BR112020011810A2 - molécula de ligação cd16 x antígeno de doença, composição farmacêutica, uso da composição farmacêutica, e método para o tratamento de uma doença - Google Patents

molécula de ligação cd16 x antígeno de doença, composição farmacêutica, uso da composição farmacêutica, e método para o tratamento de uma doença Download PDF

Info

Publication number
BR112020011810A2
BR112020011810A2 BR112020011810-9A BR112020011810A BR112020011810A2 BR 112020011810 A2 BR112020011810 A2 BR 112020011810A2 BR 112020011810 A BR112020011810 A BR 112020011810A BR 112020011810 A2 BR112020011810 A2 BR 112020011810A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
domain
seq
amino acid
acid sequence
cancer
Prior art date
Application number
BR112020011810-9A
Other languages
English (en)
Inventor
Gundo Diedrich
Liqin Liu
Hua Watson Li
Leslie S. Johnson
Original Assignee
Macrogenics, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Macrogenics, Inc. filed Critical Macrogenics, Inc.
Publication of BR112020011810A2 publication Critical patent/BR112020011810A2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1027—Paramyxoviridae, e.g. respiratory syncytial virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1036—Retroviridae, e.g. leukemia viruses
    • C07K16/1045—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1036—Retroviridae, e.g. leukemia viruses
    • C07K16/1045—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV
    • C07K16/1063—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV env, e.g. gp41, gp110/120, gp160, V3, PND, CD4 binding site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/626—Diabody or triabody
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/73—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing coiled-coiled motif (leucine zippers)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

A presente invenção é direcionada às moléculas (por exemplo, um anticorpo, um diacorpo, um scFv, um anticorpo, um TandAb, etc.) capaz de se ligar a um epítopo de CD16 humano (uma Molécula de Ligação CD16). A presente invenção é adicionalmente direcionada às Moléculas de Ligação CD16 que são capazes de se ligar a um epítopo de CD16 humano e um ou mais epítopos de um Antígeno de Doença (DA) (por exemplo, uma Molécula de Ligação CD16 x DA). A presente invenção é particularmente direcionada a essas Moléculas de Ligação CD16 x DA que são anticorpos, ou que compreendem um Domínio de Ligação de Epítopo do mesmo, ou são diacorpos (que incluem diacorpos DART®), anticorpos biespecíficos, TandAbs, outras moléculas de ligação multiespecíficas (por exemplo, moléculas TRIDENT? trivalente), etc. A invenção refere-se particularmente às Moléculas de Ligação CD16 x DA que são capazes de ligar um Antígeno de Doença que é um Antígeno de Câncer ou um Antígeno Associado a Patógenos, além ser capaz de se ligar ao CD16. A invenção refere-se particularmente ao uso desse CD16 e Moléculas de Ligação CD16 x DA no tratamento de câncer e doenças associadas a patógenos. A presente invenção também é direcionada a composições farmacêuticas que compreendem essa molécula (ou moléculas).

Description

MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X ANTÍGENO DE DOENÇA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, USO DA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E
MÉTODO PARA O TRATAMENTO DE UMA DOENÇA REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica prioridade do Pedido de Patente No de Série US 62/597.800 (depositado em 12 de dezembro de 2017; pendente), cujo pedido é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.
REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[002] Este pedido inclui uma ou mais Listagens de Sequências de acordo com 37 C.F.R. 1.821 et seq., que são divulgadas em meio legível por computador (nome do arquivo: 1301_0153PCT_Sequence_Listing_ST25.txt, criado em 4 de dezembro de 2018 e tendo um tamanho de 276.384 bytes), cujo arquivo é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO
[003] A presente invenção é dirigida a moléculas (por exemplo, um anticorpo, um diacorpo, um scFv, um anticorpo, um TandAb, etc.) capazes de se ligar a um epítopo de CD16 humano (uma “Molécula de Ligação CD16”). A presente invenção também é dirigida a Moléculas de Ligação CD16 que são capazes de se ligar a um epítopo de CD16 humano e um ou mais epítopos de um Antígeno de Doença (“DA”) (por exemplo, uma “Molécula de Ligação CD16 x DA”). A presente invenção é particularmente dirigida a essas Moléculas de Ligação CD16 x DA que são anticorpos, ou que compreendem um Domínio de Ligação ao Epítopo dos mesmos, ou são diacorpos (incluindo diacorpos DART®), anticorpos biespecíficos, TandAbs, outras moléculas de ligação multiespecíficas (por exemplo, moléculas TRIDENT™ trivalentes), etc. A invenção particularmente se refere Moléculas de Ligação CD16 x DA que são capazes de se ligar a um Antígeno de Doença que é um Antígeno de Câncer ou um Antígeno Associado ao Patógeno além de ser capaz de se ligar a CD16. A invenção particularmente se refere ao uso de tais Moléculas de Ligação CD16 e CD16 x DA no tratamento de câncer e doenças associadas a patógenos. A presente invenção também é dirigida a composições farmacêuticas que compreendem tal molécula (ou moléculas).
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[004] O sistema imunológico de mamíferos serve como uma defesa contra uma variedade de condições, incluindo, por exemplo, lesão, infecção e neoplasia. A eficiência com que humanos e outros mamíferos desenvolvem uma resposta imunológica aos patógenos, substâncias estranhas e antígenos de câncer se baseia em duas características: a especificidade requintada da resposta imune para reconhecimento de antígeno e a memória imunológica que permite respostas mais rápidas e mais vigorosas após a reativação com o mesmo antígeno (Portolés, P. et al. (2009) “The TCR/CD3 Complex: Opening the Gate to Successful Vaccination”, Current Pharmaceutical Design 15:3290 a 3300; Guy, C.S. et al. (2009) “Organization of Proximal Signal Initiation at the TCR:CD3 Complex”, Immunol Rev. 232(1):7 a 21; Topalian, S.L. et al. (2015) “Immune Checkpoint Blockade: A Common Denominator Approach to Cancer Therapy”, Cancer Cell 27:450 a 461).
[005] Em indivíduos saudáveis, o sistema imunológico está em um estado de repouso, inibido por um repertório de diversos receptores inibitórios e receptores ligantes. Após o reconhecimento de um antígeno de câncer, patógeno microbiano ou um alérgeno, uma série de receptores ativadores e receptores ligantes são acionados para induzir a ativação do sistema imunológico. Essa ativação leva à ativação de macrófagos, células Exterminadoras Naturais (NK) e células T citotóxicas específicas de antígeno, e promove a liberação de várias citocinas, todas as quais atuam para combater a ameaça percebida à saúde do sujeito (Dong, C. et al. (2003) “Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules”, Immunolog. Res. 28(1):39 a 48; Viglietta, V. et al. (2007) “Modulating Co-Stimulation”, Neurotherapeutics 4:666 a 675; Korman, A.J. et al. (2007) “Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy”, Adv. Immunol. 90:297 a 339). O sistema imunológico é capaz de retornar ao seu estado normal de repouso quando os sinais imunes inibitórios compensatórios superam os sinais imunes ativadores.
[006] Assim, o estado da doença de câncer (e certamente os estados das doenças de doenças infecciosas) pode ser considerado como refletindo uma falha para ativar adequadamente um sistema imunológico do sujeito. Essa falha pode refletir uma apresentação inadequada de sinais imunes ativadores ou pode refletir uma capacidade inadequada para aliviar sinais imunes inibitórios no sujeito. Em alguns casos, os pesquisadores determinaram que as células de câncer podem cooptar o sistema imunológico para evitar serem detectadas pelo sistema imunológico (Topalian, S.L. et al. (2015) “Immune Checkpoint Blockade: A Common Denominator Approach to Cancer Therapy”, Cancer Cell 27:450 a 461).
[007] Entre os receptores envolvidos na ativação do sistema imunológico estão os receptores Fc: CD16, CD32 e CD64. Esses receptores Fc são encontrados nas superfícies de múltiplos tipos de células do sistema imune
(por exemplo, linfócitos B, células dendríticas foliculares, células exterminadoras naturais, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos e mastócitos). Esses receptores têm uma porção “extracelular” (que é, portanto, capaz de se ligar a um Domínio Fc), uma porção “transmembranar” (que se estende através da membrana celular), e uma porção “citoplasmática” (posicionada dentro da célula). Múltiplos tipos de FcγRs foram identificados: CD16A (FcγRIIIA), CD16B (FcγRIIIB), CD32A (FcγRIIA), CD32B (FcγRIIB) e CD64 (FcγRI). Esses receptores se ligam à porção Fc de anticorpos IgG, desencadeando assim a transdução de sinais ativadores ou inibitórios ao sistema imunológico.
[008] CD16 é um nome genérico para a ativação de receptores Fc, FcγRIIIA (CD16A) e FcγRIIIB (CD16B). Esses receptores se ligam à porção Fc de anticorpos IgG, desencadeando assim a liberação de citocinas. Se esses anticorpos estiverem ligados a um Antígeno de Doença que é expressado na superfície de uma célula (por exemplo, uma célula de câncer, célula infectada por patógeno, etc.), então essa liberação medeia a morte da célula alvo.
[009] CD16A é expressado por células Exterminadoras Naturais (NK) e macrófagos de tecidos que se ligam à IgG humana agregada, mas não monomérica (Selvaraj, P. et al. (2004) “Functional Regulation Of Human Neutrophil Fc Gamma Receptors”, Immunol Res. 29(1-3):219 a 230; Peltz, G.A. et al. (1989) “Human Fc Gamma RIII: Cloning, Expression, And Identification Of The Chromosomal Locus Of Two Fc Receptors For IgG”, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86(3):1013 a 1017; Bachanova, V. et al. (2014) “NK Cells In Therapy Of Cancer”, Crit. Rev. Oncog. 19(1-2):133 a 141; Miller, J.S. (2013)
“Therapeutic Applications: Natural Killer Cells In The Clinic”, Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2013:247 a 253; Youinou, P. et al. (2002) “Pathogenic Effects Of Anti- Fc Gamma Receptor IIIB (CD16) On Polymorphonuclear Neutrophils In Non-Organ-Specific Autoimmune Diseases”, Autoimmun Rev. 1(1-2):13 a 19; Peipp, M. et al. (2002) “Bispecific Antibodies Targeting Cancer Cells”, Biochem. Soc. Trans. 30(4):507 a 511; Unkeless, J.C. et al. (1995) “Function Of Human Fc Gamma RIIA And Fc Gamma RIIIB”, Semin. Immunol. 7(1):37 a 44).
[0010] A expressão de CD16A por células Exterminadoras Naturais (NK) tem particular relevância para a presente invenção, visto que tais células liberam citocinas quando suas moléculas CD16 se ligam ao Domínio Fc de um anticorpo. Assim, quando um anticorpo natural se liga a um Antígeno de Doença de uma célula alvo, seu Domínio Fc pode ser reconhecido por uma molécula CD16 de uma célula Exterminadora Natural, que então medeia a morte da célula alvo. Visto que essa morte é dependente de anticorpo, é denominada citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpo (ADCC). A ADCC depende, portanto, de uma resposta anterior de anticorpo, e, como estabelecido, exige a presença e participação de uma célula efetora que expressa FcγR (tipicamente células Exterminadoras Naturais (NK), mas também macrófagos, neutrófilos e eosinófilos). ADCC sinaliza CD16A através de interações com a proteína CD ξ de células NK e sinaliza a morte mediada por macrófago através de interações com cadeias FcγR de macrófagos.
[0011] CD16A possui duas formas polimórficas principais, F158 e V158, que diferem por possuir uma fenilalanina ou uma valina no resíduo 158 (mostrado como resíduo 160 do domínio extracelular de CD16A (Figura 7), que corresponde ao resíduo 176 da proteína de comprimento total (Wu, J. et al. (1997) “A Novel Polymorphism of FcγRIIIa (CD16) Alters Receptor Function and Predisposes to Autoimmune Disease”, J. Clin.Invest. 100(5):1059 a 1070; Ravetch, J. V. et al. (1989) “Alternative Membrane Forms Of FcγRIII(CD16) On Human Natural Killer Cells And Neutrophils”, J. Exper. Med. 170:481 a 497; Koene, H.R. et al. (1997) “FcγRIIIa-158V/F Polymorphism Influences the Binding of IgG by Natural Killer Cell FcγRIIIa, Independently of the FcγRIIIa-48L/R/H Phenotype”, Blood, 90(3):1109 a 1114; van Sorge, N.M. (2003) “FcgammaR Polymorphisms: Implications For Function, Disease Susceptibility And Immunotherapy”, Tissue Antigens 61(3):189 a 202; Fijen, C.A. (2000) “The Role Of Fcgamma Receptor Polymorphisms And C3 In The Immune Defence Against Neisseria Meningitidis In Complement-Deficient Individuals”, Clin. Exp. Immunol. 120(2):338 a 345). 50% dos Caucasianos são homozigotos para o polimorfismo de fenilalanina (F158/F158), enquanto 39% dos Caucasianos são heterozigotos para este polimorfismo (F158/V158) e 11% dos Caucasianos são homozigotos para o polimorfismo de valina (V158/V158).
[0012] CD16B é expressado em neutrófilos e está ancorado em glicofosfatidilinositol (“ancorado em GPI”) (Meknache, N. et al. (2009) “Human Basophils Express The Glycosylphosphatidylinositol-Anchored Low-Affinity IgG Receptor FcgammaRIIIB (CD16B)”, J. Immunol. 182(4):2542 a 2550 Fernandes, M.J. et al. (2006) “CD16b Associates With High-Density, Detergent-Resistant Membranes In Human Neutrophils”, Biochem. J. 393(Pt 1):351 a 359; Selvaraj, P.
et al. (2004) “Functional Regulation Of Human Neutrophil Fc Gamma Receptors”, Immunol Res. 29(1 a 3):219 a 230; Unkeless, J.C. et al. (1995) “Function Of Human Fc Gamma RIIA And Fc Gamma RIIIB”, Semin. Immunol. 7(1):37 a 44). Embora seja considerado um receptor de engodo, também pode transmitir sinais (Fernandes, M.J. (2005) “Signaling Through CD16b In Human Neutrophils Involves The Tec Family Of Tyrosine Kinases”, J. Leukoc. Biol. 78(2):524 a 532), and is downregulated/cleaved by ADAM17 after cell activation (Wang, Y. et al. (2013) “ADAM17 Cleaves CD16b (FcγRIIIb) In Human Neutrophils”, Biochim. Biophys. Acta 1833(3):680 a 685; Guo, S. et al. (2012) “Role of ADAM10 and ADAM17 in CD16b Shedding Mediated By Different Stimulators”, Chin. Med. Sci. J. 27(2):73 a 79).
[0013] CD16B possui duas formas polimórficas principais, NA1 e NA2, que exibem diferentes afinidades de ligação para subclasses de IgG1 e IgG3 (Bournazos, S. et al. (2010) “Fcγ Receptor IIIb (CD16b) Polymorphisms Are Associated With Susceptibility To Idiopathic Pulmonary Fibrosis”, Lung 188(6):475 a 481; van Sorge, N.M. (2003) “FcgammaR Polymorphisms: Implications For Function, Disease Susceptibility And Immunotherapy”, Tissue Antigens 61(3):189 a 202). 13% dos Caucasianos e 16% dos Indianos são homozigotos para o polimorfismo de NA1 (NA1/NA1), enquanto 55% dos Caucasianos e 28% dos Indianos são heterozigotos para este polimorfismo (NA1/NA2) e 32% dos Caucasianos e 55% dos Indianos são homozigotos para o polimorfismo de NA2 (NA2/NA2). O alinhamento dos alótipos CD16A e CD16B humanos é mostrado na Figura 7.
[0014] CD32A (FcγRIIA) (Brandsma, A.M. (2015)
“Fc Receptor Inside-Out Signaling And Possible Impact On Antibody Therapy”, Immunol Rev. 268(1):74 a 87; van Sorge, N.M. et al. (2003) “FcgammaR Polymorphisms: Implications For Function, Disease Susceptibility And Immunotherapy”, Tissue Antigens 61(3):189-202; Selvaraj, P. et al. (2004) “Functional Regulation Of Human Neutrophil Fc Gamma Receptors”, Immunol.
Res. 29(1 a 3):219 a 230) and CD64 (FcγRI) (Lu, S. et al. (2015) “Structural Mechanism Of High Affinity FcγRI recognition Of Immunoglobulin G”, Immunol.
Rev. 268(1):192 a 200; Swisher, J.F. et al. (2015) “The Many Faces Of FcγRI: Implications For Therapeutic Antibody Function”, Immunol.
Rev. 268(1):160 a 174; Thepen, T. et al. (2009) “Fcgamma Receptor 1 (CD64), A Target Beyond Cancer”, Curr.
Pharm.
Des. 15(23):2712 a 2718; Rouard, H. et al. (1997) “Fc Receptors As Targets For Immunotherapy”, Int.
Rev.
Immunol. 16(1 a 2):147 a 185) estão ativando os receptores Fc que são expressados em macrófagos, neutrófilos, eosinófilos e células dendríticas (e para CD32A, também em plaquetas e células de Langerhan). Ao contrário, CD32B (FcγRIIB) é um receptor Fc inibidor em linfócitos B (macrófagos, neutrófilos e eosinófilos) (Stopforth, R.J. et al. (2016) “Regulation of Monoclonal Antibody Immunotherapy by FcγRIIB”, J.
Clin.
Immunol. [2016 Feb 27 Epub], pp. 1 a 7; Bruhns, P. et al. (2009) “Specificity And Affinity Of Human Fcgamma Receptors And Their Polymorphic Variants For Human IgG Subclasses”, Blood. 113(16):3716 a 3725; White, A.L. et al. (2014) “FcγRIIB As A Key Determinant Of Agonistic Antibody Efficacy”, Curr.
Top.
Microbiol.
Immunol. 382:355-372; Selvaraj, P. et al. (2004) “Functional Regulation Of Human Neutrophil Fc Gamma Receptors”, Immunol.
Res. 29(1 a 3):219 a
230).
[0015] A capacidade dos diferentes FcγRs para mediar funções diametricamente opostas reflete suas diferenças estruturais e, em particular, se o FcγR possui um motivo de ativação de imunorreceptor baseado em tirosina (“ITAM”) ou um motivo inibitório de imunorreceptor com base em tirosina (“ITIM”). O recrutamento de diferentes enzimas citoplasmáticas para essas estruturas determina o resultado das respostas celulares mediadas por FcγR. FcγRs contendo ITAM incluem FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIIA e ativam o sistema imunológico quando ligados aos Domínios Fc (por exemplo, Domínios Fc agregados presentes em um complexo imune). FcγRIIB é o único FcγR contendo ITIM natural atualmente conhecido; atua para amortecer ou inibir o sistema imunológico quando ligado aos Domínios Fc agregados.
[0016] Embora os anticorpos IgG naturais dirigidos a um epítopo de um Antígeno de Doença particular possuam Domínios Fc que podem interagir com as moléculas CD16 para ativar uma resposta imune do sujeito, no caso de muitas doenças e muitos sujeitos, essa ativação do sistema imunológico não é suficiente para fornecer uma terapia eficaz para a doença. Assim, apesar dos avanços anteriores em identificar as moléculas envolvidas nas respostas imunes de mamíferos, permanece uma necessidade por terapias melhoradas para tratar cânceres e doenças infecciosas. As Moléculas de Ligação CD16 da presente invenção e, particularmente, as Moléculas de Ligação CD16 x DA da presente invenção que compreendem um Domínio de Ligação a CD16 e um Domínio de Ligação específico para um Antígeno de Doença expressados em uma célula alvo são capazes de colocalizar células que expressam CD16 no sítio (ou sítios) de células que expressam o Antígeno de Doença. Essa colocalização aumenta a morte mediada por ADCC de células alvo aumentando-se a probabilidade de que uma porção Fc de um anticorpo dirigida contra um epítopo do Antígeno de Doença se ligará a uma célula efetora que expressa CD16 e, através desta interação Fc-CD16, desencadear a ativação do sistema imunológico e a liberação de citocinas contra a célula alvo. Assim, a presente invenção é dirigida a melhorar a ativação de uma resposta imune do sujeito a um antígeno de Doença e outros objetivos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0017] A presente invenção é dirigida a moléculas (por exemplo, um anticorpo, um diacorpo, um scFv, um anticorpo, um TandAb, etc.) capazes de se ligar a um epítopo de CD16 humano (uma “Molécula de Ligação CD16”). A presente invenção também é dirigida a Moléculas de Ligação CD16 que são capazes de se ligar a um epítopo de CD16 humano e um ou mais epítopos de um Antígeno de Doença (“DA”) (por exemplo, uma “Molécula de Ligação CD16 x DA”). A presente invenção é particularmente dirigida a essas “Molécula de Ligação CD16 x DA que são anticorpos, ou que compreendem um Domínio de Ligação ao Epítopo dos mesmos, ou são diacorpos (incluindo diacorpos DART®), anticorpos biespecíficos, TandAbs, outras moléculas de ligação multiespecíficas (por exemplo, moléculas TRIDENT™ trivalentes), etc. A invenção particularmente se refere a Moléculas de Ligação CD16 x DA que são capazes de se ligar a um Antígeno de Doença que é um Antígeno de Câncer ou um Antígeno Associado ao Patógeno além de serem capazes de se ligar a CD16. A invenção particularmente se refere ao uso de tais Moléculas de Ligação CD16 e CD16 x DA no tratamento de câncer e doenças associadas a patógenos. A presente invenção também é dirigida a composições farmacêuticas que compreendem essa molécula (ou moléculas).
[0018] Em detalhes, a invenção fornece uma Molécula de Ligação CD16 x Antígeno de Doença (CD16 x DA) compreendendo um Domínio de Ligação a CD16 capaz de se ligar a um epítopo de CD16 e também um Domínio de Ligação ao Antígeno de Doença capaz de se ligar a um epítopo de um Antígeno de Doença, em que o Domínio de Ligação a CD16 compreende um ou mais de:
[0019] (I) (A) um Domínio de CDRH1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 66;
[0020] (B) um Domínio de CDRH2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 67;
[0021] (C) um Domínio de CDRH3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 68 ou SEQ ID NO: 60;
[0022] (D) um Domínio de CDRL1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 69 ou SEQ ID NO: 74;
[0023] (E) um Domínio de CDRL2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 70; e
[0024] (F) um Domínio de CDRL3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 71 ou SEQ ID NO: 61;
[0025] (II) (A) um Domínio de CDRH1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 77;
[0026] (B) um Domínio de CDRH2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 78;
[0027] (C) um Domínio de CDRH3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 79;
[0028] (D) um Domínio de CDRL1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 80;
[0029] (E) um Domínio de CDRL2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 81; e
[0030] (F) um Domínio de CDRL3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 82;
[0031] (III) um Domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, ou SEQ ID NO: 58;
[0032] (IV) um Domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 85 ou SEQ ID NO: 59;
[0033] (V) um Domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 72 e um Domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 73; e
[0034] (VI) um Domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 83 ou SEQ ID NO: 84 e um Domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 85
[0035] (VII) um Domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 58 e um Domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 73;
[0036] (VIII) um Domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 72 e um Domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 59; e
[0037] (IX) um Domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 58 e um Domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 59.
[0038] A invenção adicionalmente se refere à modalidade de tais Molécula de Ligação CD16 x Antígeno de
Doença, em que a Molécula é um anticorpo biespecífico, um diacorpo biespecífico, um TandAb biespecífico, uma molécula trivalente biespecífica ou um CAR biespecífico.
[0039] A invenção adicionalmente se refere à modalidade de tais Moléculas de Ligação CD16 x Antígeno de Doença, em que a Molécula é capaz de se ligar a mais de um Antígeno de Doença e/ou mais de um epítopo de CD16.
[0040] A invenção adicionalmente se refere à modalidade de tais Moléculas de Ligação CD16 x Antígeno de Doença, em que o Domínio de Ligação a CD16 compreende:
[0041] (A) um Domínio de CDRH1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 66;
[0042] (B) um Domínio de CDRH2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 67;
[0043] (C) um Domínio de CDRH3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 68 ou SEQ ID NO: 60;
[0044] (D) um Domínio de CDRL1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 69 ou SEQ ID NO: 74;
[0045] (E) um Domínio de CDRL2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 70; e
[0046] (F) um Domínio de CDRL3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 71 ou SEQ ID NO: 61.
[0047] A invenção adicionalmente se refere à modalidade de tais Moléculas de Ligação CD16 x Antígeno de Doença, em que o Domínio de Ligação a CD16 compreende:
[0048] (A) um Domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 72 ou SEQ ID NO: 58;
[0049] (B) um Domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 73 ou SEQ ID NO: 59; ou
[0050] (C) um Domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 72 e um Domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 73
[0051] (D) um Domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 58 e um Domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 73;
[0052] (E) um Domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 72 e um Domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 59; ou
[0053] (F) um Domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 58 e um Domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 59.
[0054] A invenção adicionalmente se refere à modalidade de tais Moléculas de Ligação CD16 x Antígeno de Doença, em que o Domínio de Ligação a CD16 compreende:
[0055] (A) um Domínio de CDRH1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 77;
[0056] (B) um Domínio de CDRH2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 78;
[0057] (C) um Domínio de CDRH3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 79;
[0058] (D) um Domínio de CDRL1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 80;
[0059] (E) um Domínio de CDRL2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 81; e
[0060] (F) um Domínio de CDRL3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 82.
[0061] A invenção adicionalmente se refere à modalidade de tais Moléculas de Ligação CD16 x Antígeno de Doença, em que o Domínio de Ligação a CD16 compreende:
[0062] (A) um Domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 83 ou SEQ ID NO: 84;
[0063] (B) um Domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da ou SEQ ID NO: 85; ou
[0064] (C) um Domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 83 ou SEQ ID NO: 84 e um Domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 85.
[0065] A invenção adicionalmente se refere à modalidade de tais Moléculas de Ligação CD16 x Antígeno de Doença, em que o Antígeno de Doença é um Antígeno de Câncer e a doença é câncer.
[0066] A invenção adicionalmente se refere à modalidade de tais Moléculas de Ligação CD16 x Antígeno de Doença, em que o câncer é selecionado do grupo consiste em câncer adrenal, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer colorretal, câncer gástrico, glioblastoma, câncer de rim, câncer de pulmão de células não pequenas, leucemia linfocítica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica, leucemia de células pilosas, linfoma de Burkett, linfoma difuso de grandes células B, linfoma folicular, linfoma de células do manto, linfoma de zona marginal, linfoma não-Hodgkin, linfoma linfocítico pequeno, mieloma múltiplo, melanoma, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer de pele, carcinoma de células renais, câncer testicular e câncer uterino.
[0067] A invenção adicionalmente se refere à modalidade de tais Moléculas de Ligação CD16 x Antígeno de Doença, em que o Antígeno de Câncer é selecionado do grupo consiste nos Antígenos de Câncer: 19.9, 4.2, A33, ADAM-9, AH6, ALCAM, B1, B7-H3, BAGE, beta-catenina, grupo sanguíneo ALeb/Ley, antígeno do linfoma de Burkitt-38.13, C14, CA125, Carboxipeptidase M, CD5, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD27, CD28, CD33, CD36, CD40/CD154, CD45, CD56, CD46, CD52, CD56, CD79a/CD79b, CD103, CD123, CD317, CDK4, CEA, CEACAM5/CEACAM6, CO17-1A, CO-43, CO-514, CTA-1, CTLA-4, Citoqueratina 8, D1.1, D156-22, DR5, série E1, EGFR, um receptor de Efrina, EphA2, Erb, GAGE, um gangliosídeo GD2/GD3/GM2, GICA 19-9, gp100, Gp37, gp75, gpA33, HER2/neu, HMFG, papilomavírus humano- E6/papilomavírus humano-E7, HMW-MAA, antígeno I, IL13Rα2, Integrina β6, JAM-3, KID3, KID31, antígeno de pan-carcinoma KS 1/4, L6,L20, LEA, LUCA-2, M1:22:25:8, M18, M39, MAGE, MART, mesotelina, MUC-1, MUM-1, Mil, N- acetilglucosaminiltransferase, neoglicoproteína, NS-10, OFA- 1, OFA-2, Oncostatina M, p15, p97, PEM, PEMA, PIPA, PSA, PSMA, fosfato de ácido prostático, R24, ROR1, um esfingolipídeo, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, sTn, o peptídeo derivado do receptor de células T, T5A7, TAG-72, TL5, receptor TNF, receptor TNF-γ, TRA-1-85, um Receptor Transferrina, 5T4, TSTA, VEGF, um Receptor VEGF, VEP8, VEP9, VIM-D5 e hapteno Y, Ley.
[0068] A invenção adicionalmente se refere à modalidade de tais Moléculas de Ligação CD16 x Antígeno de Doença, em que o Antígeno de Doença é 5T4, B7-H3, CEACAM5/CEACAM6, CD19, CD123, EGRF, EphA2, HER2/neu, IL13Rα2 ou VEGF.
[0069] A invenção adicionalmente se refere à modalidade de tais Moléculas de Ligação CD16 x Antígeno de Doença, em que o Antígeno de Doença é um Antígeno Associado ao Patógeno.
[0070] A invenção adicionalmente se refere à modalidade de tais Moléculas de Ligação CD16 x Antígeno de Doença, em que o Antígeno Associado ao Patógeno é selecionado do grupo consiste nos Antígenos Associados a Patógenos: proteína de célula infectada com Vírus do Herpes Simples (ICP)47, Vírus do Herpes Simples gD, Vírus Epstein-Barr LMP- 1, Vírus Epstein-Barr LMP-2A, Vírus Epstein-Barr LMP-2B, Vírus da Imunodeficiência Humana gp160, Vírus da Imunodeficiência Humana gp120, Vírus da Imunodeficiência Humana gp41, etc.), Papilomavírus Humano E6, Papilomavírus Humano E7, vírus da leucemia de células T humana gp64, vírus da leucemia de células T humana gp46 e vírus da leucemia de células T humana gp21.
[0071] A invenção adicionalmente se refere à modalidade de tais Moléculas de Ligação CD16 x Antígeno de Doença, em que o Antígeno de Doença é um antígeno de HIV env.
[0072] A invenção adicionalmente se refere à modalidade de tais Moléculas de Ligação CD16 x Antígeno de Doença, em que a Molécula é:
[0073] (A) um diacorpo, o dito diacorpo sendo um complexo covalentemente ligado que compreende duas ou três, quatro ou cinco cadeias polipeptídicas; ou
[0074] (B) uma molécula de ligação trivalente, a dita molécula de ligação trivalente sendo um complexo covalentemente ligado que compreende três, quatro ou cinco cadeias polipeptídicas, ou
[0075] (C) um anticorpo biespecífico.
[0076] A invenção adicionalmente se refere à modalidade de tais Moléculas de Ligação CD16 x Antígeno de
Doença, em que a Molécula compreende uma Região Fc.
[0077] A invenção adicionalmente se refere à modalidade de tais Moléculas de Ligação CD16 x Antígeno de Doença, em que a Região Fc, é do isotipo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4.
[0078] A invenção adicionalmente se refere à modalidade de tais Moléculas de Ligação CD16 x Antígeno de Doença, em que a Região Fc é uma Região Fc variante que compreende:
[0079] (A) uma ou mais modificações de aminoácidos que reduzem a afinidade da Região Fc variante para um FcγR; e/ou
[0080] (B) uma ou mais modificações de aminoácidos que aumentam a meia-vida sérica da Região Fc variante.
[0081] A invenção adicionalmente se refere à modalidade de tais Moléculas de Ligação CD16 x Antígeno de Doença:
[0082] (A) as ditas modificações que reduzem a afinidade da Região Fc variante para um FcγR compreendem a substituição de L234A; L235A; ou L234A e L235A; e
[0083] (B) as ditas modificações que aumentam a meia-vida sérica da Região Fc variante compreendem a substituição de M252Y; M252Y e S254T; M252Y e T256E; M252Y, S254T e T256E; ou K288D e H435K,
[0084] em que a dita numeração é a do índice da EU como em Kabat.
[0085] A invenção adicionalmente se refere uma Molécula de Ligação CD16, que compreende:
[0086] (A) um Domínio de CDRH1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 66;
[0087] (B) um Domínio de CDRH2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 67;
[0088] (C) um Domínio de CDRH3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 68 ou SEQ ID NO: 60;
[0089] (D) um Domínio de CDRL1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 69 ou SEQ ID NO: 74;
[0090] (E) um Domínio de CDRL2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 70; e
[0091] (F) um Domínio de CDRL3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 71 ou SEQ ID NO: 61.
[0092] A invenção adicionalmente se refere à modalidade de tal Molécula de Ligação CD16 em que a Molécula compreende:
[0093] (A) um Domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 72 ou SEQ ID NO: 58;
[0094] (B) um Domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 73 ou SEQ ID NO: 59;
[0095] (C) um Domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 72 e um Domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 73; ou
[0096] (D) um Domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 58 e um Domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 73;
[0097] (E) um Domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 72 e um Domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 59; ou
[0098] (F) um Domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 58 e um Domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 59.
[0099] A invenção adicionalmente se refere uma Molécula de Ligação CD16 que compreende:
[00100] (A) um Domínio de CDRH1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 77;
[00101] (B) um Domínio de CDRH2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 78;
[00102] (C) um Domínio de CDRH3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 79;
[00103] (D) um Domínio de CDRL1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 80;
[00104] (E) um Domínio de CDRL2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 81; e
[00105] (F) um Domínio de CDRL3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 82.
[00106] A invenção adicionalmente se refere à modalidade de tal Molécula de Ligação CD16 em que a Molécula compreende:
[00107] (A) um Domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 83 ou SEQ ID NO: 84;
[00108] (B) um Domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da ou SEQ ID NO: 85; ou
[00109] (C) um Domínio VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 83 ou SEQ ID NO: 84 e um Domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 85.
[00110] A invenção adicionalmente se refere à modalidade de tais Moléculas de Ligação CD16 em que a molécula é selecionada do grupo consiste em: um anticorpo, um anticorpo multiespecífico, um fragmento Fab’, um fragmento F(ab’)2, um fragmento (Fv), uma cadeia simples (scFv), um anticorpo de cadeia simples, um Fv biespecífico ligado a dissulfeto (sdFv), um diacorpo, uma molécula de ligação trivalente e uma molécula CAR-T.
[00111] A invenção adicionalmente se refere uma composição farmacêutica que compreende qualquer uma das Moléculas de Ligação CD16 x Antígeno de Doença ou Moléculas de Ligação CD16 acima descritas e um portador farmaceuticamente aceitável.
[00112] A invenção adicionalmente se refere ao uso da composição farmacêutica acima descrita no tratamento de uma doença caracterizada pela expressão do Antígeno de Doença.
[00113] A invenção adicionalmente se refere um método para o tratamento de uma doença caracterizada pela expressão do Antígeno de Doença, compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica acima descrita.
[00114] A invenção adicionalmente se refere à modalidade de tal uso ou método em que a Molécula de Ligação CD16 x Antígeno de Doença é capaz de se ligar a mais de um Antígeno de Doença e/ou mais de um epítopo de CD16.
[00115] A invenção adicionalmente se refere a tal uso ou método em que a Molécula de Ligação CD16 x Antígeno de Doença, em que o Antígeno de Doença é um Antígeno de Câncer e a doença é câncer.
[00116] A invenção adicionalmente se refere a tal uso ou método em que o câncer é selecionado do grupo consiste em câncer adrenal, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer colorretal, câncer gástrico, glioblastoma, câncer de rim,
câncer de pulmão de células não pequenas, leucemia linfocítica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica, leucemia de células pilosas, linfoma de Burkett, linfoma difuso de grandes células B, linfoma folicular, linfoma de células do manto, linfoma de zona marginal, linfoma não-Hodgkin, linfoma linfocítico pequeno, mieloma múltiplo, melanoma, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer de pele, carcinoma de células renais, câncer testicular e câncer uterino.
[00117] A invenção adicionalmente se refere a tal uso ou método em que o Antígeno de Câncer é selecionado do grupo consiste nos Antígenos de Câncer: 19.9, 4.2, A33, ADAM- 9, AH6, ALCAM, B1, B7-H3, BAGE, beta-catenina, grupo sanguíneo ALeb/Ley, antígeno do linfoma de Burkitt-38.13, C14, CA125, Carboxipeptidase M, CD5, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD27, CD28, CD33, CD36, CD40/CD154, CD45, CD56, CD46, CD52, CD56, CD79a/CD79b, CD103, CD123, CD317, CDK4, CEA, CEACAM5/CEACAM6, CO17-1A, CO-43, CO-514, CTA-1, CTLA-4, Citoqueratina 8, D1.1, D156-22, DR5, série E1 , EGFR, um receptor de Efrina, EphA2, Erb, GAGE, um gangliosídeo GD2/GD3/GM2, GICA 19-9, gp100, Gp37, gp75, gpA33, HER2/neu, HMFG, papilomavírus humano-E6/papilomavírus humano-E7, HMW- MAA, antígeno I, IL13Rα2, Integrina β6, JAM-3, KID3, KID31, antígeno de pan-carcinoma KS 1/4, L6,L20, LEA, LUCA-2, M1:22:25:8, M18, M39, MAGE, MART, mesotelina, MUC-1, MUM-1, Mil, N-acetilglucosaminiltransferase, neoglicoproteína, NS- 10, OFA-1, OFA-2, Oncostatina M, p15, p97, PEM, PEMA, PIPA, PSA, PSMA, fosfato de ácido prostático, R24, ROR1, um esfingolipídeo, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, sTn, o peptídeo derivado do receptor de células T, T5A7, TAG-72, TL5, receptor TNF, receptor TNF-γ, TRA-1-85, um Receptor Transferrina, 5T4, TSTA, VEGF, um Receptor VEGF, VEP8, VEP9, VIM-D5 e hapteno Y, Ley.
[00118] A invenção adicionalmente se refere a tal uso ou método em que o Antígeno de Doença é 5T4, B7-H3, CEACAM5/CEACAM6, CD19, CD123, EGRF, EphA2, HER2/neu, IL13Rα2 ou VEGF.
[00119] A invenção adicionalmente se refere a tal uso ou método em que a Molécula de Ligação CD16 x Antígeno de Doença, em que o Antígeno de Doença é um Antígeno Associado ao Patógeno.
[00120] A invenção adicionalmente se refere a tal uso ou método em que o Antígeno Associado ao Patógeno é selecionado do grupo consiste nos Antígenos Associados a Patógenos: proteína de célula infectada com Vírus do Herpes Simples (ICP)47, Vírus do Herpes Simples gD, Vírus Epstein- Barr LMP-1, Vírus Epstein-Barr LMP-2A, Vírus Epstein-Barr LMP-2B, Vírus da Imunodeficiência Humana gp160, Vírus da Imunodeficiência Humana gp120, Vírus da Imunodeficiência Humana gp41, etc.), Papilomavírus Humano E6, Papilomavírus Humano E7, vírus da leucemia de células T humana gp64, vírus da leucemia de células T humana gp46 e vírus da leucemia de células T humana gp21.
[00121] A invenção adicionalmente se refere a tal uso ou método em que o Antígeno de Doença é um antígeno de HIV env. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS:
[00122] Figuras 1A-1B fornecem um esquema de um diacorpo covalentemente ligado representativo tendo dois sítios de ligação ao epítopo compostos por duas cadeias polipeptídicas, cada um tendo um Domínio Promotor Heterodímero espiral E ou espiral K (Domínios Promotores Heterodímeros alternativos são fornecidos abaixo). Um resíduo de cisteína pode estar presente em um conector (Figura 1A) e/ou no Domínio Promotor Heterodímero (Figura 1B). Domínios VL e VH que reconhecem o mesmo epítopo são mostrados usando o mesmo padrão de sombreamento ou preenchimento. A linha ondulada (WWW) nesta e todas as Figuras fornecendo apresentações esquemáticas de domínios de moléculas de ligação representam um ou mais Domínios Promotores Heterodímeros opcionais que estão preferivelmente presente.
[00123] Figura 2 fornece um esquema de uma molécula de diacorpo covalentemente ligada representativa tendo dois sítios de ligação ao epítopo compostos por duas cadeias polipeptídicas, cada um tendo um Domínio CH2 e CH3, de tal modo que as cadeias associadas formam toda ou parte de uma Região Fc. Os domínios VL e VH que reconhecem o mesmo epítopo são mostrados usando o mesmo padrão de sombreamento ou preenchimento.
[00124] Figuras 3A-3E fornecem esquemas que mostram diacorpos tetravalentes covalentemente ligados representativos tendo quatro sítios de ligação ao epítopo compostos por dois pares de cadeias polipeptídicas (isto é, quatro cadeias polipeptídicas em todos). Uma cadeia polipeptídica de cada par possui um Domínio CH2 e CH3, de tal modo que as cadeias associadas formam toda ou parte de uma Região Fc. Os Domínios VL e VH que reconhecem o mesmo epítopo são mostrados usando o mesmo padrão de sombreamento ou preenchimento. Os dois pares de cadeias polipeptídicas podem ser os mesmos.
Em tais modalidades, em que os dois pares de cadeias polipeptídicas são os mesmos e os Domínios VL e VH reconhecem diferentes epítopos (como mostrado nas Figuras 3A- 3B), a molécula resultante possui quatro sítios de ligação ao epítopo e é biespecífica e bivalente com respeito a cada epítopo ligado.
Em tais modalidades, em que os Domínios VL e VH reconhecem o mesmo epítopo (por exemplo, as mesmas CDRs do Domínio VL e as mesmas CDRs do Domínio VH são usadas em ambas as cadeias) a molécula resultante possui quatro sítios de ligação ao epítopo e é monoespecífica e tetravalente com respeito a um único epítopo.
Alternativamente, os dois pares de polipeptídeos podem ser diferentes.
Em tais modalidades, em que os dois pares de cadeias polipeptídicas são diferentes e os Domínios VL e VH de cada par de polipeptídeos reconhece diferentes epítopos (como mostrado pelos diferentes sombreamentos e padrões na Figura 3C), a molécula resultante possui quatro sítios de ligação ao epítopo e é tetraespecífica e monovalente com respeito a cada epítopo ligado.
Figura 3A mostra um diacorpo contendo Região Fc que contém um Domínio Promotor Heterodímero de peptídeo compreendendo um resíduo de cisteína.
Figura 3B mostra um diacorpo contendo Região Fc, que contém Domínios Promotores Heterodímeros espiral E e espiral K compreendendo um resíduo de cisteína e um conector (com um resíduo de cisteína opcional). Figura 3C, mostra um diacorpo contendo Região Fc, que contém os domínios CH1 e CL de anticorpo.
Figuras 3D-3E ilustram como a seleção dos domínios de ligação mostrados na Figura 3B pode resultar em uma Molécula de Ligação CD16 x DA tendo dois sítios de ligação específicos para um epítopo de CD16 e dois sítios de ligação específicos para um epítopo de um DA. Figuras 3D-3E ilustram exemplos não limitativos de como os domínios podem ser selecionados para produzir Moléculas de Ligação CD16 x DA tendo orientações diferentes (isto é, a Figura 3D emprega um Domínio VL CD16 como o Domínio VL1 da Molécula de Ligação, um Domínio VH CD16 como o Domínio VH1 da Molécula de Ligação, um Domínio VL DA como o Domínio VL2 da Molécula de Ligação e um Domínio VH DA como o Domínio VH2 da Molécula de Ligação. Ao contrário, a Figura 3E emprega, um Domínio VL DA como o Domínio VL1 da Molécula de Ligação, um Domínio VH DA como o Domínio VH1 da Molécula de Ligação, um Domínio VL CD16 como o Domínio VL2 da Molécula de Ligação e um Domínio VH CD16 como o Domínio VH2 da Molécula de Ligação). Como fornecido abaixo, os sítios de ligação VL/VH formados pela associação das cadeias polipeptídicas podem ser iguais ou diferentes de modo a permitir a ligação tetravalente que é monoespecífica, biespecífica, triespecífica ou tetraespecífica.
[00125] Figuras 4A e 4B fornecem esquemas de uma molécula de diacorpo covalentemente ligada representativa tendo dois sítios de ligação ao epítopo compostos por três cadeias polipeptídicas. Duas das cadeias polipeptídicas possuem um Domínio CH2 e CH3, de tal modo que as cadeias associadas formam toda ou parte de uma Região Fc. As cadeias polipeptídicas compreendendo o Domínio VL e VH compreendem ainda um Domínio Promotor Heterodímero. Os Domínios VL e VH que reconhecem o mesmo epítopo são mostrados usando o mesmo padrão de sombreamento ou preenchimento.
[00126] Figuras 5A-5D fornecem esquemas de uma Molécula de Ligação covalentemente ligada representativa tendo quatro sítios de ligação ao epítopo compostos por cinco cadeias polipeptídicas.
Figura 5A mostra a estrutura geral de uma Molécula de Ligação CD16 x DA.
Duas das cadeias polipeptídicas possuem um Domínio CH2 e CH3, de tal modo que as cadeias associadas formam uma Região Fc que compreende toda ou parte de uma Região Fc.
As cadeias polipeptídicas compreendendo os Domínios VL e VH ligados compreendem ainda um Domínio Promotor Heterodímero.
Os Domínios VL e VH que reconhecem o mesmo epítopo são mostrados usando o mesmo padrão de sombreamento ou preenchimento.
Figura 5B mostra a estrutura de uma Molécula de Ligação CD16 x DA alternativa em que os domínios variáveis mostrados na Figura 5A foram selecionados para produzir uma Molécula de Ligação CD16 x DA resultante que possui dois domínios de ligação do tipo não diacorpo específicos para um DA ilustrativo, HER2/neu e dois domínios de ligação do tipo diacorpo específicos para CD16. Figura 5C mostra a estrutura de uma Molécula de Ligação CD16 x DA alternativa em que os domínios variáveis mostrados na Figura 5A foram selecionados para produzir uma Molécula de Ligação CD16 x DA resultante que possui dois domínios de ligação do tipo não diacorpo específicos para CD16 e dois domínios de ligação do tipo diacorpo específicos para HER2/neu.
Figura 5D mostra a estrutura de uma Molécula de Ligação CD16 x DA alternativa em que os domínios variáveis mostrados na Figura 5A foram selecionados para produzir uma Molécula de Ligação CD16 x DA resultante que possui dois domínios de ligação do tipo não diacorpo específicos para um epítopo de CD16, um domínio de ligação do tipo diacorpo específico para um epítopo de HER2/neu e um segundo domínio de ligação do tipo diacorpo específico para um epítopo de CD16. Esses epítopos de CD16 podem ser iguais ou diferentes.
Como será avaliado, propondo-se a seleção dos domínios de ligação mostrados na Figura 5A, quaisquer três dos domínios de ligação podem ser selecionados para se ligar a um epítopo de CD16. Do mesmo modo, quaisquer três dos domínios de ligação podem ser selecionados para se ligar a um epítopo de HER2/neu. Como fornecido abaixo, os sítios de ligação VL/VH formados pela associação das cadeias polipeptídicas podem ser iguais ou diferentes de modo a permitir a ligação tetravalente que é monoespecífica, biespecífica, triespecífica ou tetraespecífica.
[00127] Figuras 6A-6H fornecem esquemas de moléculas de ligação trivalentes contendo Região Fc representativas tendo três sítios de ligação ao epítopo. Figuras 6A esquematicamente os domínios de moléculas de ligação trivalentes compreendendo dois domínios de ligação do tipo diacorpo e um domínio de ligação do tipo Fab tendo diferentes orientações de domínio em que os domínios de ligação do tipo diacorpo são N-terminais ou C-terminais a uma Região Fc. Figuras 6B-6C mostram a estrutura de exemplos ilustrativos não limitativos de Moléculas de Ligação CD16 x DA em que os domínios variáveis mostrados nas Figuras 6A foram selecionados para produzir uma Molécula de Ligação CD16 x DA resultante que possui um domínio de ligação do tipo não diacorpo específico para CD16, um domínio de ligação do tipo diacorpo que é específico para um DA ilustrativo, HER2/neu e um segundo domínio de ligação do tipo diacorpo que é específico para CD16. Figura 6D ilustra esquematicamente os domínios de moléculas de ligação trivalentes compreendendo dois domínios de ligação do tipo diacorpo e um domínio de ligação do tipo Fab tendo diferentes orientações de domínio em que os domínios de ligação do tipo diacorpo são N- terminais ou C-terminais a uma Região Fc. As moléculas nas Figuras 6A-6D compreendem quatro cadeias. Figuras 6E e 6F, respectivamente, ilustram esquematicamente os domínios de moléculas de ligação trivalentes compreendendo dois domínios de ligação do tipo diacorpo N-terminais a uma Região Fc e um domínio de ligação do tipo Fab em que a cadeia leve e a cadeia pesada estão ligadas por meio de um espaçador polipeptídico ou um domínio de ligação do tipo scFv. As moléculas de ligação trivalentes nas Figuras 6G e 6H, respectivamente, ilustram esquematicamente os domínios de moléculas de ligação trivalentes compreendendo dois domínios de ligação do tipo diacorpo C-terminais a uma Região Fc e um domínio de ligação do tipo Fab em que a cadeia leve e a cadeia pesada estão ligadas por meio de um espaçador polipeptídico ou um domínio de ligação do tipo scFv. As moléculas de ligação trivalentes nas Figuras 6E-6H compreendem três cadeias. Os Domínios VL e VH que reconhecem o mesmo epítopo são mostrados usando o mesmo padrão de sombreamento ou preenchimento.
[00128] Figura 7 mostra um alinhamento dos domínios extracelulares (ECD) do alótipo 158F de CD16A humano (SEQ ID NO: 146), o alótipo 158V de CD16A humano (SEQ ID NO: 147), o alótipo NA1 de CD16B humano (SEQ ID NO: 148), o alótipo NA2 de CD16B humano (SEQ ID NO: 149), e o CD16 de macacos cinomolgos (SEQ ID NO: 150). As diferenças na sequência relativa àquela do alótipo 158F de CD16A humano são mostradas em negrito sublinhado. Na porção da molécula CD16A humana apresentada, o polimorfismo de 158F/158V encontra-se na posição 160.
[00129] Figura 8 mostra o efeito de concentrações aumentadas de IgG humana na capacidade dos Domínios de Ligação a CD16 de LNK16, DJ130c e CD16-M1 se ligarem a CD16.
[00130] Figuras 9A-9C mostram a capacidade de Moléculas de Ligação CD16: DART-F e DART-G se ligarem às células NK (Figura 9A; CD16A:na), neutrófilos (Figura 9B; CD16B:na e Células T (Figura 9C) no sangue total dos sujeitos doadores, em comparação com um diacorpo HIV x CD3 (como um controle positivo para ligação às células T por meio de seu Domínio de Ligação CD3), um diacorpo HIV x RSV (como um controle negativo para todas as ligações) e uma molécula comparadora de diacorpo h3G8 x RSV.
[00131] Figuras 10A-10B mostram a capacidade das Moléculas de Ligação CD16: DART-F e DART-G se ligarem a células que expressam CD16A de uma população de linfócitos bloqueados (Figura 10A) e uma população de granulócitos bloqueados (Figura 10B), em comparação com um diacorpo HIV x RSV (como um controle negativo para todas as ligações) e uma molécula comparadora de diacorpo h3G8 x RSV.
[00132] Figuras 11A-11B mostram a capacidade dos Domínios de Ligação a CD16 de CD16-M1 e h3G8 para distinguir alótipos de glicosilação NA1 (Figura 11A) e NA2 (Figura 11B).
[00133] Figura 12 mostra a capacidade dos Domínios de Ligação a CD16 de anticorpo hCD16-M1 (presentes em DART-C) para se ligar preferencialmente a células NK no sangue total.
[00134] Figura 13 apresenta um alinhamento das sequências de aminoácidos de CD16 humano (SEQ ID NO: 183), CD16 de macacos cinomolgos (SEQ ID NO: 184) e CD16 murino (SEQ ID NO: 185). As diferenças na sequência relativas àquela do CD16 humano são mostradas em negrito sublinhado.
[00135] Figuras 14A-14E mostram a porcentagem citotoxicidade resultante de uma incubação de 24 horas de células alvo de câncer que expressam diferentes níveis de HER2/neu e Células efetoras (PBMC humanas (E:T = 30:1) ou células NK humanas purificadas (E:T = 2:1)) na presença das Moléculas de Ligação CD16 x HER2/neu:DART-C (tendo um Domínio de Ligação a hCD16-M1 CD16), DART-D (tendo um Domínio de Ligação a CD16 hCD16-M2), DART-1 (tendo um Domínio de Ligação a CD16 h3G8), um controle negativo HER2/neu x RSV diacorpo ou um positivo h3G8 x RSV diacorpo. Figura 14A: células alvo N87 HER2/neu (expressão de HER2/neu:+++)/células NK; alótipo CD16A 158F/158F; Figura 14B: células alvo MCF7 HER2/neu (expressão de HER2/neu:+/-)/células NK; alótipo CD16A 158F/158F; Figura 14C: células alvo MDA-MB-231 HER2/neu (expressão de HER2/neu:+/-)/PBMCs; alótipo CD16A não avaliado; Figura 14D: células alvo N87 HER2/neu (expressão de HER2/neu:+++)/PBMCs; alótipo CD16A 158F/158V; Figura 14E: células alvo Hs700T HER2/neu (expressão de HER2/neu:+/- )/PBMCs; alótipo CD16A 158F/158V.
[00136] Figuras 15A-15C mostram a porcentagem de citotoxicidade resultante de uma incubação de 24 horas de células alvo HEK/D371 que expressam proteína do subtipo HIV Env e Células efetoras (PBMC humanas (E:T = 30:1) ou células NK humanas purificadas (E:T = 3:1)) na presença das Moléculas de Ligação CD16 x HIV env CD16: DART-F (tendo um Domínio de Ligação a CD16 hCD16-M1), DART-G (tendo um Domínio de Ligação a CD16 hCD16-M2) ou DART-2 (tendo um Domínio de Ligação a CD16 h3G8). Figura 15A: células alvo 293HEK D371/PBMCs; alótipo CD16A 158F/158V; Figura 15B: células alvo 293HEK
D371/PBMCs; alótipo CD16A 158F/158F; Figura 15C: células alvo 293HEK D371/células NK; alótipo CD16A 158F/158V.
[00137] Figuras 16A-16B mostram a porcentagem citotoxicidade de células HEK/D371 alvo, que expressam a proteína HIV env, na presença de Células efetoras (Jurkat/CD16A 158F (Figura 16A) ou 158V/células NFAT-Luc (Figura 16B) após incubação com DART-X (tendo um Domínio de Ligação a CD16 hCD16-M1), DART-Y (tendo um Domínio de Ligação a CD16 hCD16-M2), DART-0 (tendo um Domínio de Ligação a CD16 h3G8) ou DART-3 (um diacorpo CD16 x RSV tendo um Domínio de Ligação a CD16 hCD16-M1).
[00138] Figuras 17A-17C mostram a capacidade dos Domínios de Ligação a CD16 otimizados de hCD16-M1A (presentes em DART-I) hCD16-M1B (presente em DART-J), hCD16-M1AB (presente em DART-K), para se ligar a células NK humanas (Figura 17A), células NK de macacos cinomolgos (Figura 17B), e células NK de macaco-reso (Figura 17C) presentes em amostras de PBMC em comparação com Domínio de Ligação a CD16 parental de hCD16-M1 (presente em DART-C e DART-3) e o Domínio de Ligação a CD16 de h3G8 (presente em DART-1). O diacorpo HER2/neu x RSV (sem um Domínio de Ligação a CD16) está incluído como um controle negativo.
[00139] Figuras 18A-18D mostram a capacidade dos Domínios de Ligação a CD16 optimizados de hCD16-M1A (presentes em DART-I) hCD16-M1B (presentes em DART-J), e hCD16-M1AB (presentes em DART-K) para mediar morte celular redirecionada de HER2/neu que expressam células alvo com Células efetoras de humanos e macacos cinomolgos. Plotada é a citotoxicidade resultante de uma incubação de 24 horas de células alvo JIMT-1-Luc de câncer e Células efetoras (PBMC humanas (Figuras 18A-18B) ou PMBCs de macacos cinomolgos (Figuras 18C-18D)) (E:T = 30:1) na presença das Moléculas de Ligação CD16 x HER2/neu:DART-C (tendo um Domínio de Ligação a CD16 hCD16-M1), DART-I (tendo um Domínio de Ligação a CD16 hCD16-M1A), DART-J (tendo um Domínio de Ligação hCD16-M1B), DART-K (tendo um Domínio de Ligação hCD16-M1AB), DART-1 (tendo um Domínio de Ligação a CD16 h3G8) ou um diacorpo HER2/neu x RSV de controle negativo como medido em um ensaio de morte celular redirecionada LDH (plotado como percentual de citotoxicidade, Figuras 18A e 18C) ou um ensaio de morte celular redirecionada LUM (a luminescência (LUM) é plotada em unidades de luz relativas (RLU), Figuras 18B e 18D).
[00140] Figuras 19A-19D mostram a capacidade dos Domínios de Ligação a CD16 otimizados de hCD16-M1B (presentes em DART-M), e hCD16-M1AB (presentes em DART-N) para mediar a morte celular redirecionada de CD19 que expressam células alvo com Células efetoras humanas. A citotoxicidade medida depois de incubações de 24 horas (Figuras 19A e 19C) e 48 horas (Figuras 19B e 19D) de células alvo de câncer Raji-Luc e Células efetoras PBMC humanas (E:T = 30:1) na presença de Moléculas de Ligação CD16 x CD19:DART-L (tendo um Domínio de Ligação a CD16 hCD16-M1), DART-M (tendo um Domínio de Ligação hCD16-M1B), DART-N (tendo um Domínio de Ligação hCD16-M1AB), duvortuxizumabe (um diacorpo CD3 x CD19 de controle positivo) ou diacorpos CD16 x RSV de controle negativo DART-5 (tendo um Domínio de Ligação a CD16 hCD16-M1), DART-6 (tendo um Domínio de Ligação hCD16-M1B), DART-7 (tendo um Domínio de Ligação hCD16-M1AB), como medido em um ensaio de morte celular redirecionada LDH (plotado como percentual de citotoxicidade, Figuras 19A e 19B) ou um ensaio de morte celular redirecionada LUM (LUM é plotado em RLU, Figuras 19C e 19D).
[00141] Figuras 20A-20D mostram a capacidade dos Domínios de Ligação a CD16 otimizados de hCD16-M1B (presentes em DART-M) e hCD16-M1AB (presentes em DART-N) para mediar a depleção autóloga de células B in vitro de amostras de PBMC humanas e de macacos cinomolgos. A contagem de células B (células CD3-/CD20+) depois de incubações de 72 horas (Figuras 20A e 20C), 96 horas (Figura 20B) e 144 horas (Figura 20D) de PBMCs humanas (Figuras 20A-20B) ou de macacos cinomolgos (Figuras 20C-20D) na presença das Moléculas de Ligação CD16 x CD19:DART-L (tendo um Domínio de Ligação a CD16 hCD16-M1), DART-M (tendo um Domínio de Ligação hCD16- M1B), DART-N (tendo um Domínio de Ligação hCD16-M1AB) ou diacorpos CD16 x RSV de controle negativo DART-5 (tendo um Domínio de Ligação a CD16 hCD16-M1), DART-6 (tendo um Domínio de Ligação hCD16-M1B) como medido por citometria de fluxo.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[00142] A presente invenção é dirigida a moléculas (por exemplo, um anticorpo, um diacorpo, um scFv, um anticorpo, um TandAb, etc.) capazes de se ligar a um epítopo de CD16 humano (uma “Molécula de Ligação CD16”). A presente invenção também é dirigida a Moléculas de Ligação CD16 que são capazes de se ligar a um epítopo de CD16 humano e um ou mais epítopos de um Antígeno de Doença (“DA”) (por exemplo, uma “Molécula de Ligação CD16 x DA”). A presente invenção é particularmente dirigida a tais Moléculas de Ligação CD16 x DA que são anticorpos ou que compreendem um Domínio de Ligação ao Epítopo dos mesmos ou são diacorpos (incluindo diacorpos DART®), anticorpos biespecíficos, TandAbs, outras moléculas de ligação multiespecíficas (por exemplo, moléculas TRIDENT™ trivalentes), etc. A invenção particularmente se refere a Moléculas de Ligação CD16 x DA que são capazes de se ligar a um Antígeno de Doença que é um Antígeno de Câncer ou um Antígeno Associado ao Patógeno além de serem capazes de se ligar a CD16. A invenção particularmente se refere ao uso de tais Moléculas de Ligação CD16 e CD16 x DA no tratamento de câncer e doenças associadas a patógenos. A presente invenção também é dirigida a composições farmacêuticas que compreendem essa molécula (ou moléculas). I. ANTICORPOS E OUTRAS MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO A. ANTICORPOS
[00143] As Moléculas de Ligação CD16 x DA da presente invenção podem ser anticorpos ou serem deriváveis de anticorpos (por exemplo, por fragmentação, clivagem, etc. dos polipeptídeos do anticorpo ou a partir do uso das sequências de aminoácidos de moléculas de anticorpo ou de polinucleotídeos (ou suas sequências) que codificam tais polinucleotídeos, etc.).
[00144] Anticorpos são moléculas de imunoglobulina capazes de ligação específica a um domínio ou porção ou conformação particular (um “epítopo”) de uma molécula, tal como um carboidrato, polinucleotídeo, lipídio, polipeptídeo, etc. Uma molécula contendo epítopo pode ter atividade imunogênica, de modo que provoque uma resposta de produção de anticorpos em um animal; essas moléculas são denominadas “antígenos”. Como aqui usado, os termos “anticorpo” e “anticorpos” referem a anticorpos monoclonais, anticorpos multiespecíficos, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos sintéticos, anticorpos quiméricos,
anticorpos policlonais, anticorpos camelizados, Fvs de cadeia simples (scFv), anticorpos de cadeia simples, fragmentos Fab, fragmentos F(ab’), Fvs biespecíficos ligados a dissulfeto (sdFv), intracorpos e Domínios de Ligação ao Epítopo de qualquer um dos acima. Essas moléculas de imunoglobulina podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasse.
[00145] O termo “anticorpo monoclonal” se refere a uma população de anticorpos homogêneos em que o anticorpo monoclonal é composto por aminoácidos (de ocorrência natural ou de ocorrência não natural) que estão envolvidos na ligação seletiva de um antígeno. Anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único epítopo (ou sítio antigênico). O termo “anticorpo monoclonal” abrange não apenas anticorpos monoclonais intactos e anticorpos monoclonais de comprimento total, mas também fragmentos dos mesmos (tais como Fab, Fab’, F(ab’)2, (Fv), cadeia simples (scFv), mutantes dos mesmos, proteínas de fusão compreendendo uma porção de anticorpo, anticorpos monoclonais humanizados, anticorpos monoclonais quiméricos e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um sítio de reconhecimento de antígeno com a especificidade e a capacidade necessárias para se ligar a um antígeno. Não é intencionado a estar limitado com relação à fonte do anticorpo ou à maneira em que é feito (por exemplo, por hibridoma, seleção de fagos, expressão recombinante, animais transgênicos, etc.). O termo inclui imunoglobulinas inteiras bem como os fragmentos etc. descritos acima sob a definição de “anticorpo”. Os métodos de fabricação de anticorpos monoclonais são conhecidos na técnica.
Um método que pode ser utilizado é o método de Kohler, G. et al. (1975) “Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity”, Nature 256:495-497 ou uma modificação do mesmo.
Tipicamente, os anticorpos monoclonais são desenvolvidos em camundongos, ratos ou coelhos.
Os anticorpos são produzidos imunizando-se um animal com uma quantidade imunogênica de células, extratos de célula ou preparações proteicas que contêm o epítopo desejado.
O imunógeno pode ser, mas não está limitado a células primárias, linhagens celulares cultivadas, células cancerosas, proteínas, peptídeos, ácidos nucleicos ou tecidos.
As células usadas para a imunização podem ser cultivadas por um período de tempo (por exemplo, pelo menos 24 horas) antes de seu uso como um imunógeno.
As células podem ser usadas como imunógenos por si mesmas ou em combinação com um adjuvante não desnaturante, tal como Ribi (ver, por exemplo, Jennings, V.M. (1995) “Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production”, ILAR J. 37(3):119- 125). Em geral, as células devem ser mantidas intactas e, preferivelmente, viáveis quando usadas como imunógenos.
Células intactas podem permitir que os antígenos sejam melhor detectados que células rompidas pelo animal imunizado.
O uso de adjuvantes desnaturantes ou agressivos, por exemplo, adjuvante de Freund, pode romper as células e, portanto, é desaconselhado.
O imunógeno pode ser administrado múltiplas vezes a intervalos periódicos tais como, bi semanalmente ou semanalmente ou pode ser administrado de modo a manter a viabilidade no animal (por exemplo, em um tecido recombinante). Alternativamente, os anticorpos monoclonais existentes e quaisquer outros anticorpos equivalentes que são imunoespecíficos para um epítopo patogênico desejado podem ser sequenciados e produzidos recombinantemente por qualquer meio conhecido na técnica. Em uma modalidade, este anticorpo é sequenciado e a sequência polinucleotídica é então clonada em um vetor para expressão ou propagação. A sequência que codifica o anticorpo de interesse pode ser mantida em um vetor em uma célula hospedeira e a célula hospedeira pode então ser expandida e congelada para uso futuro. A sequência polinucleotídica de tais anticorpos pode ser usada para manipulação genética para gerar as moléculas monoespecíficas ou multiespecíficas (por exemplo, biespecíficas, triespecíficas e tetraespecíficas) da invenção bem como uma afinidade otimizada, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado e/ou um anticorpo caninizado, para melhorar a afinidade ou outras características do anticorpo como detalhado abaixo.
[00146] Os anticorpos e as Moléculas de Ligação da presente invenção ligam epítopos por meio de seus Domínios de Ligação de uma maneira “imunoespecífica”. Como aqui usado, diz-se que uma molécula se liga a um epítopo de outra molécula de uma maneira imunoespecífica (ou “imunoespecificamente”) se ela se liga ou se associa mais frequentemente, mais rapidamente, com maior duração e/ou com maior afinidade com o epítopo em relação a epítopos alternativos. Por exemplo, um anticorpo que se liga imunoespecificamente a um epítopo viral é um anticorpo que que se liga a este epítopo viral com maior afinidade, avidez, mais prontamente e/ou com maior duração do que ele se liga imunoespecificamente a outros epítopos virais ou epítopos não virais. Também é entendido lendo essa definição que, por exemplo, um anticorpo (ou porção ou epítopo) que se liga imunoespecificamente a um primeiro alvo pode ou não se ligar especificamente ou preferencialmente a um segundo alvo. Como tal, “ligação imunoespecífica” não necessariamente requer (embora possa incluir) ligação exclusiva. Geralmente, mas não necessariamente, a referência à ligação significa ligação “imunoespecífica”. Anticorpos naturais são capazes de se ligar a apenas uma espécie de epítopo (isto é, eles são “monoespecíficos”), embora eles possam se ligar imunoespecificamente a múltiplas cópias daquela espécie (isto é, que exibem “bivalência” ou “multivalência”). Diz-se que duas moléculas são capazes de se ligar uma à outra de uma maneira “fisioespecífica”, se essa ligação exibe a especificidade com que os receptores se ligam aos seus respectivos ligantes.
[00147] As últimas décadas têm observado um renascimento do interesse no potencial terapêutico de anticorpos, e os anticorpos se tornaram uma das principais classes de fármacos derivados da biotecnologia (Chan, C.E. et al. (2009) “The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases”, Singapore Med. J. 50(7):663-666). Mais de 200 fármacos com base em anticorpos foram aprovados para o uso ou estão em desenvolvimento.
1. ATRIBUTOS GERAIS ESTRUTURAIS DE ANTICORPOS
[00148] A unidade estrutural básica de imunoglobulinas de ocorrência natural (por exemplo, IgG) é um tetrâmero composto por duas “Cadeias Leves” mais curtas complexadas com duas “Cadeias Pesadas” mais longas e é usualmente expressado como uma glicoproteína de cerca de
150.000 Da. Cada cadeia é composta por uma porção terminal amino (“N-terminal”) que compreende um “Domínio Variável” e uma porção terminal carbóxi (“C-terminal”) que compreende pelo menos um “Domínio Constante”. Uma Cadeia leve de IgG é composta por um único “Domínio Variável de Cadeia Leve” (“VL”) e um único “Domínio Constante de Cadeia Leve” (“CL”). Assim, a estrutura das cadeias leves de uma molécula IgG é n- VL-CL-c (onde n e c representam, respectivamente, o N- terminal e o C-terminal do polipeptídeo). Uma Cadeia Pesada de IgG é composta por um único “Domínio Variável de Cadeia Pesada” (“VH”), três “Domínios Constantes de Cadeia Pesada” (“CH1”, “CH2” e “CH3”) e uma Região de “Dobradiça” (“H”), localizada entre os Domínios CH1 e CH2. Assim, a estrutura de uma cadeia pesada de IgG é n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c (onde n e c representam, respectivamente, o N-terminal e o C-terminal do polipeptídeo). A capacidade de um anticorpo intacto não modificado (por exemplo, um anticorpo IgG) para se ligar a um epítopo de um antígeno depende da presença e sequências dos domínios variáveis. A menos que especificamente observado, a ordem dos domínios das moléculas de proteína aqui descrita é na direção “N-terminal para C-terminal”. (A) DOMÍNIOS CONSTANTES (I) DOMÍNIO CONSTANTE DE CADEIA LEVE
[00149] Um Domínio CL preferido é um Domínio CL Kappa de IgG humana. A sequência de aminoácidos de um Domínio CL Kappa humano exemplificativa é (SEQ ID NO: 1):
RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC
[00150] Alternativamente, um Domínio CL exemplificativo é um Domínio CL Lambda de IgG humana. A sequência de aminoácidos de um Domínio CL Lambda humano exemplificativa é (SEQ ID NO: 2):
QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA GVETTPSKQS NNKYAASSIL SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP
TECS (II) DOMÍNIOS CH1 DE CADEIA PESADA
[00151] Os Domínios CH1 das duas Cadeias Pesadas de um complexo de anticorpos com a região constante “CL” de Cadeia leve do anticorpo e estão ligados aos Domínios CH2 de Cadeias Pesadas por meio de um Domínio de Dobradiça intermediário.
[00152] Um Domínio CH1 exemplificativo é um Domínio CH1 de IgG1 humana. A sequência de aminoácidos de um Domínio CH1 de IgG1 humana exemplificativa é (SEQ ID NO: 3):
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRV
[00153] Um Domínio CH1 exemplificativo é um Domínio CH1 de IgG2 humana. A sequência de aminoácidos de um Domínio CH1 de IgG2 humana exemplificativa é (SEQ ID NO: 4):
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTV
[00154] Um Domínio CH1 exemplificativo é um Domínio CH1 de IgG3 humana. A sequência de aminoácidos de um Domínio CH1 de IgG3 humana exemplificativa é (SEQ ID NO: 5):
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YTCNVNHKPS NTKVDKRV
[00155] Um Domínio CH1 exemplificativo é um Domínio CH1 de IgG4 humana. A sequência de aminoácidos de um Domínio CH1 de IgG4 humana exemplificativa é (SEQ ID NO: 6):
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRV (B) REGIÕES DE DOBRADIÇA DE CADEIA PESADA
[00156] Um Domínio de Dobradiça exemplificativo é um Domínio de Dobradiça de IgG1 humana. A sequência de aminoácidos de um Domínio de Dobradiça de IgG1 humana exemplificativa é (SEQ ID NO: 7): EPKSCDKTHTCPPCP.
[00157] Outro Domínio de Dobradiça exemplificativo é um Domínio de Dobradiça de IgG2 humana. A sequência de aminoácidos de um Domínio de Dobradiça de IgG2 humana exemplificativa é (SEQ ID NO: 8): ERKCCVECPPCP.
[00158] Outro Domínio de Dobradiça exemplificativo é um Domínio de Dobradiça de IgG3 humana. A sequência de aminoácidos de um Domínio de Dobradiça de IgG2 humana exemplificativa é (SEQ ID NO: 9):
ELKTPLGDTT HTCPRCPEPK SCDTPPPCPR CPEPKSCDTP PPCPRCPEPK SCDTPPPCPR CP.
[00159] Outro Domínio de Dobradiça exemplificativo é um Domínio de Dobradiça de IgG4 humana. A sequência de aminoácidos de um Domínio de Dobradiça de IgG4 humana exemplificativa é (SEQ ID NO: 10): ESKYGPPCPSCP. Como aqui descrito, um Domínio de Dobradiça de IgG4 pode compreender uma mutação estabilizante tal como a substituição de S228P. A sequência de aminoácidos de um Domínio de Dobradiça de IgG4 humana estabilizado com S228P exemplificativa é (SEQ ID NO: 11): ESKYGPPCPPCP. (C) DOMÍNIOS CH2 E CH3 DE CADEIA PESADA
[00160] Os Domínios CH2 e CH3 das duas cadeias pesadas interagem para formar o “Domínio Fc” de anticorpos IgG que é reconhecido pelos receptores celulares Fc,
incluindo, mas não limitados a Receptores gama Fc (FcγRs). Como aqui usado, o termo “Região Fc” é usado para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada de IgG. Uma porção de uma Região Fc (incluindo uma porção que abrange uma Região Fc inteira) é referida aqui como um “Domínio Fc”. Diz-se que uma Região Fc tem um isotipo, classe ou subclasse de IgG particular se sua sequência de aminoácidos for mais homóloga àquele isotipo em relação a outros isotipos de IgG. Além de seus usos conhecidos em diagnósticos, os anticorpos mostraram ser úteis como agentes terapêuticos.
[00161] A sequência de aminoácidos do Domínio CH2-CH3 de uma IgG1 humana exemplificativa é (SEQ ID NO: 12): 231 240 250 260 270 280
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 340 350 360 370 380
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 390 400 410 420 430
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 440 447
ALHNHYTQKS LSLSPGX
[00162] conforme numerado pelo índice da EU como apresentado em Kabat, em que X é lisina (K) ou está ausente.
[00163] A sequência de aminoácidos do Domínio CH2-CH3 de uma IgG2 humana exemplificativa é (SEQ ID NO: 13): 231 240 250 260 270 280 APPVA-GPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFNWYVD 290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQFNSTF RVVSVLTVVH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPA
PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDISVE 390 400 410 420 430
WESNGQPENN YKTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 440 447
ALHNHYTQKS LSLSPGX
[00164] conforme numerado pelo índice da EU como apresentado em Kabat, em que X é lisina (K) ou está ausente.
[00165] A sequência de aminoácidos do Domínio CH2-CH3 de uma IgG3 humana exemplificativa é (SEQ ID NO: 14): 231 240 250 260 270 280
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFKWYVD 290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQYNSTF RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 340 350 360 370 380
PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 390 400 410 420 430
WESSGQPENN YNTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NIFSCSVMHE 440 447
ALHNRFTQKS LSLSPGX
[00166] conforme numerado pelo índice da EU como apresentado em Kabat, em que X é lisina (K) ou está ausente.
[00167] A sequência de aminoácidos do Domínio CH2-CH3 de uma IgG4 humana exemplificativa é (SEQ ID NO: 15): 231 240 250 260 270 280
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD 290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS 340 350 360 370 380
SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE 440 447
ALHNHYTQKS LSLSLGX
[00168] conforme numerado pelo índice da EU como apresentado em Kabat, em que X é lisina (K) ou está ausente.
[00169] Ao longo da presente especificação, a numeração dos resíduos na região constante de uma cadeia pesada de IgG é a do índice da EU como em Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service, NH1, MD (1991) (“Kabat”), expressamente incorporado aqui por referência. O termo “índice da EU como em Kabat” se refere à numeração dos domínios constantes de anticorpo IgG1 humano da EU. Os aminoácidos dos domínios variáveis das cadeias leves e pesadas maduras de imunoglobulinas também são designados pela posição de um aminoácido na cadeia. Kabat descreveu numerosas sequências de aminoácidos para anticorpos, identificou uma sequência consenso de aminoácidos para cada subgrupo e atribuiu um número de resíduo para cada aminoácido, e as CDRs são identificadas conforme definido por Kabat (será entendido que a CDRH1 como definida por Chothia, C. & Lesk, A. M. ((1987) “Canonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins”, J. Mol. Biol. 196:901 a 917) começa com cinco resíduos anteriormente). O esquema de numeração de Kabat é extensível aos anticorpos não incluídos em seu compêndio alinhando-se o anticorpo em questão com uma das sequências consenso em Kabat por referência a aminoácidos conservados. Este método para atribuir números de resíduos se tornou padrão no campo e prontamente identifica aminoácidos em posições equivalentes em diferentes anticorpos, incluindo variantes quiméricos ou humanizados. Por exemplo, um aminoácido na posição 50 de uma cadeia leve de anticorpo humano ocupa a posição equivalente a um aminoácido na posição 50 de uma cadeia leve de anticorpo de camundongo.
[00170] Polimorfismos foram observados em várias posições diferentes dentro das regiões constantes do anticorpo (por exemplo, posições Fc, incluindo, mas não limitadas às posições 270, 272, 312, 315, 356 e 358 conforme numerado pelo índice da EU como apresentado em Kabat) e portanto, podem existir leves diferenças entre a sequência apresentada e as sequências na técnica anterior. As formas polimórficas de imunoglobulinas humanas foram bem caracterizadas. No presente, alótipos de 18 Gm são conhecidos: G1m (1, 2, 3, 17) ou G1m (a, x, f, z), G2m (23) ou G2m (n), G3m (5, 6, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 21, 24, 26, 27, 28) ou G3m (b1, c3, b3, b0, b3, b4, s, t, g1, c5, u, v, g5) (Lefranc et al., “The Human IgG Subclasses: Molecular Analysis Of Structure, Function And Regulation.” Pergamon, Oxford, pp. 43 a 78 (1990); Lefranc, G. et al., 1979, Hum. Genet.: 50, 199 a 211). É especificamente considerado que os anticorpos da presente invenção podem incorporar qualquer alótipo, isoalótipo ou haplótipo de qualquer gene de imunoglobulina e não estão limitados ao alótipo, isoalótipo ou haplótipo das sequências aqui fornecidas. Além disso, em alguns sistemas de expressão, o resíduo de aminoácido C- terminal (em negrito acima) do Domínio CH3 pode ser pós- traducionalmente removido. Consequentemente, o resíduo C- terminal do Domínio CH3 é um resíduo opcional de aminoácido nas Moléculas de Ligação CD16 x DA da invenção.
Especificamente abrangidas pela presente invenção estão Moléculas de Ligação CD16 x DA sem o resíduo C-terminal do Domínio CH3. Também especificamente abrangido pela presente invenção estão tais construtos compreendendo o resíduo de lisina C-terminal do Domínio CH3. (D) DOMÍNIOS VARIÁVEIS
[00171] Os domínios variáveis de uma molécula IgG consistem de três “regiões determinantes de complementaridade” (“CDRs”), que contêm os resíduos de aminoácido do anticorpo que estarão em contato com o epítopo, bem como segmentos não-CDR de intervenção, referidos como “regiões de estrutura” (“FRs”), que, em geral, mantêm a estrutura e determinam o posicionamento dos loops da CDR de modo a permitir esse contato (embora certos resíduos de estrutura também possam contatar o epítopo). Assim, os Domínios VL e VH têm a estrutura n-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3- CDR3-FR4-c. As sequências de aminoácidos das CDRs determinam se um anticorpo será capaz de se ligar a um epítopo particular. A interação de uma cadeia leve de anticorpo com uma cadeia pesada de anticorpo e, em particular, a interação de seus Domínios VL e VH, forma um sítio de ligação ao epítopo do anticorpo.
[00172] Os polipeptídeos que são (ou podem servir como) a primeira, segunda e terceira CDR da Cadeia leve de um anticorpo são aqui respectivamente designados como: Domínio de CDRL1, Domínio de CDRL2 e Domínio de CDRL3. Similarmente, os polipeptídeos que são (ou podem servir como) a primeira, segunda e terceira CDR da Cadeia Pesada de um anticorpo são aqui respectivamente designados como: Domínio de CDRH1, Domínio de CDRH2 e Domínio de CDRH3. Assim, os termos Domínio de CDRL1, Domínio de CDRL2, Domínio de CDRL3, Domínio de CDRH1, Domínio de CDRH2 e Domínio de CDRH3 são dirigidos a polipeptídeos que, quando incorporados em uma proteína, fazem com que essa proteína seja capaz de se ligar a um epítopo específico, independentemente de se essa proteína é um anticorpo tendo cadeias leves e pesadas ou é um diacorpo ou uma molécula de ligação de cadeia simples (por exemplo, um scFv, um BiTe, etc.) ou é outro tipo de proteína.
[00173] O termo “Domínio de Ligação ao Epítopo” denota um fragmento ou porção de uma molécula de ligação (ou um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de tal fragmento ou porção) que contribui para a capacidade da molécula de ligação se ligar imunoespecificamente a um epítopo. Um Domínio de Ligação ao Epítopo pode conter um Domínio VL ou VH de um anticorpo ou qualquer 1, 2, 3, 4 ou 5 dos Domínios da CDR de um anticorpo ou pode conter todos os 6 dos Domínios da CDR de um anticorpo e, embora capaz de se ligar imunoespecificamente esse epítopo, pode exibir uma imunoespecificidade, afinidade ou seletividade em relação a este epítopo que difere daquela do anticorpo. Um Domínio de Ligação ao Epítopo pode conter apenas parte de uma CDR, isto é, o subconjunto de resíduos da CDR necessários para a ligação, denominados SDRs (Kim, J.H. et al. (2012) “Humanization By CDR Grafting And Specificity-Determining Residue Grafting”, Methods Mol. Biol. 907:237 a 245; Kim, K.S. et al. (2010) “Construction Of A Humanized Antibody To Hepatitis B Surface Antigen By Specificity-Determining Residues (SDR)-Grafting And De-Immunization”, Biochem. Biophys. Res. Commun. 396(2):231 a 237; Kashmiri, S.V. et al. (2005) “SDR Grafting – A New Approach To Antibody
Humanization”, Methods 36(1):25 a 34; Gonzales, N.R. et al. (2004) “SDR Grafting Of A Murine Antibody Using Multiple Human Germline Templates To Minimize Its Immunogenicity”, Mol. Immunol. 41:863 a 872). Preferivelmente, entretanto, um Domínio de Ligação ao Epítopo conterá todos os 6 dos Domínios da CDR desse anticorpo. Um Domínio de Ligação ao Epítopo pode ser uma cadeia polipeptídica única (por exemplo, um scFv) ou pode compreender duas ou mais cadeias polipeptídicas, que podem ter um terminal amino e um terminal carbóxi (por exemplo, um diacorpo, um fragmento Fab, um fragmento Fab2, etc.) e que podem ser covalentemente ligados um ao outro por meio de uma ligação dissulfeto.
2. HUMANIZAÇÃO DE ANTICORPOS
[00174] A invenção também particularmente abrange Moléculas de Ligação que compreendem um Domínio VL ou VH de um anticorpo, e, preferivelmente, um Domínio VL e um VH de um anticorpo. Preferivelmente, este anticorpo é um anticorpo humanizado. Anticorpos monoclonais são tipicamente preparados em espécies não humanas, tais como camundongo ou coelho. Os Domínios Variáveis e/ou Constantes destes anticorpos podem ser reconhecidos como imunógenos, provocando assim uma resposta imune contra eles. Tais moléculas podem, entretanto, serem “humanizadas” introduzindo-se uma ou mais substituições de aminoácidos de modo a tornar esses anticorpos mais semelhantes aos anticorpos produzidos por humanos, desse modo reduzindo ou eliminando sua imunogenicidade. O termo anticorpo “humanizado” se refere a uma molécula quimérica, geralmente preparada usando técnicas recombinantes, tendo um sítio de ligação ao epítopo de uma imunoglobulina de uma espécie não humana e uma estrutura remanescente da molécula de imunoglobulina que tem como base a estrutura e/ou sequência de uma imunoglobulina humana.
A sequência polinucleotídica dos domínios variáveis destes anticorpos pode ser usada para a manipulação genética para gerar esses derivados e para melhorar a afinidade ou outras características destes anticorpos.
A aplicação deste método a vários anticorpos foi relatada por LoBuglio, A.F. et al. (1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response”, Proc.
Natl.
Acad.
Sci. (U.S.A.) 86:4220 a 4224; Sato, K. et al. (1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy”, Nature 332:323 a 327; Verhoeyen, M. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity”, Science 239:1534 a 1536; Kettleborough, C.
A. et al. (1991) “Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation”, Protein Engineering 4:773 a 3783; Maeda, H. et al. (1991) “Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity”, Human Antibodies Hybridoma 2:124 a 134; Gorman, S.
D. et al. (1991) “Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody”, Proc.
Natl.
Acad.
Sci. (U.S.A.) 88:4181 a 4185; Tempest, P.R. et al. (1991) “Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo”, Bio/Technology 9:266 a 271; Co, M.
S. et al. (1991) “Humanized Antibodies For Antiviral Therapy”, Proc.
Natl.
Acad.
Sci. (U.S.A.) 88:2869 a 2873; Carter, P. et al. (1992) “Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy”, Proc.
Natl.
Acad.
Sci. (U.S.A.) 89:4285 a 4289; and Co, M.S. et al. (1992) “Chimeric And Humanized Antibodies
With Specificity For The CD33 Antigen”, J. Immunol. 148:1149 a 1154. Em algumas modalidades, os anticorpos humanizados preservam todas as sequências CDR (por exemplo, um anticorpo de camundongo humanizado que contém todas as seis CDRs dos anticorpos do camundongo). Em outras modalidades, os anticorpos humanizados têm uma ou mais CDRs (uma, duas, três, quatro, cinco e/ou seis) que diferem da sequência em relação ao anticorpo original.
[00175] O princípio geral na humanização de um anticorpo envolve manter a sequência básica do Domínio de Ligação ao Epítopo do anticorpo, enquanto troca o restante não humano do anticorpo por sequências de anticorpos humanos. Existem quatro etapas gerais para humanizar um anticorpo monoclonal. Essas são: (1) determinar a sequência nucleotídica e de aminoácidos prognosticada dos domínios variáveis leves e pesados do anticorpo de partida (2) projetar o anticorpo humanizado ou anticorpo caninizado, isto é, decidir qual região de estrutura do anticorpo usar durante o processo de humanização ou canonização (3) as metodologias/técnicas de humanização ou caninização reais e (4) a transfecção e expressão do anticorpo humanizado. Ver, por exemplo, Patentes U.S. Nos 4.816.567; 5.807.715;
5.866.692; e 6.331.415.
[00176] Várias moléculas de anticorpo humanizado compreendendo um Domínio de Ligação ao Epítopo derivadas de uma imunoglobulina não humana foram descritas, incluindo anticorpos quiméricos tendo Domínio Variável de roedor ou de roedor modificado e suas regiões determinantes de complementaridade (CDRs) associadas fundidas aos domínios constantes humanos (ver, por exemplo, Winter et al. (1991)
“Man-made Antibodies”, Nature 349:293 a 299; Lobuglio et al. (1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response”, Proc.
Natl.
Acad.
Sci. (U.S.A.) 86:4220 a 4224 (1989), Shaw et al. (1987) “Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen”, J.
Immunol. 138:4534 a 4538, and Brown et al. (1987) “Tumor- Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody”, Cancer Res. 47:3577 a 3583). Outras referências descrevem as CDRs de roedor enxertadas em uma região de estrutura de suporte humana (FR) antes da fusão com um Domínio Constante de anticorpo humano apropriado (ver, por exemplo, Riechmann, L. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy”, Nature 332:323 a 327; Verhoeyen, M. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity”, Science 239:1534 a 1536; and Jones et al. (1986) “Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse”, Nature 321:522 a 525). Outra referência descreve CDRs de roedor sustentadas por regiões de estrutura de roedor folheadas recombinantementes.
Ver, por exemplo, Publicação de Patente Europeia No 519.596. Essas moléculas “humanizadas” são projetadas para minimizar resposta imunológica indesejada contra moléculas de anticorpos anti-humanos de roedor, que limitam a duração e efetividade de aplicações terapêuticas daquelas porções em receptores humanos.
Outros métodos de humanização de anticorpos que também podem ser utilizados são divulgados por Daugherty et al. (1991) ““Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against
The CD18 Component Of Leukocyte Integrins”, Nucl. Acids Res. 19:2471 a 2476 e nas Patentes U.S. Nos 6.180.377; 6.054.297;
5.997.867; e 5.866.692. A invenção particularmente abrange moléculas de ligação (incluindo anticorpos e diacorpos) que compreendem um Domínio VL e/ou VH de um anticorpo “humanizado”.
[00177] Não obstante tais sucessos, a produção de diacorpos não monoespecíficos estável, heterodiméricos funcionais otimizada para uso terapêutico pode ser melhorada ainda mais pela consideração cuidadosa e colocação dos Domínios utilizados nas cadeias polipeptídicas. A presente invenção é, portanto, dirigida à provisão de polipeptídeos específicos que são particularmente projetados para formar, por meio de ligação covalente, diacorpos heterodiméricos e diacorpos Fc heterodiméricos estáveis e terapeuticamente úteis que são capazes de se ligar simultaneamente a CD16 e a um Antígeno de Doença. B. ANTICORPOS BIESPECÍFICOS
[00178] Como indicado acima, os anticorpos naturais são capazes de se ligar a apenas uma espécie de epítopo, embora eles possam se ligar a múltiplas cópias daquela espécie. A capacidade de um anticorpo se ligar a um epítopo de um antígeno depende da presença e sequência de aminoácidos dos Domínios VL e VH do anticorpo. A interação de uma Cadeia leve e Cadeia Pesada do anticorpo e, em particular, a interação de seus Domínios VL e VH forma um dos dois Domínios de Ligação ao Epítopo de um anticorpo natural, tal como um IgG. Anticorpos naturais são capazes de se ligar a apenas uma espécie de epítopo (isto é, eles são monoespecíficos), embora eles possam se ligar a múltiplas cópias daquela espécie (isto é, que exibem bivalência ou multivalência).
[00179] A funcionalidade de anticorpos pode ser aprimorada gerando-se moléculas com base em anticorpos multiespecíficas que podem simultaneamente se ligar a dois antígenos separados e distintos (ou diferentes epítopos do mesmo antígeno) e/ou gerando-se molécula com base em anticorpo tendo valência maior (isto é, mais que dois Domínios de Ligação) para o mesmo epítopo e/ou antígeno.
[00180] De modo a fornecer moléculas tendo maior capacidade que os anticorpos naturais, uma ampla variedade de formatos de anticorpos biespecíficos recombinantes foram desenvolvidos (ver, por exemplo, Publicação PCT Nos WO 2008/003116, WO 2009/132876, WO 2008/003103, WO 2007/146968, WO 2009/018386, WO 2012/009544, WO 2013/070565). A maioria dessas abordagens usa peptídeos conectores para fundir um domínio de ligação adicional (e.g. um scFv, VL, VH, etc.) em ou dentro do núcleo do anticorpo (IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM) ou para fundir múltiplas porções de ligação ao anticorpo umas às outras (e.g. dois fragmentos Fab ou scFv). Formatos alternativos usam peptídeos conectores para fundir uma proteína de ligação (por exemplo, um scFv, VL, VH, etc.) a um domínio de dimerização tal como o Domínio CH2-CH3 ou polipeptídeos alternativos (WO 2005/070966, WO 2006/107786A WO 2006/107617A, WO 2007/046893). Tipicamente, essas abordagens envolvem compromissos e trocas. Por exemplo, Publicações PCT Nos WO 2013/174873, WO 2011/133886 e WO 2010/136172 divulgam que o uso de conectores pode causar problemas em contextos terapêuticos e ensina um anticorpo triespecífico em que os Domínios CL e CH1 são alternados de suas respectivas posições naturais e os Domínios VL e VH foram diversificados (WO 2008/027236; WO 2010/108127) para permitir que eles se liguem a mais de um antígeno.
Assim, as moléculas divulgadas nestes documentos trocam especificidade de ligação pela capacidade para se ligar a espécies de antígenos adicionais.
As Publicações PCT Nos WO 2013/163427 e WO 2013/119903 divulgam modificações no Domínio CH2 para conter um aduto de proteína de fusão compreendendo um domínio de ligação.
O documento observa que o Domínio CH2 provavelmente desempenha apenas um papel mínimo na mediação da função efetora.
Publicações PCT Nos WO 2010/028797, WO2010028796 e WO 2010/028795 divulgam anticorpos recombinantes cujas Regiões Fc foram substituídas por Domínios VL e VH adicionais, de modo a formar moléculas de ligação trivalentes.
Publicações PCT Nos WO 2003/025018 e WO2003012069 divulgam diacorpos recombinantes cujas cadeias individuais contêm domínios scFv.
As Publicações PCT Nos WO 2013/006544 divulga moléculas Fab multivalentes que são sintetizadas como uma única cadeia polipeptídica e depois submetidas à proteólise para produzir estruturas heterodiméricas.
Assim, as moléculas divulgadas nestes documentos trocam todas ou algumas das capacidades de mediar a função efetora pela capacidade para se ligar a espécies de antígenos adicionais.
As Publicações PCT Nos WO 2014/022540, WO 2013/003652, WO 2012/162583, WO 2012/156430, WO 2011/086091, WO 2008/024188, WO 2007/024715, WO 2007/075270, WO 1998/002463, WO 1992/022583 e WO 1991/003493 divulgam a adição de Domínios de Ligação ou grupos funcionais adicionais a um anticorpo ou uma porção de anticorpo (por exemplo, adicionar um diacorpo à cadeia leve do anticorpo ou adicionar
Domínios VL e VH adicionais às cadeias leves e pesadas do anticorpo ou adicionar uma proteína de fusão heteróloga ou encadear múltiplos Domínios Fab um ao outro). Assim, as moléculas divulgadas nestes documentos trocam estruturas de anticorpos nativos pela capacidade para se ligar a espécies de antígenos adicionais. C. RECEPTORES DE ANTÍGENO QUIMÉRICOS
[00181] As moléculas de ligação da presente invenção podem ser Receptores de Antígenos Quiméricos (“CARs”) que compreendem um fragmento variável de cadeia única (scFv) capaz de se ligar a CD16 e um Antígeno de Doença. Como indicado acima, scFvs são feitos pela ligação de Domínios Variáveis de Cadeia Leve e Pesada juntos por meio de um peptídeo de ligação curto. CARs de primeira geração tipicamente tinham o domínio intracelular da cadeia CD3 ζ, que é o principal transmissor de sinais de TCRs endógenos. CARs de segunda geração possuem domínios de sinalização intracelular adicionais de vários receptores de proteínas coestimuladores (por exemplo, CD28, 41BB, ICOS, etc.) para a cauda citoplásmica da CAR de modo a fornecer sinais adicionais às células T. CARs de terceira geração combinam múltiplos domínios de sinalização, tais como CD3z-CD28-41BB ou CD3z-CD28-OX40, de modo a aumentar ainda mais a potência (Tettamanti, S. et al. (2013) “Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric Antigen Receptor”, Br. J. Haematol. 161:389 a 401; Gill, S. et al. (2014) “Efficacy Against Human Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of Normal Hematopoiesis In A Mouse Model Using Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells”, Blood 123(15): 2343 a 2354;
Mardiros, A. et al. (2013) “T Cells Expressing CD123-Specific Chimeric Antigen Receptors Exhibit Specific Cytolytic Effector Functions And Antitumor Effects Against Human Acute Myeloid Leukemia”, Blood 122:3138 a 3148; Pizzitola, I. et al. (2014) “Chimeric Antigen Receptors Against CD33/CD123 Antigens Efficiently Target Primary Acute Myeloid Leukemia Cells in vivo”, Leukemia doi:10.1038/leu.2014.62.
[00182] O domínio intracelular das CARs da presente invenção é preferivelmente selecionado do domínio intracelular de qualquer um de: 41BB-CD3ζ, b2c-CD3ζ, CD28, CD28-4-1BB-CD3ζ, CD28-CD3ζ, CD28-FcεRIγ, CD28mut-CD3ζ, CD28- OX40-CD3ζ, CD28-OX40-CD3ζ, CD3ζ, CD4-CD3ζ, CD4-FcεRIγ, CD8- CD3ζ, FcεRIγ, FcεRIγCAIX, Heregulin-CD3ζ, IL-13-CD3ζ ou Ly49H-CD3ζ (Tettamanti, S. et al. (2013) “Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric Antigen Receptor”, Br. J. Haematol. 161:389 a 401; Gill, S. et al. (2014) “Efficacy Against Human Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of Normal Hematopoiesis In A Mouse Model Using Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells”, Blood 123(15): 2343 a 2354; Mardiros, A. et al. (2013) “T Cells Expressing CD123-Specific Chimeric Antigen Receptors Exhibit Specific Cytolytic Effector Functions And Antitumor Effects Against Human Acute Myeloid Leukemia”, Blood 122:3138 a 3148; Pizzitola, I. et al. (2014) “Chimeric Antigen Receptors Against CD33/CD123 Antigens Efficiently Target Primary Acute Myeloid Leukemia Cells in vivo”, Leukemia doi:10.1038/leu.2014.62). II. DIACORPOS BIESPECÍFICOS
[00183] A técnica tem adicionalmente observado a capacidade de produzir diacorpos que se diferem dos anticorpos naturais em serem capazes de se ligar a duas ou mais espécies diferentes de epítopo (isto é, que exibem biespecificidade ou multiespecificidade além de bivalência ou multivalência) (ver, por exemplo, Holliger et al. (1993) “’Diabodies’: Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments”, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448; US 2004/0058400 (Hollinger et al.); US 2004/0220388 (Mertens et al.); Alt et al. (1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94; Lu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity”, J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672; WO 02/02781 (Mertens et al.); Olafsen, T. et al. (2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications”, Protein Eng Des Sel. 17(1):21-27; Wu, A. et al. (2001) “Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange”, Protein Engineering 14(2):1025-1033; Asano et al. (2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain”, Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System”, Protein Eng. 13(8):583-588; Baeuerle, P.A. et al. (2009) “Bispecific T cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy”, Cancer Res. 69(12):4941-4944).
[00184] O projeto de um diacorpo é fundamentado na estrutura do fragmento do Domínio Variável de cadeia simples (scFv), em que os Domínios Variáveis de Cadeia Leve e
Pesada são ligados um ao outro usando um peptídeo de ligação curto. Bird et al. (1988) (“Single-Chain Antigen-Binding Proteins”, Science 242:423-426) descrevem exemplos de peptídeos de ligação que se estendem aproximadamente 3,5 nm entre o terminal carbóxi de um Domínio Variável e o terminal amino do outro Domínio Variável. Os conectores de outras sequências foram projetados e usados (Bird et al. (1988) “Single-Chain Antigen-Binding Proteins”, Science 242:423- 426). Os conectores podem, por sua vez, serem modificados para funções adicionais, tais como fixação de fármacos ou fixação a suportes sólidos. As variantes de cadeia simples podem ser produzidas recombinantemente ou sinteticamente. Para a produção sintética de scFv, um sintesizador automatizado pode ser usado. Para a produção recombinante de scFv, um plasmídeo contendo polinucleotídeo adequado que codifica o scFv pode ser introduzido em uma célula hospedeira adequada, como eucariótica, tal como células de levedura, planta, inseto ou mamíferos ou procariótica, tal como E. coli. Os polinucleotídeos que codificam o scFv de interesse podem ser feitos por manipulações de routina tais como ligação de polinucleotídeos. O scFv resultante pode ser isolado usando técnicas de purificação de proteínas padrão conhecidas na técnica.
[00185] A provisão de “diacorpos” não monoespecíficos fornece uma vantagem significativa sobre os anticorpos: a capacidade para coligar e colocalizar células que expressam diferentes epítopos. Diacorpos biespecíficos, portanto, têm ampla faixa aplicações incluindo terapia e imunodiagnóstico. A biespecificidade permite uma grande flexibilidade no projeto e engenharia do diacorpo em várias aplicações, fornecendo avidez aprimorada a antígenos multiméricos, a reticulação de diferentes antígenos e dirigidos ao alvejamento de tipos de célula específicos dependendo da presença de ambos os antígenos alvo. Devido à sua bivalência, taxas de baixa dissociação e rápida liberação da circulação (para diacorpos de pequeno tamanho, com ou abaixo de ~50 kDa), moléculas de diacorpo conhecidas na técnica também têm mostrado uso particular no campo de imagiologia tumoral (Fitzgerald et al. (1997) “Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris”, Protein Eng. 10:1221 a 1225).
[00186] A capacidade para produzir diacorpos biespecíficos tem levado o seu uso (em “trans”) para coligar duas células juntas, por exemplo, coligando receptores que estão presentes na superfície de diferentes células (por exemplo, reticulação de células T citotóxicas a células alvo, tais como células de câncer ou células infectadas por patógeno, que expressam um Antígeno de Doença) (Staerz et al. (1985) “Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells”, Nature 314:628 a 631, and Holliger et al. (1996) “Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody”, Protein Eng. 9:299 a 305; Marvin et al. (2005) “Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies”, Acta Pharmacol. Sin. 26:649 a 658; Sloan et al. (2015) “Targeting HIV Reservoir in Infected CD4 T Cells by Dual-Affinity Re-targeting Molecules (DARTs) that Bind HIV Envelope and Recruit Cytotoxic T Cells”, PLoS Pathog 11(11): e1005233. doi:10.1371/journal.ppat.1005233)). Alternativamente (ou adicionalmente), diacorpos biespecíficos (ou multiespecíficos) podem ser usados (em “cis”) para coligar moléculas, tais como receptores, etc., que estão presentes na superfície da mesma célula. A coligação de diferentes células e/ou receptores é útil para modular funções efetoras e/ou sinalização da célula imune. Moléculas multiespecíficas (por exemplo, diacorpos biespecíficos) compreendendo Domínios de Ligação ao Epítopo podem ser dirigida a uma superfície determinante de qualquer célula imune tal como CD2, CD3, CD8, CD16, TCR, NKG2D, etc., que são expressadas em linfócitos T, células Exterminadoras Naturais (NK), Células Apresentadoras de Antígeno ou outras células mononucleares ou a uma superfície determinante de uma célula B, tal como CD19, CD20, CD22, CD30, CD37, CD40 e CD74 (Moore, P.A. et al. (2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T cell Killing Of B- Cell Lymphoma”, Blood 117(17):4542 a 4551; Cheson, B.D. et al. (2008) “Monoclonal Antibody Therapy For B-Cell Non- Hodgkin’s Lymphoma”, N. Engl. J. Med. 359(6):613 a 626; Castillo, J. et al. (2008) “Newer Monoclonal Antibodies For Hematological Malignancies”, Exp. Hematol. 36(7):755 a 768). Em particular, os Domínios de Ligação ao Epítopo dirigidos a um receptor da superfície celular que estão presentes em células efetoras imunes, são úteis na geração de Moléculas de Ligação multiespecíficas capazes de mediar a morte celular redirecionada.
[00187] Em muitos estudos, a ligação do diacorpo aos determinantes da célula efetora, por exemplo, receptores Fcγ (FcγR), também foi encontrada para ativar a célula efetora (Holliger et al. (1996) “Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T cells Mediated By A Bispecific Diabody”, Protein Eng. 9:299 a 305; Holliger et al. (1999)
“Carcinoembryonic Antigen (CEA)-Specific T cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti-CEA Bispecific Fusion Proteins”, Cancer Res. 59:2909 a 2916; WO 2006/113665; WO 2008/157379; WO 2010/080538; WO 2012/018687; WO 2012/162068). Normalmente, a ativação da célula efetora é desencadeada pela ligação de um anticorpo ligado ao antígeno a uma célula efetora por meio de uma interação Domínio Fc-FcγR; assim, a este respeito, as moléculas de diacorpo podem exibir funcionalidade como Ig independente de se elas compreendem um Domínio Fc (por exemplo, como avaliado em qualquer ensaio de função efetora conhecido na técnica ou exemplificado aqui (por exemplo, ensaio ADCC)). Ao reticular as células tumorais e efetoras, o diacorpo não apenas leva a célula efetora para a proximidade de uma célula tumoral, mas leva à morte eficaz do tumor (ver por exemplo, Cao et al. (2003) “Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics”, Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171 a 197).
[00188] Entretanto, as vantagens dos diacorpos biespecíficos descritos acima têm um custo proeminente. A formação destes diacorpos não monoespecíficos requer a montagem bem-sucedida de dois ou mais polipeptídeos distintos e diferentes (isto é, essa formação requer que os diacorpos sejam formados através da heterodimerização de diferentes espécies de cadeia polipeptídica). Este fato contrasta com os diacorpos monoespecíficos, que são formados através da homodimerização de cadeias polipeptídicas idênticas. Como pelo menos dois polipeptídeos diferentes (isto é, duas espécies de polipeptídeo) devem ser fornacidas de modo a formar um diacorpo não monoespecífico e como a homodimerização de tais polipeptídeos leva a moléculas inativas (Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System”, Protein Eng. 13(8):583 a 588), a produção de tais polipeptídeos deve ser realizada em maneira tal de modo a impedir a ligação covalente entre polipeptídeos da mesma espécie (isto é, de modo a impedir a homodimerização) (Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System”, Protein Eng. 13(8):583 a 588). A técnica ensinou, portanto, a associação não covalente de tais polipeptídeos (ver, por exemplo, Olafsen et al. (2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications”, Prot. Engr. Des. Sel. 17:21 a 27; Asano et al. (2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain”, Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System”, Protein Eng. 13(8):583 a 588; Lu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity”, J. Biol. Chem. 280(20):19665 a 19672).
[00189] Entretanto, a técnica tem reconhecido que os compostos de diacorpos biespecíficos por polipeptídeos não covalentemente associados são instáveis e prontamente se dissociam em monômeros de cadeia polipeptídica única não funcionais (ver, por exemplo, Lu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The
Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity”, J. Biol. Chem. 280(20):19665 a 19672).
[00190] Em face deste desafio, a técnica tem progredido no desenvolvimento de diacorpos não monoespecíficos heterodiméricos covalentemente ligados estáveis, denominados diacorpos DART®, ver, por exemplo, Sloan, D.D. et al. (2015) “Targeting HIV Reservoir in Infected CD4 T Cells by Dual-Affinity Re-targeting Molecules (DARTs) that Bind HIV Envelope and Recruit Cytotoxic T Cells”, PLoS Pathog. 11(11):e1005233. doi:
10.1371/journal.ppat.1005233; Al Hussaini, M. et al. (2015) “Targeting CD123 In AML Using A T-Cell Directed Dual-Affinity Re-Targeting (DART®) Platform”, Blood pii: blood-2014-05- 575704; Chichili, G.R. et al. (2015) “A CD3xCD123 Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia: Preclinical Activity And Safety In Nonhuman Primates”, Sci. Transl. Med. 7(289):289ra82; Johnson, S. et al. (2010) “Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And In Vivo B-Cell Depletion”, J. Molec. Biol. 399(3):436 a 449; Veri, M.C. et al. (2010) “Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIB (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold”, Arthritis Rheum. 62(7):1933 a 1943; Moore, P.A. et al. (2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T cell Killing Of B- Cell Lymphoma”, Blood 117(17):4542 a 4551; Patentes US Nos
8.044.180; 8.133.982; 8.187.593; 8.193.318; 8.530.627;
8.669.349; 8.778.339; 8.784.808; 8.795.667; 8.802.091;
8.802.093; 8.946.387; 8.968.730; e 8.993.730; Publicações de Patentes US Nos 2009/0060910; 2010/0174053; 2011/0081347; 2011/0097323; 2011/0117089; 2012/0009186; 2012/0034221; 2012/0141476; 2012/0294796; 2013/0149236; 2013/0295121; 2014/0017237; e 2014/0099318; Documentos de Patente Europeia No EP 1868650; EP 2158221; EP 2247304; EP 2252631; EP 2282770; EP 2328934; EP 2376109; EP 2542256; EP 2601216; EP 2714079; EP 2714733; EP 2786762; EP 2839842; EP 2840091; e Publicação PCT Nos WO 2006/113665; WO 2008/157379; WO 2010/027797; WO 2010/033279; WO 2010/080538; WO 2011/109400; WO 2012/018687; WO 2012/162067; WO 2012/162068; WO 2014/159940; WO 2015/021089; WO 2015/026892; e WO 2015/026894). Esses diacorpos compreendem dois ou mais polipeptídeos covalentemente complexados e envolvem engenharia de um ou mais resíduos de cisteína em cada uma das espécies de polipeptídeo utilizadas que permitem ligações dissulfeto para formar e, desse modo, ligar covalentemente um ou mais pares destas cadeias polipeptídicas uns aos outros. Por exemplo, a adição de um resíduo de cisteína ao C-terminal destes construtos demonstrou possibilitar a união dissulfeto entre as cadeias polipeptídicas envolvidas, estabilizando o diacorpo resultante sem interferir com as características de ligação do diacorpo.
[00191] O diacorpo DART® mais simples compreende duas cadeias polipeptídicas cada uma compreendendo três Domínios (Figuras 1A-1B). A primeira cadeia polipeptídica compreende: (i) um Domínio que compreende uma região de ligação de um Domínio variável de cadeia leve a uma primeira imunoglobulina (VL1), (ii) um segundo Domínio que compreende uma região de ligação de um Domínio variável de cadeia pesada de uma segunda imunoglobulina (VH2) e (iii) um terceiro Domínio que serve para promover a heterodimerização (um “Domínio Promotor Heterodímero”) com a segunda cadeia polipeptídica e ligar covalentemente o primeiro polipeptídeo à segunda cadeia polipeptídica do diacorpo.
A segunda cadeia polipeptídica contém um primeiro Domínio complementar (um Domínio VL2), um segundo Domínio complementar (um VH1 Domínio) e um terceiro Domínio que complexa com o terceiro Domínio da primeira cadeia polipeptídica de modo a promover a heterodimerização (um “Domínio Promotor Heterodímero”) e a ligação covalente com a primeira cadeia polipeptídica.
Tais moléculas são estáveis, potentes e têm a capacidade para se ligar simultaneamente a dois ou mais antígenos.
Em uma modalidade, os terceiros Domínios das primeira e segunda cadeias polipeptídicas contêm um resíduo de cisteína (“©”), que serve para ligar os polipeptídeos juntos por meio de uma ligação dissulfeto.
O terceiro Domínio de uma ou ambas as cadeias polipeptídicas podem adicionalmente possuir a sequência de um Domínio CH2-CH3, de modo que a complexação dos polipeptídeos do diacorpo forma um Domínio Fc que é capaz de se ligar ao receptor Fc das células (tais como linfócitos B, células dendríticas, células exterminadoras naturais, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos e mastócitos). Muitas variações de tais moléculas foram descritas (ver, por exemplo, Publicações de Patentes dos Estados Unidos Nos 2013-0295121; 2010-0174053; 2007-0004909; 2009-0060910; Publicação de Patente Europeia No EP 2714079; EP 2601216; EP 2376109; EP 2158221 e Publicações PCT Nos WO 2012/162068; WO 2012/018687; WO 2010/080538; WO 2006/113665) e são aqui fornecidas.
Muitas variações de tais moléculas foram descritas (ver, por exemplo, Publicações de Patentes dos Estados Unidos Nos 2015/0175697; 2014/0255407; 2014/0099318; 2013/0295121; 2010/0174053; 2009/0060910; 2007- 0004909; Publicações de Patentes Europeia Nos EP 2714079; EP 2601216; EP 2376109; EP 2158221; EP 1868650; e Publicações PCT Nos WO 2012/162068; WO 2012/018687; WO 2010/080538; WO 2006/113665) e são aqui fornecidas.
[00192] Construtos alternativos são conhecidos na técnica para aplicações onde uma molécula biespecífica ou tetravalente é desejável, mas um Fc não é necessário incluindo, mas não limitadas a moléculas Engager de células T biespecíficas, também referidas como “anticorpos BiTE®” (ver, por exemplo, Publicações PCT Nos: WO 1993/11161; e WO 2004/106381) e anticorpos tandem tetravalentes, também referidos como “TandAbs®” (ver, e.g. Publicação de Patente dos Estados Unidos No: 2011-0206672; Publicação de Patente Europeia No. EP 2371866, e; Publicações PCT Nos WO 1999/057150, WO 2003/025018 e WO 2013/013700). As BiTEs são formadas a partir de uma cadeia polipeptídica única compreendendo scFvs ligados em tandem, enquanto os TandAbs são formados pela homodimerização de duas cadeias polipeptídicas idênticas, cada uma possuindo um Domínio VH1, VL2, VH2 e VL2.
[00193] A presente invenção fornece moléculas de ligação biespecíficas que são capazes de realçar uma resposta imune dirigida à morte de uma célula alvo (por exemplo, uma célula de câncer ou uma célula infectada por patógeno, um patógeno, etc.) expressando um Antígeno de Doença. Essas moléculas de ligação biespecíficas são capazes de se ligar a um “Primeiro Epítopo” e um “Segundo Epítopo”, em que um destes epítopos é um epítopo de CD16 e o outro destes epítopos é um epítopo de um Antígeno de Doença (“DA”). É irrelevante se um epítopo particular é designado como o primeiro vs. o segundo Epítopo; essa notação tem relevância apenas com respeito à presença e orientação dos Domínios das cadeias polipeptídicas das moléculas de ligação da presente invenção. Assim, as moléculas biespecíficas da presente invenção compreendem Domínios “VLCD16”/”VHCD16” que são capazes de se ligar a um epítopo de CD16 e Domínios “VLDA”/”VHDA” que são capazes de se ligar a um epítopo de um Antígeno de Doença. A presente invenção abrange diacorpos biespecíficos particulares, BiTEs, anticorpos e TandAbs produzidos usando qualquer um dos métodos aqui fornecidos. A. DIACORPOS SEM DOMÍNIOS FC
[00194] Em uma modalidade, as Moléculas de Ligação CD16 da presente invenção serão diacorpos biespecíficos e compreenderão domínios capazes de se ligar a um primeiro e um segundo Epítopo, mas carecerão de um Domínio Fc e, portanto, serão incapazes de se ligar a moléculas FcγR por meio de uma interação Fc-FcγR. Tais moléculas são, entretanto, capazes de se ligar a CD16 por meio de SDRs ou CDRs de seus Domínios de Ligação CD16. A ausência de domínios Fc serve assim para impeder as moléculas de se ligarem a FcγRs não CD16, tal como o receptor inibitório CD32B.
[00195] A primeira cadeia polipeptídica desta modalidade de diacorpos biespecíficos preferivelmente compreende, na direção N-terminal a C-terminal: um N- terminal, o Domínio VL de um anticorpo monoclonal capaz de se ligar ao primeiro ou segundo Epítopo (isto é, VLCD16 ou VLDA), um primeiro peptídeo espaçador de intervenção (Conector 1),
um Domínio VH de um anticorpo monoclonal capaz de se ligar ao epítopo do Antígeno de Doença (se essa primeira cadeia polipeptídica contém VLCD16) ou um Domínio VH de um anticorpo monoclonal capaz de se ligar a CD16 (se essa primeira cadeia polipeptídica contém VLDA), um segundo peptídeo espaçador de intervenção (Conector 2) opcionalmente contendo um resíduo de cisteína, um Domínio Promotor Heterodímero e um C-terminal (Figuras 1A-1B).
[00196] A segunda cadeia polipeptídica desta modalidade de diacorpos biespecíficos compreende, na direção N-terminal a C-terminal: um N-terminal, o Domínio VL de um anticorpo monoclonal capaz de se ligar ao primeiro ou segundo Epítopo (isto é, VLCD16 ou VLDA e sendo o Domínio VL não selecionado para inclusão na primeira cadeia polipeptídica do diacorpo), um peptídeo espaçador de intervenção (Conector 1), um Domínio VH de um anticorpo monoclonal capaz de se ligar ao primeiro ou segundo Epítopo (isto é, VHCD16 ou VHDA e sendo o Domínio VH não selecionado para inclusão na primeira cadeia polipeptídica do diacorpo), um segundo peptídeo espaçador de intervenção (Conector 2) opcionalmente contendo um resíduo de cisteína, um Domínio Promotor Heterodímero e um C-terminal (Figuras 1A-1B). Os Domínios VL e VH utilizados específicos para um epítopo particular são preferivelmente obtidos ou derivados do mesmo anticorpo monoclonal. Entretanto, esses domínios podem ser derivados de diferentes anticorpos monoclonais fornecidos que se associam para formar um Domínio de Ligação funcional capaz de se ligar imunoespecificamente a esse epítopo. Esses diferentes anticorpos são referidos aqui como sendo anticorpos “correspondentes”.
[00197] O Domínio VL da primeira cadeia polipeptídica interage com o Domínio VH da segunda cadeia polipeptídica para formar um primeiro Domínio de Ligação ao Epítopo funcional que é específico para um dos epítopos (por exemplo, o Primeiro Epítopo). Do mesmo modo, o Domínio VL da segunda cadeia polipeptídica interage com o Domínio VH da primeira cadeia polipeptídica de modo a formar um segundo Domínio de Ligação ao Epítopo funcional que é específico para o outro epítopo (isto é, o Segundo Epítopo). Assim, a seleção dos Domínios VL e VH da primeira e segunda cadeias polipeptídicas é “coordenado”, de modo que as duas cadeias polipeptídicas do diacorpo coletivamente compreendem Domínios VL e VH capazes de se ligar ao Primeiro Epítopo e ao Segundo Epítopo (isto é, eles coletivamente compreendem VLCD16/VHCD16 e VLDA/VHDA).
[00198] O mais preferivelmente, o comprimento do peptídeo espaçador de intervenção (isto é, “Conector 1”, que separa esses Domínios VL e VH) é selecionado para impedir substancialmente ou completamente os Domínios VL e VH da cadeia polipeptídica de se ligarem um ao outro (por exemplo consistindo de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 resíduos de aminoácido conectores de intervenção). Assim, os Domínios VL e VH da primeira cadeia polipeptídica são substancialmente ou completamente incapazes de se ligar um ao outro. Do mesmo modo, os Domínios VL e VH da segunda cadeia polipeptídica são substancialmente ou completamente incapazes de se ligar um ao outro. Um peptídeo espaçador de intervenção preferido (Conector 1) tem a sequência (SEQ ID NO: 16): GGGSGGGG.
[00199] O comprimento e a composição do segundo peptídeo espaçador de intervenção (“Conector 2”) é selecionado com base na escolha de um ou mais domínios polipeptídicos que promovem essa dimerização (isto é, um “Domínio Promotor Heterodímero”). Tipicamente, o segundo peptídeo espaçador de intervenção (Conector 2) compreenderá 3-20 resíduos de aminoácido. Em particular, onde os Domínios Promotores Heterodímeros utilizados não compreendem um resíduo de cisteína, um segundo peptídeo espaçador de intervenção contendo cisteína (Conector 2) é utilizado. Um segundo peptídeo espaçador de intervenção contendo cisteína (Conector 2) conterá 1, 2, 3 ou mais cisteínas. Um peptídeo espaçador contendo cisteína preferido (Conector 2) tem a sequência GGCGGG (SEQ ID NO: 17). Alternativamente, Conector 2 não compreende uma cisteína (por exemplo, GGG, GGGS (SEQ ID NO: 18), LGGGSG (SEQ ID NO: 19), GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO: 20), ASTKG (SEQ ID NO: 21), LEPKSS (SEQ ID NO: 22), APSSS (SEQ ID NO: 23), etc.) e um Domínio Promotor Heterodímero contendo cisteína, como descrito abaixo é usado. Opcionalmente, um Conector 2 contendo cisteína e um Domínio Promotor Heterodímero contendo cisteína são usados.
[00200] Os Domínios Promotores Heterodímeros podem ser GVEPKSC (SEQ ID NO: 24) ou VEPKSC (SEQ ID NO: 25) ou AEPKSC (SEQ ID NO: 26) em uma cadeia polipeptídica e GFNRGEC (SEQ ID NO: 27) ou FNRGEC (SEQ ID NO: 28) na outra cadeia polipeptídica (US2007/0004909).
[00201] Em uma modalidade preferida, os Domínios Promotores Heterodímeros compreenderão domínios espirais repetidos em tandem de carga oposta, por exemplo, um Domínio Promotor Heterodímero “espiral E” (SEQ ID NO: 29: EVAALEK- EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK), cujos resíduos de glutamato formarão uma carga negativa em pH 7 ou um Domínio Promotor Heterodímero “espiral K” (SEQ ID NO: 30: KVAALKE-KVAALKE-
KVAALKE-KVAALKE), cujos resíduos de lisina formarão uma carga positiva em pH 7. A presença de tais domínios carregados promove a associação entre o primeiro e segundo polipeptídeos e, portanto, promove a formação de heterodímeros. Os Domínios Promotores Heterodímeros que compreendem modificações das sequências espiral E e espiral K descritas acima de modo a incluir um ou mais resíduos de cisteína podem ser utilizados. A presença de tais resíduos de cisteína permite que a espiral presente em uma cadeia polipeptídica se torne covalentemente ligada a um espiral complementar presente em outra cadeia polipeptídica, unindo covalentemente as cadeias polipeptídicas uma à outra e aumentando a estabilidade do diacorpo. Exemplos destes particularmente preferidos são Domínios Promotores Heterodímeros que incluem um Espiral E Modificado tendo a sequência de aminoácidos EVAACEK-EVAALEK- EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO: 31) e um espiral K modificado tendo a sequência de aminoácidos KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE- KVAALKE (SEQ ID NO: 32).
[00202] Como divulgado em WO 2012/018687, de modo a melhorar as propriedades farmacocinéticas in vivo de diacorpos, um diacorpo pode ser modificado para conter uma porção polipeptídica de uma proteína de ligação sérica em um ou mais dos terminais do diacorpo. O mais preferivelmente, essa porção polipeptídica de uma proteína de ligação sérica será instalada no C-terminal de uma cadeia polipeptídica do diacorpo. Albumina é a proteína mais abundante no plasma e tem uma meia-vida de 19 dias em humanos. A albumina possui vários pequenos domínios de ligação a moléculas que permitem que se ligue não covalentemente a outras proteínas e, desse modo, prolongam sua meia-vida sérica. O Domínio de Ligação a
Albumina 3 (ABD3) da proteína G da cepa de Streptococcus G148 consiste em 46 resíduos de aminoácido formando um feixe estável de três hélices e tem amplas especificidade de ligação a albumina (Johansson, M.U. et al. (2002) “Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin- Binding Modules”, J. Biol. Chem. 277(10):8114 a 8120). Assim, uma porção polipeptídica particularmente preferida de uma proteína de ligação sérica para melhorar as propriedades farmacocinéticas in vivo de um diacorpo é o Domínio de Ligação a Albumina (ABD) da proteína estreptocócica G e, mais preferivelmente, o Domínio de Ligação a Albumina 3 (ABD3) da proteína G da cepa de Streptococcus G148 (SEQ ID NO: 33): LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIDNAKS AEGVKALIDE ILAALP.
[00203] Como divulgado em WO 2012/162068 (aqui incorporado por referência), variantes “desimunizadas” da SEQ ID NO: 33 têm a capacidade para atenuar ou eliminar a ligação a MHC classe II. Com base em resultados de mutação combinacional, as seguintes combinações de substituições são consideradas como sendo substituições preferidas para formar essa ABD desimunizada: 66D/70S +71A; 66S/70S +71A; 66S/70S +79A; 64A/65A/71A; 64A/65A/71A+66S; 64A/65A/71A+66D; 64A/65A/71A+66E; 64A/65A/79A+66S; 64A/65A/79A+66D; 64A/65A/79A+66E. ABDs variantes tendo as modificações L64A, I65A e D79A ou as modificações N66S, T70S e D79A. ABD desimunizada variante tendo a sequência de aminoácidos: LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLID66NAKS70 A71EGVKALIDE ILAALP
[00204] (SEQ ID NO: 34),
[00205] ou a sequência de aminoácidos: LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNA64A65NNAKT VEGVKALIA79E ILAALP
[00206] (SEQ ID NO: 35),
[00207] ou a sequência de aminoácidos: LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIS66NAKS70 VEGVKALIA79E ILAALP
[00208] (SEQ ID NO: 36),
[00209] são particularmente preferidas, pois essa ABD desimunizada exibe substancialmente uma ligação de tipo selvagem enquanto fornece ligação atenuada a MHC classe II. Assim, a primeira cadeia polipeptídica deste diacorpo tendo um ABD contém um terceiro conector (Conector 3) preferivelmente posicionado C-terminalmente ao Domínio espiral E (ou espiral K) de tal cadeia polipeptídica de modo a intervir entre o Domínio espiral E (ou espiral K) e o ABD (que é preferivelmente um ABD desimunizado). Uma sequência preferida para este Conector 3 é SEQ ID NO: 18: GGGS. B. DIACORPOS COMPREENDENDO DOMÍNIOS FC
[00210] Uma modalidade da presente invenção refere-se a diacorpos multiespecíficos (por exemplo, biespecíficos, triespecíficos, tetraespecíficos, etc.) que compreendem um Domínio Fc e que são capazes de se ligar simultaneamente a um epítopo de CD16 e um epítopo de um Antígeno de Doença. O Domínio Fc de tais moléculas pode ser de qualquer isotipo (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4). As moléculas podem compreender ainda um Domínio CH1 e/ou um Domínio de Dobradiça. Quando presente, o Domínio CH1 e/ou Domínio de Dobradiça pode ser de qualquer isotipo (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4) e é preferivelmente do mesmo isotipo que o Domínio Fc desejado.
[00211] A adição de um Domínio CH2-CH3 de IgG a uma ou ambas as cadeias polipeptídicas do diacorpo, de modo a complexar as cadeias do diacorpo resultando na formação de um Domínio Fc, aumentando a meia-vida biológica e/ou alterando a valência do diacorpo. Esses diacorpos compreendem, duas ou mais cadeias polipeptídicas cujas sequências permitem que as cadeias polipeptídicas se liguem covalentemente umas às outras para formar um diacorpo covalentemente associado que é capaz de se ligar simultaneamente ao Primeiro Epítopo e ao Segundo Epítopo. A incorporação de um Domínio CH2-CH3 de IgG em ambos os polipeptídeos do diacorpo permitirá a formação de um diacorpo contendo Domínio Fc biespecífico de duas cadeias (Figura 2).
[00212] Alternativamente, a incorporação do Domínio CH2-CH3 de IgG em apenas um dos polipeptídeos do diacorpo permitirá a formação de um diacorpo contendo Domínio Fc biespecífico de quatro cadeias mais complexo (Figuras 3A- 3C). A Figura 3C mostra um diacorpo de quatro cadeias representativo possuindo o Domínio Constante Leve (CL) e o Domínio CH1 Constante Pesado, entretanto, fragmentos de tais domínios bem como outros polipeptídeos podem, alternativamente, serem utilizados (ver, por exemplo, Figuras 3A e 3B, Publicações de Patentes dos Estados Unidos Nos 2013- 0295121; 2010-0174053 e 2009-0060910; Publicação de Patente Europeia No EP 2714079; EP 2601216; EP 2376109; EP 2158221 e Publicações PCT Nos WO 2012/162068; WO 2012/018687; WO 2010/080538). Assim, por exemplo, em vez do Domínio CH1, pode utilizar um peptídeo tendo a sequência de aminoácidos GVEPKSC (SEQ ID NO: 24), VEPKSC (SEQ ID NO: 25) ou AEPKSC (SEQ ID NO: 26), derivadas do Domínio de Dobradiça de uma IgG humana e em vez do Domínio CL, pode utilizar os 6 aminoácidos C-terminais da Cadeia Leve Kappa humana, GFNRGEC (SEQ ID NO: 27) ou FNRGEC (SEQ ID NO: 28). Um peptídeo representativo contendo diacorpo de quatro cadeias é mostrado na Figura 3A.
Alternativamente ou adicionalmente, pode utilizar um peptídeo compreendendo domínios espirais tandem de carga oposta tais como os domínios helicoidais de “espiral E” (SEQ ID NO: 29: EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK ou SEQ ID NO: 31: EVAACEK- EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK); e os domínios de “espiral K” (SEQ ID NO: 30: KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE ou SEQ ID NO: 32: KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE). Um diacorpo de quatro cadeias contendo domínio espiral representativo é mostrado na Figura 3B.
[00213] As moléculas de diacorpo contendo Domínio Fc da presente invenção podem incluir peptídeos espaçadores de intervenção adicionais (Conectores), geralmente esses Conectores serão incorporados entre um Domínio Promotor Heterodímero (por exemplo, um espiral E ou espiral K) e um Domínio CH2-CH3 e/ou entre um Domínio CH2-CH3 e um Domínio Variável (isto é, VH ou VL). Tipicamente, os Conectores adicionais compreenderão 3-20 resíduos de aminoácido e pode, opcionalmente, conter todo ou uma porção de um Domínio de Dobradiça de IgG (preferivelmente uma porção contendo cisteína de um Domínio de Dobradiça de IgG possuindo 1, 2, 3 ou mais resíduos de cisteína). Conectores que podem ser utilizados nas Moléculas de diacorpo contendo Domínio Fc biespecíficas da presente invenção incluem: GGGS (SEQ ID NO: 18), LGGGSG (SEQ ID NO: 19), GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO: 20), ASTKG (SEQ ID NO: 21), LEPKSS (SEQ ID NO: 22), APSSS (SEQ ID NO: 23), APSSSPME (SEQ ID NO: 37), VEPKSADKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 38), LEPKSADKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 39), DKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 40), o scFv conector: GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 41); o conector “longo”: GGGGSGGGSGGG (SEQ ID NO: 42), GGC e GGG. LEPKSS (SEQ ID NO: 22) pode ser usada em vez de GGG ou GGC para facilidade de clonagem. Adicionalmente, os aminoácidos GGG ou LEPKSS (SEQ ID NO: 22) podem ser imediatamente seguidos por DKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 40) para formar os conectores alternados: GGGDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 43); e LEPKSSDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 44). As moléculas contendo Domínio Fc biespecíficas da presente invenção podem incorporar um Domínio de Dobradiça de IgG além de ou no lugar de um conector. Domínios de Dobradiça exemplificativos incluem: EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 5) de IgG1, ERKCCVECPPCP (SEQ ID NO: 6) de IgG2,
ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKS CDTPPPCPRCP (SEQ ID NO: 7) de IgG3, ESKYGPPCPSCP (SEQ ID NO: 8) de IgG4 e ESKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 9) uma variante de Dobradiça de IgG4 compreendendo uma substituição estabilizadora de S228P (conforme numerado pelo índice da EU como apresentado em Kabat) para reduzir a troca de filamento.
[00214] Como fornecido na Figura 3A-3C, os diacorpos contendo Domínio Fc da invenção podem compreender quatro cadeias. A primeira e terceira cadeias polipeptídicas deste diacorpo contêm três domínios: (i) um Domínio contendo VL1, (ii) um Domínio contendo VH2, (iii) um Domínio Promotor Heterodímero e (iv) um Domínio contendo uma sequência CH2- CH3. A segunda e quarta cadeias polipeptídicas contêm: (i) um Domínio contendo VL2, (ii) um Domínio contendo VH1 e (iii) um Domínio Promotor Heterodímero, onde os Domínios Promotores Heterodímeros promovem a dimerização da primeira/terceira cadeias polipeptídicas com a segunda/quarta cadeias polipeptídicas. Os Domínios VL e/ou VH da terceira e quarta cadeias polipeptídicas e Domínios VL e/ou VH da primeira e segunda cadeias polipeptídicas podem ser iguais ou diferentes de modo a permitir a ligação tetravalente que é monoespecífica, biespecífica ou tetraespecífica. A anotação “VL3” e “VH3” denota respectivamente, o Domínio Variável de Cadeia Leve e Domínio Variável de Cadeia Pesada que se liga a um “terceiro” epítopo deste diacorpo. Similarmente, a anotação “VL4” e “VH4” denota respectivamente, o Domínio Variável de Cadeia Leve e Domínio Variável de Cadeia Pesada que se liga a um “quarto” epítopo deste diacorpo. A estrutura geral das cadeias polipeptídicas de um diacorpo biespecífico de quatro cadeias representativo contendo Domínio Fc da invenção é fornecido na Tabela 1: Tabela 1 2a Cadeia NH2-VL2-VH1-HPD-COOH 1a Cadeia NH2-VL1-VH2-HPD-CH2-CH3-COOH Biespecífico 1a Cadeia NH2-VL1-VH2-HPD-CH2-CH3-COOH 2a Cadeia NH2-VL2-VH1-HPD-COOH 2a Cadeia NH2-VL2-VH1-HPD-COOH 1a Cadeia NH2-VL1-VH2-HPD-CH2-CH3-COOH Tetraespecífico 3a Cadeia NH2-VL3-VH4-HPD-CH2-CH3-COOH 4a Cadeia NH2-VL4-VH3-HPD-COOH HPD = Domínio Promotor Heterodímero
[00215] Em uma modalidade específica, os diacorpos da presente invenção são biespecíficos, tetravalentes (isto é, possuem quatro Domínios de Ligação ao Epítopo), diacorpos contendo Fc que são compostos por quatro cadeias polipeptídicas totais (Figuras 3A-3C). Os diacorpos biespecíficos, tetravalentes contendo Fc da invenção compreendem dois Primeiros Domínios de Ligação ao Epítopo e dois Segundos Domínios de Ligação ao Epítopo.
[00216] Em uma outra modalidade, os diacorpos contendo Domínio Fc da presente invenção pode compreender três cadeias polipeptídicas.
O primeiro polipeptídeo deste diacorpo contém três domínios: (i) um Domínio contendo VL1, (ii) um Domínio contendo VH2 e (iii) um Domínio contendo uma sequência CH2-CH3. O segundo polipeptídeo deste diacorpo contém: (i) um Domínio contendo VL2, (ii) um Domínio contendo VH1 e (iii) um Domínio que promove a heterodimerização e ligação covalente com a primeira cadeia polipeptídica do diacorpo.
O terceiro polipeptídeo deste diacorpo compreende uma sequência CH2-CH3. Assim, a primeira e segunda cadeias polipeptídicas deste diacorpo se associam para formar um Domínio de Ligação ao Epítopo VL1/VH1 que é capaz de se ligar ao primeiro ou segundo Epítopo, bem como um Domínio de Ligação ao Epítopo VL2/VH2 que é capaz de se ligar ao outro de tais epítopos.
O primeiro e segundo polipeptídeos são ligados um ao outro através de uma ligação dissulfeto envolvendo resíduos de cisteína em seus respectivos terceiros Domínios.
Notavelmente, a primeira e terceira cadeias polipeptídicas complexam uma com a outra para formar um Domínio Fc que é estabilizado por meio de uma ligação dissulfeto.
Esses diacorpos biespecíficos têm potência aprimorada.
As Figuras 4A e 4B ilustram as estruturas destes diacorpos.
Tais diacorpos contendo Domínio Fc podem ter uma de duas orientações (Tabela 2):
Tabela 2 3a Cadeia NH2-CH2-CH3-COOH Primeira 1a Cadeia NH2-VL1-VH2-HPD-CH2-CH3-COOH Orientação 2a Cadeia NH2-VL2-VH1-HPD-COOH Segunda 3a Cadeia NH2-CH2-CH3-COOH Orientação 1a Cadeia NH2-CH2-CH3-VL1-VH2-HPD-COOH
2a Cadeia NH2-VL2-VH1-HPD-COOH HPD = Domínio Promotor Heterodímero
[00217] Em uma modalidade específica, os diacorpos da presente invenção são biespecíficos, bivalentes (isto é, possuem dois Domínios de Ligação ao Epítopo), diacorpos contendo Fc que são compostos por três cadeias polipeptídicas totais (Figuras 4A-4B). Os diacorpos biespecíficos, bivalentes contendo Fc da invenção compreendem um Domínio de Ligação ao Epítopo imunoespecífico para o primeiro ou segundo Epítopo, bem como um Domínio de Ligação ao Epítopo VL2/VH2 que é capaz de se ligar ao outro de tais epítopos.
[00218] Em uma outra modalidade, os diacorpos contendo Domínio Fc podem compreender um total de cinco cadeias polipeptídicas. Em uma modalidade particular, duas das cinco cadeias polipeptídicas têm a mesma sequência de aminoácidos. A primeira cadeia polipeptídica deste diacorpo contém: (i) um Domínio contendo VH1, (ii) um Domínio contendo CH1 e (iii) um Domínio contendo uma sequência CH2-CH3. A primeira cadeia polipeptídica pode ser a Cadeia Pesada de um anticorpo que contém um VH1 e uma região constante de Cadeia Pesada. A segunda e quinta cadeias polipeptídicas deste diacorpo contêm: (i) um Domínio contendo VL1 e (ii) um Domínio contendo CL. A segunda e/ou quinta cadeias polipeptídicas deste diacorpo podem ser Cadeias Leves de um anticorpo que contém um VL1 complementar a VH1 da primeira/terceira cadeia polipeptídica. A primeira, segunda e/ou quinta cadeias polipeptídicas podem ser isoladas de um anticorpo de ocorrência natural. Alternativamente, ele pode ser recombinantemente construído. A terceira cadeia polipeptídica deste diacorpo contém: (i) um Domínio contendo VH1, (ii) um Domínio contendo CH1, (iii) um Domínio contendo uma sequência CH2-CH3, (iv) um Domínio contendo VL2, (v) um Domínio contendo VH3 e (vi) um Domínio Promotor Heterodímero, onde os Domínios Promotores Heterodímeros promovem a dimerização da terceira cadeia com a quarta cadeia. O quarto polipeptídeo destes diacorpos contém: (i) um Domínio contendo VL3, (ii) um Domínio contendo VH2 e (iii) um Domínio que promove a heterodimerização e a ligação covalente com a terceira cadeia polipeptídica do diacorpo.
[00219] Assim, a primeira e segunda e a terceira e quinta cadeias polipeptídicas destes diacorpos se associam para formar dois Domínios de Ligação ao Epítopo VL1/VH1 capazes de se ligar a um Primeiro Epítopo. A terceira e quarta cadeias polipeptídicas destes diacorpos se associam para formar um Domínio de Ligação ao Epítopo VL2/VH2 que é capaz de se ligar a um Segundo Epítopo, bem como um Domínio de Ligação ao Epítopo VL3/VH3 que é capaz de se ligar a um Terceiro Epítopo. O primeiro e terceiro polipeptídeos são ligados um ao outro através de uma ligação dissulfeto envolvendo resíduos de cisteína em suas respectivas regiões constantes. Notavelmente, a primeira e terceira cadeias polipeptídicas complexam uma com a outra para formar um Domínio Fc. Esses diacorpos multiespecíficos têm potência aprimorada. Figura 5 ilustra a estrutura de tais diacorpos. Será entendido que os Domínios VL1/VH1, VL2/VH2 e VL3/VH3 podem ser iguais ou diferentes de modo a permitir a ligação que é monoespecífica, biespecífica ou triespecífica.
[00220] Os domínios VL e VH das cadeias polipeptídicas são selecionados de modo a formar os Domínios de Ligação ao Epítopo VL/VH específicos para um epítopo desejado.
Os Domínios de Ligação ao Epítopo VL/VH formados pela associação das cadeias polipeptídicas podem ser iguais ou diferentes de modo a permitir a ligação tetravalente que é monoespecífica, biespecífica, triespecífica ou tetraespecífica.
Em particular, os Domínios VL e VH podem ser selecionados de modo que um diacorpo multivalente pode compreender dois Domínios de Ligação para um Primeiro Epítopo e dois Domínios de Ligação para um Segundo Epítopo ou três Domínios de Ligação para um Primeiro Epítopo e um Domínio de Ligação para um Segundo Epítopo ou dois Domínios de Ligação para um Primeiro Epítopo, um Domínio de Ligação para um Segundo Epítopo e um Domínio de Ligação para um Terceiro Epítopo (conforme representado na Figura 5). A estrutura geral das cadeias polipeptídicas de diacorpos de cinco cadeias representativos contendo Domínio Fc da invenção é fornecida na Tabela 3:
Tabela 3 2a NH2-VL1-CL-COOH Cadeia 1a NH2-VH1-CH1-CH2-CH3-COOH Cadeia Biespecífico 3a NH2-VH1-CH1-CH2-CH3-VL2-VH2-HPD-COOH (2x2) Cadeia 5a NH2-VL1-CL-COOH Cadeia 4a NH2-VL2-VH2-HPD-COOH Cadeia 2a NH2-VL1-CL-COOH Biespecífico Cadeia (3x1) 1a NH2-VH1-CH1-CH2-CH3-COOH Cadeia
3a NH2-VH1-CH1-CH2-CH3-VL1-VH2-HPD-COOH Cadeia 5a NH2-VL1-CL-COOH Cadeia 4a NH2-VL2-VH1-HPD-COOH Cadeia 2a NH2-VL1-CL-COOH Cadeia 1a NH2-VH1-CH1-CH2-CH3-COOH Cadeia Triespecífico 3a NH2-VH1-CH1-CH2-CH3-VL2-VH3-HPD-COOH (2x1x1) Cadeia 5a NH2-VL1-CL-COOH Cadeia 4a NH2-VL3-VH2-HPD-COOH Cadeia HPD = Domínio Promotor Heterodímero
[00221] Em uma modalidade específica, os diacorpos da presente invenção são biespecíficos, tetravalentes (isto é, possuem quatro Domínios de Ligação ao Epítopo), diacorpos contendo Fc que são compostos por cinco cadeias polipeptídicas totais tendo dois Domínios de Ligação ao Epítopo imunoespecíficos para o Primeiro Epítopo e dois Domínios de Ligação ao Epítopo específicos para o Segundo Epítopo. Em outra modalidade, os diacorpos biespecíficos, tetravalentes contendo Fc da invenção compreendem três Domínios de Ligação ao Epítopo imunoespecíficos para o Primeiro Epítopo e um Domínio de Ligação ao Epítopo específico para o Segundo Epítopo. Como fornecido acima, os Domínios VL e VH podem ser selecionados para permitir a ligação triespecífica. Consequentemente, a invenção também abrange diacorpos triespecíficos, tetravalentes contendo Fc. Os diacorpos triespecíficos, tetravalentes contendo Fc da invenção compreendem dois Domínios de Ligação ao Epítopo imunoespecíficos para o Primeiro Epítopo, um Domínio de Ligação ao Epítopo imunoespecífico para o Segundo Epítopo e um Domínio de Ligação ao Epítopo imunoespecífico para o Terceiro Epítopo.
[00222] Na função imune tradicional, a interação dos complexos anticorpo-antígeno com células do sistema imunológico resulta em uma ampla gama de respostas, que variam de funções efetoras tais como citotoxicidade dependente de anticorpo, desgranulação de mastócito e fagocitose para sinais imunomoduladores tais como regulação de proliferação linfocítica e secreção de anticorpo. Todas destas interações são iniciadas através da ligação do Domínio Fc de anticorpos ou complexos imunes a receptores da superfície celular especializados em células hematopoieticas. Como discutido acima, a diversidade de respostas celulares desencadeadas por anticorpos e complexos imunes resulta da heterogeneidade estrutural dos três receptores Fc: FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) e FcγRIII (CD16). FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32A) e FcγRIII (CD16) são receptores ativadores (isto é, aprimoramento do sistema imunológico); FcγRIIB (CD32B) é um receptor inibidor (isto é, amortece o sistema imunológico). Além disso, a interação com o receptor Fc neonatal (FcRn) medeia a reciclagem de moléculas IgG do endossoma para a superfície celular e a liberação no sangue. A sequência de aminoácidos da IgG1 (SEQ ID NO: 12), IgG2 (SEQ ID NO: 13), IgG3 (SEQ ID NO: 14) e IgG4 (SEQ ID NO: 15) tipo selvagem exemplificativa são apresentadas acima.
[00223] A modificação do Domínio Fc pode levar a um fenótipo alterado, por exemplo, meia-vida sérica alterada,
estabilidade alterada, suscetibilidade a enzimas celulares alterada ou função efetora alterada. Portanto, pode ser desejável modificar uma molécula de ligação contendo Domínio Fc da presente invenção com respeito à função efetora, por exemplo, de modo a realçar a efetividade desta molécula no tratamento de câncer. A redução ou eliminação da função efetora mediada pelo Domínio Fc é desejável em certos casos, por exemplo, no caso de anticorpos cujo mecanismo de ação envolve bloqueio ou antagonismo, mas não morte das células portadoras de um antígeno alvo. A função efetora aumentada é geralmente desejável quando dirigida a células indesejáveis, tais como células tumorais e estranhas, onde os FcγRs são expressados em baixos níveis, por exemplo, células B específicas de tumor com baixos níveis de FcγRIIB (por exemplo, linfoma não-Hodgkin, CLL e linfoma de Burkitt). As moléculas da invenção possuindo essa atividade de função efetora conferida ou alterada são úteis para o tratamento e/ou prevenção de uma doença, transtorno ou infecção em que uma eficácia aprimorada da atividade de função efetora é desejada.
[00224] Consequentemente, em certas modalidades, o Domínio Fc das moléculas contendo Domínio Fc da presente invenção pode ser um Domínio Fc variante manipulado. Embora o Domínio Fc das moléculas contendo Domínio Fc biespecíficas da presente invenção possa possuir a capacidade para se ligar a um ou mais receptores Fc (por exemplo, FcγR (ou FcyRs)), mais preferivelmente este Domínio Fc variante têm ligação alterada a FcγRIA (CD64), FcγRIIA (CD32A), FcγRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD16a) ou FcγRIIIB (CD16b) (em relação à ligação exibida por um Domínio Fc de tipo selvagem), por exemplo, terá ligação aprimorada e/ou terá substancialmente reduzida a um receptor ativador ou nenhuma capacidade para se ligar a receptores inibitórios. Assim, o Domínio Fc das moléculas contendo Domínio Fc da presente invenção podem incluir parte ou todo o Domínio CH2 e/ou parte ou todo o Domínio CH3 de um Domínio Fc completo ou pode compreender uma sequência CH2 variante e/ou uma CH3 variante (que podem incluir, por exemplo, uma ou mais inserções e/ou uma ou mais deleções com respeito aos Domínios CH2 ou CH3 de um Domínio Fc completo). Esses Domínios Fc podem compreender porções de polipeptídeos não Fc ou pode compreender porções de Domínios Fc não naturalmente completos ou podem compreender orientações de ocorrência não natural de Domínios CH2 e/ou CH3 (tais como, por exemplo, dois Domínios CH2 ou dois Domínios CH3 ou na direção N-terminal a C- terminal, um Domínio CH3 ligado a um Domínio CH2, etc.).
[00225] As modificações do Domínio Fc identificadas como alterações da função efetora são conhecidas na técnica, incluindo modificações que aumentam receptores ativadores de ligação (por exemplo, FcγRIIA (CD16A) e reduzem receptores inibitórios de ligação (por exemplo, FcγRIIB (CD32B) (ver, por exemplo, Stavenhagen, J.B. et al. (2007) “Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors”, Cancer Res. 57(18):8882 a 8890). A Tabela 4 lista substituições únicas, duplas, triplas, quádruplas e quintuplas exemplificativas (numeradas (de acordo com o índice da EU) e as substituições são relativas à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12 como apresentada acima) de modificação exemplificativas que aumentam os receptores ativadores de ligação e/ou reduzem os receptores inibitórios de ligação.
Tabela 4 Variações de Domínios Fc de Ativação Preferidos† Variações de Sítio Único F243L R292G D270E R292P Y300L P396L Variações de Sítio Duplo F243L e R292P F243L e Y300L F243L e P396L R292P e Y300L D270E e P396L R292P e V305I P396L e Q419H P247L e N421K R292P e P396L Y300L e P396L R255L e P396L R292P e P305I K392T e P396L Variações de Sítio Triplo F243L, P247L e N421K P247L, D270E e N421K F243L, R292P e Y300L R255L, D270E e P396L F243L, R292P e V305I D270E, G316D e R416G F243L, R292P e P396L D270E, K392T e P396L F243L, Y300L e P396L D270E, P396L e Q419H V284M, R292L e K370N R292P, Y300L e P396L Variações de Sítio Quádruplo L234F, F243L, R292P e Y300L F243L, P247L, D270E e N421K L234F, F243L, R292P e Y300L F243L, R255L, D270E e P396L L235I, F243L, R292P e Y300L F243L, D270E, G316D e R416G L235Q, F243L, R292P e Y300L F243L, D270E, K392T e P396L P247L, D270E, Y300L e N421K F243L, R292P, Y300L e P396L R255L, D270E, R292G e P396L F243L, R292P, V305I e P396L R255L, D270E, Y300L e P396L F243L, D270E, P396L e Q419H D270E, G316D, P396L e R416G Variações de Sítio Quíntuplo L235V, F243L, R292P, Y300L e F243L, R292P, V305I, Y300L e P396L P396L
L235P, F243L, R292P, Y300L e P396L † a numeração está de acordo com o índice da EU como em Kabat
[00226] Variantes exemplificativas de Domínios Fc de IgG1 humana com CD32B de ligação reduzida e/ou CD16A de ligação aumentada contêm substituições de F243L, R292P, Y300L, V305I ou P396L, em que a numeração é a do índice da EU como em Kabat. Essas substituições de aminoácidos podem estar presentes em um Domínio Fc de IgG1 humana em qualquer combinação. Em uma modalidade, o Domínio Fc de IgG1 humana variante contém uma substituição F243L, R292P e Y300L. Em outra modalidade, o Domínio Fc de IgG1 humana variante contém uma substituição de F243L, R292P, Y300L, V305I e P396L.
[00227] Em certas modalidades, é preferido para os Domínios Fc das moléculas conterem o Domínio Fc de ligação da presente invenção para exibir ligação diminuída (ou substancialmente nenhuma) de FcγRIA (CD64), FcγRIIA (CD32A), FcγRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD16a) ou FcγRIIIB (CD16b) (em relação à ligação exibida pelo IgG1 Domínio Fc de tipo selvagem (SEQ ID NO: 12). Em uma modalidade específica, as moléculas contendo Domínio Fc de ligação da presente invenção compreendem um Domínio Fc de IgG que exibe função efetora de citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpo (ADCC) reduzida. Em uma modalidade preferida, os Domínios CH2-CH3 destas moléculas de ligação incluem qualquer 1, 2, 3 ou 4 das substituições: L234A, L235A, D265A, N297Q e N297G, em que a numeração é a do índice da EU como em Kabat. Em outra modalidade, os Domínios CH2-CH3 contêm uma substituição de N297Q, uma substituição de N297G, substituições de L234A e L235A ou uma substituição de D265A, pois essas mutações abolem a ligação de FcR. Alternativamente, um Domínio CH2-CH3 de um Domínio Fc de ocorrência natural que inerentemente exibe ligação diminuída (ou substancialmente nenhuma) de FcγRIIIA (CD16a) e/ou função efetora reduzida (em relação à ligação e função efetora exibida pelo Domínio Fc de IgG1 de tipo selvagem (SEQ ID NO: 12)) é utilizado. Em uma modalidade específica, as moléculas contendo Domínio Fc de ligação da presente invenção compreendem um Domínio Fc de IgG2 (SEQ ID NO: 13), um Domínio Fc de IgG3 (SEQ ID NO: 14) ou um Domínio Fc de IgG4 (SEQ ID NO: 15). Quando um Domínio Fc de IgG4 é utilizado, a presente invenção também abrange a introdução de uma mutação estabilizante, tal como a substituição de S228P da Região de Dobradiça descrita acima (ver, por exemplo, SEQ ID NO: 11). Visto que as substituições de N297G, N297Q, L234A, L235A e D265A abolem a função efetora, em circunstâncias em que a função efetora é desejada, essas substituições preferivelmente não seriam utilizadas.
[00228] Uma sequência de IgG1 preferida para os Domínios CH2 e CH3 das moléculas contendo Domínio Fc da presente invenção tendo função efetora reduzida ou abolida compreenderão as substituições L234A/L235A (SEQ ID NO: 45):
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGX
[00229] em que X é lisina (K) ou está ausente.
[00230] Uma segunda sequência de IgG1 preferida para os Domínios CH2 e CH3 das moléculas contendo a Região Fc da presente invenção compreende uma substituição de S442C
(mostrada sublinhada), de modo a permitir que dois Domínios CH3 sejam covalentemente ligados um ao outro por meio de uma ligação dissulfeto ou para permitir a conjugação de uma porção de fármaco. A sequência de aminoácidos desta molécula é (SEQ ID NO: 46):
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LCLSPGX
[00231] em que X é lisina (K) ou está ausente.
[00232] Uma terceira sequência de IgG1 preferida para os Domínios CH2 e CH3 das moléculas contendo a Região Fc da presente invenção compreende as substituições de L234A/L235A (mostrada sublinhada) que reduzem ou abolem a função efetora e a substituição de S442C (mostrada sublinhada) que permite que dois Domínios CH3 sejam covalentemente ligados um ao outro por meio de uma ligação dissulfeto ou conjugação de uma porção de fármaco. A sequência de aminoácidos desta molécula é (SEQ ID NO: 47):
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LCLSPGX
[00233] em que X é lisina (K) ou está ausente.
[00234] A meia-vida sérica das proteínas compreendendo os Domínios Fc pode ser aumentada aumentando-se a afinidade de ligação do Domínio Fc para FcRn. O termo “meia-vida” como aqui usado significa uma propriedade farmacocinética de uma molécula que é uma medição do tempo de sobrevivência médio das moléculas após sua administração. A meia-vida pode ser expressada como o tempo necessário para eliminar cinquenta por cento (50%) de uma quantidade conhecida da Molécula do corpo do sujeito (por exemplo, um paciente humano ou outro mamífero) ou um compartimento específico dos mesmos, por exemplo, como medido no soro, isto é, meia-vida circulante ou em outros tecidos. Em geral, um aumento na meia-vida resulta em um aumento no tempo médio de permanência (MRT) na circulação para a molécula administrada.
[00235] Em algumas modalidades, as moléculas de ligação contendo Domínio Fc da presente invenção compreendem um Domínio Fc variante que compreende pelo menos uma modificação de aminoácido em relação a um Domínio Fc de tipo selvagem, de modo que a molécula tem uma meia-vida aumentada (em relação a essa molécula se compreendendo um Domínio Fc de tipo selvagem). Em algumas modalidades, as moléculas de ligação contendo Domínio Fc da presente invenção compreendem um Domínio Fc de IgG variante que compreende uma substituição de aminoácido que estende a meia-vida em uma ou mais posições selecionadas do grupo consiste em 238, 250, 252, 254, 256, 257, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, 428, 433, 434, 435 e 436, em que a numeração é a do índice da EU como em Kabat. Numerosas mutações capazes de aumentar a meia-vida de uma molécula contendo Domínio Fc são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo M252Y, S254T, T256E e combinações das mesmas. Por exemplo, ver as mutações descritas nas Patentes U.S. Nos 6.277.375, 7.083.784;
7.217.797, 8.088.376; Publicações U.S. Nos 2002/0147311;
2007/0148164; e Publicações PCT Nos WO 98/23289; WO 2009/058492; e WO 2010/033279, que são aqui incorporados por referência em sua totalidade.
[00236] Em algumas modalidades, as moléculas de ligação contendo Domínio Fc da presente invenção que exibem meia-vida aprimorada possuem um Domínio Fc variante compreendendo substituições em dois ou mais dos resíduos do Domínio Fc 250, 252, 254, 256, 257, 288, 307, 308, 309, 311, 378, 428, 433, 434, 435 e 436. Em particular, duas ou mais substituições selecionadas de: T250Q, M252Y, S254T, T256E, K288D, T307Q, V308P, A378V, M428L, N434A, H435K e Y436I, em que a numeração é a do índice da EU como em Kabat. Em uma modalidade específica, tais moléculas podem possuir um Domínio Fc de IgG variante compreendendo a substituição:
[00237] (A) M252Y, S254T e T256E;
[00238] (B) M252Y e S254T;
[00239] (C) M252Y e T256E;
[00240] (D) T250Q e M428L;
[00241] (E) T307Q e N434A;
[00242] (F) A378V e N434A;
[00243] (G) N434A e Y436I;
[00244] (H) V308P e N434A; ou
[00245] (I) K288D e H435K.
[00246] Em uma modalidade preferida, uma molécula de ligação CD16 x DA contendo Domínio Fc da presente invenção possui uma Região Fc de IgG variante compreendendo qualquer 1, 2 ou 3 das substituições: M252Y, S254T e T256E. A invenção abrange ainda Moléculas de Ligação CD16 x DA possuindo Regiões Fc variantes compreendendo:
[00247] (A) uma ou mais mutações que alteram a função efetora e/ou FcγR; e
[00248] (B) uma ou mais mutações que estendem a meia-vida sérica.
[00249] Um sequência de IgG1 para os Domínios CH2 e CH3 das moléculas contendo Domínio Fc da presente invenção que fornece uma meia-vida aumentada (e que tem um aumento de 10 vezes na ligação em macacos cinomolgos e FcRn humano) (Dall’Acqua, W.F. et al. (2006) “Properties of Human IgG1s Engineered for Enhanced Binding to the Neonatal Fc Receptor (FcRn)”, J. Biol. Chem. 281(33):23514-23524) compreenderão as substituições M252Y/S254T/T256E (SEQ ID NO: 48):
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGX
[00250] em que X é lisina (K) ou está ausente.
[00251] Uma sequência alternativa de IgG1 para os Domínios CH2 e CH3 das moléculas contendo Domínio Fc da presente invenção combinando a função efetora reduzida ou abolida fornecida pelas substituições L234A/L235A e a meia- vida sérica aumentada fornecida pelas substituições M252Y/S254T/T256E é fornecida pela SEQ ID NO: 49:
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHNHYTQKS LSLSPGX em que X é lisina (K) ou está ausente.
[00252] Uma outra sequência de IgG1 preferida para os Domínios CH2 e CH3 das moléculas contendo a Região Fc da presente invenção compreende as substituições L234A/L235A (mostradas sublinhadas) que reduzem ou abolem a função efetora e as substituições M252Y, S254T e T256E (mostradas sublinhadas), de modo a estende-se a meia-vida sérica e a substituição de S442C (mostrada sublinhada), de modo a permitir que dois Domínios CH3 sejam covalentemente ligados um ao outro por meio de uma ligação dissulfeto ou para permitir a conjugação de uma porção de fármaco. A sequência de aminoácidos desta molécula é (SEQ ID NO: 50):
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LCLSPGX
[00253] em que X é lisina (K) ou está ausente.
[00254] Para certos anticorpos, diacorpos e moléculas de ligação trivalentes que se desejam possuir cadeias polipeptídicas contendo Domínio Fc de diferentes sequências de aminoácidos (por exemplo, cujas cadeias polipeptídicas contendo Domínio Fc são desejadas não serem idênticas), é desejável reduzir ou impedir que a homodimerização ocorra entre os Domínios CH2-CH3 de cadeias idênticas (por exemplo, duas primeiras cadeias polipeptídicas ou entre os Domínios CH2-CH3 de duas terceiras cadeias polipeptídicas). Os Domínios CH2 e/ou CH3 destas cadeias polipeptídicas não precisam ser idênticos na sequência e, vantajosamente, são modificados para promover a complexação de heterodímeros entre as duas cadeias polipeptídicas. Por exemplo, uma substituição de aminoácido (preferivelmente uma substituição com um aminoácido compreendendo um grupo lateral volumoso formando um “knob”, por exemplo, triptofano) pode ser introduzido no Domínio CH2 ou CH3 de modo que a interferência estérica impedirá a interação com um domínio similarmente mutado e obrigará o domínio mutado a parear com um domínio em que uma mutação complementar ou favorável foi manipulada, isto é, “hole” (por exemplo, uma substituição com glicina). Esses conjuntos de mutações podem ser manipulados em qualquer par de polipeptídeos compreendendo os Domínios CH2-CH3 que formam um Domínio Fc para promover a heterodímeroização. Métodos da engenharia de proteínas para favorecer a heterodímeroização sobre a homodimerização são bem conhecidos na técnica, em particular com respeito à engenharia de moléculas do tipo imunoglobulina e são abrangidos aqui (ver por exemplo, Ridgway et al. (1996) “‘Knobs-Into-Holes’ Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization”, Protein Engr. 9:617 a 621, Atwell et al. (1997) “Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library”, J. Mol. Biol. 270: 26 a 35, and Xie et al. (2005) “A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis”, J. Immunol. Methods 296:95 a 101; cada um dos quais é aqui incorporado por referência em sua totalidade).
[00255] Um knob preferido é criado modificando-se um Domínio Fc de IgG para conter a modificação T366W. Um orifício preferido é criado modificando-se um Domínio Fc de IgG para conter a modificação T366S, L368A e Y407V. Para auxiliar na purificação de um homodímero de cadeia polipeptídica hole-bearing a partir de moléculas heterodiméricas biespecíficas finais contendo Domínio Fc, o Domínio de Ligação à proteína A dos Domínios CH2 e CH3 hole- bearing de uma cadeia polipeptídica é preferivelmente mutado pela substituição de aminoácido na posição 435 (H435R). Assim, o homodímero de cadeia polipeptídica hole-bearing não se ligará à proteína A, enquanto o heterodímero biespecífico manterá sua capacidade para se ligar à proteína A por meio do Domínio de Ligação à proteína A. Em uma modalidade alternativa, a cadeia polipeptídica hole-bearing pode incorporar substituições de aminoácidos nas posições 434 e 435 (N434A/N435K).
[00256] Uma sequência de IgG1 preferida de aminoácidos para os Domínios CH2 e CH3 de uma cadeia polipeptídica contendo Domínio Fc de uma molécula contendo Domínio Fc da presente invenção terá a sequência “knob- bearing” (SEQ ID NO: 51):
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGX
[00257] em que X é lisina (K) ou está ausente.
[00258] Uma sequência alternativa de IgG1 de aminoácidos para os Domínios CH2 e CH3 de uma cadeia polipeptídica contendo Domínio Fc de uma molécula contendo Domínio Fc da presente invenção tendo uma substituição M252Y/S254T/T256E e uma sequência “knob-bearing” é SEQ ID NO: 52:
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGX
[00259] em que X é lisina (K) ou está ausente.
[00260] Uma sequência de IgG1 preferida de aminoácidos para os Domínios CH2 e CH3 de outra cadeia polipeptídica contendo Domínio Fc de uma molécula contendo Domínio Fc da presente invenção tendo duas cadeias polipeptídicas (ou a terceira cadeia polipeptídica de uma molécula contendo Domínio Fc tendo três, quatro ou cinco cadeias polipeptídicas) terá a sequência “hole-bearing” (SEQ ID NO: 53):
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNRYTQKS LSLSPGX
[00261] em que X é lisina (K) ou está ausente.
[00262] Uma sequência alternativa de IgG1 de aminoácidos para os Domínios CH2 e CH3 de outra cadeia polipeptídica contendo Domínio Fc de uma molécula contendo Domínio Fc da presente invenção tendo uma substituição M252Y/S254T/T256E e uma sequência “hole-bearing” é SEQ ID NO: 54:
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNRYTQKS LSLSPGX
[00263] em que X é lisina (K) ou está ausente.
[00264] Como será observado, os Domínios CH2-CH3 da SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO: 54 incluem uma substituição na posição 234 com alanina e 235 com alanina e assim formam um Domínio Fc que exibe ligação diminuída (ou substancialmente nenhuma) de FcγRIA (CD64), FcγRIIA (CD32A), FcγRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD16a) ou FcγRIIIB (CD16b) (em relação à ligação exibida pelo Domínio Fc de tipo selvagem (SEQ ID NO: 12). A invenção também abrange tais Domínios CH2-CH3, que compreendem substituições alternativas e/ou adicionais dos resíduos de alanina de tipo selvagem, que modificam a função efetora e/ou ligação atividade de FγR do Domínio Fc. A invenção também abrange tais Domínios CH2-CH3, que compreendem ainda uma ou mais substituições que estendem a meia-vida de aminoácidos. Em particular, a invenção abrange esses Domínios CH2-CH3 hole- bearing e knob-bearing que compreendem ainda M252Y/S254T/T256E.
[00265] Uma sequência de aminoácidos de IgG4 para os Domínios CH2 e CH3 de uma cadeia polipeptídica contendo Domínio Fc de uma molécula contendo Domínio Fc da presente invenção tem meia-vida sérica aprimorada (em relação aos Domínios CH2 e CH3 de IgG1) devido à sua posse de Y252/T254/E256 (SEQ ID NO: 55):
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGX
[00266] em que X é lisina (K) ou está ausente.
[00267] Uma variante “knob-bearing” desta sequência de aminoácidos CH2-CH3 de IgG4 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56:
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGX
[00268] em que X é lisina (K) ou está ausente.
[00269] Uma variante “hole-bearing” de uma sequência de aminoácidos CH2-CH3 de IgG4 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57:
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNRYTQKS LSLSLGX
[00270] em que X é lisina (K) ou está ausente.
[00271] É preferido que a primeira cadeia polipeptídica tenha uma sequência CH2-CH3 “knob-bearing”, tal como da SEQ ID NO: 51 ou SEQ ID NO: 52. Entretanto, como será reconhecido, um Domínio CH2-CH3 “hole-bearing” (por exemplo, SEQ ID NO: 53 ou SEQ ID NO: 54) pode ser utilizado na primeira cadeia polipeptídica, caso este em que, um Domínio CH2-CH3 “knob-bearing” (por exemplo, SEQ ID NO: 51 ou SEQ ID NO: 52) será utilizado na segunda cadeia polipeptídica de uma molécula contendo Domínio Fc da presente invenção tendo duas cadeias polipeptídicas (ou na terceira cadeia polipeptídica de uma molécula contendo Domínio Fc tendo três, quatro ou cinco cadeias polipeptídicas).
[00272] Em outras modalidades, a invenção abrange moléculas de ligação contendo Domínio Fc compreendendo os Domínios CH2 e/ou CH3 que foram manipulados para favorecer a heterodímeroização sobre a homodimerização usando mutações conhecidas na técnica, tais como aquelas divulgadas na Publicação PCT No WO 2007/110205; WO 2011/143545; WO 2012/058768; WO 2013/06867, todas as quais são aqui incorporadas por referência em sua totalidade. III. MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO TRIVALENTES CONTENDO OS
DOMÍNIOS FC
[00273] Uma outra modalidade da presente invenção refere-se a moléculas de ligação trivalentes compreendendo um Domínio Fc capazes de se ligarem simultaneamente a um Primeiro Epítopo, um Segundo Epítopo e um Terceiro Epítopo, em que pelo menos um destes epítopos não é idêntico ao outro. Tais moléculas de ligação trivalentes compreendem três Domínios de Ligação ao Epítopo, dois dos quais são Domínios de Ligação do Tipo Diacorpo, que fornecem o Domínio de Ligação A e o Domínio de Ligação B e um que é um Domínio de Ligação do Tipo Fab ou um Domínio de Ligação do Tipo scFv, que fornece Domínio de Ligação C (ver, por exemplo, Figuras 6A-6H, Publicações PCT Nos. WO 2015/184207 e WO 2015/184203). Tais moléculas de ligação trivalentes compreendem os domínios “VL1”/”VH1” que são capazes de se ligar ao Primeiro Epítopo e domínios “VL2”/”VH2” que são capazes de se ligar ao Segundo Epítopo e domínios “VL3” e “VH3” que são capazes de se ligar ao “terceiro” epítopo desta molécula de ligação trivalente. Um “Domínio de Ligação do Tipo Diacorpo” é o tipo de Domínio de Ligação ao Epítopo presente em um diacorpo, como descrito acima. Cada um de um “Domínio de Ligação do Tipo Fab” e um “Domínio de Ligação do Tipo scFv” são Domínios de Ligação ao
Epítopo que são formados pela interação do Domínio VL de uma Cadeia leve de imunoglobulina e um Domínio VH complementar de uma Cadeia Pesada de imunoglobulina. Domínios de Ligação do Tipo Fab diferem dos Domínios de Ligação do Tipo Diacorpo em que as duas cadeias polipeptídicas que formam um Domínio de Ligação do Tipo Fab compreendem apenas um único Domínio de Ligação ao Epítopo, enquanto as duas cadeias polipeptídicas que formam um Domínio de Ligação do Tipo Diacorpo compreendem pelo menos dois Domínios de Ligação ao Epítopo. Similarmente, Domínios de Ligação do Tipo scFv também diferem dos Domínios de Ligação do Tipo Diacorpo em que compreendem apenas um único Domínio de Ligação ao Epítopo. Assim, como aqui usado Domínios de Ligação do Tipo Fab e do Tipo scFv são distintos dos Domínios de Ligação do Tipo Diacorpo.
[00274] Tipicamente, as Moléculas de Ligação trivalentes da presente invenção compreenderão quatro diferentes cadeias polipeptídicas (ver Figuras 6A-6B), entretanto, as moléculas podem compreender números menores ou maiores de cadeias polipeptídicas, por exemplo fundindo-se essas cadeias polipeptídicas uma à outra (por exemplo, por meio de uma ligação peptídica) ou dividindo-se essas cadeias polipeptídicas para formar cadeias polipeptídicas adicionais ou associando-se cadeias polipeptídicas menores ou adicionais por meio de ligações dissulfeto. Figuras 6E-6F ilustra este aspecto da presente invenção representando esquematicamente tais moléculas tendo três cadeias polipeptídicas. Como fornecido nas Figuras 6A-6H, as moléculas de ligação trivalentes da presente invenção podem ter orientações alternativas em que os Domínios de Ligação do Tipo Diacorpo são N-terminais (Figuras 6A, 6B, 6C, 6E e 6F) ou C-terminais
(Figuras 6D, 6G e 6H) a um Domínio Fc. Os Domínios CH2 e CH3 úteis para a geração de moléculas de ligação trivalentes são fornecidos acima e incluem domínios knob-bearing e hole- bearing.
[00275] Em certas modalidades, a primeira cadeia polipeptídica de tais moléculas de ligação trivalentes da presente invenção contém: (i) um Domínio contendo VL1, (ii) um Domínio contendo VH2, (iii) um Domínio Promotor Heterodímero e (iv) um Domínio contendo uma sequência CH2- CH3. Os Domínios VL1 e VL2 estão localizados N-terminal ou C- terminal ao domínio contendo CH2-CH3 como apresentado na Tabela 4 (ver também, Figuras 6A e 6B). A segunda cadeia polipeptídica destas modalidades contém: (i) um Domínio contendo VL2, (ii) um Domínio contendo VH1 e (iii) um Domínio Promotor Heterodímero. A terceira cadeia polipeptídica destas modalidades contém: (i) um Domínio contendo VH3, (ii) um Domínio contendo CH1 e (iii) um Domínio contendo uma sequência CH2-CH3. A terceira cadeia polipeptídica pode ser a Cadeia Pesada de um anticorpo que contém um VH3 e uma região constante de Cadeia Pesada ou um polipeptídeo que contém tais domínios. O quarto polipeptídeo destas modalidades contém: (i) um Domínio contendo VL3 e (ii) um Domínio contendo CL. As quartas cadeias polipeptídicas podem ser uma cadeia leve de um anticorpo que contém um VL3 complementar ao VH3 da terceira cadeia polipeptídica ou um polipeptídeo que contém tais domínios. A terceira ou quarta cadeias polipeptídicas podem ser isoladas dos anticorpos de ocorrência natural. Alternativamente, eles podem ser construídos recombinantemente, sinteticamente ou por outros meios.
[00276] O Domínio Variável de Cadeia Leve das primeira e segunda cadeias polipeptídicas é separado dos Domínios Variáveis de Cadeia Pesada destas cadeias polipeptídicas por um peptídeo espaçador de intervenção tendo um comprimento que é muito curto para permitir que seus domínios VL1/VH2 (ou seus VL2/VH1) se associem para formar um Domínio de Ligação ao Epítopo capaz de se ligar ao primeiro ou segundo Epítopo.
Um peptídeo espaçador de intervenção preferido (Conector 1) para este propósito tem a sequência (SEQ ID NO: 16): GGGSGGGG.
Outros Domínios das moléculas de ligação trivalentes podem ser separados por um ou mais peptídeos espaçadores de intervenção (Conectores), opcionalmente compreendendo um resíduo de cisteína.
Em particular, como fornecido acima, esses Conectores tipicamente serão incorporados entre os Domínios variáveis (isto é, VH ou VL) e Domínios Promotores Heterodímeros de peptídeos (por exemplo, um espiral E ou espiral K) e entre esses Domínios Promotores Heterodímeros de peptídeos (por exemplo, um espiral E ou espiral K) e Domínios CH2-CH3. Conectores exemplificativos úteis para a geração de moléculas de ligação trivalentes são fornecidos acima e também são fornecidos nos Pedidos PCT Nos: PCT/US15/33081; e PCT/US15/33076. Assim, a primeira e segunda cadeias polipeptídicas de tais moléculas de ligação trivalentes se associam para formar um Domínio de Ligação VL1/VH1 capaz de se ligar a um Primeiro Epítopo, bem como um Domínio de Ligação VL2/VH2 que é capaz de se ligar a um Segundo Epítopo.
A terceira e quarta cadeias polipeptídicas de tais moléculas de ligação trivalentes se associam para formar um Domínio de Ligação VL3/VH3 que é capaz de se ligar a um Terceiro Epítopo.
[00277] Como descrito acima, as moléculas de ligação trivalentes da presente invenção podem compreender três polipeptídeos. As moléculas de ligação trivalentes compreendendo três cadeias polipeptídicas podem ser obtidas por ligação aos Domínios do quarto polipeptídeo N-terminal ao Domínio contendo VH3 do terceiro polipeptídeo (por exemplo, usando um peptídeo espaçador de intervenção (Conector 4)). Alternativamente, uma terceira cadeia polipeptídica de uma molécula de ligação trivalente da invenção contendo os seguintes domínios é utilizada: (i) um Domínio contendo VL3, (ii) um Domínio contendo VH3 e (iii) um Domínio contendo uma sequência CH2-CH3, em que VL3 e VH3 são espaçados um do outro por um peptídeo espaçador de intervenção que é suficientemente longo (pelo menos 9 ou mais resíduos de aminoácido) de modo a permitir a associação destes domínios para formar um Domínio de Ligação ao Epítopo. Um peptídeo espaçador de intervenção preferido para este propósito tem a sequência: GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 41).
[00278] Será entendido que os Domínios VL1/VH1, VL2/VH2 e VL3/VH3 de tais moléculas de ligação trivalentes podem ser diferentes de modo a permitir a ligação que é monoespecífica, biespecífica ou triespecífica. Em particular, os Domínios VL e VH podem ser selecionados de modo que uma molécula de ligação trivalente compreende dois Domínios de Ligação para um Primeiro Epítopo e um Domínio de Ligação para um Segundo Epítopo ou um Domínio de Ligação para um Primeiro Epítopo e dois Domínios de Ligação para um Segundo Epítopo ou um Domínio de Ligação para um Primeiro Epítopo, um Domínio de Ligação para um Segundo Epítopo e um Domínio de Ligação para um Terceiro Epítopo.
[00279] A estrutura geral das cadeias polipeptídicas de moléculas de ligação trivalentes representativas da invenção é fornecida nas Figuras 6A-6H e na Tabela 5: Tabela 5 2a NH2-VL2-VH1-HPD-COOH Cadeia 1a 1a Orientaçã NH2-VL1-VH2-HPD-CH2-CH3-COOH Cadeia o de Quatro 3a NH2-VH3-CH1-CH2-CH3-COOH Cadeias Cadeia 2a NH2-VL3-CL-COOH Cadeia 2a NH2-VL2-VH1-HPD-COOH Cadeia 2a 1a Orientaçã NH2-CH2-CH3-VL1-VH2-HPD-COOH Cadeia o de Quatro 3a NH2-VH3-CH1-CH2-CH3-COOH Cadeias Cadeia 2a NH2-VL3-CL-COOH Cadeia 2a NH2-VL2-VH1-HPD-COOH Cadeia 1a Orientaçã 1a NH2-VL1-VH2-HPD-CH2-CH3-COOH o de Três Cadeia Cadeias 3a NH2-VL3-VH3-HPD-CH2-CH3-COOH Cadeia 2a NH2-VL2-VH1-HPD-COOH Cadeia 2a Orientaçã 1a NH2-CH2-CH3-VL1-VH2-HPD-COOH o de Três Cadeia Cadeias 3a NH2-VL3-VH3-HPD-CH2-CH3-COOH Cadeia HPD = Domínio Promotor Heterodímero
[00280] Como fornecido acima, tais moléculas de ligação trivalentes podem compreender três, quatro, cinco ou mais cadeias polipeptídicas. IV. MODALIDADES DA INVENÇÃO
[00281] Como estabelecido acima, a presente invenção é dirigida a uma Molécula de Ligação CD16 x DA (por exemplo, um anticorpo, um diacorpo, um scFv, um anticorpo, um TandAb, etc.) compreendendo um Domínio de Ligação capaz de se ligar a um epítopo de CD16 (isto é, um “Domínio de Ligação a CD16”) e um Domínio de Ligação capaz de se ligar a um epítopo de um Antígeno de Doença (isto é, um “Domínio de Ligação ao Antígeno de Doença”). A invenção abrange, portanto, moléculas de ligação compreendendo um ou mais dos Domínios VH e/ou VL de um anticorpo que se liga a CD16 ou, mais preferivelmente, as porções CDRH1, CDRH2 e CDRH3 e CDRL1, CDRL2 e CDRL3 de tais domínios. Em uma modalidade preferida da invenção, essas moléculas de ligação adicionalmente conterão Domínios de Ligação suficientes para permitir que tais moléculas se liguem a epítopos de um, dois, três ou mais que três Antígenos de Doença. A presente invenção também é dirigida a composições farmacêuticas que compreendem essa molécula (ou moléculas).
[00282] Por possuir Domínios de Ligação suficientes para se ligar imunoespecificamente a CD16 e um Antígeno de Doença, as moléculas da presente invenção têm a capacidade para colocalizar células que expressam CD16 (e especialmente células Exterminadoras Naturais) no sítio (ou sítios) de células que expressam o Antígeno de Doença de modo a realçar a probabilidade de morte mediada por ADCC da célula alvo. Como discutido acima, tais moléculas podem ser biespecíficas ou podem ser capazes de se ligar a mais de dois epítopos.
[00283] Em uma modalidade, essas moléculas de ligação CD16 da presente invenção serão monoespecíficas de modo a possuir a capacidade para se ligar a apenas um único epítopo de CD16 e apenas um único epítopo de um Antígeno de Doença.
[00284] Alternativamente, tais moléculas podem ser multiespecíficas, isto é, capazes de se ligar a um, dois, três ou quatro epítopos totais, que pode ser repartidas de qualquer maneira para se ligarem a um, dois ou três epítopos de CD16 (em que dois ou três epítopos de CD16 podem ser iguais ou diferentes) e um, dois ou três epítopos de um ou mais Antígenos de Doença.
[00285] Assim, onde tais moléculas são capazes de se ligar imunoespecificamente a apenas um único Antígeno de Doença, elas podem ser capazes de se ligar imunoespecificamente a apenas um epítopo de CD16 e a um, dois ou três epítopos do Antígeno de Doença (em que dois epítopos do Antígeno de Doença podem ser iguais ou diferentes e que três epítopos podem ser iguais ou podem ser diferentes ou podem ser dois epítopos que são iguais e um epítopo que é diferente) ou elas podem ser capazes de se ligar imunoespecificamente a apenas dois epítopos de CD16 (em que dois epítopos podem ser iguais ou diferentes) e um ou dois epítopos do Antígeno de Doença (em que dois epítopos do Antígeno de Doença podem ser iguais ou diferentes) ou elas podem ser capazes de se ligar imunoespecificamente a três epítopos de CD16 (em que três epítopos podem ser iguais ou podem ser diferentes ou podem ser dois epítopos que são iguais e um epítopo que é diferente) e 1 epítopo do Antígeno de Doença.
[00286] Similarmente, onde tais moléculas são capazes de se ligar imunoespecificamente a dois diferentes Antígenos de Doença (por exemplo, um Primeiro Antígeno de Doença e um Segundo Antígeno de Doença), elas podem ser capazes de se ligar imunoespecificamente a apenas um epítopo de CD16 e a um ou dois epítopos do primeiro Antígeno de Doença (em que os dois primeiros epítopos do Antígeno de Doença podem ser iguais ou diferentes) e um ou dois epítopos do Segundo Antígeno de Doença (em que dois epítopos do Segundo Antígeno de Doença podem ser iguais ou diferentes) ou elas podem ser capazes de se ligar imunoespecificamente a apenas dois epítopos de CD16 (em que dois epítopos podem ser iguais ou diferentes) e um epítopo do Primeiro Antígeno de Doença e um epítopo do Segundo Antígeno de Doença.
[00287] Similarmente, tais moléculas podem ser capazes de se ligar imunoespecificamente a três diferentes Antígenos de Doença (por exemplo, um Primeiro Antígeno de Doença, um Segundo Antígeno de Doença e um Terceiro Antígeno de Doença) e apenas um epítopo de CD16.
[00288] Assim, por exemplo, tais moléculas podem se ligar a:
[00289] (1) um único epítopo de CD16 e um único epítopo de um Antígeno de Doença que estão dispostos na superfície da célula alvo;
[00290] (2) um único epítopo de CD16 e dois epítopos de um Antígeno de Doença que estão dispostos na superfície da célula alvo
[00291] (3) um único epítopo de CD16 e três epítopos de um Antígeno de Doença que estão dispostos na superfície da célula alvo;
[00292] (4) um único epítopo de CD16, um epítopo de um Primeiro Antígeno de Doença que estão dispostos na superfície da célula alvo e um epítopo de um Segundo Antígeno de Doença que estão dispostos na superfície da célula alvo;
[00293] (5) um único epítopo de CD16, dois epítopos de um Primeiro Antígeno de Doença que estão dispostos na superfície da célula alvo e um epítopo de um Segundo Antígeno de Doença que estão dispostos na superfície da célula alvo;
[00294] (6) dois epítopos de CD16 e um único epítopo de um Antígeno de Doença que estão dispostos na superfície da célula alvo;
[00295] (7) dois epítopos de CD16 e dois epítopos de um Antígeno de Doença que estão dispostos na superfície da célula alvo;
[00296] (8) dois epítopos de CD16 e um epítopo de um Primeiro Antígeno de Doença que estão dispostos na superfície da célula alvo e um epítopo de um Segundo Antígeno de Doença que estão dispostos na superfície da célula alvo;
[00297] (9) três epítopos de CD16 e um epítopo de um Antígeno de Doença que estão dispostos na superfície da célula alvo;
[00298] em todos casos em que ligação é a mais de um epítopo de CD16 ou um Antígeno de Doença, esses epítopos podem ser iguais ou podem ser diferentes ou podem ser iguais para um epítopo e diferentes para o outro epítopo.
[00299] Tabela 6 ilustra possíveis combinações de especificidades de ligação de moléculas exemplificativas da invenção.
Tabela 6 Número de Epítopos Reconhecidos por Moléculas de Ligação CD16 x DA Exemplificativas da Invenção Possuindo Dois, Três ou Quatro Domínios de Ligação ao Epítopo Que São Capazes de Mediar a Morte Redirecionada de uma Célula Alvo Número de Epítopos Número Número de Número de Número de da Total de Número de Epítopos Epítopos Epítopos Molécula Domínios Epítopos do 1o do 2o do 3o de de de CD16 Antígeno Antígeno Antígeno Superfíci Ligação de Doença de Doença de Doença e Celular Não CD16 2 1 1 0 0 0 3 1 1 1 0 0 3 1 1 0 0 1 3 1 2 0 0 0 3 2 1 0 0 0 4 1 1 1 0 1 4 1 1 1 1 0 4 1 2 0 0 1 4 1 2 1 0 0 4 2 1 1 0 0 4 2 1 0 0 1
[00300] Ao formar mais moléculas complexas, pode- se obter moléculas de ligação CD16 que são capazes de se ligar a um ou mais Antígenos de Doença e que possuem mais de quatro domínios de ligação ao epítopo. Assim, nenhuma limitação é colocada à natureza dos epítopos ou epítopos adicionais que podem ser ligados pelas moléculas da presente invenção exceto que essa capacidade de ligação adicional não evite que a Molécula ou Domínio de Ligação da mesma de seja capaz de se ligar a um epítopo de CD16 a partir desta ligação e não evite que a Molécula ou Domínio de Ligação da mesma seja capaz de se ligar a um epítopo de um Antígeno de Doença a partir desta ligação. Assim, as Moléculas de Ligação CD16 da presente invenção podem possuir Domínios de Ligação ao Epítopo alternativos ou Domínios de Ligação ao Epítopo adicionais. Como um exemplo, a invenção contempla uma molécula de ligação que compreende um primeiro Domínio de Ligação ao Epítopo capaz de se ligar imunoespecificamente a um epítopo de CD16 e um Segundo Domínio de Ligação ao Epítopo que é capaz de se ligar imunoespecificamente a um epítopo de um Antígeno de Doença que está disposto na superfície desta célula alvo e um Terceiro Domínio de Ligação ao Epítopo capaz de se ligar imunoespecificamente a uma molécula diferente da superfície celular, tal como uma molécula da superfície celular não CD16 de uma célula Exterminadora Natural. V. MOLÉCULAS EXEMPLIFICATIVAS DE LIGAÇÃO
[00301] A presente invenção é dirigida a moléculas (por exemplo, um anticorpo, um diacorpo, um scFv, um anticorpo, um TandAb, etc.) capazes de se ligar a CD16 humano em virtude de possuírem um Domínio de Ligação a CD16. A presente invenção é particularmente dirigida a essas Moléculas de Ligação CD-16 que são Moléculas de Ligação CD16 x DA. São listados abaixo anticorpos exemplificativos que podem ser usados para produzir as moléculas de ligação e terapia de combinação da presente invenção. A. ANTICORPOS ANTI-CD16 HUMANO EXEMPLIFICATIVOS
1. CD16-M1 E CD16-M2 E SEUS DERIVADOS HCD16-M1 E HCD16-M2 HUMANIZADOS
[00302] A presente invenção fornece anticorpos monoclonais anti-CD16 humano de murino: CD16-M1 e CD16-M2 e seus derivados humanizados: hCD16-M1 e hCD16-M2, que são anticorpos monoclonais anti-CD16 humano inovadores de alta afinidade que se ligam bem ao alótipo CD16 158F e ao alótipo CD16 158V e que se ligam a CD16 em um sítio que não bloqueia a ligação CD16-IgG. Esses anticorpos são particularmente preferidos para os propósitos da presente invenção visto que eles podem ser prontamente utilizados em uma população de pacientes independentemente de seus polimorfismos 158F/158V CD16A. (A) ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-CD16 HUMANO CD16-M1
[00303] A sequência de aminoácidos do Domínio VH do anticorpo monoclonal anti-CD16 humano de murino CD16-M1 (SEQ ID NO: 64) é mostrada abaixo (resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
EVKLVESGGT LVKPGGSLKL SCAASGFTFN NYGMSWVRQT PEKRLEWVAT ISGGGSYTFY PDSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMSSLRSED TALYYCIRQS ARAPEPYWGQ GTLVTVSS
[00304] A sequência de aminoácidos do Domínio VL do anticorpo monoclonal anti-CD16 humano de murino CD16-M1 (SEQ ID NO: 65) é mostrada abaixo (resíduos de CDRL são mostrados sublinhados):
DIVMTQSQKF MSTSVGDRVS VTCKASQNVG THVAWYQQKS GQSPKSLLYS ASYRYSGVPD RFSGSGSGTD FTLTISNVQS EDLAEYFCQQ YKSYPLTFGA GTKLELK
[00305] As CDRs do anticorpo monoclonal anti-CD16 humano CD16-M1 são mostradas na Tabela 7. Tabela 7 CDRs do Anticorpo Monoclonal Anti-CD16 Humano CD16-M1 CDR Sequência SEQ ID NO CDRH1 NYGMS SEQ ID NO: 66 CDRH2 TISGGGSYTFYPDSVKG SEQ ID NO: 67
CDRH3 QSARAPEPY SEQ ID NO: 68 CDRL1 KASQNVGTHVA SEQ ID NO: 69 CDRL2 SASYRYS SEQ ID NO: 70 CDRL3 QQYKSYPLT SEQ ID NO: 71
[00306] hCD16-M1 é um derivado humanizado do anticorpo monoclonal anti-CD16 humano de murino CD16-M1. A sequência de aminoácidos do Domínio VH de hCD16-M1 (SEQ ID NO: 72) é mostrada abaixo (resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS NYGMSWVRQA PGKGLEWVAT ISGGGSYTFY PDSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRTED TALYYCVRQS ARAPEPYWGQ GTLVTVSS
[00307] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de hCD16-M1 (SEQ ID NO: 73) é mostrada abaixo (resíduos de CDRL são mostrados sublinhados):
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASQNVG THVAWYQQKP GKAPKSLLYS ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQS EDIATYYCQQ YKSYPLTFGQ GTKLEIK
[00308] hCD16-M1A é um derivado otimizado do anticorpo monoclonal anti-CD16 humano humanizado hCD16-M1. hCD16-M1A compreende o Domínio VL de hCD16-M1 (SEQ ID NO: 73) e um Domínio VH otimizado compreendendo mutações em CDRH3. A sequência de aminoácidos do Domínio VH otimizado de hCD16-M1A (SEQ ID NO: 58) é mostrada abaixo (os resíduos de CDRH3 mutados são mostrados sublinhados):
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS NYGMSWVRQA PGKGLEWVAT ISGGGSYTFY PDSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRTED TALYYCVRQS ANSPVPYWGQ GTLVTVSS
[00309] hCD16-M1B é um derivado otimizado do anticorpo monoclonal anti-CD16 humano humanizado hCD16-M1.
hCD16-M1B compreende o Domínio VH de hCD16-M1 (SEQ ID NO: 72) e um Domínio VL otimizado compreendendo mutações em CDRL3. A sequência de aminoácidos do Domínio VL otimizado de hCD16-M1B (SEQ ID NO: 59) é mostrada abaixo (os resíduos de CDRL3 mutados são mostrados sublinhados):
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASQNVG THVAWYQQKP GKAPKSLLYS ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQS EDIATYYCQD YTNYPLTFGQ GTKLEIK
[00310] hCD16-M1AB é um derivado otimizado do anticorpo monoclonal anti-CD16 humano humanizado hCD16-M1. hCD16-M1AB compreende o Domínio VH otimizado de hCD16-M1A (SEQ ID NO: 58) e o Domínio VL otimizado de hCD16-M1B (SEQ ID NO: 59).
[00311] As CDRs do anticorpo monoclonal anti-CD16 humano humanizado hCD16-M1 e os anticorpos monoclonais anti- CD16 humano hCD16-M1A, hCD16-M1B, hCD16-M1AB otimizados são mostrados na Tabela 8. Tabela 8 CDRs de Anticorpo Monoclonal Anti-CD16 Humano hCD16-M1 CDR Sequência SEQ ID NO CDRH1 NYGMS SEQ ID NO: 66 CDRH2 TISGGGSYTFYPDSVKG SEQ ID NO: 67 CDRH3 QSARAPEPY SEQ ID NO: 68 CDRL1 RASQNVGTHVA SEQ ID NO: 74 CDRL2 SASYRYS SEQ ID NO: 70 CDRL3 QQYKSYPLT SEQ ID NO: 71 hCD16-M1A CDRH1 NYGMS SEQ ID NO: 66 CDRH2 TISGGGSYTFYPDSVKG SEQ ID NO: 67 CDRH3 QSANSPVPY SEQ ID NO: 60
CDRL1 RASQNVGTHVA SEQ ID NO: 74 CDRL2 SASYRYS SEQ ID NO: 70 CDRL3 QQYKSYPLT SEQ ID NO: 71 hCD16-M1B CDRH1 NYGMS SEQ ID NO: 66 CDRH2 TISGGGSYTFYPDSVKG SEQ ID NO: 67 CDRH3 QSARAPEPY SEQ ID NO: 68 CDRL1 RASQNVGTHVA SEQ ID NO: 74 CDRL2 SASYRYS SEQ ID NO: 70 CDRL3 QDYTNYPLT SEQ ID NO: 61 hCD16-M1AB CDRH1 NYGMS SEQ ID NO: 66 CDRH2 TISGGGSYTFYPDSVKG SEQ ID NO: 67 CDRH3 QSANSPVPY SEQ ID NO: 60 CDRL1 RASQNVGTHVA SEQ ID NO: 74 CDRL2 SASYRYS SEQ ID NO: 70 CDRL3 QDYTNYPLT SEQ ID NO: 61
[00312] Como será reconhecido, CDRL1 de hCD16-M1, hCD16-M1A, hCD16-M1B e hCD16-M1AB (RASQNVGTHVA; SEQ ID NO: 74) se defere de CDRL1 de CD16-M1 (KASQNVGTHVA; SEQ ID NO: 69) no primeiro resíduo. CDRL1 pode ser utilizado permutavelmente e a presente invenção abrange Moléculas de Ligação CD16 humanizadas e otimizadas que compreendem um Domínio de Ligação ao Epítopo de CD16 tendo a sequência de aminoácidos de 1, 2 ou 3 das seguintes CDRHs e/ou 1, 2 ou 3 de tais CDRLs. (B) ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-CD16 HUMANO CD16-M2
[00313] A sequência de aminoácidos do Domínio VH do anticorpo monoclonal anti-CD16 humano de murino CD16-M2 (SEQ ID NO: 75) é mostrada abaixo (resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
EVQLQQSGPE LVKPGASVKM SCKASGYTFT SSAMHWVKKN PGQGLEWIGY INHYNDGIKY NERFKGKATL TSDKSSSTAY MELSSLTSED SAVYYCATGY RYASWFASWG QGTLVTVSS
[00314] A sequência de aminoácidos do Domínio VL do anticorpo monoclonal anti-CD16 humano de murino CD16-M2 (SEQ ID NO: 76) é mostrada abaixo (resíduos de CDRL são mostrados sublinhados):
DILLTQSPAI LSVSPGERVS FSCRASQNIG TSIHWYQQRT DGSPRLLIKS VSESISGIPS RFSGSGSGTD FTLTINGVES GDISDYYCQQ SNSWPLTFGA GTKLELK
[00315] As CDRs do anticorpo monoclonal anti-CD16 humano CD16-M2 são mostradas na Tabela 9: Tabela 9 CDRs do Anticorpo Monoclonal Anti-CD16 Humano CD16-M2 CDR Sequência SEQ ID NO CDRH1 SSAMH SEQ ID NO: 77 CDRH2 YINHYNDGIKYNERFKG SEQ ID NO: 78 CDRH3 GYRYASWFAS SEQ ID NO: 79 CDRL1 RASQNIGTSIH SEQ ID NO: 80 CDRL2 SVSESIS SEQ ID NO: 81 CDRL3 QQSNSWPLT SEQ ID NO: 82
[00316] hCD16-M2 é um derivado humanizado do anticorpo monoclonal anti-CD16 humano de murino CD16-M2. A humanização resultou em dois Domínios VH adequados (hCD16-M2 VH1 e hCD16-M2 VH2), ambos os quais podem ser utilizados com o Domínio VL humanizado obtido (hCD16-M2 VL1).
[00317] A sequência de aminoácidos do Domínio VH hCD16-M2 VH1 (SEQ ID NO: 83) é mostrada abaixo (resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SSAMHWVRQA PGQGLEWMGY INHYNDGIKY NERFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCATGY RYASWFASWG QGTLVTVSS
[00318] A sequência de aminoácidos do Domínio VH hCD16-M2 VH2 (SEQ ID NO: 84) é mostrada abaixo (resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SSAMHWVRQA PGQGLEWMGY INHYNDGIKY NERFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARGY RYASWFASWG QGTLVTVSS
[00319] Como será reconhecido, a sequência de aminoácidos de hCD16-M2 VH1 (SEQ ID NO: 83) se difere daquela de hCD16-M2 VH2 (SEQ ID NO: 84) em possuir uma substituição T98R no resíduo que precede imediatamente CDRH3 (mostrado na caixa acima).
[00320] A sequência de aminoácidos do Domínio VL hCD16-M2 VL1 (SEQ ID NO: 85) é mostrada abaixo (resíduos de CDRL são mostrados sublinhados):
EIVLTQSPAT LSVSPGERAT LSCRASQNIG TSIHWYQQKP DQSPKLLIKS VSESISGVPS RFSGSGSGTD FTLTINSLEA EDFATYYCQQ SNSWPLTFGQ GTKLEIK
[00321] As CDRs do anticorpo monoclonal anti-CD16 humano humanizado hCD16-M2 são mostrados na Tabela 10. Tabela 10 CDRs do Anticorpo Monoclonal Anti-CD16 Humano hCD16-M2 CDR Sequência SEQ ID NO CDRH1 SSAMH SEQ ID NO: 77 CDRH2 YINHYNDGIKYNERFKG SEQ ID NO: 78 CDRH3 GYRYASWFAS SEQ ID NO: 79 CDRL1 RASQNIGTSIH SEQ ID NO: 80 CDRL2 SVSESIS SEQ ID NO: 81 CDRL3 QQSNSWPLT SEQ ID NO: 82 B. ANTICORPOS EXEMPLIFICATIVOS QUE SE LIGAM À
SUPERFÍCIE CELULAR DE CÉLULAS EFETORAS
[00322] As Moléculas de Ligação CD16 x DA da presente invenção e particularmente as Moléculas de Ligação CD16 x DA triespecíficas da presente invenção podem compreender um sítio de ligação para uma molécula da superfície celular não CD16 de uma célula efetora. Como aqui usado, o termo “célula efetora” denota uma célula que medeia diretamente ou indiretamente a morte de células alvo (por exemplo, células estranhas, células infectadas ou células de câncer). Exemplos de células efetoras incluem Células T auxiliares, Células T citotóxicas, Células Exterminadoras Naturais (NK), células plasmáticas (células B que secretam anticorpo), macrófagos e granulócitos. Moléculas da superfície celular preferidas de tais células incluem CD2, CD3, CD8, CD16, TCR e o receptor NKG2D. Consequentemente, moléculas capazes de se ligar imunoespecificamente a um epítopo de tais moléculas ou a outras moléculas da superfície da célula efetora podem ser usadas de acordo com os princípios da presente invenção. Anticorpos exemplificativos, cujos Domínios VH e VL podem ser usados para construir moléculas capazes de mediar a morte redirecionada de uma célula alvo são fornecidos abaixo.
1. ANTICORPOS ANTI-NKG2D EXEMPLIFICATIVOS
[00323] Uma molécula preferida da superfície celular não CD16 de uma célula efetora Exterminadora Natural é o receptor NKG2D. O receptor NKG2D é expressado em todas as células Exterminadoras Naturais humanas (e de outros mamíferos) (Bauer, S. et al. (1999) “Activation Of NK Cells And T Cells By NKG2D, A Receptor For Stress-Inducible MICA”, Science 285(5428):727 a 729; Jamieson, A.M. et al. (2002)
“The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing”, Immunity 17(1):19 a 29) bem como em todas as células T CD8+ (Groh, V. et al. (2001) “Costimulation Of CD8αβ T Cells By NKG2D Via Engagement By MIC Induced On Virus-Infected Cells”, Nat. Immunol. 2(3):255 a 260; Jamieson, A.M. et al. (2002) “The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing”, Immunity 17(1):19 a 29). Esses ligantes de ligação e particularmente aqueles que não são expressados em células normais, incluem a molécula de histocompatibilidade 60 (H60), o produto do gene indutível precoce do ácido retinóico 1 (RAE-1) e o transcrito semelhante à proteina de ligação a UL16 murino 1 (MULT1) (Raulet D.H. (2003) “Roles Of The NKG2D Immunoreceptor And Its Ligands”, Nature Rev. Immunol. 3:781 a 790; Coudert, J.D. et al. (2005) “Altered NKG2D Function In NK Cells Induced By Chronic Exposure To Altered NKG2D Ligand- Expressing Tumor Cells”, Blood 106:1711 a 1717). As moléculas que se ligam especificamente ao Receptor NKG2D incluem os anticorpos anti-NKG2D “KYK-1.0” e “KYK-2,0” (Kwong, KY et al. (2008) “Generation, Affinity Maturation, And Characterization Of A Human Anti-Human NKG2D Monoclonal Antibody With Dual Antagonistic And Agonistic Activity”, J. Mol. Biol. 384:1143 a 1156).
[00324] A sequência de aminoácidos do Domínio VH de KYK-1.0 (SEQ ID NO: 86) é mostrada abaixo (resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
EVQLVESGGG VVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYGMHWVRQA PGKGLEWVAF IRYDGSNKYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTKY LQMNSLRAED TAVYYCAKDR FGYYLDYWGQ GTLVTVSS
[00325] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de KYK-1.0 (SEQ ID NO: 87) é mostrada abaixo (resíduos de CDRL são mostrados sublinhados):
QPVLTQPSSV SVAPGETARI PCGGDDIETK SVHWYQQKPG QAPVLVIYDD DDRPSGIPER FFGSNSGNTA TLSISRVEAG DEADYYCQVW DDNNDEWVFG GGTQLTVL
[00326] A sequência de aminoácidos de um Domínio VH de KYK-2,0 (SEQ ID NO: 88) é mostrada abaixo (resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
QVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYGMHWVRQA PGKGLEWVAF IRYDGSNKYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKDR GLGDGTYFDY WGQGTTVTVS S
[00327] A sequência de aminoácidos de um Domínio VL de KYK-2,0 (SEQ ID NO: 89) é mostrada abaixo (resíduos de CDRL são mostrados sublinhados):
QSALTQPASV SGSPGQSITI SCSGSSSNIG NNAVNWYQQL PGKAPKLLIY YDDLLPSGVS DRFSGSKSGT SAFLAISGLQ SEDEADYYCA AWDDSLNGPV FGGGTKLTVL
[00328] Outros anticorpos exemplificativos que se ligam à superfície celular de uma célula Exterminadora Natural incluem anticorpos: A1, AC2, EPR3678(2), EPR20461, EPR20627 e IMG17B5F11 (que se ligam a CD39); TB01, HNK-1/Leu- 7 e NK1 (que se ligam a CD57); FN50 (que se liga a CD69); 5B5, B-L2, TS82b e C33 (que se ligam a CD82); 3B3, B199,2 e EP7169 (que se ligam a CD161); 17D9 (que se liga a CLEC1B); 2F9 (que se liga a KIR2DL1); EPR8825 (que se liga a KIR2DL2); mAb 33 (que se liga a KIR2DL4); 11E3, 17B4, EPR4392(2), EPR20261 e EPR 20627 (que se ligam ao Gene 3 de Ativação de Linfócitos); A10, C7, CX5, 1D11 e MM0489-10R27 (que se ligam a NKG2D); BMK13 (que se liga a PRG2); EPR9916 (que se liga a SLAMF6); etc. Anticorpos capazes de se ligar a cada uma destas moléculas da superfície celular não CD16 exemplificativas são comercialmente disponíveis da Abcam plc e outras fontes e podem ser prontamente adaptados aos propósitos da presente invenção.
2. ANTICORPOS ANTI-CD2 EXEMPLIFICATIVOS
[00329] Em uma modalidade, as moléculas da presente invenção que são capazes de mediar a morte redirecionada de uma célula alvo irão se ligar a uma célula efetora ligando-se imunoespecificamente a um epítopo de CD2 presente na superfície desta célula efetora. As moléculas que se ligam especificamente a CD2 incluem o anticorpo anti-CD2 “CD2 mAb Lo-CD2a”.
[00330] A sequência de aminoácidos do Domínio VH de CD2 mAb Lo-CD2a (No de Acesso ATCC: 11423); SEQ ID NO: 90) é mostrada abaixo (resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
EVQLQQSGPE LQRPGASVKL SCKASGYIFT EYYMYWVKQR PKQGLELVGR IDPEDGSIDY VEKFKKKATL TADTSSNTAY MQLSSLTSED TATYFCARGK FNYRFAYWGQ GTLVTVSS
[00331] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de CD2 mAb Lo-CD2a (No de Acesso ATCC: 11423; SEQ ID NO: 91) é mostrada abaixo (resíduos de CDRL são mostrados sublinhados):
DVVLTQTPPT LLATIGQSVS ISCRSSQSLL HSSGNTYLNW LLQRTGQSPQ PLIYLVSKLE SGVPNRFSGS GSGTDFTLKI SGVEAEDLGV YYCMQFTHYP YTFGAGTKLE LK
3. ANTICORPOS ANTI-CD8 EXEMPLIFICATIVOS
[00332] Em uma modalidade, as moléculas da presente invenção que são capazes de mediar a morte redirecionada de uma célula alvo irão se ligar a uma célula efetora ligando-se imunoespecificamente a um epítopo de CD8 presente na superfície desta célula efetora. Os anticorpos que se ligam especificamente a CD8 incluem os anticorpos anti-CD8 “OKT8” e “TRX2”.
[00333] A sequência de aminoácidos do Domínio VH de OKT8 (SEQ ID NO: 92) é mostrada abaixo (resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
QVQLLESGPE LLKPGASVKM SCKASGYTFT DYNMHWVKQS HGKSLEWIGY IYPYTGGTGY NQKFKNKATL TVDSSSSTAY MELRSLTSED SAVYYCARNF RYTYWYFDVW GQGTTVTVSS
[00334] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de OKT8 (SEQ ID NO: 93) é mostrada abaixo (resíduos de CDRL são mostrados sublinhados):
DIVMTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASESVD SYDNSLMHWY QQKPGQPPKV LIYLASNLES GVPARFSGSG SRTDFTLTID PVEADDAATY YCQQNNEDPY TFGGGTKLEI KR
[00335] A sequência de aminoácidos do Domínio VH de TRX2 (SEQ ID NO: 94) é mostrada abaixo (resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS DFGMNWVRQA PGKGLEWVAL IYYDGSNKFY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPH YDGYYHFFDS WGQGTLVTVS S
[00336] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de TRX2 (SEQ ID NO: 95) é mostrada abaixo (resíduos de CDRL são mostrados sublinhados):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKGSQDIN NYLAWYQQKP GKAPKLLIYN TDILHTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYYCYQ YNNGYTFGQG TKVEIK VI. ANTÍGENOS DE DOENÇA EXEMPLIFICATIVOS
[00337] Os Antígenos de Doença da presente invenção compreendem antígenos de superfície celular que são característicos de uma célula de câncer (“Antígenos de Câncer”) bem como os antígenos de superfície celular que são característicos de uma célula de patógeno ou uma célula infectada por um patógeno (Antígenos Associados a Patógenos”). A. ANTÍGENOS DE CÂNCER EXEMPLIFICATIVOS DISPOSTOS
NA SUPERFÍCIE DE CÉLULAS DE CÂNCER
[00338] Como aqui usado, o termo “Antígeno de Câncer” denota um antígeno que é caracteristicamente expressado na superfície de uma célula de câncer e que pode, portanto, ser tratado com uma Molécula Com Base no Anticorpo ou uma Molécula Imunomoduladora. Exemplos de Antígenos de Câncer incluem, mas não estão limitados a: 19.9 como encontrado em mucinas de câncer de cólon, câncer gástrico;
4.2; A33 (a colorectal carcinoma antigen; Almqvist, Y. (2006) “In vitro and in vivo Characterization of 177Lu-huA33: A Radioimmunoconjugate Against Colorectal Cancer”, Nucl. Med. Biol. 33(8):991 a 998); ADAM-9 (Publicação de Patente dos Estados Unidos No. 2006/0172350; Publicação PCT No WO 06/084075); AH6 como encontrado no câncer gástrico; ALCAM (Publicação PCT No WO 03/093443); APO-1 (antígeno linfocitário maligno humano) (Trauth, B.C. et al. (1989) “Monoclonal Antibody-Mediated Tumor Regression By Induction Of Apoptosis”, Science 245:301 a 304); B1 (Egloff, A.M. et al. (2006) “Cyclin B1 And Other Cyclins As Tumor Antigens In Immunosurveillance And Immunotherapy Of Cancer”, Cancer Res. 66(1):6 a 9); B7-H3 (Collins, M. et al. (2005) “The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands”, Genome Biol. 6:223.1-223.7). Chapoval, A. et al. (2001) “B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-γ Production”, Nature Immunol.
2:269 a 274; Sun, M. et al. (2002) “Characterization of Mouse and Human B7-H3 Genes”, J. Immunol. 168:6294 a 6297); BAGE (Bodey, B. (2002) “Cancer-Testis Antigens: Promising Targets For Antigen Directed Antineoplastic Immunotherapy”, Expert Opin. Biol. Ther. 2(6):577 a 584); beta-catenina (Prange W. et al. (2003) “Beta-Catenin Accumulation In The Progression Of Human Hepatocarcinogenesis Correlates With Loss Of E- Cadherin And Accumulation Of P53, But Not With Expression Of Conventional WNT-1 Target Genes”, J. Pathol. 201(2):250 a 259); grupo sanguíneo ALeb/Ley como encontrado em adenocarcinoma colônico; antígeno do linfoma de Burkitt-
38.13; C14 como encontrado em adenocarcinoma colônico; CA125 (antígeno do carcinoma de ovário) (Bast, R.C. Jr. et al. (2005) “New Tumor Markers: CA125 And Beyond”, Int. J. Gynecol. Cancer 15(Suppl 3):274 a 281; Yu et al. (1991) “Coexpression Of Different Antigenic Markers On Moieties That Bear CA 125 Determinants”, Cancer Res. 51(2):468-475); Carboxipeptidase M (Publicação de Patente dos Estados Unidos No 2006/0166291); CD5 (Calin, G.A. et al. (2006) “Genomics Of Chronic Lymphocytic Leukemia MicroRNAs As New Players With Clinical Significance”, Semin. Oncol. 33(2):167 a 173; CD19 (Ghetie et al. (1994) “Anti-CD19 Inhibits The Growth Of Human B-Cell Tumor Lines In Vitro And Of Daudi Cells In SCID Mice By Inducing Cell Cycle Arrest”, Blood 83:1329 a 1336; Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48); CD20 (Reff et al. (1994) “Depletion Of B Cells In Vivo By A Chimeric Mouse Human Monoclonal Antibody To CD20”, Blood 83:435 a 445; Thomas, D.A. et al. 2006 Hematol Oncol Clin North Am. 20(5):1125-36); CD22 (Kreitman, R.J. (2006) “Immunotoxins For Targeted Cancer Therapy”, AAPS J. 8(3):E532 a 51); CD23 (Rosati, S. et al. (2005) “Chronic Lymphocytic Leukaemia: A Review Of The Immuno-Architecture”, Curr.
Top.
Microbiol.
Immunol. 294:91 a 107); CD25 (Troussard, X. et al. (1998) “Hairy Cell Leukemia.
What Is New Forty Years After The First Description?” Hematol.
Cell.
Ther. 40(4):139 a 148); CD27 (Bataille, R. (2006) “The Phenotype Of Normal, Reactive And Malignant Plasma Cells.
Identification Of "Many And Multiple Myelomas" And Of New Targets For Myeloma Therapy”, Haematologica 91(9):1234 a 1240); CD28 (Bataille, R. (2006) “The Phenotype Of Normal, Reactive And Malignant Plasma Cells.
Identification Of "Many And Multiple Myelomas" And Of New Targets For Myeloma Therapy”, Haematologica 91(9):1234 a 1240); CD33 (Sgouros et al. (1993) “Modeling And Dosimetry Of Monoclonal Antibody M195 (Anti-CD33) In Acute Myelogenous Leukemia”, J.
Nucl.
Med. 34:422 a 430); CD36 (Ge, Y. (2005) “CD36: A Multiligand Molecule”, Lab Hematol. 11(1):31 a 7); CD40/CD154 (Messmer, D. et al. (2005) “CD154 Gene Therapy For Human B-Cell Malignancies”, Ann.
N. Y.
Acad.
Sci. 1062:51 a 60); CD45 (Jurcic, J.G. (2005) “Immunotherapy For Acute Myeloid Leukemia”, Curr.
Oncol.
Rep. 7(5):339-346); CD56 (Bataille, R. (2006) “The Phenotype Of Normal, Reactive And Malignant Plasma Cells.
Identification Of "Many And Multiple Myelomas" And Of New Targets For Myeloma Therapy”, Haematologica 91(9):1234 a 1240); CD46 (United States Patent No. 7,148,038; PCT Publication No.
WO 03/032814); CD52 (Eketorp, S.S. et al. (2014) “Alemtuzumab (Anti-CD52 Monoclonal Antibody) As Single-Agent Therapy In Patients With Relapsed/Refractory Chronic Lymphocytic Leukaemia (CLL)-A Single Region Experience On Consecutive Patients”, Ann Hematol. 93(10):1725 a 1733; Suresh, T. et al. (2014) “New
Antibody Approaches To Lymphoma Therapy”, J.
Hematol.
Oncol. 7:58; Hoelzer, D. (2013) “Targeted Therapy With Monoclonal Antibodies In Acute Lymphoblastic Leukemia”, Curr.
Opin.
Oncol. 25(6):701 a 706); CD56 (Bataille, R. (2006) “The Phenotype Of Normal, Reactive And Malignant Plasma Cells.
Identification Of "Many And Multiple Myelomas" And Of New Targets For Myeloma Therapy”, Haematologica 91(9):1234 a 1240); CD79a/CD79b (Troussard, X. et al. (1998) “Hairy Cell Leukemia.
What Is New Forty Years After The First Description?” Hematol.
Cell.
Ther. 40(4):139 a 148; Chu, P.G. et al. (2001) “CD79: A Review”, Appl.
Immunohistochem.
Mol.
Morphol. 9(2):97 a 106); CD103 (Troussard, X. et al. (1998) “Hairy Cell Leukemia.
What Is New Forty Years After The First Description?” Hematol.
Cell.
Ther. 40(4):139 a 148); CD317 (Kawai, S. et al. (2008) “Interferon-Α Enhances CD317 Expression And The Antitumor Activity Of Anti-CD317 Monoclonal Antibody In Renal Cell Carcinoma Xenograft Models”, Cancer Science 99(12):2461 a 2466; Wang, W. et al. (2009) HM1.24 (CD317) Is A Novel Target Against Lung Cancer For Immunotherapy Using Anti-HM1.24 Antibody”, Cancer Immunology, Immunotherapy 58(6):967 a 976; Wang, W. et al. (2009) “Chimeric And Humanized Anti-HM1.24 Antibodies Mediate Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Against Lung Cancer Cells.
Lung Cancer”, 63(1):23 a 31; Sayeed, A. et al. (2013) “Aberrant Regulation Of The BST2 (Tetherin) Promoter Enhances Cell Proliferation And Apoptosis Evasion In High Grade Breast Cancer Cells”, PLoS ONE 8(6)e67191, pp. 1 a 10); CDK4 (Lee, Y.M. et al. (2006) “Targeting Cyclins And Cyclin-Dependent Kinases In Cancer: Lessons From Mice, Hopes For Therapeutic Applications In Human”, Cell Cycle 5(18):2110 a 2114); CEA
(antígeno carcinoembrionário; Foon et al. (1995) “Immune Response To The Carcinoembryonic Antigen In Patients Treated With An Anti-Idiotype Antibody Vaccine”, J.
Clin.
Invest. 96(1):334 a 42); Mathelin, C. (2006) “Circulating Proteinic Biomarkers And Breast Cancer”, Gynecol.
Obstet.
Fertil. 34(7- 8):638 a 646; Tellez-Avila, F.I. et al. (2005) “The Carcinoembryonic Antigen: Apropos Of An Old Friend”, Rev.
Invest.
Clin. 57(6):814-819); CEACAM5/CEACAM6 (Zheng, C. et al. (2011) “A Novel Anti-CEACAM5 Monoclonal Antibody, CC4, Suppresses Colorectal Tumor Growth and Enhances NK Cells- Mediated Tumor Immunity”, PLoS One 6(6):e21146, pp. 1 a 11); CO17-1A (Ragnhammar et al. (1993) “Effect Of Monoclonal Antibody 17-1A And GM-CSF In Patients With Advanced Colorectal Carcinoma - Long-Lasting, Complete Remissions Can Be Induced”, Int.
J.
Cancer 53:751 a 758); CO-43 (grupo sanguíneo Leb); CO-514 (grupo sanguíneo Lea) como encontrado em adenocarcinoma; CTA-1; CTLA-4 (Peggs, K.S. et al. (2006) “Principles And Use Of Anti-CTLA4 Antibody In Human Cancer Immunotherapy”, Curr.
Opin.
Immunol. 18(2):206 a 13); Citoqueratina 8 (Publicação PCT No WO 03/024191); D1.1; D156- 22; DR5 (Abdulghani, J. et al. (2010) “TRAIL Receptor Signaling And Therapeutics”, Expert Opin.
Ther.
Targets 14(10):1091 a 1108; Andera, L. (2009) “Signaling Activated By The Death Receptors Of The TNFR Family”, Biomed.
Pap.
Med.
Fac.
Univ.
Palacky Olomouc Czech.
Repub. 153(3):173 a 180; Carlo-Stella, C. et al. (2007) “Targeting TRAIL Agonistic Receptors for Cancer Therapy”, Clin, Cancer 13(8):2313 a 2317; Chaudhari, B.R. et al. (2006) “Following the TRAIL to Apoptosis”, Immunologic Res. 35(3):249-262); E1 série (grupo sanguíneo B) como encontrado no câncer pancreático; EGFR
(Receptor de fator de crescimento epidérmico; Adenis, A. et al. (2003) “Inhibitors Of Epidermal Growth Factor Receptor And Colorectal Cancer”, Bull.
Cancer. 90 Spec No:S228-S232); Receptores de Efrina (e em particular EphA2 (Patente dos Estados Unidos No 7.569.672; Publicação PCT No WO 06/084226); Erb (ErbB1; ErbB3; ErbB4; Zhou, H. et al. (2002) “Lung Tumorigenesis Associated With Erb-B-2 And Erb-B-3 Overexpression In Human Erb-B-3 Transgenic Mice Is Enhanced By Methylnitrosourea”, Oncogene 21(57):8732 a 8740; Rimon, E. et al. (2004) “Gonadotropin-Induced Gene Regulation In Human Granulosa Cells Obtained From IVF Patients: Modulation Of Genes Coding For Growth Factors And Their Receptors And Genes Involved In Cancer And Other Diseases”, Int.
J.
Oncol. 24(5):1325 a 1338); GAGE (GAGE-1; GAGE-2; Akcakanat, A. et al. (2006) “Heterogeneous Expression Of GAGE, NY-ESO-1, MAGE- A and SSX Proteins In Esophageal Cancer: Implications For Immunotherapy”, Int.
J.
Cancer. 118(1):123 a 128); GD2/GD3/GM2 (Livingston, P.O. et al. (2005) “Selection Of GM2, Fucosyl GM1, Globo H And Polysialic Acid As Targets On Small Cell Lung Cancers For Antibody-Mediated Immunotherapy”, Cancer Immunol.
Immunother. 54(10):1018 a 1025); gangliosídeo GD2 (GD2; Saleh et al. (1993) “Generation Of A Human Anti- Idiotypic Antibody That Mimics The GD2 Antigen”, J.
Immunol., 151, 3390-3398); gangliosídeo GD3 (GD3; Shitara et al. (1993) “A Mouse/Human Chimeric Anti-(Ganglioside GD3) Antibody With Enhanced Antitumor Activities”, Cancer Immunol.
Immunother. 36:373 a 380); gangliosídeo GM2 (GM2; Livingston et al. (1994) “Improved Survival In Stage III Melanoma Patients With GM2 Antibodies: A Randomized Trial Of Adjuvant Vaccination With GM2 Ganglioside”, J.
Clin.
Oncol. 12:1036 a 1044);
gangliosídeo GM3 (GM3; Hoon et al. (1993) “Molecular Cloning Of A Human Monoclonal Antibody Reactive To Ganglioside GM3 Antigen On Human Cancers”, Cancer Res. 53:5244 a 5250); GICA 19-9 (Herlyn et al. (1982) “Monoclonal Antibody Detection Of A Circulating Tumor-Associated Antigen.
I.
Presence Of Antigen In Sera Of Patients With Colorectal, Gastric, And Pancreatic Carcinoma”, J.
Clin.
Immunol. 2:135 a 140); gp100 (Lotem, M. et al. (2006) “Presentation Of Tumor Antigens By Dendritic Cells Genetically Modified With Viral And Nonviral Vectors”, J.
Immunother. 29(6):616 a 27); Gp37 (antígeno de células T de leucemia humana; Bhattacharya-Chatterjee et al. (1988) “Idiotype Vaccines Against Human T Cell Leukemia.
II.
Generation And Characterization Of A Monoclonal Idiotype Cascade (Ab1, Ab2, and Ab3)”, J.
Immunol. 141:1398 a 1403); gp75 (antígeno de melanoma; Vijayasardahl et al. (1990) “The Melanoma Antigen Gp75 Is The Human Homologue Of The Mouse B (Brown) Locus Gene Product”, J.
Exp.
Med. 171(4):1375 a 1380); gpA33 (Heath, J.K. et al. (1997) “The Human A33 Antigen Is A Transmembrane Glycoprotein And A Novel Member Of The Immunoglobulin Superfamily”, Proc.
Natl.
Acad.
Sci. (U.S.A.) 94(2):469 a 474; Ritter, G. et al. (1997) “Characterization Of Posttranslational Modifications Of Human A33 Antigen, A Novel Palmitoylated Surface Glycoprotein Of Human Gastrointestinal Epithelium”, Biochem.
Biophys.
Res.
Commun. 236(3):682 a 686; Wong, N.A. et al. (2006) “EpCAM and gpA33 Are Markers Of Barrett's Metaplasia”, J.
Clin.
Pathol. 59(3):260 a 263); antígeno HER2 (HER2/neu, p185HER2; Pal, S.K. et al. (2006) “Targeting HER2 Epitopes”, Semin.
Oncol. 33(4):386 a 391); HMFG (antígeno de glóbulos de gordura do leite humano; WO1995015171); papilomavírus humano-
E6/papilomavírus humano-E7 (DiMaio, D. et al. (2006) “Human Papillomaviruses And Cervical Cancer”, Adv.
Virus Res. 66:125 a 59; HMW-MAA (antígeno de melanoma de alto peso molecular; Natali et al. (1987) “Immunohistochemical Detection Of Antigen In Human Primary And Metastatic Melanomas By The Monoclonal Antibody 140.240 And Its Possible Prognostic Significance”, Cancer 59:55 a 63; Mittelman et al. (1990) “Active Specific Immunotherapy In Patients With Melanoma.
A Clinical Trial With Mouse Antiidiotypic Monoclonal Antibodies Elicited With Syngeneic Anti-High-Molecular-Weight-Melanoma- Associated Antigen Monoclonal Antibodies”, J.
Clin.
Invest. 86:2136 a 2144); IL13Rα2 (Publicação PCT No WO 2008/146911; Brown, C.E. et al. (2013) “Glioma IL13Rα2 Is Associated With Mesenchymal Signature Gene Expression And Poor Patient Prognosis”, PLoS One. 18;8(10):e77769; Barderas, R. et al. (2012) “High Expression Of IL-13 Receptor Α2 In Colorectal Cancer Is Associated With Invasion, Liver Metastasis, And Poor Prognosis”, Cancer Res. 72(11):2780 a 2790; Kasaian, M.T. et al. (2011) “IL-13 Antibodies Influence IL-13 Clearance In Humans By Modulating Scavenger Activity Of IL- 13Rα2”, J.
Immunol. 187(1):561 a 569; Bozinov, O. et al. (2010) “Decreasing Expression Of The Interleukin-13 Receptor IL-13Ralpha2 In Treated Recurrent Malignant Gliomas”, Neurol.
Med.
Chir. (Tokyo) 50(8):617 a 621; Fujisawa, T. et al. (2009) “A novel role of interleukin-13 receptor alpha2 in pancreatic cancer invasion and metastasis”, Cancer Res. 69(22):8678 a 8685); Integrina β6 (Publicação PCT No WO 03/087340); JAM-3 (Publicação PCT No WO 06/084078); KID3 (Publicação PCT No WO 05/028498); KID31 (Publicação PCT No WO 06/076584); antígeno de pan-carcinoma KS 1/4 (Perez et al.
(1989) “Isolation And Characterization Of A cDNA Encoding The Ks1/4 Epithelial Carcinoma Marker”, J.
Immunol. 142:3662 a 3667; Möller et al. (1991) “Bispecific-Monoclonal-Antibody- Directed Lysis Of Ovarian Carcinoma Cells By Activated Human T Lymphocytes”, Cancer Immunol.
Immunother. 33(4):210-216; Ragupathi, G. 2005 Cancer Treat Res. 123:157 a 80); L6 e L20 (antígenos de carcinoma de pulmão humanos; Hellström et al. (1986) “Monoclonal Mouse Antibodies Raised Against Human Lung Carcinoma”, Cancer Res. 46:3917 a 3923); LEA; LUCA-2 (Publicação de Patente dos Estados Unidos No 2006/0172349; Publicação PCT No WO 06/083852); M1:22:25:8; M18; M39; MAGE (MAGE-1; MAGE-3; (Bodey, B. (2002) “Cancer-Testis Antigens: Promising Targets For Antigen Directed Antineoplastic Immunotherapy”, Expert Opin.
Biol.
Ther. 2(6):577 a 584); MART (Kounalakis, N. et al. (2005) “Tumor Cell And Circulating Markers In Melanoma: Diagnosis, Prognosis, And Management”, Curr.
Oncol.
Rep. 7(5):377-382; mesotelina (Chang, K. et al. (1996) “Molecular Cloning Of Mesothelin, A Differentiation Antigen Present On Mesothelium, Mesotheliomas, And Ovarian Cancers”, Proc.
Natl.
Acad.
Sci. (U.S.A.) 93:136 a 140); MUC-1 (Mathelin, C. (2006) “Circulating Proteinic Biomarkers And Breast Cancer”, Gynecol.
Obstet.
Fertil. 34(7-8):638 a 646); MUM-1 (Castelli, C. et al. (2000) “T-Cell Recognition Of Melanoma-Associated Antigens”, J.
Cell.
Physiol. 182(3):323 a 331); Mil; N- acetilglucosaminiltransferase (Dennis, J.W. (1999) “Glycoprotein Glycosylation And Cancer Progression”, Biochim.
Biophys.
Acta. 6;1473(1):21 a 34); neoglicoproteína; NS-10 como encontrado em adenocarcinomas; OFA-1; OFA-2; Oncostatina M (Receptor Beta da Oncostatina; Patente dos Estados Unidos
No 7.572.896; Publicação PCT No WO 06/084092); p15 (Gil, J. et al. (2006) “Regulation Of The INK4b-ARF-INK4a Tumour Suppressor Locus: All For One Or One For All”, Nat.
Rev.
Mol.
Cell Biol. 7(9):667 a 677); p97 (antígeno associado ao melanoma; Estin et al. (1989) “Transfected Mouse Melanoma Lines That Express Various Levels Of Human Melanoma- Associated Antigen p97”, J.
Natl.
Cancer Instit. 81(6):445 a 454); PEM (mucina epitelial polimórfica; Hilkens et al. (1992) “Cell Membrane-Associated Mucins And Their Adhesion- Modulating Property”, Trends in Biochem.
Sci. 17:359-363); PEMA (antígeno da mucina epitelial polimórfica); PIPA (Patente dos Estados Unidos No 7.405.061; Publicação PCT No WO 04/043239); PSA (antígeno específico de próstata; Henttu et al. (1989) “cDNA Coding For The Entire Human Prostate Specific Antigen Shows High Homologies To The Human Tissue Kallikrein Genes”, Biochem.
Biophys.
Res.
Comm. 10(2):903 a 910; Israeli et al. (1993) “Molecular Cloning Of A Complementary DNA Encoding A Prostate-Specific Membrane Antigen”, Cancer Res. 53:227 a 230; Cracco, C.M. et al. (2005) “Immune Response In Prostate Cancer”, Minerva Urol.
Nefrol. 57(4):301 a 311); PSMA (antígeno de membrana específico de próstata; Ragupathi, G. (2005) “Antibody Inducing Polyvalent Cancer Vaccines”, Cancer Treat.
Res. 123:157 a 180); fosfato de ácido prostático (Tailor et al. (1990) “Nucleotide Sequence Of Human Prostatic Acid Phosphatase Determined From A Full-Length cDNA Clone”, Nucl.
Acids Res. 18(16):4928); R24 como encontrado em melanoma; ROR1 (Patente dos Estados Unidos No 5.843.749); esfingolipídios; SSEA-1; SSEA-3; SSEA-4; sTn (Holmberg, L.A. (2001) “Theratope Vaccine (STn-KLH)”, Expert Opin.
Biol.
Ther. 1(5):881 a 91); peptídeo derivado do receptor de células T de um linfoma de células T cutâneo (ver Edelson (1998) “Cutaneous T-Cell Lymphoma: A Model For Selective Immunotherapy”, Cancer J.
Sci.
Am. 4:62 a 71); T5A7 encontrado em mielócitos; TAG-72 (Yokota et al. (1992) “Rapid Tumor Penetration Of A Single-Chain Fv And Comparison With Other Immunoglobulin Forms”, Cancer Res. 52:3402-3408); TL5 (grupo sanguíneo A); receptor TNF (receptor TNF-α, receptor TNF-ß; receptor TNF-γ (van Horssen, R. et al. (2006) “TNF- Alpha In Cancer Treatment: Molecular Insights, Antitumor Effects, And Clinical Utility”, Oncologist 11(4):397 a 408; Gardnerova, M. et al. (2000) “The Use Of TNF Family Ligands And Receptors And Agents Which Modify Their Interaction As Therapeutic Agents”, Curr.
Drug Targets 1(4):327-364); TRA-1- 85 (grupo sanguíneo H); Receptor Transferrina (Patente dos Estados Unidos No 7.572.895; Publicação PCT No WO 05/121179); 5T4 (TPBG, glicoproteína trofoblástica; Boghaert, E.R. et al. (2008) “The Oncofetal Protein, 5T4, Is A Suitable Target For Antibody-Guided Anti-Cancer Chemotherapy With Calicheamicin”, Int.
J.
Oncol. 32(1):221 a 234; Eisen, T. et al. (2014) “Naptumomab Estafenatox: Targeted Immunotherapy with a Novel Immunotoxin”, Curr.
Oncol.
Rep. 16:370, pp. 1 a 6); TSTA (antígeno de transplante específico de tumor) tal como antígenos de tumor viralmente induzidos incluindo vírus tumorais de DNA de antígeno T e antígenos de envelope de vírus tumorais de RNA, fetoproteína alfa de antígeno oncofetal tal como CEA de antígeno oncofetal de tumor de cólon e bexiga (Hellström et al. (1985) “Monoclonal Antibodies To Cell Surface Antigens Shared By Chemically Induced Mouse Bladder Carcinomas”, Cancer.
Res. 45:2210 a
2188); VEGF (Pietrantonio, F. et al. (2015) “Bevacizumab- Based Neoadjuvant Chemotherapy For Colorectal Cancer Liver Metastases: Pitfalls And Helpful Tricks In A Review For Clinicians”, Crit. Rev. Oncol. Hematol. 95(3):272 a 281; Grabowski, J.P. (2015) “Current Management Of Ovarian Cancer”, Minerva Med. 106(3):151 a 156; Field, K.M. (2015) “Bevacizumab And Glioblastoma: Scientific Review, Newly Reported Updates, And Ongoing Controversies”, Cancer 121(7):997 a 1007; Suh, D.H. et al. (2015) “Major Clinical Research Advances In Gynecologic Cancer In 2014”, J. Gynecol. Oncol. 26(2):156 a 167; Liu, K.J. et al. (2015) “Bevacizumab In Combination With Anticancer Drugs For Previously Treated Advanced Non-Small Cell Lung Cancer”, Tumour Biol. 36(3):1323 a 1327; Di Bartolomeo, M. et al. (2015) “Bevacizumab Treatment In The Elderly Patient With Metastatic Colorectal Cancer”, Clin. Interv. Aging 10:127 a 133); Receptor VEGF (O’Dwyer. P.J. (2006) “The Present And Future Of Angiogenesis-Directed Treatments Of Colorectal Cancer”, Oncologist 11(9):992 a 998); VEP8; VEP9; VIM-D5; e hapteno Y, Ley como encontrado em células de carcinoma embrionário. Antígenos de Câncer adicionais e moléculas (por exemplo, anticorpos) que se ligam a eles são divulgados na Tabela 11. 5T4, B7-H3, CEACAM5/CEACAM6, CD123, DR5, EGFR, um receptor de Efrina, gpA33, HER2/neu, IL13Rα2, ROR1 e VEGF são “Antígenos de Câncer” particularmente preferidos da presente invenção.
Tabela 11 Anticorpo e Moléculas Com Base em Anticorpos Nome do Antígenos de Aplicação Terapêutica Alvo Anticorpo Câncer 3F8 Gd2 Neuroblastoma
Neuroblastoma, Sarcoma, 8H9 B7-H3 Cânceres Cerebrais Metastáticos Abagovomabe CA-125 Câncer Ovariano Adecatumumabe Epcam Câncer de Próstata e Mama Afutuzumabe CD20 Linfoma Alacizumabe VEGFR2 Câncer Altumomabe CEA Câncer Colorretal Amatuximabe Mesotelina Câncer Anatumobabe Carcinoma de Pulmão de Células TAG-72 mafenatox Não Pequenas Receptor Α/Β do Anifrolumabe Lúpus Eritematoso Sistêmico Interferon Anrucinzumabe IL-13 Câncer Apolizumabe HLA-DR Cânceres Hematológicos Arcitumomabe CEA Câncer Gastrointestinal Atinumabe RTN4 Câncer Bectumomabe CD22 Linfoma Não Hodgkin (Detecção) Belimumabe BAFF Linfoma Não Hodgkin Câncer Metastático, Bevacizumabe VEGF-A Retinopatia de Prematuridade Bivatuzumabe CD44 V6 Carcinoma de Células Escamosas Blinatumomabe CD19 Câncer Brentuximabe CD30 (TNFRSF8) Cânceres Hematológicos Cantuzumabe MUC1 Cânceres Cantuzumabe Canag Mucina Câncer Colorretal mertansina Caplacizumabe VWF Cânceres Células de Capromabe Carcinoma Câncer de Próstata (Detecção) Prostático Carlumabe MCP-1 Indicações Oncolágicas/Imunes Catumaxomabe Epcam, CD3 Câncer Ovariano, Ascites
Malignas, Câncer Gástrico Cc49 Tag-72 Detecção Tumoral Câncer Metastático Colorretal Cetuximabe EGFR e Câncer de Cabeça e Pescoço Ch,14,18 Indeterminado Neuroblastoma Câncer Ovariano e Outros Citatuzumabe Epcam Tumores Sólidos Cixutumumabe Receptor IGF-1 Tumores Sólidos Clivatuzumabe MUC1 Câncer Pancreático Conatumumabe TRAIL-R2 Câncer Dacetuzumabe CD40 Cânceres Hematológicos Receptor do Fator de Dalotuzumabe Câncer Crescimento do Tipo Insulina I Daratumumabe CD38 Câncer Demcizumabe DLL4 Câncer Célula de Detumomabe Linfoma Linfoma B Drozitumabe DR5 Câncer Duligotumabe HER3 Câncer Dusigitumabe ILGF2 Câncer Gangliosídeo Ecromeximabe Melanoma Maligno GD3 Hemoglobinúria Paroxística Eculizumabe C5 Noturna Edrecolomabe Epcam Carcinoma Colorretal Elotuzumabe SLAMF7 Mieloma Múltiplo Elsilimomabe IL-6 Câncer Enavatuzumabe Receptor TWEAK Câncer Enlimomabe ICAM-1 (CD54) Câncer Enokizumabe IL9 Asma Enoticumabe DLL4 Câncer
Ensituximabe 5AC Câncer Epitumomabe Episialina Câncer Cituxetano Epratuzumabe CD22 Câncer, SLE Ertumaxomabe HER2/neu, CD3 Câncer de Mama Melanoma, Câncer de Próstata, Etaracizumabe Integrina Αvβ3 Câncer Ovariano Receptor de Faralimomabe Câncer Interferon Receptor de Farletuzumabe Câncer Ovariano Folato 1 Fasinumabe HNGF Câncer Fbta05 CD20 Leucemia Linfocítica Crônica Ficlatuzumabe HGF Câncer Carcinoma Adrenocortical, Figitumumabe Receptor IGF-1 Carcinoma de Pulmão de Células Não Pequenas TYRP1 Flanvotumabe (Glicoproteína Melanoma 75) Fontolizumabe IFN-γ Doença de Crohn Fibrose Pulmonar Idiopática, Fresolimumabe TGF-Β Glomerulosclerose Segmental Focal, Câncer Futuximabe EGFR Câncer Galiximabe CD80 Linfoma de Células B Ganitumabe IGF-I Câncer Gemtuzumabe CD33 Leucemia Mielógena Aguda Ozogamicina Gevokizumabe IL-1β Diabetes Anidrase Carcinoma de Células Renais de Girentuximabe Carbônica 9 Célula Clara (CA-IX) Glembatumumab GPNMB Melanoma, Câncer de Mama e Vedotina
Artrite Reumatoide, Artrite Golimumabe TNF-Α psoriática, Espondilite Anquilosante Ibritumomabe CD20 Linfoma Não Hodgkin Tiuxetano Icrucumabe VEGFR-1 Câncer Igovomabe CA-125 Câncer ovariano (Diagnosis) Adenocarcinomas Imab362 Cldn18,2 Gastrointestinais e Tumor Pancreático Imgatuzumabe EGFR Câncer Inclacumabe Selectina P Câncer Indatuximabe SDC1 Câncer Ravtansina Inotuzumabe CD22 Câncer Ozogamicina Tumores Sólidos (Câncer de Intetumumabe CD51 Próstata, Melanoma) Ipilimumabe CD152 Melanoma Iratumumabe CD30 (TNFRSF8) Linfoma de Hodgkin Itolizumabe CD6 Câncer Labetuzumabe CEA Câncer Colorretal Lambrolizumab PDCD1 Agente Antineoplásico e Lampalizumabe CFD Câncer Lexatumumabe TRAIL-R2 Câncer Hepatite B Libivirumabe Superfície Hepatite B Antígeno Ligelizumabe IGHE Câncer Lintuzumabe CD33 Câncer Lirilumabe KIR2D Câncer Lorvotuzumabe CD56 Câncer Lucatumumabe CD40 Mieloma Múltiplo, Linfoma Não
Hodgkin, Linfoma de Hodgkin Lumiliximabe CD23 Leucemia Linfocítica Crônica Mapatumumabe TRAIL-R1 Câncer Margetuximabe Ch4d5 Câncer Colorretal, Pulmão e Câncer de Matuzumabe EGFR Estômago Mieloma Múltiplo e Outras Milatuzumabe CD74 Malignidades Hematológicas Minretumomabe TAG-72 Câncer Gangliosídeo Carcinoma de Pulmão de Células Mitumomabe GD3 Pequenas Mogamulizumab CCR4 Câncer e Morolimumabe Fator Reso Câncer Moxetumomabe CD22 Câncer Pasudotox Nacolomabe Antígeno C242 Câncer Colorretal Tafenatox Namilumabe CSF2 Câncer Carcinoma de Pulmão de Células Naptumomabe 5T4 Não Pequenas, Carcinoma de Estafenatox Células Renais Narnatumabe RON Câncer Nebacumabe Endotoxina Sepse Carcinoma de Pulmão de Células Necitumumabe EGFR Não Pequenas Nerelimomabe TNF-Α Câncer Nesvacumabe Angiopoietina 2 Câncer Carcinoma de Células Escamosas, Câncer de Cabeça e Nimotuzumabe EGFR Pescoço, Câncer de Nasofaringe, Glioma Nivolumabe PD-1 Câncer Nofetumomabe Indeterminado Câncer Merpentano
Ocaratuzumabe CD20 Câncer Ofatumumabe CD20 Leucemia Linfocítica Crônica Olaratumabe PDGF-R Α Câncer Olokizumabe IL6 Câncer Receptor Cinase do Fator de Onartuzumabe Câncer Dispersão Humano Ontuxizumabe TEM1 Câncer Oportuzumabe Epcam Câncer Monatox Oregovomabe CA-125 Câncer Ovariano Orticumabe Oxldl Câncer Otlertuzumabe CD37 Câncer Panitumumabe EGFR Câncer Colorretal Glicosilação Pankomabe Específica Câncer Ovariano Tumoral de MUC1 Parsatuzumabe EGFL7 Câncer Patritumabe HER3 Câncer Pembrolizumab PD-1 Câncer e Pemtumomabe MUC1 Câncer Perakizumabe IL17A Artrite Pertuzumabe HER2/neu Câncer Pidilizumabe PD-1 Câncer e Doenças Infecciosas Pinatuzumabe CD22 Câncer Vedotina Antígeno Pintumomabe Adenocarcinoma Adenocarcinoma Placulumabe TNF Humano Câncer Polatuzumabe CD79B Câncer Vedotina Pritoxaximabe Toxina de E.
Câncer
Coli Shiga Tipo-1 Pritumumabe Vimentina Câncer Cerebral Quilizumabe IGHE Câncer Ácido N- Racotumomabe Glicolilneuramí Câncer nico Fibronectina Radretumabe Câncer Extra Domínio-B Ramucirumabe VEGFR2 Tumores Sólidos Rilotumumabe HGF Tumores Sólidos Linfomas, Leucemias, Alguns Rituximabe CD20 Transtornos Autoimunes Robatumumabe Receptor IGF-1 Câncer Roledumabe RHD Câncer Samalizumabe CD200 Câncer Satumomabe TAG-72 Câncer Pendetide Seribantumabe ERBB3 Câncer Toxina de E.
Setoxaximabe Coli Shiga Câncer Tipo-1 Leucemia Linfoblástica Aguda e Sgn-CD19a CD19 Célula B Linfoma Não Hodgkin Sgn-CD33a CD33 Leucemia Mieloide Aguda Sibrotuzumabe FAP Câncer Siltuximabe IL-6 Câncer Solitomabe Epcam Câncer Sontuzumabe Episialina Câncer Tabalumabe BAFF Cânceres de Células B Tacatuzumabe Alfa- Câncer Tetraxetano Fetoproteina Taplitumomabe CD19 Câncer Paptox
Telimomabe Indeterminado Câncer Tenatumomabe Tenascina C Câncer Teneliximabe CD40 Câncer Teprotumumabe CD221 Tumores Hematológicos Ticilimumabe CTLA-4 Câncer Tigatuzumabe TRAIL-R2 Câncer Tnx-650 Il-13 Linfoma de Hodgkin Tositumomabe CD20 Linfoma Folicular Tovetumabe CD140a Câncer Trastuzumabe HER2/neu Câncer de Mama Trbs07 Gd2 Melanoma Tremelimumabe CTLA-4 Câncer Tucotuzumabe Epcam Câncer Celmoleucina Ublituximabe MS4A1 Câncer Urelumabe 4-1BB Câncer Receptor Vantictumabe Câncer Frizzled Vapaliximabe AOC3 (VAP-1) Câncer Vatelizumabe ITGA2 Câncer Veltuzumabe CD20 Linfoma Não Hodgkin Vesencumabe NRP1 Câncer Volociximabe Integrina Α5β1 Tumores Sólidos Vorsetuzumabe CD70 Câncer Antígeno Votumumabe Tumoral Tumores Colorretais CTAA16.88 Carcinoma de Células Escamosas Zalutumumabe EGFR de Cabeça E Pescoço Zatuximabe HER1 Câncer Ziralimumabe CD147 Câncer
[00339] Anticorpos exemplificativos, cujos
Domínios VH e VL podem ser usados para construir as moléculas de ligação da presente invenção que são capazes de se ligar a um Antígeno de Câncer disposto na superfície de uma célula de câncer e mediar a morte redirecionada destas células de câncer são listados na Tabela 11, anticorpos adicionais que podem ser usados para construir moléculas capazes de se ligar a um Antígeno de Câncer disposto na superfície de uma célula de câncer e mediar a morte redirecionada destas células de câncer são fornecidos abaixo.
1. ANTICORPOS ANTI-B7-H3 EXEMPLIFICATIVO
[00340] B7-H3 é um Antígeno de Câncer que é superexpressado em uma ampla variedade de tipos de tumores sólidos e é um membro da família B7 de moléculas que estão envolvidas na regulação imune (ver, Patente US No 8.802.091; US 2014/0328750; US 2013/0149236; Loo, D. et al. (2012) “Development Of An Fc-Enhanced Anti-B7-H3 Monoclonal Antibody With Potent Antitumor Activity”, Clin. Cancer Res. 18(14):3834-3845). Em particular, vários estudos independentes têm mostrado que células cancerosas malignas humanas (por exemplo, células de câncer de neuroblastomas e gástrico, câncer de ovário e de pulmão de células não pequenas) exibem um marcador aumentado na expressão da proteína B7-H3 e essa expressão aumentada foi associada à severidade aumentada da doença (Zang, X. et al. (2007) “The B7 Family And Cancer Therapy: Costimulation And Coinhibition”, Clin. Cancer Res. 13:5271-5279), sugerindo que a B7-H3 é explorada por tumores como uma via de evasão imune (Hofmeyer, K. et al. (2008) “The Contrasting Role Of B7-H3”, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278).
[00341] Verificou-se também que a B7-H3 coestimula a proliferação de células T CD4+ e CD8+. A B7-H3 também estimula a produção de IFN-γ e atividade lítica de CD8+ (Chapoval, A. et al. (2001) “B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-γ Production”, Nature Immunol. 2:269–274; Sharpe, A.H. et al. (2002) “The B7-CD28 Superfamily”, Nature Rev. Immunol. 2:116-126). Entretanto, a proteína também possivelmente atua através de fatores NFAT (fator nuclear para células T ativadas), NF-κB (fator nuclear kappa B) e AP-1 (Proteína Ativadora-1) para inibir a ativação de células T ((Yi. K.H. et al. (2009) “Fine Tuning The Immune Response Through B7-H3 And B7-H4”, Immunol. Rev. 229:145- 151). Acredita-se que a B7-H3 também inibe Th1, Th2 ou Th17 in vivo (Prasad, D.V. et al. (2004) “Murine B7–H3 Is A Negative Regulator Of T Cells”, J. Immunol. 173:2500-2506; Fukushima, A. et al. (2007) “B7–H3 Regulates The Development Of Experimental Allergic Conjunctivitis In Mice”, Immunol. Lett. 113:52-57; Yi. K.H. et al. (2009) “Fine Tuning The Immune Response Through B7-H3 And B7-H4”, Immunol. Rev. 229:145-151).
[00342] As moléculas de ligação B7-H3 preferidas possuem os Domínios VL e/ou VH, de anticorpo monoclonal anti- B7-H3 humana humanizado “B7-H3 mAb-B”, “B7-H3 mAb-C”, “B7-H3 mAb-D”, e mais preferivelmente possuem 1, 2 ou todas as 3 das CDRLs da Região VL e/ou 1, 2 ou todas as 3 das CDRHs do Domínio VH destes anticorpos monoclonais anti-B7-H3.
[00343] Após a humanização, o anticorpo B7-H3 mAb-B produziu dois Domínio VHs variantes, B7-H3 mAb-B VH1 e B7-H3 mAb-B VH2; e dois Domínios VL variantes B7-H3 mAb-B VL1 e B7-H3 mAb-B VL2, que podem ser usados em qualquer combinação de Domínio VH/VLs para produzir um Domínio de
Ligação a B7-H3 funcional.
[00344] A sequência de aminoácidos do Domínio VH de B7-H3 mAb-B VH1 (SEQ ID NO: 96) é mostrada abaixo (resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMQWVRQA PGQGLEWMGT IYPGDGDTRY TQKFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARRG IPRLWYFDVW GQGTTVTVSS
[00345] A sequência de aminoácidos do Domínio VH de B7-H3 mAb-B VH2 (SEQ ID NO: 97) é mostrada abaixo (resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMQWVRQA PGQGLEWMGT IYPGGGDTRY TQKFQGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARRG IPRLWYFDVW GQGTTVTVSS
[00346] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de B7-H3 mAb-B VL1 (SEQ ID NO: 98) é mostrada abaixo (resíduos de CDRL são mostrados sublinhados).
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYCQQ GNTLPPTFGG GTKLEIK
[00347] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de B7-H3 mAb-B VL2 (SEQ ID NO: 99) é mostrada abaixo (resíduos de CDRL são mostrados sublinhados).
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIS SYLNWYQQKP GKAPKLLIYY TSRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYCQQ GNTLPPTFGG GTKLEIK
[00348] A sequência de aminoácidos do Domínio VH de B7-H3 mAb-C humanizado (SEQ ID NO: 100) é mostrada abaixo (resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYGMSWVRQA PGKGLEWVAT INSGGSNTYY PDSLKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARHD GGAMDYWGQG TTVTVSS
[00349] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de B7-H3 mAb-C humanizado (SEQ ID NO: 101) é mostrada abaixo (resíduos de CDRL são mostrados sublinhados).
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASESIY SYLAWYQQKP GKAPKLLVYN TKTLPEGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQH HYGTPPWTFG QGTRLEIK
[00350] A sequência de aminoácidos do Domínio VH de B7-H3 mAb-D (SEQ ID NO: 102) é mostrada abaixo (resíduos de CDRH são mostrados sublinhados).
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PGKGLEWVAY ISSGSGTIYY ADTVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARHG YRYEGFDYWG QGTTVTVSS
[00351] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de B7-H3 mAb-D (SEQ ID NO: 103) é mostrada abaixo (resíduos de CDRL são mostrados sublinhados).
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKALIYS ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFAEYFCQQ YNNYPFTFGQ GTKLEIK
[00352] Particularmente preferidas são moléculas de ligação B7-H3 que possuem um Domínio VH e/ou VL humanizado incluindo, mas não limitado a “Enoblituzumabe” (também conhecido como MGA271; CAS Reg No 1353485-38-7). Enoblituzumabe é um anticorpo monoclonal otimizado em Fc que se liga a HER2/neu e medeia a atividade de ADCC aprimorada. As sequências de aminoácidos das Cadeias Leves e Pesadas completas do Enoblituzumabe são conhecidas na técnica (ver., por exemplo, WHO Drug Information, 2017, Recommended INN: List 77, 31(1):49).
[00353] A sequência de aminoácidos do Domínio VH de Enoblituzumabe (SEQ ID NO: 104) é mostrada abaixo (resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PGKGLEWVAY ISSDSSAIYY ADTVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRDED TAVYYCGRGR ENIYYGSRLD YWGQGTTVTV SS
[00354] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de Enoblituzumabe (SEQ ID NO: 105) é mostrada abaixo (resíduos de CDRL são mostrados sublinhados):
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKALIYS ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNNYPFTFGQ GTKLEIK
[00355] Além das Moléculas de Ligação anti-B7-H3 acima identificadas preferidas, a invenção contempla o uso de qualquer uma das seguintes Moléculas de Ligação anti-B7-H3: LUCA1; BLA8; PA20; ou SKN2 (ver, Patentes US Nos 7.527.969;
8.779.098 e Publicação de Patente PCT WO 2004/001381); M30; cM30; M30-H1-L1; M30-H1-L2; M30-H1-L3; M30-H1-L4; M30-H1-L5; M30-H1-L6; M30-H1-L7; M30-H4-L1; M30-H4-L2; M30-H4-L3; e M30- H4-L4 (ver, Publicação de Patente US 2013/0078234 e Publicação de Patente PCT WO 2012/147713); e 8H9 (ver Patentes US Nos 7.666.424; 7.737.258; 7.740.845; 8.148.154;
8.414.892; 8.501.471; 9.062.110; Publicação de Patente US 2010/0143245 e Publicação de Patente PCT WO 2008/116219).
[00356] A presente invenção especificamente inclui e abrange Moléculas de Ligação CD16 x B7-H3 que compreendem o Domínio VL e/ou VH e/ou 1, 2 ou todas as 3 das CDRLs da Região VL e/ou 1, 2 ou todas as 3 das CDRHs do Domínio VH de qualquer um de B7-H3 mAb-B, B7-H3 mAb-B VH1, B7-H3 mAb-B VH2, B7-H3 mAb-B VL1, B7-H3 mAb-B VL2, B7-H3 mAb- C, B7-H3 mAb-D ou Enoblituzumabe ou qualquer um doa outros anticorpos anti-B7-H3 aqui fornecidos; e mais preferivelmente possuem 1, 2 ou todas as 3 das CDRLs da Região VL e/ou 1, 2 ou todas as 3 das CDRHs do Domínio VH destes anticorpos monoclonais anti-B7-H3.
2. ANTICORPOS ANTI-CEACAM5 E ANTI-CEACAM6
EXEMPLIFICATIVOS
[00357] Verificou-se que as Moléculas de Adesão Celular Relacionadas ao Antígeno Carcinoembrionário 5 (CEACAM5) e 6 (CEACAM6) estão associadas a vários tipos de cânceres incluindo câncer medular da tireoide, câncer colorretal, câncer pancreático, carcinoma hepatocelular, câncer gástrico, câncer de pulmão, câncer de cabeça e pescoço, câncer urinário de bexiga, câncer de próstata, câncer uterino, câncer do endométrio, câncer de mama, câncer hematopoiético, leucemia e câncer ovariano (Publicação PCT No WO 2011/034660) e particularmente câncer colorretal, gastrointestinal, pancreático, câncer de pulmão de células não pequenas (NSCL), mama, tireoide, estômago, ovário e carcinomas uterinos (Zheng, C. et al. (2011) “A Novel Anti- CEACAM5 Monoclonal Antibody, CC4, Suppresses Colorectal Tumor Growth and Enhances NK Cells-Mediated Tumor Immunity”, PLoS One 6(6):e21146, pp. 1-11).
[00358] Verificou-se que as CEACAM5 são superexpressadas em 90% dos cânceres gastrointestinal, colorretal e pancreático, 70% dos cânceres de pulmão de células não pequenas e 50% dos cânceres de mama (Thompson, J.A. et al. (1991) “Carcinoembryonic Antigen Gene Family: Molecular Biology And Clinical Perspectives”, J. Clin. Lab. Anal. 5:344-366). A molécula de adesão celular relacionada ao antígeno carcinoembrionário 6 (CEACAM6) superexpressada desempenha papéis importantes na invasão e metástase de uma variedade de cânceres humanos, incluindo câncer medular da tireoide, câncer colorretal, câncer pancreático, carcinoma hepatocelular, câncer gástrico, câncer de pulmão, câncer de cabeça e pescoço, câncer urinário de bexiga, câncer de próstata, câncer uterino, câncer do endométrio, câncer de mama, câncer hematopoiético, leucemia e câncer ovariano (Publicação PCT No WO 2011/034660; Deng, X. et al. (2014) “Expression Profiling Of CEACAM6 Associated With The Tumorigenesis And Progression In Gastric Adenocarcinoma”, Genet. Mol. Res. 13(3):7686-7697; Cameron, S. et al. (2012) “Focal Overexpression Of CEACAM6 Contributes To Enhanced Tumourigenesis In Head And Neck Cancer Via Suppression Of Apoptosis”, Mol. Cancer 11:74, pp. 1-11; Chapin, C. et al. (2012) “Distribution And Surfactant Association Of Carcinoembryonic Cell Adhesion Molecule 6 In Human Lung”, Amer. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 302(2):L216-L25; Riley, C.J. et al. (2009) “Design And Activity Of A Murine And Humanized Anti-CEACAM6 Single-Chain Variable Fragment In The Treatment Of Pancreatic Cancer”, Cancer Res. 69(5):1933- 1940; Lewis-Wambi, J.S. et al. (2008) “Overexpression Of CEACAM6 Promotes Migration And Invasion Of Oestrogen-Deprived Breast Cancer Cells”, Eur. J. Cancer 44(12):1770-1779; Blumenthal, R.D. et al. (2007) “Expression Patterns Of CEACAM5 And CEACAM6 In Primary And Metastatic Cancers”, BMC Cancer. 7:2, pp. 1-15). Antibodies that immunospecifically bind CEACAM5 and CEACAM6 are commercially available (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Novus Biologicals LLC; Abnova Corporation).
[00359] A sequência de aminoácidos do Domínio VH do anticorpo humanizado anti-CEACAM5/ANTI-CEACAM6 16C3 (EP 2585476) (SEQ ID NO: 106) é mostrada abaixo (resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
QVQLQQSGPE VVRPGVSVKI SCKGSGYTFT DYAMHWVKQS HAKSLEWIGL ISTYSGDTKY NQNFKGKATM TVDKSASTAY MELSSLRSED TAVYYCARGD YSGSRYWFAY WGQGTLVTVS S
[00360] A sequência de aminoácidos do Domínio VL do anticorpo humanizado anti-CEACAM5/ANTI-CEACAM6 16C3 (EP 2585476) (SEQ ID NO: 107) é mostrada abaixo (resíduos de CDRL são mostrados sublinhados):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCGASENIY GALNWYQRKP GKSPKLLIWG ASNLADGMPS RFSGSGSGRQ YTLTISSLQP EDVATYYCQN VLSSPYTFGG GTKLEIK
[00361] A sequência de aminoácidos do Domínio VH do anticorpo humanizado anti-CEACAM5/CEACAM6 hMN15 (WO 2011/034660) (SEQ ID NO: 108) é mostrada abaixo (resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCSSSGFALT DYYMSWVRQA PGKGLEWLGF IANKANGHTT DYSPSVKGRF TISRDNSKNT LFLQMDSLRP EDTGVYFCAR DMGIRWNFDV WGQGTPVTVS S
[00362] A sequência de aminoácidos do Domínio VL do anticorpo humanizado anti-CEACAM5/CEACAM6 hMN15 (WO 2011/034660) (SEQ ID NO: 109) é mostrada abaixo (resíduos de CDRL são mostrados sublinhados):
DIQLTQSPSS LSASVGDRVT MTCSASSRVS YIHWYQQKPG KAPKRWIYGT STLASGVPAR FSGSGSGTDF TFTISSLQPE DIATYYCQQW SYNPPTFGQG TKVEIKR
[00363] A presente invenção especificamente inclui e abrange Moléculas de Ligação CD16 x CEACAM5/CEACAM6 que compreendem o Domínio VL e/ou VH e/ou 1, 2 ou todas as 3 das CDRLs da Região VL e/ou 1, 2 ou todas as 3 das CDRHs do Domínio VH dos anticorpos monoclonais anti-CEACAM5/CEACAM6 16C3 ou hMN15.
3. ANTICORPOS ANTI-EGRF EXEMPLIFICATIVOS
[00364] Receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) é um Antígeno de Câncer de certo câncer colorretal metastático, certo câncer colorretal metastático, câncer de pulmão de células não pequenas metastático e câncer de cabeça e pescoço. Anticorpos exemplificativos que se ligam a EGRF humano são “Cetuximabe” e “Panitumumabe”. Cetuximabe é um anticorpo monoclonal IgG do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) quimérico humano-camundongo recombinante 1 (Govindan R. (2004) “Cetuximab In Advanced Non-Small Cell Lung Cancer,” Clin. Cancer Res. 10(12 Pt 2):4241s-4244s; Bou-Assaly, W. et al. (2010) “Cetuximab (Erbitux),” Am. J. Neuroradiol. 31(4):626-627). Panitumumab (Vectibix®, Amgen) é um anticorpo monoclonal IgG2 receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) completamente humanizado (Foon, K.A. et al. (2004) “Preclinical And Clinical Evaluations Of ABX-EGF, A Fully Human Anti-Epidermal Growth Factor Receptor Antibody,” Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 58(3):984-990; Yazdi, M.H. et al. (2015) “A Comprehensive Review of Clinical Trials on EGFR Inhibitors Such as Cetuximab and Panitumumab as Monotherapy and in Combination for Treatment of Metastático Colorectal Cancer,” Avicenna J. Med. Biotechnol. 7(4):134-144).
[00365] A sequência de aminoácidos do Domínio VH do anticorpo anti-EGFR quimérico Cetuximabe (SEQ ID NO: 110) é mostrada abaixo (resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
QVQLKQSGPG LVQPSQSLSI TCTVSGFSLT NYGVHWVRQS PGKGLEWLGV IWSGGNTDYN TPFTSRLSIN KDNSKSQVFF KMNSLQSNDT AIYYCARALT YYDYEFAYWG QGTLVTVSA
[00366] A sequência de aminoácidos do Domínio VL do anticorpo anti-EGFR quimérico Cetuximabe (SEQ ID NO: 111) é mostrada abaixo (resíduos de CDRL são mostrados sublinhados):
DILLTQSPVI LSVSPGERVS FSCRASQSIG TNIHWYQQRT NGSPRLLIKY ASESISGIPS RFSGSGSGTD FTLSINSVES EDIADYYCQQ NNNWPTTFGA GTKLELKR
[00367] A sequência de aminoácidos do Domínio VH de Panitumumab (SEQ ID NO: 112) é mostrada abaixo (resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGGSVS SGDYYWTWIR QSPGKGLEWI GHIYYSGNTN YNPSLKSRLT ISIDTSKTQF SLKLSSVTAA DTAIYYCVRD RVTGAFDIWG QGTMVTVSS
[00368] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de Panitumumabe (SEQ ID NO: 113) é mostrada abaixo (resíduos de CDRL são mostrados sublinhados):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCQASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYD ASNLETGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQH FDHLPLAFGG GTKVEIKR
[00369] A presente invenção especificamente inclui e abrange CD16 x EGFR “Molécula de Ligação que compreende o Domínio VL e/ou VH e/ou 1, 2 ou todas as 3 das CDRLs da Região VL e/ou 1, 2 ou todas as 3 das CDRHs do Domínio VH dos anticorpos monoclonais anti-EGFR Cetuximabe ou Panitumumabe.
4. ANTICORPOS ANTI-EPHA2 EXEMPLIFICATIVOS
[00370] O receptor tirosina cinase, Receptor 2
Efrina tipo-A (EphA2) é normalmente expressado nos sítios de contato de célula a célula em tecidos epiteliais adultos, entretanto, estudos recentes mostraram que também é superexpressado em vários tipos de carcinomas epiteliais, com o maior nível de expressão de EphA2 observado em lesões metastáticas. Altos níveis de expressão de EphA2 foram encontrados em uma ampla gama de cânceres e em numerosas linhagens de célula de câncer, incluindo câncer de próstata, câncer de mama, câncer e melanoma de pulmão de células não pequenas (Xu, J. et al. (2014) “High EphA2 Protein Expression In Renal Cell Carcinoma Is Associated With A Poor Disease Outcome,” Oncol. Lett. Aug 2014; 8(2): 687-692; Miao, B. et al. (2014) “EphA2 is a Mediator of Vemurafenib Resistance and a Novel Therapeutic Target in Melanoma,” Cancer Discov. pii: CD-14-0295). O EphA2 não parece ser apenas um marcador para o câncer, mas parece ser persistentemente superexpressado e funcionalmente alterado em vários cânceres humanos (Chen, P. et al. (2014) “EphA2 Enhances The Proliferation And Invasion Ability Of LnCap Prostate Cancer Cells,” Oncol. Lett. 8(1):41-46). Anticorpos exemplificativos que se ligam a EphA2 humano são “EphA2 mAb 1,” “EphA2 mAb 2” e “EphA2 mAb 3”.
[00371] A sequência de aminoácidos do Domínio VH de EphA2 mAb 1 (SEQ ID NO: 114) é mostrada abaixo (resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
QVQLKESGPG LVAPSQSLSI TCTVSGFSLS RYSVHWVRQP PGKGLEWLGM IWGGGSTDYN SALKSRLSIS KDNSKSQVFL KMNSLQTDDT AMYYCARKHG NYYTMDYWGQ GTSVTVSS
[00372] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de EphA2 mAb 1 (SEQ ID NO: 115) é mostrada abaixo (resíduos de CDRL são mostrados sublinhados):
DIQMTQTTSS LSASLGDRIT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GYTLYTFGGG TKLEIK
[00373] A sequência de aminoácidos do Domínio VH de EphA2 mAb 2 (SEQ ID NO: 116) é mostrada abaixo (resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGFTFT NYGMNWVKQA PGKGLKWMGW INTYIGEPTY ADDFKGRFVF SLETSASTAY LQINNLKNED MATYFCAREL GPYYFDYWGQ GTTLTVSS
[00374] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de EphA2 mAb 2 (SEQ ID NO: 117) é mostrada abaixo (resíduos de CDRL são mostrados sublinhados):
DVVMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSSGNTYLHW YLQKPGQSPK LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP TFGSGTKLEI K
[00375] A sequência de aminoácidos do Domínio VH de EphA2 mAb 3 (SEQ ID NO: 118) é mostrada abaixo (resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
EVQLVESGGG SVKPGGSLKL SCAASGFTFT DHYMYWVRQT PEKRLEWVAT ISDGGSFTSY PDSVKGRFTI SRDIAKNNLY LQMSSLKSED TAMYYCTRDE SDRPFPYWGQ GTLVTVSS
[00376] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de EphA2 mAb 3 (SEQ ID NO: 119) é mostrada abaixo (resíduos de CDRL são mostrados sublinhados):
DIVLTQSHRS MSTSVGDRVN ITCKASQDVT TAVAWYQQKP GQSPKLLIFW ASTRHAGVPD RFTGSGSGTD FTLTISSVQA GDLALYYCQQ HYSTPYTFGG GTKLEIK
[00377] A presente invenção especificamente inclui e abrange CD16 x EphA2 “Molécula de Ligação que compreende o Domínio VL e/ou VH e/ou 1, 2 ou todas as 3 das CDRLs da Região VL e/ou 1, 2 ou todas as 3 das CDRHs do
Domínio VH de anticorpos monoclonais anti-EphA2 EphA2 mAb 1, EphA2 mAb 2 e EphA2 mAb 3.
5. ANTICORPOS ANTI-GPA33 EXEMPLIFICATIVOS
[00378] A glicoproteína transmembranar A33 43kD (gpA33) é expressada em >95% de todos carcinomas colorretais (Heath, J.K. et al. (1997) “The Human A33 Antigen Is A Transmembrane Glycoprotein And A Novel Member Of The Immunoglobulin Superfamily,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 94(2):469-474; Ritter, G. et al. (1997) “Characterization Of Posttranslational Modifications Of Human A33 Antigen, A Novel Palmitoylated Surface Glycoprotein Of Human Gastrointestinal Epithelium,” Biochem. Biophys. Res. Commun. 236(3):682-686; Wong, N.A. et al. (2006) “EpCAM and gpA33 Are Markers Of Barrett's Metaplasia,” J. Clin. Pathol. 59(3):260-263). Um anticorpo exemplificativo que se liga a gpA33 humano é “gpA33 mAb 1”.
[00379] A sequência de aminoácidos do Domínio VH de gpA33 mAb 1 (SEQ ID NO: 120) é mostrada abaixo (resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GSWMNWVRQA PGQGLEWIGR IYPGDGETNY NGKFKDRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARIY GNNVYFDVWG QGTTVTVSS
[00380] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de gpA33 mAb 1 (SEQ ID NO: 121) é mostrada abaixo (resíduos de CDRL são mostrados sublinhados):
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCSARSSIS FMYWYQQKPG KAPKLLIYDT SNLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGQG TKLEIK
[00381] A presente invenção especificamente inclui e abrange CD16 x gpA33 “Molécula de Ligação que compreende o Domínio VL e/ou VH e/ou 1, 2 ou todas as 3 das
CDRLs da Região VL e/ou 1, 2 ou todas as 3 das CDRHs do Domínio VH de anti-gpA33 anticorpos monoclonais gpA33 mAb 1 ou de qualquer um dos anticorpos monoclonais anti-gpA33 fornecidos em WO 2015/026894.
6. ANTICORPOS ANTI-HER2/NEU EXEMPLIFICATIVOS
[00382] HER2/neu é uma proteína receptora 185 kDa que foi originalmente identificada como o produto do gene de transformação de neuroblastomas de ratos quimicamente tratados. HER2/neu foi extensivamente investigado por causa de seu papel em vários carcinomas humanos e no desenvolvimento de mamíferos (Hynes et al. (1994) Biochim. Biophys. Acta 1198:165-184; Dougall et al. (1994) Oncogene 9:2109-2123; Lee et al. (1995) Nature 378:394-398). Anticorpos exemplificativos que se liga a HER2/neu humano incluem “Margetuximabe”, “Trastuzumabe” e “Pertuzumabe”. Margetuximabe (também conhecido como MGAH22; No DE Reg. CAS 1350624-75-7) é um anticorpo monoclonal otimizado por Fc que se liga a HER2/neu e medeia atividade de ADCC aprimorada. Trastuzumabe (também conhecida como rhuMAB4D5 e comercializada como HERCEPTIN®; No de Reg. CAS 180288-69-1; ver, Patente US No 5.821.337) é a versão humanizada de anticorpo 4D5, tendo regiões constantes de IgG1/kappa. Pertuzumabe (também conhecida como rhuMAB2C4 e comercializada como PERJETA™; No de Reg. CAS 380610-27-5; ver, por exemplo, WO2001/000245) é uma versão humanizada de anticorpo 2C4 tendo regiões constantes de IgG1/kappa.
[00383] A presente invenção especificamente inclui e abrange CD16 x HER2/neu “Molécula de Ligação que compreende o Domínio VL e/ou VH e/ou 1, 2 ou todas as 3 das CDRLs da Região VL e/ou 1, 2 ou todas as 3 das CDRHs do
Domínio VH dos anticorpos monoclonais anti-HER2/neu Margetuximabe, Trastuzumabe ou Pertuzumabe.
[00384] A sequência de aminoácidos do Domínio VH de Margetuximabe (SEQ ID NO: 122 é mostrada abaixo (resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
QVQLQQSGPE LVKPGASLKL SCTASGFNIK DTYIHWVKQR PEQGLEWIGR IYPTNGYTRY DPKFQDKATI TADTSSNTAY LQVSRLTSED TAVYYCSRWG GDGFYAMDYW GQGASVTVSS
[00385] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de Margetuximabe (SEQ ID NO: 123) é mostrada abaixo (resíduos de CDRL são mostrados sublinhados):
DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GHSPKLLIYS ASFRYTGVPD RFTGSRSGTD FTFTISSVQA EDLAVYYCQQ HYTTPPTFGG GTKVEIK
[00386] As sequências de aminoácidos das Cadeias Pesadas e Leves completas de Margetuximabe são conhecidas na técnica (ver., por exemplo, WHO Drug Information, 2014, Recommended INN: List 71, 28(1):93-94).
[00387] A sequência de aminoácidos do Domínio VH de Trastuzumabe (SEQ ID NO: 124) é mostrada abaixo (resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIK DTYIHWVRQA PGKGLEWVAR IYPTNGYTRY ADSVKGRFTI SADTSKNTAY LQMNSLRAED TAVYYCSRWG GDGFYAMDYW GQGTLVTVSS
[00388] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de Trastuzumabe (SEQ ID NO: 125) é mostrada abaixo (resíduos de CDRL são mostrados sublinhados):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASFLYSGVPS RFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYTTPPTFGQ GTKVEIK
[00389] A sequência de aminoácidos do Domínio VH de Pertuzumabe (SEQ ID NO: 126) é mostrada abaixo (resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFT DYTMDWVRQA PGKGLEWVAD VNPNSGGSIY NQRFKGRFTL SVDRSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARNL GPSFYFDYWG QGTLVTVSS
[00390] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de Pertuzumabe (SEQ ID NO: 127) é mostrada abaixo (resíduos de CDRL são mostrados sublinhados):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVS IGVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YYIYPYTFGQ GTKVEIK
[00391] Além das Moléculas de Ligação anti- HER2/neu preferidas acima identificadas, a invenção inclui e abrange CD16 x HER2/neu “Molécula de Ligação que compreende o Domínio VL e/ou VH e/ou 1, 2 ou todas as 3 das CDRLs da Região VL e/ou 1, 2 ou todas as 3 das CDRHs do Domínio VH de qualquer uma das seguintes Moléculas de Ligação anti- HER2/neu: 1,44,1; 1,140; 1,43; 1,14,1; 1,100,1; 1,96; 1,18,1; 1,20; 1,39; 1,24; e 1,71,3 (Patente US No 8.350.011;
8.858.942; e Publicação de Patente PCT WO 2008/019290); F5 e C1 (Patente US Nos 7.892.554; 8.173.424; 8.974.792; e Publicação de Patente PCT WO 99/55367); e qualquer outra anti-HER2/neu “Molécula de Ligação da Publicação de Patente US US2013017114 e Publicações de Patente PCT WO2011/147986 e WO 2012/143524).
[00392] A presente invenção especificamente inclui e abrange CD16 x HER2/neu “Molécula de Ligação que compreende o Domínio VL e/ou VH e/ou 1, 2 ou todas as 3 das CDRLs da Região VL e/ou 1, 2 ou todas as 3 das CDRHs do
Domínio VH de qualquer um de Margetuximabe, Trastuzumabe ou Pertuzumabe ou qualquer um dos outros anticorpos anti- HER2/neu aqui fornecidos; e mais preferivelmente possuem 1, 2 ou todas as 3 das CDRLs da Região VL e/ou 1, 2 ou todas as 3 das CDRHs do Domínio VH de tais anticorpos monoclonais anti- HER2/neu.
7. ANTICORPOS ANTI-VEGF EXEMPLIFICATIVOS
[00393] VEGF-A é um sinal químico que estimula angiogênese em uma variedade de doenças, especialmente em certos cânceres metastáticos, tais como câncer de cólon metastático e em certos cânceres de pulmão, cânceres renais, cânceres ovarianos e glioblastoma multiforme do cérebro. Um anticorpo exemplificativo que se liga a VEGF-A humano é “Bevacizumabe” (Avastin®). Bevacizumabe é um anticorpo monoclonal IgG1 humanizado recombinante (Midgley, R. et al. (2005) “Bevacizumab – Current Status And Future Directions,” Ann. Oncol. 16(7):999-1004; Hall, R.D. et al. (2015) “Angiogenesis Inhibition As A Therapeutic Strategy In Non- Small Cell Lung Cancer (NSCLC),” Transl. Lung Cancer Res. 4(5):515-523; Narita, Y. (2015) “Bevacizumab For Glioblastoma,” Ther. Clin. Risk Manag. 11:1759-1765).
[00394] A sequência de aminoácidos do Domínio VH de Bevacizumabe (SEQ ID NO: 128) é mostrada abaixo (resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCAKYP HYYGSSHWYF DVWGQGTLVT VSS
[00395] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de Bevacizumabe (SEQ ID NO: 129) é mostrada abaixo (resíduos de CDRL são mostrados sublinhados):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ GTKVEIKR
[00396] A presente invenção especificamente inclui e abrange CD16 x VEGF “Molécula de Ligação que compreende o Domínio VL e/ou VH e/ou 1, 2 ou todas as 3 das CDRLs da Região VL e/ou 1, 2 ou todas as 3 das CDRHs do Domínio VH do anticorpo monoclonal anti-VEGF Bevacizumabe.
8. ANTICORPOS ANTI-5T4 EXEMPLIFICATIVOS
[00397] A proteína oncofetal, 5T4, é um proteína associada ao tumor exibida na membrana celular de muitos carcinomas, incluindo carcinoma de rim, cólon, próstata, pulmão e em leucemia linfoblástica aguda (ver, Boghaert, E.R. et al. (2008) “The Oncofetal Protein, 5T4, Is A Suitable Target For Antibody-Guided Anti-Cancer Chemotherapy With Calicheamicin,” Int. J. Oncol. 32(1):221-234; Eisen, T. et al. (2014) “Naptumomab Estafenatox: Targeted Immunotherapy with a Novel Immunotoxin,” Curr. Oncol. Rep. 16:370, pp. 1- 6). Anticorpos exemplificativos que se ligam a 5T4 humano incluem “5T4 mAb 1” e “5T4 mAb 2”.
[00398] A sequência de aminoácidos do Domínio VH de 5T4 mAb 1 (SEQ ID NO: 130) é mostrada abaixo (resíduos de CDR são mostrados sublinhados):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SFWMHWVRQA PGQGLEWMGR IDPNRGGTEY NEKAKSRVTM TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAGGN PYYPMDYWGQ GTTVTVSS
[00399] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de um 5T4 mAb 1 (SEQ ID NO: 131) é mostrada abaixo (resíduos de CDR são mostrados sublinhados):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS NYLAWFQQKP GKAPKSLIYR ANRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCLQ YDDFPWTFGQ GTKLEIK
[00400] A sequência de aminoácidos do Domínio VH de 5T4 mAb 2 (SEQ ID NO: 132) é mostrada abaixo (resíduos de CDR são mostrados sublinhados):
QVQLQQPGAE LVKPGASVKM SCKASGYTFT SYWITWVKQR PGQGLEWIGD IYPGSGRANY NEKFKSKATL TVDTSSSTAY MQLSSLTSED SAVYNCARYG PLFTTVVDPN SYAMDYWGQG TSVTVSS
[00401] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de 5T4 mAb 2 (SEQ ID NO: 133) é mostrada abaixo (resíduos de CDR são mostrados sublinhados):
DVLMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSIV YSNGNTYLEW YLQKPGQSPK LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCFQGSHVP FTFGSGTKLE IK
[00402] A presente invenção especificamente inclui e abrange CD16 x 5T4 “Molécula de Ligação que compreende o Domínio VL e/ou VH e/ou 1, 2 ou todas as 3 das CDRLs da Região VL e/ou 1, 2 ou todas as 3 das CDRHs do Domínio VH dos anticorpos monoclonais anti-5T4 5T4 mAb 1 ou 5T4 mAb 2 ou de qualquer um dos anticorpos anti-5T4 fornecidos em WO 2013/041687 ou WO 2015/184203.
[00403] O presente pedido adicionalmente especificamente inclui e abrange CD16 x 5T4 Triespecífica “Molécula de Ligação que é capaz de se ligar a 5T4, a CD16 e a CD8 e particularmente tal molécula de ligação triespecífica que compreende o Domínio VL e/ou VH e/ou 1, 2 ou todas as 3 das CDRLs da Região VL e/ou 1, 2 ou todas as 3 das CDRHs do Domínio VH dos anticorpos monoclonais anti-5T4 5T4 mAb 1 ou 5T4 mAb 2 ou de qualquer um dos anticorpos monoclonais anti- 5T4 fornecidos em WO 2015/184203 e/ou o Domínio VL e/ou VH e/ou 1, 2 ou todas as 3 das CDRLs da Região VL e/ou 1, 2 ou todas as 3 das CDRHs do Domínio VH de qualquer um dos anticorpos monoclonais anti-CD8 aqui fornecidos.
9. ANTICORPOS ANTI-IL13RΑ2 EXEMPLIFICATIVOS
[00404] Receptor α2 de Interleucina-13 (IL13Rα2) é superexpressado em uma variedade de cânceres, incluindo glioblastoma, câncer colorretal, câncer cervical, câncer pancreático, melanoma múltiplo, osteossarcoma, leucemia, linfoma, câncer de próstata e câncer de pulmão (Publicação PCT No WO 2008/146911; Brown, C.E. et al. (2013) “Glioma IL13Rα2 Is Associated With Mesenchymal Signature Gene Expression And Poor Patient Prognosis,” PLoS One. 18;8(10):e77769; Barderas, R. et al. (2012) “High Expression Of IL-13 Receptor Α2 In Colorectal Cancer Is Associated With Invasion, Liver Metastasis, And Poor Prognosis,” Cancer Res. 72(11):2780-2790; Kasaian, M.T. et al. (2011) “IL-13 Antibodies Influence IL-13 Clearance In Humans By Modulating Scavenger Activity Of IL-13Rα2,” J. Immunol. 187(1):561-569; Bozinov, O. et al. (2010) “Decreasing Expression Of The Interleukin-13 Receptor IL-13Ralpha2 In Treated Recurrent Malignant Gliomas,” Neurol. Med. Chir. (Tokyo) 50(8):617-621; Fujisawa, T. et al. (2009) “A Novel Role Of Interleukin-13 Receptor alfa2 In Pancreatic Cancer Invasion And Metastasis,” Cancer Res. 69(22):8678-8685). Anticorpos que se ligam imunoespecificamente a IL13Rα2 são comercialmente disponíveis e foram descritos na técnica (Abnova Corporation, Biorbyt, LifeSpan BioSciences, United States Biologicals; ver também Publicação PCT No WO 2008/146911). Anticorpos exemplificativos que se ligam a IL13Rα2 humano incluem “hu08” (ver, por exemplo, Publicação PCT No WO 2014/072888).
[00405] A sequência de aminoácidos do Domínio VH de hu08 (SEQ ID NO: 134) é mostrada abaixo (resíduos de CDR são mostrados sublinhados):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RNGMSWVRQA PGKGLEWVAT VSSGGSYIYY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARQG TTALATRFFD VWGQGTLVTV SS
[00406] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de hu08 (SEQ ID NO: 135) é mostrada abaixo (resíduos de CDR são mostrados sublinhados):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVG TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASYRSTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQH HYSAPWTFGG GTKVEIK
[00407] A presente invenção especificamente inclui e abrange CD16 x IL13Rα2 “Molécula de Ligação que compreende o Domínio VL e/ou VH e/ou 1, 2 ou todas as 3 das CDRLs da Região VL e/ou 1, 2 ou todas as 3 das CDRHs do Domínio VH do anticorpo monoclonal anti-IL13Rα2 hu08.
10. ANTICORPOS ANTI-CD123 EXEMPLIFICATIVOS
[00408] CD123 (receptor alfa de interleucina 3, IL-3Ra) é uma molécula 40 kDa e é parte do complexo receptor de interleucina 3 (Stomski, F.C. et al. (1996) ““Human Interleukin-3 (IL-3) Induces Disulfide-Linked IL-3 Receptor Alpha- And Beta-Chain Heterodimerization, Which Is Required For Receptor Activation But Not High-Affinity Binding,” Mol. Cell. Biol. 16(6):3035-3046). A interleucina 3 (IL-3) promove a diferenciação precoce de células-tronco multipotentes em células dos progenitores eritroide, mieloide e linfoide. Foi relatado que o CD123 está superexpresso em células malignas em uma ampla gama de neoplasias hematológicas, incluindo leucemia mieloide aguda (AML) e síndrome mielodisplásica
(MDS) ((Muñoz, L. et al. (2001) “Interleukin-3 Receptor Alpha Chain (CD123) Is Widely Expressed In Hematologic Malignancies,” Haematologica 86(12):1261-1269). Superexpressão de CD123 está associada com pior prognóstico em AML (Tettamanti, M.S. et al. (2013) “Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric Antigen Receptor,” Br. J. Haematol. 161:389-401).
[00409] Um anticorpo exemplificativo que se liga a CD123 humano e que pode ser utilizado na presente invenção, é “CD123 mAb 1” (ver, por exemplo, Publicação de Patente PCT WO 2015/026892).
[00410] A sequência de aminoácidos do Domínio VH de CD123 mAb 1 (SEQ ID NO: 136) é mostrada abaixo (resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
EVQLVQSGAE LKKPGASVKV SCKASGYTFT DYYMKWVRQA PGQGLEWIGD IIPSNGATFY NQKFKGRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARSH LLRASWFAYW GQGTLVTVSS
[00411] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de CD123 mAb 1 (SEQ ID NO: 137) é mostrada abaixo (resíduos de CDRL são mostrados sublinhados):
DFVMTQSPDS LAVSLGERVT MSCKSSQSLL NSGNQKNYLT WYQQKPGQPP KLLIYWASTR ESGVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLQAEDVA VYYCQNDYSY PYTFGQGTKL EIK
[00412] A presente invenção especificamente inclui e abrange CD16 x CD123 “Molécula de Ligação que compreende o Domínio VL e/ou VH e/ou 1, 2 ou todas as 3 das CDRLs da Região VL e/ou 1, 2 ou todas as 3 das CDRHs do Domínio VH do anticorpo monoclonal anti-CD123 CD123 mAb 1 ou qualquer um dos anticorpos anti-CD123 divulgados em US
2017/081424 e WO 2016/036937.
11. ANTICORPOS ANTI-CD19 EXEMPLIFICATIVOS
[00413] CD19 (antígeno B4 de superfície de linfócitos B, número de acesso Genbank M28170) é um componente do complexo receptor de células B (BCR) e é um regulador positivo da sinalização de células B que modula o limiar para a ativação de células B e imunidade humoral. CD19 é um dos antígenos mais onipresente na linhagem de células B e é expresso em >95% das neoplasias malignas de células B, incluindo leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL) e linfoma não-Hodgkin (NHL). Notavelmente, a expressão de CD19 é mantida em linfomas de células B que se tornam resistentes à terapia anti-CD20 (Davis et al. (1999) “Therapy of B-cell Lymphoma With Anti- CD20 Antibodies Can Result In The Loss Of CD20 Antigen Expression.” Clin Cancer Res, 5:611-615, 1999). O CD19 também foi sugerido como alvo para o tratamento de doenças autoimunes (Tedder (2009) “CD19: A Promising B Cell Target For Rheumatoid Arthritis,” Nat. Rev. Rheumatol. 5:572-577).
[00414] Um anticorpo exemplificativo que se liga a CD19 humano e que pode ser utilizado na presente invenção, é o anticorpo anti-CD19 divulgado em WO 2016/048938 (referido aqui como “CD19 mAb 1”).
[00415] A sequência de aminoácidos do Domínio VH de CD19 mAb 1 (SEQ ID NO: 123) é mostrada abaixo (resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
QVTLRESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS TSGMGVGWIR QPPGKALEWL AHIWWDDDKR YNPALKSRLT ISKDTSKNQV FLTMTNMDPV DTATYYCARM ELWSYYFDYW GQGTTVTVSS
[00416] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de CD19 mAb 1 (SEQ ID NO: 139) é mostrada abaixo (resíduos de CDRL são mostrados sublinhados):
ENVLTQSPAT LSVTPGEKAT ITCRASQSVS YMHWYQQKPG QAPRLLIYDA SNRASGVPSR FSGSGSGTDH TLTISSLEAE DAATYYCFQG SVYPFTFGQG TKLEIK
[00417] A presente invenção especificamente inclui e abrange CD16 x CD19 “Molécula de Ligação que compreende o Domínio VL e/ou VH e/ou 1, 2 ou todas as 3 das CDRLs da Região VL e/ou 1, 2 ou todas as 3 das CDRHs do Domínio VH do anticorpo monoclonal anti-CD19 CD19 mAb 1 ou qualquer um dos anticorpos anti-CD19 divulgados na Patente US
7.112.324. B. ANTÍGENOS ASSOCIADOS A PATÓGENOS
EXEMPLIFICATIVOS
[00418] Como usado aqui, o termo “Antígeno associado a patógenos” indica um antígeno que é caracteristicamente expresso na superfície de uma célula infectada por patógenos e que pode ser tratado com uma molécula baseada em anticorpos ou uma molécula imunomoduladora. Exemplos de antígenos associados a patógenos incluem, entre outros, antígenos expressos na superfície de uma célula infectada com: um vírus Herpes Simplex (por exemplo, proteína celular infectada (ICP) 47, gD, etc.), um vírus varicela-zoster, um herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi, um vírus Epstein-Barr (por exemplo, LMP-1, LMP-2A, LMP-2B, etc.), um citomegalovírus (por exemplo, UL11, etc.), vírus de imunodeficiência humana (por exemplo, proteínas env gp160, gp120, gp41, etc.), um vírus do papiloma humano (por exemplo, E6, E7, etc.), um vírus de leucemia de células T humanas (por exemplo, proteínas env gp64, gp46, gp21, etc.), vírus da hepatite A, vírus da Hepatite B, vírus da Hepatite
C, vírus da Estomatite Vesicular (VSV), Bacilos, Citrobactérias, Cólera, Difteria, Enterobactérias, Gonococos, Helicobacter pylori, Klebsiella, Legionella, Meningococos, Micobactérias, Pseudomonas, Pneumonococos, Salmonia, Rickettsias Estafilococos, estreptococos, tétano, Aspergillus (fumigatus, niger, etc.), Blastomyces dermatitidis, Candida (albicans, krusei, gl) abrata, tropicalis, etc.), Cryptococcus neoformans, Gênero Mucorales (mucor, absídios, rizópus), Sporothrix schenkii, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Leptospirose, Borrelia burgdorferi, parasitas do vírus da gripe, parasitas do vírus da gripe, parasitas do vírus da gripe, Schistosomia), Giardia lambia, trichinella, Dientamoeba Fragilis, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi e Leishmania donovani). Tais anticorpos estão disponíveis comercialmente em um grande número de fontes ou podem ser obtidos imunizando camundongos ou outros animais (inclusive para a produção de anticorpos monoclonais) com esses antígenos.
[00419] Anticorpos exemplificativos, cujos domínios VH e VL podem ser usados para construir moléculas capazes de se ligar a um antígeno associado a patógenos, dispostos na superfície de uma célula infectada por patógenos, são anticorpos fornecidos abaixo, anticorpos adicionais são conhecidos na técnica.
1. ANTICORPOS ANTI-HIV EXEMPLIFICATIVOS
[00420] A proteína de HIV env é um Antígeno Associado ao Patógeno exemplificativo e anticorpos que se ligam à proteína de HIV env são exemplificativos de anticorpos capazes de se ligar a um Antígeno Associado ao Patógeno.
[00421] A etapa inicial na infecção por HIV-1 ocorre com a ligação de CD4 de superfície celular às glicoproteínas envelopadas de HIV-1 triméricas (env), um heterodímero de uma glicoproteína transmembranar (gp41) e uma glicoproteína de superfície (gp120). As glicoproteínas gp120 e gp41 são inicialmente sintetizadas como um único polipeptídeo gp160 que é subsequentemente clivado para gerar o complexo de gp120/gp41 não covalentemente associado. A ectodomínio de env é um heterodímero com massa de aproximadamente 140 kDa, compostos pelo componente inteiro de gp120 e aproximadamente 20 kDa de gp41 (Harris, A. et al. (2011) “Trimeric HIV-1 Glycoprotein Gp140 Immunogens And Native HIV-1 Envelope Glycoproteins Display The Same Closed And Open Quaternary Molecular Architectures,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 108(28):11440-11445). Anticorpos que se ligam imunoespecificamente às proteínas env são comercialmente disponíveis e foram descritos na técnica (ver, por exemplo, No de Acesso GenBank AFQ31503; Buchacher, A. et al. (1994) “Generation Of Human Monoclonal Antibodies Against HIV-1 Proteins; Electrofusion And Epstein-Barr Virus Transformation For Peripheral Blood Lymphocyte Immortalization,” AIDS Res. Hum. Retroviruses 10(4):359-369; Shen, R. (2010) “GP41-Specific Antibody Blocks Cell-Free HIV Type 1 Transcytosis Through Human Rectal Mucosa And Model Colonic Epithelium,” J. Immunol. 184(7):3648-3655; WO 2012/162068; e WO 2016/054101). Anticorpos exemplificativos que se ligam a HIV env incluem “7B2” (No de Acesso GenBank AFQ31503) e “A32” (Publicação PCT No WO 2014/159940).
[00422] Anticorpo 7B2 (Números de acesso Genbank JX188438 e JX188439) é um anticorpo humano IgG1 env anti-HIV que que se liga a HIV gp41 a 598-604 na região hélice-alça- hélice imunodominante da Molécula (Sadraeian, M. et al. (2017) “Selective Cytotoxicity Of A Novel Immunotoxin Based On Pulchellin A Chain For Cells Expressing HIV Envelope,” Sci. Rep. 7(1):7579 doi: 10.1038/s41598-017-08037-3). O anticorpo foi isolado de um sujeito cronicamente infectado por HIV-1 usando virus Epstein-Barr (EB), transformação de células B e produção de hetero-hibridoma (Pincus, S.H. et al. (2003) “In Vivo Efficacy Of Anti-Glycoprotein 41, But Not Anti-Glycoprotein 120, Immunotoxins In A Mouse Model Of HIV Infection,” J. Immunol. 170(4):2236-2241). Anticorpo 7B2 foi capaz de reconhecer ambos as partículas virais e células infectadas (Santra, S. et al. (2015) “Human Non-neutralizing HIV-1 Envelope Monoclonal Antibodies Limit the Number of Founder Viruses during SHIV Mucosal Infection in Rhesus Macaques,” PLoS Pathog. 11(8):e1005042. doi:
10.1371/journal.ppat.1005042; Tay, M.Z. et al. (2016) “Antibody-Mediated Internalization of Infectious HIV-1 Virions Differs among Antibody Isotypes and Subclasses,” PLoS Pathog. 12(8):e1005817. doi: 10.1371/journal.ppat.1005817).
[00423] A sequência de aminoácidos do Domínio VH de 7B2 (SEQ ID NO: 140) é mostrada abaixo (resíduos de CDR são mostrados sublinhados):
QVQLVQSGGG VFKPGGSLRL SCEASGFTFT EYYMTWVRQA PGKGLEWLAY ISKNGEYSKY SPSSNGRFTI SRDNAKNSVF LQLDRLSADD TAVYYCARAD GLTYFSELLQ YIFDLWGQGA RVTVSS
[00424] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de 7B2 (SEQ ID NO: 141) é mostrada abaixo (resíduos de CDR são mostrados sublinhados):
DIVMTQSPDS LAVSPGERAT IHCKSSQTLL YSSNNRHSIA WYQQRPGQPP KLLLYWASMR LSGVPDRFSG SGSGTDFTLT INNLQAEDVA IYYCHQYSSH PPTFGHGTRV EIK
[00425] Anticorpo monoclonal A32 reconhece um epítopo conformacional na região C1 de HIV-1 Env gp120 (Wyatt et al. (1995) “Involvement Of The V1/V2 Variable Loop Structure In The Exposure Of Human Immunodeficiency Virus Type 1 gp120 Epitopes Induced By Receptor Binding,” J. Virol. 69:5723-5733) e medeia atividade de ADCC potente e pode bloquear proporção uma significativa de atividade detectável de Ab mediando ADCC em indivíduos infectados por HIV-1 (Ferrari, G. et al. (2011) “An HIV-1 gp120 Envelope Human Monoclonal Antibody That Recognizes a C1 Conformational Epitope Mediates Potent Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity (ADCC) Activity and Defines a Common ADCC Epitope in Human HIV-1 Serum,” J. Virol. 85(14):7029-7036).
[00426] Múltiplos Domínios VH de Anticorpo A32 foram relatados na técnica que possuem menores alterações nas regiões de estrutura 1 e/ou 4 relatadas (ver, por exemplo, Número de acesso ao banco de dados de proteínas PDB: 4YBL_H, US 2015/0239961 e WO 2006/044410). Qualquer um destes Domínios VH de Anticorpo A32 variantes pode ser utilizado de acordo com a presente invenção. A sequência de aminoácidos de um Domínio VH de A32 ilustrativo (SEQ ID NO: 142) é mostrada abaixo (resíduos de CDR são mostrados sublinhados):
QVQLQESGPG LVKPSQTLSL SCTVSGGSSS SGAHYWSWIR QYPGKGLEWI GYIHYSGNTY YNPSLKSRIT ISQHTSENQF SLKLNSVTVA DTAVYYCARG TRLRTLRNAF DIWGQGTLVT VSS
[00427] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de A32 (SEQ ID NO: 143) é mostrada abaixo (resíduos de CDR são mostrados sublinhados):
QSALTQPPSA SGSPGQSVTI SCTGTSSDVG GYNYVSWYQH HPGKAPKLII SEVNNRPSGV PDRFSGSKSG NTASLTVSGL QAEDEAEYYC SSYTDIHNFV FGGGTKLTVL
[00428] A sequência de aminoácidos do Domínio VL de A32 (SEQ ID NO: 143) pode ser utilizada com o Domínio VH de A32 ilustrativo (SEQ ID NO: 142) ou com qualquer um dos Domínios VH de Anticorpo A32 variante (ver, por exemplo, Número de acesso ao banco de dados de proteínas PDB: 4YBL_H, US 2015/0239961 e WO 2006/044410) para formar um Sítio de Ligação de Epítopo gp120 Env anti-HIV-1.
[00429] A presente invenção especificamente inclui e abrange CD16 x HIV “Molécula de Ligação que compreende o Domínio VL e/ou VH e/ou 1, 2 ou todas as 3 das CDRLs da Região VL e/ou 1, 2 ou todas as 3 das CDRHs do Domínio VH dos anticorpos monoclonais anti-HIV 7B2 ou A32 ou de qualquer um dos anticorpos anti-HIV divulgados em WO 2016196975, WO 2016/149710, WO 2016/149698, WO 2016/149695, WO 2015/048610, WO 2012/030904, WO 2013/163427, WO 2013/192589, WO 2014/063059, WO 20170/11413, WO 2016/054101, WO 2014/159940 ou WO 2017/011414.
[00430] O presente pedido adicionalmente especificamente inclui e abrange CD16 x HIV “Molécula de Ligação que são capazes de se ligar a HIV, a CD16 e a CD8 e particularmente tal molécula de ligação triespecífica que compreende o Domínio VL e/ou VH e/ou 1, 2 ou todas as 3 das CDRLs da Região VL e/ou 1, 2 ou todas as 3 das CDRHs do Domínio VH do anticorpos monoclonais anti-HIV 7B2 ou A32 ou de qualquer um dos anticorpos monoclonais anti-HIV fornecidos em WO 2015/184203, WO 2016/054101, WO 2017/011413, WO 2017/011414.
2. ANTICORPO ANTI-RSV EXEMPLIFICATIVO
[00431] Um outro Antígeno Associado ao Patógeno ilustrativo é glicoproteína F de RSV. Um anticorpo de glicoproteína F anti-RSV exemplificativo é Palivizumabe (ver, por exemplo, Banco de Dados de Proteína (PDB) No de ID 2HWZ). Anticorpos de glicoproteína F anti-RSV alternativas incluem motavizumabe (ver, por exemplo, No de ID de PDB 3IXT) e uma variante de palivizumabe (também referido aqui como “vPalivizumabe”) que foi manipulado para remover um resíduo de cisteína de CDRL1 de palivizumabe. A sequência de aminoácidos do Domínio VH da variante de palivizumabe (SEQ ID NO: 144) é mostrada abaixo (resíduos de CDR são mostrados sublinhados):
QVTLRESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS TSGMSVGWIR QPPGKALEWL ADIWWDDKKD YNPSLKSRLT ISKDTSKNQV VLKVTNMDPA DTATYYCARS MITNWYFDVW GAGTTVTVSS
[00432] A sequência de aminoácidos do Domínio VL da variante de palivizumabe (SEQ ID NO: 145) é mostrada abaixo (resíduos de CDR são mostrados sublinhados):
DIQMTQSPST LSASVGDRVT ITCRASQSVG YMHWYQQKPG KAPKLLIYDT SKLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPD DFATYYCFQG SGYPFTFGGG TKLEIK
[00433] A presente invenção especificamente inclui e abrange CD16 x RSV “Molécula de Ligação que compreende o Domínio VL e/ou VH e/ou 1, 2 ou todas as 3 das CDRLs da Região VL e/ou 1, 2 ou todas as 3 das CDRHs do Domínio VH do anticorpo monoclonal anti-RSV palivizumabe ou vPalivizumabe. VII. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO EXEMPLIFICATIVA DA
PRESENTE INVENÇÃO
[00434] Os princípios da presente invenção são ilustrados por uma série de Moléculas de Ligação CD16 x DA exemplificativas incorporando domínios de ligação anti-CD16 de murino ou humanizado diferentes e tendo um Domínio de Ligação que é imunoespecíficos para um Antígeno de Doença. A estruturas e sequências de Diacorpo covalente de tais Moléculas de Ligação CD16 x DA ilustrativas são resumidas na Tabela 12 e são descritos em detalhe abaixo. Como será reconhecido, diacorpos análogos e outras moléculas biespecíficas podem do mesmo modo ser construídos (utilizando-se os Domínios VL e VH de anticorpos desejados no lugar dos Domínios VL e VH usados na Moléculas de Ligação CD16 x DA ilustrativa.
Tabela 12 Nome Cadeia SEQ SEQ SEQ do Domín Domín Polipep ID Anticorpo ID Anticorpo ID Diacor io io tídica NO NO NO po Trastuzum 1 151 VL 125 CD16-M1 VH 64 abe DART-A Trastuzum 2 152 CD16-M1 VL 65 VH 124 abe 3 153 Cadeia Polipeptídica de Diacorpo Comum Trastuzum 1 154 VL 125 CD16-M2 VH 75 abe DART-B Trastuzum 2 155 CD16-M2 VL 76 VH 124 abe 3 153 Cadeia Polipeptídica de Diacorpo Comum Trastuzum 1 156 VL 125 hCD16-M1 VH 72 abe DART-C Trastuzum 2 157 hCD16-M1 VL 73 VH 124 abe 3 153 Cadeia Polipeptídica de Diacorpo Comum DART-D 1 158 Trastuzum VL 125 hCD16-M2 VH1 83 abe Trastuzum 2 159 hCD16-M2 VL 85 VH 124 abe 3 153 Cadeia Polipeptídica de Diacorpo Comum Trastuzum 1 160 VL 125 hCD16-M2 VH2 84 abe DART-E Trastuzum 2 159 hCD16-M2 VL 85 VH 124 abe 3 153 Cadeia Polipeptídica de Diacorpo Comum 1 161 A32 VL 143 hCD16-M1 VH 72 DART-F 2 162 hCD16-M1 VL 73 A32 VH 142 3 153 Cadeia Polipeptídica de Diacorpo Comum 1 163 A32 VL 143 hCD16-M2 VH1 83 DART-G 2 164 hCD16-M2 VL 85 A32 VH 142 3 153 Cadeia Polipeptídica de Diacorpo Comum 1 165 7B2 VL 141 hCD16-M1 VH 72 DART-H 2 166 hCD16-M1 VL 73 7B2 VH 140 3 153 Cadeia Polipeptídica de Diacorpo Comum Trastuzum 1 186 VL 125 hCD16-M1A VH 58 abe DART-I Trastuzum 2 157 hCD16-M1 VL 73 VH 124 ab 3 153 Cadeia Polipeptídica de Diacorpo Comum Trastuzum 1 156 VL 125 hCD16-M1 VH 72 abe DART-J Trastuzum 2 187 hCD16-M1B VL 59 VH 124 abe 3 153 Cadeia Polipeptídica de Diacorpo Comum Trastuzum 1 186 VL 125 hCD16-M1A VH 58 abe DART-K Trastuzum 2 187 hCD16-M1B VL 59 VH 124 abe 3 153 Cadeia Polipeptídica de Diacorpo Comum
CD19 mAb 1 188 VL 139 hCD16-M1 VH 72 1 DART-L CD19 mAb 2 189 hCD16-M1 VL 73 VH 138 1 3 153 Cadeia Polipeptídica de Diacorpo Comum CD19 mAb 1 188 VL 139 hCD16-M1 VH 72 1 DART-M CD19 mAb 2 190 hCD16-M1B VL 59 VH 138 1 3 153 Cadeia Polipeptídica de Diacorpo Comum CD19 mAb 1 191 VL 139 hCD16-M1A VH 58 1 DART-N CD19 mAb 2 190 hCD16-M1B VL 59 VH 138 1 3 153 Cadeia Polipeptídica de Diacorpo Comum Trastuzum 1 167 VL 125 h3G8 VH 62 abe DART-1 Trastuzum 2 168 h3G8 VL 63 VH 124 abe 3 153 Cadeia Polipeptídica de Diacorpo Comum vPalivizu 1 - VL 145 h3G8 VH 62 mabe DART-2 vPalivizu 2 - h3G8 VL 63 VH 144 mabe 3 153 Cadeia Polipeptídica de Diacorpo Comum vPalivizu 1 169 VL 145 hCD16-M1 VH 72 mabe DART-3 vPalivizu 2 170 hCD16-M1 VL 73 VH 144 mabe 3 153 Cadeia Polipeptídica de Diacorpo Comum 1 - 7B2 VL 141 h3G8 VH 62 DART-4 2 - h3G8 VL 63 7B2 VH 140 3 153 Cadeia Polipeptídica de Diacorpo Comum DART-5 1 - vPalivizu VL 145 hCD16-M1 VH 72 mab vPalivizu 2 - hCD16-M1 VL 73 VH 144 mab 3 153 Cadeia Polipeptídica de Diacorpo Comum vPalivizu 1 - VL 145 hCD16-M1 VH 72 mab DART-6 vPalivizu 2 - hCD16-M1B VL 59 VH 144 mab 3 153 Cadeia Polipeptídica de Diacorpo Comum vPalivizu 1 - VL 145 hCD16-M1A VH 58 mab DART-7 vPalivizu 2 - hCD16-M1B VL 59 VH 144 mab 3 153 Cadeia Polipeptídica de Diacorpo Comum 1 171 7B2 VL 141 CD16-M1 VH 64 DART-X 2 172 CD16-M1 VL 65 7B2 VH 140 1 173 7B2 VL 141 CD16-M2 VH 75 DART-Y 2 174 CD16-M2 VL 76 7B2 VH 140 1 - A32 VL 143 4-LSN1 VH 175 DART-Z 2 - 4-LSN1 VL 176 A32 VH 142 1 - 7B2 VL 141 h3G8 VH 62 DART-0 2 - h3G8 VL 63 7B2 VH 140 A. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X HER2/NEU, DART-A
[00435] A Molécula de Ligação CD16 x HER2/neu designada “DART-A” é uma primeira Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa. DART-A é um Diacorpo biespecífico contendo Domínio Fc, capaz de se ligar a CD16 e ao antígeno de câncer HER2/neu. DART-A é composta por três cadeias polipeptídicas e possui um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH de anticorpo CD16 anti-humano CD16-M1 (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo de CD16) e um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH de Trastuzumabe (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo do Antígeno de Câncer HER2/neu). As três cadeias polipeptídicas se associam para formar um Diacorpo DART® covalentemente ligado capaz de se ligar imunoespecificamente ao epítopo de CD16 e ao epítopo do Antígeno de Câncer HER2/neu (ver, por exemplo, Figura 4A).
[00436] A primeira cadeia polipeptídica de DART-A tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 151:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASFLYSGVPS RFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYTTPPTFGQ GTKVEIKGGG SGGGGEVKLV ESGGTLVKPG GSLKLSCAAS GFTFNNYGMS WVRQTPEKRL EWVATISGGG SYTFYPDSVK GRFTISRDNA KNSLYLQMSS LRSEDTALYY CIRQSARAPE PYWGQGTLVT VSSASTKGEV AACEKEVAAL EKEVAALEKE VAALEKGGGD KTHTCPPCPA PEAAGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLWCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK
[00437] Resíduos 1-107 da primeira cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 151) de tal Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa correspondem ao Domínio VL de Trastuzumabe (SEQ ID NO: 125). Resíduos 108-115 (sublinhado duplo) da primeira cadeia polipeptídica correspondem ao Conector 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO: 16). Resíduos 116-233 da primeira cadeia polipeptídica correspondem ao Domínio VH de anticorpo CD16 anti-humano CD16-M1 (SEQ ID NO: 64). Resíduos 234-238 correspondem a um conector (SEQ ID NO: 21, sublinhado). Resíduos 239-266 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um espiral E contendo cisteína (SEQ ID NO: 31). Resíduos 267-279 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um conector (SEQ ID NO: 43).
Resíduos 280-496 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um “knob-bearing” (SEQ ID NO: 51), em que o resíduo final é lisina.
[00438] A segunda cadeia polipeptídica de DART-A tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 152:
DIVMTQSQKF MSTSVGDRVS VTCKASQNVG THVAWYQQKS GQSPKSLLYS ASYRYSGVPD RFSGSGSGTD FTLTISNVQS EDLAEYFCQQ YKSYPLTFGA GTKLELKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFNIKDTYIH WVRQAPGKGL EWVARIYPTN GYTRYADSVK GRFTISADTS KNTAYLQMNS LRAEDTAVYY CSRWGGDGFY AMDYWGQGTL VTVSSASTKG KVAACKEKVA ALKEKVAALK EKVAALKE
[00439] Resíduos 1-107 da segunda cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 152) de tal Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa correspondem ao Domínio VL de anticorpo CD16 anti-humano CD16-M1 (SEQ ID NO: 65). Resíduos 108-115 (sublinhado duplo) da segunda cadeia polipeptídica correspondem ao Conector 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO: 16). Resíduos 116-235 da segunda cadeia polipeptídica correspondem ao Domínio VH de Trastuzumabe (SEQ ID NO: 124). Resíduos 236- 240 da segunda cadeia polipeptídica correspondem a um conector (SEQ ID NO: 21, sublinhado). Resíduos 241-268 da segunda cadeia polipeptídica correspondem a um espiral K contendo cisteína (SEQ ID NO: 32).
[00440] A terceira cadeia polipeptídica do DART-A tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 153:
DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNRYTQKS LSLSPGK
[00441] Resíduos 1-10 da terceira cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 153) de tal Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa correspondem a um conector (SEQ ID NO: 40). Resíduos 11-227 da terceira cadeia polipeptídica correspondem a um Domínio CH2-CH3 de IgG1 “hole-bearing” (SEQ ID NO: 53), contendo a substituição de H435R (mostrado sublinhado) e em que o resíduo final é lisina. Como estabelecido acima, a substituição de H435R elimina a capacidade da Molécula para se ligar à proteína A.
[00442] Como será reconhecido, a terceira cadeia polipeptídica de DART-A não contém qualquer Sítios de Ligação de Epítopo e pode ser, assim, utilizada em várias Moléculas de Ligação CD16 x DA. Consequentemente, a terceira cadeia polipeptídica de DART-A é referida como uma “Cadeia Polipeptídica de Diacorpo Comum”. B. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X HER2/NEU, “DART-B”
[00443] A Molécula de Ligação CD16 x Her2/neu designada “DART-B” é uma outra Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa. DART-B é um Diacorpo biespecífico contendo Domínio Fc, capaz de se ligar a CD16 e ao Antígeno HER2/neu de Câncer. DART-B é composta por três cadeias polipeptídicas e possui um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH de anticorpo CD16 anti-humano CD16-M2 (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo de CD16) e um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH de Trastuzumabe (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo do Antígeno HER2/neu de Câncer). As três cadeias polipeptídicas se associam para formar um Diacorpo DART® covalentemente ligado capaz de se ligar imunoespecificamente ao epítopo de CD16 e ao epítopo do Antígeno HER2/neu de Câncer (ver, por exemplo,
Figura 4A).
[00444] A primeira cadeia polipeptídica de DART-B tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 154:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASFLYSGVPS RFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYTTPPTFGQ GTKVEIKGGG SGGGGEVQLQ QSGPELVKPG ASVKMSCKAS GYTFTSSAMH WVKKNPGQGL EWIGYINHYN DGIKYNERFK GKATLTSDKS SSTAYMELSS LTSEDSAVYY CATGYRYASW FASWGQGTLV TVSSASTKGE VAACEKEVAA LEKEVAALEK EVAALEKGGG DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK
[00445] Resíduos 1-107 da primeira cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 154) de tal Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa correspondem ao Domínio VL de Trastuzumabe (SEQ ID NO: 125). Resíduos 108-115 (sublinhado duplo) da primeira cadeia polipeptídica correspondem ao Conector 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO: 16). Resíduos 116-234 da primeira cadeia polipeptídica correspondem ao Domínio VH de anticorpo CD16 anti-humano CD16-M2 (SEQ ID NO: 75). Resíduos 235-239 correspondem a um conector (SEQ ID NO: 21, sublinhado). Resíduos 240-267 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um espiral E contendo cisteína (SEQ ID NO: 31). Resíduos 268-280 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um conector (SEQ ID NO: 43). Resíduos 281-497 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um Domínio CH2-CH3 de IgG1 “knob-bearing” (SEQ ID NO: 51), em que o resíduo final é lisina.
[00446] A segunda cadeia polipeptídica de DART-B tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 155:
DILLTQSPAI LSVSPGERVS FSCRASQNIG TSIHWYQQRT DGSPRLLIKS VSESISGIPS RFSGSGSGTD FTLTINGVES GDISDYYCQQ SNSWPLTFGA GTKLELKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFNIKDTYIH WVRQAPGKGL EWVARIYPTN GYTRYADSVK GRFTISADTS KNTAYLQMNS LRAEDTAVYY CSRWGGDGFY AMDYWGQGTL VTVSSASTKG KVAACKEKVA ALKEKVAALK EKVAALKE
[00447] Resíduos 1-107 da segunda cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 155) de tal Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa correspondem ao Domínio VL de anticorpo CD16 anti-humano CD16-M2 (SEQ ID NO: 76). Resíduos 108-115 (sublinhado duplo) da segunda cadeia polipeptídica correspondem ao Conector 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO: 16). Resíduos 116-235 da segunda cadeia polipeptídica correspondem ao Domínio VH de Trastuzumabe (SEQ ID NO: 124). Resíduos 236- 240 da segunda cadeia polipeptídica correspondem a um conector (SEQ ID NO: 21, sublinhado). Resíduos 241-268 da segunda cadeia polipeptídica correspondem a um espiral K contendo cisteína (SEQ ID NO: 32).
[00448] A terceira cadeia polipeptídica de DART-B tem a sequência de aminoácidos da Cadeia Polipeptídica de Diacorpo Comum (SEQ ID NO: 153). C. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X HER2/NEU “DART-C”
[00449] A Molécula de Ligação CD16 x Her2/neu designada “DART-C” é uma outra Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa. DART-C é um Diacorpo biespecífico contendo Domínio Fc, capaz de se ligar a CD16 e ao Antígeno HER2/neu de Câncer. DART-C é composta por três cadeias polipeptídicas e possui um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH de anticorpo CD16 anti-humano humanizado hCD16-M1 (e é,
portanto, imunoespecífico para um epítopo de CD16) e um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH de Trastuzumabe (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo do Antígeno HER2/neu de Câncer). As três cadeias polipeptídicas se associam para formar um Diacorpo DART® covalentemente ligado capaz de se ligar imunoespecificamente ao epítopo de CD16 e ao epítopo do Antígeno HER2/neu de Câncer (ver, por exemplo, Figura 4A).
[00450] A primeira cadeia polipeptídica de DART-C tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 156:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASFLYSGVPS RFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYTTPPTFGQ GTKVEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVKPG GSLRLSCAAS GFTFSNYGMS WVRQAPGKGL EWVATISGGG SYTFYPDSVK GRFTISRDNA KNSLYLQMNS LRTEDTALYY CVRQSARAPE PYWGQGTLVT VSSASTKGEV AACEKEVAAL EKEVAALEKE VAALEKGGGD KTHTCPPCPA PEAAGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLWCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK
[00451] Resíduos 1-107 da primeira cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 156) de tal Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa correspondem ao Domínio VL de Trastuzumabe (SEQ ID NO: 125). Resíduos 108-115 (sublinhado duplo) da primeira cadeia polipeptídica correspondem ao Conector 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO: 16). Resíduos 116-233 da primeira cadeia polipeptídica correspondem ao Domínio VH do anticorpo CD16 anti-humano humanizado hCD16-M1 (SEQ ID NO: 72). Resíduos 234-238 correspondem a um conector (SEQ ID NO: 21, sublinhado). Resíduos 239-266 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um espiral E contendo cisteína (SEQ ID NO: 31). Resíduos 267-279 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um conector (SEQ ID NO: 43). Resíduos 280-496 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um Domínio CH2-CH3 de IgG1 “knob-bearing” (SEQ ID NO: 51), em que o resíduo final é lisina.
[00452] A segunda cadeia polipeptídica de DART-C tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 157:
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASQNVG THVAWYQQKP GKAPKSLLYS ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQS EDIATYYCQQ YKSYPLTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFNIKDTYIH WVRQAPGKGL EWVARIYPTN GYTRYADSVK GRFTISADTS KNTAYLQMNS LRAEDTAVYY CSRWGGDGFY AMDYWGQGTL VTVSSASTKG KVAACKEKVA ALKEKVAALK EKVAALKE
[00453] Resíduos 1-107 da segunda cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 157) de tal Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa correspondem ao Domínio VL de anticorpo CD16 anti-humano humanizado hCD16-M1 (SEQ ID NO: 73). Resíduos 108-115 (sublinhado duplo) da segunda cadeia polipeptídica correspondem ao Conector 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO: 16). Resíduos 116-235 da segunda cadeia polipeptídica correspondem ao Domínio VH de Trastuzumabe (SEQ ID NO: 124). Resíduos 236-240 da segunda cadeia polipeptídica correspondem a um conector (SEQ ID NO: 21, sublinhado). Resíduos 241-268 da segunda cadeia polipeptídica correspondem a um espiral K contendo cisteína (SEQ ID NO: 32).
[00454] A terceira cadeia polipeptídica de DART-C tem a sequência de aminoácidos da Cadeia Polipeptídica de Diacorpo Comum (SEQ ID NO: 153). D. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X HER2/NEU “DART-D”
[00455] A Molécula de Ligação CD16 x Her2/neu designada “DART-D” é uma outra Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa. DART-D é um Diacorpo biespecífico contendo Domínio Fc, capaz de se ligar a CD16 e ao Antígeno HER2/neu de Câncer. DART-D é composta por três cadeias polipeptídicas e possui um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH de anticorpo CD16 anti-humano humanizado hCD16-M2 (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo de CD16) e um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH de Trastuzumabe (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo do Antígeno HER2/neu de Câncer). As três cadeias polipeptídicas se associam para formar um Diacorpo DART® covalentemente ligado capaz de se ligar imunoespecificamente ao epítopo de CD16 e ao epítopo do Antígeno HER2/neu de Câncer (ver, por exemplo, Figura 4A).
[00456] A primeira cadeia polipeptídica de DART-D tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 158:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASFLYSGVPS RFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYTTPPTFGQ GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSSAMH WVRQAPGQGL EWMGYINHYN DGIKYNERFK GRVTITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CATGYRYASW FASWGQGTLV TVSSASTKGE VAACEKEVAA LEKEVAALEK EVAALEKGGG DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK
[00457] Resíduos 1-107 da primeira cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 158) de tal Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa correspondem ao Domínio VL de
Trastuzumabe (SEQ ID NO: 125). Resíduos 108-115 (sublinhado duplo) da primeira cadeia polipeptídica correspondem ao Conector 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO: 16). Resíduos 116-234 da primeira cadeia polipeptídica correspondem ao Domínio VH1 do anticorpo CD16 anti-humano humanizado hCD16-M2 (SEQ ID NO: 83). Resíduos 235-239 correspondem a um conector (SEQ ID NO: 21, sublinhado). Resíduos 240-267 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um espiral E contendo cisteína (SEQ ID NO: 31). Resíduos 268-280 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um conector (SEQ ID NO: 43). Resíduos 281-497 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um Domínio CH2-CH3 de IgG1 “knob-bearing” (SEQ ID NO: 51), em que o resíduo final é lisina.
[00458] A segunda cadeia polipeptídica de DART-D tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 159:
EIVLTQSPAT LSVSPGERAT LSCRASQNIG TSIHWYQQKP DQSPKLLIKS VSESISGVPS RFSGSGSGTD FTLTINSLEA EDFATYYCQQ SNSWPLTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFNIKDTYIH WVRQAPGKGL EWVARIYPTN GYTRYADSVK GRFTISADTS KNTAYLQMNS LRAEDTAVYY CSRWGGDGFY AMDYWGQGTL VTVSSASTKG KVAACKEKVA ALKEKVAALK EKVAALKE
[00459] Resíduos 1-107 da segunda cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 159) de tal Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa correspondem ao Domínio VL1 de anticorpo CD16 anti-humano humanizado hCD16-M2 (SEQ ID NO: 85). Resíduos 108-115 (sublinhado duplo) da segunda cadeia polipeptídica correspondem ao Conector 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO: 16). Resíduos 116-235 da segunda cadeia polipeptídica correspondem ao Domínio VH de Trastuzumabe (SEQ ID NO: 124). Resíduos 236-240 da segunda cadeia polipeptídica correspondem a um conector (SEQ ID NO: 21, sublinhado). Resíduos 241-268 da segunda cadeia polipeptídica correspondem a um espiral K contendo cisteína (SEQ ID NO: 32).
[00460] A terceira cadeia polipeptídica de DART-D tem a sequência de aminoácidos da Cadeia Polipeptídica de Diacorpo Comum (SEQ ID NO: 153). E. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X HER2/NEU “DART-E”
[00461] A Molécula de Ligação CD16 x Her2/neu designada “DART-E” é uma outra Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa. DART-E é um Diacorpo biespecífico capaz de se ligar a CD16 e ao Antígeno HER2/neu de Câncer. DART-E é composta por três cadeias polipeptídicas e possui um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH de anticorpo CD16 anti-humano humanizado hCD16-M2 (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo de CD16) e um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH de Trastuzumabe (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo do Antígeno HER2/neu de Câncer). As três cadeias polipeptídicas se associam para formar um Diacorpo DART® covalentemente ligado capaz de se ligar imunoespecificamente ao epítopo de CD16 e ao epítopo do Antígeno HER2/neu de Câncer (ver, por exemplo, Figura 4A).
[00462] A primeira cadeia polipeptídica de DART-E tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 160:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASFLYSGVPS RFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYTTPPTFGQ GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSSAMH WVRQAPGQGL EWMGYINHYN DGIKYNERFK GRVTITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CARGYRYASW FASWGQGTLV TVSSASTKGE VAACEKEVAA LEKEVAALEK EVAALEKGGG DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK
[00463] Resíduos 1-107 da primeira cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 160) de tal Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa correspondem ao Domínio VL de Trastuzumabe (SEQ ID NO: 125). Resíduos 108-115 (sublinhado duplo) da primeira cadeia polipeptídica correspondem ao Conector 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO: 16). Resíduos 116-234 da primeira cadeia polipeptídica correspondem ao Domínio VH2 do anticorpo CD16 anti-humano humanizado hCD16-M2 (SEQ ID NO: 84). Resíduos 235-239 correspondem a um conector (SEQ ID NO: 21, sublinhado). Resíduos 240-267 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um espiral E contendo cisteína (SEQ ID NO: 31). Resíduos 268-280 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um conector (SEQ ID NO: 43). Resíduos 281-497 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um Domínio CH2-CH3 de IgG1 “knob-bearing” (SEQ ID NO: 51), em que o resíduo final é lisina.
[00464] A segunda cadeia polipeptídica de DART-E é idêntica em sequência à segunda cadeia polipeptídica de DART-D (SEQ ID NO: 159).
[00465] A terceira cadeia polipeptídica de DART-E tem a sequência de aminoácidos da Cadeia Polipeptídica de Diacorpo Comum (SEQ ID NO: 153). F. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X HIV ENV “DART-F”
[00466] A Molécula de Ligação CD16 x HIV env designada “DART-F” é uma outra Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa. DART-F é um Diacorpo biespecífico capaz de se ligar a CD16 e à proteína de HIV env. DART-F é composta por três cadeias polipeptídicas e possui um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH de anticorpo CD16 anti- humano humanizado hCD16-M1 (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo de CD16) e um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH de Anticorpo A32 (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo da proteína de HIV env). As três cadeias polipeptídicas se associam para formar um Diacorpo DART® covalentemente ligado capaz de se ligar imunoespecificamente ao epítopo de CD16 e ao epítopo da proteína de HIV env (ver, por exemplo, Figura 4A).
[00467] A primeira cadeia polipeptídica de DART-F tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 161:
QSALTQPPSA SGSPGQSVTI SCTGTSSDVG GYNYVSWYQH HPGKAPKLII SEVNNRPSGV PDRFSGSKSG NTASLTVSGL QAEDEAEYYC SSYTDIHNFV FGGGTKLTVL GGGSGGGGEV QLVESGGGLV KPGGSLRLSC AASGFTFSNY GMSWVRQAPG KGLEWVATIS GGGSYTFYPD SVKGRFTISR DNAKNSLYLQ MNSLRTEDTA LYYCVRQSAR APEPYWGQGT LVTVSSASTK GEVAACEKEV AALEKEVAAL EKEVAALEKG GGDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK
[00468] Resíduos 1-110 da primeira cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 161) de tal Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa correspondem ao Domínio VL de Anticorpo A32 (SEQ ID NO: 143). Resíduos 111-118 (sublinhado duplo) da primeira cadeia polipeptídica correspondem ao Conector 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO: 16). Resíduos 119-236 da primeira cadeia polipeptídica correspondem ao Domínio VH do anticorpo
CD16 anti-humano humanizado hCD16-M1 (SEQ ID NO: 72). Resíduos 237-241 correspondem a um conector (SEQ ID NO: 21, sublinhado). Resíduos 242-269 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um espiral E contendo cisteína (SEQ ID NO: 31). Resíduos 270-282 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um conector (SEQ ID NO: 43). Resíduos 283-499 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um Domínio CH2-CH3 de IgG1 “knob-bearing” (SEQ ID NO: 51), em que o resíduo final é lisina.
[00469] A segunda cadeia polipeptídica de DART-F tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 162:
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASQNVG THVAWYQQKP GKAPKSLLYS ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQS EDIATYYCQQ YKSYPLTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLQ ESGPGLVKPS QTLSLSCTVS GGSSSSGAHY WSWIRQYPGK GLEWIGYIHY SGNTYYNPSL KSRITISQHT SENQFSLKLN SVTVADTAVY YCARGTRLRT LRNAFDIWGQ GTLVTVSSAS TKGKVAACKE KVAALKEKVA ALKEKVAALK E
[00470] Resíduos 1-107 da segunda cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 162) de tal Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa correspondem ao Domínio VL de anticorpo CD16 anti-humano humanizado hCD16-M1 (SEQ ID NO: 73). Resíduos 108-115 (sublinhado duplo) da segunda cadeia polipeptídica correspondem ao Conector 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO: 16). Resíduos 116-238 da segunda cadeia polipeptídica correspondem ao Domínio VH de Anticorpo A32 (SEQ ID NO: 142). Resíduos 239-243 da segunda cadeia polipeptídica correspondem a um conector (SEQ ID NO: 21, sublinhado). Resíduos 244-271 da segunda cadeia polipeptídica correspondem a um espiral K contendo cisteína (SEQ ID NO: 32).
[00471] A terceira cadeia polipeptídica de DART-F tem a sequência de aminoácidos da Cadeia Polipeptídica de Diacorpo Comum (SEQ ID NO: 153). G. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X HIV ENV “DART-G”
[00472] A Molécula de Ligação CD16 x HIV env designada “DART-G” é uma outra Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa. DART-G é um Diacorpo biespecífico capaz de se ligar a CD16 e à proteína de HIV env. DART-G é composta por três cadeias polipeptídicas e possui um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH de anticorpo CD16 anti- humano humanizado hCD16-M2 (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo de CD16) e um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH de Anticorpo A32 (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo da proteína de HIV env). As três cadeias polipeptídicas se associam para formar um composto de Diacorpo DART® covalentemente ligado capaz de se ligar imunoespecificamente ao epítopo de CD16 e ao epítopo da proteína de HIV env (ver, por exemplo, Figura 4A).
[00473] A primeira cadeia polipeptídica de the DART-G tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 163:
QSALTQPPSA SGSPGQSVTI SCTGTSSDVG GYNYVSWYQH HPGKAPKLII SEVNNRPSGV PDRFSGSKSG NTASLTVSGL QAEDEAEYYC SSYTDIHNFV FGGGTKLTVL GGGSGGGGQV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTSS AMHWVRQAPG QGLEWMGYIN HYNDGIKYNE RFKGRVTITA DKSTSTAYME LSSLRSEDTA VYYCATGYRY ASWFASWGQG TLVTVSSAST KGEVAACEKE VAALEKEVAA LEKEVAALEK GGGDKTHTCP PCPAPEAAGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLWC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
[00474] Resíduos 1-110 da primeira cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 163) de tal Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa correspondem ao Domínio VL de Anticorpo A32 (SEQ ID NO: 143). Resíduos 111-118 (sublinhado duplo) da primeira cadeia polipeptídica correspondem ao Conector 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO: 16). Resíduos 119-237 da primeira cadeia polipeptídica correspondem ao Domínio VH do anticorpo CD16 anti-humano humanizado hCD16-M2 (SEQ ID NO: 83). Resíduos 238-242 correspondem a um conector (SEQ ID NO: 21, sublinhado). Resíduos 243-270 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um espiral E contendo cisteína (SEQ ID NO: 31). Resíduos 271-283 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um conector (SEQ ID NO: 43). Resíduos 284-500 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um Domínio CH2-CH3 de IgG1 “knob-bearing” (SEQ ID NO: 51), em que o resíduo final é lisina.
[00475] A segunda cadeia polipeptídica da DART-G tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 164:
EIVLTQSPAT LSVSPGERAT LSCRASQNIG TSIHWYQQKP DQSPKLLIKS VSESISGVPS RFSGSGSGTD FTLTINSLEA EDFATYYCQQ SNSWPLTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLQ ESGPGLVKPS QTLSLSCTVS GGSSSSGAHY WSWIRQYPGK GLEWIGYIHY SGNTYYNPSL KSRITISQHT SENQFSLKLN SVTVADTAVY YCARGTRLRT LRNAFDIWGQ GTLVTVSSAS TKGKVAACKE KVAALKEKVA ALKEKVAALK E
[00476] Resíduos 1-107 da segunda cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 164) de tal Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa correspondem ao Domínio VL de anticorpo CD16 anti-humano humanizado hCD16-M2 (SEQ ID NO: 85). Resíduos 108-115 (sublinhado duplo) da segunda cadeia polipeptídica correspondem ao Conector 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO: 16). Resíduos 116-238 da segunda cadeia polipeptídica correspondem ao Domínio VH de Anticorpo A32 (SEQ ID NO: 142). Resíduos 239-243 da segunda cadeia polipeptídica correspondem a um conector (SEQ ID NO: 21, sublinhado). Resíduos 244-271 da segunda cadeia polipeptídica correspondem a um espiral K contendo cisteína (SEQ ID NO: 32).
[00477] A terceira cadeia polipeptídica de DART-G tem a sequência de aminoácidos da Cadeia Polipeptídica de Diacorpo Comum (SEQ ID NO: 153). H. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X HIV ENV “DART-H”
[00478] A Molécula de Ligação CD16 x HIV env designada “DART-H” é uma outra Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa. DART-H é um Diacorpo biespecífico capaz de se ligar a CD16 e à proteína de HIV env. DART-H é composta por três cadeias polipeptídicas e possui um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH de anticorpo CD16 anti- humano humanizado hCD16-M1 (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo de CD16) e um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH de Anticorpo 7B2 (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo da proteína de HIV env). As três cadeias polipeptídicas se associam para formar um Diacorpo DART® covalentemente ligado capaz de se ligar imunoespecificamente ao epítopo de CD16 e ao epítopo da proteína de HIV env (ver, por exemplo, Figura 4A).
[00479] A primeira cadeia polipeptídica de DART-H tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 165:
DIVMTQSPDS LAVSPGERAT IHCKSSQTLL YSSNNRHSIA WYQQRPGQPP KLLLYWASMR LSGVPDRFSG SGSGTDFTLT INNLQAEDVA IYYCHQYSSH PPTFGHGTRV EIKGGGSGGG GEVQLVESGG GLVKPGGSLR LSCAASGFTF SNYGMSWVRQ APGKGLEWVA TISGGGSYTF YPDSVKGRFT ISRDNAKNSL YLQMNSLRTE DTALYYCVRQ SARAPEPYWG QGTLVTVSSA STKGEVAACE KEVAALEKEV AALEKEVAAL EKGGGDKTHT CPPCPAPEAA GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL WCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
[00480] Resíduos 1-113 da primeira cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 165) de tal Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa correspondem ao Domínio VL de Anticorpo 7B2 (SEQ ID NO: 141). Resíduos 114-121 (sublinhado duplo) da primeira cadeia polipeptídica correspondem ao Conector 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO: 16). Resíduos 122-239 da primeira cadeia polipeptídica correspondem ao Domínio VH do anticorpo CD16 anti-humano humanizado hCD16-M1 (SEQ ID NO: 72). Resíduos 240-244 correspondem a um conector (SEQ ID NO: 21, sublinhado). Resíduos 245-272 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um espiral E contendo cisteína (SEQ ID NO: 31). Resíduos 273-285 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um conector (SEQ ID NO: 43). Resíduos 286-502 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um Domínio CH2-CH3 de IgG1 “knob-bearing” (SEQ ID NO: 51), em que o resíduo final é lisina.
[00481] A segunda cadeia polipeptídica de DART-H tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 166:
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASQNVG THVAWYQQKP GKAPKSLLYS ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQS EDIATYYCQQ YKSYPLTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGGGVFKPG GSLRLSCEAS GFTFTEYYMT WVRQAPGKGL EWLAYISKNG EYSKYSPSSN GRFTISRDNA KNSVFLQLDR LSADDTAVYY CARADGLTYF SELLQYIFDL WGQGARVTVS SASTKGKVAA CKEKVAALKE KVAALKEKVA ALKE
[00482] Resíduos 1-107 da segunda cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 166) de tal Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa correspondem ao Domínio VL de anticorpo CD16 anti-humano humanizado hCD16-M1 (SEQ ID NO: 73). Resíduos 108-115 (sublinhado duplo) da segunda cadeia polipeptídica correspondem ao Conector 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO: 16). Resíduos 116-241 da segunda cadeia polipeptídica correspondem ao Domínio VH de Anticorpo 7B2 (SEQ ID NO: 140). Resíduos 242-246 da segunda cadeia polipeptídica correspondem a um conector (SEQ ID NO: 21, sublinhado). Resíduos 247-274 da segunda cadeia polipeptídica correspondem a um espiral K contendo cisteína (SEQ ID NO: 32).
[00483] A terceira cadeia polipeptídica de DART-H tem a sequência de aminoácidos da Cadeia Polipeptídica de Diacorpo Comum (SEQ ID NO: 153). I. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X HER2/NEU “DART-I”
[00484] A Molécula de Ligação CD16 x Her2/neu designada “DART-I” é uma outra Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa. DART-I é similar à DART-C descrita acima, mas contém o VH de hCD16-M1A (compreendendo um CDRH3 mutado). Como indicado acima, o Domínio VL de hCD16-M1A tem a mesma sequência de aminoácidos como o Domínio VL de hCD16-M1.
[00485] A primeira cadeia polipeptídica de DART-I tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 186:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASFLYSGVPS RFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYTTPPTFGQ GTKVEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVKPG GSLRLSCAAS GFTFSNYGMS WVRQAPGKGL EWVATISGGG SYTFYPDSVK GRFTISRDNA KNSLYLQMNS LRTEDTALYY CVRQSANSPV PYWGQGTLVT VSSASTKGEV AACEKEVAAL EKEVAALEKE VAALEKGGGD KTHTCPPCPA PEAAGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLWCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK
[00486] Resíduos 1-107 da primeira cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 186) de tal Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa correspondem ao Domínio VL de Trastuzumabe (SEQ ID NO: 125). Resíduos 108-115 (sublinhado duplo) da primeira cadeia polipeptídica correspondem ao Conector 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO: 16). Resíduos 116-233 da primeira cadeia polipeptídica correspondem ao Domínio VH do anticorpo CD16 anti-humano otimizado hCD16-M1A (SEQ ID NO: 58). Resíduos 234-238 correspondem a um conector (SEQ ID NO: 21, sublinhado). Resíduos 239-266 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um espiral E contendo cisteína (SEQ ID NO: 31). Resíduos 267-279 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um conector (SEQ ID NO: 43). Resíduos 280-496 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um Domínio CH2-CH3 de IgG1 “knob-bearing” (SEQ ID NO: 51), em que o resíduo final é lisina.
[00487] Visto que o Domínio VL de hCD16-M1A é o mesmo como de hCD16-M1, a sequência de aminoácidos da segunda cadeia polipeptídica de DART-I é a mesma como da segunda cadeia polipeptídica da DART-C (isto é, SEQ ID NO: 157). Similarmente, a terceira cadeia polipeptídica de DART-I tem a sequência de aminoácidos da Cadeia Polipeptídica de Diacorpo Comum (SEQ ID NO: 153). J. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X HER2/NEU “DART-J”
[00488] A Molécula de Ligação CD16 x Her2/neu designada “DART-J” é uma outra Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa. DART-J é similar à DART-C descrita acima, mas contém o VL de hCD16-M1B (compreendendo um CDRL3 mutado). Como indicado acima, o Domínio VH de hCD16-M1B tem a mesma sequência de aminoácidos como o Domínio VH de hCD16-M1.
[00489] Visto que o Domínio VH de hCD16-M1B é o mesmo como de hCD16-M1, a sequência de aminoácidos da primeira cadeia polipeptídica de DART-J é a mesma como da primeira cadeia polipeptídica da DART-C (isto é, SEQ ID NO: 156).
[00490] A segunda cadeia polipeptídica de DART-J tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 187:
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASQNVG THVAWYQQKP GKAPKSLLYS ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQS EDIATYYCQD YTNYPLTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFNIKDTYIH WVRQAPGKGL EWVARIYPTN GYTRYADSVK GRFTISADTS KNTAYLQMNS LRAEDTAVYY CSRWGGDGFY AMDYWGQGTL VTVSSASTKG KVAACKEKVA ALKEKVAALK EKVAALKE
[00491] Resíduos 1-107 da segunda cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 157) de tal Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa correspondem ao Domínio VL de anticorpo CD16 anti-humano humanizado hCD16-M1B (SEQ ID NO: 59). Resíduos 108-115 (sublinhado duplo) da segunda cadeia polipeptídica correspondem ao Conector 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO: 16). Resíduos 116-235 da segunda cadeia polipeptídica correspondem ao Domínio VH de Trastuzumabe (SEQ ID NO: 124). Resíduos 236-240 da segunda cadeia polipeptídica correspondem a um conector (SEQ ID NO: 21, sublinhado). Resíduos 241-268 da segunda cadeia polipeptídica correspondem a um espiral K contendo cisteína (SEQ ID NO: 32).
[00492] A terceira cadeia polipeptídica de DART-J tem a sequência de aminoácidos da Cadeia Polipeptídica de
Diacorpo Comum (SEQ ID NO: 153). K. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X HER2/NEU “DART-K”
[00493] A Molécula de Ligação CD16 x Her2/neu designada “DART-K” é uma outra Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa. DART-K é similar à DART-J descrita acima, mas também contém VH de hCD16-M1A (compreendendo um CDRH3 mutado) Assim, DART-K contém o VL e VH de hCD16-M1AB (compreendendo um CDRL3 mutado e um CDRH3 mutado).
[00494] Visto que DART-K contém o VH de hCD16-M1A a sequência de aminoácidos da primeira cadeia polipeptídica de DART-K é a mesma como da primeira cadeia polipeptídica da DART-I (isto é, SEQ ID NO: 186).
[00495] Visto que DART-K contém Domínio VL de hCD16-M1B, a sequência de aminoácidos da segunda cadeia polipeptídica de DART-K é a mesma como da segunda cadeia polipeptídica da DART-J (isto é, SEQ ID NO: 187).
[00496] A terceira cadeia polipeptídica de DART-J tem a sequência de aminoácidos da Cadeia Polipeptídica de Diacorpo Comum (SEQ ID NO: 153). L. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X CD19 “DART-L”
[00497] A Molécula de Ligação CD16 x CD19 designada “DART-L” é uma outra Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa. DART-L é um Diacorpo biespecífico contendo Domínio Fc, capaz de se ligar a CD16 e à antígeno tumoral de células B de CD19. DART-L é composta por três cadeias polipeptídicas e possui um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH de anticorpo CD16 anti-humano hCD16-M1 (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo de CD16) e um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH de CD19 mAb 1 (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo do
Antígeno de CD19 de Câncer). As três cadeias polipeptídicas se associam para formar um Diacorpo DART® covalentemente ligado capaz de se ligar imunoespecificamente ao epítopo de CD16 e ao epítopo do Antígeno de CD19 de Câncer (ver, por exemplo, Figura 4A).
[00498] A primeira cadeia polipeptídica de DART-L tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 188:
ENVLTQSPAT LSVTPGEKAT ITCRASQSVS YMHWYQQKPG QAPRLLIYDA SNRASGVPSR FSGSGSGTDH TLTISSLEAE DAATYYCFQG SVYPFTFGQG TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE SGGGLVKPGG SLRLSCAASG FTFSNYGMSW VRQAPGKGLE WVATISGGGS YTFYPDSVKG RFTISRDNAK NSLYLQMNSL RTEDTALYYC VRQSARAPEP YWGQGTLVTV SSGGCGGGEV AACEKEVAAL EKEVAALEKE VAALEKGGGD KTHTCPPCPA PEAAGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLWCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK
[00499] Resíduos 1-106 da primeira cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 188) de tal Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa correspondem ao Domínio VL de CD19 mAb 1 (SEQ ID NO: 139). Resíduos 107-114 (sublinhado duplo) da primeira cadeia polipeptídica correspondem ao Conector 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO: 16). Resíduos 115-232 da primeira cadeia polipeptídica correspondem ao Domínio VH de anticorpo CD16 anti-humano hCD16-M1 (SEQ ID NO: 72). Resíduos 233-238 correspondem a um conector (SEQ ID NO: 17, sublinhado). Resíduos 239-266 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um espiral E contendo cisteína (SEQ ID NO: 31). Resíduos 267-279 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um conector (SEQ ID NO: 43). Resíduos 280-496 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um “knob- bearing” (SEQ ID NO: 51), em que o resíduo final é lisina.
[00500] A segunda cadeia polipeptídica de DART-L tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 189:
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASQNVG THVAWYQQKP GKAPKSLLYS ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQS EDIATYYCQQ YKSYPLTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVTLR ESGPALVKPT QTLTLTCTFS GFSLSTSGMG VGWIRQPPGK ALEWLAHIWW DDDKRYNPAL KSRLTISKDT SKNQVFLTMT NMDPVDTATY YCARMELWSY YFDYWGQGTT VTVSSGGCGG GKVAACKEKV AALKEKVAAL KEKVAALKE
[00501] Resíduos 1-107 da segunda cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 189) de tal Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa correspondem ao Domínio VL de anticorpo CD16 anti-humano hCD16-M1 (SEQ ID NO: 73). Resíduos 108-115 (sublinhado duplo) da segunda cadeia polipeptídica correspondem ao Conector 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO: 16). Resíduos 116-235 da segunda cadeia polipeptídica correspondem ao Domínio VH de CD19 mAb 1 (SEQ ID NO: 138). Resíduos 236- 241 da segunda cadeia polipeptídica correspondem a um conector (SEQ ID NO: 17, sublinhado). Resíduos 242-269 da segunda cadeia polipeptídica correspondem a um espiral K contendo cisteína (SEQ ID NO: 32).
[00502] A terceira cadeia polipeptídica de DART-L tem a sequência de aminoácidos da Cadeia Polipeptídica de Diacorpo Comum (SEQ ID NO: 153). M. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X CD19 “DART-M”
[00503] A Molécula de Ligação CD16 x CD19 designada “DART-M” é uma outra Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa. DART-M é similar à DART-L descrita acima, mas contém o VL de hCD16-M1B (compreendendo um CDRL3 mutado).
Como indicado acima, o Domínio VH de hCD16-M1B tem a mesma sequência de aminoácidos como o Domínio VH de hCD16-M1.
[00504] Visto que o Domínio VH de hCD16-M1B é o mesmo como de hCD16-M1, a sequência de aminoácidos da primeira cadeia polipeptídica de DART-M é a mesma como da primeira cadeia polipeptídica da DART-L (isto é, SEQ ID NO: 188).
[00505] A segunda cadeia polipeptídica de DART-M tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 190:
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASQNVG THVAWYQQKP GKAPKSLLYS ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQS EDIATYYCQD YTNYPLTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVTLR ESGPALVKPT QTLTLTCTFS GFSLSTSGMG VGWIRQPPGK ALEWLAHIWW DDDKRYNPAL KSRLTISKDT SKNQVFLTMT NMDPVDTATY YCARMELWSY YFDYWGQGTT VTVSSGGCGG GKVAACKEKV AALKEKVAAL KEKVAALKE
[00506] Resíduos 1-107 da segunda cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 190) de tal Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa correspondem ao Domínio VL de anticorpo CD16 anti-humano hCD16-M1B (SEQ ID NO: 59). Resíduos 108-115 (sublinhado duplo) da segunda cadeia polipeptídica correspondem ao Conector 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO: 16). Resíduos 116-235 da segunda cadeia polipeptídica correspondem ao Domínio VH de CD19 mAb 1 (SEQ ID NO: 138). Resíduos 236- 241 da segunda cadeia polipeptídica correspondem a um conector (SEQ ID NO: 17, sublinhado). Resíduos 242-269 da segunda cadeia polipeptídica correspondem a um espiral K contendo cisteína (SEQ ID NO: 32).
[00507] A terceira cadeia polipeptídica de DART-M tem a sequência de aminoácidos da Cadeia Polipeptídica de Diacorpo Comum (SEQ ID NO: 153).
N. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X CD19 “DART-N”
[00508] A Molécula de Ligação CD16 x CD19 designada “DART-N” é uma outra Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa. DART-N é similar à DART-M descrita acima, mas também contém o VH de hCD16-M1A (compreendendo um CDRH3 mutado). Assim, DART-N contém o VL e VH de hCD16-M1AB (compreendendo um CDRL3 mutado e um CDRH3 mutado)).
[00509] A primeira cadeia polipeptídica de DART-N tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 191:
ENVLTQSPAT LSVTPGEKAT ITCRASQSVS YMHWYQQKPG QAPRLLIYDA SNRASGVPSR FSGSGSGTDH TLTISSLEAE DAATYYCFQG SVYPFTFGQG TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE SGGGLVKPGG SLRLSCAASG FTFSNYGMSW VRQAPGKGLE WVATISGGGS YTFYPDSVKG RFTISRDNAK NSLYLQMNSL RTEDTALYYC VRQSANSPVP YWGQGTLVTV SSGGCGGGEV AACEKEVAAL EKEVAALEKE VAALEKGGGD KTHTCPPCPA PEAAGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLWCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK
[00510] Resíduos 1-106 da primeira cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 191) de tal Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa correspondem ao Domínio VL de CD19 mAb 1 (SEQ ID NO: 139). Resíduos 107-114 (sublinhado duplo) da primeira cadeia polipeptídica correspondem ao Conector 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO: 16). Resíduos 115-232 da primeira cadeia polipeptídica correspondem ao Domínio VH de anticorpo CD16 anti-humano hCD16-M1A (SEQ ID NO: 58). Resíduos 233-238 correspondem a um conector (SEQ ID NO: 17, sublinhado). Resíduos 239-266 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um espiral E contendo cisteína (SEQ ID NO:
31). Resíduos 267-279 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um conector (SEQ ID NO: 43). Resíduos 280-496 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um “knob- bearing” (SEQ ID NO: 51), em que o resíduo final é lisina.
[00511] Visto que DART-N contém Domínio VL de hCD16-M1B, a sequência de aminoácidos da segunda cadeia polipeptídica de DART-N é a mesma como da segunda cadeia polipeptídica da DART-M (isto é, SEQ ID NO: 190).
[00512] A terceira cadeia polipeptídica de DART-N tem a sequência de aminoácidos da Cadeia Polipeptídica de Diacorpo Comum (SEQ ID NO: 153). O. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X HER2/NEU “DART-1”
[00513] A Molécula de Ligação CD16 x Her2/neu designada “DART-1” é uma outra Molécula de Ligação CD16 x DA. DART-1 ilustrativa é um Diacorpo biespecífico capaz de se ligar a CD16 e ao Antígeno HER2/neu de Câncer. DART-1 é essencialmente a mesma como DART-A, exceto que possui os Domínios VL e VH do anticorpo CD16 anti-humano humanizado h3G8 (ver, por exemplo, Publicação de Patente U.S. No 2004/0010124; Publicação PCT No WO 2017/142928; Li, W. et al. (2016) “Identification Of High-Affinity Anti-CD16A Allotype- Independent Human Antibody Domains,” Exp. Mol. Pathol. 101(2):281-289):
[00514] Domínio VH de CD16 Anti-Humano Humanizado mAb h3G8 (SEQ ID NO: 62) é mostrado abaixo (resíduos de CDRH são mostrados sublinhados):
QVTLRESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS TSGMGVGWIR QPPGKALEWL AHIWWDDDKR YNPALKSRLT ISKDTSKNQV VLTMTNMDPV DTATYYCAQI NPAWFAYWGQ GTLVTVSS
[00515] Domínio VL de CD16 humanizado mAb h3G8
(SEQ ID NO: 63) é mostrado abaixo (resíduos de CDRL são mostrados sublinhados):
DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKASQSVD FDGDSFMNWY QQKPGQPPKL LIYTTSNLES GVPDRFSGSG SGTDFTLTIS SLQAEDVAVY YCQQSNEDPY TFGQGTKLEI K
[00516] Em vez do Domínios VH e VL de anticorpo CD16 anti-humano CD16-M1 (SEQ ID NO: 64 e SEQ ID NO: 65, respectivamente) que estão presentes na DART-A. Os Domínios VH e VL de h3G8 são usados aqui como um sítio de ligação a CD16 comparador. DART-1 é composta por três cadeias polipeptídicas tendo dois Domínios de Ligação que compreende os Domínios VL e VH de anticorpo CD16 anti-humano CD16-M1 (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo de CD16) e um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH de Trastuzumabe (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo do Antígeno HER2/neu de Câncer). As três cadeias polipeptídicas se associam para formar um Diacorpo DART® covalentemente ligado capaz de se ligar imunoespecificamente ao epítopo de CD16 e ao epítopo do Antígeno HER2/neu de Câncer (ver, por exemplo, Figura 4A).
[00517] A primeira cadeia polipeptídica de DART-1 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 167:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASFLYSGVPS RFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYTTPPTFGQ GTKVEIKGGG SGGGGQVTLR ESGPALVKPT QTLTLTCTFS GFSLSTSGMG VGWIRQPPGK ALEWLAHIWW DDDKRYNPAL KSRLTISKDT SKNQVVLTMT NMDPVDTATY YCAQINPAWF AYWGQGTLVT VSSASTKGEV AACEKEVAAL EKEVAALEKE VAALEKGGGD KTHTCPPCPA PEAAGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLWCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK
[00518] Resíduos 1-107 da primeira cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 167) de tal Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa correspondem ao Domínio VL de Trastuzumabe (SEQ ID NO: 125). Resíduos 108-115 (sublinhado duplo) da primeira cadeia polipeptídica correspondem ao Conector 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO: 16). Resíduos 116-233 da primeira cadeia polipeptídica correspondem ao Domínio VH do anticorpo CD16 anti-humano humanizado h3G8 (SEQ ID NO: 62). Resíduos 234-238 correspondem a um conector (SEQ ID NO: 21, sublinhado). Resíduos 239-266 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um espiral E contendo cisteína (SEQ ID NO: 31). Resíduos 267-279 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um conector (SEQ ID NO: 43). Resíduos 280-496 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um Domínio CH2-CH3 de IgG1 “knob-bearing” (SEQ ID NO: 51), em que o resíduo final é lisina.
[00519] A segunda cadeia polipeptídica de DART-1 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 168:
DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKASQSVD FDGDSFMNWY QQKPGQPPKL LIYTTSNLES GVPDRFSGSG SGTDFTLTIS SLQAEDVAVY YCQQSNEDPY TFGQGTKLEI KGGGSGGGGE VQLVESGGGL VQPGGSLRLS CAASGFNIKD TYIHWVRQAP GKGLEWVARI YPTNGYTRYA DSVKGRFTIS ADTSKNTAIL QMNSLRAEDT AVYYCSRWGG DGFYAMDYWG QGTLVTVSSA STKGKVAACK EKVAALKEKV AALKEKVAAL KE
[00520] Resíduos 1-111 da segunda cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 168) de tal Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa correspondem ao Domínio VL de anticorpo CD16 anti-humano humanizado h3G8 (SEQ ID NO: 63). Resíduos
112-119 (sublinhado duplo) da segunda cadeia polipeptídica correspondem ao Conector 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO: 16). Resíduos 120-239 da segunda cadeia polipeptídica correspondem ao Domínio VH de Trastuzumabe (SEQ ID NO: 124). Resíduos 240- 244 da segunda cadeia polipeptídica correspondem a um conector (SEQ ID NO: 21, sublinhado). Resíduos 244-272 da segunda cadeia polipeptídica correspondem a um espiral K contendo cisteína (SEQ ID NO: 32).
[00521] A terceira cadeia polipeptídica de DART-1 tem a sequência de aminoácidos da Cadeia Polipeptídica de Diacorpo Comum (SEQ ID NO: 153). P. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X RSV “DART-2”
[00522] A Molécula de Ligação CD16 x RSV designada “DART-2” é uma outra ilustrativa Molécula de Ligação CD16 x DA. DART-2 é um Diacorpo biespecífico capaz de se ligar a CD16 e à glicoproteína F de RSV. DART-2 é essencialmente a mesma como a DART-1, exceto que possui os Domínios VH e VL do anticorpo de glicoproteína F anti-RSV vPalivizumabe (SEQ ID NO: 144 e SEQ ID NO: 145, respectivamente) em vez dos Domínios VH e VL de Trastuzumabe (SEQ ID NO: 124 e SEQ ID NO: 125, respectivamente) que estão presentes em Diacorpo DART-1. Assim, DART-2 é composta por três cadeias polipeptídicas e possui um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH do anticorpo CD16 anti- humano humanizado h3G8 (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo de CD16) e um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH de vPalivizumabe (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo da glicoproteína F de RSV). A terceira cadeia polipeptídica tem a sequência de aminoácidos da Cadeia Polipeptídica de Diacorpo Comum (SEQ ID NO: 153).
As três cadeias polipeptídicas se associam para formar um Diacorpo DART® covalentemente ligado capaz de se ligar imunoespecificamente ao epítopo de CD16 e ao epítopo de glicoproteína F de RSV (ver, por exemplo, Figura 4A). Como observado acima, os Domínios VH e VL de h3G8 são usados aqui como um sítio de ligação a CD16 comparador. Q. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X RSV “DART-3”
[00523] A Molécula de Ligação CD16 x RSV designada “DART-3” é uma outra Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa. A DART-3 CD16 x RSV é um Diacorpo biespecífico capaz de se ligar a CD16 e à glicoproteína F de RSV. DART-3 é composta por três cadeias polipeptídicas e possui um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH do anticorpo CD16 anti-humano humanizado hCD16-M1 (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo de CD16) e um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH de vPalivizumabe (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo da glicoproteína F de RSV). As três cadeias polipeptídicas se associam para formar um Diacorpo DART® covalentemente ligado capaz de se ligar imunoespecificamente ao epítopo de CD16 e ao epítopo da glicoproteína F de RSV (ver, por exemplo, Figura 4A).
[00524] A primeira cadeia polipeptídica de DART-3 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 169:
DIQMTQSPST LSASVGDRVT ITCRASQSVG YMHWYQQKPG KAPKLLIYDT SKLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPD DFATYYCFQG SGYPFTFGGG TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE SGGGLVKPGG SLRLSCAASG FTFSNYGMSW VRQAPGKGLE WVATISGGGS YTFYPDSVKG RFTISRDNAK NSLYLQMNSL RTEDTALYYC VRQSARAPEP YWGQGTLVTV SSASTKGEVA ACEKEVAALE KEVAALEKEV AALEKGGGDK THTCPPCPAP EAAGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLWCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK
[00525] Resíduos 1-106 da primeira cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 169) de tal Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa correspondem ao Domínio VL de vPalivizumabe (SEQ ID NO: 145). Resíduos 107-114 (sublinhado duplo) da primeira cadeia polipeptídica correspondem ao Conector 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO: 16). Resíduos 115-232 da primeira cadeia polipeptídica correspondem ao Domínio VH do anticorpo CD16 anti-humano humanizado hCD16-M1 (SEQ ID NO: 72). Resíduos 233-237 correspondem a um conector (SEQ ID NO: 21, sublinhado). Resíduos 238-265 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um espiral E contendo cisteína (SEQ ID NO: 31). Resíduos 266-278 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um conector (SEQ ID NO: 43). Resíduos 279-495 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um Domínio CH2-CH3 de IgG1 “knob-bearing” (SEQ ID NO: 51), em que o resíduo final é lisina.
[00526] A segunda cadeia polipeptídica de DART-3 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 170:
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASQNVG THVAWYQQKP GKAPKSLLYS ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQS EDIATYYCQQ YKSYPLTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVTLR ESGPALVKPT QTLTLTCTFS GFSLSTSGMS VGWIRQPPGK ALEWLADIWW DDKKDYNPSL KSRLTISKDT SKNQVVLKVT NMDPADTATY YCARSMITNW YFDVWGAGTT VTVSSASTKG KVAACKEKVA ALKEKVAALK EKVAALKE
[00527] Resíduos 1-107 da segunda cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 170) de tal Molécula de Ligação
CD16 x DA ilustrativa correspondem ao Domínio VL de anticorpo CD16 anti-humano humanizado hCD16-M1 (SEQ ID NO: 73). Resíduos 108-115 (sublinhado duplo) da segunda cadeia polipeptídica correspondem ao Conector 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO: 16). Resíduos 116-235 da segunda cadeia polipeptídica correspondem ao Domínio VH de vPalivizumabe (SEQ ID NO: 144). Resíduos 236-240 da segunda cadeia polipeptídica correspondem a um conector (SEQ ID NO: 21, sublinhado). Resíduos 241-268 da segunda cadeia polipeptídica correspondem a um espiral K contendo cisteína (SEQ ID NO: 32).
[00528] A terceira cadeia polipeptídica da DART-3 tem a sequência de aminoácidos da Cadeia Polipeptídica de Diacorpo Comum (SEQ ID NO: 153). R. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X HIV ENV “DART-4
[00529] A Molécula de Ligação CD16 x HIV env designada “DART-4” é uma outra Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa. DART-4 é um Diacorpo biespecífico capaz de se ligar a CD16 e à proteína de HIV env. DART-4 é essencialmente a mesma como DART-1, exceto que possui os Domínios VH e VL do anticorpo da proteína env anti-HIV 7B2 (SEQ ID NO: 140 e SEQ ID NO: 141, respectivamente) em vez dos Domínios VH e VL de Trastuzumabe (SEQ ID NO: 124 e SEQ ID NO: 125, respectivamente) que estão presentes em DART-1. Assim, DART-4 é composta por três cadeias polipeptídicas e possui um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH do anticorpo CD16 anti-humano humanizado h3G8 (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo de CD16) e um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH de 7B2 (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo da proteína de HIV env). A terceira cadeia polipeptídica tem a sequência de aminoácidos da Cadeia Polipeptídica de Diacorpo Comum (SEQ ID NO: 153). As três cadeias polipeptídicas se associam para formar um Diacorpo DART® covalentemente ligado capaz de se ligar imunoespecificamente ao epítopo de CD16 e ao epítopo da proteína de HIV env (ver, por exemplo, Figura 4A). Como observado acima, os Domínios VH e VL de h3G8 são usados aqui como um sítio de ligação a CD16 comparador. S. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X RSV “DART-5”
[00530] A Molécula de Ligação CD16 x RSV designada “DART-5” é uma outra ilustrativa Molécula de Ligação CD16 x DA. DART-5 é um Diacorpo biespecífico capaz de se ligar a CD16 e à glicoproteína F de RSV. DART-5 é essencialmente a mesma como DART-L, exceto que possui os Domínios VL e VH do anticorpo de glicoproteína F anti-RSV vPalivizumabe (SEQ ID NO: 144 e SEQ ID NO: 145, respectivamente) em vez dos Domínios VH e VL de CD19 mAb 1 (SEQ ID NO: 138 e SEQ ID NO: 139, respectivamente) que estão presentes em DART-L. Assim, DART-5 é composta por três cadeias polipeptídicas e possui um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH do anticorpo CD16 anti-humano humanizado hCD16-M1 (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo de CD16) e um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH de vPalivizumabe (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo da glicoproteína F de RSV). A terceira cadeia polipeptídica tem a sequência de aminoácidos da Cadeia Polipeptídica de Diacorpo Comum (SEQ ID NO: 153). As três cadeias polipeptídicas se associam para formar um Diacorpo DART® covalentemente ligado capaz de se ligar imunoespecificamente ao epítopo de CD16 e ao epítopo de glicoproteína F de RSV (ver, por exemplo, Figura 4A).
T. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X RSV “DART-6”
[00531] A Molécula de Ligação CD16 x RSV designada “DART-6” é uma outra Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa. DART-6 é um Diacorpo biespecífico capaz de se ligar a CD16 e à glicoproteína F de RSV. DART-6 é essencialmente a mesma como DART-M, exceto que possui os Domínios VL e VH do anticorpo de glicoproteína F anti-RSV vPalivizumabe (SEQ ID NO: 144 e SEQ ID NO: 145, respectivamente) em vez dos Domínios VH e VL de CD19 mAb 1 (SEQ ID NO: 138 e SEQ ID NO: 139, respectivamente) que estão presentes em DART-M. Assim, DART-6 é composta por três cadeias polipeptídicas e possui um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH do anticorpo CD16 anti-humano otimizado hCD16-M1B (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo de CD16) e um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH de vPalivizumabe (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo da glicoproteína F de RSV). A terceira cadeia polipeptídica tem a sequência de aminoácidos da Cadeia Polipeptídica de Diacorpo Comum (SEQ ID NO: 153). As três cadeias polipeptídicas se associam para formar um Diacorpo DART® covalentemente ligado capaz de se ligar imunoespecificamente ao epítopo de CD16 e ao epítopo de glicoproteína F de RSV (ver, por exemplo, Figura 4A). U. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X RSV “DART-7”
[00532] A Molécula de Ligação CD16 x RSV designada “DART-7” é uma outra Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa. DART-7 é um Diacorpo biespecífico capaz de se ligar a CD16 e à glicoproteína F de RSV. DART-7 é essencialmente a mesma como DART-N, exceto que possui os Domínios VL e VH do anticorpo de glicoproteína F anti-RSV vPalivizumabe (SEQ ID NO: 144 e SEQ ID NO: 145, respectivamente) em vez dos Domínios VH e VL de CD19 mAb 1 (SEQ ID NO: 138 e SEQ ID NO: 139, respectivamente) que estão presentes em DART-N. Assim, DART-7 é composta por três cadeias polipeptídicas e possui um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH do anticorpo CD16 anti-humano otimizado hCD16-M1AB (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo de CD16) e um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH de vPalivizumabe (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo da glicoproteína F de RSV). A terceira cadeia polipeptídica tem a sequência de aminoácidos da Cadeia Polipeptídica de Diacorpo Comum (SEQ ID NO: 153). As três cadeias polipeptídicas se associam para formar um Diacorpo DART® covalentemente ligado capaz de se ligar imunoespecificamente ao epítopo de CD16 e ao epítopo de glicoproteína F de RSV (ver, por exemplo, Figura 4A). V. MOLÉCULA CD16 X HIV ENV “DART-X”
[00533] A Molécula de Ligação CD16 x HIV env designada “DART-X” é uma outra Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa. DART-X é um Diacorpo biespecífico capaz de se ligar a CD16 e a proteína de HIV env. DART-X é composta por duas cadeias polipeptídicas e possui um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH do anticorpo CD16 anti- humano CD16-M1 (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo de CD16) e um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH de 7B2 (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo da proteína de HIV env). As duas cadeias polipeptídicas se associam para formar um Diacorpo DART® covalentemente ligado capaz de se ligar imunoespecificamente ao epítopo de CD16 e ao epítopo da proteína de HIV env (ver,
por exemplo, Figuras 1A-1B).
[00534] A primeira cadeia polipeptídica de DART-X tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 171:
DIVMTQSPDS LAVSPGERAT IHCKSSQTLL YSSNNRHSIA WYQQRPGQPP KLLLYWASMR LSGVPDRFSG SGSGTDFTLT INNLQAEDVA IYYCHQYSSH PPTFGHGTRV EIKGGGSGGG GEVKLVESGG TLVKPGGSLK LSCAASGFTF NNYGMSWVRQ TPEKRLEWVA TISGGGSYTF YPDSVKGRFT ISRDNAKNSL YLQMSSLRSE DTALYYCIRQ SARAPEPYWG QGTLVTVSSA STKGEVAACE KEVAALEKEV AALEKEVAAL EK
[00535] Resíduos 1-113 da primeira cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 171) de tal Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativo correspondem ao Domínio VL de 7B2 (SEQ ID NO: 141). Resíduos 114-121 (sublinhado duplo) da primeira cadeia polipeptídica correspondem ao Conector 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO: 16). Resíduos 122-239 da primeira cadeia polipeptídica correspondem ao Domínio VH do anticorpo CD16 anti-humano CD16-M1 (SEQ ID NO: 64). Resíduos 240-244 correspondem a um conector (SEQ ID NO: 21, sublinhado). Resíduos 245-272 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um espiral E contendo cisteína (SEQ ID NO: 31).
[00536] A segunda cadeia polipeptídica de DART-X tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 172:
DIVMTQSQKF MSTSVGDRVS VTCKASQNVG THVAWYQQKS GQSPKSLLYS ASYRYSGVPD RFSGSGSGTD FTLTISNVQS EDLAEYFCQQ YKSYPLTFGA GTKLELKGGG SGGGGQVQLV QSGGGVFKPG GSLRLSCEAS GFTFTEYYMT WVRQAPGKGL EWLAYISKNG EYSKYSPSSN GRFTISRDNA KNSVFLQLDR LSADDTAVYY CARADGLTYF SELLQYIFDL WGQGARVTVS SASTKGKVAA CKEKVAALKE KVAALKEKVA ALKE
[00537] Resíduos 1-107 da segunda cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 172) de tal Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa correspondem ao Domínio VL de anticorpo CD16 anti-humano CD16-M1 (SEQ ID NO: 65). Resíduos 108-115 (sublinhado duplo) da segunda cadeia polipeptídica correspondem ao Conector 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO: 16). Resíduos 116-241 da segunda cadeia polipeptídica correspondem ao Domínio VH de 7B2 (SEQ ID NO: 140). Resíduos 242-246 da segunda cadeia polipeptídica correspondem a um conector (SEQ ID NO: 21, sublinhado). Resíduos 247-274 da segunda cadeia polipeptídica correspondem a um espiral K contendo cisteína (SEQ ID NO: 32). W. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X HIV ENV “DART-Y”
[00538] A Molécula de Ligação CD16 x HIV env designada “DART-Y” é uma outra Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa. DART-Y é um Diacorpo biespecífico capaz de se ligar a CD16 e à proteína de HIV env. DART-Y é composta por duas cadeias polipeptídicas e possui um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH do anticorpo CD16 anti- humano CD16-M2 (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo de CD16) e um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH de 7B2 (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo da proteína de HIV env). As duas cadeias polipeptídicas se associam para formar um Diacorpo DART® covalentemente ligado capaz de se ligar imunoespecificamente ao epítopo de CD16 e ao epítopo da proteína de HIV env (ver, por exemplo, Figura 1B).
[00539] A primeira cadeia polipeptídica de DART-Y tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 173:
DIVMTQSPDS LAVSPGERAT IHCKSSQTLL YSSNNRHSIA WYQQRPGQPP KLLLYWASMR LSGVPDRFSG SGSGTDFTLT INNLQAEDVA IYYCHQYSSH PPTFGHGTRV EIKGGGSGGG GEVQLQQSGP ELVKPGASVK MSCKASGYTF TSSAMHWVKK NPGQGLEWIG YINHYNDGIK YNERFKGKAT LTSDKSSSTA YMELSSLTSE DSAVYYCATG YRYASWFASW GQGTLVTVSS ASTKGEVAAC EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEK
[00540] Resíduos 1-113 da primeira cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 173) de tal Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa correspondem ao Domínio VL de 7B2 (SEQ ID NO: 141). Resíduos 114-121 (sublinhado duplo) da primeira cadeia polipeptídica correspondem ao Conector 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO: 16). Resíduos 122-240 da primeira cadeia polipeptídica correspondem ao Domínio VH do anticorpo CD16 anti-humano CD16-M2 (SEQ ID NO: 75). Resíduos 241-245 correspondem a um conector (SEQ ID NO: 21, sublinhado). Resíduos 246-273 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um espiral E contendo cisteína (SEQ ID NO: 31).
[00541] A segunda cadeia polipeptídica de DART-Y tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 174:
DILLTQSPAI LSVSPGERVS FSCRASQNIG TSIHWYQQRT DGSPRLLIKS VSESISGIPS RFSGSGSGTD FTLTINGVES GDISDYYCQQ SNSWPLTFGA GTKLELKGGG SGGGGQVQLV QSGGGVFKPG GSLRLSCEAS GFTFTEYYMT WVRQAPGKGL EWLAYISKNG EYSKYSPSSN GRFTISRDNA KNSVFLQLDR LSADDTAVYY CARADGLTYF SELLQYIFDL WGQGARVTVS SASTKGKVAA CKEKVAALKE KVAALKEKVA ALKE
[00542] Resíduos 1-107 da segunda cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 174) de tal Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa correspondem ao Domínio VL de anticorpo CD16 anti-humano CD16-M2 (SEQ ID NO: 76). Resíduos 108-115 (sublinhado duplo) da segunda cadeia polipeptídica correspondem ao Conector 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO: 16).
Resíduos 116-241 da segunda cadeia polipeptídica correspondem ao Domínio VH de 7B2 (SEQ ID NO: 140). Resíduos 242-246 da segunda cadeia polipeptídica correspondem a um conector (SEQ ID NO: 21, sublinhado). Resíduos 247-274 da segunda cadeia polipeptídica correspondem a um espiral K contendo cisteína (SEQ ID NO: 32). X. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X HIV ENV “DART-0”
[00543] A Molécula de Ligação CD16 x HIV env designada “DART-0 é uma outra Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa. DART-0 é um Diacorpo biespecífico capaz de se ligar a CD16 e a proteína de HIV env. DART-0 é essencialmente a mesma como DART-X, exceto que possui os Domínios VH e VL do anticorpo CD16 anti-humano humanizado h3G8 (SEQ ID NO: 62 e SEQ ID NO: 63, respectivamente) em vez dos Domínios VH e VL de anticorpo CD16 anti-humano CD16-M1 (SEQ ID NO: 64 e SEQ ID NO: 65, respectivamente) que estão presentes na DART-X. Assim, DART-0 é composta por duas cadeias polipeptídicas tendo um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH do anticorpo CD16 anti-humano humanizado h3G8 (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo de CD16) e um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH de 7B2 (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo da proteína de HIV env). Essas cadeias polipeptídicas se associam para formar um Diacorpo DART® covalentemente ligado composto por duas cadeias polipeptídicas que possuem um Domínio de Ligação imunoespecífico para o epítopo de CD16 e um Domínio de Ligação imunoespecífico para o epítopo da proteína de HIV env (ver, por exemplo, Figura 1A-1B). Como observado acima, os Domínios VH e VL de h3G8 são usados aqui como um sítio de ligação a CD16 comparador.
Y. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X HIV ENV “DART-Z”
[00544] A Molécula de Ligação CD16 x HIV env designada “DART-Z” é uma outra Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa. DART-Z é um Diacorpo biespecífico capaz de se ligar a CD16 e à proteína de HIV env. DART-Z é essencialmente a mesma como DART-X, exceto que possui os Domínios VH e VL do anticorpo env anti-HIV A32 (SEQ ID NOs:142 e 143, respectivamente) ao invés dos Domínios VH e VL do anticorpo env anti-HIV 7B2 e possui os Domínios VH e VL do CD16A scFv anti-humano 4-LS21 (Publicação de Patente U.S. No 2015/0218275):
[00545] Domínio VH de CD16A scFv anti-humano 4- LS21 (SEQ ID NO: 175):
EEVQLVQSGA EVKKPGESLK VSCKASGYTF TSYYMHWVRQ APGQGLEWMG IINPSGGSTS YAQKFQGRVT MTRDTSTSTV YMELSSLRSE DTAVYYCARG SAYYYDFADY WGQGTLVTVS S
[00546] Domínio VL de CD16A scFv anti-humano 4- LS21 (SEQ ID NO: 176):
QPVLTQPSSV SVAPGQTATI SCGGHNIGSK NVHWYQQRPG QSPVLVIYQD NKRPSGIPER FSGSNSGNTA TLTISGTQAM DEADYYCQVW DNYSVLFGGG TKLTVL
[00547] em vez dos Domínios VH e VL de anticorpo CD16 anti-humano CD16-M1 (SEQ ID NO: 64 e SEQ ID NO: 65, respectivamente) que estão presentes em DART-X. Assim, DART-Z é composta por duas cadeias polipeptídicas tendo um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH do CD16A scFv anti-humano 4-LS21 (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo de CD16) e um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH de A32 (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo da proteína de HIV env). Essas cadeias polipeptídicas se associam para formar um Diacorpo DART® covalentemente ligado composto por duas cadeias polipeptídicas que possuem um Domínio de Ligação imunoespecíficos para o epítopo de CD16 e um Domínio de Ligação imunoespecíficos para o epítopo da proteína de HIV env (ver, por exemplo, Figura 1A-1B). Os Domínios VH e VL de 4-LS21 são usados aqui como sítios de ligação a CD16comparador. Z. MOLÉCULAS TRIVALENTES CD16 X HIV ENV X HIV ENV
[00548] As moléculas de Ligação CD16 x DA da presente invenção são ainda ilustradas pelo Domínio contendo Fc, Moléculas Trivalentes CD16 x HIV env x HIV env biespecíficas ou triespecíficas que compreendem dois Domínios de Ligação capazes de se ligar a um epítopo da proteína de HIV env e um Domínio de Ligação capaz de se ligar a um epítopo de CD16. Tais epítopos da proteína de HIV env podem ser os mesmos (como na Molécula Trivalente CD16 x HIV env x HIV env “TRIDENT-A”) ou eles podem ser diferentes (como na Molécula Trivalente CD16 x HIV env x HIV env “TRIDENT-B”). As estruturas e sequências de Moléculas Trivalentes TRIDENT™ ilustrativas são resumidas na Tabela 13 e são descritas em detalhe abaixo.
Tabela 13 Nome da Cadeia SEQ SEQ SEQ Molécula Antico Domín Anticor Domín Polipept ID ID ID Trivalent rpo io po io ídica NO NO NO e hCD16- 1 177 A32 VL 143 VH 72 M1 TRIDENT-A hCD16- 2 178 VL 73 A32 VH 142 M1 3 179 A32 VH 142
4 180 A32 VL 143 hCD16- 1 177 A32 VL 143 VH 72 M1 hCD16- TRIDENT-B 2 178 VL 73 A32 VH 142 M1 3 181 7B2 VH 140 4 182 7B2 VL 141
1. MOLÉCULA TRIVALENTE CD16 X HIV ENV X HIV ENV “TRIDENT-A”
[00549] Molécula Trivalente CD16 x HIV env x HIV env designada “TRIDENT-A” é composta por quatro cadeias polipeptídicas e possui um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH de anticorpo CD16 anti-humano hCD16-M1 (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo de CD16) e dois Domínios de Ligação que compreendem os Domínios VL e VH de A32 (e é, portanto, imunoespecífico para o epítopo da proteína de HIV env reconhecido por anticorpo A32). As quatro cadeias polipeptídicas se associam para formar uma molécula TRIDENT™ covalentemente ligada capaz de se ligar imunoespecificamente a uma ou duas cópias da proteína de HIV env epítopo reconhecido por anticorpo A32 e a um epítopo de CD16 (ver Figura 6A).
[00550] A primeira cadeia polipeptídica de TRIDENT-A tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 177:
QSALTQPPSA SGSPGQSVTI SCTGTSSDVG GYNYVSWYQH HPGKAPKLII SEVNNRPSGV PDRFSGSKSG NTASLTVSGL QAEDEAEYYC SSYTDIHNFV FGGGTKLTVL GGGSGGGGEV QLVESGGGLV KPGGSLRLSC AASGFTFSNY GMSWVRQAPG KGLEWVATIS GGGSYTFYPD SVKGRFTISR DNAKNSLYLQ MNSLRTEDTA LYYCVRQSAR APEPYWGQGT LVTVSSASTK GEVAACEKEV AALEKEVAAL EKEVAALEKG GGDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK
[00551] Resíduos 1-110 da primeira cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 177) de tal Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa correspondem ao Domínio VL de Anticorpo A32 (SEQ ID NO: 143). Resíduos 111-118 (sublinhado duplo) da primeira cadeia polipeptídica correspondem ao Conector 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO: 16). Resíduos 119-236 da primeira cadeia polipeptídica correspondem ao Domínio VH de anticorpo CD16 anti-humano hCD16-M1 (SEQ ID NO: 72). Resíduos 237-241 correspondem a um conector (SEQ ID NO: 21, sublinhado). Resíduos 242-269 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um espiral E contendo cisteína (SEQ ID NO: 31). Resíduos 270-282 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um conector (SEQ ID NO: 43). Resíduos 283-499 da primeira cadeia polipeptídica correspondem a um Domínio CH2-CH3 de IgG1 “knob-bearing” (SEQ ID NO: 51), em que o resíduo final é lisina.
[00552] A segunda cadeia polipeptídica de TRIDENT-A tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 178:
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASQNVG THVAWYQQKP GKAPKSLLYS ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQS EDIATYYCQQ YKSYPLTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLQ ESGPGLVKPS QTLSLSCTVS GGSSSSGAHY WSWIRQYPGK GLEWIGYIHY SGNTYYNPSL KSRITISQHT SENQFSLKLN SVTVADTAVY YCARGTRLRT LRNAFDIWGQ GTLVTVSSAS TKGKVAACKE KVAALKEKVA ALKEKVAALK E
[00553] Resíduos 1-107 da segunda cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 178) de tal Molécula de Ligação CD16 x DA ilustrativa correspondem ao Domínio VL de Anticorpo hCD16-M1 (SEQ ID NO: 73). Resíduos 108-115 (sublinhado duplo) da segunda cadeia polipeptídica correspondem ao Conector 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO: 16). Resíduos 116-238 da segunda cadeia polipeptídica correspondem ao Domínio VH de Anticorpo A32 (SEQ ID NO: 142). Resíduos 239-243 da segunda cadeia polipeptídica correspondem a um conector (SEQ ID NO: 43). Resíduos 244-271 da segunda cadeia polipeptídica correspondem a um espiral K contendo cisteína (SEQ ID NO: 32).
[00554] A terceira cadeia polipeptídica de TRIDENT-A tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 179:
QVQLQESGPG LVKPSQTLSL SCTVSGGSSS SGAHYWSWIR QYPGKGLEWI GYIHYSGNTY YNPSLKSRIT ISQHTSENQF SLKLNSVTVA DTAVYYCARG TRLRTLRNAF DIWGQGTLVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKR VEPKSCDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LSCAVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLVSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN RYTQKSLSLS PGK
[00555] Resíduos 1-123 da terceira cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 179) correspondem ao Domínio VH de Anticorpo A32 (SEQ ID NO: 142). Resíduos 124-221 da terceira cadeia polipeptídica correspondem a um Domínio CH1 de IgG1 humana (SEQ ID NO: 3). Resíduos 222-236 da terceira cadeia polipeptídica correspondem a um IgG Domínio de Dobradiça (SEQ ID NO: 7, sublinhado). Resíduos 237-453 da terceira cadeia polipeptídica correspondem a um Domínio CH2-CH3 IgG1 “hole- bearing” (SEQ ID NO: 53), em que o resíduo final é lisina.
[00556] A quarta cadeia polipeptídica de TRIDENT- A tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 180:
QSALTQPPSA SGSPGQSVTI SCTGTSSDVG GYNYVSWYQH HPGKAPKLII SEVNNRPSGV PDRFSGSKSG NTASLTVSGL QAEDEAEYYC SSYTDIHNFV FGGGTKLTVL RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC
[00557] Resíduos 1-110 da quarta cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 180) correspondem ao Domínio VL de Anticorpo A32 (SEQ ID NO: 143). Resíduos 111-217 da quarta cadeia polipeptídica correspondem a um Domínio CL Kappa humano (SEQ ID NO: 1).
2. MOLÉCULA TRIVALENTE CD16 X HIV ENV X HIV ENV “TRIDENT-B”
[00558] A Molécula Trivalente CD16 x HIV env x HIV env ilustrativa designada “TRIDENT-B” também é composta por quatro cadeias polipeptídicas. Possui um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH de anticorpo CD16 anti-humano hCD16-M1 (e é, portanto, imunoespecífico para um epítopo de CD16), um Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH de A32 (e é, portanto, imunoespecífico para o epítopo da proteína de HIV env reconhecido por anticorpo A32) e um outro Domínio de Ligação que compreende os Domínios VL e VH de 7B2 (e é, portanto, imunoespecífico para o epítopo da proteína de HIV env reconhecido por anticorpo 7B2). As quatro cadeias polipeptídicas se associam para formar uma molécula TRIDENT™ covalentemente ligada capaz de se ligar imunoespecificamente ao epítopo da proteína de HIV env reconhecido por anticorpo A32 e/ou ao epítopo da proteína de HIV env reconhecido por anticorpo 7B2 e um epítopo de CD16 (ver Figura 6A).
[00559] A primeira cadeia polipeptídica de
TRIDENT-B é idêntica à primeira cadeia polipeptídica de TRIDENT-A (SEQ ID NO: 177).
[00560] A segunda cadeia polipeptídica de TRIDENT-B é idêntica à segunda cadeia polipeptídica de TRIDENT-A (SEQ ID NO: 178).
[00561] A terceira cadeia polipeptídica de TRIDENT-B tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 181:
QVQLVQSGGG VFKPGGSLRL SCEASGFTFT EYYMTWVRQA PGKGLEWLAY ISKNGEYSKY SPSSNGRFTI SRDNAKNSVF LQLDRLSADD TAVYYCARAD GLTYFSELLQ YIFDLWGQGA RVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKSTSGGTAA LGCLVKDYFP EPVTVSWNSG ALTSGVHTFP AVLQSSGLYS LSSVVTVPSS SLGTQTYICN VNHKPSNTKV DKRVEPKSCD KTHTCPPCPA PEAAGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLSCAVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLVSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNRYTQKSL SLSPGK
[00562] Resíduos 1-126 da terceira cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 181) correspondem ao Domínio VH de Anticorpo 7B2 (SEQ ID NO: 140). Resíduos 127-224 da terceira cadeia polipeptídica correspondem a um Domínio CH1 de IgG1 humana (SEQ ID NO: 3). Resíduos 225-239 da terceira cadeia polipeptídica correspondem a um Domínio de Dobradiça de IgG (SEQ ID NO: 7, sublinhado). Resíduos 240-456 da terceira cadeia polipeptídica correspondem a um Domínio CH2-CH3 de IgG1 “hole-bearing” (SEQ ID NO: 53), em que o resíduo final é lisina.
[00563] A quarta cadeia polipeptídica de TRIDENT- B tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 182:
DIVMTQSPDS LAVSPGERAT IHCKSSQTLL YSSNNRHSIA WYQQRPGQPP KLLLYWASMR LSGVPDRFSG SGSGTDFTLT INNLQAEDVA IYYCHQYSSH PPTFGHGTRV EIKRTVAAPS VFIFPPSDEQ LKSGTASVVC LLNNFYPREA KVQWKVDNAL QSGNSQESVT EQDSKDSTYS LSSTLTLSKA DYEKHKVYAC EVTHQGLSSP VTKSFNRGEC
[00564] Resíduos 1-113 da quarta cadeia polipeptídica (SEQ ID NO: 182) correspondem ao Domínio VL de Anticorpo 7B2 (SEQ ID NO: 141). Resíduos 114-220 da quarta cadeia polipeptídica correspondem a um Domínio CL Kappa humano (SEQ ID NO: 1). VIII. MÉTODOS DE PRODUÇÃO
[00565] As moléculas da presente invenção são mais preferencialmente produzidas através da expressão recombinante de moléculas de ácido nucleico que codificam esses polipeptídeos, como é bem conhecido na técnica.
[00566] Os polipeptídeos da invenção podem ser convenientemente preparados usando a síntese de peptídeos em fase sólida (Merrifield, B. (1986) “Solid Phase Synthesis,” Science 232(4748):341-347; Houghten, R.A. (1985) “General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82(15):5131-5135; Ganesan, A. (2006) “Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century,” Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3-10).
[00567] Os anticorpos podem ser produzidos de forma recombinante e expressos utilizando qualquer método conhecido na técnica. Os anticorpos podem ser produzidos de forma recombinante, primeiro isolando os anticorpos produzidos a partir de animais hospedeiros, obtendo a sequência do gene e usando a sequência do gene para expressar o anticorpo de forma recombinante nas células hospedeiras
(por exemplo, células de CHO). Outro método que pode ser empregado é o de expressar a sequência de anticorpos em plantas (por exemplo, tabaco) ou leite transgênico. Métodos adequados para expressar anticorpos de forma recombinante em plantas ou leite foram divulgados (ver, por exemplo, Peeters et al. (2001) “Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants,” Vaccine 19:2756; Lonberg, N. et al. (1995) “Human Antibodies From Transgenic Mice,” Int. Rev. Immunol 13:65-93; and Pollock et al. (1999) “Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies,” J. Immunol. Methods 231:147-157). Os métodos adequados para a produção de derivados de anticorpos, por exemplo, humanizados, de cadeia única, etc. são conhecidos na técnica e foram descritos acima. Em outra alternativa, os anticorpos podem ser produzidos de forma recombinante pela tecnologia de exibição de fagos (ver, por exemplo, as patentes US
5.565.332; 5.580.717; 5.733.743; 6.265.150; e Winter, G. et al. (1994), “Making Antibodies By Phage Display Technology,” Annu. Rev. Immunol. 12.433-455).
[00568] Vetores contendo polinucleotídeos de interesse (por exemplo, polinucleotídeos que codificam as cadeias polipeptídicas das moléculas de ligação da presente invenção) podem ser introduzidos na célula hospedeira por qualquer um de vários meios apropriados, incluindo eletroporação, transfecção empregando cloreto de cálcio, cloreto de rubídio, fosfato de cálcio, DEAE-dextrano ou outras substâncias; bombardeio de microprojetos; lipofecção; e infecção (por exemplo, onde o vetor é um agente infeccioso como o vírus vaccinia). A escolha de introduzir vetores ou polinucleotídeos dependerá frequentemente das características da célula hospedeira.
[00569] Qualquer célula hospedeira capaz de superexpressar DNAs heterólogos pode ser usada com a finalidade de expressar um polipeptídeo ou proteína de interesse. Exemplos não limitativos de células hospedeiras de mamífero adequadas incluem, mas não estão limitados a, células COS, HeLa e CHO.
[00570] A invenção inclui polipeptídeos compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma molécula de ligação desta invenção. Os polipeptídeos desta invenção podem ser produzidos por procedimentos conhecidos na técnica. Os polipeptídeos podem ser produzidos por degradação proteolítica ou outra dos anticorpos, por métodos recombinantes (isto é, polipeptídeos simples ou de fusão) como descrito acima ou por síntese química. Polipeptídeos dos anticorpos, especialmente polipeptídeos mais curtos até cerca de 50 aminoácidos, são convenientemente produzidos por síntese química. Os métodos de síntese química são conhecidos na técnica e estão disponíveis comercialmente.
[00571] A invenção inclui variantes das moléculas de ligação divulgadas, incluindo polipeptídeos funcionalmente equivalentes que não afetam significativamente as propriedades de tais moléculas, bem como variantes que possuem atividade aprimorada ou diminuída. A modificação de polipeptídeos é uma prática rotineira na técnica e não precisa ser descrita em detalhes aqui. Exemplos de polipeptídeos modificados incluem polipeptídeos com substituições conservadoras de resíduos de aminoácidos, uma ou mais deleções ou adições de aminoácidos que não alteram significativa ou prejudicialmente a atividade funcional ou o uso de análogos químicos. Os resíduos de aminoácidos que podem ser substituídos conservativamente um pelo outro incluem, mas não estão limitados a: glicina/alanina; serina/treonina; valina/isoleucina/leucina; asparagina/glutamina; ácido aspártico/ácido glutâmico; lisina/arginina; e fenilalanina/tirosina. Esses polipeptídeos também incluem polipeptídeos glicosilados e não glicosilados, bem como polipeptídeos com outras modificações pós- traducionais, como, por exemplo, glicosilação com diferentes açúcares, acetilação e fosforilação. De preferência, as substituições de aminoácidos seriam conservadoras, isto é, o aminoácido substituído possuiria propriedades químicas semelhantes às do aminoácido original. Tais substituições conservativas são conhecidas na técnica e os exemplos foram fornecidos acima. As modificações de aminoácidos podem variar desde a alteração ou modificação de um ou mais aminoácidos até o reprojeto completo de uma região, como o Domínio Variável. Alterações no domínio variável podem alterar a afinidade e/ou especificidade de ligação. Outros métodos de modificação incluem o uso de técnicas de acoplamento conhecidas na técnica, incluindo, entre outros, meios enzimáticos, substituição oxidativa e quelação. Podem ser utilizadas modificações, por exemplo, para fixação de marcadores para imunoensaio, como a fixação de porções radioativas para radioimunoensaio. Os polipeptídeos modificados são feitos usando procedimentos estabelecidos na técnica e podem ser rastreados usando ensaios padrão conhecidos na técnica.
[00572] Em uma modalidade, é fornecido um polipeptídeo de fusão que compreende uma cadeia leve, uma cadeia pesada ou uma cadeia leve e pesada. Em outra modalidade, o polipeptídeo de fusão contém uma região constante de imunoglobulina heteróloga. Em outra modalidade, o polipeptídeo de fusão contém um domínio VH e VL de um anticorpo produzido a partir de um hibridoma depositado publicamente. Para os fins desta invenção, uma proteína de fusão de anticorpos contém domínios polipeptídicos que permitem que a proteína se ligue imunoespecificamente a CD16 e um antígeno da doença e que contém outra sequência de aminoácidos à qual não está ligada na molécula nativa, por exemplo, uma sequência heteróloga ou uma sequência homóloga de outra região (por exemplo, um domínio de ligação à albumina desimunizada, uma sequência de reconhecimento de proteína A, um marcador de peptídeo, etc.).
[00573] A presente invenção abrange particularmente tais moléculas de ligação (por exemplo, anticorpos, diacorpos, moléculas de ligação trivalentes, etc.) conjugadas a uma fração de diagnóstico ou terapêutica. Para fins de diagnóstico, as moléculas de ligação da invenção podem ser acopladas a uma substância detectável. Tais moléculas de ligação são úteis para monitorar e/ou progredir o desenvolvimento ou progressão de uma doença como parte de um procedimento de teste clínico, como determinar a eficácia de uma terapia específica. Exemplos de substâncias detectáveis incluem várias enzimas (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre, beta-galactosidase, etc.), grupos protéticos (por exemplo, avidina/biotina), materiais fluorescentes (por exemplo, umbelliferona, fluoresceína ou fitoeritrina), materiais luminescentes (por exemplo, luminol), materiais bioluminescentes (por exemplo, luciferase ou aequorina), materiais radioativos (por exemplo, carbono- 14, manganês-54, estrôncio-85 ou zinco-65), metais emissores de pósitrons e íons metálicos paramagnéticos não radioativos. A substância detectável pode ser acoplada ou conjugada diretamente à molécula de ligação ou indiretamente, através de um intermediário (por exemplo, um conector) usando técnicas conhecidas na técnica.
[00574] Para fins terapêuticos, as moléculas de ligação da invenção podem ser conjugadas com uma porção terapêutica, como uma citotoxina (por exemplo, um agente citostático ou citocida), um agente terapêutico ou um íon metálico radioativo, por exemplo, emissores alfa. Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que é prejudicial para as células, como, por exemplo, exotoxina de Pseudomonas, toxina Difteria, toxina botulínica A a F, ricina abrin, saporina e fragmentos citotóxicos destes agentes. Um agente terapêutico inclui qualquer agente que tenha um efeito terapêutico para tratar profilaticamente ou terapeuticamente um transtorno. Tais agentes terapêuticos podem ser agentes terapêuticos químicos, agentes terapêuticos de proteínas ou polipeptídeos e incluem agentes terapêuticos que possuem uma atividade biológica desejada e/ou modificam uma dada resposta biológica. Exemplos de agentes terapêuticos incluem agentes alquilantes, inibidores da angiogênese, agentes anti- mitóticos, agentes de terapia hormonal e anticorpos úteis para o tratamento de transtornos proliferativos celulares. A fração terapêutica pode ser acoplada ou conjugada diretamente à molécula de ligação ou indiretamente, através de um intermediário (por exemplo, um conector) usando técnicas conhecidas na técnica.
IX. USOS DAS MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO DA PRESENTE INVENÇÃO
[00575] Como discutido acima, moléculas capazes de se ligar a CD16 e um antígeno da doença são capazes de mediar a morte celular redirecionada de uma célula alvo (isto é, uma célula cancerígena ou uma célula infectada por patógeno) que expressa este antígeno da doença na superfície celular. Tais moléculas podem ser usadas para fins terapêuticos, por exemplo, em indivíduos com câncer ou uma infecção. Assim, as moléculas de ligação da presente invenção têm a capacidade de tratar qualquer doença ou condição associada ou caracterizada pela expressão de um antígeno de doença, particularmente um antígeno de câncer ou um antígeno associado a patógenos, na superfície desta célula alvo. Assim, sem limitação, as moléculas de ligação da presente invenção podem ser empregues no tratamento de câncer, particularmente um câncer caracterizado pela expressão de um antígeno de câncer. As moléculas de ligação da presente invenção podem ser empregues no tratamento de infecção, particularmente uma infecção caracterizada pela expressão de um antígeno associado a patógenos.
[00576] Em particular, a presente invenção abrange métodos em que a molécula capaz de se ligar a CD16 compreende um domínio de ligação ao epítopo de um anticorpo capaz de se ligar a CD16 e também compreende um domínio de ligação ao epítopo capaz de se ligar a um antígeno de doença (em particular, um antígeno de câncer ou um antígeno associado a patógenos) na superfície de uma célula alvo, de modo a mediar a morte redirecionada da célula alvo (por exemplo, mediando a morte celular redirecionada (por exemplo,
célula T redirecionada ou célula NK redirecionada) citotoxicidade)).
[00577] Em uma modalidade específica, a molécula capaz de se ligar a CD16 e ao antígeno da doença é um anticorpo biespecífico ou suas partes de ligação (incluindo um scFv), um BiTe, um TandAb e um CAR.
[00578] Em uma modalidade específica, a molécula capaz de se ligar a CD16 e ao antígeno da doença é um diacorpo biespecífico.
[00579] Em uma modalidade específica, a molécula capaz de se ligar a CD16 e ao antígeno da doença é uma molécula de ligação trivalente.
[00580] Como usado aqui, os termos: “fornecer uma terapia” e “tratar” se referem a qualquer administração de uma composição que esteja associada a qualquer indício de resultado benéfico ou desejado, incluindo, sem limitação, qualquer resultado clínico, como diminuição dos sintomas resultante da doença, atenuando um sintoma de infecção (por exemplo, carga viral, febre, dor, sepse etc.) um encolhimento do tamanho de um tumor (no contexto do câncer, por exemplo, um tumor de mama, câncer de estômago ou próstata), retardo do crescimento das células cancerígenas, atraso no início, desenvolvimento ou progressão de metástases, diminuição de um sintoma resultante da doença, aumento da qualidade de vida do indivíduo receptor, diminuição da dose de outros fármacos sendo fornecidos para tratar a doença de um sujeito, um aprimoramento do efeito de outro fármaco, como por meio de direcionamento e/ou internalização, atraso na progressão da doença e/ou prolongamento da sobrevivência do sujeito receptor.
[00581] Os sujeitos para tratamento incluem animais, mais preferencialmente espécies de mamíferos como não primatas (por exemplo, bovinos, equinos, felinos, caninos, roedores, etc.) ou primatas (por exemplo, macacos, como um macaco cinomolgo, humano, etc.). Em uma modalidade preferida, o sujeito é um humano.
[00582] Transtornos exemplificativos que podem ser tratados por várias modalidades da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, transtornos proliferativos, transtornos proliferativos celulares e câncer (especialmente um câncer que expressa um antígeno do câncer ligado a uma molécula capaz de mediar morte de células redirecionadas), doenças associadas a patógenos (especialmente uma infecção viral crônica associada à expressão de um antígeno associado a patógenos ligado a uma molécula capaz de mediar a morte celular redirecionada). Em várias modalidades, a invenção abrange métodos e composições para tratamento, prevenção ou manejo de uma doença ou transtorno em um sujeito, compreendendo a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz das moléculas de ligação da presente invenção. Tais moléculas são particularmente úteis para a prevenção, inibição, redução do crescimento ou regressão de tumores primários e metástases de tumores, e para reduzir a carga de patógenos ou eliminar células infectadas por patógenos. Embora não pretendam se vincular a um mecanismo de ação específico, essas moléculas podem mediar a função efetora contra as células-alvo, promover a ativação do sistema imunológico contra as células- alvo, reticular antígenos da superfície celular e/ou receptores nas células-alvo e melhorar apoptose ou sinalização regulatória de crescimento negativo, ou uma combinação dos mesmos, resultando em depuração e/ou redução no número de células alvo.
[00583] Os cânceres que podem ser tratados por moléculas da presente invenção, e pelos métodos da presente invenção, incluem, mas não estão limitados a: um câncer de glândula adrenal, incluindo, mas não se limitando a, um feocromocitoma ou um carcinoma adrenocortical; um câncer associado à AIDS; um sarcoma de parte mole alveolar; um tumor astrocitico; um câncer basal; um câncer de bexiga, incluindo, sem limitação, carcinoma de células transicionais, câncer de células escamosas, adenocarcinoma ou carcinossarcoma; um sarcoma ósseo e do tecido conjuntivo, como, sem limitação, sarcoma ósseo, osteossarcoma, condrosarcoma, sarcoma de Ewing, tumor maligno de células gigantes, fibrossarcoma ósseo, cordoma, sarcoma periosteal, sarcomas de tecidos moles, angiossarcoma (hemangiossarcoma), fibrosarcoma Sarcoma de Kaposi, leiomiossarcoma, lipossarcoma, linfangiossarcoma, neurilemoma, rabdomiossarcoma ou um sarcoma sinovial; um câncer no cérebro, incluindo, sem limitação, glioma, astrocitoma, glioma do tronco encefálico, ependimoma, oligodendroglioma, tumor nonglial, neurinoma acústico, craniofaringioma, meduloblastoma, meningioma, pinocitoma, pinoblastoma ou linfoma primário do cérebro; um câncer no cérebro e na medula espinhal; um câncer de mama, incluindo, sem limitação, adenocarcinoma, carcinoma lobular (de pequenas células), carcinoma intraductal, câncer de mama medular, câncer de mama mucinoso, câncer de mama tubular, câncer de mama papilar, doença de Paget ou um câncer de mama inflamatório; um tumor no corpo carotídeo; um câncer do colo do útero, incluindo, sem limitação, carcinoma espinocelular ou adenocarcinoma; um colangiocarcinoma, incluindo mas não limitado a, um colangiocarcinoma papilar, nodular ou difuso; um condrossarcoma; um cordoma; um carcinoma de células renais cromofóbico; um carcinoma celular claro; um câncer de cólon; um câncer colorretal; um histiocitoma fibroso benigno cutâneo; um tumor desmoplástico de pequenas células redondas; um ependimoma; um câncer ocular, incluindo, mas não limitado a, um melanoma ocular, como melanoma da íris, melanoma coroide e melanoma do corpo ciliar e retinoblastoma; um câncer de esôfago, incluindo, sem limitação, câncer escamoso, adenocarcinoma, carcinoma adenoide cítico, carcinoma mucoepidermoide, carcinoma adenoescamoso, sarcoma, melanoma, plasmocitoma, carcinoma verrucoso e carcinoma de células de aveia (pequenas células); um tumor de Ewing; um condrossarcoma mixoide extra-esquelético; uma fibrogênese imperfeita óssio; uma displasia fibrosa do osso; um câncer de vesícula biliar ou do ducto biliar, incluindo, mas não limitado a, um adenocarcinoma; um câncer gástrico; uma doença trofoblástica gestacional; um tumor de células germinativas; um câncer de cabeça e pescoço; um carcinoma hepatocelular; doença de cadeia pesada; um tumor de células ilhotas; um sarcoma de Kaposi; uma leucemia, incluindo, mas não se limitando a, uma leucemia aguda; leucemia linfocica aguda; uma leucemia mielocítica aguda, tal como, mas não se limitando a, uma leucemia mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica ou eritroleucemia ou uma síndrome mielodisplásica; uma leucemia crônica, tal como, sem limitação, uma leucemia mielocítica (granulocítica), uma leucemia linfocítica crônica, uma leucemia de células cabeludas; um tumor lipoma/lipomatoso benigno; um lipossarcoma/tumor lipomatoso maligno; um câncer de fígado, incluindo, sem limitação, carcinoma hepatocelular ou hepatoblastoma; um linfoma, tal como mas não limitado a, doença de Hodgkin; doença não Hodgkin; um câncer de pulmão, incluindo, sem limitação, câncer de pulmão de células não pequenas, carcinoma de células escamosas (carcinoma epidermoide), adenocarcinoma, carcinoma de células grandes ou câncer de pulmão de células pequenas; um meduloblastoma; um melanoma; um meningioma; uma gamopatia monoclonal benigna; uma gamopatia monoclonal de significado indeterminado; uma neoplasia endócrina múltipla; um mieloma múltiplo, tal como, sem limitação, um mieloma múltiplo latente, mieloma não secretor, mieloma osteosclerótico, leucemia de células plasmáticas, plasmocitoma solitário e plasmocitoma extramedular; uma síndrome mielodisplásica; um neuroblastoma; um tumor neuroendócrino; um câncer bucal, incluindo mas não limitado a, carcinoma de células escamosas; um câncer de ovário; incluindo, sem limitação, carcinoma epitelial ovariano, tumor limítrofe, tumor de células germinativas e tumor estromal; um câncer de pâncreas, incluindo, sem limitação, uma insulinoma, gastrinoma, glucagonoma, vipoma, tumor secretor de somatostatina ou tumor de células carcinoides ou ilhotas; um tumor da paratireoide; um câncer pediátrico; um câncer penal; um tumor de bainha de nervo periférico; um feocromocitoma; um câncer de faringe, incluindo, mas não limitado a, um câncer de células escamosas ou um câncer verrucoso; um câncer de hipófise, incluindo, sem limitação, doença de Cushing, tumor secretor de prolactina, acromegalia ou tumor de diacorpos insípio; um câncer de próstata, incluindo, sem limitação, adenocarcinoma, leiomiossarcoma ou rabdomiossarcoma; policitemia vera; um melanoma uveal póstero; um transtorno hematológico raro; um câncer renal, incluindo, sem limitação, adenocarcinoma, hipernefroma, fibrossarcoma, câncer renal metastático ou câncer de células em transição (pelve renal e/ou útero); um tumor rabdoide; um rabdomiossarcoma; um câncer de glândula salivar, incluindo mas não limitado a, um adenocarcinoma, carcinoma mucoepidermoide ou um carcinoma adenoidcístico; um sarcoma; um câncer de pele, incluindo, sem limitação, carcinoma basocelular, carcinoma espinocelular e melanoma, melanoma de espalhamento superficial, melanoma nodular, melanoma maligno por lentigo ou melanoma acent lentiginoso; um sarcoma de tecidos moles; um câncer de células escamosas; um câncer de estômago, incluindo, sem limitação, um adenocarcinoma, um linfoma fungoide (polipoide), ulcerativo, superficial, difuso ou difuso ou maligno, lipossarcoma, fibrossarcoma e carcinosarcoma; um sarcoma sinovial; um câncer testicular, incluindo, sem limitação, tumor germinativo, seminoma anaplásico, clássico (típico), espermatocítico, não seminoma, carcinoma embrionário, carcinoma de teratoma ou coriocarcinoma (tumor do saco vitelino); um carcinoma timo; um timoma; um câncer de tireoide, tal como, sem limitação, câncer de tireoide papilar ou folicular, câncer de tireoide metastático, câncer de tireoide medular ou câncer de tireoide anaplásico; um câncer uterino, incluindo, sem limitação, carcinoma endometrial ou sarcoma uterino; um câncer vaginal, incluindo, sem limitação, carcinoma espinocelular, adenocarcinoma ou melanoma; um câncer vulvar, incluindo, sem limitação, carcinoma espinocelular, melanoma, adenocarcinoma, carcinoma basocelular, sarcoma ou doença de Paget; uma macroglobulinemia de Waldenström ou tumor de Wilms. Além disso, os cancros incluem mixossarcoma, sarcoma osteogénico, endoteliossarcoma, lifângio-endoteliossarcoma, mesotelioma, sinovioma, hemangioblastoma, carcinoma epitelial, cistadenocarcinoma, carcinoma broncogénico, carcinoma da glândula de suor, carcinoma de glândula sebácea, carcinoma papilar e adenocarcinomas papilares (para uma revisão de tais transtornos, ver Fishman et al., 1985, Medicine, 2a Ed., JB Lippincott Co., Philadelphia and Murphy et al., 1997, Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc.).
[00584] Em particular, as moléculas de ligação da presente invenção podem ser usadas no tratamento de câncer adrenal, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer colorretal, câncer gástrico, glioblastoma, câncer de rim, câncer de pulmão de células não pequenas, linfocítica aguda leucemia, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica, leucemia de células cabeludas, linfoma de Burkett, linfoma difuso de células B grandes, linfoma folicular, linfoma de células do manto, linfoma de zona marginal, linfoma não Hodgkin, linfoma pequeno de linfocitoma, mieloma múltiplo, mieloma múltiplo, câncer de ovário, câncer de pâncreas, câncer de próstata, câncer de pele, carcinoma de células renais, câncer de testículo e câncer de útero.
[00585] As doenças associadas a patógenos que podem ser tratadas pelas moléculas de ligação CD16 da presente invenção incluem infecções virais, bacterianas, fúngicas e parasitárias crônicas. As infecções crônicas que podem ser tratadas pelas moléculas de ligação CD16 da presente invenção incluem o vírus Epstein Barr, vírus da hepatite A (HAV); Vírus da hepatite B (HBV); Vírus da hepatite C (HCV); vírus do herpes (por exemplo, HSV-1, HSV-2, HHV-6, CMV), vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus da estomatite vesicular (VSV), bacilos, citrobactérias, cólera, difteria, enterobactérias, gonococos, Helicobacter pylori, Klebsiella, Legionella, meningococos, micobactérias, Pseudomonas, Pneumonococci, rickettsia bactérias, Salmonella, Serratia, Staphylococcus, Streptococcus, Tétano, Aspergillus (fumigatus, niger, etc.), Blastomyces dermatitidis, Candida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis, etc.), Cryptococcus neoformans, Genus Mucorales (Mucor, Absidia, Rhizopus), Sporothrix schenkii, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, leptospirose, Borrelia burgdorferi, helmintos parasitas (ancilóstomo, ténias, solhas, vermes achatados (por exemplo, Schistosomia), Giardia lamblia, trichinella Dientamoeba Fragilis, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi e Leishmania donovani). X. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS
[00586] A presente invenção abrange composições compreendendo uma molécula capaz de se ligar a CD16 e também capaz de se ligar a um antígeno de doença. As composições da invenção incluem composições de fármaco em massa úteis na fabricação de composições farmacêuticas (por exemplo, composições impuras ou não estéreis) e composições farmacêuticas (isto é, composições que são adequadas para administração a um sujeito ou paciente) que podem ser usadas na preparação de formas de dosagem unitárias. Tais composições compreendem uma quantidade profilática ou terapeuticamente eficaz de uma molécula capaz de se ligar a CD16 e também capaz de se ligar a um antígeno da doença, de modo a ser capaz de mediar a morte redirecionada de uma célula alvo (por exemplo, uma célula cancerígena, uma infecção por patógeno), etc.) ou uma combinação destes agentes e um portador farmaceuticamente aceitável. Preferencialmente, as composições da invenção compreendem uma quantidade profilática ou terapeuticamente eficaz das moléculas de ligação da presente invenção e um portador farmaceuticamente aceitável. Em um aspecto preferido, essas composições são substancialmente purificadas (isto é, substancialmente livres de substâncias que limitam seu efeito ou produzem efeitos colaterais indesejados).
[00587] Várias formulações de tais composições podem ser utilizadas para administração. Além do agente (ou agentes) farmaceuticamente ativo, as composições da presente invenção podem conter veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados compreendendo excipientes e auxiliares que são bem conhecidos na técnica e são substâncias relativamente inertes que facilitam a administração de uma substância farmaceuticamente eficaz ou que facilitam o processamento dos compostos ativos em preparações que podem ser usadas farmaceuticamente para entrega no local da ação. Por exemplo, um excipiente pode dar forma ou consistência ou agir como um diluente. Excipientes adequados incluem, mas não estão limitados a, agentes estabilizantes, umectantes e emulsificantes, sais para osmolaridade variável, agentes encapsulantes, tampões e intensificadores de penetração na pele.
[00588] Em uma modalidade específica, o termo “farmaceuticamente aceitável” significa aprovado por uma agência reguladora do governo federal ou estadual ou listado na Farmacopeia dos EUA ou em outra farmacopeia geralmente reconhecida para uso em animais e, mais particularmente, em seres humanos. O termo “portador” refere-se a um diluente, adjuvante (por exemplo, adjuvante de Freund (completo e incompleto), excipiente ou portador com o qual a terapêutica é administrada. Em geral, os ingredientes das composições da invenção são fornecidos separadamente ou misturados em conjunto na forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó liofilizado seco ou concentrado sem água em um recipiente hermeticamente fechado, como uma ampola ou saqueta, indicando a quantidade de agente ativo. Quando a composição for administrada por infusão, ela pode ser dispensada com um frasco de infusão contendo água ou solução salina estéril de grau farmacêutico. Quando a composição é administrada por injeção, uma ampola de água estéril para injeção ou solução salina pode ser fornecida para que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.
[00589] A invenção também fornece uma embalagem ou kit farmacêutico compreendendo um ou mais recipientes cheios com uma molécula de ligação da presente invenção, isoladamente ou com este portador farmaceuticamente aceitável. Além disso, um ou mais outros agentes profiláticos ou terapêuticos úteis para o tratamento de uma doença também podem ser incluídos na embalagem ou kit farmacêutico. A invenção também fornece uma embalagem ou kit farmacêutico compreendendo um ou mais recipientes cheios com um ou mais dos ingredientes das composições farmacêuticas da invenção. Opcionalmente associado a esse recipiente (ou recipientes), pode haver um aviso na forma prescrita por uma agência governamental que regula a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, aviso que reflete a aprovação da agência de fabricação, uso ou venda para administração humana.
[00590] A presente invenção fornece kits que podem ser utilizados nos métodos acima. Um kit pode compreender qualquer uma das moléculas de ligação da presente invenção. O kit pode ainda compreender um ou mais outros agentes profiláticos e/ou terapêuticos úteis para o tratamento de câncer, em um ou mais recipientes. XI. MÉTODOS DE ADMINISTRAÇÃO
[00591] As composições da presente invenção podem ser fornecidas para o tratamento, profilaxia e melhoria de um ou mais sintomas associados a uma doença, transtorno ou infecção, administrando a um sujeito uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica CD16 x DA da presente invenção. Em um aspecto preferido, essas composições são substancialmente purificadas (isto é, substancialmente livres de substâncias que limitam seu efeito ou produzem efeitos colaterais indesejados). Em uma modalidade específica, o sujeito é um animal, preferencialmente um mamífero como não primata (por exemplo, bovino, equino, felino, canino, roedor etc.) ou um primata (por exemplo, macaco como um macaco cinomolgo, humano)., etc). Em uma modalidade preferida, o sujeito é um ser humano.
[00592] Os métodos de administração de uma Molécula de Ligação CD16 x DA ou composição farmacêutica da invenção incluem, entre outros, administração parentérica (por exemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa e subcutânea), epidural e mucosa (por exemplo, intranasal e vias orais). Em uma modalidade específica, as moléculas de ligação da presente invenção são administradas por via intramuscular, intravenosa ou subcutânea. As composições podem ser administradas por qualquer via conveniente, por exemplo, por infusão ou injeção em bolus, por absorção através de revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (por exemplo, mucosa oral, mucosa retal e intestinal, etc.) e podem ser administradas em conjunto com outros agentes biologicamente ativos. A administração pode ser sistêmica ou local.
[00593] A invenção também prevê que as preparações das moléculas de ligação da presente invenção são embaladas em um recipiente hermeticamente selado tal como uma ampola ou saqueta indicando a quantidade da molécula. Em uma modalidade, essas moléculas são fornecidas como um pó liofilizado esterilizado seco ou concentrado sem água em um recipiente hermeticamente fechado e podem ser reconstituídas, por exemplo, com água ou solução salina na concentração apropriada para administração a um indivíduo. Preferencialmente, as moléculas de ligação da presente invenção são fornecidas como um pó liofilizado estéril seco em um recipiente hermeticamente fechado.
[00594] As preparações liofilizadas das moléculas de ligação da presente invenção devem ser armazenadas entre 2 °C e 8 °C em seu recipiente original e as moléculas devem ser administradas dentro de 12 horas, preferencialmente dentro de 6 horas, dentro de 5 horas, dentro de 3 horas ou 1 hora após a reconstituição. Em uma modalidade alternativa, essas moléculas são fornecidas na forma líquida em um recipiente hermeticamente fechado, indicando a quantidade e a concentração da molécula, proteína de fusão ou molécula conjugada. De preferência, essas moléculas de ligação, quando fornecidas na forma líquida, são fornecidas em um recipiente hermeticamente fechado.
[00595] A quantidade de tais preparações da invenção que serão eficazes no tratamento, prevenção ou melhoria de um ou mais sintomas associados a um transtorno pode ser determinada por técnicas clínicas padrão. A dose exata a ser empregada na formulação também dependerá da via de administração e da gravidade da condição e deve ser decidida de acordo com o julgamento do médico e as circunstâncias de cada paciente. As doses efetivas podem ser extrapoladas a partir de curvas dose-resposta derivadas de sistemas de teste in vitro ou em modelo animal.
[00596] Como usado aqui, uma “quantidade eficaz” de uma composição farmacêutica é uma quantidade suficiente para afetar resultados benéficos ou desejados, incluindo, sem limitação, resultados clínicos, como diminuição dos sintomas resultantes da doença, atenuação de um sintoma de infecção (por exemplo, carga viral, febre, dor, sepse etc.) ou um sintoma de câncer (por exemplo, proliferação de células cancerígenas, presença de tumor, metástases tumorais, etc.), aumentando assim a qualidade de vida das pessoas que sofrem da doença, diminuindo a dose de outros fármacos necessários para tratar a doença, melhorando o efeito de outro fármaco, como direcionamento e/ou internalização, retardando a progressão da doença e/ou prolongando a sobrevivência dos indivíduos. Quando aplicado a um ingrediente ativo individual, administrado isoladamente, o termo refere-se a este ingrediente isoladamente. Quando aplicado a uma combinação, o termo refere-se a quantidades combinadas dos ingredientes ativos que resultam no efeito terapêutico, seja administrado em combinação, em série ou simultaneamente.
[00597] Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações. Para os fins desta invenção, uma quantidade eficaz de fármaco, composto ou composição farmacêutica é uma quantidade suficiente: para matar e/ou reduzir a proliferação de células cancerígenas e/ou para eliminar, reduzir e/ou retardar o desenvolvimento de metástases de um sítio primário de câncer; ou reduzir a proliferação (ou o efeito) de um patógeno infeccioso e reduzir e/ou retardar o desenvolvimento da doença mediada por patógeno, direta ou indiretamente. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de um fármaco, composto ou composição farmacêutica pode ou não ser alcançada em conjunto com outro fármaco, composto ou composição farmacêutica. Assim, uma “quantidade eficaz” pode ser considerada no contexto de administrar um ou mais agentes quimioterapêuticos, e um agente único pode ser considerado para ser dado em uma quantidade eficaz se, em conjunto com um ou mais outros agentes, um resultado desejável pode ser ou é alcançado. Embora as necessidades individuais variem, a determinação de faixas ótimas de quantidades efetivas de cada componente está dentro dos conhecimentos da técnica.
[00598] Para as moléculas de ligação abrangidas pela invenção, a dosagem administrada a um paciente é preferencialmente determinada com base no peso corporal (kg)
do sujeito receptor. Para as moléculas de ligação abrangidas pela invenção, a dosagem administrada a um paciente é tipicamente de cerca de 0,01 µg/kg a cerca de 30 mg/kg ou mais do peso corporal do sujeito.
[00599] A dosagem e frequência de administração de uma molécula de ligação da presente invenção podem ser reduzidas ou alteradas aumentando a captação e a penetração de tecido da molécula por modificações como, por exemplo, lipidação.
[00600] A dosagem de uma molécula de ligação da invenção administrada a um paciente pode ser calculada para uso como uma terapia de agente único. Alternativamente, a molécula pode ser usada em combinação com outras composições terapêuticas e a dosagem administrada a um paciente é menor do que quando as referidas moléculas são usadas como uma terapia de agente único.
[00601] As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas localmente na área que necessita de tratamento; isso pode ser alcançado por, por exemplo, e não por limitação, infusão local, por injeção ou por meio de um implante, sendo o implante de um material poroso, não poroso ou gelatinoso, incluindo membranas, como membranas ou fibras SIALASTIC®. De preferência, ao administrar uma molécula da invenção, deve-se tomar cuidado para usar materiais aos quais a molécula não absorve.
[00602] As composições da invenção podem ser liberadas em uma vesícula, em particular um lipossoma (ver Langer (1990) “New Methods Of Drug Delivery,” Science 249:1527-1533); Treat et al., in LIPOSOMES IN THE THERAPY OF INFECTIOUS DISEASE AND CANCER, Lopez-Berestein and Fidler (eds.),
Liss, New York, pp. 353- 365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327).
[00603] O tratamento de um sujeito com uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de uma molécula de ligação da presente invenção pode incluir um único tratamento ou, preferencialmente, pode incluir uma série de tratamentos. Em um exemplo preferido, um sujeito é tratado com uma composição farmacêutica da invenção por entre cerca de 1 a 10 semanas, preferencialmente entre 2 a 8 semanas, mais preferencialmente entre cerca de 3 a 7 semanas e ainda mais preferencialmente por cerca de 4, 5, ou 6 semanas. As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas uma vez ao dia, ocorrendo uma vez por semana, duas vezes por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez por mês, uma vez a cada seis semanas, uma vez a cada dois meses, duas vezes por ano ou uma vez por ano, etc. Alternativamente, as composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas duas vezes ao dia, ocorrendo uma vez por semana, duas vezes por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez por mês, uma vez a cada seis semanas, uma vez a cada dois meses, duas vezes por ano ou uma vez por ano, etc. Alternativamente, as composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas três vezes ao dia com essa administração ocorrendo uma vez por semana, duas vezes por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez por mês, uma vez a cada seis semanas, uma vez a cada dois meses, duas vezes por ano ou uma vez por ano, etc. Também será apreciado que a dosagem eficaz das moléculas utilizadas para o tratamento pode aumentar ou diminuir ao longo de um determinado tratamento.
EXEMPLOS
[00604] Tendo agora descrito geralmente a invenção, o mesmo será mais facilmente entendido por referência aos exemplos seguintes, que são fornecidos por via de ilustração e não são pretendem limitar a presente invenção, a menos que especificado. EXEMPLO 1 CARACTERIZAÇÃO DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO CD16
[00605] Como debatido acima, uma série de Moléculas de Ligação CD16 x DA Diacorpo DART® foi generada incorporando domínios de ligação anti-CD16 murino, humanizados ou optimizados diferentes e tendo um Domínio de Ligação que é immunoespecífico para: (1) o antígeno tumoral HER2/neu (Domínio de Ligação de Trastuzumabe), (2) um Domínio de Ligação que é immunoespecífico para um antígeno de HIV (Domínio de Ligação de A32 ou 7B2), (3) o antígeno de células B CD19 (Domínio de Ligação de CD19 mAb 1), ou (4) um Domínio de Ligação que é immunoespecífico para um antígeno de RSV (Domínio de Ligação de Palivizumabe) (Tabela 14). Tabela 14 Designação Especificidades CD16 VH/VL VH/VL Alvo DART-A CD16 x HER2/neu CD16-M1 Trastuzumabe DART-B CD16 x HER2/neu CD16-M2 Trastuzumabe DART-C CD16 x HER2/neu hCD16-M1 Trastuzumabe DART-D CD16 x HER2/neu hCD16-M2 (VH1) Trastuzumabe DART-E CD16 x HER2/neu hCD16-M2 (VH2) Trastuzumabe DART-F CD16 x HIV hCD16-M1 A32 DART-G CD16 x HIV hCD16-M2 (VH1) A32 DART-H CD16 x HIV hCD16-M1 7B2 DART-I CD16 x HER2/neu hCD16-M1A Trastuzumabe
DART-J CD16 x HER2/neu hCD16-M1B Trastuzumabe DART-K CD16 x HER2/neu hCD16-M1AB Trastuzumabe DART-L CD16 x CD19 hCD16-M1 CD19 mAb 1 DART-M CD16 x CD19 hCD16-M1B CD19 mAb 1 DART-N CD16 x CD19 hCD16-M1AB CD19 mAb 1 DART-1 CD16 x HER2/neu h3G8 Trastuzumabe Variante de DART-2 CD16 x RSV h3G8 Palivizumabe DART-3 CD16 x RSV hCD16-M1 vPalivizumabe DART-4 CD16 x HIV h3G8 7B2 DART-5 CD16 x RSV hCD16-M1 vPalivizumabe DART-6 CD16 x RSV hCD16-M1B vPalivizumabe DART-7 CD16 x RSV hCD16-M1AB vPalivizumabe DART-X CD16 x HIV CD16-M1 7B2 DART-Y CD16 x HIV CD16-M2 7B2 DART-Z CD16 x HIV 4-LSN1 A32 DART-0 CD16 x HIV h3G8 7B2
[00606] Estudos de competição foram realizados com os dois diacorpos de cadeia (DART-X, DART-Y e DART-0) compreendendo anticorpo CD16-M1 murino, anticorpo CD16-M2 murino, anticorpo humanizado 3G8 e dois anticorpos comerciais amplamente disponíveis: LNK16 e DJ130c (Abcam, etc.). Uma análise ProteOn foi conduzida para avaliar a ligação de artigos de teste às moléculas CD16 que foram imobilizadas em um chip. As moléculas CD16 foram primeiro incubadas com Fusão CD16-Fc 5 nM (IgG2 humana) capturada, seguido pela incubação com 10 nM de um primeiro artigo de teste (artigo de teste 1), seguido por uma incubação com 10 nM de um segundo artigo de teste (artigo de teste 2). A ligação foi detectada usando fragmentos Fc F(ab’)2 anti-humanos.
[00607] Este estudo revelou que os domínios de ligação CD16-M1, CD16-M2, LNK16 e 3G8 ligados a diferentes epítopos de CD16. Verificou-se que CD16-M2 compete com anticorpo DJ130c para se ligar a CD16; Foi relatado que DJ130c se liga a CD16 a um sítio que não se sobrepõe ao sítio de ligação Fc de CD16 (Tamm, A. et al. (1996) “The Binding Epitopes Of CD16 humana (Fc Gamma RIII) Monoclonal Antibodies. Implications For Ligand Binding,” J. Immunol. 157(4):1576-1581; Tamm, A. et al. (1996) “The Igg Binding Site Of Human FcgammaRIIIB Receptor Involves CC' And FG Loops Of The Membrane-Proximal Domain,” J. Biol. Chem. 271(7):3659- 3666).
[00608] A capacidade de CD16-M1, DJ130c e LNK16 de se ligar a CD16A na presença de IgG foi avaliada. Verificou-se que a presença de IgG inibiu a ligação por NK16, mas que presença de IgG não inibe a ligação entre CD16 e CD16-M1 não foi inibido pela presença de IgG, considerando L. Retatou-se que o epítopo 3G8 se sobrepõe ao sítio de ligação Fc de CD16 (Tamm, A. et al. (1996) J. Biol. Chem. 271(7):3659-3666).
[00609] Concentrações crescentes de IgG humana (hIgG) diminuiram a ligação de anticorpo LNK16 a CD16, indicando, assim, que o epítopo reconhecido por LNK16 se sobrepõe ao sítio de ligação Fc de CD16; ao contrário, a ligação pelos domínios de ligação CD16 de DJ130c ou CD16-M1 não foi substancialmente afetada, indicando, assim, que os epítopos de CD16 reconhecidos pelas moléculas não se sobrepõem ao sítio de ligação Fc de CD16 (Figura 8).
[00610] Como debatido acima, CD16A possui dois alótipos principais, refletindo um polimorfismo de 158F vs. 158V. Como mostrado na Tabela 15, verificou-se que os
Domínios de Ligação CD16 de CD16-M1 e CD16-M2 se ligam a alótipos de CD16 com alta afinidade similar (aproximadamente 3 a 25 vezes melhor do que h3G8, que tem uma afinidade 10 vezes menor ao alótipo CD16 158F, em relação ao alótipo CD16 158V. Verificou-se que o domínio de ligação de h3G8 exibe uma rápida taxa de desativação. A análise foi conduzida usando um formato BIACORE® em que as moléculas diacorpo foram capturadas em uma superfície Fc anti-humana (Fab’)2 de cabra, e as moléculas CD16A V/F humanas (marcadas com Avitag) foram passadas sobre os diacorpos capturados (normalizados; ajuste de ligação 1:1). Tabela 15 Molécula ka kd KD (nM) CD16A 158F Humana DART-1 1,7 x 106 1,1 x 10-1 65,9 DART-C 1,6 x 106 3,0 x 10-4 0,2 DART-D 4,7 x 105 1,2 x 10-3 2,5 DART-F 1,5 x 106 3,4 x 10-4 0,2 DART-G 4,7 x 105 1,2 x 10-3 2,6 CD16A 158V Humana DART-1 1,3 x 106 9,0 x 10-3 6,9 DART-C 1,4 x 106 3,9 x 10-4 0,3 DART-D 5,2 x 105 1,2 x 10-3 2,3 DART-F 1,4 x 106 3,7 x 10-4 0,3 DART-G 5,4 x 105 1,2 x 10-3 2,2
[00611] Uma análise ProteOn foi conduzida para avaliar a ligação dos Domínios de Ligação CD16 dos diacorpos construídos para moléculas marcadas com CD16-His (R&D Systems) que foram imobilizadas em um chip. As moléculas CD16 foram imobilizadas através de um anticorpo anti-PentaHis,
seguido pela incubação com os diacorpos.
Os resultados dos estudos de ligação CD16 são resumidos na Tabela 16 (o Domínio de Ligação CD16 de DART-Z deriva de scFv 4-LS21, que é específico para CD16A). Tabela 16 Molécula ka kd KD (nM) CD16A V158F Humana DART-A 4,2 x 106 3,3 x 10-4 0,1 DART-B 2,9 x 105 4,8 x 10-4 1,7 DART-1 5,3 x 105 3,4 x 10-2 63,1 DART-C 2,8 x 106 2,6 x 10-4 0,1 DART-D 4,3 x 105 1,0 x 10-3 2,4 DART-E 2,3 x 105 1,6 x 10-3 7,2 DART-F 4,2 x 106 2,4 x 10-4 0,1 DART-G 4,7 x 105 8,9 x 10-4 1,9 DART-H 4,5 x 106 1,9 x 10-4 0,04 DART-4 6,1 x 105 4,7 x 10-2 76,8 DART-Z 2,9 x 105 4,3 x 10-3 15,2 CD16A 158V Humana DART-A 3,9 x 106 4,5 x 10-4 0,1 DART-B 3,2 x 105 4,1 x 10-4 1,3 DART-1 2,4 x 105 6,5 x 10-3 26,7 DART-C 2,4 x 106 3,2 x 10-4 0,1 DART-D 5,6 x 105 7,1 x 10-4 1,3 DART-E 3,3 x 105 1,1 x 10-3 3,3 DART-F 4,0 x 106 4,0 x 10-4 0,1 DART-G 6,6 x 105 5,5 x 10-4 0,8 DART-H 3,9 x 106 3,7 x 10-4 0,1 DART-4 2,9 x 106 6,9 x 10-3 23,3 DART-Z 2,6 x 105 4,2 x 10-3 15,7
CD16B Humana DART-A 2,6 x 106 1,3 x 10-3 0,5 DART-B 2,2 x 105 7,4 x 10-4 3,3 DART-1 8,9 x 105 5,5 x 10-3 6,1 DART-C 1,5 x 106 6,9 x 10-4 0,5 DART-D 3,5 x 105 1,3 x 10-3 3,6 DART-E 1,5 x 105 1,9 x 10-3 12,5 DART-F 2,8 x 106 1,1 x 10-3 0,4 DART-G 4,6 x 105 1,2 x 10-3 2,6 DART-H 2,5 x 106 8,9 x 10-4 0,4 DART-4 7,8 x 105 6,1 x 10-3 7,8 DART-Z N/A* N/A* N/A* * O Domínio de Ligação CD16 de DART-Z deriva de scFv 4-LS21, que é específico para CD16A
[00612] Os resultados indicam que diacorpos compreendendo Domínios de Ligação CD16 CD16-M1 ou CD16-M2 exibiram afinidade mais alta para ambos os alelos de CD16A e afinidade mais alta do que moléculas comparadoras. Diacorpos compreendendo Domínios de Ligação CD16 hCD16-M2 (VH1) exibiram levemente melhor ligação do que diacorpos compreendendo os Domínios de Ligação CD16hCD16-M2 (VH2) (compare DART-D vs. DART-E). EXEMPLO 2 LIGAÇÃO DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO CD16 DART-F E DART- G ÀS CÉLULAS NK, NEUTRÓFILOS E CÉLULAS T
[00613] De modo a demonstrar a capacidade das Moléculas de Ligação CD16 x DA da invenção de se ligar a CD16, o sangue total de sujeitos doadores foi incubado na presença de diacorpos de ligação CD16: DART-F e DART-G, um diacorpo HIV x CD3 (como um controle positivo para ligação de células T através de seu Domínio de Ligação CD3), um diacorpo
HIV x RSV (como um controle negativo para todas as ligações), e uma molécula comparadora de diacorpo h3G8 x RSV. Após a incubação, as células foram marcadas com: anti-CD56- aloficocianina (CD56 APC, marcador de célula NK), anti-CD66b- fluoresceína isotiocianato (CD66b FITC, marcador de célula neutrófila) e anti-CD3-peridinina clorofila proteína-Cy5.5 (CD3 PerCP Cy5.5, marcador de células T), e anti-Fc humana- Ficoeritrina (αhFc PE) para detectar a ligação diacorpo e a superfície celular. As células marcadas foram analisadas por citometria de fluxo bloqueada em células NK. Os resultados de cocoloração da investigação para um primeiro sujeito são mostrados nas Figuras 9A-9C, e indicam que DART-F (hCD16-M1) teve uma afinidade mais alta para CD16A na superfície de células NK em relação a DART-G (hCD16-M2), ambas das quais tiveram uma afinidade mais alta do que a molécula comparadora de diacorpo h3G8 x RSV (Figura 9A). Ao contrário, enquanto que a molécula comparadora de diacorpo h3G8 x RSV foi capaz de se ligar a CD16B de neutrófilos, DART-G teve capacidade de ligação mais baixa, e DART-F não teve, essencialmente, capacidade de ligação (Figura 9B). Como mostrado na Figura 9C, as Moléculas de Ligação CD16 não foram capazes de se ligar às células T.
[00614] Ligação similar foi observada usando sangue total de um segundo sujeito doador. Ligação de Linfócito (CD16A F/V) e ligação de Neutrófilo (CD16B, alótipo não determinado) foram avaliadas, essencialmente, como descrito usando DART-F (hCD16-M1), DART-G (hCD16-M1) e o comparador diacorpo h3G8 x RSV. Os resultados da investigação são mostrados nas Figuras 10A-10B. Como mostrado na Figura 10A, DART-F (hCD16-M1) e DART-G (hCD16-M1) exibiram ligação às células que expressam CD16A da população de linfócitos bloqueada, com DART-F exibindo maior ligação; a molécula comparadora de diacorpo h3G8 x RSV exibiu ligação muito mais fraca. Como mostrado na Figura 10B, DART-F falharia em se ligar às células que expressam CD16B da população de granulócitos bloqueada, ao contrário de DART-G e da molécula comparadora de diacorpo h3G8 x RSV, que exibiram ligação. EXEMPLO 3 ESPECIFICIDADE DE ALÓTIPO CD16B DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO ANTI-CD16 CD16-M1 E CD16-M2
[00615] De modo a demonstrar a capacidade das Moléculas de Ligação CD16 x DA da invenção de distinguir alótipos de glicosilação NA1 e NA2 de CD16B, DART-F (hCD16- M1) e o comparador de diacorpo h3G8 x RSV foram incubados na presença de sangue total e analisados essencialmente como descrito acima. Os resultados mostram coloração de diacorpo de sangue total que foi bloqueada nas células CD66b+ (isto é, neutrófilos e eosinófilos). Figuras 11A-11B mostram os resultados de tal análise, e indicam que o comparador de diacorpo h3G8 x RSV exibiu ligação forte a NA1 e ligação média a NA2. Ao contrário, DART-F exibiu ligação forte a NA2 e ligação fraca a NA1. EXEMPLO 4 ESPECIFICIDADE DE ALÓTIPO CD16B DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO CD16 CD16-M1 E CD16-M2
[00616] De modo a avaliar ainda a capacidade das Moléculas de Ligação CD16 x DA da invenção de se ligar a leucócitos, a capacidade dos Domínios de Ligação CD16 de CD16-M1 de se ligar às células NK e granulócitos do sangue total foi avaliada. DART-C foi incubada na presença de células leucocitárias do sangue total e analisada, essencialmente, como descrito acima. Os resultados mostram coloração de diacorpo do sangue total que foi bloqueada em células NK (0,6% de leucocitárias) ou em granulócitos (49% de leucócitos). Figura 12 mostra os resultados de tal análise, e indica que CD16-M1, preferencialmente, se liga às células NK. EXEMPLO 5 LIGAÇÃO DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO CD16 À CD16 HUMANA, CD16 DE MACACO CINOMOLGO E CD16 DE MURINO
[00617] Visto que as sequências de aminoácidos de CD16 humana, CD16 de macaco cinomolgo e CD16 de murino compartilham graus variados de homologia (Figura 13; SEQ ID NOs:183, 184 e 185, respectivamente), a capacidade de Moléculas de Ligação CD16 x DA processar Domínios de Ligação CD16 de anticorpos CD16-M1, CD16-M2 e 3G8 se ligara a CD16 humana, CD16 de macaco cinomolgo e CD16 de murino foi investigada. A análise foi conduzida usando um formato BIACORE® no qual as moléculas diacorpos foram capturadas em uma superfície Her2-His-tag, e as moléculas CD16 (proteínas de fusão IgG2-Fc, 25 e 100 nM) foram passadas sobre os diacorpos capturados (normalizados; ajuste de ligação bivalente estimado). Os resultados da investigação são resumidos na Tabela 17. Tabela 17 CD16 de Molécula Domínio de CD16 158F CD16 de Macaco de Ligação Ligação humana Murino Cinomolgo CD16 CD16 KD (nM) KD (nM) KD (nM) Nenhuma DART-1 h3G8 13 29 Ligação DART-C hCD16-M1 12 571 Nenhuma
Ligação Nenhuma DART-D hCD16-M2 4 597 Ligação
[00618] Verificou-se que o domínio de ligação CD16 de h3G8 foi capaz de se ligar a CD16a de macaco cinomolgo com afinidade um pouco reduzida em relação a sua ligação a CD16 humana. Os domínios de ligação CD16 de DART-C (hCD16-M1) e DART-D (hCD16-M2) tiveram baixa afinidade para CD16 de macaco cinomolgo. Nenhuma das moléculas de ligação CD16 testadas foram capazes de ligação a CD16 de murino, proporcional com sua homologia mais baixa para CD16 humana. EXEMPLO 6
AVALIAÇÃO DE CITOTOXICIDADE MEDIADA POR MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 DE CÉLULAS POSITIVAS HER2/NEU
[00619] De modo a demonstrar a capacidade das Moléculas de Ligação CD16 x DA da invenção de mediar a morte celular, as Moléculas de Ligação CD16 x HER2/neu:
[00620] DART-C (tendo um Domínio de Ligação CD16 hCD16-M1);
[00621] DART-D (tendo um Domínio de Ligação de CD16 hCD16-M2);
[00622] DART-1 (tendo um Domínio de Ligação de CD16 h3G8);
[00623] ou um diacorpo HER2/Neux RSV (controle negativo) foram separadamente incubadas com células cancerosas alvo que expressam níveis diferentes de HER2/neu na presença de células efetoras (PBMC humana (E:T = 30:1) ou células NK humanas purificadas (E:T = 2:1)) por 24 horas. A porcentagem de citotoxicidade (isto é, morte celular redirecionada) foi determinada medindo-se a liberação de lactato desidrogenase (LDH) nos meios por células danificadas, essencialmente, como descrito abaixo. Os resultados desta investigação são mostrados nas Figuras 14A- 14E. Figura 14A mostra a citotoxicidade exibida contra células alvo N87 HER2/neu ((expressão de HER2/neu: +++) por células NK purificadas; o alótipo CD16A de tais células NK foi 158F/158F. Figura 14B mostra a citotoxicidade exibida contra células alvo MCF7 HER2/neu (expressão de HER2/neu: +/- ) por células NK purificadas; o alótipo CD16A de tais células NK foi 158F/158F. Figura 14C mostra a citotoxicidade exibida contra células alvo MDA-MB-231 HER2/neu (expressão de HER2/neu: +/-) por PBMCs; o alótipo CD16A das células NK de tal preparação de PBMC não foi avaliado. Figura 14D mostra a citotoxicidade exibida contra células alvo N87 HER2/neu (expressão de HER2/neu: +++) por PBMCs; o alótipo CD16A das células NK de tal preparação de PBMC foi 158F/158V. Figura 14E mostra a citotoxicidade exibiu contra células alvo Hs700T HER2/neu (expressão de HER2/neu: +/-) por PBMCs; o alótipo CD16A das células NK de tal preparação de PBMC foi 158F/158V. Os resultados mostram que as Moléculas de Ligação CD16 x DA compreendendo o Domínio de Ligação de CD16 hCD16-M1 exibiu maior citotoxicidade contra as células cancerosas que expressam HER2/neu do que as Moléculas de Ligação CD16 x DA compreendendo o Domínio de Ligação de CD16 hCD16-M2, e que as moléculas compreendendo tais Domínios de Ligação CD16 exibiram maior citotoxicidade do que as Moléculas de Ligação CD16 x DA compreendendo o Domínio de Ligação de CD16 h3G8. EXEMPLO 7
[00624] AVALIAÇÃO DE CITOTOXICIDADE MEDIADA POR MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 DE CÉLULAS INFECTADAS POR HIV
[00625] De modo a demonstrar ainda a capacidade das Moléculas de Ligação CD16 x DA da invenção mediar a morte celular, as Moléculas de Ligação CD16 x HIV env:
[00626] DART-F (tendo um Domínio de Ligação de CD16 hCD16-M1);
[00627] DART-G (tendo um Domínio de Ligação de CD16 hCD16-M2);
[00628] ou DART-2 (um diacorpo h3G8 x RSV usado como um controle negativo aqui)), foram separadamente incubadas com 293HEK D371 alvo, que expressa HIV Env, na presença de células efetoras (PBMC humana (E:T = 30:1) ou células NK humanas purificadas (E:T = 3:1) por 24 horas. A porcentagem de citotoxicidade (isto é, morte celular redirecionada) foi determinada medindo-se a liberação de lactato desidrogenase (LDH) nos meios por células danificadas usando um ensaio de morte celular redirecionada LDH, essencialmente, como descrito abaixo. Os resultados desta investigação são mostrados nas Figuras 15A-15C. Figura 15A mostra a citotoxicidade exibida contra as células alvo 293HEK D371 por PBMCs de um primeiro doador; o alótipo CD16A de células NK de tal preparação de PBMC foi 158F/158V. Figura 15B mostra a citotoxicidade exibida contra as células alvo 293HEK D371 por PBMCs de um segundo doador; o alótipo CD16A das células NK de tal preparação de PBMC foi 158F/158F. Figura 15C mostra a citotoxicidade exibida contra as células alvo 293HEK D371 MC por células NK purificadas; o alótipo CD16A das células NK foi 158F/158V. Os resultados novamente mostraram que as Moléculas de Ligação CD16 x DA compreendendo o Domínio de Ligação de CD16 hCD16-M1 exibiu maior citotoxicidade contra as células que expressam HIV env do que as Moléculas de Ligação CD16 x DA compreendendo o Domínio de Ligação de CD16 hCD16-M2.
[00629] Como indicado acima, DART-F e DART-G são diacorpos contendo Domínio Fc compostos de três cadeias polipeptídicas. De modo a demonstrar a capacidade de Moléculas de Ligação CD16 x DA da invenção que carecem de Domínios Fc para mediar morte celular, as Moléculas de Ligação CD16 x HIV env:
[00630] DART-X (tendo um Domínio de Ligação de CD16 hCD16-M1);
[00631] DART-Y (tendo um Domínio de Ligação de CD16 hCD16-M2);
[00632] DART-0 (tendo um Domínio de Ligação de CD16 h3G8);
[00633] ou DART-3 (um diacorpo CD16 x RSV tendo um Domínio de Ligação CD16 hCD16-M1 usado como um controle negativo aqui), foram separadamente incubadas com células HEK/D371 alvo, que expressam a proteína de HIV env, na presença de células efetoras (Jurkat/CD16A 158F (Figura 16A) ou células 158V/NFAT-Luc (Figura 16B)). A porcentagem de citotoxicidade (isto é, morte celular) foi determinada medindo-se a liberação de lactato desidrogenase (LDH) nos meios por células danificadas usando um ensaio de morte celular redirecionada LDH, essencialmente, como descrito abaixo. Os resultados desta investigação são mostrados nas Figuras 16A-16B.
[00634] Figuras 16A-16B mostram que DART-X (tendo um Domínio de Ligação de CD16 hCD16-M1) exibiu uma porcentagem mais alta de citotoxicidade do que DART-Y (tendo um Domínio de Ligação de CD16 hCD16-M2). Verificou-se que
DART-0 (tendo um Domínio de Ligação de CD16 h3G8) medeia um nível mais alto de citotoxicidade do que DART-Y, mas este efeito foi dependente nas células efetoras tendo um alótipo 158V (Figura 16A vs. Figura 16B). Ao contrário, a citotoxicidade mediada por DART-X ou DART-Y foi independente de alótipo CD16A (Figura 16A vs. Figura 16B). EXEMPLO 8 OTIMIZAÇÃO DE LIGAÇÃO A CD16 DE PRIMATA NÃO HUMANA
[00635] Como observado acima, verificou-se que hCD16-M1 possui baixa afinidade para CD16 de macaco cinomolgo (CD16 cino). A mutagênese aleatória foi usada para introduzir substituições dentro dos Domínios de CDRL3 (posições Kabat 90-95) e CDRH3 (posições Kabat 96-100) de hCD16-M1. Os mutantes foram triados para identificar clones tendo ligação aprimorada a CD16 de primata não humano (por exemplo, CD16 cino) e que afinidade de ligação retida se liga ambos os alelos de CD16 humana. Uma variante designada “hCD16-M1A” tendo um CDRH3 mutado, e uma variante designada “hCD16-M1B” tendo um CDRL3 mutado foram selecionados para outra análise. Além disso, uma terceira variante combinando as mutações CDRH3 e CDRL3 foi gerada e designada “hCD16-M1AB.” A sequência de aminoácidos das CDRs e Domínios VH e VL foi fornecida acima (ver, por exemplo, Tabela 8). Moléculas de Ligação CD16 x DA exemplificativa incorporando-se os domínios de ligação anti-CD16 otimizados: hCD16-M1A, hCD16-M1B ou hCD16-M1AB, e tendo um Domínio de Ligação anti-HER2/neu foram gerados e designados DART-I, DART-J, e DART-K, respectivamente (ver, Tabela 12 para sumário e acima para descrição detalhada e sequências de aminoácidos totais).
[00636] A capacidade das Moléculas de Ligação
CD16 x HER2/neu exemplificativas compreendendo hCD16-M1A, hCD16-M1B e hCD16-M1AB otimizados, para se ligar a CD16 expressado na superfície de células NK humanas (Figura 17A), de macaco cinomolgo (Figura 17B) e de macaco-reso (Figura 17C) foi examinada por citometria de fluxo. Brevemente, as PBMCs foram isoladas e incubadas na presença de diacorpos de ligação CD16: DART-C (tendo os domínios VH e VL hCD16-M1 parentais); DART-I; DART-J; DART-K (tendo os Domínios VH/VL hCD16-M1A, hCD16-M1B e hCD16-M1AB otimizados, respectivamente); um diacorpo HER2/neu x RSV (como um controle negativo para ligação CD16); DART-3 (um diacorpo controle CD16 x RSV tendo os domínios VH e VL hCD16-M1 parentais); ou a molécula comparadora DART-1 (diacorpo h3G8 x HER2/neu). Após a incubação, as células foram marcadas com: anti-CD56-aloficocianina (CD56 APC, marcador de célula NK), e anti-CD3-peridinina clorofila proteína-Cy5.5 (CD3 PerCP Cy5.5, marcador de células T), e Fc-Ficoeritrina anti-humana (αhFc PE) para detectar diacorpo de ligação e a superfície celular. As células marcadas foram analisadas por citometria de fluxo bloqueada em células NK.
[00637] Os resultados de cocoloração da investigação são mostrados nas Figuras 17A-17C e indicam que as Moléculas de Ligação CD16 x DA compreendendo as variantes otimizadas, particularmente, hCD16-M1AB (DART-K), exibiram afinidade melhorada para CD16 de primata não humano (Figuras 17B-17C), embora as moléculas compreendendo hCD16-M1B (DART- J) e hCD16-M1AB (DART-K) exibiram alguma redução na ligação à CD16 humana (Figura 17A) neste ensaio. Nenhuma Ligação foi observada pelo controle negativo.
[00638] A capacidade de Moléculas de Ligação CD16 x DA tendo domínios de ligação hCD16-M1A, hCD16-M1B, e hCD16- M1AB otimizados, para mediar morte celular redirecionada de células alvo JIMT-1-Luc com células efetoras PBMCs humanas (PBMCs humanas) ou PBMC de macaco cinomolgo (PBMCs cino) de vários doadores foi avaliada usando dois ensaios de morte celular redirecionada diferentes. Dados representativos destes estudos são apresentados nas Figuras 18A-18D e resumidos na Tabela 18. Em ambos os ensaios, DART-C (tendo os domínios VH e VL hCD16-M1 parentais), DART-I, DART-J ou DART- K (tendo os Domínios VH/VL hCD16-M1A, hCD16-M1B e hCD16-M1AB otimizados, respectivamente); um controle negativo (diacorpo HER2/neu x RSV ou a molécula comparadora de diacorpo CD16 x RSV, DART-3); ou DART-1 (diacorpo h3G8 x HER2/neu), foram incubados com huPMBCs (Figura 18A-18B) ou PBMCs cino (Figura 18C-18D) e JIMT-1-Luc células tumorais alvo a uma razão E:T de 30:1 e a porcentagem de citotoxicidade (isto é, morte celular) foi determinada. Em um ensaio, a morte celular foi determinada medindo-se a liberação de lactato desidrogenase (LDH) nos meios por células danificadas usando um ensaio de morte celular redirecionada LDH, essencialmente, como descrito abaixo (Figuras 18A e 18C)). Em um outro ensaio, a citotoxicidade foi determinada por ensaio de luminescência (LUM) medindo-se a atividade de luciferase celular das células alvo usando um ensaio de morte celular redirecionada LUM, essencialmente, como descrito abaixo (Figuras 18B e 18D). Os valores de EC50 (ng/ml) para o ensaio de LDH depois de 24 horas e 48 horas de incubação é apresentado na Tabela
18. Tabela 18 Ensaio de 24 horas/LDH Ensaio de 48 horas/LDH
EC50, ng/ml EC50, ng/ml PBMCs PBMCs PBMCs cino PBMCs cino humanas humanas DART-1 131 170 156,1 101 DART-C 1,42 51,47 0,822 70,6 DART-I 1,05 36,98 0,492 13,31 DART-J 4,4 39,91 1,06 10,88 DART-K 10,8 29,44 2,24 6,66
[00639] Esses dados mostram que, embora a Molécula de Ligação CD16 x DA compreendendo o domínio de ligação CD16 de hCD16-M1 (DART-C) se liga a CD16 cino com baixa afinidade evidente, é capaz de mediar morte celular redirecionada. Além disso, as Moléculas de Ligação CD16 x DA compreendendo os domínios de ligação CD16 hCD16-M1A (DART-I), hCD16-M1B (DART-J) ou hCD16-M1AB (DART-K) otimizados exibiram citotoxicidade melhorada com PBMCs cino exibindo apenas uma leve redução em citotoxicidade com PBMCs humanas em comparação com mesma molécula compreendendo hCD16-M1 (DART- C). EXEMPLO 9 MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO CD16 X CD19
[00640] Em outros estudos, as Moléculas de Ligação CD16 x DA exemplificativas tendo um Domínio de Ligação anti-CD19 e incorporando o domínio de ligação anti- CD16 de hCD16-M1, ou o domínio de ligação anti-CD16 otimizado de hCD16-M1B ou hCD16-M1AB, foram geradas e designadas DART- L, DART-M e DART-N, respectivamente (ver, Tabela 12 para sumário e acima para descrição detalhada e sequências de aminoácidos totais). Três moléculas adicionais foram geradas e designadas DART-5 (compreendendo hCD16-M1), DART-6 (compreendendo hCD16-M1A) e DART-7 (compreendendo hCD16-
M1AB), em que o Domínio de Ligação CD19 foi substituído com um domínio de ligação anti-RSV (ver, Tabela 12 para sumário e acima para descrição detalhada), tais Moléculas de Ligação CD16 x RSV exemplificativas são usadas abaixo como controles negativos para a ligação CD19.
[00641] A capacidade de: DART-L, DART-M e DART-N; as moléculas controle: DART-5, DART-6 e DART-7; ou o duvortuxizumabe diacorpo DART® CD3 x CD19 (também conhecido como MGD011; sequência de aminoácidos encontrada em WHO Drug Information, 2016, Proposed INN: List 116, 30(4):627-629) para mediar a morte celular redirecionada de células alvo Raji-Luc com células efetoras PBMCs humanas (PBMCs humanas) (E:T = 30:1) foi avaliada nos ensaios de morte celular LDH e LUM, essencialmente, como descrito abaixo. Dados representativos destes estudos são apresentados nas Figuras 19A-19D. Os resultados dos ensaios LDH mostram que incubações depois de 24 horas (Figura 19A) e 48 horas (Figura 19B), as Moléculas de Ligação CD16 x DA exibiram atividade de citotoxicidade similar como MGD011, com as Moléculas de Ligação CD16 x DA compreendendo os domínios de ligação CD16 hCD16-M1B (DART-M), ou hCD16-M1AB (DART-N) otimizados, exibiram citotoxicidade similar com PBMCs humanas em comparação com a mesma molécula compreendendo hCD16-M1 (DART- L). Resultados similares foram observados depois de 24 horas (Figura 19C) e 48 horas (Figura 19D) nos ensaios LUM. Citotoxicidade mínima foi observada para as moléculas controle faltando um domínio de ligação CD19 (DART-5, DART-6 e DART-7) nestes estudos.
[00642] As Moléculas de Ligação CD16 x DA DART-L, DART-M, DART-N exemplificativas (tendo um sítio de ligação para o antígeno de células B CD19) e os controles negativos: DART-5 e DART-6 (tendo um sítio de ligação para CD16 e um sítio de ligação para RSV) foram avaliados quanto a sua capacidade de mediar depleção autóloga de células B in vitro. Brevemente, PMBCs isoladas de ser humano ou macaco cinomolgo foram incubadas em meio suplementado na presença de concentrações crescentes de DART-L, DART-M, DART-N e de moléculas controle faltando um domínio de ligação CD19 DART-5 e DART-6. Os níveis de células B foram analisados por citometria de fluxo (usando CD3 para seleção negativa e CD20 como um marcador de células B; CD3/CD20+) a 72 horas e 96 horas após a incubação para PBMCs humanas (Figuras 20A-20B, respectivamente) e a 72 horas e 144 horas após a incubação para PBMCs cino (Figuras 20C-20D, respectivamente). Dados representativos destes estudos são apresentados nas Figuras 20A-20D, e mostram que todos as Moléculas de Ligação CD16 x DA foram capazes de depletar células B autólogas de PBMCs humanas (Figuras 20A-20B) e PBMCs cino (Figuras 20C-20D). Moléculas de Ligação CD16 x DA compreendendo os domínios de ligação CD16 hCD16-M1B (DART-M), ou hCD16-M1AB (DART-N) otimizados, mediaram uma grande redução em células B, com PBMCs humanas e PBMCs cino em comparação com a mesma molécula compreendendo hCD16-M1 (DART-L). Entretanto, concentrações mais altas foram necessárias para depletar células B de PBMCs cino. Essa tendência foi observada para múltiplos doadores de PBMC. A depleção mínima de células B foi observada para as moléculas controle faltando um domínio de ligação CD19 (DART- 5 e DART-6). EXEMPLO 10
ENSAIOS DE MORTE CELULAR REDIRECIONADA EXEMPLIFICATIVOS
[00643] Ensaio de morte celular redirecionada LDH: Esses ensaios podem ser realizados usando o Kit de Ensaio de Citotoxicidade Não Radioativa CytoTox 96® (Promega), ou similar, que mede quantitativamente a liberação de LDH, essencialmente, como descrito abaixo. As células alvo (por exemplo, células alvo tumorais) são recolocadas em suspensão a uma densidade de 4 x 105 células/ml (ou densidade apropriada para obter a razão E:T desejada) em meios de ensaio (por exemplo, RPMI 1640 sem vermelho de fenol, FBS a 10%, 1% de pen/strep) e, preferivelmente, uma viabilidade superior a 90% na iniciação de ensaio, e células efetoras purificadas isoladas (por exemplo, células PBMC ou NK purificadas de doador humano ou primata não humano (por exemplo, macaco cinomolgo)) colocadas em suspensão nos meios de ensaio na densidade apropriada (por exemplo, 4 x 105 células/ml) para obter uma razão de célula efetora para alvo (E:T) de 10:1, ou 30:1 (ou outra razão E:T desejada) são usadas. Uma alíquota de suspensão celular alvo (por exemplo, 50 μl, ~20.000 células), uma alíquota de suspensão celular efetora (por exemplo, 100 μl, ~200.000 células para razão E:T 10:1), e uma alíquota (por exemplo, 50 μl) de artigo de teste diluído em série (por exemplo, 5 vezes ou 10 vezes) são adicionadas para duplicar poços de uma placa microtituladora e incubadas (37 °C com CO2 a 5%) por 24 a 96 horas ou mais se desejado. No final da incubação, uma alíquota de solução de lise (por exemplo, 30 μl) é adicionada e as placas são incubadas por ~10 minutos para lisar completamente as células alvo. As placas são, então, centrifugadas para granular os detritos celulares (por exemplo, 212 x g por 5 minutos) e uma alíquota (por exemplo, 40 μl) de sobrenadante é transferida de cada poço da placa de ensaio a uma placa de ELISA fundo plano e uma alíquota (por exemplo, 40 μl) de solução de substrato de LDH é adicionada a cada poço. As placas são incubadas por 10 a 20 minutos na temperatura ambiente no escuro e uma alíquota (por exemplo, 40 μl) de solução de parada (Promega Cat # G183A) é adionada. A densidade óptica é medida a 490 nm dentro de 1 hora em um leitor de placa Multicamada Victor2 (Perkin Elmer # 1420-014), ou similar. Lise celular específica é calculada a partir dos dados de densidade óptica (OD) usando a seguinte fórmula:
[00644] em que “AICC” é citotoxicidade celular independente de anticorpo, “MR” é liberação máxima e “SR” é liberação espontânea. As curvas de dose-resposta são geradas usando software GraphPad Prisma 6 (ou similar) pela curva ajustando os valores de citotoxicidade à função de dose- resposta sigmoidal.
[00645] Ensaio de morte celular redirecionada de luminescência (LUM): Esses ensaios podem ser realizados usando o substrato de luciferase Steady-Glo (Promega) ou um sustrato similar, e medem quantitativamente a atividade de luciferase celular em células alvo vivas engendradas para expressar o gene repórter de luciferase (luc) (por exemplo, células JIMT-1-Luc, Raji-Luc), essencialmente, como descrito abaixo. A preparação e configuração para esses ensaios são, essencialmente, idênticas ao ensaio LDH descrito acima. Após a incubação, uma alíquota (por exemplo, 100 μl) de meio de cultura é removida de cada poço e uma alíquota (por exemplo,
100 μl) de substrato de luciferase Steady-Glo ((Promega), ou similar) é subsequentemente adicionada a cada poço, seguido por pipetagem várias vezes para completar a lise de células alvo. As placas são incubadas na temperatura ambiente no escuro por 10 minutos e, depois, a intensidade de luminescência é medida usando um leitor de placa Multicamada VictorX4 (Perkin Elmer # 1420-014, ou similar) com unidade de luz relativa de luminescência (RLU) conforme a leitura. RLU é indicativa de viabilidade relativa das células alvo. Curvas de dose-resposta são geradas usando software GraphPad Prisma 6 (ou similar) pela curva ajustando os valores de RLU à função de dose-resposta sigmoidal.
[00646] Todas as publicações e patentes mencionadas neste relatório descritivo são aqui incorporadas por referência na mesma extensão como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicada para ser incorporada por referência em sua totalidade. Embora a invenção tenha sido descrita em conexão com modalidades específicas da mesma, será entendido que é capaz de modificações adicionais e que este pedido se destina a cobrir quaisquer variações, usos ou adaptações da invenção, seguindo, em geral, os princípios da invenção e a inclusão de tais desvios da presente divulgação que se enquadram na prática conhecida ou costumeira dentro da técnica a que a invenção se refere e que pode ser aplicada às características essenciais aqui descritas anteriormente.

Claims (36)

REIVINDICAÇÕES
1. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X ANTÍGENO DE DOENÇA (CD16 X DA), caracterizada por compreender um Domínio de Ligação CD16 capaz de se ligar a um epítopo de CD16 e também um Domínio de Ligação a Antígeno de Doença capaz de se ligar a um epítopo de um Antígeno de Doença, em que o dito Domínio de Ligação CD16 compreende um ou mais dentre: (I) (A) um Domínio CDRH1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:66; (B) um Domínio CDRH2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:67; (C) um Domínio CDRH3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:68 ou SEQ ID NO:60; (D) um Domínio CDRL1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:69 ou SEQ ID NO:74; (E) um Domínio CDRL2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:70; e (F) um CDRL3 Domínio que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:71 ou SEQ ID NO:61; (II) (A) um Domínio CDRH1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:77; (B) um Domínio CDRH2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:78; (C) um Domínio CDRH3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:79; (D) um Domínio CDRL1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:80; (E) um Domínio CDRL2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:81; e (F) um Domínio CDRL3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:82; (III) um Domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, ou SEQ ID NO:58; (IV) um Domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:85, ou SEQ ID NO:59; (V) um Domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:72 e um Domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:73; (VI) um Domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:83 ou SEQ ID NO:84 e um Domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:85; (VII) um Domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:58 e um Domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:73; (VIII) um Domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:72 e um Domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:59; e (IX) um Domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:58 e um Domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:59.
2. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X ANTÍGENO DE DOENÇA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela dita Molécula ser um anticorpo biespecífico, um diacorpo biespecífico, um TandAb biespecífico, uma molécula trivalente biespecífica, ou um CAR biespecífico.
3. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X ANTÍGENO DE DOENÇA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizada pela dita Molécula ser capaz de se ligar a mais de um Antígeno de Doença e/ou mais de um epítopo de CD16.
4. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X ANTÍGENO DE DOENÇA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo dito Domínio de Ligação CD16 compreender: (A) um Domínio CDRH1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:66; (B) um Domínio CDRH2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:67; (C) um Domínio CDRH3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:68, ou SEQ ID NO:60; (D) um Domínio CDRL1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:69 ou SEQ ID NO:74; (E) um Domínio CDRL2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:70; e (F) um Domínio CDRL3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:71, ou SEQ ID NO:61.
5. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X ANTÍGENO DE DOENÇA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo dito Domínio de Ligação CD16 compreender: (A) um Domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:72, ou SEQ ID NO:58; (B) um Domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:73, ou SEQ ID NO:59; (C) um Domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:72 e um Domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:73; (D) um Domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:58 e um Domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:73; (E) um Domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:72 e um Domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:59; ou (F) um Domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:58 e um Domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:59.
6. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X ANTÍGENO DE DOENÇA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo dito Domínio de Ligação CD16 compreender: (A) um Domínio CDRH1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:77; (B) um Domínio CDRH2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:78; (C) um Domínio CDRH3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:79; (D) um Domínio CDRL1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:80; (E) um Domínio CDRL2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:81; e (F) um Domínio CDRL3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:82.
7. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X ANTÍGENO DE DOENÇA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo dito Domínio de Ligação CD16 compreender: (A) um Domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:83, ou SEQ ID NO:84; (B) um Domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de ou SEQ ID NO:85; ou (C) um Domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:83 ou SEQ ID NO:84 e um Domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:85.
8. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X ANTÍGENO DE DOENÇA,
de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo dito Antígeno de Doença ser um Antígeno de Câncer e a dita doença ser um câncer.
9. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X ANTÍGENO DE DOENÇA, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo dito câncer ser selecionado do grupo que consiste em câncer adrenal, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer colorretal, câncer gástrico, glioblastoma, câncer renal, câncer de pulmão de células não pequenas, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielóide aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielóide crônica, leucemia de células capilares, Linfoma de Burkett, linfoma difuso de grandes células B, linfoma folicular, linfoma de células do manto, linfoma de zona marginal, linfoma de não- Hodgkin, linfoma linfocítico pequeno, mieloma múltiplo, melanoma, câncer de ovário, câncer de pâncreas, câncer de próstata, câncer de pele, carcinoma de células renais, câncer de testículo, e câncer de útero.
10. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X ANTÍGENO DE DOENÇA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 e 9, caracterizada pelo dito Antígeno de Câncer ser selecionado do grupo que consiste nos Antígenos de Câncer: 19.9, 4.2, A33, ADAM-9, AH6, ALCAM, B1, B7-H3, BAGE, beta-catenina, grupo sanguíneo ALeb/Ley, Antígeno do linfoma de Burkitt-38.13, C14, CA125, Carboxipeptidase M, CD5, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD27, CD28, CD33, CD36, CD40/CD154, CD45, CD56, CD46, CD52, CD56, CD79a/CD79b, CD103, CD123, CD317, CDK4, CEA, CEACAM5/CEACAM6, CO17-1A, CO-43, CO-514, CTA-1, CTLA-4, Citoqueratina 8, D1.1, D156-22, DR5, série E1 , EGFR, um receptor de Ephrin, EphA2, Erb, GAGE, um gangliosídeo GD2/GD3/GM2, GICA 19-9, gp100, Gp37, gp75, gpA33, HER2/neu,
HMFG, papiloma vírus humano-E6/papiloma vírus humano-E7, HMW- MAA, Antígeno I, IL13Rα2, Integrina β6, JAM-3, KID3, KID31, KS 1/4 antígeno de pan-carcinoma, L6,L20, LEA, LUCA-2, M1:22:25:8, M18, M39, MAGE, MART, mesotelina, MUC-1, MUM-1, Myl, N-acetilglucosaminiltransferase, neoglicoproteína, NS- 10, OFA-1, OFA-2, Oncostatina M, p15, p97, PEM, PEMA, PIPA, PSA, PSMA, fosfato de ácido prostático , R24, ROR1, um esfingolipídio, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, sTn, o receptor de célula T derivado de peptídeo, T5A7, TAG-72, TL5, receptor TNF, receptor TNF-y, TRA-1-85, um receptor Transferrin, 5T4, TSTA, VEGF, um Receptor VEGF, VEP8, VEP9, VIM-D5, e Y hapten, Ley.
11. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X ANTÍGENO DE DOENÇA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo dito Antígeno de Doença ser 5T4, B7-H3, CEACAM5/CEACAM6, CD19, CD123, EGRF, EphA2, HER2/neu, IL13Rα2 ou VEGF.
12. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X ANTÍGENO DE DOENÇA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo dito Antígeno de Doença ser um Antígeno Associado a Patógenos.
13. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X ANTÍGENO DE DOENÇA de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo dito Antígeno Associado a Patógenos ser selecionado do grupo que consiste nos Antígenos Associados a Patógenos: Proteína celular infectada por Vírus Herpes Simplex (ICP)47, Vírus Herpes Simplex gD, Vírus Epstein-Barr LMP-1, Vírus Epstein- Barr LMP-2A, Vírus Epstein-Barr LMP-2B, Vírus de Imunodeficiência Humana gp160, Vírus de Imunodeficiência Humana gp120, Vírus de Imunodeficiência Humana gp41, etc.), Papilomavírus Humano E6, Papilomavírus Humano E7, vírus da leucemia de células T humanas gp64, vírus da leucemia de células T humanas gp46, e vírus da leucemia de células T humanas gp21.
14. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X ANTÍGENO DE DOENÇA, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizada pelo dito Antígeno de Doença ser um Antígeno env HIV.
15. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X ANTÍGENO DE DOENÇA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pela dita molécula ser: (A) um diacorpo, o dito diacorpo que é um complexo ligado covalentemente que compreende dois, ou três, quatro ou cinco cadeias polipeptídicas; ou (B) uma molécula de ligação trivalente, a dita molécula de ligação trivalente que é um complexo ligado covalentemente que compreende três, quatro ou cinco cadeias polipeptídicas, ou (C) um anticorpo biespecífico.
16. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X ANTÍGENO DE DOENÇA, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pela dita molécula compreender uma região Fc.
17. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X ANTÍGENO DE DOENÇA, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pela dita Região Fc ser um dos isótopos IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4.
18. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X ANTÍGENO DE DOENÇA, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizada pela dita Região Fc ser uma Região Fc variante que compreende: (A) uma ou mais modificações de aminoácidos que reduzem a afinidade da Região Fc variante para um FcγR; e/ou (B) uma ou mais modificações de aminoácidos que melhoram a meia-vida sérica da Região Fc variante.
19. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 X ANTÍGENO DE DOENÇA, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada: (A) pelas ditas modificações que reduzem a afinidade da Região Fc variante para um FcγR compreenderem a substituição de L234A; L235A; ou L234A e L235A; e (B) pelas ditas modificações que melhoram a meia vida sérica da Região Fc variante compreenderem a substituição de M252Y; M252Y e S254T; M252Y e T256E; M252Y, S254T e T256E; ou K288D e H435K, em que a dita numeração é a do índice da UE como em Kabat.
20. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16, caracterizada por compreender: (A) um CDRH1 Domínio que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:66; (B) um Domínio CDRH2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:67; (C) um Domínio CDRH3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:68, ou SEQ ID NO:60; (D) um Domínio CDRL1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:69 ou SEQ ID NO:74; (E) um Domínio CDRL2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:70; e (F) um Domínio CDRL3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:71, ou SEQ ID NO:61.
21. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pela dita molécula compreender: (A) um Domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:72, ou SEQ ID NO:58;
(B) um Domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:73, ou SEQ ID NO:59; (C) um Domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:72 e um Domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:73; (D) um Domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:58 e um Domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:73; (E) um Domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:72 e um Domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:59; ou (F) um Domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:58 e um Domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:59.
22. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16 caracterizada por compreender: (A) um Domínio CDRH1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:77; (B) um Domínio CDRH2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:78; (C) um Domínio CDRH3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:79; (D) um Domínio CDRL1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:80; (E) um Domínio CDRL2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:81; e (F) um Domínio CDRL3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:82.
23. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pela dita molécula compreender: (A) um Domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:83 ou SEQ ID NO:84; (B) um Domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de ou SEQ ID NO:85; ou (C) um Domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:83 ou SEQ ID NO:84 e um Domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:85.
24. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO CD16, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 23, caracterizada pela dita molécula ser selecionada do grupo que consiste em: um anticorpo, um anticorpo multiespecífico, um fragmento Fab', um fragmento F(ab')2, um fragmento (Fv), uma cadeia-única (scFv), um anticorpo de cadeia-única, um Fv biespecífico ligado a dissulfeto (sdFv), um diacorpo, uma molécula de ligação trivalente, e uma molécula de CAR-T.
25. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA caracterizada por compreender a Molécula de Ligação CD16 x Antígeno de Doença, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
26. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA caracterizada por compreender a Molécula de Ligação CD16, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 20 a 24 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
27. USO DA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 25, no tratamento de uma doença, caracterizada pela expressão do dito Antígeno de Doença.
28. MÉTODO PARA O TRATAMENTO DE UMA DOENÇA, caracterizado pela expressão do dito Antígeno de Doença e por compreender a administração a um sujeito em necessidade do mesmo de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica da reivindicação 25.
29. USO, de acordo com a reivindicação 27 ou MÉTODO, conforme definido na reivindicação 28, caracterizados pela Molécula de Ligação CD16 x Antígeno de Doença serem capazes de se ligar a mais de um Antígeno de Doença e/ou mais de um epítopo de CD16.
30. USO, de acordo com a reivindicação 27 ou MÉTODO, conforme definido na reivindicação 28, caracterizados pelo dito CD16 x Antígeno de Doença, e pelo dito Antígeno de Doença ser um Antígeno de Câncer, e pela dita doença ser câncer.
31. USO OU MÉTODO, de acordo com a reivindicação 30, caracterizados pelo dito câncer ser selecionado do grupo que consiste em câncer adrenal, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer colorretal, câncer gástrico, glioblastoma, câncer renal, câncer de pulmão de células não pequenas, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielóide aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielóide crônica, leucemia de células capilares, Linfoma de Burkett, linfoma difuso de grandes células B, linfoma folicular, linfoma de células do manto, linfoma de zona marginal, linfoma não-Hodgkin, linfoma linfocítico pequeno, mieloma múltiplo, melanoma, câncer de ovário, câncer de pâncreas, câncer de próstata, câncer de pele, carcinoma de células renais, câncer de testículo, e câncer de útero.
32. USO OU MÉTODO, de acordo com a reivindicação 30, caracterizados pelo dito Antígeno de Câncer ser selecionado do grupo que consiste nos Antígenos de Câncer: 19.9, 4.2, A33, ADAM-9, AH6, ALCAM, B1, B7-H3, BAGE, beta-catenina, grupo sanguíneo ALeb/Ley, Antígeno do linfoma de Burkitt-38.13, C14,
CA125, Carboxipeptidase M, CD5, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD27, CD28, CD33, CD36, CD40/CD154, CD45, CD56, CD46, CD52, CD56, CD79a/CD79b, CD103, CD123, CD317, CDK4, CEA, CEACAM5/CEACAM6, CO17-1A, CO-43, CO-514, CTA-1, CTLA-4, Citoqueratina 8, D1.1, D156-22, DR5, E1 série, EGFR, um receptor de Ephrin, EphA2, Erb, GAGE, a GD2/GD3/GM2 gangliosídeo, GICA 19-9, gp100, Gp37, gp75, gpA33, HER2/neu, HMFG, papiloma vírus humano-E6/papiloma vírus humano-E7, HMW- MAA, Antígeno I, IL13Rα2, Integrina β6, JAM-3, KID3, KID31, KS 1/4 antígeno de pan-carcinoma, L6,L20, LEA, LUCA-2, M1:22:25:8, M18, M39, MAGE, MART, mesotelina, MUC-1, MUM-1, Myl, N-acetilglucosaminiltransferase, neoglicoproteína, NS- 10, OFA-1, OFA-2, Oncostatina M, p15, p97, PEM, PEMA, PIPA, PSA, PSMA, fosfato de ácido prostático , R24, ROR1, um esfingolipídio, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, sTn, o receptor de célula T derivado de peptídeo, T5A7, TAG-72, TL5, Receptor TNF, Receptor TNF-y, TRA-1-85, um receptor Transferrin, 5T4, TSTA, VEGF, um Receptor VEGF, VEP8, VEP9, VIM-D5, e Y hapten, Ley.
33. USO OU MÉTODO, de acordo com a reivindicação 32, caracterizados pelo dito Antígeno de Doença ser 5T4, B7- H3, CEACAM5/CEACAM6, CD19, CD123, EGRF, EphA2, HER2/neu, IL13Rα2 ou VEGF.
34. USO, de acordo com a reivindicação 27 ou MÉTODO, conforme definido na reivindicação 28, caracterizados pela Molécula de Ligação CD16 x Antígeno de Doença, e pelo dito Antígeno de Doença ser um Antígeno Associado a Patógenos.
35. USO OU MÉTODO, de acordo com a reivindicação 34, caracterizados pelo dito Antígeno Associado a Patógenos ser selecionado do grupo que consiste nos Antígenos Associados a Patógenos: Proteína celular infectada por Vírus Herpes
Simplex (ICP)47, Vírus Herpes Simplex gD, Vírus Epstein-Barr LMP-1, Vírus Epstein-Barr LMP-2A, Vírus Epstein-Barr LMP-2B, Vírus de Imunodeficiência Humana gp160, Vírus de Imunodeficiência Humana gp120, Vírus de Imunodeficiência Humana gp41, etc.), Papilomavírus Humano E6, Papilomavírus Humano E7, vírus da leucemia de células T humanas gp64, vírus da leucemia de células T humanas gp46, e vírus da leucemia de células T humanas gp21.
36. USO OU MÉTODO, de acordo com a reivindicação 35, caracterizados pelo dito Antígeno de Doença ser um Antígeno env HIV.
BR112020011810-9A 2017-12-12 2018-12-06 molécula de ligação cd16 x antígeno de doença, composição farmacêutica, uso da composição farmacêutica, e método para o tratamento de uma doença BR112020011810A2 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762597800P 2017-12-12 2017-12-12
US62/597,800 2017-12-12
PCT/US2018/064204 WO2019118266A1 (en) 2017-12-12 2018-12-06 Bispecific cd 16-binding molecules and their use in the treatment of disease

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112020011810A2 true BR112020011810A2 (pt) 2020-11-17

Family

ID=66819475

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112020011810-9A BR112020011810A2 (pt) 2017-12-12 2018-12-06 molécula de ligação cd16 x antígeno de doença, composição farmacêutica, uso da composição farmacêutica, e método para o tratamento de uma doença

Country Status (15)

Country Link
US (1) US11795226B2 (pt)
EP (1) EP3724231A4 (pt)
JP (1) JP2021505637A (pt)
KR (1) KR20200098590A (pt)
CN (1) CN111465618A (pt)
AU (1) AU2018385409A1 (pt)
BR (1) BR112020011810A2 (pt)
CA (1) CA3085432A1 (pt)
IL (1) IL275322A (pt)
MX (1) MX2020006155A (pt)
RU (1) RU2020122822A (pt)
SG (1) SG11202005557TA (pt)
TW (1) TWI814758B (pt)
WO (1) WO2019118266A1 (pt)
ZA (1) ZA202003445B (pt)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3954703A3 (en) 2014-05-29 2022-05-18 MacroGenics, Inc. Tri-specific binding molecules and methods of use thereof
WO2016048938A1 (en) * 2014-09-26 2016-03-31 Macrogenics, Inc. Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding cd19 and cd3, and uses thereof
BR112020011810A2 (pt) 2017-12-12 2020-11-17 Macrogenics, Inc. molécula de ligação cd16 x antígeno de doença, composição farmacêutica, uso da composição farmacêutica, e método para o tratamento de uma doença
WO2024092073A1 (en) * 2022-10-26 2024-05-02 Abbratech Inc. Chimeric antibodies and methods of making and using same

Family Cites Families (160)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
AU6290090A (en) 1989-08-29 1991-04-08 University Of Southampton Bi-or trispecific (fab)3 or (fab)4 conjugates
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5972337A (en) 1990-11-01 1999-10-26 Cancer Research Fund Of Contra Costa 46 kilodalton human milk fat globule (HMFG) antigen, fragments and fusion protein
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
GB9112536D0 (en) 1991-06-11 1991-07-31 Celltech Ltd Chemical compounds
US6407213B1 (en) 1991-06-14 2002-06-18 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
GB9115364D0 (en) 1991-07-16 1991-08-28 Wellcome Found Antibody
US5843749A (en) 1991-07-26 1998-12-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ehk and Ror tyrosine kinases
AU669124B2 (en) 1991-09-18 1996-05-30 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Process for producing humanized chimera antibody
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
ATE297465T1 (de) 1991-11-25 2005-06-15 Enzon Inc Verfahren zur herstellung von multivalenten antigenbindenden proteinen
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US6180377B1 (en) 1993-06-16 2001-01-30 Celltech Therapeutics Limited Humanized antibodies
US6265150B1 (en) 1995-06-07 2001-07-24 Becton Dickinson & Company Phage antibodies
US5922845A (en) 1996-07-11 1999-07-13 Medarex, Inc. Therapeutic multispecific compounds comprised of anti-Fcα receptor antibodies
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
KR100508289B1 (ko) 1998-04-21 2005-08-17 마이크로메트 에이지 Ｃｄ１９×ｃｄ３ 특이 폴리펩티드 및 그의 용도
US7244826B1 (en) 1998-04-24 2007-07-17 The Regents Of The University Of California Internalizing ERB2 antibodies
DE19819846B4 (de) 1998-05-05 2016-11-24 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Multivalente Antikörper-Konstrukte
WO2001000245A2 (en) 1999-06-25 2001-01-04 Genentech, Inc. HUMANIZED ANTI-ErbB2 ANTIBODIES AND TREATMENT WITH ANTI-ErbB2 ANTIBODIES
AU4314801A (en) 2000-02-11 2001-08-20 Lexigen Pharm Corp Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
EP1272647B1 (en) 2000-04-11 2014-11-12 Genentech, Inc. Multivalent antibodies and uses therefor
AU2001270609A1 (en) 2000-06-30 2002-01-14 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Heterodimeric fusion proteins
US7737258B2 (en) 2000-10-18 2010-06-15 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Uses of monoclonal antibody 8H9
US8414892B2 (en) 2000-10-18 2013-04-09 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Uses of monoclonal antibody 8H9
US8501471B2 (en) 2000-10-18 2013-08-06 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Uses of monoclonal antibody 8H9
US7740845B2 (en) 2000-10-18 2010-06-22 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Uses of monoclonal antibody 8H9
US7666424B2 (en) 2001-10-17 2010-02-23 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Methods of preparing and using single chain anti-tumor antibodies
DE60143544D1 (de) 2000-12-12 2011-01-05 Medimmune Llc Moleküle mit längeren halbwertszeiten, zusammensetzungen und deren verwendung
AU2002309100A1 (en) * 2001-03-12 2002-11-18 Proteologics, Ltd. Compositions and methods for the modulation of viral maturation
US6833441B2 (en) 2001-08-01 2004-12-21 Abmaxis, Inc. Compositions and methods for generating chimeric heteromultimers
CA2458627C (en) 2001-08-31 2013-09-10 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Human cdr-grafted antibody and antibody fragment thereof
EP1293514B1 (en) 2001-09-14 2006-11-29 Affimed Therapeutics AG Multimeric single chain tandem Fv-antibodies
US20030138425A1 (en) 2001-09-21 2003-07-24 Mather Jennie Powell Antibodies that bind to cancer-associated antigen cytokeratin 8 and methods of use thereof
EP1441766B1 (en) 2001-10-16 2011-09-14 MacroGenics West, Inc. Antibodies that bind to cancer-associated antigen cd46 and methods of use thereof
ATE356149T1 (de) * 2001-11-14 2007-03-15 Affimed Therapeutics Ag Bispezifische antikörper gegen cd19 und cd16 und deren verwendung
JP2006506323A (ja) 2002-04-12 2006-02-23 レイヴェン バイオテクノロジーズ， インコーポレイテッド インテグリンα−ｖ−β−６に結合する抗体およびその使用方法
JP2005524399A (ja) 2002-05-03 2005-08-18 レイヴェン バイオテクノロジーズ， インコーポレイテッド Ａｌｃａｍおよびａｌｃａｍ調節因子
PT1565489E (pt) 2002-06-19 2011-02-23 Raven Biotechnologies Inc Anticorpos internalizantes específicos para o alvo de superfície celular raag10
US8044180B2 (en) 2002-08-14 2011-10-25 Macrogenics, Inc. FcγRIIB specific antibodies and methods of use thereof
US8968730B2 (en) 2002-08-14 2015-03-03 Macrogenics Inc. FcγRIIB specific antibodies and methods of use thereof
US8946387B2 (en) 2002-08-14 2015-02-03 Macrogenics, Inc. FcγRIIB specific antibodies and methods of use thereof
US8187593B2 (en) 2002-08-14 2012-05-29 Macrogenics, Inc. FcγRIIB specific antibodies and methods of use thereof
US8193318B2 (en) 2002-08-14 2012-06-05 Macrogenics, Inc. FcγRIIB specific antibodies and methods of use thereof
US8530627B2 (en) 2002-08-14 2013-09-10 Macrogenics, Inc. FcγRIIB specific antibodies and methods of use thereof
US7217797B2 (en) 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
US7405061B2 (en) 2002-11-13 2008-07-29 Raven Biotechnologies, Inc. Antigen PIPA and antibodies that bind thereto
GB0309126D0 (en) 2003-04-17 2003-05-28 Neutec Pharma Plc Clostridium difficile focussed antibodies
RU2005141512A (ru) 2003-05-31 2007-07-20 Микромет Аг (De) Фармацевтические композиции, включающие биспецифические анти-cd3, анти-cd19 конструкции антител для лечения расстройств, связанных с b-клетками
EP1664082B1 (en) 2003-09-18 2014-03-05 MacroGenics West, Inc. Kid3 and anti-kid3 antibodies
WO2005047327A2 (en) 2003-11-12 2005-05-26 Biogen Idec Ma Inc. NEONATAL Fc RECEPTOR (FcRn)-BINDING POLYPEPTIDE VARIANTS, DIMERIC Fc BINDING PROTEINS AND METHODS RELATED THERETO
AU2005206536B2 (en) 2004-01-16 2010-09-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fusion polypeptides capable of activating receptors
AU2005244058B2 (en) 2004-05-10 2011-07-28 Macrogenics, Inc. Humanized FcgammaRIIB specific antibodies and methods of use thereof
AU2005252699B2 (en) 2004-06-07 2010-12-23 Macrogenics West, Inc. Transferrin receptor antibodies
US20080038280A1 (en) 2004-10-14 2008-02-14 Government Of The United States Of America A32 Monoclonal Antibody Fusion Proteins For Use As Hiv Inhibitors And Vaccines
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US8802820B2 (en) 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
FR2879605B1 (fr) * 2004-12-16 2008-10-17 Centre Nat Rech Scient Cnrse Production de formats d'anticorps et applications immunologiques de ces formats
JP2008526256A (ja) 2005-01-12 2008-07-24 レイベン バイオテクノロジーズ，インコーポレイティド Ｋｉｄ３１およびｋｉｄ３１に結合する抗体
CA2596115A1 (en) 2005-01-31 2006-08-10 Raven Biotechnologies, Inc. Luca2 and antibodies that bind thereto
US20060171952A1 (en) 2005-02-02 2006-08-03 Mather Jennie P JAM-3 and antibodies that bind thereto
CA2596273C (en) 2005-02-02 2017-11-14 Raven Biotechnologies, Inc. Adam-9 modulators
JP5328156B2 (ja) 2005-02-03 2013-10-30 マクロジェニックス ウエスト， インコーポレイテッド オンコスタチンｍレセプターに対する抗体
CN104059150B (zh) 2005-02-04 2018-10-02 宏观基因有限公司 结合epha2的抗体及其使用方法
AU2006232920B2 (en) 2005-04-06 2011-09-29 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods for generating stably linked complexes composed of homodimers, homotetramers or dimers of dimers and uses
AU2006232310B9 (en) 2005-04-06 2011-07-21 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Improved stably tethered structures of defined compositions with multiple functions or binding specificities
EP1868650B1 (en) 2005-04-15 2018-10-03 MacroGenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US9963510B2 (en) 2005-04-15 2018-05-08 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US9284375B2 (en) 2005-04-15 2016-03-15 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
GB0510790D0 (en) * 2005-05-26 2005-06-29 Syngenta Crop Protection Ag Anti-CD16 binding molecules
EP1726650A1 (en) 2005-05-27 2006-11-29 Universitätsklinikum Freiburg Monoclonal antibodies and single chain antibody fragments against cell-surface prostate specific membrane antigen
FR2888850B1 (fr) * 2005-07-22 2013-01-11 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
WO2007024715A2 (en) 2005-08-19 2007-03-01 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobin and uses thereof
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
CA2607056C (en) 2005-10-19 2015-11-24 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for generating bioactive assemblies of increased complexity and uses
JP5090366B2 (ja) 2005-12-16 2012-12-05 アイビーシー ファーマスーティカルズ，インク． 多価イムノグロブリン系生物活性アセンブリー
PL1999154T3 (pl) 2006-03-24 2013-03-29 Merck Patent Gmbh Skonstruowane metodami inżynierii heterodimeryczne domeny białkowe
NZ573646A (en) 2006-06-12 2012-04-27 Wyeth Llc Single-chain multivalent binding proteins with effector function
EP2032159B1 (en) 2006-06-26 2015-01-07 MacroGenics, Inc. Combination of fcgammariib antibodies and cd20-specific antibodies and methods of use thereof
AT503902B1 (de) 2006-07-05 2008-06-15 F Star Biotech Forsch & Entw Verfahren zur manipulation von immunglobulinen
AT503889B1 (de) 2006-07-05 2011-12-15 Star Biotechnologische Forschungs Und Entwicklungsges M B H F Multivalente immunglobuline
ES2613957T3 (es) 2006-08-04 2017-05-29 Medimmune Limited Anticuerpos contra ERBB2
EP2059533B1 (en) 2006-08-30 2012-11-14 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
KR20100014527A (ko) 2007-03-22 2010-02-10 슬로안-케테링인스티튜트퍼캔서리서치 단일클론항체 8ｈ9의 용도
JP2010190572A (ja) 2007-06-01 2010-09-02 Sapporo Medical Univ ＩＬ１３Ｒａ２に対する抗体およびこれを含む診断・治療薬
EP2174957B1 (en) * 2007-06-15 2016-03-16 Xiamen University Monoclonal antibodies binding to avian influenza virus subtype h5 haemagglutinin and uses thereof
PL2158221T3 (pl) 2007-06-21 2019-02-28 Macrogenics, Inc. Kowalencyjne diaciała i ich zastosowania
EP2069401A4 (en) 2007-07-31 2011-02-23 Medimmune Llc MULTISPECIENT EPITOP BINDING PROTEINS AND THEIR USE
US8795667B2 (en) 2007-12-19 2014-08-05 Macrogenics, Inc. Compositions for the prevention and treatment of smallpox
PL2247304T3 (pl) 2008-04-02 2017-01-31 Macrogenics, Inc. Przeciwciała specyficzne wobec HER2/neu oraz sposoby ich zastosowania
MX2010010387A (es) 2008-04-02 2010-10-15 Macrogenics Inc Anticuerpos especificos para el complejo de bcr y metodos para el uso de los mismos.
EP2113255A1 (en) 2008-05-02 2009-11-04 f-star Biotechnologische Forschungs- und Entwicklungsges.m.b.H. Cytotoxic immunoglobulin
EP2282770B1 (en) 2008-06-04 2018-03-07 MacroGenics, Inc. Antibodies with altered binding to fcrn and methods of using same
JP2012501178A (ja) 2008-08-26 2012-01-19 マクロジェニクス，インコーポレーテッド Ｔ細胞受容体抗体およびその使用方法
WO2010028797A1 (en) 2008-09-10 2010-03-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Multivalent antibodies
WO2010028795A1 (en) 2008-09-10 2010-03-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Multivalent antibodies
WO2010028796A1 (en) 2008-09-10 2010-03-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Trispecific hexavalent antibodies
SG10201407908VA (en) 2008-12-19 2015-01-29 Macrogenics Inc Covalent diabodies and uses thereof
SG10201402742YA (en) 2009-03-20 2014-08-28 Genentech Inc Bispecific anti-her antibodies
BRPI1007602A2 (pt) 2009-05-27 2016-02-16 Hoffmann La Roche "anticorpo tri ou tetraespecífico, método para preparação de um anticorpo triespecífico ou tetraespecífico, célula hospedeira, composição, composição farmacêutica e método para o tratamento de um paciente com necessidade de terapia"
WO2011034660A1 (en) 2009-09-16 2011-03-24 Immunomedics, Inc. Class i anti-cea antibodies and uses thereof
GB201000467D0 (en) 2010-01-12 2010-02-24 Ucb Pharma Sa Antibodies
US20110206672A1 (en) 2010-02-25 2011-08-25 Melvyn Little Antigen-Binding Molecule And Uses Thereof
LT2361936T (lt) 2010-02-25 2016-09-12 Affimed Gmbh Antigeną rišanti molekulė ir jos panaudojimas
JP5998060B2 (ja) 2010-03-04 2016-09-28 マクロジェニクス，インコーポレーテッド Ｂ７−ｈ３と反応性のある抗体、その免疫学的に活性なフラグメントおよびその使用
US8802091B2 (en) 2010-03-04 2014-08-12 Macrogenics, Inc. Antibodies reactive with B7-H3 and uses thereof
EP2560683B2 (en) 2010-04-23 2022-07-20 F. Hoffmann-La Roche AG Production of heteromultimeric proteins
EP2569337A1 (en) 2010-05-14 2013-03-20 Rinat Neuroscience Corp. Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
WO2011147986A1 (en) 2010-05-27 2011-12-01 Genmab A/S Monoclonal antibodies against her2
WO2012009544A2 (en) 2010-07-14 2012-01-19 Amgen Inc. Domain insertion immunoglobulin
CN103154025B (zh) * 2010-08-02 2015-07-01 宏观基因有限公司 共价双抗体及其用途
ES2920140T3 (es) 2010-08-31 2022-08-01 Theraclone Sciences Inc Anticuerpos neutralizantes del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)
RS59589B1 (sr) 2010-11-05 2019-12-31 Zymeworks Inc Dizajniranje stabilnog heterodimernog antitela sa mutacijama u fc domenu
CA2832389A1 (en) 2011-04-20 2012-10-26 Genmab A/S Bispecific antibodies against her2 and cd3
PT2703486T (pt) 2011-04-25 2018-05-18 Daiichi Sankyo Co Ltd Anticorpo anti-b7-h3
EP2709655B1 (en) 2011-05-17 2018-11-14 Trion Research GmbH Vaccine preparation containing trifunctional antibodies with antigen immunogenicity enhancer properties
NZ703939A (en) 2011-05-21 2016-01-29 Macrogenics Inc Cd3-binding molecules capable of binding to human and non-human cd3
UA111612C2 (uk) 2011-05-21 2016-05-25 Макродженікс, Інк. Домени, які зв'язуються з деімунізованою сироваткою, і їхнє застосування для збільшення часу напівжиття в сироватці
WO2012162583A1 (en) 2011-05-26 2012-11-29 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Design and construction of novel multivalent antibodies
WO2013003652A1 (en) 2011-06-28 2013-01-03 Sea Lane Biotechnologies, Llc Multispecific stacked variable domain binding proteins
EP2729488A4 (en) 2011-07-06 2015-01-14 Medimmune Llc PROCESS FOR PREPARING MULTIMANT POLYPEPTIDES
WO2013006867A1 (en) 2011-07-07 2013-01-10 Massachussetts Institute Of Technology Methods and apparatus for ultrathin catalyst layer for photoelectrode
BR112014001573B8 (pt) 2011-07-22 2022-11-08 Affimed Therapeutics Ag Molécula fv ao antígeno multivalente
EP2758438A1 (en) 2011-09-23 2014-07-30 Amgen Research (Munich) GmbH Bispecific binding molecules for 5t4 and cd3
CA2854806A1 (en) 2011-11-07 2013-05-16 Medimmune, Llc Multispecific and multivalent binding proteins and uses thereof
EP2812432B1 (en) 2012-02-10 2020-10-14 Research Corporation Technologies, Inc. Fusion proteins comprising immunoglobulin constant domain-derived scaffolds
WO2013163427A1 (en) 2012-04-25 2013-10-31 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Antibodies to treat hiv-1 infection
JP2015520168A (ja) 2012-05-24 2015-07-16 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 多重特異性抗体
US9879068B2 (en) 2012-06-21 2018-01-30 California Institute Of Technology Antibodies targeting HIV escape mutants
WO2014022540A1 (en) 2012-08-02 2014-02-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
DK2908912T3 (da) 2012-10-18 2020-10-26 Univ Rockefeller Bredt neutraliserende anti-hiv-antistoffer
AU2013343111A1 (en) 2012-11-07 2015-05-14 Pfizer Inc. Anti-IL-13 receptor alpha 2 antibodies and antibody-drug conjugates
US9487587B2 (en) 2013-03-05 2016-11-08 Macrogenics, Inc. Bispecific molecules that are immunoreactive with immune effector cells of a companion animal that express an activating receptor and cells that express B7-H3 and uses thereof
DK2968520T3 (da) 2013-03-14 2021-08-09 Macrogenics Inc Bispecifikke molekyler som er immunoreaktive med immuneffektorceller der udtrykker en aktiverende receptor
UA116479C2 (uk) 2013-08-09 2018-03-26 Макродженікс, Інк. БІСПЕЦИФІЧНЕ МОНОВАЛЕНТНЕ Fc-ДІАТІЛО, ЯКЕ ОДНОЧАСНО ЗВ'ЯЗУЄ CD32B I CD79b, ТА ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ
EP2840091A1 (en) 2013-08-23 2015-02-25 MacroGenics, Inc. Bi-specific diabodies that are capable of binding gpA33 and CD3 and uses thereof
EP2839842A1 (en) 2013-08-23 2015-02-25 MacroGenics, Inc. Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding CD123 and CD3 and uses thereof
WO2015048610A1 (en) 2013-09-27 2015-04-02 Duke University Hiv-1 immunogens and broadly neutralizing hiv-1 antibodies
WO2015095412A1 (en) 2013-12-19 2015-06-25 Zhong Wang Bispecific antibody with two single-domain antigen-binding fragments
EP3954703A3 (en) * 2014-05-29 2022-05-18 MacroGenics, Inc. Tri-specific binding molecules and methods of use thereof
TWI693232B (zh) * 2014-06-26 2020-05-11 美商宏觀基因股份有限公司 與pd-1和lag-3具有免疫反應性的共價結合的雙抗體和其使用方法
KR102540192B1 (ko) 2014-09-05 2023-06-02 얀센 파마슈티카 엔.브이. Cd123 결합제 및 그의 용도
EP3201227A4 (en) * 2014-09-29 2018-04-18 Duke University Bispecific molecules comprising an hiv-1 envelope targeting arm
WO2016109668A1 (en) 2014-12-31 2016-07-07 Anthrogenesis Corporation Methods of treating hematological disorders, solid tumors, or infectious diseases using natural killer cells
WO2016149695A1 (en) 2015-03-19 2016-09-22 Duke University HIV-1 NEUTRALIZING ANTIBODIES AND USES THEREOF (CD4bs ANTIBODIES)
US11071783B2 (en) 2015-03-19 2021-07-27 Duke University HIV-1 neutralizing antibodies and uses thereof
WO2016149698A2 (en) 2015-03-19 2016-09-22 Duke University Hiv-1 neutralizing antibodies and uses thereof (v3 antibodies)
CA3115002C (en) 2015-03-23 2022-02-15 Hubbell Incorporated Connectors for flexible busbar and methods of connecting
WO2016196975A1 (en) 2015-06-03 2016-12-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health & Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
WO2017011413A1 (en) 2015-07-10 2017-01-19 Duke University Bispecific molecules comprising an hiv-1 envelope targeting arm
WO2017011414A1 (en) 2015-07-10 2017-01-19 Duke University Bispecific molecules comprising an hiv-1 envelope targeting arm
EP3359168A4 (en) * 2015-10-06 2019-08-07 Regents of the University of Minnesota THERAPEUTIC COMPOUNDS AND METHODS
CN109153728A (zh) * 2016-03-21 2019-01-04 埃尔斯塔治疗公司 多特异性和多功能分子及其用途
MA44776A (fr) * 2016-04-15 2019-03-06 Immunext Inc Anticorps anti-vista humain et leur utilisation
BR112020011810A2 (pt) 2017-12-12 2020-11-17 Macrogenics, Inc. molécula de ligação cd16 x antígeno de doença, composição farmacêutica, uso da composição farmacêutica, e método para o tratamento de uma doença
JP2021524451A (ja) * 2018-05-18 2021-09-13 マクロジェニクス，インコーポレーテッド 最適化済みｇｐ４１結合分子及びその使用

Also Published As

Publication number Publication date
CA3085432A1 (en) 2019-06-20
SG11202005557TA (en) 2020-07-29
RU2020122822A (ru) 2022-01-13
TW201938192A (zh) 2019-10-01
RU2020122822A3 (pt) 2022-04-26
JP2021505637A (ja) 2021-02-18
CN111465618A (zh) 2020-07-28
US11795226B2 (en) 2023-10-24
MX2020006155A (es) 2020-08-13
AU2018385409A1 (en) 2020-07-02
TWI814758B (zh) 2023-09-11
ZA202003445B (en) 2021-10-27
WO2019118266A1 (en) 2019-06-20
EP3724231A4 (en) 2021-08-11
KR20200098590A (ko) 2020-08-20
US20210171630A1 (en) 2021-06-10
IL275322A (en) 2020-07-30
EP3724231A1 (en) 2020-10-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11942149B2 (en) Bispecific binding molecules that are capable of binding CD137 and tumor antigens, and uses thereof
AU2019204236B2 (en) Tri-specific binding molecules and methods of use thereof
AU2017278325A1 (en) Combination therapy
US11685781B2 (en) Variant CD3-binding domains and their use in combination therapies for the treatment of disease
JP2019506444A (ja) Ｐｄ‐１及びｃｔｌａ‐４との免疫応答性を有する二重特異性並びにその使用方法
US11795226B2 (en) Bispecific CD16-binding molecules and their use in the treatment of disease
CA3165839A1 (en) Therapy for the treatment of cancer
TW202035453A (zh) Pd-l1-結合分子及其用於治療疾病的用途
US20230094162A1 (en) Cd137 binding molecules and uses thereof
EA046873B1 (ru) Cd137-связывающие молекулы и варианты их применения

Legal Events

Date Code Title Description
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]
B08F Application dismissed because of non-payment of annual fees [chapter 8.6 patent gazette]

Free format text: REFERENTE A 6A ANUIDADE.