ES2926969T3 - Anticuerpos contra el receptor de factor de necrosis de tumor inducido por glucocorticoides (gitr) y usos de los mismos - Google Patents

Anticuerpos contra el receptor de factor de necrosis de tumor inducido por glucocorticoides (gitr) y usos de los mismos Download PDF

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Abstract

En el presente documento se proporcionan anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos, que se unen al receptor de TNF inducible por glucocorticoides (GITR). También se proporcionan usos de estas proteínas en aplicaciones terapéuticas, como en el tratamiento del cáncer. Además se proporcionan células que producen los anticuerpos, polinucleótidos que codifican la región variable de cadena pesada y/o ligera de los anticuerpos y vectores que comprenden los polinucleótidos que codifican la región variable de cadena pesada y/o ligera de los anticuerpos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos contra el receptor de factor de necrosis de tumor inducido por glucocorticoides (gitr) y usos de los mismos
Antecedentes de la Invención
La proteína relacionada con el TNFR inducido por glucocorticoide (GITR, por sus siglas en inglés), una molécula co­ estimuladora también conocida como TNFRSF18, AITR, CD357, y GITR-D, es un miembro de la familia del receptor del TNF identificado originalmente en líneas de células T tratadas con dexametasona (Nocentini et al., PNAS 1997; 94:6216-21). Otros miembros relacionados de la familia del receptor del TNF incluyen Cd 40, CD27, 4-1BB, y OX40. Aúnque la expresión del GITR es baja en células CD4+ y CD8+ sin tratamiento previo, es constitutivamente expresado en células T reguladoras (Tone et al., PNAS 2003;100:15059-64). Sin embargo, una vez que la expresión se induce en células T efectoras, el acoplamiento del GITR promueve su activación, proliferación y producción de citocina (Watts, Annual Reviewsin Immunology 2005; 23:23-68). Con respecto a células T reguladoras (Tregs, por sus siglas en inglés) CD4+CD25+, Shimizu reportó que el acoplamiento del GITR suprime su función (Shimizu et al., Nature Immunology 2002; 3:135-42) usando un ensayo de supresión de cultivo combinado. Sin embargo, el trabajo subsecuente por Stephans et al (JI 2004 15; 173(8):5008-20) determinó que el acoplamiento del GITR en células Tefectoras (Tef) las hace menos susceptibles a supresión de Treg, lo que explica la supresión reducida observada en co-cultivos de células Treg-Tef. La estimulación del GITR mediada por el anticuerpo d TA-1 (GITR anti-ratón de rata promueve la actividad anti-tumoral en múltiples modelos de tumor.
El GITR-L, el ligando para GITR, es expresado a niveles bajos en células que presentan antígeno (por ejemplo, células B, células dendríticas), pero es temporalmente regulado en estas células después de la activación, por ejemplo, por transfección viral (Suvas et al., J Virol. 2005; 79:11935-42).
Los documentos US 2015/964294 y WO 2015/187835 describen proteínas de unión a antígeno que activan GITR y anticuerpos que se unen a GITR, así como usos terapéuticos de los mismos en tratamientos de inmunoterapia, entre los que se incluyen tratamientos de diversos cánceres e infecciones.
Dada la necesidad continua de estrategias mejoradas para enfermedades objetivo tales como cáncer, los beneficios de respuestas inmune mejoradas, en particular, respuestas de células T, nuevos agentes y métodos que modulan la actividad de GITR son altamente deseables.
Sumario
Se proporcionan en la presente anticuerpos aislados, tales como anticuerpos monoclonales, en particular anticuerpos monoclonales humanos, que se unen específicamente a GITR y tienen propiedades funcionales deseables. Estas propiedades incluyen alta afinidad de unión al GITR humano, unión al GITR de mono (por ejemplo, GITR cinomólogo), y la capacidad para estimular respuestas de células T específicas del antígeno. Los anticuerpos descritos en la presente pueden ser usados para estimular respuestas de células T específicas del antígeno, tales como en un sujeto que porta un tumor o porta un virus (infectado con virus), y para detectar la proteína del GITR en una muestra.
Por consiguiente, en un aspecto, la invención se refiere a anticuerpos que se unen a GITR y comprenden una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 394 o una región constante de cadena pesada que difiere de la misma por una sustitución, adición o deleción de aminoácidos, en donde dicha una sustitución, adición o deleción de aminoácido no está en las posiciones de aminoácidos 16, 20, 21, 75, 76, 82, 86, 97, 100, 102, 104 y 105 del SEQ ID NO: 394. En ciertas modalidades, los anticuerpos presentan al menos una de las siguientes propiedades:
(a) unión al GITR humano soluble;
(b) unión al GITR humano que se une a la membrana;
(c) unión al GITR cinomólogo que se une a la membrana;
(d) inducir o mejorar la activación de células T, por ejemplo, activación de células T específicas del antígeno; (e) inhibición de la unión del ligando del GITR al GITR en células 3A9-hGITR;
(f) a lo sumo parcialmente inhibición de la unión del ligando del GITR al GITR en células T activadas;
(g) unión a un epítopo conformacional en GITR humano maduro (SEQ ID NO: 4);
(h) unión a tanto GITr humano O-ligado como N-glicosilado y no glicosilado;
(i) tener actividad agonista en la ausencia de unión a un receptor Fc, pero en donde la unión a un receptor Fc mejora además la actividad agonista; y
(j) competir en cualquier dirección o ambas direcciones para unión al GITR humano con uno o más de los anticuerpos 28F3, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10, y6G10.
En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-GITR, o porciones de los mismos de unión al antígeno, descritos en la presente estimulan una respuesta anti-tumoral, por ejemplo, una respuesta de células T específicas del antígeno. En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-GITR, o porciones de los mismos de unión al antígeno, incrementan la producción de citocina (por ejemplo, IL-2 y/o IFN-y) en células T que expresan el GITR y/o incrementan la proliferación de células T.
Los anticuerpos anti-GITR de la invención se unen a uno o más FcyRs, por ejemplo, FcyRs de activación o FcyRs inhibidores.
En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-GITR, o porciones de los mismos de unión al antígeno, se unen al GITR humano soluble con una Kd de 10 nM o menos como se mide por Biacore, se unen al GITR humano unido a la membrana con una Kd de 1 nM o menos como se mide por Scatchard, se unen al GITR humano unido a la membrana con una EC50 de 1 nM o menos como se mide por FACS, se unen al GITR de cinomólogo unido a la membrana con una EC50 de 10 nM o menos como se mide por FACS, inducen o mejoran la activación de células T, por ejemplo, células Tef, sin requerir reticulaciones multivalentes, inhiben la unión del ligando del GITR al GITR con una EC50 de 1 |jg/mL o menos como se mide por FACS, y/o se unen dentro de las regiones PTGGPGCGPGRLLLGTGT (SEQ ID NO: 217) y CRDYPGEE (SEQ ID NO: 218) del GITR humano maduro (SEQ ID NO: 4). En ciertas realizaciones, los anticuerpos de la invención comprenden las tres CDR de cadena pesada variable y las tres CDR de cadena ligera variable que están en los pares de cadena pesada variable y cadena ligera variable seleccionados entre:
(a) SEQ ID NOs: 13 y 14;
(b) SEQ ID NOs: 26 y 27;
(c) SEQ ID NOs: 39 y 40;
(d) SEQ ID NOs: 52 y 53;
(e) SEQ ID NOs: 52 y 54;
(f) SEQ ID NOs: 71 y 72;
(g) SEQ ID NOs: 84 y 85;
(h) SEQ ID NOs: 97 y 98;
(i) SEQ ID NOs: 97 y 99;
(j) SEQ ID NOs: 115 y 116;
(k) SEQ ID NOs: 128 y 129;
(l) SEQ ID NOs: 128 y 130; y
(m) SEQ ID NOs: 335 y 336.
En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención comprenden:
(a) secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena pesada que comprenden los SEQ ID NOs: 20, 21, y 22, respectivamente, y/o secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena ligera que comprenden los SEQ ID NOs: 23, 24, y 25, respectivamente;
(b) secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena pesada que comprenden los SEQ ID NOs: 33, 34, y 35, respectivamente, y/o secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena ligera que comprenden los SEQ ID NOs: 36, 37, y 38, respectivamente; o
(c) secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena pesada que comprenden los SEQ ID NOs: 46, 47, y 48, respectivamente, y/o secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena ligera que comprenden los SEQ ID NOs: 49, 50, y 51, respectivamente;
(d) secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena pesada que comprenden los SEQ ID NOs: 62, 63, y 64, respectivamente, y/o secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena ligera que comprenden los SEQ ID NOs: 65, 66, y 67, respectivamente;
(e) secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena pesada que comprenden los SEQ ID NOs: 62, 63, y 64, respectivamente, y/o secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena ligera que comprenden los SEQ ID NOs: 68, 69, y 70, respectivamente;
(f) secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena pesada que comprenden los SEQ ID NOs: 78, 79, y 80, respectivamente, y/o secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena ligera que comprenden los SEQ ID NOs: 81, 82, y 83, respectivamente;
(g) secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena pesada que comprenden los SEQ ID NOs: 91, 92, y 93, respectivamente, y/o secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena ligera que comprenden los SEQ ID NOs: 94, 95, y 96, respectivamente;
(h) secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena pesada que comprenden los SEQ ID NOs: 106, 107, y 108, respectivamente, y/o secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena ligera que comprenden los SEQ ID NOs: 109, 110, y 111, respectivamente;
(i) secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena pesada que comprenden los SEQ ID NOs: 106, 107, y 108, respectivamente, y/o secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena ligera que comprenden los SEQ ID NOs: 112, 113, y 114, respectivamente;
(j) secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena pesada que comprenden los SEQ ID NOs: 122, 123, y 124, respectivamente, y/o secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena ligera que comprenden los SEQ ID NOs: 125, 126, y 127, respectivamente;
(k) secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena pesada que comprenden los SEQ ID NOs: 138, 139, y 140, respectivamente, y/o secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena ligera que comprenden los SEQ ID NOs: 141, 142, y 143, respectivamente;
(l) secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena pesada que comprenden los SEQ ID NOs: 138, 139, y 140, respectivamente, y/o secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena ligera que comprenden los SEQ ID NOs: 144, 145, y 146, respectivamente; o
(m) secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena pesada que comprenden los SEQ ID NOs: 342, 343, y 344, respectivamente, y secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena ligera que comprenden los SEQ ID NOs: 345, 346, y 347, respectivamente.
En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención comprenden secuencias de región variable de cadena pesada y ligera seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) SEQ ID NOs: 13 y 14, respectivamente;
(b) SEQ ID NOs: 26 y 27, respectivamente;
(c) SEQ ID NOs: 39 y 40, respectivamente;
(d) SEQ ID NOs: 52 y 53, respectivamente;
(e) SEQ ID NOs: 52 y 54, respectivamente;
(f) SEQ ID NOs: 71 y 72, respectivamente;
(g) SEQ ID NOs: 84 y 85, respectivamente;
(h) SEQ ID NOs: 97 y 98, respectivamente;
(i) SEQ ID NOs: 97 y 99, respectivamente;
(j) SEQ ID NOs: 115 y 116, respectivamente;
(k) SEQ ID NOs: 128 y 129, respectivamente;
(l) SEQ ID NOs: 128 y 130, respectivamente; y
(m) SEQ ID NOs: 335 y 336, respectivamente.
En ciertas modalidades, los anticuerpos monoclonales aislados (a) se unen al mismo epítopo en el GITR que 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2 y/o 6G10, y (b) inhiben la unión de 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, y/o6G 10al GITR en células T activadas en al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % como se mide por, por ejemplo, FACS.
En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-GITR se unen dentro de las regiones PTGGPGCGPGRLLLGTGT (SEQ ID NO: 217) y CRDYPGEE (SEQ ID NO: 218) del GITR humano maduro (SEQ ID NO: 4). En algunas modalidades, los anticuerpos anti-GITR descritos en la presente, se unen a tanto GITR humano como cinomólogo.
En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-GITR comprenden un Fc que tiene unión mejorada a un FcyR de activación, por ejemplo, con relación a un Fc IgG1 de tipo silvestre. En ciertas modalidades, los residuos de metionina en las regiones CDR de los anticuerpos anti-GITR, o porciones de los mismos de unión al antígeno, son sustituidos por residuos de aminoácidos que no se someten a oxidación. En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-GITR, o porciones de los mismos de unión al antígeno, son anticuerpos humanos o humanizados.
En ciertas modalidades, la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en los SEQ ID NOs: 16, 19, 29, 32, 42, 45, 56, 57, 60, 61, 74, 87, 90, 101, 104, 105, 118, 121, 132, 133, 136, 137, 338, 341, y 371 o una cadena ligera que difiere de esta a lo sumo en 10 aminoácidos o es al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de aminoácido de los SEQ ID NOs: 16, 19, 29, 32, 42, 45, 56, 57, 60, 61, 74, 87, 90, 101, 104, 105, 118, 121, 132, 133, 136, 137, 338, 341, y 371.
En otro aspecto, la invención se refiere a moléculas biespecíficas que comprenden un anticuerpo anti-GITR de la invención ligado a una molécula que tiene una segunda especificidad de unión.
En otro aspecto, la invención se refiere a ácidos nucleicos que codifican las regiones variables de cadena pesada y ligera de los anticuerpos anti-GITR de la invención, vectores de expresión que comprenden las moléculas de ácido nucleico y células transformadas con los vectores de expresión.
En otro aspecto, la invención se refiere a inmunoconjugados que comprenden los anticuerpos anti-GITR de la invención, ligados a un agente.
En otro aspecto, la invención se refiere a composiciones que comprenden anticuerpos anti-GITR de la invención y un vehículo. También se proporcionan en la presente kits que comprenden los anticuerpos anti-GITR, o porciones de los mismos de unión al antígeno, e instrucciones para uso.
En otro aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo, molécula biespecífica o inmunoconjugado de la invención para uso en un método para tratar cáncer, por ejemplo, por inmunoterapia, que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo anti-GITR, molécula biespecífica o conjugado que comprende el anticuerpo anti-GITR, o composición que comprende el anticuerpo anti-GITR, para tratar el cáncer. En ciertas modalidades, el cáncer es cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer uterino/cervical, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer testicular, cáncer esofageal, cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, cáncer colorrectal, cáncer de colon, cáncer renal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer pulmonar, cáncer de estómago, cáncer de células germinales, cáncer de hueso, cáncer hepático, cáncer tiroideo, cáncer de piel, neoplasma del sistema nervioso central, linfoma, leucemia, mieloma, sarcoma y cáncer relacionado con virus. En ciertas modalidades, el cáncer es un cáncer metastásico, cáncer refractario, o cáncer recurrente.
En ciertas modalidades, los usos médicos de la invención comprenden además administrar uno o más terapéuticos adicionales con un anticuerpo anti-GITR, por ejemplo, un anticuerpo anti-PD1, un anticuerpo LAG-3, un anticuerpo CTLA-4, y/o un anticuerpo PDL-1.
Otras características y ventajas de la presente descripción serán aparentes a partir de la siguiente descripción detallada y ejemplos.
Breve Descripción de las Figuras
La Figura 1 muestra las secuencias de aminoácido de las regiones variables de cadena pesada y ligera de anticuerpos monoclonales 28F3 (SEQ ID NO: 13 y 14, respectivamente), 18E10 (SEQ ID NO: 39 y 40, respectivamente), y 19d 3 (SEQ ID NO: 26 y 27, respectivamente). Las CDR de VH y Vl de 28F3 están subrayadas.
La Figura 2A muestra la secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 147) y secuencia de aminoácido (SEQ ID NO: 13) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 28F3. Las regiones de CDR1 (SEQ ID NO: 20), CDR2 (SEQ ID NO: 21) y CDR3 (SEQ ID NO: 22) son delineadas y las derivaciones de líneas germinal V, D y J, están indicadas.
La Figura 2B muestra la secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 148) y secuencia de aminoácido (SEQ ID NO: 14) de la región variable de cadena ligera kappa del anticuerpo monoclonal humano 28F3. Las regiones de CDR1 (SEQ ID NO: 23), CDR2 (SEQ ID NO: 24) y CDR3 (SEQ iD NO: 25) son delineadas y las derivaciones de la línea germinal V y J, están indicadas.
La Figura 3A muestra la secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 158) y secuencia de aminoácido (SEQ ID NO: 39) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 18E10. Las regiones de CDR1 (SEQ ID NO: 46), CDR2 (SEQ ID NO: 47) y CDR3 (SEQ ID NO: 48) son delineadas y las derivaciones de líneas germinal V, D y J, están indicadas.
La Figura 3B muestra la secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 159) y secuencia de aminoácido (SEQ ID NO: 40) de la región variable de cadena ligera kappa del anticuerpo monoclonal humano 18E10. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 49), CDR2 (SEQ ID NO: 50) y CDR3 (SEQ ID NO: 51) son delineadas y las derivaciones de la línea germinal V y J, están indicadas.
La Figura 4A muestra la secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 154) y secuencia de aminoácido (SEQ ID NO: 26) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 19D3. Las regiones de CDR1 (SEQ ID NO: 33), CDR2 (SEQ ID NO: 34) y CDR3 (SEQ ID NO: 35) son delineadas y las derivaciones de líneas germinal V, D y J, están indicadas.
La Figura 4B muestra la secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 155) y secuencia de aminoácido (SEQ ID NO: 27) de la región variable de cadena ligera kappa del anticuerpo monoclonal humano 19D3. Las regiones de CDR1 (SEQ ID NO: 36), CDR2 (SEQ ID NO: 37) y CDR3 (SEQ iD NO: 38) son delineadas y las derivaciones de la línea germinal V y J, están indicadas.
La Figura 5A muestra la secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 162) y secuencia de aminoácido (SEQ ID NO: 52) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 3C3. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 62), CDR2 (SEQ ID NO: 63) y Cd R3 (SEQ ID NO: 64) son delineadas y las derivaciones de líneas germinal V, D y J, están indicadas.
La Figura 5B muestra la secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 163) y secuencia de aminoácido (SEQ ID NO: 53) de la región variable de cadena ligera kappa (VK1) del anticuerpo monoclonal humano 3C3. Las regiones de CDR1 (SEQ ID NO: 65), CDR2 (SEQ ID NO: 66) y CDR3 (SEQ ID n O: 67) son delineadas y las derivaciones de la línea germinal V y J, están indicadas.
La Figura 5C muestra la secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 164) y secuencia de aminoácido (SEQ ID NO: 54) de la región variable de cadena ligera kappa (VK2) del anticuerpo monoclonal humano 3C3. Las regiones de CDR1 (SEQ ID NO: 68), CDR2 (SEQ ID NO: 69) y CDR3 (SEQ ID n O: 70) son delineadas y las derivaciones de la línea germinal V y J, están indicadas.
La Figura 6A muestra la secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 168) y secuencia de aminoácido (SEQ ID NO: 71) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 2G6. Las regiones de CDR1 (SEQ ID NO: 78), CDR2 (SEQ ID NO: 79) y CDR3 (SEQ ID NO: 80) son delineadas y las derivaciones de líneas germinal V, D y J, están indicadas.
La Figura 6B muestra la secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 169) y secuencia de aminoácido (SEQ ID NO: 72) de la región variable de cadena ligera kappa del anticuerpo monoclonal humano 2G6. Las regiones de CDR1 (SEQ ID NO: 81), CDR2 (SEQ ID NO: 82) y CDR3 (SEQ ID NO: 83) son delineadas y las derivaciones de la línea germinal V y J, están indicadas.
La Figura 7A muestra la secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 172) y secuencia de aminoácido (SEQ ID NO: 84) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 8A6. Las regiones de CDR1 (SEQ ID NO: 91), CDR2 (SEQ ID NO: 92) y CDR3 (SEQ ID No : 93) son delineadas y las derivaciones de líneas germinal V, D y J, están indicadas.
La Figura 7B muestra la secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 173) y secuencia de aminoácido (SEQ ID NO: 85) de la región variable de cadena ligera kappa del anticuerpo monoclonal humano 8A6. Las regiones de CDR1 (SEQ ID NO: 94), CDR2 (SEQ ID NO: 95) y CDR3 (SEQ ID NO: 96) son delineadas y las derivaciones de la línea germinal V y J, están indicadas.
La Figura 8A muestra la secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 176) y secuencia de aminoácido (SEQ ID NO: 97) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 9G7. Las regiones de CDR1 (SEQ ID NO: 106), CDR2 (SEQ ID NO: 107) y CDR3 (SEQ ID NO: 108) son delineadas y las derivaciones de líneas germinal V, D y J, están indicadas.
La Figura 8B muestra la secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 177) y secuencia de aminoácido (SEQ ID NO: 98) de la región variable de cadena ligera kappa (VK1) del anticuerpo monoclonal humano 9G7. Las regiones de CDR1 (SEQ ID NO: 109), CDR2 (SEQ ID NO: 110) y CDR3 (SEQ ID NO: 111) son delineadas y las derivaciones de la línea germinal V y J, están indicadas.
La Figura 8C muestra la secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 178) y secuencia de aminoácido (SEQ ID NO: 99) de la región variable de cadena ligera kappa (VK2) del anticuerpo monoclonal humano 9G7. Las regiones de CDR1 (SEQ ID NO: 112), CDR2 (SEQ ID NO: 113) y CDR3 (SEQ ID NO: 114) son delineadas y las derivaciones de la línea germinal V y J, están indicadas.
La Figura 9A muestra la secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 182) y secuencia de aminoácido (SEQ ID NO: 115) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 14E3. Las regiones de CDR1 (SEQ ID NO: 122), CDR2 (SEQ ID NO: 123) y CDR3 (SEQ ID NO: 124) son delineadas y las derivaciones de líneas germinal V, D y J, están indicadas.
La Figura 9B muestra la secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 183) y secuencia de aminoácido (SEQ ID NO: 116) de la región variable de cadena ligera kappa del anticuerpo monoclonal humano 14E3. Las regiones de CDR1 (SEQ ID NO: 125), CDR2 (SEQ ID NO: 126) y CDR3 (SEQ ID NO: 127) son delineadas y las derivaciones de la línea germinal V y J, están indicadas.
La Figura 10A muestra la secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 186) y secuencia de aminoácido (SEQ ID NO: 128) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 19H8. Las regiones de CDR1 (SEQ ID NO: 138), CDR2 (SEQ ID NO: 139) y CDR3 (SEQ ID NO: 140) son delineadas y las derivaciones de líneas germinal V, D y J, están indicadas.
La Figura 10B muestra la secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 187) y secuencia de aminoácido (SEQ ID NO: 129) de la región variable de cadena ligera kappa (VK1) del anticuerpo monoclonal humano 19H8. Las regiones de CDR1 (SEQ ID NO: 141), CDR2 (SEQ ID NO: 142) y CDR3 (SEQ ID NO: 143) son delineadas y las derivaciones de la línea germinal V y J, están indicadas.
La Figura 10C muestra la secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 188) y secuencia de aminoácido (SEQ ID NO: 130) de la región variable de cadena ligera kappa (VK2) del anticuerpo monoclonal humano 19H8. Las regiones de CDR1 (SEQ ID NO: 144), CDR2 (SEQ ID NO: 145) y CDR3 (SEQ ID NO: 146) son delineadas y las derivaciones de la línea germinal V y J, están indicadas.
La Figura 11A muestra la secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 353) y secuencia de aminoácido (SEQ ID NO: 335) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 6G10. Las regiones de CDR1 (SEQ ID NO: 342), CDR2 (SEQ ID NO: 343) y CDR3 (SEQ ID NO: 344) son delineadas y las derivaciones de líneas germinal V, D y J, están indicadas.
La Figura 11B muestra la secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 354) y secuencia de aminoácido (SEQ ID NO: 336) de la región variable de cadena ligera kappa del anticuerpo monoclonal humano 6G10. Las regiones de CDR1 (SEQ ID NO: 345), CDR2 (SEQ ID NO: 346) y CDR3 (SEQ ID NO: 347) son delineadas y las derivaciones de la línea germinal V y J, están indicadas.
La Figura 12 muestra una alineación de la secuencia de aminoácido de las regiones variables de cadena pesada de 28F3 (SEQ ID NO: 13) con las secuencias de aminoácido 3-33, 3-10 y JH6 de Vh de línea germinal humana (SEQ ID No s : 192, 193, y 196, respectivamente).
La Figura 13 muestra una alineación de la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena ligera de 28F3 (SEQ ID NO: 14) con las secuencias de aminoácidos L18 y JK2 de Vk de línea germinal humana (SEQ ID NOs: 204 y 205, respectivamente).
La Figura 14 muestra una alineación de la secuencia de aminoácido de las regiones variables de cadena pesada de 18E10 (SEQ ID NO: 39) con las secuencias de aminoácido 3-33, 6-19 y JH6 de Vh de línea germinal humana (SEQ ID NOs: 192, 199, y 197, respectivamente).
La Figura 15 muestra una alineación de la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena ligera de 18E10 (SEQ ID NO: 40) con las secuencias de aminoácido L15 y JK2 de Vk de línea germinal humana (SEQ ID NO: 207 y 205, respectivamente).
La Figura 16 muestra una alineación de la secuencia de aminoácido de las regiones variables de cadena pesada de 19D3 (SEQ ID NO: 26) con las secuencias de aminoácidos 3-33, 3-16, y JH6 de Vh de línea germinal humana (SEQ ID Nos: 192, 200, y 198, respectivamente).
La Figura 17 muestra una alineación de la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena ligera de 19D3 (SEQ ID NO: 27) con las secuencias de aminoácido L15 y JK2 de Vk de línea germinal humana (SEQ ID NOs: 207 y 205, respectivamente).
La Figura 18 muestra una alineación de la secuencia de aminoácido de las regiones variables de cadena pesada de 3C3 (SEQ ID NO: 52) con las secuencias de aminoácido 4-34 y JH3 de Vh de línea germinal humana (SEQ ID NOs: 201 y 202, respectivamente).
La Figura 19A muestra una alineación de la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena ligera (VK1) de 3C3 (SEQ ID NO: 53) con las secuencias de aminoácido L15 y JK2 de Vk de línea germinal humana (SEQ ID NOs: 207 y 205, respectivamente).
La Figura 19B muestra una alineación de la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena ligera (VK2) de 3C3 (SEQ ID NO: 54) con las secuencias de aminoácido L20 y JK2 de Vk de línea germinal humana (SEQ ID NOs: 208 y 206, respectivamente).
La Figura 20 muestra una alineación de la secuencia de aminoácido de las regiones variables de cadena pesada de 2G6 (SEQ ID NO: 71) con las secuencias de aminoácido 3-33 y JH6 de Vh de línea germinal humana (SEQ ID NOs: 192 y 197, respectivamente).
La Figura 21 muestra una alineación de la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena ligera de 2G6 (SEQ ID NO: 72) con las secuencias de aminoácido L15 y JK2 de Vk de línea germinal humana (SEQ ID NOs: 207 y 205, respectivamente).
La Figura 22 muestra una alineación de la secuencia de aminoácido de las regiones variables de cadena pesada de 8A6 (SEQ ID NO: 84) con las secuencias de aminoácido 3-33, 3-10 y JH6 de Vh de línea germinal humana (SEQ ID NOs: 192, 193, y 197, respectivamente).
La Figura 23 muestra una alineación de la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena ligera de 8A6 (SEQ ID NO: 85) con las secuencias de aminoácidos L18 y JK2 de Vk de línea germinal humana (SEQ ID NOs: 204 y 205, respectivamente).
La Figura 24 muestra una alineación de la secuencia de aminoácido de las regiones variables de cadena pesada de 9G7 (SEQ ID NO: 97) con las secuencias de aminoácido 3-15, 3-10, y JH6 de Vh de línea germinal humana (SEQ ID NOs: 203, 194, y 198, respectivamente).
La Figura 25A muestra una alineación de la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena ligera (VK1) de 9G7 (SEQ ID NO: 98) con las secuencias de aminoácido A27 y JK1 de Vk de línea germinal humana (SEQ ID NOs: 209 y 210, respectivamente).
La Figura 25B muestra una alineación de la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena ligera (VK2) de 9G7 (SEQ ID NO: 99) con las secuencias de aminoácidos A27 y JK5 de Vk de línea germinal humana (SEQ ID NOs: 209 y 212, respectivamente).
La Figura 26 muestra una alineación de la secuencia de aminoácido de las regiones variables de cadena pesada de 14E3 (SEQ ID NO: 115) con las secuencias de aminoácido 4-34 y JH3 de Vh de línea germinal humana (SEQ ID NOs: 201 y 202, respectivamente).
La Figura 27 muestra una alineación de la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena ligera de 14E3 (SEQ ID NO: 116) con las secuencias de aminoácido L15 y JK1 de Vk de línea germinal humana (SEQ ID NOs: 207 y 211, respectivamente).
La Figura 28 muestra una alineación de la secuencia de aminoácido de las regiones variables de cadena pesada de 19H8 (SEQ ID NO: 128) con las secuencias de aminoácido 3-33, 3-10 y JH6 de Vh de línea germinal humana (SEQ ID No s : 192, 195, y 196, respectivamente).
La Figura 29A muestra una alineación de la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena ligera (VK1) de 19H8 (SEQ ID NO: 129) con las secuencias de aminoácido L18 y JK1 de Vk de línea germinal humana (SEQ ID NOs: 204 y 211, respectivamente).
La Figura 29B muestra una alineación de la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena ligera (VK2) de 19H8 (SEQ ID NO: 130) con las secuencias de aminoácido L6 y JK4 de Vk de línea germinal humana (SEQ ID NOs: 213 y 214, respectivamente).
La Figura 30 muestra una alineación de la secuencia de aminoácido de las regiones variables de cadena pesada de 6G10 (SEQ ID NO: 335) con las secuencias de aminoácido 3-33, 3-10 y JH6 de Vh de línea germinal humana (SEQ ID Nos: 192, 195, y 196, respectivamente).
La Figura 31 muestra una alineación de la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena ligera (VK1) de 6G10 (SEQ ID NO: 336) con las secuencias de aminoácidos L18 y JK2 de Vk de línea germinal humana (SEQ ID NOs: 204 y 205, respectivamente).
La Figura 32 muestra la afinidad de unión (en nM) de varios anticuerpos anti-GITR para células T humanas activadas, sin anticuerpo, IgG1, y controles de anticuerpo hIgG2, como se evalúa por FACS.
La Figura 33 muestra la afinidad de unión (en nM) de varios anticuerpos anti-GITR para células T cinomólogas activadas, sin anticuerpo y hIgG1 y anticuerpo hIgG2 como controles, como se evalúa por FACS.
Las Figuras 34A y 34B muestran la capacidad de varios anticuerpos anti-GITR para inhibir la unión del ligando del GITR (GITR-L) a células 3A9 del GITR, con hIgG1, hIgG2, sin anticuerpo, y células solas como controles.
La Figura 34C muestra la unión de GITR-L recombinante a células T CD4 y CD8 activadas.
La Figura 34D muestra que el GITR-L bloquea parcialmente la unión de 28F3-hIgG1 a células T CD4+ humanas activadas. La unión de 28F3-hIgG1 a una concentración fija de 0,5 pg/mL a células T activadas se bloqueó parcialmente por GITR-L pre-unido con una IC50 de 0,0024 pg/mL.
La Figura 34E muestra que el 28F3-hIgG1 no bloquea la unión de 0,6 pg/ml de GITR-L a células T humanas activadas. Cuando el GITR-L se agregó a células T CD4+ 0,6 mg/mL, aproximadamente 90 % de saturación, el 28F3-hIgG1 pre-unido fue incapaz de bloquear a GITR-L variando desde 100 mg/mL hasta 0,00056 mg/mL. La Figura 34F muestra que el 28F3-hIgG1 bloquea parcialmente la unión de 0,02 pg/ml de GITR-L a células T humanas activadas. La unión de GITR-L a una concentración fija de 20 ng/mL a células T activadas se bloqueó parcialmente por el 28F3-hIgG1 pre-unido con una IC50 de 0,075 pg/mL.
La Figura 35A muestra un Western blot demostrando que el anticuerpo anti-GITR 28F3 se une a GITR nativo, pero no al humano desnaturalizado, y que la unión no es afectada por la presencia o ausencia de glicosilación N-ligada. Un signo “+” indica las muestras tratadas con PNGasa F para remover la glicosilación N-ligada.
La Figura 35B es un gel de teñido de azul Coomassie que muestra la presencia de todas las formas de GITR humano antes de la transferencia sobre la nitrocelulosa para el análisis de Western blot.
Las Figuras 36A-36B muestran la unión de los anticuerpos 28F3 y 3C3 a fragmentos GITR nativos generados por digestión con Endoproteinasa Arg-C (1), Endoproteinasa Lys-C (2), Tripsina (3), Endoproteinasa Glu-C (4), o Endoproteinasa Asp-N (5).
La Figura 37 muestra una vista del mapa de calor del anticuerpo anti-GITR 28F3 que se une a los fragmentos peptídicos del GITR humano generados a partir de la digestión de una proteína de GITR humano nativa con Endoproteinasa Glu-C y Tripsina (“Glu-C y Tripsina”), Endoproteinasa Arg-C (“Arg-C”), Endoproteinasa Lys-C y Tripsina (“Lys-C y Tripsina”), Tripsina, o Endoproteinasa Asp-N y Endoproteinasa Glu-C (“AspN y GluC”), identificando la ubicación del epítopo al cual se une el anticuerpo 28F3 (región encuadrada). La secuencia de aminoácido del dominio extracelular maduro de GITR humano se muestra en gris oscuro y la secuencia de Fc de ratón, ligado C-terminalmente a este se muestra en gris claro.
La Figura 38A muestra los péptidos en la fracción a través del flujo, después de la incubación de perillas recubiertas de 28F3 a péptidos que resultan de una digestión de tripsina de GITR humano nativo.
La Figura 38B muestra dos péptidos unidos a 28F3 principales (indicados por un asterisco).
La Figura 38C muestra la identificación por LC-MS del primero de los dos picos en la Figura 34B como correspondientes al péptido N-terminal que tiene la secuencia mostrada y que carece de la glicosilación O-ligada. La Figura 38D muestra la identificación por LC-MS del segundo de los dos picos en la Figura 34B como correspondientes al péptido N-terminal que tiene la secuencia mostrada y que tiene una glicosilación O-ligada en T20.
La Figura 38E muestra el péptido del GITR que permanece después de la digestión in situ con endoproteinasa Asp-N de un péptido más largo que se incubó junto con 28F3.
La Figura 39A muestra una lista de péptidos peptídicos para el GITR/Fc humano recombinante y complejo de proteína de GITR/Fc humano recombinante e IgG1 28F3, que logra una cobertura de secuencia de 86 % para la región N-terminal del GITR.
La Figura 39B muestra los niveles de absorción de deuterio por espectrometría de masas HDX (MS) en la ausencia/presencia del mAb IgG1 28F3 (“GITR.6”).
La Figura 39C representa las dos regiones en GITR humano maduro unido por 28F3, como se determina por HDX MS.
La Figura 40 muestra los efectos de varios anticuerpos anti-GITR agonistas en la secreción de IL-2 por células 39A-hGITR en la presencia de anticuerpos anti-CD3 unidos a la placa.
La Figura 41A muestra los efectos de anticuerpos anti-GITR agonistas 18E10, 13H2 (los mismos como 28F3), y 28F3 en la secreción de IL-2 por células 39A-hGITR activadas por un antígeno específico.
La Figura 41B muestra los efectos de anticuerpos anti-GITR agonistas 3C3 (mostrados como “GITR.3”), 28F3, 19D3, y 18E10 en la secreción de IL-2 por células 39A-hGITR activadas por un antígeno específico.
La Figura 42A muestra los efectos de varios agonistas de anticuerpos anti-GITR HuMabs en secreción de gamma interferón (IFN-y) por células T estimuladas con células CHO-OKT3 (es decir, células CHO que expresan el scfv OKT3).
La Figura 42B muestra los efectos del anticuerpo agonista anti-GITR 28F3 en la secreción de IL-2 por células T CD4+ estimuladas con células CHO que expresan OKT3, en donde las células T son de un primer donador. La Figura 42C muestra los efectos del anticuerpo anti-GITR 28F3 en la secreción del IFN-y por células T CD4+ estimuladas con células CHO que expresan OKT3, en donde las células T son del primer donador.
La Figura 42D muestra los efectos del anticuerpo anti-GITR 28F3 en la secreción de IL-2 por células T CD4+ estimuladas con células CHO que expresan OKT3, en donde las células T son de un segundo donador.
La Figura 42E muestra los efectos del anticuerpo anti-GITR 28F3 en la secreción del IFN-y por células T CD4+ estimuladas con células CHO que expresan OKT3, en donde las células T son del segundo donador.
La Figura 43 muestra los efectos del anticuerpo anti-GITR 28F3 (IgG2), fragmento 28F3-F(ab')2, y 28F3-Fab en la secreción de IL-2 por células 39A-hGITR estimuladas con células LK35.2 en la presencia del péptido HEL48-63. La Figura 44 muestra la inmunohistoquímica de especímenes de amígdala humana con el anticuerpo monoclonal 28F3-FITC.
Las Figuras 45A-45D muestran los efectos de diferentes isotipos del anticuerpo GITR anti-ratón de rata, DTA-1, en la actividad anti-tumoral medida por cambios en los volúmenes del tumor en ratones individuales tratados con estos isotipos en un modelo de adenocarcinoma de colon MC38: (Figura 45A) anticuerpo IgG1 de ratón de control (10 mg/kg); (Figura 45B) IgG2b de rata DTA-1 (10 mg/kg); (Figura 45C) IgG1 de ratón DTA-1 (10 mg/kg); (Figura 45D) IgG2a de ratón DTA-1 (10 mg/kg). El número de ratones libres de tumor (TF) por grupo se muestra para cada grupo de 10 ratones.
Las Figuras 46A y 46B muestran los cambios en volúmenes de tumor medio (Figura 46A) y mediano (Figura 46B) de tumores MC38 en grupos de ratones tratados con anticuerpos DTA-1 (10 mg/kg) de diferentes isotipos.
Las Figuras 47A-47F muestran un análisis citométrico de flujo de bazos (Figuras 47A-47C) y linfocitos de infiltración del tumor (TIL) (Figuras 47D-47F) a partir de ratones que portan tumor MC38 tratados con los diferentes isotipos y anticuerpos de control anti-GITR (DTA-1) y anti-CTLA-4 (9D9) indicados. (Figura 47A) Porcentaje de células T CD8+ en el bazo; (Figura 47B) Porcentaje de células CD4+ en el bazo; (Figura 47C) Porcentaje de células CD4+ que son también Foxp3+ en el bazo; (Figura 47D) Porcentaje de células T CD8+ en TIL; (Figura 47E) Porcentaje de células CD4+ en TIL; (Figura 47F) Porcentaje de células CD4+ que son también Foxp3+ en TIL.
Las Figuras 48A-48F muestran los efectos de diferentes isotipos del anticuerpo GITR anti-ratón de rata, DTA-1, rediseñados por ingeniería genética para minimizar la agregación (referido como “mGITR.7”), en la actividad antitumoral como se mide por cambios en los volúmenes del tumor en ratones individuales tratados con estos isotipos en un modelo MC38: (Figura 48A) anticuerpo IgG1 de ratón de control; (Figura 48B) mGITR.7 mIgG1; (Figura 48C) mGITR.7 mIgG1-D265A; (Figura 48D) mGITR.7 mIgG2a; (Figura 48E) mGITR.7 mIgG2b; (Figura 48F) mGITR.7 IgG2b de rata. El número de ratones TF por grupo se muestra para cada grupo de 9 ratones.
Las Figuras 49A y 49B muestran los cambios en los volúmenes de tumor medio (Figura 49A) y mediano (Figura 49B) de tumores MC38 en grupos de ratones tratados con anticuerpos DTA-1 rediseñados por ingeniería genética de diferentes isotipos.
Las Figuras 50A y 50B muestran un análisis citométrico de flujo de los efectos de diferentes isotipos DTA-1 (DTA-1 “mGITR” rediseñado por ingeniería genética o los anticuerpos “DTA-1” originalmente diseñados por ingeniería genética) y anti-CTLA-4 (9D9) en Tregs Foxp3+/CD4+ en los bazos (Figura 50A) y TIL (Figura 50B) a partir de ratones que portan el tumor MC38.
Las Figuras 51A-51E muestran la actividad anti-tumoral de diferentes isotipos DTA-1 de ratón en un modelo de ratón de fibrosarcoma Sa1N como se mide por los cambios en los volúmenes de tumor de ratones individuales tratados con tres isotipos: (Figura 51A) anticuerpo IgG1 de ratón de control; (Figura 51B) IgG2a de ratón DTA-1; (Figura 51C) IgG2b de rata DTA-1; (Figura 51D) IgG1 de ratón DTA-1; (Figura 51E) IgG1 de ratón DTA-1-D265A. El número de ratones TF por grupo se muestra para cada grupo de hasta 10 ratones.
Las Figuras 52A y 52B muestran los cambios en los volúmenes de tumor medios (Figura 52A) y medianos (Figura 52B) de tumores Sa1N en grupos de ratones tratados con anticuerpos DTA-1 de diferentes isotipos.
Las Figuras 53Ay 53B muestran los efectos de diferentes isotipos DTA-1 y anti-CTLA-4 (9D9) en Tregs Foxp3+/CD4+ en los bazos (Figura 53A) y TIL (Figura 53B) a partir de ratones que portan tumor Sa1N.
Las Figuras 54A-54D muestran los efectos del anticuerpo de rata anti-GITR, DTA-1, en el volumen del tumor usando un modelo de adenocarcinoma de colon MC38 por etapas. Los ratones se trataron con (Figura 54A) mIgG1 de control, (Figura 54B) mIgG DTA-1, (Figura 54C) mIgG PD-1, y (Figura 54D) PD-1 DTA-1 en los días 7, 10, y 14. El número de ratones libres de tumor (TF) por grupo se muestra para cada grupo de 10 ratones.
Las Figuras 55A y 55B muestran el efecto de varias combinaciones de mutaciones en VH CDR3 en el anticuerpo anti-GITR 28F3 en unión a células 3A9-hGITR.
Las Figuras 56A-56F muestran el efecto de varias combinaciones de mutaciones en VH CDR3 en el anticuerpo anti-GITR 28F3 en el nivel de secreción IL-2 de células 3A9-hGITR en la presencia de anti-CD3 unido a la placa. La Figura 57 muestra la afinidad de unión de los anticuerpos anti-GITR indicados para células T activadas. Los anticuerpos probados comprenden una de las siguientes regiones constantes de cadena pesada: una región constante IgG1 (“anti-GITR.g1f”), una región constante IgG1 menos efectora (“anti-GITR.g1.1f”), una región constante IgG2 (“anti-GITR-G2”), un dominio Fc de bisagra IgG1 e IgG2 (“anti-GITR.G2.G1f”), y un dominio Fc IgG1 menos efector y de bisagra IgG2 (“anti-GITR.G2.G1.1f”).
Las Figuras 58A-58C muestran la secreción de IFN-y e IL-2 a partir de células T CD4 donadoras estimuladas con anticuerpos anti-GITR humanos solubles con diferentes regiones constantes de cadena pesada. La Figura 58A muestra la secreción de IFN-y a partir de células T CD4 donadoras estimuladas con células CHO que expresan OKT3 y varias concentraciones de anticuerpos anti-GITR humanos con una región constante IgG2-IgG1. La Figura 58B muestra la secreción de IL-2 a partir de células T CD4 donadoras estimuladas con células CHO que expresan OKT3 y varias concentraciones de un dominio constante de cadena pesada IgG1 o un dominio constante de cadena pesada híbrida IgG2-IgG1. La Figura 58C muestra la secreción de IL-2 a partir de células T CD4 donadoras estimuladas con células CHO que expresan OKT3 y varias concentraciones de versiones menos efectoras (IgG1.1) de los anticuerpos en las Figuras 55A y 55B.
La Figura 59 muestra una comparación de los anticuerpos anti-GITR indicados en la secreción de IL-2 de células 3A9-hGITR en la presencia de anti-CD3 unido a la placa.
Las Figuras 60A-60D muestran el efecto de 28F3.IgG1 y 28F3.IgG1.1 en la proliferación de células Treg y Tef. Las Figuras 61A-61F muestran el efecto de 28F3.IgG1 (“GITR.6IgG1”) y 28F3.IgG1.1 (“GITR.6IgG1.1”) en lisis inducida por células NK de células CD4+ activadas, células CD8+ y células enriquecidas con Treg a partir de dos diferentes donadores.
Las Figuras 62A-62C muestran el efecto de un anticuerpo IgG1 de control, 28F3.IgG1 (“anti-GITR IgG1”), y 28F3.IgG1.1 (anti-GITR IgG1.1”) en el crecimiento de tumores MC38.
Las Figuras 63A y 63B muestran el volumen medio y el volumen mediando, respectivamente, de tumores MC38 en ratones tratados con anticuerpo hIgG1 de control, 28F3.IgG1 (“anti-GITR IgG1”), y 28F3.IgG1.1 (“anti-GITR IgG1.1”).
Las Figuras 64Ay 64B muestran el % medio de cambio de peso corporal y % de cambio de peso corporal mediano, respectivamente, de ratones con tumores MC38 tratados con anticuerpo hIgG1 de control, 28F3.IgG1 (“anti-GITR IgG1”), y 28F3.IgG1.1 (“anti-GITR IgG1.1”).
La Figura 65 muestra los efectos de 28F3.IgG1 (“GITR IgG1”), con relación al control de isotipo, en la supresión de células Treg en el modelo de tumor MC38.
La Figura 66 muestra los efectos de 28F3.IgG1 (“GITR IgG1”), con relación al control de isotipo, en el porcentaje de células T CD8+ en el modelo de tumor MC38.
La Figura 67 muestra el efecto de 28F3.IgG1 (“GITR.6IgG1”) y 28F3.IgG1.1 (“GITR.6IgG1.1”) soluble y reticulado en la secreción del IFN-y a partir de células T cuando son co-cultivadas con células CHO-OKT3 y CHO-OKT3-CD32a.
La Figura 68 muestra el efecto de 28F3.IgG1 (“GITR.6IgG1”) y 28F3.IgG1.1 (“GITR.6IgG1.1”) soluble y reticulado en proliferación de células T cuando son co-cultivados con células CHO-OKT3 y CHO-OKT3-CD32a.
La Figura 69 muestra el nivel de IL-2 secretado por células T CD4+ co-cultivadas con células CHO-OKT3 en la presencia de un anticuerpo anti-GITR que tiene las regiones constantes indicadas.
La Figura 70 muestra la unión del anticuerpo a proteínas FcYR-his capturada con Fab anti-his. Las respuestas de unión son trazadas como porcentaje de la Rmáx teórica asumiendo una estequiometría de unión 1:1 mAb:FcYR.
Las barras para cada anticuerpo se muestran en el orden proporcionado por las leyendas de color en el fondo de la laminilla.
La Figura 71 muestra la unión del anticuerpo a proteínas FcgR-his capturadas con Fab anti-his. Las respuestas de unión son trazadas como porcentaje de la Rmáx teórica asumiendo una estequiometría de unión 1:1 mAb:FcYR. Las barras para cada anticuerpo se muestran en el orden proporcionado por las leyendas de color en el fondo de la laminilla.
La Figura 72 muestra un análisis de curso de tiempo de internalización de anticuerpos anti-GITR.
La Figura 73A muestra análisis de co-localización del marcador EEA2 del endosoma temprano y GITR al tiempo cero.
La Figura 73B muestra análisis de co-localización del marcador EEA2 del endosoma temprano y GITR al tiempo 30 y 120 minutos.
La Figura 73C muestra los resultados de cuantificación de co-localización endosomal mostrados en las Figuras de co co-localización endosomal mostrados en las Figuras 73A y 73B trazados como la relación de intensidad del pixel colocalizado con relación al teñido total.
La Figura 74A muestra la activación de señalización NFkB en células T CD8+ tratadas con los anticuerpos anti-GITR indicados.
La Figura 74B muestra la activación de señalización NFkB en células T CD4+ tratadas con los anticuerpos anti-GITR indicados.
La Figura 75 muestra la activación de P38 en células T CD4+ tratadas con los anticuerpos anti-GITR indicados. La Figura 76A muestra el nivel de IL-2 secretado por células T CD4+ co-cultivadas con células CHO-OKT3 en la presencia de diferentes concentraciones de un anticuerpo anti-GITR que tiene las regiones constantes indicadas. La Figura 76B muestra el nivel de IL-2 secretado por células T CD4+ co-cultivadas con células CHO-OKT3 en la presencia de 5 pg/ml de un anticuerpo anti-GITR que tiene las regiones constantes indicadas (mismo experimento como aquel en la Figura 76A).
La Figura 76C muestra el nivel de IL-2 secretado por células T CD4+ co-cultivadas con células CHO-OKT3 en la presencia de 1,25 pg/ml de un anticuerpo anti-GITR que tiene las regiones constantes indicadas (mismo experimento como aquel en la Figura 76A).
La Figura 76D muestra el nivel de IL-2 secretado por células T CD4+ co-cultivadas con células CHO-OKT3 en la presencia de 0,313 pg/ml de un anticuerpo anti-GITR que tiene las regiones constantes indicadas (mismo experimento como aquel en la Figura 76A).
Descripción Detallada de la Invención
La descripción técnica expuesta a continuación puede ir más alla, en algunos aspectos, del alcance de la invención, que se define por las reivindicaciones adjuntas. Los elementos de la descripción que no están dentro del alcance de las reivindicaciones se proporcionan con fines informativos, particularmente para situar la invención reivindicada real en un contexto técnico más amplio.
Se describen en la presente anticuerpos aislados, particularmente anticuerpos monoclonales, por ejemplo, anticuerpos monoclonales humanos, los cuales se unen específicamente a GITR y de este modo activan la señalización del GITR corriente abajo (“anticuerpos anti-GITR agonistas”). En ciertas modalidades, los anticuerpos descritos en la presente se derivan a partir de secuencias de línea germinal de cadena pesada y ligera particulares y/o que comprenden particular características estructurales tales como regiones CDR que comprenden secuencias de aminoácido particulares. Se proporcionan en la presente anticuerpos aislados, métodos para elaborar tales anticuerpos, inmunoconjugados y moléculas biespecíficas que comprenden tales anticuerpos, y composiciones farmacéuticas formuladas para contener los anticuerpos. También se proporcionan en la presente métodos para usar los anticuerpos para mejorar la respuesta inmune, solos o en combinación con otros agentes inmunoestimuladores (por ejemplo, anticuerpos) y/o terapias de cáncer. Por consiguiente, los anticuerpos anti-GITR descritos en la presente pueden ser usados en un tratamiento en una amplia variedad de aplicaciones terapéuticas, que incluyen, por ejemplo, inhibición del crecimiento del tumor y tratamiento de infecciones virales.
Definiciones
Con el fin de que la presente descripción puede ser más fácilmente entendida, ciertos términos son primero definidos. Las definiciones adicionales se exponen a través de la descripción detallada.
El término “receptor del TNF inducible por glucocorticoide” o “GITR” como se usa en la presente se refiere a un receptor que es un miembro de la superfamilia del receptor del TNF, el cual se une al ligando del GITR (GITR-L). El GITR es también referido como la superfamilia del receptor del factor necrosis del tumor, miembro 18 (TNFRSF18, por sus siglas en inglés), AITR y CD357. El término “GITR” incluye algunas variantes o isoformas del GITR las cuales son naturalmente expresadas por células. Por consiguiente, los anticuerpos descritos en la presente pueden reaccionar cruzado con GITR a partir de especies distintas de la humana (por ejemplo, GITR cinomólogo). Alternativamente, los anticuerpos pueden ser específicos para GITR humano y pueden no presentar alguna reactividad cruzada con otras especies. El GITR o algunas variantes e isoformas del mismo, pueden ya sea ser aislados a partir de células o tejidos los cuales los expresan naturalmente o ser producidos recombinantemente usando técnicas bien conocidas en el arte y/o aquellas descritas en la presente.
Tres isotermas de GITR humano han sido identificadas, todas las cuales comparten el mismo dominio extracelular, excepto para su porción C-terminal. La Variante 1 (Acceso No. NP_004186; SEQ ID NO: 1) consiste de 241 aminoácidos y representa el transcripto más largo. Contiene un segmento codificante adicional que conduce a un cambio de marco, comparado con la variante 2. La proteína resultante (isoforma 1) contiene un C-terminal más corto y distinto, comparado con la isoforma 2. La Variante 2 (Acceso No. NP_683699; SEQ ID NO: 2) codifica la proteína más larga (isoforma 2), que consiste de 255 aminoácidos, y es soluble. La Variante 3 (Acceso No. NP_683700; SEQ ID NO: 3) contiene un segmento codificante adicional que conduce a un cambio de marco, comparado con la variante 2. La proteína resultante (isoforma 3) contiene un C-terminal más corto y distinto, comparado con la isoforma 2, y consiste de 234 aminoácidos.
Abajo están las secuencias de aminoácido de las tres isoformas del GITR humano conocidas, GITR cino y GITR-L.
El GITR humano isoforma 1 (Acceso No. NP_004186; SEQ ID NO: 1; codificado por la secuencia de nucleótido que tiene Acceso No. NM_004195.2):
MAQHGAMGAFRALCGLALLCALSLGQRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGEECCSEWDCMC VQPEFHCGDPCCTTCRHHPCPPGQGVQSQGKFSFGFQCIDCASGTFSGGHEGHCKPWTDCTQFGFLTVFPGNKTH NAVCVPGSPPAEPLGWLTVVLLAVAACVLLLTSAQLGLHIWQLRSQCMWPRETQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERG ERSAEEKGRLGDLWV
El GITR humano isoforma 2 (Acceso No. NP_683699.1; SEQ ID NO: 2; codificado por la secuencia de nucleótido que tiene Acceso No. NM_148901.1):
MAQHGAMGAFRALCGLALLCALSLGQRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGEECCSEWDCMC VQPEFHCGDPCCTTCRHHPCPPGQGVQSQGKFSFGFQCIDCASGTFSGGHEGHCKPWTDCCWRCRRRPKTPEAA SSPRKSGASDRQRRRGGWETCGCEPGRPPGPPTAASPSPGAPQAAGALRSALGRALLPWQQKWVQEGGSDQRP GPCSSAAAAGPCRRERETQSWPPSSLAGPDGVGS
El GITR humano isoforma 3 (Acceso No. NP_683700.1; SEQ ID NO: 3; codificado por la secuencia de nucleótido que tiene Acceso No. NM_148902.1):
MAQHGAMGAFRALCGLALLCALSLGQRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGEECCSEWDCMC VQPEFHCGDPCCTTCRHHPCPPGQGVQSQGKFSFGFQCIDCASGTFSGGHEGHCKPWTDCTQFGFLTVFPGNKTH NAVCVPGSPPAEPLGWLTVVLLAVAACVLLLTSAQLGLHIWQLRKTQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEK GRLGDLWV
La secuencia señal de las isoformas 1-3 corresponde a los aminoácidos 1-25. De este modo, las isoformas maduras 1, 2 y 3 consisten de los aminoácidos 26 a 241, 255 o 234, respectivamente. El dominio extracelular de GITR maduro consiste de aminoácidos 26-162 y tiene la secuencia de aminoácido:
QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGEECCSEWDCMCVQPEFHCGDPCCTTCRHHPCPPGQ GVQSQGKFSFGFQCIDCASGTFSGGHEGHCKPWTDCTQFGFLTVFPGNKTHNAVCVPGSPPAEP (SEQ ID NO: 4)
Secuencia de proteína del GITR cinomólogo (SEQ ID NO: 5):
MCASGTLCCLALLCAASLGQRPTGGPGCGPGRLLLGTGKDARCCRVHPTRCCRDYQGEECCSEWDCVCVQPEFH CGNPCCTTCQHHPCPSGQGVQPQGKFSFGFRCVDCALGTFSRGHDGHCKPWTDCTQFGFLTVFPGNKTHNAVCV PGSPPAEPPGWLTIILLAVAACVLLLTSAQLGLHIWQLRSQPTGPRETQLLLEVPPSTEDASSCQFPEEERGERLAEEK GRLGDLWV
Secuencia de proteína del GITR-L humano (Acceso No. NP_005083.2; SEQ ID NO: 6):
MTLHPSPITCEFLFSTALISPKMCLSHLENMPLSHSRTQGAQRSSWKLWLFCSIVMLLFLCSFSWLIFIFLQLETAKEPC MAKFGPLPSKWQMASSEPPCVNKVSDWKLEILQNGLYLIYGQVAPNANYNDVAPFEVRLYKNKDMIQTLTNKSKIQN VGGTYELHVGDTIDLIFNSEHQVLKNNTYWGIILLANPQFIS
El término “anticuerpo” como se usa en la presente incluye anticuerpos completos y cualquier fragmento de unión al antígeno (es decir, “porciones de unión al antígeno”) o cadenas de los mismos simples. En una modalidad, un “anticuerpo” se refiere a una glucoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por puentes disulfuro, o una porción del mismo de unión al antígeno. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de cadena pesada (que se abrevia en la presente como Vh) y una región constante de cadena pesada. En determinados anticuerpos que se originan naturalmente, la región constante de cadena pesada comprende tres dominios, CH1, CH2 y CH3. En determinados anticuerpos que se originan naturalmente, cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente como Vl) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio, CL. Las regiones Vh y Vl también se pueden subdividir en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés), intercaladas con regiones más conservadas, denominadas regiones de armazón (FR, por sus siglas en inglés). Cada Vh y Vl está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el terminal amino hasta carboxi C-terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, Cd R2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a los tejidos hospedero o factores, incluso varias células del sistema inmune (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema complementario clásico.
Los anticuerpos se unen específicamente normalmente a su antígeno cognado con alta afinidad, lo cual se refleja mediante una constante de disociación (Kd) de 10-5 a 10-11 M o menor. En general, se considera que cualquier Kd mayor de aproximadamente 10-4 M indica una unión no específica. Como se usa en la presente, un anticuerpo que “se une específicamente” a un antígeno se refiere a un anticuerpo que se une al antígeno y los antígenos sustancialmente idénticos con alta afinidad, lo que implica tener una Kd de 10-7 M o menos, preferentemente, 10-8 M o menos, con mayor preferencia, 5 x 10-9 M o menor y, con máxima preferencia, entre 10-8 M y 10'1° M o menos, pero no se une con alta afinidad a antígenos no relacionados. Un antígeno es “sustancialmente idéntico” a un antígeno determinado si exhibe un alto grado de identidad de secuencia con el antígeno determinado, por ejemplo, si presenta al menos 80 %, al menos 90 %, preferiblemente al menos 95 %, más preferiblemente al menos 97 %, o aún más preferiblemente menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia del antígeno determinado. A modo de ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a GITR humana también puede reaccionar de manera cruzada con antígenos del GITR de determinadas especies de primates (por ejemplo, GITR cinomólogo), pero pueden no reaccionar de manera cruzada con antígenos del GITR de otras especies, o con un antígeno diferente del GITR.
Una inmunoglobulina puede ser de cualquiera de los isotipos comúnmente conocidos, que incluyen, pero no se limitan a, IgA, IgA secretora, IgG e IgM. El isotipo IgG se divide en subclases en determinadas especies: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 en seres humanos, e IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3 en ratones. En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-CD73 descritos en la presente son del subtipo IgG1 o IgG2. Las inmunoglobulinas, por ejemplo, IgG1, existen en varios alotipos, que se diferencian entre sí en algunos aminoácidos, como máximo. “Anticuerpo” puede incluir, a modo de ejemplo, anticuerpos que se originan naturalmente y que no se originan naturalmente; anticuerpos monoclonales y policlonales; anticuerpos quiméricos y humanizados; anticuerpos humanos y no humanos; anticuerpos completamente sintéticos; y anticuerpos de cadena sencilla.
El término “porción de unión al antígeno” de un anticuerpo, como se usa en la presente, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, GITR humano). Tales “fragmentos” son, por ejemplo de entre aproximadamente 8 y aproximadamente 1500 aminoácidos de longitud, adecuadamente de entre aproximadamente 8 y aproximadamente 745 aminoácidos de longitud, adecuadamente de aproximadamente 8 hasta aproximadamente 300, por ejemplo aproximadamente 8 hasta aproximadamente 200 aminoácidos, o aproximadamente 10 hasta aproximadamente 50 o 100 aminoácidos de longitud. Se ha mostrado que la función de unión al antígeno de un anticuerpo, puede ser realizada por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término “porción de unión al antígeno” de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo anti-GITR descrito en la presente, incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios Vl, Vh, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios Vh y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios Vl y Vh de un único brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio Vh; y (vi) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada o (vii) una combinación de dos o más CDR aisladas que, opcionalmente, se pueden unir mediante un ligador sintético. Además, si bien los dos dominios del fragmento Fv, Vl y Vh, son codificados por genes diferentes, se pueden unir, usando métodos recombinantes, mediante un ligador sintético que permite obtenerlos como una cadena proteica simple en donde las regiones Vl y Vh se aparean para formar moléculas monovalentes conocidas como Fv de cadena única (scFv); véase, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Tales anticuerpos de cadena única también están propuestos para estar abarcados dentro del término “porción de unión al antígeno” d un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen mediante técnicas convencionales conocidas por las personas expertas en la técnica, y los fragmentos son seleccionados para determinar la utilidad de la misma manera que con los anticuerpos intactos. Las porciones de unión al antígeno se pueden producir mediante técnicas de ADN recombinante o mediante escisión enzimática o química de inmunoglobulinas intactas.
Un “anticuerpo bifuncional” o “biespecífico” es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadenas pesadas/ligeras diferentes, y dos sitios de unión al antígeno diferentes. Los anticuerpos biespecíficos se pueden producir mediante diversos métodos que incluyen la fusión de hibridomas o la unión de fragmentos Fab'. Véase, por ejemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992).
La expresión “anticuerpo monoclonal”, como se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo que muestra una afinidad y especificidad de unión única para un epítopo en particular o una composición de anticuerpos en la que todos los anticuerpos muestran una afinidad y especificidad de unión única para un epítopo particular. Por consiguiente, el término “anticuerpo monoclonal humano” se refiere a un anticuerpo o composición de anticuerpo que presenta(n) una especificidad de unión única y la cual tiene regiones constantes opcionales y variables derivadas a partir de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal. En una modalidad, se producen anticuerpos monoclonales humanos por un hibridoma que incluye una célula B obtenida a partir de un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgen de cadena pesada humana y un transgen de cadena ligera fusionados a una célula inmortalizada.
El término “anticuerpo humano recombinante”, como se usa en la presente, incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico para los genes de inmunoglobulina humanos o un hibridoma preparados de estos, (b) anticuerpos aislados de una célula hospedera transformada para expresar el anticuerpo, por ejemplo, de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos humanos combinatoria recombinante, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por otros medios que incluyen el empalme de secuencias génicas de inmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes comprenden regiones variables y constantes que utilizan secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana particulares están codificados por los genes de la línea germinal, pero incluyen redisposiciones y mutaciones posteriores que se producen, por ejemplo, durante la maduración del anticuerpo. Como se conoce en la técnica (véase, por ejemplo, Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9):1117-1125), la región variable contiene el dominio de unión al antígeno, que está codificado por diversos genes que se redisponen para formar un anticuerpo específico para un antígeno extraño. Además de la redisposición, la región variable también se puede modificar mediante cambios múltiples de aminoácidos simples (referidos como mutación somática o hipermutación) para aumentar la afinidad del anticuerpo al antígeno extraño. La región constante cambiará en respuesta adicional a un antígeno (es decir, cambio de isotipo). Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico redispuestas y sometidas a mutación somática que codifican los polipéptidos de inmunoglobulina de cadena ligera y la cadena pesada en respuesta a un antígeno pueden no tener identidad de secuencia con las moléculas de ácido nucleico originales, pero, en su lugar, serán sustancialmente idénticas o similares (es decir, tendrán al menos 80 % de identidad).
Un anticuerpo “humano” (HuMAb) se refiere a un anticuerpo que tiene regiones variables en donde las regiones armazón y CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Asimismo, si el anticuerpo contiene una región constante, esta también deriva de las secuencias de inmunoglobulinas de línea germinal humanas. Los anticuerpos descritos en la presente pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas al azar, mutagénesis específica de sitio in vitro o mutación somática in vivo). Sin embargo, como se usa en la presente, la expresión “anticuerpo humano” no incluye anticuerpos en donde las secuencias de CDR que derivan de la línea germinal de otras especies de mamíferos, como ratón, se injertaron en secuencias de armazón humanas. Las expresiones anticuerpos “humanos” y anticuerpos “completamente humanos” se usan como sinónimos.
Un anticuerpo “humanizado” se refiere a un anticuerpo en donde algunos, todos o la mayor parte de los aminoácidos fuera de los dominios CDR de un anticuerpo no humano se reemplazan por los aminoácidos correspondientes que derivan de inmunoglobulinas humanas. En una modalidad de una forma humanizada de un anticuerpo, algunos, todos o la mayor parte de los aminoácidos fuera de los dominios CDR se reemplazaron por aminoácidos de inmunoglobulinas humanas, mientras que algunos, todos o la mayor parte de los aminoácidos dentro de una o más regiones CDR permanecen sin cambios. Se permiten pequeñas adiciones, supresiones, inserciones, sustituciones o modificaciones de aminoácidos, siempre que no anulen la capacidad del anticuerpo de unirse a un antígeno en particular. Un anticuerpo “humanizado” retiene una especificidad antigénica similar a aquella del anticuerpo original.
Un “anticuerpo quimérico” se refiere a un anticuerpo en donde las regiones variables se derivan de una especie y las regiones constantes se derivan de otra especie, tal como un anticuerpo en donde las regiones variables se derivan de un anticuerpo de ratón y las regiones constantes se derivan de un anticuerpo humano.
Como se usa en la presente, “ isotipo” se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, los anticuerpos IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD e IgE) que es codificado por los genes de la región constante de cadena pesada.
“Alotipo” se refiere a las variantes naturales dentro de un grupo de isotipo específico, cuyas variantes difieren en algunos aminoácidos (véase, por ejemplo, Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1). Los anticuerpos descritos en la presente pueden ser de cualquier alotipo. Como se usa en la presente, los anticuerpos referidos como isotipo “ IgG1f” o “ IgG1.1f” son anticuerpos IgG1 e IgG1.1 menos efectores, respectivamente, del alotipo “f,” es decir, que tienen 214R, 356E y 358M de conformidad con el índice EU como en Kabat, como se muestra, por ejemplo, en el SEQ ID NO: 7, (véase residuos subrayados en el SEQ ID NO: 7 de Tabla 15).
Las frases “un anticuerpo que reconoce un antígeno” y “un anticuerpo específico para un antígeno” se usan en la presente de manera indistinta con la frase “un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno”.
Como se usa en la presente, un “anticuerpo aislado” se refiere a un anticuerpo el cual es sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen especificidades antigénicas diferentes (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a GITR es sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos diferentes de GITR). Un anticuerpo aislado que se une específicamente a un epítopo de GITR puede, no obstante, tener reactividad cruzada a otras proteínas GITR de especies diferentes.
Como se usa en la presente, un anticuerpo que “ inhibe la unión de GITR-L a GITR” está propuesto para referirse a un anticuerpo que inhibe la unión de GITR-L a GITR, por ejemplo, en ensayos de unión usando células 3A9-hGITR, con una EC50 de aproximadamente 1 pg/mL o menos, tal como aproximadamente 0,9 pg/mL o menos, aproximadamente 0,85 pg/mL o menos, aproximadamente 0,8 pg/mL o menos, aproximadamente 0,75 pg/mL o menos, aproximadamente 0,7 pg/mL o menos, aproximadamente 0,65 pg/mL o menos, aproximadamente 0,6 pg/mL o menos, aproximadamente 0,55 pg/mL o menos, aproximadamente 0,5 pg/mL o menos, aproximadamente 0,45 pg/mL o menos, aproximadamente 0,4 pg/mL o menos, aproximadamente 0,35 pg/mL o menos, aproximadamente 0,3 pg/mL o menos, aproximadamente 0,25 pg/mL o menos, aproximadamente 0,2 pg/mL o menos, aproximadamente 0,15 pg/mL o menos, o aproximadamente 0,1 pg/mL o menos, en métodos reconocidos en la técnica, por ejemplo, los ensayos de unión a base de FAC-S descritos en la presente.
Una “función efectora” se refiere a la interacción de una región Fc del anticuerpo con un receptor Fc o ligando, o un episodio bioquímico como resultado de esta. Los ejemplos de “funciones efectoras” incluyen unión a Clq, citotoxicidad dependiente del complemento (CDC, por sus siglas en inglés), unión al receptor Fc, funciones efectoras mediadas por FcyR, tales como ADCC y fagocitosis celular dependiente de anticuerpo (ADCP, por sus siglas en inglés) y regulación descendente de un receptor de la superficie celular (por ejemplo, receptor de célula B; BCR). En general, estas funciones efectoras requieren que la región Fc se combine con un dominio de unión (por ejemplo, un dominio variable del anticuerpo).
Un “receptor Fc” o “FcR” es un receptor que se une a la región Fc de una inmunoglobulina. Los FcR que se unen a un anticuerpo IgG comprenden receptores de la familia de FcyR, que incluyen variantes alélicas y, de manera alternativa, las formas empalmadas de estos receptores. La familia de FcyR consiste en tres receptores activadores (FcyRI, FcyRIII, y FcyRIV en ratones; FcyRIA, FcyRIIA y FcyRIIIA en humanos) y uno inhibidor (FcyRIIB). Diversas propiedades de FcyR humanos se resumen en la Tabla 1. La mayor parte de los tipos de células efectoras innatas coexpresa uno o más de los FcyR activadores y los FcyRIIB inhibidores, mientras que las células asesinas naturales (NK) expresan de manera selectiva un receptor Fc activador (FcyRIII en ratones y FcyRIIIA en humanos) pero no el FcyRIIB inhibidor en ratones y humanos. IgG1 humana se une a la mayor parte de los receptores Fc humanos y se considera equivalente a IgG2a murina con respecto a los tipos de receptores Fc activadores a los que se une.
Tabla 1. Pro iedades de FcyR humanos
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Una “región Fc” (región cristalizable del fragmento) o “dominio Fc” o “Fc” se refiere a la región del C-terminal de la cadena pesada de un anticuerpo que media la unión de la inmunoglobulina a factores o tejidos hospederos, lo que incluye la unión a receptores Fc ubicados en diferentes células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) o al primer componente (C1q) del sistema de complementos clásico. Por lo tanto, una región Fc comprende la región constante de un anticuerpo, sin incluir el primer dominio de la región constante de inmunoglobulina (por ejemplo, CH1 o CL). En isotipos de anticuerpos IgG, IgA e IgD, la región Fc comprende dos fragmentos de proteína idéntica, derivados de los dominios constantes segundo (Ch2) y tercero (Ch3) de las dos cadenas pesadas del anticuerpo; las regiones Fc de IgM e IgE comprenden tres dominios constantes de la cadena pesada (dominios 2-4 de Ch) en cada cadena de polipéptidos. Para IgG, la región Fc comprende los dominios de inmunoglobulina Cy2 y Cy3 y la bisagra entre Cy1 y Cy2. Si bien los límites de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la región Fc de la cadena pesada de IgG humana se define, por lo general, desde un residuo de aminoácido en la posición C226 o P230 (o un aminoácido entre estos dos aminoácidos) hasta el C-terminal de la cadena pesada, en donde la numeración se realiza de conformidad con el índice EU como en Kabat. El dominio Ch2 de una región Fc de IgG humana se extiende desde aproximadamente el aminoácido 231 hasta aproximadamente el aminoácido 340, mientras que el dominio Ch3 está ubicado en el lado del C-terminal de un dominio Ch2 en una región Fc, es decir, se extiende desde aproximadamente el aminoácido 341 hasta aproximadamente el aminoácido 447 de una IgG. Como se usa en la presente, la región Fc puede ser una Fc de secuencia nativa, que incluye cualquier variante alotípica, o una Fc variante (por ejemplo, una Fc que no se origina naturalmente). La Fc también se puede referir a esta región aislada o en el contexto de un polipéptido de proteína que comprende Fc, tal como una “proteína de unión que comprende una región Fc”, también referida como una “proteína de fusión Fc” (por ejemplo, un anticuerpo o inmunoadhesina).
Una “región Fc de la secuencia nativa” o “Fc de la secuencia nativa” comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fc encontrada en la naturaleza. Las regiones Fc humanas de secuencia nativa incluyen una región Fc de IgG1 humana de secuencia nativa; región Fc de IgG2 humana de secuencia nativa; región Fc de IgG3 humana de secuencia nativa; y región Fc de IgG4 humana de secuencia nativa, además de las variantes que se originan naturalmente de estas. La Fc de secuencia nativa incluye los diferentes alotipos de Fc. (Véase, por ejemplo, Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1).
Las expresiones “bisagra”, “dominio bisagra”, o “región bisagra” o “región bisagra del anticuerpo” se refieren al dominio de una región constante de cadena pesada que une el dominio CH1 al dominio CH2 e incluye las porciones superior, media e inferior de la bisagra (Roux et al. J. Immunol. 1998 161:4083). La bisagra proporciona diversos niveles de flexibilidad entre las regiones de unión y efectoras de un anticuerpo y también proporciona sitios para los puentes disulfuro intermoleculares entre las dos regiones constantes de cadena pesada. Como se usa en la presente, una bisagra comienza en Glu216 y termina en Gly237 para todos los isotipos IgG (Roux et al., 1998 J Immunol 161:4083). Las secuencias de las bisagras de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 de tipo silvestre se muestran en las Tablas 2 y 29. Tabla 2
Aminoácidos de la región bisagra
Tipo de Ig Ch1 de C-terminal* Bisagra superior Bisagra media Bisagra inferior IgG1 VDKRV EPKSCDKTHT CPPCP APELLGG
(SEQ ID NO: 299) (SEQ ID NO: 301) (SEQ ID NO: 305) (SEQ ID NO: 313) IgG2 VDKTV ERK CCVECPPCP APPVAG
(SEQ ID NO: 300) (SEQ ID NO: 306) (SEQ ID NO: 314) IgG3 (17-15-15­ VDKRV ELKTPLGDTTHT CPRCP APELLGG
15)
(SEQ ID NO: 299) (SEQ ID NO: 302) (EPKSCDTPPPCP (SEQ ID NO: 313) RCP)3
(SEQ ID NO: 307)
IgG3 (17-15-15) VDKRV ELKTPLGDTTHT CPRCP APELLGG
(SEQ ID NO: 299) (SEQ ID NO: 302) (EPKSCDTPPPCP (SEQ ID NO: 313) RCP)2
(SEQ ID NO: 308)
IgG3 (17-15) VDKRV ELKTPLGDTTHT CPRCP APELLGG
(SEQ ID NO: 299) (SEQ ID NO: 302) (EPKSCDTPPPCP (SEQ ID NO: 313) RCP)1
(SEQ ID NO: 309)
IgG3 (15-15-15) VDKRV EPKS CDTPPPCPRCP APELLGG
(SEQ ID NO: 299) (SEQ ID NO: 303) (EPKSCDTPPPCP (SEQ ID NO: 313) RCP)2
(SEQ ID NO: 310)
IgG3(15) VDKRV EPKS CDTPPPCPRCP APELLGG
(continuación)
Tipo de Ig
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Ch1 de C-terminal* Bisagra superior Bisagra media Bisagra inferior IgG4 VDKRV ESKYGPP CPSCP a p e f l g g
(SEQ ID NO: 299) (SEQ ID NO: 304) (SEQ ID NO: 312) (SEQ ID NO: 313) * secuencias de aminoácidos de C-terminal de los dominios CH1.
El término “bisagra” incluye bisagras de tipo silvestre (tales como las indicadas en la Tabla 15), así como variantes de estas (por ejemplo, bisagras que no se originan naturalmente o bisagras modificadas). Por ejemplo, el término “bisagra de IgG2” incluye la bisagra de IgG2 de tipo silvestre, como se muestra en la Tabla 15, y variantes que tienen 1, 2, 3, 4, 5, 1-3, 1-5, 3-5 y/o, como máximo, 5, 4, 3, 2 o 1 mutaciones, por ejemplo, sustituciones, supresiones o adiciones. Los ejemplos de las variantes de la bisagra de IgG2 incluyen bisagras de IgG2 en donde 1,2, 3 o las 4 cisteínas (C219, C220, C226 y C229) cambian a otro aminoácido. En una modalidad específica, una IgG2 comprende una sustitución C219S. En ciertas modalidades, una bisagra es una bisagra híbrida que comprende secuencias de al menos dos isotipos. Por ejemplo, una bisagra puede comprender la bisagra superior, media o inferior de un isotipo y el resto de la bisagra de uno o más isotipos diferentes. Por ejemplo, una bisagra puede ser una bisagra de IgG2/IgG1 y puede comprender, por ejemplo, las bisagras superior y media de IgG2 y la bisagra inferior de IgG1. Una bisagra puede tener una función efectora o carecer de ella. Por ejemplo, la bisagra inferior de IgG1 de tipo silvestre proporciona una función efectora. White et al. ((2015) Cancer Cell 27: 138-148) reportan que la conformación de la bisagra de la IgG2 humana (completa) imparte actividad agonista independiente de FcyR a anticuerpos anticancerosos inmunoestimuladores.
El término “dominio CH1” se refiere a la región constante de cadena pesada que une el dominio variable a la bisagra en un dominio constante de cadena pesada. Como se usa en la presente, un dominio CH1 comienza en A118 y termina en V215. El término “dominio CH1” incluye los dominios CH1 de tipo silvestre (tal como que tienen SEQ ID NO: 288 para IgG1 y SEQ ID NO: 278 para IgG2; Tabla 15), así como también variantes de estos (por ejemplo, dominios CH1 que no se originan naturalmente o dominios CH1 modificados). Por ejemplo, el término “dominio CH1” incluye los dominios CH1 de tipo silvestre y variantes de estos que tienen 1, 2, 3, 4, 5, 1-3, 1-5, 3-5 y/o, como máximo, 5, 4, 3, 2 o 1 mutaciones, por ejemplo, sustituciones, supresiones o adiciones. Los ejemplos de dominios CH1 incluyen dominios CH1 con mutaciones que modifican una actividad biológica de un anticuerpo, tal como ADCC, CDC o semivida. Las modificaciones al dominio CH1 que afectan una actividad biológica de un anticuerpo se proporcionan en la presente.
El término “dominio CH2” se refiere a la región constante de cadena pesada que une la bisagra al dominio CH3 en un dominio constante de cadena pesada. Como se usa en la presente, un dominio CH2 comienza en P238 y termina en K340. El término “dominio CH2” incluye los dominios CH2 de tipo silvestre (tal como que tienen SEQ ID NO: 280 para IgG1 y SEQ ID NO:297 para IgG2; Tabla 15), así como también variantes de estos (por ejemplo, dominios CH2 que no se originan naturalmente o dominios CH2 modificados). Por ejemplo, el término “dominio CH2” incluye los dominios CH2 de tipo silvestre y variantes de estos que tienen 1, 2, 3, 4, 5, 1-3, 1-5, 3-5 y/o, como máximo, 5, 4, 3, 2 o 1 mutaciones, por ejemplo, sustituciones, supresiones o adiciones. Los ejemplos de dominios CH2 incluyen dominios CH2 con mutaciones que modifican una actividad biológica de un anticuerpo, tal como ADCC, CDC o semivida. En ciertas modalidades, un dominio CH2 comprende las sustituciones A330S/P331S que reducen la función efectora. Otras modificaciones al dominio CH2 que afectan una actividad biológica de un anticuerpo se proporcionan en la presente.
El término “dominio CH3” se refiere a la región constante de cadena pesada que es C-terminal para el dominio CH2 en un dominio constante de cadena pesada. Como se usa en la presente, un dominio CH3 comienza en G341 y termina en K447. El término “dominio CH3” incluye los dominios CH3 de tipo silvestre (tales como que tienen el SEQ ID NO: 282 para IgG1 y SEQ ID NO:298 para IgG2; Tabla 15), así como también variantes de estos (por ejemplo, dominios CH3 que no se originan naturalmente o dominios CH3 modificados). Por ejemplo, el término “dominio CH3” incluye los dominios CH3 de tipo silvestre y variantes de estos que tienen 1,2, 3, 4, 5, 1-3, 1-5, 3-5 y/o, como máximo, 5, 4, 3, 2 o 1 mutaciones, por ejemplo, sustituciones, supresiones o adiciones. Los ejemplos de dominios CH3 incluyen dominios CH3 con mutaciones que modifican una actividad biológica de un anticuerpo, tal como ADCC, CDC o semivida. Las modificaciones al dominio CH3 que afectan una actividad biológica de un anticuerpo se proporcionan en la presente.
Una “región Fc de la secuencia nativa” o “Fc de la secuencia nativa” comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fc encontrada en la naturaleza. Las regiones Fc humanas de secuencia nativa incluyen una región Fc de IgG1 humana de secuencia nativa; región Fc de IgG2 humana de secuencia nativa; región Fc de IgG3 humana de secuencia nativa; y región Fc de IgG4 humana de secuencia nativa, así como también variantes que se originan naturalmente de estas. La Fc de secuencia nativa incluye los diversos alotipos de Fc (véase, por ejemplo, Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1).
Los términos “epítopo” o “determinante antigénico” se refieren a un sitio en un antígeno (por ejemplo, GITR) al que una inmunoglobulina o un anticuerpo se unen específicamente. Los epítopos dentro de los antígenos de proteínas se pueden formar de aminoácidos contiguos (en general, un epítopo lineal) o aminoácidos no contiguos yuxtapuestos mediante el plegamiento terciario de la proteína (usualmente, un epítopo conformacional). En general, pero no siempre, los epítopos formados de aminoácidos contiguos quedan retenidos en la exposición a solventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados mediante el plegamiento terciario, por lo general, se pierden en el tratamiento con solventes desnaturalizantes. En general, un epítopo incluye al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos en una conformación espacial única. Los métodos para determinar qué epítopos están unidos por un anticuerpo determinado (es decir, mapeo de epítopos) son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, ensayos de inmunotransferencia e inmunoprecipitación, en donde los péptidos superpuestos o contiguos (por ejemplo, de GITR) se evalúan para determinar su reactividad con un anticuerpo determinado (por ejemplo, el anticuerpo anti- GITR). Los métodos para determinar la conformación espacial de los epítopos incluyen técnicas en la técnica y las descritas en la presente, por ejemplo, cristalografía de rayos X, resonancia magnética nuclear bidimensional y HDX-MS (véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)).
El término “mapeo de epítopos” se refiere al proceso de identificación de los determinantes moleculares para el reconocimiento anticuerpo-antígeno.
El término “se unen al mismo epítopo” en referencia a dos o más anticuerpos significa que los anticuerpos se unen al mismo segmento de residuos de aminoácidos, como se determina mediante un método dado. Las técnicas para determinar si los anticuerpos se unen al “mismo epítopo en GITR” con los anticuerpos descritos en la presente incluyen, por ejemplo, métodos de mapeo de epítopos, tales como análisis de rayos X de cristales de complejos antígeno:anticuerpo, que proporciona la resolución atómica del epítopo, y espectrometría de masa de intercambio de hidrógeno/deuterio (HDX-MS). Otros métodos que monitorean la unión del anticuerpo a fragmentos del antígeno o variaciones mutadas del antígeno, en donde la pérdida de unión debido a una modificación de un residuo de aminoácidos dentro de la secuencia de antígenos es a menudo considerada una indicación del un componente del epítopo. Asimismo, también se pueden usar métodos computacionales combinatorios para el mapeo de epítopos. Estos métodos dependen de la capacidad del anticuerpo de interés para aislar la afinidad de péptidos cortos específicos de bibliotecas de péptidos de expresión en fago combinatorias. Los anticuerpos que tienen las mismas VH y Vl o las mismas secuencias CDR1, 2 y 3, se espera se unan al mismo epítopo.
Los anticuerpos que “compiten con otro anticuerpo para unirse a un objetivo” se refieren a los anticuerpos que inhiben (parcial o completamente) la unión del otro anticuerpo al objetivo. Se puede determinar si dos anticuerpos compiten entre sí para unirse a un objetivo, es decir, si un anticuerpo inhibe la unión del otro anticuerpo a un objetivo, y en qué medida lo hace, usando los experimentos de competencia conocidos. En ciertas modalidades, un anticuerpo compite con otro anticuerpo e inhibe la unión de este a un objetivo en al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 %. El nivel de inhibición o competencia puede variar según qué anticuerpo sea el “anticuerpo de bloqueo” (es decir, el anticuerpo de reacción en frío que se incuba primero con el objetivo). Los ensayos de competencia se pueden llevar a cabo según se describe, por ejemplo, en Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.prot4277 o en el capítulo 11 de “Using Antibodies” por Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA., 1999. Los anticuerpos que compiten se unen al mismo epítopo, un epítopo superpuesto o a epítopos adyacentes (por ejemplo, como se muestra mediante el impedimento estérico).
Otros ensayos de unión competitiva incluyen: radioinmunoensayo (RIA) directo o indirecto en fase sólida, inmunoensayo enzimático (EIA) directo o indirecto en fase sólida, ensayo de competencia de intercalado (véase Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983)); EIA de biotina-avidina directo en fase sólida (véase Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986)); ensayo con etiqueta directo en fase sólida, ensayo de intercalado con etiqueta directo en fase sólida (véase Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); RIA con etiqueta directo en fase sólida, usando una etiqueta I-125 (véase Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)); EIA de biotina-avidina directo en fase sólida (Cheung et al., Virology 176:546 (1990)); y RIA directo con etiqueta. (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990)).
Como se usa en la presente, los términos “unión específica”, “unión selectiva”, “se une de manera selectiva” y “se une específicamente” se refieren a la unión del anticuerpo a un epítopo en un antígeno predeterminado. Normalmente, el anticuerpo (i) se une con una constante de disociación de equilibrio (Kd) de, aproximadamente, menos de 10'7 M, tal como aproximadamente menos de 10'8M, 10'9M, 10'1°M o incluso menor cuando se determina mediante, por ejemplo, tecnología de resonancia de plasmones superficiales (SPR, por sus siglas en inglés) en un instrumento BIACo Re® 2000 usando el antígeno predeterminado, por ejemplo, GITR humano recombinante como analito y el anticuerpo como ligando, o mediante el análisis de Scatchard de la unión del anticuerpo a células positivas al antígeno, y (ii) se une al antígeno predeterminado con una afinidad que es al menos dos veces mayor que su afinidad para unirse a un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína) diferente del antígeno predeterminado o un antígeno estrechamente relacionado. En consecuencia, un anticuerpo que “se une específicamente a GITR humano” se refiere a un anticuerpo que se une a GITR humano soluble o unido a células con una Kd de 10'7 M o menos, tal como, aproximadamente, menos de 10'8 M, 10'9 M, 10'10 M o incluso menor. Un anticuerpo que “reacciona de manera cruzada con GITR de cinomólogo”, se refiere a un anticuerpo que se une a GITR de cinomólogo con una Kd de 10'7 M o menos, tal como aproximadamente menos de 10'8 M, 10'9 M o 10'10 M, o incluso menor. En ciertas modalidades, los anticuerpos que no reaccionan de manera cruzada con GITR de una especie no humana exhiben una unión esencialmente indetectable en comparación con estas proteínas en ensayos de unión estándar.
Los términos “kasoc” o “ka”, como se usan en la presente, se pretenden para referirse a la constante de velocidad de asociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular, mientras que los términos “kdis” o “kd”, como se usan en la presente, se pretenden para refieren a la constante de velocidad de disociación de una interacción anticuerpoantígeno particular. El término “Kd”, como se usa en la presente, está propuesto para refiere a la constante de disociación, la cual se obtiene de la relación de kd con respecto a ka (es decir, kd/ka) y se expresa como una concentración molar (M). Los valores Kd de los anticuerpos se pueden determinar usando métodos establecidos en la técnica. Un método preferido para determinar la Kd de un anticuerpo es la resonancia de plasmones superficiales, preferentemente, usando un sistema biosensor, tal como un sistema de resonancia de plasmones superficiales Biacore® o citometría de flujo y análisis de Scatchard.
Como se usa en la presente, el término “alta afinidad” para un anticuerpo IgG se refiere a un anticuerpo que tiene una Kd de 1°'8 M o menos, más preferiblemente 1°'9 M o menos y aún más preferiblemente 1°'1° M o menos para un antígeno objetivo. Sin embargo, la unión de “alta afinidad” puede variar para otros isotipos de anticuerpo. Por ejemplo, unión de “alta afinidad” para un isotipo IgM se refiere a un anticuerpo que tiene una Kd de 1°'7 M o menos, más preferiblemente 1°'8 M o menos.
El término “EC50”, en el contexto de un ensayo in vitro o in vivo usando un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de este, se refiere a la concentración de un anticuerpo o una porción de unión al antígeno de este que induce una respuesta que representa el 5° % de la respuesta máxima, es decir, un valor intermedio entre la respuesta máxima y el valor inicial.
La expresión “se une a GITR inmovilizado” se refiere a la capacidad de un anticuerpo descrito en la presente para unirse a GITR, por ejemplo, expresado en la superficie de una célula o unido a un soporte sólido.
La expresión “reacciona de manera cruzada”, como se usa en la presente, se refiere a la capacidad de un anticuerpo descrito en la presente para unirse a GITR de una especie diferente. Por ejemplo, un anticuerpo descrito en la presente que se une a GITR humano también se puede unir a GITR de otras especies (por ejemplo, GITR de cinomólogo). Como se usa en la presente, la reactividad cruzada se puede medir detectando una reactividad específica con antígeno purificado en ensayos de unión (por ejemplo, SPR, ELISA), o unión a, o de otro modo interactuando funcionalmente con, células que expresan fisiológicamente GITR. Los métodos para determinar la reactividad cruzada incluyen análisis de unión estándares como se describen en la presente, por ejemplo, mediante análisis por resonancia de plasmones superficiales (SPR) de BIACORE™ usando un instrumento de SPR BIACORE™ 200° (Biacore AB, Uppsala, Suecia) o técnicas de citometría de flujo.
El término “que se originan naturalmente”, como se usa en la presente en referencia a un objeto, se refiere al hecho de que un objeto se puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptidos o polinucleótidos presente en un organismo (que incluye virus) que se puede aislar de una fuente en la naturaleza y que no fue modificada de manera intencional por el hombre en el laboratorio se origina naturalmente.
Un “polipéptido” se refiere a una cadena que comprende al menos dos residuos de aminoácidos unidos consecutivamente, sin límite superior en la longitud de cadena. Uno o más residuos de aminoácidos en la proteína pueden contener una modificación, tal como, pero no limitado a, formación de unión de glicosilación, fosforilación o unión de disulfuro. Una “proteína” puede comprender uno o más polipéptidos.
La expresión “molécula de ácido nucleico”, como se usa en la presente, incluye moléculas de ADN y moléculas de ARN. Una molécula de ácido nucleico puede ser de cadena única o de cadena doble, y puede ser cADN.
También se proporcionan “modificaciones de secuencia conservadora” de las secuencias expuestas en la presente, por ejemplo, en la Tabla 15, tal como en los SEQ ID NOs: 13-191, es decir, modificaciones de secuencias de nucleótidos y aminoácidos las cuales no anulan la unión del anticuerpo codificado por la secuencia de nucleótidos, o que contiene la secuencia de aminoácidos, al antígeno. Tales modificaciones de secuencia conservadora incluyen sustituciones de nucleótidos y aminoácidos conservadoras, así como también, adiciones y supresiones de aminoácidos y nucleótidos. Por ejemplo, las modificaciones se pueden introducir en una secuencia en la Tabla 15, por ejemplo, SEQ ID NOs: 13-191, por técnicas estándares conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras, incluyen aquellas en las cuales el residuo de aminoácido se reemplaza por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Se han definido en el arte familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales ramificadas beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). De este modo, un residuo de aminoácido no esencial previsto en un anticuerpo anti-GITR se reemplaza, preferentemente, por otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadenas laterales. Los métodos para identificar sustituciones conservadoras de nucleótidos y aminoácidos que no eliminan la unión al antígeno son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Brummell et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); y Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997)). De manera alternativa, en otra modalidad, las mutaciones se pueden introducir aleatoriamente en la totalidad o en parte de una secuencia que codifica el anticuerpo anti-GITR, tal como, mediante mutagénesis por saturación, y los anticuerpos anti-GITR modificados resultantes se pueden seleccionar para la actividad de unión.
Para los ácidos nucleicos, la expresión “homología sustancial” indica que dos ácidos nucleicos, o las secuencias designadas de estos, cuando se alinean de manera óptima y se comparan, son idénticos, con las inserciones o supresiones de nucleótidos adecuadas, en al menos aproximadamente 80 % de los nucleótidos, en general, al menos aproximadamente 90 % a 95 % y, con mayor preferencia, al menos aproximadamente 98 % a 99,5 % de los nucleótidos. De manera alternativa, la homología sustancial existe cuando los segmentos se hibridan en condiciones de hibridación selectivas, al complemento de la hebra.
Para los polipéptidos, la expresión “homología sustancial” indica que dos polipéptidos, o las secuencias designadas de estos, cuando se alinean de manera óptima y se comparan, son idénticos, con las inserciones o supresiones de aminoácidos adecuadas, en al menos aproximadamente 80 % de los aminoácidos, en general, al menos aproximadamente 90 % a 95 % y, con mayor preferencia, al menos aproximadamente 98 % a 99,5 % de los aminoácidos.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de homología = % de posiciones idénticas/ % de posiciones x 100), teniendo en cuenta el número de espacios y la longitud de cada espacio, que se deben incorporar para una alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias pueden lograrse usando un algoritmo matemático, como se describe en los ejemplos no limitativos que se indican más adelante.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se puede determinar mediante el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz NWSgapdna.CMP, un peso de espacio de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitud de 1,2, 3, 4, 5 o 6. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos también se puede determinar con el algoritmo de E. Meyers and W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)) que se incorporó en el programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de residuo de peso PAM120, penalidad por longitud de espacio de 12 y penalidad por espacio de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar mediante el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)), que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de espacio de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
Las secuencias de ácido nucleico y proteína descritas en la presente también se pueden usar como “secuencia de consulta” para realizar una búsqueda en bases de datos públicas, por ejemplo, para identificar secuencias afines. Tales búsquedas pueden llevarse a cabo con los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Las búsquedas de nucleótidos con BLAST pueden llevarse a cabo con el programa NBLAST, calificación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente. Las búsquedas de proteínas con BLAST pueden llevarse a cabo con el programa XBLAST, calificación=50, longitud de palabra=3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de proteína descritas en la presente. A fin de obtener alineaciones espaciadas para fines comparativos, se puede utilizar Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden usarse los parámetros predeterminados de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Véase www.ncbi.nlm.nih.gov.
Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células enteras, en un lisado celular o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un ácido nucleico está “aislado” o “se vuelve sustancialmente puro” cuando se purifica de otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otras proteínas o ácidos nucleicos celulares (por ejemplo, las otras partes del cromosoma), mediante técnicas estándares, que incluyen el tratamiento con SDS/alcalino, bandas de CsCl, cromatografía en columna, electroforesis en gel de agarosa y otras técnicas conocidas en la técnica. Véase, F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, Nueva York (1987).
Los ácidos nucleicos, por ejemplo, cADN, se pueden mutar de conformidad con técnicas estándares para proporcionar secuencias de genes. Para secuencias codificantes, estas mutaciones pueden afectar la secuencia de aminoácidos según se desee. En particular, se contemplan las secuencias de ADN sustancialmente homólogas a, o derivadas de, secuencias nativas V, D, J, constantes, cambios y otras secuencias descritas en la presente (donde “derivado” indica que una secuencia es idéntica o modificada de otra secuencia).
El término “vector,” como se usa en la presente, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ligó. Un tipo de vector es un “plásmido”, que se refiere a un bucle de ADN de doble hebra circular en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde se pueden ligar segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. Determinados vectores son capaces de replicarse de manera autónoma en una célula hospedera en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episomales de mamíferos). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episomales de mamíferos) se pueden integrar en el genoma de una célula hospedera luego de la introducción en la célula hospedera y, de este modo, se replican junto con el genoma hospedero. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que se ligan operativamente. Estos vectores se denominan en la presente “vectores de expresión recombinante” (o simplemente, “vectores de expresión”). En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante suelen encontrarse en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, “plásmido” y “vector” se pueden usar de manera indistinta, dado que el plásmido es la forma de vector más comúnmente usada. No obstante, también se incluyen otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus, adenovirus y virus asociados a adeno incapaces de replicarse), que cumplen funciones equivalentes.
La expresión “célula hospedera recombinante” (o simplemente “célula hospedera”), como se usa en la presente, se refiere a una célula que comprende un ácido nucleico que no se presenta naturalmente en la célula y puede ser una célula en la que se introdujo un vector de expresión recombinante. Cabe destacar que estas expresiones no solo se refieren a una célula del sujeto particular sino también a la progenie de esa célula. Dado que se pueden producir ciertas modificaciones en las generaciones posteriores debido a mutaciones o influencias ambientales, es posible que la progenie no sea, de hecho, idéntica a la célula de origen, pero aún así está incluida en el alcance de la expresión “célula hospedera” que se usa en la presente.
Como se usa en la presente, el término “antígeno” se refiere a cualquier sustancia inmunógena natural o sintética, tal como una proteína, un péptido o un hapteno. Un antígeno puede ser GITR o un fragmento de este. Un antígeno también puede ser un antígeno tumoral, contra el cual se desean respuestas inmunes terapéuticas o protectoras, por ejemplo, antígenos expresados por una célula tumoral (por ejemplo, en una vacuna en combinación con un anticuerpo anti-GITR). Los antígenos incluyen antígenos asociados al tumor para la prevención o tratamiento de cánceres. Ejemplos de antígenos asociados al tumor incluyen, pero no se limitan a, secuencias que comprenden toda o parte de las secuencias de phCG, gp100 o Pmel17, HER2/neu, WT1, mesotelina, CEA, gp100, MART1, TRP-2, melan-A, NY-ESO-1, NY-BR-1, Ny -CO-58, MN (gp250), idiotipo, MAGE-1, MAGE-3, MAGE-A3, Tirosinasa, Telomerasa, antígenos SSX2 y MUC-1, y células germinales derivadas de antígenos tumorales. Los antígenos asociados al tumor también incluyen los antígenos del grupo sanguíneo, por ejemplo, antígenos Lea, Leb, LeX, LeY, H-2, B-1, B-2. Alternativamente, más de un antígeno puede ser incluido en un constructo. Por ejemplo, un antígeno MAGE puede ser combinado con otros antígenos tales como melanina A, tirosinasa, y gp100 largo con adyuvantes tales como GM-CSF o IL-12, y ligados a un anticuerpo anti-APC.
Las secuencias de los antígenos extraños son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un ejemplo de una secuencia de ADNc MAGE-3 se proporciona en el documento US 6.235.525 (Ludwig Institute for Cancer Research); ejemplos de secuencias de proteína y ácido nucleico NY-ESO-1 se proporcionan en el documento US 5.804.381 y US 6.069.233 (Ludwig Institute for Cancer Research); ejemplos de secuencias de proteína y ácido nucleico Melan-A se proporcionan en el documento US 5.620.886 y US 5.854.203 (Ludwig Institute for Cancer Research); ejemplos de proteína y ácido nucleico NY-BR-1 se proporcionan en el documento 6.774.226 y US 6.911.529 (Ludwig Institute for Cancer Research) y ejemplos de secuencias de proteína y ácido nucleico NY-CO-58 se proporcionan en el documento WO 02090986 (Ludwig Institute for Cancer Research); un ejemplo de una secuencia de aminoácido para la proteína HER-2/neu está disponible en GENBANK® Acceso No. AAA58637; y una secuencia de nucleótido (ARNm) para (CEA-1) similar al antígeno 1 carcinoembriónico humano está disponible en GENBANK® Acceso No. NM020219.
Una “respuesta inmune” se refiere a una respuesta biológica en un vertebrado contra agentes extraños, en la cual la respuesta protege al organismo contra estos agentes y las enfermedades causadas por estos. Una respuesta inmune está mediada por la acción de una célula del sistema inmune (por ejemplo, un linfocito T, linfocito B, célula asesina natural (NK), macrófago, eosinófilo, célula mástil, célula dendrítica o neutrófilo) y macromoléculas solubles producidas mediante cualquiera de estas células o el hígado (que incluyen anticuerpos, citocinas y complementos) que dan como resultado direccionamiento selectivo, unión a, daño, destrucción y/o supresión del cuerpo del vertebrado de patógenos invasores, células o tejidos infectados con patógenos, células cancerosas u otras células anormales, o, en casos de autoinmunidad o inflamación patológica, células o tejidos humanos normales. Una respuesta inmune o reacción incluye, por ejemplo, la activación o inhibición de una célula T, por ejemplo, una célula T efectora o una célula Th, tal como una célula T CD4+ o CD8+, o la inhibición de una célula Treg.
Un “ inmunomodulador” o “ inmunorregulador” se refiere a un agente, por ejemplo, un componente de una trayectoria de señalización, que puede estar involucrado en la modulación, regulación, o modificación de una respuesta inmune. “Modular”, “regular” o “modificar” una respuesta inmune se refieren a cualquier alteración en una célula del sistema inmune o en la actividad de esa célula (por ejemplo, una célula T efectora). Esta modulación incluye la estimulación o supresión del sistema inmune que se puede manifestar mediante un aumento o una disminución en la cantidad de células de diversos tipos, un aumento o una disminución en la actividad de estas células o cualquier otro cambio que pueda ocurrir dentro del sistema inmune. Se identificaron los inmunomoduladores inhibidores y estimuladores, algunos de los cuales pueden tener una función mejorada en un microentorno tumoral. En modalidades preferidas, el inmunomodulador se puede ubicar en la superficie de una célula T. Un “objetivo inmunomodulador” o “objetivo inmunorregulador” es un inmunomodulador que se dirige a la unión por, y cuya actividad es alterada por la unión de, una sustancia, un agente, porción, compuesto o molécula. Los objetivos inmunorreguladores incluyen, por ejemplo, receptores en la superficie de una célula (“receptores inmunomoduladores”) y ligandos receptores (“ ligandos inmunomoduladores”).
La “ inmunoterapia” se refiere al tratamiento de un sujeto que padece, o está en riesgo de contraer o sufrir una recaída en una enfermedad, mediante un método que comprende inducir, mejorar, inhibir o modificar de otro modo una respuesta inmune.
La “terapia inmunoestimulante” o “terapia inmunoestimuladora” se refiere a una terapia que da como resultado el aumento (inducción o mejora) de la respuesta inmune en un sujeto a fin de, por ejemplo, tratar el cáncer.
“Potenciar una respuesta inmune endógena” significa aumentar la efectividad o potencia de una respuesta inmune existente en un sujeto. Este aumento en la efectividad y potencia se puede lograr, por ejemplo, superando mecanismos que supriman la respuesta inmune endógena del hospedero o estimulando mecanismos que mejoren la respuesta inmune endógena del hospedero.
Las células “T efectoras” (“Tef”) se refieren a células T (por ejemplo, células T CD4+ y CD8+) con actividades citolíticas, además de células T auxiliadoras (Th), que secretan citocinas y activan y dirigen otras células inmunes, pero no incluyen células T reguladoras (células Treg). Los anticuerpos anti-GITR descritos en la presente activan las células Tef, por ejemplo, células Tef CD4+ y CD8+.
Un aumento en la capacidad para estimular una respuesta inmune, o el sistema inmune, puede surgir como resultado de una actividad agonista mejorada de los receptores coestimuladores de células T y/o una actividad antagonista mejorada de los receptores inhibidores. Un aumento en la capacidad para estimular una respuesta inmune o el sistema inmune se puede reflejar en un aumento al doble de la EC50 o un nivel máximo de actividad en un ensayo que mide una respuesta inmune, por ejemplo, un ensayo que mide los cambios en la liberación de citocina o quimiocina, la actividad citolítica (determinada directamente en células objetivo o indirectamente mediante la detección de CD107a o granzimas) y la proliferación. La capacidad para estimular una respuesta inmune o la actividad del sistema inmune se puede mejorar en al menos 10 %, 30 %, 50 %, 75 %, 2 veces, 3 veces, 5 veces o más.
En ciertas modalidades, un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada modificada tiene actividad agonista más potente, con relación al mismo anticuerpo que no comprende una región constante de cadena pesada modificada. La actividad agonista mejorada de un anticuerpo puede ser determinada, por ejemplo, como se muestra en los Ejemplos, por ejemplo, midiendo el nivel de secreción de IFN-y o IL-2 a partir de células T que son puestas en contacto con el anticuerpo. La actividad agonista puede ser mejorada por al menos 10 %, 30 %, 50 %, 75 %, 2 veces, 3 veces, 5 veces o más como se define por la liberación incrementada de citocina o proliferación incrementada en células T efectoras; actividad reducida de células T reguladoras si el acoplamiento con Tregs reduce la función Treg; o supresión incrementada de Tregs. Por ejemplo, la cantidad de IFN-y o IL-2 secretada a partir de células T estimuladas con un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada modificada puede ser al menos 10 %, 30 %, 50 %, 75 %, 2 veces, 3 veces, 5 veces o más, superior que aquella de células T simulada con el mismo anticuerpo que no comprende una región constante de cadena pesada modificada.
Como se usa en la presente, el término “enlazado” se refiere a la asociación de dos o más moléculas. El enlace puede ser covalente o no covalente. El enlace también puede ser genético (es decir, fusionado de manera recombinante). Estos enlaces se pueden lograr usando una amplia variedad de técnicas conocidas en la técnica, tales como conjugación química y producción de proteína recombinante.
Como se usa en la presente, “administrar” se refiere a la introducción física de una composición que comprende un agente terapéutico a un sujeto, usando cualquiera de los diversos métodos y sistemas de administración conocidos por las personas expertas en la técnica. Las rutas de administración preferidas para los anticuerpos descritos en la presente incluyen las siguientes: intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, espinal u otras rutas de administración parenterales, tales como inyección o infusión. La expresión “administración parenteral”, como se usa en la presente, significa modos de administración diferentes de la administración entérica y tópica, por lo general, mediante inyección, e incluye, entre otras, la infusión y la inyección intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intratecal, intralinfática, intralesional, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal, epidural e intraesternal, además de la electroporación in vivo. De manera alternativa, un anticuerpo descrito en la presente se puede administrar a través de una trayectoria no parenteral, tal como la ruta de administración tópica, epidérmica o mucosa, por ejemplo, intranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual o tópica. La administración también se puede realizar, por ejemplo, una vez, múltiples veces y/o durante uno o más períodos extendidos.
Como se usa en la presente, la expresión “respuesta mediada por células T” se refiere a una respuesta mediada por células T, que incluyen células T efectoras (por ejemplo, células CD8+) y células T auxiliadoras (por ejemplo, células CD4+). Las respuestas mediadas por células T incluyen, por ejemplo, citotoxicidad y proliferación de células T.
Como se usa en la presente, la expresión “respuesta de célula T citotóxicas (CTL)” se refiere a una respuesta inmune inducida por células T citotóxicos. Las respuestas CTL están mediadas principalmente por células T CD8+.
Como se usa en la presente, los términos “ inhiben” o “bloquean” (por ejemplo, que se refieren a inhibición/bloqueo de unión de GITR-L a GITR en células) son usados intercambiablemente y abarcan tanto inhibición/bloqueo parcial como completo. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-GITR inhibe la unión de GITR-L a GITR por al menos aproximadamente 50 %, por ejemplo, aproximadamente 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 %, o 100 %, determinado, por ejemplo, como se describe además en la presente. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-GITR inhibe la unión de GITR-L a GITR por no más de 50 %, por ejemplo, por aproximadamente 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 % o 1 %, determinado, por ejemplo, como se describe además en la presente.
Como se usa en la presente, el término “ inhibe el crecimiento” de un tumor incluye cualquier reducción medible en el crecimiento de un tumor, por ejemplo, la inhibición de crecimiento de un tumor por al menos aproximadamente 10 %, por ejemplo, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 99 %, o 100 %.
Como se usa en la presente, “cáncer” se refiere a un grupo amplio de enfermedades caracterizadas por el crecimiento no controlado de células anormales. La división celular no regulada puede dar como resultado la formación de células o tumores malignos que invaden tejidos próximos y pueden hacer metástasis en partes lejanas del cuerpo a través del sistema linfático o torrente sanguíneo.
Los términos “tratar” y “tratamiento”, como se usan en la presente, se refieren a cualquier tipo de intervención o proceso que se realiza en el sujeto, o la administración de un agente activo al sujeto, con el objeto de revertir, aliviar, mejorar, inhibir, o retrasar o prevenir el progreso, desarrollo, gravedad o recurrencia de un síntoma, complicación, afección o indicios bioquímicos asociados a una enfermedad. El tratamiento puede ser de un sujeto que tiene una enfermedad o un sujeto que no tiene una enfermedad (por ejemplo, para profilaxis).
Una “malignidad hematológica” incluye un linfoma, leucemia, mieloma o una malignidad linfoide, así como también un cáncer de bazo y de los ganglios linfáticos. Los ejemplos de linfomas incluyen linfomas de célula B (un cáncer hematológico de células B) y linfomas de células T. Los linfomas de célula B incluyen linfomas de Hodgkin y la mayor parte de los linfomas no de Hodgkin. Los ejemplos no limitativos de linfomas de célula B incluyen linfoma difuso de célula B grandes, linfoma folicular, linfoma de tejido linfoide asociado a mucosa, linfoma linfocítico de células pequeñas (se superpone con leucemia linfocítica crónica), linfoma de células del manto (MCL, por sus siglas en inglés), linfoma de Burkitt, linfoma mediastinal de célula B grandes, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma nodal de la zona marginal de célula B, linfoma esplénico de la zona marginal, linfoma intravascular de célula B grandes, linfoma de efusión primaria, granulomatosis linfomatoide. Los ejemplos no limitativos de linfomas de células T incluyen linfoma extranodal de células T, linfomas cutáneos de células T, linfoma anaplásico de células grandes y linfoma angioinmunoblástico de células T. Las malignidades hematológicas también incluyen tipos de leucemia, tales como, pero no limitados a, leucemia secundaria, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica y leucemia linfoblástica aguda. Las malignidades hematológicas también incluyen mielomas, tales como, pero no limitados a, mieloma múltiple y mieloma múltiple quiescente. Otros cánceres asociados con células T o células B y/o hematológicos, están abarcados por el término malignidad hematológica.
Los términos “dosis efectiva” o “dosificación efectiva” se definen como una cantidad suficiente para lograr, o al menos lograr parcialmente, un efecto deseado. Una “cantidad terapéuticamente efectiva” o “dosis terapéuticamente efectiva” de un fármaco o agente terapéutico es cualquier cantidad del fármaco que, cuando se usa solo o en combinación con otro agente terapéutico, promueve la regresión de la enfermedad que se muestra en una disminución de la gravedad de los síntomas de enfermedad, un aumento de la frecuencia y duración de los períodos sin síntomas de enfermedad o una prevención de disfunciones o discapacidades como consecuencia de la enfermedad. Una cantidad terapéuticamente efectiva o dosificación de un fármaco incluye una “cantidad profilácticamente efectiva” o una “dosificación profilácticamente efectiva”, la cual es cualquier cantidad del fármaco que, cuando se administra sola o en combinación con otro agente terapéutico a un sujeto en riesgo de desarrollar una enfermedad o de sufrir una recaída en la enfermedad, inhibe el desarrollo o la recurrencia de la enfermedad. La capacidad de un agente terapéutico o profiláctico para promover la regresión de la enfermedad o inhibir el desarrollo o la recurrencia de la enfermedad se puede evaluar usando varios métodos conocidos por el médico experto, por ejemplo, en sujetos humanos durante ensayos clínicos, en sistemas de modelos de animales que predicen la eficacia en humanos o evaluando la actividad del agente en ensayos in vitro.
A modo de ejemplo, un agente anti-cancerígeno es un fármaco que promueve la regresión del cáncer en un sujeto. En modalidades preferidas, una cantidad terapéuticamente efectiva del fármaco promueve la regresión del cáncer al punto de eliminar el cáncer. “Promover la regresión del cáncer” significa que administrar una cantidad efectiva del fármaco, solo o en combinación con un agente antineoplásico, da como resultado una reducción del crecimiento o tamaño del tumor, necrosis del tumor, una disminución de la gravedad de al menos un síntoma de enfermedad, un aumento de la frecuencia y duración de los períodos sin síntomas de enfermedad, una prevención de disfunciones o discapacidades como consecuencia de la enfermedad u otro tipo de mejora de los síntomas de enfermedad en el paciente. En adición, los términos “efectiva” y “efectividad” con respecto al tratamiento incluyen tanto efectividad farmacológica como seguridad fisiológica. La eficacia farmacológica se refiere a la capacidad del fármaco de promover la regresión del cáncer en el paciente. La seguridad fisiológica se refiere a un nivel de toxicidad, u otros efectos fisiológicos adversos a nivel de células, órganos y/u organismos (efectos adversos) que surgen como resultado de la administración del fármaco.
A modo de ejemplo, para el tratamiento de tumores, una cantidad o dosis terapéuticamente efectiva del fármaco inhibe, preferentemente, el crecimiento celular o tumoral en al menos aproximadamente 2 0 %, con mayor preferencia, al menos aproximadamente 40 %, aún con mayor preferencia, al menos aproximadamente 60 % y, aún con mayor preferencia, al menos aproximadamente 80 % con respecto a los sujetos sin tratar. En las modalidades de máxima preferencia, una cantidad o dosis terapéuticamente efectiva del fármaco inhibe completamente el crecimiento celular o tumoral, es decir, preferentemente, inhibe el crecimiento celular o tumoral en 100 %. La capacidad de un compuesto para inhibir el crecimiento tumoral se puede evaluar usando los ensayos que se describen más adelante. De manera alternativa, esta propiedad de una composición se puede evaluar analizando la capacidad del compuesto para inhibir el crecimiento celular; esta inhibición se puede medir in vitro, mediante ensayos conocidos por el médico experto. En otras modalidades preferidas descritas en la presente, la regresión tumoral se puede observar y continuar durante un período de al menos aproximadamente 20 días, con mayor preferencia, al menos aproximadamente 40 días o, incluso con mayor preferencia, al menos aproximadamente 60 días.
El término “paciente” incluye sujetos humanos y otros mamíferos que reciben ya sea tratamiento profiláctico o terapéutico.
Como se usa en la presente, el término “sujeto” incluye cualquier animal humano o no humano. Por ejemplo, los métodos y composiciones descritos en la presente pueden ser usados para tratar un sujeto que tiene cáncer. El término “animal no humano” incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perro, vaca, pollos, anfibios, reptiles, etc.
Como se usa en la presente, los términos “ug” y “uM” son usados intercambiablemente con “|jg” y “ |j M”.
Varios aspectos descritos en la presente son divulgados en detalle adicional en las siguientes subsecciones.
I. Anticuerpos Anti-GITR
Se describen en la presente anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos completamente humanos, los cuales son caracterizados por características o propiedades funcionales apropiadas. Por ejemplo, los anticuerpos se unen específicamente a GITR humano. Adicionalmente, los anticuerpos pueden reaccionar cruzado con el GlTR a partir de uno o más primates no humanos, tales como GITR cinomólogo.
Además de la unión específicamente a GITR humano unido a la membrana y/o soluble, los anticuerpos descritos en la presente presentan una o más de las siguientes propiedades funcionales:
(a) unión a GITR cinomólogo;
(b) estimular o mejorar una respuesta inmune;
(c) activar células T (como se evidencia, por ejemplo, por secreción y/o proliferación mejorada de la citocina); (d) inhibir la unión de GITRL al GITR en células 3A9-hGITR;
(e) a lo sumo parcialmente inhibición de la unión del ligando del GITR al GITR en células T activadas;
(f) unión a un epítopo conformacional en la porción N-terminal de GITR humano;
(g) unión a tanto GITR humano glicosilado como no glicosilado; y
(h) tener actividad agonista en la ausencia de unión a un receptor Fc, pero en donde la unión a un receptor Fc mejora además la actividad agonista.
Preferiblemente, los anticuerpos anti-GITR se unen a GITR con alta afinidad, por ejemplo, con una Kd de 10-7 M o menos, 10-8 M o menos, 10-9 M o menos, 10-10 M o menos, 10-11 M o menos, l0 -12 M o menos, 10-12 M hasta 10-7 M, 10-11 M hasta 10-7 M, 10-10 M hasta 10-7 M, o 10-9 M hasta 10-7 M. En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-GITR se une a GITR humano soluble, por ejemplo, como se determina por Biacore, con una Kd de 10‘ 7 M o menos, 10' 8 M o menos, 10' 9 M (1 nM) o menos, 10'1° M o menos, 10‘ 12 M hasta 10‘ 7 M, 10' 11 M hasta 10‘ 7 M, 10'1° M hasta 10‘ 7 M, 10' 9 M hasta 10' 7 M, o 10' 8 M hasta 10' 7 M. En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-GITR se une a GITR humano (por ejemplo, unido a la membrana celular), tales como en células T humanas activadas, por ejemplo, como se determina por citometría de flujo y trazo Scatchard, con una Kd de 10' 7 M o menos, 10' 8 M o menos, 10' 9 M (1 nM) o menos, 10' 10 M o menos, 10' 12 M hasta 10' 7 M, 10' 11 M hasta 10' 8 M, 10' 10 M hasta 10' 8 M, 10' 9 M hasta 10' 8 M, 10' 11 M hasta 10' 9 M, o 10' 10 M hasta 10' 9 M. En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-GITR se une a GITR humano (por ejemplo, unido a la membrana celular), tales como en células T humanas activadas, por ejemplo, como se determina por FACS, con una EC50 de 10‘ 7 M o menos, 10‘ 8 M o menos, 10‘ 9 M (1 nM) o menos, 10’ 10 M o menos, 10‘ 12 M hasta 10‘ 7 M, 10‘ 11 M hasta 10‘ 8 M, 10’ 10 M hasta 10‘ 8 M, 10‘ 9 M hasta 10‘ 8 M, 10‘ 11 M hasta 10‘ 9 M, o 10’ 10 M hasta 10‘ 9 M. En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-GITR se une a GITR humano soluble con una Kd de 10‘ 7 M o menos, 10‘ 8 M o menos, 10-9 M (1 nM) o menos, 10’ 10 M o menos, 10‘12M hasta 10‘7 M, 10’ 11 M hasta 10‘7 M, 10-10M hasta 10‘7 M, 10‘9 M hasta 10-7 M, o 10-8 M hasta 10-7 M, y a GITR humano unido a la membrana celular con una Kd o EC50 de 10-7 M o menos, 10-8 M o menos, 10-9 M (1 nM) o menos, 10-10 M o menos, 10-12 M hasta 10-7 M, 10-11 M hasta 10-8 M, 10-10 M hasta 10-8 M, 10-9 M hasta 10-8 M, 10-11 M hasta 10-9 M, o 10-10 M hasta 10-9 M.
Los anticuerpos anti-GITR pueden unirse a GITR cinomólogo, por ejemplo, se unen al GITR de cinomólogo unido a la membrana, por ejemplo, con una EC50 de 100 nM o menos, 10 nM o menos, 100 nM hasta 0,01 nM, 100 nM hasta 0,1 nM, 100 nM hasta 1 nM, o 10 nM hasta 1 nM, por ejemplo, como se mide por FACS (por ejemplo, como se describe en los Ejemplos).
Los anticuerpos anti-GITR pueden estimular o mejorar una respuesta inmune, por ejemplo, activando células Tef, limitando la supresión de células Tefectoras por células Treg, suprimiendo y/o inhibiendo las células Treg tumorales y/o activando las células NK, por ejemplo, en el tumor. Por ejemplo, los anticuerpos anti-GITR pueden activar o coestimular células Tef como se pone en evidencia, por ejemplo, por proliferación mejorada y/o secreción mejorada de la citocina (por ejemplo, IL-2 y IFN-y). En ciertas modalidades, la estimulación de CD3 también se proporciona. En ciertas modalidades, un factor del GITR incrementa la secreción de IL-2 por un factor de 50 %, 100 % (es decir, 2 veces), 3 veces, 4 veces, 5 veces o más, opcionalmente con un máximo de hasta 10 veces, 30 veces, 100 veces, como se mide, por ejemplo, en células T humanas primarias o células T que expresan GITR humano (por ejemplo, como se describe además en los Ejemplos). En ciertas modalidades, un anticuerpo GITR incrementa la secreción del IFN-y por un factor de 50 %, 100 % (es decir, 2 veces), 3 veces, 4 veces, 5 veces o más, opcionalmente con un máximo de hasta 10 veces, 30 veces, 100 veces, como se mide, por ejemplo, en células T humanas primarias o células T que expresan GITR humano (por ejemplo, como se describe además en los Ejemplos).
Los anticuerpos anti-GITR pueden inhibir la unión de GITRL humano a GITR humano en las células, por ejemplo, células 39A que expresan GITR humano, por ejemplo, con una EC50 de 10 pg/ml o menos, 1 pg/ml o menos, 0,01 |jg/ml hasta 10 pg/ml, 0,1 pg/ml hasta 10 pg/ml, o 0,1 pg/ml hasta 1 pg/ml (véase Ejemplo 5).
En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-GITR a lo sumo solamente inhiben parcialmente la unión de GITRL humano a GITR humano en las células, por ejemplo, células T activadas (véase Ejemplo 5).
Los anticuerpos anti-GITR pueden unirse a un epítopo, por ejemplo, un epítopo conformacional en la porción N-terminal de GITR humano, por ejemplo, un epítopo localizado dentro de los aminoácidos 1 a 39 del GITR humano maduro (véase Ejemplo 9), como se determina, por ejemplo, por unión de los anticuerpos a fragmentos de GITR humano, por ejemplo, fragmentos nativos (es decir, no desnaturalizados) de GITR humano. Los anticuerpos anti-GITR pueden unirse a, o a un epítopo localizado dentro de, aminoácidos 1 a 20 del GITR humano maduro, como se determina, por ejemplo, por unión de los anticuerpos a fragmentos de GITR humano, por ejemplo, fragmentos nativos (es decir, no desnaturalizados) de GITR humano, seguido por escisión enzimática o por HDX (véase Ejemplos 11 y 12, respectivamente). Los anticuerpos anti-GITR pueden unirse a, o a un epítopo dentro de, los aminoácidos 3 a 20 del GITR humano maduro (PTGGPGCGPGRLLl Gt GT, SEQ ID NO: 217). Los anticuerpos anti-GITR pueden unirse a, o a un epítopo dentro de, aminoácidos 3 a 20 y aminoácidos 33 a 40 del GITR humano maduro, es decir, secuencia de aminoácidos PTGGPGCGPGRLLLGTGT (SEQ ID NO: 217) y CRDYPGEE (SEQ ID NO: 218). En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-GITR se unen a GITR humano tanto glicosilado como no glicosilado. En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-GITR se unen a secuencia de aminoácidos PTGGPGCGPGRLLLGTGT (SEQ ID NO: 217) y CRDYPGEE (Se Q ID NO: 218), como se determina por HDX, por ejemplo, usando el protocolo expuesto en los Ejemplos.
Los anticuerpos anti-GITR pueden competir para unión a GITR con (o inhiben la unión de) los anticuerpos anti-GITR que comprenden CDR o regiones variables descritas en la presente, por ejemplo, 28F3, 3C3-1,3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10, y/o 6G10. En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-GITR inhiben la unión de 28F3, 3C3, 2G6, 8A6, 9G7, 14E3, 19H8, 19D3, 18E10, y/o 6G10 a GITR humano por al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o por 100 %. En ciertas modalidades, 28F3, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10, y/o 6G10 inhiben la unión de los anticuerpos anti-GITR a GITR humano por al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o por 100 %. En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-GITR inhiben la unión de 28F3, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10, y/o 6G10 a GITR humano por al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o por 100 % y 28F3, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10, y/o 6G10 inhiben la unión de los anticuerpos anti-GITR a GITR humano por al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o por 100 % (por ejemplo, compiten en ambas direcciones).
En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-GITR inducen o mejoran las células T activación sin requerir reticulaciones multivalentes, como se determina, por ejemplo, por la carencia de requerimiento de unión al FcR. En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-GITR son multivalentes, por ejemplo, bivalentes. En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-GITR no son monovalentes. Se ha mostrado en la presente que los fragmentos F'(ab)2 son más efectivos que los fragmentos Fab en la activación de células T (véase, Ejemplos).
En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-GITR no requieren reticulación mediante receptores Fc por su actividad agonista, sin embargo, la reticulación a receptores Fc mejora su actividad agonista con relación al mismo anticuerpo que no se une a receptores Fc.
En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-GITR tienen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 de las siguientes características:
(1) unión al GITR humano soluble, por ejemplo, con una Kd de 10 nM o menos (por ejemplo, 0,01 nM hasta 10 nM), por ejemplo, como se mide por Biacore;
(2) unión al GITR humano que se une a la membrana, por ejemplo, con una Kd de 1 nM o menos (por ejemplo, 0,01 nM hasta 1 nM), por ejemplo, como se mide por Scatchard;
(3) unión al GITR humano que se une a la membrana, por ejemplo, con una EC50 de 1 nM o menos (por ejemplo, 0,01 nM hasta 1 nM), por ejemplo, como se mide por FACS;
(4) unión a GITR cinomólogo, por ejemplo, unión al GITR cinomólogo que se une a la membrana, por ejemplo, con una EC50 de 10 nM o menos (por ejemplo, 0,01 nM hasta 10 nM), por ejemplo, como se mide por FACS;
(5) inducir o mejorar la activación de células T, tal como en la presencia de acoplamiento CD3 (por ejemplo, en la presencia de concentraciones subópticas de anti-CD3), como se pone en evidencia por (i) producción incrementada de IL-2 y/o IFN-y en células T que expresan el GITR y/o (ii) proliferación mejorada de células T; (6) inducir o mejorar la activación de células T si requerir reticulación multivalente;
(7) tener actividad agonista en la ausencia de unión a un receptor Fc, pero en donde la unión a un receptor Fc mejora además la actividad agonista;
(8) inhibición de la unión del ligando del GITR a GITR, por ejemplo, con una EC50 de 1 pg/mL o menos como se mide por FACS, por ejemplo, en un ensayo con células 3A9-hGITR;
(9) a lo sumo parcialmente inhibición de la unión del ligando del GITR al GITR en células T activadas;
(10) unión a un epítopo conformacional en GITR humano maduro (SEQ ID NO: 4), por ejemplo, un epítopo discontinuo dentro de la secuencia de aminoácidos PTGGPGCGPGr Ll LGTGT (SEQ ID NO: 217) y CRDYPg Ee (SEQ ID NO: 218);
(11) unión a tanto GITR humano glicosilado como no glicosilado O-ligado y N-ligado; y
(12) competir en cualquier dirección o ambas direcciones para unión al GITR humano con 28F3, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10, y/o6G10.
Los anticuerpos anti-GITR también pueden inducir la internalización de GITR en células T activadas, por ejemplo, células T CD4+ y CD8+, por ejemplo, dentro de 10, 30 o 60 minutos, y transducción de señal subsecuente, por ejemplo, activación (es decir, fosforilación) de p65 NF-kB y p38 MAPcinasa.
Por consiguiente, un anticuerpo que presenta una o más de estas propiedades funcionales (por ejemplo, actividades bioquímicas, inmunoquímicas, celulares, fisiológicas u otras biológicas, o similares) como se determina de conformidad con metodologías conocidas en la técnica y se describen en la presente, se entenderá referirse a una diferencia estadísticamente significante en la actividad particular con relación a aquella vista en la ausencia del anticuerpo (por ejemplo, o cuando un anticuerpo de control de especificidad irrelevante está presente). Preferiblemente, el incremento inducido por el anticuerpo anti-GITR es un parámetro medido (por ejemplo, proliferación de células T, producción de citocina), efectúa un incremento estadísticamente significante por al menos 10 % del parámetro medido, más preferiblemente por al menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 % (es decir, 2 veces), 3 veces, 5 veces o 10 veces, y en ciertas modalidades preferidas, un anticuerpo descrito en la presente puede incrementar el parámetro medido por más de 92 %, 94 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 % (es decir, 2 veces), 3 veces, 5 veces o 10 veces. Contrariamente, la disminución inducida por el anticuerpo anti-GITR en un parámetro medido (por ejemplo, volumen el tumor, unión de GITR-L a GITR, cantidad de células T reguladoras en tumores) efectúa una disminución estadísticamente significante por al menos 10 % del parámetro medido, más preferiblemente por al menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %, y en ciertas modalidades preferidas, un anticuerpo descrito en la presente puede disminuir el parámetro medido por más de 92 %, 94 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 %.
Los ensayos estándares para evaluar la capacidad de unión de los anticuerpos hacia GITR de varias especies se conocen en la técnica, que incluyen por ejemplo, ELISA, Western blot, y RIAs. Los ensayos adecuados se describen en detalle en los Ejemplos. Las cinéticas de unión (por ejemplo, afinidad de unión) de los anticuerpos también pueden ser evaluadas por ensayos estándares conocidos en la técnica, tales como por análisis Biacore. Los ensayos para evaluar los efectos de los anticuerpos en propiedades funcionales de GITR (por ejemplo, unión del ligando, proliferación de células T, producción de citocina), se describen en detalle adicional posteriormente y en los Ejemplos.
En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-GITR no son anticuerpos nativos o no son anticuerpos que se originan naturalmente. Por ejemplo, los anticuerpos anti-GITR tienen modificaciones post-traduccionales que son diferentes de aquellas de los anticuerpos que se originan naturalmente, tales como que tienen más, menos o un tipo diferente de modificación post-traduccional.
II. Anticuerpos anti-GITR A modo de ejemplo
Anticuerpos particulares descritos en la presente son anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, que tienen las secuencias de región variable y/o CDR de anticuerpos 28F3, 19D3, 18E10, 3C3, 2G6, 8A6, 9G7, 14E3, 19H8, y 6G10, aislados y estructuralmente caracterizados como se describe en el Ejemplo 1, así como también anticuerpos que tienen al menos 80 % de identidad (por ejemplo, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 99 % de identidad) con las secuencias de región variable o CDR. Las secuencias de aminoácidos de Vh de 28F3, 19D3, 18E10, 3C3 (3C3-1 y 3C3-2), 2G6, 8A6, 9G7 (9G7-1 y 9G7-2), 14E3, 19H8 (19H8-1 y 19H8-2), y 6G10 se exponen en los SEQ ID NOs: 13, 26, 39, 52, 71, 84, 97, 115, 128, y 335, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de Vl de 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, y 6G10 se muestran en los SEQ ID NOs: 14, 27, 40, 53, 54, 72, 85, 98, 99, 116, 129, 130, y 336, respectivamente.
Por consiguiente, se proporcionan en la presente anticuerpos aislados, o porciones de los mismos de unión al antígeno, que comprenden regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de los SEQ ID NOs: 13, 26, 39, 52, 71, 84, 97, 115, 128, y 335.
También se proporcionan anticuerpos aislados, o porciones de los mismos de unión al antígeno, que comprenden regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de los SEQ ID NOs: 14, 27, 40, 53, 54, 72, 85, 98, 99, 116, 129, 130, y 336.
Se proporcionan en la presente anticuerpos aislados, o porciones de los mismos de unión al antígeno, que comprenden:
(a) secuencias de región variable de cadena pesada y ligera que comprenden los SEQ ID NOs: 13 y 14 respectivamente;
(b) secuencias de región variable de cadena pesada y ligera que comprenden los SEQ ID NOs: 26 y 27 respectivamente;
(c) secuencias de región variable de cadena pesada y ligera que comprenden los SEQ ID NOs: 39 y 40 respectivamente;
(d) secuencias de región variable de cadena pesada y ligera que comprenden los SEQ ID NOs: 52 y 53 respectivamente;
(e) secuencias de región variable de cadena pesada y ligera que comprenden los SEQ ID NOs: 52 y 54 respectivamente;
(f) secuencias de región variable de cadena pesada y ligera que comprenden los SEQ ID NOs: 71 y 72 respectivamente;
(g) secuencias de región variable de cadena pesada y ligera que comprenden los SEQ ID NOs: 84 y 85 respectivamente;
(h) secuencias de región variable de cadena pesada y ligera que comprenden los SEQ ID NOs: 97 y 98 respectivamente;
(i) secuencias de región variable de cadena pesada y ligera que comprenden los SEQ ID NOs: 97 y 99 respectivamente;
(j) secuencias de región variable de cadena pesada y ligera que comprenden los SEQ ID NOs: 115 y 116, respectivamente;
(k) secuencias de región variable de cadena pesada y ligera que comprenden los SEQ ID NOs: 128 y 129, respectivamente;
(l) secuencias de región variable de cadena pesada y ligera que comprenden los SEQ ID NOs: 128 y 130, respectivamente; o
(m) secuencias de región variable de cadena pesada y ligera que comprenden los SEQ ID NOs: 335 y 336, respectivamente.
Los anticuerpos anti-GITR pueden comprender las CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena ligera y pesada de 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, y 6G10, o combinaciones de los mismos. La secuencia de aminoácidos de las CDR1s de Vh 28F3, 19D3, 18E10, 3C3 (3C3-1 y 3C3-2), 2G6, 8A6, 9G7 (9G7-1 y 9G7-2), 14E3, 19H8(19H8-1 y 19H8-2), y 6G10 se exponen en los SEQ ID NOs: 20, 33, 46, 62, 78,91, 106, 122, 138, y 342, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las CDR2s de Vh 28F3, 19D3, 18E10, 3C3 (3C3-1 y 3C3-2), 2G6, 8A6, 9G7 (9G7-1 y 9G7-2), 14E3, 19H8 (19H8-1 y 19H8-2), y 6G10 se exponen en los SEQ ID NOs: 21, 34, 47, 63, 79, 92, 107, 123, 139, y 343, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las CDR3s de Vh 28F3, 19D3, 18E10, 3C3 (3C3-1 y 3C3-2), 2G6, 8A6, 9G7 (9G7-1 y 9G7-2), 14E3, 19H8 (19H8-1 y 19H8-2), y 6G10 se exponen en los Se Q ID n Os: 22, 35, 48, 64, 80, 93, 108, 124, 140, y 344. Las secuencias de aminoácidos de las CDR1s de Vl 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, y 6G10 se exponen en los SEQ ID NOs: 23, 36, 49, 65, 68, 81, 94, 109, 112, 125, 141, 144, y 345, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las CDR2s de Vl 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, y 6G10 se exponen en los SEQ ID NOs: 24, 37, 50, 66, 69, 82, 95, 110, 113, 126, 142, 145, y 346, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las CDR3s de Vl 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2 G6 , 8A6, 9g 7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, y 6G10 se exponen en los SEQ ID NOs: 25, 38, 51, 67, 70, 83, 96, 111, 114, 127, 143, 146, y 347, respectivamente. Las regiones CDR son delineadas usando el sistema Kabat (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242).
Debido a que cada uno de estos anticuerpos se une a GITR y que la especificidad de unión al antígeno se proporciona, en primer lugar, a través de las regiones CDR1,2 y 3, las secuencias de CDR1,2 y 3 de Vh y las secuencias de CDR1, 2 y 3 de Vl se pueden “mezclar y aparear” (es decir, las CDR de diferentes anticuerpos se pueden mezclar y aparear, a pesar de que cada anticuerpo debe contener una CDR1, 2 y 3 de Vh y una CDR1, 2 y 3 de Vl) para crear otras moléculas de unión a anti-GITR descritas en la presente. La unión de tales anticuerpos “mezclados y apareados” a GITR se puede evaluar usando los ensayos de unión descritos anteriormente y en los Ejemplos (por ejemplo, ELISA). Preferentemente, cuando las secuencias de CDR de Vh se mezclan y se aparean, la secuencia de CDR1, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia de Vh particular se reemplaza por una secuencia de CDR estructuralmente similar. Asimismo, cuando las secuencias de CDR de Vl se mezclan y se aparean, la secuencia de CDR1, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia de Vl particular se reemplaza, preferentemente, por una secuencia de CDR estructuralmente similar. Será evidente para las personas expertas en la técnica que las secuencias de Vh y Vl novedosas se pueden crear sustituyendo una o más secuencias de la región CDR de Vh y/o Vl con secuencias estructuralmente similares de las secuencias de CDR descritas en la presente para los anticuerpos monoclonales 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, y 6G10.
Se proporcionan en la presente anticuerpos aislados, o porciones de los mismos de unión al antígeno que comprenden:
(a) una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de los SEQ ID NOs: 20, 33, 46, 62, 78, 91, 106, 122, 138, y 342;
(b) una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de los SEQ ID NOs: 21, 34, 47, 63, 79, 92, 107, 123, 139, y 343;
(c) una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de los SEQ ID NOs: 22, 35, 48, 64, 80, 93, 108, 124, 140, y 344;
(d) una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de los SEQ ID NOs: 23, 36, 49, 65, 68, 81, 94, 109, 112, 125, 141, 144, y 345;
(e) una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de los SEQ ID NOs: 24, 37, 50, 66, 69, 82, 95, 110, 113, 126, 142, 145, y 346; y (f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de los SEQ ID NOs: 25, 38, 51, 67, 70, 83, 96, 111, 114, 127, 143, 146, y 347;
en donde el anticuerpo se une específicamente a GITR humano.
En una modalidad, el anticuerpo comprende regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde las regiones CDR1, CDR2, y CDR3 de la región variable de cadena pesada comprenden:
(a) SEQ ID NOs: 20-22;
(b) SEQ ID NOs: 33-35;
(c) SEQ ID NOs: 46-48;
(d) SEQ ID NOs: 62-64;
(e) SEQ ID NOs: 78-80;
(f) SEQ ID NOs: 91-93;
(g) SEQ ID NOs: 106-108;
(h) SEQ ID NOs: 122-124;
(i) SEQ ID NOs: 138-140; o
(j) SEQ ID NOs: 342-344;
en donde el anticuerpo se une específicamente a GITR humano.
En otra modalidad, el anticuerpo comprende regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde las regiones CDR1, CDR2, y CDR3 de la región variable de cadena ligera comprenden:
(a) SEQ ID NOs: 23-25;
(b) SEQ ID NOs: 36-38;
(c) SEQ ID NOs: 49-51;
(d) SEQ ID NOs: 65-67;
(e) SEQ ID NOs: 68-70;
(f) SEQ ID NOs: 81-83;
(f) SEQ ID NOs: 94-96;
(g) SEQ ID NOs: 109-111;
(h) SEQ ID NOs: 112-114;
(i) SEQ ID NOs: 125-127;
(j) SEQ ID NOs: 141-143;
(k) SEQ ID NOs: 144-146; o
(l) SEQ ID NOs: 345-347;
en donde el anticuerpo se une específicamente a GITR humano.
En una modalidad particular, el anticuerpo comprende regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde:
(a) la región variable de cadena pesada CDR1, CDR2, y CDR3 comprende SEQ ID NOs: 20-22, respectivamente, y la región variable de cadena ligera CDR1, CDR2, y CDR3 comprende SEQ ID NOs: 23-25, respectivamente; (b) la región variable de cadena pesada CDR1, CDR2, y CDR3 comprende SEQ ID NOs: 33-35, respectivamente, y la región variable de cadena ligera CDR1, CDR2, y CDR3 comprende SEQ ID NOs: 36-38, respectivamente; (c) la región variable de cadena pesada CDR1, CDR2, y CDR3 comprende SEQ ID NOs: 46-48, respectivamente, y la región variable de cadena ligera CDR1, CDR2, y CDR3 comprende SEQ ID NOs: 49-51, respectivamente; (d) la región variable de cadena pesada CDR1, CDR2, y CDR3 comprende SEQ ID NOs: 62-64, respectivamente, y la región variable de cadena ligera CDR1, CDR2, y CDR3 comprende SEQ ID NOs: 65-67, respectivamente; (e) la región variable de cadena pesada CDR1, CDR2, y CDR3 comprende SEQ ID NOs: 62-64, respectivamente, y la región variable de cadena ligera CDR1, CDR2, y CDR3 comprende SEQ ID NOs: 68-70, respectivamente; (f) la región variable de cadena pesada CDR1, CDR2, y CDR3 comprende SEQ ID NOs: 78-80, respectivamente, y la región variable de cadena ligera CDR1, CDR2, y CDR3 comprende SEQ ID NOs: 81-83, respectivamente; (g) la región variable de cadena pesada CDR1, CDR2, y CDR3 comprende SEQ ID NOs: 91-93, respectivamente, y la región variable de cadena ligera CDR1, CDR2, y CDR3 comprende SEQ ID NOs: 94-96, respectivamente; (h) la región variable de cadena pesada CDR1, CDR2, y CDR3 comprende SEQ ID NOs: 106-108, respectivamente, y la región variable de cadena ligera CDR1, CDR2, y CDR3 comprende SEQ ID NOs: 109-111, respectivamente;
(i) la región variable de cadena pesada CDR1, CDR2, y CDR3 comprende SEQ ID NOs: 106-108, respectivamente, y la región variable de cadena ligera CDR1, CDR2, y CDR3 comprende SEQ ID NOs: 112-114, respectivamente; (j) la región variable de cadena pesada CDR1, CDR2, y CDR3 comprende SEQ ID NOs: 122-124, respectivamente, y la región variable de cadena ligera CDR1, CDR2, y CDR3 comprende SEQ ID NOs: 125-127, respectivamente; (k) la región variable de cadena pesada CDR1, CDR2, y CDR3 comprende SEQ ID No s : 138-140, respectivamente, y la región variable de cadena ligera CDR1, CDR2, y CDR3 comprende SEQ ID NOs: 141-143, respectivamente;
(l) la región variable de cadena pesada CDR1, CDR2, y CDR3 comprende SEQ ID NOs: 138-140, respectivamente, y la región variable de cadena ligera CDR1, CDR2, y CDR3 comprende SEQ ID NOs: 144-146, respectivamente; o
(m) la región variable de cadena pesada CDR1, CDR2, y CDR3 comprende SEQ ID NOs: 342-344, respectivamente, y la región variable de cadena ligera CDR1, c DR2, y CDR3 comprende SEQ ID NOs: 345-347, respectivamente;
en donde el anticuerpo se une específicamente a GITR humano.
Un dominio de VH, o una o más CDR del mismo, descritos en la presente pueden ser ligados a un dominio constante para formar una cadena pesada, por ejemplo, una cadena pesada de longitud completa. De manera similar, un dominio de VL, o una o más CDR del mismo, descritos en la presente pueden ser ligados a un dominio constante para formar una cadena ligera, por ejemplo, una cadena ligera de longitud completa. Una cadena pesada de longitud completa (con la excepción de la lisina C-terminal (K) o con la excepción de la glicina y lisina C-terminal (GK), la cual puede estar ausente) y cadena ligera de longitud completa, se combinan para formar un anticuerpo de longitud completa.
Un dominio de VH descrito en la presente puede ser fusionado al dominio constante de un IgG humano, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, los cuales ya sea se originan naturalmente o son modificados, por ejemplo, como se describe además en la presente. Por ejemplo, un dominio de VH puede comprender la secuencia de aminoácido de cualquier dominio de VH descrito en la presente fusionado a la siguiente secuencia de aminoácido IgG1 humana:
ASTKGP SVFPLAPSSK STSGGTAALG CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV LQSSGLYSLS SVVTVPSSSL GTQTYICNVN HKPSNTKVDK RVEPKSCDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPG (SEQ ID NO: 7)
El dominio constante IgG1 humano también puede ser aquel de una variante alotípica. Por ejemplo, una variante alotípica de IgG1 comprende un R107K, E189D y M191L (subrayado arriba) y numeración de conformidad con aquella en el SEQ ID NO: 7). Dentro de la región pesada de longitud completa, estas sustituciones de aminoácido son numeradas R214K, e 356D y M358L.
Un dominio de VL descrito en la presente puede ser fusionado al dominio constante de una cadena ligera Kappa o Lambda humana. Por ejemplo, un dominio de VL puede comprender la secuencia de aminoácido de cualquier dominio de VL descrito en la presente fusionado a la siguiente secuencia de aminoácido de cadena ligera kappa de IgG1 humano:
RTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC (SEQ ID NO: 12)
En ciertas modalidades, la región constante de cadena pesada comprende una lisina u otro aminoácido en el C-terminal, por ejemplo, comprende los siguientes últimos aminoácidos: LSPGK (SEQ ID NO: 220) para la cadena pesada. En ciertos aspectos, la región constante de cadena pesada está carente de uno o más aminoácidos en el C-terminal, y tiene, por ejemplo, la secuencia C-terminal LSPG (SEQ ID NO: 276) o LSP.
Las secuencias de aminoácidos de cadenas pesada y ligera a modo de ejemplo se exponen en la Tabla 15 y corresponden a los SEQ ID NOs: 15, 17, 18, 28, 30, 31, 41, 43, 44, 55, 58, 59, 73, 75, 76, 86, 88, 89, 100, 102, 103, 117, 119, 120, 131, 134, 135, 227-275, 337, 339, 340, 348-352, 361, y 362 para las cadenas pesadas y SEQ ID NOs: 16, 19, 29, 32, 42, 45, 56, 57, 60, 61, 74, 87, 90, 101, 104, 105, 118, 121, 132, 133, 136, 137, 338, 341, y 371 para las cadenas ligeras. Los anticuerpos de la invención comprenden una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 394 o una región constante de cadena pesada que difiere de la misma por una sustitución, adición o deleción de aminoácido, en donde dicha una sustitución, adición o deleción de aminoácido no está en las posiciones de aminoácidos 16, 20, 21, 75, 76, 82, 86, 97, 100, 102 y 104-108 del SEQ ID NO: 394.
Las cadenas pesada y ligera que comprenden una secuencia de aminoácido que es al menos 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 % o 70 % idéntica a cualquiera de las cadenas pesada o ligera expuestas en la Tabla 15 (o sus regiones variables), por ejemplo, SEQ ID NOs: 13-19, 26-32, 40-45, 52-61, 71-77, 84-90, 97-105, 116-121, 128-137, 227-275, 337-341, 348-352, 361, 362, y 371 pueden ser usadas para formar anticuerpos humanos anti-GITR que tienen las características deseadas, por ejemplo, aquellas descritas además en la presente. Las variantes a modo de ejemplo son aquellas que comprenden una variación alotípica, por ejemplo, en el dominio constante, y/o una mutación en las regiones variable o constante, tal como las mutaciones descritas en la presente. Las cadenas pesada y ligera que comprenden una secuencia de aminoácido que difiere a lo sumo de 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 1­ 4, 1-3, 1-2 o 1 aminoácidos (por sustitución, adición o deleción) de cualquiera de las cadenas pesada o ligera expuestas en la Tabla 15 (o sus regiones variables) pueden ser usadas para formar anticuerpos humanos anti-GITR que tienen las características deseadas, por ejemplo, aquellas descritas además en la presente.
En varias modalidades, los anticuerpos descritos anteriormente presentan una o más, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más, nueve o más, diez o más, once, o todas las siguientes propiedades funcionales:
(1) unión al GITR humano soluble, por ejemplo, con una Kd de 10 nM o menos (por ejemplo, 0,01 nM hasta 10 nM), por ejemplo, como se mide por Biacore;
(2) unión al GITR humano que se une a la membrana, por ejemplo, con una Kd de 1 nM o menos (por ejemplo, 0,01 nM hasta 1 nM), por ejemplo, como se mide por Scatchard;
(3) unión al GITR humano que se une a la membrana, por ejemplo, con una EC50 de 1 nM o menos (por ejemplo, 0,01 nM hasta 1 nM), por ejemplo, como se mide por FACS;
(4) unión a GITR cinomólogo, por ejemplo, se unen al GITR de cinomólogo unido a la membrana, por ejemplo, con una EC50 de 10 nM o menos (por ejemplo, 0,01 nM hasta 10 nM), por ejemplo, como se mide por FACS;
(5) inducir o mejorar la activación de células T, tal como en la presencia de acoplamiento CD3 (por ejemplo, en la presencia de concentraciones subópticas de anti-CD3), como se pone en evidencia, por (i) producción incrementada de IL-2 y/o IFN-y en células T que expresan el GITR y/o (ii) proliferación mejorada de células T; (6) inducir o mejorar la activación de células T si requerir reticulación multivalente;
(7) inhibición de la unión del ligando del GITR al GITR en células 3A9-hGITR, por ejemplo, con una EC50 de 1 |jg/mL o menos como se mide por FACS;
(8) a lo sumo parcialmente inhibición de la unión del ligando del GITR al GITR en células T activadas;
(9) unión a un epítopo conformacional en GITR humano maduro (SEQ ID NO: 4), por ejemplo, un epítopo discontinuo dentro de las secuencias de aminoácidos PTGGPGCGPGRLLLGt Gt (Se Q ID NO: 217) y CRDYPGEE (SEQ ID NO: 218);
(10) unión a tanto GITR humano glicosilado como no glicosilado O-ligado y N-ligado;
(11) tener actividad agonista en la ausencia de unión a un receptor Fc, pero en donde la unión a un receptor Fc mejora además la actividad agonista; y
(12) competir en cualquier dirección o ambas direcciones para unión al GITR humano con 28F3, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10, y/o6G10.
Tales anticuerpos incluyen, por ejemplo, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, o anticuerpos quiméricos.
En una modalidad, los anticuerpos anti-GITR descritos en la presente se unen a tanto GITR glicosilado (por ejemplo, glicosilación N-ligada u O-ligada) como no glicosilado.
En una modalidad, los anticuerpos anti-GITR descritos en la presente se unen a un epítopo conformacional.
En una modalidad, los anticuerpos anti-GITR descritos en la presente se unen a residuos de aminoácido dentro de la siguiente región del GITR humano maduro (SEQ ID NO: 4):
QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGE (SEQ ID NO: 215),
que corresponde a los residuos de aminoácido 1-39 de las isotermas 1, 2 o 3 del GITR humano maduro (SEQ ID NO: 4).
En una modalidad, el anticuerpo anti-GITR descritos en la presente se une a residuos de aminoácido dentro de la siguiente región del GITR humano maduro (SEQ ID NO: 4):
QRPTGGPGCGPGRLLLGTGT (SEQ ID NO: 216),
que corresponde a los residuos de aminoácido 1-20 de las isotermas 1, 2 o 3 del GITR humano maduro (SEQ ID NO: 4).
En una modalidad, el anticuerpo anti-GITR descritos en la presente se une a residuos de aminoácido dentro de las siguientes regiones del GITR humano maduro (SEQ ID NO: 4):
PTGGPGCGPGRLLLGTGT (SEQ ID NO: 217) y CRDYPGEE (SEQ ID NO: 218).
Dominios constantes de cadena pesada modificados
Como se discute además en la presente, la región constante de cadena pesada de los anticuerpos anti-GITR descritos en la presente pueden ser de cualquier isotipo, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, o combinaciones de los mismos y/o modificaciones de los mismos. Un anticuerpo anti-GITR puede tener función efectora o puede tener función reducida o no efectora. En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-GITR comprenden una región constante de cadena pesada modificada que proporciona propiedades mejoradas al anticuerpo. Como se muestra en los Ejemplos, los anticuerpos anti-GITR, que tienen una región constante de cadena pesada modificada que comprende una bisagra IgG2 son agonistas más potentes con relación a anticuerpos que tienen la misma región variable pero con una bisagra no IgG2. Por ejemplo, un anticuerpo que comprende una bisagra IgG2, un dominio CH2 y CH3 del isotipo IgG1, y ya sea con o sin función efectora, tiene actividad agonista mejorada como se mide por secreción mejorada de IFN-y y IL-2 a partir de células T incubadas con los anticuerpos. Sin desear ser limitado a un mecanismo específico de acción, es hipotético que los anticuerpos anti-GITR que tienen bisagras IgG2 forman complejos de anticuerpo/antígeno más grandes y ser internalizados más efectivamente, de este modo resultando en actividad agonista incrementada. La formación de grandes complejos se cree resulta de una mayor rigidez de la bisagra IgG2 con relación a bisagras de otros tipos (por ejemplo, IgG1, IgG3 e IgG4). Como se describe además en los Ejemplos, una actividad agonista incrementada no parece estar asociada con una afinidad mayor o reducida del anticuerpo. Por consiguiente, se proporcionan en la presente los anticuerpos anti-GITR que tienen una región constante de cadena pesada modificada, en donde los anticuerpos anti-GITR tienen una actividad agonista incrementada, y en donde, la afinidad del anticuerpo con la región constante de cadena pesada modificada se une a GITR con una afinidad similar como las mismas regiones variables, pero con una diferente región constante de cadena pesada.
Por consiguiente, se proporcionan en la presente también métodos para mejorar la actividad agonista de los anticuerpos anti-GITR, que comprenden proporcionar un anticuerpo anti-GITR que tiene una bisagra sin IgG2, y reemplazar la bisagra sin IgG2 con una bisagra IgG2. Los anticuerpos que pueden beneficiarse de tal modificación incluyen cualquier anticuerpo anti-GITR, tal como aquellos conocidos en la técnica, por ejemplo, anticuerpo 6C8 o un anticuerpo humanizado que tiene las CDR de 6C8, como se describe, por ejemplo, en el documento WO2006/105021; un anticuerpo descrito en los documentos WO2011/028683, JP2008278814, KR20080105674, US20040072566, US2001472565, US20140065152 o en WO2015/031667.
En ciertos aspectos, una región constante de cadena pesada modificada comprende una bisagra del isotipo IgG2 (una “bisagra IgG2”) y un dominio CH1, CH2 y CH3. En ciertos aspectos, una región constante de cadena pesada modificada comprende una bisagra IgG2 y un dominio CH1, CH2 y CH3, en donde al menos uno de los dominios CH1, CH2 y CH3 no es del isotipo IgG2. La bisagra IgG2 puede ser una bisagra IgG2 de tipo silvestre, por ejemplo, una bisagra IgG2 humana de tipo silvestre (por ejemplo, ERKCCVECPPCPAPPVAG; SEQ ID NO: 291) o una variante del mismo, siempre que la bisagra IgG2 retiene la capacidad para conferir al anticuerpo una actividad mejorada con relación al mismo anticuerpo que comprende una bisagra no IgG2. En ciertas modalidades, una variante de bisagra IgG2 retiene rigidez o fuerza similar a aquella de una bisagra IgG2 de tipo silvestre. La rigidez de una bisagra puede ser determinada, por ejemplo, mediante modelado por computadora, microscopía de electrones, espectros como resonancia magnética nuclear (RMN), cristalografía de rayos X (factores B), o ultracentrifugación analítica de velocidad de sedimentación (AUC, por sus siglas en inglés) para medir o comparar el radio de giro de anticuerpos que comprende la bisagra. Una bisagra puede tener una rigidez similar o mayor con respecto a otra bisagra si un anticuerpo que comprende la bisagra tiene un valor obtenido de una de las pruebas descritas en la oración anterior que difiere del valor del mismo anticuerpo con una bisagra diferente, por ejemplo, una bisagra de IgG1, en menos de 5 %, 10 %, 25 %, 50 %, 75 % o 100 %. Una persona experta en la técnica podría determinar a partir de las pruebas si una bisagra o un anticuerpo tienen al menos una rigidez similar a la de otra bisagra o anticuerpo, respectivamente, interpretando los resultados de estas pruebas. Un ejemplo de variante de la bisagra de IgG2 humana es una bisagra de IgG2 que comprende una sustitución de uno o más de los cuatro residuos de cisteína (es decir, C219, C220, C226 y C229) con otro aminoácido. Una cisteína se puede reemplazar por una serina. Un ejemplo de bisagra de IgG2 es una bisagra de IgG2 humana que comprende una mutación C219X o una mutación C220X, en donde X es cualquier aminoácido excepto serina. En algunas modalidades, una bisagra IgG2 no comprende tanto C219X como una sustitución C220X. En algunas modalidades, una bisagra IgG2 comprende C219S o C220S, pero no tanto C219S como C220S (por ejemplo, ERKSCVECPPCPAPPVAG; SEQ ID NO: 292). Otras variantes de la bisagra de IgG2 que se pueden usar incluyen bisagras de IgG2 humana que comprende una sustitución C220, C226 y/o C229, por ejemplo, una mutación C220S, C226S o C229S (que se puede combinar con una mutación C219S). Una bisagra de IgG2 también puede ser una bisagra de IgG2 en donde una porción de la bisagra es de otro isotipo (es decir, es una bisagra quimérica o bisagra híbrida), siempre que la rigidez de la bisagra quimérica sea al menos similar a la de una bisagra de IgG2 de tipo silvestre. Por ejemplo, una bisagra de IgG2 puede ser una bisagra de IgG2 en donde la bisagra inferior (como se define en la Tabla 2) es de un isotipo IgG1 y es, por ejemplo, una bisagra inferior de IgG1 de tipo silvestre. Mutaciones de bisagra IgG2 adicionales que pueden ser usadas en una bisagra IgG2 incluyen las mutaciones SE (S267E), SELF (S267E/L328F), SDIE (S239D/I332E), SEFF y GASDALIE (G236A/S239D/A330L/I332E). Los anticuerpos de la invención comprenden una región constante de cadena pesada modificada en donde el dominio CHI y la bisagra superior son del isotipo IgG2 y todas las demás regiones son del isotipo IgGl (SEQ ID NO: 394). Los anticuerpos de la invención pueden diferir de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 394 en una sustitución, adición o deleción de aminoácido, en donde dicha una sustitución, adición o deleción de aminoácido no está en las posiciones de aminoácido 16, 20, 21, 75, 76, 82, 86, 97, 100, 102, 104 y 105 del SEQ ID NO: 394.
Una bisagra “híbrida” o “quimérica” es referida a un isotipo específico si más de la mitad de los aminoácidos consecutivos de la bisagra son de ese isotipo. Por ejemplo, una bisagra que tiene una bisagra superior e intermedia de IgG2 y la bisagra inferior de IgG1 se considera una bisagra híbrida de IgG2.
En ciertos aspectos, un anticuerpo GITR descrito en la presente comprende una región constante de cadena pesada modificada que comprende una bisagra IgG2 que comprende una de las siguientes secuencias:
ERKCCVECPPCPAPPVAG (SEQ ID NO: 447);
ERKSCVECPPCPAPPVAG (SEQ ID NO: 448);
ERKCSVECPPCPAPPVAG (SEQ ID NO: 449);
ERKXCVECPPCPAPPVAG (SEQ ID NO: 450);
ERKCXVECPPCPAPPVAG (SEQ ID NO: 451);
ERKCCVECPPCPAPPVAGX (SEQ ID NO: 452);
ERKSCVECPPCPAPPVAGX (SEQ ID NO: 453);
ERKCSVECPPCPAPPVAGX (SEQ ID NO: 454);
ERKXCVECPPCPAPPVAGX (SEQ ID NO: 455);
ERKCXVECPPCPAPPVAGX (SEQ ID NO: 456);
ERKCCVECPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 457);
ERKSCVECPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 458);
ERKCCSVECPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 459);
ERKXCVECPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 460);
ERKCXVECPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 461);
ERKCCVECPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 462);
ERKSCVECPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 463);
ERKCCSVECPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 464);
ERKXCVECPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 465);
ERKCXVECPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 466);
ERKCCVECPPCPAP (SEQ ID NO: 467);
ERKSCVECPPCPAP (SEQ ID NO: 468);
ERKCSVECPPCPAP (SEQ ID NO: 469);
ERKXCVECPPCPAP (SEQ ID NO: 470); o
ERKCXVECPPCPAP (SEQ ID NO: 471),
en donde X es cualquier aminoácido, excepto una cisteína,
o cualquiera de las secuencias anteriores, en las cuales 1-5, 1-3, 1-2 o 1 aminoácido es insertado entre residuos de aminoácido CVE y CPP. En ciertos aspectos, THT o GGG es insertado. En ciertos aspectos, 1, 1-2, o 1-3 aminoácidos son insertados entre la bisagra y el dominio CH2. Por ejemplo, una glicina puede ser insertada entre la bisagra y el dominio CH2.
En ciertos aspectos, la bisagra comprendel SEQ ID NO: 447, 448, 449, 450, o 451, en donde 1,2, 3 o todos los 4 aminoácidos P233, V234, A235 y G237 (que corresponden a los 4 aminoácidos C-terminales “PVAG” (SEQ ID NO: 472) son suprimidos o sustituidos con otro aminoácido, por ejemplo, los aminoácidos del C-terminal de la bisagra IgG1 (ELLG (SEQ ID NO: 473) o ELLGG (SEQ ID NO: 474). En ciertos aspectos, la bisagra comprendel SEQ ID NO: 447, 448, 449, 450, o 451, en donde V234, A235 y G237 son suprimidos o sustituidos con otro aminoácido. En ciertos aspectos, la bisagra comprendel SEQ ID NO: 447, 448, 449, 450, o 451, en donde A235 y G237 son suprimidos o sustituidos con otro aminoácido. En ciertos aspectos, la bisagra comprendel SEQ ID NO: 447, 448, 449, 450, o 451, en donde G237 es suprimido o sustituido con otro aminoácido. En ciertos aspectos, la bisagra comprendel SEQ ID NO: 447, 448, 449, 450, o 451, en donde V234 y A235 son suprimidos o sustituidos con otro aminoácido. La sustitución de PVAG (SEQ ID NO: 472) en una IgG2 con los aminoácidos correspondientes de una bisagra IgG1, es decir, (ELLG (SEQ ID NO: 473) o ELLGG (SEQ ID NO: 474)) para obtener una bisagra híbrida, por ejemplo, mostrada anteriormente, que proporciona una bisagra que tiene las ventajas de una bisagra IgG2 y la función efectora de las bisagras IgG1.
En ciertos aspectos, una región constante de cadena pesada modificada descrita en la presente comprende una bisagra que consiste de o consiste esencialmente de una de las secuencias mostradas anteriormente, por ejemplo, cualquiera de los SEQ ID NOs: 447-471, y en ciertos aspectos, no comprenden residuos de aminoácido de bisagra adicionales.
En ciertas modalidades de la invención, la región constante de cadena pesada modificada comprende una bisagra que consiste en una cualquiera de los SEQ ID NOs: 457, 459, 461, 462, 464 y 466, y no comprende residuos de aminoácido de bisagra adicionales.
En ciertas modalidades un anticuerpo anti-GITR comprende una región constante de cadena pesada modificada que comprende una región constante IgG1 o IgG2, en donde la bisagra comprende una supresión de 1-10 aminoácidos. Como se muestra en los Ejemplos, un anticuerpo IgG1 que carece de los residuos de aminoácido SCDKTHT (S219, C220, D221, K222, T223, H224 y T225; SEQ Id NO: 475) confiere internalización GITR mediada por el anticuerpo más efectivamente que el mismo anticuerpo que tiene una región constante IgG1 de tipo silvestre. De manera similar, en el contexto de un anticuerpo IgG2, un anticuerpo IgG2 que carece de los residuos de aminoácido CCVE (C219, C220, V222, y E224; SEQ ID NO: 476) confiere internalización GITR mediada por el anticuerpo más efectivamente que el mismo anticuerpo que tiene una región constante IgG1 de tipo silvestre. Por consiguiente, se proporcionan en la presente regiones constantes de cadena pesada modificadas en las cuales la bisagra comprende una supresión de 1, 2, 3, 4, 5, 6, o 7 residuos de aminoácido, seleccionados a partir de los residuos S219, C220, D221, k222, T223, H224 y T225 para un anticuerpo IgG1, y residuos C219, C220, V222, y E224 para un anticuerpo IgG2.
En ciertos aspectos descritos en el presente documento, una región constante de cadena pesada modificada comprende un dominio CH1 que es un dominio CH1 de tipo silvestre del isotipo IgG1 o IgG2 (“dominio CH1 IgG1” o “dominio CH1 IgG2”, respectivamente). Los dominios CH1 de los isotipos IgG3 e IgG4 (“dominio CH1 IgG3 y “dominio CH1 IgG2”, respectivamente) también pueden ser usados. Un dominio CH1 también puede ser una variante de un dominio CH1 de tipo silvestre, por ejemplo, una variante de un dominio CH1 IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 de tipo silvestre. Variantes a modo de ejemplo de dominios CH1 incluyen A114C y T173C y/o C131, por ejemplo, C131S. Un dominio CH1, por ejemplo, un dominio CH1 IgG2, puede comprender la sustitución C131S, en la cual la sustitución se confiere sobre un anticuerpo IgG2 o anticuerpo que tiene un CH1 IgG2 y la forma B de bisagra (o conformación). Los anticuerpos de la invención comprenden una región constante de cadena pesada modificada en donde el dominio CHI y la bisagra superior son del isotipo IgG2 y todas las demás regiones son del isotipo IgGl (SEQ ID NO: 394). Los anticuerpos de la invención pueden diferir de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 394 en una sustitución, adición o deleción de aminoácido, en donde dicha una sustitución, adición o deleción de aminoácido no está en las posiciones de aminoácidos 16, 20, 21, 75, 76, 82, 86, 97, 100, 102, 104 y 105 del SEQ ID NO: 394.
En ciertos aspectos descritos en la presente y en los anticuerpos de la invención, la región constante de cadena pesada modificada comprende un dominio CH1 que es del isotipo IgG2. En ciertas modalidades, el dominio CH1 es el dominio CH1 IgG2 de tipo silvestre, por ejemplo, que tiene la secuencia de aminoácido: ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNfG TQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV (SEQ ID NO: 477). En ciertas modalidades, el dominio CH1 es una variante del SEQ ID NO: 477 y comprende 1-10, 1-5, 1-2 o 1, y según la invención un máximo de 1, sustituciones o supresiones de aminoácido con relación a el SEQ ID NO: 477. Como se describe además en los Ejemplos, se ha mostrado en la presente que un dominio CH1 IgG2 o variantes del mismo confieren propiedades de internalización mejoradas o alteradas a los anticuerpos anti-GITR con relación a los anticuerpos IgG1 y aún internalización más alterada o mejorada cuando los anticuerpos también comprenden una bisagra IgG2. En ciertas modalidades, la variantes CH1 IgG2 no comprenden una sustitución o deleción de aminoácido en uno o más de los siguientes residuos de aminoácido: C131, R133, E137 y S138, en los cuales los residuos de aminoácido se muestran en negritas y subrayados en el SEQ ID NO: 477 mostrada anteriormente. Por ejemplo, una región constante de cadena pesada modificada puede comprender un dominio CH1 IgG2 en el cual ninguno de R133, E137 y S138 son sustituidos con otros aminoácidos o son suprimidos o en los cuales ninguno de C131, R133, E137 y S138 son sustituidos con otros aminoácidos o son suprimidos. En ciertas modalidades, C131 es sustituido con otro aminoácido, por ejemplo, C131S, en el cual la sustitución activa al anticuerpo para adoptar la conformación B. Tanto los anticuerpos de conformación A como conformación B tienen regiones constantes de cadena pesada modificadas que han sido mostradas en la presente por tener actividades mejoradas con relación al mismo anticuerpo con una región constante IgG1.
En ciertos aspectos, N192 y/o F193 (mostrados como residuos en cursiva y subrayados en el SEQ ID NO: 477 mostrada anteriormente) son sustituidos con otros aminoácidos, por ejemplo, con los aminoácidos correspondientes en IgG1, es decir, N192S y/o F193L.
En ciertos aspectos, uno o más residuos de aminoácido de un dominio CH1 IgG2 son sustituidos con los residuos de aminoácido correspondientes en IgG4. Por ejemplo, N192 puede ser N192S; F193 puede ser F193L; C131 puede ser C131K; y/o T214 puede serT214R.
Un anticuerpo descrito en la presente puede comprender una región constante de cadena pesada modificada que comprende un dominio CH1 IgG2 o variante del mismo y bisagra IgG2 o variante del mismo. La bisagra y dominio CH1 puede ser una combinación de cualquier bisagra IgG2 y dominio CH1 IgG2 descritos en la presente. En ciertos aspectos descritos en la presente, el CH1 IgG2 y bisagra comprenden la siguiente secuencia de aminoácido ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNfG TQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPyAG (SEQ ID NO: 478), o una secuencia de aminoácido que difiere de esta a lo sumo de 1-10 aminoácidos. Las variantes de aminoácido son como se describen para la bisagra y dominios CH1 anteriores. En ciertos aspectos, los anticuerpos comprenden al menos una bisagra IgG2, y opcionalmente también un dominio CH1 IgG2 o fragmento o derivado de la bisagra y/o dominio CH1 y el anticuerpo tiene la forma adoptada (de conformación) A (véase, por ejemplo, Allen et al. (2009) Biochemistry 48:3755). En ciertos aspectos, los anticuerpos anti-GITR comprenden al menos una bisagra IgG2, y opcionalmente también un dominio CH1 IgG2 o fragmento o derivado de la bisagra y/o dominio CH1 y el anticuerpo tienen la forma adoptada B (véase, por ejemplo, Allen et al. (2009) Biochemistry 48:3755).
En ciertos aspectos descritos en la presente, una región constante de cadena pesada modificada comprende un dominio CH2 que es un dominio CH2 de tipo silvestre del isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 (“dominio CH2 de IgG1”, “dominio CH2 de IgG2”, “dominio CH2 de IgG3” o “dominio CH2 de IgG4”, respectivamente). Un dominio CH2 también puede ser una variante de un dominio CH2 de tipo silvestre, por ejemplo, una variante de un dominio CH2 de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 de tipo silvestre. Los anticuerpos de la invención comprenden una región constante de cadena pesada modificada, en donde el dominio CH2 es del isotipo IgG1. Los ejemplos de variantes de los dominios CH2 incluyen variantes que modulan una actividad biológica de la región Fc de un anticuerpo, tal como ADCC o CDC, o modulan la semivida del anticuerpo o su estabilidad. En un aspecto descrito en la presente, el dominio CH2 es un dominio CH2 de IgG1 humana con una mutación A330S y P331S, en donde el dominio CH2 tiene una función efectora reducida con respecto a la misma mutación de CH2 sin las mutaciones. Un dominio CH2 puede tener una función efectora mejorada. Los dominios CH2 pueden comprender una o más de las siguientes mutaciones: SE (S267E), SELF (S267E/L328F), SDIE (S239D/I332E), SEFF y GASDALIE (G236A/S239D/A330L/I332E) y/o una o más mutaciones en los siguientes aminoácidos: E233, G237, P238, H268, P271, L328 y A330. Otras mutaciones son además mostradas en la presente en otra parte. Los anticuerpos de la invención pueden diferir de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 394 en una sustitución, adición o deleción de aminoácido, en donde dicha una sustitución, adición o deleción de aminoácido no está en las posiciones de aminoácido 16, 20, 21, 75, 76, 82, 86, 97, 100, 102, 104 y 105 del SEQ ID NO: 394.
En ciertos aspectos descritos en la presente, una región constante de cadena pesada modificada comprende un dominio CH3 que es un dominio CH3 de tipo silvestre del isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 (“dominio CH3 de IgG1”, “dominio CH3 de IgG2”, “dominio CH3 de IgG3” o “dominio CH3 de IgG4”, respectivamente). Un dominio CH3 también puede ser una variante de un dominio CH3 de tipo silvestre, por ejemplo, una variante de un dominio CH3 de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 de tipo silvestre. Los anticuerpos de la invención comprenden una región constante de cadena pesada modificada, en donde el dominio CH3 es del isotipo IgG1. Los ejemplos de variantes de los dominios CH3 incluyen variantes que modulan una actividad biológica de la región Fc de un anticuerpo, tal como ADCC o CDC, o modulan la semivida del anticuerpo o su estabilidad.
Por lo general, las variantes de los dominios CH1, bisagra, CH2 o CH3 pueden comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más mutaciones, y/o como máximo 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 mutación, o 1-10 o 1-5 mutaciones, o pueden comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica al dominio de tipo silvestre correspondiente (dominios CH1, bisagra, CH2 o CH3, respectivamente), siempre que la región constante de cadena pesada que comprende la variante específica retenga la actividad biológica necesaria. Los anticuerpos de la invención pueden diferir de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 394 en una sustitución, adición o deleción de aminoácido, en donde dicha una sustitución, adición o deleción de aminoácido no está en las posiciones de aminoácido 16, 20, 21, 75, 76, 82, 86, 97, 100, 102, 104 y 105 del SEQ ID NO: 394.
La Tabla 3 muestra ejemplos de regiones constantes de cadena pesada humana que comprenden dominios CH1, bisagra, CH2 y/o CH3 humanos, en donde cada dominio es un dominio de tipo silvestre o una variante de este que proporciona la actividad biológica deseada a la región constante de cadena pesada. Una celda vacía en la Tabla 3 indica que el dominio está presente o no, y si está presente, puede ser de cualquier isotipo, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. Por ejemplo, un anticuerpo que comprende la región constante de cadena pesada 1 en la Tabla 3 es un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada que comprende al menos una bisagra de IgG2, y que también puede comprender un dominio CH1, CH2 y/o CH3, y si está presente, el dominio CH1, CH2 y/o CH3 es de un isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. Como otro ejemplo para comprender la Tabla 3, un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada 8 es un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada que comprende un dominio CH1 de IgG1, y una bisagra de IgG2, un dominio CH2 de IgG1, y que puede o no comprender un dominio CH3, si se presenta, puede ser de un isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.
Tabla 3. Config r i n A m m l r i n n n n sada humana
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En ciertos aspectos, un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada mostrada en la Tabla 3 tiene una actividad biológica mejorada con relación al mismo anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada que no comprende esta región constante de cadena pesada específica o con relación al mismo anticuerpo que comprende una región constante de IgG1.
En ciertos aspectos descritos en la presente, un método para proporcionar la actividad biológica de un anticuerpo GITR que comprende una bisagra no de IgG2 y/o dominio CH1 no de IgG2 comprende proporcionar un anticuerpo GITR que comprende una bisagra no de IgG2 y/o un dominio CH1 no de IgG2, y que reemplaza la bisagra no de IgG2 y el dominio CH1 no de IgG2 con una bisagra de IgG2 y un dominio CH1 de IgG2, respectivamente. Un método para mejorar la actividad biológica de un anticuerpo GITR que no comprende una región constante de cadena pesada, puede comprender proporcionar un anticuerpo GITR que no comprende una región constante de cadena pesada, y que reemplaza su región constante de cadena pesada con una región constante de cadena pesada modificada.
Los ejemplos de regiones constantes de cadena pesada modificadas que pueden estar ligadas a las regiones variables de GITR, por ejemplo, aquellas descritas en la presente, se proporcionan en la Tabla 4, que muestra la identidad de cada uno de los dominios.
Ta l 4 R i n n n n m ifi m m l
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(continuación)
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En ciertos aspectos, un anticuerpo anti-GITR descrito en la presente comprende una región constante de cadena pesada modificada que comprende una bisagra IgG2 que comprenden cualquiera de los SEQ ID NO: 291, 292, 293, 294, y 447-471 o una variante de las mismas, tal como una bisagra IgG2 que comprende una secuencia de aminoácido que (i) difiere de cualquiera de los SEQ ID NO: 291,292, 293, 294, y 447-471 en 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácido; (ii) difiere de cualquiera de los SEQ ID NO: 291, 292, 293, 294, o 447-471 a lo sumo de 5, 4, 3, 2, o 1 sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácido; (iii) difiere de cualquiera de los SEQ ID NO: 291, 292, 293, 294, o 447-471 en 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 o 3-5 sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácido y/o (iv) comprende una secuencia de aminoácido que es al menos aproximadamente 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a cualquiera del SEQ ID NO: 291, 292, 293, 294, o 447-471, en donde en cualquiera de (i)-(iv), una sustitución de aminoácido puede ser una sustitución de aminoácido conservativa o una sustitución de aminoácido no conservativa; y en donde la región constante de cadena pesada modificada proporciona una actividad agonista incrementada a un anticuerpo anti-GITR con relación a otra región constante de cadena pesada, por ejemplo, una región constante de cadena pesada que comprende una bisagra no IgG2 o con relación a la misma región constante de cadena pesada modificada que comprende una bisagra no IgG2.
En ciertos aspectos, un anticuerpo anti-GITR descrito en la presente comprende una región constante de cadena pesada modificada que comprende un dominio CH1 IgG1 que comprendel SEQ ID NO: 278 o un dominio CH1 IgG2 que comprendel Se Q ID NO: 279, o una variante del SEQ ID NO: 278 o 279, en la cual la variante (i) difiere del SEQ ID NO: 278 o 279 en 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácido; (ii) difiere del SEQ ID NO: 278 o 279 a lo sumo de 5, 4, 3, 2, o 1 sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácido; (iii) difiere del SEQ ID NO: 278 o 279 en 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 o 3-5 sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácido y/o (iv) comprende una secuencia de aminoácido que es al menos aproximadamente 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a el SEQ ID NO: 278 o 279, en donde en cualquiera de (i)-(iv), una sustitución de aminoácido puede ser una sustitución de aminoácido conservativa o una sustitución de aminoácido no conservativa; y en donde el anticuerpo anti-GITR que comprende una región constante de cadena pesada modificada tiene una actividad agonista incrementada con relación a aquella del anticuerpo anti-GITR pero con otra región constante de cadena pesada, por ejemplo, una región constante de cadena pesada que comprende una bisagra no IgG2 o con relación a la misma región constante de cadena pesada modificada que comprende una bisagra no IgG2.
En ciertos aspectos, un anticuerpo anti-GITR descrito en la presente comprende una región constante de cadena pesada modificada que comprende un dominio CH2 IgG1 que comprendel SEQ ID NO: 280 o 281, o una variante del SEQ ID NO: 280 o 281, en la cual la variante (i) difiere del SEQ ID NO: 280 o 281 en 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácido; (ii) difiere del SEQ ID NO: 280 o 281 a lo sumo de 5, 4, 3, 2, o 1 sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácido; (iii) difiere del SEQ ID NO: 280 o 281 en 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 o 3-5 sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácido y/o (iv) comprende una secuencia de aminoácido que es al menos aproximadamente 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a el SEQ ID NO: 280 o 281, en donde en cualquiera de (i)-(iv), una sustitución de aminoácido puede ser una sustitución de aminoácido conservativa o una sustitución de aminoácido no conservativa; y en donde la región constante de cadena pesada modificada proporciona una actividad agonista incrementada a un anticuerpo anti-GITR con relación a aquella de otra región constante de cadena pesada, por ejemplo, una región constante de cadena pesada que comprende una bisagra no IgG2 o con relación a la misma región constante de cadena pesada modificada que comprende una bisagra no IgG2.
En ciertos aspectos, un anticuerpo anti-GITR descrito en la presente comprende una región constante de cadena pesada modificada que comprende un dominio CH3 IgG1 que comprendel SEQ ID NO: 282, o una variante del SEQ ID NO: 282, en la cual la variante (i) difiere del SEQ ID NO: 282 en 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácido; (ii) difiere del SEQ ID NO: 282 a lo sumo de 5, 4, 3, 2, o 1 sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácido; (iii) difiere del SEQ ID NO: 282 en 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 o 3-5 sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácido y/o (iv) comprende una secuencia de aminoácido que es al menos aproximadamente 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a el SEQ ID NO: 282, en donde en cualquiera de (i)-(iv), una sustitución de aminoácido puede ser una sustitución de aminoácido conservativa o una sustitución de aminoácido no conservativa; y en donde la región constante de cadena pesada modificada proporciona una actividad agonista incrementada con relación a aquella de otra región constante de cadena pesada, por ejemplo, una región constante de cadena pesada que comprende una bisagra no IgG2 o con relación a la misma región constante de cadena pesada modificada que comprende una bisagra no IgG2.
Las regiones constantes de cadena pesada modificada también pueden comprender una combinación de los dominios CH1, bisagra, CH2 y CH3 descritos anteriormente.
En ciertos aspectos, un anticuerpo anti-GITR descrito en la presente comprende una región constante de cadena pesada modificada que comprende cualquiera de los SEQ ID NOs: 223, 224, 225, 226, 283, 284, 285286, 287, 288, 289, 290, 383-446 y 480-543 o una variante de cualquiera de los SEQ ID NOs: 223, 224, 225, 226, 283, 284, 285286, 287, 288, 289, 290, 383-446 y 480-543, en los cuales la variante (i) difiere de cualquiera de los SEQ ID NOs: 223, 224, 225, 226, 283, 284, 285286, 287, 288, 289, 290, 383-446 y 480-543 en 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 , 8 , 9 , 10 o más sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácido; (ii) difiere de cualquiera de los SEQ ID NOs: 223, 224, 225, 226, 283, 284, 285 286, 287, 288, 289, 290, 383-446 y 480-543 a lo sumo de 10, 9, 8, 7, 6,5, 4, 3, 2, o 1 sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácido; (iii) difiere de cualquiera de los SEQ ID NOs: 223, 224, 225, 226, 283, 284, 285286, 287, 288, 289, 290, 383-446 y 480-543 en 1-5, 1-3, 1-2, 2-5, 3-5, 1-10, o 5-10 sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácido y/o (iv) comprende una secuencia de aminoácido que es al menos aproximadamente 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia seleccionada a partir de los SEQ ID NOs: 223, 224, 225, 226, 283, 284, 285286, 287, 288, 289, 290, 383-446 y 480-543, en donde en cualquiera de (i)-(iv), una sustitución de aminoácido puede ser una sustitución de aminoácido conservativa o una sustitución de aminoácido no conservativa y la(s) modificación(es) no ocurren en el aminoácido en el SEQ ID NO: 223, 224, 225, 226, 283, 284, 285 286, 287, 288, 289, 290, 383-446 y 480-543 que difieren del aminoácido de tipo silvestre en tal posición; y en donde la región constante de cadena pesada modificada proporciona una actividad agonista incrementada con relación a aquella de otra región constante de cadena pesada, por ejemplo, una región constante de cadena pesada que comprende una bisagra no IgG2 o con relación a la misma región constante de cadena pesada modificada que comprende una bisagra no IgG2.
Los anticuerpos de la invención comprenden una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 394 o una región constante de cadena pesada que difiere de la misma en una sustitución, adición o deleción de aminoácido, en donde dicha una sustitución, adición o deleción de aminoácido no está en las posiciones de aminoácido 16, 20, 21, 75, 76, 82, 86, 97, 100, 102, 104 y 105 del SEQ ID NO: 394.
Las regiones constantes de cadena pesada modificadas pueden tener (i) función efectora similar, reducida o incrementada (por ejemplo, unión a un FcyR) con relación a una región constante de cadena pesada de tipo silvestre y o (ii) semivida similar, reducida o incrementada (o unión al receptor FcRn) con relación a una región constante de cadena pesada de tipo silvestre.
MI. Anticuerpos que tienen secuencias particulares de línea germinal
En algunas modalidades, un anticuerpo anti-GITR comprende una región variable de cadena pesada de un gen de inmunoglobulina particular de cadena pesada de una línea germinal y/o una región variable de cadena ligera de un gen de inmunoglobulina particular de cadena pesada.
Como se demuestra en la presente, se prepararon los anticuerpos humanos específicos contra GITR que comprenden una región variable de cadena pesada que es el producto del gen 3-33 VH, gen 3-10 VH, gen 3-15 VH, gen 3-16 VH, gen Jh6b VH, gen 6-19 VH, gen 4-34 VH y/o gen JH3b VH de la línea germinal humana, o deriva de estos. En consecuencia, en la presente se proporcionan anticuerpos monoclonales aislados, o porciones de los mismos de unión al antígeno, que comprenden una región variable de cadena pesada que es el producto de un gen de la línea germinal VH humana, o que deriva de este, seleccionado del grupo que consiste en: 3-33 VH, 3-10 VH, 3-15 VH, 3-16 VH, JH6b VH, 6-19 VH y 4-34 VH y/o JH3b VH.
Se prepararon los anticuerpos humanos específicos contra GITR que comprenden una región variable de cadena ligera que es el producto del gen L6 VK, gen L18 VK, gen L15 VK, gen L20 VK, gen A27 VK, gen JK5 VK, gen JK4 VK, gen JK2 VK, y gen JK1 VK de la línea germinal humana, o que deriva de estos. En consecuencia, en la presente se proporcionan anticuerpos monoclonales aislados específicos contra CD73 humana, o porciones de los mismos de unión al antígeno, que comprenden una región variable de cadena ligera que es el producto de un gen de la línea germinal VK humana, o que deriva de este, seleccionado del grupo que consiste en: VK L6, VK L18, VK L15, VK L20, VK A27, VK JK5, VK JK4, VK JK2, y VK JK1.
Los anticuerpos preferidos descritos en la presente son aquellos que comprenden una región variable de cadena pesada que es el producto de uno de los genes VH de la línea germinal humana antes mencionados, o que deriva de estos, y que también comprenden una región variable de cadena ligera que es el producto de uno de los genes VK de la línea germinal humana antes mencionados, o que deriva de estos, como se muestra en las Figuras 2A-11B.
Como se usa en la presente, un anticuerpo humano que comprende regiones variables de las cadenas pesada o ligera que es “el producto de” o “derivado de” una secuencia particular de la línea germinal si las regiones variables del anticuerpo se obtienen de un sistema que usa genes de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Tales sistemas incluyen inmunizar un ratón transgénico que tiene genes de inmunoglobulina humana con el antígeno de interés o seleccionar una biblioteca de inmunoglobulina humana expresada en fago con el antígeno de interés. Un anticuerpo humano que es “el producto de” o “derivado de” una secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana se pueden identificar como tal comparando la secuencia de aminoácidos del anticuerpo humano con las secuencias de aminoácidos de las inmunoglobulinas de la línea germinal humana y seleccionando la secuencia de inmunoglobulinas de la línea germinal humana que está más cerca en secuencia (es decir, que tiene mayor % de identidad) de la secuencia del anticuerpo humano. Un anticuerpo humano que es “el producto de” o “derivado de” una secuencia particular de inmunoglobulinas de la línea germinal humana puede contener diferencias de aminoácidos en comparación con la secuencia de la línea germinal, debido a, por ejemplo, mutaciones somáticas naturales o una introducción intencional de mutaciones dirigidas al sitio. Sin embargo, un anticuerpo humano seleccionado es, en general, al menos 90 % idéntico en cuanto a la secuencia de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos codificada por un gen de inmunoglobulina de la línea germinal humana y contiene residuos de aminoácidos que identifican el anticuerpo humano como humano cuando se compara con las secuencias de aminoácidos de inmunoglobulina de la línea germinal de otras especies (por ejemplo, secuencias de la línea germinal murina). En determinados casos, un anticuerpo humano puede ser al menos 95 %, o incluso al menos 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico en cuando a la secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal. Por lo general, un anticuerpo humano derivado de una secuencia particular de la línea germinal humana expresará no más de 10 diferencias de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En determinados casos, el anticuerpo humano puede expresar no más de 5, o incluso no más de 4, 3, 2 o 1 diferencia de aminoácido de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal.
IV. Anticuerpos homólogos
En la presente se incluyen los anticuerpos que tienen regiones de cadena ligera variable y pesada que comprenden secuencias de aminoácidos que son homólogas a las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos preferidos descritos en la presente, y en donde los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-GITR descritos en la presente.
Por ejemplo, un anticuerpo anti-GITR aislado, o una porción de unión al antígeno de este, puede comprender una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en donde:
(a) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácido que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de los SEQ ID NOs: 13, 26, 39, 52, 71, 84, 97, 115, 128, y 335, o comprende 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, o 1-50 cambios de aminoácido (es decir, sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácido) con relación a una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de los SEQ ID NOs: 13, 26, 39, 52, 71, 84, 97, 115, 128, y 335;
(b) la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácido que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de los SEQ ID NOs: 14, 27, 40, 53, 54, 72, 85, 98, 99, 116, 129, 130, y 336, o comprende 1, 2, 3, 4, 5, 1­ 2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, o 1-50 cambios de aminoácido (es decir, sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácido) con relación a una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de los SEQ ID NOs: 14, 27, 40, 53, 54, 72, 85, 98, 99, 116, 129, 130, y 336;
(c) el anticuerpo se une específicamente a GITR, y
(d) el anticuerpo presenta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o todas las siguientes propiedades funcionales:
(1) unión al GITR humano soluble, por ejemplo, con una Kd de 10 nM o menos (por ejemplo, 0,01 nM hasta 10 nM), por ejemplo, como se mide por Biacore;
(2) unión al GITR humano que se une a la membrana, por ejemplo, con una Kd de 1 nM o menos (por ejemplo, 0,01 nM hasta 1 nM), por ejemplo, como se mide por Scatchard;
(3) unión al GITR humano que se une a la membrana, por ejemplo, con una EC50 de 1 nM o menos (por ejemplo, 0,01 nM hasta 1 nM), por ejemplo, como se mide por FACS;
(4) unión a GITR cinomólogo, por ejemplo, se unen al GITR de cinomólogo unido a la membrana, por ejemplo, con una EC50 de 10 nM o menos (por ejemplo, 0,01 nM hasta 10 nM), por ejemplo, como se mide por FACS; (5) inducir o mejorar la activación de células T, tal como en la presencia de acoplamiento CD3 (por ejemplo, en la presencia de concentraciones subópticas de anti-CD3), como se pone en evidencia, por (i) producción incrementada de IL-2 y/o IFN-y en células T que expresan el GITR y/o (ii) proliferación mejorada de células T; (6) inducir o mejorar la activación de células T si requerir reticulación multivalente;
(7) inhibición de la unión del ligando del GITR al GITr en células 3A9-hGITR, por ejemplo, con una EC50 de 1 |jg/mL o menos como se mide por FACS;
(8) a lo sumo parcialmente inhibición de la unión del ligando del GITR al GITR en células T activadas;
(9) unión a un epítopo conformacional en GITR humano maduro (SEQ ID NO: 4), por ejemplo, un epítopo discontinuo dentro de las secuencias de aminoácidos PTGGPGCGPGRLLLGTGT (SEQ ID NO: 217) y CRDYPGEE (SEQ ID NO: 218);
(10) unión a tanto GITR humano glicosilado como no glicosilado O-ligado y N-ligado;
(11) tener actividad agonista en la ausencia de unión a un receptor Fc, pero en donde la unión a un receptor Fc mejora además la actividad agonista;
(12) competir en cualquier dirección o ambas direcciones para unión al GITR humano con 28F3, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10, y 6G10.
En varias modalidades, el anticuerpo puede presentar una o más, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más, nueve, diez, once, o todas las propiedades funcionales listadas como (1) hasta (12) anteriores. El anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico.
Un anticuerpo anti-GITR aislado, o porción del mismo de unión al antígeno, descritos en la presente pueden comprender una cadena pesada y una cadena ligera, en donde:
(a) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácido que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de los SEQ ID NOs: 15, 17, 18, 28, 30, 31, 41, 43, 44, 55, 58, 59, 73, 75, 76, 86, 88, 89, 100, 102, 103, 117, 119, 120, 131, 134, 135, 227-275, 337, 339, 340, 348-352, 361, y 362, o comprende 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-10, 1­ 15, 1-20, 1-25, o 1-50 cambios de aminoácido (es decir, sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácido) con relación a una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de los SEQ ID NOs: 15, 17, 18, 28, 30, 31, 41, 43, 44, 55, 58, 59, 73, 75, 76, 86, 88, 89, 100, 102, 103, 117, 119, 120, 131, 134, 135, 227­ 275, 337, 339, 340, 348-352, 361, y 362, con la condición de que, en ciertas modalidades, si la secuencia es aquella de una cadena pesada menos efectora, las mutaciones que proporcionan la cadena pesada menos efectora no son modificadas (es decir, no se hace modificación a A234, E235, A237, S330 y S331);
(b) la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácido que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de los SEQ ID NOs: 16, 19, 29, 32, 42, 45, 56, 57, 60, 61, 74, 87, 90, 101, 104, 105, 118, 121, 132, 133, 136, 137, 338, 341, y 371, o comprende 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, o 1-50 cambios de aminoácido (es decir, sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácido) con relación a una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de los SEQ ID NOs: 16, 19, 29, 32, 42, 45, 56, 57, 60, 61, 74, 87, 90, 101, 104, 105, 118, 121, 132, 133, 136, 137, 338, 341, y 371;
(c) el anticuerpo se une específicamente a GITR, y
(d) el anticuerpo presenta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o todas las siguientes propiedades funcionales:
(1) unión al GITR humano soluble, por ejemplo, con una Kd de 10 nM o menos (por ejemplo, 0,01 nM hasta 10 nM), por ejemplo, como se mide por Biacore;
(2) unión al GITR humano que se une a la membrana, por ejemplo, con una Kd de 1 nM o menos (por ejemplo, 0,01 nM hasta 1 nM), por ejemplo, como se mide por Scatchard;
(3) unión al GITR humano que se une a la membrana, por ejemplo, con una EC50 de 1 nM o menos (por ejemplo, 0,01 nM hasta 1 nM), por ejemplo, como se mide por FACS;
(4) unión a GITR cinomólogo, por ejemplo, se unen al GITR de cinomólogo unido a la membrana, por ejemplo, con una EC50 de 10 nM o menos (por ejemplo, 0,01 nM hasta 10 nM), por ejemplo, como se mide por FACS; (5) inducir o mejorar la activación de células T, tal como en la presencia de acoplamiento CD3 (por ejemplo, en la presencia de concentraciones subópticas de anti-CD3), como se pone en evidencia, por (i) producción incrementada de IL-2 y/o IFN-y en células T que expresan el GITR y/o (ii) proliferación mejorada de células T; (6) inducir o mejorar la activación de células T si requerir reticulación multivalente;
(7) inhibición de la unión del ligando del GITR al GITr en células 3A9-hGITR, por ejemplo, con una EC50 de 1 |jg/mL o menos como se mide por FACS;
(8) a lo sumo parcialmente inhibición de la unión del ligando del GITR al GITR en células T activadas (9) unión a un epítopo conformacional en GITR humano maduro (SEQ ID NO: 4), por ejemplo, un epítopo discontinuo dentro de las secuencias de aminoácidos PTGGPGCGPGRLLLGTGT (SEQ ID NO: 2 l7 ) y CRDYPGEE (SEQ ID NO: 218);
(10) unión a tanto GITR humano glicosilado como no glicosilado O-ligado y N-ligado
(11) tener actividad agonista en la ausencia de unión a un receptor Fc, pero en donde la unión a un receptor Fc mejora además la actividad agonista; y
(12) competir en cualquier dirección o ambas direcciones para unión al GITR humano con 28F3, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10, y 6G10.
También se proporcionan los anticuerpos anti-GITR que comprenden una VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VLCDR1, VLCDR2, y/o v Lc DR3 que difieren de las CDR correspondientes de 28F3, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10, y/o 6G10, en 1,2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, o 1-5 cambios de aminoácido (es decir, sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácido). En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-GITR comprende 1-5 cambios de aminoácido en cada una de 1, 2, 3, 4, 5 o 6 de las CDR con relación a la secuencia correspondiente en 28F3, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10, y/o 6G10. En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-GITR comprende en total de 1-5 cambios de aminoácido a través de todas las CDR con relación a las CDR en 28F3, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10, y/o 6G10.
En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-GITR comprende CDR de VH y VL que consisten de aquellas de 28F3, en donde uno o más de los aminoácidos en una o más CDR son aquellos de uno de los otros anticuerpos anti-GITR descritos en la presente.
Por ejemplo, en ciertas modalidades, un anticuerpo anti-GITR comprende una VHCDR1 que comprende una o más modificaciones de aminoácido con relación a SYGMH (SEQ ID NO: 20), y puede comprender, por ejemplo, una de las siguientes secuencias degeneradas:
SYGXH (SEQ ID NO: 372), en donde X es cualquier aminoácido, por ejemplo, M o F;
X1YGX2H, en donde X1 es cualquier aminoácido, por ejemplo, S, N o D; y X2 es cualquier aminoácido, por ejemplo, M o F; y
X1YGX2X3, en donde X1 es cualquier aminoácido, por ejemplo, S, N o D; X2 es cualquier aminoácido, por ejemplo, M o F, y X3 es cualquier aminoácido, por ejemplo, H o Q.
En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-GITR comprende una VHCDR2 que comprende una o más modificaciones de aminoácido con relación a VIWYEGSNKYYADSv Kg (SEQ ID NO: 21), y puede comprender una de las siguientes secuencias degeneradas:
VIWYX1GSNKX2YADSVKG (SEQ ID NO: 373), en donde X1 es cualquier aminoácido, por ejemplo, E o A; y X2 es cualquier aminoácido, por ejemplo, Y o F; y
VIWYX1GSNKX2YX3DSVKG (SEQ ID NO: 374), en donde X1 es cualquier aminoácido, por ejemplo, E, A, G o D; X2 es cualquier aminoácido, por ejemplo, Y o F; y X3 es cualquier aminoácido, por ejemplo, A o V.
En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-GITR comprende una VHCDR3 que comprende una o más modificaciones de aminoácido con relación a GGSMVRGDYYYGMDV (SEQ ID NO: 22), y puede comprender, por ejemplo, una de las siguientes secuencias degeneradas:
GGSX1VRGDYYYGMDV (SEQ ID NO: 375), en donde X1 es cualquier aminoácido, por ejemplo, M o V, L, I o A. GGSX1VRGX2YYYGMDV (SEQ ID NO: 376), en donde X1 es cualquier aminoácido, por ejemplo, M o V, L, I o A; y X2 es cualquier aminoácido, por ejemplo, Do E. Combinaciones particulares deX 1 yX 2 se exponen en los Ejemplos. GG (6-7aa) MDVWYYX1MDVW (SEQ ID NO: 377), en donde X1 es cualquier aminoácido, por ejemplo, G, S o V. En ciertas modalidades, los aminoácidos 6-7 corresponden a los aminoácidos en tal posición en una secuencia VHCDR3 de un anticuerpo anti-GITR descrito en la presente.
En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-GITR comprende una VLCDR1 que comprende una o más modificaciones de aminoácido con relación a RASQGISSALA (SEQ ID NO: 23), y puede comprender, por ejemplo, una de las siguientes secuencias degeneradas:
RASQGISSXLA (SEQ ID NO: 378), en donde X es cualquier aminoácido, por ejemplo, A o W (o A, W o Y); y RASQG (2-3 aa) SX1LA (SEQ ID NO: 379), en donde X1 es cualquier aminoácido, por ejemplo, W, Y o A y los aminoácidos 2-3 son cualquiera de los aminoácidos, por ejemplo, GI, SVS o SVT.
En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-GITR comprende una VLCDR2 que comprende una o más modificaciones de aminoácido con relación a DASSLES (SEQ ID NO: 24), y puede comprender, por ejemplo, una de las siguientes secuencias degeneradas:
DASSLXS (SEQ ID NO: 380), en donde X es cualquier aminoácido, por ejemplo, E o Q; y
X1ASSX2X3X4 , en donde X1 es cualquier aminoácido, por ejemplo, A, D o G; X4 es cualquier aminoácido, por ejemplo, Lo R; X3 es cualquier aminoácido, por ejemplo, Q, E o A; y X4 es cualquier aminoácido, por ejemplo, S o T.
En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-GITR comprende una VLCDR3 que comprende una o más modificaciones de aminoácido con relación a QQFNSYPYT (SEQ ID NO: 25), y puede comprender, por ejemplo, una de las siguientes secuencias degeneradas:
QQXNSYPYT (SEQ ID NO: 381), en donde X es cualquier aminoácido, por ejemplo, F o Y; y QQX1X2SX3PX4T (SEQ ID NO: 382), en donde Xi es cualquier aminoácido, por ejemplo, F o Y; X2 es cualquier aminoácido, por ejemplo, N o G; X3 es cualquier aminoácido, por ejemplo, Y o S; y X4 es cualquier aminoácido, por ejemplo, Y, W, I, P o Q.
Los anticuerpos que tienen secuencias con homología a aquellas de 28F3, 3C3, 2G6, 8A6, 9G7, 14E3, 19H8, 19D3, 18E10, y/o 6G10, por ejemplo, las regiones Vh y Vl de los SEQ ID NOs: 13, 26, 39, 52, 71, 84, 97, 115, 128, y 335, y SEQ ID NOs: 14, 27, 40, 53, 54, 72, 85, 98, 99, 116, 129, 130, y 336, respectivamente, o las cadenas pesada y ligera de los SEQ ID NOs: 15, 17, 18, 28, 30, 31, 41, 43, 44, 55, 58, 59, 73, 75, 76, 86, 88, 89, 100, 102, 103, 117, 119, 120, 131, 134, 135, y 337, y SEQ ID NOs: 16, 19, 29, 32, 42, 45, 56, 60, 61, 74, 87, 90, 101, 104, 105, 118, 121, 132, 133, 136, 137, y 338, respectivamente, o CDR se pueden obtener por mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis de sitio dirigido o mediada por PCR) de moléculas de ácido nucleico que codifican los Se Q ID NOs: 147, 154, 158, 162, 168, 172, 176, 182, 186, 353 y/o SEQ ID NOs: 148, 155, 159, 163, 164, 169, 173, 177, 178, 183, 187, 188, 354 o SEQ ID NOs: 149, 151, 152, 156, 160, 165, 170, 174, 179, 184, 189, 355 y/o SEQ ID NOs: 150, 153, 157, 161, 166, 171, 175, 180, 185, 190, 191, 356, seguidas por pruebas del anticuerpo alterado codificado por la función retenida (es decir, las funciones expuestas en (1) hasta (12) anteriores) usan los ensayos funcionales descritos en la presente.
V. Anticuerpos con Modificaciones Conservativas
Los anticuerpos anti-GITR pueden comprender una región variable de cadena pesada que comprende secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias CDR1, CDR2 y CDR3, en donde una o más de estas secuencias de CDR comprenden secuencias de aminoácidos especificadas con base en los anticuerpos preferidos descritos en la presente (por ejemplo, 28F3, 19D3, 18E10, 3C3, 2G6, 8A6, 9G7, 14E3, 19H8, y 6G10), o modificaciones conservativas de los mismos, y en donde los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-GITR descritos en la presente. Por consiguiente, un anticuerpo anti-GITR aislado, o porción del mismo de unión al antígeno, pueden comprender una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias CDR1, CDR2, y CDR3, en donde:
(a) la secuencia de región variable de cadena pesada CDR3 comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NOs: 22, 35, 48, 64, 80, 93, 108, 124, 140, y 344, y modificaciones conservativas de los mismos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 o 1-5 sustituciones de aminoácido conservativas;
(b) la secuencia de región variable de cadena ligera CDR3 comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de secuencia de aminoácido de los SEQ ID NOs: 25, 38, 51, 67, 70, 83, 96, 111, 114, 127, 143, 146, y 347, y modificaciones conservativas de los mismos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 o 1-5 sustituciones de aminoácido conservativas;
(c) el anticuerpo se une específicamente a GITR, and
(d) el anticuerpo presenta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o todas las siguientes propiedades funcionales:
(1) unión al GITR humano soluble, por ejemplo, con una Kd de 10 nM o menos (por ejemplo, 0,01 nM hasta 10 nM), por ejemplo, como se mide por Biacore;
(2) unión al GITR humano que se une a la membrana, por ejemplo, con una Kd de 1 nM o menos (por ejemplo, 0,01 nM hasta 1 nM), por ejemplo, como se mide por Scatchard;
(3) unión al GITR humano que se une a la membrana, por ejemplo, con una EC50 de 1 nM o menos (por ejemplo, 0,01 nM hasta 1 nM), por ejemplo, como se mide por FACS;
(4) unión a GITR cinomólogo, por ejemplo, se unen al GITR de cinomólogo unido a la membrana, por ejemplo, con una EC50 de 10 nM o menos (por ejemplo, 0,01 nM hasta 10 nM), por ejemplo, como se mide por FACS; (5) inducir o mejorar la activación de células T, tal como en la presencia de acoplamiento CD3 (por ejemplo, en la presencia de concentraciones subópticas de anti-CD3), como se pone en evidencia, por (i) producción incrementada de IL-2 y/o IFN-y en células T que expresan el GITR y/o (ii) proliferación mejorada de células T; (6) inducir o mejorar la activación de células T si requerir reticulación multivalente;
(7) inhibición de la unión del ligando del GITR al GITr en células 3A9-hGITR, por ejemplo, con una EC50 de 1 |jg/mL o menos como se mide por FACS;
(8) a lo sumo parcialmente inhibición de la unión del ligando del GITR al GITR en células T activadas;
(9) unión a un epítopo conformacional en GITR humano maduro (SEQ ID NO: 4), por ejemplo, un epítopo discontinuo dentro de las secuencias de aminoácidos PTGGPGCGPGRLLLGTGT (SEQ ID NO: 217) y CRDYPGEE (SEQ ID NO: 218);
(10) unión a tanto GITR humano glicosilado como no glicosilado O-ligado y N-ligado;
(11) tener actividad agonista en la ausencia de unión a un receptor Fc, pero en donde la unión a un receptor Fc mejora además la actividad agonista; y
(12) competir en cualquier dirección o ambas direcciones para unión al GITR humano con 28F3, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10, y/o 6G10.
En una modalidad preferida, la secuencia de región variable de cadena pesada CDR2 comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NOs: 21, 34, 47, 63, 79, 92, 107, 123, 139, y 343, y modificaciones conservativas de los mismos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1­ 3, 1-4 o 1-5 sustituciones de aminoácido conservativas; y la secuencia de región variable de cadena ligera CDR2 comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NOs: 24, 37, 50, 66, 69, 82, 95, 110, 113, 126, 142, 145, y 346, y modificaciones conservativas de los mismos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 o 1-5 sustituciones de aminoácido conservativas. En otra modalidad preferida, la secuencia de región variable de cadena pesada CDR1 comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NOs: 20, 33, 46, 62, 78, 91, 106, 122, 138, y 342, y modificaciones conservativas de los mismos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 o 1-5 sustituciones de aminoácido conservativas; y la secuencia de región variable de cadena ligera CDR1 comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NOs: 23, 36, 49, 65, 68, 81, 94, 109, 112, 125, 141, 144, y 345, y modificaciones conservativas de los mismos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 o 1-5 sustituciones de aminoácido conservativas.
En varias modalidades, el anticuerpo puede presentar una o más, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más, nueve, o todas las propiedades funcionales listadas como (1) hasta (12) anteriores. Tales anticuerpos pueden ser, por ejemplo, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados o anticuerpos quiméricos.
Las sustituciones de aminoácido conservativas también pueden hacerse en porciones de los anticuerpos distintos de, o en adición a, las CDR. Por ejemplo, las modificaciones de aminoácido conservativas pueden hacerse en una región de armazón o en la región Fc. Una región variable o cadena ligera o pesada puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, o 1-50 sustituciones de aminoácido conservativas con relación a las secuencias de anticuerpo anti-GITR proporcionadas en la presente. En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-GITR comprende una combinación de modificación de aminoácido conservativa y no conservativa.
VI. Anticuerpos que se unen al mismo epítopo en GITR como, o compiten para unión a GITR con, los anticuerpos descritos en la presente
También se proporcionan anticuerpos que compiten por unión a GITR con los anticuerpos particulares anti-GITR descritos en la presente (por ejemplo, anticuerpos 28F3, 19D3, 18E10, 3C3, 2G6, 8A6, 9G7, 14E3, 19H8, y 6G10).
Tales anticuerpos de competición pueden ser identificados con base en su capacidad para inhibir competitivamente la unión de un GITR de uno o más de anticuerpos monoclonales 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2 G6 , 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, y 6G10 en ensayos de unión GITR estándares. Por ejemplo, se pueden usar ensayos ELISA estándares o ensayos ELISA competitivos en donde una proteína GITR humana recombinante se inmoviliza en la placa, se agregan diversas concentraciones del primer anticuerpo no etiquetado, la placa se lava, se agrega el segundo anticuerpo etiquetado, y se mide la cantidad de etiqueta unida. Si el aumento de concentración del (primer) anticuerpo no etiquetado (también denominado “anticuerpo de bloqueo”) inhibe la unión del (segundo) anticuerpo etiquetado, se dice que el primer anticuerpo inhibe la unión del segundo anticuerpo al objetivo en la placa, o se dice que compite con la unión del segundo anticuerpo. De manera adicional o alternativa, se puede usar el análisis de BIACORE® para evaluar la capacidad de los anticuerpos de competir. La capacidad de un anticuerpo de prueba para inhibir la unión de un anticuerpo anti-GITR descrito en la presente a GITR demuestra que el anticuerpo de prueba puede competir con el anticuerpo para la unión a GITR.
Por consiguiente, se proporcionan en la presente los anticuerpos anti-GITR que inhiben la unión de los anticuerpos anti-GITR descritos en la presente a GITR en células, por ejemplo, células T activadas, por al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % y/o cuya unión a GITR en células, por ejemplo, células T activadas, se inhibe por al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 %, por ejemplo, como se mide por ELISA o FACS, tal como usando el ensayo descrito en el siguiente párrafo.
Un experimento de competencia a modo de ejemplo para determinar por ejemplo, si un primer anticuerpo bloquea la unión de (es decir, “compite con”) un anticuerpo secundario, puede ser conducido como sigue: células T humanas activadas se prepararon como sigue: Células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se aislaron a partir de sangre completa humana usando gradiente de Ficoll y se activaron con 10|jg/mL de fitohemaglutinina (PHA-L) (USBiol#P3370-30) y 200IU/mL de IL-2 recombinante (Peprotech#200-02) por 3 días. Las células T activadas se suspendieron en amortiguador FACS (PBS con 5 % de suero bovino fetal) y se sembraron a 105 células por cavidad de muestra en una placa de 96 cavidades. La placa se fijó en hielo seguido por la adición de un primer anticuerpo conjugado a concentraciones que varían desde 0 hasta 50 jg/m L (titulación tres-veces partiendo de una concentración más alta de 50 jg/mL). Un IgG no relacionado puede ser usado como un control de isotipo para el primer anticuerpo y agregado a las mismas concentraciones (titulación tres veces partiendo de una concentración más alta de 50jg/mL). Una muestra pre-incubada con 50jg/mL de segundo anticuerpo no etiquetado puede ser incluida como un control positivo para bloqueo completo ( 1 0 0 % de inhibición), y una muestra sin anticuerpo en la incubación primera puede ser usada como un control negativo (sin competición; 0 % de inhibición). Después de 30 minutos de incubación, se etiquetó, por ejemplo, el segundo anticuerpo biotinilado se agregó a una concentración de 2jg/m L por cavidad sin lavado. Las muestras se incubaron por otros 30 minutos en hielo. Los anticuerpos no unidos se removieron lavando las células con amortiguador FACS. El segundo anticuerpo etiquetado unido a la célula se detectó con un agente que detecta la etiqueta, por ejemplo, estreptavidina conjugada a PE (Invitrogen, catálogo#S21388) para detectar biotina. Las muestras se adquirieron en un Citómetro de Flujo FACS Calibur (BD, San Jose) y se analizaron con software Flowjo (Tree Star, Inc, Ashland, OR). Los resultados pueden ser presentados como el % de inhibición (es decir, sustrayendo desde 1 0 0 % la cantidad de etiqueta en cada concentración dividida por la cantidad de etiqueta obtenida sin anticuerpo de bloqueo). Normalmente, el mismo experimento se conduce entonces a la inversa, es decir, el primer anticuerpo es el segundo anticuerpo y el segundo anticuerpo es el primer anticuerpo. En ciertas modalidades, un anticuerpo al menos parcialmente (por ejemplo, al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, o 90 %) o completamente (10 %) bloquea la unión de los otros anticuerpos al objetivo, por ejemplo, GITR humano o porción del mismo, y con respecto de si la inhibición ocurre cuando uno o el otro anticuerpo es el primer anticuerpo. Un primero y un segundo anticuerpo de unión “bloquean cruzado” de entre sí al objetivo, cuando los anticuerpos compiten entre sí ambas trayectorias, es decir, en experimentos de competición en los cuales el primer anticuerpo es agregado primero y en experimentos de competición en el cual el segundo experimento se agrega primero. En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-GITR se unen al mismo epítopo como aquel de los anticuerpos anti-GITR descritos en la presente (por ejemplo, anticuerpos 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8 A6 , 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, y 6G10), por ejemplo, como se determina por una técnica de mapeo de epítopo dado. Como se discute además en la presente, el anticuerpo 28F3 se une dentro de una región en GITR humano dentro de QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGE (SEQ ID NO: 215). Por consiguiente, en ciertas modalidades, un anticuerpo anti-GITR se une a residuos de aminoácido dentro de la región QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGE (SEQ ID NO: 215), que corresponde a los residuos de aminoácido 1-39 del GITR humano maduro (SEQ ID NO: 4). En una modalidad, el anticuerpo anti-GITR se une a residuos de aminoácido dentro de la región QRPTGGPGCGPGRLLLGTGT (SEQ ID NO: 216) del GITR humano maduro. En una modalidad, los anticuerpos anti-GITR descritos en la presente se une a residuos de aminoácido dentro de la región PTGGPGCGPGRLLLGTGT (SEQ ID NO: 217) y CRDYPGEE (SEQ ID NO: 218) del GITR humano maduro. En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-GITR se unen a secuencia de aminoácidos PTGGPGCGPGRLLLGTGT (SEQ ID NO: 217) y CRDYPGEE (SEQ ID NO: 218), como se determina por HDX, por ejemplo, usando el protocolo expuesto en los Ejemplos.
Las técnicas para determinar anticuerpos que se unen al “mismo epítopo en GITR” con los anticuerpos descritos en la presente incluyen, por ejemplo, métodos de mapeo de epítopos, tales como análisis de rayos X de cristales de complejos antígeno: anticuerpo, que proporciona la resolución atómica del epítopo. Otros métodos controlan la unión del anticuerpo a los fragmentos de antígeno o variaciones mutadas del antígeno en donde la pérdida de la unión debido a una modificación de un residuo de aminoácido dentro de la secuencia de antígenos es considerada a menudo como un indicador de un componente de epítopo. Asimismo, también se pueden usar métodos computacionales combinatorios para el mapeo de epítopos. Los métodos también pueden depender de la capacidad de un anticuerpo de interés para aislar por afinidad péptidos cortos específicos (ya sea en forma tridimensional nativa o en forma desnaturalizada) de bibliotecas de péptidos de expresión en fago combinatorias. Los péptidos luego son considerados como derivaciones para la definición del epítopo correspondientes al anticuerpo utilizado para analizar la biblioteca de péptidos. Para el mapeo de epítopos, también se desarrollaron algoritmos computacionales que han demostrado mapear epítopos discontinuos conformacionales.
Los anticuerpos que compiten por la unión con, o se unen al mismo epítopo como, los anticuerpos anti-GITR descritos en la presente se pueden identificar mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los ratones pueden ser inmunizados con GITR humana como se describe en la presente, los hibridomas producidos y los anticuerpos monoclonales resultantes analizados por la capacidad de competir con un anticuerpo descrito en la presente por la unión a GITR. Los ratones también se pueden inmunizar con un fragmento más pequeño de GITR que contiene el epítopo al que se fije el anticuerpo. El epítopo o la región que comprende el epítopo se pueden identificar mediante, por ejemplo, análisis de unión a una serie de péptidos superpuestos que abarcan GITR. De manera alternativa, el método de Jespers et al., Biotechnology 12:899, 1994 se puede usar para guiar la selección de anticuerpos que tienen el mismo epítopo y, por lo tanto, propiedades similares al anticuerpo anti-GITR descrito en la presente. Usando la expresión en fago, la cadena pesada del anticuerpo anti-GITR se aparea, en primer lugar, con un repertorio de cadenas ligeras (preferentemente, humanas) para seleccionar un anticuerpo que se une a GITR, y luego la nueva cadena ligera se aparea con un repertorio de cadenas pesadas (preferentemente, humanas) para seleccionar un anticuerpo que se une a GITR (preferentemente, humano) que tiene el mismo epítopo o la misma región de epítopo que un anticuerpo anti-GITR descrito en la presente. De manera alternativa, las variantes de un anticuerpo descrito en la presente se pueden obtener mediante mutagénesis de cADN que codifica las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo.
La mutagénesis de barrido de alanina, como se describe en Cunningham and Wells (1989) Science 244: 1081-1085, o alguna otra forma de mutagénesis puntual de residuos de aminoácidos en GITR también se puede usar para determinar el epítopo funcional para un anticuerpo anti-GITR. Los estudios de mutagénesis, sin embargo, también pueden revelar residuos de aminoácidos que son importantes para la estructura tridimensional completa de GITR, pero que no participan directamente en los contactos anticuerpo-antígeno, y por ende, es posible que se necesiten otros métodos para confirmar un epítopo funcional determinado mediante este método.
El epítopo o la región de epítopo (una “región de epítopo” es una región que comprende el epítopo o que se superpone con el epítopo) unido mediante un anticuerpo específico también se puede determinar mediante la evaluación de unión del anticuerpo a péptidos que comprenden fragmentos de GITR, por ejemplo, fragmentos desnaturalizados y no desnaturalizados. Una serie de péptidos superpuestos que abarcan la secuencia de GITR (por ejemplo, GITR humana) se puede sintetizar y analizar para determinar la unión, por ejemplo, en un ELISA directo, un ELISA competitivo (en donde el péptido se evalúa para determinar su capacidad de prevenir la unión de un anticuerpo a GITR unido a una cavidad de una placa de microtitulación), o en un chip. Tales métodos de cribado de péptidos pueden no tener la capacidad de detectar algunos epítopos funcionales discontinuos, es decir, epítopos funcionales que incluyen residuos de aminoácidos que no son contiguos a lo largo de la secuencia primaria de cadena de polipéptidos GITR.
Un epítopo también se puede identificar mediante huella proteica basada en MS, tal como espectrometría de masa de intercambio de hidrógeno/deuterio (HDX-MS) y oxidación fotoquímica rápida de proteínas (FPOP, por sus siglas en inglés). Se puede llevar a cabo HDX-MS, por ejemplo, como también se describe en los ejemplos y en Wei et al. (2014) Drug Discovery Today 19:95. Se lleva a cabo FPOp como se describe, por ejemplo, en Hambley and Gross (2005) J. American Soc. Mass Spectrometry 16:2057.
El epítopo unido mediante anticuerpos anti-GITR también se puede determinar mediante métodos estructurales, tales como determinación de la estructura de cristal mediante rayos X (por ejemplo, WO2005/044853), modelado molecular y espectroscopia por resonancia magnética nuclear (RMN), que incluye determinación por RMN de velocidades de intercambio de H-D de hidrógenos de amida lábil en GITR cuando se encuentran libres y cuando están unidos en un complejo con un anticuerpo de interés (Zinn-Justin et al. (1992) Biochemistry 31, 11335-11347; Zinn-Justin et al. (1993) Biochemistry 32, 6884-6891).
Con respecto a cristalografía de rayos X, la cristalización se puede alcanzar usando cualquier método conocido en la técnica (por ejemplo Giege et al. (1994) Acta Crystallogr. D50:339-350; McPherson (1990) Eur. J. Biochem. 189:1-23), que incluye microbatch (por ejemplo, Chayen (1997) Structure 5:1269-1274), difusión de vapor de gotas colgantes (por ejemplo, McPherson (1976) J. Biol. Chem. 251:6300-6303), siembra y diálisis. Es conveniente usar una preparación de proteínas que tenga una concentración de al menos aproximadamente 1 mg/ml y, preferentemente, aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml. La cristalización se puede alcanzar mejor en una solución de precipitante que contiene polietilenglicol 1000-20,000 (PEG; peso molecular promedio que varía de aproximadamente 1000 a aproximadamente 20,000 Da), preferentemente, aproximadamente 5000 a aproximadamente 7000 Da, con mayor preferencia, aproximadamente 6000 Da, con concentraciones que varían de aproximadamente 10 % a aproximadamente 30 % (p/v). También se desea incluir un agente estabilizante de proteínas, por ejemplo, glicerol en una concentración que varía de aproximadamente 0,5 % a aproximadamente 20 %. También se desea una sal adecuada, tal como cloruro de sodio, cloruro de litio o citrato de sodio, en la solución de precipitante, preferentemente, en una concentración que varía de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 1000 mM. El precipitante se amortigua, preferentemente, a un pH de aproximadamente 3,0 a alrededor 5,0, preferentemente, aproximadamente 4,0. Los amortiguadores específicos útiles en la solución de precipitante pueden variar y son conocidos en la técnica (Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, tercera ed., (1994) Springer-Verlag, Nueva York). Algunos ejemplos de amortiguadores útiles incluyen, entre otros, HEPES, Tris, MES y acetato. Los cristales se pueden cultivar en un intervalo amplio de temperaturas, que incluye 2 °C, 4 °C, 8 °C y 26 °C.
Los cristales anticuerpo:antígeno se pueden estudiar usando técnicas de difracción de rayos X conocidas y se pueden refinar usando software informático, tal como X-PLOR (Yale University, 1992, distribuido por Molecular Simulations, Inc.; véanse, por ejemplo, Blundell & Johnson (1985) Meth. Enzymol. 114 & 115, H. W. Wyckoff et al., eds., Academic Press; publicación de la Solicitud de Patente Estadounidense No. 2004/0014194), y BUSTER (Bricogne (1993) Acta Cryst. D49:37-60; Bricogne (1997) Meth. Enzymol. 276A:361-423, Carter & Sweet, eds.; Roversi et al. (2000) Acta Cryst. D56:1313-1323).
Los anticuerpos anti-GITR se pueden unir al mismo epítopo que cualquier anticuerpo anti-GITR que tiene secuencias de aminoácidos descritas en la presente, como se determina mediante una técnica de mapeo de epítopos, tal como una técnica descrita en la presente.
VII. Anticuerpos m odificados y sometidos a ingeniería genética
Regiones VH y VL
También se proporcionan anticuerpos modificados y sometidos a ingeniería genética que se pueden preparar mediante un anticuerpo que tenga una o más de las secuencias de Vh y/o Vl descritas en la presente como material de inicio para diseñar un anticuerpo modificado, que puede tener propiedades alteradas con respecto al anticuerpo de inicio. Un anticuerpo se puede someter a ingeniería genética modificando uno o más residuos en una o ambas regiones variables (es decir, Vh y/o Vl), por ejemplo, en una o más regiones CDR y/o en una o más regiones marco. De manera adicional o alternativa, un anticuerpo se puede someter a ingeniería genética modificando los residuos en las regiones constantes, por ejemplo, para alterar las funciones efectoras del anticuerpo.
Un tipo de modificación por ingeniería genética de la región variable que se puede llevar a cabo es injerto de CDR. Los anticuerpos interactúan con los antígenos diana predominantemente a través de los residuos de aminoácidos que se ubican en las seis regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cadena pesada y la cadena ligera. Por ello, las secuencias de aminoácidos en las CDR son más diversas entre los anticuerpos individuales que en las secuencias fuera de las CDR. Dado que las secuencias de CDR son responsables de la mayoría de las interacciones anticuerpo-antígeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imiten las propiedades de anticuerpos que se originan naturalmente específicos mediante la construcción de vectores de expresión que incluyen secuencias de CDR del anticuerpo específico que se origina naturalmente injertado en secuencias de armazón de un anticuerpo diferente con propiedades diferentes (véase, por ejemplo, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033; Patente Estadounidense No. 5.225.539 por Winter, y Patentes Estadounidenses Nos. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370 por Queen et al.).
Por consiguiente, otra modalidad descrita en la presente pertenece a un anticuerpo monoclonal aislado, o porción del mismo de unión al antígeno, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 que comprenden una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de los SEQ ID NOs: 20, 33, 46, 62, 78, 91, 106, 122, 138, y 342, SEQ ID NOs: 21, 34, 47, 63, 79, 92, 107, 123, 139, y 343, y SEQ ID NOs: 22, 35, 48, 64, 80, 93, 108, 124, 140, y 344, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de los SEQ ID NOs: 23, 36, 49, 65, 68, 81, 94, 109, 112, 125, 141, 144, y 345, SEQ ID NOs: 24, 37, 50, 66, 69, 82, 95, 110, 113, 126, 142, 145, y 346, y SEQ ID NOs: 25, 38, 51, 67, 70, 83, 96, 111, 114, 127, 143, 146, y 347, respectivamente. De este modo, tales anticuerpos contienen las secuencias CDR de Vh y Vl de anticuerpos monoclonales 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, y 6G10, pueden aún contener diferentes secuencias de armazón a partir de estos anticuerpos.
Las secuencias de armazón se pueden obtener de bases de datos de ADN públicas o de referencias publicadas que incluyen secuencias génicas de anticuerpos germinales. Por ejemplo, las secuencias de ADN de la línea germinal para los genes de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera humanas se pueden hallar en la base de datos de la secuencia de la línea germinal humana “VBase” (disponible en Internet en www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase) y en Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, publicación NIH N.° 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) “The Repertoire of Human Germline Vh Sequences Reveals about Fifty Groups of Vh Segments with Different Hypervariable Loops” J. Mol. Biol. 227:776-798; y Cox, J. P. L. et al. (1994) “A Directory of Human Germ-line Vh Segments Reveals a Strong Bias in their Usage” Eur. J. Immunol. 24:827-836.
Las secuencias de armazón preferidas para usar en los anticuerpos descritos en la presente son aquellas que son estructuralmente similares a las secuencias de armazón usadas por los anticuerpos descritos en la presente. Las secuencias CDR1, 2 y 3 de Vh y las secuencias CDR1, 2 y 3 de Vl se pueden injertar en regiones de armazón que tienen una secuencia idéntica a la que se halla en el gen de inmunoglobulina de la línea germinal del que deriva la secuencia de armazón, o las secuencias CDR se pueden injertar en las regiones de armazón que contienen una o más de aminoácidos, en comparación con las secuencias de la línea germinal. Por ejemplo, se ha descubierto que, en algunos casos, es conveniente mutar los residuos en las regiones armazón para mantener o mejorar la capacidad de unión al antígeno del anticuerpo (véanse, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Nos. 5.530.101, 5.585.089, 5.693.762 y 6.180.370 otorgadas a Queen et al).
Los anticuerpos modificados por ingeniería genética descritos en la presente incluyen aquellos en los que se realizaron modificaciones en los residuos del armazón en Vh y/o Vl, por ejemplo, para mejorar las propiedades del anticuerpo. En general, las modificaciones del armazón se realizan para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, un método consiste en “retromutar” uno o más residuos del armazón a la secuencia de la línea germinal correspondiente. Más específicamente, un anticuerpo que se sometió a mutación somática puede contener residuos del armazón que difieren de la secuencia de la línea germinal de la que deriva el anticuerpo. Los residuos se pueden identificar comparando las secuencias de armazón del anticuerpo con las secuencias de la línea germinal de la que deriva el anticuerpo. Con el fin de devolver las secuencias de la región de armazón a la configuración de la línea germinal, las mutaciones somáticas se pueden “retromutar” a la secuencia de la línea germinal mediante, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis mediada por PCR. También se pretende abarcar tales anticuerpos “retromutados”. Otro tipo de modificación del armazón implica la mutación de uno o más residuos en la región de marco, o incluso en una o más regiones CDR, pare eliminar los epítopos de las células T y así reducir la posible inmunogenicidad del anticuerpo. Este enfoque también se denomina “desinmunización” y se describe en mayor detalle en la publicación de Patente Estadounidense No. 20030153043 de Carr et al.
Otro tipo de modificación de región variable es mutar residuos de aminoácido dentro de las regiones CDR1, CDR2 y/o CDR3 de Vh y/o Vl para de este modo, mejorar una o más propiedades de unión (por ejemplo, afinidad) del anticuerpo de interés. Mutagénesis de sitio dirigido o mutagénesis mediada por PCR puede ser realizada para introducir la(s) mutación(es) y el efecto en unión del anticuerpo, u otra propiedad funcional de interés, puede ser evaluada en ensayos in vitro o in vivo como se describe en la presente y se proporciona en los Ejemplos. Preferiblemente, se introducen modificaciones conservativas (como se discute anteriormente). Las mutaciones pueden ser sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácido, pero son preferiblemente sustituciones. Sin embargo, normalmente no más de uno, dos, tres, cuatro o cinco residuos dentro de una región CDR son alterados.
Por consiguiente, también se proporcionan anticuerpos monoclonales anti-GITR aislados, o porciones de los mismos de unión al antígeno, que comprenden una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una región CDR1 de Vh que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de los SEQ ID NOs: 20, 33, 46, 62, 78, 91, 106, 122, 138, y 342, o una secuencia de aminoácido que tiene uno, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácido comparadas con los SEQ ID NOs: 20, 33, 46, 62, 78, 91, 106, 122, 138, y 342; (b) una región CDR2 de Vh que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de los SEQ ID NOs: 21, 34, 47, 63, 79, 92, 107, 123, 139, y 343, o una secuencia de aminoácido que tiene uno, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácido comparadas con los Se Q ID NOs: 21, 34, 47, 63, 79, 92, 107, 123, 139, y 343; (c) una región CDR3 de Vh que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de los SEQ ID NOs: 22, 35, 48, 64, 80, 93, 108, 124, 140, y 344, o una secuencia de aminoácido que tiene uno, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácido comparadas con los Se Q ID NOs: 22, 35, 48, 64, 80, 93, 108, 124, 140, y 344; (d) una región CDR1 de Vl que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de los SEQ ID NOs: 23, 36, 49, 65, 68, 81, 94, 109, 112, 125, 141, 144, y 345, o una secuencia de aminoácido que tiene uno, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácido comparadas con los SEQ ID NOs: 23, 36, 49, 65, 68, 81, 94, 109, 112, 125, 141, 144, y 345; (e) una región CDR2a de Vl que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de los SEQ ID NOs: 24, 37, 50, 66, 69, 82, 95, 110, 113, 126, 142, 145, y 346, o una secuencia de aminoácido que tiene uno, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácido comparadas con los Se Q ID NOs: 24, 37, 50, 66, 69, 82, 95, 110, 113, 126, 142, 145, y 346; y (f) una región CDR3 de Vl que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de los SEQ ID NOs: 25, 38, 51,67, 70, 83, 96, 111, 114, 127, 143, 146, y 347, o una secuencia de aminoácido que tiene uno, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácido comparadas con los SEQ ID NOs: 25, 38, 51, 67, 70, 83, 96, 111, 114, 127, 143, 146, y 347.
Los residuos de metionina en CDR de anticuerpos pueden ser oxidados, resultando en degradación química potencial y reducción consecuente en potencia del anticuerpo. Por consiguiente, también se proporcionan los anticuerpos anti-GITR los cuales tienen uno o más residuos de metionina en las CDR de cadena pesada y/o ligera reemplazados con residuos de aminoácido los cuales no sufren oxidación degradativa. En una modalidad, los residuos de metionina en las CDR de anticuerpos 28F3, 18E10, 19D3, y 6G10 son reemplazados con residuos de aminoácido los cuales no sufren degradación oxidativa.
De manera similar, los sitios de desamidación pueden ser removidos a partir de los anticuerpos anti-GITR, particularmente en as CDR.
Fc y Fc modificados
Regiones variables anti-GITR descritas en la presente pueden ser ligadas (por ejemplo, covalentemente ligadas o fusionadas) a un Fc, por ejemplo, un IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 Fc, el cual puede ser de cualquier alotipo o isoalotipo, ejemplo, para IgG1: G1m, G1m1(a), G1m2(x), G1m3(f), G1m17(z); para IgG2: G2m, G2m23(n); para IgG3: G3m, G3m21(g1), G3m28(g5), G3m11(b0), G3m5(b1), G3m13(b3), G3m14(b4), G3m10(b5), G3m15(s), G3m16(t), G3m6(c3), G3m24(c5), G3m26(u), G3m27(v); y para K: Km, Km1, Km2, Km3 (véase, por ejemplo, Jefferies et al. (2009) mAbs 1:1).
Los anticuerpos anti-GITR de la invención comprenden una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 394 o una región constante de cadena pesada que difiere de la misma en una sustitución, adición o deleción de aminoácido, en donde dicha una sustitución, adición o deleción de aminoácido no está en las posiciones de aminoácido 16, 20, 21, 75, 76, 82, 86, 97, 100, 102, 104 y 105 de SEQ ID NO: 394. En la región constante de cadena pesada modificada de los anticuerpos de la invención, el dominio CH1 y la bisagra superior son del isotipo IgG2 y todas las demás regiones (bisagra inferior, dominio CH2 y CH3) son del isotipo IgGl.
En ciertas modalidades, regiones variables anti-GITR se describen en la presente ligadas a un Fc que se unen a uno o más receptores Fc de activación (FcyI, FcYIIa o FcYIIIa), y de este modo estimulan la ADCC y pueden causar supresión de células T. En ciertas modalidades, las regiones variables anti-GITR se describen en la presente ligadas a un Fc que causa supresión. Como se describe además en los Ejemplos (Ejemplos 16 y 17), isotipos IgG2a de ratón e IgG2b de rata (equivalente a IgG2a de ratón en unión a FcR de activación de ratón) induce la inhibición más grande de crecimiento del tumor en varios modelos de tumor de ratón. Los isotipos anti-GITR mG2a, mG2b y rG2b, tienen poco efecto en, o inducen menor incremento en población Treg en la periferia contra inducir significante supresión de Treg en el ambiente del tumor, el cual se correlaciona con la inhibición del crecimiento del tumor. Contrariamente, el isotipo mIgG2a causa un incremento en el porcentaje de células CD8+ en el sitio del tumor, mientras el mIgG1 e IgG2b de rata no causan, o solamente incrementan marginalmente en, el porcentaje de células CD8+. Por consiguiente, en ciertas modalidades, las regiones variables anti-GITR se describen en la presente ligadas a Fc de IgG1 o IgG3 humano, es decir, los anticuerpos son del isotipo IgG1 o IgG3. En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-GITR son anticuerpos de supresión, en particular, suprimen las células Treg que están en el microambiente del tumor (y de este modo mejoran la actividad anti-tumoral), pero no suprimen significantemente las células Tef que están en el microambiente del tumor y median el efecto anti-tumoral, y/o no suprimen significantemente células Treg y Tef que están fuera del tumor, por ejemplo, en la periferia. En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-GITR son de un isotipo, (ya sea que se originan naturalmente o que no se originan naturalmente (por ejemplo, que incluyen mutación(es)) que estimulan la supresión o eliminación de células Treg en el sitio del tumor y activación concomitante de células Tef. En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-GITR crean una relación elevada Tef a Treg en el sitio del tumor, lo cual es indicativo de actividad anti-tumoral potente, y preferiblemente sin suprimir significantemente las células Treg y Tef que están fuera del tumor, por ejemplo, en la periferia. En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-GITR bloquean la actividad inmunosupresora de Tregs. En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-GITR tienen un receptor Fc sin, o con unión FcR reducido, por ejemplo, unión reducida a la activación de FcR. En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-GITR tienen un Fc que se une a, o tiene unión mejorada a FcRIIb, lo cual puede proporcionar agonismo mejorado.
En ciertas modalidades, la potencia de un anticuerpo anti-GITR para potenciar una respuesta inmune endógena es mejorada, optimizada o maximizada por un método que comprende seleccionar, diseñar o modificar la región Fc del anticuerpo así para mejorar la unión de tal región Fc a un receptor Fc de activación. En una modalidad, el anticuerpo anti-GITR es TRX-518.
En ciertas modalidades, las regiones variables anti-GITR se describen en la presente ligadas a un Fc menos efector o principalmente menos efector, por ejemplo, IgG2 o IgG4.
Las regiones variables anti-GITR descritas en la presente pueden ser ligadas a una región Fc que no se origina naturalmente, por ejemplo, una Fc menos efectora o una Fc con unión mejorada a uno o más receptores Fc de activación (FcyI, FcYIIa o FcYIIIa), tal como para mejorar la supresión de Treg en el ambiente del tumor.
En general, regiones variables descritas en la presente pueden ser ligadas a un Fc que comprende una o más modificaciones, normalmente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, tal como vita útil del suero, fijación del complemento, unión al receptor Fc, y/o citotoxicidad celular dependiente del antígeno. Además, un anticuerpo descrito en la presente puede ser químicamente modificado (por ejemplo, una o más porciones químicas pueden ser unidas al anticuerpo) o ser modificado para alterar su glicosilación, para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo. Cada una de estas modalidades se describe en detalle adicional abajo. La numeración de residuos en la región Fc es aquella del índice EU de Kabat.
La región Fc abarca dominios derivados a partir de la región constante de una inmunoglobulina, preferiblemente una inmunoglobulina humana, que incluye un fragmento, análogo, variante, mutante o derivado de la región constante. Las inmunoglobulinas adecuadas incluyen IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, y otras clases tales como IgA, IgD, IgE e IgM. La región constante de una inmunoglobulina se define como un polipéptido que se origina naturalmente o que se produce sintéticamente homólogo a la región C-terminal de inmunoglobulina, y puede incluir un dominio CH1, una bisagra, un dominio CH2, un dominio CH3, o un dominio CH4, separadamente o en combinación.
La región constante de una inmunoglobulina es responsable de muchas funciones importantes del anticuerpo que incluyen fijación del complemento y unión del receptor Fc (FcR). Existen cinco clases principales de región constante de cadena pesada, clasificada como IgA, IgG, IgD, IgE, IgM, cada una con funciones efectoras características designadas por isotipo. Por ejemplo, el IgG es separado en cuatro subclases conocidas como IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4.
Las moléculas Ig interactúan con clases múltiples de receptores celulares. Por ejemplo, moléculas IgG interactúan con tres clases de receptores Fcy (FcyR) específicos para la clase de IgG de anticuerpo, es decir FcyRI, FcyRII, y FcyRIII. Las secuencias importantes para la unión de IgG a los receptores FcyR han sido reportadas por estar localizadas en los dominios CH2 y CH3. La semivida del suero de un anticuerpo es influenciada por la capacidad de tal anticuerpo para unirse a un receptor Fc (FcR).
En ciertas modalidades, la región Fc es una región Fc variante, por ejemplo, una secuencia Fc que ha sido modificada (por ejemplo, por sustitución, deleción y/o inserción de aminoácido) con relación a una secuencia Fc precursora (por ejemplo, un polipéptido Fc no modificado que es subsecuentemente modificado para generar una variante), para proporcionar características estructurales y/o actividad biológica deseables.
Por ejemplo, se pueden hacer modificaciones en la región Fc con el fin de generar una variante Fc que (a) ha incrementado o reducido la citotoxicidad mediada por la célula dependiente del anticuerpo (ADCC), (b) incrementado o reducido la citotoxicidad mediada por el complemento (CDC), (c) ha incrementado o reducido la afinidad para C1q y/o (d) ha incrementado o reducido la afinidad para un receptor Fc con relación al Fc precursor. Tales regiones variantes Fc en general, comprenderán al menos una modificación de aminoácido en la región Fc. Combinar las modificaciones de aminoácido se piensa es particularmente deseable. Por ejemplo, la región variante Fc puede incluir dos, tres, cuatro, cinco, etc., sustituciones en esta, por ejemplo, de las posiciones de la región Fc específicas identificadas en la presente.
Una región variante Fc también puede comprender una alteración de secuencia en donde los aminoácidos involucrados en la formación de enlace disulfuro son removidos o recolocados con otros aminoácidos. Tal remoción puede evitar la reacción con otras proteínas que contienen cisteína presentes en la célula hospedera usada para producir los anticuerpos descritos en la presente. Aún cuando los residuos de cisteína son removidos, los dominios Fc de cadena única pueden todavía formar un dominio Fc dimérico que es mantenido en conjunto no covalentemente. En otras modalidades, la región Fc puede ser modificada para hacerla más compatible con una célula hospedera seleccionada. Por ejemplo, se puede remover la secuencia PA cerca del término-N de una región Fc nativa típica, la cual puede ser reconocida por una enzima digestiva en E. coli tal como aminopeptidasa de prolina. En otras modalidades, uno o más sitios de glicosilación dentro del dominio Fc pueden ser removidos. Los residuos que son normalmente glicosilados (por ejemplo, asparagina) pueden conferir la respuesta citolítica. Tales residuos pueden ser suprimidos o sustituidos con residuos no glicosilados (por ejemplo, alanina). En otras modalidades, los sitios involucrados en la interacción con el complemento, tal como el sitio de unión C1q, pueden ser removidos de la región Fc. Por ejemplo, se puede suprimir o sustituir la secuencia EKK de IgG1 humano. En ciertas modalidades, los sitios que afectan la unión a receptores Fc pueden ser removidos, preferiblemente sitios distintos de sitios de unión del receptor salvajes. En otras modalidades, una región Fc puede ser modificada para remover un sitio ADCC. Los sitios ADCC se conocen en la técnica; véase, por ejemplo, Molec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992) con respecto a sitios ADCC en IgG1. Ejemplos específicos de dominios Fc variantes se describen, por ejemplo, en los documentos WO 97/34631 y WO 96/32478.
En una modalidad, la región de bisagra de Fc es modificada de manera que el número de residuos de cisteína en la región de bisagra se altera, por ejemplo, incrementa o reduce. Este procedimiento se describe además en la Patente Estadounidense No. 5.677.425 por Bodmer et al. El número de residuos de cisteína en la región de bisagra de Fc se altera para, por ejemplo, facilitar el ensamble de las cadenas pesada y ligera para incrementar o reducir la estabilidad del anticuerpo. En una modalidad, la región de bisagra del Fc de un anticuerpo es mutada para reducir la semivida biológica del anticuerpo. Más específicamente, una o más mutaciones de aminoácido son introducidas en la región de interferencia del dominio CH2-CH3 del fragmento de bisagra-Fc de manera que el anticuerpo tiene unión alterada de la proteína A Estafilocócica (SpA) con relación a la unión de SpA del dominio de bisagra-Fc nativo. Este procedimiento se describe en detalle adicional en la Patente Estadounidense No. 6.165.745 por Ward et al.
En aún otras modalidades, la región Fc es alterada para reemplazar al menos un residuo de aminoácido con un diferente residuo de aminoácido para alterar la(s) función(es) efector(as) del anticuerpo. Por ejemplo, uno o más aminoácidos seleccionados a partir de los residuos de aminoácido 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 y 322 pueden ser reemplazados con un diferente residuo de aminoácido de manera que el anticuerpo tiene una afinidad alterada para un ligando efector pero retiene la capacidad de unión al antígeno del anticuerpo precursor. El ligando efector al cual la afinidad es alterada puede ser, por ejemplo, un receptor Fc o el componente C1 del complemento. Este procedimiento se describe en detalle adicional en las Patentes Estadounidenses Nos. 5.624.821 y 5.648.260, ambas por Winter et al.
En otro ejemplo, uno o más aminoácidos seleccionados a partir de residuos de aminoácido 329, 331 y 322 pueden ser reemplazados con un diferente residuo de aminoácido de manera que el anticuerpo tiene unión C1q alterada y/o citotoxicidad dependiente del complemente (CDC) abolida o reducida. Este procedimiento se describe en detalle adicional en la Patente Estadounidense Nos. 6.194.551 por Idusogie et al.
En otro ejemplo, uno o más residuos de aminoácido dentro de las posiciones de aminoácido 231 y 239 son alterados para de este modo alterar la capacidad del anticuerpo para fijar el complemente. Este procedimiento se describe además en la Publicación de Pc T WO 94/29351 por Bodmer et al.
En aún otro ejemplo, la región Fc puede ser modificada para incrementar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) y/o para incrementar la afinidad para un receptor de Fcy para modificar uno o más aminoácidos en las siguientes posiciones: 234, 235, 236, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 313, 315, 320, 322, 324, 325, 326, 327, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 433, 434, 435, 436, 437, 438 o 439.
Sustituciones a modo de ejemplo incluyen 236A, 239D, 239E, 268D, 267E, 268E, 268F, 324T, 332D, y 332E. Variantes a modo de ejemplo incluyen 239D/332E, 236A/332E, 236A/239D/332E, 268F/324T, 267E/268F, 267E/324T, y 267E/268F/324T. Otras modificaciones para mejorar las interacciones FcyR y del complemento incluyen pero no se limitan a sustituciones 298A, 333A, 334A, 326A, 247I, 339D, 339Q, 280H, 290S, 298D, 298V, 243L, 292P, 300L, 396L, 305I, y 396L. Estas y otras modificaciones son revisadas en Strohl, 2009, Current Opinión in Biotechnology 20:685-691.
Las modificaciones Fc que incrementan la unión a un receptor Fcy incluyen modificaciones de aminoácido en cualquier o más de las posiciones de aminoácido 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 279, 280, 283, 285, 298, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 312, 315, 324, 327, 329, 330, 335, 337, 3338, 340, 360, 373, 376, 379, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 o 439 de la región Fc, en donde la numeración de los residuos en la región Fc es aquella del índice EU como en Kabat (WO00/42072).
Otras modificaciones Fc que pueden ser elaboradas para Fc son aquellas para reducir o ablatir la unión a FcyR y/o proteínas del complemento, de este modo reducen o ablaten las funciones efectoras mediadas por Fc tales como ADCC, ADCP, y CDC. Modificaciones a modo de ejemplo incluyen pero no se limitan a sustituciones, inserciones y supresiones en las posiciones 234, 235, 236, 237, 267, 269, 325, y 328, en donde la numeración es de conformidad con el índice EU. Sustituciones a modo de ejemplo incluyen pero no se limitan a 234G, 235G, 236R, 237K, 267R, 269R, 325L, y 328R, en donde la numeración es de conformidad con el índice EU. Una variante Fc puede comprender 236R/328R. Otras modificaciones para reducir las interacciones de FcyR y el complemento incluyen sustituciones 297A, 234A, 235A, 237A, 318A, 228P, 236E, 268Q, 309L, 330S, 331 S, 220S, 226S, 229S, 238S, 233P, y 234V, así como también remoción de la glicosilación en la posición 297 por medios enzimáticos o mutacionales o por producción en organismos tales como bacterias que no glicosilan proteínas. Estas y otras modificaciones son revisadas en Strohl, 2009, Current Opinion in Biotechnology 20:685-691.
Opcionalmente, la región Fc puede comprender un residuo de aminoácido que no se origina naturalmente en posiciones adicionales y/o alternativas conocidas por un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Patentes Estadounidenses Nos. 5.624.821; 6.277.375; 6.737.056; 6.194.551; 7.317.091; 8.101.720; Publicaciones de Patente PCT WO 00/42072; WO 01/58957; WO 02/06919; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752; WO 04/074455; WO 04/099249; WO 04/063351; WO 05/070963; WO 05/040217, WO 05/092925 y WO 06/020114).
Las variantes Fc que mejoran la afinidad para un receptor inhibidor FcyRllb también pueden ser usadas. Tales variantes pueden proporcionar una proteína de fusión Fc con actividades inmunonoduladoras relacionadas con células FcyRllb+, que incluyen por ejemplo, células B y monocitos. En una modalidad, las variantes Fc proporcionan afinidad selectivamente mejorada a FcyRllb con relación a uno o más receptores de activación. Las modificaciones para alterar la unión a FcyRllb incluyen una o más modificaciones en una posición seleccionada a partir del grupo que consiste de 234, 235, 236, 237, 239, 266, 267, 268, 325, 326, 327, 328, y 332, de conformidad con el índice EU. Sustituciones a modo de ejemplo para mejorar la afinidad de FcyRllb incluyen pero no se limitan a 234D, 234E, 234F, 234W, 235D, 235F, 235R, 235Y, 236D, 236N, 237D, 237N, 239D, 239E, 266M, 267D, 267E, 268D, 268E, 327D, 327E, 328F, 328W, 328Y, y 332E. Sustituciones a modo de ejemplo incluyen 235Y, 236D, 239D, 266M, 267E, 268D, 268E, 328F, 328W, y 328Y. Otras variantes Fc para mejorar la unión a FcyRllb incluyen 235Y/267E, 236D/267E, 239D/268D, 239D/267E, 267E/268D, 267E/268E, y 267E/328F.
Las afinidades y propiedades de unión de una región Fc para su ligando pueden ser determinadas por varios métodos de ensayo in vitro (ensayos de base bioquímica o inmunológicos) conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, métodos de equilibrio (por ejemplo, ensayo inmunosorbente ligado a la enzima (ELISA), o radioinmunoensayo (RIA)), o cinéticas (por ejemplo, análisis BIACORE), y otros métodos tales como ensayos de unión indirecta, ensayos de inhibición competitiva, transferencia de energía de resonancia por fluorescencia (FRET, por sus siglas en inglés), electroforesis en gel y cromatografía (por ejemplo, filtración en gel). Estos y otros métodos pueden utilizar una etiqueta en uno o más de los componentes siendo examinados y/o emplear varios métodos de detección que incluyen pero no se limitan a, etiquetas cromogénicas, fluorescentes, luminiscentes, o isotópicas. Una descripción detallada de afinidades y cinéticas de unión se puede encontrar en Paul, W. E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999), el cual se enfoca en las interacciones de anticuerpo-inmunógeno.
En ciertas modalidades, el anticuerpo es modificado para incrementar su semivida biológica. Varios procedimientos son posibles. Por ejemplo, estos se pueden hacer incrementando la afinidad de unión de la región Fc para FcRn. Por ejemplo, uno o más de los siguientes residuos pueden ser mutados: 252, 254, 256, 433, 435, 436, como se describe en la Patente Estadounidense No. 6.277.375. Sustituciones a modo de ejemplo específicas incluyen una o más de las siguientes: T252L, T254S, y/o T256F. Alternativamente, para incrementar la semivida biológica, el anticuerpo puede ser alterado dentro de la región CH1 o CL para contener un eptítopo de unión al receptor salvaje tomado a partir de dos bucles de un dominio CH2 de una región Fc de un IgG, como se describe en las Patentes Estadounidenses Nos.
5.869.046 y 6.121.022 por Presta et al. Otras variantes a modo de ejemplo que incrementan la unión a FcRn y/o mejoran las propiedades farmacocinéticas incluyen sustituciones en las posiciones 259, 308, 428, y 434, que incluyen por ejemplo 259l, 308F, 428L, 428M, 434S, 434h , 434F, 434Y, y 434M. Otras variantes que incrementan la unión de Fc a FcRn incluyen: 250E, 250Q, 428L, 428F, 250Q/428L (Hinton etal., 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216, Hinton et al. 2006 Journal of Immunology 176:346-356), 256A, 272A, 286A, 305A, 307A, 307Q, 31 1A, 312A, 376A, 378Q, 380A, 382A, 434A(Shields etal, Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(9):6591-6604), 252F, 252T, 252Y, 252W, 254T, 256S, 256R, 256Q, 256E, 256D, 256T, 309P, 311S, 433R, 433S, 433I, 433P, 433Q, 434H, 434F, 434Y, 252Y/254T/256E, 433K/434F/436H, 308T/309P/311S (Dall Acqua et al. Journal of Immunology, 2002, 169:5171-5180, Dall'Acqua et al., 2006, Journal of Biological Chemistry 281:23514-23524). Otras modificaciones para modular la unión del FcRn se describen en Yeung et al., 2010, J Immunol, 182:7663-7671. En ciertas modalidades, los isótopos IgG híbridos con características biológicas particulares pueden ser usados. Por ejemplo, una variante híbrida IgG1/IgG3 puede ser construida sustituyendo las posiciones del IgG1 en la región CH2 y/o CH3 con los aminoácidos de IgG3 en las posiciones donde los dos isotipos difieren. De este modo, un anticuerpo IgG variante híbrido puede ser construido, que comprende una o más sustituciones, por ejemplo, 274Q, 276K, 300F, 339T, 356E, 358M, 384S, 392N, 397M, 4221, 435R, y 436F. En otras modalidades se describe en la presente, una variante híbrida de IgG1/IgG2 puede ser construida sustituyendo las posiciones de IgG2 en la región c H2 y/o CH3 con aminoácidos de IgG1 en las posiciones donde los dos isotipos difieren. De este modo un anticuerpo IgG variante híbrido puede ser construido, que comprende una o más sustituciones, por ejemplo, una o más de las siguientes sustituciones de aminoácido: 233E, 234L, 235L, -236G (con referencia a una inserción de una glicina en la posición 236), y 327A.
Sin embargo, los sitios de unión en IgG1 humano para FcyR1, FcyRII, FcyRIII y FcRn han sido mapeados y variantes con unión mejorada han sido descritos (véase Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604). Mutaciones específicas en las posiciones 256, 290, 298, 333, 334 y 339 se muestran por mejorar la unión a FcyRIII. Adicionalmente, las siguientes combinaciones de mutantes se muestran por mejorar la unión de FcyRIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A y S298A/E333A/K334A, los cuales han sido mostrados por presentar actividad de ADCC y unión a FcYRIIIa mejorada (Shields et al., 2001). Otras variantes IgG1 con unión fuertemente mejorada a FcYRIIIa han sido identificadas, incluyendo variantes con mutaciones S239D/I332E y S239D/I332E/A330L las cuales muestran el incremento más grande en afinidad para FcYRIIIa, una disminución en la unión de FcYRIIb, y actividad citotóxica fuerte en monos cinomólogos (Lazar et al., 2006). La introducción de mutaciones triples en anticuerpos tales como alemtuzumab (específico de CD52), trastuzumab (específico de HER2/neu), rituximab (específico de CD20), y cetuximab (específico de EGFR-) se traduce en actividad ADCC mayormente mejorada in vitro, y la variante S239D/I332E mostró una capacidad mejorada para suprimir las células B en monos (Lazar et al., 2006). En adición, se han identificado IgG1 mutantes que contienen mutaciones L235V, F243L, R292P, Y300Ly P396L las cuales presentan unión mejorada a FcYRIIIa y concomitantemente actividad ADCC mejorada en ratones transgénicos que expresan FcyRIIIa humano en modelos de malignidades de células B y cáncer de mama (Stavenhagen et al., 2007; Nordstrom et al., 2011). Otros mutantes Fc que pueden ser usados incluyen: S298A/E333A/L334A, S239D/I332E, S239D/I332E/A330L, L235V/F243L/R292P/Y300L/ P396L, y M428L/N434S.
En ciertas modalidades, se elige un Fc que tiene unión reducida a FcyRs. Un Fc a modo de ejemplo, por ejemplo, Fc IgG1, con unión de FcyR reducida comprende las siguientes tres sustituciones de aminoácido: L234a , L235E y G237A.
En ciertas modalidades, se elige un Fc que tiene fijación reducida al complemento. Un Fc a modo de ejemplo, por ejemplo, Fc IgG1, con fijación reducida al complemento tiene las siguientes dos sustituciones de aminoácido: A330S y P331S.
En ciertas modalidades, se elige un Fc que esencialmente no tiene función efectora, es decir, tiene unión reducida a FcyRs y fijación reducida al complemento. Un Fc a modo de ejemplo, por ejemplo, Fc IgG1, que es menos efector, comprende las siguientes cinco mutaciones: L234A, L235E, G237A, A330S y P331S. Las cadenas pesadas a modo de ejemplo que comprenden estas mutaciones se exponen en la Tabla 15.
Cuando se usa un dominio constante IgG4, es usualmente preferible incluir la sustitución S228P, la cual imita la secuencia bisagra en IgG1 y de este modo estabiliza las moléculas IgG4.
Los anticuerpos de la invención comprenden una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 394 o una región constante de cadena pesada que difiere de la misma en una sustitución, adición o deleción de aminoácido, en donde dicha una sustitución, adición o deleción de aminoácido no está en las posiciones de aminoácido 16, 20, 21, 75, 76, 82, 86, 97, 100, 102, 104 y 105 del SEQ ID NO: 394.
En todavía otra modalidad, la glicosilación de un anticuerpo es modificada. Por ejemplo, puede ser elaborado un anticuerpo aglicosilado (es decir, el anticuerpo carece de glicosilación). La glicosilación puede ser alterada para, por ejemplo, incrementar la afinidad del anticuerpo para el antígeno. Tales modificaciones de carbohidrato pueden ser realizadas mediante, por ejemplo, alterar uno o más sitios de glicosilación dentro de la secuencia de anticuerpo. Por ejemplo, una o más sustituciones de aminoácido pueden hacerse que den como resultado eliminación de uno o más sitios de glicosilación de armazón de región variable para de este modo, eliminar la glicosilación en tal sitio. Tal aglicosilación puede incrementar la afinidad del anticuerpo para el antígeno. Tal procedimiento se describe en detalle adicional en las Patentes Estadounidenses Nos. 5.714.350 y 6.350.861 por Co et al.
La glicosilación de la región constante en N297 puede ser prevenida por mutación del residuo N297 a otro residuo, por ejemplo, N297A, y/o por mutación de un aminoácido adyacente, por ejemplo, 298 para de este modo, reducir la glicosilación en N297.
Adicionalmente o alternativamente, un anticuerpo puede ser elaborado que tiene un tipo alterado de glicosilación, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tiene cantidades reducidas de residuos de fucosilo o un anticuerpo que tiene estructuras GlcNac de bisección incrementadas. Tales patrones de glicosilación alterados han sido demostrados por incrementar la capacidad de ADCC de anticuerpos. Tales modificaciones de carbohidratos pueden ser realizadas mediante, por ejemplo, expresar el anticuerpo en una célula hospedera con maquinaria de glicosilación alterada. Las células con maquinaria de glicosilación alterada han sido descritas en la técnica y pueden ser usadas como células hospederas en las cuales expresan los anticuerpos recombinantes descritos en la presente para de este modo producir un anticuerpo con glicosilación alterada. Por ejemplo, el documento EP 1.176.195 por Hanai et al. describe una línea celular con un gen FUT8 funcionalmente interrumpido, el cual codifica una fucosil transferasa, de manera que los anticuerpos expresados en tal línea de células presentan hipofucosilación. La Publicación de PCT WO 03/035835 por Presta describe una línea de células CHO variante, células Lec13, con capacidad reducida para unir la fucosa a carbohidratos ligados a Asn(297), que resulta también en la hipofucosilación de anticuerpos expresados en tal célula hospedera (véase también Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740). La Publicación de PCT WO 99/54342 por Umana et al. describe líneas de células diseñadas por ingeniería para expresar glicosil transferasas que modifican la proteína (por ejemplo, beta(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)) de manera que los anticuerpos expresados en las líneas de células diseñadas por ingeniería presentan estructuras GlcNac de bisección incrementadas, lo cual resulta en actividad de ADCC incrementada de los anticuerpos (véase también Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180).
Otra modificación de los anticuerpos descritos en la presente es pegilación. Un anticuerpo puede ser pegilado para, por ejemplo, incrementar la semivida biológica (por ejemplo, suero) del anticuerpo. Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo, o fragmento del mismo, normalmente se hace reaccionar con polietilenglicol (PEG), tal como un éster reactivo o derivado de aldehído de PEG, bajo condiciones en las cuales uno o más grupos PEG llegan a ser unidos al anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Preferiblemente, la pegilación se lleva a cabo mediante una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula PEG reactiva (o un polímero soluble en agua reactivo análogo). Como se usa en la presente, el término “polietilenglicol” está propuesto para abarcar cualquiera de las formas de PEG que han sido usada para derivatizar otras proteínas, tales como mono alcoxi (C1-C10) - ariloxi-polietilen glicol o polietilenglicol maleimida. En ciertas modalidades, el anticuerpo que será pegilado es un anticuerpo aglicosilado. Los métodos para pegilar proteínas se conocen en la técnica y pueden ser aplicados a los anticuerpos descritos en la presente. Véase por ejemplo, EP 0154 316 por Nishimura et al. y EP 0401 384 por Ishikawa et al.
VIII. Propiedades Físicas de los Anticuerpos
Los anticuerpos descritos en la presente pueden contener uno o más sitios de glicosilación en la región variable de cadena ligera o pesada. Tales sitios de glicosilación pueden dar como resultado un aumento de la inmunogenicidad del anticuerpo o una alteración de la pK del anticuerpo debido a la unión alterada al antígeno (Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala and Morrison (2004) J Immunol 172:5489-94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706). Se sabe que la glicosilación se produce en las porciones que contienen una secuencia N-X-S/T. En algunos casos, se prefiere un anticuerpo anti-GITR que no contenga glicosilación en la región variable. Esto se puede lograr seleccionando anticuerpos que no contienen la porción de glicosilación en la región variable o mutando residuos en la región de glicosilación.
En algunas modalidades, los anticuerpos descritos en la presente no contienen sitios de isomerismo de asparagina. La desamidación de asparagina se puede producir en secuencias N-G o D-G y puede dar como resultado la creación de un residuo de ácido isoaspártico que puede introducir un pliegue en la cadena de polipéptidos y puede disminuir su estabilidad (efecto del ácido isoaspártico).
Cada anticuerpo tendrá un punto isoeléctrico único (pI), que a menudo se encuentra en el intervalo de pH 6 a 9,5. A menudo, el pH de un anticuerpo IgG1 se encuentra en el intervalo de pH de 7-9,5, y el pI de un anticuerpo IgG4 se encuentra en el intervalo de pH de 6 -8. Existen conjeturas con respecto a que los anticuerpos con un pI fuera del intervalo normal pueden presentar desplegamiento e inestabilidad en condiciones in vivo. Por ello, es preferible tener un anticuerpo anti-GITR que contenga un valor pI que se encuentre dentro del intervalo normal. Esto puede lograrse seleccionando anticuerpos con un pI en el intervalo normal o mutando residuos de superficie cargada.
Cada anticuerpo tendrá una temperatura de fusión característica, con una temperatura de fusión más alta que indica mayor estabilidad general in vivo (Krishnamurthy R and Manning M C (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71). En general, se prefiere que la Tm1 (temperatura de desplegamiento inicial) sea mayor de 60 °C, preferentemente, mayor de 65 °C, aún con mayor preferencia, mayor de 70 °C. El punto de fusión de un anticuerpo se puede medir usando calorimetría diferencial de barrido (Chen et al (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68:47-52) o dicroísmo circular (Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9). En una modalidad preferida, se seleccionan anticuerpos que no se degradan rápidamente. La degradación de un anticuerpo se puede medir usando electroforesis capilar (CE) y MALDI-MS (Alexander A J and Hughes D E (1995) Anal Chem 67:3626-32).
En otra modalidad preferida, se seleccionan anticuerpos que tienen efectos de agregabilidad mínimos, que pueden producir el desencadenamiento de una respuesta inmune no deseada y/o propiedades farmacocinéticas alteradas y/o desfavorables. En general, los anticuerpos son aceptables con una agregabilidad de 25 % o menos, preferentemente, 20 % o menos, aún con mayor preferencia, 15 % o menos, aún con mayor preferencia, 10 % o menos, y aún con mayor preferencia, 5 % o menos. La agregabilidad se puede medir mediante diversas técnicas, que incluyen columna de exclusión por tamaño (SEC), cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y dispersión de luz.
IX. Métodos para diseñar anticuerpos por ingeniería genética
Como se analizó anteriormente, los anticuerpos anti-GITR que tienen las secuencias Vh y Vl descritos en la presente se pueden usar para crear nuevos anticuerpos anti- GITR mediante la modificación de las secuencias VH y/o VL, o las regiones constantes unidas a estas. Por lo tanto, en otro aspecto descrito en la presente, las características estructurales de un anticuerpo anti-GITR descrito en la presente, por ejemplo, 28F3, 19D3, 18E10, 3C3, 2G6, 8 A6 , 9G7, 14E3, 19H8, y 6G10, se usan para crear anticuerpos anti-GITR estructuralmente relacionados que retienen al menos una propiedad funcional de los anticuerpos descritos en la presente, tal como la unión a GITR humana y GITR de cinomólogo. Por ejemplo, una o más regiones CDR de 28F3, 19D3, 18E10, 3C3, 2G6, 8 A6 , 9G7, 14E3, 19H8, y 6G10, o sus mutaciones, se pueden combinar de manera recombinante con regiones de marco conocidas y/u otras CDR para crear anticuerpos anti-GITR descritos en la presente adicionales y modificados por ingeniería genética de manera recombinante, como se analizó anteriormente. Otros tipos de modificaciones incluyen aquellos descritos en la sección anterior. El material de inicio para el método de modificación por ingeniería genética es una o más de las secuencias Vh y/o Vl proporcionadas en la presente, o una o más de las regiones CDR de estas. Para crear el anticuerpo modificado por ingeniería genética, no es necesario realmente preparar (es decir, expresar como una proteína) un anticuerpo que tenga uno o más de las secuencias Vh y/o Vl proporcionadas en la presente, o una o más de las regiones CDR de estas. En su lugar, la información contenida en las secuencias se usa como el material de inicio para crear secuencias de “segunda generación” derivadas de las secuencias originales y, luego, las secuencias de “segunda generación” se preparan y se expresan como una proteína.
Por consiguiente, se proporcionan en la presente (pero no se reivindican) métodos para preparar un anticuerpo anti-GITR que comprende:
(a) proporcionar: (i) una secuencia de región variable de cadena pesada de anticuerpo que comprende una secuencia CDR1 seleccionada a partir del grupo que consiste de los SEQ ID NOs: 20, 33, 46, 6 2 , 78, 91, 106, 122, 138, y 342, una secuencia CDR2 seleccionada a partir del grupo que consiste de los SEQ ID NOs: 21, 34, 47, 63, 79, 92, 107, 123, 139, y 343, y/o una secuencia CDR3 seleccionada a partir del grupo que consiste de los SEQ ID NOs: 22, 35, 48, 64, 80, 93, 108, 124, 140, y 344; y (ii) una secuencia de región variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende una secuencia CDR1 seleccionada a partir del grupo que consiste de los SEQ ID NOs: 23, 36, 49, 65, 6 8 , 81, 94, 109, 112, 125, 141, 144, y 345, una secuencia CDR2 seleccionada a partir del grupo que consiste de los SEQ ID NOs: 24, 37, 50, 6 6 , 69, 82, 95, 110, 113, 126, 142, 145, y 346, y/o una secuencia Cd R3 seleccionada a partir del grupo que consiste de los SEQ ID NOs: 25, 38, 51, 67, 70, 83, 96, 111, 114, 127, 143, 146, y 347;
(b) alterar al menos un residuo de aminoácido dentro de la secuencia de región variable de cadena pesada de anticuerpo y/o la secuencia de región variable de cadena ligera de anticuerpo para crear al menos una secuencia de anticuerpo alterado; y
(c) expresar la secuencia de anticuerpo alterado como una proteína.
Las técnicas de biología molecular estándares se pueden usar para preparar y expresar la secuencia de anticuerpos alterados.
Preferiblemente, el anticuerpo codificado por la secuencia de anticuerpo alterado(s) es uno que retiene una, algunas o todas las propiedades funcionales de los anticuerpos anti-GITR descritos en la presente, los cuales incluyen,
(1) unión al GITR humano soluble, por ejemplo, con una Kd de 10 nM o menos (por ejemplo, 0,01 nM hasta 10 nM), por ejemplo, como se mide por Biacore;
(2) unión al GITR humano que se une a la membrana, por ejemplo, con una Kd de 1 nM o menos (por ejemplo, 0,01 nM hasta 1 nM), por ejemplo, como se mide por Scatchard;
(3) unión al GITR humano que se une a la membrana, por ejemplo, con una EC50 de 1 nM o menos (por ejemplo, 0,01 nM hasta 1 nM), por ejemplo, como se mide por FACS;
(4) unión a GITR cinomólogo, por ejemplo, se unen al GITR de cinomólogo unido a la membrana, por ejemplo, con una EC50 de 10 nM o menos (por ejemplo, 0,01 nM hasta 10 nM), por ejemplo, como se mide por FACS;
(5) inducir o mejorar la activación de células T, tal como en la presencia de acoplamiento CD3 (por ejemplo, en la presencia de concentraciones subópticas de anti-CD3), como se pone en evidencia, por (i) producción incrementada de IL-2 y/o IFN-y en células T que expresan el GITR y/o (ii) proliferación mejorada de células T; (6 ) inducir o mejorar la activación de células T si requerir reticulación multivalente;
(7) inhibición de la unión del ligando del GITR al GITR en células 3A9-hGITR, por ejemplo, con una EC50 de 1 |jg/mL o menos como se mide por FACS;
(8 ) a lo sumo parcialmente inhibición de la unión del ligando del GITR al GITR en células T activadas;
(9) unión a un epítopo conformacional en GITR humano maduro (SEQ ID NO: 4), por ejemplo, un epítopo discontinuo dentro de las secuencias de aminoácidos PTGGPGCGPGRLLLGt Gt (Se Q ID NO: 217) y CRDYPGEE (SEQ ID NO: 218);
(10) unión a tanto GITR humano glicosilado como no glicosilado O-ligado y N-ligado;
(11) tener actividad agonista en la ausencia de unión a un receptor Fc, pero en donde la unión a un receptor Fc mejora además la actividad agonista; y
(12) competir en cualquier dirección o ambas direcciones para unión al GITR humano con 28F3, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10, y/o6G10.
El anticuerpo alterado puede presentar una o más, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más, nueve o más, diez o más, once, o todas las propiedades funcionales como se exponen en (1) hasta (12) anteriores. Las propiedades funcionales de los anticuerpos alterados se pueden evaluar usando ensayos estándares disponibles en la técnica y/o descritos en la presente, tales como los indicados en los ejemplos (por ejemplo, ELISA, FACS).
En algunas modalidades de los métodos para diseñar anticuerpos por ingeniería genética descritos en la presente, las mutaciones se pueden introducir de manera aleatoria o selectiva a lo largo de todo o en una parte de un anticuerpo anti-GITR que codifica la secuencia, y los anticuerpos anti-GITR modificados resultantes se pueden seleccionar para evaluar la actividad de unión y/u otras propiedades funcionales, tal como se describe en la presente. Los métodos mutacionales se describieron en la técnica. Por ejemplo, la publicación PCT WO 02/092780 de Short describe métodos para crear y seleccionar mutaciones de anticuerpo mediante mutagénesis por saturación, ensamble de ligadura sintética o una combinación de estos. De manera alternativa, la publicación PCT WO 03/074679 de Lazar et al. describe métodos para usar métodos computacionales de cribado con el fin de optimizar propiedades fisioquímicas de anticuerpos.
X. Moléculas de ácidos nucleicos
Otro aspecto descrito en la presente se refiere a moléculas de ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos descritos en la presente. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células enteras, en un lisado celular o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un ácido nucleico está “aislado” o “se vuelve sustancialmente puro” cuando se purifica de otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otras proteínas o ácidos nucleicos celulares (por ejemplo, otro ADN cromosómico, por ejemplo, el ADN cromosómico que se liga al ADN aislado en la naturaleza), mediante técnicas estándares, que incluyen el tratamiento con SDS/alcalino, bandas de CsCl, cromatografía en columna, enzimas de restricción, electroforesis en gel de agarosa y otras técnicas conocidas en la técnica. Véase, F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, Nueva York. Un ácido nucleico descrito en la presente puede ser, por ejemplo, ADN o ARN, y puede contener secuencias intrónicas o no. En algunas modalidades, el ácido nucleico es una molécula de cADN.
Los ácidos nucleicos descritos en la presente se pueden obtener usando técnicas estándares de biología molecular. En el caso de los anticuerpos expresados por hibridomas (por ejemplo, hibridomas preparados de ratones transgénicos que tienen genes de inmunoglobulina humana como se describe más adelante), los cADN que codifican la cadena ligera y la cadena pesada del anticuerpo obtenido mediante el hibridoma se pueden obtener mediante técnicas estándares de amplificación por PCR o clonación de cADN. En el caso de los anticuerpos obtenidos de una biblioteca de inmunoglobulina (por ejemplo, usando técnicas de expresión en fago), se puede recuperar el ácido nucleico que codifica el anticuerpo de la biblioteca.
Las moléculas de ácidos nucleicos preferidas descritas en la presenta son aquellas que codifican las secuencias VH y VL de los anticuerpos monoclonales 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, y 6G10. Secuencias de ADN a modo de ejemplo que codifican las secuencias VH de 28F3, 19D3, 18E10, 3C3, 2G6, 8A6, 9G7, 14E3, 19H8, y 6G10 se exponen en los SEQ ID NOs: 147, 154, 158, 162, 168, 172, 176, 182, 186, y 353, respectivamente. Las secuencias de ADN a modo de ejemplo que codifican las secuencias de VL de 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1,9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, y 6G10 se exponen en los SEQ ID NOs: 148, 155, 163, 164, 169, 173, 177, 178, 183, 187, 188, y 354, respectivamente. Secuencias de ADN a modo de ejemplo que codifican las secuencias de cadena pesada de 28F3, 19D3, 18E10, 3C3 (3C3-1 y 3C3-2), 2G6, 8A6, 9G7 (9g 7-1 y 9G7-2), 14E3, 19H8 (19H8-1 y 19H8-2), y 6G10 se exponen en los SEQ ID NOs: 149, 156, 160, 165, 170, 174, 179, 184, 189, y 355, respectivamente. Secuencias de ADN a modo de ejemplo que codifican las secuencias de cadena ligera de 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, y 6G10 se exponen en los SEQ ID NOs: 150, 157, 161, 166, 167, 171, 175, 181, 180, 185, 190, 191, y 356, respectivamente.
Los ácidos nucleicos a modo de ejemplo que codifican los dominios maduros de VH y VL de anticuerpos 28F3.IgG1 y 28F3.IgG1.1 (misma región variable) se exponen como SEQ ID NOs: 147 y 148, respectivamente. Los ácidos nucleicos a modo de ejemplo que codifican las cadenas pesadas maduras de anticuerpos 28F3.IgG1 y 28F3.IgG1.1 se exponen como SEQ ID NOs: 151 y 152, respectivamente, y un ácido nucleico a modo de ejemplo que codifica la cadena ligera madura de anticuerpos 28F3.IgG1 y 28F3.IgG1.1 se expone como SEQ ID NO: 153.
Los dominios VH y VL a modo de ejemplo de anticuerpos 28F3.IgG1 y 28F3.IgG1.1 (misma región variable) con un péptido señal se exponen como s Eq Id NOs: 357 y 358, respectivamente, y las secuencias de nucleótidos que codifican a estos se exponen como SEQ ID NOs: 359 y 360, respectivamente.
Las cadenas pesadas a modo de ejemplo de anticuerpos 28F3.IgG1 y 28F3.IgG1.1 con un péptido seña se exponen como SEQ ID NOs: 361 y 362, respectivamente, y secuencias de nucleótido a modo de ejemplo que codifican estas se exponen como SEQ ID NOs: 363 y 364, respectivamente. Una cadena ligera a modo de ejemplo de anticuerpos 28F3.IgG1 y 28F3.IgG1.1 con un péptido señal se expone como SEQ ID NO: 365, y una secuencia de nucleótido a modo de ejemplo que la codifica se expone como SEQ ID NOs: 366.
Un método para elaborar 28F3.IgG1 puede comprender expresar la cadena pesada y las cadenas ligeras en una línea de células que comprende las secuencias de nucleótidos que codifican las cadenas pesada y ligera con un péptido señal, por ejemplo, SEQ ID NO: 363 y 365, respectivamente. Un método para elaborar 28F3.IgG1.1 puede comprender expresar la cadena pesada y las cadenas ligeras en una línea de células que comprende las secuencias de nucleótido que codifican las cadenas pesada y ligera con un péptido señal, por ejemplo, SEQ ID NO: 364 y 366, respectivamente. Las células hospederas que comprenden estas secuencias de nucleótido están abarcadas en la presente.
Una vez que los fragmentos de ADN que codifican segmentos de VH y VL se obtienen, estos fragmentos de ADN pueden ser además manipulados por técnicas de ADN recombinante estándares, por ejemplo, para convertir los genes de región variable a genes de cadena de anticuerpo de longitud completa, a genes de fragmento Fab o a un gen scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifica a VL o VH es operativamente ligado a otro fragmento de ADN que codifica otra proteína, tal como una región constante de anticuerpo o un enlazador flexible. El término “operativamente ligado”, como se usa en este contexto, está propuesto para significar que los dos fragmentos de ADN están unidos de manera que las secuencias de aminoácidos codificados por los dos fragmentos de ADN permanecen en la estructura.
El ADN aislados que codifica la región VH puede ser convertido a un gen de cadena pesada de longitud completa para enlazar operativamente el ADN que codifica a VH a otra molécula de ADN que codifica las regiones constantes de cadena pesada (bisagra, CH1, CH2 y/o CH3). Las secuencias de genes de región constante de cadena pesada humana se conocen en la técnica (véase por ejemplo, Kabat, E. A., el al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones se pueden obtener por amplificación de PCR estándar. La región constante de cadena pesada puede ser una región constante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM o IgD, por ejemplo, una región IgG1. Para un gen de cadena pesada del fragmento Fab, el ADN que codifica a VH puede ser operativamente ligado a otra molécula de ADN codificando solamente la región constante CH1 de cadena pesada.
El ADN aislado que codifica la región VL puede ser convertido a un gen de cadena ligera de longitud completa (así como también a un gen de cadena ligera Fab) para enlazar operativamente el ADN que codifica a VL con otra molécula de ADN que codifica la región constante de cadena ligera, CL. Las secuencias de genes de región constante de cadena ligera humana se conocen en la técnica (véase por ejemplo, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones se pueden obtener por amplificación de PCR estándar. La región constante de cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda.
Para crear un gen scFv, los fragmentos de ADN que codifican a VH y VL son operativamente ligados a otro fragmento que codifica un enlazador flexible, por ejemplo, que codifica la secuencia de aminoácido (Gly4 -Ser)3, de manera que las secuencias VH y VL pueden ser expresadas como una proteína de cadena única contigua, con las regiones VL y VH unidas por el enlazador flexible (véase por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554).
También se proporcionan en las moléculas de ácido nucleico que codifican secuencias de VH y VL que son homólogas a aquellas de los anticuerpos monoclonales 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9g 7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, y 6G10. Las moléculas de ácido nucleico a modo de ejemplo codifican secuencias VH y VL que son al menos 70 % idénticas, por ejemplo, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 99 % idénticas, a moléculas de ácido nucleico que codifican las secuencias VH y VL de los anticuerpos monoclonales 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, y6G10. También se proporcionan en la presente moléculas de ácido nucleico con sustituciones conservativas (es decir, sustituciones que no alteran la secuencia de aminoácido resultante después de la traducción de la molécula de ácido nucleico), por ejemplo, para optimización del codón.
XI. Producción de anticuerpos
Anticuerpos monoclonales descritos en la presente se pueden producir usando varias técnicas conocidas, tales como la técnica de hibridación celular somática estándar descrita por Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975). Aúnque se prefieren los procedimientos de hibridación celular somática, en principio, también se pueden usar otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales, por ejemplo, transformación viral u oncogénica de célula B y técnica de expresión en fago que usa bibliotecas de genes de anticuerpo humano.
El sistema animal preferido para preparar hibridomas es el sistema murino. La producción de hibridomas en el ratón es un proceso sólidamente establecido. Los protocolos de inmunización y las técnicas para aislar esplenocitos inmunizados con fines de fusión son conocidos en la técnica. Los componentes de fusión (por ejemplo, células de mieloma murinas) y los procedimientos de fusión también son conocidos.
Los anticuerpos quiméricos o humanizados descritos en la presente se pueden preparar en función de la secuencia de un anticuerpo monoclonal murino preparado como se describe anteriormente. El ADN que codifica las inmunoglobulinas de las cadenas pesada y ligera se puede obtener del hibridoma murino de interés y se puede modificar por ingeniería genética para contener secuencias de inmunoglobulina no murina (por ejemplo, humana) usando las técnicas de biología molecular estándares. Por ejemplo, para crear un anticuerpo quimérico, las regiones variables murinas se pueden ligar a regiones constantes humanas usando los métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 4.816.567 de Cabilly et al.). Para crear un anticuerpo humanizado, las regiones CDR murinas se pueden insertar en un marco humano usando los métodos conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 5.225.539 de Winter y las Patentes Estadounidenses Nos. 5.530.101, 5.585.089, 5.693.762 y 6.180.370 de Queen et al.).
En una modalidad, los anticuerpos descritos en la presente son anticuerpos monoclonales humanos. Tales anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra GITR se pueden generar usando ratones transgénicos o transcromosómicos que tienen partes del sistema inmune humano en lugar del sistema de ratón. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen ratones que, en la presente, se denominan ratón HuMAb y ratón KM, respectivamente, y en conjunto, “ratones de Ig humana”.
HuMAb mouse® (Medarex®, Inc.) contiene minilocus del gen de inmunoglobulina humana que codifican secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada (|j y y) y de cadena ligera k humana sin redisposición, junto con mutaciones dirigidas que inactivan el locus de las cadenas j y k endógeno (véase, por ejemplo, Lonberg et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859). En consecuencia, los ratones muestran una expresión reducida de k o IgM de ratón, y en respuesta a la inmunización, los transgenes de las cadenas pesada y ligera humanos introducidos se someten a un cambio de clase y mutación somática para generar monoclonales de IgGk humana con alta afinidad (Lonberg et al. (1994), supra; se hace una reseña en Lonberg, N. (1994) Handbook o f Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, y Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546). La preparación y el uso de ratón HuMAb, y las modificaciones genómicas que tienen tales ratones también se describen en Taylor et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; y Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851. Véanse también las Patentes Estadounidenses Nos. 5.545.806, 5.569.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.789.650, 5.877.397, 5.661.016, 5.814.318, 5.874.299 y 5.770.429, todas de Lonberg y Kay; la Patente Estadounidense No. 5.545.807 de Surani et al.; las Publicaciones de PCT Nos. WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 y WO 99/45962, todas de Lonberg y Kay; y la Publicación de PCT No. WO 01/14424 de Korman et al.
En algunas modalidades, los anticuerpos descritos en la presente se pueden obtener usando un ratón que tiene secuencias de inmunoglobulina humana en transgenes y transcromosomas, tales como un ratón que tiene un transgen de cadena pesada humana y un transcromosoma de cadena ligera humana. Tales ratones, denominados en la presente “ratones KM”, se describen en detalle en la publicación PCT WO 02/43478 de Ishida et al.
Asimismo, los sistemas animales transgénicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana están disponibles en la técnica y se pueden usar para obtener los anticuerpos anti-GITR descritos en la presente. Por ejemplo, se puede usar un sistema transgénico alternativo denominado Xenomouse (Abgenix, Inc.); Tales ratones se describen en, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Nos. 5.939.598, 6.075.181, 6.114.598, 6.150.584 y 6.162.963 de Kucherlapati et al.
Además, los sistemas animales transcromosómicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana están disponibles en la técnica y se pueden usar para obtener los anticuerpos anti-CD73 descritos en la presente. Por ejemplo, se pueden usar ratones que tienen un transcromosoma de cadena pesada humana y un transcromosoma de cadena ligera humana, denominados “ratones TC”; los cuales se describen en Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727. Asimismo, las vacas que tienen transcromosomas de las cadenas pesada y ligera humanas se describieron en la técnica (Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894) y se pueden usar para obtener los anticuerpos anti-CD73 descritos en la presente.
Los sistemas de ratón adicionales descritos en la técnica para obtener anticuerpos humanos, por ejemplo, anticuerpos humanos anti-GITR, incluyen (i) el ratón Veloclmmune® (Regeneron Pharmaceuticals, Inc.), en donde las regiones variables endógenas de las cadenas pesada y ligera del ratón se reemplazaron, mediante recombinación homóloga, con regiones variables de las cadenas pesada y ligera humanas, operativamente ligadas a las regiones constantes endógenas del ratón, de modo que los anticuerpos quiméricos (humano V/ratón C) se obtienen en los ratones y, luego, se convierten en anticuerpos completamente humanos mediante las técnicas de ADN recombinante estándares; y (ii) el ratón MeMo® (Merus Biopharmaceuticals, Inc.), en donde el ratón contiene regiones de cadena pesada variable humana sin redisposición pero una sola región variable de cadena ligera humana común con redisposición. Tales ratones, y su uso para obtener anticuerpos, se describen en, por ejemplo, los documentos WO 2009/15777, US 2010/0069614, WO 2011/072204, WO 2011/097603, WO 2011/163311, WO 2011/163314, WO 2012/148873, US 2012/0070861 y US 2012/0073004.
Los anticuerpos monoclonales humanos descritos en la presente también se pueden preparar usando métodos de expresión en fago para seleccionar bibliotecas de genes de inmunoglobulina humana. Estos métodos de expresión en fago para aislar anticuerpos humanos se establecieron en la técnica. Véanse, por ejemplo: las Patentes Estadounidenses Nos. 5.223.409, 5.403.484 y 5.571.698 de Ladner et al.; las Patentes Estadounidenses Nos.
5.427.908 y 5.580.717 de Dower et al.; las Patentes Estadounidenses Nos. 5.969.108 y 6.172.197 de McCafferty et al.; y las Patentes Estadounidenses Nos. 5.885.793, 6.521.404, 6.544.731, 6.555.313, 6.582.915 y 6.593.081 de Griffiths et al.
Los anticuerpos monoclonales humanos descritos en la presente también se pueden preparar usando ratones SCID en los que se reconstituyeron células inmunes humanas, de manera que se puede generar una respuesta de anticuerpos humanos al momento de la inmunización. Tales ratones se describen en, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Nos. 5.476.996 y 5.698.767 de Wilson et al.
Inmunizaciones
A fin de generar anticuerpos completamente humanos contra GITR, los ratones transgénicos o transcromosómicos que contienen genes de inmunoglobulina humana (por ejemplo, ratones HCo12, HCo7 o KM) se pueden inmunizar con una preparación purificada o enriquecida del antígeno GITR y/o células que expresan GITR o fragmentos del mismo, como se describe para otros antígenos, por ejemplo, en Lonberg et al. (1994) Nature 368(6474): 856859; Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 y WO 98/24884. De manera alternativa, los ratones se pueden inmunizar con ADN que codifica GITR humano o fragmento del mismo. Preferentemente, los ratones tendrán 6-16 semanas de vida luego de la primera infusión. Por ejemplo, una preparación purificada o enriquecida (5-50 |jg) del antígeno GITR recombinante se puede usar para inmunizar los ratones HuMAb por ruta intraperitoneal. Si las inmunizaciones que usan una preparación purificada o enriquecida del antígeno GITR no producen anticuerpos, los ratones también se pueden inmunizar con células que expresan GITR, por ejemplo, una línea celular, para promover las respuestas inmunes. Los ejemplos de líneas celulares incluyen líneas celulares estables CHO y Raji que sobreexpresan GITR.
La experiencia acumulativa con diversos antígenos demostró que los ratones HuMAb transgénicos responden mejor cuando se inmunizan inicialmente por ruta intraperitoneal (IP) o subcutánea (SC) con antígeno en adyuvante de Ribi, seguido por inmunizaciones IP/SC (hasta un total de 10) con antígeno en adyuvante de Ribi cada dos semanas. La respuesta inmune se puede monitorear durante el protocolo de inmunización, en donde se obtienen muestras de plasma mediante extracción de sangre retroorbital. El plasma se puede seleccionar mediante ELISA y FACS (como se describe a continuación), y se pueden usar ratones con tituladores suficientes de inmunoglobulina humana anti-GITR para las fusiones. Los ratones pueden recibir una dosis de refuerzo con antígeno por ruta intravenosa 3 días antes de ser sacrificados y de que se les retire el bazo y los ganglios linfáticos. Se espera que se puedan necesitar realizar 2-3 fusiones para cada inmunización. En general, se inmunizan entre 6 y 24 ratones para cada antígeno. Habitualmente, se usan las cepas HCo7, HCo12 y KM. De manera adicional, el transgen HCo7 y el transgen Hco12 se pueden criar juntos en un solo ratón que tiene dos transgenes de cadena pesada humana diferentes (HCo7/HCo12).
Generación de Hibridomas que Producen Anticuerpos Monoclonales Contra GITR
Para generar hibridomas que produzcan los anticuerpos monoclonales humanos descritos en la presente, se pueden aislar esplenocitos y/o células de nódulos linfáticos de ratones inmunizados, y fusionarlos a una línea celular inmortalizada adecuada, tal como una línea celular de mieloma de ratón. Los hibridomas resultantes se pueden seleccionar para la producción de anticuerpos específicos de antígeno. Por ejemplo, las suspensiones de células simples de células esplénicos de ratones inmunizados se pueden fusionar con células de mieloma de ratón Sp2/0 no segregadoras (ATCC, CRL 1581) con 50 % de PEG. Las células se colocan en placas a aproximadamente 2 x 105 en una placa de microtitulación de fondo plano, y luego se incuban durante dos semanas en medio selectivo que contiene 10 % de suero De Clon fetal, 18 % de medio condicionado “653”, 5 % de origen (IGEN), 4 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sodio, 5mM de HEPES, 0,055 mM de 2-mercaptoetanol, 50 unidades/ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina, 50 mg/ml de gentamicina y 1X HAT (Sigma). Después de aproximadamente dos semanas, las células se pueden cultivar en un medio en el cual HAT se reemplaza por HT. Luego, las cavidades individuales se pueden seleccionar mediante ELISA para anticuerpos monoclonales humanos IgM e IgG. Una vez que ocurre el crecimiento extenso del hibridoma, el medio se puede observar, en general, después de 10-14 días. Los hibridomas que secretan anticuerpos se pueden volver a colocar en placas, se pueden volver a seleccionar y, si todavía expresan IgG humana, los anticuerpos monoclonales se pueden subclonar al menos dos veces limitando la dilución. Los subclones estables luego se pueden cultivar in vitro para generar pequeñas cantidades de anticuerpo en medio de cultivo tisular para la caracterización.
A fin de purificar anticuerpos monoclonales humanos, se pueden cultivar hibridomas seleccionados en matraces de centrifugadoras de dos litros para la purificación de anticuerpos monoclonales. Los sobrenadantes se pueden filtrar y concentrar antes de la cromatografía por afinidad con proteína A-sepharose (Pharmacia, Piscataway, N.J.). La IgG eluida se puede verificar mediante electroforesis en gel y cromatografía de líquidos de alta resolución para garantizar la pureza. La solución amortiguadora se puede intercambiar en PBS, y la concentración se puede determinar mediante OD280 usando un coeficiente de extinción de 1,43. Los anticuerpos monoclonales se pueden dividir en alícuotas y almacenar a -80° C.
Generación de Transfectomas que Producen Anticuerpos Monoclonales Contra GITR
Los anticuerpos se pueden producir en un transfectoma de célula hospedera usando, por ejemplo, una combinación de técnicas de ADN recombinante y métodos de transfección génica conocidos en la técnica (Morrison, S. (1985) Science 229:1202).
Por ejemplo, para expresar anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos de estos, el ADN que codifica cadenas ligeras y pesadas parciales o de longitud completa se puede obtener mediante técnicas de biología molecular estándares (por ejemplo, amplificación por PCR o clonación de cADN mediante el uso de un hibridoma que expresa el anticuerpo de interés), y el ADN se puede insertar en vectores de expresión, de manera que los genes se liguen operativamente a las secuencias de control de transcripción y traducción. En este contexto, la expresión “enlazado operativamente” significa que un gen del anticuerpo se liga en un vector, de manera que las secuencias de control de la transcripción y de la traducción en el vector cumplen su función prevista de regular la transcripción y la traducción del gen del anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de la expresión se eligen de manera que sean compatibles con la célula hospedera de expresión que se usa. El gen de cadena ligera del anticuerpo y el gen de cadena pesada del anticuerpo se pueden insertar en vectores separados, o ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión. Los genes del anticuerpo se insertan en los vectores de expresión mediante métodos estándares (por ejemplo, ligadura de sitios de restricción complementarios en el fragmento y el vector del gen del anticuerpo, o ligadura de extremo roto si no hay ningún sitio de restricción presente). Las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos descritos en la presente se pueden usar para crear genes de anticuerpos de longitud completa de cualquier isotipo de anticuerpo insertándolas en vectores de expresión que ya codifican regiones constantes de cadena pesada y regiones constantes de cadena ligera del isotipo deseado, de manera que el segmento Vh se ligue operativamente al segmento Ch en el vector y el segmento Vl se ligue operativamente al segmento Cl en el vector.
De manera adicional o alternativa, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido de señal que facilita la secreción de cadena de anticuerpos de una célula hospedera. El gen de cadena del anticuerpo se puede clonar en el vector, de manera que el péptido de señal se ligue en el marco al terminal amino del gen de cadena de anticuerpos. El péptido de señal puede ser un péptido de señal de inmunoglobulina o un péptido de señal heterólogo (es decir, un péptido de señal de una proteína que no es inmunoglobulina).
En modalidades a modo de ejemplo, los siguientes péptidos señal a partir de cadenas pesada y ligera de anticuerpo humano pueden ser usados: MEFGLSWVFLVALLRGVQC (SEQ ID NO: 315); MKHLWFFLLLVAAPRWVLS (SEQ ID NO: 321); MEFGLNWVFLVALLRGVQC (SEQ ID NO: 327); MEFGLSWIFLAAILKGVQC (SEQ ID NO: 329); MKHLWFFLLLVAAPRWVLS (SEQ ID NO: 333); MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARC (SEQ ID NO: 323); MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG (SEQ ID NO: 325); MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC (SEQ ID NO: 317); MRVLAQLLGLLLLCFPGARC (SEQ ID NO: 319); y METPAQLLFLLLLWLPDTTG (SEQ ID NO: 331).
Las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos anti-GITR pueden ser expresadas con la secuencia señal respectiva que se liga a cada cadena en el hibridoma a partir del cual fueron clonado. Abajo están las secuencias señal de varios anticuerpos anti-GITR como se presentan en el hibridoma a partir del cual son clonados, en los cuales las secuencias señal pueden ser usadas para expresar el mismo anticuerpo u otro anticuerpo:
Secuencia señal de VH 28F3:
MEFGLSWVFLVALLRGVQC (SEQ ID NO: 315)
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGT(SEQ ID NO: 316)
Secuencia señal de VL 28F3:
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC (SEQ ID NO: 317)
ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGAT (SEQ ID NO: 318)
Secuencia señal de VH 18E10:
MEFGLSWVFLVALLRGVQC (SEQ ID NO: 315)
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGT (SEQ ID NO: 316)
Secuencia señal de VL 18H10:
MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARC (SEQ ID NO: 317)
ATGGACATGAGGGTCCTCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGTTTCCCAGGTGCCAGAT (SEQ ID NO: 318)
Secuencia señal de VH 19D3:
MEFGLSWVFLVALLRGVQC (SEQ ID NO: 315)
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGT(SEQ ID NO: 316)
Secuencia señal de VL 19D3:
MRVLAQLLGLLLLCFPGARC (SEQ ID NO: 319) ATGAGGGTCCTCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGTTTCCCAGGTGCCAGATGT (SEQ ID NO: 320)
Secuencia señal de VH 3C3:
MKHLWFFLLLVAAPRWVLS (SEQ ID NO: 321)
ATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTCCTCCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCC (SEQ ID NO: 322)
Secuencia señal de VL1 3C3:
MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARC (SEQ ID NO: 323) ATGGACATGAGGGTCCTCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGTTTCCCAGGTGCCAGATGT (SEQ ID NO: 324)
Secuencia señal de VL2 3C3:
MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG (SEQ ID NO: 325) ATGGAAGCCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA(SEQ ID NO: 326)
Secuencia señal de VH 8A6:
MEFGLNWVFLVALLRGVQC (SEQ ID NO: 327)
ATGGAGTTTGGGCTGAACTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGT(SEQ ID NO: 328)
Secuencia señal de VL 8A6:
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC (SEQ ID NO: 317) ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGT (SEQ ID NO: 318)
Secuencia señal de VH 9G7:
MEFGLSWIFLAAILKGVQC (SEQ ID NO: 329)
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGATTTTCCTTGCTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGT (SEQ ID NO: 330)
Secuencia señal de VL1 y VL2 9G7:
METPAQLLFLLLLWLPDTTG (SEQ ID NO: 331) ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA(SEQ ID NO: 332)
Secuencia señal de VH 14E3:
MKHLWFFLLLVAAPRWVLS (SEQ ID NO: 333)
ATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTCCTCCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCC (SEQ ID NO: 334)
Secuencia señal de VL 14E3:
MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARC (SEQ ID NO: 323) ATGGACATGAGGGTCCTCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGTTTCCCAGGTGCCAGATGT (SEQ ID NO: 324)
Secuencia señal de VH 19H8:
MEFGLSWVFLVALLRGVQC (SEQ ID NO: 315)
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGT(SEQ ID NO: 316)
Secuencia señal de VL1 19H8:
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC (SEQ ID NO: 317) ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGT (SEQ ID NO: 318)
Secuencia señal de VL2 19H8:
MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG (SEQ ID NO: 325) ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA(SEQ ID NO: 326) 6G10 Secuencia señal de VH:
MEFGLSWVFLVALLRGVQC (SEQ ID NO: 315)
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGT(SEQ ID NO: 316)
6G10 Secuencia señal de VL:
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC (SEQ ID NO: 317) ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGT (SEQ ID NO: 318)
La secuencia señal MRAWIFFLLCLAGRALA (SEQ ID NO: 367) puede ser usada para expresar las cadenas pesada y ligera.
Las cadenas pesada y ligera o porciones de las mismas, tales como aquellas proporcionadas en la Tabla 15, pueden ser ligadas a una secuencia señal proporcionada en la presente, la cadena pesada o región variable de la misma 28F3, por ejemplo, que comprendel SEQ ID NO: 13, 15, 17, o 18 puede ser ligada o fusionada a un péptido señal que comprende o que consiste de MEFGLSWVFLVALLRGVQC (SEQ ID NO: 315) o MRAWIFFLLCLAGRALA (SEQ ID NO: 367). La cadena ligera o región variable de la misma 28F3, por ejemplo, que comprendel SEQ ID NO: 14, 16, o 19 puede ser ligado o fusionado a un péptido señal que comprende o consiste de MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC (SEQ ID NO: 317) o MRAWIFFLLCLAGRALA (SEQ ID NO: 367).
Además de los genes de cadena de anticuerpos, los vectores de expresión recombinantes pueden tener secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de cadena de anticuerpos en una célula hospedera. La expresión “secuencia reguladora” incluye promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o la traducción de los genes de cadena del anticuerpo. Estas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Las personas expertas en la técnica tendrán en cuenta que el diseño del vector de expresión, incluida la selección de secuencias reguladoras, puede depender de factores, tales como la elección de la célula hospedera que se transformará, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Las secuencias reguladoras preferidas para la expresión de células hospederas de mamíferos incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresión proteica en células de mamíferos, tales como promotores y/o potenciadores derivados de citomegalovirus (CMV), virus del simio 40 (SV40), adenovirus, (por ejemplo, el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP)) y polioma. De manera alternativa, se pueden usar secuencias reguladoras no virales, tales como el promotor de ubiquitina o el promotor de p-globina. Asimismo, se pueden usar elementos reguladores compuestos por secuencias de diferentes fuentes, tal como el sistema promotor SRa, que contiene secuencias del promotor temprano de SV40 y la repetición del terminal largo del virus de la leucemia humana de células T tipo 1 (Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472).
Además de los genes de cadena de anticuerpos y de las secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinantes pueden tener secuencias adicionales, tales como las secuencias que regulan la replicación del vector en las células hospederas (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de células hospederas en las que se introdujo el vector (véanse, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Nos. 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017, todas de Axel et al.). Por ejemplo, en general, el gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula hospedera en la que se introdujo el vector. Los genes marcadores seleccionables preferidos incluyen el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) (para usar en células hospederas dhfr con amplificación/selección de metotrexato) y el gen neo (para la selección de G418).
Para la expresión de las cadenas ligera y pesada, los vectores de expresión que codifican las cadenas ligera y pesada se transfectan en una célula hospedera mediante técnicas estándares. Las diversas formas del término “transfección” abarcan una amplia variedad de técnicas que se usan con frecuencia para la introducción de ADN exógeno en una célula hospedera procariota o eucariota, por ejemplo, electroporación, precipitación de fosfato de calcio, transfección de DEAE-dextrano y similares. Si bien es posible, en teoría, expresar los anticuerpos descritos en la presente en células hospederas procariotas o eucariotas, la expresión de los anticuerpos en las células eucariotas y, con mayor preferencia, en las células hospederas de mamíferos, es de máxima preferencia porque las células eucariotas y, en particular, células de mamíferos son más susceptibles de agruparse y segregar un anticuerpo activo desde el punto de vista inmunológico y plegado adecuadamente, que las células procariotas. Se informó que la expresión procariótica de genes de anticuerpos es inefectiva para producir altos rendimientos de anticuerpo activo (Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13).
Las células hospederas de mamíferos que se prefieren para expresar los anticuerpos recombinantes descritos en la presente incluyen las de ovario de hámster chino (células CHO, por sus siglas en inglés) (que incluyen células CHO dhfr-, descritas en Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, que se usan con un marcador seleccionable DHFR, por ejemplo, como se describe en R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), células de mieloma NSO, células COS y células SP2. En particular, para usar con las células de mieloma NSO, otro sistema de expresión preferido es el sistema de expresión del gen GS descrito en WO 87/04462, WO 89/01036 y EP 338.841. Cuando los vectores de expresión recombinante que codifican genes de anticuerpos se introducen en células hospederas de mamíferos, los anticuerpos se producen cultivando las células hospederas durante un período suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células hospederas o, con mayor preferencia, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo donde se desarrollan las células hospederas. Los anticuerpos se pueden recuperar del medio de cultivo usando métodos estándares de purificación de proteínas.
XII. Ensayos
Los anticuerpos descritos en la presente se pueden analizar para evaluar la unión a GITR mediante, por ejemplo, ELISA estándar. En síntesis, las placas de microtitulación se recubrieron con GITR purificada a 1-2 pg/ml en PBS, y luego se bloquearon con 5 % de albúmina de suero bovino en PBS. Las diluciones de anticuerpo (por ejemplo, diluciones de plasma de ratones inmunizados con GITR) se agregaron a cada cavidad y se incubaron durante 1-2 horas a 37 oC. Las placas se lavaron con PBS/Tween y luego se incubaron con reactivo secundario (por ejemplo, para anticuerpos humanos, un reactivo policlonal específico de Fc de IgG antihumana de cabra) conjugado con peroxidasa de rábano (HRP) durante 1 hora a 37 oC. Luego del lavado, las placas se desarrollaron con sustrato ABTS (Moss Inc, producto: ABTS-1000) y se analizaron mediante un espectrofotómetro a OD 415-495. El suero de ratones inmunizados luego se volvió a seleccionar mediante citometría de flujo para unirse a una línea celular que expresa GITR humana, pero no a una línea celular de control que no expresa GITR. En resumen, la unión de anticuerpos anti-GITR se evaluó incubando GITR que expresa células GITR con el anticuerpo anti-GITR a 1:20 de dilución. Las células se lavaron, y se detectó la unión con IgG Ab antihumana etiquetada con PE. Los análisis citométricos de flujo se realizaron usando citrometría de flujo FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA). Preferentemente, los ratones que desarrollen las titulaciones más altas se usarán para fusiones.
Se puede usar un ensayo ELISA como se describió anteriormente para seleccionar anticuerpos y, por lo tanto, hibridomas que producen anticuerpos que muestran reactividad positiva con el inmunógeno GITR. Los hibridomas que producen anticuerpos que se fijan, preferentemente con afinidad alta, a GITR luego se pueden subclonar y volver a caracterizar. Un clon de cada hibridoma, que retiene la reactividad de las células de origen (mediante ELISA), luego se puede elegir para fabricar un banco de células, y para la purificación de anticuerpos.
A fin de purificar anticuerpos anti-GITR, se pueden cultivar hibridomas seleccionados en matraces de centrifugadoras de dos litros para la purificación de anticuerpos monoclonales. Los sobrenadantes se pueden filtrar y concentrar antes de la cromatografía por afinidad con proteína A-sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ). La IgG eluida se puede verificar mediante electroforesis en gel y cromatografía de líquidos de alta resolución para garantizar la pureza. La solución amortiguadora se puede intercambiar en PBS, y la concentración se puede determinar mediante OD280 usando un coeficiente de extinción de 1,43. Los anticuerpos monoclonales se pueden dividir en alícuotas y almacenar a -80 °C.
A fin de determinar si los anticuerpos monoclonales anti-GITR seleccionados se unen a epítopos únicos, cada anticuerpo se puede biotinilar usando reactivos disponibles en el comercio (Pierce, Rockford, IL). La unión a MAb biotinilado se puede detectar con una sonda etiquetada con estreptavidina. Los estudios de competencia que usan anticuerpos monoclonales no etiquetados y anticuerpos monoclonales biotinilados se pueden realizar usando placas ELISA recubiertas con GITR, como se describió anteriormente.
A fin de determinar el isotipo de anticuerpos purificados, ELISA de isotipo se puede realizar usando reactivos específicos para anticuerpos de un isotipo particular. Por ejemplo, para determinar el isotipo de un anticuerpo monoclonal humano, las cavidades de las placas de microtitulación se pueden recubrir con 1 pg/ml de inmunoglobulina antihumana durante la noche a 4° C. Después de bloquearse con 1 % de BSA, las placas se hacen reaccionar con 1 pg /ml o menos de anticuerpos monoclonales de prueba o controles de isotipo purificado, a temperatura ambiente durante una o dos horas. Las cavidades luego se pueden hacer reaccionar con sondas conjugadas con fosfatasa alcalina específicas de IgG1 humana o IgM humana. Las placas se desarrollaron y se analizaron como se describió anteriormente.
A fin de evaluar la unión de anticuerpos monoclonales a células vivas que expresan GITR, se puede usar citometría de flujo, como se describió en los ejemplos. En resumen, las líneas celulares que expresan GITR unida a la membrana (cultivada en condiciones de cultivo estándares) se mezclan con diversas concentraciones de anticuerpos monoclonales en PBS que contiene 0,1 % de BSA a 4 °C durante 1 hora. Luego del lavado, las células se hacen reaccionar con anticuerpo anti-IgG etiquetado con fluoresceína en las mismas condiciones que la tinción con anticuerpo primario. Las muestras se pueden analizar mediante el instrumento FACScan usando luz y propiedades de dispersión lateral para regular células simples, y así se determina la unión de los anticuerpos etiquetados. Se puede usar un ensayo alternativo que usa microscopía de fluorescencia, además del ensayo de citometría de flujo, o en lugar de este. Las células se pueden teñir exactamente como se describió anteriormente y se pueden examinar mediante microscopía de fluorescencia. Este método permite la visualización de células individuales, pero puede tener una sensibilidad disminuida en función de la densidad del antígeno.
Los anticuerpos anti-GITR se pueden volver a evaluar para determinar la reactividad con el antígeno GITR mediante Western blot. En resumen, se pueden preparar extractos celulares de células que expresan GITR y estos se pueden someter a electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio. Después de la electroforesis, los antígenos separados se transfieren a membranas de nitrocelulosa, se bloquean con 20 % de suero de ratón y se sondean con los anticuerpos monoclonales que se desean evaluar. La unión a IgG se puede detectar usando fosfatasa alcalina anti-IgG y se puede desarrollar con comprimidos de sustrato de BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO).
Los métodos para analizar la afinidad de unión, la reactividad cruzada y la cinética de unión de diversos anticuerpos anti-GITR incluyen ensayos estándares conocidos en la técnica, por ejemplo, análisis de resonancia de plasmón de superficie Biacore™ (SPR) usando un instrumento Biacore™ 2000 SPR (Biacore AB, Uppsala, Sweden).
En una modalidad, un anticuerpo se une específicamente a la región extracelular de GITR humano. Un anticuerpo puede unirse específicamente a un dominio particular (por ejemplo, un dominio funcional) dentro del dominio extracelular de GITR. En una modalidad particular, el anticuerpo se une específicamente al sitio GITR en el cual se une GITR-L. En ciertas modalidades, el anticuerpo se une específicamente a la región extracelular de GITR humano y la región extracelular de GITR cinomólogo. Preferiblemente, un anticuerpo se une a GITR humano con alta afinidad.
XNI. Inmunoconjugados, Derivados de Anticuerpo y Diagnósticos
Los anticuerpos descritos en la presente se pueden usar con fines de diagnóstico, lo que incluye la evaluación de muestras y el diagnóstico de imágenes in vivo, y para este propósito, el anticuerpo (o el fragmento de unión de este) se puede conjugar con un agente detectable adecuado para formar un inmunoconjugado. Con fines de diagnóstico, los agentes adecuados son etiquetas detectables que incluyen radioisótopos para el diagnóstico de imágenes de cuerpo entero y radioisótopos, enzimas, etiquetas fluorescentes y otras etiquetas de anticuerpo adecuadas para la evaluación de muestras.
Las etiquetas detectables pueden ser cualquiera de los diversos tipos usados actualmente en el campo de los diagnósticos in vitro, lo que incluye etiquetas particuladas, por ejemplo, soles metálicos, tales como oro coloidal, isótopos, tales como I125 o Tc99, presentados, por ejemplo, con un agente quelante peptídico de tipo N2S2, N3S o N4 , cromóforos, que incluyen marcadores fluorescentes, marcadores luminiscentes, marcadores fosforescentes y similares, así como etiquetas de enzimas que convierten un sustrato determinado en un marcador detectable, y etiquetas de polinucleótidos que son reveladas luego de la amplificación mediante, por ejemplo, reacción en cadena de polimerasa. Las etiquetas de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina y similares. Por ejemplo, la etiqueta puede ser la enzima fosfatasa alcalina, detectada mediante la medición de la presencia o la formación de quimioluminiscencia luego de la conversión de sustratos de 1,2 dioxetano, tales como adamantil metoxi fosforiloxi fenil dioxetano (AMPPD), 3-(4-(metoxispiro{1,2-dioxetan-3,2'-(5'-cloro)triciclo{3.3.1.13,7}decan}-4-il)fenilfosfato de disodio (CSPD), así como CDP y CDP-star® u otros sustratos luminiscentes conocidos por las personas expertas en la técnica, por ejemplo, los quelatos de lantánidos adecuados, tales como terbio(III) y europio(III). Los medios de detección se determinan mediante la etiqueta elegida. La aparición de la etiqueta o de sus productos de reacción se puede lograr a simple vista, cuando la etiqueta es particulada y se acumula en niveles adecuados, o se puede lograr usando instrumentos, tales como un espectrofotómetro, un luminómetro, un fluorímetro y similares, todos de conformidad con la práctica estándar.
Preferentemente, los métodos de conjugación dan como resultado enlaces que son sustancialmente (o casi) no inmunógenos, por ejemplo, enlaces de péptido (es decir, amida), sulfuro, (impedido estéricamente), disulfuro, hidrazona y éter. Estos enlaces son casi no inmunógenos y muestran una estabilidad razonable en suero (véase, por ejemplo Senter, P. D., Curr. Opin. Chem. Biol. 13 (2009) 235-244; WO 2009/059278; WO 95/17886).
En función de la natura bioquímica de la porción y el anticuerpo, se pueden usar diferentes estrategias de conjugación. En caso de que la porción sea una que se origina naturalmente o recombinante de entre 50 y 500 aminoácidos, existen procedimientos estándares en libros de texto que describen la química para la síntesis de conjugados de proteínas, que la persona experta en la técnica puede seguir fácilmente (véase, por ejemplo, Hackenberger, C. P. R. y Schwarzer, D., Angew. Chem. ed. int. Engl. 47 (2008) 10030-10074). En una modalidad, se usa la reacción de una porción de maleinimido con un residuo de cisteína en el anticuerpo o la porción. Esta es una química de acoplamiento especialmente adecuada en caso de que se use, por ejemplo, un fragmento Fab o Fab' de un anticuerpo. De manera alternativa, en una modalidad, se realiza el acoplamiento al extremo de C-terminal del anticuerpo o de la porción. La modificación de C-terminal de una proteína, por ejemplo, de un fragmento Fab, se puede realizar como se describe en (Sunbul, M. and Yin, J., Org. Biomol. Chem. 7 (2009) 3361-3371).
En general, la reacción específica de sitio y el acoplamiento covalente se basan en transformar un aminoácido natural en un aminoácido con una reactividad que es ortogonal a la reactividad de otros grupos funcionales presentes. Por ejemplo, una cisteína especifica en un contexto de secuencias raras se puede convertir de manera enzimática en un aldehído (véase Frese, M. A. and Dierks, T., ChemBioChem. 10 (2009) 425-427). Es posible también obtener una modificación de aminoácidos deseada mediante la utilización de la reactividad enzimática específica de determinadas enzimas con un aminoácido natural en un contexto de secuencias determinado (véanse, por ejemplo, Taki, M. et al., Prot. Eng. Des. Sel. 17 (2004) 119-126; Gautier, A. et al. Chem. Biol. 15 (2008) 128-136. La formación catalizada con proteasa de enlaces C--N se describe en Bordusa, F., Highlights in Bioorganic Chemistry (2004) 389-403.
La reacción específica de sitio y el acoplamiento covalente se pueden lograr también mediante la reacción selectiva de aminoácidos terminales con reactivos de modificación adecuados.
La reactividad de una cisteína de N-terminal con benzonitrilos (véase Ren, H. et al., Angew. Chem. ed. int. Engl. 48 (2009) 9658-9662) se puede usar para lograr un acoplamiento covalente específico de sitio.
La ligadura química nativa también puede depender de los residuos de cisteína de C-terminal (Taylor, E. Vogel; Imperiali, B, Nucleic Acids and Molecular Biology (2009), 22 (Protein Engineering), 65-96).
El documento EP 1074 563 describe un método de conjugación que se basa en una reacción más rápida de una cisteína con una porción de aminoácidos cargados negativamente con una cisteína ubicada en una porción de aminoácidos cargados positivamente.
La porción puede ser también un péptido de síntesis o un imitador de péptido. En caso de que un polipéptido se sintetice químicamente, los aminoácidos con reactividad química ortogonal se pueden incorporar durante la síntesis (véase, por ejemplo, de Graaf, A. J. et al., Bioconjug. Chem. 20 (2009) 1281-1295). Dado que una gran variedad de grupos funcionales ortogonales están en juego y se pueden introducir en un péptido de síntesis, la conjugación de dicho péptido a un enlazador es química estándar.
A fin de obtener un polipéptido monoetiquetado, el conjugado con estequiometría 1:1 se puede separar mediante cromatografía de otros productos derivados de conjugación. Este procedimiento se puede facilitar usando un miembro del par de unión etiquetado con tintura y un enlazador cargado. Mediante el uso de este tipo de miembro del par de unión etiquetado y cargado muy negativamente, los polipéptidos monoconjugados se separan con facilidad de los polipéptidos no etiquetados y de los polipéptidos que tienen más de un enlazador, dado que la diferencia en carga y peso molecular se puede usar para la separación. La tintura fluorescente puede ser útil para purificar el complejo de componentes no unidos, tal como un aglutinante monovalente etiquetado.
En una modalidad, la porción unida a un anticuerpo anti-GITR se selecciona del grupo que consiste en una porción de unión, una porción de etiquetado y una porción biológicamente activa.
Los anticuerpos descritos en la presente también se pueden conjugar con un agente terapéutico para formar un inmunoconjugado, tal como un conjugado de anticuerpo-fármaco (a Dc ). Los agentes terapéuticos adecuados incluyen antimetabolitos, agentes alquilantes, aglutinantes de ranura menor de ADN, intercalantes de ADN, reticuladores de ADN, inhibidores de histona desacetilasa, inhibidores de la exportación nuclear, inhibidores del proteasoma, inhibidores de topoisomerasa I o II, inhibidores de la proteína de choque térmico, inhibidores de tirosina cinasa, antibióticos y agentes antimitóticos. En el ADC, el anticuerpo y el agente terapéutico se conjugan preferentemente mediante un enlazador desdoblado, tal como un enlazador de peptidilo, disulfuro o hidrazona. Con mayor preferencia, el enlazador es un enlazador de peptidilo, tal como Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Pro-Val-Gly-Val-Val (SEQ ID NO: 219), Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Cit-Cit, Val-Lys, Lys, Cit, Ser o Glu. Los ADC se pueden preparar como se describe en las Patentes Estadounidenses Nos. 7.087.600, 6.989.452 y 7.129.261; las publicaciones PCT WO 02/096910, WO 07/038658, WO 07/051081, WO 07/059404, WO 08/083312 y WO 08/103693; las publicaciones de patentes estadounidenses 20060024317, 20060004081 y 20060247295.
Los anticuerpos anti-GITR, por ejemplo, aquellos descritos en la presente, también pueden ser usados para detectar GITR, tal como GITR humano, por ejemplo, GITR humano en tejidos o muestras de tejido. Los anticuerpos pueden ser usados, por ejemplo, en un ensayo ELISA o en citometría de flujo. En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-GITR es puesto en contacto con células, por ejemplo, células en un tejido, por un tiempo apropiado para que ocurra la unión específica, y después se agrega un reactivo, por ejemplo, un anticuerpo que detecta el anticuerpo anti-GITR. Se proporcionan ensayos a modo de ejemplo en los Ejemplos. El anticuerpo anti-GITR puede ser un anticuerpo completamente humano, o puede ser un anticuerpo quimérico, tal como un anticuerpo que tiene regiones variables humanas y regiones constantes murinas o una porción de las mismas. Métodos a modo de ejemplo para detectar GITR, por ejemplo, GITR humano, en una muestra (muestra de célula o tejido) comprenden (i) poner en contacto una muestra con un anticuerpo anti-GITR, por un tiempo suficiente para permitir la unión específica del anticuerpo anti-GITR a GITR en la muestra, y (2) poner en contacto la muestra con un reactivo de detección, por ejemplo, un anticuerpo, que se une específicamente al anticuerpo anti-GITR, tal como a la región Fc del anticuerpo anti-GITR, para de este modo detectar el GITR unido por el anticuerpo anti-GITR. Las etapas de lavado pueden ser incluidas después de la incubación con el anticuerpo y/o reactivo de detección. Los anticuerpos anti-GITR para uso en estos métodos no tienen que ser ligados a una etiqueta o agentes de detección, ya que un agente de detección separado puede ser usado.
Otros usos para los anticuerpos anti-GITR, por ejemplo, como monoterapia o terapia de combinación, son proporcionados en otra parte en la presente, por ejemplo, en la sección que pertenece a tratamientos de combinación.
XIV. Moléculas Biespecíficas
Los anticuerpos descritos en la presente se pueden usar para formar moléculas biespecíficas. Un anticuerpo anti-GITR, o porciones de unión al antígeno, se pueden derivatizar o ligar a otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína (por ejemplo, otro anticuerpo o ligando para un receptor) a fin de generar una molécula biespecífica que se una, al menos, a dos sitios de unión o moléculas objetivo diferentes. Por ejemplo, un anticuerpo anti-GITR puede ser ligado a un anticuerpo o scFv que se une específicamente a cualquier proteína que puede ser usada como objetivos potenciales para tratamientos de combinación, tales como las proteínas descritas en la presente (por ejemplo, anticuerpos a PD-1, PD-L1 o LAG-3). De hecho, el anticuerpo descrito en la presente se puede derivatizar o ligar a más de una molécula funcional para generar moléculas multiespecíficas que se unen a más de dos sitios de unión diferentes y/o moléculas objetivo; como se usa en la presente, la expresión “molécula biespecífica” también pretende abarcar tales moléculas biespecíficas. Para crear una molécula biespecífica descrita en la presente, se puede ligar funcionalmente un anticuerpo descrito en la presente (por ejemplo, por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más moléculas de unión, tales como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, péptido o mimético de unión, a fin de obtener una molécula biespecífica.
En consecuencia, en la presente se proporcionan moléculas biespecíficas que comprenden al menos una primera especificidad de unión para GITR y una segunda especificidad de unión para un segundo epítopo objetivo. En una modalidad descrita en la presente, en donde la molécula biespecífica es multiespecífica, la molécula puede también incluir una tercera especificidad de unión.
En una modalidad, las moléculas biespecíficas descritas en la presente comprenden, como una especificidad de unión, al menos un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo de este, que incluye, por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2 , Fv o Fv (scFv) de cadena única. El anticuerpo también puede ser un dímero de la cadena ligera o la cadena pesada, o cualquier fragmento mínimo de este, tal como Fv o un constructo de cadena única como se describe en Ladner et al. Patente Estadounidense No. 4.946.778.
Si bien se prefieren los anticuerpos monoclonales humanos, otros anticuerpos lo cuales se pueden usar en las moléculas biespecíficas descritas en la presente son anticuerpos monoclonales humanizados, quiméricos y murinos.
Las moléculas biespecíficas descritas en la presente se pueden preparar conjugando las especificidades de unión constitutivas usando métodos conocidos en el estado de la técnica. Por ejemplo, cada especificidad de unión de la molécula biespecífica se puede generar por separado y luego conjugarse una con otra. Cuando las especificidades de unión son proteínas o péptidos, se pueden usar varios agentes de acoplamiento o reticulación para la conjugación covalente. Los ejemplos de agentes de reticulación incluyen proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetiltioacetato (SATA), 5,5'-ditio-bis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNb ), o-fenilendimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) y 4-(N-maleimidometil) ciclohexan-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC) (véase, por ejemplo, Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.
82:8648). Otros métodos incluyen los que se describen en Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83) y Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375). Los agentes de conjugación preferidos son SATA y sulfo-SMCC, ambos disponibles de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).
Cuando las especificidades de unión son anticuerpos, se pueden conjugar a través de un enlace de sulfhidrilo de las regiones bisagra del C-terminal de las dos cadenas pesadas. En una modalidad de particular preferencia, la región bisagra se modifica para contener un número impar de residuos de sulfhidrilo, preferentemente, uno, antes de la conjugación.
De manera alternativa, ambas especificidades de unión pueden codificarse en el mismo vector y expresarse y ensamblarse en la misma célula hospedera. Este método es particularmente útil cuando la molécula biespecífica es una proteína de fusión mAb x mAb, mAb x Fab, mAb x (scFv) 2, Fab x F(ab')2 o ligando x Fab. Un anticuerpo biespecífico puede comprender un anticuerpo que comprende un scFv en el C-terminal de cada cadena pesada. Una molécula biespecífica descrita en la presente puede ser una molécula de cadena única que comprende un anticuerpo de cadena única y un determinante de unión, o una molécula biespecífica de cadena única que comprende dos determinantes de unión. Las moléculas biespecíficas pueden comprender al menos dos moléculas de cadena únicas. Los métodos para preparar moléculas biespecíficas se describen, por ejemplo, en la Patente Estadounidense No.
5.260.203; Patente Estadounidense No. 5.455.030; Patente Estadounidense No. 4.881.175; Patente Estadounidense No. 5.132.405; Patente Estadounidense No. 5.091.513; Patente Estadounidense No. 5.476.786; Patente Estadounidense No. 5.013.653; Patente Estadounidense No. 5.258.498; y Patente Estadounidense No. 5.482.858.
La unión de las moléculas biespecíficas a sus objetivos específicas se puede confirmar usando métodos reconocidos en el estado de la técnica, tales como ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), análisis FACS, bioensayos (por ejemplo, inhibición del crecimiento) o ensayo de Western blot. En general, cada uno de los mismos ensayos detecta la presencia de complejos proteína-anticuerpo de particular interés al usar un reactivo etiquetado (por ejemplo, un anticuerpo) específico para el complejo de interés.
XVI. Composiciones
Además, se proporcionan composiciones, por ejemplo, composiciones farmacéuticas, que contienen un anticuerpo anti-GITR o una combinación de anticuerpos, o combinación con otros anticuerpos a otros objetivos, o porciones de los mismos de unión al antígeno, descritas en la presente, formuladas junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones pueden incluir un anticuerpo o inmunoconjugados o moléculas biespecíficas descritos en la presente, o una combinación de estos (por ejemplo, dos o más diferentes). Por ejemplo, una composición farmacéutica descrita en la presente puede comprender una combinación de anticuerpos (o inmunoconjugados o moléculas biespecíficas) que se unen a diferentes epítopos en el antígeno objetivo o que tienen actividades complementarias.
En algunas modalidades, una composición comprende un anticuerpo anti-GITR a una concentración de al menos 1 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 50 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 1-300 mg/ml o 100-300 mg/ml.
Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente también se pueden administrar en un tratamiento conjunto, es decir, combinadas con otros agentes. Por ejemplo, el tratamiento conjunto puede incluir un anticuerpo anti-GITR descrito en la presente combinado con al menos un agente antineoplásico y/o estimulador (por ejemplo, activador) de células T diferente. Los ejemplos de agentes terapéuticos que se pueden usar en el tratamiento conjunto se describen con mayor detalle más adelante en la sección de usos de los anticuerpos descritos en la presente.
En algunas modalidades, las composiciones terapéuticas descritas en la presente pueden incluir otros compuestos, fármacos y/o agentes usados para el tratamiento contra el cáncer. Los compuestos, fármacos y/o agentes pueden incluir, por ejemplo, fármacos de quimioterapia, fármacos de moléculas pequeñas o anticuerpos que estimulan la respuesta inmune a un tipo de cáncer determinado. En algunos casos, las composiciones terapéuticas pueden incluir, por ejemplo, uno o más de un anticuerpo anti-CTLA-4, un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PDL-1, un anticuerpo anti-OX40 (también conocido como CD134, TNFRSF4, ACt 35 y/o TXGP1L), un anticuerpo anti-CD137, o un anticuerpo anti-LAG-3.
Como se usa en la presente, un “vehículo farmacéuticamente aceptable” incluye todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes retardadores de la absorción e isotónicos, y similares que son fisiológicamente compatibles. Preferentemente, el vehículo es adecuado para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo, por inyección o infusión). En función de la ruta de administración, el compuesto activo, es decir, un anticuerpo, un inmunoconjugado o una molécula biespecífica, se puede recubrir con un material para proteger el compuesto de la acción de ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto.
Los compuestos farmacéuticos descritos en la presente pueden incluir una o más sales farmacéuticamente aceptables. Una “sal farmacéuticamente aceptable” se refiere a una sal que retiene la actividad biológica deseada del compuesto de origen y no produce ningún efecto toxicológico no deseado (véase, por ejemplo, Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Los ejemplos de estas sales incluyen sales de adición ácida y sales de adición básica. Las sales de adición ácida incluyen aquellas derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como ácido clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fosforoso y similares, y también de ácidos orgánicos no tóxicos, tales como ácidos monocarboxílicos y dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanoicos sustituidos con fenilo, ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos aromáticos y alifáticos, y similares. Las sales de adición básica incluyen aquellas derivadas de metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, y de aminas orgánicas no tóxicas, tales como N,N-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaína y similares.
Una composición farmacéutica descrita en la presente también puede incluir un antioxidante farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptable incluyen: (1) antioxidantes hidrosolubles, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y similares; y (3) agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiamintetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares.
Los ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos adecuados que se pueden usar en las composiciones farmacéuticas descritas en la presente incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) y mezclas adecuadas de estos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. La correcta fluidez se puede mantener, por ejemplo, usando materiales de recubrimiento, tales como lecitina, manteniendo el tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y usando tensioactivos.
Estas composiciones también pueden contener adyuvantes, tales como conservantes, agentes humectantes, emulgentes y dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos se puede garantizar mediante procedimientos de esterilización, como se indicó anteriormente, y mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio y similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable se puede lograr mediante la inclusión de agentes que demoran la absorción, tales como monoestearato de aluminio y gelatina.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce en la técnica. Excepto en el caso de que un medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones farmacéuticas descritas en la presente. Una composición farmacéutica puede comprender un preservativo puede ser desprovista de un preservativo. Compuestos activos complementarios pueden ser incorporados en las composiciones.
Normalmente, las composiciones terapéuticas deben ser estériles y estables en las condiciones de manufactura y almacenamiento. La composición se puede formular como una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para obtener una concentración farmacológica alta. El vehículo puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de estos. La correcta fluidez se puede mantener, por ejemplo, usando un recubrimiento, tal como lecitina, manteniendo el tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y usando tensioactivos. En muchos casos, puede ser preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes, tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede obtener incluyendo en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar mediante la incorporación del compuesto activo en la cantidad necesaria en un solvente adecuado con uno de los ingredientes mencionados anteriormente o una combinación de estos, según sea necesario, seguido de la microfiltración para su esterilización. En general, las dispersiones se prepararon mediante la incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básica y los otros ingredientes requeridos que se enumeraron en la presente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secados al vacío y liofilización que producen un polvo del ingrediente activo, más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución previamente esterilizada por filtración del mismo.
La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con un material vehículo para producir una forma de dosis única variará según el sujeto que se trate y el modo de administración particular. La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con un material vehículo para producir una forma de dosis única será, generalmente, la cantidad de composición que produzca un efecto terapéutico. En general, del 100 %, esta cantidad variará de aproximadamente del 0,01 % a aproximadamente el 99 % de ingrediente activo, preferentemente, de aproximadamente 0,1 % a aproximadamente el 70 %, con máxima preferencia, de aproximadamente del 1 % a aproximadamente el 30 % del ingrediente activo, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Los regímenes de dosificación se ajustan para brindar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar un solo bolo, se pueden administrar varias dosis divididas con el tiempo, o la dosis se puede reducir o aumentar proporcionalmente, según indiquen las exigencias de la situación terapéutica. En especial, resulta ventajoso formular composiciones parenterales en forma de dosis unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. Como se usa en la presente, la forma de dosis unitaria se refiere a unidades físicamente diferenciadas útiles como dosis unitarias para los sujetos que se tratan; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo, calculada para producir el efecto terapéutico deseado junto con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación de las formas de dosis unitarias descritas en la presente depende directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que se desea obtener, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de obtener dicho compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos.
Para la administración del anticuerpo, las dosis varían de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg y, con mayor frecuencia, de 0,01 a 5 o 10 mg/kg del peso corporal del hospedero. Por ejemplo, las dosis pueden ser de 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 1-10 mg/kg. Un régimen de tratamiento de ejemplo implica la administración una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez por mes, una vez cada tres meses o una vez cada tres a seis meses. Los regímenes de dosificación preferidos para un anticuerpo anti-GITR descrito en la presente incluyen 1 mg/kg de peso corporal o 3 mg/kg de peso corporal mediante administración intravenosa, con el anticuerpo siendo proporcionado usando uno de los siguientes esquemas de dosificación: (i) cada cuatro semanas por seis dosificaciones, después cada tres meses; (ii) cada tres semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal una vez seguido por 1 mg/kg de peso corporal cada tres semanas.
Un anticuerpo anti-GITR puede ser administrado a una dosis plana (régimen de dosis plana).
En algunos métodos, se administran simultáneamente dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de unión, en cuyo caso, la dosificación de cada anticuerpo administrado se encuentra dentro de los intervalos indicados. Por lo general, el anticuerpo se administra en numerosas ocasiones. Los intervalos entre dosis únicas pueden ser, por ejemplo, semanales, mensuales, trimestrales o anuales. Los intervalos también pueden ser irregulares, según se indique mediante la medición de los niveles en sangre del anticuerpo dirigido al antígeno diana en el paciente. En algunos métodos, la dosis se ajusta para alcanzar una concentración plasmática del anticuerpo de aproximadamente 1-1000 pg/ml y, en algunos métodos, aproximadamente 25-300 pg/ml.
Un anticuerpo anti-GITR puede ser administrado con otro anticuerpo en el régimen de dosificación del otro anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo anti-GITR puede ser administrado con un anticuerpo anti-PD-1, tal como nivolumab (OPDIVO), cada dos semanas como infusión i.v. durante 60 minutos hasta que ocurre el progreso de la enfermedad o toxicidad inaceptable. Un anticuerpo anti-GITR puede ser administrado con pembrolizumab (KEYTRUDA) cada 3 semanas como una infusión i.v. durante 30 minutos hasta que ocurre el progreso de la enfermedad o toxicidad inaceptable.
Un anticuerpo se puede administrar como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso es necesaria una administración menos frecuente. La dosificación y la frecuencia varían en función de la semivida del anticuerpo en el paciente. Por lo general, los anticuerpos humanos muestran la semivida más prolongada, seguido por anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos y anticuerpos no humanos. La dosificación y la frecuencia de administración pueden variar en función de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En el caso de aplicaciones profilácticas, se administra una dosis relativamente baja a intervalos relativamente poco frecuente durante un período prolongado. Algunos pacientes reciben el tratamiento de por vida. En el caso de aplicaciones terapéuticas, en ocasiones, es necesaria una dosis relativamente alta a intervalos relativamente cortos hasta que se reduzca o se concluya la progresión de la enfermedad y, preferentemente, hasta que el paciente muestre una mejora parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. A partir de ahí, el paciente puede recibir un régimen profiláctico.
Los niveles de dosis reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas descritas en la presente pueden variar, a fin de obtener una cantidad de ingrediente activo que sea efectiva para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, una composición y un modo de administración particulares sin que sea tóxico para el paciente. El nivel de dosis seleccionado dependerá de varios factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares descritas en la presente que se usan, o del éster, la sal o la amida del mismo, la ruta de administración, el tiempo de administración, la velocidad de excreción del compuesto particular que se use, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones particulares que se usen, la edad, el sexo, el peso, la afección, la salud en general y los antecedentes médicos del paciente que está en tratamiento y factores similares conocidos en el campo de la medicina.
Una “dosis terapéuticamente efectiva” de un anticuerpo anti-GITR descrito en la presente da como resultado, preferentemente, una disminución de la gravedad de los síntomas de la enfermedad, un aumento de la frecuencia y duración de los períodos sin síntomas de la enfermedad, o la prevención de disfunciones o incapacidades causadas por la enfermedad. En el contexto del cáncer, una dosis terapéuticamente efectiva preferiblemente da como resultado un incremento en supervivencia, y/o prevención del deterioro mayor de síntomas físicos asociados con el cáncer. Los síntomas del cáncer son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, características poco comunes en lunares, cambios en la apariencia de lunares, lo que incluye asimetría, borde, color y/o diámetro, áreas de la piel recientemente pigmentadas, lunares anormales, áreas oscuras debajo de las uñas, bultos en las mamas, cambios en los pezones, quistes en las mamas, dolor de mamas, muerte, pérdida de peso, debilidad, fatiga excesiva, dificultad para comer, pérdida de apetito, tos crónica, empeoramiento de la disnea, tos con sangre, sangre en la orina, sangre en heces, náuseas, vómitos, metástasis hepática, metástasis pulmonar, metástasis ósea, plenitud abdominal, meteorismo, líquidos en la cavidad peritoneal, hemorragia vaginal, constipación, distensión abdominal, perforación de colon, peritonitis aguda (infección, fiebre, dolor), dolor, vómitos con sangre, transpiración excesiva, fiebre, hipertensión arterial, anemia, diarrea, ictericia, mareos, escalofríos, espasmos musculares, metástasis en el colon, metástasis pulmonar, metástasis en la vejiga, metástasis hepática, metástasis ósea, metástasis renal y metástasis pancreática, dificultad para tragar y similares.
Una dosis terapéuticamente efectiva puede prevenir o retrasar la aparición del cáncer, tal como puede ser deseable cuando aparecen los signos tempranos o preliminares de la enfermedad. Las pruebas de laboratorio usadas en el diagnóstico de cáncer incluyen procedimientos químicos (tales como la medición de niveles de GITR), hematología, serología y radiología. En consecuencia, cualquier ensayo clínico o bioquímico que monitorea cualquiera de las anteriores se puede usar para determinar si un tratamiento en particular es una dosis terapéuticamente efectiva para tratar el cáncer. Una persona experta en la técnica podrá determinar tales cantidades en función de factores, tales como el tamaño del sujeto, la gravedad de los síntomas del sujeto y la composición o ruta de administración particulares seleccionadas.
Una composición descrita en la presente se puede administrar a través de una o más rutas de administración usando uno o más métodos conocidos en la técnica. La persona experta en la técnica considerará que la ruta de administración y/o el modo de administración variarán en función de los resultados deseados. Las rutas de administración preferidas de los anticuerpos descritos en la presente incluyen las siguientes: intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras rutas de administración parenterales, por ejemplo, inyección o infusión. La expresión “administración parenteral”, como se usa en la presente, significa modos de administración diferentes de la administración entérica y tópica, por lo general, mediante inyección, e incluye, entre otras, la infusión y la inyección intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal, epidural e intraesternal.
De manera alternativa, un anticuerpo descrito en la presente se puede administrar a través de una trayectoria no parenteral, tal como la trayectoria de administración tópica, epidérmica o mucosa, por ejemplo, intranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual o tópica.
Los compuestos activos se pueden preparar con vehículos que protegerán el compuesto contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulada. Se pueden usar polímeros biodegradables biocompatibles, tales como etileno vinil acetato, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos de los métodos para la preparación de tales formulaciones están patentados o, en general, son conocidos por las personas expertas en la técnica. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.
Las composiciones terapéuticas se pueden administrar con dispositivos médicos conocidos en el estado de la técnica. Por ejemplo, en una modalidad preferida, una composición terapéutica descrita en la presente se puede administrar con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja, tal como los dispositivos descritos en las Patentes Estadounidenses Nos. 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824 o 4.596.556. Los ejemplos de implantes y módulos conocidos para usar con anticuerpos anti-GITR descritos en la presente incluyen: la Patente Estadounidense No. 4.487.603, que describe una bomba de microinfusión implantable para administrar medicamentos a una velocidad controlada; la Patente Estadounidense No. 4.486.194, que describe un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; la Patente Estadounidense No. 4.447.233, que describe una bomba de infusión de medicamentos para administrar medicamentos a una velocidad de infusión precisa; la Patente Estadounidense No. 4.447.224, que describe un aparato de infusión implantable de flujo variable para la administración continua de fármacos; la Patente Estadounidense No. 4.439.196, que describe un sistema de administración de fármacos osmótico, que tiene compartimientos multicámara; y la Patente Estadounidense No. 4.475.196, que describe un sistema de administración de fármacos osmótico. Estas patentes se incorporan en la presente por referencia. Existen numerosos implantes, sistemas de administración y módulos conocidos por las personas expertas en la técnica.
En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-GITR descritos en la presente se pueden formular a fin de garantizar la distribución adecuada in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BBB, por sus siglas en inglés) excluye numerosos compuestos altamente hidrófilos. A fin de garantizar que los compuestos terapéuticos descritos en la presente atraviesen la BBB (si se desea, por ejemplo, para cánceres cerebrales), se pueden formular, por ejemplo, en liposomas. Para obtener información sobre métodos de manufactura de liposomas, véanse, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Nos. 4.522.811, 5.374.548 y 5.399.331. Los liposomas pueden comprender una o más porciones las cuales son transportadas selectivamente a células u órganos específicos, y por lo tanto, se mejora la administración dirigida del fármaco (véase, por ejemplo, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Los ejemplos de porciones de direccionamiento incluyen folato o biotina (véase, por ejemplo, la patente estadounidense 5.416.016 otorgada a Low et al.); manósidos (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); anticuerpos (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); receptor de la proteína A del tensioactivo (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); véanse también K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994,) Immunomethods 4:273.
XVI. Usos y Métodos
Los anticuerpos, las composiciones de anticuerpo y los métodos descritos en la presente tienen varias utilidades in vitro e in vivo que involucran, por ejemplo, mejoramiento de la respuesta inmune mediante, activación de la señalización de GITR o la detección de GITR. En una modalidad preferida, los anticuerpos descritos en la presente son anticuerpos humanos. Por ejemplo, los anticuerpos anti-GITR descritos en la presente se pueden administrar a células en cultivo, in vitro o ex vivo, o a sujetos humanos, por ejemplo, in vivo, para mejorar la inmunidad en diversas enfermedades. En consecuencia, en la presente se proporcionan anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos, descritos en la presente para uso en métodos para modificar una respuesta inmune en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto un anticuerpo, o una porción del mismo de unión al antígeno, descrito en la presente, de modo que se modifique respuesta inmune en el sujeto. Preferiblemente, la respuesta es mejorada, estimulada o regulada ascendentemente.
Los sujetos preferidos incluyen pacientes humanos en los cuales sería deseable la mejora de una respuesta inmune. Los usos médicos son particularmente adecuados para tratar pacientes humanos que presentan un trastorno que se puede tratar aumentando la respuesta inmune (por ejemplo, una respuesta inmune mediada por células T, por ejemplo, una respuesta de células T específica del antígeno). En una modalidad particular, los usos médicos son particularmente adecuados para el tratamiento del cáncer in vivo. Para obtener una mejora de la inmunidad específica del antígeno, los anticuerpos anti-GITR descritos en la presente se pueden administrar junto con un antígeno de interés, o el antígeno puede estar presente en el sujeto que se tratará (por ejemplo, un sujeto que tiene un tumor o un virus). Cuando los anticuerpos contra GITR se administran junto con otro agente, ambos pueden administrarse por separado o de manera simultánea.
Por consiguiente, en un aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo de la invención para uso en un método de tratamiento de cánceres, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo.
También se abarcan en la presente métodos para detectar la presencia del antígeno GITR humano en una muestra, o medir la cantidad de antígeno GITR humano, que comprenden poner en contacto la muestra y una muestra de control con un anticuerpo monoclonal, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal humano o una porción del mismo de unión al antígeno, que se une específicamente a GITR humano en condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo o una porción de este y GITR humano. Luego se detecta la formación de un complejo, en donde una diferencia en la formación de un complejo entre la muestra en comparación con la muestra de control indica la presencia del antígeno GITR humano en la muestra. Además, los anticuerpos anti-GITR descritos en la presente se pueden usar para purificar GITR humano mediante la purificación por inmunoafinidad.
Debido a la capacidad de los anticuerpos anti-GITR descritos en la presente para estimular o co-estimular respuestas de células T, por ejemplo, respuestas de células T específicas de antígeno, en la presente se proporcionan métodos in vitro e in vivo para usar los anticuerpos descritos en la presente para estimular, mejorar o regular de manera ascendente las respuestas de células T específicas de antígeno, por ejemplo, respuestas de células T anti-tumorales. En ciertas modalidades, también se proporciona la estimulación de CD3 (por ejemplo, mediante coincubación con una célula que expresa CD3 unida a la membrana), en la cual la estimulación se puede proporcionar antes, durante o después del la estimulación con un anticuerpo anti-GITR. Por ejemplo, en la presente se proporcionan usos médicos para estimular una respuesta de células T específicas de antígeno que comprende poner en contacto la célula T con un anticuerpo anti-GITR descrito en la presente, y opcionalmente con un anticuerpo anti-CD3, de manera que se estimula la respuesta de células T específicas de antígeno. Se puede usar cualquier indicador adecuado de una respuesta de las células T específicas del antígeno para medir la respuesta de las células T específicas del antígeno. Los ejemplos no limitantes de los mismos indicadores adecuados incluyen el aumento de la proliferación de células T en presencia del anticuerpo y/o el aumento de la producción de citocina en presencia del anticuerpo. En una modalidad preferida, se mejora la producción de interleucina 2 y/o interferón-Y por parte de la célula T específica de antígeno.
Las células T que pueden ser mejoradas o co-estimuladas con los anticuerpos anti-GITR incluyen células T CD4+ y células T CD8+. Las células T pueden ser células Tef, por ejemplo, células Tef CD4+, Células Tef CD8+, células Tauxiliadoras (Th) y células T citotóxicas (Tc).
También se abarcan usos médicos para estimular una respuesta inmune (por ejemplo, una respuesta de las células T específicas de antígeno) en un sujeto, que comprende administrar un anticuerpo anti-GITR descrito en la presente al sujeto, de manera que se estimula una respuesta inmune (por ejemplo, una respuesta de las células T específicas de antígeno) en el sujeto. En una modalidad preferida, el sujeto es un sujeto que porta un tumor, y se estimula una respuesta inmune contra el tumor. Un tumor puede ser un tumor sólido o un tumor líquido, por ejemplo, una malignidad hematológica. En ciertas modalidades, un tumor es un tumor inmunógeno. En ciertas modalidades, un tumor es no inmunogénico. En ciertas modalidades, un tumor es PD-L1 positivo. En ciertas modalidades, un tumor es PD-L1 negativo. Un sujeto también puede tener un virus, y se estimula una respuesta inmune contra el virus.
También se proporcionan usos médicos para inhibir el crecimiento de células tumorales en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto un anticuerpo anti-GITR descrito en la presente, de manera que se inhiba el crecimiento del tumor en el sujeto. También se proporcionan usos médicos para tratar una infección viral en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un anticuerpo anti-GITR descrito en la presente, de manera que se trate la infección viral en el sujeto.
En la presente, también se abarcan usos médicos para disminuir las células Treg del microentorno tumoral de un sujeto que tiene un tumor, por ejemplo, un tumor canceroso, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-GITR descrito en la presente, que comprende un Fc que estimula la disminución de células Treg en el microentorno tumoral. Un Fc puede ser, por ejemplo, un Fc con función efectora o función efectora mejorada, tal como unión, o que tenga unión mejorada a uno o más receptores Fc de activación. En una modalidad preferida, la disminución de Treg se produce sin disminución o inhibición significativa de Tef en el microentorno tumoral, y sin disminución o inhibición significativa de células Tef y células Treg fuera del microambiente tumoral, por ejemplo, en la periferia. En ciertas modalidades, el sujeto tiene niveles más elevados de GITR en las células Treg que en las células Tef, por ejemplo, en el microambiente del tumor.
En ciertas modalidades, un sujeto es tratado con un anticuerpo anti-GITR que tiene un Fc que mejora el agonismo, por ejemplo, se une a o tiene unión mejorada con el inhibidor FcRIIb. Ciertos tratamientos se conducen con un anticuerpo anti-GITR que tiene un Fc que no se une a, o ha reducido a unión a, uno o más FcR de activación. Los anticuerpos anti-GITR pueden suprimir los Tregs en tumores y/o Tregs en linfocitos de infiltración del tumor (TIL).
En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-GITR es dado a un sujeto como una terapia adjuntiva. Los tratamientos de sujetos que tienen cáncer con un anticuerpo anti-GITR pueden conducir a supervivencia prolongada, por ejemplo, respuesta durable a largo plazo con relación al estándar actual de cuidado; supervivencia a largo plazo de al menos 3 meses, 6 meses, 9 meses, 1, 2, 3, 4, 5, 10 o más años, o supervivencia libre de recurrencia de al menos 3 meses, 6 meses, 9 meses, 1, 2, 3, 4, 5, o 10 o más años. En ciertas modalidades, el tratamiento de un sujeto que tiene cáncer con un anticuerpo anti-GITR previene la recurrencia de cáncer o retarda la recurrencia de cáncer mediante, por ejemplo, 3 meses, 6 meses, 9 meses, 1,2, 3, 4, 5, o 10 o más años. Un tratamiento anti-GITR puede ser usado como una primera, segunda, o tercera línea de tratamiento.
En modalidades preferidas, un anticuerpo anti-GITR descrito en la presente no es significantemente tóxico. Por ejemplo, un anticuerpo GITR no es significantemente tóxico a un órgano de un humano, por ejemplo, uno o más del hígado, riñón, cerebro, pulmones, y corazón, como se determina, por ejemplo, en ensayos clínicos. En ciertas modalidades, un anticuerpo GITR no activa significantemente una respuesta inmune indeseable, por ejemplo, autoinmunidad o inflamación.
En ciertas modalidades, el tratamiento de un sujeto con un agonista anti-GITR (por ejemplo, un anticuerpo anti-GITR) no resulta en la sobreestimulación del sistema inmune en la medida en que el sistema inmune del sujeto entonces ataca al sujeto mismo (por ejemplo, respuesta autoinmune) o resulta en, por ejemplo, anafilaxis. De este modo, los anticuerpos anti-GITR preferiblemente no causan anafilaxis.
En ciertas modalidades, el tratamiento de un sujeto con un anticuerpo anti-GITR descrito en la presente, por ejemplo, un anticuerpo que comprenden las CDR o regiones variables de 28F3, no causan reacciones inflamatorias significantes, por ejemplo, neumonitis mediada inmune, colitis mediada inmune, hepatitis mediada inmune, disfunción renal o nefritis mediada inmune, hipofisitis mediada inmune, hipotiroidismo mediado inmune e hipertiroidismo, u otras reacciones adversas mediadas inmunes. En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-GITR que comprenden las CDR o regiones variables de 28F3 causan pocas reacciones inflamatorias, por ejemplo, neumonitis mediada inmune, colitis mediada inmune, hepatitis mediada inmune, nefritis mediada inmune, o disfunción renal, hipofisitis mediada inmune, hipotiroidismo mediado inmune e hipertiroidismo, anafilaxis u otras reacciones adversas mediadas inmune, que otros anticuerpos anti-GITR. Otras reacciones adversas mediadas inmunes incluyen: trastornos cardiacos, por ejemplo, arritmia ventricular, trastornos oculares, por ejemplo, iridociclitis; reacciones relacionadas con la infusión, amilasa incrementada, lipasa incrementada; trastornos del sistema nervioso, por ejemplo, vértigos, neuropatía periférica y sensorial; trastornos del tejido subcutáneo y piel, por ejemplo, sarpullido, prurito, dermatitis exfoliativa, eritema multiforme, vitíligo o psoriasis; trastornos respiratorios, torácicos y mediastinales, por ejemplo, tos; fatiga; náuseas; apetito reducido; estreñimiento; artralgia; y diarrea.
En ciertas modalidades, un anticuerpo GITR proporciona efectos anti-tumorales sinergísticos en combinación con otra terapia para el cáncer, tal como un compuesto que estimula el sistema inmune (por ejemplo, un agente oncológico inmune), por ejemplo, un compuesto descrito en la presente o un compuesto que modula un objetivo descrito en la presente.
Estos y otros métodos descritos en la presente se discuten en detalle adicional posteriormente.
Cáncer
La activación de GITR mediante anticuerpos anti-GITR puede mejorar la respuesta inmune a células cancerosas en el paciente. En la presente se proporcionan y se reivindican anticuerpos anti-GITR de la invención para uso en métodos para tratar a un sujeto que tiene cáncer, que comprende administrar al sujeto un anticuerpo anti-GITR, de modo que el sujeto es tratado, por ejemplo, de manera que el crecimiento de los tumores cancerosos se inhiba o se reduzca y/o que se logre un regreso del tumor y/o una supervivencia prolongada. Se puede usar un anticuerpo anti-GITR solo para inhibir el crecimiento de tumores cancerosos. De manera alternativa, se puede usar un anticuerpo anti-GITR junto con otro agente, por ejemplo, otros agentes inmunogénicos, un tratamiento de cuidado estándar, u otro anticuerpo, como se describe abajo.
En consecuencia, se proporcionan en la presente usos médicos para tratar el cáncer, por ejemplo, inhibiendo el crecimiento de células tumorales, en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-GITR descrito en la presente, por ejemplo, 28F3.IgG1 o 28F3.IgG1.1 o una porción de unión al antígeno de este. El anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-GITR humano (tal como cualquiera de los anticuerpos anti-GITR humano de ser humano descritos en la presente). De manera adicional o alternativa, el anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-GITR quimérico o humanizado, por ejemplo, un anticuerpo anti-GITR quimérico o humanizado que comprende las secuencias de 28F3 u otros anticuerpos anti-GITR descritos en la presente.
Los tipos de cáncer cuyo crecimiento se puede inhibir usando los anticuerpos de la invención incluyen los tipos de cáncer que generalmente son sensibles a la inmunoterapia y aquellos que no son normalmente sensibles a inmunoterapia. Los cánceres pueden ser cánceres con tumores sólidos o malignidades sanguíneas (tumores líquidos). Los ejemplos no limitativos de tipos de cáncer para tratamiento incluyen carcinoma de células escamosas, cáncer pulmonar de células pequeñas, cáncer pulmonar de células no pequeñas, cáncer pulmonar de células no pequeñas escamosas (NSCLC, por sus siglas en inglés), NSCLC de células no escamosas, glioma, cáncer gastrointestinal, cáncer renal (por ejemplo, carcinoma de células claras), cáncer de ovarios, cáncer de hígado, cáncer colorrectal, cáncer de endometrio, cáncer de riñón (por ejemplo, carcinoma de células renales (RCC, por sus siglas en inglés)), cáncer de próstata (por ejemplo, adenocarcinoma de próstata resistente al tratamiento hormonal), cáncer de tiroides, neuroblastoma, cáncer de pancreático, glioblastoma (glioblastoma multiforme), cáncer de cuello uterino, cáncer de estómago, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, carcinoma de colon y cáncer (o carcinoma) de cabeza y cuello, cáncer gástrico, tumor de células germinales, sarcoma pediátrico, células asesinas naturales sinonasales, melanoma (por ejemplo, melanoma maligno metastásico, tal como melanoma maligno cutáneo o intraocular), cáncer óseo, cáncer de piel, cáncer de útero, cáncer de la región anal, cáncer testicular, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma de endometrio, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, cáncer de esofágico, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula adrenal, sarcoma del tejido blando, cáncer de uretra, cáncer de pene, tumores sólidos de la infancia, cáncer de uretra, carcinoma de pelvis renal, neoplasma del sistema nervioso central (SNC, por sus siglas en inglés), linfoma del SNC primario, angiogénesis tumoral, tumor del eje espinal, cáncer cerebral, glioma troncal cerebral, adenoma pituitario, sarcoma de Kaposi, cáncer epidermoide, cáncer de células escamosas, linfoma de células T, tipos de cáncer provocados por el entorno, que incluyen los provocados por asbestos, cánceres relacionados con virus o cánceres de origen viral (por ejemplo, virus del papiloma humano (tumores que se originan o se relacionan con el VPH)), y malignidades hematológicas derivadas de cualquiera de los dos linajes de glóbulos sanguíneos principales, es decir, la línea celular mieloide (que produce granulocitos, eritrocitos, trombocitos, macrófagos y células mástil) o la línea celular linfoide (que produce célula B, T, NK y células plasmáticas), tales como todos los tipos de leucemias, linfomas y mielomas, por ejemplo, leucemia aguda, crónica, linfocítica y/o mielógena, tal como leucemia aguda (ALL), leucemia mielógena aguda (AML, por sus siglas en inglés), leucemia linfocítica crónica (CLL, por sus siglas en inglés) y leucemia mielógena crónica (CML, por sus siglas en inglés), AML indiferenciado (M0), leucemia mieloblástica (M1), leucemia mieloblástica (M2; con maduración celular), leucemia promielocítica (M3 o variante de M3 [M3V]), leucemia mielomonocítica (M4 o variante de M4 con eosinofilia [M4E]), leucemia monocítica (M5), eritroleucemia (M6), leucemia megacarioblástica (M7), sarcoma granulocítico aislado y cloroma; linfomas, tales como linfoma de Hodgkin (HL, por sus siglas en inglés), linfoma no Hodgkin (NHL, por sus siglas en inglés), malignidades hematológicas de célula B, por ejemplo, linfomas de células B, linfomas de células T, linfoma linfoplasmacitoide, linfoma de célula B monocitoides, linfoma del tejido linfoide asociado a las mucosas (MALT, por sus siglas en inglés), linfoma anaplásico (por ejemplo, Ki 1+) de células grandes, linfoma/leucemia de células T del adulto, linfoma de células del manto, linfoma angioinmunoblástico de células T, linfoma angiocéntrico, linfoma intestinal de células T, linfoma primario mediastinal de célula B, linfoma linfoblástico de precursores T, linfoblástico T; y linfoma/leucemia (T-Lbly/T-ALL), linfoma periférico de células T, linfoma linfoblástico, trastorno linfoproliferativo posterior al trasplante, linfoma histiocítico verdadero, linfoma del sistema nervioso central primario, linfoma de efusión primaria, linfoma de células B, linfoma linfoblástico (LBL, por sus siglas en inglés), tumores hematopoyéticos de linaje linfoide, leucemia linfoblástica aguda, linfoma difuso de célula B grandes, linfoma de Burkitt, linfoma folicular, linfoma histiocítico difuso (DHL, por sus siglas en inglés), linfoma inmunoblástico de células grandes, linfoma linfoblástico de precursores B, linfoma cutáneo de células T (CTLC, por sus siglas en inglés) (también denominado micosis fungoide o síndrome de Sezary), y linfoma linfoplasmacitoide (LPL, por sus siglas en inglés) con macroglobulinemia de Waldenstrom; mielomas, tales como mieloma de IgG, mieloma de cadena ligera, mieloma no secretor, mieloma quiescente (también denominado mieloma indolente), plasmocitoma solitario y mielomas múltiples, leucemia linfocítica crónica (CLL), linfoma de células vellosas; tumores hematopoyéticos de linaje mieloide, tumores de origen mesenquimatoso, que incluye fibrosarcoma y rabdomioscarcoma; seminoma, teratocarcinoma, tumores del sistema nervioso central y periférico, que incluyen astrocitoma, schwannoma; tumores de origen mesenquimatoso, que incluyen fibrosarcoma, rabdomiosarcoma y osteosarcoma; y otros tumores, que incluyen melanoma, xerodermia pigmentosa, queratoacantoma, seminoma, cáncer de tiroides folicular y teratocarcinoma, tumores hematopoyéticos de linaje linfoide, por ejemplo, tumores de células T y de célula B, que incluyen, entre otros, trastornos de células T, tales como leucemia prolinfocítica T (T-PLL), que incluye los tipos de células pequeñas y células cerebriformes; leucemia linfocítica granular de células grandes (LGL, por sus siglas en inglés), preferentemente, del tipo de células T; linfoma NHL hepatoesplénico de células T a/d; linfoma de células T periféricos/postímicos (subtipos pleomorfo e inmunoblástico); linfoma angiocéntrico (nasal) de células T; cáncer de cabeza o cuello, cáncer renal, cáncer rectal, cáncer de la glándula tiroides; linfoma mieloide agudo, y cualquier combinación de estos tipos de cáncer. Los métodos descritos en la presente también se pueden usar para el tratamiento de cánceres metastásicos, cánceres no resecables y/o refractarios (por ejemplo, cáncer refractario a inmunoterapia previa, por ejemplo, con un anticuerpo de bloqueo c TlA-4 o PD-1) y cánceres recurrentes.
En ciertas modalidades, un Ab anti-GITR es administrado a pacientes que tienen un cáncer que presenta una respuesta inadecuada a un tratamiento previo, por ejemplo, un tratamiento previo con un fármaco inmuno-oncológico, o pacientes que tienen un cáncer que es refractario o resistente, ya sea refractario o resistente intrínsecamente (por ejemplo, refractario a un antagonista de la trayectoria PD-1), o en donde la resistencia o estado refractario se adquieren. Por ejemplo, sujetos quienes son no sensibles o no suficientemente sensibles a una primera terapia o quienes ven el progreso de la enfermedad después del tratamiento, por ejemplo, tratamiento anti-PD-1, pueden ser tratados por administración de un anticuerpo anti-GITR solo o en combinación con otra terapia (por ejemplo, con una terapia anti-PD-1).
En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-GITR es administrado a pacientes quienes no han recibido previamente (es decir, han sido tratados con) un agente inmuno-oncológico, por ejemplo, un antagonista de la trayectoria PD-1.
Un anticuerpo anti-GITR puede ser administrado con un estándar de tratamiento de cuidado. Un anticuerpo anti-GITR puede ser administrado como una terapia de mantenimiento, por ejemplo, una terapia que está propuesta para prevenir la aparición o recurrencia de tumores.
Un anticuerpo anti-GITR puede ser administrado con otro tratamiento, por ejemplo, radiación, cirugía, o quimioterapia. Por ejemplo, la terapia adjuntiva con anticuerpo anti-GITR puede ser administrada cuando existe un riesgo de que la micrometástasis pueda estar presente y/o con el fin de reducir el riesgo de una recaída.
Un anticuerpo anti-GITR se puede administrar como monoterapia, o como la única terapia inmunoestimuladora. Los anticuerpos contra GITR, por ejemplo, los anticuerpos anti- GITR descritos en la presente, también se pueden combinar con un agente inmunógeno, tal como células cancerosas, antígenos tumorales purificados (que incluyen proteínas recombinantes, péptidos y moléculas de hidratos de carbono), células, y células transfectadas con genes que codifican citocinas inmunoestimuladoras (He et al (2004) J. Immunol. 173:4919-28). Los ejemplos de vacunas antitumorales que se pueden usar incluyen péptidos de antígenos de melanoma, tales como péptidos de gp100, antígenos MAGE, Trp-2, MARTI y/o tirosinasa, o células tumorales transfectadas para expresar la citocina GM-CSF (discutido más adelante).
En los seres humanos, algunos tumores demostraron ser inmunógenos, tales como los melanomas. Disminuyendo el umbral de la activación de células T mediante la activación de GITR, se pueden activar las respuestas tumorales en el hospedero, lo que permite el tratamiento de tumores no inmunógenos o del mismo que tienen inmunogenicidad limitada.
Un anticuerpo anti-GITR, por ejemplo, un anticuerpo anti-GITR descrito en la presente, se puede combinar con un protocolo de vacunación. Se trazaron diversas estrategias experimentales para la vacunación contra los tumores (véanse Rosenberg, S., 2000, Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C., 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428; Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738; véase también Restifo, N. y Sznol, M., Cancer Vaccines, capítulo 61, pp. 3023-3043 en DeVita et al. (eds.), 1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology, quinta edición). En una de estas estrategias, se prepara una vacuna en la que se usan células tumorales autólogas o alogénicas. Estas vacunas celulares demostraron ser más eficaces cuando las células tumorales se transducen para expresar GM-CSF. GM-CSF demostró ser un activador potente de la presentación de antígenos para la vacunación contra los tumores (Dranoff et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 90: 3539-43).
El estudio de los patrones de expresión génica y de expresión génica a gran escala en diversos tumores produjo la definición de los denominados antígenos específicos de tumores (Rosenberg, S A (1999) Immunity 10: 281-7). En varios casos, estos antígenos específicos de tumores son antígenos de diferenciación que se expresan en los tumores y en la célula donde se produjo el tumor, por ejemplo, antígenos melanocitos gp100, antígenos MAGE y Trp-2. Lo que es más importante, se puede demostrar que muchos de estos antígenos son las dianas de células T específicos del tumor en el hospedero. La activación de GITR se puede usar en combinación con un conjunto de proteínas recombinantes y/o péptidos expresados en un tumor, a fin de generar una respuesta inmune a estas proteínas. En general, el sistema inmune considera estas proteínas como autoantígenos y, por lo tanto, son tolerantes a ellos. El antígeno tumoral puede incluir la proteína telomerasa, que es necesaria para la síntesis de telómeros de cromosomas y que se expresa en más del 85 % de los tipos de cáncer en seres humanos y solo en una cantidad limitada de tejidos somáticos (Kim et al. (1994) Science 266: 2011-2013). El antígeno tumoral también puede ser un “neoantígeno” expresado en células cancerosas debido a las mutaciones somáticas que alteran la secuencia proteica o crean proteínas de fusión entre dos secuencias no relacionadas (es decir, bcr-abl en el cromosoma Philadelphia), o idiotipo de tumores de célula B.
Otras vacunas antitumorales pueden incluir las proteínas de virus implicados en ciertos tipos de cáncer humano, tales como el virus del papiloma humano (VPH), el virus de la hepatitis (HBV y HCV) y el virus herpes asociado al sarcoma de Kaposi (KHSV, por sus siglas en inglés). Otra forma de antígeno específico de tumores que se puede usar junto con la activación de GITR son las proteínas de choque térmico (HSP, por sus siglas en inglés) purificadas aisladas del tejido tumoral en sí mismo. Estas proteínas de choque térmico contienen fragmentos de proteínas de las células tumorales, y estas HSP son altamente eficaces para el suministro a las células que presentan antígenos, a fin de provocar inmunidad tumoral (Suot & Srivastava (1995) Science 269:1585-1588; Tamura et al. (1997) Science 278:117-120).
Las células dendríticas (DC, por sus siglas en inglés) son células que presentan antígenos potentes que se pueden usar para cebar respuestas específicas del antígeno. Las DC se pueden producir ex vivo y cargar con varios antígenos de proteínas y péptidos, así como extractos de células tumorales (Nestle et al. (1998) Nature Medicine 4: 328-332). Asimismo, las Dc también se pueden transducir por medios genéticos para que también expresen estos antígenos tumorales. Las DC también se fusionaron directamente a las células tumorales, a fin de lograr la inmunización (Kugler et al. (2000) Nature Medicine 6:332-336). Como método de vacunación, la inmunización de DC se puede combinar de manera efectiva con la activación de GITR para activar respuestas antitumorales más potentes.
La activación de GITR también se puede combinar con tratamiento estándares contra el cáncer (por ejemplo, cirugía, radiación y quimioterapia). La activación de GITR se puede combinar efectivamente con regímenes quimioterapéuticos. En estos casos, es posible reducir la dosis de reactivos quimioterapéuticos administrados (Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304). Un ejemplo de tal combinación es un anticuerpo anti-GITR en combinación con decarbazina para el tratamiento del melanoma. Otro ejemplo de tal combinación es un anticuerpo anti-GITR en combinación con interleucina-2 (IL-2) para el tratamiento del melanoma. La razón científica del uso combinado de la activación de GITR y la quimioterapia es que la muerte celular, que es una consecuencia de la acción citotóxica de la mayoría de los compuestos quimioterapéuticos, debería provocar el aumento de los niveles de antígenos tumorales en la ruta de presentación de antígenos. Otras terapias conjuntas que pueden dar como resultado la sinergia con la activación de GITR mediante la muerte celular son la radiación, la cirugía y la privación hormonal. Cada uno de estos protocolos crea una fuente de antígeno tumoral en el hospedero. Los inhibidores de la angiogénesis también se pueden combinar con activación de GITR. La inhibición de la angiogenia produce la muerte de células tumorales que podrían alimentar el antígeno tumoral en las trayectorias de presentación del antígeno del hospedero.
Los anticuerpos anti-GITR descritos en la presente también se pueden usar en combinación con anticuerpos biespecíficos que dirigen las células efectoras que expresan el receptor Fea o Fcy a las células tumorales (véanse, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Nos. 5.922.845 y 5.837.243). Los anticuerpos biespecíficos se pueden usar para dirigir dos antígenos separados. Por ejemplo, se usaron anticuerpos biespecíficos del receptor anti-Fc/antígeno antitumoral (por ejemplo, Her-2/neu) para dirigir macrófagos a sitios tumorales. Este direccionamiento puede activar de manera más efectiva las repuestas específicas tumorales. El brazo de las células T de estas respuestas se podría aumentar mediante la activación de GITR. De manera alternativa, el antígeno se puede administrar directamente a las DC usando anticuerpos biespecíficos los cuales se unen al antígeno tumoral, y un marcador de la superficie celular específico de la célula dendrítica.
Los tumores evaden la vigilancia inmune del hospedero mediante una gran variedad de mecanismos. Varios de los mismos mecanismos pueden lograrse mediante la inactivación de proteínas las cuales son expresadas por los tumores y las cuales son inmunosupresoras. Estas incluyen, entre otras, TGF-p (Kehrl et al. (1986) J. Exp. Med. 163: 1037­ 1050), IL-10 (Howard & O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200) y ligando Fas (Hahne et al. (1996) Science 274: 1363-1365). Los anticuerpos de cada una de estas entidades se pueden usar en combinación con anticuerpos anti-GITR para contrarrestar los efectos del agente inmunosupresor y favorecer las respuestas inmunes tumorales por parte del hospedero.
Se pueden usar otros anticuerpos los cuales activan la respuesta inmune del hospedero en combinación con anticuerpos anti-GITR. Estos incluyen moléculas en la superficie de células dendríticas, las cuales activan la función de DC y la presentación de antígenos. Los anticuerpos anti-CD40 pueden sustituir efectivamente la actividad de las células T auxiliadoras (Ridge et al. (1998) Nature 393: 474-478) y se pueden usar junto con los anticuerpos anti-GITR. La activación de anticuerpos a moléculas coestimuladoras de células T tales como CLTA-4 (por ejemplo, Patente Estadounidense No. 5.811.097), OX-40 (Weinberg et al. (2000) Immunol 164: 2160-2169), 4-1BB (Melero et al. (1997) Nature Medicine 3: 682-685 (1997) e ICOS (Hutloff et al. (1999) Nature 397: 262-266) también pueden proporcionar mayores niveles de activación de células T. Los inhibidores de PD-1, o PD-L1 también se pueden usar junto con anticuerpos anti-GITR.
El trasplante de médula ósea se usa actualmente para tratar varios tumores de origen hematopoyético. Si bien la enfermedad del injerto contra el hospedero es una consecuencia de este tratamiento, se puede obtener un beneficio terapéutico de las respuestas del injerto contra el tumor. La activación de GITR se puede usar para aumentar la eficacia de las células T específicas de tumor injertados en el donante.
También hay varios protocolos de tratamiento experimental que incluyen la activación y expansión ex vivo de células T específicas de antígeno y la transferencia adoptiva de estas células a receptores, a fin de estimular las células T específicas de antígeno contra los tumores (Greenberg & Riddell (1999) Science 285: 546-51). Estos métodos también se pueden usar para activar las respuestas de las células T a los agentes infecciosos, tales como CMV. La activación ex vivo en presencia de anticuerpos anti-GITR puede aumentar la frecuencia y la actividad de las células T transferidos de manera adoptiva.
Enfermedades Infecciosas
Los usos médicos descritos en la presente también pueden ser usados para tratar pacientes que han sido expuestos a toxinas o patógenos particulares. Por consiguiente, otro aspecto descrito en la presente proporciona un anticuerpo anti-GITR, o porción de unión a antígeno del mismo, para uso en un método para tratar una enfermedad infecciosa en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un anticuerpo anti-GITR, o una porción del mismo de unión al antígeno, de modo que el sujeto es tratado para la enfermedad infecciosa. Adicionalmente o alternativamente, el anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico o humanizado.
De manera similar a su aplicación a tumores como se discute anteriormente, la activación de GITR mediada por anticuerpos se puede usar sola, o como adyuvante, en combinación con vacunas, para estimular la respuesta inmune a patógenos, toxinas y autoantígenos. Los ejemplos de patógenos para los cuales este procedimiento terapéutico puede ser particularmente útil incluyen patógenos para los cuales actualmente no existe una vacuna efectiva, o patógenos para los cuales las vacunas convencionales son menos que completamente efectivas. Estas incluyen, pero no se limitan a, VIH, hepatitis (A, B y C), influenza, Herpes, Giardia, Malaria, Leishmania, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa. La inhibición de GITR es particularmente útil contra infecciones establecidas por agentes, tales como el VIH, que presentan antígenos alterados durante el curso de las infecciones. Estos nuevos epítopos se reconocen como extraños al momento de la administración de anticuerpo anti-GITR humano y, por lo tanto, provocan una fuerte respuesta de las células T.
Algunos ejemplos de virus patógenos que causan infecciones que se pueden tratar mediante los métodos descritos en la presente incluyen VIH, hepatitis (A, B o C), virus del herpes (por ejemplo, VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II y CMV, virus de Epstein Barr), adenovirus, virus de la influenza, flavivirus, virus ECHO, rinovirus, virus de Coxsackie, coronavirus, virus respiratorio sinsicial, virus de la parotiditis, rotavirus, virus del sarampión, virus de la rubeola, parvovirus, viruela vacunoide, virus de HTLV, virus del dengue, virus del papiloma, virus del molusco contagioso, poliovirus, virus de la rabia, virus de John Cunningham y encefalitis causada por arbovirus.
Algunos ejemplos de bacterias patógenas que causan infecciones que se pueden tratar mediante los métodos descritos en la presente incluyen clamidia, bacterias rickettsias, micobacterias, estafilococos, estreptococos, neumonococos, meningococos y gonococos, Klebsiella, próteo, Serratia, seudomonas, legionela, difteria, salmonela, bacilos, cólera, tétanos, botulismo, ántrax, peste, leptospirosis y bacterias de la enfermedad de Lyme.
Algunos ejemplos de hongos patógenos que causan infecciones que se pueden tratar mediante los métodos descritos en la presente incluyen Candida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis, etc.), Cryptococcus neoformans, Aspergillus (fumigatus, niger, etc.), género Mucorales (Mucor, Absidia, Rhizopus), Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis e Histoplasma capsulatum.
Algunos ejemplos de parásitos patógenos que causen infecciones que se pueden tratar mediante los métodos descritos en la presente incluyen Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleriafowleri, Acanthamoeba sp., Giardia lambia, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondii y Nippostrongylus brasiliensis.
En todos los métodos anteriores, la activación de GITR se puede combinar con otras formas de inmunoterapia, tales como tratamiento de citocinas (por ejemplo, interferones, GM-CSF, G-CSF, IL-2) o terapia de anticuerpos biespecíficos, que proporciona una presentación mejorada de antígenos tumorales (véase, por ejemplo, Holliger (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU. 90:6444-6448; Poljak (1994) Structure 2:1121-1123).
Reacciones Autoinmunes
Los anticuerpos anti-GITR pueden provocar y amplificar respuestas inmunes. Sin embargo, la inducción de respuestas anti-tumorales usando vacunas peptídicas y células tumorales revela que muchas respuestas anti-tumorales involucran reactividades anti-autónomas (van Elsas et al. (2001) J. Exp. Med. 194:481-489; Overwijk, et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 2982-2987; Hurwitz, (2000) supra; Rosenberg & White (1996) J. Immunother Emphasis Tumor Immunol 19(1): 81-4). Por lo tanto, es posibles considerar usar los anticuerpos anti-GITR en conjunto con varias auto-proteínas con el fin de contemplar los protocolos de vacunación para generar eficientemente respuestas inmunes contra estas auto-proteínas para el tratamiento de enfermedades. Por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer involucra acumulación inapropiada de péptido Ap en depósitos amiloides en el cerebro; las respuestas de anticuerpo contra amiloides son capaz de separar estos depósitos amiloides (Schenk et al., (1999) Nature 400: 173­ 177).
Otras auto-proteínas también pueden ser usadas como objetivos tales como IgE para el tratamiento de alergia y asma, y TNFc para artritis reumatoide. Finalmente, las respuestas de anticuerpo a varias hormonas pueden ser inducidas por el uso de anticuerpos anti-GITR. Las respuestas de anticuerpos neutralizantes a hormonas reproductivas pueden ser usadas para la anticoncepción. Las respuestas de anticuerpo neutralizante a hormonas y otros factores solubles que son requeridos para el crecimiento de tumores particulares también pueden ser consideradas como objetivos de vacunación posibles.
Los métodos análogos como se describe anteriormente para el uso de los anticuerpos anti-GITR pueden ser usados para inducción de respuestas autoinmunes terapéuticas para tratar pacientes que tienen una acumulación inapropiada de otros auto-antígenos, tales como depósitos amiloides, que incluyen Ap en enfermedad de Alzheimer, citocinas tales como TNFa, e IgE.
Vacunas
Los anticuerpos anti-GITR descritos en la presente se pueden usar para estimular respuestas inmunes específicas de antígeno mediante la coadministración de un anticuerpo anti-GITR con un antígeno de interés (por ejemplo, una vacuna). En consecuencia, en la presente se proporcionan usos médicos para mejorar una respuesta inmune a un antígeno en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto: (i) el antígeno; y (ii) un anticuerpo anti-GITR, o una porción del mismo de unión al antígeno, de modo que se mejora la respuesta inmune al antígeno en el sujeto. El anticuerpo puede ser un anticuerpo GITR anti-humano de ser humano (tal como cualquiera de los anticuerpos anti-GITR humanos descritos en la presente). Adicionalmente o alternativamente, el anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico o humanizado. El antígeno puede ser, por ejemplo, un antígeno tumoral, un antígeno viral, un antígeno bacteriano o un antígeno de un patógeno. Los ejemplos no limitantes de esos antígenos incluyen los que se analizan en las secciones anteriores, tales como los antígenos tumorales (o vacunas contra tumores) analizados anteriormente, o los antígenos de virus, bacterias u otros patógenos descritos anteriormente.
En ciertas modalidades, un péptido o una proteína de fusión que comprende el epítopo al que se une un anticuerpo anti-GITR se usa como vacuna en lugar de, o además de, un anticuerpo anti-GITR.
Las rutas adecuadas para administrar las composiciones de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas e inmunoconjugados) descritas en la presente in vivo e in vitro son conocidas en el estado de la técnica, y las pueden seleccionar las personas expertas en la técnica. Por ejemplo, las composiciones de anticuerpos pueden administrarse mediante inyección (por ejemplo, intravenosa o subcutánea).
Las dosis adecuadas de las moléculas usadas dependerán de la edad y el peso del sujeto y de la concentración y/o la formulación de la composición de anticuerpo.
Como se describió anteriormente, los anticuerpos anti-GITR descritos en la presente se pueden coadministrar con uno o más agentes terapéuticos, por ejemplo, un agente citotóxico, un agente radiotóxico o un agente inmunodepresor. El anticuerpo se puede fijar al agente (como un inmunocomplejo) o se puede administrar de manera separada del agente. En el último caso (administración por separado), el anticuerpo se puede administrar antes o después del agente, o de manera simultánea con este, o se puede coadministrar con otras terapias conocidas, por ejemplo, una terapia contra el cáncer, por ejemplo, radiación. Los agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, agentes antineoplásicos, como doxorrubicina (adriamicina), cisplatino, sulfato de bleomicina, carmustina, clorambucil, dacarbazina y ciclofosfamida hidroxiurea, los cuales por sí solos, son efectivos únicamente a niveles que son tóxicos o subtóxicos para un paciente. El cisplatino se administra de manera intravenosa en dosis de 100 mg/ml una vez cada cuatro semanas, y la adriamicina se administra de manera intravenosa en una dosis de 60-75 mg/ml una vez cada 21 días. La coadministración de los anticuerpos anti-GITR, o los fragmentos de los mismos de unión al antígeno, descritos en la presente con agentes quimioterapéuticos proporciona dos agentes contra el cáncer los cuales funcionan mediante diferentes mecanismos los cuales producen un efecto citotóxico en las células tumorales humanas. La coadministración puede solucionar problemas debidos al desarrollo de resistencia a los fármacos o a un cambio en la antigenicidad de las células tumorales, lo cual las volvería no reactivas con el anticuerpo.
Dentro del alcance descrito en la presente también se encuentran kits que comprenden las composiciones de anticuerpos descritas en la presente (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas biespecíficas o multiespecíficas, o inmunoconjugados) e instrucciones de uso. El kit también puede contener al menos un reactivo adicional, o uno o más anticuerpos humanos adicionales descritos en la presente (por ejemplo, un anticuerpo humano con actividad complementaria el cual se une a un epítopo en un antígeno GITR distinto del primer anticuerpo humano). En general, los kits incluyen una etiqueta que indica el uso previsto del contenido del kit. El término “etiqueta” incluye cualquier leyenda o material grabado suministrado sobre el kit o junto con él, o que acompaña de otro modo al kit.
Terapias de Combinación
En adición a las terapias de combinación proporcionadas anteriormente, los anticuerpos anti-GITR, por ejemplo, aquellos descritos en la presente, también pueden ser usados en terapia de combinación, por ejemplo, para tratar cáncer, como se describe abajo.
Se proporcionan en la presente métodos de terapia de combinación en los cuales un anticuerpo anti-GITR es coadministrado con uno o más agentes adicionales, por ejemplo, fármacos de molécula pequeña, anticuerpos o porciones de los mismos de unión al antígeno, que son efectivos para estimular respuestas inmunes para de este modo mejorar, estimular o regular ascendentemente además, respuestas inmunes en un sujeto. Como se muestra en los Ejemplos, la administración de un anticuerpo agonista anti-GITR y un anticuerpo antagonista anti-PD-1 a ratones, tiene un efecto sinergístico en la inhibición del crecimiento del tumor.
En general, un anticuerpo anti-GITR, por ejemplo, descrito en la presente, puede ser combinado con (i) un agonista de una molécula estimuladora (por ejemplo, co-estimuladora) (por ejemplo, receptor o ligando) y/o (ii) un antagonista de una molécula o señal inhibidora (por ejemplo, receptor o ligando) en células inmunes, tales como células T, ambas de las cuales resultan en amplificación de respuestas inmunes, tales como respuestas de células T específicas del antígeno. En ciertos aspectos, un agente inmuno-oncológico es (a) un agonista de una molécula estimuladora (que incluye una co-estimuladora) (por ejemplo, receptor o ligando) o (ii) un antagonista de una molécula inhibidora (que incluye una co-inhibidora) (por ejemplo, receptor o ligando) en células involucradas es la inmunidad innata, por ejemplo, células NK, y en donde el agente inmuno-oncológico mejora la inmunidad innata. Tales agentes inmunooncológicos son a menudo referidos como reguladores del punto de comprobación inmune, por ejemplo, inhibidor de comprobación inmune o estimulador de comprobación inmune.
En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-GITR es administrado con un agente que dirige una molécula estimuladora o inhibidora que es un miembro de la superfamilia de inmunoglobulina (IgSF). Por ejemplo, los anticuerpos anti-GITR, por ejemplo, descritos en la presente, pueden ser administrados a un sujeto con un agente que se dirige a un miembro de la familia IgSF para incrementar una respuesta inmune. Por ejemplo, un anticuerpo anti-GITR puede ser administrado con un agente que se dirige (o se une específicamente a) un miembro de la familia B7 de ligandos unidos a la membrana que incluyen B7-1, B7-2, B7-H1 (PD-L1), B7-DC (PD-L2), B7-H2 (ICOS-L), B7-H3, B7-H4, B7-H5 (VISTA), y B7-H6 o un receptor co-estimulador o co-inhibidor que se une específicamente a un miembro de la familia B7.
Un anticuerpo anti-GITR también puede ser administrado con un agente que se dirige a un miembro de la familia del TNF y TNFR de moléculas (ligandos o receptores), tales como CD40 y CD40L, OX-40, OX-40L, CD70, CD27L, CD30, CD30L, 4-1BBL, CD137, TRAIL/Apo2-L, TRAILR1/DR4, TRAILR2/DR5, TRAILR3, TRAILR4, OPG, RANK, RANKL, TWEAKR/Fn14, TWEAK, BAFFR, EDAR, XEDAR, TACI, APRIL, BCMA, LTpR, LIGHT, DcR3, HVEM, VEGI/TL1A, TRAMP/DR3, EDA1, EDA2, TNFR1, Linfotoxina a/TNFp, TNFR2, TNFa, LTpR, Linfotoxina a ip2, FAS, FASL, RELT, DR6, TROY, y NGFR (véase, por ejemplo, Tansey (2009) Drug Discovery Today 00:1).
Las respuestas de células T pueden ser estimuladas por una combinación de los anticuerpos anti-GITR descritos en la presente, por ejemplo, 28F3.IgG1 y 28F3.IgG1.1, y uno o más de los siguientes agentes:
(1) Un antagonista (inhibidor o agente de bloqueo) de una proteína que inhibe la activación de células T (por ejemplo, inhibidores de comprobación inmune), tal como CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, y LAG-3, como se describe anteriormente, y cualquiera de las siguientes proteínas: TIM-3, Galectina 9, CEACAM-1, BTLA, CD69, Galectina-1, GITR, CD113, GPR56, VISTA, B7-H3, B7-H4, 2B4, CD48, GARP, PD1H, LAIR1, TIM-1, y TIM-4; y/o
(2) Un agonista de una proteína que estimula la activación de células T, tal como B7-1, B7-2, CD28, 4-1BB (CD137), 4-1BBL, ICOS, ICOS-L, OX40, OX40L, CD70, CD27, CD40, DR3 y CD28H.
Agentes a modo de ejemplo que modulan una de las proteínas anteriores y pueden ser de combinación con anticuerpos anti-GITR agonistas, por ejemplo, aquellos descritos en la presente, para tratar cáncer, incluyen: Yervoy™ (ipilimumab) o Tremelimumab (para c TlA-4), galiximab (para B7.1), BMS-936558 (para PD-1), MK-3475 (para PD-1), AMP224 (para B7DC), BMS-936559 (para B7-H1), MPDL3280A (para B7-H1), MEDI-570 (para ICOS), AMG557 (para B7H2), MGA271 (para B7H3), IMP321 (para LAG-3), BMS-663513 (para CD137), PF-05082566 (para CD137), CDX-1127 (para CD27), anti-OX40 (Providence Health Services), huMAbOX40L (para OX40L), Atacicept (para Ta C i), CP-870893 (para CD40), Lucatumumab (para CD40), Dacetuzumab (para CD40), Muromonab-CD3 (para CD3), Ipilumumab (para CTLA-4).
Los anticuerpos anti-GITR también pueden ser administrados con pidilizumab (CT-011), aúnque su especificidad para la unión de PD-1 se ha cuestionado.
Otras moléculas que pueden ser combinadas con anticuerpos antagonistas anti-GITR para el tratamiento de cáncer incluyen antagonistas de receptores inhibidores en células NK o agonistas de receptores de activación en células NK. Por ejemplo, anticuerpos agonistas anti-GITR pueden ser de combinación con antagonistas de KIR (por ejemplo, lirilumab).
La activación de células T también es regulada por citocinas solubles, y los anticuerpos anti-GITR pueden ser administrados a un sujeto, por ejemplo, que tienen cáncer, con antagonistas de citocinas que inhiben la proliferación de células T o antagonistas de citocinas que estimulan la activación de células T.
En algunas modalidades, los anticuerpos anti-GITR se pueden usar en combinación con (i) antagonistas (o inhibidores o agentes de bloqueo) de proteínas de la familia IgSFl, la familia B7 o la familia TNF que inhiben la activación de células T o antagonistas de citocinas que inhiben la activación de células T (por ejemplo, IL-6, IL-10, TGF-13, VEGF; “citocinas inmunosupresoras”) y/o (ii) agonistas de receptores estimuladores de la familia IgSF, la familia B7 o la familia TNF o de citocinas que estimulan la activación de células T, para estimular una respuesta inmune, por ejemplo, para tratar enfermedades proliferativas, tales como cáncer.
Aún otros agentes para terapias de combinación incluyen agentes que inhiben o disminuyen los macrófagos o monocitos, que incluyen, entre otros, antagonistas de CSF-1R, tales como anticuerpos antagonistas de CSF-1R, que incluyen RG7155 (documentos WO11/70024, WO11/107553, WO11/131407, WO13/87699, WO13/119716, WO13/132044) o FPA-008 (documentos WO11/140249; WO13169264; WO14/036357).
Los anticuerpos anti-GITR también se pueden administrar con agentes que inhiben la señalización de TGF-p.
Otros agentes que se pueden combinar con un anticuerpo anti-GITR incluyen agentes que mejoran la presentación del antígeno tumoral, por ejemplo, vacunas de células dendríticas, vacunas celulares secretoras de GM-CSF, oligonucleótidos de CpG, e imiquimod, o terapias que mejoran la inmunogenicidad de células tumorales (por ejemplo, antraciclinas).
Aún otras terapias que se pueden combinar con un anticuerpo anti-GITR incluyen terapias que disminuyen o bloquean las células Treg, por ejemplo, un agente que se une específicamente a CD25.
Otro tratamiento que se puede combinar con un anticuerpo anti-GITR es un tratamiento que inhibe una enzima metabólica, tal como indolamina dioxigenasa (IDO), dioxigenasa, arginasa o sintetasa de óxido nítrico.
Otra clase de agentes que se pueden usar con un anticuerpo anti-GITR incluye agentes que inhiben la formación de adenosina o que inhiben el receptor de adenosina A2A.
Otros terapias que se pueden combinar con un anticuerpo anti-GITR para tratar el cáncer incluyen terapias que revierten/previenen la anergia o el agotamiento de células T y terapias que desencadenan una inmunoactivación innata y/o inflamación en el sitio de un tumor.
Un anticuerpo anti-GITR se puede combinar con más de un agente inmunooncológico, y se puede combinar, por ejemplo, con un enfoque de combinación que se dirige a múltiples elementos de la ruta inmune, tal como uno o más de los siguientes: un tratamiento que mejora la presentación de un antígeno tumoral (por ejemplo, vacuna de células dendríticas, vacunas celulares secretoras de GM-CSF, oligonucleótidos de CpG, imiquimod); un tratamiento que inhibe la regulación inmune negativa, por ejemplo, mediante la inhibición de las rutas CTLA-4 y/o PD1/PD-L1/PD-L2 y/o la disminución o el bloqueo de Treg u otras células supresoras inmunes; un tratamiento que estimula la regulación inmune positiva, por ejemplo, con agonistas que estimulan la ruta de CD-137, OX-40 y/o GITR y/o estimulan la función efectora de células T; un tratamiento que aumenta sistémicamente la frecuencia de células T antitumorales; un tratamiento que disminuye o inhibe Treg, tales como Treg en el tumor, por ejemplo, usando un antagonista de CD25 (por ejemplo, daclizumab) o mediante la disminución de perlillas mediante anti-CD25 ex vivo; un tratamiento que afecta la función de células mieloides supresoras en el tumor; un tratamiento que mejora la inmunogenicidad de células tumorales (por ejemplo, antraciclinas); transferencia de células T o células NK adoptivas que incluyen células modificadas genéticamente, por ejemplo, células modificadas mediante receptores del antígeno quimérico (tratamiento con CAR-T); un tratamiento que inhibe una enzima metabólica, tal como indolamina dioxigenasa (IDO), dioxigenasa, arginasa o sintetasa de óxido nítrico; un tratamiento que revierte/previene la anergia o el agotamiento de células T; un tratamiento que desencadena una inmunoactivación innata y/o la inflamación en el sitio de un tumor; administración de citocinas inmunoestimuladoras; o el bloqueo de citocinas inmuno represoras.
Los anticuerpos anti-GITR descritos en la presente se pueden usar juntos con uno o más de los agentes agonistas que se ligan a receptores coestimuladores positivos, agentes de bloqueo que atenúan la señalización a través de receptores inhibidores, antagonistas y uno o más agentes que aumentan sistémicamente la frecuencia de células T antitumorales, agentes que superan las rutas supresoras inmunes distintivas en el microentorno tumoral (por ejemplo, bloquean el acoplamiento de receptores inhibidores (por ejemplo, interacciones PD-L1/PD-1), disminuyen o inhiben Treg (por ejemplo, usando un anticuerpo monoclonal anti-CD25 (por ejemplo, daclizumab) o mediante la disminución de perlillas mediante anti-CD25 ex vivo), inhiben enzimas metabólicas, tales como IDO, o revierten/previenen la anergia o el agotamiento de células T) y los agentes que desencadenan la inmunoactivación innata y/o la inflamación en los sitios del tumor.
En algunas modalidades, un anticuerpo anti-GITR se administra a un sujeto junto con un inhibidor de BRAF si el sujeto es positivo para la mutación de BRAF V600.
En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-GITR que es administrado junto con otro anticuerpo inmunoestimulador es un anticuerpo descrito en la presente. En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-GITR que es administrado junto con otro anticuerpo inmunoestimulador es un anticuerpo que tiene las secuencias CDR de 6C8, por ejemplo, un anticuerpo humanizado que tiene las CDR de 6C8, como se describe, por ejemplo, en el documento WO2006/105021; un anticuerpo que comprende las CDR de un anticuerpo anti-GITR descrito en el documento WO2011/028683; un anticuerpo que comprende las CDR de un anticuerpo anti-GITR descrito en el documento JP2008278814, un anticuerpo que comprenden las CDR de un anticuerpo anti-GITR descrito en el documento WO2015/031667, u otro anticuerpo anti-GITR descrito o referido en la presente.
En la presente se proporcionan usos médicos para estimular una respuesta inmune en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto una molécula anti-GITR agonista, por ejemplo, un anticuerpo, y uno o más anticuerpos inmunoestimuladores adicionales, tales como un antagonista anti-PD-1, por ejemplo, anticuerpo antagonista, un antagonista anti-PD-L1, por ejemplo, anticuerpo antagonista, un antagonista anti-CTLA-4, por ejemplo, anticuerpo antagonista y/o un antagonista anti-LAG3, por ejemplo, un anticuerpo antagonista, de modo que se estimule una respuesta inmune en el sujeto, por ejemplo, para inhibir el crecimiento tumoral o para estimular una respuesta antiviral. En una modalidad, el sujeto es administrado con un agonista de anticuerpo anti-GITR y un anticuerpo antagonista anti-PD-1. En una modalidad, se le administra al sujeto un anticuerpo antagonista anti-GITR y un anticuerpo anti-PD-L1 antagonista. En una modalidad, se le administra al sujeto un anticuerpo anti-GITR antagonista y un anticuerpo anti-CTLA-4 antagonista. En una modalidad, el anticuerpo anti-GITR es un anticuerpo humano, tal como un anticuerpo descrito en la presente. De manera alternativa, el anticuerpo anti-GITR puede ser, por ejemplo, un anticuerpo quimérico o humanizado (por ejemplo, preparado de un mAb anti-GITR de ratón), tales como los que se describen en mayor detalle en la presente. En una modalidad, al menos un anticuerpo inmunoestimulador adicional (por ejemplo, un anti-PD-1 antagonista, un anti-PD-L1 antagonista, un anti-CTLA-4 antagonista y/o un anticuerpo anti-LAG3 antagonista) es un anticuerpo humano. De manera alternativa, al menos un anticuerpo inmunoestimulador adicional puede ser, por ejemplo, un anticuerpo quimérico o humanizado (por ejemplo, preparado de un anticuerpo anti-PD-1, anti-PD-L1, anti-CTLA-4 y/o anti-LAG3 de ratón).
En la presente se proporcionan y se reivindican usos médicos para tratar una enfermedad hiperproliferativa (por ejemplo, cáncer), que comprende administrar a un sujeto un anticuerpo agonista anti-GITR y un anticuerpo antagonista PD-1. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-GITR se administra en una dosis subterapéutica, el anticuerpo anti-PD-1 se administra en una dosis subterapéutica, o se administran ambos en una dosis subterapéutica. En la presente también se proporcionan métodos para alterar un evento adverso asociado al tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa con un agente inmunoestimulador, que comprende administrar a un sujeto un anticuerpo anti-GITR y una dosis subterapéutica del anticuerpo anti-PD-1. En algunas modalidades, el sujeto es humano. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-PD-1 es un anticuerpo monoclonal de secuencia humana, y el anticuerpo anti-GITR es un anticuerpo monoclonal de secuencia humana, tal como un anticuerpo que comprende las CDR o regiones variables de 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, y 6G10 descritas en la presente (por ejemplo, 28F3.IgG1 o 28F3.IgG1.1) u otro anticuerpo agonista anti-GITR descrito en la presente.
Los antagonistas de PD-1 adecuados para usar en los usos médicos descritos en la presente incluyen, entre otros, ligandos, anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales y anticuerpos biespecíficos) y agentes multivalentes. En una modalidad, el antagonista de PD-1 es una proteína de fusión, por ejemplo, una proteína de fusión de Fc, tal como AMP-244. En una modalidad, el antagonista de PD-1 es un anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1.
Un ejemplo de anticuerpo anti-PD-1 es nivolumab (BMS-936558) o un anticuerpo que comprende las regiones CDR o regiones variables de uno de los anticuerpos 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 7D3, 5F4 y 4A11 descritos en el documento WO 2006/121168. En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-PD1 es MK-3475 (Lambrolizumab), descrito en el documento WO2012/145493; y AMP-514, descrito en el documento WO2012/145493. Anticuerpos PD-1 conocidos adicionales y otros PD-1 inhibidores incluyen aquellos descritos en los documentos WO 2009/014708, WO 03/099196, w O 2009/114335, WO 2011/066389, WO 2011/161699, WO 2012/145493, Patentes Estadounidenses Nos. 7.635.757 y 8.217.149, y la Publicación de Patente Estadounidense No. 2009/0317368. También se puede usar cualquiera de los anticuerpos anti-PD-1 descritos en el documento WO2013/173223. Un anticuerpo anti-PD-1 que compite por la unión con, y/o se une al mismo epítopo en PD-1 que uno de estos anticuerpos también se puede usar en tratamientos de combinación. Otro procedimiento para dirigir el receptor PD-1 es la proteína recombinante compuesta del dominio extracelular de PD-L2 (B7-DC) fusionado a la porción Fc de IgG1, llamada AMP-224.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-PD-1 se une a PD-1 humano con una Kd de 5 x 10'8 M o menos, se une a PD-1 humano con una Kd de 1 x 10'8 M o menos, se une a PD-1 humano con una Kd de 5 x 10'9 M o menos, o se une a PD-1 humano con una Kd de 1 x 10'8 M a 1 x 10'1° M o menos.
En la presente se proporcionan y se reivindican usos médicos para tratar una enfermedad hiperproliferativa (por ejemplo, cáncer, según se reivindica), que comprende administrar a un sujeto un anticuerpo agonista anti-GITR y un anticuerpo antagonista PD-L1. En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-GITR se administra en una dosis subterapéutica, el anticuerpo anti-PD-L1 se administra en una dosis subterapéutica, o se administran ambos en una dosis subterapéutica. En la presente se proporcionan usos médicos para alterar un evento adverso asociado al tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa con un agente inmunoestimulador, que comprenden administrar a un sujeto un anticuerpo anti-GITR y una dosis subterapéutica del anticuerpo anti-PD-L1. En algunas modalidades, el sujeto es humano. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-PD-L1 es un anticuerpo monoclonal de secuencia humana, y el anticuerpo anti-GITR es un anticuerpo monoclonal de secuencia humana, tal como un anticuerpo que comprende las CDR o regiones variables de 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1,9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, y 6G10 descritos en la presente (por ejemplo, 28F3.IgG1 o 28F3.IgG1.1) u otro anticuerpo agonista anti-GITR descrito en la presente.
En una modalidad, el anticuerpo anti-PD-L1 es BMS-936559 (denominado 12A4 en WO 2007/005874 y en la Patente Estadounidense No. 7.943.743), o un anticuerpo que comprende las CDR o regiones variables de 3G10, 12A4, 10A5, 5F8, 10H10, 1B12, 7H1, 11E6, 12B7 y 13G4, que se describen en la publicación PCT WO 07/005874 y en la Patente Estadounidense No. 7.943.743. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-PD-L1 es MEDI4736 (también conocido como anti-B7-H1) o MPDL3280A (también conocido como RG7446). MSB0010718C (WO2013/79174), o rHigM12B7. Cualquiera de los anticuerpos anti-PD-L1 descritos en los documentos WO2013/173223, WO2011/066389, WO2012/145493, Patentes Estadoundenses Nos. 7.635.757 y 8.217.149 y Publicación Estadounidense No.
2009/145493, pueden ser usados. Anticuerpos anti-PD-L1 que compiten con y/o se unen al mismo epítopo que el de cualquiera de estos anticuerpos también se puede usar en terapias de combinación.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-PD-L1 se une a PD-L1 humano con una Kd de 5 x 10'8 M o menos, se une a PD-L1 humano con una Kd de 1 x 10'8 M o menos, se une a PD-L1 humano con una Kd de 5 x 10'9 M o menos, o se une a PD-L1 humano con una Kd de 1 x 10'8 M a 1 x 10'10 M o menos.
En la presente se proporcionan y se reivindican usos médicos para tratar una enfermedad hiperproliferativa (por ejemplo, cáncer según se reivindica), que comprende administrar a un sujeto un anticuerpo anti-GITR de la invención y un anticuerpo antagonista de CTLA-4. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-GITR se administra en una dosis subterapéutica, el anticuerpo anti-CTLA-4 se administra en una dosis subterapéutica, o se administran ambos en una dosis subterapéutica. En la presente se proporcionan métodos para alterar un evento adverso asociado al tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa con un agente inmunoestimulador, que comprenden administrar a un sujeto un anticuerpo anti-GITR y una dosis subterapéutica del anticuerpo anti-CTLA-4. En algunas modalidades, el sujeto es humano. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CTLA-4 es un anticuerpo seleccionado del grupo de: Yervoy™ (ipilimumab o anticuerpo 10D1, descrito en la publicación PCT WO 01/14424), tremelimumab (anteriormente ticilimumab, CP-675,206), anticuerpo monoclonal o anti-CTLA-4 descrito en cualquiera de las siguientes publicaciones: WO 98/42752; WO 00/37504; Patente Estadounidense No. 6.207.156; Hurwitz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(17):10067-10071; Camacho et al. (2004) J. Clin. Oncology 22(145): Resumen No. 2505 (anticuerpo CP-675206); y Mokyr et al. (1998) Cáncer Res. 58:5301-5304. También se puede usar cualquiera de los anticuerpos anti-CTLA-4 descritos en WO2013/173223.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CTLA-4 se une a CTLA-4 humano con una Kd de 5 x 10'8 M o menos, se une a CTLA-4 humano con una Kd de 1 x 10-8 M o menos, se une a CTLA-4 humano con una Kd de 5 x 10-9 M o menos, o se une a CTLA-4 humano con una Kd de 1 x 10-8 M a 1 x 10-10 M o menos.
En la presente se proporcionan y se reivindican usos médicos para tratar una enfermedad hiperproliferativa (por ejemplo, cáncer según se reivindica), que comprende administrar a un sujeto un anticuerpo anti-GITR y un anticuerpo anti-LAG-3. En otras modalidades, el anticuerpo anti-GITR se administra en una dosis subterapéutica, el anticuerpo anti-LAG-3 se administra en una dosis subterapéutica, o se administran ambos en una dosis subterapéutica. En la presente se proporcionan métodos para alterar un evento adverso asociado al tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa con un agente inmunoestimulador, que comprenden administrar a un sujeto un anticuerpo anti-GITR y una dosis subterapéutica del anticuerpo anti-LAG-3. En algunas modalidades, el sujeto es humano. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-PD-L1 es un anticuerpo monoclonal de secuencia humana, y el anticuerpo anti-GITR es un anticuerpo monoclonal de secuencia humana, tal como un anticuerpo que comprende las CDR o regiones variables de 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, o 6G10 descritos en la presente (por ejemplo, 28F3.IgG1 o 28F3.IgG1.1) otro anticuerpo antagonista anti-GITR descrito en la presente. Los ejemplos de anticuerpos anti-LAG3 incluyen anticuerpos que comprenden las CDR o regiones variables de anticuerpos 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 o 17E5, que se describen en las Publicaciones de Patentes Estadounidenses Nos. US2011/0150892, WO10/19570 y WO2014/008218. En una modalidad, un anticuerpo anti-LAG-3 es BMS-986016. Otros anticuerpos anti-LAG-3 reconocidos en la técnica que se pueden usar incluyen IMP731 y IMP-321 descritos en los documentos US 2011/007023, WO08/132601, y WO09/44273US 2011/007023. Los anticuerpos anti-LAG-3 que compiten con y/o se unen al mismo epítopo que el de cualquiera de estos anticuerpos también se puede usar en terapias de combinación.
En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-LAG-3 se une a LAG-3 humano con una Kd de 5 x 10'8 M o menos, se une a LAG-3 humano con una Kd de 1 x 10'8 M o menos, se une a LAG-3 humano con una Kd de 5 x 10'9 M o menos, o se une a LAG-3 humano con una Kd de 1 x 10'8 M a 1 x 10'1° M o menos.
La administración de anticuerpos anti-GITR descritos en la presente y antagonistas, por ejemplo, anticuerpos antagonistas, a uno o más antígenos diana secundarios, tales como LAG-3, CTLA-4, PD-1 y/o PD-L1, puede mejorar la respuesta inmune a células cancerosas en el paciente. Los tipos de cáncer cuyo crecimiento se puede inhibir usando los anticuerpos de la presente descripción incluyen los tipos de cáncer que responden a la inmunoterapia y aquellos que no responden normalmente a inmunoterapia. Ejemplos representativos de tipos de cáncer para el tratamiento con la terapia de combinación de la presente descripción incluyen aquellos cánceres listados en la presente.
En algunas modalidades, la combinación de anticuerpos terapéuticos analizada en la presente se puede administrar simultáneamente como una sola combinación en un vehículo farmacéuticamente aceptable, o simultáneamente como composiciones separadas con cada anticuerpo en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la combinación de anticuerpos terapéuticos se puede administrar en forma secuencial. Por ejemplo, un anticuerpo anti-CTLA-4 y un anticuerpo anti-GITR se pueden administrar en forma secuencial, por ejemplo, se puede administrar primero un anticuerpo anti-CTLA-4 y luego un anticuerpo anti-GITR, o se puede administrar primero un anticuerpo anti-GITR y luego un anticuerpo anti-CTLA-4. De manera adicional o alternativa, un anticuerpo anti-PD-1 y un anticuerpo anti-GITR se pueden administrar en forma secuencial, por ejemplo, se puede administrar primero un anticuerpo anti-PD-1 y luego un anticuerpo anti-GITR, o se puede administrar primero un anticuerpo anti-GITR y luego un anticuerpo anti-PD-1. De manera adicional o alternativa, un anticuerpo anti-PD-L1 y un anticuerpo anti-GITR se pueden administrar en forma secuencial, por ejemplo, se puede administrar primero un anticuerpo anti-PD-L1 y luego un anticuerpo anti-GITR, o se puede administrar primero un anticuerpo anti-GITR y luego un anticuerpo anti-PD-L1. De manera adicional o alternativa, un anticuerpo anti-LAG-3 y un anticuerpo anti-GITR se pueden administrar en forma secuencial, por ejemplo, se puede administrar primero un anticuerpo anti-LAG-3 y luego un anticuerpo anti-GITR, o se puede administrar primero un anticuerpo anti-GITR y luego un anticuerpo anti-LAG-3.
Asimismo, si se administra en forma secuencial más de una dosis del tratamiento conjunto, el orden de la administración secuencial se puede invertir o mantener en el mismo orden en cada punto temporal de administración, las administraciones secuenciales se pueden combinar con administraciones simultáneas, o cualquier combinación de estas. Por ejemplo, la primera administración de una combinación de anticuerpo anti-CTLA-4 y anticuerpo anti-GITR puede ser concurrente, la segunda administración puede ser secuencial, con anticuerpo anti-CTLA-4 primero y anticuerpo anti-GITR segundo, y la tercera administración puede ser secuencial, con anticuerpo anti-GITR primero y anticuerpo anti-CTLA-4 segundo, etc. De manera adicional o alternativa, la primera administración de una combinación de anticuerpo anti-PD-1 y anticuerpo anti-GITR puede ser concurrente, la segunda administración puede ser secuencial con anticuerpo anti-PD-1 primero y anticuerpo anti-GITR segundo, y la tercera administración puede ser secuencial, con anticuerpo anti-GITR primero y anticuerpo anti-PD-1 segundo, etc. De manera adicional o alternativa, la primera administración de una combinación de anticuerpo anti-PD-L1 y anticuerpo anti-GITR puede ser concurrente, la segunda administración puede ser secuencial, con anticuerpo anti-PD-L1 primero y anticuerpo anti-GITR segundo, y la tercera administración puede ser secuencial, con anticuerpo anti-GITR primero y anticuerpo anti-PD-L1 segundo, etc. De manera adicional o alternativa, la primera administración de una combinación de anticuerpo anti-LAG-3 y anticuerpo anti-GITR puede ser concurrente, la segunda administración puede ser secuencial, con anticuerpo anti-LAG-3 primero y anticuerpo anti-GITR segundo, y la tercera administración puede ser secuencial, con anticuerpo anti-GITR primero y anticuerpo anti-LAG-3 segundo, etc. Otro esquema de dosificación representativo puede incluir una primera administración que es secuencial con anti-GITR primero y anticuerpo anti-CTLA-4 (y/o anticuerpo anti-PD-1, anticuerpo anti-PD-LI y/o anticuerpo anti-LAG-3) segundo, y las administraciones posteriores pueden ser concurrentes.
En una modalidad, un sujeto que tiene una enfermedad que se puede beneficiar de la estimulación del sistema inmune, por ejemplo, cáncer o una enfermedad infecciosa, se trata por administración al sujeto de un anticuerpo anti-GITR y un agente inmunooncológico, en donde el agente inmunooncológico es un agonista de CD137 (4-1BB), tal como un anticuerpo agonista de CD137. Los anticuerpos contra CD137 adecuados incluyen, por ejemplo, urelumab o PF-05082566 (WO12/32433).
En una modalidad, un sujeto que tiene una enfermedad que se puede beneficiar de la estimulación del sistema inmune, por ejemplo, cáncer o una enfermedad infecciosa, se trata por administración al sujeto de un anticuerpo anti-GITR y un agente inmunooncológico, en donde el agente inmunooncológico es un agonista de OX40, tal como un anticuerpo agonista de OX40. Los anticuerpos contra OX40 adecuados incluyen, por ejemplo, MEDI-6383, MEDI-6469 o MOXR0916 (RG7888; WO06/029879).
En una modalidad, un sujeto que tiene una enfermedad que se puede beneficiar de la estimulación del sistema inmune, por ejemplo, cáncer o una enfermedad infecciosa, se trata por administración al sujeto de un anticuerpo anti-GITR y un agente inmunooncológico, en donde el agente inmunooncológico es un agonista de CD40, tal como un anticuerpo agonista de CD40. En algunas modalidades, el agente inmunooncológico es un antagonista de CD40, tal como un anticuerpo antagonista de CD40. Los anticuerpos contra CD40 adecuados incluyen, por ejemplo, lucatumumab (HCD122), dacetuzumab (SGN-40), CP-870,893 o Chi Lob 7/4.
En una modalidad, un sujeto que tiene una enfermedad que se puede beneficiar de la estimulación del sistema inmune, por ejemplo, cáncer o una enfermedad infecciosa, se trata por administración al sujeto de un anticuerpo anti-GITR y un agente inmunooncológico, en donde el agente inmunooncológico es un agonista de CD27, tal como un anticuerpo agonista de CD27. Los anticuerpos CD27 adecuados incluyen, por ejemplo, varlilumab (CDX-1127).
En una modalidad, un sujeto que tiene una enfermedad que se puede beneficiar de la estimulación del sistema inmune, por ejemplo, cáncer o una enfermedad infecciosa, se trata por administración al sujeto de un anticuerpo anti-GITR y un agente inmunooncológico, en donde el agente inmunooncológico es MGA271 (para B7H3) (WO11/109400).
En una modalidad, un sujeto que tiene una enfermedad que se puede beneficiar de la estimulación del sistema inmune, por ejemplo, cáncer o una enfermedad infecciosa, se trata por administración al sujeto de un anticuerpo anti-GITR y un agente inmunooncológico, en donde el agente inmunooncológico es un antagonista de KIR, tal como lirilumab.
En una modalidad, un sujeto que tiene una enfermedad que se puede beneficiar de la estimulación del sistema inmune, por ejemplo, cáncer o una enfermedad infecciosa, se trata por administración al sujeto de un anticuerpo anti-GITR y un agente inmunooncológico, en donde el agente inmunooncológico es un antagonista de IDO. Los antagonistas de IDO incluyen, por ejemplo, INCB-024360 (WO2006/122150, WO07/75598, WO08/36653, WO08/36642), indoximod, NLG-919 (WO09/73620, WO09/1156652, WO11/56652, WO12/142237) o F001287.
En una modalidad, un sujeto que tiene una enfermedad que se puede beneficiar de la estimulación del sistema inmune, por ejemplo, cáncer o una enfermedad infecciosa, se trata por administración al sujeto de un anticuerpo anti-GITR y un agente inmunooncológico, en donde el agente inmunooncológico es un agonista del receptor de tipo Toll, por ejemplo, un agonista de TLR2/4 (por ejemplo, Bacillus Calmette-Guerin); un agonista de TLR7 (por ejemplo, Hiltonol o Imiquimod); un agonista de TLR7/8 (por ejemplo, Resiquimod); o un agonista de TLR9 (por ejemplo, CpG7909).
En una modalidad, un sujeto que tiene una enfermedad que se puede beneficiar de la estimulación del sistema inmune, por ejemplo, cáncer o una enfermedad infecciosa, se trata por administración al sujeto de un anticuerpo anti-GITR y un agente inmunooncológico, en donde el agente inmunooncológico es un inhibidor de TGF-p, por ejemplo, GC1008, LY2157299, TEW7197 o IMC-TR1.
En un aspecto, un anticuerpo anti-GITR se administra secuencialmente antes de la administración de un segundo agente, por ejemplo, un agente inmunooncológico. En un aspecto, un anticuerpo anti-GITR se administra de manera concurrente con el segundo agente, por ejemplo, un agente inmunooncológico. Aún en un aspecto, un anticuerpo anti-GITR se administra secuencialmente después de la administración del segundo agente. La administración de los dos agentes puede comenzar en momentos con una separación de, por ejemplo, 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos, 120 minutos, 3 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 3 días, 5 días, 7 días, o una o más semanas, o la administración del segundo agente puede comenzar, por ejemplo, 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos, 120 minutos, 3 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 3 días, 5 días, 7 días, o una o más semanas después de la administración del primer agente.
En algunos aspectos, un anticuerpo anti-GITR y un segundo agente, por ejemplo, un agente inmunooncológico, se administran a un paciente simultáneamente, por ejemplo, simultáneamente mediante infusión, por ejemplo, durante un período de 30 o 60 minutos. Un anticuerpo anti-GITR se puede coformular con un segundo agente, por ejemplo, un agente inmunooncológico.
Opcionalmente, un anti-GITR como único agente inmunoterapéutico, o la combinación de un anticuerpo anti-GITR y uno o más anticuerpos inmunoterapéuticos adicionales (por ejemplo, bloqueo de anti-CTLA-4, anti-PD-1, anti-PD-L1 y/o anti-LAG-3) se pueden combinar adicionalmente con un agente inmunógeno, tal como células cancerosas, antígenos tumorales purificados (que incluyen proteínas recombinantes, péptidos y moléculas de carbohidratos), células y células transfectadas con genes que codifican las citocinas estimuladoras del sistema inmune (He et al. (2004), J. Immunol. 173:4919-28). Los ejemplos de vacunas antitumorales que se pueden usar incluyen péptidos de antígenos de melanoma, tales como péptidos de gp100, antígenos MAGE, Trp-2, MARTI y/o tirosinasa, o células tumorales transfectadas para expresar la citocina GM-CSF (analizada más adelante). Una activación combinada de GITR y uno o más anticuerpos adicionales (por ejemplo, bloqueo de CTLA-4, PD-1, PD-L1 y/o LAG-3) también se pueden combinar con terapias estándares contra el cáncer. Por ejemplo, una activación combinada de GITR y uno o más anticuerpos adicionales (por ejemplo, bloqueo de CTLA-4, PD-1, PD-L1 y/o LAG-3) se puede combinar efectivamente con regímenes quimioterapéuticos. En estos casos, es posible reducir la dosis de otro reactivo quimioterapéutico administrado en combinación con la presente descripción (Mokyr et al. (1998) Cáncer Research 58: 5301-5304). Un ejemplo de esa combinación es una combinación de anticuerpo agonista anti-GITR con o sin un anticuerpo adicional, tal como anticuerpos anti-CTLA-4, anticuerpos anti-PD-1, anticuerpos anti-PD-L1 y/o anticuerpos anti-LAG-3) también en combinación con decarbazina para el tratamiento de melanoma. Otro ejemplo es una combinación de anticuerpo anti-GITR con o sin anticuerpos anti-CTLA-4, anticuerpos anti-PD-1, anticuerpos anti-PD-L1 y/o anticuerpos contra LAG-3, de combinación adicionalmente con interleucina-2 (IL-2) para el tratamiento de melanoma. Las razones científicas del uso combinado de la activación de GITR y el bloqueo de CTLA-4 y/o PD-1 y/o PD-L1 y/o LAG-3 con la quimioterapia consisten en que la muerte celular, que es una consecuencia de la acción citotóxica de la mayoría de los compuestos quimioterapéuticos, debería provocar el aumento de los niveles de antígenos tumorales en la ruta de presentación de antígenos. Otras terapias de combinación que pueden ocasionar sinergia con una combinación de activación de GITR con o sin el bloqueo de CTLA-4 y/o PD-1 y/o PD-L1 y/o LAG-3 a través de la muerte celular incluyen radiación, cirugía o carencia hormonal. Cada uno de estos protocolos crea una fuente de antígeno tumoral en el hospedero. Los inhibidores de la angiogénesis también se pueden combinar con una activación combinada de GITR y el bloqueo de CTLA-4 y/o PD-1 y/o PD-L1 y/o LAG-3. La inhibición de la angiogénesis provoca la muerte de células tumorales, que puede ser una fuente de antígenos tumorales alimentados hacia las trayectorias de presentación de antígenos del hospedero.
Un anticuerpo agonista anti-GITR como único agente inmunoterapéutico, o una combinación de anticuerpo agonista de GITR y anticuerpos de bloqueo de CTLA-4, PD-1, PD-L1 y/o lAG-3 también se pueden usar junto con anticuerpos biespecíficos que dirigen células efectoras que expresan los receptores Fca o Fcy a células tumorales (véanse, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Nos. 5.922.845 y 5.837.243). Los anticuerpos biespecíficos se pueden usar para dirigir dos antígenos separados. El brazo de células T de estas respuestas se podría aumentar mediante el uso de la combinación de activación de GITR y bloqueo de CTLA-4, PD-1, PD-L1 y/o LAG-3.
En otro ejemplo, un anticuerpo agonista anti-GITR como único agente inmunoterapéutico, o una combinación de un anticuerpo anti-GITR y un agente inmunoestimulador adicional, por ejemplo, un anticuerpo anti-CTLA-4 y/o un anticuerpo anti-PD-1 y/o un anticuerpo anti-PD-L1 y/o un agente lAG-3, por ejemplo, un anticuerpo, se puede usar junto con un anticuerpo antineoplásico, tal como Rituxan® (rituximab), Herceptin® (trastuzumab), Bexxar® (tositumomab), Zevalin® (ibritumomab), Campath® (alemtuzumab), Lymphocide® (eprtuzumab), Avastin® (bevacizumab), Tarceva® (erlotinib) y similares. A modo de ejemplo y sin pretender limitarse a ninguna teoría, el tratamiento con un anticuerpo antineoplásico o un anticuerpo antineoplásico conjugado con una toxina puede provocar la muerte de células cancerosas (por ejemplo, células tumorales) que podrían potenciar una respuesta inmune mediada por el agente inmunoestimulador, por ejemplo, GITR, CTLA-4, PD-1, PD-L1 o un agente LAG-3, por ejemplo, un anticuerpo. En una modalidad de ejemplo, un tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa (por ejemplo, un tumor cancerígeno) puede incluir un agente antineoplásico, por ejemplo, un anticuerpo, en combinación con anti-GITR y, opcionalmente, un agente inmunoestimulador adicional, por ejemplo, un agente anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 y/o anti-LAG-3, por ejemplo, un anticuerpo, de manera simultánea o secuencial, o una combinación de estos, lo que puede potenciar una respuesta inmune antitumoral por parte del hospedero.
Los tumores evaden la vigilancia inmune del hospedero mediante una gran variedad de mecanismos. Varios de estos mecanismos pueden lograrse mediante la inactivación de las proteínas, que son expresadas por los tumores y que son inmunodepresoras. Estas incluyen, entre otras, TGF-p (Kehrl et al. (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050), IL-10 (Howard & O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200) y ligando Fas (Hahne et al. (1996) Science 274: 1363­ 1365). Los anticuerpos de cada una de estas entidades también se pueden combinar con un anticuerpo anti-GITR con o sin un agente inmunoestimulador adicional, por ejemplo, un agente anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 y/o anti-LAG-3, tal como un anticuerpo, para contrarrestar los efectos de los agentes inmunosupresores y favorecer las respuestas inmunes antitumorales por parte del hospedero.
Otros agentes, por ejemplo, anticuerpos, que se pueden usar para activar la respuesta inmune del hospedero también se pueden usar en combinación con un anticuerpo anti-GITR con o sin un agente inmunoestimulador adicional, tal como un anticuerpo anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 y/o anti-LAG-3. Estos incluyen moléculas en la superficie de células dendríticas, que activan la función de DC y la presentación de antígenos. Los anticuerpos anti-CD40 (Ridge et al., supra) se pueden usar junto con un anticuerpo anti-GITR y, opcionalmente, un agente inmunoestimulador adicional, por ejemplo, un agente anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-Ll y/o anti-LAG-3, por ejemplo, un anticuerpo. Otros anticuerpos activadores de las moléculas coestimuladoras de células T (Weinberg et al, supra, Melero et al. supra, Hutloff et al., supra) también pueden proporcionar mayores niveles de activación de células T.
Como se discutió anteriormente, el trasplante de médula ósea se usa actualmente para tratar varios tumores de origen hematopoyético. Se puede usar inmunoterapia anti-GITR sola o en combinación con un bloqueo de CTLA-4 y/o PD-1 y/o PD-L1 y/o LAG-3 para aumentar la eficacia de las células T específicos de tumor injertados en el donante.
Varios protocolos de tratamiento experimental incluyen la activación ex vivo, la expansión de células T específicos de antígeno y la transferencia adoptiva de estos células a receptores, a fin de estimular las células T específicos de antígeno contra el tumor (Greenberg & Riddell, supra). Estos métodos también se pueden usar para activar las respuestas de las células T a los agentes infecciosos, tales como CMV. Se prevé que la activación ex vivo en presencia de anti-GITR con o sin un tratamiento inmunoestimulador adicional, por ejemplo, anticuerpos anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 y/o anti-LAG-3 aumenta la frecuencia y actividad de las células T transferidos de manera adoptiva.
En la presente se proporcionan usos médicos para alterar un evento adverso asociado al tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa (por ejemplo, cáncer) con un agente inmunoestimulador, que comprende administrar un anticuerpo anti-GITR con o sin agente anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 y/o anti-LAG-3, por ejemplo, un anticuerpo, a un sujeto. Por ejemplo, los usos médicos descritos en la presente proporcionan un uso médico para reducir la incidencia de diarrea o colitis inducida por anticuerpos terapéuticos inmunoestimuladores mediante la administración de un esteroide no absorbible al paciente. Como se usa en la presente, un “esteroide no absorbible” es un glucocorticoide que muestra un metabolismo amplio en la primera pasada, de modo que después del metabolismo en el hígado, la biodisponibilidad del esteroide sea baja, es decir, de menos de aproximadamente 20 %. En una modalidad descrita en la presente, el esteroide no absorbible es budesónida. La budesónida es un glucocorticoesteroide de acción local, que es metabolizado en forma amplia, principalmente por el hígado, después de la administración oral. ENTOCORTEc ® (Astra-Zeneca) es una formulación oral de budesónida dependiente del pH y del tiempo, desarrollada para optimizar la administración del fármaco al íleo y en el colon. ENTOCORTEC® está aprobado en los Estados Unidos para el tratamiento de la enfermedad de Crohn de leve a moderada que afecta el íleo y/o el colon ascendente. La dosis oral habitual de ENTOCORTEC® para el tratamiento de la enfermedad de Crohn es de 6 a 9 mg/día. ENTOCORTEC® se libera en los intestinos antes de ser absorbido y retenido en la mucosa intestinal. Una vez que pasa a través del tejido diana de la mucosa intestinal, ENTOCORTEC® es ampliamente metabolizado por el sistema de citocromo P450 en el hígado con metabolitos que tienen una actividad de glucocorticoides insignificante. Por lo tanto, la biodisponibilidad es baja (de aproximadamente 10 %). La baja biodisponibilidad de budesónida da como resultado una relación terapéutica mejorada en comparación con otros glucocorticoides que tienen metabolismo de primera pasada menos amplio. La budesónida da como resultado menos cantidad de efectos adversos, incluso una menor inhibición hipotalámica-hipofisaria, que los corticoesteroides de acción sistemática. Sin embargo, la administración crónica de ENTOCORTEC® puede dar como resultado efectos glucocorticoides sistémicos, tales como hipercorticismo e inhibición suprarrenal. Véase PDR 58a. ed. 2004; 608-610.
Aún en otras modalidades, una activación de GITR con o sin bloqueo de CTLA-4 y/o PD-1 y/o PD-L1 y/o LAG-3 (es decir, los anticuerpos terapéuticos inmunoestimuladores anti-GITR y, opcionalmente, los anticuerpos anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 y/o anti-LAG-3) junto con un esteroide no absorbible también se puede combinar con un salicilato. Los salicilatos incluyen agentes 5-ASA, tales como: sulfasalazina (AZULFIDINE®, Pharmacia & UpJohn); olsalazina (DIPENTUM®, Pharmacia & UpJohn); balsalazida (COLAZAL®, Salix Pharmaceuticals, Inc.); y mesalamina (ASACOL®, Procter & Gamble Pharmaceuticals; PENTASA®, Shire US; CANASA®, Axcan Scandipharm, Inc.; ROWASA®, Solvay).
De conformidad con los usos médicos descritos en la presente, un salicilato administrado en combinación con anti-GITR con o sin los anticuerpos anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 y/o LAG-3 y un esteroide no absorbible puede incluir la administración secuencial o superpuesta de salicilato y el esteroide no absorbible, a fin de disminuir la incidencia de colitis inducida por los anticuerpos inmunoestimuladores. Así, por ejemplo, los métodos para reducir la incidencia de colitis inducida por los anticuerpos inmunoestimuladores descritos en la presente abarcan administrar un salicilato y un esteroide no absorbible de manera simultánea o secuencial (por ejemplo, se administra un salicilato 6 horas después de un esteroide no absorbible), o cualquier combinación de estos. Asimismo, un salicilato y un esteroide no absorbible se pueden administrar por la misma ruta (por ejemplo, ambos se administran de manera oral) o por rutas diferentes (por ejemplo, un salicilato se administra de manera oral y un esteroide no absorbible se administra de manera rectal), que pueden ser diferentes de las rutas usadas para administrar los anticuerpos anti-GITR y anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 y/o anti-LAG-3.
Los anticuerpos anti-GITR y las terapias combinadas con anticuerpos descritos en la presente también se pueden usar junto con otros terapias conocidos que se seleccionan por su utilidad particular contra la enfermedad que se trata (por ejemplo, cáncer). Las combinaciones de anticuerpos anti-GITR descritas en la presente se pueden usar de manera secuencial con agentes farmacéuticamente aceptable conocidos.
Por ejemplo, los anticuerpos anti-GITR y las terapias combinadas descritos en la presente se pueden usar en combinación (por ejemplo, de manera simultánea o separada) con un tratamiento adicional, tal como irradiación, quimioterapia (por ejemplo, usando camptotecina (CPT-11), 5-fluorouracilo (5-FU), cisplatino, doxorrubicina, irinotecano, paclitaxel, gemcitabina, cisplatino, paclitaxel, carboplatin-paclitaxel (Taxol), doxorrubicina, 5-fu o camptotecina apo2l/TRAIL (combo x6)), uno o más inhibidores de proteasoma (por ejemplo, bortezomib o MG132), uno o más inhibidores de Bcl-2 (por ejemplo, BH3I-2' (inhibidor de bcl-xl), inhibidor de indolamina dioxigenasa-1 por ejemplo, INCB24360, inodximod, NLG-919, o F001287), AT-101 (derivado de R-(-)-gosipol), ABT-263 (molécula pequeña), GX-15-070 (obatoclax) o antagonistas de MCL-1 (proteína de diferenciación celular en leucemia mieloide 1)), antagonistas de iAP (proteína inhibidora de apoptosis) (por ejemplo, smac7, smac4, smac mimética de moléculas pequeñas, péptidos smac sintéticos (véase Fulda et al., Nat Med 2002;8:808-15), ISIS23722 (LY2181308) o AEG-35156 (GEM-640)), inhibidores de HDAC (histona desacetilasa), anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo, rituximab), inhibidores de la angiogenia (por ejemplo, bevacizumab), agentes antiangiogénicos dirigidos a v Eg F y VEGFR (por ejemplo, Avastin), triterpenoides sintéticos (véase Hyer et al., Cancer Research 2005;65:4799-808), moduladores de c-FLIP (proteína celular inhibidora de FLICE) (por ejemplo, ligandos naturales y sintéticos de PPARy (receptor y activado por proliferador de peroxisoma), 5809354 o 5569100), inhibidores de cinasa (por ejemplo, sorafenib), trastuzumab, cetuximab, temsirolimus, inhibidores de mTOR, tales como rapamicina y temsirolimus, bortezomib, inhibidores de JAK2, inhibidores de HSP90, inhibidores de PI3K-AKT, lenalildomide, inhibidores de GSK3p, inhibidores de IAP y/o fármacos genotóxicos.
Los anticuerpos anti-GITR y las terapias combinadas con anticuerpos descritos en la presente también se pueden usar en combinación con uno o más agentes citotóxicos antiproliferativos. Las clases de compuestos que se pueden usar como agentes citotóxicos antiproliferativos incluyen, entre otras, las siguientes:
Agentes alquilantes (que incluyen, entre otros, mostazas de nitrógeno, derivados de etilenimina, alquilsulfonatos, nitrosoureas y triazenos): Mostaza de uracilo, clormetina, fosfamida ciclofosfamida (CYTOXAN™), Melfalan, clorambucilo, pipobromán, trietilenmelamina, trietilentiofosforamina, busulfan, carmustina, lomustina, estreptozocina, dacarbazina y temozolomida.
Antimetabolitos (que incluyen, entre otros, antagonistas del ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina e inhibidores de adenosina desaminasa): Metotrexato, 5-fluorouracilo, floxuridina, citarabina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, fludarabina fosfato, pentostatina y gemcitabina.
Agentes antiproliferativos adecuados para combinar con anticuerpos agonistas anti-GITR, entre otros, taxanos, paclitaxel (paclitaxel se encuentra disponible en el comercio como TAXOLTM), docetaxel, discodermolida (DDM), dictiostatina (DCT), Pelorusida A, epotilonas, epotilona A, epotilona B, epotilona C, epotilona D, epotilona E, epotilona F, furanoepotilona D, desoxiepotilona B1, [17]-deshidrodesoxiepotilona B, [18]deshidrodesoxiepotilonas B, C12,13-ciclopropil-epotilona A, epotilona A C6-C8 en puente, trans-9,10-deshidroepotilona D, cis-9,10-deshidroepotilona D, 16-desmetilepotilona B, epotilona B10, discoderomolido, patupilona (EPO-906), KOS-862, KOS-1584, ZK-EPO, ABJ-789, XAA296A (Discodermolido), TZT-1027 (soblidotin), ILX-651 (clorhidrato de tasidotina), halicondrina B, mesilato de eribulina (E-7389), hemiasterlina (HTI-286), E-7974, criptoficinas, LY-355703, inmunoconjugados de maitansinoides (DM-1), MKC-1, ABT-751, T1-38067, T-900607, SB-715992 (ispinesib), SB-743921, MK-0731, STA-5312, eleuterobina, 17beta-acetoxi-2-etoxi-6-oxo-B-homo-estra-1,3,5(10)-trien-3-ol, ciclostreptina, isolaulimalido, laulimalido, 4-epi-7-deshidroxi-14,16-didesmetil-(+)-discodermolides y croptotilona 1, además de otros agentes estabilizantes de microtubulina conocidos en la técnica.
En casos en donde es conveniente hacer que las células anómalamente proliferativas se vuelvan inactivas durante o antes del tratamiento con los anticuerpos anti-GITR descritos en la presente, también se pueden administrar al paciente hormonas y esteroides (que incluyen análogos sintéticos), tales como 17a-etinilestradiol, dietilestilbestrol, testosterona, prednisona, fluoximesterona, dromostanolona propionato, testolactona, megestrolacetato, metilprednisolona, metil-testosterona, prednisolona, triamcinolona, clorotrianiseno, hidroxiprogesterona, aminoglutetimida, estramustina, medroxiprogesteronacetato, leuprolida, flutamida, toremifeno, ZOLADEx ™ . Cuando se emplean los métodos o las composiciones descritos en la presente, otros agentes que se usan en la modulación del crecimiento tumoral o metástasis en un ámbito clínico, tales como antimiméticos, también se pueden administrar según se desee.
Los métodos para una administración segura y efectiva de agentes quimioterapéuticos son conocidos por las personas expertas en la técnica. Asimismo, su administración se describe en la literatura estándar. Por ejemplo, la administración de muchos de los agentes quimioterapéuticos se describe en el manual de referencia para médicos Physicians' Desk Reference (PDR), por ejemplo, la edición de 1996 (Medical Economics Company, Montvale, N.J. 07645-1742, EE. UU.).
Los agentes quimioterapéuticos y/o la radioterapia se pueden administrar de conformidad con los protocolos terapéuticos conocidos en la técnica. Será evidente para las personas expertas en la técnica que la administración de agentes quimioterapéuticos y/o radioterapia puede variar según la enfermedad que se trata y los efectos conocidos de los agentes quimioterapéuticos y/o la radioterapia en esa enfermedad. Además, de conformidad con el conocimiento de la persona experta en la técnica, los protocolos terapéuticos (por ejemplo, la cantidad de dosis y el momento de la administración) pueden variar según los efectos observados de los agentes terapéuticos en el paciente y según las respuestas observadas de la enfermedad a los agentes terapéuticos administrados.
La presente descripción es además ilustrada por los siguientes ejemplos.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Generación de diferentes anticuerpos anti-GITR
Se generaron anticuerpos monoclonales anti-GITR humanos en cepas Hco7, Hco27, Hco20, Hco12, Hco17, y Hc2 de ratones transgénicos HuMAb® (“HuMAb” es una marca comercial de Medarex, Inc., Princeton, New Jersey) y ratones KM (la cepa KM Mouse® contiene el transcromosoma SC20 como se describe en la Publicación de PCT WO 02/43478). Ratones HC2/KCo27 HuMAb y ratones KM se generaron como se describe en las Patentes Estadounidenses Nos.
5.770.429 y 5.545.806, las descripciones completadas de las cuales están de este modo incorporadas por referencia.
Un total de 94 ratones, que incluyen 7 genotipos de ratones transgénicos (KM, Hco7, Hco27, Hco20, Hco12, Hco17 y Hc2), se inmunizaron con diferentes estrategias de inmunización (diferente antígeno, diferente dosis, duración, rutas de administración (almohadilla plantar (fp), intraperitoneal (ip) y subcutánea (sc) y adyuvante (CFA/IFA, Ribi y anticuerpo), etc). 36 fusiones de 54 ratones se realizaron y seleccionaron. Se identificaron 157 anticuerpos a partir de estas 36 fusiones, y la caracterización adicional condujo al aislamiento de anticuerpos de interés particular, incluyendo los anticuerpos designados como 28F3, 19D3, 18E10, 3C3, 2G6, 8A6, 9G7, 14E3, 19H8, y 6G10.
El secuenciamiento de ADNc identificó una cadena pesada y una cadena ligera para cada uno de los anticuerpos 28F3, 19D3, 18D10, 2G6, 8A6, 14E3 y 6G10, y una cadena pesada y dos cadenas ligeras (cadena ligera 1 o “l 1” y cadena ligera 2 o “L2”) para cada uno de los anticuerpos 3C3, 9G7 y 19H8. Para análisis de proteína, una cadena ligera única se identificó para los anticuerpos 3C3 y 9G7, y el secuenciamiento N-terminal y determinación de peso molecular indicaron que fue de cadena ligera L1 para 3C3 y cadena ligera L2 para 9G7. Con respecto al anticuerpo 19H8, 93 % de los anticuerpos expresados por el hibridoma contienen la cadena ligera L1 y 3 % contienen la cadena ligera L2. Los anticuerpos 3C3-1 y 3C3-2 corresponden al anticuerpo 3C3 con una cadena ligera L1 y L2, respectivamente. Los anticuerpos 9G7-1 y 9G7-2 corresponden al anticuerpo 9G73 con una cadena ligera L1 y L2, respectivamente. Los anticuerpos 19H8-1 y 19H8-2 corresponden al anticuerpo 19H8 con una cadena ligera L1 y L2, respectivamente. Las secuencias de aminoácido y nucleótidos de cada una de las cadenas ligeras de los 3 anticuerpos se proporcionan en la Tabla 15.
Las secuencias de aminoácido de la región variable y el isotipo de los anticuerpos 28F3, 19D3, 18E10, 3C3 (3C3-1 y 3C3-2), 2G6, 8A6, 9G7 (9G7-1 y 9G7-2), 14E3, 19H8 (19H8-1 y 19H8-2) y 6G10 se exponen en las Figuras 2-31. Las secuencias de aminoácido y nucleótido de las cadenas ligera y pesada de cada anticuerpo se proporcionan en la Tabla 15. Las cadenas pesada y ligera de 28F3 consisten de las secuencias de aminoácido de los SEQ ID NOs: 15 y 16. Las cadenas pesada y ligera de 19D3 consisten de las secuencias de aminoácido de los SEQ ID NOs: 28 y 29. Las cadenas pesada y ligera de 18E10 consisten de las secuencias de aminoácido de los SEQ ID NOs: 41 y 42. Las cadenas pesada y ligera de 3C3 consisten de las secuencias de aminoácido de los SEQ ID NOs: 55 y 56. Las cadenas pesada y ligera de 2G6 consisten de las secuencias de aminoácido de los SEQ ID NOs: 73 y 74. Las cadenas pesada y ligera de 8A6 consisten de las secuencias de aminoácido de los SEQ ID NOs: 86 y 87. Las cadenas pesada y ligera de 9G7 consisten de las secuencias de aminoácido de los SEQ ID NOs: 100 y 101. Las cadenas pesada y ligera de 14E3 consisten de las secuencias de aminoácido de los SEQ ID NOs: 117 y 118. Las cadenas pesada y ligera de 19H8-1 consisten de las secuencias de aminoácido de los SEQ ID NOs: 131 y 132. Las cadenas pesada y ligera de 19H8-2 consisten de las secuencias de aminoácido de los SEQ ID NOs: 131 y 133. Las cadenas pesada y ligera de 6G10 consisten de las secuencias de aminoácidos 337 y 338. Las secuencias de nucleótido que codifican estas proteínas se proporcionan en la Tabla 15.
Ejemplo 2: Unión de los anticuerpos anti-GITR a células T cino y humanas activadas
Los anticuerpos monoclonales humanos anti-GITR generados en el Ejemplo 1 se probaron para unión a células T humanas y cino activadas, las cuales expresan GITR en su superficie.
Células mononucleares de sangre periférica (PBMC) aisladas de mono humano o cinomólogo se activaron con anticuerpo anti-CD3 recubierto en placa (Clon: UCHT1 para activación de células T humanas; Clon: SP34 para activación de células T cinomólogas; ambas de BD Biosciences) y anticuerpo anti-CD28 soluble (Clon:CD28.2 para tanto humano como mono cinomólogo, BD Biosciences) por 4 días (humano)/ o 5 días (mono cinomólogo). Las células se probaron por unión de mAb GITR en un ensayo a base de clasificación activada por fluorescencia (FACS) usando un anticuerpo IgG anti-humano conjugado a ficoeritrina (PE) (Jackson ImmunoResearch). Las muestras se analizaron en un Citómetro de Flujo BD FACS Canto.
Los anticuerpos anti-GITR 3C3, 19D3, 18E10, y 28F3, se unen a tanto células T humanas como cinomólogas activadas. Como se muestra en la Figura 32, los anticuerpos 3C3, 19D3, 18E10, y 28F3 se unen fuertemente a células T humanas activadas, como se refleja en los valores Ec 50 de 0,04916 nM, 0,3633 nM, 0,1461 nM y 0,1916 nM, respectivamente. De manera similar, los anticuerpos 18E10 y 28F3 se unen a células T cinomólogas activadas, con valores EC50 para 18E10 y 28F3 de 0,9134 nM y 1,044 nM, respectivamente (Figura 33). El 3C3 no se une significantemente a células T cinomólogas.
Ejemplo 3: Unión de los anticuerpos anti-GITR a GITR soluble
La unión de los anticuerpos anti-GITR a GITR soluble se determinó por Biacore. Los anticuerpos anti-GITR se capturaron en chips recubiertos con kappa humano (~5KRUs; Southernbiotech cat#2060-01), y el GITR humano recombinante (rHGITR/Fc: R&D systems, CAT#689-GR) se hizo fluir a través del chip a concentraciones de 500 nM, 250 nM, 125 nM, 62 nM, y 31 nM. La concentración de captura del volúmen/mAb fue 2-40 pg/mL (5 pL a 10 pL/min). El tiempo de asociación al antígeno fue 5 minutos a 15 pL/min, el tiempo de disociación al antígeno fue 6 minutos, y se realizó regeneración con 50 mM de HCl/50 mM de NaOH (12 pL de cada uno a 100 pL/min). Los resultados obtenidos con 28F3 y varios otros anticuerpos anti-GITR se muestran en la Tabla 5.
Tabla 5: Kasoc ka Kdisoc kd K de anticuer os antiGITR
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Los resultados indican que los anticuerpos anti-GITR se unen a GITR soluble con una Kd variando desde 1,2 10'8 hasta 3,5 10'8M. Los datos se proporcionan para 2 subclones de 3C3, con una Kd variando desde 1,33 10'8 hasta 1,44 10-8M.
En un experimento Biacore separado, se determinaron las características de unión de los anticuerpos que tienen las regiones variables de 28F3 con tres diferentes regiones constantes. El primer anticuerpo 28F3 tiene una región constante IgG1 de tipo silvestre (“g1f”, también referida como “g1” o “ IgG1” o “IgG1f”; cadena pesada que tiene el SEQ ID NO: 17 y cadena ligera que tiene el SEQ ID NO: 19). El sufijo “f” se refiere al alotipo. El segundo anticuerpo tiene una región constante IgG1 menos efectora que tiene tres mutaciones en la región Fc (“g1.1f”, también referida como “g1.1”, “ IgG1.1” y “IgG1.1f” que tiene L234A, L235E, G237A; la cadena pesada que tiene SEQ ID NO: 18 y la cadena ligera que tiene el SEQ ID NO: 19); y el tercer anticuerpo 28F3 tiene una región constante IgG1 que tiene una mutación N297A.
El experimento Biacore se condujo como se describe anteriormente, excepto que los chips se recubrieron con anti-CH1 (Invitrogen Ref# 054500). Los resultados, los cuales se muestran en la Tabla 6, indican que todos los tres anticuerpos tienen características de unión similares, con una Kd variando desde 3,93 x 10'8 M a 4,39 x 10'8 M.
Tabla 6: Características de cinética de 28F3 ue tiene varios Fc
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Ejemplo 4: Afinidad de unión de los anticuerpos anti-GITR a células T humanas activadas y células 3A9-huGITR
La unión de los anticuerpos anti-GITR a GITR en células T humanas activadas y línea de células 3A9 de hibridoma de células T de ratón las cuales expresan ectópicamente GITR humano (3A9-hGITR) se determinó por análisis Scatchard. Este ensayo se condujo con 28F3.IgG1.1 (SEQ ID NO: 18 para la cadena pesada y SEQ ID NO: 19 para la cadena ligera) a 4,59 mg/mL.
El análisis Scatchard en células T humanas activadas se condujo como sigue. Las células T obtenidas a partir de un donador humano se lavaron una vez con medio de cultivo (RPMI con 10 % de FBS, 2mM de L-Glutamina, Piruvato de sodio, 2-mercaptoetanol) y se resuspendieron en el mismo medio de cultivo suplementado con 1 pg/mL de anti-CD28 (CD28.2, BD#555725) y 100U/mL de IL-2 (Peprotech#200-02) a 106células/mL. Células 5x106cada una se plaquearon en tres cavidades de una placa de 6 cavidades la cual se recubrió con 20ug de anti-CD3 (5mL, 4 pg/mL, durante la noche a 4°C; UCHT-1, BD#555329). Las células se incubaron por 3 días a 37°C, y la mitad de estas células se usaron para análisis Scatchard (análisis “día 3”). El medio agotado de la otra mitad se reemplazó con 5 mL de medio fresco y las células se incubaron por otro día, y después se usaron para análisis Scatchard (análisis “día 4”) con estas células.
Para el análisis Scatchard, 28F3.IgG1.1 fue radio yodado con 125I-Na (Perkin Elmer# NEZ033H001MC (1mCi) usando reactivo de yodación de fase sólida IODO-GEN® (1,3,4,6-tetracloro-3a-6a-difenilglicurilo; Pierce #28601). El exceso de yodo se removió usando una columna de desalación (Pierce #43243). Las fracciones del anticuerpo etiquetado se recolectaron y analizaron por radioactividad en un contador gamma Wizard 1470 (Perkin-Elmer). La concentración de 125I-28F3.IgG1.1 en cada fracción se calculó en el fluorómetro Qubit™ de Invitrogen. La radiopureza se estableció por cromatografía de capa delgada de la proteína pico y las fracciones radioactivas (Pinestar Technology #151-005).
El 28F3.IgG1.1 radio yodado que se une a células T humanas activadas se demostró mediante incubación de células T humanas activadas con una titulación de 125I-28F3.IgG1.1. La unión no específica se determinó por unión en la presencia de una titulación de 100 veces el exceso molar de anticuerpo no etiquetado y se sustrajo de CPM total para calcular la unión específica. Una curva lineal estándar de concentración de 125I-28F3.IgG1.1 contra CPM se usó para extrapolar el nM máximo unido a 125I-28F3.IgG1.1 y de este modo calcular el número de receptores por células. El número de moléculas de GITR humano por células T CD4+ humanas estimuladas en el día 3 fue aproximadamente 8.400. y en el día 4, aproximadamente 13.200. Los resultados del análisis Scatchard indican que 28F3.IgG1.1 se une específicamente a células T CD4+ humanas estimuladas 3 días con una Kd de 0,7 nM y células T CD4+ humanas estimuladas 4 días con una KDde 0,87 nM.
El 28F3.IgG1.1 radio yodado que se une a células 3A9-huGITR se demostró por incubar 3A9-huGITR células con una titulación de 125I-28F3.IgG1.1. La unión no específica se determinó por unión en la presencia de una titulación de un exceso molar de 100 veces de anticuerpo no etiquetado y se sustrajo de CPM total para calcular la unión específica. Una curva lineal estándar de concentración de 125I-28F3.IgG1.1 contra CPM se usó para extrapolar el nM máximo unido a 125I-28F3. IgG1.1 y de este modo calcular el número de receptores por células. El número de moléculas de GITR humano por células 3A9-huGITR fue aproximadamente 180.000. Los resultados del análisis Scatchard indican que 28F3.IgG1.1 se une específicamente a células 3A9-huGITR con una Kd de 0,5 nM.
En otro experimento, se determinó la unión de 28F3.IgG1 y 28F3.IgG1.1 a células T CD4+ y CD8+ activadas de donadores cino y humanos. Células T CD4+ y CD8+ de humano y cino se aislaron a partir de donadores humanos y cino, y se trataron con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 para activación. Los resultados indican que 28F3.IgG1 y 28.IgG1.1 se unen de manera similar a, con EC50s de 0,55 nM y 0,67 nM, respectivamente, y de manera similar a células CD8+ humanas activadas, con EC50s de 0,56 nM y 0,65 nM, respectivamente. 28F3.IgG1 y 28.IgG1.1 se unen a células CD4+ cino activadas, con EC50s de 1 nM y 0,86 nM, respectivamente, y de manera similar a células CD8+ cino activadas, con EC50s de 1,26 nM y 0,74 nM, respectivamente.
Ejemplo 5: Anticuerpos anti-GITR monoclonales humanos inhiben la unión de GITR-L a GITR
Para determinar si los anticuerpos anti-GITR HuMab inhiben la unión del ligando del GITR al GITR, la línea de células 3A9 de hibridoma de células T de ratón las cuales expresan ectópicamente GITR humano (células GITR-3A9) se pre­ incubaron con GITR mAbs a concentraciones que varían desde 10'4 pg/mL hasta 100 pg/mL, seguido por incubación del ligando GITR (R&D Systems#6987-GL) a una concentración de 10 ng/mL. La unión del ligando GITR en células se determinó en un ensayo a base de FACS usando un anticuerpo etiquetado con anti-hemaglutinina (HA) conjugado a PE, y las muestras se analizaron en un Citómetro de Flujo BD FACS Canto. Como se muestra en la Figura 34A y 34B, bajo estas condiciones, los anticuerpos 19D3, 28F3, y GITR.3 (3C3) todos bloquean la unión de células GITR-L a GITR-3A9, con valores EC50 de 0,7546, 0,2783, y 0,06934, respectivamente. Se obtuvieron resultados similares con el anticuerpo 19H8.
Otra serie de experimentos se condujo bajo condiciones diferentes para evaluar además la extensión a la cual los anticuerpos anti-GITR bloquean la unión de GITR-L a GITR. En estos experimentos, un trímero hGITR-L recombinante a concentraciones de 1,06 x 10'9 hasta 100 mg/ml se agregó a células T humanas activadas y se unió en una manera dependiente de la dosis a células T CD4+ y CD8+ con valores EC50 de 0,016 ug/ml (Figura 34C). El experimento se condujo como sigue: Trímero hGITR-L recombinante (R&D Systems Cat. 6987-GL) a concentración de 1,06e-9 hasta 100 pg/mL se agregó a células T activadas por PHA. Después de una incubación primaria de 30 minutos, el GITR-L unido a la célula se detectó usando etiqueta anti-HA conjugada a PE (Miltenyi Cat. 120-002-687). Las muestras se adquirieron en un Citómetro de Flujo FACs Canto (BD, San Jose) y se analizaron con software FlowJo (Tree Star, Inc, Ashland, OR).
La pre-unión de rhGITR-L a concentraciones de 1,06 x 10'9 hasta 100 ug/ml en células T activadas bloquea la unión de subsecuente de 0,5 ug/ml de 28F3-hIgG1 (aproximadamente 90 % de saturación) con una IC50 de 0,0024 ug/ml. Puesto que a 100 ug/ml el MFI no va al valor de referencia (el control de IgG), la inhibición fue parcial (Figura 34D). El experimento se condujo como sigue: células T activadas PHA se trataron primero con titulación de 3 veces de 24 puntos de trímero de GITR-L recombinante (R&D Systems 6987-GL), partiendo a 100 pg/mL, por 30 minutos. Se agregó 28F3-hIgG1 subsecuentemente a una concentración fija de 0,5 pg/mL a la mezcla celular, la cual se sometió a otros 30 minutos de incubación. El 28F3-hIgG1 unido a la célula se detectó usando anticuerpo secundario conjugado a PE contra Fc IgG humano (Jackson ImmunoResearch Cat. 109-116-098). Un Ab hIgG1 no relacionado se usó como un control de isotipo para 28F3-hIgG1 mientras que una muestra sin pre-incubación de GITR-L se incluyó para mostrar la unión de 28F3-hIgG1 en la ausencia de bloqueo. Las muestras se adquirieron en un Citómetro de Flujo FACS Canto (BD, San Jose) y se analizaron con software FlowJo (Tree Star, Inc, Ashland, OR).
Cuando las células T activadas se pre-incubaron con 28F3-hIgG1 a concentraciones que varían desde 1,06 x 10'9 hasta 100 ug/ml, la unión de GITR-L a 0,6 ug/ml (aproximadamente 90 % de saturación) no se afectó (Figura 34E). Sin embargo, cuando el GITR-L se agregó a una concentración inferior de 20 ng/ml, cerca de su EC50, su unión se bloqueó parcialmente por el 28F3-hIgG1 pre-unido con una IC50 de 0,076 mg/ml (Figura 34F). Los experimentos se condujeron como sigue: Células T activadas por PHA se pre-incubaron con 28F3-hIgG1 a concentraciones que varían desde 0,00056 hasta 100 pg/mL, seguido por la adición de 0,6 ug/ml o 20 ng/mL de GITR-L. El GITR-L unido a la célula se detectó con etiqueta anti-HA conjugada a PE. Un hIgGI no relacionado se incluyó como un control de isotipo para 28F3-hIgG1 y una muestra sin anticuerpo primario se usó para mostrar la unión de GITR-L sin bloqueo. Las muestras se adquirieron en un Citómetro de Flujo FACS Canto (Bd , San Jose) y se analizaron con software FlowJo (Tree Star, Inc, Ashland, OR).
Estos datos muestran que 28F3-hIgG1 es un bloqueador de ligando parcial el cual puede permitir algún acoplamiento in vivo de GITR por G iTr-L.
Ejemplo 6: Todos los anticuerpos anti-GITR se contienen en un grupo
Se condujeron experimentos de contención de anticuerpo con los siguientes anticuerpos anti-GITR humanos: 28F3, 18E10, 19D3, 14E3, 8A6, 9G7, 3C3, y6G10.
Los anticuerpos anti-GITR se inmovilizaron en superficies de chip Sensor Chip CM5 (Series S, GE Healthcare CAT# BR-1005-30), flowcell2, flowcell3 y flowcell4 (5000 RUs), y flowcelll se usó como un control negativo. Los anticuerpos se diluyeron a 120 pg/mL (2X) a concentraciones de partida. Se hicieron una serie de diluciones para dilución 1:3 de concentraciones de anticuerpo con amortiguador por ocho concentraciones diferentes (120 pg/ml-0,0 pg/ml, 2X) para obtener una curva de titulación. Cada serie de concentración de anticuerpo se dividió en dos mitades. En la primera mitad de la serie de concentraciones, se agregaron 40 nM (2X) de antígeno GITR (rHGITR/Fc CAT# 689-GR) para hacer las series de concentración final (60 pg/ml-0,0 pg/ml) y 20 nM de concentración de antígeno final en cada cavidad. En la segunda mitad de las series de concentración, en lugar del antígeno, se agregó amortiguadora la mitad del anticuerpo diluido a la misma concentración, y esta mitad se trató como el blanco. Los complejos se incubaron por 2 horas. 40 pL de complejos se inyectaron en la superficie cubierta de anticuerpo a una velocidad de flujo de 30 pL/min. Se usó un instrumento Biacore T200 y el amortiguador de corrida fue HBE-EP, GE Healthcare Ca T# BR-1001-88, Filtrado, desgasificado, 0,01M de HEpES, pH7,4, 0,15 de NaCl, 3Mm de EDTA, 0,005 % de Tensioactivo P20. La superficie se regeneró con 25 mM de NaOH (Código de orden: BR-1003-58, GE Healthcare) a 100 pL/min por 5 segundos. Los datos se analizaron usando Microsoft Excel donde las series de concentración de anticuerpo se trazaron contra la unidad de respuesta correspondiente para obtener curvas de titulación.
Los resultados indican que todos los anticuerpos probados se contienen en un grupo, indicando que todos se unen a una región similar de la región extracelular de GITR humano.
Ejemplo 7: Los anticuerpos anti-GITR se unen a un epítopo conformacional
Este Ejemplo muestra que los anticuerpos anti-GITR 28F3 y 3C3 se unen a GITR humano no desnaturalizado, pero no al GITR humano desnaturalizado, y que la unión no es afectada por glicosilación N- u O-ligada.
La unión de los anticuerpos anti-GITR a GITR nativo o desnaturalizado que tiene o no tiene glicosilación N-ligada se determinó como sigue. Muestras de GITR humano nativo (es decir, no desnaturalizado) y desnaturalizado, se incubaron con o sin la enzima N-glicanasa PNGasa F a 37 °C en PBS durante la noche para remover la N-glicosilación. La duración de GITR se hizo por reducción a 37 °C en 50 mM de ditiotreitol y 4 M de clorhidrato de guanidina por 45 minutos, y después seguido por alquilación en 100 mM de yodoacetamida por 20 minutos a temperatura ambiente. Las muestras de GITR humano nativo con o sin glicosilación N-ligada se sometieron a electroforesis en gel SDS, y las muestras de GITR desnaturalizado con o sin glicosilación N-ligada se sometieron a desnaturalización de electroforesis en gel SDS. Las proteínas se transfirieron en membrana de nitrocelulosa para análisis de Western blot. La membrana se incubó con el anticuerpo 28F3. La unión se detectó por incubación con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (etiquetada con HRP) específica a cadenas pesada y ligera de IgG humano (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), y seguida por detección por luminiscencia capturada en película. Los resultados, los cuales se muestran en las Figuras 35A-35B, indican que el Ab anti-GITR 28F3 se une solamente a GITR nativo, y no a la forma desnaturalizada, y que la presencia o ausencia de sitios de glicosilación no afecta la unión. Se obtuvieron resultados similares con el anticuerpo anti-GITR 3C3.
De este modo, los anticuerpos anti-GITR 28F3 y 3C3 se unen a un epítopo que es conformacional e independiente de glicosilación N-ligada y O-ligada.
Ejemplo 8: Patrones de unión de 28F3 y 3C3 a péptidos GITR humanos nativos
El patrón de unión a 28F3 y 3C3 a GITR humano se investigó para probar la unión de estos anticuerpos a péptidos generados a partir de GITR humano nativo por SDS-PAGE y análisis de Western blot. El experimento se condujo como sigue. Primero, el GITR humano nativo se sometió a proteólisis por incubación con Endoproteinasa Arg-C, Endoproteinasa Lys-C, Tripsina, Endoproteinasa Glu-C o Endoproteinasa Asp-N a una relación al 2 % en p/p a 37OC en p Bs por 5 horas sin la presencia de reactivos de desnaturalización. La mezcla de reacción completa, 2 |jg de cada digestión, entonces se sometió a electroforesis SDS-PAGE no desnaturalizante, y se transfirió en nitrocelulosa para análisis de Western blot. Los Western blots se incubaron entonces con anticuerpo 28F3 o 3C3, y la unión detectada se detectó por incubación con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (etiquetado HRP) específico a cadenas pesada y ligera de IgG anti-humano (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), y seguido por detección de luminiscencia capturada en película. Los resultados, los cuales se muestran en las Figuras 36A y 36B, indican que el patrón de unión de 28F3 y 3C3 es diferente, sugiriendo que estos anticuerpos no se unen a la misma región de GlTR humano de manera exacta.
Ejemplo 9: Anticuerpo anti-GITR 28F3 se une al N-término del dominio extracelular de GITR humano
La ubicación de la región en GITR humano a la cual 28F3 se une, se determinó para probar la unión en solución del anticuerpo a varios fragmentos no desnaturalizados de GITR humano. El experimento se condujo como sigue: fragmentos peptídicos de GITR humano se generaron por incubación de GITR humano con Endoproteinasa Arg-C, Endoproteinasa Lys-C, Tripsina, Endoproteinasa Glu-C o Endoproteinasa Asp-N a una relación al 2 % en p/p a 37OC en PBS por cinco horas en la presencia de reactivos de desnaturalización. La mezcla peptídica entonces se incubó con perlillas de Ab anti-GITR en PBS a temperatura ambiente por dos horas. Algunas muestras se sometieron a escisión secundaria in situ por incubación con una enzima diferente en PBS por una hora. Los péptidos no unidos se removieron lavando las perlillas de Ab anti-GITR dos veces con PBS. Los péptidos que se unen en Ab anti-GITR 28F3 se eluyeron con 2 % de ácido fórmico, y después se sometieron a identificación de secuencia por LC-MS. Los resultados, los cuales se muestran como un mapa de calor en la Figura 37, indican que 28F3 se une a un epítopo conformacional dentro del siguiente estiramiento de aminoácido N-terminal:
QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGE (SEQ ID NO: 215), el cual corresponde a los residuos de aminoácido 1 a 39 del GITR humano maduro (SEQ ID NO: 4) o dentro del fragmento más corto QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTR (SEQ ID NO: 370).
Ejemplo 10: La glicosilación O-ligada en GITR humano no interfiere con la unión de 28F3
No existe glicosilación O-ligada conocida o documentada en el dominio extracelular de GITR humano. Sin embargo, los residuos T18 y T20 del SEQ ID NO: 215 contienen una secuencia consenso de O-glicosilación. Estos residuos están subrayados en la secuencia de epítopo:
QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGE (SEQ ID NO: 215). Por lo tanto, se determinó si la glicosilación O-ligada afecta la unión de 28F3 a GITR humano.
La unión de 28F3 a un péptido glicosilado o no glicosilado que consiste del SEQ ID NO: 215 se condujo como sigue: péptidos N-terminales parcialmente glicosilados y no glicosilados de GITR humano se generaron por proteólisis del dominio extracelular de GITR humano nativo intacto ligado a Fc de ratón. Un péptido del GITR no glicosilado que consiste de los residuos de aminoácido 1 a 39 del SEQ ID NO: 215 también se generó por síntesis orgánica. Los procedimientos para unión de 28F3 a los péptidos se describen en la sección previa (usando perillas recubiertas de 28F3). Como se muestra en la Figura 38B, dos péptidos se encontraron por unirse a las perlillas recubiertas de 28F3, y estos se identificaron por LC-MS por ser el péptido N-terminal sin glicosilación O-ligada (Figura 38A) y el otro es el mismo péptido N-terminal glicosilación O-ligada en T18 y/o T20 del SEQ ID NO: 215 (Figura 38D).
De este modo, el 28F3 se une a la región N-terminal de GITR humano con respecto de si tiene un azúcar O-ligado en el aminoácido T18 y/o T20.
Ejemplo 11: Unión de anticuerpo anti-GITR 28F3 a un 20-mer
Como parte del experimento descrito en el Ejemplo previo, un péptido sintético que tiene el SEQ ID NO: 215 que no tiene alguna glicosilación O-ligada se unión primero sobre las perillas recubiertas de 28F3, y después se escindió por digestión in situ con endoproteinasa Asp-N. El péptido restante, que consiste de la secuencia de aminoácido QRPTGGPGCGPGRLLLGTGT (SEQ ID NO: 216) y que contiene los residuos de aminoácido T18 y T20 sin la glicosilación O-ligada, se une a 28F3 (Figura 38E). De este modo, 28F3 se une a un 20-mer que consiste del SEQ ID NO: 216.
Ejemplo 12: Mapeo de epítopo para HDX-MS
El método de espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio (HDX-MS) prueba la conformación de proteína y dinámicas de conformación en solución monitoreando la velocidad y extensión del intercambio de deuterio del esqueleto de los átomos de hidrógeno de amida. El nivel de HDX depende de la accesibilidad del solvente de los átomos de hidrógeno de amida de la estructura y las uniones de hidrógeno de la proteína. El incremento de masa de la proteína sobre HDX puede ser medido de manera precisa por MS. Cuando esta técnica es apareada con digestión enzimática, las características de estructura al nivel del péptido pueden ser resueltas, permitiendo la diferenciación de los péptidos expuestos a la superficie a partir de aquellos plegados dentro. Normalmente, se realizaron experimentos de apagado subsecuente y etiquetación de deuterio, seguido por digestión de pepsina en línea, separación del péptido, y análisis de MS.
Previo al mapeo de epítopo de mAb 28F3.IgG1 (que tiene una cadena pesada y ligera que consiste de los SEQ ID NOs: 17 y 19, respectivamente) en GITR por HDX-MS, se realizaron experimentos no deuterados para generar una lista de péptidos peptídicos comunes para GITR humano recombinante/Fc (R&D systems, 10 j M, el cual contiene la sustitución de aminoácido T20A) y complejo de proteína de GITR humano recombinante/Fc y mAb de 28F3.IgG1 (relación 1:2 molar, 10 j M y 20 j M), logrando una cobertura de secuencia de 86 % para la región N-terminal de GITR (Figura 39A). En este experimento, 10 mM de amortiguador de fosfato (pH 7,0) se usaron durante la etapa de etiquetado, seguido por adición de amortiguador de apagado (200 mM de amortiguador de fosfato con 4M de GdnCl y 0,5M de TCEP, pH 2,5, 1:1, v/v). Para experimentos de mapeo de epítopo, 5 j L de cada muestra (GITR/Fc o GITR/Fc con mAb de 28F3.IgG1 (relación molar 1:2)) se diluyó en 55 j L de amortiguador D2O (10 mM de amortiguador de fosfato, D2O, pD 7,0) para iniciar las reacciones de etiquetación a temperatura ambiente. Las reacciones se llevaron a cabo por diferentes periodos de tiempo: 20 seg, 1 min, 10 min, 60 min y 240 min. Para el final de cada periodo de reacción de etiquetado, la reacción se apagó agregando amortiguador de lavado (1:1 v/v) y 50 j L de muestra apagada se inyectaron en sistema Waters HDX-MS para análisis. Los péptidos peptídicos comunes observados se monitorearon en sus niveles de absorción de deuterio en la ausencia/presencia de mAb 28F3.IgG1.
Los datos experimentales mostrados en las Figuras 39B y 39C obtenidos a partir de mediciones de HDX-MS en mAb 28F3.IgG1 en GITR indican que el mAb 28F3.IgG1 tiene un epítopo discontinuo comprendido de (o dentro de) dos regiones peptídicas en la región N-terminal de GITR:
Región peptídica 1: PTGGPGCGPGRLLLGTGA (SEQ ID NO: 217)
Región peptídica 2: CRDYPGEE (SEQ ID NO: 218)
Con base en los cambios de niveles de absorción de deuterio relativos, las dos regiones peptídicas pueden ser clasificadas como región 1 > 2 con la región 1 que tiene los cambios más significantes en la absorción de deuterio, y con la región 2 siendo estadísticamente significante.
Ejemplo 13: Los anticuerpos anti-GITR inducen secreción de IL-2 e IFN-y a partir de células T
Los anticuerpos anti-GITR se probaron por su capacidad para mejorar la actividad de células T in vitro para medir la cantidad de IL-2 e IFN-y secretada por células T incubadas con los anticuerpos.
La línea de células 3A9 de hibridoma de células T de ratón las cuales expresan ectópicamente GITR humano (3A9-hGITR) se cultivó en placas recubiertas de anticuerpo monoclonal anti-CD3 en la presencia de cantidades incrementadas de anticuerpos 19D3, 18E10, y 28F3. Células 3A9-hGITR 5 x 104 se cultivaron en placas recubiertas con 1 jg/m l de anticuerpo anti-CD3 (Clon 145-2C11; BD Biosciences), y se trataron con las concentraciones indicadas de anticuerpos por 24 horas. Como se muestra en la Figura 40, los anticuerpos 3C3 (GITR.3), 28F3, 19D3, y 18E10, todos mejoran la secreción de IL-2 de células T en una manera dependiente de la dosis. Como se esperaba, los anticuerpos de control hIgG1 e hIgG2 no incrementan la secreción de IL-2 a partir de células 3A9-hGITR.
Dado que los anticuerpos anti-GITR mejoran la secreción IL-12 de células 3A9-hGITR en la presencia de señal CD3 estimuladora, se probó la capacidad de los anticuerpos para mejorar la secreción de IL-2 a partir de células 3A9-hGITR activadas por un antígeno específico. Células 3A9-hGITR 5 x 104 se co-cultivaron con 2.5 x 104 de células que presentan antígeno LK35.2 en la presencia de 0,4 j M de péptido HEL48-63 y los anticuerpos indicados por 24 horas. Como se muestra en la Figuras 41A y 41B, los anticuerpos 18E10, 13H2 (mismo anticuerpo como 28F3), 28F3, 3C3, y 19D3 mejoran la secreción IL-12 de células 3A9-hGITR en una manera dependiente de la dosis.
En experimentos adicionales, se probó el efecto de 28F3 en la secreción de IL-2 e IFN-y por células T en células T humanas donadoras que fueron estimuladas con anti-CD3scFv (OKT3) para expresar células CHO. Las células CHO expresan niveles bajos de OKT3 para promover la estimulación subóptima por ser capaz de observar el agonismo por los anticuerpos anti-GITR. En una serie de experimentos, las células T CD3+ a partir de un donador fueron estimuladas con células CHO que expresan OKT3 y un anticuerpo anti-GITR, y se midió la secreción IFN-y, y en una segunda serie de experimentos, células T CD4+ a partir de 2 donadores (diferentes del donador de células T CD3+) fueron estimuladas con células CHO que expresan OKT3 y un anticuerpo anti-GITR, y se midió la secreción IL-2 e IFN-y. Los experimentos se condujeron como sigue. Células T Pan se obtuvieron de PBMC humanos aislados de gradiente Ficoll (Amersham Bioscience 17-1440-03) con kit de aislamiento de células Pan T (Miltenyi#130-091-156) de conformidad con el protocolo del fabricante. Para experimentos con células T CD4+, se obtuvieron células T CD4+ a partir de PBMC humanas (donadores 1 y 2) con cóctel de enriquecimiento de células T CD4+ humanas RosetteSep (StemCell Technology#15062) de conformidad con el protocolo del fabricante. Células CHO que expresan anti-CD3scFv (OKT3) (CHO-OKT3) se lavaron dos veces con medio RPMI y se sometieron con una dosificación de 50K Rad. Las células fueron recolectadas y se resuspendieron en medio de cultivo (RPMI-1640 suplementado con 10 % de Suero Bovino Fetal, 2mM de L-glutamina, 55nM de p-Mercaptoetanol, 1mM de piruvato de sodio, y 100U/mL de Penicilina/estreptomicina) a 2,5x105/mL. Células CHO-OKT32,5x104 y células T 1x105 fueron sembradas por cavidad en una placa de fondo plano de grado TC de 96 cavidades (Costar). Las células se incubaron con una titulación de 3-veces de 8 puntos de anticuerpo GITR partiendo a 20 |jg/mL Un hIgGI no relacionado se agregó a 20 jg/m L como un control de isotipo. Una muestra con células se incluyó solamente para mostrar la actividad del valor de referencia sin algún tratamiento. El sobrenadante de cada muestra se recolectó al día 2 para medición de IL-2 (solamente para ensayos con células T CD4+) (kit ELISA BD optEIA Humano IFN-g; BD Bioscience#555190) y al día 3 para medición del IFN-y (Kit ELISA BD optEIA Humano IFN-g; BD Bioscience#555142).
Los resultados, los cuales se muestran en la Figura 42B-E, indican un incremento de 28F3 dependiente de la dosis en la secreción de IL-2 e IFN-y para células T CD4+ para ambos donadores.
La secreción de IFN-y por células T donadoras estimuladas con otros anticuerpos anti-GITR también se demostró. El ensayo se condujo como se describe anteriormente. Como se muestra en la Figura 42A, los anticuerpos 28F3, 3C3, 19D3, y 18E10, todos mejoraron la secreción del IFN-y a partir de células T CD3+ en una manera dependiente de la dosis, con anticuerpos 28F3 y 3C3 que muestran el efecto más grande de los anticuerpos probados.
En otro experimento, la proliferación de células T en la presencia de los anticuerpos anti-GITR, en particular, 28F3, se observó en las reacciones combinadas del linfocito (MLR).
Colectivamente, estos datos indican que los anticuerpos 18E10, 19D3, y 28F3 funcionan como anticuerpos agonistas anti-GITR que mejoran la secreción de citocinas a partir de células T.
Ejemplo 14: Los anticuerpos anti-GITR activan las respuestas de células T independientemente de interacción FcR in vitro
Se ha reportado que los anticuerpos anti-TNFR agonistas requieren coacoplamiento del FcyRIIB por su actividad in vivo (Li et al., Cell Cycle 2012;11:3343-3344). Para determinar si este requerimiento también se extiende a los anticuerpos anti-GITR, células 3A9-hGITR fueron co-cultivadas con células LK35.2 y el péptido HEL48-63 como se describe en el Ejemplo 13, se trató con el anticuerpo anti-GITR 28F3 (hIgG2) de longitud completa, fragmento F(ab')2 de 28F3 o fragmento Fab de 28F3, y se evaluó por la producción de mIL-2. Los resultados, los cuales se exponen en la Figura 43, muestran que tanto el fragmento 28F3 de longitud completa como el fragmento F(ab')2 de 28F3 mejoran la producción de mIL-2, aúnque el fragmento Fab de 28F3 tiene un efecto más débil, sugiriendo que el acoplamiento bivalente pero no monovalente, contribuye al efecto del anticuerpo anti-GITR 28F3. Estos resultados sugieren colectivamente que aúnque el co-acoplamiento del FcyRIIB no es requerido para los efectos de mejoramiento de células T de los anticuerpos agonistas anti-GITR in vitro, el acoplamiento del receptor del FcyRIIB puede potenciar la actividad agonista. Los anticuerpos anti-GITR pueden ser diseñados por ingeniería genética para incrementar la unión al receptor FcyRIIB para incrementar su agonismo.
Ejemplo 15: El anticuerpo anti-GITR 28F3 etiqueta los linfocitos en una amígdala humana
Para determinar cuales tejidos expresan GITR, el anticuerpo anti-GITR 28F3 se usó para detección inmunohistoquímica de GITR en varios tejidos. Se encontró teñido no específico en tejidos no linfoides (que incluyen corazón, hígado, pulmón, riñón, piel, nervio periférico, tiroides, testículos, próstata). El teñido positivo se observó solamente en subseries dispersadas de linfocitos y/o células mononucleares en tejidos linfoides (que incluyen amígdalas, bazo y timo) y tejidos ricos en linfoides (lámina propia de colon, estómago, útero). El teñido en la amígdala se muestra en la Figura 44. El teñido positivo se observó en linfocitos dispersados en la región inter/para-folicular y el centro germinal. Los grupos dispersados de células mononucleares (detrás del epitelio) y linfocitos de infiltración del epitelio también se tiñeron positivo.
Ejemplo 16: Actividad antitumoral de isotipos anti-GITR variantes en modelo de tumor MC38
El DTA-1 es un anticuerpo GITR anti-ratón de rata agonista (Shimizu et al., 2002; eBioscience, San Diego, CA). Este anticuerpo IgG2b ha sido mostrado por modular tanto Tregs como Tefs durante el tratamiento de melanoma B16. En adición, la expresión de GITR la expresión de ambos Tefs como Tregs fue necesaria para los efectos completos de DTA-1. Cohen et al. (2010) sugiere que mientras la ligación de GITR por DTA-1 no abroga globalmente la actividad supresora de Treg, altera la infiltración del tumor Treg y tiende a pérdida de la expresión de Foxp3 dentro de Tregs intratumorales, implicando una abrogación localizada de supresión. El resultado neto es una relación Tef:Treg intratumoral aumentada y mayor activación y función de Tef dentro del tumor. El DTA-1 bloquea la interacción entre el GITR y ligando GITR (GITRL) y el anticuerpo soluble es efectivo en promover una respuesta de células in vitro. También es eficaz en varios modelos de tumor en la inhibición del crecimiento del tumor (véase, por ejemplo, Turk et al., 2004; Cohen et al., 2010).
a) Experimento MC38 #1
La actividad antitumoral de los diferentes isotipos anti-GITR (DTA-1) se evaluó en un modelo de tumor de adenocarcinoma de colon MC38 por etapas. Ratones C57BL/6 se inyectaron cada uno subcutáneamente con 2 x 106 de células tumorales MC38. Después de 7 días, los ratones se aleatorizaron en 5 grupos de tratamiento y anticuerpos de prueba fueron administrados IP en los días 7, 10 y 14 a 200 |jg por dosis en un volumen de 200 j l como sigue: Grupo 1: control IgG1 de ratón (IgG); Grupo 2: Ab IgG2b de rata anti-GITR (DTA-rG2b); Grupo 3: Ab IgG1 de ratón anti-GITR (DTA-mG1); y Grupo 4: Ab 2a IgG de ratón anti-GITR (DTA-mG2a). Los tumores y bazos fueron recolectados en el día 15.
La Figura 45C muestra que los tumores tratados con IgG1 anti-GITR crece a una velocidad comparable con aquella de tumores tratados con el control IgG1 de ratón (Figura 45A), ninguno de los 10 ratones están libres de tumor (TF) por el final del monitoreo del ratón. Sin embargo, DTA-rG2b (Figura 45B) y DTA-mG2a (Figura 45D) reducen significantemente la velocidad de crecimiento del tumor, con 3 y 2 de 10 ratones, respectivamente siendo TF.
Los cambios en los volúmenes medios del tumor y volúmenes medianos del tumor de los ratones de grupos tratados con los diferentes isotipos anti-GITR se trazaron en las Figuras 46A y 46B. Estos trazos confirman que los datos del ratón individual muestran en la Figura 45 que el isotipo IgG2b del anticuerpo anti-GITR presenta el efecto inhibidor más potente en el crecimiento del tumor MC38, con el isotipo IgG2a solamente ligeramente menos potente. El isotipo IgG1 muestra poca inhibición del crecimiento del tumor, con los volúmenes de tumor media y mediano siendo similares a aquellos en ratones tratados con el control de IgG de ratón.
Los efectos de isotipos anti-GITR en subseries de células T MC38 en TIL y bazo también se determinaron. Las poblaciones de subseries de células T en TLs MC38 y bazos de ratones tratados con los diferentes isotipos anti-GITR fueron comparados. En el bazo, DTA-m2a y DTA-r2b causaron una ligera reducción en el nivel de células CD8+ mientras el 9D9-m2a (un anticuerpo anti-CTLA-4) y DTA-m1 no altera los niveles de células T CD8+ (Figura 47A). Ninguna de las variantes de isotipo probadas tiene un efecto significante en el porcentaje de células CD4+ o CD4+Foxp3+ en el bazo (Figuras 47B y 47C).
En TIL, el 9D9-m2a causó al menos un incremento de 2 veces en el porcentaje de células CD8+ comparado con tanto el control IgG1 de ratón (Figura 47D). El DTA-m2a tiene un efecto menos pronunciado, incrementando el porcentaje de células CD8+ aproximadamente 50 %, mientras el DTA-m1 y DTA-r2b causa ninguno, o solamente un incremento marginal en el porcentaje de células CD8+, comparado con el control de isotipo IgG1 de ratón (Figura 47D). El 9D9-m2a causa un pequeño incremento en el porcentaje de células CD4+ comparado con el control de isotipo IgG1 de ratón, mientras el DTA-m1 no causa cambio en c D4+ (Figura 47E). Por el contrario, tanto DTA-m2a como DTA-r2b reduce los porcentajes de CD4+ por 40-50 % comparado con ambos isotipos IgG1 de ratón (Figura 47E).
Los efectos más dramáticos fueron vistos con los niveles de Tregs CD4+Foxp3+ entre los TIL. Mientras el DTA-m1 no tiene efecto en esta población de células T, 9D9-m2a y DTA-m2a inducen una reducción aproximadamente 6 veces en el nivel de Tregs CD4+Foxp3+ comparado con el isotipo IgG1 y DTA-m1 (Figura 47F). Estos datos demuestran que la variante IgG2a de anti-GITR reduce el nivel de Tregs específicamente en el ambiente tumoral. De este modo, el isotipo IgG2a anti-GITR induce un incremento en Tefs CD8+ y disminución en Tregs en el sitio del tumor lo cual se traduce en una relación elevada Tef a Treg es indicativo de la actividad anti-tumoral robusta. El DTA-r2b también induce significante reducción en el nivel de Tregs CD4+Foxp3+ comparado con el control de IgG1, aúnque no una reducción tan pronunciada como aquella inducida por 9D9-m2a y DTA-m2a, consistente con la unión inferior de la región Fc IgG2b de rata a FcyRs de activación murina. Estos datos demuestran que el anti-GITR de anticuerpo agonista requiere el acoplamiento de FcyRs de activación para actividad de supresión.
La medición citométrica de flujo del nivel de expresión de GITR en diferentes subseries de células T en TIL MC38 y bazo mostró que el GITR no fue altamente expresado en Tregs en el sitio del tumor, que el nivel de expresión es superior que en Tregs en la periferia o Tefs CD8+ en el sitio del tumor, lo cual a su vez presenta mayor expresión que Tefs CD8+ o CD4+ en la periferia. El nivel relativo más bajo de expresión de GITR se observó en Tefs CD4+ en el sitio del tumor. Estos datos sugieren un mecanismo de este modo la actividad de supresión de células T ayuda a estimular una respuesta de células T y de este modo mejorar la eficacia antitumoral de una proteína de fusión Fc si el objetivo de la proteína de fusión Fc es altamente expresado en Tregs en el sitio del tumor con relación a la expresión del objetivo en Tefs en el sitio del tumor, y la proteína de fusión Fc se une a un FcR de activación que media la supresión de la célula objetivo.
b) Experimento MC38 #2
Debido a la agregación encontrada en las variantes DTA-1 (excepto la forma original comercialmente obtenida de DTA-r2b), una nueva serie de variantes isotópicas se diseñaron nuevamente por ingeniería genética para obtener anticuerpos DTA-1 que no son agregados. La agregación observada se trazó a un aminoácido adicional que inadvertidamente ha sido incorporado en la cadena ligera de las variantes isotópicas diseñadas por ingeniería genética, y el problema se alivió por remoción de este aminoácido extraño. Los anticuerpos diseñados nuevamente por ingeniería genética fueron usados en este Experimento #2. La actividad antitumoral de los isotipos anti-GITR diseñado nuevamente por ingeniería (series DTA-1; GITR.7) se evaluó usando un modelo MC38 por etapas. Ratones C57BL/6 fueron cada uno subcutáneamente implantados con células MC38 2 x 106 Después de 7 días, los ratones se aleatorizaron en 7 grupos de tratamiento para así tener volúmenes de tumor medio comparables de aproximadamente 148 mm3/2), y los anticuerpos de prueba fueron administrados IP en los días 7, 10 y 14 a 200 |jg por dosis (excepto para el control mIgG el cual se administró a una dosis de 200 jg ) como sigue: Grupo 1: control IgG1 de ratón (mIgG o “ isotipo”); Grupo 2: IgG1Ab de ratón anti-GITR (mGITR.7.mg1); Grupo 3: isotipo IgG1D265A de ratón anti-GITR (mGITR.7.mg1-D265A); Grupo 4: Ab IgG2a de ratón anti-GITR (mGITR.7.mg2a); Grupo 5: Ab IgG2b anti-GITR de ratón (mGITR.7.mg2b); y Grupo 6: Ab IgG2b de rata anti-GITR (mGITR.7.r2b o DTA-1-rG2b). Los tumores y bazos fueron recolectados en el día 15.
Las Figuras 48B y 48C muestran que los tumores tratados con IgG1 e IgG1-D265A anti-GITR crecen a una velocidad comparable con aquella de tumores tratados con el control IgG1 de ratón (Figura 48A). En cada caso, ninguno de los 9 ratones es TF para el término del monitoreo de los ratones 35 días post-implante. Sin embargo, similar a los resultados en el Experimento MC38 #1, mGITR.7.mg2a (Figura 48D) induce la inhibición más grande del crecimiento del tumor, con 2 de los 9 ratones siendo TF. Los anticuerpos anti-GITR-2b de rata y ratón también reducen significantemente la velocidad de crecimiento del tumor a extensiones similares (Figuras 48E y 48F), aúnque el anticuerpo 2b de rata produce 1 ratón TF mientras el anticuerpo 2b de ratón no produce algún ratón TF 35 días post­ implante.
Los cambios en los volúmenes de tumor medio y volúmenes de tumor mediano se muestran en las Figuras 49A y 49B. Las tendencias son similares a aquellas vistas en el Experimento 1 MC38 excepto que el isotipo IgG2a anti-GITR fue el inhibidor más potente de crecimiento del tumor MC38, mientras el isotipo IgG2b presenta potencia inferior pero significante, en la inhibición del crecimiento del tumor. Los isotipos IgG1 e IgG1-D265A muestran una inhibición de bajo nivel del crecimiento del tumor comparado con el control de IgG de ratón.
Los efectos de los diferentes isotipos anti-GITR en las poblaciones de Tregs en TIL y bazos a partir de los ratones tratados se muestran en las Figuras 50A-50B. Como se observa en el Experimento #1, ninguna de las variantes de isotipo probadas tiene un enorme efecto en el porcentaje de Tregs CD4+Foxp3+ en el bazo: el efecto más fuerte fue menor que el 40 % de incremento inducido por el tratamiento con el isotipo IgG2b anti-GITR de rata, mientras el isotipo IgG2b anti-GITR de ratón reduce marginalmente el porcentaje de Tregs CD4+Foxp3+. Los otros isotipos anti-GITR probados y el anticuerpo IgG2a anti-CTLA-4 (9D9-mG2a) incrementa marginalmente el porcentaje de Tregs (Figura 50A).
Por el contrario, en los TIL, con la excepción del isotipo IgG1, lo cual no causa cambio comparado con el control de isotipo, todos de los anticuerpos probados inducen reducciones significantes en el porcentaje de Tregs. El 9D9-mG2a de anticuerpo anti-CTLA-4 causa una reducción de aproximadamente 4 veces en el nivel de Tregs CD4+Foxp3+ comparado con el isotipo IgG1; los isotipos 2a y 2b de ratón anti-GITR y los isotipos 2b de rata, todos reducen el nivel de Tregs aproximadamente 2-veces, y el mutante IgG1-D265A causa una reducción ligeramente inferior (Figura 50B). Estos datos confirman los efectos vistos en el Experimento #1 demostrando que los isotipos anti-GITR mG2a, mG2b y rG2b inducen supresión significante de Treg en el ambiente del tumor, lo cual se correlaciona con la inhibición del crecimiento del tumor.
Los datos obtenidos en el Experimento MC38 #2 son ampliamente consistentes con aquellos obtenidos en el Experimento #1, lo cual sugiere que la agregación de los anticuerpos no interfiere indebidamente con las actividades de los anticuerpos. Posiblemente, los anticuerpos agregados son rápidamente lavados a chorro en el ratón, y de este modo, la agregación de anticuerpos no puede ser un problema significante en los ensayos in vivo.
Ejemplo 17: Actividad anti-tumoral de isotipos anti-GITR variantes en un modelo de tumor Sa1N por etapas
La actividad antitumoral de anti-GITR también se evaluó en un modelo de sarcoma Sa1N en ratones A/J. Los ratones fueron subcutáneamente inyectados con 2 x 106 células Sa1N por implante. Después de 7 días, se determinaron los volúmenes del tumor y se aleatorizaron en grupos de tratamiento para así tener volúmenes de tumor medios comparables (aproximadamente 75 mm3/2). Los anticuerpos anti-GITR (DTA-1) diseñados por ingeniería para tener diferentes isotipos como se describe en el Ejemplo 10, Experimento MC38 #1, fueron administrados IP en los días 7, 10 y 12 a 200 jg por dosis.
Los efectos en el crecimiento del tumor se muestran en las Figuras 51A-51E. El tratamiento con el anticuerpo IgG2a anti-GITR inhibe completamente el crecimiento del tumor y todos los 10 ratones fueron TF por aproximadamente Día 20 post-implante (Figura 51B), y el isotipo IgG2b de rata tiene un efecto similar en 9 de 10 ratones TF por aproximadamente Día 20 (Figura 51C). Los isotipos IgG1 (Figura 51D) e IgG1D265A (Figura 51E) inhiben tumores en alguna extensión comparado con el crecimiento no inhibido de tumores tratados con el control de isotipo IgG1 (Figura 51A) pero esto fue mucho menor que la inhibición vista con los isotipos mIgG2a y rIgG2b. Los cambios en los volúmenes medios del tumor y volúmenes medianos del tumor, mostrados en las Figuras 52A y 52B, confirman el efecto inhibidor virtualmente completo de los anticuerpos mIgG2a y rIgG2b en el crecimiento del tumor, comparado con la inhibición muy inferior del crecimiento del tumor presentado por los isotipos mIgG1 y mIgG1-D265A.
Colectivamente, los datos en las Figuras 51A y 52B confirman los datos obtenidos con el modelo de tumor MC38 (Ejemplo 10) que muestra que los isotipos mIgG2a y rIgG2b anti-GITR presentan potente actividad anti-tumoral contrario a los isotipos mIgG1 (ymIgG1-D265A) los cuales presentan actividad anti-tumoral muy inferior. La actividad antitumoral en el modelo Sa1N de los anticuerpos variantes mIgG1 y D265A es consistente con los efectos del agonismo de GITR sin supresión de Treg.
Los efectos de los diferentes isotipos anti-GITR en las poblaciones de Tregs en TIL Sa1N y bazos de los ratones tratados se muestran en las Figuras 53A-53B. Todas las variantes de isotipo anti-GITR probadas, inducen incrementos relativamente pequeños de aproximadamente 20-40 % en el nivel de Tregs CD4+Foxp3+ en el bazo. El incremento más alto se indujo por tratamiento con el isotipo IgG2a anti-GITR de ratón, lo cual causó el mismo incremento como el tratamiento con los anticuerpos anti-CTLA-4 IgG2b (9D9-G2b) e IgG1-D265A (9D9-G1-D265A) (Figura 53A). Los últimos isotipos anti-CTLA-4 fueron usados como controles positivos en el estudio GITR conforme la supresión de Treg ha sido previamente observada con el isotipo IgG2b.
Contrario al efecto de Tregs en la periferia, los isotipos m2a y r2b anti-GITR, así como también los isotipos 2b anti-CTLA-4, todos reducen el nivel de Tregs en el sitio del tumor por al menos 3,5-veces (Figura 53B). El isotipo IgG1 anti-GITR y el mutante IgG1-D265A ambos inducen reducciones inferiores de aproximadamente 35 % en el porcentaje de Tregs, mientras el mutante IgG1-D265A anti-CTLA-4 no causa cambio en el porcentaje de Tregs en TIL (Figura 53B). De este modo, como se observa en el modelo de tumor MC38, los isotipos mG2a y rG2B anti-GITR inducen supresión Treg significante en el ambiente del tumor, mucho más que los anticuerpos IgG1 e IgG1-D265A, lo cual se correlaciona con al inhibición del crecimiento del tumor.
Ejemplo 18: Actividad sinergística en combinación del anticuerpo anti-GITR y anticuerpo antagonista anti-PD1
Para determinar si un efecto anti-tumoral sinergístico podría obtenerse combinando el anticuerpo DTA-1 Con un anticuerpo que antagoniza PD-1, una molécula la cual proporciona una señal inhibidora de los mecanismos antitumorales, se evaluó el efecto de la combinación de anticuerpos en el volumen del tumor usando un modelo de adenocarcinoma de colon MC38 por etapas. Los ratones se trataron con (A) mIgG1 de control, (B) mIgG DTA-1, (C) mIgG PD-1 (clon 4H2, BMS), y (D) PD-1 DTA-1 en los días 7, 10, y 14.
Los efectos en el crecimiento del tumor se muestran en las Figuras 54A-54D. El tratamiento con el anticuerpo DTA-1 o anticuerpo anti-PD-1 inhibe individualmente el crecimiento del tumor a una cierta extensión, con 2 de 10 ratones siendo cada uno TF. Por el contrario, la combinación de anticuerpo DTA-1 y anticuerpo anti-PD-1 incrementa sustancialmente el número de ratones TF por el día 30, con 7 de 10 ratones siendo TF. Como se espera, no hubo ratones TF en mIgG de control administrado a ratones.
Estos resultados sugieren que la combinación de anticuerpos anti-GITR agonistas y anticuerpos anti-PD-1 antagonistas actúa sinergísticamente para inhibir el crecimiento del tumor.
Ejemplo 19: Efecto de mutación de aminoácido de CDR en afinidad de unión
Este Ejemplo muestra que ciertos residuos de aminoácidos en CDR3 de VH de 28F3 pueden ser mutados a otros aminoácidos sin afectar significantemente su afinidad de unión.
48 mutantes de 28F3 fueron creadas mutando uno o más de los siguientes aminoácidos en CD3 VH: M102, D106 y M111 (numeración de conformidad con el SEQ ID NO: 13) y se probaron las siguientes actividades: unión a células 3A9-hGIT y secreción de IL-2 de células 3A9-hGITR en la presencia de anti-CD3 unido a la placa. Los experimentos se condujeron como se describe anteriormente.
Los resultados se muestran en las Figuras 55Ay 55B (unión a células 3A9-hGITR), Figuras 56A-56F (secreción IL-2), y Tabla 7.
Tabla 7: Efectos de mutaciones de aminoácido de CDR en afinidad de unión
Figure imgf000092_0001
A2 1,338 0,5543 B2
Figure imgf000093_0001
Figure imgf000093_0002
~399,9 (continuación)
Figure imgf000094_0001
Los resultados indican que varios mutantes tienen unión y actividad comparable con aquellos de 28F3, mientras otras mutaciones reducen cualquiera o abmas de la unión y secreción de IL-2. Los siguientes mutantes tienen datos de unión y actividad comparable: M98V; M98V/D106E; M98L/D106E; M98I/D160E; y M98A/D106E.
Ejemplo 20: Efectos de modificaciones de región constante en actividad agonista del anticuerpo GITR Este ejemplo demuestra que los anticuerpos GITR que comprenden una bisagra IgG2 tienen una capacidad incrementada para inducir la secreción de IL-2 e IFN-y a partir de células T con relación al mismo anticuerpos que tienen una bisagra IgG1.
Se ha observado en ensayos CHO-OKT3 y 3A9 descrito anteriormente que los anticuerpos derivados de hibridoma, que tienen una región constante IgG2, son más potentes en la estimulación de la secreción de insulina que los mismos anticuerpos en los cuales la región constante de cadena pesada se intercambió con aquellos de IgG1 o un IgG1 menos efectos (lgG1.1). Por lo tanto, el efecto de una región constante IgG2 o bisagra se probó además en los anticuerpos anti-GITR en estos ensayos.
La región variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-GITR humano se ligó a las siguientes regiones constantes de cadena pesada:
T l nfi r i n ^ r i n n n n i r n i- ITR m lifi
Figure imgf000095_0001
Primero, las afinidades de unión de estos anticuerpos GITR fueron comparadas con aquellas de los anticuerpos GITR que tienen una bisagra IgG1. Las afinidades de unión fueron determinadas como se describe en el Ejemplo 2. Como se muestra en la Figura 57, todos los tres anticuerpos GITR tienen una bisagra IgG2 que tiene afinidades similares para células T activadas como los dos anticuerpos GITR que tienen una región constante IgG1 o IgG1.1.
Después, la capacidad de anticuerpos GITR que tienen región constante IgG1 o dominio Fc de IgG1/IgG2 de bisagra se probaron por su capacidad para inducir la secreción del IL-2 e IFN-y a partir de células T estimuladas con células CHO que expresan OKT3, como se describe en el Ejemplo 13. Como se muestra en la Figuras 58A y 58B, el anticuerpo con el dominio Fc de IgG1/IgG2 de bisagra (“anti-GITR.G2.g1f”) induce tanto la secreción de IFN-y como IL-2 a partir de células T a un grado mayor que el anticuerpo con la región constante IgG1 (“anti-GITR.g1f”). Se obtuvieron resultados similares con las versiones menos efectoras de estos dominios constantes (Figuras 58C).
Para confirmar además la activación incrementada de células T con los anticuerpos anti-GITR que comprenden una bisagra IgG2, se probó la secreción de IL-2 en diferentes formatos experimentales. En este experimento, se probó la capacidad de anticuerpos GITR para inducir la secreción de IL-2 a partir de células 3A9-hGITR (línea de células 3A9 de hibridoma de células T de ratón que expresan ectópicamente GITR humano), como se describe en el Ejemplo 13. Como se muestra en la Figura 59, todos los anticuerpos que tienen la bisagra IgG2 (anti-GITR.g2, anti-GITR.g2.g1f, y anti-GITR.g2.g1.1f) inducen la secreción de IL-2 a partir de células 3A9-hGITR a un grado superior que su región constante IgG1 que contiene contrapartes (anti-GITR.g1f y anti-GITR.g1.1f”).
Estos resultados sugieren colectivamente que los anticuerpos anti-GITR que tienen una bisagra IgG2 y regiones constantes g1 o g1.1 son más potentes que los mismos anticuerpos que tienen una bisagra IgG1. Un mecanismo potencial para explicar los efectos mejorados de la bisagra IgG2 que contiene anticuerpos GITR es la formación del complejo incrementado y/o internalización incrementada de estos anticuerpos en la superficie celular, con relación a los mismos anticuerpos que comprenden una bisagra IgG1.
Ejemplo 21: La proliferación inducida por anticuerpo anti-GITR es intrínseca de células Tef
El GITR es expresado en tanto células T reguladoras humanas como de ratón (Treg). Los datos en la literatura han mostrado que los anticuerpos anti-GITR agonistas accionan la proliferación de células T efectoras CD4+Foxp3-(Tef) en la presencia de células Treg. Adicionalmente, se ha sugerido que este efecto es accionado principalmente a través de la unión del anticuerpo anti-GITR a células Tef en lugar de efectos directos en la función supresora de células Treg. Otras publicaciones muestran que los anticuerpos anti-GITR accionan la proliferación de células Treg y pueden inducir la inestabilidad del linaje de células Treg caracterizado por pérdida de Foxp3.
Para examinar los efectos de los anticuerpos anti-GITR en la función de células Treg, se condujo un ensayo de supresión de células Treg de ratón en el cual las células Tef fueron estimuladas con anti-CD3 y varios isotipos de DTA-1 de mAb de GITR anti-ratón en la presencia de APCs y números de titulación de células Treg. Los resultados muestran que el tratamiento de anticuerpo DTA-1 incrementa la proliferación comparada con un control de isotipo. Además, los isotipos IgG1, 2a, 2b, e IgG1 D265A inerte fueron todos efectivos para incrementar la proliferación de células Tef, de este modo demostrando que la unión del FcR no se requiere para la función del anticuerpo anti-GITR en este sistema.
A partir del experimento previo no fue claro si la proliferación de Tef incrementada fue debido a los anticuerpos anti-GITR que actúan en las células Treg y/o Tef. Para atender esta cuestión, se usaron ratones “de gen activado” de GITR humano (huGITR KI). En estos ratones, el gen que codifica al GITR de ratón, Tnfrsf18, se reemplazó con el gen TNFRSF18 humano, y el GITR humano se expresó de manera similar a muGITR en ratones silvestre de tipo humano; el GITR humano se expresó en tanto células Tef como Treg con niveles superiores en las últimas. Se encontró que el mAb anti-GITR 28F3 fue capaz de accionar la proliferación de células Tef a partir de ratones huGITR KI. Debido a que el 28F3 se une a GITR humano pero no a GITR de ratón, fue posible establecer un sistema de ensayo de supresión de Teg en el cual, el GITR podría ser diferencialmente dirigido en células Tef y Treg. Este sistema también permite la examinación de las diferencias funcionales entre 28F3 con ya sea una región Fc IgG1 humana o IgG1.1 inerte.
Las células Treg y Tef fueron clasificadas con base en la expresión de CD4 y CD25 a partir de ratones huGITR KI y WT. Las células Treg y Tef de WT y huGITR se mezclaron en combinaciones que permitieron el objetivo no compartimental de ya sea células Treg o Tef con 28F3 (Células Tef huGITR KI con células Treg tipo silvestre, etc.). Como controles, se incluyeron condiciones en las cuales el 28F3 podría unirse a tanto células Treg como Tef o a ninguna. Los cultivos que contienen células Tef y Treg fueron estimulados con anti-CD3 en la presencia de APCs y ya sea 28F3 IgG1, 28F3 IgG1.1, o un isotipo de control.
Los resultados se proporcionan en las Figuras 60A-60D. Como se esperaba, un incremento en la proliferación de células Tef se observó cuando 28F3 podría unirse a tanto células Treg como Tef, y este efecto se mantuvo en las condiciones en las cuales 28F3 podría unirse solamente a células Tef. Por el contrario, cuando 28F3 fue capaz solamente de unirse a células Treg, no hubo incremento en la proliferación de Tef sobre el control de isotipo. Con respecto al isotipo, no hubo diferencia significante entre el Fc IgG1 e IgG1.1 en las condiciones donde 28F3 no mostró un efecto. Esto es consistente con los datos descritos anteriormente que muestra que la reticulación Fc no se requiere para el agonismo anti-GITR. Tomados en conjunto, en este sistema, los anticuerpos anti-GITR actúan principalmente a través de su capacidad para modular la función de células Tef y no a través de la inhibición de la capacidad supresora de células Treg. Sin embargo, esto no excluye una función para la señalización de GITR en células Treg in vivo, ya que los anticuerpos anti-GITR pueden accionar la proliferación de células Treg o proporcionar un objetivo específico de Treg para ADCC o ADCP.
Ejemplo 22: Citotoxicidad Mediada por Células Dependientes del Anticuerpos (ADCC)
La actividad ADCC in vitro de 28F3.IgG1f y 28F3.IgG1.1f se evaluó usando ya sea células NK92/CD16 o células NK primarias como efectoras y varias células conocidas para expresar GITR fueron usadas como objetivos.
Tres días previos al ensayo, las subseries de células T objetivo CD4+ y CD8+, fueron aisladas por selección negativa y las Treg fueron además aisladas a partir de las células T CD4+ para selección positiva c D25. Cada una de las subseries de células T se estimuló por tres días con perlillas CD2/CD3/CD28 (Miltenyi Biotec) para inducir la regulación ascendente de GITR. Un día previo al ensayo, las células NK primarias fueron aisladas de PBMC frescos para selección negativa (StemCell Technologies, Inc) e incubaron durante la noche en medio MyeloCult H5100 (StemCell) suplementado con 500IU/mL de IL-2 recombinante (R&D Systems) y 1uM de hidrocortisona (StemCell). En el día del ensayo, las células efectoras (células NK primarias o NK92/CD16) se incubaron con células T activadas etiquetadas con Calceína AM en relaciones efectora a objetivo especificadas en la presencia de 1 ug/mL de 28F3.IgG1f y 28F3.IgG1.1f.
Usando ya sea células NK primarias o células NK92/CD16 como efectoras, lisis inducida por 28F3.IgG1 de células T efectoras y Treg CD4+ activadas, mientras menos lisis de células T CD8+ activadas se observaron (Figuras 61A-61F). Como se esperaba, 28F3.IgG1.1 no media la ADCC de algunas células objetivo usando ya sea células NK92 o NK primarias como efectoras. De este modo, la lisis inducida por 28F3.IgG1 de células T efectoras y Treg CD4+ activadas y a una extensión inferior, activan las células T CD8+ y el nivel de lisis inducido por28F3.IgG1 parece ser proporcional al nivel de expresión de GITR en las células objetivo.
Ejemplo 23: Actividad de Anticuerpo 28F3.IgG1 en Ratones con Gen Activado GITR humano
Este Ejemplo muestra que 28F3.IgG1 y 28F3IgG1.1 tienen actividad antitumoral en tumores MC38 en ratones C57BL/6 que tienen un sistema inmune humano y proteína GITR humana, y que la actividad antitumoral es más fuerte con 28F3.IgG1.
Generación de Ratones con Gen Activado GITR humano: Ratones C57BL/6 fueron diseñados por ingeniería genética para expresar el dominio extracelular de GITR humano (ECD) en lugar de ECD GITR de ratón, manteniendo intacta la transmembrana de ratón y secuencias citoplásmicas. La expresión del GITR quimérico de humano/ratón se confirmó por teñido de células del bazo activadas con anti-CD3/CD28- con un anticuerpo anti-GITR humano.
Células MC38 se cultivaron en medio DMEM con 10 % de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS), 2 mM de L-glutamina, 4,5 g/L (45 %) de glucosa (10 mL/L), y 1 mM de piruvato de sodio (10 mL/L). Las células se dividieron 1:10 cada 2 días. Dos grupos de ratones se usaron, y ambos grupos, el flanco derecho de cada ratón, se implantó subcutáneamente con 0,75 millones de células MC38 en 0,2 mL de PBS, usando una jeringa de 1-cm3 y una aguja de 1,27 cm (media pulgada) de calibre 25. Para el grupo 1, en el día 7 posterior al implante, 40 ratones fueron aleatorizados a 3 grupos de 12-13 ratones cada uno de conformidad con el volumen del tumor (LxWxH/2). Todos los grupos tienen volúmenes de tumor promedio de aproximadamente 174 mm3/2 En los días 7, 10, y 14, el control de vehículo o mAb se administró a 10 mg/kg. Para el grupo 2, en el día 7 posterior al implante, 10 ratones fueron aleatorizados a 2 grupos de 5 ratones cada uno de conformidad con el volumen del tumor (LxWxH/2). Todos los grupos tienen volúmenes de tumor promedio de aproximadamente 69 mm3/2. En los días 7, 10, y 14, el control de vehículo o mAb 28F3.IgG1 se administró a 10 mg/kg.
Los ratones fueron dosificados intraperitonealmente (IP) a las concentraciones y los datos se resumen en la Tabla 9.
Tabla 9
Grupos Días post-implante
Isotipo IgG1, 10 mg/kg 7, 10, y 14
28F3.IgG1, 10 mg/kg 7, 10, y 14
28F3.IgG1.1f, 10 mg/kg 7, 10, y 14
Los tumores y pesos corporales se midieron dos veces por semana a través de la terminación del estudio. Los tumores se midieron en 3 dimensiones con un Calibrador Digital Fowler Electronic (Modelo 62379-531; Fred V. Fowler Co., Newton, MA), y los datos se registraron electrónicamente usando software StudyDirector de Studylog Systems, Inc. (South San Francisco, CA).
En este estudio de tumor, el Grupo 1 se terminó en el día 52 posterior al implante. Se usó Excel de Microsoft para calcular la media, desviación estándar (SD, por sus siglas en inglés), y valores medianos de los volúmenes del tumor y pesos corporales. Los valores medios y medianos se calcularon cuando 100 % y al menos 60 % de los animales de estudio permanecieron en cada grupo de tratamiento, respectivamente. Los tumores de ratones en el Grupo 2 fueron recolectados en el día 15.
Los resultados indican que, en el Día 22 posterior al implante del tumor, el último día cuando todos los ratones en el estudio estuvieron vivos, la dosis de 10 mg/kg de 28F3.IgG1 mostró 67 % de inhibición de crecimiento de tumor medio (TGI, por sus siglas en inglés) en injertos heterólogos MC38 comparado con el anticuerpo de control de isotipo. El Tumor TGI es resumido para el grupo de tratamiento en la Tabla 10. Las curvas de crecimiento del tumor para el grupo de tratamiento se muestran en las Figuras 62A-62C. Las curvas de crecimiento de tumor medio y mediano para grupo de tratamiento, son presentadas en las Figuras 63A-63B. No fue aparente la toxicidad en cualquier grupo de tratamiento ya que los cambios de peso corporal medio y mediano fueron menos de 20 %. Los cambios de porcentaje y pesos corporales del ratón con el tiempo, se muestran en las Figuras 64A-64B.
Tabla 10
Día 22 Día 25
Volumen de Volumen de
Grupo de tratamiento tumor medio TGI % tumor mediano TGI ( %)
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Isotipo IgG1, 10 mg/kg 1342 N/A 1790 N/A
28F3.IgG1, 10 mg/kg 447 67 380 79 28F3.IgG1.1f, 10 mg/kg 1049 22 1064 41
Estos resultados muestran que 28F3.IgG1 tiene 67 % de TGI mientras 28F3.IgG1.1f tiene 22 % de TGI en el Día 22 posterior al implante, indicando que ambos anticuerpos reducen el crecimiento del tumor en el modelo de tumor MC38. En adición, los resultados sugieren que la unión Fc para 28F3.IgG1 mejora la potencia anti-tumoral en el modelo de tumor MC38.
Para investigar el efecto que 28F3.IgG1 tiene en la población de células T, los tejidos se recolectaron de 5 ratones en cada grupo de tratamiento en el día 15 posterior al implante. Los bazos y tumores fueron procesados en un gentleMACS Octo Dissociator™ (Miltenyi, San Diego, CA). Las suspensiones de células únicas fueron teñidas por marcadores de células T usando citometría de flujo (FACS). La fluorescencia de anticuerpo se detectó por citometría de flujo en el Fortessa (BD Biosciences, San Jose, CA) y los resultados se analizaron con el programa de computadora, Flowjo (Flowjo, LLC, Ashland, OR).
Los resultados, los cuales se muestran en las Figuras 65 y 66, muestran el porcentaje reducido de células Treg, consistentes con la supresión en los ratones tratados con 28F3.IgG1 con relación al control de isotipo (Figura 65). Contrariamente, no hubo incremento en el porcentaje de células T CD8+ en el grupo 28F3.IgG1 (Figura 66).
De este modo, el monitoreo inmune en ratones tratados con 28F3.IgG1 comparado con el isotipo de control sugiere que el TGI puede ser mediado por la supresión de Treg y un incremento en células T CD8+.
Ejemplo 24: La reticulación de 28F3.IgG1 incrementa su potencia
Este Ejemplo muestra que la reticulación de 28F3.IgG1 incrementa su potencia para mejorar la secreción de IFN-y de células T y promueve la proliferación de células T.
Las células T fueron co-cultivadas con ya sea células CHO-OKT3 o CHO-OKT3-CD32aaltas en la presencia de varias concentraciones de los anticuerpos anti-GITR o reactivos de control, y los niveles de secreción de interferón-Y (IFN-y) y proliferación celular fueron medidos. Las líneas de células CHO-OKT3-CD32alta tienen un nivel muy alto de CD32a del receptor Fc, y expresión OKT3 ligeramente superior que es el clon CHO-OKT3 precursor.
El ensayo se condujo como sigue. Células T respondedoras se obtuvieron de PBMC humanas aisladas de gradiente Ficoll (Amersham Bioscience 17-1440-03) con el kit de aislamiento de células T CD4 (Life technologies, Cat. 113.31D) y Microperlillas CD25 (Miltenyi, Cat. 130-092-983) de conformidad con el protocolo del fabricante. Células CHO que expresan anti-CD3scFv (OKT3) (CHO-OKT3) o células CHO que expresan anti-CD3scFvy CD32a lavadas dos veces con medio RPMI se sometieron a irradiación con una dosificación de 50K Rad. Las células fueron recolectadas y se resuspendieron en medio de cultivo (RPMI-1640 suplementado con 10 % de suero bovino fetla, 2 mM de L-glutamina, 55 nM de p-Mercaptoetanol, 1mM de piruvato de sodio, y 100U/mLde penicilina/estreptomicina) a2,5x105/mL. Células CHO 2,5x104 y células T 1x105 se sembraron por cavidad en una placa de fondo plano de grado TC de 96 cavidades (Costar). Las células se incubaron con una titulación de 4 veces, de 8 puntos del anticuerpo GITR partiendo a 20 |jg/mL. Un hIgG1 no relacionado se agregó a 20 jg/m L como el control de isotipo. Una muestra con solamente células se incluyó para mostrar la actividad del valor de referencia sin algún tratamiento. El sobrenadante de cada muestra se recolectó al día 3 para medición del IFN-y (Kit ELISA BD optEIA Humano IFN-g; BD Bioscience#555142). La proliferación celular se evaluó por incorporación de 3H-timidina por las últimas 8 horas de incubación. Los resultados, los cuales se muestran en la Figura 67 y 68, indican que, en la presencia de 28F3.IgG1, más IFN-y es secretado de las células T que fueron co-cultivadas con CHO-OKT3-CD32aalto con relación a aquellos que fueron co-cultivados con células CHO-OKT3 (Figura 67). Como se esperaba, no se observó diferencia significante con el anticuerpo 28F3.IgG1.1f menos efector, el cual no se une a CD32a. En adición, en la presencia de 28F3.IgG1, se observó más proliferación de células T en células T que fueron co-cultivadas con CHO-OKT3-CD32aalto con relación a aquellas que fueron co-cultivadas con células CHO-OKT3; este efecto no se observó con el anticuerpo 28F3.IgG1.1f menos efector (Figura 68). De este modo, la reticulación de 28F3.IgG1 incrementa su potencia para mejorar la secreción de IFN-y de células T y promover la proliferación de células T. Este efecto de potenciamiento fue también visto en la proliferación de células T con células CHO-OKT3 que expresan niveles inferiores de CD32a. El GITR.6 g1.1f muestra niveles superiores de IFN-y cuando se reticulan comparado con es soluble. Esto es probablemente una reflexión de un nivel ligeramente superior de OKT3 expresado en células CHO-OKT3-CD32aalto con relación a células CHO-OKT3. El incremento observado con GITR.6 g1f reticuladas es mayor que aquel observado con el isotipo inerte, sugiriendo un beneficio positivo para reticulación. La versión de G1f promueve altos niveles de IFN-y aún a dosis bajas donde los anticuerpos solubles demostraron poco agonismo sobre el antecedente, sugiriendo nuevamente una función positiva de reticulación.
De este modo, tanto 28F3.IgG1 como los anticuerpos 28F3.IgG1 menos efectores, estimulan la producción de IFN-y y estimulan la proliferación de células T, sin embargo, la reticulación de 28F3.IgG1 incrementa además su potencia para mejorar la secreción de IFN-y de células T y promover la proliferación de células T.
Ejemplo 25: La CH1 de IgG2 mejora la secreción de IL-2 inducida por Ab GITR por células T CD4+
Este Ejemplo muestra que un dominio CH1 del isotipo IgG2 mejora la actividad de células T inducidas por el anticuerpo anti-GITR, con relación al anticuerpo con un dominio CH1 del isotipo IgG1.
Las regiones constantes de cadena pesada modificadas mostradas en la Tabla 11 fueron ligadas a las regiones variables del anticuerpo anti-GITR. Las células T CD4+ donadoras se incubaron con OKT3-scFv que expresa células CHO y los varios anticuerpos anti-GITR, y se midió el nivel de IL-2 secretado. Esto se condujo como se describe en el Ejemplo 20.
Tabla 11: Regiones constantes de cadena pesada modificada:
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Los resultados, los cuales se muestran en la Figura 69, indican que todos los anticuerpos anti-GITR que tiene un dominio CH1 del isotipo IgG2, en adición a una bisagra del isotipo IgG2, son más efectivos en la estimulación de la secreción de IL-2 a partir de células T CD4+ que aquellas que tienen una bisagra IgG1 y CH1.
De este modo, este Ejemplo muestra que la presencia de una bisagra IgG2 y dominio CH1 IgG2 en un anticuerpo anti-GITR agonista mejora además la actividad agonista del anticuerpo con relación al mismo anticuerpo que no tiene una bisagra y/o un dominio CH1 del isotipo IgG2. Un anticuerpo que tiene tanto una bisagra como un dominio CH1 del isotipo IgG2 tiene un efecto agonista más fuerte con relación a un anticuerpo que tiene una bisagra, pero no CH1, del isotipo IgG2. Adicionalmente, un anticuerpo con un dominio CH1 de IgG2 tiene una actividad agonista más fuerte que un anticuerpo con un dominio CH1 del isotipo IgG1. Un anticuerpo con una bisagra de IgG2 y un dominio CH1 de IgG1 tiene actividad agonista más fuerte que un anticuerpo con un CH1 y bisagra del isotipo IgG1.
Ejemplo 26: Unión del receptor Fc para anticuerpos con dominios constantes diseñados por ingeniería genética
Este ejemplo demuestra que anticuerpos que tienen regiones constantes de cadenas pesadas modificadas que comprenden el CH1 y bisagra de IgG2 se unen a FcyRs cuando contienen dominios CH2 y CH3 de IgG1.
En adición a la unión del antígeno por los dominios variables, los anticuerpos pueden acoplar los receptores Fc-gamma (FcgRs) a través de la interacción con los dominios constantes. Estas interacciones median las funciones efectoras tales como citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) y fagocitosis celular dependiente del anticuerpo (ADCP). La actividad de la función efectora es alta para el isotipo IgG1, pero muy baja o ausente para IgG2 e IgG4 debido a estos isotipos que tienen afinidad inferior para FcgRs. En adición, la función efectora de IgG1 puede ser modificada a través de la mutación de residuos de aminoácidos dentro de las regiones constantes para alterar la afinidad y selectividad de FcgR.
La unión de anticuerpos a receptores gamma Fc (FcyRs o FcgRs) se estudió usando tecnologías biosensor que incluyen resonancia de plasmón de superficie Biacore (SPR) e Interferometría de Biocapa Fortebio (BLI). Se realizaron estudios de SPR en un instrumento Biacore T100 (GE Healthcare) a 25oC. El fragmento Fab de un anticuerpo anti-6xHis murino se inmovilizó en un chip sensor CM5 usando EDC/NHS a una densidad de ~3000 RU. Varios FcgRs etiquetados con his (7 ug/ml) se capturaron mediante la etiqueta his C-terminal usando un tiempo de contacto de 30 s a 10 ul/min, y se evaluó la unión de 1,0 uM de anticuerpo en un amortiguador de corrida de 10 mM de NaPO4, 130 mM de NaCl, 0,05 % de p20 (PBS-T) pH 7,1. Los FcgRs usados para estos experimentos incluyen CD64 (FcgRI), CD32a-H131 (FcgRIIa-H131), CD32a-R131 (FcgRIIa-R131), CD32b (FcgRIIb), CD16a-V158 (FcgRIIIa-V158), CD16b-NA1 (FcgRIIIb-NA1), y CD16B-NA2 (FcgRIIIb-NA2). Se realizaron entonces experimentos de BLI en un instrumento Fortebio Octet RED (Pall, Fortebio) a 25°C en 10 mM de NaPO4, 130 mM de NaCl, 0,05 % de p20 (PBS-T) pH 7,1. Los anticuerpos se capturaron de sobrenadantes de expresión no diluida en sensores recubiertos de proteína A, seguido por la unión de analitos 1|j M hCD32a-H131, hCD32a-R131, hCD32b, hCD16a-V158, o 0,1 j M hCD64.
Primero, se hicieron anticuerpos que contienen dominios Fc IgG1 modificados que incluyen las sustituciones S267E (SE) y S267E/L328F (SELF), así como también varias combinaciones de las mutaciones P238D, P271G, H268D, A330R, G237D, E233D, referidas como V4, V7, V8, V9 y V12. La unión de estos anticuerpos se estudió por Biacore SPR con comparación a anticuerpos IgG1f, IgG2.3 (IgG2-C219S) e IgG4.1 (IgG4-S228P), así como también un anticuerpo IgG1.1f el cual ha sido diseñado por ingeniería genética para reducir la unión a todos los FcgRs. Los resultados, los cuales se muestran en la Figura 70, demuestran las propiedades de unión de FcgR esperadas para IgG1f, IgG2.3 e IgG4.1 y los anticuerpos IgG1 mutados, que incluyen unión incrementada CD32a-H131, CD32a-R131 y CD32b para SE y SELF, así como también selectividad incrementada de los mutantes V4, V7, V8, V9 y V12 para CD32b sobre CD32a-H131 y CD32a-R131 (Figura 70).
La siguiente serie de constructos se usó para diseñar por ingeniería genética la función efectora de otro modo isotipo IgG2 negativo. Para este estudio, las mutaciones descritas anteriormente se introdujeron en el contexto de región constante IgG2.3, o un híbrido IgG2.3/IgG1f llamado IgG2.3G1-AY (Tabla 12). Los anticuerpos se expresaron a escaña menor como sobrenadantes, y se probaron por unión a FcgRs usando tecnología de biosensor de Iterferometría de BioCapa Fortebio Octet. Puesto que los anticuerpos estuvieron presentes a bajas concentraciones en los sobrenadantes, el experimento se realizó para capturar anticuerpos de los sobrenadantes usando sensores recubiertos con proteína A, seguidos por unión de analitos FcgR en solución. El IgG1f de control sobrenadante y purificado que incluye anticuerpos IgG1, SE, P238D, V4 y V12 de tipo silvestre también se incluyeron para comparación, y cada uno de estos anticuerpos de control demostró propiedades de unión de FcgR esperadas (Figura 71). El anticuerpo IgG2.3 también demostró el perfil de unión esperada, con unión apreciable a solamente CD32a-H131. Sin embargo, todas mutaciones para introducir las mutaciones S267E, L328F, P238D, P271G, H268D, A330R, G237D, o E233D en IgG2.3 fallaron para recapitular la afinidad de FcgR de los mAbs IgG1 diseñados por ingeniería genética correspondientes (Figura 71). Por el contrario, los constructos IgG2.3G1-AY fueron capaces de preservar completamente las propiedades de unión de FcgR de IgG1 de tipo silvestre, mientras se retienen las regiones de CH1 y bisagra de IgG2.3. En adición, todos los mutantes IgG2.3G1-AY que contienen S267E, L328F, P238D, P271G, H268D, A330R, G237D, y E233D mostró las propiedades de unión FcgR comparables con los mAbs de la versión IgG1 que contienen las mismas mutaciones (Figura 71). Esto demuestra que los anticuerpos diseñados por ingeniería genética exitosos con regiones de bisagra y CH1 de IgG2 se combinan con la función efectora de IgG1 mutante o de tipo silvestre.
T l 12 n r I 2 i ñ r in ni rí n i
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(continaución)
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Esta estrategia de ingeniería genética se exploró además para producir otros anticuerpos formateados con IgG2.3G1-AY, IgG2.3G1-AY-S267E (IgG2.3G1-AY-V27), así como también formas variantes IgG2-B (IgG2.5G1-AY e IgG2.5G1-AY-V27), y otros anticuerpos híbridos que contienen diferentes combinaciones de dominios constantes IgG1 e IgG2, y se probó la unión de estos anticuerpos a FcgRs etiquetados con his capturados con Fab anti-his usando tecnología Biacore SPR. De acuerdo con los datos de sobrenadante Octet, los datos de SPR mostraron que los anticuerpos IgG2.3G1-AY e IgG2.3G1-AY-V27 tienen propiedades de unión a FcgR comparables a IgG1f e IgG1f-S267E respectivamente, debido a que contienen las regiones CH1 y bisagra de un anticuerpo IgG2 forma A (IgG2.3) (Tabla 13). Datos similares también se obtuvieron usando anticuerpos IgG2.5G1-AY e IgG2.5G1-AY-V27, demostrando la ingeniería genética exitosa de los anticuerpos IgG2 forma B (que contienen mutación C131S llamada IgG2.5) que tienen funciones efectoras como IgG1f o IgG1f modificadas. Los datos para varios otros anticuerpos con las regiones constantes IgG2.3G1-AY, IgG2.3G1-AY-V27, IgG2.5G1-AY, o IgG2.5G1-AY-V27, pero regiones variables diferentes, demuestran que esta estrategia de ingeniería es ampliamente aplicable a otros anticuerpos independientes de los dominios variables (Tabla 13). Otros constructos que demuestran propiedades de unión FcgR similares a IgG1f son IgG1-G2.3G1-AY, e IgG1deltaTHT, mientras varios de los constructos de región constante modificados fueron incapaces de retener las propiedades de unión de FcgR similares a IgG1f, incluyendo constructos IgG2.3G1-KH, IgG2.5G1-KH, IgG2.3plusTHT, IgG2.5plusTHT e IgG2.3plusGGG (Tabla 13).
Tabla 13: % de valores Rmáx para 1 uM de anticuerpos que se unen a proteínas FcgR-his capturadas con Fab anti-his
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(continuación)
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Tomados en conjunto, estos datos muestran que la secuencia en IgG1 inmediatamente C-terminal a la porción CPPCPAP (SEQ ID NO: 479) conservada en la región de bisagra confieren función efectora mediada por FcgR, mientras las porciones CH1 y superior de la bisagra del anticuerpo pueden ser remplazadas con secuencias IgG2 o IgG2 modificadas, para combinar potencialmente las funciones efectoras de IgG1 e IgG2 modificado con las propiedades de señalización e internalización superiores de anticuerpos que contienen regiones de bisagra y/o IgG2 CH1.
Ejemplo 27: La internalización del anticuerpo agonista del GITR se mejora en anticuerpos que tienen un dominio CH1 y bisagra de IgG2
Para inducir la expresión de GITR, se incubaron células por 72h a 37°C con 20 ng/ml de anti-CD3 1000 ng/ml de CD28. Como un método alternativa de activación de células T, se prepararon lotes grandes de células T CD4+ activadas para un protocolo de cultivo de tres etapas. Brevemente, se estimularon células T CD4+ con CD3 unido a la placa (1,5 |jg/ml) suplementado con 1 jg/m l de CD28 soluble por 72h a 37°C, se expandieron en cultivo por 14 días en la presencia de 20 u/ml de IL-2 y finalmente se expusieron a otra ronda de activación por adición de 10 jg/m l de PHA, 2 u/ml de IL-2 y 1 jg/m l de c D28 por 72h a 37°C. Las células T estimuladas se sembraron en placas de imagen de PDL de 384 cavidades por2h para adherir las células, se enfrió por 15 minutos a 4oC, y después anticuerpos GITR etiquetados con Alexa 488 se agregaron separadamente por 1h. Las placas fueron finalmente formadas en imagen por HC y los datos se reportaron como intensidad total por célula.
Tres diferentes anticuerpos GITR se han evaluado usando los métodos de activación de células T mencionados anteriormente. Son anticuerpos GITR.6 como un isotipo G1 y un isotipo inerte (IgG1.1) incapaz de unirse a receptores Fc, así como también una quimera con la bisagra IgG2 en lugar de la bisagra IgG1.
La internalización inducida por el anticuerpo GITR se evaluó en células T CD4+ estimuladas con CD3, usando el formato de ensayo apagado Alexa. Las células T positivas CD4 recientemente obtenidas se incubaron bajo condiciones como se describe anteriormente para inducir la expresión de GITR. Después de la estimulación, las células se resuspendieron en medio fresco y se plaquearon para ensayos de internalización como sigue. Las células se incubaron con anticuerpo como se describe anteriormente, se lavaron con medio caliente e incubaron a 37°C por los tiempos indicados previo a la fijación y apagado. El anticuerpo internalizado se midió como fluorescencia incrementada arriba de la pequeña señal no apagable observada en tiempo cero y después se normalizó contra la fluorescencia total “control no apagado” inicialmente unida a las células. Como se muestra en la Figura 72, la ligación del GITR resultó en rápida internalización alcanzando el máximo entre 30-60 minutos para cada anticuerpo probado mientras los anticuerpos de control se encontraron por mantener la localización a la membrana plasmática. Los resultados indican que la región de bisagra IgG2 mejora la internalización inducida por ligación del GITr .
Para diseccionar además los mecanismos detallados de dinámicas asociadas e internalización, la endocitosis del anticuerpo y suministro en compartimentos de endosoma temprano se analizó. En este experimento, las células se sometieron a análisis de pulso de seguimiento con anticuerpos no etiquetados. Después de la fijación, las células se permeabilizaron y tiñeron por el marcador de endosoma temprano EEA1 (Tecnología de Señalización Celular), se lavaron y después se detectaron con anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con Alexa fluor-488 (EEA1) y anticuerpo anti-humano conjugado con Alexa fluor-647 (GITR). Las placas se formaron en imagen en un sistema confocal Opera con un objetivo de inmersión en agua 60X. Los resultados indican la segregación clara entre el anticuerpo unido a la membrana teñido con anti-GITR y la señal EEA1 intracelular. Después del calentamiento de los cultivos, se detectó el agrupamiento para algunos anticuerpos, que parecen co-localizarse con proteínas endosomales. La cuantificación de co-localización endosomal se realizó usando software HCS y los resultados se trazaron como la relación de intensidad de pixel colocalizado con relación a un teñido total (Figura 73A-73C). La colocalización del anticuerpo GITR y endosoma primario es más prominente a 30 minutos. En este punto de tiempo probado, el GITR.6.G2.G1f mostró una fracción superior colocalizada que el anticuerpo GITR.6.G1f. Los resultados de colocalización se correlacionan con las observaciones hechas usando el método de apagado Alexa descrito anteriormente y que soportan un modelo sugiriendo que la bisagra G2 tiene ventaja potencial sobre G1 para inducir la internalización del GITR.
Ejemplo 28: La señalización de anticuerpo agonista GITR en células T CD4+ y CD8+ activadas por el receptor de células T se mejora en anticuerpos que tienen un dominio CH1 y bisagra IgG2
Para investigar además los mecanismos para anticuerpos agonistas anti-GITR, se monitorearon varias trayectorias de señalización involucradas en la activación de células T, tales como trayectorias de señalización de NFkB y P38.
Células T CD4+ y CD8+ a partir de donadores sanos (M6576) se activaron con 0,4 pg/ml DE anti-CD3 y 0,4 pg/ml DE anti-CD28 recubiertos en placa. Después de 3 días, las células se recolectaron y plaquearon sobre placas de imagen de 384 cavidades para activación de señalización. Después que las células se sedimentaron en la placa por 2 horas, se trataron con los anticuerpos anti-GITR por 15 minutos y los eventos de señalización se terminaron agregando formaldheído a un final de 1o % en las placas de ensayo. Las células entonces se permeabilizaron y tiñeron con anticuerpo NFKB fosfor-p65 para detección de señalización. Como se muestra en la Figuras 74A y 74B, los anticuerpos GITR.6.G2 y GITR.6.G2.Glf tienen respuestas de señalización superiores comparadas con el GITR.6.G1f en tanto células T CD4+ como CD8+. Aúnque no existe evidencia directa de activación de la trayectoria de señalización e internalización de unión, es intrigante indicar que el isotipo G2 parece mejorar ambos aspectos de las actividades funcionales del anticuerpo comparadas con el IgG1 para GITR.6.
Para cuantificar las actividades de señalización para cada anticuerpo, se calcularon tanto EC50 como Emáx para cada anticuerpo, puesto que ambos parámetros son críticos para capturar la extensión final del evento de señalización. El nivel de respuesta de GITR.6.G2.G1f se eligió por ser el control 100 %, y todos los otros cuerpos fueron normalizados contra este. Como se muestra en la Tabla 14 para tanto células T CD4+ como CD8+, las poblaciones activadas por anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 estuvieron a un intervalo de actividades para anticuerpos GITR en términos de tanto potencia (EC50s) como eficacia (Emáx %). Aúnque el GITR.6.G2, GITR.6.G2.G1f y GITR.6.G1f mostraron potencias similares (EC50s) alrededor de un intervalo de 10 mM, la eficacia (Emáx) fue casi diferente para diferentes isotipos, sugiriendo que el anticuerpo G1 no tiene señal tan efectivamente como los isotipos G2 o quiméricos.
Tabla 14. Sumario de las actividades de señalización de NFKB HuMab GITR en células T CD4+ y CD8+ i r T R
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Para confirmar además si la diferencia de señalización de GITR.6.G2 y GITR.6.G2.G1f comparada con GITR.6.G1f está limitada a la señalización de NFkB solamente o si es verdadera para otros eventos de señalización también, se exploró una lectura de señalización de P38MAPK. Como se muestra en la Figura 75, anticuerpos GITR.6.G2 y GITR.6.G2.G1f tienen respuestas de señalización superiores comparadas con el anticuerpo GITR.6.G1f en el ensayo de activación de MAPK p38 de células CD4+. Por lo tanto, las mejores actividades de señalización para el isotipo G2 de GITR.6 comparadas con el isotipo G1 no está limitada solamente a la señalización de NFkB.
Ejemplo 29: Relevancia de ciertos residuos de aminoácidos en la bisagra y CH1 IgG2 en el mejoramiento del agonismo de GITR en células T
Los anticuerpos anti-GITR (GITR.6) con las regiones constantes de cadenas pesadas de 28F3 se prepararon y probaron en los ensayos de producción de IL-2 como se describe en los Ejemplo 25, pero en los cuales los sobrenadantes se recolectaron a 40 horas en lugar de 48 horas. Los resultados se muestran en la Figura 76A-76D.
TABLA 15: SUMARIO DE LISTADO DE SECUENCIAS
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Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo que se une a un receptor humano del TNF inducible por glucocorticoide (GITR) y comprende una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 394 o una región constante de cadena pesada que difiere de la misma en una sustitución, una adición o una deleción de aminoácido, en donde dicha una sustitución, adición o deleción de aminoácido no está en las posiciones de aminoácido 16, 20, 21, 75, 76, 82, 86, 97, 100, 102, 104 y 105 del SEQ ID NO: 394.
2. El anticuerpo de la reivindicación 1, que comprende
(a) secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena pesada que comprenden los SEQ ID NOs: 20, 21, y 22, respectivamente, y secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena ligera que comprenden los SEQ ID NOs: 23, 24, y 25, respectivamente;
(b) secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena pesada que comprenden los SEQ ID NOs: 33, 34, y 35, respectivamente, y secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena ligera que comprenden los SEQ ID NOs: 36, 37, y 38, respectivamente;
(c) secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena pesada que comprenden los SEQ ID NOs: 46, 47, y 48, respectivamente, y secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena ligera que comprenden los SEQ ID NOs: 49, 50, y 51, respectivamente;
(d) secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena pesada que comprenden los SEQ ID NOs: 62, 63, y 64, respectivamente, y secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena ligera que comprenden los SEQ ID NOs: 65, 66, y 67, respectivamente;
(e) secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena pesada que comprenden los SEQ ID NOs: 62, 63, y 64, respectivamente, y secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena ligera que comprenden los SEQ ID NOs: 68, 69, y 70, respectivamente;
(f) secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena pesada que comprenden los SEQ ID NOs: 78, 79, y 80, respectivamente, y secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena ligera que comprenden los SEQ ID NOs: 81, 82, y 83, respectivamente;
(g) secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena pesada que comprenden los SEQ ID NOs: 91, 92, y 93, respectivamente, y secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena ligera que comprenden los SEQ ID NOs: 94, 95, y 96, respectivamente;
(h) secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena pesada que comprenden los SEQ ID NOs: 106, 107, y 108, respectivamente, y secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena ligera que comprenden los SEQ ID NOs: 109, 110, y 111, respectivamente;
(i) secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena pesada que comprenden los SEQ ID NOs: 106, 107, y 108, respectivamente, y secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena ligera que comprenden los SEQ ID NOs: 112, 113, y 114, respectivamente;
(j) secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena pesada que comprenden los SEQ ID NOs: 122, 123, y 124, respectivamente, y secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena ligera que comprenden los SEQ ID NOs: 125, 126, y 127, respectivamente;
(k) secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena pesada que comprenden los SEQ ID NOs: 138, 139, y 140, respectivamente, y secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena ligera que comprenden los SEQ ID NOs: 141, 142, y 143, respectivamente;
(l) secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena pesada que comprenden los SEQ ID NOs: 138, 139, y 140, respectivamente, y secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena ligera que comprenden los SEQ ID NOs: 144, 145, y 146, respectivamente; o
(m) secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena pesada que comprenden los SEQ ID NOs: 342-344, respectivamente, y secuencias c DR1, CDR2, y CDR3 de cadena ligera que comprenden los SEQ ID NOs: 345­ 347, respectivamente.
3. El anticuerpo de las reivindicaciones 1 o 2, que comprende secuencias de región variable de cadena pesada y ligera seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) SEQ ID NOs: 13 y 14, respectivamente;
(b) SEQ ID NOs: 26 y 27, respectivamente;
(c) SEQ ID NOs: 39 y 40, respectivamente;
(d) SEQ ID NOs: 52 y 53, respectivamente;
(e) SEQ ID NOs: 52 y 54, respectivamente;
(f) SEQ ID NOs: 71 y 72, respectivamente;
(g) SEQ ID NOs: 84 y 85, respectivamente;
(h) SEQ ID NOs: 97 y 98, respectivamente;
(i) SEQ ID NOs: 97 y 99, respectivamente;
(j) SEQ ID NOs: 115 y 116, respectivamente;
(k) SEQ ID NOs: 128 y 129, respectivamente;
(l) SEQ ID NOs: 128 y 130, respectivamente; y
(m) SEQ ID NOs: 335 y 336, respectivamente.
4. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende un Fc que tienen unión mejorada a un FcyR de activación.
5. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende una sustitución S267E en la región constante de cadena pesada.
6. Una molécula biespecífica que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 ligado a una molécula que tiene una segunda especificidad de unión.
7. Un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, ligado a un agente.
8. Un ácido nucleico que codifica las regiones de cadena pesada y ligera del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
9. Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 8.
10. Una célula transformada con (i) un vector de expresión de la reivindicación 9 o (ii) un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica la cadena pesada del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y un vector de expresión separado que comprende un ácido nucleico que codifica la cadena ligera del anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
11. Una composición que comprende el anticuerpo, la molécula biespecífica o el inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, y un vehículo.
12. Un anticuerpo, una molécula biespecífica o un inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para uso en un método de tratamiento de cáncer, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo, de la molécula biespecífica o del conjugado.
13. El anticuerpo, la molécula biespecífica o el inmunoconjugado para el uso de la reivindicación 12, que comprende además administrar uno o más agentes terapéuticos adicionales.
14. El anticuerpo, la molécula biespecífica o el inmunoconjugado para el uso de la reivindicación 13, en donde el agente terapéutico adicional es un anticuerpo anti-PD1, un anticuerpo anti-LAG-3, un anticuerpo anti-CTLA-4 o un anticuerpo anti-PD-L1.
O b se rva c io n e s :
El d o c u m e n to c o m p le to que in c luye las T a b la s de R e fe re n c ia y el L is ta d o de S e c u e n c ia s se pued e d e s c a rg a r de la pá g in a w e b de la EPO .
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