DE60036945T2

DE60036945T2 - Stimulierung oder hemmung von angiogenese und herzvaskularisierung mit tumor nekrose faktor ligand/rezeptor homologen

Info

Publication number: DE60036945T2
Application number: DE60036945T
Authority: DE
Inventors: P. Mickey Half Moon Bay Williams; Mary E. San Mateo GERRITSEN
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1999-07-12
Filing date: 2000-07-11
Publication date: 2008-08-21
Anticipated expiration: 2020-07-12
Also published as: JP2003504343A; IL147442A; WO2001003720A9; ES2295040T3; WO2001003720A2; IL147442A0; CA2378179A1; AU2005203642A1; WO2001003720A3; EP1196186A2; AU2009200385A1; EP1196186B1; PT1196186E; DE60036945D1; ATE376837T1; DK1196186T3; AU6085700A; US20050202008A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Fachgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Verfahren zur Förderung oder Hemmung von Angiogenese und/oder Kardiovaskularisierung in Säugetieren, die eine solche biologische Wirkung benötigen. Dies umfasst die Diagnose und Behandlung von kardiovaskulären Erkrankungen sowie onkologischen Erkrankungen.
Beschreibung des Hintergrunds der Erfindung
Herzerkrankungen und Faktoren
Herzinsuffizienz betrifft etwa fünf Millionen Amerikaner, und neue Fälle von Herzinsuffizienz belaufen sich auf etwa 400.000 pro Jahr. Es ist die häufigste alleinige Ursache für Krankenhausaufenthalt von Menschen im Alter von 65 Jahren und älter in den Vereinigten Staaten. Jüngste Fortschritte im Umgang mit akuten Herzerkrankungen, einschließlich akuten Myokardinfarkt, führten zu einer expandierenden Patientenpopulation, die letztlich chronische Herzinsuffizienz entwickeln wird. Von 1979 bis 1995 stiegen Hospitalisierungen aufgrund von Stauungsinsuffizienz (CHF) von 377.000 auf 872.000 (ein 130-prozentiger Anstieg), und CHF-Todesfälle stiegen um 116 Prozent.
CHF ist ein Syndrom, das durch eine Fehlfunktion des linken Ventrikels, reduzierte Toleranz gegenüber körperlicher Betätigung, gestörte Lebensqualität und deutlich verkürzte Lebenserwartung gekennzeichnet ist. Das Sine qua non von Herzinsuffizienz ist ein Unvermögen des Herzens, Blut in einer ausreichenden Rate zu pumpen, um die Stoffwechselbedürfnisse der Körpergewebe zu erfüllen (in anderen Worten besteht unzureichende Herzleistung).
Zumindest vier große Kompensationsmechanismen werden im Bereich von Herzinsuffizienz aktiviert, um die Herzleistung, einschließlich peripherer Vasokonstriktion, erhöhter Herzrate, erhöhter Herzkontraktilität und erhöhtes Plasmavolumen, zu boosten. Diese Wirkungen werden primär durch das sympathische Nervensystem und das Renin-Angiotensin-System vermittelt. Siehe Eichhorn, American Journal of Medicine 104, 163–169 (1998). Erhöhte Leistung des sympathischen Nervensystems erhöht den Gefäßtonus, die Herzrate und Kontraktilität. Angiotensin-II erhöhte Blutdruck durch (1) direkte Stimulation der Muskelkontraktion der glatten Muskulatur, (2) Förderung der Plasmavolumenexpansion durch Stimulation von Aldosteron und antidiuretischer Hormonsekretion, (3) Stimulation von sympathisch vermitteltem Gefäßtonus und (4) Katalysieren des Abbaus von Bradykinin, das vasodilatorische und natriuretische Aktivität aufweist. Siehe Übersichtsartikel von Brown und Vaughan, Circulation 97, 1411–1420 (1998). Wie nachstehend beschrieben kann Angiotensin II auch direkt schädliche Wirkungen auf das Herz haben, indem Myozytennekrose (wodurch die systolische Funktion geschädigt wird) und intrakardiale Fibrose (was diastolische und in manchen Fällen systolische Funktion schädigt) gefördert wird. Siehe Weber, Circulation 96, 4065–4982 (1998).
Ein logisches Merkmal von Stauungsinsuffizienz (CHF) ist Herzhypertrophie, eine Vergrößerung des Herzens, die sowohl durch mechanische als auch hormonelle Reize aktiviert wird und dem Herzen ermöglicht, sich an die Bedürfnisse erhöhter Herzleistung anzupassen. Morgan und Baker, Circulation 83, 13–25 (1991). Diese hypertrophische Reaktion wird häufig mit einer Vielzahl von verschiedenen pathologischen Leiden wie Hypertonie, Aortenstenose, Myokardinfarkt, Kardiomyopathie, Klappeninsuffizienz und intrakardialem Shunt assoziiert, wovon alle zu chronischer hämodynamischer Überlastung führen.
Hypertrophie ist im Allgemeinen als Anstieg der Größe eines Organs oder Struktur unabhängig vom natürlichem Wachstum definiert, welches keine Tumorbildung um fasst. Hypertrophie des Herzens ist entweder auf einen Anstieg der Masse der individuellen Zellen (Myozyten) oder einen Anstieg der Zahl der Zellen, die das Gewebe bilden (Hyperplasie), zurückzuführen oder beides. Während die Erweiterung eines embryonalen Herzens stark vom Anstieg der Myozytenzahl abhängt (die bis kurz nach der Geburt fortgesetzt wird), verlieren postnatale Myozyten ihre proliferative Kapazität. Weiteres Wachstum tritt durch Hypertrophie der individuellen Zellen auf.
Myozytenhypertrophie beim Erwachsenen ist anfänglich als kurzfristige Reaktion auf gestörte Herzfunktion durch Ermöglichung eines Rückgangs der Belastung auf individuellen Muskelfasern vorteilhaft. Mit schwerer, lang andauernder Überlastung beginnt sich der Zustand der einer Hypertrophie unterworfenen Zellen zu verschlechtern bzw. beginnen sie abzusterben. Katz, „Heart Failure", in: A. M. Katz, Hrsg., Physiology of the Heart, New York, Raven Press, 638–668 (1992). Herzhypertrophie ist ein signifikanter Risikofaktor sowohl für Mortalität als auch Morbidität im klinischen Verlauf von Herzinsuffizienz. Katz, Trends Cardiovasc. Med. 5, 37–44 (1995). Für weitere Details für die Gründe und die Pathologie von Herzhypertrophie siehe z. B. Heart Disease, A Textbook of Cardiovascular Medicine, E. Braunwald, Hrsg., [W. B. Saunders Co. (1988)] Kapitel 14, „Pathophysiology of Heart Failure".
Auf zellulärer Ebene besteht das Herz aus Myozyten und sie umgebenden Trägerzellen, die im Allgemeinen Nicht-Myozyten genannt werden. Während Nicht-Myozyten primäre Fibroblasten (Mesenchymzellen) sind, umfassen sie auch Endothelzellen und Zellen glatter Muskulatur. Obwohl Myozyten den Großteil der erwachsenen Myokardmasse ausmachen, repräsentieren sie nur etwa 30% der gesamten Zellzahl, die im Herz gegenwärtig ist. Als Reaktion of hormonelle, physiologische, hämodynamische und pathologische Reize können sich erwachsene Ventrikelmuskelzellen an er höhte Arbeitspensen durch die Aktivierung eines hypertrophischen Verfahrens anpassen. Diese Reaktion ist durch einen Anstieg der Myozytenzellgröße und des kontraktilen Proteingehalts von individuellen Herzmuskelzellen ohne gleichzeitige Zellteilung und Aktivierung von Embryogenen gekennzeichnet, das Gen für atriales natriuretisches Peptid (ANP) umfassend. Chien et al., FASEB J. 5, 3037–3046 (1991), Chien et al., Annu Rev. Physiol. 55, 77–95 (1993). Ein Anstieg der Myokardmasse als Folge eines Anstieges der Myozytengröße, die mit einer Akkumulation von interstitiellem Collagen innerhalb der extrazellulären Matrix verbunden ist, und um Intramyokard-Koronararterien ist bei Hypertrophie des linken Ventrikels sekundär zur Drucküberladung bei Menschen beschrieben worden. Caspari et al., Cardiovasc. Res. 11, 554–558 (1977), Schwarz et al., Am J. Cardiol. 42, 895–903 (1978), Hess et al., Circulation 63, 360–371 (1981), Pearlman et al., Lab Invest. 46, 158–164 (1982).
Es ist auch vorgeschlagen worden, dass parakrine Faktoren, die durch nicht-myozyten-tragende Zellen produziert werden, zusätzlich in die Entwicklung von Herzhypertrophie involviert sein können, und verschiedene von Nicht-Myozyten abstammende Hypertrophiefaktoren, wie z. B. Leukozytenhemmfaktor (LIF) und Endothelin, sind identifiziert worden. Metcalf, Growth Factors 7, 169–173 (1992), Kurzrock et al., Endocrine Reviews 12, 208–217 (1991), Inoue et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 86, 2863–2867 (1989), Yanagisawa und Masaki, Trends Pharm. Sci. 10, 374–378 (1989), US-Patent Nr. 5.573.762 (am 12. November 1996 ausgegeben). Weitere beispielhafte Faktoren, die als potenzielle Mediatoren von Herzhypertrophie identifiziert worden sind, umfassen Cardiotrophin-1(CT-1) [Pennica et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92, 1142–1146 (1995)], Catecholamine, Adrenocorticosteroide, Angiotensin und Prostaglandine.
Derzeit variiert die Behandlung von Herzhypertrophie abhängig von der zugrunde liegenden Herzerkrankung. Catecholamine, Adrenocorticosteroide, Angiotensin, Prostaglandine, LIF, Endothelin (einschließlich Endothelin-1, -2, und -3 und großes Endothelin) und CT-1 gehören zu den Faktoren, die als potenzielle Mediatoren von Hypertrophie identifiziert wurden. Zum Beispiel sind betaadrenerge rezeptorblockierende Arzneimittel (Betablocker, z. B. Propranolol, Timolol, Tertalolol, Carteolol, Nadolol, Betaxolol, Penbutolol, Acetobutolol, Atenolol, Metoprolol, Carvedilol etc.) und Verapamil in der Behandlung von hypertrophischer Kardiomyopathie umfassend verwendet worden. Die günstigen Wirkungen von Betablockern auf Symptome (z. B. Brustschmerzen) und Toleranz von körperlicher Betätigung sind großteils auf einen Rückgang der Herzrate mit einer nachfolgenden Verlängerung der Diastole und erhöhte passive Ventrikelfüllung zurückzuführen. Thompson et al., Br. Heart J. 44, 488– 98 (1980), Harrison et al., Circulation 29, 84–98 (1964). Von Verapamil ist berichtet worden, dass es Ventrikelfüllung zu verbessern und möglicherweise Myokardischämie zu reduzieren scheint. Bonow et al., Circulation 72, 853–64 (1985).
Nifedipin und Diltiazem sind ebenfalls gelegentlich in der Behandlung von hypertrophischer Kardiomyopathie verwendet worden. Lorell et al., Circulation 65, 499–507 (1982), Betocchi et al., Am. J. Cardiol 78, 451–457 (1996). Jedoch kann Nifedipin aufgrund seiner kräftigen vasodilatorischen Eigenschaften schädlich sein, insbesondere bei Patienten mit Ausflussverschluss. Disopyramid ist verwendet worden, um Symptome durch seine negativen inotropen Eigenschaften zu lindern. Pollick, N. Engl. J. Med. 307, 997–999 (1982). Bei vielen Patienten nehmen die anfänglichen Vorteile mit der Zeit ab. Wigle et al., Circulation 92, 1680–1692 (1995).
Von Antihypertonikatherapie ist berichtet worden, dass sie positive Wirkungen auf Herzhypertrophie zeigen, die mit erhöhtem Blutdruck assoziiert ist. Beispiele für Arzneimittel, die in Antihypertonietherapie verwendet werden, alleine oder in Kombination, sind Kalziumantagonisten, z. B. Nitrendipin, blockierende Mittel adrenerger Rezeptoren, z. B. die oben angeführten, angiotensinumwandelnde Enzym-(ACE-)Inhibitoren, wie Quinapril, Captopril, Enalapril, Ramipril, Benazepril, Fosinopril und Lisinopril, Diuretika, z. B. Chlorthiazid, Hydrochlorthiazid, Hydroflumethazid, Methylchlothiazid, Benzthiazid, Dichlorphenamid, Acetazolamid und Indapamid, und Kalziumkanalblocker, z. B. Diltiazem, Nifedipin, Verapamil und Nicardipin.
Zum Beispiel zeigte die Behandlung von Hypertonie mit Diltiazem und Captopril einen Rückgang der Muskelmasse des linken Ventrikels, aber die Doppler-Indizes der diastolischen Funktionen normalisieren sich nicht. Szlachcic et al., Am. J. Cardiol. 63, 198–201 (1989), Shahi et al., Lancet 336, 458–461 (1990). Diese Ergebnisse wurden interpretiert, um zu zeigen, dass übermäßige Mengen von interstitiellem Collagen nach Regression der Hypertrophie des linken Ventrikels bleiben. Rossi et al., Am Heart J. 124, 700–709 (1992). Rossi et al., siehe oben, untersuchten die Wirkung von Captopril auf die Prävention und Regression von Myokardzellhypertrophie und interstitieller Fibrose in Drucküberlastungsherzhypertrophie bei Versuchsratten.
Von Mitteln, die Herzkontraktilität direkt verstärken (inotropische Mittel), wurde anfänglich angenommen, dass sie Patienten mit Herzinsuffizienz zugute kommen, weil sie die Herzleistung kurzfristig verbesserten. Jedoch hat sich herausgestellt, dass notropische Mittel mit Ausnahme von Digoxigenin zu erhöhter langfristiger Mortalität führen, trotz kurzfristiger Verbesserungen der Herzleistung. Massie, Curr. Opin. Cardiology 12, 233–241 (1997), Reddy et al., Curr. Opin. Cardiol. 12, 233–241 (1997). Betaadrenerge Rezeptorenblocker sind kürzlich für ihre Verwendung bei Herzinsuffizienz verteidigt worden. Beweise aus klinischen Verfahren lassen vermuten, dass Verbesserungen der Herzfunktion ohne erhöhte Mortalität erreicht werden können, obwohl bisher dokumentierte Verbesserungen des Patientenüberlebens noch nicht demonstriert worden sind. Siehe auch US-Patent Nr. 5.624.806 , 5.661.122 und 5.610.134 und WO95/28173 hinsichtlich der Verwendung von Cardiotropin-1 oder Antagonisten davon oder Wachstumhormon und/oder insulinähnlichem Wachstumsfaktor I bei der Behandlung von CHF. Eine andere Behandlungsmodalität ist Herztransplantation, aber diese ist durch die Verfügbarkeit von Spenderherzen eingeschränkt.
Endothelin ist ein Vasokonstringenz-Peptid, 21 Aminosäuren umfassend, das aus Kulturüberstand von Schweine-Endothelkultur isoliert wird und strukturell bestimmt wird. Yanagisawa et al., Nature 332, 411–415 (1988). Es wurde festgestellt, dass Endothelin verschiedene Wirkungen zeigt, und Endothelinantikörper als Endothelinantagonisten haben sich als wirkungsvoll in der Behandlung von Myokardinfarkt, Nierenversagen und anderen Erkrankungen erwiesen. Da Endothelin in lebenden Körpern gegenwärtig ist und Vasokonstringenzwirkung zeigt, wird erwartet, dass es ein endogener Faktor ist, der in die Regulierung des Kreislaufsystems involviert ist, und mit Hypertonie, kardiovaskulären Erkrankungen wie Myokardinfarkt und Nierenerzkrankungen wie akutem Nierenversagen assoziiert sein kann. Endothelinantagonisten sind z. B. in US-Patent Nr. 5.773.414 ; JP Pat.-Veröffentlichung 3130299/1991 , EP 457.195 ; EP 460.679 und EP 552.489 beschrieben. Ein neuer Endothelin-B-Rezeptor zur Identifikation von Endothelin-Rezeptorantagonisten ist in US-Patent Nr. 5.773.223 beschrieben.
Die derzeitige Therapie für Herzinsuffizienz ist primär auf die Verwendung von angiotensinkonvertierenden Enzym(ACE-)Hemmern, wie z. B. Captopril, und Diuretika ausgerichtet. Diese Arzneimittel verbessern das hämodynamische Profil und die Toleranz körperlicher Betätigung und reduzieren die Inzidenz von Morbidität und Mortalität bei Patienten mit CHF. Kramer et al., Circulation 67 (4), 807–816 (1983). Captopril Multicenter Research Group, J. A. C. C. 2(4), 755–763 (1983), The CONSENUS Trial Study Group, N. Engl. J. Med. 316 (23), 1429–1435 (1987), THE SOLVD Investigators, N. Engl. J Med., 325 (5), 293–302 (1991). Weiters sind sie zur Behandlung von Hypertonie, Fehlfunktion des linken Ventrikels, atherosklerotische Gefäßerkrankung und diabetische Nephropathie nützlich. Brown und Vaughan, siehe oben. Jedoch ist die Reaktion auf ACE-Inhibitoren trotz bewiesener Wirksamkeit eingeschränkt. Zum Beispiel scheinen ACE-Inhibitoren, während sie das Überleben bei Herzinsuffizienz verlängern, das Fortschreiten Richtung Herzinsuffizienz im Endstadium zu verlangsamen, und wesentliche Zahlen von Patienten, die mit ACE-Inhibitoren behandelt werden, weisen funktionale Klasse-III-Herzinsuffizienz auf.
Weiters ist die Verbesserung von funktionaler Kapazität und Dauer sportlicher Betätigung nur gering, und Mortalität, obwohl reduziert, ist weiterhin hoch. Die Consensus Trial Study Group, N. Engl. J. Med. 316 (23), 1429–1453 (1987): Die SOLVD Investigators, N. Engl. J. Med. 325 (5), 293–302 (1991), Cohn et al., N. Engl. J. Med. 325 (5), 303–310 (1991), The Captopril-Digoxin Multicenter Research Group, JAMA 259 (4), 539–544 (1988). Daher scheinen ACE-Inhibitoren durchwegs nicht in der Lage zu sein, Symptome bei mehr als 60% der Herzinsuffizienzpatienten zu lindern, und reduzieren Mortalität von Herzinsuffizienz nur um etwa 15–20%. Für weitere Nebenwirkungen siehe Brown und Vaughan, siehe oben.
Eine Alternative zu ACE-Inhibitoren ist durch spezifische AT1-Rezeptorantagonisten dargestellt. Klinische Studien sollen die Wirksamkeit dieser beiden Modalitäten in der Behandlung von kardiovaskulärer Erkrankung und Nierenerkrankung vergleichen. Jedoch lässt das Tiermodell vermuten, dass der ACE/Ang-II-Weg, während er eindeutig in Herzhypertrophie involviert ist, nicht der einzige oder gar der primäre in dieser Rolle aktive Weg ist. Genetische Maus-„Knockout"-Modelle sind hergestellt wor den, um individuelle Komponenten des Wegs zu testen. In einem solchen Modell ist der primäre Herzrezeptor für Ang II, AT sub 1A, genetisch deletiert worden. Diese Mäuse entwickeln keine Hypertrophie, wenn Ang II experimentell gegeben wird (was den grundlegenden Erfolg des Modells in der Elimination von Hypertrophie sekundär zu Ang II bestätigt). Jedoch werden die Herzen immer noch hypertrophisch, wenn die Aorta in diesen Tieren eingeengt ist (ein Modell hypertoner Herzbelastung). Dies lässt vermuten, dass alternative Signalgebungswege, die nicht von diesem Rezeptor (AT sub 1A) abhängen, bei Hypertonie aktiviert werden. ACE-Inhibitoren wären vermutlich nicht in der Lage, diese Wege zu hemmen. Siehe Harada et al., Circulation 97, 1952–1959 (1998). Siehe auch Homcy, Circulation 97, 1890–1892 (1998), hinsichtlich des Rätsels, das mit dem Verfahren und Mechanismus von Herzhypertrophie assoziiert ist.
Etwa 750.000 Patienten erleiden jährlich akuten Myokardinfarkt (AMI), und etwa ein Viertel aller Todesfälle in den Vereinigten Staaten sind auf AMI zurückzuführen. In den letzten Jahren haben thrombolytische Mittel, z. B. Streptokinase, Urokinase und insbesondere Gewebsplasminogenaktivator (t-PA), das Überleben von Patienten, die Myokardinfarkt erlitten, signifikant erhöht. Wenn als kontinuierliche intravenöse Infusion über 1,5 bis 4 Stunden verabreicht, produziert t-PA Koronardurchgängigkeit bei 90 Minuten bei 60% bis 90% der behandelten Patienten. Topol et al., Am. J. Cardiol. 61, 723–728 (1988), Neuhaus et al., J. Am. Coll. Cardiol. 12, 581–587 (1988), Neuhaus et al., J. Am Coll. Cardiol. 14, 1566–1569 (1989). Die höchsten Durchgängigkeitsraten sind bei höherer Dosis oder beschleunigten Dosierungsplänen berichtet worden. Topol, J. Am. Coll. Cardiol. 15, 922–924 (1990). t-PA kann auch als einzelner Bolus verabreicht werden, obwohl es aufgrund seiner relativ kurzen Halbwertszeit für Infusionstherapie besser geeignet ist. Tebbe et al., Am. J. Cardiol. 64, 448 453 (1989). Eine t-PA-Variante, die spezifisch entworfen ist, um eine längere Halbwertszeit und sehr hohe Fibrinspezifität zu haben, TNK-t-PA (eine T103N, N117Q KHRR (296–299) AAAA t-PA-Variante, Keyt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3670–3674 (1994)), ist besonders für Bolus-Verabreichung geeignet. Jedoch hängt trotz aller Vorteile die Langzeitprognose von Patientenüberleben stark von der Über wachung nach Infarkt und Behandlung der Patienten ab, was Monitoring und Behandlung von Herzhypertrophie umfasst.
Wachstumsfaktoren
Verschiedene natürlich auftretende Polypeptide haben wie berichtet die Proliferation von Endothelzellen induziert. Zu diesen Polypeptiden zählen die basischen und sauren Fibroblastenwachstumfaktoren (FGF) (Burgess und Maciag, Annual Rev. Biochem. 58 (1989)), von Blutplättchen abstammende Endothelzellwachstumsfaktoren (PF-ECGF) (Ishikawa et al., Nature 338, 557 (1989)) und Gefäßendothelwachstumsfaktor (VEGF). Leung et al., Science 246, 1306 (1989), Ferrara und Henzel, Biochem. Biophys. Res. Commun. 161, 851 (1989), Tischer et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 165, 1198 (1989), EP 471.7546 , erteilt am 31. Juli 1996.
Medien, die durch Zellen konditioniert sind, die mit der menschlichen VEGF-(hVEGF-)cDNA transfiziert sind, förderten die Proliferation von kapillaren Endothelzellen, während Kontrollzellen dies nicht taten. Leung et al., Science 246, 1306 (1989). Mehrere zusätzliche cDNAs werden in menschlichen cDNA-Bibliotheken identifiziert, die für 121-, 189- und 206-Aminosäureisoformen von hVEGF kodierten (allgemein auch als hVEGF-verwandte Proteine bezeichnet). Das 121-Aminosäureprotein unterscheidet sich von hVEGF durch die Deletion der 44 Aminosäuren zwischen den Resten 116 und 159 in hVEGF. Das 189-Aminosäureprotein unterscheidet sich von hVEGF durch die Insertion von 24 Aminosäuren an Rest 116 in hVEGF und ist offensichtlich mit menschlichem Gefäßpermeabilitätsfaktor (hVPF) identisch. Das 206-Aminosäureprotein unterscheidet sich von hVEGF durch eine Insertion von 41 Aminosäuren an Rest 116 in hVEGF. Houck et al., Mol. Endocrin. 5, 1806 (1991); Ferrara et al., J. Cell Biochem. 47, 211 (1991), Ferrara et al., Endocrine Reviews 13, 18 (1992), Keck et al., Science 246, 1309 (1989), Connolly et al., J. Biol. Chem. 264, 20017 (1989), EP 370.989 , veröffentlicht am 30. Mai 1990.
Es ist nun klar, dass Angiogenese, welche die Bildung von neuen Blutgefäßen aus vorher bestehendem Endothel umfasst, in die Pathogenese einer Vielzahl von Er krankungen impliziert ist. Diese umfassen feste Tumoren und Metastase, Atherosklerose, retrolentale Fibroplasie, Hämangiome, chronische Entzündung, intraokulare neovaskuläre Syndrome, wie z. B. proliferative Retinopathien, z. B. diabetische Retinopathie, altersbedingte Makuladegeneration (AMD), neovaskuläres Glaukom, Immunabstoßung von transplantiertem Hornhautgewebe und anderen Geweben, rheumatoide Arthritis und Psoriasis. Folkman et al., J. Biol. Chem. 267, 10931–10934 (1992), Klagsbrun et al., Annu. Rev. Physiol. 53, 217–239 (1991), und A. Garner, „Vascular diseases", in: Pathophysiology of Ocular Disease, A Dynamic Approach, A. Garner, G. K. Klintworth, Hrsg., 2. Auflage (Marcel Dekker NY, 1994), 1625–1710.
Im Fall von Tumorwachstum scheint Angiogenese für die Umwandlung von Hyperplasie in Neoplasie und für die Bereitstellung von Nahrung für den wachsenden festen Tumor entscheidend zu sein. Folkman et al., Nature 339, 58 (1989). Die Neovaskularisierung ermöglicht den Tumorzellen einen Wachstumsvorteil und proliferative Autonomie im Vergleich zu normalen Zellen. Dementsprechend ist eine Beziehung zwischen der Dichte von Mikrogefäßen in Tumorsektionen und bei Patientenüberleben in Brustkrebs sowie in mehreren anderen Tumoren beobachtet worden. Weidner et al., New Engl. J. Med. 324, 1–6 (1991), Horak et al., Lancet 340, 1120–1124 (1992), Macchiarini et al., Lancet 340, 145–146 (1992).
Die Suche nach positiven Regulatoren von Angiogenese hat mehrere Kandidaten erbracht, einschließlich ein aFGF, bFGF, TGF-α, TGF-β, HGF, TNF-α, Angiogenin, IL-8 etc. Folkman et al., J. B. C., siehe oben, und Klagsbrun et al., siehe oben. Die bisher identifizierten negativen Regulatoren umfassen Thrombospondin (Good et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6624–6628 (1990)), das N-terminale 16-Kilodalton-Fragment von Prolactin (Clapp et al., Endocrinology 133, 1292–1299 (1993)), Angiostatin (O'Reilly et al., Cell 79, 315–328 (1994)) und Endostatin. O'Reilly et al., Cell 88, 277–285 (1996).
Was in den letzten Jahren erreicht worden ist, hat die Schlüsselrolle von VEGF geschaffen, nicht nur in der Stimulation von Gefäßendothelzellproliferation, sondern auch in der Induktion von Gefäßpermeabilität und Angiogenese. Ferrara et al., En docr. Rev. 18, 4–25 (1997). Das Ergebnis, dass der Verlust von sogar einem einzigen VEGF-Allel zur embryonalen Letalität führt, weist auf eine unersetzbare Rolle hin, die dieser Faktor in der Entwicklung und Differenzierung des Gefäßsystems übernimmt. Weiters hat sich VEGF als Schlüsselmediator von Neovaskularisierung erwiesen, die mit Tumoren und intraokularen Erkrankungen assoziiert sind. Ferrara et al., Endocr. Rev., siehe oben. Die VEGF-mRNA wird durch die Mehrheit von untersuchten menschlichen Tumoren überexprimiert. Berkman et al., J. Clin. Invest. 91, 153–159 (1993), Brown et al., Human Pathol. 26, 86–91 (1995), Brown et al., Cancer Res. 53, 4727–4735 (1993), Mattern et al., Brit. J. Cancer 73, 931–934 (1996), Dvorak et al., Am J. Pathol. 146, 1029–1039 (1995).
Auch sind die Konzentrationsspiegel von VEGF und Augenfluide mit der Gegenwart von aktiver Proliferation von Blutgefäßen in Patienten mit diabetischen und anderen ischämieverwandten Retinopathien verbunden. Aiello et al., N. Engl. J. Med. 331, 1480–1487 (1994). Weiters haben jüngste Studien die Lokalisierung von VEGF in neovaskulären Chorioidea-Membranen bei Patienten gezeigt, die von AMD betroffen sind. Lopez et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 37, 855–868 (1996).
Neutralisierende Anti-VEGF-Antikörper supprimieren das Wachstum einer Vielzahl von menschlichen Tumorzelllinien bei Nacktmäusen [Kim et al., Nature 362, 841–844 (1993), Warren et al., J. Clin. Invest. 95, 1789–1797 (1995), Borgström et al., Cancer Res. 56, 4032–4039 (1996), Melnyk et al., Cancer Res. 56, 921–924 (1996)] und hemmt auch intraokulare Angiogenese in Modellen von ischämischen Retinaerkrankungen. Adamis et al., Arch. Ophthalmol. 114, 66–71 (1996). Deshalb sind monoklonale Anti-VEGF-Antikörper oder andere Inhibitoren von VEGF-Wirkung vielversprechende Kandidaten für die Behandlung von festen Tumoren und verschiedene intraokulare neovaskuläre Erkrankungen. Solche Antikörper sind z. B. in EP 817.648 , veröffentlicht am 14. Jänner 1998, und in PCT/US98/06724 , hinterlegt am 3. April 1998, beschrieben.
Es gibt mehrere verschiedene Wachstumsfaktoren und Mitogene, einschließlich transformierende Onkogene, die in der Lage sind, eine komplexe Reihe an Genen rasch zu induzieren, um durch bestimmte Zellen exprimiert zu werden. Lau und Nathans, Molecular Aspects of Cellular Regulation 6, 165–202 (1991). Diese Gene, die als unmittelbare frühe oder frühe Reaktionsgene bezeichnet werden, sind transkriptionell innerhalb weniger Minuten nach Kontakt mit einem Wachstumsfaktor oder Mitogen aktiviert, unabhängig von der De-novo-Proteinsynthese. Eine Gruppe dieser unmittelbaren-frühen Gene kodiert für sekretierte, extrazelluläre Proteine, die für Koordination von komplexen biologischen Verfahren wie z. B. Differenzierung und Proliferation, Regeneration und Wundheilung nötig sind. Ryseck et al., Cell Growth Differ. 2, 235–233 (1991).
Höchst verwandte Proteine, die dieser Gruppe angehören, umfassen cef 10 (Simmons et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1178–1182 (1989)), cyr 61, das rasch durch von Serum oder Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktor (PDGF) aktiviert wird (O'Brien et al., Mol. Cell Biol. 10, 3569–3577 (1990)), menschlichen Bindegewebswachstumsfaktor (CTGF) [Bradham et al., J. Cell Biol. 114, 1285–1294 (1991)], das durch menschliche Gefäßendothelzellen in höheren Spiegeln nach Aktivierung mit transformierendem Wachstumsfaktor beta (TGF-β) sekretiert wird, PDGFähnliche biologische oder immunologische Aktivitäten zeigt und mit PDGF um einen bestimmten Zelloberflächenrezeptor fisp-12 konkurriert (Ryseck et al., Cell Growth Differ. 2, 235–233 (1991)), menschlichen Gefäß-IBP-ähnlichen Wachstumsfaktor (VIGF) ( WO96/17931 ) und nov, normalerweise in erwachsenen Nierenzellen arretiert, das in myeloblastose-assozierten Virus-Typ1-induzierten Nephroblastomen überexprimiert wurde. Joloit et al., Mol. Cell. Biol. 12, 10–21 (1992).
Die Expression dieser unmittelbaren frühen Gene wirkt als „dritte Messenger" in der Reihe von Ereignissen, die durch Wachstumsfaktoren ausgelöst werden. Es ist auch zu erwarten, dass sie notwendig sind, um komplexe biologische Verfahren, wie z. B. Differenzierung und Wundheilung, in welchen Zellproliferation ein häufiges Ereignis ist, zu integrieren und zu koordinieren.
Es hat sich gezeigt, dass insulinähnliche Wachstumsfaktorbindungsproteine (IGFBPs) als zusätzliche Mitogene in Komplex mit insulinähnlichem Wachstumsfak tor (IGF) erhöhte Bindung von IGF an Fibroblast und Zelloberflächenrezeptoren glatter Muskulatur stimulieren. Clemmons et al., J. Clin. Invest. 77, 1548 (1986). Hemmwirkungen von IGFBP auf verschiedene IGF-Wirkungen in vitro umfassen Stimulation von Glukosetransport durch Adipozyten, Sulfatinkorporation durch Chondrozyten und Thymidininkorporation in Fibroblasten. Zapf et al., J. Clin. Invest. 63, 1077 (1979). Zusätzlich dazu sind Hemmwirkungen von IGFBPs auf wachstumsfaktorvermittelte Mitogenaktivität in normalen Zellen gezeigt worden.
Tumornekrosefaktorrezeptoren und -liganden
Verschiedene Moleküle, wie z. B. Tumornekrosefaktor-α („TNF-α"), Tumornekrosefaktor-β („TNF-β") oder „Lymphotoxin-α", Lymphotoxin-β („LT-β"), CD30-Ligand, CD27-Ligand und Apo-2-Ligand (auch als TRAIL bezeichnet), sind als Elemente der Tumornekrosefaktorfamilie („TNF"-Familie) von Cytokinen identifiziert worden (siehe z. B. Gruss und Dower, Blood 85, 3378–3404 (1995), Pitti et al., J. Biol. Chem. 271, 12687–12690 (1996), Wiley et al., Immunity 3, 673–682 (1995), Browning et al., Cell 72, 847–856 (1993), Armitage et al., Nature 357, 80–82 (1992), WO 97/01633 , veröffentlicht am 16. Jänner 1997, WO 97/25428 , veröffentlicht am 17. Juli (1997)).
Induktion von verschiedenen Zellreaktionen, die durch solche TNF-Famlien-Cytokine vermittelt werden, sollen durch ihre Bindung an spezifische Zellrezeptoren initiiert werden. Zwei verschiedene TNF-Rezeptoren von etwa 55 kDa (TNFR1) und 75 kDa (TNFR2) sind identifiziert worden [Hohman et al., J. Biol. Chem. 264, 14927–14934 (1989), Brockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 3127–3131 (1990), EP 417.563 , veröffentlicht am 20. März 1991), und menschliche und Mäuse-cDNAs, die den beiden Rezeptorentypen entsprechen, sind isoliert und charakterisiert worden [Loetscher et al., Cell 61, 351 (1990), Schall et al., Cell 61, 361 (1990), Smith et al., Science 248, 1019–1023 (1990), Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 2830–2834 (1991), Goodwin et al., Mol. Cell. Biol. 11, 3020–3026 (1991)]. Umfassende Polymorphismen sind mit beiden TNF-Rezeptorgenen assoziiert worden [siehe z. B. Takao et al., Immunogenetics 37, 199–203 (1993)]. Beide TNFRs teilen die typische Struktur von Zelloberflächenrezeptoren, einschließlich extrazellulärer, Transmembran- und intrazellulärer Regionen. Die extrazellulären Abschnitte beider Rezeptoren sind natürlich auch als lösliche TNF-Bindungsproteine zu finden [Y. Nophar et al., EMBO J. 9, 3269 (1990), und T. Kohno et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8331 (1990)]. Kürzlich wurde von Hale et al. [J. Cell. Biochem. Supplement 15F, 113 (P424) (1991)] über die Klonierung von rekombinanten löslichen TNF-Rezeptoren berichtet.
Der extrazelluläre Abschnitt von Typ-1- und Typ-2-TNFRs (TNFR1 und TNFR2) enthält ein sich wiederholendes Aminosäuresequenzmuster von vier cysteinreichen Domänen (CRDs), die 1 bis 4 genannt werden, beginnend vom NH₂-Terminus. Jede CRD ist etwa 40 Aminosäuren lang und enthält vier bis sechs Cysteinreste an Positionen, die gut konserviert sind [Schall et al., siehe oben, Loetscher et al., siehe oben, Smith et al., siehe oben, Nophar et al., siehe oben, Kohno et al., siehe oben]. In TFNR1 sind die ungefähren Grenzen der vier CRDs wie folgt: CRD1 Aminosäuren 14 bis etwa 53, CRD2 Aminosäuren von etwa 54 bis etwa 97, CRD3 Aminosäuren von etwa 98 bis etwa 138, CRD4 Aminosäuren von etwa 139 bis etwa 167. In TNFR2 umfasst CRD1 Aminosäuren 17 bis etwa 54, CRD2 Aminosäuren von etwa 55 bis etwa 97; CRD3 Aminosäuren von etwa 98 bis etwa 140 und CRD4 Aminosäuren von etwa 141 bis etwa 179 [Banner et al., Cell 73, 431–435 (1993)]. Die potenzielle Rolle von CRDs in Ligandenbindung ist auch von Banner et al., siehe oben, beschrieben.
Ein ähnliches repetitives Muster von CRDs existiert in mehreren anderen Zelloberflächenproteinen, einschließlich des p75-Nervenwachstumsfaktorrezeptors (NGFR) [Johnson et al., Cell 47, 545 (1986), Radeke et al., Nature 325, 593 (1987)), des B-Zellantigens CD40 [Stamenkovic et al., EMBO J. 8, 1403 (1989)], des T-Zellantigens OX40, [Mallet et al., EMBO J. 9, 1063 (1990)] und des Fas-Antigens [Yonehara et al., siehe oben, und Itoh et al., Cell 66, 233–243 (1991)]. CRDs sind auch in löslichen TNFR-(sTNFR-)ähnlichen T2-Proteinen der Shope- und Myxom-Pockenviren [Upton et al., Virology 160, 20–29 (1987), Smith et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 176, 335 (1991), Upton et al., Virology 184, 370 (1991)] zu finden. Optimale Anordnung dieser Sequenzen zeigt, dass die Positionen der Cysteinreste gut konserviert sind. Diese Rezeptoren werden manchmal insgesamt als Element der TNF/NGF-Rezeptor-Überfamilie bezeichnet. Jüngste Studien auf p75NGFR zeigten, dass die Deletion von CRD1 [A. A. Welcher et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 159–163 (1991)] oder eine 5-Aminosäureinsertion in dieser Domäne [H. Yan und M. V. Chao, J. Biol. Chem. 266, 12099–12104 (1991)] wenig oder keine Wirkung auf NGF-Bindung hat [H. Yan und M. V. Chao, siehe oben]. p75-NGFR enthält einen prolinreichen Abschnitt von etwa 60 Aminosäuren zwischen ihrem CRD4 und der Transmembranregion, die nicht in die NGF-Bindung involviert ist [C. Peetre et al., Eur. J. Hematol. 41, 414–419 (1988), P. Seckinger et al., J. Biol. Chem. 264, 11966–11973 (1989), H. Yan und M. V. Chao, siehe oben]. Eine ähnliche prolinreiche Region ist in TNFR2, aber nicht in TNFR1 zu finden.
Die TNF-Familienliganden, die bisher identifiziert wurden, mit Ausnahme von Lymphotoxin-α, sind Typ-II-Transmembranproteine, deren C-Terminus extrazellulär ist. Hingegen sind die meisten Rezeptoren in der TNF-Rezeptor-(TNFR-)Familie, die bisher identifiziert worden sind, Typ-I-Transmembranproteine. Sowohl im TNF-Liganden- als auch -Rezeptorfamilien ist die Homologie, die zwischen Familienmitgliedern festgestellt worden ist, hauptsächlich in der extrazellulären Domäne („ECD") zu finden gewesen. Mehrere der TNF-Familie-Cytokine, einschließlich TNF-α, Apo-1-Ligand und CD40-Ligarad, werden an der Zelloberfläche proteolytisch gespalten, wobei das resultierende Protein in jedem Fall typischerweise ein homotrimeres Molekül bildet, das als lösliches Cytokin fungiert. TNF-Rezeptorfamilienproteine werden üblicherweise auch proteolytisch gespalten, um lösliche Rezeptor-ECDs freizusetzen, die als Inhibitoren der zugehörigen Cytokine wirken.
Vor kurzem sind andere Elemente der TNFR-Familie identifiziert worden. Solche neu identifizierten Elemente der TNFR-Familie umfassen CAR1, HVEM und Osteoprotegerin (OPG) [Brojatsch et al., Cell 87, 845–855 (1996), Montgomery et al., Cell 87, 427–436 (1996), Marsters et al., J. Biol. Chem. 272, 14029–14032 (1997), Simonet et al., Cell 89, 309–319 (1997)]. Anders als bekannte TNFR-ähnliche Moleküle berichten Simonet et al., s. o., dass OPG keine hydrophobe transmembranüberspannende Sequenzen enthält.
Weiters ist ein neues Element der TNF/NGF-Rezeptorfamilie bei Mäusen identifiziert worden, ein Rezeptor, der als „GITR" bezeichnet wird, für „glucokortikoidinduziertes tumornekrosefaktorrezeptorfamilieverwandtes Gen" [Nocentini et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 94, 6216–6221 (1997)]. Der Maus-GITR-Rezeptor ist ein 228-Aminosäure-Typ-I-Transmembranprotein, das in normalen Maus-T-Lymphozyten aus Thymus, Milz und Lymphknoten exprimiert wird. Expression des Maus-GITR-Rezeptors wurde in T-Lymphozyten nach Aktivierung mit Anti-CD3-Antikörpern, Con A oder Phorbol-12-myristat-13-acetet induziert. Es wurde von den Autoren spekuliert, dass der Maus-GITR-Rezeptor in die Regulation von T-zellrezeptorvermitteltem Zelltod involviert war.
In Marsters et al., Curr. Biol. 6, 750 (1996), beschreiben Wissenschafter eine native Sequenz eines menschlichen Polypeptids voller Länge, das Apo-3 genannt wird, das Ähnlichkeit mit der TNFR-Familie in ihrer extrazellulären cysteinreichen Wiederholung aufweist und TNFR1 und CD95 ähnelt, als dass es eine cytoplasmatische Todesdomänensequenz aufweist [siehe auch Marsters et al., Curr. Biol. 6, 1669 (1996)]. Apo-3 ist auch von anderen Wissenschaftern als DR3, wsl-1 und TRAMP bezeichnet worden [Chinnaiyan et al., Science 274, 990 (1996), Kitson et al., Nature 384, 372 (1996), Bodmer et al., Immunity 6, 79 (1997)].
Pan et al. haben eine anderes TNF-Rezeptorfamilienelement offenbart, das „DR4" genannt wurde [Pan et al., Science 276, 111–113 (1997)]. Es wurde berichtet, dass das DR4 eine zytoplasmatische Todesdomäne enthielt, die in der Lage ist, den Zellsuizidapparat auszulösen. Pan et al. offenbaren, dass DR4 ein Rezeptor für den Liganden sein soll, der als Apo-2-Ligand oder TRAIL bekannt ist.
In Sheridan et al., Science 277, 818–821 (1997), und Pan et al., Science 277, 815–818 (1997), wird ein anderes Molekül beschrieben, von dem angenommen wurde, dass es ein Rezeptor für den Apo-2-Liganden (TRAIL) ist. Dieses Molekül wird als DR5 bezeichnet (es ist alternativ auch Apo-2 genannt worden). Ähnlich DR4 soll DR5 eine zytoplasmatische Todesdomäne enthalten und in der Lage sein, Apoptose zu signalisieren.
In Sheridan et al., siehe oben, ist ein Rezeptor, der DcR1 (oder alternativ Apo-2DcR) genannt wird, als potenzieller Lockrezeptor für Apo-2-Ligand (TRAIL) offenbart. Sheridan et al. berichten, dass DcR1 Apo-1-Ligandenfunktion in vitro hemmen kann. Siehe auch Pan et al., siehe oben, für eine Offenbarung über den Lockrezeptor, der TRID genannt wird.
Für einen Bericht über die TNF-Familie von Cytokinen und deren Rezeptoren siehe Gruss und Dower, siehe oben.
Bedarf an weiteren Behandlungen
Angesichts der Rolle des Gefäßendothelzellwachstums und der Angiogenese bei vielen Erkrankungen und Störungen ist es wünschenswert, über ein Mittel zur Reduktion oder Inhibition einer oder mehrere biologische Wirkungen zu verfügen, das diese Prozesse verursacht. Es ist auch wünschenswert, über ein Mittel zum Testen der Gegenwart von pathogenen Polypeptiden unter normalen und unter Krankheitsbedingungen und insbesondere Krebs zu verfügen. Weiters gibt es in einem besonderen Aspekt keine allgemein anwendbare Therapie zur Behandlung von Herzyhypertrophie. Die Identifikation von Faktoren, die Herzmyozytenhypertrophie vermeiden oder reduzieren kann, ist von primärer Bedeutung in der Entwicklung für neue therapeutische Strategien, um pathophysiologisches Herzwachstum zu hemmen. Während es mehrere Behandlungsmodalitäten für verschiedene kardiovaskuläre und ankologische Erkrankungen gibt, besteht noch immer ein Bedarf an zusätzlichen therapeutischen Ansätzen.
Zusammenfassung der Erfindung
Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren zur Förderung oder Hemmung von Angiogenese und/oder Kardiovaskularisierung bei Säugetieren. Hierin sind cDNA-Klone beschrieben, die für die Polypeptide kodieren, die in der vorliegenden Anmeldung „PRO364" und „PRO175" genannt werden. Diese Proteine werden in verschiedenen kardiovaskulären Tests, welche die Förderung oder Hemmung bestimmter biologischer Aktivitäten testen, als positiv getestet. Dementsprechend sollen die Proteine nützliche Arzneimittel zur Diagnose und/oder Behandlung (einschließlich Prävention) von Erkrankungen sein, wo solche Wirkungen gewünscht sind, wie z. B. die Förderung oder Hemmung von Angiogenese, Hemmung des Wachstums. oder der Proliferation von Gefäßendothelzellen, Hemmung von Tumorwachstum und Hemmung von angiogeneseabhängigem Gewebswachstum.
In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, umfassend ein PRO364-Polypeptid (hGITR) in Beimischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger und ein kardiovaskuläres, endotheliales oder angiogenes Mittel oder ein angiostatisches Mittel. In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung bereit, umfassend ein PRO175-Polypeptid (hGITRL oder GLITTER) in Beimischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger. In einem Aspekt umfasst die Zusammensetzung eine therapeutisch wirksame Menge von einem oder beiden Polypeptiden. In einem anderen Aspekt umfasst die Zusammensetzung einen weiteren aktiven Inhaltsstoff, nämlich ein kardiovaskuläres, endotheliales oder angiogenes Mittel oder ein angiostatisches Mittel, vorzugsweise ein angiogenes oder angiostatisches Mittel. Vorzugsweise ist die Zusammensetzung steril. PRO364- oder PRO175-Polypeptid können in Form einer flüssigen pharmazeutischen Formulierung verabreicht werden, die konserviert werden kann, um verlängerte Speicherstabilität zu erreichen. Konservierte flüssige pharmazeutische Formulierungen können Mehrfachdosen von PRO364- oder PRO175-Polypeptid enthalten und können daher für wiederholte Verwendung geeignet sein.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Zusammensetzung zur Behandlung einer kardiovaskulären, endothelialen und angiogenen Erkrankung bereit, umfassend die Beimischung einer therapeutisch wirksamen Menge von PRO364- oder PRO175-Polypeptid zu dem Träger.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein pharmazeutisches Produkt bereit, umfassend:

(a) eine Zusammensetzung; umfassend eine therapeutisch wirksame Menge an PRO364-Polypeptid in Beimischung mit einem kardiovaskulären, endothelialen oder angiogenen Mittel oder einem angiostatischen Mittel oder ein PRO175-Polypeptid;
(b) einen Behälter, der die Zusammensetzung enthält; sowie
(c) eine Markierung, die an dem Behälter angebracht ist, oder eine Packungsbeilage, die in dem pharmazeutischen Produkt inkludiert ist, die sich auf die Verwendung des PRO364- oder PRO175-Polypeptids in der Behandlung einer kardiovaskulären oder endothelialen oder angiogenen Erkrankung bezieht.

In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Diagnose einer Erkrankung oder einer Anfälligkeit für eine Erkrankung, die mit einer Mutation in einer PRO364- oder PRO175-Nucleinsäuresequenz in Zusammenhang steht, bereit, umfassend:

(a) das Isolieren einer Nucleinsäuresequenz, die für das PRO364- oder PRO175-Polypeptid kodiert, aus einer Probe, die von einem Wirt stammt; sowie
(b) das Bestimmen einer Mutation in der PRO364- oder PRO175-PolypeptidNucleinsäuresequenz.

In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Diagnose bereit, umfassend Analyse auf Gegenwart von PRO364- oder PRO175-Polypeptid in einer Probe, die von einem Wirt abstammt.
In wieder einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Diagnose kardiovaskulärer oder endothelialer oder angiogener Erkrankungen bei einem Säugetier, umfassend die Detektion der Expressionsmenge eines Gens, das für ein PRO364- oder PRO175-Polypeptid kodiert, und zwar (a) in einer Testprobe an Gewebezellen, die von dem Säugetier erhalten wurden, und (b) in einer Kontrollprobe bekannter normaler Gewebezellen desselben Zelltyps, worin eine höhere oder geringere Expressionsmenge in der Testprobe die Gegenwart einer kardiovaskulären oder endothelialen oder angiogenen Dysfunktion bei dem Säugetier zeigt, von dem die Testgewebe-Zellen erhalten wurden.
In wieder einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung eines PRO364- oder PRO175-Polypeptids zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer kardiovaskulären oder endothelialen oder angiogenen Erkrankung in einem Säugetier. Vorzugsweise ist die Erkrankung Herzhypertrophie, Trauma, wie Wunden oder Verbrennungen, oder eine Form von Krebs.
In einem weiteren Aspekt ist das Säugetier weiters Angioplastie oder einem Arzneimittel ausgesetzt, das kardiovaskuläre, endotheliale und angiogene Erkrankungen behandelt, wie z. B. ACE-Inhibitoren oder Chemotherapeutika, wenn die kardiovaskuläre, endotheliale und angiogene Erkrankung eine Form von Krebs ist. Vorzugsweise ist das Säugetier ein Mensch, vorzugsweise einer, der das Risiko aufweist, Herzhypertrophie zu entwickeln, und noch bevorzugter einen Myokardinfarkt erlitten hat.
In einem anderen bevorzugten Aspekt ist die Herzhypertrophie durch die Gegenwart eines erhöhten Spiegels an PGF_2α gekennzeichnet. Alternativ dazu kann die Herzhypertrophie durch Myokardinfarkt induziert werden, worin vorzugsweise die Versbreichung von PRO364- oder PRO175-Polypeptid innerhalb von 48 Stunden, noch bevorzugter innerhalb von 24 Stunden, nach Myokardinfarkt initiiert wird.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Herzhypertrophie durch die Gegenwart einer erhöhten Menge an PGF_2α gekennzeichnet. Alternativ dazu kann die Herzhypertrophie durch Myokardinfarkt induziert werden, worin vorzugsweise die Verabreichung des PRO364- oder PRO175-Polypeptids innerhalb von 48 Stunden, noch bevorzugter innerhalb von 24 Stunden, nach dem Myokardinfarkt initiiert wird.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der kardiovaskulären oder endothelialen oder angiogenen Erkrankung um Herzhypertrophie, und das PRO364- oder PRO175-Polypeptid wird zusammen mit einem kardiovaskulären, endothelialen oder angiogenen Mittel verabreicht. Das bevorzugte kardiovaskuläre, endotheliale oder angiogene Mittel für diesen Zweck ist aus der aus einem blutdrucksenkenden Arzneimittel, einem ACE-Hemmer, einem Endothelin-Rezeptorantagonisten und einem thrombolytischen Mittel bestehenden Gruppe ausgewählt. Wenn ein thrombolytisches Mittel verabreicht wird, wird das PRO364- oder PR175-Polypeptid nach Verabreichung eines solchen Mittels verabreicht. Noch bevorzugter ist das thrombolytische Mittel ein rekombinanter menschlicher Gewebsplasminogenaktivator.
In einem anderen bevorzugten Aspekt handelt es sich bei der kardiovaskulären, endothelialen oder angiogenen Erkrankung um Herzhypertrophie, und das PRO364- oder PRO175-Polypeptid wird nach primärer Angioplastie zur Behandlung von akutem Myokardinfarkt verabreicht, vorzugsweise worin das Säugetier Angioplastie oder einem kardiovaskulären, endothelialen oder angiogenen Mittel ausgesetzt wird.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die kardiovaskuläre, endotheliale und angiogene Erkrankung Krebs, und das PRO364- oder PRO175-Polypeptid wird in Kombination mit einem chemotherapeutischem Mittel, einem wachstumshemmenden Mittel oder einem zytotoxischen Mittel verabreicht.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Identifikation von Agonisten für das PRO364- oder PRO175-Polypeptid bereit, umfassend:

(a) das Kontaktieren von. Zellen und einer Verbindung, die gescreent werden soll, unter Bedingungen, die für die Stimulierung der Zellproliferation durch PRO364 oder PRO175 geeignet sind; und
(b) das Messen der Zellproliferation, um zu bestimmen, ob die Verbindung ein wirksamer Agonist ist;

(a) das Kontaktieren von Zellen und einer Verbindung, die gescreent werden soll, in Gegenwart eines PRO364- oder PRO175-Polypeptids unter Bedingungen, die für die Stimulierung der Zellproliferation durch ein PRO364- oder PRO175-Polypeptid geeignet sind; und
(b) das Messen der Zellproliferation, um zu bestimmen, ob die Verbindung ein wirksamer Antagonist ist.

Hierin ist ebenfalls die Verwendung eines Antagonisten zu PRO364- oder PRO175-Polypeptid zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer kardiovaskulären oder endothelialen oder angiogenen Erkrankung in einem Säugetier beschrieben. Vorzugsweise ist die kardiovaskuläre, endotheliale und angiogene Erkrankung Herzhypertrophie, Traumata, eine Krebsart oder altersbedingte Makuladegeneration. Es ist auch bevorzugt, wo das Säugetier ein Mensch ist und wo eine wirksame Menge eines angiogenen oder angiostatischen Mittels gemeinsam mit dem Antagonisten verabreicht wird.
Eine Form von Antagonist eines PRO364- oder PRO175-Polypeptids, das eine oder mehrere der Funktionen oder Aktivitäten des PRO364- oder PRO175-Polypeptids hemmt, ist ein Antikörper. Hierin ist ebenfalls ein isolierter Antikörper beschrieben, der PRO364- oder PRO175-Polypeptid bindet. Der Antikörper kann ein monoklonaler Antikörper sein, der vorzugsweise nicht-menschliche komplementaritätsbestimmende Region-(CDR-)Reste und menschliche Gerüstregionen-(FR-)Reste aufweist. Der Antikörper kann markiert und auf einem festen Träger immobilisiert sein. Der Antikörper kann ein Antikörperfragment, ein einkettiger Antikörper oder ein anti-idiotypischer Antikörper sein.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart eines PRO364- oder PRO175-Polypeptids bereit, umfassend das Aussetzen einer Zelle, von der angenommen wird, dass sie das PRO364- oder PRO175-Polypeptid enthält, gegenüber einem Anti-PRO364- oder -PRO175-Antikörper sowie das Bestimmen der Bindung des Antikörpers an die Zelle.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Diagnose kardiovaskulärer oder endothelialer oder angiogener Erkrankungen bei einem Säugetier bereit, umfassend (a) das Kontaktieren eines Anti-PRO364- oder -PRO175-Antikörpers mit einer Testprobe an Gewebezellen, die von dem Säugetier erhalten wurden, und (b) das Detektieren der Bildung eines Komplexes zwischen dem Anti-PRO364- oder -PRO175-Antikörper und dem PRO364- oder PRO175-Polypeptid in der Testprobe. Die Detektion kann qualitativ oder quantitativ erfolgen und kann im Vergleich mit der Überwachung von Komplexbildung in einer Kontrollprobe von bekannten normalen Gewebszellen desselben Zelltyps durchgeführt werden. Eine größere oder kleinere Menge von Komplexen, die in der Testprobe gebildet werden, zeigt die Gegenwart von kardiovaskulären, endothelialen oder angiogenen Fehlfunktionen im Säugetier, aus welchen die Testgewebszellen erhalten wurden. Der Antikörper trägt vorzugsweise eine detektierbare Markierung. Komplexbildung kann überwacht werden, zum Beispiel durch Lichtmikroskopie, Durchflusszytometrie, Fluorometrie oder andere fachbekannte Verfahren. Die Testprobe wird üblicherweise von einem Individuum erhalten, das unter dem Verdacht steht, kardiovaskuläre, endotheliale und angiogene Erkrankungen aufzuweisen.
In weiteren Aspekten stellt die Erfindung ein Krebs-Diagnose-Set bereit, umfassend einen Anti-PRO364- oder -PRO175-Antikörper und einen Träger in einer geeigneten Verpackung. Vorzugsweise umfasst ein solches Set Anweisungen zur Verwendung des Antikörpers zur Detektion des PRO364- oder PRO175-Polypeptids. Vorzugsweise ist der Träger z. B. ein Puffer.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung einen Artikel bereit, umfassend:

einen Behälter;
eine Markierung auf dem Behälter; sowie
eine Zusammensetzung, umfassend einen Anti-PRO364- oder -PRO175-Antikörper, die im Behälter enthalten ist; worin die Markierung auf dem Behälter angibt, dass die Zusammensetzung zur Behandlung von kardiovaskulären oder endothelialen oder angiogenen Erkrankungen verwendet werden kann.

In wieder einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung die Verwendung eines Antikörpers, der ein PRO364- oder PRO175-Polypeptid bindet, zur Herstellung eines Medikaments bereit, das die Angiogenese in einem Säugetier inhibiert, die durch das PRO364- oder PRO175-Polypeptid induziert wird. Vorzugsweise ist das Säugetier ein Mensch, und noch bevorzugter weist das Säugetier einen Tumor oder eine Netzhauterkrankung auf.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt eine Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 1), welche die Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 2) einer Nativsequenz-PRO364-cDNA (Nucleotide 121–843) enthält, worin die Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 1) ein Klon ist, der hierin. „UNQ319" und/oder „DNA47365-1206" genannt wird. Es wird auch die Position des Initiatormethioninrests sowie die Position von drei Oligonucleotidprimern bereitgestellt, die „47365.tm.f", „47365.tm.p" und „47365.tm.r", wie unterstrichen, genannt werden. Die mutmaßliche Transmembrandomäne des Proteins wird durch die Nucleotide 604–660 in der Figur kodiert.
2 zeigt die PRO364-Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 3), die von Nucleotiden 121–843 der in 1 dargestellten Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 2) abstammt. Eine potenzielle Transmembrandomäne besteht zwischen und einschließlich der Aminosäuren 162 bis 180 in der Figur.
3A–C zeigt eine Consensus-Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 4), die „<consen01>" genannt wird.
4 zeigt die „<consen01>"-Consensusnucleotidsequenz, die in 3A–C gezeigt wird, die in der vorliegenden Anmeldung DNA44825 (Seq.-ID Nr. 4) genannt wird. Es ist auch die Position der Oligonucleotidprimer dargestellt, die „44825.GITR.f" (Seq.-ID Nr. 5), „44825.f1" (Seq.-ID Nr. 6), „44825.GITR.p" (Seq.-ID Nr. 7), „44825.r2" (Seq.-ID Nr. 8), „44825.p1" (Seq.-ID Nr. 9), „44825.GITR.r" (Seq.-ID Nr. 10), „44825.f2" (Seq.-ID Nr. 11) und „44825.r1" (Seq.-ID Nr. 12), wie unterstrichen, genannt werden.
5A–B zeigen die kodierende Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 13) und abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 14) eines cDNA-Klons, der hierin als PRO175-1150 bezeichnet wurde.
6 veranschaulicht die relative mRNA-Expression von PRO364 in verschiedenen menschlichen Zellen und Geweben, wie durch quantitative Umkehrtranskriptase-PCR bestimmt.
7 veranschaulicht die relative mRNA-Expression von PRO364 in primären menschlichen T-Zellen und Monozyten (behandelt mit einem Anti-CD3-Antikörper, PHA oder LPS), wie durch quantitative Umkehrtranskriptase-PCR bestimmt.
8 zeigt eine Northern-Blot-Analyse von PRO175-mRNA-Expression in menschlichen Geweben (identifizierte erwachsene und fötale Gewebe) und Tumorzelllinien (HL60-Promyelozytenleukämie, HeLa-S3-Zervixkarzinom, chronische myelogene K562-Leukämie, lymphoblastische MOLT4-Leukämie, Raji-Burkitt-Lymphom, kolorektales SW480-Adenokarzinom, A549-Lungenkarzinom und G361-Melanom).
9 zeigt eine Analyse von löslichem PRO175-Polypeptid durch SDS-PAGE.
10 zeigt die Ergebnisse eines Co-Präzipitationstests, der in Beispiel 6 nachstehend beschrieben ist. Das Autoradiogramm des SDS-PAGE-Gels zeigte das PRO364-IgG-Molekül, gebunden an das radioiodierte PRO175-Polypeptid. Bindung war für die anderen identifizierten Immunadhäsinkonstrukte nicht zu beobachten.
11A zeigt die Ergebnisse der FACS-Analyse von transfizierten 293-Zellen, die auf Bindung an die identifizierten Rezeptoren oder Ligandenimmunadhäsinkonstrukte getestet wurden.
11B zeigt die Ergebnisse der FACS-Analyse von HUVEC-Zellen, die auf Bindung an die identifizierten Immunadhäsinkonstrukte getestet wurde.
12 ist ein Histogramm, das die Wirkung von PRO175-Ligand auf c-fos-Expression in menschlichen Perizyten zeigte.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
1. Definitionen
Die Ausdrücke „kardiovaskuläre, endotheliale und angiogene Erkrankung" und „kardiovaskuläre, endotheliale und angiogene Funktionsstörung" werden austauschbar verwendet und beziehen sich auf systemische Erkrankungen, die Gefäße betreffen, wie z. B. Diabetes mellitus, sowie Erkrankungen der Gefäße selbst, wie z. B. der Arterien, Kapillaren, Venen und/oder Lymphgefäße. Dies umfasst Anzeichen, die Angiogenese und/oder Kardiovaskularisierung stimulieren, und jene, die Angiogenese und/oder Kardiovaskularisierung hemmen. Solche Erkrankungen umfassen z. B. arterielle Erkrankungen, wie z. B. Atherosklerose, Hypertonie, entzündliche Vaskulitiden, Rwynaud-Erkrankung und Reynaud-Phänomen, Aneurysmen und arterielle Restenose, venöse und lymphatische Erkrankungen, wie z. B. Thrombophlebitis, Lymphangitis und Lymphödem, und andere Gefäßerkrankungen, wie z. B. periphere Gefäßer krankung, Krebs, wie z. B. Gefäßtumoren, z. B. Hämangiom (kapillär und kavernös), Glomustumoren, Teleangiektasien, bazilläre Angiomatose, Hämangioendotheliom, Angiosarkom, Hämangiopericytom, Kaposi-Sarkom, Lymphangiom, und Lymphangiosarkom, Tumorangiogenese, Traumata, wie z. B. Wunden, Verbrennungen und verletztes Gewebe, Transplantatfixierung, Verschwartung, Ischämie-Reperfusions-Verletzung, rheumatoide Arthritis, zerebrovaskuläre Erkrankung, Nierenerkrankung, wie z. B. akute Niereninsuffizienz, und Osteoporose. Dies umfasst auch Angina, Myokardinfarkte, wie z. B. akute Myokardinfarkte, Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz, wie z. B. CHF.
„Hypertrophie" wird wie hierin verwendet als Anstieg der Masse eines Organs oder einer Struktur unabhängig von natürlichem Wachstum definiert, das keine Tumorbildung umfasst. Hypertrophie eines Organs oder Gewebes ist entweder auf einen Anstieg der Masse der individuellen Zeilen (wahre Hypertrophie) oder einen Anstieg der Zahl der Zellen zurückzuführen, die das Gewebe ausmachen (Hyperplasie), oder beide. Bestimmte Organe, wie z. B. das Herz, verlieren ihre Fähigkeit, sich kurz nach der Geburt zu teilen. Dementsprechend wird „Herzhypertrophie" als Anstieg der Herzmasse definiert, die bei Erwachsenen durch einen Anstieg der Myozytenzellgröße und des kontraktilen Proteingehalts ohne gleichzeitige Zellteilung gekennzeichnet ist. Der Charakter der Belastung, die für das Stimulieren der Hypertrophie verantwortlich ist (z. B. erhöhte Vorbeladung, erhöhte Nachbeladung, Verlust an Myozyten, wie bei Myokardinfarkt, oder primäre Depression von Kontraktilität), scheint eine wichtige Rolle in der Bestimmung des Wesens der Reaktion zu spielen. Das frühe Stadium der Herzhypertrophie ist üblicherweise morphologisch durch Anstiege der Größe der Mikrofibrillen und Mitochondrien gekennzeichnet sowie durch eine Vergrößerung der Mitochondrien und Nuklei. In diesem Stadium, während die Muskelzellen größer als normal sind, ist die Zellorganisation großteils konserviert. In einem fortgeschritteneren Stadium von Herzhypertrophie gibt es einen vorteilhaften Anstieg der Größe oder Zahl von spezifischen Organellen, wie z. B. Mitochondrien, und neue kontraktile Elemente werden in lokalisierten Bereichen der Zellen auf unregelmäßige Art und Weise hinzugegeben. Zellen, die einer lang anhaltenden Hypertrophie unterworfen werden, zeigen offensichtlichere Unterbrechungen der Zellorganisation, einschließlich deut lich markierte vergrößerte Nuklei mit höchst feingelappten Membranen, die angrenzende Myofibrillen ersetzen und einen Zusammenbruch von normaler Z-Bandenregistrierung verursachen. Der Ausdruck „Herzhypertrophie" wird dazu verwendet, alle Stadien des Fortschreitens dieses Leidens zu umfassen, das durch verschiedene Grade an strukturellem Schaden des Herzmuskels gekennzeichnet ist, unabhängig von der zugrunde liegenden Herzerkrankung. Daher umfasst der Begriff auch physiologische Leiden, die zur Entwicklung von Herzhypertrophie beitragen, wie z. B. erhöhter Blutdruck, Aortenstenose oder Myokardinfarkt.
„Herzinsuffizienz" bezeichnet eine Anomalie von Herzfunktion, wo das Herz kein Blut in der nötigen Geschwindigkeit für die Anforderungen von metabolisierenden Geweben pumpt. Die Herzinsuffizienz kann durch eine Reihe von Faktoren verursacht sein, einschließlich ischämischer, angeborener, rheumatischer oder idiopathischer Formen.
„Kongestive Herzinsuffizienz" (CHF) ist ein progressiver pathologischer Zustand, wo das Herz zunehmend nicht in der Lage ist, adäquate Herzleistung bereitzustellen (das Blutvolumen, das vom Herz über einen gewissen Zeitraum ausgepumpt wird), um das sauerstoffangereicherte Blut in periphere Gewebe zu transportieren. Mit Fortschreiten von CHF treten strukturelle und hämodynamische Schäden auf. CHF ist ein übliches Endergebnis einer Reihe von verschiedenen Herzerkrankungen.
„Myokardinfarkt" resultiert im Allgemeinen aus Atheriosklerose der Koronararterien, oft mit überlagernder Koronarthrombose. Dieser kann in zwei Hauptformen unterteilt sein: transmurale Infarkte, bei welchen Myokardnekrose die gesamte Dicke der Gefäßwand umfasst, und subendokardiale (nicht-transmurale) Infarkte, bei welchen die. Nekrose das Subendokard umfasst, das intramurale Myokard oder beide, ohne sich vollständig durch die Ventrikelwand zum Epikard zu erstrecken. Myokardinfarkt soll sowohl eine Veränderung der hämodynamischen Wirkungen als auch eine Änderung der Struktur in beschädigten und gesunden Bereichen des Herzens verursachen. Daher reduziert Myokardinfarkt zum Beispiel die maximale Herzleistung und das Herzschlagvolumen. Mit dem Myokardinfarkt ist auch eine Stimulation der DNA- Synthese verbunden, die im Zwischenraum auftritt, sowie ein Anstieg der Bildung von Collagen in den nicht betroffen Bereichen des Herzens.
Als Folge der erhöhten Belastung oder Beanspruchung, die das Herz bei lang andauernder Hypertonie belastet, zum Beispiel aufgrund der erhöhten Gesamtperipherresistenz, ist Herzhypertrophie lange mit „Hypertonie" assoziiert worden. Eine Eigenschaft des Ventrikels, das hypertrophisch wird, als Folge von chronischer Drucküberladung ist eine gestörte diastolische Leistung. Fouad et al., J. Am. Coll. Cardiol. 4, 1500–1506 (1984), Smith et al., J. Am. Coll. Cardiol. 5, 869–874 (1985). Eine lang andauernde Entspannung des linken Ventrikels ist bei früher wesentlicher Hypertonie detektiert worden, trotz normaler oder supranormaler systolischer Funktion. Hartford et al., Hypertension 6, 329–338 (1984). Jedoch gibt es keine engen Parallelen zwischen Blutdruckspiegeln und Herzhypertrophie. Obwohl von einer Verbesserung der Funktion des linken Ventrikels als Reaktion auf Therapie mit Antihypertensiva bei Menschen berichtet worden ist, haben Patienten, die mehrfach mit einem Diuretikum (Hydrochiorthiazid), einem β-Blocker (Propranolol) oder einem Kalziumkanalblocker (Diltiazem) behandelt wurden, Umkehr der Hypertrophie des linken Ventrikels gezeigt, ohne Verbesserung der diastolischen Funktion. Inouye et al., Am. J. Cardiol. 53, 1583–7 (1984).
Eine andere komplexe Herzerkrankung, die mit Herzhypertrophie assoziiert ist, ist „hypertrophische Kardiomyopathie". Dieses Leiden ist durch eine große Vielfalt an morphologischen, funktionalen und klinischen Eigenschaften gekennzeichnet [Maron et al., N. Engl. J. Med. 316, 780–789 (1987), Spirito et al., N. Engl. J. Med. 320, 749–755 (1989), Louie and Edwards, Prog. Cardiovasc. Dis. 36, 275–308 (1994), Wigle et al., Circulation 92, 1680–1692 (1995)], die Heterogenität davon wird durch die Tatsache hervorgehoben, dass sie Patienten in allen Altersgruppen betrifft. Spirito et al., N. Engl. J. Med. 336, 775–785 (1997). Die verursachenden Faktoren von hypertrophischer Kardiomyopathie sind ebenfalls vielfältig und kaum verstanden. Im Allgemeinen sind Mutationen in Genen, die für Sarkomer-Proteine kodieren, mit hypertrophischer Kardiomyopathie assoziiert. Jüngste Daten lassen vermuten, dass β-Myosin- Schwerkettenmutationen etwa 30 bis 40 Prozent von Fällen familiärer hypertrophischer Kardiomyopathie ausmachen können. Watkins et al., N. Engl. J. Med. 326, 1108–1114 (1992), Schwartz et al., Circulation 91, 532–540 (1995), Marian und Roberts, Circulation 92, 1336–1347 (1995), Thierfelder et al., Cell 77, 701–712 (1994), Watkins et al., Nat. Gen. 11, 434–437 (1995). Neben β-Myosin-Schwerkette umfassen andere Stellen genetischer Mutationen Herz-Troponin-T, Alpha-Topomyosin, Herz-Myosin-Bindungsprotein-C, essentielle Myosinleichtkette und regulierende Myosinleichtkette. Siehe Malik und Watkins, Curr. Opin. Cardiol. 12, 295–302 (1997).
Supravalvuläre „Aortenstenose". ist eine erbliche Gefäßerkrankung, die durch Verengung der Aorta ascendens gekennzeichnet ist, aber andere Arterien, einschließlich Lungenarterien, können ebenfalls betroffen sein. Unbehandelte Aortenstenose kann zu erhöhtem intrakardialem Druck führen, der zu Myokardhypertrophie und letztlich zu Herzinsuffizienz und Tod führt. Die Pathogenese dieser Erkrankung ist nicht völlig verstanden, aber Hypertrophie und mögliche Hyperplasie von medialer glatter Muskulatur sind vorherrschende Eigenschaften dieser Erkrankung. Es ist berichtet worden, dass Molekülvarianten des Elastingens in die Entwicklung und Pathogenese von Aortenstenose involviert sind. US-Patent Nr. 5.650.282 , ausgegeben am 22. Juli 1997.
„Klappenregurgitation" tritt als Folge von Herzerkrankungen auf, die zu Störungen der Herzklappen führen. Verschiedene Erkrankungen, wie rheumatisches Fieber, können das Schrumpfen oder Wegziehen des Klappenorificiums verursachen, während andere Erkrankungen zu Endokarditis, einer Entzündung des Endokards oder der umgebenden Membran der atrioventrikulären Orifizien und Operation des Herzens führen können. Defekte wie die Verengung der Klappenstenose oder der defekte Verschluss der Klappe führen zu einer Akkumulation von Blut in der Herzhöhle oder Regurgitation von Blut aus der Klappe. Wenn dies nicht korrigiert wird, kann andauernde Klappenstenose oder Insuffizienz zu Herzhypertrophie und assoziiertem Schaden am Herzmuskel führen, was letztlich das Ersetzen der Klappe erforderlich machen kann.
Die Behandlung all dieser und anderer kardiovaskulärer, endothelialer und angiogener Erkrankungen, die von Herzhypertrophie begleitet sein können oder nicht, ist in der vorliegenden Erfindung enthalten.
Die Begriffe „Krebs", „kanzerös" und „bösartig" beziehen sich auf ein physiologisches Leiden bei Säugetieren oder beschreiben dieses, das typischerweise durch nicht-reguliertes Zellwachstum gekennzeichnet ist. Beispiele für Krebs umfassen unter anderem Karzinom, einschließlich Adenokarzinom, Lymphom, Blastom, Melanom, Sarkom und Leukämie. Beispiele für Krebsarten umfassen unter anderem Karzinom, einschließlich Adenokarzinom, Lymphom, Blastom, Melanom, Sarkom und Leukämie. Noch speziellere Beispiele für solche Krebsformen umfassen Plattenepithelkarzinom, kleinzelligen Lungenkrebs, nicht-kleinzelligen Lungenkrebs, Gastrointestinalkrebs, Hodgkin- und Non-Hodgkin-Lymphom, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Glioblastom, Cervixkrebs, Ovarialkrebs, Leberkrebs, wie beispielsweise hepatisches Karzinom und Hepatom, Blasenkrebs, Brustkrebs, Kolonkrebs, Kolorektalkrebs, Endometriumkarzinom, Speicheldrüsenkarzinom, Nierenkrebs, wie z. B. Nierenzellenkarzinom und Wilms-Tumoren, Basalzellkarzinom, Melanom, Prostatakrebs, Vulvakarzinom, Schilddrüsenkarzinom, Hodenkrebs, Speiseröhrenkrebs und verschiedene Formen von Kopf- und Nackenkrebs. Die bevorzugten Krebsarten zur hierin beschriebenen Behandlung sind Brust-, Colon-, Lungen-, Melanom-, Ovarial- und andere Tumoren, einschließlich der oben angeführten Gefäßtumoren.
Der Begriff „zytotoxisches Mittel" wie hierin verwendet bezeichnet eine Substanz, welche die Funktion von Zellen hemmt oder vermeidet und/oder Zellzerstörung verursacht. Der Begriff soll radioaktive Isotope (z. B. ¹³¹I, ¹²⁵I, ⁹⁰Y und ¹⁸⁶Re), chemotherapeutische Mittel und Toxine, wie z. B. enzymatisch aktive Toxine von bakteriellem, Pilz-, pflanzlichem oder tierischem Ursprung oder Fragmente davon umfassen.
Ein „chemotherapeutisches Mittel" ist eine chemische Verbindung, die in der Behandlung von Krebs nützlich ist. Beispiele für solche chemotherapeutische Mittel umfassen Alkylierungsmittel, Folsäureantagonisten, Antimetabolite von Nucleinsäuremetabolismus, Antibiotika, Pyrimidinanaloga, 5-Fluoruracil, Cisplatin, Purinnucleoside, A mine, Aminosäuren, Triazolnucleoside oder Corticosteroide. Spezifische Beispiele umfassen Adriamycin, Doxorubicin, 5-Fluoruracil, Cytosinarabinosid („Ara-C"), Cyclophosphamid, Thiotepa, Busulfan, Cytoxin, Taxiol, Toxoter, Methotrexat, Cisplatin, Melphalan, Vinblastin, Bleomycin, Etoposid, Ifosfamid, Mitomycin-C, Mitoxantron, Vincristin, Vinorelbin, Carboplatin, Teniposid, Daunomycin, Carminomycin, Aminopterin, Dactinomycin, Mitomycine, Esperamicine (siehe US-Patent Nr. 4.675.187 ), Melphalan und andere verwandte Stickstoff-Lostverbindungen. Es sind in dieser Definition auch hormonelle Mittel enthalten, die wirken, um Hormonwirkung auf Tumoren zu regulieren oder zu hemmen, wie z. B. Tamoxifen und Onapriston.
Ein „wachstumshemmendes Mittel" bezeichnet wie hierin verwendet eine Verbindung oder Zusammensetzung, die das Wachstum einer Zelle, wie z. B. eine Wnt-überexprimierende Krebszelle, entweder in vitro oder in vivo hemmt. Daher ist das wachstumshemmende Mittel eines, das den Prozentsatz von malignen Zellen in S-Phase signifikant reduziert. Beispiele für wachstumshemmende Mittel umfassen Mittel, die die Zellzyklusprogression (an einer anderen Stelle als die S-Phase) blockieren, wie z. B. Mittel, die G1-Arretierungen und M-Phasen-Arretierung induzieren. Klassische M-Phasenblocker umfassen Vincas (Vincristin und Vinblastin), Taxol und Topo-II-Inhibitoren, wie z. B. Doxorubicin, Daunorubicin, Etoposid und Bleomycin. Diese Mittel, die G1 arretieren, laufen auch in die S-Phasenarretierung über, z. B. DNA-Alkylierungsmittel, wie z. B. Tamoxifen, Prednison, Dacarbazin, Mechlorethamin, Cisplatin, Methotrexat, 5-Fluoruracil und Ara-C. Weitere Information ist in The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn und Israel, Hrsg., Kapitel 1, genannt „Cell cyle regulation, oncogenes and antineoplastic drugs” von Murakami et al. (WB Saunders, Philadelphia (1995)), insbesondere S. 13, zu finden. Weitere Beispiele umfassen Tumornekrosefaktor (TNF), einen Antikörper, der in der Lage ist, die angiogene Aktivität von saurem oder basischem FGF oder Hepatozytenwachstumsfaktor (HGF) zu hemmen oder zu neutralisieren, einen Antikörper, der in der Lage ist, die koagulierenden Aktivitäten des Gewebefaktors, Protein C oder Protein S (siehe WO 91/01753 , veröffentlicht am 21. Februar 1991) zu hemmen oder zu neutralisieren, oder einen Antikörper, der in der Lage ist, sich an den HER2-Rezeptor zu binden ( WO 89/06692 ), wie z. B. der 4D5-Antikörper (und funktionale Äquivalente davon) (z. B. WO 92/22653 ).
„Behandlung" ist eine Intervention, die mit der Absicht durchgeführt wird, die Entwicklung oder Änderung der Pathologie einer kardiovaskulären, endothelialen oder angiogenen Erkrankung zu ändern. Der Begriff der Behandlung wird im weitesten Sinn verwendet und umfasst insbesondere die Prävention (Prophylaxe), Linderung, Reduktion und Heilung von kardiovaskulären, endothelialen und angiogenen Erkrankungen in jedem Stadium. Demgemäß bezieht sich „Behandlung" auf sowohl therapeutische Behandlung und prophylaktische oder präventive Maßnahmen, worin das Ziel ist, eine kardiovaskuläre, endotheliale oder angiogene Erkrankung, wie z. B. Hypertrophie, zu verhindern oder zu verlangsamen (zu lindern). Jene, die eine Behandlung benötigen, umfassen jene, die schon eine Erkrankung aufweisen, sowie jene, die für diese Erkrankung anfällig sind, oder jene, bei welchen die Erkrankung vermieden werden soll. Die Erkrankung kann aus einer beliebigen Ursache resultieren, einschließlich idiopathischer, kardiotropher oder myotropher Ursachen oder Ischämie oder ischämische Angriffe, wie z. B. Myokardinfarkt.
„Chronische" Verabreichung bezeichnet Verabreichung von Mittel(n) in einer kontinuierlichen Weise im Vergleich zum akuten Modus, um die anfängliche Wirkung aufrechtzuerhalten, wie z. B. eine antihypertrophische Wirkung, über einen andauernden Zeitraum.
„Säugetier" für Behandlungszwecke bezeichnet ein beliebiges Tier, das als Säugetier klassifiziert wird, einschließlich Menschen, Haus- und Nutztiere und Zoo-, Sport- oder Haustiere, wie z. B. Hunde, Pferde, Katzen, Kühe, Schafe, Schweine etc. Vorzugsweise ist das Säugetier ein Mensch.
Verabreichung „in Kombination mit" einem oder mehreren weiteren therapeutischen Mitteln umfasst die gleichzeitige (simultane) und konsekutive Verabreichung in beliebiger Reihenfolge.
Der Begriff „kardiovaskuläres, endotheliales oder angiogenes Mittel" betrifft im Allgemeinen ein beliebiges Arzneimittel, das wirkt, um kardiovaskuläre, endotheliale oder angiogene Erkrankungen zu behandeln. Beispiele für kardiovaskuläre Mittel sind jene, die Gefäßhomöostase durch Modulation von Blutdruck, Herzrate, Herzkontraktilität und endotheliale und Glattmuskelbiologie fördern, wovon alle Faktoren eine Rolle in kardiovaskulärer Erkrankung spielen. Spezifische Beispiele dafür umfassen Angiotensin-II-Rezeptor-Antagonisten, Endothelin-Rezeptorantagonisten, wie z. B. BOSENTAN^TM und MOXONODIN^TM, Interferon-gamma (IFN-γ), des-Aspartat-Angiotensin-I, thrombolytische Mittel, z. B. Streptokinase, Urokinase, t-PA, und eine t-PA-Variante, die speziell entworfen ist, um eine längere Halbwertszeit und sehr hohe Fibrinspezifität aufzuweisen, TNK t-PA (eine T103N, N117Q, KHRR (296–299) AAAA t-PA-Variante, Keyt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3670–3674 (1994)), inotrope oder hypertensive Mittel, wie z. B. Digoxigenin und blockierende Mittel für β-adrenergen Rezeptor, z. B. Propranolol, Timolol, Tertalol, Carteolol, Nadolol, Betaxolol, Penbutolol, Acetobutolol, Atenolol, Metoprolol, und Carvedilol, angiotensinkonvertierende Enzym-(ACE-)Inhibitoren, z. B. Quinapril, Captopril, Enalapril, Ramipril, Benazepril, Fosinopril und Lisinopril, Diuretika, z. B. Chlorthiazid, Hydrochlorthiazid, Hydrofluormethazid, Methylchlorthiazid, Benzthiazid, Dichlorphenamid, Acetazolamid und Indapamid, und Kalziumkanalblocker, z. B. Diltiazem, Nifedipin, Verapamil, Nicardipin. Eine bevorzugte Kategorie für diesen Typ ist ein therapeutisches Mittel, das zur Behandlung von Herzhypertrophie oder ein physiologisches Leiden verwendet wird, das für die Entwicklung von Herzhypertrophie wesentlich ist, wie z. B. erhöhter Blutdruck, Aortenstenose oder Myokardinfarkt.
„Angiogene Mittel" und „endotheliale Mittel" sind aktive Mittel, die Angiogenese und/oder endotheliales Zellwachstum oder, wenn anwendbar, Vaskulogenese för dern. Dies umfasst Faktoren, die Wundheilung beschleunigen, wie z. B. Wachstumshormon, insulinähnlicher Wachstumsfaktor-I (IGF-I), VEGF, VIGF, PDGF, Epidermiswachstumsfaktor (EGF), CTGF und Elemente seiner Familie, FGF und TGF-α und TGF-β.
„Angiostatische Mittel" sind aktive Mittel, die Angiogenese oder Vaskulogenese hemmen oder aber das Wachstum von Krebszellen hemmen oder verhindern. Beispiele umfassen Antikörper oder andere Antagonisten zu angiogenen Mitteln wie oben definiert, wie z. B. Antikörper zu VEGF. Sie umfassen außerdem cytotherapeutische Mittel, wie z. B. zytotoxische Mittel, chemotherapeutische Mittel, wachstumshemmende Mittel, apoptotische Mittel und andere Mittel zur Behandlung von Krebs, wie z. B. Anti-HER-2, Anti-CD20 und andere bioaktive und organische chemische Mittel.
In einem pharmakologischen Sinn im Kontext der vorliegenden Erfindung bezeichnet eine „therapeutisch wirksame Menge" eines solchen aktiven Mittels, wie z. B. PRO364- oder PRO175-Polypeptid oder Antagonist dazu, eine wirksame Menge in der Behandlung einer kardiovaskulären, endothelialen und angiogenen Erkrankung.
Wie hierin verwendet wird ein „PRO364-Polypeptid" dazu verwendet, sich auf ein PRO364-Polypeptid mit einer nativen Sequenz zu beziehen, das über dieselbe Aminosäuresequenz verfügt wie ein PRO364-Polypeptid (Seq.-ID Nr. 3), das aus der Natur stammt. Ein solches PRO364-Polypeptid mit einer nativen Sequenz kann aus der Natur isoliert werden oder durch rekombinante oder synthetische Mittel produziert werden. Der Begriff umfasst insbesondere natürlich auftretende trunkierte oder sekretiere Formen eines PRO364 (z. B. lösliche Formen, die z. B. eine extrazelluläre Domänensequenz enthalten), natürlich auftretende Variantenformen (z. B. alternativ gespleißte Formen) und natürlich auftretende Allelvarianten des PRO364-Polypeptids. Die Begriffe „PRO364-Poylpeptid" und „PRO364", wenn sie wie hierin verwendet werden, um auf dieselben Polypeptide Bezug zu nehmen, die in der Literatur als „GITR" bezeichnet werden. In einer Ausführungsform der Erfindung ist das PRO364-Polypeptid mit der nativen Sequenz ein reifes PRO364-Polypeptid mit einer nativen Sequenz oder ein PRO364-Poyleptid mit einer nativen Sequenz voller Länge, das die Aminosäuren 1 bis 241 von 1 umfasst (Seq.-ID Nr. 3). Zusätzliche Ausführungsformen sind auf PRO364-Polypeptid gerichtet, das die Aminosäuren 26-241 von 2 (Seq.-ID Nr. 3) umfasst. In wieder einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist das PRO364-Polypeptid mit einer nativen Sequenz eine extrazelluläre Domänense quenz des Volllängen-PRO364-Proteins, worin die vermeintliche Transmembrandomäne des PRO364-Polypeptids voller Länge Aminosäuren 162–180 der Sequenz umfasst, die in 2 dargestellt ist (Seq.-ID Nr. 3). Alternativ dazu wird das PRO364-Polypeptid durch die Expression des Polypeptids erhalten oder ist dadurch erhältlich, für welches das cDNA-Insert des Vektors DNA47365-1206 kodiert, das als ATCC 209436 hinterlegt wurde. Daher betreffen zusätzliche Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung Polypeptide, die Aminosäuren 1-161 oder 26-161 der Aminosäuresequenz umfassen, die in 2 (Seq.-ID Nr. 3) dargestellt ist.
Der Begriff „extrazelluläre Domäne", wenn er als Verweis auf ein PRO364-Polypeptid verwendet wird, bezieht sich auf eine Form des PRO364-Polypeptids, die im Wesentlichen frei von ihrer Transmembran- und cytoplasmatischen Domänen ist. Üblicherweise wird eine ECD weniger als 1% solcher Transmembran- und/oder cytoplasmatischen Domäenen aufweisen und vorzugsweise weniger als 0,5% solcher Domänen. Es sind Deletionsvarianten oder Fragmente der vollen Länge oder ECD enthalten, in welchen eine oder mehrere Aminosäuren aus dem N- oder C-Terminus deletiert sind. Vorzugsweise besitzen solche Deletionsvarianten oder Fragmente eine gewünschte Aktivität, wie hierin beschrieben. Es versteht sich, dass eine beliebige Transmembrandomäne, die für das PRO364-Polypeptid der vorliegenden Erfindung identifiziert wurde, nach den Kriterien identifiziert wird, die routinemäßig im Fachgebiet verwendet werden, um die Form von hydrophober Domäne zu identifizieren. Die exakten Grenzen einer Transmembrandomäne können variieren, aber am wahrscheinlichsten um nicht mehr als etwa 5 Aminosäuren an beiden Enden der Domäne wie anfänglich identifiziert. Dementsprechend kann die PRO364-Polypeptid-ECD gegebenenfalls Aminosäuren Y bis X von 2 umfassen (Seq.-ID Nr. 3), worin Y einer der Aminosäurereste 1 bis 26 ist und X einer der Aminosäurereste 157 bis 167 von 2 (Seq.-ID Nr. 3) ist.
Der Begriff „Variante", wenn er verwendet wird, um auf ein PRO364-Polypeptid Bezug zu nehmen, wird nachstehend so definiert, dass sie zumindest etwa 80% Aminosäuresequenzidentität mit dem PRO364-Polypeptid mit der in 2 (Seq.-ID Nr. 3) dargestellten abgeleiteten Aminosäuresequenz für ein Nativsequenz-PRO364- Polypeptid voller Länge oder eine extrazelluläre Domänensequenz davon aufweist. Solche PRO364-Polypeptidvarianten umfassen z. B. PRO364-Polypeptide, worin ein oder mehrere Aminosäurereste am N- oder C-Terminus der Sequenz aus 2 (Seq.-ID Nr. 3) hinzugefügt oder deletiert sind. Üblicherweise verfügt eine PRO364-Polypeptidvariante über zumindest etwa 80% Aminosäuresequenzidentität, vorzugsweise zumindest etwa 85% Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 90% Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 95% Aminosäuresequenzidentität und noch bevorzugter 98% Aminosäuresequenzidentität, mit der Aminosäuresequenz aus 2 (Seq.-ID Nr. 3).
Wie hierin verwendet wird ein „PRO175-Polypeptid" dazu verwendet, auf ein Nativsequenz-PRO175-Polypeptid Bezug zu nehmen, die über dieselbe Aminosäuresequenz wie PRO175-Polypeptid (Seq.-ID Nr. 14) verfügt, das aus der Natur stammt. Solche Nativsequenz-PRO175-Polypeptide können aus der Natur isoliert werden oder durch rekombinante oder synthetische Mittel isoliert werden. Der Begriff umfasst insbesondere natürlich auftretende trunkierte oder sekretierte Formen eines PRO175-Polypeptids (z. B. lösliche Formen, die z. B. eine extrazelluläre Domänensequenz enthalten), natürlich auftretende Variantenformen (z. B. alternativ gespleißte Formen) und natürlich auftretende Allelvarianten des PRO175-Polypeptids. Die Begriffe „PRO175-Polypeptid" und „PRO175", wenn sie hierin verwendet werden, beziehen sich auf dieselben Polypeptide, die in der Literatur als „GLITTER" bezeichnet werden. In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Polypeptid mit einer nativen Sequenz, für welches das PRO175 kodiert, ein reifes oder Volllängen-Polypeptid mit einer nativen Sequenz, das Aminosäuren 1 bis 177 von 5 umfasst (Seq.-ID Nr. 14). In wieder einer anderen Ausführungsform der Erfindung umfasst das PRO175-Polypeptid Aminosäuren 52 bis 177 von 5 (Seq.-ID Nr. 14). Gegebenenfalls wird das PRO175-Polypeptid durch Expression des Polypeptids, für welches das cDNA-Insert des Vektors kodiert, das als ATCC 209466 hinterlegt ist, erhalten oder kann dadurch erhalten werden. Daher betreffen weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung Polypeptide, die Aminosäuren 1 bis 177 oder 52 bis 177 der 5 umfassen (Seq.-ID Nr. 14).
Der Begriff „extrazelluläre Domäne", wenn er verwendet wird, um auf ein PRO175-Polypeptid zu verweisen, bezieht sich auf eine Form des PRO175-Polypeptids, die im Wesentlichen frei von ihrer Transmembran- und cytoplasmatischen Domänen ist. Üblicherweise verfügt eine ECD über weniger als 1% solcher Transmembran- und/oder cytoplasmatischen Domänen und verfügt vorzugsweise über weniger als 0,5% solcher Domänen. Es sind Deletionsvarianten oder Fragmente der vollen Länge oder ECD enthalten, in welchen eine oder mehrere Aminosäuren aus dem N- oder C-Terminus deletiert sind. Vorzugsweise besitzen solche Deletionsvarianten oder Fragmente eine gewünschte Aktivität, wie hierin beschrieben. Es versteht sich, dass eine beliebige Transmembrandomäne, die für das PRO175-Polypeptid der vorliegenden Erfindung identifiziert wurde, nach den Kriterien identifiziert wurde, die routinemäßig im Fachgebiet zur Identifikation dieser Art von hydrophoben Domäne verwendet werden. Die exakten Grenzen einer Transmembrandomäne können variieren, aber am wahrscheinlichsten um nicht mehr als etwa 5 Aminosäuren an beiden Enden der Domäne, wie anfänglich identifiziert. Dementsprechend umfasst die PRO175-ECD Aminosäurereste X bis 177 von 5 (Seq.-ID Nr. 14), worin X ein beliebiger der Aminosäurereste 48 bis 57 von 5 (Seq.-ID Nr. 14) ist.
Der Begriff „Variante", wenn er verwendet wird, um ein PRO175-Polypeptid zu beschreiben, ist nachstehend so definiert, dass sie zumindest etwa 80% Aminosäuresequenzidentität mit dem PRO175-Polypeptid mit der in in 5 (Seq.-ID Nr. 14) dargestellten abgeleiteten Aminosäuresequenz für ein Volllängen-Nativsequenz-PRO175-Polypeptid oder eine extrazelluläre Domänensequenz davon aufweist. Eine PRO175-Polypeptidvariante umfasst z. B. ein PRO175-Polypeptid, worin eine oder mehrere Aminosäurereste am N- oder C-Terminus der Sequenz aus 5 (Seq.-ID Nr. 14) hinzugefügt oder deletiert sind. Üblicherweise verfügt eine PRO175-Polypeptidvariante zumindest über etwa 80% Aminosäuresequenzidentität, vorzugsweise zumindest etwa 85% Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 90% Aminosäuresequenzidentität, noch bevorzugter zumindest etwa 95% Aminosäuresequenzidentität und noch bevorzugter 98% Aminosäuresequenzidentität, mit der Aminosäuresequenz von 5 (Seq.-ID Nr. 14).
„Prozentuelle (%) Aminosäuresequenzidentität" hinsichtlich der hierin identifizierten Sequenzen wird als Prozentsatz der Aminosäurereste in einer Kandidatensequenz definiert, die mit den Aminosäureresten in der PRO364-Polypeptidsequenz oder der PRO175-Polypeptidsequenz identisch sind, nach Anordnung der Sequenzen und Einführung von Lücken, wenn notwendig, um die maximale prozentuelle Sequenzidentität zu erreichen, wobei beliebige konservative Substitutionen als Teil der Sequenzidentität nicht berücksichtigt werden. Anordnung zum Zwecke der Bestimmung von prozentueller Aminosäuresequenzidentität kann auf verschiedene Arten erreicht werden, die im Fachgebiet liegen. Ein Fachmann kann geeignete Parameter zur Messung von Anordnung bestimmen, einschließlich Zuteilung von Algorithmen, die notwendig sind, um maximale Anordnung über die verglichenen Volllängen-Sequenzen zu erreichen. Für hierin angeführte Zwecke können prozentuelle Aminosäureidentitätswerte unter Verwendung des Sequenzvergleichsprogramms ALIGN-2 erhalten werden, das von Genentech, Inc., geschrieben wurde, und der Quellcode davon ist mit Benutzerdokumentation im US Copyright Office, Washington DC 20559, hinterlegt worden, registriert unter der US Copyright Registrierungs-Nr. TXU510087. Das ALIGN-2-Programm ist öffentlich über Genentech, Inc., South San Francisco, CA, erhältlich. Alle Sequenzvergleichsparameter sind vom ALIGN-2-Programm festgelegt und variieren nicht. Verfahren zur Durchführung von Sequenzanordnung und Bestimmung von Sequenzidentität sind Fachleuten bekannt, können ohne übermäßiges Experimentieren durchgeführt werden, und Berechnungen der prozentuellen Identitätswerte kann mit Bestimmtheit erhalten werden.
„Isoliert", sofern verwendet, um die verschiedenen, hierin offenbarten Polypeptide zu beschreiben, bezeichnet ein Polypeptid, das identifiziert und aus einer Komponente aus seiner natürlichen Umgebung getrennt und/oder gewonnen wurde. Verunreinigende Komponenten seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, die typischerweise diagnostische oder therapeutische Verwendungen für das Polypeptid stören würden, und können Enzyme, Hormone und andere proteinhältige oder nicht-proteinhältige Gelöststoffe einbinden. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Polypeptid (1) bis zu einem ausreichenden Grad, um zumindest 15 Reste von N-terminaler oder innerer Aminosäuresequenz zu erhalten, durch Verwendung eines Zentrifugenröhrchensequenzierers gereinigt oder (2) durch SDS-PAGE unter nichtreduzierenden oder reduzierenden Bedingungen mittels Coomassie-Blau- oder, vorzugsweise, Silberfärbung bis zur Homogenität gereinigt. Isoliertes Polypeptid schließt Polypeptid in situ innerhalb rekombinanter Zellen ein, da zumindest eine Komponente der natürlichen Umgebung des PRO364- oder PRO175-Ligandenpolypeptids nicht vorhanden ist. Üblicherweise wird isoliertes Polypeptid durch zumindest einen Reinigungsschritt hergestellt.
Ein „isoliertes" PRO364- oder PRO175-Nucleinsäuremolekül ist ein Nucleinsäuremolekül, das aus zumindest einem verunreinigenden Nucleinsäuremolekül identifiziert und getrennt wird, mit dem es normalerweise in der natürlichen Quelle der PRO364- oder PRO175-Nucleinsäure assoziiert ist. Ein isoliertes PRO364- oder PRO175-Nucleinsäuremolekül liegt in einer anderen Form oder Beschaffenheit vor, als es in der Natur zu finden ist. Isolierte PRO364- oder PRO175-Nucleinsäuremoleküle werden daher von dem PRO364- oder PRO175-Nucleinsäuremolekül unterschieden, wie es in natürlichen Zellen existiert. Ein isoliertes PRO364- oder PRO175-Nucleinsäuremolekül schließt jedoch PRO364- oder PRO175-Nucleinsäuremoleküle ein, die in Zellen enthalten sind, welche üblicherweise das PRO364 oder PRO175 exprimieren, wobei sich beispielsweise das Nucleinsäuremolekül an einer anderen chromosomalen Stelle befindet als in natürlichen Zellen.
Die Bezeichnung „Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die zur Expression einer operabel gebundenen Kodiersequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus erforderlich sind. Die Kontrollsequenzen, die beispielsweise für Prokaryoten geeignet sind, schließen einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz und eine Ribosombindungsstelle ein. Eukaryotische Zellen sind bekannt dafür, Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer zu verwenden.
Nucleinsäure ist „operabel gebunden", wenn sie in eine funktionelle Beziehung mit einer anderen Nucleinsäuresequenz gebracht wird. Beispielsweise ist DNA für eine Präsequenz oder einen Sekretionsleader operabel an DNA für ein PRO364- oder PRO175-Polypeptid gebunden, wenn sie als ein Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids teilnimmt; ein Promotor oder ein Enhancer ist operabel an eine Kodiersequenz gebunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosombindungsstelle ist operabel an eine Kodiersequenz gebunden, wenn sie so positioniert ist, dass sie Translation unterstützt. Im Allgemeinen bedeutet „operabel gebunden", dass die DNA-Sequenzen, die verbunden sind, zusammenhängend sind und, im Fall eines Sekretionsleaders, zusammenhängend und in Lesephase sind. Enhancer müssen jedoch nicht zusammenhängend sein. Bindung erfolgt durch Ligation an passenden Restriktionsstellen. Bestehen solche Stellen nicht, so werden die synthetischen Oligonucleotidadaptoren oder Linker gemäß herkömmlichen Praktiken verwendet.
„Stringenz" von Hybridisierungsreaktionen können Fachleute leicht bestimmen und beruht im Allgemeinen auf einer empirischen Berechnung, die von Sondenlänge, Waschtemperatur und Salzkonzentration abhängt. Im Allgemeinen erfordern längere Sonden höhere Temperaturen für korrektes Anellieren, während kürzere Sonden niedrigere Temperaturen erfordern. Hybridisierung im Allgemeinen hängt von der Fähigkeit denaturierter DNA ab, neuerlich zu anellieren, wenn komplementäre Stränge in einer Umgebung unter ihrer Schmelztemperatur vorhanden sind. Je höher der Grad an erwünschter Homologie zwischen der Sonde und der hybridisierbaren Sequenz ist, desto höher ist auch die relative Temperatur, die verwendet werden kann. Als Resultat folgt, dass höhere relative Temperaturen dazu neigen würden, die Reaktionsbedingungen stringenter zu gestalten, während niedrigere Temperaturen dies weniger verlangen würden. Für zusätzliche Details und Erklärungen zur Stringenz von Hybridisierungsreaktionen siehe Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995).
„Stringente Bedingungen" oder „Bedingungen hoher Stringenz" wie hierin definiert können als jene Bedingungen identifiziert werden, die: (1) geringe Ionenstärke und hohe Temperaturen für das Waschen verwenden, beispielsweise 0,015 M Natriumchlorid/0,0015 M Natriumcitrat/0,1% Natriumdodecylsulfat bei 50°C; (2) während der Hybridisierung ein denaturierendes Mittel verwenden, wie beispielsweise Formamid, z. B. 50 Vol.-% Formamid mit 0,1% Rinderserumalbumin/0,1% Ficoll/0,1% Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM Natriumchlorid, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C; oder (3) 50% Formamid, 5 × SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 0,1% Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardts Lösung, beschallte Lachssperma-DNA (50 μg/ml), 0,1% SDS und 10% Dextransulfat bei 42°C verwenden, mit Waschschritten bei 42°C in 0,2 × SSC (Natriumchlorid/Natriumcitrat) und 50% Formamid bei 55°C, gefolgt von einem Waschschritt bei hoher Stringenz bestehend aus 0,1 × SSC, das EDTA enthält, bei 55°C.
„Moderat stringente Bedingungen" können wie von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press (1989), beschrieben definiert werden und schließen die Verwendung von Waschlösung und Hybridisierungsbedingungen (z. B. Temperatur, Ionenstärke und% SDS) ein, die weniger stringent sind als jene, die zuvor beschrieben wurden. Ein Beispiel für moderat stringente Bedingungen ist Übernacht-Inkubation bei 37°C in einer Lösung, umfassend: 20% Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardts Lösung, 10% Dextransulfat und 20 mg/ml denaturierte gescherte Lachssperma-DNA; gefolgt von Waschen der Filter in 1 × SSC bei etwa 37–50°C. Fachleute werden erkennen, wie Temperatur, Ionenstärke usw. nach Erfordernis einzustellen sind, um Faktoren wie Sondenlänge und dergleichen Rechnung zu tragen.
Die Bezeichnung „epitopmarkiert", wenn hierin verwendet, bezieht sich auf ein Hybridpolypeptid, das ein an ein „Markierungs-Polypeptid" fusioniertes PRO364- oder PRO175-Polypeptid umfasst. Das Markierungs-Polypeptid weist genug Reste auf, um ein Epitop bereitzustellen, gegen das ein Antikörper hergestellt werden kann, ist jedoch auch ausreichend kurz, dass es die Aktivität des Polypeptids, an das es fusioniert ist, nicht stört. Das Markierungs-Polypeptid ist vorzugsweise auch eher einmalig, sodass der Antikörper mit anderen Epitopen im Wesentlichen nicht kreuzreagiert. Geeignete Markierungs-Polypeptide haben im Allgemeinen zumindest sechs Aminosäurenreste und üblicherweise zwischen etwa 8 und 50 Aminosäurereste (vorzugsweise zwischen etwa 10 und 20 Aminosäurereste).
„Aktiv” oder „Aktivität" im Kontext von PRO364- oder PRO175-Varianten bezieht sich auf Form(en) von PRO364- oder PRO175-Proteinen, die die biologischen und/oder immunologischen Aktivitäten von nativem oder natürlich auftretendem PRO364- oder PRO175-Polypeptid in sich tragen.
„Biologische Aktivität" im Kontext eines Moleküls, das PRO364 oder PRO175-Polypeptid antagonisiert, das durch die hierin offenbarten Screeningtests identifiziert werden kann (z. B. ein organisches oder anorganisches kleines Molekül, Peptid etc.), wird dazu verwendet, sich auf die Fähigkeit solcher Moleküle zu beziehen, sich an das PRO364- oder PRO175-Polypeptid, das hierin identifiziert wird, zu binden oder damit einen Komplex zu bilden oder aber die Wechselwirkung mit dem PRO364- oder PRO175-Polypeptid mit anderen Zellproteinen zu beeinflussen. Besonders bevorzugte biologische Aktivität umfasst Herzhypertrophie, Aktivität, die auf systemische Erkrankungen, die Gefäße betreffen, wie z. B. Diabetes mellitus, sowie Erkrankungen der Arterien, Kapillaren, Venen und/oder Lymphgefäße und Krebs wirkt.
Die Bezeichnung „Antagonist" wird im weitesten Sinne verwendet und schließt jedes beliebige Molekül ein, das biologische Aktivitäten eines hierin offenbarten nativen PRO364- oder PRO175-Polypeptids teilweise oder gänzlich blockiert, hemmt oder neutralisiert, z. B., wenn anwendbar, seine mitogene oder angiogene Aktivität. Antagonisten von PRO364- oder PRO175-Polypeptid können durch Eingreifen in die Bindung von PRO364- oder PRO175-Polypeptid an einen Zellrezeptor wirken, durch Unfähigmachen oder Töten von Zellen, die von PRO364- oder PRO175-Polypeptid aktiviert worden sind, oder durch Eingreifen in die Gefäßendothelzellaktivierung nach Bindung von PRO364- oder PRO175-Polypeptid an einen Zellrezeptor. All diese Interventionspunkte durch einen PRO364- oder PRO175-Polypeptidantagonisten sollen als äquivalent für Zwecke dieser Erfindung betrachtet werden. Die Antagonisten hemmen die mitogene, angiogene oder andere biologische Aktivität von PRO364- oder PRO175-Polypeptiden und sind daher zur Behandlung von Erkrankungen oder Leiden nützlich, die durch nicht-erwünschte exzessive Neovaskularisierung gekennzeichnet sind, einschließlich beispielsweise Tumoren und insbesondere feste maligne Tumoren, rheumatoide Arthritis, Psoriasis, Atherosklerose, diabetische und ande re Retinopathien, retrolentale Fibroplasie, altersbedingte Makuladegeneration, neovaskuläres Glaukom, Hämangiome, Schilddrüsenhyperplasien (einschließlich Basedow-Krankheit), Hornhaut- und andere Gewebstransplantation und chronische Entzündung. Die Antagonisten sind ebenfalls zur Behandlung von Erkrankungen und Störungen nützlich, die durch unerwünschte exzessive Gefäßpermeabilität gekennzeichnet sind, wie z. B. Ödem assoziiert mit Gehirntumoren, Asziten, die mit Malignitäten assoziiert sind, Meigs-Syndrom, Lungenentzündung, nephrotisches Syndrom, Perikardeffusion (sowie jene, die mit Perikarditis assoziiert ist) und Pleuraeffusion. Auf ähnliche Weise wird der Begriff „Agonist" im weitesten Sinn verwendet und umfasst ein beliebiges Molekül, das eine biologische Aktivität eines nativen PRO364- oder PRO175-Polypepdtis, das hierin offenbart ist, nachahmt. Geeignete Agonisten- oder Antagonistenmoleküle umfassen insbesondere Agonisten- oder Antagonisten-Antikörper oder -Antikörperfragmente, Fragmente oder Aminosäuresequenzvarianten von nativen PRO364- oder PRO175-Polypeptiden.
„Antikörper" (Abs) und „Immunglobuline" (Igs) sind Glykoproteine, die dieselben strukturellen Eigenschaften aufweisen. Während Antikörper Bindungsspezifität an ein spezifisches Antigen zeigen, umfassen Immunglobuline sowohl Antikörper als auch andere antikörperähnliche Moleküle, denen Antigenspezifität fehlt. Polypeptide letzterer Art werden z. B. in geringeren Ausmaßen durch das Lymphsystem und in erhöhten Ausmaßen durch Myelome produziert. Der Begriff „Antikörper" wird im weitesten Sinn verwendet und umfasst insbesondere ohne Einschränkung intakte monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper, multispezifische Antikörper (z. B. bispezifische Antikörper), die aus zumindest zwei intakten Antikörpern gebildet werden, und Antikörperfragmente, solange sie die gewünschte biologische Aktivität zeigen.
„Native Antikörper" und „native Immunglobuline" sind üblicherweise heterotetramere Glykoproteine von etwa 150.000 Dalton, bestehend aus zwei identischen Leicht-(L-)Ketten und zwei identischen Schwer-(H-)Ketten. Jede Leichtkette ist an eine Schwerkette durch eine kovalente Disulfidbindung gebunden, während die Zahl der Disulfidbindungen unter den Schwerketten der verschiedenen Immunglobulinisotypen variiert. Jede Schwer- und Leichtkette weist auch regelmäßig beabstandete Intraketten-Disulfidbrücken auf. Jede Schwerkette weist an einem Ende eine variable Domäne (V_H) gefolgt von einigen konstanten Domänen auf. Jede Leichtkette weist an einem Ende eine variable Domäne (V_L) und eine konstante Domäne an ihrem anderen Ende auf; die konstante Domäne der Leichtkette ist mit der ersten konstanten Domäne der Schwerekette angeordnet, und die variable Leichtkettendomäne ist mit der variablen Domäne der Schwerkette angeordnet. Spezielle Aminosäurereste sollen eine Schnittfläche zwischen den variablen Leicht- und Schwerkettendomänen bilden.
Der Begriff „variabel" bezieht sich auf die Tatsache, dass bestimmte Abschnitte der variablen Domänen sich umfassend in der Sequenz zwischen Antikörpern unterscheiden und in der Bindung und Spezifität jedes bestimmten Antikörpers zu und für sein spezielles Antigen verwendet werden. Jedoch ist die Variabilität nicht gleichmäßig in den variablen Domänen von Antikörpern verteilt. Sie ist in drei Segmente konzentriert, die komplementaritätsbestimmende Regionen (CDRs) oder hypervariable Regionen sowohl in den variablen Leichtketten- als auch Schwerkettendomänen genannt werden. Die höchst konservierten Abschnitte der variablen Domänen werden Gerüstregionen (FR) genannt. Die variablen Domänen der nativen Schwer- und Leichtketten umfassen jeweils vier FR-Regionen, die großteils eine Beta-Faltblattkonfiguration annehmen, die durch drei CDRs verbunden ist, die Schleifen bilden, die die Beta-Faltblattstruktur verbinden und in manchen Fällen einen Teil davon bilden. Die CDRs in jeder Kette werden in enger Nähe durch die FR-Regionen zusammengehalten und tragen mit den CDRs aus den anderen Ketten zur Bildung der Antigenbindungsstelle von Antikörpern bei. Siehe Kabat et al., NIH Publ. Nr. 91-3242, Band 1, Seiten 647–669 (1991). Die konstanten Domänen sind nicht direkt in die Bindung eines Antikörpers an ein Antigen involviert, zeigen aber verschiedene Effektorfunktionen, wie z. B. Teilnahme des Antikörpers an antikörperabhängiger Zelltoxizität.
„Antikörperfragmente" umfassen einen Abschnitt eines intakten Antikörpers, vorzugsweise die Antigenbindungs- oder variable Region des intakten Antikörpers. Beispiele für Antikörperfragmente umfassen Fab-, Fab'-, F(ab')₂- und Fv-Fragmente; Diabodies; lineare Antikörper (Zapata et al., Protein Eng. 8(10), 1057–1062 (1995)); einket tige Antikörpermoleküle; und multispezifische Antikörper, gebildet aus Antikörperfragmenten.
Papainverdau von Antikörpern produziert zwei identische Antigenbindungsfragmente, genannt „Fab"-Fragmente, jeweils mit einer einzelnen Antigen-Bindungsstelle, und ein verbleibendes „Fc"-Fragment, eine Bezeichnung, die die Fähigkeit widerspiegelt, leicht zu kristallisieren. Pepsinbehandlung ergibt ein F(ab')₂-Fragment, das zwei Antigen-kombinierende Stellen aufweist und dennoch zur Vernetzung von Antigen in der Lage ist.
„Fv" ist das minimale Antikörperfragment, das eine vollständige Antigenerkennungs- und -bindungsstelle aufweist. Diese Region besteht aus einem Dimer einer variablen Schwer- und einer variablen Leichtkettendomäne in enger, nicht-kovalenter Assoziation. In dieser Konfiguration erfolgt eine Wechselwirkung zwischen den drei CDRs jeder variablen Domäne zur Definition einer Antigen-Bindungsstelle an der Oberfläche des V_H-V_L-Dimers. Gemeinsam verleihen die sechs CDRs dem Antikörper Antigen-Bindungsspezifität. Jedoch weist sogar eine einzelne variable Domäne (oder die Hälfte eines Fv, das nur drei CDRs umfasst, die für ein Antigen spezifisch sind) die Fähigkeit auf, Antigen zu erkennen und zu binden, dies jedoch bei einer geringeren Affinität als die gesamte Bindungsstelle.
Das Fab-Fragment enthält auch die konstante Domäne der leichten Kette und die erste konstante Domäne (CH1) der schweren Kette. Fab'-Fragmente unterscheiden sich von Fab-Fragmenten durch die Addition einiger weniger Reste am Carboxy-Terminus der Schwerketten-CH1-Domäne, einschließlich eines oder mehrerer Cysteine aus der Antikörper-Gelenksregion. Fab'-SH ist hierin die Bezeichnung für Fab', in dem der/die Cysteinrest(e) der konstanten Domänen eine freie Thiolgruppe aufweist/aufweisen. F(ab')₂-Antikörperfragmente wurden ursprünglich als Paare von Fab'-Fragmenten produziert, die Gelenks-Cysteine zwischen sich aufwiesen. Auch andere chemische Bindungen sind für Antikörperfragmente bekannt.
Die „leichten Ketten" von Antikörpern (Immunglobulinen) aus jeder beliebigen Wirbeltierspezies können einem oder zwei eindeutig unterscheidbaren Typen, genannt kappa (k) und lambda (λ), basierend auf den Aminosäuresequenzen ihrer konstanten Domänen zugeordnet werden.
Je nach Aminosäuresequenz der konstanten Domäne ihrer schweren Ketten können Immunglobuline verschiedenen Klassen zugeordnet werden. Es gibt fünf Hauptklassen von Immunglobulinen: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM, und mehrere von diesen können weiters in Unterklassen (Isotypen) unterteilt werden, z. B.: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA und IgA2. Die konstanten Schwerkettendomänen, die den verschiedenen Klassen von Immunglobulinen entsprechen, werden jeweils α, δ, ε, γ und μ genannt, Die Untereinheitsstrukturen und dreidimensionalen Konfigurationen von verschiedenen Klassen von Immunglobulinen sind bekannt.
Die Bezeichnung „monoklonaler Antikörper" wie hierin verwendet bezieht sich auf einen Antikörper, der aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern gewonnen wurde, d. h. dass die einzelnen Antikörper, aus denen die Population besteht, identisch sind, unter Ausnahme möglicher, natürlich vorkommender Mutationen, die in geringen Mengen vorhanden sein können. Monoklonale Antikörper sind höchst spezifisch und gegen eine einzelne Antigenstelle gerichtet. Weiters ist im Gegensatz zu herkömmlichen (polyklonalen) Antikörperformulierungen, die typischerweise verschiedene Antikörper umfassen, die gegen verschiedene Determinanten (Epitope) gerichtet sind, jeder monoklonale Antikörper gegen eine einzelne Determinante auf dem Antigen gerichtet. Zusätzlich zu ihrer Spezifität sind die monoklonalen Antikörper vorteilhaft, insofern als dass sie durch die Hybridomkultur synthetisiert werden, nicht-kontaminiert von anderen Immunglobulinen. Der Modifikator „monoklonal" gibt den Charakter des Antikörpers an, wie er von einer im Wesentlichen homogenen Population von Antikörpern erhalten wird, und ist nicht so beschaffen, dass er Produktion des Antikörpers durch ein bestimmtes Verfahren erfordert. Zum Beispiel können die monoklonalen Antikörper, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, durch das Hybridomverfahren hergestellt werden, das zuerst von Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), beschrieben ist, oder können durch DNA-Rekombinationsverfahren (siehe z. B. US-Patent Nr. 4.816.567 ) hergestellt werden. Die „monoklonalen Antikörper" können auch aus Phagenantikörperbibliotheken unter Verwendung der in Clackson et al., Nature 352, 624–628 (1991), und Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581–597 (1991), beschriebenen Verfahren isoliert werden.
Die hierin angeführten monoklonalen Antikörper umfassen insbesondere „chimäre" Antikörper (Immunglobuline), in welchen ein Abschnitt der Schwer- und/oder Leichtkette mit den entsprechenden Sequenzen in Antikörpern identisch ist oder zu ihnen homolog ist, die von einer besonderen Spezies abstammen oder einer besonderen Antikörperklasse oder -unterklasse angehören, während der Rest der Kette(n) mit entsprechenden Sequenzen in Antikörpern, die von einer anderen Spezies abstammen oder einer anderen Antikörperklasse oder -nterklasse angehören, identisch oder homolog sind, sowie Fragmente solcher Antikörper, solange sie die gewünschte biologische Aktivität zeigen. US-Patent Nr. 4.816.567 , Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851–6855 (1984).
Humanisierte Formen von nicht-menschlichen (z. B. Maus-)Antikörpern sind chimäre Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (wie z. B. Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ oder andere Antigen-bindende Subsequenzen von Antikörpern), die eine Mindest-Sequenz, abgeleitet aus nicht-menschlichem Immunglobulin, enthalten. Humanisierte Antikörper umfassen meistens menschliche Immunglobuline (Empfängerantikörper), in denen Reste aus einer komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) des Empfängers durch Reste aus einer CDR einer nicht-menschlichen Spezies (Spenderantikörper) wie Maus, Ratte oder Kaninchen mit der erwünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt sind. In manchen Fällen sind Fv-Gerüstreste des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nicht-menschliche Reste ersetzt. Humanisierte Antikörper können auch Reste umfassen, die weder im Empfängerantikörper noch in den importierten CDR- oder Gerüstsequenzen zu finden sind. Diese Modifikationen werden gemacht, um die Antikörperleistung zu verfeinern und zu maximieren. Im Allgemeinen umfasst der humanisierte Antikörper im Wesentlichen die gesamte von zumindest einer, und typischerweise zwei, variablen Domä nen, in denen alle oder im Wesentlichen alle der CDR-Regionen jenen eines nicht-menschlichen Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle der FR-Regionen jene einer menschlichen Immunglobulin-Sequenz sind. Die humanisierten Antikörper umfassen vorzugsweise auch zumindest einen Abschnitt einer konstanten Immunglobulinregion (Fc), typischerweise jenen eines menschlichen Immunglobulins. Für weitere Details siehe Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986), Riechmann et al., Nature 332, 323–329 (1988), und Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593–596 (1992). Der humanisierte Antikörper umfasst einen PRIMATIZED^TM Antikörper, worin die Antigenbindungsregion des Antikörpers von einem Antikörper stammt, der durch Immunisierung von Makaken-Affen mit dem Antigen von Interesse stammt.
„Einkettige Fv"- oder „sFv"-Antikörperfragmente umfassen die V_H- und V_L-Domänen eines Antikörpers, worin diese Domänen in einer einzigen Polypeptidkette vorhanden sind. Vorzugsweise umfasst das Fv-Polypeptid weiters einen Polypeptidlinker zwischen den V_H- und V_L-Domänen, was dem sFv die Möglichkeit gibt, die erwünschte Struktur für Antigenbindung zu bilden. Einen Überblick zum Thema sFv liefert Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Bd. 113, Rosenburg & Moore (Hrsg.), Springer-Verlag, New York, 269–315 (1994).
Die Bezeichnung „Diabodies" bezieht sich auf kleine Antikörperfragmente mit zwei Antigen-Bindungsstellen, worin die Fragmente eine variable Schwerkettendomäne (V_H) verbunden mit einer variablen Leichtkettendomäne (V_L) in derselben Polypeptidkette (V_H-V_L) umfassen. Unter Verwendung eines Linkers, der zu kurz ist, um Paarung zwischen den zwei Domänen an derselben Kette zu ermöglichen, werden die Domänen gezwungen, mit den komplementären Domänen einer anderen Kette Paare zu bilden und zwei Antigen-Bindungsstellen zu schaffen. Diabodies werden ausführlicher beispielsweise in der EP 404.097 ; der WO 93/11161 ; und in Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444–6448 (1993), beschrieben.
Ein „isolierter" Antikörper ist einer, der aus einer Komponente seiner natürlichen Umgebung identifiziert und getrennt und/oder gewonnen wurde. Verunreinigende Komponenten seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, die diagnostische oder the rapeutische Verwendungen für den Antikörper stören würden, und können Enzyme, Hormone und andere proteinhältige oder nicht-proteinhältige Gelöststoffe einbinden. In bevorzugten Ausführungsformen wird der Antikörper (1) zu einer Reinheit von über 95 Gew.-% des Antikörpers, bestimmt durch das Lowry-Verfahren, und am meisten bevorzugt zu einer Reinheit von über 99 Gew.-%, (2) zu einem ausreichenden Grad, um zumindest 15 Reste von N-terminaler oder innerer Aminosäuresequenz zu erhalten, mittels eines Zentrifugenröhrchensequenzierers oder (3) bis zur Homogenität mittels SDS-PAGE unter reduzierenden oder nichtreduzierenden Bedingungen mittels Coomassie-Blau- oder, vorzugsweise, Silberfärbung gereinigt. Isolierter Antikörper schließt den Antikörper in situ innerhalb rekombinanter Zellen ein, da zumindest eine Komponente der natürlichen Umgebung des Antikörpers nicht vorhanden ist. Üblicherweise wird ein isolierter Antikörper jedoch durch zumindest einen Reinigungsschritt hergestellt.
Das Wort „Markierung", sofern hierin verwendet, bezieht sich auf eine nachweisbare Verbindung oder Zusammensetzung, die direkt oder indirekt an den Antikörper konjugiert ist, um einen „markierten" Antikörper zu bilden. Die Markierung kann durch sich selbst nachweisbar sein (z. B. Radioisotopmarkierungen oder fluoreszierende Markierungen) oder kann, im Fall einer enzymatischen Markierung, chemische Änderung einer Substratverbindung oder -zusammensetzung katalysieren, die wiederum nachweisbar ist.
Unter „Festphase" wird eine nichtwässrige Matrix verstanden, an die der Antikörper der vorliegenden Erfindung anhaften kann. Beispiele für Festphasen, die hierzu gehören, schließen jene ein, die teilweise oder vollständig aus Glas (z. B. Controlled Pore Glass), Polysacchariden (z. B. Agarose), Polyacrylamiden, Polystyrol, Polyvinylalkohol und Silikonen gebildet sind. In bestimmten Ausführungsformen, je nach Kontext, kann die Festphase den Well einer Testplatte umfassen, in anderen ist sie eine Reinigungssäule (z. B. eine Affinitätschromatographiesäule). Diese Bezeichnung umfasst auch eine diskontinuierliche Festphase aus einzelnen Teilchen, wie z. B. jene, die um US-Patent Nr. 4.275.149 beschrieben werden.
Ein „Liposom" ist ein kleines Vesikel, das sich aus verschiedenen Typen an Lipiden, Phospholipiden und/oder Tensid zusammensetzt und zur Zufuhr eines Wirkstoffs (wie z. B. dem PRO364- oder PRO175-Polypeptid oder Antikörpern dazu, die hierin offenbart sind) zu einem Säugetier nützlich ist. Die Komponenten des Liposoms sind üblicherweise in einer zweischichtigen Formation angeordnet, ähnlich der Lipidanordnung biologischer Membranen.
Wie hierin verwendet beschreibt die Bezeichnung „Immunadhäsin" antikörperähnliche Moleküle, die die Bindungsspezifität eines heterologen Proteins (eines „Adhäsins") mit den Effektorfunktionen von konstanten Immunglobulindomänen kombinieren. Strukturell umfassen die Immunadhäsine eine Fusion einer Aminosäuresequenz mit der gewünschten Bindungsspezifität, die anders ist als die Antigenerkennung und Bindungsstelle eines Antikörpers (d. h. sie ist „heterolog"), und einer Sequenz einer konstanten Immunglobulindomäne. Der Adhäsinteil eines Immunglobulinmoleküls ist typischerweise eine zusammenhängende Aminosäuresequenz, die zumindest die Bindungsstelle eines Rezeptors oder eines Liganden umfasst. Die Sequenz in der konstanten Immunglobulindomäne im Immunadhäsin kann von einem beliebigen Immunglobulin erhalten werden, wie z. B. IgG-1-, IgG-2-, IgG-3- oder IgG-4-Subtypen, IgA (einschließlich IgA1 und IgA2), IgE, IgD oder IgM.
II. Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung
A. Herstellung der PRO364- oder PRO175-Polypeptide
Die vorliegende Erfindung verwendet isolierte Nucleotidsequenzen, die für Polypeptide kodieren, die in der vorliegenden Anmeldung als PRO364 (auch als PRO687 oder UNQ319 bezeichnet) und als PRO175 bezeichnet werden. Insbesondere wurden cDNAs, die für PRO364- und PRO175-Polypeptide kodieren, isoliert und verwendet, wie näher in den nachstehenden Beispielen offenbart wird. Es gilt anzumerken, dass Proteine, die in getrennten Expressionsdurchgängen produziert wurden, unterschiedliche PRO-Nummern verliehen bekommen können, dass jedoch die UNQ-Nummer für jede bestimmte DNA und das kodierte Protein einmalig ist und nicht geändert wird.
Die nachstehende Beschreibung betrifft primär die Produktion von PRO364- und PRO175-Polypeptid durch Kultivierung von Zellen, die mit einem Vektor transformiert oder transfiziert wurden, der Nucleinsäure enthält, die für PRO364- oder PRO175-Polypeptid kodiert. Es versteht sich natürlich, dass alternative Verfahren, die fachbekannt sind, verwendet werden können, um PRO364 oder PRO175 herzustellen. Zum Beispiel können PRO364- oder PRO175-Polypeptidsequenzen oder Abschnitte davon durch direkte Peptidsynthese unter Verwendung von Festphasenverfahren produziert werden. Siehe z. B. Stewart et al., Solid-Phase-Peptide Synthesis (W. H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969), Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149–2154 (1963). In-vitro-Proteinsynthese kann unter Verwendung manueller Verfahren oder durch Automatisierung durchgeführt werden. Automatisierte Synthese kann erreicht werden, zum Beispiel mit einem Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) unter Verwendung der Anweisungen des Herstellers. Verschiedene Abschnitte PRO364 oder PRO175 können separat chemisch synthetisiert werden und unter Verwendung chemischer oder enzymatischer Verfahren kombiniert werden, um das Volllängen-PRO364- oder -PRO175-Polypeptid zu produzieren.
Isolierung von DNA, die für PRO364 oder PRO175 kodiert
DNA, die für PRO364- oder PRO175-Polypeptid kodiert, kann aus einer cDNA-Bibliothek gewonnen werden, die aus Gewebe hergestellt wird, von dem angenommen wird, dass es die für PRO364 oder PRO175 kodierende mRNA aufweist und diese in einem nachweisbaren Ausmaß exprimiert. Demgemäß können DNAs, die für menschliches PRO364 oder menschliches PRO175 kodieren, leicht aus einer cDNA-Bibliothek gewonnen werden, die aus menschlichem Gewebe hergestellt wird, wie es auch in den Beispielen beschrieben ist. Das für PRO364- oder PRO175-Polypeptid kodierende Gen kann auch aus einer genomischen Bibliothek oder mittels Oligonucleotidsynthese gewonnen werden.
Bibliotheken können mit Sonden (wie Antikörpern gegen das PRO364- oder PRO175-Poyleptid oder Oligonucleotide mit zumindest etwa 20–80 Basen) gescreent werden, deren Zweck es ist, das Gen von Interesse oder das durch dieses Gen kodierte Protein zu identifizieren. Screening der cDNA- oder der genomischen Bibliothek mit der ausgewählten Sonde kann unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt werden, die z. B. in Sambrook et al., s. o., beschrieben sind. Ein alternatives Mittel zum Isolieren des für PRO364 oder PRO175 kodierenden Gens ist die Verwendung der PCR-Methode [Sambrook et al., s. o.; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1995))].
Die nachstehenden Beispiele beschreiben Verfahren zum Screenen einer cDNA-Bibliothek. Die als Sonden ausgewählten Oligonucleotidsequenzen sollten eine ausreichende Länge aufweisen und ausreichend eindeutig sein, sodass falsche Positive minimiert werden. Das Oligonucleotid ist vorzugsweise so markiert, dass es durch Hybridisierung an DNA in der zu screenenden Bibliothek nachgewiesen werden kann. Markierungsverfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und umfassen die Verwendung von radioaktiven Markierungen wie z. B. von ³²P-markiertem ATP, Biotinylierung oder Enzymmarkierung. Hybridisierungsbedingungen, einschließlich moderater Stringenz und hoher Stringenz, sind in Sambrook et al., s. o., beschrieben.
Sequenzen, die in solchen Bibliotheks-Screening-Verfahren identifiziert werden, können mit anderen bekannten Sequenzen, die in öffentlichen Datenbanken wie z. B. GenBank oder anderen privaten Sequenzdatenbanken hinterlegt und zugänglich sind, verglichen und abgeglichen werden. Sequenzidentität (entweder auf Niveau der Aminosäuren oder der Nucleotide) innerhalb definierter Regionen des Moleküls oder über die gesamte Volllängensequenz hinweg kann mittels Sequenzanordnung unter Verwendung von Computer-Softwareprogrammen wie z. B. ALIGN, DNAStar und INHERIT bestimmt werden.
Nucleinsäure mit Protein-kodierender Sequenz kann durch Screenen ausgewählter cDNA- oder genomischer Bibliotheken unter Verwendung der hierin zum ersten Mal offenbarten, abgeleiteten Aminosäuresequenz und, sofern erforderlich, unter Verwendung herkömmlicher Primerextensionsverfahren wie in Sambrook et al., s. o., beschrieben gewonnen werden, um Vorläufer und Verarbeitungs-Zwischenprodukte von mRNA zu detektieren, die eventuell nicht in cDNA revers-transkribiert worden sind.
Zusätzlich zu dem hierin beschriebenen Nativsequenz-PRO364-Polypeptid oder -PRO175-Polypeptid voller Länge versteht es sich, dass PRO364- oder PRO175-Varianten hergestellt werden können. PRO364- oder PRO175-Varianten können durch Einführung geeigneter Nucleotidänderungen in die für PRO364 oder PRO175 kodierende DNA hergestellt werden oder durch Synthese des gewünschten PRO364- oder PRO175-Polypeptids. Fachleuten wird bekannt sein, dass Aminosäureänderungen posttranslationale Prozesse des PRO364- oder PRO175-Polypeptids verändern können, wie z. B. die Anzahl oder Position von Glykosylierungsstellen oder Ändern der Membranverankerungs-Eigenschaften.
Variationen im nativen Volllängensequenz-PRO364 oder -PRO175 oder in verschiedenen Domänen des hierin beschriebenen PRO364- oder PRO175-Polypeptids können gemacht werden, beispielsweise unter Verwendung beliebiger Verfahren und Richtlinien für konservative und nicht-konservative Mutationen, die beispielsweise im US-Patent Nr. 5.364.934 beschrieben sind. Variationen können eine Substitution, Deletion oder Insertion von einem oder mehrerer Codons sein, die für das PRO364- oder PRO175-Polypeptid kodieren, die zu einer Änderung der Aminosäuresequenz des PRO364- oder PRO175-Polypeptids im Vergleich mit Nativsequenz-PRO364 oder -PRO175 führen. Gegebenenfalls erfolgt diese Variation durch Substitution von zumindest einer Aminosäure mit jeder anderen Aminosäure in einer oder mehreren Domänen des PRO364- oder PRO175-Polypeptids. Hilfestellung bei der Bestimmung, welcher Aminosäurerest insertiert, substituiert oder deletiert werden kann, ohne die erwünschte Aktivität negativ zu beeinflussen, kann durch Vergleichen der Sequenz des PRO364- oder PRO175-Polypeptids mit jener von homologen bekannten Proteinmolekülen und durch Minimieren der Anzahl an Aminosäuresequenzänderungen in Regionen hoher Homologie gefunden werden. Aminosäuresubstitutionen kön nen durch Ersetzen einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen strukturellen und/oder chemischen Eigenschaften, beispielsweise durch Ersetzen eines Leucins mit einem Serin, d. h. durch konservative Aminosäureersetzungen, entstehen. Insertionen oder Deletionen können gegebenenfalls im Bereich von etwa 1 bis 5 Aminösäuren liegen. Die zugelassene Variation kann durch systematisches Durchführen von Insertionen, Deletionen oder Substitutionen von Aminosäuren in die Sequenz und Testen der resultierenden Varianten auf Aktivität in einem beliebigen der In-vitro-Tests, die in den Beispielen nachstehend beschrieben sind, bestimmt werden.
Die Variationen können unter Verwendung von fachbekannten Verfahren, wie z. B. oligonucleotidvermittelter (ortsspezifischer) Mutagenese, Alaninscanning und PCR-Mutagenese hergestellt werden. Ortsgerichtete Mutagenese [Carter et al., Nucl. Acids Res. 13, 4331 (1986), Zoller et al., Nucl. Acids Res. 10, 6487 (1987)], Kassettenmutagenese [Wells et al., Gene 34, 315 (1985)], Restriktionsselektionsmutagenese [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317, 415 (1986)] oder andere bekannte Verfahren können auf der klonierten DNA durchgeführt werden, um die für PRO364-kodierende Varianten-DNA zu produzieren.
Scanning-Aminosäureanalyse kann ebenfalls verwendet werden, um eine oder mehrere Aminosäuren entlang einer zusammenhängenden Sequenz zu identifizieren. Unter den bevorzugten Scanning-Aminosäuren sind relativ kleine, neutrale Aminosäuren. Solche Aminosäuren umfassen Alanin, Glycin, Serin und Cystein. Alanin ist typischerweise eine bevorzugte Scanning-Aminosäure in dieser Gruppe, da sie die Seitenkette über den Beta-Kohlenstoff eliminiert und es weniger wahrscheinlich ist, dass sie die Hauptkettenkonformation der Variante ändert. Alanin wird typischerweise ebenfalls bevorzugt, weil sie die häufigste Aminosäure ist. Weitres ist sie häufig in beiden begrabenen und exponierten Positionen zu finden [Creighton, The Proteins, W. H. Freeman & Co., N.Y, Chothia, J. Mol. Biol. 150, 1 (1976)]. Wenn Alaninsubstitution keine adäquaten Mengen an Varianten erbringt, kann eine isoterische Aminosäure verwendet werden.
Modifikationen von PRO364
Kovalente Modifikationen von PRO364- oder PRO175-Polypeptiden sind im Schutzumfang dieser Erfindung enthalten. Eine Form von kovalenter Modifikation umfasst das Umsetzen von Aminosäureresten eines PRO364- oder PRO175-Polypeptids, auf das abgezielt wird, mit einem organischen Derivatisierungsmittel, das in der Lage ist, sich mit ausgewählten Seitenketten oder den N- oder C-terminalen Resten eines PRO364- oder PRO175-Polypeptids umzusetzen. Derivatisierung mit bifunktionalen Mitteln ist z. B. zur Vernetzung von PRO364 oder PRO175 mit einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder Oberfläche zur Verwendung im Verfahren zur Reinigung von Anti-PRO364- oder -PRO175-Antikörpern und umgekehrt nützlich. Häufig verwendete Vernetzer umfassen z. B. 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, z. B. Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester, einschließlich Disuccinimidylester wie z. B. 3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat), bifunktionale Maleinimide wie z. B. Bis-N-maleinimido-1,8-octan und Mittel wie z. B. Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidat.
Andere Modifikationen umfassen Deamidierung von Glutaminyl- und Asparaginylresten zu den entsprechenden Glutamyl- bzw. Aspartylresten, Hydroxylierung von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Hydroxygruppen von Seryl- oder Threonylresten, Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidin-Seitenketten [T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 79–86 (1983)], Acetylierung des N-terminalen Amins und Amidierung jeder beliebigen C-terminalen Carboxygruppe.
Eine andere Art kovalenter Modifikation des PRO364- oder PRO175-Polypeptids, dies in den Schutzumfang dieser Erfindung fällt, umfasst das Ändern des nativen Glykosylierungsmusters des Polypeptids. „Ändern des nativen Glykosylierungsmusters" bedeutet für die vorliegenden Zwecke die Deletion von einer oder mehreren Kohlenhydratgruppierungen, die in Nativsequenz-PRO364- oder -PRO175-Polypeptid zu finden sind, und/oder das Addieren einer oder mehrerer Glykosylierungsstellen, die im Nativsequenz-PRO364- oder -PRO175-Polypeptid nicht zu finden sind.
Das Hinzufügen von Glykosylierungsstellen zum PRO364- oder PRO175-Polypeptid kann durch Ändern der Aminosäuresequenz davon erfolgen. Die Änderung kann beispielsweise durch die Addition von oder die Substitution durch einen oder mehrere Serin- oder Threoninreste zum oder am Nativsequenz-PRO364- oder -PRO175-Polypeptid (für O-gebundene Glykosylierungsstellen) durchgeführt werden. Die PRO364- oder PRO175-Aminosäuresequenz kann gegebenenfalls durch Änderungen auf DNA-Niveau geändert werden, insbesondere durch Mutation der DNA, die für das PRO364- oder PRO175-Polypeptid kodiert, an präselektierten Basen, sodass Codons gebildet werden, die zu den erwünschten Aminosäuren translatieren.
Ein anderes Mittel zur Steigerung der Anzahl an Kohlenhydratgruppierungen am PRO364- oder PRO175-Polypeptid ist chemisches oder enzymatisches Binden von Glykosiden an das Polypeptid. Solche Verfahren werden auf dem Gebiet der Erfindung, z. B. in der WO 87/05330 , veröffentlicht am 11. September 1987, und in Aplin & Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 259–306 (1981), beschrieben.
Das Entfernen von Kohlenhydratgruppierungen, die am PRO364- oder PRO175-Polypeptid vorhanden sind, kann chemisch oder enzymatisch oder durch Mutationssubstitutionen von Codons, die für Aminosäurereste kodieren, die als Targets für Glykosylierung dienen, durchgeführt werden. Chemische Deglykosylierungsverfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und werden beispielsweise von Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259, 52 (1987), und von Edge et al., Anal. Biochem. 118, 131 (1981), beschrieben. Enzymatische Spaltung von Kohlenhydratgruppierungen an Polypeptiden kann durch die Verwendung einer Vielzahl an Endo- und Exo-Glykosidasen erreicht werden, wie von Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138, 350 (1987), beschrieben wird.
Eine andere Art von kovalenter Modifikation von PRO364 oder PRO175 umfasst das Binden des PRO364- oder PRO175-Polypeptids an eines einer Vielzahl nicht-proteinhältiger Polymere, z. B. Polyethylenglykol (PEG), Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylene, auf die Art und Weise, die in den US-Patenten Nr. 4.640.835 ; 4.496.689 ; 4.301.144 ; 4.670.417 ; 4.791.192 oder 4.179.337 beschrieben wird.
Die PRO364- oder PRO175-Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auch auf eine Weise modifiziert werden, dass Hybridmoleküle gebildet werden, die ein PRO364- oder PRO175-Polypeptid, fusioniert an ein anderes, heterologes Polypeptid oder eine andere, heterologe Aminosäuresequenz, umfasst. In einer Ausführungsform umfasst solch ein Hybridmolekül eine Fusion eines PRO364- oder PRO175-Polypeptids mit einem Markierungspolypeptid, das ein Epitop bereitstellt, an das sich ein Anti-Markierungs-Antikörper selektiv binden kann. Die Epitopmarkierung wird im Allgemeinen an den Amino- oder Carboxyterminus des PRO364- oder PRO175-Polypeptids platziert. Die Gegenwart solcher Epitop-markierten Formen eines PRO364- oder PRO175-Polypeptids kann unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Markierungs-Polypeptid nachgewiesen werden. Die Bereitstellung der Epitopmarkierung ermöglicht es somit auch, dass PRO364- oder PRO175-Polypeptid leicht mittels Affinitätsreinigung unter Verwendung eines Anti-Markierungs-Antikörpers oder eines anderen Typs von Affinitätsmatrize, die sich an die Epitopmarkierung bindet, gereinigt werden kann. In einer alternativen Ausführungsform kann das Hybridmolekül eine Fusion eines PRO364- oder PRO175-Polypeptids mit einem Immunglobulin oder einer speziellen Region eines Immunglobulins umfassen. Für eine bivalente Form des Hybridmoleküls kann eine solche Fusion an die Fc-Region eines IgG-Moleküls sein. Gegebenenfalls umfasst das Hybridmolekül eine PRO364- oder PRO175-ECD-Sequenz fusioniert an eine Fc-Region eines IgG-Moleküls.
Verschiedene Markierungspolypeptide und ihre jeweiligen Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Beispiele umfassen Poly-Histidin-(polty-his-) oder Pole-Histidin-Glycin-(poly-his-gly-)Markierungen; das flu-HA-Markierungspolypeptid und seinen Antikörper 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol. 8, 2159–2165 (1988)]; die c-myc-Markierung und die Antikörper 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 und 9E10 hierzu [Evas et al., Molecular and Cellular Biology 5, 3610–3616 (1985)]; und die Herpes-Simplex-Virus-Glykoprotein-D-(-gD-)Markierung und ihren Antikörper [Paborsky et al., Protein Engineering 3(6), 547–553 (1990)). Andere Markierungspolypeptide umfassen das Flag-Peptid [Hopp et al., BioTechnology 6, 1204–1210 (1988)]; das KT3-Epitoppeptid [Martin et al., Science 255, 192–194 (1992)]; ein α-Tubulinepitoppeptid [Skinner et al., J. Biol. Chem. 266, 15163–15166 (1991)]; und die T7-Gen-10-Proteinpeptidmarkierung [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6393–6397 (1990)].
Das PRO364- oder PRO175-Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann ebenfalls auf eine Art und Weise modifiziert werden, um ein Hybridmolekül zu bilden, das ein PRO364- oder PRO175-Polypeptid an einen Leucin-Zipper fusioniert umfasst. Verschiedene Leucin-Zipper-Polypeptide sind im Fachgebiet beschrieben worden. Siehe z. B. Landschulz et al., Science 240, 1759 (1988), WO 94/10308 , Hoppe et al., FEBS Letters 344, 1991 (1994), Maniatis et al., Nature 341, 24 (1989). Es wird davon ausgegangen, dass die Verwendung eines Leucin-Zippers, fusioniert an ein PRO364- oder PRO175-Polypeptid, wünschenswert sein kann, um zur Dimerisierung oder Trimerisierung von löslichem PRO364- oder PRO175-Polypeptid in Lösung beizutragen. Fachleute verstehen, dass der Leucin-Zipper entweder an das N- oder C-terminale Ende des PRO364- oder PRO175-Moleküls fusioniert sein kann.
Selektion und Transformation von Wirtszellen
Wirtszellen werden mit Expressions- oder Kloniervektoren, die hierin zur PRO364- oder PRO175-Produktion beschrieben werden, transfiziert oder transformiert und in herkömmlichem Nährmedium kultiviert, das zum Induzieren von Promotoren, zur Selektion von Transformanten oder Amplifikation der Gene, die für die erwünschten Sequenzen kodieren, geeignet modifiziert ist. Die Kulturbedingungen, wie z. B. Medium, Temperatur, pH und dergleichen, können von Fachleuten ohne übermäßiges Experimentieren ausgewählt werden. Im Allgemeinen können Prinzipien, Arbeitsvorschriften und praktische Techniken zur Maximierung der Produktivität von Zellkulturen in Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler (Hrsg.), IRL Press (1991), und in Sambrook et al., s. o., gefunden werden.
Verfahren zur Transfektion sind durchschnittlichen Fachleuten bekannt, z. B. CaPO₄-Behandlung und Elektroporation. Je nach verwendeten Wirtszellen erfolgt die Transformation unter Verwendung von Standardverfahren, die für die entsprechenden Zellen geeignet sind. Die Calciumbehandlung mittels Calciumchlorid, wie in Sambrook et al., s. o., beschrieben, oder Elektroporation wird im Allgemeinen für Prokaryoten oder andere Zellen verwendet, die wesentliche Zellwandbarrieren enthalten. Infektion mit Agrobacterium tumefaciens wird zur Transformation bestimmter Pflanzenzellen verwendet, wie Shaw et al., Gene 23, 315 (1983), und die WO 89/05859 , veröffentlicht am 29. Juni 1989, beschreiben. Für Säugetierzellen ohne solche Zellwände kann das Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren von Graham & van der Eb, Virology 52, 456–457 (1978), verwendet werden. Allgemeine Aspekte von Säugetierzellen-Wirtssystemtransformationen werden im US-Patent Nr. 4.399.216 beschrieben. Transformationen in Hefe werden typischerweise gemäß dem Verfahren von Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977), und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76, 3829 (1979), durchgeführt. Es können jedoch auch andere Verfahren zum Einführen von DNA in Zellen, wie beispielsweise Kernmikroinjektion, Elektroporation, bakterielle Protoplastenfusion mit intakten Zellen, oder Polykationen, z. B. Polybren, Polyornithin, verwendet werden. Für verschiedene Verfahren zur Transformation von Säugetierzellen siehe Keown et al., Methods in Enzymology 185, 527–537 (1990), und Mansour et al., Nature 336, 348–352 (1988).
Geeignete Wirtszellen zum Klonieren oder Exprimieren der DNA in die bzw. den Vektoren hierin schließen Prokaryoten-, Hefe- oder höhere Eukaryotenzellen ein. Geeignete Prokaryoten umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Eubakterien, wie z. B. gram-negative oder gram-positive Organismen, beispielsweise Enterobacteriaceae wie z. B. E. coli. Verschiedene E.-coli-Stämme sind öffentlich erhältlich, wie z. B. E.-coli-K12-Stamm MM294 (ATCC 31.446), E. coli X1776 (ATCC 31.537), E.-coli-Stamm W3110 (ATCC 27.325) und K5 772 (ATCC 53.635).
Zusätzlich zu Prokaryoten sind eukaryotische Mikroben wie beispielsweise Fadenpilze oder Hefe geeignete Klonier- oder Expressionswirte für PRO364- oder PRO175-kodierende Vektoren. Saccharomyces cerevisiae ist ein üblicherweise verwendeter, nieder-eukaryotischer Wirtsmikroorganismus.
Geeignete Wirtszellen für die Expression von Nucleinsäure, die für glykosyliertes PRO364 oder PRO175 kodiert, werden von multizellulären Organismen abgeleitet.
Beispiele für Wirbellosenzellen umfassen Insektenzellen wie z. B. Drosophila S2 und Spodoptera Sf9 sowie Pflanzenzellen. Beispiele für nützliche Säugetierwirtszelllinien umfassen Chinahamster-Eierstock-(CHO-) und COS-Zellen. Spezifischere Beispiele umfassen Affennieren-CV1-Linie, transformiert mit SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); menschliche embryonale Nierenlinie (293- oder 293-Zellen, subkloniert zum Wachstum in Suspensionskultur, Graham et al., J. Gen Virol. 36, 59 (1977)); Chinahamster-Eierstockzellen/-DHFR (CHO, Urlaub & Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)); Maus-Sertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243–251 (1980)); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); und Maus-Brusttumor (MMT 060562, ATCC CCL51). Es wird erachtet, dass die Auswahl der geeigneten Wirtszelle in den Bereich der Erfindung fällt.
Auswahl und Verwendung eines replizierbaren Vektors
Die Nucleinsäure (z. B. cDNA oder genomische DNA), die für PRO364 oder PRO175 kodiert, kann zum Klonieren (Amplifikation der DNA) oder zur Expression in einen replizierbaren Vektor insertiert werden. Verschiedene Vektoren sind öffentlich erhältlich. Der Vektor kann beispielsweise in Form eines Plasmids, Cosmids, viralen Partikels oder Phagen vorliegen. Die geeignete Nucleinsäuresequenz kann in den Vektor mittels zahlreicher verschiedener Verfahren insertiert werden. Im Allgemeinen wird DNA in (eine) geeignete Restriktionsendonucleasestelle(n) mittels auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Verfahren insertiert. Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen, sind jedoch nicht beschränkt auf, eine oder mehrere Signalsequenzen, wenn die Sequenz sekretiert werden soll, einen Replikationsursprung, ein oder mehrere Markergene, ein Enhancer-Element, einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz. Bei der Konstruktion geeigneter Vektoren, die eine oder mehrere dieser Komponenten enthalten, werden herkömmliche Ligationsverfahren eingesetzt, die Fachleuten bekannt sind.
Das PRO364 oder PRO175 kann rekombinant nicht nur direkt, sondern auch als ein Fusionspolypeptid mit einem heterologen Polypeptid hergestellt werden, das eine Signalsequenz oder ein anderes Polypeptid mit einer spezifischen Spaltungsstelle am N-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids sein kann. Im Allgemeinen kann die Signalsequenz eine Komponente des Vektors oder kann ein Teil der für PRO364 oder PRO175 kodierenden DNA sein, die in den Vektor insertiert wird. Die Signalsequenz kann eine prokaryotische Signalsequenz, ausgewählt beispielsweise aus der aus alkalischer Phosphatase, Penicillinase, Ipp oder wärmestabilen Enterotoxin-II-Leadern bestehenden Gruppe, sein. Zur Hefesekretion kann die Signalsequenz z. B. der Hefe-Invertaseleader, Alpha-Faktorleader (einschließlich Saccharomyces- und Kluyveromyces-α-Faktorleader, wobei Letzterer im US-Patent Nr. 5.010.182 beschrieben wird) oder saure Phosphataseleader, der C.-albicans-Glucoamylaseleader ( EP 362.179 , veröffentlicht am 4. April 1990) oder das in der WO 90/13646 , veröffentlicht am 15. November 1990, beschriebene Signal sein. Zur Säugetierzellexpression können Säugetiersignalsequenzen verwendet werden, um Sekretion des Proteins zu steuern, wie beispielsweise Signalsequenzen aus sekretierten Polypeptiden derselben oder einer verwandten Spezies sowie virale Sekretionsleader.
Sowohl Expressions- als auch Kloniervektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz, die es ermöglicht, dass sich der Vektor in einer oder mehreren der ausgewählten Wirtszellen repliziert. Solche Sequenzen sind für zahlreiche verschiedene Bakterien, Hefen und Viren bekannt. Der Replikationsursprung aus dem Plasmid pBR322 ist für die meisten gram-negativen Bakterien geeignet, der 2μ-Plasmidursprung ist für Hefe geeignet, und verschiedene virale Ursprünge (SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) sind für Kloniervektoren in Säugetierzellen nützlich.
Expressions- und Kloniervektoren enthalten typischerweise ein Selektionsgen, das auch als selektierbarer Marker bezeichnet wird. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, die (a) Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen Toxinen, z. B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin, verleihen, (b) auxotrophe Mängel beheben oder (c) essenzielle Nährstoffe, die aus komplexem Medium nicht erhältlich sind, z. B. das für D-Alaninracemase für Bacilli kodierende Gen, zuführen.
Ein Beispiel für geeignete selektierbare Marker für Säugetierzellen sind jene, die die Identifikation von Zellen ermöglichen, die in der Lage sind, die für PRO364 oder PRO175 kodierende Nucleinsäure aufzunehmen, wie z. B. DHFR oder Thymidinkinase. Eine geeignete Wirtszelle ist, sofern Wildtyp-DHFR verwendet wird, die CHO-Zelllinie, der DHFR-Aktivität fehlt und die wie von Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980), beschrieben hergestellt und vermehrt wird. Ein geeignetes Selektionsgen zur Verwendung in Hefe ist das trp1-Gen, das im Hefeplasmid YRp7 vorhanden ist [Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979), Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979), Tschemper et al., Gene 10, 157 (1980)]. Das trp1-Gen liefert einen Selektionsmarker für einen mutierten Hefestamm, dem die Fähigkeit fehlt, in Tryptophan zu wachsen, beispielsweise ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 [Jones, Genetics 85, 12 (1977)].
Expressions- und Kloniervektoren enthalten üblicherweise einen Promotor, der operabel an die für PRO364 oder PRO175 kodierende Nucleinsäuresequenz gebunden ist, um mRNA-Synthese zu steuern. Promotoren, die durch zahlreiche verschiedene potenzielle Wirtszellen erkannt werden, sind bekannt. Promotoren, die zur Verwendung mit prokaryotischen Wirten geeignet sind, umfassen die β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme [Chang et al., Nature 275, 615 (1978), Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)], alkalische Phosphatase, ein Tryptophan-(trp-)Promotorsystem [Goeddel, Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980), EP 36.776 ] und Hybridpromotoren wie z. B. den tac-Promotor [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21–25 (1983)]. Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen enthalten auch eine Shine-Dalgarno-(S. D.-)Sequenz, die operabel an die für PRO364 oder PRO175 kodierende DNA gebunden ist.
Beispiele für geeignete Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase [Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)] oder andere glykolytische Enzyme [Ness et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968), Holland, Biochemistry 17, 4900 (1978)], wie z. B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.
Andere Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren sind und den zusätzlichen Vorteil haben, dass ihre Transkription durch Wachstumsbedingungen gesteuert wird, sind die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, degradative Enzyme, die mit Stickstoffmetabolismus assoziiert sind, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase und Enzyme, die für Maltose- und Galactoseverwertung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei Hefeexpression werden näher in EP 73.657 beschrieben.
PRO364- oder PRO175-Nucleinsäure-Transkription aus Vektoren in Säugetier-Wirtszellen wird beispielsweise durch Promotoren, die aus den Genomen von Viren wie z. B. Polyomavirus, Geflügelpockenvirus ( UK 2.211.504 , veröffentlicht am 5. Juli 1989), Adenovirus (wie z. B. Adenovirus 2), Rinderpapillomavirus, Vogel-Sarkomvirus, Zytomegalie-Virus, einem Retrovirus, Hepatitis-B-Virus und Affenvirus 40 (SV40) gewonnen werden, durch heterologe Säugetierpromotoren, z. B. den Actinpromotor oder einen Immunglobulinpromotor, und durch Hitzeschock-Promotoren gesteuert, vorausgesetzt, solche Promotoren sind mit den Wirtszellsystemen kompatibel.
Transkription einer DNA, die für das PRO364 oder PRO175 kodiert, durch höhere Eukaryoten kann durch Insertieren einer Enhancersequenz in den Vektor gesteigert werden. Enhancer sind cis-wirkende Elemente von DNA, üblicherweise mit etwa 10 bis 300 bp, die auf einen Promotor so wirken, dass seine Transkription gesteigert wird. Zahlreiche Enhancersequenzen sind aus Säugetiergenen bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin). Typischerweise wird jedoch ein Enhancer aus einem eukaryotischen Zellvirus verwendet. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer an der späten Seite des Replikationsursprungs (bpp 100–270), den früher Zytomegalie-Virus-Promotorenhancer, den Polyoma-Enhancer an der späten Seite des Replikationsursprungs und Adenovirus-Enhancer. Der Enhancer kann in den Vektor an einer Position 5' oder 3' zur PRO364- oder PRO175-Kodiersequenz gespleißt werden, wird jedoch vorzugsweise an einer Stelle 5' vom Promotor angeordnet.
Expressionsvektoren, die in eukaryotischen Wirtszellen (Hefe-, Pilz-, Insekten-, Pflanzen-, Tier-, Mensch- oder kernhaltigen Zellen aus anderen multizellulären Organismen) verwendet werden, enthalten auch Sequenzen, die zum Abschluss von Transkription und zur Stabilisierung der mRNA erforderlich sind. Solche Sequenzen sind üblicherweise aus den untranslatierten 5'-, und gegebenenfalls 3'-, Regionen eukaryotischer oder viraler DNAs oder cDNAs erhältlich. Diese Regionen enthalten Nucleotidsegmente, die als polyadenylierte Fragmente im untranslatierten Abschnitt der für PRO364 oder PRO175 kodierenden mRNA transkribiert werden.
Weitere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die zur Adaption an die Synthese von PRO364 oder PRO175 in rekombinanter Wirbeltierzellkultur geeignet sind, sind in Gething et al., Nature 293, 620–625 (1981), Mantei et al., Nature 281, 40–46 (1979), EP 117.060 ; und EP 117.058 beschrieben.
Detektion von Genamplifikation/expression
Genamplifikation und/oder -expression kann basierend auf den hierin bereitgestellten Sequenzen in einer Probe direkt gemessen werden, z. B. durch herkömmliches Southern-Blotting, Northern-Blotting zur Quantifizierung der Transkription von mRNA [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201–5205 (1980)], Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder In-situ-Hybridisierung unter Verwendung einer geeigneten markierten Sonde, basierend auf den hierin bereitgestellten Sequenzen. Alternativ dazu können Antikörper verwendet werden, die spezifische Duplices, einschließlich DNA-Duplices, RNA-Duplices und DNA-RNA-Hybridduplices oder DNA-Protein-Duplices, erkennen. Die Antikörper wiederum können markiert sein, und der Test kann durchgeführt werden, wenn der Duplex an eine Oberfläche gebunden ist, sodass bei Bildung von Duplex an der Oberfläche die Gegenwart von Antikörper, der an den Duplex gebunden ist, nachgewiesen werden kann.
Genexpression kann alternativ dazu durch immunologische Verfahren, wie beispielsweise immunhistochemisches Färben von Zellen oder Gewebeschnitten und Tests von Zellkultur oder Körperflüssigkeiten, gemessen werden, um die Expression von Genprodukt direkt zu quantifizieren. Antikörper, die für immunhistochemisches Färben und/oder Testen von Probenflüssigkeiten nützlich sind, können entweder monoklonal oder polyklonal sein und können in jedem beliebigen Säugetier hergestellt werden. Auf einfache Weise können die Antikörper gegen ein Nativsequenz-PRO364- oder -PRO175-Polypeptid oder gegen ein synthetisches Peptid, basierend auf den hierin bereitgestellten DNA-Sequenzen, oder gegen exogene Sequenz, fusioniert an für PRO364 oder PRO175 und für ein spezifisches Antikörperepitop kodierende DNA, hergestellt werden.
Reinigung von Polypeptid
Formen von PRO364 oder PRO175 können aus Kulturmedium oder aus Wirtszelllysaten gewonnen werden. Sofern membrangebunden, kann es unter Verwendung einer geeigneten Tensidlösung (z. B. Triton-X^TM 100) oder durch enzymatische Spaltung aus der Membran freigesetzt werden. Zellen, die zur Expression von Nucleinsäure, die für PRO364 oder PRO175 kodiert, verwendet werden, können mittels verschiedener physikalischer oder chemischer Mittel, wie z. B. Gefrier-Auftau-Zyklieren, Beschallung, mechanischer Aufbruch oder Zelllysemittel, aufgeschlossen werden.
Es kann erwünscht sein, PRO364- oder PRO175-Polypeptid aus rekombinanten Zellproteinen oder Polypeptiden zu reinigen. Die folgenden Verfahren sind Beispiele für geeignete Reinigungsverfahren: Fraktionierung an einer Ionenaustauschsäule; Ethanolfällung; Umkehrphasen-HPLC; Chromatographie an Siliciumdioxid oder an einem Kationenaustauschharz wie z. B. DEAE; Chromatofokussierung; SDS-PAGE; Ammoniumsulfatfällung; Gelfiltration unter Verwendung von beispielsweise Sephadex G-75; Protein-A-Sepharose-Säulen zur Entfernung von Verunreinigungen wie IgG; und Metallchelator-Säulen zur Bindung von Epitop-markierten Formen des PRO364 oder PRO175. Verschiedene Verfahren von Proteinreinigung können verwendet werden, und solche Verfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und beispielsweise in Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990), Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982), beschrieben. Der/Die ausgewählte(n) Reinigungsschritt(e) hängt/hängen beispielsweise von der Beschaffenheit des verwendeten Herstellungsverfahrens und dem bestimmten hergestellten PRO364 oder RPO175 ab.
Verwendungen der PRO364- oder PRO175-Polypeptide
i. Tests auf kardiovaskuläre, endotheliale und angiogene Aktivität
Verschiedene Tests können verwendet werden, um das hierin angeführte Polypeptid auf kardiovaskuläre, endotheliale und angiogene Aktivität zu testen. Solche Tests umfassen die in den nachstehenden Beispielen angeführten.
Tests zum Testen auf Endothelin-Antagonisten-Aktivität, wie in US-Patent Nr. 5.773.414 offenbart, umfassen einen Ratten-Herzventrikelbindungstest, wo das Polypeptid auf seine Fähigkeit getestet wird, iodierte Endothelin-1-Bindung in einem Rezeptortest zu hemmen, einen Endothelin-Rezeptorbindungstest auf intakte Zellbindung von radiomarkiertem Endothelin-1 unter Verwendung von Nierenarterien-Gefäßzellen glatter Muskulatur von Kaninchen, einen Inositolphosphatakkumulierungstest, wo funktionale Aktivität in Rat-1-Zellen durch Messung von intrazellulären Werten zweiter Messenger bestimmt wird, einen Arachidonsäurefreisetzungstest, der die Fähigkeit von hinzugefügten Verbindungen misst, endothelinstimulierte Arachidonsäurefreisetzung in kultivierter glatter Muskulatur zu reduzieren, In-vitro-Studien (isoliertes Gefäß) unter Verwendung von Endothel aus männlichen Neuseeland-Kaninchen und In-vivo-Studien unter Verwendung von männlichen Sprague-Dawley-Ratten.
Tests auf Gewebsherstellungsaktivität umfassen unter anderem jene, die in WO 95/16035 (Knochen, Knorpel, Sehne), WO 95/05846 (Nerven, neuronal) und WO 91/07491 (Haut, Endothel) beschrieben sind.
Tests auf Wundheilungsaktivität umfassen z. B. jene, die in Winter, Epidermal Wound Healing, H. I. Maibach und D. T. Rovee, Hrsg., Year Book Medical Publishers, Inc., Chicago, 71–112, wie vom Artikel von Eaglestein und Mertz, J. Invest. Dermatol. 71, 382–384 (1987), modifiziert, beschrieben sind.
Ein Test zum Screenen auf ein Testmolekül, das auf ein PRO364- oder PRO175-Polypeptid hinweist, das ein Endothelin-B₁-(ETB₁-)Rezeptorpolypeptid bindet und Signaltransduktionsaktivität moduliert, umfasst die Bereitstellung einer Wirtszelle, die mit einer DNA transfomiert ist, die für Endothelin-B₁-Rezeptorpolypeptid kodiert, das Exponieren der Zellen gegenüber der Testverbindung und Messen der Endothelin-B₁-Rezeptorsignaltransduktionsaktivität wie z. B. in US-Patent Nr. 5.773.223 beschrieben.
Es gibt mehrere Herzhypertrophietests. In-vitro-Tests umfassen Induktion der Verbreitung von erwachsenen Rattenherzmyozyten. In diesem Test werden Ventrikelmyozyten aus einer einzelnen (männlichen Sprague-Dawley-)Ratte isoliert, im Wesentlichen nach einer Modifikation des im Detail von Piper et al., „Adult ventricular rat heart muscle cells" in Cell Culture Techniques in Heart and Vessel Research, H. M. Piper, Hrsg., Berlin, Springer-Verlag, 36–60 (1990), beschriebenen Verfahren isoliert. Dieses Verfahren ermöglicht die Isolation von erwachsenen Ventrikelmyozyten und die langfristige Kultur dieser Zellen im stangenförmigen Phänotyp. Es hat sich gezeigt, dass Phenylephrin und Prostglandin-F_2α(PGF_2α) eine Verbreitungsreaktion in diesen erwachsenen Zellen induzieren. Die Hemmung von Myozytenverbreitung, die durch PGF_2α- oder PGF_2α Analoga (z. B. Fluprostenol) und Phenylephrin induziert sind, durch verschiedene potenzielle Inhibitoren von Herzhypertrophie wird dann getestet.
Ein Beispiel für einen In-vivo-Test ist ein Test zur Hemmung von Herzhypertrophie; induziert durch Fluprostenil, in vivo. Dieses pharmakologische Modell testet die Fähigkeit von PRO364- oder PRO175-Polypeptid, Herzhypertrophie, die in Ratten (z. B. männliche Wistar- oder Sprague-Dawley-Ratten) durch subkutane Injektion von Fluprostenol (einem Agonistenanalogon von PGF_2α) induziert wird, zu hemmen. Es ist bekannt, dass Ratten mit pathologischer Herzhypertrophie, die durch Myokardin farkt induziert ist, chronisch erhöhte Spiegel von extrahierbarem PGF_2α in ihrem Myokard aufweisen. Lai et al., Am. J. Physiol. (Heart Circ. Physiol.) 271, H2197–H2208 (1996). Dementsprechend sind Faktoren, die die Wirkungen von Fluprostenol auf Myokardwachstum in vivo hemmen können, potenziell zur Behandlung von Herzhypertrophie nützlich. Die Wirkungen des PRO364- oder PRO175-Polypeptids auf Herzhypertrophie werden durch Messung des Gewichts von Herz, Ventrikel und linkem Ventrikel (durch Körpergewicht normalisiert) im Vergleich zu fluprostenolbehandelten Ratten bestimmt, die kein PRO364- oder PRO175-Polypeptid erhalten.
Ein anderes Beispiel für einen In-vivo-Test ist der Drucküberlastungsherzhypertrophietest. Zum In-vivo-Testen ist es üblich, Drucküberlastungsherzhypertrophie durch Konstriktion der abdominalen Aorta von Testtieren zu induzieren. In einer typischen Vorschrift werden Ratten (z. B. männliche Wistar- oder Sprague-Dawley-Ratten) unter Anästhesie behandelt, und die abdominale Aorta jeder Ratte wird knapp unter dem Diaphragma verengt. M. Beznak, Can. J. Biochem. Physiol. 33, 985–94 (1955). Die Aorta wird dann durch eine chirurgische Inzision exponiert, und eine abgestumpfte Nadel wird neben das Gefäß platziert. Die Aorta wird dann mit einer Ligatur von Seidenfaden um die Nadel geschnürt, die unmittelbar entfernt wird und das Lumen der Aorta auf den Durchmesser der Nadel reduziert. Dieser Ansatz ist z. B. in Rossi et al., Am. Heart J. 124, 700–709 (1992), und O'Rourke und Reibel, P. S. E. M. B. 200, 95–100 (1992), beschrieben.
In wieder einem anderen In-vivo-Test wurde die Wirkung auf Herzhypertrophie nach experimentell induziertem Myokardinfarkt (MI) gemessen. Akuter MI wird in Ratten durch Ligation der linken Kororararterie induziert und durch eine elektrokardiographische Untersuchung nachgewiesen. Eine scheinoperierte Gruppe von Tieren wird] auch als Kontrolltiere eingesetzt. Frühere Daten haben gezeigt, dass Herzhypertrophie in der Gruppe von Tieren mit MI gegenwärtig ist, wie durch einen 18%igen Anstieg des Herzgewicht-zu-Körpergewicht-Verhältnisses veranschaulicht wird. Lai et al., siehe oben. Behandlung dieser Tiere mit Kandidatenblockern von Herzhypertrophie, z. B. PRO364- oder PRO175-Polypeptid, stellt wertvolle Information über das therapeutische Potenzial der getesteten Kandidaten bereit. Ein weiterer solcher Test für die Induktion von Herzhypertrophie ist in US-Patent Nr. 5.773.415 unter Verwendung von Sprague-Dawley-Ratten offenbart.
Für Krebs ist eine Vielzahl von bekannten Tiermodellen verwendet worden, um die Rolle der hierin identifizierten Gene in der Entwicklung und Pathogenese von Tumoren zu verstehen und um die Wirksamkeit von therapeutischen Kandidatenmitteln, einschließlich Antikörpern und anderer Antagonisten der nativen PRO364- oder PRO175-Polypeptide, wie z. B. Antagonisten in Form kleiner Moleküle, zu testen. Das In-vivo-Wesen solcher Modelle macht diese insbesondere für Reaktionen bei menschlichen Patienten prognostisch: Tiermodelle von Tumoren und Krebs (z. B. Brustkrebs, Colonkrebs, Prostatakrebs, Lungenkrebs etc.) umfassen sowohl nicht-rekombinante als auch rekombinante (transgene) Tiere. Nicht-rekombinante Tiermodelle umfassen z. B. Nagetiermodelle, z. B. Mausmodelle. Solche Modelle können durch Einführung von Tumorzellen in syngenetische Mäuse unter Verwendung von Standardverfahren, z. B. subkutane Injektion, Schwanzveneninjektion, Milzimplantation, intraperitoneale Implantation, Implantation unter der Nierenkapsel oder Orthopinimplanation, z. B. von Colon-Krebszellen, die in Colongewebe implantiert werden, erzeugt werden. Siehe z. B. PCT-Veröffentlichung Nr. WO 97/33551 , veröffentlicht am 18. September 1997.
Die vermutlich am häufigsten verwendete Tierspezies in onkologischen Studien sind immundefiziente Mäuse und insbesondere Nacktmäuse. Die Beobachtung, dass die Nacktmaus mit Thymus-Hypoplasie/Aplasie erfolgreich als Wirt für menschliche Tumorxenotransplantate wirken kann, hat zu ihrer weit verbreiteten Verwendung für diesen Zweck geführt. Das autosomale rezessive nu-Gen ist in eine sehr große Zahl verschiedener kongener Stämme von Nacktmäusen eingeführt worden, einschließlich z. B. ASW, A/He, AKR, BALG/c, B10.LP, C17, C3H, C57BL, C57, CBA, DBA, DDD, I/st, NC, NFR, NFS, NFS/N, NZB, NZC, NZW, P, RIII und SJL. Zusätzlich dazu ist eine große Vielzahl an anderen Tieren mit vererbten immunologischen Defekten, die keine Nacktmäuse sind, gezüchtet und als Empfänger von Tumorxenotransplantaten verwendet worden. Fürweitere Details siehe z. B. The Nude Mouse in Oncology Research, E. Boven und B. Winograd, Hrsg., CRC Press Inc. (1991).
Die in solche Tiere eingeführten Zellen können von bekannten Tumor-/Krebszelllinien, wie z. B. einer beliebigen der oben angeführten Tumorzelllinien, abstammen und z. B. von der B104-1-1-Zelllinie (stabile NIH-3T3-Zelllinie, transfiziert mit Neu-Proto-Onkogen), ras-transfizierten NIH-3T3-Zellen, Caco-2 (ATCC HTB-37) oder einer mäßig gut differenzierten Grad-II-Zelllinie von menschlichem Colonkarzinom, HT-29 (ATCC HTB-38), oder aus Tumoren und Krebs abstammen. Proben von Tumor- oder Krebszellen können aus Patienten, die Chirurgie unterzogen werden, unter Verwendung von Standardbedingungen erhalten werden, die Gefrieren und Lagern in flüssigem Stickstoff umfassen. Karmali et al., Br. J. Cancer 48, 689–696 (1983).
Tumorzellen können durch eine Vielzahl von Verfahren in Tiere wie z. B. Nacktmäuse eingeführt werden. Der subkutane (s. c.) Raum in Mäusen ist für Tumorimplantation sehr geeignet. Tumoren können s. c. als feste Blöcke, als Nadelbiopsien durch die Verwendung eines Trokars oder als Zellsuspensionen transplantiert werden. Für Festblock- oder Trokarimplantation werden Tumorgewebsfragmente von geeigneter Größe in den s. c.-Raum eingeführt. Zellsuspensionen werden frisch aus primären Tumoren oder stabilen Tumorzelllinien hergestellt und subkutan injiziert. Tumorzellen können auch als subdermale Implantate injiziert werden. An dieser Stelle wird das Inokulum zwischen dem unteren Teil des Hautbindegewebes und des s. c.-Gewebes hinterlegt.
Tiermodelle von Brustkrebs können erzeugt werden z. B. durch Implantation von Ratten-Neuroblastom-Zellen (aus welchen anfänglich das neu-Onkogen isoliert wurde) oder neu-transformierte NIH-3T3-Zellen in Nacktmäuse, im Wesentlichen wie von Drebin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 9129–9133 (1986), beschrieben.
Ähnlich können Tiermodelle von Kolonkrebs bei Tieren, z. B. Nacktmäusen, durch Passagieren von Kolonkrebszellen erzeugt werden, was zum Auftreten von Tumoren in diesen Tieren führt. Ein orthotopes Transplantatmodell von menschlichem Colon-Krebs in Nacktmäusen ist beschrieben worden, z. B. von Wang et al., Cancer Research 54, 4726–4728 (1994), und Too et al., Cancer Research 55, 681–684 (1995).
Dieses Modell basiert auf dem so genannten METAMOUSE^TM, das von AntiCancer Inc. (San Diego, Kalifornien) verkauft wird.
Tumoren, die bei Tieren auftreten, können entfernt und in vitro kultiviert werden. Zellen aus den In-vitro-Kulturen können dann in Tiere passagiert werden. Solche Tumoren können als Targets für weiteres Testen oder Arzneimittelscreening dienen. Alternativ dazu können die Tumoren, die aus der Passage resultieren, isoliert werden und RNA aus vorpassagierten Zellen und Zellen, die nach einer oder mehreren Passage-Runden isoliert wurden, auf differentielle Expression von Genen von Interesse getestet werden. Solche Passage-Verfahren können mit beliebigen bekannten Tumor- oder Krebszelllinien durchgeführt werden.
Zum Beispiel sind Meth A, CMS4, CMS5, CMS21 und WEHI-164 chemisch induzierte Fibrosarkome von weiblichen BALB/c-Mäusen (DeLeo et al., J. Exp. Med. 146, 720 (1977)), die ein höchst kontrollierbares Modellsystem zum Studium der Anti-Tumoraktivitäten von verschiedenen Mitteln bereitstellen. Palladino et al., J. Immunol. 138, 4023–4032 (1987). Kurz gesagt pflanzen sich Tumorzellen in Zellkultur in vitro fort. Vor Injektion in die Tiere werden die Zelllinien gewaschen und in Puffer bei einer Zelldichte von etwa 10 × 10⁶ bis 10 × 10⁷ Zellen/ml supendiert. Die Tiere werden dann subkutan mit 10 bis 100 μl der Zellsuspension infiziert, worauf in ein bis drei Wochen ein Tumor auftritt.
Zusätzlich dazu kann das Lewis-Lungenkarinom (3LL) von Mäusen, das einer der am ausgiebigsten studierten Versuchstumoren ist, als Untersuchungs-Tumormodell verwendet werden. Wirksamkeit in diesem Tumormodell ist mit vorteilhaften Wirkungen in der Behandlung von menschlichen Patienten verbunden gewesen, bei denen kleinzelliges Lungenkarzinom (SCCL) diagnostiziert wurde. Dieser Tumor kann in normale Mäuse nach Injektion von Tumorfragmenten von einer betroffenen Maus oder von Zellen eingeführt werden, die in Kultur aufrechterhalten werden. Zupi et al., Br. J. Cancer 41, Suppl. 4, 30 (1980). Beweise zeigen, dass Tumoren aus Injektion von sogar einer einzelnen Zelle gestartet werden können und dass ein sehr hoher Anteil an infizierten Tumorzellen überlebt. Für weitere Informationen über diese Tumormodelle siehe Zacharski, Haemostasis 16, 300–320 (1986).
Eine Form zur Beurteilung der Wirksamkeit einer Testverbindung in einem Tumormodell mit einem implantierten Tumor ist es, die Größe des Tumors vor und nach Behandlung zu messen. Traditionellerweise ist die Größe der implantierten Tumoren mit einer Schublehre in zwei oder drei Dimensionen gemessen worden. Das Maß, das auf zwei Dimensionen beschränkt ist, reflektiert die Größe des Tumors nicht richtig. Deshab wird es üblicherweise in das entsprechende Volumen umgewandelt, indem eine mathematische Formel verwendet wird. Jedoch ist die Abmessung der Tumorgröße sehr ungenau. Die therapeutischen Wirkungen eines Arzneimittelkandidaten können besser als behandlungsinduzierte Wachstumsverzögerung und spezifische Wachstumsverzögerung beschrieben werden. Eine andere wichtige Variable in der Beschreibung von Tumorwachstum ist die Tumorvolumenverdopplungszeit. Computerprogramme zur Berechnung und Beschreibung von Tumorwachstum sind ebenfalls erhältlich, wie z. B. das Programm, von dem von Rygaard und Spang-Thomsen berichtet worden ist, Proc. 6th Int. Workshop an Immune-Deficient Animals, Wu und Sheng, Hrsg., Basel, 301 (1989). Es versteht sich jedoch, dass Nekrose und entzündliche Reaktionen nach Behandlung tatsächlich zu einem Anstieg der Tumorgröße führen, zumindest anfänglich. Deshalb müssen diese Veränderungen behutsam durch eine Kombination eines morphometrischen Verfahrens und durchflusszytometrischer Analyse überwacht werden.
Weiters können rekombinante (transgene) Tiermodelle erzeugt werden, indem der Kodierabschnitt der PRO364- oder PRO175-Gene, die hierin identifiziert sind, unter Verwendung von Standardverfahren zur Produktion von transgenen Tieren in das Genom von Tieren von Interesse eingeführt wird. Tiere, die als Target für transgene Manipulation dienen, umfassen unter anderem Mäuse, Ratten, Kaninchen, Meerschweinchen, Schafe, Ziegen, Schweine und nicht-menschliche Primaten, z. B. Paviane, Schimpansen und Affen. Verfahren, von denen im Fachgebiet bekannt ist, dass sie ein Transgen in solche Tiere einführen, umfassen Pronukleus-Mikroinjektion ( US-Patent Nr. 4.873.191 ), retrovirus-vermittelten Gentransfer in Keimbahnen (z. B. Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148–615 (1985)), Gen-Targeting in embryonale Stammzellen (Thompson et al., Cell 56, 313–321 (1989)), Elektroporation von Embryos (Lo, Mol. Cell Biol. 3, 1803–1814 (1983)) und keimvermittelten Gentransfer, Lavitrano et al., Cell 57, 717–73 (1989). Für einen Bericht siehe z. B. US-Patent Nr. 4.736.866 .
Zum Zwecke der vorliegenden Erfindung umfassen transgene Tiere jene Tiere, die das Transgen nur in einem Teil ihrer Zellen tragen („Mosaiktiere"). Das Transgen kann entweder als einzelnes Transgen oder in Concatameren, z. B. Kopf-zu-Kopf- oder Kopf-zu-Schwanz-Tandems, integriert werden. Selektive Einführung eines Transgens in einen besonderen Zelltyp ist beispielsweise auch durch folgendes Verfahren von Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6232–636 (1992), möglich.
Die Expression des Transgens in transgenen Tieren kann durch Standardverfahren überwacht werden. Zum Beispiel können Southern-Blot-Analyse oder PCR-Amplifikation verwendet werden, um die Integration des Transgens zu verifizieren. Der Grad der mRNA-Expression kann dann unter Verwendung von Verfahren wie In-situ-Hybridisierung, Northern-Blot-Analyse, PCR oder Immunzytochemie analysiert werden. Die Tiere werden weiters auf Zeichen für Tumor- oder Krebsentwicklung untersucht.
Alternativ dazu können „Knock-out"-Tiere konstruiert werden, die ein defektes oder verändertes, für hierin definiertes PRO364- oder PRO175-Polypeptid kodierendes Gen als ein Resultat homologer Rekombination zwischen dem endogenen, für PRO364 oder PRO175-Polypeptid kodierenden Gen und geänderter genomischer, für dasselbe Polypeptid kodierender DNA, eingeführt in eine embryonale Zelle des Tiers, aufweist. Beispielsweise kann für ein bestimmtes PRO364- oder PRO175-Polypeptid kodierende cDNA verwendet werden, um für das Polypeptid kodierende genomische DNA gemäß den bekannten Verfahren zu klonieren. Ein Abschnitt der genomischen, für PRO364- oder PRO175-Polypeptid kodierenden DNA kann deletiert oder durch ein anderes Gen ersetzt werden, wie beispielsweise durch ein Gen, das für einen selektierbaren Marker kodiert, der verwendet werden kann, um Integra tion zu überwachen. Typischerweise werden mehrere kb unveränderter flankierender DNA (sowohl an den 5'- als auch 3'-Enden) in den Vektor eingebunden [siehe z. B. Thomas & Capecchi, Cell 51, 503 (1987), für eine Beschreibung homologer Rekombinationsvektoren]. Der Vektor wird in eine embryonale Stammzellenlinie (z. B. durch Elektroporation) eingeführt, und Zellen, in denen sich die eingeführte DNA mit der endogenen DNA homolog rekombiniert hat, werden ausgewählt [siehe z. B. Li et al., Cell 69, 915 (1992)]. Die ausgewählten Zellen werden dann in eine Blastozyste eines Tiers (z. B. einer Maus oder Ratte) injiziert, um Aggregationschimären zu bilden [siehe z. B. Bradley, in: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson (Hrsg.) (IRL, Oxford, 1987), 113–152]. Ein Hybridembryo kann dann in ein geeignetes, scheinschwangeres weibliches Ammentier implantiert werden und der Embryo ausgetragen werden, um ein „Knock-out"-Tier zu schaffen. Nachkommenschaft, die die homolog rekombinierte DNA in ihren Keimzellen trägt, kann mittels Standardverfahren identifiziert werden und kann verwendet werden, um Tiere zu züchten, in denen alle Zellen des Tiers die homolog rekombinierte DNA enthalten. Knockout-Tiere können beispielsweise aufgrund ihrer Fähigkeit, Abwehr gegen bestimmte pathologische Leiden aufzubauen, sowie aufgrund ihrer Entwicklung pathologischer Leiden wegen des fehlenden PRO364- oder PRO175-Polypeptids charakterisiert werden.
Die Wirksamkeit von Antikörpern, die sich spezifisch an PRO364- oder PRO175-Polypeptide, die hierin identifiziert sind, und andere Arzneimittelkandidaten binden, können auch in der Behandlung von spontanen Tiertumoren getestet werden. Ein geeignetes Target für solche Studien ist das feline orale Plattenepithelkarzinom (SCC). Felines orales SCC ist ein höchst invasiver maligner Tumor, der die häufigste orale Malignität bei Katzen ist, die für über 60% der oralen Tumoren verantwortliche ist, von denen bei dieser Spezies berichtet wird. Es metastasiert selten an entfernten Stellen, obwohl diese geringe Inzidenz von Metastasen nur eine Reflektion der kurzen Überlebenszeiten für Katzen mit diesem Tumor sein kann. Diese Tumoren sind üblicherweise nicht der Chirurgie zugänglich, primär aufgrund der Anatomie der felinen oralen Kavität. Derzeit gibt es keine wirksame Behandlung dieses Tumors. Vor Eintritt in die Studie wird jede Katze vollständiger klinischer Untersuchung und Biop sie unterzogen und durch Computertomographie (CT) untersucht. Katzen, bei denen sublinguale orale Plattenepithelzelltumoren diagnostiziert werden, sind aus dieser Studie ausgenommen. Die Zunge kann als Folge eines solchen Tumors paralysiert sein, und sogar wenn die Behandlung den Tumor tötet, ist es möglich, dass die Tiere nicht in der Lage sind, selbst Nahrung aufzunehmen. Jede Katze wird wiederholt über einen längeren Zeitraum behandelt. Es werden Fotografien der Tumoren während des Behandlungszeitraums täglich und zu jeder nachfolgenden wiederholten Überprüfung aufgenommen. Nach Behandlung wird jede Katze einem weiteren CT-Scan unterzogen. CT-Scans und Thoraxradiogramme werden danach alle 8 Wochen beurteilt. Die Daten werden auf Unterschiede im Überleben, in der Reaktion und Toxizität im Vergleich mit Kontrollgruppen beurteilt. Positive Reaktion kann Nachweis von Tumorregression erfordern, vorzugsweise mit einer Verbesserung der Lebensqualität und/oder erhöhter Lebensdauer.
Zusätzlich dazu können auch spontane Tiertumoren, wie z. B. Fibrosarkom, Adenokarzinom, Lymphom, Chondrom oder Leiomyosarkom, von Hunden, Katzen und Pavianen getestet werden. Von diesen ist Brustadenokarzinom bei Hunden und Katzen ein bevorzugtes Modell, da sein Auftreten und Verhalten sehr ähnlich jenem von Menschen ist. Jedoch ist die Verwendung dieses Modells durch das seltene Auftreten dieser Form von Tumor bei Tieren eingeschränkt.
Andere fachbekannte kardiovaskuläre, endotheliale und angiogene In-vitro- und In-vivo-Tests sind hierin geeignet.
ii. Gewebsverteilung
Die Ergebnisse der kardiovaskulären, endothelialen und angiogenen Tests hierin können durch weitere Studien verifiziert werden, wie z. B. durch Bestimmung der mRNA-Expression in verschiedenen menschlichen Geweben.
Wie zuvor erwähnt kann Genamplifikation und/oder Genexpression in verschiedenen Geweben durch herkömmliches Southern-Blotting, Northern-Blotting, um die Trans kription von mRNA zu quantifizieren (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201–5205 (1980)), Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder In-situ-Hybridisierung unter Verwendung einer geeignet markierten Sonde, basierend auf den hierin bereitgestellten Sequenzen, gemessen werden. Alternativ dazu können die Antikörper verwendet werden, die spezifische Duplexe erkennen können, einschließlich DNA-Duplexe, RNA-Duplexe und DNA-RNA-Hybrid-Duplexe oder DNA-Protein-Duplexe.
Genexpression in verschiedenen Geweben kann alternativ dazu durch immunologische Verfahren getestet werden, wie z. B. immunhistochemisches Färben von Gewebsabschnitten und Test von Zellkultur oder Körperflüssigkeiten, um die Expression von Genprodukt direkt zu quantifizieren. Antikörper, die zur immunhistochemischen Färbung und/oder für Tests von Probenflüssigkeiten geeignet sind, können entweder monoklonal oder polyklonal sein und können in einem beliebigen Säugetier hergestellt werden. Auf herkömmliche Weise können die Antikörper gegen ein Nativsequenz-PRO364- oder -PRO175-Polypeptid oder gegen ein synthetisches Peptid basierend auf den hierin bereitgestellten DNA-Sequenzen oder gegen eine exogene Sequenz bereitgestellt werden, die an PRO364- oder PRO175-DNA fusioniert ist und für ein spezifisches Antikörperepitop kodiert. Allgemeine Verfahren zur Herstellung von Antikörpern und spezielle Protokolle für In-situ-Hybridisierung sind hierin nachstehend bereitgestellt.
iii. Antikörperbindungsstudien
Die Ergebnisse der kardiovaskulären, endothelialen und angiogenen Studie können weiters durch Antikörperbindungsstudien verifiziert werden, bei welchen die Fähigkeit von Anti-PRO364- oder -PRO175-Antikörpern, die Wirkung von PRO364- oder PRO175-Polypeptiden auf endothelialen Zellen oder anderen Zellen, die in den kardiovaskulären, endothelialen und angiogenen Tests verwendet werden, zu hemmen, getestet wird. Beispielhafte Antikörper umfassen polyklonale, monoklonale, humanisierte, bispezifische und Heterokonjugatantikörper, deren Herstellung nachstehend beschrieben ist.
Antikörperbindungsstudien können in einem beliebigen bekannten Testverfahren durchgeführt werden, wie z. B. kompetitiven Bindungstests, direkten und indirekten Sandwichtests und Immunpräzipitationstests. Zola, Monoclonal Antibodies, A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., 147–158 (1987).
Kompetitive Bindungstests basieren auf der Fähigkeit eines markierten Standards, mit dem Testprobenanalyten um die Bindung mit einer beschränkten Menge von Antikörpern zu konkurrieren. Die Menge von Targetprotein in der Testprobe ist umgekehrt proportional zur Menge des Standards, der an die Antikörper gebunden wird. Um die Bestimmung der Menge von Standard zu erleichtern, der gebunden wird, sind die Antikörper vorzugsweise vor oder nach der Konkurrenz unlöslich, sodass der Standard und Analyt, die an die Antikörper gebunden sind, auf einfache Weise vom Standard und Analysten getrennt werden können, die ungebunden bleiben.
Sandwich-Tests umfassen die Verwendung von zwei Antikörpern, wobei jeder in der Lage ist, sich an einen anderen immunogenen Abschnitt oder ein anderes immunogene Epitop des zu detektierenden Proteins zu binden. In einem Sandwichtest ist der Testprobenanalyt durch einen ersten Antikörper gebunden, der an einem festen Träger immobilisiert ist, und danach bindet ein zweiter Antikörper an den Analyt, wodurch ein unlöslicher dreiteiliger Komplex gebildet wird. Siehe z. B. US-Patent Nr. 4.376.110 . Der zweite Antikörper kann selbst mit einer detektierbaren Gruppierung markiert sein (direkter Sandwichtest) oder kann unter Verwendung eines Anti-Immunglobulin-Antikörpers gemessen werden, der mit einer detektierbaren Gruppierung (indirektem Sandwich-Test) markiert ist. Zum Beispiel ist eine Form von Sandwichtest ein ELISA-Test, in diesem Fall ist die detektierbare Gruppierung ein Enzym.
Für Immunhistochemie kann die Gewebsprobe frisch oder gefroren sein oder in Paraffin eingebettet sein und mit einem Konservierungsmittel, wie z. B. Formalin, fixiert sein.
iv. Zellbasierte Tumortests
Zellbasierte Tests und Tiermodelle für kardiovaskuläre, endotheliale und angiogene Erkrankungen, wie z. B. Tumoren, können verwendet werden, um die Ergebnisse eines hierin beschriebenen kardiovaskulären, endothelialen und angiogenen Tests zu verifizieren und die Beziehung zwischen den hierin identifizierten Genen und der Entwicklung und Pathogenese von unerwünschtem kardiovaskulärem, endothelialem und angiogenem Zellwachstum weiter zu verstehen. Die Rolle von Genprodukten, die hierin identifiziert sind, in der Entwicklung und Pathologie von unerwünschtem kardiovaskulärem, endothelialem, angiogenem Zellwachstum, z. B. Tumorzellen, kann unter Verwendung von Zellen oder Zelllinien getestet werden, die identifiziert wurden, dass sie durch das hierin beschriebene PRO364- oder PRO175-Polypeptid stimuliert oder gehemmt werden. Solche Zellen umfassen z. B. jene, die in den nachstehenden Beispielen dargelegt sind.
In einem anderen Ansatz werden Zellen eines Zelltyps, von denen bekannt ist, dass sie in eine besondere kardiovaskuläre, endotheliale und angiogene Erkrankung involviert sind, mit den hierin beschriebenen cDNAs transfiziert, und die Fähigkeit dieser cDNAs, exzessives Wachstum zu induzieren oder Wachstum zu hemmen, wird analysiert. Wenn die kardiovaskuläre, endotheliale und angiogene Erkrankung Krebs ist, umfassen geeignete Tumorzellen z. B. stabile Tumorzelllinien wie z. B. B104-1-1-Zelllinie (stabile N1H-3T3-Zelllinie, mit dem neu-Proto-Onkogen transfiziert) und rastransfizierte NIH-3T3-Zellen, die mit dem gewünschten Gen transfiziert werden können und für Tumorwachstum überwacht werden können. Solche transfizierten Zelllinien können dann verwendet werden, um die Fähigkeit von polty- oder monoklonalen Antikörpern oder Antikörperzusammensetzungen zu testen, tumorigenes Zellwachsturn durch Ausübung zytostatischer oder zytotoxischer Aktivität auf das Wachstum von transformierten Zellen oder durch Vermittlung von antikörperabhängiger Zellzytotoxizität (ADCC) zu hemmen. Zellen, die mit den Kodiersequenzen der hierin identifizierten Gene transfiziert sind, können weiters verwendet werden, um Arzneimittelkandidaten zur Behandlung von kardiovaskulären, endothelialen und angiogenen Erkrankungen, wie z. B. Krebs, zu identifizieren.
Zusätzlich dazu können primäre Kulturen, die von Tumoren in transgenen Tieren (wie oben beschrieben) abstammen, in zellbasierten Tests hierin verwendet werden, obwohl stabile Zelllinien bevorzugt sind. Verfahren zur Ableitung von kontinuierlichen Zelllinien aus transgenen Tieren sind fachbekannt. Siehe z. B. Small et al., Mol. Cell. Biol. 5, 642–648 (1985).
v. Gentherapie
Das PRO364- oder PRO175-Polypeptid hierin und Polypeptidylagonisten und -Antagonisten können durch Expression solcher Polypeptide in vivo verwendet werden, was oft als Gentherapie bezeichnet wird.
Es gibt zwei Hauptansätze, um die Nucleinsäure (gegebenenfalls in einem Vektor enthalten) in die Patientenzellen zu bringen: in vivo und ex vivo. Für In-vivo-Zufuhr wird die Nucleinsäure direkt in den Patienten injiziert, üblicherweise an den Stellen, wo PRO364- oder PRO175-Polypeptid erforderlich ist, d. h. die Stelle der Synthese des PRO364- oder PRO175-Polypeptids, wenn bekannt, und die Stelle (z. B. Wunde), wo biologische Aktivität von PRO364- oder PRO175-Polypeptid notwendig ist. Für Ex-vivo-Behandlung werden die Patientenzellen entfernt, die Nucleinsäure in diese isolierten Zellen eingeführt und die modifizierten Zellen dem Patienten entweder direkt oder z. B. eingekapselt in poröse Membranen verabreicht, die in den Patienten transplantiert werden (siehe z. B. US-Patent Nr. 4.892.538 und 5.283.187 ).
Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, die zur Einführung von Nucleinsäuren in lebensfähige Zellen erhältlich sind. Die Verfahren variieren abhängig davon, ob die Nucleinsäure in vitro in kultivierte Zellen transferiert wird oder in vivo in die Zellen des beabsichtigen Wirts transferiert wird. Geeignete Verfahren zum Transfer von Nucleinsäure in Säugetierzellen in vitro umfassen die Verwendung von Liposomen, Elektroporation, Mikroinjektion, Transfektion, Zellfusion, DEAE-Dextran, das Calciumphosphatfällungsverfahren etc. Transduktion umfasst die Assoziation eines replikationsdefekten, rekombinanten viralen (vorzugsweise retroviralen) Teilchens mit einem Zellrezeptor, gefolgt von der Einführung der Nucleinsäuren, die in dem Teilchen enthalten sind, in die Zelle. Ein häufig verwendeter Vektor für Ex-vivo-Zufuhr des Gens ist ein Retrovirus.
Die zur Zeit bevorzugten In-vivo-Nucleinsäuretransferverfahren umfassen Transfektion über virale oder nicht-virale Vektoren (wie z. B. Adenovirus, Lentivirus, Herpessimplex-I-Virus oder adenoassoziiertes Virus (AAV)) und lipidbasierte Systeme (nützliche Lipide für lipid-vermittelten Transfer des Gens sind z. B. DOTMA, DOPE und DC-Chol, siehe z. B. Tonkinson et al., Cancer Investigation 14(1), 54–65 (1996)). Die bevorzugteten Vektoren zur Verwendung in Gentherapie sind Viren, am bevorzugtesten Adenoviren, AAV, Lentiviren oder Retroviren. Ein Virusvektor wie z. B. ein retroviraler Vektor umfasst zumindest einen Transkriptionspromotor/Enhancer oder lokusdefinierende/s Element(e) oder andere Elemente, die Genexpression durch andere Mittel, wie z. B. alternierendes Spleißen, Kern-RNA-Export oder Posttranslationsmodifikation von Messenger, kontrollieren. Zusätzlich dazu umfasst ein Virusvektor, wie z. B. ein retroviraler Vektor, ein Nucleinsäuremolekül, das, wenn es in Gegenwart eines Gens transkribiert wird, das für PRO364- oder PRO175-Polypeptid kodiert, operabel daran gebunden ist und als Translationsinitiationssequenz wirkt. Solche Vektorkonstrukte umfassen auch ein Verpackungssignal, lange terminale Wiederholungen (LTRs) oder Abschnitte davon und Positiv- und Negativstrang-Primerbindungsstellen, die für das Virus geeignet sind, das verwendet wird (wenn diese nicht schon im Virusvektor gegenwärtig sind). Zusätzlich dazu umfasst ein solcher Vektor typischerweise eine Signalsequenz zur Sekretion des PRO364- oder PRO175-Polypeptids aus einer Wirtszelle, in welche es platziert wird. Vorzugsweise ist die Signalsequenz für diesen Zweck eine Säugetiersignalsequenz, am bevorzugtesten die native Signalsequenz für PRO364- oder PRO175-Polypeptid. Gegebenenfalls kann das Vektorkonstrukt auch ein Signal, das Polyadenylierung steuert, sowie eine oder mehrere Restriktionsstellen und eine Translationsterminationssequenz umfassen. Beispielsweise umfassen solche Vektoren typischerweise eine 5'-LTR, eine tRNA-Bindungsstelle, ein Verpackungssignal, einen Ursprung einer Zweitstrang-DNA-Synthese und eine 3'-LTR oder einen Abschnitt davon. Andere Vektoren, die verwendet werden können, sind nicht-viral, wie z. B. kationische Lipide, Polylysine und Dendrimere.
In manchen Situationen ist es wünschenswert, die Nucleinsäurequelle mit einem Mittel bereitzustellen, das auf die Targetzellen gerichtet ist, wie beispielsweise mit einem Antikörper, der für ein Zelloberflächenmembranprotein oder für die Targetzelle spezifisch ist, mit einem Liganden für einen Rezeptor auf der Targetzelle usw. Werden Liposomen verwendet, so können Proteine, die sich an ein mit Endozytose assoziiertes Zelloberflächenmembranprotein binden, zum Targeting und/oder zur Erleichterung der Aufnahme verwendet werden, z. B. Capsidproteine oder Fragmente davon, die für einen bestimmten Zelltyp tropisch sind, Antikörper für Proteine, die beim Zyklieren Internalisierung erfahren, oder Proteine, die auf intrazelluläre Lokalisierung gerichtet sind und intrazelluläre Halbwertszeit verlängern. Das Verfahren der rezeptorvermittelten Endozytose wird beispielsweise von Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429–4432 (1987), und von Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410–3414 (1990), beschrieben. Ein Überblick zu Genmarkierungs- und Gentherapie-Arbeitsvorschriften wird in Anderson et al., Science 256, 808–813 (1992), geliefert. Siehe auch WO 93/25673 und die dort zitierten Verweise.
Geeignete Gentherapie und Verfahren zur Herstellung von retroviralen Teilchen und strukturellen Proteinen sind z. B. in US-Patent Nr. 5.681.746 beschrieben.
vi. Verwendung von Gen als diagnostisches Mittel
Diese Erfindung betrifft auch die Verwendung des Gens, das für das PRO364- oder PRO175-Polypeptid kodiert, als diagnostisches Mittel. Detektion einer mutierten Form des PRO364- oder PRO175-Polypeptids ermöglicht eine Diagnose einer kardiovaskulären, endothelialen und angiogenen Erkrankung oder einer Empfindlichkeit für eine kardiovaskuläre, endotheliale und angiogene Erkrankung, wie z. B. einen Tumor, da Mutationen im PRO364- oder PRO175-Polypeptid Tumoren verursachen können.
Individuen, die Mutationen in den Genen tragen, die für menschliches PRO364- oder menschliches PRO175-Polypeptid kodieren, können auf DNA-Ebene durch eine Vielzahl von Verfahren detektiert werden. Nucleinsäuren zur Diagnose können aus einer Patientenzelle erhalten werden, wie z. B. Blut, Urin, Speichel, Gewebsbiopsie und Autopsiematerial. Die genomische DNA kann direkt zur Detektion verwendet werden oder vor Analyse enzymatisch unter Verwendung von PCR amplifiziert werden (Saiki et al., Nature 324, 163–166 (1986)). RNA oder cDNA kann auch für denselben Zweck verwendet werden. Als Beispiel können PCR-Primer, die zur Nucleinsäure komplementär sind, die für PRO364- der PRO175-Polypeptid kodieren, verwendet werden, um die PRO364- oder PRO175-Polypeptidmutationen zu identifizieren. Zum Beispiel können Deletionen und Insertionen durch eine Veränderung der Größe des amplifizierten Produkts im Vergleich zum normalen Genotyp detektiert werden. Punktmutationen können durch Hybridisierung von amplifizierter DNA an radiomarkierte RNA identifiziert werden, die für PRO364- oder PRO175-Polypeptid kodiert, oder alternativ dazu radiomarkierte Antisense-DNA-Sequenzen, die für das PRO364- oder PRO175-Polypeptid kodieren. Perfekt gepaarte Sequenzen können von fehlgepaarten Duplexen durch RNAse-A-Verdau oder durch Unterschiede in Schmelztemperaturen unterschieden werden.
Genetisches Testen basierend auf DNA-Sequenzunterschieden kann durch Detektion oder Änderung der elektrophoretischen Mobilität von DNA-Fragmenten in Gelen mit oder ohne Denaturierungsmitteln erreicht werden. Kleine Sequenzdeletionen und -insertionen können durch Hochresolutionsgelektrophorese visualisiert werden. DNA-Fragmente verschiedener Sequenzen können auf denaturierenden Formamidin-Gradientengelen unterschieden werden, in welchen die Mobilitäten von verschiedenen DNA-Fragmenten an verschiedenen Positionen gemäß ihrer besonderen Schmelz- oder partiellen Schmelztemperaturen in Gel retardiert werden. Siehe z. B. Myers et al., Science 230, 1242 (1985).
Sequenzveränderungen an spezifischen Stellen können auch durch Nuclease-Protease-Tests enthüllt werden, wie z. B. RNAse- und S1-Schutz und/oder das chemische Spaltverfahren, z. B. Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 4397–4401 (1985).
Daher kann die Detektion einer spezifischen DNA-Sequenz durch Verfahren, wie z. B. Hybridisierung, RNase-Schutz, chemische Spaltung, direkte DNA-Sequenzierung oder die Verwendung von Restriktionsenzymen, z. B. Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) und Southern-Blotting von genomischer DNA, erreicht werden.
vii. Verwendung zur Detektion von PRO364- oder PRO175-Polypeptidspiegeln
Zusätzlich zur herkömmlichen Gelelektrophorese und DNA-Sequenzierung können Mutationen auch durch In-situ-Analyse detektiert werden.
Expression von Nucleinsäure, die für PRO364- oder PRO175-Polypeptid kodiert, kann mit Gefäßerkrankung oder Neovaskularisierung verbunden sein, die mit Tumorbildung assoziiert ist. Wenn das PRO364- oder PRO175-Polypeptid eine Signalsequenz aufweist und die mRNA in Endothelzellen höchst exprimiert wird und in einem geringeren Grad in Zellen glatter Muskulatur, zeigt dies, dass das PRO364- oder PRO175-Polypeptid in Serum vorliegt. Dementsprechend kann ein Anti-PRO364- oder -PRO175-Polypeptidantikörper verwendet werden, um Gefäßerkrankung oder Neovaskularisierung zu diagnostizieren, die mit Tumorbildung assoziiert ist, da ein geändertes Ausmaß dieses PRO364- oder PRO175-Polypeptids solche Erkrankungen anzeigt.
Ein Konkurrenztest kann verwendet werden, worin Antikörper, die für das PRO364- oder PRO175-Polypeptid spezifisch sind, an einen festen Träger angeheftet werden, und ein markiertes PRO364- oder PRO175-Polypeptid und eine Probe, die von dem Wirt stammt, werden über den festen Träger geführt, und das Ausmaß der detektierten Markierung, die an den festen Träger angeheftet ist, kann mit einer Menge von PRO364- oder PRO175-Polypeptid in der Probe in Verbindung gebracht werden.
viii. Chromosomenkartierung
Die Sequenzen der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls für Chromosomenidentifikation wertvoll. Die Sequenz ist spezifisch auf eine spezielle Stelle auf einem indivi duellen menschlichen Chromosom ausgerichtet und kann damit hybridisieren. Weiters gibt es derzeit Bedarf an der Identifikation von speziellen Stellen auf dem Chromosom. Wenige Chromosomenmarkierungsreagenzien, basierend auf den tatsächlichen Sequenzdaten (Wiederholungspolymorphsimen), sind derzeit für die Markierung von Chromosomenstellen erhältlich. Die Kartierung von DNAs mit Chromosomen gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein wichtiger erster Schritt in der Korrelation jener Sequenzen mit Genen, die mit der Erkrankung assoziiert sind.
Kurz gesagt, Sequenzen können an Chromosomen kartiert werden, indem PCR-Primer (vorzugsweise 15–25 bp) aus der cDNA hergestellt werden. Computeranalyse für die nicht-translatierte 3'-Region wird verwendet, um rasch Primer auszuwählen, die sich über. nicht mehr als ein Exon in der genomischen DNA erstrecken, wodurch das Amplifikationsverfahren kompliziert wird. Diese Primer werden dann zum PCR-Screening von somatischen Zellhybriden verwendet, die individuelle menschliche Chromosomen enthalten. Nur jene Hybride, die das menschliche Gen enthalten, das dem Primer entspricht, erbringen ein amplifiziertes Fragment.
PCR-Kartierung von Somazellhybriden ist ein rasches Verfahren zum Zuordnen einer besonderen DNA zu einem speziellen Chromosom. Unter Verwendung der vorliegenden Erfindung mit denselben Oligonucleotidprimern kann Sublokalisierung mit Tafeln von Fragmenten aus spezifischen Chromosomen oder Pools von großen genomischen Klonen auf analoge Art erreicht werden. Andere Kartierungsstrategien, die auf ähnliche Weise verwendet werden können, um ihr Chromosom zu kartieren, umfassen In-situ-Hybridisierung, Präscreening mit markierten durchfluss-sortierten Chromosomen und Präselektion durch Hybridisierung, um chromosomenspezifische cDNA-Bibliotheken herzustellen.
Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FSH) eines cDNA-Klons zu einer Methaphasen-Chromosomenverbreitung kann verwendet werden, um eine präzise Chromosomenstelle in einem Schritt bereitzustellen. Dieses Verfahren kann mit cDNA verwendet werden, die 500 oder 600 Basen kurz ist, jedoch weisen Klone von mehr als 2.000 bp eine größere Wahrscheinlichkeit auf, sich an eine einzigartige Chromosomenstel le mit ausreichender Signalintensität für einfache Detektion zu binden. FISH erfordert die Verwendung von Klonen, von welchen das Gen, das für PRO364- oder PRO175-Polypeptid kodiert, abgeleitet wurde, und je länger desto besser. Zum Beispel sind 2.000 bp gut, 4.000 bp besser und mehr als 4.000 bp wahrscheinlich nicht notwendig, um in einem vernünftigen Prozentsatz der Zeit gute Ergebnisse zu erhalten. Für einen Bericht über dieses Verfahren siehe Verna et al., Human Chromosome, A Manual of Basic Techniques, Pegramin Press, New York (1988).
Sobald eine Sequenz an eine präzise Chromosomenstelle kartiert worden ist, kann die physikalische Position der Sequenz auf dem Chromosom mit Daten einer genetischen Karte in Verbindung gebracht werden. Solche Daten sind z. B. in V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (online erhältlich über Johns Hopkins University Welch Medical Library), zu finden. Die Beziehung zwischen Genen und Erkrankungen, die auf derselben Chromosomenregion kartiert worden sind, wird dann durch Bindungsanalyse kartiert (Co-Vererbung von physisch angrenzenden Genen).
Weiters ist es notwendig, die Unterschiede in der cDNA oder genomischen Sequenz zwischen betroffenen und nicht-betroffenen Individuen festzustellen. Wenn eine Mutation bei einigen oder allen betroffenen Individuen zu beobachten ist, aber nicht bei normalen Individuen, verursacht die Mutation wahrscheinlich die Erkrankung.
Mit derzeitiger Auflösung von physikalischen Kartierungs- und genetischen Katierungsverfahren kann eine cDNA, die auf einer Chromosomenregion exakt lokalisiert werden kann, die mit der Erkrankung assoziiert ist, eines zwischen 50 und 500 potenziell verursachenden Genen sein. (Dies geht von 1-Megabasen-Kartierungsauflösung und einem Gen pro 20 kb aus.)
ix. Screeningtests für Arzneimittelkandidaten
Diese Erfindung umfasst Verfahren zum Screenen von Verbindungen, um jene zu identifizieren, die das PRO364- oder PRO175-Polypeptid nachahmen (Agonisten) oder die Wirkung des PRO364- oder PRO175-Polypeptids unterbinden (Antagonis ten). Screeningtests für Antagonisten-Arzneimittelkandidaten sind entworfen worden, um Verbindungen zu identifizieren, die sich an die PRO364- oder PRO175-Polypeptide, für die die hierin identifizierten Gene kodieren, binden oder mit ihnen Komplexe bilden oder die sonst die Wechselwirkung der kodierten Polypeptide mit anderen Zellproteinen stören. Solche Screeningtests umfassen Tests, die für Hochdurchsatzscreening von chemischen Bibliotheken zugänglich sind, wodurch sie sich besonders gut zur Identifikation niedermolekularer Arzneimittelkandidaten eignen.
Die Tests können in zahlreichen verschiedenen Formaten durchgeführt werden, einschließlich Protein-Protein-Bindungstests, biochemischer Screeningtests, Immuntests und zellbasierter Tests, die auf dem Gebiet der Erfindung eingehend beschrieben sind. Alle Tests für Antagonisten gleichen sich darin, dass sie das Kontaktieren des Arzneimittelkandidaten mit einem PRO364- oder PRO175-Polypeptid, für das eine hierin identifizierte Nucleinsäure kodiert, unter Bedingungen und eine ausreichende Zeit lang erfordern, um diese zwei Komponenten in Wechselwirkung zu setzen.
Bei Bindungstests manifestiert sich die Wechselwirkung in Form einer Bindung, und der gebildete Komplex kann im Reaktionsgemisch isoliert oder nachgewiesen werden. In einer bestimmten Ausführungsform wird das durch das hierin identifizierte Gen kodierte PRO364- oder PRO175-Polypeptid oder der Arzneimittelkandidat an einer festen Phase, z. B. einer Mikrotiterplatte, durch kovalente oder nicht-kovalente Bindungen immobilisiert. Nicht-kovalente Bindung erfolgt im Allgemeinen durch Beschichten der festen Oberfläche mit einer Lösung des PRO364- oder PRO175-Polypeptids und Trocknen. Alternativ dazu kann ein immobilisierter Antikörper, z. B. ein monoklonaler Antikörper, der für das zu immobilisierende PRO364- oder PRO175-Polypeptid spezifisch ist, verwendet werden, um es an einer festen Oberfläche zu verankern. Der Test wird durch Zusetzen der nicht-immobilisierten Komponente, die mit einer nachweisbaren Markierung markiert sein kann, zur immobilisierten Komponente, z. B. der beschichteten Oberfläche, die die verankerte Komponente aufweist, durchgeführt. Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, werden die nicht umgesetzten Komponenten z. B. durch Waschen entfernt, und die an der festen Oberfläche verankerten Komplexe werden nachgewiesen. Trägt die ursprünglich nicht- immobilisierte Komponente eine nachweisbare Markierung, so weist die Detektion von an der Oberfläche immobilisierter Markierung darauf hin, dass Komplexbildung stattgefunden hatte. Trägt die ursprünglich nicht-immobilisierte Komponente keine Markierung, kann Komplexbildung beispielsweise durch Verwendung eines markierten Antikörpers, der den immobilisierten Komplex spezifisch bindet, nachgewiesen werden.
Zeigt die Kandidatenverbindung mit einem bestimmten PRO364- oder PRO175-Polypeptid, für das das hierin identifizierte Gen kodiert, Wechselwirkung, bindet sich jedoch nicht daran, so kann ihre Wechselwirkung mit diesem Polypeptid mittels zur Detektion von Protein-Protein-Wechselwirkungen bekannter Verfahren getestet werden. Solche Tests umfassen herkömmliche Ansätze, wie z. B. Vernetzung, Co-Immunfällung und Co-Reinigung mittels Gradienten oder chromatographischer Säulen. Darüber hinaus können Protein-Protein-Wechselwirkungen unter Verwendung eines auf Hefe basierenden genetischen Systems beobachtet werden, das von Fields & Mitarbeitern (Fields & Song, Nature (London) 340, 245–246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578–9582 (1991)), beschrieben wurde, wie von Chevray & Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789–5793 (1991), offenbart. Zahlreiche Transkriptionsaktivatoren, wie z. B. Hefe GAL4, bestehen aus zwei physikalisch getrennten modularen Domänen, wobei die eine als die DNA-Bindungsdomäne und die andere als die Transkriptions-Aktivierungsdomäne agiert. Das in den obigen Veröffentlichungen beschriebene Hefeexpressionssystem (im Allgemeinen als das „Zweihybridsystem" bezeichnet) profitiert von dieser Eigenschaft und verwendet zwei Hybridproteine, eines, in dem das Targetprotein an die DNA-Bindungsdomäne von GAL4 fusioniert ist, und ein zweites, in dem Kandidaten-Aktivierungsproteine an die Aktivierungsdomäne fusioniert sind. Die Expression von einem GAL1-lacZ-Reportergen unter der Kontrolle eines GAL4-aktivierten Promotors hängt von der Wiederherstellung von GAL4-Aktivität über Protein-Protein-Wechselwirkung ab. Kolonien, die wechselwirkende Polypeptide enthalten, werden mit einem chromogenen Substrat für β-Galactosidase nachgewiesen. Ein vollständiges Set (MATCHMAKER^TM) zur Identifikation von Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen zwei spezifischen Proteinen unter Verwendung des Zweihybridverfahrens ist im Handel bei Clontech erhältlich. Dieses System kann auch ausgedehnt werden, um Proteindomänen zu kartieren, die in spezifische Protein-Wechselwirkungen involviert sind, sowie Aminosäurereste, die für diese Wechselwirkungen maßgeblich sind, genau zu lokalisieren.
Verbindungen, die die Wechselwirkung eines Gens, das für ein hierin identifiziertes PRO364- oder PRO175-Polypeptid kodiert, und anderer intra- oder extrazellulärer Komponenten stören, können wie folgt getestet werden: üblicherweise wird ein Reaktionsgemisch hergestellt, das das Produkt des Gens und die intra- oder extrazelluläre Komponente enthält, und zwar unter solchen Bedingungen und über eine bestimmte Zeitspanne hinweg, die Wechselwirkung und Bindung der zwei Produkte ermöglicht. Um die Fähigkeit einer Kandidatenverbindung zu testen, Bindung zu hemmen, wird die Reaktion in Abwesenheit und in Gegenwart der Testverbindung durchgeführt. Weiters kann ein Placebo zu einem dritten Reaktionsgemisch zugesetzt werden, das als positive Kontrolle dient. Die Bindung (Komplexbildung) zwischen der Testverbindung und der intra- oder extrazellulären Komponente, die im Gemisch vorhanden sind, wird wie zuvor beschrieben beobachtet. Die Bildung eines Komplexes in der/den Kontrollreaktion(en), jedoch nicht im Reaktionsgemisch, das die Testverbindung enthält, weist darauf hin, dass die Testverbindung die Wechselwirkung der Testverbindung und ihres Reaktionspartners stört.
Wenn das PRO364- oder PRO175-Polypeptid die Fähigkeit hat, die Proliferation von Endothelzellen in Gegenwart von Co-Mitogen ConA zu stimulieren, profitiert ein Beispiel für ein Screeningverfahren von dieser Fähigkeit. Insbesondere im Proliferationstest werden menschliche Nabelschnurvenen-Endothelzellen erhalten und in 96-Well-Flachboden-Kulturplatten (Costar, Cambridge, MA) kultiviert und mit einem Reaktionsgemisch ergänzt, das dazu geeignet ist, die Proliferation von Zellen zu erleichtern, wobei das Gemisch Con-A (Calbiochem, La Jolla, CA) enthält. Con-A und die zu screenende Verbindung werden hinzugefügt, und nach Inkubation bei 37°C werden die Kulturen mit ^3–H-Thymidin pulsiert und auf Glasfaserfiltern geerntet (phD; Cambridge Technology, Watertown, MA). Mittlere ³(H)-Thymidininkorporation (cpm) von Triplikatkulturen wird unter Verwendung eines Flüssigszintillationszählers be stimmt (Beckman Instruments, Irvine, CA). Signifikante ³(H)-Thymidininkorporation gibt die Stimulation von Endothelzellproliferation an.
Um auf Antagonisten zu testen, wird der oben beschriebene Test durchgeführt, jedoch wird in diesem Test das PRO364- oder PRO175-Polypeptid gemeinsam mit der zu screenenden Verbindung zugesetzt, und die Fähigkeit der Verbindung, ³(H)-Thymidininkorporation in Gegenwart des PRO364- oder PRO175-Polypeptids zu hemmen, weist darauf hin, dass die Verbindung ein Antagonist gegenüber dem PRO364- oder PRO175-Polypeptid ist. Alternativ dazu können Antagonisten durch Kombinieren des PRO364- oder PRO175-Polypeptids und eines potenziellen Antagonisten mit membrangebundenen PRO364- oder PRO175-Polypeptidrezeptoren oder rekombinanten Rezeptoren unter für einen Konkurrenzhemmungstest geeigneten Bedingungen nachgewiesen werden. Das PRO364- oder PRO175-Polypeptid kann markiert sein, beispielsweise durch Radioaktivität, sodass die Anzahl an PRO364- oder PRO175-Polypeptidmolekülen, die an den Rezeptor gebunden sind, verwendet werden kann, um die Wirksamkeit des potenziellen Antagonisten zu bestimmen. Das für den Rezeptor kodierende Gen kann durch zahlreiche verschiedene Verfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, beispielsweise durch Liganden-Panning und FACS-Sortieren, identifiziert werden. Coligan et al., Current Protocols in Immun. 1(2), Kapitel 5 (1991). Vorzugsweise wird Expressionsklonieren verwendet, wobei polyadenylierte RNA aus einer Zelle hergestellt wird, die auf ein PRO364- oder PRO175-Polypeptid reagiert, und eine cDNA-Bibliothek, die aus dieser RNA hergestellt wird, in Pools aufgeteilt und verwendet wird, um COS-Zellen oder andere Zellen zu transfizieren, die auf das PRO364- oder PRO175-Polypeptid nicht reagieren. Transfizierte Zellen, die auf Glasobjektträgern gezüchtet werden, werden markiertem PRO364- oder PRO175-Polypeptid ausgesetzt. Das PRO364- oder PRO175-Polypeptid kann durch zahlreiche verschiedene Mittel markiert sein, einschließlich Iodierung oder Einschluss einer Erkennungsstelle für eine ortsspezifische Proteinkinase. Nach Fixierung und Inkubation werden die Objektträger autoradiographischer Analyse unterzogen. Positive Pools werden identifiziert, und Sub-Pools werden unter Verwendung eines interaktiven Sub-Pooling- und Re-Screening-Verfahrens hergestellt und neu transfiziert, was schließlich einen einzelnen Klon ergibt, der für den mutmaßlichen Rezeptor kodiert.
Als ein alternativer Ansatz für Rezeptoridentifikation kann markiertes PRO364- oder RPO175-Polypeptid mittels Photoaffinität mit Zellmembran- oder mit Extraktpräparaten, die das Rezeptormolekül exprimieren, verbunden werden. Vernetztes Material wird durch PAGE aufgelöst, und ein Röntgenfilm wird damit belichtet. Der markierte Komplex, der den Rezeptor enthält, kann ausgeschnitten, in Peptidfragmente aufgelöst und Protein-Mikrosequenzieren unterzogen werden. Die mittels Mikrosequenzierens gewonnene Aminosäuresequenz würde dann verwendet werden, um eine Reihe von degenerierten Oligonucleotid-Sonden zu entwerfen, um eine cDNA-Bibliothek zu screenen und hierdurch das für den mutmaßlichen Rezeptor kodierende Gen zu identifizieren.
In einem anderen Test für Antagonisten werden Säugetierzellen oder ein Membranpräparat, das den Rezeptor exprimiert, mit markiertem PRO364- oder PRO175-Polypeptid in Gegenwart der Kandidatenverbindung inkubiert. Die Fähigkeit der Verbindung, diese Wechselwirkung zu fördern oder zu blockieren, kann dann gemessen werden.
Die Zusammensetzungen, die in der Behandlung von kardiovaskulären, endothelialen und angiogenen Erkrankungen nützlich sind, umfassen unter anderem Antikörper, kleine organische und anorganische Moleküle, Peptide, Phosphopeptide, Antisense- und Ribozymmoleküle, Tripelhelixmoleküle etc., die die Expression und/oder Aktivität des Targetgenprodukts hemmen.
Spezifischere Beispiele für potenzielle Antagonisten umfassen ein Oligonucleotid, das sich an die Fusionen von Immunglobulin mit PRO364- oder PRO175-Polypeptid bindet, und insbesondere Antikörper einschließlich, ohne dadurch eine Einschränkung darzustellen, poly- und monoklonaler Antikörper und Antikörperfragmente, einkettiger Antikörper, anti-idiotypischer Antikörper und chimärer oder humanisierter Versionen solcher Antikörper oder Fragmente sowie menschlicher Antikörper und Antikörperfragmente. Alternativ dazu kann ein potentieller Antagonist ein nahe verwandtes Protein, beispielsweise eine mutierte Form des PRO364- oder PRO175-Polypeptids, das den Rezeptor erkennt, jedoch keine Wirkung verleiht, sein und dabei die Wirkung des PRO364- oder PRO175-Polypeptids kompetitiv hemmen.
Ein anderer potenzieller PRO364- oder PRO175-Polypeptidantagonist ist ein Antisense-RNA- oder -DNA-Konstrukt, hergestellt unter Verwendung von Antisense-Technologie, worin z. B. ein Antisense-RNA- oder -DNA-Molekül so wirkt, dass es die Translation von mRNA durch Hybridisieren an Target-mRNA und Unterbinden von Proteintranslation blockiert. Antisense-Technologie kann verwendet werden, um Genexpression durch Tripelhelix-Bildung oder durch Antisense-DNA oder -RNA zu steuern, wobei beide Verfahren auf Bindung eines Polynucleotids an DNA oder RNA basieren. Beispielsweise wird der 5'-Kodierabschnitt der Polynucleotidsequenz, die für die reifen PRO364- oder PRO175-Polypeptide hierin kodiert, verwendet, um ein Antisense-RNA-Oligonucleotid mit einer Länge von etwa 10 bis 40 Basenpaaren zu entwerfen. Ein DNA-Oligonucleotid wird so entworfen, dass es komplementär zu einer Region des Gens ist, das in Transkription eingebunden ist (Tripelhelix – siehe Lee et al., Nucl. Acids Res. 6, 3073 (1979); Cooney et al., Science 241, 456 (1988); Dervan et al., Science 251, 1360 (1991)), wodurch Transkription und die Produktion des PRO364- oder PRO175-Polypeptids unterbunden werden. Das Antisense-RNA-Oligonucleotid hybridisiert an die mRNA in vivo und blockiert Translation des mRNA-Moleküls zum PRO364- oder PRO175-Polypeptid (Antisense – Okano, Neurochem. 56, 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)). Die zuvor beschriebenen Oligonucleotide können auch Zellen zugeführt werden, sodass die Antisense-RNA oder -DNA in vivo exprimiert werden kann, um Produktion des PRO364- oder PRO175-Polypeptids zu hemmen. Wird Antisense-DNA verwendet, so werden Oligodesoxyribonucleotide, die von der Translationsstartstelle, z. B. zwischen den Positionen von etwa –10 und +10 der Targetgen-Nucleotidsequenz, abstammen, bevorzugt.
Potenzielle Antagonisten umfassen kleine Moleküle, die sich an die aktive Stelle, die Rezeptorbindungsstelle oder den Wachstumsfaktor oder eine andere relevante Bin dungsstelle des PRO364- oder PRO175-Polypeptids binden, wodurch die normale biologische Aktivität des PRO364- oder PRO175-Polypeptids blockiert wird. Beispiele für kleine Moleküle umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, kleine Peptide oder peptidähnliche Moleküle, vorzugsweise lösliche Peptide, und synthetische, organische oder anorganische Nichtpeptidyl-Verbindungen.
Ribozyme sind enzymatische RNA-Moleküle, die in der Lage sind, die spezifische Spaltung von RNA zu katalysieren. Ribozyme wirken durch sequenzspezifische Hybridisierung an die komplementäre Target-RNA, gefolgt von endonucleolytischer Spaltung. Spezifische Ribozym-Spaltungsstellen innerhalb eines potenziellen RNA-Targets können durch bekannte Verfahren identifiziert werden. Für nähere Details siehe z. B. Rossi, Current Biology 5, 469–471 (1994), und die PCT-Veröffentlichung Nr. WO 97/33551 (veröffentlicht am 18. September 1997).
Nucleinsäuremoleküle in Tripelhelix-Anordnung, die verwendet werden, um Transkription zu hemmen, sollten einzelsträngig und aus Desoxynucleotiden zusammengesetzt sein. Die Basenzusammensetzung dieser Oligonucleotide ist so bestimmt, dass sie Tripelhelix-Anordnung gemäß den Hoogsteen-Basenpaarungsregeln fördert, die im Allgemeinen relativ große Abschnitte mit Purinen oder Pyrimidinen an einem Strang eines Duplex erfordern. Für nähere Details siehe z. B. die PCT-Veröffentlichung Nr. WO 97/33551 , s. o.
Diese kleinen Moleküle können durch einen oder mehrere der Screeningtests, die hierin erläutert werden, und/oder durch irgendein anderes Screeningverfahren, das Fachleuten bekannt ist, identifiziert werden.
x. Formen zu behandelnder kardiovaskulärer, endothelialer und angiogener Erkrankungen
Das PRO364- oder PRO175-Polypeptid oder Agonisten oder Antagonisten dazu, die in den hierin beschriebenen kardiovaskulären, angiogenen und endothelialen Tests Aktivität zeigen und/oder deren Genprodukt auf dem kardiovaskulären System lokali siert war, zeigen wahrscheinlich therapeutische Anwendungen in einer Vielzahl von kardiovaskulären, endothelialen und angiogenen Ekrankungen, einschließlich systemischer Erkrankungen, die Gefäße betreffen, wie z. B. Diabetes mellitus. Ihre therapeutische Nützlichkeit kann Erkrankungen der Arterien, Kapillaren, Venen und/oder Lymphgefäße umfassen. Beispiele für Behandlungen, die darunter fallen, umfassen die Behandlung von Muskelatrophie, Osteoporose, Unterstützung der Implantatfixierung, um das Wachstum von Zellen um das Implantat zu stimulieren und deshalb ihre Anheftung an die beabsichtigte Stelle zu erleichtern, die Verbesserung der IGF-Stabilität in Geweben oder in Serum, wenn anwendbar, und Erhöhung der Bindung an den IGF-Rezeptor (da sich gezeigt hat, dass IGF das Wachstum menschlicher Mark-Erythrozyten- und Granulozyten-Vorläuferzellen in vitro steigert).
Das PRO364- oder PRO175-Polypeptid oder Agonisten oder Antagonisten dazu können auch verwendet werden, um Erythropoese oder Granulopoese zu stimulieren, um Wundheilung oder Gewebsregeneration und assoziierte Therapien zu stimulieren, die sich mit erneutem Gewebswachstum, wie z. B. Bindegewebe, Haut, Knochen, Knorpel, Muskel, Lunge oder Niere, befassen, um Angiogenese zu fördern, um Migration von Endothelzellen zu stimulieren oder zu hemmen und um das Wachstum von Gefäßglattmuskel und Endothelzellproduktion zu proliferieren. Der Anstieg der Angiogenese, die durch PRO364- oder PRO175-Polypeptid oder -Antagonist vermittelt wird, kann für ischämische Gewebe und kollaterale Koronarentwicklung im Herz nach Koronarstenose von Vorteil sein. Antagonisten werden verwendet, um die Wirkung solcher Polypeptide zu hemmen, z. B. um die Produktion von übermäßigem Bindegewebe während Wundheilung oder Lungenfibrose einzuschränken, wenn das PRO364- oder PRO175-Polypeptid eine solche Produktion fördert. Dies umfasst die Behandlung von akutem Myokardinfarkt und Herzinsuffizienz.
Weiters betrifft die vorliegende Erfindung die Behandlung von Herzhypertrophie, unabhängig von der zugrunde liegenden Ursache, durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Dosis von PRO364- oder PRO175-Polypeptid. Wenn das Ziel die Behandlung von menschlichen Patienten ist, ist das PRO364- oder PRO175-Polypeptid vorzugsweise rekombinantes menschliches PRO364- oder PRO175- Polypeptid (rhPRO364- oder rhPRO175-Polypeptid). Die Behandlung von Herzhypertrophie kann in jedem beliebigen ihrer verschiedenen Stadien durchgeführt werden, die aus einer Vielzahl von verschiedenen pathologischen Leiden resultieren können, einschießlich Myokardinfarkt, Hypertonie, hypertrophischer Kardiomyopathie und Klappeninsuffizienz. Die Behandlung erstreckt sich über alle Stufen des Fortschreitens von Herzhypertrophie mit oder ohne strukturelle Schädigung des Herzmuskels, unabhängig von der zugrunde liegenden Herzerkrankung.
Die Entscheidung, ob das Molekül selbst oder ein Agonist davon für eine bestimmte Indikation eingesetzt werden soll, im Gegensatz zu einem Antagonisten zum Molekül, hängt hauptsächlich davon ab, ob das Molekül hierin Kardiovaskularisierung, Genese von Endothelzellen oder Angiogenese fördert oder diese Leiden hemmt. Zum Beispiel, wenn das Molekül Angiogenese fördert, ist ein Antagonist davon zur Behandlung von Erkrankungen nützlich, wo es wünschenswert ist, Angiogenese einzuschränken oder zu vermeiden. Beispiele für solche Erkrankungen umfassen Gefäßtumoren, wie z. B. Hämangiom, Tumorangiogenese, Neovaskularisierung in der Retina, der Choroidea oder Hornhaut in Zusammenhang mit diabetischer Retinopathie oder Retinopathia praematurorum oder Makuladegeneration und proliferativer Vitreoretinopathie, rheumatoide Arthritis, Crohn-Erkrankung, Atherosklerose, Ovarialhyperstimulation, Psoriasis, Endometriose in Verbindung mit Neovaskularisierung, Restenose nach Angiogenese unter Verwendung von Ballonkathetern, Überproduktion von Narbengewebe, die z. B. bei Keloid zu beobachten ist, das sich nach Chirurgie bildet, Fibrose nach Myokardinfarkt oder fibrotische Läsionen in Verbindung mit Lungenfibrose.
Wenn jedoch das Molekül Angiogenese hemmt, wird erwartet, dass es direkt zur Behandlung der obigen Leiden verwendet wird.
Wenn das Molekül Angiogenese stimuliert, wäre es andererseits selbst (oder ein Agonist davon) für Indikationen nützlich, wo Angiogenese wünschenswert ist, wie z. B. periphere Gefäßerkrankung, Hypertonie, entzündliche Vaskulitis, Reynaud-Erkrankung und Reynaud-Phänomen, Aneurysmen, arterielle Restenose, Thrombophlebitis, Lymphangitis, Lymphödem, Wundheilung und Gewebsreparatur, Ischämie-Reperfusions-Verletzung, Angina, Myokardinfarkte, wie z. B. akute Myokardinfarkte, chronische Herzerkrankungen, Herzinsuffizienz, wie z. B. CHF, und Osteoporose.
Wenn jedoch das Molekül Angiogenese hemmt, würde ein Antagonist davon zur Behandlung jener Leiden verwendet werden, wo Angiogenese erwünscht ist.
Spezifische Formen von Erkrankungen sind nachstehend beschrieben, wo sich das PRO364- oder PRO175-Polypeptid hierin oder Antagonisten davon als nützlich für gefäßverwandtes Arzneimitteltargeting oder als therapeutische Targets für die Behandlung oder Prävention der Erkrankungen dienen kann. Atherosklerose ist eine Ekrankung, die durch Akkumulation von Plaques von Intimaverdickung in Arterien gekennzeichnet ist, aufgrund von Akkumulation von Lipiden, Proliferation von Zellen glatter Muskulatur und Bildung von fibrösem Gewebe innerhalb der Arterienwand. Die Erkrankung kann große, mittlere und kleine Arterien in einem beliebigen Organ betreffen. Von Veränderungen der Funktion von Zellen glatter Muskulatur im Endothel und Gefäß ist bekannt, dass sie eine wichtige Rolle in der Modulation der Akkumulation und Regression dieser Plaques spielen.
Hypertonie ist durch erhöhten Gefäßdruck in systemischen arteriellen, Lungenarterien- oder Pfortadersystemen gekennzeichnet. Erhöhter Druck kann aus geschädigter Endothelfunktion und/oder Gefäßerkrankung resultieren oder dazu führen.
Entzündliche Vaskulitis umfasst Riesenzellarteriitis, Takayasu-Krankheit, Polyarteriitis nodosa (einschließlich mikroangiopathischer Formen), Kawasaki-Erkrankung, mikroskopischer Polyangiitis, Wegener-Granulomatose und einer Vielzahl von infektiös verwandten Gefäßerkrankungen (einschließlich Purpura Schoenlein-Henoch). Geänderte Endotheizellfunktion hat sich bei diesen Erkrankungen als wichtig erwiesen.
Reynaud-Erkrankung und Reynaud-Phänomen sind durch intermittierende abnorme Schädigung des Kreislaufs durch die Extremitäten bei Exposition gegenüber Kälte gekennzeichnet. Geänderte Endothelzellfunktion hat sich bei dieser Erkrankung als wichtig erwiesen.
Aneurysmen sind Sackdilatationen oder spindelförmige Dilatationen des arteriellen oder venösen Baums, die mit geänderter Endothelzellen und/oder Zellen glatter Gefäßmuskulatur verbunden sind.
Arterielle Restenose (Restenose der Arterienwand) kann nach Angioplastie als Folge der Änderung der Funktion und Proliferation von Endothelzellen und/oder Zellen glatter Gefäßmuskulatur auftreten.
Thrombophlebitis und Lymphangitis sind entzündliche Erkrankungen von Venen bzw. Lymphgefäßen, die aus geänderter Endothelzellfunktion resultieren und/oder dazu führen können. Auf ähnliche Weise ist Lymphödem ein Leiden, das geschädigte Lymphgefäße umfasst, die aus Endothelzellfunktion resultieren.
Die Familie gutartiger und bösartiger Gefäßtumoren ist durch abnorme Proliferation und Wachstum von Zellelementen des Gefäßsystems gekennzeichnet. Zum Beispiel sind Lymphangiome gutartige Tumoren des Lymphgefäßes, die angeborene, oft zystische, Fehlbildungen der Lymphgefäße sind, die üblicherweise bei Neugeborenen auftreten. Zystische Tumoren tendieren dazu, im angrenzenden Gewebe zu wachsen. Zystische Tumoren treten üblicherweise in der Cervix- und Achselregion auf. Sie können auch im Weichteilgewebe von Extremitäten auftreten. Die Hauptsymptome sind erweiterte, manchmal retikuläre, strukturierte Lymphgefäße und Lymphozysten, die von Bindegewebe umgeben sind. Lymphangiome sollen durch ungenau verbundene embryonale Lymphgefäße oder ihre Defizienz verursacht sein. Das Ergebnis wird durch lokale Lymphdrainage gestört. Griener et al., Lymphology 4, 140–144 (1971).
Eine andere Verwendung für die hierin beschriebenen PRO364- oder PRO175-Polypeptide oder Antagonisten dazu ist die Prävention von Tumorangiogenese, die die Vaskularisierung eines Tumors umfasst, um ihm zu ermöglichen, zu wachsen und/oder zu metastasieren. Dieses Verfahren hängt vom Wachstum neuer Blutgefäße ab. Beispiele für Neoplasmen und verwandte Leiden, die Tumorangiogenese umfassen, umfassen Brustkarzinome, Lungenkarzinome, Magenkarzinome, Speiseröhrenkarzinome, kolorektale Karzinome, Leberkarzinome, Ovarialkarzinome, Thekazelltumoren, Arrhenoblastome, Zervixkarzinome, Endometriumkarzinom, Endometriumhyperplasie, Endometriose, Fibrosarkome, Chorionkarzinome, Kopf- und Nackenkrebs, Nasopharyngealkarzinom, Larynxkarzinom, Hepatoblastom, Kaposi-Sarkom, Melanom, Hautkarzinome, Hämangiom, kavernöses Hämangiom, Hämangioblastom, Pankreaskarzinome, Retinoblastome, Astrozytome, Glioblastom, Schwannom, Oligodendrogliom, Medulloblastom, Neuroblastome, Rhabdomyosarkom, Osteosarkom, Leiomyosarkome, Harnwegskarzinome, Schilddrüsenkarzinome, Wilms-Tumor, Nierenzellkarzinom, Prostatakarzinom, abnorme Gefäßproliferation assoziiert mit Phakomatosen, Odem (wie z. B. in Verbindung mit Gehirntumoren) und Meigs-Syndrom.
Altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist eine führende Ursache von schwerwiegendem Verlust des Augenlichts bei älteren Menschen. Die exsudative Form von AMD ist durch chorioidale Neovaskularisation und Retinapigment-Epithelzellenablösung gekennzeichnet. Da chorioidale Neovaskularisation mit einer dramatischen Verschlechterung der Prognose verbunden ist, wird erwartet, dass die PRO364- oder PRO175-Polypeptide oder Antagonisten dazu in der Reduktion der Schwere von AMD nützlich sind.
Heilung von Trauma, wie z. B. Wundheilung und Gewebsreparatur, ist auch ein Verwendungsbereich von PRO364- oder PRO175-Polypeptiden hierin oder ihrer Antagonisten, auf den abgezielt wird. Bildung und Regression neuer Blutgefäße ist für Gewebsheilung und -reparatur wesentlich. Diese Kategorie umfasst Knochen-, Knorpel-, Sehnen-, Band- und/oder Nervengewebswachstum oder -regeneration sowie Wundheilung und Gewebsreparatur und -ersatz und in der Behandlung von Verbrennungen, Inzisionen und Geschwüren. Ein PRO364- oder PRO175-Polypeptid oder Antagonist davon, der Knorpel- und/oder Knochenwachstum unter Umständen, unter welchen Knochen normalerweise gebildet werden, induziert, findet Anwendung in der Heilung von Knochenfrakturen und Knorpelschäden oder -defekten bei Menschen und anderen Tieren. Ein solches Präparat, das ein PRO364- oder PRO175-Polypeptid oder einen Antagonisten davon verwendet, kann prophylaktische Anwendung in der Reduktion von geschlossenen und offenen Frakturen und in der verbesserten Fixierung von künstlichen Gelenken finden. De-novo-Knochenbildung, die durch ein knochenbildendes Mittel induziert wird, trägt zur Reparatur von angeborenen, traumainduzierten oder onkologischen, resektionsinduzierten kraniofazialen Defekten bei und ist auch in kosmetischer plastischer Chirurgie nützlich.
PRO364- oder PRO175-Polypeptid oder Antagonisten dazu können nützlich sein, um eine bessere oder schnellere Schließung von nicht-heilenden Wunden zu fördern, einschließlich unter anderem Druckulkus, Ulkus assoziiert mit Gefäßinsuffizienz, chirurgischer und traumatischer Wunden und dergleichen.
Es wird davon ausgegangen, dass ein PRO364- oder PRO175-Polypeptid oder ein Antagonist davon auch Aktivität für die Herstellung oder Regeneration von anderen Geweben zeigen kann, wie z. B. Organen (einschließlich z. B. Pankreas, Leber, Darm, Niere, Haut oder Endothel), Muskulatur (glatter, Skelett- oder Herzmuskulatur) und Gefäß-(einschließlich Gefäßendothel)Gewebe, oder zur Förderung des Wachstums von Zellen, die solche Gewebe umfassen. Ein Teil der gewünschten Wirkungen kann. die Hemmung oder Modulation von fibrotischer Narbenbildung sein, um normalem Gewebe zu ermöglichen, sich zu regenerieren.
Ein PRO364- oder PRO175-Polypeptid hierin oder ein Antagonist dazu kann auch zum Schutz des Darms oder Regeneration und Behandlung von Lungen- oder Leberfibrose, Reperfusionsverletzung in verschiedenen Geweben und Leiden dienen, die aus systemischem Cytokinschaden resultieren. Das PRO364- oder PRO175-Polypeptid oder ein Antagonist dazu kann auch zur Förderung oder Hemmung der Differenzierung von Geweben, die oben beschrieben sind, aus Vorläufergeweben oder -zellen oder zur Hemmung des Wachstums von oben beschriebenen Geweben dienen.
Ein PRO364- oder PRO175-Polypeptid oder ein Antagonist dazu kann auch in der Behandlung von Parodontalerkrankungen und in anderen Zahnreparaturverfahren verwendet werden. Solche Mittel können eine Umgebung bereitstellen, um knochenbildene Zellen anzuziehen, Wachstum von knochenbildenden Zellen zu stimulieren oder Differenzierung von Vorläufern von knochenbildenden Zellen zu induzieren. Ein PRO364- oder PRO175-Polypeptid hierin oder ein Antagonist dazu kann auch in der Behandlung von Osteoporose oder Osteoarthritis nützlich sein, wie z. B. durch Stimulation von Knochen- und/oder Knorpelreparatur oder durch Blockieren von Entzündung oder Gewebszerstörungsprozessen (Collagenaseaktivität, Osteoklastenaktivität etc.), vermittelt durch entzündliche Prozesse, da Blutgefäße eine wichtige Rolle in der Regulation von Knochenleistung und -wachstum spielen.
Eine andere Kategorie von Gewebsregenerationsaktivität, die dem hierin beschriebenem PRO364- oder PRO175-Polypeptid oder einem Antagonisten davon zugeschrieben werden kann, ist die Sehnen-/Bandbildung. Ein Protein, das sehnen-/bandähnliche Gewebe oder eine andere Gewebsbildung unter Umständen induziert, unter welchen ein solches Gewebe normalerweise nicht gebildet wird, findet in der Heilung von Sehnen- oder Bänderrissen, -missbildungen und anderen Sehnen- oder Bänderdefekten bei Menschen und anderen Tieren Anwendung. Ein solches Präparat kann prophylaktisch in der Prävention von Schäden an Sehnen- oder Bändergeweben dienen sowie in der verbesserten Fixierung von Sehne oder Band an Knochen oder anderen Geweben und in der Reparatur von Defekten an Sehnen- oder Bändergewebe verwendet werden. De-novo-Bildung von sehnen-/bänderähnlichem Gewebe, die durch eine Zusammensetzung des PRO364- oder PRO175-Polypeptids hierin oder eines Antagonisten dazu verursacht ist, trägt zur Reparatur von angeborenen, traumainduzierten oder anderen Sehnen- oder Bänderdefekten von anderem Ursprung bei und ist auch in kosmetischer plastischer Chirurgie zur Anheftung oder Reparatur von Sehnen oder Bändern nützlich. Die Zusammensetzungen hierin können auch eine Umgebung bereitstellen, um sehnen- oder bänderbildende Zellen anzuziehen, Wachstum von sehnen- oder bänderbildenden Zellen zu stimulieren, Differenzierung von Vorläufern von Sehnen oder bänderbildenden Zellen zu induzieren oder Wachstum von Sehnen-/Bänderzellen oder Vorläufern ex vivo zur Zufuhr in vivo zu induzieren, um Gewebsreparatur auszuüben. Die Zusammensetzungen hierin können auch in der Behandlung von Tendinitis, Karpaltunnelsyndrom und anderen Sehnen- oder Bänderdefekten nützlich sein. Die Zusammensetzungen können auch ein geeignetes Matrix- und/oder Sequestiermittel als Träger umfassen, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist.
Das PRO364- oder PRO175-Polypeptid oder sein Antagonist kann auch zur Proliferation von Nervenzellen und zur Regeneration von Nerven- und Gehirngewebe nützlich sein, d. h. zur Behandlung von Erkrankungen des zentralen und peripheren Nervensystems und von Neuropathien sowie mechanischen und traumatischen Störungen, die Degeneration, Tod oder Trauma von Nervenzellen oder Nervengewebe umfassen. Genauer gesagt kann ein PRO364- oder PRO175-Polypeptid oder sein Antagonist in der Behandlung von Erkrankungen des peripheren Nervensystems verwendet werden, wie z. B. Schäden am peripheren Nerv, peripherer Neuropathie und lokalisierter Neuropathien, und Erkrankungen des zentralen Nervensystems, wie z. B. Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Syndrom, Huntington-Chores, amyotrophischer Lateralsklerose und Shy-Drager-Syndrom. Weitere Leiden, die gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, umfassen mechanische und traumatische Leiden, wie z. B. Rückenmarkserkrankungen, Kopftrauma und zerebrovaskuläre Erkrankungen wie z. B. Schlaganfall. Periphere Neuropathien, die aus Chemotherapie oder anderen medizinischen Therapien resultieren, können auch unter Verwendung eines PRO364- oder PRO175-Polypeptids hierin oder eines Antagonisten dazu behandelt werden.
Ischämie-Reperfusions-Verletzung ist eine weitere Indikation. Endothelzelldysfunktion kann sowohl am Beginn als auch in der Regulation der Anzeichen für Ereignisse wichtig sind, die nach Ischämie-Reperfusions-Verletzung auftreten.
Rheumatoide Arthritis ist eine weitere Indikation. Blutgefäßwachstum und Targeting von entzündlichen Zeilen durch die Gefäße ist eine wichtige Komponente in der Pathogenese von rheumatoiden und sero-negativen Formen von Arthritis.
PRO364- oder PRO175-Polypeptid oder sein Antagonist kann auch prophylaktisch an Patienten mit Herzhypertrophie verabreicht werden, um das Fortschreiten des Leidens zu verhindern und plötzlichen Tod zu vermeiden, einschließlich Tod von asymptomatischen Patienten. Eine solche Präventivtherapie ist insbesondere im Fall von Patienten gerechtfertigt, bei denen massive Herzhypertrophie des linken Ventrikels (maximale Wanddicke von 35 mm oder mehr bei Erwachsenen oder ein vergleichbarer Wert bei Kindern) diagnostiziert wird, oder in Fällen, wo die hämodynamische Last auf das Herz besonders stark ist.
Das PRO364- oder PRO175-Polypeptid oder sein Antagonist kann auch in der Handhabung von Vorhofflimmern nützlich sein, das sich bei einem wesentlichen Teil von Patienten entwickelt, bei denen hypertrophische Kardiomyopathie diagnostiziert wird.
Weitere Indikationen umfassen Angina, Myokardinfarkte, wie z. B. akute Myokardinfarkte, und Herzinsuffizienz, wie z. B. Stauungsinsuffizienz. Weitere nicht-neoplastische Leiden umfassen Psoriasis, diabetische und andere proliferative Retinopathien, einschließlich Retinopathia praematurorum, retrolentale Fibroplasie, neovaskuläres Glaukom, Schilddrüsenhyperplasie (einschließlich Basedow-Krankheit), Hornhaut- und andere Gewebstransplantation, chronische Entzündung, Lungenentzündung, Nephrose, Präeklampsie, Ascites, Perikarderguss (wie jener, der mit Perikarditis assoziiert ist) und Pleuraerguss.
Angesichts des Obigen spielen die hierin beschriebenen PRO364- oder PRO175-Polypeptide oder Agonisten oder Antagonisten davon, die Endothelzellfunktion, -proliferation und/oder -form ändern oder beeinflussen sollen, wahrscheinlich eine wichtige Rolle in der Ätiologie und Pathogenese vieler oder aller obigen Erkrankungen, und als solche können sie als therapeutische Targets zur Steigerung oder Hemmung dieser Prozesse oder für gefäß-assoziiertes Arzneimitteltargeting bei diesen Erkrankungen dienen.
xi. Verabreichungsprotokolle, Pläne, Dosen und Formulierungen
Die hierin offenbarten Moleküle und Agonisten und Antagonisten davon sind pharmazeutisch als prophylaktisches und therapeutisches Mittel für verschiedene Störungen und Erkrankungen, wie zuvor dargelegt, nützlich.
Therapeutische Zusammensetzungen der PRO364- oder PRO175-Polypeptide oder -Agonisten oder -Antagonisten werden zur Lagerung durch Vermischen des erwünschten Moleküls mit geeignetem Reinheitsgrad mit optionalen pharmazeutisch annehmbaren Trägern, Exzipienten oder Stabilisatoren (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage, A. Osol (Hrsg.) (1980)) in Form von lyophilisierten Formulierungen oder wässrigen Lösungen hergestellt. Annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren sind für Rezipienten bei den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch und umfassen Puffer wie z. B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidationsmittel einschließlich Ascorbinsäure und Methionin; Konservierungsmittel (wie z. B. Octadecyldimethylbenzylammoniumchlorid, Hexamethoniumchlorid; Benzalkoniumchlorid, Benzethoniumchlorid; Phenol, Butyl- oder Benzylalkohol; Alkylparabene, wie z. B. Methyl- oder Propylparaben; Katechol; Resorcin; Cyclohexanol; 3-Pentanol und m-Kresol); niedermolekulare Polypeptide (mit weniger als etwa 10 Resten); Proteine wie z. B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere wie z. B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie z. B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner wie EDTA; Zucker, wie z. B. Saccharose, Mannit, Trehalose oder Sorbit; salzbildende Gegenionen, wie z. B. Natrium; Metallkomplexe (wie z. B. Zn-Protein-Komplexe); und/oder nichtionische Tenside wie TWEEN^TM, PLURONICS^TM oder Polyethylenglykol (PEG).
Zusätzlich Beispiele für solche Träger umfassen Ionenaustauscher, Aluminiumoxid, Aluminiumstearat, Lecithin, Serumproteine, wie z. B. menschliches Serumalbumin, Puffersubstanzen, wie z. B. Phosphate, Glycin, Sorbinsäure, Kaliumsorbat, Gemische partieller Glyceride von gesättigten pflanzlichen Fettsäuren, Wasser, Salze oder E lektrolyte, wie z. B. Protaminsulfat, Dinatriumhydrogenphosphat, Kaliumhydrogenphosphat, Natriumchlorid, Zinksalze, kolloidale Kieselsäure, Magnesiumtrisilicat, Polyvinylpyrrolidon, Substanzen auf Cellulose-Basis und Polyethylenglykol. Träger für topische Formen des Antagonisten oder Formen auf Gel-Basis umfassen Polysaccharide, wie z. B. Natriumcarboxymethylcellulose oder Methylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Polyacrylate, Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockpolymere, Polyethylenglykol und Holzwachsalkohole. Für alle Verabreichungsformen können auf geeignete Weise herkömmliche Depotformen eingesetzt werden. Solche Formen umfassen beispielsweise Mikrokapseln, Nanokapseln, Liposomen, Pflaster, Inhalationsformen, Nasensprays, sublinguale Tabletten und Retardpräparate. Die PRO230-, PRO216- oder PRO302-Polypeptide oder -Agonisten oder -Antagonisten werden in solchen Trägern typischerweise in einer Konzentration von etwa 0,1 mg/ml bis 100 mg/ml formuliert.
Eine andere Formulierung umfasst das Integrieren eines PRO364- oder PRO175-Polypeptide oder Antagonisten davon in Formstücke. Solche Gegenstände können zur Modulation von Endothelzellwachstum und Angiogenese eingesetzt werden. Zusätzlich dazu können Tumorinvasion und Metastasenbildung unter Einsatz dieser Gegenstände moduliert werden.
PRO364- oder PRO175-Polypeptide oder -Antagonisten, die zur In-vivo-Verabreichung eingesetzt werden sollen, müssen steril sein. Dies wird leicht mittels Filtration durch sterile Filtrationsmembranen vor oder nach Gefriertrocknung und Wiederherstellung erreicht. PRO364- oder PRO175-Polypeptid wird bei systemischer Verabreichung herkömmlicherweise in gefriergetrockneter oder gelöster Form gelagert. Wenn PRO364- oder PRO175-Polypeptid oder -Antagonist in gefriergetrockneter Form-vorliegen, sind sie typischerweise in Kombination mit anderen Inhaltsstoffen für die Wiederherstellung mit einem geeigneten Verdünnungsmittel zum Zeitpunkt des Einsatzes formuliert. Ein Beispiel für eine flüssige Formulierung von PRO364- oder PRO175-Polypeptid oder -Antagonist ist eine sterile, klare, farblose nicht konservierte Lösung, die für eine subkutane Injektion in eine Einfachdosis-Phiole gefüllt wird. Konservierte pharmazeutische Zusammensetzungen, die für den wiederholten Ein satz geeignet sind, enthalten hauptsächlich in Abhängigkeit von der Indikation und der Art des Polypeptids Folgendes:

a) PRO364- oder PRO175-Polypeptid oder einen Agonisten oder Antagonisten davon;
b) einen Puffer, der in der Lage ist, den pH-Wert in einem Bereich maximaler Stabilität des Polypeptids oder anderer gelöster Moleküle zu halten, vorzugsweise in einem Bereich von etwa 4–8;
c) ein Detergens/Tensid; hauptsächlich zur Stabilisierung des Polypeptids oder Moleküls gegen durch Schütteln hervorgerufene Aggregation;
d) ein Isotonisierungsmittel;
e) ein Konservierungsmittel, das aus der aus Phenol, Benzylalkohol und Benethoniumhalogenid, z. B. -chlorid, bestehenden Gruppe ausgewählt ist, und
f) Wasser.

Wenn das verwendete Detergens nichtionisch ist, kann es sich beispielsweise um Polysorbate (z. B. POLYSORBAT^TM, (TWEEN^TM) 20, 80 etc.) oder Poloxamere (z. B. POLOXAMER^TM 188) handeln. Die Verwendung von nichtionischen Tensiden ermöglicht, dass die Formulierung Scherbeanspruchung an der Oberfläche ausgesetzt werden kann, ohne dass es zu einer Denaturierung des Polypeptids kommt. Solche tensidhältigen Formulierungen können ferner in Aerosol-Vorrichtungen eingesetzt werden, wie z. B. in jenen, die für pulmonare Dosierungen und nadellose Jet-Injektionspistolen (siehe z. B. EP 257.956 ) verwendet werden.
Ein Isotonisierungsmittel kann vorhanden sein, um die Isotonie einer flüssigen Zusammensetzung des PRO364- oder PRO175-Polypeptids oder Antagonisten davon sicherzustellen, und umfasst mehrwertige Zuckeralkohole, vorzugsweise drei- oder höherwertige Zuckeralkohole, wie z. B. Glycerin, Erythrit, Arabit, Xylit, Sorbit und Mannit. Diese Zuckeralkohole können einzeln oder in Kombination eingesetzt werden. Alternativ dazu können Natriumchlorid oder andere geeignete anorganische Salze eingesetzt werden, um die Lösungen isotonisch zu machen.
Bei dem Puffer kann es sich in Abhängigkeit von dem gewünschten pH beispielsweise um einen Acetat-, Citrat-, Succinat- oder Phosphatpuffer handeln. Der pH eines Typs einer flüssigen Formulierung der vorliegenden Erfindung wird im Bereich von etwa 4 bis 8, vorzugsweise etwa um den physiologischen pH, gepuffert.
Die Konservierungsmittel Phenol, Benzylalkohol und Benzethoniumhalogenide, z. B. -chlorid, sind bekannte antimikrobielle Mittel, die eingesetzt werden können.
Therapeutische PRO364- oder PRO175-Polypeptidzusammensetzungen werden im Allgemeinen in einen Behälter mit einer sterilen Zugangsöffnung gefüllt, beispielsweise in einen intravenösen Lösungsbeutel oder eine Phiole mit einem Septum, das mit einer subkutanen Injektionsnadel durchstochen werden kann. Die Formulierungen werden vorzugsweise in Form von wiederholten intravenösen (i. v.), subkutanen (s. c.) oder intramuskulären (i. m.) Injektionen oder in Form von Aerosolformulierungen, die zur intranasalen oder intrapulmonaren Zufuhr geeignet sind (in Bezug auf intrapulmonare Zufuhr siehe z. B. EP 257.956 ), verabreicht.
PRO364- oder PRO175-Polypeptide können auch in Form von Retardpräparaten verabreicht werden. Geeignete Beispiele für Retardpräparate umfassen semipermeable Matrizen von festen hydrophoben Polymeren, die das Protein enthalten, wobei die Matrizen in Form von Formstücken, z. B. in Form von Filmen oder Mikrokapseln, vorliegen. Beispiele für Retardmatrizen umfassen Polyester, Hydrogele (z. B. Poly(2-hydroxyethylmethacrylat), wie von Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15, 167–277 (1981), und Langer, Chem. Tech. 12, 98–105 (1982), beschrieben, oder Poly(vinylalkohol)), Polylactide ( US-Patent Nr. 3.773.919 , EP 58.481 ), Copolymere von L-Glutaminsäure und γ-Ethyl-L-Glutamat (Sidman et al., Biopolymers 22, 547–556 (1983)), nicht abbaubares Ethylenvinylacetat (Langer et al., s. o.), abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere, wie z. B. Lupron Depot^TM (injizierbare Mikrokügelchen aus Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer und Leuprolidacetat), und Poly-D-(-)-3-hydroxybuttersäure ( EP 133.988 ).
Während Polymere, wie z. B. Ethylenvinylacetat und Milchsäure-Glykolsäure, die Freisetzung von Molekülen über mehr als 100 Tage hinweg ermöglichen, setzen bestimmte Hydrogele Proteine über einen kürzeren Zeitraum hinweg frei. Wenn verkapselte Proteine eine lange Zeit über im Körper bleiben, können sie in Folge des Einflusses von Feuchtigkeit bei 37°C denaturieren oder aggregieren, was zu einem Verlust der biologischen Aktivität und zu möglichen Veränderungen der Immunogenität führt. Es können rationale Strategien zur Proteinstabilisierung in Abhängigkeit von dem beteiligten Mechanismus ausgearbeitet werden. Wenn beispielsweise festgestellt wird, dass es sich bei dem Aggregationsmechanismus um die Bildung von intermolekularen S-S-Bindungen durch Thiodisulfid-Austausch handelt, kann eine Stabilisierung erzielt werden, indem die Sulfhydrylreste modifiziert werden, aus sauren Lösungen lyophilisiert wird, der Feuchtigkeitsgehalt gesteuert wird, geeignete Additive eingesetzt werden und spezifische Polymer-Matrix-Zusammensetzungen entwickelt werden.
PRO364- oder PRO175-Polypeptid-Retardzusammensetzungen umfassen auch in Liposomen eingeschlossene PRO364- oder PRO175-Polypeptide. Liposomen, die PRO364- oder PRO175-Polypeptide enthalten, werden durch an sich bekannte Verfahren hergestellt: DE 3.218.121 ; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688–3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030–4034 (1980); EP 52.322 ; EP 36.676 ; EP 88.046 ; EP 143.949 ; EP 142.641 ; Japanische Patentanmeldung 83-118008 ; US-Patente Nr. 4.485.045 und 4.544.545 sowie EP 102.324 . Herkömmlicherweise gehören die Liposomen zu der kleinen (etwa 200–800 Angström) unilamellaren Art, in der der Lipidgehalt mehr als etwa 30 Mol-% Cholesterin beträgt, wobei der ausgewählte Anteil für die optimale Therapie angepasst wird.
Die therapeutisch wirksame Dosis von PRO364- oder PRO175-Polypeptiden oder den Antagonisten davon variiert selbstverständlich in Abhängigkeit von Faktoren, wie dem zu behandelnden pathologischen Zustand (einschließlich Prävention), dem Verabreichungsverfahren, der Art der zur Behandlung eingesetzten Verbindung, etwaigen Co-Therapien, dem Alter, Gewicht, dem allgemeinen Gesundheitszustand und der Krankengeschichte des Patienten etc., und kann von dem behandelnden Arzt bestimmt werden. Dementsprechend ist es erforderlich, dass der behandelnde Arzt die Dosierung titriert und den Verabreichungsweg nach Bedarf modifiziert, um eine maximale therapeutische Wirkung zu erzielen. Wenn PRO364- oder PRO175-Polypeptide auch ein enges Wirtsspektrum aufweisen, sind zur Behandlung von menschlichen Patienten Formulierungen, die menschliches PRO364- oder menschliches PRO175-Polypeptid enthalten, noch bevorzugter menschliches Nativsequenz-PRO364- oder -PRO175-Polypeptid, zu bevorzugen. Der Arzt verabreicht PRO364- oder PRO175-Polypeptid, bis eine Dosierung erreicht ist, die die gewünschte Wirkung zur Behandlung der jeweiligen Erkrankung erzielt. Wenn das Ziel beispielsweise in der Behandlung von CHF besteht, würde die zu verabreichende Menge jener Menge entsprechen, die die fortschreitende Herzhypertrophie, die mit dieser Erkrankung einhergeht, hemmt. Der Fortschritt dieser Therapie kann leicht mittels Ultraschallkardiographie überwacht werden. Auf ähnliche Weise kann Patienten mit hypertropher Kardiomyopathie PRO364- oder PRO175-Polypeptid auf empirischer Basis verabreicht werden.
Unter Berücksichtigung der oben angeführten Richtlinien liegt die wirksame Dosis im Allgemeinen im Bereich von etwa 0,001 bis etwa 1,0 mg/kg, noch bevorzugter von etwa 0,01 bis 1 mg/kg und besonders bevorzugt von etwa 0,01 bis 0,1 mg/kg.
Für den nicht-oralen Einsatz zur Behandlung von Hypertonie bei erwachsenen Menschen werden PRO364- oder PRO175-Polypeptide vorteilhafterweise in Form einer Injektion in einer Menge von etwa 0,01 bis 50 mg, vorzugsweise von etwa 0,05 bis 20 mg und besonders bevorzugt von 1 bis 20 mg, pro Kilogramm Körpergewicht 1- bis 3-mal täglich mittels intravenöser Injektionen verabreicht. Bei oraler Verabreichung wird ein Molekül auf PRO364- oder PRO175-Polypeptid-Basis vorzugsweise in einer Menge von etwa 5 mg bis 1 g, vorzugsweise von etwa 10 bis 100 mg, pro kg Körpergewicht 1- bis 3-mal täglich verabreicht. Es ist anzumerken, dass eine Verunreinigung durch Endotoxin minimal auf einem sicheren Niveau gehalten werden sollte, beispielsweise auf weniger als 0,5 ng/mg Protein. Bei Verabreichung an menschliche Patienten sollten die Formulierungen vorzugsweise weiters die Anforderungen in Bezug auf Sterilität, Pyrogenizität, allgemeine Sicherheit und Reinheit gemäß den FDA Office and Biologics Standards erfüllen.
Das Dosierungsschema einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die PRO364- oder PRO175-Polypeptid enthält und zur Gewebewiederherstellung eingesetzt werden soll, wird durch den behandelnden Arzt unter Berücksichtigung von verschiedenen Faktoren bestimmt, die die Wirkung des Polypeptids modifizieren können, z. B. von dem Gewicht des Gewebes, das gebildet werden soll, der Stelle der Schädigung, dem Zustand des beschädigten Gewebes, der Größe einer Wunde, der Art des beschädigten Gewebes (z. B. Knochen), dem Alter, Geschlecht und der Ernährung des Patienten, der Schwere einer etwaigen Infektion, der Verabreichungszeit und anderer klinischer Faktoren. Die Dosierung kann in Abhängigkeit vom Typ der zur Wiederherstellung eingesetzten Matrix und der Integration anderer Proteine in der pharmazeutischen Zusammensetzung variieren. Die Zugabe anderer bekannter Wachstumsfaktoren, wie z. B. IGF-I, zu der endgültigen Zusammensetzung kann beispielsweise auch die Dosierung beeinflussen. Der Fortschritt kann durch regelmäßige Überprüfungen von Gewebe-/Knochenwachstum und/oder -reparatur beispielsweise unter Einsatz von Röntgenstrahlung, histomorphometrischen Bestimmungen und Tetrazyklin-Markierung überwacht werden.
Die Art der Verabreichung von PRO364- oder PRO175-Polypeptiden oder -Antagonisten oder -Agonisten entspricht bekannten Verfahren, z. B. erfolgt die Verabreichung durch Injektion oder Infusion auf intravenösem, intramuskulärem, intrazerebralem, intraperitonealem, intracerebrospinalem, subkutanem, intraokularem, intraartikulärem, intrasynovialem, intrathekalem, oralem, topischem Weg oder auf dem Inhalationsweg oder mittels Retardsystemen, wie untenstehend beschrieben. Das PRO364- oder PRO175-Polypeptid oder Antagonisten davon werden auf geeignete Weise auch auf intratumoralem, peritumoralem, intraläsionalem oder periläsionalem Weg verabreicht, um eine lokale sowie systemische therapeutische Wirkung zu erzielen. Es wird erwartet, dass der intraperitoneale Weg besonders nützlich ist, beispielsweise zur Behandlung von Ovarialtumoren.
Wenn ein Peptid oder kleines Molekül als Antagonist oder Agonist eingesetzt wird, wird es Säugetieren vorzugsweise oral oder nicht oral in Form einer Flüssigkeit oder eines Feststoffs verabreicht.
Beispiele für pharmakologisch annehmbare Salze von Molekülen, die Salze bilden und hierin nützlich sind, umfassen Alkalimetallsalze (z. B. Natriumsalz, Kaliumsalz), Erdalkalimetallsalze (z. B. Calciumsalz, Magnesiumsalz), Ammoniumsalze, organische Basensalze (z. B. Pyridinsalz, Triethylaminsalz), anorganische Säuresalze (z. B. Hydrochlorid, Sulfat, Nitrat) und Salze von organischen Säuren (z. B. Acetat, Oxalat, p-Toluolsulfonat).
Für hierin offenbarte Zusammensetzungen, die nützlich zur Wiederherstellung von Knochen, Knorpel, Sehnen oder Bändern sind, umfasst das therapeutische Verfahren die topische, systemische oder lokale Verabreichung in Form eines Implantats oder einer Vorrichtung. Bei der Verabreichung liegt die zu verwendende therapeutische Zusammensetzung in pyrogenfreier, physiologisch annehmbarer Form vor. Die Zusammensetzung kann ferner wünschenswerterweise verkapselt sein oder in viskoser Form zur Zufuhr zu der Stelle der Schädigung an Knochen, Knorpel oder Gewebe injiziert werden. Die topische Verabreichung kann zur Wundheilung und zur Gewebereparatur geeignet sein. Vorzugsweise umfasst die Zusammensetzung zur Bildung von Knochen und/oder Knorpel eine Matrix, die in der Lage ist, die proteinhältige Zusammensetzung zu der Stelle des Knochen- und/oder Knorpelschadens zuzuführen, wobei eine Struktur für den in der Entwicklung befindlichen Knochen und Knorpel bereitgestellt wird und die Matrix vorzugsweise wieder in den Körper resorbiert werden kann. Solche Matrizen können aus Materialien gebildet werden, die derzeit für andere implantierte medizinische Anwendungen eingesetzt werden.
Die Wahl des Matrixmaterials basiert auf Bioverträglichkeit, biologischer Abbaubarkeit, mechanischen Eigenschaften, kosmetischem Erscheinungsbild und Kontaktflächeneigenschaften. Die spezielle Anwendung der Zusammensetzungen definiert die geeignete Formulierung. Potentielle Matrizen für die Zusammensetzungen können biologisch abbaubare(s) und chemisch definierte(s) Calciumsulfat, Tricalcium phosphat, Hydroxyapatit, Polymilchsäure, Polyglykolsäure und Polyanhydride sein. Weitere potentielle Matrixmaterialien sind biologisch abbaubar und biologisch definiert, wie z. B. Knochen- oder Hautkollagen.
Weitere Matrizen bestehen aus reinen Proteinen oder extrazellulären Matrixkomponenten. Weitere potentielle Matrizen sind nicht biologisch abbaubar und chemisch definiert, wie z. B. gesinterter Hydroxyapatit, Bioglas, Aluminate oder andere Keramik. Matrizen können aus einer Kombination beliebiger der oben angeführten Materialtypen bestehen, wie z. B. Polymilchsäure und Hydroxyapatit oder Kollagen und Tricalciumphosphat. Die Zusammensetzung der Biokeramik kann verändert werden, wie z. B. in Calcium-Aluminat-Phosphat und einer Bearbeitung zur Veränderung der Porengröße, der Teilchengröße, der Teilchenform und der biologischen Abbaubarkeit.
Bei einer speziellen Ausführungsform handelt es sich um ein 50:50-(Molekulargewicht)Copolymer aus Milchsäure und Glykolsäure in Form poröser Teilchen mit Durchmessern im Bereich von 150 bis 800 μm. In einigen Anwendungen ist es nützlich, ein Maskierungsmittel, wie z. B. Carboxymethylcellulose oder ein autologes Blutgerinnsel, einzusetzen, um zu verhindern, dass sich die Polypeptidzusammensetzungen von der Matrix lösen.
Eine geeignete Familie von Maskierungsmitteln umfasst Cellulosematerialien, wie z. B. Alkylcellulosen (einschließlich Hydroxyalkylcellulosen), einschließlich Methylcellulose, Ethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose und Carboxymethylcellulose, wobei kationische Salze von Carboxymethylcellulose (CMC) zu den bevorzugten gehören. Weitere bevorzugte Maskierungsmittel umfassen Hyaluronsäure, Natriumalginat, Poly(ethylenglykol), Polyoxyethylenoxid, Carboxyvinylpolymer und Poly(vinylalkohol). Die Menge an Maskierungsmittel, die hierin nützlich ist, beträgt, bezogen auf das Gesamtgewicht der Formulierung, 0,5 bis 20 Gew.-%, vorzugsweise 1–10 Gew.-%, was der Menge entspricht, die erforderlich ist, um die Desorption des Polypeptids (oder seines Antagonisten) von der Polymermatrix zu verhindern und eine angemessene Handhabbarkeit der Zusammensetzung bereitzustellen, wobei die Menge nicht so groß ist, dass ver hindert wird, dass die Vorläuferzellen die Matrix infiltrieren, wodurch dem Polypeptid (oder seinem Antagonist) ermöglicht wird, die osteogene Aktivität der Vorläuferzellen zu unterstützen.
xii. Kombinationstherapien
Die Wirksamkeit von PRO364- oder PRO175-Polypeptiden oder einem Agonisten oder Antagonisten davon zur Prävention oder Behandlung der jeweiligen Störung kann dadurch verbessert werden, dass der Wirkstoff seriell oder in Kombination mit einem anderen Mittel verabreicht wird, das zu diesem Zweck wirksam ist, entweder in derselben Zusammensetzung oder in Form von separaten Zusammensetzungen.
Zur Behandlung von Herzhypertrophie kann eine PRO364- oder PRO175-Polypeptidtherapie beispielsweise mit der Verabreichung von Inhibitoren bekannter Herzmyozytenhypertrophie-Faktoren kombiniert werden, z. B. Inhibitoren von α-adrenergen Agonisten, wie z. B. Phenylephrin; Enothelin-1-Inhibitoren, wie z. B. BOSENTAN^TM und MOXONODIN^TM; Inhibitoren für CT-1 ( US-Patent Nr. 5.679.545 ); Inhibitoren für LIF; ACE-Inhibitoren; Des-Aspartat-Angiotensin-I-Inhibitoren ( US-Patent Nr. 5.773.415 ) und Angiotensin-II-Inhibitoren.
Zur Behandlung von Herzhypertrophie in Zusammenhang mit Hypertonie können PRO362- oder PRO175-Polypeptide in Kombination mit Blockiermitteln für β-adrenerge Rezeptoren, wie z. B. Propranolol, Timolol, Tertalolol, Carteolol, Nadolol, Betaxolol, Penbutolol, Acetobutolol, Atenolol, Metoprolol oder Carvedilol; mit ACE-Inhibitoren, z. B. Quinapril, Captopril, Enalapril, Ramipril, Benazepril, Fosinopril oder Lisinopril; mit Diuretika, wie z. B. Chlorthiazid, Hydrochlorthiazid, Hydroflumethazid, Methylchlothiazid, Benzthiazid, Dichlorphenamid, Acetazolamid oder Indapamid; und/oder mit Calciumkanalblockern, wie z. B. Dilitazem, Nifedipin, Verapamil oder Nicardipin, verabreicht werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die die hierin durch ihre generischen Bezeichnungen identifizierten therapeutischen Wirkstoffe umfassen, sind im Handel erhältlich und sind gemäß den Herstellerhinweisen in Bezug auf Dosierung, Verabreichung, Nebenwirkungen, Gegenanzeigen etc. zu verabreichen. Siehe z. B. Physicians' Desk Reference (51. Aufl.), Medical Economics Data Production Co., Montavale, NJ (1997).
Bevorzugte Kandidaten für eine Kombinationstherapie zur Behandlung von hypertropher Kardiomyopathie sind β-adrenerge Blockiermittel (z. B. Propranolol, Timolol, Tertalolol, Carteolol, Nadolol, Betaxolol, Penbutolol, Acetobutolol, Atenolol, Metoprolol oder Carvedilol), Verapamil, Difedipin oder Diltiazem. Die Behandlung von Hypertrophie in Zusammenhang mit hohem Blutdruck kann den Einsatz einer antihypersensitiven Arzneimitteltherapie unter Einsatz von Calciumkanalblockern, wie z. B. Diltiazem, Nifedipin, Verapamil oder Nicardipin; β-adrenergen Blockiermitteln; Diuretika, wie z. B. Chlorthiazid, Hydrochlorthiazid, Hydroflumethazid, Methylchlothiazid, Benzthiazid, Dichlorphenamid, Acetazolamid oder Indapamid; und/oder ACE-Inhibitoren, wie z. B. Quinapril, Captopril, Enalapril, Ramipril, Benazepril, Fosinopril oder Lisinopril, erfordern.
Bei anderen Indikationen können PRO364- oder PRO175-Polypeptide oder deren Antagonisten mit anderen Mitteln kombiniert werden, die nützlich für die Behandlung der betreffenden Knochen- und/oder Knorpelschäden, Wunden oder Gewebe sind. Diese Mittel umfassen verschiedene Wachstumsfaktoren, wie z. B. EGF, PDGF, TFG-α oder TGF-β, IGF, FGF und CTGF.
Zusätzlich dazu können PRO364- oder PRO175-Polypeptide oder deren Antagonisten, die zur Behandlung von Krebs eingesetzt werden, mit zytotoxischen, chemotherapeutischen oder wachstumshemmenden Mitteln, wie obenstehend identifiziert, kombiniert werden. Zur Krebsbehandlung werden die PRO364- oder PRO175-Polypeptide oder Antagonisten davon auf geeignete Weise seriell oder in Kombination mit radiologischen Behandlungen verabreicht, unabhängig davon, ob diese Bestrahlung oder die Verabreichung radioaktiver Substanzen beinhalten.
Die wirksamen Mengen der in Kombination mit PRO364- oder PRO175-Polypeptiden oder Antagonisten davon verabreichten Wirkstoffe liegen im Ermessen des behandelnden Arztes oder Veterinärmediziners. Die Verabreichung und Anpassung der Dosierung erfolgt, um eine bestmögliche Behandlung der zu behandelnden Erkrankung zu erzielen. Zur Behandlung von Hypertonie werden bei der Bestimmung dieser Mengen idealerweise die Verwendung von Diuretika oder Digitalis sowie Erkrankungen, wie Hyper- oder Hypotonie, eine Beeinträchtigung der Nierenfunktion etc., berücksichtigt. Die Dosis hängt zusätzlich dazu von Faktoren wie der Art des einzusetzenden Wirkstoffs und dem zu behandelnden Patienten ab. Typischerweise entspricht die verwendete Menge derselben Dosis, die eingesetzt wird, wenn der jeweilige Wirkstoff ohne PRO364- oder PRO175-Polypeptid verabreicht wird.
xiii. Fabrikate
Ein Fabrikat, wie z. B. ein Set, das PRO364- oder PRO175-Polypeptide oder Antagonisten davon umfasst und zur Diagnose oder Behandlung der oben beschriebenen Störungen geeignet ist, umfasst zumindest einen Behälter und ein Etikett. Geeignete Behälter umfassen beispielsweise Flaschen, Phiolen, Spritzen und Teströhrchen. Die Behälter können aus verschiedenen Materialien, wie z. B. Glas oder Kunststoff, bestehen. Der Behälter enthält eine Zusammensetzung, die zur Diagnose oder Behandlung der Erkrankung wirksam ist, und weist eine sterile Zugangsöffnung auf (bei dem Behälter kann es sich beispielsweise um einen intravenösen Lösungsbeutel oder eine Phiole mit einem Septum, das mit einer subkutanen Injektionsnadel durchstochen werden kann, handeln). Bei dem Wirkstoff in der Zusammensetzung handelt es sich um das PRO364- oder PRO175-Polypeptid oder einen Agonisten oder Antagonisten davon. Das Etikett, das sich auf dem Behälter befindet oder mit diesem geliefert wird, zeigt an, dass die Zusammensetzung zur Diagnose oder Behandlung der jeweiligen Erkrankung eingesetzt wird. Das Fabrikat kann ferner einen zweiten Behälter umfassen, der einen pharmazeutisch annehmbaren Puffer enthält, wie z. B. phosphatgepufferte Salzlösung, Ringersche Lösung und Dextroselösung. Es kann weiters andere Materialien umfassen, die aus kommerzieller Sicht sowie aus Sicht des Verbrauchers wünschenswert sind, einschließlich weitere Puffer, Verdünnungs mittel, Filter, Nadeln, Spritzen und Beipackzettel mit Hinweisen zur Verwendung. Das Fabrikat kann auch, wie oben beschrieben, einen zweiten oder dritten Behälter mit einem anderen Wirkstoff umfassen.
C. Antikörper
Bei einigen der vielversprechendsten erfindungsgemäßen Arzneimittelkandidaten handelt es sich um Antikörper und Antikörperfragmente, die die Produktion oder das Genprodukt der hierin identifizierten Gene inhibieren und/oder die Aktivität der Genprodukte reduzieren.
i. Polyklonale Antikörper
Verfahren zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern sind Fachleuten bekannt. Polyklonale Antikörper können in einem Säugetier, beispielsweise durch eine oder mehrere Injektionen eines immunisierenden Mittels und, sofern erwünscht, eines Adjuvans, gezüchtet werden. Typischerweise wird das immunisierende Mittel und/oder das Adjuvans dem Säugetier durch multiple subkutane oder intraperitoneale Injektionen injiziert. Das immunisierende Mittel kann das PRO364- oder PRO175-Polypeptid oder ein Fusionsprotein davon umfassen. Es kann nützlich sein, das immunisierende Mittel an ein Protein zu konjugieren, das dafür bekannt ist, im zu immunisierenden Säugetier immunogen zu sein. Beispiele für solche immunogenen Proteine umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinderthyreoglobulin und Sojabohnentrypsininhibitor. Beispiele für Adjuvanzien, die verwendet werden können, umfassen komplettes Freundsches Adjuvans und MPL-TDM-Adjuvans (Monophosphoryl-Lipid A oder synthetisches Trehalosedicorynomycolat). Die Arbeitsvorschrift zur Immunisierung kann von Fachleuten ohne übermäßiges Experimentieren ausgewählt werden.
ii. Monoklonale Antikörper
Die Anti-PRO364- oder -PRO175-Antikörper können alternativ dazu monoklonale Antikörper sein. Monoklonale Antikörper können unter Verwendung von Hybridomverfahren, wie beispielsweise jenen, die von Kohler & Milstein, Nature 356, 495 (1975), beschrieben werden, hergestellt werden. In einem Hybridomverfahren wird eine Maus, ein Hamster oder ein anderes geeignetes Wirttier typischerweise mit einem immunisierenden Mittel immunisiert, um Lymphozyten hervorzubringen, die Antikörper produzieren oder zu produzieren in der Lage sind, die sich spezifisch an das immunisierende Mittel binden. Alternativ dazu können die Lymphozyten in vitro immunisiert werden.
Das immunisierende Mittel umfasst typischerweise das PRO364- oder PRO175-Polypeptid oder ein Fusionsprotein davon. Im Allgemeinen werden entweder Lymphozyten des peripheren Bluts („PBLs"), sofern Zellen menschlichen Ursprungs erwünscht sind, oder Milzzellen oder Lymphknotenzellen verwendet, sofern nicht-menschliche Säugetierquellen erwünscht sind. Die Lymphozyten werden dann mit einer sich unbegrenzt vermehrenden Zelllinie unter Verwendung eines geeigneten Fusionsmittels, wie z. B. Polyethylenglykol, fusioniert, um eine Hybridomzelle zu bilden [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 59–103 (1986)]. Sich unbegrenzt vermehrende Zelllinien sind üblicherweise transformierte Säugetierzellen, insbesondere Myelomzellen von Nagetieren, Rindern und Menschen. Üblicherweise werden Ratten- oder Mausmyelomzelllinien verwendet. Die Hybridomzellen können in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert werden, das vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum oder Überleben der nicht fusionierten, sich unbegrenzt vermehrenden Zellen hemmen. Fehlt beispielsweise den Ausgangszellen das Enzym Hypoxanthinguaninphosphoribosyltransferase (HGPRT oder HPRT), so umfasst das Kulturmedium für die Hybridome typischerweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin („HAT-Medium"), Substanzen, die das Wachstum von HGPRT-defizienten Zellen unterbindet.
Bevorzugte, sich unbegrenzt vermehrende Zelllinien sind jene, die wirksam fusionieren, die stabile hochgradige Expression von Antikörper durch die ausgewählten, Antikörper produzierenden Zellen fördern und die auf ein Medium wie beispielsweise HAT-Medium empfindlich sind. Noch bevorzugtere, sich unbegrenzt vermehrende Zelllinien sind Maus-Myelomlinien, die beispielsweise beim Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornien, und bei der American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, erhalten werden können. Menschliche Myelom- und. Maus-Mensch-Heteromyelomzelllinien wurden auch für die Herstellung von menschlichen monoklonalen Antikörpern beschrieben [Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, 51–63 (1987)].
Das Kulturmedium, in dem die Hybridomzellen kultiviert werden, kann dann auf die Gegenwart von monoklonalen Antikörpern, die gegen PRO364 oder PRO175 gerichtet sind, getestet werden. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität von monoklonalen Antikörpern, die durch die Hybridomzellen produziert werden, durch Immunfällung oder durch einen In-vitro-Bindungstest, wie beispielsweise Radioimmuntest (RIA) oder enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung (ELISA), bestimmt. Solche Verfahren und Tests sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Die Bindungsaffinität des monoklonalen Antikörpers kann beispielsweise durch die Scatchard-Analyse von Munson & Pollard, Anal. Biochem. 107, 220 (1980), bestimmt werden.
Nachdem die erwünschten Hybridomzellen identifiziert wurden, können die Klone durch Grenzverdünnungsverfahren subkloniert und mittels herkömmlicher Verfahren gezüchtet werden [Goding, s. o.]. Geeignete Kulturmedien für diesen Zweck umfassen beispielsweise Dulbecco's Modified Eagle's Medium und RPMI-1640-Medium Alternativ dazu können die Hybridomzellen in vivo als Aszites in einem Säugetier gezüchtet werden.
Die monoklonalen Antikörper, die durch die Subklone sekretiert werden, können aus dem Kulturmedium oder der Ascitesflüssigkeit durch herkömmliche Immunglobulinreinigungsverfahren, wie beispielsweise Protein-A-Sepharose, Hydroxylapatitchro matographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie, isoliert oder gereinigt werden.
Die monoklonalen Antikörper können auch durch DNA-Rekombinationsverfahren, wie jenen, die im US-Patent Nr. 4.816.567 beschrieben werden, hergestellt werden. DNA, die für die monoklonalen Antikörper der Erfindung kodiert, kann leicht isoliert und unter Verwendung herkömmlicher Verfahren (z. B. unter Verwendung von Oligonucleotidsonden, die in der Lage sind, sich spezifisch an Gene zu binden, die für die schweren und leichten Ketten von Maus-Antikörper kodieren) sequenziert werden. Die Hybridomzellen der Erfindung dienen als eine bevorzugte Quelle für solche DNA. Nachdem sie isoliert wurde, kann die DNA in Expressionsvektoren platziert werden, die dann in Wirtszellen wie beispielsweise Affen-COS-Zellen, Chinahamster-Eierstock-(CHO-)Zellen oder Myelomzellen transfiziert werden, die sonst kein Immunglobulinprotein produzieren, um die Synthese von monoklonalen Antikörpern in den rekombinanten Wirtszellen zu erreichen. Die DNA kann auch beispielsweise durch Substituieren der Kodiersequenz für menschliche Schwer- und Leichtketten-Konstantdomänen anstelle der homologen Maus-Sequenzen [ US-Patent Nr. 4.816.567 ; Morrison et al., s. o.] oder durch kovalentes Binden der gesamten oder eines Teils der Kodiersequenz für ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid an die Immunglobulin-Kodiersequenz modifiziert werden. Solch ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid kann anstelle der konstanten Domänen eines Antikörpers der Erfindung oder anstelle der variablen Domänen einer Antigen-Bindungsstelle eines Antikörpers der Erfindung eingesetzt werden, um einen zweiwertigen Hybridantikörper zu bilden.
Die Antikörper können einwertige Antikörper sein. Verfahren zur Herstellung einwertiger Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Beispielsweise umfasst ein Verfahren rekombinante Expression von Immunglobulin-Leichtkette und modifizierter -Schwerkette. Die Schwerkette ist im Allgemeinen an einem beliebigen Punkt in der Fc-Region trunkiert, sodass Schwerketten-Vernetzung unterbunden wird. Alternativ dazu werden die relevanten Cysteinreste durch einen anderen Aminosäurerest substituiert oder werden deletiert, um Vernetzung zu unterbinden.
In-vitro-Verfahren sind auch zur Herstellung einwertiger Antikörper geeignet. Verdau von Antikörpern zur Produktion von Fragmenten davon, vorzugsweise Fab-Fragmenten, kann gemäß herkömmlichen Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, durchgeführt werden.
iii. Menschliche und humanisierte Antikörper
Die Anti-PRO364- oder -PRO175-Antikörper der Erfindung können weiters humanisierte Antikörper oder menschliche Antikörper umfassen. Humanisierte Formen von nicht-menschlichen (z. B. Maus-)Antikörpern sind chimäre Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (wie z. B. Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ oder andere Antigen-bindende Subsequenzen von Antikörpern), die eine Mindest-Sequenz, abgeleitet aus nicht-menschlichem Immunglobulin, enthalten. Humanisierte Antikörper umfassen menschliche Immunglobuline (Akzeptorantikörper), in denen Reste aus einer CDR des Akzeptors durch Reste aus einer CDR einer nicht-menschlichen Spezies (Donorantikörper) wie Maus, Ratte oder Kaninchen mit der erwünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt sind. In manchen Fällen sind Fv-Gerüstreste des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nicht-menschliche Reste ersetzt. Humanisierte Antikörper können auch Reste umfassen, die weder im Akzeptorantikörper noch in den importierten CDR- oder Gerüstsequenzen zu finden sind. Im Allgemeinen umfasst der humanisierte Antikörper im Wesentlichen die gesamte von zumindest einer, und typischerweise zwei, variablen Domänen, in denen alle oder im Wesentlichen alle der CDR-Regionen jenen eines nicht-menschlichen Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle der FR-Regionen jene einer menschlichen Immunglobulin-Consensussequenz sind. Die humanisierten Antikörper umfassen vorzugsweise auch zumindest einen Abschnitt einer konstanten Immunglobulinregion (Fc), typischerweise jenen eines menschlichen Immunglobulins [Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323–329 (1988); und Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593–596 (1992)].
Verfahren zur Humanisierung nicht-menschlicher Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Im Allgemeinen weist ein humanisierter Antikörper einen oder mehrere Aminosäurereste auf, die in ihn aus einer Quelle eingeführt wurden, die nicht-menschlich ist. Diese nicht-menschlichen Aminosäurereste werden oft als „Import"-Reste bezeichnet, die typischerweise aus einer variablen „Import"-Domäne genommen werden. Humanisierung kann im Wesentlichen gemäß dem Verfahren von Winter und Mitarbeitern [Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323–327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534–1536 (1988)] durch Substituieren von Nagetier-CDRs- oder -CDR-Sequenzen anstelle der entsprechenden Sequenzen eines menschlichen Antikörpers durchgeführt werden. Demgemäß sind solche „humanisierten" Antikörper Hybridantikörper ( US-Patent Nr. 4.816.567 ), worin wesentlich weniger als eine intakte menschliche variable Domäne durch die entsprechende Sequenz aus einer nicht-menschlichen Spezies substituiert wurde. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise menschliche Antikörper, in denen manche CDR-Reste und möglicherweise manche FR-Reste durch Reste aus analogen Stellen in Nagetierantikörpern ersetzt sind.
Menschliche Antikörper können auch unter Verwendung verschiedener Techniken, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, einschließlich Phagendisplay-Bibliotheken [Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227, 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991)], hergestellt werden. Die Verfahren von Cole et al. und Boerner et al. sind auch zur Herstellung von menschlichen monoklonalen Antikörpern geeignet [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, S. 77 (1985), und Boerner et al., J. Immunol. 147(1), 86–95 (1991)]. Auf ähnliche Weise können menschliche Antikörper durch Einführen menschlicher Immunglobulinloci in transgene Tiere, z. B. Mäuse, in denen die endogenen Immunglobulingene teilweise oder vollständig deaktiviert wurden, hergestellt werden. Bei Provokation wird menschliche Antikörperproduktion beobachtet, die jener in allen Aspekten sehr stark ähnlich ist, die in Menschen selbst beobachtet wurde, einschließlich Genneuanordnung, Anordnung und Antikörperrepertoire. Dieser Ansatz wird beispielsweise in den US-Patenten Nr. 5.545.807 ; 5.545.806 ; 5.569.825 ; 5.625.126 ; 5.633.425 ; 5.661.016 und den folgenden wissenschaftlichen Publikationen beschrieben: Marks et al., Bio/Technology 10, 779–783 (1992); Lonberg et al., Nature 368, 856–859 (1994); Morrison, Nature 368, 812–813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845– 851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg & Huszar, intern. Rev. Immunol. 13, 65–93 (1995).
iv. Bispezifische Antikörper
Bispezifische Antikörper sind monoklonale, vorzugsweise menschliche oder humanisierte, Antikörper, die Bindungsspezifitäten für zumindest zwei verschiedene Antigene aufweisen. Im vorliegenden Fall ist eine der Bindungsspezifitäten für PRO364 oder PRO175, die andere ist für jedes beliebige andere Antigen und vorzugsweise für ein(en) Zelloberflächen-Protein oder -Rezeptor oder eine Rezeptoruntereinheit.
Verfahren zur Herstellung bispezifischer Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Herkömmlicherweise basiert die Produktion von bispezifischen Antikörpern auf der Co-Expression von zwei Immunglobulin-Schwerketten/Leichtketten-Paaren, worin die zwei schweren Ketten unterschiedliche Spezifitäten aufweisen [Milstein & Cuello, Nature 305, 537–539 (1983)]. Aufgrund der zufälligen Auswahl an Immunglobulinschwer- und -leichtketten produzieren diese Hybridome (Quadrome) ein potenzielles Gemisch von zehn verschiedenen Antikörpermolekülen, von denen nur eines die korrekte bispezifische Struktur aufweist. Die Reinigung des korrekten Moleküls erfolgt üblicherweise durch Affinitätschromatographieschritte. Ähnliche Verfahren sind in der WO 93/08829 , veröffentlicht am 13. Mai 1993, und in Traunecker et al., EMBO J. 10, 3655–3659 (1991), offenbart.
Variable Antikörperdomänen mit den erwünschten Bindungsspezifitäten (Antikörper-Antigen-Kombinationsstellen) können an Immunglobulinkonstantdomänen-Sequenzen fusioniert werden. Die Fusion erfolgt vorzugsweise mit einer Immunglobulin-Schwerkettenkonstantdomäne, umfassend zumindest einen Teil der Gelenks-, CH2- und CH3-Regionen. Es wird bevorzugt, dass die erste Schwerketten-Konstantregion (CH1) die Stelle enthält, die für Leichtkettenbindung, vorhanden in zumindest einer der Fusionen, erforderlich ist. DNAs, die für die Immunglobulin-Schwerkettenfusionen und, sofern erwünscht, für die Immunglobulin-Leichtkette kodieren, werden in getrennte Expressionsvektoren insertiert und werden in geeignete Wirtsorganismen co- transfiziert. Für nähere Details zur Herstellung von bispezifischen Antikörpern siehe beispielsweise Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 210 (1986).
v. Heterokonjugierte Antikörper
Heterokonjugierte Antikörper setzen sich aus zwei kovalent gebundenen Antikörpern zusammen. Solche Antikörper wurden beispielsweise vorgeschlagen, um Immunsystemzellen auf unerwünschte Zellen zu richten [ US-Patent Nr. 4.676.980 ] sowie zur Behandlung von HIV-Infektion [ WO 91/00360 ; WO 92/200373 ; EP 03089 ]. Es wird erwogen, dass die Antikörper in vitro unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Gebiet der synthetischen Proteinchemie bekannt sind, hergestellt werden können, einschließlich jener, die Vernetzungsmittel einbinden. Beispielsweise können Immunotoxine unter Verwendung einer Disulfid-Austauschreaktion oder durch Bildung einer Thioetherbindung konstruiert werden. Beispiele für geeignete Reagenzien für diesen Zweck umfassen Iminothiolat und Methyl-4-mercaptobutyrimidat sowie jene Reagenzien, die beispielsweise im US-Patent Nr. 4.676.980 offenbart sind.
vi. Effektorfunktionsbearbeitung
Es kann wünschenswert sein, den Antikörper der Erfindung hinsichtlich der Effektorfunktion zu modifizieren, um z. B. die Wirksamkeit des Antikörpers bei der Behandlung von Krebs zu steigern. Beispielsweise können ein oder mehrere Cysteinreste in die Fc-Region eingeführt werden, wodurch die Bildung von Disulfidbindungen zwischen den Ketten in dieser Region ermöglicht wird. Der so gebildete homodimere Antikörper kann verbesserte Internalisierungsfähigkeit und/oder gesteigertes komplementvermitteltes Zelltöten und antikörpervermittelte zelluläre Zytotoxizität (ADCC) aufweisen. Siehe Caron et al., J. Exp. Med. 176, 1191–1195 (1992), und Shopes, J. Immunol. 148, 2918–2922 (1992). Homodimere Antikörper mit gesteigerter Anti-Tumor-Aktivität können auch unter Verwendung heterobifunktioneller Vernetzer hergestellt werden, wie in Wolff et al., Cancer Research 53, 2560–2565 (1993), beschrieben wird. Alternativ dazu kann ein Antikörper so bearbeitet werden, dass er duale Fc-Regionen aufweist und dadurch über gesteigerte Komplementlyse- und ADCC-Fähigkeiten verfügen kann. Siehe Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3, 219–230 (1989).
vii. Immunkonjugate
Die Erfindung betrifft auch Immunkonjugate, die einen Antikörper umfassen, der an ein zytotoxisches Mittel wie beispielsweise ein chemotherapeutisches Mittel, Toxin (z. B. ein enzymatisch aktives Toxin bakteriellen, pflanzlichen oder tierischen Ursprungs oder auch von Pilzen oder Fragmente davon) oder an ein radioaktives Isotop konjugiert ist (d. h. ein Radiokonjugat).
Chemotherapeutische Mittel, die zur Herstellung solcher Immunkonjugate nützlich sind, wurden oben beschrieben. Enzymatisch aktive Toxine und Fragmente davon, die verwendet werden können, umfassen Diphtherie-A-Kette, nichtbindende aktive Fragmente von Diphtherietoxin, Exotoxin-A-Kette (aus Pseudomonas aeruginosa), Ricin-A-Kette, Abrin-A-Kette, Modeccin-A-Kette, alpha-Sarcin, Aleurites-fordii-Proteine, Dianthin-Proteine, Phytolaca-americana-Proteine (PAPI, PAPII und PAP-S), Momordica-charantia-Inhibitor, Curcin, Crotin, Sapaonaria-officinalis-Inhibitor, Gelonin, Mitogellin, Restrictocin, Phenomycin, Enomycin und die Tricothecene. Zahlreiche verschiedene Radionuclide sind zur Herstellung von radiokonjugierten Antikörpern erhältlich. Beispiele umfassen ²¹²Bi, ¹³¹I, ¹³¹In, ⁹⁰Y und ¹⁸⁶Re.
Konjugate des Antikörpers und des zytotoxischen Mittels werden unter Verwendung zahlreicher verschiedener bifunktioneller Proteinbindungsmittel wie z. B. N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionat (SPDP), Iminothiolan (IT), bifunktionellen Derivaten von Imidoestern (wie z. B. Dimethyladipimidat-HCl), aktiver Ester (wie z. B. Disuccinimidylsuberat), Aldehyden (wie Glutaraldehyd), Bisazido-Verbindungen (wie z. B. Bis(p-azidobenzoyl)hexandiamin), Bisdiazonium-Derivaten (wie z. B. Bis(p-diazoniumbenzoyl)ethylendiamin), Diisocyanaten (wie Toluol-2,6-diisocyanat) und bis-aktiven Fluorverbindungen (wie z. B. 1,5-Difluor-2,4-dinitrobenzol) hergestellt. Beispielsweise kann ein Ricinimmunotoxin wie in Vitetta et al., Science 238, 1098 (1987), beschrieben hergestellt werden. C-14-markierte 1-Isothiocyanatobenzyl-3- methyldiethylentriaminpentaessigsäure (MX-DTPA) ist ein beispielhafter Chelatbildner zur Konjugation von Radionucleotid an den Antikörper. Siehe die WO 94/11026 .
In einer anderen Ausführungsform kann der Antikörper an einen „Rezeptor" (wie Streptavidin) zur Verwendung bei Tumor-Pretargeting konjugiert werden, worin das Antikörper-Rezeptor-Konjugat dem Patienten verabreicht wird, gefolgt von der Entfernung ungebundenen Konjugats aus dem Blutkreislauf unter Verwendung eines Klärungsmittels und der anschließenden Verabreichung eines „Liganden" (z. B. Avidin), der an ein zytotoxisches Mittel (z. B. ein Radionucleotid) konjugiert ist.
viii. Immunoliposomen
Die hierin offenbarten Antikörper können auch als Immunoliposomen formuliert werden. Liposomen, die den Antikörper enthalten, werden durch auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren hergestellt, wie sie beispielsweise in Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030 (1980); und den US-Patenten Nr. 4.485.045 und 4.544.545 beschrieben werden. Liposomen mit gesteigerter Zirkulationsdauer sind im US-Patent Nr. 5.013.556 offenbart.
Besonders nützliche Liposomen können durch das Umkehrphasenverdampfungsverfahren mit einer Lipidzusammensetzung, die Phosphatidylcholin, Cholesterin und PEG-derivatisiertes Phosphatidylethanolamin (PEG-PE) umfasst, hergestellt werden. Liposomen werden durch Filter von definierter Porengröße filtriert, um Liposomen mit dem erwünschten Durchmesser zu ergeben. Fab'-Fragmente des Antikörpers der vorliegenden Erfindung können an die Liposomen wie in Martin et al., J. Biol. Chem. 257, 286–288 (1982), beschrieben mittels einer Disulfid-Austauschreaktion konjugiert werden. Ein chemotherapeutisches Mittel (wie beispielsweise Doxorubicin) ist gegebenenfalls im Liposom enthalten. Siehe Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19), 1484 (1989).
ix. Pharmazeutische Zusammensetzungen von Antikörpern
Antikörper, die spezifisch an ein hierin identifiziertes PRO364- oder PRO175-Polypeptid binden, sowie andere Moleküle, die durch die zuvor offenbarten Screeningtests identifiziert wurden, können zur Behandlung von verschiedenen Erkrankungen in Form von pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden.
Ist das PRO364- oder PRO175-Polypeptid intrazellulär und werden ganze Antikörper als Inhibitoren verwendet, werden internalisierende Antikörper bevorzugt. Es können jedoch auch Lipofektionen oder Liposomen verwendet werden, um den Antikörper oder ein Antikörperfragment an Zellen abzugeben. Werden Antikörperfragmente verwendet, so wird das kleinste Inhibitionsfragment, das sich spezifisch an die Bindungsdomäne des Targetproteins bindet, bevorzugt. Beispielsweise können auf Grundlage der Sequenzen der variablen Regionen eines Antikörpers Peptidmoleküle entworfen werden, die die Fähigkeit beibehalten, die Target-Proteinsequenz zu binden. Solche Peptide können chemisch synthetisiert und/oder durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden. Siehe z. B. Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889–7893 (1993).
Die Formulierung hierin kann auch mehr als nur eine aktive Verbindung als für die bestimmte zu behandelnde Indikation erforderlich ist enthalten, vorzugsweise jene mit komplementären Aktivitäten, die sich gegenseitig nicht negativ beeinflussen. Alternativ oder zusätzlich dazu kann die Zusammensetzung ein Mittel umfassen, das ihre Funktion steigert, wie beispielsweise ein zytotoxisches Mittel, Zytokin, ein chemotherapeutisches Mittel oder ein wachstumshemmendes Mittel. Solche Moleküle sind geeigneterweise in Kombination in Mengen vorhanden, die für die beabsichtigten Zwecke wirksam sind.
Die Wirkstoffe können auch in Mikrokapseln eingekapselt werden, beispielsweise durch Koazervierungsverfahren oder durch Grenzflächenpolymerisation, z. B. in Hydroxymethylcellulose- oder Gelatine-Mikrokapseln bzw. Poly(methylmethacrylat)-Mikrokapseln, in kolloidale Wirkstoffzufuhrsysteme (z. B. Liposomen, Albuminmikro kügelchen, Mikroemulsionen, Nanopartikeln und Nanokapseln) oder in Makroemulsionen. Solche Verfahren sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, s. o., offenbart.
Die Formulierungen, die zur In-vivo-Verabreichung verwendet werden, müssen steril sein. Dies kann leicht mittels Filtration durch sterile Filtermembranen erreicht werden.
Es können Retardpräparate hergestellt werden. Geeignete Beispiele für Retardpräparate umfassen semipermeable Matrizen von festen hydrophoben Polymeren, die den Antikörper enthalten, wobei die Matrizen in Form von Formstücken, z. B. Filmen oder Mikrokapseln, vorliegen. Beispiele für Retard-Matrizen umfassen Polyester, Hydrogele (z. B. Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) oder Poly(vinylalkohol)), Polylactide ( US-Patent Nr. 3.773.919 ), Copolymere von L-Glutaminsäure und γ-Ethyl-L-glutamat, nicht abbaubares Ethylenvinylacetat, abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere wie z. B. LUPRON DEPOT^TM (injizierbare Mikrokügelchen, zusammengesetzt aus Milch-Glykolsäure-Copolymer und Leuprolidacetat) und Poly-D-(-)-3-hydroxybuttersäure. Während Polymere wie z. B. Ethylenvinylacetat und Milchsäure-Glykolsäure die Freisetzung von Molekülen über eine Zeitspanne von 100 Tagen ermöglichen, setzen bestimmte Hydrogele Proteine über kürzere Zeitspannen hinweg frei. Verbleiben eingekapselte Antikörper über eine längere Zeit im Körper, so können sie als ein Resultat von Aussetzung gegenüber Feuchtigkeit bei 37°C denaturieren oder aggregieren, was zu einem Verlust von biologischer Aktivität und möglichen Veränderungen der Immunogenität führen kann. Je nach vorliegendem Mechanismus können rationale Vorgehensweisen zur Stabilisierung entwickelt werden. Ist der gefundene Aggregationsmechanismus beispielsweise intermolekulare S-S-Bindungsbildung durch Thiodisulfidaustausch, so kann Stabilisierung durch Modifikation von Sulfhydrylresten, Lyophilisierung aus sauren Lösungen, Steuerung des Feuchtigkeitsgehalts, Verwendung geeigneter Additive und Entwicklung spezifischer Polymermatrizenzusammensetzungen erreicht werden.
x. Behandlungsverfahren unter Einsatz des Antikörpers
Es wird erwogen, dass die Antikörper für PRO-364- oder PRO175-Polypeptide eingesetzt werden können, um, wie oben angeführt, verschiedene kardiovaskuläre, endotheliale und angiogene Erkrankungen zu behandeln.
Die Antikörper werden einem Säugetier, vorzugsweise einem Menschen, gemäß bekannten Verfahren, wie z. B. durch intravenöse Verabreichung in Form eines Bolus oder durch kontinuierliche Infusion über einen bestimmten Zeitraum hinweg, auf intramuskulärem, intraperitonealem, intracerebrospinalem, subkutanem, intraartikulärem, intrasynovialem, intrathekalem, oralem, topischem Weg oder auf dem Inhalationsweg verabreicht werden. Die intravenöse Verabreichung des Antikörpers ist zu bevorzugen.
Weitere Therapieschemata können mit der Verabreichung von erfindungsgemäßen Antikörpern, wie oben angeführt, kombiniert werden. Wenn die Antikörper beispielsweise zur Behandlung von Krebs eingesetzt werden sollen, kann der Patient, der mit solchen Antikörpern behandelt werden soll, auch eine Bestrahlungstherapie erhalten. Alternativ oder zusätzlich dazu kann dem Patienten auch ein chemotherapeutisches Mittel verabreicht werden. Die Herstellungs- und Dosierungspläne für solche chemotherapeutischen Mittel können gemäß den Herstellerhinweisen oder wie durch Fachleute auf empirischem Weg bestimmt eingesetzt werden. Die Herstellungs- und Dosierungsschemata für solche Chemotherapien werden auch in M. C. Perry (Hrsg.), Chemotherapy Service, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992), beschrieben. Das chemotherapeutische Mittel kann vor oder nach der Verabreichung des Antikörpers oder gleichzeitig mit diesem verabreicht werden: Der Antikörper kann mit einer Anti-Ostrogen-Verbindung, wie z. B. Tamoxifen oder EVISTA^TM, oder einem Anti-Progesteron, wie z. B. Onapriston (siehe EP 616812 ), in für solche Moleküle bekannten Dosierungen kombiniert werden.
Wenn die Antikörper zur Behandlung von Krebs eingesetzt werden, kann es wünschenswert sein, auch Antikörper gegen andere Antigene in Verbindung mit Tumoren zu verabreichen, wie z. B. Antikörper, die an einen oder mehrere der ErbB2-, EGFR-, ErbB3-, ErbB4- oder VEGF-Rezeptor(en) binden. Diese umfassen auch die oben angeführten Mittel. Der Antikörper wird auf geeignete Weise auch seriell oder in Kombination mit radiologischen Behandlungen verabreicht, unabhängig davon, ob es sich um eine Bestrahlung oder die Verabreichung von radioaktiven Substanzen handelt. Alternativ oder zusätzlich dazu können zwei oder mehrere Antikörper, die an dasselbe oder zwei oder mehrere verschiedene hierin offenbarte Antigene binden, dem Patienten gemeinsam verabreicht werden. Manchmal kann es nützlich sein, dem Patienten auch zwei oder mehrere Zytokine zu verabreichen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Antikörper hierin gemeinsam mit einem wachstumshemmenden Mittel verabreicht. Das wachstumshemmende Mittel kann beispielsweise zuerst verabreicht werden, wonach ein Antikörper der vorliegenden Erfindung verabreicht wird. Die gleichzeitige Verabreichung oder die Verabreichung des Antikörpers vor dem wachstumshemmenden Mittel werden jedoch auch in Betracht gezogen. Geeignete Dosierungen für das wachstumshemmende Mittel entsprechen jenen, die derzeit eingesetzt werden, und können aufgrund der kombinierten Wirkung (Synergie) des wachstumshemmenden Mittels und des Antikörpers hierin gesenkt werden.
In einer Ausführungsform wird die Gefäßbildung von Tumoren durch eine Kombinationstherapie angegriffen. Das Anti-PRO364- oder -PRO175-Polypeptid und ein anderer Antikörper (z. B. Anti-VEGF) werden Patienten, die an einem Tumor leiden, in therapeutisch wirksamen Dosierungen verabreicht, wie beispielsweise durch die Beobachtung der Nekrose des Tumors oder, bei Vorhandensein, der Metastasenherde bestimmt. Diese Therapie wird so lange fortgesetzt, bis keine weitere nützliche Wirkung mehr zu beobachten ist oder eine klinische Untersuchung keine Spur des Tumors oder etwaiger Metastasenherde mehr zeigt. Dann wird TNF verabreicht, allein oder in Kombination mit einem Hilfsmittel, wie z. B. α-, β- oder γ-Interferon, Anti-HER2-Antiköprer, Heregulin, Anti-Heregulin-Antikörper, D-Faktor, Interleukin-1 (IL-2), Interleukin-2 (IL-2), Granulozyten-Markophagen-Kolonien-stimulierendem Faktor (GM-CSF) oder mit Mitteln, die die mikrovaskuläre Gerinnung in Tumoren fördern, wie z. B. Anti-Protein-C-Antikörper, Anti-Protein-S-Antikörper oder C4b-Bindungs- Protein (siehe WO 91/01753 , veröffentlicht am 21. Februar 1991) oder mit Wärme oder Bestrahlung.
Da die Wirksamkeit der Hilfsmittel variiert, ist es wünschenswert, ihren Einfluss auf den Tumor durch Matrixscreening auf herkömmliche Weise zu vergleichen. Die Verabreichung von Anti-PRO364- oder Anti-PRO175-Polypeptid-Antikörper und TNF wird wiederholt, bis die erwünschte klinische Wirkung erzielt wurde. Alternativ dazu wird der Anti-PRO364- oder Anti-PRO175-Polypeptid-Antikörper gemeinsam mit TNF und gegebenenfalls mit einem Hilfsmittel/Hilfsmitteln verabreicht. Wenn feste Tumoren in den Gliedmaßen oder an anderen Orten vorhanden sind, die von dem Gesamtblutkreislauf isoliert werden können, werden die hierin beschriebenen Wirkstoffe dem isolierten Tumor oder Organ verabreicht. In anderen Ausführungsformen wird ein FGF- oder PDGF-Antagonist, wie z. B. ein neutralisierender Anti-FGF- oder ein Anti-PDGF-Antikörper, dem Patienten in Verbindung mit dem Anti-PRO364- oder dem Anti-PRO175-Polypeptid-Antikörper verabreicht. Die Behandlung mit Anti-PRO364- oder Anti-PRO175-Polypeptid-Antikörpern wird in Phasen der Wundheilung oder wünschenswerter Gefäßneubildung vorzugsweise ausgesetzt.
Zur Prävention oder Behandlung von kardiovaskulären, endothelialen und angiogenen Störungen hängt die geeignete Dosierung des hierin offenbarten Antikörpers von der Art der wie oben definierten, zu behandelnden Störung, der Schwere und dem Verlauf der Erkrankung, von der Tatsache, ob der Antikörper zu Präventions- oder Therapiezwecken verabreicht wird, von vorhergehenden Therapien, der Krankengeschichte des Patienten und der Reaktion auf den Antikörper sowie dem Ermessen des behandelnden Arztes ab. Der Antikörper wird einem Patienten auf geeignete Weise ein Mal oder im Verlauf einer Behandlungsserie verabreicht.
In Abhängigkeit von der Art und Schwere der Störung handelt es sich beispielsweise bei etwa 1 mg/kg bis 50 mg/kg (z. B. 0,1–20 mg/kg) Antikörper um eine mögliche Anfangsdosis, die dem Patienten verabreicht wird, beispielsweise in Form einer oder mehrerer separater Verabreichungen oder durch kontinuierliche Infusion. Eine typische tägliche oder wöchentliche Dosierung kann in Abhängigkeit von den oben ange führten Faktoren im Bereich von etwa 1 mg/kg bis 100 mg/kg oder mehr liegen. Bei wiederholten Verabreichungen im Verlauf von mehreren Tagen oder mehr wird die Behandlung, in Abhängigkeit von der Erkrankung, wiederholt oder fortgeführt, bis eine gewünschte Hemmung von Symptomen der Störung eintritt. Andere Dosierungsschemata können jedoch auch nützlich sein. Die Fortschritte dieser Therapie können leicht durch herkömmliche Verfahren und Tests, wie z. B. durch radiographische Tumordarstellung, überwacht werden.
xi. Fabrikate mit Antikörpern
Ein Fabrikat, das einen Behälter mit dem Antikörper und ein Etikett umfasst, wird auch bereitgestellt. Solche Fabrikate wurden obenstehend beschrieben, wobei es sich bei dem Wirkstoff um einen Anti-PRO364- oder -PRO175-Antikörper handelt.
xii. Diagnose und Prognose von Tumoren unter Einsatz von Antikörpern
Wenn es sich bei der Indikation, für die die Antikörper eingesetzt werden, um Krebs handelt, finden Zelloberflächenproteine in Verbindung mit PRO364- oder PRO175-Polypeptiden zusätzliche Anwendung in der Diagnose und Prognose von Tumoren, während dieselben Proteine, wie z. B. Wachstumsrezeptoren, die in bestimmten Tumoren überexprimiert werden, hervorragende Ziele für Arzneimittelkandidaten oder Tumor-(z. B. Krebs-)behandlung sind. Gegen die PRO364- oder PRO175-Polypeptide gerichtete Antikörper können beispielsweise als Tumordiagnose- oder -prognosemittel eingesetzt werden.
Antikörper, einschließlich Antikörperfragmente, können beispielsweise qualitativ oder quantitativ eingesetzt werden, um die Expression von Genen zu detektieren, einschließlich des Gens, das für das PRO364- oder PRO175-Polypeptid kodiert. Der Antikörper ist vorzugsweise mit einer detektierbaren, z. B. fluoreszierenden, Markierung versehen, und die Bindung kann durch Lichtmikroskopie, Durchflusszytometrie, Fluorimetrie oder andere auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren überprüft werden. Solche Bindungstests werden im Wesentlichen wie oben beschrieben durchgeführt.
Die In-situ-Detektion der Bindung von Antikörpern an Markergenprodukte kann beispielsweise mittels Immunfluoreszenz- oder Immunelektronenmikroskopie erfolgen. Zu diesem Zweck wird eine histologische Probe aus dem Patienten entnommen, und ein markierter Antikörper wird auf diese angewandt, vorzugsweise indem der Antikörper über eine biologische Probe geschichtet wird. Dieses Verfahren ermöglicht auch die Bestimmung der Verteilung des Markergenprodukts in dem untersuchten Gewebe. Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung ist klar, dass viele verschiedene histologische Verfahren für die In-situ-Detektion zur Verfügung stehen.
Die folgenden Beispiele dienen ausschließlich der Veranschaulichung und sollen den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung auf keine Weise einschränken.
Die Offenbarungen aller in der vorliegenden Beschreibung zitierten Patent- und Literaturquellen werden hiermit in ihrer Gesamtheit hierin aufgenommen.
BEISPIELE
Im Handel erhältliche Reagenzien, auf die in den Beispielen verwiesen wird, wurden, außer anders angemerkt, gemäß den Vorschriften der Hersteller verwendet. Die Quelle jener Zellen, die in den folgenden Beispielen und in der gesamten Beschreibung durch ATCC-Zugriffsnummern identifiziert werden, ist die American Type Culture Collection, Manassas, VA. Wenn nicht anders angegeben werden in der vorliegenden Erfindung herkömmliche Verfahren der DNA-Rekombinationstechnologie eingesetzt, wie z. B. die obenstehend und in folgenden Lehrbüchern beschriebenen: Sambrook et al., s. o.; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, NY (1990); Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., NY (1990); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor (1988); Gait, Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, Oxford (1984); Freshney, Animal Cell Culture (1987); Coligan et al., Current Protocols in Immunology (1991).
BEISPIEL 1
Isolation von cDNA-Klonen, die für menschliches PRO364 kodieren.
Eine exprimierte Sequenzmarkierungs-(EST-)DNA-Datenbank (LIFESEQ^TM, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, Kalif.) wurde durchsucht, und eine EST (Incyte EST Nr. 3003460) wurde identifiziert, die Homologie mit den Mitgliedern der Tumornekrosefaktorrezeptor-(TNFR-)Polypeptidfamilie aufwies.
Eine Consensus-DNA-Sequenz wurde dann unter Einsatz von wiederholten BLAST-Zyklen (Altshul et al., Methods in Enzymology 266, 460–480 (1996)) und „phrap"-Zyklen (Phil Green, University of Washington, Seattle, http://bozeman.mbt.washington.edu/phrap.docs.phrap.html) bezogen auf die Incyte-3003640-EST und andere EST-Sequenzen assembliert. Diese Consensussequenz wird hierin in 3A–C als „<consen01>" bezeichnet. Die in 3A–C angeführte „<consen01>"-Consensussequenz (Seq.-ID Nr. 4) wird hierin auch als „DNA44825" bezeichnet (siehe 4, Seq.-ID Nr. 4).
Basierend auf den in 3–4 dargestellten DNA44825- und „<consen01>"-Consensussequenzen wurden Oligonucleotide synthetisiert, 1) zur Identifikation einer cDNA-Bibliothek, die die Sequenz von Interesse enthielt, mittels PCR und 2) zum Einsatz als Sonden zur Isolation eines Klons der Kodiersequenz voller Länge für PRO364. Vorwärts- und Rückwärts-PCR-Primer liegen im Allgemeinen im Beeich von 20 bis 30 Nucleotiden und werden oft so gestaltet, dass sie ein PCR-Produkt mit einer Länge von etwa 100–1000 bp liefern. Die Sondensequenzen sind typischerweise 40–55 bp lang. In manchen Fällen werden zusätzliche Oligonucleotide synthetisiert, wenn die Consensussequenz länger als etwa 1–1,5 kbp ist. Um mehrere Bibliotheken auf einen Volllängenklon zu screenen, wurde DNA aus den Bibliotheken durch PCR-Amplifikation, wie von Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Bio logy, beschrieben, mit dem PCR-Primerpaar gescreent. Eine positive Bibliothek wurde dann verwendet, um unter Verwendung des Sonden-Oligonucleotids und eines der Primerpaare Klone zu isolieren, die für das Gen von Interesse kodieren.
(Vorwärts- und Rückwärts-)PCR-Primerpaare wurden synthetisiert:
Vorwärts-PCR-Primer (44825.f1): 5'-CACAGCACGGGGCGATGGG-3' (Seq.-ID Nr. 6)
Vorwärts-PCR-Primer (44825.f2): 5'-GCTCTGCGTTCTGCTCTG-3' (Seq.-ID Nr. 11)
Vorwärts-PCR-Primer (44825.GITR.f): 5'-GGCACAGCACGGGGCGATGGGCGCGTTT-3' (Seq.-ID Nr. 5)
Rückwärts-PCR-Primer (44825.r1): 5'-CTGGTCACTGCCACCTTCCTGCAC-3' (Seq.-ID Nr. 12)
Rückwärts-PCR-Primer (44825.r2): 5'-CGCTGACCCAGGCTGAG-3' (Seq.-ID Nr. 8)
Rückwärts-PCR-Primer (44825.GITR.r): 5'-GAAGGTCCCCGAGGCACAGTCGATACA-3' (Seq.-ID Nr. 10)
Zusätzlich dazu wurden synthetische Oligonucleotidhybridisierungssonden aus der Consensus-DNA44825-Sequenz gebildet, die folgende Nucleotidsequenzen aufwiesen:
Hybridisierungssonde (44825.p1):
5'-GAGGAGTGCTGTTCCGAGTGGGACTGCATGTGTGTCCAGC-3' (Seq.-ID Nr. 9)
Hybridisierungssonde (44825.GITR.p2):
5'-AGCCTGGGTCAGCGCCCCACCGGGGGTCCCGGGTGCGGCC-3' (Seq.-ID Nr. 7)
Um mehrere Bibliotheken auf die Quelle eines Volllängenklons zu screenen, wurde DNA aus den Bibliotheken mittels PCR-Amplifikation mit den oben identifizierten Primerpaaren gescreent. Eine positive Bibliothek wurde dann eingesetzt, um Klone, die für das PRO364-Gen kodieren, unter Einsatz der Sondenoligonucleotide und eines der PCR-Primer zu isolieren.
RNA zur Erstellung der cDNA-Bibliotheken wurde aus menschlichem Knochenmarkgewebe isoliert. Die cDNA-Bibliotheken, die zur Isolation der cDNA-Klone eingesetzt wurden, wurden durch herkömmliche Verfahren unter Einsatz von im Handel erhältlichen Reagenzien, wie z. B. jenen von Invitrogen, San Diego, Kalif., erstellt. Die cDNA wurde mit Oligo-dT, das eine NotI-Stelle enthielt, geprimt, mit dem Blunt-Ende an Sa-II-hemikinasierte Adaptoren gebunden, mit NotI gespalten, mittels Gelelektrophorese auf geeignete Weise dimensioniert und in einer definierten Ausrichtung in einen geeigneten Klonierungsvektor (wie z. B. pRKB oder pRKD; pRK5B ist ein Vorläufer von PRK5D, der die SfiI-Stelle nicht aufweist; siehe Holmes et al., Science 253, 1278–1280 (1991)) an den einzigen XhoI- und NotI-Stellen kloniert.
Das DNA-Sequenzieren der wie oben beschrieben isolierten Klone lieferte eine Volllängen-DNA-Sequenz für PRO364 [hierin als UNQ319 (DNA47365-1206) bezeichnet] (Seq.-ID Nr. 1) und die abgeleitete Proteinsequenz für PRO364.
Die gesamte Nucleotidsequenz von UNQ319 (DNA47365-1206) ist in 1 angeführt (Seq.-ID Nr. 1). Der Klon UNQ319 (DNA47365-1206) wurde bei der ATCC hinterlegt und erhielt die ATCC-Hinterlegungs-Nr. ATCC 209436. Der Klon UNQ319 (DNA47365-1206) enthält einen einzigen offenen Leseraster mit einer offensichtlichen Translationsinitiationsstelle an den Nucleotidpositionen 121–123 [Kozak et al., s. o.] und endet an dem Stoppcodon an den Nucleotidpositionen 844–846 (1, Seq.-ID Nr. 1). Der vorhergesagte Polypeptid-Vorläufer ist 241 Aminosäuren lang (2, Seq.-ID Nr. 3). Das in 2 dargestellte PRO364-Protein voller Länge (Seq.-ID Nr. 3) weist ein geschätztes Molekulargewicht von etwa 26.000 Dalton und einen pl von etwa 6,34 auf. Zwischen den Aminosäuren 146 und 149 der in 2 dargestellten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 3) ist eine potentielle N-Glykosylierungsstelle vorhanden. Eine Hydropathie-Analyse (nicht dargestellt) deutete auf eine Transmembran-Typologie vom Typ I hin; von Aminosäure 1 bis 25 ist eine mögliche Signalsequenz vorhanden, und zwischen den Aminosäuren 162 und 180 der in 2 dargestellten Sequenz (Seq.-ID Nr. 3) ist eine potentielle Transmembrandomäne vorhanden.
Die Analyse der Aminosäuresequenz des PRO364-Polypeptids voller Länge deutet darauf hin, dass Abschnitte davon eine Homologie in Bezug auf die Tumornekrosefaktor-Rezeptorfamilie aufweisen, was darauf hindeutet, dass PRO364 ein neues Mitglied der Tumornekrosefaktor-Rezeptorfamilie sein kann. Die intrazelluläre Domäne von PRO364 enthält ein Motiv (im Bereich der Aminosäuren 207–214 in 2: Seq.-ID Nr. 3), das der minimalen Domäne in dem CD30-Rezeptor ähnlich ist, von dem gezeigt wurde, dass er für die TRAF2-Bindung erforderlich ist, und das auch in TNFR2 vorhanden ist (Lee et al., s. o. (1996)). Es gibt drei offensichtliche extrazelluläre Cystein-reiche Domänen, die typisch für die TNFR-Familie sind (siehe Naismith und Sprang, Trends Biochem. Sci. 23, 74–79 (1998)), von denen die dritte CRD 3 anstelle der typischeren 4 oder 6 Cysteine der TNFR-Familie aufweist. Im Vergleich mit Maus-GITR (untenstehend beschrieben) weist die PRO364-Aminosäuresequenz 8 Cysteine in CRD1 auf, während Maus-GITR 5 Cysteine in CRD1 aufweist, und eine potentielle N-gebundene Glykosylierungsstelle ist in der ECD vorhanden, während in Maus-GITR 4 potentielle N-gebundene Glykosylierungsstellen vorhanden sind.
Eine detaillierte Betrachtung der mutmaßlichen Aminosäuresequenz des nativen PRO364-Polypeptids voller Länge und der Nucleotidsequenz, die für diese kodiert, deutet auf eine Sequenzhomologie mit dem Maus-GITR-(mGITR-)Protein hin, über das von Nocentini et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 6216–6221 (1997), berichtet wird. Aus diesem Grund ist es möglich, dass PRO364 das menschliche Gegenstück oder Ortholog zum Maus-GITR-Protein darstellt, über das Nocentini et al. berichten.
BEISPIEL 2
Isolation von menschlichem PRO175
Die in Klein et al., PNAS 93, 7108–7113 (1996), beschriebenen Verfahren wurden mit folgenden Modifikationen eingesetzt. Die Hefetransformation erfolgte unter Einsatz von einschränkenden Mengen transformierender DNA, um die Anzahl mehrfach transformierter Hefezellen zu reduzieren. Anstelle der Plasmidisolierung aus der He fe, auf die die Transformation von E. coli wie in Klein et al., s. o., folgte, wurde eine PCR-Analyse einzelner Hefekolonien durchgeführt. Dies erfolgte durch das erneute Ausstreichen der ursprünglichen Saccharose-positiven Kolonie auf frisches Saccharose-Medium zur Reinigung des positiven Klons. Eine einzige gereinigte Kolonie wurde dann unter Einsatz folgender Primer für eine PCR eingesetzt:
TGTAAAACGACGGCCAGTTTCTCTCAGAGAAACAAGCAAAAC (Seq.-ID Nr. 15) und CAGGAAACAGCTATGACCGAAGTGGACCAAAGGTCTATCGCTA (Seq.-ID Nr. 16). Die PCR-Primer sind zweiteilig, um das Insert und einen kleinen Abschnitt des Invertase-Gens zu amplifizieren (was ermöglicht, zu bestimmen, dass das Insert mit der Invertase im Leseraster war) und universelle Seqenzierprimerstellen hinzuzufügen.
Eine Bibliothek von cDNA-Fragmenten, die von an Invertase fusionierten menschlichen HUVEC-Zellen stammen, wurde in Hefe transformiert, und Transformanten wurden auf SC-URA-Medium ausgewählt. URA und die Transformanten wurden auf Saccharosemedium mehrfachplattiert, um die Klone zu identifizieren, die Invertase sekretieren. Positive Klone wurden dann erneut getestet, und PCR-Produkte wurden sequenziert. Es wurde bestimmt, dass die Sequenz eines Klons, DNA1840, eine Signalpeptidkodiersequenz enthielt. Oligonucleotid-Primer und -Sonden wurden unter Verwendung der Nucleotidsequenz von DNA1840 hergestellt. Eine Volllängenplasmidbibliothek von cDNAs von menschlichen Nabelschnur-Venen-Endothelzellen (HUVEC) wurde aufgetitert, und etwa 100.000 cfu wurden in 192 Pools mit 500 cfu/Pool in 96-Well-Rundboden-Platten ausplattiert. Die Pools wurden über Nacht bei 37°C unter Schütteln (200 U/min) kultiviert. Eine PCR wurde auf die einzelnen Kulturen unter Einsatz von für DNA1840 spezifischen Primern durchgeführt. Eine Agaroseelelektrohorese würde durch efährt, und positive Wells wurden durch die Visualisierung einer Bande der erwarteten Größe identifiziert. Einzelne positive Klone wurden durch Kolonieabhebungen gefolgt von einer Hybridisierung mit ³²P-markiertem Oligonucleotid erhalten. Diese Klone wurden mittels PCR, Restriktionsverdau und Southern-Blot-Analysen charakterisiert.
Ein c-DNA-Klon (DNA119355) wurde vollständig sequenziert. Eine Nucleotidsequenz von PRO175 ist in 5A–B dargestellt (Seq.-ID Nr. 13). Klon PRO175-1150 enthält einen einzigen offenen Leseraster mit einer offensichtlichen Translationsinitiationsstelle an den Nucleotidpositionen 21–23 (Kozak et al., s. o.) (5; Seq.-ID Nr. 13). Der vorhergesagte Polypeptid-Vorläufer ist 177 Aminosäuren lang und weist ein berechnetes Molekulargewicht von etwa 20.308 Dalton auf. Die Hydropathie-Analyse deutet auf eine Transmembranprotein-Typologie vom Typ II mit einer mutmaßlichen zytoplasmatischen Region (Aminosäuren 1–25), einer Transmembranregion (Aminosäuren 26–51) und einer extrazellulären Region (Aminosäuren 52–177) hin. Zwei potentielle N-gebundene Glykosylierungsstellen wurden an Position 129 (Asn) und an Position 161 (Asn) der in 5 dargestellten Sequenz (Seq.-ID Nr. 14) identifiziert. Klon PRO175-1150 wurde bei der ATCC hinterlegt und erhielt die ATCC-Hinterlegungs-Nr. 209466. PRO175-Polypeptid wird durch das Exprimieren des Moleküls erhalten, für das das cDNA-Insert des hinterlegten ATCC-209466-Vektors kodiert, oder ist auf diese Weise erhältlich. Der Verdau des Vektors mit XbaI- und NotI-Restriktionsenzymen liefert ein 1411-bp-Fragment bzw. ein 668-bp-Fragment.
Bezogen auf eine BLAST- und eine FastA-Sequenzanordnungsanalyse (unter Einsatz des ALIGN-Computerprogramms) der extrazellulären Sequenz weist PRO175 eine Aminosäuresequenzidentität mit mehreren Mitgliedern der TNF-Cytokin-Familie und insbesondere mit menschlichem Apo-2L (19,8%), dem Fas/Apo1-Liganden (19,0%), TNF-α (20,6%) und Lymphotoxin-α (17,5%) auf. Der Großteil der Aminosäuresequenzidentität ist in den Regionen vorhanden, die den β-Strängen in der Kristallstruktur von TNF-α entsprechen [Banner et al., Cell 73, 431–435 (1993); Eck et al., J. Biol. Chem. 264, 17595–17605 (1989); Lewit-Bentley et al., J. Mol. Biol. 199, 389–392 (1988)]. Die Sequenz von Strang C ist insbesondere in allen Mitgliedern der Familie erhalten. Die Sequenz zwischen der mutmaßlichen Transmembrandomäne und dem ersten β-Strang des PRO175-Polypeptids ist relativ kurz und umfasst 5 Reste im Vergleich zu etwa 30 bis etwa 80 Resten in TNF-α, CD95L oder dem Apo-2-Liganden.
BEISPIEL 3
Northern-Blot-Analyse von PRO175
Die Expression von PRO175-mRNA in menschlichen Geweben und Tumorzelllinien wurde mittels Northern-Blot-Analyse untersucht (siehe 8). Menschliche RNA-Blots wurden an eine etwa 700 bp lange, ³²P-markierte DNA-Sonde hybridisiert, die durch den Verdau des pRK5-Plasmids, das für PRO175-cDNA voller Länge kodiert, mit Xba-I erzeugt wurde; diese Sonde entspricht der gesamten Kodierungssequenz plus einigen flankierenden 5'- und 3'-Sequenzen.
Menschliche fötale, adulte oder Krebszelllinien-mRNA-Blots (Clontech) wurden mit der DNA-Sonde in Hybridisierungspuffer (5 × SSPE, 2 × Denhardtsche Lösung; 100 mg/ml denaturierte gescherte Lachsspermien-DNA, 50% Formamid, 2% SDS) 60 h lang bei 42°C inkubiert. Die Blots wurden mehrmals 1 h lang bei Raumtemperatur in 2 × SSC, 0,05% SDS gewaschen, worauf 30-minütiges Waschen in 0,1 × SSC, 0,1 SDS bei 50°C folgte. Die Blots wurden entwickelt, nachdem sie über Nacht einer Phosphorimager-Analyse (Fuji) ausgesetzt worden waren.
Wie in 8 gezeigt wurde ein vorherrschendes mRNA-Transkript mit etwa 3,2 kb in fötalen Nieren und Lungen und in adultem Dünndarm detektiert. Die Expression wurde auch in 6 von 8 getesteten menschlichen Tumorzelllinien detektiert, die etwa dasselbe 3,2-kb-Transkript aufwiesen sowie eine schwächere Expression von etwa 1,5- und etwa 5-kb-Transkripten aufwiesen.
Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die mRNA-Expression des PRO175-Polypeptids in normalen Geweben relativ eingeschränkt ist, aber in Tumorzelllinien lymphoiden und nicht-lymphoiden Ursprungs deutlich erhöht ist.
BEISPIEL 4
Test zur Detektion der Expression von PRO364-mRNA in menschlichen Zellen und Geweben
Es wurden Tests zur Untersuchung der Expression von PRO364-mRNA in normalem menschlichem Gewebe und in Krebszelllinien durchgeführt.
Verschiedene menschliche Gewebe und Krebszelllinien (Clontech) wurden mittels Northern-Blot-Hybridisierung zur Detektion von PRO364-Transkripten getestet, wobei jedoch keine detektiert wurden. Unter Einsatz von quantitativer Umkehrtranskriptase-PCR wurde PRO364-mRNA in PBL, Gehirn, Knochenmark, Milz, Thymusdrüse und Lunge und in geringerem Ausmaß in Nieren-, Herz-, Dünndarm- und Lebergeweben detektiert (siehe 6). Das relative mRNA-Expressionsausmaß wurde mittels quantitativer PCR unter Einsatz eines Taqman-Instruments (ABI) im Wesentlichen wie in Heid et al., Genome Res. 6, 986–994 (1996), unter Einsatz von PRO364-spezifischen Primern und fluorogenen Sonden bestimmt:
DNA47365.tm.f – CCACTGAAACCTTGGACAGA (Seq.-ID Nr. 17)
DNA47365.tm.p – CCCAGTTCGGGTTTCTCACTGTGTTCC (Seq.-ID Nr. 18)
DNA47365.tm.r – ACAGCGTTGTGGGTCTTGTTC (Seq.-ID Nr. 19)
Die Authentizität des PCR-Produkts wurde mittels Southern-Blot-Hybridisierung an die entsprechende cDNA bestätigt. Das Expressionsausmaß wurde in Bezug auf Dünndarmgewebe normalisiert.
In einem getrennten Test wurden primäre menschliche T-Zellen (unter Einsatz einer T-Zellen-Anreicherungssäule (R&D Systems) aus Spendervollblut isoliert) und Monozyten/Makrophagen (aus Spendervollblut durch die Haftung an Gewebekulturkolben isoliert) in mit 10% RBS und 2 mM Glutamin ergänztem RPMI gehalten. Die Zellen wurden dann 24 h lang mit PHA (1 μg/ml, Sigma), Anti-CD3-Antikörper (1 μg/ml, Pharmingen), LPS (1 μg/ml, Sigma), TNF-α (1 μg/ml, im Wesentlichen wie in Pennica et al., Nature 312, 724–729 (1984) hergestellt) oder dem löslichen PRO175-Liganden (5 μg/ml) behandelt. Das relative mRNA-Expressionsausmaß wurde dann mittels des oben beschriebenen Taqman-Verfahrens analysiert. Das Expressionsausmaß wurde bezogen auf pufferbehandelte T-Zellen normalisiert.
Die Ergebnisse sind in 7 dargestellt. Eine deutliche Hochregulierung von PRO364-mRNA wurde in isolierten peripheren Blut-T-Zellen nach der Stimulierung durch Phytohämagglutinin (PHA) oder Anti-CD3-Antikörper beobachtet. Ein hohes Expressionsausmaß wurde in isolierten Monozyten/Makrophagen beobachtet, und diese Expression wurde durch LPS weiter gesteigert (siehe 7).
BEISPIEL 5
Expression von PRO175 in E. coli
Die DNA-Sequenz (5A–B; Seq.-ID Nr. 13), die für eine extrazelluläre Region des PRO175-Polypeptids kodiert (Aminosäuren 52 bis 177 aus 5; Seq.-ID Nr. 14), wurde mit PCR-Primern, die flankierende NdeI- bzw. XbaI-Restriktionsstellen enthielten, amplifiziert: Vorwärts: 5'-GAC GAC AAG CAT ATG TTA GAG ACT GCT AAG GAG CCC TG-3' (Seq.-ID Nr. 20); Rückwärts: 5'-TAG CAG CCG GAT CCT AGG AGA TGA ATT GGG GATT-3' (Seq.-ID Nr. 21). Die PCR wurde verdaut und in die NdeI- und XbaI-Stellen des Plasmids pET19B (Novagen) stromab und im Leseraster einer Met-Gly-His₁₀-Sequenz, gefolgt von einer Enterokinase-Spaltungsstelle mit 12 Aminosäuren (von dem Plasmid abgeleitet) kloniert:
Met Gly His His His His His His His His His His Ser Ser Gly His Ile Asp Asp Asp Asp Lys His Met (Seq.-ID Nr. 22).
Das resultierende Plasmid wurde eingesetzt, um den E.-coli-Stamm JM109 (ATCC 53323) unter Einsatz der in Sambrook et al., s. o., beschriebenen Verfahren zu transformieren. Transformanten wurden mittels PCR identifiziert. Plasmid-DNA wurde isoliert und mittels Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzieren bestätigt.
Ausgewählte Klone wurden über Nacht in flüssigem LB-Nährmedium, ergänzt mit Antibiotika, gezüchtet. Die Übernacht-Kultur wurde in weiterer Folge verwendet, um eine Kultur größeren Ausmaßes zu inokulieren. Die Zellen wurden dann bis zu einer erwünschten optischen Dichte gezüchtet, währenddessen der Expressionspromotor angeschaltet ist.
Nach dem Kultivieren der Zellen über mehrere weitere Stunden hinweg können die Zellen durch Zentrifugation geerntet werden. Das durch die Zentrifugation erhaltene Zellpellet wurde unter Verwendung eines Mikroverflüssigungsmittels in einem Puffer, der 0,1 M Tris, 0,2 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 8,0, enthielt, solubilisiert. Das solubilisierte PRO175-Protein wurde durch Nickel-Sepharose-Affinitätschromatographie gereinigt.
Das PRO175-Protein wurde mittels SDS-PAGE gefolgt von einem Western-Blotting mit nickelkonjugierter Meerrettichperoxidase gefolgt von ECL-Detektion (Boehringer Mannheim) analysiert. Drei vorherrschende Proteinbanden wurden detektiert, die in Bezug auf ihre Größe den monomeren, homodimeren und homotrimeren Formen des Proteins entsprachen (9). Basierend auf diesem Ergebnis wird angenommen, dass lösliches PRO175-Protein in nativer Form bei fehlender SDS-Denaturierung zur Bildung von Homotrimeren in der Lage ist.
BEISPIEL 6
Bindungsspezifität von PRO175 für den PRO364-Rezeptor
Es wurden Tests durchgeführt, um zu bestimmen, ob das PRO175-Polypeptid (obenstehend in Beispiel 2, 3 und 5 beschrieben) mit PRO364, von dem angenommen wird, dass es sich um ein menschliches Ortholog des von Nocentini et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 6216–6221 (1997), beschriebenen Maus-GITR-(m-GITR-)Polypeptids handelt, in Wechselwirkung tritt und spezifisch an dieses bindet.
Um einen Bindungstest durchzuführen, wurde ein lösliches Immunglobulinfusionsprotein (Immunadhäsin), das eine extrazelluläre PRO364-Domäne (siehe Aminosäuren 1–161 in 2, Seq.-ID Nr. 3) umfasste, in Insektenzellen exprimiert. Die PRO364-ECD wurde als C-terminale, IgG-Fc-markierte Form in Insektenzellen unter Einsatz von Baculovirus exprimiert. Ein lösliches PRO175-Polypeptid wurde durch die Expression einer ECD wie obenstehend in Beispiel 5 beschrieben hergestellt.
Das lösliche PRO175-ECD-Molekül wurde zur Überprüfung seiner Fähigkeit, mit dem PRO364-Immunadhäsin in Wechselwirkung zu treten, mit ¹²⁵I markiert. Zum Vergleich wurden auch Immunadhäsin-Konstrukte folgender TNF-Rezeptorfamilienmitglieder angefertigt: CD95, DR4, DR5, TNFR1, TNFR2 und Apo-3. CD95-, DR4-, DR5-, TNFR1-, TNFR2- und Apo-3-Immunadhäsine wurden durch die Fusion der ECD jedes Rezeptors an die Gelenks- und Fc-Abschnitte von menschlichem IgG wie zuvor für TNFR1 beschrieben [Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 10535–10539 (1991)] hergestellt. Die jeweiligen TNF-Rezeptorfamilienmitglieder werden im Abschnitt „Hintergrund der Erfindung" beschrieben (und relevante Verweise werden zitiert).
Für den Mitfällungstest wurde jedes Immunadhäsin (5 μg) mit ¹²⁵I-markiertem löslichem PRO175-Polypeptid (1 μg) 1 h lang bei 24°C, danach 30 min lang mit Protein-A-Sepharose auf Eis inkubiert. Die Reaktionsgemische wurden zentrifugiert und mehrmals in PBS gewaschen, in SDS-PAGE-Puffer, der 20 mM Dithiothreit enthielt, gekocht und dann mittels SDS-PAGE-Autoradiographie aufgelöst.
Die Ergebnisse sind in 9 angeführt. Die Position der Molekulargewichtmarker (kDa) ist in 9 angegeben. Das PRO364-IgG band an das radioiodierte lösliche PRO175-Polypeptid. Das PRO364-IgG band jedoch nicht an die Immunadhäsin-Konstrukte von CD95, DR4, DR5, TNFR1, TNFR2 oder Apo-3.
In einem weiteren Test wurden menschliche 293-Zellen vorübergehend mit PRO175 voller Länge transfiziert, und die Fähigkeit des Rezeptor-Immunadhäsin-Konstrukts für PRO364, TNFR1, HVEM und DcR1, diese transfizierten Zellen zu binden, wurde mittels FACS-Analyse bestimmt. Die 293-Zellen wurden in mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM Glutamin, 100 μg/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin ergänztem DMEM-Medium mit hohem Glucosegehalt gehalten. Die transfizierten Zellen (1 × 10⁵) wurden 60 min lang bei 4°C in 200 μl 2%iger FBS/PBS mit 1 μg des jeweiligen Rezeptor- oder Liganden-Immunadhäsins inkubiert. Die Zellen wurden dann mit 2%iger FBS/PBS gewaschen, mit R-Phycoerythrin-konjugiertem Ziegen-Anti-Human-Antikörper (Jackson Immunoresearch, West Grove, Pa.) gefärbt. Dann wurden die Zellen mittels FACS analysiert. Um die Bindung der jeweiligen Immunadhäsine an die vorübergehend transfizierten Zellen zu testen, wurde ein Expressionsvektor (pRK5-CD4; Smith et al., Science 328, 1704–1707 (1987)) für CD4 mit dem PRO175-Expressionvektor (siehe oben) co-transfiziert. FITC-konjugiertes Anti-CD4 (Pharmingen, San Diego, Kalif.) wurde dann eingesetzt, um die transfizierte Zellpopulation in der FACS-Analyse zu identifizieren und zu messen.
Wie in 11A dargestellt band das PRO364-IgG spezifisch an die Oberfläche von Zellen, die mit dem Expressionsplasmid transfiziert waren, das für PRO175 voller Länge kodiert. Eine solche Bindung war bei TNFR1-, HVEM- oder DcR1-Immunadhäsinen nicht zu beobachten. Das PRO364-IgG band nicht an die mit einem Kontrollplasmid transfizierten Zellen (Daten nicht angeführt).
Die Ergebnisse zeigen, dass eine spezifische Bindungswechselwirkung zwischen dem PRO175-Polypeptid und PRO364 besteht und dass das PRO175-Polypeptid mit keinem der anderen getesteten Mitgliedern der TNF-Rezeptorfamilie in Wechselwirkung tritt.
Das PRO175-Polypeptid wurde in einer Bibliothek menschlicher Nabelschnur-Venen-Endothelzellen (HUVEC) identifiziert, wonach PRO175-Polypeptidtranskripte mittels RT-PCR in HUVEC leicht detektiert werden konnten (Daten nicht angeführt). Ein FACS-Analysetest wurde durchgeführt, um zu überprüfen, ob die spezifische Bindung von PRO364-IgG mit HUVEC mittels FACS-Analyse demonstriert werden konn te. HUVEC wurden von Cell Systems (Kirkland, Wash.) bezogen und in einem 50:50-Gemisch von Hams F12 und glukosearmem DMEM-Medium, das 10% fötales Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, 10 mM HEPES und 10 ng/ml basischen FGF enthielt, kultiviert. Die Zellen wurden mittels FACS mit PBS, PRO364-IgG, TNFR1-IgG oder Fas-IgG als primärem Antikörper und an Phycoerythrin (CalTag, Burlingame, Kalif.) konjugiertem Ziegen-Anti-Human-F(ab')₂ sortiert.
Es wurde festgestellt, dass PRO364-IgG spezifisch an HUVEC band (siehe 11B). Weder Fas-IgG noch TNFR1-IgG wiesen eine spezifische Bindung an die Endothelzellen auf.
BEISPIEL 7
Chromosomenkartierung
Die Chromosomenlokalisierung von menschlichem PRO175-Gen wurde mittels Strahlungs-Hybrid-(RH-)Panel-Analyse untersucht. Die RH-Kartierung wurde mittels PCR unter Verwendung eines Maus-Mensch-Zellen-Strahlungs-Hybrid-Panels (Research Genetics) und Primern, die auf der für die PRO175-cDNA kodierenden Regionen basierten [Gelb et al., Hum. Genet. 98, 141 (1996)], durchgeführt. Die Analyse der PCR-Daten unter Verwendung der Stanford Human Genome Center Database deutete darauf hin, dass PRO175 mit dem STS-Marker D1S2790 und dem Genethon-Marker AFMb352xe9 verbunden ist und dem menschlichen Chromosom 1q23 zugeordnet wird. Bemerkenswerterweise wird CD95L auch dem Chromosom 1q23 zugeordnet [Takahashi et al., Int. Immunol. 6, 1567–1574 (1994)], während OX40-Liganden dem Chromosom 1q25 zugeordnet werden [Baum et al., EMBO J. 13, 3992–4001 (1994)]. Dementsprechend könnten diese TNF-Familienmitglieder durch die Verdoppelung und Divergenz von einem gemeinsamen ursprünglichen Gen entstanden sein.
BEISPIEL 8
Induktion von c-fos in Endothelzellen
Dieser Test wurde durchgeführt, um zu bestimmen, ob PRO364 (menschlicher GITR) die Fähigkeit aufweist, c-fos in Endothelzellen zu induzieren.
Menschliche venöse Nabelschnur-Venen-Endothelzellen (HUVEC; Cell Systems) in Wachstumsmedium (50 5 Hams F12 ohne GHT: glukosearm, und 50% DMEM ohne Glycin: mit NaHCO₃, 1% Glutamin, 10 mM HEPES, 10% FBS, 10 ng/ml bFGF) wurden auf 96-Well-Mikrotiterplatten mit einer Zelldichte von 1 × 10⁴ Zellen/Well ausplattiert. Am Tag nach dem Ausplattieren wurden die Zellen durch die Entfernung des Wachstumsmediums und die Zugabe von 100 μl/Well serumfreiem Medium (Wachstumsmedium ohne FBS oder bFGF) verhungern gelassen. Nach 24 h wurde das serumfreie Medium entfernt. Die Zellen wurden mit 100 μl/Well Testproben und Kontrollen (positive Kontrolle: Wachstumsmedium; negative Kontrolle: 10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 4% (Gew./Vol.) Mannit, pH 6,8) behandelt. Die Zellen wurden 30 min lang bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert. Die Proben wurden entfernt, und der erste Teil der bDNA-Set-Arbeitsvorschrift (Chiron Diagnostics Kat.-Nr. 6005-037) wird durchgeführt, wobei jedes/r in Großbuchstaben geschriebenes/r, untenstehend angeführtes/r Reagens/Puffer in diesem Set zur Verfügung steht.
Die Mengen der für die Tests erforderlichen TM-LYSEPUFFER und -SONDEN wurden bezogen auf die durch den Hersteller bereitgestellten Informationen berechnet. Die angemessenen Mengen der aufgetauten SONDEN wurden zu dem TMLYSEPUFFER zugesetzt. Der CAPTURE-HYBRIDISIERUNGSPUFFER wurde auf} Raumtemperatur erwärmt. Die bDNA-Streifen wurden auf den Metallstreifenhaltevorrichtungen angebracht, und 100 ml CAPTURE-HYBRIDISIERUNGSPUFFER wurden zu jedem benötigten bDNA-Well zugesetzt, worauf eine zumindest 30-minütige Inkubation folgte. Die Testplatten mit den Zellen wurden aus dem Inkubator entnommen, und die Medien wurden vorsichtig unter Einsatz der Vakuumsaugvorrichtung entfernt. 100 ml LYSEHYBRIDISIERUNGSPUFFER mit SONDEN wurde rasch in jeden Well der Mikrotiterplatten pipettiert. Die Platten wurden dann 15 min lang bei 55°C inkubiert. Nach der Entfernung aus dem Inkubator wurden die Platten in einem Vortex-Mischer mit Mikrotiter-Adapterkopf platziert, wobei der Vortex-Mischer 1 min lang auf Stufe 2 eingestellt wurde. 80 ml des Lysats wurden entfernt und zu den bDNA-Wells zugesetzt, die den CAPTURE-HYBRIDISIERUNGSPUFFER enthielten, und zum Vermischen auf- und abpipettiert. Die Platten wurden zumindest 16 h lang bei 53°C inkubiert.
Am nächsten Tag wurde der zweite Teil der bDNA-Set-Arbeitsvorschrift durchgeführt. Genauer gesagt wurden die Platten aus dem Inkubator entfernt und 10 min lang zum Abkühlen auf dem Labortisch platziert. Die benötigten Zugabevolumina wurden bezogen auf die durch den Hersteller bereitgestellten Informationen berechnet. Eine VERSTÄRKERARBEITSLÖSUNG wurde durch die Herstellung einer im Verhältnis 1:100 verdünnten Lösung des VERSTÄRKERKONZENTRATS (20 fm/μl) in ALHYBRIDISIERUGNSPUFFER erzeugt. Das Hybridisierungsgemisch wurde von den Platten entfernt und zwei Mal mit WASCHLÖSUNG A gewaschen. 50 μl der VERSTÄRKERARBEITSLÖSUNG wurden zu jedem Well zugesetzt, und die Wells wurden 30 min lang bei 53°C inkubiert. Die Platten wurden dann aus dem Inkubator entfernt und 10 min lang abkühlen gelassen. Die MARKIERUNGSSONDENARBEITSLÖSUNG wurde durch die Herstellung einer im Verhältnis 1:100 verdünnten Lösung von MARKIERUNGSKONZENTRAT (40 pmol/μl) in AL-HYBRIDISIERUNGSPUFFER hergestellt. Nach einer Abkühlungsphase von 10 min wurde das Verstärkungshybridisierungsgemisch entfernt, und die Platten wurden zwei Mal mit WASCHLÖSUNG A gewaschen. 50 ml der MARKIERUNGSSONDENARBEITSLÖSUNG wurden zu jedem Well zugesetzt, und die Wells wurden 15 min lang bei 53°C zugesetzt. Die SUBSTRATLÖSUNG wurde durch die Herstellung einer im Verhältnis 1:100 verdünnten Lösung von SUBSTRATENHANCER in SUBSTRATPUFFER erzeugt. Die Platten wurden 10 min lang abkühlen gelassen, das Markierungshybridisierungsgemisch wurde entfernt, und die Platten wurden zwei Mal mit WASCHLÖSUNG A und drei Mal mit WASCHLÖSUNG D gewaschen. 50 μl der SUBSTRATLÖSUNG mit dem ENHANCER wurden zu jedem Well zugesetzt. Die Platten wurden 30 min lang bei 37°C inkubiert, und die RLU wurde in einem geeigneten Luminometer abgelesen.
Der Mittelwert der Wiederholungen und der Variationskoeffizient wurden bestimmt. Das Aktivitätsmaß und der Anstieg bezogen auf den Wert der negativen Kontrolle (des oben beschriebenen HEPES-Puffers) wurde in Chemolumineszenzeinheiten (RLU) angegeben. Proben, die einen Wert aufweisen, der zumindest dem Zweifachen des Werts der negativen Kontrolle entsprachen, wurden als positiv erachtet.
PRO364-Testergebnisse:

1. Negative Kontrolle = 2,57 RLU Positive Kontrolle = 29,57 RLU PRO364 bei 0,01% = 8,60 RLU PRO364 bei 0,1% = 9,66 RLU PRO364 bei 1% = 3,44 RLU
2. Negative Kontrolle = 3,19 RLU Positive Kontrolle = 18,22 RLU PRO364 bei 0,01% = 3,51 RLU PRO364 bei 0,1% = 4,54 RLU PRO364 bei 1% = 6,98 RLU

Wie oben dargestellt wurde PRO364 zwei Mal positiv getestet, was auf dessen Fähigkeit hindeutet, die Expression von c-fos in Endothelzellen hervorzurufen.
BEISPIEL 9
Dieser Test wurde durchgeführt, um zu bestimmen, ob PRO175 (hGLITTER) die Fähigkeit aufweist, c-fos in Perizyten zu induzieren.
An Tag 1 wurden 4 T-25-Gewebekulturkolben mit Rinderperizyten (VEC Technologies) in Nährmedium erhalten. Das Medium wurde bis auf 5 ml vollständig entfernt, und die Kolben wurden bei 37°C in 5% CO₂ in einem Inkubator platziert. An Tag 2 wurden die Perizyten trypsiniert, zentrifugiert, erneut in Nährmedium (glukosearmes DMEM mit 20% FBS, 1 × Penicillin und Streptomycin und 1 × Fungizone) suspendiert und auf 4 96-Well-Mikrotiterplatten ausplattiert. An Tag 7 wurde das Medium entfernt, und die Perizyten wurden mit 100 ml Testproben und Kontrollen behandelt (Testverdünnungsmittel: DMEM + 5% FBS; positive Kontrolle: DMEM + 5% Serum +/– 50 ng/ml PDGF; negative Kontrolle: Protein 32). Die Zellen wurden 30 min lang bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert. Die Proben wurden entfernt, und der erste Teil der bDNA-Set-Arbeitsvorschriften (Chiron) wurde durchgeführt.
c-fos-Sonden wurden zu dem in dem bDNA-Set enthaltenen LYSEPUFFER zugesetzt. Nach 30-minütiger Inkubation wurde das Medium von den Zellen abgesaugt, und 100 μl des die c-fos-Sonden enthaltenden LYSEPUFFERS wurden zu jedem Well zugesetzt. Die Platten wurden dann 15 min lang bei 55°C inkubiert. Während dieser Zeit wurden 100 μl CAPTURE-HYBRIDISIERUNGSPUFFER zu der in dem Set enthaltenen bDNA-PLATTE zugesetzt. Nach den 15 min wurden die Zellen aus dem Inkubator entfernt und auf einem Mikrotiterplatten-Schüttler 1 min lang verwirbelt. 85 μl des Zelllysats wurden entfernt und zu den 100 μl CAPTURE-HYBRIDISIERUNGSPUFFER in der bDNA-PLATTE zugesetzt. Die Platten wurden dann zumindest 16 h lang bei 53°C inkubiert.
Am nächsten Tag wurde der zweite Teil der bDNA-Set-Arbeitsvorschrift durchgeführt. Alle Reagenzien wurden aus dem Set entnommen und auf Raumtemperatur erwärmen gelassen. Die Platten wurden aus dem Inkubator entfernt und auf dem Labortisch 10 min lang zum Auskühlen platziert. Der VERSTÄRKER wurde im Verhältnis 1:100 VERSTÄRKER/MARKIERUNGSSONDENVERDÜNNUNGSMITTEL verdünnt. Nach 10 min wurde das Hybridisierungsgemisch von den Platten abgesaugt, und die Wells wurden zwei Mal mit dem WASCHPUFFER A gewaschen. 50 μl des verdünnten Verstärkers wurden zu jedem Well zugesetzt, und die Platten wurden 30 min lang bei 53°C inkubiert. Die Platten wurden dann aus dem Inkubator entfernt und 10 min lang abkühlen gelassen. Die MARKIERUNGSSONDE wurde im Verhältnis 1:100 VERSTÄRKER/MARKIERUNGSSONDENVERDÜNNUNGSMITTEL verdünnt. Nach 10 min wurde der Verstärker abgesaugt, und die Platten wurden erneut mit WASCHPUFFER A gewaschen. 50 μl der verdünnten MARKIERUNGSSONDE wurden zu jedem Well zugesetzt, und die Platten wurden 15 min lang bei 53°C inkubiert. Die Platten wurden dann aus dem Inkubator entfernt und 10 min lang abkühlen gelassen. An diesem Punkt wurde die Substratlösung hergestellt, indem 3 μl SUBSTRATENHANCER zu jedem ml des für den Test erforderlichen SUBSTRATS zugesetzt wurden. Das Markierungssondengemisch wurde dann von den Wells abgesaugt, und die Platten wurden zwei Mal mit WASCHPUFFER A und drei Mal mit WASCHPUFFER B gewaschen. 50 μl der Substratlösung wurden zu jedem Well zugesetzt, und die Platten wurden 30 min lang bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden dann in Bezug auf Chemolumineszenz unter Einsatz eines Luminometers gelesen.
Der Mittelwert der Wiederholungen und die Standardabweichung/der Variationskoeffizient wurden ermittelt. Das Aktivitätsmaß des Anstiegs in Bezug auf den Wert der negativen Kontrolle (Protein 32) wurde durch Chemolumineszenzeinheiten (RLU) angegeben. Proben, die einen Wert aufweisen, der zumindest dem Zweifachen des Werts der negativen Kontrolle entspricht, wurden als positiv erachtet. Die Ergebnisse dieser Analysen sind in 12 angeführt.
Wie in 12 dargestellt wurde PRO175 in Bezug auf das Hervorrufen der Expression von c-fos in Rinderperizyten positiv getestet.
Hinterlequng von Material
Folgende Materialien wurden bei der American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, Virginia, USA (ATCC), hinterlegt:

Material ATCC-Hinterlegungs-Nr. Hinterlegungsdatum

DNA47365-1206 ATCC 209436 7. November 1997

DNA19355-1150 ATCC 209466 7. November 1997
Diese Hinterlegung erfolgte gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrages über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren und den darunter gültigen Bestimmungen (Budapester Vertrag). Dies sichert die Erhaltung einer lebensfähigen Kultur der Hinterlegung 30 Jahre lang ab dem Zeitpunkt der Hinterlegung. Die Hinterlegungen werden von der ATCC gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrages und gemäß einem Abkommen zwischen Genentech, Inc., und ATCC verfügbar gemacht, das permanente und uneingeschränkte Verfügbarkeit der Nachkommenschaft der Kultur der Hinterlegung für die Öffentlichkeit bei Ausgabe des betreffenden US-Patents oder bei Offenlegung für die Öffentlichkeit entweder der US- oder einer ausländischen Patentanmeldung, je nachdem, was zuerst eintritt, garantiert und das die Verfügbarkeit der Nachkommenschaft für jemanden, der durch den Präsident des Patentamtes der Vereinigten Staaten hierzu gemäß 35 USC § 122 und den dazu gültigen Bestimmungen (einschließlich 37 CFR § 1.14 unter besonderem Verweis auf 886 OG 638) befugt ist, sicherstellt.
Der Abtretungsempfänger der vorliegenden Anmeldung hat sich einverstanden erklärt, dass, sofern eine Kultur der hinterlegten Materialien, die unter geeigneten Bedingungen kultiviert wurde, sterben oder verloren gehen oder zerstört werden sollte, die Materialien unverzüglich nach Benachrichtigung durch neue derselben Art ersetzt werden. Verfügbarkeit des hinterlegten Materials ist nicht als eine Lizenz zur Ausführung der Erfindung in Widerspruch mit den durch die Amtsgewalt einer Regierung gemäß ihren Patentgesetzen erteilten Rechte zu verstehen.
Die obige schriftliche Beschreibung wird als ausreichend erachtet, um Fachleuten die Möglichkeit zu geben, die Erfindung durchzuführen. Die vorliegende Erfindung soll in ihrem Schutzumfang durch das hinterlegte Konstrukt/die hinterlegten Konstrukte nicht als eingeschränkt gelten, da die hinterlegte(n) Ausführungsform(en) einzig als Veranschaulichung bestimmter Aspekte der Erfindung zu verstehen ist (sind), und andere Konstrukte, die funktionell äquivalent sind, liegen ebenfalls im Schutzumfang dieser Erfindung. Die Hinterlegung des hierin offenbarten Materials/der hierin offenbarten Materialien stellt weder ein Eingeständnis dar, dass die hierin enthaltene schriftliche Beschreibung unzureichend ist, um die praktische Durchführung irgendeines Aspektes der Erfindung, einschließlich der besten Ausführungsform davon, zu ermöglichen, noch ist sie als eine Einschränkung des Schutzumfangs der Ansprüche auf die spezifischen Veranschaulichungen, die sie darstellt, zu verstehen.

Claims

Zusammensetzung, umfassend ein PRO364-Polypeptid in Beimischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger und einem kardiovaskulären, endothelialen oder angiogenen Mittel oder einem angiostatischen Mittel, worin das PRO364-Polypeptid: (1) die Aminosäuren 1 bis 241 umfasst, wie in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt; oder (2) die Aminosäuren 26 bis 241 umfasst, wie in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt; oder (3) die Aminosäurereste Y bis X umfasst, wie in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt, worin Y ein beliebiger der Aminosäurereste 1 bis 26 ist und X ein beliebiger der Aminosäurereste 157 bis 167 ist; oder (4) eine Sequenzidentität von zumindest 80% entweder mit einem PRO364-Polypeptid voller Länge mit Aminosäureresten 1 bis 241, wie in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt, oder einer extrazellulären Domäne des PRO364-Polypeptids mit Aminosäureresten Y bis X, wie in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt, aufweist, worin Y ein beliebiger der Aminosäurereste 1 bis 26 und X ein beliebiger der Aminosäurereste 157 bis 167 ist.
Zusammensetzung, umfassend ein PRO175-Polypeptid in Beimischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, worin das PRO175-Polypeptid: (1) die Aminosäuren 1 bis 177 umfasst, wie in Seq.-ID Nr. 14 dargelegt; oder (2) die Aminosäuren 52 bis 177 umfasst, wie in Seq.-ID Nr. 14 dargelegt; oder (3) die Aminosäurereste X bis 177 umfasst, wie in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt, worin X ein beliebiger der Aminosäurereste 48 bis 57 ist; oder (4) eine Sequenzidentität von zumindest 80% entweder mit einem PRO175-Polypeptid voller Länge mit Aminosäureresten 1 bis 177, wie in Seq.-ID Nr. 14 dargelegt, oder einer extrazellulären Domäne des PRO175-Polypeptids mit Aminosäureresten X bis 177, wie in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt, aufweist, worin X ein beliebiger der Aminosäurereste 48 bis 57 ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge des Polypeptids.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, worin das PRO175-Polypeptid in Beimischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger und einem kardiovaskulären, endothelialen oder angiogenen Mittel oder einem angiostatischen Mittel vorliegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, worin das Polypeptid und das Mittel in therapeutisch wirksamen Mengen vorhanden sind.
Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung eines beliebigen der vorangehenden Ansprüche zur Behandlung einer kardiovaskulären oder endothelialen oder angiogenen Erkrankung, umfassend die Beimischung einer therapeutisch wirksamen Menge eines PRO364- oder PRO175-Polypeptids zu einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Pharmazeutisches Produkt, umfassend: (a) eine Zusammensetzung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge an PRO364-Polypeptid in Beimischung mit einem kardiovaskulären, endothelialen oder angiogenen Mittel oder einem angiostatischen Mittel oder an PRO175-Polypeptid in Beimischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger; (b) einen Behälter, der die Zusammensetzung enthält; sowie (c) eine Markierung, die an dem Behälter angebracht ist, oder eine Packungsbeilage, die in dem pharmazeutischen Produkt inkludiert ist, die sich auf die Verwendung der PRO364- oder PRO175-Polypeptidzusammensetzung in der Behandlung einer kardiovaskulären oder endothelialen oder angiogenen Erkrankung bezieht; worin das PRO364-Polypeptid: (1) die Aminosäuren 1 bis 241 umfasst, wie in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt; oder (2) die Aminosäuren 26 bis 241 umfasst; wie in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt; oder (3) die Aminosäurereste Y bis X umfasst, wie in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt, worin Y ein beliebiger der Aminosäurereste 1 bis 26 ist und X ein beliebiger der Aminosäurereste 157 bis 167 ist; oder (4) eine Sequenzidentität von zumindest 80% entweder mit einem PRO364-Polypeptid voller Länge mit Aminosäureresten 1 bis 241, wie in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt, oder einer extrazellulären Domäne des PRO364-Polypeptids mit Aminosäure resten Y bis X, wie in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt, aufweist, worin Y ein beliebiger der Aminosäurereste 1 bis 26 und X ein beliebiger der Aminosäurereste 157 bis 167 ist; oder worin das PRO175-Polypeptid: (1) die Aminosäuren 1 bis 177 umfasst, wie in Seq.-ID Nr. 14 dargelegt; oder (2) die Aminosäuren 52 bis 177 umfasst, wie in Seq.-ID Nr. 14 dargelegt; oder (3) die Aminosäurereste X bis 177 umfasst, wie in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt, worin X ein beliebiger der Aminosäurereste 48 bis 57 ist; oder (4) eine Sequenzidentität von zumindest 80% entweder mit einem PRO175-Polypeptid voller Länge mit Aminosäureresten 1 bis 177, wie in Seq.-ID Nr. 14 dargelegt, oder einer extrazellulären Domäne des PRO175-Polypeptids mit Aminosäureresten X bis 177, wie in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt, aufweist, worin X ein beliebiger der Aminosäurereste 48 bis 57 ist.
Verfahren zur Diagnose einer Erkrankung oder einer Anfälligkeit für eine Erkrankung, die mit einer Mutation in einer Nucleinsäuresequenz in Zusammenhang steht, die für das PRO364- oder PRO175-Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz kodiert, wie in Seq.-ID Nr. 3 oder 14 dargelegt ist, umfassend: (a) das isolieren einer Nucleinsäuresequenz, die für das PRO364- oder PRO175-Polypeptid kodiert, aus einer Probe, die von einem Wirt stammt; sowie (b) das Bestimmen einer Mutation in der Nucleinsäuresequenz, die für das PRO364- oder PRO175-Polypeptid kodiert.
Verfahren zur Diagnose kardiovaskulärer oder endothelialer oder angiogener Erkrankungen bei einem Säugetier, umfassend die Detektion der Expressionsmenge eines Gens, das für ein PRO364- oder PRO175-Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz kodiert, wie in Seq.-ID Nr. 3 oder 14 dargelegt, und zwar (a) in einer Testprobe an Gewebezellen, die von dem Säugetier erhalten wurden, und (b) in einer Kontrollprobe bekannter normaler Gewebezellen desselben Zelltyps, worin eine höhere oder geringere Expressionsmenge in der Testprobe die Gegenwart einer kardiovaskulären oder endothelialen oder angiogenen Dysfunktion bei dem Säugetier zeigt, von dem die Testgewebe-Zellen erhalten wurden.
Verwendung eines PRO364- oder PRO175-Polypeptids zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer kardiovaskulären oder endothelialen oder angiogenen Erkrankung in einem Säugetier; worin das PRO364-Polypeptid: (1) die Aminosäuren 1 bis 241 umfasst, wie in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt; oder (2) die Aminosäuren 26 bis 241 umfasst, wie in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt; oder (3) die Aminosäurereste Y bis X umfasst, wie in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt, worin Y ein beliebiger der Aminosäurereste 1 bis 26 ist und X ein beliebiger der Aminosäurereste 157 bis 167 ist; oder (4) eine Sequenzidentität von zumindest 80% entweder mit einem PRO364-Polypeptid voller Länge mit Aminosäureresten 1 bis 241, wie in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt, oder einer extrazellulären Domäne des PRO364-Polypeptids mit Aminosäureresten Y bis X, wie in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt, aufweist, worin Y ein beliebiger der Aminosäurereste 1 bis 26 und X ein beliebiger der Aminosäurereste 157 bis 167 ist; oder worin das PRO175-Polypeptid: (1) die Aminosäuren 1 bis 177 umfasst, wie in Seq.-ID Nr. 14 dargelegt; oder (2) die Aminosäuren 52 bis 177 umfasst, wie in Seq.-ID Nr. 14 dargelegt; oder (3) die Aminosäurereste X bis 177 umfasst, wie in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt, worin X ein beliebiger der Aminosäurereste 48 bis 57 ist; oder (4) eine Sequenzidentität von zumindest 80% entweder mit einem PRO175-Polypeptid voller Länge mit Aminosäureresten 1 bis 177, wie in Seq.-ID Nr. 14 dargelegt, oder einer extrazellulären Domäne des PRO175-Polypeptids mit Aminosäureresten X bis 177, wie in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt, aufweist, worin X ein beliebiger der Aminosäurereste 48 bis 57 ist.
Verwendung nach Anspruch 10, worin es sich bei der kardiovaskulären oder endothelialen oder angiogenen Erkrankung um Herzhypertrophie oder Trauma oder Krebs handelt.
Verwendung nach Anspruch 10, worin das Säugetier ein Mensch ist.
Verwendung nach Anspruch 11, worin die Herzhypertrophie durch die Gegenwart einer erhöhten Menge an PGF_2α gekennzeichnet ist.
Verwendung nach Anspruch 11, worin die Herzhypertrophie durch Myocardinfarkt induziert wurde.
Verwendung nach Anspruch 14, worin die Verabreichung des PRO364- oder PRO175-Polypeptids innerhalb von 48 Stunden nach dem Myocardinfarkt initiiert wird.
Verwendung nach Anspruch 11, worin es sich bei der kardiovaskulären oder endothelialen oder angiogenen Erkrankung um Herzhypertrophie handelt und das PRO364- oder PRO175-Polypeptid zusammen mit einem kardiovaskulären, endothelialen oder angiogenen Mittel verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 16, worin das kardiovaskuläre, endotheliale oder angiogene Mittel aus der aus einem blutdrucksenkenden Arzneimittel, einem ACE-Hemmer, einem Endothelin-Rezeptorantagonisten und einem thrombolytischen Mittel bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 11, worin die kardiovaskuläre, endotheliale oder angiogene Erkrankung eine Krebsart ist und das PRO364- oder PRO175-Polypeptid in Kombination mit einem chemotherapeutischen Mittel, einem wachstumshemmenden Mittel oder einem zytotoxischen Mittel verabreicht wird.
Verfahren zur Identifikation von Agonisten für das PRO364- oder PRO175-Polypeptid, umfassend: (a) das Kontaktieren von Zellen und einer Verbindung, die gescreent werden soll, unter Bedingungen, die für die Stimulierung der Zellproliferation durch das PRO364- oder PRO175-Polypeptid geeignet sind; und (b) das Messen der Zellproliferation, um zu bestimmen, ob die Verbindung ein wirksamer Agonist ist; worin das PRO364-Polypeptid: (1) die Aminosäuren 1 bis 241 umfasst, wie in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt; oder (2) die Aminosäuren 26 bis 241 umfasst, wie in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt; oder (3) die Aminosäurereste Y bis X umfasst, wie in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt, worin Y ein beliebiger der Aminosäurereste 1 bis 26 ist und X ein beliebiger der Aminosäurereste 157 bis 167 ist; oder (4) eine Sequenzidentität von zumindest 80% entweder mit einem PRO364-Polypeptid voller Länge mit Aminosäureresten 1 bis 241, wie in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt, oder einer extrazellulären Domäne des PRO364-Polypeptids mit Aminosäureresten Y bis X, wie in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt, aufweist, worin Y ein beliebiger der Aminosäurereste 1 bis 26 und X ein beliebiger der Aminosäurereste 157 bis 167 ist; oder worin das PRO175-Polypeptid: (1) die Aminosäuren 1 bis 177 umfasst, wie in Seq.-ID Nr. 14 dargelegt; oder (2) die Aminosäuren 52 bis 177 umfasst, wie in Seq.-ID Nr. 14 dargelegt; oder (3) die Aminosäurereste X bis 177 umfasst, wie in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt, worin X ein beliebiger der Aminosäurereste 48 bis 57 ist; oder (4) eine Sequenzidentität von zumindest 80% entweder mit einem PRO175-Polypeptid voller Länge mit Aminosäureresten 1 bis 177, wie in Seq.-ID Nr. 14 dargelegt, oder einer extrazellulären Domäne des PRO175-Polypeptids mit Aminosäureresten X bis 177, wie in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt, aufweist, worin X ein beliebiger der Aminosäurereste 48 bis 57 ist.
Verfahren zur Identifikation einer Verbindung, welche die Expression oder Aktivität eines PRO364- oder PRO175-Polypeptids inhibiert, umfassend das Kontaktieren einer Kandidatenverbindung mit einem PRO364- oder PRO175-Polypeptid unter Bedingungen und für eine Zeitspanne, die ausreichen/ausreicht, um eine Wechselwirkung zwischen der Verbindung und dem Polypeptid zu ermöglichen; worin das PRO364-Polypeptid: (1) die Aminosäuren 1 bis 241 umfasst, wie in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt; oder (2) die Aminosäuren 26 bis 241 umfasst, wie in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt; oder (3) die Aminosäurereste Y bis X umfasst, wie in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt, worin Y ein beliebiger der Aminosäurereste 1 bis 26 ist und X ein beliebiger der Aminosäurereste 157 bis 167 ist; oder (4) eine Sequenzidentität von zumindest 80% entweder mit einem PRO364-Polypeptid voller Länge mit Aminosäureresten 1 bis 241, wie in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt, oder einer extrazellulären Domäne des PRO364-Polypeptids mit Aminosäureresten Y bis X, wie in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt, aufweist, worin Y ein beliebiger der Aminosäurereste 1 bis 26 und X ein beliebiger der Aminosäurereste 157 bis 167 ist; oder worin das PRO175-Polypeptid: (1) die Aminosäuren 1 bis 177 umfasst, wie in Seq.-ID Nr. 14 dargelegt; oder (2) die Aminosäuren 52 bis 177 umfasst, wie in Seq.-ID Nr. 14 dargelegt; oder (3) die Aminosäurereste X bis 177 umfasst, wie in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt, worin X ein beliebiger der Aminosäurereste 48 bis 57 ist; oder (4) eine Sequenzidentität von zumindest 80% entweder mit einem PRO175-Polypeptid voller Länge mit Aminosäureresten 1 bis 177, wie in Seq.-ID Nr. 14 dargelegt, oder einer extrazellulären Domäne des PRO175-Polypeptids mit Aminosäureresten X bis 177, wie in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt, aufweist, worin X ein beliebiger der Aminosäurereste 48 bis 57 ist.
Verfahren nach Anspruch 20, umfassend folgende Schritte: (a) das Kontaktieren von Zellen und einer Verbindung, die gescreent werden soll, in Gegenwart eines PRO364- oder PRO175-Polypeptids unter Bedingungen, die für die Stimulierung der Zellproliferation durch ein PRO364- oder PRO175-Polypeptid geeignet sind; und (b) das Messen der Zellproliferation, um zu bestimmen, ob die Verbindung ein wirksamer Antagonist ist.
In-vitro-Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart eines PRO364- oder PRO175-Polypeptids, umfassend das Aussetzen einer Zelle, von der angenommen wird, dass sie das PRO364- oder PRO175-Polypeptid enthält, gegenüber einem Anti- PRO364- oder -PRO175-Antikörper sowie das Bestimmen der Bindung des Antikörpers an die Zelle; worin das PRO364-Polypeptid: (1) die Aminosäuren 1 bis 241 umfasst, wie in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt; oder (2) die Aminosäuren 26 bis 241 umfasst, wie in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt; oder (3) die Aminosäurereste Y bis X umfasst, wie in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt, worin Y ein beliebiger der Aminosäurereste 1 bis 26 ist und X ein beliebiger der Aminosäurereste 157 bis 167 ist; oder (4) eine Sequenzidentität von zumindest 80% entweder mit einem PRO364-Polypeptid voller Länge mit Aminosäureresten 1 bis 241, wie in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt, oder einer extrazellulären Domäne des PRO364-Polypeptids mit Aminosäureresten Y bis X, wie in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt, aufweist, worin Y ein beliebiger der Aminosäurereste 1 bis 26 und X ein beliebiger der Aminosäurereste 157 bis 167 ist; oder worin das PRO175-Polypeptid: (1) die Aminosäuren 1 bis 177 umfasst, wie in Seq.-ID Nr. 14 dargelegt; oder (2) die Aminosäuren 52 bis 177 umfasst, wie in Seq.-ID Nr. 14 dargelegt; oder (3) die Aminosäurereste X bis 177 umfasst, wie in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt, worin X ein beliebiger der Aminosäurereste 48 bis 57 ist; oder (4) eine Sequenzidentität von zumindest 80% entweder mit einem PRO175-Polypeptid voller Länge mit Aminosäureresten 1 bis 177, wie in Seq.-ID Nr. 14 dargelegt, oder einer extrazellulären Domäne des PRO175-Polypeptids mit Aminosäureresten X bis 177, wie in Seq.-ID Nr. 3 dargelegt, aufweist, worin X ein beliebiger der Aminosäurereste 48 bis 57 ist.
Verfahren zur Diagnose kardiovaskulärer oder endothelialer oder angiogener e Erkrankungen bei einem Säugetier, umfassend (a) das Kontaktieren eines Anti-PRO364- oder -PRO175-Antikörpers mit einer Testprobe an Gewebezellen, die von dem Säugetier erhalten wurden, und (b) das Detektieren der Bildung eines Komplexes zwischen dem Anti-PRO364- oder -PRO175-Antikörper und dem PRO364- oder PRO175-Polypeptid in der Testprobe.
Krebs-Diagnose-Set, umfassend einen Anti-PRO364- oder -PRO175-Antikörper und einen Träger in einer geeigneten Verpackung.
Set nach Anspruch 24, weiters umfassend Anweisungen zur Verwendung des Antikörpers zur Detektion des PRO364- oder PRO175-Polypeptids.
Artikel, umfassend: einen Behälter; eine Markierung auf dem Behälter; sowie eine Zusammensetzung, umfassend einen Anti-PRO364- oder -PRO175-Antikörper, die im Behälter enthalten ist; worin die Markierung auf dem Behälter angibt, dass die Zusammensetzung zur Behandlung von kardiovaskulären oder endothelialen oder angiogenen Erkrankungen verwendet werden kann.
Verwendung eines Antikörpers, der ein PRO364- oder -PRO175-Polypeptid bindet, zur Herstellung eines Medikaments, das die Angiogenese in einem Säugetier inhibiert, die durch das PRO364- oder -PRO175-Polypeptid induziert wird.
Verwendung nach Anspruch 27, worin das Säugetier ein Mensch ist.
Verwendung nach Anspruch 27, worin das Säugetier unter einem Tumor oder einer Netzhauterkrankung leidet.