ES2269366T3 - Mejoramiento de la vida media en circulacion de proteinas de fusion basadas en anticuerpos. - Google Patents

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Abstract

Una proteína de fusión alterada basada en anticuerpo, que tiene una vida media en circulación más larga in vivo que una proteína de fusión basada en anticuerpo correspondiente sin dicha alteración, que comprende una cadena de inmunoglobulina (Ig) o una porción de la misma con un dominio CH2 y CH3, enlazada a su término C al término N de una proteína no Ig secretada o una porción de la misma que retiene las propiedades funcionales de la proteína no Ig intacta, donde dicha alteración incluye una mutación puntual, una inserción, una eliminación o un reordenamiento de genes en el residuo de aminoácidos C-terminal de la cadena Ig.

Description

Mejoramiento de la vida media en circulación de proteínas de fusión basadas en anticuerpos.
Campo de la invención
La presente invención se relaciona en general con proteínas de fusión. Más específicamente, la presente invención se relaciona con métodos para el mejoramiento de la vida media en circulación de proteínas de fusión basadas en anticuerpos.
Antecedentes de la invención
El uso de anticuerpos para el tratamiento de enfermedades humanas está bien establecido y se ha hecho más sofisticado con la introducción de la ingeniería genética. Varias técnicas han sido desarrolladas para mejorar la utilidad de los anticuerpos. Éstas incluyen: (1) la generación de anticuerpos monoclonales por fusión celular para crear "hibridomas" o por clonación molecular de cadenas de anticuerpos pesadas (H) y livianas (L) a partir de células productoras de anticuerpos; (2) la conjugación de otras moléculas en anticuerpos para liberarlos en los lugares preferidos in vivo, por ejemplo, radioisótopos, fármacos tóxicos, toxinas de proteínas y citoquinas; (3) la manipulación de las funciones de efector de anticuerpos para mejorar o disminuir la actividad biológica; (4) la unión de otras proteínas tales como toxinas y citoquinas con anticuerpos a nivel genético para producir proteínas de fusión basadas en anticuerpos; y (5) la unión de uno o más juegos de regiones combinantes de anticuerpos a nivel genético para producir anticuerpos bi-específicos.
Las proteínas pueden ser unidas entre sí bien a través de manipulación química o genética usando métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo Gillies et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1428-1432 (1992); y U.S. Patent No. 5,650,150.
Sin embargo, la utilidad de las proteínas de fusión basadas en anticuerpos producidas por recombinación puede ser limitada por su rápida desaparición in vivo de la circulación. Las proteínas de fusión anticuerpo-citoquina, por ejemplo, han demostrado tener una vida media circulando in vivo significativamente más baja que el anticuerpo libre. Cuando se prueba una variedad de proteínas de fusión anticuerpo-citoquina, Pilles et al. reportó que todas las proteínas de fusión probadas tenían una fase \alpha (fase de distribución), de vida media de menos de 1. 5 horas. En efecto, la mayor parte de las proteínas de fusión basadas en anticuerpos fueron disminuidas al 10% de la concentración de suero del anticuerpo libre en dos horas. Véase Gillies et al., BIOCONJ. CHEM. 4: 230-235 (1993). Más recientemente se ha demostrado que las proteínas de fusión basadas en anticuerpos con afinidad de enlace reducida por un receptor Fc tienen vidas medias de circulación mejoradas. También se demostró que una afinidad de enlace reducida por el receptor eje se interfería con algunas de las funciones de efector del anticuerpo tales como la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC), pero no interfería con otras funciones tales como la fijación de complemento o el enlace del antígeno. Véase Gillies et al., Cancer Res. 59(9):2159-66 (1999).
En algunos casos, tales como el tratamiento de cáncer o enfermedades virales, sería deseable mantener las funciones de efector del anticuerpo y una vida media en circulación larga. Por lo tanto, hay una necesidad en la técnica por métodos adicionales para incrementar la vida media en circulación in vivo de proteínas de fusión basadas en anticuerpos.
Resumen de la invención
Las moléculas de inmunoglobulinas G (IgC) interactúan con múltiples casos de receptores celulares que incluyen tres clases de receptores Fc\gamma (Fc\gammar) específicos para la clase IgG de anticuerpo, denominados Fc\gammaRI, Fc\gammaRII y Fc\gammaRIII. También interactúan con la clase FcRp del receptor de una manera que depende del pH con poco o ningún enlace a pH neutro pero un alto enlace a un pH de 6.0. La vida media en el suero de un anticuerpo está influenciada por la capacidad del anticuerpo para enlazarse a un receptor Fc (FcR) y al receptor de protección Fc (FcRp). La vida media en suero de las proteínas de fusión de la inmunoglobulina también está influenciada, por ejemplo, por la habilidad para enlazarse a tales receptores (Gillies et al., Cancer Res. 59:2159-66 (1999)).
La invención revela la sorprendente observación de que, con proteínas de fusión que comprenden una unidad estructural de inmunoglobulina (Ig) y una unidad estructural que no es inmunoglobulina (no-Ig), la alteración de los aminoácidos junto a la unión de las dos unidades estructurales incrementa dramáticamente la vida media en suero de la proteína de fusión. La observación es sorprendente porque los cambios de aminoácidos afectan las superficies de las proteínas que son distintas de las superficies de interacción de la región Fc con los receptores FC y con el receptor de protección Fc. Además, los cambios de aminoácidos de la invención tienen su efecto aún cuando el receptor conocido Fc y el receptor de protección Fc no determinan primariamente la vida media en suero de la proteína de fusión. Así, las alteraciones en aminoácidos de la invención pueden ser combinadas con alteraciones en aminoácidos que afecten la interacción con el receptor Fc y/o el receptor de protección Fc para alcanzar efectos sinérgicos.
La presente invención provee proteínas de fusión que contienen una inmunoglobulina en la cual la vida media en el suero se mejora como resultado de alteraciones que se encuentran en sitios diferentes de la superficie de interacción de la región Fc con el receptor Fc y con el receptor de protección Fc (FcRp). La presente invención también provee métodos para la producción de proteínas de fusión entre una unidad estructural inmunoglobulina y una segunda proteína que no es inmunoglobulina y que tiene una vida media en suero mejorada.
Las alteraciones en la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión se encuentran preferiblemente en la unión de la unidad estructural Ig y la unidad estructural que no es Ig. La región de unión de la proteína de fusión contiene alteraciones que, con respecto a las secuencias que se presentan de manera natural de la cadena pesada Ig y de la por proteína que no es Ig, cae preferiblemente alrededor de los 10 aminoácidos del punto de unión. Más preferiblemente, los cambios en aminoácidos causan un incremento en la hidrofobicidad. Aun más preferiblemente, los cambios en aminoácidos involucran el cambio de la lisina C-terminal al de la unidad estructural de anticuerpo a un aminoácido hidrófobo, tal como la alanina o la leucina. En una modalidad preferida, la proteína de fusión de la invención comprende una cadena pesada Ig, preferiblemente localizada N-terminal N con respecto a una segunda proteína que no es Ig.
En otra modalidad de la invención, la afinidad de enlace de las proteínas de fusión por FCRp se optimiza por alteración de la superficie de interacción de la unidad estructural Fc que está en contacto con FcRp. Las secuencias importantes para el enlace de la Ig al receptor FcRp han sido reportadas como localizadas en los dominios CH2 y CH3. De acuerdo con la invención, las alteraciones de la unión de fusión en una proteína de fusión se combinan con alteraciones de la superficie de interacción del Fc con FcRp para producir un efecto sinérgico. En algunos casos esto puede ser útil para incrementar la interacción de la unidad estructural Fc con FcRp a pH 6, y también puede ser útil para disminuir la interacción de la unidad estructural Fc con FcRp a pH 8. Tales modificaciones incluyen alteraciones de residuos necesarias para contactar los receptores Fc o alteración de otros que afectan los contactos entre residuos de otras cadenas y el receptor FcRp a través de cambios conformacionales inducidos. Así, en una modalidad preferida, una proteína de fusión basada en anticuerpos con vida media en circulación in vivo mejorada se obtiene uniendo primero las secuencias de codificación de una región constante de una IG y una segunda proteína que no es inmunoglobulina y luego introduciendo una mutación (tal como una mutación puntual, una eliminación, una inserción, o un reordenamiento genético) en una región constante en o cerca de uno o más aminoácidos seleccionados a partir de Ile 253, His 310 e His 435. Las proteínas de fusión basadas en anticuerpos o resultantes tienen una vida media en circulación in vivo más larga que las proteínas de fusión no modificadas.
En ciertas circunstancias es útil hacer mutar ciertas funciones del efector de la unidad estructural Fc. Por ejemplo, la fijación de complemento puede ser eliminada. Alternativamente o además, en otro juego de modalidades el componente Ig de la proteína de fusión tiene al menos una porción de la región constante de una crisis así que tiene una afinidad de enlace reducida por al menos uno de Fc\gammaRI, Fc\gammaRII o Fc\gammaRIII. Por ejemplo, la cadena de gamma 4 de IgG puede ser utilizada en vez de la gamma 1. La alteración tiene la ventaja de que la cadena gamma 4 se traduce en una vida media en suero más larga, funcionando de manera sinérgica con una o más mutaciones en la unión de fusión. De acuerdo con ello, la IgG 2 también puede ser utilizada en lugar de la IgG 1. En una modalidad alternativa de la invención, una proteína de fusión incluye una región constante mutante IgGI, por ejemplo una región constante IgGI que tiene una o más mutaciones o eliminaciones de Leu234, Leu235, Gly236, G1y237, Asn297, o Pro331. En una modalidad adicional de la invención, una proteína de fusión incluye una región constante mutante y IgG3, por ejemplo una región constante IgG3 que tiene una o más mutaciones o eliminaciones de Leu281, Leu282, Gly283, Gly284, Asn344, o Pro378. Sin embargo, para algunas aplicaciones, puede ser útil retener la función de efector que acompaña el enlace del receptor Fc, tal como el ADCC.
En una modalidad preferida, la segunda unidad estructural que no es inmunoglobulina de la proteína de fusión es una citoquina. El término "citoquina" se usa aquí para describir proteínas de ocurrencia natural o recombinantes, análogos de las mismas, y fragmentos de las mismas que elicitan una respuesta biológica específica en una célula que tiene un receptor para esa citoquina. Preferiblemente, las citoquinas son proteínas que pueden ser producidas y excretas por una célula. Las citoquinas incluyen preferiblemente interleucinas tale como interlecin-2 (IL-2), IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16 and IL-18, factores hematopoyéticos tales como el factor de estimulación de la colonia de granulocito-macrófagos (GM-CSF), factor de estimulación de granulocitos en el colon (G-CSF) y eritropyetina, factores de necrosis de tumor (TNF) tales como TNFa, citoquinas tales como la linfotoxina, reguladores de procesos metabólicos tales como la leptina, interferones tales como el interferón \alpha, el interferón \beta, y el interferón \gamma, y quimioquinas. Preferiblemente, la proteína de fusión citoquina anticuerpo de la presente invención despliega actividad biológica de citoquina.
En una modalidad alternativa preferida, la segunda unidad estructural que no es inmunoglobulina de la proteína de fusión es una proteína ligando-enlace con actividad biológica. Tales proteínas ligando-enlace pueden, por ejemplo, (1) bloquear las interacciones receptor-ligando en la superficie de la célula; o (2) neutralizar la actividad biológica de una molécula (por ejemplo, una citoquina) en la fase fluida de la sangre, previniendo así que se alcance su objetivo celular. Preferiblemente, las proteínas ligando-enlace incluyen receptores CD4, CTLA-4, TNF, o receptores de interleucina tal como los receptores IL-1 y IL-4. Preferiblemente, la proteína de fusión anticuerpo-receptor de la presente invención despliega la actividad biológica de la proteína ligando-enlace.
En aún otra modalidad preferida alternativa, la segunda unidad estructural que no es inmunoglobulina de la proteína de fusión es una toxina proteínica. Preferiblemente, la proteína de fusión anticuerpo-toxina de la presente invención despliega la actividad tóxica de la toxina proteínica.
\newpage
En aún otras modalidades preferidas, la segunda unidad estructural que no es inmunoglobulina de la proteína de fusión es una hormona, de neurotrofina, regulador del peso corporal, proteína de suero, factor de coagulación, proteasa, componente de matriz extracelular, factor y clínico, factor angiogénico, u otra proteína secretada o dominio secretado. Por ejemplo, CD26, receptor IgE, receptor polimérico IgA, otros receptores de anticuerpos, Factor VIII, Factor IX, Factor X, TrkA, PSA, PSMA, Flt-3 Ligando, endostatina,
Angiostatina y dominios de estas proteínas
En aún otras modalidades, la segunda unidad estructural que no es inmunoglobulina es una proteína no humana o no proveniente de mamíferos. Por ejemplo HIV gp 120, HIV Tat, proteínas de superficie de otros virus tales como adenovirus y RSV, otros componentes de VIH, proteínas parásitas de superficie tales como antígenos de la malaria, y proteínas de superficie bacterianas son las preferidas. Estas proteínas no humanas puede ser usadas, por ejemplo, como antígenos o porque tienen actividades útiles. Por ejemplo, la segunda unidad estructural que no es inmunoglobulina puede ser estreptoquinasa, estafiloquinasa, uroquinasa, activador palsminógeno tisular, u otras proteínas con actividades enzimáticas útiles.
De acuerdo con la invención, la unidad estructural que no es inmunoglobulina puede ser una porción de una proteína. Preferiblemente, la unidad estructural de proteína que no es Ig es una porción de proteína que retiene sustancialmente las propiedades funcionales y/o estructurales de una proteína intacta. En una modalidad preferida, la unidad estructural de proteína no Ig es una porción funcional o estructural de una proteína descrita aquí.
En una modalidad preferida, la proteína de fusión basada en anticuerpos comprende una región específica variable para un antígeno objetivo así como una región constante, la cual es también el basada través de una unión peptídica a una segunda proteína no inmunoglobulina. La región constante puede ser la región constante normalmente asociada con la región variable, o una diferente, por ejemplo, regiones variables y constantes de diferentes especies. La cadena pesada puede incluir cualquier combinación de uno o más dominios CH1, CH2, o CH3. Preferiblemente, la cadena pesada incluye dominios CH1, CH2, y CH3, y más preferiblemente solamente dominios CH2 y CH3. En una modalidad, la proteína de fusión basada en anticuerpo comprende una región Fv con regiones variables de cadena pesadas y livianas fusionadas. También abarcadas dentro del término "proteína de fusión" hay construcciones que tienen dominios de enlace que comprenden regiones de marco y regiones variables (por ejemplo, regiones que determinan la complementariedad) de diferentes especies, tales como las descritas por Winter, et al., Great Britain Patent No. 2,188, 638. Las proteínas de fusión basadas en anticuerpos que comprenden una región variable preferiblemente despliegan especificidad antígeno-enlace. En aún otra modalidad preferida, la proteína de fusión basada en anticuerpos comprende además una cadena liviana. La invención provee así proteínas de fusión en las cuales la especificidad antígeno-enlace y la actividad de un anticuerpo están combinadas con la potente actividad biológica de una segunda proteína que no es inmunoglobulina, tal como una citoquina. Una proteína de fusión de la presente invención puede ser utilizada para liberar selectivamente la segunda proteína que no es inmunoglobulina hacia una célula objetivo in vivo de tal manera que la segunda proteína que no es inmunoglobulina pueda ejercer un efecto biológico localizado.
En una modalidad preferida alternativa, la proteína de fusión basada en anticuerpos comprende una región constante de cadena pesada enlazada través de un enlace peptídico a una segunda proteína que no es inmunoglobulina, pero no comprende una región de cadena pesada variable. La invención provee así además proteínas de fusión que retienen la potente actividad biológica de una segunda proteína que no es inmunoglobulina, pero que carece de la especificidad antígeno-enlace y de la actividad de un anticuerpo.
En modalidades preferidas, la proteína de fusión comprende dos cadenas quiméricas que comprende al menos una porción de una cadena pesada y una segunda proteína que no es Ig enlazada a través de un puente bisulfuro.
En modalidades preferidas, las proteínas de fusión de la invención son útiles para tratar cáncer, infecciones virales, desórdenes inmunes, y para incrementar el crecimiento (incluyendo la proliferación) de tipos celulares específicos.
La invención también caracteriza construcciones de ADN que codifican las proteínas de fusión antes descritas, y líneas celulares, por ejemplo mielomas, transfectadas con estas construcciones.
Estos y otros objetivos junto con ventajas y características de la invención aquí reveladas, serán más evidentes a partir de la descripción, dibujos y reivindicaciones que siguen.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra el comportamiento fármaco cinético de la proteína de fusión párrafo 25 y de varias proteínas de fusión mutantes que contienen sustituciones de la unidad estructural lisina C-terminal de la cadena pesada u otras alteraciones descritas en los ejemplos. Los niveles de anticuerpos o de proteína de fusión fueron medidos por una ELISA que detecta IL-2 (figura 1A) o Fc humana (Figura 1B).
La figura 2 muestra las propiedades farmacocinéticas de las proteínas de fusión KS-IL-2 que llevan bien la cadena gamma 1 o gamma 4 bien sea con la lisina tipo silvestre o la mutación lisina a alanina en el término C de la cadena pesada del anticuerpo. Los niveles de anticuerpos o proteínas de fusión fueron medidos mediante una ELISA para detectar la unidad estructural IL-2.
La figura 3 muestra las propiedades farmacocinéticas de fusiones de un anticuerpo humano al factor de necrosis tumoral (TNF alfa). Los niveles de proteína de fusión fueron medidos por una ELISA que detecta la región del Fc ser humano. Se muestran los niveles de una proteína de fusión intacta anticuerpo-TNF alfa (diamantes negros) y los niveles de una proteína de fusión por lo demás idéntica, en la cual la lisina C-terminal de la unidad estructural del anticuerpo ha sido eliminada (cuadrados grises).
La figura 4 muestra el enlace de las proteínas de fusión IL-2-anticuerpos a membranas de células fijas J774, las cuales son ricas en la clase Fc\gammaR del receptor. Se muestran los enlaces de una proteína de fusión no mutantes Ks-IL-12 (diamantes negros) y una proteína de fusión KS-Il-12 que porta una mutación de la lisina de la cadena C-terminal lisina a alanina (cuadrados grises).
La figura 5 muestra el efecto del tratamiento con una proteína de fusión anticuerpo-citoquina de ratones Balb/C que llevan tumores subcutáneos derivados de células de carcinoma del colon CT 26 que han sido manipulados para expresar el EpCAM 25 humano, el antígeno para KS.
Descripción detallada de la invención
La presente invención provee proteínas de fusión de anticuerpos que tienen una o más mutaciones en la unión entre las unidades estructurales Ig y no Ig, e incrementa las vidas medias en circulación de las proteínas de fusión. Las proteínas de fusión mutante de la invención tienen la propiedad ventajosa de que su vida media en suero se mejora sin afectar la interacción de la unidad estructural del anticuerpo con cualquiera de los dos receptores que determinan las farmacocinéticas conocidas en el cuerpo: el receptor Fc y FcRp.
En general, una proteína de fusión basada en anticuerpos de la invención comprende una porción de una proteína inmunoglobulina (Ig) unida a una proteína que no es inmunoglobulina (no Ig), tal que la secuencia de aminoácidos de la región que barre la unión entre las proteínas Ig y no Ig tiene al menos una mutación cuando se compara con la secuencia de aminoácidos tipo silvestre de las proteínas Ig y no Ig.
En una modalidad, al menos una mutación está en la región C-terminal de la porción Ig. En otra modalidad, al menos una mutación está en la región N-terminal de la proteína no Ig. En una modalidad adicional, la proteína de fusión contiene al menos una mutación en la región C-terminal de la porción Ig, y al menos una mutación en la región N-terminal de la proteína no Ig. Una mutación puede ser una mutación puntual, una inserción, una eliminación, o un reordenamiento de genes. En modalidades preferidas en la mutación incrementa la hidrofobicidad de la región de unión. Por ejemplo, la mutación remplaza un aminoácido cargado ionizable con un aminoácido no cargado o hidrófobo. (Por ejemplo, una Lys, Arg, u otro residuo ionizable es remplazado con una Ala, Leu, Gly, Trp, u otro residuo no cargado o hidrófobo).
En una modalidad opcional, se inserta un péptido espaciador o de enlace entre las proteínas Ig y no Ig. El péptido espaciador o de enlace preferiblemente no es cargado, más preferiblemente no polar y/o hidrófobo. La longitud de un péptido espaciador o de enlace es preferiblemente entre uno y aproximadamente 100 aminoácidos, mas preferiblemente entre 1 y aproximadamente 50 aminoácidos, o entre 1 y aproximadamente 25 aminoácidos, y aún más preferiblemente entre 1 y aproximadamente 15 aminoácidos. En otra modalidad de la invención, las unidades estructurales Ig y no Ig de la proteína de fusión están unidas a través en un péptido espaciador o de enlace, y hay al menos una mutación en una o en ambas de las unidades estructurales Ig y no Ig. En una modalidad alternativa de la invención, las unidades estructurales Ig y no Ig están separadas por un espaciador sintético, por ejemplo un espaciador PNA, que es preferiblemente no cargado, mas preferiblemente no polar, y/o hidrófobo.
De acuerdo con la invención, una cadena de inmunoglobulina (Ig) es una proteína de inmunoglobulina o una porción de una proteína de inmunoglobulina que incluye un dominio variable o constante. Una cadena Ig es preferiblemente una porción de una cadena pesada de inmunoglobulina, por ejemplo, una región variable de inmunoglobulina capaz de enlazar un tipo de célula preseleccionado. En una modalidad preferida, la cadena Ig comprende una región variable específica para un antígeno objetivo así como una región constante. La región constante puede ser la región constante normalmente asociada con la región variable, o una diferente, por ejemplo, o regiones variables y constantes de diferentes especies. En una modalidad más preferida, una cadena Ig incluye una cadena pesada. La cadena pesada puede incluir cualquier combinación de uno o más dominios CHI, CH2 o CH3. Preferiblemente, la cadena pesada incluye dominios CH1, CH2 y CH3 y más preferiblemente sólo dominios CH2 y CH3. En otra modalidad, la porción de la inmunoglobulina incluye una región Fv con regiones de cadenas variables pesadas y ligeras fusionadas
De acuerdo con la invención, una proteína no inmunoglobulina incluye una proteína de ocurrencia natural que no es una inmunoglobulina, una proteína sintética o recombinante que no es una inmunoglobulina, o un fragmento de cualquiera de las anteriores. En una modalidad preferida, una proteína no inmunoglobulina incluye un dominio funcional tal como un dominio de enlace del ligando, un dominio enzimático, un dominio regulador, o un dominio que interactúa con uno o más factores celulares. En una modalidad alternativa, un dominio de no inmunoglobulina comprende un dominio estructural o un epítopo.
En una modalidad preferida la cadena Ig está unida a la proteína no Ig a través de una fusión de genes. Preferiblemente, la fusión es sintética o recombinante, y se genera utilizando técnicas estándar en el campo de la biología molecular. Típicamente, una mutación es introducida como parte de la construcción de fusión del gen. Alternativamente, puede introducirse una mutación subsecuentemente, utilizando métodos conocidos de mutagénesis (por ejemplo exponiendo la construcción de fusión de genes a irradiación, o por mutagénesis química o biológica).
De acuerdo con la invención, una región de unión es la región de la proteína de fusión que rodea el punto de unión entre las unidades estructurales Ig y no Ig de la proteína de fusión. En una modalidad preferida, la región de unión incluye la porción C-terminal de la unidad estructural Ig y la porción N-terminal de la unidad estructural no Ig. En una modalidad, la región de unión también comprende un péptido espaciador o de unión insertado en el punto de unión entre las unidades estructurales Ig y no Ig.
De acuerdo con modalidades preferidas de la invención, una mutación en la unidad estructural Ig está en la porción C-terminal de la unidad estructural Ig, preferiblemente dentro de aproximadamente 100 residuos, más preferiblemente dentro de aproximadamente 50 residuos, o aproximadamente 25 residuos, y aún más preferiblemente dentro de 10 residuos del término C de la unidad estructural Ig.
De acuerdo con modalidades preferidas de la invención, una mutación en la unidad estructural no Ig está en la porción N-terminal de la unidad estructural no Ig, preferiblemente dentro de aproximadamente 100 residuos, más preferiblemente dentro de aproximadamente 50 residuos, o aproximadamente 25 residuos, y aun más preferiblemente dentro de aproximadamente 10 residuos del término N. de la unidad estructural no Ig.
En modalidades preferidas de la invención, una mutación está en la región C-terminal de la unidad estructural Ig, pero la mutación no está en una parte de la proteína Ig que interactúa con el receptor Fc (FcR) o FcRp.
Una proteína de fusión de anticuerpos que tiene una mutación de acuerdo con la invención tiene una vida media en circulación in vivo incrementada en comparación con la vida media en circulación de una proteína de fusión de anticuerpos sin la mutación. La vida media en circulación de una proteína de fusión de anticuerpos puede medirse probando el nivel en suero de la proteína de fusión como función del tiempo.
Las evidencias experimentales indican que los efectos de las mutaciones preferidas de la invención no dependen de interacciones con FcR o FcRp. Primero las mutaciones preferidas que incrementan la vida media en circulación de una proteína de fusión no afectan afecciones del anticuerpo que, sobre las estructuras tridimensionales, son parte de la superficie de interacción que enlaza FcR o FcRp. Segundo, las mutaciones preferidas de la invención pueden causar un mejoramiento en la vida media en suero aun cuando la interacción con FcR sea retirada mediante el uso de una cadena igG-gamma4 y la interacción con FcRp es retirada adelantando un estudio farmacocinético en ratones mutantes beta 2 microglobulina en el cual FcRp 38 es defectuosa. Tercero, las modalidades preferidas de la invención no afectan significativamente el enlace de proteínas de fusión Ig a células J774.
Los análisis de mutagénesis dirigidos a un sitio indican que la superficie de Fc que interactúa con el receptor Fc está cercana a la región de bisagra del dominio CH2. La región Fc de la superficie de interacción FcR es muy lejana, en tres dimensiones, del término C del Fc. Análisis similares indican que FcRp interactúa con residuos de aminoácidos localizados en la interfaz entre los dominios CH2 y CH3.
FcRp enlaza su ligando con una afinidad muchísimo más alta a pH ácido (pH 6.0), que a un pH neutro o ligeramente básico (pH 7.4). Esto es consistente con el papel del FcRp en la protección de moléculas que contienen Fc tales como los anticuerpos que siguen su internalización celular dentro de los endosomas. Estos compartimientos celulares se acidifican después de la fusión con el lisosoma y sus proteínas constituyentes son degradadas por proteasas ácidas. El enlanzamiento FcRp enlazado a la membrana durante este proceso previene la degradación del anticuerpo y permite que sea reciclado hacia el exterior de la célula (de regreso en la circulación) o a través de una capa de células (un proceso denominado transitocis). Este último proceso permite que la IgG pase a través de la mucosa intestinal neonatal siguiendo la ingestión de la leche en el ambiente ácido de los intestinos.
La estructura del complejo Fc/FcRp indica que FcRp se enlaza al lado de la región Fc, con contactos tanto en los dominios CH2 y CH3, y que la región contactada no es particularmente cercana al término-C de la región Fc. Así, no se espera que la alteración de la región C-terminal del Fc altere la integración con FcRp.
No queriendo ser restringidos por cualquier teoría particular, se cree que la mutación en la región de unión de fusión puede incrementar la vida media circulatoria de una proteína de fusión. De acuerdo con la invención también reduce la ruptura de la proteína de fusión en un ensayo de ruptura con proteasa, como se ilustra en el ejemplo 15. Se cree además de la digestión de la proteasa puede contribuir a la desaparición de proteínas intactas del cuerpo, incluyendo proteínas de fusión. Así, la resistencia a las proteasas puede contribuir directamente a la farmacocinética mejorada de las proteínas. También se cree que la acción de la proteasa de proteínas no desnaturalizadas involucra el acceso mediante una proteasa a una secuencia expuesta en la conformación correcta, así como el reconocimiento de una secuencia específica de aminoácidos. Así, mutaciones en la unión de fusión que afecten la conformación general de una proteína y afecten así el acceso de las proteasa hasta sus sitios de ruptura pueden contribuir a la resistencia a la proteasa y a una fármaco-cinética mejorada. Además, las mutaciones que alteran las secuencias de reconocimiento específicas de la proteasa pueden contribuir a la resistencia a la proteasa y a mejorar la farmacocinética.
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Un aspecto de las mutaciones de la invención es que pueden ser combinadas con otras mutaciones o sustituciones en la unidad estructural del anticuerpo para modular de manera sinérgica la vida media en el suero u otras propiedades de la unidad estructural Ig. Por ejemplo una o más mutaciones de la invención que incrementen la vida media en circulación de una proteína de fusión del anticuerpo pueden ser combinadas con una o más mutaciones que afecten la interacción entre la proteína de fusión del anticuerpo y FcR o FcRp.
Además las mutaciones de la invención pueden ser utilizadas con una amplia variedad de unidades estructurales de anticuerpos y con una amplia variedad de asociados de fusión no Ig. Las inmunoglobulinas incluyen IgG, IgM, IgA, IgD, y IgE. Los asociados de fusión no Ig incluyen citoquinas, otras proteínas secretadas, enzimas, o fragmentos solubles de receptores tales como dominios ligando- enlace. De acuerdo con la invención, una proteína de fusión basada en anticuerpos con vida media en circulación in vivo mejorada puede mejorarse aún modificando la porción Fc misma. Estos pueden ser residuos que incluyan o sean adyacentes a Ile 253, His 310 o His 435 u otros residuos que pueden efectuar los ambientes iónicos de estos residuos cuando la proteína se pliega en su estructura tridimensional. Las proteínas resultantes pueden ser probadas en cuanto a su enlace óptimo a pH 6 y a pH 7.4-8 y aquellos con altos niveles de enlace a pH 6 y bajos niveles de enlace a pH 8 son seleccionados para su uso in vivo. Tales mutaciones pueden ser combinadas de manera útil con las mutaciones de unión de la invención.
Los métodos y composiciones de la invención son útiles cuando se coadministran con inhibidores de angiogénesis tales como los divulgados en PCT/US99/08335 (WO 99/52562) o inhibidores de prostaglandina tales como los revelados en PCT/US99/08376 (WO 99/53958). Los métodos y composiciones de la invención también pueden ser utilizados en complejos múltiples citoquina proteína tales como los descritos en PCT/US00/21715. Los métodos y composiciones de la invención también son útiles en combinación con otras mutaciones descritas en PCT/US99/03966 (WO 99/43713) que incrementan la vida media en circulación de una proteína de fusión.
Los métodos no limitantes para sintetizar modalidades útiles de la invención están descritos en los ejemplos aquí incluidos, así como ensayos útiles para probar las actividades farmacocinéticas, tanto en modelos in vitro como en modelos pre- clínicos animales in vivo. La construcción genética preferida que codifica una cadena quimérica incluye en orientación 5' a 3', un segmento de ADN que codifica al menos una porción de una inmunoglobulina y ADN que codifica una segunda proteína que no es inmunoglobulina. Una construcción genética alternativa preferida incluye, en orientación 5' a 3', un segmento de ADN que codifica una segunda proteína que no es inmunoglobulina y ADN que codifica al menos una porción de una inmunoglobulina. El gen fusionado es ensamblado en o insertado dentro de un vector de extracción para transfección de las células recipientes apropiadas cuando se expresa.
La invención también provee métodos para identificar mutaciones que incrementan la vida media circulatoria de una proteína de fusión basada en anti-cuerpos. Los métodos comprenden introducir una o más mutaciones en una región que barre la unión entre la unidad estructural Ig y la unidad estructural no Ig de una proteína de fusión basada en anticuerpos. La vida media en circulación de la proteína de fusión multada es probada, preferiblemente monitoreando su nivel en suero in vivo como una función del tiempo.
En una modalidad de la invención, una mutación que incremente la vida media circulatoria de una proteína de fusión basada en anticuerpos es una mutación que reduce la ruptura de la proteína de fusión en una prueba de ruptura con proteasa, según se discute en el ejemplo 15. La mutación es preferiblemente una mutación en una región que barre la unión entre la unidad estructural Ig y la unidad estructural no Ig de la proteína de fusión (por ejemplo, una mutación en la región de unión discutida más arriba). Alternativamente, la mutación puede ser cualquier mutación en la proteína de fusión que reduzca la ruptura con proteasa que incrementa la vida media circulatoria de la proteína de fusión como se describe en el ejemplo 16. De acuerdo con ello, la invención provee métodos para analizar las mutaciones en proteínas en general y preferiblemente en una proteína de fusión Ig-citoquina, para identificar mutaciones que incrementen la vida media circulatoria de la proteína de fusión.
La invención se ilustra adicionalmente con los siguientes ejemplos no limitantes. Los números de residuos de aminoácidos utilizados aquí se refieren a la secuencia de aminoácidos IgG1. Cualquier persona de habilidad ordinaria en la técnica entenderá que las mutaciones correspondientes en proteínas de fusión que involucren otras proteínas Ig son útiles para incrementar sus vidas medias de circulación.
De acuerdo con ello, las enseñanzas presentadas aquí son aplicables a otras moléculas de Ig tales como IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgD, o IgE.
Ejemplos Ejemplo 1 Construcción de genes de anticuerpo IL-2 con sustituciones del codón Lys en la unión de fusión
La secuencia de aminoácidos en la unión de la proteína de fusión anticuerpo IL-2 es SerProGlyLys-AlaProThr (SEQ ID NO: 1), en la cual SerProGlyLys (SEQ ID No. 2) es el término carboxi terminal de la cadena pesada del anticuerpo, y AlaProThr es la secuencia N-terminal de IL-2 maduro. Con el fin de determinar las alteraciones de efecto en la región de la unión de fusión sobre la farmacocinética de la proteína de fusión, se hicieron sustituciones o eliminaciones del residuo por mutagénesis como se describe más abajo.
El vector de expresión para las inmunocitoquinas fue descrito Gillies et al., (1998) J. Immunol. 160:6195-6203.
En el gen humano gamma-1 que codifica la cadena pesada, el sitio de restricción XmaI localizado corriente arriba del codón de detención de la traducción fue destruido introduciendo una mutación silenciosa (TCC a TCA). Otra mutación silenciosa (TCT a TCC) fue introducida en los tres residuos del codón Ser corriente arriba de la lisina del terminal C de la cadena pesada para crear la secuencia TCC CCG GGT AAA (SEQ ID No. 3), la cual contiene el nuevo sitio XmaI. [Lo et al., (1998) Protein Engineering 11:495-500]. El cADN IL-2 fue construido por síntesis química y contiene un nuevo y único sitio de restricción PvuII [Gillies et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89:1428-1432]. Los sitios XmaI y PvuII son únicos en el vector de expresión y facilitan la mutagénesis del codón de glicina que cae en la unión del CH3 y el IL-2 ADN.
La sustitución o eliminación del codón de glicina fue alcanzada reemplazando el fragmento XmaI-PvuII en el sector de expresión de inmuno citoquina con un dúplex de oligonucleótidos que codifica la mutación deseada. En este caso las regiones variables de las cadenas pesada y ligera fueron derivadas a partir del anticuerpo humanizado KS, el cual reconoció un antígeno humano llamado EpCAM (molécula de adhesión celular epitelial). Las secuencias de los dúplex de los oligonucleótidos utilizados en la presente invención se muestran más abajo, donde los codones en negrilla codifican las mutaciones deseadas, y las secuencias en itálica, CCCGG y CAG son el extremo de cohesión ante del sitio XmaI y el extremo romo del sitio PvuII, respectivamente. El dúplex de oligonucleótido con extremos entre 5'-hidroxilo se utilizaron para ligar el vector de expresión digerido XmaI-PvuII. El uso de oligonucleótidos con extremos 5'-hidroxilo elimina la autorización de los dúplex de oligonucleótidos.
1.) Sustitución Lys a Ala
1
2.) Sustitución Lys a Arg
2
Un sitio de restricción NarI (GGCGCC) fue introducido también por mutación para facilitar el análisis de clones recombinantes.
3.) Eliminación de Lys
3
4.) Sustitución Lys a Gly
4
Un sitio de restricción ApaI (GGGCCC) fue introducido también por mutación silenciosa para facilitar el análisis de clones recombinantes.
5.) Sustitución Lys a Leu
5
Un sitio de restricción NarI (GGCGCC) fue introducido también por mutación silenciosa para facilitar el análisis de clones recombinantes.
6.) Sustitución Lys a AlaAlaAla
6
7.) Sustitución Lys a Cys
7
Un sitio de restricción FspI (TGCGCA) fue introducido también por mutación silenciosa para facilitar el análisis de clones recombinantes.
8.) Sustitución Lys a Asp
8
Las construcciones de genes recombinante se contienen las diversas sustituciones o eliminaciones del codón lisina fueron confirmadas por secuenciamiento de ADN.
Ejemplo 2 Construcción de genes de anticuerpo IL-2 que codifican residuos extra de aminoácidos en la unión de fusión
Es común en la técnica separar dominios en proteínas de fusión con enlazantes flexibles que contienen residuos de aminoácidos tales como glicina y serina. La importancia del espaciador entre CH3 e IL-2 fue estudiada en los siguientes experimentos de mutagénesis. Los dúplex de oligonucleótidos con extremos romos que codifican diferentes números de residuos de aminoácidos fueron insertados en el sitio de restricción de la endonucleasa SmaI (mismo sitio de reconocimiento que el XmaI mencionado anteriormente) del vector de expresión huKSIL-2 por enlace; y la orientación conecta de la inserción fue confirmada por secuenciamiento de ADN. Como se discute anteriormente, los dúplex de oligonucleótidos con extremos 5'-hidroxilo fueron utilizados para eliminar el autoenlace.
9.) Sustitución de Lys a Cys con ligazón con enlazante
El siguiente enlazante (dúplex de oligonucleótidos) fue insertado en el sitio de restricción SmaI de endonucleasa del del vector de expresión huKSIL-2 por ligazón. La secuencia GCATGC codifica un sitio de restricción SphI, facilita el análisis de los recombinantes que contienen la inserción del ligante.
9
Después de la ligazón del ligante en el sitio (CCCGGG)párrafo 66, la secuencia en la unión de fusión se hizo
10
Por lo tanto, el ligante pone un residuo Cys en la posición original del residuo Lys, para una posible formación de la ínter cadena de puente disulfuro. El residuo original lisina fue empujado hacia atrás por tres residuos de aminoácidos (AlaCysGly).
10. Un ligante que codifica 6 residuos de aminoácidos
El siguiente ligante (dúplex de oligonucleótidos) fue insertado en el sitio de restricción de la endonucleasa huKSIL-2 del vector de expresión por ligazón. La secuencia GGATCC codifica un sitio de restricción BamHI, que facilitó el análisis de los recombinantes que contenían la inserción del ligante.
11
Después de la ligazón del ligante en el sitio SmaI, la secuencia en la unión de fusión se hizo ProGlySerGlySerGlyGlyGlyLys (SEQ ID NO: 24), donde los seis residuos de aminoácidos insertados están subrayados.
11. Un ligante que codifica 11 residuos de aminoácidos
El siguiente ligante (dúplex de oligonucleótidos) fue insertado del sitio de restricción de la endonucleasa huKSIL-2 del vector de expresión por ligazón. La secuencia GGATCC codifica un sitio de restricción BamHI, que facilitó el análisis de los recombinantes que contenían la inserción del ligante.
12
Después de la ligazón del ligante en el sitio SmaI, la secuencia en la unión de fusión se hizo ProGlySerGlySerGlySerGlySerGlySerGlyGlyLys (SEQ ID NO: 27), donde los 11 residuos de aminoácidos insertados están subrayados.
Ejemplo 3 Construcción de genes de anticuerpos IL-2 con sustituciones en el codón Pro en la unión de fusión
La prorina en la secuencia ProGlyLys en el término carboxilo del CH3 muta a Ala, Leu o Gly, y otros aminoácidos. Esto se logra reemplazando un fragmento de 25 pares de bases SapI-SmaI del vector de expresión KS-IL-2 mediante un dúplex de oligonucleótidos que codifica el cambio deseado. Cada uno de los siguientes dúplex de oligonucleótidos tiene un extremo cohesivo SapI (sobrante de tres bases) y un extremo romo (para ligar con el extremo SmaI del fragmento de restricción). La sustituciones en el codón Pro se denotan en negrilla. Esta sustituciones no tienen efecto significativo sobre la farmacocinética de la proteína de fusión, indicando que las propiedades estructurales de los residuos Pro no tienen efecto significativo sobre la farmacocinética de la proteína de fusión
12. Sustitución Pro a Ala
13
13.) Sustitución Pro a Leu
14
12.) Sustitución Pro a Gly
15
Ejemplo 4
Con el fin de mostrar que el efecto de la sustitución Lys a Ala sobre la farmacocinética de la proteína de fusión anticuerpos-IL-2 no estaba limitado al anticuerpo huKS, escogimos un anticuerpo diferente, humanizado 14.18 (hu14.18) que reconocía el GD2 numérico, un gangliósido sobreexpresado sobre la superficie de muchas células tumorales humanas. El vector de expresión para hu14.18-(Lys a Ala)-IL-2 fue construido como se describió más arriba.
Ejemplo 5 Construcción de huKS-(Lys eliminada)-TNF\alphaADN
Con el fin de demostrar que el efecto del residuo lisina sobre la farmacocinética de la proteína de fusión anticuerpos-IL-2 en la aplicable a otras citoquinas, escogimos una citoquina diferente, TNF\alpha. La secuencia completa de cADN de TNF\alpha fue publicada por Nedwin at al. in Nucleic Acids Res. (1985) 13:6361-6373, y la expresión de un anticuerpo de TNF\alpha había sido descritas por Gillies et al. in Bioconjugate Chem. (1993) 4:230-235. La unión de fusión del anticuerpo -tiene la secuencia SerProGlyLys- ValArgSerSerSer (SEQ ID NO: 34), donde Val es el residuo N-terminal de TNF\alpha maduro. Con el fin de comparar con huKS-TNF\alpha, el ADN que codifica huKS-(Lys eliminada)-TNF\alpha fue construido superponiendo un método PCR [Daugherty et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19:2471-2476] con iniciadores mutagénicos que codificaban la eliminación del residuo de lisina. El vector de expresión resultante para huKS-(eliminada Lys)-TNF\alphacodifica la secuencia de péptidos SerProGly-ValArgSerSerSer (SEQ ID NO: 35) en la unión de fusión. Modificaciones adicionales de esta proteína de fusión de acuerdo con la nueva invención podrían incluir la eliminación del residuo Arg en la secuencia amino terminal del TNF para reducir adicionalmente la carga global de la región de unión.
Ejemplo 6 Construcción de huKS-(EU)-(Lys a Ala)-IL-2 ADN
Todas las proteínas de fusión anticuerpos-citoquina mencionadas en los ejemplos anteriores se basaron en un cierto alotipo de la IgG1 humana representada por la cadena del mieloma H, KOL. Con el fin de demostrar que el efecto de la sustitución de lisina por alanina sobre la farmacocinética de la proteína de fusión anticuerpos-IL-2 no está limitada al KOL, escogimos un alotipo IgC1 diferente representado por la cadena de mieloma H., EU. El alotipo EU difiere del alotipo KOL en tres residuos de aminoácidos en la región constante. El alotipo EU contiene Lys-229 al extremo de CH1, y Asp-356 y Leu-358 en el inicio de CH3. El alotipo KOL contiene Glu-356 y Met-358 en las posiciones correspondientes. El alotipo que codificaba el ADN fue obtenido por mutagénesis de KOL ADN utilizando el método superpuesto de PCR. El EU ADN resultante fue utilizado para remplazar el fragmento correspondiente KOL ADN para generar el vector de expresión para producir huKS-(EU)-(Lys a Ala)-IL-2.
Ejemplo 7 Transfección de células y expresión de proteínas
Para una transfección transiente, el plásmido fue introducido en células de riñón de Hámster Baby (BHK) por lipofección utilizando Llipofectamina Plus (Life Technologies, Gaithersburg, MD) de acuerdo con el protocolo del proveedor.
Con el fin de obtener clones transfectados con estabilidad, el plásmido de ADN fue introducido en células NS/0 del mieloma del ratón por electroporación. Las células NS/0 fueron cultivadas en medio Tagle modificado de Dulbecco complementado con suero bovino fetal al 10%, glutamina 2 mM y penicilina/estreptomicina. Alrededor de 5x10^{6} células fueron lavadas una vez con lo PBS y re-suspendidas en 0.5 ml de PBS. Se incubó entonces 10 \mug de plásmido linealizado de ADN con las células en una cubeta Gene Pulser (0.4 cm de espacio de electrodo, BioRad) sobre hielo durante 10 minutos. La electroporación ejecutada utilizando un Gene Pulser (BioRad, Hercules, CA) con valores fijados a 0.25 V y 500 \muF. Las células se dejaron recuperar durante 10 minutos sobre hielo, después de lo cual fueron resuspendidas en un medio de crecimiento nuevo sembradas en placa sobre placas de 96 pozos. Los clones establemente transfectados fueron seleccionados haciéndolos crecer en presencia de metotrexato 100 mM (MTX), el cual fue introducido dos días después de la transfección. Las células fueron alimentadas cada tres días por dos o tres veces más, y los clones persistentes MTX aparecieron en dos a tres semanas. Lo sobrenadantes de los clones fueron probados por ELISA anti-Fc para identificar los altos productores. Los clones de alta producción fueron aislados y preparados en medios de crecimiento que contenían MTX 100 mM.
Para una caracterización rutinaria mediante electroforesis por gel, las proteínas de fusión anticuerpo-citoquina en medio acondicionado fueron capturadas sobre Protein A Sepharose (Repligen, Cambridge, MA) y luego eluidas haciendo hervir en del regulador de muestra de proteína con o sin 2-mercaptoetanol. Después de la electroforesis sobre el gel SDS, las bandas de proteínas fueron visualizadas por tinción de Coomassie. La cadena IL-2 pesada de anticuerpo y la cadena liviana tenían un peso molecular aparente de aproximadamente 67 y 28 kD respectivamente, sobre SDS-PAGE.
Para purificación, las proteínas de fusión enlazadas a Protein A Sepharose fueron diluidas por un regulador de fosfato de sodio (100 mM NaH_{2}PO_{4}, pH 3, y 150 mM NaCl). El eludido fue neutralizado inmediatamente con 0.1 N NaOH.
Ejemplo 8 Procedimientos ELISA
Se usó ELISA para determinar las concentraciones de productos de proteína en los sobrenadantes de los clones resistentes a MTX y otras muestras de prueba. La ELISA anti huFC consiste de una capa de captura que utiliza IgG de cabra anti humana (contra ambas cadenas pesada y liviana) y una capa de detección que utiliza el fragmento F(ab')2 conjugado con peroxidasa de rábano de IgG de cabra anti humana, fragmento específico Fc. Por lo tanto, la ELISA anti huFc mide la IgG humana, bien como un anticuerpo por sí mismo o como una proteína de fusión de citoquina. Para determinar la concentración de la proteína de fusión anticuerpos-IL-2 intacta, se utilizó una detección ELISA IL-2. Consiste de la misma etapa de captura utilizando IgG de cabra anti humana (contra ambas cadenas pesada y liviana), pero la etapa de detección utiliza un anticuerpo de detección dirigido contra IL-2. En algunos experimentos, se utilizó EPCAM en desde un anticuerpo de captura para detectar las proteínas de fusión KS-IL-2, puesto que el anticuerpo KS reconoce EPCAM. En algunos experimentos, se utilizó un juego de detección de ELISA IL-2 humana comercial, (R&D Systems). Todos los diferentes procedimientos ELISA que involucraban anticuerpos de detección IL-2 dieron resultados similares. Sin embargo, como puede verse a partir de una comparación de la figura 1A y figura 1B, hay una pérdida progresiva de material inmunoreactivo reactivo IL-2 en comparación con el material inmunoreactivo humano ejerce en puntos posteriores del tiempo farmacocinético. El efecto es más pronunciado para proteínas de fusión que tienen las propiedades farmacocinéticas más pobres.
El ELISA huFc se describe en detalle más abajo.
A. Recubrimiento de placas
Las placas ELISA fueron recubiertas con AffiniPure Goat anti-Human IgG (H+L) (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA) a 5 \mug/mL en PBS, y 100 PL/pozo en placas de 96 poxos (Nunc-Immuno placa Maxisorp). Las placas recubiertas fueron cubiertas e incubadas a 4ºC durante la noche. Las placas fueron lavadas entonces cuatro veces con 0.05% Tween (Tween 20) en PBS, y se bloquearon con 1% BSA/1% suero de cabra en PBS, 200 PL/pozo. Después de la incubación con el regulador de bloqueo a 37ºC durante dos horas, las placas fueron lavadas cuatro veces con 0.05% Tween en PBS y secadas sobre toallas de papel.
B. Las muestras de prueba fueron diluidas hasta una concentración apropiada en regulador de muestra, que contenía 1% BSA/1% suero de cabra/0.05% Tween en PBS. Se preparó una curva estándar con un anticuerpo quimérico (con Fc humana), cuya concentración era conocida. Para preparar una curva estándar, se hacen diluciones en serie del regulador de muestra para dar una curva estándar que varía desde 125 ng/mL a 3.9 ng/mL. Las muestras diluidas y los estándares se añadieron a la placa, 100 \muL/pozo y la placa se incubó a 37ºC durante dos horas. Después de la incubación, la placa se lavó ocho veces con 0.05% Tween en PBS. A cada pozo se añadió entonces 100 \muL del anticuerpo secundario, el conjugado de peroxidasa de rábano AffiniPure F (ab')2 fragmento cabra anti IgG humana, Fc fragmento específico (Jackson Immuno Research), se diluyó alrededor de 1:120,000 en el regulador de muestra. La dilución exacta del anticuerpo secundario tiene que ser determinada para cada lote de la HRP anti humana conjugada con IgG. Después de la incubación a 37ºC durante 2 horas, la placa fue lavada 8 veces con 0.05% Tween en PBS.
C. Desarrollo
La solución de susIg fue añadida a la placa a 100 L/pozo. La solución de susIg fue preparada disolviendo 30 mg de OPD (bicloruro de o-fenilenediamina 1 tableta) en 15 mL de ácido cítrico 0.025 M/regulador 0.05 M Na_{2}HPO_{4} pH 5, que contenía 0.03% de H_{2}O_{2} recién añadido. El color se dejó desarrollar durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. El tiempo de desarrollo está sujeto a cambio, dependiendo de la variabilidad lote a lote de las placas recubiertas, del anticuerpo secundario, etcétera. Se mide el desarrollo de color en la curva estándar para determinar cuándo detener la reacción. La reacción fue detenida añadiendo 4N H_{2}SO_{4}, 100 \muL/pozo. La placa fue leída en un lector de placas, que estaba fijado a 490 y 690 nm y programado para sustraer la señal de fondo del OD a 490 nm.
Ejemplo 9 Comportamiento fármacocinético de proteínas de fusión anticuerpo-citoquina que portan alteraciones en la unión de fusión
Las proteínas de fusión fueron probadas en cuanto a su comportamiento farmacocinético siguiendo la inyección intravenosa en ratones Balb/c. Se recolectó sangre de los ratones por sangrado retro orbital y se almacenó a 4ºC en tubos de micro centrífuga Eppendorf. En algunos casos, se utilizaron dos métodos ELISA diferentes para medir tanto la cantidad de anticuerpo humano como la cantidad de la segunda proteína fusionada no Ig que permanecía en la sangre en varios puntos del tiempo. Alternativamente, la presencia de la unidad estructural no Ig fue inferida por análisis de transferencia Western de los puntos de tiempo farmacocinético.
Utilizando las técnicas descritas en los ejemplos precedentes, las proteínas mutantes de fusión KS(gamma1)-IL-2 fueron inyectadas en ratones, y el efecto sobre la vida media de suero fue determinado. Algunos de los resultados se muestran en la figura 1 y figura 2. Además, el efecto de eliminación de la cadena pesada del anticuerpo fue examinado en una fusión IgG(gamma1)-IL-2 en la cual el anticuerpo tenía una especificidad de enlace diferente. Las propiedades farmacocinéticas de 14.18(Lys\rightarrowAla)-IL-2 fueron superiores a 14.18-IL-2 hasta un grado en que eran similares al mejoramiento de KS(Lys\rightarrowAla)-IL-2 en comparación con KS-IL-2.
Para fusiones anticuerpo IL-2, la clasificación del efecto de las mutaciones que afectan la lisina C-terminal de la cadena pesada sobre las propiedades farmacocinéticas fue (de mejor a peor): Lys\rightarrowLeu \sim Lys\rightarrowAla \sim Lys\rightarrowAla3\rightarrowLys\rightarrow(eliminada)\rightarrowLys\rightarrowAsp\rightarrowLys\rightarrowGly\rightarrowLys\rightarrow(sin cambio) \sim Lys\rightarrow Cys\rightarrow Lys\rightarrowArg.
Las propiedades farmacocinéticas de KS(Lys\rightarroweliminada)-TNFalfa se mejoraron significativamente en comparación con KS-TNFalfa (figura 3). El perfil farmacocinético de la proteína de fusión KS-TNFalfa era inusual en cuanto que, cuando los niveles de anticuerpo humano eran medidos por ELISA Fc, había una aguda caída en el nivel de proteína detectada durante los primeros 30 minutos, seguido por un lento incremento en el nivel de material reactivo al Fc humano. Este efecto fue altamente reproducible.
Cuando se analizaron muestras farmacocinéticas por transferencia Western se encontró que el material de reactividad cruzada con el Fc humano estaba en forma de anticuerpo intacto; la unidad estructural TNF había sido rota y se había perdido. Sin embargo, un análisis similar de la proteína de fusión KS-TNFalfa que portaba una eliminación de la lisina C-terminal indicaba que esta proteína sobrevivía primariamente en una forma intacta, estando el TNF todavía presente.
Además, una proteína de fusión KS-TNFalfa fue expresada en la cual los primero ocho aminoácidos de la secuencia KS-TNFalfa madura fueron eliminados. Las propiedades farmacocinéticas de la proteína de fusión elimina KS-TNFalfa fueron superiores a las proteínas correspondientes que tenían la secuencia tiene quemadura completa. Esto probablemente se debe a la eliminación del residuo Arg cargado en la posición +2 de la TNF madura lo que incrementa la hidrofobicidad en la región de la unión.
Cambiando las regiones constantes de la cadena pesada de KS(Lys \rightarrow) Ala)-IL-2 y KS-IL-2 de KOL a EU no surtió efecto alguno sobre las propiedades farmacocinéticas de ninguna de las proteínas.
Tomados en conjunto, estos resultados indican que la mutación de la unión produjo un mejoramiento significativo de las propiedades farmacocinéticas de las proteínas de fusión Ig. El efecto fue visto en diversos anticuerpos, y en diversas proteínas no Ig fusionadas con una unidad estructural Ig.
Ejemplo 10 La combinación de mutaciones en la unión de fusión con un cambio en el tipo de Ig de las guías gamma 1 a gamma 4 hasta un aumento sinérgico de la vida media del suero es independiente de la función FcRp
La región de gamma 4 Fc humana se enlaza pobremente a los receptores Fc. Como resultado, las proteínas de fusión que comprende en una región gamma 4 Fc tienen generalmente propiedades farmacocinéticas superiores en comparación con las proteínas de fusión que tiene la cadena gamma 1. Para discernir si las mutaciones de la unión afectan la farmacocinéticas a través de un efecto sobre una interacción con el receptor Fc, y una interacción FcRp, o ambas, las propiedades a farmacocinéticas de las proteínas de fusión que contienen gamma 1 y gamma 4 con o sin mutaciones de unión fueron examinadas en ratones que eran normales o defectuosos en FcRp. Los resultados de estos los experimentos farmacocinéticos se muestran en la figura 2.
La figura 2 muestra el comportamiento farmacocinético de una proteína de fusión KS(gamma1)-IL-2, una proteína de fusión KS(gamma4)-IL-2, una proteína de fusión a KS(gamma1)(Lys-to-Ala)-IL-2 y una proteína de fusión KS(gamma4)(Lys-to-Ala)-IL-2. Se examinaron ratones normales y ratones mutantes defectuosos en beta 2 microglobulina.
Estos datos indicaron que, en un ratón normal, la farmacocinética de una proteína de fusión IgG-gamma1 anticuerpo-IL-2 se mejoraba introduciendo una mutación Lys-a-Ala en el términos de la unidad estructural del anticuerpo. De la misma forma, la farmacocinética de una proteína de fusión IgG-gamma4 anticuerpo-IL-2 se mejoraba introduciendo una mutación Lys-a-Ala en el extremo se de la unidad estructural del anticuerpo. Éstos datos indican que una mutación en la unión puede mejorar las propiedades farmacocinéticas de una proteína de fusión que tiene ya propiedades farmacocinéticas mejoradas como resultado de un enlace reducido del receptor Fc.
La figura 2 también muestra las propiedades farmacocinéticas de las mismas proteínas cuando se inyectan en ratones mutantes que carecen de la proteína beta 2 microglobulina, que es una subunidad esencial de FcRp (Junghans and Anderson, Proc. Nat Acad. Sci. (1996) 93:5512-5516). Así, estos ratones mutantes son defectuosos en actividad Fc. Como resultado, el catabolismo de los anticuerpos es aproximadamente 10 veces más rápido en tales ratones mutantes que en ratones normales.
Los datos de la figura 2 indican que el anticuerpo KS (gamma1), una proteína de fusión KS (gamma1)-IL-2, una proteína de fusión KS(gamma4)-IL-2, una proteína de fusión KS (gamma1)(Lys-a-Ala)-IL-2 y una proteína de fusión KS (gamma4)(Lys-a-Ala)-IL-2 fueron todos catabolizados dos veces más rápidamente en los ratones mutantes con beta 2-microglobulina que en ratones tipo silvestre. Sin embargo, el orden relativo de las vidas medias en suero es el mismo en estas proteínas en ambas cepas de ratones: el anticuerpo no fusionado tiene la mejor farmacocinética, seguida por la proteína de fusión KS(gamma4)(Lys-a-Ala)-IL-2, la proteína de fusión KS(gamma1) (Lys-a-Ala)-IL-2, la proteína de fusión KS(gamma4)-IL-2, teniendo la proteína de fusión KS(gamma1)-IL-2 las peores propiedades farmacocinéticas. Si una mutación en la unión tiene su efecto exclusivamente cambiando la interacción de una proteína de fusión con el FcRp, entonces en la ausencia de la función FcRp, la mutación de la unión no tendría efectos sobre la farmacocinética.
Ejemplo 11 La mutación de la región de unión en un anticuerpo intacto no tiene efecto sobre la vida media en suero
Una mutación en un gen que codifica la cadena pesada del anticuerpo intacto no fusionado KS es manipulada para cambiar la lisina C-terminal en una alanina. Las formas tipo silvestre y mutante del KS son expresadas y purificadas por los métodos descritos anteriormente, y se comparan sus propiedades farmacocinéticas. Se encuentra que el comportamiento farmacocinético de los anticuerpos silvestre y mutante son indistinguibles.
Ejemplo 12 Enlazamiento a un receptor Fc por proteínas de fusión de anticuerpo con o sin mutaciones en la unión de fusión
Utilizando un procedimiento estándar, se examinó el enlazamiento de KS-IL-2 y KS(K-A)- IL-2 con los receptores Fc. No se encontró efecto de la mutación. Las proteínas de fusión fueron expresadas y purificadas como se describió anteriormente, y fueron probadas en cuanto a su capacidad para enlazarse a células fijas J774, las cuales expresan el receptor Fc. Los resultados se muestran en la figura 4.
Ejemplo 13 Tratamiento de carcinoma de colon en un mamífero con una proteína de fusión anticuerpo-citoquina que contiene una mutación de unión
Para probar si una proteína de fusión citoquina-anticuerpo con una mutación en la unión sería ventajosa en el tratamiento de carcinoma de colon en un mamífero, se ejecutaron los siguientes experimentos. CT26 es una línea celular de carcinoma de colon derivada de ratones Balb/C. Mediante técnicas estándar de ingeniería genética, esta línea celular fue manipulada para expresar la molécula de adhesión celular epitelial humana (EpCAM), que es el antígeno reconocido por el anticuerpo K S; estas células son denominadas células CT26/EpCAM (Gillies at al. Journal of Immunology (1998) 160:6195-6203).
Los ratones Balb/C fueron inoculados subcutáneamente con 2x10^{6} células CT26/EpCAM. Cuando los tumores alcanzaron un volumen de aproximadamente 50-200 mm^{3}, los ratones fueron distribuidos aleatoriamente en tres grupos de siete ratones para estudio posterior. Comenzando el día 0, los ratones que tenían tumor fueron tratados con PBS, aproximadamente 10 \mug de KS-1L2 con una cadena pesada de IgG (KS-IL2gamma1), o aproximadamente 10 microgramos de KS-IL2 con una cadena pesada de IgG1 y la mutación Lys a Ala descrita en los anteriores ejemplos (KS-IL2gamma1 [Lys a Ala]). Los ratones fueron infectados intravenosamente, una vez por día durante cinco días. Los tamaños de los tumores fueron medidos con calibradores.
Los resultados de tales experimentos se muestran en la figura 5. En este experimento KS-IL3 gamma1 causó un descenso significativo en el volumen de muchos, pero no de todos los tumores. En seis de los siete animales tratados con KS-IL2gamma1, los tumores eran aún medibles al día 21. Sin embargo, en los animales tratados con KS-IL2gamma1(Lys a Ala) todos los tumores se encogieron, de modo que para el día 21, los tumores en todo los siete animales no eran medibles, y para el día 16, sólo dos de los siete ratones tenían tumores medibles. En la figura 5, los diamantes negros indican volúmenes de tumor promedio en ratones que fueron infectados con PBS como control en los días 0, 1, 2, 3 y 4. Los círculos llenos indican volúmenes de tumor promedio en ratones tratados con 10 \mug de KS-IL2gamma1. Se utilizaron inyecciones intravenosas. El eje X indica el número de días transcurridos a continuación de la primera inyección; el eje Y indica el volumen promedio de tumor en milímetros cúbicos.
Ejemplo 14 Inhibición de metástasis en un mamífero tratado como una proteína de fusión anticuerpo-citoquina que contiene una mutación en la unión
Para probar si una proteína de fusión anticuerpo-citoquina podría inhibir el crecimiento metastásico de células tumorales, se ejecutaron los siguientes experimentos. El carcinoma de pulmón o de Lewis (LLC) es una línea celular de carcinoma de pulmón derivada de ratones C57/B16. Mediante técnicas de ingeniería genética estándar, esta línea celular fue manipulada para expresar la molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM), la cual es el antígeno reconocido por el anticuerpo KS; estas células se denominan células LLC/EpCAM.
Ratones C57/B16 fueron inyectados intravenosamente con 1x10^{6} LLC /células EpCAM. Después de cinco días, los ratones fueron separados aleatoriamente en tres grupos de 6 ratones y tratados bien con PBS, aproximadamente 20 microgramos de KS-IL2, o aproximadamente 20 \mug de KSAIa-IL2 (KS-IL2 con un cambio Lys a Ala en el carbono terminal de la unidad estructural Ig). Las metástasis fueron cuantificadas en el día 24. Como se indica en la tabla más abajo, el grupo tratado con PBS tenía números grandes de metástasis en los pulmones. Los animales tratados con KS-\gammaIL2 tenían un número significativamente reducido de metástasis. Sin embargo, los animales tratados con KS-\gamma1-ala-IL2 tenían metástasis a un menores que los animales tratados con KS-\gamma1-IL2 y en un animal, no se detectó metástasis.
Grupo tratamiento Número de metástasis Peso pulmón (g)
PBS >250, >250, >250, >250, >250, >250 0.92 +/- 0.14
KS-\gamma1-IL2 62,37,18,17,11,9 0.27+/- 0.04
KS-\gamma1-ala-IL2 4, 4, 3, 3, 1, 0 0.25 +/- 0.02
Tomados en conjunto, los ejemplos 13 y 14 ilustran que las proteínas de fusión anticuerpo-citoquina pueden inhibir el establecimiento de metástasis así como el crecimiento de células tumorales en el sitio primario. Además, los resultados indican que las proteínas de fusión anticuerpo-citoquina pueden inhibir la enfermedad resultante de una gran variedad de tipos de tumor diferentes, tales como cáncer de colon y cáncer de pulmón. Adicionalmente, las proteínas de fusión anticuerpo-citoquina con al menos un cambio de aminoácido en la región ligante de acuerdo con la invención son aún más efectivas para la inhibición de la metástasis y el crecimiento tumoral que las proteínas de fusión anticuerpo-citoquina sin cambio de aminoácidos en la región ligante.
Ejemplo 15 Ensayo de proteínas de fusión de anticuerpo con mutaciones en la unión para resistencia a las proteasas
Para establecer si las proteínas de fusión anticuerpo-citoquina con mutaciones en la unión eran más o menos sensibles a la digestión con la proteasa, se trataron KS-IL2 y KS-Ala-IL2 purificados con diversas proteasas varias veces, y los productos resultantes fueron analizados por SDS-PAGE.
En un experimento se trataron 4 \mug de KS-IL2 yd KS-Ala-IL2 con 0.1 mU o 0.4 mU de Catepsina D (Enzyme Systems, Livermore, California) durante aproximadamente 16 horas a 37ºC y se analizaron por SDS-PAGE. Se utilizaron condiciones de regulación de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cuando KS-IL2 se trató con 0.4 mU de Catepsina aproximadamente 50% de la cadena pesada de KS-IL2 se convirtió en diversas formas de bajo peso molecular. El producto de digestión dominante tenía un peso molecular ligeramente inferior al de la cadena pesada de KS-IL2, pero mucho más grande que el de la cadena pesada KS. Este resultado indica que la mayor parte de la ruptura por Catepsina D no tuvo lugar en la unión de la cadena pesada IL-2.
En contraste, cuando se incubó KS-Ala-IL2 con 0.4 mU de catepsina D, bajo lasmismas condiciones, el grado de ruptura por la catepsina era mucho menor, y una banda con el peso molecular del producto principal de degradación de KS-IL2 era esencialmente no detectable.
En un segundo experimento, se trataron 4 \mug de KS-IL2 y KS-Ala-IL2 con 25 mU o 50 mU de catepsina L (Enzyme Systems, Livermore, California) durante aproximadamente 16 horas a 37ºC y se analizó por SDS-PAGE. Se usaron las condiciones de regulación de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cuando KS-IL2 fue tratado con 50 mU de Catepsina L casi toda la cadena pesada de KS-IL2 fue convertida en diversas formas de peso molecular más bajo. El producto dominante de la digestión tenía un peso molecular aproximadamente el mismo de la cadena pesada de KS. Este resultado indica que una buena parte de la ruptura por Catepsina L tomaba lugar cerca o en la unión de la cadena pesada IL-2.
En contraste cuando se incubó KS-Ala-IL2 con 50 mU de Catepsina L bajo las mismas condiciones, el grado de ruptura por la Catepsina L fue mucho menor, y una banda con el peso molecular del producto principal de degradación de KS-IL2 fue aún la especie de mayor peso molecular observada.
En un tercer experimento, se trataron 4 \mug de KS-IL2 KS-Ala-IL2 con 0.04 mU, 0.1 mU o 0,2 mU de plasmina (Sigma, St. Louis, Minnesota) durante aproximadamente 16 horas a 37ºC y se analizó por SDS-PAGE. Se usaron condiciones de regulación de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cuando se trató el KS-IL2 con 0.04 mU de plasmina, aproximadamente tres cuartas partes de la cadena pesada de KS-IL2 fueron convertidas en una forma de peso molecular más bajo con un peso molecular aparente de aproximadamente 30 aminoácidos mayor que el de la cadena pesada KS. Cuando KS-IL2 se trató con 0.2 mU de plasmina, esencialmente toda la cadena pesada de KS-IL2 fue convertida en una forma con un peso molecular más bajo con un peso molecular aparente de aproximadamente 30 aminoácidos mayor que el de la cadena pesada KS. Estos resultados indican que la ruptura de KS-IL2 tuvo lugar cerca del, pero no en la unión cadena pesada-IL-2.
En contraste, cuando se incubó KS-Ala-IL2 con 0.04 mU de plasmina bajo las mismas condiciones, el grado de ruptura por parte de la plasmina era apenas detectable. Cuando se incubó KS- Ala-IL2 con 0.2 mU de plasmina, se detectó algún producto no sometido a ruptura. Además, cuando KS-Ala-IL2 fue sometido a ruptura con plasmina, una especie con un tamaño molecular de aproximadamente 90 aminoácidos más grande que en la cadena pesada KS-IL-2 se acumuló hasta un grado significativo; en las digestiones KS-IL-2, plasmina, esta especie +90 fue probablemente sometida rápidamente a ruptura hasta la especie de peso molecular más bajo +30, y así no pudo acumularse. No obstante, la mutación Lys a Ala produjo una significativa estabilización del KS-IL-2 intacto en presencia de plasmina. En cada caso, la cadena liviana del anticuerpo no fue sometida a ruptura bajo las condiciones utilizadas.
Tomados en conjunto, estos resultados indican que la mutación Lys a Ala produce una resistencia general a la ruptura por proteasa, aun para rupturas que no tienen lugar en el sitio de la mutación. Sin querer limitarnos con cualquier teoría particular, la mutación Lys a Ala puede causar que la unidad estructural IL2 de KS se hará más resistente a las proteasas. Las proteasas pueden jugar un papel importante en las propiedades farmacocinéticas de las proteínas de fusión de anticuerpos. Por ejemplo, cuando las proteínas de fusión de anticuerpos son tomadas por células que llevan un receptor Fc y transportadas hacia los endosomas tempranos puede ser que la unidad estructural del anticuerpo sea resistente a las condiciones proteolíticas utilizadas, pero la unidad estructural asociada a la fusión es más sensible, resultando en una digestión parcial o completa de la proteína de fusión del anticuerpo.
Ejemplo 16 Uso de la digestión con proteasa para evaluar las mutaciones en proteínas de fusión de anticuerpo
Este ejemplo provee un método general para mejorar las propiedades farmacocinéticas de una proteína. Una proteína es probada en cuanto a sus propiedades farmacocinéticas y también su sensibilidad a las proteasas. Las proteínas variantes se generan y prueban en cuanto a su mayor resistencia a la proteólisis. Estas variantes con resistencia aumentada a la proteólisis son probadas entonces en cuanto a sus propiedades farmacocinéticas. Se encuentra que la proporción de proteínas resistentes a la proteólisis con propiedades farmacocinéticas mejoradas es mayor y para la población de proteínas variables como un todo algunas proteínas variables con propiedades farmacocinéticas mejoradas tienen una o más sustituciones de aminoácidos que no causan un cambio profundo en la estructura de la proteína que pueda ser inferida por inspección de la secuencia codificante, tal como la introducción de un sitio de glicosilación unido a un sitio N.
Las proteínas variantes se generan, por ejemplo, por mutagénesis de una construcción de expresión y aislamiento de clones que expresar proteínas variantes individuales. Cualquiera de una variedad de técnicas de mutagénesis es utilizada, incluyendo la mutagénesis dirigida a un sitio, la mutagénesis aleatoria, la mutagénesis por PCR, y técnicas de mutagénesis que generan secuencias híbridas a partir de genes relacionados.
Es útil utilizar proteasas intracelulares, tales como proteasas endosómicas, para estos ensayos. Sin querer quedar limitados por cualquier teoría particular, se cree que la farmacocinética de ciertas proteínas, particularmente proteínas que no son retiradas por filtración renal, es determinada por la proteólisis que ocurre por endocitosis.
También es útil utilizar proteasas extracelulares, tales como la tripsina, quimiotripsina, plasmina, otras proteasas digestivas, otras proteasas del suero tales como factores coagulantes, y proteasas específicas de los tejidos. Por ejemplo, las proteasas específicas para los tumores se utilizan para probar proteínas variantes e identificar aquellas variantes que tienen propiedades farmacocinéticas y estabilidad mejoradas dentro del microambiente del tumor. En otro ejemplo, las proteínas que van a ser administradas oralmente son probadas en cuanto a su resistencia a enzimas presentes en el tracto gastrointestinal, tales como tripsina y quimiotripsina. Se encuentra que las proteínas variantes con resistencia incrementada a las enzimas gastrointestinales tienen propiedades farmacocinéticas mejoradas, tales como un mayor AUC (Área Bajo la Curva).
Por ejemplo, una construcción de expresión que codifica una proteína de fusión que contiene parte o todo un anticuerpo es mutagenizada. Se generan los clones, se expresan las proteínas correspondientes, y las proteínas son probadas, bien individualmente o en pequeños grupos. En cuanto a su sensibilidad relativa a las proteasas las proteínas de fusión de anticuerpos variantes con resistencia incrementada a las proteasas son probadas entonces en cuanto a sus propiedades farmacocinéticas, y un significativo número de las proteínas de fusión de anticuerpo resistentes a las proteasas tienen propiedades farmacocinéticas mejoradas. Los ácidos nucleicos que codifican las proteínas de fusión variantes mejoradas son secuenciados, y se encuentran algunas variantes mejoradas para contener mutaciones en sitios diferentes a la unión de fusión de la proteína que causan un fenotipo de resistencia incrementada a la proteólisis y una farmacocinética mejorada.
<110> Lexigen Pharmaceuticals Corp.
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<120> Mejoramiento de la vida media en circulación de proteínas de fusión basadas en anticuerpos
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<130> LEX-01 1PC
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<150> US 60/181,768
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<151> 2000-02-11
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<160> 35
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<170> PatentIn version 3.0
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<210> 1
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<211> 7
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> secuencia de unión Ig-IL-2 secuencia de unión
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<400> 1
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\sa{Ser Pro Gly Lys Ala Pro Thr}
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<210> 2
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<211> 4
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<212> PRT
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> Ig C- secuencia terminal
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<400> 2
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\sa{Ser Pro Gly Lys}
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<210> 3
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<211> 12
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<212> ADN
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<223> secuencia sintética
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tccccgggta aa 
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<211> 42
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<212> ADN
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<223> secuencia sintética
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ctgtgttttc tttgtagaac ttgaagtagg tgctgcac 
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<211> 42
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Secuencia sintética
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgtgttttc tttgtagaac ttgaagtagg tgcac 
\hfill
35 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccgggtgggg cccctacttc aagttctaca aagaaaacac ag 
\hfill
42 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgtgttttc tttgtagaac ttgaagtagg ggccccac 
\hfill
38 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
<21I> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccgggtctgg cgccaacttc aagttctaca aagaaaacac ag 
\hfill
42 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgtgttttc tttgtagaac ttgaagttgg cgccagac 
\hfill
38 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccgggtgcag cagctgcccc aacttcaagt tctacaaaga aaacacag 
\hfill
48 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211>44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgtgttttc tttgtagaac ttgaagttgg ggcagctgct gcac 
\hfill
44 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccgggttgcg caccaacttc aagttctaca aagaaaacac ag 
\hfill
42 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgtgttttc tttgtagaac ttgaagttgg tgcgcaac 
\hfill
38 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccgggtgacg caccaacttc aagttctaca aagaaaacac ag 
\hfill
42 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211>38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgtgttttc tttgtagaac ttgaagttgg tgcgtcac 
\hfill
38 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)..(19)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
100 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Ala Cys Gly Gly Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggttcagga tccggagg 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cctccggatc ctgaaccc 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggttcaggc tctggatcag ggtccggatc cgg 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccggatccgg accctgatcc agagcctgaa ccc 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgcagaagag cctctccctg tccgc 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcggacaggg agaggctctt ct 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgcagaagag cctctccctg tccct 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agggacaggg agaggctctt ct 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgcagaagag cctctccctg tccgg 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccggacaggg agaggctctt ct 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ig-TNF secuencia de unión
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Pro Gly Lys Val Arg Ser Ser Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia de fusión Ig-(eliminada Lys)-TNF
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Pro Gly Val Arg Ser Ser Ser}
\vskip1.000000\baselineskip

Claims (27)

1. Una proteína de fusión alterada basada en anticuerpo, que tiene una vida media en circulación más larga in vivo que una proteína de fusión basada en anticuerpo correspondiente sin dicha alteración, que comprende una cadena de inmunoglobulina (Ig) o una porción de la misma con un dominio CH2 y CH3, enlazada a su término C al término N de una proteína no Ig secretada o una porción de la misma que retiene las propiedades funcionales de la proteína no Ig intacta, donde dicha alteración incluye una mutación puntual, una inserción, una eliminación o un reordenamiento de genes en el residuo de aminoácidos C-terminal de la cadena Ig.
2. Una proteína de fusión basada en anticuerpos de la reivindicación 1, donde la alteración de aminoácidos incrementa la hidrofobicidad de dicha proteína de fusión basada en anticuerpos.
3. Una proteína de fusión basada en anticuerpos de la reivindicación 1, donde dicha alteración de aminoácidos incluyen mutación puntual, inserción o reordenamiento de genes de residuos de aminoácidos no cargados.
4. Una proteína de fusión basada en anticuerpos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el residuo de aminoácido C-terminal de la cadena Ig es remplazado por Ala, Leu, Gly y Trp.
5. Una proteína de fusión basada en anticuerpo de la reivindicación 4, donde su residuo de aminoácido C-terminal es remplazado por Ala.
6. Una proteína de fusión basada en anticuerpos de la reivindicación 4 donde el residuo de aminoácido C-terminal de la cadena Ig es retrasado por Ala-Ala-Ala.
7. Una proteína de fusión basada en anticuerpos de la reivindicación 1 o 2, donde el residuo de aminoácido C-terminal de la cadena Ig es eliminado.
8. Una proteína de fusión basada en anticuerpos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde un péptido espaciador o ligante, que tiene de 1 a 15 residuos de aminoácidos, es insertado entre la cadena Ig y la unidad estructural no Ig.
9. Una proteína de fusión basada en anticuerpos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 que comprende mutación adicional dentro de la región de 10 residuos de aminoácidos del término C de la unidad estructural Ig reemplazando residuos de aminoácidos ionizables en dicha región o residuos no cargados o hidrófobos.
10. Una proteína de fusión basada en anticuerpos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 que comprende mutación adicional dentro de la región de 10 residuos de aminoácidos del término N de la unidad estructural de proteína no Ig reemplazando residuos de aminoácidos- ionizables en dicha región por residuos no cargados o hidrófobos.
11. Una proteína de fusión basada en anticuerpos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 que comprende además una mutación dentro de la región de 10 residuos de aminoácidos de término C de la unidad estructural Ig y dentro de la región de 10 residuos de aminoácidos del término N de la unidad estructural de proteína no Ig, reemplazando residuos ionizables por residuos no cargados o hidrófobos.
12. Una proteína de fusión basada en anticuerpos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde dicha cadena Ig comprende al menos el dominio CH2 o una región constante IgG2 o IgG4.
13. Una proteína de fusión basada en anticuerpos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde dicha cadena Ig comprende al menos una porción de una región constante IgG1 que tiene una mutación o una eliminación en uno o más de los aminoácidos seleccionados del grupo consistente Leu234, Leu235, G1y236, G1y237, Asn297, y Pro331.
14. Una proteína de fusión basada en anticuerpos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde dicha cadena del Ig comprende al menos una porción de una región constante IgG3 que tiene una mutación o una eliminación en uno o más aminoácidos seleccionados del grupo consistente de Leu281, Leu282, G1y283, Gly284, Asn344, y pro378.
15. Una proteína de fusión basada en anticuerpos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde dicha cadena Ig tiene afinidad de enlace con un receptor de protección de inmunoglobulina.
16. Una proteína de fusión basada en anticuerpos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde dicha cadena Ig tiene afinidad de enlace sustancialmente reducida por un receptor Fc seleccionados del grupo consistente de Fc\gammaRI, Fc\gammaRII y Fc\gammaRIII.
17. Una proteína de fusión basada en anticuerpos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, donde dicha proteína no Ig es seleccionada del grupo consistente en una citoquina, una proteína ligando-enlace y una toxina proteínica.
18. Una proteína de fusión basada en anticuerpos de la reivindicación 17, donde dicha citoquina es seleccionada del grupo consistente de un factor de necrosis tumoral, una interleucina y una linfoquina.
19. Una proteína de fusión basada en anticuerpos de la reivindicación 18, donde dicho factor de necrosis tumoral es un factor de necrosis tumoral alfa.
20. Una proteína de fusión basada en anticuerpos de la reivindicación 18, donde dicha interleucina es interleucina-2.
21 una proteína de fusión basada en anticuerpos de la reivindicación 18 donde dicha linfoquina es una linfotoxina o un factor estimulador de la colonia.
22. Una proteína de fusión basada en anticuerpos de la reivindicación 21, donde el factor estimulante de la colonia es un factor de estimulación de la colonia granulocitos-macrófago.
23. Una proteína de fusión basada en anticuerpos de la reivindicación 17, donde dicha proteína ligando-enlace es seleccionada del grupo consistente de CD4, CTLA-4, receptor TNF, y un receptor de interleucina.
24. Un método para incrementar la vida media en circulación de una proteína de fusión basada en anticuerpos que comprende una cadena pesada de inmunoglobulina (Ig) o una porción de la misma con un dominio CH2 y CH3 enlazado en su término C al término N de una proteína secretada no Ig o una porción de la misma que retiene las propiedades funcionales de la proteína intacta, comprendiendo el método la alteración del residuo C-terminal de la cadena Ig por mutación puntual, inserción, eliminación o reordenamiento de genes, donde dicha alteración lleva a una hidrofobicidad incrementada de dicha proteína de fusión.
25. Un método de la reivindicación 24, que comprende adicionalmente alterar residuos de aminoácidos por mutación puntual, inserción, eliminación o reordenamiento de genes dentro de la región que barre la unión entre la unidad estructural Ig y la unidad estructural no Ig de 10 residuos de aminoácidos del término C de la cadena Ig a 10 residuos de aminoácidos del término N de la unidad estructural no Ig; donde dicha alteración lleva a una hidrofobicidad incrementada de dicha proteína de fusión.
26. Un método para identificar una mutación que incrementa la vida media en circulación de una proteína de fusión basada en anticuerpos que comprende una porción de la misma con un dominio CH2 y CH3 enlazado en su término C al término N de una proteína no Ig secretada o una porción de la misma que retiene las propiedades funcionales de la proteína intacta, comprendiendo el método las etapas de:
a) introducir una o más mutaciones en la región que barre la unión entre la unidad estructural Ig y la unidad estructural que proteína no Ig de 10 residuos de aminoácidos desde el término C de la proteína Ig hasta 10r residuos de aminoácidos desde el término N de la unidad estructural de proteína no Ig, sin embargo al menos una mutación del residuo de aminoácidos en el término C de la cadena Ig, donde dichas mutaciones llevan a una hidrofobicidad incrementada de la proteína de fusión;
b) comparar las vidas medias en suero de la proteína de fusión basada en anticuerpos con y sin una mutación; y,
c) seleccionar una mutación que incremente la vida media en suero de la proteína de fusión basada en anticuerpos.
27. Uso de una proteína de fusión basada en anticuerpos de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 23 para producir un medicamento para el tratamiento de enfermedades relacionadas con tumores.
28. Uso de acuerdo con la reivindicación 27, donde la enfermedad relacionada con tumores incluye metástasis.
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