, CD40, 4-1BB, OX40, DR3, GITR, CD30, TIM1, CD2, CD226, 또는 이의 임의의 조합을 자극하는 제제이다. 일부 구현예에서, 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제는 CD28을 자극하는 제제이다. 일부 구현예에서, CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제는 항체(예를 들어, 단일 도메인 항체(예를 들어, 중쇄 가변 도메인 항체), 펩티바디, Fab 단편, 또는 scFv), 소분자, 또는 리간드(예를 들어, 천연, 재조합, 또는 키메라 리간드)로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제는 항체(예를 들어, 단일 도메인 항체(예를 들어, 중쇄 가변 도메인 항체), 펩티바디, Fab 단편, 또는 scFv), 소분자, 또는 리간드(예를 들어, 천연, 재조합, 또는 키메라 리간드)로부터 선택된다. 일부 구현예에서, CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제는 비드를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제는 비드를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제는 항-CD3 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제는 항-CD28 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제는 콜로이드 고분자 나노매트릭스에 공유 부착된 항-CD3 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, CD3을 자극하는 제제는, 표 27에 제공된 항-CD3 또는 항-TCR 항체와 같은(이에 한정되지 않음), 항-CD3 또는 항-TCR 항체 또는 이의 하나 이상의 CDR, 중쇄, 및/또는 경쇄를 포함하는 항체 단편과 같은(이에 한정되지 않음) CD3 또는 TCR 항원 결합 도메인 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제는 콜로이드 고분자 나노매트릭스에 공유 부착된 항-CD28 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제는 CD28, ICOS, CD27, CD25, 4-1BB, IL6RA, IL6RB, 또는 CD2를 자극하는 제제이다. 일부 구현예에서, 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제는, 표 27에 제공된 항-CD28, 항-ICOS, 항-CD27, 항-CD25, 항-4-1BB, 항-IL6RA, 항-IL6RB, 또는 항-CD2 항체와 같은(이에 한정되지 않음), 항-CD28, 항-ICOS, 항-CD27, 항-CD25, 항-4-1BB, 항-IL6RA, 항-IL6RB, 또는 항-CD2 항체 또는 이의 하나 이상의 CDR, 중쇄, 및/또는 경쇄를 포함하는 항체 단편과 같은(이에 한정되지 않음) CD28, ICOS, CD27, CD25, 4-1BB, IL6RB, 및/또는 CD2 항원 결합 도메인 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제, 및 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제는 T Cell TransActTM를 포함한다. 일부 구현예에서, CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제, 및 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제는 다중특이적 결합 분자에 포함된다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 CD3 항원 결합 도메인 및 CD28 또는 CD2 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 표 28에 제공된 중쇄 및/또는 경쇄와 같은(이에 한정되지 않음) 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 이중특이적 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 도 50a에 제공된 도식 중 임의의 하나로 구성된다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 1가 또는 2가이다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 Fc 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체의 Fc 영역은 침묵화된다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 복수의 이중특이적 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 이중특이적 항체 중 하나 이상은 1가이다. 일부 구현예에서, 복수의 이중특이적 항체 중 하나 이상은 Fc 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 이중특이적 항체 중 하나 이상의 Fc 영역은 침묵화된다. 일부 구현예에서, 복수의 이중특이적 항체 중 하나 이상은 함께 다량체로 접합된다. 일부 구현예에서, 다량체는 도 50b에 제공된 도식 중 임의의 하나로 구성된다.
일부 구현예에서, 매트릭스는 고분자, 예를 들어 생분해성 또는 생체적합성 비활성 물질, 예를 들어 세포에 비독성인 물질을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 매트릭스는 친수성 고분자 사슬로 구성되며, 이는 사슬의 수화로 인해 수용액에서 최대의 이동성을 얻는다. 일부 구현예에서, 이동성 매트릭스는 콜라겐, 정제된 단백질, 정제된 펩티드, 다당류, 글리코사미노글리칸, 또는 세포외 매트릭스 조성물로 구성될 수 있다. 다당류는 예를 들어, 셀룰로스 에테르, 전분, 아라빅검, 아가로스, 덱스트란, 키토산, 히알루론산, 펙틴, 잔탄, 구아검, 또는 알긴산염을 포함할 수 있다. 다른 중합체는 폴리에스테르, 폴리에테르, 폴리아크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리아민, 폴리에틸렌 이민, 폴리쿼터늄 중합체, 폴리포스파젠, 폴리비닐알코올, 폴리비닐아세테이트, 폴리비닐피롤리돈, 블록 공중합체, 또는 폴리우레탄을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이동성 매트릭스는 덱스트란 중합체이다.
일부 구현예에서, 세포의 집단은 CAR을 암호화하는 핵산 분자와 접촉된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 CAR을 암호화하는 DNA 분자로 형질도입된다.
일부 구현예에서, 세포의 집단을 CAR을 암호화하는 핵산 분자와 접촉시키는 단계는 세포의 집단을 전술한 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉시키는 단계와 동시에 일어난다. 일부 구현예에서, 세포의 집단을 CAR을 암호화하는 핵산 분자와 접촉시키는 단계는 세포의 집단을 전술한 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉시키는 단계의 시작 후 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 또는 0.5시간 이내에 일어난다. 일부 구현예에서, 세포의 집단을 CAR을 암호화하는 핵산 분자와 접촉시키는 단계는 세포의 집단을 전술한 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉시키는 단계의 시작 후 20시간 이내에 일어난다. 일부 구현예에서, 세포의 집단을 CAR을 암호화하는 핵산 분자와 접촉시키는 단계는 세포의 집단을 전술한 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉시키는 단계의 시작 후 19시간 이내에 일어난다. 일부 구현예에서, 세포의 집단을 CAR을 암호화하는 핵산 분자와 접촉시키는 단계는 세포의 집단을 전술한 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉시키는 단계의 시작 후 18시간 이내에 일어난다. 일부 구현예에서, 세포의 집단을 CAR을 암호화하는 핵산 분자와 접촉시키는 단계는 세포의 집단을 전술한 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉시키는 단계의 시작 후 17시간 이내에 일어난다. 일부 구현예에서, 세포의 집단을 CAR을 암호화하는 핵산 분자와 접촉시키는 단계는 세포의 집단을 전술한 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉시키는 단계의 시작 후 16시간 이내에 일어난다. 일부 구현예에서, 세포의 집단을 CAR을 암호화하는 핵산 분자와 접촉시키는 단계는 세포의 집단을 전술한 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉시키는 단계의 시작 후 15시간 이내에 일어난다. 일부 구현예에서, 세포의 집단을 CAR을 암호화하는 핵산 분자와 접촉시키는 단계는 세포의 집단을 전술한 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉시키는 단계의 시작 후 14시간 이내에 일어난다. 일부 구현예에서, 세포의 집단을 CAR을 암호화하는 핵산 분자와 접촉시키는 단계는 세포의 집단을 전술한 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉시키는 단계의 시작 후 14시간 이내에 일어난다. 일부 구현예에서, 세포의 집단을 CAR을 암호화하는 핵산 분자와 접촉시키는 단계는 세포의 집단을 전술한 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉시키는 단계의 시작 후 13시간 이내에 일어난다. 일부 구현예에서, 세포의 집단을 CAR을 암호화하는 핵산 분자와 접촉시키는 단계는 세포의 집단을 전술한 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉시키는 단계의 시작 후 12시간 이내에 일어난다. 일부 구현예에서, 세포의 집단을 CAR을 암호화하는 핵산 분자와 접촉시키는 단계는 세포의 집단을 전술한 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉시키는 단계의 시작 후 11시간 이내에 일어난다. 일부 구현예에서, 세포의 집단을 CAR을 암호화하는 핵산 분자와 접촉시키는 단계는 세포의 집단을 전술한 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉시키는 단계의 시작 후 10시간 이내에 일어난다. 일부 구현예에서, 세포의 집단을 CAR을 암호화하는 핵산 분자와 접촉시키는 단계는 세포의 집단을 전술한 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉시키는 단계의 시작 후 9시간 이내에 일어난다. 일부 구현예에서, 세포의 집단을 CAR을 암호화하는 핵산 분자와 접촉시키는 단계는 세포의 집단을 전술한 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉시키는 단계의 시작 후 8시간 이내에 일어난다. 일부 구현예에서, 세포의 집단을 CAR을 암호화하는 핵산 분자와 접촉시키는 단계는 세포의 집단을 전술한 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉시키는 단계의 시작 후 7시간 이내에 일어난다. 일부 구현예에서, 세포의 집단을 CAR을 암호화하는 핵산 분자와 접촉시키는 단계는 세포의 집단을 전술한 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉시키는 단계의 시작 후 6시간 이내에 일어난다. 일부 구현예에서, 세포의 집단을 CAR을 암호화하는 핵산 분자와 접촉시키는 단계는 세포의 집단을 전술한 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉시키는 단계의 시작 후 5시간 이내에 일어난다. 일부 구현예에서, 세포의 집단을 CAR을 암호화하는 핵산 분자와 접촉시키는 단계는 세포의 집단을 전술한 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉시키는 단계의 시작 후 4시간 이내에 일어난다. 일부 구현예에서, 세포의 집단을 CAR을 암호화하는 핵산 분자와 접촉시키는 단계는 세포의 집단을 전술한 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉시키는 단계의 시작 후 3시간 이내에 일어난다. 일부 구현예에서, 세포의 집단을 CAR을 암호화하는 핵산 분자와 접촉시키는 단계는 세포의 집단을 전술한 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉시키는 단계의 시작 후 2시간 이내에 일어난다. 일부 구현예에서, 세포의 집단을 CAR을 암호화하는 핵산 분자와 접촉시키는 단계는 세포의 집단을 전술한 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉시키는 단계의 시작 후 1시간 이내에 일어난다. 일부 구현예에서, 세포의 집단을 CAR을 암호화하는 핵산 분자와 접촉시키는 단계는 세포의 집단을 전술한 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉시키는 단계의 시작 후 30분 이내에 일어난다.
일부 구현예에서, 세포의 집단은 보관 또는 투여를 위해 수확된다.
일부 구현예에서, 세포의 집단은 세포의 집단을 전술한 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉시키는 단계의 시작 후 72, 60, 48, 36, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 또는 18시간 이내에 보관 또는 투여를 위해 수확된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 세포의 집단을 전술한 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉시키는 단계의 시작 후 26시간 이내에 보관 또는 투여를 위해 수확된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 세포의 집단을 전술한 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉시키는 단계의 시작 후 25시간 이내에 보관 또는 투여를 위해 수확된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 세포의 집단을 전술한 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉시키는 단계의 시작 후 24시간 이내에 보관 또는 투여를 위해 수확된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 세포의 집단을 전술한 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉시키는 단계의 시작 후 23시간 이내에 보관 또는 투여를 위해 수확된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 세포의 집단을 전술한 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉시키는 단계의 시작 후 22시간 이내에 보관 또는 투여를 위해 수확된다.
일부 구현예에서, 세포의 집단은 생체 외에서 증식되지 않는다.
일부 구현예에서, 세포의 집단은 전술한 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉되기 전의 세포의 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 또는 60% 이하만큼 증식된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 전술한 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉되기 전의 세포의 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 5% 이하만큼 증식된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 전술한 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉되기 전의 세포의 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 10% 이하만큼 증식된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 전술한 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉되기 전의 세포의 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 15% 이하만큼 증식된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 전술한 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉되기 전의 세포의 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 20% 이하만큼 증식된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 전술한 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉되기 전의 세포의 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 25% 이하만큼 증식된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 전술한 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉되기 전의 세포의 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 30% 이하만큼 증식된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 전술한 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉되기 전의 세포의 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 35% 이하만큼 증식된다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 전술한 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 접촉되기 전의 세포의 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 40% 이하만큼 증식된다.
일부 구현예에서, 세포의 집단은 전술한 하나 이상의 사이토카인과 접촉되기 전의 세포 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 16, 20, 24, 36, 또는 48시간 이내에 증식된다.
일부 구현예에서, 활성화 프로세스는 무혈청 세포 배지에서 수행된다. 일부 구현예에서, 활성화 프로세스는 IL-2, IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)), 또는 IL-6(예를 들어, IL-6/sIL-6Ra)로부터 선택된 하나 이상의 사이토카인을 포함하는 세포 배지에서 수행된다. 일부 구현예에서, hetIL-15는 NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQG(서열번호 309)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, hetIL-15는 서열번호 309에 대해 적어도 약 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 활성화 프로세스는 LSD1 억제제를 포함하는 세포 배지에서 수행된다. 일부 구현예에서, 활성화 프로세스는 MALT1 억제제를 포함하는 세포 배지에서 수행된다. 일부 구현예에서, 무혈청 세포 배지는 혈청 대체물을 포함한다. 일부 구현예에서, 혈청 대체물은 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물(ICSR)이다. 일부 구현예에서, ICSR의 수준은 예를 들어 최대 5%, 예를 들어 약 1%, 2%, 3%, 4%, 또는 5%일 수 있다. 이론에 구애되고자 함이 없이, ICSR, 예를 들어 2% ICSR을 포함하는 세포 배지, 예를 들어 표 21 또는 표 25에 나타낸 Rapid 배지를 사용하면 본원에 기술된 제조 프로세스 중 세포 생존능이 개선될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 제조하는 방법으로서, (a) 대상체로부터 수집된 성분채집 샘플(예를 들어, 신선한 또는 동결보존된 백혈구 성분채집 샘플)을 제공하는 단계; (b) (예를 들어, 음성 선택, 양성 선택, 또는 무비드 선택을 사용하여) 성분채집 샘플로부터 T세포를 선택하는 단계; (c) 단리된 T세포를 예를 들어 1 x 106 내지 1 x 107개 세포/mL로 시딩하는 단계; (d) T세포를 자극하는 제제, 예를 들어 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및/또는 세포 표면의 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제와 T세포를 접촉시키는 단계(예를 들어, T세포를 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체와 접촉시키는 단계, 예를 들어 T세포를 TransAct와 접촉시키는 단계); (e) T세포를, 예를 들어 6~48시간, 예를 들어 20~28시간 동안, CAR을 암호화하는 핵산 분자(예를 들어, DNA 또는 RNA 분자)와 접촉시키는 단계(예를 들어, T세포를 CAR을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 바이러스와 접촉시키는 단계); 및 (f) 보관(예를 들어, 동결보존 배지에 T세포를 재제형화) 또는 투여를 위해 T세포를 세척 및 수확하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 단계 (f)는 단계 (d) 또는 (e)의 시작 후 30, 36, 또는 48시간 이내, 예를 들어 단계 (d) 또는 (e)의 시작 후 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 또는 48시간 이내에 수행된다.
전술한 방법의 일부 구현예에서, 방법은 폐쇄 시스템에서 수행된다. 일부 구현예에서, T세포 분리, 활성화, 형질도입, 인큐베이션, 및 세척은 모두 폐쇄 시스템에서 수행된다. 전술한 방법의 일부 구현예에서, 방법은 별개의 장치에서 수행된다. 일부 구현예에서, T세포 분리, 활성화 및 형질도입, 인큐베이션, 및 세척은 별개의 장치에서 수행된다.
전술한 방법의 일부 구현예에서, 방법은 형질도입 효율을 향상시키기 위해 세포 배양 배지에 보조제 또는 형질도입 강화 시약을 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 보조제 또는 형질도입 강화 시약은 양이온성 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 보조제 또는 형질도입 강화 시약은 LentiBOOSTTM(Sirion Biotech), 벡토퓨신(vectofusin)-1, F108(폴록사머(Poloxamer) 338 또는 Pluronic® F-38), 프로타민 설페이트, 헥사디메트린 브로마이드(Polybrene), PEA, Pluronic F68, Pluronic F127, Synperonic 또는 LentiTrans™로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 형질도입 강화 시약은 LentiBOOSTTM(Sirion Biotech)이다. 일부 구현예에서, 형질도입 강화 시약은 F108(폴록사머 338 또는 Pluronic® F-38)이다.
전술한 방법의 일부 구현예에서, 바이러스 벡터로 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 형질도입시키는 단계는 형질도입 효율이 향상되는 조건하에서 세포 집단 및 바이러스 벡터에 원심력을 가하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 세포는 스핀접종(spinoculation)에 의해 형질도입된다.
전술한 방법의 일부 구현예에서, 세포(예를 들어, T세포)는 기체 교환을 실질적으로 손상시키지 않으면서 큰 배지 부피를 지지하는 기체 투과성 막을 맨 아래 부분에 포함하는 세포 배양 플라스크에서 활성화되고 형질도입된다. 일부 구현예에서, 세포 성장은 대류를 통해 영양분에 대한 접근, 예를 들어 실질적으로 연속된 접근을 제공함으로써 달성된다.
항-CD28 항체 분자
일부 구현예에서, 항-CD28 항체, 예를 들어 본원에 기술된 다중특이적 결합 분자에 사용될 항-CD28 항체는 표 27에 기술된 항-CD28 (2) 유래의 적어도 하나의 항원 결합 영역, 예를 들어 가변 영역 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD28 항체 분자는 표 27에 기술된 항-CD28 (2) 유래의 1개 또는 2개의 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD28 항체는 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR1), HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR1), LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 각각 서열번호 538, 539, 540, 530, 531, 및 532의 아미노산 서열을 포함하거나; HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 각각 서열번호 541, 539, 540, 530, 531, 및 532의 아미노산 서열을 포함하거나; HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 각각 서열번호 542, 543, 540, 533, 534, 및 535의 아미노산 서열을 포함하거나; HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 각각 서열번호 544, 545, 546, 536, 534, 및 532의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD28 항체 분자는 서열번호 547 또는 548의 아미노산 서열, 또는 서열번호 547 또는 548에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD28 항체는 서열번호 537의 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD28 항체는 서열번호 547 및 537의 아미노산 서열(또는 임의의 상기 서열에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열)을 각각 포함하는 VH 및 VL을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD28 항체는 서열번호 548 및 537의 아미노산 서열(또는 임의의 상기 서열에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열)을 각각 포함하는 VH 및 VL을 포함한다.
본원에 기술된 항-CD28 항체는 예를 들어 추가의 결합 도메인, 예를 들어 본원에 기술된 항-CD3 결합 도메인과 함께 다중특이적 결합 분자의 맥락에서 사용될 수 있는 것으로 이해된다. 또한, 본원에 기술된 항-CD28 항체는 다른 맥락에서, 예를 들어 단일특이적 항체로서 사용될 수 있는 것으로 이해된다.
다중특이적 결합 분자 시약
일부 구현예에서, CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제는 CD3을 자극하는 제제이다. 일부 구현예에서, CD3을 자극하는 제제는 항-CD3 또는 항-TCR 항체 또는 이의 하나 이상의 CDR, VH, 중쇄, VL, 및/또는 경쇄를 포함하는 항체 단편과 같은(이에 한정되지 않음), CD3 또는 TCR 항원 결합 도메인 중 하나 이상을 포함한다.
항-CD3 항체 서열 및 이러한 항체의 제조 방법은 당업계에 알려져 있다. 항-CD3 항체 서열의 비제한적인 예는 관련 CDR, VH, 및 VL 서열과 함께 표 27에 제공되어 있다. 일부 구현예에서, 항-CD3 결합 도메인은 서열번호 437 및 427의 아미노산 서열을 각각 포함하는 VH 및 VL을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 결합 도메인은 서열번호 456 및 445의 아미노산 서열을 각각 포함하는 VH 및 VL을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 결합 도메인은 서열번호 457 및 446의 아미노산 서열을 각각 포함하는 VH 및 VL을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 결합 도메인은 서열번호 475 및 467의 아미노산 서열을 각각 포함하는 VH 및 VL을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 결합 도메인은 서열번호 476 및 468의 아미노산 서열을 각각 포함하는 VH 및 VL을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 결합 도메인은 서열번호 494 및 484의 아미노산 서열을 각각 포함하는 VH 및 VL을 포함한다.
항-TCR 항체 서열 및 이러한 항체의 제조 방법은 당업계에 알려져 있다. 항-TCR 항체 서열의 비제한적인 예는 관련 CDR, VH, 및 VL 서열과 함께 표 27에 제공되어 있다.
일부 구현예에서, 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제는 CD28, ICOS, CD27, CD25, 4-1BB, IL6RA, IL6RB, 또는 CD2를 자극하는 제제이다. 일부 구현예에서, 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제는 항-CD28, 항-ICOS, 항-CD27, 항-CD25, 항-4-1BB, 항-IL6RA, 항-IL6RB, 또는 항-CD2 항체 또는 이의 하나 이상의 CDR, 중쇄, 및/또는 경쇄를 포함하는 항체 단편과 같은(이에 한정되지 않음), CD28, ICOS, CD27, CD25, 4-1BB, IL6RB, 및/또는 CD2 항원 결합 도메인 중 하나 이상을 포함한다.
항-CD28 항체 서열 및 이러한 항체의 제조 방법은 당업계에 알려져 있다. 항-CD28 항체 서열의 비제한적인 예는 관련 CDR, VH, VL, HC, 및 LC 서열과 함께 표 27에 제공되어 있다. 항-ICOS 항체 서열 및 이러한 항체의 제조 방법은 당업계에 알려져 있다. 항-ICOS 항체 서열의 비제한적인 예는 관련 CDR, VH, VL, 및 LC 서열과 함께 표 27에 제공되어 있다.
항-CD27 항체 서열 및 이러한 항체의 제조 방법은 당업계에 알려져 있다. 항-CD27 항체 서열의 비제한적인 예는 관련 CDR, VH, 및 VL 서열과 함께 표 27에 제공되어 있다.
항-CD25 항체 서열 및 이러한 항체의 제조 방법은 당업계에 알려져 있다. 항-CD25 항체 서열의 비제한적인 예는 관련 CDR, VH, VL, HC, 및 LC 서열과 함께 표 27에 제공되어 있다.
항-4-1BB 항체 서열 및 이러한 항체의 제조 방법은 당업계에 알려져 있다. 항-4-1BB 항체 서열의 비제한적인 예는 관련 CDR, VH, 및 VL 서열과 함께 표 27에 제공되어 있다.
항-IL6RA 항체 서열 및 이러한 항체의 제조 방법은 당업계에 알려져 있다. IL6RA 항체 서열의 비제한적인 예는 관련 CDR, VH, 및 VL 서열과 함께 표 27에 제공되어 있다.
항-IL6RB 항체 서열 및 이러한 항체의 제조 방법은 당업계에 알려져 있다. IL6RB 항체 서열의 비제한적인 예는 관련 CDR, VH, 및 VL 서열과 함께 표 27에 제공되어 있다.
항-CD2 항체 서열 및 이러한 항체의 제조 방법은 당업계에 알려져 있다. 항-CD2 항체 서열의 비제한적인 예는 관련 CDR, VH, VL, HC, 및 LC 서열과 함께 표 27에 제공되어 있다.
[표 27]
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
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Figure pct00012
일부 구현예에서, CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제, 및 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제는 다중특이적 결합 분자에 포함된다. 따라서, CD28, ICOS, CD27, CD25, 4-1BB, IL6RA, IL6RB, 및/또는 CD2 항원 결합 도메인 중 하나 이상 및 CD3 항원 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 결합 분자와 같은(이에 한정되지 않음), CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제를 포함하는 다중특이적 결합 분자가 본원에서 고려된다. 상기 언급된 바와 같은 이러한 결합 도메인의 비제한적인 예는 상기, 예를 들어 표 27 및 본원에 참조로 포함되는 공개문헌에 제공되어 있다.
일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 CD3 항원 결합 도메인 및 CD28 또는 CD2 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CD3 항원 결합 도메인은 항-CD3 항체, 임의로, 표 27에 제공된 항-CD3 (1), 항-CD3 (2), 항-CD3 (3), 또는 항CD3 (4), 또는 이의 하나 이상의 CDR, VH, 및/또는 VL을 포함하는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, CD28 항원 결합 도메인은 항-CD28 항체, 임의로, 표 27에 제공된 항-CD28 (1) 또는 항-CD28 (2), 또는 이의 하나 이상의 CDR, VH, 중쇄, VL, 및/또는 경쇄를 포함하는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, CD2 항원 결합 도메인은 항-CD2 항체, 임의로, 표 27에 제공된 항-CD2 (1), 또는 이의 하나 이상의 CDR, VH, 중쇄, VL, 및/또는 경쇄를 포함하는 항체 단편이다.
일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄를 포함한다. 이러한 다중특이적 결합 분자에 포함될 수 있는 비제한적인 예시적 중쇄 및 경쇄 서열은 아래 표 28에 제공되어 있다. 이들의 비제한적인 예시적 조합이 구성체 내에서 언급된 중쇄 및/또는 경쇄의 분류에 기초하여 표 28에 제안되어 있다. 이러한 구성체 구조는 중쇄 및/또는 경쇄의 구성의 예를 제공하지만 이들의 추가 조합 및 치환도 가능하다.
[표 28]
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Figure pct00019
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Figure pct00022
Figure pct00023
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일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 이중특이적 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 도 50a, 도 51a 및 도 51b, 도 61a 및 도 61b, 및 도 63a 및 도 63b에 제공된 도식 중 임의의 하나로 구성된다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 1가 또는 2가이다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 Fc 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체의 Fc 영역은 침묵화된다.
일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 복수의 이중특이적 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 이중특이적 항체 중 하나 이상은 1가이다. 일부 구현예에서, 복수의 이중특이적 항체 중 하나 이상은 Fc 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 이중특이적 항체 중 하나 이상의 Fc 영역은 침묵화된다. 일부 구현예에서, 복수의 이중특이적 항체 중 하나 이상은 함께 다량체로 접합된다. 일부 구현예에서, 다량체는 도 50b 및 도 51b에 제공된 도식 중 임의의 하나로 구성된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 다중특이적 결합 분자는 Fc 영역을 포함하고, 예를 들어 Fc 영역은 Fc 침묵 영역이다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 D265, N297, 및 P329 중 하나 이상(예를 들어, 전부)에서 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 돌연변이 D265A, N297A, 및 P329A(DANAPA)를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 다중특이적 결합 분자는 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인을 포함한다. 예를 들어, 제1 결합 도메인은 항-CD3 결합 도메인일 수 있고 제2 결합 도메인은 공동자극 분자 결합 도메인일 수 있거나, 또는 제1 결합 도메인은 공동자극 분자 결합 도메인일 수 있고 제2 결합 도메인은 항-CD3 결합 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, 공동자극 분자 결합 도메인은 CD2, CD28, CD25, CD27, IL6Rb, ICOS, 또는 41BB에 결합한다. 일부 구현예에서, 공동자극 분자 결합 도메인은 CD2, CD28, CD25, CD27, IL6Rb, ICOS, 또는 41BB를 활성화한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 다중특이적 결합 분자는 Fc 수용체에 대한 결합이 감소되도록 또는 ADCC, ADCP, 또는 CDC 활성이 감소되도록 돌연변이된 Fc 영역, 예를 들어 돌연변이 D265A, N297A, 및 P329A(DANAPA)를 포함하는 Fc 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 결합 도메인(예를 들어, scFv)은 예를 들어 펩티드 링커를 통해 연결된, 제2 결합 도메인(예를 들어, Fab 단편)의 VH의 N-말단이다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 예를 들어 N-말단에서 C-말단으로의 순서로, CH1, CH2, 및 CH3 중 하나 이상(예를 들어, 전부)을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자의 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단 방향으로 다음의 서열을 포함한다: 제1 결합 도메인의 VH, 제1 펩티드 링커(예를 들어, (G4S)4 링커), 제1 결합 도메인의 VL, 제2 펩티드 링커(예를 들어, (G4S)4 링커), 제2 결합 도메인의 VH, CH1, CH2, 및 CH3. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자의 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단 방향으로 다음의 서열을 포함한다: 제2 결합 도메인의 VL 및 CL. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 Fc 수용체에 대한 결합이 감소되도록 또는 ADCC, ADCP, 또는 CDC 활성이 감소되도록 돌연변이된 Fc 영역, 예를 들어 돌연변이 D265A, N297A, 및 P329A(DANAPA)를 포함하는 Fc 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 결합 단편은 예를 들어 표 27에 개시된 항-CD3 서열을 포함하는 항-CD3 결합 도메인, 예를 들어 항-CD3 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 결합 도메인은 예를 들어 표 27에 개시된 항-CD2 서열을 포함하는 공동자극 분자 결합 도메인, 예를 들어 항-CD2 결합 도메인, 예를 들어 항-CD2 Fab를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 결합 도메인은 예를 들어 표 27에 개시된 항-CD28 서열을 포함하는 공동자극 분자 결합 도메인, 예를 들어 항-CD28 결합 도메인, 예를 들어 항-CD28 Fab를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 결합 단편은 예를 들어 표 27에 개시된 항-CD2 또는 항-CD28 서열을 포함하는 공동자극 분자 결합 도메인, 예를 들어 항-CD2 또는 항-CD28 결합 도메인, 예를 들어 항-CD2 또는 항-CD28 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 결합 도메인은 예를 들어 표 27에 개시된 항-CD3 서열을 포함하는 항-CD3 결합 도메인, 예를 들어 항-CD3 Fab를 포함한다. 이러한 다중특이적 결합 분자의 예는 도 50a의 좌측 상단 구성체; 도 51a의 구성체 1 또는 구성체 2; 및 표 28의 구성체 1 또는 구성체 2로 표시되어 있다.
일부 구현예에서, 제1 결합 도메인(예를 들어, Fab 단편)은 제2 결합 도메인(예를 들어, scFv)의 N-말단이고, 예를 들어 Fc 영역은 제1 결합 도메인과 제2 결합 도메인 사이에 위치한다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 Fc 수용체에 대한 결합이 감소되도록 또는 ADCC, ADCP, 또는 CDC 활성이 감소되도록 돌연변이된다(예를 들어, Fc 영역은 돌연변이 D265A, N297A, 및 P329A(DANAPA)를 포함함). 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 예를 들어 N-말단에서 C-말단으로의 순서로, CH1, CH2, 및 CH3 중 하나 이상(예를 들어, 전부)을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자의 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단 방향으로 다음의 서열을 포함한다: 제1 결합 도메인의 VH, CH1, CH2, CH3, 제1 펩티드 링커(예를 들어, (G4S)4 링커), 제2 결합 도메인의 VH, 제2 펩티드 링커(예를 들어, (G4S)4 링커), 및 제2 결합 도메인의 VL. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자의 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단 방향으로 다음의 서열을 포함한다: 제1 결합 도메인의 VL 및 CL. 일부 구현예에서, 제1 결합 도메인은 예를 들어 표 27에 개시된 항-CD2 서열을 포함하는 공동자극 분자 결합 도메인, 예를 들어 항-CD2 결합 도메인, 예를 들어 항-CD2 Fab를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 결합 도메인은 예를 들어 표 27에 개시된 항-CD28 서열, 예를 들어 항-CD28 (1) 또는 항-CD28 (2)를 포함하는 공동자극 분자 결합 도메인, 예를 들어 항-CD28 결합 도메인, 예를 들어 항-CD28 Fab를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 결합 도메인은 예를 들어 표 27에 개시된 항-CD3 서열, 예를 들어 항-CD3 (1), 항-CD3 (2), 항-CD3 (3), 또는 항-CD3 (4)를 포함하는 항-CD3 결합 도메인, 예를 들어 항-CD3 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 결합 도메인은 예를 들어 표 27에 개시된 항-CD3 서열, 예를 들어 항-CD3 (1), 항-CD3 (2), 항-CD3 (3), 또는 항-CD3 (4)를 포함하는 항-CD3 결합 도메인, 예를 들어 항-CD3 Fab를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 결합 도메인은 예를 들어 표 27에 개시된 항-CD2 또는 항-CD28 서열을 포함하는 공동자극 분자 결합 도메인, 예를 들어 항-CD2 또는 항-CD28 결합 도메인, 예를 들어 항-CD2 또는 항-CD28 scFv를 포함한다. 이러한 다중특이적 결합 분자의 예는 도 50a의 상단 행 왼쪽에서 두 번째 구성체; 도 51a의 구성체 3 또는 구성체 4; 및 표 28의 구성체 3 또는 구성체 4로 표시되어 있다.
일부 구현예에서, 제1 결합 도메인(예를 들어, Fab 단편)은 예를 들어 펩티드 링커를 통해 제2 결합 도메인(예를 들어, scFv)의 N-말단에 존재한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 예를 들어 N-말단에서 C-말단으로의 순서로, CH1, CH2, 및 CH3 중 하나 이상(예를 들어, 전부)을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자의 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단 방향으로 다음의 서열을 포함한다: 제1 결합 도메인의 VH, CH1, 제1 펩티드 링커(예를 들어, (G4S)2 링커), 제2 결합 도메인의 VH, 제2 펩티드 링커(예를 들어, (G4S)4 링커), 제2 결합 도메인의 VL, 제3 펩티드 링커(예를 들어, (G4S)4 링커), CH2, 및 CH3. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자의 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단 방향으로 다음의 서열을 포함한다: 제1 결합 도메인의 VL 및 CL. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 Fc 수용체에 대한 결합이 감소되도록 또는 ADCC, ADCP, 또는 CDC 활성이 감소되도록 돌연변이된 Fc 영역, 예를 들어 돌연변이 D265A, N297A, 및 P329A(DANAPA)를 포함하는 Fc 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 결합 도메인은 예를 들어 표 27에 개시된 항-CD2 서열을 포함하는 공동자극 분자 결합 도메인, 예를 들어 항-CD2 결합 도메인, 예를 들어 항-CD2 Fab를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 결합 도메인은 예를 들어 표 27에 개시된 항-CD28 서열, 예를 들어 항-CD28 (1) 또는 항-CD28 (2)를 포함하는 공동자극 분자 결합 도메인, 예를 들어 항-CD28 결합 도메인, 예를 들어 항-CD28 Fab를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 결합 도메인은 공동자극 분자 결합 도메인, 예를 들어 항-CD25 결합 도메인(예를 들어, 항-CD25 Fab), 항-CD27 결합 도메인(예를 들어, 항-CD27 Fab), 항-IL6Rb 결합 도메인(예를 들어, 항-IL6Rb Fab), 항-ICOS 결합 도메인(예를 들어, 항-ICOS Fab), 또는 항-41BB 결합 도메인(예를 들어, 항-41BB Fab)을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 결합 도메인은 예를 들어 표 27에 개시된 항-CD3 서열, 예를 들어 항-CD3 (1), 항-CD3 (2), 항-CD3 (3), 또는 항-CD3 (4)를 포함하는 항-CD3 결합 도메인, 예를 들어 항-CD3 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 결합 도메인은 예를 들어 표 27에 개시된 항-CD3 서열, 예를 들어 항-CD3 (1), 항-CD3 (2), 항-CD3 (3), 또는 항-CD3 (4)를 포함하는 항-CD3 결합 도메인, 예를 들어 항-CD3 Fab를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 결합 도메인은 공동자극 분자 결합 도메인, 예를 들어 항-CD2 결합 도메인(예를 들어, 항-CD2 scFv), 항-CD28 결합 도메인(예를 들어, 항-CD28 scFv), 항-CD25 결합 도메인(예를 들어, 항-CD25 scFv), 항-CD27 결합 도메인(예를 들어, 항-CD27 scFv), 항-IL6Rb 결합 도메인(예를 들어, 항-IL6Rb scFv), 항-ICOS 결합 도메인(예를 들어, 항-ICOS scFv), 또는 항-41BB 결합 도메인(예를 들어, 항-41BB scFv)을 포함한다. 이러한 다중특이적 결합 분자의 예는 도 50a의 상단 행 왼쪽에서 세 번째 구성체; 도 51a의 구성체 5 또는 구성체 6; 및 표 28의 구성체 5 또는 구성체 6으로 표시되어 있다.
일부 구현예에서, 제1 결합 도메인(예를 들어, scFv)은 제2 결합 도메인(예를 들어, Fab 단편)의 N-말단이고, 예를 들어 Fc 영역은 제1 결합 도메인과 제2 결합 도메인 사이에 위치한다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 Fc 수용체에 대한 결합이 감소되도록 또는 ADCC, ADCP, 또는 CDC 활성이 감소되도록 돌연변이된다(예를 들어, Fc 영역은 돌연변이 D265A, N297A, 및 P329A(DANAPA)를 포함함). 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 예를 들어 N-말단에서 C-말단으로의 순서로, CH2, CH3, 및 CH1 중 하나 이상(예를 들어, 전부)을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자의 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단 방향으로 다음의 서열을 포함한다: 제1 결합 도메인의 VH, 제1 펩티드 링커(예를 들어, (G4S)4 링커), 제1 결합 도메인의 VL, 제2 펩티드 링커(예를 들어, (G4S) 링커), CH2, CH3, 제3 펩티드 링커(예를 들어, (G4S)4 링커), 제2 결합 도메인의 VH, 및 CH1. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자의 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단 방향으로 다음의 서열을 포함한다: 제2 결합 도메인의 VL 및 CL. 일부 구현예에서, 제1 결합 도메인은 예를 들어 표 27에 개시된 항-CD3 서열을 포함하는 항-CD3 결합 도메인, 예를 들어 항-CD3 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 결합 도메인은 예를 들어 표 27에 개시된 항-CD2 서열을 포함하는 공동자극 분자 결합 도메인, 예를 들어 항-CD2 결합 도메인, 예를 들어 항-CD2 Fab를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 결합 도메인은 예를 들어 표 27에 개시된 항-CD28 서열을 포함하는 공동자극 분자 결합 도메인, 예를 들어 항-CD28 결합 도메인, 예를 들어 항-CD28 Fab를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 결합 도메인은 예를 들어 표 27에 개시된 항-CD2 또는 항-CD28 서열을 포함하는 공동자극 분자 결합 도메인, 예를 들어 항-CD2 또는 항-CD28 결합 도메인, 예를 들어 항-CD2 또는 항-CD28 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 결합 도메인은 예를 들어 표 27에 개시된 항-CD3 서열을 포함하는 항-CD3 결합 도메인, 예를 들어 항-CD3 Fab를 포함한다. 이러한 다중특이적 결합 분자의 예는 도 50a의 상단 행 가장 오른쪽 구성체; 도 51a의 구성체 7 또는 구성체 8; 및 표 28의 구성체 7 또는 구성체 8로 표시되어 있다.
일부 구현예에서, 제1 결합 도메인(예를 들어, Fab 단편)은 제1 Fc 영역의 N-말단에 위치한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 예를 들어 N-말단에서 C-말단으로의 순서로, 제1 CH1, 제1 CH2, 및 제1 CH3 중 하나 이상(예를 들어, 전부)을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 결합 도메인(예를 들어, scFv)은 예를 들어 제2 폴리펩티드 쇄에서, 제2 Fc 영역의 N-말단에 위치한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 예를 들어 제2 폴리펩티드 쇄에서, 예를 들어 N-말단에서 C-말단으로의 순서로, 제2 CH2 및 제2 CH3 중 하나 이상(예를 들어, 둘 다)을 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 예를 들어 제1 및 제2 Fc 영역이 노브-인투-홀(knob-into-hole) 돌연변이를 포함하는 것과 같은 이종이량체 항체 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 Fc 영역은 제1 Fc 영역이 제1 Fc 영역의 다른 카피에 결합하는 것보다 더 강력하게 제2 Fc 영역에 결합한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자의 제1 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단 방향으로 다음의 서열을 포함한다: 제1 결합 도메인의 VH, 제1 CH1, 제1 CH2, 및 제1 CH3. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자의 제2 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단 방향으로 다음의 서열을 포함한다: 제2 결합 도메인의 VH, 제1 펩티드 링커(예를 들어, (G4S) 링커), 제2 결합 도메인의 VL, 제2 CH2, 및 제2 CH3. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자의 제3 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단 방향으로 다음의 서열을 포함한다: 제1 결합 도메인의 VL 및 CL. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자의 제2 폴리펩티드는 예를 들어 펩티드 링커(예를 들어, (G4S)4 링커, (G4S) 링커, 또는 (G4S)3 링커)를 통해, 제2 CH3의 C-말단에, 동종다량체화 도메인, 예를 들어 Matrilin1 단백질 또는 연골 올리고머 매트릭스 단백질의 코일드 코일 도메인(COMPcc)을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 예를 들어 도 50b에 도시된 바와 같이, 2, 3, 4, 또는 5개의 제1 결합 도메인 카피 및 동일한 수의 제2 결합 도메인 카피를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 결합 도메인은 공동자극 분자 결합 도메인, 예를 들어 항-CD2 결합 도메인(예를 들어, 항-CD2 Fab)을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 결합 도메인은 공동자극 분자 결합 도메인, 예를 들어 항-CD28 결합 도메인(예를 들어, 항-CD28 Fab)을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 결합 도메인은 항-CD3 결합 도메인, 예를 들어 항-CD3 scFv를 포함한다. 이러한 다중특이적 결합 분자의 예는 도 50a의 하단 행 가장 왼쪽 구성체; 도 50b의 구성체; 도 51b의 구성체 9, 구성체 10, 구성체 12, 구성체 13, 구성체 15, 및 구성체 16; 및 표 28의 구성체 9, 구성체 10, 구성체 12, 구성체 13, 구성체 15, 및 구성체 16으로 표시되어 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 결합 분자는 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 도메인(예를 들어, scFv)은 Fc 영역의 N-말단에 위치한다. 일부 구현예에서, 결합 분자는 예를 들어 제1 및 제2 Fc 영역이 노브-인투-홀 돌연변이를 포함하는 것과 같은 이종이량체 항체 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 Fc 영역은 제1 Fc 영역이 제1 Fc 영역의 다른 카피에 결합하는 것보다 더 강력하게 제2 Fc 영역에 결합한다. 일부 구현예에서, 결합 분자는 예를 들어 N-말단에서 C-말단으로의 순서로, CH2 및 CH3 중 하나 이상(예를 들어, 전부)을 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 분자의 제2 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단 방향으로 다음의 서열을 포함한다: 결합 도메인의 VH, 제1 펩티드 링커(예를 들어, (G4S)4 링커), 결합 도메인의 VL, 제2 펩티드 링커(예를 들어, (G4S)4 링커 또는 (G4S) 링커), CH2, 및 CH3. 일부 구현예에서, 결합 분자의 제2 폴리펩티드는 예를 들어 펩티드 링커(예를 들어, (G4S)4 링커, (GS4)3 링커, 또는 (G4S) 링커)를 통해, 제2 CH3의 C-말단에, 동종다량체화 도메인, 예를 들어 Matrilin1 단백질 또는 연골 올리고머 매트릭스 단백질의 코일드 코일 도메인(COMPcc)을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 분자는 도 50b에 도시된 바와 같이, 2, 3, 4, 또는 5개의 결합 카피를 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 도메인은 항-CD3 결합 도메인, 예를 들어 항-CD3 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, 공동자극 분자 결합 도메인은 존재하지 않는다. 이러한 결합 분자의 예는 도 50a의 하단 행 가장 오른쪽 구성체; 도 51b의 구성체 11, 구성체 14, 및 구성체 17; 및 표 28의 구성체 11, 구성체 14, 및 구성체 17로 표시되어 있다.
본원의 많은 구현예에서 다중특이적 결합 분자는 예를 들어 이황화 가교를 통해 서로 공유 연결된 2개 이상의 폴리펩티드 쇄를 포함하는 것으로 이해된다. 그러나 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자의 2개 이상의 폴리펩티드 쇄는 서로 비공유 결합될 수 있다.
Fab 단편은 더 큰 단백질의 일부로서 존재할 수 있으며, 예를 들어 Fab 단편은 CH2 및 CH3과 융합되어 전장 항체의 일부가 될 수 있는 것으로 또한 이해된다.
본원에 개시된 CD3/TCR 복합체를 자극하는 제제 및 공동자극 분자 및/또는 성장인자 수용체를 자극하는 제제를 포함하는 다중특이적 결합 분자는 본원에 개시된 제조 구현예, 예를 들어 종래의 제조 또는 활성화된 신속 제조에서의 사용을 위해 고려된다.
Fc 변이체
일부 구현예에서, 본원에 기술된 다중특이적 결합 분자는 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 Fc 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 야생형 Fc 영역, 예를 들어 야생형 인간 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 예를 들어 적어도 하나의 Fc 수용체에 대한 친화성의 감소나 제거를 초래하는 변이체를 포함한다(예를 들어, Fc 영역에 적어도 하나의 아미노산 잔기의 부가, 치환, 또는 결실을 포함하는 Fc 영역).
일부 구현예에서, 항체의 Fc 영역은 Fc 수용체(예를 들어, FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIIA), 보체 단백질 CIq, 및 단백질 A 및 G와 같은 기타 분자를 비롯한 다수의 수용체 또는 리간드와 상호작용한다. 이러한 상호작용은 다음과 같은 다양한 이펙터 기능 및 다운스트림 신호전달 이벤트를 촉진한다: 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC), 항체 의존성 세포 식세포작용(ADCP), 및 보체 의존성 세포독성(CDC).
일부 구현예에서, 변이 Fc 영역을 포함하는 본원에 기술된 다중특이적 결합 분자는 Fc 수용체, 예를 들어 본원에 기술된 Fc 수용체에 대한 친화성이 감소(예를 들어, 제거)된다. 일부 구현예에서, 감소된 친화성은 야생형 Fc 영역을 갖는 다른 유사한 항체와 비교된다.
일부 구현예에서, 변이 Fc 영역을 포함하는 본원에 기술된 다중특이적 결합 분자는 다음 특성 중 하나 이상을 갖는다: (1) 감소된 이펙터 기능(예를 들어, 감소된 ADCC, ADCP, 및/또는 CDC); (2) 하나 이상의 Fc 수용체에 대한 감소된 결합, 및/또는 (3) C1q 보체에 대한 감소된 결합. 일부 구현예에서, 특성 (1) 내지 (3) 중 임의의 하나 또는 전부의 감소는 야생형 Fc 영역을 갖는 다른 유사한 항체와 비교된다.
예시적인 Fc 영역 변이체는 표 34에 제공되어 있고, 문헌[Saunders O, (2019) Frontiers in Immunology; vol 10, article 1296]에도 개시되어 있으며, 그 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 다중특이적 결합 분자는 표 34에 개시된 Fc 영역 변이체, 예를 들어 돌연변이의 임의의 하나 또는 전부, 또는 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 다중특이적 결합 분자는 L234, 예를 들어 L234A 및/또는 L235, 예를 들어 IgG1 Fc 아미노산 서열에서의 L234A 돌연변이(LALA); D265, 예를 들어 D265A 및/또는 P329, 예를 들어 P329A(DAPA); N297, 예를 들어 N297A; DANAPA(D265A, N297A, 및 P329A); 및/또는 L234, 예를 들어 L234A, L235, 예를 들어 L235A, D265, 예를 들어 D265A, N297, 예를 들어 N297A, 및 P331, 예를 들어 P331S(LALADANAPS)를 포함하는 돌연변이의 임의의 하나 또는 전부, 또는 임의의 조합을 포함한다.
[표 34]
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본원에 개시된 프로세스에 의해 제조된 CAR-발현 세포의 집단
일부 구현예에서, 본 개시는 CAR을 발현하도록 조작된, 예를 들어 본원에 기술된 임의의 제조 방법에 의해 제조된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T세포 또는 NK세포)를 특징으로 하며, 조작된 면역 이펙터 세포는 항종양 특성을 나타낸다. 일부 구현예에서, CAR은 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 예시적인 항원은 본원에 기술된 암 관련 항원이다. 일부 구현예에서, 세포(예를 들어, T세포 또는 NK세포)는 CAR로 형질전환되고, CAR은 세포 표면에서 발현된다. 일부 구현예에서, 세포(예를 들어, T세포 또는 NK세포)는 CAR을 암호화하는 바이러스 벡터로 형질도입된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 이러한 구현예에서, 세포는 CAR을 안정적으로 발현할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포(예를 들어, T세포 또는 NK세포)는 CAR을 암호화하는 핵산, 예를 들어 mRNA, cDNA, 또는 DNA로 형질감염된다. 일부 이러한 구현예에서, 세포는 CAR을 일시적으로 발현할 수 있다.
일부 구현예에서, CAR을 발현하도록 조작된, 본원에 기술된 임의의 제조 프로세스(예를 들어, 사이토카인 프로세스 또는 활성화 프로세스)에 의해 제조된 세포(예를 들어, 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T세포 또는 NK세포)의 집단이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 제조 프로세스의 종료시(예를 들어, 본원에 기술된 사이토카인 프로세스 또는 활성화 프로세스의 종료시) 세포의 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 백분율은 제조 프로세스의 시작시(예를 들어, 본원에 기술된 사이토카인 프로세스 또는 활성화 프로세스의 시작시) 세포의 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ 세포의 백분율과 비교하여, (1) 동일하거나, (2) 예를 들어 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15% 이하만큼 상이하거나, (3) 예를 들어 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25%만큼 증가된다. 일부 구현예에서, 제조 프로세스의 종료시(예를 들어, 본원에 기술된 사이토카인 프로세스 또는 활성화 프로세스의 종료시) 세포의 집단은, 예를 들어 26시간을 초과하여 지속(예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 지속)되는 다른 유사한 방법, 또는 예를 들어 3일을 초과하여 시험관 내에서 세포의 집단을 증식시키는 단계(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15일 동안 시험관 내에서 세포의 집단을 증식시키는 단계)를 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포와 비교하여, 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 더 높은(예를 들어, 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50% 더 높은) 백분율을 나타낸다.
일부 구현예에서, 제조 프로세스의 종료시(예를 들어, 본원에 기술된 사이토카인 프로세스 또는 활성화 프로세스의 종료시) 세포의 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 백분율은 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 또는 60% 이상이다.
일부 구현예에서, 제조 프로세스의 종료시(예를 들어, 본원에 기술된 사이토카인 프로세스 또는 활성화 프로세스의 종료시) 세포의 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CD95+ 중심 기억 T세포의 백분율은 제조 프로세스의 시작시(예를 들어, 본원에 기술된 사이토카인 프로세스 또는 활성화 프로세스의 시작시) 세포의 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CD95+ 중심 기억 T세포의 백분율과 비교하여, (1) 동일하거나, (2) 예를 들어 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15% 이하만큼 상이하거나, (3) 예를 들어 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25%만큼 감소된다. 일부 구현예에서, 제조 프로세스의 종료시(예를 들어, 본원에 기술된 사이토카인 프로세스 또는 활성화 프로세스의 종료시) 세포의 집단은, 예를 들어 26시간을 초과하여 지속(예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 지속)되는 다른 유사한 방법, 또는 예를 들어 3일을 초과하여 시험관 내에서 세포의 집단을 증식시키는 단계(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15일 동안 시험관 내에서 세포의 집단을 증식시키는 단계)를 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포와 비교하여, 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CD95+ 중심 기억 T세포의 더 낮은(예를 들어, 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50% 더 낮은) 백분율을 나타낸다.
일부 구현예에서, 제조 프로세스의 종료시(예를 들어, 본원에 기술된 사이토카인 프로세스 또는 활성화 프로세스의 종료시) 세포의 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CD95+ 중심 기억 T세포의 백분율은 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 또는 80% 이하이다.
일부 구현예에서, 제조 프로세스의 종료시(예를 들어, 본원에 기술된 사이토카인 프로세스 또는 활성화 프로세스의 종료시) 세포의 집단은 생체 내에 투여된 후, 예를 들어 26시간을 초과하여 지속(예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 지속)되는 다른 유사한 방법, 또는 예를 들어 3일을 초과하여 시험관 내에서 세포의 집단을 증식시키는 단계(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15일 동안 시험관 내에서 세포의 집단을 증식시키는 단계)를 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포와 비교하여, (예를 들어, 도 4c와 관련하여 실시예 1에 기술된 방법을 이용하여 평가할 때) 더 오래 존속하거나 더 높은(예를 들어, 적어도 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 또는 90% 더 높은) 수준으로 증식된다.
일부 구현예에서, 세포의 집단은 제조 프로세스의 시작 전에(예를 들어, 본원에 기술된 사이토카인 프로세스 또는 활성화 프로세스의 시작 전)에 IL6R-발현 세포(예를 들어, IL6Rα 및/또는 IL6Rβ에 대해 양성인 세포)에 대해 강화되었다. 일부 구현예에서, 세포의 집단은 제조 프로세스의 시작시(예를 들어, 본원에 기술된 사이토카인 프로세스 또는 활성화 프로세스의 시작시) 예를 들어, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 또는 80% 이상의 IL6R-발현 세포(예를 들어, IL6Rα 및/또는 IL6Rβ에 대해 양성인 세포)를 포함한다.
약학적 조성물
또한, 본 개시는 CAR-발현 세포 조성물, 및 다른 질환 중 특히, 본원에 기술된 바와 같은 종양 항원을 발현하는 세포 또는 조직을 포함하는 암 또는 임의의 악성 또는 자가면역 질환의 치료를 위한 의약 또는 방법에 있어서 이들의 용도를 제공한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 제조 프로세스(예를 들어, 본원에 기술된 사이토카인 프로세스 또는 활성화 프로세스)에 의해 제조된 CAR-발현 세포, 예를 들어 복수의 CAR-발현 세포를 하나 이상의 약학적 또는 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제와 조합하여 포함하는 약학적 조성물이 본원에 제공된다.
키메라 항원 수용체(CAR)
본 발명은 면역 이펙터 세포(예를 들어, T세포 또는 NK세포)를 암으로 유도하는 하나 이상의 CAR을 함유하도록 조작된 면역 이펙터 세포를 제공한다. 이는 암 관련 항원에 특이적인 CAR 상의 항원 결합 도메인을 통해 달성된다. 본원에 기술된 CAR이 표적화할 수 있는 두 가지 부류의 암 관련 항원(종양 항원)이 있다: (1) 암세포의 표면에서 발현되는 암 관련 항원; 및 (2) 암 관련 항원으로서, 그 자신은 세포 내에 있지만 이러한 항원의 단편(펩티드)이 MHC(주요 조직적합성 복합체)에 의해 암세포의 표면에 제시되는, 암 관련 항원.
따라서, 예를 들어, 본원에 기술된 방법에 의해 수득된, 면역 이펙터 세포는 다음의 암 관련 항원(종양 항원) 중 하나를 표적화하는 CAR을 함유하도록 조작될 수 있다: CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII , GD2, GD3, BCMA, Tn Ag, PSMA, ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, 메소텔린, IL-11Ra, PSCA, VEGFR2, LewisY, CD24, PDGFR-베타, PRSS21, SSEA-4, CD20, 폴레이트 수용체 알파, ERBB2(Her2/neu), MUC1, EGFR, NCAM, 프로스타제, PAP, ELF2M, 에프린 B2, IGF-I 수용체, CAIX, LMP2, gp100, bcr-abl, 티로시나제, EphA2, 푸코실 GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-아세틸-GD2, 폴레이트 수용체 베타, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, TSHR, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-1a, 레구마인, HPV E6,E7, MAGE-A1, MAGE A1, ETV6-AML, 정자 단백질 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-관련 항원 1, p53, p53 돌연변이체, 프로스테인, 서바이빈 및 텔로머라제, PCTA-1/갈렉틴 8, 멜란A/MART1, Ras 돌연변이체, hTERT, 육종 전좌 중단점, ML-IAP, ERG(TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, 인간 텔로머라제 역전사효소, RU1, RU2, 장내 카복실 에스테라제, 및 mut hsp70-2.
본원에 기술된 CAR 분자의 일부일 수 있는 다양한 구성요소의 비제한적인 예의 서열이 표 1에 열거되어 있으며, 표에서 "aa"는 아미노산을 나타내고 "na"는 상응하는 펩티드를 암호화하는 핵산을 나타낸다.
[표 1]
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
이중특이적 CAR
일부 구현예에서, 다중특이적 항체 분자는 이중특이적 항체 분자이다. 이중특이적 항체는 2개 이하의 항원에 대해 특이성을 갖는다. 이중특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 제1 면역글로불린 가변 도메인 서열, 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 제2 면역글로불린 가변 도메인 서열을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 제1 에피토프와 제2 에피토프는 동일한 항원, 예를 들어 동일한 단백질(또는 다량체성 단백질의 서브유닛) 상에 존재한다. 일부 구현예에서, 제1 에피토프와 제2 에피토프는 중첩된다. 일부 구현예에서, 제1 에피토프와 제2 에피토프는 중첩되지 않는다. 일부 구현예에서, 제1 에피토프와 제2 에피토프는 상이한 항원, 예를 들어 상이한 단백질(또는 다량체성 단백질의 상이한 서브유닛) 상에 존재한다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 중쇄 가변 도메인 서열과 경쇄 가변 도메인 서열, 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 중쇄 가변 도메인 서열과 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 절반 항체, 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 절반 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 절반 항체 또는 이의 단편, 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 절반 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 scFv 또는 이의 단편, 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 scFv 또는 이의 단편을 포함한다.
특정 구현예에서, 항체 분자는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적 또는 삼중특이적) 항체 분자이다. 이중특이적 또는 이종이량체 항체 분자를 생성하는 프로토콜, 및 이중특이적 항체 분자에 대한 다양한 구성은 예를 들어, 전체가 참조로 포함되는, 2015년 3월 13일 출원된 WO2015/142675의 455~458 단락에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 이중특이적 항체 분자는 제1 면역글로불린 가변 도메인 서열, 예를 들어 CD19에 대한 결합 특이성을 갖는 scFv, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 scFv를 포함하거나 본원에 기술된 scFv로부터의 경쇄 CDR 및/또는 중쇄 CDR을 포함하는 제1 면역글로불린 가변 도메인 서열, 및 상이한 항원 상의 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 제2 면역글로불린 가변 도메인 서열을 특징으로 한다.
키메라 TCR
일부 구현예에서, 본 발명의 항체 및 항체 단편(예를 들어, CD19 항체 및 단편)은 T세포 수용체("TCR") 쇄, 예를 들어 TCR 알파 또는 TCR 베타 쇄의 하나 이상의 불변 도메인에 그래프트되어 키메라 TCR을 생성할 수 있다. 이론에 구애되고자 함이 없이, 키메라 TCR은 항원 결합시 TCR 복합체를 통해 신호를 전달할 것으로 여겨진다. 예를 들어 본원에 개시된 바와 같은 scFv가 TCR 쇄, 예를 들어 TCR 알파 쇄 및/또는 TCR 베타 쇄의 불변 도메인, 예를 들어 세포외 불변 도메인의 적어도 일부, 막관통 도메인, 및 세포질 도메인에 그래프트될 수 있다. 또 다른 예로서, 항체 단편, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 VL 도메인이 TCR 알파 쇄의 불변 도메인에 그래프트될 수 있고, 항체 단편, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 VH 도메인이 TCR 베타 쇄의 불변 도메인에 그래프트될 수 있다(또는 대안적으로, VL 도메인이 TCR 베타 쇄의 불변 도메인에 그래프트될 수 있고, VH 도메인이 TCR 알파 쇄에 그래프트될 수 있다). 또 다른 예로서, 항체 또는 항체 단편의 CDR이 TCR 알파 및/또는 베타 쇄에 그래프트되어 키메라 TCR을 생성할 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 LCDR이 TCR 알파 쇄의 가변 도메인에 그래프트될 수 있고, 본원에 개시된 HCDR이 TCR 베타 쇄의 가변 도메인에 그래프트될 수 있거나, 또는 그 반대도 가능하다. 이러한 키메라 TCR은 예를 들어 당업계에 알려진 방법에 의해 생성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Willemsen RA et al, Gene Therapy 2000; 7: 1369-1377; Zhang T et al, Cancer Gene Ther 2004; 11: 487-496; Aggen et al, Gene Ther. 2012 Apr;19(4):365-74]).
비항체 스캐폴드
구현예에서, 항원 결합 도메인은 비항체 스캐폴드, 예를 들어 피브로넥틴, 안키린, 도메인 항체, 리포칼린, 소형 모듈 면역약제, 맥시바디, 단백질 A, 또는 아필린을 포함한다. 비항체 스캐폴드는 세포의 표적 항원에 결합하는 능력이 있다. 구현예에서, 항원 결합 도메인은 세포에서 발현된 천연 단백질의 폴리펩티드 또는 이의 단편이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 비항체 스캐폴드를 포함한다. 표적 세포의 표적 항원에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 결합 영역을 생성된 폴리펩티드가 포함하는 한, 매우 다양한 비항체 스캐폴드가 이용될 수 있다.
비항체 스캐폴드는 다음을 포함한다: 피브로넥틴(Novartis, MA), 안키린(Molecular Partners AG, Zurich, Switzerland), 도메인 항체(Domantis, Ltd., Cambridge, MA, 및 Ablynx nv, Zwijnaarde, Belgium), 리포칼린(Pieris Proteolab AG, Freising, Germany), 소형 모듈 면역약제(Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA), 맥시바디(Avidia, Inc., Mountain View, CA), 단백질 A(Affibody AG, Sweden), 및 아필린(감마-크리스탈린 또는 유비퀴틴)(Scil Proteins GmbH, Halle, Germany).
일부 구현예에서 항원 결합 도메인은 표적 세포의 표면 상의 카운터리간드(counterligand)와 결합하는 분자의 세포외 도메인 또는 이의 카운터리간드 결합 단편을 포함한다.
면역 이펙터 세포는 CAR을 암호화하는 서열을 포함하는 재조합 DNA 구성체를 포함할 수 있고, CAR은 종양 항원, 예를 들어 본원에 기술된 종양 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인(예를 들어, 항체 또는 항체 단편, TCR 또는 TCR 단편), 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 신호전달 도메인 및/또는 일차 신호전달 도메인, 예를 들어 제타 쇄를 포함할 수 있다. 다른 곳에서 기술된 바와 같이, 본원에 기술된 방법은 CAR, 예를 들어 본원에 기술된 CAR을 암호화하는 핵산으로 예를 들어 T 조절 고갈 세포 집단으로부터의 세포를 형질도입시키는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, CAR은 scFv 도메인을 포함하고, scFv는 서열번호 1로 제공되는 것과 같은 선택적 리더 서열이 앞에 올 수 있고, 서열번호 2 또는 서열번호 36 또는 서열번호 38로 제공되는 것과 같은 선택적 힌지 서열, 서열번호 6으로 제공되는 것과 같은 막관통 영역, 서열번호 7 또는 서열번호 16을 포함하는 세포내 신호전달 도메인, 및 서열번호 9 또는 서열번호 10을 포함하는 CD3 제타 서열이 뒤따를 수 있으며, 예를 들어 이 도메인들은 단일 융합 단백질을 형성하도록 인접하여 동일 리딩 프레임 내에 있다.
일부 구현예에서, 예시적인 CAR 구성체는 선택적 리더 서열(예를 들어, 본원에 기술된 리더 서열), 세포외 항원 결합 도메인(예를 들어, 본원에 기술된 항원 결합 도메인), 힌지(예를 들어, 본원에 기술된 힌지 영역), 막관통 도메인(예를 들어, 본원에 기술된 막관통 도메인), 및 세포내 자극 도메인(예를 들어, 본원에 기술된 세포내 자극 도메인)을 포함한다. 일부 구현예에서, 예시적인 CAR 구성체는 선택적 리더 서열(예를 들어, 본원에 기술된 리더 서열), 세포외 항원 결합 도메인(예를 들어, 본원에 기술된 항원 결합 도메인), 힌지(예를 들어, 본원에 기술된 힌지 영역), 막관통 도메인(예를 들어, 본원에 기술된 막관통 도메인), 세포내 공동자극 신호전달 도메인(예를 들어, 본원에 기술된 공동자극 신호전달 도메인), 및/또는 세포내 일차 신호전달 도메인(예를 들어, 본원에 기술된 일차 신호전달 도메인)을 포함한다.
예시적인 리더 서열은 서열번호 1로서 제공된다. 예시적인 힌지/스페이서 서열은 서열번호 2 또는 서열번호 36 또는 서열번호 38로서 제공된다. 예시적인 막관통 도메인 서열은 서열번호 6으로서 제공된다. 4-1BB 단백질의 세포내 신호전달 도메인의 예시적인 서열은 서열번호 7로서 제공된다. CD27의 세포내 신호전달 도메인의 예시적인 서열은 서열번호 16으로서 제공된다. 예시적인 CD3제타 도메인 서열은 서열번호 9 또는 서열번호 10으로서 제공된다.
일부 구현예에서, 면역 이펙터 세포는 CAR을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 핵산 구성체를 포함하고, 핵산 분자는 항원 결합 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 포함하며, 이 서열은 세포내 신호전달 도메인을 암호화하는 핵산 서열과 인접하고 이와 동일한 리딩 프레임 내에 존재한다. CAR에 사용될 수 있는 예시적인 세포내 신호전달 도메인은 예를 들어 CD3-제타, CD28, CD27, 4-1BB 등의 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 예에서, CAR은 CD3-제타, CD28, 4-1BB 등의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
목적하는 분자를 암호화하는 핵산 서열은 당업계에 알려진 재조합 방법을 사용하여, 예를 들어 해당 핵산 분자를 발현하는 세포로부터 라이브러리를 스크리닝하거나, 해당 핵산 분자를 포함하는 것으로 알려진 벡터로부터 해당 핵산 분자를 유도하거나, 표준 기술을 사용하여 해당 핵산 분자를 함유하는 세포 및 조직으로부터 직접 단리함으로써 수득될 수 있다. 대안적으로, 관심 핵산은 클로닝되기 보다는 합성에 의해 생성될 수 있다.
CAR을 암호화하는 핵산은 예를 들어, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터 구성체를 이용하여 면역 이펙터 세포 내로 도입될 수 있다.
CAR을 암호화하는 핵산은 예를 들어, 세포 내로 직접 형질감염될 수 있는 RNA 구성체를 이용하여 면역 이펙터 세포 내로 도입될 수 있다. 형질감염에 사용하기 위한 mRNA를 생성하는 방법은, 3' 및 5' 비번역 서열("UTR")(예를 들어, 본원에 기술된 3' 및/또는 5' UTR), 5' 캡(예를 들어, 본원에 기술된 5' 캡) 및/또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)(예를 들어, 본원에 기술된 IRES), 발현시킬 핵산, 및 폴리(A) 테일을 함유하는, 일반적으로 50 내지 2000개 염기 길이의 구성체(예를 들어, 실시예에서 기술된 구성체, 예를 들어 서열번호 35)을 생성하기 위해, 특수하게 설계된 프라이머를 사용한 주형의 시험관내 전사(IVT)에 이은 폴리(A) 부가를 수반한다. 이렇게 생성된 RNA는 다양한 종류의 세포를 효율적으로 형질감염시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 주형은 CAR에 대한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA CAR 벡터는 전기천공법에 의해 세포, 예를 들어 T세포 내로 형질도입된다.
항원 결합 도메인
일부 구현예에서, 복수의 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 조절 고갈 세포의 집단은 다르게는 항원 결합 도메인으로 지칭되는 표적 특이적 결합 요소를 포함하는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함한다. 결합 요소의 선택은 표적 세포의 표면을 규정하는 리간드의 유형 및 수에 따라 달라진다. 예를 들어 항원 결합 도메인은 특정 질환 상태와 관련된 표적 세포 상의 세포 표면 마커로서 작용하는 리간드를 인식하도록 선택될 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 CAR에서 항원 결합 도메인에 대한 리간드로서 작용할 수 있는 세포 표면 마커의 예는 바이러스, 박테리아 및 기생충 감염, 자가면역 질환 및 암세포와 관련된 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR의 부분은 종양 항원, 예를 들어 본원에 기술된 종양 항원을 표적화하는 항원 결합 도메인을 포함한다.
항원 결합 도메인은 단클론 항체, 다클론 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 및 이의 기능적 단편(중쇄 가변 도메인(VH), 경쇄 가변 도메인(VL), 및 낙타과 유래 나노바디의 가변 도메인(VHH)과 같은 단일 도메인 항체, 및 항원 결합 도메인으로서 기능하는 것으로 당업계에 알려진 대안적 스캐폴드, 예컨대 재조합 피브로넥틴 도메인, T세포 수용체(TCR), 또는 이의 단편, 예를 들어 단일쇄 TCR 등을 포함하나 이에 한정되지 않음)을 포함하는(이에 한정되지 않음), 항원에 결합하는 임의의 도메인일 수 있다. 일부 예에서, 항원 결합 도메인은 CAR이 궁극적으로 사용될 종과 동일한 종으로부터 유래되는 것이 유리하다. 예를 들어 인간에서 사용하기 위해, CAR의 항원 결합 도메인이 항체 또는 항체 단편의 항원 결합 도메인에 대한 인간 또는 인간화 잔기를 포함하는 것이 유리할 수 있다.
CD19 CAR
일부 구현예에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 CD19 CAR-발현 세포(예를 들어, 인간 CD19에 결합하는 CAR을 발현하는 세포)이다.
일부 구현예에서, CD19 CAR의 항원 결합 도메인은 문헌[Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997)]에 기술된 FMC63 scFv 단편과 동일하거나 유사한 결합 특이성을 갖는다. 일부 구현예에서, CD19 CAR의 항원 결합 도메인은 문헌[Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997)]에 기술된 scFv 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, CD19 CAR은 본원에 참조로 포함되는 WO2014/153270의 표 3에 따른 항원 결합 도메인(예를 들어, 인간화 항원 결합 도메인)을 포함한다. 또한, WO2014/153270에는 다양한 CAR 구성체의 결합 및 효능의 분석 방법이 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 모체 뮤린 scFv 서열은 PCT WO2012/079000(본원에 참조로 포함)에 제공되는 CAR19 구성체이다. 일부 구현예에서, 항-CD19 결합 도메인은 WO2012/079000에 기술된 scFv이다.
일부 구현예에서, CAR 분자는 PCT 공개 WO2012/079000에 서열번호 12로서 제공된 융합 폴리펩티드 서열을 포함하고, 이는 인간 CD19에 특이적으로 결합하는 뮤린 기원의 scFv 단편을 제공한다.
일부 구현예에서, CD19 CAR은 PCT 공개 WO2012/079000에 서열번호 12로서 제공된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 아미노산 서열은
Diqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(서열번호 292), 또는 이와 실질적으로 상동성인 서열이다.
일부 구현예에서, CD19 CAR은 USAN 명칭 TISAGENLECLEUCEL-T를 갖는다. 구현예에서, CTL019는 EF-1 알파 프로모터의 제어하에 CTL019 이식유전자를 함유하는 자가-비활성화, 복제 결핍 렌티바이러스(LV) 벡터를 이용한 형질도입을 통한 안정적인 삽입에 의해 매개되는 T세포의 유전자 변형에 의해 제조된다. CTL019는 이식유전자 양성 T세포 백분율에 기초하여 대상체에게 전달되는 이식유전자 양성 및 음성 T세포의 혼합물일 수 있다.
다른 구현예에서, CD19 CAR은 본원에 참조로 포함되는 WO2014/153270의 표 3에 따른 항원 결합 도메인(예를 들어, 인간화 항원 결합 도메인)을 포함한다.
뮤린 CD19 항체의 인간화는 마우스-특이적 잔기가 CART19 치료, 즉 CAR19 구성체로 형질도입된 T세포를 사용한 치료를 받은 환자에서 인간-항-마우스 항원(HAMA) 반응을 유도할 수 있는 임상 환경에 바람직하다. 인간화 CD19 CAR 서열의 생성, 특성화, 및 효능은 전문(실시예 1 내지 5(p. 115-159) 포함)이 본원에 참조로 포함되는 국제 출원 WO2014/153270에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, CAR 분자는 다음의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 CD19 CAR이다: eivmtqspatlslspgeratlscrasqdiskylnwyqqkpgqaprlliyhtsrlhsgiparfsgsgsgtdytltisslqpedfavyfcqqgntlpytfgqgtkleikggggsggggsggggsqvqlqesgpglvkpsetlsltctvsgvslpdygvswirqppgkglewigviwgsettyyqsslksrvtiskdnsknqvslklssvtaadtavyycakhyyyggsyamdywgqgtlvtvss (서열번호 293)
일부 구현예에서, CAR 분자는 다음의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 CD19 CAR이다:
eivmtqspatlslspgeratlscrasqdiskylnwyqqkpgqaprlliyhtsrlhsgiparfsgsgsgtdytltisslqpedfavyfcqqgntlpytfgqgtkleikggggsggggsggggsqvqlqesgpglvkpsetlsltctvsgvslpdygvswirqppgkglewigviwgsettyyqsslksrvtiskdnsknqvslklssvtaadtavyycakhyyyggsyamdywgqgtlvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr (서열번호 294)
당해 분야에서의 임의의 공지된 CD19 CAR, 예를 들어 임의의 공지된 CD19 CAR의 CD19 항원 결합 도메인이 본 개시에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어 LG-740; 문헌[미국 특허 8,399,645호; 미국 특허 7,446,190호; Xu et al., Leuk Lymphoma. 2013 54(2):255-260(2012); Cruz et al., Blood 122(17):2965-2973 (2013); Brentjens et al., Blood, 118(18):4817-4828 (2011); Kochenderfer et al., Blood 116(20):4099-102 (2010); Kochenderfer et al., Blood 122 (25):4129-39(2013); 및 16th Annu Meet Am Soc Gen Cell Ther (ASGCT) (May 15-18, Salt Lake City) 2013, Abst 10]에 기술된 CD19 CAR.
예시적인 CD19 CAR은 본원에 기술된 CD19 CAR 또는 문헌[Xu et al. Blood 123.24(2014):3750-9; Kochenderfer et al. Blood 122.25(2013):4129-39, Cruz et al. Blood 122.17(2013):2965-73, NCT00586391, NCT01087294, NCT02456350, NCT00840853, NCT02659943, NCT02650999, NCT02640209, NCT01747486, NCT02546739, NCT02656147, NCT02772198, NCT00709033, NCT02081937, NCT00924326, NCT02735083, NCT02794246, NCT02746952, NCT01593696, NCT02134262, NCT01853631, NCT02443831, NCT02277522, NCT02348216, NCT02614066, NCT02030834, NCT02624258, NCT02625480, NCT02030847, NCT02644655, NCT02349698, NCT02813837, NCT02050347, NCT01683279, NCT02529813, NCT02537977, NCT02799550, NCT02672501, NCT02819583, NCT02028455, NCT01840566, NCT01318317, NCT01864889, NCT02706405, NCT01475058, NCT01430390, NCT02146924, NCT02051257, NCT02431988, NCT01815749, NCT02153580, NCT01865617, NCT02208362, NCT02685670, NCT02535364, NCT02631044, NCT02728882, NCT02735291, NCT01860937, NCT02822326, NCT02737085, NCT02465983, NCT02132624, NCT02782351, NCT01493453, NCT02652910, NCT02247609, NCT01029366, NCT01626495, NCT02721407, NCT01044069, NCT00422383, NCT01680991, NCT02794961, 또는 NCT02456207]에 기술된 항-CD19 CAR을 포함하며, 각각의 문헌은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, CD19 CAR은 표 2에 개시된 서열, 예를 들어 CDR, VH, VL, scFv, 또는 전체 CAR 서열, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
[표 2]
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
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BCMA CAR
일부 구현예에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 BCMA CAR-발현 세포(예를 들어, 인간 BCMA에 결합하는 CAR을 발현하는 세포)이다. 예시적인 BCMA CAR은 본원에 참조로 포함되는 WO2016/014565의 표 1 또는 16에 개시된 서열을 포함할 수 있다. BCMA CAR 구성체는 선택적 리더 서열; 선택적 힌지 도메인, 예를 들어 CD8 힌지 도메인; 막관통 도메인, 예를 들어 CD8 막관통 도메인; 세포내 도메인, 예를 들어 4-1BB 세포내 도메인; 및 기능적 신호전달 도메인, 예를 들어 CD3 제타 도메인을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 도메인들은 인접하고, 동일 리딩 프레임 내에 존재하여 단일 융합 단백질을 형성한다. 다른 구현예에서, 도메인들은 예를 들어 본원에 기술된 RCAR 분자에서와 같이 별개의 폴리펩티드에 존재한다.
일부 구현예에서, BCMA CAR 분자는 WO2016/014565에 개시된 BCMA-1, BCMA-2, BCMA-3, BCMA-4, BCMA-5, BCMA-6, BCMA-7, BCMA-8, BCMA-9, BCMA-10, BCMA-11, BCMA-12, BCMA-13, BCMA-14, BCMA-15, 149362, 149363, 149364, 149365, 149366, 149367, 149368, 149369, BCMA_EBB-C1978-A4, BCMA_EBB-C1978-G1, BCMA_EBB-C1979-C1, BCMA_EBB-C1978-C7, BCMA_EBB-C1978-D10, BCMA_EBB-C1979-C12, BCMA_EBB-C1980-G4, BCMA_EBB-C1980-D2, BCMA_EBB-C1978-A10, BCMA_EBB-C1978-D4, BCMA_EBB-C1980-A2, BCMA_EBB-C1981-C3, BCMA_EBB-C1978-G4, A7D12.2, C11D5.3, C12A3.2, 또는 C13F12.1의 하나 이상의 CDR, VH, VL, scFv, 또는 전장 서열, 또는 이와 실질적으로(예를 들어, 95~99%) 동일한 서열을 포함한다.
항-BCMA CAR 구성체에 사용될 수 있는 추가의 예시적인 BCMA-표적화 서열은 WO 2017/021450, WO 2017/011804, WO 2017/025038, WO 2016/090327, WO 2016/130598, WO 2016/210293, WO 2016/090320, WO 2016/014789, WO 2016/094304, WO 2016/154055, WO 2015/166073, WO 2015/188119, WO 2015/158671, US 9,243,058, US 8,920,776, US 9,273,141, US 7,083,785, US 9,034,324, US 2007/0049735, US 2015/0284467, US 2015/0051266, US 2015/0344844, US 2016/0131655, US 2016/0297884, US 2016/0297885, US 2017/0051308, US 2017/0051252, US 2017/0051252, WO 2016/020332, WO 2016/087531, WO 2016/079177, WO 2015/172800, WO 2017/008169, US 9,340,621, US 2013/0273055, US 2016/0176973, US 2015/0368351, US 2017/0051068, US 2016/0368988, 및 US 2015/0232557에 개시되어 있으며, 이들의 전문은 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, 추가의 예시적인 BCMA CAR 구성체는 PCT 공개 WO2012/0163805(이의 내용은 전체가 본원에 참조로 포함됨)로부터의 VH 및 VL 서열을 사용하여 생성된다.
일부 구현예에서, BCMA CAR은 표 3 내지 15에 개시된 서열, 예를 들어 CDR, VH, VL, scFv, 또는 전체 CAR 서열, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 인간 항체 또는 인간 항체 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 항-BCMA 결합 도메인은 본원(예를 들어, 표 3 내지 10 및 12 내지 15)에 기술된 인간 항-BCMA 결합 도메인의 하나 이상(예를 들어, 3개 모두)의 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3 및/또는 본원(예를 들어, 표 3 내지 10 및 12 내지 15)에 기술된 인간 항-BCMA 결합 도메인의 하나 이상(예를 들어, 3개 모두)의 HC CDR1, HC CDR2, 및 HC CDR3을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 항-BCMA 결합 도메인은 본원(예를 들어, 표 3, 7, 및 12)에 기술된 인간 VL 및/또는 본원(예를 들어, 표 3, 7, 및 12)에 기술된 인간 VH를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-BCMA 결합 도메인은 표 3, 7, 및 12의 아미노산 서열의 VL 및 VH를 포함하는 scFv이다. 일부 구현예에서, 항-BCMA 결합 도메인(예를 들어, scFv)은 다음을 포함한다: 표 3, 7, 및 12에 제공된 아미노산 서열의 1, 2, 또는 3개 이상의 변형(예를 들어, 치환, 예를 들어 보존적 치환), 30, 20, 또는 10개 이하의 변형(예를 들어, 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열 또는 표 3, 7, 및 12에 제공된 아미노산 서열에 대해 95~99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL, 및/또는 표 3, 7, 및 12에 제공된 아미노산 서열의 1, 2, 또는 3개 이상의 변형(예를 들어, 치환, 예를 들어 보존적 치환), 30, 20, 또는 10개 이하의 변형(예를 들어, 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열 또는 표 3, 7, 및 12에 제공된 아미노산 서열에 대해 95~99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH.
[표 3]
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Figure pct00039
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[표 4]
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[표 5]
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[표 6]
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[표 7]
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[표 8]
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[표 9]
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[표 10]
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[표 11]
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[표 12]
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[표 13]
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[표 14]
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[표 15]
Figure pct00071
일부 구현예에서, 인간 항-BCMA 결합 도메인은 HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 CAR 분자 또는 본원에 기술된 항-BCMA 결합 도메인은 다음을 포함한다:
(1) 다음으로부터 선택된 1, 2, 또는 3개의 경쇄(LC) CDR:
(i) 서열번호 54의 LC CDR1, 서열번호 55의 LC CDR2, 및 서열번호 56의 LC CDR3; 및/또는
(2) 다음 중 하나로부터의 1, 2, 또는 3개의 중쇄(HC) CDR:
(i) 서열번호 44의 HC CDR1, 서열번호 45의 HC CDR2, 및 서열번호 84의 HC CDR3; (ii) 서열번호 44의 HC CDR1, 서열번호 45의 HC CDR2, 및 서열번호 46의 HC CDR3; (iii) 서열번호 44의 HC CDR1, 서열번호 45의 HC CDR2, 및 서열번호 68의 HC CDR3; 또는 (iv) 서열번호 44의 HC CDR1, 서열번호 45의 HC CDR2, 및 서열번호 76의 HC CDR3.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 CAR 분자 또는 본원에 기술된 항-BCMA 결합 도메인은 다음을 포함한다:
(1) 다음 중 하나로부터의 1, 2, 또는 3개의 경쇄(LC) CDR:
(i) 서열번호 95의 LC CDR1, 서열번호 131의 LC CDR2, 및 서열번호 132의 LC CDR3; (ii) 서열번호 95의 LC CDR1, 서열번호 96의 LC CDR2, 및 서열번호 97의 LC CDR3; (iii) 서열번호 95의 LC CDR1, 서열번호 114의 LC CDR2, 및 서열번호 115의 LC CDR3; 또는 (iv) 서열번호 95의 LC CDR1, 서열번호 114의 LC CDR2, 및 서열번호 97의 LC CDR3; 및/또는
(2) 다음 중 하나로부터의 1, 2, 또는 3개의 중쇄(HC) CDR:
(i) 서열번호 86의 HC CDR1, 서열번호 130의 HC CDR2, 및 서열번호 88의 HC CDR3; (ii) 서열번호 86의 HC CDR1, 서열번호 87의 HC CDR2, 및 서열번호 88의 HC CDR3; 또는 (iii) 서열번호 86의 HC CDR1, 서열번호 109의 HC CDR2, 및 서열번호 88의 HC CDR3.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 CAR 분자 또는 본원에 기술된 항-BCMA 결합 도메인은 다음을 포함한다:
(1) 다음 중 하나로부터의 1, 2, 또는 3개의 경쇄(LC) CDR:
(i) 서열번호 147의 LC CDR1, 서열번호 182의 LC CDR2, 및 서열번호 183의 LC CDR3; (ii) 서열번호 147의 LC CDR1, 서열번호 148의 LC CDR2, 및 서열번호 149의 LC CDR3; 또는 (iii) 서열번호 147의 LC CDR1, 서열번호 170의 LC CDR2, 및 서열번호 171의 LC CDR3; 및/또는
(2) 다음 중 하나로부터의 1, 2, 또는 3개의 중쇄(HC) CDR:
(i) 서열번호 179의 HC CDR1, 서열번호 180의 HC CDR2, 및 서열번호 181의 HC CDR3; (ii) 서열번호 137의 HC CDR1, 서열번호 138의 HC CDR2, 및 서열번호 139의 HC CDR3; 또는 (iii) 서열번호 160의 HC CDR1, 서열번호 161의 HC CDR2, 및 서열번호 162의 HC CDR3.
일부 구현예에서, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3은 각각 서열번호 44, 45, 84, 54, 55, 및 56의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3은 각각 서열번호 44, 45, 46, 54, 55, 및 56의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3은 각각 서열번호 44, 45, 68, 54, 55, 및 56의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3은 각각 서열번호 44, 45, 76, 54, 55, 및 56의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3은 각각 서열번호 47, 48, 84, 57, 58, 및 59의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3은 각각 서열번호 47, 48, 46, 57, 58, 및 59의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3은 각각 서열번호 47, 48, 68, 57, 58, 및 59의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3은 각각 서열번호 47, 48, 76, 57, 58, 및 59의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3은 각각 서열번호 49, 50, 85, 60, 58, 및 56의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3은 각각 서열번호 49, 50, 51, 60, 58, 및 56의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3은 각각 서열번호 49, 50, 69, 60, 58, 및 56의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3은 각각 서열번호 49, 50, 77, 60, 58, 및 56의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 인간 항-BCMA 결합 도메인은 VH(예를 들어, 본원에 기술된 VH) 및 VL(예를 들어, 본원에 기술된 VL)을 포함하는 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, VH는 링커, 예를 들어 본원에 기술된 링커, 예를 들어 표 1에 기술된 링커를 통해 VL에 부착된다. 일부 구현예에서, 인간 항-BCMA 결합 도메인은 (Gly4-Ser)n 링커를 포함하며, n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6, 바람직하게는 3 또는 4이다(서열번호 26). scFv의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은 예를 들어, 다음의 배향 중 임의의 배향일 수 있다: 경쇄 가변 영역-링커-중쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역-링커-경쇄 가변 영역.
일부 구현예에서, 항-BCMA 결합 도메인은 단편, 예를 들어 단일쇄 가변 단편(scFv)이다. 일부 구현예에서, 항-BCMA 결합 도메인은 Fv, Fab, (Fab')2, 또는 이중기능적(예를 들어, 이중특이적) 하이브리드 항체이다(예를 들어, 문헌[Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)]). 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 및 이의 단편은 야생형 또는 향상된 친화도로 BCMA 단백질에 결합한다.
일부 예에서, scFv는 당업계에 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다(예를 들어, 문헌[Bird et al., (1988) Science 242:423-426 및 Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조). scFv 분자는 유연성 폴리펩티드 링커를 사용하여 VH 및 VL 영역을 함께 연결함으로써 생성될 수 있다. scFv 분자는 최적화된 길이 및/또는 아미노산 조성을 갖는 링커(예를 들어, Ser-Gly 링커)를 포함한다. 링커 길이는 scFv 가변 영역의 폴딩 및 상호작용 방식에 크게 영향을 미칠 수 있다. 실제로, 짧은 폴리펩티드 링커(예를 들어, 5 내지 10개 아미노산)가 사용되는 경우 쇄내 폴딩이 방지된다. 쇄간 폴딩은 또한 2개의 가변 영역을 함께 모아 기능적 에피토프 결합 부위를 형성하기 위해 필요하다. 링커 배향 및 크기의 예는 예를 들어 본원에 참조로 포함되는 문헌[Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448, 미국 특허 출원 공개 2005/0100543호, 2005/0175606호, 2007/0014794호, 및 PCT 공개 WO2006/020258호 및 WO2007/024715호] 참조.
scFv는 이의 VL 영역과 VH 영역 사이에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 아미노산 잔기의 링커를 포함할 수 있다. 링커 서열은 임의의 천연 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 아미노산 글리신 및 세린을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 글리신 및 세린 반복의 세트, 예컨대 (Gly4Ser)n을 포함하며, 여기서 n은 1 이상의 양의 정수이다(서열번호 25). 일부 구현예에서, 링커는 (Gly4Ser)4(서열번호 27) 또는 (Gly4Ser)3(서열번호 28)일 수 있다. 링커 길이의 변화는 활성을 유지하거나 향상시켜, 활성 연구에서 우수한 효능을 유도할 수 있다.
CD20 CAR
일부 구현예에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 CD20 CAR-발현 세포(예를 들어, 인간 CD20에 결합하는 CAR을 발현하는 세포)이다. 일부 구현예에서, CD20 CAR-발현 세포는 본원에 참조로 포함되는 WO2016164731 및 WO2018067992에 따른 항원 결합 도메인을 포함한다. 예시적인 CD20 결합 서열 또는 CD20 CAR 서열은 예를 들어, WO2018067992의 표 1 내지 5에 개시되어 있다. 일부 구현예에서, CD20 CAR은 WO2018067992 또는 WO2016164731에 개시된 CD20 CAR의 CDR, 가변 영역, scFv, 또는 전장 서열을 포함한다.
CD22 CAR
일부 구현예에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 CD22 CAR-발현 세포(예를 들어, 인간 CD22에 결합하는 CAR을 발현하는 세포)이다. 일부 구현예에서, CD22 CAR-발현 세포는 본원에 참조로 포함되는 WO2016164731 및 WO2018067992에 따른 항원 결합 도메인을 포함한다. 예시적인 CD22 결합 서열 또는 CD22 CAR 서열은 예를 들어, WO2016164731의 표 6A, 6B, 7A, 7B, 7C, 8A, 8B, 9A, 9B, 10A, 및 10B, 및 WO2018067992의 표 6 내지 10에 개시되어 있다. 일부 구현예에서, CD22 CAR 서열은 WO2018067992 또는 WO2016164731에 개시된 CD22 CAR의 CDR, 가변 영역, scFv, 또는 전장 서열을 포함한다.
구현예에서, CAR 분자는 CD22에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다(CD22 CAR). 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 인간 CD22를 표적화한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 본원에 기술된 바와 같은 단일쇄 Fv 서열을 포함한다.
인간 CD22 CAR의 서열은 하기에 제공된다. 일부 구현예에서, 인간 CD22 CAR은 CAR22-65이다.
인간 CD22 CAR scFv 서열
EVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSMLSNSDTWNWIRQSPSRGLEWLGRTYHRSTWYDDYASSVRGRVSINVDTSKNQYSLQLNAVTPEDTGVYYCARVRLQDGNSWSDAFDVWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGTGTQLTVL (서열번호 285)
인간 CD22 CAR 중쇄 가변 영역
EVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSMLSNSDTWNWIRQSPSRGLEWLGRTYHRSTWYDDYASSVRGRVSINVDTSKNQYSLQLNAVTPEDTGVYYCARVRLQDGNSWSDAFDVWGQGTMVTVSS (서열번호 286)
인간 CD22 CAR 경쇄 가변 영역
QSALTQPASASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGTGTQLTVL (서열번호 287)
[표 16]
Figure pct00072
[표 17]
Figure pct00073
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 표 16에 열거된 임의의 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 HC CDR1, HC CDR2, 및 HC CDR3을 포함한다. 구현예에서, 항원 결합 도메인은 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3을 추가로 포함한다. 구현예에서, 항원 결합 도메인은 표 17에 열거된 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 표 17에 열거된 임의의 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3 중 1개, 2개, 또는 전부 및 표 16에 열거된 임의의 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 HC CDR1, HC CDR2, 및 HC CDR3 중 1개, 2개, 또는 전부를 포함한다.
일부 구현예에서, CDR은 Kabat 넘버링 체계, Chothia 넘버링 체계, 또는 이의 조합에 따라 정의된다.
scFv에서 VL 및 VH 도메인이 나타나는 순서는 다를 수 있고(즉, VL-VH, 또는 VH-VL 배향), 각각의 서브유닛이 서열 GGGGS(서열번호 25)를 포함하는 "G4S" 서브유닛(서열번호 25)의 1, 2, 3 또는 4개 카피 중 임의의 카피(예를 들어, (G4S)3(서열번호 28) 또는 (G4S)4(서열번호 27))가 가변 도메인과 연결되어 scFv 도메인 전체를 생성할 수 있다. 대안적으로, CAR 구성체는 예를 들어, 서열 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(서열번호 43)를 포함하는 링커를 포함할 수 있다. 대안적으로, CAR 구성체는 예를 들어, 서열 LAEAAAK(서열번호 308)를 포함하는 링커를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, CAR 구성체는 VL과 VH 도메인 사이에 링커를 포함하지 않는다.
이들 클론은 모두 CD3제타 쇄로부터 유래된 공동자극 도메인의 신호 도메인 내에 Q/K 잔기 변경을 포함하였다.
EGFR CAR
일부 구현예에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 EGFR CAR-발현 세포(예를 들어, 인간 EGFR에 결합하는 CAR을 발현하는 세포)이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 EGFRvIII CAR-발현 세포(예를 들어, 인간 EGFRvIII에 결합하는 CAR을 발현하는 세포)이다. 예시적인 EGFRvIII CAR은 본원에 참조로 포함되는 WO2014/130657, 예를 들어 WO2014/130657의 표 2에 개시된 서열을 포함할 수 있다.
예시적인 EGFRvIII 결합 서열 또는 EGFR CAR 서열은 WO2014/130657에 개시된 EGFR CAR의 CDR, 가변 영역, scFv, 또는 전장 CAR 서열을 포함할 수 있다.
메소텔린 CAR
일부 구현예에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 메소텔린 CAR-발현 세포(예를 들어, 인간 메소텔린에 결합하는 CAR을 발현하는 세포)이다. 예시적인 메소텔린 CAR은 본원에 참조로 포함되는 WO2015090230 및 WO2017112741, 예를 들어 WO2017112741의 표 2, 3, 4, 및 5에 개시된 서열을 포함할 수 있다.
기타 예시적인 CAR
다른 구현예에서, CAR-발현 세포는 CD123에 특이적으로 결합할 수 있으며, 예를 들어 본원에 참조로 포함되는 WO 2014/130635의 표 1 내지 2에 따른 CAR 분자(예를 들어, CAR1 내지 CAR8 중 임의의 것) 또는 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. CD123 CAR 분자 및 항원 결합 도메인(예를 들어, Kabat 또는 Chothia에 따른 1, 2, 3개의 VH CDR; 및 1, 2, 3개의 VL CDR 포함)을 암호화하는 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 WO 2014/130635에 명시되어 있다. 다른 구현예에서, CAR-발현 세포는 CD123에 특이적으로 결합할 수 있으며, 예를 들어 본원에 참조로 포함되는 WO2016/028896의 표 2, 6, 및 9에 따른 CAR 분자(예를 들어, CAR123-1 내지 CAR123-4 및 hzCAR123-1 내지 hzCAR123-32 중 임의의 것) 또는 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. CD123 CAR 분자 및 항원 결합 도메인(예를 들어, Kabat 또는 Chothia에 따른 1, 2, 3개의 VH CDR; 및 1, 2, 3개의 VL CDR 포함)을 암호화하는 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 WO2016/028896에 명시되어 있다.
일부 구현예에서, CAR 분자는 본원에 기술된 CLL1 CAR, 예를 들어 본원에 참조로 포함되는 US2016/0051651A1에 기술된 CLL1 CAR을 포함한다. 구현예에서, CLL1 CAR은 본원에 참조로 포함되는 US2016/0051651A1에 제시된 아미노산을 포함하거나, 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 다른 구현예에서, CAR-발현 세포는 CLL-1에 특이적으로 결합할 수 있으며, 예를 들어 본원에 참조로 포함되는 WO2016/014535의 표 2에 따른 CAR 분자 또는 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. CLL-1 CAR 분자 및 항원 결합 도메인(예를 들어, Kabat 또는 Chothia에 따른 1, 2, 3개의 VH CDR; 및 1, 2, 3개의 VL CDR 포함)을 암호화하는 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 WO2016/014535에 명시되어 있다.
일부 구현예에서, CAR 분자는 본원에 기술된 CD33 CAR, 예를 들어 본원에 참조로 포함되는 US2016/0096892A1에 기술된 CD33 CAR을 포함한다. 구현예에서, CD33 CAR은 본원에 참조로 포함되는 US2016/0096892A1에 제시된 아미노산을 포함하거나, 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 다른 구현예에서, CAR-발현 세포는 CD33에 특이적으로 결합할 수 있으며, 예를 들어 본원에 참조로 포함되는 WO2016/014576의 표 2 또는 9에 따른 CAR 분자(예를 들어, CAR33-1 내지 CAR-33-9 중 임의의 것) 또는 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. CD33 CAR 분자 및 항원 결합 도메인(예를 들어, Kabat 또는 Chothia에 따른 1, 2, 3개의 VH CDR; 및 1, 2, 3개의 VL CDR 포함)을 암호화하는 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 WO2016/014576에 명시되어 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 본원에 기술된 항체(예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 WO2015/142675, US-2015-0283178-A1, US-2016-0046724-A1, US2014/0322212A1, US2016/0068601A1, US2016/0051651A1, US2016/0096892A1, US2014/0322275A1, 또는 WO2015/090230에 기술된 항체)로부터의 1, 2, 3개(예를 들어, 3개 모두)의 중쇄 CDR, HC CDR1, HC CDR2, 및 HC CDR3 및/또는 본원에 기술된 항체(예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 WO2015/142675, US-2015-0283178-A1, US-2016-0046724-A1, US2014/0322212A1, US2016/0068601A1, US2016/0051651A1, US2016/0096892A1, US2014/0322275A1, 또는 WO2015/090230에 기술된 항체)로부터의 1, 2, 3개(예를 들어, 3개 모두)의 경쇄 CDR, LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 상기 열거된 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
구현예에서, 항원 결합 도메인은 본원에 참조로 포함되는 WO2015/142675, US-2015-0283178-A1, US-2016-0046724-A1, US2014/0322212A1, US2016/0068601A1, US2016/0051651A1, US2016/0096892A1, US2014/0322275A1, 또는 WO2015/090230에 기술된 항원 결합 도메인이다.
구현예에서, 항원 결합 도메인은 BCMA를 표적화하며, US-2016-0046724-A1에 기술되어 있다. 구현예에서, 항원 결합 도메인은 CD19를 표적화하며, US-2015-0283178-A1에 기술되어 있다. 구현예에서, 항원 결합 도메인은 CD123을 표적화하며, US2014/0322212A1, US2016/0068601A1에 기술되어 있다. 구현예에서, 항원 결합 도메인은 CLL1을 표적화하며, US2016/0051651A1에 기술되어 있다. 구현예에서, 항원 결합 도메인은 CD33을 표적화하며, US2016/0096892A1에 기술되어 있다.
CAR-발현 세포를 사용하여 표적화될 수 있는 예시적인 표적 항원은 특히, 예를 들어 각각의 전문이 본원에 참조로 포함되는 WO2014/153270, WO 2014/130635, WO2016/028896, WO 2014/130657, WO2016/014576, WO 2015/090230, WO2016/014565, WO2016/014535, 및 WO2016/025880에 기술된 바와 같은 CD19, CD123, EGFRvIII, CD33, 메소텔린, BCMA, 및 GFR ALPHA-4를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
다른 구현예에서, CAR-발현 세포는 GFR ALPHA-4에 특이적으로 결합할 수 있으며, 예를 들어 본원에 참조로 포함되는 WO2016/025880의 표 2에 따른 CAR 분자 또는 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. GFR ALPHA-4 CAR 분자 및 항원 결합 도메인(예를 들어, Kabat 또는 Chothia에 따른 1, 2, 3개의 VH CDR; 및 1, 2, 3개의 VL CDR 포함)을 암호화하는 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 WO2016/025880에 명시되어 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 CAR 분자 중 임의의 것(예를 들어, CD19, CD123, EGFRvIII, CD33, 메소텔린, BCMA, 및 GFR ALPHA-4 중 임의의 것)의 항원 결합 도메인은 상기 열거된 항체로부터의 1, 2, 3개(예를 들어, 3개 모두)의 중쇄 CDR, HC CDR1, HC CDR2, 및 HC CDR3 및/또는 상기 열거된 항원 결합 도메인으로부터의 1, 2, 3개(예를 들어, 3개 모두)의 경쇄 CDR, LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 상기 열거되거나 기술된 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 상기 열거된 항체로부터의 1, 2, 3개(예를 들어, 3개 모두)의 중쇄 CDR, HC CDR1, HC CDR2, 및 HC CDR3 및/또는 상기 열거된 항체로부터의 1, 2, 3개(예를 들어, 3개 모두)의 경쇄 CDR, LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 상기 열거되거나 기술된 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 종양 항원은 전문이 본원에 참조로 포함되는, 2015년 3월 13일 출원된 국제 출원 WO2015/142675에 기술된 종양 항원이다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 다음 중 하나 이상으로부터 선택된다: CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1(CD2 서브세트 1, CRACC, SLAMF7, CD319, 및 19A24로도 지칭됨); C형 렉틴-유사 분자-1(CLL-1 또는 CLECL1); CD33; 표피 성장 인자 수용체 변이체 III(EGFRvIII); 강글리오시드 G2(GD2); 강글리오시드 GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); TNF 수용체 패밀리 구성원 B세포 성숙(BCMA); Tn 항원((Tn Ag) 또는 (GalNAcα-Ser/Thr)); 전립선-특이적 막 항원(PSMA); 수용체 티로신 키나제-유사 고아 수용체 1(ROR1); Fms-유사 티로신 키나제 3(FLT3); 종양 관련 당단백질 72(TAG72); CD38; CD44v6; 암배아성 항원(CEA); 상피세포 부착 분자(EPCAM); B7H3(CD276); KIT(CD117); 인터류킨-13 수용체 서브유닛 알파-2(IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메소텔린; 인터류킨 11 수용체 알파(IL-11Ra); 전립선 줄기세포 항원(PSCA); 프로테아제 세린 21(테스티신(Testisin) 또는 PRSS21); 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2); Lewis(Y) 항원; CD24; 혈소판-유래 성장 인자 수용체 베타(PDGFR-베타); 단계-특이적 배아 항원-4(SSEA-4); CD20; 폴레이트 수용체 알파; 수용체 티로신-단백질 키나제 ERBB2(Her2/neu); 뮤신 1, 세포 표면 관련(MUC1); 상피 성장 인자 수용체(EGFR); 신경세포 부착 분자(NCAM); 프로스타제(Prostase); 전립선 산 포스파타제(PAP); 돌연변이된 신장 인자(ELF2M); 에프린(Ephrin) B2; 섬유모세포 활성화 단백질 알파(FAP); 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체(IGF-I 수용체), 탄산 탈수효소 IX(CAIX); 프로테아좀(프로좀, 마크로파인) 서브유닛, 베타형, 9(LMP2); 당단백질 100(gp100); 절단점 클러스터 영역(BCR)과 아벨슨 뮤린 백혈병 바이러스 종양유전자 상동체 1(Abl)로 이루어진 종양유전자 융합 단백질(bcr-abl); 티로시나제; 에프린 A형 수용체 2(EphA2); 푸코실 GM1; 시알릴 Lewis 부착 분자(sLe); 강글리오시드 GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); 트랜스글루타미나제 5(TGS5); 고분자량 흑색종 관련 항원(HMWMAA); o-아세틸-GD2 강글리오시드(OAcGD2); 폴레이트 수용체 베타; 종양 내피 마커 1(TEM1/CD248); 종양 내피 마커 7-관련(TEM7R); 클라우딘(claudin) 6(CLDN6); 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR); G 단백질 커플링된 수용체 클래스 C 그룹 5, 구성원 D(GPRC5D); 염색체 X 오픈 리딩 프레임 61(CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제(ALK); 폴리시알산; 태반-특이적 1(PLAC1); 글로보H 글리코세라미드의 육당류 부분(GloboH); 유선 분화 항원(NY-BR-1); 유로플라킨 2(UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1(HAVCR1); 아드레날린수용체 베타 3(ADRB3); 파넥신 3(PANX3); G 단백질 커플링된 수용체 20(GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 K 9(LY6K); 후각 수용체 51E2(OR51E2); TCR 감마 대체 리딩 프레임 단백질(TARP); 빌름스 종양 단백질(WT1); 암/고환 항원 1(NY-ESO-1); 암/고환 항원 2(LAGE-1a); 흑색종 관련 항원 1(MAGE-A1); 염색체 12p에 위치한 ETS 전위-변이 유전자 6(ETV6-AML); 정자 단백질 17(SPA17); X 항원 패밀리, 구성원 1A(XAGE1); 안지오포이에틴 결합 세포 표면 수용체 2(Tie 2); 흑색종 암 고환 항원-1(MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2(MAD-CT-2); Fos 관련 항원 1; 종양 단백질 p53(p53); p53 돌연변이체; 프로스테인; 서바이빙(surviving); 텔로머라제; 전립선 암종 종양 항원-1(PCTA-1 또는 갈렉틴 8); T세포 1에 의해 인식되는 흑색종 항원(MelanA 또는 MART1); 래트 육종(Ras) 돌연변이체; 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT); 육종 전위 절단점; 흑색종 아폽토시스 억제제(ML-IAP); ERG(막관통 프로테아제, 세린 2(TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코사미닐-트랜스퍼라제 V(NA17); 쌍 형성된 박스 단백질 Pax-3(PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 B1; v-myc 조류 골수구종증 바이러스 종양유전자 신경모세포종 유래 상동체(MYCN); Ras 상동체 패밀리 구성원 C(RhoC); 티로시나제 관련 단백질 2(TRP-2); 시토크롬 P450 1B1(CYP1B1); CCCTC 결합 인자(징크 핑거 단백질)-유사(BORIS(Brother of the Regulator of Imprinted Sites)), T세포 3에 의해 인식되는 편평세포 암종 항원(SART3); 쌍 형성된 박스 단백질 Pax-5(PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32(OY-TES1); 림프구-특이적 단백질 티로신 키나제(LCK); A 키나제 앵커 단백질 4(AKAP-4); 활막 육종, X 절단점 2(SSX2); 진행성 당화 최종산물에 대한 수용체(RAGE-1); 신장 편재 1(RU1); 신장 편재 2(RU2); 레구마인(legumain); 인간 유두종 바이러스 E6(HPV E6); 인간 유두종 바이러스 E7(HPV E7); 장내 카복실 에스테라제; 돌연변이된 열충격 단백질 70-2(mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구 관련 면역글로불린-유사 수용체 1(LAIR1); IgA 수용체의 Fc 단편(FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2(LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f(CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A(CLEC12A); 골수 기질세포 항원 2(BST2); EGF-유사 모듈 함유 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 2(EMR2); 림프구 항원 75(LY75); 글리피칸(Glypican)-3(GPC3); Fc 수용체-유사 5(FCRL5); 및 면역글로불린 람다-유사 폴리펩티드 1(IGLL1).
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 상기 열거된 항체로부터의 1, 2, 3개(예를 들어, 3개 모두)의 중쇄 CDR, HC CDR1, HC CDR2, 및 HC CDR3 및/또는 상기 열거된 항체로부터의 1, 2, 3개(예를 들어, 3개 모두)의 경쇄 CDR, LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 상기 열거되거나 기술된 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항종양 항원 결합 도메인은 단편, 예를 들어 단일쇄 가변 단편(scFv)이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 항암 관련 항원 결합 도메인은 Fv, Fab, (Fab')2, 또는 이중기능적(예를 들어, 이중특이적) 하이브리드 항체이다(예를 들어, 문헌[Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)]). 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 및 이의 단편은 야생형 또는 향상된 친화도로 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원 단백질에 결합한다.
일부 예에서, scFv는 당업계에 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다(예를 들어, 문헌[Bird et al., (1988) Science 242:423-426 및 Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조). scFv 분자는 유연성 폴리펩티드 링커를 사용하여 VH 및 VL 영역을 함께 연결함으로써 생성될 수 있다. scFv 분자는 최적화된 길이 및/또는 아미노산 조성을 갖는 링커(예를 들어, Ser-Gly 링커)를 포함한다. 링커 길이는 scFv 가변 영역의 폴딩 및 상호작용 방식에 크게 영향을 미칠 수 있다. 실제로, 짧은 폴리펩티드 링커(예를 들어, 5 내지 10개 아미노산)가 사용되는 경우 쇄내 폴딩이 방지된다. 쇄간 폴딩은 또한 2개의 가변 영역을 함께 모아 기능적 에피토프 결합 부위를 형성하기 위해 필요하다. 링커 배향 및 크기의 예는 예를 들어 본원에 참조로 포함되는 문헌[Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448, 미국 특허 출원 공개 2005/0100543호, 2005/0175606호, 2007/0014794호, 및 PCT 공개 WO2006/020258호 및 WO2007/024715호] 참조.
scFv는 이의 VL 영역과 VH 영역 사이에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 아미노산 잔기의 링커를 포함할 수 있다. 링커 서열은 임의의 천연 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 아미노산 글리신 및 세린을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 글리신 및 세린 반복의 세트, 예컨대 (Gly4Ser)n을 포함하며, 여기서 n은 1 이상의 양의 정수이다(서열번호 25). 일부 구현예에서, 링커는 (Gly4Ser)4(서열번호 27) 또는 (Gly4Ser)3(서열번호 28)일 수 있다. 링커 길이의 변화는 활성을 유지하거나 향상시켜, 활성 연구에서 우수한 효능을 유도할 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 T세포 수용체("TCR"), 또는 이의 단편, 예를 들어 단일쇄 TCR(scTCR)이다. 이러한 TCR을 제조하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Willemsen RA et al, Gene Therapy 7: 1369-1377 (2000); Zhang T et al, Cancer Gene Ther 11: 487-496 (2004); Aggen et al, Gene Ther. 19(4):365-74 (2012)] 참조(참고문헌들은 전체가 본원에 포함됨). 예를 들어, 링커(예를 들어, 유연성 펩티드)에 의해 연결된 T세포 클론으로부터 Vα 및 Vβ 유전자를 함유하는 scTCR이 조작될 수 있다. 이러한 접근법은 그 자체는 세포 내에 있으나 이러한 항원의 단편(펩티드)이 MHC에 의해 암세포의 표면에 제시되는 암 관련 표적에 매우 유용하다.
막관통 도메인
막관통 도메인과 관련하여, 다양한 구현예에서, CAR은 CAR의 세포외 도메인에 부착된 막관통 도메인을 포함하도록 설계될 수 있다. 막관통 도메인은 막관통 영역에 인접한 하나 이상의 추가의 아미노산, 예를 들어 막관통 영역이 유래된 단백질의 세포외 영역과 관련된 하나 이상의 아미노산(예를 들어, 세포외 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 최대 15개의 아미노산) 및/또는 막관통 단백질이 유래된 단백질의 세포내 영역과 관련된 하나 이상의 추가의 아미노산(예를 들어, 세포내 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 최대 15개의 아미노산)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 CAR의 다른 도메인 중 하나와 관련된 도메인이다. 일부 예에서, 막관통 도메인은 이러한 도메인이 동일한 또는 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 결합하지 못하도록, 예를 들어 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하도록 선택되거나 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 CAR-발현 세포, 예를 들어 CART 세포의 표면에서 또 다른 CAR과 동종이량체화할 수 있다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인의 아미노산 서열은 동일한 CAR-발현 세포, 예를 들어 CART에 존재하는 고유 결합 파트너의 결합 도메인과의 상호작용을 최소화하도록 변형되거나 치환될 수 있다.
막관통 도메인은 천연 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연인 경우, 도메인은 임의의 막결합 또는 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 CAR이 표적에 결합할 때마다 세포내 도메인(들)에 신호를 전달할 수 있다. 본 발명에 특히 유용한 막관통 도메인은 적어도, 예를 들어 T세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8(예를 들어, CD8 알파, CD8 베타), CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154의 막관통 영역(들)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 적어도, 공동자극 분자, 예를 들어 MHC 클래스 I 분자, TNF 수용체 단백질, 면역글로불린-유사 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구 활성화 분자(SLAM 단백질), 활성화 NK세포 수용체, BTLA, 톨 리간드 수용체, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), 4-1BB(CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS(CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM(LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드의 막관통 영역(들)을 포함할 수 있다.
일부 예에서, 막관통 도메인은 힌지, 예를 들어 인간 단백질의 힌지를 통해 CAR의 세포외 영역, 예를 들어 CAR의 항원 결합 도메인에 부착될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 힌지는 인간 Ig(면역글로불린) 힌지, 예를 들어 IgG4 힌지, 또는 CD8a 힌지일 수 있다. 일부 구현예에서, 힌지 또는 스페이서는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함한다(예를 들어, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진다). 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 서열번호 6의 막관통 도메인을 포함한다(예를 들어, 서열번호 6의 막관통 도메인으로 이루어진다).
일부 구현예에서, 힌지 또는 스페이서는 IgG4 힌지를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 힌지 또는 스페이서는 서열번호 3의 힌지를 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 또는 스페이서는 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 힌지를 포함한다.
일부 구현예에서, 힌지 또는 스페이서는 IgD 힌지를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 힌지 또는 스페이서는 서열번호 4의 아미노산 서열의 힌지를 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 또는 스페이서는 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 힌지를 포함한다.
일부 구현예에서, 막관통 도메인은 재조합 도메인일 수 있으며, 이 경우 막관통 도메인은 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 주로 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 페닐알라닌, 트립토판, 및 발린의 삼중체가 재조합 막관통 도메인의 각각의 말단에서 발견될 수 있다.
임의로, 2 내지 10개 아미노산 길이의 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커가 CAR의 막관통 도메인과 세포질 영역 사이의 연결을 형성할 수 있다. 글리신-세린 이중체는 특히 적합한 링커를 제공한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 링커는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, 힌지 또는 스페이서는 KIR2DS2 힌지를 포함한다.
세포질 도메인
본 발명의 CAR의 세포질 도메인 또는 영역은 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일반적으로 세포내 신호전달 도메인은 CAR이 도입된 면역 세포의 정상적인 이펙터 기능 중 적어도 하나의 활성화를 담당한다.
본 발명의 CAR에 사용하기 위한 세포내 신호전달 도메인의 예는 T세포 수용체(TCR) 및 항원 수용체 결합 후에 신호 전달을 개시하기 위해 함께 작용하는 공동수용체의 세포질 서열뿐만 아니라 이들 서열의 임의의 유도체 또는 변이체 및 동일한 기능적 능력을 갖는 임의의 재조합 서열을 포함한다.
TCR을 통해 생성된 신호만으로는 T세포의 완전한 활성화에 충분하지 않으며 이차 및/또는 공동자극 신호도 필요한 것으로 알려져 있다. 따라서, T세포 활성화는 다음의 두 가지 다른 부류의 세포질 신호전달 서열에 의해 매개된다고 할 수 있다: TCR을 통해 항원 의존적 일차 활성화를 개시하는 것(일차 세포내 신호전달 도메인) 및 항원 독립적인 방식으로 작용하여 이차 또는 공동자극 신호를 제공하는 것(이차 세포질 도메인, 예를 들어 공동자극 도메인).
일차 신호전달 도메인은 TCR 복합체의 일차 활성화를 자극적 방식 또는 억제적 방식으로 조절한다. 자극적 방식으로 작용하는 일차 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 알려져 있는 신호전달 모티프를 함유할 수 있다.
본 발명에 특히 유용한 일차 세포내 신호전달 도메인을 함유하는 ITAM의 예는 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278("ICOS"로도 알려짐), FcεRI, DAP10, DAP12, 및 CD66d의 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 CAR은 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 CD3-제타의 일차 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 일차 신호전달 도메인은 고유 ITAM 도메인과 비교하여 변경된(예를 들어, 증가된 또는 감소된) 활성을 갖는 변형된 ITAM 도메인, 예를 들어 돌연변이된 ITAM 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 일차 신호전달 도메인은 변형된 ITAM 함유 일차 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 최적화 및/또는 절단된 ITAM 함유 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 일차 신호전달 도메인은 1, 2, 3, 또는 4개 이상의 ITAM 모티프를 포함한다.
본 발명에 특히 유용한 일차 세포내 신호전달 도메인을 함유하는 분자의 추가의 예는 DAP10, DAP12, 및 CD32의 것을 포함한다.
CAR의 세포내 신호전달 도메인은 일차 신호전달 도메인, 예를 들어 CD3-제타 신호전달 도메인을 그 자체로 포함할 수 있거나, 또는 본 발명의 CAR과 관련하여 유용한 임의의 다른 목적하는 세포내 신호전달 도메인(들)과 조합될 수 있다. 예를 들어 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 일차 신호전달 도메인, 예를 들어 CD3 제타 쇄 부분, 및 공동자극 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 공동자극 신호전달 도메인은 공동자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는 CAR의 부분을 나타낸다. 공동자극 분자는 항원에 대한 림프구의 효율적인 반응에 필요한, 항원 수용체 또는 그 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 이러한 분자의 예는 MHC 클래스 I 분자, TNF 수용체 단백질, 면역글로불린-유사 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구 활성화 분자(SLAM 단백질), 활성화 NK세포 수용체, BTLA, 톨 리간드 수용체, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), 4-1BB(CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS(CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM(LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함한다. 예를 들어, CD27 공동자극은 시험관 내에서 인간 CART 세포의 증식, 이펙터 기능, 및 생존을 강화하고, 생체 내에서 인간 T세포 지속성 및 항종양 활성을 증가시키는 것으로 입증된 바 있다(문헌[Song et al. Blood. 2012; 119(3):696-706]). 본 발명의 CAR의 세포질 부분 내의 세포내 신호전달 서열은 무작위 또는 특정 순서로 서로 연결될 수 있다. 임의로, 예를 들어 2 내지 10개 아미노산(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산) 길이의 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커가 세포내 신호전달 서열 사이의 연결을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 링커로서 글리신-세린 이중체가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 링커로서 단일 아미노산, 예를 들어 알라닌, 글리신이 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 2개 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 5개 이상의 공동자극 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 일부 구현예에서, 2개 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 5개 이상의 공동자극 신호전달 도메인은 링커 분자, 예를 들어 본원에 기술된 링커 분자에 의해 분리된다. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 2개의 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커 분자는 글리신 잔기이다. 일부 구현예에서, 링커는 알라닌 잔기이다.
일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 CD28의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 일부 구현예에서, 4-1BB의 신호전달 도메인은 서열번호 7의 신호전달 도메인이다. 일부 구현예에서, CD3-제타의 신호전달 도메인은 서열번호 9(돌연변이 CD3제타) 또는 서열번호 10(야생형 인간 CD3제타)의 신호전달 도메인이다.
일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 CD27의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 일부 구현예에서, CD27의 신호전달 도메인은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CD27의 신호전달 도메인은 서열번호 19의 핵산 서열에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 CD28의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 일부 구현예에서, CD28의 신호전달 도메인은 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CD28의 신호전달 도메인은 서열번호 37의 핵산 서열에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 ICOS의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 일부 구현예에서, ICOS의 신호전달 도메인은 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ICOS의 신호전달 도메인은 서열번호 39의 핵산 서열에 의해 암호화된다.
CAR과 다른 분자 또는 제제의 공동 발현
제2 CAR의 공동 발현
일부 구현예에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 제2 CAR, 예를 들어 동일한 표적(예를 들어, CD19) 또는 상이한 표적(예를 들어, CD19 이외의 표적, 예를 들어 본원에 기술된 표적)에 대한 상이한 항원 결합 도메인을 포함하는 제2 CAR을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포, 예를 들어 본원에 기술된 방법을 이용하여 제조된 CAR-발현 세포는 (i) BCMA에 결합하는 제1 CAR을 암호화하는 제1 핵산 분자 및 (ii) CD19에 결합하는 제2 CAR을 암호화하는 제2 핵산 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 CAR은 항-BCMA 결합 도메인, 제1 막관통 도메인, 및 제1 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 항-BCMA 결합 도메인은 중쇄 상보성 결정 영역 1(HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2(HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3(HC CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 경쇄 상보성 결정 영역 1(LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2(LC CDR2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3(LC CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3은 각각 서열번호 86, 87, 88, 95, 96, 및 97의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 CAR은 항-CD19 결합 도메인, 제2 막관통 도메인, 및 제2 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 항-CD19 결합 도메인은 HC CDR1, HC CDR2, 및 HC CDR3을 포함하는 VH, 및 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3을 포함하는 VL을 포함하고, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3은 각각 서열번호 295, 304, 및 297 내지 300의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, (i) 항-BCMA 결합 도메인의 VH 및 VL은 각각 서열번호 93 및 102의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD19 결합 도메인의 VH 및 VL은 각각 서열번호 250 및 251의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-BCMA 결합 도메인은 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD19 결합 도메인은 서열번호 293의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 CAR은 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 CAR은 서열번호 225의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포, 예를 들어 본원에 기술된 방법을 이용하여 제조된 CAR-발현 세포는 (i) CD22에 결합하는 제1 CAR을 암호화하는 제1 핵산 분자 및 (ii) CD19에 결합하는 제2 CAR을 암호화하는 제2 핵산 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, CD22 CAR은 CD22 항원 결합 도메인, 및 제1 막관통 도메인; 제1 공동자극 신호전달 도메인; 및/또는 제1 일차 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CD19 CAR은 CD19 항원 결합 도메인, 및 제2 막관통 도메인; 제2 공동자극 신호전달 도메인; 및/또는 제2 일차 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, CD22 항원 결합 도메인은 본원(예를 들어, 표 16, 17, 30, 31, 또는 32)에 기술된 CD22 결합 도메인의 하나 이상(예를 들어, 3개 모두)의 경쇄 상보성 결정 영역 1(LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2(LC CDR2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3(LC CDR3); 및/또는 본원(예를 들어, 표 16, 17, 30, 31, 또는 32)에 기술된 CD22 결합 도메인의 하나 이상(예를 들어, 3개 모두)의 중쇄 상보성 결정 영역 1(HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2(HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3(HC CDR3)을 포함한다. 일 구현예에서, CD22 항원 결합 도메인은 본원(예를 들어, 표 16, 17, 30, 31, 또는 33)에 기술된 CD22 결합 도메인의 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3; 및/또는 본원(예를 들어, 표 16, 17, 30, 31, 또는 33)에 기술된 CD22 결합 도메인의 HC CDR1, HC CDR2, 및 HC CDR3을 포함한다. 일부 구현예에서, CD19 항원 결합 도메인은 본원(예를 들어, 표 2, 30, 31, 또는 32)에 기술된 CD19 결합 도메인의 하나 이상(예를 들어, 3개 모두)의 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3; 및/또는 본원(예를 들어, 표 2, 30, 31, 및 32)에 기술된 CD19 결합 도메인의 하나 이상(예를 들어, 3개 모두)의 HC CDR1, HC CDR2, 및 HC CDR3을 포함한다. 일부 구현예에서, CD19 항원 결합 도메인은 본원(예를 들어, 표 2, 30, 31, 및 32)에 기술된 CD19 결합 도메인의 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3; 및/또는 본원(예를 들어, 표 2, 30, 31, 및 32)에 기술된 CD19 결합 도메인의 HC CDR1, HC CDR2, 및 HC CDR3을 포함한다.
일부 구현예에서, CD22 항원 결합 도메인(예를 들어, scFv)은 본원(예를 들어, 표 30 또는 32)에 기술된 CD22 결합 도메인의 경쇄 가변(VL) 영역; 및/또는 본원(예를 들어, 표 30 또는 32)에 기술된 CD22 결합 도메인의 중쇄 가변(VH) 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, CD22 항원 결합 도메인은 표 30 또는 32에 제공된 CD22 VL 영역 서열의 1, 2, 또는 3개 이상의 변형(예를 들어, 치환), 30, 20, 또는 10개 이하의 변형(예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, CD22 항원 결합 도메인은 표 30 또는 32에 제공된 아미노산 서열 또는 임의의 상기 서열에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, CD22 항원 결합 도메인은 표 30 또는 32에 제공된 CD22 VH 영역 서열의 1, 2, 또는 3개 이상의 변형(예를 들어, 치환), 30, 20, 또는 10개 이하의 변형(예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, CD22 항원 결합 도메인은 표 30 또는 32에 제공된 CD22 VH 영역 서열의 아미노산 서열 또는 임의의 상기 서열에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, CD19 항원 결합 도메인(예를 들어, scFv)은 본원(예를 들어, 표 2, 30, 또는 32)에 기술된 CD19 결합 도메인의 VL 영역; 및/또는 본원(예를 들어, 표 2, 30, 또는 32)에 기술된 CD19 결합 도메인의 VH 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, CD19 항원 결합 도메인은 표 2, 30, 또는 32에 제공된 CD19 VL 영역 서열의 1, 2, 또는 3개 이상의 변형(예를 들어, 치환), 30, 20, 또는 10개 이하의 변형(예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, CD19 항원 결합 도메인은 표 2, 30, 또는 32에 제공된 CD19 VL 영역 서열의 아미노산 서열 또는 임의의 상기 서열에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, CD19 항원 결합 도메인은 표 2, 30, 또는 32에 제공된 CD19 VH 영역 서열의 1, 2, 또는 3개 이상의 변형(예를 들어, 치환), 30, 20, 또는 10개 이하의 변형(예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, CD19 항원 결합 도메인은 표 2, 30, 또는 32에 제공된 CD19 VH 영역 서열의 아미노산 서열 또는 임의의 상기 서열에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, CD22 항원 결합은 표 30 또는 32에 제공된 CD22 scFv 서열의 1, 2, 또는 3개 이상의 변형(예를 들어, 치환), 30, 20, 또는 10개 이하의 변형(예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, CD22 항원 결합은 표 30 또는 32에 제공된 CD22 scFv 서열의 아미노산 서열 또는 임의의 상기 서열에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, CD19 항원 결합 도메인은 표 2, 30, 또는 32에 제공된 CD19 scFv 서열의 1, 2, 또는 3개 이상의 변형(예를 들어, 치환), 30, 20, 또는 10개 이하의 변형(예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, CD19 항원 결합 도메인은 표 2, 30, 또는 32에 제공된 CD19 scFv 서열의 아미노산 서열 또는 임의의 상기 서열에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 scFv를 포함한다.
일부 구현예에서, CD22 CAR 분자 및/또는 CD19 CAR 분자는 표 33에 제공된 아미노산 서열 또는 임의의 상기 서열에 대해 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나; 또는 표 33에 제공된 뉴클레오티드 서열 또는 임의의 상기 서열에 대해 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열에 의해 암호화된 추가의 구성요소, 예를 들어 신호 펩티드, 힌지, 막관통 도메인, 공동자극 신호전달 도메인 및/또는 제1 일차 신호전달 도메인, P2A 부위, 및/또는 링커를 포함한다.
CAR 분자, 예를 들어 본원에 개시된 (i) CD22에 결합하는 제1 CAR 및 (ii) CD19에 결합하는 제2 CAR을 포함하는 이중 CAR 분자의 예시적인 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 표 30에 제공되어 있다.
[표 30]
Figure pct00074
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Figure pct00079
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Figure pct00084
Figure pct00085
본 개시의 이중 CAR(예를 들어, (i) CD22에 결합하는 제1 CAR 및 (ii) CD19에 결합하는 제2 CAR을 포함하는 이중 CAR 분자)의 CD22 및 CD19 CDR이 표 31에 제공되어 있다.
[표 31]
Figure pct00086
Figure pct00087
표 32는 본원에 개시된 이중 CAR 또는 탠덤 CAR, 예를 들어 (i) CD22에 결합하는 제1 CAR 및 (ii) CD19에 결합하는 제2 CAR을 포함하는 이중 CAR 또는 탠덤 CAR의 CD19 및 CD22 결합 도메인에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 제공한다.
[표 32]
Figure pct00088
Figure pct00089
Figure pct00090
Figure pct00091
표 33은 CAR 분자, 예를 들어 본원에 기술된 이중 CAR 분자(예를 들어, (i) CD22에 결합하는 제1 CAR 및 (ii) CD19에 결합하는 제2 CAR을 포함하는 이중 CAR 분자)에 사용될 수 있는 추가의 CAR 구성요소, 예를 들어 신호 펩티드, 링커, 및 P2A 부위에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 제공한다.
[표 33]
Figure pct00092
Figure pct00093
Figure pct00094
일부 구현예에서, CAR-발현 세포는, 제1 항원을 표적화하고 공동자극 신호전달 도메인을 갖지만 일차 신호전달 도메인은 갖지 않는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CAR, 및 제2의 상이한 항원을 표적화하고 일차 신호전달 도메인을 갖지만 공동자극 신호전달 도메인은 갖지 않는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR을 포함한다. 공동자극 신호전달 도메인, 예를 들어 4-1BB, CD28, CD27, OX-40, 또는 ICOS를 제1 CAR에 배치하고, 일차 신호전달 도메인, 예를 들어 CD3 제타를 제2 CAR에 배치하면, 두 표적이 모두 발현되는 세포로 CAR 활성을 제한할 수 있다. 일부 구현예에서, CAR-발현 세포는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 공동자극 도메인을 포함하는 제1 CAR, 및 또 다른 항원을 표적화하고 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 일차 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR-발현 세포는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 일차 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CAR, 및 또 다른 항원을 표적화하고 항원에 대한 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 공동자극 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR-발현 세포는 본원에 기술된 XCAR 및 억제성 CAR을 포함한다. 일부 구현예에서, 억제성 CAR은 암세포가 아닌 정상 세포, 예를 들어 X를 또한 발현하는 정상 세포에서 발견되는 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 억제성 CAR은 억제성 분자의 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 포함한다. 예를 들어, 억제성 CAR의 세포내 도메인은 PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM(CEACAM-1, CEACAM-3, 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3(CD276), B7-H4(VTCN1), HVEM(TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, GAL9, 아데노신, 및 TGF(예를 들어, TGF 베타)의 세포내 도메인일 수 있다.
일부 구현예에서, CAR-발현 세포가 2개 이상의 상이한 CAR을 포함하는 경우, 상이한 CAR의 항원 결합 도메인은 항원 결합 도메인이 서로 상호작용하지 않도록 하는 것일 수 있다. 예를 들어, 제1 및 제2 CAR을 발현하는 세포는 제2 CAR의 항원 결합 도메인(예를 들어, 제2 CAR의 항원 결합 도메인은 VHH임)과 회합을 형성하지 않는 제1 CAR의 항원 결합 도메인을, 예를 들어 단편(예를 들어, scFv)으로서, 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 상보성 결정 영역이 단일 도메인 폴리펩티드의 일부인 분자를 포함하는 단일 도메인 항원 결합(SDAB) 분자를 포함한다. 예는 중쇄 가변 도메인, 천연적으로 경쇄가 결여된 결합 분자, 통상적인 4쇄 항체로부터 유래된 단일 도메인, 조작된 도메인, 및 항체로부터 유래된 것 이외의 단일 도메인 스캐폴드를 포함하나 이에 한정되지 않는다. SDAB 분자는 당해 분야의 임의의 분자, 또는 임의의 미래의 단일 도메인 분자일 수 있다. SDAB 분자는 마우스, 인간, 낙타, 라마, 칠성장어, 어류, 상어, 염소, 토끼, 및 소를 비롯한(이에 한정되지 않음) 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 이 용어는 또한 낙타과 및 상어 이외의 종으로부터의 천연 단일 도메인 항체 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, SDAB 분자는 예를 들어 상어의 혈청에서 발견되는 신규 항원 수용체(NAR)로서 알려진 면역글로불린 이소형으로부터 유래된 것과 같이, 어류에서 발견되는 면역글로불린의 가변 영역으로부터 유래될 수 있다. NAR의 가변 영역으로부터 유래된 단일 도메인 분자("IgNAR")를 생성하는 방법은 문헌[WO 03/014161 및 Streltsov (2005) Protein Sci. 14:2901-2909]에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, SDAB 분자는 경쇄가 없는 중쇄로서 알려진 천연 단일 도메인 항원 결합 분자이다. 이러한 단일 도메인 분자는 예를 들어 문헌[WO 9404678 및 Hamers-Casterman, C. et al. (1993) Nature 363:446-448]에 개시되어 있다. 명확성을 위해, 천연적으로 경쇄가 결여된 중쇄 분자로부터 유래된 이러한 가변 도메인은 4쇄 면역글로불린의 통상적인 VH와 구별하기 위해 본원에서 VHH 또는 나노바디로 알려져 있다. 이러한 VHH 분자는 낙타과 종으로부터, 예를 들어 낙타, 라마, 단봉낙타, 알파카 및 과나코에서 유래될 수 있다. 낙타과 이외의 다른 종이 천연적으로 경쇄가 결여된 중쇄 분자를 생성할 수 있고, 이러한 VHH는 본 발명의 범위 내에 있다.
SDAB 분자는 재조합, CDR-그래프트, 인간화, 낙타화, 탈면역화, 및/또는 시험관내 생성(예를 들어, 파지 디스플레이에 의해 선택)될 수 있다.
또한, 수용체의 항원 결합 도메인 사이의 상호작용은 예를 들어 항원 결합 도메인 중 하나 이상이 이의 동족 항원에 결합하는 능력을 억제하기 때문에, 항원 결합 도메인을 포함하는 복수의 키메라 막 임베딩된 수용체를 갖는 세포는 바람직하지 않을 수 있는 것으로 밝혀진 바 있다. 따라서, 이러한 상호작용을 최소화하는 항원 결합 도메인을 포함하는 제1 및 제2 비천연 키메라 막 임베딩된 수용체를 갖는 세포가 본원에 개시된다. 또한, 이러한 상호작용을 최소화하는 항원 결합 도메인을 포함하는 제1 및 제2 비천연 키메라 막 임베딩된 수용체를 암호화하는 핵산, 그리고 이러한 세포 및 핵산의 제조 및 사용 방법이 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 비천연 키메라 막 임베딩된 수용체 중 하나의 항원 결합 도메인은 scFv를 포함하고, 다른 하나는 단일 VH 도메인, 예를 들어 낙타과, 상어, 또는 칠성장어 단일 VH 도메인, 또는 인간 또는 마우스 서열로부터 유래된 단일 VH 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원의 조성물은 제1 및 제2 CAR을 포함하며, 제1 및 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 가변 경쇄 도메인 및 가변 중쇄 도메인을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 scFv이고, 다른 하나는 scFv가 아니다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 단일 VH 도메인, 예를 들어 낙타과, 상어, 또는 칠성장어 단일 VH 도메인, 또는 인간 또는 마우스 서열로부터 유래된 단일 VH 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 나노바디를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 낙타과 VHH 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 scFv를 포함하고, 다른 하나는 단일 VH 도메인, 예를 들어 낙타과, 상어, 또는 칠성장어 단일 VH 도메인, 또는 인간 또는 마우스 서열로부터 유래된 단일 VH 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 scFv를 포함하고, 다른 하나는 나노바디를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 scFv를 포함하고, 다른 하나는 낙타과 VHH 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포의 표면에 존재하는 경우, 제1 CAR의 항원 결합 도메인의 이의 동족 항원에 대한 결합은 제2 CAR의 존재에 의해 실질적으로 감소되지 않는다. 일부 구현예에서, 제2 CAR의 존재하에서 제1 CAR의 항원 결합 도메인의 이의 동족 항원에 대한 결합은 제2 CAR의 부재하에서 제1 CAR의 항원 결합 도메인의 이의 동족 항원에 대한 결합의 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 예를 들어 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%이다.
일부 구현예에서, 세포의 표면에 존재하는 경우, 제1 및 제2 CAR의 항원 결합 도메인은 둘 다가 scFv 항원 결합 도메인인 경우보다 서로 덜 회합한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 CAR의 항원 결합 도메인은 둘 다가 scFv 항원 결합 도메인인 경우보다 서로 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 더 적게, 예를 들어 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 더 적게 회합한다.
CAR 활성을 향상시키는 제제의 공동 발현
일부 구현예에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 다른 제제, 예를 들어 CAR-발현 세포의 활성 또는 적합성을 향상시키는 제제를 추가로 발현할 수 있다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 제제는 T세포 기능을 조정하거나 조절하는, 예를 들어 억제하는 분자를 억제하는 제제일 수 있다. 일부 구현예에서, T세포 기능을 조정하거나 조절하는 분자는 억제성 분자이다. 억제성 분자, 예를 들어 PD1은 일부 구현예에서 면역 이펙터 반응을 일으키는 CAR-발현 세포의 능력을 감소시킬 수 있다. 억제성 분자의 예는 PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3(CD276), B7-H4(VTCN1), HVEM(TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, GAL9, 아데노신, 또는 TGF 베타를 포함한다.
구현예에서, CAR-발현 세포에서 T세포 기능을 조정하거나 조절하는, 예를 들어 억제하는 분자의 발현을 억제하기 위해 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 제제, 예를 들어 억제성 핵산, 예를 들어 dsRNA, 예를 들어 siRNA 또는 shRNA; 또는 예를 들어 억제성 단백질 또는 시스템, 예를 들어 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부(CRISPR), 전사 활성자 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 또는 징크 핑거 엔도뉴클레아제(ZFN)가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 제제는 shRNA, 예를 들어 본원에 기술된 shRNA이다. 일부 구현예에서, T세포 기능을 조정하거나 조절하는, 예를 들어 억제하는 제제는 CAR-발현 세포 내에서 억제된다. 예를 들어, T세포 기능을 조정하거나 조절하는, 예를 들어 억제하는 분자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자는 CAR의 구성요소, 예를 들어 모든 구성요소를 암호화하는 핵산에 연결된다.
일부 구현예에서, 억제성 분자를 억제하는 제제는 세포에 양성 신호를 제공하는 제2 폴리펩티드, 예를 들어 본원에 기술된 세포내 신호전달 도메인과 회합된, 제1 폴리펩티드, 예를 들어 억제성 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 제제는 예를 들어 억제성 분자, 예컨대 PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3(CD276), B7-H4(VTCN1), HVEM(TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, GAL9, 아데노신, 또는 TGF 베타, 또는 이들 중 임의의 것의 단편(예를 들어, 이들 중 임의의 것의 세포외 도메인의 적어도 일부)의 제1 폴리펩티드, 및 본원에 기술된 세포내 신호전달 도메인(예를 들어, 공동자극 도메인(예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은, 예를 들어 41BB, CD27, 또는 CD28) 및/또는 일차 신호전달 도메인(예를 들어, 본원에 기술된 CD3 제타 신호전달 도메인) 포함)인 제2 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 제제는 PD1 또는 이의 단편(예를 들어, PD1의 세포외 도메인의 적어도 일부)의 제1 폴리펩티드, 및 본원에 기술된 세포내 신호전달 도메인(예를 들어, 본원에 기술된 CD28 신호전달 도메인 및/또는 본원에 기술된 CD3 제타 신호전달 도메인)의 제2 폴리펩티드를 포함한다. PD1은 CD28, CTLA-4, ICOS, 및 BTLA를 또한 포함하는 CD28 수용체 패밀리의 억제성 구성원이다. PD-1은 활성화된 B세포, T세포, 및 골수 세포에서 발현된다(문헌[Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75]). PD1에 대한 2개의 리간드, PD-L1 및 PD-L2는 PD1에 대한 결합시 T세포 활성화를 하향 조절하는 것으로 나타났다(문헌[Freeman et a. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43]). PD-L1은 인간 암에 다량 존재한다(문헌[(Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094)]). 면역 억제는 PD1과 PD-L1의 국소 상호작용을 억제함으로써 역전될 수 있다.
일부 구현예에서, 억제성 분자, 예를 들어 PD1(Programmed Death 1)의 세포외 도메인(ECD)을 포함하는 제제는 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인, 예컨대 41BB 및 CD3 제타에 융합될 수 있다(본원에서 PD1 CAR로도 지칭됨). 일부 구현예에서, 본원에 기술된 XCAR과 조합하여 사용되는 경우 PD1 CAR은 T세포의 지속성을 향상시킨다. 일부 구현예에서, CAR은 서열번호 24에 밑줄로 표시한 PD1의 세포외 도메인을 포함하는 PD1 CAR이다. 일부 구현예에서, PD1 CAR은 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, PD1 CAR은 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제제는 PD1 CAR, 예를 들어 본원에 기술된 PD1 CAR을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, PD1 CAR에 대한 핵산 서열은 서열번호 23으로 제공되며, PD1 ECD는 밑줄 표시되어 있다.
또 다른 예로, 일부 구현예에서, CAR-발현 세포의 활성을 향상시키는 제제는 공동자극 분자 또는 공동자극 분자 리간드일 수 있다. 공동자극 분자의 예는 MHC 클래스 I 분자, BTLA 및 톨 리간드 수용체, 뿐만 아니라 OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), ICOS(CD278), 및 4-1BB(CD137)를 포함한다. 이러한 공동자극 분자의 추가적인 예는, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드를 포함한다. 공동자극 분자 리간드의 예는 CD80, CD86, CD40L, ICOSL, CD70, OX40L, 4-1BBL, GITRL, 및 LIGHT를 포함한다. 구현예에서, 공동자극 분자 리간드는 CAR의 공동자극 분자 도메인과 상이한 공동자극 분자에 대한 리간드이다. 구현예에서, 공동자극 분자 리간드는 CAR의 공동자극 분자 도메인과 동일한 공동자극 분자에 대한 리간드이다. 일부 구현예에서, 공동자극 분자 리간드는 4-1BBL이다. 일부 구현예에서, 공동자극 리간드는 CD80 또는 CD86이다. 일부 구현예에서, 공동자극 분자 리간드는 CD70이다. 구현예에서, 본원에 기술된 CAR-발현 면역 이펙터 세포는 하나 이상의 추가의 공동자극 분자 또는 공동자극 분자 리간드를 발현하도록 추가로 조작될 수 있다.
TET2 shRNA
예를 들어 일부 구현예에서, 제제는 예를 들어 사이토카인 생성의 조절 및/또는 탈과립화를 통한 (i) 증식 강화 및/또는 (ii) 이펙터 기능 조절에 의해 CAR-T 세포 기능을 강화하는 표적의 발현을 억제하는 제제일 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 제제, 예를 들어 억제성 핵산, 예를 들어 dsRNA, 예를 들어 siRNA 또는 shRNA; 또는 예를 들어 억제성 단백질 또는 시스템, 예를 들어 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부(CRISPR), 전사 활성자 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 또는 징크 핑거 엔도뉴클레아제(ZFN)가 CAR-발현 세포 기능을 강화하는 표적의 발현을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적은 Tet2이다. 일부 구현예에서, 제제는 예를 들어 Tet2 표적 서열을 포함하는 센스 가닥 및 전체적으로 또는 부분적으로 센스 가닥에 상보적인 안티센스 가닥을 포함하는 shRNA, 예를 들어 Tet를 표적화하는 shRNA이다. 일부 구현예에서, shRNA는 벡터에 암호화되고, 이 벡터는 본원에 개시된 CAR을 암호화하는 벡터와 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, shRNA를 암호화하는 벡터는 프로모터, Tet2 표적 서열을 포함하는 센스 가닥, 루프, 전체적으로 또는 부분적으로 센스 가닥에 상보적인 안티센스 가닥, 및 임의로 폴리T 테일을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 U6 프로모터, 임의로 인간 U6 프로모터이다. shRNA에 대한 U6 프로모터의 서열 및 사용 방법은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 본원에 참조로 포함되는 문헌[Gao et al. Transcription, 8(5):275-287, 2017; Kunkel & Pederson, Genes & Dev 2:196-204, 1988; Goomer & Kunkel Nucleic Acid Res. 20:4903-4912, 1992; 및 Ma et al Molecular Therapy-Nucleic Acids 3:e161, 2014]에서 확인된다. U6 프로모터 서열(TATA 박스에 밑줄 표시)의 비제한적인 예는 다음을 포함한다:
TATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACC(서열번호 787)
TATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG(서열번호 788)
ttatatatcttgtggaaaggacgaaacacc(서열번호 789)
ttatatatcttgtggaaaggacgaaacacca(서열번호 790)
ttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccg(서열번호 791)
일부 구현예에서, Tet2 표적 서열을 포함하는 센스 가닥은 19, 20, 또는 21개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 전체적으로 또는 부분적으로 센스 가닥에 상보적인 안티센스 가닥은 19, 20, 또는 21개의 뉴클레오티드를 포함하며, 임의로 센스 가닥과 동일한 길이이다. 일부 구현예에서, 상보적 안티센스 가닥은 (3'에서 5' 방향으로 읽을 때) 부분적으로, 예를 들어 적어도 2 내지 18번 위치 또는 1 내지 9 및 11 내지 19, 20, 또는 21번 위치에서, Tet2 표적 서열을 포함하는 센스 가닥에 상보적이다. 일부 구현예에서, Tet2 표적 서열을 포함하는 센스 가닥에 상보적인 안티센스 가닥은 (3'에서 5' 방향으로 읽을 때) 전체적으로, 즉 Tet2 표적 서열을 포함하는 센스 가닥의 전체 길이에 걸쳐, 예를 들어 1 내지 19, 1 내지 20, 또는 1 내지 21번 위치에서, Tet2 표적 서열을 포함하는 센스 가닥에 상보적이다. 일부 구현예에서, 센스 가닥은 본원에 참조로 포함되는 WO2017/049166의 표 4에 제공된 Tet2 표적 서열 중 하나 이상을 포함한다. 비제한적인 예시적 Tet2 표적 서열은 다음을 포함한다:
GGGTAAGCCAAGAAAGAAA(서열번호 418)
TTTCTTTCTTGGCTTACCC(서열번호 419)
서열번호 418의 역보체인 안티센스 가닥이 서열번호 419로서 위에 제공되어 있지만, 이의 결정은 당업 분야의 기술에 기초하여(bioinformations.org/sms2/rev_comp.html에서 이용 가능한 시퀀스 매니퓰레이션 사이트 이용) 용이하게 수행될 수 있음에 유의한다. 일부 구현예에서, 루프는 본원에 참조로 포함되는 문헌[Bofill-De Ros & Gu, Methods 103: 157-166, 2016; Gu et al. Cell 151(4): 900-911, 2012; Cullen, Gene Ther.13:503-508, 2006; 및 Schopman et al Antiviral Res. 86:204-211, 2014]에 개시된 것들과 같은(이에 한정되지 않음), 당업계에 알려진 서열로부터 선택된다. 비제한적인 예시적 루프 서열은 다음을 포함한다:
GTTAATATTCATAGC(서열번호 792)
CCTGACCCA(서열번호 793)
일부 구현예에서, shRNA를 암호화하는 벡터는 폴리T 테일, 즉 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 연속 T 뉴클레오티드, 예를 들어 TT, TTT, TTTT, TTTTT, TTTTTT, TTTTTT, TTTTTTT, TTTTTTTTT, TTTTTTTTT 등을 포함한다. 이 단락에 기술된 모든 벡터 요소를 포함하는 비제한적인 예시적 서열은 다음을 포함한다:
[표 29]
Figure pct00095
당업자는 shRNA를 암호화하는 벡터와 관련하여, "T"를 "U"로 대체함으로써 본원에 개시된 DNA 서열을 RNA로 전사하여 shRNA 서열을 용이하게 생성할 수 있는 것으로 이해된다. 일부 구현예에서, shRNA 또는 shRNA를 암호화하는 벡터는 상기 본원에 개시된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 제조하는 방법의 단계 (ii)(즉, 접촉 단계)에서 사용된다. 따라서, 단계 (ii)는 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 본원에 기술된 shRNA와, 임의로, shRNA를 암호화하는 벡터와 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, shRNA를 암호화하는 벡터는 검출 가능한 태그, 즉 벡터와 접촉된 세포에서 검출되어 성공적인 형질도입을 나타낼 수 있는 태그를 추가로 포함한다. 형광 태그 및/또는 인공 표면 마커와 같은(이에 한정되지 않음), 임의로, 상업적으로 입수 가능한 항체 또는 기타 분자에 의해 검출 가능한, 이러한 검출 가능한 태그의 비제한적인 예는 공지되어 있다. 추가의 비제한적 예는 절단된 EGFR 또는 비오틴/스트렙타비딘과 같은 인공 표면 마커를 포함하며, 이러한 태그는 당업계에 잘 알려져 있다. 일부 구현예에서, shRNA를 암호화하는 벡터는, 상기 본원에 개시된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 제조하는 방법의 단계 (ii)(즉, 접촉 단계)에서 사용되고 상기 본원에 개시된, CAR을 암호화하는 핵산을 포함한다.
CAR과 케모카인 수용체의 공동 발현
구현예에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포, 예를 들어 CD19 CAR-발현 세포는 케모카인 수용체 분자를 추가로 포함한다. T세포에서 케모카인 수용체 CCR2b 또는 CXCR2의 유전자이식 발현은 흑색종 및 신경모세포종을 비롯한 CCL2- 또는 CXCL1-분비 고형 종양으로의 전달을 강화한다(문헌[Craddock et al., J Immunother. 2010 Oct; 33(8):780-8 및 Kershaw et al., Hum Gene Ther. 2002 Nov 1; 13(16):1971-80]). 따라서, 이론에 구애되고자 함이 없이, 종양, 예를 들어 고형 종양이 분비하는 케모카인을 인식하는 CAR-발현 세포에서 발현되는 케모카인 수용체는 CAR-발현 세포의 종양으로의 회귀를 향상시키고, CAR-발현 세포의 종양으로의 침윤을 촉진시키고, CAR-발현 세포의 항종양 효능을 강화하는 것으로 여겨진다. 케모카인 수용체 분자는 천연 또는 재조합 케모카인 수용체 또는 이의 케모카인 결합 단편을 포함할 수 있다. 본원에 기술된 CAR-발현 세포(예를 들어, CAR-Tx)에서의 발현에 적합한 케모카인 수용체 분자는 CXC 케모카인 수용체(예를 들어, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, 또는 CXCR7), CC 케모카인 수용체(예를 들어, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, 또는 CCR11), CX3C 케모카인 수용체(예를 들어, CX3CR1), XC 케모카인 수용체(예를 들어, XCR1), 또는 이의 케모카인 결합 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 CAR과 함께 발현될 케모카인 수용체 분자는 종양에 의해 분비되는 케모카인(들)에 기초하여 선택된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 CCR2b 수용체 또는 CXCR2 수용체를 추가로 포함, 예를 들어 발현한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 CAR 및 케모카인 수용체 분자는 동일한 벡터 상에 존재하거나, 또는 2개의 상이한 벡터 상에 존재한다. 본원에 기술된 CAR 및 케모카인 수용체 분자가 동일한 벡터 상에 존재하는 구현예에서, CAR 및 케모카인 수용체 분자는 각각 2개의 상이한 프로모터의 제어하에 있거나, 또는 동일한 프로모터의 제어하에 있다.
CAR을 암호화하는 핵산 구성체
또한, 본 발명은 본원에 기술된 하나 이상의 CAR 구성체를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 면역 이펙터 세포, 예를 들어 본원에 기술된 방법에 의해 제조된 면역 이펙터 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 메신저 RNA 전사체로서 제공된다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 DNA 구성체로서 제공된다.
본원에 기술된 핵산 분자는 DNA 분자, RNA 분자, 또는 이의 조합일 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 본원에 기술된 바와 같은 CAR 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA이다. 다른 구현예에서, 핵산 분자는 전술한 핵산 분자 중 임의의 것을 포함하는 벡터이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 CAR의 항원 결합 도메인(예를 들어, scFv)은 포유류 세포에서의 발현에 대해 서열이 코돈 최적화된 핵산 분자에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 전체 CAR 구성체는 포유류 세포에서의 발현에 대해 전체 서열이 코돈 최적화된 핵산 분자에 의해 암호화된다. 코돈 최적화는 암호화 DNA 내의 동의 코돈(즉, 동일한 아미노산을 암호화하는 코돈)의 발생 빈도가 상이한 종에서 편향된다는 발견을 의미한다. 이러한 코돈 중축성으로 인해, 동일한 폴리펩티드가 다양한 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. 다양한 코돈 최적화 방법이 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 적어도 미국 특허 5,786,464호 및 6,114,148호에 개시된 방법을 포함한다.
따라서, 일부 구현예에서, 예를 들어 본원에 기술된 방법에 의해 제조된 면역 이펙터 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산 분자를 포함하며, CAR은 본원에 기술된 종양 항원에 결합하는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인(예를 들어, 본원에 기술된 막관통 도메인), 및 자극 도메인, 예를 들어 공동자극 신호전달 도메인(예를 들어, 본원에 기술된 공동자극 신호전달 도메인) 및/또는 일차 신호전달 도메인(예를 들어, 본원에 기술된 일차 신호전달 도메인, 예를 들어 본원에 기술된 제타 쇄)을 포함하는 세포내 신호전달 도메인(예를 들어, 본원에 기술된 세포내 신호전달 도메인)을 포함한다.
또한, 본 발명은 CAR을 암호화하는 핵산 분자, 예를 들어 본원에 기술된 핵산 분자가 삽입된 벡터를 제공한다. 렌티바이러스와 같은 레트로바이러스로부터 유래된 벡터는 딸세포에서의 이식유전자의 장기적이고 안정적인 통합 및 그 증식을 가능하게 하므로 장기적인 유전자 전달을 달성하는 데 적합한 도구이다. 렌티바이러스 벡터는 간세포와 같은 비증식성 세포의 형질도입을 가능하게 할 수 있다는 점에서 뮤린 백혈병 바이러스와 같은 종양-레트로바이러스로부터 유래된 벡터에 비해 추가적인 장점을 갖는다. 렌티바이러스 벡터는 또한 낮은 면역원성의 추가 장점을 갖는다. 레트로바이러스 벡터는 또한 예를 들어 감마레트로바이러스 벡터일 수 있다. 감마레트로바이러스 벡터는 예를 들어 프로모터, 패키징 신호(Ψ), 프라이머 결합 부위(PBS), 하나 이상(예를 들어, 2개)의 긴 말단 반복부(LTR), 및 관심 이식유전자, 예를 들어 CAR을 암호화하는 유전자를 포함할 수 있다. 감마레트로바이러스 벡터에는 gag, pol, 및 env와 같은 바이러스 구조 유전자가 결여되어 있을 수 있다. 예시적인 감마레트로바이러스 벡터는 뮤린 백혈병 바이러스(MLV), 비장-병소 형성 바이러스(SFFV), 및 골수증식성 육종 바이러스(MPSV), 및 이들로부터 유래된 벡터를 포함한다. 다른 감마레트로바이러스 벡터는 예를 들어 문헌[Tobias Maetzig et al., "Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application" Viruses. 2011 Jun; 3(6): 677-713]에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 목적하는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터는 아데노바이러스 벡터(A5/35)이다. 일부 구현예에서, CAR을 암호화하는 핵산의 발현은 트랜스포존, 예컨대 슬리핑 뷰티, crisper, CAS9, 및 징크 핑거 뉴클레아제를 사용하여 달성될 수 있다. 본원에 참조로 포함되는 문헌[June et al. 2009 Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716] 참조.
간략히 요약하면, CAR을 암호화하는 천연 또는 합성 핵산의 발현은 일반적으로, CAR 폴리펩티드 또는 그 일부를 암호화하는 핵산을 프로모터에 작동 가능하게 연결하고 구성체를 발현 벡터에 통합함으로써 달성된다. 벡터는 복제 및 통합 진핵생물에 적합할 수 있다. 전형적인 클로닝 벡터는 전사 및 번역 종결인자, 개시 서열, 및 목적하는 핵산 서열의 발현 조절에 유용한 프로모터를 포함한다.
핵산은 여러 유형의 벡터에 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 동물 바이러스, 및 코스미드를 비롯한(이에 한정되지 않음) 벡터에 클로닝될 수 있다. 특히 관심 있는 벡터는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터, 및 시퀀싱 벡터를 포함한다.
또한, 발현 벡터는 바이러스 벡터의 형태로 세포에 제공될 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY], 및 기타 바이러스학 및 분자생물학 매뉴얼에 기재되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 및 렌티바이러스를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일반적으로, 적합한 바이러스는 적어도 하나의 유기체에서 기능적인 복제 기점, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위, 및 하나 이상의 선별 마커를 포함한다(예를 들어, WO 01/96584호; WO 01/29058호; 및 미국 특허 6,326,193호).
포유류 세포 내로 유전자를 전달하기 위한 다수의 바이러스 기반 시스템이 개발된 바 있다. 예를 들어 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 선택된 유전자는 당업계에 알려진 기술을 이용해 벡터에 삽입되고 레트로바이러스 입자에 패키징될 수 있다. 이어서, 재조합 바이러스는 단리되고, 생체 내 또는 생체 외에서 대상체의 세포로 전달될 수 있다. 다수의 레트로바이러스 시스템이 당업계에 알려져 있다. 일부 구현예에서, 아데노바이러스 벡터가 사용된다. 다수의 아데노바이러스 벡터가 당업계에 알려져 있다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터가 사용된다.
추가의 프로모터 요소, 예를 들어 인핸서는 전사 개시의 빈도를 조절한다. 다수의 프로모터가 시작 부위의 다운스트림에도 기능적 요소를 포함하는 것으로 나타났지만, 일반적으로 프로모터 요소는 시작 부위의 30~110 bp 업스트림 영역에 위치한다. 프로모터 요소 사이의 간격은 흔히 탄력적이므로, 요소들이 역전되거나 서로에 대해 이동할 때 프로모터 기능은 보존된다. 티미딘 키나제(tk) 프로모터에서, 활성이 감소하기 시작하기 전에 프로모터 요소 사이의 간격을 50 bp까지 늘릴 수 있다. 프로모터에 따라, 개별 요소들이 협동적으로 또는 독립적으로 기능하여 전사를 활성화할 수 있는 것으로 보인다. 예시적인 프로모터는 CMV IE 유전자, EF-1α, 유비퀴틴 C, 또는 포스포글리세로키나제(PGK) 프로모터를 포함한다.
포유류 T세포에서 CAR 암호화 핵산 분자를 발현할 수 있는 프로모터의 예로는 EF1a 프로모터가 있다. 고유 EF1a 프로모터는 아미노아실 tRNA의 리보솜으로의 효소적 전달을 담당하는 신장 인자-1 복합체의 알파 서브유닛의 발현을 유도한다. EF1a 프로모터는 포유류 발현 플라스미드에서 광범위하게 사용되었으며, 렌티바이러스 벡터에 클로닝된 핵산 분자로부터 CAR 발현을 유도하는 데 효과적인 것으로 나타났다. 예를 들어, 문헌[Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)] 참조. 일부 구현예에서, EF1a 프로모터는 실시예에 제공된 서열을 포함한다.
프로모터의 또 다른 예로는 극초기 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 서열이 있다. 이 프로모터 서열은 이 서열에 작동 가능하게 연결된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열의 높은 수준의 발현을 유도할 수 있는 강력한 항시적 프로모터 서열이다. 그러나, 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 신장 인자-1α 프로모터, 헤모글로빈 프로모터, 및 크레아틴 키나제 프로모터와 같은(이에 한정되지 않음) 인간 유전자 프로모터, 및 시미안 바이러스 40(SV40) 초기발현 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인바(Epstein-Barr) 바이러스 극초기발현 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터를 비롯한(이에 한정되지 않음) 다른 항시적 프로모터 서열이 또한 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 항시적 프로모터의 사용에 한정되지 않아야 한다. 유도성 프로모터도 본 발명의 일부로서 고려된다. 유도성 프로모터의 사용은 발현이 요망되는 경우 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 활성화할 수 있거나, 또는 발현이 요망되지 않는 경우 발현을 비활성화할 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 유도성 프로모터의 예는 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터, 및 테트라사이클린 프로모터를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
프로모터의 또 다른 예는 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터이다. 구현예에서, 절단된 PGK 프로모터(예를 들어, 야생형 PGK 프로모터 서열에 비해 하나 이상, 예를 들어 1, 2, 5, 10, 100, 200, 300, 또는 400개의 뉴클레오티드 결실을 갖는 PGK 프로모터)가 바람직할 수 있다.
예시적 PGK 프로모터의 뉴클레오티드 서열이 아래에 제공된다.
WT PGK 프로모터:
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCGCGGCGACGCAAAGGGCCTTGGTGCGGGTCTCGTCGGCGCAGGGACGCGTTTGGGTCCCGACGGAACCTTTTCCGCGTTGGGGTTGGGGCACCATAAGCT (서열번호 190)
예시적 절단된 PGK 프로모터:
PGK100:
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTG (서열번호 198)
PGK200:
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACG (서열번호 191)
PGK300:
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCG (서열번호 192)
PGK400:
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCG (서열번호 193)
또한, 벡터는 예를 들어 분비를 용이하게 하기 위한 신호 서열, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결인자(예를 들어, 소 성장 호르몬(BGH) 유전자 유래), 에피솜 복제 및 원핵생물에서의 복제를 가능하게 하는 요소(예를 들어, SV40 원점 및 ColE1 또는 당업계에 알려져 있는 다른 것) 및/또는 선택을 가능하게 하기 위한 요소(예를 들어, 암피실린 저항성 유전자 및/또는 제오신 마커)를 포함할 수 있다.
CAR 폴리펩티드 또는 그 일부의 발현을 평가하기 위해, 세포 내로 도입될 발현 벡터는 바이러스 벡터를 통해 형질감염 또는 감염시키려는 세포 집단으로부터의 발현 세포의 식별 및 선택을 용이하게 하기 위한 선별 마커 유전자 또는 리포터 유전자 또는 둘 다를 또한 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 선별 마커는 별도의 DNA 조각에 운반되어 공동 형질감염 절차에 사용될 수 있다. 선별 마커 및 리포터 유전자는 둘 다 숙주 세포에서 발현을 가능하게 하는 적절한 조절 서열로 플랭킹될 수 있다. 유용한 선별 마커는 예를 들어 neo 등과 같은 항생제 저항성 유전자를 포함한다.
리포터 유전자는 잠재적으로 형질감염된 세포를 식별하고 조절 서열의 기능을 평가하기 위해 사용된다. 일반적으로, 리포터 유전자는 수여 유기체 또는 조직에 존재하지 않거나 이에 의해 발현되지 않는 유전자로서, 일부 용이하게 검출 가능한 특성, 예를 들어 효소 활성에 의해 발현이 나타나는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수여체 세포 내로 도입된 후 적합한 시점에 분석된다. 적합한 리포터 유전자는 루시퍼라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 분비형 알칼리 포스파타제를 암호화하는 유전자, 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 포함할 수 있다(예를 들어, 문헌[Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82]). 적합한 발현 시스템은 잘 알려져 있으며, 공지기술을 사용하여 제조하거나 상업적으로 수득할 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자의 가장 높은 수준의 발현을 나타내는 최소 5' 플랭킹 영역을 갖는 구성체가 프로모터로서 확인된다. 이러한 프로모터 영역은 리포터 유전자에 연결될 수 있으며, 프로모터에 의한 전사를 조정하는 능력에 대해 제제를 평가하는 데 사용될 수 있다.
구현예에서, 벡터는 CAR, 예를 들어 본원에 기술된 CAR, 예를 들어 CD19 CAR, 및 제2 CAR, 예를 들어 억제성 CAR, 또는 CD19 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 CAR을 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 구현예에서, CAR을 암호화하는 2개 이상의 핵산 서열은 동일한 프레임 내 단일 핵산 분자에 의해 단일 폴리펩티드 쇄로서 암호화된다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 CAR은 예를 들어 하나 이상의 펩티드 절단 부위에 의해 분리될 수 있다. (예를 들어, 자가 절단 부위 또는 세포내 프로테아제의 기질). 펩티드 절단 부위의 예는 T2A, P2A, E2A, 또는 F2A 부위를 포함한다.
유전자를 세포 내로 도입하고 발현시키는 방법은 당업계에 알려져 있다. 발현 벡터와 관련하여, 벡터는 임의의 방법, 예를 들어 당업계에 알려진 방법에 의해 숙주 세포, 예를 들어 포유류, 박테리아, 효모, 또는 곤충 세포 내로 용이하게 도입될 수 있다. 예를 들어 발현 벡터는 물리적, 화학적, 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 물리적 방법은 인산칼슘 침전법, 리포펙션, 입자 충격법, 미세주입법, 전기천공법 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생성하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY] 참조. 숙주 세포 내로 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 적합한 방법은 인산칼슘 형질감염이다.
숙주 세포 내로 관심 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터, 특히 레트로바이러스 벡터는 유전자를 포유류, 예를 들어 인간 세포 내로 삽입하기 위한 가장 널리 사용되는 방법이 되었다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 포진 바이러스 I, 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 5,350,674호 및 5,585,362호 참조.
숙주 세포 내로 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 화학적 수단은 콜로이드성 분산 시스템, 예컨대 마크로분자 복합체, 나노캡슐, 미소구체, 비드, 및 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합 미셀, 및 리포솜을 비롯한 지질 기반 시스템을 포함한다. 시험관내 및 생체내 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적 콜로이드 시스템은 리포솜(예를 들어, 인공 막소포)이다. 표적화된 나노입자 또는 기타 적합한 서브미크론 크기의 전달 시스템을 사용한 폴리뉴클레오티드의 전달과 같은, 핵산의 최신 표적화된 전달의 다른 방법이 이용 가능하다.
비바이러스성 전달 시스템이 사용되는 경우, 예시적인 전달 비히클은 리포솜이다. 핵산을 숙주 세포 내로 도입(시험관내, 생체외, 또는 생체내 도입)하기 위해 지질 제형의 사용이 고려된다. 일부 구현예에서, 핵산은 지질과 회합될 수 있다. 지질과 회합된 핵산은 리포솜의 수성 내부에 캡슐화되거나, 리포솜의 지질 이중층 내에 산재되거나, 리포솜 및 올리고뉴클레오티드 둘 다와 회합되는 연결 분자를 통해 리포솜에 부착되거나, 리포솜 내에 포획되거나, 리포솜과 복합체화되거나, 지질 함유 용액 중에 분산되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 조합되거나, 지질 내에 현탁액으로서 함유되거나, 미셀과 함께 함유되거나 복합체화되거나, 달리 지질과 회합될 수 있다. 지질, 지질/DNA, 또는 지질/발현 벡터 관련 조성물은 용액 중의 임의의 특정한 구조로 한정되지 않는다. 예를 들어, 이들은 이중층 구조로 존재하거나, 미셀로 존재하거나, 또는 "붕괴된" 구조로 존재할 수 있다. 이들은 또한 단순히 용액 중에 산재되어서, 가능하게는 크기 또는 형상이 균일하지 않은 응집체를 형성할 수 있다. 지질은 천연 또는 합성 지질일 수 있는 지방 물질이다. 예를 들어, 지질은 세포질에서 자연적으로 발생하는 지방구(fatty droplet) 뿐만 아니라, 지방산, 알코올, 아민, 아미노 알코올, 및 알데히드와 같은 장쇄 지방족 탄화수소 및 그 유도체를 함유하는 화합물 부류를 포함한다.
사용하기에 적합한 지질은 상업적 공급처로부터 입수할 수 있다. 예를 들어, 디미리스틸 포스파티딜콜린("DMPC")은 Sigma(St. Louis, MO)로부터 입수할 수 있고, 디세틸 포스페이트("DCP")는 K & K Laboratories(Plainview, NY)로부터 입수할 수 있고, 콜레스테롤("Choi")은 Calbiochem-Behring로부터 입수할 수 있고, 디미리스틸 포스파티딜글리세롤("DMPG") 및 다른 지질은 Avanti Polar Lipids, Inc.(Birmingham, AL.)로부터 입수할 수 있다. 클로로포름 또는 클로로포름/메탄올 중의 지질 스톡 용액은 약 -20℃에서 보관될 수 있다. 클로로포름은 메탄올보다 더 용이하게 증발되기 때문에 유일한 용매로서 사용된다. "리포솜"은 둘러싸인 지질 이중층 또는 응집체의 생성에 의해 형성된 다양한 단일 및 다중층 지질 비히클을 포괄하는 일반용어이다. 리포솜은 인지질 이중층 막과 내부 수성 매질을 갖는 소포 구조를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 다중층 리포솜은 수성 매질에 의해 분리된 여러 지질층을 갖는다. 다중층 리포솜은 인지질이 과량의 수용액에 현탁될 때 자발적으로 형성된다. 지질 성분은 폐쇄형 구조를 형성하기 전에 자가 재배열을 거쳐 지질 이중층 사이에 물 및 용해된 용질을 포획한다(문헌[Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10]). 그러나, 용액에서 정상 소포 구조와 다른 구조를 갖는 조성물도 포함된다. 예를 들어, 지질은 미셀 구조를 취하거나, 단순히 지질 분자의 불균일 응집체로서 존재할 수 있다. 또한, 리포펙타민-핵산 복합체가 고려된다.
외인성 핵산을 숙주 세포 내로 도입하거나 세포를 본 발명의 억제제에 노출시키는 데 사용되는 방법에 관계없이, 숙주 세포 내 재조합 핵산 서열의 존재를 확인하기 위해 다양한 분석이 수행될 수 있다. 이러한 분석은 예를 들어, 서던 및 노던 블롯팅, RT-PCR 및 PCR과 같이 당업자에게 잘 알려진 "분자 생물학적" 분석; 예를 들어 면역학적 수단(ELISA 및 웨스턴 블롯) 또는 본원에 기술된 분석에 의해 특정 펩티드의 존재 여부를 검출하여 본 발명의 범위 내에 속하는 제제를 확인하는 것과 같은 "생화학적" 분석을 포함한다.
자연살해 세포 수용체(NKR) CAR
일부 구현예에서, 본원에 기술된 CAR 분자는 자연살해 세포 수용체(NKR)의 하나 이상의 구성요소를 포함함으로써 NKR-CAR을 형성한다. NKR 구성요소는 다음의 자연살해 세포 수용체 중 임의의 것으로부터의 막관통 도메인, 힌지 도메인, 또는 세포질 도메인일 수 있다: 살해 세포 면역글로불린-유사 수용체(KIR), 예를 들어 KIR2DL1, KIR2DL2/L3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, DIR2DS5, KIR3DL1/S1, KIR3DL2, KIR3DL3, KIR2DP1, 및 KIR3DP1; 자연 세포독성 수용체(NCR), 예를 들어 NKp30, NKp44, NKp46; 면역 세포 수용체의 신호전달 림프구 활성화 분자(SLAM) 패밀리, 예를 들어 CD48, CD229, 2B4, CD84, NTB-A, CRACC, BLAME, 및 CD2F-10; Fc 수용체(FcR), 예를 들어 CD16, 및 CD64; Ly49 수용체, 예를 들어 LY49A, LY49C. 본원에 기술된 NKR-CAR 분자는 어댑터 분자 또는 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 DAP12와 상호작용할 수 있다. NKR 구성요소를 포함하는 CAR 분자의 예시적인 구성 및 서열은 국제 공개 WO2014/145252호에 기술되어 있고, 그 내용은 본원에 참조로 포함된다.
스플릿 CAR
일부 구현예에서, CAR-발현 세포는 스플릿 CAR을 사용한다. 스플릿 CAR 접근법은 공개문헌 WO2014/055442 및 WO2014/055657에 보다 상세히 설명되어 있다. 간략하게, 스플릿 CAR 시스템은 제1 항원 결합 도메인 및 공동자극 도메인(예를 들어, 41BB)을 갖는 제1 CAR을 발현하는 세포를 포함하고, 세포는 또한 제2 항원 결합 도메인 및 세포내 신호전달 도메인(예를 들어, CD3 제타)을 갖는 제2 CAR을 발현한다. 세포가 제1 항원을 만나면, 공동자극 도메인이 활성화되고 세포는 증식한다. 세포가 제2 항원을 만나면, 세포내 신호전달 도메인이 활성화되고 세포사멸 활성이 시작된다. 따라서, CAR-발현 세포는 두 항원이 모두 존재할 때만 완전히 활성화된다.
키메라 항원 수용체 조절 전략
일부 구현예에서, CAR 활성이 제어될 수 있는 조절 가능한 CAR(RCAR)은 CAR 요법의 안전성 및 효능을 최적화하는 데 바람직하다. CAR 활성을 조절할 수 있는 많은 방식이 존재한다. 예를 들어, 이량체화 도메인에 융합된 카스파제를 사용한 유도 가능한 아폽토시스(예를 들어, 문헌[Di Stasa et al., N Engl. J. Med. 2011 Nov. 3; 365(18):1673-1683])가 본 발명의 CAR 요법에서 안전 스위치로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 CAR을 발현하는 세포(예를 들어, T세포 또는 NK세포)는 유도 가능한 아폽토시스 스위치를 추가로 포함하며, 인간 카스파제(예를 들어, 카스파제 9) 또는 변형된 버전이 조건부 이량체화를 가능하게 하는 인간 FKB 단백질의 변형에 융합된다. 라파로그(예를 들어, AP 1903, AP20187)와 같은 소분자의 존재하에, 유도 가능한 카스파제(예를 들어, 카스파제 9)가 활성화되고, 본 발명의 CAR을 발현하는 세포(예를 들어, T세포 또는 NK세포)의 신속한 아폽토시스 및 사멸을 야기한다. 카스파제 기반의 유도 가능한 아폽토시스 스위치의 예(또는 이러한 스위치의 하나 이상의 양태)는, 예를 들어 본원에 참조로 포함되는 US2004040047; US20110286980; US20140255360; WO1997031899; WO2014151960; WO2014164348; WO2014197638; WO2014197638에 기술되어 있다.
또 다른 예에서, CAR-발현 세포는 또한 이량체화제(예를 들어, 리미두시드(AP1903(Bellicum Pharmaceuticals) 또는 AP20187(Ariad)이라고도 함))의 투여시 카스파제-9의 활성화 및 세포의 아폽토시스를 야기하는 유도 가능한 카스파제-9(iCaspase-9) 분자를 발현할 수 있다. iCaspase-9 분자는 이량체화 화학 유도제(CID)의 존재하에 이량체화를 매개하는 CID 결합 도메인을 포함한다. 이는 CAR-발현 세포의 유도 가능하고 선택적인 고갈을 초래한다. 일부 경우에, iCaspase-9 분자는 CAR-암호화 벡터(들)와 별개인 핵산 분자에 의해 암호화된다. 일부 경우에, iCaspase-9 분자는 CAR-암호화 벡터와 동일한 핵산 분자에 의해 암호화된다. iCaspase-9는 CAR-발현 세포의 임의의 독성을 피할 안전 스위치를 제공할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Song et al. Cancer Gene Ther. 2008; 15(10):667-75; Clinical Trial Id. No. NCT02107963; 및 Di Stasi et al. N. Engl. J. Med. 2011; 365:1673-83] 참조.
본 발명의 CAR 요법을 조절하기 위한 대안적 전략은, 예를 들어 CAR-발현 세포를 제거함으로써, 예를 들어 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)을 유도함으로써 CAR 활성을 비활성화하거나 턴오프하는 소분자 또는 항체를 활용하는 것을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 세포 사멸, 예를 들어 ADCC 또는 보체 유도 세포 사멸을 유도할 수 있는 분자에 의해 인식되는 항원을 또한 발현할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 항체 또는 항체 단편에 의해 표적화될 수 있는 수용체를 또한 발현할 수 있다. 이러한 수용체의 예는 EpCAM, VEGFR, 인테그린(예를 들어, 엔테그린 ανβ3, α4, αΙ¾β3, α4β7, α5β1, ανβ3, αν), TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원(예를 들어, TRAIL-R1, TRAIL-R2), PDGF 수용체, 인터페론 수용체, 폴레이트 수용체, GPNMB, ICAM-1, HLA-DR, CEA, CA-125, MUC1, TAG-72, IL-6 수용체, 5T4, GD2, GD3, CD2, CD3, CD4, CD5, CD11, CD11a/LFA-1, CD15, CD18/ITGB2, CD19, CD20, CD22, CD23/lgE 수용체, CD25, CD28, CD30, CD33, CD38, CD40, CD41, CD44, CD51, CD52, CD62L, CD74, CD80, CD125, CD147/바시진(basigin), CD152/CTLA-4, CD154/CD40L, CD195/CCR5, CD319/SLAMF7, 및 EGFR, 및 이들의 절단된 버전(예를 들어, 하나 이상의 세포외 에피토프를 보존하지만 세포질 도메인 내에 하나 이상의 영역이 결여된 버전)을 포함한다.
예를 들어, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 또한, 신호전달 능력은 없지만, ADCC를 유도할 수 있는 분자, 예를 들어 세툭시맙(ERBITUX®)에 의해 인식되는 에피토프를 보유한 절단된 표피 성장 인자 수용체(EGFR)를 발현하여, 세툭시맙의 투여가 ADCC 및 이후의 CAR-발현 세포의 고갈을 유도하도록 할 수 있다(예를 들어, 문헌[WO2011/056894 및 Jonnalagadda et al., Gene Ther. 2013; 20(8)853-860] 참조). 또 다른 전략은, 리툭시맙에 결합하는, 본원에 기술된 CAR-발현 세포에서 CD32 및 CD20 항원 모두로부터의 표적 에피토프를 조합하는 매우 컴팩트한 마커/자살 유전자를 발현시켜, 예를 들어 ADCC에 의해, CAR-발현 세포의 선택적 고갈을 초래하는 것을 포함한다(예를 들어, 문헌[Philip et al., Blood. 2014; 124(8) 1277-1287] 참조). 본원에 기술된 CAR-발현 세포를 고갈시키는 다른 방법은, 예를 들어 ADCC를 유도하여, 파괴시키기 위해, 성숙한 림프구, 예를 들어 CAR-발현 세포에 선택적으로 결합하고 이를 표적으로 하는 단클론 항-CD52 항체, CAMPATH를 투여하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, CAR-발현 세포는 CAR 리간드, 예를 들어 항-이디오타입 항체를 사용하여 선택적으로 표적화될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 이펙터 세포 활성, 예를 들어 ADCC 또는 ADC 활성을 야기함으로써 CAR-발현 세포의 수를 감소시킬 수 있다. 다른 구현예에서, CAR 리간드, 예를 들어 항-이디오타입 항체는 세포 사멸을 유도하는 제제, 예를 들어 독소에 커플링됨으로써 CAR-발현 세포의 수를 감소시킬 수 있다. 대안적으로, CAR 분자 자체는, 후술되는 바와 같이 활성이 조절될 수 있도록, 예를 들어 턴온 및 턴오프될 수 있도록 구성될 수 있다.
다른 구현예에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 T세포 고갈제에 의해 인식되는 표적 단백질을 또한 발현할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 단백질은 CD20이고, T세포 고갈제는 항-CD20 항체, 예를 들어 리툭시맙이다. 일부 구현예에서, T세포 고갈제는 예를 들어 CAR 유도 독성을 완화하기 위해, CAR-발현 세포를 감소 또는 제거하는 것이 바람직할 때 투여된다. 다른 구현예에서, T세포 고갈제는 항-CD52 항체, 예를 들어 본원의 실시예에 기술된 바와 같은 알렘투주맙이다.
다른 구현예에서, RCAR은 본원에 기술된 표준 CAR의 구성요소, 예를 들어 항원 결합 도메인 및 세포내 신호전달 도메인이 개별 폴리펩티드 또는 구성원 상에 분배되어 있는 폴리펩티드(가장 단순한 구현예에서 일반적으로 2개의 폴리펩티드)의 세트를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드의 세트는 이량체화 분자의 존재시 폴리펩티드를 서로 커플링시킬 수 있는, 예를 들어 항원 결합 도메인을 세포내 신호전달 도메인에 커플링시킬 수 있는 이량체화 스위치를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 CAR은 예를 들어 본원에 참조로 포함되는 WO2014127261에 기술된 것과 같은 이량체화 스위치를 사용한다. 이러한 조절 가능한 CAR에 대한 추가설명 및 예시적인 구성은 본원 및 예를 들어, 전문이 참조로서 포함되는, 2015년 3월 13일 출원된 국제 공개 WO 2015/090229호의 단락 527~551에 제공되어 있다. 일부 구현예에서, RCAR은 스위치 도메인, 예를 들어 서열번호 275에 기재된 바와 같은 FKBP 스위치 도메인을 수반하거나, 또는 예를 들어 서열번호 276에 기재된 바와 같은, FRB와 결합하는 능력을 가진 FKBP의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, RCAR은 예를 들어 서열번호 277에 기재된 바와 같은 FRB 서열, 또는 예를 들어 서열번호 278 내지 283 중 임의의 것에 기재된 바와 같은 돌연변이 FRB 서열을 포함하는 스위치 도메인을 수반한다.
DVPDYASLGGPSSPKKKRKVSRGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLETSY (서열번호 275)
VQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLETS (서열번호 276)
ILWHEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLTQAWDLYYHVFRRISK (서열번호 277)
[표 18]
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RNA 형질감염
시험관내 전사된 RNA CAR을 생성하는 방법이 본원에 개시된다. RNA CAR 및 이를 사용하는 방법은 예를 들어, 전문이 본원에 참조로 포함되는, 2015년 3월 13일 출원된 국제 출원 WO2015/142675의 단락 553~570에 기술되어 있다.
면역 이펙터 세포는 메신저 RNA(mRNA)에 의해 암호화된 CAR을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 CAR을 암호화하는 mRNA는 CAR-발현 세포의 생성을 위해, 예를 들어 본원에 기술된 방법에 의해 제조된 면역 이펙터 세포 내로 도입된다.
일부 구현예에서, 시험관내 전사된 RNA CAR은 일시적 형질감염의 형태로 세포에 도입될 수 있다. RNA는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)으로 생성된 주형을 이용한 시험관내 전사에 의해 생성된다. 임의의 공급원으로부터의 관심 DNA는 적절한 프라이머 및 RNA 폴리머라제를 사용하여 PCR에 의해 시험관내 mRNA 합성을 위한 주형으로 직접 변환될 수 있다. DNA의 공급원은 예를 들어 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 파지 DNA, cDNA, 합성 DNA 서열, 또는 임의의 다른 적절한 DNA 공급원일 수 있다. 목적하는 시험관내 전사용 주형은 본원에 기술된 CAR이다. 예를 들어, RNA CAR을 위한 주형은 본원에 기술된 종양 관련 항원에 대한 항체의 단일쇄 가변 도메인; 힌지 영역(예를 들어, 본원에 기술된 힌지 영역), 막관통 도메인(예를 들어, CD8a의 막관통 도메인과 같은 본원에 기술된 막관통 도메인)을 포함하는 세포외 영역; 및 예를 들어, CD3-제타의 신호전달 도메인 및 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 본원에 기술된 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, PCR에 사용되는 DNA는 오픈 리딩 프레임을 포함한다. DNA는 유기체 게놈의 천연 DNA로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산은 5' 및/또는 3' 비번역 영역(UTR)의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다. 핵산은 엑손 및 인트론을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, PCR에 사용되는 DNA는 인간 핵산 서열이다. 일부 구현예에서, PCR에 사용되는 DNA는 5' 및 3' UTR을 포함하는 인간 핵산 서열이다. 대안적으로 DNA는 천연 유기체에서 정상적으로는 발현되지 않는 인공 DNA 서열일 수 있다. 예시적인 인공 DNA 서열은, 함께 라이게이션되어 융합 단백질을 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 형성하는 유전자의 부분을 포함하는 서열이다. 함께 라이게이션되는 DNA의 부분은 단일 유기체로부터 또는 둘 이상의 유기체로부터 유래될 수 있다.
PCR은 형질감염에 사용되는 mRNA의 시험관내 전사를 위한 주형을 생성하기 위해 사용된다. PCR을 수행하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. PCR에 사용하기 위한 프라이머는 PCR을 위한 주형으로서 사용될 DNA의 영역에 실질적으로 상보적인 영역을 갖도록 설계된다. 본원에서 사용되는 "실질적으로 상보적인"은 프라이머 서열의 대부분의 또는 모든 염기가 상보적이거나 하나 이상의 염기가 비상보적이거나 불일치하는 뉴클레오티드의 서열을 나타낸다. 실질적으로 상보적인 서열은 PCR에 사용되는 어닐링 조건하에, 의도된 DNA 표적과 어닐링 또는 혼성화될 수 있다. 프라이머는 DNA 주형의 임의의 부분에 실질적으로 상보적이도록 설계될 수 있다. 예를 들어 프라이머는 5' 및 3' UTR을 포함하는, 세포에서 정상적으로 전사되는 핵산의 부분(오픈 리딩 프레임)을 증폭하도록 설계될 수 있다. 프라이머는 또한 특정 관심 도메인을 암호화하는 핵산의 부분을 증폭하도록 설계될 수 있다. 일부 구현예에서, 프라이머는 5' 및 3' UTR의 전부 또는 일부를 포함하는 인간 cDNA의 암호화 영역을 증폭하도록 설계된다. PCR에 유용한 프라이머는 당업계에 잘 알려진 합성 방법에 의해 생성될 수 있다. "정방향 프라이머"는 증폭될 DNA 서열의 업스트림에 있는 DNA 주형 상의 뉴클레오티드에 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드의 영역을 포함하는 프라이머이다. "업스트림"은 암호화 가닥과 관련하여 증폭될 DNA 서열에 대해 5' 위치를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. "역방향 프라이머"는 증폭될 DNA 서열의 다운스트림에 있는 이중가닥 DNA 주형에 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드의 영역을 포함하는 프라이머이다. "다운스트림"은 암호화 가닥과 관련하여 증폭될 DNA 서열에 대해 3' 위치를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다.
PCR에 유용한 임의의 DNA 폴리머라제가 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있다. 시약 및 폴리머라제는 여러 공급처로부터 상업적으로 입수 가능하다.
안정성 및/또는 번역 효율을 촉진하는 능력을 갖는 화학 구조도 사용될 수 있다. 구현예에서 RNA는 5' 및 3' UTR을 갖는다. 일부 구현예에서, 5' UTR은 1 내지 3000개 뉴클레오티드 길이이다. 암호화 영역에 부가되는 5' 및 3' UTR 서열의 길이는 UTR의 상이한 영역에 어닐링하는 PCR용 프라이머의 설계를 비롯한(이에 한정되지 않음) 상이한 방법에 의해 변경될 수 있다. 이러한 접근법을 사용하여, 당업자는 전사된 RNA의 형질감염 후 최적 번역 효율을 달성하는 데 필요한 5' 및 3' UTR 길이를 수정할 수 있다.
5' 및 3' UTR은 관심 핵산에 대한 천연, 내인성 5' 및 3' UTR일 수 있다. 대안적으로, 관심 핵산에 내인성이 아닌 UTR 서열이 정방향 및 역방향 프라이머에 해당 UTR 서열을 통합시켜 부가되거나 주형의 임의의 다른 변형에 의해 부가될 수 있다. 관심 핵산에 내인성이 아닌 UTR 서열의 사용은 RNA의 안정성 및/또는 번역 효율을 수정하는 데 유용할 수 있다. 예를 들어, 3' UTR 서열의 AU-풍부 요소는 mRNA의 안정성을 감소시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 3' UTR은 당업계에 잘 알려진 UTR의 특성에 기초하여 전사 RNA의 안정성을 증가시키도록 선택되거나 설계될 수 있다.
일부 구현예에서, 5' UTR은 내인성 핵산의 Kozak 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 관심 핵산에 내인성이 아닌 5' UTR이 전술한 바와 같이 PCR에 의해 부가되는 경우, 5' UTR 서열을 부가함으로써 컨센서스 Kozak 서열이 재설계될 수 있다. Kozak 서열은 일부 RNA 전사체의 번역 효율을 증가시킬 수 있지만, 모든 RNA에 대해 효율적인 번역을 가능하게 하기 위해 필요한 것으로 보이지는 않는다. 많은 mRNA에 있어서 Kozak 서열에 대한 요건은 당업계에 알려져 있다. 다른 구현예에서, 5' UTR은 RNA 게놈이 세포에서 안정한 RNA 바이러스의 5' UTR일 수 있다. 다른 구현예에서, mRNA의 엑소뉴클레아제 분해를 지연시키기 위해 다양한 뉴클레오티드 유사체가 3' 또는 5' UTR에 사용될 수 있다.
유전자 클로닝 필요 없이 DNA 주형으로부터 RNA 합성을 가능하게 하기 위해, 전사될 서열의 업스트림 DNA 주형에 전사 프로모터가 부착되어야 한다. RNA 폴리머라제에 대한 프로모터로서 기능하는 서열이 정방향 프라이머의 5' 말단에 부가되는 경우, RNA 폴리머라제 프로모터는 전사될 오픈 리딩 프레임의 업스트림 PCR 생성물에 통합된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같은 T7 폴리머라제 프로모터이다. 다른 유용한 프로모터는 T3 및 SP6 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함하나 이에 한정되지 않는다. T7, T3, 및 SP6 프로모터에 대한 컨센서스 뉴클레오티드 서열은 당업계에 알려져 있다.
일부 구현예에서, mRNA는 세포에서 리보솜 결합, 번역의 개시, 및 mRNA의 안정성을 결정하는 5' 말단 상의 캡 및 3' 폴리(A) 테일 둘 다를 갖는다. 원형 DNA 주형, 예를 들어 플라스미드 DNA에서, RNA 폴리머라제는 진핵 세포에서의 발현에 적합하지 않은 긴 콘카타머 생성물을 생성한다. 3' UTR의 말단에서 선형화된 플라스미드 DNA의 전사는 전사 후에 폴리아데닐화되는 경우에도 진핵 형질감염에 효과적이지 않은 정상 크기의 mRNA를 초래한다.
선형 DNA 주형에서, 파지 T7 RNA 폴리머라제는 주형의 마지막 염기를 넘어서 전사체의 3' 말단을 연장할 수 있다(문헌[Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003)]).
폴리(A)/T 스트레치를 DNA 주형에 통합하는 통상적인 방법은 분자 클로닝이다. 그러나, 플라스미드 DNA에 통합된 폴리(A)/T 서열은 플라스미드 불안정성을 유발할 수 있으며, 이는 박테리아 세포에서 얻은 플라스미드 DNA 주형이 종종 결실 및 기타 이상으로 심하게 오염되는 이유이다. 이로 인해 클로닝 절차가 어려워지고 시간이 많이 소요될 뿐만 아니라 신뢰할 수 없는 경우가 많다. 이러한 이유 때문에, 클로닝 없이 폴리(A)/T 3' 스트레치로 DNA 주형을 구성할 수 있는 방법이 매우 바람직하다.
전사 DNA 주형의 폴리(A)/T 분절은 100T 테일(서열번호 31)과 같은 폴리T 테일(크기는 50~5000T일 수 있음(서열번호 32))을 포함하는 역방향 프라이머를 사용하여 PCR 중에 생성되거나, DNA 라이게이션 또는 시험관내 재조합을 비롯한(이에 한정되지 않음) 임의의 다른 방법에 의해 PCR 후에 생성될 수 있다. 폴리(A) 테일은 또한 RNA에 안정성을 제공하고 RNA 분해를 감소시킨다. 일반적으로, 폴리(A) 테일의 길이는 전사된 RNA의 안정성과 양(+)의 상관관계가 있다. 일부 구현예에서, 폴리(A) 테일은 100 내지 5000개 아데노신(예를 들어, 서열번호 33)이다.
RNA의 폴리(A) 테일은 E. 콜라이 폴리(A) 폴리머라제(E-PAP)와 같은 폴리(A) 폴리머라제를 사용하여 시험관내 전사 후 추가로 연장될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리(A) 테일의 길이를 100개 뉴클레오티드에서 300 내지 400개 뉴클레오티드(서열번호 34)로 증가시키면 RNA의 번역 효율은 약 2배 증가된다. 또한, 3' 말단에 다른 화학기를 부착하면 mRNA 안정성을 증가시킬 수 있다. 이러한 부착은 변형/인공 뉴클레오티드, 압타머, 및 다른 화합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리(A) 폴리머라제를 사용하여 폴리(A) 테일에 ATP 유사체를 통합할 수 있다. ATP 유사체는 RNA의 안정성을 더욱 증가시킬 수 있다.
5' 캡이 또한 RNA 분자에 안정성을 제공한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 RNA는 5' 캡을 포함한다. 5' 캡은 당업계에 알려지고 본원에 설명된 기술을 이용해 제공된다(문헌[Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)]).
본원에 개시된 방법에 의해 생성된 RNA는 또한 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열을 포함할 수 있다. IRES 서열은 mRNA에 대한 캡-독립적 리보솜 결합을 개시하고 번역 개시를 촉진하는 임의의 바이러스 서열, 염색체 서열, 또는 인공적 설계 서열일 수 있다. 당, 펩티드, 지질, 단백질, 항산화제, 및 계면활성제와 같이 세포 투과성 및 생존능을 촉진하는 인자를 함유할 수 있는, 세포 전기천공에 적합한 임의의 용질이 포함될 수 있다.
RNA는 여러 다양한 방법, 예를 들어 전기천공(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems, Cologne, Germany), ECM 830(BTX)(Harvard Instruments, Boston, Mass.) 또는 Gene Pulser II(BioRad, Denver, Colo.), Multiporator(Eppendort, Hamburg Germany)), 리포펙션을 이용한 양이온성 리포솜 매개 형질감염, 폴리머 캡슐화, 펩티드 매개 형질감염, 또는 "유전자 총"과 같은 생물학적 입자 전달 시스템을 비롯한(이에 한정되지 않음) 상업적으로 이용 가능한 방법 중 임의의 방법을 사용하여 표적 세포 내로 도입될 수 있다(예를 들어, 문헌[Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)] 참조).
비바이러스성 전달 방법
일부 구현예에서, 본원에 기술된 CAR을 암호화하는 핵산을 세포 또는 조직 또는 대상체 내로 전달하기 위해 비바이러스성 방법이 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 비바이러스성 방법은 트랜스포존(전위 요소라고도 함)의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 트랜스포존은 게놈 내 위치에 자신을 삽입할 수 있는 DNA 조각, 예를 들어 자기복제가 가능하고 자신의 카피를 게놈에 삽입할 수 있는 DNA 조각, 또는 보다 긴 핵산에서 스플라이싱되어 게놈 내 다른 위치에 삽입될 수 있는 DNA 조각이다. 예를 들어, 트랜스포존은 전위를 위한 유전자를 플랭킹하는 역위 반복으로 이루어진 DNA 서열을 포함한다.
트랜스포존을 이용한 예시적인 핵산 전달 방법은 슬리핑 뷰티 트랜스포존 시스템(SBTS) 및 피기백(piggyBacTM)(PB) 트랜스포존 시스템을 포함한다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 문헌[Aronovich et al. Hum. Mol. Genet. 20.R1(2011):R14-20; Singh et al. Cancer Res. 15(2008):2961-2971; Huang et al. Mol. Ther. 16(2008):580-589; Grabundzija et al. Mol. Ther. 18(2010):1200-1209; Kebriaei et al. Blood. 122.21(2013):166; Williams. Molecular Therapy 16.9(2008):1515-16; Bell et al. Nat. Protoc. 2.12(2007):3153-65; 및 Ding et al. Cell. 122.3(2005):473-83] 참조.
SBTS는 다음의 2가지 구성요소를 포함한다: 1) 이식유전자를 함유하는 트랜스포존 및 2) 트랜스포사제 효소의 공급원. 트랜스포사제는 트랜스포존을 운반체 플라스미드(또는 다른 공여체 DNA)로부터 숙주 세포 염색체/게놈과 같은 표적 DNA로 전위시킬 수 있다. 예를 들어 트랜스포사제는 운반체 플라스미드/공여체 DNA에 결합하고, 플라스미드로부터 트랜스포존(이식유전자(들) 포함)을 절단하고, 이를 숙주 세포의 게놈에 삽입한다. 예를 들어, 상기 문헌[Aronovich et al.] 참조.
예시적인 트랜스포존은 pT2 기반 트랜스포존을 포함한다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 문헌[Grabundzija et al. Nucleic Acids Res. 41.3(2013):1829-47; 및 Singh et al. Cancer Res. 68.8(2008): 2961-2971] 참조. 예시적인 트랜스포사제는 Tc1/마리너형 트랜스포사제, 예를 들어 SB10 트랜스포사제 또는 SB11 트랜스포사제(예를 들어, 사이토메갈로바이러스 프로모터로부터 발현될 수 있는 과활성 트랜스포사제)를 포함한다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 문헌[Aronovich et al.; Kebriaei et al.; 및 Grabundzija et al.] 참조.
SBTS를 사용하면 이식유전자, 예를 들어 본원에 기술된 CAR을 암호화하는 핵산의 효율적인 통합 및 발현이 가능하다. 예를 들어 SBTS와 같은 트랜스포존 시스템을 사용하여 본원에 기술된 CAR을 안정적으로 발현하는 세포, 예를 들어 T세포 또는 NK세포를 생성하는 방법이 본원에 제공된다.
본원에 기술된 방법에 따르면, 일부 구현예에서, SBTS 구성요소를 포함하는 하나 이상의 핵산, 예를 들어 플라스미드가 세포(예를 들어, T세포 또는 NK세포)에 전달된다. 예를 들어 핵산(들)은 핵산(예를 들어, 플라스미드 DNA) 전달의 표준 방법, 예를 들어 본원에 기술된 방법, 예를 들어 전기천공, 형질감염, 또는 리포펙션에 의해 전달된다. 일부 구현예에서, 핵산은 이식유전자, 예를 들어 본원에 기술된 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 트랜스포존을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 이식유전자(예를 들어, 본원에 기술된 CAR을 암호화하는 핵산)뿐만 아니라 트랜스포사제 효소를 암호화하는 핵산 서열도 포함하는 트랜스포존을 포함한다. 다른 구현예에서, 2종의 핵산을 갖는 시스템, 예를 들어 이중 플라스미드 시스템(예를 들어, 제1 플라스미드는 이식유전자를 포함하는 트랜스포존을 포함하고, 제2 플라스미드는 트랜스포사제 효소를 암호화하는 핵산 서열을 포함함)이 제공된다. 예를 들어, 제1 및 제2 핵산은 숙주 세포 내로 공동 전달된다.
일부 구현예에서, SBTS를 이용한 유전자 삽입과 뉴클레아제(예를 들어, 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), CRISPR/Cas 시스템, 또는 조작된 메가뉴클레아제 재조작된 호밍 엔도뉴클레아제)를 이용한 유전자 편집의 조합을 사용하여, 본원에 기술된 CAR을 발현하는 세포, 예를 들어 T세포 또는 NK세포가 생성된다.
일부 구현예에서, 비바이러스성 전달 방법을 사용하면 세포, 예를 들어 T세포 또는 NK세포의 재프로그래밍, 및 대상체 내로의 세포의 직접 주입이 가능하다. 비바이러스 벡터의 장점은 환자 집단을 충족시키는 데 필요한 충분한 양의 생산에 대한 용이성 및 상대적으로 낮은 비용, 보관 중의 안정성, 및 면역원성의 결여를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
제조/생산 방법
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 세포(예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 면역 이펙터 세포) 처치 후 T세포 고갈제를 투여하여 CAR-발현 세포(예를 들어, CD19CAR-발현 세포)를 감소시키는(예를 들어, 고갈시키는) 단계를 추가로 포함한다. 이러한 T세포 고갈제는 독성을 완화하기 위해 CAR-발현 세포(예를 들어, CD19CAR-발현 세포)를 효과적으로 고갈시키는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, CAR-발현 세포를 본원에 기술된 방법에 따라 제조하였고, 예를 들어 본원의 방법에 따라 (예를 들어, 형질감염 또는 형질도입 전 또는 후에) 분석하였다.
일부 구현예에서, T세포 고갈제는 세포, 예를 들어 본원에 기술된 면역 이펙터 세포 집단의 투여 1, 2, 3, 4, 또는 5주 후에 투여된다.
일부 구현예에서, T세포 고갈제는 예를 들어 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 및/또는 보체 유도 세포 사멸을 유도하여, CAR-발현 세포를 고갈시키는 제제이다. 예를 들어, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 세포 사멸, 예를 들어 ADCC 또는 보체 유도 세포 사멸을 유도할 수 있는 분자에 의해 인식되는 항원(예를 들어, 표적 항원)을 또한 발현할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 항체 또는 항체 단편에 의해 표적화될 수 있는 표적 단백질(예를 들어, 수용체)을 또한 발현할 수 있다. 이러한 표적 단백질의 예는 EpCAM, VEGFR, 인테그린(예를 들어, 엔테그린 ανβ3, α4, αΙ3/4β3, α4β7, α5β1, ανβ3, αν), TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원(예를 들어, TRAIL-R1, TRAIL-R2), PDGF 수용체, 인터페론 수용체, 폴레이트 수용체, GPNMB, ICAM-1, HLA-DR, CEA, CA-125, MUC1, TAG-72, IL-6 수용체, 5T4, GD2, GD3, CD2, CD3, CD4, CD5, CD11, CD11a/LFA-1, CD15, CD18/ITGB2, CD19, CD20, CD22, CD23/lgE 수용체, CD25, CD28, CD30, CD33, CD38, CD40, CD41, CD44, CD51, CD52, CD62L, CD74, CD80, CD125, CD147/바시진, CD152/CTLA-4, CD154/CD40L, CD195/CCR5, CD319/SLAMF7, 및 EGFR, 및 이들의 절단된 버전(예를 들어, 하나 이상의 세포외 에피토프를 보존하지만 세포질 도메인 내에 하나 이상의 영역이 결여된 버전)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, CAR-발현 세포는 CAR과 표적 단백질을 공동 발현하고, 예를 들어 표적 단백질을 자연적으로 발현하거나, 또는 표적 단백질을 발현하도록 조작된다. 예를 들어, 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포 집단은 CAR 핵산(예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 CAR 핵산)을 포함하는 핵산(예를 들어, 벡터), 및 표적 단백질을 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, T세포 고갈제는 CD52 억제제, 예를 들어 항-CD52 항체 분자, 예를 들어 알렘투주무맙이다.
다른 구현예에서, 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포 집단은 본원에 기술된 바와 같은 CAR 분자(예를 들어, CD19CAR), 및 T세포 고갈제에 의해 인식되는 표적 단백질을 발현한다. 일부 구현예에서, 표적 단백질은 CD20이다. 표적 단백질이 CD20인 구현예에서, T세포 고갈제는 항-CD20 항체, 예를 들어 리툭시맙이다.
전술한 방법 중 임의의 방법의 추가 구현예에서, 방법은 세포, 예를 들어 조혈 줄기세포, 또는 골수를 포유류 내로 이식하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 세포 이식 전에 포유류를 컨디셔닝하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 CAR 핵산 또는 폴리펩티드, 예를 들어 CD19 CAR 핵산 또는 폴리펩티드를 포함하는 세포의 유효량을 포유류에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 이식은 줄기세포 이식, 예를 들어 조혈 줄기세포 이식, 또는 골수 이식이다. 다른 구현예에서, 세포 이식 전에 대상체를 컨디셔닝하는 것은 대상체에서 표적-발현 세포, 예를 들어 CD19-발현 정상 세포 또는 CD19-발현 암세포의 수를 감소시키는 것을 포함한다.
용리(Elutriation)
일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 원치 않는 세포, 예를 들어 단핵구 및 모세포를 제거하여 CAR 발현에 적합한 목적하는 면역 이펙터 세포의 강화를 개선시키는 용리 방법을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 용리 방법은 이전에 동결된 샘플, 예를 들어 해동된 샘플로부터의 CAR 발현에 적합한 목적하는 면역 이펙터 세포의 강화를 위해 최적화되어 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 용리 방법은 당업계에 알려진 용리 프로토콜로부터 수집된 세포의 제조와 비교하여 개선된 순도를 갖는 세포의 제조를 제공한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 용리 방법은 특정 등장액(예를 들어, PBS)으로 희석함으로써 출발 샘플, 예를 들어 세포 샘플, 예를 들어 해동된 세포 샘플의 최적화된 점도를 이용하는 것, 및 용리 장치에 의해 수집된 각 분획에 대한 유속과 수집 부피의 최적화된 조합을 이용하는 것을 포함한다. 본 발명에 적용될 수 있는 예시적인 용리 방법은 전문이 본원에 참조로 포함되는 WO 2017/117112의 48~51 페이지에 기술되어 있다.
밀도 구배 원심분리
입양 세포 치료제의 제조는 말초혈액 성분채집 출발물질에 존재하는 혈액 세포 및 혈액 요소의 복합적 혼합물로부터 벗어나 목적하는 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포를 처리하는 것을 필요로 한다. 말초혈액 유래 림프구 샘플은 Ficoll 용액을 통한 밀도 구배 원심분리를 사용하여 성공적으로 단리되었다. 그러나 Ficoll은 임상 용도에 적합하지 않기 때문에, Ficoll은 치료 용도로 세포를 단리하는 데 바람직한 시약이 아니다. 또한, Ficoll에는 세포에 독성 가능성이 있는 글리콜이 함유되어 있다. 또한, 동결보존 후 해동된 성분채집 생성물의 Ficoll 밀도 구배 원심분리는, 예를 들어 본원의 실시예에 기술된 바와 같이, 최적이 아닌 T세포 생성물을 생성한다. 예를 들어, Ficoll 용액을 통한 밀도 구배 원심분리에 의해 단리된 세포 제제에서 비-T세포, 특히 바람직하지 않은 B세포, 모세포, 및 단핵구의 상대적인 증가와 함께 최종 생성물에서의 T세포 소실이 관찰되었다.
이론에 구애되고자 함이 없이, 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T세포는 동결보존 중에 탈수되어 신선한 세포보다 밀도가 높아지는 것으로 여겨진다. 이론에 구애되고자 함이 없이, 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T세포는 다른 혈액 세포보다 더 오래 높은 밀도를 유지하므로, 다른 세포와 비교하여 Ficoll 밀도 구배 분리 중에 더 용이하게 소실되는 것으로 또한 여겨진다. 따라서, 이론에 구애되고자 함이 없이, Ficoll보다 더 큰 밀도를 갖는 배지는 Ficoll 또는 Ficoll과 동일한 밀도(예를 들어, 1.077 g/ml)를 갖는 다른 배지와 비교하여, 목적하는 면역 이펙터 세포의 개선된 단리를 제공하는 것으로 여겨진다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 밀도 구배 원심분리 방법은 요오딕사놀을 포함하는 밀도 구배 배지의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 밀도 구배 배지는 물 중 약 60%의 요오딕사놀을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 밀도 구배 원심분리 방법은 Ficoll보다 더 큰 밀도를 갖는 밀도 구배 배지의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 밀도 구배 원심분리 방법은 1.077 g/mL 초과, 예를 들어 1.077 g/mL 초과, 1.1 g/mL 초과, 1.15 g/mL 초과, 1.2 g/mL 초과, 1.25 g/mL 초과, 1.3 g/mL 초과, 1.31 g/mL 초과의 밀도를 갖는 밀도 구배 배지의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 밀도 구배 배지는 약 1.32 g/mL의 밀도를 갖는다.
밀도 구배 원심분리의 추가 구현예는 전문이 본원에 참조로 포함되는 WO 2017/117112의 51~53 페이지에 기술되어 있다.
선택에 의한 강화
CAR 발현에 적합한 목적하는 면역 이펙터 세포의 강화를 개선하기 위한 특정 세포의 선택 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 선택은 양성 선택, 예를 들어 목적하는 면역 이펙터 세포에 대한 선택을 포함한다. 일부 구현예에서, 선택은 음성 선택, 예를 들어 원치 않는 세포에 대한 선택, 예를 들어 원치 않는 세포의 제거를 포함한다. 구현예에서, 본원에 기술된 양성 또는 음성 선택 방법은 예를 들어, 관류(flow-through) 장치, 예를 들어 본원에 기술된 관류 장치를 사용하여 유동 조건하에 수행된다. 예시적인 양성 및 음성 선택은 전문이 본원에 참조로 포함되는 WO 2017/117112의 53~57 페이지에 기술되어 있다. 선택 방법은 CAR 발현에 적합한 목적하는 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T세포의 세포 제제를 추가로 강화하기 위해, 예를 들어 세포 처리 시스템이라고도 하는 관류 장치를 사용하여 유동 조건하에 수행될 수 있다. 예시적인 관류 장치는 전문이 본원에 참조로 포함되는 WO 2017/117112의 57~70 페이지에 기술되어 있다. 예시적인 세포 분리 및 비드제거 방법은 전문이 본원에 참조로 포함되는 WO 2017/117112의 70~78 페이지에 기술되어 있다.
선택 절차는 WO 2017/117112의 57~70 페이지에 기술된 것에 한정되지 않는다. 컬럼 기술(CliniMACS® Plus 또는 CliniMACS® Prodigy®)과 조합한 CD19, CD14, 및 CD26 Miltenyi 비드를 이용한 원치 않는 세포의 제거를 통한 음성 T세포 선택, 또는 CD4 및 CD8 Miltenyi 비드와 컬럼 기술(CliniMACS® Plus 또는 CliniMACS® Prodigy®)의 조합을 이용한 양성 T세포 선택이 사용될 수 있다. 대안적으로, 방출 가능한 CD3 비드(GE Healthcare)를 이용한 무컬럼(column-free) 기술이 사용될 수 있다.
또한, ThermoGenesis X 시리즈 장치와 같은 무비드(bead-free) 기술도 활용될 수 있다.
임상적 적용
본원의 모든 프로세스는 임상우수원료의약품제조관리기준(clinical good manufacturing practice, cGMP)에 따라 수행될 수 있다.
프로세스는 특히 제조 프로세스의 시작시 출발 원료물질(특히 세포)의 수집 중, 뿐만 아니라, 세포 요법을 위한 세포의 선택 또는 증식을 위한 제조 프로세스 중에도 세포 정제, 강화, 수확, 세척, 농축, 또는 세포 배지 교체에 사용될 수 있다.
세포는 임의의 복수의 세포를 포함할 수 있다. 세포는 동일 세포 유형이거나 혼합 세포 유형일 수 있다. 또한, 세포는 하나의 공여체, 예컨대 자가 공여체 또는 세포 요법을 위한 단일 동종이계 공여체로부터 유래할 수 있다. 세포는 예를 들어, 백혈구 성분채집 또는 성분채집에 의해 환자로부터 수득될 수 있다. 세포는 T세포를 포함할 수 있고, 예를 들어 50% 초과의 T세포, 60% 초과의 T세포, 70% 초과의 T세포, 80% 초과의 T세포, 또는 90%의 T세포를 갖는 집단을 포함할 수 있다.
선택 프로세스는 배양 및 증식 전에 세포를 선택하는 데 특히 유용할 수 있다. 예를 들어, 항-CD3 및/또는 항 CD28로 코팅된 상자성 입자를 사용하여 증식을 위해 또는 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 기타 단백질을 암호화하는 핵산의 도입을 위해 T세포를 선택할 수 있다. 이러한 프로세스는 급성 림프모구성 백혈병(ALL)의 치료를 위한 CTL019 T세포를 생산하는 데 사용된다.
본원에 개시된 비드제거 프로세스 및 모듈은 세포 요법을 위한 세포의 제조(예를 들어, 배양 및 증식 전 또는 후 세포의 정제)에 특히 유용할 수 있다. 예를 들어, 항-CD3 및/또는 항 CD28 항체로 코팅된 상자성 입자를 사용하여, T세포, 예를 들어 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 기타 단백질을 암호화하는 핵산의 도입에 의해 변형되거나 변형될 T세포를 선택적으로 증식시켜 CAR이 T세포에 의해 발현되도록 할 수 있다. 이러한 T세포의 제조 중에, 비드제거 프로세스 또는 모듈은 상자성 입자로부터 T세포를 분리하는 데 사용될 수 있다. 이러한 비드제거 프로세스 또는 모듈은 예를 들어, 급성 림프모구성 백혈병(ALL)의 치료를 위한 CTL019 T세포를 생산하는 데 사용된다.
예로서 본원에 설명된 이러한 하나의 프로세스에서, 세포, 예를 들어 T세포는 성분채집(예를 들어, 백혈구 성분채집)을 통해 공여체(예를 들어, 자가 키메라 항원 수용체 T세포 생성물로 치료될 환자)로부터 수집된다. 그 후, 수집된 세포는 임의로 예를 들어, 용리 단계에 의해, 또는 표적 세포(예를 들어, T세포)의 양성 또는 음성 선택을 통해, 정제될 수 있다. 그 후, 상자성 입자, 예를 들어 항-CD3/항-CD28 코팅된 상자성 입자를 세포의 집단에 첨가하여 T세포를 증식시킬 수 있다. 이러한 프로세스는 또한, 하나 이상의 목적하는 단백질, 예를 들어 CAR, 예를 들어 CD19를 표적화하는 CAR을 암호화하는 핵산이 세포 내로 도입되는 형질도입 단계를 포함할 수 있다. 핵산은 렌티바이러스 벡터에 도입될 수 있다. 그 후, 세포, 예를 들어 렌티바이러스로 형질도입된 세포는 예를 들어, 적합한 배지의 존재하에, 일정 기간 동안, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10일 이상 증식될 수 있다. 증식 후, 본원에 기술된 비드제거 프로세스/모듈은 상자성 입자로부터 목적하는 T세포를 분리시키는 데 사용될 수 있다. 이러한 프로세스는 본 개시의 프로세스에 따른 하나 이상의 비드제거 단계를 포함할 수 있다. 그 후, 비드제거된 세포는 환자에게 투여하기 위해 제형화될 수 있다. CAR T세포 및 이의 제조의 예는 예를 들어, WO2012/079000에 추가로 기술되어 있으며, 이는 본원에 그 전체가 참조로 포함된다. 본 개시의 시스템 및 방법은 WO2012/079000에 기술되거나 이와 관련된 임의의 세포 분리/정제/비드제거 프로세스에 이용될 수 있다. 추가의 CAR T 제조 프로세스는 예를 들어, WO2016109410 및 WO2017117112에 기술되어 있으며, 이들은 본원에 그 전체가 참조로 포함된다.
본원의 시스템 및 방법은 종래의 시스템 및 방법과 비교하여 더 적은 수의 바람직한 세포를 쓰고, 세포 외상을 덜 초래하며, 화학 제제에 적게 노출시키거나 노출시키지 않고도 세포로부터 자성 및 임의의 상자성 입자를 더욱 신뢰할 수 있게 제거하여, 다른 세포 요법 제품에 유사하게 도움이 될 수 있다.
본 개시의 예시적인 구현예만이 위에 구체적으로 기술되어 있지만, 본 개시의 사상 및 의도한 범위로부터 벗어나지 않고도 이러한 예의 수정 및 변형이 가능함이 인정될 것이다. 예를 들어, 자성 모듈 및 이를 함유하는 시스템이 배열되어 기술된 것들 이외의 다양한 구성에 사용될 수 있다. 또한, 비자성 모듈도 활용될 수 있다. 또한, 이러한 시스템 및 방법은 본원에 구체적으로 기술되지 않은 추가의 구성요소 및 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 방법은 기포를 제거하고 세포 현탁액 또는 완충액 이동에 대한 저항을 감소시키기 위해 구성요소에 먼저 유체를 도입하는 프라이밍을 포함할 수 있다. 나아가, 구현예는 본원에 기술된 방법과 함께 사용하기 위해 본원에 기술된 시스템의 일부만을 포함할 수 있다. 예를 들어, 구현예는 세포 생성물을 생산하기 위해 세포를 분리하거나 비드제거할 수 있는 완전한 시스템을 형성하기 위해 일회용이 아닌 장비 내에서 사용 가능한 일회용 모듈, 호스 등에 관한 것일 수 있다.
본 발명과 조합할 수 있는 추가의 제조 방법 및 프로세스가 당해 분야에 기술된 바 있다. 예를 들어, WO 2017/117112의 86~91페이지는 개선된 세척 단계 및 개선된 제조 프로세스를 기술하고 있다.
면역 이펙터 세포의 공급원
이 섹션은 목적하는 면역 이펙터 세포를 포함하는 투입 샘플을 수득하고, 목적하는 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T세포를 단리 및 처리하고, 원치 않는 물질, 예를 들어 원치 않는 세포를 제거하는 추가의 방법 또는 단계를 제공한다. 이 섹션에 기술된 추가의 방법 또는 단계는 이전의 섹션에서 기술된 용리, 밀도 구배 원심분리, 유동 조건하에서의 선택, 또는 개선된 세척 단계 중 임의의 것과 조합하여 사용될 수 있다.
세포, 예를 들어 T세포 또는 자연살해(NK) 세포의 공급원은 대상체로부터 수득될 수 있다. 대상체의 예는 인간, 원숭이, 침팬지, 개, 고양이, 마우스, 래트, 및 이의 유전자이식 종을 포함한다. T세포는 말초혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위의 조직, 복수, 흉막 삼출액, 비장 조직, 및 종양을 비롯한 여러 공급원으로부터 수득될 수 있다.
본 개시의 일부 구현예에서, 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T세포는 당업자에게 알려진 여러 기술, 및 본원에 개시된 임의의 방법을 이의 단계들을 임의로 조합하여 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포는 성분채집에 의해 수득된다. 성분채집 생성물은 일반적으로 T세포, 단핵구, 과립구, B세포를 포함한 림프구, 다른 유핵 백혈구, 적혈구, 및 혈소판을 함유한다. 일부 구현예에서, 성분채집에 의해 수집된 세포를 세척하여 혈장 분획을 제거하고, 임의로 후속 처리 단계를 위해 세포를 적절한 완충액 또는 배지에 넣을 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척된다. 일부 구현예에서, 세척액에는 칼슘이 없고, 마그네슘이 없을 수 있거나, 전부는 아니지만 많은 2가 양이온이 없을 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 본원에 기술된 개선된 세척 단계를 이용하여 세척된다.
칼슘 부재하의 초기 활성화 단계는 활성화를 확대할 수 있다. 당업자가 용이하게 인식하는 바와 같이, 당업자가 용이하게 이해할 수 있는 바와 같이, 세척 단계는 당업자에게 알려진 방법에 의해, 예컨대 반자동 "관류" 원심분리기(예를 들어, Cobe 2991 세포 처리기, Baxter CytoMateTM, 또는 Haemonetics Cell Saver 5), Haemonetics Cell Saver Elite(GE Healthcare Sepax 또는 Sefia), 또는 스피닝 막 여과 기술을 활용하는 장치(Fresenius Kabi LOVO)를 제조업체의 지침에 따라 사용함으로써 달성될 수 있다. 세척 후, 세포는 다양한 생체적합성 완충액, 예를 들어 Ca-무함유, Mg-무함유 PBS, PlasmaLyte A, 인간 혈청 알부민(HSA)이 보충된 PBS-EDTA, 또는 완충액이 있거나 없는 기타 식염수에 재현탁될 수 있다. 대안적으로, 성분채집 샘플의 바람직하지 않은 성분을 제거하고, 세포를 배양 배지에 직접 재현탁시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 적혈구를 용해하고, 예를 들어 PERCOLLTM 구배를 통한 원심분리에 의해 또는 역류 원심분리 용리에 의해 단핵구를 고갈시켜 말초혈액 림프구로부터 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T세포가 단리된다.
본원에 기술된 방법은 예를 들어 본원에 기술된, 예를 들어 음성 선택 기술을 이용한, 예를 들어 T 조절 세포-고갈 집단, 예를 들어 CD25+ 고갈 세포 또는 CD25high 고갈 세포인 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T세포의 특정 하위집단의 선택을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, T 조절 고갈 세포의 집단은 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만의 CD25+ 세포 또는 CD25high 세포를 함유한다.
일부 구현예에서, T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ T세포 또는 CD25high T세포는 항-CD25 항체 또는 이의 단편, 또는 CD25 결합 리간드, 예를 들어 IL-2를 사용하여 집단으로부터 제거된다. 일부 구현예에서, 항-CD25 항체 또는 이의 단편, 또는 CD25 결합 리간드는 기질(예를 들어, 비드)에 접합되거나, 달리 기질(예를 들어, 비드)에 코팅된다. 일부 구현예에서, 항-CD25 항체 또는 이의 단편은 본원에 기술된 바와 같은 기질에 접합된다.
일부 구현예에서, T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ T세포 또는 CD25high T세포는 MiltenyiTM의 CD25 고갈 시약을 사용하여 집단으로부터 제거된다. 일부 구현예에서, 세포 대 CD25 고갈 시약의 비는 1e7개 세포 대 20 μL, 또는 1e7개 세포 대 15 μL, 또는 1e7개 세포 대 10 μL, 또는 1e7개 세포 대 5 μL, 또는 1e7개 세포 대 2.5 μL, 또는 1e7개 세포 대 1.25 μL이다. 일부 구현예에서, 예를 들어 T 조절 세포의 경우, 5억 개 초과의 세포/ml가 사용된다. 일부 구현예에서, 6억, 7억, 8억, 또는 9억 개 세포/ml의 세포 농도가 사용된다.
일부 구현예에서, 고갈될 면역 이펙터 세포의 집단은 약 6 x 109개의 CD25+ T세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 고갈될 면역 이펙터 세포의 집단은 약 1 x 109 내지 1x 1010개, 및 그 사이의 임의의 정수값의 CD25+ T세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 생성된 T 조절 고갈 세포의 집단은 2 x 109개 이하의 T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ 세포 또는 CD25high 세포(예를 들어, 1 x 109, 5 x 108, 1 x 108, 5 x 107, 1 x 107개 이하의 T 조절 세포)를 갖는다.
일부 구현예에서, T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ 세포 또는 CD25high 세포는 예를 들어 튜빙 162-01과 같은 고갈 튜빙 세트가 구비된 CliniMAC 시스템을 사용하여 집단으로부터 제거된다. 일부 구현예에서, CliniMAC 시스템은 예를 들어 DEPLETION2.1과 같은 고갈 시스템에서 실행된다.
특정 이론에 구애되고자 함이 없이, 성분채집 전에 또는 CAR-발현세포 생성물의 제조 중에 대상체에서 면역 세포의 음성 조절인자의 수준을 감소시키면(예를 들어, 원치 않는 면역 세포, 예를 들어 Treg 세포의 수를 감소시키면) 대상체의 재발 위험이 현저히 감소된다. 예를 들어, Treg 세포를 고갈시키는 방법은 당업계에 알려져 있다. Treg 세포를 감소시키는 방법은 시클로포스파미드, 항-GITR 항체(본원에 기술된 항-GITR 항체), CD25-고갈, 및 이들의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 제조 방법은 CAR-발현 세포의 제조 전에 Treg 세포의 수를 감소시키는(예를 들어, Treg 세포를 고갈시키는) 단계를 포함한다. 예를 들어, 제조 방법은 샘플, 예를 들어 성분채집 샘플을 항-GITR 항체 및/또는 항-CD25 항체(또는 이의 단편, 또는 CD25 결합 리간드)와 접촉시켜, 예를 들어 CAR-발현 세포(예를 들어, T세포, NK세포) 생성물의 제조 전에 Treg 세포를 고갈시키는 단계를 포함한다.
특정 이론에 구애되고자 함이 없이, 성분채집 전에 또는 CAR-발현세포 생성물의 제조 중에 대상체에서 면역 세포의 음성 조절인자의 수준을 감소시키면(예를 들어, 원치 않는 면역 세포, 예를 들어 Treg 세포의 수를 감소시키면) 대상체의 재발 위험을 줄일 수 있다. 일부 구현예에서, CAR-발현 세포 생성물 제조를 위한 세포의 수집 전에 Treg 세포를 감소시키는 하나 이상의 요법으로 대상체를 사전 처치함으로써, CAR-발현 세포 처치에 대한 대상체 재발 위험이 줄어든다. 일부 구현예에서, Treg 세포를 감소시키는 방법은 시클로포스파미드, 항-GITR 항체, CD25-고갈, 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 대상체에게 투여하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, Treg 세포를 감소시키는 방법은 시클로포스파미드, 항-GITR 항체, CD25-고갈, 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 대상체에게 투여하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 시클로포스파미드, 항-GITR 항체, CD25-고갈, 또는 이들의 조합 중 하나 이상의 투여는 CAR-발현 세포 생성물의 주입 전, 주입 중, 또는 주입 후에 일어날 수 있다. 시클로포스파미드, 항-GITR 항체, CD25-고갈, 또는 이들의 조합 중 하나 이상의 투여는 CAR-발현 세포 생성물의 주입 전, 주입 중, 또는 주입 후에 일어날 수 있다.
일부 구현예에서, 제조 방법은 CAR-발현 세포의 제조 전에 Treg 세포의 수를 감소시키는(예를 들어, Treg 세포를 고갈시키는) 단계를 포함한다. 예를 들어, 제조 방법은 샘플, 예를 들어 성분채집 샘플을 항-GITR 항체 및/또는 항-CD25 항체(또는 이의 단편, 또는 CD25 결합 리간드)와 접촉시켜, 예를 들어 CAR-발현 세포(예를 들어, T세포, NK세포) 생성물의 제조 전에 Treg 세포를 고갈시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR-발현 세포 생성물 제조를 위한 세포의 수집 전에 시클로포스파미드로 대상체를 사전 처치함으로써, CAR-발현 세포 처치(예를 들어, CTL019 처치)에 대한 대상체 재발 위험이 줄어든다. 일부 구현예에서, CAR-발현 세포(예를 들어, T세포 또는 NK세포) 생성물 제조를 위한 세포의 수집 전에 항-GITR 항체로 대상체를 사전 처치함으로써, CAR-발현 세포 처치에 대한 대상체 재발 위험이 줄어든다.
일부 구현예에서, CAR-발현 세포(예컨대, T세포, NK세포) 제조 프로세스는 CAR-발현 세포(예를 들어, T세포, NK세포) 생성물(예를 들어, CTL019 생성물)의 제조 전에 Treg 세포를 고갈시키도록 변형된다. 일부 구현예에서, CD25-고갈은 CAR-발현 세포(예를 들어, T세포, NK세포) 생성물(예를 들어, CTL019 생성물)의 제조 전에 Treg 세포를 고갈시키는 데 사용된다.
일부 구현예에서, 제거될 세포의 집단은 조절 T세포나 종양세포가 아니라, CART 세포의 증식 및/또는 기능에 부정적인 영향을 미치는 세포, 예를 들어 CD14, CD11b, CD33, CD15, 또는 잠재적 면역 억제 세포에 의해 발현되는 다른 마커를 발현하는 세포이다. 일부 구현예에서, 이러한 세포는 조절 T세포 및/또는 종양세포와 동시에, 또는 상기 고갈 이후에, 또는 또 다른 순서로 제거되는 것이 고려된다.
본원에 기술된 방법은 1개 초과의 선택 단계, 예를 들어 1개 초과의 고갈 단계를 포함할 수 있다. 음성 선택에 의한 T세포 집단의 강화는, 예를 들어 음성 선택된 세포에 고유한 표면 마커에 대해 유도된 항체의 조합을 이용하여 달성될 수 있다. 하나의 방법으로는 음성 선택된 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커에 대해 유도된 단클론 항체의 칵테일을 사용하는 유세포 분석 또는 음성 자기 면역부착을 통한 세포 분류 및/또는 선택이 있다. 예를 들어 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 강화하기 위해, 단클론 항체 칵테일은 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체를 포함할 수 있다.
본원에 기술된 방법은 종양 항원, 예를 들어 CD25를 포함하지 않는 종양 항원, 예를 들어 CD19, CD30, CD38, CD123, CD20, CD14, 또는 CD11b를 발현하는 세포를 집단으로부터 제거하여, CAR, 예를 들어 본원에 기술된 CAR의 발현에 적합한 T 조절 고갈, 예를 들어 CD25+ 고갈 및 종양 항원 고갈 세포의 집단을 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 종양 항원 발현 세포는 T 조절, 예를 들어 CD25+ 세포 또는 CD25high 세포와 동시에 제거된다. 예를 들어 항-CD25 항체 또는 이의 단편, 및 항종양 항원 항체 또는 이의 단편은 세포를 제거하는 데 사용될 수 있는 동일한 기질, 예를 들어 비드에 부착될 수 있거나, 항-CD25 항체 또는 이의 단편, 또는 항종양 항원 항체 또는 이의 단편은 개별 비드에 부착될 수 있고, 이들의 혼합물이 세포를 제거하는 데 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ 세포 또는 CD25high 세포의 제거 및 종양 항원 발현 세포의 제거는 순차적이고, 예를 들어 어느 순서로든 발생할 수 있다.
또한, 체크포인트 억제제, 예를 들어 본원에 기술된 체크포인트 억제제를 발현하는 세포, 예를 들어 PD1+ 세포, LAG3+ 세포, 및 TIM3+ 세포 중 하나 이상을 집단으로부터 제거하여, T 조절 고갈, 예를 들어 CD25+ 고갈 세포 및 체크포인트 억제제 고갈 세포, 예를 들어 PD1+, LAG3+, 및/또는 TIM3+ 고갈 세포의 집단을 제공하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 예시적인 체크포인트 억제제는 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM(예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3, 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3(CD276), B7-H4(VTCN1), HVEM(TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, GAL9, 아데노신, 및 TGF(예를 들어, TGF 베타)를 포함한다. 일부 구현예에서, 체크포인트 억제제 발현 세포는 T 조절, 예를 들어 CD25+ 세포 또는 CD25high 세포와 동시에 제거된다. 예를 들어, 항-CD25 항체 또는 이의 단편, 및 항-체크포인트 억제제 항체 또는 이의 단편은 세포를 제거하는 데 사용될 수 있는 동일한 비드에 부착될 수 있거나, 항-CD25 항체 또는 이의 단편, 및 항-체크포인트 억제제 항체 또는 이의 단편은 개별 비드에 부착될 수 있고, 이들의 혼합물이 세포를 제거하는 데 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ 세포 또는 CD25high 세포의 제거 및 체크포인트 억제제 발현 세포의 제거는 순차적이고, 예를 들어 어느 순서로든 발생할 수 있다.
본원에 기술된 방법은 양성 선택 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, T세포는 목적하는 T세포의 양성 선택에 충분한 기간 동안 항-CD3/항-CD28(예를 들어, 3x28)-접합 비드, 예컨대 Dynabeads® M-450 CD3/CD28 T와 함께 인큐베이션함으로써 단리될 수 있다. 일부 구현예에서, 기간은 약 30분이다. 일부 구현예에서, 기간은 30분 내지 36시간 이상 및 그 사이의 모든 정수값의 범위이다. 일부 구현예에서, 기간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6시간이다. 일부 구현예에서, 기간은 10 내지 24시간, 예를 들어 24시간이다. 다른 세포 유형에 비해 T세포가 거의 없는 임의의 상황에서, 예컨대 종양 조직 또는 면역손상 개체로부터 종양 침윤 림프구(TIL)를 단리하는 데 있어서, T세포를 단리하기 위해 보다 긴 인큐베이션 시간이 사용될 수 있다. 또한, 보다 긴 인큐베이션 시간의 사용은 CD8+ T세포의 포획 효율을 증가시킬 수 있다. 따라서, T세포가 CD3/CD28 비드에 결합할 수 있는 시간을 단순히 단축하거나 연장하고/하거나, (본원에 추가로 기재된 바와 같이) T세포에 대한 비드의 비를 증가 또는 감소시킴으로써, T세포의 하위집단을 우선적으로 배양 개시 시점 또는 프로세스 중 다른 시점에 그에 대해 또는 그에 반해 선택할 수 있다. 추가로, 비드 또는 다른 표면 상의 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체의 비를 증가 또는 감소시킴으로써, T세포의 하위집단을 우선적으로 배양 개시 시점 또는 다른 원하는 시점에 그에 대해 또는 그에 반해 선택할 수 있다.
일부 구현예에서, IFN-γ, TNFα, IL-17A, IL-2, IL-3, IL-4, GM-CSF, IL-10, IL-13, 그랜자임 B, 및 퍼포린, 또는 다른 적절한 분자, 예를 들어 다른 사이토카인 중 하나 이상을 발현하는 T세포 집단이 선택될 수 있다. 세포 발현에 대한 스크리닝 방법은, 예를 들어 PCT 공개 WO 2013/126712호에 기술된 방법에 의해 결정될 수 있다.
양성 또는 음성 선택에 의한 목적하는 세포 집단의 단리에 있어서, 세포 농도 및 표면(예를 들어, 비드와 같은 입자)은 달라질 수 있다. 일부 구현예에서, 세포와 비드의 최대 접촉을 보장하기 위해, 비드와 세포가 함께 혼합되는 부피를 유의하게 감소시키는(예를 들어, 세포의 농도를 증가시키는) 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어 일부 구현예에서, 100억 개 세포/ml, 90억 개/ml, 80억 개/ml, 70억 개/ml, 60억 개/ml, 또는 50억 개/ml의 농도가 사용된다. 일부 구현예에서, 10억 개 세포/ml의 농도가 사용된다. 일부 구현예에서, 7500만, 8000만, 8500만, 9000만, 9500만, 또는 1억 개 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 일부 구현예에서, 1억 2500만 또는 1억 5000만 개 세포/ml의 농도가 사용될 수 있다.
높은 농도를 사용하면 세포 수율, 세포 활성화, 및 세포 증식을 증가시킬 수 있다. 또한, 높은 세포 농도를 사용하면, 많은 종양세포가 존재하는 샘플(예를 들어, 백혈병 혈액, 종양 조직 등)로부터, CD28-음성 T세포와 같이 관심 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포를 보다 효율적으로 포획할 수 있다. 이러한 세포 집단은 치료적 가치를 가질 수 있고, 수득하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어 높은 농도의 세포를 사용하면, 보통은 더 약한 CD28 발현을 갖는 CD8+ T세포를 보다 효율적으로 선택할 수 있다.
일부 구현예에서, 보다 낮은 농도의 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. T세포와 표면(예를 들어, 비드와 같은 입자)의 혼합물을 상당히 희석함으로써, 입자와 세포 사이의 상호작용이 최소화된다. 이에 따라, 입자에 결합되는 다량의 목적 항원을 발현하는 세포가 선택된다. 예를 들어, CD4+ T세포는 희석 농도에서 보다 높은 수준의 CD28을 발현하고 CD8+ T세포보다 더 효율적으로 포획된다. 일부 구현예에서, 사용되는 세포 농도는 5 x 106/ml이다. 일부 구현예에서, 사용되는 농도는 약 1 x 105/ml 내지 1 x 106/ml, 및 그 사이의 임의의 정수값일 수 있다.
일부 구현예에서, 세포는 2~10℃ 또는 실온에서 다양한 속도로 다양한 기간 동안 회전장치에서 인큐베이션될 수 있다.
일부 구현예에서, 집단의 복수의 면역 이펙터 세포는 디아글리세롤 키나제(DGK)를 발현하지 않으며, 예를 들어 DGK가 결핍되어 있다. 일부 구현예에서, 집단의 복수의 면역 이펙터 세포는 Ikaros를 발현하지 않으며, 예를 들어 Ikaros가 결핍되어 있다. 일부 구현예에서, 집단의 복수의 면역 이펙터 세포는 DGK 및 Ikaros를 발현하지 않으며, 예를 들어 DGK 및 Ikaros가 둘 다 결핍되어 있다.
자극을 위한 T세포는 또한 세척 단계 후에 동결될 수 있다. 이론에 구애되고자 함이 없이, 동결 및 후속 해동 단계는 세포 집단에서 과립구 및 어느 정도까지의 단핵구를 제거함으로써 보다 균일한 생성물을 제공한다. 혈장 및 혈소판을 제거하는 세척 단계 후, 세포는 동결 용액에 현탁될 수 있다. 많은 동결 용액 및 파라미터가 당업계에 알려져 있고 이러한 맥락에서 유용할 것이지만, 한 가지 방법은 20%의 DMSO 및 8%의 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBS, 또는 10%의 덱스트란 40 및 5%의 덱스트로스, 20%의 인간 혈청 알부민 및 7.5%의 DMSO, 또는 31.25%의 Plasmalyte-A, 31.25%의 덱스트로스 5%, 0.45%의 NaCl, 10%의 덱스트란 40 및 5%의 덱스트로스, 20%의 인간 혈청 알부민, 및 7.5%의 DMSO를 함유하는 배양 배지, 또는 예를 들어 Hespan 및 PlasmaLyte A를 함유하는 기타 적합한 세포 동결 배지를 사용하는 것을 수반하고, 이어서 세포는 분당 1℃의 속도로 -80℃까지 동결되고 액체 질소 저장 탱크의 증기상에 보관된다. -20℃ 또는 액체 질소에서의 즉각적인 제어되지 않은 동결뿐만 아니라 다른 제어된 동결 방법이 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 동결보존된 세포는 본원에 기술된 바와 같이 해동 및 세척되고, 실온에서 1시간 동안 정치된 후, 본 발명의 방법을 사용하여 활성화된다.
또한, 본 발명과 관련하여 본원에 기술된 바와 같은 증식 세포가 필요한 시기 이전에 대상체로부터 혈액 샘플 또는 성분채집 생성물을 수집하는 것이 고려된다. 이와 같이, 증식될 세포의 공급원은 필요한 임의의 시점에 수집될 수 있으며, T세포와 같은 목적하는 세포는 면역 이펙터 세포 요법으로부터 이억을 얻을 수 있는 본원에 기술된 바와 같은 많은 질환 또는 병태에 대한 면역 이펙터 세포 요법에서의 차후 사용을 위해 단리되고 동결된다. 일부 구현예에서, 혈액 샘플 또는 성분채집은 대체로 건강한 대상체로부터 채취된다. 일부 구현예에서, 혈액 샘플 또는 성분채집은 질환 발병 위험이 있지만 아직 질환이 발병하지 않은 대체로 건강한 대상체로부터 채취되며, 관심 세포는 추후 사용을 위해 단리되고 동결된다. 일부 구현예에서, T세포는 증식, 동결되어, 추후 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플은 본원에 기술된 바와 같은 특정 질환의 진단 직후에, 그러나 임의의 치료 이전에 환자로부터 수집된다. 일부 구현예에서, 세포는 많은 관련 치료 방식(나탈리주맙, 에팔리주맙, 항바이러스제와 같은 제제, 화학요법, 방사선, 면역억제제, 예컨대 시클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트, 및 FK506, 항체, 또는 기타 면역제거제, 예컨대 CAMPATH, 항-CD3 항체, 시톡산, 플루다라빈, 시클로스포린, FK506, 라파마이신, 미코페놀산, 스테로이드, FR901228, 및 방사선조사를 이용한 치료를 포함하나 이에 한정되지 않음) 이전에 대상체의 혈액 샘플 또는 성분채집으로부터 단리된다.
본 발명의 일부 구현예에서, T세포는 기능적 T세포를 사용한 대상체의 치료 직후에 환자로부터 수득된다. 이와 관련하여, 특정 암치료, 특히 면역계를 손상시키는 약물을 사용한 치료 후, 환자가 치료로부터 정상적으로 회복되는 기간 중의 치료 직후에, 수득된 T세포의 품질이 생체외 증식 능력에 대해 최적이거나 개선될 수 있는 것으로 관찰되었다. 마찬가지로, 본원에 기술된 방법을 사용한 생체외 조작 후에, 이들 세포는 강화된 생착 및 생체내 증식을 위한 바람직한 상태로 존재할 수 있다. 따라서, 이러한 회복기 동안 T세포, 수지상세포, 또는 조혈 계통의 다른 세포를 포함하는 혈액 세포를 수집하는 것이 본 발명의 맥락 내에서 고려된다. 또한, 일부 구현예에서, 특히 요법 후의 규정된 시간 윈도우 중에, 특정 세포 유형의 재증식, 재순환, 재생, 및/또는 증식이 유리한 대상체 상태를 생성하기 위해 동원(예를 들어, GM-CSF를 사용한 동원) 및 컨디셔닝 요법이 사용될 수 있다. 예시적인 세포 유형은 T세포, B세포, 수지상세포, 및 면역계의 다른 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR 분자, 예를 들어 본원에 기술된 CAR 분자를 발현하는 면역 이펙터 세포는 낮은, 면역 강화 용량의 mTOR 억제제를 제공받은 대상체로부터 수득된다. 일부 구현예에서, CAR을 발현하도록 조작될 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T세포의 집단은 대상체 내의, 또는 대상체로부터 수확된, PD1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T세포의 수준, 또는 PD1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T세포/PD1 양성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T세포의 비가 적어도 일시적으로 증가되도록, 충분한 시간 후, 또는 낮은, 면역 강화 용량의 mTOR 억제제의 충분한 투약 후에 수확된다.
다른 구현예에서, CAR을 발현하도록 조작되었거나 조작될 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T세포의 집단은, PD1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T세포의 수를 증가시키거나, PD1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T세포/PD1 양성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T세포의 비를 증가시키는 양의 mTOR 억제제와 접촉시켜 생체외 처치될 수 있다.
본 출원의 방법은 5% 이하, 예를 들어 2%의 인간 AB 혈청을 포함하는 배양 배지 조건을 활용할 수 있고, 공지의 배양 배지 조건 및 조성, 예를 들어 문헌[Smith et al., "Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTSTM Immune Cell Serum Replacement" Clinical & Translational Immunology (2015) 4, e31; doi:10.1038/cti.2014.31]에 기술된 것들을 이용할 수 있는 것으로 인식된다.
일부 구현예에서, 본 출원의 방법은 적어도 약 0.1%, 0.5%, 1.0%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10%의 혈청을 포함하는 배지 조건을 이용할 수 있다. 일부 구현예에서, 배지는 약 0.5%~5%, 약 0.5%~4.5%, 약 0.5%~4%, 약 0.5%~3.5%, 약 0.5%~3%, 약 0.5%~2.5%, 약 0.5%~2%, 약 0.5%~1.5%, 약 0.5%~1.0%, 약 1.0%~5%, 약 1.5%~5%, 약 2%~5%, 약 2.5%~5%, 약 3%~5%, 약 3.5%~5%, 약 4%~5%, 또는 약 4.5%~5%의 혈청을 포함한다. 일부 구현예에서, 배지는 약 0.5%의 혈청을 포함한다. 일부 구현예에서, 배지는 약 0.5%의 혈청을 포함한다. 일부 구현예에서, 배지는 약 1%의 혈청을 포함한다. 일부 구현예에서, 배지는 약 1.5%의 혈청을 포함한다. 일부 구현예에서, 배지는 약 2%의 혈청을 포함한다. 일부 구현예에서, 배지는 약 2.5%의 혈청을 포함한다. 일부 구현예에서, 배지는 약 3%의 혈청을 포함한다. 일부 구현예에서, 배지는 약 3.5%의 혈청을 포함한다. 일부 구현예에서, 배지는 약 4%의 혈청을 포함한다. 일부 구현예에서, 배지는 약 4.5%의 혈청을 포함한다. 일부 구현예에서, 배지는 약 5%의 혈청을 포함한다. 일부 구현예에서, 혈청은 인간 혈청, 예를 들어 인간 AB 혈청을 포함한다. 일부 구현예에서, 혈청은 수집 후 자연적으로 응고하도록 한 인간 혈청, 예를 들어 오프 더 클롯(off-the-clot, OTC) 혈청이다. 일부 구현예에서, 혈청은 혈장 유래 혈청 인간 혈청이다. 혈장 유래 혈청은 항응고제, 예를 들어 시트르산나트륨의 존재하에 수집한, 풀링된 인간 혈장의 섬유소를 제거하여 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 출원의 방법은 무혈청 배지를 포함하는 배양 배지 조건을 활용할 수 있다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 OpTmizerTM CTSTM(LifeTech), ImmunocultTM XF(Stemcell technologies), CellGroTM(CellGenix), TexMacsTM(Miltenyi), StemlineTM(Sigma), Xvivo15TM(Lonza), PrimeXV®(Irvine Scientific), 또는 StemXVivo®(RandD systems)이다. 무혈청 배지는 LifeTech의 ICSR(면역 세포 혈청 대체물)과 같은 혈청 대체물로 보충될 수 있다. 혈청 대체물(예를 들어, ICSR)의 수준은 예를 들어 최대 5%, 예를 들어 약 1%, 2%, 3%, 4%, 또는 5%일 수 있다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 혈청, 예를 들어 인간 혈청, 예를 들어 인간 AB 혈청으로 보충될 수 있다. 일부 구현예에서, 혈청은 수집 후 자연적으로 응고하도록 한 인간 혈청, 예를 들어 오프 더 클롯(off-the-clot, OTC) 혈청이다. 일부 구현예에서, 혈청은 혈장 유래 인간 혈청이다. 혈장 유래 혈청은 항응고제, 예를 들어 시트르산나트륨의 존재하에 수집한, 풀링된 인간 혈장의 섬유소를 제거하여 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, T세포 집단은 디아글리세롤 키나제(DGK)가 결핍되어 있다. DGK-결핍 세포는 DGK RNA 또는 단백질을 발현하지 않는 세포, 또는 DGK 활성이 감소되거나 억제된 세포를 포함한다. DGK-결핍 세포는 유전적 접근법에 의해, 예를 들어 RNA 간섭제, 예를 들어 siRNA, shRNA, miRNA를 투여하여 DGK 발현을 감소 또는 방지함으로써 생성될 수 있다. 대안적으로, DGK-결핍 세포는 본원에 기술된 DGK 억제제를 이용한 처치에 의해 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, T세포 집단은 Ikaros가 결핍되어 있다. Ikaros-결핍 세포는 Ikaros RNA 또는 단백질을 발현하지 않는 세포, 또는 Ikaros 활성이 감소되거나 억제된 세포를 포함하며, Ikaros-결핍 세포는 유전적 접근법에 의해, 예를 들어 RNA 간섭제, 예를 들어 siRNA, shRNA, miRNA를 투여하여 Ikaros 발현을 감소 또는 방지함으로써 생성될 수 있다. 대안적으로, Ikaros-결핍 세포는 Ikaros 억제제, 예를 들어 레날리도미드를 이용한 처치에 의해 생성될 수 있다.
구현예에서, T세포 집단은 DGK-결핍 및 Ikaros-결핍 집단이며, 예를 들어 DGK 및 Ikaros를 발현하지 않거나, 또는 감소되거나 억제된 DGK 및 Ikaros 활성을 갖는다. 이러한 DGK 및 Ikaros-결핍 세포는 본원에 기술된 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, NK세포는 대상체로부터 수득된다. 일부 구현예에서, NK세포는 NK세포주, 예를 들어 NK-92 세포주(Conkwest)이다.
동종이계 CAR-발현 세포
본원에 기술된 구현예에서, 면역 이펙터 세포는 동종이계 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T세포 또는 NK세포일 수 있다. 예를 들어 세포는 동종이계 T세포, 예를 들어 기능적 T세포 수용체(TCR) 및/또는 인간 백혈구 항원(HLA), 예를 들어 HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II의 발현이 결여된 동종이계 T세포일 수 있다.
기능적 TCR이 결여된 T세포는 예를 들어 이의 표면 상에 임의의 기능적 TCR을 발현하지 않도록 조작되거나, 기능적 TCR을 포함하는 하나 이상의 서브유닛을 발현하지 않도록 조작되거나(예를 들어, TCR 알파, TCR 베타, TCR 감마, TCR 델타, TCR 엡실론, 및/또는 TCR 제타를 발현하지 않도록(또는 이의 감소된 발현을 나타내도록) 조작되거나), 또는 이의 표면 상에 매우 적은 기능적 TCR을 생성하도록 조작될 수 있다. 대안적으로, T세포는 예를 들어 TCR의 서브유닛 중 하나 이상의 돌연변이되거나 절단된 형태의 발현에 의해 실질적으로 손상된 TCR을 발현할 수 있다. "실질적으로 손상된 TCR"이라는 용어는 이러한 TCR이 숙주에서 유해한 면역 반응을 일으키지 않는다는 것을 의미한다.
본원에 기술된 T세포는 예를 들어 표면에 기능적 HLA를 발현하지 않도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 T세포는 세포 표면 발현 HLA, 예를 들어 HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II가 하향 조절되도록 조작될 수 있다. 일부 구현예에서, HLA의 하향 조절은 베타-2 마이크로글로불린(B2M)의 발현을 감소시키거나 제거함으로써 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, T세포는 기능적 TCR 및 기능적 HLA, 예를 들어 HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II가 결여될 수 있다.
기능적 TCR 및/또는 HLA의 발현이 결여된 변형된 T세포는 TCR 또는 HLA의 하나 이상의 서브유닛의 녹아웃 또는 녹다운을 포함한 임의의 적합한 수단에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어 T세포는 siRNA, shRNA, 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부(CRISPR), 전사 활성자 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 또는 징크 핑거 엔도뉴클레아제(ZFN)를 사용한 TCR 및/또는 HLA의 녹다운을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 동종이계 세포는, 예를 들어 본원에 기술된 임의의 방법에 의해 억제성 분자를 발현하지 않거나 낮은 수준으로 발현하는 세포일 수 있다. 예를 들어, 세포는 예를 들어 면역 이펙터 반응을 일으키는 CAR-발현 세포의 능력을 감소시킬 수 있는 억제성 분자를 발현하지 않거나 낮은 수준으로 발현하는 세포일 수 있다. 억제성 분자의 예는 PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM(예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3, 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3(CD276), B7-H4(VTCN1), HVEM(TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, GAL9, 아데노신, 및 TGF(예를 들어, TGF 베타)를 포함한다. 예를 들어 DNA, RNA 또는 단백질 수준에서의 억제에 의한 억제성 분자의 억제는 CAR-발현 세포 성능을 최적화할 수 있다. 구현예에서, 억제성 핵산, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 억제성 핵산, 예를 들어 dsRNA, 예를 들어 siRNA 또는 shRNA, 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부(CRISPR), 전사 활성자 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 또는 징크 핑거 엔도뉴클레아제(ZFN)가 사용될 수 있다.
TCR 또는 HLA를 억제하는 siRNA 및 shRNA
일부 구현예에서, TCR 발현 및/또는 HLA 발현은, 세포, 예를 들어 T세포에서 본원에 기술된 억제성 분자(예를 들어, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM(예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3, 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3(CD276), B7-H4(VTCN1), HVEM(TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, GAL9, 아데노신, 및 TGF 베타), 및/또는 TCR 및/또는 HLA를 암호화하는 핵산을 표적으로 하는 siRNA 또는 shRNA를 사용하여 억제될 수 있다.
siRNA 및 shRNA에 대한 발현 시스템, 및 예시적인 shRNA는 예를 들어 전문이 참조로 포함되는, 2015년 3월 13일 출원된 국제 출원 WO2015/142675의 단락 649 및 650에 기술되어 있다.
TCR 또는 HLA를 억제하는 CRISPR
본원에서 사용되는 "CRISPR" 또는 "TCR 및/또는 HLA에 대한 CRISPR" 또는 "TCR 및/또는 HLA를 억제하는 CRISPR"은 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부의 세트, 또는 이러한 반복부의 세트를 포함하는 시스템을 지칭한다. 본원에서 사용되는 "Cas"는 CRISPR-관련 단백질을 지칭한다. "CRISPR/Cas" 시스템은 세포, 예를 들어 T세포에서 본원에 기술된 억제성 분자(예를 들어, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM(예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3, 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3(CD276), B7-H4(VTCN1), HVEM(TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, GAL9, 아데노신, 및 TGF 베타), 및/또는 TCR 및/또는 HLA 유전자를 침묵시키거나 돌연변이시키는 데 사용될 수 있는 CRISPR 및 Cas로부터 유래된 시스템을 지칭한다.
CRISPR/Cas 시스템 및 이의 용도는, 예를 들어 전문이 참조로 포함되는, 2015년 3월 13일 출원된 국제 출원 WO2015/142675의 단락 651~658에 기술되어 있다.
TCR 및/또는 HLA를 억제하는 TALEN
"TALEN" 또는 "HLA 및/또는 TCR에 대한 TALEN" 또는 "HLA 및/또는 TCR을 억제하는 TALEN"은 세포, 예를 들어 T세포에서 본원에 기술된 억제성 분자(예를 들어, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM(예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3, 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3(CD276), B7-H4(VTCN1), HVEM(TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, GAL9, 아데노신, 및 TGF 베타), 및/또는 HLA 및/또는 TCR 유전자를 편집하는 데 사용될 수 있는 인공 뉴클레아제, 전사 활성자-유사 이펙터 뉴클레아제를 지칭한다.
TALEN 및 이의 용도는, 예를 들어 전문이 참조로 포함되는, 2015년 3월 13일 출원된 국제 출원 WO2015/142675의 단락 659~665에 기술되어 있다.
HLA 및/또는 TCR을 억제하는 징크 핑거 뉴클레아제
"ZFN" 또는 "징크 핑거 뉴클레아제" 또는 "HLA 및/또는 TCR에 대한 ZFN" 또는 "HLA 및/또는 TCR을 억제하는 ZFN"은 세포, 예를 들어 T세포에서 본원에 기술된 억제성 분자(예를 들어, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM(예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3, 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3(CD276), B7-H4(VTCN1), HVEM(TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, GAL9, 아데노신, 및 TGF 베타), 및/또는 HLA 및/또는 TCR 유전자를 편집하는 데 사용될 수 있는 인공 뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제를 지칭한다.
ZFN 및 이의 용도는, 예를 들어 전문이 참조로 포함되는, 2015년 3월 13일 출원된 국제 출원 WO2015/142675의 단락 666~671에 기술되어 있다.
텔로머라제 발현
텔로미어는 체세포 지속성에 있어서 중요한 역할을 하며, 이들의 길이는 텔로머라제(TERT)에 의해 유지된다. CLL 세포에서 텔로미어 길이는 매우 짧을 수 있고(문헌[Roth et al., "Significantly shorter telomeres in T-cells of patients with ZAP-70+/CD38 chronic lymphocytic leukaemia" British Journal of Haematology, 143, 383-386, August 28 2008]), 제조된 CAR-발현 세포, 예를 들어 CART19 세포에서는 훨씬 더 짧을 수 있어, 환자로의 입양 이식 후 이러한 세포가 증식될 가능성을 제한한다. 텔로머라제 발현은 복제 소진으로부터 CAR-발현 세포를 구할 수 있다.
어떠한 특정한 이론에 구애되고자 함이 없이, 일부 구현예에서, 치료적 T세포는 T세포 내에서의 단축된 텔로미어로 인해 환자에서 단기 지속성을 갖고; 이에 따라, 텔로머라제 유전자를 이용한 형질감염은 T세포의 텔로미어를 연장시키고 환자에서의 T세포의 지속성을 개선할 수 있다. 문헌[Carl June, "Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic", Journal of Clinical Investigation, 117:1466-1476 (2007)] 참조. 따라서, 일부 구현예에서, 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T세포는 텔로머라제 서브유닛, 예를 들어 텔로머라제의 촉매 서브유닛, 예를 들어 TERT, 예를 들어 hTERT를 이소적으로 발현한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 세포를 텔로머라제 서브유닛, 예를 들어 텔로머라제의 촉매 서브유닛, 예를 들어 TERT, 예를 들어 hTERT를 암호화하는 핵산과 접촉시키는 단계를 포함하는, CAR-발현 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 세포는 CAR을 암호화하는 구성체와의 접촉 이전, 접촉과 동시, 또는 접촉 이후에 핵산과 접촉될 수 있다.
텔로머라제 발현은 안정적일 수 있거나(예를 들어, 핵산이 세포의 게놈 내로 통합될 수 있음), 일시적일 수 있다(예를 들어, 핵산이 통합되지 않고, 발현이 일정 기간 후에, 예를 들어 며칠 후에 감소한다). 안정적인 발현은 텔로머라제 서브유닛 및 선별 마커를 암호화하는 DNA로 세포를 형질감염 또는 형질도입시키고, 안정적인 구성성분을 선택함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로 또는 조합하여, 안정적인 발현은 예를 들어 Cre/Lox 또는 FLP/FRT 시스템을 이용한 부위 특이적 재조합에 의해 달성될 수 있다.
일시적인 발현은 핵산, 예를 들어 DNA 또는 RNA, 예컨대, mRNA를 사용한 형질감염 또는 형질도입을 수반할 수 있다. 일부 구현예에서, 일시적인 mRNA 형질감염은 때때로 TERT를 사용한 안정적인 형질감염과 관련된 유전적 불안정성을 피한다. 외인성 텔로머라제 활성의 일시적인 발현은 예를 들어, 전문이 본원에 참조로 포함되는 국제 출원 WO2014/130909에 기술되어 있다. 구현예에서, 텔로머라제 서브유닛의 mRNA 기반 형질감염은 Moderna Therapeutics가 상용화한 메신저 RNA Therapeutics™ 플랫폼에 따라 수행된다. 예를 들어, 상기 방법은 미국 특허 8710200호, 8822663호, 8680069호, 8754062호, 8664194호, 또는 8680069호에 기술된 방법일 수 있다.
일부 구현예에서, hTERT는 GenBank 단백질 ID AAC51724.1의 아미노산 서열을 갖는다(문헌[Meyerson et al., "hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization" Cell Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795]): MPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVGDDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRRGAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSLEGALSGTRHSHPSVGRQHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPWQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVRGCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQETSPLRDAVVIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVVNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSIRASLTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD (서열번호 284)
일부 구현예에서, hTERT는 서열번호 284의 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, hTERT는 서열번호 284의 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, hTERT는 N-말단, C-말단, 또는 둘 다에서 (예를 들어, 5, 10, 15, 20, 또는 30개 이하 아미노산의) 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, hTERT는 N-말단, C-말단, 또는 둘 다에서 (예를 들어, 5, 10, 15, 20, 또는 30개 이하 아미노산의) 이식유전자 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, hTERT는 GenBank 수탁번호 AF018167의 핵산 서열에 의해 암호화된다(문헌[Meyerson et al., "hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization" Cell Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795]).
면역 이펙터 세포(예를 들어, T세포)의 활성화 및 증식
본원에 기술된 방법에 의해 생성되거나 강화된 T세포와 같은 면역 이펙터 세포는 일반적으로 예를 들어 미국 특허 6,352,694호; 6,534,055호; 6,905,680호; 6,692,964호; 5,858,358호; 6,887,466호; 6,905,681호; 7,144,575호; 7,067,318호; 7,172,869호; 7,232,566호; 7,175,843호; 5,883,223호; 6,905,874호; 6,797,514호; 6,867,041호; 및 미국 특허 출원 공개 20060121005호에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 활성화되고 증식될 수 있다.
일반적으로, 면역 이펙터 세포 집단은 CD3/TCR 복합체 관련 신호를 자극하는 제제 및 T세포 표면의 공동자극 분자를 자극하는 리간드가 부착된 표면과의 접촉에 의해 증식될 수 있다. 특히, T세포 집단은 본원에 기술된 바와 같이, 예컨대 표면에 고정된 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 항-CD2 항체와의 접촉에 의해, 또는 칼슘 이오노포어와 함께 단백질 키나제 C 활성화제(예를 들어, 브리오스타틴)와의 접촉에 의해 자극될 수 있다. T세포 표면의 보조 분자의 공동자극의 경우, 보조 분자에 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들어, T세포 집단은 T세포의 증식을 자극하기에 적절한 조건하에 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. CD4+ T세포 또는 CD8+ T세포의 증식을 자극하기 위해, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체가 사용될 수 있다. 항-CD28 항체의 예는 9.3, B-T3, XR-CD28(Diaclone, 프랑스 브장송)을 포함하며, 당업계에 일반적으로 알려진 다른 방법과 같이 사용될 수 있다(문헌[Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999]).
일부 구현예에서, T세포에 대한 일차 자극 신호 및 공동자극 신호는 상이한 프로토콜에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어 각각의 신호를 제공하는 제제는 용액 중에 존재하거나 표면에 커플링될 수 있다. 표면에 커플링되는 경우, 제제는 동일한 표면에 커플링되거나(즉, "시스" 형성) 개별 표면에 커플링될 수 있다(즉, "트랜스" 형성). 대안적으로, 한 제제는 표면에 커플링되고 다른 제제는 용액 중에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 공동자극 신호를 제공하는 제제는 세포 표면에 결합되고, 일차 활성화 신호를 제공하는 제제는 용액 중에 존재하거나 표면에 커플링된다. 일부 구현예에서, 두 제제 모두 용액 중에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 제제는 가용성 형태로 존재하며, 이어서, Fc 수용체 또는 항체 또는 제제에 결합할 다른 결합제를 발현하는 세포와 같은 표면에 가교될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명에서 T세포를 활성화하고 증식시키는 데 사용하기 위해 고려되는 인공 항원 제시 세포(aAPC)에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 출원 공개 20040101519호 및 20060034810호를 참조한다.
일부 구현예에서, 두 제제는 동일한 비드 상에(즉 "시스") 고정되거나 개별 비드에(즉 "트랜스") 고정된다. 예로서, 일차 활성화 신호를 제공하는 제제는 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, 공동자극 신호를 제공하는 제제는 항-CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며, 두 제제 모두 동등한 분자의 양으로 동일한 비드에 공동 고정된다. 일부 구현예에서, CD4+ T세포 증식 및 T세포 성장을 위해 비드에 결합된 1:1 비의 각각의 항체가 사용된다. 본 발명의 일부 구현예에서, 비드에 결합된 항 CD3:CD28 항체의 비는 1:1의 비를 사용하여 관찰된 증식과 비교하여 T세포 증식의 증가가 관찰되도록 사용된다. 일부 구현예에서, 1:1의 비를 사용하여 관찰된 증식과 비교하여 약 1 내지 약 3배의 증가가 관찰된다. 일부 구현예에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 항체의 비는 100:1 내지 1:100 및 그 사이의 모든 정수값의 범위이다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체보다 더 많은 항-CD28 항체가 입자에 결합된다(즉, CD3:CD28의 비는 1 미만이다). 일부 구현예에서, 비드에 결합된 항 CD28 항체 대 항 CD3 항체의 비는 2:1보다 크다. 일부 구현예에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 비 1:100의 항체가 사용된다. 일부 구현예에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 비 1:75의 항체가 사용된다. 일부 구현예에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 비 1:50의 항체가 사용된다. 일부 구현예에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 비 오전 1:30의 항체가 사용된다. 일부 구현예에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 비 오전 1:10의 항체가 사용된다. 일부 구현예에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 비 1:3의 항체가 사용된다. 일부 구현예에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 비 3:1의 항체가 사용된다.
T세포 또는 다른 표적 세포를 자극하기 위해 1:500 내지 500:1 및 그 사이의 임의의 정수값의 입자 대 세포 비가 사용될 수 있다. 당업자가 용이하게 이해할 수 있는 바와 같이, 입자 대 세포의 비는 표적 세포에 대한 입자 크기에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 작은 크기의 비드는 적은 수의 세포에만 결합할 수 있지만, 보다 큰 비드는 많은 세포에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 대 입자의 비는 1:100 내지 100:1 및 그 사이의 임의의 정수값의 범위이고, 일부 구현예에서 1:9 내지 9:1 및 그 사이의 임의의 정수 값을 포함하는 비가 또한 T세포를 자극하는 데 사용될 수 있다. T세포 자극을 유발하는 항-CD3 및 항-CD28-커플링된 입자 대 T세포의 비는 상기 언급된 바와 같이 다양할 수 있지만, 적합한 특정 값은 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 및 15:1을 포함하고, 하나의 적합한 비는 적어도 1:1의 입자/T세포이다. 일부 구현예에서, 1:1 이하의 입자 대 세포의 비가 사용된다. 일부 구현예에서, 적합한 입자:세포의 비는 1:5이다. 일부 구현예에서, 입자 대 세포의 비는 자극 일에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어 일부 구현예에서, 입자 대 세포의 비는 1일차에 1:1 내지 10:1이고, 이후 최대 10일 동안 매일 또는 격일로 추가의 입자가 1:1 내지 1:10의 최종 비(첨가 일의 세포 수 기준)로 세포에 첨가된다. 일부 구현예에서, 입자 대 세포의 비는 자극 1일차에 1:1이고, 자극 3일차 및 5일차에 1:5로 조정된다. 일부 구현예에서, 입자는 매일 또는 격일 기준으로 자극 1일차에 1:1, 3일차 및 5일차에 1:5의 최종 비로 첨가된다. 일부 구현예에서, 입자 대 세포의 비는 자극 1일차에 2:1이고, 자극 3일차 및 5일차에 1:10으로 조정된다. 일부 구현예에서, 입자는 매일 또는 격일 기준으로 자극 1일차에 1:1, 3일차 및 5일차에 1:10의 최종 비로 첨가된다. 당업자는 다양한 다른 비가 본 발명에 사용하기에 적합할 수 있음을 이해할 것이다. 특히, 비는 입자의 크기 및 세포의 크기 및 유형에 따라 달라질 것이다. 일부 구현예에서, 사용하기에 가장 일반적인 비는 1일차에 대략 1:1, 2:1, 및 3:1이다.
일부 구현예에서, T세포와 같은 세포는 제제-코팅된 비드와 배합되고, 이후에 비드와 세포가 분리된 후, 세포가 배양된다. 일부 구현예에서, 배양 전에, 제제-코팅된 비드와 세포는 분리되지 않고 함께 배양된다. 일부 구현예에서, 자기력과 같은 물리력을 적용하여 비드와 세포를 먼저 농축하여 세포 표면 마커의 라이게이션을 증가시켜 세포 자극을 유도한다.
예를 들어, 세포 표면 단백질은 항-CD3 및 항-CD28이 부착되는 상자성 비드(3x28 비드)가 T세포와 접촉하도록 함으로써 라이게이션될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포(예를 들어, 104 내지 109개 T세포)와 비드(예를 들어, 1:1 비의 Dynabeads® M-450 CD3/CD28 T 상자성 비드)는 완충액, 예를 들어 PBS(칼슘 및 마그네슘과 같은 2가 양이온 미함유)에서 배합된다. 또한, 당업자는 임의의 세포 농도가 사용될 수 있음을 쉽게 이해할 수 있다. 예를 들어, 표적 세포는 샘플에 매우 드물 수 있고 단지 샘플의 0.01%만을 이루거나, 또는 전체 샘플(즉, 100%)이 관심 표적 세포를 포함할 수 있다. 따라서, 임의의 세포 수가 본 발명의 맥락 내에 있다. 일부 구현예에서, 세포와 입자의 최대 접촉을 보장하기 위해, 입자와 세포가 함께 혼합되는 부피를 유의하게 감소시키는(즉, 세포의 농도를 증가시키는) 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어 일부 구현예에서, 약 100억 개 세포/ml, 90억 개/ml, 80억 개/ml, 70억 개/ml, 60억 개/ml, 50억 개/ml, 또는 20억 개 세포/ml의 농도가 사용된다. 일부 구현예에서, 1억 개 세포/ml 초과의 농도가 사용된다. 일부 구현예에서, 1000만, 1500만, 2000만, 2500만, 3000만, 3500만, 4000만, 4500만, 또는 5000만 개 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 일부 구현예에서, 7500만, 8000만, 8500만, 9000만, 9500만, 또는 1억 개 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 일부 구현예에서, 1억 2500만 또는 1억 5000만 개 세포/ml의 농도가 사용될 수 있다. 높은 농도를 사용하면 세포 수율, 세포 활성화, 및 세포 증식을 증가시킬 수 있다. 또한, 높은 세포 농도를 사용하면 관심 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포, 예컨대 CD28-음성 T세포를 보다 효율적으로 포획할 수 있다. 이러한 세포 집단은 치료적 가치를 가질 수 있고, 일부 구현예에서 수득하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어 높은 농도의 세포를 사용하면, 보통은 더 약한 CD28 발현을 갖는 CD8+ T세포를 보다 효율적으로 선택할 수 있다.
일부 구현예에서, CAR, 예를 들어 본원에 기술된 CAR, 예를 들어 본원에 기술된 CD19 CAR을 암호화하는 핵산으로 형질도입된 세포는, 예를 들어 본원에 기술된 방법에 의해 증식된다. 일부 구현예에서, 세포는 수 시간(예를 들어, 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 18, 21시간) 내지 약 14일(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14일)의 기간 동안 배양 중에 증식된다. 일부 구현예에서, 세포는 4 내지 9일의 기간 동안 증식된다. 일부 구현예에서, 세포는 8일 이하, 예를 들어 7, 6, 또는 5일의 기간 동안 증식된다. 일부 구현예에서, 세포는 5일 동안 배양 중에 증식되고, 생성된 세포는 동일한 배양 조건하에서 9일 동안 배양 중에 증식된 동일한 세포보다 더 강력하다. 효력은, 예를 들어 다양한 T세포 기능, 예를 들어 증식, 표적 세포 사멸, 사이토카인 생성, 활성화, 이동, 표면 CAR 발현, CAR 정량적 PCR, 또는 이들의 조합에 의해 정의될 수 있다. 일부 구현예에서, 5일 동안 증식된 세포, 예를 들어 본원에 기술된 CD19 CAR 세포는 동일한 배양 조건하에서 9일 동안 배양 중에 증식된 동일한 세포와 비교하여 항원 자극시 세포 배가의 적어도 1, 2, 3, 또는 4배 증가를 보인다. 일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 본원에 기술된 CD19 CAR을 발현하는 세포는 5일 동안 배양 중에 증식되고, 생성된 세포는 동일한 배양 조건하에서 9일 동안 배양 중에 증식된 동일한 세포와 비교하여 더 높은 염증촉진 사이토카인 생성, 예를 들어 IFN-γ 및/또는 GM-CSF 수준을 나타낸다. 일부 구현예에서, 5일 동안 증식된 세포, 예를 들어 본원에 기술된 CD19 CAR 세포는 동일한 배양 조건하에서 9일 동안 배양 중에 증식된 동일한 세포와 비교하여 염증촉진 사이토카인 생성(pg/ml), 예를 들어 IFN-γ 및/또는 GM-CSF 수준의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10배 이상의 증가를 보인다.
또한, T세포의 배양 시간이 60일 이상이 될 수 있도록 여러 사이클의 자극이 요구될 수 있다. T세포 배양에 적절한 조건은 혈청(예를 들어, 소태아 또는 인간 혈청), 인터류킨-2(IL-2), 인슐린, IFNγ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ, 및 TNFα 또는 당업자에게 알려진 세포 성장을 위한 임의의 다른 첨가제를 포함하는, 증식 및 생존능에 필요한 인자를 함유할 수 있는 적절한 배지(예를 들어, 최소 필수 배지, α-MEM, RPMI 배지 1640, AIM-V, DMEM, F-12, 또는 X-vivo 15(Lonza), X-Vivo 20, OpTmizer, 및 IMDM)를 포함한다. 세포의 성장을 위한 다른 첨가제는 계면활성제, 플라스마네이트, 및 환원제, 예컨대 N-아세틸-시스테인 및 2-머캅토에탄올을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 배지는 아미노산, 피루브산나트륨, 및 비타민이 첨가된, 무혈청이거나 또는 적절한 양의 혈청(또는 혈장) 또는 규정된 세트의 호르몬, 및/또는 T세포의 성장 및 증식에 충분한 양의 사이토카인(들)이 보충된 RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15, X-Vivo 20, OpTmizer, 및 IMDM을 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 항생제, 예를 들어 페니실린 및 스트렙토마이신은 실험 배양에만 포함되고, 대상체에 주입되어야 하는 세포의 배양물에는 포함되지 않는다. 표적 세포는 성장을 지지하는 데 필요한 조건, 예를 들어 적절한 온도(예를 들어, 37℃) 및 분위기(예를 들어, 공기 + 5% CO2)하에 유지된다.
일부 구현예에서, 세포는, 예를 들어 유세포 분석과 같은 본원에 기술된 방법에 의해 측정시 14일의 증식 기간에 걸쳐 세포를 적어도 200배(예를 들어, 200배, 250배, 300배, 350배) 증가시키는 하나 이상의 인터류킨을 포함하는 적절한 배지(예를 들어, 본원에 기술된 배지)에서 증식된다. 일부 구현예에서, 세포는 IL-15 및/또는 IL-7(예를 들어, IL-15 및 IL-7)의 존재하에 증식된다.
구현예에서, 본원에 기술된 방법, 예를 들어 CAR-발현 세포의 제조 방법은, 예를 들어 항-CD25 항체 또는 이의 단편, 또는 CD25 결합 리간드, IL-2를 사용하여 세포 집단으로부터 T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ T세포 또는 CD25high T세포를 제거하는 단계를 포함한다. 세포 집단으로부터 T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ T세포 또는 CD25high T세포를 제거하는 방법이 본원에 기술되어 있다. 구현예에서, 방법, 예를 들어 제조 방법은 세포 집단(예를 들어, CD25+ T세포 또는 CD25high T세포와 같은 T 조절 세포가 고갈된 세포 집단; 또는 항-CD25 항체, 이의 단편, 또는 CD25 결합 리간드와 이전에 접촉한 세포 집단)을 IL-15 및/또는 IL-7과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 세포 집단(예를 들어, 항-CD25 항체, 이의 단편, 또는 CD25 결합 리간드와 이전에 접촉한 세포 집단)은 IL-15 및/또는 IL-7의 존재하에 증식된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 CAR-발현 세포의 제조 중에, 예를 들어 생체 외에서, 인터류킨-15(IL-15) 폴리펩티드, 인터류킨-15 수용체 알파(IL-15Ra) 폴리펩티드, 또는 IL-15 폴리펩티드 및 IL-15Ra 폴리펩티드 둘 모두의 조합, 예를 들어 hetIL-15를 포함하는 조성물과 접촉된다. 구현예에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 CAR-발현 세포의 제조 중에, 예를 들어 생체 외에서, IL-15 폴리펩티드를 포함하는 조성물과 접촉된다. 구현예에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 CAR-발현 세포의 제조 중에, 예를 들어 생체 외에서, IL-15 폴리펩티드 및 IL-15 Ra 폴리펩티드 둘 모두의 조합을 포함하는 조성물과 접촉된다. 구현예에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 CAR-발현 세포의 제조 중에, 예를 들어 생체 외에서, hetIL-15를 포함하는 조성물과 접촉된다.
일부 구현예에서 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 생체외 증식 중에 hetIL-15를 포함하는 조성물과 접촉된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 생체외 증식 중에 IL-15 폴리펩티드를 포함하는 조성물과 접촉된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 생체외 증식 중에 IL-15 폴리펩티드 및 IL-15Ra 폴리펩티드 둘 다를 포함하는 조성물과 접촉된다. 일부 구현예에서, 접촉은 림프구 하위집단, 예를 들어 CD8+ T세포의 생존 및 증식을 초래한다.
상이한 자극 횟수에 노출된 T세포는 상이한 특징을 나타낼 수 있다. 예를 들어 전형적인 혈액 또는 성분채집을 거친 말초혈액 단핵 세포 생성물은 세포독성 또는 억제인자 T세포 집단(TC, CD8+)보다 더 큰 헬퍼 T세포 집단(TH, CD4+)을 갖는다. CD3 및 CD28 수용체를 자극하는 것에 의한 T세포의 생체외 증식은 약 8~9일차 이전에는 주로 TH 세포로 이루어진 T세포 집단을 생성하는 반면, 약 8~9일차 이후 T세포 집단은 점점 더 큰 TC 세포 집단을 포함한다. 따라서, 치료의 목적에 따라, 대상체에게 주로 TH 세포를 포함하는 T세포 집단을 주입하는 것이 유리할 수 있다. 이와 유사하게, TC 세포의 항원-특이적 서브세트가 단리된 경우, 이 서브세트를 더 큰 정도로 증식시키는 것이 유리할 수 있다.
또한, CD4 및 CD8 마커 외에도, 다른 표현형 마커는 크게 다르지만, 대부분 세포 증식 과정 중에 재현 가능하다. 따라서, 이러한 재현성은 활성화된 T세포 생성물을 특정 목적에 맞게 조정할 수 있는 능력을 가능하게 한다.
본원에 기술된 CAR이 구성되면, 항원 자극 후 T세포를 증식시키는 능력, 재자극 없이 T세포 증식을 지속시키는 능력, 및 적절한 시험관내 및 동물 모델에서의 항암 활성과 같은(이에 한정되지 않음) 분자의 활성을 평가하기 위해 다양한 분석이 사용될 수 있다. 본 발명의 CAR의 효과를 평가하기 위한 분석법을 이하 더 상세히 기술한다.
단량체 및 이량체의 존재를 검출하기 위해, 예를 들어 전문이 본원에 참조로 포함되는, 2015년 3월 13일 출원된 국제 출원 WO2015/142675의 단락 695에 기술된 바와 같이, 일차 T세포에서 CAR 발현의 웨스턴 블롯 분석이 사용될 수 있다.
항원 자극 후 CAR+ T세포의 시험관내 증식은 유세포 분석으로 측정될 수 있다. 예를 들어, CD4+ 및 CD8+ T세포의 혼합물을 αCD3/αCD28 aAPC로 자극한 후, 분석할 프로모터의 제어하에 GFP를 발현하는 렌티바이러스 벡터를 이용하여 형질도입시킨다. 예시적인 프로모터는 CMV IE 유전자, EF-1α, 유비퀴틴 C, 또는 포스포글리세로키나제(PGK) 프로모터를 포함한다. GFP 형광은 CD4+ 및/또는 CD8+ T세포 서브세트에서 배양 6일차에 유세포 분석에 의해 평가된다. 예를 들어, 문헌[Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)] 참조. 대안적으로, CD4+ 및 CD8+ T세포의 혼합물을 0일차에 αCD3/αCD28 코팅된 자성 비드로 자극하고, 2A 리보솜 스키핑 서열을 사용하여 eGFP와 함께 CAR을 발현하는 바이시스트론 렌티바이러스 벡터를 사용하여 1일차에 CAR로 형질도입시킨다. 배양물을 본원에 기술된 암 관련 항원+ K562 세포(본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원을 발현하는 K562), 야생형 K562 세포(K562 야생형), 또는 항CD3 및 항-CD28 항체의 존재하에 hCD32 및 4-1BBL을 발현하는 K562 세포(K562-BBL-3/28) 중 어느 하나로 재자극한다. 외인성 IL-2를 배양물에 격일로 100 IU/ml로 첨가한다. 비드 기반 계수를 이용하여 유세포 분석에 의해 GFP+ T세포를 계수한다. 예를 들어, 문헌[Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)] 참조.
재자극 없이 지속되는 CAR+ T세포 증식도 측정될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)] 참조. 간략하게, 0일차의 αCD3/αCD28 코팅된 자기 비드를 사용한 자극 및 1일차의 표시된 CAR을 이용한 형질도입 후, Coulter Multisizer III 입자 계수기 또는 더 높은 버전, Nexcelom Cellometer Vision, Millipore Scepter, 또는 기타 세포 계수기를 사용하여 배양 8일차에 평균 T세포 부피(fl)를 측정한다.
또한, CAR-발현 세포 활성을 측정하기 위해, 예를 들어 전문이 본원에 참조로 포함되는, 2015년 3월 13일 출원된 국제 출원 WO2015/142675의 단락 698에 기술된 바와 같이 동물 모델이 사용될 수 있다.
용량 의존성 CAR 치료 반응은, 예를 들어 전문이 본원에 참조로 포함되는, 2015년 3월 13일 출원된 국제 출원 WO2015/142675의 단락 699에 기술된 바와 같이 평가될 수 있다.
세포 증식 및 사이토카인 생성 평가는, 예를 들어 전문이 본원에 참조로 포함되는, 2015년 3월 13일 출원된 국제 출원 WO2015/142675의 단락 700에 기술된 바와 같이 이전에 기술된 바 있다.
세포독성은, 예를 들어 전문이 본원에 참조로 포함되는, 2015년 3월 13일 출원된 국제 출원 WO2015/142675의 단락 701에 기술된 바와 같이 표준 51Cr-방출 분석에 의해 평가될 수 있다. 대안적인 비방사성 방법도 활용될 수 있다.
또한, 세포독성은 예를 들어 xCELLigence 실시간 세포 분석기(RTCA)를 사용하여 부착 세포의 전기 임피던스의 변화를 측정함으로써 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포독성은 여러 시점에서 측정된다.
종양 보유 동물 모델에서 CAR의 특이적 전달 및 증식을 평가하기 위해, 예를 들어 전문이 본원에 참조로 포함되는, 2015년 3월 13일 출원된 국제 출원 WO2015/142675의 단락 702에 기술된 바와 같이 이미징 기술이 사용될 수 있다.
본원의 실시예 섹션에서 기술된 것 및 당업계에 알려진 것을 비롯한 다른 분석법도 본원에 기술된 CAR을 평가하는 데 사용될 수 있다.
대안적으로, 또는 본원에 개시된 방법과 조합하여, CAR-발현 세포의 검출 및/또는 정량화(예를 들어, 시험관내 또는 생체내(예를 들어, 임상 모니터링)); 면역 세포 증식 및/또는 활성화; 및/또는 CAR 리간드의 사용을 수반하는 CAR 특이적 선택 중 하나 이상을 위한 방법 및 조성물이 개시된다. 일부 구현예에서, CAR 리간드는 CAR 분자에 결합하는, 예를 들어 CAR의 세포외 항원 결합 도메인에 결합하는 항체(예를 들어, 항원 결합 도메인에 결합하는 항체, 예를 들어 항-이디오타입 항체; 또는 세포외 결합 도메인의 불변 영역에 결합하는 항체)이다. 다른 구현예에서, CAR 리간드는 CAR 항원 분자(예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 CAR 항원 분자)이다.
일부 구현예에서, CAR-발현 세포를 검출 및/또는 정량화하는 방법이 개시된다. 예를 들어, CAR 리간드는 시험관 내 또는 생체 내에서 CAR-발현 세포를 검출 및/또는 정량화하는 데 사용될 수 있다(예를 들어, 환자에서 CAR-발현 세포의 임상 모니터링, 또는 환자에의 투여). 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
CAR 리간드(임의로, 라벨링된 CAR 리간드, 예를 들어 태그, 비드, 방사성 또는 형광 라벨을 포함하는 CAR 리간드)를 제공하는 단계;
CAR-발현 세포를 획득하는 단계(예를 들어, CAR-발현 세포를 함유하는 샘플, 예컨대 제조 샘플 또는 임상 샘플을 획득하는 단계);
CAR-발현 세포를 결합이 일어나는 조건하에 CAR 리간드와 접촉시켜, 존재하는 CAR-발현 세포의 수준(예를 들어, 양)을 검출하는 단계. CAR-발현 세포와 CAR 리간드의 결합은 FACS, ELISA 등과 같은 표준 기술을 사용하여 검출할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포(예를 들어, 면역 이펙터 세포)를 증식 및/또는 활성화하는 방법이 개시된다. 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
CAR-발현 세포(예를 들어, 제1 CAR-발현 세포 또는 일시적 발현 CAR 세포)를 제공하는 단계;
상기 CAR-발현 세포를 면역 세포 증식 및/또는 급증이 일어나는 조건하에 CAR 리간드, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 CAR 리간드와 접촉시켜, 활성화 및/또는 증식된 세포 집단을 생성하는 단계.
특정 구현예에서, CAR 리간드는 기질 상에 존재한다(예를 들어, 기질, 예를 들어 비천연 기질에 고정되거나 부착됨). 일부 구현예에서, 기질은 비세포 기질이다. 비세포 기질은 플레이트(예를 들어, 미세적정 플레이트), 막(예를 들어, 니트로셀룰로스 막), 매트릭스, 칩 또는 비드로부터 선택된 고체 지지체일 수 있다. 구현예에서, CAR 리간드는 기질(예를 들어, 기질 표면)에 존재한다. CAR 리간드는 기질에 공유적으로 또는 비공유적으로 고정되거나, 부착되거나, 회합된다(예를 들어, 가교된다). 일부 구현예에서, CAR 리간드는 비드에 부착된다(예를 들어, 공유적으로 부착된다). 전술한 구현예에서, 면역 세포 집단은 시험관 내 또는 생체 외에서 증식될 수 있다. 상기 방법은 CAR 분자의 리간드의 존재하에, 예를 들어 본원에 기술된 임의의 방법을 사용하여 면역 세포의 집단을 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 세포를 증식 및/또는 활성화하는 방법은 제2 자극 분자, 예를 들어 CD28의 첨가를 추가로 포함한다. 예를 들어, CAR 리간드 및 제2 자극 분자는 기질, 예를 들어 하나 이상의 비드에 고정되어, 증가된 세포 증식 및/또는 활성화를 제공할 수 있다.
일부 구현예에서, CAR-발현 세포를 선택 또는 강화하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 CAR-발현 세포를 본원에 기술된 바와 같은 CAR 리간드와 접촉시키는 단계; 및 CAR 리간드의 결합에 기초하여 세포를 선택하는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, CAR-발현 세포를 고갈, 감소, 및/또는 사멸시키는 방법이 제공된다. 상기 방법은 CAR-발현 세포를 본원에 기술된 바와 같은 CAR 리간드와 접촉시키는 단계; 및 CAR 리간드의 결합에 기초하여 세포를 표적화하여, CAR-발현 세포의 수를 감소시키고/감소시키거나 CAR-발현 세포를 사멸시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR 리간드는 독성제(예를 들어, 독소 또는 세포 제거제)에 커플링된다. 일부 구현예에서, 항-이디오타입 항체는 이펙터 세포 활성, 예를 들어 ADCC 또는 ADC 활성을 야기할 수 있다.
본원에 개시된 방법에 사용될 수 있는 예시적인 항-CAR 항체는 예를 들어 문헌[WO 2014/190273 및 Jena et al., "Chimeric Antigen Receptor (CAR)-Specific Monoclonal Antibody to Detect CD19-Specific T cells in Clinical Trials", PLOS March 2013 8:3 e57838]에 기술되어 있고, 이의 내용은 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 본원의 조성물 및 방법은, 예를 들어 2015년 7월 31일 출원된 US 제PCT/US2015/043219호에 기술된 바와 같이 T세포의 특정 서브세트에 대해 최적화되고, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, T세포의 최적화된 서브세트는 대조군 T세포, 예를 들어 동일한 구성체를 발현하는 상이한 유형(예를 들어, CD8+ 또는 CD4+)의 T세포와 비교하여 향상된 지속성을 나타낸다.
일부 구현예에서, CD4+ T세포는 본원에 기술된 CAR을 포함하며, 이 CAR은 CD4+ T세포에 적합한(예를 들어, 최적화된, 예를 들어 지속성을 향상시키는) 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 ICOS 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CD8+ T세포는 본원에 기술된 CAR을 포함하며, 이 CAR은 CD8+ T세포에 적합한(예를 들어, 최적화된, 예를 들어 지속성을 향상시키는) 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 4-1BB 도메인, CD28 도메인, 또는 ICOS 도메인 이외의 다른 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 CAR은 본원에 기술된 항원 결합 도메인, 예를 들어 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 포함한다.
일부 구현예에서, 대상체, 예를 들어 암을 앓는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기술된다. 상기 방법은 상기 대상체에게
1) CAR을 포함하는 CD4+ T세포(CARCD4+)로서,
항원 결합 도메인, 예를 들어 본원에 기술된 항원 결합 도메인;
막관통 도메인; 및
세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 제1 공동자극 도메인, 예를 들어 ICOS 도메인을 포함하는 CARCD4+; 및
2) CAR을 포함하는 CD8+ T세포(CARCD8+)로서,
항원 결합 도메인, 예를 들어 본원에 기술된 항원 결합 도메인;
막관통 도메인; 및
세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 제2 공동자극 도메인, 예를 들어 4-1BB 도메인, CD28 도메인, 또는 ICOS 도메인 이외의 다른 공동자극 도메인을 포함하는 CARCD8+
의 유효량을 투여하는 단계를 포함하며,
CARCD4+와 CARCD8+는 서로 상이하다.
임의로, 상기 방법은
3) CAR을 포함하는 제2 CD8+ T세포(제2 CARCD8+)로서,
항원 결합 도메인, 예를 들어 본원에 기술된 항원 결합 도메인;
막관통 도메인; 및
세포내 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CARCD8+를 투여하는 단계를 추가로 포함하며, 제2 CARCD8+는 CARCD8+ 상에 존재하지 않는 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 공동자극 신호전달 도메인을 포함하고, 임의로 ICOS 신호전달 도메인을 포함하지 않는다.
생체고분자 전달 방법
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 하나 이상의 CAR-발현 세포는 생체고분자 스캐폴드, 예를 들어 생체고분자 임플란트를 통해 대상체에게 투여되거나 전달될 수 있다. 생체고분자 스캐폴드는 본원에 기술된 CAR-발현 세포의 전달, 증식, 및/또는 분산을 지지하거나 강화할 수 있다. 생체고분자 스캐폴드는 자연발생적 또는 합성적일 수 있는 생체적합성(예를 들어, 염증 또는 면역 반응을 실질적으로 유도하지 않음) 및/또는 생분해성 중합체를 포함한다. 예시적인 생체고분자는, 예를 들어 전문이 본원에 참조로 포함되는, 2015년 3월 13일 출원된 국제 출원 WO2015/142675의 단락 1004~1006에 기술되어 있다.
약학적 조성물 및 치료
일부 구현예에서, 본 개시는 본원에 기술된 바와 같이 생산된 CAR-발현 세포를, 임의로 하나 이상의 다른 요법과 조합하여, 투여하는 단계를 포함하는, 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 본원에 기술된 바와 같은 CAR-발현 세포를 포함하는 반응 혼합물을, 임의로 하나 이상의 다른 요법과 조합하여, 투여하는 단계를 포함하는, 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 본원에 기술된 바와 같은 CAR-발현 세포를 포함하는 반응 혼합물을 운송 또는 수용하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 본원에 기술된 바와 같이 생산된 CAR-발현 세포를 수용하는 단계를 포함하고, 환자에게 CAR-발현 세포를, 임의로 하나 이상의 다른 요법과 조합하여 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 CAR-발현 세포를 본원에 기술된 바와 같이 생산하는 단계를 포함하고, 환자에게 CAR-발현 세포를, 임의로 하나 이상의 다른 요법과 조합하여 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 다른 요법은, 예를 들어 암 요법, 예컨대 화학요법일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 CAR을 발현하는 세포는 Treg 세포 집단을 감소시키는 분자와 조합하여 대상체에게 투여된다. Treg 세포의 수를 감소시키는(예를 들어, Treg 세포를 고갈시키는) 방법은 당업계에 알려져 있고, 예를 들어 CD25 고갈, 시클로포스파미드 투여, GITR 기능 조정을 포함한다. 이론에 구애되고자 함이 없이, 성분채집 전 또는 본원에 기술된 CAR-발현 세포의 투여 전에 대상체에서 Treg 세포의 수를 감소시키는 것은 종양 미세환경에서 원치 않는 면역 세포(예를 들어, Treg)의 수를 감소시키고 대상체의 재발 위험을 감소시키는 것으로 여겨진다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 요법, 예를 들어 CAR-발현 세포는 GITR을 표적화하고/표적화하거나 GITR 기능을 조정하는 분자, 예컨대 GITR 작용제 및/또는 조절 T세포(Treg)를 고갈시키는 GITR 항체와 조합하여 대상체에게 투여된다. 구현예에서, 본원에 기술된 CAR을 발현하는 세포는 시클로포스파미드와 조합하여 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, GITR 결합 분자 및/또는 GITR 기능을 조정하는 분자(예를 들어, GITR 작용제 및/또는 Treg-고갈 GITR 항체)는 CAR-발현 세포 이전에 투여된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, GITR 작용제는 세포의 성분채집 전에 투여될 수 있다.　구현예에서, 시클로포스파미드는 CAR-발현 세포의 투여(예를 들어, 주입 또는 재주입) 전에 또는 세포의 성분채집 전에 대상체에게 투여된다. 구현예에서, 시클로포스파미드 및 항-GITR 항체는 CAR-발현 세포의 투여(예를 들어, 주입 또는 재주입) 전에 또는 세포의 성분채집 전에 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체는 암(예를 들어, 고형 암 또는 혈액암, 예컨대 ALL 또는 CLL)을 앓는다. 일부 구현예에서, 대상체는 CLL을 앓는다. 구현예에서, 대상체는 ALL을 앓는다. 구현예에서, 대상체는 고형 암, 예를 들어 본원에 기술된 고형 암을 앓는다. 예시적인 GITR 작용제는 예를 들어 GITR 융합 단백질 및 항-GITR 항체(예를 들어, 2가 항-GITR 항체), 예컨대 미국 특허 6,111,090호, 유럽 특허 090505B1호, 미국 특허 8,586,023호, PCT 공개 WO 2010/003118호 및 2011/090754호에 기재된 GITR 융합 단백질, 또는 예를 들어 미국 특허 7,025,962호, 유럽 특허 1947183B1호, 미국 특허 7,812,135호, 미국 특허 8,388,967호, 미국 특허 8,591,886호, 유럽 특허 EP 1866339호, PCT 공개 WO 2011/028683호, PCT 공개 WO 2013/039954호, PCT 공개 WO2005/007190호, PCT 공개 WO 2007/133822호, PCT 공개 WO2005/055808호, PCT 공개 WO 99/40196호, PCT 공개 WO 2001/03720호, PCT 공개 WO99/20758호, PCT 공개 WO2006/083289호, PCT 공개 WO 2005/115451호, 미국 특허 7,618,632호, 및 PCT 공개 WO 2011/051726호에 기재된 항-GITR 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 CAR-발현 세포는 GITR 작용제, 예를 들어 본원에 기술된 GITR 작용제와 조합하여 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, GITR 작용제는 CAR-발현 세포 이전에 투여된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, GITR 작용제는 세포의 성분채집 전에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 CLL을 앓는다.
본원에 기술된 방법은 CAR-발현 세포를 약학적 조성물에 제형화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 약학적 조성물은, 본원에 기술된 바와 같은 CAR-발현 세포, 예를 들어 복수의 CAR-발현 세포를 하나 이상의 약학적으로 또는 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제와 조합하여 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 완충제, 예컨대 중성 완충 식염수, 인산염 완충 식염수 등; 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산, 예컨대 글리신; 항산화제; 킬레이팅제, 예컨대 EDTA 또는 글루타티온; 보조제(예를 들어, 수산화알루미늄); 및 보존제를 포함할 수 있다. 조성물은 예를 들어, 정맥내 투여용으로 제형화될 수 있다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 예를 들어 내독소, 미코플라스마, 복제가능 렌티바이러스(RCL), p24, VSV-G 핵산, HIV gag, 잔류 항-CD3/항-CD28 코팅 비드, 마우스 항체, 풀링된 인간 혈청, 소혈청 알부민, 소혈청, 배양 배지 성분, 벡터 패키징 세포 또는 플라스미드 성분, 박테리아 및 진균으로 이루어진 군으로부터 선택된 오염물이 실질적으로 없다(예를 들어, 검출 가능한 수준으로 존재하지 않는다). 일부 구현예에서, 박테리아는 알칼리게네스 파에칼리스(Alcaligenes faecalis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 에셰리키아 콜라이(Escherichia coli), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza), 네이세리아 메닌기티데스(Neisseria meningitides), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코쿠스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia), 및 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 그룹 A로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나이다.
"면역학적 유효량", "항암 유효량", "암 억제 유효량", 또는 "치료량"이 표시되는 경우, 투여할 조성물의 정확한 양은 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이의 정도, 및 환자(대상체) 상태의 개인차를 고려하여 의사가 결정할 수 있다. 일반적으로, 본원에 기술된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T세포, NK세포)를 포함하는 약학적 조성물은 104 내지 109개 세포/kg(체중), 일부 예에서 105 내지 106개 세포/kg(체중)의 투여량(상기 범위 내의 모든 정수값 포함)으로 투여될 수 있음이 언급될 수 있다. T세포 조성물은 또한 이러한 투여량으로 다회 투여될 수 있다. 세포는 면역요법에서 일반적으로 알려져 있는 주입 기술을 사용하여 투여될 수 있다(예를 들어, 문헌[Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988] 참조).
일부 구현예에서, CAR 세포(예를 들어, CD19 CAR 세포)의 용량은 약 1 x 106, 1.1 x 106, 2 x 106, 3.6 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 1.8 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 또는 5 x 108개 세포/kg을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR 세포(예를 들어, CD19 CAR 세포)의 용량은 적어도 약 1 x 106, 1.1 x 106, 2 x 106, 3.6 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 1.8 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 또는 5 x 108개 세포/kg을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR 세포(예를 들어, CD19 CAR 세포)의 용량은 최대 약 1 x 106, 1.1 x 106, 2 x 106, 3.6 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 1.8 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 또는 5 x 108개 세포/kg을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR 세포(예를 들어, CD19 CAR 세포)의 용량은 약 1.1 x 106 내지 1.8 x 107개 세포/kg을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR 세포(예를 들어, CD19 CAR 세포)의 용량은 약 1 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 2 x 109, 또는 5 x 109개 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR 세포(예를 들어, CD19 CAR 세포)의 용량은 적어도 약 1 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 2 x 109, 또는 5 x 109개 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR 세포(예를 들어, CD19 CAR 세포)의 용량은 최대 약 1 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 2 x 109, 또는 5 x 109개 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 활성화된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T세포, NK세포)를 대상체에게 투여한 후, 후속적으로 혈액을 재채취하고 (또는 성분채집을 수행하고), 그로부터의 면역 이펙터 세포(예를 들어, T세포, NK세포)를 활성화하고, 환자에게 이들 활성화되고 증식된 면역 이펙터 세포(예를 들어, T세포, NK세포)를 재주입하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 프로세스는 수주마다 다회 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 이펙터 세포(예를 들어, T세포, NK세포)는 10 cc 내지 400 cc의 채혈로부터 활성화될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 이펙터 세포(예를 들어, T세포, NK세포)는 20 cc, 30 cc, 40 cc, 50 cc, 60 cc, 70 cc, 80 cc, 90 cc, 또는 100 cc의 채혈로부터 활성화된다.
대상 조성물의 투여는 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본원에 기술된 조성물은 경동맥으로, 피하로, 피내로, 종양내로, 결절내로, 수질내로, 근육내로, 정맥내(i.v.) 주사에 의해, 또는 복강내로, 예를 들어 피내 또는 피하 주사에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 면역 이펙터 세포(예를 들어, T세포, NK세포)의 조성물은 종양, 림프절, 또는 감염 부위 내로 직접 주사될 수 있다.
투여 요법
일부 구현예에서, 생존 가능한 CAR-발현 세포(예를 들어, 생존 가능한 CD19, BCMA, CD20, 또는 CD22 CAR-발현 세포)의 용량은 약 0.5 x 106개의 생존 가능한 CAR-발현 세포 내지 약 1.25 x 109개의 생존 가능한 CAR-발현 세포(예를 들어, 0.5 x 106개의 생존 가능한 CAR-발현 세포 내지 1.25 x 109개의 생존 가능한 CAR-발현 세포)를 포함한다. 일부 구현예에서, 생존 가능한 CAR-발현 세포(예를 들어, 생존 가능한 CD19, BCMA, CD20, 또는 CD22 CAR-발현 세포)의 용량은 약 1 x 106, 약 2.5 x 106, 약 5 x 106, 약 1.25 x 107, 약 2.5 x 107, 약 5 x 107, 약 5.75 x 107, 또는 약 8 x 107개의 생존 가능한 CAR-발현 세포를 포함한다.
환자 선택
대상체의 치료 방법 또는 본원에 개시된 사용을 위한 조성물 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 대상체는 암, 예를 들어 혈액암을 앓는다. 일부 구현예에서, 암은 림프구성 백혈병(CLL), 맨틀세포 림프종(MCL), 다발성 골수종, 급성 림프성 백혈병(ALL), 호지킨 림프종, B세포 급성 림프성 백혈병(BALL), T세포 급성 림프성 백혈병(TALL), 소림프구성 백혈병(SLL), B세포 전림프구성 백혈병, 모세포성 형질세포양 수지상세포 신생물, 버킷 림프종, 확산성 거대 B세포 림프종(DLBCL), 만성 염증과 관련된 DLBCL, 만성 골수성 백혈병, 골수증식성 신생물, 소포 림프종, 소아 소포 림프종, 모발상세포 백혈병, 소세포- 또는 대세포-소포 림프종, 악성 림프증식성 병태, MALT 림프종(점막-관련 림프 조직의 외연 변연부 림프종), 변연부 림프종, 골수이형성증, 골수이형성 증후군, 비호지킨 림프종, 형질모세포성 림프종, 형질세포양 수지상세포 신생물, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 비장 변연부 림프종, 비장 림프종/백혈병, 비장 확산성 적색 속질 소 B세포 림프종, 모발상세포 백혈병-변이체, 림프형질세포성 림프종, 중쇄병, 형질세포 골수종, 뼈의 고립성 형질세포종, 골외 형질세포종, 결절 변연부 림프종, 소아 결절 변연부 림프종, 원발성 피부 소포중심 림프종, 림프종양 육아종증, 원발성 종격동(흉선) 거대 B세포 림프종, 혈관내 거대 B세포 림프종, ALK+ 거대 B세포 림프종, HHV8-관련 다심성 캐슬맨 질환에서 발생하는 거대 B세포 림프종, 원발성 삼출 림프종, B세포 림프종, 급성 골수성 백혈병(AML), 또는 미분류 림프종으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 암은 재발성 및/또는 불응성 암이다.
대상체의 치료 방법 또는 본원에 개시된 사용을 위한 조성물 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 대상체는 CLL 또는 SLL을 앓는다. 일부 구현예에서, CLL 또는 SLL을 앓는 대상체는 이전에 BTK 억제제 요법, 예를 들어 이브루티닙을 적어도 1~12개월, 예를 들어 6개월 동안 투여받았다. 일부 구현예에서, BTK 억제제 요법, 예를 들어 이브루티닙 요법은 제2선 요법이다. 일부 구현예에서, 대상체는 BTK 억제제 요법에 대해 부분 반응을 나타냈거나 또는 안정 질환을 나타냈다. 일부 구현예에서, 대상체는 BTK 억제제 요법에 반응하지 않았다. 일부 구현예에서, 대상체는 내성이 발생했고, 예를 들어 이브루티닙 내성 돌연변이가 발생했다. 일부 구현예에서, 이브루티닙 내성 돌연변이는 BTK를 암호화하는 유전자 및/또는 PLCg2를 암호화하는 유전자의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체는 예를 들어, 적어도 18세의 성인이다.
대상체의 치료 방법 또는 본원에 개시된 사용을 위한 조성물 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 대상체는 DLBCL, 예를 들어 재발성 및/또는 불응성 DLBCL을 앓는다. 일부 구현예에서, DLBCL, 예를 들어 재발성 및/또는 불응성 DLBCL을 앓는 대상체는 이전에 적어도 2선의 화학요법, 예를 들어 항-CD20 요법 및/또는 안트라사이클린 기반의 화학요법을 투여받은 적이 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 이전에 줄기세포 요법, 예를 들어 자가 줄기세포 요법을 받은 적이 있고, 상기 줄기세포 요법에 반응하지 않았다. 일부 구현예에서, 대상체는 줄기세포 요법, 예를 들어 자가 줄기세포 요법에 적합하지 않다. 일부 구현예에서, 대상체는 예를 들어, 적어도 18세의 성인이다.
CAR 효과 평가를 위한 바이오마커
일부 구현예에서, 대상체(예를 들어, 암, 예를 들어 혈액암을 앓는 대상체)에서 CAR-발현 세포 요법(예를 들어, CD19 또는 BCMA CAR 요법)의 효과를 평가하거나 모니터링하는 방법이 본원에 개시된다. 상기 방법은 CAR 요법에 대한 효과값을 획득하는 단계를 포함하며, 상기 값은 CAR-발현 세포 요법의 효과 또는 적합성을 나타낸다.
구현예에서, CLL 또는 SLL을 앓는 대상체에서 CAR 요법에 대한 효과값은 다음 파라미터 중 1, 2, 3개, 또는 전부의 척도를 포함한다:
(i) 샘플(예를 들어, 성분채집 샘플 또는 제조된 CAR-발현 세포 생성물 샘플)에서 BTK를 암호화하는 유전자의 돌연변이;
(ii) 샘플(예를 들어, 성분채집 샘플 또는 제조된 CAR-발현 세포 생성물 샘플)에서 PLCg2를 암호화하는 유전자의 돌연변이;
(iii) 샘플(예를 들어, 대상체로부터의 성분채집 샘플 또는 종양 샘플)에서, 예를 들어 CD8, CD4, CD3, CD5, CD19, CD20, CD22, CD43, CD79b, CD27, CD45RO, CD45RA, CCR7, CD95, Lag3, PD-1, Tim-3, 및/또는 CD81의 수준 및/또는 활성으로 평가하거나; 또는 면역글로불린 심층 시퀀싱(deep sequencing)으로 평가한, 최소 잔류 질환; 또는
(iv) 샘플, 예를 들어 대상체로부터의 성분채집 샘플에서, IFN-g, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-15, TNF-a, IP-10, MCP1, MIP1a로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10종의 또는 모든 사이토카인의 수준 또는 활성.
구현예에서, DLBCL, 예를 들어 재발성 및/또는 불응성 DLBCL을 앓는 대상체에서 CAR 요법에 대한 효과값은 다음 파라미터 중 하나 또는 둘 모두의 척도를 포함한다:
(i) 샘플(예를 들어, 대상체로부터의 성분채집 샘플 또는 종양 샘플)에서, 예를 들어 CD8, CD4, CD19, CD3, CD27, CD45RO, CD45RA, CCR7, CD95, Lag3, PD-1, 및/또는 Tim-3의 수준 및/또는 활성으로 평가하거나; 또는 면역글로불린 심층 시퀀싱으로 평가한, 최소 잔류 질환; 또는
(ii) 샘플(예를 들어, 대상체로부터의 성분채집 샘플)에서, IFN-g, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-15, TNF-a, IP-10, MCP1, MIP1a로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10종의 또는 모든 사이토카인의 수준 또는 활성.
다른 구현예에서, CAR 요법에 대한 효과값은 다음 파라미터 중 1, 2, 3, 4, 5, 6개 이상(전부)의 척도를 추가로 포함한다:
(i) 샘플(예를 들어, 성분채집 샘플 또는 제조된 CAR-발현 세포 생성물 샘플)에서, 휴면 TEFF 세포, 휴면 TREG 세포, 더 어린 T세포(예를 들어, 나이브 T세포(예를 들어, 나이브 CD4 또는 CD8 T세포, 나이브 감마/델타 T세포), 또는 줄기 기억 T세포(예를 들어, 줄기 기억 CD4 또는 CD8 T세포, 또는 줄기 기억 감마/델타 T세포), 또는 초기 기억 T세포, 또는 이의 조합 중 1, 2, 3종 이상(예를 들어, 전부)의 수준 또는 활성;
(ii) 샘플(예를 들어, 성분채집 샘플 또는 제조된 CAR-발현 세포 생성물 샘플)에서, 활성화 TEFF 세포, 활성화 TREG 세포, 더 늙은 T세포 (예를 들어, 더 늙은 CD4 또는 CD8 세포), 또는 후기 기억 T세포, 또는 이의 조합 중 1, 2, 3종 이상(예를 들어, 전부)의 수준 또는 활성;
(iii) 샘플(예를 들어, 성분채집 샘플 또는 제조된 CAR-발현 세포 생성물 샘플)에서, 면역 세포 소진 마커, 예를 들어 1, 2종 이상의 면역 체크포인트 억제제(예를 들어, PD-1, PD-L1, TIM-3, TIGIT, 및/또는 LAG-3)의 수준 또는 활성. 일부 구현예에서, 면역 세포는 소진된 표현형을 갖는다. 예를 들어, 적어도 2종의 소진 마커를 공동 발현한다. 예를 들어, PD-1 및 TIM-3을 공동 발현한다. 다른 구현예에서, 면역 세포는 소진된 표현형을 갖는다. 예를 들어, 적어도 2종의 소진 마커를 공동 발현한다. 예를 들어, PD-1 및 LAG-3을 공동 발현한다;
(iv) 샘플(예를 들어, 성분채집 샘플 또는 제조된 CAR-발현 세포 생성물 샘플)에서, 예를 들어 CD4+ 또는 CD8+ T세포 집단에서 CD27 및/또는 CD45RO-(예를 들어, CD27+ CD45RO-) 면역 이펙터 세포의 수준 또는 활성;
(v) CCL20, IL-17a, IL-6, PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L, KLRG1로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11종의 또는 모든 바이오마커의 수준 또는 활성;
(vi) CAR-발현 세포 생성물 샘플, 예를 들어 CALL-1 발현 세포 생성물 샘플에서 사이토카인의 수준 또는 활성(예를 들어, 사이토카인 레퍼토리의 품질); 또는
(vii) 제조된 CAR-발현 세포 생성물 샘플에서 CAR-발현 세포의 형질도입 효율.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 구현예에서, CAR-발현 세포 요법은 복수의 CAR-발현 면역 이펙터 세포(예를 들어, 이의 집단), 예를 들어 복수의 T세포 또는 NK세포(예를 들어, 이의 집단), 또는 이의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR-발현 세포 요법은 CD19 CAR 요법이다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 본원에 개시된 파라미터 중 하나 이상의 척도는 대상체로부터 얻은 성분채집 샘플로부터 얻는다. 성분채집 샘플은 주입 또는 재주입 전에 평가될 수 있다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 본원에 개시된 파라미터 중 하나 이상의 척도는 대상체로부터 얻은 종양 샘플로부터 얻는다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 본원에 개시된 파라미터 중 하나 이상의 척도는 제조된 CAR-발현 세포 생성물 샘플, 예를 들어 CD19 CAR-발현 세포 생성물 샘플로부터 얻는다. 제조된 CAR-발현 세포 생성물은 주입 또는 재주입 전에 평가될 수 있다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 대상체는 CAR-발현 세포 요법을 받기 전에, 받는 중에, 또는 받은 후에 평가된다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 본원에 개시된 파라미터 중 하나 이상의 척도는 유전자 발현, 유세포 분석, 또는 단백질 발현 중 하나 이상에 대한 프로파일을 평가한다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 방법은 본원에 개시된 파라미터 중 하나 이상의 척도에 기초하여, 대상체를 반응자, 비반응자, 재발자, 또는 비재발자로 확인하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 반응자, 예를 들어 완전 반응자는 기준값, 예를 들어 비반응자의 CD8+ T세포의 백분율과 비교하여, 더 큰, 예를 들어 통계적으로 유의미하게 더 큰 백분율의 CD8+ T세포를 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 반응자, 예를 들어 완전 반응자는 기준값, 예를 들어 비반응자의 CD27+ CD45RO- 면역 이펙터 세포 수와 비교하여, 예를 들어 CD8+ 집단 중 더 큰 백분율의 CD27+ CD45RO- 면역 이펙터 세포를 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 반응자, 예를 들어 완전 반응자 또는 부분 반응자는 기준값, 예를 들어 비반응자의 CD4+ T세포의 백분율과 비교하여, 더 큰, 예를 들어 통계적으로 유의미하게 더 큰 백분율의 CD4+ T세포를 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 반응자, 예를 들어 완전 반응자는 기준값, 예를 들어 비반응자의 휴면 TEFF 세포, 휴면 TREG 세포, 더 어린 T세포, 또는 초기 기억 T세포의 수와 비교하여, 더 큰 백분율의, 휴면 TEFF 세포, 휴면 TREG 세포, 더 어린 T세포, 또는 초기 기억 T세포, 또는 이의 조합 중 1, 2, 3종 이상(예를 들어, 전부)을 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 비반응자는 기준값, 예를 들어 반응자의 활성화 TEFF 세포, 활성화 TREG 세포, 더 늙은 T세포 (예를 들어, 더 늙은 CD4 또는 CD8 세포), 또는 후기 기억 T세포의 수와 비교하여, 더 큰 백분율의, 활성화 TEFF 세포, 활성화 TREG 세포, 더 늙은 T세포(예를 들어, 더 늙은 CD4 또는 CD8 세포), 또는 후기 기억 T세포, 또는 이의 조합 중 1, 2, 3종 이상(예를 들어, 전부)을 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 비반응자는 더 큰 백분율의 면역 세포 소진 마커, 예를 들어 1, 2종 이상의 면역 체크포인트 억제제(예를 들어, PD-1, PD-L1, TIM-3, TIGIT, 및/또는 LAG-3)를 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된다. 일부 구현예에서, 비반응자는 반응자로부터의 PD-1 또는 LAG-3 발현 면역 이펙터 세포의 백분율과 비교하여, 더 큰 백분율의 PD-1, PD-L1, 또는 LAG-3 발현 면역 이펙터 세포(예를 들어, CD4+ T세포 및/또는 CD8+ T세포)(예를 들어, CAR-발현 CD4+ 세포 및/또는 CD8+ T세포)를 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된다.
일부 구현예에서, 비반응자는 더 큰 백분율의, 소진된 표현형을 갖는 면역 세포, 예를 들어 적어도 2종의 소진 마커를 공동 발현하는, 예를 들어 PD-1, PD-L1, 및/또는 TIM-3을 공동 발현하는 면역 세포를 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된다. 다른 구현예에서, 비반응자는 더 큰 백분율의, 소진된 표현형을 갖는 면역 세포, 예를 들어 적어도 2종의 소진 마커를 공동 발현하는, 예를 들어 PD-1 및/또는 LAG-3을 공동 발현하는 면역 세포를 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 비반응자는 CAR-발현 세포 요법에 대한 반응자(예를 들어, 완전 반응자)와 비교하여, 더 큰 백분율의 CAR-발현 세포 집단(예를 들어, CLL-1 CAR+ 세포 집단) 중 PD-1/ PD-L1+/LAG-3+ 세포를 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 반응자(예를 들어, 완전 또는 부분 반응자)는 다음 프로파일 중 1, 2, 3개 이상(또는 전부)을 갖는다:
(i) 기준값, 예를 들어 비반응자의 CD27+ 면역 이펙터 세포의 수와 비교하여, 더 큰 수의 CD27+ 면역 이펙터 세포를 가짐;
(ii) 기준값, 예를 들어 비반응자의 CD8+ T세포의 수와 비교하여, 더 큰 수의 CD8+ T세포를 가짐;
(iii) 기준값, 예를 들어 비반응자의 하나 이상의 체크포인트 억제제를 발현하는 세포의 수와 비교하여, 더 적은 수의, 하나 이상의 체크포인트 억제제, 예를 들어 PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3, 또는 KLRG-1, 또는 이의 조합으로부터 선택된 체크포인트 억제제를 발현하는 면역 세포를 가짐; 또는
(iv) 기준값, 예를 들어 비반응자의 휴면 TEFF 세포, 휴면 TREG 세포, 나이브 CD4 세포, 비자극 기억 세포, 또는 초기 기억 T세포의 수와 비교하여, 더 큰 수의, 휴면 TEFF 세포, 휴면 TREG 세포, 나이브 CD4 세포, 비자극 기억 세포, 또는 초기 기억 T세포, 또는 이의 조합 중 1, 2, 3, 4종 이상(전부)을 가짐.
구현예에서, 본원의 방법에 의해 확인된 반응자, 비반응자, 재발자, 또는 비재발자인 대상체는 임상 기준에 따라 추가로 평가될 수 있다. 예를 들어, 완전 반응자는 치료에 대해 완전 반응, 예를 들어 완전 관해를 나타내는 질환, 예를 들어 암을 앓는 대상체를 갖거나, 이러한 대상체로 확인된다. 완전 반응은 예를 들어, NCCN 가이드라인(NCCN Guidelines®), 또는 문헌[Hallek M et al., Blood (2018) 131:2745-2760 "iwCLL guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment, and supportive management of CLL"]에 개시된 만성 림프구성 백혈병 국제워크샵(International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia (iwCLL)) 2018년 가이드라인을 이용하여 확인될 수 있으며, 이들의 전체 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 부분 반응자는 치료에 대해 부분 반응, 예를 들어 부분 관해를 나타내는 질환, 예를 들어 암을 앓는 대상체를 갖거나, 이러한 대상체로 확인된다. 부분 반응은, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 NCCN 가이드라인 또는 iwCLL 2018 기준을 이용하여 확인될 수 있다. 비반응자는 치료에 대해 반응을 나타내지 않는 질환, 예를 들어 암을 앓는 대상체를 갖거나, 이러한 대상체로 확인되며, 예를 들어 이러한 환자는 안정 질환 또는 진행성 질환을 앓는다. 비반응자는, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 NCCN 가이드라인 또는 iwCLL 2018 기준을 이용하여 확인될 수 있다.
대안적으로, 또는 본원에 개시된 방법과 조합하여, 상기 값에 반응하여, 다음 단계 중 1, 2, 3, 4개 이상을 수행한다:
예를 들어 반응자 또는 비재발자에게, CAR-발현 세포 요법을 투여하는 단계;
변경된 용량의 CAR-발현 세포 요법을 투여하는 단계;
CAR-발현 세포 요법의 스케줄 또는 시간 경과를 변경하는 단계;
예를 들어 비반응자 또는 부분 반응자에게, CAR-발현 세포 요법과 조합하여 추가 제제, 예를 들어 체크포인트 억제제, 예를 들어 본원에 기술된 체크포인트 억제제를 투여하는 단계;
CAR-발현 세포 요법을 이용한 치료 전에 대상체에서 더 어린 T세포의 수를 증가시키는 요법을 비반응자 또는 부분 반응자에게 투여하는 단계;
예를 들어 비반응자 또는 부분 반응자로 확인된 대상체에 대해, CAR-발현 세포 요법의 제조 프로세스를 수정하는 단계, 예를 들어 CAR을 암호화하는 핵산을 도입하기 전에 더 어린 T세포를 강화하거나, 또는 형질도입 효율을 증가시키는 단계;
예를 들어 비반응자 또는 부분 반응자 또는 재발자에 대해, 대안적인 요법을 투여하는 단계; 또는
대상체가 비반응자 또는 재발자이거나, 또는 비반응자 또는 재발자로 확인되는 경우, 예를 들어 CD25 고갈, 시클로포스파미드, 항-GITR 항체, 또는 이의 조합의 투여 중 하나 이상에 의해, TREG 세포 집단 및/또는 TREG 유전자 표지를 감소시키는 단계.
실시예
본 발명은 하기 실험 실시예를 참조하여 더욱 상세히 설명된다. 이들 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공되고, 달리 명시되지 않는 한 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 따라서, 본 발명은 하기 실시예로 제한되는 것으로 해석되어서는 안 되며, 오히려 본원에 제공된 교시의 결과로서 명백해지는 임의의 모든 변형을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
실시예 1: 사이토카인 자극을 이용한 CART의 생성
요약
이 실시예는 "사이토카인 프로세스"라는 CART 제조 프로세스를 설명한다. 일부 구현예에서, 세포(예를 들어, T세포)는 배지(예를 들어, 혈청 함유 배지, 예를 들어 2% 혈청을 함유하는 배지)에 시딩된다. 하나 이상의 사이토카인(예를 들어, IL-2, IL-7, IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)), IL-21, 또는 IL-6(예를 들어, IL-6/sIL-6Ra)으로부터 선택된 하나 이상의 사이토카인) 및 CAR을 암호화하는 벡터(예를 들어, 렌티바이러스 벡터)가 세포에 첨가된다. 20~24시간 동안의 인큐베이션 후, 세포는 세척되고, 제형화되고, 동결보존된다. 예시적인 사이토카인 프로세스를 도 1a에 나타냈다.
종래의 CART 제조 프로세스와 비교하여, 수정된 이 프로세스는 CD3/CD28 자극 및 생체외 T세포 증식을 제거한다. 이론에 구애되고자 함이 없이, 항-CD3/항-CD28 비드는 중심 기억 세포로의 분화를 유도하는 반면, IL-15, IL-21, 및 IL-7과 같은 사이토카인은 형질도입된 CD3+ T세포의 미분화된 표현형을 보존하는 데 도움이 될 수 있다. 결과적으로, CD3/CD28 활성화를 수반하지 않는 사이토카인 프로세스는 종래의 접근법을 사용하여 생성된 CART 세포와 비교하여, 더 높은 백분율의 나이브/줄기 T세포가 있는 CART 세포를 생성할 수 있다.
방법
수집 24시간 이내의 성분채집물을 얻은 후, T세포를 정제하고, 수득한 T세포의 순도를 유세포 분석으로 평가하였다. T세포를 동결시키고, 사용에 필요할 때까지 액체 질소에 두었다.
대안적으로, 동결보존된 성분채집 샘플을 제조하고, Prodigy® 장치를 사용하여 CD4+ T세포 및/또는 CD8+ T세포를 강화한다.
IL-7 및 IL-15를 필요한 최종 농도의 1,000배로 제조하였다. IL-2를 배지에서 10배 희석하여 제조하였다.
[표 19]
Figure pct00097
증식기의 비드 자극 조건에서, 계산을 수행하여 3:1의 비드 대 세포 비의 최종 농도로 세포를 플레이팅하였다. Dynabeads® 자성 비드를 Dynamag®를 사용하여 2회 세척하고, 실험에 필요한 양의 배지에 재현탁시켰다. 세척된 비드를 특정 사이토카인과 세포를 함유한 튜브에 첨가하였다.
플레이팅시, 렌티바이러스 벡터를 사용하여 1의 감염 다중도(MOI)로 세포를 형질도입시켰다. 형질도입되는 벡터의 비부피는 사용 중인 벡터 로트의 감염 다중도(MOI) 및 농도(역가)를 기반으로 계산되었다. 역가 및 MOI는 일차 T 세포주를 기반으로 측정되었다.
자극을 위해 사이토카인만을 사용하는 조건에서, 세포를 세척 후 1E7/ml의 농도로 재현탁시키고, 조건에 따라 이미 사이토카인을 함유한 코니칼 튜브에 첨가하였다(표 19). 세포 및 사이토카인을 첨가한 후, 렌티바이러스 벡터를 첨가한 다음 배지를 첨가하였다.
모든 조건에서 세포를 혼합하고 1 ml를 24웰 플레이트의 14개 웰에 플레이팅하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO2의 인큐베이터에 넣었다.
다음날 세포를 수확하고 세포의 농도와 생존능을 기록하였다. 세포 독성 및 증식(EDU) 통합 분석을 이용하여 세포의 기능을 측정하였다. 이러한 세포를 "1일차 CART"라고 지칭하였다.
T세포 분화 상태에 대해 세포의 면역표현형을 분석하고, 유세포 분석을 이용하여 CAR의 형질도입을 평가하였다. 세포를 세척하고, 생존능 염료를 첨가한 다음, 항체 칵테일(표 20)을 첨가하고, 플레이트를 실온에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 세포를 2회 세척하고 BD fortessa에서 분석하기 전에 고정시켰다.
[표 20]
Figure pct00098
1일차 CART가 수확 후 증식 능력을 여전히 유지하는지 확인하기 위해, T25 플라스크에서 CD3/CD28 비드를 사용하여 3:1(비드 대 세포)의 비로 5e6개 세포/조건을 증식시켰다. Dynabeads® 마그네틱 비드를 전술한 바와 같이 세척하였다. 배지는 사이토카인을 함유하지 않았다. 세포를 37℃ 및 5% CO2의 인큐베이터에 넣었다.
2일마다 CD3/CD28 비드로 증식시킨 T세포의 경우, 세포를 계수하고 배양 중 최대 10일까지 유출시켰다. 10일차에 세포를 수확하고, 계수하고, 분화 패널(표 20)을 사용하여 면역표현형을 분석하고, Cryostor 10™에서 동결시켰다. 세포독성 분석, 증식 분석, 및 사이토카인 분비 분석을 포함하는 기능적 분석을 위해 세포를 해동시켰다.
10일 동안 시험관 내에서 CD3/CD28 비드의 존재하에 증식된 세포를 "10일차 CART"로 지칭하였다.
결과
정제된 T세포가 임의의 다른 활성화 자극의 부재하에 사이토카인과 함께 인큐베이션되었을 때, 1일차부터 4일차까지 형질도입의 증가가 있었다(도 1b). 시점 및 사이토카인 조건과 무관하게, CAR 양성 집단 내에서 우세한 집단은 나이브였다(도 1d, 도 1e, 및 도 1f). 활성화제의 제거는 원시 집단에 대한 형질도입의 향상으로 이어졌다. 특히, IL-2 또는 IL-15에 대한 노출은 시험관 내에서 자가 재생 T세포를 유지시켰다(도 1g). 테스트한 다른 사이토카인 처치(IL-7; IL2+IL7; IL-7+IL-15; 및 IL2+IL-15)하에서 유사한 현상이 관찰되었다(데이터 미도시). 사이토카인 프로세스(이 특정 실시예에서는 IL2 또는 IL-15 사용)는 CD45RO-CCR7+ 세포의 백분율을 유지시키거나 약간 증가시켰다(도 1g). IL-2, IL-15, 및 IL-7과 IL-15의 조합에 대한 유사한 데이터를 도 1h 및 도 1i에 나타냈다. 표시된 사이토카인으로 24시간 동안 T세포를 배양하자 CD3+ T세포의 나이브 표현형이 유지되었고, 중심 기억 T세포의 백분율이 감소되었다(도 1h 및 도 1i).
24시간 이내에 관찰된 형질도입이 안정적인지 확인하기 위해, 24시간 이내에 생성된 CART를 세척하여 임의의 잔류 바이러스를 제거하고 CD3/D28 증식 비드를 사용하여 10일에 걸쳐 증식시켰다. 증식된 세포는 1일차 CART와 거의 동등한 형질도입을 보여주었고, 이는 형질도입이 안정적임을 나타낸다(도 2a).
세포독성, 사이토카인 방출, 및 증식 분석을 이용하여 1일차 CART 및 10일차 CART의 기능성을 테스트하였다. 표적 세포는 CD19를 발현하는 B세포 ALL 세포주, Nalm6 세포였다. 세포독성 분석은 1일차 CART가 훨씬 더 적은 형질도입 세포를 가졌음에도 불구하고 증식 후 1일차 CART가 10일차 CART와 비교하여 사멸에서 동등함을 보여주었다(도 2b). 증식된 동일한 1일차 CART를 IFN-감마 분비에 대해 비교한 결과 10일차 CART와 비교하여 IFN-감마 분비가 더 낮은 것으로 확인되었고(도 2c), 이는 형질도입된 세포의 수의 차이로 인한 것일 가능성이 있었다. 1일차 CART가 더 높은 수준의 형질도입을 나타낸 별도의 연구에서, 더 높은 수준의 IFN-감마가 분비되었다(데이터 미도시). 또한, IL7 단독 조건을 제외한 모든 처치 조건으로부터의 1일차 CART는 10일차 CART와 비교하여 유사하거나 더 높은 증식을 나타냈다(도 2d). 도 2d에 제시된 데이터는 형질도입 수준에 대해 정규화되지 않았다.
10일차 CART에서 안정적인 형질도입이 관찰되었지만, 효율은 일관되게 낮았다. 렌티바이러스 벡터의 증가하는 감염 다중도(MOI)의 적정을 4개의 사이토카인 조건에서 테스트하였으며, 테스트한 모든 조건에서 형질도입과의 선형 관계가 관찰되었다(도 3a).
또한, 상이한 배지 조성(주로 5% 내지 2%에서 무혈청으로의 혈청 농도의 감소)을 비교하여 이들이 형질도입 효율에 영향을 미치는지를 확인하였다. 2% 인간 혈청으로의 혈청 감소는 가장 높은 형질도입 효율로 이어졌다(도 3b). Glutamax 단독 첨가도 형질도입 효율에 상당한 영향을 미치는 것으로 간주되었다.
다음으로, 마우스 ALL 모델을 사용하여 1일차 CART 및 10일차 CART의 생체내 항종양 활성을 조사하였다. 간략하게, 1일차 CART 및 10일차 CART를 80% 초과의 생존능으로 전술한 바와 같이 제조하였다(도 4a 및 도 4b). CART를 종양 보유 마우스에 투여하고 생체내 증식에 대해 모니터링하였다. 도 4c에 도시된 바와 같이, 1일차 CART는 10일차 대응물보다 더 높은 수준의 생체내 증식을 나타냈다. 특히, IL-2의 존재하에 제조된 CART는 가장 높은 수준의 생체내 증식을 나타냈다(도 4c). 1일차 CART가 10일차 CART와 비교하여 지연된 동역학을 나타냈지만, 테스트한 모든 CART는 생체내 종양 성장을 억제하였다(도 4d). 이 특정 공여체에서, IL2 조건은 가장 큰 생체내 종양 제거 능력을 보여주었다(도 4d).
또한, 이 제조 프로세스가 확장 가능한지 여부를 테스트하였다. 동결된 성분채집 샘플로부터의 정제된 T세포를 강화 후 24웰 플레이트 또는 PL30 백에서 IL2 또는 hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)의 존재하에 항-CD19 CAR로 형질도입시켰다. hetIL-15는 전문이 본원에 참조로 포함되는 WO 2014/066527에 기술되어 있으며, 가용성 형태의 인간 IL-15Ra와 복합체화된 인간 IL-15를 포함한다. 세포를 24시간 후에 수확하고, CAR의 발현을 테스트하였다. 도 5b에 도시된 바와 같이, IL2 또는 hetIL-15의 존재하에 24웰 플레이트에서부터 PL30 백으로 프로세스 규모를 확장시켰을 때, 관찰된 형질도입에는 영향이 없었다.
실시예 2: TCR 자극을 이용한 CART의 생성
요약
이 실시예는 "활성화 프로세스"라는 CART 제조 프로세스를 설명한다. 일부 구현예에서, 세포(예를 들어, T세포)를, IL-2를 함유하는 배지(예를 들어, 무혈청 배지, 예를 들어 OpTmizerTM 배지)(예를 들어, OpTmizerTM 보충제, GlutaMAX, 및 100 IU/ml의 IL-2를 함유하는 OpTmizerTM 배지)에 시딩하고, 세포 배양 장치에 넣고, 항-CD3/항-CD28(예를 들어, TransAct)과 접촉시킨다. 12시간 후, CAR을 암호화하는 벡터(예를 들어, 렌티바이러스 벡터)를 세포에 첨가하고, 세포를 인큐베이터에 다시 넣는다. 세포 배양 개시로부터 24시간째에 세포를 수확하고, 샘플링하고, 제형화한다. 이론에 구애되고자 함이 없이, 항-CD3/항-CD28(예를 들어, TransAct)을 이용한 짧은 CD3 및 CD28 활성화는 자가 재생 T세포의 효율적인 형질도입을 촉진한다.
이 실시예 및 다른 실시예에서, "종래의 제조(TM)" 프로세스라고 하는 CART 제조 프로세스를 대조군으로 사용하였다. 일부 구현예에서, T세포를 신선한 또는 동결보존된 백혈구 성분채집 샘플로부터 (예를 들어, 양성 또는 음성 선택을 이용하여) 선택하고, (예를 들어, 항-CD3/항-CD28 항체가 코팅된 Dynabeads®를 사용하여) 활성화하고, CAR 분자를 암호화하는 핵산 분자와 접촉시키고(예를 들어, CAR 분자를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입시키고), 시험관 내에서, 예를 들어 7, 8, 9, 10, 또는 11일 동안 증식시킨다. d9 대조군으로부터 CAR 세포를 제조하는 데 사용되는 방법으로서 예시적인 TM 프로세스가 이 실시예에 제공된다.
방법
일부 구현예에서, 본원에 제공된 활성화 프로세스는 동결된 또는 신선한 백혈구 성분채집 생성물로 시작한다. 계수 및 QC를 위한 샘플을 수득한 후, 생성물을 세포 분류기(예를 들어, 설치된 CliniMACS® Prodigy® 장치 키트)에 부착하고, 프로그램을 시작한다. 세포를 세척하고, 목적하는 표면 마커 또는 마커들(예컨대, CD3, CD4, CD8, CD27, CD28, CD45RO, CCR7, CD62L, CD14, CD34, CD95, CD19, CD20, CD22, 및/또는 CD56)에 결합하는 마이크로비드와 함께 인큐베이션시킨다. 세포를 자성 컬럼 사이로 통과시켜 비드 라벨링된 세포를 선택한다. 원하는 경우, 제2 표면 마커 세트(예컨대, CD3, CD4, CD8, CD27, CD28, CD45RO, CCR7, CD62L, CD14, CD34, CD95, CD19, CD20, CD22, 및/또는 CD56)에 결합하는 비드와 함께 음성 분획을 인큐베이션시키고, 세포를 다시 자성 분리 컬럼 사이로 통과시켜 세포를 추가로 분리할 수 있다. 단리된 세포를 다시 세척하고, 세포 배지를 분리 완충액으로 교체한다. 그 후, 정제된 세포를 계속 배양하거나 나중에 사용하기 위해 동결보존한다. 동결보존된 세포는 해동시켜, 사전에 가온시킨 세포 배지 중에 세척하고, 세포 배지에 재현탁시킬 수 있다. 신선한 세포가 배양물에 직접 첨가될 수 있다. 세포를 막 cm2당 0.4~1.2e6개의 세포로 막 생물반응기에 시딩하고, 항-CD3/항-CD28 비드/중합체, 나노입자, 또는 나노콜로이드와 같은 활성화 시약(및/또는 단독 또는 조합의 다음의 보조활성화제: ICOS, CD27, HVEM, LIGHT, CD40, 4-1BB, OX40, DR3, GITR, CD30, TIM1, CD2, 또는 CD226을 자극하는 시약)을 첨가하고, 세포 배지를 막 cm2당 0.25~2 ml의 최종 부피까지 첨가한다. CAR을 암호화하는 벡터(예를 들어, 렌티바이러스 벡터)를 배양 개시 후 즉시 또는 최대 18시간까지 첨가한다. 세포를 배양 개시 후 총 24 시간 동안 상기 벡터 및 활성화 시약과 함께 인큐베이션시킨다. 배양을 24시간 동안 진행한 후, 세포를 스월링 또는 피펫팅 또는 다른 교반에 의해 기계적으로 재현탁시키고, 시뮬레이션 시약 스캐폴드를 적절한 완충액으로 용해시킨다. 세포를 세척하여 불필요한 시약을 제거하고, 동결보존 배지에서 재제형화한다. 세포를 투여에 필요할 때까지 동결보존한다.
도 6a 내지 도 6c와 관련된 연구를 위해, 다음의 프로토콜을 사용하였다.
자동화 ficoll(Sepax 2, BioSafe)을 사용하여 신선한 ¼ 류코팩으로부터 세포를 정제하여 말초혈액 단핵 세포(PBMC)를 생성하였다. 이들 PBMC를 면역자기 음성 선택(PanT 음성 선택 키트, Miltenyi)을 이용하여 추가로 정제하여 고순도(98~100%)의 CD3 T세포를 생성하였다. 이들 세포를 막 생물반응기에서 OpTmizerTM(Thermo) 완전 배지(패키지 삽입물에 따라 제형화하고 100 IU/ml의 IL-2(Proleukin, Prometheus)로 보충함) 및 권장 용량의 항-CD3/CD28 활성화 시약(TransAct, Milenyi)과 함께 배양물에 넣었다. 그 후, 활성화를 위해 세포를 37℃, 5% CO2에서 12시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 인큐베이터에서 제거하고, 새로 해동시킨 렌티바이러스 벡터를 2.5 tu/세포의 감염 다중도(MOI)로 배양물에 첨가하였다. 형질도입을 위해 세포를 추가로 12시간 동안 인큐베이터로 되돌렸다. 세포를 수확하고, 배지로 2회 세척하고, 멸균 PBS(Invitrogen)에 직접 제형화하고, 꼬리 정맥을 통해 NSG 마우스에 주사하였다. d9 대조군의 세포를 10% 소태아 혈청(Seradigm)이 보충된 RPMI 배지(Thermo)(완전 배지, 즉, "R10") 및 T세포당 3개 비드의 항 CD3/28 증식기 Dynabeads®(Thermo)를 사용하여 플라스크(T25-T225, Corning)에서 성장시켰다. 그 후, 활성화를 위해 세포를 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 인큐베이터에서 제거하고, 새로 해동시킨 렌티바이러스 벡터를 2.5 tu/세포의 MOI로 배양물에 첨가하였다. 세포를 추가 7일 동안 인큐베이터로 되돌려, 2일마다 분할하여 5e5개 세포/ml의 농도를 유지시켰다. 증식된 세포를 50 ml의 원심분리 튜브(Corning)로 옮기고, 스탠딩 자석(Dynamag-50, Thermo)을 사용하여 2회의 비드 제거를 수행하였다. 그 후, 비드제거된 세포를 배지로 2회 세척하고, CryoStor10 동결배지(STEMCELL Technologies)에 제형화하고, CoolCell 장치(BioCision)를 사용하여 동결보존하고, 최소 48시간 동안 증기상 액체 질소에 보관하였다. 세포를 사전에 가온한 R10 배지에 해동시키고, 배지로 2회 세척한 후, 멸균 PBS(Invitrogen)에 직접 제형화하고, 꼬리 정맥을 통해 NSG 마우스에 주사하였다.
6~8주령의 NSG 마우스(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJl, Jackson Labs)에 루시퍼화 NALM6 종양세포(ATCC CRL-3273, ATCC)를 사전 조정 없이 CART 주입 4일 전에 1e6개 세포/마우스로 주사하였다. PBS 제형화된 CART 세포를 NSG당 2e6, 5e5, 또는 2e5개의 CAR+ 세포로 주사하거나, 또는 일치된 용량의 형질도입되지 않은 증식된 T세포 또는 PBS 비히클 대조군을 주사하였다. 매주 채혈, 격주 루시퍼라제 이미징(Xenogen IVIS, PerkinElmer), 및 격주 체중 측정으로 마우스를 모니터링하였다. 모든 동물의 독성의 징후(체중 감소, 빈사 상태)를 모니터링하고, 증상이 있는 경우 안락사시켰다. 모든 생존 마우스를 연구 종료시(제5주)에 안락사시키고, 말단 혈액, 골수, 및 비장 샘플을 얻었다. IACUC 및 기타 모든 적용 가능한 지침에 따라 연구를 수행하였다.
결과
CART 세포를 전술한 활성화 프로세스를 이용하여 생성하고, 마우스 ALL 모델에서 생체내 항종양 활성에 대해 특성화하였다. 도 6a 내지 도 6c에 도시된 바와 같이, 활성화 프로세스를 이용하여 제조된 CART 세포는 생체 내에서 강력한 항종양 활성을 나타냈다.
실시예 3: T세포 상에서의 IL6R 발현 및 T세포 증식에 미치는 사이토카인의 영향
재료 및 방법
T세포 배양
이전에 동결시킨 T세포를 해동시키고, 0일차에 표시된 사이토카인의 존재하에 αCD3/αCD28 dynal 비드(1:3의 세포 대 비드 비)와 접촉시켰다. 3일차부터, 3, 5, 6, 9, 12, 15, 및 18일차에 2배 더 많은 T세포 성장 배지(RPMI1640, 10% FBS, 2 mM L-글루타민, 100 μM 비필수 아미노산, 1 mM 피루브산나트륨, 10 mM Hepes, 55 μM β-머캅토에탄올, 10% FBS, 및 100 U/ml의 페니실린-스트렙토마이신)를 표시된 사이토카인(사이토카인 없음, rhIL2(50 IU/ml, Novartis), IL6(10 ng/ml, R&D systems), IL7(10 ng/ml, Peprotech), IL15(10 ng/ml, Peprotech), 및 IL21(10 ng/ml, Peprotech))이 있는 플레이트에 첨가하였다. 사이토카인 없이, IL6, 또는 IL21 처치된 세포는 18일차까지 배양하고, IL2, IL7, 또는 IL15로 처치된 세포는 25일차까지 배양하였다.
세포 표면 염색
세포를 표시된 시점에 수확한 다음, live/dead 염료(eFluro780, eBioscience), CD3(BioLegend, 클론#: OKT3), CD4(BioLegend, 클론#: OKT4), CD8(BD Bioscience, 클론#: RPA-T8), CD45RO(BioLegend, 클론#: UCHL1), CCR7(BioLegend, 클론#: G043H7), CD27(BD Horizon, 클론#: L128), CD127(BioLegend, 클론#: A019D5), CD57(BioLegend, 클론#: HCD57), CD126(BioLegend, 클론#: UV4), 및 CD130(R&D Systems, 클론#: 28126) 항체로 염색하였다. 세포를 FACS Fortessa로 얻은 다음, 데이터 분석을 위해 FlowJo 프로그램을 사용하였다.
세포내 사이토카인 염색
사이토카인 생성 세포의 백분율을 조사하기 위해, 25일차에 T세포를 수확한 후, 37℃의 인큐베이터에서 브레펠딘 A(BioLegend)의 존재하에 4시간 동안 PMA(50 ng/ml, Sigma-Aldrich) 및 이오노마이신(1 μM, Sigma-Aldrich)로 짧게 활성화하였다. 그 후, T세포를 live/dead 염료(eFluro780, eBioscience), CD3(BioLegend, 클론#: OKT3), CD4(BioLegend, 클론#: OKT4), CD8(BD Bioscience, 클론#: RPA-T8) 항체로 염색한 다음, 고정화 및 투과화하였다. 그 후, T세포를 IFN-γ(BioLegend, 클론#: 4S.B3), IL-2(BioLegend, MQ1-17H12), 및 TNF-a(BioLegend, Mab11)에 대한 항체로 추가로 염색하였다. 세포를 FACS Fortessa로 얻은 다음, 데이터 분석을 위해 FlowJo 프로그램을 사용하였다.
결과
IL6Rα 및/또는 IL6Rβ 발현 세포는 CD4 및 CD8 T세포 둘 모두의 덜 분화된 T세포 서브세트에서 강화되었다. 도 7a 및 도 7b에 도시된 바와 같이, 나이브 CD4 및 CD8 T세포는 상응하는 기억 T세포보다 더 높은 수준의 IL6Rα 및 IL6Rβ를 발현하였다. IL6Rα 및 IL6Rβ 둘 다를 발현하는 T세포는 우세하게 CD45RA+CD45RO-CD27+CD28+ 세포였다(도 8a 및 도 8b). TCR 자극시, IL6Rα 발현은 하향 조절되었으나, IL6Rβ 발현은 그렇지 않았다(도 11).
다음으로, T세포 증식에 미치는 영향에 대해 서로 다른 사이토카인을 비교하였다. 테스트한 사이토카인 중에서, IL15, IL2, 및 IL7은 T세포 증식을 향상시켰고, IL15가 가장 큰 향상을 나타냈다(도 12). 사이토카인 처치는 세포 크기(도 13a) 및 생존능(도 13b)에 영향을 미치지 않았다. 또한, IL15 처치는 IL6Rβ 발현 세포의 발현을 향상시켰다(도 14). IL6Rβ 발현 세포는 TCR 결합 후 15일차에 CD4 및 CD8 둘 다에서 주로 CD27+(도 16) 또는 CD57-(도 17) T세포 서브세트에 있었고, TCR 활성화 후 25일차에 IL2, IFNγ, 및 TNFα 사이토카인을 생성하였다(도 18).
실시예 4: 전임상 연구를 위한 TCR 자극을 이용한 CART의 생성
전임상 연구를 위한 조작 실행의 0일차 단위 작업은 0일차에 사용된 배지: Rapid 완충액 및 Rapid 배지(표 21)의 제조와 함께 시작되었다. Rapid 완충액(RB)은 0.5% HSA와 함께 CliniMACS® 완충액(Miltenyi)을 함유한다. 제조 0일차에 Rapid 배지(표 21)를 제형화하였고, 기본 배지는 Glutamax, IL-2, CTSTM 보충제, 및 ICSR이 있는 OpTmizerTM라는 규격품 배지를 함유한다. Prodigy® 장치를 0일차에 사용을 위해 준비시켰다.
[표 21]
Figure pct00099
0일차에 Prodigy® 장치를 준비시키는 동안, 건강한 공여체 백혈구 성분채집 물질을 해동시키고, 나중에 Prodigy® 상에 결합시킬 수 있는 600 mL의 이송 백으로 성분채집 물질을 합쳤다. IPC 샘플을 600 mL의 이송 백에서 추출하고, NC200으로 측정하여 출발 성분채집 물질에 대한 생존 가능한 세포 수와 생존능 백분율 둘 다를 얻었다. Prodigy®의 준비를 완료한 후, 성분채집 물질을 적용 백으로 옮겼다. TCT 프로그램 시작 후 성분채집물이 Prodigy® 장치에 들어간 후, 수행한 양성 선택 분리 횟수에 따라 3시간 45분에서 4시간 15분까지 프로그램을 실행하였다. 0일차에 TCT 프로그램은 Rapid 완충액을 사용하여 센트리컬트(Centricult)에서 DMSO를 세척 제거하고, 센트리컬트에서 혈소판 세척, 부피 감소, CD4 및 CD8 마이크로비드를 사용한 성분채집물의 인큐베이션을 수행한 다음, Prodigy®에서 자석을 사용한 양성 선택을 통해 마이크로비드로 T세포를 선택하였다. CD4 및 CD8 시약으로 선택한 T세포를 Rapid 배지를 사용하여 재적용(reapplication) 백에 용리시켰다. 프로세스 내 제어(In-process control, IPC) 샘플을 재적용 백에서 꺼내어, 배양 용기(G-Rex500MCS)에 시딩할 수 있는 총 생존 가능한 세포 수를 결정하였다.
G-Rex 배양 장치를 먼저 Rapid 배지로 준비시킨 후, 재적용 백으로부터 표적 세포 부피를 배양 용기에 첨가하였다. 이어서, 활성화 시약(TransACT)을 배양 용기에 첨가하였다. 그 후, TransACT 도입 후 렌티바이러스 벡터를 배양 용기에 첨가하고, 1.0의 MOI를 사용하여 벡터 첨가를 수행하였다. 그 후, G-Rex500MCS 배양 용기를 벡터 첨가 부피 + 250 mL의 최종 배지 부피까지 Rapid 배지로 플러싱하였다. 그 후, G-Rex 배양 용기를 인큐베이터에 넣어 배양물이 20~28시간의 범위에서 목표 24시간 동안 인큐베이션되도록 하였다.
목표 24시간의 인큐베이션 후, CART 배양물을 인큐베이터에서 꺼내 샘플을 추출하여 수확 세척 전에 세포 배양물의 생존 가능한 세포 수 및 생존능을 얻었다. 수확 전에 채취한 샘플은 IPC였으며, LOVO 세척 장치의 투입물로 사용하여 스피닝 여과막으로의 세포 유속을 결정하였다. LOVO는 생존 가능한 WBC 농도를 IPC로 사용하였다. CART 제조 프로세스에 사용된 프로그램은 하나의 용액으로 4회 세척하는 것으로 설명되었으며 수확 완충액(PBS + 2.0% HSA)을 사용하였다. LOVO 세척 중에, IPC 백을 사용하여 부피를 줄이고, 최종적으로 산출 백으로 용리시키기 전에 수확 완충액으로 세포를 세척하였다. 그 후, sanisure 병으로 수동 원심분리를 수행하고 동결배지로 최종 제형화의 최종 단계를 수행하기 위해, LOVO 세척의 산출 백을 샘플링하여, 생존 가능한 세포 수 및 생존능을 얻었다.
실시예 5: 활성화된 신속 제조(ARM) 프로세스를 이용한 BCMA CART의 생성
요약
이 실시예는 "활성화된 신속 제조(ARM)"라는 CART 제조 프로세스를 설명한다. 일부 구현예에서, 세포(예를 들어, T세포)를 배지(예를 들어, 무혈청 배지, 예를 들어 OpTmizerTM 배지), 재조합 인간 IL-2(예를 들어, OpTmizerTM 보충제, GlutaMAX, 및 100 IU/ml의 IL-2를 함유하는 OpTmizerTM 배지), 항-CD3/항-CD28(예를 들어, TransAct), 및 BCMA CAR을 암호화하는 벡터(예를 들어, 렌티바이러스 벡터)를 함유하는 세포 배양 장치에서 배양한다. 24시간 후, "1일차 CART 생성물"이라 지칭되는 세포를 수확하고, 샘플링하고, 제형화한다. 이론에 구애되고자 함이 없이, 항-CD3/항-CD28(예를 들어, TransAct)을 이용한 짧은 CD3 및 CD28 활성화는 자가 재생 T세포의 효율적인 형질도입을 촉진한다. 일부 경우에, 시험관내 BCMA CAR 발현 동역학을 측정하기 위한 배양 후 48시간, 72시간, 및 96시간 또는 7일 후에 일부 세포를 수확한다. 1일차 CART 반응은 생체내 세포용해 활성 및 증식을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
ARM 프로세스를 이용한 1일차 BCMA CART의 생성
일부 구현예에서, 본원에 제공된 활성화 프로세스는 동결된 또는 신선한 백혈구 성분채집 생성물로 시작한다. 계수 및 QC를 위한 샘플을 수득한 후, 생성물을 세포 분류기(예를 들어, 설치된 CliniMACS® Prodigy® 장치 키트)에 부착하고, 프로그램을 시작한다. 세포를 세척하고, CD4 및 CD8과 같은 목적하는 표면 마커에 결합하는 마이크로비드와 함께 인큐베이션시킨다. 세포를 자성 컬럼 사이로 통과시켜 비드 라벨링된 세포를 선택한다. 단리된 세포를 다시 세척하고, 세포 배지를 분리 완충액으로 교체한다. 그 후, 정제된 T세포를 계속 배양하거나 나중에 사용하기 위해 동결보존한다. 단리된 T세포의 순도는 유세포 분석 평가에 의해 QC 단계를 통과할 것이다. 동결보존된 세포는 해동시켜, 사전에 가온시킨 세포 배지 중에 세척하고, 세포 배지에 재현탁시킬 수 있다. 신선한 세포가 배양물에 직접 첨가될 수 있다. 막 cm2당 0.4~1.2e6개의 세포로 세포를 막 생물반응기에 시딩하고, 항-CD3/항-CD28 비드/중합체, 나노입자, 또는 나노콜로이드와 같은 활성화 시약을 첨가하고, 세포 배지를 막 cm2당 0.25~2 ml의 최종 부피까지 첨가한다. 플레이팅시, BCMA CAR을 암호화하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 다양한 감염 다중도(MOI)로 세포를 형질도입시켰다. 역가 및 MOI는 SupT1과 같은 세포주를 기반으로 측정한다. 24시간째에, 유세포 분석에 의한 CAR 발현 측정을 위한 염색 전에 세포를 세척하여 불필요한 시약을 제거하고, 동결보존 배지에 생체내 연구를 위한 "1일차 CART 생성물"로서 재제형화하였다.
ARM 프로세스를 이용하여 제조된 BCMA CAR R1B6, R1F2, R1G5, PI61, B61-02, B61-10, 또는 Hy03을 발현하는 T세포의 생성 및 특성화가 이 실시예에 기술된다. R1B6, R1F2, 및 R1G5의 서열은 표 3 내지 6에 개시되어 있다. PI61, B61-02, 및 B61-10의 서열은 표 7 내지 11에 개시되어 있다. Hy03의 서열은 표 12 내지 15에 개시되어 있다.
BCMA CAR을 암호화하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 2.5의 MOI로 T세포를 형질도입시킨 후 24시간 후에, rBCMA_Fc를 사용하여 유세포 분석에 의해 CAR의 발현을 측정하였다. 도 19a에 도시된 바와 같이, 살아있는 CD3+ T세포의 전체 집단이 상이한 정도로 우측으로 이동하였음이 관찰되었다. R1G5, R1B6, 또는 PI61을 발현하도록 형질도입된 세포가 가장 높은 CAR 발현을 나타냈다(도 19a). 유세포 분석에 의해 측정된 이 발현 패턴은 CAR을 발현하도록 형질도입된 세포의 전형적인 유세포 분석 히스토그램(CAR 양성 집단이 음성 집단과 명확히 분리됨)과는 상이하였다. 도 19a는 rBCMA_Fc에 의해 검출된 "유사형질도입 또는 일시적인 발현"이 있을 수 있음을 나타내며, 이는 항상 실제 유전자 발현을 나타내는 것은 아니다. 벡터 첨가시에 시작되어 CD34+ 세포에서 최대 24시간, 293 세포에서 최대 72시간 지속되는 렌티바이러스 유사형질도입이 관찰된 것으로 이전에 보고된 바 있다(문헌[Haas DL, et al. Mol Ther. 2000. 291: 71-80]). 인테그라제 결핍 렌티바이러스 벡터는 CD34+ 세포에서 최대 10일 동안, 293 세포에서 최대 14일 동안 일시적인 eGFP 발현을 유발하였다. T세포에서의 렌티바이러스 유사형질도입이 광범위하게 연구되지는 않았지만, 이러한 짧은 시간 내의 일시적인 발현의 가능성을 배제할 수 없다. 따라서, 하기 나타낸 바와 같이 ARM을 이용하여 제조된 세포의 CAR 발현을 측정하기 위해 시험관내 동역학 연구를 수행하였다.
ARM 프로세스를 이용하여 제조된 세포의 시험관내 CAR 발현 동역학 연구
여기에 기술된 연구는 ARM 프로세스를 이용하여 제조된 세포가 시간 경과에 따라 CAR 분자를 어떻게 발현하는지를 조사한다. 간략하게, 건강한 공여체의 T세포를 1의 MOI에서 ARM 프로세스를 이용하여 BCMA CAR을 발현하도록 제조하였으며, 상이한 기간 동안 배양액 중에 보관하였고, AF647이 라벨링된 rBCMA_Fc를 사용한 유세포 분석에 의해 CAR 발현 동역학을 평가하기 위해 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 및 7일차에 수확하였다. CAR 발현 동역학을 이해하는 것은 생체내 분류 또는 임상 투여 전략을 위한 실제적이고 안정적인 발현을 위한 대리 시점을 발견하는 데 도움을 준다.
1일차에, 1의 MOI로 형질도입된 세포의 CAR 발현 패턴(도 20a)은 2.5의 MOI로 형질도입된 세포의 것과 유사하다(도 19a). 두 MOI 조건 모두 1일차에 유사(pseudo) 또는 일시적인 발현 패턴을 나타냈다(도 19a 및 도 20a). 그러나 2일차에는, rBCMA_Fc 양성 집단이 UTD 음성 대조군으로부터 분리되기 시작했다(도 20a). 3일차 및 4일차에는, BCMA CAR-발현 세포를 나타내고 UTD군에는 없는 rBCMA_Fc 양성 집단이, BCMA CAR을 발현하도록 세포가 형질도입된 모든 군에서 명확하게 나타났다. 3일차부터 4일차까지, CAR+ %는 각각의 CAR 구성체에 대해 비교적 안정적이었으며(도 20b), 가장 높은 MFI는 3일차에 관찰되었다(도 20c)(세포는 이 시점에서 가장 컸다). 도 19a에 제시된 데이터와 일관되게, PI61, R1G5, 및 R1B6을 발현하도록 형질도입된 세포는 가장 높은 CAR 발현자였다(도 20a). 특히, R1F2 또는 Hy03을 암호화하는 벡터로 형질도입된 세포는 1일차에는 일시적인 CAR 발현을 나타내지 않았지만, 이후 3일차 및 4일차에 BCMA CAR 분자를 명확하게 발현시켰다(도 20a). 결론적으로, 상이한 CAR을 암호화하는 벡터는 시간이 지남에 따라 상이한 CAR 발현 동역학을 가질 수 있으며, CAR 발현을 위한 대리 시점으로 3일차를 선택하였다.
1일차 ARM 처리된 BCMA CART의 생체내 기능성 평가
파종성 KMS-11-luc 다발성 골수종 이종이식 마우스 모델을 사용하여 1일차 CART의 생체내 항종양 활성을 조사하였다. 루시퍼라제 리포터는 정량적 생체발광 이미징(BLI)에 의해 질환 부담의 모니터링을 가능하게 한다. 간략하게, 전술한 바와 같이 제조된 1일차 CART를 종양 보유 마우스에 투여하였다. 첫 번째 생체내 연구(도 21a 및 도 21b)에서, 각 마우스는 1.5E6개 세포의 용량으로 최종 CART 생성물을 투여받았다. 1일차 및 7일차에 CAR 발현을 분석하였다(도 21a). 생체내 효능 연구에서, PI61, R1G5, 또는 R1B6을 발현하는 세포는 강력한 항종양 활성을 나타냈다(도 21b). R1F2를 발현하는 세포는 지연된 효능을 나타냈다(도 21b). UTD군은 또한 CART 주사 14일 후에 부분적인 항종양 활성을 나타냈으며, 이는 동종반응 때문일 수 있다(도 21b). 두 번째 생체내 연구는 CAR+ T세포의 용량 적정을 테스트했다. CAR+ T세포의 용량은 3일차의 CAR+ %를 기반으로 하였다(도 22a). 종양 흡수 동역학을 BLI 측정에 의해 주 2회 모니터링하였다. 도 22a는 1일차 및 3일차에 검출된 CAR 발현을 보여준다. 생체내 결과는 1.5e5개 CAR+ T세포 및 5e4개 CAR+ T세포의 두 용량 모두에서 3종의 클론 PI61, R1B6, 및 R1G5 모두가 도 22b에 도시된 바와 같이 종양을 거부하고 제거할 수 있음을 나타낸다. 도 22c는 이 연구 과정에 걸쳐 GVHD의 징후를 나타내지 않는 체중 변화를 보여준다.
실시예 6: 12~24시간 사이에 수확된 신속 CART의 동역학
서설
신속 CART 생성물이 24시간 미만 내에 생성될 수 있는지를 확인하기 위해, 배양 12~24시간 후에 생성된 신속 CART를 수확하기 위한 동역학의 특성을 분석하였다. 이 평가는 동결보존된 건강한 공여체의 성분채집물로부터 강화된 T세포 및 시딩 시 TransAct 활성화 시약과 기술 등급의 CTL019 벡터의 동시 첨가를 이용하여 소규모로 수행되었다. 1차 판독값은 새로 수확된 CART 생성물에 대한 생존능, 증식 후 생존 가능한 세포 회수율, 백혈구 및 T세포 서브세트 조성, 및 (표면 면역표현형 분석을 통해 결정된) 형질도입 효율이었다.
방법
렌티바이러스 생성 및 역가 결정: CTL019를 암호화하는 렌티바이러스 벡터를 4.7x107 TU/mL의 HEK293T 기반 qPCR 역가 및 1.88x107 TU/mL의 근사 T세포 기반 역가로 제조하였다.
T세포 단리: 건강한 공여체 성분채집물의 동결보존된 류코팩(LKPK)을 Hemacare로부터 입수하여, 필요할 때까지 액체 질소에 보관하였다. 0일차에, 작은 얼음 결정이 남을 때까지 성분채집물을 해동시킨 후, Prodigy® 프로세스 완충액으로 희석하였다. 그 후, TS 520 튜빙 세트 및 T세포 형질도입(TCT) 프로그램 소프트웨어 버전 1.0을 구비한 CliniMACS® Prodigy®에서 자동화 CD4/CD8 양성 선택을 수행하였다. 최종 Prodigy® 생성물을 OpTmizerTM 완전 T세포 배지에서 용리시키고, Cellometer Vision(Nexcelom)에 열거된 AO/PI 염색에 의해 세포 농도와 생존능을 결정하였다.
배양 개시 및 형질도입: Prodigy® 생성물의 세포를 총 7개의 용기(형질도입 배양용 5개의 용기 및 비형질도입(UTD) 배양용 2개의 용기)에 즉시 시딩하였다. 시점 0에서, 각 용기에 막 cm2당 0.6x106개의 생존 가능한 세포의 밀도로 시딩하고, GMP 등급 TransAct를 첨가하고, IL-2를 함유하는 OpTmizerTM 완전 T세포 배지로 최종 농도를 1.2×106개의 생존 가능한 세포/mL가 되도록 하였다. 벡터를 실온에서 해동시키고, 근사 T세포 역가를 기반으로 0.45의 MOI로 각 형질도입된 배양물에 첨가하였다. UTD 대조군에는 바이러스가 첨가되지 않았다. 시딩된 후에는, 수확 준비가 될 때까지 37℃ 및 5% CO2에서 배양물을 인큐베이션시켰다.
수확: 배양 개시 12~24시간 후 각각의 시점에서, 수확을 위해 하나의 형질도입된 배양물을 선택하였다. 용기를 스월링시켜 세포를 막에서 부드럽게 재현탁시켜 수확하고, 전체 배양 부피를 재현탁시키고, 혈청 피펫으로 코니칼 튜브로 옮겼다. 세척 전 계수, 생존능 결정, 및 유동 염색을 위해 소량의 분취량을 취했다. 각 배양물의 나머지를 50 mL에서 2회(UTD 용기의 경우 100 mL에서 2회) 세척하고, 재현탁시키고, 세척 후 분취량을 취하여 계수 및 생존능을 조사하였다.
CART 제조 중 백혈구 조성 및 CD19-CAR 발현의 유세포 분석: 배양 전후의 프로세스 내 샘플을 백혈구 조성, T세포 표현형, 및 해당되는 경우 CAR 발현에 대해 염색시켰다. 형질도입된 T세포 상의 CTL019-CAR 발현을 맞춤형 형광단 라벨링된 항-이디오타입 항체(eBioscience)를 사용하여 평가하였다. 각 수확 시점에서, 배양물의 분취량을 생존능 염료(Biolegend)로 즉시 염색하고 세척한 다음, CD3 착색제 및 항-이디오타입 항체 둘 다를 함유하는 두 개의 유동 패널로 염색하고, 획득을 위해 파라포름알데히드에 고정시켰다. 샘플을 유세포 분석기(BD LSRFortessa; 보정을 위해 단색 대조군을 사용함)에서 측정하였고, 데이터를 FlowJo 소프트웨어로 분석하였다. 분석을 위해, 백혈구 조성에 대해 염색된 모든 샘플을 생존 가능한 CD45+ 단일항 이벤트에서 사전 게이팅하고, T세포 서브세트에 대해 염색된 모든 샘플을 생존 가능한 CD3+ 단일항 이벤트에서 사전 게이팅하였다. CD45RO 및 CCR7에 대한 게이트를 FMO(fluorescence minus one) 대조군을 사용하여 확립하였다.
결과
배양 전 Prodigy® 생성물 LKPK 및 배양 후 CART 생성물의 백혈구 조성을 0일차 및 각 수확 시점에 유세포 분석을 이용하여 특성화하였다. 확인된 세포 유형은 T세포(CD3+), 단핵구(CD14+), B세포(CD19+), 자연살해(NK) 세포(CD3-56+), 및 기타 세포였다(표 22). Prodigy® 강화는 생존 가능성이 높은(92.9%) 0일차의 출발물질을 생성하였고, 오염된 B세포를 감소시키고(6%에서 0.10%로 감소), 단핵구와 NK세포를 각각 4% 미만으로 감소시키면서 T세포를 강화하였다(48%에서 92%로 강화). 배양 12~24시간 후, 생존 가능한 세포의 순도는 추가로 3~4.4% 증가하였고, 이는 단핵구와 B세포가 12시간째까지 즉시 감소하고 NK세포가 12 내지 24시간째 사이에 점진적으로 감소한 것과 부합하였다. 유세포 분석에 의해 세포외 CAR을 발현하는 백혈구 중 3% 미만이 오염 세포(즉, T세포가 아님)였으며, CAR 순도의 가장 큰 증가(96.6%에서 99.2%로 증가)는 시딩 후 15 내지 18시간 사이에 발생했다.
[표 22]
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배양 18시간 동안 CAR-발현 세포의 순도 증가(표 22)는 CAR 표면 발현을 갖는 T세포의 백분율 증가와 일치한다(도 23a 및 도 23c). 배양 24시간 후 유세포 분석에 의해 평가된 신속 CART 생성물에서 이전에 관찰된 바와 같이(실시예 5 참조), CAR 표면 발현은 뚜렷한 양성 및 음성 집단으로 이어지지 않았다. 따라서, UTD 샘플을 하한으로 사용하여 CAR 양성에 대한 게이팅을 설정하였다. 세포외 CAR을 발현하는 CD3+ 세포의 비율은 시딩 후 15시간까지 1% 미만으로 유지되었고, 그 후, CAR 발현은 3시간마다 3~4% 증가하여 포화없이 최대 11.8%까지 증가하였다(도 23a). MFI에 의해 결정된 CAR 발현의 강도는 또한 18시간 초과의 배양에서 약간 증가했지만, 24시간째까지 현저한 증가 없이 유지되었다(도 23b).
또한, T세포 서브세트(CD4:CD8 비 및 기억 서브세트 조성)를 CD4, CD8, CD45RO, 및 CCR7의 조합을 사용하여 각 시점(도 24a 및 도 24b)에서 평가하였다. 여기서, 미분화된 나이브-유사 T세포는 CCR7+CD45RO-, 중심 기억 세포는 CCR7+CD45RO+, 이펙터 기억 세포는 CCR7-CD45RO+, 고도로 분화된 이펙터 T세포는 CCR7-CD45RO-로 정의되었다. 평가한 모든 시점에서, UTD를 포함하여, 배양물은 초기 출발물질(각각 23% 및 52%)보다 더 큰 비율의 나이브 세포(40~47%) 및 더 낮은 비율의 중심 기억 세포(33~39%)를 함유하였다. 흥미롭게도, 벌크 조성에서 나이브 또는 중심 기억 T세포의 빈도는 12 내지 24시간 사이에서 변하지 않았지만, 이후 수확은 더 높은 빈도의, 나이브인 세포외 CAR-발현 세포 및 더 낮은 빈도의, 중심 기억인 세포외 CAR-발현 세포와 관련이 있었다(18시간에서 CAR-발현 세포 중 16% 나이브/63% 중심 기억 대 24시간에서 CAR-발현 세포 중 24% 나이브/54% 중심 기억). 유사하게, 벌크 CD4:CD8 비율은 크게 변하지 않았지만, CAR+ 세포의 CD4 분획은 18~24시간 사이에 10%만큼(66%에서 56%로) 감소하였다. 이들 빈도를 총 세포 수로 변환하면(도 25) 가장 초기에 CAR을 발현하는 것으로 보이는 T세포의 서브세트는 대부분 배양 15~18시간 사이에서 나이브 CD4 세포이며, 그 후, 나이브 CD8 CAR과 중심 기억 CD8 CAR의 빈도가 빠르게 증가함을 나타낸다.
각 수확 시점에서, 생존 가능한 세포 회수율(또는 배수 증식) 및 세척 전후의 생존능을 결정하였다(도 26 및 도 27). 생존 가능한 세포의 회수율은 시딩 후 18시간까지 13% 감소하였고(최저 46%, 증가된 세포외 CAR 발현율과 일치), 이후 시점에서 수확된 배양물의 경우 52%까지 약간 증가하였다(도 26). 생성물의 생존능은 세척 후 71~77%로 증가했으며, 수확에 대한 생존능은 15~24시간 사이에 감소하였다(도 27).
결론
12~24시간 사이에 테스트한 시점 중, TransAct 및 기술 등급의 CTL019 벡터와 동시에 시딩된 신속 CART는 24시간에서 가장 높은 CAR 표면 발현을 나타낸다. 시딩 후 15시간까지 CAR+(수확시 측정)는 극소수의 세포이며, 그 후 CAR %는 더 빠르게 증가한다. CAR 발현의 강도는 약하지만 시딩 후 18시간 후에 서서히 증가한다.
신속 CART 생성물은 처음 12시간 동안 단핵구 손실로 인해 시딩 후 12 내지 24시간 사이의 모든 시점에서 출발물질보다 순도가 높아지고(T세포 %가 더 높음), 이어서 NK세포의 약간의 손실이 있고, 잔류 B세포는 Prodigy® 강화에 의해 제거되지 않는다.
전체 세포 회수율은 시딩 18시간 후에 수확했을 때 가장 낮지만(24시간까지 약간 개선됨), 전체 T세포 조성은 시딩 후 12 내지 24시간 사이에 변하지 않는다. 세포외 CAR을 처음 발현하는 T세포는 시딩 후 15 내지 18시간 사이에 대부분 중심 기억 CD4이고, 그 후, 나이브 및 중심 기억 CD8이 CAR 발현을 나타낸다.
실시예 7: 활성화된 신속 제조(ARM) 프로세스의 설명
일부 구현예에서, CART 세포는 약 2일에 걸쳐 지속적인 활성화된 신속 제조(ARM) 프로세스를 이용하여 제조되며, 이는 잠재적으로 더 많은 수의 덜 분화된 T세포(T 나이브 및 TSCM(줄기 중심 기억 T) 세포)가 생체내 세포 증식을 위해 환자에게 되돌려질 수 있게 할 것이다. 짧은 제조 기간은 초기 분화된 T세포 프로파일이 생체외 배양 용기에서가 아니라 원하는 최종 분화된 상태를 위해 체내에서 증식할 수 있게 한다.
일부 구현예에서, CART 세포는 동결보존된 백혈구 성분채집 원료물질, 예를 들어 비가동화(non-mobilized) 자가 말초혈액 백혈구 성분채집(LKPK) 물질을 이용하여 제조된다. 동결보존된 원료물질은 항-CD4/항-CD8 면역자기 시스템에 의해 생성 첫 날(0일차)에 T세포 강화를 위한 처리 단계를 거친다. 그 후, 양성 분획을 G-rex 배양 용기에 시딩하고, 항-CD3/CD28 시스템(TransACT)으로 활성화하고, 같은 날 CAR을 암호화하는 렌티바이러스 벡터(LV)로 형질도입시킨다. 다음 날, 20~28시간의 형질도입 후, T세포를 수확하고, 4회 세척하고, 동결 배지에서 제형화한 다음, CRF(Controlled Rate Freezer)에 의해 동결시킨다. 0일차의 프로세스 시작부터 다음 날 수확 시작까지, 세포를 0일차 시딩 후 24시간을 목표로 20~28시간 동안 배양한다.
0일차용 배지를 표 21에 따라 제조하였다. 동결보존된 백혈구 성분채집 물질을 해동시킨다. 해동된 세포를 Rapid 완충액(표 21)으로 희석하고, CliniMACS® Prodigy® 장치에서 세척한다. T세포를 CliniMACS® CD4 및 CD8 마이크로비드에 의해 선택한다. T세포 선택 프로그램이 완료되면(약 3시간 40분 ~ 4시간 40분), Rapid 배지(표 21)에 현탁된 세포를 함유한 재적용 백을 이동용 팩으로 옮긴다. 생존능과 세포 수를 위해 샘플을 채취한다. 양성 분획 백의 세포 수 및 생존능 데이터를 이용하여 활성화 및 벡터 형질도입을 위해 배양 용기에 시딩할 때의 세포 농도를 결정한다.
CliniMACS® 마이크로비드(CD4 및 CD8)를 통한 T세포의 양성 선택 후, 세포를 배양 용기인 G-Rex에 시딩한다. 세포가 시딩되면, 활성화 시약(TransACT)을 배양 용기에 첨가한다. 그 후, CAR을 암호화하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 1.0(0.8~1.2)의 목표 MOI로 세포를 형질도입시킨다. 벡터 첨가 후, 배양 용기를 인큐베이터로 옮기고, 공칭 온도 37℃(작동 범위 36~38℃) 및 공칭 5%의 CO2(작동 범위 4.5~5.5%)에서 목표 24시간(작동 범위 20~28시간) 동안 인큐베이션시킨다. 인큐베이션 후, 세포를 수확 세척 용액(표 21)으로 4회 세척하여 임의의 통합되지 않은 벡터 및 잔류 바이러스 입자 및 임의의 기타 프로세스 관련 불순물을 제거한다. 그 후, 세포를 용리시키고, 테스트를 위해 세포 수 및 생존능에 대한 샘플을 채취하고, 그 결과를 이용하여 CryoStor® CS10으로 최종 제형을 위해 세포를 재현탁시키는 데 필요한 부피를 결정한다. 그 후, 세포를 원심분리하여 수확 세척 용액을 제거하고, 동결보존을 진행한다.
일부 구현예에서, CART 세포에서 발현된 CAR은 CD19에 결합한다. 일부 구현예에서, Rapid 배지(RM)(표 21)에 사용된 IL-2는 IL-15, hetIL-15(IL-15/sIL-15Ra), IL-6, 또는 IL-6/sIL-6Ra로 대체될 수 있다.
일부 구현예에서, CART 세포에서 발현된 CAR은 BCMA에 결합한다. 일부 구현예에서, Rapid 배지(RM)(표 21)에 사용된 IL-2는 IL-15, hetIL-15(IL-15/sIL-15Ra), IL-6, 또는 IL-6/sIL-6Ra로 대체될 수 있다.
실시예 8: 활성화된 신속 제조(ARM) 프로세스를 이용하여 제조된 CD19 CART 세포의 특성화
활성화된 신속 제조(ARM) 프로세스를 이용하여 제조된 항-CD19 CAR-T 세포 생성물이 본원에 개시된다. ARM 프로세스는 종래의 제조(TM) 프로세스와 비교하여 총 처리 시간을 감소시켜, 향후 환자에게 항-CD19 CAR-T 세포 생성물을 적시에 주입할 수 있게 한다. 또한, ARM 프로세스는 개선된 항종양 효능과 관련된 세포 서브세트인 추정 줄기 기억 T(Tstem) 세포도 보존한다. 제조상의 주요 차이점은 TM 프로세스는 항-CD19 CAR T세포가 제형화 전에 인터류킨(IL-) 2와 함께 9일 동안 시험관 내에서 배양되는 증식 단계를 포함하지만, ARM 프로세스는 불과 24시간의 배양 후에 제형화가 가능하다는 점이다. 이는 CD3 및 CD28에 대한 작용성 활성이 있는 단클론 항체(mAb)에 커플링된 완전 생체적합성 나노매트릭스를 사용함으로써 가능하게 되며, 이는 TM 프로세스에 사용되는 CD3/CD28 상자성 비드와는 달리, 형질도입 직후에 잔류 렌티바이러스로 세척 제거될 수 있다. 이종이식 마우스 모델의 결과 및 Tstem 세포에 대한 최종 생성물 강화, 증가된 지속성 및 장기적인 항종양 효과와 관련된 하위집단은, TM 프로세스를 이용하여 제조된 항-CD19 CAR T세포와 비교하여, ARM 프로세스를 이용하여 제조된 항-CD19 CAR T세포의 전체적으로 개선된 치료 가능성을 시사한다. 이종이식 마우스 모델에 의해 밝혀진 또 다른 중요한 차이점은 TM 프로세스를 이용하여 제조된 대응물에 비해 대략 일주일 동안의 ARM 프로세스를 이용하여 제조된 항-CD19 CAR T세포의 잠재적인 지연된 세포 동역학 증식이다. 이 지연은 대략 1주로 추정되며, 이는 잠재적인 독성을 주의 깊게 모니터링하기 위한 윈도우를 3주(TM 프로세스를 이용하여 제조된 항-CD19 CAR T세포의 경우)에서 4주로 상응하여 연장시킨다. 반대로, 시험관내 사이토카인 방출 모델의 비임상 안전성 데이터는 ARM 프로세스를 이용하여 제조된 항-CD19 CAR T세포와 TM 프로세스를 이용하여 제조된 세포가 생체내 IL-6 생성을 유도할 수 있는 유사한 잠재력을 가질 수 있으며, 따라서 유사한 사이토카인 방출 증후군(CRS) 위험을 보유함을 나타낸다. 이 증거를 바탕으로, ARM 프로세스를 이용하여 제조된 항-CD19 CAR T세포를 진행성 소림프구성 림프종(SLL)/만성 림프구성 백혈병(CLL) 환자를 대상으로, 이 적응증에서 이미 승인된 약물인 브루톤 티로신 키나제 억제제(BTKi)인 이브루티닙(임브루비카)과 조합하여, 그리고 DLBCL에서 단일 제제로서, I상, 공개 라벨 임상 연구에서 조사할 것이다.
생성 및 시험관내 분석
임상 규모에서 항-CD19 CAR T세포 제조를 위한 ARM 프로세스를 테스트하기 위해, 동결된 건강한 공여체 백혈구 성분채집 생성물(류코팩, LKPK)을 대표적인 예로서, 도 28a에 기재된, 출발물질로 사용하였다. LKPK는 37%의 T세포, 4%의 NK세포, 37%의 단핵구, 및 15%의 B세포를 함유하였다(도 28a). 해동 후, 항-CD4 및 항-CD8 마이크로비드를 사용하여 T세포를 양성으로 선택하였다. 양성 T세포 선택 후 생성물의 조성은 95.4%의 T세포, 1.9%의 NK세포, 1.7%의 단핵구, 및 0.1%의 B세포였다(도 28a).
양성으로 선택된 T세포를 항-CD3 및 항-CD28 작용제 단클론 항체에 접합된 고분자 나노매트릭스를 사용하여 활성화하고, 항-CD19 CAR을 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입시켰다. 배양 24시간 후, 세포를 수확하고 동결보존하였다(이러한 세포는 이 실시예에서 "ARM-CD19 CAR"로 지칭된다). 동시에, 동일한 공여체 T세포 및 렌티바이러스 벡터를 사용하여 종래의 제조(TM) 프로세스를 이용하여 CAR-T 세포를 생성하였다(이러한 세포는 이 실시예에서 "TM-CD19 CAR"로 지칭된다). TM 프로세스는 항-CD3 및 항-CD28 항체에 커플링된 상자성 비드와 조직 배양 플라스크에서 9일의 배양 기간을 사용한 후, 동일한 수확 및 동결 절차를 이용하였다. 각 프로세스에 의해 생성된 CAR-T 세포를 해동 후 CAR 발현뿐만 아니라, T세포 표현형을 평가하기 위해 유세포 분석에 의해 분석하였다(도 28b 내지 도 28d). T세포 표현형 분석에 따르면, ARM 프로세스는 CD8 및 CD4 구획 모두에서 나이브-유사 T세포(45.1%의 CD45RO-/CCR7+)를 보유한 반면, TM 프로세스는 주로 중심 기억 T(TCM) 세포를 초래하였다(ARM-CD19 CAR의 경우 43.6%에 비해 68.6%의 CD45RO+/CCR7+)(도 28c 및 도 28d). 중요한 점은, ARM 프로세스가 CAR+ 집단에서도 TM 프로세스에 비해 초기 나이브-유사 CD45RO-/CCR7+ T세포 집단을 더 잘 유지했다는 점이다(출발물질에서 28.6%, ARM-CD19 CAR의 경우 37.5%, TM-CD19 CAR의 경우 4.5%)(도 28c 및 도 28d). 이 T세포 집단은 문헌[Fraietta, et al (2018) Nat Med, 24(5); 563-571]에 기술된, 그리고 CLL I상 임상 시험에서 지속적인 관해와 관련된 CD45RO-/CD27+ Tstem 세포와 대체로 중첩된다.
표현형 외에도 최종 ARM-CD19 CAR 세포 생성물의 시험관내 기능에 대해서도 평가하였다. ARM-CD19 CAR 및 TM-CD19 CAR을 해동시키고 CD19-발현 세포주 NALM6(ALL) 또는 TMD-8(DLBCL)과 공동배양하였다. 공동배양 48시간 후의 상청액의 사이토카인 수준을 비교한 결과, 자극하는 암세포(NALM6 또는 TMD-8)에 따라 TM-CD19 CAR과 비교하여 ARM-CD19 CAR에 의해 분비되는 IFN-γ가 11~17배 증가하였고 IL-2 수준이 3.5~10배 증가한 것으로 나타났다(도 29a 및 도 29c). ARM 또는 TM 프로세스를 거친 비형질도입(UTD) 세포(도 29c) 또는 CD19 음성 NALM6(NALM6-19KO) 표적 세포(도 29d)를 사용한 실험은 ARM-CD19 CAR 및 TM-CD19 CAR에 의한 CD19 특이적 인식을 확인시켜 주었다. CD19 특이적 자극의 부재시 ARM-UTD 및 ARM-CD19 CAR에 의한 IFN-γ 분비의 더 높은 백그라운드(각각 도 29a 및 도 29b)는 이들 생성물의 활성화된 특성 때문일 가능성이 있다. 이 백그라운드 분비는 공동배양 48시간까지 감소했다(도 29b 및 도 29d). 처음 24시간의 표적 세포와의 공동배양 후 세포를 중간 세척한 후에 추가 24시간 동안 공동배양시(24h+24h), 백그라운드와 CD19 특이적 사이토카인 분비 간의 차이가 더욱 강화되었다. 이 24h+24h 조건은 ARM-CD19 CAR에 의한 백그라운드 IFN-γ 분비가 처음 24시간 후에 약화됨을 강조한다.
요약하면, ARM-CD19 CAR을 생성하는 데 사용된 ARM 프로세스는 TM-CD19 CAR과 유사하거나 더 높은 CAR 발현을 나타내는 T세포를 생성한다. 중요한 점은, ARM 프로세스가 투입 물질과 유사한 T세포 표현형을 유지한다는 점이다. ARM-CD19 CAR은 시험관내 CD19 특이적 활성화를 나타내고, TM-CD19 CAR과 비교하여 더 높은 수준의 IL-2를 분비하며, 이는 Tstem 표현형과 상관관계가 있다.
생체내 효능
생체내 효능 연구를 이용하여 ARM 프로세스 개발을 유도하였으며, 궁극적으로 임상 항-CD19 CAR T세포 제조에 이용될 프로세스로 이어졌다. 여기에 기술된 실험을 위해, ARM-CD19 CAR을 임상적 규모로 생성하였다. 동시에, 동일한 공여체로부터의 T세포와 동일한 렌티바이러스 벡터를 사용하여 TM-CD19 CAR을 생성하였다. 상이한 프로세스를 이용하여 생성된 CAR-T 세포의 효능을 pre-B ALL 세포주 NALM6을 접종한 면역결핍 NSG 마우스(NOD-scid IL2Rg-null)에서 평가하였다. 이 종양 세포주는 골수에 생착되지만, 높은 종양 부담의 경우 순환기에서 검출될 수도 있다. 백혈병 접종 7일 후, 마우스 코호트는 CAR+ T세포의 단일 주입을 받았다(도 30a). 0.2×106, 0.5×106, 및 2×106개의 생존 가능한 CAR+ T세포의 계획된 용량은 0일차 TM-CD19 CAR 및 ARM-CD19 CAR의 해동 후 유동 분석을 기반으로 결정되었다.
해동 후 0일차 ARM-CD19 CAR에 대한 유사형질도입의 우려로 인해, 센티넬 바이알을 해동시키고, 최대 5일 동안 배양하고, CAR 발현(백분율 및 평균 형광 강도)을 상이한 시점들에서 유세포 분석으로 분석하였다(도 30b). 이후 시점에서 양성 세포의 백분율은 해동 후 0일차 샘플에 비해 더 낮았다. 동시에, CAR 평균 형광 강도는 세포당 더 높았고, 이는 안정적으로 형질도입된 CAR-T 세포를 반영하였다. 3일차의 측정치를 이용하여 ARM-CD19 CAR의 실제 용량을 결정했으며, 이는 0.1×106, 0.25×106, 및 1×106개의 생존 가능한 CAR+ T세포로 결정되었다. 해동 후 샘플의 유동 분석이 휴지 상태의, 완전히 통합된 CART 세포에서 수행되었기 때문에 TM-CD19 CAR 용량은 변경되지 않은 채로 유지되었다(0.2×106, 0.5×106, 및 2×106개의 생존 가능한 CAR+ T세포).
ARM-CD19 CAR 및 TM-CD19 CAR은 모두 용량 의존적 방식으로 종양 퇴행을 유도했다(도 30c). 0.5x106 또는 2x106개의 TM-CD19 CAR 세포 또는 0.25×106 또는 1×106개의 ARM-CD19 CAR 세포로 처치된 마우스는 지속적인 종양 퇴행을 경험하였다. 흥미롭게도, 테스트한 각각의 최저 용량(0.2×106개의 TM-CD19 CAR 세포 또는 0.1×106개의 ARM-CD19 CAR 세포)에서 TM-CD19 CAR에 대한 반응은 지속되지 않았고 모든 마우스는 초기 부분 백혈병 통제 후 결국 재발했다. 대조적으로, 최저 용량(0.1x106개)에서 ARM-CD19 CAR-처치된 마우스는 연구가 끝날 때까지 지속된 종양 부담의 꾸준한 감소를 보였다. 종양 퇴행의 동역학은 ARM-CD19 CAR의 활성화가 약 1주 지연되었음을 시사하며, 이는 Tstem 세포가 항종양 활성을 발휘하기 위해 증식하고 이펙터 세포로 분화할 필요가 있음을 시사한다.
두 제조 프로세스에 의해 생성된 CAR-T 세포 및 UTD 세포로 처치된 마우스를 주 2회 채혈하여 사이토카인 수준을 측정하였다(도 31의 A 내지 D). ARM-CD19 CAR 또는 TM-CD19 CAR의 CAR-T 세포가 주입된 마우스의 순환 IFN-γ 수준은 2상 패턴을 나타냈다(도 31의 A). 초기 IFN-γ 최고점은 CAR-T 세포 주입 후 4~7일차에 관찰되었으며, TM-UTD 또는 ARM-UTD가 주입된 마우스에서는 분명하지 않았기 때문에, 종양 인식 후 CD19 특이적 활성화와 관련이 있을 가능성이 높았다(도 31의 B). 초기 CD19 매개 활성화는 생체내 IL-2 수준의 동반 상승에 의해 확인되었으나(도 31의 C), 이는 이후 시점에 약화되었다.
생체내 세포 동역학
NSG 마우스에서 ARM-CD19 CAR의 효능을 평가하기 위한 약리학 연구의 일환으로, CAR+ T세포의 증식을 생체 내에서 평가하였다(도 32). 주입 후 최대 4주까지 유세포 분석으로 혈액의 CD3+/CAR+ T세포 농도를 분석하였다. CAR-T 세포 증식이 추정될 수 있다. 그러나 X-GVHD의 발병에 따른 제한된 연구 시간으로 인해 장기적인 지속성을 평가할 수 없다. 0.2×106개 세포의 최저 용량에서의 TM-CD19 CAR을 제외한 모든 용량에서 ARM-CD19 CAR 및 TM-CD19 CAR 둘 모두에 대해 세포 증식이 관찰되었다. 노출(세포 주사 후 21일 이내의 Cmax 및 AUC)은 TM-CD19 CAR 및 ARM-CD19 CAR 모두에 대한 용량 증가와 함께 증가하였다. 동일한 용량 수준에서 ARM-CD19 CAR 대 TM-CD19 CAR의 증식을 비교하기 위해, TM-CD19 CAR의 노출을 비슷한 용량의 ARM-CD19 CAR로 보간하였다(0.25×106 및 1×106개 세포). 0.25×106 및 1×106개 세포의 용량에서의 TM-CD19 CAR에 비해 Cmax는 24~46배 더 높았고 AUC0-21d는 18~33배 더 높았다. ARM-CD19 CAR 최대 증식까지의 시간(Tmax)은 TM-CD19 CAR과 비교하여 적어도 1주 동안 지연되었다.
요약하면, ARM-CD19 CAR을 시험관 내에서 평가하는 약리학 연구는 ARM-CD19 CAR이 초기 분화된 표현형을 가지고 있으며 더 많은 IFN-γ 및 IL-2를 분비할 가능성이 있음을 보여준다. 생체 내에서, ARM-CD19 CAR은 TM-CD19 CAR과 비교하여 지연되었지만 더 높은 세포 증식을 보여주었고, 더 많은 IL-2 분비를 유도하였으며, 더 낮은 용량에서 종양 성장을 제어하였다. 논의된 ARM-CD19 CAR의 다른 특징, 예를 들어 이후 시점에서의 상승된 수준의 혈장 IFN-γ 및 X-GVHD의 조기 발병이 ARM-CD19 CAR과 ARM-UTD 모두에서 나타났으며, 이는 여기에 사용된 이종이식 마우스 모델의 한계가 바탕이 된다. 종합하면, 이러한 결과는 ARM-CD19 CAR이 더 많은 줄기세포능 특징을 가진 T세포를 함유하여, ARM-CD19 CAR이 효과적으로 생착되고, 증식되고, 종양을 거부할 수 있게 한다는 가설을 뒷받침한다.
시험관내 IL-6 방출 분석
CART 세포에 의한 IL-6 유도 가능성의 시험관내 조사를 위한 3자 공동배양 모델은 문헌[Norelli, et al (2018) Nat Med., Jun;24(6); 739-748]에서 최초로 공개되었으며, 이를 약간 조정하여 여기에 적용하였다. 이 모델은 CAR-T 세포, 백혈병 표적 세포, 및 방관자 THP-1 단핵구 세포(IL-6 생성을 극대화하기 위한 골수 세포의 공급원)로 구성된다. 이 시험관내 세포 모델에서, ARM-CD19 CAR 또는 TM-CD19 CAR 단독에 의한 IL-6 분비는 CD19-발현 표적 및 THP-1 세포와의 공동배양에 의해 증가되었다(도 33a 및 도 33b). 중요한 점은, ARM-CD19 CAR에 의해 유도된 시간 의존적 CD19 특이적 IL-6 분비가 TM-CD19 CAR에 의해 유도된 것과 중첩될 수 있었다는 점이다. 동일한 시험관내 모델에서, ARM-CD19 CAR 조건에서의 CD19 특이적 IFN-γ 분비는 TM-CD19 CAR 조건에서보다 10배 더 높았다(데이터 미도시).
요약
이러한 결과는 ARM-CD19 CAR이 TM-CD19 CAR과 비교하여 더 큰 항종양 잠재력 및 유사한 안전성 프로파일을 가질 수 있음을 시사한다. 더 큰 항종양 잠재력은 테스트된 최저 용량에서의 더 나은 종양 제어 및 더 높은 생체내 세포 증식에 의해 추정된다. 그러나 이러한 계산은 처음 ARM-CD19 CAR이 조사될 2가지의 질환 적응증(CLL 및 DLBCL)보다 더욱 공격적인 ALL 모델(NALM6)에서 분석되었기 때문에 ARM-CD19 CAR의 전반적인 치료 가능성의 과소평가일 수 있다. 특히 생체내 CAR-T 세포 증식이 종양 퇴행과 강력한 상관관계가 있는 CLL에서(문헌[Mueller, et al (2017) Blood. 130(21); 2317-2325; Fraietta, et al (2018) Nat Med, 24(5); 563-571]), ARM-CD19 CAR의 훨씬 더 높은 증식 가능성(최대 20배)은 TM-CD19 CAR에 비해 유의미한 우수한 효능을 가져올 수 있다.
마우스에서, CAR 매개 종양 퇴행과 관련된 ARM-CD19 CAR에 의한 IFN-γ 및 IL-2의 초기 전신 방출은 종래 제조된 CAR-T 세포에 의해 유도된 것보다 각각 3배 및 10배 더 높았다.IL-6 수준은 생체 내에서 연구되지 않았는데, 이 계통에서는 기능적 골수 세포의 부족으로 인해 염증성 사이토카인이 생성될 수 없기 때문이다(문헌[Norelli, et al (2018) Nat Med., Jun;24(6); 739-748; Giavridis, et al (2018) Nat Med., Jun;24(6);731-738]). 이를 방지하고 ARM-CD19 CAR에 의해 유도된 생체내 IL-6 방출 가능성을 평가하기 위해, 방관자 단핵구 세포가 염증성 사이토카인의 공급원으로서 첨가되는 시험관내 3자 공동배양 시스템이 사용되었다(문헌[Norelli, et al (2018) Nat Med., Jun;24(6); 739-748]). 이 시스템에서, IL-6 생성은 ARM-CD19 CAR과 종래 제조된 CAR-T 세포간에 유사하였으며, 이는 CRS에 대한 비슷한 위험을 시사한다. 반대로, ARM-CD19 CAR 세포 증식의 지연된 동역학은 CRS 모니터링 기간을 TM-CD19 CAR의 전형적인 3주에서 4주로 연장하는 것을 필요로 할 것이다. ARM-CD19 CAR을 사용한 시험관내 실험은 또한 해동 후 배양 첫 3일 동안 ARM-CD19 CAR에 의한 일시적인, 비-CAR 매개성 IFN-γ 및 IL-2 분비의 가능성을 보여주었다. 재조합 인간 IL-2(Proleukin) 및 재조합 인간 IFN-γ(ACTIMMUNE)를 투여받는 환자의 데이터를 기반으로 하고 ARM-CD19 CAR 주입 후 예상되는 노출을 고려한 포괄적인 위험 평가는, 이들 환자에서 설명된 바와 같이 전신 증상(발열, 오한, 홍반)의 위험이 매우 낮음을 나타낸다. 이러한 위험을 더욱 완화하기 위해, ARM-CD19 CAR을 투여받는 환자는 세포 생성물 주입 후 적어도 72시간 동안 입원하게 될 것이다.
마지막으로, 비-GLP 준수 독성학 연구에서, ARM-CD19 CAR이 생착된 NSG 마우스는 혈액 또는 림프 기관 면역표현형 분석 및 관련 기관 세트의 조직학적 평가로 평가할 때, 종래 제조된 CAR-T 세포 및 ARM 프로세스를 거치는 형질도입되지 않은 세포와 비교하여 예상치 못한 거동을 보이지 않았다.
실시예 9: ARM 프로세스를 이용하여 제조된 BCMA CART 세포
방법
T세포 단리
건강한 공여체 성분채집의 신선한 류코팩을 Hemacare에서 입수하여 필요할 때까지 증기상 액체 질소(LN2)에 보관하였다. 0일차에, 2/4 류코펙을 LN2에서 꺼내어, 작은 얼음 결정이 남을 때까지 Plasmatherm(Barkey, Leopoldshoehe, Germany)에서 가온하고, Prodigy® 프로세스 완충액으로 희석하였다. 그 후, TS 520 튜빙 세트 및 T세포 형질도입(TCT) 프로그램 소프트웨어 버전 1.0을 구비한 CliniMACS® Prodigy®에서 자동화 CD4/CD8 양성 선택을 수행하였다. 총 세포 회수율 및 T세포 회수율을 평가하기 위해 Cellometer Vision(Nexcelom, Lawrence, MA)에 열거된 AO/PI 염색에 의해 각 Prodigy® 산출물(생성물, 폐기물, 및 비표적 세포)에 대한 세포 수 및 생존능을 결정하였다. CD4/CD8이 강화된 생성물을 OpTmizerTM 완전 T세포 배지에 용리시키고, 24시간 또는 종래의 9일 프로세스(TM)를 이용한 추가 배양을 위해 나누었다. 나머지 T세포를 LN 탱크에서 동결시켰다. T세포 순도는 유세포 분석에 의해 평가하였다.
ARM 프로세스를 이용한 CAR-T 세포 생산
Prodigy®에 의해 정제된 T세포를 플레이트, 플라스크, G-REX 용기와 같은 상이한 규모의 용기, 또는 센트리컬트의 완전 임상 규모로 시딩하였다. 시딩시, 임상 등급의 렌티바이러스 벡터 이외에도, 항-CD3 및 항-CD28 작용제에 접합된 고분자 나노매트릭스인 TransAct(Miltenyi Biotec)를 첨가하였다. 세포를 수확 및 동결보존 전 24시간 동안 100 IU/mL의 인간 재조합 IL-2(Prometheus, San Diego, CA), 2%의 ICRS(Life Technologies)를 함유하는 OpTmizerTM 완전 T세포 배지에서 인큐베이션시켰다.
동결보존된 CAR-T 세포의 분취량을 사전 가온한 OpTmizerTM 완전 배지에 해동시키고, 배양 전에 20x 부피의 사전 가온한 배지로 2회 세척하고, 해동 후 상이한 시점에서의 BCMA-CAR 발현 및 줄기세포능 특징을 평가하기 위한 유세포 분석을 수행하였다. 특정 항원 자극에 대한 사이토카인 방출을 평가하기 위해 세포 생성물의 분취량을 표적 세포주와 공동배양하였다.
TM 프로세스를 이용한 CAR-T 세포 생산
Prodigy® 처리된 T세포를 따뜻한 RPMI 완전 T세포 배지에 재현탁시키고, 24웰 플레이트에 플레이팅하였다. T세포를 3:1의 비드 대 세포 비로 인간 T-증식기 CD3/CD28 비드와 함께 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다.
1일차에, SUP-T1역가를 기반으로 2의 MOI로 렌티바이러스를 첨가하였다. 비형질도입 대조군(UTD)에는 바이러스가 첨가되지 않았다. T세포를 37℃에서 밤새 인큐베이션시킨 다음, 웰당 1 mL의 완전 T세포 배지를 첨가한 후, 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 나머지 7일의 배양 증식 동안, T세포를 조직 배양 플라스크로 옮기고, 2일마다 완전 T세포 배지로 희석하였다.
8일차에서 9일차 사이에 T세포를 비드제거하고, 수확하고, CryoStor CS10 동결 배지에서 동결보존하고, CoolCell 세포 동결 용기(Biocision)에서 -80℃로 동결시키고, 다음 날 LN2로 옮겼다. 작은 분취량의 T세포를 CAR 발현을 위해 염색하였다. 보정을 위해 단색 대조군을 포함시켰다. 샘플을 유세포 분석기(BD LSRFortessa)에서 측정하였고, 데이터를 FlowJo 소프트웨어로 분석하였다.
표적 세포주 및 배양
Nalm6 세포를 렌티바이러스 반딧불이 루시퍼라제 리포터 구성체로 형질감염시켜 Nalm6-luc 세포주를 생성하였다. 세포를 5% CO2가 있는 37℃의 인큐베이터에서 성장시켰다. 세포의 분취량을 사용 전 종양 항원 BCMA 발현의 검출을 위해 사용하였다.
시험관내 사이토카인 분비 분석
BCMA-발현 표적 세포에 대한 항-BCMA CAR-T(이펙터 세포라 지칭함)의 사이토카인 분비를, CAR-T 세포를 표적 세포와 2.5배의 E:T 비로 96웰 평판 플레이트에서 20시간 동안 인큐베이션시켜 평가하였다. 이펙터 세포는 ARM 또는 TM 프로세스를 이용하여 생성된 PI61, R1G5, 및 BCMA10 CART 세포였다. ARM 프로세스를 이용하여 제조된 CART 세포를 24시간의 세척 조건에 대해 플레이팅하여 세포가 휴면을 취하고 비특이적 활성을 최소화하게 하였다. 표적 세포는 BCMA 양성 KMS11-luc 또는 BCMA 음성 NALM6-luc를 포함한다. 이러한 표적 세포를 새롭게 플레이팅된 T세포 또는 24시간 세척 조건으로부터의 T세포(ARM 세포만 해당)에 첨가하였다. 이 분석을 위해, BCMA CAR-T에 UTD를 첨가하여 CAR-T 세포의 형질도입 %를 정규화하였다. 이로써 각 샘플에서 동일한 수의 CAR-T 및 동일한 총 T세포 수를 비교할 수 있었다. 이펙터 대 표적의 20시간 공동배양 시점으로부터의 상청액을 각 웰에서 수확하고 -20℃에서 동결시켜 MSD 사이토카인 분석에 사용하였다. 맞춤형 MSD V-PLEX 인간 IFN-γ, IL-2 키트(#K151A0H-4A)를 사용하여 각 상청액 샘플에서 분비된 사이토카인을 정량화하였다.
결과
ARM 프로세스는 T세포의 줄기세포능을 보존한다
ARM 프로세스를 이용하여 생성된 CAR-T 세포를 해동시 및 해동 후 48시간에서의 CAR 발현뿐만 아니라, T세포 표현형을 평가하기 위해 유세포 분석에 의해 분석하였다(도 34의 A, B, 및 C) TM 프로세스를 이용하여 제조된 CAR-T 세포의 경우, 수확 전 9일차에 CAR 발현을 평가하였다(도 35의 A). BCMA-CAR은 도 34의 A에 도시된 해동시에서 거의 검출되지 않았다. 그러나 해동 후 48시간에서, BCMA-CAR은 PI61의 경우 32.9%, R1G5의 경우 35.9%, BCMA10의 경우 17.4%로 명확하게 발현되었다. TM 프로세스를 이용하여 생성된 9일차의 세포는 BCMA-CAR 발현이 PI61의 경우 36%, R1G5의 경우 40%, 및 BCMA10의 경우 7%인 것으로 나타났다(도 35의 A). CAR+T 세포 표현형의 분석 결과, ARM 프로세스가 나이브-유사 T세포를 유지하는 것으로 나타났다(PI61 및 R1G5의 경우 CD45RO-/CCR7+의 약 60%, BCMA10의 경우 CD45RO-/CCR7+의 32%)(도 34의 C). TM 프로세스는 주로 중심 기억 T세포(TCM)를 초래하였지만(3개의 BCMA CAR-T 모두에 대해 72~81%의 CD45RO+/CCR7+), 나이브-유사 T세포 집단은 TM 프로세스를 이용하여 제조된 CAR+T 세포에서 거의 사라졌다(도 35의 B). 전반적으로, 나이브 T 세포 집단은 이전 보고서(문헌[Cohen AD, et al (2019). J Clin Invest. 130. pii: 126397. doi: 10.1172/JCI126397; Fraietta, JA, et al (2018). Nat Med, 24(5); 563-571])에서 기술된 CD45RO-/CD27+ Tstem 세포와 대체로 중첩되며, 반응 및 CAR-T 증식과 관련이 있다.
표현형 외에도 최종 PI61, R1G5, 및 BCMA10 CART 세포 생성물의 시험관내 기능에 대해서도 평가하였다. PI61, R1G5, 및 BCMA10 세포 생성물을 해동시키고 BCMA-발현 세포주 KMS-11과 1:1의 비로 공동배양하였다. 해동 후 ARM 처리된 세포를 공동배양이 확립되기 전 24시간 동안 휴면하게 하였다. 공동배양 24시간 후의 상청액의 사이토카인 수준을 비교한 결과, 도 36의 A 내지 D에 도시된 바와 같이, TM 생성물과 비교하여 ARM 생성물에 의해 분비되는 IL-2가 약 5~25배 증가하였고, IFN-γ 수준이 약 3~7배 증가한 것으로 나타났다. ARM 또는 TM 프로세스를 거친 비형질도입(UTD) 세포를 사용한 실험은 PI61, R1G5, 및 BCMA10에 의한 BCMA 특이적 인식을 확인시켜 주었다.
요약하면, ARM 프로세스를 이용하여 생산된 PI61, R1G5, 및 BCMA10 CART 세포는 시험관내 BCMA 특이적 활성화를 나타내고, TM 처리된 생성물과 비교하여 더 높은 수준의 IL-2 및 IFN-γ를 분비하며, 이는 ARM 프로세스를 이용하여 생산된 CART 세포의 Tstem 표현형과 상관관계가 있다.
실시예 10: ARM 프로세스를 이용하여 제조된 CART 세포의 유전자 표지 분석
방법
단일 세포 RNAseq
단일 세포 RNAseq 라이브러리를 10X Genomics Chromium Controller 기기와 지원 라이브러리 구축 키트를 이용하여 생성하였다.
10X Genomics 기기에 로딩하기 전에, 동결보존된 세포를 해동시키고, 계수하고, 유동 분류하였다(연구 질문에 필요한 경우). 개별 세포를 액적으로 로딩하고, 개별 액적 내의 RNA를 GemCode 비드를 통해 바코드로 표시하였다. 바코드 표시된 RNA는 액적에서 방출되어, 전체 전사체 Illumina 호환 가능한 시퀀싱 라이브러리로 변환되었다.
생성된 라이브러리를 Illumina HiSeq 기기에서 시퀀싱하고, 10X Genomics 분석 파이프 라인 및 Loupe Cell Browser 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
단일 세포 면역 세포 프로파일링
전체 전사체 10X Genomics 단일 세포 라이브러리를 면역 세포 프로파일링 및 레퍼토리 분석을 생성하기 위한 주형 재료로 사용하였다. T세포 수용체 서열을 Chromium Single Cell 5' 라이브러리로부터 PCR 증폭시켜 Illumina 시퀀싱 기기에서 분석하였다.
분석 파이프라인
단일 세포 RNAseq 데이터를 FASTQ 파일로 시작하는 Cell Ranger 분석 파이프라인을 통해 처리하였다. Cell Ranger 분석 파이프라인에 대한 상세한 설명은 https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger에서 확인할 수 있다. 일반적인 파이프라인은 정렬, 필터링, 바코드 카운팅, 및 UMI 카운팅을 포함하였다. 세포 바코드를 이용하여 유전자 바코드 매트릭스를 생성하고, 클러스터를 결정하고, 유전자 발현 분석을 수행하였다. Seurat Bioconductor 패키지를 사용하여 유전자 발현 계수 데이터를 정규화하였다. 발현된 유전자가 200개 미만인 세포는 분석에서 제외되었다. 2개 이하의 세포에서만 발현되는 유전자는 분석에서 제외되었다. 나머지 데이터를 10,000의 환산 계수를 사용하여 Seurat 로그 정규화 방법으로 정규화하였다. 데이터를 세포당 검출된 분자의 수에 대한 회귀를 통해 확장시켰다. 유전자 세트에 있는 모든 유전자의 평균 로그 정규화 유전자 발현 값을 취하여 유전자 세트 점수를 계산하였다. 각 유전자는 샘플에서 유전자의 평균 발현이 0이고 표준 편차가 1이 되도록 z-점수 정규화된다. 그 후, 유전자 세트에 있는 유전자의 정규화된 값의 평균으로 유전자 세트 점수를 계산한다. 예시적인 유전자 세트 점수 계산은 아래에 기술되어 있다.
유전자 세트 점수 계산의 이 예에서, 6개 유전자에 대한 2개 샘플의 정규화된 유전자 발현을 표 23에 제공하였다. 예시적인 이러한 계산을 위해, 유전자 세트는 유전자 1 내지 4로 구성된다. 따라서, 샘플 1과 2는 모두 유전자 세트 점수가 0이다.
[표 23]
Figure pct00101
유전자 세트 "위 TEM 대 아래 TSCM"은 다음의 유전자를 포함한다: MXRA7, CLIC1, NAT13, TBC1D2B, GLCCI1, DUSP10, APOBEC3D, CACNB3, ANXA2P2, TPRG1, EOMES, MATK, ARHGAP10, ADAM8, MAN1A1, SLFN12L, SH2D2A, EIF2C4, CD58, MYO1F, RAB27B, ERN1, NPC1, NBEAL2, APOBEC3G, SYTL2, SLC4A4, PIK3AP1, PTGDR, MAF, PLEKHA5, ADRB2, PLXND1, GNAO1, THBS1, PPP2R2B, CYTH3, KLRF1, FLJ16686, AUTS2, PTPRM, GNLY, 및 GFPT2.
유전자 세트 "위 Treg 대 아래 Teff"는 다음의 유전자를 포함한다: C12orf75, SELPLG, SWAP70, RGS1, PRR11, SPATS2L, SPATS2L, TSHR, C14orf145, CASP8, SYT11, ACTN4, ANXA5, GLRX, HLA-DMB, PMCH, RAB11FIP1, IL32, FAM160B1, SHMT2, FRMD4B, CCR3, TNFRSF13B, NTNG2, CLDND1, BARD1, FCER1G, TYMS, ATP1B1, GJB6, FGL2, TK1, SLC2A8, CDKN2A, SKAP2, GPR55, CDCA7, S100A4, GDPD5, PMAIP1, ACOT9, CEP55, SGMS1, ADPRH, AKAP2, HDAC9, IKZF4, CARD17, VAV3, OBFC2A, ITGB1, CIITA, SETD7, HLA-DMA, CCR10, KIAA0101, SLC14A1, PTTG3P, DUSP10, FAM164A, PYHIN1, MYO1F, SLC1A4, MYBL2, PTTG1, RRM2, TP53INP1, CCR5, ST8SIA6, TOX, BFSP2, ITPRIPL1, NCAPH, HLA-DPB2, SYT4, NINJ2, FAM46C, CCR4, GBP5, C15orf53, LMCD1, MKI67, NUSAP1, PDE4A, E2F2, CD58, ARHGEF12, LOC100188949, FAS, HLA-DPB1, SELP, WEE1, HLA-DPA1, FCRL1, ICA1, CNTNAP1, OAS1, METTL7A, CCR6, HLA-DRB4, ANXA2P3, STAM, HLA-DQB2, LGALS1, ANXA2, PI16, DUSP4, LAYN, ANXA2P2, PTPLA, ANXA2P1, ZNF365, LAIR2, LOC541471, RASGRP4, BCAS1, UTS2, MIAT, PRDM1, SEMA3G, FAM129A, HPGD, NCF4, LGALS3, CEACAM4, JAKMIP1, TIGIT, HLA-DRA, IKZF2, HLA-DRB1, FANK1, RTKN2, TRIB1, FCRL3, 및 FOXP3.
유전자 세트 "아래 줄기세포능"은 다음의 유전자를 포함한다: ACE, BATF, CDK6, CHD2, ERCC2, HOXB4, MEOX1, SFRP1, SP7, SRF, TAL1, 및 XRCC5.
유전자 세트 "위 저산소증"은 다음의 유전자를 포함한다: ABCB1, ACAT1, ADM, ADORA2B, AK2, AK3, ALDH1A1, ALDH1A3, ALDOA, ALDOC, ANGPT2, ANGPTL4, ANXA1, ANXA2, ANXA5, ARHGAP5, ARSE, ART1, BACE2, BATF3, BCL2L1, BCL2L2, BHLHE40, BHLHE41, BIK, BIRC2, BNIP3, BNIP3L, BPI, BTG1, C11orf2, C7orf68, CA12, CA9, CALD1, CCNG2, CCT6A, CD99, CDK1, CDKN1A, CDKN1B, CITED2, CLK1, CNOT7, COL4A5, COL5A1, COL5A2, COL5A3, CP, CTSD, CXCR4, D4S234E, DDIT3, DDIT4, 1-Dec, DKC1, DR1, EDN1, EDN2, EFNA1, EGF, EGR1, EIF4A3, ELF3, ELL2, ENG, ENO1, ENO3, ENPEP, EPO, ERRFI1, ETS1, F3, FABP5, FGF3, FKBP4, FLT1, FN1, FOS, FTL, GAPDH, GBE1, GLRX, GPI, GPRC5A, HAP1, HBP1, HDAC1, HDAC9, HERC3, HERPUD1, HGF, HIF1A, HK1, HK2, HLA-DQB1, HMOX1, HMOX2, HSPA5, HSPD1, HSPH1, HYOU1, ICAM1, ID2, IFI27, IGF2, IGFBP1, IGFBP2, IGFBP3, IGFBP5, IL6, IL8, INSIG1, IRF6, ITGA5, JUN, KDR, KRT14, KRT18, KRT19, LDHA, LDHB, LEP, LGALS1, LONP1, LOX, LRP1, MAP4, MET, MIF, MMP13, MMP2, MMP7, MPI, MT1L, MTL3P, MUC1, MXI1, NDRG1, NFIL3, NFKB1, NFKB2, NOS1, NOS2, NOS2P1, NOS2P2, NOS3, NR3C1, NR4A1, NT5E, ODC1, P4HA1, P4HA2, PAICS, PDGFB, PDK3, PFKFB1, PFKFB3, PFKFB4, PFKL, PGAM1, PGF, PGK1, PGK2, PGM1, PIM1, PIM2, PKM2, PLAU, PLAUR, PLIN2, PLOD2, PNN, PNP, POLM, PPARA, PPAT, PROK1, PSMA3, PSMD9, PTGS1, PTGS2, QSOX1, RBPJ, RELA, RIOK3, RNASEL, RPL36A, RRP9, SAT1, SERPINB2, SERPINE1, SGSM2, SIAH2, SIN3A, SIRPA, SLC16A1, SLC16A2, SLC20A1, SLC2A1, SLC2A3, SLC3A2, SLC6A10P, SLC6A16, SLC6A6, SLC6A8, SORL1, SPP1, SRSF6, SSSCA1, STC2, STRA13, SYT7, TBPL1, TCEAL1, TEK, TF, TFF3, TFRC, TGFA, TGFB1, TGFB3, TGFBI, TGM2, TH, THBS1, THBS2, TIMM17A, TNFAIP3, TP53, TPBG, TPD52, TPI1, TXN, TXNIP, UMPS, VEGFA, VEGFB, VEGFC, VIM, VPS11, 및 XRCC6.
유전자 세트 "위 자가포식"은 다음의 유전자를 포함한다: ABL1, ACBD5, ACIN1, ACTRT1, ADAMTS7, AKR1E2, ALKBH5, ALPK1, AMBRA1, ANXA5, ANXA7, ARSB, ASB2, ATG10, ATG12, ATG13, ATG14, ATG16L1, ATG16L2, ATG2A, ATG2B, ATG3, ATG4A, ATG4B, ATG4C, ATG4D, ATG5, ATG7, ATG9A, ATG9B, ATP13A2, ATP1B1, ATPAF1-AS1, ATPIF1, BECN1, BECN1P1, BLOC1S1, BMP2KL, BNIP1, BNIP3, BOC, C11orf2, C11orf41, C12orf44, C12orf5, C14orf133, C1orf210, C5, C6orf106, C7orf59, C7orf68, C8orf59, C9orf72, CA7, CALCB, CALCOCO2, CAPS, CCDC36, CD163L1, CD93, CDC37, CDKN2A, CHAF1B, CHMP2A, CHMP2B, CHMP3, CHMP4A, CHMP4B, CHMP4C, CHMP6, CHST3, CISD2, CLDN7, CLEC16A, CLN3, CLVS1, COX8A, CPA3, CRNKL1, CSPG5, CTSA, CTSB, CTSD, CXCR7, DAP, DKKL1, DNAAF2, DPF3, DRAM1, DRAM2, DYNLL1, DYNLL2, DZANK1, EI24, EIF2S1, EPG5, EPM2A, FABP1, FAM125A, FAM131B, FAM134B, FAM13B, FAM176A, FAM176B, FAM48A, FANCC, FANCF, FANCL, FBXO7, FCGR3B, FGF14, FGF7, FGFBP1, FIS1, FNBP1L, FOXO1, FUNDC1, FUNDC2, FXR2, GABARAP, GABARAPL1, GABARAPL2, GABARAPL3, GABRA5, GDF5, GMIP, HAP1, HAPLN1, HBXIP, HCAR1, HDAC6, HGS, HIST1H3A, HIST1H3B, HIST1H3C, HIST1H3D, HIST1H3E, HIST1H3F, HIST1H3G, HIST1H3H, HIST1H3I, HIST1H3J, HK2, HMGB1, HPR, HSF2BP, HSP90AA1, HSPA8, IFI16, IPPK, IRGM, IST1, ITGB4, ITPKC, KCNK3, KCNQ1, KIAA0226, KIAA1324, KRCC1, KRT15, KRT73, LAMP1, LAMP2, LAMTOR1, LAMTOR2, LAMTOR3, LARP1B, LENG9, LGALS8, LIX1, LIX1L, LMCD1, LRRK2, LRSAM1, LSM4, MAP1A, MAP1LC3A, MAP1LC3B, MAP1LC3B2, MAP1LC3C, MAP1S, MAP2K1, MAP3K12, MARK2, MBD5, MDH1, MEX3C, MFN1, MFN2, MLST8, MRPS10, MRPS2, MSTN, MTERFD1, MTMR14, MTMR3, MTOR, MTSS1, MYH11, MYLK, MYOM1, NBR1, NDUFB9, NEFM, NHLRC1, NME2, NPC1, NR2C2, NRBF2, NTHL1, NUP93, OBSCN, OPTN, P2RX5, PACS2, PARK2, PARK7, PDK1, PDK4, PEX13, PEX3, PFKP, PGK2, PHF23, PHYHIP, PI4K2A, PIK3C3, PIK3CA, PIK3CB, PIK3R4, PINK1, PLEKHM1, PLOD2, PNPO, PPARGC1A, PPY, PRKAA1, PRKAA2, PRKAB1, PRKAB2, PRKAG1, PRKAG2, PRKAG3, PRKD2, PRKG1, PSEN1, PTPN22, RAB12, RAB1A, RAB1B, RAB23, RAB24, RAB33B, RAB39, RAB7A, RB1CC1, RBM18, REEP2, REP15, RFWD3, RGS19, RHEB, RIMS3, RNF185, RNF41, RPS27A, RPTOR, RRAGA, RRAGB, RRAGC, RRAGD, S100A8, S100A9, SCN1A, SERPINB10, SESN2, SFRP4, SH3GLB1, SIRT2, SLC1A3, SLC1A4, SLC22A3, SLC25A19, SLC35B3, SLC35C1, SLC37A4, SLC6A1, SLCO1A2, SMURF1, SNAP29, SNAPIN, SNF8, SNRPB, SNRPB2, SNRPD1, SNRPF, SNTG1, SNX14, SPATA18, SQSTM1, SRPX, STAM, STAM2, STAT2, STBD1, STK11, STK32A, STOM, STX12, STX17, SUPT3H, TBC1D17, TBC1D25, TBC1D5, TCIRG1, TEAD4, TECPR1, TECPR2, TFEB, TM9SF1, TMBIM6, TMEM203, TMEM208, TMEM39A, TMEM39B, TMEM59, TMEM74, TMEM93, TNIK, TOLLIP, TOMM20, TOMM22, TOMM40, TOMM5, TOMM6, TOMM7, TOMM70A, TP53INP1, TP53INP2, TRAPPC8, TREM1, TRIM17, TRIM5, TSG101, TXLNA, UBA52, UBB, UBC, UBQLN1, UBQLN2, UBQLN4, ULK1, ULK2, ULK3, USP10, USP13, USP30, UVRAG, VAMP7, VAMP8, VDAC1, VMP1, VPS11, VPS16, VPS18, VPS25, VPS28, VPS33A, VPS33B, VPS36, VPS37A, VPS37B, VPS37C, VPS37D, VPS39, VPS41, VPS4A, VPS4B, VTA1, VTI1A, VTI1B, WDFY3, WDR45, WDR45L, WIPI1, WIPI2, XBP1, YIPF1, ZCCHC17, ZFYVE1, ZKSCAN3, ZNF189, ZNF593, 및 ZNF681.
유전자 세트 "위 휴면 대 아래 활성화"는 다음의 유전자를 포함한다: ABCA7, ABCF3, ACAP2, AMT, ANKH, ATF7IP2, ATG14, ATP1A1, ATXN7, ATXN7L3B, BCL7A, BEX4, BSDC1, BTG1, BTG2, BTN3A1, C11orf21, C19orf22, C21orf2, CAMK2G, CARS2, CCNL2, CD248, CD5, CD55, CEP164, CHKB, CLK1, CLK4, CTSL1, DBP, DCUN1D2, DENND1C, DGKD, DLG1, DUSP1, EAPP, ECE1, ECHDC2, ERBB2IP, FAM117A, FAM134B, FAM134C, FAM169A, FAM190B, FAU, FLJ10038, FOXJ2, FOXJ3, FOXL1, FOXO1, FXYD5, FYB, HLA-E, HSPA1L, HYAL2, ICAM2, IFIT5, IFITM1, IKBKB, IQSEC1, IRS4, KIAA0664L3, KIAA0748, KLF3, KLF9, KRT18, LEF1, LINC00342, LIPA, LIPT1, LLGL2, LMBR1L, LPAR2, LTBP3, LYPD3, LZTFL1, MANBA, MAP2K6, MAP3K1, MARCH8, MAU2, MGEA5, MMP8, MPO, MSL1, MSL3, MYH3, MYLIP, NAGPA, NDST2, NISCH, NKTR, NLRP1, NOSIP, NPIP, NUMA1, PAIP2B, PAPD7, PBXIP1, PCIF1, PI4KA, PLCL2, PLEKHA1, PLEKHF2, PNISR, PPFIBP2, PRKCA, PRKCZ, PRKD3, PRMT2, PTP4A3, PXN, RASA2, RASA3, RASGRP2, RBM38, REPIN1, RNF38, RNF44, ROR1, RPL30, RPL32, RPLP1, RPS20, RPS24, RPS27, RPS6, RPS9, RXRA, RYK, SCAND2, SEMA4C, SETD1B, SETD6, SETX, SF3B1, SH2B1, SLC2A4RG, SLC35E2B, SLC46A3, SMAGP, SMARCE1, SMPD1, SNPH, SP140L, SPATA6, SPG7, SREK1IP1, SRSF5, STAT5B, SVIL, SYF2, SYNJ2BP, TAF1C, TBC1D4, TCF20, TECTA, TES, TMEM127, TMEM159, TMEM30B, TMEM66, TMEM8B, TP53TG1, TPCN1, TRIM22, TRIM44, TSC1, TSC22D1, TSC22D3, TSPYL2, TTC9, TTN, UBE2G2, USP33, USP34, VAMP1, VILL, VIPR1, VPS13C, ZBED5, ZBTB25, ZBTB40, ZC3H3, ZFP161, ZFP36L1, ZFP36L2, ZHX2, ZMYM5, ZNF136, ZNF148, ZNF318, ZNF350, ZNF512B, ZNF609, ZNF652, ZNF83, ZNF862, 및 ZNF91.
유전자 세트 "기억 분화에서 점진적으로 증가"는 다음의 유전자를 포함한다: MTCH2, RAB6C, KIAA0195, SETD2, C2orf24, NRD1, GNA13, COPA, SELT, TNIP1, CBFA2T2, LRP10, PRKCI, BRE, ANKS1A, PNPLA6, ARL6IP1, WDFY1, MAPK1, GPR153, SHKBP1, MAP1LC3B2, PIP4K2A, HCN3, GTPBP1, TLN1, C4orf34, KIF3B, TCIRG1, PPP3CA, ATG4D, TYMP, TRAF6, C17orf76, WIPF1, FAM108A1, MYL6, NRM, SPCS2, GGT3P, GALK1, CLIP4, ARL4C, YWHAQ, LPCAT4, ATG2A, IDS, TBC1D5, DMPK, ST6GALNAC6, REEP5, ABHD6, KIAA0247, EMB, TSEN54, SPIRE2, PIWIL4, ZSCAN22, ICAM1, CHD9, LPIN2, SETD8, ZC3H12A, ULBP3, IL15RA, HLA-DQB2, LCP1, CHP, RUNX3, TMEM43, REEP4, MEF2D, ABL1, TMEM39A, PCBP4, PLCD1, CHST12, RASGRP1, C1orf58, C11orf63, C6orf129, FHOD1, DKFZp434F142, PIK3CG, ITPR3, BTG3, C4orf50, CNNM3, IFI16, AK1, CDK2AP1, REL, BCL2L1, MVD, TTC39C, PLEKHA2, FKBP11, EML4, FANCA, CDCA4, FUCA2, MFSD10, TBCD, CAPN2, IQGAP1, CHST11, PIK3R1, MYO5A, KIR2DL3, DLG3, MXD4, RALGDS, S1PR5, WSB2, CCR3, TIPARP, SP140, CD151, SOX13, KRTAP5-2, NF1, PEA15, PARP8, RNF166, UEVLD, LIMK1, CACNB1, TMX4, SLC6A6, LBA1, SV2A, LLGL2, IRF1, PPP2R5C, CD99, RAPGEF1, PPP4R1, OSBPL7, FOXP4, SLA2, TBC1D2B, ST7, JAZF1, GGA2, PI4K2A, CD68, LPGAT1, STX11, ZAK, FAM160B1, RORA, C8orf80, APOBEC3F, TGFBI, DNAJC1, GPR114, LRP8, CD69, CMIP, NAT13, TGFB1, FLJ00049, ANTXR2, NR4A3, IL12RB1, NTNG2, RDX, MLLT4, GPRIN3, ADCY9, CD300A, SCD5, ABI3, PTPN22, LGALS1, SYTL3, BMPR1A, TBK1, PMAIP1, RASGEF1A, GCNT1, GABARAPL1, STOM, CALHM2, ABCA2, PPP1R16B, SYNE2, PAM, C12orf75, CLCF1, MXRA7, APOBEC3C, CLSTN3, ACOT9, HIP1, LAG3, TNFAIP3, DCBLD1, KLF6, CACNB3, RNF19A, RAB27A, FADS3, DLG5, APOBEC3D, TNFRSF1B, ACTN4, TBKBP1, ATXN1, ARAP2, ARHGEF12, FAM53B, MAN1A1, FAM38A, PLXNC1, GRLF1, SRGN, HLA-DRB5, B4GALT5, WIPI1, PTPRJ, SLFN11, DUSP2, ANXA5, AHNAK, NEO1, CLIC1, EIF2C4, MAP3K5, IL2RB, PLEKHG1, MYO6, GTDC1, EDARADD, GALM, TARP, ADAM8, MSC, HNRPLL, SYT11, ATP2B4, NHSL2, MATK, ARHGAP18, SLFN12L, SPATS2L, RAB27B, PIK3R3, TP53INP1, MBOAT1, GYG1, KATNAL1, FAM46C, ZC3HAV1L, ANXA2P2, CTNNA1, NPC1, C3AR1, CRIM1, SH2D2A, ERN1, YPEL1, TBX21, SLC1A4, FASLG, PHACTR2, GALNT3, ADRB2, PIK3AP1, TLR3, PLEKHA5, DUSP10, GNAO1, PTGDR, FRMD4B, ANXA2, EOMES, CADM1, MAF, TPRG1, NBEAL2, PPP2R2B, PELO, SLC4A4, KLRF1, FOSL2, RGS2, TGFBR3, PRF1, MYO1F, GAB3, C17orf66, MICAL2, CYTH3, TOX, HLA-DRA, SYNE1, WEE1, PYHIN1, F2R, PLD1, THBS1, CD58, FAS, NETO2, CXCR6, ST6GALNAC2, DUSP4, AUTS2, C1orf21, KLRG1, TNIP3, GZMA, PRR5L, PRDM1, ST8SIA6, PLXND1, PTPRM, GFPT2, MYBL1, SLAMF7, FLJ16686, GNLY, ZEB2, CST7, IL18RAP, CCL5, KLRD1, 및 KLRB1.
유전자 세트 "위 TEM 대 아래 TN"은 다음의 유전자를 포함한다: MYO5A, MXD4, STK3, S1PR5, GLCCI1, CCR3, SOX13, KRTAP5-2, PEA15, PARP8, RNF166, UEVLD, LIMK1, SLC6A6, SV2A, KPNA2, OSBPL7, ST7, GGA2, PI4K2A, CD68, ZAK, RORA, TGFBI, DNAJC1, JOSD1, ZFYVE28, LRP8, OSBPL3, CMIP, NAT13, TGFB1, ANTXR2, NR4A3, RDX, ADCY9, CHN1, CD300A, SCD5, PTPN22, LGALS1, RASGEF1A, GCNT1, GLUL, ABCA2, CLDND1, PAM, CLCF1, MXRA7, CLSTN3, ACOT9, METRNL, BMPR1A, LRIG1, APOBEC3G, CACNB3, RNF19A, RAB27A, FADS3, ACTN4, TBKBP1, FAM53B, MAN1A1, FAM38A, GRLF1, B4GALT5, WIPI1, DUSP2, ANXA5, AHNAK, CLIC1, MAP3K5, ST8SIA1, TARP, ADAM8, MATK, SLFN12L, PIK3R3, FAM46C, ANXA2P2, CTNNA1, NPC1, SH2D2A, ERN1, YPEL1, TBX21, STOM, PHACTR2, GBP5, ADRB2, PIK3AP1, DUSP10, PTGDR, EOMES, MAF, TPRG1, NBEAL2, NCAPH, SLC4A4, FOSL2, RGS2, TGFBR3, MYO1F, C17orf66, CYTH3, WEE1, PYHIN1, F2R, THBS1, CD58, AUTS2, FAM129A, TNIP3, GZMA, PRR5L, PRDM1, PLXND1, PTPRM, GFPT2, MYBL1, SLAMF7, ZEB2, CST7, CCL5, GZMK, 및 KLRB1.
유사한 프로세스 및/또는 특성을 설명하는 다른 유전자 세트를 사용하여 상기 세포 표현형을 특성화할 수도 있다.
Cell Ranger VDJ를 사용하여 단일 세포 VDJ 서열과 각 단일 세포 5' 라이브러리에 대한 주석을 생성하였다. 데이터 분석 및 시각화를 위해 Loupe Cell Browser 소프트웨어와 Bioconductor 패키지를 사용하였다.
결과
이 실시예는 단일 세포 RNA-seq(scRNA-seq)를 사용하여, 투입 세포로 작용하는 정제된 T세포, ARM 프로세스를 이용하여 제조된 CART 세포("1일차" 세포로 라벨링됨) 및 TM 프로세스를 이용하여 제조된 CART 세포("9일차" 세포로 라벨링됨) 간의 T세포 상태를 비교하는 것을 목적으로 한다. 또한, 단일 세포 TCR-seq(scTCR-seq)를 수행하여 클론성을 연구하고 투입에서 제조 후 물질까지 세포 분화를 추적하였다.
도 37의 A 내지 C에 도시된 바와 같이, 투입 세포는 발현된 유전자와 UMI가 가장 적었고, 이는 이들 세포가 전사적으로 활성이 아니고 휴지 상태에 있음을 시사한다. 1일차 및 9일차 세포는 더 많은 유전자를 발현했으며, 9일차 세포가 전사적으로 가장 활성이었다. 유사한 결과가 도 38a 내지 도 38d에 도시되어 있다. 투입 세포는 증식 유전자를 발현하지 않았다(도 38a 및 도 38d).
추가 유전자 세트 분석 데이터는 도 39a 내지 도 39e에 도시되어 있다. 유전자 세트 점수 중앙값을 사용하여 상이한 세포 집단을 비교하였다. 1일차 세포와 투입 세포는 더 어리고, 더 줄기-유사 기억 상태에 있었다(도 39a 내지 도 39c). 도 39a에서, 1일차 세포, 9일차 세포, 및 투입 세포에 대한 유전자 세트 점수 중앙값(위 TEM 대 아래 TSCM)은 각각 -0.084, 0.035, 및 -0.1이다. 도 39b에서, 1일차 세포, 9일차 세포, 및 투입 세포에 대한 유전자 세트 점수 중앙값(위 Treg 대 아래 Teff)는 각각 -0.082, 0.087, 및 -0.071이다. 도 39c에서, 1일차 세포, 9일차 세포, 및 투입 세포에 대한 유전자 세트 점수 중앙값(아래 줄기세포능)은 각각 -0.062, 0.14, 및 -0.081이다.
또한, 1일차 세포는 9일차 세포와 비교하여 더욱 이상적인 대사 상태에 있었다(도 39d 및 도 39e). 도 39d에서, 1일차 세포, 9일차 세포, 및 투입 세포에 대한 유전자 세트 점수 중앙값(위 저산소증)은 각각 0.019, 0.11, 및 -0.096이다. 도 39e에서, 1일차 세포, 9일차 세포, 및 투입 세포에 대한 유전자 세트 점수 중앙값(위 자가포식)은 각각 0.066, 0.11, 및 -0.09이다.
유전자 발현을 기반으로, 투입 세포는 4개의 클러스터를 포함한다. 클러스터 0은 LMNA, S100A4 등의 높은 발현을 특징으로 한다. 클러스터 1은 RP913, PRKCQ-AS1 등의 높은 발현을 특징으로 한다. 클러스터 2는 PR11-291B21.2, CD8B 등의 높은 발현을 특징으로 한다. 클러스터 3은 NKG7, GZMH, CCL5, CST7, GNLY, FGFBP2, GZMA, CCL4, CTSW, CD8A 등의 높은 발현을 특징으로 한다. 투입 세포에 대한 T-분산 확률적 이웃 임베딩(TSNE) 플롯에서, 클러스터 3은 다른 세포로부터 두드러졌고, 클러스터 1과 클러스터 2는 구별하기 어려웠다.
도 40의 A 내지 C에 도시된 유전자 세트 분석에 따르면, 클러스터 0과 클러스터 3은 T 이펙터 표현형이 강화된 클러스터 1과 클러스터 2와 비교하여 T 조절 표현형이 강화되었다. 클러스터 3은 후기 기억/이펙터 기억(TEM) 세포가 우세하였고, 클러스터 1과 클러스터 2는 초기 기억 세포와 나이브 세포가 우세하였고, 클러스터 0은 중간이다. 투입 세포의 대부분은 초기 기억, 나이브 상태였다. 이론에 구애되고자 함이 없이, 이러한 세포는 제조 과정에서 가장 잘 작동할 수 있다.
1일차 세포 및 9일차 세포에서 더 적은 전사 이질성이 관찰되었다(데이터 미도시).
투입 집단과 마찬가지로, 1일차 세포는 TSNE 플롯에서 초기 기억 세포의 큰 클러스터와 후기 기억 세포의 더 작은 클러스터를 나타냈으며, 이는 투입 세포의 클러스터 3에서 관찰된 것과 유사하다. 대조적으로, 9일차 세포는 TSNE 플롯에서 초기 기억 세포의 뚜렷한 클러스터를 나타내지 않았다. 이는 9일차까지 세포가 더 균질해졌음을 의미한다.
TCR을 시퀀싱하고, 클로노타입 다양성을 측정하였다. 전반적으로, 3개의 클로노타입 프로파일은 매우 평평하였다. 대부분의 클론은 한 번만 수집되었다(도 41의 A 내지 C 및 표 24). 표 24의 섀넌 엔트로피는 분포의 평탄도를 측정한다. 투입 세포의 지배적인 클론은 후기 기억 세포였다. 1일차 세포는 투입 세포와 비슷해 보였지만 균일해지기 시작했다. 9일차까지, 지배적인 클론은 대체로 균일해졌고, 분포는 훨씬 더 평탄했다. 투입 세포 또는 1일차 세포보다 9일차 세포에서 분포가 훨씬 더 균일하고 평평했기 때문에 다양성 측정은 9일차에 가장 높았다.
[표 24]
Figure pct00102
요약
1일차와 9일차 생성물 사이에 상당한 T세포 상태 차이가 있었다. 1일차 세포는 투입 세포와 훨씬 더 유사했으며, 줄기세포능 표지가 강화되어, 더 효과적인 생성물을 나타냈다.
실시예 11: 재발성 및/또는 불응성 다발성 골수종(MM)이 있는 성인 환자에서 B세포 성숙 항원(BCMA) 유도성 CAR-T 세포의 I상, 공개 라벨, 연구
이 연구는 IMiD(예를 들어, 레날리도미드 또는 포말리도미드), 프로테아좀 억제제(예를 들어, 보르테조밉, 카르필조밉), 및 이용 가능한 경우, 승인된 항-CD38 항체(예를 들어, 다라투무맙)를 포함한, 적어도 2가지 이전의 치료 요법에 대해 재발성 및/또는 불응성이고, 문서화된 질환 진행의 증거(IMWG 기준)가 있는 성인 MM 피험자에서 항-BCMA CART-T 세포 요법의 안전성 및 내약성을 평가한다.
항-BCMA CAR은 PI61 항-BCMA scFv, CD8 힌지 및 막관통 영역, 4-1BB 공동자극 도메인, 및 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함한다. 이 연구에서, 항-BCMA CAR-T 세포 생성물은 활성화된 신속 제조(ARM) 프로세스를 이용하여 제조된다. 이러한 세포를 "ARM-BCMA CAR"이라고 지칭한다. 구체적으로, T세포 표면에서 CD4 및 CD8 공동수용체를 포획하는, 상업적으로 이용 가능한 자성 비드를 사용하여 피험자의 백혈구 성분채집 단위로부터 T세포를 강화한다. 그 후, 강화된 T세포를 인간 CD3 및 CD28에 대한 인간화 재조합 작용제 항체에 공유적으로 부착된 콜로이드 고분자 나노매트릭스로 자극한다. 시딩, 활성화, 및 형질도입 후 24시간 후에, CAR-T 세포를 수확하고 세척하여 잔류하는 통합되지 않은 벡터 및 결합되지 않은 활성화 매트릭스를 제거한다. 세척 후, BCMA CART 세포 요법을 농축하고, 동결보존한다. 방출 테스트 절차의 결과는 투여를 위한 생성물의 방출 전에 요구된다.
렌티바이러스 벡터로 형질도입시킨 후 7~8일 동안 지속되는 생체외 T세포 증식 기간에 의존하는 CAR-T 세포를 위한 TM 프로세스와 비교하여, ARM 프로세스는 생체외 T세포 증식을 포함하지 않는다. 대조적으로, ARM 생산된 T세포는 유전자 전달 24시간 후에 수확되어 환자의 생체 내에서 증식이 가능하다. ARM 프로세스로 달성된 생체내 T세포 증식이 클수록, 덜 분화된 T세포 표현형을 초래하여, 최종 세포 생성물에서 기억 줄기 T세포의 더 많은 분획을 보존할 것으로 예측된다. 덜 분화된 기억 CAR-T 세포의 존재는 임상 연구에서 개선된 항종양 효능과 관련이 있었다(문헌[Fraietta JA, et al., (2018) Nat Med, 24(5); 563-71]). 이론에 구애되고자 함이 없이, 더 많은 분획의 기억 T 줄기세포로 구성된 BCMA CART 세포는 환자에서 CAR-T 세포 증식을 향상시키며, 따라서 이펙터 T세포 고갈을 극복하고, 종래의 제조 프로세스로 생산된 BCMA CART와 비교하여, MM 환자에서 오래 지속되는 효능을 가져온다.
ARM 프로세스는 종래의 제조(TM) 프로세스를 이용하여 제조된 CART 세포와 비교하여, 전체 생성물과 CAR 양성 분획 모두에서, 현저히 더 큰 비율의 나이브-유사 기억 T세포(CCR7+/CD45RO-)로 구성된 CAR-T 세포를 생산한다. ARM-BCMA CAR은 용량 반응 방식으로 전임상 MM 모델에서 종양 근절을 보여주었다. ARM-BCMA CAR은 TM 프로세스로 생성된 BCMA CAR-T 세포에 비해 적어도 5배 더 강력하며, 더 높은 수준의 전신 사이토카인과 함께, 생체 내에서 연장된 CAR-T 증식으로 이어졌다. 종합하면, 이러한 결과는 ARM 프로세스로 제조된 항-BCMA CAR-T 세포 생성물이 뚜렷한 기억 줄기세포 표현형을 가진 T세포를 함유하여, 향상된 생착, 증식, 및 항-MM 특성을 갖는 BCMA CAR-T 세포 생성물로 이어진다는 가설을 뒷받침한다.
이 I상 연구에서, 스크리닝 중에 먼저 임상 적격에 대해 각 피험자를 평가한다. 이 연구에 포함될 자격이 있는 피험자는 하기의 모든 기준을 충족해야 한다: (1) ICF 서명 당시 18세 이상; (2) 스크리닝시 0 또는 1인 ECOG 활동도; (3) IMiD(예를 들어, 레날리도미드 또는 포말리도미드), 프로테아좀 억제제(예를 들어, 보르테조밉, 카르필조밉), 및 승인된 항-CD38 항체(예를 들어, 다라투무맙)(이용 가능한 경우)를 포함한, 적어도 2가지 이전의 치료 요법에 대해 재발성 및/또는 불응성이고, 문서화된 질환 진행의 증거(IMWG 기준)가 있는 MM 피험자; (4) 피험자는 다음 3가지 측정값 중 적어도 하나로 정의되는 측정 가능한 질병이 있어야 함: 혈청 M-단백질 ≥ 1.0 g/dL, 소변 M-단백질 ≥ 200 mg/24시간, 또는 혈청 유리 경쇄(sFLC) > 100 mg/L의 관련 FLC; (5) 모든 환자는 기관의 지침에 따라 연속 골수 생검 및/또는 흡인 채취에 적합해야 하며 이 연구에 설명된 이러한 반복 절차를 기꺼이 받아야 함; (6) 피험자는 스크리닝시 다음 혈액학적 값을 충족해야 함:테스트 전 7일 이내에 성장인자 보조 없이 절대 호중구 수(ANC) ≥ 1,000/mm3 (≥ 1×109/L), 테스트 전 7일 이내에 수혈 보조 없이 CD3+ T세포의 절대 수 > 150/mm3 (> 0.15×109/L), 혈소판 ≥ 50 000/mm3 (≥ 50×109/L), 및 헤모글로빈 ≥ 8.0 g/dl (≥ 4.9 mmol/L); (7) 플루다라빈/시클로포스파미드 LD 요법을 받기에 적합한 환자라고 임상시험자에 의해 간주되어야 함; 및 (8) 제조를 위해 승인된 비가동화 세포의 백혈구 성분채집 물질이 있어야 함. 자격이 있는 경우, 피험자는 CAR-T 제조를 위해 수집 및 제출된 백혈구 성분채집 생성물을 갖는다. 피험자는 제조 시작을 위한 백혈구 성분채집 생성물의 수락과 함께 등록된다.
피험자는 최종 생성물이 이용 가능한 것으로 확인된 후에만 림프구제거(LD) 화학요법을 받는다. LD 화학요법 후, 단일 용량의 항-BCMA CAR-T 세포 생성물이 해동 후 90분 이내에 피험자에게 정맥내(i.v.) 주사를 통해 투여된다(도 42). ARM-BCMA CAR의 시작 용량은 1×107개의 생존 가능한 CAR 양성 T세포이다. 5×107개의 생존 가능한 CAR 양성 T세포의 용량도 테스트한다. 각 피험자는 항-BCMA CAR-T 세포 투여 후 처음 72시간 동안 입원한다.
약동학 분석을 위해, 연속 혈액 샘플을 서로 다른 시점에 수집하여 유세포 분석 및 qPCR에 의해 말초혈액에서 ARM-BCMA CAR 세포 동역학을 측정하고, 유세포 분석 및 qPCR에 의해 골수에서 세포 및 체액 면역원성을 측정하고, ELISA에 의해 말초혈액에서, sBCMA, BAFF, 및 APRIL을 포함한 잠재적인 약력학적 마커를 측정한다. 특히, 피험자는 말초혈액, 골수, 또는 기타 관련 조직에서 CAR 이식유전자의 양; 말초혈액 또는 골수에서 CAR 양성 T세포의 표면 발현; 혈청 내 항-mCAR 항체; PBMC에서 IFN-γ 양성 CD4/CD8 T세포의 백분율; 면역 세포 활성화 마커; 가용성 면역 인자 및 사이토카인(예를 들어, sBCMA, IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-15, TNF-α), CAR-T 클론성; 및 혈청 내 가용성 BCMA, APRIL, 및 BAFF의 수준에 대해 분석된다.
실시예 12: 활성화된 신속 제조(ARM) 프로세스를 이용한 CART 세포의 제조
BCMA CART 세포의 ARM 프로세스는 표 25에 요약된 바와 같은 배지 제조로 시작한다.
동결보존된 백혈구 성분채집 생성물을 출발물질로 사용하며, T세포 강화를 위해 처리한다. 가능한 경우, 성분채집 서류를 사용하여 T세포 백분율을 정의한다. 성분채집 서류에 T세포 백분율 데이터가 없는 경우, 입수되는 동결보존된 백혈구 성분채집 생성물에 대해 센티넬 바이알 테스트를 수행하여 성분채집에 대한 T세포 백분율 표적을 얻는다. T세포 백분율에 대한 결과는 ARM 프로세스의 0일차에 해동되는 백의 수를 결정한다.
[표 25]
Figure pct00103
동결보존된 성분채집물을 해동시키고, 세척한 다음, CliniMACS® 마이크로비드 기술을 사용하여 T세포 선택 및 강화를 수행한다. 생존 가능한 유핵 세포(VNC)를 TransACT(Miltenyi)로 활성화하고, CAR을 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입시킨다. Miltenyi 마이크로비드로 선택된 생존 가능한 세포를 비가습 인큐베이션 챔버인 Prodigy®의 센트리컬트에 시딩한다. 배양하는 동안, T세포 활성화 및 형질도입을 촉진하기 위해 구성요소 중 CTSTM 보충제(ThermoFisher), Glutamax, IL-2, 및 2%의 면역 세포 혈청 대체물을 함유하는 OpTmizerTM CTSTM 기반의 배지인 Rapid 배지에 세포를 현탁시킨다. TransACT를 배양 배지에 희석된 세포에 첨가한 후, 시딩 당일에 렌티바이러스 형질도입을 1회 수행한다. 렌티바이러스 벡터는 시딩 당일 사용 직전에 실온에서 최대 30분 동안 해동될 것이다.
0일차 프로세스 시작부터 배양물 세척 및 수확 시작까지, BCMA CART 세포를 시딩으로부터 20~28시간 동안 배양한다. 배양 후, 세포 현탁액은 센트리컬트 챔버(Miltenyi Biotech) 내에서 2회의 배양물 세척과 1회의 수확 세척을 거친다.
1일차에 CliniMACS® Prodigy®에서 수확 세척 후, 세포 현탁액을 샘플링하여 생존 가능한 세포 수 및 생존능을 결정한다. 그 후, 세포 현탁액을 원심분리기로 옮겨 수동으로 펠릿화한다. 상청액을 제거하고, 세포 펠릿을 CS10(BioLife Solution)에 재현탁시켜, 최종 DMSO 농도가 약 10.0%인 생성물 제형을 생성한다. 생존 가능한 세포 수를 투여를 위한 수확 종료시 공식화한다. 그 후, 용량을 개별 냉동 백에 분배하고, 냉동바이알에 분석 샘플링을 수행한다.
동결보존된 생성물을 최종 방출 및 운송시까지 안전하고 제한된 접근 구역에서 모니터링되는 LN2 저장 탱크에 보관한다.
실시예 13: 활성화된 신속 제조(ARM) 프로세스를 이용하여 제조된 BCMA CART 세포의 특성화
요약
이 실시예는 ARM 프로세스를 이용하여 제조된 BCMA CART 세포의 특성화를 설명한다. ARM 프로세스는 종래의 제조(TM) 프로세스 생성물과 비교하여, 현저히 더 큰 비율의 나이브-유사 기억 T세포(CCR7+/CD45RO-)로 구성된 CAR-T 세포를 생성한다. 다발성 골수종(MM)의 전임상 모델에서, ARM 프로세스를 이용하여 제조된 BCMA CART 세포는 용량 의존적 방식으로 종양 퇴행을 유도했으며, TM 프로세스를 이용하여 제조된 BCMA CART 세포에 비해, 종양을 사멸시키는 데 최대 5배 더 효과적이었다. 또한, ARM 제조 세포는 TM 제조 세포에 비해 생체 내에서 연장된 CART 증식을 나타냈고(최대 3배 더 높은 Cmax 및 AUC0-21d), 더 높은 전신 사이토카인을 유도했다(3.5배의 IFN-γ). 종합하면, 이러한 결과는 ARM 프로세스로 제조된 BCMA CART 세포가 뚜렷한 기억 줄기세포 표현형과 향상된 생체내 증식 가능성을 갖는 T세포를 함유한다는 가설을 뒷받침한다.
ARM 프로세스를 이용하여, CAR은 바이러스 첨가 후 96시간째(생성물의 해동 후 72시간째라고도 지칭함)에 안정적으로 발현될 수 있다. 따라서, 바이러스 첨가 후 96시간 또는 해동 후 72시간은 시험관내 및 생체내 활성에 대한 CAR 발현의 대리 시점으로 간주된다. ARM 프로세스를 이용하여 제조된 BCMA CART 세포는 TM 프로세스로 제조된 BCMA CART 세포에 비해, 덜 분화된 세포 집단을 보존하고, 시험관 내에서 더 높은 표적 특이적 사이토카인 생성을 보여준다.
ARM 프로세스를 이용하여 제조된 BCMA CART 세포는 상용 인간 원형질 막 단백질 어레이를 이용하여 BCMA에 높은 특이성을 나타냈다. 이 분석법은 BCMA(TNFRSF17)에 대한 결합을 검출하였지만, 다른 강하거나, 중간이거나 약한 결합제에 대한 결합은 그렇지 않았다. 이러한 스크린은 BCMA CART 생성물에서 발현된 항-인간 BCMA 단일쇄 항체 가변 단편(scFv)(PI61)의 교차 반응 단백질의 존재를 높은 신뢰도로 확인하지 못했다. 잠재적인 오프-종양(off-tumor) 온-타겟(on-target) 독성을 결정하기 위해 표적 분포 연구를 수행하였다. 면역조직화학(IHC), 인시튜 혼성화(ISH), 및 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 분석을 이용하여 정상 인간 조직에서 BCMA의 분포를 조사하였다. 이러한 분석은 BCMA 발현이 이차 림프 기관, 골수, 및 점막 관련 림프 조직과 같은, 정상 형질세포(PC)를 함유하는 부위로 제한된다는 점을 입증했다. 중추신경계(CNS) 신경독성은 다른 세포 기반 요법의 관심사였으므로, 뇌에서의 발현을 조사하였다. BCMA에 특이적인 것으로 밝혀진 상업적으로 입수 가능한 항체를 이용하는 면역조직화학에 의해서도, 그리고 BCMA 표적화 scFv를 함유하는 인간-토끼 키메라 도구 항체를 이용하는 결합 분석에 의해서도, CNS의 염색이 관찰되지 않았다. 이러한 발견은 인시튜 혼성화 및 PCR 기반의 스플라이스 변이체 분석에 의해 측정했을 때 이러한 조직에서의 BCMA mRNA의 부재에 의해 확인되었다. 정상 PC 및 BCMA-발현 형질세포양 수지상세포의 BCMA CART 표적화는 이들의 고갈을 초래할 가능성이 있다. 그러나 다른 세포 유형의 표적화는 예상되지 않는다.
결과
아래에 기술된 연구는 ARM 프로세스를 이용하여 제조된 BCMA CART 세포("ARM-BCMA CAR"이라고 지칭함)를 TM 프로세스를 이용하여 제조된 BCMA CART 세포("TM-BCMA CAR" 또는 "TM-BCMA CAR*"이라 지칭함)와 비교하였다. ARM-BCMA CAR에서 발현된 CAR과 TM-BCMA CAR*에서 발현된 CAR은 PI61 scFv, CD8 힌지 및 막관통 영역, 4-1BB 공동자극 도메인, 및 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하는 동일한 서열을 갖는다. TM-BCMA CAR에서 발현된 CAR은 BCMA10 scFv, CD8 힌지 및 막관통 영역, 4-1BB 공동자극 도메인, 및 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함한다.
시험관내 ARM-BCMA CAR 발현 동역학
8~9일 후 CAR 이식유전자의 렌티바이러스 통합을 측정하는 TM과 달리, ARM 프로세스에서는, 렌티바이러스 유사형질도입이 발생할 수 있기 때문에 렌티바이러스 이식유전자는 렌티바이러스 첨가 후 24시간 이내에 완전히 통합되지 않고 엄밀히 발현되지 않을 수 있다(문헌[Haas DL, et al., (2000) Mol Ther; 2(1):71-80; Galla M, et al., (2004) Mol Cell; 16(2):309-15]). 따라서, BCMA-CAR 발현 패턴을 3'-아지도-3'-데옥시티미딘(AZT)의 존재 또는 부재하에 ARM-BCMA CAR을 시험관 내에서 연장 배양하여 시간 경과에 따라 평가하여 CAR 이식유전자의 잠재적인 유사형질도입 대 안정적인 통합 및 발현을 평가하였다. T세포 활성화 및 렌티바이러스 벡터를 이용한 형질도입 후 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 및 168시간 후에 CAR 표면 발현을 검출하기 위해 유세포 분석(FACS)을 수행하였다. 일부 경우에, 다른 분석에서의 추가 특성화를 위해 ARM-BCMA CAR 및 이 생성물의 분취량을 수확 즉시 동결시켰다.
도 43에 도시된 바와 같이, FACS 분석은 BCMA-CAR이 렌티바이러스 벡터를 첨가한 후 24시간 후에 실질적으로 발현을 나타내지 않았음을 나타낸다. 그러나 CAR+ 집단은 처음에 48시간째에 나타났다. CAR+ 집단은 바이러스 첨가 후 48시간에서 168시간까지의 각 시점에서 약간 증가하였다. CAR은 96시간째부터 안정적으로 발현되는 것으로 보였다. 이는 48시간째부터 임의의 시점에서 CAR+ 집단을 나타내지 않은 비형질도입(UTD) 샘플 및 AZT 처치된 샘플과 대조된다(도 43). AZT는 30 μM 및 100 μM의 용량 둘 다에서 CAR 발현을 효과적으로 억제할 수 있었고, 이는 BCMA-CAR 발현이 숙주 세포 게놈 내로의 바이러스 유전자 통합으로 인한 것이고 렌티바이러스 유사형질도입의 결과일 가능성은 낮음을 시사한다.
ARM-BCMA CAR은 T세포 줄기세포능을 보존한다
ARM-BCMA CAR 및 TM-BCMA CAR을 FACS에 의해 분석하여 해동시 CAR 발현뿐만 아니라 해동 후 48시간째의 T세포 표현형을 평가하였다(도 44a 및 도 44b). BCMA-CAR은 두 공여체에서 관찰된 해동 시점에서 거의 검출되지 않았으며(도 44a), 이는 도 43에 도시된 CAR 발현 동역학 연구에서의 관찰과 일치한다. 그러나 해동 후 48시간째, BCMA-CAR 발현은 ARM-BCMA CAR에 대해 32.9%였다. 대조적으로, TM-BCMA CAR은 7%의 BCMA-CAR 발현을 나타냈다(도 44b). CAR+ T세포 표현형의 분석 결과, ARM 프로세스는 이펙터 기억 T세포 집단(CD45RO+/CCR7-)보다 26배 더 많은 것으로 입증된 나이브-유사 T세포(60% CD45RO-/CCR7+)를 보유하는 것으로 나타났다. TM 프로세스는 주로 CAR+ T세포 내에 중심 기억 T세포(81%의 CD45RO+/CCR7+)를 생성하였다. 나이브-유사 T세포 집단은 TM 프로세스에서는 거의 없었다. 이 나이브 T세포 집단은 CD45RO-/CD27+ Tstem 세포와 대체로 중첩되며(문헌[Cohen AD, et al., (2019) J Clin Invest; 129(6):2210-21]; 및 문헌[Fraietta, et al (2018) Nat Med, 24(5); 563-571]에 기술됨), 향상된 CAR-T 발현 및 임상 반응과 관련이 있다.
표현형 외에도 최종 ARM-BCMA CAR 세포 생성물의 시험관내 활성화에 대해서도 평가하였다. ARM-BCMA CAR 및 TM-BCMA CAR을 해동시키고 BCMA-발현 세포주 KMS-11과 공동배양하였다. 해동 후 ARM-BCMA CAR 세포를 공동배양이 확립되기 전 24시간 동안 휴면하게 하였다. 공동배양 24시간 후의 상청액의 사이토카인 수준을 비교한 결과, 도 45a 및 도 45b에 도시된 바와 같이, TM-BCMA CAR과 비교하여 ARM-BCMA CAR에 의해 분비되는 IL-2가 5배 증가하였고, IFN-γ 수준이 2배 증가한 것으로 나타났다. ARM 또는 TM 프로세스를 거친 UTD 세포를 사용한 실험은 ARM-BCMA CAR 및 TM-BCMA CAR에 의한 BCMA 특이적 인식을 확인시켜 주었다. 그러나 BCMA 특이적 자극의 부재시 ARM-UTD에 의한 IFN-γ 분비의 더 높은 백그라운드(도 45b)는 ARM 생성물의 활성화된 특성 때문일 가능성이 있다.
요약하면, BCMA CART 세포를 생성하는 데 사용된 ARM 프로세스는 TM 프로세스보다 더 높은 CAR 발현을 나타내는 T세포를 생성한다. ARM-BCMA CAR은 시험관내 BCMA 특이적 활성화를 나타내고, TM-BCMA CAR과 비교하여 더 높은 수준의 IL-2를 분비하며, 이는 Tstem 표현형과 상관관계가 있다.
이종이식 모델에서 ARM-BCMA CAR 및 TM-BCMA CAR의 효능
ARM-BCMA CAR의 개발을 유도하기 위해 생체내 약리학 연구를 이용하였다. 도 46에 기술된 실험을 위해, GMP 재료로 ARM-BCMA CAR을 생성하였다. 동시에, 동일한 배치의 T 세포를 사용하되 TM을 이용하여 TM-BCMA CAR을 제조하였다. ARM-BCMA CAR을 이용한 용량 계산의 경우, 생성물 해동 후 72시간째 CAR+ % 측정을 이용하여 용량을 계산한 반면, TM-BCMA CAR의 경우, 9일차 TM 생성물의 CAR+ %를 이용하여 용량을 계산하였다. 상이한 프로세스를 이용하여 생성된 CAR-T 세포의 효능을 MM 세포주 KMS-11-Luc를 접종한 면역결핍 NSG 마우스(NOD-scid IL2Rg-null)에서 평가하였다. 이 종양 세포주는 골수에 생착된다. MM 접종 8일 후, 마우스 코호트는 CAR+ T세포의 단일 주입을 받았다. 용량을 매치된 용량군에 대한 총 CAR-T 세포에 대해 정규화하였다. UTD T세포를 유사하게 준비하고, 종양에 대한 동종이계 반응을 제어하기 위해 독립적인 군으로서 제공하였다. UTD 용량은 TM 및 ARM 둘 모두에 대해 달성할 수 있는 각 프로세스의 가장 높은 총 T세포 용량을 반영하였다.
[표 26]
Figure pct00104
도 47은 모든 군에 대한 종양 퇴행 곡선이다. 두 BCMA CAR-T 생성물 모두(ARM-BCMA CAR 및 TM-BCMA CAR)는 테스트한 용량 수준에서, 가장 낮은 용량군에서조차, 종양을 제거할 수 있었다. 종양 퇴행은 용량 의존적 방식으로 유도되었다. 종양 사멸 효과의 시작은 고용량군과 비교하여 저용량군에서 약 1주일 동안 지연되었다. ARM-BCMA CAR은 TM-BCMA CAR보다 3~5배 낮은 용량에서 유사한 종양 퇴행을 유도했으며, 이는 ARM-BCMA CAR이 종양 사멸에서 TM-BCMA CAR에 비해 3~5배 더 강력함을 나타낸다.
또한, 이 연구에서 TM-BCMA CAR*의 효능도 평가하였다. TM-BCMA CAR*과 ARM-BCMA CAR은 동일한 항-BCMA CAR을 발현했지만, 각각 TM 프로세스와 ARM 프로세스의 상이한 프로세스를 이용하여 제조되었다. 결과는 ARM-BCMA CAR이 TM-BCMA CAR*보다 1~5배 낮은 용량에서 유사한 종양 퇴행을 유도했음을 보여주었다.
모든 마우스에서 CAR-T 요법 후 2일차, 7일차, 14일차, 및 21일차에 채혈하여 혈장 IFN-γ를 측정하였다(도 48a 내지 도 48c). 초기 최고점은 관찰되지 않았고 모든 군이 2일차에 매우 낮은 수준의 순환 IFN-γ(<10 pg/ml)를 나타냈다. CAR-T 투여 후 14일 이내에 모든 군에 대한 최고점이 관찰되었다. 그러나 IFN-γ 수준은 TM-BCMA CAR에 비해 ARM-BCMA CAR의 경우 3.5배 더 높았다. ARM-UTD군은 연구 종료 전 2일차 및 7일차에 IFN-γ를 거의 또는 전혀 생성하지 않는다. IFN-γ는 ARM-BCMA CAR 1e4 및 TM-BCMA CAR 5e4 군과 비교할 때 21일차에 더 높은 용량군에서 감소했으며, CAR+ T세포는 이들 두 군에서 지연된 종양 억제와 함께 여전히 증식 중이었다.
생체내 ARM-BCMA CAR 세포 동역학
NSG 마우스에서 효능을 평가하기 위한 이 약리학 연구의 일환으로, 주입 후 최대 3주까지 FACS에 의해 말초혈액 CAR-T 세포의 증식을 분석하였다. CD3+ T세포 및 CAR+ T세포 증식 둘 모두가 모든 CAR-T 처치군에서 관찰되었다. Cmax 또는 AUC0-21d와 관련하여 ARM-BCMA CAR 또는 TM-BCMA CAR에 대한 명확한 용량 의존적 증식은 없었다. ARM-BCMA CAR 또는 MTV273에 대한 세포 증식의 최고점은 21일 이내에 달성되지 않았다. 그러나 5e5의 용량군에서의 TM-BCMA CAR 및 0.5e5의 용량군에서의 ARM-BCMA CAR은 14일차에 명백한 최대 증식을 달성하였다(도 49). ARM-BCMA CAR의 증식을 21일 이내의 TM-BCMA CAR의 증식과 비교하면, ARM-BCMA CAR의 Cmax와 AUC0-21d 둘 모두가 2~3배 더 높았다.
실시예 14: IL-15 또는 hetIL-15(IL-15/sIL-15Ra)를 이용한 활성화된 신속 제조(ARM) 프로세스를 이용한 BCMA CART 세포의 제조
BCMA CART 세포의 ARM 프로세스는 표 25에 요약된 바와 같은 배지 제조로 시작한다.
동결보존된 백혈구 성분채집 생성물을 출발물질로 사용하며, T세포 강화를 위해 처리한다. 가능한 경우, 성분채집 서류를 사용하여 T세포 백분율을 정의한다. 성분채집 서류에 T세포 백분율 데이터가 없는 경우, 입수되는 동결보존된 백혈구 성분채집 생성물에 대해 센티넬 바이알 테스트를 수행하여 성분채집에 대한 T세포 백분율 표적을 얻는다. T세포 백분율에 대한 결과는 ARM 프로세스의 0일차에 해동되는 백의 수를 결정한다.
동결보존된 성분채집물을 해동시키고, 세척한 다음, CliniMACS® 마이크로비드 기술을 사용하여 T세포 선택 및 강화를 수행한다. 생존 가능한 유핵 세포(VNC)를 TransACT(Miltenyi)로 활성화하고, CAR을 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입시킨다. Miltenyi 마이크로비드로 선택된 생존 가능한 세포를 비가습 인큐베이션 챔버인 Prodigy®의 센트리컬트에 시딩한다. 배양하는 동안, T세포 활성화 및 형질도입을 촉진하기 위해 구성요소 중 CTSTM 보충제(ThermoFisher), Glutamax, IL-15 또는 hetIL-15(IL-15/sIL-15Ra), 및 2%의 면역 세포 혈청 대체물을 함유하는 OpTmizerTM CTSTM 기반의 배지인 Rapid 배지에 세포를 현탁시킨다. TransACT를 배양 배지에 희석된 세포에 첨가한 후, 시딩 당일에 렌티바이러스 형질도입을 1회 수행한다. 렌티바이러스 벡터는 시딩 당일 사용 직전에 실온에서 최대 30분 동안 해동될 것이다.
0일차 프로세스 시작부터 배양물 세척 및 수확 시작까지, BCMA CART 세포를 시딩으로부터 20~28시간 동안 배양한다. 배양 후, 세포 현탁액은 센트리컬트 챔버(Miltenyi Biotech) 내에서 2회의 배양물 세척과 1회의 수확 세척을 거친다.
1일차에 CliniMACS® Prodigy®에서 수확 세척 후, 세포 현탁액을 샘플링하여 생존 가능한 세포 수 및 생존능을 결정한다. 그 후, 세포 현탁액을 원심분리기로 옮겨 수동으로 펠릿화한다. 상청액을 제거하고, 세포 펠릿을 CS10(BioLife Solution)에 재현탁시켜, 최종 DMSO 농도가 약 10.0%인 생성물 제형을 생성한다. 생존 가능한 세포 수를 투여를 위한 수확 종료시 공식화한다. 그 후, 용량을 개별 냉동 백에 분배하고, 냉동바이알에 분석 샘플링을 수행한다.
동결보존된 생성물을 최종 방출 및 운송시까지 안전하고 제한된 접근 구역에서 모니터링되는 LN2 저장 탱크에 보관한다.
일부 구현예에서, OpTmizerTM CTSTM 기반 배지에 사용된 IL-15 또는 hetIL-15는 IL-6 또는 IL-6/sIL-6Ra로 대체될 수 있다.
실시예 15: 활성화된 신속 제조(ARM) 프로세스를 이용한 CD19 CART 세포의 제조
CD19 CART 세포의 ARM 프로세스는 표 25에 요약된 바와 같은 배지 제조로 시작한다.
동결보존된 백혈구 성분채집 생성물을 출발물질로 사용하며, T세포 강화를 위해 처리한다. 가능한 경우, 성분채집 서류를 사용하여 T세포 백분율을 정의한다. 성분채집 서류에 T세포 백분율 데이터가 없는 경우, 입수되는 동결보존된 백혈구 성분채집 생성물에 대해 센티넬 바이알 테스트를 수행하여 성분채집에 대한 T세포 백분율 표적을 얻는다. T세포 백분율에 대한 결과는 ARM 프로세스의 0일차에 해동되는 백의 수를 결정한다.
동결보존된 성분채집물을 해동시키고, 세척한 다음, CliniMACS® 마이크로비드 기술을 사용하여 T세포 선택 및 강화를 수행한다. 생존 가능한 유핵 세포(VNC)를 TransACT(Miltenyi)로 활성화하고, CAR을 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입시킨다. Miltenyi 마이크로비드로 선택된 생존 가능한 세포를 비가습 인큐베이션 챔버인 Prodigy®의 센트리컬트에 시딩한다. 배양하는 동안, T세포 활성화 및 형질도입을 촉진하기 위해 구성요소 중 CTSTM 보충제(ThermoFisher), Glutamax, IL-2, 및 2%의 면역 세포 혈청 대체물을 함유하는 OpTmizerTM CTSTM 기반의 배지인 Rapid 배지에 세포를 현탁시킨다. TransACT를 배양 배지에 희석된 세포에 첨가한 후, 시딩 당일에 렌티바이러스 형질도입을 1회 수행한다. 렌티바이러스 벡터는 시딩 당일 사용 직전에 실온에서 최대 30분 동안 해동될 것이다.
0일차 프로세스 시작부터 배양물 세척 및 수확 시작까지, CD19 CART 세포를 시딩으로부터 20~28시간 동안 배양한다. 배양 후, 세포 현탁액은 센트리컬트 챔버(Miltenyi Biotech) 내에서 2회의 배양물 세척과 1회의 수확 세척을 거친다.
1일차에 CliniMACS® Prodigy®에서 수확 세척 후, 세포 현탁액을 샘플링하여 생존 가능한 세포 수 및 생존능을 결정한다. 그 후, 세포 현탁액을 원심분리기로 옮겨 수동으로 펠릿화한다. 상청액을 제거하고, 세포 펠릿을 CS10(BioLife Solution)에 재현탁시켜, 최종 DMSO 농도가 약 10.0%인 생성물 제형을 생성한다. 생존 가능한 세포 수를 투여를 위한 수확 종료시 공식화한다. 그 후, 용량을 개별 냉동 백에 분배하고, 냉동바이알에 분석 샘플링을 수행한다.
동결보존된 생성물을 최종 방출 및 운송시까지 안전하고 제한된 접근 구역에서 모니터링되는 LN2 저장 탱크에 보관한다.
일부 구현예에서, OpTmizerTM CTSTM 기반 배지에 사용된 IL-2는 IL-15, hetIL-15(IL-15/sIL-15Ra), IL-6, 또는 IL-6/sIL-6Ra로 대체될 수 있다.
실시예 16 - 다중특이적 결합 분자를 이용한 CAR T세포 활성화
다양한 구성의 이중특이적 항체 및 이의 다량체 접합체를 생성하였다. 이들 접합체의 도식은 도 51a 및 도 51b(구성체 1 내지 17, F1 내지 F17이라고도 함)에 제공된다.
T세포 활성화 및 렌티바이러스 형질도입을 특성화하기 위해, 보충 배지의 96웰 플레이트에 T세포를 다양한 농도로 시딩하였다. 다양한 농도의 도 51a 및 도 51b의 구성체 1 내지 17을 포함하는 시약을 사용하여 30분 동안 T세포를 자극하였다. 최적 적정 농도의 Miltenyi TransAct를 양성 대조군으로 사용하였다. 이어서, 자극된 T세포를 CD19 CAR을 암호화하는 벡터를 포함하는 렌티바이러스를 사용하여 20% 형질도입을 목표로 하는 MOI로 처치하였다. 세포를 배양한 후, FACS 분석을 위해 배양액의 75%를 제거하였다. 나머지 25%를 배양하고 FACS로 1회 더 분석하였다. 성공적인 CD19 CAR 형질도입을 평가하기 위해 Celigo 이미징, 상청액의 IFN 감마 및 IL-2 분석, 및 FACS에 의해 세포를 분석하였다. 도 52는 생성된 T세포 클러스터링을 보여준다.
실시예 17 - 다중특이적 결합 분자로 활성화된 CAR T세포의 특성화
3개의 다른 공여체로부터 단리된 T세포를 보충 배지의 96웰 플레이트에 시딩하였다. 다양한 농도의 도 51a 및 도 51b의 구성체 1 내지 17을 포함하는 시약을 사용하여 T세포를 자극하였다. 최적 적정 농도의 Miltenyi TransAct를 양성 대조군으로 사용하였다. 이어서, 자극된 T세포를 CD19 CAR을 암호화하는 벡터를 포함하는 렌티바이러스를 사용하여 20% 형질도입을 목표로 하는 MOI로 처치하였다. MSD(Meso Scale Discovery)를 위해 자극 24시간 후에 상청액을 제거하였다. CAR 발현 측정을 위해, 바이러스 첨가 3.5일 후에 세포를 채취하였다. 성공적인 CD19 CAR 형질도입을 평가하기 위해 Celigo 이미징, 상청액의 10-플렉스 사이토카인 분석, 및 FACS에 의해 세포를 분석하였다.
형태 1 및 10이 일부 조건하에서 감소된 생존능을 나타냈지만, 대부분의 구성체에서 70% 초과의 세포 생존능이 관찰되었다. 구성체 1~5, 7, 12, 13, 15, 및 16은 3개의 공여체에 걸쳐 평균 20% 초과의 CAR 형질도입을 나타냈다(도 54). 다량체 구성체는 종 모양의 형질도입을 보여주었다. 감소된 형질도입은 CD3 단독 구성체인 구성체 14 및 17로 자극된 T세포에서 관찰되었다. 1일차 MSD 데이터는 도 53에 제공되어 있다.
실시예 18 - 다중특이적 결합 분자로 제조된 CAR T세포의 시험관내 평가
T세포를 다양한 농도의 구성체 1, 2, 3, 4, 5, 7, 12, 13, 15, 16, 또는 TransAct를 포함하는 시약으로 활성화하고, CD19 CAR을 암호화하는 벡터를 포함하는 렌티바이러스를 사용하여 20% 형질도입을 목표로 하는 MOI로 24시간 동안 형질도입시켰다. 세포를 세척하고, 표현형에 대해 분석하고, 동결시켰다. T세포를 나중에 해동시키고, 해동 후 같은 날 회수율 및 생존능에 대해 평가하였다. 해동 후, T세포를 표현형 및 CAR 형질도입에 대해 분석하고, Nalm6 WT 및 Nalm6 CD19 KO에서의 사이토카인 프로파일 및 사멸 분석 판독값을 얻었다.
한 연구에서, 세포를 세척하고 유동 염색을 위해 세포의 절반을 채취하고, 세포의 절반을 다시 플레이팅하고 3일 동안 인큐베이션시켰다. CAR 발현을 위해 4일차에 세포를 염색하였다. 다른 연구에서, 세포를 나중에 해동시키고, 0.6:1 내지 5:1의 CART 세포:표적 세포 비로 24시간 동안 루시퍼화 표적 세포와 함께 플레이팅하였다. 도 57a 및 도 57b에 도시된 연구의 경우, 2.5:1의 CART:표적 세포 비를 사용하였다. 24시간 후, 표적 세포 생존능에 대한 대용물로서 루시퍼라제 신호를 측정하였다. 이를 사용하여 CAR T세포의 효과적인 사멸 능력을 계산하였다.
도 55에 도시된 바와 같이, 모두 리간드 원자가가 2인 F1, F3, F5, 및 F4는 다량체 구성체보다 높은 활성을 나타냈다. CD2 표적화 구성체는 0.1 내지 10 μg/mL의 농도에 걸쳐 향상된 형질도입을 나타냈다. 도 56a 내지 도 56d는 생성된 CAR T세포가 CD19+ 세포의 특이적 사멸을 나타냄을 추가로 보여준다. 도 57a 및 도 57b에 따르며, 생성된 CAR T세포는 또한 항원 특이적 방식으로 사이토카인을 분비한다.
실시예 19 - 다중특이적 결합 분자로 제조된 CAR T세포의 생체내 평가
두 공여체로부터의 T세포를 구성체 3 및 4 또는 TransAct를 포함하는 시약으로 활성화하고, CAR을 암호화하는 벡터를 포함하는 렌티바이러스를 사용하여 20% 형질도입을 목표로 하는 1의 MOI로 24시간 동안 형질도입시켰다. 세포를 세척하고, 표현형에 대해 분석하고, 사이토카인 생성에 대해 분석하고, 동결시켰다. T세포를 나중에 해동시키고, 해동 후 같은 날 회수율 및 생존능에 대해 평가하였다. 해동 후, T세포를 추가 3일 동안 배양하고, CAR 형질동입에 대해 분석하였다.
구성체 3, 4, 또는 TransAct로 활성화된 CD19 표적화 CAR T세포 세트의 항종양 활성을 또한 NALM6 이종이식 모델에서 생체내에서 평가하였다.
모델 및 프로토콜에 대한 세부사항을 이하 제공한다.
세포주 - Nalm6(RRID: CVCL_0092)은 인간 급성 림프모구성 백혈병(ALL) 세포주이다. 현탁액 중 10%의 소태아 혈청을 함유하는 RPMI 배지에서 세포를 성장시켰다. 이들 세포는 정맥내 이식되는 경우 마우스에서 존속하고 증식한다. 세포는 루시퍼라제를 발현하도록 변형되었으므로, 기질 루시페린을 주사한 후 마우스를 이미징함으로써 종양세포 성장을 모니터링할 수도 있다.
마우스 - 6주령 NSG(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ) 마우스를 Jackson Laboratory로부터 받았다.
프로토콜 - Nalm6 세포를 마우스에 주사하였다. Nalm6 세포는 내인적으로 CD19를 발현하므로, CD19-유도된 CAR T세포의 생체내 효능을 테스트하는 데 사용된다.
종양 이식 후 Nalm6 처치를 위해 CAR T세포를 마우스에 투여하였다. CART를 마우스에 주사하였다. 그룹당 5마리의 마우스를 PBS 단독(PBS), TransAct, F3 또는 F4 STARTERS로 처치된 비형질도입 T세포, 또는 F3, F4, 또는 TransAct를 이용하여 제조된 CAR T세포로 처치하였다. 모든 세포는 동시에 제조하였다.
주 2회의 체중 측정을 포함하여 마우스의 건강 상태를 매일 모니터링하였다. 체중의 변화 백분율은 (BW현재 - BW초기)/(BW초기) x 100%로서 계산되었다. 마우스를 이미징하여 종양을 주 2회 모니터링하였다.
도 58에 도시된 바와 같이, 생성된 CD19 CAR T세포는 높은 생체내 종양 부담을 제거할 수 있었고, 구성체 3(F3) 및 4(F4) 둘 모두에 대한 TransAct와 비슷했다. 구성체 3(F3) 및 4(F4)로 생성된 CD19 CAR T세포는 또한 생체 내에서 증식되는 것으로 확인되었다(도 59).
한 연구에서, 동결보존된 공여체 세포를 opTmizer 배지에 해동시키고 플레이팅하였다. 벡터 및 자극 시약을 첨가하고 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 세척하고, 세포의 50%를 동결보존하고, 25%를 유동 염색하고, 세포의 25%를 다시 플레이팅하고 3일 동안 인큐베이션시켰다. CAR 발현을 위해 4일차에 세포를 염색하였다. 세포의 동결보존된 부분을 나중에 배지에 해동시키고 계수하였다. 그 후, 세포를 PBS에 재현탁하고, 이전에 루시퍼화 종양을 주사한 마우스에 주사하였다. 루시퍼라제 신호 및 말초혈액 내 CART 세포의 수를 매주 측정하여 효능을 확인하였다.
도 60a 내지 도 60d에 도시된 바와 같이, 구성체 F3 또는 F4를 사용하여 생성된 CART 세포는 항종양 활성 및 생체내 증식을 나타냈다.
실시예 20 -Tet2 shRNA로 제조된 CAR T세포의 생체내 효능
본원에 기술된 증식 또는 무증식 제조 프로세스를 이용하여, Tet2 shRNA의 도입과 함께 또는 도입 없이 CAR T세포를 생성한다. 일부 반복에서, Tet2 shRNA는 CAR과 동일한 벡터에 제공된다. 일부 반복에서, Tet2 shRNA는 CAR과 다른 벡터에 제공되고, 이 경우, Tet2 shRNA 벡터는 검출 가능한 태그를 추가로 포함한다. 일부 반복에서, CAR은 CD19, BCMA, CD20, CD22, CLL-1, 또는 EGFRvIII에 특이적이다. 이어서 CAR T세포를 동결시킨다. CAR T세포를 해동시키고 TMD8 마우스 모델에 투여한다. 종양 이식 후 주 2회 마우스를 측정하고 체중을 잰다. 마우스의 혈장 샘플은 FACS를 통해 분석된다. T세포 표현형 분석을 위해 골수, 비장, 및 종양을 수집하고, 사이토카인 생성을 측정한다. Tet2 shRNA로 제조된 CAR T세포는 대조군에 비해 항종양 효과와 증식이 더 우수한 것으로 확인된다.
실시예 21 - 형질도입 촉진
본원에 기술된 무증식 제조 프로세스를 이용하고, 형질도입 중에 벡토퓨신-1, F108, 또는 렌티부스트(lentiboost)를 추가로 첨가하여 CART 세포를 생성하고, 다양한 농도 및 시점에서 형질도입 %에 대해 분석하였다. F108은 렌티바이러스 형질도입을 촉진하는 것으로 확인되었다. 동일한 프로세스에서 추가 시약 F68, F127, 프로타민 설페이트, 및 폴리브렌을 테스트한다. 일부 반복에서, 형질도입을 위해 벡터에 암호화된 CAR은 CD19, BCMA, CD20, CD22, CLL-1, 또는 EGFRvIII에 특이적이다.
실시예 22 - 2세대 자극 구성체
이 실시예는 2세대 자극 구성체의 특성화를 설명한다. 도 61a에 나타낸 바와 같이, 상이한 공동자극 분자를 표적으로 하는 결합제(예를 들어, CD25, IL6Rb, CD27, 41BB, ICOS, 또는 CD2)를 테스트하기 위해 구성체를 생성하였다. 추가로, 상이한 항-CD3 결합제(항-CD3 (1) 또는 항-CD3 (2)를 기반으로 한 결합제)를 또한 비교하였다. 모든 2세대 자극 구성체는 도 61b에 나타낸 구성을 갖는다. 이 실시예에서 테스트한 상이한 결합제의 서열은 표 27에서 확인할 수 있다.
한 연구에서, 2세대 구성체를 형질도입 효율에 대해 비교하였다. TransAct를 대조군으로 사용하였다. 간략하게, 동결보존된 공여체 세포를 optimizer 배지에 해동시키고 플레이팅하였다. 벡터 및 자극 시약을 첨가하고 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 세척하고, 유동 염색을 위해 세포의 50%를 채취하고, 세포의 50%를 다시 플레이팅하고 3일 동안 인큐베이션시켰다. CAR 발현을 위해 4일차에 세포를 염색하였다.
도 62에 도시된 바와 같이, F5 ICOS는 0.01 μg/mL에서 매우 효과적이었으며, F5 ICOS 농도가 증가하면 형질도입 효율이 감소했다. F5(항-CD3 (1) 기반 항-CD3 결합제를 사용한 구성체)는 F5 항-CD3 (2)(항-CD3 (2) 기반 항-CD3 결합제를 사용한 구성체)보다 더 강력했다.
실시예 23 - 3세대 자극 구성체
이론에 구애되고자 함이 없이, FcR에 대한 자극 구성체의 결합을 감소시키면 T세포에 의한 FcR-발현 세포의 원치 않는 사멸을 감소시키거나 예방할 수 있다. 자극 구성체의 IgG1 Fc 영역에 D265A/N297A/P329A 치환(Kabat에 따른 EU 넘버링)("DANAPA")을 도입함으로써 3세대 자극 구성체를 생성하였다. 추가로, 상이한 항-CD3 결합제(항-CD3 (1), 항-CD3 (2), 또는 항-CD3 (3)을 기반으로 한 결합제) 및 상이한 항-CD28 결합제(항-CD28 (1) 또는 항-CD28 (2)를 기반으로 한 결합제)를 또한 비교하였다(도 63a). 모든 3세대 자극 구성체는 도 63b에 나타낸 구성을 갖는다. 이 실시예에서 테스트한 상이한 결합제의 서열은 표 27에서 확인할 수 있다.
한 연구에서, 3세대 구성체를 형질도입 효율에 대해 비교하였다. 간략하게, 동결보존된 공여체 세포를 opTmizer 배지에 해동시키고 플레이팅하였다. 벡터 및 자극 시약을 첨가하고 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 세척하고, 유동 염색을 위해 세포의 50%를 채취하고, 세포의 50%를 다시 플레이팅하고 3일 동안 인큐베이션시켰다. CAR 발현을 위해 4일차에 세포를 염색하였다.
도 64에 도시된 바와 같이, 테스트한 모든 항-CD3/CD28 또는 항-CD3/CD2 구성체는 CAR 형질도입을 촉진시켰다.
다른 연구에서, 3세대 구성체를 특이적 사멸 대 비특이적 사멸에 대해 비교하였다. 간략하게, 동결보존된 공여체 세포를 opTmizer 배지에 해동시키고 플레이팅하였다. 벡터 및 자극 시약을 첨가하고 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 세척하고, 세포의 50%를 동결보존하고, 세포의 25%를 유세포 분석을 위해 염색하고, 세포의 25%를 다시 플레이팅하고 3일 동안 인큐베이션시켰다. CAR 발현을 위해 4일차에 세포를 염색하였다. 동결보존된 세포를 나중에 해동시키고, 0.6:1 내지 5:1, 예를 들어 1:5의 CART 세포:종양세포 비로 24시간 동안 루시퍼화 표적 종양세포 및 비표적 종양세포와 함께 플레이팅하였다. 24시간 후, 표적 세포 생존능에 대한 대용물로서 루시퍼라제 신호를 측정하였다. 이를 사용하여 CAR T세포의 특이적 및 비특이적 사멸 능력을 계산하였다.
F3 및 F4의 침묵화된 형태(Fc 영역에 DANAPA 치환이 있는 F3 및 F4), NEG2042 및 NEG2043은 표적 세포의 동등한 사멸을 나타냈지만(도 65a), 비표적 세포의 비특이적 사멸을 나타내지 않는다(도 65b). 대조적으로, 야생형 Fc 영역을 갖는 F3 및 F4는 FcγR-발현 세포의 비특이적 사멸을 나타냈다(도 65b).
다른 연구에서, 3세대 구성체 NEG2043을 사용하여 2개의 CAR을 발현하는 세포를 생성하였다. 첫 번째 연구에서, 동결보존된 공여체 T세포를 OpTmizer 배지에 해동시키고, 자극 시약 및 2개의 벡터(CD19-표적화 CAR을 암호화하는 제1 벡터, 및 BCMA-표적화 CAR을 암호화하는 제2 벡터)와 24시간 동안 공동 인큐베이션시켰다. 24시간 후, 세포를 세척하고, 세포의 50%를 유세포 분석을 위해 염색하고, 세포의 50%를 다시 플레이팅하고 추가 3일 동안 인큐베이션시켰다. 4일차에 CAR 발현을 위해 세포를 염색하였다. 두 번째 연구에서, 동결보존된 공여체 백혈구 성분채집물을 해동시키고, 세척하고, CliniMACS Prodigy를 사용하여 T세포를 강화하였다. 강화된 세포를 OpTmizer 배지에 용리시켰다. 강화된 세포를 자극 시약 및 CD19-표적화 CAR과 CD22-표적화 CAR 둘 다를 암호화하는 벡터와 24시간 동안 공동 인큐베이션시켰다. 24시간 후, 세포를 세척하고, 세포의 50%를 유세포 분석을 위해 염색하고, 세포의 50%를 다시 플레이팅하고 추가 3~6일 동안 인큐베이션시켰다. 4일차 및 7일차에 CAR 발현을 위해 세포를 염색하였다.
F4 및 F4의 침묵화된 형태(NEG2043)는 T세포가 (1) 2개의 CAR-암호화 벡터로 공동 형질도입되거나 (2) 2개의 CAR을 암호화하는 단일 벡터로 형질도입된 경우, 하나의 CAR 또는 두 CAR 모두를 발현할 수 있었다. 도 66a는 CD19-표적화 CAR을 암호화하는 제1 벡터, 및 BCMA-표적화 CAR을 암호화하는 제2 벡터의 공동 형질도입을 보여준다. 도 66b는 CD19-표적화 CAR과 CD22-표적화 CAR 둘 다를 암호화하는 단일 벡터의 형질도입을 보여준다.
균등물
본원에 인용된 각각의 모든 특허, 특허 출원, 및 공개문헌의 개시 내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다. 본 발명은 특정 구현예와 관련하여 개시되었지만, 당해 분야의 다른 당업자가 본 발명의 진정한 사상 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 본 발명의 추가 구현예 및 변형을 고안할 수 있을 것임이 분명하다. 첨부된 청구범위는 이러한 모든 구현예 및 동등한 변형예를 포함하는 것으로 해석되도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> NOVARTIS AG <120> METHODS OF MAKING CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR-EXPRESSING CELLS <130> N2067-7170WO <140> <141> <150> 62/982,665 <151> 2020-02-27 <160> 793 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 1 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro 20 <210> 2 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 2 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 35 40 45 <210> 3 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 3 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 480 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 540 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 600 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 660 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 720 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1080 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 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tttttttttt 3420 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3480 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3540 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3600 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3660 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3720 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3780 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3840 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3900 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3960 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4020 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4080 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4140 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4200 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 720 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1080 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1440 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1560 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1680 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1740 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1860 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2000 <210> 36 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 36 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 35 40 <210> 37 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> 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of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 157 gaagtgcaac tggtggagag cggtggaggg cttgtccagc ccggaggatc gctgcggctg 60 tcctgtgctg cgtccgggtt caccttctcc ggcttctgga tgtcctgggt cagacaggca 120 ccgggaaagg gcctcgaatg ggtggccaac atcaagcagg atggctccga gaagtactac 180 gtcgactccg tgagaggccg cttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa ctcgctgtac 240 ctccaaatga atagcctcag ggcggaagat actgctgtgt attactgcgc acgcgccctt 300 gactactacg gcatggacgt ctggggccaa gggaccactg tgaccgtgtc tagcggaggc 360 ggaggttcag ggggcggtgg atcaggcgga ggaggatcgg ggggtggtgg atcggatatc 420 gtgatgaccc agactcccct gtccctgcct gtgactcccg gagaaccagc ctccatttcc 480 tgccggtcct cccagtccct gctggacagc gacgacggca acacttacct ggactggtac 540 ttgcagaagc cgggccaatc gcctcgcctg ctgatctata ccctgtcata ccgggcctca 600 ggagtgcctg accgcttctc gggatcaggg agcgggaccg atttcaccct gaaaatttcc 660 cgagtggaag ccgaggacgt cggactgtac tactgcaccc agcgcctcga attcccgtcg 720 attacgtttg gacagggtac ccggcttgag atcaag 756 <210> 158 <211> 475 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 764 cagtccgctc tgactcagcc ggcctcagct tcggggtccc ctggtcaaag cgtcactatt 60 tcctgtaccg gaacctcatc agacgtgggc ggctacaatt acgtgtcctg gtaccaacag 120 caccccggaa aggctcctaa gcttatgatc tacgacgtgt ccaaccggcc gtcaggagtg 180 tccaacagat tctccggctc caagagcgga aacactgcca gcttgaccat tagcggcttg 240 caggccgagg acgaagccga ctactactgc tctagctaca catcctcgtc taccctctac 300 gtgtttggaa cggggaccca gctgactgtg ctcgggggtg gaggatcaga ggtgcaactc 360 cagcagtccg gtcctggcct cgtgaaaccg tcccaaaccc tgtccctgac ttgcgccatc 420 tcgggcgact ccatgctgtc caattccgac acctggaact ggattagaca atcgcctagc 480 cggggactcg aatggctggg ccggacctac caccggtcca cgtggtatga cgactacgca 540 agctccgtcc ggggaagggt gtccattaac gtcgatacct ccaagaacca gtacagcctt 600 cagctgaacg ctgtgacccc cgaggatacc ggcgtctact actgtgcaag agtgcgattg 660 caggatggaa actcgtggtc ggacgcattc gatgtctggg gacagggaac tatggtcact 720 gtgtcctcc 729 <210> 765 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 765 atggccctgc ccgtgactgc gctcctgctt ccgttggccc tgctcctgca tgccgccaga 60 cct 63 <210> 766 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 766 atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60 ccg 63 <210> 767 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 767 atggcacttc ccgtcaccgc cctgctgctc ccactcgccc tccttctgca cgccgcccgc 60 ccc 63 <210> 768 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 768 atggccctgc cagtgaccgc gctcctgctg cccctggctc tgctgcttca cgcggcccgg 60 cct 63 <210> 769 <211> 207 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 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Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 777 cgcgtgaagt tcagccgaag cgccgacgcc ccggcctacc agcagggcca gaaccaactg 60 tacaacgaac tcaacctggg tcggagagaa gagtacgacg tgctggacaa aagacgcggc 120 agggaccccg agatgggcgg aaagcctcgc cgcaagaacc cgcaggaggg cctctacaac 180 gagctgcaga aggacaagat ggccgaagcc tactcagaga tcggcatgaa gggggagcgg 240 aggcgcggga agggccacga cggtttgtac caaggacttt ccactgcgac caaggacacc 300 tacgatgccc tccatatgca agccctgccg ccccgg 336 <210> 778 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 778 agggtcaagt tctcccggtc cgccgatgct cccgcctacc aacaggggca gaaccagctt 60 tataacgaac tgaacctggg caggagggag gaatatgatg tgttggataa gcgccggggc 120 cgggacccag aaatgggggg aaagcccaga agaaagaacc ctcaagaggg actttacaac 180 gaattgcaga aagacaaaat ggccgaggcc tactccgaga ttgggatgaa gggcgaaaga 240 cggagaggaa aggggcacga cgggctctac cagggactca gcaccgccac 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Claims (77)

  1. 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 제조하는 방법으로서,
    (i) 세포(예를 들어, T세포, 예를 들어 동결된 또는 신선한 백혈구 성분채집 생성물로부터 단리된 T세포)의 집단을 (A) 항-CD3 결합 도메인 및 (B) 공동자극 분자 결합 도메인(예를 들어, 항-CD2 결합 도메인 또는 항-CD28 결합 도메인)을 포함하는 다중특이적 결합 분자와 접촉(예를 들어, 결합)시키는 단계;
    (ii) 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 CAR을 암호화하는 핵산 분자(예를 들어, DNA 또는 RNA 분자)와 접촉시켜, 핵산 분자를 포함하는 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 제공하는 단계; 및
    (iii) 보관(예를 들어, 동결보존 배지에 세포의 집단을 재제형화) 또는 투여하기 위해 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 수확하는 단계를 포함하고,
    (a) 단계 (ii)는 단계 (i)과 함께 또는 단계 (i)의 시작 후 20시간 이내, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18시간 이내, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 18시간 이내에 수행되고,
    단계 (iii)은 단계 (i)의 시작 후 30시간 이내(예를 들어, 26시간), 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30시간 이내, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 24시간 이내에 수행되거나,
    (b) 단계 (ii)는 단계 (i)과 함께 또는 단계 (i)의 시작 후 20시간 이내, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18시간 이내, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 18시간 이내에 수행되고,
    단계 (iii)은 단계 (ii)의 시작 후 30시간 이내, 예를 들어 단계 (ii)의 시작 후 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30시간 이내에 수행되거나,
    (c) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 증식되지 않거나, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40% 이하, 예를 들어 10% 이하만큼 증식되고,
    임의로 단계 (ii)의 핵산 분자는 바이러스 벡터 상에 있고, 임의로 단계 (ii)의 핵산 분자는 바이러스 벡터 상의 RNA 분자이고, 임의로 단계 (ii)는 CAR을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 바이러스 벡터로 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 형질도입시키는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    (i) 항-CD3 결합 도메인, 예를 들어 항-CD3 scFv는 공동자극 분자 결합 도메인, 예를 들어 항-CD2 Fab 또는 항-CD28 Fab의 N-말단에 위치하거나;
    (ii) 항-CD3 결합 도메인, 예를 들어 항-CD3 scFv는 공동자극 분자 결합 도메인, 예를 들어 항-CD2 Fab 또는 항-CD28 Fab의 C-말단에 위치하고, 임의로,
    Fc 영역은 항-CD3 결합 도메인과 공동자극 분자 결합 도메인 사이에 위치하거나;
    다중특이적 결합 분자는 CH2를 포함하고, 항-CD3 결합 도메인은 CH2의 N-말단에 위치하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 다중특이적 결합 분자는
    (i) N-말단에서 C-말단 방향으로, 항-CD3 결합 도메인의 VH, 항-CD3 결합 도메인의 VL, 공동자극 분자 결합 도메인의 VH, CH1, CH2, 및 CH3을 포함하는 제1 폴리펩티드; 및
    (ii) N-말단에서 C-말단 방향으로, 공동자극 분자 결합 도메인의 VL 및 CL을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는, 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 다중특이적 결합 분자는
    (i) N-말단에서 C-말단 방향으로, 공동자극 분자 결합 도메인의 VH, CH1, CH2, CH3, 항-CD3 결합 도메인의 VH, 및 항-CD3 결합 도메인의 VL을 포함하는 제1 폴리펩티드; 및
    (ii) N-말단에서 C-말단 방향으로, 공동자극 분자 결합 도메인의 VL 및 CL을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는, 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 다중특이적 결합 분자는
    (i) N-말단에서 C-말단 방향으로, 공동자극 분자 결합 도메인의 VH, CH1, 항-CD3 결합 도메인의 VH, 항-CD3 결합 도메인의 VL, CH2, 및 CH3을 포함하는 제1 폴리펩티드; 및
    (ii) N-말단에서 C-말단 방향으로, 공동자극 분자 결합 도메인의 VL 및 CL을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD3 결합 도메인은 scFv를 포함하고 공동자극 분자 결합 도메인은 Fab 단편의 일부인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD3 결합 도메인은
    (i) 표 27의 항-CD3 항체 분자(예를 들어, 항-CD3 (1), 항-CD3 (2), 항-CD3 (3), 또는 항-CD3 (4))의 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR1), HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 가변 중쇄 영역(VH), 및 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR1), LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 및/또는
    (ii) 표 27에 제공된 항-CD3 항체 분자(예를 들어, 항-CD3 (1), 항-CD3 (2), 항-CD3 (3), 또는 항-CD3 (4))의 임의의 VH 및/또는 VL 영역의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 공동자극 분자 결합 도메인은 항-CD2 결합 도메인이고, 임의로 항-CD2 결합 도메인은
    (i) 표 27의 항-CD2 항체 분자(예를 들어, 항-CD2 (1))의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 VH, 및 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 VL; 및/또는
    (ii) 표 27에 제공된 항-CD2 항체 분자(예를 들어, 항-CD2 (1))의 임의의 VH 및/또는 VL 영역의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 공동자극 분자 결합 도메인은 항-CD28 결합 도메인이고, 임의로 항-CD28 결합 도메인은
    (i) 표 27의 항-CD28 항체 분자(예를 들어, 항-CD28 (1) 또는 항-CD28 (2))의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 VH, 및 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 VL; 및/또는
    (ii) 표 27에 제공된 항-CD28 항체 분자(예를 들어, 항-CD28 (1) 또는 항-CD28 (2))의 임의의 VH 및/또는 VL 영역의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD3 결합 도메인은
    (i) scFv;
    (ii) 펩티드 링커, 예를 들어 글리신-세린 링커, 예를 들어 (G4S)4 링커에 의해 VL에 연결된 VH; 또는
    (iii) VH 및 VL(VH는 VL의 N-말단임)을 포함하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 공동자극 분자 결합 도메인은 Fab 단편, 예를 들어 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩티드 서열의 일부인 Fab 단편의 일부이고, 임의로 Fc 도메인은 표 28에 제공된 아미노산 서열을 포함하거나, 표 28에 제공된 Fc 도메인의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD3 결합 도메인은 공동자극 분자 결합 도메인의 N-말단에 위치하고, 임의로 항-CD3 결합 도메인은 펩티드 링커, 예를 들어 글리신-세린 링커, 예를 들어 (G4S)4 링커에 의해 공동자극 분자 결합 도메인에 연결되는, 방법.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD3 결합 도메인은 공동자극 분자 결합 도메인의 C-말단에 위치하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    (i) Fc 영역은 항-CD3 결합 도메인과 공동자극 분자 결합 도메인 사이에 위치하고/하거나;
    (ii) 다중특이적 결합 분자는 CH2 및 CH3 중 하나 또는 둘 다를 포함하고, 임의로 항-CD3 결합 도메인은 펩티드 링커, 예를 들어 글리신-세린 링커, 예를 들어 (G4S)4 링커에 의해 CH3에 연결되는, 방법.
  15. 제13항에 있어서,
    (i) 다중특이적 결합 분자는 CH2를 포함하고, 항-CD3 결합 도메인은 CH2의 N-말단에 위치하고/하거나;
    (ii) 항-CD3 결합 도메인은 펩티드 링커, 예를 들어 글리신-세린 링커, 예를 들어 (G4S)2 링커에 의해 CH1에 연결되고/되거나;
    (iii) 항-CD3 결합 도메인은 펩티드 링커, 예를 들어 글리신-세린 링커, 예를 들어 (G4S)4 링커에 의해 CH2에 연결되는, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 다중특이적 결합 분자는
    (i) 표 28에 제공된 임의의 중쇄의 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및/또는
    (ii) 표 28에 제공된 임의의 경쇄의 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i)은 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 CAR-발현 세포의 백분율을 증가시키며, 예를 들어 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 단계 (i)이 없는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포와 비교하여, CAR-발현 세포의 더 높은(예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 또는 60% 더 높은) 백분율을 나타내는, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 백분율은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ 세포의 백분율과 동일하거나 5 또는 10% 이하만큼 상이하거나;
    (b) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 백분율은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ 세포의 백분율과 비교하여, 예를 들어 적어도 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.0, 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 또는 3배만큼 증가되거나;
    (c) 세포 집단 중 CAR-발현 나이브 T세포, 예를 들어 CAR-발현 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 백분율은 단계 (ii)의 기간 중에 증가(예를 들어, 단계 (ii)의 시작 후 18 내지 24시간 사이에 예를 들어, 적어도 30, 35, 40, 45, 50, 55, 또는 60%만큼 증가)하거나;
    (d) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 백분율은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ 세포의 백분율과 비교하여 감소하지 않거나, 5 또는 10% 이하만큼 감소하는, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포와 비교하여, 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 더 높은(예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 또는 40% 더 높은) 백분율을 나타내거나;
    (b) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 백분율은 단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 백분율보다 높거나(예를 들어, 적어도 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.0, 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 또는 3배 더 높거나);
    (c) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 CAR-발현 나이브 T세포, 예를 들어 CAR-발현 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 백분율은 단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포 중 CAR-발현 나이브 T세포, 예를 들어 CAR-발현 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 백분율보다 높거나(예를 들어, 적어도 4, 6, 8, 10, 또는 12배 더 높거나);
    (d) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포와 비교하여, 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 더 높은(예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 또는 40% 더 높은) 백분율을 나타내거나;
    (e) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 백분율은 단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포 중 나이브 세포, 예를 들어 나이브 T세포, 예를 들어 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 백분율보다 높거나(예를 들어, 적어도 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.0, 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 또는 3배 더 높거나);
    (f) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 CAR-발현 나이브 T세포, 예를 들어 CAR-발현 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 백분율은 단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포 중 CAR-발현 나이브 T세포, 예를 들어 CAR-발현 CD45RA+ CD45RO- CCR7+ T세포의 백분율보다 높은(예를 들어, 적어도 4, 6, 8, 10, 또는 12배 더 높은), 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CD95+ 중심 기억 T세포의 백분율은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CD95+ 중심 기억 T세포의 백분율과 동일하거나 5 또는 10% 이하만큼 상이하거나;
    (b) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CCR7+CD45RO+ T세포의 백분율은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CCR7+CD45RO+ T세포의 백분율과 비교하여 적어도 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50%만큼 감소되거나;
    (c) CAR-발현 중심 기억 T세포, 예를 들어 CAR-발현 CCR7+CD45RO+ 세포의 백분율은 단계 (ii)의 기간 중에 감소(예를 들어, 단계 (ii)의 시작 후 18 내지 24시간 사이에 예를 들어, 적어도 8, 10, 12, 14, 16, 18, 또는 20%만큼 감소)하거나;
    (d) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CCR7+CD45RO+ T세포의 백분율은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CCR7+CD45RO+ T세포의 백분율과 비교하여 증가하지 않거나, 5 또는 10% 이하만큼 증가하는, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포와 비교하여, 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CD95+ 중심 기억 T세포의 더 낮은(예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 또는 40% 더 낮은) 백분율을 나타내거나;
    (b) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CCR7+CD45RO+ T세포의 백분율은 단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CCR7+CD45RO+ T세포의 백분율보다 낮거나(예를 들어, 적어도 20, 30, 40, 또는 50% 더 낮거나);
    (c) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 CAR-발현 중심 기억 T세포, 예를 들어 CAR-발현 CCR7+CD45RO+ T세포의 백분율은 단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포 중 CAR-발현 중심 기억 T세포, 예를 들어 CAR-발현 CCR7+CD45RO+ T세포의 백분율보다 낮거나(예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 또는 40% 더 낮거나);
    (d) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포와 비교하여, 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CD95+ 중심 기억 T세포의 더 낮은(예를 들어, 10, 20, 30, 또는 40% 더 낮은) 백분율을 나타내거나;
    (e) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CCR7+CD45RO+ T세포의 백분율은 단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포 중 중심 기억 세포, 예를 들어 중심 기억 T세포, 예를 들어 CCR7+CD45RO+ T세포의 백분율보다 낮거나(예를 들어, 적어도 20, 30, 40, 또는 50% 더 낮거나);
    (f) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 CAR-발현 중심 기억 T세포, 예를 들어 CAR-발현 CCR7+CD45RO+ T세포의 백분율은 단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포 중 CAR-발현 중심 기억 T세포, 예를 들어 CAR-발현 CCR7+CD45RO+ T세포의 백분율보다 낮은(예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 또는 40% 더 낮은), 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 백분율은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단 중 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 백분율과 비교하여 증가되거나;
    (b) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 CAR-발현 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CAR-발현 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 백분율은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단 중 CAR-발현 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CAR-발현 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 백분율과 비교하여 증가되거나;
    (c) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 백분율은 단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포 중 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 백분율보다 높거나;
    (d) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 CAR-발현 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CAR-발현 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 백분율은 단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포 중 CAR-발현 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CAR-발현 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 백분율보다 높거나;
    (e) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 백분율은 단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포 중 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 백분율보다 높거나;
    (f) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 CAR-발현 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CAR-발현 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 백분율은 단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포 중 CAR-발현 줄기 기억 T세포, 예를 들어 CAR-발현 CD45RA+CD95+IL-2 수용체 β+CCR7+CD62L+ T세포의 백분율보다 높은, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 TEM 대 아래 TSCM)은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 TEM 대 아래 TSCM)과 거의 동일하거나 약 25, 50, 75, 100, 또는 125% 이하만큼 상이하거나(예를 들어, 증가되거나);
    (b) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 TEM 대 아래 TSCM)은
    단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포, 또는
    단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포
    의 유전자 세트 점수 중앙값(위 TEM 대 아래 TSCM)보다 낮거나(예를 들어, 적어도 약 100, 150, 200, 250, 또는 300% 더 낮거나);
    (c) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 Treg 대 아래 Teff)은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 Treg 대 아래 Teff)과 거의 동일하거나 약 25, 50, 100, 150, 또는 200% 이하만큼 상이하거나(예를 들어, 증가되거나);
    (d) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 Treg 대 아래 Teff)은
    단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포, 또는
    단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포
    의 유전자 세트 점수 중앙값(위 Treg 대 아래 Teff)보다 낮거나(예를 들어, 적어도 약 50, 100, 125, 150, 또는 175% 더 낮거나);
    (e) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(아래 줄기세포능)은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(아래 줄기세포능)과 거의 동일하거나 약 25, 50, 100, 150, 200, 또는 250% 이하만큼 상이하거나(예를 들어, 증가되거나);
    (f) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(아래 줄기세포능)은
    단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포, 또는
    단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포
    의 유전자 세트 점수 중앙값(아래 줄기세포능)보다 낮거나(예를 들어, 적어도 약 50, 100, 또는 125% 더 낮거나);
    (g) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 저산소증)은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 저산소증)과 거의 동일하거나 약 125, 150, 175, 또는 200% 이하만큼 상이하거나(예를 들어, 증가되거나);
    (h) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 저산소증)은
    단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포, 또는
    단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포
    의 유전자 세트 점수 중앙값(위 저산소증)보다 낮거나(예를 들어, 적어도 약 40, 50, 60, 70, 또는 80% 더 낮거나);
    (j) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 자가포식)은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 자가포식)과 거의 동일하거나 약 180, 190, 200, 또는 210% 이하만큼 상이하거나(예를 들어, 증가되거나);
    (k) 단계 (iii)으로부터의 세포 집단의 유전자 세트 점수 중앙값(위 자가포식)은
    단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포, 또는
    단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포
    의 유전자 세트 점수 중앙값(위 자가포식)보다 낮은(예를 들어, 적어도 20, 30, 또는 40% 더 낮은), 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 CAR에 의해 인식되는 항원을 발현하는 세포와 함께 인큐베이션된 후, 예를 들어 도 29c 및 도 29d와 관련하여 실시예 8에 기술된 방법을 이용하여 평가할 때, 단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포, 또는 단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포보다 더 높은(예를 들어, 적어도 2, 4, 6, 8, 10, 12, 또는 14배 더 높은) 수준으로 IL-2를 분비하는, 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 생체 내에 투여된 후, 단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포와 비교하여, 또는 단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포와 비교하여, (예를 들어, 도 4c와 관련하여 실시예 1에 기술된 방법을 이용하여 평가할 때) 더 오래 존속하거나 더 높은 수준으로 증식되는, 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 생체 내에 투여된 후, 단계 (iii)이 단계 (i)의 시작 후 26시간을 초과하여, 예를 들어 단계 (i)의 시작 후 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일을 초과하여 수행되는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포, 또는 단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에 3일을 초과하여, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 또는 9일 동안 시험관 내에서 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 다른 유사한 방법에 의해 제조된 세포보다 더 강한 항종양 활성(예를 들어, 낮은 용량, 예를 들어 0.15 x 106, 0.2 x 106, 0.25 x 106, 또는 0.3 x 106개 이하의 생존 가능한 CAR-발현 세포의 용량에서 더 강한 항종양 활성)을 나타내는, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 증식되지 않거나, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40% 이하만큼 증식되고, 임의로 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 살아있는 세포의 수는 단계 (i)의 시작시의 세포 집단 중 살아있는 세포의 수로부터 감소하는, 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 단계 (i)의 시작시의 세포 집단과 비교하여 증식되지 않거나, 2시간 미만, 예를 들어 1시간 또는 1.5시간 미만까지 증식되는, 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i) 및/또는 (ii)는 IL-2, IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra)), IL-7, IL-21, IL-6(예를 들어, IL-6/sIL-6Ra), LSD1 억제제, MALT1 억제제, 또는 이의 조합을 포함하는 세포 배지(예를 들어, 무혈청 배지)에서 수행되는, 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i) 및/또는 (ii)는 혈청 대체물을 포함하는 무혈청 세포 배지에서 수행되는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 혈청 대체물은 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물(ICSR)인, 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i) 이전에
    (iv) (임의로) 독립체, 예를 들어 실험실, 병원, 또는 의료인으로부터 신선한 백혈구 성분채집 생성물(또는 조혈 조직의 대체 공급원, 예컨대 신선한 전혈 생성물, 신선한 골수 생성물, 또는 신선한 종양 또는 기관 생검물 또는 제거물(예를 들어, 흉선 절제술로부터의 신선한 생성물))을 받는 단계, 및
    (v) 신선한 백혈구 성분채집 생성물(또는 조혈 조직의 대체 공급원, 예컨대 신선한 전혈 생성물, 신선한 골수 생성물, 또는 신선한 종양 또는 기관 생검물 또는 제거물(예를 들어, 흉선 절제술로부터의 신선한 생성물))로부터 단계 (i)에서 접촉된 세포(예를 들어, T세포, 예를 들어 CD8+ 및/또는 CD4+ T세포)의 집단을 단리하는 단계를 추가로 포함하고, 임의로
    단계 (iii)은 단계 (v)의 시작 후 35시간 이내, 예를 들어 단계 (v)의 시작 후 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 또는 35시간 이내, 예를 들어 단계 (v)의 시작 후 30시간 이내에 수행되거나,
    단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 단계 (v)의 종료시의 세포 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 증식되지 않거나, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40% 이하, 예를 들어 10% 이하만큼 증식되는, 방법.
  33. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i) 이전에 독립체, 예를 들어 실험실, 병원, 또는 의료인으로부터 백혈구 성분채집 생성물로부터 단리된 동결보존된 T세포(또는 조혈 조직의 대체 공급원, 예컨대 전혈, 골수, 또는 종양 또는 기관 생검 또는 제거(예를 들어, 흉선 절제술)로부터 단리된 동결보존된 T세포)를 받는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  34. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i) 이전에
    (iv) (임의로) 독립체, 예를 들어 실험실, 병원, 또는 의료인으로부터, 동결보존된 백혈구 성분채집 생성물(또는 조혈 조직의 대체 공급원, 예컨대 동결보존된 전혈 생성물, 동결보존된 골수 생성물, 또는 동결보존된 종양 또는 기관 생검물 또는 제거물(예를 들어, 흉선 절제술로부터의 동결보존된 생성물))을 받는 단계, 및
    (v) 동결보존된 백혈구 성분채집 생성물(또는 조혈 조직의 대체 공급원, 예컨대 동결보존된 전혈 생성물, 동결보존된 골수 생성물, 또는 동결보존된 종양 또는 기관 생검물 또는 제거물(예를 들어, 흉선 절제술로부터의 동결보존된 생성물))로부터 단계 (i)에서 접촉된 세포(예를 들어, T세포, 예를 들어 CD8+ 및/또는 CD4+ T세포)의 집단을 단리하는 단계를 추가로 포함하고, 임의로
    단계 (iii)은 단계 (v)의 시작 후 35시간 이내, 예를 들어 단계 (v)의 시작 후 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 또는 35시간 이내, 예를 들어 단계 (v)의 시작 후 30시간 이내에 수행되거나,
    단계 (iii)으로부터의 세포 집단은 단계 (v)의 종료시의 세포 집단과 비교하여, 예를 들어 살아있는 세포의 수로 평가할 때, 증식되지 않거나, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40% 이하, 예를 들어 10% 이하만큼 증식되는, 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 일부를 적어도 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 또는 7일 동안, 예를 들어 2일 이상 7일 이하 동안 배양하고, 이 일부에서 CAR 발현 수준을 측정하는(예를 들어, 이 일부에서 생존 가능한 CAR-발현 세포의 백분율을 측정하는) 단계 (vi)를 추가로 포함하고, 임의로
    단계 (iii)은 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 수확하고 동결시키는 단계를 포함하고 단계 (vi)은 단계 (iii)으로부터의 세포 집단 중 일부를 해동시키고, 이 일부를 적어도 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 또는 7일 동안, 예를 들어 2일 이상 7일 이하 동안 배양하고, 이 일부에서 CAR 발현 수준을 측정하는(예를 들어, 이 일부에서 생존 가능한 CAR-발현 세포의 백분율을 측정하는) 단계를 포함하는, 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii)는 형질도입 중에 F108을 첨가하고/하거나 세포(예를 들어, T세포)의 집단을 Tet2를 표적화하는 shRNA와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i) 또는 단계 (1)의 시작시의 세포 집단은 IL6R-발현 세포(예를 들어, IL6Rα 및/또는 IL6Rβ에 대해 양성인 세포)가 강화된, 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i) 또는 단계 (1)의 시작시의 세포 집단은 50, 60, 또는 70% 이상의 IL6R-발현 세포(예를 들어, IL6Rα 및/또는 IL6Rβ에 대해 양성인 세포)를 포함하는, 방법.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (i) 및 (ii) 또는 단계 (1) 및 (2)는 IL-15(예를 들어, hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))를 포함하는 세포 배지에서 수행되는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, IL-15는 예를 들어 10, 15, 20, 또는 25일 후에 세포 집단이 증식하는 능력을 증가시키는, 방법.
  41. 제39항에 있어서, IL-15는 세포 집단 중 IL6Rβ-발현 세포의 백분율을 증가시키는, 방법.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, CAR은 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 항원 결합 도메인은 CD19, CD20, CD22, BCMA, 메소텔린, EGFRvIII, GD2, Tn 항원, sTn 항원, Tn-O-글리코펩티드, sTn-O-글리코펩티드, PSMA, CD97, TAG72, CD44v6, CEA, EPCAM, KIT, IL-13Ra2, 레구만(leguman), GD3, CD171, IL-11Ra, PSCA, MAD-CT-1, MAD-CT-2, VEGFR2, LewisY, CD24, PDGFR-베타, SSEA-4, 엽산 수용체 알파, ERBB(예: ERBB2), Her2/neu, MUC1, EGFR, NCAM, 에프린 B2, CAIX, LMP2, sLe, HMWMAA, o-아세틸-GD2, 엽산 수용체 베타, TEM1/CD248, TEM7R, FAP, 레구마인(Legumain), HPV E6 또는 E7, ML-IAP, CLDN6, TSHR, GPRC5D, ALK, 폴리시알산, Fos-관련 항원, 호중구 엘라스타제, TRP-2, CYP1B1, 정자 단백질 17, 베타 인간 융모막 성선자극호르몬, AFP, 티로글로불린, PLAC1, globoH, RAGE1, MN-CA IX, 인간 텔로머라제 역전사효소, 장내 카복실 에스테라제, mut hsp 70-2, NA-17, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, NY-ESO-1, GPR20, Ly6k, OR51E2, TARP, GFRα4, 또는 MHC에 제시된 임의의 이들 항원의 펩티드로부터 선택되는 항원에 결합하는, 방법.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 항원 결합 도메인은 본원에 개시된 CDR, VH, VL, scFv, 또는 CAR 서열을 포함하고, 임의로
    (a) 항원 결합 도메인은 BCMA에 결합하고, 표 3 내지 15에 개시된 CDR, VH, VL, scFv, 또는 CAR 서열, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
    (b) 항원 결합 도메인은 CD19에 결합하고, 표 2에 개시된 CDR, VH, VL, scFv, 또는 CAR 서열, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
    (c) 항원 결합 도메인은 CD20에 결합하고, 본원에 개시된 CDR, VH, VL, scFv, 또는 CAR 서열, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
    (d) 항원 결합 도메인은 CD22에 결합하고, 본원에 개시된 CDR, VH, VL, scFv, 또는 CAR 서열, 또는 이에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 방법.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 도메인은 VH 및 VL을 포함하고, VH와 VL은 링커에 의해 연결되고, 임의로 링커는 서열번호 63 또는 104의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  46. 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 막관통 도메인은 T세포 수용체의 알파, 베타, 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, 및 CD154로부터 선택되는 단백질의 막관통 도메인을 포함하거나,
    (b) 막관통 도메인은 CD8의 막관통 도메인을 포함하거나,
    (c) 막관통 도메인은 서열번호 6의 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나,
    (d) 핵산 분자는 막관통 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 핵산 서열은 서열번호 17의 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 방법.
  47. 제42항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 도메인은 힌지 영역에 의해 막관통 도메인에 연결되고, 임의로
    (a) 힌지 영역은 서열번호 2, 3, 또는 4의 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나,
    (b) 핵산 분자는 힌지 영역을 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 핵산 서열은 서열번호 13, 14, 또는 15의 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 방법.
  48. 제42항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인은 일차 신호전달 도메인을 포함하고, 임의로 일차 신호전달 도메인은 CD3 제타, TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278(ICOS), FcεRI, DAP10, DAP12, 또는 CD66d로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하고, 임의로
    (a) 일차 신호전달 도메인은 CD3 제타로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하거나,
    (b) 일차 신호전달 도메인은 서열번호 9 또는 10의 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나,
    (c) 핵산 분자는 일차 신호전달 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 핵산 서열은 서열번호 20 또는 21의 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 방법.
  49. 제42항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 신호전달 도메인을 포함하고, 임의로 공동자극 신호전달 도메인은 MHC 클래스 I 분자, TNF 수용체 단백질, 면역글로불린-유사 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구 활성화 분자(SLAM 단백질), 활성화 NK세포 수용체, BTLA, 톨 리간드 수용체, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, 4-1BB(CD137), B7-H3, ICOS(CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM(LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD28-OX40, CD28-4-1BB, 또는 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하고, 임의로
    (a) 공동자극 신호전달 도메인은 4-1BB로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하거나,
    (b) 공동자극 신호전달 도메인은 서열번호 7의 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나,
    (c) 핵산 분자는 공동자극 신호전달 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 핵산 서열은 서열번호 18의 핵산 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 방법.
  50. 제42항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인 및 CD3 제타로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하고, 임의로 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 7의 아미노산 서열(또는 이에 대해 적어도 약 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열) 및 서열번호 9 또는 10의 아미노산 서열(또는 이에 대해 적어도 약 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열)을 포함하고, 임의로 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 7의 아미노산 서열 및 서열번호 9 또는 10의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  51. 제42항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, CAR은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 리더 서열을 추가로 포함하는, 방법.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 CAR-발현 세포(예를 들어, 자가 또는 동종이계 CAR-발현 T세포 또는 NK세포)의 집단.
  53. 제52항의 CAR-발현 세포의 집단 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  54. 대상체의 면역 반응을 증가시키는 방법으로서, 제52항의 CAR-발현 세포의 집단 또는 제53항의 약학적 조성물을 대상체에게 투여하여 대상체의 면역 반응을 증가시키는 단계를 포함하는 방법.
  55. 대상체의 암을 치료하는 방법으로서, 제52항의 CAR-발현 세포의 집단 또는 제53항의 약학적 조성물을 대상체에게 투여하여 대상체의 암을 치료하는 단계를 포함하는 방법.
  56. 제55항에 있어서, 암은 예를 들어, 중피종, 악성 흉막 중피종, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 편평세포 폐암, 대세포 폐암, 췌장암, 췌관 선암종, 식도 선암종, 유방암, 교모세포종, 난소암, 결장직장암, 전립선암, 자궁경부암, 피부암, 흑색종, 신장암, 간암, 뇌암, 흉선종, 육종, 암종, 자궁암, 신장암, 위장암, 요로상피암, 인두암, 두경부암, 직장암, 식도암, 또는 방광암 중 하나 이상, 또는 이의 전이로부터 선택되는 고형암인, 방법.
  57. 제55항에 있어서, 암은 예를 들어, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 맨틀세포 림프종(MCL), 다발성 골수종, 급성 림프성 백혈병(ALL), 호지킨 림프종, B세포 급성 림프성 백혈병(BALL), T세포 급성 림프성 백혈병(TALL), 소림프구성 백혈병(SLL), B세포 전림프구성 백혈병, 모세포성 형질세포양 수지상세포 신생물, 버킷 림프종, 확산성 거대 B세포 림프종(DLBCL), 만성 염증과 관련된 DLBCL, 만성 골수성 백혈병, 골수증식성 신생물, 소포 림프종, 소아 소포 림프종, 모발상세포 백혈병, 소세포- 또는 대세포-소포 림프종, 악성 림프증식성 병태, MALT 림프종(점막-관련 림프 조직의 외연 변연부 림프종), 변연부 림프종, 골수이형성증, 골수이형성 증후군, 비호지킨 림프종, 형질모세포성 림프종, 형질세포양 수지상세포 신생물, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 비장 변연부 림프종, 비장 림프종/백혈병, 비장 확산성 적색 속질 소 B세포 림프종, 모발상세포 백혈병-변이체, 림프형질세포성 림프종, 중쇄병, 형질세포 골수종, 뼈의 고립성 형질세포종, 골외 형질세포종, 결절 변연부 림프종, 소아 결절 변연부 림프종, 원발성 피부 소포중심 림프종, 림프종양 육아종증, 원발성 종격동(흉선) 거대 B세포 림프종, 혈관내 거대 B세포 림프종, ALK+ 거대 B세포 림프종, HHV8-관련 다심성 캐슬맨 질환에서 발생하는 거대 B세포 림프종, 원발성 삼출 림프종, B세포 림프종, 급성 골수성 백혈병(AML), 또는 미분류 림프종으로부터 선택되는 액상암인, 방법.
  58. 제54항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 치료제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  59. 제54항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, CAR-발현 세포의 집단은 제35항에서 측정된 CAR-발현 세포의 백분율에 기초하여 결정된 용량으로 투여되는, 방법.
  60. 제52항 또는 제53항에 있어서, CAR-발현 세포의 집단의 유효량 또는 약학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체의 면역 반응을 증가시키는 방법에 사용하기 위한 CAR-발현 세포의 집단 또는 약학적 조성물.
  61. 제52항 또는 제53항에 있어서, CAR-발현 세포의 집단의 유효량 또는 약학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체의 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 CAR-발현 세포의 집단 또는 약학적 조성물.
  62. CD28에 결합하는 항체 분자로서, 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR1), HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR1), LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고,
    (i) HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 각각 서열번호 538, 539, 540, 530, 531, 및 532의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (ii) HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 각각 서열번호 541, 539, 540, 530, 531, 및 532의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (iii) HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 각각 서열번호 542, 543, 540, 533, 534, 및 535의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (iv) HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 각각 서열번호 544, 545, 546, 536, 534, 및 532의 아미노산 서열을 포함하는. 항체 분자.
  63. 제62항에 있어서,
    (i) 서열번호 547 또는 548의 아미노산 서열, 또는 서열번호 547 또는 548에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH;
    (ii) 서열번호 537의 아미노산 서열, 또는 이에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL;
    (iii) 서열번호 547의 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 537의 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL; 또는
    (iv) 서열번호 548의 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 537의 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL
    을 포함하는 항체 분자.
  64. 제62항 또는 제63항에 있어서, 전장 항체, 이중특이적 항체, Fab, F(ab')2, Fv, 또는 단일쇄 Fv 단편(scFv)인 항체 분자.
  65. 제62항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로부터 선택되는 중쇄 불변 영역, 및 카파 또는 람다 경쇄 불변 영역으로부터 선택되는 경쇄 불변 영역을 포함하는 항체 분자.
  66. (i) CD28에 대한 결합을 위해 제62항 내지 제65항 중 어느 한 항의 항체 분자와 경쟁하고/하거나;
    (ii) 제62항 내지 제65항 중 어느 한 항의 항체 분자의 에피토프와 동일한 에피토프, 실질적으로 동일한 에피토프, 중첩되는 에피토프, 또는 실질적으로 중첩되는 에피토프에 결합하는 항체 분자.
  67. 제62항 내지 제66항 중 어느 한 항의 항체 분자를 암호화하는 단리된 핵산 분자.
  68. (i) 항-CD3 결합 도메인, 및
    (ii) 제62항 내지 제66항 중 어느 한 항의 항체 분자를 포함하는 항-CD28 결합 도메인
    을 포함하는 다중특이적 결합 분자.
  69. 제68항에 있어서, 항-CD3 결합 도메인은
    (i) 표 27의 항-CD3 항체 분자(예를 들어, 항-CD3 (1), 항-CD3 (2), 항-CD3 (3), 또는 항-CD3 (4))의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3; 또는
    (ii) 표 27에 제공된 항-CD3 항체 분자(예를 들어, 항-CD3 (1), 항-CD3 (2), 항-CD3 (3), 또는 항-CD3 (4))의 임의의 VH 및/또는 VL 영역의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 다중특이적 결합 분자.
  70. 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 결합 분자로서,
    (i) N-말단에서 C-말단 방향으로, 제1 결합 도메인의 VH, 제1 결합 도메인의 VL, 제2 결합 도메인의 VH, CH1, CH2, 및 CH3을 포함하는 제1 폴리펩티드; 및
    (ii) N-말단에서 C-말단 방향으로, 제2 결합 도메인의 VL 및 CL을 포함하는 제2 폴리펩티드
    를 포함하는 다중특이적 결합 분자.
  71. 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 결합 분자로서,
    (i) N-말단에서 C-말단 방향으로, 제2 결합 도메인의 VH, CH1, CH2, CH3, 제1 결합 도메인의 VH, 및 제1 결합 도메인의 VL을 포함하는 제1 폴리펩티드; 및
    (ii) N-말단에서 C-말단 방향으로, 제2 결합 도메인의 VL 및 CL을 포함하는 제2 폴리펩티드
    를 포함하는 다중특이적 결합 분자.
  72. 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 결합 분자로서,
    (i) N-말단에서 C-말단 방향으로, 제2 결합 도메인의 VH, CH1, 제1 결합 도메인의 VH, 제1 결합 도메인의 VL, CH2, 및 CH3을 포함하는 제1 폴리펩티드; 및
    (ii) N-말단에서 C-말단 방향으로, 제2 결합 도메인의 VL 및 CL을 포함하는 제2 폴리펩티드
    를 포함하는 다중특이적 결합 분자.
  73. 제70항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 결합 도메인은 항-CD3 결합 도메인을 포함하고 제2 결합 도메인은 공동자극 분자 결합 도메인을 포함하는, 다중특이적 결합 분자.
  74. 제70항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 결합 도메인은 공동자극 분자 결합 도메인을 포함하고 제2 결합 도메인은 항-CD3 결합 도메인을 포함하는, 다중특이적 결합 분자.
  75. 제73항 또는 제74항에 있어서, 공동자극 분자 결합 도메인은 항-CD2 결합 도메인 또는 항-CD28 결합 도메인을 포함하는, 다중특이적 결합 분자.
  76. 세포(예를 들어, 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T세포)를 활성화하는 방법으로서, 세포(예를 들어, T세포, 예를 들어 동결된 또는 신선한 백혈구 성분채집 생성물로부터 단리된 T세포)의 집단을 제68항 내지 제75항 중 어느 한 항의 다중특이적 결합 분자 또는 제62항 내지 제66항 중 어느 한 항의 항체 분자와 접촉(예를 들어, 결합)시키는 단계를 포함하는 방법.
  77. 세포(예를 들어, 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T세포)를 형질도입시키는 방법으로서, 세포(예를 들어, T세포, 예를 들어 동결된 또는 신선한 백혈구 성분채집 생성물로부터 단리된 T세포)의 집단을 (i) 제68항 내지 제75항 중 어느 한 항의 다중특이적 결합 분자 또는 제62항 내지 제66항 중 어느 한 항의 항체 분자 및 (ii) 핵산 분자, 예를 들어 CAR을 암호화하는 핵산 분자와 접촉(예를 들어, 결합)시키는 단계를 포함하는 방법.
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2970426B1 (en) 2013-03-15 2019-08-28 Michael C. Milone Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
TW202016139A (zh) 2018-06-13 2020-05-01 瑞士商諾華公司 Bcma 嵌合抗原受體及其用途
AR126838A1 (es) 2021-08-20 2023-11-22 Novartis Ag Métodos para preparar células que expresan receptores de antígeno quiméricos
WO2023076912A2 (en) * 2021-10-26 2023-05-04 ImmPACT Bio USA Inc. Cd4+ and/or cd8+ cell populations comprising icars for use in treatment therapies
WO2024056809A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 Novartis Ag Treatment of autoimmune disorders using chimeric antigen receptor therapy

Family Cites Families (90)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
ATE427968T1 (de) 1992-08-21 2009-04-15 Univ Bruxelles Immunoglobuline ohne leichtkette
US5350674A (en) 1992-09-04 1994-09-27 Becton, Dickinson And Company Intrinsic factor - horse peroxidase conjugates and a method for increasing the stability thereof
US5786464C1 (en) 1994-09-19 2012-04-24 Gen Hospital Corp Overexpression of mammalian and viral proteins
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
JP4936345B2 (ja) 1996-02-28 2012-05-23 アリアド・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド イムノフィリン由来ドメインとのキメラタンパク質用の多量体化剤としてのラパマイシンの合成誘導体
US6114148C1 (en) 1996-09-20 2012-05-01 Gen Hospital Corp High level expression of proteins
US6673901B2 (en) 1997-06-12 2004-01-06 Research Corporation Technologies, Inc. Artificial antibody polypeptides
US20040040047A1 (en) 1998-03-30 2004-02-26 Spencer David M. Regulated apoptosis using chemically induced dimerization of apoptosis factors
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
WO2001012812A2 (en) 1999-08-17 2001-02-22 Biogen, Inc. Baff receptor (bcma), an immunoregulatory agent
CA2386270A1 (en) 1999-10-15 2001-04-26 University Of Massachusetts Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference
US6326193B1 (en) 1999-11-05 2001-12-04 Cambria Biosciences, Llc Insect control agent
US20040002068A1 (en) 2000-03-01 2004-01-01 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
WO2001096584A2 (en) 2000-06-12 2001-12-20 Akkadix Corporation Materials and methods for the control of nematodes
WO2002066516A2 (en) 2001-02-20 2002-08-29 Zymogenetics, Inc. Antibodies that bind both bcma and taci
CN1294148C (zh) 2001-04-11 2007-01-10 中国科学院遗传与发育生物学研究所 环状单链三特异抗体
EP2277914A3 (en) 2001-08-10 2012-08-08 Aberdeen University Antigen binding domains from fish
US7446190B2 (en) 2002-05-28 2008-11-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Nucleic acids encoding chimeric T cell receptors
AU2004255216B2 (en) 2003-07-01 2010-08-19 Immunomedics, Inc. Multivalent carriers of bi-specific antibodies
US7435596B2 (en) 2004-11-04 2008-10-14 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Modified cell line and method for expansion of NK cell
EP1786918A4 (en) 2004-07-17 2009-02-11 Imclone Systems Inc NEW BISPECIFIC ANTIBODY TETRAVALENT
KR20140053410A (ko) 2005-08-19 2014-05-07 아보트 러보러터리즈 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
WO2010104949A2 (en) 2009-03-10 2010-09-16 Biogen Idec Ma Inc. Anti-bcma antibodies
ES2911246T3 (es) 2009-11-03 2022-05-18 Hope City Receptor del factor de crecimiento epidérmico truncado (EGFRT) para selección de células T transducidas
WO2011146862A1 (en) 2010-05-21 2011-11-24 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Methods for inducing selective apoptosis
AR083847A1 (es) 2010-11-15 2013-03-27 Novartis Ag Variantes de fc (fragmento constante) silenciosas de los anticuerpos anti-cd40
JP2014500879A (ja) 2010-11-16 2014-01-16 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング Ｂｃｍａ発現に相関性を有する疾患を治療する因子及び方法
DK3214091T3 (en) 2010-12-09 2019-01-07 Univ Pennsylvania USE OF CHEMICAL ANTIGEN RECEPTOR MODIFIED T CELLS FOR TREATMENT OF CANCER
CA2832540C (en) 2011-04-08 2020-09-15 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-epidermal growth factor receptor variant iii chimeric antigen receptors and use of same for the treatment of cancer
US20130101599A1 (en) 2011-04-21 2013-04-25 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bcma-based stratification and therapy for multiple myeloma patients
PE20141045A1 (es) 2011-05-27 2014-09-10 Glaxo Group Ltd Proteinas de union a bcma (cd269/tnfrsf17)
UA112434C2 (uk) 2011-05-27 2016-09-12 Ґлаксо Ґруп Лімітед Антигензв'язувальний білок, який специфічно зв'язується з всма
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
CA2869562C (en) 2012-04-11 2023-09-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric antigen receptors targeting b-cell maturation antigen
US10202452B2 (en) 2012-04-20 2019-02-12 Aptevo Research And Development Llc CD3 binding polypeptides
EP2711418B1 (en) 2012-09-25 2017-08-23 Miltenyi Biotec GmbH Method for polyclonal stimulation of T cells by flexible nanomatrices
WO2014055442A2 (en) 2012-10-01 2014-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for targeting stromal cells for the treatment of cancer
WO2014055657A1 (en) 2012-10-05 2014-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of a trans-signaling approach in chimeric antigen receptors
EP3508503B1 (en) 2012-11-01 2022-11-02 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin in der Helmholtz-Gemeinschaft Antibody against cd269 (bcma)
US9243058B2 (en) 2012-12-07 2016-01-26 Amgen, Inc. BCMA antigen binding proteins
US10077315B2 (en) 2013-02-05 2018-09-18 Engmab Sàrl Bispecific antibodies against CD3 and BCMA
CA2901115A1 (en) 2013-02-15 2014-08-21 The Regents Of The University Of California Heterodimeric conditionally active chimeric antigen receptor and methods of use thereof
US9394368B2 (en) 2013-02-20 2016-07-19 Novartis Ag Treatment of cancer using humanized anti-EGFRvIII chimeric antigen receptor
EP2958942B1 (en) 2013-02-20 2020-06-03 Novartis AG Effective targeting of primary human leukemia using anti-cd123 chimeric antigen receptor engineered t cells
US9434935B2 (en) 2013-03-10 2016-09-06 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Modified caspase polypeptides and uses thereof
CA2905352A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Methods for controlling t cell proliferation
EP2970426B1 (en) 2013-03-15 2019-08-28 Michael C. Milone Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
AR095374A1 (es) 2013-03-15 2015-10-14 Amgen Res (Munich) Gmbh Moléculas de unión para bcma y cd3
TWI654206B (zh) 2013-03-16 2019-03-21 諾華公司 使用人類化抗－ｃｄ１９嵌合抗原受體治療癌症
US9913882B2 (en) 2013-06-05 2018-03-13 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Methods for inducing partial apoptosis using caspase polypeptides
TWI672379B (zh) 2013-12-19 2019-09-21 瑞士商諾華公司 人類間皮素嵌合性抗原受體及其用途
JP6793902B2 (ja) 2013-12-20 2020-12-02 ノバルティス アーゲー 調節可能キメラ抗原受容体
KR20220119176A (ko) 2014-02-04 2022-08-26 카이트 파마 인코포레이티드 B 세포 악성종양 및 다른 암을 치료하는데 유용한 자가 t 세포 및 그의 조성물의 생산 방법
EP3593812A3 (en) * 2014-03-15 2020-05-27 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
ES2876263T3 (es) 2014-04-07 2021-11-12 Novartis Ag Tratamiento del cáncer usando receptor de antígeno quimérico anti-cd19
CA2945620C (en) 2014-04-14 2022-12-06 Cellectis Bcma (cd269) specific chimeric antigen receptors for cancer immunotherapy
DK3689899T3 (da) 2014-04-25 2021-11-22 2Seventy Bio Inc Kimære mnd-promotor-antigenreceptorer
JP6817069B2 (ja) * 2014-04-25 2021-01-20 ブルーバード バイオ， インコーポレイテッド 養子細胞療法薬を製造するための改善された方法
IL248257B1 (en) 2014-04-30 2024-04-01 Max Delbruck Centrum Fur Molekulare Medizin In Der Helmholtz Gemeinschaft Human antibodies against CD269(BCMA)
JP2017521998A (ja) 2014-05-12 2017-08-10 ヌマブ アクチェンゲゼルシャフト 新規多重特異性分子及びかかる多重特異性分子に基づく新規治療方法
CN111394317A (zh) 2014-06-06 2020-07-10 蓝鸟生物公司 改善的t细胞组合物
AU2015292811B2 (en) 2014-07-21 2019-12-19 Novartis Ag Treatment of cancer using a CLL-1 chimeric antigen receptor
CN106687483B (zh) 2014-07-21 2020-12-04 诺华股份有限公司 使用人源化抗-bcma嵌合抗原受体治疗癌症
SG11201700416TA (en) 2014-07-21 2017-02-27 Novartis Ag Treatment of cancer using a cd33 chimeric antigen receptor
MX2017001079A (es) 2014-07-24 2017-09-12 Bluebird Bio Inc Receptores de antígeno quiméricos de antígeno de maduración de células b (bcma).
EP2982692A1 (en) 2014-08-04 2016-02-10 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
WO2016025880A1 (en) 2014-08-14 2016-02-18 Novartis Ag Treatment of cancer using gfr alpha-4 chimeric antigen receptor
EP3712171A1 (en) 2014-08-19 2020-09-23 Novartis AG Treatment of cancer using a cd123 chimeric antigen receptor
EP3023437A1 (en) 2014-11-20 2016-05-25 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
EP3029068A1 (en) 2014-12-03 2016-06-08 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA for use in the treatment of diseases
EP3227432B1 (en) 2014-12-05 2023-10-11 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Chimeric antigen receptors targeting b-cell maturation antigen and uses thereof
SI3226897T1 (sl) 2014-12-05 2021-08-31 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Protitelesa, ki ciljajo na B-celični maturacijski antigen, in postopki uporabe
EA036379B1 (ru) 2014-12-12 2020-11-02 Блубёрд Био, Инк. Химерные антигенные рецепторы к bcma
US10647778B2 (en) 2015-02-09 2020-05-12 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Bi-specific chimeric antigen receptor and uses thereof
WO2016154055A1 (en) 2015-03-20 2016-09-29 Bluebird Bio, Inc. Vector formulations
JP6961490B2 (ja) 2015-04-08 2021-11-05 ノバルティス アーゲー Ｃｄ２０療法、ｃｄ２２療法、およびｃｄ１９キメラ抗原受容体（ｃａｒ）発現細胞との併用療法
CA2925329C (en) 2015-04-13 2024-01-02 Pfizer Inc. Anti-bcma antibodies, anti-cd3 antibodies and bi-specific antibodies binding to bcma and cd3
KR102349475B1 (ko) 2015-04-13 2022-01-11 화이자 인코포레이티드 B-세포 성숙 항원을 표적화하는 키메라 항원 수용체
EP3313872A4 (en) 2015-06-25 2019-03-20 iCell Gene Therapeutics LLC CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS (CARS) COMPOSITIONS AND METHOD FOR USE THEREOF
EP3757129A1 (en) 2015-07-10 2020-12-30 Merus N.V. Human cd3 binding antibody
MA42895A (fr) 2015-07-15 2018-05-23 Juno Therapeutics Inc Cellules modifiées pour thérapie cellulaire adoptive
EP3322735A4 (en) 2015-07-15 2019-03-13 Zymeworks Inc. BISPECIFIC ANTIGEN-BINDING CONSTRUCTS CONJUGATED TO A MEDICINAL PRODUCT
PT3331910T (pt) 2015-08-03 2020-03-24 Engmab Sarl Anticorpos monoclonais contra o antigénio de maturação de células b (bcma) humano
CN105384825B (zh) 2015-08-11 2018-06-01 南京传奇生物科技有限公司 一种基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体及其应用
ES2814550T3 (es) 2015-08-17 2021-03-29 Janssen Pharmaceutica Nv Anticuerpos anti-BCMA, moléculas que se unen a antígeno biespecífico que se unen a BCMA y CD3, y usos de los mismos
BR112018005295A2 (pt) 2015-09-17 2018-12-11 Novartis Ag terapias com célula t car com eficácia aumentada
JP7082055B2 (ja) 2015-12-22 2022-06-07 ノバルティス アーゲー 抗癌治療における組み合わせ使用のためのメソテリンキメラ抗原受容体（ｃａｒ）およびｐｄ－ｌ１阻害剤に対する抗体
AU2017341047A1 (en) 2016-10-07 2019-05-02 Novartis Ag Chimeric antigen receptors for the treatment of cancer
AU2019331496A1 (en) * 2018-08-31 2021-03-18 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells

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