ES2876263T3 - Tratamiento del cáncer usando receptor de antígeno quimérico anti-cd19 - Google Patents

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Marcela Maus
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David Porter
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William Sellers
Mariusz Wasik
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Abstract

Una composición que comprende una célula que expresa una molécula CAR que se une a CD19 (una "célula que expresa CAR19") y uno o más inhibidores de cinasa, en la que dicho uno o más inhibidores de cinasa incluye un inhibidor de tirosina cinasa de Bruton (BTK), opcionalmente en la que la célula que expresa CAR19 y el uno o más inhibidores de cinasa están presentes en una forma de dosis única, o como dos o más formas de dosis.

Description

DESCRIPCIÓN
Tratamiento del cáncer usando receptor de antígeno quimérico anti-CD19
Esta solicitud reivindica la prioridad de los documentos U.S. Serie n° 61/976.396, presentado el 7 de abril de 2014, U.S. Serie n° 62/007.309, presentado el 3 de junio de 2014, U.S. Serie n° 62/036.493, presentado el 12 de agosto de 2014, U.S. Serie n° 62/076.238, presentado el 6 de noviembre de 2014, U.S. Serie n° 62/087.888, presentado el 5 de diciembre de 2014, y U.S. Serie n° 62/097.278, presentado el 29 de diciembre de 2014.
Lista de secuencias
La presente solicitud contiene una Lista de secuencias que se ha presentado por vía electrónica en formato ASCII. Dicha copia ASCII, creada el 6 de abril de 2015, se denomina N2067-7051WO_SL.txt, y tiene un tamaño de 252.236 bytes.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere en general al uso de células T diseñadas para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR), por ejemplo, en combinación con otro agente tal como, por ejemplo, un inhibidor de cinasa y/o una citocina, para tratar una enfermedad asociada con la expresión de la proteína Cúmulo de Diferenciación 19 (CD19).
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Muchos pacientes con neoplasias malignas de células B son incurables con la terapia estándar. Además, las opciones de tratamiento tradicionales a menudo tienen efectos secundarios graves. Se han realizado intentos en la inmunoterapia del cáncer; sin embargo, varios obstáculos hacen que esta sea una meta muy difícil para lograr la eficacia clínica. Aunque se han identificado centenares de los denominados antígenos tumorales, estos generalmente derivan de sí mismos, y de este modo, son poco inmunogénicos. Además, los tumores usan diversos mecanismos para volverse hostiles al inicio y propagación del ataque inmunológico.
Los desarrollos recientes que usan la terapia de células T autólogas (CART) modificadas con receptor de antígeno quimérico (CAR), que se basa en redirigir las células T hacia una molécula de superficie celular adecuada en las células cancerosas, tales como neoplasias malignas de células B, muestran resultados prometedores en el aprovechamiento del poder del sistema inmunitario para tratar neoplasias malignas de células B y otros cánceres (véase, por ejemplo, Sadelain et al., Cancer Discovery 3: 388-398 (2013)). Los resultados clínicos del CART19 derivado de múrido (es decir, “CTL019”) han mostrado ser prometedores para establecer remisiones completas en pacientes que padecen CLL, así como en la ALL infantil (véanse, por ejemplo, Kalos et al., Sci Transl Med 3: 95ra73 (2011), Porter et al., NEJM 365: 725-733 (2011), Grupp et al., NEJM 368: 1509-1518 (2013)). Además de la capacidad del receptor antigénico quimérico de los linfocitos T modificados genéticamente de reconocer y destruir las células diana, una terapia con linfocitos T terapéuticos exitosa necesita tener la capacidad de proliferar y persistir a lo largo del tiempo, y de además detectar células leucémicas resistentes. La calidad variable de células T, ya sea como resultado de la anergia, la supresión o el agotamiento, tendrá efectos sobre el comportamiento de las células T transformadas con CAR, pero sobre las cuales los médicos expertos tienen un control limitado en este momento. Para que sean efectivos, los linfocitos T de pacientes transformados con CAR necesitan persistir y mantener la capacidad de proliferar en respuesta al antígeno del CAR. Se ha demostrado que las células T de pacientes con ALL pueden hacer esto con CART19 que comprende un scFv murino (véase, por ejemplo, Grupp et al., NEJM 368: 1509-1518 (2013)).
Huye et al. Molecular Therapy (2011); 19(12):2239-2248 se refieren a la combinación de inhibidores de mTOR con células T resistentes a rapamicina. Brown et al. ASCO Educational Book (2014); 34:e317-e325 describen los tratamientos para la leucemia linfocítica crónica.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La descripción se refiere, al menos en parte, a composiciones y métodos para tratar trastornos tales como el cáncer (por ejemplo, cánceres hematológicos u otras neoplasias malignas de células B) usando células efectoras inmunitarias (por ejemplo, células T o células NK) que expresan una molecula de receptor de antígeno quimérico (CAR) (por ejemplo, un CAR que se une a un antígeno de células B, por ejemplo, proteína Cúmulo de Diferenciación 19 (CD19) (por ejemplo, OMIM Acc. No. 107265, Swiss Prot. Acc No. P15391). Las composiciones incluyen, y los métodos incluyen, la administración de células efectoras inmunitarias (por ejemplo, células T o células NK) que expresan un CAR dirigido contra células B, en combinación con un inhibidor de cinasa (por ejemplo, uno o más de un inhibidor de CDK4/6, un inhibidor de BTK, un inhibidor de mTOR, un inhibidor de MNK, un inhibidor dual de PI3K/mTOR, o una combinación de los mismos). En algunos casos, la combinación mantiene, o tiene una mejor eficacia clínica, en comparación con cualquiera de las terapias solas. La descripción se refiere además al uso de células modificadas genéticamente, por ejemplo, células efectoras inmunitarias (por ejemplo, células T o células NK), para expresar una molécula CAR que se une a un antígeno de células B, por ejemplo, c D19, en combinación con un inhibidor de cinasa (por ejemplo, un inhibidor de cinasa escogido de uno o más de un inhibidor de cinasa 4 dependiente de ciclina (CDK4), un inhibidor de la tirosina cinasa de Bruton (BTK), un inhibidor de mTOR, un inhibidor de la cinasa que interactúa con la proteína cinasa activada por mitógenos (MNK), un inhibidor dual de fosfatidilinositol 3 -cinasa (PI3k )/itiTO R, o una combinación de los mismos) para tratar un trastorno asociado con la expresión de un antígeno de células B, por ejemplo, CD19 (por ejemplo, un cáncer, por ejemplo, un cáncer hematológico).
Por consiguiente, en un aspecto, la presente descripción se refiere a un método para tratar a un sujeto, por ejemplo, un mamífero, que tiene una enfermedad asociada con la expresión de un antígeno de células B, por ejemplo, c D19. El método comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de una célula, por ejemplo, una célula efectora inmune (por ejemplo, una célula T o una célula NK) que expresa una molécula CAR que se une al antígeno de células B, en combinación con un inhibidor de cinasa, por ejemplo, un inhibidor de cinasa descrito aquí. En un caso, la molécula CAR se une a CD19, por ejemplo, una molécula c A r que se une a CD19 descrita aquí. En otros casos, la molécula CAR se une a uno o más de CD20, CD22 o ROR1.
En un caso, la enfermedad asociada con la expresión de un antígeno de células B (por ejemplo, la expresión de uno o más de CD19, CD20, CD22 o ROR1) se selecciona de una enfermedad proliferativa tal como un cáncer, una neoplasia maligna, o una afección precancerosa tal como una mielodisplasia, un síndrome mielodisplásico, o una preleucemia, o es una indicación no relacionada con el cáncer asociada con la expresión del antígeno de células B, por ejemplo, uno o más de CD19, CD20, CD22 o ROR1. En un caso, la enfermedad es un tumor sólido o líquido. En un caso, el cáncer es cáncer de páncreas. En un caso, la enfermedad es un cáncer hematológico. En un caso, el cáncer hematológico es leucemia. En un caso, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en una o más leucemias agudas, que incluyen, pero no se limitan a, leucemia linfoide aguda de células B (b a Ll ), leucemia linfoide aguda de células T (TALL), leucemia linfocítica pequeña (SLL), leucemia linfoide aguda (ALL); una o más leucemias crónicas, que incluyen, pero no se limitan a, leucemia mielógena crónica (CML), leucemia linfocítica crónica (CLL). Otros cánceres hematológicos o afecciones hematológicas incluyen, pero no se limitan a, linfoma de células del manto (MCL), leucemia prolinfocítica de células B, neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas, linfoma de Burkitt, linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), linfoma folicular, leucemia de células pilosas, linfoma folicular de células pequeñas o de células grandes, afecciones linfoproliferativas malignas, linfoma MALT, linfoma de la zona marginal, mieloma múltiple, mielodisplasia y síndrome mielodisplásico, linfoma no de Hodgkin, linfoma de Hodgkin, linfoma plasmoblástico, neoplasias de células dendríticas plasmocitoides, y macroglobulinemia de Waldenstrom. En ciertos casos, la enfermedad asociada con la expresión del antígeno de células B (por ejemplo, uno o más de CD19, CD20, CD22 o ROR1) es una “preleucemia”, que es una colección diversa de afecciones hematológicas unidas por una producción ineficaz (o displasia) de células sanguíneas mieloides. En algunos casos, la enfermedad asociada con la expresión del antígeno de células B (por ejemplo, uno o más de CD19, CD20, CD22 o ROR1) incluye, pero no se limita a, cánceres atípicos y/o no clásicos, neoplasias, afecciones precancerosas o enfermedades proliferativas que expresan el antígeno de células B (por ejemplo, uno o más de CD19, CD20, CD22 o ROR1). Cualquier combinación de las enfermedades asociadas con la expresión del antígeno de células B (por ejemplo, uno o más de CD19, CD20, CD22 o ROR1) descritas aquí puede tratarse con los métodos y composiciones descritos aquí.
En un caso, la enfermedad asociada con la expresión del antígeno de células B (por ejemplo, uno o más de CD19, CD20, CD22 o ROR1) es un linfoma, por ejemplo, m Cl , linfoma de Hodgkin o DLBCL. En un caso, la enfermedad asociada con la expresión del antígeno de células B (por ejemplo, uno o más de CD19, CD20, CD22 o ROR1) es leucemia, por ejemplo, SLL, CLL y/o ALL. En un caso, la enfermedad asociada con la expresión del antígeno de células B es mieloma múltiple (por ejemplo, un mieloma múltiple que es negativo para CD19, por ejemplo, que tiene una gran mayoría (99,95%) de las células plasmáticas neoplásicas con un fenotipo negativo para CD19, por ejemplo, detectado tanto por citometría de flujo como por RT-PCR.
En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de CDK4, por ejemplo, un inhibidor de CDK4 descrito en la presente, por ejemplo, un inhibidor de CD4/6, tal como, por ejemplo, clorhidrato de 6-acetil-8-ciclopentil-5-metil-2-(5-piperazin-1-ilpiridin-2-ilamino)-8H-pirido[2,3-d]pirimidin-7-ona (también denominado palbociclib o PD0332991). En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de BTK, por ejemplo, un inhibidor de BTK descrito en la presente, tal como, por ejemplo, ibrutinib. En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor de mTOR descrito en la presente, tal como, por ejemplo, rapamicina, un análogo de rapamicina, OSI-027. El inhibidor de mTOR puede ser, por ejemplo, un inhibidor de t TORc I y/o un inhibidor de mTORC2, por ejemplo, un inhibidor de mTORCI y/o inhibidor de mTORC2 descrito en la presente. En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de MNK, por ejemplo, un inhibidor de MNK descrito en la presente, tal como, por ejemplo, 4-amino-5-(4-fluoroanilino)pirazolo [3,4-d] pirimidina. El inhibidor de MNK puede ser, por ejemplo, un inhibidor de MNK1a, MNK1b, MNK2a y/o MNK2b. En un caso, el inhibidor puede ser un inhibidor dual de PI3K/mTOR, por ejemplo, PF-04695102.
En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de CDK4 seleccionado de aloisina A; flavopiridol o HMR-1275, 2-(2-clorofenil)-5,7-dihidroxi-8-[(3S,4R)-3-hidroxi-1-metil-4-piperidinil]-4-cromenona; crizotinib (PF-02341066); 2-(2-Clorofenil)-5,7-dihidroxi-8-[(2R,3S)-2-(hidroximetil)-1-metil-3-pirrolidinil]-4H-1-benzopiran-4-ona, hidrocloruro (P276-00); 1 -metil-5-[[2-[5-(trifluorometil)-1H-imidazol-2-il]-4-piridinil]oxi]-W-[4-(trifluorometil)fenil]-1H-bencimidazol-2-amina (RAF265); indisulam (E7070); roscovitina (CYC202); palbociclib (PD0332991); dinaciclib (SCH727965); N-[5-[[(5-terc-butiloxazol-2il)metil]tio]tiazol-2-il]piperidin-4-carboxamida (BMS 387032); ácido 4-[[9-cloro-7-(2,6-d¡fluorofen¡l)-5H-p¡r¡m¡do[5,4-d][2]benzazepin-2-¡l]amino]-benzo¡co (MLN8054); 5-[3-(4,6-d¡fluoro-1H-benc¡m¡dazol-2-¡l)-1H-¡ndazol-5-¡l]-N-et¡l-4-met¡l-3-piridinmetanamina (AG-024322); N-(p¡per¡d¡n-4-¡l)am¡da del ác¡do 4-(2,6-d¡dorobenzo¡lam¡no)-1H-p¡razol-3-carboxíl¡co (AT7519); 4-[2-met¡l-1-(1-met¡let¡l)-1H-¡m¡dazol-5-¡l]-A/-[4-(met¡lsulfon¡l)fen¡l]-2-p¡rim¡d¡nam¡na (AZD5438); XL281 (BMS908662); y ribociclib
En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de CDK4, por ejemplo, palbociclib (PD0332991), y el palbociclib se administra con una dosis de aproximadamente 50 mg, 60 mg, 70 mg, 75 mg, 80 mg, 90 mg, 100 mg, 105 mg, 110 mg, 115 mg, 120 mg, 125 mg, 130 mg, 135 mg (por ejemplo, 75 mg, 100 mg o 125 mg) a diario durante un periodo de tiempo, por ejemplo, a diario durante 14-21 días de un ciclo de 28 días, o a diario durante 7-12 días de un ciclo de 21 días. En un caso, se administran 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más ciclos de palbociclib.
En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de BTK seleccionado de ibrutinib (PCI-32765); GDC-0834; RN-486; CGI-560; CGI-1764; HM-71224; CC-292; ONO-4059; CNX-774; y LFM-A13. En un caso preferido, el inhibidor de BTK no reduce ni inhibe la actividad cinasa de la cinasa inducible por interleucina 2 (ITK) y se selecciona de GDC-0834; RN-486; CGI-560; CGI-1764; HM-71224; CC-292; ONO-4059; CNX-774; y LFM-A13.
En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de BTK, por ejemplo, ibrutinib (PCI-32765), y el ibrutinib se administra en una dosis de alrededor de 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 420 mg, 440 mg, 460 mg, 480 mg, 500 mg, 520 mg, 540 mg, 560 mg, 580 mg, 600 mg (por ejemplo, 250 mg, 420 mg o 560 mg) al día durante un período de tiempo, por ejemplo, diariamente durante un ciclo de 21 días, o diariamente durante un ciclo de 28 días. En un caso, se administran 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más ciclos de ibrutinib.
En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de mTOR seleccionado de temsirolimus; ridaforolimus dimetilfosfinato de (1E,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21E, 23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35E)-1,18-dih¡drox¡-19,30-d¡metox¡-15,17,21,23,29,35-hexamet¡l-2,3,10,14,20-pentaoxo-11,36-d¡oxa-4-azatr¡c¡clo[30.3.1.049]hexatr¡aconta-16,24,26,28-tetraen-12-¡l]propil]-2-metox¡c¡clohex¡lo, también conocido como AP23573 y MK8669; everolimus (RAD001); rapamicina (AY22989); semapimod; (5-{2,4-b¡s[(3S)-3-met¡lmorfol¡n-4-¡l]pir¡do[2,3-d]p¡r¡m¡d¡n-7-¡l}-2-metox¡fen¡l)metanol (AZD8055); 2-am¡no-8-[frans-4-(2-h¡drox¡etox¡)c¡clohex¡l]-6-(6-metox¡-3-p¡r¡d¡n¡l)-4-met¡l-p¡r¡do[2,3-d]p¡r¡m¡d¡n-7(8H)-ona (PF04691502); y W2-[1,4-d¡oxo-4-[[4-(4-oxo-8-fen¡l-4H-1-benzop¡ran-2-¡l)morfol¡n¡o-4-¡l]metox¡]but¡l]-L-arg¡n¡lglic¡l-L-aaspartilL-serina-, sal interna (SF1126); y XL765.
En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de mTOR, por ejemplo, rapamicina, y la rapamicina se administra con una dosis de aproximadamente 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg (por ejemplo, 6 mg) a diario durante un periodo de tiempo, por ejemplo, a diario durante un ciclo ciclo de 21 días, o a diario durante un ciclo de 28 días. En un caso, se administran 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más ciclos de rapamicina. En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de mTOR, por ejemplo, everolimus y el everolimus se administra con una dosis de aproximadamente 2 mg, 2.5 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 11 mg, 12 mg, 13 mg, 14 mg, 15 mg (por ejemplo, 10 mg) a diario durante un periodo de tiempo, por ejemplo, a diario durante un ciclo de 28 días. En un caso, se administran 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más ciclos de everolimus.
En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de MNK seleccionado entre CGP052088; 4-amino-3-(pfluorofenilam¡no)pirazolo [3,4-d] pirimidina (CGP57380); cercosporamida; ETC-1780445-2; y 4-amino-5-(4-fluoroanil¡no)pirazolo [3,4-d]pirim¡d¡na.
En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor dual de fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3K) y de mTOR seleccionado de 2-Am¡no-8-[frans-4-(2-h¡drox¡etox¡)c¡clohex¡l]-6-(6-metox¡-3-p¡r¡d¡n¡l)-4-met¡l-p¡r¡do[2,3-d]p¡r¡m¡d¡n-7(8H)-ona (PF-04691502); W-[4-[[4-(D¡met¡lam¡no)-1-p¡per¡d¡n¡l]carbon¡l]fen¡l]-W’-[4-(4,6-d¡-4-morfolin¡l-1,3,5-tr¡az¡n-2-¡l)fen¡l]urea (PF-05212384, PKI-587); 2-Met¡l-2-{4-[3-met¡l-2-oxo-8-(qu¡nol¡n-3-¡l)-2,3-d¡h¡dro-1H-¡m¡dazo[4,5-c]qu¡nol¡n-1-¡l]fen¡l}propanonitr¡lo (BEZ-235); apitolisib (GDC-0980, RG7422); 2,4-D¡fluoro-N-{2-(met¡lox¡)-5-[4-(4-p¡r¡daz¡n¡l)-6-qu¡nol¡nil]-3-p¡r¡d¡n¡l}bencenosulfonam¡da (GSK2126458); 8-(6-metox¡p¡r¡d¡n-3-¡l)-3-met¡l-1-(4-(p¡peraz¡n-1-¡l)-3-(tr¡fluoromet¡l)fen¡l)-1H-im¡dazo[4,5-c]qu¡nol¡n-2(3H)-ona, sal de ácido maleico (NVP-BGT226); 3-[4-(4-Morfol¡n¡lpir¡do[3',2':4,5]furo[3,2-d]p¡r¡m¡d¡n-2-¡l]fenol (PI-103); 5-(9-¡soprop¡l-8-met¡l-2-morfolino-9H-pur¡n-6-¡l)p¡r¡m¡d¡n-2-am¡na (Vs -5584, s B2343); y N-[2-[(3,5-D¡metox¡fen¡l)am¡no]qu¡noxal¡n-3-¡l]-4-[(4-met¡l-3-metox¡fen¡l)carbonil]am¡nofen¡lsulfonam¡da (XL765).
En un caso, la célula expresa una molécula CAR que comprende un dominio de unión anti-CD19 (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo murino o humanizado que se une específicamente a CD19), un dominio transmembrana, y un dominio de señalización intracelular (por ejemplo, un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio coestimulador y/o un dominio de señalización primario). En un caso, el CAR comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que incluye un dominio de unión anti-CD19 descrito aquí (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo murino o humanizado que se une específicamente a CD19 como se describe aquí), un dominio transmembrana descrito aquí, y un dominio de señalización intracelular descrito aquí (por ejemplo, un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio coestimulador y/o un dominio de señalización primario descrito aquí).
En un caso, la molécula CAR es capaz de unirse a CD19 (por ejemplo, CD19 humano de tipo salvaje o mutante). En un caso, la molécula CAR comprende un dominio de unión anti-CD19 que comprende una o más (por ejemplo, las tres) de la región 1 determinante de la complementariedad de cadena ligera (LC CDR1), la región 2 determinante de la complementariedad de cadena ligera (LC CDR2), y la región 3 determinante de la complementariedad de cadena ligera (LC CDR3) de un dominio de unión anti-CD19 descrito aquí, y una o más (por ejemplo, las tres) de la región 1 determinante de la complementariedad de cadena pesada (HC CDR1), la región 2 determinante de la complementariedad de cadena pesada (HC CDR2), y la región 3 determinante de la complementariedad de cadena pesada (HC CDR3) de un dominio de unión anti-CD19 descrito aquí, por ejemplo, un dominio de unión anti-CD19 que comprende una o más, por ejemplo, las tres, LC CDR, y una o más, por ejemplo, las tres, HC CDR. En un caso, el dominio de unión anti-CD19 comprende una o más (por ejemplo, las tres) de la región 1 determinante de la complementariedad de cadena pesada (HC CDR1), la región 2 determinante de la complementariedad de cadena pesada (HC CDR2), y la región 3 determinante de la complementariedad de cadena pesada (HC CDR3) de un dominio de unión anti-CD19 descrito aquí, por ejemplo, el dominio de unión anti-CD19 tiene dos regiones variables de cadena pesada, comprendiendo cada una de ellas una HC CDR1, una HC CDR2 y una HC CDR3 descritas aquí. En un caso, el dominio de unión anti-CD 19 comprende una región variable de cadena ligera murina descrita aquí (por ejemplo, en la Tabla 7), y/o una región variable de cadena pesada murina descrita aquí (por ejemplo, en la Tabla 7). En un caso, el dominio de unión anti-CD19 es un scFv que comprende una cadena ligera murina y una cadena pesada murina de una secuencia de aminoácidos de la Tabla 7. En un caso, el dominio de unión anti-CD19 (por ejemplo, un scFv) comprende: una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena ligera proporcionada en la Tabla 7, o una secuencia con una identidad del 95-99% con una secuencia de aminoácidos de la Tabla 7; y/o una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena pesada proporcionada en la Tabla 7, o una secuencia con una identidad del 95-99% con una secuencia de aminoácidos de la Tabla 7. En un caso, el dominio de unión anti-CD19 comprende una secuencia de SEQ ID NO:59, o una secuencia con una identidad del 95-99% con la misma. En un caso, el dominio de unión anti-CD19 es un scFv; y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos descrita aquí, por ejemplo, en la Tabla 7, está unida a una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos descrita aquí, por ejemplo, en la Tabla 7, a través de un enlazador, por ejemplo, un enlazador descrito aquí. En un caso, el dominio de unión anti-CD19 incluye un enlazador (Gly4-Ser)n, en el que n es 1, 2, 3, 4, 5 o 6, preferiblemente 3 o 4 (SEQ ID NO:53). La región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada de un scFv pueden estar, por ejemplo, en cualquiera de las siguientes orientaciones: región variable de cadena ligera-enlazador-región variable de cadena pesada, o región variable de cadena pesadaenlazador-región variable de cadena ligera.
En un caso, la molécula CAR comprende un dominio de unión anti-CD19 humanizado que incluye una o más (por ejemplo, las tres) de la región 1 determinante de la complementariedad de cadena ligera (LC CDR1), la región 2 determinante de la complementariedad de cadena ligera (LC CDR2), y la región 3 determinante de la complementariedad de cadena ligera (LC c DR3) de un dominio de unión anti-CD19 humanizado descrito aquí, y una o más (por ejemplo, las tres) de la región 1 determinante de complementariedad de cadena pesada (HC CDR1), la región 2 determinante de complementariedad de cadena pesada (HC CDR2), y la región 3 determinante de complementariedad de cadena pesada (HC CDR3) de un dominio de unión anti-CD19 humanizado descrito aquí, por ejemplo, un dominio de unión anti-CD19 humanizado que comprende una o más, por ejemplo, las tres, LC CDR, y una o más, por ejemplo, las tres, HC CDR. En un caso, el dominio de unión anti-CD19 humanizado comprende al menos HC CDR2. En un caso, el dominio de unión anti-CD19 humanizado comprende una o más (por ejemplo, las tres) de la región 1 determinante de la complementariedad de cadena pesada (HC CDR1), la región 2 determinante de la complementariedad de cadena pesada (HC CDR2), y la región 3 determinante de la complementariedad de cadena pesada (Hc CDR3) de un dominio de unión anti-CD19 humanizado descrito aquí, por ejemplo, el dominio de unión anti-CD19 humanizado tiene dos regiones variables de cadena pesada, comprendiendo cada una de ellas una HC CDR1, una HC CDR2 y una HC CDR3 descritas aquí. En un caso, el dominio de unión anti-CD19 humanizado comprende al menos HC CDR2. En un caso, la región variable de cadena ligera comprende una, dos, tres o las cuatro regiones marco de la secuencia de línea germinal VK3_L25. En un caso, la región variable de la cadena ligera tiene una modificación (por ejemplo, sustitución, por ejemplo, una sustitución de uno o más aminoácidos que se encuentran en la posición correspondiente en la región variable de cadena ligera murina de SEQ ID NO:58, por ejemplo, una sustitución en una o más de las posiciones 71 y 87). En un caso, la región variable de cadena pesada comprende una, dos, tres o las cuatro regiones marco de la secuencia de línea germinal VH4_4-59. En un caso, la región variable de cadena pesada tiene una modificación (por ejemplo, sustitución, por ejemplo, una sustitución de uno o más aminoácidos que se encuentran en la posición correspondiente en la región variable de cadena pesada murina de SEQ ID NO:58, por ejemplo, una sustitución en una o más de las posiciones 71, 73 y 78). En un caso, el dominio de unión anti-CD19 humanizado comprende una región variable de cadena ligera descrita aquí (por ejemplo, en la Tabla 3) y/o una región variable de cadena pesada descrita aquí (por ejemplo, en la Tabla 3). En un caso, el dominio de unión anti-CD19 humanizado es un scFv que comprende una cadena ligera y una cadena pesada de una secuencia de aminoácidos de la Tabla 3. En un caso, el dominio de unión anti-CD19 humanizado (por ejemplo, un scFv) comprende: una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena ligera proporcionada en la Tabla 3, o una secuencia con una identidad del 95-99% con una secuencia de aminoácidos de la Tabla 3; y/o una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena pesada proporcionada en la Tabla 3, o una secuencia con una identidad del 95-99% con una secuencia de aminoácidos de la Tabla 3. En un caso, el dominio de unión anti-CD19 humanizado comprende una secuencia seleccionada de un grupo que consiste en SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 , SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 y SEQ ID NO:12, o una secuencia con una identidad del 95-99% con las mismas. En un caso, el dominio de unión anti-CD19 humanizado es un scFv; y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos descrita aquí, por ejemplo, en la Tabla 3, se une a una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos descrita aquí, por ejemplo, en la Tabla 3, a través de un enlazador, por ejemplo, un enlazador descrito aquí. En un caso, el dominio de unión anti-CD19 humanizado incluye un enlazador (Gly4-Ser)n, en el que n es 1,2, 3, 4, 5 o 6, preferiblemente 3 o 4 (SEQ ID NO:53). La región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada de un scFv pueden estar, por ejemplo, en cualquiera de las siguientes orientaciones: región variable de cadena ligera-enlazador-región variable de cadena pesada, o región variable de cadena pesada-enlazador-región variable de cadena ligera.
En un caso, la molécula CAR comprende un dominio transmembrana de una proteína seleccionada del grupo que consiste en la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, Cd 9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, cD l34 , CD137 y CD154. En un caso, el dominio transmembrana comprende una secuencia de la SEQ ID NO:15. En un caso, el dominio transmembrana comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones) pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:15, o una secuencia con una identidad del 95-99% con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:15.
En un caso, el dominio de unión anti-CD19 está conectado al dominio transmembrana mediante una región de bisagra, por ejemplo, una región de bisagra descrita aquí. En un caso, la región de bisagra codificada comprende SEQ ID NO:14 o SEQ ID NO:45, o una secuencia con una identidad del 95-99% con las mismas.
En un caso, la molécula CAR comprende además una secuencia que codifica un dominio coestimulador, por ejemplo, un dominio coestimulador descrito aquí. En un caso, el dominio coestimulador comprende un dominio de señalización funcional de una proteína seleccionada del grupo que consiste en OX40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18) y 4-1BB (CD137). En un caso, el dominio coestimulador comprende una secuencia de la SEQ ID NO:16. En un caso, el dominio coestimulador comprende una secuencia de la SEQ ID NO:51. En un caso, el dominio coestimulador comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones) pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:51, o una secuencia con una identidad del 95-99% con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:51.
En un caso, la molécula CAR comprende además una secuencia que codifica un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular descrito aquí. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización funcional de 4-1BB y/o un dominio de señalización funcional de CD3 zeta. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de SEQ ID NO:16 y/o la secuencia de SEQ ID NO:17. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de SEQ ID NO:16 y/o la secuencia de SEQ ID NO:43. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización funcional de CD27 y/o un dominio de señalización funcional de CD3 zeta. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de SEQ ID NO:51 y/o la secuencia de SEQ ID NO:17. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de SEQ ID NO:51 y/o la secuencia de SEQ ID NO:43. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones) pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID n O:16 o SEQ ID NO:51 y/o una secuencia de aminoácidos de SEQ ID n O:17 o SEQ ID NO:43, o una secuencia con una identidad del 95-99% con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:51 y/o una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:17 o SEQ ID NO:43. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:51 y la secuencia de SEQ ID NO:17 o SEQ ID NO:43, en el que las secuencias que comprenden el dominio de señalización intracelular se expresan en el mismo marco y como una sola cadena polipeptídica.
En un caso, la molécula CAR comprende además una secuencia líder, por ejemplo, una secuencia líder descrita aquí. En un caso, la secuencia líder comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:13, o una secuencia con una identidad del 95-99% con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:13.
En un caso, la molécula CAR comprende una secuencia líder, por ejemplo, una secuencia líder descrita aquí, por ejemplo, una secuencia líder de SEQ ID NO:13, o que tiene una identidad del 95-99% con la misma; un dominio de unión anti-CD19 descrito aquí, por ejemplo, un dominio de unión anti-CD19 que comprende una LC CDR1, una LC CDR2, una LC CDR3, una HC CDR1, una HC CDR2 y una HC CDR3 descritas aquí, por ejemplo, un dominio de unión anti-CD19 murino descrito en la Tabla 7, un dominio de unión anti-CD19 humanizado descrito en la Tabla 3, o una secuencia con una identidad del 95-99% con el mismo; una región de bisagra, por ejemplo, una región de bisagra descrita aquí, por ejemplo, una región de bisagra de SEQ ID NO:14 o que tiene una identidad del 95-99% con la misma; un dominio transmembrana, por ejemplo, un dominio transmembrana descrito aquí, por ejemplo, un dominio transmembrana que tiene una secuencia de SEQ ID NO:15 o una secuencia que tiene una identidad del 95-99% con la misma; un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular descrito aquí (por ejemplo, un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio coestimulador y/o un dominio de señalización primario). En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio coestimulador, por ejemplo, un dominio coestimulador descrito aquí, por ejemplo, un dominio coestimulador 4-1BB que tiene una secuencia de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:51, o que tiene una identidad del 95-99% con las mismas, y/o un dominio de señalización primario, por ejemplo, un dominio de señalización primario descrito aquí, por ejemplo, un dominio estimulador CD3 zeta que tiene una secuencia de SEQ ID NO:17 o SEQ ID NO:43, o que tiene una identidad del 95-99% con las mismas.
En un caso, la molécula CAR comprende (por ejemplo, consiste en) una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41 o SEQ ID NO:42, o un secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, 10, 15, 20 o 30 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) pero no más de 60, 50 o 40 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO : 38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41 o SEQ ID NO:42, o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41 o SEQ ID NO:42.
En un caso, la célula que expresa la molécula CAR comprende un vector que incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica la molécula CAR. En un caso, el vector se selecciona del grupo constituido por un ADN, un ARN, un plásmido, un vector lentivírico, vector adenovírico o un vector retrovírico. En un caso, el vector es un vector lentivírico. En un caso, el vector comprende además un promotor. En un caso, el promotor es un promotor EF-1. En un caso, el promotor EF-1 comprende una secuencia de SEQ ID NO:100. En un caso, el vector es un vector transcrito in vitro, por ejemplo, un vector que transcribe ARN de una molécula de ácido nucleico descrita en la presente. En un caso, la secuencia de ácido nucleico en el vector in vitro comprende además una cola de poli(A), por ejemplo, una cola de poli A descrita aquí, por ejemplo, que comprende alrededor de 150 bases de adenosina (SEQ ID n O:104). En un caso, la secuencia de ácido nucleico en el vector in vitro comprende además una 3'UTR, por ejemplo, una 3'UTR descrita aquí, por ejemplo, que comprende al menos una repetición de una 3'UTR derivada de beta-globulina humana. En un caso, la secuencia de ácido nucleico en el vector in vitro comprende además un promotor, por ejemplo, un promotor T2A.
En ciertos casos de las composiciones y métodos descritos aquí, la célula que expresa la molécula CAR (también denominada aquí “célula que expresa CAR”) es una célula o población de células como se describe aquí, por ejemplo, una célula efectora inmunitaria humana o población de células (por ejemplo, una célula T humana o una célula NK humana, por ejemplo, una célula T humana descrita aquí o una célula n K humana descrita aquí). En un caso, el linfocito T humano es un linfocito T CD8+. En un caso, la célula es una célula T autóloga. En un caso, la célula es una célula T alogénica. En un caso, la célula es una célula T, y la célula T es deficiente en diaglicerol cinasa (DGK). En un caso, la célula es una célula T, y la célula T es deficiente en Ikaros. En un caso, la célula es una célula T, y la célula T es deficiente tanto en DGK como en Ikaros. Debe entenderse que las composiciones y métodos descritos aquí que enumeran el término “célula” abarcan composiciones y métodos que comprenden una o más células, por ejemplo, una población de células.
En otro caso, la célula que expresa la molécula CAR, por ejemplo, como se describe aquí, puede expresar además otro agente, por ejemplo, un agente que potencia la actividad de una célula que expresa CAR.
En un caso, el método incluye además administrar una célula que expresa la molécula CAR, como se describe aquí, opcionalmente en combinación con un inhibidor de cinasa, por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib, en combinación con un agente que mejora la actividad de una célula que expresa CAR. En ciertos casos, el agente es una citocina, por ejemplo, IL-7, IL-15, IL-21, o una combinación de las mismas. En un caso, el método incluye administrar IL-7 al sujeto. La citocina se puede administrar en combinación con, por ejemplo, simultáneamente o poco después de, la administración de la célula que expresa CAR. Alternativamente, la citocina se puede administrar después de un período de tiempo prolongado después de la administración de la célula que expresa c A r , por ejemplo, después de la evaluación de la respuesta del sujeto a la célula que expresa CAR.
En otros casos, el agente que potencia la actividad de una célula que expresa CAR puede ser un agente que inhibe una molécula inmunoinhibidora. Ejemplos de moléculas inmunoinhibidoras incluyen p D1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 y TGFR beta. En un caso, el agente que inhibe una molécula inhibidora inmunitaria comprende un primer polipéptido, por ejemplo, una molécula inhibidora inmunitaria, asociada con un segundo polipéptido que proporciona una señal positiva a la célula, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular descrito aquí. En un caso, el agente comprende un primer polipéptido, por ejemplo, de una molécula inhibidora tal como PD1, Pd -L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CeAc A m -1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 o TGFR beta, o un fragmento de cualquiera de estas (por ejemplo, al menos una parte del dominio extracelular de cualquiera de estas), y un segundo polipéptido que es un dominio de señalización intracelular descrito aquí (por ejemplo, que comprende un dominio coestimulador (por ejemplo, 41BB, CD27 o CD28, por ejemplo, como se describe aquí) y/o un dominio de señalización primario (por ejemplo, un dominio de señalización de CD3 zeta descrito aquí). En un caso, el agente comprende un primer polipéptido de PD1 o un fragmento de este (por ejemplo, al menos una porción del dominio extracelular de PD1) y un segundo polipéptido de un dominio de señalización intracelular descrito en la presente (por ejemplo, un dominio de señalización de Cd 28 descrito en la presente y/o un dominio de señalización de CD3 zeta como los descritos en la presente).
En un caso, la infusión de células, por ejemplo, la infusión de células alogénicas, se usa en el tratamiento del cáncer, en el que la infusión de células comprende al menos una célula que expresa CAR que se une a un antígeno de células B (por ejemplo, CD19) (también denominado aquí como célula que expresa CAR CD19), como se describe aquí. En un caso, la infusión de células autólogas se usa en el tratamiento del cáncer, en el que la infusión de células autólogas comprende al menos una célula que expresa CD19.
En un caso, la célula que expresa CAR CD19, por ejemplo, célula T, se administra a un sujeto que ha recibido un trasplante previo de células madre, por ejemplo, trasplante autólogo de células madre.
En un caso, la célula que expresa CAR CD19, por ejemplo, célula T, se administra a un sujeto que ha recibido una dosis anterior de melfalán.
En un caso, la célula que expresa la molécula CAR, por ejemplo, una molécula CAR descrita aquí, se administra en combinación con un agente que mejora uno o más efectos secundarios asociados con la administración de una célula que expresa una molécula CAR, por ejemplo, un agente descrito aquí.
En un caso, el inhibidor de cinasa se administra en combinación con un agente que mejora uno o más efectos secundarios asociados con la administración del inhibidor de cinasa, por ejemplo, un agente descrito aquí.
En un caso, la célula que expresa la molécula CAR, por ejemplo, una molécula CAR descrita aquí, y el inhibidor de cinasa se administran en combinación con un agente adicional que trata la enfermedad asociada con CD19, por ejemplo, un agente adicional descrito aquí.
En un caso, las células que expresan una molécula CAR, por ejemplo, una molécula CAR descrita aquí, se administran a una dosis y/o programa de dosificación descrito aquí.
En un caso, la molécula CAR se introduce en las células T, por ejemplo, usando transcripción in vitro, y el sujeto (por ejemplo, un ser humano) recibe una administración inicial de células que comprenden una molécula CAR, y una o más administraciones posteriores de células que comprenden una molécula CAR, en la que una o más administraciones posteriores se administran en menos de 15 días, por ejemplo, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 días después de la administración anterior. En un caso, se administra al sujeto (por ejemplo, un ser humano) más de una administración de células que comprenden una molécula CAR por semana, por ejemplo, se administran 2, 3 o 4 administraciones de células que comprenden una molécula CAR por semana. En un caso, el sujeto (por ejemplo, un sujeto humano) recibe más de una administración de células que comprenden una molécula CAR por semana (por ejemplo, 2, 3 o 4 administraciones por semana) (también denominado aquí como un ciclo), seguido de una semana sin administración de células que comprenden una molécula CAR, y después se administra al sujeto una o más administraciones adicionales de células que comprenden una molécula de CAR (por ejemplo, más de una administración de células que comprenden una molécula CAR por semana). En otro caso, el sujeto (por ejemplo, un sujeto humano) recibe más de un ciclo de células que comprenden una molécula CAR, y el tiempo entre cada ciclo es menor que 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 o 3 días. En un caso, las células que comprenden una molécula c Ar se administran cada dos días durante 3 administraciones por semana. En un caso, las células que comprenden una molécula CAR se administran durante al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más semanas.
En un caso, la combinación del inhibidor de cinasa y las células que expresan una molécula CAR, por ejemplo, una molécula CAR descrita aquí, se administra como tratamiento de primera línea para la enfermedad, por ejemplo, el cáncer, por ejemplo, el cáncer descrito aquí. En otro caso, la combinación del inhibidor de cinasa y las células que expresan una molécula CAR, por ejemplo, una molécula CAR descrita aquí, se administra como un tratamiento de segunda, tercera, cuarta línea para la enfermedad, por ejemplo, el cáncer, por ejemplo, el cáncer descrito aquí.
En un caso, se administra al sujeto una célula (por ejemplo, una población de células) descrita aquí.
En un caso, el método incluye administrar una población de células, una pluralidad de las cuales comprende una molécula CAR descrita aquí. En algunos casos, la población de células que expresan CAR comprende una mezcla de células que expresan diferentes CAR. por ejemplo, en un caso, la población de células que expresan CAR puede incluir una primera célula que expresa un CAR que tiene un dominio de unión anti-CD19 descrito aquí, y una segunda célula que expresa un CAR que tiene un dominio de unión anti-CD19 diferente, por ejemplo, un dominio de unión anti-CD19 descrito aquí que difiere del dominio de unión anti-CD19 en el CAR expresado por la primera célula. Como otro ejemplo, la población de células que expresan CAR puede incluir una primera célula que expresa un CAR que incluye un dominio de unión anti-CD19, por ejemplo, como se describe aquí, y una segunda célula que expresa un CAR que incluye un dominio de unión a antígeno a una diana distinta de CD19 (por ejemplo, CD123 o mesotelina). En un caso, la población de células que expresan CAR incluye, por ejemplo, una primera célula que expresa un CAR que incluye un dominio de señalización intracelular primario, y una segunda célula que expresa un CAR que incluye un dominio de señalización secundario.
En un caso, el método incluye administrar una población de células en la que al menos una célula de la población expresa un CAR que tiene un dominio anti-CD19 descrito aquí, y un agente que mejora la actividad de una célula que expresa CAR, por ejemplo, una segunda célula que expresa el agente que mejora la actividad de una célula que expresa CAR. por ejemplo, en un caso, el agente puede ser un agente que inhibe una molécula inhibidora inmunitaria. Ejemplos de moléculas inmunoinhibidoras incluyen PD1, PD-L1, CTLA-4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 y TGFR beta. En un caso, el agente que inhibe una molécula inmunoinhibidora comprende un primer polipéptido, por ejemplo, una molécula inhibidora, asociado con un segundo polipéptido que proporciona una señal positiva a la célula, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular descrito aquí. En un caso, el agente comprende un primer polipéptido, por ejemplo, de una molécula inhibidora tal como PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 o TGFR beta, o un fragmento de cualquiera de estas (por ejemplo, al menos una parte de un dominio extracelular de cualquiera de estas), y un segundo polipéptido que es un dominio de señalización intracelular descrito aquí (por ejemplo, que comprende un dominio coestimulador (por ejemplo, 41BB, CD27 o CD28, por ejemplo, como se describe aquí) y/o un dominio de señalización primario (por ejemplo, un dominio de señalización de CD3 zeta descrito aquí). En un caso, el agente comprende un primer polipéptido de PD1 o un fragmento de este (por ejemplo, al menos una porción del dominio extracelular de PD1) y un segundo polipéptido de un dominio de señalización intracelular descrito en la presente (por ejemplo, un dominio de señalización de CD28 descrito en la presente y/o un dominio de señalización de CD3 zeta como los descritos en la presente).
En otro aspecto, la presente descripción se refiere a una célula que expresa una molécula CAR descrita aquí para uso como medicamento en combinación con un inhibidor de cinasa, por ejemplo, un inhibidor de cinasa descrito aquí (por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib). En otro aspecto, la presente descripción se refiere a un inhibidor de cinasa descrito aquí (por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib) para uso como medicamento en combinación con una célula que expresa una molécula CAR descrita aquí.
En otro aspecto, la presente descripción se refiere a una célula que expresa una molécula CAR descrita aquí para uso en combinación con un inhibidor de cinasa, por ejemplo, un inhibidor de cinasa descrito aquí (por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib), en el tratamiento de una enfermedad que expresa el antígeno de células B (por ejemplo, CD19). En otro aspecto, la presente descripción se refiere a un inhibidor de cinasa descrito aquí (por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib), para uso en combinación con una célula que expresa una molécula CAR descrita aquí, en el tratamiento de una enfermedad que expresa el antígeno de células B (por ejemplo, CD19). La enfermedad puede ser, por ejemplo, un cáncer, tal como un cáncer hematológico. El cáncer puede ser, por ejemplo, un linfoma, CLL, MCL, ALL, Dl BCL, mieloma múltiple u otro cáncer descrito aquí.
En otro aspecto, la presente descripción se refiere a una célula que expresa una molécula CAR descrita aquí para uso como medicamento en combinación con una citocina, por ejemplo, IL-7, IL-15 y/o IL-21 como se describe aquí. En otro aspecto, la presente descripción se refiere a una citocina descrita aquí para uso como medicamento en combinación con una célula que expresa una molécula CAR descrita aquí.
En otro aspecto, la presente descripción se refiere a una célula que expresa una molécula CAR descrita aquí para uso en combinación con una citocina, por ejemplo, IL-7, IL-15 y/o IL-21 como se describe aquí, en el tratamiento de una enfermedad que expresa CD19. En otro aspecto, la presente descripción se refiere a una citocina descrita aquí para uso en combinación con una célula que expresa una molécula CAR descrita aquí, en el tratamiento de una enfermedad que expresa CD19.
En otro aspecto, la presente descripción se refiere a un método de tratamiento de un mamífero que tiene linfoma de Hodgkin, que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de la célula (por ejemplo, células) que expresa una molécula CAR, por ejemplo, una molécula CAR descrita aquí.
En un caso, la célula que expresa una molécula CAR, por ejemplo, una molécula CAR descrita aquí, se administra en combinación con un agente que aumenta la eficacia de una célula que expresa una molécula CAR, por ejemplo, un agente descrito aquí.
En un caso, la célula que expresa una molécula CAR, por ejemplo, una molécula CAR descrita aquí, se administra en combinación con un agente que mejora uno o más efectos secundarios asociados con la administración de una célula que expresa una molécula CAR, por ejemplo, un agente descrito aquí.
En un caso, la célula que expresa una molécula CAR, por ejemplo, una molécula CAR descrita aquí, se administra en combinación con un agente que trata el linfoma de Hodgkin, por ejemplo, un agente descrito aquí.
En un caso, la célula que expresa una molécula CAR, por ejemplo, una molécula CAR descrita aquí, se administra en combinación con una dosis baja potenciadora del sistema inmunológico de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor de mTOR descrito aquí. Sin desear ceñirse a la teoría, se cree que el tratamiento con una dosis baja, de potenciación inmunitaria, (por ejemplo, una dosis que es insuficiente para suprimir por completo el sistema inmunitario pero suficiente para mejorar la función inmunitaria) está acompañado por un descenso en linfocitos T positivos para PD-1 o un incremento en linfocitos negativos para PD-1. Los linfocitos T positivos para PD-1, pero no los linfocitos T negativos para PD-1, se pueden agotar mediante unión con células que expresan un ligando de PD-1, por ejemplo, PD-L1 o PD-L2.
En un caso, este enfoque puede usarse para optimizar el rendimiento de una célula CAR descrita aquí en el objeto. Aunque sin desear ceñirse a la teoría, se cree que, en un caso, se mejora el rendimiento de células efectoras inmunitarias no modificadas, endógenas, por ejemplo, linfocitos T. Aunque sin desear ceñirse a la teoría, se cree que, en un caso, se mejora el rendimiento de una célula que expresa CAR CD19. En otros casos, las células, por ejemplo, las células T, que tienen, o serán modificadas genéticamente para expresar un CAR, pueden tratarse ex vivo por contacto con una cantidad de un inhibidor de mTOR que aumenta el número de células efectoras inmunitarias negativas para PD1, por ejemplo, células T, o aumenta la proporción de células efectoras inmunitarias negativas para PD1, por ejemplo, células T/células efectoras inmunitarias positivas para PD1, por ejemplo, células T.
En un caso, la administración de una dosis baja, potenciadora del sistema inmunológico, de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor alostérico, por ejemplo, RAD001, o un inhibidor catalítico, se inicia antes de la administración de una célula que expresa CAR descrita aquí, por ejemplo, células T. En un caso, el inhibidor de mTOR es RAD001 o rapamicina. En un caso, las células CAR se administran después de un tiempo suficiente, o una dosis suficiente, de un inhibidor de mTOR, de modo que el nivel de células efectoras inmunitarias negativas para PD1, por ejemplo, células T, o la proporción de células efectoras inmunitarias negativas para PD1, por ejemplo, células T/células efectoras inmunitarias positivas para PD1, por ejemplo, células T, se ha incrementado, al menos transitoriamente.
En un caso, la célula, por ejemplo, una célula efectora inmunitaria (por ejemplo, una célula T o una célula NK), que se diseñará para expresar un CAR, se recolecta después de un tiempo suficiente, o después de una dosificación suficiente de la dosis baja, potenciadora del sistema inmunológico, de un inhibidor de mTOR, tal que el nivel de células efectoras inmunitarias negativas para PD1, por ejemplo, células T, o la proporción de células efectoras inmunitarias negativas para PD1, por ejemplo, células T/células efectoras inmunitarias positivas para PD1, por ejemplo, células T, en el sujeto o cosechadas del sujeto se ha incrementado, al menos transitoriamente.
En casos, cualquiera de los métodos descritos aquí comprende además realizar la linfodepleción en un sujeto, por ejemplo, antes de administrar una o más células que expresan una molécula CAR descrita aquí, por ejemplo, una molécula CAR que se une a CD19. La linfodepleción puede comprender, por ejemplo, administrar uno o más de entre melfalán, citoxano, ciclofosfamida y fludarabina.
En algunos casos, la célula que expresa CAR que se administra comprende un CAR regulable (RCAR), por ejemplo, un RCAR como se describe aquí. El RCAR puede comprender, por ejemplo, un miembro de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización intracelular y un primer dominio de conmutación, un miembro de unión a antígeno que comprende un dominio de unión a antígeno que se une a CD19 y un segundo dominio de conmutación; y un dominio transmembrana. El método puede comprender además administrar una molécula de dimerización, por ejemplo, en una cantidad suficiente para provocar la dimerización del primer y segundo dominio de conmutación.
En algunos casos, la célula que expresa CAR y el inhibidor de cinasa se administran de forma simultánea o sustancialmente simultánea, por ejemplo, como primera línea de terapia. En algunos casos, el método comprende administrar una combinación del inhibidor de BTK (por ejemplo, ibrutinib) y la célula que expresa CAR (por ejemplo, una célula que expresa CAR19) al sujeto, como terapia de primera línea.
En otros casos, la célula que expresa CAR y el inhibidor de cinasa se administran secuencialmente. por ejemplo, el inhibidor de cinasa se administra antes que la célula que expresa CAR, o la célula que expresa CAR se administra antes que el inhibidor de cinasa.
En algunos casos, la enfermedad asociada con la expresión de CD19 es un cáncer hematológico (por ejemplo, un cáncer hematológico descrito aquí tal como CLL, MCL o ALL), y el sujeto es, o se identifica como, respondedor parcial, no respondedor, o recidivante a una o más terapias para el cáncer hematológico, por ejemplo, a un inhibidor de BTK tal como ibrutinib. En algún caso, el sujeto tiene, o se identifica que tiene, una mutación en BTK. La mutación puede ser, por ejemplo, una mutación puntual, una inserción o una deleción. La mutación puede ser, por ejemplo, una mutación en el sitio de unión para el inhibidor de BTK, por ejemplo, en o cerca del bolsillo de unión a ATP. La mutación puede conferir una respuesta disminuida (por ejemplo, resistencia) al inhibidor de BTK.
En algunos casos de cualquiera de los métodos descritos aquí, el método comprende administrar el inhibidor de BTK (por ejemplo, Ibrutinib) al sujeto, reducir la cantidad (por ejemplo, cesar la administración) del inhibidor de BTK, y posteriormente administrar la célula que expresa CAR (por ejemplo, una célula que expresa CAR19) al sujeto.
En algunos casos, el método comprende administrar el inhibidor de BTK (por ejemplo, ibrutinib) al sujeto y posteriormente administrar una combinación del inhibidor de BTK y la célula que expresa CAR (por ejemplo, una célula que expresa CAR19) al sujeto.
En algunos casos, el método comprende administrar el inhibidor de BTK (por ejemplo, Ibrutinib) al sujeto, reducir la cantidad (por ejemplo, cesar o interrumpir la administración) del inhibidor de bTk , y posteriormente administrar una combinación de la célula que expresa CAR (por ejemplo, una célula que expresa CAR19) y un segundo inhibidor de BTK (por ejemplo, un inhibidor de bTk distinto del primer inhibidor de bTk , por ejemplo, distinto de ibrutinib) al sujeto. En algunos casos, el segundo inhibidor de BTK se escoge de uno o más de Gd C-0834, RN-486, CGI-560, Cg I-1764, HM-71224, CC-292, ONO-4059, CNX-774 o LFM- A13, o una combinación de los mismos.
En algunos casos, la enfermedad asociada con la expresión del antígeno de células B (por ejemplo, CD19) es un cáncer hematológico (por ejemplo, un cáncer hematológico descrito aquí, por ejemplo, CLL, MCL o ALL), y el método retrasa o disminuye la resistencia al inhibidor de cinasa (por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib), la célula que expresa CAR (por ejemplo, una célula que expresa CAR19) al sujeto, o ambos. En algunos casos, la enfermedad asociada con la expresión de CD19 es un cáncer hematológico (por ejemplo, un cáncer hematológico descrito aquí, por ejemplo, CLL, MCL o ALL), y en el que el método prolonga la remisión o retrasa la recaída del cáncer hematológico. por ejemplo, se puede prolongar la remisión, se puede retrasar la recaída, se puede retrasar la resistencia o se puede disminuir la resistencia, en comparación con el curso esperado de la enfermedad cuando se trata con una monoterapia del inhibidor de cinasa o la célula que expresa CAR.
Los regímenes de tratamiento ejemplares que se pueden usar en cualquiera de los métodos mencionados anteriormente incluyen uno o más de los siguientes:
En un caso, el inhibidor de cinasa y la célula que expresa CAR (por ejemplo, la célula que expresa CAR19) se administran al sujeto, por ejemplo, un mamífero, como primera línea de terapia.
En otro caso, la célula que expresa CAR (por ejemplo, la célula que expresa CAR19) se administra al sujeto, por ejemplo, un mamífero, después de la administración del inhibidor de cinasa.
En otros casos, la célula que expresa CAR (por ejemplo, la célula que expresa CAR19) se administra después de cesar la administración del inhibidor de cinasa.
En otros casos, la administración del inhibidor de cinasa se inicia antes de la administración de la célula que expresa CAR19, y la célula que expresa CAR19 se administra en combinación con la administración continuada del inhibidor de cinasa.
En un caso, a un sujeto se le administra un inhibidor de cinasa (por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib), por ejemplo, como terapia de primera línea. Después de un intervalo de tiempo predeterminado (por ejemplo, 1 o 2 meses, pero también 2 semanas, 3 semanas, 1 mes, 1,5 meses, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 6 meses, 9 meses, 12 meses, 15 meses o 18 meses), se administra una célula que expresa CAR (por ejemplo, una célula que expresa CAR19) al sujeto, sola o en combinación con el inhibidor de cinasa. En algunos casos, la respuesta del sujeto al tratamiento se evalúa a intervalos de tiempo predeterminados, por ejemplo, antes o durante el tratamiento con el inhibidor de cinasa y/o la célula que expresa CAR. Si la evaluación muestra que el sujeto responde completamente, no se administra la célula que expresa CAR (por ejemplo, una célula que expresa CAR19). Si la evaluación muestra que el sujeto es un respondedor parcial, o tiene una enfermedad estable en respuesta al inhibidor de cinasa, la célula que expresa CAR (por ejemplo, una célula que expresa CAR19) se administra en combinación con el inhibidor de cinasa, por ejemplo, como se describe aquí. Si la evaluación muestra que el sujeto no responde o recae, la célula que expresa CAR (por ejemplo, una célula que expresa CAR19) se administra en combinación con el inhibidor de cinasa o un segundo inhibidor de cinasa, por ejemplo, un segundo inhibidor de cinasa como se describe aquí.
En otros casos, el sujeto, por ejemplo, un mamífero, es o se identifica como un respondedor completo o parcial al inhibidor de BTK (por ejemplo, ibrutinib), o un respondedor completo o parcial a la célula que expresa CAR19.
En algunos casos, cuando un sujeto es (o se identifica como) un respondedor completo al inhibidor de cinasa (por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib), al sujeto no se le administra una célula que expresa CAR (por ejemplo, una célula que expresa CAR19) durante el período de respuesta completa. En otros casos, cuando un sujeto es (o se identifica como) un respondedor completo (por ejemplo, un respondedor completo a ibrutinib) al inhibidor de cinasa, al sujeto se le administra una célula que expresa CAR (por ejemplo, una célula que expresa CAR19) durante el período de respuesta completa. En un caso, después de la célula que expresa CAR (por ejemplo, una célula que expresa CAR19), el sujeto experimenta una respuesta prolongada o una recaída retardada (por ejemplo, en comparación con el curso esperado de la enfermedad cuando se trata sin la terapia de CAR).
En algunos casos, cuando un sujeto es (o se identifica como) un respondedor parcial al inhibidor de cinasa (por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib), al sujeto no se le administra una célula que expresa CAR (por ejemplo, una célula que expresa CAR19) durante el período de respuesta parcial. En otros casos, cuando un sujeto es (o se identifica como) un respondedor parcial al inhibidor de cinasa, al sujeto se le administra una célula que expresa CAR (por ejemplo, una célula que expresa CAR19) (sola o en combinación con el inhibidor BTK) durante el período de respuesta parcial. En un caso, después de la terapia de CAR, el sujeto experimenta una respuesta completa y/o una respuesta prolongada o una recaída retrasada (por ejemplo, en comparación con el curso esperado de la enfermedad cuando se trata sin la terapia de CAR).
En algunos casos, cuando un sujeto tiene (o se identifica que tiene) enfermedad estable después del tratamiento con el inhibidor de cinasa (por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib), al sujeto no se le administra una terapia de CAR durante el período de enfermedad estable. En otros casos, cuando un sujeto tiene (o se identifica que tiene) una enfermedad estable después del tratamiento con el inhibidor de cinasa, al sujeto se le administra una terapia de CAR durante el período de enfermedad estable. En un caso, después de la terapia de CAR, el sujeto experimenta una respuesta parcial, una respuesta completa y/o una respuesta prolongada o una recaída tardía (por ejemplo, en comparación con el curso esperado de la enfermedad cuando se trata sin terapia de CAR).
En algunos casos, cuando un sujeto tiene (o se identifica que tiene) una enfermedad progresiva después del tratamiento con el inhibidor de cinasa (por ejemplo, un inhibidor de bTk tal como ibrutinib), al sujeto no se le administra una célula que expresa CAR (por ejemplo, una célula que expresa CAR19) durante el período de enfermedad progresiva. En otros casos, cuando un sujeto tiene (o se identifica que tiene) una enfermedad progresiva después del tratamiento con el inhibidor de cinasa, al sujeto se le administra una célula que expresa CAR (por ejemplo, una célula que expresa CAR19) durante el período de enfermedad progresiva. En un caso, después de la terapia de CAR, el sujeto experimenta una enfermedad estable, una respuesta parcial, una respuesta completa y/o una respuesta prolongada o una recaída retardada (por ejemplo, en comparación con el curso esperado de la enfermedad cuando se trata sin terapia de CAR).
En otros casos, la célula que expresa CAR se administra en combinación con un segundo inhibidor de cinasa, en la que el segundo inhibidor de cinasa es distinto de ibrutinib, cuando el mamífero es, o se identifica como, no respondedor o reincidente a ibrutinib. El segundo inhibidor de cinasa se puede escoger de uno o más de GDC-0834, RN-486, CGI-560, CGI-1764, HM-71224, CC-292, ONO-4059, CNX-774 o LFM-A13, o una combinación de los mismos.
En otros casos, el sujeto, por ejemplo, el mamífero, es (o se identifica como) un respondedor parcial al inhibidor de cinasa, y al sujeto se le administra la célula que expresa CAR (por ejemplo, la célula que expresa CAR19), sola o en combinación con el inhibidor de BTK, durante el período de respuesta parcial.
En otros casos, el sujeto, por ejemplo, el mamífero, es (o se ha identificado como) un no respondedor que tiene una enfermedad progresiva o estable después del tratamiento con ibrutinib, y al sujeto se le administra la célula que expresa CAR (por ejemplo, la célula que expresa CAR19), sola o en combinación con un segundo inhibidor de BTK, durante el período de enfermedad progresiva o estable, en el que el segundo inhibidor de cinasa es distinto de ibrutinib.
En otro aspecto, se describe aquí un método para tratar a un sujeto, por ejemplo, un mamífero, que tiene una enfermedad asociada con la expresión del antígeno de células B (por ejemplo, CD19). El método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un inhibidor de cinasa como se describe aquí (por ejemplo, un inhibidor de cinasa BTK descrito aquí, por ejemplo, ibrutinib) y una célula que expresa CAR (por ejemplo, una célula que expresa CAR19) en combinación (por ejemplo, simultáneamente (o sustancialmente de forma simultánea) o secuencialmente).
En algunos casos, el inhibidor de cinasa y la célula que expresa CAR (por ejemplo, una célula CAR19) se administran, en combinación, por ejemplo, como primera línea de terapia.
En algunos casos, el inhibidor de cinasa se administra inicialmente, por ejemplo, una monoterapia o una primera línea de terapia; después de reducir la cantidad (por ejemplo, cesar o interrumpir la administración) del inhibidor de cinasa, se administra la célula que expresa CAR (por ejemplo, una célula que expresa CAR19) al sujeto.
En otros casos, el inhibidor de cinasa se administra inicialmente, por ejemplo, una monoterapia o una primera línea de terapia; y posteriormente se administra una combinación del inhibidor de cinasa y la célula que expresa CAR (por ejemplo, una célula que expresa CAR19) al sujeto.
En otros casos, el inhibidor de cinasa se administra inicialmente, por ejemplo, una monoterapia o una primera línea de terapia; después de reducir la cantidad (por ejemplo, cesar o interrumpir la administración) del inhibidor de cinasa, se administra una combinación de un segundo inhibidor de cinasa y la célula que expresa CAR (por ejemplo, una célula que expresa CAR19) al sujeto.
En algunos casos, la respuesta del sujeto al tratamiento se evalúa a intervalos de tiempo predeterminados, por ejemplo, antes o durante el tratamiento con el inhibidor de cinasa y/o la célula que expresa CAR. Si la evaluación muestra que el sujeto responde completamente, no se administra la célula que expresa CAR (por ejemplo, una célula que expresa CAR19). Si la evaluación muestra que el sujeto es un respondedor parcial, o tiene una enfermedad estable en respuesta al inhibidor de cinasa, la célula que expresa CAR (por ejemplo, una célula que expresa CAR19) se administra en combinación con el inhibidor de cinasa, por ejemplo, como se describe aquí. Si la evaluación muestra que el sujeto no responde o recae, la célula que expresa CAR (por ejemplo, una célula que expresa CAR19) se administra en combinación con el inhibidor de cinasa o un segundo inhibidor de cinasa, por ejemplo, un segundo inhibidor de cinasa como se describe aquí.
En algunos casos, la enfermedad asociada con la expresión de un antígeno de células B (por ejemplo, CD19) es un cáncer hematológico, leucemia, linfoma, MCL, CLL, ALL, linfoma de Hodgkin, o mieloma múltiple.
En algunos casos, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de BTK escogido de ibrutinib, GDC-0834, RN-486, CGI-560, CGI-1764, HM-71224, CC-292, ONO-4059, CNX-774 o LFM-A13; un inhibidor de CDK4 escogido de palbociclib, aloisina A, flavopiridol, 2-(2-clorofenil)-5,7-dihidroxi-8-[(3S,4R)-3-hidroxi-1-metil-4-piperidinil]-4-cromenona; crizotinib (PF-02341066, P276-00, RAF265, indisulam, roscovitina, dinaciclib, BMS 387032, MLN8054, AG-024322, AT7519, AZD5438, BMS908662; o ribociclib; un inhibidor de mTOR escogido de rapamicina, un análogo de rapamicina tal como everolimus, temsirolimus, ridaforolimus, semapimod, AZD8055, PF04691502, SF1126, XL765 u OSI-027; o un inhibidor de MNK se escoge de: CGP052088, CGP57380, cercosporamida, o ETC-1780445-2, o 4-amino-5-(4-fluoroanilino)-pirazolo[3,4-d]pirimidina.
En algunos aspectos, la presente descripción presenta un método para tratar o proporcionar una inmunidad antitumoral en un sujeto, por ejemplo, un mamífero, que tiene linfoma de Hodgkin. El método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una célula que expresa una molécula CAR que se une a CD19, sola o en combinación con una segunda terapia.
En otro aspecto, la presente descripción presenta un método para tratar o proporcionar inmunidad antitumoral a un sujeto, por ejemplo, un mamífero, que tiene un mieloma múltiple (por ejemplo, un mieloma múltiple positivo para CD19, o un mieloma negativo para CD19). En un caso, el mieloma múltiple es negativo para CD19, por ejemplo, tiene una gran mayoría (99,95%) de las células plasmáticas neoplásicas con un fenotipo negativo para CD19, por ejemplo, detectado por citometría de flujo y RT-PCR. El método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una célula que expresa una molécula CAR que se une a CD19, sola o en combinación con una segunda terapia (por ejemplo, una terapia estándar de atención para el mieloma múltiple). El método puede comprender además administrar un inhibidor de cinasa como se describe aquí.
En los casos de los métodos relacionados con el linfoma de Hodgkin o el mieloma múltiple, la molécula CAR es una molécula CAR humanizada, por ejemplo, como se describe aquí. En casos, la molécula CAR es una molécula CAR como se describe aquí. por ejemplo, en casos, la molécula CAR comprende un dominio de unión anti-CD19 que comprende una o más de (por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o todas) LC CDR1 de SEQ ID NO:5, una LC CDR2 de SEQ ID n O:26, y una LC CDR3 de SEQ ID NO:27; una HC CDR1 de SEQ ID NO:19, una LC CDR2 de cualquiera de SEQ ID NOS:20-23, y una HC CDR3 de SEQ ID NO:24.
En algunos casos de los métodos relacionados con el linfoma de Hodgkin o el mieloma múltiple, la molécula CAR (por ejemplo, CART19 o CTL019) se administra como monoterapia. En algunos casos, el método comprende además administrar un inhibidor de cinasa, por ejemplo, un inhibidor de BTK (tal como ibrutinib), un inhibidor de CDK4, un inhibidor de mTOR, o un inhibidor de MNK.
En algunos casos de los métodos relacionados con el mieloma múltiple, la molécula CAR (por ejemplo, CART19 o CTL019) se administra en combinación con una terapia estándar de atención para el mieloma múltiple, por ejemplo, con quimioterapia mielosupresora y/o rescate de trasplante de células madre autólogas (por ejemplo, después de la administración de melfalán (por ejemplo, melfalán en dosis altas)).
En otro aspecto, la presente descripción presenta una composición que comprende una célula que expresa una molécula CAR que se une a un antígeno de células B (por ejemplo, uno o más de CD19, CD20. CD22 o ROR1), y uno o más inhibidores de cinasa, en la que el inhibidor de cinasa se escoge de un inhibidor de la tirosina cinasa (BTK) de Bruton, un inhibidor de cinasa 4 dependiente de ciclina (CDK4), un inhibidor de mTOR, o un inhibidor de cinasa que interactúa con proteína cinasa activada por mitógenos (MNK). La célula que expresa CAR y el uno o más inhibidores de cinasa pueden estar presentes en una forma de dosis única, o como dos o más formas de dosis.
En casos, las composiciones descritas aquí son para uso como medicamento.
En casos, las composiciones descritas aquí se usan en el tratamiento de una enfermedad asociada con la expresión de un antígeno de células B (por ejemplo, CD19).
Métodos y composiciones para producir células que expresan CAR
La presente descripción también proporciona, en ciertos aspectos, un método para producir una población de células efectoras inmunitarias (por ejemplo, células T o células NK) que se pueden diseñar para expresar un CAR (por ejemplo, un CAR descrito aquí), comprendiendo el método: proporcionar una población de células efectoras inmunitarias; y poner en contacto las células efectoras inmunitarias con un inhibidor de cinasa (por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib) en condiciones suficientes para inhibir una diana del inhibidor de cinasa (por ejemplo, BTK y/o ITK). El método puede comprender además poner en contacto, por ejemplo, transducir, las células efectoras inmunitarias con un ácido nucleico que codifica una molécula CAR.
En algunos aspectos, la descripción proporciona un método para obtener una célula que expresa CAR (por ejemplo, una célula efectora inmunitaria que expresa CAR o una población de células), que comprende: poner en contacto la célula o población de células con un inhibidor de cinasa, por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib; e introducir (por ejemplo, transducir) un ácido nucleico que codifica una molécula CAR en la célula o población de células en condiciones tales que se exprese la molécula CAR.
En ciertos casos de los métodos para producir células que expresan CAR, la molécula CAR codificada por el ácido nucleico es una molécula CAR que se une a CD19. En casos, el método comprende además cultivar la célula o células en condiciones que permitan que la célula o al menos una subpoblación de células expresen la molécula CAR. En casos, la célula es una célula T o una célula NK, o la población de células incluye células T, células NK o ambas. En casos, el método comprende poner en contacto la célula o células con el inhibidor de cinasa (por ejemplo, durante 10-20, 20-30, 30-40, 40-60 o 60-120 minutos) y posteriormente eliminar de la célula o células la mayor parte o la totalidad del inhibidor de cinasa. En casos, el inhibidor de cinasa se añade después de que se recolectan la célula o células, o antes de que se estimulen las células. En casos, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de BTK, un inhibidor de CDK4, un inhibidor de mTOR, o un inhibidor de MNK. En casos, el inhibidor de cinasa es ibrutinib. En casos, la población de células también comprende células cancerosas, por ejemplo, células de leucemia o linfoma. Las células cancerosas pueden ser, por ejemplo, células de CLL, MCL o ALL. En casos, el inhibidor de cinasa inhibe una diana (por ejemplo, BTK) en las células cancerosas, por ejemplo, reduce su actividad en al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99%. En casos, el inhibidor de cinasa inhibe una diana (por ejemplo, ITK) en las células efectoras inmunitarias, por ejemplo, reduce su actividad en al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80 %, 90%, 95% o 99%.
En algunos aspectos, la presente descripción también proporciona una mezcla de reacción que comprende un inhibidor de cinasa (por ejemplo, un inhibidor de BTK) y una molécula CAR o un ácido nucleico que codifica una molécula CAR. En algunos casos, la mezcla de reacción comprende además una población de células efectoras inmunitarias.
En algunos casos, una o más de las células efectoras inmunitarias expresa la molécula CAR o comprende el ácido nucleico que codifica la molécula CAR. En algunos casos, el inhibidor de cinasa se escoge de un inhibidor de BTK, un inhibidor de CDK4, un inhibidor de mTOR, o un inhibidor de MNK. En algunos casos, el inhibidor de BTK se escoge de: ibrutinib, GDC-0834, RN-486, CGI-560, CGI-1764, HM-71224, CC-292, ONO-4059, CNX-774 o LFM-A13. En casos, la mezcla de reacción comprende células cancerosas, por ejemplo, células cancerosas hematológicas. Las células cancerosas pueden ser, por ejemplo, células que se recogeron del sujeto cuando se recogeron las células efectoras inmunitarias del sujeto.
En ciertos aspectos, la presente descripción también proporciona una mezcla de reacción que comprende una población de células efectoras inmunitarias y una molécula CAR o un ácido nucleico que codifica una molécula CAR, en la que las células efectoras inmunitarias comprenden ITK inactivado covalentemente. En casos, al menos el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de ITK se inactiva covalentemente. En algunos casos, la mezcla de reacción comprende además células cancerosas. En casos, las células cancerosas comprenden BTK inactivada covalentemente. En casos, al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de BTK se inactiva covalentemente. En casos, BTK o ITK forman un enlace covalente en o cerca de su dominio de unión de ATP a una molécula pequeña tal como ibrutinib. En casos, la BTK forma un enlace covalente en o cerca de su cisteína-481 a una molécula pequeña como ibrutinib.
En casos, una mezcla de reacción como se describe aquí comprende además un amortiguador u otro reactivo, por ejemplo, una disolución que contiene PBS. En casos, la mezcla de reacción comprende además un agente que activa y/o expande las células de la población, por ejemplo, un agente que estimula una señal asociada al complejo CD3/TCR y/o un ligando que estimula una molécula coestimuladora en la superficie del células. En casos, el agente es una perla conjugada con un anticuerpo anti-CD3, o un fragmento del mismo, y/o un anticuerpo anti-CD28, o un fragmento del mismo. En casos, la mezcla de reacción comprende además uno o más factores para la proliferación y/o viabilidad, incluyendo suero (por ejemplo, suero fetal bovino o humano), interleucina-2 (IL-2), insulina, IFN-y, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFp y TNF-a o cualquier otro aditivo para el crecimiento de células. En casos, la mezcla de reacción comprende además IL-15 y/o IL-7. En casos, una pluralidad de las células de la población en la mezcla de reacción comprenden una molécula de ácido nucleico, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico descrita aquí, que comprende una secuencia que codifica CAR, por ejemplo, una secuencia que codifica CAR CD19, por ejemplo, como se describe aquí. En casos, una pluralidad de las células de la población en la mezcla de reacción comprenden un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR, por ejemplo, un CAR descrito aquí, por ejemplo, un CAR c D l9 descrito aquí. En casos, el vector es un vector descrito aquí, por ejemplo, un vector seleccionado del grupo que consiste en un a Dn , un ARN, un plásmido, un vector lentivirus, un vector adenoviral, o un vector retrovírico. En casos, la mezcla de reacción comprende además un crioprotector o estabilizador tal como, por ejemplo, un sacárido, un oligosacárido, un polisacárido y un poliol (por ejemplo, trehalosa, manitol, sorbitol, lactosa, sacarosa, glucosa y dextrano), sales y éteres corona. En un caso, el crioprotector es dextrano.
En algunos casos, el método de obtención descrito aquí comprende además poner en contacto la población de células efectoras inmunitarias con un ácido nucleico que codifica una subunidad de telomerasa, por ejemplo, hTERT. El ácido nucleico que codifica la subunidad de telomerasa puede ser ADN.
En algunos casos, el método de obtención descrito aquí comprende además cultivar la población de células efectoras inmunitarias en suero que comprende suero hAB al 2%.
Los títulos, subtítulos o elementos numerados o con letras, por ejemplo, (a), (b), (i), etc., se presentan simplemente para facilitar la lectura. El uso de títulos o elementos numerados o con letras en este documento no requiere que las etapas o elementos se realicen en orden alfabético o que las etapas o elementos sean necesariamente discretos uno de otro.
Otras características, objetos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción y dibujos, y a partir de las reivindicaciones.
Ciertos casos de la presente divulgación proporcionan realizaciones de la presente invención. Más particularmente, la presente invención proporciona lo siguiente:
1. Una composición que comprende una célula que expresa una molécula CAR que se une a CD19 (una “célula que expresa CAR19”) y uno o más inhibidores de cinasa, en la que dicho uno o más inhibidores de cinasa incluye un inhibidor de tirosina cinasa de Bruton (BTK), opcionalmente en la que la célula que expresa CAR19 y uno o más inhibidores de cinasa están presentes en una forma de dosis única, o como dos o más formas de dosis.
2. La composición de 1, para uso como medicamento.
3. Una composición que comprende una célula (por ejemplo, una población de células) que expresa una molécula CAR que se une a CD19 (una “célula que expresa CAR19”) para uso, en combinación con uno o más inhibidores de cinasas, en el tratamiento de un cáncer hematológico en un mamífero, en la que dicho uno o más inhibidores de cinasa incluye un inhibidor de tirosina cinasa de Bruton (BTK).
4. Célula efectora inmunitaria que expresa una molécula CAR que se une a CD19, para uso en el tratamiento del cáncer en combinación con un inhibidor de la tirosina cinasa de Bruton.
5. Un método para obtener una célula que expresa CAR (por ejemplo, una célula efectora inmunitaria que expresa CAR) o una población de células, que comprende:
(a) poner en contacto la célula o población de células con un inhibidor de BTK; y
(b) introducir (por ejemplo, transducir) un ácido nucleico que codifica una molécula CAR en la célula o población de células en condiciones tales que se exprese la molécula CAR,
en el que la molécula CAR es una molécula CAR que se une a CD19.
6. Una mezcla de reacción que comprende una población de células efectoras inmunitarias, un inhibidor de BTK y una molécula CAR o un ácido nucleico que codifica una molécula CAR, en la que la molécula CAR se une a c D 19.
7. Una mezcla de reacción que comprende una población de células efectoras inmunitarias y una molécula CAR o un ácido nucleico que codifica una molécula CAR, en la que las células efectoras inmunitarias comprenden ITK inactivada covalentemente; adicionalmente, en la que la molécula CAR se une a CD19.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
FIG. 1A, 1B y 1C son representaciones gráficas de la citotoxicidad ensayada en células T ND317 (donante normal) transducidas con CAR anti-CD19 de ratón o CARs anti-CD19 humanizados de la invención y cultivadas con células K562 de control que no expresan CD19 (K562cc) como se muestra en la FIG. 1A, células K562 transformadas con CD19 (K562.CD19) como se muestra en la FIG. 1B, o células B malignas aisladas de un paciente con CLL (aislado de células Pt 14 B) como se muestra en la FIG. 1C.
FIG. 2A y 2B son gráficos que muestran la respuesta proliferativa de células que expresan CAR anti-CD19 humanizado y de ratón a células CD19+, en las que un mayor número de células T CAR+ viables se correlaciona con poblaciones que muestran una proliferación máxima de células T CD4+ y CD8+ a células de CLL primarias.
FIG. 3 es una representación gráfica de los espectros de masas de HPLC deconvolucionados para scFv de la invención, en la que la fila superior representa scFv sin tratar y la fila inferior representa el scFv desglicosilado relacionado.
FIG. 4 es una representación gráfica de la estabilidad de la conformación, medida por Fluorimetría de Barrido Diferencial. La Tm de scFv de ratón fue 57°C (línea gruesa). Todas las variantes de scFv humanizado muestran una Tm más alta a alrededor de 70°C en comparación con el scFv de ratón parental. Los restos introducidos por humanización han mejorado la Tm en más de 10°C.
FIG. 5 es una representación gráfica de la proliferación de células T transducidas con CAR CD19, en la que las células CART19 se dirigen contra (a) una línea celular de leucemia mielógena crónica (“CML”) que es negativa para la expresión de CD19, y por lo tanto se usa como control; (b) células K562 recombinantes positivas para la expresión de CD19, y por lo tanto se usan como control positivo; o (c) células B Pt14 aisladas de un paciente con CLL y que expresan CD19 en la superficie celular.
FIG. 6A y 6B son esquemas de CARs representativos.
FIG. 7 representa la progresión de la enfermedad de ALL primaria HALLX5447 en ratones NSG después del tratamiento con células T CAR transducidas con CD19. El crecimiento de células de ALL humanas primarias en ratones NSG después del tratamiento con células T CAR específicas para CD19 demostró el control de la progresión de la enfermedad. El porcentaje medio de células de ALL humanas CD19+ fue un indicador de la carga de enfermedad en la sangre periférica en ratones NSG hasta el día 65 después del implante del tumor. Círculos negros: ratones tratados con 100 ul de PBS a través de la vena de la cola; cuadrados rojos: ratones tratados con células T transducidas simuladas; triángulos azules: ratones tratados con células T transducidas con CAR CD19 murino; y triángulos morados invertidos: ratones tratados con células T transducidas con CAR CD19 humanizado. Significancia calculada por ANOVA; * denota P <0,01.
FIG. 8 representa la expresión de CD19 en células tumorales de un paciente. Células tumorales CD138+ CD45dim se tiñeron para CD19 (eje x) y CD38 (eje y). Alrededor de 1-2% de las células tumorales expresaron el antígeno CD19.
FIG. 9 son dos gráficos que muestran la proliferación celular y el tamaño celular de las células CART19 cuando se tratan con concentraciones crecientes de ibrutinib (10 nM, 100 nM y 1000 nM).
FIG. 10A y 10B muestra la proliferación de células CART19 estimuladas con líneas celulares MCL, en presencia o ausencia de ibrutinib. FIG. 10A es una serie de histogramas que muestran la proliferación de células CART19 estimuladas con líneas de células tumorales MOLM14, JEKO-1 y RL, en presencia o ausencia de concentraciones crecientes de ibrutinib (10 nM, 100 nM y 1000 nM). Las células se tiñeron con CFSE y se analizaron mediante citometría de flujo para determinar el porcentaje de células en proliferación, designado por la barra en cada histograma. FIG. 10B es una cuantificación de histogramas representativos en la FIG. 10A.
FIG. 11A y 11B muestran la desgranulación de CD107a de células CART19 estimuladas con líneas celulares MCL en presencia o ausencia de ibrutinib. FIG. 11A es una serie de perfiles de citometría de flujo que muestran la desgranulación de CD107a de células CART19 estimuladas con líneas de células tumorales (MOLM14, JEKO-1 y RL) en presencia o ausencia de concentraciones crecientes de ibrutinib (10 nM, 100 nM y 1000 nM). La expresión de CD107a se mide en el eje y. FIG. 11B es la cuantificación de los resultados de la FIG. 11A.
FIG. 12 es una serie de perfiles de citometría de flujo que muestran la producción intracitoplasmática de IL-2 por células CART19 estimuladas con líneas de células tumorales (MOLM14, JEKO-1 y RL) en presencia o ausencia de concentraciones crecientes de ibrutinib (10 nM, 100 nM, y 1000 nM). El eje y representa la expresión de IL-2.
FIG. 13 es una serie de perfiles de citometría de flujo que muestran la producción de TNF-a intracitoplasmático por células CART19 estimuladas con líneas de células tumorales (MOLM14, JEKO-1 y RL) en presencia o ausencia de concentraciones crecientes de ibrutinib (10 nM, 100 nM, y 1000 nM). El eje y representa la expresión de TNF-a.
FIG. 14 es una serie de perfiles de citometría de flujo que muestran la producción intracitoplasmática de IFN-g por células CART19 estimuladas con líneas de células tumorales (MOLM14, JEKO-1 y RL) en presencia o ausencia de concentraciones crecientes de ibrutinib (10 nM, 100 nM, y 1000 nM). El eje y representa la expresión de IFN-g.
FIG. 15 es una serie de gráficos que muestran la secreción de citocinas de células CART19 estimuladas con líneas de células tumorales (MOLM14, JEKO-1 y RL) en presencia o ausencia de concentraciones crecientes de ibrutinib (10 nM, 100 nM y 1000 nM).
FIG. 16A, 16B, 16C, 16D, 16E y 16F son gráficos que muestran la destrucción de células tumorales MOLM14 (FIG. 16A y 16D), JEKO (FIG. 16B y 16E) y RL (FIG. 16C y 16F) mediante CART19, solo o en presencia de concentraciones crecientes de ibrutinib. Se incubaron células no transducidas (UTD) o CART19 con células tumorales en proporciones variables, y se evaluó el flujo total de células (FIG. 16A, 16B y 16C) y el porcentaje de células muertas (16D, 16E y 16F).
FIG. 17A, 17B y 17C son representaciones gráficas de la destrucción de células tumorales por CART19 después de 24 horas, según se mide por citometría de flujo para contar el número total de células. Las líneas de células tumorales MOLM14 (FIG. 17A), JEk O (FIG. 17B) y RL (FIG. 17C) se incubaron con células no transducidas (UTD) o CART19, solas (SOLAS), o en combinación con concentraciones variables de ibrutinib.
FIG. 18A, 18B, 18C y 18D son representaciones gráficas del hallazgo de dosis de CART19 en el modelo de ratón RL MCL. La carga tumoral se monitorizó mediante formación de imágenes por bioluminiscencia (BLI) a lo largo del tiempo (FIG. 18A y 18B). La supervivencia global se monitorizó a lo largo del tiempo (FIG. 18C).
FIG. 19A y 19B son representaciones gráficas del hallazgo de dosis de CART19 en el modelo de ratón JEKO-1 MCL. El tamaño del tumor se monitoriza mediante formación de imágenes por bioluminiscencia (BLI) a lo largo del tiempo (FIG. 19A), y también se monitoriza la supervivencia global a lo largo del tiempo (FIG. 19B).
FIG. 20 es un esquema que muestra el protocolo para administrar y evaluar la terapia de combinación de CART19 e ibrutinib en modelos de ratón in vivo.
FIG. 21A, 21B, 21C y 21D es una representación gráfica que muestra la eficacia de transducción de PBMCs para generar células T CART19 cuando las células se tratan con ibrutinib antes de la transducción. Las PBMCs no tratadas se analizaron para determinar la expresión de CAR19 antes de la transducción (FIG. 21A) y después de la transducción (FIG. 21C). Las PBMCs tratadas con ibrutinib se analizaron para determinar la expresión de CAR19 antes de la transducción (FIG. 21B) y después de la transducción (FIG. 21D).
FIG. 22A, 22B, 22C, 22D y 22E es una representación gráfica del efecto del tratamiento con ibrutinib sobre la proliferación de células T estimuladas por CD3/CD28. Se evaluaron concentraciones crecientes de ibrutinib: sin tratar (FIG. 22A); ibrutinib 0,1 pM (FIG. 22B); ibrutinib 0,5 pM (FIG. 22C), ibrutinib 1 pM (FIG. 22D), e ibrutinib 5 pM (FIG. 22E).
FIG. 23 es una representación gráfica que demuestra que ibrutinib no afecta la citotoxicidad de CART19.
FIG. 24 es una serie de representaciones gráficas que demuestran que el tratamiento con ibrutinib no promueve el sesgo de citocinas Th1/Th2 en células CART19.
FIG. 25A y 25B son representaciones gráficas que muestran que la administración continua de ibrutinib no afecta la función de CART19 en la eliminación de las células tumorales in vivo. FIG. 25A muestra las células Nalm/6 detectadas en sangre periférica durante cada régimen de tratamiento. FIG. 25B muestra una curva de supervivencia de Kaplan-Meier que compara la supervivencia de ratones que recibieron CART19 con o sin dosificación de ibrutinib.
FIG. 26A, 26B, 26C, 26D, 26E y 26F son representaciones gráficas que muestran la eficacia de la transducción de CAR19 en células de pacientes con CLL en los puntos de tiempo indicados durante el tratamiento con ibrutinib. Las células no se transdujeron (FIG. 26A, 26B y 26C) o se transdujeron con CAR19 (FIG. 26D, 26E y 26F). Las células teñidas con GAM expresan CAR19 y están presentes en los recuadros en cada perfil.
FIG. 27 es una serie de representaciones gráficas que representan la tasa de proliferación de células no transducidas en comparación con células que se transdujeron con CAR19 en los puntos de tiempo indicados durante el tratamiento con ibrutinib de un panel de pacientes.
FIG. 28A, 28B y 28C son representaciones gráficas que demuestran que el tratamiento con ibrutinib en pacientes con CLL induce linfocitosis. Las células del paciente se aislaron en los puntos de tiempo indicados: línea de base (FIG. 28A); ciclo 2, día 1 (FIG. 28B); y ciclo 12, día 1 (FIG. 28C).
FIG. 29A, 29B y 29C son representaciones gráficas que demuestran que el tratamiento con ibrutinib en tres pacientes con CLL reduce la expresión de CD200 en las células tumorales con el tiempo en la CLL. Cada perfil contiene una superposición de histogramas de expresión de CD200 de células aisladas en los puntos de tiempo indicados: línea de base (pantalla); ciclo 2, día 1; y ciclo 12, día 1.
FIG. 30A, 30B y 30C son representaciones gráficas que demuestran que el tratamiento con ibrutinib en pacientes con CLL disminuye la frecuencia de células T PD1+ con el tiempo. Las células del paciente se aislaron en los puntos de tiempo indicados: línea de base (FIG. 30A); ciclo 2, día 1 (FIG. 30B); y ciclo 12, día 1 (FIG. 30C).
FIG. 31A y 31B es una representación gráfica que demuestra la sensibilidad de las líneas celulares de MCL RL (FIG. 31A) y JEKO-1 (FIG. 31B) al tratamiento con ibrutinib.
FIG. 32 es una representación gráfica que demuestra el efecto del tratamiento con ibrutinib en un modelo in vivo de MCL.
FIG. 33A y B son imágenes de análisis inmunohistoquímico de un linfoma de Hogdkin que muestran células que expresan CD19 presentes en el tumor. FIG. 33A tiene un aumento de 1X, y la FIG. 33B tiene un aumento de 20X.
FIG. 34 es un diagrama esquemático de la configuración experimental para un estudio para evaluar la eficacia terapéutica del tratamiento con CART19 en pacientes con linfoma de Hodgkin.
FIG. 35A, 35B, 35C y 35D muestran análisis de citometría de flujo de la expresión de PD1 y CAR19 en células T. FIG. 35A y 35B son perfiles de citometría de flujo representativos que demuestran la distribución de la expresión de PD-1 y CAR19 en células T CD4+ de sujetos que son respondedores completos (CR) o no respondedores (NR) a la terapia de CART. FIG. 35C es un gráfico que muestra el porcentaje de células PD1 en la población de células T CD4+ de grupos de sujetos con diferentes respuestas a la terapia de CARt . FIG. 35D es un gráfico que muestra el porcentaje de células PD1 en la población de células T CD8+ de grupos de sujetos con diferentes respuestas a la terapia de CART.
FIG. 36A y 36B muestran la distribución de la expresión de PD1 en células que expresan CD4 y CAR19 (FIG. 36A) o células que expresan CD8 y CAR19 (FIG. 36B) de grupos de sujetos con diferentes respuestas a la terapia de CART.
FIG. 37 muestra el análisis de citometría de flujo de la expresión de PD1, CAR 19, LAG3 y TIM3 en células T de sujetos que son respondedores completos (CR) o no respondedores (NR) a la terapia de CART.
FIG. 38A y 38B muestran la distribución de la expresión de PD1 y LAG3 (FIG. 38A) o la expresión de PD1 y TIM3 (FIG. 38B) de grupos de sujetos con diferentes respuestas a la terapia de CART.
FIG. 39 muestra el inmunofenotipado de IgA de células plasmáticas de un paciente con mieloma que recibió CART19, que demuestra la respuesta a la terapia de CART19.
FIG. 40A y 40B son gráficos que muestran un aumento en los títulos de las cepas de la vacuna contra la gripe en comparación con el placebo. En la FIG. 40A se muestra, para cada una de las cohortes de dosificación de RAD001 en la población de intención a tratar, el aumento por encima de la línea de base en los títulos medios geométricos de la gripe para cada una de las 3 cepas de la vacuna contra la gripe (H1N1 A/California/ 07/2009, H3N2 A/Victoria/210/2009, B/Brisbane/60/ 2008) con respecto al aumento en la cohorte de placebo 4 semanas después de la vacunación. La línea negra en negrita indica el aumento de 1,2 veces en los títulos con respecto al placebo que se debe cumplir para 2 de cada 3 cepas de la vacuna contra la gripe para cumplir con el criterio de valoración principal del estudio. La estrella “*” indica que el aumento en el título de GMT con respecto al placebo supera 1 con una probabilidad posterior de al menos el 80%. La FIG. 40B es un gráfico de los mismos datos que en la FIG. 40A para el subconjunto de sujetos con títulos de gripe basales <= 1:40.
FIG. 41 muestra un gráfico de dispersión de la concentración de RAD001 frente al aumento de veces en el título medio geométrico para cada cepa de la vacuna contra la gripe 4 semanas después de la vacunación. Las concentraciones de RAD001 (1 hora después de la dosis) se midieron después de que los sujetos habían recibido la dosis durante 4 semanas. Todos los sujetos que tenían medidas farmacocinéticas se incluyeron en el conjunto de análisis. El aumento de veces en los títulos medios geométricos a las 4 semanas después de la vacunación con respecto a la línea de base se muestra en el eje y.
FIG. 42 es una representación gráfica que muestra el aumento en los títulos de las cepas de gripe heterólogas en comparación con el placebo. El aumento por encima de la línea de base en los títulos de la media geométrica de la gripe para 2 cepas de gripe heterólogas (A/H1N1 cepa A/New Jersey/8/76 y A/H3N2 cepa A/Victoria/361/11) no contenidas en la vacuna contra la gripe, con respecto al aumento en la cohorte de placebo 4 semanas después de la vacunación, se muestra para cada una de las cohortes de dosificación de RAD001 en la población de intención a tratar. * indica que el aumento del título con respecto al placebo supera 1 con una probabilidad posterior de al menos el 80%.
FIG. 43A y 43B son representaciones gráficas de los niveles de IgG e IgM antes y después de la vacunación contra la gripe. Los niveles de IgG e IgM anti-gripe A/H1N1/California/07/2009 se midieron en el suero obtenido de los sujetos antes y 4 semanas después de la vacunación contra la gripe. No se detectaron diferencias significativas en el cambio desde el inicio hasta las 4 semanas posteriores a la vacunación en los niveles de IgG e IgM anti-gripe H1N1 entre las cohortes de RAD001 y placebo (todos los valores de p > 0,05 según la prueba de la suma de rangos de Kruskal-Wallis).
FIG. 44A, 44B y 44C son representaciones gráficas de la disminución en el porcentaje de CD4 y CD8 positivos para PD-1 y el aumento de células T CD4 negativas para PD-1 después del tratamiento con RAD001. El porcentaje de células T CD4, CD8 positivas para PD-1 y células T CD4 negativoas para PD-1 se determinó mediante el análisis FACS de muestras de PBMC al inicio del estudio, después de 6 semanas de tratamiento con el fármaco del estudio (Semana 6), y 6 semanas después de la interrupción del fármaco del estudio y 4 semanas después de la vacunación contra la gripe (Semana 12). FIG. 44A muestra que hubo una disminución significativa (-37,1 - -28,5%) en las células T CD4 positivas para PD-1 en la semana 12 en las cohortes que recibieron RAD001 a niveles de dosis de 0,5 mg/día (n=25), 5 mg/semana (n=29) y 20 mg/semana (n=30) en comparación con la cohorte de placebo (n=25), con p = 0,002 (0,02), p = 0,003 (q = 0,03), y p = 0,01 (q = 0,05) respectivamente . FIG. 44B muestra que hubo una disminución significativa (-43,3 - -38,5%) en las células T CD8 positivas para PD-1 en la semana 12 en las cohortes que recibieron RAD001 (n=109) a niveles de dosis de 0,5 mg/día (n=25), 5 mg/semana (n=29) y 20 mg/semana (n=30), en comparación con la cohorte de placebo (n=25), con p = 0,01 (0,05), p = 0,007 (q = 0,04), y p = 0,01 (q = 0,05) respectivamente. FIG.
44C muestra un aumento significativo (3,0 - 4,9%) en las células T CD4 negativas para PD-1 en la semana 12 en las cohortes que recibieron RAD001 (n=109) a niveles de dosis de 0,5 mg/día (n=25), 5 mg/semana (n=29) y 20 mg/semana (n=30), en comparación con la cohorte de placebo (n=25), con p = 0,0007 (0,02), p = 0,03 (q = 0,07), y p = 0,03 (q = 0,08) respectivamente.
FIG. 45A y 45B son representaciones gráficas de la disminución en el porcentaje de CD4 y CD8 positivas para PD-1 y el aumento de las células T CD4 negativas para PD-1 después del tratamiento con RAD001 ajustado para diferencias en la expresión de PD-1 inicial. El porcentaje de células T CD4, CD8 positivas para PD-1 y células T CD4 negativas para PD-1 se determinó mediante el análisis FACS de muestras de PBMC al inicio del estudio, después de 6 semanas de tratamiento con el fármaco del estudio (Semana 6), y 6 semanas después de la interrupción del fármaco del estudio y 4 semanas después de la vacunación contra la gripe (Semana 12). FIG. 45A muestra una disminución significativa del 30,2% en células T CD4 PD-1+ en la semana 6 en la cohorte de RAD agrupada (n = 84) en comparación con la cohorte de placebo (n=25) con p = 0,03 (q = 0,13). La disminución de las células T CD4 positivas para PD-1 en la semana 12 en la cohorte de RAD agrupada en comparación con la cohorte de placebo es 32,7%, con p = 0,05 (q = 0,19). FIG. 45B muestra una disminución significativa del 37,4% en las células T CD8 positivas para PD-1 en la semana 6 en la cohorte de RAD001 agrupada (n=84), en comparación con la cohorte de placebo (n=25), con p = 0,008 (q = 0,07). La disminución de las células T CD8 positivas para PD-1 en la semana 12 en la cohorte de RAD001 agrupada en comparación con la cohorte de placebo es 41,4%, con p = 0,066 (q = 0,21). FIG. 45A y 45B representan los datos en FIG. 44A, 44B y 44C, pero con los diferentes grupos de dosificación de RAD001 de la FIG. 44A, 44B y 44C agrupados en el único grupo tratado con RAD001 en la FIG. 45A y 45B.
FIG. 46 muestra aumentos en el ejercicio y la energía en sujetos de edad avanzada en respuesta a RAD001.
FIG. 47A y 47B representan el efecto previsto de RAD001 sobre la actividad de P70 S6K en células. FIG.
47A representa la inhibición de la cinasa P70 S6 con dosis más altas de RAD001 semanal y diaria; FIG. 47B representa la inhibición de la cinasa P70 S6 con dosis más bajas de RAD001 semanal.
FIG. 48A y 48B muestran la expresión del receptor de IL-7 (CD127) en líneas de células cancerosas y células CART. La expresión de CD127 se midió mediante análisis de citometría de flujo en tres líneas de células cancerosas: RL (linfoma de células del manto), JEKO (también conocida como Jeko-1, linfoma de células del manto) y Nalm-6 (B-ALL) (Fig. 48A). La expresión de CD127 se midió mediante análisis de citometría de flujo en células CD3 positivas (CART) que se habían infundido y circulaban en ratones NSG (Fig. 48B).
FIG. 49A, 49B y 49C muestran la respuesta antitumoral después del tratamiento con CART19 y el posterior tratamiento con IL-7. Los ratones NSG injertados con una línea celular de linfoma de manto que expresa luciferasa (RL-luc) el día 0 se trataron con dosis variables de células CART19 el día 6 y se monitorizó la carga tumoral. Los ratones se dividieron en 4 grupos y recibieron ninguna célula CART19, 0,5x106 células CART19 (CART19 0.5E6), 1x106 células CART19 (CART19 1E6), o 2x106 Células CART19 (CART192E6). La carga tumoral después del tratamiento con CART se midió mediante la detección de bioluminiscencia (BLI medio) (Fig. 49A). Ratones que reciben 0.5x106 células CART19 (CART190.5E6) o 1x106 células CART19 (CART19 1E6) se aleatorizaron para recibir IL-7 humana recombinante (rhIL-7) o no. La carga tumoral, representada aquí por bioluminiscencia media (BLI), se monitorizó para los tres ratones (n.° 3827, n.° 3829 y n.° 3815, que recibieron la dosis inicial indicada de CART19) de la Figura 49A que se trataron con IL-7 a partir del día 85 (Figura 49B). La IL-7 se administró mediante inyección IP 3 veces a la semana. La carga tumoral, representada aquí por bioluminiscencia media (BLI) antes del día 85 (PRE) y después del día 115 (POST), se comparó entre ratones que no recibieron IL-7 (CTRL) y ratones que recibieron tratamiento con IL-7 (IL-7) (Fig. 49C).
FIG. 50A y 50B muestran la dinámica de las células T después del tratamiento con IL-7. El nivel de células T humanas detectadas en la sangre se monitorizó para cada uno de los ratones que recibieron IL-7 o ratones de control (Fig. 50A). El nivel de células CART19 (células CD3+) detectadas en la sangre se midió antes (PRE) y 14 días después (Día 14) del inicio del tratamiento con IL-7 (Fig. 50B).
FIG. 51 representa las estructuras de dos configuraciones RCAR ejemplares. Los miembros de unión al antígeno comprenden un dominio de unión al antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de tipo interruptor. Los miembros de unión intracelulares comprenden un dominio de tipo interruptor, un dominio de señalización coestimulador y un dominio de señalización primaria. Las dos configuraciones demuestran que el primer y el segundo dominios de tipo interruptor descritos en la presente pueden estar en diferentes orientaciones con respecto al miembro de unión al antígeno y el miembro de unión intracelular. En la presente se describen en más detalle otras configuraciones RCAR.
FIG. 52A es una imagen de una línea celular RL.
FIG. 52B es un conjunto de diagramas de dispersión de citometría de flujo que muestran la expresión de CD19 y CD5 en líneas celulares RL primarias y RL.
FIG. 52C es una imagen que muestra la translocación t(11; 14) por hibridación in situ por fluorescencia (FISH).
FIG. 52D es un gráfico que muestra la CI50 (por porcentaje de conversión de MTT) de la inhibición de ibrutinib en diferentes líneas celulares.
FIG. 52E es un conjunto de imágenes y gráficos que muestran el injerto de células RL en ratones NOD-SCID-gamma chain knockout (NSG) y la carga tumoral resultante.
FIG. 52F es un conjunto de imágenes histológicas que muestran la localización de células MCL en diversos órganos en ratones.
FIG. 52G es un conjunto de imágenes histológicas de ratones a los que se les han inyectado células MCL-RL.
FIG. 53A es un conjunto de gráficos que muestran el número de células CD107a+ CART19 cuando se exponen a diversas líneas celulares MCL.
FIG. 53B es un conjunto de gráficos que muestran la cantidad de IL-2 y TNF-alfa producida por las células CART19 cuando se exponen a diversas líneas celulares MCL.
FIG. 53C es un gráfico que muestra el porcentaje de muerte de diversas líneas de células MCL por células CART19 en diversas proporciones de células efectoras: diana.
FIG. 53D es un gráfico que muestra la cantidad de éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE), una medida de proliferación, en células CART19 expuestas a diversas líneas celulares MCL.
FIG. 53E es un conjunto de gráficos que muestran el porcentaje de células T antes y después de la expansión.
FIG. 53F es un conjunto de gráficos que muestran el porcentaje de células T no transducidas o transducidas con CAR-19 que expresan o producen diversas biomoléculas (por ejemplo, citocinas).
FIG. 54A es un conjunto de imágenes que muestran la activación de la cinasa de células T inducible por interleucina-2 (ITK) cuando las células CART19 se estimularon de forma específica o no específica.
FIG. 54B es un conjunto de gráficos que muestran la expresión de superficie de CD107a (una medida de desgranulación), la producción de IL-2 y la producción de TNF-alfa por células CART19 con diversas concentraciones con ibrutinib.
FIG. 54C es un conjunto de histogramas que muestran la cantidad de CFSE en las células CART19 con diversas concentraciones de ibrutinib y expuestas a diversas líneas celulares de MCL.
FIG. 54D es un conjunto de gráficos que muestran la expresión o producción de diversas citocinas y biomarcadores como indicadores del estado Th1 o Th2 de células CART19 cuando se combinan con diferentes concentraciones de ibrutinib.
FIG. 54E es un conjunto de gráficos que muestran el porcentaje de muerte por células CART19 de diversas líneas celulares de MCL cuando se combinan con diferentes concentraciones de ibrutinib.
FIG. 54F es un gráfico de barras que muestra la expresión de diversos marcadores de la función citotóxica intrínseca de las células CART19 cuando se combinan con diversas concentraciones de ibrutinib.
FIG. 55 es un esquema de una configuración experimental de modelo de ratón in vivo para probar el efecto de CART19 y/o ibrutinib en ratones inyectados con MCL-RL, con una lectura de luminiscencia (una medida del número de células tumorales).
FIG. 56 es un esquema de una configuración experimental de modelo de ratón in vivo para probar el efecto de CART19 y/o ibrutinib en ratones inyectados con MCL-RL, con una lectura de luminiscencia (una medida del número de células tumorales).
FIG. 57 es un conjunto de gráficos que muestran la luminiscencia (una medida de la medida del número de células tumorales) en ratones tratados con ibrutinib a diferentes concentraciones y su supervivencia general después del tratamiento.
FIG. 58 es un conjunto de gráficos que muestran la luminiscencia (una medida del número de células tumorales) en ratones tratados con ibrutinib o células CART19, así como su supervivencia general después del tratamiento.
FIG. 59 es un gráfico que muestra la luminiscencia (una medida del número de células tumorales) en ratones después del tratamiento con ibrutinib, células T no transducidas, ibrutinib con células T no transducidas, células CART19, y células CART19 con ibrutinib.
FIG. 60 es un gráfico que muestra la luminiscencia (una medida del número de células tumorales) en ratones después del tratamiento con ibrutinib solo, células CART19 solas, o la combinación de ibrutinib con células CART19.
FIG. 61A es un conjunto de gráficos que muestran el nivel de citocinas Th1 producidas en ratones tratados con ibrutinib y/o células CART19. FIG. 61B es un conjunto de gráficos que muestran el nivel de citocinas Th2 producidas en ratones tratados con ibrutinib y/o células CART19.
FIG. 61C es un gráfico que muestra el porcentaje de células que expresan el marcador de proliferación Ki67 en ratones tratados con células CART19 o células CART19 más ibrutinib.
FIG. 61D es un gráfico que muestra el porcentaje de células que expresan el marcador antiapoptótico BCL-2 en ratones tratados con células CART19 o células CART19 más ibrutinib.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Definiciones
A menos que se defina lo contrario, todas las expresiones y términos técnicos y científicos utilizados en esta memoria tienen el mismo significado que el entendido un experto ordinario en la técnica a la que pertenece esta invención.
El término «un» y «uno/a» se refiere a uno o más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, «un elemento» significa un elemento o más de un elemento.
El término «aproximadamente», cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad, una duración temporal y similares, se pretende que abarque variaciones de ±20% o en algunos casos ±10%, o en algunos casos ±5%, o en algunos casos ±1%, o en algunos casos ±0,1% del valor especificado, ya que tales variaciones son apropiadas para realizar los métodos divulgados.
La expresión “receptor de antígeno quimérico” o alternativamente un “CAR” se refiere a un conjunto de polipéptidos, típicamente dos en las realizaciones más simples, que cuando están en una célula efectora inmunitaria, proporcionan a la célula especificidad para una célula diana, típicamente una célula cancerosa y con generación de señales intracelulares. En algunas realizaciones, un CAR comprende al menos un dominio de unión a antígeno extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización citoplasmático (también denominado aquí como “un dominio de señalización intracelular”) que comprende un dominio de señalización funcional derivado de una molécula estimuladora y/o coestimuladora molécula como se define a continuación. En algunos aspectos, el conjunto de polipéptidos son contiguos entre sí, por ejemplo, están en la misma cadena polipeptídica (por ejemplo, comprenden una proteína de fusión quimérica). En algunas realizaciones, el conjunto de polipéptidos no son contiguos entre sí, por ejemplo, están en diferentes cadenas polipeptídicas. En algunas realizaciones, el conjunto de polipéptidos incluye un conmutador de dimerización que, tras la presencia de una molécula de dimerización, puede acoplar los polipéptidos entre sí, por ejemplo, puede acoplar un dominio de unión a antígeno a un dominio de señalización intracelular. En un aspecto, la molécula estimulante es la cadena zeta asociada con el complejo receptor de células T. En un aspecto, el dominio de señalización citoplasmático comprende además uno o más dominios de señalización funcionales derivados de al menos una molécula coestimuladora tal como se define más adelante. En un aspecto, la molécula coestimuladora se escoge de las moléculas coestimuladoras descritas aquí, por ejemplo, 4-1BB (es decir, CD137), CD27 y/o CD28. En un aspecto, el CAR comprende una proteína de fusión quimérica que comprende un dominio de unión a antígeno extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización funcional derivado de una molécula estimuladora. En un aspecto, el CAR comprende una proteína de fusión quimérica que comprende un dominio de unión a antígeno extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización funcional derivado de una molécula coestimuladora y un dominio de señalización funcional derivado de una molécula estimuladora. En un aspecto, el CAR comprende una proteína de fusión quimérica que comprende un dominio de unión a antígeno extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que comprende dos dominios de señalización funcionales derivados de una o más moléculas coestimuladoras y un dominio de señalización funcional derivado de una molécula estimuladora. En un aspecto, el CAR comprende una proteína de fusión quimérica que comprende un dominio de unión a antígeno extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que comprende al menos dos dominios de señalización funcionales derivados de una o más moléculas coestimuladoras y un dominio de señalización funcional derivado de una molécula estimuladora. En un aspecto, el CAR comprende una secuencia líder opcional en el extremo amino (N-ter) de la proteína de fusión CAR. En un aspecto, el CAR comprende además una secuencia líder en el extremo N del dominio de unión al antígeno extracelular, en el que la secuencia líder se escinde opcionalmente del dominio de unión al antígeno (por ejemplo, un scFv) durante el procesamiento celular y la localización del CAR a la membrana celular.
La expresión "dominio de señalización" se refiere a la porción funcional de una proteína que actúa transmitiendo información dentro de la célula para regular la actividad celular a través de vías de señalización definidas generando segundos mensajeros o funcionando como efectores que responden a mensajeros de este tipo.
Como se usa aquí, el término “CD19” se refiere a la proteína del Grupo de Diferenciación 19, que es un determinante antigénico detectable en células precursoras de leucemia. Las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos humanos y murinos se pueden encontrar en una base de datos pública, como GenBank, UniProt y Swiss-Prot. por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de CD19 humana se puede encontrar con el N.° de acceso P15391 en el UniProt/Swiss-Prot y la secuencia de nucleótidos que codifica la CD19 humana se puede encontrar con el N.° de acceso NM_001178098. Tal como se utiliza en la presente, «CD19» incluye proteínas que comprenden mutaciones, por ejemplo, mutaciones puntuales, fragmentos, inserciones, deleciones y variantes de corte y empalme de la CD19 de tipo natural completa. CD19 se expresa en la mayoría de los cánceres de linaje B, que incluyen, por ejemplo, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica y linfoma no Hodgkin. Otras células con expresión de CDl9 se proporcionan a continuación en la definición de “enfermedad asociada con la expresión de CD19”. También es un marcador temprano de progenitores de células B. Véase, por ejemplo, Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997). En un aspecto, la porción de unión a antígeno del c A r T reconoce y se une a un antígeno dentro del dominio extracelular de la proteína c D19. En un aspecto, la proteína CD19 se expresa en una célula cancerosa.
Como se usa aquí, el término “CD20” se refiere a un determinante antigénico que se sabe que es detectable en las células B. El CD20 humano también se denomina 4 dominios que atraviesan la membrana, subfamilia A, miembro 1 (MS4A1). Las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos humanos y murinos se pueden encontrar en una base de datos pública, como GenBank, UniProt y Swiss-Prot. por ejemplo, la secuencia de aminoácidos del CD20 humano se puede encontrar en los números de acceso NP_690605.1 y NP_068769.2, y la secuencia de nucleótidos que codifica las variantes de transcripción 1 y 3 del CD20 humano se puede encontrar en el número de acceso NM_152866.2 y NM_021950.3, respectivamente. En un aspecto, la porción de unión al antígeno del CAR reconoce y se une a un antígeno dentro del dominio extracelular de la proteína CD20. En un aspecto, la proteína CD20 se expresa en una célula cancerosa.
Como se usa aquí, el término “CD22” se refiere a un determinante antigénico que se sabe que es detectable en células precursoras de leucemia. Las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos humanos y murinos se pueden encontrar en una base de datos pública, como GenBank, UniProt y Swiss-Prot. por ejemplo, las secuencias de aminoácidos de las isotermas 1-5 de CD22 humano se pueden encontrar en los números de acceso NP 001762.2, NP 001172028.1, NP 001172029.1, NP 001172030.1 y NP 001265346.1, respectivamente, y la secuencia de nucleótidos que codifica las variantes 1-5 de CD22 humano se puede encontrar en el número de acceso NM 001771.3, NM 001185099.1, NM 001185100.1, NM 001185101.1 y NM 001278417.1, respectivamente. En un aspecto, la porción de unión al antígeno del CAR reconoce y se une a un antígeno dentro del dominio extracelular de la proteína CD22. En un aspecto, la proteína CD22 se expresa en una célula cancerosa.
Como se usa aquí, el término “ROR1” se refiere a un determinante antigénico que se sabe que es detectable en células precursoras de leucemia. Las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos humanos y murinos se pueden encontrar en una base de datos pública, como GenBank, UniProt y Swiss-Prot. por ejemplo, las secuencias de aminoácidos de las isoformas 1 y 2 precursoras de ROR1 humano se pueden encontrar en los números de acceso NP_005003.2 y NP_001077061.1, respectivamente, y las secuencias de ARNm que las codifican se pueden encontrar en los números de acceso NM_005012.3 y NM_001083592.1, respectivamente. En un aspecto, la porción de unión al antígeno del CAR reconoce y se une a un antígeno dentro del dominio extracelular de la proteína ROR1. En un aspecto, la proteína ROR1 se expresa en una célula cancerosa.
El término «anticuerpo», tal como se utiliza en la presente, se refiere a una proteína o secuencia polipeptídica derivada de una molécula de inmunoglobulina que se une específicamente a un antígeno. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales, multi- o monocatenarios, o inmunoglobulinas intactas, y pueden derivarse de fuentes naturales o de fuentes recombinantes. Los anticuerpos pueden ser tetrámeros de moléculas de inmunoglobulina.
La expresión “fragmento de anticuerpo” se refiere a al menos una porción de un anticuerpo, que conserva la capacidad de interactuar específicamente con (por ejemplo, mediante unión, impedimento estérico, estabilización/desestabilización, distribución espacial) un epítopo de un antígeno. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab', F(ab')2, fragmentos Fv, fragmentos de anticuerpos scFv, Fvs unidos por disulfuro (sdFv), un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1, anticuerpos lineales, anticuerpos de dominio único como sdAb (ya sea VL o VH), dominios VHH de camélidos, anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos tales como un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra, y una CDR aislada u otros fragmentos de unión a epítopo de un anticuerpo. Un fragmento de unión al antígeno también se puede incorporar a anticuerpos de dominio único, maxicuerpos, minicuerpos, nanocuerpos, intracuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, v-NAR y bis-scFv (remítase, por ejemplo, a Hollinger y Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005). También se pueden injertar fragmentos de unión al antígeno en esqueletos basados en polipéptidos tales como una fibronectina de tipo III (Fn3) (remítase a la Pat. de EE. UU. N.° 6703 199, que describe minicuerpos del polipéptido fibronectina).
El término “scFv” se refiere a una proteína de fusión que comprende al menos un fragmento de anticuerpo que comprende una región variable de una cadena ligera y al menos un fragmento de anticuerpo que comprende una región variable de una cadena pesada, en el que las regiones variables de la cadena ligera y pesada están unidas contiguamente, por ejemplo, mediante un enlazador sintético, por ejemplo, un enlazador polipeptídico flexible corto y capaz de expresarse como un polipéptido de cadena sencilla, y en el que el scFv retiene la especificidad del anticuerpo intacto del que deriva. A menos que se especifique, como se usa aquí, un scFv puede tener las regiones variables VL y VH en cualquier orden, por ejemplo, con respecto a los extremos N-terminal y C-terminal del polipéptido, el scFv puede comprender VL-enlazador-VH o puede comprender VH-enlazador-VL.
La porción del CAR de la presente descripción que comprende un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo del mismo puede existir en una variedad de formas en las que el dominio de unión al antígeno se expresa como parte de una cadena polipeptídica contigua que incluye, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo de dominio único (sdAb), un anticuerpo monocatenario (scFv), un anticuerpo humanizado o un anticuerpo biespecífico (Harlow et al., 1999, en: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, En: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426). En un aspecto, el dominio de unión al antígeno de una composición de CAR de la invención comprende un fragmento de anticuerpo. En un aspecto adicional, el CAR comprende un fragmento de anticuerpo que comprende un scFv. Los límites exactos de la secuencia de aminoácidos de una CDR dada pueden determinarse usando cualquiera de varios esquemas bien conocidos, incluidos los descritos por Kabat et al. (1991), «Sequences of Proteins of Immunological Interest», 5.a Ed. Public Health Service, Institutos Nacionales de la Salud, Bethesda, MD (esquema de numeración de «Kabat»), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948 (esquema de numeración de «Chothia») o una combinación de estos.
Tal como se utiliza en la presente, la expresión «dominio de unión» o «molécula de anticuerpo» se refiere a una proteína, por ejemplo, una cadena de inmunoglobulina o fragmento de esta, que comprende al menos una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina. La expresión «dominio de unión» o «molécula de anticuerpo» abarca anticuerpos y fragmentos de anticuerpo. En una realización, una molécula de anticuerpo es una molécula de anticuerpo multiespecífico, por ejemplo, comprende una pluralidad de secuencias del dominio variable de inmunoglobulina, donde una primera secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la pluralidad tiene especificidad de unión por un primer epítopo y una segunda secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la pluralidad tiene especificidad de unión por un segundo epítopo. En una realización, una molécula de anticuerpo multiespecífico es una molécula de anticuerpo biespecífico. Un anticuerpo biespecífico tiene especificidad por dos antígenos como máximo. Una molécula de anticuerpo biespecífico está caracterizada por una primera secuencia del dominio variable de inmunoglobulina que tiene especificidad de unión por un primer epítopo y una segunda secuencia del dominio variable de inmunoglobulina que tiene especificidad de unión por un segundo epítopo.
La porción del CAR de la presente descripción que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo puede existir en una variedad de formas en las que el dominio de unión al antígeno se expresa como parte de una cadena polipeptídica contigua que incluye, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo de dominio único (sdAb), un anticuerpo monocatenario (scFv), un anticuerpo humanizado o un anticuerpo biespecífico (Harlow et al., 1999, en: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, En: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426). En un aspecto, el dominio de unión al antígeno de una composición de CAR de la invención comprende un fragmento de anticuerpo. En un aspecto adicional, el CAR comprende un fragmento de anticuerpo que comprende un scFv.
La expresión «cadena pesada de anticuerpo» se refiere al mayor de los dos tipos de cadenas polipeptídicas presentes en moléculas de anticuerpo en sus conformaciones de origen natural y que normalmente determina la clase a la que pertenece el anticuerpo.
La expresión «cadena ligera de anticuerpo» se refiere al menor de los dos tipos de cadenas polipeptídicas presentes en moléculas de anticuerpos en sus conformaciones de origen natural. Las cadenas ligeras kappa (k) y lambda (A) se refieren a los dos isotipos principales de la cadena ligera de anticuerpo.
La expresión «anticuerpo recombinante» se refiere a un anticuerpo que se genera utilizando tecnología de ADN recombinante, tal como, por ejemplo, un anticuerpo expresado por un bacteriófago o un sistema de expresión en levaduras. También se debe entender que la expresión se refiere a un anticuerpo que ha sido generado por la síntesis de una molécula de ADN que codifica el anticuerpo y donde la molécula de ADN expresa una proteína de anticuerpo, o una secuencia de aminoácidos que especifica el anticuerpo, en donde la secuencia de ADN o de aminoácidos se ha obtenido utilizando ADN recombinante o tecnología de secuencias de aminoácidos que está disponible y es muy conocida en la técnica.
El término «antígeno» o «Ag» se refiere a una molécula que provoca una respuesta inmunitaria. Esta respuesta inmunitaria puede conllevar la producción de anticuerpos o la activación de células inmunológicamente competentes específicas, o ambas. El experto en la técnica entenderá que cualquier macromolécula, incluidas virtualmente todas las proteínas o péptidos, puede servir como antígeno. Además, los antígenos pueden derivarse de ADN recombinante o genómico. Un experto entenderá que cualquier ADN, que comprende una secuencia de nucleótidos o una secuencia de nucleótidos parcial que codifica una proteína que provoca una respuesta inmunitaria, codifica, por lo tanto, un "antígeno" tal como se utiliza ese término en esta memoria. Además, un experto en la técnica entenderá que no es necesario que un antígeno esté codificado únicamente por una secuencia de nucleótidos completa de un gen. Es muy obvio que la presente divulgación incluye, sin carácter limitante, el uso de secuencias de nucleótidos parciales de más de un gen y que estas secuencias de nucleótidos están dispuestas en diversas combinaciones para codificar polipéptidos que provocan la respuesta inmunitaria deseada. Además, un experto en la técnica entenderá que no es necesario que un antígeno esté codificado por un "gen" en absoluto. Es muy obvio que un antígeno se puede generar sintetizado o puede derivarse de una muestra biológica, o podría ser una macromolécula además de un polipéptido. Una muestra biológica de este tipo puede incluir, pero no se limita a una muestra de tejido, una muestra de tumor, una célula o un fluido con otros componentes biológicos.
La expresión «efecto anticanceroso» se refiere a un efecto biológico que se puede poner de manifiesto por diversos medios, que incluyen, sin carácter limitante, por ejemplo, una disminución del volumen tumoral, una disminución del número de células cancerosas, una disminución del número de metástasis, un aumento de la esperanza de vida, una disminución de la proliferación de células cancerosas, una disminución de la supervivencia de células cancerosas o una mejora de diversos síntomas fisiológicos asociados con la afección cancerosa. Un «efecto anticanceroso» también se puede poner de manifiesto por la capacidad de los péptidos, polinucleótidos, células y anticuerpos descritos para prevenir la aparición del cáncer en primer lugar. La expresión «efecto antitumoral» se refiere a un efecto biológico que se puede poner de manifiesto por diversos medios, que incluyen, sin carácter limitante, por ejemplo, una disminución del volumen del tumor, una disminución del número de células tumorales, una disminución de la proliferación de células tumorales o una disminución de la supervivencia de células tumorales.
El término «autólogo» se refiere a cualquier material derivado del mismo individuo que luego se reintroducirá en el individuo.
El término «alogénico» se refiere a cualquier material derivado de un animal diferente que es de la misma especie que el individuo en el que se introduce el material. Se dice que dos o más individuos son alogénicos entre sí cuando los genes en uno o más loci no son idénticos. En algunos aspectos, el material alogénico de individuos de la misma especie puede ser suficientemente genéticamente diferente para interactuar antigénicamente.
El término «xenogénico» se refiere a un injerto derivado de un animal de una especie diferente.
El término “cáncer” se refiere a una enfermedad caracterizada por el crecimiento incontrolado de células aberrantes. Las células cancerosas pueden diseminarse localmente o a través del torrente sanguíneo y el sistema linfático a otras partes del cuerpo. En la presente se describen ejemplos de diversos cánceres e incluyen, sin carácter limitante, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de piel, cáncer de páncreas, cáncer colorrectal, cáncer renal, cáncer de hígado, cáncer de cerebro, linfoma, leucemia, cáncer de pulmón y similares. Los términos «tumor» y «cáncer» se utilizan indistintamente en la presente, por ejemplo, ambos términos abarcan tumores sólidos y neoplasias hemolinfáticas, por ejemplo, difusos o circulantes. Tal como se utiliza en la presente, el término «cáncer» o «tumor» incluye cánceres y tumores tanto premalignos como malignos.
La frase “enfermedad asociada con la expresión de CD19” incluye, pero no se limita a, una enfermedad asociada con la expresión de CD19 o afección asociada con células que expresan, o expresan en cualquier momento, CD19, incluyendo, por ejemplo, enfermedades proliferativas tales como un cáncer o neoplasia o una afección precancerosa tal como una mielodisplasia, un síndrome mielodisplásico o una preleucemia; o una indicación no relacionada con el cáncer asociada con células que expresan CD19. Para evitar dudas, una enfermedad asociada con la expresión de CD19 puede incluir una afección asociada con células que actualmente no expresan CD19, por ejemplo, debido a que la expresión de CD19 se ha regulado negativamente, por ejemplo, debido al tratamiento con una molécula dirigida a CD19, por ejemplo, CD19 CAR, pero que en un momento expresó CD19. En un aspecto, el cáncer asociado con la expresión de CD19 es un cáncer hematológico. En un aspecto, el cáncer hematólico es una leucemia o un linfoma. En un aspecto, un cáncer asociado con la expresión de CD19 incluye cánceres y neoplasias que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, una o más leucemias agudas que incluyen pero no se limitan a, por ejemplo, leucemia linfoide aguda de células B (BALL), leucemia linfoide aguda de células T (TALL), leucemia linfoide aguda (ALL); una o más leucemias crónicas que incluyen pero no se limitan a, por ejemplo, leucemia mielógena crónica (CML), leucemia linfoide crónica (CLL). Los cánceres o afecciones hematológicas adicionales asociadas con la expresión de CD19 comprenden, entre otros, leucemia prolinfocítica de células B, neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas, linfoma de Burkitt, linfoma difuso de células B grandes, linfoma folicular, leucemia de células pilosas, linfoma folicular de células pequeñas o de células grandes, afecciones linfoproliferativas malignas, linfoma MALT, linfoma de células del manto (MCL), linfoma de la zona marginal, mieloma múltiple, mielodisplasia y síndrome mielodisplásico, linfoma no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, linfoma plasmoblástico, neoplasia de células dendríticas plasmacitoides, macroglobulinemia de Waldenstrom, y “preleucemia”, que son una colección diversa de afecciones hematológicas unidas por la producción ineficaz (o displasia) de células sanguíneas mieloides, y similares. Otras enfermedades asociadas con la expresión de la expresión de CD19 incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, cánceres atípicos y/o no clásicos, neoplasias malignas, afecciones precancerosas o enfermedades proliferativas asociadas con la expresión de CD19. Las indicaciones no relacionadas con el cáncer asociadas con la expresión de CD19 incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, enfermedad autoinmune (por ejemplo, lupus), trastornos inflamatorios (alergia y asma) y trasplante. En algunas realizaciones, las células que expresan el antígeno tumoral expresan, o expresan en cualquier momento, el ARNm que codifica el antígeno tumoral. En una realización, las células que expresan el antígeno tumoral producen la proteína del antígeno tumoral (por ejemplo, de tipo salvaje o mutante), y la proteína del antígeno tumoral puede estar presente a niveles normales o niveles reducidos. En una realización, las células que expresan el antígeno tumoral produjeron niveles detectables de una proteína antigénica tumoral en un punto, y posteriormente no produjeron sustancialmente ninguna proteína antigénica tumoral detectable.
La frase “enfermedad asociada con la expresión de un antígeno de células B” incluye, pero no se limita a, una enfermedad asociada con la expresión de uno o más de CD19, CD20, CD22 o ROR1, o una afección asociada con células que expresan, o en cualquier momento expresan, uno o más de CD19, CD20, CD22 o ROR1, incluyendo, por ejemplo, enfermedades proliferativas tales como cáncer o neoplasia o una afección precancerosa tal como mielodisplasia, síndrome mielodisplásico o preleucemia; o una indicación no relacionada con el cáncer asociada con células que expresan uno o más de CD19, CD20, CD22 o ROR1. Para evitar dudas, una enfermedad asociada con la expresión del antígeno de células B puede incluir una afección asociada con células que actualmente no expresan el antígeno de células B, por ejemplo, debido a que la expresión del antígeno se ha regulado negativamente, por ejemplo, debido al tratamiento con una molécula dirigida al antígeno de células B, por ejemplo, una célula B dirigida a CAR, pero que en un momento expresó el antígeno. La frase “enfermedad asociada con la expresión de un antígeno de células B” incluye una enfermedad asociada con la expresión de CD19, como se describe aquí.
La expresión “modificaciones de secuencia conservativas” se refiere a modificaciones de aminoácidos que no afectan o alteran significativamente las características de unión del anticuerpo o fragmento de anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos. Tales modificaciones conservadoras incluyen sustituciones, adiciones y deleciones de aminoácidos. Pueden introducirse modificaciones en un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente descripción mediante técnicas estándar conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones de aminoácidos conservativas son aquellas en las que el resto de aminoácido se reemplaza con un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (p. ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales de carácter ácido (p. ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (p. ej., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales apolares (p. ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta ramificadas (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por tanto, uno o más restos de aminoácidos dentro de un CAR de la presente descripción se pueden reemplazar con otros restos de aminoácidos de la misma familia de cadenas laterales, y el CAR alterado se puede probar usando los ensayos funcionales descritos aquí.
El término “estimulación” se refiere a una respuesta primaria inducida por la unión de una molécula estimuladora (por ejemplo, un complejo TCR/CD3 o CAR) con su ligando afín (o antígeno tumoral en el caso de un CAR) mediando así un evento de transducción de señales, tales como, pero sin limitarse a, la transducción de señales a través del complejo TCR/CD3 o la transducción de señales a través del receptor NK apropiado o los dominios de señalización del CAR. La estimulación puede mediar la expresión alterada de ciertas moléculas.
La expresión “molécula estimuladora” se refiere a una molécula expresada por una célula inmunitaria (por ejemplo, célula T, célula NK, célula B) que proporciona la o las secuencias de señalización citoplasmática que regulan la activación de la célula inmunitaria de forma estimulante para al menos algún aspecto de la vía de señalización de las células inmunitarias. En un aspecto, la señal es una señal primaria que se inicia, por ejemplo, mediante la unión de un complejo TCR/CD3 con una molécula de MHC cargada con péptido, y que conduce a la mediación de una respuesta de células T, que incluye, pero no se limita a, proliferación, activación, diferenciación y similares. Una secuencia de señalización citoplasmática primaria (también denominada "dominio de señalización primaria") que actúa de manera estimuladora puede contener un motivo de señalización que se conoce como motivo de activación basado en tirosina de inmunorreceptores o ITAM. Ejemplos de una secuencia de señalización citoplásmica que contiene ITAM que es de uso particular en la invención incluye, pero no se limita a, aquellas derivadas de CD3 zeta, FcR gamma común (FCER1G), Fc gamma RIIa, FcR beta (Fc épsilon R1b), CD3 gamma, CD3 delta, CD3 épsilon, CD79a, CD79b, DAP10 y DAP12. En un CAR específico de la presente descripción, el dominio de señalización intracelular en uno o más CARS de la presente descripción comprende una secuencia de señalización intracelular, por ejemplo, una secuencia de señalización primaria de CD3-zeta. En un CAR específico de la presente descripción, la secuencia de señalización primaria de CD3-zeta es la secuencia proporcionada como SEQ ID NO:17, o los restos equivalentes de una especie no humana, por ejemplo, ratón, roedor, mono, mono y similares. En un CAR específico de la presente descripción, la secuencia de señalización primaria de CD3-zeta es la secuencia proporcionada en SEQ ID NO:43, o los restos equivalentes de una especie no humana, por ejemplo, ratón, roedor, mono, mono y similares.
La expresión «célula presentadora de antígeno» o «APC» (por sus siglas en inglés) se refiere a una célula del sistema inmunitario tal como una célula accesoria (por ejemplo, un linfocito B, una célula dendrítica y similares) que muestra un antígeno extraño complejado con complejos mayores de histocompatibilidad (MHC) en su superficie. Los células T pueden reconocer estos complejos utilizando sus receptores de los células T (TCRs). Las APC procesan antígenos y los presentan a los células T.
Un "dominio de señalización intracelular", tal como se utiliza la expresión en esta memoria, se refiere a una porción intracelular de una molécula. El dominio de señalización intracelular genera una señal que fomenta una función efectora inmune de la célula que contiene CAR, p. ej., una célula CART. Ejemplos de la función efectora inmune, p. ej., en una célula CART, incluyen actividad citolítica y actividad auxiliar, incluida la secreción de citoquinas.
En una realización, el dominio de señalización intracelular puede comprender un dominio de señalización intracelular primaria. Los dominios de señalización intracelular primaria a modo de ejemplo incluyen los derivados de las moléculas responsables de la estimulación primaria, o simulación dependiente de antígeno. En una realización, el dominio de señalización intracelular puede comprender un dominio intracelular coestimulador. Los dominios de señalización intracelular coestimuladores a modo de ejemplo incluyen los derivados de las moléculas responsables de las señales coestimuladoras, o la simulación independiente de antígeno. por ejemplo, en el caso de un CART, un dominio de señalización intracelular primaria puede comprender una secuencia citoplasmática de un receptor de células T, y un dominio de señalización intracelular co-estimuladora puede comprender una secuencia citoplasmática de molécula coreceptora o co-estimuladora.
Un dominio de señalización intracelular primaria puede comprender un motivo de señalización que se conoce como un motivo de activación basado en tirosina de inmunorreceptores o ITAM. Los ejemplos de ITAM que contienen secuencias de señalización citoplásmicas primarias incluyen, pero no se limitan a, los derivados de CD3 zeta, FcR gamma común (FCER1G), Fc gamma RIIa, FcR beta (Fc épsilon R1b), CD3 gamma, CD3 delta, CD3 épsilon, CD79a, CD79b, DAP10 y DAP12.
El término “zeta” o alternativamente “cadena zeta”, “CD3-zeta” o “TCR-zeta” se define como la proteína proporcionada como GenBan Acc. No. BAG36664.1, o los restos equivalentes de una especie no humana, por ejemplo, ratón, roedor, mono, simio y similares, y un “dominio estimulante zeta” o alternativamente un “dominio estimulante CD3-zeta” o un “dominio estimulante de TCR-zeta” se define como los restos de aminoácidos del dominio citoplásmico de la cadena zeta, o derivados funcionales del mismo, que son suficientes para transmitir funcionalmente una señal inicial necesaria para la activación de las células T. En un aspecto, el dominio citoplasmático de zeta comprende los residuos 52 a 164 del N.° de acceso BAG36664.1 del GenBank o los residuos equivalentes de una especie no humana, p. ej., ratón, roedor, mono, simio y similares, que son ortólogos funcionales de estos. En un aspecto, el «dominio estimulador zeta» o un «dominio estimulador CD3-zeta» es la secuencia proporcionada como la SEQ ID NO: 17. En un aspecto, el «dominio estimulador zeta» o un «dominio estimulador CD3-zeta» es la secuencia proporcionada como la SEQ ID NO: 43.
La expresión «molécula coestimuladora» se refiere a compañero de unión afín en un linfocito T que se une específicamente con un ligando coestimulador, y de esta manera media en una respuesta coestimuladora por parte del linfocito T, tal como, sin carácter limitante, proliferación. Las moléculas coestimuladoras son moléculas de la superficie celular distintas de los receptores de antígenos o sus ligandos que contribuyen a una respuesta inmune eficaz. Las moléculas coestimuladoras incluyen, entre otras, una molécula de MHC de clase I, BTLA y un receptor de ligando Toll, así como OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278) y 4-1BB (CD137). Otros ejemplos de tales moléculas coestimuladoras incluyen CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL2R beta, IL2R gamma , IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (táctil), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, La T, GADS, SLP-76, pAG/Cbp, CD19a, y un ligando que se une específicamente a CD83.
Un dominio de señalización intracelular coestimulador puede ser la porción intracelular de una molécula coestimuladora. Una molécula coestimuladora puede representarse en las siguientes familias de proteínas: proteínas receptoras de TNF, proteínas de tipo inmunoglobulina, receptores de citoquinas, integrinas, moléculas de activación linfocítica de señalización (proteínas SLAm ) y receptores de células NK activantes. Ejemplos de tales moléculas incluyen CD27, CD28, 4-1BB (CD 137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, ICAM-1, antígeno 1 asociado a la función de las células (LFA-1), CD2, CDS, CD7, CD287, LIGHT, NKG2C, NKG2D, SLAMF7, NKp80, NKp30, NKp44, NKp46, CD160, B7-H3, y un ligando que se une específicamente con CD83, y similares.
El dominio de señalización intracelular puede comprender la porción intracelular completa, o el dominio de señalización intracelular nativo completo, de la molécula de la que deriva, o un fragmento funcional o derivado de la misma.
El término «4-1BB» se refiere al miembro de la superfamilia de TNFR con una secuencia de aminoácidos proporcionada como el N.° de acceso AAA62478.2 del GenBank, o los residuos equivalentes de una especie no humana, por ejemplo, ratón, roedor, mono, simio y similares; y un «dominio coestimulador de 4-1BB» se define como los residuos aminoacídicos 214-255 del N.° de acceso AAA62478.2 del GenBank, o los residuos equivalentes de una especie no humana, por ejemplo, ratón, roedor, mono, simio y similares. En un aspecto, el "dominio coestimulador de 4-1BB" es la secuencia proporcionada como SEQ ID NO: 16 o los residuos equivalentes de una especie no humana, p. ej., ratón, roedor, mono, simio y similares.
La «célula efectora inmunitaria», según se utiliza el término en la presente, se refiere a una célula que participa en una respuesta inmunitaria, por ejemplo, en la promoción de una respuesta efectora inmunitaria. Los ejemplos de células efectoras inmunitarias incluyen los linfocitos T, por ejemplo, linfocitos T alfa/beta y linfocitos T gamma/delta, linfocitos B, linfocitos citolíticos naturales (NK), linfocitos T citolíticos naturales (NKT), mastocitos y fagocitos de origen mieloide.
La «función efectora inmunitaria o respuesta efectora inmunitaria», tal como se utiliza la expresión en la presente, se refiere a una función o respuesta, por ejemplo, de una célula efectora inmunitaria, que fomenta o promueve un ataque inmunitario de una célula diana. por ejemplo, una función o respuesta efectora inmunitaria se refiere a una propiedad de un linfocito T o NK que promueve la muerte o la inhibición del crecimiento o proliferación, de una célula diana. En el caso de un linfocito T, la estimulación primaria y coestimulación son ejemplos de función o respuesta efectora inmunitaria.
El término «codificante» se refiere a la propiedad inherente de secuencias específicas de nucleótidos en un polinucleótido, tal como un gen, un ADNc o un ARNm, para servir como moldes para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas en procesos biológicos que tienen una secuencia definida de nucleótidos (por ejemplo, ARNr, ARNt y ARNm) o una secuencia definida de aminoácidos y las propiedades biológicas resultantes de estos. Por lo tanto, un gen, ADNc o ARN, codifica una proteína si la transcripción y traducción del ARNm correspondiente a ese gen produce la proteína en una célula u otro sistema biológico. Tanto a la cadena codificante, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica a la secuencia de ARNm y generalmente se proporciona en listas de secuencias, como a la cadena no codificante, utilizada como el molde para la transcripción de un gen o ADNc, se las puede denominar codificantes de la proteína u otro producto de ese gen o ADNc.
A menos que se especifique lo contrario, una "secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos" incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones degeneradas entre sí y que codifican la misma secuencia de aminoácidos. La frase secuencia de nucleótidos que codifica una proteína o un ARN también puede incluir intrones en la medida en que la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína pueda contener, en alguna versión, un(os) intrón(intrones).
Las expresiones «cantidad eficaz» o «cantidad terapéuticamente eficaz» se utilizan indistintamente en la presente, y se refieren a una cantidad de un compuesto, formulación, material o composición, tal como se describen en la presente, eficaz para lograr un resultado biológico particular.
El término «endógeno» se refiere a cualquier material de un organismo, célula, tejido o sistema o producido dentro de estos.
El término «exógeno» se refiere a cualquier material introducido desde fuera de un organismo, célula, tejido o sistema o producido fuera de estos.
El término «expresión» se refiere a la transcripción y/o traducción de una secuencia de nucleótidos particular impulsada por un promotor.
El término “vector de transferencia” se refiere a una composición de materia que comprende un ácido nucleico aislado y que puede usarse para administrar el ácido nucleico aislado al interior de una célula. Se conocen numerosos vectores en la técnica que incluyen, pero no se limitan a polinucleótidos lineales, polinucleótidos asociados con compuestos iónicos o anfifílicos, plásmidos y virus. Por lo tanto, la expresión "vector de transferencia " incluye un virus o un plásmido que se replica de forma autónoma. La expresión también debe interpretarse para incluir además compuestos no plasmídicos y no víricos que facilitan la transferencia de ácido nucleico al interior de las células, tales como, por ejemplo, un compuesto de polilisina, liposoma y similares. Ejemplos de vectores de transferencia víricos incluyen, sin carácter limitante, vectores adenovíricos, vectores de virus adenoasociados, vectores retrovíricos, vectores lentivíricos y similares.
La expresión «vector de expresión» se refiere a un vector que comprende un polinucleótido recombinante que comprende secuencias de control de la expresión ligadas operablemente a una secuencia de nucleótidos que se va a expresar. Un vector de expresión comprende suficientes elementos de acción cis para la expresión; otros elementos para la expresión pueden ser suministrados por la célula hospedadora o en un sistema de expresión in vitro. Los vectores de expresión incluyen todos los conocidos en la técnica, incluidos los cósmidos, plásmidos (por ejemplo, desnudos o contenidos en liposomas) y virus (por ejemplo, lentivirus, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados) que incorporan el polinucleótido recombinante.
El término «lentivirus» se refiere a un género de la familia Retroviridae. Los lentivirus son únicos entre los retrovirus ya que son capaces de infectar células que no se dividen; pueden suministrar una cantidad significativa de información genética al ADN de la célula huésped, por lo que son uno de los métodos más eficaces de un vector de suministro de genes. El HIV, SIV y FIV son ejemplos de lentivirus.
La expresión «vector lentivírico» se refiere a un vector derivado de al menos una porción de un genoma de lentivirus, que incluye especialmente un vector lentivírico autoinactivante como se proporciona en Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453­ 1464 (2009). Otros ejemplos de vectores de lentivirus que se pueden utilizar en la clínica incluyen, sin carácter limitante, por ejemplo, la tecnología de suministro de genes LENTIVECTOR® de Oxford BioMedica, el sistema vectorial LENTIMAX™ de Lentigen y similares. También se puede disponer de tipos no clínicos de vectores lentivirales y estos son conocidos para el experto en la técnica.
El término «homólogo» o «identidad» se refiere a la identidad secuencial de subunidades entre dos moléculas poliméricas, por ejemplo, entre dos moléculas de ácido nucleico, tales como dos moléculas de ADN o dos moléculas de ARN, o entre dos moléculas polipeptídicas. Cuando una posición de subunidad en las dos moléculas está ocupada por la misma subunidad monomérica; por ejemplo, si una posición en cada una de las dos moléculas de ADN está ocupada por adenina, entonces son homólogas o idénticas en esa posición. La homología entre dos secuencias es una función directa del número de posiciones coincidentes u homólogas; por ejemplo, si la mitad (por ejemplo, cinco posiciones en un polímero de diez subunidades de longitud) de las posiciones en dos secuencias son homólogas, las dos secuencias son homólogas en un 50%; si el 90% de las posiciones (por ejemplo, 9 de 10) son coincidentes u homólogas, las dos secuencias son homólogas en un 90%.
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (p. ej., murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de estas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de anticuerpos que se unen al antígeno) que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados y fragmentos de anticuerpo de estos son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo o fragmento de anticuerpo receptor) en los que los residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor son reemplazados por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata o conejo que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región de marco (FR) Fv de la inmunoglobulina humana son reemplazados por los residuos no humanos correspondientes. Además, un anticuerpo/fragmento de anticuerpo humanizado puede comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias CDR o de armazón importadas. Estas modificaciones pueden refinar y optimizar adicionalmente el comportamiento del anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado o el fragmento de anticuerpo de este comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o una parte significativa de las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo humanizado también puede comprender al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, remítase a Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593­ 596, 1992.
La expresión «completamente humano» se refiere a una inmunoglobulina, tal como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, en que la molécula completa es de origen humano o está constituida por una secuencia de aminoácidos idéntica a una forma humana del anticuerpo o inmunoglobulina.
El término “aislado” significa alterado o eliminado del estado natural. por ejemplo, un ácido nucleico o un péptido presente de forma natural en un animal vivo no está "aislado", pero es el mismo ácido nucleico o péptido parcial o completamente separado de los materiales coexistentes de su estado natural está "aislado". Un ácido nucleico aislado o proteína puede existir en forma sustancialmente purificada, o puede existir en un entorno no nativo tal como, por ejemplo, una célula huésped.
En el contexto de la presente invención, se utilizan las siguientes abreviaturas para las bases de ácidos nucleicos que se producen de manera habitual. "A" se refiere a adenosina, "C" se refiere a citosina, "G" se refiere a guanosina, "T" se refiere a timidina y "U" se refiere a uridina.
La expresión «ligado operablemente» o «control transcripcional» se refiere al enlace funcional entre una secuencia reguladora y una secuencia de ácido nucleico heterólogo que da como resultado la expresión de este último. por ejemplo, una primera secuencia de ácido nucleico está enlazada operablemente con una segunda secuencia de ácido nucleico cuando la primera secuencia de ácido nucleico se coloca en una relación funcional con la segunda secuencia de ácido nucleico. por ejemplo, un promotor está enlazado operablemente a una secuencia codificante si el promotor afecta a la transcripción o expresión de la secuencia codificante. Las secuencias de ADN ligadas operablemente pueden ser contiguas entre sí y, por ejemplo, cuando sea necesario unir dos regiones codificantes de proteínas, están en el mismo marco de lectura.
La expresión administración «parenteral» de una composición inmunógena incluye, por ejemplo, la inyección subcutánea (s.c.), intravenosa (i.v.), intramuscular (i.m.) o intraesternal, intratumoral o técnicas de infusión.
La expresión «ácido nucleico» o «polinucleótido» se refiere a ácidos desoxirribonucleicos (ADN) o ácidos ribonucleicos (ARN) y sus polímeros, ya sea en forma mono- o bicatenaria. A menos que se limite de forma específica, la expresión engloba ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen unas propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia y que se metabolizan de manera similar a la de los nucleótidos de origen natural. A menos que se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucleico particular también incluye implícitamente variantes modificadas de forma conservadora de la misma (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados), alelos, ortólogos, SNP y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. Específicamente, se pueden conseguir sustituciones de codones degenerados generando secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o su totalidad) se sustituya con residuos de desoxiinosina o base mixta (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985) y Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).
Los términos “péptido”, “polipéptido” y “proteína” se usan indistintamente y se refieren a un compuesto compuesto por restos de aminoácidos unidos covalentemente por enlaces peptídicos. Una proteína o péptido debe contener al menos dos aminoácidos, y no se establece limitación alguna en el número máximo de aminoácidos que puede comprender una secuencia de proteína o péptido. Polipéptidos incluyen cualquier péptido o proteína que comprenda dos o más aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos. Tal como se utiliza en esta memoria, el término se refiere tanto a cadenas cortas, a las que también se alude comúnmente en la técnica como péptidos, oligopéptidos y oligómeros, por ejemplo, como a cadenas más largas, a las que generalmente se alude en la técnica como proteínas, de las cuales hay muchos tipos. "Polipéptidos" incluyen, por ejemplo, fragmentos biológicamente activos, polipéptidos sustancialmente homólogos, oligopéptidos, homodímeros, heterodímeros, variantes de polipéptidos, polipéptidos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusión, entre otros. Un polipéptido incluye un péptido natural, un péptido recombinante o una combinación de los mismos.
El término «promotor» se refiere a una secuencia de ADN reconocida por la maquinaria sintética de la célula, o maquinaria sintética introducida, requerida para iniciar la transcripción específica de una secuencia polinucleotídica.
La expresión «secuencia promotora/reguladora» se refiere a una secuencia de ácido nucleico que se requiere para la expresión de un producto génico ligado operablemente a la secuencia promotora/reguladora. En algunos casos, esta secuencia puede ser la secuencia de promotor central y en otros casos, esta secuencia también puede incluir una secuencia de potenciador y otros elementos reguladores que se requieren para la expresión del producto génico. La secuencia de promotor/regulador puede ser, por ejemplo, una que exprese el producto génico de una manera específica para el tejido.
El término promotor «constitutivo» se refiere a una secuencia de nucleótidos que, cuando está ligada operablemente con un polinucleótido que codifica o especifica un producto génico, provoca que el producto génico se produzca en una célula en la mayoría o la totalidad de condiciones fisiológicas de la célula.
La expresión promotor «inducible» se refiere a una secuencia de nucleótidos que, cuando está ligada operablemente con un polinucleótido que codifica o especifica un producto génico, provoca que el producto génico se produzca en una célula sustancialmente solo cuando está presente en la célula un inductor que corresponde al promotor.
La expresión promotor «específico para el tejido» se refiere a una secuencia de nucleótidos que, cuando está ligada operablemente con un polinucleótido que codifica o especificado por un gen, provoca que el producto génico se produzca en una célula sustancialmente solo si la célula es una célula del tipo de tejido correspondiente al promotor.
La expresión «conector polipeptídico flexible» o «conector», tal como se utiliza en el contexto de un scFv, se refiere a un conector peptídico constituido por aminoácidos tales como residuos de glicina y/o serina utilizados solos o combinados, para conectar regiones de la cadena pesada variables y de la cadena ligera variables. En una realización, el enlazador polipeptídico flexible es un enlazador Gly/Ser y comprende la secuencia de aminoácidos (Gly-Gly-Gly-Ser)n, en la que n es un número entero positivo igual o mayor que 1. por ejemplo, n = 1, n = 2, n = 3, n = 4, n = 5 y n = 6, n = 7, n = 8, n = 9 y n = 10 (SEQ ID n O:105). En una realización, los enlazadores polipeptídicos flexibles incluyen, pero no se limitan a, (Gly4Ser)4 (SEQ ID NO:106) o (Gly4Ser)3 (SEQ ID NO:107). En otra realización, los conectores incluyen múltiples repeticiones de (Gly2Ser), (GlySer) o (Gly3Ser) (SEQ ID NO:108). También se incluyen dentro del alcance de la invención los conectores descritos en el documento WO2012/138475.
Tal como se utiliza en esta memoria, una caperuza 5' (también denominada una caperuza de ARN, una caperuza de ARN 7-metilguanosina o una caperuza de ARN m7G) es un nucleótido de guanina modificado que ha sido añadido al extremo "frontal" o 5' de un ARN mensajero eucariota poco después del inicio de la transcripción. La caperuza 5' está constituida por un grupo terminal que está enlazado al primer nucleótido transcrito. Su presencia es crucial para el reconocimiento por parte del ribosoma y la protección contra las RNasas. La adición de la caperuza está acoplada a la transcripción, y se produce co-transcripcionalmente, de modo que cada una influye sobre la otra. Poco después del comienzo de la transcripción, se une al extremo 5' del ARNm que está siendo sintetizado un complejo de síntesis de la caperuza asociado con ARN polimerasa. Este complejo enzimático cataliza las reacciones químicas que se requieren para la generación de la caperuza del ARNm. La síntesis prosigue como una reacción bioquímica de múltiples etapas. El resto de adición de la caperuza se puede modificar para modular la funcionalidad del ARNm tal como su estabilidad o eficacia de traducción.
Tal como se utiliza en la presente, «ARN transcrito in vitro» se refiere a ARN, preferentemente ARNm, que ha sido sintetizado in vitro. Generalmente, el ARN transcrito in vitro se genera a partir de un vector de transcripción in vitro. El vector de transcripción in vitro comprende un molde que se utiliza para generar el ARN transcrito in vitro.
Tal como se utiliza en la presente, un «poli(A)» es una serie de adenosinas unidas por poliadenilación al ARNm. En la realización preferida de una construcción para expresión transitoria, el poliA está entre 50 y 5000 (SEQ ID NO:109), preferiblemente mayor de 64, más preferiblemente mayor de 100, lo más preferiblemente mayor de 300 o 400, secuencias de poli(A) se pueden modificar química o enzimáticamente para modular la funcionalidad del ARNm, como la localización, la estabilidad o la eficacia de la traducción.
Tal como se utiliza en esta memoria, el término "poliadenilación" se refiere al enlace covalente de un resto poliadenililo, o su variante modificada, a una molécula de ARN mensajero. En los organismos eucariotas, la mayoría de las moléculas de ARN mensajero (ARNm) están poliadeniladas en el extremo 3'. La cola de poli(A) 3' es una secuencia larga de nucleótidos de adenina (a menudo varios cientos) añadidos al pre-ARNm a través de la acción de una enzima, la poliadenilato polimerasa. En eucariotas superiores, la cola de poli(A) se añade a transcritos que contienen una secuencia específica, la señal de poliadenilación. La cola de poli(A) y la proteína unida a ella ayudan a proteger el ARNm de la degradación por parte de exonucleasas. La poliadenilación también es importante para la terminación de la transcripción, la exportación del ARNm desde el núcleo y la traducción. La poliadenilación ocurre en el núcleo inmediatamente después de la transcripción de ADN en ARN, pero además también puede ocurrir más tarde en el citoplasma. Una vez terminada la transcripción, la cadena de ARNm se escinde mediante la acción de un complejo de endonucleasa asociado con la ARN polimerasa. El sitio de escisión generalmente se caracteriza por la presencia de la secuencia de bases AAUAAA cerca del sitio de escisión. Después de que se haya escindido el ARNm, se añaden residuos adenosina al extremo 3' libre en el sitio de escisión.
Tal como se utiliza en la presente, «transitorio» se refiere a la expresión de un transgén no integrado durante un período de horas, días o semanas, donde el período de tiempo de expresión es menor que el período de tiempo para la expresión del gen si está integrado en el genoma o está contenido dentro de un replicón plasmídico estable en la célula hospedadora.
La expresión «ruta de transducción de señales» se refiere a la relación bioquímica entre una diversidad de moléculas de transducción de señales que desempeñan una función en la transmisión de una señal de una porción de una célula a otra porción de una célula. La expresión "receptor de la superficie celular" incluye moléculas y complejos de moléculas capaces de recibir una señal y transmitir la señal a través de la membrana de una célula.
El término «sujeto» se pretende que incluya organismos vivos en los que se puede provocar una respuesta inmunitaria (por ejemplo, un ser humano).
La expresión célula «sustancialmente purificada» se refiere a una célula que está esencialmente exenta de otros tipos de células. Una célula sustancialmente purificada también se refiere a una célula que ha sido separada de otros tipos de células con las que normalmente está asociada en su estado natural. En algunos casos, una población de células sustancialmente purificadas se refiere a una población homogénea de células. En otros casos, esta expresión se refiere simplemente a la célula que ha sido separada de las células con las que está normalmente asociada en su estado natural. En algunos aspectos, las células se cultivan in vitro. En otros aspectos, las células no se cultivan in vitro.
El término "terapéutico", tal como se utiliza en esta memoria, significa un tratamiento. Se obtiene un efecto terapéutico por reducción, supresión, remisión o erradicación de un estado patológico.
El término "profilaxis", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a la prevención o el tratamiento protector para una enfermedad o estado patológico.
En el contexto de la presente descripción, “antígeno tumoral” o “antígeno de trastorno hiperproliferativo” o “antígeno asociado con un trastorno hiperproliferativo” se refiere a antígenos que son comunes a trastornos hiperproliferativos específicos. En ciertos aspectos, los antígenos del trastorno hiperproliferativo de la presente divulgación se derivan de cánceres que incluyen, sin carácter limitante, melanoma primario o metastásico, timoma, linfoma, sarcoma, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, linfoma no hodgkiniano, linfoma de Hodgkin, leucemias, cáncer uterino, cáncer de cuello uterino, cáncer de vejiga, cáncer de riñón y adenocarcinomas tales como cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, y similares.
El término «transfectado» o «transformado» o «transducido» se refiere a un proceso por el cual el ácido nucleico exógeno se transfiere o introduce en la célula hospedadora. Una célula «transfectada» o «transformada» o «transducida» es una que ha sido transfectada, transformada o transducida con ácido nucleico exógeno. La célula incluye la célula objeto principal y su progenie.
La expresión “se une específicamente” se refiere a un anticuerpo, o un ligando, que reconoce y se une a una proteína asociada de unión (por ejemplo, un antígeno tumoral estimulante) presente en una muestra, pero cuyo anticuerpo o ligando no reconoce o se une sustancialmente a otros moléculas en la muestra.
"Receptor de antígeno quimérico regulable (RCAR)”, como se usa ese término aquí, se refiere a un conjunto de polipéptidos, típicamente dos en las realizaciones más simples, que cuando están en una célula RCARX, proporcionan a la célula RCARx especificidad para una célula diana, típicamente una célula cancerosa, y con generación o proliferación de señales intracelulares regulables, que pueden optimizar una propiedad efectora inmunitaria de la célula RCARX. Una célula RCARX se basa, al menos en parte, en un dominio de unión a antígeno para proporcionar especificidad a una célula diana que comprende el antígeno unido por el dominio de unión a antígeno. En una realización, un RCAR incluye un conmutador de dimerización que, tras la presencia de una molécula de dimerización, puede acoplar un dominio de señalización intracelular al dominio de unión al antígeno.
El «anclaje a la membrana» o «dominio de fijación a la membrana», tal como se utiliza la expresión en la presente, se refiere a un polipéptido o resto, por ejemplo, un grupo miristoílo, suficiente para anclar un dominio extracelular o intracelular a la membrana plasmática.
El «dominio de tipo interruptor», tal como se utiliza la expresión en la presente, por ejemplo, cuando se refiere a un RCAR, se refiere a una entidad, normalmente una entidad de base polipeptídica, que, en presencia de una molécula de dimerización, se asocia con otro dominio de tipo interruptor. La asociación da como resultado un acoplamiento funcional de una primera entidad ligada a, por ejemplo, fusionada con, un primer dominio de tipo interruptor, y una segunda entidad ligada a, por ejemplo, fusionada con, un segundo dominio de tipo interruptor. Un primer y segundo dominios de tipo interruptor se denominan de manera global un interruptor de dimerización. En algunas realizaciones, el primer y segundo dominios de tipo interruptor son idénticos entre sí, por ejemplo, son polipéptidos que tienen la misma secuencia de aminoácidos primaria y se denominan de manera global un interruptor de homodimerización. En algunas realizaciones, el primer y segundo dominios de tipo interruptor son diferentes entre sí, por ejemplo, son polipéptidos que tienen diferentes secuencias de aminoácidos primarias y se denominan de manera global un interruptor de heterodimerización. En algunas realizaciones, el interruptor es intracelular. En algunas realizaciones, el interruptor es extracelular. En algunas realizaciones, el dominio de tipo interruptor es una entidad de base polipeptídica, por ejemplo, basado en FRB o FKBP, y la molécula de dimerización es una molécula de bajo peso molecular, por ejemplo, un rapálogo. En algunas realizaciones, el dominio de tipo interruptor es una entidad de base polipeptídica, por ejemplo, un scFv que se une al péptido myc, y la molécula de dimerización es un polipéptido, un fragmento de este, o un multímero de un polipéptido, por ejemplo, un ligando myc o multímeros de un ligando myc que se unen a uno o más scFv para myc. En algunas realizaciones, el dominio de tipo interruptor es una entidad de base polipeptídica, por ejemplo, un receptor para myc, y la molécula de dimerización es un anticuerpo o fragmento de este, por ejemplo, un anticuerpo para myc.
La «molécula de dimerización», tal como se utiliza la expresión en la presente, por ejemplo, cuando se refiere a un RCAR, se refiera una molécula que promueve la asociación de un primer dominio de tipo interruptor con un segundo dominio de tipo interruptor. En algunas realizaciones, la molécula de dimerización no se produce de manera natural en el sujeto, o no se producen concentraciones que darían como resultado una dimerización significativa. En algunas realizaciones, la molécula de dimerización es una molécula de bajo peso molecular, por ejemplo, rapamicina o un rapálogo, por ejemplo, RAD001.
El término «bioequivalente» se refiere una cantidad de un agente que no es el compuesto de referencia (por ejemplo, RAD001), necesaria para producir un efecto equivalente al efecto producido por la dosis de referencia o cantidad de referencia del compuesto de referencia (por ejemplo, RAD001). En una realización, el efecto es el nivel de inhibición de mTOR, por ejemplo, tal como se mide en función de la inhibición de la cinasa P70 S6, por ejemplo, tal como se evalúa en un ensayo in vivo o in vitro, por ejemplo, tal como se mide con un ensayo descrito en la presente, por ejemplo, el ensayo Boulay, o la medida de los niveles de S6 fosforilada por inmunoelectrotransferencia. En una realización, el efecto es la alteración de la proporción de células T PD-1 positivas/PD-1 negativas, medida por clasificación celular. En una realización, una cantidad o dosis bioequivalente de un inhibidor de mTOR es la cantidad o dosis que consigue el mismo nivel de inhibición de la cinasa P70 S6 que la dosis de referencia o cantidad de referencia de un compuesto de referencia. En una realización, una cantidad o dosis bioequivalente de un inhibidor de mTOR es la cantidad o dosis que logra el mismo nivel de alteración en la proporción de células T PD-1 positivas/PD-1 negativas que la dosis de referencia o la cantidad de referencia de un compuesto de referencia.
La expresión «dosis baja, de potenciación inmunitaria» cuando se utiliza junto con un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor alostérico de mTOR, por ejemplo, RAD001 o rapamicina, o un inhibidor catalítico de mTOR, se refiere a una dosis de un inhibidor de mTOR que inhibe parcial, pero no totalmente, la actividad de mTOR, por ejemplo, según se mide mediante la inhibición de la actividad cinasa de P70 S6. En la presente se analizan métodos para evaluar la actividad de mTOR, por ejemplo, mediante la inhibición de la cinasa P70 S6. La dosis es insuficiente para dar como resultado una supresión inmunitaria completa pero es suficiente para potenciar la respuesta inmunitaria. En una realización, la dosis baja, potenciadora del sistema inmunológico, de inhibidor de mTOR da como resultado una disminución en el número de células T positivas para PD-1 y/o un aumento en el número de células T negativas para PD-1, o un aumento en la proporción de células T PD-1 negativas/células T PD-1 positivas. En una realización, la dosis baja, de potenciación inmunitaria, del inhibidor de mTOR da como resultado un incremento en el número de linfocitos T vírgenes. En una realización, la dosis baja, de potenciación inmunitaria, del inhibidor de mTOR da como resultado uno o más de los siguientes:
un incremento en la expresión de uno o más de los siguientes marcadores: CD62Lelevado, CD127elevado, CD27+ y BCL2, por ejemplo, en los linfocitos T de memoria, por ejemplo, precursores de los linfocitos T de memoria;
un descenso en la expresión de KLRG1, por ejemplo, en los linfocitos T de memoria, por ejemplo, precursores de los linfocitos T de memoria; y
un incremento en el número de precursores de los linfocitos T de memoria, por ejemplo, células con cualquiera de las siguientes características o una combinación de estas: incremento de CD62Lelevado, incremento de CD127elevado, incremento de CD27+, disminución de KLRG1 e incremento de BCL2;
donde cualquiera de los cambios descritos anteriormente se produce, por ejemplo, al menos de manera transitoria, por ejemplo, en comparación con un sujeto no tratado.
El término «refractario» tal como se utiliza en la presente se refiere una enfermedad, por ejemplo, cáncer, que no responde a un tratamiento. En las realizaciones, un cáncer refractario puede ser resistente a un tratamiento antes o al comienzo del tratamiento. En otras realizaciones, el cáncer refractario puede volverse refractario durante un tratamiento.
Un “respondedor completo” como se usa aquí se refiere a un sujeto que tiene una enfermedad, por ejemplo, un cáncer, que exhibe una respuesta completa, por ejemplo, una remisión completa, a un tratamiento. Puede identificarse una respuesta completa, por ejemplo, usando los criterios de Cheson como se describe aquí.
Un “respondedor parcial”, como se usa aquí, se refiere a un sujeto que tiene una enfermedad, por ejemplo, un cáncer, que muestra una respuesta parcial, por ejemplo, una remisión parcial, a un tratamiento. Puede identificarse una respuesta parcial, por ejemplo, usando los criterios de Cheson.
Un “no respondedor” como se usa aquí se refiere a un sujeto que tiene una enfermedad, por ejemplo, un cáncer, que no muestra una respuesta a un tratamiento, por ejemplo, el paciente tiene una enfermedad estable o una enfermedad progresiva. Puede identificarse un no respondedor, por ejemplo, usando los criterios de Cheson como se describe aquí.
El término “recaída” como se usa aquí se refiere a la reaparición de una enfermedad (por ejemplo, cáncer) después de un período inicial de respuesta (por ejemplo, respuesta completa o respuesta parcial). El periodo inicial de respuesta puede conllevar que el nivel de células cancerosas caiga por debajo de un cierto umbral, por ejemplo, por debajo de un 20%, 1%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, o un 1%. La reaparición puede conllevar que el nivel de células cancerosas se eleve por encima de un cierto umbral, por ejemplo, por encima de un 20%, 1%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% o un 1%. La recaída puede identificarse, por ejemplo, usando los criterios de Cheson como se describe aquí.
Intervalos: a lo largo de esta divulgación, se pueden presentar en un formato de intervalo diversos aspectos de la invención. Se debe entender que la descripción en formato de intervalo es meramente por conveniencia y brevedad y no se debe interpretar como una limitación inflexible en el alcance de la invención. Por consiguiente, se debe considerar que la descripción de un intervalo divulga específicamente todos los posibles subintervalos, así como también los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. por ejemplo, se debe considerar que la descripción de un intervalo tal como de 1 a 6 divulga específicamente subintervalos tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., así como también números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5,3 y 6. Como otro ejemplo, un intervalo tal como un 95-99% de a identidad, incluye algo con una identidad de un 95%, 96%, 97%, 98% o un 99%, e incluye subintervalos tales como una identidad de un 96-99%, 96-98%, 96-97%, 97-99%, 97-98% y 98-99%. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.
Descripción
Aquí se proporcionan composiciones de materia y métodos de uso para el tratamiento de una enfermedad como el cáncer (por ejemplo, cánceres hematológicos u otras neoplasias malignas de células B) usando células efectoras inmunitarias (por ejemplo, células T o células NK) que expresan un receptor de antígeno quimérico (CAR) (por ejemplo, un CAR que se dirige a un marcador de células B, tal como CD19). Los métodos incluyen, pero no se limitan a, administrar células efectoras inmunitarias (por ejemplo, células T o células NK) que expresan un CAR que se dirige a células B descrito aquí en combinación con otro agente tal como un inhibidor de cinasa, por ejemplo, un inhibidor de cinasa descrito aquí.
La presente descripción proporciona, al menos en parte, experimentos que respaldan la alta eficacia de una combinación de una terapia de CAR (por ejemplo, una terapia de CAR dirigida a células B) y un inhibidor de cinasa, por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib. La combinación de un inhibidor de cinasa, por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib, con una terapia de CAR puede aumentar la eficacia de la terapia de combinación con respecto a una monoterapia del inhibidor de cinasa, o una dosis de células que expresan CAR, o ambas. Estos efectos beneficiosos pueden, por ejemplo, permitir una dosis más baja del inhibidor de cinasa o las células que expresan CAR, o ambos, mientras se mantiene la eficacia. Los resultados de este documento son aplicables a una amplia gama de cánceres, por ejemplo, cánceres hematológicos y otras neoplasias malignas de células B. por ejemplo, ibrutinib inhibe la BTK, que está elevada en la mayoría de los linfomas. Una célula efectora inmunitaria (por ejemplo, célula T o célula NK) que expresa CAR19 se dirige a cánceres con expresión de superficie de CD19, que se expresa en la mayoría de las neoplasias malignas de células B. Alternativamente o en combinación con CAR19, cualquier otro CAR dirigido a células B (por ejemplo, un CAR dirigido a uno o más de: CD20, CD22 o ROR1) puede usarse en las terapias de combinación descritas aquí. Por lo tanto, la combinación de una terapia de CAR (por ejemplo, uno o más de una terapia CD19 CAR, CD20 CAR, CD22 CAR o ROR1 CAR) con un inhibidor de BTK (por ejemplo, ibrutinib) es adecuada para tratar una amplia gama de cánceres que involucran la sobreproliferación de células B, incluidos linfomas (por ejemplo, linfoma de Hodgkin), MCL, CLL, DLBCL y mieloma múltiple.
Según la presente invención, ibrutinib puede reducir las masas tumorales y movilizar las células B neoplásicas en la sangre periférica (véase, por ejemplo, el Ejemplo 8 aquí). Sin desear ceñirse a la teoría, ciertos linfomas, como el MCL, se caracterizan por masas de células cancerosas en los centros de proliferación de los ganglios linfáticos. Las células efectoras inmunitarias que expresan CAR a veces tienen dificultades para penetrar en estas masas densamente empaquetadas. Por lo tanto, un inhibidor de BTK, como ibrutinib, puede reducir las masas tumorales y movilizar las células B neoplásicas en la sangre periférica, haciendo que las células del linfoma sean más vulnerables a las células que expresan CAR.
Alternativamente o en combinación, los inhibidores de BTK, como ibrutinib, también pueden afectar a las células que expresan CAR. La presente invención demuestra que el tratamiento con ibrutinib aumenta el nivel de células CART19 circulantes (véase, por ejemplo, los datos mostrados en el Ejemplo 8). Sin desear ceñirse a la teoría, el aumento en el nivel de células CART19 circulantes puede ser el resultado de, por ejemplo, un aumento de la proliferación, alteración del fenotipo de las células T u otros factores. por ejemplo, ibrutinib puede inhibir ITK, una cinasa con homología con BTK. ITK se expresa en células T y su inhibición puede alterar el fenotipo de las células T. El tratamiento con un inhibidor de cinasa, como ibrutinib, puede alterar el fenotipo de las células T de un fenotipo Th2 a un fenotipo Th1, y, por tanto, aumentar la capacidad proliferativa de las células T. El pretratamiento, o la coadministración, a un sujeto, de un inhibidor de BTK puede aumentar la capacidad proliferativa de células T en el sujeto, aumentando así el nivel de células que expresan CAR circulantes. Además, un sujeto pretratado con un inhibidor de BTK, por ejemplo, ibrutinib, puede tener una población de células T con una mayor capacidad proliferativa en su aféresis para la fabricación de CAR.
En un aspecto, la presente descripción proporciona varios receptores de antígenos quiméricos (CAR) que comprenden un anticuerpo o fragmento de anticuerpo diseñado para la unión específica a un antígeno de células B (por ejemplo, escogido de una o más de las proteínas CD19, CD20, CD22 o ROR1). En un aspecto, la presente descripción proporciona una célula (por ejemplo, célula T) diseñada para expresar un CAR, en la que la célula CART (“CART”) exhibe una propiedad anticancerígena. En un aspecto, una célula se transforma con el CAR y el CAR se expresa en la superficie celular. En algunos casos, la célula (por ejemplo, célula T) se transduce con un vector viral que codifica un CAR. En algunos casos, el vector vírico es un vector retrovírico. En algunos casos, el vector vírico es un vector lentivírico. En tales casos, la célula puede expresar de manera estable el CAR. En otro caso, la célula (por ejemplo, célula T) se transfecta con un ácido nucleico, por ejemplo, ARNm, ADNc, ADN, que codifica un CAR. En algunos de tales casos, la célula puede expresar de manera transitoria el CAR.
En un aspecto, la porción de unión a proteína anti-CD19 del CAR es un fragmento de anticuerpo scFv. En un aspecto, dichos fragmentos de anticuerpo son funcionales porque retienen la afinidad de unión equivalente, por ejemplo, se unen al mismo antígeno con afinidad comparable, como el anticuerpo IgG del que deriva. En un aspecto, dichos fragmentos de anticuerpos son funcionales porque proporcionan una respuesta biológica que puede incluir, pero no se limita a, la activación de una respuesta inmune, la inhibición del origen de la transducción de señales a partir de su antígeno diana, la inhibición de la actividad cinasa y similares, como entenderá un experto. En un aspecto, el dominio de unión al antígeno anti-CD19 del CAR es un fragmento de anticuerpo scFv que se humaniza en comparación con la secuencia murina del scFv del que deriva. En un aspecto, la secuencia scFv murina parental es la construcción CAR19 proporcionada en PCT publication WO2012/079000 y se proporciona aquí como SEQ ID NO:59. En una realización, el dominio de unión anti-CD19 es un scFv descrito en WO2012/079000 y proporcionado en SEQ ID NO:59.
En algunos aspectos, los anticuerpos de la presente descripción se incorporan en un receptor de antígeno quimérico (CAR). En un aspecto, el CAR comprende la secuencia polipeptídica proporcionada como SEQ ID NO:12 en la publicación PCT WO2012/079000, y se proporciona aquí como SEQ ID NO:58, en el que el dominio scFv está sustituido con una o más secuencias seleccionadas de SEQ ID NOS:1-12. En un aspecto, los dominios scFv de SEQ ID NOS:1-12 son variantes humanizadas del dominio scFv de SEQ ID NO:59, que es un fragmento scFv de origen murino que se une específicamente a CD19 humano. La humanización de este scFv de ratón puede ser deseable para el entorno clínico, en que los residuos específicos para ratón pueden inducir una respuesta del antígeno anti-ratón humano. (HAMA) en pacientes que reciben tratamiento con CART19, p. ej., tratamiento con células T transducidas con la construcción CAR19.
En un aspecto, el dominio de unión anti-CD19, por ejemplo, scFv humanizado, parte de un CAR de la presente descripción está codificado por un transgén cuya secuencia ha sido optimizada para codones para la expresión en una célula de mamífero. En un aspecto, la construcción CAR completa de la presente descripción está codificada por un transgén cuya secuencia completa ha sido optimizada para codones para la expresión en una célula de mamífero. La optimización de codones se refiere al descubrimiento de que la frecuencia de aparición de codones sinónimos (es decir, codones que codifican el mismo aminoácido) en el ADN codificante está sesgada en diferentes especies. Una degeneración de codones de este tipo permite que un polipéptido idéntico sea codificado por una diversidad de secuencias de nucleótidos. Se conoce en la técnica una diversidad de métodos de optimización de codones, e incluyen, p. ej., métodos descritos en al menos las patentes de EE.UU. Números 5.786.464 y 6.114.148.
En un aspecto, el CAR19 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO:1. En un aspecto, el CAR19 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO:2. En un aspecto, el CAR19 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO:3. En un aspecto, el CAR19 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en SEQ iD NO:4. En un aspecto, el CAR19 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO:5. En un aspecto, el CAR19 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en SEQ iD NO:6. En un aspecto, el CAR19 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO:7. En un aspecto, el CAR19 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO:8. En un aspecto, el CAR19 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO:9. En un aspecto, el CAR19 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO:10. En un aspecto, el CAR19 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO:11. En un aspecto, el CAR19 humanizado comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO:12.
En un aspecto, los CAR de la presente descripción combinan un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo específico con una molécula de señalización intracelular. por ejemplo, en algunos aspectos, la molécula de señalización intracelular incluye, sin carácter limitante, la cadena CD3-zeta, los módulos de señalización 4-1BB y CD28 y combinaciones de estos. En un aspecto, el CAR CD19 comprende un CAR seleccionado de la secuencia proporcionada en una o más de SEQ ID NOS:31 -42. En un aspecto, el CAR CD19 comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID NO:31. En un aspecto, el CAR CD19 comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID n O:32. En un aspecto, el CAR CD19 comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID NO:33. En un aspecto, el CAR CD19 comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID NO:34. En un aspecto, el CAR CD19 comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID NO:35. En un aspecto, el CAR CD19 comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID NO:36. En un aspecto, el CAR CD19 comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID n O:37. En un aspecto, el CAR CD19 comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID NO:38. En un aspecto, el CAR CD19 comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID NO:39. En un aspecto, el CAR CD19 comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID NO:40. En un aspecto, el CAR CD19 comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID NO:41. En un aspecto, el CAR CD19 comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID NO:42.
Además, la presente divulgación proporciona composiciones de CAR CD19 y su uso en medicamentos o métodos para tratar, entre otras enfermedades, cáncer o cualquier neoplasia maligna o enfermedades autoinmunitarias vinculadas con células o tejidos que expresan CD19.
En un aspecto, el CAR de la presente descripción puede usarse para erradicar células normales que expresan CD19, por lo que es aplicable para uso como terapia de acondicionamiento celular antes del trasplante celular. En un aspecto, la célula normal que expresa CD19 es una célula madre normal que expresa CD19 y el trasplante de células es un trasplante de células madre.
En un aspecto, la presente descripción proporciona una célula (por ejemplo, célula T) diseñada para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR), en el que la célula que expresa CAR, por ejemplo, célula T CAR (“CART”), exhibe una propiedad anticancerígena. Un antígeno preferido es CD19. En un aspecto, el dominio de unión al antígeno del CAR comprende un fragmento de anticuerpo anti-CD19 parcialmente humanizado. En un aspecto, el dominio de unión al antígeno del CAR comprende un fragmento de anticuerpo anti-CD19 parcialmente humanizado que comprende un scFv. Por consiguiente, la presente descripción proporciona un CD19-CAR que comprende un dominio de unión anti-CD19 humanizado y está diseñado en una célula efectora inmunitaria, por ejemplo, una célula T o una célula NK, y métodos para uso para terapia adoptiva.
En un aspecto, el CD19-CAR comprende al menos un dominio intracelular seleccionado del grupo de un dominio de señalización de CD137 (4-1BB), un dominio de señalización de CD28, un dominio de señal de CD3zeta y cualquier combinación de los mismos. En un aspecto, el CD19-CAR comprende al menos un dominio de señalización intracelular que proviene de una o más moléculas coestimuladoras distintas de CD137 (4-1BB) o CD28.
Receptor de Antígeno Quimérico (CAR)
La presente descripción abarca una construcción de ADN recombinante que comprende secuencias que codifican un CAR, en el que el CAR comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a un antígeno de células B (por ejemplo, CD19, por ejemplo, CD19 humano), en el que la secuencia del fragmento de anticuerpo es contigua y está en el mismo marco de lectura que una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de señalización intracelular. El dominio de señalización intracelular puede comprender un dominio de señalización coestimulador y/o un dominio de señalización primaria, por ejemplo, una cadena zeta. El dominio de señalización coestimulador se refiere a una porción del CAR que comprende al menos una porción del dominio intracelular de una molécula coestimuladora. En un caso, el dominio de unión al antígeno es un anticuerpo murino o un fragmento de anticuerpo descrito aquí. En un caso, el dominio de unión al antígeno es un anticuerpo humanizado o un fragmento de anticuerpo.
En aspectos específicos, una construcción CAR de la presente descripción comprende un dominio scFv seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOS:1-12 o un dominio scFV de SEQ ID NO:59, en el que el scFv puede estar precedido por una secuencia líder opcional tal como se proporciona en SEQ ID NO:13, y seguida de una secuencia de bisagra opcional tal como se proporciona en SEQ ID NO:14 o SEQ ID NO:45 o SEQ ID NO:47 o SEQ ID NO:49, una región transmembrana tal como se proporciona en SEQ ID NO:15, un dominio de señalización intracelular que incluye SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:51, y una secuencia CD3 zeta que incluye SEQ ID NO:17 o SEQ ID NO:43, en la que los dominios son contiguos a y están en el mismo marco de lectura para formar una única proteína de fusión. También se incluye en la presente descripción una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de cada uno de los fragmentos scFv seleccionados del grupo que consiste en SEQ IS NO: 1, SEQ ID NO:2, s Eq ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ IS NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 y SEQ ID NO:59. También se incluye en la presente descripción una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de cada uno de los fragmentos scFv seleccionados del grupo que consiste en SEQ IS NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ IS NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 y SEQ ID NO:59, y cada uno de los dominios de SEQ ID NOS:13-17, más la proteína de fusión CD19CAR codificada de la presente descripción. En un aspecto, las construcciones de CD19CAR ejemplares comprenden una secuencia líder opcional, un dominio de unión a antígeno extracelular, una bisagra, un dominio transmembrana y un dominio estimulante intracelular. En un aspecto, una construcción CD19CAR ejemplar comprende una secuencia líder opcional, un dominio de unión a antígeno extracelular, una bisagra, un dominio transmembrana, un dominio coestimulador intracelular y un dominio estimulante intracelular. Las construcciones CD19 CAR específicas que contienen dominios scFv humanizados de la presente descripción se proporcionan como SEQ ID NOS:31-42, o un dominio scFv murino como se proporciona como SEQ ID NO:59.
Las secuencias CAR de longitud completa también se proporcionan aquí como SEQ ID NOS:31-42 y 58, como se muestra en la Tabla 7 y la Tabla 3.
Se proporciona una secuencia líder ejemplar como SEQ ID NO:13. Se proporciona una secuencia de bisagra/espaciadora a modo de ejemplo como la SEQ iD n O:14 o SEQ ID NO:45 o SEQ ID NO:47 o SEQ ID NO:49. Se proporciona una secuencia del dominio transmembrana a modo de ejemplo como SEQ ID NO: 15. Se proporciona una secuencia ejemplar del dominio de señalización intracelular de la proteína 4-1BB como SEQ ID NO:16. Se proporciona una secuencia a modo de ejemplo del dominio de señalización intracelular de CD27 como la SEQ ID NO:51. Se proporciona una secuencia de dominio CD3zeta ejemplar como SEQ ID NO:17 o SEQ ID NO:43.
En un aspecto, la presente invención abarca una construcción de ácido nucleico recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un CAR, en la que la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de unión anti-CD19, por ejemplo, descrito aquí, que es contiguo a y en el mismo marco de lectura que una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de señalización intracelular. En un aspecto, el dominio de unión anti-CD19 se selecciona de una o más de las SEQ ID NOS:1-12 y 58. En un aspecto, el dominio de unión anti-CD19 está codificado por los restos de nucleótidos 64 a 813 de la secuencia proporcionada en una o más de SEQ ID NOS: 61-72 y 59. En un aspecto, el dominio de unión anti-CD19 está codificado por los restos de nucleótidos 64 a 813 de SEQ ID NO:61. En un aspecto, el dominio de unión anti-CD19 está codificado por los restos de nucleótidos 64 a 813 de SEQ ID NO:62. En un aspecto, el dominio de unión anti-CD19 está codificado por los restos de nucleótidos 64 a 813 de SEQ ID NO:63. En un aspecto, el dominio de unión anti-CD19 está codificado por los restos de nucleótidos 64 a 813 de SEQ ID NO:64. En un aspecto, el dominio de unión anti-CD19 está codificado por los restos de nucleótidos 64 a 813 de SEQ ID NO:65. En un aspecto, el dominio de unión anti-CD19 está codificado por los restos de nucleótidos 64 a 813 de SEQ ID NO:66. En un aspecto, el dominio de unión anti-CD19 está codificado por los restos de nucleótidos 64 a 813 de SEQ ID NO:67. En un aspecto, el dominio de unión anti-CD19 está codificado por los restos de nucleótidos 64 a 813 de SEQ ID NO:68. En un aspecto, el dominio de unión anti-CD19 está codificado por los restos de nucleótidos 64 a 813 de SEQ ID NO:69. En un aspecto, el dominio de unión anti-CD19 está codificado por los restos de nucleótidos 64 a 813 de SEQ ID NO:70. En un aspecto, el dominio de unión anti-CD19 está codificado por los restos de nucleótidos 64 a 813 de SEQ ID NO:71. En un aspecto, el dominio de unión anti-CD19 está codificado por los restos de nucleótidos 64 a 813 de SEQ ID NO:72.
En un aspecto, la presente invención abarca una construcción de ácido nucleico recombinante que comprende un transgén que codifica un CAR, en el que la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de unión anti-CD19 seleccionado de uno o más de SEQ ID NOS:61-72, en el que la secuencia es contigua y está en el mismo marco de lectura que la secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de señalización intracelular. Un dominio de señalización intracelular a modo de ejemplo que se puede utilizar en el CAR incluye, sin carácter limitante, uno o más dominios de señalización intracelular de, por ejemplo, CD3-zeta, CD28, 4-1BB y similares. En algunos casos, el CAR puede comprender cualquier combinación de CD3-zeta, CD28, 4-1BB y similares. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de una construcción CAR de la presente descripción se selecciona de una o más de las SEQ ID NOS:85-96. En un aspecto, la secuencia de ácidos nucleicos de una construcción de CAR es SEQ ID NO: 85. En un aspecto, la secuencia de ácidos nucleicos de una construcción de CAR es SEQ ID NO: 86. En un aspecto, la secuencia de ácidos nucleicos de una construcción de CAR es SEQ ID NO: 87. En un aspecto, la secuencia de ácidos nucleicos de una construcción de CAR es SEQ ID NO: 88. En un aspecto, la secuencia de ácidos nucleicos de una construcción de CAR es SEQ ID NO: 89. En un aspecto, la secuencia de ácidos nucleicos de una construcción de CAR es SEQ ID NO: 90. En un aspecto, la secuencia de ácidos nucleicos de una construcción de CAR es SEQ ID NO: 91. En un aspecto, la secuencia de ácidos nucleicos de una construcción de CAR es SEQ ID NO: 92. En un aspecto, la secuencia de ácidos nucleicos de una construcción de CAR es SEQ ID NO: 93. En un aspecto, la secuencia de ácidos nucleicos de una construcción de CAR es SEQ ID NO: 94. En un aspecto, la secuencia de ácidos nucleicos de una construcción de CAR es SEQ ID NO: 95. En un aspecto, la secuencia de ácidos nucleicos de una construcción de CAR es SEQ ID NO: 96. En un aspecto, la secuencia de ácidos nucleicos de una construcción de CAR es SEQ ID NO: 97. En un aspecto, la secuencia de ácidos nucleicos de una construcción de CAR es SEQ ID NO: 98. En un aspecto, la secuencia de ácidos nucleicos de una construcción de CAR es SEQ ID NO: 99.
Las secuencias de ácido nucleico que codifican las moléculas deseadas se pueden obtener usando métodos recombinantes conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, seleccionando bibliotecas de células que expresan el gen, derivando el gen de un vector que se sabe que incluye el mismo, o aislando directamente de células y tejidos que lo contienen, usando técnicas estándar. Alternativamente, el ácido nucleico de interés puede producirse sintéticamente, en lugar de clonarse.
La presente descripción incluye construcciones de vectores retrovirales y lentivirales que expresan un CAR que puede transducirse directamente en una célula.
La presente divulgación también incluye una construcción de ARN que se puede transfectar directamente en una célula. Un método para generar ARNm para uso en la transfección implica la transcripción in vitro (IVT) de un molde con cebadores especialmente diseñados, seguida de la adición de poliA, para producir una construcción que contenga secuencias 3' y 5' no traducidas ("UTR"), un casquete 5' y/o sitio de entrada al ribosoma interno (IRES), el ácido nucleico que se ha de expresar, y una cola de poliA, típicamente de 50-2000 bases de longitud (SEQ ID NO: 118). El ARN así producido puede transfectar eficazmente diferentes tipos de células. En una realización, el molde incluye secuencias para el CAR. En una realización, un vector de ARN de CAR se utiliza para transducir un linfocito T por electroporación.
Dominio de unión a antígeno
En un aspecto, el CAR de la presente divulgación comprende un elemento de unión específico para la diana al que se denomina de otra manera un dominio de unión al antígeno. La elección del resto depende del tipo y del número de ligandos que definen la superficie de una célula diana. por ejemplo, el dominio de unión al antígeno se puede elegir para reconocer un ligando que actúa como un marcador de la superficie celular en las células diana asociadas con un estado patológico particular. Por tanto, los ejemplos de marcadores de superficie celular que pueden actuar como ligandos para el dominio de unión a antígeno en un c A r de la presente descripción incluyen los asociados con infecciones víricas, bacterianas y parasitarias, enfermedades autoinmunes y células cancerosas.
En un aspecto, la respuesta de células T mediada por CAR puede dirigirse a un antígeno de interés mediante la ingeniería de un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno deseado en el CAR.
En un aspecto, la parte del CAR que comprende el dominio de unión a antígeno comprende un dominio de unión a antígeno que se dirige a CD19. En un aspecto, el dominio de unión al antígeno se dirige al CD19 humano. En un aspecto, el dominio de unión al antígeno del CAR tiene la misma o similar especificidad de unión que el fragmento scFv de FMC63 descrito en Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997). En una realización, el dominio de unión a antígeno del CAR incluye el fragmento scFv descrito en Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997).
El dominio de unión al antígeno puede ser cualquier dominio que se una al antígeno, incluidos, entre otros, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo murino, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado y un fragmento funcional del mismo, incluyendo, pero no se limita, a un anticuerpo de dominio único, como un dominio variable de cadena pesada (VH), un dominio variable de cadena ligera (VL) y un dominio variable (VHH) de nanocuerpo derivado de camélidos, y a un andamio alternativo conocido en la técnica para funcionar como dominio de unión a antígeno, tal como un dominio de fibronectina recombinante, y similares.
En una realización, la molécula CAR comprende un dominio de unión anti-CD19 que comprende una o más (por ejemplo, las tres) de la región determinante de la complementariedad 1 de cadena ligera (LC CDR1), región determinante de la complementariedad 2 de cadena ligera (LC CDR2) y región determinante de la complementariedad 3 de cadena ligera (LC CDR3) de un dominio de unión anti-CD19 descrito aquí, y una o más (por ejemplo, las tres) de la región determinante de la complementariedad 1 de cadena pesada (HC CDR1), región determinante de la complementariedad 2 de cadena pesada (HC CDR2), y región determinante de la complementariedad 3 de cadena pesada (HC CDR3) de un dominio de unión anti-CD19 descrito aquí, por ejemplo, un dominio de unión anti-CD19 que comprende uno o más, por ejemplo, las tres, CDR de LC, y uno o más, por ejemplo, , las tres, HC CDR. En una realización, el dominio de unión anti-CD19 comprende una o más (por ejemplo, las tres) de la región determinante de la complementariedad 1 de cadena pesada (HC CDR1), región determinante de la complementariedad 2 de cadena pesada (HC CDR2) y región determinante de la complementariedad 3 de cadena pesada (Hc CDR3) de un dominio de unión anti-CD19 descrito aquí, por ejemplo, el dominio de unión anti-CD19 tiene dos regiones de cadena pesada variable, cada una de las cuales comprende una HC CDR1, una HC CDR2 y una HC CDR3 descritas en la presente. En una realización, el dominio de unión anti-CD19 comprende una región variable de cadena ligera murina descrita aquí (por ejemplo, en la Tabla 7) y/o una región variable de cadena pesada murina descrita aquí (por ejemplo, en la Tabla 7). En una realización, el dominio de unión anti-CD19 es un scFv que comprende una cadena ligera murina y una cadena pesada murina de una secuencia de aminoácidos de la Tabla 7. En una realización, el dominio de unión anti-CD19 (por ejemplo, un scFv) comprende: una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena ligera proporcionada en la Tabla 7, o una secuencia con una identidad del 95-99% con una secuencia de aminoácidos de la Tabla 7; y/o una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena pesada proporcionada en la Tabla 7, o una secuencia con una identidad del 95-99% con una secuencia de aminoácidos de la Tabla 7. En una realización, el dominio de unión anti-CD19 comprende una secuencia de SEQ ID NO:59, o una secuencia con una identidad del 95-99% con la misma. En una realización, el dominio de unión anti-CD19 es un scFv, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos descrita aquí, por ejemplo, en la Tabla 7, se une a una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos descrita aquí, por ejemplo, en la Tabla 7, a través de un enlazador, por ejemplo, un enlazador descrito aquí. En una realización, el dominio de unión anti-CD19 incluye un enlazador (Gly4-Ser)n, en el que n es 1,2, 3, 4, 5 o 6, preferiblemente 3 o 4 (SEQ ID NO:53). La región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada de un scFv pueden estar, por ejemplo, en cualquiera de las siguientes orientaciones: región variable de cadena ligera-enlazador-región variable de cadena pesada, o región variable de cadena pesada-enlazador-región variable de cadena ligera.
En algunos casos, es beneficioso que el dominio de unión al antígeno se derive de la misma especie en la que se utilizará finalmente el CAR. por ejemplo, para uso en seres humanos, puede ser beneficioso que el dominio de unión al antígeno del CAR comprenda residuos humanos o humanizados para el dominio de unión al antígeno de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.
Por lo tanto, en un aspecto, el dominio de unión al antígeno comprende un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo humanizados. En una realización, el dominio de unión anti-CD19 humanizado comprende una o más (por ejemplo, las tres) de la región determinante de la complementariedad 1 de cadena ligera (LC CDR1), región determinante de la complementariedad 2 de cadena ligera (LC CDR2) y región determinante de la complementariedad 3 de cadena ligera (LC CDR3) de un dominio de unión anti-CD19 murino o humanizado descrito aquí, y/o una o más (por ejemplo, las tres) de la región determinante de complementariedad 1 de cadena pesada (HC CDR1), región determinante de complementariedad 2 de cadena pesada (HC CDR2) y la región determinante de la complementariedad 3 de la cadena pesada (HC CDR3) de un dominio de unión anti-CD19 murino o humanizado descrito aquí, por ejemplo, un dominio de unión anti-CD19 humanizado que comprende una o más, por ejemplo, las tres, CDR de LC, y una o más, por ejemplo, las tres, HC CDR. En una realización, el dominio de unión anti-CD19 humanizado comprende una o más (por ejemplo, las tres) de la región determinante de la complementariedad 1 de cadena pesada (HC CDR1), región determinante de la complementariedad 2 de cadena pesada (HC CDR2) y región determinante de la complementariedad 3 de cadena pesada (HC CDR3) de un dominio de unión anti-CD19 murino o humanizado descrito aquí, por ejemplo, el dominio de unión anti-CD19 humanizado tiene dos regiones variables de cadena pesada, cada una de las cuales comprende una HC CDR1, una HC CDR2 y una HC CDR3 descritas aquí. En una realización, el dominio de unión anti-CD19 humanizado comprende una región variable de cadena ligera humanizada descrita aquí (por ejemplo, en la Tabla 3) y/o una región variable de cadena pesada humanizada descrita aquí (por ejemplo, en la Tabla 3). En una realización, el dominio de unión anti-CD19 humanizado comprende una región variable de cadena pesada humanizada descrita aquí (por ejemplo, en la Tabla 3), por ejemplo, al menos dos regiones variables de cadena pesada humanizada descritas aquí (por ejemplo, en la Tabla 3). En una realización, el dominio de unión anti-CD19 es un scFv que comprende una cadena ligera y una cadena pesada de una secuencia de aminoácidos de la Tabla 3. En una realización, el dominio de unión anti-CD19 (por ejemplo, un scFv) comprende: una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena ligera proporcionada en la Tabla 3, o una secuencia con una identidad del 95-99% con una secuencia de aminoácidos de la Tabla 3; y/o una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena pesada proporcionada en la Tabla 3, o una secuencia con una identidad del 95-99% con una secuencia de aminoácidos de la Tabla 3. En una realización, el dominio de unión anti-CD19 humanizado comprende una secuencia seleccionada de un grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 y SEQ ID NO:12, o una secuencia con una identidad del 95-99% de las mismas. En una realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de unión anti-CD19 humanizado comprende una secuencia seleccionada de un grupo que consiste en SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71 y SEQ ID NO:72, o una secuencia conuna identidad del 95-99% de las mismas. En una realización, el dominio de unión anti-CD19 humanizado es un scFv, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos descrita aquí, por ejemplo, en la Tabla 3, se une a una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos descrita aquí, por ejemplo, en la Tabla 3, a través de un enlazador, por ejemplo, un enlazador descrito aquí. En una realización, el dominio de unión anti-CD19 humanizado incluye un enlazador (Gly4-Ser)n, en el que n es 1, 2, 3, 4, 5 o 6, preferiblemente 3 o 4 (SEQ ID NO:53). La región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada de un scFv pueden estar, por ejemplo, en cualquiera de las siguientes orientaciones: región variable de cadena ligera-enlazador-región variable de cadena pesada, o región variable de cadena pesada-enlazador-región variable de cadena ligera.
En un aspecto, la porción del dominio de unión al antígeno comprende una o más secuencias seleccionadas de SEQ ID NOS:1-12. En un aspecto, el CAR humanizado se selecciona de una o más secuencias seleccionadas de SEQ ID NOS:31-42. En algunos aspectos, un anticuerpo no humano se humaniza, donde las secuencias o regiones específicas del anticuerpo se modifican para incrementar la similitud con un anticuerpo producido de forma natural en un ser humano o fragmento de este.
Un anticuerpo humanizado se puede producir usando una variedad de técnicas conocidas en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, injerto de CDR (véase, por ejemplo, la Patente Europea No. EP 239,400; Publicación Internacional No. WO 91/09967; y las Patentes U.S. N°s 5.225.539, 5.530.101 y 5.585.089), revestimiento o acondicionamiento (véanse, p. ej., las Patentes Europeas N°s EP 592.106 y EP 519.596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814; y Roguska et al.,1994, PNAS, 91:969-973), barajado de cadenas (véase, p. ej., la Pat. de EE.UU. N° 5.565.332) y técnicas descritas en, p. ej., la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N° US2005/0042664, la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N° US2005/0048617, la Pat. de EE. UU. N° 6.407.213, la Pat. de EE.UU. N.° 5766 886, Publicación Internacional N.° WO 9317105, Tan et al., J. Immunol., 169:1119-25 (2002), Caldas et al., Protein Eng., 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods, 20(3):267-79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem., 272(16):10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng., 9(10):895-904 (1996), Couto et al., Cancer Res., 55 (23 Sup):5973s-5977s (1995), Couto et al., Cancer Res., 55(8):1717-22 (1995), Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10 (1994) y Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235(3):959-73 (1994). A menudo, los residuos de marco en las regiones de marco se sustituirán con el residuo correspondiente del anticuerpo donante de CDR para alterar, por ejemplo, mejorar la unión a antígeno. Estas sustituciones de marco se identifican por métodos bien conocidos en la técnica, p. ej., modelando las interacciones de la CDR y los residuos de marco para identificar residuos de marco importantes para la unión al antígeno y la comparación secuencial para identificar residuos de marco inusuales en posiciones particulares. (Véase, por ejemplo, Queen et al., Patente U.S. N° 5.585.089; y Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323.)
Un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos que permanecen en él procedentes de una fuente que no es humana. A estos residuos de aminoácidos no humanos se les alude a menudo como residuos "importados", que típicamente se toman de un dominio variable "importado". Como se proporciona en esta memoria, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos humanizados comprenden una o más CDRs de moléculas de inmunoglobulina no humanas y regiones marco, en donde los residuos de aminoácidos que comprenden el marco se derivan completa o principalmente de la línea germinal humana. Múltiples técnicas para la humanización de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos son bien conocidas en la técnica y se pueden realizar esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), sustituyendo las CDRs o secuencias de CDR de roedores con las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano, es decir, injerto de CDR (documento EP 239.400; Publicación PCT N° WO 91/09967; y Pat. de EE.UU. N°s 4.816.567; 6.331.415; 5.225.539; 5.530.101; 5.585.089; 6.548.640). En anticuerpos y fragmentos de anticuerpos humanizados de este tipo, sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido con la secuencia correspondiente de una especie no humana. Los anticuerpos humanizados son a menudo anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de marco (FR) se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores. La humanización de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos también se puede lograr mediante recubrimiento o acondicionamiento (documentos EP 592,106; EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994); y Roguska et al., PNAS, 91:969-973 (1994)) o barajado de cadenas (Pat. de EE.UU. N.° 5565 332).
La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, que se pueden utilizar en la producción de los anticuerpos humanizados es para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el denominado método de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se criba frente a toda la colección de secuencias conocidas de dominio variable humano. La secuencia humana más cercana a la del roedor se acepta entonces como el armazón (FR) humano para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Otro método utiliza un armazón particular derivado de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. Se puede utilizar el mismo armazón para diferentes anticuerpos humanizados (véanse, por ejemplo, Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997); Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. UsA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)). En algunas realizaciones, la región marco, por ejemplo, las cuatro regiones marco, de la región variable de la cadena pesada derivan de una secuencia de línea germinal VH4_4-59. En una realización, la región marco puede comprender una, dos, tres, cuatro o cinco modificaciones, por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, del aminoácido en la secuencia murina correspondiente (por ejemplo, de SEQ ID NO:59). En una realización, la región marco, por ejemplo, las cuatro regiones marco de la región variable de la cadena ligera derivan de una secuencia de línea germinal VK3_1.25. En una realización, la región marco puede comprender una, dos, tres, cuatro o cinco modificaciones, por ejemplo, sustituciones, por ejemplo, del aminoácido en la secuencia murina correspondiente (por ejemplo, de SEQ ID NO:59).
En algunos aspectos, la porción de una composición de CAR de la invención que comprende un fragmento de anticuerpo se humaniza con retención de alta afinidad por el antígeno diana y otras propiedades biológicas favorables. Según un aspecto de la presente descripción, los anticuerpos humanizados y los fragmentos de anticuerpos se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y varios productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales están comúnmente disponibles y son familiares para los expertos en la técnica. Hay disponibles programas informáticos que ilustran y muestran probables estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias de inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. La inspección de estas exposiciones permite el análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, p. ej., el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata de unirse al antígeno diana. De esta manera, residuos de Fr pueden seleccionarse y combinarse a partir del receptor y las secuencias importadas, de modo que se logre el anticuerpo o la característica del fragmento de anticuerpo deseados, tal como una mayor afinidad por el antígeno diana. En general, los residuos de CDR están directa y más sustancialmente implicados en influir en la unión del antígeno.
Un anticuerpo humanizado o un fragmento de anticuerpo puede conservar una especificidad antigénica similar a la del anticuerpo original, por ejemplo, en la presente descripción, la capacidad de unirse a CD19 humano. En algunas realizaciones, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo humanizado puede tener una afinidad y/o especificidad mejoradas de unión a CD19 humana.
En un aspecto, el dominio de unión anti-CD19 se caracteriza por características o propiedades funcionales particulares de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. por ejemplo, en un aspecto, la parte de una composición de CAR de la presente descripción que comprende un dominio de unión a antígeno se une específicamente a CD19 humano. En un aspecto, el dominio de unión al antígeno tiene la misma o similar especificidad de unión al CD19 humano que el scFv de f Mc 63 descrito en Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997). En un aspecto, la presente descripción se refiere a un dominio de unión a antígeno que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, en el que el dominio de unión al anticuerpo se une específicamente a una proteína CD19 o fragmento de la misma, en el que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una cadena ligera variable y/o una cadena pesada variable que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1-12 o SEQ ID NO:59. En un aspecto, el dominio de unión al antígeno comprende una secuencia de aminoácidos de un scFv seleccionada de SEQ ID NO:1-12 o SEQ ID NO:59. En ciertos aspectos, el scFv es contiguo y está en el mismo marco de lectura que una secuencia líder. En un aspecto, la secuencia conductora es la secuencia polipeptídica proporcionada como SEQ ID NO: 13.
En un aspecto, el dominio de unión anti-CD19 es un fragmento, p. ej., un fragmento variable de cadena sencilla (scFv). En un aspecto, el dominio de unión anti-CD19 es un anticuerpo híbrido Fv, un Fab, un (Fab')2, o un anticuerpo híbrido bifuncional (por ejemplo, biespecífico) (por ejemplo, Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)). En un aspecto, los anticuerpos y fragmentos de los mismos de la presente descripción se unen a una proteína CD19 con afinidad mejorada o de tipo salvaje.
En algunos casos, los scFv se pueden preparar de acuerdo con un método conocido en la técnica (véanse, por ejemplo, Bird et al., (1988) Science 242:423-426 y Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Las moléculas de ScFv se pueden producir enlazando regiones VH y VL entre sí utilizando conectores polipeptídicos flexibles. Las moléculas de scFv comprenden un enlazador (p. ej., un enlazador de Ser-Gly) con una longitud y/o composición de aminoácidos optimizadas. La longitud del enlazador puede afectar en gran medida cómo las regiones variables de un scFv se pliegan e interactúan. De hecho, si se emplea un enlazador polipeptídico corto (p. ej., entre 5-10 aminoácidos) se evita el plegamiento intracadena. También se requiere el plegamiento entre cadenas para unir las dos regiones variables para formar un sitio de unión de epítopo funcional. Para consultar ejemplos de orientación del conector y tamaño, véanse, por ejemplo, Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448, Publicaciones de Solicitud de Patente de EE. UU. N.os 2005/0100543, 2005/0175606, 2007/0014794 y publicaciones de PCT N.os WO2006/020258 y WO2007/024715.
Un scFv puede comprender un enlazador de al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 , 30, 35, 40, 45, 50 o más restos de aminoácidos entre sus regiones VL y VH. La secuencia de enlazador puede comprender cualquier aminoácido que se produce de forma natural. En algunas realizaciones, la secuencia de enlazador comprende los aminoácidos glicina y serina. En otra realización, la secuencia de enlazador comprende conjuntos de repeticiones de glicina y serina tales como (Gly4Ser)n, en donde n es un número entero positivo igual o mayor que 1 (SEQ ID NO: 18). En una realización, el enlazador puede ser (Gly4Ser)4 (SEQ ID NO:106) o (Gly4Ser)3 (SEQ ID NO:107). La variación en la longitud del enlazador puede retener o mejorar la actividad, dando lugar a una eficacia superior en los estudios de actividad.
En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del dominio de unión al antígeno (u otras porciones o el CAR completo) puede modificarse, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos descrita aquí puede modificarse, por ejemplo, mediante una sustitución conservadora. En la técnica se han definido las familias de residuos aminoacídicos que tienen cadenas laterales similares, que incluyen las cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales con ramificaciones en la posición beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).
El porcentaje de identidad en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias polipeptídicas, se refiere a dos o más secuencias que son iguales. Dos secuencias son «sustancialmente idénticas» si las dos secuencias tienen un porcentaje especificado de residuos aminoacídicos o nucleotídicos que son iguales (por ejemplo, una identidad de un 60%, opcionalmente una identidad de un 70%, 71%. 72%. 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%,81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% a lo largo de una región especificada o, cuando no se especifique, a lo largo de toda la secuencia), cuando se comparan y se alinean para conseguir una correspondencia máxima en una ventana de comparación, o región designada según se mide utilizando uno de los algoritmos de comparación de secuencias siguientes o por alineamiento manual e inspección visual. Opcionalmente, la identidad existe a lo largo de una región que tiene una longitud de al menos aproximadamente 50 nucleótidos (o 10 aminoácidos), o más preferentemente a lo largo de una región que tiene una longitud de 100 a 500 o 1000 o más nucleótidos (o 20, 50, 200 o más aminoácidos).
Para la comparación de secuencias, habitualmente una secuencia actúa como secuencia de referencia respecto a la cual se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se ingresan en una computadora, se designan coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan parámetros del programa del algoritmo de secuencia. Se pueden utilizar parámetros de programa predeterminados o se pueden designar parámetros alternativos. A continuación, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidades de secuencia para las secuencias de prueba en relación con la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa. Los métodos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. El alineamiento óptimo de secuencias para la comparación se puede realizar, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, (1970) Adv Appl. Math. 2: 482c, por el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443, por el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, mediante implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software de genética de Wisconsin, Grupo computacional de genética, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante alineamiento manual e inspección visual (remítase, por ejemplo, a Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology).
Dos ejemplos de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad secuencial y similitud secuencial son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, los cuales se describen en Altschul et al. (1977) Nuc. Acids Res.
25:3389-3402; y Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. El software para realizar análisis BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller 1988, Comput. Appl. Biosci. 4: 11-17) que se ha incorporado al programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de restos de peso PAM120, una penalización de longitud de espacio de 12 y una penalización de espacio de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 444-453) que ha sido incorporado al programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en www.gcg.com), utilizando una matriz Blossom 62 o una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
En un aspecto, la presente divulgación contempla modificaciones de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo o fragmento (por ejemplo, scFv) de partida que generan moléculas equivalentes desde un punto de vista funcional. por ejemplo, el VH o VL de un dominio de unión anti-CD19, por ejemplo, scFv, comprendido en el CAR se puede modificar para retener al menos alrededor de 70%, 71%. 72%. 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%,81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de la región marco de VH o VL de partida del dominio de unión anti-CD19, por ejemplo, scFv. La presente descripción contempla modificaciones de la construcción CAR completa, por ejemplo, modificaciones en una o más secuencias de aminoácidos de los diversos dominios de la construcción CAR para generar moléculas funcionalmente equivalentes. La construcción de CAR se puede modificar para mantener una identidad de al menos aproximadamente un 70%, 71%. 72%. 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%,81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de la construcción de CAR de partida.
CAR biespecíficos
En una realización, una molécula de anticuerpo multiespecífico es una molécula de anticuerpo biespecífico. Un anticuerpo biespecífico tiene especificidad por dos antígenos como máximo. Una molécula de anticuerpo biespecífico está caracterizada por una primera secuencia del dominio variable de inmunoglobulina que tiene especificidad de unión por un primer epítopo y una segunda secuencia del dominio variable de inmunoglobulina que tiene especificidad de unión por un segundo epítopo. En un caso, el primer y segundo epítopos están en el mismo antígeno, por ejemplo, la misma proteína (o subunidad de una proteína multimérica). En una realización, el primer y segundo epítopos se superponen. En una realización, el primer y segundo epítopos no se superponen. En un caso, el primer y segundo epítopos se encuentran en diferentes antígenos, por ejemplo, diferentes proteínas (o diferentes subunidades de una proteína multimérica). En una realización, una molécula de anticuerpo biespecífico comprende una secuencia del dominio variable de la cadena pesada y una secuencia del dominio variable de la cadena ligera que tienen especificidad de unión por un primer epítopo y una secuencia del dominio variable de la cadena pesada y una secuencia del dominio variable de la cadena ligera que tienen especificidad de unión por un segundo epítopo. En una realización, una molécula de anticuerpo biespecífico comprende medio anticuerpo que tiene especificidad de unión por un primer epítopo y medio anticuerpo que tiene especificidad de unión por un segundo epítopo. En una realización, una molécula de anticuerpo biespecífico comprende medio anticuerpo, o un fragmento de este, que tiene especificidad de unión por un primer epítopo y medio anticuerpo, o un fragmento de este, que tiene especificidad de unión por un segundo epítopo. En una realización, una molécula de anticuerpo biespecífico comprende un scFv, o un fragmento de este, que tiene especificidad de unión por un primer epítopo y un scFv, o un fragmento de este, que tiene especificidad de unión por un segundo epítopo.
Dominio transmembrana
Con respecto al dominio transmembrana, en diversas realizaciones, un CAR se puede diseñar para que comprenda un dominio transmembrana que esté unido al dominio extracelular del CAR. Un dominio transmembrana puede incluir uno o más aminoácidos adicionales adyacentes a la región transmembrana, por ejemplo, uno o más aminoácidos asociados con la región extracelular de la proteína de la que deriva la transmembrana (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 hasta 15 aminoácidos de la región extracelular) y/o uno o más aminoácidos adicionales asociados con la región intracelular de la proteína de la que deriva la proteína transmembrana (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 hasta 15 aminoácidos de la región intracelular). En un aspecto, el dominio transmembrana es aquel que está asociado con uno de los otros dominios del CAR, por ejemplo, en una realización, el dominio transmembrana puede ser de la misma proteína de la que deriva el dominio de señalización, el dominio coestimulador o el dominio bisagra. En otro aspecto, el dominio transmembrana no deriva de la misma proteína de la que deriva cualquier otro dominio del CAR. En algunos casos, el dominio transmembrana se puede seleccionar o modificar por sustitución de aminoácidos para evitar la unión de dichos dominios a los dominios transmembrana de las mismas o diferentes proteínas de la membrana superficial, por ejemplo, para minimizar las interacciones con otros miembros del complejo receptor. En un aspecto, el dominio transmembrana es capaz de homodimerización con otro CAR en la superficie celular de una célula que expresa CAR. En un aspecto diferente, la secuencia de aminoácidos del dominio transmembrana puede modificarse o sustituirse para minimizar las interacciones con los dominios de unión de la pareja de unión nativa presente en la misma célula que expresa CAR.
El dominio transmembrana puede proceder de una fuente natural o recombinante. Cuando la fuente es natural, el dominio puede derivarse de cualquier proteína unida a la membrana o transmembrana. En un aspecto, el dominio transmembrana es capaz de señalizar al(a los) dominio(s) intracelular(es) cada vez que el CAR se ha unido a una diana. Un dominio transmembrana de uso particular en esta invención puede incluir al menos la región o regiones transmembrana de, por ejemplo, la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. En algunas realizaciones, un dominio transmembrana puede incluir al menos la(s) región(regiones) transmembrana de, por ejemplo, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKG2D, NKG2C.
En algunos casos, el dominio transmembrana se puede unir a la región extracelular del CAR, por ejemplo, el dominio de unión al antígeno del CAR, a través de una bisagra, por ejemplo, una bisagra de una proteína humana. por ejemplo, en una realización, la bisagra puede ser una bisagra de Ig (inmunoglobulina) humana, por ejemplo, una bisagra de IgG4, una bisagra de IgD), un enlazador GS (por ejemplo, un enlazador GS descrito aquí), una bisagra KIR2DS2 o una bisagra CD8a. En una realización, la bisagra o el espaciador comprende (por ejemplo, está constituido por) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14. En un aspecto, el dominio transmembrana comprende (por ejemplo, consiste en) un dominio transmembrana de SEQ ID NO:15.
En un aspecto, la bisagra o el espaciador comprende una bisagra de IgG4. por ejemplo, en una realización, la bisagra o espaciador comprende una bisagra de la secuencia de aminoácidos ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM (SEQ ID NO:45). En algunas realizaciones, la bisagra o el espaciador comprende una bisagra codificada por una secuencia de nucleótidos de
GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGG
ACCCAGCGT GTT CCT GTTCCCCCCC AAGCCC AAGGAC ACCCT GAT GATC AGCCGGA CCCCCGAGGTGACCT GT GT GGTGGT GGACGT GT CCC AGG AGGACCCCGAGGTCC A GTT CAACT GGT ACGT GGACGGCGTGGAGGT GC ACAACGCCAAGACCAAGCCCCGG GAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCA GGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCC AGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGG TGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGAC CTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAAC GGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCA GCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAA CGTCTTT AGCTGCT CCGT GAT GC ACG AGGCCCT GC AC AACCACT AC ACCC AG AAG A GCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG (SEQ ID NO:46).
En un aspecto, la bisagra o el espaciador comprende una bisagra de IgD. por ejemplo, en una realización, la bisagra o espaciador comprende una bisagra de la secuencia de aminoácidos RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAV QDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPS LPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTF WAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH (SEQ ID NO:47). En algunas realizaciones, la bisagra o el espaciador comprende una bisagra codificada por una secuencia de nucleótidos de AGGTGGCCCGAAAGTCCCAAGGCCCAGGCATCTAGTGTTCCTACTGCACAGCCCCA GGCAGAAGGCAGCCTAGCCAAAGCTACTACTGCACCTGCCACTACGCGCAATACT GGCCGTGGCGGGGAGGAGAAGAAAAAGGAGAAAGAGAAAGAAGAACAGGAAGA GAGGGAGACCAAGACCCCTGAATGTCCATCCCATACCCAGCCGCTGGGCGTCTATC TCTT G ACTCCCGCAGT AC AGG ACTT GT GGCTT AG AG AT AAGGCC ACCTTT AC AT GT TTCGTCGTGGGCTCTGACCTGAAGGATGCCCATTTGACTTGGGAGGTTGCCGGAAA GGTACCCACAGGGGGGGTTGAGGAAGGGTTGCTGGAGCGCCATTCCAATGGCTCT CAGAGCCAGCACTCAAGACTCACCCTTCCGAGATCCCTGTGGAACGCCGGGACCTC T GT CACAT GT ACTCT A A A T CATCCT AGCCT GCCCCC ACAGCGT CTGAT GGCCCTT AG AGAGCCAGCCGCCC AGGCACCAGTTAAGCTTAGCCT GAAT CT GCT CGCCAGTAGTG ATCCCCCAGAGGCCGCCAGCTGGCTCTTATGCGAAGTGTCCGGCTTTAGCCCGCCC AAC AT CTTGCT CAT GT GGCT GGAGG ACC AGCG AG AAG T G AAC AC C AGCGGCTT CG CTCCAGCCCGGCCCCCACCCCAGCCGGGTTCTACCACATTCTGGGCCTGGAGTGTC TTAAGGGT CCCAGCACC ACCT AGCCCCCAGCCAGCCAC ATACACCT GTGTT GT GT C CCATGAAGATAGCAGGACCCTGCTAAATGCTTCTAGGAGTCTGGAGGTTTCCTACG TGACTGACCATT (SEQ ID NO:48).
En un aspecto, el dominio transmembrana puede ser recombinante, en cuyo caso comprenderá predominantemente residuos hidrófobos, tales como leucina y valina. En un aspecto, se puede detectar un triplete de fenilalanina, triptófano y valina en cada uno de los extremos de un dominio transmembrana recombinante.
Opcionalmente, un conector oligo- o polipéptido corto, por ejemplo, de una longitud de entre 2 y 10 aminoácidos, puede formar la unión entre el dominio transmembrana y la región citoplasmática del CAR. Un doblete de glicina-serina proporciona un conector especialmente adecuado. por ejemplo, en un aspecto, el conector comprende la secuencia de aminoácidos de GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:49). En algunas realizaciones, el enlazador está codificado por una secuencia de nucleótidos de GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC (SEQ ID NO:50).
En un aspecto, la bisagra o el espaciador comprende una bisagra de KIR2DS2.
Dominio citoplasm ático
El dominio o región citoplasmático del CAR incluye un dominio de señalización intracelular. Un dominio de señalización intracelular es generalmente responsable de la activación de al menos una de las funciones efectoras normales de la célula inmune en la que ha sido introducido el CAR. La expresión "función efectora" se refiere a una función especializada de una célula. La función efectora de un linfocito T, por ejemplo, puede ser actividad citolítica o actividad auxiliar, incluida la secreción de citocinas. Por lo tanto, la expresión "dominio de señalización intracelular" se refiere a la porción de una proteína que transduce la señal de la función efectora y dirige a la célula para realizar una función especializada. Aunque generalmente se puede emplear todo el dominio de señalización intracelular, en muchos casos no es necesario utilizar la cadena completa. En la medida en que se utilice una porción truncada del dominio de señalización intracelular, dicha porción truncada se puede utilizar en lugar de la cadena intacta, siempre que transduzca la señal de la función efectora. Se pretende, por tanto, que la expresión dominio de señalización intracelular incluya cualquier porción truncada del dominio de señalización intracelular suficiente para transducir la señal de función efectora.
Ejemplos de dominios de señalización intracelular para uso en el CAR de la presente descripción incluyen las secuencias citoplasmáticas del receptor de células T (TCR) y co-receptores que actúan en conjunto para iniciar la transducción de señales después de la participación del receptor de antígeno, así como cualquier derivado o variante de estas secuencias y cualquier secuencia recombinante que tenga la misma capacidad funcional.
Se sabe que las señales generadas a través del TCR solo son insuficientes para una activación completa del linfocito T y que también se requiere una señal secundaria y/o coestimuladora. Por lo tanto, se puede decir que la activación de los linfocitos T está mediada por dos clases distintas de secuencias de señalización citoplasmáticas: las que inician la activación primaria dependiente del antígeno a través del TCR (dominios de señalización intracelular primaria) y las que actúan de manera independiente del antígeno para proporcionar una señal secundaria o coestimuladora (dominio citoplasmático secundario, por ejemplo, un dominio coestimulador).
Un dominio de señalización primaria regula la activación primaria del complejo TCR, ya sea de manera estimuladora o inhibidora. Los dominios de señalización intracelular primaria que actúan de manera estimuladora pueden contener motivos de señalización que se conocen como motivos de activación basados en tirosina de inmunorreceptores o ITAM.
Ejemplos de ITAM que contienen dominios de señalización intracelular primarios que son de uso particular en la invención incluyen los de CD3 zeta, FcR gamma común (FCER1G), Fc gamma RIIa, FcR beta (Fc Epsilon R1b), CD3 gamma, CD3 delta, CD3 épsilon, CD79a, CD79b, DAP10 y DAP12. En un caso, un CAR de la presente descripción comprende un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización primario de CD3-zeta.
En una realización, un dominio de señalización primaria comprende un dominio ITAM modificado, por ejemplo, un dominio ITAM mutado que tiene una actividad alterada (por ejemplo, incrementada o disminuida) en comparación con el dominio ITAM nativo. En una realización, un dominio de señalización primaria comprende un dominio de señalización intracelular primaria que contiene ITAM modificado, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primaria que contiene ITAM optimizado y/o truncado. En una realización, un dominio de señalización primaria comprende uno, dos, tres, cuatro o más motivos ITAM.
Otros ejemplos de moléculas que contienen un dominio de señalización primaria que son de uso particular en la invención incluyen aquellos de DAP10, Da P12 y CD32.
El dominio de señalización intracelular del CAR puede comprender el dominio de señalización CD3-zeta por sí mismo, o puede combinarse con cualquier otro dominio o dominios de señalización intracelular deseados útiles en el contexto de un CAR de la presente descripción. por ejemplo, el dominio de señalización intracelular del CAR puede comprender una porción de cadena CD3-zeta y un dominio de señalización co-estimulante. El dominio de señalización coestimulador se refiere a una porción del CAR que comprende el dominio intracelular de una molécula coestimuladora. Una molécula coestimuladora es una molécula de la superficie celular distinta de un receptor de antígeno o sus ligandos que se requiere para una respuesta eficaz de linfocitos frente a un antígeno. Ejemplos de moléculas de este tipo incluyen CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD1, ICOS, antígeno asociado a la función linfocítica-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, y un ligando que se une específicamente con CD83, y similares. por ejemplo, se ha demostrado que la coestimulación de CD27 potencia la expansión, función efectora y supervivencia de linfocitos CART humanos in vitro y aumenta la persistencia de linfocitos T humanos y actividad antitumoral in vivo (Song et al. Blood. 2012; 119(3):696-706). Otros ejemplos de tales moléculas coestimuladoras incluyen CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHt R), SLAMf 7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (táctil), NKG2D, CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp y CD19a.
Las secuencias de señalización intracelular dentro de la porción citoplásmica del CAR de la presente descripción se pueden unir entre sí en un orden aleatorio o especificado. Opcionalmente, un enlazador oligo- o polipeptídico corto, por ejemplo, entre 2 y 10 aminoácidos (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos) de longitud puede formar el enlace entre secuencia de señalización intracelular. En una realización, se puede utilizar un doblete de glicina-serina como un conector adecuado. En una realización, se puede utilizar un único aminoácido, por ejemplo, una alanina, una glicina, como un conector adecuado.
En un aspecto, el dominio de señalización intracelular está diseñado para comprender dos o más, por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o más, dominios de señalización coestimuladores. En una realización, los dos o más, por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o más dominios de señalización coestimuladores, están separados por una molécula conectora, por ejemplo, una molécula conectora descrita en la presente. En una realización, el dominio de señalización intracelular comprende dos dominios de señalización coestimuladores. En algunas realizaciones, la molécula conectora es un residuo de glicina. En algunas realizaciones, el conector es un residuo de alanina.
En un aspecto, el dominio de señalización intracelular está diseñado para comprender el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de CD28. En un aspecto, el dominio de señalización intracelular está diseñado para comprender el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de 4-1BB. En un aspecto, el dominio de señalización de 4-1BB es un dominio de señalización de SEQ ID NO:16. En un aspecto, el dominio de señalización de CD3-zeta es un dominio de señalización de SEQ ID NO:17.
En un aspecto, el dominio de señalización intracelular está diseñado para comprender el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de CD27. En un aspecto, el dominio de señalización de CD27 comprende una secuencia de aminoácidos de QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP (SEQ ID NO: 51). En un aspecto, el dominio de señalización de CD27 está codificado por una secuencia de ácido nucleico de AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCC
GCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCA
GCCTATCGCTCC (SEQ ID NO:52).
En un aspecto, la célula que expresa CAR descrita aquí puede comprender además un segundo CAR, por ejemplo, un segundo CAR que incluye un dominio de unión a antígeno diferente, por ejemplo, a la misma diana (CD19) o una diana diferente (por ejemplo, CD123 o mesotelina). En una realización, cuando la célula que expresa CAR comprende dos o más CAR diferentes, los dominios de unión a antígeno de los diferentes CAR pueden ser tales que los dominios de unión a antígeno no interaccionen entre sí. por ejemplo, una célula que expresa un primer y un segundo CAR puede tener un dominio de unión al antígeno del primer c A r , por ejemplo, como un fragmento, por ejemplo, un scFv, que no forma una asociación con el dominio de unión al antígeno del segundo CAR, por ejemplo, el dominio de unión al antígeno del segundo CAR es un VHH.
En otro caso, la célula que expresa CAR descrita en la presente puede expresar además otro agente, por ejemplo, un agente que potencia la actividad de una célula que expresa CAR. por ejemplo, en un caso, el agente puede ser un agente que inhibe una molécula inhibidora. Las moléculas inhibidoras, por ejemplo, PD1, pueden, en algunos casos, disminuir la capacidad de una célula que expresa CAR de organizar una respuesta efectora inmunitaria. Ejemplos de moléculas inhibidoras incluyen PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, T iGIT, LAIR1, CD160, 2B4 y TGFR beta. En un caso, el agente que inhibe una molécula inhibidora comprende un primer polipéptido, por ejemplo, una molécula inhibidora, asociado con un segundo polipéptido que proporciona una señal positiva a la célula, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular descrito en la presente. En un caso, el agente comprende un primer polipéptido, por ejemplo, de una molécula inhibidora tal como PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 o TGFR beta, o un fragmento de cualquiera de estas (por ejemplo, al menos una parte de un dominio extracelular de cualquiera de estas), y un segundo polipéptido que es un dominio de señalización intracelular descrito aquí (por ejemplo, que comprende un dominio coestimulador (por ejemplo, 41BB, CD27 o CD28, por ejemplo, como se describe aquí) y/o un dominio de señalización primario (por ejemplo, un dominio de señalización de CD3 zeta descrito aquí). En un caso, el agente comprende un primer polipéptido de PD1 o un fragmento de este (por ejemplo, al menos una porción de un dominio extracelular de PD1) y un segundo polipéptido de un dominio de señalización intracelular descrito en la presente (por ejemplo, un dominio de señalización de CD28 descrito en la presente y/o un dominio de señalización de CD3 zeta tal como se describe en la presente). PD1 es un miembro inhibidor de la familia de receptores CD28 que también incluye CD28, CTLA-4, ICOS y BTLA. PD-1 se expresa en linfocitos B activados, linfocitos T y células mieloides (Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75). Se ha mostrado que dos ligandos para PD1, PD-L1 y PD-L2 reducen de manera regulada la activación de linfocitos T tras unirse a PD1 (Freeman et al. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43). PD-L1 es abundante en los cánceres humanos (Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cáncer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cáncer Res 10:5094). La supresión inmunitaria puede invertirse inhibiendo la interacción local de PD1 con PD-L1.
En un caso, el agente comprende el dominio extracelular (ECD, por sus siglas en inglés) de una molécula inhibidora, por ejemplo, muerte programada 1 (PD1, por sus siglas en inglés) se puede fusionar a un dominio transmembrana y dominios de señalización intracelular tales como 41BB y CD3 zeta (también denominado en la presente CAR PD1). En un caso, el PD1 CAR, cuando se usa en combinación con un CD19 CAR descrito aquí, mejora la persistencia de la célula T. En un caso, el CAR es un CAR de PD1 que comprende el dominio extracelular de p D1 indicado como subrayado en SEQ ID NO:121. En un caso, el CAR PD1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:121.
MalnvtalllnlalllhaarnngwfldsndrnwnnntfsDallvvtcgdnatftcsfsntscsfvlnwvrmsnsnatdk laafpedrsqpgqdcrfrvtq lpngrdfhm svvrarm dsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtl vtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacd iyiw aplagtcgvlllslv itlyckrgrkklly ifkqpfm rpvqttq
eed gcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlyneln lgrreeydvldkrrgrdpem ggkprrknpqeglynelqkdk
m aeayseigm kgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhm qalppr (SE Q ID N O : 121).
En un caso, el CAR PD1 comprende la secuencia de aminoácidos que se proporciona a continuación (SEQ ID NO:119).
pgw fldspdrpw npptfspallvvtegdnatftcsfsn tsesfv lnw vrm spsnqtdk laafpedrsqpgqdcrfrvt
qlpngrdfhm svvrarm dsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspspipagqfqtlvtttpapipptpaptiasqpl
slrpeacrp aaggavh trg ld facd iy iw ap lagtcgv llls lv itlyck rgrk k lly ifk q p fm rp vq ttq eed gcscrfpeeeeggcel rvkfsrsadapaykqgqnqlyneln lgrreeydvldkrrgrdpem ggkprrknpqeglynelqkdkm aeayseigm kgerrrgk ghdglyqglstatkdtydalhm qalppr (SE Q ID N O : 119).
En un caso, el agente comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el CAR PD1, por ejemplo, el CAR PD1 descrito en la presente. En un caso, la secuencia de ácido nucleico para el PD1 CAR se muestra a continuación, con el PD1 ECD subrayado a continuación en SEQ ID NO:120
atggccctccc tg tca ctg ccctg cttc tccccctcg ca ctcc tg ctcca cg ccg cta g a cca cccggatggtttctggac
tc tccg g atcgcccgtggaatcccccaaccttctcaccggcactcttgg ttg tgactgagggcgataatgcgaccttcacgtgctcg ttctc
ca a cacctccgaatca ttcg tgctgaactggtaccgcatgagcccgtcaaaccagaccgacaagctcgccgcgtttccggaagatcggt
cgca a ccg g g a ca g g a ttg tcg g ttccg cg tg a ctca a ctg ccg a a tg g ca g a g a cttcca ca tg a g cg tg g tccg cg cta g g cg a a a
cga ctccg g g a ccta cctg tg cg g a g cca tctcg ctg g cg ccta a g g ccca a a tca a a g a g a g cttg a g g g ccg a a ctg a g a g tg a c
cg a g cg ca g a g ctg a g g tg cca a ctg ca ca tcca tcccca tcg cctcg g cctg cg g g g ca g tttca g a ccctg g tcacgaccactccg
g cg ccg cg ccca ccg a c tccg g cc cca a c ta tcg cg a g cca g cccc tg tcg c tg a g g ccg g a a g ca tg ccg cc c tg ccg ccg g a g g
tgctg tgcatacccggggattggacttcgcatgcgacatctacatttgggctcctctcgccggaacttg tggcgtgctccttctg tccctggt catcaccctgtactgcaagcggggtcggaaaaagcttctg tacattttcaagcagcccttca tgaggcccgtgcaaaccacccaggagga
g g a cg g ttg ctcctg ccg g ttccccg a a g a g g a a g a a g g a g g ttg cg a g ctg cg cg tg a a g ttc tcccg g a g cg ccg a cg cccccg c
cta taag ca g g g cca g a a cca g ctg ta ca a cg a a ctg a a cctg g g a cg g cg g g a a g a g ta cg a tg tg ctg g a ca a g cg g cg cg g cc
g g g a ccccg a a a tg g g cg g g a a g ccta g aagaaagaaccctcaggaaggcctg ta taacgagctgcagaaggacaagatggccga
g g cc ta c tccg a a a ttg g g a tg a a g g g a g a g cg g cg g a g g g g a a a g g g g ca cg a cg g cctg ta cca a g g a ctg tcca ccg cca cc
a a g g a ca ca ta cg a tg ccctg ca ca tg ca g g cccttccccctcg c (SE Q ID N O : 120).
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona una población de células que expresan CAR, p. ej., células CART. En algunos casos, la población de células que expresan CAR comprende una mezcla de células que expresan diferentes CAR. por ejemplo, en un caso, la población de células que expresan CAR puede incluir una primera célula que expresa un CAR que tiene un dominio de unión anti-CD19 descrito aquí, y una segunda célula que expresa un CAR que tiene un dominio de unión anti-CD19 diferente, por ejemplo, un dominio de unión anti-CD19 descrito aquí que difiere del dominio de unión anti-CD19 en el CAR expresado por la primera célula. Como otro ejemplo, la población de células que expresan CAR puede incluir una primera célula que expresa un CAR que incluye un dominio de unión anti-CD19, por ejemplo, como se describe aquí, y una segunda célula que expresa un CAR que incluye un dominio de unión de antígeno a una diana distinta de CD19 (por ejemplo, CD123). En un caso, la población de células que expresan CAR incluye, por ejemplo, una primera célula que expresa un CAR que incluye un dominio de señalización intracelular primario, y una segunda célula que expresa un CAR que incluye un dominio de señalización secundario.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona una población de células en la que al menos una célula de la población expresa un CAR que tiene un dominio de unión anti-CD19 descrito aquí, y una segunda célula que expresa otro agente, por ejemplo, un agente que mejora la actividad de una célula que expresa CAR. por ejemplo, en un caso, el agente puede ser un agente que inhibe una molécula inhibidora. Las moléculas inhibidoras, por ejemplo, pueden, en algunas realizaciones, disminuir la capacidad de una célula que expresa CAR de organizar una respuesta efectora inmunitaria. Ejemplos de moléculas inhibidoras incluyen PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, T iGIT, LAIR1, CD160, 2B4 o TGFR beta. En un caso, el agente que inhibe una molécula inhibidora comprende un primer polipéptido, por ejemplo, una molécula inhibidora, asociado con un segundo polipéptido que proporciona una señal positiva a la célula, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular descrito en la presente. En un caso, el agente comprende un primer polipéptido, por ejemplo, de una molécula inhibidora tal como PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 o TGFR beta, o un fragmento de cualquiera de estas (por ejemplo, al menos una parte de un dominio extracelular de cualquiera de estas), y un segundo polipéptido que es un dominio de señalización intracelular descrito aquí (por ejemplo, que comprende un dominio coestimulador (por ejemplo, 41BB, CD27 o CD28, por ejemplo, como se describe aquí) y/o un dominio de señalización primario (por ejemplo, un dominio de señalización de CD3 zeta descrito aquí). En un caso, el agente comprende un primer polipéptido de p D1 o un fragmento de este (por ejemplo, al menos una porción del dominio extracelular de PD1) y un segundo polipéptido de un dominio de señalización intracelular descrito en la presente (por ejemplo, un dominio de señalización de CD28 descrito en la presente y/o un dominio de señalización de CD3 zeta como los descritos en la presente).
Receptores de antígenos quiméricos regulables
En algunas realizaciones, un CAR regulable (RCAR) donde la actividad CAR se puede controlar es deseable para optimizar la seguridad y eficacia de una terapia con CAR. Existen muchas maneras de regular las actividades de CAR. por ejemplo, se puede utilizar apoptosis inducible, usando, por ejemplo, una caspasa fusionada a un dominio de dimerización (véase, por ejemplo, Di Stasa et al., N Engl. J. Med. 2011 Nov. 3; 365(18):1673-1683), como conmutador de seguridad en la terapia de CAR de la presente invención. En un caso, las células (por ejemplo, células T o células NK) que expresan un CAR de la presente descripción comprenden además un conmutador de apoptosis inducible, en el que una caspasa humana (por ejemplo, caspasa 9) o una versión modificada se fusiona con una modificación de la proteína FKB humana que permite la dimerización condicional. En presencia de una molécula pequeña, tal como un rapalog (por ejemplo, AP 1903, AP20187), la caspasa inducible (por ejemplo, caspasa 9) se activa y conduce a la rápida apoptosis y muerte de las células (por ejemplo, células T o células Nk ) que expresan un CAR de la presente descripción. Se han descrito ejemplos de un conmutador de apoptosis inducible basado en caspasa (o uno o más aspectos de dicho conmutador) en, por ejemplo, US2004040047; US20110286980; US20140255360; WO1997031899; WO2014151960; WO2014164348; WO2014197638; WO2014197638.
En un aspecto, un RCAR comprende un conjunto de polipéptidos, típicamente dos en los casos más simples, en los que los componentes de un CAR estándar descrito aquí, por ejemplo, un dominio de unión a antígeno y un dominio de señalización intracelular, se dividen en polipéptidos o miembros separados. En algunos casos, el conjunto de polipéptidos incluye un interruptor de dimerización que, cuando está presente una molécula de dimerización, puede acoplar los polipéptidos entre sí, por ejemplo, puede acoplar un dominio de unión al antígeno con un dominio de señalización intracelular. En un caso, los CAR de la presente descripción usan un conmutador de dimerización como los descritos en, por ejemplo, WO2014127261.
En un aspecto, un RCAR comprende dos polipéptidos o miembros: 1) un miembro de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primario descrito aquí, y un primer dominio de conmutación; 2) un miembro de unión a antígeno que comprende un dominio de unión a antígeno, por ejemplo, que se dirige contra CD19, como se describe aquí, y un segundo dominio de conmutación. Opcionalmente, el RCAR comprende un dominio transmembrana descrito en la presente. En un caso, se puede disponer un dominio transmembrana en el miembro de señalización intracelular, o el miembro de unión al antígeno, o en ambos. (A menos que se indique lo contrario, cuando se describen en la presente miembros o elementos de un RCAR, el orden puede ser según se proporciona, pero también se incluyen otros órdenes. Dicho de otra manera, en un caso el orden es tal como se expone en el texto, pero en otros casos el orden puede ser diferente. por ejemplo, el orden de los elementos en un lado de una región transmembrana puede ser diferente del ejemplo, por ejemplo, la ubicación de un dominio de conmutación con respecto a un dominio de señalización intracelular puede ser diferente, por ejemplo, invertida).
En un caso, el primer y segundo dominios de tipo interruptor pueden formar un interruptor de dimerización intracelular o extracelular. En un caso, el interruptor de dimerización puede ser un interruptor de homodimerización, por ejemplo, donde el primer y segundo dominio de dimerización son idénticos, o un interruptor de heterodimerización, por ejemplo, donde el primer y segundo dominios de dimerización son diferentes entre sí.
En casos, un RCAR puede comprender un «multiinterruptor». Un multiinterruptor puede comprender dominios de tipo interruptor de heterodimerización o dominios de tipo interruptor de homodimerización. Un multiinterruptor comprende una pluralidad de, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, dominios de tipo interruptor, independientemente, en un primer miembro, por ejemplo, un miembro de unión al antígeno, y un segundo miembro, por ejemplo, un miembro de señalización intracelular. En un caso, el primer miembro puede comprender una pluralidad de primeros dominios de tipo interruptor, por ejemplo, dominios de tipo interruptor basados en FKBP, y un segundo miembro puede comprender una pluralidad de segundos dominios de tipo interruptor, por ejemplo, dominios de tipo interruptor basados en f Rb . En un caso, el primer miembro puede comprender un primer y un segundo dominio de tipo interruptor, por ejemplo, un dominio de tipo interruptor basado en FKBP y un dominio de tipo interruptor basado en FRB, y el segundo miembro puede comprender un primer y un segundo dominio de tipo interruptor, por ejemplo, un dominio de tipo interruptor basado en FKBP y un dominio de tipo interruptor basado en FRB.
En un caso, el miembro de señalización intracelular comprende uno o más dominios de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primaria y uno o más dominios de señalización coestimuladores.
En un caso, el miembro de unión al antígeno puede comprender uno o más dominios de señalización intracelular, por ejemplo, uno o más dominios de señalización coestimuladores. En un caso, el miembro de unión al antígeno comprende una pluralidad, por ejemplo, 2 o 3 dominios de señalización coestimuladores descritos en la presente, por ejemplo, seleccionados entre 41BB, CD28, CD27, ICOS y OX40, y en casos, ningún dominio de señalización intracelular primaria. En un caso, el miembro de unión al antígeno comprende los siguientes dominios de señalización coestimuladores, en dirección de extracelular a intracelular: 41BB-CD27; 41BB-CD27; CD27-41BB; 41BB-CD28; CD28-41BB; OX40-CD28; CD28-OX40; CD28-41BB; o 41BB-CD28. En tales casos, el miembro de unión intracelular comprende un dominio CD3zeta. En un caso de este tipo, el RCAR comprende (1) un miembro de unión al antígeno que comprende un dominio de unión al antígeno, un dominio transmembrana y dos dominios coestimuladores y un primer dominio de tipo interruptor; y (2) un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio transmembrana o dominio de fijación a la membrana y al menos un dominio de señalización intracelular primaria, y un segundo dominio de tipo interruptor.
Un caso proporciona RCAR donde el miembro de unión al antígeno no está fijado a la superficie de la célula CAR. Esto permite que una célula que tiene un miembro de señalización intracelular se empareje convenientemente con uno o más dominios de unión al antígeno, sin transformar la célula con una secuencia que codifica el miembro de unión al antígeno. En tales casos, el RCAR comprende: 1) un miembro de señalización intracelular que comprende: un primer dominio de tipo interruptor, un dominio transmembrana, un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primaria, y un primer dominio de tipo interruptor; y 2) un miembro de unión al antígeno que comprende: un dominio de unión al antígeno, y un segundo dominio de tipo interruptor, donde el miembro de unión al antígeno no comprende un dominio transmembrana o dominio de fijación a la membrana y, opcionalmente, no comprende un dominio de señalización intracelular. En algunos casos, el RCAR puede comprender además 3) un segundo miembro de unión al antígeno que comprende: un segundo dominio de unión al antígeno, por ejemplo, un segundo dominio de unión al antígeno que se une a un antígeno diferente del que se une al dominio de unión al antígeno; y un segundo dominio de tipo interruptor.
También se proporcionan en la presente RCAR donde el miembro de unión al antígeno comprende capacidad de activación y direccionamiento biespecíficas. En este caso, el miembro de unión al antígeno puede comprender una pluralidad, por ejemplo, 2, 3, 4 o 5 dominios de unión al antígeno, por ejemplo, scFv, donde cada dominio de unión al antígeno se une a un antígeno diana, por ejemplo, antígenos diferentes o el mismo antígeno, por ejemplo, el mismo o diferentes epítopos en el mismo antígeno. En un caso, la pluralidad de dominios de unión al antígeno están en tándem, y opcionalmente, se dispone un conector o región de bisagra entre cada uno de los dominios de unión al antígeno. En la presente se describen conectores y región de bisagra adecuados.
Un caso proporciona RCAR que tienen una configuración que permite realizar un cambio de la proliferación. En este caso, el RCAR comprende: 1) un miembro de señalización intracelular que comprende: opcionalmente, un dominio transmembrana o dominio de anclaje a la membrana; uno o más dominios de señalización coestimuladores, por ejemplo, seleccionados entre 41BB, CD28, CD27, ICOS y OX40, y un dominio de tipo interruptor; y 2) un miembro de unión al antígeno que comprende: un dominio de unión al antígeno, un dominio transmembrana, y un dominio de señalización intracelular primaria, por ejemplo, un dominio de CD3zeta, donde el miembro de unión al antígeno no comprende un dominio de tipo interruptor, o no comprende un dominio de tipo interruptor que dimeriza con un dominio de tipo interruptor en el miembro de señalización intracelular. En un caso, el miembro de unión al antígeno no comprende un dominio de señalización coestimulador. En un caso, el miembro de señalización intracelular comprende un dominio de tipo interruptor de un interruptor de homodimerización. En un caso, el miembro de señalización intracelular comprende un primer dominio de tipo interruptor de un interruptor de heterodimerización y el RCAR comprende un segundo miembro de señalización intracelular que comprende un segundo dominio de tipo interruptor del interruptor de heterodimerización. En tales casos, el segundo miembro de señalización intracelular comprende los mismos dominios de señalización intracelular que el miembro de señalización intracelular. En un caso, el interruptor de dimerización es intracelular. En un caso, el interruptor de dimerización es extracelular.
En cualquiera de las configuraciones RCAR descritas en la presente, el primer y segundo dominios de tipo interruptor comprenden un interruptor basado en FKBP-FRB tal como se describe en la presente.
También se proporcionan en la presente células que comprenden un RCAR descrito en la presente. Se puede utilizar cualquier célula que se modifica para expresar un RCAR como una célula RCARX. En un caso, la célula Rc ARX es un linfocito T y se denomina linfocito RCART. En un caso, la célula RCARX es un linfocito NK y se denomina célula RCARN. También se proporcionan en la presente ácidos nucleicos y vectores que comprenden secuencias que codifican RCAR. Las secuencias que codifican diversos elementos de un RCAR se pueden disponer en la misma molécula de ácido nucleico, por ejemplo, el mismo plásmido o vector, por ejemplo, vector vírico, por ejemplo, vector lentivírico. En un caso, (i) una secuencia que codifica un miembro de unión al antígeno y (ii) una secuencia que codifica un miembro de señalización intracelular pueden estar presentes en el mismo ácido nucleico, por ejemplo, vector. La producción de las correspondientes proteínas se puede lograr, por ejemplo, mediante el uso de promotores separados, o mediante el uso de un producto de transcripción bicistrónico (que puede dar como resultado la producción de dos proteínas mediante la escisión de un único producto de traducción o mediante la traducción de dos productos proteicos separados). En un caso, se dispone entre (i) y (ii) una secuencia que codifica un péptido escindible, por ejemplo, secuencia P2A o F2A. En un caso, se dispone entre (i) y (ii) una secuencia que codifica un IRES, por ejemplo, un EMCV o EV71 IRES. En estos casos, (i) y (ii) se transcriben como un ARN único. En un caso, un primer promotor está ligado operablemente a (i) y un segundo promotor está ligado operablemente a (ii), de modo que (i) y (ii) se transcriben como ARNm separados.
Como alternativa, la secuencia que codifica diversos elementos de un RCAR se puede disponer en las diferentes moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, diferentes plásmidos o vectores, por ejemplo, vector vírico, por ejemplo, vector lentivírico. por ejemplo, la (i) secuencia que codifica un miembro de unión al antígeno puede estar presente en un primer ácido nucleico, por ejemplo, un primer vector, y la (ii) secuencia que codifica un miembro de señalización intracelular puede estar presente en el segundo ácido nucleico, por ejemplo, el segundo vector.
Interruptores de dimerización
Los interruptores de dimerización pueden ser no covalentes o covalentes. En un interruptor de dimerización no covalente, la molécula de dimerización promueve una interacción no covalente entre los dominios de tipo interruptor. En un interruptor de dimerización covalente, la molécula de dimerización promueve una interacción covalente entre los dominios de tipo interruptor.
En una realización, el RCAR comprende un interruptor de dimerización basado en FKBP/FRB o FKBP/FRAP. FKBP12 (FKBP o proteína de unión a FK506) es una proteína citoplasmática abundante que actúa como la diana intracelular inicial para el fármaco inmunosupresor de tipo producto natural rapamicina. La rapamicina se une a FKBP y al homólogo de PI3K grande FRAP (RAfT, mTOR). Fr B es una porción de 93 aminoácidos de FRAP, que es suficiente para unir el complejo FKBP-rapamicina (Chen, J., Zheng, X. F., Brown, E. J. & Schreiber, S. L. (1995) Identification of an 11-kDa FKBP12-rapamycin-binding domain within the 289-kDa FKBP12-rapamycin-associated protein and characterization of a critical serine residue. Proc Natl Acad Sci U S A 92: 4947-51).
En algunas realizaciones, un interruptor basado en FKBP/FRAP, por ejemplo, FKBP/FRB, puede usar una molécula de dimerización, por ejemplo, rapamicina o un análogo de rapamicina.
La secuencia de aminoácidos de FKBP es la siguiente:
D V P D Y A S L G G P S S P K K K R K V S R G V Q V E T I S P G D G R T F P K R G Q T C V V H Y T G M L E D G K K F D S S R D R N K P F K F M L G K Q E V I R G W E E
Figure imgf000049_0001
En realizaciones, un dominio de conmutación de FKBP puede comprender un fragmento de FKBP que tiene la capacidad de unirse con FRB, o un fragmento o análogo del mismo, en presencia de rapamicina o un rapalog, por ejemplo, la parte subrayada de SEQ ID NO:122, que es:
V Q V E T I S P G D G R T F P K R G Q T C V V H Y T G M L E D G K K F D S S R D R N K P F K F M L G K Q E V I R G W E E G V A Q M S V G Q R A K L T I S P D Y A Y G A
Figure imgf000049_0002
La secuencia de aminoácidos de FRB es la siguiente:
IL W H E M W H E G L E E A S R L Y F G E R N V K G M F E V L E P L H A M M E R G P Q T L K E T SF
N Q A Y G R D L M E A Q E W C R K Y M K S G N V K D L T Q A W D L Y Y H Y F R R IS K (S E Q ID N O :
124)
”FKBP/FRAP, por ejemplo, un interruptor basado en FKBP/FRB”, como se usa ese término aquí, se refiere a un conmutador de dimerización que comprende: un primer dominio de conmutador, que comprende un fragmento de FKBP o un análogo del mismo que tiene la capacidad de unirse con FRB, o un fragmento o análogo del mismo, en presencia de rapamicina o un rapalog, por ejemplo, RAD001, y tiene al menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con, o difiere en no más de 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 restos de aminoácidos de la secuencia FKBP de SEQ ID NO:122 o 123; y un segundo dominio de tipo de conmutación, que comprende un fragmento de FRB o análogo del mismo que tiene la capacidad de unirse con FRB, o un fragmento o análogo del mismo, en presencia de rapamicina o un rapalog, y tiene al menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con, o difiere en no más de 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 restos de aminoácidos de la secuencia FRB de SEQ ID NO:124. En un caso, un RCAR descrito aquí comprende un dominio de tipo de conmutación que comprende restos de aminoácidos descritos en SEQ ID NO:122 (o SEQ ID NO:123), y un dominio de tipo de conmutación comprende restos de aminoácidos descritos en SEQ ID NO: 124.
En algunas realizaciones, el interruptor de dimerización FKBP/FRB comprende un dominio de tipo interruptor FRB modificado que muestra una formación compleja alterada, por ejemplo, potenciada, entre un dominio de tipo interruptor basado en FRB, por ejemplo, el dominio de tipo interruptor FRB modificado, un dominio de tipo interruptor basado en FKBP, y la molécula de dimerización, por ejemplo, rapamicina o un rapálogo, por ejemplo, RAD001. En una realización, el dominio de tipo interruptor FRB modificado comprende una o más mutaciones, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más, seleccionadas entre mutaciones en la(s) posición(posiciones) aminoacídica(s) L2031, E2032, S2035, R2036, F2039, G2040, T2098, W2101, D2102, Y2105 y f2108, donde el aminoácido de tipo natural está mutado a otro aminoácido de origen natural. En una realización, un FRB mutante comprende una mutación en E2032, en la que E2032 se muta a fenilalanina (E2032F), metionina (E2032M), arginina (E2032R), valina (E2032V), tirosina (E2032Y), isoleucina (E2032I), por ejemplo, SEQ ID NO:125, o leucina (E2032L), por ejemplo, SEQ ID NO:126. En una realización, un FRB mutante comprende una mutación en T2098, en la que T2098 está mutado a fenilalanina (T2098F) o leucina (T2098L), por ejemplo, SEQ ID NO:127. En una realización, un f Rb mutante comprende una mutación en E2032 y en T2098, en la que E2032 está mutado a cualquier aminoácido, y en la que T2098 está mutado a cualquier aminoácido, por ejemplo, SEQ ID NO:128. En En una realización, un FRB mutante comprende una mutación E2032I y T2098L, por ejemplo, SEQ ID NO:129. En En una realización, un FRB mutante comprende una mutación E2032L y T2098L, por ejemplo, SEQ ID NO:130.
T l 1 FRB m n m m l i n n m r fini r n m l l im riz i n
Figure imgf000050_0001
Otros interruptores de dimerización adecuados incluyen el interruptor de dimerización basado en GyrB-GyrB, un interruptor de dimerización basado en Giberelina, un interruptor de dimerización marcador/fijador y un interruptor de dimerización marcador-halo/marcador-SNAP. Siguiendo las directrices que se proporcionan en la presente, tales interruptores y moléculas de dimerización relevantes serán evidentes para un experto en la técnica.
Molécula de dimerización
La asociación entre los dominios de tipo interruptor está fomentada por la molécula de dimerización. En presencia de la molécula de dimerización la interacción o asociación entre dominios de tipo interruptor permite la transducción de señales entre un polipéptido asociado con, por ejemplo, fusionado con, un primer dominio de tipo interruptor, y un polipéptido asociado con, por ejemplo, fusionado con, un segundo dominio de tipo interruptor. En presencia de niveles no limitantes de la molécula de dimerización la transducción de señales aumenta en 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 5, 10, 50, 100 veces, por ejemplo, según se mide en un sistema descrito en la presente.
Se pueden utilizar rapamicina y análogos de rapamicina (denominados a veces rapálogos), por ejemplo, RAD001, como moléculas de dimerización en un interruptor de dimerización basado en FKBP/FRB descrito en la presente. En un caso, la molécula de dimerización puede seleccionarse de rapamicina (sirolimus), RAD001 (everolimus), zotarolimus, temsirolimus, AP-23573 (ridaforolimus), biolimus y AP21967. Los análogos de rapamicina adicionales adecuados para uso con conmutadores de dimerización basados en FKBP/FRB se describen adicionalmente en la sección titulada “Terapias de combinación”, o en la subsección titulada “Inhibidores de mTOR ejemplares”.
CAR divid ido
En algunas realizaciones, la célula que expresa CAR utiliza un CAR dividido. La estrategia de CAR dividido se describe más detalladamente en las publicaciones WO2014/055442 y WO2014/055657. Resumiendo, un sistema CAR dividido comprende una célula que expresa un primer CAR que tiene un primer dominio de unión al antígeno y un dominio coestimulador (por ejemplo, 41BB) y la célula también expresa un segundo CAR que tiene un segundo dominio de unión al antígeno y un dominio de señalización intracelular (por ejemplo, CD3 zeta). Cuando la célula encuentra el primer antígeno, se activa el dominio coestimulador y la célula prolifera. Cuando la célula encuentra el segundo antígeno, se activa el dominio de señalización intracelular y comienza la actividad citolítica. Por lo tanto, la célula que expresa CAR solo está totalmente activada en presencia de ambos antígenos.
Transfección con ARN
En esta memoria se divulgan métodos para producir un ARN de CAR transcrito in vitro La presente descripción también incluye una construcción de ARN que codifica CAR que se puede transfectar directamente en una célula. Un método para generar ARNm para su uso en la transfección puede conllevar la transcripción in vitro (IVT) de un molde con cebadores diseñados especialmente, seguida de la adición de poliA, para producir un constructo que contiene la secuencia no traducida 3' y 5' («UTR»), una caperuza 5' y/o un Sitio Interno de Entrada al Ribosoma (IRES), el ácido nucleico que se va a expresar y una cola de poliA, normalmente de una longitud de 50 a 2000 bases (SEQ ID NO: 118). Con el ARN producido de esta manera se pueden transfectar eficientemente diferentes tipos de células. En un aspecto, el molde incluye secuencias para el CAR.
En un aspecto, el CAR anti-CD19 está codificado por un ARN mensajero (ARNm). En un aspecto, el ARNm que codifica el CAR anti-CD19 se introduce en una célula efectora inmunitaria, por ejemplo, una célula T o una célula NK, para la producción de una célula que expresa CAR, por ejemplo, una célula CART o una célula CAR NK.
En una realización, el ARN de CAR transcrito in vitro se puede introducir en una célula como una forma de transfección transitoria. El ARN se produce por transcripción in vitro utilizando un molde generado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El ADN de interés de cualquier fuente se puede convertir directamente mediante PCR en un molde para la síntesis de ARNm in vitro usando cebadores apropiados y ARN polimerasa. La fuente del ADN puede ser, por ejemplo, ADN genómico, ADN plasmídico, ADN de fago, ADNc, secuencia de ADN sintético o cualquier otra fuente apropiada de ADN. El molde deseado para la transcripción in vitro es un CAR de la presente descripción. por ejemplo, el molde para el ARN de CAR comprende una región extracelular que comprende un dominio variable monocatenario de un anticuerpo antitumoral; una región de bisagra, un dominio transmembrana (por ejemplo, un dominio transmembrana de CD8a); y una región citoplasmática que incluye un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, que comprende el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de 4-1BB.
En un caso, el ADN que se utilizará para la PCR contiene un marco de lectura abierto. El ADN puede ser de una secuencia de ADN de origen natural procedente del genoma de un organismo. En un caso, el ácido nucleico puede incluir algunas o todas las regiones no traducidas (UTR) 5' y/o 3'. El ácido nucleico puede incluir exones e intrones. En un caso, el ADN que se utilizará para la PCR es una secuencia de ácido nucleico humana. En otro caso, el ADN que se utilizará para la PCR es una secuencia de ácido nucleico humana que incluye las UTR 5' y 3'. Como alternativa, el ADN puede ser una secuencia de ADN artificial que normalmente no se expresa en un organismo de origen natural. Una secuencia de ADN artificial a modo de ejemplo es aquella que contiene porciones de genes que están ligadas para formar un marco de lectura abierto que codifica una proteína de fusión. Las porciones de ADN que están ligadas entre sí pueden proceder de un solo organismo o de más de un organismo.
La PCR se utiliza para generar un molde para la transcripción in vitro de ARNm que se utiliza para la transfección. Métodos para realizar la PCR son muy conocidos en la técnica. Los cebadores para uso en la PCR están diseñados para tener regiones que son sustancialmente complementarias a las regiones del ADN que se van a utilizar como un molde para la PCR. La expresión «sustancialmente complementarias», tal como se utiliza en la presente, se refiere a secuencias de nucleótidos en las que una mayoría o todas las bases en la secuencia del cebador son complementarias, o una o más bases no son complementarias o están emparejadas de manera errónea. Las secuencias sustancialmente complementarias son capaces de asociarse o hibridarse con la diana de ADN objetivo en las condiciones de hibridación utilizadas para la PCR. Los cebadores se pueden diseñar para ser sustancialmente complementarios a cualquier porción del molde de ADN. por ejemplo, los cebadores se pueden diseñar para amplificar la porción de un ácido nucleico que normalmente se transcribe en las células (el marco de lectura abierto), incluidas las u Tr 5' y 3'. Los cebadores también se pueden diseñar para amplificar una porción de un ácido nucleico que codifica un dominio particular de interés. En un caso, los cebadores están diseñados para amplificar la región codificante de un ADNc humano, incluyendo todas o porciones de las UTR 5' y 3'. Se pueden generar cebadores útiles para la PCR mediante métodos sintéticos muy conocidos en la técnica. Los «cebadores directos» son cebadores que contienen una región de nucleótidos que son sustancialmente complementarios a los nucleótidos en el molde de ADN que están en dirección 5' respecto a la secuencia de ADN que se va a amplificar. «En dirección 5'» se utiliza en la presente para referirse a una ubicación 5' respecto a la secuencia de ADN que se va a amplificar en relación a la cadena codificante. Los «cebadores inversos» son cebadores que contienen una región de nucleótidos que son sustancialmente complementarios a un molde de ADN bicatenario que están en dirección 3' respecto a la secuencia de ADN que se va a amplificar. «En dirección 3'» se utiliza en la presente para referirse a una ubicación 3' respecto a la secuencia de ADN que se va a amplificar en relación a la cadena codificante.
Se puede usar cualquier ADN polimerasa útil para la PCR en los métodos descritos aquí. Los reactivos y la polimerasa son comercializados por varios proveedores.
También se pueden utilizar estructuras químicas con la capacidad de fomentar la estabilidad y/o la eficacia de la traducción. El ARN tiene preferentemente UTR 5' y 3'. En una realización, la UTR 5' tiene una longitud de entre uno y 3000 nucleótidos. La longitud de las secuencias u Tr 5' y 3' que se van a añadir a la región codificante se puede alterar mediante diferentes métodos, que incluyen, sin carácter limitante, diseño de cebadores para PCR que se hibridan a diferentes regiones de las UTR. Utilizando este enfoque, un experto en la técnica puede modificar la longitud de las UTR 5 'y 3' requerida para lograr una eficacia de traducción óptima después de la transfección con el ARN transcrito.
Las UTR 5' y 3' pueden ser las UTR 5' y 3' que se producen de forma natural, endógenas respecto al ácido nucleico de interés. Como alternativa, las secuencias UTR que no son endógenas respecto al ácido nucleico de interés se pueden añadir incorporando las secuencias UTR en los cebadores directo e inverso o mediante cualesquiera otras modificaciones del molde. El uso de secuencias UTR que no son endógenas respecto al ácido nucleico de interés puede ser útil para modificar la estabilidad y/o la eficacia de traducción del ARN. por ejemplo, se sabe que elementos ricos en AU en las secuencias UTR 3' pueden disminuir la estabilidad del ARNm. Por lo tanto, las 3'UTR pueden seleccionarse o diseñarse para aumentar la estabilidad del ARN transcrito basándose en las propiedades de las UTR que son bien conocidas en la técnica.
En una realización, la UTR 5' puede contener la secuencia Kozak del ácido nucleico endógeno. Como alternativa, cuando se añade una UTR 5' que no es endógena respecto al ácido nucleico de interés por PCR, tal como se ha descrito anteriormente, se puede rediseñar una secuencia Kozak consenso añadiendo la secuencia UTR 5'. Las secuencias Kozak pueden aumentar la eficacia de la traducción de algunos transcritos de ARN, pero no parece que se necesiten en todos los ARN para posibilitar una traducción eficaz. Existe constancia del requisito de secuencias de Kozak para muchos ARNm. En otras realizaciones, la UTR 5' puede ser una UTR 5' de un virus de ARN, cuyo genoma de ARN es estable en las células. En otras realizaciones, se pueden utilizar diversos análogos de nucleótidos en la UTR 3' o 5' para impedir la degradación por exonucleasa del ARNm.
Para permitir la síntesis de ARN a partir de un molde de ADN sin la necesidad de clonación génica, se debe unir un promotor de la transcripción al molde de ADN en dirección 5' respecto a la secuencia que se va a transcribir. Cuando se añade una secuencia que funciona como un promotor de una ARN polimerasa al extremo 5' del cebador directo, el promotor de ARN polimerasa se incorpora al producto de la PCR en dirección 5' del marco de lectura abierto que se va a transcribir. En una realización preferida, el promotor es un promotor de la polimerasa T7, tal como se describe en otra parte de la presente. Otros promotores útiles incluyen, pero no se limitan a, promotores de ARN polimerasa T3 y SP6. Las secuencias de nucleótidos de consenso para los promotores T7, T3 y SP6 son conocidas en la técnica.
En una realización preferida, el ARNm tiene tanto una caperuza en el extremo 5' como una cola de poli(A) 3' que determina la unión al ribosoma, el inicio de la traducción y la estabilidad del ARNm en la célula. En un molde de ADN circular, por ejemplo, ADN plasmídico, la ARN polimerasa produce un producto concatemérico largo que no es adecuado para la expresión en células eucariotas. La transcripción del ADN plasmídico linearizado en el extremo de la UTR 3' da como resultado un ARNm de tamaño normal que no es eficaz en la transfección eucariota, incluso si se poliadenila después de la transcripción.
En un molde de ADN lineal, la ARN polimerasa del fago T7 puede extender el extremo 3' del transcrito más allá de la última base del molde (Schenborn y Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva y Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003).
El método convencional de integración de tramos de poliA/T en un molde de ADN es la clonación molecular. Sin embargo, la secuencia de poliA/T integrada en el ADN plasmídico puede provocar inestabilidad plasmídica, que es por lo que los moldes de ADN plasmídico obtenidos de células bacterianas están a menudo muy contaminados con deleciones y otras aberraciones. Esto hace que los procedimientos de clonación no solo sean laboriosos y lentos, sino que a menudo no sean fiables. Es por eso que un método que permite la construcción de moldes de ADN con un tramo de poliA/T 3' sin clonación es sumamente deseable.
El segmento poliA/T del molde de ADN transcripcional se puede producir durante la PCR mediante el uso de un cebador inverso que contiene una cola polyT, tal como la cola 100T (SEQ ID NO:110) (el tamaño puede ser 50-5000 T (SEQ ID NO:111)), o después de la PCR mediante cualquier otro método, incluidos, entre otros, la ligadura de ADN o la recombinación in vitro. Las colas de poli(A) también proporcionan estabilidad a los ARN y reducen su degradación. Generalmente, la longitud de una cola de poli(A) se correlaciona positivamente con la estabilidad del ARN transcrito. En una realización, la cola de poli(A) tiene entre 100 y 5000 adenosinas (SEQ ID NO:112).
Las colas de poli(A) de los ARN se pueden extender aún más después de la transcripción in vitro con el uso de una poli(A) polimerasa, tal como la poliA polimerasa de E. coli (E-PAP). En una realización, aumentar la longitud de una cola de poli(A) de 100 nucleótidos a entre 300 y 400 nucleótidos (SEQ ID NO:113) da como resultado un aumento de alrededor de dos veces en la eficiencia de traducción del ARN. Adicionalmente, la unión de diferentes grupos químicos al extremo 3' puede aumentar la estabilidad del ARNm. Una unión de este tipo puede contener nucleótidos modificados/artificiales, aptámeros y otros compuestos. por ejemplo, los análogos de a Tp se pueden incorporar en la cola de poli(A) usando poli(A) polimerasa. Los análogos de a Tp pueden aumentar adicionalmente la estabilidad del ARN.
Las caperuzas 5' también proporcionan estabilidad a las moléculas de ARN. En una realización preferida, los ARN producidos por los métodos descritos en la presente incluyen una caperuza 5'. La caperuza 5' se proporciona utilizando técnicas conocidas en la materia y descritas en la presente (Cougot et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski et al., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)).
Los ARN producidos por los métodos divulgados en la presente también pueden contener una secuencia del sitio interno de entrada al ribosoma (IRES). La secuencia IRES puede ser cualquier secuencia vírica, cromosómica o diseñada por medios artificiales que inicie la unión del ribosoma independiente de la caperuza al ARNm y facilite el inicio de la traducción. Se pueden incluir cualesquiera solutos adecuados para la electroporación celular, que puede contener factores que facilitan la permeabilidad y la viabilidad celular, tales como azúcares, péptidos, lípidos, proteínas, antioxidantes y surfactantes.
El ARN se puede introducir en células diana utilizando cualquiera de varios métodos diferentes, por ejemplo, métodos comercializados que incluyen, sin carácter limitante, electroporación (Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems, Colonia, Alemania)), (ECM 830 (bTx ) (Harvard Instruments, Boston, Mass.) o Gene Pulser II (BioRad, Denver, Colo.), Multiporator (Eppendort, Hamburgo Alemania), la transfección mediada por liposomas catiónicos utilizando lipofección, encapsulación de polímeros, transfección mediada por péptidos o sistemas de suministro biolístico de partículas, tales como «cañones de genes» (remítase, por ejemplo, a Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12 (8): 861 -70 (2001).
Métodos de sum inistro no víricos
En algunos aspectos, se pueden utilizar métodos no víricos para suministrar un ácido nucleico que codifica un CAR descrito en la presente a una célula o tejido en un sujeto.
En algunas realizaciones, el método no viral incluye el uso de un transposón (también llamado elemento transponible). En algunas realizaciones, un transposón es un fragmento de ADN que puede insertarse en un lugar de un genoma, por ejemplo, un fragmento de ADN que es capaz de auto-replicarse e insertar su copia en un genoma, o un fragmento de ADN que se puede cortar y empalmar de un ácido nucleico más largo e insertarse en otro lugar del genoma. por ejemplo, un transposón comprende una secuencia de ADN compuesta de repeticiones invertidas que flanquean genes para la transposición.
Los métodos a modo de ejemplo de suministro de ácido nucleico utilizando un transposón incluyen el sistema transposón Bella Durmiente (SBTS, por sus siglas en inglés) y un sistema transposón piggyBac (PB). Remítase, por ejemplo, a Aronovich et al. Hum. Mol. Genet. 20.R1(2011):R14-20; Singh et al. Cancer Res. 15(2008):2961-2971; Huang et al. Mol. Ther. 16(2008):580-589; Grabundzija et al. Mol. Ther. 18(2010):1200-1209; Kebriaei et al. Blood. 122.21(2013):166; Williams. Molecular Therapy 16.9(2008):1515-16; Bell et al. Nat. Protoc. 2.12(2007):3153-65; y Ding et al. Cell.
122.3(2005):473-83.
El SBTS incluye dos componentes: 1) un transposón que contiene un transgén y 2) una fuente de enzima transposasa. La transposasa puede transponer el transposón de un plásmido portador (u otro ADN donante) a un ADN diana, tal como un cromosoma/genoma de la célula hospedadora. por ejemplo, la transposasa se une al ADN donante/plásmido portador, corta el transposón (incluido(s) el(los) transgén(es)) del plásmido, y lo inserta en el genoma de la célula hospedadora. Remítase, por ejemplo, a Aronovich et al., mencionado anteriormente.
Los tansposones a modo de ejemplo incluyen un transposón basado en pT2. Véanse, por ejemplo, Grabundzija et al.
Nucleic Acids Res. 41.3(2013):1829-47; y Singh et al. Cáncer Res. 68.8(2008): 2961-2971. Las transposasas a modo de ejemplo incluyen una transposasa de tipo Tc1/mariner, por ejemplo, la transposasa SB10 o la transposasa SB11 (una transposasa hiperactiva que se puede expresar, por ejemplo, a partir de un promotor de citomegalovirus). Véanse, por ejemplo, Aronovich et al.; Kebriaei et al.; y Grabundzija et al.
El uso de SBTS permite la integración y expresión eficaces de un transgén, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un CAR descrito en la presente. En la presente se proporcionan métodos para generar una célula, por ejemplo, un linfocito T o linfocito NK, que expresa de manera estable un CAR descrito en la presente, por ejemplo, utilizando un sistema transposón tal como SBTS.
De acuerdo con los métodos descritos en la presente, en algunas realizaciones, se suministran a una célula (por ejemplo, linfocito T o NK) uno o más ácidos nucleicos, por ejemplo, plásmidos, que contienen los componentes SBTS. por ejemplo, el(los) ácido(s) nucleico(s) se suministra(n) mediante métodos estándar de suministro de ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN plasmídico), por ejemplo, métodos descritos en la presente, por ejemplo, electroporación, transfección o lipofección. En algunos casos, el ácido nucleico contiene un transposón que comprende un transgén, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un CAR descrito en la presente. En algunos casos, el ácido nucleico contiene un transposón que comprende un transgén (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un CAR descrito en la presente) así como también una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima transposasa. En otros casos, se proporciona un sistema con dos ácidos nucleicos, por ejemplo, un sistema plasmídico dual, por ejemplo, donde un primer plásmido contiene un transposón que comprende un transgén, y un segundo plásmido contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima transposasa. por ejemplo, el primer y el segundo ácidos nucleicos se suministran conjuntamente a la célula hospedadora.
En algunos casos, se generan células, por ejemplo, linfocitos T o NK, que expresan un CAR descrito en la presente utilizando una combinación de inserción génica utilizando SBTS y edición génica utilizando una nucleasa (por ejemplo, nucleasas con dedos de zinc (ZFN, por sus siglas en inglés), nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN, por sus siglas en inglés), el sistema CRISPR/Cas o meganucleasas modificadas (endonucleasas de asentamiento rediseñadas).
En algunas realizaciones, el uso de un método no vírico de suministro permite la reprogramación de células, por ejemplo, linfocitos T o NK, e infusión directa de las células en el sujeto. Las ventajas de los vectores no víricos incluyen, sin carácter limitante, la facilidad y coste relativamente bajo de producción de cantidades suficientes para que una población de pacientes esté cubierta, la estabilidad durante el almacenamiento y la ausencia de inmunogenicidad.
Construcciones de Ácidos Nucleicos que Codifican un CAR
La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican uno o más constructos CAR descritos en la presente. En un aspecto, la molécula de ácido nucleico se proporciona como una transcripción de ARN mensajero. En un aspecto, la molécula de ácido nucleico se proporciona como una construcción de ADN.
En consecuencia, en un aspecto, la presente descripción se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR), en la que el CAR comprende un dominio de unión anti-CD19 (por ejemplo, un dominio de unión anti-CD19 humanizado), un dominio transmembrana, y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio estimulante, por ejemplo, un dominio de señalización coestimulador y/o un dominio de señalización primario, por ejemplo, cadena zeta. En un caso, el dominio de unión anti-CD19 es un dominio de unión anti-CD19 descrito aquí, por ejemplo, un dominio de unión anti-CD19 que comprende una secuencia seleccionada de un grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 y SEQ ID NO:59, o una secuencia con una identidad del 95-99% con las mismas. En un caso, el dominio transmembrana es el dominio transmembrana de una proteína seleccionada del grupo que consiste en la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 y CD154. En un caso, el dominio transmembrana comprende una secuencia de SEQ ID NO:15, o una secuencia con una identidad del 95-99% con la misma. En un caso, el dominio de unión anti-CD19 está conectado al dominio transmembrana mediante una región de bisagra, por ejemplo, una bisagra descrita aquí. En un caso, la región de bisagra comprende las SEQ ID NO:14 o SEQ ID NO:45 o SEQ ID NO:47 o SEQ ID NO:49, o una secuencia con una identidad de un 95-99% con estas. En un caso, la molécula de ácido nucleico aislada comprende además una secuencia que codifica un dominio coestimulador. En un caso, el dominio coestimulador es un dominio de señalización funcional de una proteína seleccionada del grupo que consiste en OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278) y 4-1BB (CD137). En un caso, el dominio coestimulador comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 16 o una secuencia con una identidad de un 95-99% con esta. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización funcional de 4-1BB y un dominio de señalización funcional de CD3 zeta. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:51, o una secuencia con una identidad del 95-99% con la misma, y la secuencia de SEQ ID NO:17 o SEQ ID NO:43 , o una secuencia con una identidad del 95-99% con la misma, en la que las secuencias que comprenden el dominio de señalización intracelular se expresan en el mismo marco y como una única cadena polipeptídica.
En otro aspecto, la presente descripción se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una construcción CAR que comprende una secuencia líder de SEQ ID NO:13, un dominio scFv que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 y SEQ ID NO:59, (o una secuencia con una identidad del 95-99% con las mismas), una región de bisagra de SEQ ID NO:14 o SEQ ID NO:45 o SEQ ID NO:47 o SEQ ID NO:49 (o una secuencia con una identidad del 95-99% con las mismas), un dominio transmembrana que tiene una secuencia de SEQ ID NO:15 (o una secuencia con una identidad del 95-99% con la misma), un dominio coestimulador 4-1BB que tiene una secuencia de SEQ ID NO:16 o un dominio coestimulador CD27 que tiene una secuencia de SEQ ID NO:51 (o una secuencia con una identidad del 95-99% con la misma), y un dominio estimulante de CD3 zeta que tiene una secuencia de SEQ ID NO:17 o SEQ ID NO:43 (o una secuencia con una identidad del 95-99% con las mismas).
En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una molécula polipeptídica aislada codificada por la molécula de ácido nucleico. En un caso, la molécula de polipéptido aislada comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:59, o una secuencia con una identidad del 95-99% con las mismas.
En otro aspecto, la presente descripción se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un dominio de unión anti-CD19, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio estimulante, y en la que dicho dominio de unión anti-CD19 comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 y SEQ ID NO:59, o una secuencia con una identidad del 95-99% con las mismas.
En un caso, la molécula CAR codificada comprende además una secuencia que codifica un dominio coestimulador. En un caso, el dominio coestimulador es un dominio de señalización funcional de una proteína seleccionada del grupo que consiste en OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18) y 4-1BB (CD137). En un caso, el dominio coestimulador comprende una secuencia de la SEQ ID NO:16. En un caso, el dominio transmembrana es el dominio transmembrana de una proteína seleccionada del grupo que consiste en la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 y CD154. En un caso, el dominio transmembrana comprende una secuencia de la SEQ ID NO:15. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización funcional de 4-1BB y un dominio de señalización funcional de zeta. En un caso, el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de SEQ ID NO:16 y la secuencia de SEQ ID NO:17, en el que las secuencias que comprenden el dominio de señalización intracelular se expresan en el mismo marco y como una única cadena polipeptídica. En un caso, el dominio de unión anti-CD19 está conectado al dominio transmembrana mediante una región de bisagra. En un caso, la región de bisagra comprende la SEQ ID NO:14. En un caso, la región de bisagra comprende la SEQ ID NO:45 o SEQ ID NO:47 o SEQ ID NO:49.
En otro aspecto, la presente descripción se refiere a una molécula CAR codificada que comprende una secuencia líder de SEQ ID NO:13, un dominio scFv que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 y SEQ ID NO:59, o una secuencia con una identidad del 95-99% con las mismas, una región de bisagra de SEQ ID NO:14 o SEQ ID NO:45 o SEQ ID NO:47 o SEQ ID NO:49, un dominio transmembrana que tiene una secuencia de SEQ ID NO:15, un dominio coestimulador 4-1BB que tiene una secuencia de SEQ ID NO:16 o un dominio coestimulador CD27 que tiene una secuencia de SEQ ID NO:51, y un dominio estimulante CD3 zeta que tiene una secuencia de SEQ ID NO:17 o SEQ ID NO:43. En un caso, la molécula CAR codificada comprende una secuencia seleccionada de un grupo que consiste en SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID No :34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42 y SEQ ID NO:59, o una secuencia con una identidad del 95-99% con las mismas.
Las secuencias de ácido nucleico que codifican las moléculas deseadas se pueden obtener usando métodos recombinantes conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, seleccionando bibliotecas de células que expresan el gen, derivando el gen de un vector que se sabe que incluye el mismo, o aislando directamente de células y tejidos que lo contienen, usando técnicas estándar. Como alternativa, el gen de interés se puede producir por medios sintéticos, en lugar de clonarse.
La presente descripción también proporciona vectores en los que se inserta un ADN de la presente descripción. Los vectores derivados de retrovirus tales como el lentivirus son herramientas adecuadas para lograr la transferencia génica a largo plazo, ya que permiten la integración estable a largo plazo de un transgén y su propagación en células hijas. Los vectores lentivíricos tienen la ventaja añadida frente a los vectores derivados de oncorretrovirus, tales como los virus de la leucemia murina, de que pueden transducir células no proliferantes, tales como hepatocitos. También tienen la ventaja añadida de una baja inmunogenicidad. Un vector retrovírico también puede ser, por ejemplo, un vector gammarretrovírico. Un vector gammarretrovírico puede incluir, por ejemplo, un promotor, una señal de empaquetamiento (y ), un sitio de unión al cebador (PBS, por sus siglas en inglés), uno o más (por ejemplo, dos) repeticiones terminales largas (LTR, por sus siglas en inglés), y un transgén de interés, por ejemplo, un gen que codifica un CAR. Un vector gammarretrovírico puede carecer de genes estructurales víricos tales como gag, pol y env. Los vectores gammarretrovíricos a modo de ejemplo incluyen el virus de la leucemia murina (MLV, por sus siglas en inglés), virus formador de focos en el bazo (SFFV, por sus siglas en inglés) y virus del sarcoma mieloproliferativo (MPSV, por sus siglas en inglés), y vectores derivados de estos. Otros vectores gammarretrovíricos se describen, por ejemplo, en Tobias Maetzig et al., «Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application» Viruses. junio de 2011; 3(6): 677-713.
En otro caso, el vector que comprende el ácido nucleico que codifica el CAR deseado de la presente descripción es un vector adenoviral (A5/35). En otro caso, la expresión de ácidos nucleicos que codifican CAR se puede lograr usando transposones tal como las nucleasas sleeping beauty, crisper, CAS9 y dedos de zinc. Vea abajo June et al. 2009 Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716.
En resumen, la expresión de ácidos nucleicos naturales o sintéticos que codifican los CAR se logra normalmente ligando operablemente un ácido nucleico que codifica el polipéptido CAR o porciones de este a un promotor, e incorporando el constructo en un vector de expresión. Los vectores pueden ser adecuados para la replicación y la integración en eucariotas. Vectores típicos de clonación contienen terminadores de la transcripción y la traducción, secuencias de iniciación y promotores útiles para la regulación de la expresión de la secuencia deseada de ácido nucleico.
Las construcciones de expresión de la presente descripción también pueden usarse para inmunización de ácidos nucleicos y terapia génica, usando protocolos estándar de administración de genes. En la técnica existe constancia de métodos para el suministro de genes. Remítase, por ejemplo, a las Pat. de EE.UU. N.os 5399346, 5580 859, 5589 466. En otro caso, la descripción proporciona un vector de terapia génica.
El ácido nucleico se puede clonar en un cierto número de tipos de vectores. por ejemplo, el ácido nucleico se puede clonar en un vector que incluye, pero no se limita a un plásmido, un fagémido, un derivado de fago, un virus animal y un cósmido. Los vectores de particular interés incluyen vectores de expresión, vectores de replicación, vectores de generación de sondas y vectores de secuenciación.
Además, el vector de expresión se puede proporcionar a una célula en forma de un vector vírico. La tecnología de vectores víricos es muy conocida en la técnica y se describe, por ejemplo, en Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volúmenes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY), y en otros manuales de virología y biología molecular. Virus, que son útiles como vectores incluyen, pero no se limitan a retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociados, virus del herpes y lentivirus. En general, un vector adecuado contiene un origen de replicación funcional en al menos un organismo, una secuencia promotora, sitios para endonucleasas de restricción convenientes y uno o más marcadores seleccionables (por ejemplo, documentos w O 01/96584; WO 01/29058; y Pat de EE.UU. N.° 6326 193).
Se ha desarrollado un cierto número de sistemas basados en virus para la transferencia de genes a células de mamíferos. por ejemplo, los retrovirus proporcionan una plataforma conveniente para los sistemas de suministro de genes. Un gen seleccionado se puede insertar en un vector y empaquetar en partículas retrovíricas utilizando técnicas conocidas en la técnica. El virus recombinante se puede aislar y suministrar a las células del sujeto ya sea in vivo o ex vivo. En la técnica existe constancia de cierto número de sistemas retrovíricos. En algunas realizaciones, se utilizan vectores adenovíricos. En la técnica existe constancia de un cierto número de vectores adenovíricos. En una realización, se utilizan vectores lentivíricos.
Elementos promotores adicionales, por ejemplo, potenciadores, regulan la frecuencia de la iniciación transcripcional. Típicamente, estos se ubican en la región de 30-110 pb en dirección 5' respecto al sitio de inicio, aunque se ha mostrado que un cierto número de promotores contienen también elementos funcionales en dirección 3' respecto al sitio de inicio. El espacio entre los elementos promotores con frecuencia es flexible, de modo que la función del promotor se conserva cuando los elementos se invierten o se mueven uno con respecto al otro. En el promotor de timidina-cinasa (tk), el espacio entre los elementos promotores se puede aumentar a 50 pb de separación antes de que la actividad comience a disminuir. Dependiendo del promotor, parece ser que los elementos individuales pueden funcionar de manera cooperativa o independiente para activar la transcripción. Los promotores a modo de ejemplo incluyen promotores del gen lE de CMV, EF-1a, ubiquitina C o de la fosfoglicerocinasa (PGK).
Un ejemplo de un promotor que es capaz de expresar un transgén CAR en un linfocito T de mamífero es el promotor EF1a. El promotor EF1a nativo impulsa la expresión de la subunidad alfa del complejo del factor de elongación 1, que es responsable del suministro enzimático de los aminoacil-ARNt al ribosoma. El promotor EF1a se ha utilizado exhaustivamente en los plásmidos de expresión de mamíferos y ha mostrado ser eficaz para impulsar la expresión de CAR a partir de los transgenes clonados en un vector lentivírico. Remítase, por ejemplo, a Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009). En un aspecto, el promotor EF1a comprende la secuencia proporcionada como la SEQ ID NO:100.
Otro ejemplo de un promotor es la secuencia promotora del citomegalovirus (CMV) inmediata temprana. Esta secuencia promotora es una secuencia promotora constitutiva fuerte capaz de impulsar niveles elevados de expresión de cualquier secuencia polinucleotídica ligada operablemente a ella. Sin embargo, también se pueden utilizar otras secuencias promotoras constitutivas, que incluyen, sin carácter limitante, el promotor temprano del virus simio 40 (SV40, por sus siglas en inglés), el virus del tumor mamario de ratones (MMTV, por sus siglas en inglés), el promotor de repeticiones terminales largas (LTR, por sus siglas en inglés) del virus de inmunodeficiencia humana (HIV, por sus siglas en inglés), el promotor de MoMuLV, un promotor del virus de la leucemia aviar, un promotor inmediato temprano del virus de Epstein-Barr, un promotor del virus del sarcoma de Rous, así como también promotores de genes humanos, tales como, sin carácter limitante, el promotor de actina, el promotor de miosina, el promotor del factor de elongación 1a, el promotor de hemoglobina y el promotor de creatina-cinasa. Además, la invención no debe limitarse al uso de promotores constitutivos. Los promotores inducibles también se contemplan como parte de la invención. El uso de un promotor inducible proporciona un interruptor molecular capaz de activar la expresión de la secuencia polinucleotídica que está ligada operablemente cuando se desea tal expresión, o capaz de desactivar la expresión cuando no se desea la expresión. Ejemplos de promotores inducibles incluyen, sin carácter limitante, un promotor de metalotionina, un promotor de glucocorticoides, un promotor de progesterona y un promotor de tetraciclinas.
Un vector también puede incluir, por ejemplo, una secuencia señal para facilitar la secreción, una señal de poliadenilación y un terminador de la transcripción (por ejemplo, gen de la Hormona de Crecimiento Bovina (BGH, por sus siglas en inglés)), un elemento que permite la replicación episómica y la replicación en procariotas (por ejemplo, origen SV40 y ColEI u otros conocidos en la técnica) y/o elementos para permitir la selección (por ejemplo, gen de resistencia a la ampicilina y/o marcador de zeocina).
Con el fin de evaluar la expresión de un polipéptido CAR o porciones de este, el vector de expresión que se va a introducir en una célula también puede contener un gen marcador seleccionable o un gen indicador o ambos para facilitar la identificación y selección de células que lo expresan a partir de la población de células que se desea transfectar o infectar mediante vectores víricos. En otros aspectos, el marcador seleccionable se puede transportar en una pieza de ADN separada y utilizar en un procedimiento de cotransfección. Tanto los marcadores seleccionables como los genes informadores pueden estar flanqueados por secuencias reguladoras apropiadas para permitir la expresión en las células hospedadora. Marcadores seleccionables útiles incluyen, por ejemplo, genes de resistencia a antibióticos, tales como neo y similares.
Los genes informadores se utilizan para identificar células que pueden haber sido transfectadas y para evaluar la funcionalidad de las secuencias reguladoras. En general, un gen informador es un gen que no está presente ni se expresa en el organismo o tejido receptor y que codifica un polipéptido cuya expresión se pone de manifiesto por alguna propiedad fácilmente detectable, por ejemplo, actividad enzimática. La expresión del gen informador se analiza en un momento adecuado después de que el ADN se haya introducido en las células receptoras. Los genes indicadores adecuados pueden incluir genes que codifican luciferasa, beta-galactosidasa, cloranfenicol-acetiltransferasa, fosfatasa alcalina secretada o el gen de la proteína fluorescente verde (por ejemplo, Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82). Sistemas de expresión adecuados son bien conocidos y se pueden preparar utilizando técnicas conocidas u obtenerse de proveedores comerciales. En general, la construcción con la región flanqueante 5' mínima que muestra el nivel más alto de expresión del gen indicador se identifica como el promotor. Regiones promotoras de este tipo pueden enlazarse a un gen informador y utilizarse para evaluar la capacidad de los agentes para modular la transcripción impulsada por el promotor.
En la técnica existe constancia de métodos para introducir y expresar genes en una célula. En el contexto de un vector de expresión, el vector se puede introducir fácilmente en una célula hospedadora, por ejemplo, células de mamífero, bacterianas, de levaduras o de insectos mediante cualquier método de la técnica. por ejemplo, el vector de expresión se puede transferir a una célula hospedadora por medios físicos, químicos o biológicos.
Métodos físicos para introducir un polinucleótido en una célula hospedadora incluyen precipitación con fosfato de calcio, lipofección, bombardeo de partículas, microinyección, electroporación y similares. Métodos para producir células que comprenden vectores y/o ácidos nucleicos exógenos son muy conocidos en la técnica. Remítase, por ejemplo, a Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volúmenes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY). Un método preferido para la introducción de un polinucleótido en una célula hospedadora es la transfección con fosfato de calcio.
Métodos biológicos para introducir un polinucleótido de interés en una célula hospedadora incluyen el uso de vectores de ADN y ARN. Los vectores víricos, y especialmente los vectores retrovíricos, se han convertido en el método más ampliamente utilizado para insertar genes en células de mamíferos, por ejemplo, seres humanos. Otros vectores víricos pueden derivarse de lentivirus, poxvirus, virus del herpes simplex I, adenovirus y virus adenoasociados, y similares. Remítase, por ejemplo, a las Pat. de EE.UU. N.os 5350674 y 5585 362.
Los medios químicos para introducir un polinucleótido en una célula hospedadora incluyen sistemas de dispersión coloidal, tales como complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lípidos que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Un sistema coloidal a modo de ejemplo para su uso como vehículo de suministro in vitro e in vivo es un liposoma (p. ej., una vesícula de membrana artificial). Se dispone de otros métodos de vanguardia de suministro dirigido de ácidos nucleicos tales como el suministro de polinucleótidos con nanopartículas dirigidas u otro sistema de suministro adecuado para tamaños submicrométricos.
En el caso en el que se utiliza un sistema de suministro no vírico, un vehículo de suministro a modo de ejemplo es un liposoma. Se contempla el uso de formulaciones lipídicas para la introducción de los ácidos nucleicos en una célula hospedadora (in vitro, ex vivo o in vivo). En otro aspecto, el ácido nucleico puede estar asociado con un lípido. El ácido nucleico asociado con un lípido puede estar encapsulado en el interior acuoso de un liposoma, intercalado dentro de la bicapa lipídica de un liposoma, unido a un liposoma a través de una molécula de enlace que está asociada tanto con el liposoma como con el oligonucleótido, atrapado en un liposoma, complejado con un liposoma, dispersado en una solución que contiene un lípido, mezclado con un lípido, combinado con un lípido, contenido como una suspensión en un lípido, contenido o complejado con una micela, o asociado de otra manera con un lípido. Las composiciones asociadas a lípidos, lípidos/ADN o lípidos/vectores de expresión no se limitan a ninguna estructura particular en solución. por ejemplo, pueden estar presentes en una estructura bicapa, como micelas, o con una estructura «colapsada». También pueden simplemente intercalarse en una solución, posiblemente formando agregados que no tienen un tamaño o forma uniformes. Los lípidos son sustancias grasas que pueden ser lípidos de origen natural o sintéticos. por ejemplo, los lípidos incluyen las microgotas grasas que se producen de forma natural en el citoplasma, así como también la clase de compuestos que contienen hidrocarburos alifáticos de cadena larga y sus derivados, tales como ácidos grasos, alcoholes, aminas, aminoalcoholes y aldehídos.
Se pueden obtener lípidos adecuados para su uso de proveedores comerciales. por ejemplo, se puede obtener dimiristilfosfatidilcolina ("DMPC") de Sigma, St. Louis, MO; se puede obtener fosfato de dicetilo ("DCP") de K & K Laboratories (Plainview, NY); se puede obtener colesterol ("Choi") de Calbiochem-Behring; se puede obtener dimiristilfosfatidilglicerol ("DMPG") y otros lípidos de Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL). Las soluciones de partida de lípidos en cloroformo o cloroformo/metanol se pueden almacenar a aproximadamente -20°C. El cloroformo se utiliza como el único disolvente, ya que se evapora más fácilmente que el metanol. "Liposoma" es un término genérico que abarca una diversidad de vehículos lipídicos simples y multilamelares formados por la generación de bicapas o agregados lipídicos encerrados. Los liposomas pueden estar caracterizados por tener estructuras vesiculares con una membrana de bicapa de fosfolípidos y un medio acuoso interno. Los liposomas multilamelares tienen múltiples capas de lípidos separadas por un medio acuoso. Se forman de manera espontánea cuando los fosfolípidos se suspenden en un exceso de solución acuosa. Los componentes lipídicos se reorganizan antes de la formación de estructuras cerradas y atrapan agua y solutos disueltos entre las bicapas lipídicas (Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10). Sin embargo, también se incluyen composiciones que tienen diferentes estructuras en solución que la estructura vesicular normal. por ejemplo, los lípidos pueden asumir una estructura micelar o simplemente existir como agregados no uniformes de moléculas lipídicas. También se contemplan los complejos de lipofectamina-ácido nucleico.
Independientemente del método utilizado para introducir ácidos nucleicos exógenos en una célula hospedadora o exponer de otra manera una célula al inhibidor de la presente divulgación, con el fin de confirmar la presencia de la secuencia de ADN recombinante en la célula hospedadora, se pueden realizar varios ensayos. Ensayos de este tipo incluyen, por ejemplo, ensayos "biológicos moleculares" bien conocidos por los expertos en la técnica, tales como transferencia Southern y Northern, RT-PCR y PCR; ensayos "bioquímicos", tales como detectar la presencia o ausencia de un péptido particular, p. ej., por medios inmunológicos (ELISAs y borrones Western) o por ensayos descritos en esta memoria para identificar agentes que caen dentro del alcance de la invención.
La presente divulgación proporciona, además, un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica CAR. En un aspecto, un vector CAR se puede transducir directamente a una célula, por ejemplo, una célula T. En un aspecto, el vector es un vector de clonación o expresión, por ejemplo, un vector que incluye, pero no se limita a, uno o más plásmidos (por ejemplo, plásmidos de expresión, vectores de clonación, minicírculos, minivectores, cromosomas dobles diminutos), construcciones de vectores retrovirales y lentivirales. En un aspecto, el vector es capaz de expresar la construcción CAR en células T de mamífero. En un aspecto, en linfocito T de mamífero es un linfocito T humano.
Fuentes de células
Antes de la expansión y modificación genética u otra modificación, puede obtenerse de un sujeto una fuente de células, por ejemplo, células T o células asesinas naturales (NK). El término "sujeto" se pretende que incluya organismos vivos en los que se puede provocar una respuesta inmunitaria (por ejemplo, mamíferos). Los ejemplos de sujetos incluyen seres humanos, monos, chimpancés, perros, gatos, ratones, ratas, y especies transgénicas de los mismos. Células T se pueden obtener de un cierto número de fuentes, incluidas las células mononucleares de la sangre periférica, la médula ósea, tejido de los ganglios linfáticos, sangre del cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo y tumores.
En ciertos aspectos de la presente descripción, las células efectoras inmunitarias, por ejemplo, las células T, se pueden obtener a partir de una unidad de sangre extraída de un sujeto usando cualquier número de técnicas conocidas por el experto en la técnica, tal como la separación Ficoll™. En un aspecto preferido, se obtienen células de la sangre circulante de un individuo por aféresis. El producto de aféresis contiene típicamente linfocitos, incluidos células T, monocitos, granulocitos, linfocitos B, otros glóbulos blancos nucleados, glóbulos rojos y plaquetas. En un aspecto, las células recolectadas por aféresis pueden lavarse para eliminar la fracción de plasma y, opcionalmente, colocar las células en un amortiguador o medio apropiado para las etapas de procesamiento posteriores. En un caso, las células se lavan con disolución salina tamponada con fosfato (PBS). En un caso alternativo, la disolución de lavado carece de calcio y puede carecer de magnesio o puede carecer de muchos, si no todos, cationes divalentes.
Las etapas de activación iniciales en ausencia de calcio pueden conducir a una activación magnificada. Como los expertos ordinarios en la técnica apreciarían fácilmente, una etapa de lavado se puede lograr mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, tal como utilizando una centrífuga semiautomática de «flujo continuo» (por ejemplo, el procesador de células Cobe 2991, el Baxter CytoMate o el Haemonetics Cell Saver 5) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después del lavado, las células se pueden resuspender en diversos tampones biocompatibles, tales como, por ejemplo, PBS exento de Ca, exento de Mg, PlasmaLyte A u otra solución salina con o sin tampón. Como alternativa, los componentes indeseables de la muestra de aféresis se pueden separar y las células resuspender directamente en medios de cultivo.
En un aspecto, las células T se aíslan de los linfocitos de sangre periférica lisando los glóbulos rojos y agotando los monocitos, por ejemplo, mediante centrifugación a través de un gradiente PERCOLL ™ o mediante elutriación centrífuga en contraflujo.
Los métodos descritos en la presente pueden incluir, por ejemplo, la selección de una subpoblación específica de células efectoras inmunitarias, por ejemplo, linfocitos T, que son una población depletada de linfocitos T reguladores, células depletadas de CD25+, utilizando, por ejemplo, una técnica de selección negativa, por ejemplo, descrita en la presente. Preferentemente, la población de células depletadas de linfocitos T reguladores contiene menos de un 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% de células CD25+.
En un caso, las células T reguladoras, por ejemplo, las células T CD25+, se eliminan de la población usando un anticuerpo anti-CD25, o un fragmento del mismo, o un ligando de unión a CD25, IL-2. En un caso, el anticuerpo anti-CD25, o fragmento del mismo, o ligando de unión a CD25 se conjuga con un sustrato, por ejemplo, una perla, o se recubre de otro modo sobre un sustrato, por ejemplo, una perla. En un caso, el anticuerpo anti-CD25, o un fragmento del mismo, se conjuga con un sustrato como se describe aquí.
En un caso, las células T reguladoras, por ejemplo, células T CD25+, se eliminan de la población usando reactivo de depleción de CD25 de Miltenyi™. En un caso, la proporción de células a reactivo de depleción de CD25 es 1e7 células a 20 ul, o 1e7 células a 15 ul, o 1e7 células a 10 ul, o 1e7 células a 5 ul, o 1e7 células a 2,5 ul, o 1e7 células a 1,25 ul. En un caso, por ejemplo, para células T reguladoras, por ejemplo, agotamiento de CD25+, se usa más de 500 millones de células/ml. En un aspecto adicional, se utiliza una concentración de células de 600, 700, 800 o 900 millones de células/mL.
En un caso, la población de células efectoras inmunitarias que se agotarán incluye alrededor de 6 x 109 células T CD25+. En otros aspectos, la población de células efectoras inmunitarias que se agotarán incluye alrededor de 1 x 109 a 1x 1010 célula T CD25+, y cualquier valor entero intermedio. En un caso, la población resultante de células T reguladoras empobrecidas tiene 2 x 109 células T reguladoras, por ejemplo, células CD25+, o menos (por ejemplo, 1 x 109, 5 x 108, 1 x 108, 5 x 107, 1 x 107, o menos células CD25+).
En un caso, las células T reguladoras, por ejemplo, células CD25+, se eliminan de la población usando el sistema CliniMAC con un conjunto de tubos de agotamiento, como por ejemplo, el tubo 162-01. En un caso, el sistema CliniMAC se ejecuta en una configuración de agotamiento tal como, por ejemplo, DEPLETION2.1.
Sin desear ceñirse a ninguna teoría particular, la reducción del nivel de reguladores negativos de las células inmunitarias (por ejemplo, disminución del número de células inmunitarias no deseadas, por ejemplo, linfocitos Treg), en un sujeto antes de la aféresis o durante la producción de un producto de tipo célula que expresa CAR puede reducir el riesgo de recaídas del sujeto. por ejemplo, los métodos de agotamiento de células Treg son conocidos en la técnica. Los métodos de disminución de linfocitos Treg incluyen, sin carácter limitante, ciclofosfamida, anticuerpo anti-GITR (un anticuerpo anti-GITR descrito en la presente), depleción de CD25, y combinaciones de estos.
En algunos casos, los métodos de fabricación comprenden reducir el número de (por ejemplo, agotar) células Treg antes de la fabricación de la célula que expresa CAR. por ejemplo, los métodos de fabricación comprenden poner en contacto la muestra, por ejemplo, la muestra de aféresis, con un anticuerpo anti-GITR y/o un anticuerpo anti-CD25 (o un fragmento del mismo, o un ligando de unión a CD25), por ejemplo, para agotar células Treg antes de la fabricación del producto de células que expresan CAR (por ejemplo, células T, células NK).
En un caso, un sujeto es pretratado con una o más terapias que reducen las células Treg antes de la recolección de células para la fabricación de productos celulares que expresan CAR, reduciendo así el riesgo de recaída del sujeto al tratamiento con células que expresan CAR. En un caso, los métodos para disminuir células Treg incluyen, pero no se limitan a, la administración al sujeto de uno o más de ciclofosfamida, anticuerpo anti-GITR, depleción de c D25, o una combinación de los mismos. La administración de uno o más de: ciclofosfamida, anticuerpo anti-GITR, depleción de CD25 o una combinación de estos puede ocurrir antes, durante o después de una infusión del producto de tipo célula que expresa CAR.
En un caso, un sujeto se trata previamente con ciclofosfamida antes de la recolección de células para la fabricación de productos celulares que expresan CAR, reduciendo así el riesgo de recaída del sujeto al tratamiento con células que expresan CAR. En un caso, un sujeto se trata previamente con un anticuerpo anti-GITR antes de la recolección de células para la fabricación de productos celulares que expresan CAR, reduciendo así el riesgo de recaída del sujeto al tratamiento con células que expresan CAR.
En un caso, la población de células que se eliminarán no son las células T reguladoras o las células tumorales, sino las células que de otro modo afectan negativamente la expansión y/o función de las células CART, por ejemplo, células que expresan CD14, CD11b, CD33, CD15 u otros marcadores expresados por células potencialmente inmunosupresoras. En un caso, se prevé que dichas células se eliminen al mismo tiempo que las células T reguladoras y/o las células tumorales, o después de dicho agotamiento, o en otro orden.
Los métodos descritos en la presente pueden incluir más de un paso de selección, por ejemplo, más de un paso de depleción. El enriquecimiento de una población de linfocitos T mediante selección negativa se puede lograr, por ejemplo, con una combinación de anticuerpos dirigidos a marcadores superficiales únicos para las células seleccionadas de manera negativa. Un método es la clasificación y/o selección celular mediante inmunoadherencia magnética negativa o citometría de flujo que utiliza un combinado de anticuerpos monoclonales dirigidos a marcadores de la superficie celular presentes en las células seleccionadas de manera negativa. por ejemplo, para enriquecer en células CD4+ por selección negativa, un combinado de anticuerpos monoclonales puede incluir anticuerpos contra CD14, CD20, CD11bb, CD16, HLA-DR y CD8.
Los métodos descritos en la presente pueden incluir además la eliminación de células de la población que expresa un tumor antigénico, por ejemplo, un tumor antigénico que no comprende CD25, por ejemplo, CD19, CD30, CD38, CD123, CD20, CD14 o CD11b, para proporcionar de esta manera una población de células depletadas de linfocitos T reguladores, por ejemplo, depletadas de CD25+, y depletadas de antígenos tumorales que son adecuadas para la expresión de un CAR, por ejemplo, un CAR descrito en la presente. En un caso, las células que expresan el antígeno tumoral se eliminan simultáneamente con las células T reguladoras, por ejemplo, CD25+. por ejemplo, un anticuerpo anti-CD25, o fragmento de este, y un anticuerpo anti-antígeno tumoral, o fragmento de este, se pueden unir al mismo sustrato, por ejemplo, perla, que se puede utilizar para eliminar las células o un anticuerpo anti-CD25, o fragmento de este, o el anticuerpo antiantígeno tumoral, o fragmento de este, se pueden unir a perlas separadas, y esta mezcla se puede utilizar para eliminar las células. En otros casos, la eliminación de las células T reguladoras, por ejemplo, células CD25+, y la eliminación de las células que expresan el antígeno tumoral es secuencial, y puede ocurrir, por ejemplo, en cualquier orden.
También se proporcionan métodos que incluyen eliminar células de la población que expresan un inhibidor de puntos de control, por ejemplo, un inhibidor de puntos de control descritos en la presente, por ejemplo, una o más células PD1+, células LAG3+, y células TIM3+, para proporcionar de esta manera una población de células depletadas de linfocitos T reguladores, por ejemplo, células depletadas de CD25+, y depletadas de inhibidores de puntos de control, por ejemplo, células depletadas de PD1+, LAG3+ y/o TIM3+. Los inhibidores de puntos de control a modo de ejemplo incluyen B7-H1, B7-1, CD160, P1H, 2B4, PD1, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, TIGIT, CTLA-4, BTLA y LAIR1. En un caso, las células que expresan el inhibidor del punto de control se eliminan simultáneamente con las células T reguladoras, por ejemplo, CD25+. por ejemplo, un anticuerpo anti-CD25, o fragmento de este, y un anticuerpo anti-inhibidor de puntos de control, o fragmento de este, se pueden unir a la misma perla, que se puede utilizar para eliminar las células o un anticuerpo anti-CD25, o fragmento de este, y el anticuerpo anti-inhibidor de puntos de control, o fragmento de este, se pueden unir a perlas separadas, y esta mezcla se puede utilizar para eliminar las células. En otros casos, la eliminación de las células T reguladoras, por ejemplo, células CD25+, y la eliminación de las células que expresan el inhibidor del punto de control es secuencial, y puede ocurrir, por ejemplo, en cualquier orden.
Los métodos descritos aquí pueden incluir una etapa de selección positiva. por ejemplo, las células T pueden aislarse mediante incubación con perlas conjugadas con anti-CD3/anti-CD28 (por ejemplo, 3x28), tal como DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T, durante un período de tiempo suficiente para la selección positiva de las células T deseadas. En un caso, el período de tiempo es de alrededor de 30 minutos. En otro caso, el período de tiempo varía de 30 minutos a 36 horas o más, y todos los valores enteros entre ellos. En otro caso, el período de tiempo es de al menos 1, 2, 3, 4, 5 o 6 horas. En otro caso más, el período de tiempo es de 10 a 24 horas, por ejemplo, 24 horas. Se pueden utilizar tiempos de incubación más largos para aislar células T en cualquier situación en la que haya pocos células T en comparación con otros tipos de células, tal como en el aislamiento de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) del tejido tumoral o de individuos inmunocomprometidos. Además, el uso de tiempos de incubación más prolongados puede aumentar la eficacia de captura de células T CD8+. Por lo tanto, simplemente acortando o alargando el tiempo en que se permite que los células T se unan a las perlas de CD3/CD28 y/o aumentando o disminuyendo la relación de perlas respecto a células T (tal como se describe más adelante en esta memoria), se puede seleccionar preferentemente a favor o en contra de subpoblaciones de células T en el inicio del cultivo o en otros puntos temporales durante el proceso. Adicionalmente, al aumentar o disminuir la relación de anticuerpos anti-CD3 y/o anti-CD28 en las perlas u otra superficie, se puede seleccionar preferentemente a favor o en contra de las subpoblaciones de células T en el inicio del cultivo o en otros puntos temporales deseados.
En un caso, se puede seleccionar una población de células T que exprese uno o más de IFN-y, TNFa, IL-17A, IL-2, IL-3, IL-4, GM-CSF, IL-10, IL-13, granzima B y perforina, u otras moléculas apropiadas, por ejemplo, otras citocinas. Se pueden determinar métodos para el cribado de la expresión celular, por ejemplo, según los métodos descritos en la Publicación de PCT N.°: WO 2013/126712.
Para el aislamiento de una población de células deseada mediante selección positiva o negativa, se puede variar la concentración de células y superficie (por ejemplo, partículas tales como perlas). En determinados aspectos, puede ser deseable disminuir significativamente el volumen en el que se mezclan juntas las perlas y las células (por ejemplo, aumento de la concentración de células), para garantizar el máximo contacto de las células y las perlas. por ejemplo, en un aspecto, se usa una concentración de 10 mil millones de células/ml, 9 mil millones/ml, 8 mil millones/ml, 7 mil millones/ml, 6 mil millones/ml, o 5 mil millones/ml. En un aspecto, se utiliza una concentración de 1 billón de células/ml. En un aspecto más, se utiliza una concentración de células de 75, 80, 85, 90, 95 o 100 millones de células/ml. En aspectos adicionales, pueden usarse concentraciones de 125 o 150 millones de células/ml.
El uso de concentraciones elevadas puede dar como resultado un mayor rendimiento celular, activación celular y expansión celular. Además, el uso de altas concentraciones de células permite una captura más eficaz de las células que puedan expresar débilmente antígenos diana de interés, tales como linfocitos T negativos para CD28, o de muestras en las que hay muchas células tumorales presentes (por ejemplo, sangre leucémica, tejido tumoral, etc.). Poblaciones de células de este tipo pueden tener valor terapéutico y serían deseables de obtener. por ejemplo, el uso de una alta concentración de células permite una selección más eficaz de células T CD8+ que normalmente tienen una expresión de CD28 más débil.
En un aspecto relacionado, puede ser deseable utilizar concentraciones más bajas de células. Al diluir significativamente la mezcla de células T y superficie (p. ej., partículas tales como perlas), se minimizan las interacciones entre las partículas y las células. Esto selecciona las células que expresan cantidades elevadas de antígenos deseados para unirse a las partículas. por ejemplo, los linfocitos T CD4+ expresan niveles más elevados de CD28 y se capturan de manera más eficaz que los linfocitos T CD8+ en concentraciones diluidas. En un aspecto, la concentración de células utilizadas es 5 x 106/ml. En otros aspectos, la concentración utilizada puede ser alrededor de 1 x 105/ml a 1 x 106/ml, y cualquier valor entero intermedio.
En otros aspectos, las células se pueden incubar en un dispositivo rotatorio durante períodos de tiempo variables a velocidades variables a 2-10 °C o a temperatura ambiente.
Los células T para estimulación también se pueden congelar después de una etapa de lavado. Sin desear ceñirse a ninguna teoría, el paso de congelación y descongelación posterior proporciona un producto más uniforme al separar granulocitos y, en cierta medida, monocitos en la población celular. Después de la etapa de lavado que separa el plasma y las plaquetas, las células se pueden suspender en una solución de congelación. Si bien muchas soluciones y parámetros de congelación son conocidos en la técnica y serán útiles en este contexto, un método conlleva el uso de PBS que contiene un 20% de DMSO y un 8% de albúmina de suero humano, o medios de cultivo que contienen un 10% de Dextrano 40 y un 5% de Dextrosa, un 20% de Albúmina de Suero Humano y un 7,5% de DMSO, o un 31,25% de Plasmalyte-A, un 31,25% de Dextrosa 5%, un 0,45% de NaCl, un 10% de Dextrano 40 y un 5% de Dextrosa, un 20% de Albúmina de Suero Humano y un 7,5% de DMSO u otros medios de congelación celular adecuados que contienen, por ejemplo, Hespan y PlasmaLyte A, las células se congelan después a -80°C a una velocidad de 1° por minuto y se almacenan en la fase de vapor de un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido. Se pueden utilizar otros métodos de congelación controlada, así como la congelación no controlada inmediatamente a -20 °C o en nitrógeno líquido.
En ciertos aspectos, las células crioconservadas se descongelan y lavan como se describe aquí y se dejan reposar durante una hora a temperatura ambiente antes de la activación usando los métodos de la presente descripción.
También se contempla en el contexto de la invención la recogida de muestras de sangre o producto de aféresis de un sujeto en un período de tiempo anterior al momento en que se podrían necesitar las células expandidas tal como se describen en la presente. Como tal, la fuente de las células que se expandirán se puede recoger en cualquier momento necesario, y las células deseadas, tales como las células T, se pueden aislar y congelar para uso posterior en la terapia de células efectoras inmunitarias para cualquier número de enfermedades o afecciones que se beneficiarían de la terapia con células efectoras inmunitarias, tales como las descritas aquí. En un aspecto, se toma una muestra de sangre o una aféresis de un sujeto generalmente sano. En ciertos aspectos, se toma una muestra de sangre o una aféresis de un sujeto generalmente sano que está en riesgo de desarrollar una enfermedad, pero que aún no ha desarrollado una enfermedad, y las células de interés se aíslan y congelan para su uso posterior. En determinados aspectos, las células T pueden expandirse, congelarse y utilizarse en un momento posterior. En ciertos aspectos, se recogen muestras de un paciente poco después del diagnóstico de una enfermedad particular tal como se describe en la presente, pero antes de cualesquiera tratamientos. En un aspecto adicional, las células se aíslan de una muestra de sangre o de una aféresis de un sujeto antes de cualquier número de modalidades de tratamiento relevantes, que incluyen, sin carácter limitante, tratamiento con agentes tales como natalizumab, efalizumab, agentes antivíricos, quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, tales como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos u otros agentes inmunoablativos, tales como CAMPATH, anticuerpos anti-CD3, citoxano, fludarabina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228 e irradiación.
En un aspecto adicional de la presente descripción, las células T se obtienen de un paciente directamente después del tratamiento que deja al sujeto con células T funcionales. A este respecto, se ha observado que después de determinados tratamientos contra el cáncer, en particular los tratamientos con fármacos que dañan el sistema inmunitario, poco después del tratamiento durante el período en que los pacientes normalmente se recuperarían del tratamiento, la calidad de los linfocitos T obtenidos puede ser óptima o mejorada en lo que respecta a su capacidad de expandirse ex vivo. Del mismo modo, después de la manipulación ex vivo utilizando los métodos descritos en la presente, estas células pueden estar en un estado preferido para un mejor prendimiento del injerto y expansión in vivo. Por lo tanto, se contempla dentro del contexto de la presente invención recoger células de la sangre, incluidos linfocitos T, células dendríticas u otras células del linaje hematopoyético, durante esta fase de recuperación. Además, en ciertos aspectos, los regímenes de movilización (por ejemplo, la movilización con GM-CSF) y acondicionamiento pueden utilizarse para crear una condición en un sujeto en el que se favorezca la repoblación, recirculación, regeneración y/o expansión de tipos de células particulares, especialmente durante un intervalo de tiempo definido después de la terapia. Tipos ilustrativos de células incluyen células T, células B, células dendríticas y otras células del sistema inmunitario.
En un caso, las células efectoras inmunitarias que expresan una molécula CAR, por ejemplo, una molécula CAR descrita en al presente, se obtienen de un sujeto que ha recibido una dosis baja, de potenciación inmunitaria, de un inhibidor de mTOR. En un caso, la población de células efectoras inmunitarias, por ejemplo, células T, que se van a manipular para expresar un CAR, se recolecta después de un tiempo suficiente, o después de una dosificación suficiente de la dosis baja, potenciadora del sistema inmunológico, de un inhibidor de mTOR, de manera que se ha aumentado, al menos transitoriamente, el nivel de células efectoras inmunitarias negativas para PD1, por ejemplo, células T, o la proporción de células efectoras inmunitarias negativas para PD1, por ejemplo, células T/células efectoras inmunitarias positivas para PD1, por ejemplo, células T, en el sujeto o recolectadas del sujeto.
En otras realizaciones, la población de células efectoras inmunitarias, por ejemplo, linfocitos T, que tienen, o se modificarán para expresar un CAR, se pueden tratar ex vivo por contacto con una cantidad de un inhibidor de mTOR que incrementa el número de células efectoras inmunitarias negativas para PD1, por ejemplo, linfocitos T, o incrementa la relación de células efectoras inmunitarias negativas para PD1, por ejemplo, linfocitos T/células efectoras inmunitarias positivas para PD1, por ejemplo, linfocitos T.
En una realización, una población de linfocitos T es deficiente en diaglicerol cinasa (DGK, por sus siglas en inglés). Las células deficientes en d Gk incluyen células que no expresan ARN o proteína de DGK, o tienen una reducción o inhibición de la actividad de DGK. Las células deficientes en DGK se pueden generar mediante estrategias genéticas, por ejemplo, administración de agentes de interferencia por ARN, por ejemplo, ARNip, ARNhc, miARN, para reducir o prevenir el expresión de DGK. Como alternativa, las células deficientes en DGK se pueden generar mediante tratamiento con inhibidores de DGK descritos en la presente.
En una realización, una población de linfocitos T es deficiente en Ikaros. Las células deficientes en Ikaros incluyen células que no expresan el ARN o la proteína de Ikaros, o tienen una reducción o inhibición de la actividad de Ikaros, las células deficientes en Ikaros se pueden generar mediante estrategias genéticas, por ejemplo, administrando agentes de interferencia por ARN, por ejemplo, ARNip, ARNhc, miARN, para reducir o evitar la expresión de Ikaros. Como alternativa, las células deficientes en Ikaros se pueden generar mediante tratamiento con inhibidores de Ikaros, por ejemplo, lenalidomida.
En algunas realizaciones, una población de linfocitos T es deficiente en DGK y deficiente en Ikaros, por ejemplo, no expresa DGK ni Ikaros, o tiene una reducción o inhibición de la actividad de DGK e Ikaros. Tales células deficientes en DGK e Ikaros se pueden generar mediante cualquiera de los métodos descritos en la presente.
En una realización, los linfocitos NK se obtienen del sujeto. En otra realización, los linfocitos NK son una línea de linfocitos NK, por ejemplo, línea de linfocitos NK-92 (Conkewest).
CAR alogénico
En las realizaciones descritas en la presente, la célula efectora inmunitaria puede ser una célula efectora inmunitaria alogénica, por ejemplo, linfocito T o linfocito NK. por ejemplo, la célula puede ser un linfocito T alogénico, por ejemplo, un linfocito T alogénico que carece de la expresión de un receptor de linfocitos T (TCR) y/o antígeno leucocitario humano (HLA), por ejemplo, HLA de clase I y/o h La de clase II, funcionales.
Una célula T que carece de un TCR funcional puede, por ejemplo, diseñarse de manera que no exprese ningún TCR funcional en su superficie, diseñarse de tal manera que no exprese una o más subunidades que comprendan un TCR funcional, o diseñarse de tal manera que produzca muy poco t Cr funcional en su superficie. Como alternativa, el linfocito T puede expresar un TCR sustancialmente alterado, por ejemplo, por expresión de formas mutadas o truncadas de una 0 más subunidades del TCR. La expresión «TCR sustancialmente alterado» significa que este TCR no suscita una reacción inmunitaria adversa en un hospedador.
Un linfocito T descrito en la presente se puede, por ejemplo, modificar de manera que no exprese un HLA funcional en su superficie. por ejemplo, un linfocito T descrito en la presente, se puede modificar de modo que la expresión en la superficie celular de HLA, por ejemplo, HLA de clase 1 y/o h La de clase II, experimente una disminución regulada.
En algunas realizaciones, el linfocito T puede carecer de un TCR funcional y un HLA funcional, por ejemplo, HLA de clase 1 y/o HLA de clase II.
Los linfocitos T modificados que carecen de un TCR y/o HLA funcionales se pueden obtener mediante cualquier medio adecuado, incluida la supresión o disminución de una o más subunidades de TCR o HLA. por ejemplo, el linfocito T puede incluir una disminución de TCR y/o HLA utilizando ARNip, ARNhc, grupos de repeticiones palindrómicas cortas en intervalos regulares (CRISPR), nucleasa efectora de tipo activador de la transcripción (TALEN) o endonucleasa con dedos de zinc (ZFN).
En algunas realizaciones, la célula alogénica puede ser una célula que no expresa o expresa en niveles bajos una molécula inhibidora, por ejemplo, por cualquier método descrito aquí. por ejemplo, la célula puede ser una célula que no expresa o expresa con niveles bajos una molécula inhibidora, por ejemplo, que puede reducir la capacidad de una célula que expresa CAR para organizar una respuesta efectora inmunitaria. Ejemplos de moléculas inhibidoras incluyen PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 y TGFR beta. La inhibición de una molécula inhibidora, por ejemplo, mediante inhibición a nivel de ADN, ARN o proteína, puede optimizar el rendimiento de una célula que expresa CAR. En algunas realizaciones, se puede utilizar un ácido nucleico inhibidor, por ejemplo, un ácido nucleico inhibidor, por ejemplo, un ARNbc, por ejemplo, un ARNip o ARNhc, grupos de repeticiones palindrómicas cortas en intervalos regulares (CRISPR), una nucleasa efectora de tipo activador de la transcripción (TALEN) o una endonucleasa con dedos de zinc (ZFN), por ejemplo, tal como se describe en la presente.
ARNip y ARNhc para inhibir TCR o HLA
En algunas realizaciones, la expresión de TCR y/o la expresión de HLA se pueden inhibir usando ARNip o ARNhc que se dirige a un ácido nucleico que codifica un TCR y/o HLA en una célula T.
La expresión de ARNip o ARNhc en linfocitos T se puede lograr utilizando cualquier sistema de expresión convencional, por ejemplo, tal como un sistema de expresión lentivírico.
Los ARNhc a modo de ejemplo que reducen de manera regulada la expresión de componentes del TCR se describen, por ejemplo, en la Publicación de EE. UU. N.°: 2012/0321667. Los ARNip y ARNhc a modo de ejemplo que reducen de manera regulada la expresión de los genes de HLA de clase I y/o HLA de clase II se describen, por ejemplo, en la publicación de EE. UU. N.°: US 2007/0036773.
CRISPR para inhibir TCR o HLA
El término «CRISPR» o «CRISPR contra TCR y/o HLA» o «CRISPR para inhibir TCR y/o HLA», tal como se utiliza en la presente, se refiere a un conjunto de grupos de repeticiones palindrómicas cortas en intervalos regulares, o un sistema que comprende un conjunto de repeticiones de este tipo. El término «Cas», tal como se utiliza en la presente, se refiere a una proteína asociada a CRISPR. Un sistema “CRISPR/Cas” se refiere a un sistema derivado de CRISPR y Cas que puede usarse para silenciar o mutar un gen TCR y/o HLA.
Se observan sistemas CRISPR/Cas de origen natural en aproximadamente un 40% de los genomas eubacterianos secuenciados y en un 90% de las arqueas secuenciadas. Grissa et al. (2007) BMC Bioinformatics 8: 172. Este sistema es un tipo de sistema inmunitario procariótico que confiere resistencia a elementos genéticos exógenos tales como plásmidos y fagos y proporciona una forma de inmunidad adquirida. Barrangou et al. (2007) Science 315: 1709-1712; Marragini et al. (2008) Science 322: 1843-1845.
El sistema CRISPR/Cas ha sido modificado para su uso en la edición génica (silenciar, potenciar o cambiar genes específicos) en eucariotas tales como ratones o primates. Wiedenheft et al. (2012) Nature 482: 331-8. Esto se logra introduciendo en la célula eucariota un plásmido que contiene un CRISPR diseñado específicamente y una o más Cas apropiadas.
La secuencia CRISPR, a veces denominada locus CRISPR, comprende repeticiones y espaciadores que se alternan. En un CRISPR de origen natural, los espaciadores comprenden normalmente secuencias exógenas respecto a la bacteria tal como una secuencia de fago o plásmido; en el sistema CRISPR/Cas TCR y/o HLA, los espaciadores se derivan de la secuencia del gen TCR o HLA.
El ARN del locus CRISPR es expresado de manera constitutiva y procesado por proteínas Cas para obtener ARN pequeños. Estos comprenden un espaciador flanqueado por una secuencia repetida. Los ARN guían otras proteínas Cas para silenciar elementos genéticos exógenos a nivel de a Rn o ADN. Horvath et al. (2010) Science 327: 167-170; Makarova et al. (2006) Biology Direct 1: 7. Los espaciadores sirven de este modo como moldes para moléculas de ARN, de manera análoga a los ARNip. Pennisi (2013) Science 341: 833-836.
Ya que estos ocurren de manera natural en muchos tipos diferentes de bacterias, las disposiciones exactas de los CRISPR y la estructura, función y número de genes Cas y su producto difieren un tanto de unas especies a otras. Haft et al. (2005) PLoS Comput. Biol. 1: e60; Kunin et al. (2007) Genome Biol. 8: R61; Mojica et al. (2005) J. Mol. Evol. 60: 174-182; Bolotin et al. (2005) Microbiol. 151: 2551-2561; Pourcel et al. (2005) Microbiol. 151: 653-663; y Stern et al. (2010) Trends. Genet.
28: 335-340. por ejemplo, las proteínas Cse (subtipo Cas, E. coli) (por ejemplo, CasA) forman un complejo funcional, Cascade, que procesa los transcritos de ARN CRISPR para obtener unidades de espaciador-repetición que retiene Cascade. Brouns et al. (2008) Science 321: 960-964. En otras procariotas, Cas6 procesa el transcrito CRISPR. La inactivación de fagos basada en CRISPR en E. coli requiere Cascade y Cas3, pero no Cas1 o Cas2. La proteína Cmr (módulo Cas RAMP) en Pyrococcus furiosus y otras procariotas forman un complejo funcional con ARN CRISPR pequeños que reconoce y escinde ARN diana complementarios. Un sistema CRISPR más simple depende de la proteína Cas9, que es una nucleasa con dos sitios de corte activos, uno para cada hebra de la doble hélice. La combinación de Cas9 y ARN del locus CRISPR modificado se puede utilizar en un sistema para la edición génica. Pennisi (2013) Science 341: 833­ 836.
El sistema CRISPR/Cas se puede utilizar, por lo tanto, para editar un gen de TCR y/o HLA (añadiendo o eliminando un par de bases) o introducir una parada prematura que disminuya de esta manera la expresión de TCR y/o HLA. Como alternativa, el sistema CRISPR/Cas se puede utilizar como un ARN de interferencia, desactivando el gen de TCR y/o HLA de manera reversible. En una célula de mamífero, por ejemplo, el ARN puede guiar la proteína Cas a un promotor de TCR y/o HLA, y bloquear estéricamente las ARN polimerasas.
Se pueden generar sistemas CRISPR/Cas artificiales que inhiben TCR y/o HLA, utilizando tecnología conocida en la técnica, por ejemplo, la descrita en la Publicación de EE. UU. N.° 20140068797 y Cong (2013) Science 339: 819-823. También se pueden generar otros sistemas CRISPR/Cas que se conocen en la técnica que inhiben TCR y/o HLA, por ejemplo, el descrito en Tsai (2014) Nature Biotechnol., 32:6 569-576, Patente de EE. UU. N.°: 8 871 445; 8865 406; 8 795 965; 8771 945; y 8697 359.
TALEN para inhibir TCR y/o HLA
"TALEN” o “TALEN contra HLA y/o TCR” o “TALEN para inhibir HLA y/o TCR” se refiere a una nucleasa efectora de tipo activador de la transcripción, una nucleasa artificial que puede usarse para editar el gen HLA y/o TCR.
Los TALEN se producen de manera artificial fusionando un dominio de unión a ADN del efector TAL con un dominio de escisión de ADN. Los efectos de tipo activación de la transcripción (TALE) se pueden modificar para que se unan a cualquier secuencia de ADN deseada, incluida una porción del gen de HLA o TCR. Al combinar un TALE modificado con un dominio de escisión de ADN, se puede producir una enzima de restricción que es específica para cualquier secuencia de ADN deseada, incluida una secuencia HLA o TCR. Estas se pueden introducir posteriormente en una célula, donde se pueden utilizar para la edición genómica. Boch (2011) Nature Biotech. 29: 135-6; y Boch et al. (2009) Science 326: 1509­ 12; Moscou et al. (2009) Science 326: 3501.
Los TALE son proteínas secretadas por bacterias Xanthomonas. El dominio de unión a ADN contiene una secuencia repetida de 33-34 aminoácidos muy conservados con excepción de los aminoácidos 12.° y 13.°. Estas dos posiciones son muy variables y muestran una sólida correlación con el reconocimiento de nucleótidos específicos. Por lo tanto, se pueden modificar para unirse a una secuencia de ADN deseada.
Para producir un TALEN, se fusiona una proteína TALE a una nucleasa (N), que es una endonucleasa Fokl de tipo natural o mutada. Se han realizado varias mutaciones en Fokl para su uso en TALEN; estas, por ejemplo, mejoran la especificidad o actividad de escisión. Cermak et al. (2011) Nucl. Acids Res. 39: e82; Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8; Hockemeyer et al. (2011) Nature Biotech. 29: 731-734; Wood et al. (2011) Science 333: 307; Doyon et al. (2010) Nature Methods 8: 74-79; Szczepek et al. (2007) Nature Biotech. 25: 786-793; y Guo et al. (2010) J. Mol. Biol. 200: 96.
El dominio Fokl funciona como un dímero, que requiere dos constructos con dominios de unión a ADN únicos para sitios en el genoma diana con una orientación y separación adecuadas. Tanto el número de residuos aminoacídicos entre el dominio de unión a ADN de TALE y el dominio de escisión Fokl como el número de bases entre dos sitios de unión de TALEN individuales parecen ser parámetros importantes para lograr niveles elevados de actividad. Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8.
Se puede utilizar una TALEN para HLA o TCR dentro de una célula para producir una rotura bicatenaria (DSB, por sus siglas en inglés). Se puede introducir una mutación en el sitio de rotura si los mecanismos de reparación reparan de manera incorrecta la ruta mediante unión de extremos no homólogos. por ejemplo, la reparación incorrecta puede introducir una mutación del marco de lectura. Como alternativa, se puede introducir ADN exógeno en la célula junto con la TALEN; dependiendo de las secuencias del ADN exógeno y la secuencia cromosómica, este proceso se puede utilizar para corregir un defecto en el gen de HLA o TCR o introducir un defecto de este tipo en un gen de HLA o TCR de tipo natural, y reducir de este modo la expresión de HLA o TCR.
Se pueden construir TALEN específicas para secuencias en HLA o TCR utilizando cualquier método conocido en la técnica, incluidos varios esquemas que utilizan componentes modulares. Zhang et al. (2011) Nature Biotech. 29: 149-53; Geibler et al. (2011) PLoS ONE 6: e19509.
Nucleasa de dedos de zinc para inhibir HLA y/o TCR
”ZFN” o “Nucleasa de dedos de zinc” o “ZFN contra HLA y/o TCR” o “ZFN para inhibir HLA y/o TCR” se refieren a una nucleasa de dedos de zinc, una nucleasa artificial que puede usarse para editar el gen HLA y/o TCR.
Como una TALEN, una ZFN comprende un dominio nucleasa Fokl (o derivado de este) fusionado con un dominio de unión a ADN. En el caso de una ZFN, el dominio de unión a ADN comprende uno o más dedos de zinc. Carroll et al. (2011) Genetics Society of America 188: 773-782; y Kim et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1156-1160.
Un dedo de zinc es un pequeño motivo estructural proteico estabilizado por uno o más iones de zinc. Un dedo de zinc puede comprender, por ejemplo, Cys2His2, y puede reconocer una secuencia de aproximadamente 3 pb. Se pueden combinar diversos dedos de zinc de especificidad conocida para producir polipéptidos con múltiples dedos que reconocen secuencias de aproximadamente 6, 9, 12, 15 o 18 pb. Se puede disponer de diversas técnicas de selección y ensamblaje modular para generar dedos de zinc (y combinaciones de estos) que reconocen secuencias específicas, incluidos la presentación en fagos, sistemas de único híbrido en levaduras, sistemas de único híbrido y de doble híbrido bacterianos, y células de mamífero.
Como una TALEN, una ZFN debe dimerizar para escindir ADN. Por lo tanto, se necesita un par de ZFN para tener como diana sitios de ADN no palindrómicos. Las dos ZFN individuales deben unirse a hebras opuestas del ADN con sus nucleasas debidamente separadas. Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10570-5.
También al igual que una TALEN, una ZFN puede crear una rotura bicatenaria en el ADN, que puede crear una mutación del marco de lectura si se repara de forma incorrecta, lo que conlleva un descenso en la expresión y cantidad de HLA y/o TCR en una célula. Las ZFN también se pueden utilizar con recombinación homóloga para mutar en el gen de HLA o TCR.
Se pueden construir ZFN específicas para secuencias en HLA y/o TCR utilizando cualquier método conocido en la técnica. Remítase, por ejemplo, a Provasi (2011) Nature Med. 18: 807-815; Torikai (2013) Blood 122: 1341-1349; Cathomen et al. (2008) Mol. Ther. 16: 1200-7; y Guo et al. (2010) J. Mol. Biol. 400: 96; Publicación de Patente de EE. UU. 2011/0158957; y Publicación de Patente de EE. UU. 2012/0060230.
Expresión de telomerasa
Sin desear ceñirse a ninguna teoría particular, en algunas realizaciones, un linfocito T terapéutico tiene una persistencia poco prolongada en un paciente, debido a telómeros acortados en el linfocito T; en consecuencia, la transfección con un gen de telomerasa puede alargar los telómeros del linfocito T y mejorar la persistencia del linfocito T en el paciente. Remítase a Carl June, «Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic», Journal of Clinical Investigaron, 117:1466-1476 (2007). Por lo tanto, en una realización, una célula efectora inmunitaria, por ejemplo, un linfocito T, expresa de manera ectópica una subunidad de telomerasa, por ejemplo, la subunidad catalítica de la telomerasa, por ejemplo, TERT, por ejemplo, hTERT. En algunos aspectos, esta divulgación proporciona un método para producir una célula que expresa CAR, que comprende poner en contacto una célula con un ácido nucleico que codifica una subunidad de telomerasa, por ejemplo, la subunidad catalítica de la telomerasa, por ejemplo, TERT, por ejemplo, hTERT. La célula se puede poner en contacto con el ácido nucleico antes, a la vez o después de ponerse en contacto con un constructo que codifica un CAR.
En un aspecto, la descripción presenta un método para preparar una población de células efectoras inmunitarias (por ejemplo, células T o células NK). En una realización, el método comprende: proporcionar una población de células efectoras inmunitarias (por ejemplo, células T o células NK), poner en contacto la población de células efectoras inmunitarias con un ácido nucleico que codifica un CAR; y poner en contacto la población de células efectoras inmunitarias con un ácido nucleico que codifica una subunidad de telomerasa, por ejemplo, hTERT, en condiciones que permitan la expresión de CAR y telomerasa.
En una realización, el ácido nucleico que codifica la subunidad de telomerasa es ADN. En una realización, el ácido nucleico que codifica la subunidad de telomerasa comprende un promotor capaz de dirigir la expresión de la subunidad de telomerasa.
En una realización, hTERT tiene la secuencia de aminoácidos de GenBank Protein ID AAC51724.1 (Meyerson et al., "hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization" Cell Volume 90, número 4, 22 de agosto de 1997, páginas 785-795) como sigue:
M P R A P R C R A V R S L L R S H Y R E V L P L A T F V R R L G P Q G W R L V Q R G D P A A F R A L V A Q C L V C V P W D A R P P P A A P S F R Q V S C L K E L V A R V L Q R L C E R G A K N V L A F G F A L L D G A R G G P P E A F TT S V R S Y L P N T Y T D A L R G S G A W G L L L R R V G D D V L V H L L A R C A L F V L Y A P S C A Y Q V C G P P L Y Q L G A A T Q A R P P P H A S G P R R R L G C E R A W N H S V R E A G V P L G L P A P G A R R R G G S A S R S L P L P K R P R R G A A P E P E R T P V G Q G S W A H P G R T R G P S D R G F C W S P A R P A E E A T S L E G A L SG T R H S H P S V G R Q H H A G P P S T S R P P R P W D T P C P P V Y A E T K H F L Y S S G D K E Q L R P S F L L S S L R P S L T G A R R L V E T IF L G SR P W M P G T P R R L P R L P Q R Y W Q M R P L F L E L L G N H A Q C P Y G V L L K T H C P L R A A V T P A A G V C A R E K P Q G S V A A P E E E D T D P R R L V Q L L R Q H S S P W Q V Y G F V R A C L R R L V P P G L W G S R H N E R R F L R N T K K F IS L G K H A K L S L Q E L T W K M S V R G C A W L R R SP G V G C V P A A E H R L R E E IL A K F L H W L M S V Y V V E L L R S F F Y V T E T T F Q K N R L F F Y R K S V W S K L Q S IG IR Q H L K R V Q L R E L S E A E V R Q H R E A R P A L L T S R L R F IP K P D G L R P IV N M D Y W G A R T F R R E K R A E R L T S R V K A L F S V L N Y E R A R R P G L L G A S V L G L D D 1H R A W R T F
V L R V R A Q D P P P E L Y F V K V D V T G A Y D T IP Q D R L T E V IA S IIK P Q N T Y C V R R Y A W Q K A A H G H V R K A F K S H Y S T L T D L Q P Y M R Q F V A H L Q E T S P L R D A W IE Q S S S L N E A S S G L F D V F L R F M C H H A Y R IR G K S Y Y Q C Q G IP Q G S IL S T L L C S L C Y G D M E N K L F A G IR R D G L L L R L Y D D F L L V T P H L T H A K T F L R T L V R G V P E Y G C W N L R K T W N F P V E D E A L G G T A F V Q M P A H G L F P W C G L L L D T R T L E V Q S D Y S S Y A R T S IR A S L T F N R G F K A G R N M R R K L F G V L R L K C H SL F L D L Q V N S L Q T V C T N IY K IL L L Q A Y R F H A C V L Q L P F H Q Q V W K N P T F F L R V IS D T A S L C Y S IL K A K N A G M S L G A K G A A G P L P S E A V Q W L C H Q A F L L K L T R H R V T Y V P L L G S L R T A Q T Q L S R K L P G T T L T A L E A A A N P A L P S D F K T IL D (SE Q ID N O : 131)
En una realización, la hTERT tiene una secuencia al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de SEQ ID NO:131. En una realización, la hTERT tiene una secuencia de SEQ ID NO:131. En una realización, la hTERT comprende una deleción (por ejemplo, de no más de 5, 10, 15, 20 o 30 aminoácidos) en el extremo N-terminal, el C- terminal, o ambos. En una realización, la hTERT comprende una secuencia de aminoácidos transgénica (por ejemplo, de no más de 5, 10, 15, 20 o 30 aminoácidos) en el extremo N-terminal, el C-terminal o ambos.
En una realización, la hTERT está codificada por la secuencia de ácido nucleico del número de acceso de GenBank AF018167 (Meyerson et al., "hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization" Cell Volume 90, número 4, 22 de agosto de 1997, páginas 785-795):
1 caggcagcgt ggtcctgctg cgcacgtggg aagccctggc cccggccacc cccgcgatgc cgcgcgctcc ccgctgccga gccgtgcgct ccctgctgcg cagccactac cgcgaggtgc tgccgctggc cacgttcgtg cggcgcctgg ggccccaggg ctggcggctg gtgcagcgcg gggacccggc ggctttccgc gcgctggtgg cccagtgcct ggtgtgcgtg ccctgggacg cacggccgcc ccccgccgcc ccctccttcc gccaggtgtc ctgcctgaag gagctggtgg cccgagtgct gcagaggctg tgcgagcgcg gcgcgaagaa cgtgctggcc ttcggcttcg cgctgctgga cggggcccgc gggggccccc ccgaggcctt caccaccagc gtgcgcagct acctgcccaa cacggtgacc gacgcactgc gggggagcgg ggcgtggggg ctgctgttgc gccgcgtggg cgacgacgtg ctggttcacc tgctggcacg ctgcgcgctc tttgtgctgg tggctcccag ctgcgcctac caggtgtgcg ggccgccgct gtaccagctc ggcgctgcca ctcaggcccg gcccccgcca cacgctagtg gaccccgaag gcgtctggga tgcgaacggg cctggaacca tagcgtcagg gaggccgggg tccccctggg cctgccagcc ccgggtgcga ggaggcgcgg gggcagtgcc agccgaagtc tgccgttgcc caagaggccc aggcgtggcg ctgcccctga gccggagcgg acgcccgttg ggcaggggtc ctgggcccac ccgggcagga cgcgtggacc gagtgaccgt ggtttctgtg tggtgtcacc tgccagaccc gccgaagaag ccacctcttt ggagggtgcg ctctctggca cgcgccactc ccacccatcc gtgggccgcc agcaccacgc gggcccccca tccacatcgc ggccaccacg tccctgggac acgccttgtc 1021 ccccggtgta cgccgagacc aagcacttcc tctactcctc aggcgacaag gagcagctgc 1081 ggccctcctt cctactcagc tctctgaggc ccagcctgac tggcgctcgg aggctcgtgg 1141 agaccatctt tctgggttcc aggccctgga tgccagggac tccccgcagg ttgccccgcc 1201 tgccccagcg ctactggcaa atgcggcccc tgtttctgga gctgcttggg aaccacgcgc 1261 agtgccccta cggggtgctc ctcaagacgc actgcccgct gcgagctgcg gtcaccccag 1321 cagccggtgt ctgtgcccgg gagaagcccc agggctctgt ggcggccccc gaggaggagg 1381 acacagaccc ccgtcgcctg gtgcagctgc tccgccagca cagcagcccc tggcaggtgt 1441 acggcttcgt gcgggcctgc ctgcgccggc tggtgccccc aggcctctgg ggctccaggc 1501 acaacgaacg ccgcttcctc aggaacacca agaagttcat ctccctgggg aagcatgcca 1561 agctctcgct gcaggagctg acgtggaaga tgagcgtgcg gggctgcgct tggctgcgca 1621 ggagcccagg ggttggctgt gttccggccg cagagcaccg tctgcgtgag gagatcctgg 1681 ccaagttcct gcactggctg atgagtgtgt acgtcgtcga gctgctcagg tctttctttt 1741 atgtcacgga gaccacgttt caaaagaaca ggctcttttt ctaccggaag agtgtctgga 1801 gcaagttgca aagcattgga atcagacagc acttgaagag ggtgcagctg cgggagctgt 1861 cggaagcaga ggtcaggcag catcgggaag ccaggcccgc cctgctgacg tccagactcc 1921 gcttcatccc caagcctgac gggctgcggc cgattgtgaa catggactac gtcgtgggag 1981 ccagaacgtt ccgcagagaa aagagggccg agcgtctcac ctcgagggtg aaggcactgt 2041 tcagcgtgct caactacgag cgggcgcggc gccccggcct cctgggcgcc tctgtgctgg 2101 gcctggacga tatccacagg gcctggcgca ccttcgtgct gcgtgtgcgg gcccaggacc 2161 cgccgcctga gctgtacttt gtcaaggtgg atgtgacggg cgcgtacgac accatccccc 2221 aggacaggct cacggaggtc atcgccagca tcatcaaacc ccagaacacg tactgcgtgc 2281 gtcggtatgc cgtggtccag aaggccgccc atgggcacgt ccgcaaggcc ttcaagagcc 2341 acgtctctac cttgacagac ctccagccgt acatgcgaca gttcgtggct cacctgcagg 2401 agaccagccc gctgagggat gccgtcgtca tcgagcagag ctcctccctg aatgaggcca 2461 gcagtggcct cttcgacgtc ttcctacgct tcatgtgcca ccacgccgtg cgcatcaggg 2521 gcaagtccta cgtccagtgc caggggatcc cgcagggctc catcctctcc acgctgctct 2581 gcagcctgtg ctacggcgac atggagaaca agctgtttgc ggggattcgg cgggacgggc 2641 tgctcctgcg tttggtggat gatttcttgt tggtgacacc tcacctcacc cacgcgaaaa 2701 ccttcctcag gaccctggtc cgaggtgtcc ctgagtatgg ctgcgtggtg aacttgcgga 2761 agacagtggt gaacttccct gtagaagacg aggccctggg tggcacggct tttgttcaga 2821 tgccggccca cggcctattc ccctggtgcg gcctgctgct ggatacccgg accctggagg 2881 tgcagagcga ctactccagc tatgcccgga cctccatcag agccagtctc accttcaacc
2941 gcggcttcaa ggctgggagg aacatgcgtc gcaaactctt tggggtcttg cggctgaagt
3001 gtcacagcct gtttctggat ttgcaggtga acagcctcca gacggtgtgc accaacatct
3061 acaagatcct cctgctgcag gcgtacaggt ttcacgcatg tgtgctgcag ctcccatttc
3121 atcagcaagt ttggaagaac cccacatttt tcctgcgcgt catctctgac acggcctccc
3181 tctgctactc catcctgaaa gccaagaacg cagggatgtc gctgggggcc aagggcgccg
3241 ccggccctct gccctccgag gccgtgcagt ggctgtgcca ccaagcattc ctgctcaagc
3301 tgactcgaca ccgtgtcacc tacgtgccac tcctggggtc actcaggaca gcccagacgc
3361 agctgagtcg gaagctcccg gggacgacgc tgactgccct ggaggccgca gccaacccgg
3421 cactgccctc agacttcaag accatcctgg actgatggcc acccgcccac agccaggccg
3481 agagcagaca ccagcagccc tgtcacgccg ggctctacgt cccagggagg gaggggcggc
3541 ccacacccag gcccgcaccg ctgggagtct gaggcctgag tgagtgtttg gccgaggcct
3601 gcatgtccgg ctgaaggctg agtgtccggc tgaggcctga gcgagtgtcc agccaagggc
3661 tgagtgtcca gcacacctgc cgtcttcact tccccacagg ctggcgctcg gctccacccc
3721 agggccagct tttcctcacc aggagcccgg cttccactcc ccacatagga atagtccatc
3781 cccagattcg ccattgttca cccctcgccc tgccctcctt tgccttccac ccccaccatc
3841 caggtggaga ccctgagaag gaccctggga gctctgggaa tttggagtga ccaaaggtgt
3901 gccctgtaca caggcgagga ccctgcacct ggatgggggt ccctgtgggt caaattgggg
3961 ggaggtgctg tgggagtaaa atactgaata tatgagtttt tcagttttga aaaaaaaaaa
4021 aaaaaaa (SEQ ID NO: 132)
En una realización, la hTERT está codificada por un ácido nucleico que tiene una secuencia al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de SEQ ID NO:132 En una realización, la hTERT está codificada por un ácido nucleico de SEQ ID NO:132.
Activación y expansión de células efectoras inmunitarias (por ejemplo, células T)
Las células efectoras inmunitarias, tales como las células T, pueden activarse y expandirse generalmente usando métodos como se describe, por ejemplo, en las patentes U.S. 6.352.694; 6.534.055; 6.905.680; 6.692.964; 5.858.358; 6.887.466; 6.905.681; 7.144.575; 7.067.318; 7.172.869; 7.232.566; 7.175.843; 5.883.223; 6.905.874; 6.797.514; 6.867.041; y Publicación de Solicitud de Patente U.S. n° 20060121005.
El procedimiento para la expansión ex vivo de las células madre y progenitoras hematopoyéticas se describe en patente U.S. n° 5.199.942, se puede aplicar a las células de la presente descripción. En la técnica se conocen otros métodos adecuados, por lo que la presente invención no se limita a ningún método particular de expansión ex vivo de las células. Brevemente, el cultivo y expansión ex vivo de células T puede comprender: (1) recoger células madre y progenitoras hematopoyéticas CD34 de un mamífero a partir de muestras de sangre periférica o explantes de médula ósea; y (2) expandir dichas celdas ex vivo. Además de los factores de crecimiento celular descritos en la Pat. de EE. UU. N.° 5 199942, se pueden utilizar otros factores, tales como flt3-L, IL-1, IL-3 y ligando c-kit, para el cultivo y la expansión de las células.
En general, una población de células efectoras inmunitarias, por ejemplo, células agotadas de células T reguladoras, puede expandirse por contacto con una superficie que tiene unido un agente que estimula una señal asociada al complejo CD3/TCR y un ligando que estimula una molécula coestimuladora en la superficie de las células T. En particular, las poblaciones de células T se pueden estimular tal como se describe en esta memoria, tal como por contacto con un anticuerpo anti-CD3, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, o un anticuerpo anti-CD2 inmovilizado sobre una superficie, o por contacto con un activador de proteína quinasa C (p. ej., briostatina) junto con un ionóforo de calcio. Para la coestimulación de una molécula accesoria en la superficie de los células T, se utiliza un ligando que se une a la molécula accesoria. por ejemplo, una población de células T se puede poner en contacto con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28, en condiciones apropiadas para estimular la proliferación de los células T. Para estimular la proliferación de linfocitos T CD4+ o linfocitos T CD8+, se pueden utilizar un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28. Los ejemplos de un anticuerpo anti-CD28 que se puede utilizar incluyen 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besan9on, Francia), al igual que otros métodos de uso común en la técnica (Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999).
En ciertos aspectos, la señal estimuladora primaria y la señal coestimuladora para el linfocito T se pueden proporcionar mediante diferentes protocolos. por ejemplo, los agentes que proporcionan cada una de las señales pueden estar en solución o acoplados a una superficie. Cuando están acoplados a una superficie, los agentes se pueden acoplar a la misma superficie (es decir, en formación «cis») o a superficies separadas (es decir, en formación «trans»). Como alternativa, un agente puede estar acoplado a una superficie y el otro agente en solución. En un aspecto, el agente que proporciona la señal coestimuladora está unido a una superficie celular y el agente que proporciona la señal de activación primaria está en solución o acoplado a una superficie. En determinados aspectos, ambos agentes pueden estar en solución. En un aspecto, los agentes pueden estar en forma soluble y después entrecruzarse con una superficie, tal como una célula que expresa receptores Fc o un anticuerpo u otro agente de unión que se unirá a los agentes. A este respecto, remítase, por ejemplo, a las Publicaciones de Solicitud de Patente de EE. u U. N.os 20040101519 y 20060034810 para células presentadoras de antígeno artificiales (aAPC, por sus siglas en inglés) que se contemplan para su uso en la activación y expansión de linfocitos T en la presente invención.
En un aspecto, los dos agentes se inmovilizan sobre perlas, ya sea en la misma perla, es decir, «cis» o en perlas separadas, es decir, «trans». A modo de ejemplo, el agente que proporciona la señal de activación primaria es un anticuerpo anti-CD3 o un fragmento de unión a antígeno de este y el agente que proporciona la señal coestimuladora es un anticuerpo anti-CD28 o un fragmento de unión a antígeno de este; y ambos agentes se coinmovilizan en la misma perla en cantidades moleculares equivalentes. En un aspecto, se utiliza una relación de 1:1 de cada uno de los anticuerpos unidos a las perlas para la expansión de linfocitos T CD4+ y el crecimiento de linfocitos T. En ciertos aspectos de la presente invención, una relación de anticuerpos antiCD3:CD28 unidos a las perlas se usa de manera que se observa un aumento en la expansión de células T en comparación con la expansión observada usando una relación 1:1. En un aspecto particular, se observa un aumento de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 veces en comparación con la expansión observada utilizando una relación de 1:1. En un aspecto, la relación de anticuerpo para CD3:CD28 unido a las perlas varía de 100:1 a 1:100 y todos los valores enteros entre ellos. En un aspecto, se une más anticuerpo anti-CD28 a las partículas que el anticuerpo anti-CD3, es decir, la relación de CD3:CD28 es menor que uno. En determinados aspectos, la relación de anticuerpo anti CD28 a anticuerpo anti CD3 unido a las perlas es mayor que 2:1. En un aspecto particular, se utiliza una relación de CD3:CD28 de 1:100 del anticuerpo unido a perlas. En un aspecto, se utiliza una relación de CD3:CD28 de 1:75 del anticuerpo unido a perlas. En un aspecto adicional, se utiliza una relación de CD3:CD28 de 1:50 del anticuerpo unido a perlas. En un aspecto, se utiliza una relación de CD3:CD28 de 1:30 del anticuerpo unido a perlas. En un aspecto preferido, se utiliza relación de CD3:CD28 de 1:10 del anticuerpo unido a perlas. En un aspecto, se utiliza relación de CD3:CD28 de 1:3 del anticuerpo unido a las perlas. En un aspecto más, se utiliza una relación de CD3:CD28 de 3:1 de anticuerpo unido a las perlas.
Se pueden utilizar relaciones de partículas respecto a células de 1:500 a 500:1 y cualquier valor entero entre ellos para estimular células T u otras células diana. Como los expertos en la técnica apreciarán fácilmente, la relación de partículas respecto a células puede depender del tamaño de partícula con relación a la célula diana. por ejemplo, las perlas de pequeño tamaño solo se pueden unir a unas pocas células, mientras que las perlas más grandes se pueden a unir muchas. En determinados aspectos, la relación de células respecto a partículas varía de 1:100 a 100:1 y cualquier valor entero intermedio, y en aspectos adicionales, la relación comprende de 1:9 a 9:1 y cualquier valor entero intermedio, que también se pueden utilizar para estimular los células T. La proporción de partículas acopladas anti-CD3 y anti-CD28 a células T que dan como resultado la estimulación de las células T puede variar como se indicó anteriormente, sin embargo, ciertos valores preferidos incluyen 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1,2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1 y 15:1, siendo una proporción preferida al menos 1:1 partículas por célula T. En un aspecto, se utiliza una relación de partículas respecto a células de 1:1 o inferior. En un aspecto particular, una relación de partículas:células preferida es 1:5. En aspectos adicionales, la relación de partículas respecto a células puede variar dependiendo del día de estimulación. por ejemplo, en un aspecto, la relación de partículas respecto a células es de 1:1 a 10:1 el primer día y se añaden partículas adicionales a las células cada día o en días alternos a partir de entonces durante hasta 10 días, con relaciones finales de 1:1 a 1:10 (basadas en recuentos de células el día de la adición). En un aspecto particular, la relación de partículas respecto a células es 1:1 el primer día de estimulación y se ajusta a 1:5 el tercer y quinto días de estimulación. En un aspecto, las partículas se añaden a diario o en días alternos con una relación final de 1:1 el primer día y de 1:5 el tercer y quinto días de estimulación. En un aspecto, la relación de partículas respecto a células es 2:1 el primer día de estimulación y se ajusta a 1:10 el tercer y quinto días de estimulación. En un aspecto, las partículas se añaden sobre una base diaria o día por medio a una relación final de 1:1 el primer día y de 1:10 el tercer y quinto días de estimulación. Un experto en la técnica apreciará que pueden ser adecuadas diversas relaciones diferentes para su uso en la presente invención. En particular, las relaciones variarán dependiendo del tamaño de partícula y del tamaño y tipo de célula. En un aspecto, las relaciones más típicas para su uso son próximas a 1:1, 2:1 y 3:1 el primer día.
En otros aspectos, las células, como las células T, se combinan con perlas recubiertas con agente, las perlas y las células se separan posteriormente, y luego se cultivan las células. En un aspecto alternativo, antes del cultivo, las perlas recubiertas con agente y las células no se separan, sino que se cultivan juntas. En un aspecto adicional, las perlas y las células se concentran primero mediante la aplicación de una fuerza, tal como una fuerza magnética, que da como resultado un incremento del ligamiento de los marcadores de la superficie celular, y con ello se induce la estimulación celular.
A modo de ejemplo, las proteínas de la superficie celular se pueden ligar permitiendo que perlas paramagnéticas a las que se unen anti-CD3 y anti-CD28 (perlas 3x28) entren en contacto con los células T. En un aspecto, las células (por ejemplo, de 104 a 109 linfocitos T) y perlas (por ejemplo, perlas paramagnéticas DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T con una relación de 1:1) se combinan en un tampón, por ejemplo, p Bs (sin cationes divalentes tales como calcio y magnesio). Nuevamente, los expertos en la técnica pueden apreciar fácilmente que se puede utilizar cualquier concentración celular. por ejemplo, la célula diana puede ser muy rara en la muestra y comprender solo un 0,01% de la muestra o toda la muestra (es decir, un 100%) puede comprender la célula diana de interés. En consecuencia, cualquier número de células está dentro del contexto de la presente invención. En ciertos aspectos, puede ser deseable disminuir significativamente el volumen en el que se mezclan juntas las partículas y las células (es decir, aumentar la concentración de células), para garantizar el máximo contacto de las células y las partículas. por ejemplo, en un aspecto, se utiliza una concentración de aproximadamente 10 000 millones de células/mL, 9000 millones/mL, 8000 millones/mL, 7000 millones/mL, 6000 millones/mL, 5000 millones/mL o 2000 millones de células/mL. En un aspecto, se utilizan más de 100 millones de células/mL. En un aspecto adicional, se usa una concentración de células de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 millones de células/ml. En un aspecto más, se utiliza una concentración de células de 75, 80, 85, 90, 95 o 100 millones de células/mL. En aspectos adicionales, pueden usarse concentraciones de 125 o 150 millones de células/ml. El uso de concentraciones elevadas puede dar como resultado un mayor rendimiento celular, activación celular y expansión celular. Además, el uso de concentraciones celulares elevadas permite una captura más eficaz de las células que puedan expresar débilmente los antígenos diana de interés, tales como células T CD28-negativas. Tales poblaciones de células pueden tener valor terapéutico y sería deseable obtenerlas en determinados aspectos. por ejemplo, el uso de una alta concentración de células permite una selección más eficaz de células T CD8+ que normalmente tienen una expresión de CD28 más débil.
En un caso, las células transducidas con un ácido nucleico que codifica un CAR, por ejemplo, un CAR descrito en la presente, se expanden, por ejemplo, mediante un método descrito en la presente. En un caso, las células se expanden en cultivo durante un período de varias horas (por ejemplo, alrededor de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 18, 21 horas) hasta alrededor de 14 días ( por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 días). En un caso, las células se expanden durante un periodo de 4 a 9 días. En un caso, las células se expanden durante un periodo de 8 días o menos, por ejemplo, 7, 6 o 5 días. En un caso, las células, por ejemplo, una célula CAR CD19 descrita en la presente, se expanden en cultivo durante 5 días, y las células resultantes son más potentes que las mismas células expandidas en cultivo durante 9 días en las mismas condiciones de cultivo. La potencia se puede definir, por ejemplo, mediante diversas funciones de los linfocitos T, por ejemplo, proliferación, muerte de células diana, producción de citocinas, activación, migración o combinaciones de estas. En un caso, las células, por ejemplo, una célula CAR CD19 descrita en la presente, expandidas durante 5 días muestran un incremento de al menos una, dos, tres o cuatro veces en duplicaciones de células tras la estimulación del antígeno, en comparación con las mismas células expandidas en cultivo durante 9 días en las mismas condiciones de cultivo. En un caso, las células, por ejemplo, las células que expresan un CAR CD19 descrito en la presente, se expanden en cultivo durante 5 días, y las células resultantes muestran una producción de citocinas proinflamatorias, por ejemplo, niveles de IFN-y y/o GM-CSF, superior en comparación con las mismas células expandidas en cultivo durante 9 días en las mismas condiciones de cultivo. En un caso, las células, por ejemplo, una célula c A r CD19 descrita en la presente, expandidas durante 5 días muestran un incremento de al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, diez veces o más en pg/mL de producción de citocinas proinflamatorias, por ejemplo, niveles de IFN-y y/o GM-CSF, en comparación con las mismas células expandidas en cultivo durante 9 días en las mismas condiciones de cultivo.
También pueden ser deseables varios ciclos de estimulación, de modo que el tiempo de cultivo de los células T pueda ser de 60 días o más. Condiciones apropiadas para el cultivo de células T incluyen un medio apropiado (p. ej., Medio Mínimo Esencial o Medio RPMI 1640 o, X-vivo 15, (Lonza)) que puede contener factores necesarios para la proliferación y la viabilidad, incluido suero (p. ej., suero humano o bovino fetal), interleuquina-2 (IL-2), insulina, IFN-y, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFp y TNF-a o cualesquiera otros aditivos para el crecimiento de células conocidos por el experto. Otros aditivos para el crecimiento de células incluyen, sin carácter limitante, un tensioactivo, plasmanate y agentes reductores, tales como N-acetil-cisteína y 2-mercaptoetanol. Los medios pueden incluir RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 15 y X-Vivo 20, Optimizer, con aminoácidos añadidos, piruvato de sodio y vitaminas, ya sea sin suero o con un suplemento de una cantidad apropiada de suero (o plasma) o un conjunto definido de hormonas, y/o una cantidad de citocina(s) suficiente para el crecimiento y la expansión de células T. Los antibióticos, p. ej., penicilina y estreptomicina, se incluyen solo en cultivos experimentales, no en cultivos de células que se han de infundir a un sujeto. Las células diana se mantienen en condiciones necesarias para propiciar el crecimiento, por ejemplo, una temperatura (por ejemplo, 37 °C) y atmósfera (p. ej., aire más un 5% de CO2) apropiadas.
En un caso, las células se expanden en un medio apropiado (por ejemplo, medio descrito aquí) que incluye una o más interleucinas que dan como resultado un aumento de al menos 200 veces (por ejemplo, 200 veces, 250 veces, 300 veces, 350 veces) en las células durante un período de expansión de 14 días, por ejemplo, medido por un método descrito aquí tal como citometría de flujo. En un caso, las células se expanden en presencia de IL-15 y/o IL-7 (por ejemplo, IL-15 e IL-7).
En casos, los métodos descritos en la presente, por ejemplo, métodos de producción de células que expresan CAR, comprenden eliminar linfocitos T reguladores, por ejemplo, linfocitos T CD25+, de una población celular, por ejemplo, utilizando un anticuerpo anti-CD25, o un fragmento de este, o un ligando de unión a CD25, IL-2. En la presente se describen métodos para eliminar linfocitos T reguladores, por ejemplo, linfocitos T CD25+, de una población de células. En casos, los métodos, por ejemplo, los métodos de fabricación, comprenden además poner en contacto una población de células (por ejemplo, una población de células en la que las células T reguladoras, como las células T CD25+, se han agotado; o una población de células que se ha puesto en contacto previamente con un anticuerpo anti-CD25, fragmento del mismo, o ligando de unión a CD25) con IL-15 y/o IL-7. por ejemplo, la población de células (por ejemplo, que se ha puesto en contacto previamente con un anticuerpo anti-CD25, fragmento de este o ligando de unión a CD25) se expande en presencia de IL-15 y/o IL-7.
En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se pone en contacto con una composición que comprende un polipéptido de tipo interleucina-15 (IL-15), un polipéptido de tipo receptor alfa de interleucina-15 (IL-15Ra), o una combinación de ambos, un polipéptido de tipo IL-15 y un polipéptido de tipo IL-15Ra, por ejemplo, hetIL-15, durante la producción de la célula que expresa CAR, por ejemplo, ex vivo. En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se pone en contacto con una composición que comprende un polipéptido de tipo IL-15 durante la producción de la célula que expresa CAR, por ejemplo, ex vivo. En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se pone en contacto con una composición que comprende una combinación de un polipéptido de tipo IL-15 y un polipéptido de tipo IL-15 Ra durante la producción de la célula que expresa CAR, por ejemplo, ex vivo. En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se pone en contacto con una composición que comprende hetIL-15 durante la producción de la célula que expresa CAR, por ejemplo, ex vivo.
En un caso, la célula que expresa CAR descrita en la presente se pone en contacto con una composición que comprende hetIL-15 durante la expansión ex vivo. En un caso, la célula que expresa CAR descrita en la presente se pone en contacto con una composición que comprende un polipéptido de tipo IL-15 durante la expansión ex vivo. En un caso, la célula que expresa CAR descrita en la presente se pone en contacto con una composición que comprende un polipéptido de tipo IL-15 y un polipéptido de tipo IL-15Ra durante la expansión ex vivo. En un caso, la puesta en contacto da como resultado la supervivencia y proliferación de una subpoblación de linfocitos, por ejemplo, linfocitos T CD8+.
Los células T que han sido expuestos a tiempos de estimulación variados pueden exhibir características diferentes. por ejemplo, productos de tipo células mononucleares de la sangre o de la sangre periférica sometida a aféresis típicos tienen una población de linfocitos T auxiliares (TH, CD4+) que es mayor que la población de linfocitos T citotóxicos o supresores (TC, CD8+). La expansión ex vivo de linfocitos T mediante la estimulación de los receptores CD3 y CD28 produce una población de linfocitos T que antes de aproximadamente los días 8-9 consiste predominantemente en células TH, mientras que después de aproximadamente los días 8-9, la población de linfocitos T comprende una población cada vez mayor de linfocitos TC. Por consiguiente, dependiendo del propósito del tratamiento, puede ser ventajoso infundir a un sujeto una población de linfocitos T que comprende predominantemente linfocitos TH. De manera similar, si se ha aislado un subconjunto de linfocitos TC específicos para el antígeno, puede ser beneficioso expandir este subconjunto hasta un grado mayor.
Además, aparte de los marcadores CD4 y CD8, otros marcadores fenotípicos varían significativamente, pero en gran parte, de forma reproducible durante el curso del proceso de expansión celular. Por lo tanto, dicha reproducibilidad permite la capacidad de adaptar un producto de tipo células T activados para fines específicos.
En otros casos, el método de preparación descrito en este documento comprende además poner en contacto la población de células efectoras inmunes con un ácido nucleico que codifica una subunidad de telomerasa, por ejemplo, hTERT. El ácido nucleico que codifica la subunidad de telomerasa puede ser ADN.
En algunos casos, se añade un inhibidor de cinasa (por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib) durante el proceso de fabricación de células CAR. Según la teoría no limitante de la presente, el inhibidor de cinasa puede mejorar la calidad de la población de células producidas. por ejemplo, las células que expresan CAR a menudo se producen a partir de la muestra de aféresis plasmática del propio paciente con cáncer, que puede contener células cancerosas, y el inhibidor de cinasa puede alterar la señalización en esas células cancerosas (por ejemplo, un cáncer que expresa bTk como CLL o MCL) , por ejemplo, reduciendo su proliferación o aumentando los niveles de apoptosis. Como otro ejemplo, el inhibidor de cinasa puede alterar la señalización en las células que expresan CAR (o células efectoras inmunitarias antes de que expresen CAR), por ejemplo, inhibiendo ITK en las células T. El inhibidor de cinasa puede cambiar el equilibrio de las células T desde las células TH2 hacia las células TH1.
El inhibidor de cinasa (por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib) se puede añadir a la mezcla de reacción en un nivel suficiente para inhibir su diana, por ejemplo, BTK. En algunos casos, el inhibidor de cinasa (por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib) se añade a una concentración de alrededor de 0,1-0,2, 0,2-0,5, 0,5-1, 1-2, 2-5 o 5-10 pM. En algunos casos, el inhibidor de cinasa es un inhibidor covalente (como ibrutinib) y un pulso corto es suficiente para inactivar irreversiblemente la diana evitando la toxicidad inespecífica. En consecuencia, el inhibidor de cinasa se puede añadir durante, por ejemplo, 10-20, 20-30, 30-40, 40-60 o 60-120 minutos. El inhibidor de cinasa también se puede añadir durante períodos de tiempo más prolongados, por ejemplo, si el inhibidor de cinasa tiene un modo de acción no covalente. Por tanto, el inhibidor de cinasa se puede añadir durante, por ejemplo, 2-4, 4-6, 6-8, 8-12, 12-18 o 18-24 horas, o durante 1­ 2, 2-3, 3- 4, 4-6, 6-8, 8-10 días, o durante todo el tiempo que se estén cultivando las células. El inhibidor de cinasa se puede añadir en varios puntos durante el proceso de fabricación, por ejemplo, después de recoger las células, antes de estimular con perlas, después de estimular con perlas, antes de la transducción, después de la transducción, o antes de la administración de las células al paciente. En algunos casos, el inhibidor de cinasa (por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib) se añade después de recoger las células o antes de estimular, por ejemplo, con perlas. Antes y después, en este contexto, puede referirse a, por ejemplo, alrededor de 1, 5, 15, 30, 45 o 60 minutos antes o después, o 1, 2, 3, 4, 5 o 6 horas antes o después.
Una vez que se construye un CAR CD19, se pueden utilizar diversos ensayos para evaluar la actividad de la molécula, tales como, sin carácter limitante, la capacidad de expandir las células T después de la estimulación con antígeno, mantener la expansión de linfocitos T en ausencia de reestimulación y actividades anticancerosas en modelos in vitro y en animales apropiados. Los ensayos para evaluar los efectos de un CAR CD19 se describen con más detalle a continuación.
Se puede utilizar el análisis por inmunoelectrotransferencia de la expresión de CAR en linfocitos T primarios para detectar la presencia de monómeros y dímeros. Véase, por ejemplo, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Muy brevemente, los linfocitos T (mezcla 1:1 de linfocitos T CD4+ y CD8+) que expresan los CAR se expanden in vitro durante más de 10 días, lo cual va seguido de lisis y SDS-PAGE en condiciones reductoras. Los CAR que contienen el dominio citoplasmático TCR-Z completo y la cadena TCR-Z endógena se detectan mediante inmunoelectrotransferencia utilizando un anticuerpo para la cadena TCR-Z. Los mismos subconjuntos de linfocitos T se utilizan para el análisis SDS-PAGE en condiciones no reductoras para permitir la evaluación de la formación de dímeros covalentes.
La expansión in vitro de linfocitos T CAR+ después de la estimulación con antígeno se puede medir mediante citometría de flujo. por ejemplo, una mezcla de células T CD4+ y CD8+ se estimulan con perlas de aCD3/aCD28, seguido de transducción con vectores lentivirales que expresan GFP bajo el control de los promotores a analizar. Los promotores a modo de ejemplo incluyen promotores del gen IE de CMV, EF-1a, ubiquitina C o de la fosfoglicerocinasa (PGK). La fluorescencia de GFP se evalúa el día 6 de cultivo en los subconjuntos de células T CD4+ y/o CD8+ mediante citometría de flujo. Véase, por ejemplo, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Alternativamente, una mezcla de células T CD4+ y CD8+ se estimulan con perlas magnéticas recubiertas de aCD3/aCD28 el día 0, y se transducen con CAR el día 1 usando un vector lentiviral bicistrónico que expresa CAR junto con eGFP usando una secuencia de omisión ribosómica 2A. Los cultivos se vuelven a estimular con células K562 CD19+ (K562-CD19), células K562 de tipo salvaje (tipo salvaje K562) o células K562 que expresan hCD32 y 4-1BBL en presencia de anticuerpo anti-CD3 y anti-CD28 (K562-b BL-3/28) después del lavado . Se añaden 100 U/mL de IL-2 exógena a los cultivos en días alternos. Los linfocitos T GFP+ se enumeran por citometría de flujo utilizando un recuento basado en las perlas. Véase, por ejemplo, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009).
También se puede medir la expansión sostenida de linfocitos T CAR+ en ausencia de reestimulación. Véase, por ejemplo, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Brevemente, el volumen medio de células T (fl) se mide el día 8 de cultivo usando un contador de partículas Coulter Multisizer, un Nexcelom Cellometer Vision o Millipore Scepter, tras la estimulación con perlas magnéticas recubiertas de aCD3 /aCD28 el día 0, y la transducción con el c A r indicado el día 1.
También se pueden utilizar modelos en animales para medir la actividad de un CART. por ejemplo, se puede utilizar un modelo de xenoinjerto utilizando linfocitos T CAR+ específicos para CD19 para tratar una pre-B ALL humana primaria en ratones inmunodeficientes. Véase, por ejemplo, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Muy brevemente, después del establecimiento de ALL, los ratones se distribuyen aleatoriamente en grupos de tratamiento. Se coinyectan diferentes números de células T modificadas por ingeniería aCD19-Z y aCD19-BB-Z en una proporción de 1:1 en ratones NOD-SCID-y-/' que portan B-ALL. El número de copias del vector aCD19-Z y aCD19-BB-Z en ADN del bazo de ratones se evalúa en diversos momentos tras la inyección con linfocitos T. Se evalúa la leucemia en los animales en intervalos semanales. Se miden los recuentos de blastos de B-ALL CD19+ de la sangre periférica en ratones a los que se inyectan linfocitos T CAR+ aCD19-Z o linfocitos T con una transducción simulada. Las curvas de supervivencia de los grupos se comparan utilizando la prueba del orden logarítmico. Además, también se pueden analizar los recuentos de linfocitos T CD4+ y CD8+ de la sangre periférica 4 semanas después de la inyección de linfocitos T en ratones NOD-SCID-Y-/'. Se inyectan en ratones células leucémicas y 3 semanas más tarde se les inyectan linfocitos T modificados para expresar CAR mediante un vector lentivírico bicistrónico que codifica el CAR ligado a eGFP. Los linfocitos T se normalizan respecto a un 45-50% de linfocitos T GFP+ de entrada mezclando células que han experimentado una transducción simulada antes de la inyección, y se confirma mediante citometría de flujo. Se evalúa la leucemia en los animales en intervalos de 1 semana. Las curvas de supervivencia de los grupos de linfocitos T CAR+ se comparan utilizando la prueba del orden logarítmico.
Se puede evaluar la respuesta al tratamiento con CAR dependiente de la dosis. Véase, por ejemplo, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). por ejemplo, se obtiene sangre periférica 35-70 días después de establecer la leucemia en ratones inyectados el día 21 con linfocitos T CAR, un número equivalente de linfocitos T sometidos a una transducción simulada, o sin linfocitos T. Se extrae sangre de manera aleatoria de ratones de cada grupo para determinar los recuentos de blastos de ALL CD19+ en la sangre periférica y posteriormente se sacrifican los días 35 y 49. Los animales restantes se evalúan los días 57 y 70.
La evaluación de la proliferación celular y la producción de citocinas se ha descrito previamente, por ejemplo, a Milone et al., Terapia molecular 17 (8): 1453-1464 (2009). Resumiendo, la evaluación de la proliferación mediada por CAR se realiza en placas de microvaloración mezclando linfocitos T lavados con células K562 que expresan CD19 (K19) o CD32 y CD137 (KT32-BBL) para obtener una relación final de linfocito T:K562 de 2:1. Las células K562 se irradian con radiación gamma antes de su uso. Los anticuerpos monoclonales anti-CD3 (clon OKT3) y anti-CD28 (clon 9.3) se añaden a cultivos con células KT32-BBL para que sirvan como control positivo para estimular la proliferación de células T, ya que estas señales apoyan la expansión ex vivo de células T CD8+ a largo plazo. Se enumeran los linfocitos T en los cultivos utilizando perlas fluorescentes CountBright™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) y citometría de flujo tal como lo describe el fabricante. Los linfocitos T CAR+ se identifican mediante la expresión de GFP utilizando linfocitos T que han sido modificados con vectores lentivíricos que expresan CAR ligado a eGFP-2A. Para los linfocitos T CAR+ que no expresan GFP, los linfocitos T CAR+ se detectan con proteína CD19 recombinante biotinilada y un conjugado secundario de avidina-PE. La expresión de CD4+ y CD8+ en células T también se detecta simultáneamente con anticuerpos monoclonales específicos (Bd Biosciences). Las mediciones de citoquinas se realizan en sobrenadantes recogidos 24 horas después de la re-estimulación utilizando el kit de matriz de perlas citométricas de citoquina TH1/TH2 humana (BD Biosciences, San Diego, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La fluorescencia se evalúa utilizando un citómetro de flujo FACScalibur, y los datos se analizan de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
La citotoxicidad puede evaluarse mediante un ensayo estándar de liberación de 51Cr. Véase, por ejemplo, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Brevemente, las células diana (líneas K562 y células primarias pro-B-ALL) se cargan con 51Cr (como NaCrO4, New England Nuclear, Boston, MA) a 37°C durante 2 horas con agitación frecuente, se lavan dos veces en RPMI completo y se siembran en placas de microtitulación. Los linfocitos T efectores se mezclan con las células diana en los pocillos en RPMI completo con relaciones variables de célula efectora:célula diana (E:D). También se preparan pocillos adicionales que contienen solo medio (liberación espontánea, SR, por sus siglas en inglés) o una solución al 1% de detergente triton-X 100 (liberación total, TR, por sus siglas en inglés). Después de 4 horas de incubación a 37 °C, se extrae el sobrenadante de cada uno de los pocillos. El 51Cr liberado se mide a continuación utilizando un contador de partículas gamma (Packard Instrument Co., Waltham, MA). Cada condición se realiza al menos por triplicado, y el porcentaje de lisis se calcula utilizando la fórmula: % de lisis = (ER-SR) / (TR - SR), donde ER representa el 51Cr medio liberado para cada condición experimental.
Se pueden utilizar tecnologías de obtención de imágenes para evaluar el tráfico y proliferación específicos de los CAR en modelos en animales portadores de tumores. Tales ensayos se han descrito, por ejemplo, en Barrett et al., Human Gene Therapy 22: 1575-1586 (2011). Resumiendo, los ratones NOD/SCID/yc^ (NSG) son inyectados IV con células Nalm-6 y 7 días después con linfocitos T 4 horas después de electroporación con los constructos CAR. Los linfocitos T están transfectados de manera estable con un constructo lentivírico para expresar luciferasa de luciérnaga, y se obtienen imágenes de los ratones por bioluminiscencia. Como alternativa, se pueden medir la eficacia terapéutica y especificidad de una única inyección de linfocitos T CAR+ en un modelo de xenoinjerto con Nalm-6 de la siguiente manera: Se inyectan Nalm-6 transducidas para expresar de manera estable luciferasa de luciérnaga en ratones NSG, seguidas de una única inyección en la vena de la cola de linfocitos T electroporados con CAR CD19 7 días más tarde. Se obtienen imágenes de los animales en diferentes puntos temporales después de la inyección. por ejemplo, se pueden generar mapas de calor de densidad de fotones de leucemia luciferasa positiva de luciérnaga en ratones representativos el día 5 (2 días antes del tratamiento) y el día 8 (24 horas después de c A r PBL).
También se pueden usar otros ensayos, incluidos los descritos en la sección de Ejemplos del presente documento, así como los conocidos en la técnica, para evaluar las construcciones CAR CD 19 de la presente descripción.
Inhibidor de Cinasa
En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de CDK4, por ejemplo, un inhibidor de CDK4 descrito en la presente, por ejemplo, un inhibidor de CDK4/6, tal como, por ejemplo, clorhidrato de 6-acetil-8-ciclopentil-5-metil-2-(5-piperazin-1-ilpiridin-2-ilamino)-8H-pirido[2,3-d]pirimidin-7-ona (también denominado palbociclib o PD0332991). En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de BTK, por ejemplo, un inhibidor de BTK descrito en la presente, tal como, por ejemplo, ibrutinib. En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor de mTOR descrito en la presente, tal como, por ejemplo, rapamicina, un análogo de rapamicina, OSI-027. El inhibidor de mTOR puede ser, por ejemplo, un inhibidor de mTORC1 y/o un inhibidor de mTORC2, por ejemplo, un inhibidor de mTORC1 y/o inhibidor de mTORC2 descrito en la presente. En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de MNK, por ejemplo, un inhibidor de MNK descrito en la presente, tal como, por ejemplo, 4-amino-5-(4-fluoroanilino)pirazolo [3,4-d] pirimidina. El inhibidor de MNK puede ser, por ejemplo, un inhibidor de MNK1a, MNK1b, MNK2a y/o MNK2b.
En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de CDK4 seleccionado de aloisina A; flavopiridol o HMR-1275, 2-(2-dorofenil)-5,7-dihidroxi-8-[(3S,4R)-3-hidroxi-1-metil-4-piperidinil]-4-cromenona; crizotinib (PF-02341066; 2- (2-clorofenil)-5,7-dihidroxi-8-[(2R,3S)-2-(hidroximetil)-1-metil-3-pirrolidinil]-4H-1-benzopiran-4-ona, hidrocloruro (P276-00); 1-metil-5-[[2-[5-(trifluorometil)-1H-imidazol-2-¡r|-4-piridinil]oxi]-N-[4-(trifluorometil)fenil]-1H-bencimidazol-2-amina (RAF265); indisulam (E7070); roscovitina (CYC202); palbociclib (PD0332991); dinaciclib (SCH727965); N-[5-[[(5-ferc-butiloxazol-2-il)metil]tio]tiazol-2-il]piperidin-4-carboxamida (BMS 387032); ácido 4-[[9-cloro-7-(2,6-difluorofenil)-5H-pirimido[5,4-d][2]benzazepin-2-il]amino]-benzoico (MLN8054); 5-[3-(4,6-difluoro-1H-bencimidazol-2-il)-1H-indazol-5-¡r|-N-etil-4-metil-3-piridinmetanamina (AG-024322); N-(piperidin-4-il)amida del ácido 4-(2,6-diclorobenzoilamino)-1H-pirazol-3-carboxílico (AT7519); 4-[2-metil-1-(1-metiletil)-1H-imidazol-5-il]-N-[4-(metilsulfonil)fenil]-2-pirimidinamina (AZD5438); y XL281 (BMS908662).
En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de CDK4, por ejemplo, palbociclib (PD0332991), y el palbociclib se administra con una dosis de aproximadamente 50 mg, 60 mg, 70 mg, 75 mg, 80 mg, 90 mg, 100 mg, 105 mg, 110 mg, 115 mg, 120 mg, 125 mg, 130 mg, 135 mg (por ejemplo, 75 mg, 100 mg o 125 mg) a diario durante un periodo de tiempo, por ejemplo, a diario durante 14-21 días de un ciclo de 28 días, o a diario durante 7-12 días de un ciclo de 21 días. En un caso, se administran 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más ciclos de palbociclib.
Un inhibidor de CDK4/6 a modo de ejemplo es LEE011 (también denominado ribociclib), cuya estructura se muestra a continuación.
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Sin desear ceñirse a ninguna teoría, se cree que la administración de una célula que expresa CAR descrita en la presente con un inhibidor de CDK4/6 (por ejemplo, LEE011 u otro inhibidor de CDK4/6 descrito en la presente) puede logar una respuesta elevada, por ejemplo, con tasas de remisión más elevadas y/o tasas de recaídas menores, por ejemplo, en comparación con un inhibidor de CDK4/6 solo.
Sin desear estar ligado a ninguna teoría, en algunos casos el inhibidor de CDK4/6 actúa para reducir la actividad de ciclina D1 en células cancerosas, por ejemplo, células MCL. Algunas células cancerosas se caracterizan por niveles elevados de ciclina D1 debido a una translocación. CDK4 se compleja con ciclina D para promover la progresión del ciclo celular. Por consiguiente, en algunos casos, la administración del inhibidor de CK4/6 reduce la proliferación de células cancerosas. Véase, por ejemplo, Marzec et al., "Mantle cell lymphoma cells express predominantly cyclin D1a isoform and are highly sensitive to selective inhibition of CDK4 kinase activity". Blood. 2006 Sep 1;108(5):1744-50. Epub 2006 May 11.
En una realización, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de BTK seleccionado de ibrutinib (PCI-32765); GDC-0834; RN-486; CGI-560; CGI-1764; HM-71224; CC-292; ONO-4059; CNX-774; y LFM-A13. En una realización, el inhibidor de BTK no reduce ni inhibe la actividad cinasa de la cinasa inducible por interleucina-2 (ITK), y se selecciona de GDC-0834; RN-486; CGI-560; CGI-1764; HM-71224; CC-292; ONO-4059; CNX-774; y LFM-A13.
En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de BTK, por ejemplo, ibrutinib (PCI-32765), y el ibrutinib se administra en una dosis de alrededor de 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 420 mg, 440 mg, 460 mg, 480 mg, 500 mg, 520 mg, 540 mg, 560 mg, 580 mg, 600 mg (por ejemplo, 250 mg, 420 mg o 560 mg) al día durante un período de tiempo, por ejemplo, diariamente durante un ciclo de 21 días, o diariamente durante un ciclo de 28 días. En una realización, se administran 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más ciclos de ibrutinib.
En realizaciones, el inhibidor de BTK (por ejemplo, ibrutinib) se administra a un sujeto que tiene CLL, linfoma de células del manto (MCL) o linfoma linfocítico pequeño (SLL). por ejemplo, el sujeto al que se le administra el inhibidor de BTK tiene una deleción en el brazo corto del cromosoma 17 (del (17p), por ejemplo, en una célula leucémica). En otros ejemplos, el sujeto al que se administra el inhibidor de BTK no tiene del(17p). En las realizaciones, el sujeto al que se le administra el inhibidor de BTK tiene CLL o SLL en recaída, por ejemplo, al sujeto se le ha administrado previamente una terapia contra el cáncer (por ejemplo, se le ha administrado previamente una, dos, tres o cuatro terapias anteriores del cáncer). En realizaciones, el sujeto al que se administra el inhibidor de BTK tiene CLL o SLL refractaria. En otras realizaciones, el sujeto al que se administra el inhibidor de BTK tiene linfoma folicular, por ejemplo, linfoma folicular recidivante o refractario.
La estructura de ibrutinib (1-[(3R)-3-[4-amino-3-(4-fenoxifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il]piperidin-1-il]prop-2-en-1-ona) se muestra a continuación.
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Las concentraciones de ibrutinib superiores a alrededor de 400 nM no son clínicamente relevantes. En el estudio de Advani et al. (J Clin Oncol 2012; 31:88), la concentración sérica máxima media de ibrutinib fue de alrededor de 130 ng/ml, lo que equivale a 295 nM (basado en el peso molecular de ibrutinib de 440,5). Por lo tanto, los datos que muestran el efecto de ibrutinib en las células T a una concentración de 1 uM exceden significativamente la concentración clínicamente relevante in vivo.
En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de mTOR seleccionado de temsirolimus; ridaforolimus dimetilfosfinato de (1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R, 23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-dihidroxi-19,30-dimetoxi-15,17,21,23,29,35-hexametil-2,3,10,14,20-pentaoxo-11,36-dioxa-4-azatriciclo[30.3.1.049]hexatriaconta-16,24,26,28-tetraen-12-il]propil]-2-metoxiciclohexilo, también conocido como AP23573 y MK8669; everolimus (RAD001); rapamicina (AY22989); semapimod; (5-{2,4-bis[(3S)-3-metilmorfolin-4-il]pirido[2,3-d]pirimidin-7-il}-2-metoxifenil)metanol (AZD8055); 2-amino-8-[//ans-4-(2-hidroxietoxi)ciclohexil]-6-(6-metoxi-3-piridinil)-4-metil-pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona (PF04691502); y N2-[1,4-dioxo-4-[[4-(4-oxo-8-fenil-4H-1-benzopiran-2-il)morfolinio-4-il]metoxi]butil]-L-arginilglicil-L-aaspartilL-serina-, sal interna (SF1126); y XL765.
En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de mTOR, por ejemplo, rapamicina, y la rapamicina se administra con una dosis de aproximadamente 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg (por ejemplo, 6 mg) a diario durante un periodo de tiempo, por ejemplo, a diario durante un ciclo ciclo de 21 días, o a diario durante un ciclo de 28 días. En un caso, se administran 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más ciclos de rapamicina. En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de mTOR, por ejemplo, everolimus y el everolimus se administra con una dosis de aproximadamente 2 mg, 2.5 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 11 mg, 12 mg, 13 mg, 14 mg, 15 mg (por ejemplo, 10 mg) a diario durante un periodo de tiempo, por ejemplo, a diario durante un ciclo de 28 días. En un caso, se administran 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más ciclos de everolimus.
En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor de MNK seleccionado entre CGP052088; 4-amino-3-(pfluorofenilamino)pirazolo [3,4-d] pirimidina (CGP57380); cercosporamida; ETC-1780445-2; y 4-amino-5-(4-fluoroanilino)pirazolo [3,4-d]pirimidina.
En casos, una célula que expresa CAR descrita aquí, opcionalmente en combinación con un inhibidor de cinasa, por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib, se administra a un sujeto en combinación con un inhibidor de fosfoinositida 3-cinasa (PI3K) (por ejemplo, un inhibidor de PI3K descrito aquí, por ejemplo, idelalisib o duvelisib) y/o rituximab. En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con idelalisib y rituximab. En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con duvelisib y rituximab. Idelalisib (también denominado GS-1101 o CAL-101; Gilead) es una molécula de bajo peso molecular que bloquea la isoforma delta de PI3K. La estructura de idelalisib (5-fluoro-3-fenil-2-[(1S)-1-(7H-purin-6-ilamino)propil]-4(3H)-quinazolinona) se muestra a continuación.
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Duvelisib es una molécula pequeña que bloquea PI3K-5,y . La estructura de duvelisib (8-cloro-2-fenil-3-[(1S)-1-(9H-purin-6-ilamino)etil]-1(2H)-isoquinolinona) se muestra a continuación.
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En casos, el sujeto padece CLL. En casos, el sujeto padece CLL recurrente, por ejemplo, al sujeto se le ha administrado previamente una terapia contra el cáncer (por ejemplo, se le ha administrado previamente un anticuerpo anti-CD20 o se le ha administrado previamente ibrutinib). por ejemplo, el sujeto tiene una deleción en el brazo corto del cromosoma 17 (del(17p), por ejemplo, en una célula leucémica). En otros ejemplos, el sujeto no tiene una del(17p). En casos, el sujeto comprende una célula leucémica que comprende una mutación en el gen de región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina (IgVH). En otros casos, el sujeto no comprende una célula leucémica que comprende una mutación en el gen de región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina (IgVH). En casos, el sujeto tiene una deleción en el brazo largo del cromosoma 11 (del(11q). En otros casos, el sujeto no tiene una del(11q). En casos, se administra idelalisib en una dosificación de aproximadamente 100-400 mg (por ejemplo, de 100-125, 125-150, 150-175, 175-200, 200-225, 225-250, 250-275, 275-300, 325-350, 350-375, o 375-400 mg), por ejemplo, dos veces al día. En casos, se administra duvelisib en una dosificación de aproximadamente 15-100 mg (por ejemplo, de aproximadamente 15-25, 25-50, 50-75, o 75-100 mg), por ejemplo, dos veces al día. En casos, se administra rituximab en una dosificación de aproximadamente 350-550 mg/m2 (por ejemplo, de 350-375, 375-400, 400-425, 425-450, 450-475, o 475-500 mg/m2), por ejemplo, por vía intravenosa.
En un caso, el inhibidor de cinasa es un inhibidor dual de fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3K) y de mTOR seleccionado de 2-Amino-8-[frans-4-(2-hidroxietoxi)ciclohexil]-6-(6-metoxi-3-piridinil)-4-metil-pirido[2,3-c(]pirimidin-7(8H)-ona (PF-04691502); W-[4-[[4-(Dimetilamino)-1-piperidinil]carbonil]fenil]-W’-[4-(4,6-di-4-morfolinil-1,3,5-triazin-2-il)fenil]urea (PF-05212384, PKI-587); 2-Metil-2-{4-[3-metil-2-oxo-8-(quinolin-3-il)-2,3-dihidro-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il]fenil}propanonitrilo (BEZ-235); apitolisib (GDC-0980, RG7422); 2,4-Difluoro-N-{2-(metiloxi)-5-[4-(4-piridazinil)-6-quinolinil]-3-piridinil}bencenosulfonamida (GSK2126458); 8-(6-metoxipiridin-3-il)-3-metil-1-(4-(piperazin-1-il)-3-(trifluorometil)fenil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-2(3H)-ona, sal de ácido maleico (NVP-BGT226); 3-[4-(4-Morfolinilpirido[3’,2’:4,5]furo[3,2-d]pirimidin-2-il]fenol (PI-103); 5-(9-isopropil-8-metil-2-morfolino-9H-purin-6-il)pirimidin-2-amina (VS-5584, SB2343); y N-[2-[(3,5-Dimetoxifenil)amino]quinoxalin-3-il]-4-[(4-metil-3-metoxifenil)carbonil]aminofenilsulfonamida (XL765).
En casos, una célula que expresa CAR descrita aquí, opcionalmente en combinación con un inhibidor de cinasa, por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib, se administra a un sujeto en combinación con un inhibidor de cinasa de linfoma anaplásico (ALK). Ejemplos de inhibidores de la cinasa ALK incluyen, pero no se limitan a, crizotinib (Pfizer), ceritinib (Novartis), alectinib (Chugai), brigatinib (también llamado AP26113; Ariad), entrectinib (Ignyta), PF-06463922 (Pfizer), TSR-011 ( Tesaro) (véase, por ejemplo, Clinical Trial Identifier No. NCT02048488), CEP-37440 (Teva) y X-396 (Xcovery). En algunos casos, el sujeto tiene un tumor sólido, por ejemplo, un cáncer sólido descrito en la presente, por ejemplo, cáncer de pulmón.
El nombre químico de crizotinib es 3-[(1R)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etoxi]-5-(1-piperidin-4-ilpirazol-4-il)piridin-2-amina. El nombre químico de ceritinib es 5-cloro-W2-[2-isopropoxi-5-metil-4-(4-piperidinil)fenil]-W4-[2-(isopropilsulfonil)fenil]-2,4-pirimidinodiamina. El nombre químico de alectinib es 9-etil-6,6-dimetil-8- (4-morfolinopiperidin-1-il) -11-oxo-6,11-dihidro-5H-benzo[b]carbazol-3-carbonitrilo. El nombre químico de brigatinib es 5-Cloro-N2-{4-[4-(dimetilamino)-1-piperidinil]-2-metoxifenil}-N4-[2-(dimetilfosforil)fenil]-2,4-pirimidindiamina. El nombre químico de entrectinib es N-(5-(3,5-difluorobencil)-1H-indazol-3-il)-4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-((tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)benzamida. El nombre químico de PF-06463922 es (10R)-7-Amino-12-fluoro-2,10,16-trimetil-15-oxo-10,15,16,17-tetrahidro-2H-8,4-(meteno)pirazolo[4,3-h][2,5,11]-benzoxadiazaciclotetradecin-3-carbonitrilo. La estructura química de CEP-37440 es (S)-2-((5-cloro-2-((6-(4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il)-1-metoxi-6,7,8,9-tetrahidro-5H-benzo[7]anulen-2-il)amino)pirimidin-4-il)amino)-W-metilbenzamida. El nombre químico de X-396 es (R)-6-amino-5-(1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etoxi)-N-(4-(4-metilpiperazin-1-carbonil)fenilo)piridazin-3-carboxamida.
En casos, una célula que expresa CAR descrita aquí, opcionalmente en combinación con un inhibidor de cinasa, por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib, se administra a un sujeto en combinación con un inhibidor de indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO). IDO es una enzima que cataliza la degradación del aminoácido L-triptófano en kinurenina. Muchos cánceres expresan IDO, por ejemplo, cáncer prostático, colorrectal, pancreático, de cuello uterino, gástrico, de ovario, de cabeza y de pulmón. Las pDC, macrófagos y células dendríticas (DC, por sus siglas en inglés) pueden expresar IDO. Sin desear ceñirse a ninguna teoría, se cree que un descenso en L-triptófano (por ejemplo, catalizado por IDO) da como resultado un medio inmunosupresor al inducir la anergia y apoptosis de linfocitos T. Por lo tanto, sin desear ceñirse a ninguna teoría, se cree que un inhibidor de IDO puede potenciar la eficacia de una célula que expresa CAR descrita en la presente, por ejemplo, al reducir la supresión o muerte de una célula inmunitaria que expresa CAR. En casos, el sujeto tiene un tumor sólido, por ejemplo, un tumor sólido descrito en la presente, por ejemplo, cáncer prostático, colorrectal, pancreático, de cuello uterino, gástrico, de ovario, de cabeza o de pulmón. Los inhibidores de IDO a modo de ejemplo incluyen, sin carácter limitante, 1-metiltriptófano, indoximod (NewLink Genetics) (remítase, por ejemplo, a los N.os de Identificador de Ensayos Clínicos NCT01191216; NCT01792050) y INCB024360 (Incyte Corp.) (remítase, por ejemplo, a los N.os de Identificador de Ensayos Clínicos NCT01604889; NCT01685255).
En casos, una célula que expresa CAR descrita aquí, opcionalmente en combinación con un inhibidor de cinasa, por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib, se administra a un sujeto en combinación con un modulador de células supresoras derivadas de mieloides (MDSC). Las MDSC se acumulan en la periferia y en el sitio tumoral de muchos tumores sólidos. Estas células suprimen las respuestas de linfocitos T, y de esta manera obstaculizan la eficacia de la terapia con células que expresan CAR. Sin desear ceñirse a ninguna teoría, se cree que la administración de un modulador de MDSC potencia la eficacia de una célula que expresa CAR descrita en la presente. En un caso, el sujeto tiene un tumor sólido, por ejemplo, un tumor sólido descrito en la presente, por ejemplo, glioblastoma. Los moduladores de MDSC a modo de ejemplo, incluyen, sin carácter limitante, MCS110 y BLZ945. MCS110 es un anticuerpo monoclonal (mAb) contra el factor estimulador de colonias de macrófagos (M-CSF). Remítase, por ejemplo, al N.° de Identificador de Ensayos Clínicos NCT00757757. BLZ945 es una molécula de bajo peso molecular inhibidora del receptor del factor 1 estimulador de colonias (CSF1R, por sus siglas en inglés). Remítase, por ejemplo, a Pyonteck et al. Nat. Med. 19(2013):1264-72. La estructura de BLZ945 se muestra a continuación.
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En algunos casos, una célula que expresa CAR descrita aquí, opcionalmente en combinación con un inhibidor de cinasa, por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib, se administra a un sujeto en combinación con un polipéptido de interleucina-15 (IL-15), un polipéptido del receptor alfa de interleucina-15 (IL-15Ra), o una combinación tanto de un polipéptido IL-15 como un polipéptido IL-15Ra, por ejemplo, hetIL-15 (Admune Therapeutics, LLC). hetIL-15 es un complejo heterodimérico no covalente de IL-15 e IL-15Ra. hetIL-15 se describe en, por ejemplo, U.S. 8.124.084, U.S.
2012/0177598, U.S. 2009/0082299, U.S. 2012/0141413, y U.S. 2011/0081311. En casos, het-IL-15 se administra por vía subcutánea. En casos, el sujeto padece un cáncer, por ejemplo, un cáncer sólido, por ejemplo, melanoma o cáncer de colon. En casos, el sujeto tiene un cáncer metastásico.
Aplicación Terapéutica
Enfermedades y/o trastornos asociados a CD19
En un aspecto, la invención se refiere al tratamiento de una enfermedad asociada con la expresión de CD19. En un aspecto, la invención se refiere al tratamiento de una enfermedad en la que parte del tumor es negativo para CD19 y parte del tumor es positivo para CD19. por ejemplo, el CAR de la presente descripción es útil para tratar sujetos que se han sometido a tratamiento por una enfermedad asociada con una expresión elevada de CD19, en el que el sujeto que se ha sometido a tratamiento por niveles elevados de CD19 presenta una enfermedad asociada con niveles elevados de CD19. Las terapias descritas aquí se pueden usar para tratar, por ejemplo, sujetos que responden a un inhibidor de cinasa como ibrutinib (por ejemplo, respuesta parcial o respuesta completa) o sujetos que no lo hacen (por ejemplo, no respondedores o recaídas). Sin desear ceñirse a la teoría, varios pacientes sometidos a tratamiento con inhibidores de la cinasa (por ejemplo, Inhibidores de BTK como ibrutinib) pueden mostrar una respuesta reducida al tratamiento (por ejemplo, son respondedores parciales o no responden al tratamiento, o recaen durante el tratamiento). Según, la administración de las terapias CAR descritas aquí, en combinación con los inhibidores de cinasa, puede dar como resultado efectos beneficiosos.
A continuación se describen regímenes terapéuticos ejemplares para estos sujetos.
En algunos casos, cuando el sujeto no es un no respondedor o recae para un inhibidor de cinasa (por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib), el inhibidor de cinasa se retira y se administra la terapia de CAR. En otros casos, cuando los sujetos no responden a un inhibidor de cinasa (por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib), se continúa la terapia con inhibidor de cinasa y se añade la terapia de CAR al régimen. Este uso está respaldado, por ejemplo, por experimentos en el Ejemplo 8 de este documento que indican que la terapia de CAR es eficaz como monoterapia en células resistentes a ibrutinib. Sin desear estar ligado a la teoría, continuar la terapia con inhibidores de cinasa puede mejorar la eficacia de la terapia de CAR, por ejemplo, aumentando el número de células que expresan CAR en el torrente sanguíneo (ver Ejemplo 8 aquí).
Sin estar ligado a la teoría, un sujeto que no responde o que recae a un inhibidor de cinasa (por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib) puede no responder por al menos dos razones: los sujetos pueden tener una mutación en la diana farmacéutica (por ejemplo, BTK, por ejemplo, una mutación C481S) que previene la inhibición de la diana, o puede tener alteraciones en otras vías que pueden impulsar la proliferación incluso cuando la diana se inhibe adecuadamente (por ejemplo, una mutación en PLCy, tal como una mutación activadora en PLCy que da como resultado una señalización celular constitutiva independiente de BTK). El tratamiento puede modificarse según el motivo de la falta de respuesta. por ejemplo, en la primera situación (en algunos casos), si los sujetos tienen (o se identifica que tienen) una mutación que evita que el inhibidor de cinasa inhiba su diana, un segundo inhibidor de cinasa (por ejemplo, dirigido contra la misma diana) puede sustituirse por (o administrarse en combinación con) el inhibidor de cinasa. Más específicamente, en algunas realizaciones en las que el paciente tiene (o se identifica que tiene) una mutación que evita que ibrutinib inhiba BTK, un segundo inhibidor de BTK, por ejemplo, un inhibidor de b Tk descrito aquí tal como GDC-0834, RN-486, CGI- 560, CGI-1764, HM-71224, CC-292, ONO-4059, CNX-774 o LFM-A13) puede sustituirse por ibrutinib. Sin desear estar ligado por la teoría, el segundo inhibidor de cinasa puede actuar sobre una región de la diana que no es alterada por la mutación y, por lo tanto, el sujeto es sensible al segundo inhibidor de cinasa. En otros casos, se mantiene el inhibidor de cinasa original (por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib). De acuerdo con la teoría no limitante aquí, el inhibidor de cinasa original puede tener una actividad útil en las células que expresan CAR, por ejemplo, promoviendo un fenotipo TH1, promoviendo la proliferación o aumentando de otro modo los niveles o la actividad de las células.
Como se señaló anteriormente, en algunos casos un sujeto no responde porque el sujeto tiene una alteración (por ejemplo, una mutación) en otra ruta que puede impulsar la proliferación incluso cuando la diana se inhibe adecuadamente. Por consiguiente, si el sujeto tiene (o se identifica que tiene) una alteración en una ruta que hace que la actividad del inhibidor de cinasa sea ineficaz, se puede mantener la terapia del inhibidor de cinasa. Sin desear estar ligado a la teoría, la actividad del inhibidor de cinasa (por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib) puede promover cambios biológicos útiles en las células cancerosas incluso si el inhibidor de cinasa solo no es suficiente para ralentizar la proliferación. por ejemplo, el inhibidor de cinasa puede ser suficiente para movilizar las células cancerosas fuera de los ganglios linfáticos, haciéndolas más vulnerables a la terapia de CAR.
Pasando ahora a los sujetos que responden a un inhibidor de cinasa (por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib), ahora se describen varios regímenes terapéuticos. En algunos casos, cuando un sujeto es (o se identifica como) un respondedor completo al inhibidor de cinasa, al sujeto no se le administra una terapia de CAR durante el período de respuesta completa. En otros casos, cuando un sujeto es (o se identifica como) un respondedor completo al inhibidor de cinasa, al sujeto se le administra una terapia de CAR durante el período de respuesta completa. En un caso, después de la terapia de CAR, el sujeto experimenta una respuesta prolongada o una recaída retardada (por ejemplo, en comparación con el curso esperado de la enfermedad cuando se trata sin terapia de CAR). por ejemplo, MCL tratada con ibrutinib en monoterapia tiene una duración media de respuesta de alrededor de 17,5 meses.
En algunos casos, cuando un sujeto es (o se identifica como) un respondedor parcial al inhibidor de cinasa (por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib), al sujeto no se le administra una terapia de CAR durante el período de respuesta parcial. En otros casos, cuando un sujeto es (o se identifica como) un respondedor parcial al inhibidor de cinasa, al sujeto se le administra una terapia de CAR durante el período de respuesta parcial. En un caso, después de la terapia de CAR, el sujeto experimenta una respuesta completa y/o una respuesta prolongada o una recaída retrasada (por ejemplo, en comparación con el curso esperado de la enfermedad cuando se trata sin la terapia de CAR).
En algunos casos, cuando un sujeto tiene (o se identifica que tiene) enfermedad estable después del comienzo del tratamiento con el inhibidor de cinasa (por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib), al sujeto no se le administra una terapia de CAR durante el período de enfermedad estable. En otros casos, cuando un sujeto tiene (o se identifica que tiene) una enfermedad estable después del comienzo del tratamiento con el inhibidor de cinasa, al sujeto se le administra una terapia de CAR durante el período de enfermedad estable. En un caso, después de la terapia de CAR, el sujeto experimenta una respuesta parcial, una respuesta completa y/o una respuesta prolongada o una recaída tardía (por ejemplo, en comparación con el curso esperado de la enfermedad cuando se trata sin terapia de CAR).
En algunos casos, cuando un sujeto tiene (o se identifica que tiene) una enfermedad progresiva después del comienzo del tratamiento con el inhibidor de cinasa (por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib), al sujeto no se le administra una terapia de CAR durante el período de enfermedad progresiva. En otros casos, cuando un sujeto tiene (o se identifica que tiene) una enfermedad progresiva después del comienzo del tratamiento con el inhibidor de cinasa, al sujeto se le administra una terapia de c A r durante el período de enfermedad progresiva. En un caso, después de la terapia de CAR, el sujeto experimenta una enfermedad estable, una respuesta parcial, una respuesta completa y/o una respuesta prolongada o una recaída retardada (por ejemplo, en comparación con el curso esperado de la enfermedad cuando se trata sin terapia de CAR).
Por tanto, se pueden realizar una o más etapas de evaluación de la enfermedad antes o durante el tratamiento, para determinar qué curso de tratamiento es adecuado para un paciente dado. por ejemplo, a un sujeto se le puede administrar un inhibidor de cinasa (por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib) como terapia de primera línea. Luego, después de un período de tiempo (por ejemplo, 1 o 2 meses, pero también 2 semanas, 3 semanas, 1 mes, 1,5 meses, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 6 meses, 9 meses, 12 meses, 15 meses o 18 meses) se puede evaluar la respuesta del paciente. Si la evaluación muestra que el sujeto responde completamente, en algunos casos no se administra la terapia de CAR, por ejemplo, como se describió anteriormente. Si la evaluación muestra que el sujeto responde parcialmente o tiene una enfermedad estable, en algunos casos se administra terapia de CAR en combinación con el inhibidor de cinasa, por ejemplo, como se describió anteriormente. Si la evaluación muestra que el sujeto no responde o recae, en algunos casos la terapia de CAR se administra en combinación con el inhibidor de cinasa o un segundo inhibidor de cinasa, por ejemplo, como se describió anteriormente. En algunos casos, el inhibidor de cinasa controla la enfermedad mientras se fabrica una célula que expresa CAR, por ejemplo, mientras se manipulan las propias células T del paciente para expresar un CAR y/u otros factores.
Los estándares clínicos para clasificar el estado de respuesta de un paciente o el estado de recaída se conocen en la técnica. Como ejemplo, para el linfoma maligno, los criterios de respuesta estandarizados se describen en Cheson et al., J Clin Oncol 17: 1244 (1999) y Cheson et al., "Revised Response Criteria for Malignant Lymphoma”, J Clin Oncol 25:579-586 (2007). Por consiguiente, en algunas realizaciones, un sujeto se considera un respondedor completo, respondedor parcial, que tiene una enfermedad estable, un no respondedor o un recidivante según los criterios de Cheson o los criterios de Cheson modificados. Los criterios para clasificar otras neoplasias hematológicas se conocen en la técnica.
De acuerdo con los criterios de la Tabla 2 de Cheson 2007, un respondedor completo tiene la desaparición de toda evidencia de enfermedad; un respondedor parcial tiene regresión de la enfermedad mensurable y no hay sitios nuevos; un paciente con enfermedad estable no logra alcanzar RC/PR o PD; y un paciente con enfermedad en recaída o enfermedad progresiva tiene una nueva lesión o un aumento mayor o igual al 50% de los sitios previamente afectados desde el nadir. La evaluación puede implicar una determinación de si la enfermedad es ávida de FDG, PET positiva o negativa, si hay nódulos presentes, por ejemplo, palpables en el hígado o el bazo, y si la médula ósea está depurada o muestra afectación.
La terapia de CAR y el inhibidor de cinasa (por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib) se pueden administrar, por ejemplo, de forma simultánea o secuencial. En algunos casos, la terapia de CAR se inicia sustancialmente al mismo tiempo que comienza la terapia con inhibidores de cinasa. En algunos casos, la terapia de CAR se inicia antes de que comience la terapia con inhibidores de cinasa. En algunos casos, la terapia de CAR se inicia después de que comienza la terapia con inhibidores de cinasa. por ejemplo, la terapia de CAR puede iniciarse, por ejemplo, al menos 1, 2, 3 o 4 semanas, o 1, 2, 3, 4, 6, 9, 12, 15, 18 o 24 meses después de que comienza la terapia del inhibidor de cinasa. En algunos casos, la terapia de CAR se inicia mientras un paciente tiene niveles fisiológicamente relevantes del inhibidor de cinasa en su cuerpo.
Cuando se administran en combinación, la terapia de CAR y el inhibidor de cinasa (por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib), o ambos, se pueden administrar en una cantidad o dosis mayor, menor o igual que la cantidad o dosis de cada agente utilizado individualmente, por ejemplo, como monoterapia. En ciertos casos, la cantidad administrada o la dosis de la terapia de CAR, el inhibidor de cinasa, o ambos, es menor (por ejemplo, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40% o al menos 50%) que la cantidad o dosis de cada agente usado individualmente, por ejemplo, como monoterapia. En otros casos, la cantidad o dosis de la terapia de CAR, el inhibidor de cinasa, o ambos, que da como resultado un efecto deseado (por ejemplo, tratamiento del cáncer) es menor (por ejemplo, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, o al menos 50% menos) que la cantidad o dosis de cada agente usado individualmente, por ejemplo, como monoterapia, requerida para lograr el mismo efecto terapéutico.
Cuando se administran en combinación, la terapia de CAR y el inhibidor de cinasa (por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib), o ambos, se pueden administrar con una duración mayor, menor o igual que la duración de cada agente usado individualmente, por ejemplo, como monoterapia. En ciertos casos, la duración de la administración de la terapia de CAR, el inhibidor de cinasa, o ambos, es más corta (por ejemplo, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40% o al menos 50%) que la duración de cada agente usado individualmente, por ejemplo, como monoterapia. En otros casos, la duración de la administración de la terapia de CAR, el inhibidor de cinasa, o ambos, que da como resultado un efecto deseado (por ejemplo, tratamiento del cáncer) es más corta (por ejemplo, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, o al menos 50% menos) que la duración de cada agente usado individualmente, por ejemplo, como monoterapia, necesaria para lograr el mismo efecto terapéutico. En algunos casos, al paciente se le administra un ciclo abreviado del inhibidor de cinasa (por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib). por ejemplo, el curso abreviado del inhibidor de cinasa puede durar alrededor de 0-2, 2-4, 4-6, 6-8, 8-10, 10-12, 12-15, 15-18, 18-21, o 21-24 meses en total, o puede durar alrededor de 0-2, 2-4, 4-6, 6-8, 8-10, 10-12, 12-15, 15-18, 18-21 o 21-24 meses después de la administración de la terapia de CAR. En casos, el curso abreviado del inhibidor de cinasa termina antes de la recaída. En casos, el inhibidor de cinasa se administra a niveles normales (por ejemplo, monoterapia) durante el curso abreviado.
En realizaciones, una dosis única de células que expresan CAR comprende alrededor de 5 x 108 células CART CD19. Una dosis de células que expresan CAR también puede comprender alrededor de 5 x 106, 1 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 2 x 109 o 5 x 109 células, por ejemplo, células CAR CD19, por ejemplo, células CART CD19.
En un aspecto, la presente descripción se refiere a un vector que comprende CD19 CAR unido operativamente al promotor para la expresión en células de mamífero, por ejemplo, células T. En un aspecto, la presente descripción proporciona una célula recombinante, por ejemplo, una célula T, que expresa el CAR CD19 para uso en el tratamiento de tumores que expresan CD19, en el que la célula T recombinante que expresa el CAR CD19 se denomina CART CD19. En un aspecto, el CART CD19 descrito aquí es capaz de poner en contacto una célula tumoral con al menos un CAR CD19 expresado en su superficie de manera que el CART se dirige a la célula tumoral y se inhibe el crecimiento del tumor.
En un aspecto, la presente descripción se refiere a un método para inhibir el crecimiento de una célula tumoral que expresa CD19, que comprende poner en contacto la célula tumoral con una célula que expresa CAR CD19, por ejemplo, una célula CART CD19, descrita aquí de manera que la CART se active en respuesta al antígeno y se dirija a la célula cancerosa, en la que se inhibe el crecimiento del tumor. La célula que expresa CAR CD19, por ejemplo, la célula T, se administra en combinación con un inhibidor de cinasa, por ejemplo, un inhibidor de cinasa descrito aquí.
Administrado “en combinación”, como se usa aquí, significa que se administran dos (o más) tratamientos diferentes al sujeto durante el curso de la aflicción del sujeto con el trastorno, por ejemplo, los dos o más tratamientos se administran después de que el sujeto ha sido diagnosticado con el trastorno y antes de que el trastorno se haya curado o eliminado o el tratamiento haya cesado por otras razones. En algunas realizaciones, la administración de un tratamiento todavía se está produciendo cuando comienza el suministro del segundo, de modo que hay superposición en términos de administración. A esto a veces se alude en esta memoria como "suministro simultáneo" o "suministro concurrente". En otras realizaciones, la administración de un tratamiento finaliza antes de que comience el suministro del otro tratamiento. En algunas realizaciones de cualquier caso, el tratamiento es más eficaz debido a la administración combinada. por ejemplo, el segundo tratamiento es más eficaz, p. ej., se observa un efecto equivalente con menos del segundo tratamiento, o el segundo tratamiento reduce los síntomas en mayor medida que lo que se vería si el segundo tratamiento se administrara en ausencia del primer tratamiento, o la situación análoga se observa con el primer tratamiento. En algunas realizaciones, el suministro es tal que la reducción de un síntoma u otro parámetro relacionado con el trastorno es mayor de lo que se observaría con un tratamiento suministrado en ausencia del otro. El efecto de los dos tratamientos puede ser parcialmente aditivo, totalmente aditivo o mayor que aditivo. El suministro puede ser tal que un efecto del primer tratamiento suministrado todavía sea detectable cuando se suministra el segundo. En un caso, la célula que expresa CAR se administra a una dosis y/o programa de dosificación descrito aquí, y el inhibidor de cinasa o agente que mejora la actividad de la célula que expresa CAR se administra a una dosis y/o programa de dosificación descrito aquí.
La invención incluye un tipo de terapia celular en la que las células T se modifican genéticamente para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR) y la célula T CAR se infunde a un receptor que lo necesita. La célula infundida es capaz de provocar la muerte de células tumorales en el receptor. A diferencia de las terapias con anticuerpos, las células T modificadas con CAR pueden replicarse in vivo, lo que da como resultado una persistencia a largo plazo que puede conducir a un control tumoral sostenido. En diversos aspectos, las células T administradas al paciente, o su progenie, persisten en el paciente durante al menos cuatro meses, cinco meses, seis meses, siete meses, ocho meses, nueve meses, diez meses, once meses, doce meses, trece meses, catorce meses, quince meses, dieciséis meses, diecisiete meses, dieciocho meses, diecinueve meses, veinte meses, veintiún meses, veintidós meses, veintitrés meses, dos años, tres años, cuatro años o cinco años después de la administración de la célula T al paciente.
La invención también incluye un tipo de terapia celular en la que las células T se modifican, por ejemplo, por ARN transcrito in vitro, para expresar transitoriamente un receptor de antígeno quimérico (CAR) y la célula CAR T se infunde a un receptor que lo necesita. La célula infundida es capaz de provocar la muerte de células tumorales en el receptor. Por lo tanto, en diversos aspectos, las células T administradas al paciente están presentes durante menos de un mes, p. ej., tres semanas, dos semanas, una semana, después de la administración de las células T al paciente.
Sin desear estar ligado a ninguna teoría particular, la respuesta inmunitaria antitumoral provocada por las células T modificadas con CAR puede ser una respuesta inmunitaria activa o pasiva, o alternativamente puede deberse a una respuesta inmunitaria directa frente a una respuesta inmunitaria indirecta. En un aspecto, las células T transducidas con CAR exhiben secreción de citocinas proinflamatorias específicas y potente actividad citolítica en respuesta a células cancerosas humanas que expresan CD19, resisten la inhibición de CD19 soluble, median en la muerte del espectador y median en la regresión de un tumor humano establecido. por ejemplo, las células tumorales sin antígeno dentro de un campo heterogéneo de tumor que expresa CD19 pueden ser susceptibles a la destrucción indirecta por células T redirigidas a CD19 que han reaccionado previamente contra células cancerosas positivas para antígenos adyacentes.
En un aspecto, las células T completamente humanas modificadas con CAR de la presente descripción pueden ser un tipo de vacuna para ex vivo inmunización y/o terapia in vivo en un mamífero. En un aspecto, el mamífero es un ser humano.
Con respecto a inmunización ex vivo, ocurre al menos uno de los siguientes in vitro antes de administrar la célula a un mamífero: i) expansión de las células, ii) introducción de un ácido nucleico que codifica un CAR en las células, o iii) crioconservación de las células.
Los procedimientos ex vivo son bien conocidos en la técnica y se comentan con más detalle a continuación. En síntesis, las células se aíslan de un mamífero (por ejemplo, un ser humano) y se modifican genéticamente (por ejemplo, se transducen o transfectan in vitro) con un vector que expresa un CAR divulgado en la presente. La célula modificada con CAR se puede administrar a un receptor mamífero para proporcionar un beneficio terapéutico. El receptor mamífero puede ser un ser humano y la célula modificada con CAR puede ser autóloga con respecto al receptor. Como alternativa, las células pueden ser alogénicas, singénicas o xenogénicas con respecto al receptor. Además de utilizar una vacuna a base de células en términos de ex vivo inmunización, también se incluyen en los métodos descritos aquí las composiciones y métodos para inmunización in vivo para provocar una respuesta inmune dirigida contra un antígeno en un paciente.
Por lo general, las células activadas y expandidas tal como se describe en la presente se pueden utilizar en el tratamiento y la prevención de enfermedades que surgen en individuos que están inmunocomprometidos. En particular, las células que expresan CAR descritas aquí se usan en el tratamiento de enfermedades, trastornos y afecciones asociadas con la expresión de CD19. En ciertos aspectos, las células se usan en el tratamiento de pacientes con riesgo de desarrollar enfermedades, trastornos y afecciones asociadas con la expresión de CD19. Por tanto, la presente descripción proporciona métodos para el tratamiento o prevención de enfermedades, trastornos y afecciones asociadas con la expresión de CD19 que comprenden administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de las células que expresan CAR descritas aquí, en combinación con un inhibidor de cinasa, por ejemplo, un inhibidor de cinasa descrito aquí.
La presente descripción también proporciona métodos para inhibir la proliferación o reducir una población de células que expresan CD19, comprendiendo los métodos poner en contacto una población de células que comprenden una célula que expresa CD19 con una célula que expresa CAR anti-CD19 descrita aquí que se une a la célula que expresa CD19, y poner en contacto la población de células que expresan CD19 con un inhibidor de cinasa, por ejemplo, un inhibidor de cinasa descrito aquí. En un aspecto específico, la presente descripción proporciona métodos para inhibir la proliferación o reducir la población de células cancerosas que expresan CD19, comprendiendo los métodos poner en contacto la población de células cancerosas que expresan CD19 con una célula que expresa CAR anti-CD19 descrita aquí que se une a la célula que expresa CD19, y poner en contacto la célula que expresa CD19 con un inhibidor de cinasa, por ejemplo, un inhibidor de cinasa descrito aquí. En un aspecto, la presente descripción proporciona métodos para inhibir la proliferación o reducir la población de células cancerosas que expresan CD19, comprendiendo los métodos poner en contacto la población de células cancerosas que expresan CD19 con una célula que expresa CAR anti-CD19 descrita aquí que se une a la célula que expresa CD19, y poner en contacto la célula que expresa CD19 con un inhibidor de cinasa, por ejemplo, un inhibidor de cinasa descrito aquí. En ciertos aspectos, la combinación de la célula que expresa CAR anti-CD19 descrita aquí y el inhibidor de cinasa, por ejemplo, un inhibidor de cinasa descrito aquí, reduce la cantidad, número, cantidad o porcentaje de células y/o células cancerosas en al menos 25%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 65%, al menos 75%, al menos 85%, al menos 95% o al menos 99% en un sujeto con o modelo animal para un cáncer hematológico u otro cáncer asociado con células que expresan CD19 con respecto a un control negativo. En un aspecto, el sujeto es un ser humano.
La presente descripción también proporciona métodos para prevenir, tratar y/o manejar una enfermedad asociada con células que expresan CD19 (por ejemplo, un cáncer hematológico o cáncer atípico que expresa CD19), comprendiendo los métodos administrar a un sujeto que necesita una célula que expresa CAR anti-CD19 que se une a la célula que expresa CD19, y administrar un inhibidor de cinasa, por ejemplo, un inhibidor de cinasa descrito aquí. En un aspecto, el sujeto es un ser humano. Los ejemplos no limitantes de trastornos asociados con células que expresan CD19 incluyen trastornos autoinmunitarios (tales como lupus), trastornos inflamatorios (tales como alergias y asma) y cánceres (tales como cánceres hematológicos o cánceres atípicos que expresan CD19).
La presente descripción también proporciona métodos para prevenir, tratar y/o manejar una enfermedad asociada con células que expresan CD19, comprendiendo los métodos administrar a un sujeto que lo necesite una célula CART anti-CD19 de la descripción que se une a la célula que expresa CD19. En un aspecto, el sujeto es un ser humano.
La presente descripción proporciona métodos para prevenir la recaída del cáncer asociado con células que expresan CD19, comprendiendo los métodos administrar a un sujeto que lo necesite una célula que expresa anti-CD19 (como una célula CART anti-CD19) de la descripción que se une a la célula que expresa CD19. En un aspecto, los métodos comprenden administrar al sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de una célula que expresa anti-CD19 (tal como una célula CART anti-CD19) descrita aquí que se une a la célula que expresa CD19 en combinación con un cantidad efectiva de otra terapia.
En un aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para tratar cáncer en un sujeto. El método comprende administrar al sujeto una célula (por ejemplo, una célula efectora inmunitaria) que expresa un CAR que se dirige a células B, por ejemplo, una célula T o una célula NK, descrita aquí, en combinación con un inhibidor de cinasa, por ejemplo, un inhibidor de cinasa descrito aquí, de modo que el cáncer se trate en el sujeto. Un ejemplo de un cáncer que se puede tratar mediante los métodos descritos aquí es un cáncer asociado con la expresión del antígeno de células B, por ejemplo, CD19. En un caso, la enfermedad es un tumor sólido o líquido. En un caso, la enfermedad es un cáncer hematológico. En un caso, el cáncer hematológico es leucemia. En un caso, el cáncer hematológico es una neoplasia de células B maduras, por ejemplo, según la clasificación de la OMS. En un caso, el cáncer hematológico es una neoplasia maligna derivada de células B CD19+. En un caso, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en una o más leucemias agudas que incluyen pero no se limitan a leucemia linfoide aguda de células B (BALL), leucemia linfoide aguda de células T (TALL), leucemia linfocítica pequeña (SLL), leucemia linfoide aguda (ALL); una o más leucemias crónicas que incluyen, pero no se limitan a, leucemia mielógena crónica (CML), leucemia linfocítica crónica (CLL); cánceres hematológicos o afecciones hematológicas adicionales que incluyen, pero no se limitan a, linterna de células del manto (MCL), leucemia prolinfocítica de células B, neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas, linterna de Burkitt, linterna difuso de células B grandes (DLBCL) (por ejemplo, linfoma de células B grandes ricas en células T/histiocitos, DLCBL primario del SNC, DLBCL cutáneo primario tipo pierna, o EBV+ DLBCL de los ancianos), DLBCL asociado con inflamación crónica, linfoma folicular, linfoma folicular pediátrico, leucemia de células pilosas, linfoma folicular de células pequeñas o células grandes, afecciones linfoproliferativas malignas, linfoma MALT (linfoma extraganglionar de la zona marginal de tejido linfoide asociado a las mucosas), linfoma de la zona marginal, mieloma múltiple, mielodisplasia y síndrome mielodisplásico, linfoma no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, linfoma de células plasmoplásticas , macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma esplénico de la zona marginal, linfoma/leucemia esplénica (por ejemplo, no clasificable), linfoma difuso de células B pequeñas de pulpa roja, variante de leucemia de células pilosas, linfoma linfoplasmocítico, una enfermedad de cadena pesada (por ejemplo, enfermedad de cadena pesada alfa, enfermedad de cadena pesada gamma o enfermedad de cadena pesada mu), mieloma de células plasmáticas, plasmocitoma óseo solitario , plasmocitoma extraóseo, linfoma ganglionar de la zona marginal, linfoma ganglionar de la zona marginal pediátrico, linfoma cutáneo primario del centro del folículo, granulomatosis linfomatoide, linfoma mediastínico primario (ténmico) de células B grandes, linfoma intravascular de células B grandes, linfoma de células B grandes ALK+, linfoma de células B grandes que surge en la enfermedad de Castleman multicéntrica asociada a HHV8, linfoma de derrame primario, linfoma de células B, no clasificable (por ejemplo, con características intermedias entre DLBCL y linfoma de Burkitt o intermedias entre LDCBG y linfoma de Hodgkin clásico) y “preleucemia”, que son una colección diversa de condiciones hematológicas unidas por la producción ineficaz (o displasia) de células sanguíneas mieloides, y a enfermedades asociadas con la expresión del antígeno de células B (por ejemplo, CD19-) que incluye, pero sin limitación, cánceres atípicos y/o no clásicos, neoplasias, afecciones precancerosas o enfermedades proliferativas que expresan antígeno de células B (por ejemplo, CD19); y cualquier combinación de los mismos.
En algunos casos, el cáncer es linfoma de Hodgkin y el paciente se trata con células que expresan CAR, por ejemplo, como monoterapia o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales. En casos, el linfoma de Hodgkin es estadio I, II, III o IV. El agente terapéutico adicional puede comprender, por ejemplo, un inhibidor de cinasa tal como un inhibidor de BTK tal como ibrutinib. El tratamiento terapéutico adicional puede comprender un tratamiento para el linfoma de Hodgkin. El tratamiento adicional puede comprender, por ejemplo, radioterapia, MOPP (Mustargen, Oncovin, Prednisona y Procarbazina), ABVD (Adriamicina, bleomicina, vinblastina y dacarbazina), Stanford V (un régimen con quimioterapia y tratamiento con radiación) o BEACOPP (Bleomicina, Etopósido, Adriamicina, Ciclofosfamida, Oncovin, Procarbazina, Prednisona). En algunos casos, el sujeto ha sido tratado previamente con, o es resistente a, o es refractario a, una o más de las terapias de radiación, MOPP, Stanford V o BEACOPP.
Las indicaciones no relacionadas con el cáncer asociadas con la expresión del antígeno de células B, por ejemplo, uno o más de CD19, CD20, CD22 o ROR1, incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, enfermedad autoinmune (por ejemplo, lupus), trastornos inflamatorios (alergia y asma) y trasplante.
En algunos casos, un cáncer que puede tratarse con la combinación aquí descrita es mieloma múltiple. El mieloma múltiple es un cáncer de la sangre que se caracteriza por la acumulación de un clon de células plasmáticas en la médula ósea. Las terapias actuales para el mieloma múltiple incluyen, pero no se limitan a, el tratamiento con lenalidomida, que es un análogo de la talidomida. La lenalidomida tiene actividades que incluyen actividad antitumoral, inhibición de la angiogénesis e inmunomodulación. En algunos casos, se puede usar un CAR CD19, por ejemplo, como se describe aquí, para dirigirlo contra células de mieloma. En algunas realizaciones, la combinación descrita aquí se puede usar con una o más terapias adicionales, por ejemplo, tratamiento con lenalidomida.
Las células que expresan CAR descritas aquí pueden administrarse solas o como una composición farmacéutica en combinación con diluyentes y/o con otros componentes tales como IL-2 u otras citocinas o poblaciones celulares.
En casos, se administra al sujeto una quimioterapia que agota los linfoides antes, al mismo tiempo o después de la administración (por ejemplo, infusión) de células CAR, por ejemplo, células que expresan CAR descritas aquí. En un ejemplo, la quimioterapia de depleción linfoide se administra al sujeto antes de la administración de células CAR. por ejemplo, la quimioterapia de agotamiento linfoide finaliza de 1 a 4 días (por ejemplo, 1, 2, 3 o 4 días) antes de la infusión de células CAR. En casos, se administran múltiples dosis de células CAR, por ejemplo, como se describe aquí. por ejemplo, una dosis única comprende alrededor de 5 x 108 células CAR. En casos, se administra al sujeto una quimioterapia que agota los linfoides antes, al mismo tiempo o después de la administración (por ejemplo, infusión) de una célula que expresa CAR descrita aquí.
Cáncer hematológico
Las condiciones de cáncer hematológico son los tipos de cáncer como la leucemia, el linfoma y las afecciones linfoproliferativas malignas que afectan la sangre, la médula ósea y el sistema linfático.
La leucemia se puede clasificar como leucemia aguda y leucemia crónica. La leucemia aguda se puede clasificar, además, como leucemia mielógena aguda (AML) y leucemia linfoide aguda (ALL). La leucemia crónica incluye leucemia mielógena crónica (CML) y leucemia linfoide crónica (CLL). Otras afecciones relacionadas incluyen los síndromes mielodisplásicos (MDS, anteriormente conocido como "preleucemia") que son una colección diversa de afecciones hematológicas unidas por la producción ineficaz (o displasia) de células de la sangre mieloides y el riesgo de transformación en AML.
El linfoma es un grupo de tumores de células de la sangre que se desarrollan a partir de linfocitos. Los linfomas a modo de ejemplo incluyen el linfoma no hodgkiniano y el linfoma de Hodgkin.
Terapias combinadas
La combinación de una célula que expresa CAR descrita aquí (por ejemplo, y un inhibidor de cinasa descrito aquí) puede usarse en combinación con otros agentes y terapias conocidos.
Una célula que expresa CAR descrita aquí, el inhibidor de cinasa y/o el al menos un agente terapéutico adicional se pueden administrar simultáneamente, en la misma o en composiciones separadas, o secuencialmente. Para la administración secuencial, la célula que expresa el CAR descrita en en esta memoria se puede administrar primero, y el agente adicional puede administrarse en segundo lugar, o el orden de administración se puede invertir.
La terapia con CAR y/u otros agentes, procedimientos o modalidades terapéuticos se pueden administrar durante periodos en los que el trastorno está activo o durante un periodo de remisión o menor actividad de la enfermedad. La terapia de CAR se puede administrar antes de otro tratamiento, al mismo tiempo que el tratamiento, después del tratamiento o durante la remisión del trastorno.
Cuando se administra en combinación, la terapia de CAR y uno o más agentes adicionales (por ejemplo, inhibidor de cinasa y/o un tercer agente), o todos, pueden administrarse en una cantidad o dosis que es mayor, menor o igual que la cantidad o dosis de cada agente usado individualmente, por ejemplo, como monoterapia. En ciertos casos, la cantidad o dosis administrada de la terapia de CAR, el agente adicional (por ejemplo,inhibidor de cinasa y/o tercer agente), o todos, es menor (por ejemplo, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, o al menos 50%) que la cantidad o dosis de cada agente usado individualmente, por ejemplo, como monoterapia. En otros casos, la cantidad o dosis de la terapia de CAR, el agente adicional (por ejemplo, inhibidor de cinasa y/o tercer agente), o todos, que da como resultado un efecto deseado (por ejemplo, tratamiento del cáncer) es menor (por ejemplo, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40% o al menos 50% menos) que la cantidad o dosis de cada agente usado individualmente, por ejemplo, como monoterapia, requerida para lograr el mismo efecto terapéutico.
En aspectos adicionales, la combinación de la célula que expresa CAR descrita aquí (por ejemplo, y el inhibidor de cinasa) puede usarse en un régimen de tratamiento en combinación con cirugía, quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, tales como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos u otros agentes inmunoablativos como CAMPATH, anticuerpos anti-CD3 u otras terapias con anticuerpos, citoxina, fludarabina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228, citocinas e irradiación, vacuna peptídica, como que se describe en Izumoto et al. 2008 J Neurosurg 108: 963-971.
En un caso, la combinación de una célula que expresa CAR descrita aquí (por ejemplo, y un inhibidor de cinasa descrito aquí) se puede usar en combinación con otro agente quimioterapéutico. Los agentes quimioterapéuticos ejemplares incluyen una antraciclina (por ejemplo, doxorrubicina (por ejemplo, doxorrubicina liposomal)); un alcaloide de la vinca (por ejemplo, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina); un agente alquilante (por ejemplo, ciclofosfamida, descarbazina, melfalán, ifosfamida, temozolomida); un anticuerpo de células inmunes (por ejemplo, alemtuzamab, gemtuzumab, rituximab, ofatumumab, tositumomab, brentuximab); un antimetabolito (que incluye, por ejemplo, antagonistas del ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina e inhibidores de adenosina desaminasa (por ejemplo, fludarabina)); un agonista de la proteína relacionada con TNFR inducida por glucocorticoides TNFR (GITR); un inhibidor del proteasoma (por ejemplo, aclacinomicina A, gliotoxina o bortezomib); un inmunomodulador como la talidomida o un derivado de la talidomida (por ejemplo, lenalidomida).
Los agentes quimioterapéuticos generales considerados para uso en terapias de combinación incluyen anastrozol (Arimidex®), bicalutamida (Casodex®), sulfato de bleomicina (Blenoxane®), busulfán (Myleran®), inyección de busulfano (Busulfex®), capecitabina (Xeloda®), N4- pentoxicarbonil-5-desoxi-5-fluorocitidina, carboplatino (Paraplatin®), carmustina (BiCNU®), clorambucilo (Leukeran®), cisplatino (Platinol®), cladribina (Leustatin®), ciclofosfamida (Cyrabtoxan® o Neosarine®) , arabinósido de citosina (Cytosar-U®), inyección de liposoma de citarabina (DepoCyt®), dacarbazina (DTIC-Dome®), dactinomicina (Actinomicina D, Cosmegan), hidrocloruro de daunorrubicina (Cerubidine®), inyección de citrato de daunorubicina en liposoma (DaunoX dexametasona, docetaxel (Taxotere®), hidrocloruro de doxorrubicina (Adriamycin®, Rubex®), etopósido (Vepesid®), fosfato de fludarabina (Fludara®), 5-fluorouracilo (Adrucil®, Efudex®), flutamida (Eulexin®), tezacitibina gemcitabina (difluorodesoxicitidina), hidroxiurea (Hydrea®), idarubicina (Idamycin®), ifosfamida (IFEX®), irinotecan (Camptosar®), L-asparaginasa (ELSPAR®), leucovorina cálcica, melfalán (Alkeran®), 6-mercaptopurina (Purinethol®), metotrexato (Folex®), mitoxantrona (Novantrone®), mylotarg, paclitaxel (Taxol®), phoenix (Yttrium90 / MX-DTPA), pentostatina, polifeprosan 20 con implante de carmustina (Gliadel®), citrato de tamoxifeno (Nolvadex®), tenipósido (Vumon®), 6-tioguanina, tiotepa, tirazoneamina ®), hidrocloruro de topotecán para inyección (Hycamptin®), vinblastina (Velban®), vincristina (Oncovin®) y vinorelbina (Navelbine®).
Los agentes alquilantes a modo de ejemplo incluyen, sin carácter limitante, mostazas nitrogenadas, derivados de etilenimina, alquilsulfonatos, nitrosoureas y triazenos): mostaza de uracilo (Aminouracil Mustard®, Chlorethaminacil®, Demethyldopan®, Desmethyldopan®, Haemanthamine®, Nordopan®, Uracil nitrogen mustard®, Uracillost®, Uracilmostaza®, Uramustin®, Uramustine®), clormetina (Mustargen®), ciclofosfamida (Cytoxan®, Neosar®, Clafen®, Endoxan®, Procytox®, Revimmune™) , ifosfamida (Mitoxana®), melfalán (Alkeran®), clorambucilo (Leukeran®), pipobromano (Amedel®, Vercyte®), trietilenomelamina (Hemel®, Hexalen®, Hexastat®), trietilentiofosforamina, Temozolomida (Temodar®), tiotepa (Thioplex®), busulfán (Busilvex®, Myleran®), carmustina (BiCNU®), lomustina (CeeNU®), estreptozocina (Zanosar®) y Dacarbazina (DTIC-Dome®). Los agentes alquilantes a modo de ejemplo adicionales incluyen, sin carácter limitante, Oxaliplatino (Eloxatin®); Temozolomida (Temodar® y Temodal®); Dactinomicina (también conocida como actinomicina-D, Cosmegen®); Melfalán (también conocido como L-PAM, L-sarcolisina y mostaza de fenilalanina, Alkeran®); Altretamina (también conocida como hexametilmelamina (HMM), Hexalen®); Carmustina (BiCNU®); Bendamustina (Treanda®); Busulfán (Busulfex® y Myleran®); Carboplatino (Paraplatin®); Lomustina (también conocida como CCNU, CeeNU®); Cisplatino (también conocido como CDDP, Platinol® y Platinol®-AQ); Clorambucilo (Leukeran®); Ciclofosfamida (Cytoxan® y Neosar®); Dacarbazina (también conocida como DTIC, DIC e imidazolcarboxamida, DTIC-Dome®); Altretamina (también conocida como hexametilmelamina (HMM), Hexalen®); Ifosfamida (Ifex®); Prednumustina; Procarbazina (Matulane®); Mecloretamina (también conocida como mostaza nitrogenada, muarin y clorhidrato de mecloroetamina, Mustargen®); Estreptozocina (Zanosar®); Tiotepa (también conocida como tiofosfoamida, TESPA y TSPA, Thioplex®); Ciclofosfamida (Endoxan®, Cytoxan®, Neosar®, Procytox®, Revimmune®); y bendamustina HCl (Treanda®).
En casos, una célula que expresa CAR descrita aquí, opcionalmente en combinación con un inhibidor de cinasa, por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib, se administra a un sujeto en combinación con fludarabina, ciclofosfamida y/o rituximab. En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con fludarabina, ciclofosfamida y rituximab (FCR). En casos, el sujeto padece CLL. por ejemplo, el sujeto tiene una deleción en el brazo corto del cromosoma 17 (del(17p), por ejemplo, en una célula leucémica). En otros ejemplos, el sujeto no tiene una del(17p). En casos, el sujeto comprende una célula leucémica que comprende una mutación en el gen de región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina (IgVH). En otros casos, el sujeto no comprende una célula leucémica que comprende una mutación en el gen de región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina (IgVH). En casos, la fludarabina se administra con una dosificación de aproximadamente 10-50 mg/m2 (por ejemplo, de aproximadamente 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, o 45-50 mg/m2), por ejemplo, por vía intravenosa. En casos, la ciclofosfamida se administra con una dosificación de aproximadamente 200-300 mg/m2 (por ejemplo, de aproximadamente 200-225, 225-250, 250-275 o 275-300 mg/m2), por ejemplo, por vía intravenosa. En casos, el rituximab se administra en una dosis de alrededor de 400-600 mg/m2 (por ejemplo, 400-450, 450-500, 500-550 o 550-600 mg/m2), por ejemplo, por vía intravenosa.
En casos, una célula que expresa CAR descrita aquí, opcionalmente en combinación con un inhibidor de cinasa, por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib, se administra a un sujeto en combinación con bendamustina y rituximab. En casos, el sujeto padece CLL. por ejemplo, el sujeto tiene una deleción en el brazo corto del cromosoma 17 (del(17p), por ejemplo, en una célula leucémica). En otros ejemplos, el sujeto no tiene una del(17p). En casos, el sujeto comprende una célula leucémica que comprende una mutación en el gen de región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina (IgVH). En otros casos, el sujeto no comprende una célula leucémica que comprende una mutación en el gen de región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina (IgVH). En casos, la bendamustina se administra en una dosis de alrededor de 70-110 mg/m2 (por ejemplo, 70-80, 80-90, 90-100, o 100-110 mg/m2), por ejemplo, por vía intravenosa. En casos, el rituximab se administra en una dosis de alrededor de 400-600 mg/m2 (por ejemplo, 400-450, 450-500, 500-550 o 550-600 mg/m2), por ejemplo, por vía intravenosa.
En casos, una célula que expresa CAR descrita aquí, opcionalmente en combinación con un inhibidor de cinasa, por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib, se administra a un sujeto en combinación con rituximab, ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y/o un corticosteroide (por ejemplo, prednisona). En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con rituximab, ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y/o prednisona (R CHOP). En casos, el sujeto padece un linfoma difuso de linfocitos B grandes (DLBCL, por sus siglas en inglés). En casos, el sujeto padece DLBCL en estadio limitado no voluminoso (por ejemplo, comprende un tumor que tiene un tamaño/diámetro de menos de 7 cm). En casos, el sujeto se trata con radiación combinada con R-CHOP. por ejemplo, al sujeto se le administra R-CHOP (por ejemplo, 1-6 ciclos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 ciclos de R-CHOP), seguido de radiación. En algunos casos, al sujeto se le administra R-CHOP (por ejemplo, 1-6 ciclos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 ciclos de R-CHOP) después de la radiación.
En casos, una célula que expresa CAR descrita aquí, opcionalmente en combinación con un inhibidor de cinasa, por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib, se administra a un sujeto en combinación con etopósido, prednisona, vincristina, ciclofosfamida, doxorrubicina y/o rituximab. En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con etopósido, prednisona, vincristina, ciclofosfamida, doxorrubicina y rituximab (EPOCH-R). En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con EPOCH-R de dosis ajustada (DA-EPOCH-R). En casos, el sujeto padece un linfoma de linfocitos B, por ejemplo, un linfoma de linfocitos B agresivo con reordenación de Myc.
En casos, una célula que expresa CAR descrita aquí, opcionalmente en combinación con un inhibidor de cinasa, por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib, se administra a un sujeto en combinación con rituximab y/o lenalidomida. Lenalidomida ((RS)-3-(4-amino-1-oxo 1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)piperidin-2,6-diona) es un inmunomodulador. En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con rituximab y lenalidomida. En casos, el sujeto padece linfoma folicular (FL, por sus siglas en inglés) o linfoma de células del manto (MCL, por sus siglas en inglés). En casos, el sujeto padece FL y no ha sido tratado previamente con una terapia contra el cáncer. En casos, lenalidomida se administra con una dosificación de aproximadamente 10-20 mg (por ejemplo, de 10-15 o 15-20 mg), por ejemplo, a diario. En casos, se administra rituximab en una dosificación de aproximadamente 350-550 mg/m2 (por ejemplo, de 350-375, 375-400, 400-425, 425-450, 450-475, o 475-500 mg/m2), por ejemplo, por vía intravenosa.
Los inmunomoduladores ejemplares incluyen, por ejemplo, afutuzumab (disponible de Roche®); pegfilgrastim (Neulasta®); lenalidomida (Cc -5013, Revlimid®); talidomida (Thalomid®), pomelidomida, actimid (CC4047); e IRX-2 (mezcla de citocinas humanas que incluyen interleucina 1, interleucina 2 e interferón y, CAS 951209-71-5, disponible en IRX Therapeutics).
Las antraciclinas a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, doxorrubicina (Adriamycin® y Rubex®); bleomicina (lenoxane®); daunorrubicina (clorhidrato de dauorrubicina, daunomicina y clorhidrato de rubidomicina, Cerubidine®); daunorrubicina liposomal (liposoma de citrato de daunorrubicina, DaunoXome®); mitoxantrona (DHAD, Novantrone®); epirrubicina (Ellence™); idarrubicina (Idamycin®, Idamicina PFS®); mitomicina C (Mutamycin®); geldanamicina; herbimicina; ravidomicina; y desacetilravidomicina.
Los alcaloides de la vinca a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, tartrato de vinorelbina (Navelbine®), Vincristina (Oncovin®) y Vindesina (Eldisine®)); vinblastina (también conocida como sulfato de vinblastina, vincaleucoblastina y VLB, Alkaban-AQ® y Velban®); y vinorelbina (Navelbine®).
Los inhibidores de proteosoma ejemplares incluyen bortezomib (Velcade®); carfilzomib (PX-171-007, (S)-4-Metil-W-((S)-1-(((S)-4-metil-1-(((R)-2-metiloxiran-2-il)-1-oxopentan-2-il)amino)-1-oxo-3-fenilpropan-2-il)-2-((S)-2-(2-morfolinoacetamido)-4-fenilbutanamido)-pentanamida); marizomib (NPI-0052); citrato de ixazomib (MLN-9708); delanzomib (CEP-18770); y 0-metil-W-[(2-metil-5-tiazolil)carbonil]-L-seril-0-metil-W-[(1S)-2-[(2R)-2-metil-2-oxiranilo]-2-oxo-1-(fenilmetil)etil]-L-serinamida (ONX-0912).
En casos, una célula que expresa CAR descrita aquí, opcionalmente en combinación con un inhibidor de cinasa, por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib, se administra a un sujeto en combinación con brentuximab. Brentuximab es un conjugado anticuerpo-fármaco de anticuerpo anti-CD30 y monometil auristatina E. En casos, el sujeto tiene linfoma de Hodgkin (HL), por ejemplo, HL recidivante o refractario. En casos, el sujeto comprende HL CD30+. En casos, el sujeto se ha sometido a un trasplante de células madre autólogo (ASCT, por sus siglas en inglés). En casos, el sujeto no se ha sometido a un ASCT. En casos, brentuximab se administra con una dosificación de aproximadamente 1-3 mg/kg (por ejemplo, de aproximadamente 1-1,5, 1,5-2, 2-2,5 o 2,5-3 mg/kg), por ejemplo, por vía intravenosa, por ejemplo, cada 3 semanas.
En casos, una célula que expresa CAR descrita aquí, opcionalmente en combinación con un inhibidor de cinasa, por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib, se administra a un sujeto en combinación con brentuximab y dacarbazina o en combinación con brentuximab y bendamustina. Dacarbazina es un agente alquilante con el nombre químico 5-(3,3-dimetil-1-triazenil)imidazol-4-carboxamida. Bendamustina es un agente alquilante con el nombre químico ácido 4-[5-[bis(2-cloroetil)amino]-1-metilbencimidazol-2-il]butanoico. En casos, el sujeto tiene linfoma de Hodgkin (HL). En casos, el sujeto no ha sido tratado previamente con una terapia contra el cáncer. En casos, el sujeto tiene una edad de al menos 60 años, por ejemplo, 60, 65, 70, 75, 80, 85 o mayor. En casos, dacarbazina se administra con una dosificación de aproximadamente 300-450 mg/m2 (por ejemplo, de aproximadamente 300-325, 325-350, 350-375, 375-400, 400-425, o 425-450 mg/m2), por ejemplo, por vía intravenosa. En casos, la bendamustina se administra en una dosis de alrededor de 75-125 mg/m2 (por ejemplo, 75-100 o 100-125 mg/m2, por ejemplo, alrededor de 90 mg/m2), por ejemplo, por vía intravenosa. En casos, brentuximab se administra con una dosificación de aproximadamente 1-3 mg/kg (por ejemplo, de aproximadamente 1-1,5, 1,5-2, 2-2,5 o 2,5-3 mg/kg), por ejemplo, por vía intravenosa, por ejemplo, cada 3 semanas.
En algunos casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con un inhibidor de CD20, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD20 (por ejemplo, un anticuerpo mono- o biespecífico anti-CD20) o un fragmento de este. Los anticuerpos anti-CD20 a modo de ejemplo incluyen, sin carácter limitante, rituximab, ofatumumab, ocrelizumab, veltuzumab, obinutuzumab, TRU-015 (Trubion Pharmaceuticals), ocaratuzumab y Pro131921 (Genentech). Remítase, por ejemplo, a Lim et al. Haematologica. 95,1(2010):135-43.
En algunos casos, el anticuerpo anti-CD20 comprende rituximab. Rituximab es un anticuerpo monoclonal IgG1 kappa quimérico de ratón/humano que se une a CD20 y provoca la citólisis de una célula que expresa CD20, por ejemplo, tal como se describe en www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/103705s5311lbl.pdf. En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con rituximab. En casos, el sujeto padece CLL o SLL.
En algunos casos, rituximab se administra por vía intravenosa, por ejemplo, como una infusión intravenosa. por ejemplo, cada infusión proporciona alrededor de 500-2000 mg (por ejemplo, alrededor de 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800, 800-850, 850-900, 900-950, 950-1000, 1000-1100, 1100-1200, 1200-1300, 1300-1400, 1400-1500, 1500-1600, 1600-1700, 1700-1800, 1800-1900, o 1900-2000 mg) de rituximab. En algunos casos, rituximab se administra a una dosis de 150 mg/m2 toa750 mg/m2, e.g., alrededor de 150-175 mg/m2, 175-200 mg/m2, 200-225 mg/m2, 225-250 mg/m2, 250-300 mg/m2, 300-325 mg/m2, 325-350 mg/m2, 350-375 mg/m2, 375-400 mg/m2, 400-425 mg/m2, 425-450 mg/m2, 450-475 mg/m2, 475-500 mg/m2, 500-525 mg/m2, 525-550 mg/m2, 550-575 mg/m2, 575-600 mg/m2, 600-625 mg/m2, 625-650 mg/m2, 650-675 mg/m2, o 675-700 mg/m2, en la que m2 indica el área de la superficie corporal del sujeto. En algunos casos, rituximab se administra con un intervalo posológico de al menos 4 días, por ejemplo, 4, 7, 14, 21, 28, 35 días o más. por ejemplo, rituximab se administra con un intervalo posológico de al menos 0,5 semanas, por ejemplo, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 semanas o más. En algunos casos, rituximab se administra en una dosis e intervalo posológico descritos en la presente durante un periodo de tiempo, por ejemplo, al menos 2 semanas, por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 semanas, o más. por ejemplo, rituximab se administra en una dosis e intervalo posológico descritos en la presente durante un total de al menos 4 dosis por ciclo de tratamiento (por ejemplo, al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o más dosis por ciclo de tratamiento).
En algunos casos, el anticuerpo anti-CD20 comprende ofatumumab. Ofatumumab es un anticuerpo monoclonal humano IgG1K anti-CD20 con un peso molecular de aproximadamente 149 kDa. por ejemplo, ofatumumab se genera utilizando un ratón transgénico y tecnología de hibridoma y se expresa y purifica a partir de una línea celular murina (NS0). Remítase, por ejemplo, a www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2009/125326lbl.pdf; y los números de Identificador de Ensayos Clínicos NCT01363128, NCT01515176, NCT01626352 y NCT01397591. En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con ofatumumab. En casos, el sujeto padece CLL o SLL.
En algunos casos, ofatumumab se administra como una infusión intravenosa. por ejemplo, cada infusión proporciona aproximadamente 150-3000 mg (por ejemplo, aproximadamente 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800, 800-850, 850-900, 900-950, 950-1000, 1000-1200, 1200-1400, 1400-1600, 1600-1800, 1800-2000, 2000-2200, 2200-2400, 2400-2600, 2600-2800, o 2800-3000 mg) de ofatumumab. En casos, ofatumumab se administra con una dosificación inicial de aproximadamente 300 mg, seguida de 2000 mg, por ejemplo, durante aproximadamente 11 dosis, por ejemplo, 24 semanas. En algunos casos, rituximab se administra en un intervalo posológico de al menos 4 días, por ejemplo, 4, 7, 14, 21, 28, 35 días o más. por ejemplo, el ofatumumab se administra en un intervalo de dosificación de al menos 1 semana, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 24, 26, 28, 20, 22, 24, 26, 28, 30 semanas o más. En algunos casos, el ofatumumab se administra a una dosis e intervalo de dosificación descritos aquí durante un período de tiempo, por ejemplo, al menos 1 semana, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 40, 50, 60 semanas o más, o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 meses o más, o 1, 2, 3, 4, 5 años o más. por ejemplo, el ofatumumab se administra a una dosis e intervalo de dosificación descritos aquí para un total de al menos 2 dosis por ciclo de tratamiento (por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20 o más dosis por ciclo de tratamiento).
En algunos casos, el anticuerpo anti-CD20 comprende ocrelizumab. Ocrelizumab es un anticuerpo monoclonal anti-CD20 humanizado, por ejemplo, tal como se describe en los N.os de Identificador de Ensayos Clínicos NCT00077870, NCT01412333, NCT00779220, NCT00673920, NCT01194570, y Kappos et al. Lancet. 19,378(2011):1779-87.
En algunos casos, el anticuerpo anti-CD20 comprende veltuzumab. Veltuzumab es un anticuerpo monoclonal humanizado contra CD20. Véase, por ejemplo, Clinical Trial Identifier No. NCT00547066, NCT00546793, NCT01101581, y Goldenberg et al. Leuk Lymphoma. 51(5)(2010):747-55.
En algunos casos, el anticuerpo anti-CD20 comprende GA101. GA101 (también denominado obinutuzumab o RO5072759) es un anticuerpo monoclonal anti-CD20 humanizado y glucomodificado. Remítase, por ejemplo, a Robak. Curr. Opin. Investig. Drugs. 10.6(2009):588-96; Números de Identificador de Ensayos Clínicos: NCT01995669, NCT01889797, NCT02229422 y NCT01414205; y www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2013/125486s000lbl.pdf.
En algunos casos, el anticuerpo anti-CD20 comprende AME-133v. AME-133v (también denominado LY2469298 u ocaratuzumab) es un anticuerpo monoclonal IgG1 humanizado contra CD20 con un aumento de la afinidad por el receptor FcYRIIIa y una potenciación de la actividad de tipo citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) en comparación con rituximab. Remítase, por ejemplo, a Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25; y Forero-Torres et al. Clin Cáncer Res. 18.5(2012):1395-403.
En algunos casos, el anticuerpo anti-CD20 comprende PRO131921. PRO131921 es un anticuerpo monoclonal anti-CD20 humanizado modificado para tener una mejor unión a FcYRIIIa y una potenciación de ADCC en comparación con rituximab. Remítase, por ejemplo, a Robak et al. BioDugs 25.1(2011):13-25; y Casulo et al. Clin Immunol. 154.1(2014):37-46; y el N.° de Identificador de Ensayos Clínicos NCT00452127.
En algunos casos, el anticuerpo anti-CD20 comprende TRU-015. TRU-015 es una proteína de fusión anti-CD20 derivada de dominios de un anticuerpo contra CD20. TRU-015 es más pequeña que los anticuerpos monoclonales, pero mantiene las funciones efectoras mediadas por Fc. Remítase, por ejemplo, a Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25. TRU-015 contiene un fragmento variable monocatenario (scFv) anti-CD20 ligado a los dominios CH2, CH3 y bisagra de IgG1 humana pero que carece de los dominios CH1 y Cl .
En algunos casos, un anticuerpo anti-CD20 descrito en la presente se conjuga o une de otra manera al agente terapéutico, por ejemplo, un agente quimioterápico (por ejemplo, citoxano, fludarabina, inhibidor de la histona desacetilasa, agente desmetilante, vacuna peptídica, antibiótico antitumoral, inhibidor de la tirosina cinasa, agente alquilante, agente antimitótico o antimicrotubular), agente antialérgico, agente contra las náuseas (o antiemético), analgésico o agente citoprotector descrito en la presente.
En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con un inhibidor del linfoma de linfocitos B 2 (BCL-2) (por ejemplo, venetoclax, también denominado ABT-199 o GDC-0199;) y/o rituximab. En casos, una célula que expresa CAR descrita en la presente se administra a un sujeto combinada con venetoclax y rituximab. Venetoclax es una molécula de bajo peso molecular que inhibe la proteína antiapoptótica BCL-2. La estructura de venetoclax (4-(4-{[2-(4-clorofenil)-4,4-dimetilciclohex-1-en-1-il]metil}piperazin-1-il)-W-({3-nitro-4-[(tetrahidro-2H-piran-4-ilmetil)amino]fenil}sulfonil)-2-(1H-pirrolo[2,3-£>]piridin-5-iloxi)benzamida) se muestra a continuación.
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En casos, el sujeto padece CLL. En casos, el sujeto padece CLL recurrente, por ejemplo, al sujeto se le ha administrado previamente una terapia contra el cáncer. En casos, venetoclax se administra con una dosificación de aproximadamente 15-600 mg (por ejemplo, de 15-20, 20-50, 50-75, 75-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, o 500-600 mg), por ejemplo, a diario. En casos, rituximab se administra con una dosificación de aproximadamente 350-550 mg/m2 (por ejemplo, de 350-375, 375-400, 400-425, 425-450, 450-475, o 475-500 mg/m2), por ejemplo, por vía intravenosa, por ejemplo, mensualmente.
En un caso, las células que expresan un CAR descritas aquí, opcionalmente en combinación con un inhibidor de cinasa, por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib, se administran a un sujeto en combinación con una molécula que disminuye la población de células Treg. En la técnica existe constancia de métodos que disminuyen el número de (por ejemplo, depletan) linfocitos Treg y estos incluyen, por ejemplo, la depleción de CD25, administración de ciclofosfamida, modulación de la función de GITR. Sin desear ceñirse a ninguna teoría, se cree que la reducción del número de linfocitos Treg en un sujeto antes de la aféresis o antes de la administración de una célula que expresa CAR descrita en la presente reduce el número de células inmunitarias no deseadas (por ejemplo, Treg) en el microentorno del tumor y reduce el riesgo de que el sujeto recaiga. En un caso, las células que expresan un CAR descritas aquí, opcionalmente en combinación con un inhibidor de cinasa, por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib, se administran a un sujeto en combinación con una molécula dirigida a GITR y/o que modula funciones de GITR, como agonista de GITR y/o un anticuerpo de GITR que agota las células T reguladoras (Tregs). En casos, las células que expresan un CAR descritas aquí, opcionalmente en combinación con un inhibidor de cinasa, por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib, se administran a un sujeto en combinación con ciclofosfamida. En un caso, las moléculas de unión a GITR y/o moléculas que modulan las funciones de GITR (por ejemplo, agonista de GITR y/o anticuerpos GITR que depletan Treg) se administran antes de la administración de la célula que expresa CAR. por ejemplo, en un caso, el agonista de GITR se puede administrar antes de la aféresis de las células. En casos, la ciclofosfamida se administra al sujeto antes de la administración (por ejemplo, infusión o reinfusión) de la célula que expresa CAR o antes de la aféresis de las células. En casos, la ciclofosfamida y un anticuerpo anti-GITR se administran al sujeto antes de la administración (por ejemplo, infusión o reinfusión) de la célula que expresa CAR o antes de la aféresis de las células. En un caso, el sujeto padece cáncer (por ejemplo, un cáncer sólido o un cáncer hematológico tal como ALL o CLL). En un caso, el sujeto padece CLL. En casos, el sujeto padece ALL. En casos, el sujeto tiene un tumor sólido, por ejemplo, un cáncer sólido descrito en la presente.
Los agonistas de GITR a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, proteínas de fusión con GITR y anticuerpos anti-GITR (por ejemplo, anticuerpos anti-GITR bivalentes) tales como, por ejemplo, una proteína de fusión con GITR descrita en la Patente de EE. UU. N.°: 6 111 090, Patente europea N.°: 090505B1, Patente de EE. UU. N.°: 8586 023, Publicación de PCT N.°s: WO 2010/003118 y 2011/090754, o un anticuerpo anti-GITR descrito, por ejemplo, en la Patente de EE. UU. N.°: 7025 962, Patente europea N.°: 1947183B1, Patente de EE. UU. N.°: 7812 135, Patente de EE. UU. N.°: 8388967, Patente de EE. UU. N.°: 8 591 886, Patente europea N.°: EP 1866339, Publicación de PCT N.°: WO 2011/028683, Publicación de PCT N.°: WO 2013/039954, Publicación de PCT N.°: W02005/007190, Publicación de PCT N.°: WO 2007/133822, Publicación de PCT N.°: WO2005/055808, Publicación de PCT N.°: WO 99/40196, Publicación de PCT N.°: WO 2001/03720, Publicación de PCT N.°: WO99/20758, Publicación de PCT N.°: WO2006/083289, Publicación de PCT N.°: WO 2005/115451, Patente de EE. UU. N.°: 7618632 y Publicación de PCT N.°: WO 2011/051726.
En un caso, la combinación de una célula que expresa CAR descrita aquí y un inhibidor de cinasa descrito aquí se administra a un sujeto en combinación con un agonista de GITR, por ejemplo, un agonista de GITR descrito aquí. En un caso, el agonista de GITR se administra antes que la célula que expresa CAR. por ejemplo, en un caso, el agonista de GITR se puede administrar antes de la aféresis de las células. En un caso, el sujeto tiene CLL.
También se pueden utilizar fármacos que inhiben ya sea la fosfatasa dependiente de calcio calcineurina (ciclosporina y FK506) o inhiben la quinasa p70S6 que es importante para la señalización inducida por el factor de crecimiento (rapamicina) (Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993). En un aspecto adicional, las composiciones de células de la presente invención pueden administrarse a un paciente junto con (por ejemplo, antes, simultáneamente o después) de un trasplante de médula ósea, terapia ablativa de células T usando agentes de quimioterapia tales como fludarabina, radiación de haz externo. terapia (XRT), ciclofosfamida y/o anticuerpos como OKT3 o CAMPATH. En un aspecto, las composiciones celulares de la presente invención se administran después de una terapia ablativa de linfocitos B tal como agentes que reaccionan con CD20, por ejemplo, Rituxan. por ejemplo, en una realización, los sujetos se pueden someter a un tratamiento estándar con una dosis elevada de quimioterapia seguida del trasplante de células madre de la sangre periférica. En ciertas realizaciones, después del trasplante, los sujetos reciben una infusión de las células inmunes expandidas de la presente descripción. En una realización adicional, las células expandidas se administran antes o después de la cirugía.
En una realización, al sujeto se le puede administrar un agente que reduce o mejora un efecto secundario asociado con la administración de una célula que expresa CAR. Los efectos secundarios asociados con la administración de una célula que expresa CAR incluyen, sin carácter limitante, CRS y la linfohistiocitosis hemofagocítica (HLH, por sus siglas en inglés), también denominada Síndrome de Activación de Macrófagos (MAS, por sus siglas en inglés). Los síntomas de CRS incluyen fiebre alta, náuseas, hipotensión transitoria, hipoxia y similares. Por consiguiente, los métodos descritos en esta memoria pueden comprender administrar una célula que expresa CAR descrita en esta memoria a un sujeto y administrar además un agente para gestionar niveles elevados de un factor soluble resultante del tratamiento con una célula que expresa CAR. En una realización, el factor soluble elevado en el sujeto es uno o más de IFN-y, TNFa, receptor de IL-2 e IL-6. Por lo tanto, un agente administrado para tratar este efecto secundario puede ser un agente que neutralice uno o más de estos factores solubles. Los ejemplos de agentes de este tipo incluyen, sin carácter limitante, un esteroide (por ejemplo, corticosteroide), un inhibidor de TNFa y un inhibidor de IL-6. Un ejemplo de un inhibidor de TNFa es una molécula de anticuerpo anti-TNFa tal como infliximab, adalimumab, certolizumab pegol y golimumab. Otro ejemplo de un inhibidor de TNFa es una proteína de fusión tal como entanercept. La molécula de bajo peso molecular inhibidora de TNFa incluye, sin carácter limitante, derivados de xantina (por ejemplo, pentoxifilina) y bupropión. Un ejemplo de un inhibidor de IL-6 es una molécula de anticuerpo anti-IL-6 o una molécula de anticuerpo anti-receptor de IL-6 como tocilizumab (toc), sarilumab, elsilimomab, CNTO 328, ALD518/BMS-945429, CNTO 136, CPSI -2364, CDP6038, VX30, ARGX-109, FE301 y FM101. En una realización, la molécula de anticuerpo anti-receptor de IL-6 es tocilizumab. Un ejemplo de un inhibidor basado en IL-1R es anakinra.
En una realización, al sujeto se le puede administrar un agente que potencie la actividad de una célula que expresa CAR. por ejemplo, en una realización, el agente puede ser un agente que inhibe una molécula inhibidora. Las moléculas inhibidoras, p. ej., muerte programada 1 (PD1), pueden, en algunas realizaciones, disminuir la capacidad de una célula que expresa CAR de organizar una respuesta efectora inmunitaria. Ejemplos de moléculas inhibidoras incluyen PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 y TGFR beta. La inhibición de una molécula inhibidora, por ejemplo, mediante inhibición a nivel de ADN, ARN o proteína, puede optimizar el rendimiento de una célula que expresa CAR. En las realizaciones, un ácido nucleico inhibidor, por ejemplo, un dsRNA, por ejemplo, un siRNA o shRNA, un clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), un transcription-activator like effector nuclease (TALEN), o un zinc finger endonuclease (ZFN), puede utilizarse para inhibir la expresión de una molécula inhibidora en la célula que expresa CAR. En una realización, el inhibidor es un ARNhc. En una realización, la molécula inhibidora es inhibida dentro de una célula que expresa CAR. En estas realizaciones, una molécula de ARNbc que inhibe la expresión de la molécula inhibidora está enlazada al ácido nucleico que codifica un componente, por ejemplo, todos los componentes del CAR. En una realización, el inhibidor de una señal inhibidora puede ser, p. ej., un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a una molécula inhibidora. por ejemplo, el agente puede ser un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a PD1, PD-L1, PD-L2 o CTLA4 (por ejemplo, ipilimumab (también denominado MDX-010 y MDX-101, y comercializado como Yervoy®; Bristol -Myers Squibb; Tremelimumab (anticuerpo monoclonal IgG2 disponible de Pfizer, conocido anteriormente como ticilimumab, CP-675,206). ). En una realización, el agente es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a TIM3. En una realización, el agente es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a LAG3. En una realización, el agente es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5).
PD1 es un miembro inhibidor de la familia de receptores CD28 que también incluye CD28, CTLA-4, ICOS y BTLA. PD1 se expresa en linfocitos B activados, linfocitos T y células mieloides (Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75). Se ha demostrado que dos ligandos para PD1, PD-L1 y PD-L2, regulan negativamente la activación de las células T al unirse a PD1 (Freeman et al. 2000 J Exp Med 192: 1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2: 261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32: 634-43). PD-L1 es abundante en los cánceres humanos (Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al.
2005 Cáncer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cáncer Res 10:5094). La supresión inmunitaria puede invertirse inhibiendo la interacción local de PD1 con PD-L1. Se conocen anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y otros inhibidores de PD1, PD-L1 y PD-L2, y pueden usarse en combinación con un CAR CD19 descrito aquí. por ejemplo, nivolumab (al que tambien se alude como BMS-936558 o MDX1106; Bristol-Myers Squibb) es un anticuerpo monoclonal IgG4 completamente humano que bloquea de manera específica PD1. Nivolumab (clon 5C4) y otros anticuerpos monoclonales humanos que se unen de manera específica a PD1 se divulgan en los documentos US 8008 449 y WO2006/121168. Pidilizumab (CT-011; Cure Tech) es un anticuerpo monoclonal de tipo IgG1k humanizado que se une a PD1. Pidilizumab y otros anticuerpos monoclonales anti-PD1 humanizados se divulgan en el documento WO2009/101611. El pembrolizumab (anteriormente conocido como lambrolizumab y también denominado Keytruda, MK03475; Merck) es un anticuerpo monoclonal IgG4 humanizado que se une a PD1. Pembrolizumab y otros anticuerpos anti-PD1 humanizados se divulgan en los documentos US 8354 509 y WO2009/114335. MEDI4736 (Medimmune) es un anticuerpo monoclonal humano que se une a PDL1 e inhibe la interacción del ligando con PD1. MDPL3280A (Genentech / Roche) es un anticuerpo monoclonal IgG1 optimizado para Fc humano que se une a PD-L1. MDPL3280A y otros anticuerpos monoclonales humanos contra PD-L1 se divulgan en la Patente de EE. UU. N.°: 7943743 y la Publicación de EE. UU. N.°: 20120039906. Otros agentes de unión anti-PD-L1 incluyen YW243.55.S70 (regiones variables de la cadena pesada y ligera se muestran en SEQ ID NOs 20 y 21 en el documento WO2010/077634) y MDX-1 105 (al que también se alude como BMS-936559, y, p. ej., agentes de unión anti-PD-L1 descritos en el documento WO2007/005874). AMP-224 (B7-DCIg; Amplimmune; por ejemplo, divulgado en el documento WO2010/027827 y WO2011/066342), es un receptor soluble de fusión PD-L2 Fc que bloquea la interacción entre PD1 y B7-H1. Otros anticuerpos anti-PD1 incluyen AMP 514 (Amplimmune), entre otros, por ejemplo, anticuerpos anti-PD1 divulgados en los documentos US 8 609 089, US 2010028330 y/o US 20120114649.
TIM3 (linfocito T inmunoglobulina-3) también regula de manera negativa la función de los linfocitos T, especialmente en linfocitos T1 citotóxicos CD8+ y linfocitos auxiliares T1 CD4+ que segregan IFN-g, y desempeña una función crucial en el agotamiento de los linfocitos T. La inhibición de la interacción entre TIM3 y sus ligandos, por ejemplo, galectina-9 (Gal9), fosfatidilserina (PS) y HMGB1, puede incrementar la respuesta inmunitaria. En la técnica se puede disponer de anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y otros inhibidores de TIM3 y sus ligandos, y estos se pueden utilizar combinados con un CAR CD19 descrito en la presente. por ejemplo, los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, moléculas de bajo peso molecular o inhibidores peptídicos que tienen como diana TIM3 se unen al dominio IgV de TIM3 para inhibir la interacción con sus ligandos. En los documentos WO2013/006490 y US20100247521 se divulgan anticuerpos y péptidos que inhiben TIM3. Otros anticuerpos anti-TIM3 incluyen versiones humanizadas de RMT3-23 (divulgado en Ngiow et al., 2011, Cancer Res, 71:3540-3551), y el clon 8B.2C12 (divulgado en Monney et al., 2002, Nature, 415:536-541). En el documento US20130156774 se divulgan anticuerpos biespecíficos que inhiben TIM3 y PD-1.
En otras realizaciones, el agente que potencia la actividad de una célula que expresa CAR es un inhibidor de CEACAM (por ejemplo, inhibidor de CEACa M-1, CEACAM-3, y/o CEACAM-5). En una realización, el inhibidor de CEACAM es una molécula de anticuerpo anti-CEACAM. Se describen anticuerpos anti-CEACAM-1 a modo de ejemplo en los documentos WO 2010/125571, WO 2013/082366 WO 2014/059251 y WO 2014/022332, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal 34B1, 26H7, y 5F4; o una forma recombinante de estos tal como se describe, por ejemplo, en los documentos US 2004/0047858, US 7 132 255 y WO 99/052552. En otras realizaciones, el anticuerpo anti-CEACAM se une a CEACAM-5 como se describe en, por ejemplo, Zheng et al. PLoS One. 2 de septiembre de 2010;5(9). pii: e12529 (DOI:10:1371/journal.pone.0021146), o presenta reactividad cruzada con CEa Ca M-1 y CEACAM-5 tal como se describe, por ejemplo, en los documentos WO 2013/054331 y US 2014/0271618.
Sin pretender imponer ninguna teoría, se cree que las moléculas de adhesión celular de antígeno carcinoembrionario (CEACAM), como CEACAM-1 y CEACAM-5, median, al menos en parte, la inhibición de una respuesta inmunitaria antitumoral (véase, por ejemplo, Markel et al. J Immunol. 2002 Mar 15;168(6):2803-10; Markel et al. J Immunol. 2006 Nov 1;177(9):6062-71; Markel et al. Immunology. 2009 Feb;126(2):186-200; Markel et al. Cancer Immunol Immunother. 2010 Feb;59(2):215-30; Ortenberg et al. Mol Cancer Ther. 2012 Jun;11(6):1300-10; Stern et al. J Immunol. 2005 Jun 1;174(11):6692-701; Zheng et al. PLoS One. 2 de septiembre de 2010;5(9). pii: e12529). por ejemplo, CEACAM-1 se ha descrito como un ligando heterófilo para TIM-3 y que desempeña un papel en la tolerancia y el agotamiento de las células T mediadas por TIM-3 (véase, por ejemplo, w O 2014/022332; Huang et al. (2014) Nature doi:10.1038/nature13848). En realizaciones, se ha demostrado que el co-bloqueo de CEACAM-1 y TIM-3 mejora una respuesta inmune antitumoral en modelos de cáncer colorrectal de xenoinjerto (véase, por ejemplo, WO 2014/022332; Huang, et al. (2014), supra). En otras realizaciones, el bloqueo conjunto de CEACAM-1 y PD-1 reduce la tolerancia de los linfocitos T tal como se describe, por ejemplo, en el documento WO 2014/059251. Por lo tanto, se pueden utilizar inhibidores de CEACAM con los otros inmunomoduladores descritos en la presente (por ejemplo, inhibidores anti-PD-1 y/o anti-TIM-3) para potenciar la respuesta inmunitaria contra un cáncer, por ejemplo, melanoma, un cáncer de pulmón (por ejemplo, NSCLC), un cáncer de vejiga, un cáncer de colon, un cáncer ovárico y otros cánceres tal como se describe en la presente.
LAG3 (gen-3 de activación de linfocitos o CD223) es una molécula de la superficie de las células expresada en linfocitos T y linfocitos B activados que ha mostrado que desempeña una función en el agotamiento de los linfocitos T CD8+. En la técnica se puede disponer de anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y otros inhibidores de LAG3 y sus ligandos, y estos se pueden utilizar combinados con un CAR CD19 descrito en la presente. por ejemplo, BMS-986016 (Bristol-Myers Squib) es un anticuerpo monoclonal que tiene como diana LAG3. IMP701 (Immutep) es un anticuerpo antagonista contra LAG3 e IMP731 (Immutep y GlaxoSmithKline) es un anticuerpo contra LAG3 depletante. Otros inhibidores de LAG3 incluyen IMP321 (Immutep), que es una proteína de fusión recombinante de una porción soluble de LAG3 e Ig que se une a moléculas MHC de clase II y activa las células presentadoras de antígeno (APC). Se divulgan otros anticuerpos, por ejemplo, en el documento WO2010/019570.
En algunas realizaciones, la terapia de CAR y el inhibidor de cinasa se administran en combinación con un agonista del receptor de tipo toll (TLR). El agonista de TLR puede ser un agonista de TLR9. En algunas realizaciones, el agonista de TLR es un oligodesoxinucleótido, por ejemplo, un oligodesoxinucleótido enriquecido con CG, por ejemplo, un oligodesoxinucleótido enriquecido con CG no metilado. Véase, por ejemplo, Sagiv-Barfi et al., “ Ibrutinib enhances the antitumor immune response induced by intratumoral injection of a TLR9 ligand in syngeneic mouse lymphoma model”. Blood. 2015 Feb 6. pii: blood-2014-08-593137. En algunas realizaciones, el agonista de TLR se administra en combinación con una célula NK que expresa CAR. Sin estar ligado a la teoría, el agonista de TLR puede promover la activación de células NK tales como células NK que expresan CAR. En algunas realizaciones, el agonista de TLR se administra mediante inyección, por ejemplo, inyección intrarumoral.
En algunas realizaciones, el agente que potencia la actividad de una célula que expresa CAR puede ser, por ejemplo, una proteína de fusión que comprende un primer dominio y un segundo dominio, donde el primer dominio es una molécula inhibidora, o fragmento de esta, y el segundo dominio es un polipéptido que está asociado con una señal positiva, por ejemplo, un polipéptido que comprende un dominio de señalización intracelular como se describe en la presente. En algunas realizaciones, el polipéptido que se asocia con una señal positiva puede incluir un dominio coestimulador de CD28, CD27, ICOS, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular de CD28, CD27 y/o ICOS, y/o un dominio de señalización primaria, por ejemplo, de CD3 zeta, por ejemplo, como se describe en la presente. En una realización, la proteína de fusión es expresada por la misma célula que expresó el CAR. En otra realización, la proteína de fusión es expresada por una célula, p. ej., una célula T que no expresa un CAR anti-CD19.
En una realización, el agente que potencia la actividad de una célula que expresa CAR descrita en la presente es miR-17-92.
En una realización, el agente que potencia la actividad de un CAR descrito aquí es una citocina. Las citocinas tienen importantes funciones relacionadas con la expansión, diferenciación, supervivencia y homeostasis de linfocitos T. Las citocinas que se pueden administrar al sujeto que recibe una célula que expresa CAR descrita en la presente incluyen: IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-18 e IL-21, o una combinación de estas. En realizaciones preferidas, la citocina administrada es IL-7, IL-15 o IL-21, o una combinación de las mismas. La citocina se puede administrar una vez al día o más de una vez al día, por ejemplo, dos veces al día, tres veces al día o cuatro veces al día. La citocina se puede administrar durante más de un día, por ejemplo, la citocina se administra durante 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas o 4 semanas. por ejemplo, la citocina se administra una vez al día durante 7 días.
En realizaciones, la citocina se administra en combinación con células que expresan CAR. La citocina se puede administrar de forma simultánea o concurrente con las células que expresan CAR, por ejemplo, administrarse el mismo día. La citocina se puede preparar en la misma composición farmacéutica que las células que expresan CAR, o se puede preparar en una composición farmacéutica separada. Alternativamente, la citocina se puede administrar poco después de la administración de las células T que expresan CAR, por ejemplo, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días después de la administración de las células T que expresan CAR. En realizaciones donde la citocina se administra en un régimen de dosificación que ocurre durante más de un día, el primer día del régimen de dosificación de citocinas puede ser el mismo día de la administración con las células que expresan CAR, o el primer día de la dosificación de citocinas puede ser 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días después de la administración de las células que expresan CAR. En una realización, el primer día, las células que expresan CAR se administran al sujeto, y el segundo día, se administra una citocina una vez al día durante los siguientes 7 días. En una realización preferida, la citocina a administrar en combinación con las células que expresan CAR es IL-7, IL-15 y/o IL-21.
En otras realizaciones, la citocina se administra un período de tiempo suficiente después de la administración de las células que expresan CAR, por ejemplo, al menos 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas, 10 semanas, 12 semanas, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses o 1 año o más después de la administración de células que expresan CAR. En una realización, la citocina se administra después de evaluar la respuesta del sujeto a las células que expresan CAR. por ejemplo, al sujeto se le administran células que expresan CAR de acuerdo con la dosificación y pautas descritas en la presente. La respuesta del sujeto a la terapia de c A r T se evalúa a las 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas, 10 semanas, 12 semanas, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses o 1 año o más después de la administración de células que expresan CAR, usando cualquiera de los métodos descritos aquí, incluida la inhibición del crecimiento tumoral, la reducción de las células tumorales circulantes o la regresión tumoral. A los sujetos que no muestran una respuesta suficiente a la terapia de CART se les puede administrar una citocina. La administración de la citocina al sujeto que tiene una respuesta subóptima a la terapia de CART mejora la eficacia de CART y/o la actividad antitumoral. En una realización preferida, la citocina administrada después de la administración de células que expresan CAR es IL-7.
Combinación con una dosis baja de un inhibidor de mTOR
En un caso, las células que expresan una molécula CAR, por ejemplo, una molécula CAR descrita en al presente, se administran en combinación con una dosis baja, de potenciación inmunitaria, de un inhibidor de mTOR.
En un caso, una dosis de un inhibidor de mTOR se asocia con, o proporciona, una inhibición de mTOR de al menos 5 pero no más del 90%, al menos 10 pero no más del 90%, al menos 15, pero no más del 90% , al menos 20 pero no más del 90%, al menos 30 pero no más del 90%, al menos 40 pero no más del 90%, al menos 50 pero no más del 90%, al menos 60 pero no más del 90% , o al menos el 70 pero no más del 90%.
En un caso, una dosis de un inhibidor de mTOR se asocia con, o proporciona, una inhibición de mTOR de al menos 5 pero no más del 80%, al menos 10 pero no más del 80%, al menos 15, pero no más del 80% , al menos 20 pero no más del 80%, al menos 30 pero no más del 80%, al menos 40 pero no más del 80%, al menos 50 pero no más del 80%, o al menos 60 pero no más del 80%.
En un caso, una dosis de un inhibidor de mTOR se asocia con, o proporciona, una inhibición de mTOR de al menos 5 pero no más del 70%, al menos 10 pero no más del 70%, al menos 15, pero no más del 70% , al menos 20 pero no más del 70%, al menos 30 pero no más del 70%, al menos 40 pero no más del 70%, o al menos 50 pero no más del 70%.
En un caso, una dosis de un inhibidor de mTOR se asocia con, o proporciona, una inhibición de mTOR de al menos 5 pero no más del 60%, al menos 10 pero no más del 60%, al menos 15, pero no más del 60% , al menos 20 pero no más del 60%, al menos 30 pero no más del 60%, o al menos 40 pero no más del 60%.
En un caso, una dosis de un inhibidor de mTOR se asocia con, o proporciona, una inhibición de mTOR de al menos 5 pero no más del 50%, al menos 10 pero no más del 50%, al menos 15, pero no más del 50% , al menos 20 pero no más del 50%, al menos 30 pero no más del 50%, o al menos 40 pero no más del 50%.
En un caso, una dosis de un inhibidor de mTOR se asocia con, o proporciona, una inhibición de mTOR de al menos 5 pero no más del 40%, al menos 10 pero no más del 40%, al menos 15, pero no más del 40% , al menos 20 pero no más del 40%, al menos 30 pero no más del 40%, o al menos 35 pero no más del 40%.
En un caso, una dosis de un inhibidor de mTOR se asocia con, o proporciona, una inhibición de mTOR de al menos 5 pero no más del 30%, al menos 10 pero no más del 30%, al menos 15, pero no más del 30% , al menos el 20 pero no más del 30%, o al menos el 25 pero no más del 30%.
En un caso, una dosis de un inhibidor de mTOR se asocia con, o proporciona, una inhibición de mTOR de al menos 1, 2, 3, 4 o 5 pero no más del 20%, al menos 1, 2, 3, 4 o 5 pero no más del 30%, al menos 1, 2, 3, 4 o 5, pero no más del 35, al menos 1,2, 3, 4 o 5 pero no más del 40%, o al menos 1, 2, 3, 4 o 5 pero no más del 45%.
En un caso, una dosis de un inhibidor de mTOR se asocia con, o proporciona, una inhibición de mTOR de al menos 1, 2, 3, 4 o 5 pero no más del 90%.
Como se discute aquí, el grado de inhibición de mTOR puede expresarse como el grado de inhibición de la cinasa P70 S6, por ejemplo, el grado de inhibición de mTOR puede determinarse por el nivel de disminución de la actividad de la cinasa P70 S6, por ejemplo, por la disminución de la fosforilación de un sustrato de cinasa P70 S6. El nivel de inhibición de mTOR puede evaluarse mediante un método descrito aquí, por ejemplo, mediante el ensayo de Boulay, o la medida de los niveles de S6 fosforilada mediante transferencia Western.
Inhibidores de MTOR ejemplares
Tal como se utiliza en la presente, la expresión «inhibidor de mTOR» se refiere a un compuesto o ligando, o una sal farmacéuticamente aceptable de este, que inhibe la cinasa mTOR en una célula. En una realización, un inhibidor de mTOR es un inhibidor alostérico. En una realización, un inhibidor de mTOR es un inhibidor catalítico.
Los inhibidores de mTOR alostéricos incluyen el compuesto tricíclico neutro rapamicina (sirolimus), compuestos relacionados con rapamicina, es decir, compuestos que tienen una similitud funcional y estructural con rapamicina que incluyen, por ejemplo, derivados de rapamicina, análogos de rapamicina (también denominados rapálogos) y otros compuestos macrólidos que inhiben la actividad de mTOR.
La rapamicina es un antibiótico macrólido conocido producido por Streptomyces hygroscopicus que tiene la estructura que se muestra en la Fórmula A.
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Remítase, por ejemplo, a McAlpine, J.B., et al., J. Antibiotics (1991) 44: 688; Schreiber, S.L., et al., J. Am. Chem. Soc. (1991) 113: 7433; Patente de e E. UU. N.° 3929992. Existen varios esquemas de numeración propuestos para rapamicina. Para evitar confusión, cuando se nombran análogos de rapamicina específicos en la presente, los nombres se proporcionan haciendo referencia a rapamicina utilizando el esquema de numeración de la fórmula A.
Los análogos de rapamicina útiles en la invención son, por ejemplo, análogos O-sutituidos en los que el grupo hidroxilo del anillo de ciclohexilo de rapamicina es reemplazado por o R1 en el cual R1 es hidroxialquilo, hidroxialcoxialquilo, acilaminoalquilo o aminoalquilo; por ejemplo, RAD001, también conocido como everolimus como se describe en los documentos US 5 665 772 y WO94/09010. Otros análogos de rapamicina adecuados incluyen los sustituidos en la posición 26 o 28. El análogo de rapamicina puede ser un epímero de un análogo mencionado anteriormente, particularmente un epímero de un análogo sustituido en la posición 40, 28 o 26, y opcionalmente puede hidrogenarse adicionalmente, por ejemplo, como se describe en los documentos US 6.015.815, WO95/14023 y WO99/15530, por ejemplo, ABT578, también conocido como zotarolimus, o un análogo de rapamicina descrito en los documentos US 7.091.213, WO98/02441 y WO01/14387, por ejemplo, AP23573, también conocido como ridaforolimus.
Ejemplos de análogos de rapamicina adecuados para uso en la presente invención de US 5,665,772 incluyen, pero no se limitan a, 40-O-bencil-rapamicina, 40-O-(4'-hidroximetil)bencil-rapamicina, 40-O-[4'-(1,2-dihidroxietil)]bencil-rapamicina, 40-O-alil-rapamicina, 40-O-[3’-(2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4(S)-il)-prop-2'-en-1'-il]-rapamicina, (2'E,4'S)-40-O-(4',5'-dihidroxipent-2'-en-1'-il)-rapamicina, 40-O-(2-hidroxi)etoxicarbonilmetil-rapamicina, 40-O-(2-hidroxi)etil-rapamicina, 40-O-(3-hidroxi)propil-rapamicina, 40-O-(6-hidroxi)hexil-rapamicina, 40-O-[2-(2-hidroxi)etoxi]etil-rapamicina, 40-O-[(3S)-2,2-dimetildioxolan-3-il]metil-rapamicina, 40-O-[(2S)-2,3-dihidroxiprop-1-il]-rapamicina, 40-O-(2-acetoxi)etil-rapamicina, 40-O-(2-nicotinoiloxi)etil-rapamicina, 40-O-[2-(N-morfolino)acetoxi]etil-rapamicina, 40-O-(2-N-imidazolilacetoxi)etil-rapamicina, 40-O-[2-(N-metil-N'-piperazinil)acetoxi]etil-rapamicina, 39-O-desmetil-39,40-O,O-etileno-rapamicina, (26R)-26-dihidro-40-O-(2-hidroxi)etil-rapamicina, 40-O-(2-aminoetil)-rapamicina, 40-O-(2-acetaminoetil)-rapamicina, 40-O-(2-nicotinamidoetil)-rapamicina, 40-O-(2-(N-metil-imidazo-2'-ilcarbetoxamido)etil)-rapamicina, 40-O-(2-etoxicarbonilaminoetil)-rapamicina, 40-O-(2-tolilsulfonamidoetil)-rapamicina y 40-O-[2-(4',5'-dicarboetoxi-1',2',3'-triazol-1'-il)-etil]-rapamicina.
Otros análogos de rapamicina útiles en la presente invención son análogos donde el grupo hidroxilo del anillo ciclohexilo de rapamicina y/o el grupo hidroxi en la posición 28 es reemplazado por un grupo hidroxiéster se describen, por ejemplo, análogos de rapamicina en el documento US RE44768, por ejemplo, temsirolimus.
Otros análogos de rapamicina útiles en la presente invención incluyen aquellos donde el grupo metoxi en la posición 16 es reemplazado por otro sustituyente, preferentemente alquiniloxi, bencilo, ortometoxibencilo o clorobencilo (opcionalmente hidroxi-sustituido) y/o donde el grupo mextoxi en la posición 39 se elimina junto con el carbono 39 de manera que el anillo ciclohexilo de la rapamicina se convierte en un anillo ciclopentilo que carece del grupo metioxi de la posición 39; por ejemplo, como se describe en los documentos WO95/16691 y WO96/41807. Los análogos se pueden modificar adicionalmente de modo que el hidroxi en la posición 40 de rapamicina esté alquilado y/o el carbonilo-32 esté reducido.
Los análogos de rapamicina del documento WO95/16691 incluyen, sin carácter limitante, 16-desmetoxi-16-(pent-2-inil)oxirrapamicina, 16-desmetoxi-16-(but-2-inil)oxirrapamicina, 16-desmtoxi-16-(propargil)oxirrapamicina, 16-desmetoxi-16-(4-hidroxibut-2-inil)oxirrapamicina, 16-desmetoxi-16-benciloxi-40-0(2-hidroxietil)rapamicina, 16-desmetoxi-16-benciloxirrapamicina, 16-desmetoxi-16-orfo-metoxibencilrapamicina, 16-desmetoxi-40-0-(2-metoxietil)-16-pent-2-inil)oxirrapamicina, 39-desmetoxi-40-desoxi-39-formil-42-nor-rapamicina, 39-desmetoxi-40-desoxi-39-hidroximetil-42-norrapamicina, 39-desmetoxi-40-desoxi-39-carboxi-42-norrapamicina, 39-desmetoxi-40-desoxi-39-(4-metilpiperazin-1-il)carbonil-42-norrapamicina, 39-desmetoxi-40-desoxi-39-(morfolin-4-il)carbonil-42-norrapamicina, 39-desmetoxi-40-desoxi-39-[N-metil, W-(2-piridin-2-iletil)]carbamoil-42-norrapamicina y 39-desmetoxi-40-desoxi-39-(ptoluenosulfonilhidrazonometil)-42-norrapamicina.
Análogos de rapamicina de WO96/41807 incluyen, pero no se limitan a, 32-desoxo-rapamicina, 16-O-pent-2-inil-32-desoxo-rapamicina, 16-O-pent-2-inil-32-deoxo-40-O-(2-hidroxi-etil)-rapamicina, 16-O-pent-2-inil-32-(S)-dibidro-40-O-(2-hidroxietil)-rapamicina, 32(S)-dihidro-40-O-(2-metoxi)etil-rapamicina y 32(S)-dihidro-40-O-(2-hidroxietil)-rapamicina.
Otro análogo de rapamicina adecuado es umirolimus como se describe en el documento US2005/0101624.
RAD001, conocido de otra forma como everolimus (Afinitor®), tiene el nombre químico (1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-1,18-dihidroxi-12-{(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-(2-hidroxietoxi)-3-metoxiciclohexil]-1-metiletil}-19,30-dimetoxi-15,17,21,23,29,35-hexametil-11,36-dioxa-4-azatriciclo[30.3.1,04,9]hexatriaconta-16,24,26,28-tetraeno-2,3,10,14,20-pentaona.
Otros ejemplos de inhibidores de mTOR alostéricos incluyen sirolimus (rapamicina, AY-22989), 40-[3-hidroxi-2-(hidroximetil)-2-metilpropanoato]rapamicina (también denominado temsirolimus o CCI-779) y ridaforolimus (AP-23573/MK-8669). Otros ejemplos de inhibidores de mTOR alostéricos incluyen zotarolimus (ABT578) y umirolimus.
Como alternativa o de manera adicional, se ha observado que los inhibidores de mTOR competitivos con ATP, catalíticos tienen como diana directamente el dominio cinasa de mTOR y tienen como diana tanto mTORci como mTORC2. Existen inhibidores de mTORCI más eficaces que estos inhibidores de mTOR alostéricos como rapamicina, debido a que modulan respuestas de mTORCI resistentes a rapamicina tales como la fosforilación de 4EBP1-T37/46 y traducción dependiente de la caperuza.
Los inhibidores catalíticos incluyen: BEZ235 o 2-metil-2-[4-(3-metil-2-oxo-8-quinolin-3-il-2,3-dihidro-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il)-fenil]-propionitrilo, o la forma de sal monotosilato. la síntesis de BEZ235 se describe en WO2006/122806; CCG168 (también conocido como AZD-8055, Chresta, C.M., et al., Cancer Res, 2010, 70 (1), 288-298) que tiene el nombre químico {5-[2,4-bis-((S)-3-metil-morfolin-4-il)-pirido[2,3d]pirimidin-7-il]-2-metoxi-fenil}-metanol; 3-[2,4-bis[(3S)-3-metilmorfolin-4-il]pirido[2,3-d]pirimidin-7-il]-N-metilbenzamida (WO091040l9); 3-(2-aminobenzo[d]oxazol-5-il)-1-isopropil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-amina (WO10051043 y WO2013023184); AN-(3-(N-(3-((3,5-dimetoxifenil)amino)quinoxalin-2-il)sulfamoil)fenil)-3-metoxi-4-metilbenzamida (WO07044729 y wOl2006552); p K|-587 (Venkatesan, A.M., J. Med. Chem., 2010, 53, 2636-2645) que tiene el nombre químico 1-[4-[4-(dimetilamino)piperidin-1-carbonil]fenil]-3-[4-(4,6-dimorfolino-1,3,5-triazin-2-il)fenil]urea; GSK-2126458 (a Cs Med. Chem. Lett., 2010, 1, 39-43) que tiene el nombre químico 2,4-difluoro-N-{2-metoxi-5-[4-(4-piridazinil)-6-quinolinil]-3-piridinil}bencenosulfonamida; 5-(9-isopropil-8-metil-2-morfolino-9H-purin-6-il)pirimidin-2-amina (WO10114484); (E)-N-(8-(6-amino-5-(trifluorometil)piridin-3-il)-1-(6-(2-cianopropan-2-il)piridin-3-il)-3-metil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-2 (3H)-iliden)cianamida (WO12007926).
Ejemplos adicionales de inhibidores de mTOR catalíticos incluyen 8-(6-metoxipiridin-3-il)-3-metil-1-(4-piperazin-1-il-3-trifluorometilfenil)-1,3-dihidroimidazo[4,5-c]quinolin-2-ona (WO2006/122806) y Ku-0063794 (Garcia-Martinez JM, et al.,Biochem J., 2009, 421(1), 29-42. Ku-0063794 es un inhibidor específico de la diana en mamíferos de rapamicina (mTOR). WYE-354 es otro ejemplo de un inhibidor de mTOR catalítico (Yu K, et al. (2009). Biochemical, Cellular, and In vivo Activity of Novel ATP-Competitive and Selective Inhibitors of the Mammalian Target of Rapamycin. Cancer Res.
69(15): 6232-6240).
Los inhibidores de mTOR útiles de acuerdo con la presente invención también incluyen profármacos, derivados, sales farmacéuticamente aceptables o análogos de estos de cualquiera de los anteriores.
Los inhibidores de mTOR, tales como RAD001, se pueden formular para el suministro basándose en métodos muy consolidados en la técnica en función de las dosificaciones particulares descritas en la presente. En paticular, la Patente de EE. UU. 6004 973 proporciona ejemplos de formulaciones que se pueden utilizar con los inhibidores de mTOR descritos en la presente.
Evaluación de la inhibición de mTOR
mTOR fosforila la cinasa P70 S6, activando así la cinasa P70 S6 y permitiéndole fosforilar su sustrato. El grado de inhibición de mTOR puede expresarse como el grado de inhibición de la cinasa P70 S6, por ejemplo, el grado de inhibición de mTOR puede determinarse por el nivel de disminución de la actividad de la cinasa P70 S6, por ejemplo, por la disminución de la fosforilación de un sustrato de cinasa P70 S6. Se puede determinar el nivel de inhibición de mTOR, midiendo la actividad de la cinasa P70 S6 (la capacidad de la cinasa P70 S6 para fosforilar un sustrato), en ausencia de inhibidor, por ejemplo, antes de la administración del inhibidor y en presencia de inhibidor, o después de la administración de inhibidor. El nivel de inhibición de la cinasa P70 S6 da el nivel de inhibición de mTOR. Por tanto, si la cinasa P70 S6 se inhibe en un 40%, la actividad de mTOR, medida por la actividad de la cinasa P70 S6, se inhibe en un 40%. El grado o nivel de inhibición al que se hace referencia aquí es el nivel medio de inhibición durante el intervalo de dosificación. A modo de ejemplo, si el inhibidor se administra una vez por semana, el nivel de inhibición viene dado por el nivel medio de inhibición durante ese intervalo, es decir, una semana.
Boulay et al., Cancer Res, 2004, 64: 252-61, enseña un ensayo que puede usarse para evaluar el nivel de inhibición de mTOR (denominado aquí ensayo de Boulay). En un caso, el ensayo se basa en la medida de la actividad cinasa P70 S6 de muestras biológicas antes y después de la administración de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, RAD001. Se pueden tomar muestras en momentos preseleccionados después del tratamiento con un inhibidor de mTOR, por ejemplo, 24, 48 y 72 horas después del tratamiento. Pueden usarse muestras biológicas, por ejemplo, de piel o células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Se preparan extractos de proteínas totales a partir de las muestras. La cinasa P70 S6 se aísla de los extractos de proteínas mediante inmunoprecipitación usando un anticuerpo que reconoce específicamente la cinasa P70 S6. La actividad de la cinasa P70 S6 aislada se puede medir en un ensayo de cinasa in vitro. La cinasa aislada se puede incubar con sustratos de la subunidad ribosómica 40S (que es un sustrato endógeno de la cinasa P70 S6) y gamma-32P en condiciones que permitan la fosforilación del sustrato. Luego, la mezcla de reacción se puede resolver en un gel SDS-PAGE, y la señal de 32P se puede analizar usando un PhosphorImager. Una señal de 32P correspondiente al tamaño de la subunidad ribosómica 40S indica sustrato fosforilado y la actividad de la cinasa P70 S6. Los aumentos y disminuciones en la actividad de la cinasa se pueden calcular cuantificando el área y la intensidad de la señal de 32P del sustrato fosforilado (por ejemplo, usando ImageQuant, Molecular Dynamics), asignando valores unitarios arbitrarios a la señal cuantificada y comparando los valores después de la administración con los valores antes de la administración o con un valor de referencia. por ejemplo, el porcentaje de inhibición de la actividad de cinasa se puede calcular con la siguiente fórmula: 1-(valor obtenido después de la administración/valor obtenido antes de la administración) X 100. Como se describió anteriormente, el grado o nivel de inhibición mencionado aquí es el nivel promedio de inhibición durante el intervalo de dosificación.
Los métodos para la evaluación de la actividad de cinasa, por ejemplo, la actividad de cinasa P70 S6, también se proporcionan en US 7.727.950.
El nivel de inhibición de mTOR también puede evaluarse mediante un cambio en la proporción de células T PD1 negativas a PD1 positivas. Las células T de sangre periférica se pueden identificar como p D1 negativas o positivas mediante métodos conocidos en la técnica.
Inhibidores de mTOR de dosis baja
Los métodos descritos aquí usan inhibidores de mTOR de dosis bajas, potenciadoras del sistema inmunológico, dosis de inhibidores de mTOR, por ejemplo, inhibidores de mTOR alostéricos, incluidos rapalogs tales como RAD001. Por el contrario, los niveles de inhibidor que inhiben total o casi totalmente la vía de mTOR son inmunosupresores y se usan, por ejemplo, para prevenir el rechazo de trasplantes de órganos. Además, altas dosis de rapalogs que inhiben completamente mTOR también inhiben el crecimiento de células tumorales y se usan para tratar una variedad de cánceres (véase, por ejemplo, Antineoplastic effects of mammalian target of rapamycine inhibitors. Salvadori M. World J Transplant.
2012 Oct 24;2(5):74-83; Current and Future Treatment Strategies for Patients with Advanced Hepatocellular Carcinoma: Role of mTOR Inhibition. Finn RS. Liver Cancer. 2012 Nov;1(3-4):247-256; Emerging Signaling Pathways in Hepatocellular Carcinoma. Moeini A, Cornella H, Villanueva A. Liver Cancer. 2012 Sep;1(2):83-93; Targeted cancer therapy - Are the days of systemic chemotherapy numbered? Joo WD, Visintin I, Mor G. Maturitas. 2013 Sep 20.; Role of natural and adaptive immunity in renal cell carcinoma response to VEGFR-TKIs and mTOR inhibitor. Santoni M, Berardi R, Amantini C, Burattini L, Santini D, Santoni G, Cascinu S. Int J Cancer. 2013 Oct 2).
La presente invención se refiere, al menos en parte, al sorprendente hallazgo de que las dosis de inhibidores de mTOR muy por debajo de las utilizadas en los entornos clínicos actuales tuvieron un efecto superior en el aumento de la respuesta inmune en un sujeto y el aumento de la proporción de células T negativas para PD-1/células T positivas para PD-1. Fue sorprendente que dosis bajas de inhibidores de mTOR, que solo producían una inhibición parcial de la actividad de mTOR, fueran capaces de mejorar eficazmente las respuestas inmunitarias en seres humanos y aumentar la proporción de células T PD-1 negativas/células T PD-1 positivas.
Alternativamente, o además, sin desear estar ligado a ninguna teoría, se cree que una dosis baja, potenciadora del sistema inmunológico, de un inhibidor de mTOR puede aumentar el número de células T vírgenes, por ejemplo, al menos transitoriamente, por ejemplo, en comparación con un sujeto no tratado. Alternativamente o adicionalmente, de nuevo, sin desear estar ligado a la teoría, se cree que el tratamiento con un inhibidor de mTOR después de una cantidad de tiempo suficiente o una dosificación suficiente da como resultado uno o más de los siguientes:
un incremento en la expresión de uno o más de los siguientes marcadores: CD62Lelevado, CD127elevado, CD27+ y BCL2, por ejemplo, en los linfocitos T de memoria, por ejemplo, precursores de los linfocitos T de memoria;
un descenso en la expresión de KLRG1, por ejemplo, en los linfocitos T de memoria, por ejemplo, precursores de los linfocitos T de memoria; y
un incremento en el número de precursores de los linfocitos T de memoria, por ejemplo, células con cualquiera de las siguientes características o una combinación de estas: incremento de CD62Lelevado, incremento de CD127elevado, incremento de CD27+, disminución de KLRG1 e incremento de BCL2;
y en el que ocurre cualquiera de los cambios descritos anteriormente, por ejemplo, al menos transitoriamente, por ejemplo, en comparación con un sujeto no tratado (Araki, K et al. (2009) Nature 460: 108-112). Los precursores de las células T de memoria son células T de memoria que se encuentran en las primeras etapas del programa de diferenciación. por ejemplo, las células T de memoria tienen una o más de las siguientes características: aumento de CD62Lelevado, aumento de CD127elevado, aumento de CD27+, disminución de KLRG1 y/o aumento de BCL2.
En una realización, la invención se refiere a una composición, o forma de dosificación, de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor de mTOR alostérico, por ejemplo, un rapalog, rapamicina o RAD001, o un inhibidor de mTOR catalítico, que, cuando se administra en un régimen de dosificación seleccionado, por ejemplo, una vez al día o una vez a la semana, está asociado con: un nivel de inhibición de mTOR que no está asociado con una inmunosupresión completa o significativa, pero que está asociado con una mejora de la respuesta inmunitaria.
Se puede proporcionar un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor de mTOR alostérico, por ejemplo, un rapalog, rapamicina o RAD001, o un inhibidor de mTOR catalítico, en una formulación de liberación sostenida. Cualquiera de las composiciones o formas de dosificación unitarias descritas aquí se puede proporcionar en una formulación de liberación sostenida. En algunas realizaciones, una formulación de liberación sostenida tendrá una menor biodisponibilidad que una formulación de liberación inmediata. por ejemplo, en realizaciones, para lograr un efecto terapéutico similar de una formulación de liberación inmediata, una formulación de liberación sostenida tendrá de alrededor de 2 a alrededor de 5, alrededor de 2,5 a alrededor de 3,5, o alrededor de 3 veces la cantidad de inhibidor proporcionada en la formulación de liberación inmediata.
En una realización, se proporcionan formas de liberación inmediata, por ejemplo, de RAD001, que se usan típicamente para una administración por semana, que tienen de 0,1 a 20, 0,5 a 10, 2,5 a 7,5, 3 a 6 o alrededor de 5 mg por forma de dosificación unitaria. Para administraciones una vez a la semana, estas formulaciones de liberación inmediata corresponden a formas de liberación sostenida, que tienen, respectivamente, 0,3 a 60, 1,5 a 30, 7,5 a 22,5, 9 a 18 o alrededor de 15 mg de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor de mTOR alostérico, por ejemplo, rapamicina o RAD001. En las realizaciones, ambas formas se administran una vez a la semana.
En una realización, las formas de liberación inmediata, por ejemplo, de RAD001, que se usan típicamente para una administración por día, tienen de 0,005 a 1,5, 0,01 a 1,5, 0,1 a 1,5, 0,2 a 1,5, 0,3 a 1,5, 0,4 a 1,5, 0,5 a 1,5, Se proporcionan 0,6 a 1,5, 0,7 a 1,5, 0,8 a 1,5, 1,0 a 1,5, 0,3 a 0,6 o alrededor de 0,5 mg por forma de dosificación unitaria. Para administraciones una vez al día, estas formas de liberación inmediata corresponden a formas de liberación sostenida, que tienen, respectivamente, 0,015 a 4,5, 0,03 a 4,5, 0,3 a 4,5, 0,6 a 4,5, 0,9 a 4,5, 1,2 a 4,5, 1,5 a 4,5, 1,8 a 4,5, 2,1 a 4,5, 2,4 a 4,5, 3,0 a 4,5, 0,9 a 1,8 o alrededor de 1,5 mg de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor de mTOR alostérico, por ejemplo, rapamicina o RAD001. Para administraciones una vez por semana, estas formas de liberación inmediata corresponden a formas de liberación sostenida, que tienen, respectivamente, 0,1 a 30, 0,2 a 30, 2 a 30, 4 a 30, 6 a 30, 8 a 30, 10 a 30, 1,2 a 30, 14 a 30, 16 a 30, 20 a 30, 6 a 12 o alrededor de 10 mg de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor de mTOR alostérico, por ejemplo, rapamicina o RAD001.
En una realización, se proporcionan formas de liberación inmediata, por ejemplo, de RAD001, que se usan típicamente para una administración por día, que tienen de 0,01 a 1,0 mg por forma de dosificación unitaria. Para administraciones de una vez al día, estas formas de liberación inmediata corresponden a formas de liberación sostenida, que tienen, respectivamente, de 0,03 a 3 mg de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor de mTOR alostérico, por ejemplo, rapamicina o RAD001. Para administraciones una vez por semana, estas formas de liberación inmediata corresponden a formas de liberación sostenida, que tienen, respectivamente, de 0,2 a 20 mg de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor de mTOR alostérico, por ejemplo, rapamicina o RAD001.
En una realización, se proporcionan formas de liberación inmediata, por ejemplo, de RAD001, que se usan típicamente para una administración por semana, que tienen de 0,5 a 5,0 mg por forma de dosificación unitaria. Para administraciones una vez por semana, estas formas de liberación inmediata corresponden a formas de liberación sostenida, que tienen, respectivamente, de 1,5 a 15 mg de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor de mTOR alostérico, por ejemplo, rapamicina o RAD001.
Como se describió anteriormente, una diana de la ruta de mTOR es la cinasa P70 S6. Por tanto, las dosis de inhibidores de mTOR que son útiles en los métodos y composiciones descritos aquí son aquellas que son suficientes para lograr una inhibición no mayor del 80% de la actividad de la cinasa P70 S6 con respecto a la actividad de la cinasa P70 S6 en ausencia de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, medido mediante un ensayo descrito aquí, por ejemplo, el ensayo de Boulay. En un aspecto adicional, la presente descripción proporciona una cantidad de un inhibidor de mTOR suficiente para lograr no más del 38% de inhibición de la actividad de la cinasa P70 S6 con respecto a la actividad de la cinasa P70 S6 en ausencia de un inhibidor de mTOR.
En un aspecto, la dosis de inhibidor de mTOR útil en los métodos y composiciones de la invención es suficiente para lograr, por ejemplo, cuando se administra a un sujeto humano, 90 /- 5% (es decir, 85-95%), 89+/-5 %, 88+/-5 %, 87+/-5 %, 86+/-5 %, 85+/-5 %, 84+/-5 %, 83+/-5 %, 82+/-5 %, 81+/-5 %, 80+/-5 %, 79+/-5 %, 78+/-5 %, 77+/-5 %, 76+/-5 %, 75+/-5 %, 74+/-5 %, 73+/-5 %, 72 /-5%, 71 /-5%, 70 /-5%, 69 /-5%, 68 /-5%, 67 /-5%, 66 /-5%, 65 /-5%, 64 /-5%, 63 /-5%, 62 /-5%, 61 /-5%, 60 /-5%, 59 /-5%, 58 /-5%, 57 /-5%, 56 /-5%, 55 /-5%, 54 /-5%, 54 /-5%, 53 /-5%, 52 /-5%, 51 /-5%, 50 /-5%, 49 /-5%, 48 /-5%, 47 /-5%, 46 /-5%, 45 /-5%, 44 /-5%, 43 /-5%, 42 /-5%, 41 /-5%, 40 /-5%, 39 /-5%, 38 /-5%, 37 /-5%, 36 /-5%, 35 /-5%, 34 /-5%, 33 /-5%, 32 /-5%, 31 /-5%, 30 /-5%, 29 /-5%, 28 /-5%, 27 /-5%, 26 /-5%, 25 /-5%, 24 /-5%, 23 /-5%, 22 /-5%, 21 /-5%, 20 /-5%, 19 /-5%, 18 /-5%, 17 /-5%, 16 /-5%, 15 /-5%, 14 /-5%, 13 /-5%, 12 /-5%, 11 /-5%, o 10 /-5%, inhibición de la actividad de cinasa P70 S6, por ejemplo, medida mediante un ensayo descrito aquí, por ejemplo, el ensayo de Boulay.
La actividad de cinasa P70 S6 en un sujeto puede medirse usando métodos conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, de acuerdo con los métodos descritos en la patente U.S. 7.727.950, mediante análisis de inmunotransferencia de los niveles de fosfoP70 S6K y/o niveles de fosfoP70 S6 o mediante ensayos de actividad de cinasa in vitro.
Como se usa aquí, el término “alrededor de” en referencia a una dosis de inhibidor de mTOR se refiere a una variabilidad de hasta /-10% en la cantidad de inhibidor de mTOR, pero puede incluir ninguna variabilidad en torno a la dosis indicada.
En algunas realizaciones, la invención comprende administrar a un sujeto un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor alostérico, por ejemplo, RAD001, a una dosis dentro de un nivel mínimo diana. En algunas realizaciones, el nivel mínimo es significativamente más bajo que los niveles mínimos asociados con los regímenes de dosificación usados en pacientes con cáncer y trasplantes de órganos. En una realización, el inhibidor de mTOR, por ejemplo, RAD001 o rapamicina, se administra para dar como resultado un nivel mínimo que es menos de ^ , 1/4, 1/10 o 1/20 del nivel mínimo que da como resultado inmunosupresión o un efecto anticanceroso. En una realización, el inhibidor de mTOR, por ejemplo, RAD001 o rapamicina, se administra para dar como resultado un nivel mínimo que es menos de ^ , 1/4, 1/10 o 1/20 del nivel mínimo proporcionado en el prospecto aprobado por la FDA para uso en inmunosupresión o indicaciones contra el cáncer.
En una realización, un método descrito aquí comprende administrar a un sujeto un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor alostérico, por ejemplo, RAD001, a una dosis que proporciona un nivel mínimo diana de 0,1 a 10 ng/ml, 0,1 a 5 ng/ml, 0,1 a 3 ng/ml, 0,1 a 2 ng/ml, o 0,1 a 1 ng/ml.
En una realización, un método descrito aquí comprende administrar a un sujeto un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor alostérico, por ejemplo, RAD001, a una dosis que proporciona un nivel mínimo diana de 0,2 a 10 ng/ml, 0,2 a 5 ng/ml, 0,2 a 3 ng/ml, 0,2 a 2 ng/ml o 0,2 a 1 ng/ml.
En una realización, un método descrito aquí comprende administrar a un sujeto un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor alostérico, por ejemplo, RAD001, en una dosis que proporciona un nivel mínimo diana de 0,3 a 10 ng/ml, 0,3 a 5 ng/ml, 0,3 a 3 ng/ml, 0,3 a 2 ng/ml o 0,3 a 1 ng/ml.
En una realización, un método descrito aquí comprende administrar a un sujeto un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor alostérico, por ejemplo, RAD001, a una dosis que proporciona un nivel mínimo diana de 0,4 a 10 ng/ml, 0,4 a 5 ng/ml, 0,4 a 3 ng/ml, 0,4 a 2 ng/ml o 0,4 a 1 ng/ml.
En una realización, un método descrito aquí comprende administrar a un sujeto un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor alostérico, por ejemplo, RAD001, en una dosis que proporciona un nivel mínimo diana de 0,5 a 10 ng/ml, 0,5 a 5 ng/ml, 0,5 a 3 ng/ml, 0,5 a 2 ng/ml o 0,5 a 1 ng/ml.
En una realización, un método descrito aquí comprende administrar a un sujeto un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor alostérico, por ejemplo, RAD001, a una dosis que proporciona un nivel mínimo diana de 1 a 10 ng/ml, 1 a 5 ng/ml, 1 a 3 ng/ml o 1 a 2 ng/ml.
Como se usa aquí, el término “nivel mínimo” se refiere a la concentración de un fármaco en el plasma justo antes de la siguiente dosis, o la concentración mínima del fármaco entre dos dosis.
En algunas realizaciones, un nivel mínimo diana de RAD001 está en un intervalo de entre alrededor de 0,1 y 4,9 ng/ml. En una realización, el nivel mínimo diana está por debajo de 3 ng/ml, por ejemplo, está entre 0,3 o menos y 3 ng/ml. En una realización, el nivel mínimo diana está por debajo de 3 ng/ml, por ejemplo, está entre 0,3 o menos y 1 ng/ml.
En un aspecto adicional, la invención puede utilizar un inhibidor de mTOR distinto de RAD001 en una cantidad que está asociada con un nivel mínimo diana que es bioequivalente al nivel mínimo diana especificado para RAD001. En una realización, el nivel mínimo diana para un inhibidor de mTOR distinto de RAD001, es un nivel que da el mismo nivel de inhibición de mTOR (por ejemplo, medido por un método descrito aquí, por ejemplo, la inhibición de la cinasa P70 S6) como lo hace un nivel mínimo de RAD001 descrito aquí.
Composiciones farmacéuticas: inhibidores de mTOR
En un aspecto, la presente descripción se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor de mTOR como se describe aquí, formulado para uso en combinación con las células CAR descritas aquí.
En algunos casos, el inhibidor de mTOR se formula para su administración en combinación con un adicional, por ejemplo, como se describe aquí.
En general, los compuestos de la presente descripción se administrarán en cantidades terapéuticamente eficaces como se describe anteriormente mediante cualquiera de los modos habituales y aceptables conocidos en la técnica, ya sea individualmente o en combinación con uno o más agentes terapéuticos.
Las formulaciones farmacéuticas se pueden preparar usando procedimientos convencionales de disolución y mezcla. por ejemplo, la sustancia farmacológica a granel (por ejemplo, un inhibidor de mTOR o una forma estabilizada del compuesto (por ejemplo, un complejo con un derivado de ciclodextrina u otro agente complejante conocido) se disuelve en un disolvente adecuado en presencia de uno o más de los excipientes descritos. El inhibidor de mTOR se formula típicamente en formas de dosificación farmacéuticas para proporcionar una dosificación fácilmente controlable del fármaco y para proporcionar al paciente un producto elegante y fácilmente manejable.
Los compuestos de la presente descripción se pueden administrar como composiciones farmacéuticas por cualquier vía convencional, en particular por vía enteral, por ejemplo, por vía oral, por ejemplo, en forma de comprimidos o cápsulas, o por vía parenteral, por ejemplo, en forma de soluciones o suspensiones inyectables, por vía tópica, por ejemplo, en forma de lociones, geles, ungüentos o cremas, o en forma nasal o de supositorio. Cuando se administra un inhibidor de mTOR en combinación con (ya sea simultáneamente con o por separado de) otro agente como se describe aquí, en un aspecto, ambos componentes pueden administrarse por la misma vía (por ejemplo, por vía parenteral). Alternativamente, se puede administrar otro agente por una ruta diferente con respecto al inhibidor de mTOR. por ejemplo, se puede administrar un inhibidor de mTOR por vía oral y el otro agente se puede administrar por vía parenteral.
Liberación sostenida
Los inhibidores de mTOR, por ejemplo, inhibidores de mTOR alostéricos o inhibidores de mTOR catalíticos, descritos aquí se pueden proporcionar como formulaciones farmacéuticas en forma de formas de dosificación sólidas orales que comprenden un inhibidor de mTOR descrito aquí, por ejemplo, rapamicina o RAD001, que satisfacen los requisitos de estabilidad del producto y/o tienen propiedades farmacocinéticas favorables sobre los comprimidos de liberación inmediata (IR), tales como concentraciones máximas medias plasmáticas reducidas, variabilidad inter e intrapaciente reducida en el grado de absorción del fármaco y en la concentración máxima plasmática, proporción reducida Cmax / Cmin y/o efectos reducidos de los alimentos. Las formulaciones farmacéuticas proporcionadas pueden permitir un ajuste de dosis más preciso y/o reducir la frecuencia de eventos adversos, proporcionando así tratamientos más seguros para pacientes con un inhibidor de mTOR descrito aquí, por ejemplo, rapamicina o RAD001.
En algunos casos, la presente descripción proporciona formulaciones estables de liberación prolongada de un inhibidor de mTOR descrito aquí, por ejemplo, rapamicina o RAD001, que son sistemas de múltiples partículas y pueden tener capas y recubrimientos funcionales.
El término “formulación de múltiples partículas de liberación prolongada, como se usa aquí, se refiere a una formulación que permite la liberación de un inhibidor de mTOR descrito aquí, por ejemplo, rapamicina o RAD001, durante un período de tiempo prolongado, por ejemplo, durante al menos 1, 2, 3, 4, 5 o 6 horas. La formulación de liberación prolongada puede contener matrices y recubrimientos hechos de excipientes especiales, por ejemplo, como se describe aquí, que se formulan de manera que el ingrediente activo esté disponible durante un período prolongado de tiempo después de la ingestión.
El término “liberación prolongada” se puede usar de manera intercambiable con los términos “liberación sostenida” (SR) o “liberación prolongada”. El término “liberación prolongada” se refiere a una formulación farmacéutica que no libera el principio activo inmediatamente después de la dosificación oral, sino durante un período prolongado de acuerdo con la definición de las farmacopeas Ph. Eur. (7a edición) monografía para tabletas y cápsulas y el capítulo general <1151> de la USP para formas farmacéuticas. El término “liberación Inmediata” (IR) como se usa aquí se refiere a una formulación farmacéutica que libera el 85% del principio activo del fármaco en menos de 60 minutos de acuerdo con la definición de “Guidance for Industry: "Dissolution Testing of Immediate Release Solid Oral Dosage Forms" (FDA CDER, 1997). En algunas realizaciones, el término “liberación inmediata” significa liberación de everolismus de comprimidos dentro del tiempo de 30 minutos, por ejemplo, medido en el ensayo de disolución descrito aquí.
Las formulaciones estables de liberación prolongada de un inhibidor de mTOR descrito aquí, por ejemplo, rapamicina o RAD001, se pueden caracterizar por un perfil de liberación in vitro usando ensayos conocidos en la técnica, como un ensayo de disolución como se describe aquí: un recipiente de disolución lleno de 900 ml de amortiguador de fosfato pH 6,8 que contiene dodecilsulfato sódico 0,2% a 37°C y la disolución se realiza usando un método de paleta a 75 rpm según la monografía ensayo USP 711, y monografía de ensayo Ph.Eur. 2.9.3. respectivamente.
En algunas realizaciones, las formulaciones estables de liberación prolongada de un inhibidor de mTOR descritas aquí, por ejemplo, rapamicina o RAD001, liberan el inhibidor de mTOR en el ensayo de liberación in vitro de acuerdo con las siguientes especificaciones de liberación:
0,5h: <45% o <40, por ejemplo, <30%
1h: 20-80%, por ejemplo, 30-60%
2h: >50%, o >70%, por ejemplo, >75%
3h: >60%, o >65%, por ejemplo, >85%, por ejemplo, >90%.
En algunas realizaciones, las formulaciones estables de liberación prolongada de un inhibidor de mTOR descritas aquí, por ejemplo, rapamicina o RAD001, liberan el 50% del inhibidor de mTOR no antes de 45, 60, 75, 90, 105 min o 120 min en el ensayo de disolución in vitro.
Métodos de sum inistro de biopolímeros
En algunos casos, una o más células que expresan CAR como se describen aquí, opcionalmente en combinación con un inhibidor de cinasa, por ejemplo, un inhibidor de BTK tal como ibrutinib, pueden administrarse o administrarse al sujeto a través de un andamio de biopolímero, por ejemplo, un implante de biopolímero. Los esqueletos biopoliméricos pueden reforzar o potenciar el suministro, expansión y/o dispersión de las células que expresan c A r descritas en la presente. Un esqueleto biopolimérico comprende un polímero biocompatible (por ejemplo, no induce sustancialmente una respuesta inflamatoria o inmunitaria) y/o biodegradable que puede ser de origen natural o sintético.
Los ejemplos de biopolímeros adecuados incluyen, sin carácter limtitante, agar, agarosa, alginato, alginato/cemento de fosfato de calcio (CPC, por sus siglas en inglés), beta-galactosidasa (p-GAL), (1,2,3,4,6-pentaacetil-a-D-galactosa), celulosa, quitina, quitosano, colágeno, elastina, gelatina, ácido hialurónico y colágeno, hidroxiapatita, poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxihexanoato) (PHBHHx), poli(lactida), poli(caprolactona) (PCL), poli(lactida-co-glicólido) (PLG), óxido de polietileno (PEO), poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), óxido de polipropileno (PPO), alcohol polivinílico (PVA), seda, proteína de soja, y aislado de proteína de soja, solo o combinado con cualquier otra composición polimérica, en cualquier concentración y en cualquier proporción. El biopolímero se puede aumentar o modificar con moléculas que fomentan la adhesión o migración, por ejemplo, péptidos que mimetizan colágeno que se unen al receptor de colágeno de los linfocitos, y/o moléculas estimuladoras para potenciar el suministro, expansión o función, por ejemplo, actividad anticancerosa, de las células que se van a suministrar. El esqueleto biopolimérico puede ser inyectable, por ejemplo, una composición en gel, o semisólida o sólida.
En algunos casos, las células que expresan CAR descritas en la presente se siembran en el esqueleto biopolimérico antes del suministro al sujeto. En casos, el esqueleto biopolimérico comprende además uno o más agentes terapéuticos adicionales descritos en la presente (por ejemplo, otra célula que expresa CAR, un anticuerpo o una molécula de bajo peso molecular) o agentes que potencian la actividad de una célula que expresa CAR, por ejemplo, incorporada a los biopolímeros del esqueleto o conjugada con estos. En casos, el esqueleto biopolimérico se inyecta, por ejemplo, por vía intratumoral, o se implanta quirúrgicamente en el tumor o a una distancia del tumor lo suficientemente próxima para mediar en un efecto antitumoral. Se describen ejemplos adicionales de composiciones de biopolímeros y métodos para su suministro en Stephan et al., Nature Biotechnology, 2015, 33:97-101; y WO2014/110591
Composiciones farmacéuticas y tratamientos
Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden comprender una célula que expresa CAR, p. ej., una pluralidad de células que expresan CAR, tal como se describe en esta memoria, en combinación con uno o más portadores, diluyentes o excipientes farmacéutica o fisiológicamente aceptables. Dichas composiciones pueden comprender tampones, tales como solución salina tamponada neutra, solución salina tamponada con fosfato y similares; hidratos de carbono, tales como glucosa, manosa, sacarosa o dextranos, manitol; proteínas; polipéptidos o aminoácidos tales como glicina; antioxidantes; agentes quelantes, tales como EDTA o glutatión; adyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio); y conservantes. Las composiciones de la presente invención están formuladas en un aspecto para la administración intravenosa.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar de una manera apropiada para la enfermedad que se va a tratar (o prevenir). La cantidad y la frecuencia de la administración estarán determinadas por factores tales como el estado del paciente y el tipo y la gravedad de la enfermedad del paciente, aunque se pueden determinar las dosificaciones apropiadas mediante ensayos clínicos.
En una realización, la composición farmacéutica está sustancialmente exenta de, p. ej. no hay niveles detectables de un contaminante, p. ej., seleccionado del grupo constituido por endotoxina, micoplasma, lentivirus competente para la replicación (RCL), p24, ácido nucleico de VSV-G, gag de HIV, perlas residuales recubiertas anti-CD3/anti-CD28, anticuerpos de ratón, suero humano combinado, albúmina de suero bovino, suero bovino, componentes de medios de cultivo, componentes de plásmidos o células de empaquetamiento de vectores, una bacteria y un hongo. En una realización, la bacteria es al menos una seleccionada del grupo consistente en Alcaligenes faecalis, Candida albicans, Escherichia coli, Haemophilus influenza, Neisseria meningitides, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumonia y grupo A de Streptococcus pyogenes.
Cuando se indica «una cantidad inmunológicamente eficaz», «una cantidad antitumoral eficaz», «una cantidad inhibidora de tumores eficaz» o «cantidad terapéutica», la cantidad precisa de las composiciones de la presente invención que se va a administrar puede ser determinada por un médico teniendo en cuenta las diferencias individuales en edad, peso, tamaño del tumor, extensión de la infección o metástasis y el estado del paciente (sujeto). Generalmente se puede afirmar que una composición farmacéutica que comprende los linfocitos T descritos en la presente se puede administrar con una dosificación de 104 a 109 células/kg de peso corporal, en algunos casos de 105 a 106 células/kg de peso corporal, incluidos todos los valores enteros dentro de esos intervalos. Las composiciones de células T también se pueden administrar múltiples veces con estas dosificaciones. Las células se pueden administrar mediante el uso de técnicas de infusión que se conocen comúnmente en inmunoterapia (véase, por ejemplo, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988).
En ciertos aspectos, puede ser deseable administrar células T activadas a un sujeto y luego volver a extraer sangre (o realizar una aféresis), activar las células T de la misma de acuerdo con la presente descripción, y reinfundir al paciente con estas células T activadas y expandidas. Este proceso se puede llevar a cabo múltiples veces cada pocas semanas. En determinados aspectos, los células T se pueden activar a partir de extracciones de sangre de 10 cc a 400 cc. En determinados aspectos, los células T se activan a partir de extracciones de sangre de 20cc, 30cc, 40cc, 50cc, 60cc, 70cc, 80cc, 90cc o 100cc.
La administración de las composiciones objeto se puede llevar a cabo de cualquier manera conveniente, que incluye la inhalación por aerosol, inyección, ingestión, transfusión, implante o trasplante. Las composiciones descritas en la presente se pueden administrar a un paciente por vía transarterial, subcutánea, intradérmica, intratumoral, intranasal, intramedular, intramuscular, mediante inyección intravenosa (i.v.) o por vía intraperitoneal. En un aspecto, las composiciones de células T de la presente invención se administran a un paciente mediante inyección intradérmica o subcutánea. En un aspecto, las composiciones de células T de la presente invención se administran por inyección i.v. Las composiciones de células T pueden inyectarse directamente en un tumor, ganglio linfático o sitio de infección.
En un aspecto ejemplar particular, los sujetos pueden someterse a leucocitaféresis, en la que los leucocitos se recogen, se enriquecen o se agotan ex vivo para seleccionar y/o aislar las células de interés, por ejemplo, células T. Estos aislados de células T pueden expandirse mediante métodos conocidos en la técnica y tratarse de manera que puedan introducirse una o más construcciones CAR de la presente descripción, creando así una célula CAR T de la presente descripción. Los sujetos que lo necesiten se pueden someter posteriormente a un tratamiento estándar con una dosis elevada de quimioterapia seguida de trasplante de células madre de la sangre periférica. En ciertos aspectos, después del trasplante o simultáneamente con él, los sujetos reciben una infusión de las células T CAR expandidas de la presente descripción. En un aspecto adicional, las células expandidas se administran antes o después de la cirugía.
La dosificación de los tratamientos anteriores que se va a administrar a un paciente variará según la naturaleza precisa de la afección que se esté tratando y el receptor del tratamiento. El escalado de las dosificaciones para la administración a seres humanos se puede realizar de acuerdo con las prácticas aceptadas en la técnica. La dosis de CAMPATH, por ejemplo, estará generalmente en el intervalo de 1 a aproximadamente 100 mg para un paciente adulto, normalmente administrada a diario durante un periodo de entre 1 y 30 días. La dosis diaria preferida es de 1 a 10 mg al día aunque en algunos casos se pueden utilizar dosis mayores de hasta 40 mg al día (descritas en la Patente de EE. UU. N.° 6 120766).
En un caso, el CAR se introduce en las células T, por ejemplo, usando transcripción in vitro, y el sujeto (por ejemplo, un ser humano) recibe una administración inicial de las células T CAR de la presente descripción, y una o más administraciones posteriores de células T CAR de la presente descripción, en las que una o más administraciones posteriores se administran menos de 15 días, por ejemplo, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 días después la administración anterior. En un caso, se administra más de una administración de las células T CAR de la presente descripción al sujeto (por ejemplo, humano) por semana, por ejemplo, se administran 2, 3 o 4 administraciones de las células T CAR de la presente descripción por semana. En una realización, el sujeto (por ejemplo, un sujeto humano) recibe más de una administración de las células T CAR por semana (por ejemplo, 2, 3 o 4 administraciones por semana) (también denominado aquí como un ciclo), seguido de una semana de ninguna administración de células T CAR, y luego se administra al sujeto una o más administraciones adicionales de las células T CAR (por ejemplo, más de una administración de las células T CAR por semana). En otra realización, el sujeto (por ejemplo, un sujeto humano) recibe más de un ciclo de células T CAR, y el tiempo entre cada ciclo es menos de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 o 3 días. En una realización, las células T CAR se administran cada dos días durante 3 administraciones por semana. En un caso, las células T CAR de la presente descripción se administran durante al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más semanas.
En un aspecto, las células que expresan CAR se generan usando vectores virales lentivirales, tales como lentivirus. Las células, por ejemplo, las CART generadas de esa manera, tendrán una expresión CAR estable.
En un aspecto, se generan células que expresan CAR, por ejemplo, CART, utilizando un vector vírico tal como un vector gammarretrovírico, por ejemplo, un vector gammarretrovírico descrito en la presente. Los CART generados utilizando estos vectores pueden tener una expresión de CAR estable.
En un aspecto, las CART expresan transitoriamente vectores CAR durante 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 días después de la transducción. La expresión transitoria de CAR se puede efectuar mediante suministro del vector de ARN de CAR. En un aspecto, el ARN c A r se transduce al interior de la célula T mediante electroporación.
Un problema potencial que puede surgir en pacientes que están siendo tratados con células T CAR que expresan de manera transitoria (particularmente con scFv murinos que llevan CART) es la anafilaxia después de múltiples tratamientos.
Sin desear ceñirse a ninguna teoría, se cree que una respuesta anafiláctica de este tipo puede estar causada porque el paciente desarrolla una respuesta anti-CAR humoral, es decir, anticuerpos anti-CAR que tienen un isotipo anti-IgE. Se cree que las células productoras de anticuerpos del paciente experimentan un cambio de clase desde un isotipo IgG (que no provoca anafilaxis) a un isotipo IgE cuando hay un descanso en la exposición al antígeno de diez a catorce días.
Si un paciente tiene un alto riesgo de generar una respuesta de anticuerpos anti-CAR durante el curso de la terapia de CAR transitoria (como las generadas por las transducciones de ARN), las pausas de infusión de CART no deben durar más de diez a catorce días.
EJEMPLOS
La invención se describe adicionalmente en más detalle haciendo referencia a los siguientes ejemplos experimentales. Estos ejemplos se proporcionan a efectos únicamente ilustrativos, y no se pretende que sean limitantes a menos que se especifique lo contrario. Por tanto, no se debe considerar que la invención se limite de ningún modo a los siguientes ejemplos, sino que más bien, se debe considerar que abarca todas y cada una de las variaciones que resultan evidentes como resultado de las enseñanzas proporcionadas en la presente.
Sin descripción adicional, se cree que un experto en la técnica puede, usando la descripción anterior y los siguientes ejemplos ilustrativos, preparar y utilizar los compuestos de la presente descripción y practicar los métodos reivindicados. Los siguientes ejemplos prácticos señalan específicamente diversos aspectos de la presente invención, y no se han de considerar limitantes de modo alguno del resto de la divulgación.
Ejemplo 1: Humanización del anticuerpo anti-CD19 murino
Una molécula de anticuerpo CD19 puede ser, por ejemplo, una molécula de anticuerpo (por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-CD19 humanizado) descrita en WO2014/153270. Se desea la humanización del anticuerpo CD19 murino para el entorno clínico, donde los restos específicos de ratón pueden inducir una respuesta de antígeno anti-ratón humano (HAMA) en pacientes que reciben tratamiento con CART19, es decir, tratamiento con células T transducidas con la construcción CAR19. Las secuencias VH y VL del anticuerpo CD19 murino derivado del hibridoma se extrajeron de la literatura publicada (Nicholson et al, 1997, supra). La humanización se logró injertando regiones CDR del anticuerpo CD19 murino en los marcos aceptores de la línea germinal humana VH4_4-59 y VK3_L25 (base de datos vBASE). Además de las regiones CDR, cinco restos marco, es decir, VH #71, #73, #78 and VL #71 #87, que se cree que apoyan la integridad estructural de las regiones CDR, fueron retenidos de la secuencia murina. Además, los elementos J humanos JH4 y JK2 se utilizaron para la cadena pesada y ligera, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos resultantes del anticuerpo humanizado se denominaron FMC63_VL_hz y FMC63_VH_hz1, respectivamente, y se muestran a continuación en la Tabla 1. La numeración de los residuos sigue a Kabat (Kabat E.A. et al, 1991, supra). Para las definiciones de CDR, se utilizaron tanto Kabat como Chothia et al, 1987 supra). Los restos procedentes del CD19 de ratón se muestran en negrita / cursiva. Las posiciones #60/61/62 enmarcadas indican un sitio potencial de modificación postraduccional (PTM) en CDR H2, también denominado HCDR2.
Tabla 1: Secuencias de aminoácidos de dominios variables de CD19 humanizados (SEQ ID Nos:114-117, respectivamente, en orden de aparición).
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Estas IgG de CD19 humanizadas se utilizaron para generar scFv solubles para probar la expresión y scFv para las construcciones CART CD19 completas (véanse los Ejemplos a continuación). Es de interés que durante la humanización, la posición 62 en la región CDRH2 prefiere ser un resto de serina en lugar de la alanina presente en la CDRH2 murina. La secuencia murina carece de una modificación postraduccional (PTM) y tiene asparagina-serina-alanina en las posiciones 60/61/62, respectivamente en CDRH2. Esto genera motivos PTM potenciales (indicados como la cita en el recuadro en CDRH2) durante el curso de la humanización. Se probó si el sitio PTM generado durante el proceso de humanización era realmente un sitio PTM “verdadero” o simplemente teórico. Se planteó la hipótesis de que el motivo de aminoácidos asparagina seguido de serina (NS) puede ser susceptible de desamidación postraduccional, pero no es algo que sea fácilmente evidente. También se planteó la hipótesis de que la asparagina seguida de cualquier aminoácido excepto prolina y luego seguida de serina (NxS, x í P) puede ser susceptible de N-glicosilación postraduccional. Para probar esta hipótesis, se generaron dos variantes de IgG en las que la asparagina en la posición 60 (conocida por ser un sitio de glicosilación) se mutó a serina o glutamina y se denominó FMC63_VH_hz2 (N60S) y FMC63_VH_hz2 (N60Q), respectivamente. Estas construcciones se generaron para eliminar el sitio de modificación postraduccional (PTM) potencial y probar la actividad retenida (véase el Ejemplo 2 a continuación).
Clonación:
Se obtuvieron secuencias de ADN que codifican dominios VL y VH humanizados y de ratón, y se optimizaron los codones para las construcciones para la expresión en células de Homo sapiens.
Las secuencias que codifican los dominios VL y VH se subclonaron a partir de los vectores de clonación en vectores de expresión adecuados para la secreción en células de mamífero. Las cadenas pesada y ligera se clonaron en vectores de expresión individuales para permitir la cotransfección. Los elementos del vector de expresión incluyen un promotor (potenciador-promotor de citomegalovirus (CMV)), una secuencia señal para facilitar la secreción, una señal de poliadenilación y un terminador de la transcripción (gen de la Hormona de Crecimiento Bovina (BGH)), un elemento que permite la replicación episomal y la replicación en procariotas (p. ej., origen SV40 y ColEI u otros conocidos en la técnica) y elementos para permitir la selección (gen de resistencia a ampicilina y marcador de zeocina).
Expresión:
Se expresaron candidatos de IgG quimeras y humanizados en células de mamífero HEK293F a una escala de 1 ml. Los sobrenadantes aclarados se utilizaron para los estudios de unión de FACS. Más precisamente, las células HEK293F se diluyeron a 5E5 células/ml en medio FreeStyle suplementado con Pen/Strep, y 1 ml se transfirió a una placa de 24 pocillos profundos de fondo redondo. Se diluyeron 0,5 ^g de plásmidos de expresión de mamíferos de cadena ligera y 0,5 ^g de cadena pesada en el mismo medio junto con 4 ^l de FuGENE HD (Roche REF 04709705001). Después de 15 min de incubación a temperatura ambiente, se añadió gota a gota la mezcla de ADN/Fugene a las células y se colocó en una incubadora con 5% de CO2 a 250 rpm, 37°C durante cinco días. A continuación, el sobrenadante se separó de las células mediante centrifugación. Para medir el contenido de IgG, se colocaron alícuotas de 200 ^l en los pocillos de placas de microtitulación de 96 pocillos. Todas las muestras y estándares se midieron por duplicado usando Protein A Dip y biosensores de lectura (Fortebio Cat No 18-5010). La placa se colocó en un instrumento Octet (ForteBio) y se dejó equilibrar a 27°C en la cámara termostatizada. Los datos se procesaron automáticamente usando el software de usuario Octet versión 3.0, y la concentración se determinó comparándola con una curva estándar de IgG.
Análisis de unión por FACS:
Los anticuerpos humanizados y quimeras se evaluaron con un ensayo de unión por citometría de flujo usando la línea celular 300.19-hsCD19FL. Esta línea celular se generó transfectando la línea celular 300.19 de preB de ratón con un vector (hCD19 FL/pEF4-myc-His A) que codifica la secuencia codificante de CD19 humana de longitud completa y el promotor natural, así como un gen de resistencia a la zeocina. En resumen, se sometieron a electroporación células 300.19 con el plásmido linealizado y luego se identificaron las células que expresaban niveles altos de hsCD19 usando un Ab anti-CD19 humano conjugado con APC (clon HIB19 de BD 555415) y posteriormente se clasificaron usando un citómetro de flujo FACS Aria. Las células hsCD19 clasificadas se cultivaron y se confirmó que expresaban de forma estable niveles elevados de hsCD19.
El ensayo de unión podría realizarse directamente con el medio de cultivo libre de suero que contiene la IgG expresada. Todas las IgG evaluadas se normalizaron a la misma concentración (85 nM), antes de diluirse mediante una dilución en serie de 3 veces hasta 1,4 pM. Luego, en una placa de 96 pocillos, alícuotas de 5x105 células/pocillo se incubaron durante 30 min a 4°C con IgG diluidas. Las células se lavaron dos veces con amortiguador FACS (BSA al 0,5% en PBS) antes de la adición del anticuerpo de detección, una IgG anti-hu de cabra conjugada con APC, fragmento Fc específico (Dianova # 109-136-098), diluida 1:1000 en amortiguador FACS. Las células se incubaron durante 30 min más a 4°C, luego se lavaron dos veces en amortiguador FACS y se ensayaron usando FACS Calibur (BD Bioscience). Trazado de curvas de unión (mediana de la intensidad de fluorescencia frente a la concentración de IgG) y la determinación de EC50 se realizó con el software GraphPad PrismTM 3.0 con análisis de regresión no lineal, respuesta a la dosis sigmoidea (pendiente variable).
Los análisis FACS muestran que la unión aparente para todas las IgG evaluadas puede variar ampliamente, con algunas construcciones que muestran un cambio de 5 a 10 veces en la EC50 como IgG frente a scFv. Basado en valores de EC50, se eligen candidatos principales que tienen una afinidad de unión dentro de un factor de 2 o mejor en comparación con la referencia quimérica.
Ejemplo 2: Caracterización de fragmentos scFv solubles anti-CD19 derivados de anticuerpos IgG CD19 humanizados
Se generaron fragmentos de scFv solubles a partir de las IgG de CD19 humanizadas descritas en el Ejemplo 1 usando técnicas de biología de moléculas estándar. Estos scFv solubles se utilizaron en estudios de caracterización para examinar la estabilidad, la expresión de la superficie celular y las propiedades de unión de los scFvs. Además, también se realizaron experimentos para investigar el impacto del potencial PTM introducido durante el proceso de humanización.
Expresión y purificación de scFv
Para la transfección de cada construcción scFv, se transfctaron alrededor de 3e8 células 293F con 100 |jg de plásmido usando PEI como reactivo de transfección en una proporción de 3:1 (PEI:ADN). Las células se cultivaron en 100 ml de medio de expresión EXPi293 (Invitrogen) en un matraz agitador a 37°C, 125 rpm, 8% de CO2. El cultivo se recogió después de seis días y se utilizó para la purificación de proteínas.
Las células 293F se recogeron centrifugando a 3500 g durante 20 minutos. El sobrenadante se recogió y se filtró a través de la Unidad de Filtro VacuCap90 PF (con súper membrana de w/0,8/0,2 jm , PALL). Se añadieron alrededor de 400 j l 400 j l de perlas de agarosa Ni-NTA (Qiagen) al sobrenadante. La mezcla se hizo girar y se incubó durante 4 h a 4°C. Se cargó en una columna de purificación y se lavó con tampón de lavado con Histidina 20 mM. La proteína se eluyó con 500 |jl de tampón de elución con Histidina 300 mM. Las muestras se dializaron contra tampón PBS a 4°C durante la noche. Las muestras de proteínas se cuantificaron utilizando nanodrop 2000c.
Análisis de conformación y estabilidad coloidal de scFv
La termoestabilidad del scFv se determinó mediante DSF: mezcle 10-20 j l de muestra de proteína con el colorante Sypro Orange (Invitrogen Cat # S6650) de una dilución final a 1:1000, en un volumen total de 25 j l en PBS, ejecute BioRad CFX1000 (25 C durante 2 min, luego incremente 0,5°C durante 30 segundos, 25 a 95°C).
Para el experimento de SEC analítico, se inyectaron alrededor de 15-20 jg de muestra de proteína scFv en 20 j l de PBS en TSKgel Super SW2000 a un caudal de 0,3 m/min en la serie n Agilent 1100.
EC50 por unión de FACS
La línea celular de ratón 300.CD19 se cultivó en RPMI 1640 con 0,5 mg/ml de zeocina. Se transfirieron alrededor de 5e5 células / pocillo a la placa de 96 pocillos BD Falcon. Las células se centrifugaron a 900 rpm (centrífuga Sorval Legend XT) durante 3 minutos. Se eliminó el sobrenadante. Las muestras de proteína scFv anti-CD19 se diluyeron en DPBS con FBS al 5%. Las muestras se añadieron a los pocillos, se mezclaron bien con las células y se incubaron durante 1 hora. Las células se lavaron dos veces en el DPBS con FBS al 5%. Las células se incubaron con antipoly His PE (R&D) durante 1 hora, se lavaron dos veces antes del análisis FACS (LSRII de BD Biosciences).
Análisis cinético de Proteon
La cinética se determinó usando Bio-Rad Proteon. La inmovilización se realizó usando acoplamiento de amina estándar en un chip sensor de GLC. Las muestras de scFv se diluyeron a 0,03 mg/ml en acetato a pH 4,5 y se aplicaron al chip a un caudal de 30 pl/min durante 300 segundos. A continuación, el ligando de CD19 se diluyó en serie en PBS-Tween y se inyectó a un caudal de 50 pl/min durante 120 segundos con un tiempo de disociación de 480 segundos. La superficie del chip se regeneró con glicina a pH 2,5. Los datos se ajustaron usando un modelo de Langmuir 1:1.
Expresión superficial de construcciones CART19 y tinción por FACS
Las células en suspensión HEK293F transfectadas transitoriamente con diferentes CART anti-hCD19 se recogeron 2 días después de la transfección. Se colocaron alrededor de 1e6 células en cada pocillo de una placa de 96 pocillos en forma de V (Greiner Bio-One, Alemania) y se lavaron tres veces con 0,2 ml de amortiguador FACS (1XPBS que contenía albúmina de suero bovino al 4% (BSA) (fracción V de BSA, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Las células se resuspendieron en 0,2 ml de amortiguador FCAS con 0,2 pg de proteína L biotinilada (GenScript, Piscataway, NJ) o 100 nM de hCD19 (AA 1-29)-hIgG1 Fc (generado en NIBRI ) y se incubaron a 4°C durante 30 minutos. Luego, las células se lavaron con 0,2 ml de amortiguador FACS tres veces y se incubaron con 1 pl de estreptavidina Alexa Fluor 488 (Life Technologies, Grand Island, NY) en 0,2 ml de amortiguador FACS para muestras con proteína L, o 2 pl de anti-Fcy humana PE (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) en 0,2 ml de amortiguador FACS para muestras con hCD19-hIgGl Fc durante 30 minutos a 4°C en la oscuridad. Después de lavar tres veces con 0,2 ml de tampón FACS, las células se analizaron en una máquina LSRII (BD Biosciences, San Jose, CA) utilizando el software FACSDiva (BD Biosciences, San Jose, CA). La tinción por inmunofluorescencia se analizó como la fluorescencia relativa logarítmica de las células vivas, y se midió el porcentaje de células positivas para Alexa Fluor 488 o positivas para PE.
Análisis de los PMT potenciales generados durante el proceso de humanización
Es de interés que durante la humanización, la posición 62 en la región CDRH2 prefiere ser un resto de serina en lugar de la alanina presente en la CDRH2 murina como se describe en el Ejemplo 1. Se probó si el sitio PTM generado durante el proceso de humanización era realmente un sitio PTM “verdadero” o simplemente uno teórico. Se generaron dos variantes de IgG en las que la asparagina en la posición 60 (conocida por ser un sitio de glicosilación) se mutó a serina o glutamina y se denominó FMC63_VH_hz2 (N60S) y FMC63_VH_hz2 (N60Q), respectivamente. Estas construcciones se generaron para eliminar el sitio de modificación postraduccional (PTM) potencial y probar la actividad retenida.
Resultados
Se expresaron scFv humanizados anti-CD19 y scFv de ratón en células 293F y se purificaron a través de la etiqueta His. La expresión y el rendimiento de todos los scFv humanizados fue mucho mayor que el scFv de ratón original (datos no mostrados).
Para confirmar la identidad y evaluar la integridad, las construcciones scFV se analizan con o sin incubación con N-glicanasa F (PNGasaF) seguido de espectrometría de masas de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC-MS) (ver Fig 3) y SDS-PAGE (datos no mostrado). PNGasaF es una enzima específica para la eliminación de estructuras de glicanos unidas a N de la secuencia consenso N-X-S/T/C donde X es cualquier aminoácido excepto prolina. Brevemente, las muestras se diluyen en agua a 0,1 pg/pl y se dejan sin tratar o se incuban con PNGasaF en una proporción de PNGasaF: scFV de 1:2 (p/p) durante 3 horas a 37°C.
El análisis SDS-PAGE se realiza usando un gel NuPAGE 4-12% Bis-Tris de Novex. Se cargan alrededor de 2 pg de scFV en cada línea, y la electroforesis se realiza a 200 V constante durante 40 minutos. Después de la electroforesis, el gel se tiñe usando colorante PhastGel Blue R 250 (Amersham Pharmacia) y se decolora con ácido acético al 10%, metanol al 30%.
El análisis HPLC-MS se realiza en el sistema Water's Acquity UPLC acoplado a un espectrómetro de masas Xevo-Tof. Alrededor de 1 pg de cada muestra se carga en una columna POROS R 1/102,1 x 100 mm 10 pm (Applied Biosciences) ajustada a 60°C a un caudal de 0,5 ml/min. Las fases móviles están compuestas por ácido fórmico al 0,1% (A) y ácido fórmico al 0,1%, isopropanol al 75%, acetonitrilo (B) al 25%. La proteína se eluye de la columna con un gradiente de fase inversa del 25% al 90% de B en 12 minutos. La adquisición se realiza mediante barrido positivo por electropulverización en el rango m/z de 600-4000 Da con una rampa de voltaje de cono de fuente de 20-50V. Los espectros resultantes se deconvolucionan usando MaxEnt1.
El sitio de glicosilación se introdujo durante el proceso de humanización. Las variantes que no son PTM (VH: N60S o N60Q) no tenían esta forma adicional. La construcción fue la única con un sitio de consenso de glicosilación ligada a N en HC CDR2. A partir del análisis de SDS-PAGE, las muestras no tratadas migraron como bandas simples coherentes con los pesos moleculares aproximados de las secuencias para todas las construcciones excepto 103101-WT (S/N) para las que se observa doblete. Esta construcción es la única con un sitio de consenso de glicosilación ligada a N en H-CDR2. Cuando se trata con PNGasaF, la banda de mayor peso molecular del doblete ya no está presente, lo que sugiere una ocupación parcial del sitio. De manera similar, los pesos moleculares observados de los espectros de masas desconvolucionados son consistentes con los predichos a partir de las secuencias de aminoácidos. Sin embargo, mientras que las otras construcciones demostraron una única especie molecular primaria, 103101-WT (S/N) también tenía una población de 1217 Daltons más alta que la predicha a partir de la secuencia que ya no está presente después del tratamiento con PNGasaF. Esto es consistente con la presencia de una única glicoforma unida a N predominante, probablemente oligomanosa 5 basada en la masa. La presencia de la forma glicosilada se confirmó mediante el análisis de EM como se muestra en la FIG. 3.
La estabilidad de la conformación se midió mediante Fluorimetría de Barrido Diferencial (DSF). Como se muestra en la FIG. 4, la Tm del scFv de ratón fue de 57°C, mientras que las variantes humanas mostraron una Tm más alta a alrededor de 70°C. La Tm para todos los scFv humanizados es mucho mejor que el scFv murino, mostrando claramente que todos los scFv humanizados son más estables que los scFv murinos. Esta estabilidad probablemente se traducirá en la construcción CART19, lo que probablemente conducirá a propiedades terapéuticas mejoradas.
La actividad del scFv purificado se midió mediante la unión a células de expresión de hCD19 así como mediante la unión al antígeno de hCD19 usando un método de detección basado en SPR. Se usó la línea celular de ratón 300 para determinar la unión de scFv. La EC50 de scFv de ratón para hCD19 fue de alrededor de 06-1,6 nM. Las variantes humanizadas mostraron EC50 del mismo rango en las EC50 baja o sub nM.
Ejemplo 3: Construcciones CAR CD19
Los scFv que se utilizarán en la construcción CAR final derivaron de la IgG humanizada descrita en el Ejemplo 1. Se hizo variar el orden en el que aparecen los dominios VL y VH en el scFv (es decir, orientación VL-VH o VH-VL) y donde tres o cuatro copias de la subunidad «G4S» (SEQ ID n O:18), en las que cada subunidad comprende la secuencia GGGGS (SEQ ID No :18) (por ejemplo, (G4S)3 (SEQ ID NO:107) o (G4S)4(Se Q ID NO:106)), conectan los dominios variables para crear la totalidad del dominio scFv, tal como se muestra en la Tabla 2.
Tabla 2. Construcciones de scFv de CD19 humanizado que muestran la orientación de VH y VL y la longitud del enlazador ("3G4S” se describe como SEQ ID NO:107 y "4G4S” se da a conocer como SEQ ID NO:106).
ID de construcción Longitud aa anotación cambio Vh
mscFvCTL019 486 VL-VH, 3G4S
104879 491 VL-VH, 4G4S N/S
104880 491 VL-VH, 4G4S N/Q
104881 491 VH-VL, 4G4S N/S
104882 491 VH-VL, 4G4S N/Q
104875 486 VL-VH, 3G4S N/S
104876 486 VL-VH, 3G4S N/Q
104877 486 VH-VL, 3G4S N/S
104878 486 VH-VL, 3G4S N/Q
105974 491 VL-VH, 4G4S S/N
105975 491 VH-VL, 4G4S S/N
105976 486 VL-VH, 3G4S S/N
105977 486 VH-VL, 3G4S S/N
Las secuencias de los fragmentos scFv humanizados (SEQ ID NOS:1-12) se proporcionan a continuación en la Tabla 3. Se generaron construcciones CAR completas usando SEQ ID NOS:1-12 con secuencias adicionales, SEQ ID NOS:13-17, que se muestran a continuación, para generar construcciones CAR completas con SEQ ID NO:31-42.
• líder (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO:13)
MALPVTALLLPLALLLHAARP
• líder (secuencia de ácido nucleico) (SEQ ID NO:54) ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACC
C
Bisagra CD8 (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO:14)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
• Bisagra CD8 (secuencia de ácido nucleico) (SEQ ID NO:55) ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTG TCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTG GACTTCGCCTGTGAT
• Transmembrana CD8 (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO:15)
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
• transmembrana (secuencia de ácido nucleico) (SEQ ID NO:56) ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCAC CCTTTACTGC
• Dominio intracelular 4-1BB (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO:16) KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
• Dominio intracelular 4-1BB (secuencia de ácido nucleico) (SEQ ID NO:60) AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAA ACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGT GAACTG
• Dominio de CD3 zeta (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO:17) RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNE LQKDKMAEAY SEIGMKGERRRGKGHDGLY QGLSTATKDTYDALHMQALPPR
• CD3 zeta (secuencia de ácido nucleico) (SEQ ID NO:101) AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTC TATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGC CGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAA TGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCG CCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACAC CTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
• Dominio de CD3 zeta (secuencia de aminoácidos; secuencia de referencia NCBI NM_000734.3) (SEQ ID NO:43) RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNE LQKDKMAEAY SEIGMKGERRRGKGFtDGLY QGLSTATKDTYDALFtMQALPPR
• CD3 zeta (secuencia de ácido nucleico; secuencia de referencia de NCBI NM_000734.3); (SEQ ID NO:44) AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAG
AACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTT TGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGA
AGAACCCT C AGGA AGGCCT GTAC AA T G AACT GC AG AAAG AT AAG A T GGCGG
AGGCCT ACAGT GAGATT GGGAT GAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGC ACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGC
CCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
Bisagra de lgG4 (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO: 102) ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSR LT VDKSRW QEGN VF SC S VMHEALHNHYT QKSL SL SLGKM
Bisagra de IgG4 (secuencia de nucleótidos) (SEQ ID NO:103)
GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCA GCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGT GACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTG GACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACC TACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATAC AAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCC AAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACC AAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGG AGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACA GCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGG GCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAG CCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG
Todos estos clones contenían un cambio de resto Q/K en el dominio señal del dominio coestimulador derivado de 4-1BB.
Tabla 3: Construcciones CAR CD19 humanizadas
Figure imgf000107_0001
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Tabla 7: Construcciones CAR CD19 murinas
Figure imgf000125_0002
Figure imgf000126_0001
Las secuencias de las secuencias de CDR humanizadas de los dominios scFv se muestran en la Tabla 4 para los dominios variables de la cadena pesada y en la Tabla 5 para los dominios variables de la cadena ligera. "ID” representa la SEQ ID NO respectiva para cada CDR.
Tabla 4. CDR de dominio variable de cadena pesada (Kabat)
Figure imgf000126_0002
murino_CART19 , GVSLPDYGVS 19 VIWGSETTYYNSALKS 20 HYYYGGSYAMDY 24 humanizado_ CART19 a VH4 GVSLPDYGVS 19 VIWGSETTYYSSSLKS 21 HYYYGGSYAMDY 24 humanizado_ CART19 b VH4 GVSLPDYGVS 19 VIWGSETTYYQSSLKS 22 HYYYGGSYAMDY 24 humanizado CART19 c VH4 GVSLPDYGVS 19 VIWGSETTYYNSSLKS 23 HYYYGGSYAMDY 24
T
Figure imgf000127_0001
Figure imgf000127_0003
humanizado CART19c VK3 RASQDISKYLN 25 HTSRLHS 26 QQGNTLPYT 27 La Tabla 6 es una clave de identificación que correlaciona los nombres numéricos de las construcciones de CD19 con la orientación específica de las cadenas ligeras y pesadas del scFv, el número de unidades enlazadoras (es decir, (G4S)3 (SEQ ID NO:107) o (G4S)4 (SEQ ID NO:106)), separando las cadenas pesada y ligera, y las secuencias de aminoácidos distintivas en la CDR2 de cadena pesada.
Tabla 6: Desi naciones CAR CD19-
Figure imgf000127_0002
A continuación, los fragmentos CAR scFv se clonaron en vectores lentivirales para crear una construcción CAR de longitud completa en un solo marco de codificación, y usando el promotor alfa EF1 para la expresión (SEQ ID NO:100).
Promotor EF1 alfa
C G T G A G G C T C C G G T G C C C G T C A G T G G G C A G A G C G C A C A T C G C C C A C A G T C C C C G A G A A G T T G G G G G G A G G G G T C G G
C A A T T G A A C C G G T G C C T A G A G A A G G T G G C G C G G G G T A A A C T G G G A A A G T G A T G T C G T G T A C T G G C T C C G C C T T T T T C C C G A G G G T G G G G G A G A A C C G T A T A T A A G T G C A G T A G T C G C C G T G A A C G T T C T T T T T C G C A A C G G G T T T G C C G C C A G A A C A C A G G T A A G T G C C G T G T G T G G T T C C C G C G G G C C T G G C C T C T T T A C G G G T T A T G G C C C T T G C G T G C C T T G A A T T A C T T C C A C C T G G C T G C A G T A C G T G A T T C T T G A T C C C G A G C T T C G G G T T G G A A G T G G G T G G G A G A G T T C G A G G C C T T G C G C T T A A G G A G C C C C T T C G C C T C G T G C T T G A G T T G A G G C C T G G C C T G G G C G C T G G G G C C G C C G C G T G C G A A T C T G G T G G C A C C T T C G C G C C T G T C T C G C T G C T T T C G A T A A G T C T C T A G C C A T T T A A A A T T T T T G A T G A C C T G C T G C G A C G C T T T T T T T C T G G C A A G A T A G T C T T G T A A A T G C G G G C C A A G A T C T G C A C A C T G G T A T T T C G G T T T T T G G G G C C G C G G G C G G C G A C G G G G C C C G T G C G T C C C A G C G C A C A T G T T C G G C G A G G C G G G G C C T G C G A G C G C G G C C A C C G A G A A T C G G A C G G G G G T A G T C T C A A G C T G G C C G G C C T G C T C T G G T G C C T G G C C T C G C G C C G C C G T G T A T C G C C C C G C C C T G G G C G G C A A G G C T G G C C C G G T C G G C A C C A G T T G C G T G A G C G G A A A G A T G G C C G C T T C C C G G C C C T G C T G C A G G G A G C T C A A A A T G G A G G A C G C G G C G C T C G G G A G A G C G G G C G G G T G A G T C A C C C A C A C A A A G G A A A A G G G C C T T T C C G T C C T C A G C C G T C G C T T C A T G T G A C T C C A C G G A G T A C C G G G C G C C G T C C A G G C A C C T C G A T T A G T T C T C G A G C T T T T G G A G T A C G T C G T C T T T A G G T T G G G G G G A G G G G T T T T A T G C G A T G G A G T T T C C C C A C A C T G A G T G G G T G G A G A C T G A A G T T A G G C C A G C T T G G C A C T T G A T G T A A T T C T C C T T G G A A T T T G C C C T T T T T G A G T T T G G A T C T T G G T T C A T T C T C A A G C C T C A G A C A G T G G T T C A A A G T T T T T T T C T T C C A T T T C A G G T G T C G T G A ( S E Q I D N O : 1 0 0 ) .
El análisis de las construcciones CAR humanizadas se realizó como se describe en el Ejemplo 4.
Ejemplo 4 : Análisis de construcciones de CD19 humanizadas en CART
Para evaluar la viabilidad de dirigirse a CD19 a través de una tecnología CAR, los fragmentos variables de cadena única para un anticuerpo anti-CD19 se clonan en un vector de expresión CAR lentiviral con la cadena CD3zeta y la molécula coestimuladora 4-1BB en cuatro configuraciones diferentes y la construcción óptima se selecciona basándose en la cantidad y calidad de la respuesta de las células T efectoras de las células T transducidas con CAR CD19 ("células T CART19” o "células T CART19”) en respuesta a las dianas CD19+. Las respuestas de linfocitos T efectores incluyen, sin carácter limitante, expansión celular, proliferación, duplicación, producción de citocinas y destrucción de células diana o actividad citolítica (desgranulación).
Materiales y métodos
Generación de células T CART19 humanizadas redirigidas
Los vectores de transferencia lentivirales CART19 humanizados se usan para producir el material genómico empaquetado en las partículas lentivirales pseudotipadas de VSVg. El ADN del vector de transferencia lentiviral se mezcla con los tres componentes de empaquetamiento de VSVg, gag/pol y rev en combinación con el reactivo de lipofectamina para transfectarlos juntos en células 293T. Después de 24 y 48 horas, el medio se recoge, se filtra y se concentra mediante ultracentrifugación. La preparación viral resultante se almacena a -80C. El número de unidades de transducción se determina mediante titulación en células SupTI. Los células T CART19 redirigidas se producen activando células T vírgenes frescas mediante el acoplamiento con perlas CD3x28 durante 24 horas y luego añadiendo el número apropiado de unidades transductoras para obtener el porcentaje deseado de células T transducidas. Se permite que estas células T modificadas se expandan hasta que descansen y bajen de tamaño, momento en el que se criopreservan para un análisis posterior. Los números y tamaños de las células se miden usando un coulter multisizer III. Antes de la crioconservación, el porcentaje de células transducidas (que expresan el CART19 en la superficie celular) y su intensidad de fluorescencia relativa de esa expresión se determinan mediante análisis de citometría de flujo en un LSRII. De las gráficas del histograma, se pueden examinar los niveles de expresión relativa de los CARs comparando el porcentaje transducido con su intensidad fluorescente relativa.
Evaluación de la actividad citolítica, las capacidades de proliferación y la secreción de citocinas de células T redirigidas CART19 humanizadas.
Para evaluar las capacidades funcionales de las células T CAR19 humanizadas para matar, proliferar y secretar citocinas, las células se descongelan y se dejan recuperar durante la noche. Además del CART19 humanizado, se usó el CART19 murino con fines comparativos, mientras que SS1-BBz se usó como CAR expresado no dirigido a diana para el efecto de fondo de las células CAR/T. El estándar de oro "control” (GS) CART19 se utilizó en todos los ensayos para comparar la variación del ensayo. Es importante destacar que las GS CART19 son células producidas en condiciones de fabricación de grado de investigación (es decir, no de grado clínico) e incluyen la adición de IL-2 al cultivo de crecimiento. Es probable que esto afecte a la viabilidad y funcionalidad generales de estas células y no debe evaluarse como una comparación directa con la producción de grado de investigación de las otras poblaciones de células T transducidas. La muerte de células T se dirigió hacia K562, una línea celular de leucemia mielógena crónica que expresa o no CD19 o Pt14, células B aisladas de pacientes con CLL. Para este ensayo de citotoxicidad basado en el flujo, las células diana se tiñen con CSFE para cuantificar su presencia. Las células diana se tiñeron para la expresión de CD19 para confirmar niveles de antígenos diana similares. Las actividades citolíticas de las células T CAR19 se miden con una titulación de las proporciones de células efectoras: diana de 10:1, 3:1, 1:1, 0,3:1 y 0:1, donde las efectoras se definieron como células T que expresan el receptor quimérico anti-CD19. Los ensayos se iniciaron mezclando un número apropiado de linfocitos T con un número constante de células diana. Después de 16 horas, se eliminó el volumen total de cada mezcla y se lavó cada pocillo combinando apropiadamente. Las células T se tiñeron para CD2 y todas las células se tiñeron con marcador live/dead 7AAD. Después del lavado final, las células granuladas se resuspendieron en un volumen específico con un número predeterminado de perlas de conteo. Los datos de tinción celular se recogieron mediante citometría de flujo LSRII y se analizaron con el software FloJo usando perlas para cuantificar los resultados.
Para medir la proliferación celular y la producción de citocinas de células T CAR19 humanizadas, las células se descongelan y se dejan recuperar durante la noche. Además del CART19 humanizado, se usó el CART19 murino con fines comparativos, mientras que SS1-BBz se usó como CAR expresado no dirigido a diana para el efecto de fondo de las células CAR/T. El estándar de oro “control” (GS) CART19 se utilizó en todos los ensayos para comparar la variación del ensayo. Las células T se dirigieron hacia K562, una línea celular de leucemia mielógena crónica que expresa o no CD19 o Pt14, células B aisladas de pacientes con CLL. Además, se utilizaron perlas CD3x28 para evaluar el potencial de las células T para responder a las señales inmunológicas endógenas. Para analizar la proliferación, las células T se tiñeron con CSFE. La proliferación es la dilución de la tinción de CSFE que refleja la separación de las marcas parentales ahora en dos células hijas. El ensayo prueba sólo una relación efector: diana de 1:1 y 1:0 donde los efectores se definieron como células T que expresan el receptor quimérico anti-CD19. El ensayo se realiza por duplicado y 24 horas después de la mezcla de las células, se retira/reemplaza el 50% del medio para el análisis de citocinas usando el panel Luminex 10-plex de detección de citocinas humanas. Después de 5 días, las células T se tiñeron para la expresión de CAR, se fenotipificaron como células CD4 o CD8 y se tiñeron para ver si estaban vivas/muertas con 7AAD. Después del lavado final, las células granuladas se resuspendieron en un volumen específico con un número predeterminado de perlas de recuento BD. Los datos de tinción celular se recogieron mediante citometría de flujo LSRII y se analizaron con el software FloJo usando perlas para cuantificar los resultados. Los recuentos de células totales se determinaron mediante un cierto número de células contadas con relación a un número específico de perlas, multiplicado por la fracción de perlas aún por contar.
Para evaluar el potencial de que las células CART19 humanizadas funcionen de manera similar a las CART19 murinas actualmente exitosas, queríamos evaluar in vitro su capacidad para matar células diana, proliferar en respuesta al antígeno diana y mostrar signos de persistencia. Empaquetando cada una de las construcciones lentivirales CART19 humanizadas y titulándolas en células SupT1, podemos determinar la cantidad de virus para normalizar las transducciones en alrededor del 50%. Esto permite comparaciones más directas de la actividad comenzando con sitios de integración promedio similares por célula.
Las células T CAR19 terapéuticas se generan partiendo de la sangre de un donante aféresido normal cuyas células T vírgenes se obtienen mediante selección negativa de células T, células CD4+ y CD8+. Estas células se activan mediante perlas CD3x28 en RPMI al 10% a 37°C, CO2 al 5%.
Después de 24 horas, las células T se disparan y se añade la cantidad normalizada de virus. Las células T comienzan a dividirse en un patrón de crecimiento logarítmico que se controla midiendo los recuentos de células por ml y el tamaño de las células. A medida que las células T comienzan a descansar, el crecimiento logarítmico disminuye y el tamaño de la célula se reduce. La combinación de una tasa de crecimiento más lenta y un tamaño de células T que se acerca a ~ 300 fl determina el estado para que las células T se criopreserven o reestimulan.
Existe una tendencia muy similar de células T en reposo según el tamaño. El patrón casi superpuesto entre las células CART humanizadas con la población actual de CART19 y UTD murinas no indica ningún efecto inusual del CAR19 humanizado sobre la expansión normal de las células T después de la activación. Como control, SS1-BBz se usa para definir la actividad CAR independiente del antígeno no deseada. El perfil de expansión en el número total de células muestra que las diferencias en los números reales en las expansiones individuales probablemente se deben principalmente a un número inicial diferente de células. Al normalizar el número de células T iniciales, se observa un grupo estrecho para todas las células CART19. Además, el efecto no deseado de la activación de CAR independiente del antígeno se detecta en la línea que corre más abajo y se aleja del grupo.
Se determinó el nivel de expresión superficial para cada una de estas células que expresan CAR19. El virus titulado normalizado para la transducción muestra niveles de expresión comparables que se correlacionan con la eficiencia de la transducción, porcentaje de células transducidas. Se extrapolaron los títulos de algunos CAR de empaquetamientos anteriores y, aunque sus porcentajes transducidos son más bajos, su MFI también se redujo como se esperaba. Los resultados indican que no hay un efecto negativo detectable del CAR19 humanizado sobre la capacidad de las células para expandirse normalmente en comparación con las células T UTD y CAR19 murinas.
Se analiza la capacidad de las células CART19 humanizadas para discernir selectivamente un epítopo específico de la superficie celular expresado en las células y destruirlas. Las células K562 de tipo salvaje no expresan CD19 pero pueden transducirse para expresar CD19. Comparando estas curvas de muerte, la valoración de la cantidad de células efectoras muestra que las células que expresan CD19 están destruidas. Las células T redirigidas del mismo donante y modificadas con células CART19 humanizadas o células CART19 murinas clínicas actuales no indican diferencia en su capacidad para matar. Las curvas de muerte muestran que se encuentra una capacidad de destrucción muy similar entre las células CART19 humanizadas que se dirigen a las células CLL CD19+ del paciente 14. Curiosamente, hay una disminución en la actividad citolítica general, en particular GS CART19, lo que sugiere que estas células pueden poseer propiedades inhibidoras específicas. El nivel similar de CD19 expresado en las células diana indica que el nivel de expresión no es la razón de las diferencias en la muerte celular.
La propiedad necesaria de las células CART19 humanizadas para proliferar después de ver las células diana se encuentra en todas las construcciones después de ser estimuladas por las perlas de control CD3x28 y las dianas que expresan CD19. Dirigirse a células Pt14 CLL parece indicar una tasa de proliferación ligeramente mayor con scFv con una orientación de cadena ligera a pesada sin sesgo visto cuando se tiene un enlace GGGGS 3x o 4x (SEQ ID NOS 107 y 106, respectivamente). Los resultados proliferativos reflejan el número total de células acumuladas durante los 5 días, lo que indica que los CART19 humanizados, 2146, 2144, 2136, 2141 y 2137 conducen una señal más proliferativa a las células T. Sorprendentemente, esto se detectó en las células CART19 humanizadas dirigidas a las células Pt14 CLL.
En general, las construcciones CART19 humanizadas exhiben características muy similares a las CART19 murinas actuales en actividad citolítica, respuesta proliferativa y secreción de citocinas a dianas específicas de antígeno. El potencial de las células CART19 humanizadas, (2146, 2144, 2136, 2141 y 2137), para impulsar una señal más proliferativa a las células T tras la activación de la diana, parecería ser un beneficio adicional de estas nuevas construcciones para mejorar potencialmente la respuesta terapéutica.
Resultados
Usando ensayos de desgranulación y producción de citocinas, se demuestra que las células T CART19 diseñadas se dirigen específicamente a las células CD19+.
Se analizaron células ND317 transducidas con construcciones CD19CAR humanizadas (también conocidas como “huCART19”) de la presente descripción. Hubo una estrecha similitud en el tamaño de las células T durante sus expansiones después de la activación y transducción de CD3x28 con los candidatos CART19 humanizados con respecto a las células T CART19 murinas y sin modificar (UTD).
Los experimentos mostraron poca diferencia en el número de células T que se acumularon durante sus expansiones después de la activación y transducción de CD3x28 con los diferentes candidatos CART19 humanizados con respecto a las células T CART19 murinas y sin modificar (UTD).
Las expresiones de la superficie celular de CART19 humanizado son comparables y su nivel de expresión muy similar al de CART19 murino. La superposición de histogramas que representan el patrón de tinción de la expresión de la superficie celular de cada célula T transducida con CART19 humanizado y la intensidad fluorescente media (MFI) calculada a partir de estos perfiles se correlaciona bien con el porcentaje de células transducidas.
Además, el CART19 humanizado tiene actividades citotóxicas específicas similares para dirigirse a células diana que expresan CD19 y es comparable al CART19 murino. Gráficos de ensayos de destrucción basados en flujo de 16 h que usan proporciones de titulación de efector a diana (E:T) con células CART19 humanizadas efectoras que se dirigen a K562cc marcadas con CSFE (FIG. 1A. controles de CD19 que no expresan), K562.CD19 (FIG. 1B, células K562 transducidas para expresar CD19) o Ptl4 (FIG. 1C, células B de un paciente con CLL). Las actividades citolíticas de todas las células CART19 humanizadas son similares y comparables a las CART19 murinas. Las diferencias en la actividad citolítica entre diferentes dianas son similares y comparables, lo que indica que la actividad de CART19 murina se conserva en la forma humanizada de CART19.
Las superposiciones de histograma de células CART19 humanizadas marcadas con CFSE 6 días después de mezclarse con células diana muestran su capacidad proliferativa (FIG. 5). La respuesta proliferativa proporcionada por el CAR19 es una respuesta necesaria después del acoplamiento y la muerte de las células diana para desarrollar una respuesta clínica positiva. La dilución de la tinción SS1-BBz CSFE, un indicador de la división de las células hijas que diluyen la tinción de la célula parental, es el resultado de que las células T sin descanso mantienen las divisiones en un mecanismo independiente de direccionamiento.
La capacidad general de proliferación de las poblaciones de células se evalúa con perlas CD3x28 que imitan el acoplamiento endógeno del TCR y el coestimulador CD28. Los datos indican que cada población celular tiene un potencial de proliferación comparable. Todas las células CART19 murinas y humanizadas proliferan fuerte y de manera comparable tras el acoplamiento con las células K562 que expresan CD19. Las células CART19 humanizadas también respondieron bien a las células B obtenidas de un paciente con CLL, aunque algunas parecen responder un poco menos. Como se muestra en la FIG. 2A y 2B, se puede ver que las células CART19 humanizadas 2136, 2137, 2140, 2141, 2144 y 2146 tienen una proliferación ligeramente más robusta como lo demuestra la mayor dilución de la tinción con CSFE. Todas estas construcciones tienen la misma orientación de cadena variable de ligera a pesada, lo que indica que esta es la orientación de elección. Una mirada más cercana a los cambios de aminoácidos en el sitio CDR2 pesado (Tabla 1) revela que cada una de las tres variaciones YSSSL, YQSSL e YNSSL (SEQ ID NOS:28, 29 y 30, respectivamente) están representadas en las construcciones que parecían tener las proliferaciones más robustas después de ver dianas. Además, estas construcciones observadas tienen tanto el enlazador G4S que contiene 3 copias de la subunidad (3G4S) (SEQ ID NO:107) como el enlazador G4S que contiene 4 copias de la subunidad (4G4S) (SEQ ID NO:106), lo que indica que el tamaño del enlazador no influyó en la función.
A partir de las expansiones proliferativas descritas anteriormente, se determina el número total de células después de 5 días después del acoplamiento del tumor. Las células muestran una disminución en el número de las que se sembraron inicialmente, lo que indica que se requiere activación para mantener la supervivencia. Se analiza un control de activación endógeno para mostrar que el recuento total de células al final de los 6 días fue similar. Las células CART19 humanizadas que se dirigen a las células K562 que expresan CD19 muestran que las dos células CART19 murinas terminan con el mayor número de células, con 2146 ligeramente por encima de todas las otras construcciones con valores similares. El número total de células también se analizó 6 días después de la exposición a las células B del Paciente 14 (pt14), y de manera interesante muestra que las construcciones CART19 humanizadas previamente seleccionadas de 2146, 2144, 2136, 2141 y 2137, todas las cuales tienen orientación de cadena ligera a pesada y representan las tres variaciones de aminoácidos YSSSL, YQSSL e YNSSL (SEQ ID NOS:28, 29 y 30, respectivamente), dieron como resultado un mayor número total de células, más alto que los CART19 murinos. Esta diferenciación inesperada entre los diversos clones anti-CD19CAR humanizados puede traducirse en una mejor eficacia clínica de las células CART transducidas con estas construcciones.
Se analizaron los niveles de fondo de citocina producidos a partir de células CART19 humanizadas después de la exposición a las células K562 de control que no expresan CD19. Los sobrenadantes de 24 horas se analizaron usando un panel luminex 30-plex. El perfil de citocinas potencial de la estimulación del sistema inmunológico endógeno con las perlas CD3x28 indica que cada una de las poblaciones de células tiene un perfil de citocinas comparable.
Los datos también muestran que el CART19 humanizado y el CART19 murino producen perfiles de citocinas similares a niveles similares cuando responden a las mismas dianas. El perfil de citocinas fue menor pero similar cuando se dirigió a las células diana Pt14.
Ejemplo 5: Tratamiento de células T CAR CD19 humanizadas en un modelo de ALL in vivo.
Las células primarias de ALL humana se pueden cultivar en ratones inmunodeprimidos sin tener que cultivarlas in vitro. Estos ratones pueden usarse para probar la eficacia de las células T del receptor de antígeno quimérico (CAR) en un modelo que representa la población de pacientes que se encontrará en la clínica. El modelo utilizado aquí, HALLX5447, se pasó dos veces en ratones NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG), antes de su uso en estudios que prueben la eficacia de las células CAR T.
Anteriormente se había demostrado que las células T CAR CD19 murinas se dirigen a las células leucémicas y las destruyen en un modelo de ratón NSG de ALL humano primario. El CD19 scFv (fragmento variable Fc de cadena sencilla) se ha humanizado y el presente ejemplo compara la capacidad de las células T que expresan un CAR CD19 humanizado (CAR 2) para eliminar las células tumorales ALL in vivo a la de las células T CAR CD19 murinas. Aquí, la eficacia de estas células se ha comparado directamente en ratones con ALL humana primaria establecida, según lo evaluado mediante análisis FACS de sangre periférica de células CD19+ humanas. Tras un implante de 1,5x106 células de ALL primarias por vía intravenosa, una carga de enfermedad de 2,5-4% de células humanas CD19+ en la sangre se logró 2 semanas después de la implantación del tumor. Este porcentaje de CD19 es del total de células en la sangre de los ratones. El 100% de las células humanas en los ratones antes del tratamiento con células CAR T son células tumorales. Porcentajes superiores al 2% de células humanas CD19+ en la sangre periférica se consideran una enfermedad de ALL humana establecida en este modelo. Los ratones portadores de leucemia se trataron con las células CAR T una vez que se estableció la leucemia en los ratones, alrededor de dos a tres semanas después de la implantación del tumor. Los ratones de cada grupo se trataron con 5x106 células T humanas totales. Las eficiencias de transducción de las células T humanas del donante con el lentivirus que expresa CAR estaban entre 40 y 60%. Después del tratamiento con las células T, se extrajo sangre de los ratones semanalmente para analizar el porcentaje de células humanas CD19+ en la sangre como biomarcador para la progresión de la enfermedad.
Materiales y métodos:
Células de ALL humana primaria: Las células primarias no se cultivaron in vitro antes de la implantación. Estas células se recogeron de un paciente con ALL y luego se transfirieron a ratones para su establecimiento y expansión. Después de que las células tumorales se expandieron en los ratones, se recogeron la médula ósea y los esplenocitos y se congelaron de manera viable en lotes separados para su reimplantación. Las células se congelaron en FBS al 90% y DMSO al 10% a una concentración mínima de 5x106 células por mililitro. Para la reimplantación, las células de ALL congeladas se descongelaron y luego se inyectaron por vía intravenosa en ratones NSG, con el fin de generar ratones con ALL que se utilizarán para comparar la eficacia antitumoral de las células T con CAR CD19 humanizadas y las células T con CAR CD19 murinas.
Ratones: Se recibieron ratones NSG (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wj/SzJ) de 6 semanas de edad de Jackson Laboratory (número de lote 005557). Se permitió que los animales se aclimataran a las instalaciones para animales de Novartis NIBRI durante al menos 3 días antes de la experimentación. Los animales se manipularon de acuerdo con las normas y directrices de Novartis ACUC.
Implante del tumor: Se descongelaron células de ALL humanas primarias pasadas en serie in vivo, modelo HALLX5447, en un baño de agua a 37°C. Las células se transfirieron a continuación a un tubo cónico de 15 mL y se lavaron dos veces con PBS estéril frío. A continuación, se contaron las células de ALL primaria y se resuspendieron a una concentración de 15x106 células por mililitro de PBS. Las células se colocaron en hielo y se implantaron inmediatamente (en una hora o menos) en los ratones. Las células de ALL se inyectaron por vía intravenosa a través de la vena de la cola en un volumen de 100 |jl, para un total de 1,5x106 células por ratón.
Dosificación de linfocitos T CAR: A los ratones se les administró 5x106 células T 16 días después de la implantación del tumor. Las células se descongelaron parcialmente en un baño de agua a 37 grados Celsius y a continuación se descongelaron completamente añadiendo 1 mL de PBS estéril frío al tubo que contenía las células. Las células descongeladas se transfirieron a un tubo Falcon de 15 mL y el volumen final se ajustó a 10 mL con PBS. Las células se lavaron dos veces a 1000 rpm durante 10 minutos cada vez y a continuación, se contaron en un hemocitómetro. Luego, las células T se resuspendieron a una concentración de 50x106 células por ml de PBS frío y se mantuvieron en hielo hasta que se administró la dosis a los ratones. Los ratones se inyectaron por vía intravenosa a través de la vena de la cola con 100 j l de células CAR T para una dosis de 5x106 células T por ratón. Se trataron cinco ratones por grupo con 100 j l de PBS solo (PBS), células T no transducidas (Simuladas), células T CAR CD19 murinas (muCTL019) o células T CAR Cd 19 humanizadas (huCTL019). Las células T no transducidas, las células T muCTL019 y las células T huCTL019 se prepararon todas a partir del mismo donante humano en paralelo.
Control de los animales: Se realizó un seguimiento del estado de salud de los ratones a diario, que incluía mediciones del peso corporal dos veces por semana. El porcentaje de cambio en el peso corporal se calculó como (BWactual -BWinicial)/(BWinicial) x 100%. La carga tumoral se controló semanalmente mediante análisis FACS de sangre periférica. Los ratones se sangraron semanalmente a través de la vena de la cola en tubos recubiertos con EDTA que se mantuvieron en hielo. Se sembraron 10-20 j l de sangre de los tubos en placas de 96 pocillos sobre hielo. Los glóbulos rojos se lisaron con amortiguador de lisis de glóbulos rojos ACK (Life Technologies, número de catálogo A10492-01) y luego se lavaron dos veces con PBS frío. Las células se incubaron con una mezcla de bloqueo Fc de bloque Fc humano y de ratón (Miltenyi Biotec, números de catálogo 130-059-901 y 130-092-575) durante 30 minutos y luego se incubaron con un anticuerpo anti-CD19 humano durante 30 minutos. Las células se fijaron con una disolución de paraformaldehído al 2% durante 20 minutos, se lavaron y se almacenaron en PBS FBS al 2% durante la noche antes del análisis en un BD Canto o Fortessa, seguido de un análisis adicional usando el software de análisis FlowJo FACS. Las células se analizaron para determinar el porcentaje de células CD19+ humanas en la sangre de ratones NSG portadores de tumores HALLX5447 ALL humanos. Los porcentajes de CD19 en la sangre se informan como la media ± error estándar de la media (SEM).
Los valores porcentuales de tratamiento/control (T/C) se calcularon usando la siguiente fórmula:
% T/C = 100 x AT/AC si AT > 0;
% Regresión = 100 x AT/Tinicial si AT < 0;
donde T = porcentaje medio de CD19 en sangre periférica del grupo tratado con fármaco en el último día del estudio; T inicial = porcentaje de CD19 en sangre periférica del grupo tratado con el fármaco el día inicial de la dosificación; AT = porcentaje medio de CD19 en sangre periférica del grupo tratado con fármaco en el último día del estudio - porcentaje medio de CD19 en sangre periférica del grupo tratado con fármaco el día inicial de la dosificación; C = porcentaje medio de CD19 en sangre periférica del grupo de control en el último día del estudio; y AC = porcentaje medio de CD19 en sangre periférica del grupo de control en el último día del estudio - porcentaje medio de CD19 en sangre periférica del grupo de control el día inicial de la dosificación.
Se interpreta que los valores de T/C en el intervalo del 100% al 42% tienen una actividad antitumoral nula o mínima; se interpreta que los valores de T/C que son < 42% y > 10% tienen actividad antitumoral o inhibición del crecimiento tumoral. Los valores de T/C < 10% o los valores de regresión > -10% se interpretan como estasis tumoral. Los valores de regresión < -10% se informan como regresión.
Resultados:
La actividad antitumoral de las células T CAR CD19 murinas y humanizadas se evaluó y se comparó directamente en un modelo primario de ALL humana. Después de la implantación del tumor el día 0, los ratones se distribuyeron aleatoriamente en grupos de tratamiento y se trataron con 5x106 células T por vía intravenosa el día 16. Se controló la carga de enfermedad de ALL y la salud animal hasta que los animales alcanzaron el punto final. Los ratones de todos los grupos se sacrificaron el día 65 después de la implantación del tumor cuando la carga de enfermedad en los grupos de control era superior al 80% de células CD19+ humanas en la sangre periférica.
Se observó una clara diferencia en la carga de enfermedad entre los grupos de control y los grupos tratados con células T CAR CD19 murinas o humanizadas con P <0,01 desde el día 24 después de la implantación del tumor, y continuando hasta el final del estudio el día 65. Las células T CAR CD19 murinas y humanas demuestran una capacidad similar para controlar el crecimiento de células tumorales HALLX5447 ALL humana en ratones NSG. Ambos grupos mostraron un nivel máximo de enfermedad en sangre periférica de 12-15% de células CD19+ humanas en el día 21 después de la implantación de HALLX5447. 42 días después de la implantación de células tumorales, las células CD19+ humanas no fueron detectables en el grupo huCTL019, mientras que el porcentaje de células CD19+ humanas del grupo muCTL019 se redujó a alrededor del 1%. Tanto las células T CAR CD19 murinas como las humanizadas dieron como resultado una capacidad comparable para controlar la expansión de las células ALL humanas primarias en este modelo (P> 0,05). Los valores de % T/C para el grupo de células T transducidas simuladas fueron del 94,40%, lo que demuestra que las células T transducidas simuladas no tenían actividad antitumoral. El porcentaje de regresión del grupo muCTL019 fue -89,75% y el grupo huCTL019 fue -90,46%, lo que demuestra que ambos tratamientos pudieron causar una regresión del modelo tumoral HALLX5447. Los porcentajes de células CD19+ humanas de sangre periférica como medida de la carga de enfermedad en estos ratones se muestran en la FIG. 7. El grupo de tratamiento con PBS, que no recibió ninguna célula T, demostró una cinética de crecimiento del tumor de ALL primaria basal en ratones NSG implantados por vía intravenosa. El grupo de tratamiento simulado recibió células T no transducidas que se sometieron al mismo proceso de expansión in vitro como las células CAR T. Estas células sirven como control de células T para mostrar la respuesta inespecífica de las células T en este modelo de tumor. Tanto los grupos de tratamiento con células T transducidas con PBS como simuladas demostraron una progresión tumoral continua a lo largo del experimento. Tanto las células T CAR CD19 murinas como las humanizadas controlan la progresión de la enfermedad dentro de una semana de inyecciones de 5x106 células T y demuestran una capacidad similar para mantener el control de la enfermedad durante el transcurso de este estudio de 65 días.
La actividad antitumoral de células T transducidas con CAR CD19 murinas y humanizadas se evaluó en un estudio de eficacia en ratones NSG que llevaban un modelo de ALL humana primaria, HALLX5447. Este estudio demostró que tanto las células T CAR CD 19 murinas como las humanizadas (muCTL019 y huCTL019) son capaces de generar una respuesta antitumoral en un modelo primario de ALL humana. Además, esta respuesta, evaluada por la carga de enfermedad de la sangre periférica, es la misma para las células muCTL019 y huCTL019. Tanto las células T CAR CD19 murinas como las humanizadas controlan el crecimiento primario de ALL dentro de una semana después de que los ratones recibieron la dosis de las células T. Inicialmente, después del tratamiento, la carga de la enfermedad siguió aumentando antes de disminuir a niveles prácticamente indetectables. Un tratamiento con células CAR T murinas o humanizadas dio como resultado una respuesta antitumoral sostenida durante el curso de la progresión de la enfermedad de 65 días en ratones tratados de control. Las células T CAR CD19 humanizadas demostraron una capacidad similar para montar una respuesta tumoral anti-CD19 eficaz y controlar la carga de enfermedad de ALL como se observó con las células T CAR CD19 murinas.
Ejemplo 6: Células T CAR CD19 para uso en el tratam iento del mieloma múltiple.
Incluso con los regímenes actuales de quimioterapia, terapias dirigidas y trasplante autólogo de células madre, el mieloma se considera una enfermedad incurable. El presente ejemplo describe el tratamiento de mieloma múltiple (MM) con células T autólogas dirigidas a CD19 con un receptor de antígeno quimérico (lentivirus/CD19: 4-1BB:CD3zeta; también conocido como “CART19” o CTL019). Este ejemplo demuestra que las terapias CAR dirigidas por CD19 tienen el potencial de establecer remisiones profundas y duraderas a largo plazo basadas en la selección de células madre de mieloma y/o células tumorales que expresan niveles muy bajos (indetectables por la mayoría de los métodos) de CD19.
Al tratar a un paciente con una leucemia de células plasmáticas secundaria agresiva, encontramos que CART19 administrado dos días después de un trasplante autólogo de células madre de rescate dio como resultado una rápida eliminación de la leucemia de células plasmáticas y una respuesta parcial muy buena en un paciente que había progresado a través de múltiples líneas de quimioterapia. Este paciente dependía de transfusiones durante meses antes del tratamiento; a los dos meses del tratamiento, recuperó sus recuentos sanguíneos (con recuentos de plaquetas y glóbulos blancos en rango normal) y no ha requerido transfusiones desde que fue dada de alta del hospital de su tratamiento.
Debido a que las células de mieloma no expresan naturalmente CD19, el hallazgo de que el tratamiento con CART19 indujo una respuesta tumoral rápida y significativa en este tumor fue sorprendente. Sin desear ceñirse a una teoría en particular, se razonó que CART19 podría usarse para tratar el mieloma porque: (1) mientras que tradicionalmente se piensa que las células de mieloma son negativas para la expresión de CD19 por citometría de flujo, hay datos que indican que las células de mieloma puede expresar niveles muy bajos de CD19, de modo que la expresión es detectable por ARN pero no por citometría de flujo o inmunohistoquímica; y (2) por el concepto de dirigirse a la célula B clonotípica, que se cree que es la célula madre cancerosa que da lugar al mieloma múltiple y es particularmente resistente a la quimioterapia. Existe una relación clonal entre las células B y las células tumorales de mieloma, pero la terapia tradicional del mieloma está dirigida a las células plasmáticas malignas en lugar de a las células B. Por lo tanto, CART19 para el tratamiento del mieloma se dirige a una población celular diferente a la de la mayoría de las terapias para el mieloma.
En nuestra experiencia con un solo paciente, el paciente tenía células plasmáticas circulantes y pudimos analizar sus células tumorales para determinar la expresión de CD19. Alrededor del 1-2% de sus células tumorales expresaron el antígeno CD19. (FIG. 8). Por lo tanto, se razonó que CART19 puede tener un efecto directo en una población muy pequeña de sus células tumorales; una respuesta parcial muy buena, aunque no se habría predicho basándose únicamente en la selección de una población muy pequeña de células tumorales CD19+.
En este caso, se administró CART19 después del rescate de trasplante de células madre autólogas después de dosis altas de melfalán. Aunque esta es una terapia estándar en el mieloma, no es curativa. Además, este paciente se había sometido previamente a trasplantes de células madre autólogas en tándem y recayó temprano (<6 meses) después del trasplante. Sin desear estar ligado a una teoría particular, el uso de células CART19 como se describe en el presente ejemplo puede tener un mecanismo de no superposición en el tratamiento del mieloma cuando se combina con un trasplante de células madre autólogas de rescate.
Un paciente con mieloma múltiple refractario fue tratado con CTL019 después de quimioterapia mielosupresora y TACM. La remisión se mantuvo a pesar de la pérdida de CTL019 detectable y la reconstitución de células B positivas para CD19 normales, lo que indica que esta respuesta no requirió actividad CTL019 sostenida. Además, la respuesta de este paciente se realizó a pesar de que la gran mayoría (99,95%) de las células plasmáticas neoplásicas eran CD19 negativas tanto por citometría de flujo como por RT-PCR.
La ausencia de expresión de CD19 detectable en la población de células plasmáticas neoplásicas dominantes de este paciente sugiere que la diana clínicamente relevante de CTL019 residía fuera de esta población dominante negativa para CD19. Las células plasmáticas neoplásicas en pacientes con mieloma múltiple exhiben heterogeneidad genética, inmunofenotípica y funcional. Es posible que se requieran subpoblaciones particulares para la supervivencia del clon a través de la terapia anti-mieloma. En el paciente descrito aquí, por ejemplo, el pequeño subconjunto de células plasmáticas que expresa CD19 podría haber sido relativamente resistente al melfalán pero sensible a CTL019. Este hallazgo sugiere que dirigirse terapéuticamente a un pequeño subconjunto del clon puede conducir a un beneficio clínico duradero cuando se combina con la terapia convencional anti-mieloma.
Alternativamente, la diana clínicamente relevante de CTL019 en este paciente puede haber residido fuera de la población de células plasmáticas neoplásicas. por ejemplo, CTL019 puede apuntar a una población de células madre que es relativamente pequeña pero da lugar a células plasmáticas neoplásicas. Por lo tanto, el mieloma múltiple puede ser una enfermedad de múltiples tipos de células de linaje B tardío, no solo células plasmáticas diferenciadas terminalmente, de modo que las terapias como CTL019 que se dirigen a los células B podrían ser complementos útiles de las terapias que se dirigen directamente a las células plasmáticas.
Diez pacientes adicionales con mieloma múltiple serán tratados con CART19 en un ensayo de fase I, al menos tres pacientes han sido tratados hasta la fecha.
Justificación de la Dosis y Riesgos/Beneficios
Hemos optado por utilizar una dosificación plana por vía intravenosa para este protocolo. El objetivo principal de este protocolo fue probar la seguridad y viabilidad de administrar células CART-19 a pacientes con mieloma múltiple. Las principales toxicidades que se anticiparon son (I) la liberación de citocinas cuando los CAR se encuentran con su antígeno CD19 sustituto en las células B malignas o normales; (2) agotamiento de las células B normales, similar a la terapia con rituximab; (3) síndromes gastrointestinales y cutáneos sensibles a los esteroides que se asemejan a la enfermedad de injerto contra huésped, como se ha observado anteriormente cuando se han acoplado células T autólogas expandidas/coestimuladas con ASCT para MM. Una preocupación teórica era si la transformación o proliferación incontrolada de las células T CART-19 podría ocurrir en respuesta a niveles altos de CD19. Esto fue menos preocupante en esta aplicación en comparación con otro estudio de pacientes con CLL, ya que se espera que la carga de células B clonotípicas en MM sea mucho más baja que la carga de células B malignas en los pacientes con CLL refractaria tratados en ese estudio.
Razón de la dosis
Con los primeros 3 pacientes, hemos observado actividad clínica a dosis que van desde 1,4 x 107 hasta 1,1 x 109 células CART-19. Esta observación demuestra, al menos en los primeros 3 pacientes tratados, que no existe una relación dosisrespuesta obvia. Se observó una respuesta completa en pacientes a los que se les administró una diferencia de dosis de dos logaritmos. Por tanto, a diferencia de los fármacos estándar que se metabolizan, las células CAR T pueden tener un amplio rango de respuesta a la dosis. Lo más probable es que esto se deba a que las células CAR T pueden proliferar ampliamente en los pacientes. Por lo tanto, establecemos un rango de dosis de 1-5 x 108 células CART-19 para infusión. En este estudio de un solo paciente ofrecido sobre una base de uso compasivo, al paciente se le ofreció hasta 5 x 108 células CART19, sin límite de dosis inferior. Para el ensayo de diez pacientes, se ofrecerá a los pacientes 1-5 x 107 células CART-19.
Diseño general
Este fue un estudio de un solo paciente que se ofreció sobre una base de uso compasivo; se modeló a partir de un estudio de fase I para determinar si la infusión de células T autólogas transducidas para expresar CART-19 es segura. Los objetivos principales del estudio fueron determinar la seguridad, la tolerabilidad y el potencial de injerto de las células T CART-19 en pacientes que se someten a un ASCT de rescate después de una recaída temprana después del primer ASCT. El protocolo consiste en un estudio piloto de etiqueta abierta.
Al ingresar, los sujetos se someterán a una biopsia de médula ósea y una evaluación de laboratorio e imágenes de rutina de su MM. Los sujetos elegibles se someterán a aféresis de estado estacionario para obtener un gran número de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) para la fabricación de CART-19. Las células T se purificarán a partir de las PBMC, se transducirán con el vector lentiviral TOPRZ/4-1BB, se expandirán in vitro y luego se congelarán para su futura administración. Se registrará el número de pacientes que tienen colecciones, expansión o fabricación inadecuadas de células T en comparación con el número de pacientes que tienen células T fabricadas con éxito; no se espera que la viabilidad de la fabricación del producto sea problemática en esta población de pacientes.
En general, los sujetos habrán tenido suficientes células madre de sangre periférica almacenadas de la movilización/recolección realizada en preparación para su primer ASCT para realizar dos ASCT adicionales. Aquellos que no lo hagan, se someterán a un segundo procedimiento de movilización/recolección antes o después de su aféresis de estado estacionario con un régimen de acuerdo con la preferencia del médico tratante. Alrededor de dos semanas después de la leucocitaféresis inicial, los sujetos serán admitidos en el hospital y recibirán melfalán en dosis altas (día -2) seguido de una infusión de células madre autólogas dos días después (día 0), y todos los sujetos recibirán una infusión de células CART-19 de doce a catorce días después (día 12-14). Se inscribirán hasta 10 pacientes.
A todos los sujetos se les harán análisis de sangre para evaluar la seguridad, el injerto y la persistencia de las células CART-19 a intervalos regulares hasta la semana 4 del estudio. En el día 42 y el día 100, los sujetos se someterán a aspirados/biopsias de médula ósea para evaluar la carga de células plasmáticas de la médula ósea y el tráfico de células CART-19 a la médula ósea. Se realizará una evaluación formal de la respuesta el día 100 de acuerdo con los criterios del International Myeloma Working Group (IMWG )136, y la TTP se controlará de acuerdo con la práctica clínica habitual de los pacientes con mieloma múltiple. El principal resultado de eficacia medido en este estudio será una comparación de TTP después de ASCT inicial de un paciente con TTP después de ASCT en este estudio.
Dado que el criterio de valoración principal de este estudio es la seguridad y la viabilidad de la infusión de células CART-19 con ASCT, el estudio empleará una regla de interrupción temprana. Brevemente, si ocurren menos de 2 eventos adversos graves e inesperados entre los primeros cinco sujetos tratados, el estudio acumulará cinco sujetos adicionales hacia una inscripción diana de 10. Observaremos a los sujetos tratados durante 40 días después de la infusión de CART-19 (es decir, a través de la primera evaluación de respuesta oficial en el día 42) antes de inscribir a un sujeto posterior hasta que se hayan inscrito cinco sujetos y se hayan observado. Para el tratamiento del segundo grupo de cinco pacientes, no se requerirá ningún período de espera entre sujetos.
Después de los 6 meses de seguimiento intensivo, los sujetos serán evaluados al menos trimestralmente durante dos años con un historial médico, examen físico y análisis de sangre. Después de esta evaluación, los sujetos ingresarán a un estudio de transferencia para seguimiento anual por teléfono y cuestionario durante hasta trece años adicionales para evaluar el diagnóstico de problemas de salud a largo plazo, como el desarrollo de una nueva neoplasia maligna.
Criterios de valoración principales del estudio
Este ensayo piloto está diseñado para probar la seguridad y viabilidad de las células T autólogas transducidas con el CD19 TCRZ/4-1BB en pacientes que se someten a ASCT de rescate para MM después de una recaída temprana después del primer ASCT.
Los criterios de valoración primarios de seguridad y viabilidad incluyen:
Ocurrencia de eventos adversos relacionados con el estudio, definidos como NCJ CTC 2: signos/síntomas de grado 3, toxicidades de laboratorio y eventos clínicos que están posible, probable o definitivamente relacionados con el tratamiento del estudio en cualquier momento desde la infusión hasta la semana 24. Esto incluirá la infusión toxicidad y cualquier toxicidad posiblemente relacionada con las células CART-19, incluidas, entre otras, las siguientes:
a. Fiebres
b. Erupción
c. Neutropenia, trombocitopenia, anemia, aplasia medular
d. Disfunción hepática
e. Infiltrados pulmonares u otra toxicidad pulmonar
f. Síndromes similares a GVHD que afectan el tracto gastrointestinal o la piel.
Viabilidad para fabricar células CART-19 a partir de productos de aféresis de pacientes. Se determinará el número de productos fabricados que no cumplen los criterios de liberación para la eficiencia de la transducción del vector, la pureza de las células T, la viabilidad, la esterilidad y la contaminación tumoral.
La profundidad y duración de la respuesta después del autotrasplante de células madre con CART19 se comparará con la profundidad y duración de la respuesta que cada paciente logró inicialmente después del autotrasplante estándar de células madre.
Selección y retirada de sujetos
Criterios de inclusión
Los sujetos deben haberse sometido a un ASCT previo para MM y haber progresado dentro de los 365 días de la infusión de células madre. Los sujetos que se hayan sometido a dos ASCT anteriores como parte de un régimen de consolidación de ASCT en tándem planificado son elegibles. La progresión se definirá de acuerdo con los criterios del IMWG para enfermedad progresiva o, para los pacientes que alcanzaron CR o sCR después de ASCT inicial, los criterios de recaída de CR (Durie et al. Leukemia 2006;20(9):1467-1473). N.B .: No existe ningún requisito de que los pacientes se inscriban dentro de los 365 días al ASCT previo, y los pacientes pueden ser tratados con otros agentes, incluidos agentes experimentales, después de la recaída/progresión después de ASCT previo antes de la inscripción en este estudio. Los sujetos deben haber firmado un consentimiento informado por escrito.
Los sujetos deben tener una función de órganos vitales adecuada para recibir melfalán en dosis altas según lo definido por los siguientes criterios, medidos dentro de las 12 semanas anteriores a la fecha de infusión de melfalán: a. Creatinina sérica < 2,5 o aclaramiento de creatinina estimado > 30 ml/min y no dependiente de diálisis. b. SGOT < 3 veces el límite superior de bilirrubina normal y total < 2,0 mg/dl (excepto en pacientes en los que la hiperbilirrubinemia se atribuye al síndrome de Gilbert). c. Fracción de eyección del ventrículo izquierdo (FEVI) > 45% o, si la FEVI es <45%, una evaluación formal por parte de un cardiólogo que no identifique un deterioro clínicamente significativo de la función cardiovascular. La evaluación de la FEVI debe haberse realizado dentro de las seis semanas posteriores a la inscripción. d. Función pulmonar adecuada con FEV1, FVC, TLC, DLCO (después del ajuste apropiado para el volumen pulmonar y la concentración de hemoglobina) >40% de los valores previstos. Las pruebas de función pulmonar deben haberse realizado dentro de las seis semanas posteriores a la inscripción.
Los sujetos deben tener un estado funcional ECOG de 0-2, a menos que un estado funcional superior se deba únicamente al dolor óseo.
Criterio de exclusión Los sujetos no deben:
Tener alguna infección activa y no controlada.
Tener hepatitis B activa, hepatitis C o infección por VIH.
Cualquier trastorno médico no controlado que impida la participación como se describe.
Régimen de tratamiento
Terapia para el mieloma múltiple en recaída/progresivo
Los pacientes pueden recibir, antes de la inscripción, terapia para el mieloma múltiple progresivo/recidivante según la preferencia de sus médicos tratantes. La terapia puede continuar después de la inscripción.
Los pacientes deben suspender toda la terapia durante dos semanas antes de la aféresis y durante dos semanas antes de la dosis alta de melfalán. Si se espera que transcurran más de dos semanas entre la aféresis y la dosis alta de melfalán, los pacientes pueden reanudar el tratamiento después de la aféresis a discreción de sus médicos tratantes.
Melfalán en dosis altas (día -2)
Los pacientes serán admitidos en el hospital el día -3 o -2 y serán examinados por el médico tratante y pruebas de laboratorio de rutina, que incluirán parámetros de monitoreo para el síndrome de lisis tumoral, antes de comenzar el protocolo de tratamiento. Se extraerá sangre para las pruebas de laboratorio de monitoreo de MM (SPEP, inmunoglobulinas cuantitativas y análisis de cadenas ligeras libres en suero) antes del inicio de la terapia si dichas pruebas no se han extraído dentro de los 7 días posteriores al ingreso.
La terapia de dosis alta consistirá en melfalán a una dosis de 200 mg/m2 administrado por vía intravenosa durante alrededor de 20 minutos el día -2. La dosis de melfalán se reducirá a 140 mg/m2 para pacientes >70 años de edad o para pacientes de cualquier edad que, a criterio del médico tratante, pueden no tolerar una dosis de 200 mg/m2 Todos los pacientes recibirán profilaxis antiemética estándar, que puede incluir dexametasona, y profilaxis antibiótica estándar.
Reinfusión de células madre (día 0)
La infusión de células madre se llevará a cabo el día 0, al menos 18 horas después de la administración de melfalán en dosis altas. Las células madre se infundirán por vía intravenosa durante alrededor de 20 a 60 minutos después de la premedicación de acuerdo con la práctica institucional estándar. Se deben infundir al menos 2 x 106 progenitores CD34+/kg de peso corporal. Además, deben estar disponibles al menos 1 x 106 progenitores CD34+/kg de peso corporal como un producto de reserva de células madre para ser infundido en caso de retraso en el injerto o falla tardía del injerto. El G-CSF debe administrarse por vía subcutánea a partir del día 5, dosificado de acuerdo con la práctica institucional estándar. Otras medidas de atención de apoyo, como el apoyo transfusional, se realizarán de acuerdo con las pautas institucionales estándar.
Infusión de células CART19 (día 12-14)
Se administrará una dosis única de células T transducidas con CART-19 que consiste en hasta 5 x 107 células CART-19. La dosis mínima aceptable para la infusión de células transducidas con el vector CD19 TCRZ4-1BB es 1 x 107. Las células CART-19 se administrarán como una dosis única por infusión intravenosa rápida el día 12-14 después de la infusión de células madre. Si el paciente no cumple con alguno de los criterios de inclusión descritos aquí en la ventana de 12-14 días, la infusión de CART-19 puede retrasarse más allá del día 12-14 hasta que se satisfagan los criterios.
Lenalidomida de mantenimiento
Los sujetos que recibieron y toleraron lenalidomida de mantenimiento después de su primer ASCT reiniciarán la terapia de mantenimiento con lenalidomida alrededor del día 100, asumiendo que no hay contraindicaciones a juicio del médico tratante. La dosis inicial será de 10 mg al día, a menos que la experiencia previa indique una dosis inicial alternativa para un paciente en particular. La terapia de mantenimiento continuará hasta la progresión de la enfermedad o la intolerancia.
Preparación y administración del fármaco de estudio
Las células T CART-19 se preparan en el CVPF y no se liberan del CVPF hasta que se cumplan los criterios de liberación aprobados por la FDA para las células infundidas (por ejemplo, dosis celular, pureza celular, esterilidad, número de copias promedio de vectores/célula, etc.). Una vez liberadas, las células se llevan al lado de la cama para su administración.
Descongelación celular. Las células congeladas se transportarán en hielo seco al lado de la cama del sujeto. Las células se descongelarán junto a la cama usando un baño de agua mantenido entre 36°C y 38°C. La bolsa se masajeará suavemente hasta que las células se hayan descongelado. No deben quedar grumos congelados en el recipiente. Si el producto de células CART-19 parece tener un daño o la bolsa tiene una fuga, o si parece estar comprometida, no debe infundirse y debe devolverse al CVPF como se especifica a continuación.
Premedicación. Los efectos secundarios después de las infusiones de células T incluyen fiebre transitoria, escalofríos y/o náuseas; véase Cruz et al. para revisión (Cytotherapy 2010; 12(6):743-749). Se recomienda que el sujeto sea premedicado con acetaminofeno e hidrocloruro de difenhidramina antes de la infusión de células CART-19. Estas medicaciones pueden repetirse cada seis horas según sea necesario. Se puede recetar un ciclo de medicación antiinflamatoria no esteroidea si el paciente continúa teniendo fiebre que no alivia con acetaminofeno. Se recomienda que los pacientes no reciban corticosteroides sistémicos como hidrocortisona, prednisona, metilprednisolona o dexametasona en ningún momento, excepto en el caso de una emergencia potencialmente mortal, ya que esto puede tener un efecto adverso sobre las células T.
Reacción febril. En el caso poco probable de que el sujeto desarrolle sepsis o bacteriemia sistémica después de la infusión de células T con CAR, se deben iniciar cultivos apropiados y tratamiento médico. Si se sospecha un producto de células T CART-19 contaminado, se puede volver a analizar la esterilidad del producto usando muestras archivadas que se almacenan en el CVPF.
Administración. La infusión se llevará a cabo en una habitación aislada en Rhoads, tomando precauciones para pacientes inmunosuprimidos. Las células T transducidas se administrarán mediante infusión intravenosa rápida a un caudal de alrededor de 10 ml a 20 ml por minuto a través de un conjunto de sangre tipo Y sin látex de calibre 18 con una llave de paso de 3 vías. La duración de la infusión se basará en el volumen total a infundir y la velocidad de infusión recomendada. Cada bolsa de infusión tendrá adherida una etiqueta que contenga lo siguiente: “SOLO PARA USO AUTÓLOGO”. Además, la etiqueta tendrá al menos dos identificadores únicos, como las iniciales del sujeto, la fecha de nacimiento y el número de estudio. Antes de la infusión, dos personas verificarán de forma independiente toda esta información en presencia del sujeto y así confirmarán que la información se corresponde correctamente con el participante.
El equipo médico de emergencia (es decir, el carrito de emergencia) estará disponible durante la infusión en caso de que el sujeto tenga una respuesta alérgica, una crisis hipotensiva grave o cualquier otra reacción a la infusión. Los signos vitales (temperatura, frecuencia respiratoria, pulso y presión arterial) se tomarán antes y después de la infusión, luego cada 15 minutos durante al menos una hora y hasta que estos signos sean satisfactorios y estables. Se le pedirá al sujeto que no se vaya hasta que el médico considere que es seguro para él o ella hacerlo.
Embalaje
La infusión estará compuesta por una dosis única de 1-5 x 107 células transducidas con CA T19, con una dosis mínima aceptable de 1 x 107 células c A r T-19 para infusión. Cada bolsa contendrá una alícuota (el volumen depende de la dosis) de criomedio que contiene los siguientes reactivos de grado infusible (% v/v): 31,25% de plasmalyte-A, 31,25% de dextrosa (5%), 0,45% de NaCl, hasta 7,5% DMSO, 1% de dextrano 40, 5% de albúmina de suero humano.
Aféresis
Se lleva a cabo un procedimiento de aféresis de gran volumen (12-15 litros o 4-6 volúmenes de sangre) en el centro de aféresis. Se obtienen PBMC para CART-19 durante este procedimiento. De una sola leucocitaféresis, la intención es cosechar al menos 5 x 109 glóbulos blancos para fabricar células T CART-19. También se obtienen y criopreservan leucocitos en sangre de referencia para los requisitos retrospectivos de la FDA y para investigación. Se espera que el producto celular esté listo para su liberación alrededor de 2-4 semanas después. Cuantificación de subconjuntos de células por citometría de flujo, incluida la determinación de células B CD19 y CD20. La evaluación de la línea de base se realiza para el anticuerpo anti-VSV-G y anti-murino humano (HAMA). Si un sujeto ha tenido previamente una colección de aféresis adecuada acumulada de acuerdo con las Buenas Prácticas de Fabricación actuales en la Instalación de Producción de Vacunas y Células Clínicas, estas células pueden usarse como fuente de células para la fabricación de CART-19. El uso de un producto de aféresis en banco evitaría el gasto, el tiempo y el riesgo para el sujeto de someterse a una recolección de aféresis adicional.
Quimioterapia citorreductora
La quimioterapia que agota los linfoides será melfalán en dosis altas como se describe aquí.
Infusión de CART-19
La infusión comenzará el día 12-14 después de la reinfusión de células madre.
El día 12-14 antes de la primera infusión, los pacientes tendrán un hemograma completo con diferencial y una evaluación de los recuentos de CD3, CD4 y CD8, ya que la quimioterapia se administra en parte para inducir linfopenia.
La primera dosis se administrará usando una sola dosis. Las células se descongelan al lado de la cama del paciente. Las células descongeladas se administrarán a una velocidad de infusión tan rápida como la tolerada, de modo que la duración de la infusión sea de alrededor de 10-15 minutos. Para facilitar la mezcla, las células se administrarán simultáneamente usando un adaptador en Y. Los sujetos serán infundidos y premedicados como se describe aquí. Se evaluarán los signos vitales de los sujetos y se realizará oximetría de pulso antes de la dosificación, al final de la infusión y cada 15 minutos a partir de entonces durante 1 hora y hasta que sean estables y satisfactorios. Se obtiene una muestra de sangre para determinar un nivel de CART-19 basal en cualquier momento antes de la primera infusión y de 20 minutos a 4 horas después de cada infusión (y se envía a TCSL).
A los pacientes que experimenten toxicidades relacionadas con el melfalán en dosis altas se les retrasará el programa de infusión hasta que estas toxicidades se hayan resuelto. Las toxicidades específicas que justifican el retraso de las infusiones de células T incluyen: 1) Pulmonar: Necesidad de oxígeno suplementario para mantener la saturación superior al 95% o presencia de anomalías radiográficas en la radiografía de tórax que son progresivas; 2) Cardíaca: Nueva arritmia cardíaca no controlada con tratamiento médico 3) Hipotensión que requiere apoyo vasopresor. 4) Infección activa: Hemocultivos positivos para bacterias, hongos o virus dentro de las 48 horas posteriores a la infusión de células T.
Manejo de la toxicidad
Proliferación incontrolada de células T. La toxicidad asociada con las infusiones de células T alogénicas o autólogas se ha tratado con un curso de inmunosupresión farmacológica. Se ha informado que la toxicidad asociada al cuerpo T responde a los corticosteroides sistémicos. Si se produce una proliferación incontrolada de células T (toxicidad de grado 3 o 4 relacionada con las células CART-19), los sujetos pueden ser tratados con corticosteroides. Los sujetos serán tratados con metilprednisolona en pulsos (2 mg/kg i.v. divididos cada 8 h x 2 días), seguido de una disminución gradual rápida.
Además, según las observaciones de sujetos tratados con otro protocolo, existe cierta preocupación por el síndrome de activación de macrófagos (MAS), aunque se espera que la carga tumoral CD19+ sea mucho menor en pacientes con mieloma que en pacientes con CLL. El tratamiento y el momento del tratamiento de esta toxicidad quedarán a criterio del médico del paciente y del investigador del estudio. El tratamiento sugerido puede incluir: si el sujeto tiene fiebre superior a 101°F que dura más de 2 días consecutivos y no hay evidencia de infección (hemocultivos negativos, CXR u otra fuente), se puede considerar tocilizumab 4 mg/kg. La adición de corticosteroides y terapia anti-TNF se puede considerar a discreción del médico.
Agotamiento de células B. Es posible que se produzca depleción de células B e hipogammaglobulinemia. Esto es común con las terapias dirigidas contra c D20. En caso de hipogammaglobulinemia clínicamente significativa (es decir, infecciones sistémicas), los sujetos recibirán inmunoglobulina intravenosa (IGIV) según las pautas de dosificación clínica establecidas para restaurar los niveles normales de inmunoglobulina sérica, como se ha hecho con Rituximab.
Fallo primario del injerto. El fallo primario del injerto (es decir, sin injerto) puede ser más común después del segundo ASCT en comparación con el primer ASCT. Los criterios de elegibilidad estipulan que deben estar disponibles suficientes células madre para reinfusión de rescate a discreción del médico tratante en caso de fallo primario del injerto.
Resultados
En este ensayo en curso, tres pacientes con mieloma múltiple avanzado refractarios al tratamiento se han tratado con CTL019. Los resultados de dos de estos pacientes muestran que ambos han tenido efectos antitumorales sustanciales de la terapia CTL019 según la evaluación de eficacia primaria en el punto de tiempo de tres meses. El tercer paciente aún no ha alcanzado el período de tres meses. Los resultados de los dos pacientes se describen con más detalle a continuación.
La primera paciente con mieloma completó su evaluación de respuesta de 100 días y tuvo una muy buena respuesta a la terapia de CART19. Se realizaron las siguientes pruebas con los siguientes resultados:
SPEP/inmunofijación: negativo
inmunofijación en orina: banda de cadena ligera kappa débil e inconmensurable en su inmunofijación (también presente en el día 38, por lo que no es nueva)
De lo contrario, la paciente cumplirá los criterios para una remisión completa estricta que incluye:
-relación de cadenas ligeras libres en suero: normal
-biopsia de médula ósea: negativa
-inmunofenotipificación de IgA: IgA está por debajo del límite de detección
Aparte del resultado de la cadena ligera kappa débil e inconmensurable de la inmunofijación de la orina, el paciente cumplió con todos los criterios para una “remisión completa estricta”. El resumen de la inmunofenotipificación de células plasmáticas en 3 puntos de tiempo (día -2, día 38, día 103) se muestra en la Figura 39 y demuestra que la IgA del paciente está por debajo del límite de detección. El resumen muestra una gran carga de mieloma en el día -2 y ninguna detectable en los días 38 y 103, lo que clasifica al paciente como “ERM negativo” por análisis de flujo. En el día 103, el resumen muestra la recuperación de células plasmáticas CD19+ policlonales, y células B normales. El paciente no tenía síntomas de enfermedad o terapia y funciona como una persona normal.
El segundo paciente tratado aún no ha alcanzado el punto de tiempo de 100 días. Sin embargo, en este momento, está bien, pero es demasiado pronto para determinar el efecto de la infusión de CTL019.
Ejemplo 7: Terapia combinada de inhibidor de cinasa/células T CAR19 para el linfoma de células del manto La terapia adoptiva de células T es muy prometedora para el tratamiento de las neoplasias linfoides. Respuestas clínicas prometedoras en linfoma linfocítico pequeño/leucemia linfocítica crónica (SLL/CLL) y leucemia linfocítica aguda (ALL), mediante la transferencia adoptiva de células T autólogas transducidas con receptores de antígenos quiméricos (CAR) contra el antígeno CD19 específico de células B (células T CAR19/células CART19) usando CTL109. Recientemente, hemos informado datos iniciales sobre 3 pacientes con SLL/CLL refractiva a quimioterapia inscritos en un ensayo de fase I para tratar neoplasias malignas positivas para CD19 usando CAR específico de CD19 (células T CAR19/células CART19). El enfoque utilizado implicó la modificación genética de células T en masa derivadas del paciente usando un lentivirus para expresar un CAR dirigido a CD19 que contiene dominios de señalización derivados de CD137 y TcRz. Para este estudio, las células se expandieron usando nuestra metodología de expansión de perlas anti-CD3 y -CD28, y las células se infundieron temprano después de la linfodepleción sin soporte de citocinas (Kalos M et al. (2011) Sci Transl Med. 3: 95ra73; y Porter d L et al. (2011) N Engl J Med. 365: 725-733). Estos primeros resultados fueron extremadamente prometedores: (i) después de un solo curso de tratamiento, 2/3 pacientes lograron remisiones completas y permanecen libres de enfermedad ahora, 15+ meses después del tratamiento, mientras que el tercer paciente, que fue tratado con corticosteroides poco después de la aparición de la infusión de células T demostró una fuerte respuesta parcial. (ii) En estos pacientes pudimos recapitular los elementos que se creían necesarios para la máxima eficacia de las estrategias basadas en la terapia adoptiva de células T, a saber, expansión sólida de células T in vivo, erradicación de la enfermedad, contracción de células T y persistencia funcional a largo plazo. Hasta la fecha, 10 pacientes con SLL/CLL han sido tratados y 2 permanecen en remisión clínica y molecular completa, 5 experimentan remisión parcial y 3 muestran falta de respuesta medible. En otro estudio, dos pacientes con ALL de células B lograron una remisión completa y 1 recayó con células leucémicas que carecen de expresión de CD19.
El linfoma de células del manto (MCL), tanto antes como después de la transformación de células grandes, probablemente también se beneficiará de la terapia adoptiva basada en CART19, en particular cuando se combina con inhibidores de cinasas como los que afectan directamente a las células MCL.
Para analizar más a fondo la combinación de la terapia adoptiva basada en CART19 en combinación con inhibidores de cinasa, se utilizarán cribados de alto rendimiento para evaluar varios inhibidores que se dirigen a las cinasas críticas para la patogénesis de MCL: CDK4/6, BTK y mTOR en combinación con células CART19. Las combinaciones más prometedoras se evaluarán con mayor detalle, tanto in vitro como in vivo, en un modelo de ratón de xenotrasplante de MCL, que en última instancia puede guiar el desarrollo de un protocolo clínico para evaluar la combinación de inhibidor de cinasa de molécula pequeña y la inmunoterapia con células CART en pacientes con MCL.
En este estudio, se realizarán estudios preclínicos para determinar la eficacia clínica potencial de este enfoque en los diversos subtipos de MCL y para evaluar la capacidad de dirigirse terapéuticamente a las células MCL usando células CART19 solas o en combinación con inhibidores de moléculas pequeñas de proteínas seleccionadas de la familia de cinasas cuya expresión y actividad es fundamental para la supervivencia y el crecimiento de las células MCL.
Plan de investigación
En un entorno preclínico, se evaluará la capacidad para dirigirse terapéuticamente a células MCL, tanto células cultivadas como de tipo primario, usando inhibidores de cinasas con relevancia patogénica documentada en células MCL y CART19. Se utilizará un ensayo de MTT de alto rendimiento para determinar el efecto de estos agentes para identificar posibles combinaciones óptimas, dosificación y tiempo de aplicación del agente. Las 2-3 combinaciones más prometedoras se evaluarán con mayor detalle en lo que respecta a la función celular, la señalización celular basada en la fosforilación y la expresión génica, primero in vitro y luego in vivo en el modelo de xenotrasplante MCL.
Estudios in vitro para caracterizar la capacidad de combinaciones de inhibidor de cinasa/células CART-19 para atacar eficazmente las células MCL
Con este objetivo, se examinarán los ensayos funcionales, fenotípicos, bioquímicos y moleculares enumerados anteriormente para estudiar in vitro el impacto de los inhibidores de cinasa de molécula pequeña en las células MCL, así como para examinar las interacciones entre las células CART19 y las células MCL y el impacto de los inhibidores sobre estas interacciones.
Los puntos de referencia para lograr este objetivo serán generar un conjunto de datos completo para:
i. documentar que las células CART19 son activadas y lisan las células MCL primarias y cultivadas;
ii. demostrar que los inhibidores de cinasa seleccionados mejoran la capacidad entre sí y/o las células CART19 para eliminar las células MCL sin afectar negativamente la función de las células CART19 cuando se aplican apropiadamente con respecto a la dosis y, para algunos, el momento de la administración del inhibidor frente a las células CART19; y iii. establecer un régimen para el programa y la dosificación del inhibidor de BTK que se utilizará en los experimentos de xenotrasplante de MCL in vivo con ratones NSG.
Los objetivos de este estudio son, por ejemplo, evaluar si identificar las combinaciones terapéuticas óptimas de inhibidores de moléculas pequeñas que se dirigen a cinasas críticas para la patobiología del MCL: CDK4, BTK y mTOR junto con células CART19, monitorear la actividad CART19 y caracterizar la función, bioquímica, y efectos moleculares de la terapia sobre MCL.
Estos estudios deben establecer un esquema racional de programación para el momento y la dosis del inhibidor de cinasa del tratamiento BTK junto con la terapia de CART19 que se evaluará in vivo en el objetivo 2.
Estudios in vivo para evaluar la capacidad de las células CART19 para atacar el linfoma folicular, solas y en combinación con el inhibidor de BTK
Con este objetivo, probaremos en modelos animales la capacidad de la combinación o combinaciones de células CART19/inhibidor seleccionadas para afectar el crecimiento de células MCL primarias y establecidas.
Los puntos de referencia para lograr este objetivo serán generar un conjunto de datos para:
I. demostrar que la combinación seleccionada de inhibidor/células CART19 mejora notablemente la supervivencia de los animales injertados con MCL en comparación con los controles (animales tratados con agente único y simulado);
ii. establecer un régimen para el programa y la dosificación de la combinación seleccionada de inhibidor de cinasa/CART19 que se utilizará como base para un ensayo clínico futuro.
Los objetivos de este estudio incluyen evaluar el tratamiento y el programa de dosis definidos en el objetivo 1 para la combinación identificada de inhibidor de cinasa/CART19 más inhibidor de BTK, y probar si el tratamiento de BTK tiene sinergia con CART19 para atacar MCL en ratones NSG xenotrasplantados con células MCL, tanto cultivadas como primarias.
Se utilizarán los siguientes tipos de células, compuestos, animales y metodologías experimentales para lograr los objetivos propuestos:
Células MCL:
Cuatro líneas celulares de MCL (Jeko-1, Mino, SP-49 y SP-53) y muestras viables congeladas de 15 MCL primarios (12 típicos y 3 blastoides). Mientras que las líneas celulares crecen bien de forma espontánea, las células primarias se cultivarán solas así como en presencia de medio acondicionado recogido de células estromales de médula ósea HS5 para mejorar su viabilidad.
Células CART19:
Las células T humanas primarias diseñadas para expresar CAR19 se generarán mediante la transducción de lentivirus y los protocolos establecidos ((Kalos M et al. (2011) Sci Transl Med. 3: 95ra73; y Porter DL et al. (2011) N Engl J Med. 365: 725-733). Después de un solo evento de transducción, las células T típicamente expresan CAR19 a frecuencias superiores al 30%.
Nuestros estudios utilizarán poblaciones CART19 de cinco pacientes con SLL/CLL (50-100 viales/paciente con 1x107 células/vial ya están disponibles). Las células CART19 se identificarán usando un anticuerpo de idiotipo específico anti-CAR19 (STM). La actividad de CART19 se controlará tanto in vitro como in vivo en ratones NSG de manera estandarizada usando líneas celulares CD19+ NALM-6, K562 negativa para CD19 y K562 transducida por CD19. Aunque la función de la célula CART19 no está restringida por MHC, también se utilizarán células CART19 de al menos 5 pacientes con MCL.
Inhibidores de cinasa.
Se probarán inhibidores de las siguientes cinasas: CDK4/6 (PD0332991), BTK (PCI-32765), mTORC1 (rapamicina), MNK (4-Amino-5-(4-fluoroanilino)-pirazolo[3,4-d]pirimidina (Marzec M, et al. PLoS One 6:e24849); y un nuevo compuesto de Eli Lilly (Gupta M, et al. (2012) Blood 119:476-487); mTOR (OSI-027), y PI3K/mTOR dual (PF-04691502).
Los compuestos se evaluarán primero en el espectro predeterminado de dosis eficaces, incluidas las concentraciones no tóxicas alcanzadas en el suero de los pacientes, para asegurar una inhibición óptima de la cinasa.
Animales:
Los experimentos in vivo se realizarán usando ratones NOD-SCID-IL-2Rgc null (NSG) que se crían y están disponibles en Stem Cell y Xenograft Core usando reproductores obtenidos del Jackson Laboratory (Bar Harbor). Los ratones se alojarán en condiciones estériles usando microaisladores con filtro HEPA y se alimentarán con alimentos irradiados y agua acidificada.
Los ratones trasplantados se tratan con antibióticos (neomicina y polimixina) durante la duración del experimento. Se utilizarán animales de seis a ocho semanas de edad, mezclas iguales de machos y hembras, para todos los estudios de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales.
Hemos utilizado animales NSG en estudios previos de transferencia adoptiva de células T específicamente para evaluar la actividad diferencial de las células CART19 (Witzig TE et al. (2010) Hematology Am Soc Hematol Educ Program.
2010:265-270, ensayo MTT). El ensayo MTT de alto rendimiento para evaluar el crecimiento de células MCL se realizará primero en respuesta a los inhibidores de cinasa aplicados solos o en varias combinaciones. Este ensayo es capaz de determinar simultáneamente la tasa de proliferación celular y la viabilidad, lo que permite una evaluación eficiente de muchas combinaciones posibles de inhibidores de moléculas pequeñas en presencia o ausencia de células CART19. Los aspectos clave de este análisis serán caracterizar el efecto del fármaco con respecto al posible efecto sinérgico, aditivo o antagonista. Además, se evaluará el efecto de los inhibidores de moléculas pequeñas sobre las células CART19. Si bien la inhibición de BTK debe ser específica de células B, la inhibición de mTOR y CDK4/6 afectará a las células CART19. Establecer el momento adecuado de la aplicación del fármaco para minimizar su efecto potencial en las células CART19 será uno de los objetivos de estos experimentos.
Para realizar la prueba, las células MCL se sembrarán en placas de 96 pocillos a 1x104 células/pocillo, por triplicado, y se exponen a inhibidores de cinasa o medio en diversas combinaciones y concentraciones de células c A r T-19. Después de 48 y 74 horas, el número relativo de células metabólicamente activas se determinará mediante el uso del ensayo colorimétrico de reducción de MTT (Promega).
La significancia de la diferencia entre los valores medios (+/- S.D.) de los controles y las diferentes condiciones de tratamiento se evaluará usando la prueba de la t de Student con el valor de P de <0,05 considerado estadísticamente significativo.
Ensayos de apoptosis y proliferación celular:
Las combinaciones de fármacos más prometedoras se evaluarán a continuación en los ensayos de marcaje CFSE y marcaje terminal dUTP de extremos cortados (tunel) para determinar los componentes citostáticos y citotóxicos de la inhibición del crecimiento celular MCL, respectivamente. En el primer ensayo, las células MCL se marcarán con la adición de CFSE del inhibidor de BTK y/o células CART-19 sin marcar. Después de 48 horas, las células cultivadas serán analizadas por FACS para el patrón de marcaje CFSE de las células de tipo MCL. El ensayo de túnel se realizará usando el kit de ensayo de fragmentación de ADN ApoAlert de BD Biosciences de acuerdo con el protocolo del fabricante.
En resumen, las células MCL se cultivarán con los inhibidores y/o células CART19 durante 48 o 72 horas. Después de lavarlas, las células se teñirán con anticuerpo anti-CD20 marcado y se permeabilizarán, lavarán e incubarán en amortiguador TdT durante 1 hora a 37°C. La reacción se detendrá, las células se lavarán, se resuspenderán y se analizarán mediante citometría de flujo usando el software CellQuest PRO.
Ensayos funcionales de CART19:
Mediremos la actividad efectora de las células CART19 contra las líneas celulares de MCL usando ensayos de desgranulación de CD107, ensayos de secreción de citocinas intracelulares (ICS), ensayos de citólisis de proliferación y ensayos de detección de citocinas múltiples (32). Para los ensayos de desgranulación e ICS, el efector (células T) y la diana (células tumorales) se incubarán conjuntamente en presencia de anticuerpo anti-CD107 durante 4 horas a E:T de 0,2:1, seguido de tinción para la superficie (CAR19, CD3, CD8, CD4) y marcadores de citocinas intracelulares según protocolos establecidos. La citólisis de células MCL se evaluará usando ensayos de citólisis basados en citometría de flujo. Para los ensayos de proliferación, las células efectoras se precargarán con CFSE (carboxifluoresceína succinimidil estercarboxi-fluorosceína-succinil esterasa), se mezclarán con las células diana a E:T de 0,2:1, se incubarán conjuntamente a 37°C durante 4 días, se tiñerán para marcadores de superficie (CAR19, CD3, CD8, CD4) y se analizarán para dilución de CFSE por citometría de flujo.
Ensayos de citocinas múltiples.
Mediremos la producción de citocinas por las células CART19 en respuesta a las dianas de MCL usando ensayos de perlas basados en Luminex como se describe en (STM32). Para estos análisis utilizaremos el kit Invitrogen 30-plex que mide simultáneamente IL-Ip, IL-1RA, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12 (p40/p70), IL-13, IL-15, IL-17, TNF-a, IFN-a, IFN-y, GM-CSF, MIP-1a, MIP-1p, IP-10, MIG, Eotaxina, RANTES, MCP-1, VEGF, G-CSF, EGF, FGF-básico y HGF en suero, plasma o sobrenadante de cultivo de tejidos.
Análisis de citometría de flujo multiparamétrico de células CART19T:
Mediremos la modulación de los marcadores de superficie asociados con la activación funcional y la supresión en las células CART19 después de la incubación conjunta con células tumorales usando citometría de flujo de cuatro colores y un BD LSRII personalizado equipado con 4 láseres (azul (488 nM), violeta (405 nM) , verde (532 nM) y rojo (633 nM) disponibles a través del Abramson Cancer Center Flow Cytometry Core de la Universidad de Pensilvania. Todos los datos de citometría de flujo se analizarán con el software FlowJo (TreeStar, San Carlos, CA). Estos análisis se realizarán esencialmente como se describe en (STM42), usando un canal de descarga para excluir células muertas y células diana (CD19+), y un reactivo específico de idiotipo CAR19 para detectar células CART19 (STM). Evaluaremos los siguientes marcadores en células CART19-positivas y negativas (CD3+/CD8+ y CD3+/CD4+) después de la coincubación con células tumorales, en células intactas o permeabilizadas según sea necesario. Hemos establecido paneles multiparamétricos para estos marcadores:
-función de activación/efectora: CD25, CD154, CD134, CD137, CD69, CD57, CD28, T-bet
- inhibición: CD152 (CTLA4), PD1, LAG3, CD200
- supresión (Treg) CD4+/CD25++/CD127-, Fox-P3+
Simultáneamente, las células MCL identificadas por tinción de CD19 y CD5, serán examinadas para la expresión de las proteínas inmunosupresoras: CD174 (PD-L1) CD173 (PD-L2) y CD152.
Impacto del inhibidor en la señalización celular:
Esta parte del estudio se centrará únicamente en los compuestos seleccionados; los que resultaron ser los más efectivos en los ensayos funcionales (crecimiento celular, proliferación y apoptosis) descritos anteriormente. El efecto se estudiará por separado para cada fármaco y para las combinaciones seleccionadas, y los estudios se ajustarán a los compuestos específicos. por ejemplo, mientras que la combinación de inhibidores de mTORC1 y MNK evaluará la señalización de mTORC1, en particular la fosforilación de eIF-4E, la inhibición de BTK se centrará en las vías PI3K-AKT y MEK-ERK, y la inhibición de CDK4/6 en la fosforilación de Rb. Estos estudios se realizarán mediante transferencia Western usando anticuerpos fosfoespecíficos como se describe (Marzec M et al. (2006) Blood 108:1744-1750; Marzec M, et al. (2008) Blood 111: 2181-2189; Zhang Q, et al. (2011) Proc Natl Acad Sci USA 108: 11977-11982). En resumen, las células MCL se lisarán y los extractos de proteínas se analizarán usando el método Lowry (Bio-Rad) y se cargarán en el gel de poliacrilamida. Para examinar la fosforilación de proteínas, las membranas transferidas se incubarán con los anticuerpos específicos del fósforo, por ejemplo, los específicos para S6rp S235/236, eIF4E S209, 4E-BP1 T37/46, 4E-BP1 T70 (señalización celular) para evaluar la actividad de mTORC1 y MNK y su inhibición. A continuación, las membranas se incubarán con los anticuerpos secundarios apropiados conjugados con peroxidasa. Las transferencias se desarrollarán usando el sistema ECL Plus de Amersham.
Análisis de expresión génica a escala del genoma:
La inhibición de la señalización celular generalmente conduce a cambios en la transcripción de genes. Para determinar los efectos del inhibidor seleccionado, o algunos inhibidores sobre la transcripción de genes en MCL, se realizará un análisis de expresión de genes a escala del genoma como se describe en Marzec M et al. (2008) Blood 111: 2181-2189; Zhang Q, et al. (2011) Proc Natl Acad Sci USA 108: 11977-11982. En resumen, las células se tratarán en cultivos por triplicado con el inhibidor seleccionado o su diluyente durante 0, 4 y 8 horas. El ARN total se purificará adicionalmente para enriquecerlo en ARNm que se transcribirá de manera inversa, se marcará y examinará mediante hibridación al microchip Affimetrix contra todos los exones de genes conocidos. Los datos de la micromatriz se normalizarán y resumirán usando RMA como se implementa en el algoritmo GeneSpring y MAS5. Los valores de p resultantes se corregirán para pruebas múltiples usando la tasa de descubrimiento falso (FDR) mediante el método de aumento de Benjamini-Hochberg. Las pruebas de expresión diferencial se llevarán a cabo usando una variedad de herramientas, incluidas SAM y PartekPro. Los genes emergentes de interés luego se agruparán en función de patrones de expresión (GeneSpring o Spotfire), y los grupos se analizarán en busca de grupos funcionales y vías en las bases de datos de KEGG, Ingenuity Pathway Analysis y Gene Ontology usando el NIH-David como herramienta de búsqueda. Para los genes identificados en base a los datos, la conformación de expresión independiente por el RTPCR cuantitativo se realizará en un grupo más grande de muestras (al menos 20) de varios tipos de MCL (estándar frente a blastoide y SOX11 positivo frente a SOX11 negativo ).
Análisis de la secuencia de ADN del exoma completo:
Para caracterizar mejor los casos de MCL con respecto a su patogénesis y, en la medida de lo posible, la respuesta a las terapias de combinación propuestas aquí, se examinará la secuencia de ADN exómico. La captura del exoma completo y la secuenciación de próxima generación del MCL y las muestras de ADN de sangre periférica normal se realizarán usando la matriz de exoma humano NimbleGen Sequence Capture 2.1M y el instrumento Illumina HiSeq 2000/1000.
Evaluación del efecto del tratamiento en los tumores xenotrasplantados:
Los ratones NSG portarán los tumores MCL (derivados de ambas líneas celulares MCL: Jeko y Mino y células primarias implantadas como fragmentos de tejido o, menos preferiblemente, suspensiones celulares). Los tumores se propagarán mediante la implantación subcutánea de los pequeños fragmentos tumorales. La terapia se iniciará una vez que los tumores alcancen 0,2-0,3 cm de diámetro. El(los) inhibidor(es) de cinasa se administrará(n) por sonda a la dosis y el tiempo preseleccionados in vitro (por ejemplo, esperamos aplicar el inhibidor de BTK simultáneamente con las células CART19, dada su especificidad de células B y la falta esperada de cualquier efecto inhibidor sobre las células CART19). Las células CART-19 se inyectarán en la vena de la cola de los ratones portadores de tumores a una dosis de 1x107/ animal, el(los) inhibidor(es) de cinasa se administrará(n) por sonda a la dosis y el momento preseleccionados in vitro. una dosis que hemos establecido es suficiente para erradicar de forma reproducible las células malignas y, al mismo tiempo, no inducir la enfermedad xenoinjerto contra huésped. Un gran lote maestro de células CART19 (1x 1010) se generará y congelará para minimizar la variabilidad asociada con las diferencias de las células efectoras. La medida principal de estos experimentos será la supervivencia, que evaluaremos usando curvas de Kaplan/Meier. Como medida secundaria, evaluaremos la expansión diferencial de las células CART19 en animales después de la infusión de células T. Esto será posible por el hecho de que el producto de células T infundido estará compuesto por células CART19 positivas y negativas en una proporción definida. Para estos análisis, los animales se sangrarán semanalmente mediante sangrado en la vena de la cola (25 microlitros cada vez), seguido de lisis de glóbulos rojos y tinción para CD3, CD4, CD8 y CART19 humanos. La expansión preferencial de células CART19 (al menos un aumento de 2 veces en la relación CART19+/CART19- será evidencia de expansión celular CART19 selectiva impulsada por MCL. Para evaluar los resultados del tratamiento, los volúmenes de los tumores subcutáneos implantados se medirán determinados de la siguiente manera, de acuerdo con la fórmula: volumen = 0,4ab2, donde a y b designan respectivamente los diámetros largo y corto del tumor. Las diferencias de volumen tumoral entre los grupos de ratones tratados y no tratados se analizarán estadísticamente usando una prueba t estándar. Los ratones serán sacrificados en el punto final de los experimentos (>30 días), o si los tumores alcanzan > 1,2 cm de diámetro, o cuando se observa cualquier evidencia de la angustia del animal. Las diferencias de volumen tumoral entre los grupos de ratones tratados y no tratados se analizarán estadísticamente usando una prueba t estándar. Los tumores, así como los órganos internos, serán recolectados, procesados y analizados por histología y, para tejidos seleccionados, por inmunohistoquímica usando la batería de anticuerpos contra células B (CD20, CD79a, Pax-5, CD10, BCL-6) y células T (CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, TIA-1) y el marcador de proliferación Ki-67.
Análisis estadístico:
En los estudios funcionales in vitro, la significancia de la diferencia entre los valores medios (+/- S.D.) de los controles y las diferentes condiciones de tratamiento se evaluará usando la prueba de la t de Student con el valor de P <0,05 considerado estadísticamente significativo. Según nuestras experiencias anteriores, se espera que las diferencias entre los grupos de ratones experimentales sean grandes. Por lo tanto, se utilizarán 10 ratones NSG para cada grupo de tratamiento, lo que garantizará al menos el 90% de potencia con un nivel de error de tipo 1 de 0,05 con una prueba de dos muestras / de dos lados, dada la relación entre la diferencia en las medias del tratamiento y la desviación estándar es de al menos 3, lo que se espera. Los datos se presentarán como media ± SEM. La comparación entre los grupos se realizará mediante la prueba de la t de dos muestras. Se considera significativo un valor de p <0,05. Para los estudios de supervivencia sin tumor, se utilizarán grupos de 10 ratones para comparar la supervivencia, y se registrará el estado de la enfermedad (tumor frente a sin tumor) y el tiempo libre de tumor para cada ratón. Se trazará la curva de supervivencia de Kaplan-Meier y se realizará la prueba de rango logarítmico para comparar las curvas de supervivencia. El nivel de significancia se controla en 0,05.
Ejemplo 8: Terapia combinada de ibrutinib/células T CAR19 para el linfoma de células del manto
Los experimentos descritos en este ejemplo caracterizan la actividad de CART19 en combinación con el tratamiento con ibrutinib para el tratamiento del linfoma de células del manto in vitro e in vivo. Ibrutinib es un inhibidor de molécula pequeña de BTK que se utiliza a menudo para el tratamiento de algunos cánceres hematológicos. Los experimentos in vitro descritos aquí incluyen la evaluación de la proliferación, la producción de citocinas, la desgranulación de CD107a y la citotoxicidad. Se utilizaron modelos de ratón de Xenoplant para investigar la eficacia y la dosis óptima de CART19 con el tratamiento con ibrutinib in vivo. Aunque ibrutinib muestra una actividad considerable en MCL, alrededor del 30% de los pacientes no responden, y entre los que responden, solo 21% a alrededor de un tercio experimentan una remisión completa (Wang et al. NEJM 369,6(2013):507-16). El logro de una remisión completa se asocia con una mejor supervivencia libre de progresión. Además, la terapia puede conducir a la farmacorresistencia con una duración de respuesta media de 17,5 meses. En algunos entornos, se han observado mutaciones en los sitios de unión de BTK o inmediatamente después de la terapia con ibrutinib, lo que destaca un mecanismo de resistencia a los medicamentos que puede volverse cada vez más frecuente. Véase, por ejemplo, Woyach et al. NEJM. 370,24(2014):2286-94. Además, el bloqueo de la función de BTK conduce a la inhibición de la señalización del receptor de células B (BCR) y no es directamente citotóxico. Véase, por ejemplo, Ponader et al. Blood. 119,5(2012):1182-89. La falta de citotoxicidad y la imposibilidad de erradicar los clones malignos predisponen a la evolución clonal bajo una presión de selección. Además, los hallazgos preliminares de una mayor transformación a enfermedad agresiva en pacientes tratados con ibrutinib para CLL son preocupantes. Véase, por ejemplo, Byrd et al. NEJM. 369.1(2013):32-42; y Parikh et al. Blood.
123.11(2014):1647-57.
La infusión de células T autólogas transducidas con receptores de antígeno quimérico (CAR) contra el antígeno CD19 específico de células B (CTL019, CART19) conduce a respuestas clínicas dramáticas en la mayoría de los pacientes con diversas neoplasias de células B, principalmente leucemia linfoblástica aguda (ALL) . Véase, por ejemplo, Maude et al. NEJM. 371.16(2014):1507-17; y Ruella et al. Expert Opin. Biol. Ther. (2015):1-6. La presencia de masas de ganglios linfáticos o enfermedad voluminosa puede conducir a una menor infiltración de células T y la consiguiente reducción de la actividad antitumoral. La linfadenopatía voluminosa no parece afectar la respuesta al ibrutinib. Wang et al. NEJM.
369.6(2013):507-16. Además, ibrutinib ha demostrado una eficacia particular para reducir las masas tumorales y movilizar las células B neoplásicas en la sangre periférica.
Métodos
Líneas celulares y muestras primarias. Las líneas celulares de MCL se obtuvieron de ATCC (Mino, Jeko-1, SP-49) mientras que MCL-RL se generó a partir de un derrame pleural progresivo de un paciente con MCL. Para experimentos in vitro, las líneas celulares se mantuvieron en cultivo con medio RPMI suplementado con suero de ternero fetal al 10%, penicilina y estreptomicina. Para algunos experimentos, las células MCL-RL y Jeko-1 se transdujeron con luciferasa de escarabajo verde/eGFP, y luego se clasificaron para obtener una población positiva >99%. Las líneas celulares de leucemia aguda MOLM-14, K562 o NALM-6 y la línea celular T-ALL JURKAT se utilizaron como controles. Estas líneas celulares se obtuvieron originalmente de la ATCC. Se obtuvieron muestras de médula ósea (BM) y sangre periférica (PB) de MCL humano primario anónimo de las prácticas clínicas de la Universidad de Pensilvania. Para todos los estudios funcionales, las células primarias se descongelaron al menos 12 horas antes del experimento y se dejaron reposar a 37°C.
Generación de constructos CAR y linfocitos T CAR. El receptor de antígeno quimérico anti-CD19 murino (que contiene una bisagra de CD8, un dominio coestimulador de 41BB y un dominio de señalización de CD3 zeta) se generó como se describió previamente. Véase, por ejemplo, Milone et al. Molecular Therapy: the Journal of the American Society of Gene Therapy. 17.8(2009):1453-64. La producción de linfocitos T que expresan CAR se realizó tal como se ha descrito previamente. Véase, por ejemplo, Gill et al. Blood. 123.15(2014):2343-54. Se obtuvieron células mononucleares de PB (PBMC, por sus siglas en inglés) o linfocitos T CD4 y CD8 de un donante normal del Centro de Inmunología Humana de la Universidad de Pensilvania. Las células T se sembraron a 1x106/ml, con una proporción CD4:CD8 de 1:1 y se expandieron en medio X-vivo 15 (Lonza, 04-418Q), AB de suero humano 5% (Gemini, 100-512), penicilina/estreptomicina (Gibco, 15070063) y Glutamax (Gibco, 35050061) usando Dynabeads anti-CD3/CD28 (Life Technologies, 11161D) añadidos el día 1 de cultivo y retirados el día 6. Los linfocitos T se transdujeron con lentivirus en el día 2. Los linfocitos T se expandieron en cultivo durante 8-15 días y se recogeron cuando el volumen celular mediano fue inferior a 300 fl. A continuación, las células T se criopreservaron en FBS DMSO al 10% para experimentos futuros. Antes de todos los experimentos, los linfocitos T se descongelaron y se dejaron reposar durante una noche a 37 °C.
Ibrutinib. Ibrutinib (PCI-32765) se adquirió de MedKoo (n° 202171) o Selleck Biochemicals (n° S2680) en forma de polvo o disolución DMSO. Para experimentos in vitro, ibrutinib se diluyó a concentraciones de 10, 100 y 1000 nM. Para los experimentos in vivo, se disolvió ibrutinib en polvo en una disolución de HP-beta-ciclodextrina al 10% (1,6 mg/ml) y se administró a ratones en el agua de bebida.
Análisis de citometría de flujo multiparamétrico. Se compraron anticuerpos contra anticuerpos humanos de Biolegend, eBioscience o Becton Dickinson. Las células se aislaron a partir de un cultivo in vitro o a partir de animales, se lavaron una vez con PBS complementado con un 2% de suero bovino fetal, y se tiñeron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Para la cuantificación del número de células, se utilizaron perlas Countbright (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En todos los análisis, la población de interés se seleccionó en función de las características de dispersión frontal vs. lateral y después se realizó una selección en singletes, y las células vivas se seleccionaron utilizando Live Dead Aqua (Invitrogen). Se incluyó selección temporal para el control de calidad. La expresión superficial de CAR19 se detectó como se describió previamente. Véase, por ejemplo, Kalos et al. Science Translational Medicine.
3.95(2011):95ra73. La citometría de flujo se realizó en un citómetro Fortessa-LSR de cuatro láser (Becton-Dickinson) y se analizó con FlowJo X 10.0.7r2 (Tree Star).
Ensayo de desgranulación. El ensayo de desgranulación se realizó como se describió previamente. Véase, por ejemplo, Kalos et al. Science Translational Medicine. 3.95(2011):95ra73. Las células T se incubaron con células diana en una proporción de 1:5 en medio de células T. Se añadieron al cocultivo anticuerpos anti-CD107a-PECY7 (Biolegend), anti-CD28 (BD Biosciences), anti-CD49d (BD Biosciences) y monensina (BD Biosciences). Después de 4 horas, las células se recogeron y se tiñeron para determinar la expresión de CAR, CD3, CD8 y tinción con Live Dead aqua (Invitrogen). Las células se fijaron y permeabilizaron (tampones Invitrogen Fix/Perm) y luego se realizó la tinción intracelular para detectar múltiples citocinas (IFN, TNFa, IL-2, GM-CSF, MIP1b).
Ensayo de proliferación. Las células T se lavaron y se resuspendieron a 1 x 107/ ml en 100 ul de PBS y se tiñeron con 100 ul de CFSE 2,5 uM (Invitrogen) durante 5 minutos a 37°C. Después, la reacción se inactivó con medio frío, y las células se lavaron tres veces. Las dianas se irradiaron con una dosis de 100 Gy. Los linfocitos T se incubaron con una proporción 1:1 con células diana irradiadas durante 120 horas, y se añadió medio a las 24 horas. A continuación, las células se recogeron, se tiñeron para detectar CD3, CAR y Live Dead aqua (Invitrogen), y se añadieron perlas Countbright (Invitrogen) antes del análisis por citometría de flujo para una cuantificación absoluta.
Ensayos de citotoxicidad. Se usaron células NALM-6 o RL luciferasa/eGFP+ para el ensayo de citotoxicidad como se describió previamente. Véase, por ejemplo, Gill et al. Blood. 123,15(2014):2343-54. Las dianas se incubaron en las proporciones indicadas con células T efectoras durante 4 o 16 horas. La muerte se calculó mediante obtención de imágenes de bioluminiscencia en una cámara IVIS-200 Spectrum de Xenogen.
Medidas de atocinas. Las células efectoras y diana se incubaron conjuntamente en una proporción de 1:1 en medio de células T durante 24 h. El sobrenadante se recogió y analizó mediante una matriz Luminex de 30 plex (Luminex Corp, FLEXMAP 3D) de acuerdo con el protocolo del fabricante (Invitrogen). Véase, por ejemplo, Kalos et al. Science Translational Medicine. 3.95(2011):95ra73.
Experimentos in vivo. Se adquirieron ratones NOD-SCID-y cadena -/- (NSG) obtenidos originalmente de Jackson Laboratories de Stem Cell and Xenograft Core de la Universidad de Pennsylvania. Todos los experimentos se realizaron con protocolos aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales (IACUC). Los esquemas de los modelos de xenoinjerto utilizados se describen aquí. Se inyectaron células (líneas celulares MCL o células T) en 200 ul de PBS a la concentración indicada en las venas de la cola de los ratones. La obtención de imágenes bioluminiscentes se realizó utilizando una cámara IVIS-200 Spectrum de Xenogen y se analizaron con software LivingImage v. 4.3.1 (Caliper LifeSciencies). Los animales se sacrificaron al final del experimento o cuando alcanzaron los criterios de valoración preespecificados de acuerdo con los protocolos IACUC.
Inmunohistoquímica. La tinción inmunohistoquímica (IHC) de tejidos embebidos en parafina fijados con formalina se realizó en un instrumento Leica Bond-III usando el Bond Polymer Refine Detection System. Los anticuerpos contra CD3, CD4, CD8, Pax5 y CyclinD1 se utilizaron sin diluir. La recuperación de epítopos inducida por calor se realizó durante 20 minutos con disolución ER2 (Leica Microsystems AR9640). Las imágenes se adquirieron digitalmente usando el Aperio ScanScope™.
Análisis estadístico. Todas las estadísticas se realizaron usando GraphPad Prism 6 para Windows, versión 6.04.
Líneas celulares de linfoma de células del manto
La mayoría de las líneas de linfoma de células del manto (MCL) que existen se han inmortalizado y propagado durante muchas generaciones in vitro, perdiendo así su dependencia de la señalización del receptor de células B. En consecuencia, son poco sensibles al ibrutinib. Se realizaron experimentos in vitro para determinar la sensibilidad de las líneas celulares de MCL en el tratamiento con ibrutinib. Estas líneas celulares también se usaron para evaluar la eficacia del tratamiento de combinación de ibrutinib/CART19 en los experimentos que se describen más adelante en este ejemplo. Las células de MCL se recogeron del derrame pleural de un paciente con MCL en recaída múltiple. Tanto las células originales (RLPrimari°) y una línea celular derivada de ellos (RL) tenían una morfología blastoide, inmunofenotipo típico de MCL y eran positivas para la translocación clásica t(11;14) por hibridación in situ de fluorescencia (FISH) (FIG. 52A, 52B, 52C).
Se cultivaron células RL y JEKO-1 con diferentes dosis de ibrutinib (0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 j M y 10 j M) y se determinó la sensibilidad a ibrutinib midiendo la reducción de bioluminiscencia (BLI). Como se muestra en la FIG. 31A, las células RL fueron sensibles al tratamiento con ibrutinib de una manera dependiente de la dosis. Sin embargo, las células JEKO-1 fueron resistentes al tratamiento con ibrutinib (no se demostró una bioluminiscencia reducida en función del aumento de la dosis de ibrutinib).
También se analizó la sensibilidad de las células RL, Jeko-1 y Mino a ibrutinib usando un ensayo MTT. La exposición de RL a concentraciones crecientes de ibrutinib in vitro condujo a una inhibición de la proliferación dependiente de la dosis y de la fosforilación del mediador aguas abajo, lo que indica un efecto sobre la diana de ibrutinib, con una CI50 de 10 nM. Por el contrario, las líneas celulares de MCL establecidas Jeko-1 y Mino eran relativamente resistentes a ibrutinib, con resultados de CI50 de hasta 10 j M (FIG. 52D). Para confirmar que RL es un modelo viable para experimentos in vivo, se injertaron ratones inmunodeficientes NOD-SCID-sin cadena y (Ns G) con 1x106 células RL que expresan luciferasa (FIG.
52e ). Se evaluó su carga tumoral y supervivencia. Después de la inyección intravenosa, el MCL se injertó en todos los ratones y se localizó en el bazo y el hígado, seguido de diseminación a la médula ósea, la sangre y los ganglios linfáticos (FIG. 52F). La histología del bazo y el hígado afectados es compatible con infiltración parenquimatosa de MCL. (FIG.
52G).
Estos resultados mostraron que estas diferentes líneas celulares podrían, por lo tanto, usarse para modelar tanto MCL sensible a ibrutinib como resistente a ibrutinib.
Las células del linfoma de células del manto son sensibles a la muerte por CART19
La mayor parte del trabajo preclínico que muestra la eficacia de CART19 se ha realizado usando líneas de células B-ALL, que no son sensibles a ibrutinib. Además, las mejores respuestas clínicas hasta la fecha se han informado en pacientes con B-ALL, mientras que los pacientes con neoplasias malignas de células B indolentes tienen, según se informa, respuestas más bajas.
Para demostrar que el MCL es sensible a la destrucción por CART19 en este modelo, se transdujeron células T de donantes sanos con una construcción CAR anti-CD19 que se ha utilizado en ensayos clínicos. Véase, por ejemplo, Porter, NEJM 2011. Se realizaron una serie de experimentos in vitro para demostrar que la línea celular sensible a ibrutinib RL y la línea celular Jeko-1 resistente a ibrutinib conducen a una desgranulación equivalente de CART-19, producción de citocinas, destrucción y proliferación (FIG. 53A, 53B, 53C, 53D). Además, se obtuvo sangre periférica o médula ósea de dos pacientes con MCL en fase leucémica, lo que permitió la expansión y transducción de células T autólogas con CAR anti-CD19. Las células CART19 autólogas derivadas de pacientes fueron reactivas a MCL mientras que las células T no transducidas no reaccionaron a sus respectivas MCL autólogas (FIG. 53E, 53F). Estos resultados indican que MCL son sensibles a las funciones efectoras de CART19.
Evaluación del tratamiento con ibrutinib/CART19 in vitro
Un efecto de ibrutinib sobre las células T se descartó previamente en base a ensayos de actividad a corto plazo, como se describe en Honigberg et al. Proc. Natl. Acad. Sci. u Sa . 107(2010):13075-80. Más tarde, se informó que un análisis del efecto de ibrutinib sobre la cinasa de células T ITK respaldaba un papel inmunomodulador de ibrutinib en las células T CD4 al inhibir la polarización de tipo Th2. Véase Dubovsky et al. Blood 122.15(2013):2539-49. El análisis de citocinas de pacientes tratados con CART19 por varios grupos indica que la terapia de CART19 está asociada tanto con Th1 (IL2, IFNy, TNF), Th2 (IL-4, IL-5, IL-10) como con otras citocinas (véase, por ejemplo, Kalos et al. Science Translational Medicine 3.95(2011):95ra73). En este ejemplo, se evaluó el efecto de la función CART19 con ibrutinib a, por encima y por debajo de las concentraciones de ibrutinib que se esperarían en los pacientes (concentración máxima media en suero 100-150 ng/ml). Véase Advani et al. J. Clin. Oncol. 2o13;31:88.
Se encontró que las células CART19 contenían ITK. La estimulación no específica de las células CART19 a través del TCR en presencia de ibrutinib condujo a una reducción de la ITK fosforilada (pITK-Y-i80) como se informó anteriormente para las células T CD4+. Véase Dubovsky et al. Blood 122.15(2013):2539-49. Por el contrario, la estimulación específica de las células CART19 a través del CAR no condujo a una activación de ITK disminuida (FIG. 54A). Esta observación indicó que la función de CART19 probablemente no se vería afectada negativamente por la exposición a ibrutinib.
Además, se determinó la función in vitro a corto y largo plazo de las células CART19 en presencia de ibrutinib. Ibrutinib en concentraciones clínicamente relevantes no afectó la proliferación, desgranulación o producción de citocinas de las células CART19; aunque a concentraciones suprafisiológicas, hubo inhibición de las funciones de las células CART19, lo que probablemente representa una toxicidad no específica (FIG. 54B, 54C, 10B).
En particular, las PBMC aisladas de un donante sano normal se transdujeron con una construcción CAR anti-CD19 lentiviral como se describió anteriormente. Las células T que expresan CAR19 resultantes (CART19) se cultivaron y pasaron para determinar la capacidad de proliferación y expansión. Se cultivó una relación 1:1 de células T que expresan CD4:CD8 con o sin diferentes concentraciones de ibrutinib (ibrutinib 10 nM, 100 nM y 1000 nM). Se añadió ibrutinib en cada pasada celular. Se contó el número de células el día 0, el día 5, el día 6, el día 7, el día 9 y el día 10 (FIG. 9A). También se controló el volumen celular (FIG. 9B).
También se utilizó el análisis de citometría de flujo y tinción CFSE para evaluar la proliferación de las células CART19 en presencia de ibrutinib después de la estimulación por las líneas celulares tumorales MOLM14, JEKO-1 y RL. MOLM14 es una línea celular de AML, y JEKO-1 y RL son líneas celulares de linfoma de células del manto. Específicamente, las células RL son una nueva línea celular de MCL derivada de células B neoplásicas obtenidas de un derrame pleural de un paciente con MCL en recaída. Las células CART19 y las células tumorales se mezclaron en una proporción de 1:1, y se evaluó la proliferación durante 5 días. El porcentaje de células en proliferación se designa en cada histograma de la FIG.
10 A. La cuantificación de la proliferación como se muestra en la FIG. 10B muestra que altas dosis de ibrutinib podrían inhibir la proliferación de células CART 19 durante el cocultivo con líneas celulares MCL.
La desgranulación de las células T indica la activación de las células T citolíticas y la capacidad de iniciar la citotoxicidad específica de antígeno. CD107a es un marcador funcional de la desgranulación de las células T expresado de forma transitoria en la superficie celular después de la estimulación de las células T. El análisis de citometría de flujo se utilizó para cuantificar las células T CART19 que expresan CD107a después de la estimulación con las líneas de células tumorales MOLM14, JEKO-1 y RL. Las células que expresan CD107a estaban presentes en Q2 (cuadrante 2) de los perfiles celulares mostrados en la FIG. 11A. La cuantificación de los resultados obtenidos de los perfiles de la FIG. 11A se muestra en la FIG. 11B. Estos resultados indican que el cultivo conjunto de células CART19 con MCL-RL o JEKO-1 condujo a una desgranulación masiva de CD107a específica de CAR.
La producción de citocinas por las células T CART19 en presencia de ibrutinib también se cuantificó después de la estimulación por diferentes líneas de células tumorales. La producción de IL-2, TNF-a e IFN-y se evaluó mediante citometría de flujo. Las células que producen las citocinas están presentes en el cuadrante 2 de los perfiles mostrados en la FIG. 12, FIG. 13 y FIG. 14. Las células T CART19 estimuladas por JEKO-1 y RL mostraron un aumento en la expresión de citocinas. Además, el aumento de las concentraciones del tratamiento con ibrutinib no afectó el porcentaje de células productoras de citocinas CART19.
La secreción de citocinas de las células CART19 después de la estimulación por células tumorales y en presencia de concentraciones variables de ibrutinib se analizó mediante el ensayo LUMINEX de 30 plex. Se ensayaron citocinas segregadas por células Th1, tales como IL-2, IFN-y y TNF-a. Se ensayaron citocinas segregadas por células Th2, incluyendo IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IL-15, IL-17, MIP1a, GM-CSF, MIP-1b, CP-1, IL-1Ra, IL-7, IP-10, IL-1b, VEGF, G-CSF, EGF, HGF, IFNa, IL-12, RANTES, Eotaxina, IL-2R, MIG, e IL-8. Como se muestra en la FIG. 15, las citocinas Th1 y Th2 fueron segregadas por las células T CART19.
Además, los experimentos que usan dos técnicas diferentes indicaron que no había diferencias en la polarización Th1/Th2 entre células CART19 expuestas a ibrutinib y no expuestas a ibrutinib (FIG. 54D).
La destrucción de células MCL por células CART19 se incrementó en presencia de ibrutinib, lo que sugiere un efecto al menos aditivo de la combinación (FIG. 54E). Sin embargo, la función citotóxica intrínseca de las células CART19 no aumentó en presencia de ibrutinib. (FIG. 54F).
Se realizaron ensayos de bioluminiscencia adicionales para evaluar la destrucción de células tumorales por células CART19. Las células CART19 se sembraron en placas con células tumorales MOLM14, JEKO-1 y RL que portaban un indicador de luciferasa en proporciones variables, tales como 1:1; 1:0,5; 1:0,25; y 1:0 en una placa de 96 pocillos, por duplicado. Después de 24 horas, se detectó y cuantificó la bioluminiscencia. Los resultados indicaron que la bioluminiscencia en las muestras de MOLM14 no disminuyó después de la incubación con células CART19. Sin embargo, para las células JEKO-1 y RL, la bioluminiscencia disminuyó en presencia de células CART19, lo que indica que las células CART19 mediaban la muerte de células JEKO-1 y RL (FIG. 16A, 16B, 16C, 16D, 16E y 16F). Hubo una disminución adicional de la bioluminiscencia cuando se trató con ibrutinib, lo que indica que la combinación de ibrutinib y CART19 provocó un aumento de la muerte de células JEKO-1 y RL que con el tratamiento con CART19 solo. De acuerdo con estos resultados, el cálculo de las células totales después de cada tratamiento mostró que el tratamiento con CART19 de las células JEKO-1 y RL provocó una reducción en el número de células y una reducción adicional cuando se trató con CART19 e ibrutinib (FIG. 17B y 17C), lo que sugiere que la terapia de combinación no solo fue eficaz para matar las células MCL, sino que también condujo a la eliminación eficaz de las líneas celulares MCL.
Evaluación del tratamiento con ibrutinib/CART19 in vivo
En estos experimentos, se utilizaron modelos de ratón de linfoma de células del manto para evaluar la terapia de combinación CART19 e ibrutinib in vivo.
Esquemas como los que se muestran en la FIG. 20, 55, y 5A se usaron en este ejemplo. La FIG. 20 muestra un esquema de prueba de la terapia de combinación CART19/ibrutinib en modelos de ratón in vivo de MCL. Se inyectan 1x106 células de líneas celulares Rl (MCL-3), JEKO-1 (MCL-4) y NALM6 (MCL-5) en ratones NSG (20 ratones para cada experimento). Después de 1 semana para permitir el injerto, el tratamiento se inicia en el día 0, en el que el tratamiento es: 0,5-1x106 células CART19 (mediante inyección), 25 mg/kg/día de ibrutinib (sonda oral), o tratamiento con CART19 ibrutinib. En el día 7, el día 14, el día 21 y el día 28, se obtienen imágenes de la bioluminiscencia para monitorizar el tamaño del tumor. Los ratones que reciben tratamiento con ibrutinib se tratan continuamente con ibrutinib. También se monitoriza la supervivencia de los ratones. Las FIG. 55 y 56 muestran esquemas adicionales de prueba de la terapia de combinación CART19/ibrutinib en los modelos de ratón in vivo de MCL. Se inyectan 2 x 106 células MCL-RL en ratones NSG. Después de una semana para permitir el injerto (injerto confirmado por imágenes de bioluminiscencia), el tratamiento se inicia el día 7 (después de la inyección de células MCL-RL), en el que el tratamiento es: control de vehículo, células CART19 (2 x 106 células) y/o ibrutinib (125 mg/kg/día). En los días 14, 21, 28 y 35 (después de la inyección de células MCL-RL), se obtienen imágenes de la bioluminiscencia para monitorizar el tamaño del tumor.
Se examinó el efecto del tratamiento con ibrutinib solo en un modelo de ratón in vivo de MCL. Las células RL transfectadas con el gen de GFP/luciferasa se inyectaron por vía intravenosa en ratones NSG inmunodeficientes, lo que resultó en un injerto de MCL del 100% en el hígado y el bazo, con eventual diseminación a los ganglios linfáticos y la médula ósea. Los ratones se trataron con dosis variables de ibrutinib, 25 mg/kg/día y 250 mg/kg/día. La bioluminiscencia media, que representa el crecimiento tumoral, se evaluó en varios momentos. Como se muestra en la FIG. 32, los tumores derivados de RL demostraron sensibilidad relacionada con la dosis. Se realizaron experimentos adicionales que titulan dosis de ibrutinib en ratones que contienen células RL y se muestran en la FIG. 57. Una dosis más alta condujo a una mejor actividad antitumoral sin aumentar la toxicidad, en consonancia con la dosis más alta de ibrutinib utilizada en la clínica para el MCL (Wang et al. NEJM 369.6(2013):507-16).
También se realizó el hallazgo de dosis de CART19. Se inyectaron dos líneas celulares de MCL, RL (MCL-1) y JEKO-1 (MCL-2), que llevaban un indicador de GFP-luciferasa en ratones NSG el día 0. Se inyectaron células T CART19 el día 7 en dosis variables, por ejemplo, a 0,5 x e6 células, 1 x e6 células, o 2 x e6 células. Los ratones se controlaron, por ejemplo, durante 100 días. En varios puntos de tiempo, los ratones se controlaron para determinar el tamaño del tumor (por ejemplo, formación de imágenes de bioluminiscencia) (FIG. 18A y 18B, y FIG. 19A), y para la supervivencia global (por ejemplo, curva de supervivencia de Kaplan-Meier) (FIG. 18C y FIG. 19B). Diferentes dosis de células CART19 que muestran una eficacia antitumoral dependiente de la dosis, siendo 2 x 106 células CART 19/ratón la dosis más eficaz (FIG. 19A).
Estos estudios brindaron la oportunidad de realizar una comparación directa de las dos terapias para el MCL. Como se muestra en la FIG. 58, la supervivencia a largo plazo se logró solo en ratones tratados con células CART-19. No hubo diferencia en el efecto antitumoral al comparar las células T no transducidas más ibrutinib con ibrutinib solo. Por tanto, en todos los experimentos posteriores, los grupos de control fueron vehículo e ibrutinib solo (FIG. 59).
También se probó la adición de CART19 a ibrutinib, como se detalla en el esquema de la FIG. 56. La evaluación del efecto de ibrutinib sobre la carga tumoral indicó un crecimiento tumoral moderadamente retrasado en los primeros momentos. Por el contrario, la terapia con células CART19 condujo a una clara disminución de la carga tumoral durante varias semanas. En los ratones que recibieron células CART19 solas, esto fue seguido por una recaída indolente que comenzó el día 40, mientras que los ratones que fueron tratados con células CART19 así como con ibrutinib no tuvieron enfermedad detectable hasta el día 80 (FIG. 60). La histopatología de los órganos extraídos al final del experimento mostró la persistencia de la enfermedad en todos los ratones de control y tratados con ibrutinib con focos de necrosis tumoral en los tratados con ibrutinib. La mayoría de los ratones tratados con CART19 solo mostraron una recaída indolente a largo plazo acompañada de la persistencia de las células CART19, mientras que los ratones tratados con CART19-ibrutinib mostraron aclaramiento del tumor y desaparición de CART19 de los órganos afectados (datos no mostrados).
Mecanismo de efecto combinado de CART19 e ibrutinib
Los experimentos in vitro de este documento indicaron que ibrutinib no alteraba ni aumentaba claramente las funciones efectoras de CART19 a corto plazo. Los estudios in vivo mostraron que la monoterapia con ibrutinib tuvo un efecto antitumoral modesto. Los resultados indicaron que ibrutinib podría mejorar significativamente la función antitumoral de las células CART19 (FIG. 60). Por lo tanto, se realizaron experimentos para determinar el mecanismo de este efecto.
Se ha demostrado que la inhibición de ITK inhibe la polarización Th2 y se inclina hacia un fenotipo Th1 (Dubovsky et al. Blood 122.15(2013):2539-49). En ratones tratados con células CART19 e ibrutinib, no se observó un aumento en las células Th1 en comparación con la monoterapia con células CART19 usando este ensayo (FIG. 61A, 61B). Sin embargo, la exposición de ratones a ibrutinib condujo a un aumento de las células CART19 periféricas. No hubo diferencia en el marcador de proliferación Ki67 entre el grupo de tratamiento y un grupo de control (FIG. 61C), por lo que este ensayo no detectó una diferencia en la proliferación. De manera similar, no hubo diferencia en el marcador antiapoptótico Bcl2 o el marcador de apoptosis fosfotidil serina, lo que sugiere que la diferencia en el número de células CART no estaba relacionada con un deterioro de la apoptosis (FIG. 61D). Como ibrutinib se ha asociado con linfocitosis periférica en pacientes, se realizaron experimentos para determinar si esto también se encontró en ratones tratados con ibrutinib solo. Una semana después de comenzar con ibrutinib, había más células MCL circulantes y menos células MCL ganglionares/órgano en ratones tratados con ibrutinib. Curiosamente, este aumento se observó tanto en el modelo in vivo sensible como resistente a ibrutinib, como también se observó en ratones NSG injertados con la línea celular de leucemia aguda NALM-6 (datos no mostrados).
Para comprender el papel de ibrutinib en la expansión de células T in vivo, injertamos ratones NSG con células MCL-RL WT y los tratamos con células T luciferasa positivas. Los ratones tratados con CTL019 y CTL019-ibrutin¡b mostraron una intensa expansión de células T en comparación con UTD o UTD-ibrutinib (datos no mostrados). Luego investigamos la frecuencia de diferentes subconjuntos de células T in vivo y no vimos diferencias en las células T PB 1 semana después de la infusión de células T. (datos no mostrados). Dado que CXCR4 está involucrado en la movilización de células B impulsada por ibrutinib en humanos, verificamos la expresión de CXCR4 in vivo en células T PB de ratones tratados con CTL019 o CTL019-ibrutinib: el nivel de CXCR4 fue similar en los 2 grupos (datos no mostrados). Por último, se analizó la expresión del receptor inhibidor/coestimulador en PB de células T de ratones tratados con CART19 y CART19-ibrutinib. No fue evidente ninguna diferencia en la expresión de TIM3, LAG3, CD137 o CTLA4; sin embargo, se observó una tendencia a una expresión reducida de PD-1 en ratones tratados con CTL019 y UTD combinados con ibrutinib.
Conclusiones
Las terapias para las neoplasias malignas de células B incluyen inhibidores de moléculas pequeñas de la señalización de BCR y terapias basadas en células T dirigidas por CD19. En el contexto del MCL recidivante, el inhibidor de BTK ibrutinib ahora está aprobado por la FDA y genera altas tasas de respuesta inicial. Desafortunadamente, estas respuestas tienden a ser transitorias y requieren dosis de fármaco más altas que las que se usan para la CLL. CART-19 conduce a respuestas duraderas en pacientes con B-ALL de alto riesgo y también puede ser eficaz en otras neoplasias malignas de células B. Los datos preliminares sugieren que las respuestas de las neoplasias de células B maduras a CART-19 pueden ser más bajas que las de B-ALL, pero aún no se ha determinado el mecanismo de esta disparidad. Este ejemplo investigó el impacto de añadir ibrutinib a CART19 en el tratamiento del MCL.
Se utilizaron diferentes líneas celulares de MCL con sensibilidades variables a ibrutinib (IC50 en el intervalo de 10 nM a 10 |jM) para experimentos in vitro. Estas diferentes líneas celulares se utilizaron para modelar el MCL sensible a ibrutinib y resistente a ibrutinib. En todas las dosis de ibrutinib, excepto las más altas, la función de las células CART19 no se vio afectada, con la cinética de expansión de las células T intactas, el reconocimiento y destrucción de tumores y la producción de citocinas. Además, los resultados no revelaron una polarización T auxiliares tras la exposición a ibrutinib. Este hallazgo puede deberse a una combinación de factores, incluido el uso de un cultivo mixto de células CD4 y CD8, en contraste con el modelo de experimentación solo con CD4 realizado por Dubovksy et al. Blood 122.15(2013):2539-49. Tanto las líneas celulares sensibles a ibrutinib como las resistentes a ibrutinib activaron fuertemente las células CART19 e indujeron la muerte, producción y proliferación de citocinas. La combinación de CART19 e ibrutinib in vitro condujo al menos a una destrucción aditiva del tumor. Los resultados de este ejemplo muestran una superioridad de CART19 sobre ibrutinib cuando cada uno se utilizó como monoterapia en dosis y programas de administración clínicamente relevantes (dosis única para CART19, administración continua de ibrutinib).
También se generó un modelo de MCL de xenoinjerto sistémico en este ejemplo, usando la línea celular MCL-RL generada en un laboratorio. El tratamiento de estos ratones con diferentes dosis de células T CAR19 alogénicas condujo a un efecto antitumoral dependiente de la dosis. También se observó una respuesta a la dosis similar a CART-19 en la línea celular JEKO-1 resistente a ibrutinib. MCL-RL se trató in vivo con diferentes dosis (por ejemplo, 0, 25 y 125 mg/kg/día) de ibrutinib, lo que dio lugar a una mediana de supervivencia global, respectivamente, de 70, 81 y 100 días (p<0,001). Una comparación directa in vivo de ibrutinib 125 mg/kg y CART19 mostró un control tumoral significativamente mejorado para los ratones tratados con CART19. Además, los ratones injertados con MCL-RL se trataron con vehículo, ibrutinib, CART19 o la combinación de CART19 e ibrutinib (iCART19). A dosis clínicamente relevantes, la monoterapia de MCL con CART19 fue superior a la monoterapia con ibrutinib, y la combinación de ibrutinib con CART19 produjo un efecto antitumoral aumentado. En particular, la combinación de iCART19 in vivo condujo a niveles circulantes inicialmente más altos de células CART19, seguidos de respuestas tumorales profundas, y las recaídas se retrasaron significativamente cuando se añadió ibrutinib a CART19. La combinación iCART19 dio como resultado un mejor control del tumor alcanzando el 80% de los ratones la remisión completa y la supervivencia sin enfermedad a largo plazo. Mecanísticamente, los ratones tratados con ibrutinib tenían un mayor número de células CART19 circulantes sin cambios en Th1/Th2 o fenotipo de memoria. Por tanto, los resultados de este documento muestran que ibrutinib se puede combinar con CART19 de una manera racional y sugieren que las propiedades de cada una de estas terapias pueden compensar las deficiencias de la otra, lo que conduce a un efecto antitumoral a largo plazo mejorado. Los experimentos y los resultados de la combinación de la inhibición de la señalización de BCR con la terapia de células T dirigida anti-CD19 allanan el camino hacia combinaciones racionales de terapias sin resistencia cruzada para las neoplasias malignas de células B.
La cinética de la respuesta tumoral y la recaída sugiere que ibrutinib sirve para profundizar la respuesta inicial lograda por CTL019 solo, o para mejorar la capacidad de inmunovigilancia a largo plazo de las células CTL019.
Ejemplo 9: Terapia combinada de ibrutinib/células T CAR19 para la leucemia linfocítica crónica
Ibrutinib también se utiliza para el tratamiento de la leucemia linfocítica crónica (CLL). Ibrutinib no ha demostrado efectos citotóxicos sobre las células T o las células NK. Sin embargo, en las células de CLL, ibrutinib promueve la muerte celular programada e inhibe la migración y adhesión de las células tumorales. En este ejemplo, se realizaron experimentos para examinar: 1) el efecto de ibrutinib sobre la producción de CART19 de pacientes sometidos a terapia con ibrutinib; y 2) el momento óptimo de tratamiento con ibrutinib en combinación con CART19 para una función in vivo óptima.
Efecto de ibrutinib sobre la producción y función de CART19
Se obtuvieron PBMC de donantes normales usando aféresis como se describe aquí, por ejemplo, en el Ejemplo 6. Las PBMC se incubaron con 5 j M de ibrutinib durante 30 minutos o se dejaron sin tratar (como control), y luego las células se lavaron dos veces. A continuación, las células se transdujeron con construcciones lentivirales que contenían CAR19 para generar células T CART19 usando los métodos descritos aquí, por ejemplo, en el Ejemplo 4. El número de células T CART19 generadas a partir un análisis de FACs de PBMC tratadas con ibrutinib se realizó para determinar el número de células T CART19 generadas a partir de PBMC tratadas con ibrutinib en comparación con PBMC no tratadas. Como se muestra en la FIG. 21, el 15% de las PBMC transducidas tratadas con ibrutinib expresaron CAR19, y el 12% de las PBMC transducidas sin tratar expresaron CAR19. Estos resultados demuestran que el tratamiento con ibrutinib no afecta la eficacia de la transducción lentiviral o la producción de células T CART19. Por lo tanto, las células T CART19 se pueden fabricar a partir de pacientes con CLL sometidos a tratamiento con ibrutinib.
Se realizó otro análisis in vitro para determinar el efecto de ibrutinib sobre la proliferación de células T CART19, la citotoxicidad de CART19, y la proporción de producción de citocinas Th1:Th2.
Para medir la proliferación celular, las células se tiñeron con CFSE para la detección de células en proliferación y se analizaron mediante FACS, como se describe en el Ejemplo 4. Se incubaron células T CART19 con concentraciones variables de ibrutinib (0,1 jiM, 0,5 jiM, 1 jiM y 5 jiM), y se estimularon con perlas CD3/CD28 o se dejaron sin estimular. En la FIG. 22, los histogramas se superpusieron para comparar las células T CART19 no estimuladas con las estimuladas con CD3/CD28 a cada concentración de ibrutinib. Para cada concentración de ibrutinib, se observó proliferación de células T estimuladas por CD3/CD28, lo que demuestra que el tratamiento con ibrutinib no afectó la proliferación de células CART19.
También se evaluó el efecto de ibrutinib sobre la citotoxicidad de las células T CART19, usando los métodos descritos en el Ejemplo 4. Se trataron células T no transducidas y transducidas con CAR19 con medio, DMSO o ibrutinib 1 jiM. Se realizó un ensayo de muerte basado en flujo usando la titulación de las proporciones de efector a diana (E;T) con células efectoras CART19 (medio, DMSO o tratadas con ibrutinib) para determinar la actividad citotóxica específica contra las células diana que expresan CD19. Como se muestra en la FIG. 23, las células T CART19 tratadas con ibrutinib demostraron el mismo porcentaje de actividad citotóxica específica contra las células diana que expresan CD19 que los controles (células T CART19 tratadas con medio o DMSO). Por tanto, el tratamiento con ibrutinib no afecta la citotoxicidad de CART19.
El tratamiento con ibrutinib puede limitar la activación de Th2 , y por lo tanto puede promover presión selectiva de Th1 en las células T y sesgo de citocinas Th1/Th2 en pacientes humanos con CLL. Se realizaron ensayos para medir producción de citocinas Th1 y Th2 en presencia o ausencia de ibrutinib o DMSO (control). Como se muestra en la FIG. 24, ibrutinib no promueve el sesgo de citocinas Th1 y Th2 en células CART19.
Eficacia del tratamiento combinado de ibrutinib/CART19 in vivo
La función CART19 se evaluó en un modelo de ratón in vivo. Se implantaron células Nalm/6 (línea celular de leucemia linfoblástica aguda humana) en ratones NSG, y los ratones se controlaron diariamente durante al menos 50 días. El modelo tumoral Nalm/6 produce tumores que no son sensibles a ibrutinib y, por tanto, permiten el análisis de la función CART19 in vivo y la eficacia para reducir el volumen tumoral / tratar el cáncer. A partir del día 7, a los ratones se les administró DMSO (control) o ibrutinib diariamente por sonda oral. Se administró CART19 el día 7 o el día 9, o los ratones se dejaron sin tratar (control). En los días 4, 11, 18, 25 y 32, se midió el número de células Nalm/6 que circulaban en los ratones, por ejemplo, mediante análisis FACS de sangre periférica, para determinar la eficacia del CART19 para eliminar las células Nalm/6 en presencia o ausencia de ibrutinib. por ejemplo, las células se tiñeron con un anticuerpo anti-CD19 humano para determinar el porcentaje de células CD19+ (Nalm/6) humanas en la sangre de los ratones NSG portadores de tumores.
Como se muestra en la FIG. 25A, los ratones que no recibieron inyecciones de CART19 mostraron un aumento en las células tumorales Nalm/6. Sin embargo, los ratones que recibieron inyecciones de CART19 en combinación con la administración diaria de DMSO mostraron una eliminación (reducción) exitosa de las células Nalm/6. Los ratones que recibieron inyecciones de CART19 en combinación con la administración diaria de ibrutinib también mostraron una eliminación exitosa de las células Nalm/6 con la misma cinética y eficacia que los ratones que recibieron tratamiento con DMSO. Por lo tanto, estos resultados demuestran que el tratamiento con ibrutinib no altera la función de CART19 para eliminar las células Nalm/6 de este modelo de tumor.
Se controló el estado de salud de los ratones durante al menos 50 días después de la inyección de las células Nalm/6. La curva de supervivencia de Kaplan-Meier de la FIG. 25B muestra que ninguno de los ratones que no fueron tratados (no recibieron células T CART19) y recibieron DMSO o ibrutinib sobrevivieron más de 30 días después de la inyección de las células Nalm/6. Sin embargo, el tratamiento con células T CART19, con DMSO o con ibrutinib aumentó la supervivencia de los ratones. Por tanto, estos resultados tomados junto con la carga tumoral resultante de la FIG. 13A demuestran que el tratamiento con ibrutinib no altera la función de CART19 para eliminar las células tumorales del modelo tumoral in vivo NSG-Nalm/6.
Momento óptimo del tratamiento combinado de ibrutinib/CART19 en pacientes con CLL
El momento óptimo durante el tratamiento con ibrutinib de CLL para la administración de CART19 se evaluó usando muestras de pacientes con CLL que estaban recibiendo tratamiento con ibrutinib durante un año. Se aislaron muestras de PBMC de 9 pacientes con CLL (paciente 111330026, paciente 111330030, paciente 111330039, paciente 111330056, paciente 111330073, paciente 111330074, paciente 111330081, paciente 111330086 y paciente 111330111) en diferentes ciclos del tratamiento con ibrutinib, y se utilizaron para fabricar células T CART19. Las muestras de PBMC se recogeron antes del tratamiento con ibrutinib para establecer una línea de base, y luego se recogeron durante el tratamiento con ibrutinib en el ciclo 2, día 1 y ciclo 12, día 1. Se evaluaron varios parámetros diferentes de fabricación de CART19, como transducción, proliferación, citotoxicidad, y producción de citocinas. Otras evaluaciones pueden incluir inmunofenotipificación ex vivo, como evaluación de la memoria, moléculas inhibidoras y agotamiento.
La FIG. 26 muestra los resultados del análisis de citometría de flujo de la transducción de CAR19 de células T del Paciente 111330030, que fue representativo de los resultados obtenidos de los otros 8 pacientes después de la transducción de CAR. Se recogeron PBMC de los pacientes en los momentos indicados (línea de base, por ejemplo, antes del tratamiento; ciclo 2 en el día 1; y ciclo 12 en el día 1) y se transdujeron con vectores lentivirales que contienen CAR19, usando métodos como se describe, por ejemplo, en el Ejemplo 4. Las PBMC transducidas se tiñeron luego para anexina, CD3, CD4 y GAM (para detectar CAR), y luego se analizaron mediante análisis FACS. La región recuadrada en los gráficos de la FIG. 14 muestra el porcentaje de células que fueron positivas para GAM y que se transdujeron con éxito a células T CART19. Los tres gráficos inferiores muestran que CAR19 se transdujo con éxito en alrededor del 23% de las células en la línea de base, el 28% de las células en el ciclo 2, día 1, y el 44% de las células en el ciclo 12, día 1.
A continuación, se evaluó la tasa de proliferación (o duplicación de la población) de las células CART19 o las células no transducidas (control) en cada punto de tiempo (línea de base, ciclo 2 en el día 1, y ciclo 12 en el día 1) durante 12 días. La FIG. 27 muestra las representaciones gráficas de las duplicaciones de la población durante 12 días para tres pacientes, Paciente 111330039 (# 9), Paciente 111330026 (#26) y Paciente 111330030 (#30). Estos resultados indican que con respecto a la tasa de proliferación, las PBMC aisladas entre o en el ciclo 2, día 1 y ciclo 12, día 1 se prefieren para la transducción de CAR.
Mecanismos potenciales del tratamiento con ibrutinib que afectan la función de CART19
Se evaluaron varios mecanismos del tratamiento con ibrutinib que pueden afectar la función de CART19 a partir de muestras de pacientes con CLL.
El análisis de células que expresan CD19 (CD19+) se evaluó mediante análisis FACS. Se aislaron PBMC de un paciente con CLL sometido a tratamiento con ibrutinib al inicio del tratamiento (antes del tratamiento con ibrutinib), en el ciclo 2, día 1, y en el ciclo 12, día 1, y posteriormente se tiñeron para CD19. El análisis FACS mostró que ibrutinib provoca una disminución en las células que expresan CD19 (FIG. 28A, FIG. 28B, y FIG. 28C). Por tanto, estos resultados indican que el tratamiento con ibrutinib induce linfocitosis.
Se realizó un análisis adicional para examinar la expresión de CD200 en células tumorales a lo largo del tiempo durante el tratamiento con ibrutinib. La molécula inmunosupresora CD200 está regulada al alza en las células tumorales de CLL de células B primarias. CD200 se une a su receptor, CD200R, que se expresa en células del linaje de monocitos/macrófagos y en linfocitos T. La interacción de CD200 con su receptor entrega una señal inhibidora al linaje de macrófagos que altera los perfiles de citocinas de Th1 a Th2 y da como resultado la inducción de células T reguladoras. Las muestras de los pacientes 111330030, 111330026 y 111330039 en la línea de base (detección), ciclo 2, día 1, y ciclo 12, día 1 se tiñeron para anexina, CD19 (para clasificar las células tumorales que expresan CD19) y CD200 y se analizaron mediante FACS . Los histogramas que detectan la expresión de CD200 en células tumorales de cada punto de tiempo se superpusieron para cada paciente (FIG. 29A, 29B y 29C). Generalmente, la expresión de CD200 en las células tumorales disminuyó con el tiempo durante el tratamiento con ibrutinib.
También se evaluó la frecuencia de células T que expresan PD1 durante el tratamiento con ibrutinib. Se obtuvieron muestras de los pacientes al inicio, ciclo 2, día 1 y ciclo 12, día 1 y se tiñeron con anexina, CD3, CD8 y PD1. Las células que fueron negativas para la anexina y positivas para CD3 se analizaron para determinar la expresión de CD8 y PD1. Las células que expresan CD8 y PD1 están designadas por el recuadro de la FIG. 30A, 30B y 30C. La comparación de los perfiles Fa CS de células en la línea de base (FIG. 30A), ciclo 2, día 1 (FIG. 30B) y ciclo 12, día 1 (FIG. 30C), indica que el tratamiento con ibrutinib disminuye la frecuencia de células que expresan PD1 a lo largo del tiempo.
Los datos obtenidos de los experimentos descritos anteriormente indican que el momento óptimo para administrar la terapia de CART19 a los pacientes con CLL que reciben ibrutinib es entre el ciclo 2 y el ciclo 12, o en el ciclo 12.
Ejemplo 10: Terapia de células T CAR19 para el linfoma de Hodgkin
La terapia con células T CAR19 también se puede usar para tratar el linfoma de Hodgkin (HL). El linfoma de Hodgkin se caracteriza por la presencia de células malignas de Hodgkin Reed-Sternberg (HRS) que se derivan de células B del centro germinal clonal. Hay varios factores que indican la eficacia terapéutica de la terapia con células T CAR19 para e1HL. La tinción con CD19 de tumores HL muestra células que expresan CD19 (CD19+) dentro del tumor y el microambiente tumoral (FIG. 33). Un estudio ha demostrado que una población de células B clonales (CD20+CD27+ALDH+) que expresa CD19 es responsable de la generación y mantenimiento de líneas celulares de linfoma de Hodgkin, y también circula en la sangre de la mayoría de los pacientes con HL (Jones et al., Blood, 2009, 113(23):5920-5926). También se ha sugerido que esta población de células B clonales da lugar o contribuye a la generación de células HRS malignas. Por tanto, la terapia de CART19 agotaría esta población de células B que contribuye a la tumorigénesis o al mantenimiento de las células tumorales. Otro estudio mostró que el agotamiento de las células B retarda el crecimiento de tumores sólidos en múltiples modelos murinos (Kim et al., J Immunotherapy, 2008, 31(5):446-57). En apoyo de la idea de que el agotamiento de las células B en el microambiente tumoral de HL da como resultado algún efecto antitumoral, las terapias actuales, como rituxan, se están probando clínicamente para detectar y reducir las células B tumorales en HL (Younes et al., Blood, 2012, 119(18):4123-8). También se ha demostrado que la carcinogénesis de novo relacionada con la inflamación crónica depende de las células B (de Visser, et al., Cancer Cell, 2005, 7(5):411-23). Los resultados de estos estudios indican que la selección como diana de la población de células B, particularmente en el microambiente tumora1HL, sería útil para tratar HL, al reducir o inhibir la progresión de la enfermedad o el crecimiento tumoral.
Además, las células B normales que expresan CD19 también se infiltran en el microambiente tumoral en HL. Estudios previos con terapia de CART19 en CLL y ALL (por ejemplo, descritos en los Ejemplos 4 y 5) muestran que la exposición de CART19 a dianas CD19+ conduce a la producción de citocinas y macrófagos. Por tanto, la modulación del microambiente tumoral de HL desde un microambiente pr tumoral a un microambiente antitumoral se puede lograr mediante la infusión de CART19 para interactuar con las células B CD19+ normales presentes en e1HL. por ejemplo, la exposición de CART19 a dianas que expresan CD19 provoca la producción de citocinas, por ejemplo, citocinas inflamatorias, que promueven la actividad antitumoral a través de la expansión de las células T citotóxicas, la activación de macrófagos y el reclutamiento de otras células efectoras inmunitarias con diversas funciones que inhiben el crecimiento tumoral, como leucocitos, macrófagos y células presentadoras de antígenos. Debido a que las células B CD19+ diana pueden no ser malignas (por ejemplo, células B que circulan normalmente), se puede preferir un efecto CART19 transitorio en lugar de prolongado para la modulación del microambiente tumoral.
Se puede realizar un estudio para examinar la eficacia terapéutica de la terapia de CART19 en pacientes con HL como se describe a continuación (FIG. 34). El estudio también evaluará la seguridad y tolerabilidad de CART19 en sujetos con HL, y determinará el efecto de las células CART19 en el microambiente tumoral de HL.
En este estudio se tratan 8 pacientes con HL clásico. Los pacientes son de todas las edades, aunque se pueden establecer protocolos separados para la administración de fármacos para pacientes pediátricos y adultos. Los pacientes de este estudio no tienen opciones de tratamiento potencialmente curativas disponibles (como autotrasplante (ASCT) o alotrasplante de células madre), o no son adecuados para tales opciones de tratamiento curativo. por ejemplo, los pacientes pueden ser cualquiera de los siguientes: PET+ después de la quimioterapia de rescate, PET+ después del tratamiento con brentuximab, o PET+ después de ASCT con o sin exposición previa a brentuximab. Los pacientes tendrán un pronóstico limitado (varios meses a menos o igual a la supervivencia esperada de 2 años) con las terapias disponibles actualmente. Y finalmente, los pacientes no habrán recibido terapia con anticuerpos anti-CD20. Se excluye a los pacientes debido a la falta de viabilidad, por ejemplo, si el paciente tiene un número insuficiente de células T para 6 infusiones de CART19.
Un ARNm CAR19 se produce mediante transcripción in vitro. El ARNm de CAR19 se electropora en células T del donante y las células resultantes se expanden y estimulan mediante incubación con perlas CD3/CD28. Se administran al paciente dosis que contienen 1x108-5x108 células T CAR19 electroporadas con ARN, tres veces por semana durante dos semanas (por ejemplo, los días 0, 2, 4, 7, 9 y 11). La tasa de respuesta general se evaluará mediante exploración clínica, TC y PET 1 mes después del tratamiento. La respuesta y la supervivencia se controlarán mensualmente durante los primeros 6 meses, luego cada 3 meses hasta 2 años después de la primera infusión de CART19 (día 0). Las técnicas de monitorización incluyen biopsia del tumor o ganglio linfático (por ejemplo, para análisis inmunohistoquímico y/o ARN para el perfil de expresión génica) y exploración por PET antes y después del tratamiento con CART19. por ejemplo, el efecto de las células CART19 en el microambiente del tumor HL se analiza comparando los resultados del perfil de expresión génica realizado en biopsias de ganglios linfáticos accesibles de pacientes seleccionados antes del tratamiento y alrededor de una semana después del tratamiento (o el tiempo apropiado después del tratamiento para permitir por alteración del fenotipo celular). Para evaluar la seguridad y tolerabilidad del tratamiento con CART19, se informa la frecuencia y gravedad de los eventos adversos, incluida la frecuencia del síndrome de liberación de citocinas (CRS) y el síndrome de activación de macrófagos (MAS).
La quimioterapia se puede administrar al mismo tiempo que el tratamiento con CART19. La primera dosis de CART19 puede ir precedida de quimioterapia linfodeplectora, por ejemplo, cytoxan.
Ejemplo 11: Un subconjunto de pacientes con CLL que no responden muestra una mayor expresión de moléculas inhibidoras de puntos de control inmunitarios
En este estudio, las células CART19 de fabricación clínica procedentes de 34 pacientes con CLL se evaluaron para la expresión de moléculas inhibidoras del punto de control inmunitario, como PD-1, LAG3 y TIM3. Se conocía la respuesta de esta cohorte a CART19 y, por tanto, se pudo evaluar una correlación entre la respuesta y los patrones de expresión de biomarcadores.
Las células CART19 fabricadas procedentes de pacientes con CLL con diferentes respuestas a la terapia de CART se analizaron mediante citometría de flujo para determinar la expresión de CAR y las moléculas inhibidoras del punto de control inmunitario PD-1, LAG3 y TIM3. Las células CART19 procedían de: donantes sanos (HD) (n=2); pacientes con CLL que respondieron a la terapia de CART (CR) (n=5); pacientes con CLL que respondieron parcialmente a la terapia de CART (PR) (n=8); pacientes con CLL que no respondieron a la terapia de CART (NR) (n=21). Las células se tiñeron con anticuerpos marcados con fluorescencia que reconocen específicamente CD3, CD4, CD8, CD27, CD45RO, la molécula CAR19 y moléculas de punto de control inmune PD-1, LAG3 y TIM3, de acuerdo con métodos estándar para análisis de citometría de flujo conocidos en la técnica. La expresión de cada marcador, por ejemplo, CD4+, CD8+, etc., se determinó mediante software de análisis de citometría de flujo, y las subpoblaciones (por ejemplo, células T CD4+, células T CD8+ o células T que expresan CAR19) se analizaron adicionalmente para determinar la expresión de moléculas de punto de control inmune PD-1, LAG3 y TIM3.
Un ejemplo del análisis de perfiles de citometría de flujo usado para determinar la expresión del marcador de superficie se muestra en la FIG. 35A y 35B. Las células T que expresan CD4 se determinaron mediante citometría de flujo y se analizaron adicionalmente para la expresión de CAR19 y PD-1, de modo que el eje x de los perfiles indica la expresión de CAR19 (los cuadrantes superior izquierdo (Q5) e inferior izquierdo (Q8) muestran células CD4+ negativas para CAR19, mientras que los cuadrantes superior derecho (Q6) e inferior derecho (Q7) muestran células CD4+ que expresan CAR19), y el eje y muestra la expresión de PD-1 (la cuadrantes inferior izquierda (Q8) y derecha (Q7) muestran células CD4+ negativas para PD-1, y los cuadrantes superior izquierdo (Q5) y derecho (Q6) muestran células CD4+ que expresan PD-1). En la población CD4+ de un respondedor CART, el 44,7% de las células CD4+ expresaron PD-1 en general, y alrededor del 22,3% de las células que expresan CAR19 fueron PD-1 positivas, mientras que el 27,2% de las células que expresan CAR19 fueron PD-1 negativas (FIG. 35A). Por el contrario, en la población CD4+ de un no respondedor, hubo una disminución significativa en las células que expresan CAR19 en general (alrededor del 15,3% en comparación con el 49,5% en CR), siendo el 14,7% de las células que expresan CAR19 positivas para PD-1, mientras que sólo el 0,64% fueron negativas para PD-1 (FIG. 35B). La comparación entre los perfiles de la FIG. 35A y FIG. 35B muestra que un porcentaje mucho mayor de células CD4+ de un no respondedor expresan PD-1 (alrededor de 92,9%) en comparación con el respondedor CART (alrededor de 44,7%).
Usando los métodos y análisis descritos anteriormente, se determinó el porcentaje de células que expresan PD-1 (PD-1+) de la población CD4+ y la población CD8+ para cada paciente en cada grupo de respuesta. Se demostró que los no respondedores tenían un mayor porcentaje de células PD-1+ en las poblaciones de CD4+ (FIG. 35C) y CD8+ (FIG. 35D) en comparación con los que respondieron a la terapia de CAR (CR); el aumento del porcentaje promedio de PD-1 fue estadísticamente significativo para las poblaciones CD4+ y CD8+. Los respondedores parciales (PR) exhibieron porcentajes más altos de células PD-1+ que los respondedores (CR) tanto en poblaciones CD4+ (FIG. 35C) como CD8+ (FIG. 35D).
A continuación, se determinó el porcentaje de células que expresan PD-1 (PD-1+) de la población CD4+ que expresa CAR19 y la población CD8+ que expresa CAR19 para cada paciente en cada grupo de respuesta. Se realizó un análisis similar al anterior, con el paso adicional de analizar las células CD4+ y CD8+ para la expresión de CAR19, y después de la identificación de las células que expresan CAR19, determinar el porcentaje de células con expresión de PD-1 de las poblaciones de células que expresan CAR19 células. Se observó una tendencia similar a la observada en las poblaciones generales CD4+ y CD8+ para las poblaciones CD4+ y CD8+ que expresan CAR19: se demostró que los no respondedores tenían un mayor porcentaje de células PD-1+ tanto en CD4+ (FIG. 36A) como en Poblaciones de CD8+ (FIG. 36B) en comparación con las que respondieron a la terapia de CAR (CR); el aumento del porcentaje promedio de PD-1 fue estadísticamente significativo para las poblaciones CD4+ y CD8+. Los respondedores parciales (PR) exhibieron porcentajes más altos de células PD-1+ que los respondedores (CR) tanto en poblaciones CD4+ (FIG. 36A) como CD8+ (FIG. 36B).
Se realizó un análisis adicional para determinar la distribución de células que expresan PD-1, LAG3 y TIM3 de pacientes con diferentes respuestas a la terapia de CAR. El análisis del perfil celular representativo para la expresión de PD-1, LAG3 y TIM3 en la población CD4+ se muestra en la FIG. 37. En primer lugar, se analizaron las poblaciones de células para determinar la expresión de CD4+ y CD8+. A continuación, se analizó la población CD4+ (o población CD8+, no mostrada) para determinar la expresión de PD-1 y CAR19 (FIG. 37, perfiles de la izquierda). Como se describió anteriormente, los no respondedores (NR) tenían un porcentaje significativamente mayor de células que eran PD-1+ en general en comparación con los respondedores CART (CR) (alrededor de 92,9% de positivas para PD-1 para NR, en comparación con 44,7% de positivas para PD-1 para CR). Además, en los no respondedores, las células que expresan CAR19 fueron en su mayoría positivas para PD-1 (14,7% positivas para PD-1 y CAR+ en comparación con 0,64% negativas para PD-1 y CAR+). Luego, las poblaciones se analizaron para la coexpresión de PD-1 y LAG3 (FIG. 37, perfiles centrales). Las células que expresaron tanto PD-1 como LAG3 se muestran en el cuadrante superior derecho (Q2). Los no respondedores tenían un porcentaje significativamente mayor de células que expresaban inhibidores de puntos de control inmunitarios, PD-1 y lAG3, en comparación con los respondedores CART (67,3% comparado con 7,31%). La expresión de PD-1 también se analizó con la expresión de TIM3. En la FIG. 37, perfiles de la derecha, el recuadro indica las células que expresan tanto PD-1 como TIM3. De manera similar a los resultados obtenidos con PD-1 y LAG3, los no respondedores tenían un porcentaje significativamente mayor de células que expresaban inhibidores de puntos de control inmunitarios, PD-1 y TIM3, en comparación con los respondedores CART (83,3% comparado con 28,5%). El porcentaje de células que expresan PD-1 (PD1+), células que expresan PD-1 y LAG3 (PD1+LAG3+) y células que expresan PD-1 y TIM3 (PD1+TIM3+) se determinó para cada paciente en cada grupo de respuesta usando el análisis de citometría de flujo como se describe anteriormente. Se demostró que los no respondedores tenían un porcentaje aumentado de células PD1 LAG3+ (FIG. 38A) y células PD1+TIM3+ (FIG. 38B) en comparación con los respondedores CART que fue estadísticamente significativo para ambas poblaciones de células. Los respondedores parciales también mostraron un mayor porcentaje de ambas poblaciones de células en comparación con los respondedores CART, y los promedios disminuyeron en comparación con los no respondedores.
Estos resultados indican que los pacientes que no responden a la terapia de CAR exhiben una mayor expresión de inhibidores de puntos de control inmunitarios (por ejemplo, PD-1, LAG3 y TIM3) en comparación con los pacientes que responden o responden parcialmente a la terapia de c A r . Por lo tanto, estos resultados muestran que los agentes que inhiben o disminuyen la expresión de inhibidores de puntos de control inmunitarios, por ejemplo, PD-1, LAG3 o TIM3, pueden ser útiles para la administración a pacientes que reciben terapia de CAR para prevenir la supresión inmunológica a través de vías de puntos de control inmunitarios (por ejemplo, por PD-1, LAG3 o TIM3), aumentando así la eficacia de las células que expresan CAR.
Ejemplo 12: Efectos de la inhibición de mTOR sobre la inmunosenescencia en ancianos
Una de las vías más claramente relacionadas con el envejecimiento es la vía de mTOR. Se ha demostrado que el inhibidor de mTOR, rapamicina, prolonga la vida útil en ratones y mejora una variedad de afecciones relacionadas con el envejecimiento en ratones viejos (Harrison, DE et al. (2009) Nature 460:392-395; Wilkinson JE et al. (2012) Aging Cell 11:675-682; y Flynn, JM et al. (2013) Aging Cell 12:851-862). Por lo tanto, estos hallazgos indican que los inhibidores de mTOR pueden tener efectos beneficiosos sobre el envejecimiento y las afecciones relacionadas con el envejecimiento en los seres humanos.
Un fenotipo relacionado con la edad que se puede estudiar en un breve período de tiempo de ensayo clínico es la inmunosenescencia. La inmunosenescencia es la disminución de la función inmunológica que ocurre en los ancianos, lo que conduce a una mayor susceptibilidad a las infecciones y una menor respuesta a la vacunación, incluida la vacunación contra la gripe. La disminución de la función inmunológica con la edad se debe a una acumulación de defectos inmunitarios, incluida una disminución en la capacidad de las células madre hematopoyéticas (HSC) para generar linfocitos vírgenes, y a un aumento en el número de linfocitos positivos para PD-1 agotados que tienen respuestas defectuosas a la estimulación antigénica (Boraschi, D et al. (2013) Sci. Transl. Med.5:185ps8; Lages, CS et al. (2010) Aging Cell 9:785-798; y Shimatani, K et al., (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:15807-15812). Los estudios en ratones de edad avanzada mostraron que 6 semanas de tratamiento con el inhibidor de mTOR rapamicina rejuvenecieron la función de las células madre hematopoyéticas HSC, lo que condujo a una mayor producción de linfocitos sin tratamiento previo, una mejor respuesta a la vacunación contra la gripe y una vida útil prolongada (Chen, C et al. (2009) Sci. Signal.
2:ra75).
Para evaluar los efectos de la inhibición de mTOR sobre los fenotipos humanos relacionados con el envejecimiento y si el inhibidor de mTOR RAD001 mejora la inmunosenescencia, se evaluó la respuesta a la vacuna contra la gripe en voluntarios ancianos que recibieron RAD001 o placebo. Los hallazgos presentados aquí sugieren que RAD001 mejoró la respuesta a la vacuna contra la gripe en voluntarios de edad avanzada en dosis que fueron bien toleradas. RAD001 también redujo el porcentaje de linfocitos T CD4 y CD8 positivos para muerte programada (PD)-1 que se acumulan con la edad. Estos resultados muestran que la inhibición de mTOR tiene efectos beneficiosos sobre la inmunosenescencia en voluntarios ancianos.
Como se describe aquí, un tratamiento de 6 semanas con el inhibidor de mTOR RAD001, un análogo de la rapamicina, mejoró la respuesta a la vacunación contra la gripe en voluntarios humanos de edad avanzada.
Métodos
Población de estudio
Se inscribieron voluntarios de edad avanzada >= 65 años sin enfermedades médicas subyacentes inestables en 9 centros de Nueva Zelanda y Australia. Los criterios de exclusión en el cribado incluyeron hemoglobina <9,0 g/dl, recuento de glóbulos blancos <3.500/mm3, recuento de neutrófilos <2000/mm3, o recuento de plaquetas <125.000/mm3, diabetes no controlada, cardiopatía isquémica inestable, enfermedad pulmonar subyacente clínicamente significativa, antecedentes de inmunodeficiencia o tratamiento inmunosupresor, antecedentes de coagulopatía o afección médica que requiera anticoagulación a largo plazo, tasa de filtración glomerular estimada <30 ml/min, presencia de hipercolesterolemia (>350 mg/dl, 9,1 mmol/l) o hipertrigliceridemia (> 500 mg/dl, 5,6 mmol/l).
Los datos demográficos iniciales entre los brazos de tratamiento fueron similares (Tabla 7). De los 218 sujetos inscritos, 211 completaron el estudio. Siete sujetos se retiraron del estudio. Cinco sujetos se retiraron debido a eventos adversos (AE), un sujeto retiró su consentimiento, y un sujeto abandonó el estudio como resultado de una violación del protocolo.
T l r rí i m r fi l l i n l i
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*El índice de masa corporal es el peso en kilogramos dividido entre el cuadrado de la altura en metros.
Diseño y realización del estudio
Desde diciembre de 2011 hasta abril de 2012, se inscribieron 218 voluntarios de edad avanzada en un ensayo aleatorizado, enmascarado para el observador, y controlado con placebo. Los sujetos fueron asignados al azar a los brazos de tratamiento usando un sistema de aleatorización automatizado validado con una proporción de RAD001 a placebo de 5:2 en cada brazo de tratamiento. Los brazos de tratamiento fueron:
RAD001 0,5 mg al día o placebo
RAD001 5 mg semanales o placebo
RAD001 20 mg semanales o placebo
El ensayo fue enmascarado para el observador porque el placebo en las cohortes RAD001 0,5 mg al día y 20 mg semanales difirió ligeramente de los comprimidos de RAD001 en esas cohortes. El personal del estudio que evaluó a los sujetos no vio la medicación del estudio y, por lo tanto, trabajaban completamente a ciegas. La duración del tratamiento para todas las cohortes fue de 6 semanas, durante las cuales los sujetos se sometieron a evaluaciones de seguridad en la clínica cada 2 semanas. Después de que los sujetos habían recibido la dosis durante 4 semanas, se midieron los niveles de estado estacionario de RAD001 antes de la dosis y una hora después de la dosis. Después de completar el curso de 6 semanas del medicamento del estudio, los sujetos recibieron un descanso libre de medicamentos de 2 semanas para revertir cualquier posible inmunosupresión inducida por RAD001, y luego se les administró una vacuna contra la gripe estacional de 2012 (Agrippal®, Novartis Vaccines and Diagnostics, Siena, Italia) que contenían las cepas H1N1 A/California/ 07/2009, H3N2 A/Victoria/210/2009, B/Brisbane/60/ 2008. Cuatro semanas después de la vacunación contra la gripe, se extrajo suero de los sujetos para medir los títulos de gripe. Los títulos de anticuerpos para las 3 cepas de la vacuna contra la gripe, así como para 2 cepas heterólogas (A/H1N1 cepa A/New Jersy/8/76 y A/H3N2 cepa A/Victoria/361/11) se midieron mediante un ensayo estándar de inhibición de la hemaglutinación (Kendal, AP et al. (1982) Concepts and procedures for laboratory-based influenza surveillance. Atlanta: Centers for Disease Control and Prevention B17-B35). Los niveles de IgG e IgM específicos para la A/H1N1/California/07/2009 se midieron en muestras de suero tomadas antes y 4 semanas después de la vacunación contra la gripe como se describió anteriormente (Spensieri, F. et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110:14330-14335). Los resultados se expresaron como intensidad de fluorescencia.
Todos los sujetos proporcionaron su consentimiento informado por escrito. El estudio se realizó de acuerdo con los principios de Buenas Prácticas Clínicas, y fue aprobado por los comités de ética y las agencias reguladoras correspondientes.
Seguridad
La evaluación de eventos adversos y la recolección de sangre para evaluaciones de seguridad hematológica y bioquímica se realizaron durante las visitas del estudio. La información sobre eventos adversos también se recopiló en diarios que los sujetos completaron en casa durante las 6 semanas que estuvieron con el fármaco del estudio. Los datos sobre todos los eventos adversos se recopilaron desde el momento del consentimiento informado hasta 30 días después de la última visita del estudio. Los investigadores clasificaron los eventos como leves, moderados o graves.
Análisis estadístico.
El análisis principal de las razones de títulos medios geométricos se realizó usando un modelo de regresión bayesiano normal con antecedentes no informativos. Este modelo se ajustó a cada título de anticuerpos en la escala logarítmica. El resultado principal en cada modelo fue la medición del día 84. La medición del día 63 se incluyó en el vector de resultado. El modelo se ajustó usando SAS 9.2 proc mezclado con la declaración anterior. La estructura de covarianza de la matriz se consideró no estructurada (tipo de opción = UN). Se utilizó un antecedente plano. Para el análisis secundario de las tasas de seroconversión, se utilizó regresión logística.
La población de intención a tratar se definió como todos los sujetos que recibieron al menos una dosis completa del fármaco del estudio y que no tuvieron desviaciones importantes del protocolo que afectaran los datos de eficacia. 199 de un total de 218 sujetos inscritos en el estudio estaban en la población de intención a tratar.
Inmunofenotipificación
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica a partir de sangre completa recogida en 3 puntos de tiempo: línea de base; después de 6 semanas de tratamiento con el fármaco del estudio; y al final del estudio cuando los sujetos habían estado sin el fármaco del estudio durante 6 semanas y 4 semanas después de la vacunación contra la gripe. Se analizaron setenta y seis subconjuntos de PBMC mediante citometría de flujo usando paneles de inmunofenotipificación de 8 colores en el Human Immune Monitoring Center en Stanford University, CA, USA, como se describió anteriormente (Maecker, HT et al. (2012) Nat Rev Immunol. 12:191-200). Se analizaron setenta y seis subconjuntos de PBMC mediante citometría de flujo usando paneles de inmunofenotipificación liofilizados de 8 colores (BD Lyoplate, BD Biosciences, San Diego, CA). En el análisis se incluyeron muestras de PBMC con viabilidad >80% y rendimiento de 2x106 células o más.
Se calcularon los cambios relativos de los inmunofenotipos desde el inicio hasta la semana 6 del tratamiento con el fármaco del estudio y desde el inicio hasta el final del estudio (semana 12) para cada una de las cohortes de dosificación de RAD001. Se realizó la prueba de la T de Student para examinar si el cambio relativo de los inmunofenotipos desde el inicio hasta los dos momentos de muestreo de sangre fue significativamente diferente de cero, respectivamente, dentro de cada grupo de dosificación después de ajustar para el efecto placebo. No se realizó la imputación de datos faltantes en el análisis del efecto del tratamiento. Por lo tanto, si a un paciente le faltan datos del fenotipo al inicio del estudio, este paciente no se incluyó en el análisis para este fenotipo. Si a un paciente le faltaban datos del fenotipo a las 6 o 12 semanas, entonces este paciente no contribuyó al análisis de este fenotipo para el punto de tiempo afectado.
Se realizaron 608 pruebas en 76 fenotipos en 3 grupos de dosificación para comparar el efecto del tratamiento con el efecto placebo. Se implementó la metodología de control de la tasa de falsos descubrimientos estratificados (FDR) para controlar la aparición de falsos positivos asociados con múltiples pruebas y, al mismo tiempo, proporcionar una potencia considerablemente mejor. El grupo de tipo de célula se tomó como factor de estratificación y se realizó el cálculo de FDR (valor q) dentro de cada estrato, respectivamente. Todas las hipótesis nulas fueron rechazadas a un nivel de significancia de 0,05 con el valor q correspondiente < 0,1. La estrategia de ajuste de prueba múltiple con rechazo a un nivel de significancia de 0,05 y la correspondiente q<0,1 aseguró que menos del 10% de los hallazgos sean falsos.
En un segundo análisis, el inmunofenotipo cambia entre el tratamiento combinado y los grupos de placebo, donde se combinaron los tres grupos de dosificación de RAD001. Para determinar qué cambios de inmunofenotipo diferían entre los grupos tratados y placebo, se calcularon las proporciones de recuento de células dentro del paciente para cada fenotipo medido entre el inicio y la semana 6 del tratamiento con el fármaco del estudio y entre el inicio y el final del estudio (semana 12). Las proporciones se transformaron logarítmicamente y se analizaron mediante análisis de covarianza en cada punto de tiempo para detectar una diferencia entre los grupos de tratamiento combinado y placebo. Se realizaron 152 pruebas en 76 fenotipos para comparar el efecto del tratamiento combinado con el efecto placebo. Se implementó la metodología de control de la tasa de falsos descubrimientos estratificados (FDR) para controlar la aparición de falsos positivos asociados con múltiples pruebas y, al mismo tiempo, proporcionar una potencia considerablemente mejor (Benjamini, Y. et al. (1995) J. Roy. Statist. 57:289-300; y Sun, L. et al. (2006) Genet. Epidemiol. 30:519-530). El grupo de tipo de célula se tomó como factor de estratificación y el cálculo de FDR (valor q) se realizó dentro de cada estrato, respectivamente. Se rechazaron todas las hipótesis nulas con un nivel de significancia de 0,05 y un valor q inferior al 20%. Esto se puede interpretar como rechazar solo aquellas hipótesis con valores de P menores que 0,05 y menos del 20% de probabilidad de que cada resultado significativo observado se deba a múltiples pruebas.
Resultados
En general, RAD001 fue bien tolerado, en particular los regímenes de dosificación de 0,5 mg diarios y 5 mg semanales. No se produjeron muertes durante el estudio. Tres sujetos experimentaron cuatro eventos adversos graves (SAE) que se evaluaron como no relacionados con RAD001. Los 4 SAE fueron hemorragia retiniana del ojo izquierdo con ceguera subsiguiente en un sujeto con recuentos plaquetarios normales que habían completado un curso de 6 semanas de 5 mg semanales de RAD001 6 semanas antes; dolor de espalda severo en un sujeto tratado con placebo, y gastroenteritis severa en un sujeto tratado con placebo. En la Tabla 8 se proporciona una lista de eventos adversos (AE) relacionados con el tratamiento con una incidencia >2% en cualquier grupo de tratamiento. El AE relacionado con RAD001 más común fue la úlcera bucal que, en la mayoría de los casos, fue de gravedad leve. En general, los sujetos que recibieron RAD001 tuvieron una incidencia similar de AE graves a los tratados con placebo. Solo se evaluó un AE grave como relacionado con las úlceras bucales RAD001 en un sujeto tratado con 20 mg semanales de RAD001.
Tabla 8: Incidencia de AE relacionados con el tratamiento >2% en cualquier grupo de tratamiento por término preferido
RAD001 RAD001
RAD001 5 mg 20 mg Placebo, Total
0,5 mg diarios semanales semanales combinado
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lipoproteínas de baja
densidad
Ulceración de la lengua 3 (5,7%) 1 (1,9%) 0 1 (1,7%) 5 (2,3%) Insomnio 1 (1,9%) 2 (3,8%) 1 (1,9%) 0 4 (1,8%)
Boca seca 0 0 2 (3,8%) 1 (1,7%) 3 (1,4%) Neutropenia 0 0 3 (5,7%) 0 3 (1,4%) Dolor oral 0 2 (3,8%) 1 (1,9%) 0 3 (1,4%) Prurito 0 2 (3,8%) 1 (1,9%) 0 3 (1,4%) Conjuntivitis 0 2 (3,8%) 0 0 2 (0,9%) Eritema 0 2 (3,8%) 0 0 2 (0,9%) Molestia en las 0 2 (3,8%) 0 0 2 (0,9%) extremidades
Inflamación de las 0 0 2 (3,8%) 0 2 (0,9%) mucosas
Parestesia oral 2 (3,8%) 0 0 0 2 (0,9%) Estomatitis 0 0 2 (3,8%) 0 2 (0,9%) Trombocitopenia 0 0 2 (3,8%) 0 2 (0,9%) Infección del tracto urinario 0 0 2 (3,8%) 0 2 (0,9%)
La capacidad de RAD001 para mejorar la función inmunológica en voluntarios ancianos se evaluó midiendo la respuesta serológica a la vacuna contra la gripe estacional de 2012. Los títulos de la media geométrica (GMT) de inhibición de la hemaglutinación (HI) para cada una de las 3 cepas de la vacuna contra la gripe al inicio y 4 semanas después de la vacunación contra la gripe se proporcionan en la Tabla 9. La variable de análisis principal fue la relación HI GMT (4 semanas después de la vacunación/inicio). El estudio tuvo el poder de demostrar que en al menos 2 de cada 3 cepas de la vacuna contra la gripe hubo 1) un aumento de GMT > 1,2 veces con respecto al placebo; y 2) una probabilidad posterior no inferior al 80% de que la proporción de GMT corregida con placebo excediera 1. Este criterio de valoración se eligió porque un aumento de 1,2 veces en la proporción de GMT de gripe inducida por el adyuvante de la vacuna MF-59 se asoció con una disminución en la enfermedad de la gripe (lob, A et al. (2005) Epidemiol Infect 133:687-693).
Tabla 9. HI GMT para cada cepa de la vacuna contra la gripe al inicio y 4 semanas después de la vacunación contra la gripe
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La línea de base indica 2 semanas antes de la vacunación contra la gripe
La semana 4 indica 4 semanas después de la vacunación contra la gripe
N es el número de sujetos por cohorte
GMT es el título medio geométrico
El índice GMT es el GMT en la semana 4 después de la vacunación / GMT al inicio
CV% indica coeficiente de variación
En la población de intención a tratar (ITT), las cohortes de dosis baja, potenciadora del sistema inmunológico, RAD001 (0,5 mg diarios o 5 mg semanales) pero no la cohorte de dosis más altas (20 mg semanales) cumplieron el criterio de valoración principal del estudio (Figura 40A). Esto demuestra que existe un mecanismo inmunomodulador distinto de RAD001 a las dosis más bajas, y que a las dosis más altas pueden entrar en juego los efectos inmunosupresores conocidos de la inhibición de mTOR. Además, los resultados sugieren una tendencia hacia una función inmunológica mejorada en los ancianos después del tratamiento con dosis bajas de RAD001 que mejoran el sistema inmunológico.
En un análisis de subgrupos, el subconjunto de sujetos con títulos bajos de gripe al inicio (< 1:40) experimentó un mayor aumento asociado con RAD001 en los títulos que la población ITT (Figura 40B). Estos datos muestran que RAD001 es particularmente eficaz para mejorar la respuesta a la vacuna contra la gripe de sujetos que no tenían títulos protectores (>1:40) al inicio del estudio y, por lo tanto, tenían el mayor riesgo de contraer gripe.
Los gráficos de dispersión de la concentración de RAD001 frente al aumento de título para cada cepa de la vacuna antigripal muestran una relación inversa entre exposición y respuesta (Figura 41). El modelado y la simulación basados en la fosforilación de la cinasa S6 (S6K) mediada por mTOR predice que el régimen de dosificación semanal de 20 mg inhibe la actividad de S6K mediada por mTOR casi por completo, el régimen de dosificación semanal de 5 mg inhibe la actividad de S6K en más del 50%, y el régimen de dosificación de 0,5 mg al día inhibe la fosforilación de S6K en alrededor de un 38% durante el intervalo de dosificación (Tanaka, C et al. (2008) J. Clin. Oncol26:1596-1602). Por tanto, la inhibición parcial de mTOR, por ejemplo, fosforilación de S6K mediada por mTOR, con una dosis baja de RAD001 potenciadora del sistema inmunitario, puede ser tan, si no más eficaz, que la inhibición casi completa de mTOR con una dosis alta de RAD001 para potenciar la respuesta inmunitaria de los ancianos.
También se evaluaron las tasas de seroconversión 4 semanas después de la vacunación contra la gripe. La seroconversión se definió como el cambio de un título negativo antes de la vacunación (es decir, un título HI <1:10) a un título HI posterior a la vacunación > 1:40 o un aumento de al menos 4 veces desde un título no negativo (> 1:10) HI previo a la vacunación. En la población de intención a tratar, las tasas de seroconversión para las cepas H3N2 y B aumentaron en el RAD001 en comparación con las cohortes de placebo, aunque los aumentos no alcanzaron la significancia estadística (Tabla 10). En la subpoblación de sujetos con títulos de gripe basales <= 1:40, el tratamiento con RAD001 también aumentó las tasas de seroconversión a las cepas H3N2 y B, y estos resultados alcanzaron significancia estadística para la cepa B en la cohorte de dosis diaria de 0,5 mg. Estos datos muestran además que RAD001 mejoró la respuesta serológica a la vacunación contra la gripe en los ancianos.
T l 1 P r n n r n r i n ri 4 m n l n i n
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* Razón de momios para la seroconversión entre RAD001 y Placebo significativamente diferente de 1 (valor de p bilateral <0,05 obtenido por regresión logística con tratamiento como efecto fijo)
Las vacunas actuales contra la gripe estacional a menudo brindan una protección inadecuada contra las cepas de gripe que surgen continuamente y que se presentan como variantes de virus que circulaban anteriormente. Sin embargo, los ratones vacunados contra la gripe en presencia del inhibidor de mTOR rapamicina, en comparación con el placebo, desarrollaron una respuesta serológica más amplia a la gripe. La respuesta serológica más amplia incluyó anticuerpos contra epítopos conservados expresados por múltiples subtipos de gripe que brindan protección contra la infección con cepas heterólogas de gripe no contenidas en la vacuna (Keating, R et al. (2013) Nat Immunology 14:2166-2178). Para determinar si RAD001 amplió la respuesta serológica a la gripe en los voluntarios ancianos, se midieron los títulos de HI a 2 cepas heterólogas de gripe no contenidas en la vacuna contra la gripe (A/H1N1 cepa A/New Jersey/8/76 y A/H3N2 cepa A/Victoria/361/11). El aumento en las proporciones de HI GMT para las cepas heterólogas fue mayor en el RAD001 en comparación con las cohortes de placebo (Figura 42). Además, las tasas de seroconversión para las cepas heterólogas fueron más altas en el RAD001 en comparación con las cohortes de placebo. El aumento en las tasas de seroconversión en las cohortes de dosis de RAD001 de 5 y 20 mg semanales fue estadísticamente significativo para la cepa heteróloga H3N2 (Tabla 11). La tasa de seroconversión de H3N2 para las cohortes combinadas de RAD001 fue del 39% frente al 20% para la cohorte de placebo (p = 0,007). Los resultados presentados aquí sugieren que la inhibición de mTOR amplía la respuesta serológica de los voluntarios ancianos a la vacunación contra la gripe y aumenta los títulos de anticuerpos contra las cepas heterólogas de gripe no contenidas en la vacuna contra la gripe estacional.
La respuesta serológica ampliada a las cepas heterólogas de gripe en ratones tratados con rapamicina se ha asociado con una inhibición del cambio de clase en las células B y un aumento en los niveles de IgM anti-gripe (Keating, R. et al. (2013) Nat Immunol 14:2166-2178). Sin embargo, la inhibición del cambio de clases puede no estar involucrada en la respuesta serológica ampliada en humanos tratados con RAD001 porque los niveles de IgM e IgG anti-gripe post­ vacunación no difirieron entre las cohortes tratadas con RAD001 y placebo (Figura 43).
Tabla 11: Porcentaje de sujetos que seroconvirtieron a cepas heterólogas de gripe 4 semanas después de la vacunación n r l ri i n l
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* Razón de momios para la seroconversión entre RAD001 y Placebo significativamente diferente de 1 (valor de p bilateral <0,05 obtenido por regresión logística con tratamiento como efecto fijo)
Para abordar el mecanismo por el cual RAD001 mejoró la función inmune en voluntarios de edad avanzada, la inmunofenotipificación se realizó en muestras de PBMC obtenidas de sujetos al inicio del estudio, después de 6 semanas de tratamiento con el fármaco del estudio y 4 semanas después de la vacunación contra la gripe (6 semanas después de la interrupción del fármaco del estudio). Aunque el porcentaje de la mayoría de los subconjuntos de PBMC no difirió entre las cohortes de RAD001 y placebo, el porcentaje de células CD4 y CD8 positivas para PD-1 fue menor en el RAD001 en comparación con las cohortes de placebo (Figura 44). Las células CD4 y CD8 positivas para PD-1 se acumulan con la edad y tienen respuestas defectuosas a la estimulación antigénica porque PD-1 inhibe la proliferación de células T inducida por el receptor de células T, la producción de citocinas y la función citolítica (Lages, Cs et al. (2010) Aging Cell 9:785-798). Hubo un aumento en el porcentaje de células T positivas para PD-1 a lo largo del tiempo en la cohorte de placebo. En la semana 12 (4 semanas después de la vacunación), este aumento puede deberse a la vacunación contra la gripe, ya que se ha demostrado que el virus de la gripe aumenta las células T positivas para PD-1 (Erikson, JJ et al. (2012) jC l 122:2967-2982). Sin embargo, el porcentaje de células T CD4 positivas para p D-1 disminuyó desde el valor inicial en la semana 6 y 12 en todas las cohortes RAD001 (Figura 44A). El porcentaje de células CD8 positivas para PD-1 también disminuyó desde el valor inicial tanto en la semana 6 como en la 12 en las dos cohortes de dosis más bajas de RAD001 (Figura 44b ). El porcentaje de células T CD4 negativas para PD-1 se evaluó y aumentó en las cohortes RAD001 en comparación con las cohortes de placebo (Figura 44C).
Bajo un análisis estadístico más riguroso, donde los resultados de las cohortes RAD001 se agruparon y se ajustaron para las diferencias en la expresión inicial de PD-1, hubo una disminución estadísticamente significativa del 30,2% en las células T CD4 positivas para PD-1 en la semana 6 en la cohorte de RAD agrupada (n=84) en comparación con la cohorte de placebo (n=25) con p=0,03 (q=0,13) (Figura 45A). La disminución de las células T CD4 positivas para PD-1 en la semana 12 en la cohorte de RAD agrupada en comparación con la cohorte de placebo es 32,7%, con p=0,05 (q=0,19). La Figura 45B muestra una disminución estadísticamente significativa del 37,4% en células T CD8 positivas para PD-1 en la semana 6 en la cohorte RAD001 agrupada (n=84) en comparación con la cohorte placebo (n=25) con p=0,008 (q=0,07). La disminución de las células T CD8 positivas para PD-1 en la semana 12 en la cohorte de RAD001 agrupada en comparación con la cohorte de placebo es 41,4%, con p=0,066 (q=0,21). Por tanto, los resultados de las Figuras 44 y 45 juntos sugieren que la disminución asociada a RAD001 en el porcentaje de células T CD4 y CD8 positivas para PD-1 puede contribuir a una función inmunológica mejorada.
Conclusión
En conclusión, los datos presentados aquí muestran que el inhibidor de mTOR RAD001 mejora el declive relacionado con la edad en la función inmunológica de los ancianos humanos según lo evaluado por la respuesta a la vacunación contra la gripe, y que esta mejora se obtiene con un balance riesgo / beneficio aceptable. En un estudio de ratones ancianos, el tratamiento de 6 semanas con el inhibidor de mTOR rapamicina no solo mejoró la respuesta a la vacunación contra la gripe sino que también prolongó la vida útil, lo que sugiere que la mejora de la inmunosenescencia puede ser un marcador de un efecto más amplio sobre los fenotipos relacionados con el envejecimiento.
Dado que la dosificación de RAD001 se interrumpió 2 semanas antes de la vacunación, los efectos de mejora inmunitaria de RAD001 pueden estar mediados por cambios en una población de células relevantes que persiste después de la interrupción del tratamiento farmacológico. Los resultados presentados aquí muestran que RAD001 disminuyó el porcentaje de células T CD4 y CD8 positivas para PD-1 agotadas en comparación con el placebo. La expresión de PD-1 es inducida por la señalización de TCR y permanece alta en el contexto de la estimulación antigénica persistente, incluida la infección viral crónica. Si bien no se desea ceñirse a la teoría, es posible que RAD001 redujera la activación inmunitaria crónica en voluntarios ancianos y, por lo tanto, condujera a una disminución en la expresión de PD-1. RAD001 también puede inhibir directamente la expresión de PD-1 como se ha informado para la inmunofilina ciclosporina A (Oestreich, KJ et al. (2008) J Immunol. 181:4832-4839). Es probable que una reducción inducida por RAD001 en el porcentaje de células T positivas para PD-1 mejore la calidad de las respuestas de las células T. Esto es consistente con estudios previos que muestran que la inhibición de mTOR mejoró la calidad de la respuesta de las células T CD8 de memoria a la vacunación en ratones y primates (Araki, K et al. (2009) Nature 460:108-112). En ratones de edad avanzada, también se ha demostrado que la inhibición de mTOR aumenta el número de células madre hematopoyéticas, lo que conduce a una mayor producción de linfocitos vírgenes (Chen, C et al. (2009) Sci Signal2:ra75). Aunque en este ejemplo no se detectaron diferencias significativas en los porcentajes de linfocitos sin tratamiento previo en las cohortes RAD001 frente a placebo, este posible mecanismo puede investigarse más a fondo.
Se puede investigar más el mecanismo por el cual RAD001 amplió la respuesta serológica a cepas heterólogas de gripe. También se ha demostrado que la rapamicina inhibe el cambio de clase en las células B después de la vacunación contra la gripe. Como resultado, se generó un repertorio único de anticuerpos anti-gripe que promovió la protección de cepas cruzadas contra la infección letal con subtipos de virus de gripe no contenidos en la vacuna contra la gripe (Keating, R et al. (2013) Nat Immunol. 14:2166-2178). Los resultados descritos aquí no mostraron que RAD001 alteró el cambio de clase de células B en los sujetos de edad avanzada que habían descontinuado RAD001 2 semanas antes de la vacunación contra la gripe. Aunque el mecanismo subyacente requiere mayor aclaración, el aumento de la respuesta serológica a las cepas de gripe heterólogas descritas aquí puede conferir protección contra la gripe en años en los que no existe una correspondencia entre la vacuna estacional y las cepas de gripe circulantes en la comunidad.
El efecto de RAD001 sobre los títulos de anticuerpos contra la gripe fue comparable al efecto del adyuvante de la vacuna MF59 que está aprobado para mejorar la respuesta de los ancianos a la vacunación contra la gripe (Podda, A (2001) Vaccine 19:2673-2680). Por lo tanto, la mejora impulsada por RAD001 de la respuesta de anticuerpos a la vacunación contra la gripe puede traducirse en un beneficio clínico, como se demostró con la vacuna contra la gripe con adyuvante MF59 en los ancianos (Iob, A et al. (2005) Epidemiol Infect. 133:687-693). Sin embargo, RAD001 también se usa para suprimir la respuesta inmune de los pacientes con trasplante de órganos. Estos hallazgos aparentemente paradójicos plantean la posibilidad de que los efectos inmunomoduladores de los inhibidores de mTOR puedan ser dependientes de la dosis y/o del antígeno (Ferrer, IR et al. (2010) J Immunol. 185:2004-2008). Aquí se observó una tendencia hacia una relación inversa entre exposición a RAD001/respuesta a la vacunación. Es posible que la inhibición completa de mTOR suprima la función inmune a través del mecanismo normal de ciclofilina-rapamicina, mientras que la inhibición parcial de mTOR, al menos en los ancianos, mejora la función inmune debido a una clara inhibición del fenotipo relacionada con el envejecimiento. De interés, la actividad de mTOR aumenta en una variedad de tejidos, incluidas las células madre hematopoyéticas en modelos animales envejecidos (Chen C. et al. (2009) Sci Signal 2:ra75 and Barns, M. et al. (2014) Int J Biochem Cell Biol. 53:174-185). Por lo tanto, reducir la actividad de mTOR a los niveles observados en tejido joven, en contraposición a una supresión más completa de la actividad de mTOR, puede tener un beneficio clínico en las indicaciones de envejecimiento.
El perfil de seguridad de los inhibidores de mTOR como RAD001 en el tratamiento de las indicaciones relacionadas con el envejecimiento ha sido motivo de preocupación. La toxicidad de RAD001 en dosis utilizadas en oncología o indicaciones de trasplante de órganos incluye tasas de estomatitis, diarrea, náuseas, citopenias, hiperlipidemia e hiperglucemia que serían inaceptables para muchas indicaciones relacionadas con el envejecimiento. Sin embargo, estos AE están relacionados con los niveles mínimos de RAD001 en sangre. Por lo tanto, los regímenes de dosificación de RAD001 utilizados en este estudio se eligieron para minimizar los niveles mínimos. Los niveles mínimos medios de RAD001 de las cohortes de dosificación de 0,5 mg diarios, 5 mg semanales y 20 mg semanales fueron 0,9 ng/ml, por debajo de 0,3 ng/ml (el límite inferior de cuantificación) y 0,7 ng/ml, respectivamente. Estos niveles mínimos son significativamente más bajos que los niveles mínimos asociados con los regímenes de dosificación utilizados en pacientes con cáncer y trasplantes de órganos. Además, el curso limitado de tratamiento de 6 semanas redujo el riesgo de eventos adversos. Estos hallazgos sugieren que los regímenes de dosificación utilizados en este estudio pueden tener un riesgo / beneficio aceptable para algunas afecciones de los ancianos. No obstante, un número significativo de sujetos en los experimentos descritos aquí desarrollaron úlceras bucales incluso cuando se administraron dosis tan bajas como 0,5 mg al día. Por lo tanto, el perfil de seguridad de la dosis baja, potenciadora del sistema inmunológico, RAD001 justifica un estudio adicional. El desarrollo de inhibidores de mTOR con perfiles de seguridad más limpios que los rapalogs actualmente disponibles puede proporcionar mejores opciones terapéuticas en el futuro para las afecciones asociadas al envejecimiento.
Ejemplo 13: Mejora de la respuesta inmunitaria a la vacuna en sujetos de edad avanzada
La función inmunológica disminuye en los ancianos, lo que lleva a un aumento de la incidencia de infección y una menor respuesta a la vacunación. Como primer paso para determinar si la inhibición de mTOR tiene efectos antienvejecimiento en los seres humanos, se realizó un ensayo aleatorizado controlado con placebo para determinar si el inhibidor de mTOR RAD001 revierte la disminución de la función inmunológica relacionada con el envejecimiento, según lo evaluado por la respuesta a la vacunación en voluntarios de edad avanzada. En todos los casos, se obtuvieron los correspondientes consentimientos de patentes y el estudio fue aprobado por las autoridades sanitarias nacionales.
En el estudio se utilizaron los siguientes 3 regímenes de dosificación de RAD001:
20 mg por semana (nivel mínimo: 0,7 ng/ml)
5 mg por semana (el nivel mínimo estaba por debajo de los límites de detección)
0,5 mg al día (nivel mínimo: 0,9 ng/ml)
Se eligieron estos regímenes de dosificación porque tienen niveles mínimos más bajos que las dosis de RAD001 aprobadas para trasplantes y para indicaciones oncológicas. El nivel mínimo es el nivel más bajo de un fármaco en el cuerpo. El nivel mínimo de RAD001 asociado con la pauta posológica oncológica diaria de 10 mg es de alrededor de 20 ng/ml. El nivel mínimo asociado con la pauta posológica de trasplante de 0,75 a 1,5 mg dos veces al día es de alrededor de 3 ng/ml. Por el contrario, el nivel mínimo asociado con las pautas posológicas utilizadas en nuestro estudio de inmunización fue 3 a 20 veces menor.
Dado que los AE relacionados con RAD001 están asociados con niveles mínimos, se predijo que los 3 regímenes de dosificación tendrían una seguridad adecuada para los voluntarios normales. Además, se predijo que las 3 dosis darían un rango de inhibición de mTOR. La cinasa P70 S6 (P70 S6K) es una diana aguas abajo que es fosforilada por mTOR. Los niveles de fosforilación de P70 S6K sirven como medida de la actividad de mTOR. Basado en el modelado y simulación de los datos de fosforilación de P70 S6K obtenidos en estudios preclínicos y clínicos de RAD001, se predijo que 20 mg semanales inhibirían casi por completo la actividad de mTOR durante una semana completa, mientras que 5 mg semanales y 0,5 mg diarios inhibirían parcialmente la actividad de mTOR .
Los voluntarios de edad avanzada >= 65 años de edad fueron asignados aleatoriamente a uno de los 3 grupos de tratamiento RAD001 (50 sujetos por brazo) o placebo (20 sujetos por brazo). Los sujetos fueron tratados con el fármaco del estudio durante 6 semanas, se les dio un descanso de 2 semanas y luego recibieron vacunas contra la gripe (Aggrippal, Novartis) y neumocócica (Pneumovax 23, Merck). La respuesta a la vacunación contra la gripe se evaluó midiendo los títulos de media geométrica (GMT) mediante un ensayo de inhibición de la hemaglutinación de las 3 cepas de gripe (subtipos de gripe H1N1, H3N2 y B) en la vacuna contra la gripe 4 semanas después de la vacunación. Los criterios de valoración principales del estudio fueron (1) seguridad y tolerabilidad y (2) un aumento de 1,2 veces en los títulos de gripe en comparación con placebo en 2/3 de las cepas de la vacuna contra la gripe 4 semanas después de la vacunación. Se eligió este criterio de valoración porque un aumento de 1,2 veces en los títulos de gripe se asocia con una disminución de la enfermedad de gripe después de la vacunación y, por lo tanto, es clínicamente relevante. Las dosis de 5 mg semanales y 0,5 mg diarias se toleraron bien y, a diferencia de la dosis semanal de 20 mg, cumplieron con el criterio de valoración primario GMT (Figura 40A). RAD001 no solo mejoró la respuesta a la vacunación contra la gripe, sino que también mejoró la respuesta a la vacunación neumocócica en comparación con el placebo en voluntarios ancianos. La vacuna antineumocócica contiene antígenos de 23 serotipos neumocócicos. Los títulos de anticuerpos para 7 de los serotipos se midieron en nuestros sujetos. Los títulos de anticuerpos para 6/7 serotipos aumentaron en las 3 cohortes RAD en comparación con el placebo.
Los datos combinados de títulos de gripe y neumococo sugieren que la inhibición parcial (menos del 80-100%) de mTOR es más efectiva para revertir la disminución de la función inmunológica relacionada con el envejecimiento que la inhibición más completa de mTOR.
Ejemplo 14: La inhibición de mTOR a dosis bajas aumenta la energía y el ejercicio
En modelos preclínicos, la inhibición de mTOR con el rapalog rapamicina aumenta la actividad física espontánea en ratones viejos (Wilkinson et al. Rapamycin slows aging in mice. (2012) Aging Cell; 11:675-82). De interés, los sujetos de la cohorte de dosificación diaria de 0,5 mg descrita en el Ejemplo 13 también informaron un aumento de la energía y la capacidad de ejercicio en comparación con el placebo en los cuestionarios administrados un año después de la dosificación (Figura 46). Estos datos sugieren que la inhibición parcial de mTOR con rapalogs puede tener efectos beneficiosos sobre la morbilidad relacionada con el envejecimiento más allá de la función inmunitaria.
Ejemplo 15: Inhibición de la cinasa P70 S6 con RAD001
Se realizaron modelos y simulación para predecir los rangos de dosis diaria y semanal de RAD001 que se predice que inhibirán parcialmente la actividad de mTOR. Como se señaló anteriormente, P70 S6K es fosforilado por mTOR y es el objetivo posterior de mTOR que está más estrechamente relacionado con el envejecimiento porque la eliminación de P70 S6K aumenta la vida. Por lo tanto, se realizó un modelado de dosis de RAD001 que inhiben parcialmente la actividad de P70 S6K. Se predice que la dosificación semanal en el intervalo de >= 0,1 mg y < 20 mg logrará una inhibición parcial de la actividad de P70 S6K (Figura 47).
Para la dosificación diaria, las concentraciones de RAD001 de 30 pM a 4 nM inhibieron parcialmente la actividad de P70 S6K en líneas celulares (Tabla 12). Se prevé que estas concentraciones séricas se alcancen con dosis de RAD001 >= 0,005 mg a < 1,5 mg al día.
Tabla 12: Porcentae de inhibición de la actividad de P70 S6K en células HeLa in vitro
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Conclusión
Métodos para tratar la morbilidad relacionada con el envejecimiento o, en general, mejorar una respuesta inmune, con dosis de inhibidores de mTOR que solo inhiben parcialmente P70 S6K. La eficacia de la inhibición parcial de mTOR con dosis bajas de RAD001 en las indicaciones de envejecimiento es un hallazgo inesperado. Los rangos de dosis de RAD001 entre >= 0,1 mg a < 20 mg semanales y >= 0,005 mg a < 1,5 mg diarios lograrán una inhibición parcial de mTOR y, por lo tanto, se espera que tengan eficacia en la morbilidad relacionada con el envejecimiento o en la mejora de la respuesta inmunitaria.
Ejemplo 16: IL-7 exógena mejora la función de las células CAR T
Después de la transferencia adoptiva de células CAR T, algunos pacientes experimentan una persistencia limitada de las células CAR T, lo que puede resultar en niveles subóptimos de actividad antitumoral. En este ejemplo, los efectos de la administración de IL-7 humana exógena se evalúan en modelos de xenoinjerto de ratón en los que se ha observado una respuesta inicial subóptima a las células T con CAR.
La expresión del receptor de IL-7 CD127 se evaluó primero en diferentes líneas de células cancerosas y en células que expresan CAR. Se analizaron dos líneas celulares de linfoma de células del manto (RL y Jeko-1) y una línea celular B-ALL (Nalm-6) mediante citometría de flujo para determinar la expresión de CD127. Como se muestra en la Figura 48A, de las tres líneas de células cancerosas probadas, se demostró que RL tenía la expresión más alta de CD127, seguida de Jeko-1 y Nalm-6. Se infundieron células CART19 en ratones NSG y se evaluó la expresión de CD127 en las células CART19 circulantes mediante citometría de flujo. Como se muestra en la Figura 48B, CD127 se expresa uniformemente en todas las células CART19 circulantes.
A continuación, se evaluó el efecto del tratamiento con IL-7 exógena sobre la actividad antitumoral de las células CART19 en un modelo animal de linfoma. Los ratones NSG se injertaron con una línea celular del manto que expresa luciferasa (RL luc) el día 0 (D0), seguido del tratamiento de las células CART19 el día 6. Los ratones NSG se dividieron en grupos, donde un grupo no recibió células CART19, un segundo grupo recibió 0.5 x106 células CART19, un tercer grupo recibió 1x106 células CART19, y un cuarto grupo recibió 2x106 células CART19. El tamaño del tumor se controló midiendo la bioluminiscencia media de los tumores injertados durante más de 80 días. Solo ratones que reciben 2x106 células CART19 demostraron rechazo del tumor e inhibición del crecimiento tumoral (Figura 49A). Se demostró que los ratones de los dos grupos que reciben 0,5 x106 células CART19 o 1x106 células CART19 tienen una respuesta antitumoral subóptima. Los ratones de estos dos grupos fueron luego asignados al azar, donde tres ratones (ratón #3827 y #3829 que recibieron 0,5x106 células CART19 y ratón #3815 que recibió 1x106 células CART19) recibieron IL-7 humana recombinante exógena a una dosis de 200 ng/ratón mediante inyección intraperitoneal tres veces por semana a partir del día 85, y dos ratones no. La carga tumoral de los ratones que recibieron IL-7 exógena desde el día 85-125, detectada por bioluminiscencia media, se muestra en la Figura 49B. Todos los ratones que recibieron IL-7 mostraron una respuesta espectacular de 1-3 log de reducción en la carga tumoral. Los ratones que originalmente recibieron una dosis más alta de células CART19 (ratón #3815 que recibió 1x106 células CART19) mostraron una respuesta más profunda. Al comparar la carga tumoral de los ratones que recibieron tratamiento con IL-7 con el control, antes y después del tratamiento con IL-7, solo se observó reducción tumoral en la carga tumoral en los ratones que habían recibido tratamiento con IL-7 (Figura 49C).
También se examinó la dinámica de las células T después del tratamiento con IL-7 en el modelo animal de linfoma. Las células CART19 humanas no eran detectables en la sangre antes del tratamiento con IL-7. Tras el tratamiento de IL-7, hubo un aumento rápido, pero variable, en el número de células T en los ratones tratados (Figura 50A). El grado de expansión de células T observado en ratones que recibieron IL-7 también se correlacionó con la respuesta tumoral. El ratón con el mayor número de células T detectadas en la sangre en el pico de expansión durante el tratamiento con IL-7 (ratón #3815) tuvo la reducción más robusta de la carga tumoral (véase Figura 49B). Además, el tiempo de expansión máxima se correlacionó con la dosis de células T inyectada como línea base. También se midió el número/nivel de células que expresan CD3 en la sangre antes y después del tratamiento con IL-7. En los ratones de control, se detectaron muy pocas células que expresan CD3, mientras que los ratones tratados con IL-7 mostraron un aumento significativo en las células CD3+ después del tratamiento con IL-7 (Figura 50B).
Juntos, los resultados de este ejemplo demuestran que el tratamiento con IL-7 exógena aumenta la proliferación de células T y la actividad antitumoral in vivo, lo que indica que el uso de IL-7 en pacientes con resultados subóptimos después de la terapia de CAR puede mejorar la respuesta antitumoral en estos pacientes.

Claims (35)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende una célula que expresa una molécula CAR que se une a CD19 (una “célula que expresa CAR19”) y uno o más inhibidores de cinasa, en la que dicho uno o más inhibidores de cinasa incluye un inhibidor de tirosina cinasa de Bruton (BTK), opcionalmente en la que la célula que expresa CAR19 y el uno o más inhibidores de cinasa están presentes en una forma de dosis única, o como dos o más formas de dosis.
2. La composición de la reivindicación 1, en la que la célula que expresa CAR19 es una célula efectora inmunitaria humana (por ejemplo, una célula T humana o una célula NK humana) o se proporciona como una población de dichas células efectoras inmunitarias humanas.
3. La composición de la reivindicación 1, para uso como medicamento.
4. Una composición que comprende una célula (por ejemplo, una población de células) que expresa una molécula CAR que se une a CD19 (una “célula que expresa CAR19”) para uso, en combinación con uno o más inhibidores de cinasas, en el tratamiento de un cáncer hematológico en un mamífero, en la que dicho uno o más inhibidores de cinasa incluyen un inhibidor de tirosina cinasa de Bruton (BTK).
5. La composición para uso de la reivindicación 4, en la que
(a) el inhibidor de cinasa y la célula que expresa CAR19 se administran al mamífero como primera línea de terapia; o
(b) la célula que expresa CAR19 se administra al mamífero después de la administración del inhibidor de cinasa, opcionalmente en la que:
(i) la célula que expresa CAR19 se administra después de cesar la administración del inhibidor de cinasa; o
(ii) la administración del inhibidor de cinasa se inicia antes de la administración de la célula que expresa CAR19, y la célula que expresa CAR19 se administra en combinación con la administración continuada del inhibidor de cinasa.
6. La composición para uso de la reivindicación 4 o 5, en la que el inhibidor de BTK se escoge de ibrutinib, GDC-0834, RN-486, CGI-560, CGI-1764, HM-71224, CC-292, ONO-4059, CNX-774 o LFM-A13.
7. La composición para uso de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en la que la célula expresa una molécula CAR que comprende un dominio de unión anti-CD19, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular.
8. La composición, para uso de la reivindicación 7, en la que:
(i) el dominio de señalización intracelular comprende un dominio coestimulador y un dominio de señalización primario; (ii) la molécula CAR comprende un dominio de unión anti-CD19 que comprende una región determinante de la complementariedad 1 de cadena ligera (LC CDR1), una región determinante de la complementariedad 2 de cadena ligera (LC CDR2), una región determinante de la complementariedad 3 de cadena ligera (LC CDR3), una región determinante de la complementariedad 1 de cadena pesada (HC CDR1), una región determinante de la complementariedad 2 de cadena pesada (Hc CDR2), y una región determinante de la complementariedad 3 de cadena pesada (HC CDR3) de un dominio de unión anti-CD19;
(iii) el dominio de unión anti-CD19 comprende una región variable de cadena ligera murina de la Tabla 7, una región variable de cadena pesada murina de la Tabla 7, o ambas;
(iv) el dominio de unión anti-CD19 comprende una LC CDR1 de SEQ ID NO:25, una LC CDR2 de SEQ ID NO:26 y una LC CDR3 de SEQ ID NO:27;
(v) el dominio de unión anti-CD19 comprende una HC CDR1 de SEQ ID NO:19, una HC CDR2 de cualquiera de SEQ ID NOS:20-23 y una HC CDR3 de SEQ ID NO:24;
(vi) el dominio de unión anti-CD19 comprende una secuencia de SEQ ID NO:59, o una secuencia con una identidad del 95-99% con la misma; y/o
(vii) el dominio de unión anti-CD19 está conectado al dominio transmembrana mediante una región de bisagra, por ejemplo, en la que la región de bisagra comprende una secuencia de SEQ ID NO:14 o SEQ ID NO:45.
9. La composición para uso de la reivindicación 7 o la reivindicación 8 (i), (ii), (iv) o (v), en la que el dominio de unión anti-CD19 es un dominio de unión anti-CD19 humanizado, opcionalmente en la que
(a) el dominio de unión anti-CD19 humanizado comprende una secuencia escogida de: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 y SEQ ID NO:12, o una secuencia con una identidad del 95-99% con las mismas; y/o
(b) el dominio de unión anti-CD19 humanizado es un scFv que comprende una región variable de cadena ligera unida a una región variable de cadena pesada mediante un enlazador, por ejemplo, en el que el enlazador comprende una secuencia de SEQ ID NO:53.
10. La composición para uso de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, en la que
(i) la molécula CAR comprende un dominio transmembrana de una proteína escogida de: la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 o CD154, en la que opcionalmente el dominio transmembrana comprende una secuencia de SEQ ID NO:15;
(ii) la molécula CAR comprende un dominio coestimulador, por ejemplo, en la que el dominio coestimulador comprende un dominio de señalización funcional de una proteína escogida de: OX40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18) o 4-1BB (CD137), por ejemplo, en la que el dominio coestimulador comprende una secuencia de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:51;
(iii) la molécula CAR comprende un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, en la que:
(a) el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización funcional de 4-1BB, un dominio de señalización funcional de CD3 zeta, o ambos; o
(b) el dominio de señalización intracelular comprende una secuencia de CD27, un dominio de señalización funcional de CD3 zeta, o ambos,
en la que, además el dominio de señalización intracelular comprende opcionalmente:
(c) una secuencia de SEQ ID NO:16, una secuencia de SEQ ID NO:17, o ambas;
(d) una secuencia de SEQ ID NO:16, una secuencia de SEQ ID NO:43, o ambas;
(e) una secuencia de SEQ ID NO:51, una secuencia de SEQ ID NO:17, o ambas; o
(f) una secuencia de SEQ ID NO:51, una secuencia de SEQ ID NO:43, o ambas;
(iv) la molécula CAR comprende además una secuencia líder, por ejemplo, en la que la secuencia líder comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:13; y/o
(v) la molécula CAR comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, o SEQ ID NO:42.
11. La composición para uso de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10, en la que la composición se para usar en combinación con un agente que inhibe una molécula inhibidora inmunológica escogida de: PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 o TGFR beta.
12. La composición para uso de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 11, en la que la composición comprende de 1 a 5 x 108 células que expresan CAR.
13. La composición para uso según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 12, en la que el cáncer hematológico se escoge de una leucemia o un linfoma, en particular leucemia linfocítica crónica (CLL), linfoma de células del manto (MCL), mieloma múltiple, leucemia linfoide aguda (ALL), linfoma de Hodgkin, leucemia linfoide aguda de células B (BALL), leucemia linfoide aguda de células T (TALL), linfoma linfocítico pequeño (SLL), leucemia prolinfocítica de células B, neoplasia plasmocitoide blástica de células dendríticas, linfoma de Burkitt, linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), DLBCL asociado con inflamación crónica, linfoma folicular, linfoma folicular pediátrico, leucemia de células pilosas, linfoma folicular de células pequeñas o células grandes, enfermedades linfoproliferativas malignas, linfoma MALT (linfoma extraganglionar de la zona marginal de tejido linfoide asociado a mucosas), linfoma de zona marginal, mielodisplasia y síndrome mielodisplásico, linfoma no Hodgkin, linfoma plasmablástico, neoplasia de células dendríticas plasmocitoides, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma de zona marginal esplénica, linfoma/leucemia esplénica, linfoma de células B pequeñas de pulpa roja difusa esplénica, variante de leucemia de células pilosas, linfoma linfoplasmocítico, enfermedad de cadenas pesadas, mieloma de células plasmáticas, plasmocitoma óseo solitario, plasmocitoma extraóseo, linfoma de zona marginal ganglionar, linfoma de zona marginal ganglionar pediátrico, linfoma cutáneo primario del centro del folículo, granulomatosis linfomatoide, linfoma mediastínico primario (tímico) de células B grandes, linfoma intravascular de células B grandes, linfoma de células B grandes ALK+, linfoma de células B grandes que surge en la enfermedad de Castleman multicéntrica asociada a HHV8, linfoma de derrame primario, linfoma de células B o linfoma no clasificable, especialmente en la que el cáncer se escoge de MCL, CLL, ALL, linfoma de Hodgkin o mieloma múltiple.
14. La composición para uso de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 13, en la que
(i) la composición se para usar en combinación con una citocina, opcionalmente en la que la citocina es IL-7, IL-15 o IL-21;
(ii) la célula que expresa CAR19 se administra en combinación con un segundo inhibidor de cinasa, en la que el segundo inhibidor de cinasa es distinto de ibrutinib, cuando el mamífero es, o se identifica como no respondedor o recidivante a ibrutinib, opcionalmente en la que el segundo inhibidor de cinasa se escoge de uno o más de GDC-0834, RN-486, CGI-560, CGI-1764, HM-71224, CC-292, ONO-4059, CNX-774, o LFM-A13, o una combinación de los mismos; y/o
(iii) el uso comprende además administrar una dosis baja potenciadora del sistema inmunológico de un inhibidor de mTOR al mamífero, opcionalmente en la que el inhibidor de mTOR es everolimus o rapamicina.
15. La composición para uso de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 14, en la que el CAR es un CAR regulable (RCAR), en el que opcionalmente el RCAR comprende:
(a) un miembro de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización intracelular y un primer dominio de tipo interruptor,
(b) un miembro de unión a antígeno que comprende un dominio de unión a antígeno que se une a CD19 y un segundo dominio de tipo interruptor; y
(c) un dominio transmembrana.
16. La composición para uso de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 15, en la que
(i) el mamífero es, o se identifica como un respondedor completo o parcial al inhibidor de BTK (por ejemplo, ibrutinib), o un respondedor completo o parcial a la célula que expresa CAR19;
(ii) el mamífero tiene, o se identifica que tiene, una mutación en BTK;
(iii) la resistencia al inhibidor de cinasa, la célula que expresa una molécula CAR al mamífero, o ambos, se retrasa o disminuye;
(iv) se prolonga la remisión del cáncer hematológico o se retrasa la recaída del cáncer hematológico;
(v) el mamífero es, o se identifica como, respondedor parcial, no respondedor o recae en una o más terapias para el cáncer hematológico;
(vi) el mamífero es (o se identifica como) un respondedor parcial al inhibidor de cinasa, y al mamífero se le administra la célula que expresa CAR19, sola o en combinación con el inhibidor de BTK, durante el período de respuesta parcial; y/o (vii) el mamífero es (o se ha identificado como) un no respondedor que tiene una enfermedad progresiva o estable después del tratamiento con ibrutinib, y al mamífero se le administra la célula que expresa CAR19, sola o en combinación con un segundo inhibidor de BTK, durante el período de enfermedad progresiva o estable, en el que el segundo inhibidor de cinasa es distinto de ibrutinib.
17. La composición para uso de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 16, en la que el inhibidor de cinasa es ibrutinib y el ibrutinib
(i) tiene una dosis de 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 420 mg, 440 mg, 460 mg, 480 mg, 500 mg, 520 mg, 540 mg, 560 mg, 580 mg o 600 mg al día; y/o
(ii) se formula para la administración durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más ciclos, por ejemplo, en la que la duración del ciclo es de 21 o 28 días.
18. La composición para uso según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 17, en la que la administración de células que expresan CAR19 se inicia al menos 1, 2, 3 o 4 semanas, o 1, 2, 3, 4, 6, 9, 12, 15, 18 o 24 meses después de que comience la administración del inhibidor de cinasa.
19. La composición para uso de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 18, en la que el uso comprende realizar una infusión de linfocitos con al menos una célula que expresa CAR CD19.
20. La composición para uso de cualquiera de las reivindicaciones 4-19, en la que la célula y el inhibidor de cinasa se formulan para administración simultánea o suministro secuencial.
21. La composición para uso de cualquiera de las reivindicaciones 4-20, en la que el mamífero ha sufrido una linfodepleción, opcionalmente en la que la linfodepleción comprende la administración de uno o más de entre melfalán, citoxano, ciclofosfamida y fludarabina.
22. La composición para uso de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 21, en la que el mamífero experimenta una reducción en las células T que expresan PD1 después de la administración del inhibidor de cinasa.
23. La composición para uso de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 22, en la que la célula que expresa CAR19 es una célula efectora inmunitaria humana (por ejemplo, una célula T humana o una célula NK humana) o se proporciona como una población de dichas células efectoras inmunitarias humanas.
24. Célula efectora inmunitaria que expresa una molécula CAR que se une a CD19, para uso en el tratamiento del cáncer en combinación con un inhibidor de la tirosina cinasa de Bruton.
25. Un método para obtener una célula que expresa CAR (por ejemplo, una célula efectora inmunitaria que expresa CAR) o una población de células, que comprende:
(a) poner en contacto la célula o población de células con un inhibidor de BTK; y
(b) introducir (por ejemplo, transducir) un ácido nucleico que codifica una molécula CAR en la célula o población de células en condiciones tales que se exprese la molécula CAR,
en el que la molécula CAR es una molécula CAR que se une a CD19.
26. El método de la reivindicación 25, en el que:
(i) la célula es una célula T o una célula NK, o la población de células incluye células T, células NK o ambas;
(ii) la población de células también comprende células cancerosas, en las que opcionalmente el inhibidor de BTK inhibe una BTK en las células cancerosas; y/o
(iii) el método comprende además reducir las células T reguladoras (por ejemplo, células CD25+) de la población de células.
27. El método de la reivindicación 25 o 26, en el que:
(i) el método comprende poner en contacto la célula o población de células con el inhibidor de BTK durante 10-20, 20-30, 30-40, 40-60 o 60-120 minutos y posteriormente eliminar la mayor parte o la totalidad del inhibidor de BTK de la célula o población de células; y/o
(ii) el inhibidor de BTK se añade después de recoger la célula o población de células o antes de que se estimule la célula o población de células.
28. El método de cualquiera de las reivindicaciones 25-27, en el que el inhibidor de BTK se escoge de: ibrutinib, GDC-0834, RN-486, CGI-560, CGI-1764, HM-71224, CC-292, ONO-4059, CNX-774 o LFM-A13.
29. El método de la reivindicación 25, en el que la célula que expresa CAR19 es una célula efectora inmunitaria humana (por ejemplo, una célula T humana o una célula NK humana) o se proporciona como una población de dichas células efectoras inmunitarias humanas.
30. Una mezcla de reacción que comprende una población de células efectoras inmunitarias, un inhibidor de BTK y una molécula CAR o un ácido nucleico que codifica una molécula CAR, en la que la molécula CAR se une a CD 19.
31. La mezcla de reacción de la reivindicación 30, en la que una o más de las células efectoras inmunitarias expresa la molécula CAR o comprende el ácido nucleico que codifica la molécula CAR.
32. La mezcla de reacción de la reivindicación 30 o 31, en la que el inhibidor de BTK se escoge de ibrutinib, GDC-0834, RN-486, CGI-560, CGI-1764, HM-71224, CC-292, ONO-4059, CNX-774 o LFM-A13.
33. La mezcla de reacción de cualquiera de las reivindicaciones 30 a 32, en la que la mezcla de reacción comprende además células cancerosas.
34. Una mezcla de reacción que comprende una población de células efectoras inmunitarias y una molécula CAR o un ácido nucleico que codifica una molécula CAR, en la que las células efectoras inmunitarias comprenden ITK inactivada covalentemente; adicionalmente, en la que la molécula CAR se une a CD19.
35. La mezcla de reacción de la reivindicación 34, en la que la mezcla de reacción comprende además células cancerosas, en la que opcionalmente las células cancerosas comprenden BTK inactivada covalentemente.
ES15719043T 2014-04-07 2015-04-07 Tratamiento del cáncer usando receptor de antígeno quimérico anti-cd19 Active ES2876263T3 (es)

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