UA111612C2 - Домени, які зв'язуються з деімунізованою сироваткою, і їхнє застосування для збільшення часу напівжиття в сироватці - Google Patents

Домени, які зв'язуються з деімунізованою сироваткою, і їхнє застосування для збільшення часу напівжиття в сироватці Download PDF

Info

Publication number
UA111612C2
UA111612C2 UAA201314984A UAA201314984A UA111612C2 UA 111612 C2 UA111612 C2 UA 111612C2 UA A201314984 A UAA201314984 A UA A201314984A UA A201314984 A UAA201314984 A UA A201314984A UA 111612 C2 UA111612 C2 UA 111612C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
binding
abo
domain
antigen
specified
Prior art date
Application number
UAA201314984A
Other languages
English (en)
Inventor
Ецио Бонвіні
Бхасваті Барат
Лін Хуан
Леслі С. Джонсон
Original Assignee
Макродженікс, Інк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=47217981&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=UA111612(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Макродженікс, Інк. filed Critical Макродженікс, Інк.
Publication of UA111612C2 publication Critical patent/UA111612C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/624—Disulfide-stabilized antibody (dsFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/626—Diabody or triabody
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/73—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing coiled-coiled motif (leucine zippers)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Винахід належить до поліпептиду, що містить частину білка, який зв’язується з деімунізованою сироваткою, здатну зв’язуватися з вказаним сироватковим білком, де вказана частина білка, що зв’язується з деімунізованою сироваткою, являє собою варіант деімунізованого альбумін-зв’язувального домену (АВD) дикого типу стрептококового G-білка, способів одержання такого поліпептиду і його застосування.

Description

Перехресне посилання на споріднені заявки
У даній заявці заявляється перевага заявки на патент США реєстр. Мо 61/488725 (поданої 21 травня 2011 р.; на розгляді), яка у всій своїй повноті вводиться в даний опис за допомогою посилання.
Посилання на список послідовностей:
Дана заявка включає один або декілька Списків послідовностей відповідно до статті 37
Зводу федеральних правил (С.Р.К.) 1.821 і далі, які представлені у вигляді текстового документа і комп'ютерного файлу, і які у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання.
Передумови створення винаходу: 1. Галузь, до якої належить винахід
Даний винахід стосується поліпептиду (наприклад, антигензв'язувальної молекули), що включає поліпептидну частину білка, який зв'язується з деімунізованою сироваткою, яка здатна зв'язуватися з вказаним сироватковим білком. Присутність білка, що зв'язується із сироваткою, сприяє збільшенню часу напівжиття поліпептиду в сироватці в порівнянні з часом напівжиття цього поліпептиду, у якому відсутня поліпептидна частина білка, що зв'язується з деімунізованою сироваткою. Даний винахід також стосується способів одержання таких молекул і їх застосування.
Даний винахід, зокрема, стосується молекул діатіл, які іноді називаються "перенацілювальні реагенти з подвійною афінністю" ("БАКТ"), і їхнього застосування для лікування ряду захворювань і розладів, включаючи імунологічні розлади і рак. Молекули діатіл відповідно до винаходу включають щонайменше два поліпептидні ланцюги, зв'язані так, що вони утворюють щонайменше два епітоп-зв'язувальні сайти, що можуть розпізнавати ті самі або різні епітопи.
Крім того, ці епітопи можуть походити від тих самих або від різних молекул, або вони можуть знаходитися на тих самих або на різних клітинах. Окремі поліпептидні ланцюги молекул діатіл можуть бути ковалентно зв'язані непептидними ковалентними зв'язками, такими як, але не обмежуються ними, дисульфідні зв'язки з цистеїнових залишків, розташованих на кожному поліпептидному ланцюзі. У конкретних варіантах винаходу молекули діатіл відповідно до винаходу також містять Есо-ділянку, яка має антитіло-подібні функціональні властивості, що
Зо підходять для конструювання такої молекули. 2. Опис попереднього рівня техніки
Конструювання ковалентно зв'язаних діатіл здійснюють на основі одноланцюжкової Ем- конструкції (5сЕм) (Ноїїїдег еї аї. (1993) "Оіародіев": Зтаї! Вімаіепі Апа Візресіїйс Апібоду
Егадтепів", Ргос. Маї!. Асад. сі. ОБА 90:6444-6448: ця публікація у всій своїй повноті вводиться в даний опис за допомогою посилання). У інтактному немодифікованому ІдСї домени МІ. ії МН розташовані на окремих поліпептидних ланцюгах, тобто на легкому ланцюзі і важкому ланцюзі, відповідно. Взаємодія легкого і важкого ланцюгів антитіла, зокрема, взаємодія доменів МІ. і МН, приводить до утворення одного з епітоп-зв'язувальних сайтів антитіла. На противагу цьому, 5сЕм-конструкція включає МІ- ії МН-домени антитіла, що містяться в одному поліпептидному ланцюзі, де вказані домени розділені гнучким лінкером, який має довжину, достатню для самозбирання двох доменів в один функціональний епітоп-зв'язувальний сайт. У випадку, коли самозбирання неможливе через недостатню довжину лінкера (приблизно менше ніж 12 амінокислотних залишків), то дві 5сЕм-конструкції піддавали взаємодії одна з одною з утворенням двовалентних молекул, тобто МІ. одиного ланцюга, зв'язаного з МН іншого ланцюга (див. огляд Магміп еї аї. (2005) "Кесотбріпапі Арргоаспез То Ідо-ІіКе Візресіїс Апіродієв" Асіа
Ріаптасої. біп. 26:649-658). Крім того, ймовірно, що додавання цистеїнового залишку до С-кінця конструкції приводить до утворення дисульфідного зв'язку в поліпептидних ланцюгах, що стабілізує отриманий димер і не чинить негативного впливу на зв'язувальні властивості двовалентної молекули (див., наприклад, Оіаїзеп еї аї. (2004) "Сомаіепі Оізийіде-І іїпКкей Апіі-СЕА Оіароду Аїоме Зпе-5ресіїїс Сопійдайоп Апа Радіоіабеїїпо Рог Титог Тагдеїйпд Арріїсайоп5", Ргої.
Епаг. Оев. 5еї. 17:21-27). Крім того, при відборі МІ - і МН-доменів з різною специфічністю може бути сконструйована не тільки двовалентна, але також і біспецифічна молекула.
Двовалентні діатіла знаходять широке застосування, включаючи застосування в терапії й у імунодіагностиці. Двовалентність додає конструкції більшої гнучкості і дозволяє сконструювати діатіло, яке може мати різні застосування, де потрібна підвищена авідність відносно мультимерних антигенів, перехресне зв'язування з різними антигенами і пряма доставка в клітини конкретних типів, залежно від обох присутніх антигенів-мішеней. Фахівцям також відомо, що молекули діатіл, завдяки їхній підвищеній валентності, низькій швидкості дисоціації і швидкому кліренсу з кровотоку (у випадку діатіл невеликого розміру, а саме, «50 кДа або бо менше), можуть бути, зокрема, використані для візуалізації ракової пухлини (Ейгдегаїа еї аї.
(1997) ""тргомед Титоиг Тагаєїїпа Ву Різиїрпіде іабіїгей Оіабодієз Ехргеззеад Іп Рісніа равіогів"
Ргоївіп Епо. 10:1221). Особливо важливою властивістю є перехресне зв'язування різних клітин, наприклад, перехресне зв'язування цитотоксичних Т-клітин з пухлинними клітинами (еаег еї аї. (1985) "Нургтіа Апіїродієз Сап Тагоєї 5пез Рог Айаск Ву Т СеїІв", Майте 314:628-631, і Ноїїїдег еї аї. (1996) "Зресіїйс Кійпа ОЇ Гутрпота СеїІє Ву Суююхіс Т-Сеїє Медіаїєй Ву А Вігресіїіс
Біароду", Ргоїєїп Епд. 9:299-305). Епітоп-зв'язувальні домени діатіл можуть бути також спрямовані проти поверхневої детермінанти будь-яких імунних ефекторних клітин, таких як
СОо3, 2016, 6032 або СОб4, які експресуються на Т-лімфоцитах, природних клітинах-кілерах (МК) або інших мононуклеарних клітинах. У багатьох дослідженнях було також виявлено, що зв'язування діатіла з детермінантами ефекторних клітин, наприклад, з Есу-рецепторами (ЕсуВ), приводить до активації ефекторних клітин (Ноїїїдег еї аїІ. (1996) "Зресійс Кійпод ОЇ Гутрпота
Сеїї Ву Суюїохіс Т-СеїІ5 Медіаїєд Ву А Візресіїїс Оіабсду", Ргоївіп Епд. 9:299-305; НоїїЇїдег єї аї. (1999) "Сагсіпоетргуопіс Апіїдеп (СЕА) -Зресіїіс Т-сеї! Асіїмайоп Іп Соїоп Сагсіпота Іпдисед Ву
Апіі-СОЗхАпіі-СЕА Візресійс Оіародіез Апа В7хАпії-СЕА Вігзресіїїс Ривіоп Ргоївіпв", Сапсег Вев. 59:2909-2916). Звичайно, активація ефекторних клітин запускається зв'язуванням антиген- зв'язаного антитіла з ефекторними клітинами за допомогою взаємодії Ес-Есук; і відповідно до цього молекули діатіл відповідно до винаходу можуть мати Ід-подібні функціональні властивості незалежно від того, чи містять вони Ес-домен чи ні (наприклад, як було визначено в аналізі на будь-яку ефекторну функцію, відомому фахівцям або описаному в даній заявці (наприклад, в аналізі на АОСС)). При перехресному зв'язуванні пухлинних і ефекторних клітин діатіло не тільки переносить ефекторні клітини на ділянку, розташовану поблизу від пухлинних клітин, але також ефективно здійснює знищення пухлини (див., наприклад, публікацію Сао еї аї. (2003) "Вівресіїїс Апіїбоду Сопіцдаїез Іп Тпегарешціїсв", Адм. Огид. Оєїїм. Веум. 55:171-197, що у всій своїй повноті вводиться в даний опис за допомогою посилання). 2.1 Рецептори ефекторних клітин і їхня роль в імунній системі
При нормальному функціонуванні імунної системи взаємодія комплексів "антитіло-антиген" із клітинами імунної системи приводить до продукування відповідей широкого ряду, а саме, від ефекторних функцій, таких як антитіло-залежна цитотоксичність, дегрануляція тучних клітин і фагоцитоз, до виробляння імуномодулюючих сигналів, таких як сигнали регуляції проліферації
Зо лімфоцитів і секреції антитіл. Усі ці взаємодії ініціюються за допомогою зв'язування Ес-домену або антитіл імунних комплексів з поверхневими рецепторами спеціалізованих клітин, розташованими на гемопоетичних клітинах. Розмаїтість клітинних відповідей, що запускаються антитілами й імунними комплексами, обумовлено структурною гетерогенністю Ес-рецепторів.
Ес-рецептори мають структурну подібність з антигензв'язувальними доменами, які переважно опосередковують передачу внутрішньоклітинного сигналу.
Есу-рецептори, тобто члени суперсімейства білків, які кодуються генами імуноглобулінів, являють собою поверхневі глікопротеїни, які можуть зв'язуватися з Есу-частиною молекул імуноглобуліну. Кожен член цього сімейства розпізнає імуноглобуліни одного або більше ізотипів за допомогою домену розпізнавання, який присутній на альфа-ланцюзі Есу-рецептора.
Есу-рецептори визначаються по їхній специфічності до підтипів імуноглобулінів. Есу-рецептори для ІС позначаються ЕсукК, для ІДЕ-ЕсеєЕ. і для ІдА-Есавм. Різні допоміжні клітини несуть Есу- рецептори для антитіл різних ізотипів, і по ізотипу антитіла визначають, які саме допоміжні клітини беруть участь у вироблянні даної відповіді (див. огляд Камеїсп ..М. еї аїЇ. (1991) "Ес
Весеріогв" Аппи. Вем. Іттипої. 9:457-92; Сепег 9.5. еї аї. (2001) "Зітшиаюгу Апа Іппірйогу зЗідпа!5 Огідіпайпуд Егот ТНе Масторнаде Есдатта Ресеріогв", Містобез апа Іптесіоп, 3:131-139;
ВіПадеацй 0.0. еї аї. (2002), ""ТАМ5 Мегзив ІТІМ5: Знікіпд А Ваіапсе Оигіпуд Сеї! Ведшаїйоп", Те
Уоштаї ої Сіїпіса! Іпмевіїдайоп, 2(109):161-1681; Намеїсн .М. еї аї. (2000) "Іттипе Іппірйогу
Весеріогв" Зсівепсе, 290:84-89; Намеїсні .).М. еї а!., (2001) "да Ес Весеріоге" Аппи. Неу. Іттипої. 19:275-90; Вамеїсн У.М. (1994) "Бс Весеріоїє: Нибог ВНейдих" СеїІ, 78(4):553-60). Різні Есу- рецептори, клітини, які експресують ці рецептори, і специфічність до їх ізотипів систематизовані в таблиці 1 (взятій з деякими змінами з публікації Іттипобіоіоду: Те Іттипе Зузіет іп Неайй апа Оівеазе, 4" ей. 1999, ЕІземієї Зсіеєпсе Па/Сапапа Рибіїзпіпу, Мем/ Могк).
Есу-рецептори
Кожен член цього сімейства являє собою інтегральний мембранний глікопротеїн, що має позаклітинні домени, споріднені С2-серії імуноглобулін-подібних доменів, один трансмембранний домен і один ввнутрішньоцитоплазматичний домен з довжиною, що варіюється. Фахівцям відомі три сук, які позначаються ЕсукІ(СОб4), Есук!І(сСО32) і
ЕсУКкЦЦ(СО16). Ці три рецептори кодуються окремими генами; однак високий ступінь гомології між цими трьома членами такого сімейства дозволяє припустити, що вони, ймовірно, утворені бо від спільного попередника в результаті дуплікації генів.
ЕсувІ(СО32)
Білки ЕсукіІ являють собою інтегральні мембранні глікопротеїни розміром 40 кДа, що зв'язуються тільки з Ід-комплексом, що зумовлено їх низькою афінністю відносно мономерного
Ід (106 М"). Цей рецептор являє собою ЕсукК, який експресується у широкого кола хазяїнів і присутній на всіх гемопоетичних клітинах, включаючи моноцити, макрофаги, В-клітини, МК- клітини, нейтрофіли, гладкі клітини і тромбоцити. ЕсуКіІ має тільки дві імуноглобулін-подібні ділянки у своєму імуноглобулін-зв'язувальному ланцюгу, а тому він має набагато меншу афінність відносно Ідс, ніж рецептор ЕсукІ. Існують три людські гени ЕсуВІЇ (ЕсуВІІ-А, ЕсуВІІ-В,
ЕсуВІ!І-С), кожний з який зчеплений з ІдС у агрегатах або в імунних комплексах.
Характерні розходження між цитоплазматичними доменами ЕсуВІіІ-А і ЕсуВІІ-В продукують дві функціонально гетерогенні відповіді на зв'язування з рецептором. Фундаментальна відмінність полягає в тому, що ізоформа А ініціює внутрішньоклітинну передачу сигналу, що приводить до активації клітин, такої як фагоцитоз і "спалах" дихальної активності клітин, а ізоформа В ініціює передачу інгібуючих сигналів, наприклад, інгібування активації В-клітин.
ЕсуВН (С016)
Через гетерогенність усередині цього класу, розмір ЕСуКІЇ у мишей і людини становить від 40 до 80 кДа. Два людські гени кодують два транскрипти, ЕсукПА, інтегральний мембранний глікопротеїн, і ЕСуКІВ, тобто варіант, зв'язаний із глікозилфосфатидил-інозитом (СРІ). Один мишачий ген кодує ЕСуУКІІЇ, гомологічний трансмембранному людському ЕсукПША. Есукії має спільні структурні властивості з двома іншими Есук. Подібно до ЕсукІЇї, ЕсукПІ зв'язується з ІДС з низькою афінністю і містить два відповідні позаклітинні Ід-подібні домени. ЕсувША експресується в макрофагах і в тучних клітинах, і тільки один ЕсукК експресується в МК-клітинах.
В даний час відомо, що СРІ-зв'язаний ЕсуКІІІВ експресується тільки в людських нейтрофілах.
Передача сигналу за допомогою Есув
Сигнали активації і інгібування передаються за допомогою Есук після їхнього зв'язування. Ці діаметрально протилежні функції обумовлені структурними розходженнями у рецепторів різних ізоформ. Два окремі домени в доменах, що передають цитоплазматичний сигнал рецептора, називаються імунорецепторними мотивами активації на основі тирозину (ІТАМ) або імунорецепторними мотивами інгібування на основі тирозину (ІТІМ) залежно від різних
Зо відповідей. Рекрутинг різних цитоплазматичних ферментів у ці структури залежить від типу
ЕсуВ-опосередкованих клітинних відповідей. ІТАМ-вмісні ЕсуВ-комплекси включають ЕсуВІ,
ЕсукПА, ЕсукПА, а ІТІМ-вмісні комплекси включають тільки ЕсуВІІВ.
Людські нейтрофіли експресують ген ЕсуКкІА. Кластеризація ЕсукПА за допомогою перехресного зв'язування з імунними комплексами або зі специфічним антитілом приводить до утворення агрегатів ІТАМ разом з кіназами, асоційованими з рецептором, що тим самим полегшує фосфорилування ІТАМ. Фосфорилування ІТАМ служить для заякорювання сайту кінази УК, активація якої приводить до активації субстратів для наступного каскаду реакцій (наприклад, РІзК). Активація клітин приводить до вивільнення медіаторів прозапальної відповіді.
Ген ЕСУуКІІВ експресується на В-лімфоцитах; і його позаклітинний домен на 96 95 ідентичний
ЕсуКІА і зв'язується з І90-комплексами незалежно від умов зв'язування. Присутність ІТІМ у цитоплазматичному домені ЕсуКІІВ дозволяє визначити, до якого інгібуючого підкласу належить
Есук. Нещодавно був установлений механізм такого інгібування на молекулярному рівні. При зв'язуванні з активуючим Есук ІТІМ в ЕсукКІІВ стає фосфорилованим і контактує з БН2-доменом інозитполіфосфат-5'і-фосфатази (ЗНІР), яка гідролізує фосфоінозитні месенджери, які вивільняються в результаті активації тирозинкінази, опосередковуваної ІТАМ-вмісним Есук, що, у свою чергу, запобігає припливу внутрішньоклітинного Са. Таким чином, перехресне зв'язування ЕСукКІІВ послаблює активуючу відповідь на зв'язування з ЕсукК і інгібує клітинну чутливість. У результаті цього припиняється активація В-клітин, проліферація В-клітин і секреція антитіл.
Таблиця 1
Рецептори для Ес-ділянок ізотипів імуноглобуліну
ЕсуВІ(СО64) ІДС Макрофаги Підвищення стимуляції 106 М" Нейтрофіли Активація "респіраторного спалаху"
Еозинофіли клітин
Дендритні клітини Індукування цитоліз
ЕсуВІІ-А (С032) ІДС Макрофаги Підвищення рівня вивільнення 2х106 М" Нейтрофіли гранул
Еозинофіли
Дендритні клітини
Тромбоцити
Клітини Лангерганса
ЕсуВІІ-82 (2032). | да Макрофаги Підвищення рівня інгібування 2х106 М" Нейтрофіли стимуляції
Еозинофіли 2х105 М" Гладкі клітини інгібування стимуляції
Есув (С016) ІДС МК-клітини Індукування цитолізу 5х105 М" Еозинофіли
Макрофаги
Нейтрофіли
Гладкі клітини
ЕсеВІ ІЗЕ Гладкі клітини Секреція гранул 10196 М" Еозинофіли
Базофіли
ЕсаВІ (СО89) ІЧАТ, ІЗА2 Макрофаги Підвищення індукування цитолізу 107 М" Нейтрофіли
Еозинофіли 3. Опис суті винаходу
Даний винахід, зокрема, стосується ковалентно зв'язаних діатіл і/або молекул ковалентно зв'язаних діатіл, і їхнього застосування для лікування ряду захворювань і розладів, включаючи рак, аутоїмунні розлади, алергійні розлади й інфекційні захворювання, які викликаються бактеріями, грибами або вірусами. Переважно, діатіло відповідно до винаходу може зв'язуватися з двома різними епітопами на двох різних клітинах, де перший епітоп експресується на клітині, що належить до типу, який відрізняється від типу клітини, на якій експресується другий епітоп, у результаті чого таке діатіло може зв'язувати разом дві клітини.
Більш конкретно, даний винахід стосується поліпептиду (а зокрема, антигензв'язувальної молекули), що містить поліпептидний ланцюг, який включає частину білка, який зв'язується з деімунізованою сироваткою, здатну зв'язуватися з вказаним сироватковим білком, де вказана частина білка, що зв'язується із сироваткою, збільшує час напівжиття вказаного поліпептиду в сироватці в порівнянні з часом напівжиття вказаного поліпептиду в сироватці, у якому відсутня вказана частина вказаного білка, який зв'язується з деімунізованою сироваткою.
Даний винахід також стосується застосування (або способів застосування) такої поліпептидної частини білка, який зв'язується з деімунізованою сироваткою, з метою збільшення часу напівжиття поліпептиду, ковалентно зв'язаного з цим білком, у сироватці, де час напівжиття вказаного поліпептиду в сироватці перевищує час напівжиття антигензв'язувальної молекули в сироватці, у якій відсутній альбумін-зв'язувальний білок.
Крім того, даний винахід стосується варіанта вищеописаного поліпептиду або його застосування, де вказаний поліпептидний ланцюг містить додаткову частину білка, який зв'язується з деімунізованою сироваткою, і де частини білка, який зв'язується з деімунізованою сироваткою, мають здатність зв'язуватися із сироватковим білком.
Даний винахід, зокрема, стосується варіанта вищеописаних поліпептидів або їхнього застосування, де вказана поліпептидна частина білка, який зв'язується з деімунізованою сироваткою, являє собою альбумін-зв'язувальний домен (АВО) стрептококового білка с, або його альбумін-зв'язувальний варіант, а зокрема, де вказаний альбумін-зв'язувальний домен
(АВО) стрептококового білка С являє собою альбумін-зв'язувальний домен З (АВОЗ) білка о стрептококового штаму 148.
Даний винахід, зокрема, стосується варіанта вищеописаних поліпептидів або їхнього застосування, де вказаний альбумін-зв'язувальний домен містить: (А) заміну валіну на аланін у положенні 71, заміну валіну на аланін у положенні 74 або заміну аспартату на аланін в положенні 79; (В) заміну лейцину на аланін у положенні 64, заміну ізолейцину на аланін у положенні 65 і заміну валіну на аланін у положенні 71; або (С) заміну аспарагіну на аспарагінову кислоту в положенні 66, заміну треоніну на серин у положенні 70 і заміну валіну на аланін у положенні 71.
Даний винахід також стосується варіанта вищеописаних поліпептидів або їхнього застосування, де вказаний альбумін-зв'язувальний домен має послідовність 56 ІЮ МО: 304,
ЗЕО ІЮ МО: 323, 5ЕО І МО: 324, 5ЕО І МО: 325, 5ЕО ІЮ МО: 326, 5ЕО ІЮ МО: 327, 5ЕО ІЮ МО: 328 або 5БЕО ІО МО: 329.
Даний винахід також стосується варіанта вищеописаних антигензв'язувальних молекул або їхнього застосування, де вказаною антигензв'язувальною молекулою є антигензв'язувальна молекула. Даний винахід також стосується варіанта, у якому антигензв'язувальною молекулою є діатіло, що складається щонайменше з першого і другого поліпептидних ланцюгів, які взаємодіють один з одним з утворенням двох антигензв'язувальних сайтів, де щонайменше один з поліпептидних ланцюгів містить другу поліпептидну частину, що включає частину білка, який зв'язується з деімунізованою сироваткою, здатну зв'язуватися із сироватковим білком.
Даний винахід також стосується варіантів таких діатіл, у яких перший і другий поліпептидні ланцюги включають другі поліпептидні частини, що містять частину білка, який зв'язується з деімунізованою сироваткою, здатну зв'язуватися із сироватковим білком, і/або де перший і другий поліпептидні ланцюги ковалентно зв'язані один з одним.
Даний винахід, зокрема, стосується варіанта вищеописаних діатіл або їхнього застосування, де вказане діатіло зв'язується: (А) з рецептором групи 20 (МКО20) природних кілерів або з Т-клітинним рецептором (ТСК); і (В) з пухлиноасоційованим антигеном.
Зо Даний винахід, зокрема, стосується варіантів усіх вищеописаних діатіл або їхнього застосування, де вказаним антигеном є антиген раку молочної залози, антиген раку яєчника, антиген раку передміхурової залози, антиген раку шийки матки, антиген карциноми підшлункової залози, антиген раку легень, антиген раку сечового міхура, антиген раку товстої кишки, антиген раку яєчок, антиген гліобластоми, антиген, асоційований зі злоякісною пухлиною
В-клітин; антиген, асоційований із множинною мієломою; антиген, асоційований з неходжкінською лімфомою, або антиген, асоційований із хронічним лімфоцитарним лейкозом.
В одному зі своїх варіантів даний винахід стосується ковалентно зв'язаного біспецифічного діатіла, що містить перший і другий поліпептидні ланцюги, де вказаний перший поліпептидний ланцюг включає (ї) перший домен, який містить зв'язувальну ділянку варіабельного домену легкого ланцюга першого імуноглобуліну (МІ1), специфічного до першого епітопу, (ії) другий домен, який містить зв'язувальну ділянку варіабельного домену важкого ланцюга другого імуноглобуліну (МН2), специфічного до другого епітопу, і необов'язково (ії) третій домен, який містить щонайменше один цистеїновий залишок, де перший і другий домени ковалентно зв'язані один з одним так, що вказані перший і другий домени не утворюють епітоп- зв'язувальний сайт; а вказаний другий поліпептидний ланцюг включає (ї) четвертий домен, який містить зв'язувальну ділянку варіабельного домену легкого ланцюга другого імуноглобуліну (МІ2), (її) п'ятий домен, який містить зв'язувальну ділянку варіабельного домену важкого ланцюга першого імуноглобуліну (МНІ), і необов'язково (ії) шостий домен, який містить щонайменше один цистеїновий залишок, де вказані четвертий і п'ятий домени ковалентно зв'язані один з одним так, що вказані четвертий і п'ятий домени не утворюють епітоп- зв'язувальний сайт; і де вказані перший поліпептидний ланцюг і другий поліпептидний ланцюг ковалентно зв'язані один з одним за умови, що ковалентний зв'язок не є пептидним зв'язком; де перший домен і п'ятий домен утворюють перший зв'язувальний сайт (МІ/1)(МН'І), який зв'язується з першим епітопом, а другий домен і четвертий домен утворюють другий зв'язувальний сайт (МІ 2)(/МН2), що зв'язується з другим епітопом.
В іншому своєму варіанті даний винахід стосується ковалентно зв'язаного біспецифічного діатіла, що містить перший і другий поліпептидні ланцюги, де вказаний перший поліпептидний ланцюг включає (ї) перший домен, який містить зв'язувальну ділянку варіабельного домену легкого ланцюга першого імуноглобуліну (МІ1), специфічного до першого епітопу, (ії) другий бо домен, який містить зв'язувальну ділянку варіабельного домену важкого ланцюга другого імуноглобуліну (МН2), специфічного до другого епітопу, і (ії) третій домен, який містить Ес- домен або його частину, де вказані перший і другий домени ковалентно зв'язані один з одним так, що вказані перший і другий домени не утворюють епітоп-зв'язувальний сайт; а вказаний другий поліпептидний ланцюг включає (ї) четвертий домен, який містить зв'язувальну ділянку варіабельного домену легкого ланцюга другого імуноглобуліну (МІ 2), (ї) п'ятий домен, який містить зв'язувальну ділянку варіабельного домену важкого ланцюга першого імуноглобуліну (УНІ), де вказані четвертий і п'ятий домени ковалентно зв'язані один з одним так, що вказані третій і четвертий домени не утворюють епітоп-зв'язувальний сайт; і де вказані перший поліпептидний ланцюг і другий поліпептидний ланцюг ковалентно зв'язані один з одним за умови, що ковалентний зв'язок не є пептидним зв'язком, де перший домен і п'ятий домен утворюють перший зв'язувальний сайт (МІ1)(МНІ), що зв'язується з першим епітопом, а другий домен і четвертий домен утворюють другий зв'язувальний сайт (МІ 2)УМН2), що зв'язується з другим епітопом.
У деяких своїх аспектах даний винахід стосується молекули діатіла, що містить перший і другий поліпептидні ланцюги, де вказаний перший поліпептидний ланцюг включає (ї) перший домен, який містить зв'язувальну ділянку варіабельного домену легкого ланцюга першого імуноглобуліну (МІ/1), специфічного до першого епітопу, (ії) другий домен, який містить зв'язувальну ділянку варіабельного домену важкого ланцюга другого імуноглобуліну (МН), специфічного до другого епітопу, і (ії) третій домен, який містить Ес-домен або його частину, де вказані перший і другий домени ковалентно зв'язані один з одним так, що вказані перший і другий домени не утворюють епітоп-зв'язувальний сайт; а вказаний другий поліпептидний ланцюг включає (ї) четвертий домен, який містить зв'язувальну ділянку варіабельного домену легкого ланцюга другого імуноглобуліну (МІ 2), (її) п'ятий домен, який містить зв'язувальну ділянку варіабельного домену важкого ланцюга першого імуноглобуліну (МНІ), і (ії) шостий домен, який містить щонайменше один цистеїновий залишок, де вказані четвертий і п'ятий домени ковалентно зв'язані один з одним так, що вказані четвертий і п'ятий домени не утворюють епітоп-зв'язувальний сайт; і де вказані перший поліпептидний ланцюг і другий поліпептидний ланцюг ковалентно зв'язані один з одним за умови, що ковалентний зв'язок не є пептидним зв'язком; де вказані перший домен і п'ятий домен утворюють перший зв'язувальний
Зо сайт (МІ1)(МНІ), що зв'язується з першим епітопом, а другий домен і четвертий домен утворюють другий зв'язувальний сайт (МІ 2)ХУН2), що зв'язується з другим епітопом.
У деяких своїх варіантах даний винахід стосується ковалентно зв'язаного біспецифічного діатіла, що являє собою димер молекул діатіла, де кожна молекула діатіла містить перший і другий поліпептидні ланцюги, де вказаний перший поліпептидний ланцюг включає (ї) перший домен, який містить зв'язувальну ділянку варіабельного домену легкого ланцюга першого імуноглобуліну (МІ/1), специфічного до першого епітопу, (ії) другий домен, який містить зв'язувальну ділянку варіабельного домену важкого ланцюга другого імуноглобуліну (МН), специфічного до другого епітопу, і (ії) третій домен, який містить Ес-домен або його частину, де вказані перший і другий домени ковалентно зв'язані один з одним так, що вони не утворюють епітоп-зв'язувальний сайт; а вказаний другий поліпептидний ланцюг включає (ї) четвертий домен, який містить зв'язувальну ділянку варіабельного домену легкого ланцюга другого імуноглобуліну (МІ 2), (ії) п'ятий домен, який містить зв'язувальну ділянку варіабельного домену важкого ланцюга першого імуноглобуліну (УНІ), і (ії) шостий домен, який містить щонайменше один цистеїновий залишок, де вказані четвертий і п'ятий домени ковалентно зв'язані один з одним так, що вказані четвертий і п'ятий домени не утворюють епітоп-зв'язувальний сайт; і де вказані перший поліпептидний ланцюг і другий поліпептидний ланцюг кожної молекули діатіла ковалентно зв'язані один з одним за умови, що ковалентний зв'язок не є пептидним зв'язком; де вказані перший домен і п'ятий домен кожної молекули діатіла утворюють перший зв'язувальний сайт (М1)ХУНІ), що зв'язується з першим епітопом, а другий домен і четвертий домен кожної молекули діатіла утворюють другий зв'язувальний сайт (МІ 2)(МН2г), що зв'язується з другим епітопом.
В інших своїх варіантах даний винахід стосується ковалентно зв'язаного тетраспецифічного діатіла, який являє собою димер молекул діатіла, де перша молекула діатіла містить перший і другий поліпептидні ланцюги, де вказаний перший поліпептидний ланцюг включає (ї) перший домен, який містить зв'язувальну ділянку варіабельного домену легкого ланцюга першого імуноглобуліну (МІ/1), специфічного до першого епітопу, (ії) другий домен, який містить зв'язувальну ділянку варіабельного домену важкого ланцюга другого імуноглобуліну (МН), специфічного до другого епітопу, і (ії) третій домен, який містить Ес-домен або його частину, де вказані перший і другий домени ковалентно зв'язані один з одним так, що вони не утворюють бо епітоп-зв'язувальний сайт; а вказаний другий поліпептидний ланцюг включає (ї) четвертий домен, який містить зв'язувальну ділянку варіабельного домену легкого ланцюга другого імуноглобуліну (МІ 2), (ії) п'ятий домен, який містить зв'язувальну ділянку варіабельного домену важкого ланцюга першого імуноглобуліну (МН), і (ії) шостий домен, який містить щонайменше один цистеїновий залишок, де вказані четвертий і п'ятий домени ковалентно зв'язані один з одним так, що вказані четвертий і п'ятий домени не утворюють епітоп-зв'язувальний сайт; і де вказані перший поліпептидний ланцюг і другий поліпептидний ланцюг діатіла ковалентно зв'язані один з одним за умови, що ковалентний зв'язок не є пептидним зв'язком; де вказані перший домен і п'ятий домен утворюють перший зв'язувальний сайт (МІ 1)(МНІ), що зв'язується з першим епітопом, а другий домен і четвертий домен утворюють другий зв'язувальний сайт (МІ2)(МН2), що зв'язується з другим епітопом; а друга молекула діатіла містить перший і другий поліпептидні ланцюги, де вказаний перший поліпептидний ланцюг включає (ії) перший домен, який містить зв'язувальну ділянку варіабельного домену легкого ланцюга третього імуноглобуліну (МІ3), специфічного до третього епітопу, (її) другий домен, який містить зв'язувальну ділянку варіабельного домену важкого ланцюга четвертого імуноглобуліну (МН), специфічного до четвертого епітопу, і (ії) третій домен, який містить Ес-домен або його частину, де вказані перший і другий домени ковалентно зв'язані один з одним так, що вони не утворюють епітоп-зв'язувальний сайт; а вказаний другий поліпептидний ланцюг включає (ї) четвертий домен, який містить зв'язувальну ділянку варіабельного домену легкого ланцюга четвертого імуноглобуліну (МІ 4), (ії) п'ятий домен, який містить зв'язувальну ділянку варіабельного домену важкого ланцюга третього імуноглобуліну (УНЗ), і (ії) шостий домен, який містить щонайменше один цистеїновий залишок, де вказані четвертий і п'ятий домени ковалентно зв'язані один з одним так, що вказані четвертий і п'ятий домени не утворюють епітоп-зв'язувальний сайт; і де вказані перший поліпептидний ланцюг і другий поліпептидний ланцюг діатіла ковалентно зв'язано один з одним за умови, що ковалентний зв'язок не є пептидним зв'язком; де вказані перший домен і п'ятий домен утворюють перший зв'язувальний сайт (МІ 3)ХМНЗ), що зв'язується з третім епітопом, а другий домен і четвертий домен утворюють другий зв'язувальний сайт (М 43ХМНЯУ), що зв'язується з четвертим епітопом.
У деяких аспектах винаходу перший епітоп, другий епітоп, а також, якщо вони присутні, третій епітоп і четвертий епітоп, можуть бути однаковими. В інших аспектах винаходу перший
Зо епітоп, другий епітоп, а також, якщо вони присутні, третій епітоп і четвертий епітоп, можуть відрізнятися один від одного. У деяких аспектах винаходу, які включають домен, який зв'язується з третім епітопом, перший епітоп і третій епітоп можуть бути однаковими. У деяких аспектах винаходу, які включають домен, який зв'язується з четвертим епітопом, перший епітоп і четвертий епітоп можуть бути однаковими. У деяких аспектах винаходу, які включають домен, що зв'язується з третім епітопом, другий епітоп і третій епітоп можуть бути однаковими. У деяких аспектах винаходу, які включають домен, що зв'язується з четвертим епітопом, другий епітоп і четвертий епітоп можуть бути однаковими. У переважних аспектах винаходу перший епітоп і другий епітоп є різними. В інших аспектах винаходу, які включають домен, що зв'язується з третім епітопом, і домен, що зв'язується з четвертим епітопом, третій епітоп і четвертий епітоп можуть бути різними. Слід зазначити, що кожна з вищевказаних комбінацій входить в обсяг даного винаходу.
У конкретних аспектах винаходу перший домен і п'ятий домен діатіла або молекули діатіла можуть походити від того самого імуноглобуліну. В іншому аспекті винаходу другий домен і четвертий домен діатіла або молекули діатіла можуть походити від того самого імуноглобуліну.
В іншому аспекті винаходу перший домен і п'ятий домен діатіла або молекули діатіла можуть походити від іншого імуноглобуліну. В іншому аспекті винаходу другий домен і четвертий домен діатіла або молекули діатіла можуть походити від іншого імуноглобуліну. Слід зазначити, що кожна з вищевказаних комбінацій входить в обсяг даного винаходу.
У деяких аспектах винаходу ковалентний зв'язок між першим поліпептидним ланцюгом і другим поліпептидним ланцюгом діатіла або молекули діатіла може бути утворений за допомогою дисульфідного зв'язку між щонайменше одним цистеїновим залишком на першому поліпептидному ланцюзі і щонайменше одним цистеїновим залишком на другому поліпептидному ланцюзі. Цистеїнові залишки на першому або другому поліпептидних ланцюгах, відповідальні за утворення дисульфідного зв'язку, можуть бути присутнім на будь-якій ділянці поліпептидного ланцюга, включаючи перший, другий, третій, четвертий, п'ятий і шостий домени.
У конкретному варіанті винаходу цистеїновий залишок на першому поліпептидному ланцюзі присутній в першому домені, а цистетїновий залишок на другому поліпептидному ланцюзі присутній в п'ятому домені. Перший, другий, четвертий і п'ятий домени, що відповідають варіабельним ділянкам, відповідальні за зв'язування. У переважних варіантах винаходу бо цистеїнові залишки, відповідальні за утворення дисульфідних зв'язків між першим і другим поліпептидними ланцюгами, розташовані в третьому і шостому доменах, відповідно. У конкретному аспекті цього варіанта третій домен першого поліпептидного ланцюга містить 6 С- кінцевих амінокислот людського легкого ланцюга каппа, ЕМКСЕС (5ЕО ІЮО МО: 23), що можуть входити в амінокислотну послідовність (ЕС ІЮ МО: 17). В іншому аспекті цього варіанта шостий домен другого поліпептидного ланцюга містить б С-кінцевих амінокислот людського легкого ланцюга каппа, ЕМКОСЕС (5ЕО ІЮ МО: 23), що можуть входити в амінокислотну послідовність (ЗЕБЕО ІЮ МО: 17). У ще одному аспекті цього варіанта третій домен першого поліпептидного ланцюга містить амінокислотну послідовність МЕРК5С (5ЕБО ІЮ МО: 77), яка походить від шарнірного домену людського Ідсї і може кодуватися нуклеотидною послідовністю (5ЕО ІЮ МО: 18). В іншому аспекті цього варіанта шостий домен другого поліпептидного ланцюга містить амінокислотну послідовність МЕРК5С (5ЕБО ІО МО: 77), яка походить від шарнірного домену людського ЇДСььі може кодуватися нуклеотидною послідовністю (ЗЕО ІЮ МО: 78). У деяких аспектах цього варіанта третій домен першого поліпептидного ланцюга містить 6 С-кінцевих амінокислот людського легкого ланцюга каппа, ЕМКОЕС (5ЕО ІЮО МО: 23), а шостий домен другого поліпептидного ланцюга містить амінокислотну послідовність МЕРКЗС (5ЕО ІО МО: 77).
В інших аспектах цього варіанта шостий домен другого поліпептидного ланцюга містить 6 С- кінцевих амінокислот людського легкого ланцюга каппа, ЕМАСЕС (З5ЕО ІЮ МО: 23), а третій домен першого поліпептидного ланцюга містить амінокислотну послідовність МЕРКЗС (5ЕО ІЮ
МО: 77). В інших аспектах цього варіанта третій домен першого поліпептидного ланцюга містить б С-кінцевих амінокислот людського легкого ланцюга каппа, ЕМАЕАСЕС (5ЕО ІО МО: 23), а шостий домен другого поліпептидного ланцюга містить шарнірний домен. В інших аспектах цього варіанта шостий домен другого поліпептидного ланцюга містить б С-кінцевих амінокислот людського легкого ланцюга каппа, ЕМКОЕС (5ЕБО ІЮО МО: 23), а третій домен першого поліпептидного ланцюга містить шарнірний домен. В інших аспектах цього варіанта третій домен першого поліпептидного ланцюга містить 6 С-кінцевих амінокислот людського легкого ланцюга каппа, ЕМКОЕС (5ЕО ІЮ МО: 23), а шостий домен першого поліпептидного ланцюга містить Ес-домен або його частину. В інших аспектах цього варіанта шостий домен другого поліпептидного ланцюга містить 6 С-кінцевих амінокислот людського легкого ланцюга каппа,
ЕМКОЕС (5ЕО ІЮО МО: 23), а третій домен першого поліпептидного ланцюга містить Есо-домен
Зо або його частину.
В інших варіантах винаходу цистеїнові залишки на першому або другому поліпептиді, відповідальні за утворення дисульфідного зв'язку, можуть бути розташовані за межами першого, другого або третього доменів на першому поліпептидному ланцюзі і за межами четвертого, п'ятого і шостого доменів на другому поліпептгидному ланцюзі. Зокрема, цистеїновий залишок на першому поліпептидному ланцюзі може бути М-кінцевим відносно першого домену або С-кінцевим відносно першого домену. Цистеїновий залишок на першому поліпептидному ланцюзі може бути М-кінцевим відносно другого домену або С-кінцевим відносно другого домену. Цистеїновий залишок на першому поліпептидному ланцюзі може бути
М-кінцевим відносно третього домену або С-кінцевим відносно третього домену. Крім того, цистеїновий залишок на другому поліпептидному ланцюзі може бути М-кінцевим відносно четвертого домену або С-кінцевим відносно четвертого домену. Цистеїновий залишок на другому поліпептидному ланцюзі може бути М-кінцевим відносно п'ятого домену або С-кінцевим відносно п'ятого домену. Відповідно до цього цистеїновий залишок на другому поліпептгидному ланцюзі може бути С-кінцевим відносно шостого домену або М-кінцевим відносно шостого домену. У конкретному аспекті винаходу дисульфідний зв'язок може бути розташований щонайменше між двома цистетновими залишками на першому поліпептидному ланцюзі і щонайменше між двома цистетовими залишками на другому поліпептидному ланцюзі. У конкретному аспекті винаходу, де третій домен і шостий домен не містять Ес-домен або його частини, цистеїновий залишок може знаходитися в С-кінця першого поліпептидного ланцюга й біля С-кінця другого поліпептидного ланцюга. Слід зазначити, що кожна з вищевказаних комбінацій входить в обсяг даного винаходу.
У конкретних варіантах даного винаходу, описаних вище, ковалентно зв'язане діатіло відповідно до винаходу включає димери молекул діатіл, де кожна молекула діатіла містить перший і другий поліпептидні ланцюги. У деяких аспектах цього варіанта молекули діатіла можуть бути ковалентно зв'язані один з одним з утворенням димера, за умови, що ковалентний зв'язок не є пептидним зв'язком. У переважних аспектах цього варіанта ковалентним зв'язком є дисульфідний зв'язок, розташований щонайменше між одним цистетновим залишком на першому поліпептидному ланцюзі і щонайменше одним цистеїновим залишком кожного димера молекул діатіла. У ще більш переважних аспектах винаходу ковалентним зв'язком є бо дисульфідний зв'язок, розташований щонайменше між одним цистетновим залишком на першому поліпептидному ланцюзі і щонайменше одним цистеїновим залишком кожної молекули діатіла, що утворює димер, де вказаний щонайменше один цистеїновий залишок присутній у третьому домені кожного першого поліпептидного ланцюга.
У деяких аспектах винаходу перший домен на першому поліпептидному ланцюзі може бути
М-кінцевим відносно другого домену або С-кінцевим відносно другого домену. Перший домен на першому поліпептидному ланцюзі може бути М-кінцевим відносно третього домену або сС- кінцевим відносно третього домену. Другий домен на першому поліпептидному ланцюзі може бути М-кінцевим відносно першого домену або С-кінцевим відносно першого домену. Крім того, другий домен на першому поліпептидному ланцюзі може бути М-кінцевим відносно третього домену або С-кінцевим відносно третього домену. Відповідно до цього третій домен на першому поліпептидному ланцюзі може бути М-кінцевим відносно першого домену або С-кінцевим відносно першого домену. Третій домен на першому поліпептгидному ланцюзі може бути М- кінцевим відносно другого домену або С-кінцевим відносно другого домену. Що стосується другого поліпептидного ланцюга, то четвертий домен може бути М-кінцевим відносно п'ятого домену або С-кінцевим відносно п'ятого домену. Четвертий домен може бути М-кінцевим відносно шостого домену або С-кінцевим відносно шостого домену. П'ятий домен на другому поліпептидному ланцюзі може бути М-кінцевим відносно четвертого домену або С-кінцевим відносно четвертого домену. П'ятий домен на другому поліпептидному ланцюзі може бути М- кінцевим відносно шостого домену або С-кінцевим відносно шостого домену. Відповідно до цього шостий домен на другому поліпептгидному ланцюзі може бути М-кінцевим відносно четвертого домену або С-кінцевим відносно четвертого домену. Шостий домен на другому поліпептидному ланцюзі може бути М-кінцевим відносно п'ятого домену або С-кінцевим відносно п'ятого домену. Слід зазначити, що кожна з вищевказаних комбінацій входить в обсяг даного винаходу.
У деяких варіантах винаходу перший домен і другий домен можуть знаходитися з боку С- кінця відносно третього домену на першому поліпептидному ланцюзі, або перший домен і другий домен можуть знаходитися з боку М-кінця відносно третього домену на першому поліпептидному ланцюзі. Що стосується другого поліпептидного ланцюга, то четвертий домен і п'ятий домен можуть знаходитися з боку С-кінця відносно шостого домену, або четвертий домен і п'ятий домен можуть знаходитися з боку М-кінця відносно шостого домену. У деяких своїх аспектах цього варіанта, даний винахід стосується ковалентно зв'язаного біспецифічного діатіла, що являє собою димер молекул діатіла, кожна з яких містить перший і другий поліпептидні ланцюги, де вказаний перший поліпептидний ланцюг включає (і) перший домен, який містить зв'язувальну ділянку варіабельного домену легкого ланцюга першого імуноглобуліну (МІ/1), специфічного до першого епітопу, (її) другий домен, який містить зв'язувальну ділянку варіабельного домену важкого ланцюга другого імуноглобуліну (МН), специфічного до другого епітопу, і (ії) третій домен, який містить Ес-домен або його частину, де вказані перший і другий домени ковалентно зв'язані один з одним так, що вказані перший і другий домени не утворюють епітоп-зв'язувальний сайт, і де третій домен знаходиться з боку М- кінця відносно першого домену і другого домену, а вказаний другий поліпептидний ланцюг включає (ї) четвертий домен, який містить зв'язувальну ділянку варіабельного домену легкого ланцюга другого імуноглобуліну (МІ 2), (її) п'ятий домен, який містить зв'язувальну ділянку варіабельного домену важкого ланцюга першого імуноглобуліну (МН), і (її) шостий домен, який містить щонайменше один цистетновий залишок, де вказані четвертий і п'ятий домени ковалентно зв'язані один з одним так, що вказані четвертий і п'ятий домени не утворюють епітоп-зв'язувальний сайт; і де вказані перший поліпептидний ланцюг і другий поліпептидний ланцюг кожної молекули діатіла ковалентно зв'язані один з одним за умови, що ковалентний зв'язок не є пептидним зв'язком; де вказані перший домен і п'ятий домен кожної молекули діатіла утворюють перший зв'язувальний сайт (МІ 1)(МНТ), що зв'язується з першим епітопом, а другий домен і четвертий домен кожної молекули діатіла утворюють другий зв'язувальний сайт (М2)уМНа), що зв'язується з другим епітопом.
В іншому своєму варіанті даний винахід стосується ковалентно зв'язаного тетраспецифічного діатіла, що являє собою димер молекул діатіла, де перша молекула діатіла містить перший і другий поліпептидні ланцюги, де вказаний перший поліпептидний ланцюг включає (і) перший домен, який містить зв'язувальну ділянку варіабельного домену легкого ланцюга першого імуноглобуліну (МІ1), специфічного до першого епітопу, (ії) другий домен, який містить зв'язувальну ділянку варіабельного домену важкого ланцюга другого імуноглобуліну (МН2г), специфічного до другого епітопу, і (ії) третій домен, який містить Ес-домен або його частину, де вказані перший і другий домени ковалентно зв'язані один з одним так, що вони не бо утворюють епітоп-зв'язувальний сайт; і де третій домен знаходиться з боку М-кінця відносно першого домену і другого домену, а вказаний другий поліпептидний ланцюг включає (Її) четвертий домен, який містить зв'язувальну ділянку варіабельного домену легкого ланцюга другого імуноглобуліну (МІ 2), (ії) п'ятий домен, який містить зв'язувальну ділянку варіабельного домену важкого ланцюга першого імуноглобуліну (МН), і (її) шостий домен, який містить щонайменше один цистеїновий залишок, де вказані четвертий і п'ятий домени ковалентно зв'язані один з одним так, що вказані четвертий і п'ятий домени не утворюють епітоп- зв'язувальний сайт; і де вказані перший поліпептидний ланцюг і другий поліпептидний ланцюг діатіла ковалентно зв'язані один з одним за умови, що вказаний ковалентний зв'язок не є пептидним зв'язком; де вказані перший домен і п'ятий домен утворюють перший зв'язувальний сайт (МІ1)(МНІ), що зв'язується з першим епітопом, а другий домен і четвертий домен утворюють другий зв'язувальний сайт (МІ 2)ХУМН2), що зв'язується з другим епітопом; де друга молекула діатіла містить перший і другий поліпептидний ланцюг, і де вказаний перший поліпептидний ланцюг включає (і) перший домен, який містить зв'язувальну ділянку варіабельного домену легкого ланцюга третього імуноглобуліну (МІ 3), специфічного до третього епітопу, (ії) другий домен, який містить зв'язувальну ділянку варіабельного домену важкого ланцюга четвертого імуноглобуліну (МН4), специфічного до четвертого епітопу, і (ії) третій домен, який містить Ес-домен або його частину, де вказані перший і другий домени ковалентно зв'язані один з одним так, що вказані перший і другий домени не утворюють епітоп- зв'язувальний сайт; і де третій домен знаходиться з боку М-кінця відносно першого домену і другого домену, а вказаний другий поліпептидний ланцюг включає (ії) четвертий домен, який містить зв'язувальну ділянку варіабельного домену легкого ланцюга четвертого імуноглобуліну (МІ.4), (її) п'ятий домен, який містить зв'язувальну ділянку варіабельного домену важкого ланцюга третього імуноглобуліну (МНЗ), і (її) шостий домен, який містить щонайменше один цистеїновий залишок, де вказані четвертий і п'ятий домени ковалентно зв'язані один з одним так, що вказані четвертий і п'ятий домени не утворюють епітоп-зв'язувальний сайт; і де вказані перший поліпептидний ланцюг і другий поліпептидний ланцюг діатіла ковалентно зв'язані один з одним за умови, що ковалентний зв'язок не є пептидним зв'язком; де вказані перший домен і п'ятий домен утворюють перший зв'язувальний сайт (МІ 3)(МНЗ), що зв'язується з третім епітопом, а другий домен і четвертий домен утворюють другий зв'язувальний сайт (МІ 4)ХМНа),
Зо що зв'язується з четвертим епітопом.
Як обговорювалося вище, домени на окремих поліпептидних ланцюгах є ковалентно зв'язаними. У конкретних аспектах винаходу ковалентний зв'язок між першим і другим доменом, першим і третім доменом, другим і третім доменом, четвертим і п'ятим доменом, четвертим і шостим доменом і/або п'ятим і шостим доменом може являти собою пептидний зв'язок.
Зокрема, перший і другий домени, і четвертий і п'ятий домени можуть бути розділені третіми доменом і шостими доменом, відповідно, або додатковими амінокислотними залишками, за умови, що перший і другий домени, і четвертий і п'ятий домени не утворюють зв'язувальний сайт. Число амінокислотних залишків може становити 0, 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8 або 9 амінокислотних залишків. В одному з переважних аспектів винаходу число амінокислотних залишків між доменами дорівнює 8.
У деяких аспектах винаходу домени першого і другого поліпептидних ланцюгів, що містять
Ес-домен, тобто, необов'язково третій і шостий домени, відповідно, можуть також включати шарнірний домен, який містить шарнірну ділянку-Рс-ділянку. В альтернативних варіантах винаходу перший поліпептидний ланцюг або другий поліпептидний ланцюг можуть містити шарнірний домен, що також не включає Ес-домен. Важкі ланцюги, легкі ланцюги, шарнірні ділянки, ЕБо-домени і/або шарнірні ділянки-Рс-домени, використовувані в даному винаході, можуть походити від імуноглобуліну будь-якого типу, включаючи ІдА, дО, ІДЕ, дос або І9М. У переважному аспекті винаходу імуноглобулін належить до типу їдС, або до будь-якого його підтипу, тобто ІдСи, ІдСі2, ІдСіз або ІдсС4. В інших аспектах винаходу імуноглобулін, від якого походять легкі і важкі ланцюги, є гуманізованим або химерним.
Крім того, перший і другий епітопи, і, якщо вони присутні, то третій і четвертий епітопи, з якими зв'язуються діатіло або молекула діатіла, можуть являти собою різні епітопи того самого антигену або різні епітопи різних антигенів. Антигени можуть являти собою будь-яку молекулу, проти якої може вироблятися антитіло. Так, наприклад, такими молекулами є білки, нуклеїнові кислоти, бактеріальні токсини, маркери клітинної поверхні, аутоімунні маркери, вірусні білки, лікарські засоби і т. п. У конкретних аспектах винаходу щонайменше один епітоп-зв'язувальний сайт діатіла є специфічним до антигену на конкретній клітині, такій як В-клітина, Т-клітина, фагоцит, природна клітина-кілер (МК) або дендритна клітина.
У деяких аспектах варіанта даного винаходу, щонайменше один епітоп-зв'язувальний сайт бо діатіла або молекули діатіла є специфічним до Ес-рецептора, де вказаний Ес-рецептор може являти собою активуючий Ес-рецептор або інгібуючий Ес-рецептор. У конкретних аспектах винаходу Ес-рецептором є Есу-рецептор, а Есу-рецептором є ЕсуВіІ-, ЕсуВіІІ- або ЕсувПІ- рецептор. У більш переважних аспектах винаходу ЕсуВіІП-рецептором є рецептор ЕсувшША (СО16А) або рецептор ЕсукІїВвВ (СО16В), а більш переважно ЕсувВПІ-рецептором є рецептор
ЕсукІПА (СО16А). В іншому переважному аспекті винаходу ЕсуВіІ-рецептор являє собою рецептор ЕсукІА (СО32А) або рецептор ЕсуКІІВ (СО32В), а більш переважно рецептор ЕсуВІІВ (СО328). В особливо переважному аспекті винаходу один зв'язувальний сайт діатіла є специфічним до СОЗ2В, а інший зв'язувальний сайт є специфічним до СО16А. У конкретному варіанті винаходу щонайменше один епітоп-зв'язувальний сайт діатіла або молекули діатіла є специфічним до активуючого Ес-рецептора, а щонайменше один інший сайт є специфічним до інгібуючого Ес-рецептора. У деяких аспектах цього варіанта активуючим Ес-рецептором є
СОЗ32А, а інгібуючим Ес-рецептором є СОЗ32В. В інших аспектах цього варіанта активуючим Ес- рецептором є ВСЕ, а інгібуючим Ес-рецептором є СО32В. В інших аспектах цього варіанта активуючим Ес-рецептором є ІДЕКІ, а інгібуючим Ес-рецептором є СОЗ2В.
У тих випадках, коли один епітоп-зв'язувальний сайт є специфічним до СО16А, домени МІ і
МН можуть бути ідентичними або аналогічними доменам Мі і МН мишачого антитіла 308, послідовність якого була клонована і представлена в даному описі. В інших випадках, коли один епітоп-зв'язувальний сайт є специфічним до СОЗ2А, домени МІ. їі МН можуть бути ідентичними або аналогічними доменам У. і МН мишачого антитіла ІМ.3. В інших випадках, коли один епітоп- зв'язувальний сайт є специфічним до СЮОЗ2В, домени МІ і МН можуть бути ідентичними або аналогічними доменам Мі. і МН мишачого антитіла 286, послідовність якого була клонована і представлена в даному описі. Слід зазначити, що будь-які домени МІ. або УН антитіл 308, 286 і
ЇМ.3 можуть бути використані в будь-якій комбінації. Даний винахід також стосується біспецифічного діатіла або молекули біспецифічного діатіла, де перший епітоп є специфічним до СОЗ2В, а другий епітоп є специфічним до СО16А.
В інших аспектах винаходу епітоп-зв'язувальні сайт може бути специфічним до патогенного антигену. Використовуваний тут патогенний антиген являє собою антиген, що викликає конкретне захворювання, яке викликається патогенами, включаючи рак, інфекцію й аутоїмунне захворювання. Таким чином, патогенними антигенами можуть бути пухлинний антиген,
Зо бактеріальний антиген, вірусний антиген або аутоімунний антиген. Репрезентативними патогенними антигенами є, але не обмежуються ними, ліпополісахарид, вірусні антигени, вибрані з групи, яка складається з вірусних антигенів, які походять від вірусу імунодефіциту людини, аденовірусу, респіраторно-синцитіального вірусу, вірусу Західного Нілу (наприклад, антигени Е16 і/або Е53) і вірусу гепатиту; нуклеїнові кислоти (ДНК і РНК) і колаген. Переважним патогенним антигеном є нейтралізуючий антиген. У переважному аспекті винаходу, один епітоп- зв'язувальний сайт є специфічним до СО16А або СОЗ2А, а інший епітоп-зв'язувальний сайт є специфічним до патогенного антигену, за винятком аутоїмунних антигенів. В іншому переважному аспекті винаходу один епітоп-зв'язувальний сайт є специфічним до СОЗ2В, а інший епітоп-зв'язувальний сайт є специфічним до будь-якого патогенного антигену. У конкретних варіантах винаходу молекула діатіла відповідно до винаходу зв'язується з двома різними антигенами на одній і тій же клітині, наприклад, один антигензв'язувальний сайт є специфічним до активуючого Ес-рецептору, а інший є специфічним до інгібуючого Ес-рецептору.
В інших варіантах винаходу молекула діатіла зв'язується з двома різними вірус- нейтралізуючими епітопами, наприклад, такими як, але не обмежуються ними, Е16 і Е5З вірусу
Західного Нілу.
В іншому варіанті даного винаходу діатіла відповідно до винаходу можуть бути використані для лікування ряду захворювань і розладів. Відповідно до цього, даний винахід стосується способу лікування захворювання або розладу, що включає введення пацієнту, який потребує цього, ефективного кількості ковалентно зв'язаного діатіла або молекули діатіла відповідно до винаходу, у яких щонайменше один зв'язувальний сайт є специфічним до патогенного антигену, такого як антиген, який експресується на поверхні ракових клітин або на поверхні бактерій або вірна, а щонайменше один інший зв'язувальний сайт є специфічним до Ес-рецептору, наприклад, до СО16А.
В іншому своєму варіанті даний винахід стосується способу лікування захворювання або розладу, що включає введення пацієнту, який потребує цього, ефективного кількості діатіла або молекули діатіла відповідно до винаходу, у яких щонайменше один зв'язувальний сайт є специфічним до СОЗ32В, а щонайменше один інший зв'язувальний сайт є специфічним до
СО16А.
В іншому своєму варіанті даний винахід стосується способу індукування імунологічної 60 толерантності до патогенного антигену, де вказаний спосіб включає введення пацієнту, який потребує цього, ефективної кількості ковалентно зв'язаного діатіла або двовалентної молекули діатіла відповідно до винаходу, у яких щонайменше один зв'язувальний сайт є специфічним до
СОЗ328В, а щонайменше один інший зв'язувальний сайт є специфічним до вказаного патогенного антигену. В аспектах цього варіанта винаходу патогенним антигеном може бути алерген або інша молекула, до яких було б бажано виробляння імунологічної толерантності, таких як білок, який експресується на трансплантованій тканині.
У ще одному своєму варіанті даний винахід стосується способу детоксифікації, де вказаний спосіб включає введення пацієнту, який потребує цього, ефективної кількості ковалентно зв'язаного діатіла або молекули діатіла відповідно до винаходу, у яких щонайменше один зв'язувальний сайт є специфічним до маркера клітинної поверхні, а щонайменше один інший зв'язувальний сайт є специфічним до токсину. У конкретних аспектах винаходу діатілом, що вводиться, відповідно до винаходу є діатіло, у якому один зв'язувальний є специфічним до маркера клітинної поверхні, такого як Ес, а інший зв'язувальний сайт є специфічним до бактеріального токсину або до лікарського засобу. В одному з аспектів винаходу маркер клітинної поверхні не присутній на еритроцитах.
Даний винахід також стосується способу збільшення часу напівжиття молекули, що містить антигензв'язувальний домен антитіла, де вказаний спосіб включає зв'язування (наприклад, пряме зв'язування або зв'язування за допомогою кон'югування, приєднання і т. п.) двох або більше альбумін-зв'язувальних доменів з молекулою. Даний винахід, зокрема, стосується варіанта такого способу, у якому зв'язування двох або більше альбумін-зв'язувальних доменів включає приєднання 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 або більше альбумін-зв'язувальних доменів до молекули, а більш конкретно, до варіанта такого способу, у якому зв'язування двох або більше альбумін-зв'язувальних доменів включає приєднання 2 альбумін-зв'язувальних доменів до молекули. Такі два або більше альбумін-зв'язувальних доменів можуть бути однаковими або різними, і переважно вони можуть бути незалежно вибрані з групи, яка складається з послідовностей ЗЕО ІЮ МО: 304, 5ЕО ІЮ МО: 323, ЗЕО ІЮ МО: 324, 5ЕО ІО МО: 325, 5ЕО І МО: 326, 5ЕО ІО МО: 327, 5ЕО ІЮ МО: 328 або 5ЕО ІО МО: 329. Даний винахід, зокрема, стосується варіанта таких способів, у яких два або більше альбумін-зв'язувальних доменів є однаковими, або в яких 2 альбумін-зв'язувальні домени є однаковими. Даний винахід, зокрема, стосується
Зо варіанта такого способу, у якому молекулою, що містить антигензв'язувальний домен антитіла, є діатіло. 3.1 Визначення
Якщо це не обговорено особливо, то усі використовувані тут спеціальні терміни, примітки й інші наукові терміни або термінологія мають загальноприйняті значення, зрозумілі фахівцю в галузі, до якої належить винахід. У деяких випадках терміни, що мають загальноприйняті значення, приводяться тут для зрозумілості і/або кращого розуміння винаходу, і такі приведені тут визначення термінів не повинні бути витлумачені як визначення, які істотно відрізняються від тих визначень, що, по суті, зрозумілі фахівцям. Для практичного здійснення даного винаходу можуть бути застосовані, якщо це не обговорено особливо, стандартні методи, застосовувані в молекулярній біології (включаючи методи рекомбінантних ДНК), мікробіології, біології клітини, біохімії, хімії нуклеїнових кислот і імунології, і відомі фахівцям. Такі методи докладно описані в літературі, наприклад, у публікаціях Сштепі Ргоїосої5 іп Ітітипоіоду (9. Е. Соїїдап еї аї, едв., 1999, включаючи доповнення, що вийшли до 2001 р. включно); Сигтепі РгоїосоїЇ5 іп МоїІесшаг
Віоіоду (Р. М. А!,зибеї еї аї, еа5., 1987, включаючи доповнення, що вийшли до 2001 р. включно);
Моїесшіаг СіІопіпд: А І арогаїгу Мапиаї, третє видання (ЗатбогоокК апа Киззеї, 2001); РОК: Те
Роїутегазе СНаїп Реасійоп, (Миїї5 еї аї., єдв., 1994)3; Тне Іттипоаззау Напароок (0. М/їа, єд.,
Зіоскіоп Ргез5 МУ, 1994); Віосопіпдаїе Тесппідцез (Стед Т. Нептапзоп, ейд., Асадетіс Ргевзв, 1996); Меїйноа5 ої Іттипоіодіса! Апаїувзів (А. Маззеуєй, МУ. Н. Аїрей, апа М. А. 5іаїіпев, єдв.,
М/віпнєїт: МСН Мепадз дезеїІзснай трнН, 1993), Напом апа І апе Овіпа Апііродієв: А І арогаюгу
Мапиаї Сода бргіпу Натог І арогаюгу Ргевз5, Со 5ргіпд Нагброг, М.У., 1999; апа Веаисаде еї аї. едв., Сцтепі Ргоїосоїв іп Мисієїс Асій Спетівігу допп УМіеу б 5опв, Іпс., Мему МоїКк, 2000).
Використовувані тут терміни "антитіло" і "антитіла" означають моноклональні антитіла, мультиспецифічні антитіла, людські антитіла, гуманізовані антитіла, синтетичні антитіла, химерні антитіла, поліклональні антитіла, верблюжі антитіла, одноланцюжкові Ем (5сСЕм), одноланцюжкові антитіла, Раб-фрагменти, Е(аб)-фрагменти, біспецифічні Ем (загм), зв'язані дисульфідним зв'язком, інтраантитіла й антиідіотипові (анти-І0) антитіла (включаючи, наприклад, анти-ій4 і анти-анти-ій антитіла проти антитіл відповідно до винаходу) і епітоп- зв'язувальні фрагменти будь-яких перерахованих вище антитіл. Зокрема, антитілами є молекули імуноглобуліну і імунологічно активні фрагменти молекул імуноглобуліну, тобто бо молекули, що містять антигензв'язувальний сайт. Молекули імуноглобуліну можуть належати до будь-якого типу (наприклад, Ідс, ІДЕ, ІМ, дО, ІдА і дм), класу (наприклад, Іде, Ід», ІдСз, ІДС,
ІА: і ІдАг) або підкласу.
Використовувані тут терміни "імуноспецифічно зв'язується", "Іімуноспецифічно розпізнає", "специфічно зв'язується", "специфічно розпізнає" і аналогічні терміни стосуються молекул, що специфічно зв'язуються з антигеном (наприклад, з епітопом або з імунним комплексом), але не зв'язуються специфічно з іншою молекулою. Молекула, що специфічно зв'язується з антигеном, може зв'язуватися з іншими пептидами або поліпептидами з більш низькою афінністю, як було визначено, наприклад, за допомогою імуноаналізів, ВіАсоге або інших аналізів, відомих фахівцям. Переважно, щоб молекули, що специфічно зв'язуються з антигеном, не мали здатність перехресно реагувати з іншими білками. Молекули, що специфічно зв'язуються з антигеном, можуть бути ідентифіковані, наприклад, за допомогою імуноаналізів, ВіАсоге або іншими методами, відомими фахівцям.
Використовуваний тут термін "імунний комплекс" означає структуру, що утворюється в тому випадку, коли щонайменше одна молекула-мішень і щонайменше один гетерологічний поліпептид, що містить Есу-ділянку, зв'язуються один з одним з утворенням комплексу з більш високою молекулярною масою. Прикладами імунних комплексів є комплекси "антиген-антитіло", що можуть бути розчинними або складатися з частинок (наприклад, комплекс антиген/антитіло на клітинній поверхні).
Використовувані тут терміни "важкий ланцюг", "легкий ланцюг", "варіабельна ділянка", "каркасна ділянка", "константний домен" і т. п. мають своє загальноприйняте значення, відоме фахівцям в галузі імунології, і означають домени в природних імуноглобулінах і відповідні домени синтетичних (наприклад, рекомбінантних) білків, що зв'язуються (наприклад, гуманізованих антитіл, одноланцюжкових антитіл, химерних антитіл і т. п.). Основною структурною одиницею природних імуноглобулінів (наприклад, ДС) є тетрамер, що має два легкі ланцюги і два важкі ланцюги і звичайно експресується у вигляді глікопротеїну розміром приблизно 150000 Да. Аміно-кінцева ("М") частина кожного ланцюга включає варіабельну ділянку приблизно з 100-110 або більше амінокислот, що, головним чином, відповідальні за розпізнавання антигену. Карбокси-кінцева ("С") частина кожного ланцюга означає константну ділянку, де легкі ланцюги мають один константний домен, а важкі ланцюги звичайно мають три
Зо константні домени і шарнірну ділянку. Таким чином, структура легких ланцюгів молекули Їдс являє собою п-МІ-Сі-с, а структура важких ланцюгів с являє собою п-Мн-Сні-Н-Сна-Сназ-с (де Н являє собою шарнірну ділянку). Варіабельні ділянки молекули ІдСс складаються з гіперваріабельних ділянок (СОК, ділянок, які визначають комплементарність), що містять залишки, які контактують з антигеном і не-СОВ-сегментами, що є каркасними сегментами, які, по суті, зберігають структуру і визначають положення СОЕ-петель (хоча деякі каркасні залишки можуть також контактувати з антигеном). Таким чином, Мі- і Мн--домени мають структуру п-ЕНІ1,
СОН, ЕНг2, СОР, ЕВЗ, СОВЗ, ЕВА-с.
Що стосується зв'язувальних білків або антитіл (визначених тут загалом), то присвоєння амінокислот кожному домену здійснюють відповідно до визначень по Кебату, Зедиепсев5 ої
Ргоївїп5 ої Іттипоіодіса! Іпієгеві (Маїопа! Іпбійшев ої Неанй, ВеШезаа, Ма., 1987 апа 1991).
Амінокислоти варіабельних ділянок зрілих важких і легень ланцюгів імуноглобулінів позначають по положенню амінокислоти в ланцюзі. Кебатом були описані різні амінокислотні послідовності для антитіл, ідентифікована амінокислотна консенсусна послідовність для кожної підгрупи, і кожній амінокислоті був присвоєний номер залишку. Схема нумерації по Кебату поширюється і на антитіла, не включені в його короткий посібник з вирівнювання розглянутого антитіла з однієї з консенсусних послідовностей, пронумерованих по консервативних амінокислотах відповідно до нумерації Кебата. Цей метод присвоєння номерів залишкам стає традиційним у даній галузі і дозволяє легко ідентифікувати амінокислоти в еквівалентних положеннях різних антитіл, включаючи химерні або гуманізовані варіанти. Так, наприклад, амінокислота в положенні 50 легкого ланцюга людського антитіла займає положення, еквівалентне положенню 50 амінокислоти в легкому ланцюзі мишачого антитіла.
Використовуваний тут термін "важкий ланцюг" визначений як важкий ланцюг антитіла да. У інтактному нативному ЇдС; важкий ланцюг містить МН-домен, СНІ1-домен, шарнірну ділянку,
СНег-домен і СНЗ-домен імуноглобуліну. В описі даного винаходу залишки у важкому ланцюзі
Ід пронумеровані відповідно до Європейської нумерації (ЕО-нумерації), як описано в публікації
Кабаї єї аї!., бедиепсевз ої Ргоївїіп5 ої Іттипоіодісаї! Іпієгеві, 5 Ед. Рибіїс Неанй 5егуісе, МНІ, МО (1991), що точно вводиться в даний опис за допомогою посилання. "ЕЄЕО-нумерація по Кебату" означає ЕО-нумерацію людського антитіла Ідс1. Приклади амінокислотних послідовностей, що містять шарнірну ділянку, СН2- і СНЗ-домени людського ІдО1, представлені на фіг. ТА і 18, як бо описано нижче. На фіг. ТА їі 18 також представлені амінокислотні послідовності шарнірної ділянки, СН2- і СНЗ-доменів важких ланцюгів Ідсе2, доз ї Ід04. Амінокислотні послідовності ізотипів Ідс2, ІдеЗ і Ід54 вирівнювали з послідовністю Ідс1 шляхом уведення першого й останнього цистеїнових залишків відповідних шарнірних ділянок, які утворюють 5-5 зв'язки між важкими ланцюгами, у ті самі положення. У шарнірній ділянці Ідс2 і ІдОСЗ не всі залишки пронумеровані відповідно до ЕО-нумерації. "Шарнірна ділянка" або "шарнірний домен" загалом визначені як фрагмент, розташований від СІ0216 до Рго230 людського ІД01. Приклад амінокислотної послідовності шарнірної ділянки людського (951 представлений на фіг. 1А (амінокислотні залишки на фіг. ТА пронумеровані відповідно до системи нумерації Кебата). Шарнірні ділянки ІдСї інших ізотипів можуть бути вирівняні з послідовністю 91 шляхом уведення першого й останнього цистеїнових залишків, що утворюють 5-54 зв'язки між важкими ланцюгами, у ті самі положення, як показано на фіг. 1А.
Використовувані тут терміни "Рсо-ділянка", "Ро-домен" або аналогічні терміни визначають як
С-кінцеву ділянку важкого ланцюга Ідс. Приклад амінокислотної послідовності, що містить людський ІдДОС1, представлений на фіг. 18. Хоча межі можуть варіюватися дуже незначно, як було визначено відповідно до системи нумерації Кебата, однак було встановлено, що Ес-домен розташований від амінокислоти 231 до амінокислоти 447 (амінокислотні залишки на фіг. 18 пронумеровані відповідно до системи нумерації Кебата). На фіг. 1В також представлені приклади амінокислотних послідовностей Ес-ділянок ізотипів Ідс, а саме, Ідса2, доз і Ід.
Ес-ділянка ІДС містить два константні домени, СН2 і СНЗ. СН2-домен Ес-ділянки людського
Ід; звичайно розташований від амінокислоти 231 до амінокислоти 341, як було визначено відповідно до системи нумерації Кебата (фіг. 18). СНЗ-домен Ес-ділянки людського Ід звичайно розташований від амінокислоти 342 до амінокислоти 447, як було визначено відповідно до системи нумерації Кебата (фіг. 18). Унікальність СН2-домену Рс-ділянки людського да (який також називається доменом "Су2") полягає в тому, що він не утворює тісно зв'язану пару з іншим доменом. Точніше, два М-зв'язаних розгалужених вуглеводних ланцюги убудовані між двома СН2-доменами інтактного нативного да.
Використовувані тут терміни "ЕсуВ-зв'язувальний білок", "ЕсуВ-антитіло" і "анти-Есув антитіло" є синонімами й означають різні імуноглобулін-подібні білки або білки, які походять від імуноглобуліну. "ЕсуВ-зв'язувальні білки" зв'язуються з Есук за допомогою взаємодії з Мі- і/або
Зо Мв-доменами (на відміну від Есу-опосередковуваного зв'язування). Прикладами Есув- зв'язувальних білків є повністю людські, поліклональні, химерні і гуманізовані антитіла (наприклад, що містять 2 важкі і 2 легкі ланцюги), їхні фрагменти (наприклад, Раб-, Рар-, Е(ав)»- і Ем-фрагменти), біфункціональні або мультифункціональні антитіла (див., наприклад,
Іапламесспіа еї аі. (1987) "Пе Ов5е ОЇ Нурпа Нурідота5 То Тагаєї Нитап Суююхіс Т
Гутрпосуїев" Єиг. У. Іттипої. 17:105-111), одноланцюжкові антитіла (див., наприклад, Віга еї аї. (1988) "Зіпдіє-СНаіп Апііїдеп-Віпаїпа Ргоїєїпв" Зсіеєпсе 242:423-26), злиті білки (наприклад, злиті білки фагового представлення), "мініантитіла" (див., наприклад, патент США Мо 5837821) і інші антигензв'язувальні білки, що містять Мі- і/або Мн-домен або його фрагмент. В одному з аспектів винаходу ЕсуВПША-зв'язувальним білком є "тетрамерне антитіло", тобто антитіло, що в основному має структуру природного Іда і містить варіабельні і константні домени, тобто два легкі ланцюги, що містять Мі -домен і константний домен легкого ланцюга, і два важкі ланцюги, що містять Мн-домен, шарнірну ділянку і константні домени важкого ланцюга.
Використовуваний тут термін "антагоністи Есук" і аналогічні терміни означають білкові і небілкові речовини, включаючи невеликі молекули, які інгібують щонайменше одну біологічну активність ЕсукК, наприклад, блокують передачу сигналу. Так, наприклад, молекули відповідно до винаходу блокують передачу сигналу за допомогою інгібування зв'язування да з ЕсувВ.
Використовуваний тут термін "похідне", що стосується поліпептидів або білків, означає поліпептид або білок, що містить амінокислотну послідовність, яка була модифікована шляхом уведення замін, делецій або додавань амінокислотних залишків. Використовуваний тут термін
БО "похідне" також означає поліпептид або білок, який був модифікований, наприклад, за допомогою ковалентного зв'язування молекули будь-якого типу з поліпептидом або білком.
Прикладами способів модифікації антитіла є, але не обмежуються ними, глікозилування, ацетилування, ПЕГилування, фосфорилування, амідування, дериватизація відомими захисними/Юлокуючими групами, протеолітичне розщеплення, зв'язування з клітинним антигеном або з іншим білком і т. п. Похідне поліпептиду або білка може бути отримане шляхом хімічних модифікацій із застосуванням методів, відомих фахівцям, включаючи, але не обмежуючись ними, специфічне хімічне розщеплення, ацетилування, формілування, метаболічний синтез тунікаміцину і т. п. Крім того, похідне поліпептиду або білка має функцію, аналогічну або ідентичну функції поліпептиду або білка, від якого воно походить.
Використовуваний тут термін "похідне", що стосується небілкового похідного, означає вторинну органічну або неорганічну молекулу, що утворюється на основі структури першої органічної або неорганічної молекули. Похідне органічної молекули включає, але не обмежується ними, молекулу, модифіковану, наприклад, у результаті додавання або делеції гідроксильної, метильної, етильної, карбоксильної групи або аміногрупи. Органічна молекула може бути також етерифікованою, алкилованою і/або фосфорилованою.
Використовуваний тут термін "молекула діатіла" означає комплекс двох або більш поліпептидних ланцюгів або білків, кожні з яких містять щонайменше один Мі-домен і один Мн- домен або їхні фрагменти, де обидва домени містяться в одному поліпептидному ланцюзі. У деяких варіантах винаходу, "молекула діатіла" включає молекули, що містять Ес або шарнірну ділянку-Ес-домен. Вказані поліпептидні ланцюги в комплексі можуть бути однаковими або різними, тобто, молекула діатіла може являти собою гомомультимер або гетеромультимер. У конкретних аспектах винаходу "молекула діатіла" включає димери або тетрамери, або вказані поліпептидні ланцюги, що містять Мі- і Мн-домен. Окремі поліпептидні ланцюги, що містять мультимерні білки, можуть бути ковалентно зв'язані щонайменше з одним іншим пептидом мультимера міжланцюговими дисульфідними зв'язками.
Використовувані тут терміни "розлад" і "захворювання" є синонімами й означають патологічний стан в індивідуума. Зокрема, термін "аутоїмунне захворювання" є синонімом терміна "аутоїмунний розлад" і означає стан індивідуума, що характеризується ушкодженням клітин, тканин і/або органів, що викликається імунологічною реакцією індивідуума на свої власні клітини, тканини і/або органи. Термін "запальне захворювання" є синонімом терміна "запальний розлад" і означає стан індивідуума, що характеризується запаленням, а переважно хронічним запаленням. Аутоїмунні розлади можуть асоціюватися, а можуть і не асоціюватися з запаленням. Крім того, запалення може викликатися, а може і не викликатися аутоіїмунним розладом. Таким чином, деякі розлади можуть бути охарактеризовані як аутоімунні і запальні розлади.
Використовуваний тут термін "ідентичні поліпептидні ланцюги" також означає поліпептидні ланцюги, що мають майже ідентичні амінокислотні послідовності, наприклад, включаючи ланцюги, що мають розходження в одній або більше амінокислотах, а переважно консервативні амінокислотні заміни, що не чинять значного впливу на активність двох поліпептидних ланцюгів.
Використовуваний тут термін "рак" означає новоутворення або пухлину, що утворюються в результаті аномального неконтрольованого росту клітин. Більш конкретно, використовуваний тут термін "рак" включає лейкоз і лімфоми. У деяких варіантах винаходу рак означає доброякісну пухлину, що зберігає свою локалізацію. В інших варіантах винаходу рак означає злоякісну пухлину, що проникає в прилеглі структури організму і руйнує їх, а також поширюється і на віддалені ділянки. У деяких варіантах винаходу рак асоціюється зі специфічним раковим антигеном.
Використовуваний тут термін ""імуномодулюючий агент" і його варіанти означає агент, що модулює імунну систему хазяїна. У деяких варіантах винаходу імуномодулюючим агентом є імуносупресорний агент. У деяких інших варіантах винаходу імуномодулюючим агентом є імуностимулюючий агент. Імуномодулюючими агентами є, але не обмежуються ними, невеликі молекули, пептиди, поліпептиди, злиті білки, антитіла, неорганічні молекули, агенти-міметики й органічні молекули.
Використовуваний тут термін "епітоп" означає фрагмент поліпептиду або білка або небілкову молекулу, що мають антигенну або імуногенну активність у тварини, переважно в ссавця, а найбільш переважно в людини. Епітоп, який має імуногенну активність, являє собою фрагмент поліпептиду або білка, що виробляє гуморальну відповідь у тварини. Епітоп, що має антигенну активність, являє собою фрагмент поліпептиду або білка, з яким імуноспецифічно зв'язується антитіло, як може бути визначено будь-яким методом, добре відомим фахівцям, наприклад, за допомогою імуноаналізів. Антигенні епітопи необов'язково повинні бути імуногенними.
Використовуваний тут термін "фрагмент" означає пептид або поліпептид, що містить амінокислотну послідовність, яка складається щонайменше з 5 суміжних амінокислотних залишків, щонайменше з 10 суміжних амінокислотних залишків, щонайменше з 15 суміжних амінокислотних залишків, щонайменше з 20 суміжних амінокислотних залишків, щонайменше з 25 суміжних амінокислотних залишків, щонайменше з 40 суміжних амінокислотних залишків, щонайменше з 50 суміжних амінокислотних залишків, по меншій мері з 60 суміжних амінокислотних залишків, щонайменше з 70 суміжних амінокислотних залишків, щонайменше з 80 суміжних амінокислотних залишків, щонайменше з 90 суміжних амінокислотних залишків, бо щонайменше з 100 суміжних амінокислотних залишків, щонайменше з 125 суміжних амінокислотних залишків, щонайменше з 150 суміжних амінокислотних залишків, щонайменше з 175 суміжних амінокислотних залишків, щонайменше з 200 суміжних амінокислотних залишків, або щонайменше з 250 суміжних амінокислотних залишків амінокислотної послідовності іншого поліпептиду. У конкретному варіанті винаходу фрагмент поліпептиду зберігає щонайменше одну функцію цього поліпептиду.
Використовувані тут терміни "нуклеїнові кислоти" і "нуклеотидні послідовності" включають молекули ДНК (наприклад, КДНК або геномну ДНК), молекули РНК (наприклад, мРНК), комбінації молекул ДНК і РНК або гібридні молекули ДНК/РНК і аналоги молекул ДНК або РНК.
Такі аналоги можуть бути отримані з використанням, наприклад, нуклеотидних аналогів, якими є, але не обмежуються ними, інозин або тритиловані основи. Такі аналоги можуть також включати молекули ДНК або РНК, що містять модифіковані кістяки, які надають молекулам цінні властивості, такі як, наприклад, резистентність до нуклеаз або підвищена здатність проходити через клітинні мембрани. Нуклеїнові кислоти або нуклеотидні послідовності можуть бути одноланцюжковими і дволанцюжковими, можуть містити одноланцюжкові і дволанцюжкові частини, і можуть містити триланцюжкові частини, але переважними є дволанцюжкові ДНК.
Використовуваний тут термін "терапевтично ефективна кількість" означає кількість терапевтичного агента, достатню для терапії або лікування захворювання або розладу.
Терапевтично ефективна кількість може означати кількість терапевтичного агента, достатню для уповільнення розвитку захворювання або мінімізації тяжкості захворювання, наприклад, для уповільнення прогресування раку або мінімізації поширення раку. Терапевтично ефективна кількість може також означати кількість терапевтичного агента, що буде давати терапевтичний ефект при терапії або лікуванні захворювання. Крім того, терапевтично ефективна кількість терапевтичного агента відповідно до винаходу означає кількість терапевтичного агента, узятого окремо або в комбінації з іншими терапевтичними агентами, що буде давати терапевтичний ефект при терапії або лікуванні захворювання.
Використовувані тут терміни "профілактичний агент" і "профілактичні агенти" означають будь-який) агент(и), який(ї) може (можуть) бути використаний(ї) для попередження розладу або попередження рецидивів або поширення такого розладу. Профілактично ефективна кількість може означати кількість профілактичного агента, достатню для попередження рецидивів або
Зо поширення гіперпроліферативного захворювання, а зокрема, раку, зниження або випадків захворюваності на рак пацієнтів, включаючи, але не обмежуючись ними, пацієнтів зі схильністю до розвитку гіперпроліферативного захворювання, наприклад, пацієнтів з генетичною схильністю до раку, або пацієнтів, що раніше піддавалися впливу канцерогенів. Профілактично ефективна кількість може також означати кількість профілактичного агента, що буде давати профілактичний ефект при попередженні захворювання. Крім того, профілактично ефективна кількість профілактичного агента відповідно до винаходу означає кількість профілактичного агента, узятого окремо або в комбінації з іншими агентами, що буде давати профілактичний ефект при попередженні захворювання.
Використовувані тут терміни "попереджати", "попереджуючий" і "попередження" стосуються попередження рецидивів або початку розвитку одного або більше симптомів розладу в індивідуума після введення профілактичного або терапевтичного агента.
Використовуваний тут термін "у комбінації" означає використання більше ніж одного профілактичного і/або терапевтичного агентів. При вживанні терміна "у комбінації" не мається на увазі обмеження порядку введення профілактичного і/або терапевтичного агентів індивідууму, що страждає на розлад. Перший профілактичний або терапевтичний агент може бути введений до (наприклад, за 5 хвилин, 15 хвилин, 30 хвилин, 45 хвилин, 1 годину, 2 години, 4 години, 6 годин, 12 годин, 24 години, 48 годин, 72 години, 96 годин, 1 тиждень, 2 тижні, З тижні, 4 тижні, 5 тижнів, б тижнів, 8 тижнів або 12 тижнів) уведення другого профілактичних або терапевтичного агента; або одночасно з уведенням вказаного другого профілактичного або терапевтичного агента, або після (наприклад, через 5 хвилин, 15 хвилин, 30 хвилин, 45 хвилин, 1 годину, 2 години, 4 години, 6 годин, 12 годин, 24 години, 48 годин, 72 години, 96 годин, 1 тиждень, 2 тижні, З тижні, 4 тижні, 5 тижнів, 6 тижнів, 8 тижнів або 12 тижнів) уведення вказаного другого профілактичного або терапевтичного агента індивідууму, що страждає на розлад.
Використовуваний тут термін "ефекторна функція" означає біохімічний процес, обумовлений взаємодією Ес-ділянки антитіла з Ес-рецептором або антигеном. Ефекторними функціями є, але не обмежуються ними, антитіло-залежна клітинно-опосередковувана цитотоксичність (АОСС), антитіло-залежний клітинно-опосередковуваний фагоцитоз (АЮСР) ії комплемент-залежна цитотоксичність (СОС). Ефекторними функціями є функції, що здійснюються після зв'язування з антигеном і незалежно від зв'язування з антигеном.
Використовуваний тут термін "ефекторна клітина" означає клітину імунної системи, яка експресує один або більше Ес-рецепторів і опосередковує здійснення однієї або більше ефекторних функцій. Ефекторними клітинами є, але не обмежуються ними, моноцити, макрофаги, нейтрофіли, дендритні клітини, еозинофіли, гладкі клітини, тромбоцити, В-клітини, великі гранулярні лімфоцити, клітини Лангерганса, природні клітини-кілери (МК), і ці клітини можуть походити від будь-яких організмів, таких як, але не обмежуваних ними, людина, миша, щур, кролики і мавпи.
Використовуваний тут термін "специфічно зв'язується з імунним комплексом" і аналогічні терміни стосуються молекул, що специфічно зв'язуються з імунним комплексом і не зв'язуються специфічно з іншою молекулою. Молекула, що специфічно зв'язується з імунним комплексом, може зв'язуватися з іншими пептидами або поліпептидами з більш низькою афінністю, і може бути визначена, наприклад, за допомогою імуноаналізів, ВіАсоге або інших аналізів, відомих фахівцям. При цьому переважно, щоб молекули, які специфічно зв'язуються з імунним комплексом, були нездатні перехресно реагувати з іншими білками. Молекули, які специфічно зв'язуються з імунним комплексом, можуть бути ідентифіковані, наприклад, за допомогою імуноаналізів, ВіАсоге, або іншими методами, відомими фахівцям.
Використовуваний тут термін "стабільний злитий білок" означає злитий білок, який піддається мінімального ступеня розкладання або взагалі не піддається розкладанню в процесі його продукування і/або збереження, як може бути визначено за допомогою стандартних біологічних і функціональних аналізів, відомих фахівцям, і який може зберігатися протягом тривалого періоду часу, не втрачаючи при цьому свою біологічну активність, наприклад, активність зв'язування з ЕсувВ. 4. Короткий опис графічного матеріалу
Фіг 1А-В. Амінокислотна послідовність СНІ1-ділянки, шарнірної ділянки і Ес-ділянки людського ІДС
На фігурах 1А) і (В) представлені амінокислотні послідовності шарнірного домену (А) і Ес- домену (В) людських ІдС1, Ідс2, доз і Ід4. (шарнірний домен Їдс1 (5ЕО ІЮ МО: 1); шарнірний домен Ідс2 (5ЕО ІЮ МО: 2); шарнірний домен дез (ЗЕО ІЮ МО: 3); шарнірний домен Ідс4 (5ЕО
ІО МО: 4); Ес-домен Ід1 (ЗЕО ІЮ МО: 5); Ес-домен Ід2 (ЗЕО ІЮ МО: 6); Ес-домен доз (5ЕО ІЮ
Зо МО: 7); Ес-домен їдДе1 (5ЕО ІО МО: 8)). Амінокислотні залишки, вказані на фігурах ТА і 18, пронумеровані відповідно до системи нумерації БЮ Кебата. Послідовності ізотипів вирівнювали з послідовністю ЇДО1 шляхом уведення першого й останнього цистеїнових залишків відповідних шарнірних ділянок, які утворюють 5-5 зв'язки між важкими ланцюгами, у ті самі положення. На фігурі 18 залишки в СН2-домені позначені ж, а залишки в СНЗ-домені позначені --.
Фіг. 2. Схематичне представлення поліпептидних ланцюгів ковалентно зв'язаних біфункціональних діатіл
Поліпептиди ковалентно зв'язаних біфункціональних діатіл складаються з Мі -домену антитіла і МН-домену антитіла, відділених один від одного коротким пептидним лінкером.
Лінкер, який складається з 8 амінокислотних залишків, запобігає самозбиранню одного поліпептидного ланцюга в 5сЕм-конструкції, і замість цього, в основному, відбувається взаємодія між МІ- ії МН-доменами різних поліпептидних ланцюгів. Були створені 4 конструкції (кожна конструкція зчитується з аміно-кінця ("п"), тобто з лівого краю конструкції, до карбокси-кінця ("с"), тобто на фігурі праворуч): конструкція (1) (ЗЕО ІЮ МО: 9) містить п-МІ-домен Ни286 - лінксер (бССБОСОСО (ЗЕО ІЮО МО: 10)) - МН-домен Ни308 - і С-кінцеву послідовність (І (1040)-с; конструкція (2) (ЗЕО ІЮ МО: 11) містить п-МІ -домен Низ30О8 - лінкер (бОСОБОСОО (5ЕО ІЮО МО: 10)) - МнН-домен Ни286 - і С-кінцеву послідовність (І (5(С)-с; конструкція (3) (ЗЕО ІЮ МО: 12) містить п-МІ -домен Ни3О8 - лінкер (бСОСБОСОО (БО ІЮО МО: 10)) - МН-домен НизЗО8 - і С- кінцеву послідовність ((0(5С)-с; конструкція (4) (ЗЕО ІО МО: 13) містить п-МІ-домен Ни286 - лінкер (ЯОСООСБОСОС (5ЕБО ІЮО МО: 10)) - МН-домен Нигвб - і С-кінцеву послідовність (І (5С)-с.
Фіг. 3. Аналіз афінно очищених діатіл за допомогою електрофорезу в ДСН-ПААГ
Афінно очищені діатіла піддавали ДСН-ПААГ-аналізу у відновних умовах (доріжки 1-3) або у невідновлювальних умовах (доріжки 4-6). Вказані приблизні молекулярні маси стандарту (між доріжками З і 4). Доріжки 1 і 4, п3058 СМО; доріжки 2 і 5, п286 СМ; і доріжки З і 6, п286-нЗзав сво.
Фіг. 4 А-В. Аналіз афінно очищених діатіл за допомогою ексклюзійної хроматографії (ЕХ)
Афінно очищені діатіла піддавали ЕХ-аналізу. (А) Профіль елюювання відомих стандартів: повнорозмірного ДС (7150 кДа), Раб-фрагмента Ідсї (750 кДа) і 5сЕм (4-30 кДа); (В) Профіль елюювання п286 СМО, пЗо8 СМ і п286-нЗзав8 СВО.
Фіг. 5. Зв'язування п286-п3О8 СВО з 500328 і 5СО16А
Зв'язування п286-п30о8 СВО з 520328 і 5С0О16А аналізували за допомогою "сендвіч»-ЕЇ І5А. 5020328 використовували як білок-мішень. Другим зондом був ПХ-кон'югований 5СО16А. пЗ3О8
СМО, яке зв'язується з СО16А, використовували як контроль.
Фіг. 6 А-С. ВІАСОВЕ-аналіз на зв'язування діатіла з 5С0О16А, 5СО328В і 50032А
Зв'язування п286-п3о8 СВО, п286 СМО і п368 СМО з 5СО16А, 520328 і 5С032А (негативний контроль) аналізували за допомогою ППР-аналіза. пЗ3О8 5сЕм також тестували як контроль. (А) Зв'язування з 5С0О16; (В) зв'язування з 500328 і (С) зв'язування з 5С0032А. Діатіла наносили шляхом інжекції в концентрації 100 нМ, а 5сЕм - у концентрації 200 нМ, по всій поверхні рецептора зі швидкістю потоку 50 мл/хв протягом 60 секунд.
Фіг. 7 А-С. ВІАСОВЕ-аналіз на зв'язування діатіла з 5СО16А і 500328
Зв'язування п286-п3о8 СВО, п286 СМО і п308 СМО з 5С016А і 520328 аналізували за допомогою ППР-аналіза. п308 5сЕм також тестували як контроль. (А) Зв'язування п3Оо8 СМО з 5СО16А; (В) зв'язування п286-п3058 СВО з 5СО16А; (С) зв'язування пЗ3О8 5сЕм з 5СО16А; (0) зв'язування п286 СМО з 520328; і (Е) зв'язування п286-п3о8 СВО з 5020328. Діатіла наносили шляхом інжекції в концентраціях 6,25-200 нМ по всій поверхні рецептора зі швидкістю потоку 70 мл/хв протягом 180 секунд.
Фіг. 8. Схематичне представлення взаємодії поліпептидних ланцюгів, які містять МІі- і МН- домени, з утворенням ковалентно зв'язаної біспецифічної молекули діатіла
МН» ї СООН являють собою аміно-кінець і карбокси-кінець кожного поліпептидного ланцюга, відповідно. 5 являє собою С-кінцевий цистетновий залишок на кожному поліпептгидному ланцюзі. Мі. ї МН означають варіабельний домен легкого ланцюга і варіабельний домен важкого ланцюга, відповідно. Два поліпептидні ланцюги розділені штриховими і пунктирними лініями, що, зокрема, представляють лінкерні частини вказаних ланцюгів. пП286 Ем і п308 Ем означають епітоп-зв'язувальний сайт, специфічний до СОЗ2В і СО16, відповідно.
Фіг. 9. Схематичне представлення поліпептидних ланцюгів, які містять Ес-домени ковалентно зв'язаних біспецифічних функціональних діатіл
Представлені поліпептидні конструкції молекул діатіла відповідно до винаходу (кожна конструкція зчитується з аміно-кінця ("п"), тобто з лівої сторони конструкції, до карбокси-кінця ("с"), тобто на фігурі праворуч): конструкція (5) (ЗЕО ІЮ МО: 14) містить п-МіІ-домен Ни286 -
Зо перший лінкер (бЯ6О500О0О0 (5ЕО ІЮ МО: 10)) - МН-домен Низ3О8 - другий лінкер (І 5ОС)- і С- кінцевий Ес-домен людського Ідс1-С; конструкція (6) (ЗЕО ІЮ МО: 15) містить п-МіІ-домен
Низав - лінкер (ЗСОСЗОСОО (ЗЕО І МО: 10)) - МН-домен Ни28В6 - і другий лінкер (І ООС)- і С- кінцевий Ес-домен людського Ідс1-с; конструкція (7) (5ЕО ІЮ МО: 16) містить п-МІ -домен Ни3Вб - перший лінкер (б0бОс5ОСОО (БО ІЮО МО: 10)) - МН-домен Ни308 - і С-кінцеву послідовність ( сасСЕМАСЕС) (5ЕО ІО МО: 17)-с; конструкція (8) (ЗЕО ІО МО: 18) містить п-мМІ -домен НизЗО8 - лінкер (ЯССсБОСОО (5ЕБО ІЮ МО: 10)) - МН-домен Ни286 - другий лінкер (І ОС)- і С-кінцевий шарнірний домен/Ес-домен людського ІдО1 (з амінокислотною заміною А215М)-с.
Фіг. 10. Зв'язування молекул діатіла, що містять Ес-домени, з 500328 і 5С016А
Зв'язування молекул діатіла, що містять Ес-домени, з 5С032В і 5С0О16А аналізували за допомогою "сендвіч»-ЕГ І5А. Аналізовані антитіла були отримані з використанням З систем рекомбінантної експресії: контрансфекції РМОХб669 і рмохХ674, експресуючих конструкції 1 і 6, відповідно; контрансфекції рМОеХ667 і рМОохХб676, експресуючих конструкції 2 ії 5, відповідно; і контрансфекції рмОехХб674 і рмМоОхХб676, експресуючих конструкції 5 і б, відповідно. 500328 використовували як білок-мішень. Другим зондом був ПХ-кон'югований 5СО16А.
Фіг. 11. Схематичне представлення взаємодії двох поліпептидних ланцюгів, кожен з який містить Ес-домен, з утворенням двовалентного ковалентно зв'язаного діатіла
МН» ї СООН являють собою аміно-кінець і карбокси-кінець кожного поліпептидного ланцюга, відповідно. З являє собою щонайменше один дисульфідний зв'язок між цистеїновими залишками в другій лінкерній послідовності кожного поліпептидного ланцюга. Мі. ї МН означають варіабельний домен легкого ланцюга і варіабельний домен важкого ланцюга, відповідно. Два поліпептидні ланцюги розділені штриховими і пунктирними лініями, що, зокрема, представляють перші лінкерні частини вказаних ланцюгів. СН2 і СНЗ означають константні СН2- і СНЗ3-домени
Ес-домену. п286 Ем і п308 Ем означають епітоп-зв'язувальний сайт, специфічний до СОЗ32В і
СО16, відповідно.
Фіг. 12. Зв'язування молекул діатіла, що містять шарнірні домени/Ес-домени, з 500328 і 5СО16А
Зв'язування молекул діатіла, що містять Ес-домени, з 5С032В і 5С0О16А аналізували за допомогою "сендвіч»-ЕГ І5А. Аналізовані антитіла були отримані з використанням 4 систем рекомбінантної експресії: котрансфекції рМмОохХбб9-рмох674, експресуючих конструкції 1 і 6, бо відповідно; котрансфекції рмМоОохХбб9-рмохб678, експресуючих конструкції 2 і 8, відповідно;
котрансфекції рмоОохХб677-рмох674, експресуючих конструкції 7 і 6, відповідно; і котрансфекції рмохб677-рмох678, експресуючих конструкції 7 і 8, відповідно. 57С0032В використовували як білок-мішень. Другим зондом був ПХ-кон'югований 5СО16А.
Фіг. 13. Схематичне представлення взаємодії поліпептидних ланцюгів з утворенням тетрамерної молекули діатіла
МН» ї СООН являють собою аміно-кінець і карбокси-кінець кожного поліпептидного ланцюга, відповідно. 5 являє собою щонайменше один дисульфідний зв'язок між цистеїновим залишком у другій лінкерній послідовності Ес-несучого "більш важкого" поліпептидного ланцюга і цистеїновим залишком у С-кінцевій послідовності, що не несе Ес, "більш легкого" поліпептидного ланцюга. Мі і МН означають варіабельний домен легкого ланцюга і варіабельний домен важкого ланцюга, відповідно. Два поліпептидні ланцюги розділені штриховими і пунктирними лініями, що, зокрема, представляють перші лінкерні частини вказаних "більш важких" або ланцюгів лінкер вказаних "більш легких" ланцюгів. СН2 і СНЗ означають константні СН2- і СНЗ-домени Ес-домену. п286 Ем і п308 Ем означають епітоп- зв'язувальний сайт, специфічний до СОЗ2В і СО16, відповідно.
Фіг. 14. Схематичне представлення поліпептидних ланцюгів, які містять Ес-домени, що утворюють ковалентно зв'язані біспецифічні діатіла
Представлені поліпептидні конструкції, які утворюють молекули діатіла відповідно до винаходу (кожна конструкція зчитується з аміно-кінця ("п"), тобто з лівої сторони конструкції, до карбокси-кінця ("с"), тобто на фігурі праворуч): конструкція (93 (ЗЕО ІЮО МО: 19) містить п- шарнірний домен/Ес-домен людського Ід(е1-МІ -домен Низ308 - лінкер (дО (5ЕО ІЮО МО: 10)) - Мн-домен Ни286 - лінкер (б0Ос56505055) (5ЕО ІЮ МО 10)) і С-кінцеву послідовність | (0с- з; конструкція (10) (ЗЕО ІЮ МО: 20) містить п-Рс-домен людського ІД1-МІ -домен Ни3О8 - лінкер (аасесавца (ЗЕО ІЮ МО: 10)) - МН-домен Ни286 - лінкер (ЯССЗОСОО (ЗЕО ІЮО МО: 10)) - і С- кінцеву послідовність І (5(05С-с; конструкція (11) (ЗЕО ІЮ МО: 21) містить п-Мі-домен Ни286 (1050) - лінкер (ЗОСЗОСОСЄ (ЗЕО ІЮ МО: 10)) - МН-домен Низ3О8 - і С-кінцевий шарнірний домен/Рсо-домен людського ЇдДс1 з амінокислотною заміною А215М-с; конструкція (12) (ЗЕО ІЮ
МО: 22) містить п-мМІ -домен НизО8 - лінкер (бОС50(0(00о (ЗЕО ІЮО МО: 10)) - МН-домен Ни286 (44) - і С-кінцеву послідовність ЕМЕСЕС (ЗЕО ІО МО: 23)-с.
Зо Фіг. 15 А-В. Електрофорез у ДСН-ПААГ і вестерн-блот-аналіз афінних тетрамерних діатіл
Діатіла, продуковані з використанням систем рекомбінантної експресії, котрансфікованних векторами, експресуючими конструкції 10 і 1, конструкції 9 ії 1 і конструкції 11 ї 12, піддавали електрофорезу в ДСН-ПААГ у невідновлювальних умовах (А) і вестерн-блот-аналізу з використанням козячого антитіла проти людських ІДС1 Н-ї як зонда (В). Білки в ДСН-ПААГ-гелі візуалізували з використанням синього барвника Зітріу Вісе Загїезіаіп (Іпийгодеп). Для обох панелей А і В молекули діатіл, що містять конструкції 10 ії 1, конструкції 9 і 1 і конструкції 11 і 12А, представлені на доріжках 1, 2 і 3, відповідно.
Фіг. 16. Зв'язування молекул діатіл, що містять Ес-домени і сконструйовані міжланцюгові дисульфідні зв'язки, з 500328 і 5С016А
Зв'язування молекул діатіл, що містять Есо-домени і сконструйовані міжланцюгові дисульфідні зв'язку між "більш легким" і "Сільш важким" поліпептидними ланцюгами, з 520328 і 5СОр16А, оцінювали за допомогою "сендвіч»-ЕГ І5А. Аналізовані діатіла були отримані з використанням З систем рекомбінантної експресії: систем, експресуючих конструкції 1 ії 10; систем, експресуючих конструкції 1 і 9; ї систем, експресуючих конструкції 11 і 12, відповідно. 5020328 використовували як білок-мішень. Другим зондом був ПХ-кон'югований 5СО16А.
Зв'язування п308 використовували як контроль.
Фіг. 17. Схематичне представлення поліпротеїнового попередника молекули діатіла і схематичне представлення поліпептидних ланцюгів, що містять легкий ланцюг лямбда і/або шарнірні домени
Представлені поліпептидні конструкції, що містять молекули діатіла відповідно до винаходу (кожна конструкція зчитується з аміно-кінця ("п"), тобто з лівої сторони конструкції, до карбокси- кінця ("с"), тобто на фігурі праворуч): конструкція (13) (ЗЕО ІЮ МО: 95) містить п-МІ -домен 308 - перший лінкер (з05Ос5ОСОСО (5ЗЕО ІЮ МО: 10)) - МнН-домен 2.4052МН - другий лінкер (ОС) - сайт розпізнавання фурину (КАКК (5ЕБЕО І МО: 93)) - Мі-домен 2.4652 - третій лінкер (ассвсаса (ЗБОЮ МО: 10)) - МН-домен 308 - і С-кінцевий домен І Ос; (нуклеотидна послідовність, яка кодує ЗЕО ІЮ МО: 95, представлена в 5ЕО ІО МО: 96). Конструкція (14) (ЗЕО
ІО МО: 97) містить п-МІ. домен 308 - перший лінкер (бОСс50(0(0(0о (5ЕО ІЮ МО: 10)) - МН-домен 2.442УН - другий лінкер (ОС) - сайт розпізнавання фурину (КАКЕ (5ЕО ІЮ МО: 93)) - сайт
ЕМО (протеаза СЗ вірусу ящуру) - МІ -домен 2.4052 - третій лінкер (35056500 (5ЕО ІЮ МО: 10)) - 60 МН домен 358 - і С-кінцевий домен Ос; (нуклеотидна послідовність, яка кодує 5ЕО ІЮ МО:
97, представлена в 5ЕО ІЮ МО: 98). Конструкція (15) (ЗЕО ІЮ МО: 99) містить п-МІ -домен Ни286 - лінкеер (З6ОС5ОСОС (ЗЕО ІЮ МО: 10)) - МН-домен Ни308-С-кінцевий-домен ЕМЕСЕС (5ЕО ІЮ
МО: 23); (нуклеотидна послідовність, яка кодує БЕО ІЮО МО: 99, представлена в ЗЕО ІЮО МО: 100).
Конструкція (16) (ЗЕО ІЮ МО: 101) містить п-МІ-домен Низ3О8 - лінкер (бСООСБОСОО (5ЕО ІЮ
МО: 10)) - МнН-домен Ни286 - і С-кінневий-домен МЕРК5С (5ЕБО ІЮО МО: 77); (нуклеотидна послідовність, яка кодує ЗЕО ІЮ МО: 101, представлена в ЗЕО ІЮО МО: 102).
Фіг. 18. Зв'язування молекул діатіл, які походять від поліпротеїнової молекули-попередника, з тСО328 і 5СО16А
Зв'язування молекул діатіл, які походять від конструкції 13 поліпротеїнової молекули- попередника (ЗЕО І МО: 95), з мишачим СО32В (тСсСО328) і розчинним СО1Т6бА (5С016А), аналізували за допомогою "сендвіч»-ЕГ ІЗА. 520328 використовували як білок-мішень. Другим зондом був кон'югований з біотином 5СО16А.
Фіг. 19. Зв'язування молекул діатіл, що містять ланцюг лямбда і/або шарнірні домени, з 5620328 і 5С016А
Зв'язування молекул діатіл, що містять домени, які походять від С-кінця людського легкого ланцюга лямбда і/або шарнірного домену Ід, з 5СО328В і 5СО16А, аналізували, і отримані результати порівнювали з результатами для діатіл, що містить конструкції 1 і 2 (фіг. 5), за допомогою "сендвіч»-ЕГІЗА. Аналізовані діатіла були отримані з використанням системи рекомбінантної експресії, яка експресує конструкції 15 ії 16 (ЗЕО ІЮО МО: 99 і 5ЕО ІЮ МО: 101, відповідно). 520328 використовували як білок-мішень. Другим зондом був ПХ-кон'югований 5СОр16А. Стовпці з невеликими "боксами" представляють комбінацію конструкцій 15/16, а стовпці з великими "боксами" представляють комбінацію конструкцій 1/2.
Фіг. 20. Схематичне представлення САКТ 2856/4420, зв'язаних з СОЗ2В, локалізованому на поверхні клітин, і з молекулою, кон'югованою із флуоресцеїном
На діаграмі проілюстрована гнучкість "універсального адаптера" анти-флуоресцеїнової гілки
БАКТ, а також можливість заміни гілки 286 на гілку з іншою специфічністю. М-ділянки представлені у вигляді боксів, лінкери сОос50(0(00 (5БО ІЮО МО: 10) показані лініями, а дисульфідний зв'язок представлений як зв'язок, що з'єднує два ланцюги. Компоненти одного ланцюга показані синім, а компоненти іншого ланцюга показані рожевим. М - аміно-кінець; С -
Зо карбокси-кінець; Р. - флуоресцеїн, МІ. - варіабельна ділянка легкого ланцюга; МН - варіабельна ділянка важкого ланцюга.
Фіг. 21 (Панелі А і В). ПОАКТ 2856/4420 специфічно зв'язується з молекулами, кон'югованими з флуоресцеїном, і може одночасно зв'язуватися з СО32В (А) 286/4420 або 2886/3058 були зв'язані з ЕІ ІЗА-планшетами, покритими білком ФІТЦ-5.
Зв'язування і функцію гілки 286 детектували шляхом контактування з розчинним СОЗ2В, а потім з антитілом, специфічним до СОЗ2В, і з "другим" детектучим антитілом, кон'югованим із ПХ. (В) 2886/4420 або 2886/3058 були зв'язані з ЕІ ІЗА-планшетами, покритими Ниїдс: або ФІТЦ-НиЇда (конюгованими з флуоресцеїном). Зв'язування детектували шляхом контактування з поліклональною сироваткою, специфічною до Ем 286, а потім із ПХ-кон'югованим "другим" антитілом.
Фіг. 22 (Панелі А і В). Активація очищених В-клітин з використанням антитіл проти людського сбр798
Очищені В-клітини активували з використанням зростаючих концентрацій ФІТЦ-кон'югованих антитіл проти людського СО79р, СВ3.1-ФІТЦ (А) або СВ3.2-ФІТЦ (В) і 50 мкг/мл Е(аб)»- фрагмента, специфічного до Ес Іда, САМ (вісь х). В-клітини активували в присутності РВ5 (білі стовпці) або 5 мкг/мл а«РІТСаСОЗ32вВбБАКТ (чорні стовпці) або аСО16баСО032ВбАКТ (сірі стовпці).
Реакції здійснювали з трьома повторностями й обчислювали стандартні відхилення.
Фіг. 23 (Панелі А і В). Активація очищених В-клітин
Очищені В-клітини, узяті в другого здорового донора, активували, як описано на фіг. 22, панель В. Індекс проліферації вимірювали в клітинах, активованих у присутності ФІТЦ- кон'югованого анти-СО79р антитіла СВ3.2 (А), і порівнювали з індексом проліферації клітин, активованих у присутності неміченого антитіла СВ3З.2 (В).
Фіг. 24 (Верхня і нижня панелі). Виснаження мишачих В-клітин іп мімо у НСО16бА/В- трансгенних мишей з використанням МОО261
Мишам тСО32-/- пСр16бА-С5781/6, тоО32-/- пСО32В-05781/6 і тсО32-/- пСО16А-СО0328-С25781/6, виведеним шляхом схрещування клітинних колоній Масгосепісв, і.м. ін'єккгували МОО261 (10, 3, 1 або 0,3 мг/кг) або нерелевантне антитіло (ПЕ16, 10 мг/кг) на дні 0,
З, 7, 10, 14 їі 17. Кров брали на день -19 (попередній забір крові) і на дні 4, 11, 18, 25 і 32 для
ЕАС5-аналізу. Здоров'я й активність тварин реєстрували три рази на тиждень. Верхня панель:
п286-358 і МУММ тАбБ; нижня панель: миші, яким уводили п286-3028-пПСО16А або -НСОЗ32В, і миші, яким уводили М/ММ тАБ-пСО16А або - НСОЗ2В.
Фіг. 25. Виснаження мишачих В-клітин іп мімо у НСО16А/В-трансгеенних мишей з використанням 2.452-30:8 ОВ
Мишам тСО16-/-, тСО16-/- пСр1бА-С5781/6, тОСО16-/- ВСО16В- ії 0 тсО16-/- пСО16АпСО16О--, виведеним шляхом схрещування клітинних колоній Масгосепісв5, і.р. ін'єктували 2.452-3058 ОВ (75 мкг/миша) або РВ5 на дні 0, 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16 ї 18. Кров брали на день -10 (попередній забір крові) і на дні 4, 11 їі 18 для ЕАС5-аналізу. Здоров'я й активність тварин реєстрували три рази на тиждень.
Фіг. 26. Ілюстрація протипухлинної активності МОО261 на моделі, якій внутрішньовенно (і.м.) уводили людські пухлинні клітини лінії КАШІ 12-20-тижневим мишам тсО16-/-, НСО16бАз, ВАС1-/- С57В1/6б, виведеним шляхом схрещування клітинних колоній Масгосепісв, і.м. ін'єЄктували 5х105 клітин Каїїі на день 0. На дні б, 9, 13, 16, 20, 23, 27 і 30 мишей внутрішньоочеревинно обробляли (і.р.) 250, 25 або 2,5 мкг
МО0261 або РВ5З (негативний контроль). Потім мишей щодня спостерігали, і масу тіла реєстрували два рази на тиждень. Мишей, у яких розвивався параліч задніх кінцівок, умертвляли.
Фіг. 27. Експресія САКТ у хазяїнів, які не є ссавцями
Клітини ВІ210ОЕЗ (Момадеп) трансформували плазмідою рЕеЕТ25Б(ю) Т7-Іас-30О8/308, і колонії, резистентні до ампіциліну, використовували для посіву бульйонної культури. Коли культура досягала 00600-0,5 одиниць, для індукування експресії додавали 0,5 мМ ІРТО.
Культуру вирощували при 30 "С протягом 2 годин і збирали безклітинне середовище.
Фіг. 28. ЕГІЗА ВОВАКТ
ЕПІЗА-аналіз на зв'язування з п3058-п3058 БАКТ проводили на 96б-ямкових планшетах
Махізогр. Після реакції планшет три рази промивали РВ5-Т і виявляли з використанням 80 мкл/ямку субстрату ТМВ. Після 5-хвилинного інкубування реакцію припиняли додаванням 40 мкл/ямку 1945 На5Ох. 00450 нм зчитували на 96-ямковому планшеті-рідері і реєстрували з використанням комп'ютерної програми ЗОЕТітах. За даними зчитування будували криву за допомогою комп'ютерної програми сгарпРаадРгізт 3.03.
Фіг. 29. ОАКТ-індукована загибель людських В-клітин
Людські МКПК інкубували протягом ночі з вказаними молекулами. Апоптоз оцінювали за допомогою ЕАС5З-аналізу, і дані виражали як відсоток Рі--анексин-У--популяцій В-клітин (СО0205- клітин) від загального числа популяцій, що не пройшли ЕЗС/55С-сортинг.
Фіг. 30. Конструкції 885-С83.1 ОАВТ
Для ілюстрації даного винаходу була отримана множина конструкцій 885-С83.1 БАВТ.
Конструкції 5 і 6, або б і 7, або 8 і 9, або 9 і 10, які кодуються експресійними плазмідами, спільно переносили в клітини НЕК-293 для експресії 885-СВ3.1 БАКТ у присутності або під час відсутності антитіла проти Пад-мітки з використанням ліпофектаміну 2000 (Іпмігодеп).
Кондиціоноване середовище збирали три рази в кожні три дні. Потім кондиціоноване середовище очищали на СОЗ32В-афінній колонці.
Фіг. 31. ЕГІЗА 885-СВ3.1 ОАВТ
ЕПІЗА-аналіз на конкурентне зв'язування з 885-с3.1 ОАКТ/сСп8655 проводили на 96-ямкових планшетах Махізогр. Після реакції планшет три рази промивали РВ5-Її і виявляли з використанням 80 мкл/ямку субстрату ТМВ. Після 5-хвилинного інкубування реакцію припиняли додаванням 40 мкл/ямку 195 Н25Ох. 00450 нм зчитували на 96-ямковому планшеті-рідері і реєстрували з використанням комп'ютерної програми 5ОБЕТтах. За даними зчитування будували криву за допомогою комп'ютерної програми СтарпРаадРіізт 3.03.
Фіг. 32. Схематична ілюстрація чотиривалентної структури ОАКТ
На цій фігурі проілюстрована загальна структура молекул ЮАКТ, отриманих шляхом збирання чотирьох поліпептидних ланцюгів. Чотири антигензв'язувальні домени Ід-подібного рАВТ показані у вигляді смуг і темно-сірих еліпсів.
Фіг. 33. Ід-подібний чотиривалентний ОАКТ
На цій фігурі схематично представлені епітоп-зв'язувальні сайти Ід-подібного чотиривалентного САКТ.
Фіг. 34. ЕІ ІЗА-аналіз на зв'язування тСО32-пСО16А
На цій фігурі представлені результати ЕГІЗА-аналізу, які показали, що молекули І/д- подібного чотиривалентного ОАКТ приклада 6.10 зв'язуються з антигеном з більшою афінністю, ніж контрольне антитіло (сп-тСО32 тАБ) або інші молекули САКТ.
Фіг. 35. Схематична ілюстрація Ід-подібних молекул ОАКТ
На цій фігурі схематично представлені Ід-подібні молекули ОАКТ. Специфічність показана у вигляді затінених, візерункових або білих ділянок, константні ділянки зафарбовані чорними, а дисульфідні зв'язки показані чорними пунктирними лініями. На цій фігурі М-кінці всіх білкових ланцюгів знаходяться зверху, а С-кінці всіх білкових ланцюгів знаходяться внизу. Панелі А-Е представляють біспецифічні антитіла, а панелі Е-) представляють триспецифічні антитіла.
Панелі А і Е представляють тривалентні антитіла. Панелі В, С, Е, І ї У представляють шестивалентні антитіла. Панелі О, с і Н представляють восьмивалентні антитіла. Докладний опис окремих доменів представлено на фігурах 1, 2, 9, 14 і 17 і в Розділі 3.1.
Фіг. 36. Активність зв'язування біспецифічного антитіла НО2Вб 4.5-НОЗИВ 5.1
На фігурі 36 проілюстрована здатність біспецифічного антитіла Ни286 4.5-НиЗа8 5.1 (квадрати) зв'язуватися з СО32Б ії СО16ба у порівнянні з діатілами Ни286 4.5 або Низо8 5.1 (трикутники).
Фіг. 37. Схематичне представлення Е-спіральних і К-спіральних похідних ОАКТ
На фігурі 37 проілюстрована загальна конформація Е-спіральних і К-спіральних похідних рАНВТ.
Фіг. 38. Спіральна структура переважних Е-спіральних і К-спіральних розділювальних послідовностей
На фігурі 38 показана спіральна структура переважної "Е-спіральної" послідовності (ЕМААЇ ЕК)« (ЗЕО ІО МО: 299) і переважної "К-спіральної" послідовності (КМААЇ КЕ)« (ЗЕО ІЮ
МО: 300).
Фіг. 39. Ес-вмісні Е-спіральні і К-спіральні похідні ОАКТ
На фігурі 39 проілюстровані різні типи Ес-вмісних Е-спіральних і К-спіральних похідних рАКТ, які можуть бути утворені за допомогою перестановки ланцюгів.
Фіг. 40. Ексклюзійна хроматографія на Е-спіральних і/або К-спіральних похідних і на Ес- вмісних Е-спіральних і/або К-спіральних похідних П2В6МАпСВЗ САТ
На фігурі 40 представлені результати ексклюзійної хроматографії на Е-спіральних і/або К- спіральних похідних і Ес-вмісних Е-спіральних і/або К-спіральних похідних П2В6МАпСВЗ БАКТ.
Було проаналізовано чотири види таких молекул, кожна з яких мала Е-спіраль і К-спіраль: ЕК (без ЕРсо-ділянки), 2,1 мг; ЕЕс/К (Ес, зв'язаний з Е-спіраллю), 2,7 мг; Е/КЕс (Ес, зв'язаний з К- спіраллю), 1,8 мг; ЕЕс/КЕс (Ес, зв'язаний з К-спіраллю і Е-спіраллю того самого АКТ), 2,0 мг.
Фіг. 41. Структура отриманих димерних молекул
На фігурі 41 показана можлива структура отриманої димерної молекули, ідентифікованої на ексклюзійному хроматографі, представленому на фігурі 40.
Фіг. 42. Аналіз Е-спіральних і/або К-спіральних похідних і Ес-вмісних Е-спіральних і/або К- спіральних похідних п2ВбУАйСВЗ АКТ, проведений за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі з ДСН
На фігурі 42 представлені результати аналізу фракцій Е-спіральних і/або К-спіральних похідних і Ес-вмісних Е-спіральних і/або К-спіральних похідних П2Вб6ХМАпСВЗ БАКТ, отриманих за допомогою ексклюзійної хроматографії (фігура 40), де вказаний аналіз проводили за допомогою електрофорезу в поліакриламідном гелі з ДСН. Крайні доріжки: контрольні молекулярні маркери; доріжка 1: ЕК (без Ес-ділянки); доріжка 2: ЕЕс/К, агрегована фракція; доріжка 3: ЕЕс/К, мономерна фракція; доріжка 4: Е/КЕс, агрегована фракція; доріжка 5: Е/КЕс, мономерна фракція; доріжка 6: ЕЕс/КЕс, агрегована фракція; доріжка 7: ЕЕс/КЕс, димерна фракція; доріжка 8: ЕЕс/КЕс, мономерна фракція.
Фіг. 43. ЕІ ІЗА-аналіз на біспецифічне зв'язування
На фігурі 43 представлені результати порівняльного ЕГІЗА-аналізу на біспецифічне зв'язування Ес-вмісних Е-спіральних/К-спіральних похідних пП2ВбМАйСВЗ БАКТ (ЕРС/К або
Е/КЕс), П2В6ХАпСВЗ ВАКТ, контролю і похідного ЕЕС/КЕс пП2В86ХАпСВЗ БАКТ.
Фіг. 44. Здатність Е-спіральних і/або К-спіральних похідних і Ес-вмісних Е-спіральних і/або К- спіральних похідних П2В6МАпСВЗ АКТ інгібувати проліферацію Т-клітин
На фігурі 44 проілюстрована здатність Е-спіральних і/або К-спіральних похідних і Ес-вмісних
Е-спіральних і/або К-спіральних похідних П2ВбХАпСВЗ АКТ інгібувати проліферацію Т-клітин.
Фіг. 45. нСр16-НСОрЗ28 АВО-БВАВТ
На фігурі 45 схематично представлена рекомбінантна молекула антитіла НСО16-НСОЗ2В
АВО-ОАРКТ, яка складається з домену АВОЗ стрептококового білка С, злитого з рекомбінантним біспецифічним БАКТ, що вступає в імунну реакцію з антигенами пНСО16 і пСО328В.
Фіг. 4А6А-46.). Афінність зв'язування ПСО16-НСОЗ2В АВО-ВОАВТ
ЕПІЗА-планшети покривали антигеном СО16 (фігура 46А) або альбуміном людської сироватки (фігура 468) у концентрації 2 мкг/мл. НСО16-НСОЗ2В АВО-БАКТ (ни) і контрольний бо пСр16-пс0328 БАКТ (0) зв'язувалися при різних концентраціях, починаючи з 2 мкг/мл. У планшет додавали біотинільований 5С032В, а потім додавали ПХ-кон'югований стрептавідин для детектування. На фігурі 46С показано, що молекула АВО-БАКТ має здатність одночасно зв'язуватися з СО32В, СО16А і НЗА. На фігурах 460-46І! показано, що НСО16-нСО0328 АВО- рАКТ і його АВО-гібридне похідне мають еквівалентну здатність зв'язуватися з розчинним СО328 (500328) і з розчинним СО16А(158Е) (5СО16А). На фігурі 46.) показано, що АВО-гібрид рАКТ зберігає здатність батьківського ПАКТ до біспецифічного зв'язування з 5СО16А і СО32В незалежно від присутності альбуміну людської сироватки.
Фіг. 4ТА/47В. Цитотоксичність білків ОАКТ
На фігурі 47А проілюстрована МКПК-опосередковує цитотоксичність білків АКТ. Аналізи на
АрСС здійснювали з використанням людських В-клітинних ліній Дауді як клітин-мішеней, інкубованих із клітинами МКПК, використовуваними як ефекторі клітини. Окремі аналізи проводили з трьома повторностями з використанням клітин у відношенні ефектор:мішень - 2071 і з титруванням антитіл: ПСЮ16А-НСОрЗ2В БАНТ (-) і пНСО16А-пСО328 АВО БАКТ (п). Клітинно- опосередковувану цитотоксичність оцінювали в аналізі на вивільнення ОН. Нижня крива при 109 відповідає ПСО16А-пСО32В АВО АКТ (п). На фігурі 47В показано, що СО16ХСО32В САТ зв'язується з СО16В-експресуючими ефекторними клітинами, що приводить до рекрутингу вказаних клітин і знищення (за допомогою перенаціленого цитолізу) клітин, експресуючих сСозав.
Фіг. 48. Поліпшені фармакокінетичні властивості пСО16-НСО32В АВО-САКТ у мишей
С5781/6
Мишам (п-3) вводили одну внутрішньовенну ін'єкцію (АХ ПСО16-НСОЗ328 АВО-ОБАВТ (-) ї (В) пСр16-пс0328 АКТ (А) при 5 мг/кг. Мишачу сироватку брали в різні періоди часу, і концентрацію білка в сироватці оцінювали за допомогою ЕГІ5А. Оцінку фармакокінетичних властивостей проводили за допомогою програми УмпМопіїп Рготеззіопаї 5.1.
Фіг. 49А-49С. Біологічна активність АВО-САВТ іп мімо
На фігурах 49А-49С продемонстровано, що НСО16-НСОЗ32В АВО-БАКТ, після його введення мишам іп мімо, зберігав свою біологічну активність. Було виявлено, що одна доза АВО-БАКТ або батьківського ПАКТ, уведена Та«(тСО16-/-пСр16А-328--)- мишам, приводить до селективного зниження концентрацій В-клітин (фігура 49А), але не чинить впливу на концентрації Т-клітин
Зо (фігура 498) або мононуклеарних периферичних клітин (фігура 495).
Фіг. 50А-50Е. Активність НЕК2ХхТСКЬ БАКТ на панелі клітинних ліній, експресуючих низькі рівні НЕК2
Молекули БАКТ, що мають домени, які зв'язуються з Негаг і з Т-клітинним рецептором (ТОК), тестували на їхню здатність опосередковувати цитотоксичність клітинних ліній при первинно- множинному раку молочної залози, раку товстої кишки і раку сечового міхура, де вказані клітинні лінії були охарактеризовані як клітинні лінії, що мають низькі рівні експресії НЕКЗ2 (а значить, були не сприйнятливими до лікування анти-Нег2/пеи антитілом, НегсеріїпФ). Тестованими клітинними лініями раку молочної залози були 2К75-1 (НЕК2 2) (фіг. 50А), МСЕ-7 (НЕВЗ 1) (фіг. 508) ії МОА-МВ468 (НЕК 2-ме) (фіг. 50С). Тестованими клітинними лініями, що не стосуються раку молочної залози, були НТ-29 (клітинна лінія раку товстої кишки) (фіг. 500) і
ЗУУ780 (клітинна лінія раку сечового міхура) (фіг. 50ОЕ).
Фіг. 51А-518. Очищення поліпептидів КУК2МІ-4420УН-ЯЕМАСЕС (5ЕБЕО ІЮ МО: 313) - Б- спіраль і 4420МІ -КУК2УН-СМЕРКБО (5ЕО ІО МО: 314)
На фіг. 51А-518 проілюстроване очищення поліпептидів КУК2МІ -4420УН-ЯЕМАВОСЕС (5ЕБО
ІО МО: 313) - Е-спіраль і 4420МІ-КУК2УН-СМЕРКБЗО (5ЕО ІО МО: 314).
Фіг. 52. Специфічність зв'язування КУК2-4420 МЕ ОАНТ
На фіг. 52 проілюстрована специфічність зв'язування КУК2-4420 МЕ САНТ.
Фіг. 53. Конструювання плазміди рРАЇ 7 КСО -АВО
На фіг. 53 схематично представлений опис конструкції плазміди рРАЇ 7 КсоїІ-АВО.
Фіг. 54. Вестерн-блот-аналіз К-спірального білка АВО, очищеного на смолі для очищення
РЕОРІМІТУ ЕХАСТ М
На фігурі 54 проілюстрований вестерн-блот-аналіз К-спірального білка АВО, очищеного на смолі для очищення РЕОРІМІТМ ЕХАСТ М (у невеликому масштабі виходячи з 10 мл культури).
Доріжки 1 і 5: неочищені лізати; доріжки 2 і 6: протоковий матеріал, доріжки 3, 4, 8 і 9: очищений білок; доріжка 7: маркер. "Перше" антитіло: кроляче поліклональне анти-ЕК антитіло; "друге" антитіло: ПХ-кон'юговане антикроляче антитіло.
Фіг. 55. ДСН-ПААГ-аналіз К-спірального білуа АВО, очищеного на смолі для очищення
РЕОРІМІТУ ЕХАСТ М
На фігурі 55 представлені результати ДСН-ПААГ-аналіза фракцій, елюйованих зі смоли для очищення РКОРІМІТМ ЕХАСТ"М. | неочищений лізат Е. соїї; ЕТ: протоковий матеріал; МУ: промивання; М: маркер.
Фіг. 56А-560. ЕІ ІЗА-аналіз на зв'язування КУК2 4420 ЕК АВО БАКТ з подвійною афінністю
На фігурах 56А-56С представлені результати ЕГІ5ЗА-аналізу, які продемонстрували, що комплекси КУК2-4420 МЕ САКТ з молекулою К-спіраль-АВО, що утворюють Е-спіраль - К- спіраль-АВО ВАКТ, мають поліпшені властивості. Фігура 56А: ОАКТ захоплювалися МКО20-Ес і були детектовані з використанням біотинільованого моноклонального анти-ЕК антитіла. Фігура 568: БАКТ захоплювалися моноклональним анти-ЕК антитілом і були детектовані з використанням ПХ-людського альбуміну. Фігура 56С: ОАКТ захоплювалися МКО20-Ес і були детектовані з використанням біотинільованого анти-ФІТЦ антитіла. Результати ЕГІЗА-аналізу показали, що всі домени в цьому комплексі можуть зв'язуватися з їх відповідними лігандами.
Фіг. 57. ЕГІЗА-аналіз деімунізованого АВЮО
На фігурі 57 представлені результати ЕГІЗА, що продемонстрували зміну рівня зв'язування, обумовлена модифікаціями в послідовності альбумін-зв'язувальних доменів.
Фіг. 58. Аналіз на зв'язування з альбуміном
На фігурі 58 представлені результати аналізів на зв'язування з альбуміном для АВО- варіантів У6ТА/65А, У61А/М660, І 64АЛ/65А" і | 64А/М660 і для АВО дикого типу.
Фіг. 59. Аналіз на зв'язування з альбуміном
На фігурі 59 представлені результати аналізів на зв'язування з альбуміном для АВО- варіантів І 640/М660, ІЄ5А/М660, Мбб5/17057 і У61А/М665/1705 і для АВО дикого типу.
Фіг. 60. Аналіз на зв'язування з альбуміном
На фігурі 60 представлені результати аналізів на зв'язування з альбуміном для АВО- варіантів УбОА/У61А, УбОТ/У61А, ІЄ5А/М66ОЛ/71А, У61А/Лб5АЛ/ТА, І 64А/М66О//71А і для АВО дикого типу.
Фіг. 61. Аналіз на зв'язування з альбуміном
На фігурі 61 представлені результати аналізів на зв'язування з альбуміном для АВО- варіантів У6О0А/ЛУ61АЛ/1А, УбОТ/У61АЛ//1А, І 64А/65АЛ/1А і для АВО дикого типу.
Фіг. 62. Аналіз на зв'язування з альбуміном
Зо На фігурі 62 представлені результати аналізів на зв'язування з альбуміном для АВО- варіантів І 645/65АЛ//А, І 6405/М660//71А, У61А/1705, Мб65, 71705, У61А/М665, І 64А/Л65А і для АВО дикого типу.
Фіг. 63. Поліпшені фармакокінетичні властивості СО16хХСО328 АВО-БАКТ і варіантів АВО- рАКТ у мишей С57ВІ /6
На фігурі 63 проілюстровані поліпшені фармакокінетичні властивості СО16ХСО32В АВО- рАКТ і варіантів АВО-САКТ у мишей С57ВІ /6. Мишам (п-3) вводили одну внутрішньовенну ін'єкцію білків АВО-ЮАКТ при 5 мг/кг. Мишачу сироватку брали в різні періоди часу, і концентрацію білка в сироватці оцінювали за допомогою ЕГІ5А. Оцінку фармакокінетичних властивостей проводили за допомогою програми УмпМопіїп Рготеззіопаї 5.1.
Фіг. 64А і 64В. Полівалентні білюи АВО АКТ
На фігурах 64А і 64В проілюстровані структури ЮАКТ, що містять полівалентні АВО, сконструйовані шляхом приєднання АВО по кінцях обох ланцюгів (ПСО16хпС0328 Е АВО/К АВО
АКТ) (фігура 64А) або шляхом приєднання тандемних АВО по кінці одного ланцюга (пср1бхпСО0328 Е АВО АВО/К БАКТ) (фігура 648).
Фіг. 65(А-С). Біспецифічна активність НСр16бхпСО0328 АВО АКТ
На фігурах 65А-65С проілюстрована біспецифічна активність НСО1б6хпиСО328 АВО бАКТ, оцінена за допомогою ЕГІЗА з подвійною специфічністю. ЕГІЗБА-планшети покривали 2 мкг/мл антигени СО16. АВО ВАКТ і Ес САКТ у різних концентраціях зв'язували з планшетом. І нарешті, у планшет додавали біотинільований антиген 5СО32В, а потім ПХ-кон'югований стрептавідин для детектування.
Фіг. 66. Час напівжиття АВО БАКТ і ЕС бАКТ у сироватці
На фігурі 66 представлені результати дослідження фармакокінетичних властивостей іп мімо, у якому мишам С57В1/6 вводили одну і.м. ін'єкцію АВО БАКТ або Ес САКТ (5 мг/кг) для оцінки часу їхнього напівжиття в сироватці. 5. Опис переважних варіантів винаходу
Кожен поліпептидний ланцюг молекули діатіла містить МІ- домен і МН-домен, які були ковалентно зв'язані так, щоб це запобігало самозбиранню. Взаємодія двох поліпептидних ланцюгів приводить до продукування пар МІ-МН, що утворюють два епітоп-зв'язувальні сайти, тобто двовалентну молекулу. Жоден з МН- або Мі-доменів не обмежений яким-небудь 60 положенням у поліпептидному ланцюзі, тобто, він обмежений тільки аміно (М)- або карбокси (С)-
кінцем, і жоден з цих доменів не обмежений їхніми положеннями один відносно одного, тобто,
МІ-домен може бути М-кінцевим відносно МН-домену і навпаки. Одним лише обмеженням є те, що комплементарний поліпептидний ланцюг повинний бути доступним для утворення функціонального діатіла. Якщо МІ- ії МН-домени походять від того самого антитіла, то два комплементарні поліпептидні ланцюги можуть бути ідентичними. Так, наприклад, якщо зв'язувальні домени походять від антитіла, специфічного до епітопу А (тобто, якщо зв'язувальний домен утворюється в результаті взаємодії Мі А-МНА), то кожен поліпептид буде містити МНаА їі Міх. Гомодимеризація двох поліпептидних ланцюгів антитіла буде приводити до утворення двох МІ А-УНА-зв'язувальних сайтів і, тим самим, до утворення двовалентного моноспецифічного антитіла. Якщо Мі- ії МН-домени походять від антитіл, специфічних до різних антигенів, то для утворення функціонального біспецифічного діатіла необхідна взаємодія двох різних поліпептидних ланцюгів, тобто утворення гетеродимера. Так, наприклад, для біспецифічного діатіла один поліпептидний ланцюг буде містити Мі дл і Мі в; а гомодимеризація вказаного ланцюга буде приводити до утворення двох Мі А-МНв-зв'язувальних сайтів, які або не зв'язуються, або їхнє зв'язування є непередбаченим. На противагу цьому, якщо два відмінні один від одного поліпептидні ланцюги є вільними для взаємодії, наприклад, у рекомбінантній експресійній системі, тобто в одній системі, що містить Мі дл ії МНв, і в іншій системі, що містить
МІ в і МНаА, то два відмінні один від одного зв'язувальні сайти будуть утворювати Мі д-МНаА і Мі в-
МНв. Для всіх пар поліпептидних ланцюгів діатіл існує імовірність помилкового вирівнювання або помилкового зв'язування на двох ланцюгах, тобто взаємодії доменів МІ -МІ або МН-МН, однак, очищення функціональних діатіл може бути легко здійснене виходячи з імуноспецифічності "правильно" димеризованого зв'язувального сайта з застосуванням будь- якого афінного методу, відомого фахівцям або описаного в даній заявці, наприклад, методу афінної хроматографії.
В інших варіантах винаходу один або більше поліпептидних ланцюгів діатіла містять Ес- домен. Бсо-домени в поліпептидних ланцюгах молекул діатіла переважно димеризуються з утворенням молекули діатіла, що має імуноглобулін-подібні властивості, наприклад, здатність до Ес-ЕсуВ-взаємодій. Ес-вмісні діатіла можуть бути димерами, наприклад, вони можуть складатися з двох поліпептидних ланцюгів, кожен з який містить МН-домен, Мі -домен і Ес-
Зо домен. Димеризація вказаних поліпептидних ланцюгів приводить до утворення двовалентного діатіла, що містить Ес-домен, хоча структура цього антитіла відрізняється від структури немодифікованого двовалентного антитіла (фіг. 11). Такі молекули діатіла, на відміну від імуноглобуліну дикого типу, мають змінені фенотипи, наприклад, вони мають змінений час напівжиття в сироватці, модифіковані зв'язувальні властивості і т. п. В інших варіантах винаходу молекули діатіла, що містять Ес-домени, можуть бути тетрамерами. Такі тетрамери містять два "більш важкі" поліпептидні ланцюги, тобто поліпептидний ланцюг, що містить Мі -, МН- ї Ес- домен, і два "більш легкі" поліпептидні ланцюги, тобто поліпептидний ланцюг, що містить МІ і
МН. Вказані "більш легкі" ії "більш важкі" ланцюги взаємодіють один з одним з утворенням мономера, а вказані мономери взаємодіють один з одним за допомогою їх неспарених Ес- доменів з утворенням Ід-подібної молекули. Таке Ід-подібне діатіло є чотиривалентним і може бути моноспецифічним, біспецифічним або тетраспецифічним.
Щонайменше два зв'язувальні сайти молекули діатіла можуть розпізнавати той самий або різні епітопи. Різні епітопи можуть походити від того самого антигену або від різних антигенів. В одному з варіантів винаходу епітопи походять від різних клітин. В іншому варіанті винаходу епітопами є антигени клітинної поверхні, які присутні на одній і тій же клітині або на тому самому вірусі. Епітоп-зв'язувальні сайти можуть розпізнавати будь-який антиген, проти якого може продукуватися антитіло. Так, наприклад, такими молекулами є білки, нуклеїнові кислоти, бактеріальні токсини, маркери клітинної поверхні, аутоїмунні маркери, вірусні білки, лікарські засоби і т. п. У конкретних аспектах винаходу щонайменше один епітоп-зв'язувальний сайт діатіла є специфічним до антигену на конкретній клітині, такій як В-клітина, Т-клітина, фагоцит, природна клітина-кілер (МК) або дендритна клітина.
Кожен домен поліпептидного ланцюга діатіла, тобто МІ-, МН- і Ес-домени, можуть бути розділені пептидним лінкером. Пептидний лінкер може мати довжину в 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 або 9 амінокислот. У деяких варіантах винаходу амінокислотна лінкерна послідовність являє собою послідовність с(3(35(3(3(5(03 (ЗЕБО ІЮ МО: 10), яка кодується послідовністю нуклеїнової кислоти (ЗЕО ІО МО: 74).
У деяких варіантах винаходу кожен поліпептидний ланцюг молекули діатіла був сконструйований так, щоб він містив щонайменше один цистеїновий залишок, який буде взаємодіяти з аналогом у положенні щонайменше одного цистеїнового залишку на другому бо поліпептидному ланцюзі відповідно до винаходу з утворенням міжланцюгового дисульфідного зв'язку. Вказані міжланцюгові дисульфідні зв'язки служать для стабілізації молекули діатіла, підвищують рівень експресії і вихід продукту в рекомбінантних системах, дозволяють одержати стабільний препарат з однорідним складом, а також підвищують стабільність виділеного і/або очищеного продукту іп мімо. Вказаний щонайменше один цистеїновий залишок може бути введений як одна амінокислота або як частина більш великої амінокислотної послідовності, наприклад, шарнірного домену, у будь-яку частину поліпептидного ланцюга. У конкретному варіанті винаходу вказаний щонайменше один цистеїновий залишок уводять так, щоб він був присутній біля С-кінця поліпептидного ланцюга. У деяких варіантах винаходу вказаний щонайменше один цистеїновий залишок вводять у поліпептидний ланцюг амінокислотної послідовності Ї050С. У конкретному варіанті винаходу С-кінець поліпептидного ланцюга, що входить до складу молекули діатіла відповідно до винаходу, містить амінокислотну послідовність 505С. В іншому варіанті винаходу вказаний щонайменше один цистеїтновий залишок вводять у поліпептид, який присутній в амінокислотній послідовності, що містить шарнірний домен, наприклад, ЗЕО ІЮ МО: 1 або ЗЕО ІЮ МО: 4. У конкретному варіанті винаходу
С-кінець поліпептидного ланцюга молекули діатіла відповідно до винаходу містить амінокислотну послідовність шарнірного домену ІдСс, наприклад, 5ЕО ІЮ МО: 1. В іншому варіанті винаходу С-кінець поліпептидного ланцюга молекули діатіла відповідно до винаходу містить амінокислотну послідовність МЕРКБС (5ЕБО І МО: 77), що може кодуватися нуклеотидною послідовністю (5ЕБЕО 10 МО: 78). В інших варіантах винаходу вказаний щонайменше один цистеїновий залишок вводять у поліпептидний ланцюг в амінокислотній послідовності І ООСЕМКОЕС (5БО ІО МО: 17) що може кодуватися нуклеотидною послідовністю (ЗЕСО ІЮ МО: 76). У конкретному варіанті винаходу С-кінець поліпептидного ланцюга, що входить до складу молекули діатіла відповідно до винаходу, містить амінокислотну послідовність ГООСЕМКОЕС (5БО ІО МО: 17) що може кодуватися нуклеотидною послідовністю (ЗЕ І МО: 76). В інших варіантах винаходу вказаний щонайменше один цистеїновий залишок вводять у поліпептидний ланцюг в амінокислотній послідовності ЕМКОСЕС (ЗЕБЕО ІЮ МО: 23), що може кодуватися нуклеотидною послідовністю (ЗЕО ІЮО МО: 75). У конкретному варіанті винаходу С-кінець поліпептидного ланцюга, що входить до складу молекули діатіла відповідно до винаходу, містить амінокислотну послідовність ЕМКОЕС (ЗЕО ІЮ
Зо МО: 23), що може кодуватися нуклеотидною послідовністю (5ЕО ІЮ МО: 75).
У деяких варіантах винаходу молекула діатіла містить щонайменше два поліпептидні ланцюги, кожен з яких включає амінокислотну послідовність Ї303С і ковалентно зв'язаний дисульфідного зв'язком, розташованим між цистеїновими залишками в вказаних послідовностях ос. В іншому конкретному варіанті винаходу молекули діатіла містять щонайменше два поліпептидні ланцюги, один з яких включає послідовність ЕМАСЕС (5ЕО ІЮО МО: 23), а інший включає шарнірний домен (який містить щонайменше один цистеїновий залишок), де вказані щонайменше два поліпептидні ланцюги ковалентно зв'язані дисульфідним зв'язком, розташованим між цистеїновим залишком у ЕМКОЕС (5ЕО 10 МО: 23) і цистеїновим залишком у шарнірному домені. У конкретних аспектах винаходу цистеїновий залишок, відповідальний за утворення дисульфідного зв'язку в шарнірному домені, являє собою Суз-128 (пронумерований відповідно до нумерації ЄЮ Кебата і розташований у шарнірному домені важкого ланцюга немодифікованого інтактного 40), а цистетновий залишок аналога в ЗЕО ІЮО МО: 23 являє собою Сув5х-214 (пронумерований відповідно до нумерації ЕЄО Кебата і розташований у шарнірному домені легкого ланцюга немодифікованого інтактного дес) (ЕІкабеї? еї аї. (2005) "Сувівіпе5 Іп СНІ Опаепіїє Веїепіп ОЇ Опаззетбівй Ід Неаму СНаїіпв" У). Віої. Спет. 280:14402- 14412; ця публікація у всій своїй повноті вводиться в даний опис за допомогою посилання). В інших варіантах винаходу щонайменше один цистеїновий залишок сконструйований так, щоб він був присутній біля М-кінця амінокислотного ланцюга. В інших варіантах винаходу щонайменше один цистеїновий залишок сконструйований так, щоб він був присутній в лінкерній частині поліпептидного ланцюга молекули діатіла. В інших варіантах винаходу МН- або МІ - домен сконструйований так, щоб він містив щонайменше одну амінокислотну модифікацію в порівнянні з батьківським МН- або Мі -доменом, де вказана амінокислотна модифікація включає заміну батьківської амінокислоти цистеїном.
Даний винахід охоплює молекули діатіл, які містять Ес-домен або його частину (наприклад,
СН2г-домен або СНЗ-домен). Ес-домен або його частину можуть походити від імуноглобуліну будь-якого ізотипу або алотипу, включаючи, але не обмежуючись ними, ІдА, дО, Іде, ІдЧЕ і дм.
У переважних варіантах винаходу Ес-домен (або його частина) походить від Їдс. У конкретних варіанті винаходу ізотипами Ідсі є ІдС1, Ідс2, ДОЗ або Іде4 або їх алотипи. В одному з варіантів винаходу молекула діатіла містить Ес-домен, де вказаний Ес-домен включає СН2- 60 домен і СНЗ-домен, незалежно вибрані з імуноглобулінів будь-яких ізотипів (тобто, Ес-домен,
який містить СН2-домен, походить від (ДС, а СНЗ-домен походить від ІДС, або СН2-домен походить від (951, а СНЗ-домен походить від Ідс2, і т. п.). Вказаний Ес-домен може бути введений у поліпептидний ланцюг, який складає молекулу діатіла відповідно до винаходу, у будь-якому положенні відносно інших доменів або частин вказаного поліпептидного ланцюга (наприклад, Ес-домен або його частина можуть бути С-кінцевими відносно Мі- і МнН-доменам поліпептиду вказаного ланцюга; М-кінцевими відносно МІ- і МН-доменам; або М-кінцевими відносно одного домену і С-кінцевими відносно іншого домену (тобто, вони можуть бути розташовані між двома доменами поліпептидного ланцюга)).
Даний винахід також охоплює молекули, що містять шарнірний домен. Шарнірний домен походить від імуноглобуліну будь-якого ізотипу або алотипу, включаючи ІдА, ІдО, Ід, ЧЕ і дм.
У переважних варіантах винаходу шарнірний домен походить від ІдС, де Ідсеї має ізотип ІДО1, 352, ІдсЗ або Ідс4 або їх алотип. Вказаний шарнірний домен може бути введений у поліпептидний ланцюг, який складає молекулу діатіла, разом з Ес-доменом, так, щоб молекула діатіла містила шарнірний домен-Ес-домен. У деяких варіантах винаходу шарнірний домен і Ес- домен незалежно вибрані з імуноглобуліну будь-якого ізотипу, відомого фахівцям або описаного в даній заявці. В інших варіантах винаходу шарнірний домен і Ес-домен розділені щонайменше одним іншим доменом поліпептидного ланцюга, наприклад, Мі -доменом. Шарнірний домен або необов'язково шарнірний домен-ЕРс-домен можуть бути введені в поліпептид відповідно до винаходу в будь-якому положенні відносно інших доменів або частин вказаного поліпептидного ланцюга. У деяких варіантах винаходу поліпептидний ланцюг відповідно до винаходу містить шарнірний домен, де вказаний шарнірний домен знаходиться біля С-кінця поліпептидного ланцюга, де вказаний поліпептидний ланцюг не містить Ес-домену. В інших варіантах винаходу поліпептидний ланцюг відповідно до винаходу містить шарнірний домен-Ес-домен, де вказаний шарнірний домен-Рс-домен знаходиться біля С-кінця поліпептидного ланцюга. В інших варіантах винаходу поліпептидний ланцюг відповідно до винаходу містить шарнірний домен-Ес- домен, що знаходиться біля М-кінця поліпептидного ланцюга.
Як обговорювалося вище, даний винахід охоплює мультимери поліпептидних ланцюгів, кожен з яких містить МН- і Мі-домени. У деяких аспектах винаходу поліпептидні ланцюги в вказаних мультимерах також містять Ес-домен. Димеризація Ес-доменів приводить до
Зо утворення молекули діатіла, що має імуноглобулін-подібні властивості, тобто /Ес- опосередковувані функціональні властивості (такі як, наприклад, взаємодія Ес-ЕсукК, зв'язування з комплементом і т. п.). У деяких варіантах винаходу МІ- і МН-домени, що містять кожен поліпептидний ланцюг, мають однакову специфічність, а вказана молекула діатіла є двовалентною і моноспецифічною. В інших варіантах винаходу МІ- і МН-домени, що містять кожен поліпептидний ланцюг, мають різні специфічності, а вказане діатіло є двовалентним і біспецифічним.
В інших варіантах винаходу молекули діатіла відповідно до винаходу охоплюють тетрамери поліпептидних ланцюгів, кожен з яких містить УН- і МІ -домени. У деяких варіантах винаходу два поліпептидні ланцюги тетрамера також включають Ес-домен. Отже, тетрамер складається з двох "більш важких" поліпептидних ланцюгів, кожен з яких містить МіІ-, МН- і Ес-домени, і двох "більш легких" поліпептидних ланцюгів, що містять Мі -- і МН-домени. Взаємодія "більш важкого" і "більш легкого" ланцюгів приводить до утворення двовалентного мономера, що, після димеризації за допомогою Ес-доменів "більш важких" ланцюгів, утворює чотиривалентну імуноглобулін- подібну молекулу (описану в прикладі 6.2 і в прикладі 6.3). У деяких аспектах винаходу вказані мономери є однаковими, а чотиривалентна молекула діатіла є моноспецифічною або біспецифічною. В інших аспектах винаходу вказані мономери відрізняються один від одного, а чотиривалентна молекула діатіла є біспецифічною або тетраспецифічною.
Для утворення тетраспецифічної молекули діатіла, описаної вище, необхідна взаємодія чотирьох різних поліпептидних ланцюгів. Такі взаємодії представляють певні труднощі для їхнього ефективного здійснення в одноклітинній системі рекомбінантного продукування, що обумовлено множиною варіантів потенційно помилкових спарювань ланцюга. Однією з можливостей підвищення імовірності помилкових спарювань є введення мутацій типу "вузли в дірках" у потрібні пари поліпептидних ланцюгів. Такі мутації відбуваються переважно при гетеродимеризації, а не при гомодимеризації. Так, наприклад, що стосується Есо-Рсо-взаємодій, то амінокислотна заміна (переважно, заміна амінокислотою, що містить об'ємну бічну групу, яка утворює "вузол", наприклад, триптофаном) може бути введена в СН2- або СНЗ-домени, так, щоб стеричне утруднення запобігало взаємодії з аналогічним чином мутованим доменом і змушувало мутований домен спарюватися з доменом, у який була введена комплементарна бо або адаптуюча мутація, тобто "діра" (наприклад, заміна гліцином). Такі серії мутацій можуть бути введені в будь-яку пару поліпептидів, що складають молекулу діатіла, і, крім того, у будь- яку частину поліпептидних ланцюгів вказаної пари. Методи конструювання білків для досягнення переважно гетеродимеризації, а не гомодимеризації, добре відомі фахівцям, зокрема, фахівцям з конструювання імуноглобулін-подібних молекул, і ці методи описані в літературі (див., наприклад, публікації: Кіддулау еї аї. (1996) "Кпорз-Іпіо-НоїЇевз" Епаіпеегіпу ОЇ
Апіїброду СНЗ Ротаїпе Рог Неаму Спаїп Неїегодітетгігайоп, "Ргоївіп Епадг. 9:617-621, Амуеї! єї а). (1997) "Маріє Неїегодітегє Егот ВНетоавєїїпа Те ботаїп Іпіепасе ОЇ А Нотодітег Овіпд А
Рпаде Оізріау І іргагу" У. Мої. Віої. 270:26-35, і Хіє еї аІ. (2005) "А Мем/ Рогтаї ОГ Візресіїїс
Апііроду: Нідпіу Ейісіепі Негегодітегігайоп, Ехргеззіоп И Титог Сеїї Гувів" У. Іттипої. Меїйоав5 296:95-101; кожна з який у всій своїй повноті вводиться в даний опис за допомогою посилання).
Даний винахід також охоплює молекули діатіла, які містять варіант Ес-домену або варіант шарнірного домену-Рс-домену (або їхньої частини), де вказаний варіант Ес-домену має щонайменше одну амінокислотну модифікацію (наприклад, заміну, інсерцію, делецію) у порівнянні з Ес-доменом дикого типу або шарнірним доменом-Ес-доменом дикого типу (або їх частинами). Молекули, що містять варіанти Ес-доменів або варіанти шарнірних доменів-Ес- доменів (або їхніх частин) (наприклад, антитіл), звичайно мають змінені фенотипи в порівнянні з молекулами, що містять Ес-домени або шарнірні домени-Ес-домени або їхні частини дикого типу. Змінений фенотип може бути охарактеризований як змінений час напівжиття в сироватці, змінена стабільність, змінена сприйнятливість до клітинних ферментів або змінена ефекторна функція, які були визначені в аналізі на МК-залежний цитоліз або макрофаг-залежний цитоліз.
Варіанти Ес-домену, ідентифіковані як варіанти, які мають змінені ефекторні функції, описані в
Міжнародній заявці УМО04/063351, у публікаціях заявок на патент США 2005/0037000 і 2005/0064514, у попередній заявці на патент США 60/626510, поданій 10 листопада 2004 р., у попередній заявці на патент США 60/636663, поданій 15 грудня 2004 р., і в попередній заявці на патент США 60/781564, поданій 10 березня 2006 р., а також у заявці на патент США 11/271140, поданій 10 листопада 2005 р., і в заявці на патент США 11/305787, поданій 15 грудня 2005р., їі в одночасно поданих заявках авторів винаходу, які у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання.
Біспецифічні діатіла відповідно до винаходу можуть одночасно зв'язуватися з двома окремими і різними епітопами. У деяких варіантах винаходу епітопи походять від того самого антигену. В інших варіантах винаходу епітопи походять від різних антигенів. У переважних варіантах винаходу щонайменше один епітоп-зв'язувальний сайт є специфічним до детермінанти, яка експресується на імунних ефекторних клітинах (наприклад, СОЗ, СО16, СОЗ32,
СОбА і т. п.) і на Т-лімфоцитах, природних клітинах-кілерах (МК) або на інших імунонуклеарних клітинах. В одному з варіантів винаходу молекула діатіла зв'язується з детермінантою ефекторної клітини, а також активує вказану ефекторну клітину. Відповідно до цього молекули діатіла відповідно до винаходу можуть мати Ід-подібні функціональні властивості незалежно від того, чи містять вони Ес-домен чи ні (як може бути проаналізовано в будь-якому аналізі на ефекторну функцію, відомому фахівцям або описаному в даній заявці (наприклад, в аналізі на
АРСС)). У деяких варіантах винаходу біспецифічне діатіло відповідно до винаходу зв'язується з раковим антигеном на пухлинній клітині і з детермінантою ефекторної клітини й активує вказану клітину. В альтернативних варіантах винаходу біспецифічне діатіло або молекула діатіла відповідно до винаходу можуть інгібувати активацію мішені, наприклад, ефекторної клітини за допомогою одночасного зв'язування і тим самим об'єднання активуючого і інгібуючого рецепторів на одній і тій же клітині (наприклад, зв'язування з СОЗ2А і СО32В, ВСЕ і СО32В або
ІЗЕКІ ї СОЗ32В), як описано вище (див. розділ "Попередній рівень техніки"). В іншому аспекті цього варіанта біспецифічне діатіло може мати противірусні властивості завдяки одночасному зв'язуванню двох нейтралізуючих епітопів на вірусі (наприклад, епітопів КМ; епітопів УУММ, таких як Е16 і Е53).
У деяких варіантах винаходу молекули біспецифічних діатіл відповідно до винаходу мають унікальну здатність націлюватися на клітини конкретних типів. Так, наприклад, біспецифічне діатіло або молекула біспецифічного діатіла можуть бути сконструйовані так, щоб вони містили комбінацію епітоп-зв'язувальних сайтів, що розпізнають серію антигенів, унікальних для клітини- або тканини-мішені конкретного типу. Крім того, якщо будь-який з окремих антигенів або обидва ці антигени є досить ізольованими, як це звичайно має місце, якщо вони знаходяться в тканині і або в клітині інших типів, то для конструювання діатіла або молекули діатіла можуть бути використані домени з низькою афінністю зв'язування. Такі домени з низькою афінністю зв'язування будуть нездатні зв'язуватися з окремим епітопом або антигеном з авідністю, достатньою для терапевтичного застосування. Однак, якщо епітопи або антигени присутні на 60 одній клітині- або тканині-мішені, то авідність діатіла або молекули діатіла для цієї або клітини тканини, у порівнянні з клітиною або тканиною, яка експресує тільки один з цих антигенів, буде підвищуватися, у результаті чого вказана клітина або тканина можуть бути ефективними мішенями відповідно до винаходу. Така біспецифічна молекула може мати підвищену здатність зв'язуватися з одним або з обома антигенами-мішенями на клітинах, які експресують обидва вказаних антигени, у порівнянні з моноспецифічним діатілом або антитілом, який має специфічність тільки до одного з цих антигенів.
Переважно, зв'язувальні властивості діатіл відповідно до винаходу можуть бути охарактеризовані за допомогою функціональних аналізів іп міо для визначення активності зв'язування і/або однієї або більше ЕсуВ-опосередковуваних функцій ефекторних клітин (опосередковуваних взаємодіями Ес-ЕсукК або імуноспецифічним зв'язуванням молекули діатіла з ЕсукК) (див. розділи 5.4.2 і 5.4.3). Афінності і зв'язувальні властивості молекул, наприклад, діатіл відповідно до винаходу відносно Есук можуть бути визначені за допомогою аналізів іп міо (біохімічних або імунологічних аналізів), відомих фахівцям і проведених для оцінки зв'язування домен-антиген або взаємодій Ес-ЕсукК, тобто специфічного зв'язування антигену зі зв'язувальним доменом або специфічного зв'язування Ес-ділянки з ЕсуК, відповідно, де вказаними аналізами є, але не обмежуються ними, ЕГІЗА-аналіз, аналіз методом поверхневого плазмонного резонансу, аналізи методом імунопреципітації (див. розділ 5.4.2). У найбільш переважних варіантах винаходу молекули відповідно до винаходу мають аналогічні зв'язувальні властивості в аналізах, проведених на моделях іп мімо (таких як моделі, що тут описані і розкриваються) і іп міго. Однак даний винахід не виключає використання молекул відповідно до винаходу, що не мають потрібного фенотипу в аналізах іп міго, але мають потрібний фенотип іп мімо.
У деяких варіантах винаходу молекули відповідно до винаходу конструюють так, щоб вони мали змінений характер глікозилування або змінену глікоформу в порівнянні з порівнюваною частиною матричної молекули. Сконструйовані глікоформи можуть бути використані в різних цілях, включаючи, але не обмежуючись ними, посилення ефекторної функції. Сконструйовані глікоформи можуть бути отримані будь-яким методом, відомим фахівцям, наприклад, з використанням сконструйованих або модифікованих експресійних штамів, шляхом коекспресії з одним або більше ферментами, наприклад, з ді-М-ацетилглікозамінілтрансферазою ПЇ (п111), шляхом експресії діатіла відповідно до винаходу в різних організмах або клітинних лініях, які походять від різних організмів, або шляхом модифікації вуглеводу(ів) після експресії й очищення діатіла. Методи одержання сконструйованих глікоформ відомі фахівцям, і такими методами є, але не обмежуються ними, методи, описані в публікаціях: Штапа еї аї. (1999) "Епдіпеетед Сіусогогптв ОЇ Ап Апііпепгоріазіота Ідсі М/йН Оріїтігед Апіїроду-Оерепаепі СеїЇІшаг
З5 Суюохіс Асіїмпу" Маї. Віотесппо! 17:176-180; Оамієвз еї аї. (2001) "Ехргезбвіоп ОЇ Сп п А
Весотбріпапі Апіі-5О20 СНО Ргодисіоп Се іпе: Ехргезвзіоп ОЇ Апіїродіез УУйН АПЦегєй
Сіусоїтоптв І єад5 То Ап Іпстеазе Іп Адсс Тпгоцди Нідпег Айіпйу Рог Рс Сатта ВІЇ" Віоїесппої!
Віоєпду 74:288-294; ЗПівїд5 еї аї. (2002) "аск Ої Рисозе Оп Нитап Ід М-Гіпкеа Оїїдозасснагіде
Ітргомев Віпаїпд То Нитап Есдатта ВІЇ Апа Апіїбоду-Оерепаепі Сеїшаг Тохісйу" у. Віої. Спет. 277:26733-26740; Зпіпкамжа єї аї. (2003) "Те Арбзепсе ОЇ Рисозе Виї Мої Те Ргезепсе ОЇ
Саїіасювзе Ог Вівзесіїпд М-АсеїуІдІисозатіпе ОЇ Нитап Іда! Сотріех-Туре Оіїдозасснагідев5 ЗПпПом/5
Те Стйіса! Воїеє ОГ Еппапсіпд Апіїбоду-Оєрепаепі Сеїшаг Суюїюхісйу" У. Віої. Спет. 278:3466- 3473), у патенті США 6602684; у О55М 10/277370; О05ЗМ 10/113929; РСТ УМО 00/61739А1; РСТ
УМО 01/292246А1; РСТ УМО 02/311140А1; РСТ УМО 02/30954А1; технологія Ройшедепі "м (Віоула,
Іпс. Ргіпсеїоп, МУ); технологія конструювання шляхом глікозилування СіусомМАБ'М (БІ УСАКТ
БіотесппоЇсду АС, 2игісп, Зм/йгепапа); де кожний із вказаних документів у всій своїй повноті вводиться в даний опис за допомогою посилання. Див. наприклад, М/О 00061739; ЕАО1229125;
ОБ 20030115614; ОКаакі єї аї. (2004) "БРисозе Оерієйоп ЕРгот Нитап да ОіїдозассНагіає
Еппапсез Віпаїпу Епінаіру Апа Аввзосіайоп Наїє Вейуеєп ІдСи Апа ЕРсСбаттанйвШшА" МВ, 336:1239-49, де кожний із вказаних документів у всій своїй повноті вводиться в даний опис за допомогою посилання.
Даний винахід також охоплює введення неприродних амінокислот з метою одержання діатіл відповідно до винаходу. Такі методи відомі фахівцям, наприклад, методи з використанням природних механізмів біосинтезу для включення неприродних амінокислот у білки, див., наприклад, публікації: Умапу еї аї. (2002) "Ехрапаїпд Те Сепеїїс Соде" Спет. Сотт. 1:1-11;
Мапа еї аї. (2001) "Ехрапаїпд Те Сепеїїс Соде ОГ ЕзсНегісніа соїї" Зсіепсе, 292:498-500; мап
Незі еї аї. (2001) "Ргоївіп-Вазейд Маїегіаі5, Тожагі А Мем Геме! ОЇ Зтисішта! Сопігої" Спет.
Сотт. 19:1897-1904, кожна з який у всій своїй повноті вводиться в даний опис за допомогою посилання. Альтернативні стратегії спрямовані на ферменти, відповідальні за біосинтез бо аміноацил-тРНК, див., наприклад, публікації: Тапод еї аї. (2001) "Віозупіпезі5 ОЇ А Нідпіу згабіє
Соїїеад-Сої! Ргоїєїп Сопіаіпіпд Нехайсого Івисіпе Іп Ап Епдіпеегей Васієвгіа! Нові" У. Ат. Спет. ос. 123(44):11089-11090; КіїсК єї аї. (2001) "Ідепійісанйоп ОЇ Ап Ехрапаєсй 5еї ОЇ Тгапз Іакопау
Асіїме Меїпіопіпе Апаіодиев5 Іп ЕвсПегісніа соїї" РЕВ5 Гей. 502(1-2):25-30; кожна з який у всій своїй повноті вводиться в даний опис за допомогою посилання.
У деяких своїх варіантах даний винахід охоплює методи модифікації МІ -, МН- або Рс-домену молекули відповідно до винаходу шляхом додавання або делеції сайта глікозилування. Методи модифікації вуглеводу білків добре відомі фахівцям і входять в обсяг даного винаходу, див., наприклад, патент США Мо 6218149; ЕР 0359096 В1; публікацію заявки США 2002/0028486; МО 03/035835; публікацію заявки США Мо 2003/0115614; патент США Мо 6218149; патент США Мо 6472511; які у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання.
Молекули діатіла відповідно до винаходу можуть бути сконструйовані так, щоб вони містили домен, що являє собою зв'язувальний ліганд для рецептора природних клітин-кілерів групи 20 (МКОо20). Такими зв'язувальними лігандами, а зокрема, лігандами, що не експресуються на нормальних клітинах, є молекула гістосумісності 60 (НбО), продукт раннього індуцибельного гена-1 ретиноєвої кислоти (КАЕ-1) і білкок-подібний транскрипт 1, що зв'язується з мишачим 016 (МИТ) (Нашіеї О.Н. (2003) "Воїез ОЇ Тне МКаг20О Іттипогесеріог Апа Ів Гідапав" Маїшйге
Вем. Іттипої!. 3:781-790; Соцаен, 4.0. еї аї. (2005) "АМегеа МКа20О Рипсійоп Іп МК Сеї5 Іпдисейд
Ву Спгопіс Ехрозиге То АМйегей МКИ20О І ідапа-Ехргезвіпу Титог СеїЇв" Віоой 106:1711-1717).
Додатковими лігандами, що реагують з людським МКО20О, є поліморфні молекули, споріднені ланцюги МНС класу І, МІСА і МІСВ (Пієетепраси, А. еї аї. (1999) "Маїшга! Кіег СеїІв: 5ігез5 Оці,
Тит Оп, Типе Іп" Ситт. Віої. 9(22):8851-88533; Вашег, 5. єї аї. (1999) "Асіїмайноп ОЇ МК Сеїї5 Апа Т
Сеїї Ву МКа20О, А Несеріог Рог бБіге55-Іпаисібіе МІСА" 5сіепсе 285(5428):727-729; Уїерпепв, Н.А. (2001) "МІСА апа МІСВ депез: сап їйе епідта ої ІНеїг роїутогрпізт Бе гезоїмей" Ттепаз Іттипо). 22:378-385).
Послідовністю МІСА є послідовність ЗЕО ІЮ МО: 311:
МОТОРМЕЇТІІЇ АСІЕРЕАРРО АААЕРНОЗІКУ МІТУІ5ИООБ МОБОЕКГТЕУН
ТОСОРЕГВСО ВОКСВАКРОС ОЙМАВЕРУТОМК ТИОВЕТВОГТ СМОКОГВМТТ,
АНІКРОКЕСІ НОІОБІВЕМСЕ ІНЕОМОТВЕ55 ОНЕУУОСВЕІЕ Г5ОМІЕТКЕМ
ТМРОББОБЕАОТ ГАММУЕМЕІК ЕБАМКТКТНУ НАМНАРСІОЕ ч1ІБЕБУТК5ОоУМ
ІВВТУРРМУМ УМТВ5ЕАВБЕСМ ІТУТСВАБ5СЕ УРИМІТІ5УиВ ОрОоУ5І5НОТ
ООйМСРУГРОС МОТУОТИМАТ ВІСОСЕЕОВЕ ТСУМЕНОЗСМН 5ТНРУРБЗОКУ
ІМІО5НИОТЕ НУ5ЗБАМААААТЇ ЕМІТІКЕУУВС СКККТ5ОЗААВС РЕГУ5ТОМГО
ОНРУСТО5ОНЕ РАТОГОСРКОРІ, М5ОГО5ТО5Т ЕбА
Послідовністю МІСВ є послідовність ЗЕО ІЮ МО: 312:
РН5ГКУМІМУ Г50005У050 ЕГБАВБСНІООСО РЕГКУОВОКВ ВАКРОСОЙШАЕ
РМІСАКТИРТ ЕТЕРІТЕМОСО БІБЕТІТНІК рОКОСІНОГО БІКУСЕІНЕР
З5ТІКО5КНЕХ УОСЕГЕГ5ОМ ГЕТОЕ5ТУРО 55КАОТГАММ УТМЕЙКЕРАМ
КТІКТНУКАМО АРСІОКІОГР РМУММІСЗЕМ 5ЕБСМІТУТСВ А5З5ОЕУРЕМІТ
ТтТивОороУбІ 5НМТООйОСрУ ГРОСМОТУОТ ЖМУАТВІКОСЕ ЕОБЕТСУМЕН
ЗОМНОТНРУР 5ОКАГУГО5О КТОЕРУУМ5БАА МРСЕМІІЇІІІЇ СУРССКККТ5
ААвЕСР
Зо
Антитілами, що специфічно зв'язуються з Т-клітинним рецептором, є анти-ТСК антитіло
ВМА 031 (Китіє, А. еї аї. (1989) "ВМА 031-А ТСВА-5ресіїїс Мопосіопа! Апіроду Рог Сііпіса!
Арріїсайоп" Тгапзріапі Ргос. 21(1 Рі 1):1017-1019; Мазнап, В. еї аї. (1987) "Гіпе Зресійсйу ОТГ А
Рапеї ОЇ Апіїрбодіеєз Адаіїпзі Те ТСВ/СОЗ Сотрієх" Тгапзріапі Ргос. 19(5):4270-4272; Зпеаттап,
СМ. єї аї. (1991) "Сопвігисіп, Ехргевзвзіоп, Ап Віоіодіс Асіїмйу Ої Мигіпе/Нитап СпПітетгіс
Апіїбодіез МУ Зресійсну Бог Тпе Нитап с/р Т Сеї" 9. Ітттипої. 146(3):928-935; ЗНнеаптап, С.М. еї ам. (1991) "Сопвігосіп, Ехргеззіоп Ап СпНагасієгігайоп ої Нитапігей Апііїродієв бігесієй
Адаіїпбї Те Нитап с/р Т СеїЇ Кесеріог" 9. Іттипої. 147(12):4366-4373). Антитілами, що специфічно зв'язуються з рецептором МКО20О, є КУК-2.0 (Кмопа, КУ еї аї. (2008) "Сепегаїйоп,
АнНіппу Майшгаїйоп, Апа Спагасієгігайноп ОЇ А Нитап Апії-Нитап МКаг2О Мопосіопа! Апіїбоду М/йН риаї Апіадопівіїс Апа Адопівіїс Асіїмйу" у. Мої. Віо!. 384:1143-1156; і РСТ/О5О9/54911).
Зо
При використанні такого діатіла клітину-мішень переорієнтовують так, щоб вона могла зв'язуватися з клітинами, які містять набір рецепторів (МКО20). Рецептор МКО20О експресується на всіх людських природних клітинах-кілерах (і в клітинах інших ссавців) (Вапег, 5. еї а. (1999) "Асіїмайоп ОЇМК Сеїїв Апа Т Сеїїє Ву МКагО, А Весеріюог Рог Бігезв-Іпдисірбіе МІСА" Зсівепсе 285(5428):727-729; датіезоп, А.М. еї аї. (2002) "Тпе Роїє ОЇ Те МКаг2О Іттипогесеріог Іп
Іттипе Сеї| Асіїмайоп Апа Маїига! Кійіпа" Іттипйу 17(1):19-29), а також на всіх СО8--Т-клітинах (Сто, М. еї аї. (2001) "Совіїтиціанйоп ОїСОзаїї Т Сеїї5 Ву МКОа20О Міа Епдадетенпі Ву МІС Іпдисєй
Оп Мігив-Іптесієй Сеїїв" Маї. Іттипої. 2(3):255-260; Уатіезоп, А.М. еї аї. (2002) "Пе Роїє ОЇ Те
Мкаг0о Іттипогесеріог Іп Іттипе Сеї! Асіїмайоп Апа Мага! Кіпр" Іттипйу 17(1):19-29).
Альтернативно, молекули діатіла відповідно до винаходу можуть бути сконструйовані так, щоб вони містили домен, який являє собою зв'язувальний ліганд для Т-клітинного рецептора ("ТС"). Природний ТСК експресується СО4-- або СО8:-Т-клітинами і дозволяє таким клітинам розпізнавати антигенні пептиди, які є зв'язаними і презентуються білками МНС класу І або класу
ІЇ на антигенпрезентуючих клітинах. Розпізнавання комплексу РМНС (пептид-МНС) рецептором
ТС ініціює вироблянні клітинної імунної відповіді, що приводить до продукування цитокінів і до лізису антигенпрезентуючих клітин (див., наприклад, Агтвігопо, К.М. еї аї. (2008) "Сопіоптпаїйопаї
Снапоаез Апа Ріехірійу Іп Т-Сеїї Весеріог Весодпійоп ОЇ Реріїде-"«МНО Сотріехе5" Віоспет. 9.
А15(РІ 2):183-196; ММ Петвеп, В. (2008) "ЗеІесіоп ОЇ Нитап Апіїроду Егадтепів Оігесієйд Адаїпві
Титог Т-Сеї! Ерйорев Рог Адоріїме Т-СеїІ! Тнегару" Суютеїйу А. 73(11):1093-1099; Веїієг, К.С. єї аІ. (2007) "Мавієг Зм/йспез ОЇ Т-Сеї! Асіїмайоп Апа Оіпегепійайоп" Еиг. Везріг. У. 29:804-812;
МаїІопе, В. єї аї. (2005) "Тагдейпа ГТ Гутрпосуїе5 Рог Іттипе Мопіогіпд Апа Іпіегуепійп п
Ашоіттипе Оіабеїев5" Ат. У. Тег. 12(6):534-550).
При конструюванні таких молекул діатіл, що додатково містять щонайменше один епітоп- зв'язувальний домен, здатний зв'язуватися, наприклад, з рецептором, який присутній на поверхні мішені, такі молекули діатіла стають молекулами БАКТ, а тому вони набувають здатності зв'язуватися з мішенями і надають цим мішеням можливість представляти ліганд для зв'язування з рецептором природних клітин-кілерів групи 20 (МКО20) або з ТСЕ (з будь-якими
ТСЕ, який присутній на мішені, зв'язаній з діатілом) (див., наприклад, Сегтаїп, С. еї аї. (2008) "Ведігесіїпд МК Сеїїв Медіаїєд Титог Сеї! Гувзіз Ву А Мем Несотбіпапі Вітипсійопа! Ргоївїп" Ргої.
Зо Епдіпеег. Оєвідп ЗеїІесійоп 21(11):665-672).
Такі діатіла можуть бути використані для переорієнтації будь-якої потрібної клітини-мішені в клітину, що буде мішенню для лізису, опосередковуваного МК-клітинами, або для цитотоксичності, опосередковуваної Т-клітинами. В одному з варіантів винаходу епітоп- зв'язувальний домен діатіла, здатний зв'язуватися з рецептором, який присутній на поверхні мішені, являє собою епітоп, що зв'язується з пухлиноасоційованим антигеном так, щоб це приводило до переорієнтації таких ракових клітин у субстрати для лізису, опосередковуваного
МК клітинами, або для цитотоксичності, опосередковуваної Т-клітинами. Особливий інтерес представляють пухлиноасоційовані антигени, що являють собою антиген раку молочної залози, антиген раку яєчника, антиген раку передміхурової залози, антиген раку шийки матки, антиген карциноми підшлункової залози, антиген раку легень, антиген раку сечового міхура, антиген раку товстої кишки, антиген раку яєчок, антиген гліобластоми, антиген, асоційований зі злоякісною пухлиною В-клітин; антиген, асоційований із множинною мієломою; антиген, асоційований з неходжкінською лімфомою, або антиген, асоційований с хронічним лімфоцитарним лейкозом.
Пухлиноасоційованими антигенами, що підходять для такого застосування, є АЗЗ (антиген карциноми прямої і ободової кишки; АїЇтоміб5і, М. 2006, Мис!І Меа Віої. Мом; 33(8):991-998); В1 (ЕдЧіої, А.М. еї а. 2006, Сапсег Нез. 66(1):6-9); ВАСЕ (Водеу, В. 2002 Ехреп Оріп Віо! Тег. 2(6):577-84); бета-катенин (Ргапде УМ. еї а). 2003 У) Раїшої. 201(2):250-9); СА125 (Вавзі, В.С. г. єї ам. 2005 Іпї ) Супесої Сапсег 15 Биуррі 3:274-81); СО5 (Саїїп, С.А. єї аі. 2006 бетіп Опсої. 5О /39(2):167-73; СО19 (Тгоизвзаго, Х. єї а. 1998 Нетайо! Сеїї Тег. 40(4):139-48); СО20 (Тпотазв, О.А. еї аі. 2006 Нетай! Опсої! Сіїп Мой Ат. 20(5)11125-36); СО22 (Ктейтап, 8.9. 2006 ААРЗ У. 18; 8(3):Е532-51); СО23 (Возаїї, 5. еї а. 2005 Сит Тор Містобріо! Іттипої. 5; 294:91-107); б0р25 (Ттоиззага, Х. єї аі. 1998 Нетай!| Сеї! ТНег. 40(4):139-48); С027 (Ваїайе, В. 2006 Наєтаїйоіодіса 91(9):1234-40); С028 (Ваїайе, В. 2006 Наетаїйоіодіса 91(9)1234-40); СО36 (Се, У. 2005 Іа
Нетаїйо!. 11(1):31-7); С040/20154 (Меззтетг, 0. єї аІ. 2005 Апп М М Асай 5сі. 1062:51-60); С045 (Читсіс, 9.2. 2005 Сицт Опсої Вер. 7(5):339-46); СО56 (Ваїайе, В. 2006 Наетайюіодіса 91(9):1234- 40); СО79а/С079Ь (Тгоиззаго, Х. єї аї. 1998 Нетай! Сеї! ТНег. 40(4):139-48; Спи, Р.О. еї а). 2001
Аррі Іттипопівіоспет Мої! Могрпої!. 9(2):97-106); СО103 (Тгоивззагос, Х. єї аІ. 1998 Нетаїй! СеїЇ
ТНнег 40(4)139-48); СОК4 (ее, М.М. єї а. 2006 Сей Сусівє 5(18)2110-4); СЕА бо (карциноембріональний антиген; Майїпеїйп, С. 2006 Супесої Орзівї Регій. 34(7-8):638-46; ТеПез-
Аміїа, Б.І. еї ам. 2005 Нем Іпмеві Сіїп. 57(6):814-9); СТІ А4 (Редов, К.5. еї аІ. 2006 Си Оріп
Іттипої. 18(2):206-13); ЕСЕ-К (рецептор епідермального фактора росту; Адепів, А. еї аї. 2003
Ви Сапсег. 90 рес Мо:5228-32); ЕТОВ (ЕгтОВІ; ЕгОВЗ3; ЕпоВа; 2пои, Н. еї а. 2002 Опсодепе 21(57):8732-40; Вітоп, Е. еї аі. 2004 Іпї У Опсої. 24(5):11325-38); САСЕ (СсАСЕ-1; пАСЕ-2; АКсакКапаї, А. еї аї. 2006 Іпї ) Сапсег. 118(1):123-83; Ч0О2/503/аМа2 (І їміпдвіоп, Р.О. єї аї. 2005
Сапсег Іттипо!ї Іттипоїйпег. 54(10):1018-25); 9дрі00 (Гоїет, М. еї аЇ. 2006 9 ІттипоїНег. 29(6):616-27); НЕВ-2/пеи (Китаг, Ра! 5 еї а. 2006 Бетіп Опсої. 33(4):386-91); людський папіломавірус-Еб/людський папіломавірус-Е7 (біМаїйо, 0. еї аі. 2006 Адм Міги5 Не5. 66:125-59;
КБА (17-1 А) (Вадираїні, й. 2005 Сапсег Ттєаї Не5. 123:157-80); МАСЕ (МАСЕ-1; МАСЕ-3; (Водеу, В. 2002 Ехреїї Оріп Віо! ТНег. 2(6):577-84); МАВТ (Коипаїаків, М. еї аІ. 2005 Си Опсої
Вер. 7(5):377-82; МОС-1 (МаїНеїйп, С. 2006 Супесої ОБрзівї Еепії. 34(7-8):638-46); МОМ-1 (СавівїЇї,
С. єї а). 2000 У СеїІ Рпувзіої. 182(3):323-31); М-ацетилглюкозамінілтрансфераза (Оеппів, УМ/. 1999
Віоспіт Віорпувз Асіа. 6; 1473(І):21-34); рі5 (сії, 9. еї аі. 2006 Маї Нем Мої Сеї Віо!. 7(9):667-77);
РЗА (антиген, специфічний для передміхурової залози; Стассо, СМ. еї аі. 2005 Міпегуа Огої
Меїтгої. 57(4):301-11); РОМА (Радирайні, с. 2005 Сапсег Тгєеаї Вев. 123:157-80); 5Тп (НоІтрега,
Г.А. 2001 Ехреп Оріп Віо! Тег. 1(5):881-91); ТМЕ-рецептор (рецептор ТМЕ-а, рецептор ТМЕ-В або рецептор ТМЕ-у; мап Ноггзеп, В. єї аІ. 2006 Опсоіодівї. 11(4):397-408; Сагапегома, М. еї аї. 2000 Сип Огид Тагаєїв. (4):327-64); або рецептор МЕСЕ (СОбмуег. Р.). 2006 Опсоподіві. 11(9):992-8).
Іншими пухлиноасоційованими антигенами, використовуваними для цих цілей (їі публікаціями, у яких описані антитіла, що специфічно реагують з такими антигенами), є АБАМ-9 (публікація заявки на патент США Мо 2006/0172350; публікація РСТ Мо М/О 06/084075); А САМ (публікація РСТ Мо УУО 03/093443); карбоксипептидаза М (публікація заявки на патент США Мо 2006/0166291); СО46 (патент США Мо 7148038; публікація РСТ Мо УМО 03/032814); цитокератин 8 (публікація РСТ Мо МУО 03/024191); рецептори ефрину (зокрема, ЕрпА2 (патент США Мо 7569672; публікація РСТ Мо МО 06/084226); інтегрин альфа-М-бета-6 (публікація РСТ Мо УМО 03/087340); ЧАМ-3 (публікація РСТ Мо УМО 06/084078); КІОЗ (публікація РСТ Мо УМО 05/028498);
КІОЗ31 (публікація РСТ Мо УМО 06/076584); ГОСА-2 (публікація патенту США Мо 2006/0172349; публікація РСТ Мо УМО 06/083852); онкостатин М (рецептор онкостатину бета) (патент США Мо
Зо 7572896; публікація РСТ Мо УУО 06/084092); РІРА (патент США Мо 7405061; публікація РСТ Мо
УМО 04/043239); ГААС10 (патент США Мо 7527969; публікація РСТ Мо УМО 04/001381); ЕОК!1 (патент США Мо 5843749); ТЕ57 (публікація РСТ Мо М/О 08/066691); і рецептор трансферину (патент США Мо 7572895; публікація РСТ Мо УМО 05/121179).
Інтерес також представляють антигени, специфічні до конкретних інфекційних агентів, наприклад, до вірусних агентів, включаючи, але не обмежуючись ними, вірус імунодефіциту людини (ВІЛ), вірус гепатиту В (НВМ), вірус грипу, людський папіломавірус (НРУ), вірус ящуру (коксаківірус), вірус сказу, вірус простого герпеса (НБУ), агенти, що викликають гастроентерит, включаючи ротавіруси, аденовіруси, каліцивіруси, астровіруси і вірус Норуолк; бактеріальні агенти, включаючи, але не обмежуючись ними, агенти БЕ. сої), ЗаІтопейа «Вурпітигішт,
Реєидотопавх аєгидіпоза, Мірпо споіІегає, Меїззепа допоппоєавє, Неїїсобасієг руїогі, Неторпуїов5 іпЯшепгає, ЗпідеПа адузепіветає, Єгарпуіососсив айгеи5, Мусобасієгійт шрегсиціов5ів і Зігеріососсив5 рпештопіає; грибкові агенти і паразити, такі як Сіагаї.
Альтернативно, такий епітоп може зв'язуватися з Ес-рецептором (наприклад, з Есукі або
ЕсукКіІ), що дозволяє, наприклад, переорієнтувати клітини гострого моноцитарного лейкозу в субстрати для лізису клітин, опосередковуваного МК-клітинами. 5.1. Зв'язувальні домени діатіл
Діатіла відповідно до винаходу включають антигензв'язувальні домени, в основному, які походять від імуноглобулінів або антитіл. Антитіла, від яких походять зв'язувальні домени, використовувані в способах відповідно до винаходу, можуть бути отримані від будь-якої тварини, включаючи птахів і ссавців (наприклад, людини, приматів, що не є людиною, мишей, ослів, овець, кроликів, кіз, морських свинок, верблюдів, коней або курей). Переважними антитілами є людські або гуманізовані моноклональні антитіла. Використовуваними тут "людськими" антитілами є антитіла, що мають амінокислотну послідовність людського імуноглобуліну, і антитіла, виділені з бібліотек людських імуноглобулінів або бібліотек синтетичних послідовностей, що кодують людські імуноглобуліни, або антитіла, виділені в мишей, у яких вказані антитіла експресуються з людських генів.
У даному винаході розглядається застосування будь-яких антитіл, відомих фахівцям, для лікування і/або попередження раку, аутоїмунного захворювання, запального захворювання або інфекційного захворювання, де вказані антитіла служать джерелом зв'язувальних доменів для 60 діатіл відповідно до винаходу. Необмежувальними прикладами відомих протиракових антитіл є антитіла, що приводяться в розділі 5.7.1, а також інші антитіла, специфічні до перерахованих антигенів-мішеней, і антитіла проти ракових антигенів, перерахованих у розділі 5.6.1; необмежувальними прикладами відомих антитіл, використовуваних для лікування і/або попередження аутоїмунного захворювання і запального захворювання, є антитіла, що приводяться в розділі 5.7.2., а також антитіла проти перерахованих антигенів-мішеней і антитіла проти антигенів, перерахованих у розділі 5.6.2; а в інших варіантах винаходу можуть бути використані антитіла проти епітопів, асоційованих з інфекційними захворюваннями, перерахованими в розділі 5.6.3. У деяких варіантах винаходу антитіла містять варіант Ес- ділянки, що має одну або більше амінокислотних модифікацій, які були ідентифіковані способами відповідно до винаходу і які надають ефекторну функцію і/або підвищену афінність до ЕСУКІІВ і знижену афінність до ЕСУКІПША у порівнянні з молекулою, що містить Ес-ділянку дикого типу. Необмежувальні приклади антитіл, що використовуються для лікування або попередження запальних розладів і які можуть бути сконструйовані відповідно до даного винаходу, представлені в таблиці 9, а необмежувальні приклади антитіл, що використовуються для лікування або попередження аутоімунного розладу, представлені в таблиці 10.
Для визначених цілей, включаючи іп мімо використання антитіл для введення людині і для іп міго аналізів по детектуванню, може виявитися переважним використовувати діатіла, що містять варіабельні домени, які походять від людських, химерних або гуманізованих антитіл.
Варіабельні домени від повністю людських антитіл є особливо придатними для терапевтичного лікування людини. Людські антитіла можуть бути отримані різними методами, відомими фахівцям, включаючи описані вище методи фагового представлення, у яких використовуються бібліотеки антитіл, які походять від послідовностей людського імуноглобуліну. Див., також патенти США МоМо 4444887 і 4716111; і публікації Міжнародних заявок М/О 98/46645, УМО 98/50433, МО 98/24893, МО 98/16654, МО 96/34096, УМО 96/33735 і УМО 91/10741, що у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання.
Гуманізованим антитілом є антитіло, його варіант або фрагмент, які мають здатність зв'язуватися з попередньо визначеним антигеном і містять каркасну ділянку, що має, в основному, амінокислотну послідовність людського імуноглобуліну, ії СОР, що має, в основному, амінокислотну послідовність нелюдського імуноглобуліну. Гуманізоване антитіло може містити,
Ко) в основному, усі, або щонайменше один, а звичайно два варіабельні домени, у яких усі або майже всі ділянки СОР. відповідають ділянкам не-людського імуноглобуліну (тобто, донорного антитіла), і всі або майже всі каркасні ділянки відповідають ділянкам консенсусної послідовності людського імуноглобуліну.
Каркасні ділянки і СОК-ділянки гуманізованого антитіла необов'язково повинні точно відповідати ділянкам батьківських послідовностей, наприклад, донорна СОК або консенсусна каркасна ділянка можуть бути піддані мутагенезу шляхом заміни, інсерції або делеції щонайменше одного залишку так, щоб залишок СОК або каркасний залишок у цьому сайті не відповідали ні консенсусному антитілу, ні донорному антитілу. Однак такі мутації переважно не є численними. Звичайно щонайменше 75 95, найчастіше 90 95 залишків, а найбільше переважно більше 9595 залишків гуманізованого антитіла відповідають послідовностям батьківської каркасної ділянки (ЕК) і СО. Гуманізовані антитіла можуть бути продуковані різними методами, відомими фахівцям, включаючи, але не обмежуючись ними, СОВ-щеплення (Європейський патент Мо ЕР 239400; публікація Міжнародної заявки Мо УМО 91/09967; і патенти США МоМо 5225539, 5530101 і 5585089), "оздоблення" або "облицювання" (Європейські патенти МоМе ЕР 592106 і ЕР 519596; Раадіап (1991) "А Роззіріе Ргоседиге Бог Редисіпда Те Іттиподепісйу ОЇ
Апіїроду Магіабіе ботаїпз5 М/піе Ргезегміпд ТНеїг І ідапа-Віпаїпа Ргорейіевз" МоїІесшаг ІттипоЇоду 28(4/5):489-498; БішапісКа еї аї. (1994) "Нитап-Епдіпеетед Мопосіопа! Апіїродієз Веїаїп Еші зЗресіїс Віпаіїпуд Асіїмпу Ву Ргезегліпд Моп-СОВ Сотрієтепіапу-Моашіаїййпа ВРезідиев" Ргоївіп
Епаіпеегтіпу 7(6):805-814; і КодизкКа еї аї. (1994) "Нитапіганоп ОЇ Мигіпе Мопосіопа! Апіїбодієв
ТАгоцди Мапаріе ЮОотаіїп ВНезипасіпд" Ргос Майї Асад бсі ОБА 91:969-973), перестановку ланцюгів (патент США Мо 5565332), і методи, описані, наприклад, у патентах США МоМо 6407213, 5766886, 5585089, у публікації Міжнародної заявки Мо УМО 9317105, Тап еї аї. (2002) "зирегппитапігесй!" Апіїродієв: Недисіїоп ОГ Іттиподепіс Роїепіза! Ву Сотріетепіатпу-Оеєїептіпіпу
Ведіоп Стайіпу МУЙН Нитап Сіептіїпе бедиепсев: Арріїсайоп То Ап Апії-С028" 9. Іттипої. 169:1119-25, Саіда5 єї аї. (2000) "Оєзідп Апа бупіпезіз ОЇ Септіїпе-Вазед. Неті-Нитапігвй
Зіпаіє-СНаіп Ем Адаїпвїі Те СО 18 бипасе Апіїдеп" Ргоїєїп Епа. 13:353-60, Могєа єї аї. (2000) "Апіїбоду Моавеїїпд: Ітріїсайоп5 Рог Епдіпеегіпа Апа Оевідп" Меїйодз 20:267-79, Васа 6вї а). (1997) "Апіїроду Нитапігайоп Овіпд Мопомаїепі Рпаде Оізріау" У. Віої. Спет. 272:10678-84, КодивкКа єї аІ. (1996) "А Сотрагізоп ої Туго Мигіпе Мопосіопа! Апіїбодіез Нитапілеа Ву СОК-Стайіпуд Апа 60 Мапаріє Юотаїп ВНезипасіпуд" Ргоїєїп Епуд. 9:895-904, Соціо єї аї. (1995) "Оевідпіпд Нитап
Сопвепвив Апіїродівв М/Н Міпіта! Розйіопа! Тетріаїевз" Сапсег Вез. 55 (23 5Бирр):59735-59778,
Соціо еї аї. (1995) "Апіі-ВА46 Мопосіопа! Апіїбоду Мез3: Нитапігайоп О5іпд А Моме! Розйіопаї
Сопвепзив Апа Іп Мімо Апа Іп Міго Спагасіегігайоп" Сапсег Вев5. 55:1717-22, запани (1994) "А
Варіа Ргоседиге Рог Тпе Нитапігайоп ОЇ Мопосіопа! Апіїродієв" Сепе 150:409-10, Редегзеп еї аї. (1994) "Сотрагзоп ОЇ бБипасе Ассеззіріє Везідцез п Нитап Апа Мигіпе Іттиподіориїйп Ем
Ротаїпв. Ітріїсайоп Рог Нитапігайоп ОЇ Мигіпе Апіїродієв" У. Мої. Віої. 235:959-973, дУопез еї аї. (1986) "Веріасіпд Тпе Сотрієтепіатпу-Оеєїеттіпіпуд Ведіопо5 Іп А Нитап Апіїбоду М/Н Тнозе Ггот
А Моизе" Маїшге 321:522-525, ВНВіесптапп еї а!. (1988) "Незпаріпд Нитап Апііродієвз Бог Тнегару"
Маїште 332:323-327, апа Ргевзіа (1992) "Апіроду Епдіпеегіпд" Сит. Ор. Віоїесй. 3(4):394-398. У більшості випадків каркасні залишки в каркасних ділянках заміняють відповідним залишком
СОК донорного антитіла з метою зміни, а переважно, підвищення рівня зв'язування з антигеном. Ці заміни в каркасних ділянках ідентифікують методами, добре відомими фахівцям, наприклад, шляхом моделювання взаємодії СОК і каркасних залишків з метою ідентифікації каркасних залишків, що відіграють важливу роль у зв'язуванні з антигеном, і для порівняння послідовностей з метою ідентифікації рідких каркасних залишків у конкретних положеннях (див., наприклад, Оцееп еї аї., патент США Мо 5585089; публікації заявок США МоМо 2004/0049014 і 2003/0229208; патенти США МоМо 6350861; 6180370; 5693762; 5693761; 5585089 і 5530101; і
Віеєсптапп есеї аї. (1988) "Не5Ппаріпд Нитап Апііродієз Гог ТПнегару" Маїиге 332:323-327, що у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання).
В особливо переважному варіанті винаходу зв'язувальний домен гуманізованого антитіла специфічно зв'язується з тим же епітопом, з яким зв'язується донорне мишаче антитіло. Для фахівця в даній галузі очевидно, що даний винахід у цілому охоплює СОК-щеплення антитіл.
Таким чином, донорне й акцепторне антитіла можуть походити від тварин того самого виду і навіть від антитіла того самого класу або підкласу. Однак, найчастіше, донорне й акцепторне антитіла походять від тварин різних видів. Звичайно донорним антитілом є нелюдське антитіло, таке як тАб гризунів, а акцепторним антитілом є людське антитіло.
У деяких варіантах винаходу щонайменше одну СОК від донорного антитіла переносять у людське антитіло. В інших варіантах винаходу щонайменше дві, а переважно всі три СОК кожної варіабельної ділянки важкого і/або легкого ланцюга переносять у людське антитіло. Ці
Зо СОР можуть містити СОК по Кебату, СОК структурної петлі або їхню комбінацію. У деяких своїх варіантах даний винахід охоплює гуманізоване ЕсуВіІВ-специфічне антитіло, що містить щонайменше один СОК-щеплений важкий ланцюг і щонайменше один СОК-щеплений легкий ланцюг.
Діатіла, використовувані в способах відповідно до винаходу, включають похідні, які були модифіковані, наприклад, шляхом ковалентного зв'язування молекули будь-якого типу з діатілом. Прикладами похідних діатіл є, але не обмежуються ними, діатіла, які були модифіковані, наприклад, шляхом глікозилування, ацетилування, ПЕГилування, фосфорилування, амідування, дериватизації відомими захисними/локуючими групами, протеолітичного розщеплення, зв'язування з клітинним лігандом або з іншим білком і т. п. Будь- які різні хімічні модифікації можуть бути здійснені з застосуванням відомих методів, включаючи, але не обмежуючись ними, специфічне хімічне розщеплення, ацетилування, формілування, метаболічний синтез туникаміцину і т. п. Крім того, вказане похідне може містити одну або більше некласичних амінокислот.
Химерне антитіло являє собою молекулу, у якій різні частини антитіла походять від різних молекул імуноглобуліну, таких як антитіла, що мають варіабельну ділянку, яка походить від нелюдського антитіла, і константну ділянку людського імуноглобуліну. Методи одержання химерних антитіл відомі фахівцям. Див., наприклад, Моггізоп (1985) "Тгап5Тесіотав5 Ргоміае
Моме!ї СНітегіс Апіїродіев" Зсіепсе 229:1202-1207; ОЇ еї а). (1986) "Спітегіс Апііродієв"
ВіоТесппіднев 4:214-221; СійШевз еї аї. (1989) "Нідн-І еме! Ехргезвіоп ОЇ Спітетгіс Апіїродіє5 Овіпа
Адарієд СОМА Магіабіе Ведіоп Саззейцев" У. Іттипої. Меїнод» 125:191-202; і патенти США МоМо 6311415, 5807715, 4816567 і 4816397, що у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання.
У більшості випадків каркасні залишки в каркасних ділянках замінюють відповідним залишком СОК донорного антитіла з метою зміни, а переважно підвищення рівня зв'язування з антигеном. Ці заміни в каркасних ділянках ідентифікують методами, добре відомими фахівцям, наприклад, шляхом моделювання взаємодій СОК і каркасних залишків з метою ідентифікації каркасних залишків, що відіграють важливу роль у зв'язуванні з антигеном, і для порівняння послідовностей з метою ідентифікації рідких каркасних залишків у конкретних положеннях (див., наприклад, патент США Мо 5585089; і Кіесптапп еї аї. (1988) "Кез5паріпд Нитап Апііродіє5 Рог
Тпегару" Мате 332:323-327, що у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання).
Моноклональні антитіла, від яких походять зв'язувальні домени діатіл відповідно до винаходу, можуть бути отримані з застосуванням технологій широкого ряду, відомих фахівцям, включаючи гібридомну технологію, техніку рекомбінантних ДНК і технологію фагового представлення або їхні комбінації. Так, наприклад, моноклональні антитіла можуть бути отримані з застосуванням гібридомної технології, включаючи технології, відомі фахівцям і описані, наприклад, у публікаціях Нагіом/ еї аї., Апіїбодіеєв: А І арогаїогу Мапиаї, (Соїд бргіпд
Нартбог І арогаюгу Ргез5, 2па єд. 1988); Наттепіпа, єї аї., іп: Мопосіопа! Апііїродієз апа Т-Сеї!
Нубгідотав, рр. 563-681 (ЕІземієг, М.У., 1981) (які у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання). Використовуваний тут термін "моноклональне антитіло" не обмежується антитілами, отриманими з застосуванням гібридомної технології. Термін "моноклональне антитіло" означає антитіло, що походить від одного клону, включаючи будь-який еукаріотичний, прокаріотичний або фаговий клон, але не обмежується способом його одержання.
Способи продукування і скринінгу специфічних антитіл із застосуванням гібридомної технології є рутинними методами, добре відомими фахівцям. У необмежувальному прикладі миші можуть бути імунізовані антигеном, що представляє інтерес, або клітиною, яка експресує такий антиген. Після детектування імунної відповіді, наприклад, антитіла, специфічні до антигену, детектують у мишачій сироватці, а потім беруть селезінку і виділяють спленоцити.
Після цього спленоцити піддають злиттю з будь-якими придатними мієломними клітинами добре відомими методами. Гібридоми відбирають і клонують шляхом лімітуючого розведення.
Потім гібридомні клони аналізують відомими методами на клітини, секретуючі антитіла, здатні зв'язуватися з антигеном. Асцитна рідина, що в основному містить високі рівні антитіл, може бути отримана шляхом внутрішньоочеревинної інокуляції мишей позитивними гібридомними клонами. Антигенами, що представляють інтерес, є, але не обмежуються ними, антигени, асоційовані з раковими захворюваннями, перерахованими в розділі 5.8.1, антигени, асоційовані з аутоїмунними і запальними захворюваннями, перерахованими в розділі 5.8.2, антигени, асоційовані з інфекційними захворюваннями, перерахованими в розділі 5.8.3, і токсини, перераховані в розділі 5.8.4.
Зо Антитіла можуть бути також отримані різними методами фагового представлення, відомими фахівцям. У методах фагового представлення функціональні домени антитіл представляють на поверхні фагових частинок, що несуть полінуклеотидні послідовності, які кодують ці домени. У конкретному варіанті винаходу такий фаг може бути використаний для представлення антигензв'язувальних доменів, таких як Бар і Ем або Ем, стабілізованих дисульфідними зв'язками, де вказані домени були експресовані з бібліотеки репертуару антитіл або комбінаторної бібліотеки антитіл (наприклад, людських або мишачих). Фаг, який експресує антигензв'язувальний домен, що зв'язується з антигеном, який представляє інтерес, може бути відібраний або ідентифікований з використанням антигену, наприклад, з використанням міченого антигену або антигену, зв'язаного з твердою поверхнею або зі сферами, або антигену, іммобілізованого на вказаних поверхнях або сферах. Фагом, використовуваним у цих методах, звичайно є нитчастий фаг, включаючи ї4 і М13. Антигензв'язувальні домени експресуються як рекомбінантні злиті білки, приєднані рекомбінантними методами до білка фагового гена ІІІ або гена МІ. Прикладами методів фагового представлення, що можуть бути застосовані для одержання імуноглобулінів або їхніх фрагментів відповідно до винаходу, є методи, описані в публікаціях ВгіпКктапп еї аї. (1995) "Рпаде Оізріау ОЇ Різийае-еїтарійлей Ем Егадтепів" ..
Іттипої. Меїйоадв5, 182:41-50; Атевз єї аї. (1995) "Сопмегвіоп ОЇ Мигіпе Раб Ізоіїаїга ГЕгот А
Сотрбіпаютгтіаї! Рнаде бізріау І ібгагу То Еш Гепдій Іттиподіориїїп5" У. Іттипої. Меїйодв», 184:177- 186; Кешеброгоцонй еї аї. (1994) "ІвоЇаййоп ОЇ Титог СеїІ-Зресіїс бЗіпаіє-СНнаіп Ем Еюот Іттипігей
Місе О5іпд Рпаде-Апіїроду І іргагіез Апа Те Не-Сопвігисіоп ОЇ М/поїє Апіїродіез Ггот Тезе
Апіїбоду Егадтепів" Єиг. у. Іттипої, 24:952-958; Регзіс евї а!ї. (1997) "Ап Іпівдгаїєд Месіог Зувівт
Еог Тне ЕиКагуосїїс Ехргеззіоп ОЇ Апіїбодієз Ог Тнеїг Егадтепів Айег 5еЇесіп Егот РНаде Оізріау
Піргапев" Сепе, 187:9-18; Випоп еї аї. (1994) "Нитап Апіїрбодіев ГЕгот СотрбБіпаюнгіа! І Ібгагієв"
Адмапсеб5 іп Іттипоіоду, 57:191-280; у заявці РСТ Мо РСТ/5891/01134; заявках РСТ УМО 90/02809; МО 91/10737; МО 92/01047; МО 92/18619; МО 93/11236; МО 95/15982; МО 95/20401; і в патентах США МоМо 5698426; 5223409; 5403484; 5580717; 5427908; 5750753; 5821047; 5571698; 5427908; 5516637; 5780225; 5658727; 5733743 і 5969108; які у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання.
Технологія фагового представлення може бути застосована для підвищення афінності антитіла відносно його антигену. Ця технологія може бути використана для одержання у бо високому ступені афінних антитіл. У цій технології, основаній на дозріванні афінності,
використовують мутагенез або "прогулянку" по СОМ і повторний відбір з використанням когнатного антигену для ідентифікації антитіл, що зв'язуються з антигеном з більш високою афінністю в порівнянні з вихідним батьківським антитілом (див., наприклад, Сіазег еї аї. (1992) "Ріввзесіоп ОГ Те Сотбіпіпд 5йе Іп А Нитапігед Апіі-Тас Апіїроду" 9. Іттипоіоду 149:2607- 2614). Мутагенез цілих кодонів, а не окремих нуклеотидів, дозволяє одержати напіврандомізований набір амінокислотних мутацій. Можуть бути сконструйовані бібліотеки, що складаються з пулу варіантів клонів, кожний 3 який відрізняється від іншого однією амінокислотною модифікацією в одній СОК, і містить варіанти, що представляють кожну можливу амінокислотну заміну для кожного залишку СОК. Мутанти з підвищеною афінністю зв'язування з антигеном можуть бути скриновані за допомогою контактування іммобілізованих мутантів з міченим антигеном. Для ідентифікації мутантних антитіл з підвищеною авідністю до антигену може бути застосований будь-який метод скринінгу, відомий фахівцям (наприклад,
ЕСІЗА) (див. УМи еї аїЇ. (1998) "ЗМеруізе Іп Міго Айіпйу Маїшигайоп ОЇ Міахіп, Ап АІрпам Веїтаз-
Зресіїйс Нитапігед тАБ" Ргос Маї). Асай 5сі. ОБА 95:6037-6042; Мейоп еї аї. (1995) "Аніпйу
Маїшигайоп ОЇ Те Вг96 Апіі-Сагсіпота Апіроду Ву Содоп-Вазей Миїадепевів" 3). Іттипоіоду 155:1994-2004). Може бути також застосований метод "прогулянки" по СОК, що дозволяє здійснити рандомізацію легкого ланцюга (див. Зспієег еї аї. (1996) "ІзоЇайоп ОЇ Рісотоїаг Айіпку
Апіі-С-ЕТЬВ-2 бЗіпаіе-СНнаіп Ем Ву Моїесшаг Емоїшіоп ОЇ Тне Сотрієтепіату Оеєїептіпіпд Ведіопе
Іп Те Сепіег ОЇ Те Апіїбоду Віпаїпуд Зйе" У. Мої. Віо. 263:551-567).
Даний винахід також охоплює використання зв'язувальних доменів, що містять амінокислотну послідовність кожного зі зв'язувальних доменів, які описані у даній заявці або відомі фахівцям і містять мутації (наприклад, одну або більше амінокислотних замін) у каркасній ділянці або в СОК-ділянці. Переважно, щоб мутації в цих зв'язувальних доменах зберігали або підвищували авідність і/або афінність зв'язувальних доменів до ЕсукКіІІВ, з яким вони імуноспецифічно зв'язуються. Для аналізу афінності антитіла до конкретного антигену можуть бути застосовані стандартні методи, відомі фахівцям (наприклад, імуноаналізи).
Для введення мутацій у нуклеотидну послідовність, яка кодує антитіло або його фрагмент, можуть бути застосовані стандартні методи, відомі фахівцям, включаючи, наприклад, сайт- направлений мутагенез і ПЛР-опосредований мутагенез, що приводить до амінокислотних
Зо замін. При цьому переважно, щоб такі похідні включали менше ніж 15 амінокислотних замін, менше ніж 10 амінокислотних замін, менше ніж 5 амінокислотних замін, менше ніж 4 амінокислотні заміни, менше ніж З амінокислотні заміни або менше ніж 2 амінокислотні заміни в порівнянні з вихідним антитілом або його фрагментом. У переважному варіанті винаходу похідні мають консервативні амінокислотні заміни, зроблені в положеннях одного або більше передбачених замінних амінокислотних залишків. 5.1.1. Діатіла, що містять епітоп-зв'язувальні сайти, які імуноспецифічно зв'язуються з
ЕсувВІІВ
У конкретному варіанті винаходу щонайменше один зі зв'язувальних доменів діатіл відповідно до винаходу діє як агоніст щонайменше однієї активності ЕСУКІІВ. В одному з варіантів винаходу вказаною активністю є інгібування передачі сигналу, опосередковуваної В- клітинним рецептором. В іншому варіанті винаходу зв'язувальний домен інгібує активацію В- клітин, проліферацію В-клітин, продукування антитіла, приплив внутрішньоклітинного кальцію у
В-клітини, проходження клітинних циклів або активність однієї або більше молекул передачі сигналу, що діють у наступних реакціях шляху передачі сигналу ЕСУуКІІВ. В іншому варіанті винаходу зв'язувальний домен підвищує рівень фосфорилування ЕсуйІІВ або рекрутинг ЗНІР. В іншому варіанті винаходу зв'язувальний домен інгібує активність кінази МАР або рекрутинг АКІ у шляху передачі сигналу, опосередковуваного В-клітинним рецептором. В іншому варіанті винаходу зв'язувальний домен підсилює ЕсуВіІІВ-опосередковуване інгібування передачі сигналу ЕсСєКІ. У конкретному варіанті винаходу вказаний зв'язувальний домен інгібує ЕсСеВІ- індуковану активацію тучних клітин, мобілізацію кальцію, дегрануляцію, продукування цитокінів або вивільнення серотоніну. В іншому варіанті винаходу зв'язувальні домени відповідно до винаходу стимулюють фосфорилування ЕсукКіІІВ, стимулюють рекрутинг ЗНІР, стимулюють фосфорилування 5НІР і його зв'язування з ЗПС, або інгібують активацію членів сімейства кіназ
МАР (наприклад, ЕгкК1, Егк2, УМК, рз8 і т. п.). В іншому варіанті винаходу зв'язувальні домени відповідно до винаходу підвищують рівень фосфорилування тирозину рбааок і його зв'язування з ЗНІР ії газсСАР. В іншому варіанті винаходу зв'язувальні домени відповідно до винаходу інгібують ЕсуВ-опосередковуваний фагоцитоз у моноцитах або у макрофагах.
В іншому варіанті винаходу зв'язувальні домени діють як антагоністи щонайменше однієї активності ЕСУКІІВ. В одному з варіантів винаходу вказаною активністю є активація передачі бо сигналу, опосередковуваної В-клітинним рецептором. У конкретному варіанті винаходу зв'язувальні домени підсилюють активність В-клітин, проліферацію В-клітин, продукування антитіла, приплив внутрішньоклітинного кальцію або активність однієї або більше молекул передачі сигналу, що діють у наступних реакціях шляху передачі сигналу ЕСУуКІІВ. В іншому конкретному варіанті винаходу зв'язувальні домени знижують рівень фосфорилування ЕсуВІії!В або рекрутинг ЗНІР. В іншому варіанті винаходу зв'язувальні домени підсилюють активність кінази МАР або рекрутинг АКЇ у шляху передачі сигналу, опосередковуваного В-клітинним рецептором. В іншому варіанті винаходу зв'язувальні домени є антагоністами ЕсуВІІВ- опосередковуваного інгібування передачі сигналу ЕсєКІ. У конкретному варіанті винаходу вказані зв'язувальні домени підсилюють ЕсСеВіІ-індуковану активацію тучних клітин, мобілізацію кальцію, дегрануляцію, продукування цитокінів або вивільнення серотоніну. В іншому варіанті винаходу зв'язувальні домени інгібують фосфорилування ЕсукіІІВ, рекрутинг 5НІР, фосфорилування 5ЗНІР і його зв'язування з 5Пс, і підсилюють активацію членів сімейства кіназ
МАР (наприклад, ЕгКк1, Егк2, УМК, рз8 і т. п.). В іншому варіанті винаходу зв'язувальні домени інгібують рівень фосфорилування тирозину рбагаок і його зв'язування з ЗНІР і газбАР. В іншому варіанті винаходу зв'язувальні домени підсилюють ЕсуН-опосередковуваний фагоцитоз у моноцитах або у макрофагах. В іншому варіанті винаходу зв'язувальні домени попереджають фагоцитоз, кліренс опсонізованих частинок макрофагами селезінки.
В інших варіантах винаходу щонайменше один зі зв'язувальних доменів може бути використаний для націлювання діатіл відповідно до винаходу на клітини, які експресують
ЕсуВІЇІВ.
В одному конкретному варіанті винаходу один зі зв'язувальних доменів походить від мишачого моноклонального антитіла, продукованого клоном 286 або ЗН7, що має реєстраційні номери АТСС РТА-4591 і РТА-4592, відповідно. Гібридоми, які продукують антитіла 286 і ЗН7, були депоновані в Американській колекції типових культур (10801 Опімегейу Віма., Мапавзав, МА. 20110-2209) 13 серпня 2002 р. відповідно до Будапештського договору про міжнародне визнання депонування мікроорганізмів для цілей патентних процедур, і мають реєстраційні номери РТА-4591 (для гібридоми, яка продукує 286) і РТА-4592 (для гібридоми, яка продукує
ЗН7), відповідно, і ці гібридоми вводяться в даний опис за допомогою посилання. У переважному варіанті винаходу зв'язувальні домени є людськими або гуманізованими,
Зо переважно походять від гуманізованого варіанта антитіла, продукованого клонами ЗН7 або 286.
Даний винахід також охоплює діатіла, що мають зв'язувальні домени, які походять від інших антитіл і специфічно зв'язуються з ЕСуКІІВ, переважно з людським ЕсСУуМІІВ і більш переважно з нативним людським ЕсукіІІВ, а також походять від клонів, включаючи, але не обмежуючись ними, клони 105, 2Е1, 2НО, 2011 і 162 з реєстраційними номерами АТС РТА-5958, РТА-5961,
РТА-5962, РТА-5960 і РТА-5959, відповідно. Гібридоми, які продукують ідентифіковані вище клони, були депоновані в Американській колекції типових культур (10801 Опімегейу Віма.,
Мапаззав, МА. 20110-2209) 7 травня 2004 р. відповідно до Будапештського договору і вводиться в даний опис за допомогою посилання. У переважних варіантах винаходу зв'язувальні домени, які походять від вищеописаних антитіл, є гуманізованими.
У конкретному варіанті винаходу зв'язувальні домени, використовувані в діатілах відповідно до винаходу, походять від антитіла або його антигензв'язувального фрагмента (наприклад, що містить одну або більше гіперваріабельних ділянок (СОМ), переважно всі 6 СОК) антитіла, продукованого клонами 286, ЗН7, 105, 2Е1, 2Не9, 2011 або 1г2. В іншому варіанті винаходу зв'язувальний домен зв'язується з тим же епітопом, з яким зв'язується мишаче моноклональне антитіло, продуковане клонами 286, ЗН7, 105, 2Е1, 2Н9, 2011 або 1БЕ2, відповідно, і/або конкурує з мишачим моноклональним антитілом, яке продукується клонами 286, ЗН7, 105, 2Е1, 2Не, 2011 або 1гЕ2, як було визначено, наприклад, у або ЕГІЗА-аналізі в іншому відповідному конкурентному імуноаналізі, а також зв'язується з ЕСуКІІВ з афінністю, яка перевищує афінність зв'язування зв'язувального домену з ЕСуУКІА.
Даний винахід також охоплює діатіла зі зв'язувальними доменами, що містять амінокислотну послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга і/або варіабельної ділянки легкого ланцюга, що щонайменше на 45 95, щонайменше на 50 95, щонайменше на 55 95, щонайменше на 60 95, щонайменше на 65 9565, щонайменше на 70 9565, щонайменше на 75 956, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95 або щонайменше на 9995 ідентична амінокислотній послідовності варіабельної ділянки важкого ланцюга і/або легкого ланцюга мишачого моноклонального антитіла, продукованого клонами 286, ЗН7, 105, 2Е1, 2Не, 2011 або 1г2. Даний винахід також охоплює діатіла зі зв'язувальними доменами, що специфічно зв'язуються з ЕСУуКІІВ з афінністю, яка перевищує афінність зв'язування вказаного антитіла або його фрагмента з ЕсуКІПА, і містять амінокислотну послідовність однієї або більше бо СОК, що щонайменше на 45 95, щонайменше на 50 9565, щонайменше на 55 96, щонайменше на
6096, щонайменше на 65 956, щонайменше на 70 95, щонайменше на 75 965, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95 або щонайменше на 9995 ідентична амінокислотній послідовності однієї або більше СОК мишачого моноклонального антитіла, продукованого клонами 286, З3Н7, 105, 2Е1, 2Н9, 2011 або 1БЕ2.
Визначення відсотка ідентичності двох амінокислотних послідовностей може бути здійснено будь-яким методом, відомим фахівцям, включаючи алгоритм пошуку білків ВІ А5Т.
Даний винахід також охоплює використання діатіл, що містять зв'язувальні домени, які специфічно зв'язуються з ЕсСуУКІІВ з афінністю, яка перевищує афінність зв'язування зв'язувального домену з ЕСУуКІІА, і кодуються нуклеотидною послідовністю, яка гібридизується з нуклеотидною послідовністю мишачого моноклонального антитіла, продукованого клонами 286,
ЗН7, 105, 2Е1, 2Не9, 2011 або 12 у відповідних умовах твердості. У переважному варіанті винаходу зв'язувальний домен специфічно зв'язується з ЕСуКіІІВ з афінністю, яка перевищує афінність зв'язування з ЕсугРІА, і містить варіабельну ділянку легкого ланцюга і/або варіабельну ділянку важкого ланцюга, які кодуються нуклеотидною послідовністю, яка гібридизується у відповідних умовах твердості з нуклеотидною послідовністю варіабельної ділянки легкого ланцюга і/або варіабельної ділянки важкого ланцюга мишачого моноклонального антитіла, продукованого клонами 286, ЗН7, 105, 2Е1, 2НеО, 2011 або 1г2 у відповідних умовах твердості.
В іншому переважному варіанті винаходу зв'язувальні домени специфічно зв'язуються з ЕСсУуВІЇВ з афінністю, яка перевищує афінність зв'язування з ЕсугІІА, і містять одну або більше СОК, які кодуються нуклеотидною послідовністю, що гібридизується у відповідних умовах твердості з нуклеотидною послідовністю однієї або більше СОК мишачого моноклонального антитіла, продукованого клонами 286, З3Н7, 105, 2Е1, 2Н9, 2011 або 12. Жорсткими умовами гібридизації є, але не обмежуються ними, гібридизація з ДНК, зв'язаної з фільтром, у 6Х хлориді натрію/цитраті натрію (5532) приблизно при 45 "С, а потім одне або більше промивань у 0,2Х
З5З0С/0,1 95 ДСН приблизно при 50-65 "С, гібридизація в умовах високої твердості, така як гібридизація з ДНК, зв'язаної з фільтром, у 6Х 55С приблизно при 45 "С, а потім одне або більше промивань у 0,1Х 55С/0,2 95 ДСН приблизно при 60 "С, або гібридизація в будь-яких інших умовах твердості, відомих фахівцям (див., наприклад, посібник А!йзиреї, Е.М. еї аї, едв. 1989 Ситепі Ргоїосої5 іп Моїесціаг Віоіоду, мої. 1, стеєп Рибіївпіпуд Авзосіаїев, Іпс. апа донп Уїеу апа Зоп5, Іпс., ММ, стор. 6.3.1-6.3.6 їі 2.10.3, що вводиться в даний опис за допомогою посилання).
Даний винахід також охоплює використання зв'язувальних доменів, які містять амінокислотну послідовність будь-яких описаних вище зв'язувальних доменів, що має мутації (наприклад, одну або більше амінокислотних замін) у каркасній ділянці або в СОК-ділянках.
Переважно, мутації в цих зв'язувальних доменах зберігають або підвищують авідність і/або афінність зв'язувальних доменів відносно ЕСуУКІіІВ, з яким вони імуноспецифічно зв'язуються.
Для аналізу афінності антитіла до конкретного антигену можуть бути застосовані стандартні методи, відомі фахівцям (наприклад, імуноаналізи).
Для введення мутацій у нуклеотидну послідовність, яка кодує антитіло або його фрагмент, можуть бути застосовані стандартні методи, відомі фахівцям, включаючи, наприклад, сайт- направлений мутагенез і ПЛР-опосередковуваний мутагенез, що приводить до амінокислотних замін. При цьому переважно, щоб такі похідні включали менше ніж 15 амінокислотних замін, менше ніж 10 амінокислотних замін, менше ніж 5 амінокислотних замін, менше ніж 4 амінокислотні заміни, менше ніж З амінокислотні заміни або менше ніж 2 амінокислотні заміни в порівнянні з вихідним антитілом або його фрагментом. У переважному варіанті винаходу похідні мають консервативні амінокислотні заміни, зроблені в одному або більше передбачених положеннях замінних амінокислотних залишків.
У переважних варіантах винаходу зв'язувальні домени походять від гуманізованих антитіл.
Гуманізоване ЕсуВіІІВ-специфічне антитіло може містити, в основному, усі або щонайменше один, а звичайно два варіабельні домени, у яких усі або майже всі СОБ-ділянки відповідають ділянкам нелюдського імуноглобуліну (тобто, донорного антитіла) і всі або майже всі каркасні ділянки відповідають ділянкам консенсусної послідовності людського імуноглобуліну.
Діатіла відповідно до винаходу містять гуманізовані варіабельні ЕсуВІІВ-специфічні домени, у яких одна або більше ділянок однієї або більше СОК варіабельних ділянок важкого і/або легкого ланцюга людського антитіла (антитіла-реципієнта) замінені аналогічними частинами однієї або більше СОМ донорного моноклонального антитіла, що специфічно зв'язується з
ЕСУКІВ оз афінністю, яка перевищує афінність зв'язування з ЕсуКІІА, наприклад, моноклонального антитіла, продукованого клонами 286, ЗН7, 105, 2Е1, 2Н9, 2011 або 1г2. В інших варіантах винаходу гуманізовані антитіла зв'язуються з тими ж епітопами, з якими 60 зв'язуються клони 286, ЗН7, 105, 2Е1, 2НО, 2011 або 1Р2, відповідно.
У переважному варіанті винаходу СОК-ділянки гуманізованого ЕсукІІВ-зв'язувального домену походять від мишачого антитіла, специфічного до ЕСУКІІВ. У деяких варіантах винаходу описані тут гуманізовані антитіла містять модифікації, включаючи, але не обмежуючись ними, амінокислотні делеції, інсерції, модифікації акцепторного антитіла, тобто каркасних ділянок людського варіабельного домену важкого і/або легкого ланцюга, які необхідні для збереження специфічності зв'язування донорного моноклонального антитіла. У деяких варіантах винаходу каркасні ділянки описаних тут гуманізованих антитіл необов'язково складаються з точно визначеної амінокислотної послідовності каркасної ділянки варіабельного домену природного людського антитіла, але містять різні модифікації включаючи, але не обмежуючись ними, амінокислотні делеції, інсерції, модифікації, що змінюють властивості гуманізованого антитіла, наприклад, поліпшують зв'язувальні властивості ділянки гуманізованого антитіла, що є специфічної до тієї ж самої мішені, до якої специфічне мишаче ЕсуВіІІВ-специфічне антитіло. У найбільш переважних варіантах винаходу в каркасну ділянку уводять мінімальне число модифікацій, щоб уникнути великих включень нелюдських каркасних залишків і для гарантії мінімальної імуногенності гуманізованого антитіла в людини. Донорним моноклональним антитілом переважно є моноклональне антитіло, продуковане клонами 286, ЗН7, 105, 2Е1, 2НО, 2011 або 1г2.
У конкретному варіанті винаходу зв'язувальний домен охоплює варіабельні домени СОК- щепленого антитіла, яке специфічно зв'язується з ЕСУуКІІВ з афінністю, яка перевищує афінність зв'язування вказаного антитіла з ЕсуКІІА, де вказане СОК-щеплене антитіло включає домен варіабельної ділянки важкого ланцюга, що містить каркасні залишки антитіла-реципієнта і залишки донорного моноклонального антитіла, що специфічно зв'язується з ЕсуКІіІВ з афінністю, яка перевищує афінність зв'язування вказаного антитіла з ЕсуКІІА, наприклад, моноклонального антитіла, продукованого клонами 286, ЗН7, 105, 2Е1, 2Н9, 2011 або 12. В іншому конкретному варіанті винаходу діатіла відповідно до винаходу включають варіабельні домени СОК-щепленого антитіла, що специфічно зв'язується з ЕсуКіІІВ з афінністю, яка перевищує афінність зв'язування вказаного антитіла з ЕсСукІА, де вказане СОК-щеплене антитіло включає домен варіабельної ділянки легкого ланцюга, що містить каркасні залишки антитіла-реципієнта і залишки донорного моноклонального антитіла, що специфічно зв'язується
Зо з ЕсСуКіІІВ з афінністю, яка перевищує афінність зв'язування вказаного антитіла з ЕсукА, наприклад, моноклонального антитіла, продукованого клонами 286, ЗН7, 105, 2Е1, 2НУ, 2011 або 1Е2.
Гуманізовані варіабельні домени анти-ЕсуКіІВ антитіла, використовувані в даному винаході, можуть мати варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність
СОМ (ЗЕО ІЮО МО: 24 або 5ЕО ІО МО: 25) лабо СОК2 (ЗЕО ІЮ МО: 26 або 5ЕО ІО МО: 27) і/або
СОЗ (5ЕБЕО ІЮО МО: 28 або 5ЕО ІЮО МО: 29), і/або варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність СОК1 (5ЕО ІЮО МО: 30 або ЗЕО ІЮО МО: 31) і/або СОМК2 (ЗЕО
ІО МО: 32, ЗЕО ІЮ МО: 33, ЗЕО ІЮ МО: 34 або 5ЕО ІЮ МО: 35) і/або СОКЗ (ЗЕО ІЮ МО: 36 або
ЗЕО І МО: 37).
В одному конкретному варіанті винаходу діатіло містить варіабельні домени гуманізованого антитіла 286, де МН-ділянка складається з ЕК-сегментів, які походять від МН-сегмента людської зародкової лінії МНІ1-18 (Маїзиаа єї аї. (1998) "Тне Сотрієїє Мисієоіїіде Зедоепсе ОЇ Тне Нитап
Іттиподіовбиїйп Неаму Спаїіп Магіабіє Недіоп Госив" у). Ехр. Мед. 188:2151-2162) і УНб (Камеїспі еї аї. (1981) "Зтисіште ОЇ Тне Нитап Іттиподіобиїїп Ми І осив: СНагасівгігайоп ОЇ Етбргуопіс Апа
Веатапдеа у Апа Ор Сепев" СеїІ 27(З3 РІ. 2):583-91), і однієї або більше СОК-ділянок МН 286, що має амінокислотну послідовність ЗЕЮ ІЮО МО: 24, ЗЕО ІО МО: 26 або 5ЕО ІО МО: 28. В одному з варіантів винаходу МН 286 має амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 38. В іншому варіанті винаходу МН-домен 286 має амінокислотну послідовність Ни2В6МН, 5ЕО ІО МО: 85, і може кодуватися нуклеотидною послідовністю ЕС ІЮ МО: 86. В іншому конкретному варіанті винаходу діатіло також містить Мі -ділянку, що складається з ЕК-сегментів Мі-сегмента людської зародкової лінії МК-А26 (І ашіпег!-НіезкКе еї а!. (1992) "Ппе Нитап Іттиподіобиїйп Карра
Госив. СНагасієгіганйоп ОЇ Те Ооиріїсаїєд А Редіопв" Єиг. У. Іттипої. 22:1023-1029) і УкаА (Ніеїег еї а!. (1982) "Емоїшіоп ОЇ Нитап Іттиподіобиїййп Карра / Ведіоп Сепев" у. Віої. Спет. 257:1516- 22), і однієї або більше СОК-ділянок МІ 286, що мають амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 30, 5ЕО ІО МО: 32, 5БО ІО МО: 33, 5БО ІО МО: 34 і 56О ІО МО: 36. В одному з варіантів винаходу МІ. 286 має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 39; 5ЕО ІЮ МО: 40 або 5ЕО ІЮ
МО: 41. У конкретному варіанті винаходу МІ 286 має амінокислотну послідовність Ни2ВбМІ,
ЗЕО ІЮ МО: 87, і може кодуватися нуклеотидною послідовністю, представленою в 5ЕО ІЮ МО: 88.
В іншому конкретному варіанті винаходу діатіло має варіабельні домени гуманізованого антитіла ЗН7, де МН-ділянка складається з ЕК-сегментів, які походять від МН-сегмента людської зародкової лінії і СОК-ділянок УН З3Н7, що мають амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО. 35. В іншому конкретному варіанті винаходу гуманізоване антитіло ЗН7 також містить Мі -ділянки, що складаються з ЕК-сегментів Мі -сегмента людської зародкової лінії і СОК-ділянок ЗН7МІ, що мають амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 42.
Зокрема, зв'язувальні домени імуноспецифічно зв'язуються з позаклітинними доменами нативного людського ЕсСУуКІІВ і містять (або альтернативно складаються з них) послідовності сок 286, ЗН7, 105, 2Е1, 2Н9О, 2011 або 1г2, у кожній з нижченаведених комбінацій: МН СОК'І і
МІ. СОКІ1; МН СО і Мі СОК2г; МН СО їі мМ СОКкз; МН СОм2 і М СОКІ1; МН СОК2 і мМ СОК2; ун СОм2 і М СОКЗ; МН СО і МН СОКІ; МН СО і М СОК2; МН СО і Мі СОКЗ; МНІ СО;
МН СОК2 і МІ СО; МН сок; МН СО і Мі СОК2; МН СО, МН СО і Мі СОЗ; МН. СО,
МН СОКЗ ії МІ СОМ; МН сСОоК2, МН СО і мі СОК2; МН СОв2г, МН СО і М СОЗ; МН. СО,
МІ СОКІ1 і М СО2; МН СОК1, М СО ії М СОоКЗ; МН СО2г, М СОКІ ії Мі СОК2; МН сома,
МІ. СОКІ1 і Мі СОКЗ; МН СОКЗ, МІ СО їі М СОК2г; МН СОКЗ, Мі СО і мМ СОкЗ; МН СО,
МН сОок2, МН СОКЗ і Мі СОКІ; МН СО, МН СО2, МН СО і М СОК2; МН. СОМ, МН СО,
МН СО ії мі СОКзЗ; УН СОК, МН СО, Мі СО і М СОК2; МН сок, МН СОК2, М СО
МІ сОмЗ3; МН СОКІ, МН СО, МІ СО і М СОК2; МН сок, МН СО, М СО і Мі СОЗ; ун Сорнг, МН СОКЗ, М СОКІ і М СОК2г; МН СОК2, МН СОКЗ, МІ СОКІ і Мі СОоКкЗ; МН СО,
МН сок, МІ СОмг і М СОКЗ; МН сок, МН СОоК2, МН Сом, Мі СОКІ1 і М СОК2; Мн сок,
МН СОК2, МН СОмЗ, МІ СОКІ їі М сСОоКЗ; МН сок, МН СОоКг, МІ СОКІ, Мі СО і Мі СО;
МН СО, МН СОВЗ, М СОКІ, М СО і М СОКзЗ; МН СОоКг, МН СО, М СОКІ, М СО їі
МІ. СОМЗ; або в будь-якій із вказаних тут комбінацій МН СОМ і МІ СОМ.
Антитіла для продукування зв'язувальних доменів, необхідних для включення в діатіла відповідно до винаходу, можуть бути також охарактеризовані шляхом картування епітопів, з метою відбору антитіл, що мають більш високу специфічність до ЕСУуКІІВ у порівнянні з ЕсукІПА.
Методи картування епітопів для антитіл добре відомі фахівцям і включені в способи відповідно до винаходу. У деяких варіантах винаходу злиті білки, що містять одну або більше ділянок
ЕсуКІІВ, можуть бути використані з метою картування епітопа для антитіла відповідно до
Зо винаходу. У конкретному варіанті винаходу злитий білок містить амінокислотну послідовність ділянки ЕСУКІЇІВ, зв'язану з Ес-частиною людського Ід52. Кожен злитий білок може також мати амінокислотні модифікації і/або заміни деяких ділянок рецептора відповідною ділянкою рецептора-гомолога, наприклад, ЕСсукІІА, як вказано нижче в таблиці 2. Плазміди рМОХ 125 і рмМоОхХ132 містять сайт зв'язування Ідс з рецептором ЕсумІІВ, де перша плазміда має С-кінець
ЕсукіІВ, а остання плазміда має С-кінець ЕсукІПА, і вони можуть бути використані для диференціації С-кінцевого зв'язування. Інші плазміди мають заміни ЕСуУКПА в зв'язувальному сайті да і в М-кінців ЕСУКПА або ЕсуКІІВ. Ці молекули дозволяють визначити частина молекули рецепторів, з яким зв'язуються антитіла.
Таблиця 2
Список гібридних білків, які можуть бути використані в дослідженні енітопу для моноклональних анти-РсуКІЇВ антитіл. Залишки 172-150 належать сайту зв'язування Ірст з ЕСУЕ НА і В. Специфічні амінокислоти послідовності ЕСУКПА показані жирним шрифтом
М- 172-180 ЗВО с- о Плазміда | Рецептор кінець | кінець
МО:
ГРМОХІ125 43 | АРЕ---855()
РМОХ126 44 АРБ----55(Ш)
РМОХІ27 | | Па ОКРБВШОРТ 45 АР5---- 550) рРМОХІ28 || пь |ККРУВСОРТ | 46 | АР5---550(П5)
РМОХІ29 | 0000000 Па ОКРУНІОРТ 47 АРЕ-А 5501)
РМОаХІЗЮ | 00000001 пьЬ ГККЕЗНЬОРЕТ 48 АРМАА 55 0
РМОХІЗІ | ра ОКЕБЕСОРМ | 49 УРБМО555ФШІ)
ОВМОХІЗ ЇЇ 00000000 ЛЬ ОО ОККЕ5В5БЮОРМ 00050 УР5МОБ55ИВ
ОЧЕ 51 УРБ5МОБ55И) 'яМОХ134 52 МРУМОБЗ5(ЩШЯ оВМОХІ35 10000000 ЛЬ ОККЕ5ВІОРТ 053 УР5МО5550а) овМОХІ36 00000001 пь ОККЕ5НБОРЕ | 54 МРУМОБ55КИ
Примика: древа являє собою ЗБОЮ МО; РОЗМОВ являє собою ЗЕСНО МО :
Злиті білюи можуть бути використані в будь-якому біохімічному аналізі на визначення зв'язування з анти-ЕСуУКкІІВ антитілом відповідно до винаходу, наприклад, у ЕГІ5ЗА-аналізі. В інших варіантах винаходу додаткове підтвердження специфічності до епітопу може бути здійснене з використанням пептидів, у яких специфічні залишки замінені залишками, які походять від послідовності ЕСУКІА.
Антитіла можуть бути охарактеризовані за допомогою аналізів на ідентифікацію функції антитіл відповідно до винаходу, зокрема, активності модуляції передачі ЕсуВІІВ-сигналу. Так, наприклад, аналізи по характеризації відповідно до винаходу дозволяють визначити рівень фосфорилування тирозинових залишків у мотиві ІТІМ ЕсУуйІІВ, або рівень інгібування мобілізації кальцію, що генерується В-клітинним рецептором. Аналізи по характеризації відповідно до винаходу можуть являти собою аналізи, проведені в присутності або під час відсутності клітин.
Фахівцями було чітко встановлено, що в тучних клітинах коагрегація ЕсукКіІІВ з високоафінним рецептором ІДЕ, ЕсеКІ, приводить до інгібування індукованого антигеном дегрануляції, мобілізації кальцію і продукування цитокінів (МеїсаїГе О.О. еї аї. (1997) "Мазі Сеїїв"
Рпузіої. Нем. 77:1033-1079; І опд Б.О. (1999) "Кедшайоп ої Іттипе Кезропзе5 Тпгоцоп Іппірйогу
Весеріогв" Аппи. Неу. Іттипої. 17:875-904). Нещодавно був точно виявлений молекулярний механізм шляху передачі такого сигналу (ОК М. Г.. (2002) "Оом/пзігеат ОЇ Кіпазе, рб2(аокК), І5 А
Меаїаг ОЇ Рсдаттаї Іппірйіоп ОГ Ес Ерзіоп ВІ Зідпаїїпдр" У. Іттипої. 162(9):4430-4439). Після коагрегації з ЕСЕКІ, ЕСсуУКІІВ швидко фосфорилується в тирозині свого мотиву ІТІМ, після чого відбувається рекрутинг гомолога-2 5гс, що містить інозіт-о-фосфатазу (ЗНІР), домену ЗН2, що містить інозитполіфосфат-5-фосфатазу, що, у свою чергу, фосфорилується і зв'язується з ЗПС і рбаеок (рбгок являє собою прототип сімейства молекул-адаптерів, що включають домени передачі сигналу, такі як домен аміно-кінцевого гомолога плекстрину (домен РН), домен РТВ і карбокси-кінцева ділянка, що містить мотиви РХХР, і множину сайтів фосфорилування) (Сагріпо еї а. (1997) "рб2(док): А Сопвійцімеїу Тугозіпе-Рпозрпогуїаіед, САР-Авзосіаїеай Ргоївїп Іп Спгопіс
МуєІодепоиз ГешКкетіа Ргодепіюг СеїІв" СеїІ, 88:197-204; Матапвні еї аї. (1997) "Ідепійісайоп ОЇ
Тне АБІ-Апа газаАР-Авзосіаїес 62 КОа Ргоївїп Аз А ОоскКіпд Ргоїєїп, бок" Сеїї, 88:205-211).
Зо Анти-ЕсСуКІІВ антитіла, використовувані в даному винаході, аналогічним чином можуть бути охарактеризовані на їхню здатність модулювати один або більше ІдЕ-опосередковуваних відповідей. Переважно, клітинні лінії, коекспресуючі високоафінний рецептор для ІдЕ іі низькоафінний рецептор для ЕсуКІІВ, можуть бути використані з метою характеризації анти-
ЕСУКІІВ антитіл на їхню здатність модулювати ІДЕ-опосередковувані відповіді. У конкретному варіанті винаходу можуть бути використані клітини, які походять від клітинної лінії щурячого базофільного лейкозу (КВІ-Н23; див. публікацію Вагоитіап Е.Ї. еї аїЇ. (1981) "І9ЧЕ-Іпдисєй
Нівіатіпе Неїіеазе БЕгот Ваї Вазорпіїйс ІеиКетіа Се Ііпев: Ібоіайоп ОЇ Веївазіпд Апа
МопгеєїІєавзіпд Сіопе5" Єиг. /). Іттипої. 11:317-323, що у всій своїй повноті вводиться в даний опис за допомогою посилання), трансфікованою повнорозмірним людським ЕсСУуВІЇІВ. ВВІ-2НЗ являє собою добре охарактеризовану щурячу клітинну лінію, що широко застосовується для вивчення механізмів передачі сигналу після ІДЕ-опосередковуваної активації клітин. При експресії в клітинах КВІ-2НЗ і при коагрегації з Есе, ЕсуКІІВ інгібує ЕсеєВіІ-індуковану мобілізацію кальцію, дегрануляцію і продукування цитокінів (Маїрес еї аї. (1998) "Рс Ерзіїоп Кесеріог І-Авз5осіаїєда ГГ уп-
Ререпаєпі Рпозрпогуїайоп ОЇ Ес Сатта ВРесеріог ІВ Оигіпа Медаїйїме Неашіайоп ОЇ Маві СеїЇ
Асіїмайоп" 9. Іттипої. 160:1647-1658; Оаєгоп еї аІ). (1995) "Недшіайоп ОЇ Нідн-Айіпйу ЧЕ
Весеріог-Медіаїєа Мазві Сеї| Асіїмайоп Ву Мигіпе І ом/-Айіпйу (да Несеріогв" У. Сііп. Іпмеві. 95:577;
ОН У. Г. (2002) "Оомпвігтєат ОЇ Кіпазе, рба(док), Із А Медіаюг ОЇ ЕсдаттаїйВ Іппірйіоп ОЇ Ес
Ерзіїоп ВІ Зідпаїїпуд" 9. Іттипої. 162(9):4430-4439).
Антитіла, використовувані в даному винаході, можуть бути також охарактеризовані на їхню здатність інгібувати ЕсєВІ-індуковану активацію тучних клітин. Так, наприклад, клітини, які походять від клітинної лінії щурячого базофільного лейкозу (КВІ-Н2З; Вагзитіап Е.І. єї аї. (1981). "ДЕ-Іпдисед Нівіатіпе ВеІєазе Егот ВРаї Вазорпіїїс І еиКетіа Сеї! Ііпе5: Івоіайоп ОЇ
Веїіеазіпа Апа МопгеїІеавзіпу Сіопе5" Єишг. у). Іттипої. 11:317-323), які були трансфіковані ЕсуВІІВ, сенсибілізували ІДЕ і стимулювали або Е(аб)2:-фрагментами кролячого антитіла проти мишачих
Ідс, для агрегації тільки ЕсеКІ, або повнорозмірним кролячим антитілом проти мишачих Ідс, для коагрегації ЕСУКІІВ і ЕсєКІ. У цій системі непряма модуляція молекул передачі сигналу наступних стадій каскаду реакцій може бути проаналізована після додавання антитіл відповідно до винаходу до сенсибілізованих і стимульованих клітин. Так, наприклад, можуть бути проаналізовані фосфорилування по тирозині ЕсукКіІІВ і рекрутинг і фосфорилування ЗНІР, активація членів сімейства кіназ МАР, включаючи, але не обмежуючись ними, ЕгКк1!, Егк2, УМК або р38; і фосфорилування по тирозині рбазок і його зв'язування з ЗНІР і ВазсАРр.
Один з репрезентативних аналізів по визначенню інгібування ЕсеВі-індукованої активації тучних клітин під дією антитіл відповідно до винаходу може включати: трансфекцію клітин КВІ -
Н2г3 людським ЕсуВІЇВ, ІДЕ- сенсибілізацію клітин КВІ-Н23, стимуляцію клітин ЕВІ-Н2З Е(ав)»г-
Зо фрагментами кролячого антитіла проти мишачих да (для агрегації тільки ЕсеєКІ і виявлення
ЕсеєВіІ-опосередковуваної передачі сигналу як контролю) або стимуляцію клітин КВІ-Н2З повнорозмірним кролячим антитілом проти мишачих Ідсї (для коагрегації ЕсукіІВ і ЕсеКіІ, що приводить до інгібування ЕсєВІ-опосередковуваної передачі сигналу). Клітини, стимульовані повнорозмірними кролячими антитілами проти мишачих С можуть бути також попередньо інкубовані з антитілами відповідно до винаходу. Вимірювання ЕсеєВіІ-залежної активності клітин, які були попередньо інкубовані з антитілами відповідно до винаходу, і клітин, які не були попередньо інкубовані з антитілами відповідно до винаходу, і порівняння рівнів ЕсеєВІ-залежної активності цих клітин указувало на модуляцію ЕсеєНІ-залежної активності під дією антитіл відповідно до винаходу.
Вищеописаний репрезентативний аналіз може бути проведений, наприклад, для ідентифікації антитіл, що блокують зв'язування ліганду (92) з рецептором ЕсуКІїВ і служать антагоністами ЕсуВІІВ-опосередковуваного інгібування передачі ЕсєВІ-сигналу за допомогою запобігання коагрегації ЕСУКІІВ і ЕсєРІІ. Аналогічним чином, цей аналіз дозволяє ідентифікувати антитіла, що підсилюють коагрегацію ЕсукИПА і БсєКІ і служать агоністами ЕсуКІІВ- опосередковуваного інгібування передачі ЕсеєВІ-сигналу за допомогою стимуляції коагрегації
ЕсуйІІВ і ЕсеВІі.
У деяких варіантах винаходу анти-ЕсуКіІВ діатіла, що містять епітоп-зв'язувальні домени ідентифікованих, описаних тут або відомих анти-ЕсукКіІВ антитіл відповідно до винаходу, були охарактеризовані на їхню здатність модулювати ІдЕ-опосередковувану відповідь шляхом моніторингу і/або оцінки дегрануляції тучних клітин або базофілів переважно в клітинному аналізі. При цьому переважно, щоб гладкі клітини або базофіли, використовувані в таких аналізах, були сконструйовані так, щоб вони містили людський ЕсуКІІВ, із застосуванням стандартних рекомбінантних методів, відомих фахівцям. У конкретному варіанті винаходу анти-
ЕСУКІІВ антитіла відповідно до винаходу характеризували на їхню здатність модулювати ІдЕ- опосередковувану відповідь у клітинному аналізі на вивільнення р-гексозамінідази (ферменту, що міститься в гранулах). Вивільнення р-гексозамінідази з тучних клітин і базофілів є першою подією при гострому алергійному і запальному стані (АкКеїапі еї аї. (2001) "Сотеїіаноп Веїмєеп
Суїозоїїс СаЇІсіпт Сопсепігайоп Апа Оедгапиїайноп Іп ВВІ-2НЗ СеїІ5 Іп ТНе Ргезепсе ОЇ Маїсив
Сопсепігайопе ОЇ Апііїдеп-Зресіїйс ІДЕв" Іттипої. Гей. 75:185-189; АКеїапі єї аї. (2000) "А 60 Зстеєпіпд Меїнод Рог Апіідеп-б5ресіїйс ІДЕ Овіпд Мазі Сеїїє Вазед Оп Іпігасеїшіаг Саїсійт зЗідпаїїпд" АпаЇ. Спет. 72:2653-2658). Вивільнення інших медіаторів запалення, включаючи, але не обмежуючись ними, серотонін і гістамін, може бути проаналізоване для оцінки ІдЕ- опосередковуваної відповіді способами відповідно до винаходу. Не обмежуючи яким-небудь конкретним механізмом дії, слід зазначити, що вивільнення гранул, таких як гранули, що містять
В-гексозамінідази тучних клітин і базофілів, являє собою внутрішньоклітинний процес, що залежить від концентрації кальцію, де вказаний процес ініціюється перехресним зв'язуванням
ЕсуВіІ з полівалентним антигеном.
Можливість дослідження людських тучних клітин обмежується відсутністю придатних довгоіїснуючих культур людських тучних клітин. Нещодавно, з аспіратів кісткового мозку пацієнта із саркомою/лейкозом тучних клітин було виділено дві нові лінії людських тучних клітин, ріст яких залежить від фактора стовбурових клітин, і ці клітини були позначені ГАЙ і ГАБ2 (див. публікацію КігПпепрашт еї аї. (2003) "Спагасіегілайоп ОЇ Моме! Біет СеїЇ Расіог Кезропвіме
Нитап Махєі Сеї! І іпез І АБО І Апа 2 Евіабіїзней Егот А Раїйєпі М/Н Мазі Сеї! Загсота/І ейКетіа;
Асіїмайоп ЕоїІом/іпа Аддгедайоп ОЇ ЕсВІ Ог ЕсуВІ" І еикетіа гезеагсп, 27:677-82, що у всій своїй повноті вводиться в даний опис за допомогою посилання). Були описані обидві клітинні лінії, які експресують ЕсСеКІ і декілька маркерів людських тучних клітин. Клітини ГАЮ 1 і 2 можуть бути використані для оцінки впливу антитіл відповідно до винаходу на ІдЕ-опосередковувані відповіді. У конкретному варіанті винаходу клітинні аналізи на вивільнення ВрВ-гексозамінідази, описані вище, можуть бути проведені для клітин ГАЮ з метою визначення будь-якої модуляції
ІДЕ-опосередковуваної відповіді під дією анти-ЕсСукіІВ антитіл відповідно до винаходу. У репрезентативному аналізі людські гладкі клітини, наприклад, ГАО1, примували химерним антитілом проти людського ІДЕ - антитілом проти нітрофенолу (МР), і стимулювали ВЗА-МР, тобто полівалентним антигеном, а потім проводили моніторинг дегрануляції клітин шляхом виміру рівня вивільнення р-гексозамінідази в супернатант (див. публікацію КігПпепрачт еї аї. (2003) "СНнагасієгігайоп Ої Моме! біет Сеї! Расіог Везропзіме Нитап Маві Сеї! І іпе5 І А І Апа 2
Евіабіїзнейд Егот А Раїйепі М/йй Мазві Сеї!Ї Загсотал/ ейКетіа; Асіїмайоп РоїІоміпд Аддгедаїйоп ОЇ
ЕСВІ Ог ЕсувВ!" І екетіа гезвєагси, 27:677-82, що у всій своїй повноті вводиться в даний опис за допомогою посилання).
У деяких варіантах винаходу, якщо в людських тучних клітинах спостерігається низький
Зо рівень експресії ендогенного ЕСУуКІІВ, як може бути визначено із застосуванням стандартних методів, відомих фахівцям, наприклад, ЕАС5З-фарбування, то в цьому випадку досить важко провести моніторинг і/або детектувати розходження в активації шляхів інгібування, опосередковуваних анти-ЕсСукіІІВ діатілами відповідно до винаходу. Даний винахід також охоплює альтернативні методи, у яких експресія ЕСУКІІВ може бути посилена з використанням цитокінів і в конкретних умовах культивування. Було продемонстровано, що ЕсукіІВ у високому ступені активується в людських моноцитарних клітинних лініях, наприклад, ТНРІ їі 0937 (Тідапаарапі єї аї. (2002) "Недшаїей Ехргезвіоп Апа Іппірйогу ЕБипсіоп Ої Есдатта ВВ Іп
Нитап Мопосуїїс СеїІв" 9. Віої. Спет., 277(7):5082-5089), і в первинних людських моноцитах (Ргісор еї аї. (2001) "ОїМегепійза! Модиїайоп ОЇ Біїтшцаюгу Апа Іппірйогу Ес Сатта ВНесеріогв Оп
Нитап Мопосуїєз Ву ТНІ Апа Тн2 СуюкКіпев" У. ої Іттипої!., 166:531-537) під дією І 4. Було продемонстровано, що диференціювання клітин ШеЗ37 під дією циклічного дибутирил-АМР приводить до підвищення рівня експресії ЕСсуВІ! (Сатегоп єї аї. (2002) "Оінегепііайоп ОЇ ТНе
Нитап Мопосуїе СеїЇ Ііпе, ШОЗ7, МУйй Біршугу! СусісАМР Іпдисез5 Те Ехргезвіоп ОЇ Те
Іппібйогу Ес Ресерюг, ЕсдаттавВі!В" Іттипоіоду І ейег5 83, 171-179). Таким чином, експресія ендогенного ЕсСуКІІВ у людських тучних клітинах, використовуваних у способах відповідно до винаходу, може бути посилена з використанням цитокінів, наприклад, 1-4, І/-13, з метою підвищення чутливості детектування.
Анти-ЕСУКІІВ діатіла можуть бути також проаналізовані на інгібування передачі сигналу, опосередковуваної В-клітинним рецептором (ВСК). ВСК-опосередковувана передача сигналу
БО може включати щонайменше одну або більше біологічних відповідей, які продукуються на більш пізніх стадіях каскаду реакцій, таких як активація і проліферація В-клітин, продукування антитіл і т. п. Коагрегація ЕсукІІВ і ВСК приводить до інгібування проходження клітинного циклу і виживаності клітин. Крім того, коагрегація ЕсСуКІІВ і ВСК приводить до інгібування ВСЕ- опосередковуваної передачі сигналу.
Зокрема, ВСК-опосередковувана передача сигналу включає щонайменше один або більше процесів, а саме, модуляцію молекул передачі сигналу, які продукуються на більш пізніх стадіях каскаду реакцій (наприклад, фосфорилування ЕсукКІІВ, рекрутинг ЗНІР, локалізацію ВІК і/або
РІ Су, активність кінази МАР, рекрутинг АК (антиапоптотичний сигнал), мобілізацію кальцію, проходження клітинного циклу і проліферацію клітин).
Хоча відомо, що багато які ефекторні функції ЕсуВіІІВ-опосередковуваного інгібування передачі ВСЕ-сигналу опосередковуються 5НІР, однак, нещодавно було продемонстровано, що активовані ліпополісахаридом (ЛПС) В-клітини ЗНІР-дефіцитних мишей мають значну ЕСУВІЇ/В- опосередковувану інгібуючу дію, спрямовану на мобілізацію кальцію, продукування Іп5(1,4,5)Рз і фосфорилування ЕгК і АК (Вгацугейег еї аїІ. (2001) "Рапапну Оівіпсї Моїесшаг Меспапізт5
Медіаге Іппібйогу ЕсдаттанВіІЇ!В Зідпаїїпу Іп Ревіїпу Апа Асіїмаїєйд В СеїЇІв" доштаї ої Іттипоіоду, 167(1):204-211). Відповідно до цього В-клітини ЗНІР-дефіцитних мишей ех мімо можуть бути використані для характеризації антитіл відповідно до винаходу. Один з репрезентативних аналізів, проведених для оцінки ЕсуВіІІВ-опосередковуваного інгібування передачі ВСК-сигналу антитілами відповідно до винаходу, може включати наступні стадії: виділення В-клітин селезінки в ЗНІР-дефіцитних мишей, активація вказаних клітин ліпополісахаридом і стимуляція вказаних клітин Е(ар)2-фрагментом анти-ІДмМ антитіла для агрегації ВСК або анти-ІДМ антитілом для коагрегації ВСЕ з ЕсумІІВ. Клітини, які були стимульовані інтактним анти-ІДМ антитілом для коагрегації ВСЕ з ЕсуКІІВ, можуть бути також попередньо інкубовані з антитілами відповідно до винаходу. ЕсуВіІІВ-залежна активність клітин може бути визначена стандартними методами, відомими фахівцям. Порівняння рівня ЕсуВіІІВ-залежної активності в клітинах, які були попередньо інкубовані з антитілами, і в клітинах, які не були попередньо інкубовані з антитілами, буде вказувати на модуляцію ЕсувВіІІВ-залежної активності під дією вказаних антитіл.
Аналіз на ЕсувВіІВ-залежну активність може включати, наприклад, визначення рівня мобілізації внутрішньоклітинного кальцію за допомогою протокової цитометрії, вимірювання рівня фосфорилування АКІ і/або ЕгкК, оцінку ВСЕК-опосередковуваної акумуляції РІ(3,4,5)Рз або оцінку ЕсуВІІВ-опосередковуваної проліферації В-клітин.
Ці аналізи можуть бути проведені, наприклад, з метою ідентифікації діатіл або анти-ЕсуВІІ!В антитіл, використовуваних у даному винаході, які модулюють ЕсуВІІВ-опосередковуване інгібування передачі ВСЕ-сигналу за допомогою блокування сайта зв'язування ліганду (ІДС) з рецептором ЕсукКІЇ!В, і які діють як антагоністи ЕСуУВІІВ-опосередковуваного інгібування передачі
ВСВ-сигналу за допомогою попередження коагрегації ЕсукКІІВ і ВСЕ. Ці аналізи можуть бути також проведені з метою ідентифікації антитіл, що підсилюють коагрегацію ЕсуКІІВ і ВСЕ, і які є
Зо агоністами ЕсуВІІВ-опосередковуваного інгібування передачі ВСЕ-сигналу.
Анти-ЕСУуКІЇВ антитіла можуть бути також проаналізовані на ЕсуВіІ-опосередковувану передачу сигналу в людських моноцитах/макрофагах. Коагрегація ЕСУКІІВ з рецептором, що несе мотив активації імунорецептора на основі тирозину (ІТАМ), чинить інгібуючу дію на Есув- опосередковуваний фагоцитоз у присутності ЗНІР як ефектора такого фагоцитозу (Тгідапаарапі еї а. (2002) "Беашаїей Ехргезвіоп Апа Іппірйогу Рипсіп Ої Есдатта ВВ Іп Нитап Мопосуїіс
СеїІв" У. Віої. Спет., 277(7):5082-5089). Коагрегація ЕсукІПА з ЕсукКІІВ приводить до швидкого фосфорилування тирозинового залишку на мотиві ІТІМ ЕсуКіІІВ, що сприяє підвищенню рівня фосфорилування ЗНІР, зв'язування ЗНІР з Зпс і фосфорилування білків, що мають молекулярну масу 120 і 60-65 кДа. Крім того, коагрегація ЕСуУКПА з ЕсукіІІВ приводить до інгібування фосфорилування АКЇ, що являє собою серин-треонін-кіназу, яка бере участь у клітинній регуляції й у інгібуванні апоптозу.
Анти-ЕСУуКІЇВ діатіла можуть бути також проаналізовані на інгібування Есув- опосередковуваного фагоцитозу в людських моноцитах/макрофагах. Так, наприклад, клітини, які походять від людської моноцитарної клітинної лінії, ТНР-1, можуть бути стимульовані Еар- фрагментами мишачого моноклонального антитіла ІМ.3 проти ЕсукКІЇї ї козячого антимишачого антитіла (для агрегації тільки ЕсукіІїІА), або повнорозмірним мишачим моноклональним антитілом ІМ.З3 ії козячим антимишачим антитілом (для коагрегації ЕСУКПА і ЕсуКІІВ). У цій системі модуляція молекул наступних стадій передачі сигналу, така як фосфорилування тирозину ЕсСУКІІВ, фосфорилування 5НІР, зв'язування 5НІР з пс, фосфорилування АК. і фосфорилування білків, що мають молекулярну масу 120 і 60-65 кДа, може бути проаналізована після додавання молекул відповідно до винаходу до стимульованих клітин. Крім того, ефективність ЕсуВіІІВ-залежного фагоцитозу моноцитарної клітинної лінії може бути безпосередньо оцінена в присутності і під час відсутності антитіл відповідно до винаходу.
Інший репрезентативний аналіз, який проводиться з метою визначення ступеня інгібування
ЕсуВ-опосередковуваного фагоцитозу в у людських моноцитах/макрофагах під дією антитіл відповідно до винаходу, може включати: стимуляцію клітин ТНР-1 Рар-фрагментом мишачого анти-ЕСукКіІ! антитіла ІМ.3 і козячого антимишачого антитіла (для агрегації тільки ЕСУуКІА і виробляння ЕсуВіІІВ-опосередковуваної передачі сигналу) або мишачим анти-ЕсукКІЇ антитілом і козячим антимишачим антитілом (для коагрегації ЕсукПА і ЕсукКіІІВ і інгібування ЕсугкПа- бо опосередковує передачі сигналу). Клітини, стимульовані повнорозмірними мишачим анти-ЕсуНВіІЇ антитілом і козячим антимишачим антитілом, можуть бути також попередньо інкубовані з молекулами відповідно до винаходу. Вимірювання ЕсукКІІА-залежної активності стимульованих клітин, які були попередньо інкубовані з молекулами відповідно до винаходу, і клітин, які не були попередньо інкубовані з антитілами відповідно до винаходу, і порівняння рівнів ЕсуКІПА- залежної активності цих клітин указувало на модуляцію ЕсукПА-залежної активності під дією антитіл відповідно до винаходу.
Вищеописаний репрезентативний аналіз може бути проведений, наприклад, для ідентифікації зв'язувальних доменів, що блокують зв'язування ліганду з рецептором ЕсСУуКІЇВ і служать антагоністами ЕсуВіІІВ-опосередковуваного інгібування передачі ЕсукПА-сигнала за допомогою запобігання коагрегації ЕсукІІВ і ЕсукПА. Аналогічним чином, цей аналіз дозволяє ідентифікувати зв'язувальні домени, що підсилюють коагрегацію ЕСУКІІВ і ЕсукКПА ії служать агоністами ЕсуКІІВ-опосередковуваного інгібування передачі ЕсукІПА-сигналу.
ЕсуВІІВ-зв'язувальні домени, які представляють інтерес, можуть бути проаналізовані для того, щоб визначити, чи містять клітини ТНР-1 антитіла, і такий аналіз може бути проведений шляхом оцінки здатності клітин ТНР-1 до фагоцитозу Ідб-опсонізованих овечих еритроцитів (ЗКВС), оброблених флуоресцеїном, методами, описаними раніше (Тгідапаарапі еї аї. (2000) "Те Адарієг Ргоївіп ГАТ Епнапсез Есдатта Весеріог-Медіаїєд 5ідпа! Тгапзаисіюоп Іп Мувїоій
Сеїв" У. Віої. Спет. 275:20480-7). Так, наприклад, репрезентативний аналіз для оцінки фагоцитозу включає: обробку клітин ТНР-1 антитілами відповідно до винаходу або контрольним антитілом, що не зв'язується з ЕсуКІїЇ; порівняння рівнів активності вказаних клітин, де розходження в активностях клітин (наприклад, активності розеткоутворення (числа клітин ТНР- 1, що зв'язуються з І(дС-покритими 5КВС), в адгезивній активності (загального числа 5КВС, зв'язаних із клітинами ТНР-1) і швидкості фагоцитозу) повинне вказувати на модуляцію ЕСУуУВІЇВ- залежної активності під дією антитіл відповідно до винаходу. Цей аналіз може бути проведений для ідентифікації, наприклад, антитіл, що блокують зв'язування ліганду з рецептором ЕсУуКІЇІВ і які є антагоністами ЕсувВіІВ-опосередковуваного інгібування фагоцитозу. Цей аналіз також дозволяє ідентифікувати антитіла, що підсилюють ЕсуВіІВ-опосередковуване інгібування передачі ЕСуУКІА-сигналу.
У переважному варіанті винаходу зв'язувальні домени модулюють ЕсуВіІВ-залежну
Зо активність у людських моноцитах/умакрофагах щонайменше по одному або більше шляхах: модуляції молекул наступних стадій передачі сигналу (наприклад, модуляції фосфорилування
ЕСУКІІВ, модуляції фосфорилування 5НІР, модуляції зв'язування 5НІР з Зйпс, модуляції фосфорилування АК, модуляції фосфорилування додаткових білків, що мають молекулярну масу приблизно 120 і 60-65 кДа) і модуляції фагоцитозу. 5.1.2. СО16А-зв'язувальні домени
У нижченаведеному розділі обговорюються СО16бА-зв'язувальні білки, які можуть бути використані як джерела варіабельних ділянок легкого і важкого ланцюгів для продукування ковалентно зв'язаного діатіла. Відповідно до даного винаходу СО16А-зв'язувальні білки включають молекули, що містять МІ- ії МН-домени анти-СО16А антитіл, де вказані МН- їі Мі - домени використовуються для одержання діатіл відповідно до винаходу.
Відповідно до даного винаходу можуть бути використані різні СО16бА-зв'язувальні білки.
Придатними СО16бА-зв'язувальними білками є людські або гуманізовані моноклональні антитіла, а також СО16А-зв'язувальні фрагменти антитіл (наприклад, 5сЕм або одноланцюжкові антитіла,
Еар-фрагменти, мініантитіла) і інші антитіло-подібні білки, які зв'язуються з СЮО16А за допомогою взаємодії з доменом варіабельної ділянки легкого ланцюга, доменом варіабельної ділянки важкого ланцюга або з обома доменами.
У деяких варіантах винаходу СЮО16бА-зв'язувальний білок, використовуваний відповідно до даного винаходу, включає МІ - і/або МН-домен, що має одну або більше СОК з послідовностями, які походять від нелюдського анти-СО16А антитіла, такого як мишаче анти-СО16А антитіло, і одну або більше каркасних ділянок, які походять від каркасних послідовностей одного або більше людських імуноглобулінів. Різні нелюдські моноклональні анти-СО16А антитіла, від яких можуть бути отримані СОК і інші послідовності, відомі фахівцям (див., наприклад, Татт еї аї. (1996) "Тне Віпаіпу Еріюрез ОЇ Нитап СО 16 (Ес датта Вії) Мопосіопа! Апііродієв. Ітріїсайопе
Еог Гідапа Віпаїпа" у. Ітт. 157:1576-81; Рівїї еї а). (1989) р.159; ГЕОКОСМУТЕ ТУРІМа ІІ: НОМАМ
МУЕГОІЮ АМО НЕМАТОРОЇЕТІС СЕ 5, Веїпнег"? евї а!., ед5. Мем Могк: Зргіпдег-Мепад; (1986);
ГЕОСОСУТЕ ТУРІМО І: УУНІТЕ СЕ ОІРРЕВЕМТІАТІОМ АМТІСЕМ5 МеМіснає! А У, ед., Охіога:
Охтога Опімегейу Ргезз5, 1986); І ЕОКОСМУТЕ ТМРІМОЕ ІМ: МУНІТЕ СЕ бІРРЕВЕМТІАТІОМ
АМТІСЕМ5, Карр еї аї., єдв. Охіога Опім. Ргезз, Охіога; ГЕОКОСМУТЕ ТУРІМО У: М/НІТЕ СЕ.
ПІРРЕВЕМТІАТІОМ АМТІСЕМ5, 5спІоззтап еї аї., єад5. Охіога Опім. Ргезз5, Охіога; ГЕОКОСУТЕ 60 ТУРІМО МІ: УУНІТЕ СЕ БІЕРЕКЕМТІАТІОМ АМТІСЕМ5, Кізпітоїю, ей. Тауїог 8. Егапсів). Крім того, як показано в Прикладах, нові СО16бА-зв'язувальні білки, що розпізнають людський СО16А, який експресується на клітинах, можуть бути отримані добре відомими методами продукування і відбору моноклональних антитіл або споріднених зв'язувальних білків (наприклад, за допомогою гібридомної технології, фагового представлення і т. п.). Див., наприклад, публікації ОСоппеї еї аї. (2002) "Рнаде Мегзи5 РНнадетіа І іІбгагіез Рог Сепегайоп ОЇ Нитап Мопосіопаї
Апііродієв" У. Мої. Віо!. 321:49-56; Ноодепроот еї аї. (2000) "Машта! Апа Оезідпег Віпаіпд 5пев
Маде Ву Ріаде Оізріау Тесппоіоду" Ітт. Тодау 21:371078; Ктебрз евї аї. (2001) "Нідн-Тптопдприї
Сепегайоп Апа Епаіпеегіпд ОЇ Весотбіпапі Нитап Апіїродієв" У. Ітт. Меїйоа5» 254:67-84; і інші цитовані там роботи. Моноклональні антитіла, які походять від видів, що не є людиною, можуть бути отримані у вигляді химерних або гуманізованих антитіл із застосуванням методів гуманізації антитіл, відомих фахівцям.
Альтернативно, повністю людські антитіла проти СО16А можуть бути отримані з використанням трансгенних тварин, які мають елементи людської імунної системи (див., наприклад, патенти США МоМо 5569825 і 5545806), з використанням людських клітин периферичної крові (Савзаїї еї а. (1986) "Нитап МопосіопаїІ5 Егот Апіїдеп-5ресіїїс ЗеїІвсіоп ОЇ В
Гутрпосуїез Апа Тгапвіоптаїйоп Ву ЕВУ" Зсівєпсе 234:476-479), шляхом скринінгу бібліотеки ДНК із людських В-клітин відповідно до загального протоколу, описаним Низхе еї аї. (1989) "Сепегайоп ОГ А Гагде Сотріпайога! Гіргагу ОЇ Те Іттиподіобиїййп Ререпоїге Іп Рнпаде Гатбраа" осівпсе 246:1275-1281, і іншими методами.
У переважному варіанті винаходу зв'язувальним донором є донор, який походить від антитіла 3058 або його гуманізованого варіанта, наприклад, описаних у публікації заявки на патент США 2004/0010124, що у всій своїй повноті вводиться в даний опис за допомогою посилання. При цьому передбачається, що для деяких цілей може виявитися переважним використання СО16бА-зв'язувальних білків, що зв'язуються з рецептором СО16А на тому ж самому епітопі, що зв'язується з 308, або щонайменше на ділянці, близькій до цього епітопу, але достатньому для блокування зв'язування з 358. Методи картування епітопів і експерименти по конкурентному зв'язуванню, застосовувані для ідентифікації зв'язувальних білків з потрібними зв'язувальними властивостями, добре відомі фахівцям в галузі експериментальної імунології. Див., наприклад, роботу Нагіом/ 8. І апе, цитовану вище; 5іапії еї аї. (1983) "Рівііпсійп
Зо ОЇ Еріюрез Ву Мопосіопа! Апіїбодієв" Меїйод5 іп Епгутоіоду 92:242-253; Кіжіапа еї аї. (1986) "Апаїузії ОЇ Те Ріпе 5ресіїйсйу Апа Сто55-Неасіїміу ОЇ Мопосіопаї! Апії-ІГірії А Апіїродієв" 9.
Іттипої. 137:3614-3619; Мотгєї! єї а. (1988) "Мопосіопа! Апіїродієє То Воміпе бЗегит АїІритіп:
Апіпйу Апа бресіїісйу Оеєїептіпайопе" Моїес. Іттипої. 25:7-15; Спешйпд єї аї. (1990) "Ерпоре-
Зресіїс Апіроду ВКезропзе То Те бБипасе Апіїдеп ОЇ Биск Нераїйів В Мігив Іп Іпієстеєд Юискв"
Мігоїоду 176:546-552; і МоїІдеппацег еї аІ. (1990) "Ідепійу ОЇ НМІ-1 Апідеп Оп Іпіевііпа!
Іпігаеріїнеїа! Т СеїЇ Апа ої В-Іу7 Апііїдеп Оп Наїгу Сеї! І енкаєтіа" Зсапа. 9. Іттипої. 32:7 7-82.
Так, наприклад, можна визначити, чи зв'язуються два антитіла з тим самим сайтом під дією одного з антитіл, іммобілізованих з антигеном на ЕГІЗА-планшеті, а потім можна оцінити здатність до зв'язування другого антитіла з іммобілізованим антигеном. Порівняння епітопів може бути також здійснене шляхом прямого або опосередкованого мічення "першого" антитіла ферментом, або радіонуклідом флуорофором, а потім може бути оцінена здатність неміченого "другого" антитіла інгібувати зв'язування "першого" антитіла з антигеном на клітинах, у розчині або на твердій фазі.
Може бути також визначена здатність антитіл блокувати зв'язування рецептора СО16А з імунними комплексами, які утворюються на ЕГІЗА-планшетах. Такі імунні комплекси одержують спочатку шляхом покриття планшета антигеном, таким як флуоресцеїн, а потім шляхом нанесення на цей планшет специфічного антитіла проти флуоресцеїну. Цей імунний комплекс служить як ліганд для розчинних Ес-рецепторів, таких як ЗХЕСКШа. Альтернативно, отриманий розчинний імунний комплекс може бути прямо або опосередковано позначений ферментом, радіонуклідом або флуорофором. Потім може бути оцінена здатність антитіл інгібувати зв'язування цих мічених імунних комплексів з Ес-рецепторами на клітинах, у розчині або на твердій фазі.
Ср1бА-зв'язувальні білки відповідно до винаходу можуть містити, а можуть і не містити, Ес- ділянку людського імуноглобуліну. Ес-ділянки відсутні, наприклад, у 5сЕм-зв'язувальних білках.
Ес-ділянки присутні, наприклад, у людських або гуманізованих тетрамерних моноклональних антитілах дб. Як описано вище, у деяких варіантах винаходу СО16бА-зв'язувальний білок включає Ес-ділянку, що має змінену ефекторну функцію, наприклад, знижену афінність відносно ефекторного ліганду, такого як Ес-рецептор або компонент комплементу С1, у порівнянні з функцією немодифікованої Ес-ділянки (наприклад, Ес природних білків Ідс1). В одному з варіантів винаходу Ес-ділянка не є глікозилованою у положенні амінокислоти, що відповідає положенню 297. Такі антитіла не мають ефекторної Ес-функції.
Таким чином, СО16бА-зв'язувальний білок може не мати здатність до Ес-опосередковуваного зв'язування з ефекторним лігандом, таким як Ес-рецептор або компонент комплементу С1, що обумовлено відсутністю Ес-домену в зв'язувальному білку, а в інших випадках відсутність зв'язувальної або ефекторної функції обумовлено модифікацією в константній ділянці антитіла. 5.1.2.1. СО1бА-зв'язувальні білки, що містять послідовності СОК, аналогічні послідовностям
СОВА тАБ ЗОа8
Ср1бА-зв'язувальними білками, які можуть бути використані для здійснення даного винаходу, є білки, які містять послідовність СОМ, яка походить (тобто, що має таку ж або аналогічну послідовність) від СОК мишачого моноклонального антитіла 358. Комплементарні
КДНК, які кодують варіабельні ділянки важкого ланцюга і легкого ланцюга мишачого моноклонального антитіла 308, що включає СОК-кодуючі послідовності, клонували і секвенували, як описано в даній заявці. Послідовності нуклеїнової кислоти і білка 308 представлені нижче. З використанням послідовностей мишачої варіабельної ділянки і СОМ було отримано велике число химерних і гуманізованих моноклональних антитіл, що містять гіперваріабельні ділянки, які походять від СОК 308, і були проаналізовані їхній властивості. Для ідентифікації гуманізованих антитіл, що зв'язуються з СО16А з високою афінністю й мають інші потрібні властивості, були отримані важкі ланцюги антитіл, що містять МН- ділянку з СОК, які походять від 308, і ці важкі ланцюги були об'єднані (за допомогою коекспресії) з легкими ланцюгами антитіл, що містять МіІ- ділянку з СОР, які походять від 358, у результаті чого було отримано тетрамерне антитіло для аналізу. Властивості отриманих тетрамерних антитіл були визначені, як описано нижче. Як описано нижче, СО16бА-зв'язувальні білки, що містять СОМ 308, такі як білки описаних тут гуманізованих антитіл, можуть бути використані відповідно до даного винаходу. 5.1.2.1.1. МН-ділянка
В одному з аспектів винаходу СО1б6А-зв'язувальний білок відповідно до винаходу може містити варіабельний домен важкого ланцюга, у якому щонайменше одна СОК (а звичайно три
СОК) має послідовність СОК (а найчастіше всі три СОК) важкі ланцюги мишачого моноклонального антитіла 308, а інші частини зв'язувального білка є в основному людськими (тобто, походять від варіабельної ділянки важкого ланцюга людського антитіла або людських антитіл і, в основному, аналогічні такій ділянці).
В одному зі своїх аспектів даний винахід стосується гуманізованого антитіла 358 або його фрагмента, що містить СОК, які походять від антитіла 308, в основному в людській каркасній ділянки, але в якій щонайменше одна СОК варіабельного домену важкого ланцюга має послідовність, що відрізняється від відповідної послідовності СОК важкого ланцюга мишачого антитіла 3058. Так, наприклад, в одному з варіантів винаходу СОК відрізняється(ються) від послідовності 308 СОК щонайменше тим, що вона (вони) має(ють) одну або більше замін СОК, що, як відомо, впливають на зв'язування 358 з СО16А, як відомо фахівцям або як показано в таблицях З і 4А-Н. Придатні СО16-зв'язувальні білки можуть містити 0, 1, 2, 3, або 4 або більше таких замін (часто від 1 до 4 таких замін), а також вони можуть містити, але необов'язково, додаткові заміни.
Таблиня З
Заміни в Ун-домені 7 52 СБК вве -озсо
Туг зро дер
Гу заз
АїЇй або
ЕЕ5
Таблиця 4А
Послідовності Ун, ПоХходять від Ун ЗОВ
ЕКІі СОК!І РКО СОКО вКЗ | Ср ра о Низовун-є В В | В | А | В | в | в
НизОа8УМ-? В в в АХ В А Е
МиЗовУН-1Т В А в (й В А Е ощиЗзовУн- 13 ВАВ дво свизовуноябі БВ 1 Є БОГА спизсвуноза ВО ВВЕ ЕВ
БиЗсвУун-оо В в в щи С с еЕ опиЗзоВунтав і в'| ВВ 'є| ов
БКи;изсвУН-ХЗ В в в ЕІ це р В
КиЗзсвУНн-Яй Е В їх. с їх А їК:
Шееесь кош нн о ни о нн ок п п нн ОН
ЕКІ сок! ЕКО 1СОКО КЗ | Сов | ЕКА оноизсВуУНАЯ2| в ОВО) Вс 01 НАВ ниаЗзовУнН-44 Е В В С Н В; В ж Букви в таблині ЗА позначають послідовності, представлені в таблицях 4 в-н
Таблиця АВ
Кт
А 11 | с 101116 1111110розжаншюеко 02З АЦ. 2522 Ж Ж («Ж Ж А 2 Є - 25 2 Ж Ж - 25 ( «« Я «25 «А А-- -- А --- - о ооо 011
НЯНИ НИВІ МИТИ ОБОВ ПИ ТИН ПНЯ ВАХ ЗОН
11013 шини ше п Я В ОО ООН ПОХОООО ИОВНН
КК ков Кк5
СЕБЕ О1 6 5185 5 8518517 ви НИ Кс МК с ОК СИ ПОЛЯ ПО З ше ли ши и М В В С В СЯ По ПО ХО б 11А АГАТ 1 1
Ух МКУ 1111119 ок рко коків м ж М І ВЕ ЗІ ПЕ М ЗО ПОН ПОХНО М НН 20850110 1010015 рр
Т Т Т Т Т 17 вв
Ми ОО ЗО ООН ПОВНО МОХ СИВИНИ
В РМ ВО РИ ПО РИ ПО Я НО НЯ ПО ПО т ЗО т нс п сл ПО с с НО СЯ ПО Ох ЗВ пи лини жи ши жо но а поса пон п: чи
Е Е Е Е г 24 855 1558115 61660101 юю юу1Бюжюиюию26
ЕЕ ОБ вв
ЕзЕе и
Я Ї. Ї. й 29 шт ни ши мит яш в тс 103 104 105 106 197 ЗО 16 КО.
5ЕОШО МО. Шослідовністьї 00000000 106 ОУТІВЕСОСРАТУКРТОТІТІТСТЕВОСКВВ.
Таблиця С сові
АСВ 2 1 юшшини шини ши пи; ши ОХ о ПО ПО З ПО | 5 1/4 ар ве ие---- (Є) (Є 35 ши ши ж ши п У бр 35В
ЛВ | 109, ..Й.ьКкК.,-.: | БЕОЮКО.
БЕОЇШО МО, Шослідовність 00000000 19585 ЕБОМОУСЄ
Таблиня 41)
ЕВ
ТАТО ОТ лзнноко нити 01011139
К Кк | 43
І. І. | 45 110 МІ о 8ЗКО В МО.
Таблиця А ср
АВ со 1 | Б | о | НО 1111) залишок ши І ПО ПО ПОЛЯ ПНЯ ПОН ПОН ПОЛОН МОН ПО ше ши о о о по оо НО ТО ПОВ ООН МОН ТО ПОН УНН ВОНО ОН НН ТОН МОНУ ННЯ рр р М р р М ІВ; ЕВ) р ром за пря ер
Р Р Р І Р Р Р Р РР 21 ва Я БІ ОА Я Я й
Мо
Таблиня ЗБЕ
ККЗ шим м о а ОХ ПО ПО НОЯ ПОЛОН ПОВНО НОХОО НО о
ВК кВ ВЕ |В В в 2 -Г'" рр тво
В рір р рі'іороі|рір,і рр 72 з кІкікікіІкккікік 75 о|0|010 0 00 ооо 77 78 79 00 |рь1ь сь 80
ММ Мм ММ Мо мМ М. х2
Є с 83 т |РІ|РІ|Р Р Р/Р Р Р |Р 8 рЕівві вн ро 00100001 56 87
Ху що 90 91 92 93 о в/о т кі АН В НО о. 94 перерви у «ур
МО. сере тя я ект
МО. терен я якотютя г нео
МО. рве нтя я ля я гяте кот
ШИ Мо. в: лис
МО, с-21 295 ВЕТІТКОІБЗКМОУУСТІМОРУВТАТУТСАВО 130 КЕТІТКОТЕКМОУМ ТМ РУБТАТУХСАН 132 КЕТІБКИТООМОУВКАПТАВЮТАТУУСА
Б 00000
КО Ів Послідовність
КО. 141 КЕТІТКОТОКМОУУБРТОРУПБЮТАТУХСАС 61 ВІЛІТКОТВККОУУЄТМОРУЄТАТУУСАН
Таблиця Кі
СсОВЗ
А ОІВ 16000715 око нти
М ТИ НЕ ПОН ВТО КС ХНН р Р Р Р 97
ЗЕО Ір Послідовність
МО.
ПІРАМЕКУ
ІМРАЖЕОХ
ІІРАУРАХ
ІМРАХЕОУ
Таблиця 4Н
ЕК жк ютютютьтютьтьтютьтьтьютьтьтьть ють тьтьтьтьтьтьтьтьу жлюлютьть тв ють ть ють ттвть вв ттютьть вв пф 9191105.
Т Т | 107 ние а о а В ОХ А
У У | 109 5010 МО
ЗЕО Ір Послідовність
МО.
В одному з варіантів винаходу СО1ТбА-зв'язувальний білок може містити послідовність варіабельного домену важкого ланцюга, яка є ідентичною або аналогічною МН-домену конструкції НиЗзО8МН-1, послідовність якої представлена в 5ЗЕО ІЮ МО: 68. Так, наприклад, даний винахід стосується СО16бА-зв'язувального білка, що містить МН-домен, послідовність якого (1) відрізняється від послідовності МНн-домену Низ8МН-1 (5ЕО ІО МО: 68) тим, що в ній відсутні СОК-заміни або присутні одна або більше ніж одна СОК-заміна, представлені в таблиці 1; (2) відрізняється від послідовності МН-домену НизОе8МН-1ї тим, що в ній відсутні заміни каркасних залишків або присутні одна або більше ніж одна заміна каркасних залишків, представлених у таблиці 1; і (3) щонайменше приблизно на 80 95, найчастіше щонайменше приблизно на 90 95, а іноді щонайменше приблизно на 95 95 або навіть щонайменше приблизно на 98 95 ідентична послідовності МН НиЗзО8УН-1 в інших положеннях.
Репрезентативні МН-домени СО16-зв'язувальних білків відповідно до винаходу мають послідовності ЗО8МУН, Низо8МУНн-5 ії Низо8МНн-22 (5ЕО ІО МО: 79, 5ЕО ІЮО МО: 69 і 5ЕО ІЮ МО: 70, відповідно). Репрезентативні нуклеотидні послідовності, які кодують послідовності ЗО8МУН і
Низавмн-5 (5ЕО ІЮ МО: 79 і 5ЕО ІО МО: 69, відповідно), представлені 5ЕО ІЮ МО: 80 і ЗЕО ІЮ
МО: 81, відповідно.
МН-домен може мати послідовність, що відрізняється від НиЗзО8МН-1ї (5ЕО ІЮ МО: 68) щонайменше однією, щонайменше двома, щонайменше трьома, щонайменше чотирма, щонайменше п'ятьма або щонайменше шістьма замінами, вказаними в таблиці 3. Ці заміни, мабуть, обумовлені підвищенням афінності відносно СО16А і/або зниженням імуногенності
СО16А-зв'язувального білка при його введенні людині. У деяких варіантах винаходу ступінь ідентичності МН-домену НизО8МУН-1 в інших положеннях становить щонайменше приблизно 80 95, щонайменше приблизно 90 95, щонайменше приблизно 95 95 або щонайменше приблизно 98 об.
Ілюстративними, але необмежувальними прикладами послідовностей МН-доменів ряду
СО16бА-зв'язувальних білків є послідовності, представлені в таблиці 4. Важкі ланцюги, що містять ці послідовності, приєднані до константної ділянки людського Су!, були коекспресовані з легким ланцюгом ПпиЗзО8МІ-1 (описаним нижче) для одержання тетрамерних антитіл, і зв'язування цих антитіл з СО16А оцінювали для визначення впливу присутності амінокислотних замін у порівнянні з МН-доменом пиЗзО8УН-1, де такі заміни були відсутні. Конструкції, у яких
МН-домен має послідовність ПИЗО8УН-1, 2, З, 4, 5, 8, 12, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27,28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 42, 43, 44 і 45, виявляють високу афінність зв'язування, а
МН-домени пизо8УНн-6 і -40 виявляють проміжний рівень зв'язування. Вважається, що СО16бА- зв'язувальні білки, що містять МН-домени пиЗО8МНн-5 і пизО8УуНн-22 (5ЕО ІЮО МО: 69 ії 5ЕО ІО
МО: 70, відповідно), мають особливо цінні зв'язувальні властивості. 5.1.2.2. МІ -ділянка
Аналогічні дослідження були проведені для ідентифікації послідовностей варіабельного домену легкого ланцюга, що мають цінні зв'язувальні властивості. В одному зі своїх аспектів даний винахід стосується СО16бА-зв'язувального білка, що містить варіабельний домен легкого ланцюга, у якому щонайменше одна СОК (і звичайно три СОК) має послідовність СОК (і найчастіше всі три СОК) легкого ланцюга мишачого моноклонального антитіла 308, а інші частини зв'язувального білка є, в основному, людськими (тобто, походять від варіабельної ділянки важкого ланцюга людського антитіла або людських антитіл і, в основному, аналогічні такій ділянці).
В одному зі своїх аспектів даний винахід стосується фрагмента гуманізованого антитіла 308, що містить СОК, які походять від антитіла 308, в основному, у людській каркасній ділянці, але в який щонайменше одна СОК варіабельного домену легкого ланцюга має послідовність, що відрізняється від відповідної послідовності СОК легкого ланцюга мишачого моноклонального антитіла 308. В одному з варіантів винаходу СОК відрізняється(ються) від послідовності 3038 наявністю щонайменше однієї або більше амінокислотних замін у СОК, наприклад, однієї або більше замін, представлених у таблиці 2 (наприклад, аргініну в положенні 24 у СОК1; серину в положенні 25 у СОК1; тирозину в положенні 32 у СОК'1; лейцину в положенні 33 у СОК'І; аспарагінової кислоти, триптофану або серину в положенні 50 у СОК2;
Зо серину в положенні 53 у СОК2; аланіну або глутаміну в положенні 55 у СОК2; треоніну в положенні 56 у СОК2; серину в положенні 93 у СОКЗ; і/або треоніну в положенні 94 у СОКЗ). У різних варіантах винаходу варіабельний домен може мати 0, 1, 2, 3, 4, 5, або більше таких замін (а найчастіше від 1 до 4 таких замін), а також він може мати, але необов'язково, додаткові заміни.
В одному з варіантів винаходу придатний СО1бА-зв'язувальний білок може містити послідовність варіабельного домену легкого ланцюга, яка є ідентичною або аналогічною МІ - домену конструкції НизО8МмІ -1 (ЗЕО ІЮ МО: 71), послідовність якої представлена в таблиці 6.
Так, наприклад, даний винахід стосується СО1Т6бА-зв'язувального білка, що містить Мі -домен, послідовність якого (1) відрізняється від послідовності МІ -домену Ни3О8МІ-1 (ЗЕО ІО МО: 71) тим, що в ній відсутні СОМК-заміни, або присутні одна або більше ніж одна СОК-заміна, представлені в таблиці 5; (2) відрізняється від послідовності Мі -домену Ни3О8МІ-1 тим, що в ній відсутні заміни каркасних залишків або присутні одна або більше ніж одна заміна каркасних залишків, представлених у таблиці 5; і (3) щонайменше приблизно на 80 95, найчастіше щонайменше приблизно на 9095, а іноді щонайменше приблизно на 9595 або навіть щонайменше приблизно на 98 95 ідентична послідовності МІ Ни308МмІ-1 (5ЕО ІЮ МО: 71) в інших положеннях.
Таблиця 5
Заміни в Ух-домені 3015
СрВІ
СОВІ
СОВІ
СОКІ
СсрЕо
СОК2 | Айз»обій сов
Таблиця 6
Послідовності Уї, похолять від Уї ЗОВ 1 Ф|ВЕВІГ СОВІ | ЕВ |СОВО ВЗ | СОВЗ вКЯ
НиЗОяМІ-5| В Е А А В А В о НІО8МІ6| В В | А А / В А | В набу В о | А | А ВАШ В. о НІО8МІ-8| В А | А | В В А | В о НнНООЖУго В А | А | с В А В.
НиЗОВМІ.-12 В А. А ЕВ А 15) о наЗОоЗУБІЗ| В | А | А й в б Ф А | В о нШОо8УріЗ Ві А | А | А В| с в о НнасВУСівє| вВ 1 А | А | А в| о | в о НнаО8УЯ7| В А | А | А В| Б | В о НнасВуро2| В | С | А ро / в' о | в о НиЗО8МІ3| В С | А 0 В в | В о НншаоВУурЯ в о | А о в'і'А. В о НШО8Уг 26) ВО | А | ОВ Б В
ПиЗО8УТ-31 В А А рр в Е в
НизСеУї-33 В А А І В А В
ПиЗаєМУ-36| В Є А Нв ІВ) В
ПиЗаєМУ-38| В В А їв ІВ) В о нщОоВУо| В | С | А | її ВвВ'| 0 | в
ЕКІІ СОКІ | ЕВ2 СОВКО) ЕК3 СсОКЗ гКЯ о НаобУуЯю В ЕЕ | А 1 1 Вв'| в дД в оо НвоВУяЯ!ї В В А У |в ов
НиЗОВУ-44| В А. А Кк в А В ж Букви в таблиці БА позначають послідовності, представлені в таблицях б в-н
Таблиця 6В
ЕН
АВ Заящеко нин ши т т 5
І. | ПИ ІВ 168 1 169 | БЕОЮМО ко. ав БКЛЛОБРАВІКУВЕ
Таблиця С
СІКІ ни а Я а ПО МОН ПОН ПО
Кк |В | к|кКк кі кі кІ| 4
ІФ) (6; а с С о іє 29
М М М М М А А 34 ке сере
Ів МО
Мо ее ят я яю
І Мо сере тя
І МО бо
ЗЕ в ; о. Послідовні о дОовнНість 470 1 о КАБОССЮВЕММОСС///// т АБО М ши 72 ООВАБОВОВВЕММО 0000000 орг РМ зросоак сс ПО ММ на Кар ЕММ000000000 звБОрсЮВ ще 4 шосе вх пиши З ї т їх ст сх ї ЗЕМ 1 ВК і ня сОЗУММ
Жіж сто : : і а хОБЕГМ
З шин юн ЕОБСБУЕИХ : ши ОБЕМА -- й -КаБВобо тА 00202 (З Я Я зсроро УТА 8 | ОЇ КАББОСОВЕММ 0000000 ст
В ОА с ша те ООВАБЯОООВВЕММ 0000000 зро : шк
А ПБЕММ
00079000 ОК55БОСО5ЕММ000000000 звошо5 ц з що ОЕМ - 2 8 00 КАББОСОБУММО 000000 З БЕ сх
ОВ рах ММ ! сти КА 5 сети каЗо їУ ЇВ що - а ЕМА
АЗС О ТЕ
Я Ми Ще ДІ: ШИ те КАВУ те -- --- КАВМОВОВНИХ, нн АВ ЗООЗКММ - ! зе КА Уго га - со - 048500 ОВАБУВСОВЕММО МЗУрої КМ : 87 87 ОКУ ВЕММ 00000000 Зам В е со й і щі ММ 1858 ОО КАЗУДОВЯЗХММ 00000000 ро Не ч С;
КА сх Ії с : пт -Я-- ша ЗОМ 90 | 90 ОЇ КАВУВЕВБЕМА 000000 Ууру їе с т сем); 1 КАВОЮ Бе не СОБІ. 0049 0001 КАБООСОЗЕММ 0000000 ро що
ОЗ М шо - кг Ми
МО. чо. жлідовність -х -йь КАВОВЕ : т У 1 З В А - 5 2- Ес ни дл КМ Ал ПММ 95 | 95 ОКАВООСОВУММ 000000 ро у т 496 96 КАВОЮ сЕЕтя
БІ т я 197 Сеник 197 | КАВОВА 0202 Р АБО рорБЕМА 195 КАБ ХУ 5 тд
ОКАБОВООЯУРА ні в СКК с А 00049800 КАБЕООЮВЕММ///////////// З ОО 300. ОО ВАВЕВООБЕММ 0000000 крово с т з 5 ОБЕММ : ее б Пе з на З ВБЕММ - о ООЖАБЕВОВВУММ 0000000 КОСОВО ,
Те стинтот ММ
А ти - 000203 |ОКАБКОСОВКОМ 1 Ку ропи 204 ОЇ КАВЕВОВБЕМА 00000000 КЕ сх
КОСОВО КМІ кАлторетАС 222 2 2 2 2
К- 5 Не рах гА
Ех
Таблиня 61)
КК ши 913 ши ЕН
Р | 44 тат ают
МО.
Таблиця бЕ
СсОоКО
А |В сов Б о |Н 11171 К о Залишок шини ни ши шт Ме Я М ЯМИ ШЕ ОА М Я АД В РИ ПО У
Б БЕ ЕЕ Б А|0О ЕЕ 0 0101 5. .- 296 2072081 2091210 1211 2123 213 214 12151216 КОЮ ' ко
Таблиця бЕ
ЕКЗ
А в Залишок пи о п чн с ж НО ОО 5 65 т Т 72 1
ПИ ПОН ПАННА
ЕВ) р 82 217 218 зо І МО
МО.
Таблиня бсх сов 441 01919 10101 59 9.5.щЩщД.9 що 1 9 0 1 90 ши ши ли и ЗИ а НИ В НИ
МО
Таблиця 6
Кк
С 20А 01008000 Залишок пе 17297106 носиш ни со п у
Т т | 102 224 225 ЗЕ ІВ е;
ЗК ІБ Песлі : осліДОВНІСТЬ
МО, 224 | ЕСОСТКОВІК
ЕСОСТКЦВІК
Репрезентативні Мі-домени СО16-зв'язувальних білків відповідно до винаходу мають послідовності ЗО8МІ, НиЗзО8МІ-1 або НизО8МмІ -43 (5ЕО І МО: 82, 5ЕО ІЮ МО: 71 ї ЗЕО ІЮ МО: 72, відповідно), як показано в таблицях 5 і 6. Репрезентативні нуклеотидні послідовності, які кодують послідовності З(З8МІ. (ЗЕО ІЮ МО:82) ї НиЗзО8МІ -1 (ЗЕО ІЮ МО: 71), представлені в ЗХЕО
ІО МО: 83 і БЕО ІЮО МО: 84, відповідно.
МІ-домен може мати послідовність, яка відрізняється від Ни3О8М1-1 (5ЕО ІО МО: 71) відсутністю замін, однією заміною, щонайменше двома, щонайменше 3, щонайменше 4, щонайменше 5 або щонайменше б, щонайменше 7, щонайменше 8 або щонайменше 9 замінами, вказаними в таблиці 2. Ці заміни, мабуть, обумовлені підвищенням афінності відносно
СО16А і/або зниженням імуногенності СО1бА-зв'язувального білка при його введенні людині. У деяких варіантах винаходу ступінь ідентичності послідовностей в інших положеннях становить щонайменше приблизно 80 95, щонайменше приблизно 90 95, щонайменше приблизно 95 95 або щонайменше приблизно 98 95.
Ілюстративними і необмежувальними прикладами послідовностей Мі -доменів ряду СЮО16бА- зв'язувальних білків є послідовності, представлені в таблиці б. Легкі ланцюги, що містять ці послідовності, приєднані до константного домену людського Ск, були коекспресовані з важким ланцюгом пиЗО8МУН (описаним вище) для одержання тетрамерних антитіл, і зв'язування цих антитіл з СО1Т6А оцінювали для визначення впливу присутності амінокислотних замін у порівнянні з МІ -доменом пизО8МмІ -1 (5ЕО ІЮ МО: 71), де такі заміни були відсутні. Конструкції, у яких МІ -домен має послідовність пиЗО8МіІ -1, 2, 3, 4,5, 10, 16, 18, 19, 21, 22, 24, 27, 28, 32, З3, 34, 35, 36, 37 і 42, виявляють високу афінність зв'язування, а пизО8МіІ -15, 17, 20, 23, 25, 26, 29, 30, 31, 38, 39, 40 і 41 виявляють проміжний рівень зв'язування. Вважається, що СО16бА- зв'язувальні білки, що містять МІ -домени пизе8МміІ -1, пизавмі -22 і пизе8МміІ -43 (ЗЕО ІО МО: 71,
ЗЕО ІЮ МО: 73 і ЗЕО ІЮ МО: 72, відповідно), мають особливо цінні зв'язувальні властивості. 5.1.2.2.1. Комбінації МІ-- іиабо МН-доменів
Як відомо фахівцям і як описано в даній заявці, легкі і важкі ланцюги імуноглобуліну можуть бути рекомбінантно експресовані в умовах, при яких вони асоціюються з утворенням діатіла,
Ко) або вони можуть бути об'єднані іп міго. Таким чином, слід зазначити, що описані тут Мі -домени, які походять від 3058, можуть бути об'єднані з описаними тут МН-доменами, які походять від 308, у результаті чого може бути отримане СО16бА-зв'язувальне діатіло і всі розглянуті його комбінації.
Ілюстративним і необмежувальними прикладами придатних СО16А діатіл є діатіла, що містять щонайменше один МН-домен і щонайменше один Мі-домен, де вказаний МН-домен походить від пиИЗО8УНн-1, пиЗзавмун-22 або пизО8МН-5 (ЗЕО ІЮ МО: 68, ЗЕО ІО МО: 70 і ЗЕО ІЮ
МО: 69, відповідно), а вказаний МІ -домен походить від пиЗО8МІ -1, пиЗаИавмі -22 або пизО8МІ -43 (ЗЕО ІО МО: 71, БЕО ІЮО МО: 73 ії БЕО ІЮ МО: 41, відповідно). Зокрема, гуманізовані антитіла, що містять пиЗзе8УН-22 (5ЕО ІЮО МО: 22) і або пизО8МІ-1, пиЗав8МІ-22 або пизО8МІ -43 (ЗЕО І
МО: 71, ЗЕО ІО МО: 70 і ЗЕО ІЮ МО: 72, відповідно), або пизЗО8МН-5 (ЗЕО ІЮ МО: 69) і пизО8МіІ - 1 (ЗЕО ІО МО: 71), мають цінні властивості.
Слід зазначити, що послідовності описаних тут МІ- ії МН-доменів можуть бути також модифіковані відомими методами, такими як дозрівання афінності (див., Зспіег еї аїЇ. (1996) "Івоїайоп ОЇ Рісотоїаг Айіпйу Апіі-С-ЕпоВ-2 БЗіпдіе-Спайп Ем Ву Моїесшаг Емоішіоп ОЇ ТНе
Сотріетепіатпу Оеїептіпіпд Ведіопе п Те Сепієї ОЇ Те Апіїроду Віпаіпуд пе" 9). Мої. Віо!. 263:551-567; Бацопепу еї аї. (1998) "Апіїроду Аніппу Маїшгаїййоп Овіпд Васієгіа! 5ипасе Оівзріау"
Ргоївіп Епо. 11:825-832; Водег єї аї. (1997) "Увазі Зипасе Оівзріау Рог Зстеепіпд Сотрбіпайогіаї
Роїуреріїде І іргагіев" Маї. ВіоїеснпоїЇ. 15:553-557; Водег еї аї. (2000) "Оігтесівй Емоїшіоп ОЇ
Апіїбоду Егадтепів М/ййп Мопомаїепі Ретіотоїаг Апіїдеп-Віпаїпуд Айіпйу" Ргос. Маї!. Асай. зсі.
И.5.А. 97:10701-10705; Нидзоп еї аї. (2003) "Епдіпеетед Апіїродієз" Маїйге Меадісіпе 9:129-39).
Так, наприклад, СО16бА-зв'язувальні білки можуть бути модифіковані методами дозрівання афінності для ідентифікації білків, що мають підвищену афінність відносно СО16А і/або знижену афінність відносно СО16В.
Одним з репрезентативних СО16бА-зв'язувальних білків є мишаче антитіло 308.
Амінокислотна послідовність, що містить МН- і МІ -домени гуманізованого 3058, описана на фіг. 2, 9, 14 і представлена в 5ЕО ІЮ МО: 9, ЗЕО ІО МО: 11, ЗЕО ІО МО: 12, ЗЕО ІЮО МО: 14, 5ЕО ІЮ
МО: 15, БЕО ІО МО: 16, 5ЕО ІЮ МО: 18, 5ЕО ІО МО: 19, 5ЕО І МО: 20, 5ЕО І МО: 21, 5ЕО І
МО: 22, 5ЕО ІЮ МО: 68, 5ЕО ІЮ МО: 69, 5ЕО ІЮО МО: 70, 5ЕО ІО МО: 71 і 5ЕО ІЮ МО: 72. 5.2. Діатіла, які містять Ес-ділянки або їхні частини
Даний винахід охоплює молекули діатіл, що містять Есо-домени або їхні частини (наприклад,
СнНе- або СНЗ- домен). У деяких варіантах винаходу Ес-домен або частина(и) містять один або більше константних доменів Ес-ділянки Ідс2, ІдеЗ або Ідс4 (наприклад, СН2 або СНЗ). В інших своїх варіантах даний винахід охоплює молекули, що містять Ес-домен або його частину, де вказаний Ес-домен або його частина мають щонайменше одну амінокислотну модифікацію (наприклад, заміну) у порівнянні з Ее-доменом або його частиною дикого типу. Варіанти Ес- доменів добре відомі фахівцям і використовуються, головним чином, для зміни фенотипу антитіла, що містить вказаний варіант Ес-домену, як може бути проаналізовано за допомогою будь-якого добре відомого аналізу на зв'язувальну активність або ефекторну функцію, наприклад, ЕГ ІЗА-аналізу, ППР-аналізу або аналізу на АОСС. Такі варіанти Ес-доменів або його частини, використовувані в даному винаході, надають або модифікують ефекторну функцію, яку має молекула діатіла відповідно до винаходу, що містить Ес-домен (або його частину), як може бути визначено у функціональному аналізі, наприклад, в аналізі, проведеному з використанням
МК-клітин або макрофагів. Варіанти Ес-домену, ідентифіковані як Ес-домени зі зміненою ефекторною функцією, описані в міжнародній заявці УУО04/063351, у публікаціях заявок на патент США 2005/0037000 і 2005/0064514, у попередній заявці на патент США 60/626510, поданій 10 листопада 2004 р., у попередній заявці на патент США 60/636663, поданій 15 грудня 2004 р., і в попередній заявці на патент США 60/781564, поданій 10 березня 2006 р., а також у заявках на патент США 11/271140, поданій 10 листопада 2005 р., і 11/305787, поданій 15 грудня 2005 р., і в одночасно поданих заявках авторів винаходу, що у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання.
В інших своїх варіантах даний винахід охоплює застосування будь-якого відомого Ес- варіанта, такого як варіант, описаний у публікаціях Юипсап еї аї. (1988) "І осаїїгайоп ОЇ Те
Віпаіпа 5йе Рог Те Нитап Нідн-Аніпйу Ес Весеріог Оп Ідс" Маїште 332:563-564; І па еї аї. (1991) "Нитап Ес Сатта ВІ Апа Гс Сатта ВІЇ! Іпіегасі М/йН Оівіїпсі Виї Омепарріпд 5пнпевз Оп
Нитап да" У. Іттипої. 147:2657-2662; І па еї аї. (1992) "Мийіріє Віпаіпд 5йе5 Оп Те СН2
Ботаїп ОЇ Ід Рог Моизе Ес Сатта ВІ!" Мої. Іттипої. 29:53-59; АїІедге еї аї. (1994) "А Моп-
Асіїмайпуд "Нитапігеа" Апіі-СОЗ Мопосіопа! Апіїбоду Веїаіп5 Іттипозирргевзвіме Ргорепіев п Мімо" Тгапз5ріапіайоп 57:1537-1543; НиїсНіп5 еї аї. (1995) "Іпргомей Віодібзійршіоп, Титог
Тагаеїпа, Апа Ведисей Іттиподепісйу іп Місе М/Н А Сатта 4 Магіапі Ої Сатраїй-ІН" Ргос.
Май. Асад. 5сі. ОО 5 А 92:11980-11984; деНегів єї аІ. (1995) "ВНесодпйоп 5йез Оп Нитап ІдСсї Гог
Ес Сатта Ресеріог5: Те ВоїЇе ОГ Спіусозуїайоп" Іттипої. Гей. 44:111-117; І па еї аї. (1995) "Оіїдозасспагіде-Ргоївїп Іпіегасіопе п їдс Сап Модшіатє Ресодпйоп Ву Ес Сатта НРесеріюогв" 60 ЕАБЗЕВ 4). 9:115-119; УеНегів єї аї. (1996) "Модиіайоп ОЇ Ес(Сатта)А Апа Нитап Сотріетепі
Асіїманйоп Ву ІдДаЗ3-Соге Оіїдозасспагіде Іпіегасійопв" Іттипої. Гей. 54:101-104; І па еї аї. (1996) "Мийіріє Іпіегасіпв ОГ да УУйй 5 Соге Оіїдозасснатіде Сап Модиїіагє Весодпійоп Ву Сотрієтепі
Апа Нитап Ес Сатта Ресеріог І Апа ІпПйнепсе Те Зупіпезів ОЇ 5 Оіїдозасспагтіде СНаїпв" .).
Іттипої. 157:4963-4969; Аптоцг єї аі. (1999) "Весотбріпапі Нитап Ідс Моїесшіев ІаскКіпд
Есдатта Несериоюг І Віпаіпд Апа Мопосуїе Тіддегіпуд Асіїмціев" Еишг. У. Іттипої. 29:2613-2624;
Ідизодіє еї аї. (2000) "Марріпд ОЇ Те С1О Віпаїпа 5йе Оп Вйихап, А СНітегтіс Апіроду М/Н А
Нитап ІдСшСтТ Ес" 9). Іттипої. 164:4178-4184; Ведау єї аї. (2000) "Еїїтіпайоп ОїЕРс Весеріюог-
Ререпаєпі ЕнНесюг Еипсійпз ОЇ А Модіїеа ІдДс24 Мопосіопа! Апіїбоду То Нитап СО 4"). Іттипої. 164:1925-1933; Хи єї аї. (2000) "п Міго СНагасієгігайоп ОЇ Ріме Нитапігед ОКТЗ Емнесюг Еипсійїоп
Маптіапі Апіїбодіев" СеїЇ. Іттипої. 200:16-26; Ідиводіє єї аї. (2001) "Епдіпеєгей Апіїродієз М/Н
Іпстеазей Асіїмнйу То Несгтий Сотріетепі" ). Іттипої. 166:2571-2575; ЗПівїід5 еї аї. (2001) "Нідп
Везоїшіоп Марріпд ОЇ ТНе Віпаіпд 5йе Оп Нитап ді Рог Гс датта ВІ, Ес датта ВІЇ, Ес датта ВІП, Апа ЕсАп Апа Оєзідп ОГ дат Магіапів МПА Ітргомей Віпаїпд То Те Ес датта В" У.
Віої. Спет. 276:6591-6604; ЧепПегів еї а). (2002) "Іпіегасіоп 5йез Оп Нитап Іда-Ес Рог
ЕсдаттавВ: Ситепі Модеї!ї5" Іттипо)ї. Гей. 82:57-65; Ргевіа евї а!. (2002) "Епдіпеетіпа ТНегарешііс
Апііродієз Еог Ітргомед Еипсіп" Віоспйет. бос. Тгап5. 30:487-490; у патентах США 5624821; 5885573; 6194551; у заявках РСТ УМО 00/42072; РСТ УМО 99/58572; де всі вказані публікації і документи у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання.
У деяких варіантах винаходу одна або більше модифікацій амінокислот Ес-ділянки приводять до зниження афінності й авідності Ес-ділянки, і тим самим, молекули діатіла відповідно до винаходу відносно одного або більше ЕсуВ-рецепторів. У своєму конкретному варіанті даний винахід охоплює діатіла, що містять варіант Ес-ділянки або його частину, де вказаний варіант Ес-ділянки має щонайменше одну амінокислотну модифікацію в порівнянні з
Ес-ділянкою дикого типу, і де вказаний варіант Ес-ділянки зв'язується тільки з одним ЕсукК, що являє собою ЕсуКППА. У своєму іншому конкретному варіанті даний винахід охоплює діатіла, що містять варіант Ес-ділянки або його частину, де вказаний варіант Ес-ділянки має щонайменше одну амінокислотну модифікацію в порівнянні з Ес-ділянкою дикого типу, і де вказаний варіант
Ес-ділянки зв'язується тільки з одним ЕсукК, що являє собою ЕсукПА. У своєму іншому конкретному варіанті даний винахід охоплює діатіла, що містять варіант Ес-ділянки або його
Зо частину, де вказаний варіант Рсо-ділянки має щонайменше одну амінокислотну модифікацію в порівнянні з Ес-ділянкою дикого типу, і де вказаний варіант Ес-ділянки зв'язується тільки з одним ЕсукК, що являє собою ЕсукКіІІВ. У своїх деяких варіантах даний винахід охоплює молекули, що містять варіант Ес-домену, де вказаний варіант надає або опосередковує підвищену АЮОСс-активність і/або підвищений рівень зв'язування з ЕСуУКІА (СОЗ32А) у порівнянні з молекулою, що не містить Бс-домену або містить Бо-домен дикого типу, як може бути визначено методами, відомими фахівцям і описаними в даній заявці. У своїх альтернативних варіантах даний винахід охоплює молекули, що містять варіант Ес-домену, де вказаний варіант надає або опосередковує знижену АЮСС-активність (або іншу ефекторну функцію) і/або підвищений рівень зв'язування з ЕсукКІІВ (СОЗ32В) у порівнянні з молекулою, що не містить Ес- домену або містить Ес-домен дикого типу, як може бути визначено методами, відомими фахівцям і описаними в даній заявці.
Даний винахід також охоплює застосування Ес-домену, що містить домени або ділянки, які походять від ІДС двох або більше ізотипів. Як відомо фахівцям, амінокислотна модифікація Ес- ділянки може значно впливати на Ес-опосередковувану ефекторну функцію і/або зв'язувальну активність. Однак ці зміни функціональних властивостей можуть бути додатково уточнені і/або змінені залежно від Ідсї вибраних ізотипів. Аналогічним чином, природні властивості ізотипа Ес можуть бути змінені за допомогою введення однієї або більше амінокислотних модифікацій. ІДС багатьох ізотипів (тобто, Ідс1, Ідо2, ІдеЗ і Ід4) мають різні фізичні і функціональні властивості, включаючи час напівжиття в сироватці, фіксацію комплементу, афінності зв'язування з ЕсукК і ефекторні функції (наприклад, АОСС, СОС), що обумовлено розходженнями амінокислотних послідовностей, їхніх шарнірних доменів і/або Ес-доменів. У деяких варіантах винаходу амінокислотну модифікацію і Ес- ділянку (ДС незалежно вибирають виходячи з їхній відповідних характерних активностей зв'язування і/або ефекторних функцій, що підходять для конструювання діатіла з потрібними властивостями. У більшості варіантів винаходу вказані амінокислотні модифікації і шарнірні ділянки/Ес-ділянки Ід: були окремо проаналізовані на зв'язувальну активність і/або на ефекторну функцію застосовно до Ідс1, описані в даній заявці або відомі фахівцям. У деяких варіантах винаходу вказана амінокислотна модифікація і шарнірна ділянка/Ес-ділянка ІДС. мають аналогічні функціональні властивості, наприклад, підвищеної афінність відносно ЕсукІПА, на що вказував їхній окремий аналіз на Есув- бо зв'язування або ефекторну функцію застосовно до молекули діатіла або до іншої Ес-вмісної молекули (наприклад, імуноглобуліну). Отже, комбінація вказаних амінокислотних модифікацій і вибраної Ес-ділянки ІдС діє адитивно або, більш переважно, синергічно, що дозволяє змінювати вказані функціональні властивості молекули діатіла відповідно до винаходу в порівнянні з молекулою діатіла відповідно до винаходу, що містить Ес-ділянку дикого типу. В інших варіантах винаходу вказані амінокислотні модифікації і Ес-ділянка ДС мають протилежну функціональну дію, наприклад, вони мають здатність підвищувати їі знижувати, відповідно, афінність відносно
ЕсуКІА, як було проаналізовано окремо на ЕсуВ-зв'язувальну функцію і/або ефекторну функцію застосовно до молекули діатіла або до іншої Рс-вмісної молекули (наприклад, імуноглобуліну), що включає Ес-ділянку дикого типу, описану в даній заявці або відому фахівцям, у результаті чого комбінація вказаної амінокислотної модифікації й вибраної ділянки ІдС, що мають "протилежну" дію, буде селективно регулювати або знижувати специфічну функціональну активність діатіла відповідно до винаходу в порівнянні з діатілом відповідно до винаходу, що не містить ЕРс-ділянку або містить Ес-ділянку дикого типу того ж ізотипу. Альтернативно, даний винахід охоплює варіанти Ес-ділянки, що мають комбінації відомих амінокислотних модифікацій, і вибрані ділянки ІдСї, які мають нові властивості, де вказані властивості не можуть бути детектовані при проведенні аналізу вказаних модифікацій і/або ділянок окремо, як описано в даній заявці.
Функціональні властивості дб: багатьох ізотипів і їх доменів добре відомі фахівцям.
Амінокислотні послідовності ІДС, Ідсе2, ІдОЗ і Ід4 представлені на фіг. ТА-1В. Відбір і/або комбінації двох або більше доменів ДС: конкретних ізотипів, використовуваних у способах відповідно до винаходу, можуть бути проведені виходячи з будь-яких відомих параметрів батьківських ізотипів, включаючи афінність відносно Есук (таблиця 7; див. публікації Ріе5сп еї а! (2000) "Рипсіїоп5 ОЇ Те Ес Несеріогїв Рог Іттиподіобиїп С" У. Сіїй. Гар. Апаї. 14:141-156;
СНарреї! еї а. (1993) "Ідепійісайноп ОЇ А бесопаагу Ес Сатта ВІ Віпаїпа 5йе М/йпіп А Сепеїїсау
Епаіпеетед Нитап Ідсо Апіроду" 9. ВіоЇ. Спет. 33:25124-25131; СНарре!ї еї аї. (1991) "Ідепійїсайоп ОЇ Те Ес Сатта Ресеріог Сіазз І Віпаіпд 5йе Іп Нитап Ід Тигоцай Те Ове ОЇ
Весотрбіпапі Ідс1/Лдаг Нубгіа Апа Роіпі-Мшиїагед Апіїродівєв" Ргос. Маї!. Асад. Зсі. ОБА 88:9036- 9040, кожна з яких у всій своїй повноті вводиться в даний опис за допомогою посилання). Так, наприклад, ділянки або домени Ідсеї конкретних ізотипів, наприклад, Ідс2 або Ід04, що мають
Зо обмежену здатність зв'язуватися з ЕСукКІІВ або взагалі не зв'язуються з ЕсукІІВ, знаходять конкретне застосування при конструюванні потрібного діатіла з метою максимізації зв'язування з активуючим рецептором і мінімізації зв'язування з інгібуючим рецептором. Аналогічним чином,
Ес-ділянки або домени Ідсї конкретних ізотипів, наприклад, ЇдО3, що, як відомо, зв'язуються переважно з С14 або ЕсукКПША (Вгиддетапп еї аї!. (1987) "Сотрагізоп ОЇ Тпе Епесіог Рипсійоп5 ОЇ
Нитап Іттиподіобиїїпе Овіпуд А Маїснєа 5еї ОЇ Спітетіс Апіїродіев" У. Ехр. Мед. 166:1351-1361), можуть бути об'єднані з відомими амінокислотними модифікаціями с з метою підвищення
АСС при конструюванні молекули діатіла, що буде мати поліпшену ефекторну функцію, тобто, буде максимізувати, наприклад, активацію комплементу або АОС.
Таолиця 7
Загальні властивості ІС, що зн'язується з ЕсукК, адаптовані по Еіезсії 5:
Мерреті. 1999, 3. СНо. Таб. Апя). 14:141-156
Рецептор Онінена афінність відносно ЇЇ Віднасна афінність о
ЕсуВІ 16-17 Ірс3 Те» 1а Я не зв'язується: 12012
Бсув ПА ВА «0 ІвО3Івоі не зв'язується: 1202. ІС
БсувПА НО «0 ІвсзМІвОо 121вО2 не зв'язується: 18034
ЕсуВІВ ? «0 ІгО3о1еО 1 1е0 не зв'язується: 1132
Есук «10 Іесті3-Івсі не зв'язується: 18032, 1204 "7 зв'язується тількн з комплексним ІрРСї 5.3. Молекулярні кон'югати
Молекули діатіла відповідно до винаходу можуть бути рекомбінантно зв'язані або хімічно кон'юговані (включаючи кон'югування за допомогою ковалентних і нековалентних зв'язків) з гетерологічними поліпептидами (тобто, з неспорідненим поліпептидом або його частиною, де вказаний поліпептид складається переважно щонайменше з 10, щонайменше з 20, щонайменше з 30, щонайменше з 40, щонайменше з 50, щонайменше з 60, щонайменше з 70, щонайменше з 80, щонайменше з 90 або щонайменше з 100 амінокислот) з одержанням злитих білків. Такі злиті білки необов'язково повинні мати безупинну послідовність, і вони можуть бути також утворені за допомогою лінкерних послідовностей.
Крім того, молекули діатіл відповідно до винаходу (тобто, поліпептиди) можуть бути кон'юговані з терапевтичним агентом або з молекулою лікарського засобу, які модифікують дану біологічну відповідь. Як альтернатива прямому кон'югуванню, щонайменше одна зв'язувальна ділянка діатіла, завдяки присутності множини епітоп-зв'язувальних сайтів на полівалентних, наприклад, чотиривалентних молекулах діатіла відповідно до винаходу, може бути сконструйована так, щоб вона зв'язувалася з терапевтичним агентом або з потрібною молекулою лікарського засобу, але не впливала на зв'язування діатіла.
Терапевтичні агенти або молекули лікарських засобів не обмежуються класичними хімічними терапевтичними агентами. Так, наприклад, молекулою лікарського засобу може бути білок або поліпептид, що має потрібну біологічну активність. Такими білками можуть бути, наприклад, токсин, такий як абрин, рицин А, екзотоксин Рхепдотопа5 (тобто, РЕ-40), або дифтерійний токсин, рицин, гелонін і противірусний білок фітолакі, білок, такий як фактор некрозу пухлини; інтерферони, включаючи, але не обмежуючись ними, а-інтерферон (ІЕМ-с), Д- інтерферон (ІЕМ-В), фактор росту нервових клітин (МОР), тромбоцитарний фактор росту (РОСЕ), тканинний активатор плазміногену (ТРА), апоптотичний агент (наприклад, ТМЕ-а, ТМЕ-
В, АЇМ І, описані в публікації РСТ Мо УМО 97/33899), АЇМ ІІ (див. публікацію РСТ Мо МО 97/34911), ліганд Ра і МЕСІ (публікація РСТ Мо УМО 99/23105), тромботичний агент або антиангіогенний агент (наприклад, ангіостатин або ендостатин) або модифікатор біологічної відповіді,
Зо наприклад, лімфокін (наприклад, інтерлейкін-1 ("1-1"), інтерлейкін-2 ("1-2"), інтерлейкін-б ("І- 6"), гранулоцитарний-макрофагальний колонієстимулюючий фактор /(ОМ-С5Е") і гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор ("5-С5Е"), макрофагальний колонієстимулюючий фактор ("М-С5Е) або фактор росту (наприклад, гормон росту ("ЗН")), протеази або рибонуклеази.
Молекули діатіла відповідно до винаходу (тобто, поліпептиди) можуть бути приєднані до маркерних послідовностей, таких як пептид, для полегшення очищення. У переважних варіантах винаходу маркерною амінокислотною послідовністю є гексагістидиновий пептид, такий як мітка, яка є у векторі РОЕ (ОІАСЕМ, Іпс., 9259 Еоп Амепие, Спаївзмжогій, СА, 91311), і інші мітки, багато які з яких є комерційно доступними. Як описано в публікації Сепія еї аї. (1989 "Віоаззау Рог Тгап5-Асіїмайоп Ов5іпд Риййей Нитап Іттиподвеїїйсівепсу Міги5 ТАТ-Епсодеай Р"гоївіп:
Тгапв-Асіїмайоп Ведиїгез тАМА БЗупіпевзіб" Ргос. Маї). Асад. осі. ОБА, 86:821-824, наприклад, гексагістидин полегшує очищення злитого білка. Іншими пептидними мітками, використовуваними для очищення, є, але не обмежуються ними, гемаглютинінова ("НА") мітка, що відповідає епітопу, який походить від білка гемаглютиніну вірусу грипу (УМі5зОП еї аї. (1984) "Те Бігисіште ОЇ Ап Апіїдепіс ЮОеїептіпапі Іп А Ргоївіп" СеїІ, 37:767-778) і Чад»-мітка (Кпаррік еї а!. (1994) "Ап Ітргомей Аніпйу Тад Вазед Оп Те РІ АС Реріїде Рог Тне Оеєїесійоп Апа Ритгіїісайоп
ОЇ Весотрбіпапі Апіїбоду Егадтепів" ВіоїєсНпіднев, 17(4):754-761).
Інші злиті білки можуть бути отримані методами перестановки генів, перестановки мотивів, перестановки екзонів і/або перестановки кодонів (які мають спільну назву методи "перестановки
ДНК"). Перестановка ДНК може бути здійснена з метою зміни активності молекул відповідно до винаходу (наприклад, епітоп-зв'язувальних сайтів з більш високими афінностями і з більш низькою швидкістю дисоціації). Загалом див. патенти США МоМо 5605793; 5811238; 5830721; 5834252 і 5837458, і публікації Райеп еї аїЇ. (1997) "Арріїсайоп5 ОЇ ОМА Зпийіпд То
Рпагтасешіїсаіє Апа Массіпев" Ст. Оріпіоп Віоїеснпої. 8:724-733; Нагауата (1998) "Апіїсіа!
Емоішіоп Ву ОМА Зпийіпоа" Ттепавз Віоїесппої. 16:76-82; Напвзоп еї аї. (1999) "Емоішіоп ОЇ рінегепіза! 5иБв5ігате Зресіїісйціев Іп Ми Сіазв СіІшатіопе Тгапеіегазез5 Ргобед Ву ОМА ЗпП!,НйІіЇїпо" 4).
МОЇ. Вісі. 287:265-276; і І огепо еї а. (1998) "РСК-Вазєйд Меїноай Рог Тне Іпігодисіоп ОЇ Миїайопе
Іп Сепез Сіопед Апа Ехргеззеад Іп Массіпіа Мігив" ВіоТесппіднез 24:308-313 (усі вказані патенти і публікації у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання). Молекули діатіла відповідно до винаходу або нуклеїнові кислоти, що кодують молекули відповідно до винаходу, можуть бути також модифіковані методом неспецифічного мутагенезу шляхом
Зо проведення ПЛР з імовірністю помилки, шляхом інсерції нуклеотидів у довільно вибраних положеннях або іншими методами, здійснюваними до рекомбінації. Одна або декілька частин полінуклеотиду, що кодує молекулу відповідно до винаходу, можуть бути піддані рекомбінації з одним або більше компонентами, мотивами, сегментами, елементами, доменами, фрагментами і т. п. однієї або більше гетерологічних молекул.
Даний винахід також охоплює молекули діатіла відповідно до винаходу, кон'юговані з діагностичними або терапевтичними агентами або з будь-якою іншою молекулою, або імуноспецифічно розпізнають ці агенти або молекули, що переважно повинні мати підвищений/знижений час напівжиття в сироватці і/або повинні бути націлені на конкретну субпопуляцію клітин. Молекули відповідно до винаходу можуть бути використані для діагностики, наприклад, для моніторингу або розвитку прогресування захворювання, розладу або інфекції при проведенні клінічної тест-процедури, наприклад, для визначення ефективності даної схеми лікування. Детектування можна полегшити шляхом приєднання молекул відповідно до винаходу до детектованої речовини або до молекул, які імуноспецифічно розпізнають детектовану речовину. Прикладами детектованих речовин є різні ферменти, простетичні групи, флуоресцентні речовини, люмінесцентні речовини, біолюмінесцентні речовини, радіоактивні речовини, позитрон-випромінюючі метали й іони нерадіоактивних парамагнітних металів.
Детектована речовина може бути зв'язана або кон'югована з молекулами відповідно до винаходу або безпосередньо, або за допомогою проміжної сполуки (такої як, наприклад, відомий лінкер) методами, відомими фахівцям, або вказана молекула може імуноспецифічно розпізнавати детектовану речовину, тобто, імуноспецифічно зв'язуватися 3 вказаною речовиною. Див., наприклад, патент США Мо 4741900, де описані іони металів, які можуть бути кон'юговані з антитілами, використовуваними як діагностичні засоби відповідно до винаходу.
Такі діагностичні і детектуючі засоби можуть бути отримані шляхом конструювання молекул, які імуноспецифічно розпізнають детектовану речовину, або шляхом приєднання молекул відповідно до винаходу до детектованих речовин, включаючи, але не обмежуючись ними, різні ферменти, включаючи, але не обмежуючись ними, пероксидазу хрону, лужну фосфатазу, бета- галактозидазу або ацетилхолінестеразу; до комплексів простетичних груп, таких як, але не обмежуються ними, стрептавідин/біотин і авідин/біотин; до флуоресцентних речовин, таких як, але які не обмежуються ними, умбеліферон, флуоресцеїн, флуоресцеїн-ізотіоціанат, родамін, бо дихлортриазиніламін-флуоресцеїн, данзилхлорид або фікоеритрин; до люмінесцентної речовини, такої як, але яка не обмежується ними, люмінол; до біолюмінесцентних речовин, таких як, але які не обмежуються ними, люцифераза, люциферин і екворин; до радіоактивних речовин, таких як, але які не обмежуються ними, вісмут (23Ві), вуглець (С), хром (Сі), кобальт (7"Со), фтор (СЕ), гадоліній (159(30, 159050), галій (98Са, 67а), германій (58се), гольмій (е6Но), індій (75, "9, 2, ТА), йод (791, 125І, 129), 1211), лантан (Іа), лютецій (1771 и), марганець (Мп), молібден (Мо), паладій (ЗР), фосфор (ЗР), празеодим (Рі), прометій (9Рт), реній (85Ве, 89Ке), родій (КП), рутеній (""Ки), самарій (З5т), скандій ("775с), селенів (5е), стронцій (955г), сірка (55), технецій (Тс), талій (21Ті), олово (З5п, 1175п), тритій (ЗН), ксенон (33Хе), ітербій (199Ур, 175), ітрій (29У), цинк (572п); до позитрон-випромінюючих металів, застосовуваних у різних методах томографії на основі позитронного випромінювання, і до іонів нерадіоактивних парамагнітних металів.
Молекули діатіла відповідно до винаходу можуть імуноспецифічно розпізнавати терапевтичну молекулу, таку як цитотоксин (наприклад, цитостатичний або цитотоксичний агент), терапевтичний агент або радіоактивний елемент (наприклад, випромінювачі альфа- частинок, випромінювачі гамма-частинок і т. п.), або вони можуть бути кон'юговані з цими молекулами. Цитотоксинами або цитотоксичними агентами є будь-який агент, який чинить токсичний вплив на клітини. Прикладами таких агентів є паклітаксел, цитохалазин В, граміцидин р, етидійбромід, еметин, мітоміцин, етопозид, теніпозид, вінкристин, вінбластин, колхіцин, доксорубіцин, даунорубіцин, дигідроксіантрациндіон, мітоксантрон, мітраміцин, актиноміцин О, 1-дегідротестостерон, глюкокортикоїди, прокаїн, тетракаїн, лідокаїн, пропранолол і пуроміцин і їхні аналоги або гомологи. Терапевтичними агентами є, але не обмежуються ними, антиметаболіти (наприклад, метотрексат, б-меркаптопурин, б-тіогуанін, цитарабін, 5- фторурацилдекарбазин), алкілуючі агенти (наприклад, мехлоретамін, хлорамбуцил тіотепа, мелфалан, кармустин (В5МІО) і ломустин (ССМІ)), циклофосфамід, бусульфан, дибромманіт, стрептозотоцин, мітоміцин С і цис-дихлордіамін-платина (ІІ) (СОР) (цисплатин), антрацикліни (наприклад, даунорубіцин (колишня назва "дауноміцин") і доксорубіцин), антибіотики (наприклад, дактиноміцин (колишня назва "актиноміцин"), блеоміцин, мітраміцин і антраміцин (АМС)), і антимітотичні агенти (наприклад, вінкристин і вінбластин).
Крім того, молекула діатіла відповідно до винаходу може бути кон'югована з
Зо терапевтичними молекулами, такими як радіоактивні речовини або макроциклічні хелатоутворювальні речовини, використовувані для кон'югування з іонами радіоактивних металів (приклади радіоактивних речовин див. вище), або вони можуть імуноспецифічно розпізнавати такі молекули. У деяких варіантах винаходу макроциклічною хелатоутворвальною речовиною є 1,4,7,10-тетраазациклододекан-М, М';М",М'"-тетраоцтова кислота (ООТА), яка може бути приєднана до поліпептиду за допомогою лінкерної молекули. Такі лінкерні молекули добре відомі фахівцям і описані в публікаціях Юепагдо еї а). (1998) "Сотрагізоп ОЇ 1,4,7,10-
Тегаагасусіододесапе-М, М'М",М'"-Теїйаасеїййс Асій (СОТА)-Реріде-СНІб, А /-Момеї
Іттипосопійдайє МУйнН о Саїабоїїгаріє ГійКег, То 2-Ітіпоїпіоіапе-2-Ір-(бготоасеїатідо)репгу||-
БОТА-СТНІ 6 Іп Вгеазі Сапсег Хеподгайв" Сіп. Сапсег Вев. 4:2483-2490; Реїеггоп вї аї. (1999) "Епгутаїйс СіІівамаде ОЇ Рерійде-ГіпКкей Радіоїабеіє Егот Іттипосопійдаїев5" Віосопішд. Спет. 10:553-; і Літтептап еї аї, (1999) "А Ттгідіусіпе СіпКег Ітргомез5 Титог Оріаке Апа Віодізігіршіоп5
Ог 67-Си-І ареївй Апіі-Мейгобіавіота тАБ сиСЕ7 Е(аб)2 Ргадтепів" Мис. Меа. Віої. 26:943-950, кожна з яких у всій своїй повноті вводиться в даний опис за допомогою посилання.
Методи кон'югування таких терапевтичних молекул з поліпептидами, включаючи, наприклад, Ес-домени, добре відомі фахівцям; див., наприклад, Агпоп еї аїЇ. "Мопосіопаї
Апііродієвз Рог Іттипоїагдеїїпа ОЇ Опов Іп Сапсег Тнегару", іп Мопосіопа! Апіїродієз Апа Сапсег
Тнегару, Неївтеїа еї аї. (еадв5.), 1985, рр. 243-56, Агап В. І ів5, Іпс.); НеїЇвігот еї аї. "Апііродієв Гог
Огид Оевїїмегу", іп Сопігоїїєд Огид Оевїїмегу (2па Еа.), Вобріпзоп еї а. (едв.), 1987, рр. 6233-53, Магсеї!
РеккКег, Іпс.); Тпогре, "Апіїрбоду Саієт5 ОЇ Суїоюхіс Адепі5 п Сапсег Тпегару: А Вемівм/", іп
Мопосіопаї! Апііродієз "84: Віоіодіса! Апа Сіїпіса! Арріїсайопв, Ріпснега еї аї. (єдв.), 1985, рр. 475- 506); "Апаїувзів, Везиїйїв, Апа Ешите Ргозресіїме ОЇ Те ТПегарецшііс Ове ОЇ Радіоїіабеї!єд Апіїбсоаду Іп
Сапсег Тнегару", іп Мопосіопа! Апіїродіє5 Рог Сапсег Оєїесіп Апа Тегару, Ваїдм/п еї аї. (едв.), 1985, рр. 303-16, Асадетіс Ргез5; і Тпогре еї а!. (1982) "Те Ргерагайоп Апа Сушюйохіс Ргорегііе5
ОГ Апіїроду-Тохіп Сопідаїев" Іттипої. Вем., 62:119-158.
Молекула діатіла відповідно до винаходу може бути введена разом з кон'югованою з нею терапевтичною молекулою, або без неї, або вона може бути введена окремо або в комбінації з цитотоксичним(и) фактором(іами) і/або з цитокіном(ами), використовуваними для терапевтичного лікування. При окремому введенні, щонайменше один епітоп полівалентної, наприклад, чотиривалентної молекули діатіла може бути сконструйований так, щоб він бо імуноспецифічно розпізнавав терапевтичний агент, наприклад, цитотоксичний(ї) фактори) і/або цитокіни), які можуть бути введені одночасно з уведенням молекули відповідно до винаходу або після її введення. Таким чином, молекула діатіла може специфічно націлювати терапевтичний агент способом, аналогічним способу прямого кон'югування. Альтернативно, молекула відповідно до винаходу може бути кон'югована з антитілом з утворенням гетерокон'югата антитіла, описаного 5едаї! у патенті США Мо 4676980, що у всій своїй повноті вводиться в даний опис за допомогою посилання. Молекули діатіла відповідно до винаходу можуть бути також приєднані до твердих носіїв, які є особливо придатними для проведення імуноаналізів або очищення антигену-мішені. Такими твердими носіями є, але не обмежуються ними, скло, целюлоза, поліакриламід, нейлон, полістирол, полівінілхлорид або поліпропілен.
Характеризація зв'язування молекул діатіл
Молекули діатіл відповідно до винаходу можуть бути охарактеризовані різними способами.
Зокрема, молекули відповідно до винаходу можуть бути проаналізовані на їхню здатність імуноспецифічно зв'язуватися з антигеном, наприклад, з ЕСУКША або ЕсуКІЇїІВ, або у випадку, якщо молекула містить Ес-домен (або його частину), вони можуть бути проаналізовані на Ес-
ЕсуВ-взаємодії, тобто на здатність Ес-домену (або його частини) специфічно зв'язуватися з
ЕсукК. Такий аналіз може бути здійснений у розчині (див., наприклад, Ноцойеп (1992) "ПТПпе О5е
ОЇ Зупіпеїйс Реріїде Сотріпайогіа! Ііргагєб5 Бог Те Ідепійісайоп ОЇ Віоасіїме Рерійдев"
ВіоТесппіднев, 13:412-421), на сферах (Гат (1991) "А Мем Туре ОЇ Зупіпейс Рерііае І іргагу Бог
Ідепійуїпуд ГГ ідапа-Віпатоу Асіїмнйу" Маїште, 354:82-84), на чипах (Бодог (1993) "МийПіріехейа
Віоспетіса! Аззауз М/йН Віоіодіса! Спірв" Маїште, 364:555-556), на бактеріях (патент США Мо 5223409), на суперечках (патенти США МоМо 5571698; 5403484 і 5223409), на плазмідах (Сиї! еї аІ. (1992) "Зсгтеєпіпд Рог Несеріог Гідапавз О5іпуд Гагде І Їбгагієє ОЇ Рерііде5 ГіпкКей То Те С
Тептіпиз5 ОЇ ТНе І ас Вергеззог" Ргос. Маї!. Асад. 5сі. ОБА, 89:1865-1869) або на фагу (5соїй еї а). (1990) "Зеагспіпу Еог Рерійає І ідапаз М/йй Ап Еріюре І ібгагу" Зсіеєпсе, 249:386-390; ЮОеміїп (1990) "Вапдот Реріїйаде І Їбгапев: А боцгсе ОЇ 5ресійс Ргоївїп Віпаіпа МоїІесшев" Зсієпсе, 249:404-406;
См/па єї аї. (1990) "Реріїде5 Оп Ріаде: А Маві І ібгагу ОЇ Реріїдез Еог Ідепійуїпу Гідапав" Ргос.
Май. Асад. 5сі. ОБА, 87:6378-6382; і Реїїсі (1991) "ЗеІесіоп ОЇ Апііїроду ІГідапа5 Егот А Іагає
Мргагу ОЇ ОІідореріїде5 Ехргеззей Оп А Мийімаієпі Ехровйоп Месіог" у. Мої. Віої, 222:301-310 (кожна з цих публікацій у всій своїй повноті вводиться в даний опис за допомогою посилання).
Зо Молекули, які були ідентифіковані як молекули, які імуноспецифічно зв'язуються з антигеном, наприклад, з ЕСуУРІША, можуть бути потім проаналізовані на їхню специфічність і афінність до антигену.
Молекули відповідно до винаходу, що були сконструйовані так, щоб вони містили множину епітоп-зв'язувальних доменів, можуть бути проаналізовані на імуноспецифічне зв'язування з одним або більше антигенами (наприклад, з раковим антигеном) і на перехресну реактивність з іншим антигеном (наприклад, Есук), або, якщо такі молекули містять Ес-домен (або його частину), то вони можуть бути проаналізовані на Бс-ЕсуВ-взаємодії будь-яким методом, відомим фахівцям. Імуноаналізами, які можуть бути проведені для аналізу на імуноспецифічне зв'язування, перехресну реактивність і Ес-ЕсуВ-взаємодії, є, але не обмежуються ними, системи конкурентних і неконкурентних аналізів із застосуванням таких технологій, як вестерн-блот- аналізи, радіоїмуноаналізи, ЕГІ5А (твердофазний імуноферментний аналіз), "сендвіч»- імуноаналізи, аналізи методом імунопреципітації, аналізи на реакцію преципітації, аналізи на реакцію преципітину, аналізи на реакцію дифузії преципітину з гелю, імунодифузійні аналізи, аналізи на реакцію аглютинації, аналіз на фіксацію комплементу, імунорадіометричні аналізи, аналізи на флуоресценцію, імуноаналізи на білку А і багато які інші. Такі аналізи є рутинними і добре відомі фахівцям (див., наприклад, посібник А!йзибеї еї аї., ед5, 1994, Сигтепі Ргоїосої!5 іп
Моїесшіаг Віоїоду, Мої. 1, дЧопп Уміеу 5 Боп5, Іпс., Мем/ ОК, що у всій своїй повноті вводиться в даний опис за допомогою посилання).
Афінність зв'язування і швидкість дисоціації комплексу антиген-зв'язувальний домен або комплексу Есо-ЕсукК можуть бути визначені за допомогою аналізів на конкурентне зв'язування.
Одним із прикладів аналізу на конкурентне зв'язування є радіоїмуноаналіз, що включає інкубування міченого антигену, такого як тетрамерний Есув. (наприклад, міченого ЗН або "2, див. розділ 5.4.1), з молекулою, що представляє інтерес (наприклад, з молекулами відповідно до винаходу, що містять множину епітоп-зв'язувальних доменів), у присутності зростаючих кількостей неміченого епітопа, такого як тетрамерний ЕсукК (див. розділ 5.4.1), і детектування молекули, зв'язаної з міченим антигеном. Афінність молекули відповідно до винаходу відносно антигену і швидкість дисоціації можуть бути визначені виходячи з даних насичення, отриманих в аналізі Скетчарда.
Афінності і зв'язувальні властивості молекул відповідно до винаходу відносно антигену або 60 Есук можуть бути попередньо визначені за допомогою відомих іп міїго аналізів (біохімічних або імунологічних аналізів) на взаємодію "антиген-зв'язувальний домен" або "Бс-Есук", включаючи, але не обмежуючись ними, ЕГІ5А-аналіз, аналіз методом поверхневого плазмонного резонансу й аналізи на імунопреципітацію. Переважно, зв'язувальні властивості молекул відповідно до винаходу можуть бути також охарактеризовані за допомогою функціональних аналізів іп міго по визначенню однієї або декількох ЕсуВ-опосередковуваних функцій ефекторних клітин, як описано в розділі 5.4.2. У найбільш переважних варіантах винаходу, при оцінці з використанням моделей іп мімо (які описані і розкриваються в даній заявці), молекули відповідно до винаходу мали такі ж зв'язувальні властивості, як і в аналізах іп міго. Однак даний винахід не виключає розгляд молекул відповідно до винаходу, що не мають потрібного фенотипу в аналізах іп міго, але мають потрібний фенотип іп мімо.
У деяких варіантах винаходу скринінг і ідентифікацію молекул, що містять множину епітоп- зв'язувальних доменів і, необов'язково, Ес-домени (або їхні частини), здійснюють за допомогою функціональних аналізів, переважно великомасштабних аналізів. Функціональними аналізами можуть бути будь-які відомі аналізи, що включають характеризацію однієї або більше Есув- опосередковуваних функцій ефекторних клітин, таких як функції, описані тут у розділах 5.4.2 і 5.4.3. Необмежувальними прикладами функцій ефекторних клітин, які можуть бути використані в способах відповідно до винаходу, є, але не обмежуються ними, антитіло-залежна клітинно- опосередковувана цитотоксичність (АЮСС), антитіло-залежний фагоцитоз, фагоцитоз, опсонізація, опсонофагоцитоз, зв'язування клітин, розеткоутворення, зв'язування з С14 і комплемент-залежна клітинно-опосередковувана цитотоксичність.
У переважному варіанті винаходу кінетичний аналіз ВіАсоге застосовують для визначення швидкості асоціації і дисоціації молекул відповідно до винаходу, що зв'язуються з антигеном іМабо Есук. Кінетичний аналіз ВіАсоге включає аналіз на зв'язування антигену або Есук з чипами і їхнє відділення від чипів з іммобілізованими молекулами (наприклад, молекулами, що містять епітоп-зв'язувальні домени або Ес-домени (або їхні частини), відповідно), які присутні на їхнє поверхні. Аналіз ВіАсоге описаний у розділі 5.4.3.
Переважно, клітинний сортинг з активацією флуоресценції (ЕАС5), проведений будь-якими відомими методами, застосовується в імунологічних або функціональних аналізах для характеризації молекул відповідно до винаходу. Протокові сортери дозволяють швидко
Зо оцінювати велике число окремих клітин, які зв'язані (наприклад, опсонізовані) з молекулами відповідно до винаходу (наприклад, 10-100 мільйонів клітин на годину) (Зпаріго еї аї. (1995)
Ргасіїса! БРіом/ Суфотеїйгу). Крім того, конкретними параметрами, використовуваними для оптимізації поводження діатіла, є, але не обмежуються ними, концентрація антигену (тобто,
ЕсуВ-тетрамерного комплексу, див. розділ 5.4.1), час кінетичної реакції конкурентного зв'язування або твердість умов проведення ЕАСзЗ-аналізу, і кожний з цих параметрів може бути змінений для відбору молекул діатіла, які містять молекули відповідно до винаходу, що мають специфічні зв'язувальні властивості, наприклад, здатність конкурентно зв'язуватися с множиною епітопів. Протокові цитометри, застосовувані для сортингу й оцінки біологічних клітин, добре відомі фахівцям. Відомі протокові цитометри описані, наприклад, у патентах США МоМо 4347935; 5464581; 5483469; 5602039; 5643796 і 6211477, кожний з який у всій своїй повноті вводиться в даний опис за допомогою посилання. Іншими відомими протоковими цитометрами є ЕАС5- система Мапіаде"мМ, що виготовляється Весіоп ОісКіпвоп 5 Сотрапу, і система СОРА5"М, ЩО виготовляється Опіоп Віотеїгіса.
Характеризація афінності зв'язування з антигеном-мішенню або афінності зв'язування Ес-
Есум, і оцінка щільності антигена-мішені або ЕсукК на клітинній поверхні можуть бути здійснені добре відомими методами, такими як аналіз Скетчарда, або методами, які проводяться з використанням наборів відповідно до інструкцій виробників, таких як Оцапіцт "М Зітріу Сеїїшаг
Ф (Вапов5 Іарогаїйогіе5, Іпс., Рієпеге, ІМ). Один або більше функціональних аналізів можуть являти собою будь-який відомий аналіз по характеризації однієї або більше Есув- опосередковуваних функцій ефекторних клітин, відомих фахівцям або описаних у даній заявці.
У конкретних варіантах винаходу молекули відповідно до винаходу, що містять множину епітоп- зв'язувальних доменів, і необов'язково Ес-домен (або його частину) аналізують у ЕГІ5А-аналізі на зв'язування з одним або більше антигеном-мішенями або з одним або більше ЕсуВ, наприклад, ЕсукПША, ЕсукПА, ЕсуйІІВ, а потім в одному або більше аналізах на АОСС. У деяких варіантах винаходу молекули відповідно до винаходу також аналізують за допомогою аналізу методом поверхневого плазмонного резонансу, наприклад, ВіАсоге. Аналізи методом поверхневого плазмонного резонансу добре відомі фахівцям, а також обговорюються в розділі 5.4.3 і описані в даній заявці, наприклад, у прикладі 6.1.
У найбільш переважних варіантах винаходу молекули відповідно до винаходу, що містять 60 множину епітоп-зв'язувальних доменів, і необов'язково Ес-домен (або його частину) додатково охарактеризовують у тварини-моделі на взаємодію з антигеном-мішенню (наприклад, з Есув) або на ЕРсо-ЕсуВ-взаємодії. При аналізі Ес-ЕсуВ-взаємодій переважними тваринами-моделями, використовуваними в способах відповідно до винаходу, є, наприклад, трансгенні миші, експресуючі людські ЕсукК, наприклад, будь-які миші-моделі, описані в патентах США МоМо 5877397 і 6676927, що у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання.
Іншими трансгенними мишами, використовуваними в таких способах, є, але не обмежуються ними, "голі" ЕсСУКкІША-дефіцитні миші, що несуть людський ЕсуКПША; "голі" ЕсУкПША-дефіцитні миші, що несуть людський ЕСУКІІА; "голі" ЕсСуУКкША-дефіцитні миші, що несуть людський ЕсСУуКІЇВ і людський ЕСуУКПША; "голі" ЕсуУКкІПА-дефіцитні миші, що несуть людський ЕсСукКіІВ і людський
ЕсуКкПА; "голі" ЕсукПША- і ЕсукПА-дефіцитні миші, що несуть людський ЕсукПА ії ЕсукПА; і "голі"
ЕсСУКПА-, ЕсуКІІА- і ЕсуУВІІВ-дефіцитні миші, що несуть людські ЕСУАША, ЕсуАКПА ії ЕсуВІЇІВ. 5.3.1. Аналізи на зв'язування, які проводяться з використанням Есуй
Характеризація зв'язування Есук з молекулами, що містять Ес-домен (або його частину) іабо містять епітоп-зв'язувальний домен, специфічний до ЕсукК, може бути проведена з використанням будь-якого ЕсукК, включаючи але не обмежуючи ними, поліморфні варіанти
Есук. У деяких варіантах винаходу використовується поліморфний варіант ЕСуУКПА, що містить фенілаланін у положенні 158. В інших варіантах винаходу характеризацію здійснюють з використанням поліморфного варіанта ЕсСукІПА, що містить валін у положенні 158. ЕсуУкКША 158М має більш високу афінність відносно Ідс1, ніж 158Е і більш високу АОСС -активність (див., наприклад, публікації Коепе еї аї. (1997) "Гс даттакШа-158М/Е РоїІутогрнпізт ІпПнепсев5 ТНе
Віпаїпд ОЇ Ід Ву Майига! Кіїег Сеїї Ес даттавВІНа, Іпаерепдепіцу ОЇ Те Ес даттавНПа-481І /8В/Н
Рпепоїуре" Віоса, 90:1109-14; Ми єї аї. (1997) "А Моме! Роїутогтрпізт ОЇ ЕсдаттавВНа (СО16)
Анеге Весеріог Еипсійоп Апа Ргєдізрозе5 То Ашіоіїттипе Оізеазе" У. Сііп. Іпмеві. 100:1059-70, що у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання); причому цей залишок фактично безпосередньо взаємодіє з нижерозташованою шарнірною ділянкою ІДС1, як було нещодавно виявлено при проведенні досліджень по спільній кристалізації Іде1-ЕсСУКША, див. наприклад, публікацію Зопаегтапп еї аї. (2000) "Те 3.2-А Стувіа! Зіписіцге ОЇ Тне Нитап Ід
Ес Бгадтепі-Рс даттаній! сотрієх" Майте, 406(6793):267-273, що у всій своїй повноті вводиться в даний опис за допомогою посилання. Проведені дослідження показали, що в
Зо деяких випадках терапевтичні антитіла мали підвищену ефективність у ЕсукША-158М- гомозиготних пацієнтів. Так, наприклад, гуманізоване моноклональне анти-СО20 антитіло ритуксимаб є терапевтично більш ефективним у ЕсукША-158М-гомозиготних пацієнтів у порівнянні з ЕсукПША-158Е-гомозиготними пацієнтами (див., наприклад, Сагігоп еї аї. (2002) "Тнегарешііс Асіїмйу ОЇ Нитапігед Апіі-СО20 Мопосіопа! Апіроду Апа Роїутогрпієт Іп Ід. Ес
Весерюг ЕсдаттавІША Сепе" Віоса, 99(3):754-758). В інших варіантах винаходу терапевтичні молекули, що містять цю ділянку, можуть бути також більш ефективними в пацієнтів, гетерозиготних по ЕсуУкША-158М ії ЕСУКкПА-158БЕ, і в пацієнтів з ЕСуУКПА-131Н. Не маючи на увазі який-небудь конкретний механізм дії, автори даного винаходу лише відзначають, що вибір молекул відповідно до винаходу з альтернативними алотипами дозволяє одержати варіанти, що, після їхнього перетворення в терапевтичні діатіла, будуть клінічно більш ефективними в пацієнтів, гомозиготних по вказаному алотипу.
Аналіз на зв'язування з Есук був розроблений для визначення рівня зв'язування молекул відповідно до винаходу з ЕсуК і, зокрема, для визначення рівня зв'язування Ес-доменів з ЕсуВ.
Цей аналіз дозволяє детектувати і кількісно визначити взаємодії Есо-Есук, незважаючи на природну низьку афінність рецептора відносно його ліганду, наприклад, у мікромолярному інтервалі для ЕсСукІІВ і ЕсукІША. Цей метод докладно описаний у міжнародній заявці
М/О04/063351 і в публікаціях заявок на патенти США 2005/0037000 і 2005/0064514, кожна з який у всій своїй повноті вводиться в даний опис за допомогою посилання. Коротко, цей метод включає одержання ЕсуВ-комплексу, що може бути використаний у будь-якому стандартному імуноаналізі, відомому фахівцям, наприклад, у ЕАС5З-аналізі, у ЕГІЗА-аналізі, в аналізі методом поверхневого плазмонного резонансу і т. п. Крім того, ЕсуВ-комплекс має підвищену авідність до Ес-ділянки в порівнянні з некомплексним ЕсуВ. Відповідно до даного винаходу переважним молекулярним комплексом є тетрамерний імунний комплекс, що включає: (а) розчинну ділянку
Есук (наприклад, розчинну ділянку БЕсСуКПША, ЕсукИА або РсуКІІВ); (Б) біотинільовану послідовність АМІТАСЄ, що складається з 15 амінокислот (АМІТАС), функціонально приєднану до
С-кінця розчинної ділянки Есук (наприклад, розчинної ділянки ЕСУКША, ЕсСукІА або ЕсуКІЇ!В); і (с) стрептавідин-фікоеритрин (ЗА-РЕ) у молярному відношенні, що підходить для утворення тетрамерного ЕсуВ-комплексу (переважно, у молярному відношенні 5:1). Злитий білок був ферментативно біотинільований з використанням, наприклад, ферменту Віг А Е. сої, тобто бо біотин-лігази, яка специфічно біотинілює лізиновий залишок у послідовності АМІТАЄ з 15 амінокислот. Потім біотинільовані розчинні білки Есуюк змішують з ЗА-РЕ у молярному відношенні їхЗА-РЕ:5х біотинільований розчинний Есук з одержанням тетрамерного Есув- комплексу.
Було показано, що поліпептиди, які містять Ес-ділянки, зв'язуються з тетрамерними Есув- комплексами з афінністю зв'язування, що щонайменше в 8 разів перевищує афінність зв'язування з мономерним некомплексним Есук. Зв'язування поліпептидів, що містять Ес- ділянки, з тетрамерними ЕсуВ-комплексами може бути визначено відомими стандартними методами, такими як, наприклад, клітинний сортинг з активацією флуоресценції (БАС5), радіоїмуноаналізи, ЕІ ІЗА-аналіз і т. п.
Даний винахід охоплює застосування імунних комплексів, що містять молекули відповідно до винаходу й отриманих описаними вище способами, з метою визначення функціональних властивостей молекул, що містять Ес-ділянку, у клітинних або в неклітинних аналізах.
Для зручності реагенти можуть поставлятися в аналітичному наборі, тобто в упаковці, що містить комбінацію реагентів для аналізу на здатність молекул, що містять Ес-ділянки, зв'язуватися з тетрамерними ЕсуНВ-комплексами. Інші форми молекулярних комплексів, застосовуваних для визначення взаємодій Ес-Есук, також можуть бути використані в способах відповідно до винаходу, наприклад, такими формами є злиті білки, отримані, як описано в попередній заявці на патент США 60/439709, поданій 13 січня 2003 р., що у всій своїй повноті вводиться в даний опис за допомогою посилання. 5.3.2. Функціональні аналізи молекул з варіантами важких ланцюгів
Даний винахід охоплює характеризацію молекул відповідно до винаходу, які містять множину епітоп-зв'язувальних доменів, і необов'язково, Есо-доменів (або їхніх частин) за допомогою відомих аналізів по ідентифікації молекул, що мають функції ефекторних клітин.
Зокрема, даний винахід охоплює характеризацію молекул відповідно до винаходу на Есув- опосередковувану функцію ефекторних клітин. Крім того, якщо щонайменше один з антигенів- мішеней для молекул діатіла відповідно до винаходу являє собою ЕсукК, то зв'язування Есук з молекулою діатіла може активувати ЕсупВК-опосередковувані шляхи, аналогічні шляхам зв'язування ЕсуВ-Бс. Таким чином, якщо щонайменше один епітоп-зв'язувальний домен молекули діатіла розпізнає ЕсуК, то молекула діатіла може мати ЕсуВ-опосередковувану
Зо функцію ефекторних клітин, що не містять Ес-домену (або його частини), або в яких не відбувається наступного зв'язування Ес-ЕсукК. Прикладами функцій ефекторних клітин, що можуть бути проаналізовані відповідно до даного винаходу, є, але не обмежуються ними, антитіло-залежна клітинно-опосередковувана цитотоксичність, фагоцитоз, опсонізація, опсонофагоцитоз, зв'язування 3 С14 ії комплемент-комплемент-залежна клітинно- опосередковувана цитотоксичність. Можуть бути проведені будь-які відомі клітинні або неклітинні аналізи на визначення функціональної активності ефекторних клітин (опис аналізів ефекторних клітин можна знайти в публікаціях Региб5іа еї аіІ. (2000) "Аззау5з Бог Апіїроду-
Ререпаєпі СеїІ-Медіаїеа Суююхісйу (АОСС) Апй Немегзе АОСС (Ведігесієй Суіоюхісйу) п
Нитап Маїшга! Кіег СеїІє" МеїШтоад» Мої. Віої!. 121:179-92; Ваддіоїїпі еї а. (1988) "СейїЙшаг Моаде!5
Еог Тне Оеєїесіюп Апа ЕмаЇнайоп ОГ Ого Тнаї Модиіаїє Нитап РНнадосуїє Асіїмну" Ехрегтієпійа, 44(10):841-848; І ептапп вї а!. (2000) "Рнадосуїюзів: Меазигетепі Ву Ріо Суютеїйу" У. Іттипої.
Меїподв, 243(1-2):229-42; Вгомп (1994) "Юї Міо Авзаув ОЇ РІадосуїйс ЕРипсіоп Ої Нитап
Регірпега! Віоой І еикосуїез: Несеріог Моашіайоп Апа Зідпа! Тгтапзаисіюп" Мейоз Сеї! Віої, 45:147-64; Мипп єї аї. (1990) "Рнадосуювзів ОЇ Титог Се Ву Нитап Мопосуїез Сипигей Іп
Весотрбіпапі Масгорнаде Соіопу-5іітшиайпд Расіог" 9). Ехр. Мей., 172:231-237, Арац-Маїйа еї аї. (2002) "Ес Весеріогв5 Аге Сійса! Бог Ашоіїттипе ІпПйаттаїгйюгу Оатаде То Те Сепіга! Мегу/оив
Зувівт Іп Ехрегітепіа! Ашоїттипе Епсернаіотуєїйів" Зсапа. У. Іттипої. 55:70-81; Оіпд еї аї. (1998) "Тмо Нитап Т Сеї! Несеріогї:в Віпа Іп А бітіїаг Оіадопа! Моде То Те НІ А-Аг/Тах Реріїде
Сотріех Овіпа Оїйегепі ТОВ Атіпо Асіав" Іттипйу 8:403-411, кожна з який у всій своїй повноті вводиться в даний опис за допомогою посилання).
В одному з варіантів винаходу молекули відповідно до винаходу можуть бути проаналізовані на ЕсуВ-опосередкований фагоцитоз у людських моноцитах. Альтернативно, ЕсувВ- опосередкований фагоцитоз молекул відповідно до винаходу може бути проаналізований в інших фагоцитах, наприклад, у нейтрофілах (поліморфонуклеарних лейкоцитах; РММ); У людських моноцитах периферичній крові й у макрофагах, які походять від моноцитів, що можуть бути отримані стандартними методами, відомими фахівцям (наприклад, див. Вгом/п (1994) "Іп
Міо Авззауз ОЇ РНадосуїїс Рипсіп ОЇ Нитап Регірнега! Віоса І ейКосуїев: Несеріог Моадшіайоп
Апа 5ідпа! Ттапзаисіюп" Меїнодз Сеї! Віо!., 45:147-164). В одному з варіантів винаходу функцію молекул відповідно до винаходу характеризують шляхом оцінки здатності клітин ТНР-1 до бо фагоцитозу мічених флуоресцеїном ІдсС-опсонізованих овечих еритроцитів (5КВС) раніше описаними методами (Тгідападарапі еї аї. (2000) "Тпе Адарієг Ргоївіп ГАТ Еппапсе5 Есдатта
Весеріюг-Меадіаїєйд 5ідпа! Тгапзаисійп Іп Муєїоїа СеїІв" У. Віої. Снет. 275:20480-20487).
Іншим репрезентативним аналізом на визначення фагоцитозу молекул відповідно до винаходу є аналіз на антитіло-залежний опсонофагоцитоз (АЮСР), який може включати: покриття біочастинки-мішені, такий як ФІТЦ-мічена ЕзспПегіспіа соїї (МоІесшаг Ргорез) або ФІТЦ- мічена бактерія Зіарпуіососси5 ашгецв, (ї) антитілом 4-4-20 дикого типу, тобто антитілом проти флуоресцеїну (див. публікацію Вейа7ук еї аІ. (1989) "Сотрагігоп ОЇ Магіаріє Кедіоп Ргітагу зЗігисіигев Мйпіп Ап Апії-Ріпогезсеїп Ідіоїтуре Ратійу" У. Віої. Спет, 264(3):1565-1569, що у всій своїй повноті вводиться в даний опис за допомогою посилання), використовуваним як контрольне антитіло для аналізу на Есук-залежний АОСР; або (ії) антитілом 4-4-20, що має мутацію Ю265А, яка приводить до запобігання зв'язування з ЕсуКІ, і використовуваним як фонове контрольне антитіло для аналізу на ЕсуВ-залежний АОСР; (ії) діатілом, яке містить епітоп-зв'язувальний домен антитіла 4-4-20 і Ес-домен і/або епітоп-зв'язувальний домен, специфічний до ЕсуРІІЇ; і утворення опсонізованої частинки; додавання будь-якої з описаних опсонізованих частинок (і-іїї) до ефекторних клітин ТНР-1 (моноцитарної клітинної лінії, що поставляється з АТСС) у відношенні 1:21, 10:1, 30:1, 60:1, 75:1 або 100:1, що приводить до Есув- опосередковуваного фагоцитозу; переважно інкубування клітин з Е. соїЇ-ФІТЦ/антитілом при 372С протягом 1,5 години; додавання трипанового синього після інкубування (переважно протягом 2-3 хвилин при кімнатній температурі) до клітин для гасіння флуоресценції бактерій, які прилипали до зовнішньої клітинної поверхні, але не інтерналізувались у клітини; перенесення клітин у ГАС5-буфер (наприклад, 0,1 95 ВЗА у РВ5, 0,1 95 азид натрію) і аналіз інтенсивності флуоресценції клітин ТНРІ1 з використанням ЕАСЗ (наприклад, ВО ЕАСЗ Саїїриг).
Переважно, клітини ТНР-1, використовувані в цьому аналізі, аналізують за допомогою ЕАС5 на експресію Есук на клітинній поверхні. Клітини ТНР-1 експресують СОЗ3З2А і СО64. СО64 являє собою високоафінний Есук, який був блокований, на що вказував аналіз на АОСР, проведений способами відповідно до винаходу. Клітини ТНР-1 переважно блокують 100 мкг/мл розчинного 9091 або 10 95 людською сироваткою. Для аналізу рівня АОСР, на клітини ТНР-1 переважно подають сигнал збудження і вимірюють середню інтенсивність флуоресценції. Потім обчислювали АЮСР-активність окремих мутантів, і отримані дані виражають як величину,
Зо нормалізовану по величині, отриманій для спМар 4-4-20 дикого типу. Опсонізовані частинки додають до клітин ТНР-1 так, щоб відношення опсонізованих частинок до клітин ТНР-Ї1 складало 30:1 або 60:1. У найбільш переважних варіантах винаходу аналіз на АОСР проводять з використанням контролю, такого як Е. соїї-ФІТЦ у середовищі, Е. соїї-ФІТЦ ії клітин ТНР-1 (для аналізу на ЕсуВ-незалежну АЮСрР-активність), Е. соїЇ-ФІТЦ, клітини ТНР-1 їі антитіло 4-4-20 дикого типу (для аналізу на ЕсуВ-залежну АЮСрР-активність), Е. соїЇ-ФІТЦ, клітини. ТНР-1 і антитіло 4-4-20 0265А (як фоновий контроль для аналізу на ЕсуВ-залежну АЮСР-активність).
В іншому варіанті винаходу молекули відповідно до винаходу можуть бути проаналізовані на
ЕсуВ-опосередковану АЮОСС-активність у ефекторних клітинах, наприклад, у природних клітинах-кілерах, із застосуванням будь-якого стандартного методу, відомого фахівцям (див., наприклад, Региб5зіа еї аі). (2000) "Аззауб5 Рог Апіроду-ЮОеєрепаєпі СеїІ-Медіаїєй Суююхісйу (АОСС) Апа Немегзе АОСС(Недігесієд Суфоїюохісйу) п Нитап Маїшга! КіПТег Сеїїв" Меїйодв Мої.
Віо!І. 121:179-92; Меп еї а!. (2003) "Тмо Іттиподіориїйп с Егадтепі С Весеріог Роїутогрпізт5
Іпдерепаепіу Ргедісї Везропзе То Вйихітаб Іп Раїепів М/йЙйп Роїїїсшаг Гутрпота" У. Сіїп. Опсої. 21:3940-3947; Ріпд еї аї. (1998) "ГТмо Нитап Т СеїЇ Весерюгз Віпа Іп А бітіїаг Оіадопа! Моде То
Тпе НІГА-Аг2/Тах Реріїде Сотріех Овіпд ОШетепі ТОВ Атіпо Асідв" Іттипійу 8:403-411).
Репрезентативний аналіз на визначення АЮСсС-активності молекул відповідно до винаходу являє собою аналіз на вивільнення г'Ст, що включає: мічення клітин-мішеней молекулою
Г'ЄСпМа»Сто» (ця молекула, що проходить через клітинну мембрану, звичайно використовується для мічення, оскільки вона зв'язується з цитоплазматичними білками і, незважаючи на її спонтанне вивільнення з клітин з низькою кінетикою, вона усе-таки вивільняється в значній кількості після некрозу клітин-мішеней); опсонізацію клітин-мішеней молекулами відповідно до винаходу, що містять варіанти важких ланцюгів; об'єднання опсонізованих радіоактивно мічених клітин-мішеней з ефекторними клітинами в мікротитраційному планшеті у відповідному відношенні клітин-мішеней до ефекторних клітин; інкубування суміші клітин протягом 16-18 годин при 372С; збір супернатантів і аналіз радіоактивності. Потім цитотоксичність молекул відповідно до винаходу може бути визначена, наприклад, по наступній формулі: Фо лізису-(експеримент, число імпульсів на хвилину (імп./хв.) - вивільнення мішені (імп./хв.)/(лізис детергенту (імп./хв.) - вивільнення мішені (імп./хв.))х100 90. Альтернативно, 95 лізису-«(АЮСС-
АІСС)/максимальне вивільнення - спонтанне вивільнення). Специфічний лізис може бути бо визначений по наступній формулі: специфічний лізис - 9о лізису під дією молекул відповідно до винаходу - 9о лізису під час відсутності молекул відповідно до винаходу. Графік може бути побудований шляхом варіювання відношення "мішень-клітина-мішень:ефекторна клітина" або концентрації антитіл.
Переважно, ефекторними клітинами, використовуваними в аналізах на АОСС відповідно до винаходу, є мононуклеарні клітини периферичної крові (МКПК), що переважно виділяють з нормальної людської крові відомими стандартними методами, наприклад, шляхом центрифугування в градієнті щільності фікола-пака. Переважні ефекторні клітини, використовувані в способах відповідно до винаходу, експресують різні активуючі Есув- рецептори. Даний винахід охоплює ефекторні клітини, ТНР-1, експресуючі Есук, ЕсукКПА і
ЕСУМІІВ, і первинні макрофаги, які походять від моноцитів, виділені з людської цільної крові, і експресуючі ЕсукКША і ЕсуРІІВ, де вказані клітини були використані для того, щоб визначити, чи можуть мутанти важкого ланцюга антитіл підвищувати АОСС -активність і фагоцитоз у порівнянні з антитілами ІДС1 дикого типу.
Людська моноцитарна клітинна лінія ТНР-1 активує фагоцитоз за допомогою експресії високоафіного рецептора Есукі і низькоафіного рецептора ЕсуКПА (Ріеї еї аїЇ. (1991) "Те
Нитап Мопосуїе-І іке СеїЇ Гіпе ТНР-1 Ехргеззе5 Ес Сатта ВІ Апа Ес Сатта ВІ!" у. І е!икК. Віої. 49:556-565). Клітини ТНР-1 не експресують конститутивно ЕсукІПА або ЕсуКІІВ. Стимуляція цих клітин цитокінами негативно впливає на характер експресії Ес (Ргісор еї аї. (2001) "Ошегепіаї!
Моашіаїйоп ОЇ Біітиіаюгу Апа Іппірйогу Ес Сатта Несеріої5 Оп Нитап Мопосуїе5 Ву ТІ Апа
Тн2 СуюкКіпев" У. ої Іттипої., 166:531-537). Ріст клітин ТНР-1 у присутності цитокіну 1/4 індукує експресію ЕСУКІІВ і приводить до зниження рівня експресії ЕСУКІІА і ЕсукКіІ. Експресія ЕсуУВІІВ може бути також посилена при підвищеній клітинній щільності (Тгічапаарапі еї аї. (2002) "Ведшіаїєа Ехргезвіоп Апа Іппірйогу Рипсіоп ОЇ Есєдатта ВОВ Іп Нитап Мопосуїїс СеїЇв" У. Віої.
Спет., 277(7):5082-5089). На противагу цьому, повідомлялося, що ІЄМу може індукувати експресію ЕсукПША (Реагзе еї аї. (1993) "ІпФЇептегоп бЗатта-Іпдисей Тгапзсегпріоп ОЇ Те Нідн-
АнНіппу Ес Весеріог Рог Ід Недшігез Аззетбріу ОЇ А Сотрієх Тнаї Іпсіцде5 Тпе 91-кДа Зибипії ОЇ
Тгкапветіріоп Расюг ІЗИЕЗ" Ргос. Маї. Асад. сі. ОБА 90:4314-4318). Присутність або відсутність рецепторів на клітинній поверхні може бути визначена за допомогою ЕАС5 загальновідомими методами. Індукована цитокіном експресія Есуюк на клітинній поверхні забезпечує систему
Зо тестування активації і інгібування в присутності ЕСуКІВ. Якщо клітини ТНР-1 не здатні експресувати ЕсСуКІіІВ, то даний винахід також охоплює іншу людську моноцитарну клітинну лінію ШеОЗ37. Було показано, що ці клітини знаходяться в термінальній стадії диференціювання в макрофагах у присутності ІЕМуУ ії ТМЕ (Когеп еї аї. (1979) "п Міго Асіїмайоп ОЇ А Нитап
Масгорнаде-Г іКе Сеї| І іпе" Майте 279:328-331).
ЕсуВ-залежний цитоліз клітин-мішеней опосередковується макрофагами і МК-клітинами в мишей з моделлю пухлини (Сіупез еї аї. (1998) "с Кесеріог5 Аге Кедиігей Іп Раззіме Апа Асіїме
Іттийу То Меїапота" Рос. Маї. Асад. осі ОБА 95:652-656). Даний винахід охоплює застосування виснажених моноцитів, узятих у донорів, як ефекторних клітин для аналізу на ефективність Ес-мутантів відносно стимуляції цитотоксичності клітин-мішеней в аналізах на фагоцитоз і АОСС. На характер експресії ЕсукКІ, ЕсукІПША ії ЕсукіІІВ впливають різні умови культивування. Експресія Есук із заморожених виснажених моноцитів, зі свіжих виснажених моноцитів, з моноцитів, що містяться в 10 95 ЕВ5, і моноцитів, культивованих у ЕВ5-ОМ-С5Е і/або в людській сироватці, може бути визначена загальновідомими методами. Так, наприклад, клітини можуть бути забарвлені в ЕсуВ-специфічними антитілами і проаналізовані за допомогою
ЕАСб5-аналізу для визначення ЕсК-профілів. У способах відповідно до винаходу були використані умови, що найбільш точно імітують експресію ЕсукК у макрофагах іп мімо.
У деяких своїх варіантах даний винахід охоплює використання мишачих клітин, особливо в тих випадках, коли неможливо одержати людські клітини з "правильними" профілями експресії
ЕсукК. У деяких своїх варіантах даний винахід охоплює клітинну лінію мишачих макрофагів
КАМУУ264.7(АТСС), яка може бути трансфікована людським ЕсукІША, після чого стабільні трансфектанти виділяють відомими методами, див., наприклад, Каїр еї аї. (1977) "Апііроаду-
Оерепаєпі Кіїййпоа ОЇ Егуїгосуїе Апа Титог Тагдеєїв Ву Масгорпаде-Неїаїєй СеїЇ Ііпев:
Еппапсетепі Ву РРО Апа І РБ" у). Іттипої. 119:950-4. Трансфектанти можуть бути кількісно оцінені на експресію ЕсукІША за допомогою БАСб5-аналізу за допомогою рутинного експериментування, і клітини з високим рівнем експресії можуть бути використані в аналізах
АОСС відповідно до винаходу. В інших своїх варіантах даний винахід охоплює виділення перитонеальних макрофагів селезінки, експресуючих людський ЕсукК у дефіцитних трансгенних мишей, описаних у даній заявці.
Лімфоцити можуть бути зібрані з периферичної крові донорів (РВМ) у градієнті фікола-пака бо (Ріагтасіа). У виділених клітинах популяції мононуклеарних клітин, у більшості випадків, ЛОСС-
активність забезпечується природними клітинами-кілерами (МК), що містять ЕсукПША, але не
ЕСУКІІВ, на своїй поверхні. Результати, отримані з використанням цих клітин, указували на ефективність мутантів відносно запуску ЛОСС МК-клітинами і дозволяють вибрати реагенти для проведення тестів з використанням виснажених моноцитів.
Клітинами-мішенями, використовуваними в аналізах на АОСС відповідно до винаходу, є, але не обмежуються ними, клітинні лінії раку молочної залози, наприклад, 5К-ВНА-3 з реєстраційним номером АТОС НТВ-30 (див., наприклад, Тгетр еї аї. (1976) "Нитап Вгеаві
Сапсег Іп Сийте" Весепі Везий5 Сапсег Вев5. 33-41); В-лімфоцити; клітини, які походять від лімфоми Беркітта, наприклад, клітини Каїї з реєстраційним номером ССІ -86 (див., наприклад,
Ерзівіп еї аї. (1965) "Спагасієгівіісв Апа Моде ОЇ Стоуйй ОЇ Тізвиє Сийите бігаіп (ЕВІ1) ОЇ Нитап
Гутрпобіавзії Ргот Витпкійше5 І утрпота" У. Майї. Сапсег Іпві. 34:231-240), і клітини Дауди з реєстраційним номером АТСС СС -213 (див., наприклад, Ківїп еї аї. (1968) "Биптасе ІЧМ-Карра зЗресіїйсну Оп А Вижкій Гутрпота Сеї! Іп Мімо Апа Іп Оєгімей Сипиге Гіпе5" Сапсег Вез. 28:1300- 1310). Ці клітини-мішені повинні розпізнаватися антигензв'язувальним сайтом аналізованої молекули діатіла.
Аналіз на АОСС оснований на здатності МК-клітин опосередковувати клітинну загибель по апоптотичному шляху. МК-клітини опосередковують клітинну загибель частково завдяки розпізнаванню ЕСсуКША Ес-доменом да, зв'язаним з антигеном на клітинній поверхні. Аналізи на АОСС, проведені способами відповідно до винаходу, можуть являти собою аналізи з використанням радіоактивних речовин або з використанням флуоресценції. Аналіз на АЮСС, здійснюваний для характеризації молекул відповідно до винаходу, що містять варіанти Ес- ділянок, включає мічення клітин-мішеней, наприклад, 5К-ВН8-3, МСЕ-7, ОМСАКЗ, Каїї, клітин
Дауді, опсонізуючих клітин-мішеней антитілом, що дозволяє розпізнавати рецептор клітинної поверхні на клітині-мішені за допомогою антигензв'язувального сайта цього антитіла; об'єднання мічених опсонізованих клітин-мішеней і ефекторних клітин у відповідному співвідношенні, що може бути визначене шляхом рутинного експериментування; збір клітин і детектування мітки в супернатанті лізованих клітин-мішеней по відповідній схемі детектування, яка проводиться по використовуваній мітці. Клітини-мішені можуть бути позначені радіоактивною міткою або флуоресцентною міткою стандартними методами, відомими
Ко) фахівцям. Так, наприклад, такими мітками є, але не обмежуються ними, Г'СпМагсСгох; і ацетоксиметиловий ефір ліганду, що підсилює флуоресценцію, 2,2762"-терпіридин-6-6"- дикарбоксилат (ТОА).
У конкретному переважному варіанті винаходу, флуориметричний аналіз з часовим розділенням використовується для визначення АЮСС -активності, спрямованої проти клітин- мішеней, які були позначені ацетоксиметиловим ефіром ліганду, що підсилює флуоресценцію, 2,2:6,2"-терпіридин-6-6"-дикарбоксилатом (ТВА). Такі флуориметричні аналізи відомі фахівцям, див., наприклад, публікацію Віотбего еї аї. (1996) "Тіте-Везоїмед Ріпоготеїйнс Аззау Еог Маїчшгаї
КіШег Асіїмйу Овіпд Тагдеї Сеїїє Іарейеа МУййп А Ріногезсепсе Еппапсіпуд Гідапа" дошттаї ої
Ітітипоїодіса! Меїподз, 193:199-206, що у всій своїй повноті вводиться в даний опис за допомогою посилання. Коротко, клітини-мішені мітять мембранопроникним ацетоксиметиловим ефіром ТВА біс(ацетоксиметил)2,2":6',2"-терпіридин-6-6"-дикарбоксилатом (ВАТРА), що швидко дифундує через клітинну мембрану життєздатних клітин. Внутрішньоклітинні естерази розщеплюють складноефірні групи, у результаті чого регенерована мембранонепроникна молекула ТОА захоплюється усередину клітини. Після інкубування ефекторних клітин і клітин- мішеней, наприклад, щонайменше протягом періоду часу від двох годин до 3,5 години при 372 в 595 СО», ТОА, що вивільняється з лізованих клітин-мішеней, піддають реакції утворення хелатного комплексу з ЕиЗ--, після чого флуоресценцію утворених хелатних комплексів европій-
ТА кількісно оцінюють на флуориметрі з часовим розділенням (наприклад, Місіог 1420, Регкіп
ЕітеМаїасе).
В іншому конкретному варіанті винаходу аналіз на АОСС, проведений для характеризації молекул відповідно до винаходу, які містять множину епітоп-зв'язувальних сайтів і, необов'язково, Ес-домен (або його частина), включає наступні стадії: переважно 4-5х105 клітин- мішеней (наприклад, 5К-ВА8-3, МСЕ-7, ОМСАКЗ, клітин Каїї) мітять біса(ацетоксиметил)2,27:6,27- терпіридин-6-6"-дикарбоксилатом (реагентом ВАТОА ОБЇРІА, РегКкіп ЕІтег///аПйас). Для досягнення оптимальної ефективності мічення, число клітин-мішеней, використовуваних в аналізі на АОСС переважно не повинно перевищувати 5х105. Реагент ВАТОА додають до клітин, і суміш інкубують при 37 "С переважно в 595 СО», щонайменше протягом 30 хвилин.
Потім клітини промивають фізіологічним буфером, наприклад, РВ5 з 0,125 мМ сульфінпіразолу і середовищем, що містить 0,125 мМ сульфінпіразолу. Після цього мічені клітини-мішені бо опсонізують (покривають) молекулою відповідно до винаходу, що містить епітоп-зв'язувальний домен, специфічний до ЕсуКІІА і, необов'язково Ес-домен (або його частину). У переважних варіантах винаходу молекула, використовувана в аналізі на АОСС, також є специфічною до рецептора клітинної поверхні, до пухлинного антигену або до ракового антигену. Молекула діатіла відповідно до винаходу може специфічно зв'язуватися з будь-яким раковим або пухлинним антигеном, таким як антигени, перераховані в розділі 5.6.1. В аналізі на АОСС клітини-мішені відбирають по епітоп-зв'язувальних сайтах, введених у діатіло відповідно до винаходу, а саме, такі клітини-мішені, у яких рецептор, який присутній на їхній клітинній поверхні, специфічно зв'язується з вказаним діатілом.
Клітини-мішені додають до ефекторних клітин, наприклад, до МКПК, так, щоб відношення ефектор:мішень приблизно складало 1:1, 10:1, 30:11, 50:1, 75:11 або 100:1. Ефекторні клітини і клітини-мішені інкубують щонайменше протягом періоду часу від двох годин до 3,5 години при 37"Сб в 595 СО». Клітинні супернатанти збирають і додають у кислотний розчин европію (наприклад, у розчин европію ОЕГ РА, РегКкіп ЕІтег//лавІМас). Флуоресценцію утворених хелатних комплексів "европій-ТОА" кількісно оцінюють на флуориметрі з часовим розділенням (наприклад, Місіог 1420, Регкіп ЕІтег///аПасе). Максимальне вивільнення (МК) і спонтанне вивільнення (ЗК) визначають шляхом інкубування клітин-мішеней з 195 ТХ-100 і тільки із середовищем, відповідно. Антитіло-незалежну клітинну цитотоксичність (АІСС) визначають шляхом інкубування клітин-мішеней і ефекторних клітин під час відсутності тест-молекули, наприклад, діатіла відповідно до винаходу. Кожен аналіз переважно здійснюють із трьома повторностями. Середній відсоток специфічного лізису обчислюють по формулі:
Експериментальне вивільнення (АОСС)-АІССІМА-5К)х100.
Даний винахід охоплює аналізи, відомі фахівцям і описані в даній заявці, де вказані аналізи здійснюють з метою характеризації зв'язування С1д і опосередкування комплемент-залежної цитотоксичності (СОС) молекулами відповідно до винаходу, що містять Ес-домени (або їхні частини). Для визначення рівня зв'язування з Сід може бути проведений ЕЇ ІЗА-аналіз на зв'язування з С1д. Репрезентативний аналіз може включати покриття аналітичних планшетів протягом ночі при 42С поліпептидом, що містить молекулу відповідно до винаходу, або вихідним поліпептидом (контролем) у буфері для нанесення покрить. Потім планшети можуть бути промиті і блоковані. Після промивання аліквота людського С14 може бути додана в кожну ямку з
Зо наступним інкубуванням протягом 2 годин при кімнатній температурі. Після додаткового промивання в кожну ямку може бути додано 100 мкл кон'югованого з пероксидазою овечого антитіла проти комплементу С14 з наступним інкубуванням протягом 1 години при кімнатній температурі. Потім планшет знову може бути промитий промивним буфером, і в кожну ямку може бути доданий 100 мкл буфери для субстрату, що містить ОРО (дигідрохлорид о- фенілендіаміну (Зідта)). Реакція окислювання, що спостерігається по появі жовтого забарвлення, може проходити протягом 30 хвилин, а потім вона може бути припинена додаванням 100 мкл 4,5 н. НезО5. Оптична густина може бути обрахована при 492-405 нм.
Для оцінки активації комплементу може бути здійснений аналіз на комплемент-залежну цитотоксичність (СОС), наприклад, як описано в публікації Сза77апо-Запіого еї аї. (1997) "А Моп-
Вадіоасіїме Сотрієтепі-Оерепадепі Суюїохіспу Авззау Рог Апіі-СО20 Мопосіопа! Апіїроау" 9.
Ітітипої. Меїйпоаз 202:163-171, що у всій своїй повноті вводиться в даний опис за допомогою посилання. Коротко, різні концентрації молекули, яка містить Ес-домен (варіант) (або його частину) і людський комплемент, можуть бути розведені буфером. Клітини, експресуючі антиген, з яким зв'язується молекула діатіла, можуть бути розведені до щільності приблизно 1х105 клітин/мл. Суміші молекул діатіла, що містять Ес-домен (варіант) (або його частину), розведеного людського комплементу і клітин, експресуючих антиген, можуть бути додані в плоскодонний 9б-ямковий планшет для культивування тканини, що потім залишають на 2 години при 37С і 595 СО» для інкубування з метою полегшення лізису клітин, опосередковуваного комплементом. Потім у кожну ямку може бути додано 50 мкл аламарового синього (Асситей Іпіегпайопаї) з наступним інкубуванням протягом ночі при 37 "С. Оптичну густину вимірюють на 9б-ямковому флуориметрі при збудженні при довжині хвилі 530 нм і випромінюванні при довжині хвилі 590 нм. Результати можуть бути виражені у відносних одиницях флуоресценції (КЕШ). Концентрації зразків можуть бути обчислені по стандартній кривій шляхом порівняння активності (відсотків) варіанта, що представляє інтерес, з активністю немодифікованої молекули, тобто молекули, що не містить Ес-домену або містить немодифікований Ес-домен. 5.3.3. Інші аналізи
Молекули відповідно до винаходу, що містять множину епітоп-зв'язувальних доменів і необов'язково Ес-домен, можуть бути проаналізовані за допомогою будь-якого відомого аналізу, 60 проведеного методом поверхневого плазмонного резонансу для характеризації кінетичних параметрів антигензв'язувального домену або зв'язування Бс-ЕсукК. Таким комерційно доступним обладнанням, яке може бути використане в даному винаході для проведення ППР- аналіза, є, але не обмежується ними, обладнання для ВіАсоге АВ, що поставляється Віасоге АВ (Оррзаїа, Зул"едеп); обладнання для ІАбзух, що поставляється Айіпйу Зепзог5 (ЕгапкКіїп, МА.); система ІВІ5, що поставляється УмМіпазог Зсіепійіс І ітйеа (Вегк5, ОК), системи ЗРК-СЕШ ІА, що поставляються Мірроп ІГазег і ЕІесігопіс5 ар (НоККаїдо, дарап), і детектор для ППР (ЗРК)
Оеїесіог Зргеєеїа, що поставляється Техаз Іпзігитепів (Обайах, ТХ). Опис ППР-технології можна знайти в публікаціях Мийек еї аі. (2000) "Бипасе Ріазтоп Кезопапсе-Вазед Іттипоаззаув"
Меїнодз 22:77-91; опа еї а!. (2002) "Боте пем/ азресів іп Біозепзогв" Немівмв іп Мої. Віоїесн. 82:303-23; БРімазий еї аї. (1998) "ВіІАсогте Рог Масготоїесшіаг Іпіегасіоп" Ситепі Оріпіоп іп
Віотесппоїоду 9:97-101; Вісн еї аї. (2000) "Адмапсе5 Іп З!ипасе Ріазтоп Незопапсе Віозепзог
Апаїузів" Ситепі Оріпіоп іп ВіотесппоІоду 11:54-61; кожна з який у всій своїй повноті вводиться в даний опис за допомогою посилання. Крім того, у способах відповідно до винаходу розглядається будь-яке обладнання для ППР і будь-які методи ППР для оцінки білок-білкових взаємодій, описані в патентах США МоМо 6373577; 6289286; 5322798; 5341215; 6268125, що у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання.
Коротко, ППР-аналізи включають іммобілізацію члена зв'язувальної пари на поверхні і моніторинг їхньої взаємодії з іншим членом зв'язувальної пари в розчині в реальному часі. ППР- аналіз оснований на вимірюванні зміни коефіцієнта переломлення розчинника, що знаходиться біля поверхні, що формується після утворення або дисоціації комплексу. Поверхня, на якій відбувається іммобілізація, являє собою сенсорний чип, що є головним атрибутом ППР- технології, і цей чип складається зі скляної поверхні, покритої тонким шаром золота, і є основою для ряду поверхонь, спеціально сконструйованих для оптимізації зв'язування молекули з поверхнею. У продажу є ряд сенсорних чипів, які спеціально поставляються компаніями, перерахованими вище, і всі ці чипи можуть бути використані в способах відповідно до винаходу.
Прикладами сенсорних чипів є чипи, що поставляються компаніями ВіАсоге АВ, Іпс., наприклад, сенсорні чипи СМ5, 5А, МТА і НРА. Молекула відповідно до винаходу може бути іммобілізована на поверхні сенсорного чипа будь-якими відомими методами іммобілізації і хімічних методів, включаючи, але не обмежуючись ними, пряме ковалентне зв'язування за допомогою аміногруп,
Зо пряме ковалентне зв'язування за допомогою сульфгідрильних груп, приєднання біотину до покритої авідином поверхні, зв'язування альдегідних груп з вуглеводними групами і приєднання за допомогою гістидинової мітки до чипів МТА.
У деяких варіантах винаходу кінетичні параметри зв'язування молекул відповідно до винаходу, що містять множину епітоп-зв'язувальних сайтів і необов'язково Ес-домен, з антигеном або ЕсукК можуть бути визначені на обладнанні ВіІАсоге (наприклад, на обладнанні
ВІАсоге 1000, ВіІАсоге Іпс., Різсагамжау, МУ). Як обговорюється вище в розділі 5.4.1, для аналізу на зв'язування молекул відповідно до винаходу може бути використаний будь-який ЕсуК, де щонайменше один епітоп-зв'язувальний сайт молекули діатіла імуноспецифічно розпізнає ЕсуВ, і/або де вказана молекула діатіла містить Ес-домен (або його частину). У конкретному варіанті винаходу Есук являє собою ЕсукША, переважно розчинний мономерний ЕсукіІПА. Так, наприклад, в одному з варіантів винаходу розчинний мономерний ЕсукПША являє собою позаклітинну ділянку ЕсСуКкІПША, зв'язану з лінкером-послідовністю АМІТАЄ (див. попередню заявку на патент США Мо 60/439498, подану 9 січня 2003 р., і попередню заявку на патент США
Мо 60/456041, подану 19 березня 2003 р., що у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання). В іншому конкретному варіанті винаходу ЕсукК являє собою ЕсуКІЇІВ, переважно розчинний димерний ЕсСуКІІВ. Так, наприклад, в одному з варіантів винаходу розчинний димерний ЕсукКіІІВ одержують методами, описаними в попередній заявці на патент
США Мо 60/439709, поданої 13 січня 2003 р., що у всій своїй повноті вводиться в даний опис за допомогою посилання.
У всіх імунологічних аналізах розпізнавання Есук/зв'язування з Есук за допомогою молекули відповідно до винаходу може бути здійснене з використанням множини доменів, а саме, у деяких варіантах винаходу молекули відповідно до винаходу імуноспецифічно розпізнають Есук за допомогою одного з множини епітоп-зв'язувальних доменів; в інших варіантах винаходу, у яких молекула відповідно до винаходу містить Ес-домен (або його частину), молекула діатіла може імуноспецифічно розпізнавати Есук за допомогою взаємодій
Ес-Есук; а в інших варіантах винаходу, у яких молекула відповідно до винаходу містить Ес- домен (або його частину) і епітоп-зв'язувальний сайт, що імуноспецифічно розпізнає Есугв, молекула діатіла може розпізнавати Есук за допомогою одного або обох епітоп-зв'язувальних доменів і Ес-доменів (або їх частини). Репрезентативний аналіз для визначення кінетичних бо параметрів зв'язування молекули, що містить множину епітоп-зв'язувальних доменів і необов'язково Ес-домен (або його частину), з антигеном і/або з ЕсуВ на обладнанні ВІіАсоге включає наступну процедуру: перший антиген іммобілізують на одній з чотирьох протокових кювет поверхні сенсорного чипа, переважно з застосуванням хімічного методу зв'язування з аміном так, щоб приблизно 5000 одиниць відгуку (КО) вказаного першого антигену іммобілізувалось на поверхні. Після приготування придатної поверхні, молекули відповідно до винаходу, що імуноспецифічно розпізнають вказаний перший антиген, пропускають по всій поверхні, переважно, шляхом 1-хвилинного упорскування 20 мкг/мл розчину в протокову кювету ємністю 5 мкл/мл. На цій стадії рівні зв'язування молекул відповідно до винаходу з поверхнею звичайно становлять у межах від 400 до 700 КИ. Потім серії розведень другого антигену (наприклад, Есук) або рецептора Есук у буфері НВ5-Р (20 мМ НЕРЕЗ5, 150 мМ Масі, З мм
ЕОТА, рН 7,5) наносять на поверхню шляхом упорскування зі швидкістю 100 мкл/хв.
Регенерацію молекул між розведеннями іншого другого антигену або рецептора здійснюють переважно шляхом разових 5-секундних упорскувань 100 мМ МанНсоз, рн 9,4; ЗМ Масі. У способі відповідно до винаходу розглядається будь-який відомий метод регенерації.
Після збору всіх даних будували результуючі загальні криві зв'язування з використанням комп'ютерних алгоритмів, що поставляються виробниками до обладнання для ППР, наприклад,
ВІАсоге, Іпс. (Ріхсаїамжау, МУ). Ці алгоритми дозволяють обчислювати Коп і Коїх, з яких була виведена удавана константа рівноважного зв'язування Ка, що виражається як відношення двох констант швидкості (тобто, Ков/Коп). Більш докладний опис обчислення окремих констант швидкості можна знайти в довідковому посібнику ВіАемаЇцайп 5оїймаге Напабоок (ВіАсоге, Іпс.,
Різсаїаулау, МУ). Аналіз отриманих даних може бути проведений будь-яким відомим методом.
Опис різних методів інтерпретації отриманих кінетичних даних можна знайти в публікаціях
МузагКа (1997) "Кіпеїїс Апаїувзів ОЇ Мастготоїесиіаг Іпіегасіюп5 Овіпд З!ипасе Ріазтоп Незопапсе
Віозепвогв" Ситепі Оріпіоп іп Віоїєсппоіоду 8:50-7; Рівпег єї а). (1994) "Зупасе Ріазтоп
Везопапсе Вазей Меїйпод5 Рог Меавзигіпд Те Кіпеїїсв Апа Віпаіпуд Айіпйе5 ОЇ Віотоіесшціаг
Іптегасіопе" Ситепі Оріпіоп іп Віоїесппоіоду 5:389-95; О"Зпаппеззу (1994) "Оєвіептіпайоп ОЇ
Кіпеїййс Наїе Апа Едиїйргійт Віпаїпуд Сопвіапів Рог Масготоїесшціаг Іпіегасіопе: А Стйїдце ОЇ Те зЗипасе Ріазтоп Незопапсе І йегайште" Ситепі Оріпіоп іп ВіоїесппоЇоду, 5:65-71; СНаїКеп еї а). (1992) "Апаїувів ОЇ Мастотоїесиіаг Іпіегасіпв Овіпу Іттобрбіїй?еа ГГідапав" Апаїуїїса! Віоспетівігу,
Зо 201:197-210; Мопоп еї аї. (1995) "Іпіегргеїпу Сотрієх Віпаїпу Кіпеїїс5 Егот Оріфса! Віозепзогв: А
Сотрагізоп ОЇ Апаїувзіз Ву І іпеагігайоп, Те Іпієдгаїєд Ваїе Едпаїйоп, Апа Митетгісаї! Іпіедгайоп"
Апа/уїіса! Віоспетівзігу 227:176-85; О'Зпаппезвзу еї аї., 1996, Апаїуїїса! Віоспетівігу 236:275-83; які у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання.
У переважних варіантах винаходу кінетичні параметри, отримані за допомогою ППР-аналіза, наприклад, ВіАсоге, можуть бути використані як прогнозованої оцінки функції молекули відповідно до винаходу у функціональному аналізі, наприклад, в аналізі на АОСС.
Репрезентативний метод прогнозування ефективності молекули відповідно до винаходу виходячи з кінетичних параметрів, отриманих за допомогою ППР-аналіза, може включати: визначення величин Кок для зв'язування молекули відповідно до винаходу з ЕСуУКПА і ЕсуВІЇІВ (за допомогою епітоп-зв'язувальний домену і/або Ес-домену (або його частини); побудова графіка залежності даних (1) Кондикого типу)/Кої (з мутацією) для ЕсукПША; (2) Кок(дикого типу)У/Кок (з мутацією) для ЕсукКіІІВ від даних по АОСС. Значення більше одиниці вказують на зниження швидкості дисоціації для ЕСуУКПША і збільшення швидкості дисоціації для ЕсукіІВ у порівнянні з молекулами дикого типу, і на наявність у них АОСС-функції і на підвищену АОСС- функцію. 5.4. Способи одержання молекул діатіл відповідно до винаходу
Молекули діатіл відповідно до винаходу можуть бути отримані різними добре відомими методами, включаючи синтез білка де помо і рекомбінантну експресію нуклеїнових кислот, що кодують зв'язувальні білки. Потрібні послідовності нуклеїнової кислоти можуть бути отримані рекомбінантними методами (наприклад, шляхом ПЛР-мутагенезу отриманого раніше варіанта потрібного полінуклеотиду) або твердофазним методом синтезу ДНК. При цьому найчастіше застосовуються рекомбінантні методи експресії. В одному зі своїх аспектів даний винахід стосується полінуклеотиду, що містить послідовність, яка кодує МН і/або МІ анти-СО16А антитіла, а в іншому своєму аспекті даний винахід стосується полінуклеотиду, що містить послідовність, яка кодує МН і/або МІ. анти-СО32В антитіла. Через виродженість генетичний код різні послідовності нуклегснової кислоти кодують кожну амінокислотну послідовність імуноглобуліну, і даний винахід включає всі нуклеїнові кислоти, що кодують описані тут зв'язувальні білки. 5.4.1. Полінуклеотиди, які кодують молекули відповідно до винаходу
Даний винахід також включає полінуклеотиди, які кодують молекули відповідно до винаходу, включаючи поліпептиди й антитіла. Можуть бути отримані полінуклеотиди, які кодують молекули відповідно до винаходу, і нуклеотидні послідовності цих полінуклеотидів можуть бути визначені будь-якими відомими методами.
Після визначення нуклеотидної послідовності молекул, ідентифікованих способами відповідно до винаходу, ця нуклеотидна послідовність може бути модифікована відомими методами, наприклад, методами рекомбінантних ДНК, сайт-направленого мутагенезу, ПЛР і т. п. (див., наприклад, методи, описані в посібнику ЗатюогоокК еї аїІ., 2001, МоїІесшіаг Сіопіпд, А
І арогагогу Мапиаї, Зга Еа., Соїд бргіпд Нагбог І абогафгу, Соїд Зргіпд Нагбог, МУ; і в посібнику
А!йзиеї еї аї, єдв., 1998, Степі Ргоюсоїв5 іп МоїІесшціаг Віоіоду, Чопп УПеу 8 5оп5, МУ, що у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання), з метою продукування, наприклад, антитіл, що мають різні амінокислотні послідовності, наприклад, шляхом введення амінокислотних замін, делецій і/або інсерцій.
В одному з варіантів винаходу людські або бібліотеки будь-які інші бібліотеки, відомі фахівцям, можуть бути скриновані відомими стандартними методами для клонування нуклеїнових кислот, що кодують молекули відповідно до винаходу. 5.4.2. Рекомбінантна експресія молекул відповідно до винаходу
Після одержання послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує молекули відповідно до винаходу (тобто, антитіла), може бути отриманий вектор для продукування молекул із застосуванням техніки рекомбінантних ДНК добре відомими методами. Такі добре відомі методи можуть бути застосовані для конструювання експресійних векторів, що містять послідовності, які кодують молекули відповідно до винаходу, і відповідні сигнали регуляції транскрипції і трансляції. Такими методами є, наприклад, техніка рекомбінантних ДНК іп міїго, методи синтезу і методи генетичної рекомбінації іп мімо. (Див., наприклад, методи, описані заток еї аї., 1990, Моїесшаг Сіопіпу, А Іарогаюту Мапиа!ї, 2а Еа., Со Зргіпд Нагтбог
Іарогаїогу, Соїй Зргіпд Нагрог, МУ ї А!йзибеї еї аїЇ. ей5., 1998, Сицтепі РгоїосоЇ5 іп МоїІесшаг
Віоіоду, Чдопп УМіеу б Бопв5, МУ).
Експресійний вектор, що містить нуклеотидну послідовність молекули, ідентифікованої способами відповідно до винаходу, може бути перенесений у клітину-хазяїна стандартними
Зо методами (наприклад, шляхом електропорації, ліпосомної трансфекції і преципітації фосфатом кальцію), а потім трансфіковані клітини можуть бути культивовані стандартними методами з одержанням молекул відповідно до винаходу. У конкретних варіантах винаходу експресія молекул відповідно до винаходу регулюється конститутивним, індуцибельним або тканиноспецифічним промотором.
Клітини-хазяїни, використовувані для експресії молекул, ідентифікованих способами відповідно до винаходу, можуть являти собою бактеріальні клітини, такі як ЕхсПегіспіа сої, або переважно еукаріотичні клітини, зокрема, клітини, що підходять для експресії повнорозмірної рекомбінантної молекули імуноглобуліну. Зокрема, клітини ссавців, такі як клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО), у комбінації з вектором, таким як елемент промотору головного передраннього гена людського цитомегаловіруса, являють собою ефективну систему експресії імуноглобулінів (БоесКіпуд еї аї. (1986) "Рожепциі Апа Мегзацйе ЕпПпапсег-Реотоїєї Опії Гог
Матитаїап Ехргезвіоп Месіогв" Сепе 45:101-106; СоскКей еї аї. (1990) "Нідй І еме! Ехргезвіоп ОЇ
Тівзце Іппірйог ОЇ МеїаїІоргоїєїпазе5 Іп Спіпезе Натзвієг Омагу СеїЇІ5 Овіпа Сішатіпе б5упіпеїазе
Сепе Атріїйісайоп" ВіоїесппоЇоду 8:662-667).
Для експресії молекул, ідентифікованих способами відповідно до винаходу, може бути застосований ряд експресійних векторних систем хазяїнів. Такі експресійні системи хазяїнів являють собою носії за допомогою яких можуть бути продуковані, а потім очищені послідовності, які кодують молекули відповідно до винаходу, а також клітини, що, після їхньої трансформації або трансфекції відповідними нуклеотидними кодуючими послідовностями, можуть експресувати молекули відповідно до винаходу іп 5йи. Такими системами є, але не обмежуються ними, мікроорганізми, такі як бактерії (наприклад, Е. соїї і В. 5иЇбБійів), трансформовані векторами, які експресують рекомбінантну ДНК бактеріофага, плазмідну ДНК або космідну ДНК їі містять послідовності, які кодують молекули, ідентифіковані способами відповідно до винаходу; дріжджі (наприклад, зЗасспаготусе5 ріспіа), трансформовані рекомбінантними дріжджовими експресійними векторами, що містять послідовності, які кодують молекули, ідентифіковані способами відповідно до винаходу; системи клітин комах, інфіковані рекомбінантними вірусними експресійними векторами (наприклад, бакуловірусними векторами), що містять послідовності, які кодують молекули, ідентифіковані способами відповідно до винаходу; системи клітин рослин, інфіковані рекомбінантними вірусними експресійними бо векторами (наприклад, вірусом мозаїки кольорової капусти (Саму) і вірусом мозаїки тютюну
(ТММ) або трансформовані рекомбінантними плазмідними експресійними векторами (наприклад, плазмідою Ті), що містять послідовності, які кодують молекули, ідентифіковані способами відповідно до винаходу; або системи клітин ссавців (наприклад, клітин СО5, СНО,
ВНК, 293, 293Т, З3Т3, лімфатичних клітин (див. патент США 5807715), клітин Рег С.6 (людських клітин сітківки, отриманих СгисеїЇ)), що містять рекомбінантні експресійні конструкції, що включають промотори, які походять від генома клітин ссавців (наприклад, промотор металотіонеїну) або від вірусів ссавців (наприклад, пізнього промотору аденовірусу; промотору 7.5К вірусу коров'ячої віспи).
У бактеріальних системах ряд експресійних векторів може бути переважно вибраний залежно від мети застосування експресованих молекул. Так, наприклад, при продукуванні великої кількості такого білка, необхідного для одержання фармацевтичних композицій антитіла, можуть виявитися бажаними вектори, що регулюють експресію високих рівнів продуктів злитого білка, які легко піддаються очищенню. Такими векторами є, але не обмежуються ними, експресійний вектор рОНг78 (Виїнег еї а). (1983) "Еазу Ідепійісайоп Ої сОМА
Сіопез" ЕМВО 3. 2:1791-1794), у якому антитілокодуюча послідовність може бути окремо лігована у вектор у рамці зчитування кодуючої ділянки Іїас 7 з одержанням злитого білка; вектори ріМ (Іпоцує еї аї. (1985) "Ор-Рготоїег Мшиїайоп5 Іп Те Ірр Сепе ОЇ ЕзсНегісніа Соїї"
Мисієїс Асідє Нев5. 13:3101-3110; Мап НеекКе еї аї. (1989) "Ехргеззіоп ОЇ Нитап Азрагадіпе зЗупіпеїазе Іп ЕвсПегіспіа Соїї" 9). Віої. Спет. 24:5503-5509); і т. п. Вектори рОЕХ можуть бути також використані для експресії чужорідних поліпептидів у вигляді злитих білків із глутатіон-5- трансферазою (55). Узагалі говорячи, такі злиті білюи є розчинними і можуть бути легко виділені з лізованих клітин за допомогою адсорбції і зв'язування зі сферами-матрицями, що містять глутатіон-агарозу, з наступним елююванням у присутності вільного глутатіону. Вектори рОЕХ були сконструйовані так, щоб вони включали сайти розщеплення тромбіном або протеазою фактора Ха, і щоб клонований продукт гена-мішені міг вивільнятися з молекули 51.
У системі комах вірус ядерного поліедрозу Ацйіодгарна саїйогпіса (АСМРМУ) використовується як вектор для експресії чужорідних генів. Цей вірус розмножується в клітинах Зродоріега їтидірегда. Антитілокодуюча послідовність може бути клонована окремо в не головні ділянки (наприклад, гена поліедрину) вірусу і може знаходитися під контролем промотору АСМРУ
Зо (наприклад, промотору полієдрину).
У клітинах-хазяях ссавців може бути застосований ряд вірусних експресійних систем. У тих випадках, коли як експресійний вектор використовується аденовірус, то антитілокодуюча послідовність, що представляє інтерес, може бути комплексом з аденовірусним комплексом регуляції транскрипції/трансляції, наприклад, з пізнім промотором і з трикомпонентною лідерною послідовністю. Цей химерний ген може бути потім убудований в аденовірусний геном за допомогою рекомбінації іп міго або іп мімо. Інсерція в не-головну ділянку вірусного генома (наприклад, в ділянці ЕТ або ЕЗ) дозволить одержати рекомбінантний вірус, що є життєздатним і має здатність експресувати молекулу імуноглобуліну в інфікованих хазяїнів (див., наприклад,
Ї одап еї аї. (1984) "Адепоміги5 Тгірапіе І єадег 5едиепсе Еппапсез Тгтапвіайоп ОЇ тАМАЗ І аїє
Апег Іпіесіоп" Ргос. Май. Асад. сі. ОБА 81:3655-3659). Специфічні сигнали ініціації можуть також знадобитися для ефективної трансляції убудованих антитілокодуючих послідовностей.
Такі сигнали включають кодон ініціації АТО і суміжні послідовності. Крім того, кодон ініціації повинний знаходитися в одній рамці зчитування з потрібною кодуючою послідовністю для гарантії трансляції усієї вставки. Такі екзогенні сигнали регуляції трансляції і кодони ініціації трансляції можуть походити від різних видів, як природних, так і синтетичних. Ефективність експресії може бути підвищена завдяки включенню відповідних елементів, а саме, енхансерів транскрипції, термінаторів транскрипції і т. п. (див. ВіНег еї аї. (1987) "Ехрге5зіоп Апа Зесгейоп
Месюгв5 Рог Уеаві" Мейоз іп Епгутої. 153:516-544).
Крім того, може бути вибраний штам клітини-хазяїна, який модулює експресію убудованих послідовностей або модифікує генний продукт і сприяє процесингу генного продукту по конкретному бажаному механізмі. Такі модифікації (наприклад, глікозилування) і процесинг (наприклад, відщеплення) білкових продуктів можуть відігравати важливу роль у функціонуванні білка. Так, наприклад, у деяких варіантах винаходу поліпептиди, що містять молекулу діатіла відповідно до винаходу, можуть експресуватися у вигляді одного генного продукту (наприклад, у вигляді одного поліпептидного ланцюга, тобто поліпротеїнового попередника) у результаті протеолітичного розщеплення по природному або рекомбінантному механізму з утворенням окремих поліпептидів молекул діатіл відповідно до винаходу. Даний винахід охоплює конструювання послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує молекулу поліпротеїнового попередника, що містить поліпептиди відповідно до винаходу, і яка включає кодуючі бо послідовності, здатні регулювати посттрансляційне відщеплення вказаного поліпротеїнового попередника. Посттрансляційне відщеплення поліпротеїнового попередника приводить до утворення поліпептидів відповідно до винаходу. Посттрансляційне відщеплення молекули- попередника, що містить поліпептиди відповідно до винаходу, може відбуватися іп мімо (тобто, у клітинах-хазяях під дією природних або рекомбінантних клітинних систем/механізмів, наприклад, розщеплення фурином у відповідному сайті), або воно може відбуватися іп мйго (наприклад, при інкубуванні вказаного поліпептидного ланцюга в композиції, що містить протеази або пептидази з відомою активністю і/або в композиції, що містить середовища або реагенти, що, як відомо, надають потрібну протеолітичну дію). Очищення і модифікацію рекомбінантних білків, добре відому фахівцям, здійснюють так, щоб конструкція поліпротеїнового попередника включала ряд варіантів, що можуть бути легко визначені фахівцем-практиком. Для внесення описаних модифікацій молекули-попередника можуть бути використані будь-які відомі протеази або пептидази, наприклад, тромбін (який розпізнає амінокислотну послідовність І МРЕЛОЗ (ЗЕО ІЮ МО: 89)) або фактор Ха (який розпізнає амінокислотну послідовність (Е/0)0К" (5ЕО ІЮО МО: 90) (Мадаї еї аІ. (1985) "Охудеп Віпаїпу
Ргорепієз ОЇ Нитап Мшапі Нетодіобіп Зупіпевзігед Іп ЕзсНегісніа Соїї" Ргос. Маї. Асай. 5сі.
ИБА 82:7252-7255, і ферменти, описані в публікаціях Уеппу еї аї. (2003) "А Стійса! Кеміеєжм ОЇ Те
Меїтоаз Рог СіІєамаде ОЇ Ривзіоп Ргоїєїпе М/Н Тпготбіп Апа Расіог Ха" Ргоївїп Ехрг. Ригії. 31: 1- 11, кожна з який у всій своїй повноті вводиться в даний опис за допомогою посилання)), ентерокіназа (яка розпізнає амінокислотну послідовність ООСОК" (ЗЕО І МО: 91) (Соїп5-Насіє еї аі. (1995) "Ргодисіп ОЇ Весотрбіпапі Воміпе ЕпіегоКіпазе Саїа|міс Зирипії Іп ЕзсНегісніа Соїї
Овіпа Тне Момеї! Зестеїюгу Ривзіоп Рагіпег О5р" ВіотесппоІоду 13:982-987; вказана публікація у всій своїй повноті вводиться в даний опис за допомогою посилання)), фурин (який розпізнає амінокислотну послідовність ЕХХК", переважно ЕХ(К/К)А" (ЗЕО ІО МО: 92 і 5ЕО ІЮ МО: 93, відповідно) (додатковий К у положенні Рб, ймовірно, підвищує ефективність розщеплення)), і АСТЕМ (який розпізнає амінокислотну послідовність ЕМІ МЕС (5ЕО ІЮО МО: 94) (Рагкз5 еї аї. (1994) "Беієазе ОЇ Ргоївіпо Апа Реріїде5 Егот Ривіоп Ргоїєїп Овіпд А Весотрбіпапі Ріапі Мігиб
Ргоїєїпазе" Апаї. Віоспет. 216:413-417; вказана публікація у всій своїй повноті вводиться в даний опис за допомогою посилання)) і протеаза СЗ вірусу ящуру. Див., наприклад, вище, розділ 6.4.
Зо Різні клітини-хазяїни мають характеристичні і специфічні механізми здійснення посттрансляційного процесингу і модифікації білків і генних продуктів. Відповідні клітинні лінії або системи хазяїнів можуть бути відповідним чином відібрані для гарантії "правильної" модифікації і "правильного" процесингу експресованого чужорідного білка. Для досягнення цієї мети можуть бути використані еукаріотичні клітини-хазяїни, що мають клітинний механізм "правильного" процесингу первинного транскрипта, глікозилування і фосфорилування генного продукту. Такими клітинами-хазяїнами ссавців є, але не обмежуються ними, клітини СНО,
МЕКУ, ВНК, Нега, СО5, МОСК, 293, 293тТ, 373, УМІЗ8, ВТ483, Н5ь578тТ, НТВ2, ВТ20 їі Т470,
СІ 7030 і Н5е578851.
Для тривалого і високоефективного продукування рекомбінантних білків переважно повинна досягатися стабільна експресія. Так, наприклад, можуть бути сконструйовані клітинні лінії, стабільно експресуючі антитіло відповідно до винаходу. Замість використання експресійних векторів, що містять вірусні оріджини реплікації, найкраще використовувати клітини-хазяїни, трансформовані ДНК під контролем відповідних елементів регуляції експресії (наприклад, промотору, енхансера, послідовностей термінації транскрипції, сайтів поліаденілування |і т. п.) і селективного маркера. Після введення чужорідної ДНК, сконструйовані клітини можуть бути культивовані протягом 1-2 днів у збагаченому середовищі, а потім це середовище може бути замінене селективним середовищем. Селективний маркер у рекомбінантній плазміді надає резистентність до відбору і дозволяє клітинам стабільно інтегрувати плазміду у свої хромосоми, а також рости з утворенням вогнищ, що, у свою чергу, можуть бути клоновані і розмножені з одержанням клітинних ліній. Цей метод переважно використовується для конструювання клітинних ліній, експресуючих антитіла відповідно до винаходу. Такі сконструйовані клітинні лінії можуть бути, зокрема, використані для скринінгу й оцінки сполук, які прямо або опосередковано взаємодіють з молекулами відповідно до винаходу.
Може бути використаний ряд систем відбору, включаючи, але не обмежуючись ними, гени тимідин-кінази вірусу простого герпесу (Умідіег еї аІ. (1977) "Тгапетег ОЇ Ригійва Негрез Міги5
ТНутідіпе Кіпазєе Сепе То Сийштей Моийивзе СеїЇв" Се 11: 223-232), гіпоксантин-гуанін- фосфорибозилтрансферази (57ураї5Ка еї аІ. (1992) "Обе Ої Те НРАТ СХепе Апа Те НАТ зЗеїІесіоп Тесппідне п ОМА-Меадіаїей Тгапв5іоптайоп ОЇ Маттаїап СеїІв: Рієвї 5іерз Тожмага
Оемеіоріпд Нурігдота Тесппідиез Апа Сбепе Тнегару" Віоєззауз 14:495-500), і аденін- 60 фосфорибозилтрансферази (ІГому еї аї. (1980) "ІзоЇїайоп ОЇ Тгапбзіоптіпуд ОМА: Сіопіпд. Те
Натвіег арп Сепе" СеїІ 22:817-823), які можуть бути використані в 1К-, Нпдри- або аргі-клітинах, відповідно. Крім того, резистентність до антиметаболітів може бути основою для відбору на наступні гени: апіт, що надає резистентність до метотрексату (Л/ідіег еї аї. (1980) "Ттапотогтайоп
ОЇ Маттаїап СеїІв Ми Ап Атріїйаріє Оотіпапі-Асіїпд Сепе" Ргос. Маї). Асад. Зсі. ОБА 77:3567- 3570; СтНаге вї аї. (1981) "Ттапетоптаїйоп ОЇ Моизе Рібгобіавзів То Меїпоїгехаїе Незівіапсе Ву А
Весотрбіпапі Ріазтій Ехргезвіпу А РгоКагуоїїс ріпуагою|аге Недисіазе" Ргос. Маї!. Асай. 5сі. ОБА 78:1527-1531); дрі, що надає резистентність до мікофенолової кислоти (Миїйїдап еї аї. (1981) "БеІесіп Рог Апіта! Се Тнаї Ехрге55 Те ЕвсНегісніа соїї Сепе Содіпуд Рог Хапіпіпе-Ссцапіпе
Ріозрпогібозуйгапеоітегавзе" Ргос. Май. Асад. сі. ОБА 78:2072-2076); пео, що надає резистентність до аміноглікозиду 5-418 (Тоівіозпем (1993) "Сепе Тнегару, Сопсерів, Ситепі
Тіаіє Апа Ршиге Оігесіопв" Апп. Нему. Рпаптасої. Тохісо!. 32:573-596; Миїїїдап (1993) "Тне Вавіс
Зсіепсе ОЇ Сепе Тнегару" Зсієпсе 260:926-932; і Могдап еї аї. (1993) "Нитап Сепе Тпегару" Апп.
Вем. Віоспет. 62:191-217), і пудго, що надає резистентність до гігроміцину (Запіе!тте еї аї. (1984) "Ехргезвіоп ОЇ РгоКагуоїїс Сепев Рог Нудготусіп В Апа с418 Вевівіапсе А5 Юотіпапі-5еїесійїоп
МагїкКеге п Моизе | СеїЇє" Сбепе 30:147-156). Можуть бути застосовані методи, добре відомі фахівцям в галузі техніки рекомбінантних ДНК і описані в публікаціях А!,зибеї еї аї. (едв.), 1993,
Ситепі РгоїосоЇ5 іп МоїІесшаг Віоіоду, бопйп УмМпПеу 5 5оп5, МУ; Кгіедіег, 1990, Сепе Тгапегег і
Ехргеззіоп, А І арогаїгу Мапиаї, БіосКіоп Ргез5, МУ; і Спарієг5 12 ї 13, Огасороїї еї аї. (едв), 1994, Степі Ргоїюосої5 іп Нитап Сепеїїсв, допп УМПеу б Бопв5, МУ.; СоІрете-Сагаріп єї а. (1981) "А Мем ботіпапі Нургіа 5еІесіїме Мажег Рог Ніднег ЕиКагуоїїс СеїІв" у). Мої. Віої. 150:1-14.
Рівні експресії молекули відповідно до винаходу можуть бути підвищені за допомогою ампліфікації вектора (опис цього методу можна знайти в публікації Вербіпдіоп і Непібспеї, Те иве ої месіог5 разей оп депе атрійісайоп ог Ше ехргезвіоп ої сіопед депез іп таттаїйап сеї5 іп
ОМА сіопіпд. Мої. З (Асадетіс Ргез5, Мем/ МогК, 1987). Якщо маркер у векторній системі, яка експресує антитіло, є ампліфікованим, то підвищення рівня інгібітору, який присутній у культурі клітин-хазяїнів, буде супроводжуватися збільшенням числа копій маркерного гена. Оскільки ампліфікована ділянка асоціюється з нуклеотидною послідовністю поліпептиду молекули діатіла, то в цьому випадку буде також спостерігатися підвищення рівня продукування вказаного поліпептиду (Стоизе еї аї. (1983) "Ехргеззіоп Апа Атрійісайоп ОЇ Епдіпеегеа Мошизе ріпуагогоЇате
Коо) Ведисіазе Міпідепев" Мої. Сеїі. Вісі. 3:257-266).
Клітина-хазяїн може бути котрансфікована двома експресійними векторами відповідно до винаходу, тобто першим вектором, що кодує перший поліпептид молекули діатіла, і другим вектором, що кодує другий поліпептид молекули діатіла. Ці два вектори можуть містити ідентичні селективні маркери, що в однаковій мірі експресують обидва поліпептиди.
З5 Альтернативно, може бути використаний один вектор, що кодує обидва поліпептиди.
Послідовності, які кодують поліпептиди молекул відповідно до винаходу, можуть містити КкДНК або геномну ДНК.
Після рекомбінантної експресії молекули відповідно до винаходу (тобто, діатіл), вона може бути очищена будь-яким методом, відомим фахівцям в галузі очищення поліпептидів, поліпротеїнів або діатіл (наприклад, за схемою, аналогічною схемі очищення антитіл на основі селективності до антигену), наприклад, за допомогою хроматографії (наприклад, іонообмінної хроматографії, афінної хроматографії, зокрема, на колонці, яка має афінність відносно специфічного антигену (необов'язково після відбору на білку А, де молекула діатіла містить Ес- домен (або його частину)), і ексклюзійної колонкової хроматографії), центрифугування, методом диференціальної розчинності або будь-яким іншим стандартним методом очищення поліпептидів, поліпротеїнів або діатіл. 5.5. Методи профілактики і терапії
Молекули відповідно до винаходу є особливо придатними для лікування і/або попередження захворювання, розладу або інфекції, де бажаною є функція ефекторних клітин (наприклад,
АРСС), опосередковувана ЕсукК (наприклад, у випадку раку й інфекційного захворювання). Як обговорювалося вище, діатіла відповідно до винаходу можуть мати антитілоподібні функціональні властивості, якіолягають у вироблянні ефекторної функції, хоча така молекула антитіла не містить Ес-домену. Молекула діатіла, завдяки тому, що вона містить щонайменше один епітоп-зв'язувальний домен, який імуноспецифічно розпізнає Есук, може мати Есув- зв'язувальні властивості й активність, аналогічні таким властивостям, як взаємодія Ес-Есук. Так, наприклад, молекули відповідно до винаходу можуть зв'язуватися з антигеном клітинної поверхні і ЕсуК (наприклад, ЕсукПА) на імунній ефекторній клітині (наприклад, на МК-клітині), тим самим, стимулюючи ефекторну функцію (наприклад, АОСС, СОС, фагоцитоз, опсонізацію і т. п.), спрямовану проти вказаної клітини.
В інших варіантах винаходу молекула діатіла відповідно до винаходу містить Ес-домен (або його частину). У таких варіантах Ес-домен може також мати щонайменше одну амінокислотну модифікацію в порівнянні з Ес-доменом дикого типу (або його частиною), і/або він може містити домени, які походять від ЇдДСї одного або більше ізотипів (наприклад, Ідс1, Ід52, ДОЗ або Ідса).
Молекули відповідно до винаходу, що містять варіанти Ес-доменів, можуть мати надані або змінені фенотипи, у порівнянні з молекулами, що містять Ес-домен дикого типу, такі як надана або змінена активність, а саме, ефекторна функція (наприклад, як може бути проаналізовано в аналізі з використанням МК-клітин або макрофагів). У вказаних варіантах винаходу молекули відповідно до винаходу з наданою або зміненою ефекторною функцією можуть бути використані для лікування і/або попередження захворювання, розладу або інфекції, при яких бажано підвищити ефективність ефекторної функції. У деяких варіантах винаходу молекули діатіла відповідно до винаходу, що містять Ес-домен (або його частину), опосередковують каскад комплемент-залежних реакцій. Варіанти Ес-доменів, ідентифіковані по зміні ефекторної функції, описані в міжнародній заявці У/О04/063351, у публікаціях заявок на патент США 2005/0037000 і 2005/0064514, у попередній заявці на патент США 60/626510, поданої 10 листопада 2004 р., у попередній заявці на патент США 60/636663, поданої 15 грудня 2004 р., і в попередній заявці на патент США 60/781564, поданої 10 березня 2006 р., а також у заявках на патент США 11/271140, поданої 10 листопада 2005 р., і 11/305787, поданої 15 грудня 2005 р., і в одночасно поданих заявках авторів винаходу, що у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання.
Даний винахід охоплює способи і композиції, застосовувані для лікування, попередження або терапії раку в індивідуума, де вказані способи включають введення індивідууму терапевтично ефективної кількості однієї або більше молекул, що містять один або більше епітоп-зв'язувальних сайтів і необов'язково Ес-домен (або його частину), сконструйовані відповідно до даного винаходу, де вказана молекула також зв'язується з раковим антигеном.
Молекули відповідно до винаходу є особливо придатними для попередження, інгібування, зниження росту або регресії первинних пухлин, метастазів ракових клітин і поширення інфекційних захворювань. Не обмежуючи описом якого-небудь конкретного механізму дії, автори лише відзначають, що молекули відповідно до винаходу опосередковують ефекторну
Зо функцію, що приводить до знищення пухлини, зменшення пухлини або того й іншого. В альтернативних варіантах винаходу діатіла відповідно до винаходу опосередковують терапевтичну активність за допомогою перехресного зв'язування антигенів і/або рецепторів клітинної поверхні і посилення апоптозу або передачі сигналів придушення росту пухлини.
Не обмежуючи описом якого-небудь конкретного механізму дії, автори лише відзначають, що молекули діатіл відповідно до винаходу мають підвищену терапевтичну активність в порівнянні з відомими терапевтичними антитілами, що, зокрема, зумовлено здатністю діатіла імуноспецифічно зв'язуватися з клітиною-мішенню, що, у результаті такого зв'язування, буде експресувати конкретний антиген (наприклад, Есук) на більш низьких рівнях, наприклад, завдяки здатності цього діатіла зберігатися на клітині-мішені протягом більш тривалого періоду часу через підвищену авідність взаємодії "діатіло-епітоп".
Діатіла відповідно до винаходу з підвищеною афінністю й авідністю до антигенів (наприклад, до Есук) є особливо придатними для лікування, попередження або терапії раку або іншого захворювання або розладу в індивідуума, де ЕсукК експресується в популяції клітин-мішеней на низькому рівні. Використовуваний тут термін "експресія Есук у клітинах" визначена як щільність таких молекул на клітину, де вказана щільність може бути виміряна відомими стандартними методами. Молекули відповідно до винаходу, що містять множину епітоп-зв'язувальних сайтів і необов'язково Есук (або його частину), переважно мають надану або підвищену авідність й афінність і/або ефекторні функції в клітинах, що експресують антиген-мішень, наприклад, раковий антиген, при щільності 30000-20000 молекул/клітину, при щільності 20000-10000 молекул/клітину, при щільності 10000 молекул/клітину або менше, при щільності 5000 молекул/клітину або менше, або при щільності 1000 молекул/клітину або менше. Молекули відповідно до винаходу є особливо придатними для лікування, попередження або терапії захворювання або розладу, такого як рак, у субпопуляції ракових клітин, де антиген-мішень експресується в популяції клітин-мішеней на низькому рівні.
Молекули відповідно до винаходу можуть також переважно використовуватися в комбінації з іншими відомими терапевтичними агентами для лікування або попередження захворювань, таких як рак, аутоїмунне захворювання, запальні розлади й інфекційні захворювання. У конкретному варіанті винаходу молекули відповідно до винаходу можуть бути використані в комбінації з моноклональними або химерними антитілами, лімфокінами або гемопоетичними бо факторами росту (наприклад, такими як ІІ -2, ІІ -3 і 1-7), що, наприклад, служать для збільшення числа або підвищення активності ефекторних клітин, які взаємодіють із вказаними молекулами, що приводить до підвищення імунної відповіді. Молекули відповідно до винаходу можуть бути також переважно використані в комбінації з одним або більше лікарськими засобами, застосовуваними для лікування захворювання, розладу або інфекції, такими як, наприклад, протиракові засоби, протизапальні засоби або противірусні засоби, наприклад, докладно описані в розділі 5.7. 5.5.1. Ракові захворювання
Даний винахід охоплює способи і композиції, застосовувані для лікування або попередження раку в індивідуума, де вказані способи включають введення індивідууму терапевтично ефективної кількості однієї або більше молекул, що містять множину епітоп-зв'язувальних доменів. У деяких варіантах винаходу даний винахід охоплює способи і композиції, застосовувані для лікування або попередження раку в індивідуума, у якого спостерігається поліморфізм ЕсукК, наприклад, гомозиготність по алелях ЕсукІША-158М або ЕсукІПША-158Б. У деяких своїх варіантах даний винахід охоплює конструювання щонайменше одного епітоп- зв'язувальний домену молекули діатіла, імуноспецифічно зв'язується з ЕСУКПША (158БЕ). У деяких своїх варіантах даний винахід охоплює конструювання щонайменше одного епітоп- зв'язувального домену молекули діатіла, що імуноспецифічно зв'язується з ЕСУКША (1584).
Ефективність стандартної терапії моноклональними антитілами залежить від Есув- поліморфізму в даного індивідуума (Сагігоп еї аї. (2002) "Тпегарешіс Асіїміу ОЇ Нитапі7еа Апії-
СбОрг20 Мопосіопа! Апіїбоду Апа Роїутогрпізт Іп Ід Ес Весеріог ЕсАШа Сепе" Віоса 99:754-758;
МУепа сеї аї. (2003) "їмо Іттипоадіобийй с Егадтепі С Весеріог Роїутогрпізт5 Іпаерепадепіу
Ргедісї Везропзе То Вйихітабр Іп Раїйепів М/йН Еоїйсшаг Гутрпота" .). Сіїй. Опсої. 21(21):3940- 3947, вказані публікації у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання).
Ці рецептори експресуються на поверхні ефекторних клітин і опосередковують АЮСС. Алелі високої афінності генів активуючих рецепторів з низькою афінністю підвищують здатність ефекторних клітин опосередковувати АЮСС. На відміну від способів досягнення Ес-ЕсувВ- взаємодій, що здійснюють ефекторну функцію, способи відповідно до винаходу охоплюють конструювання молекул для імуноспецифічного розпізнавання активуючих рецепторів з низькою афінностю, що дозволяє одержати молекули, специфічні до поліморфізму. Альтернативно або додатково, молекула відповідно до винаходу може бути сконструйована так, щоб вона містила варіант Ес-домену, що буде мати підвищену афінність до ЕсукК (у порівнянні з Ес-доменом дикого типу) на ефекторних клітинах. Такі сконструйовані молекули відповідно до винаходу дають можливість одержати поліпшені імунотерапевтичні реагенти для лікування пацієнтів, незалежно від їхнього ЕсуВ-поліморфізму.
Молекули діатіл, сконструйовані відповідно до даного винаходу, тестують на АОСС з використанням культивованої клітинної лінії або МКПК, узятих у пацієнта, для визначення здатності Ес-мутацій підвищувати АОСС. Стандартний аналіз на АОСС здійснюють описаними тут методами. Лімфоцити виділяють з периферичної крові в градієнті фіколла-пака (Рпаптасіа).
Клітини-мішені, тобто культивовані клітинні лінії або клітини, узяті в пацієнта, навантажують європієм (РегкіпЕїЇІтег) і інкубують з ефекторами протягом 4 годин при 37 "С. Європій, який вивільняється, детектують на флуоресцентному планшет-рідері (М/аПйас). Отримані дані по
АОСС указують на ефективність молекул відповідно до винаходу відносно стимуляції цитотоксичності, опосередковуваної МК-клітинами, і дозволяють установити, які молекули можуть бути протестовані з використанням зразків, узятих у пацієнтів, і виснажених моноцитів.
Потім молекули діатіл, що, як передбачається, найбільш ймовірно мають АЮсСс-активність, були потім протестовані на АОСС з використанням МКПК, узятих у пацієнтів. МКПК, узяті в здорових донорів, були використані як ефекторні клітини.
Відповідно до цього даний винахід стосується способів або попередження лікування ракового захворювання, що характеризується присутністю ракового антигену, де вказаний спосіб включає конструювання молекули діатіла, яка імуноспецифічно розпізнає вказаний раковий антиген, так, щоб молекула діатіла сама мала цитотоксичність (наприклад, за допомогою перехресного зв'язування з поверхневими рецепторами, що приводить до посилення апоптозу або до інгібування сигналів проліферації) і/або містила Ес-домен відповідно до винаходу і/або опосередковувала одну або більше ефекторних функцій (наприклад, АОСС, фагоцитоз). Діатіла, які були сконструйовані способом відповідно до винаходу, є придатними для попередження або лікування раку, оскільки вони мають цитотоксичну активність (наприклад, підвищену здатність знищувати пухлинні клітини і/або підвищувати, наприклад,
Арсб-активність або СОС-активність).
Ракові захворювання, асоційовані з раковим антигеном, можуть бути вилікувані або бо відвернені шляхом уведення діатіла, що зв'язується з раковим антигеном і є цитотоксичним іМабо яке було сконструйоване способами відповідно до винаходу так, щоб воно мало ефекторну функцію. Так, наприклад, ракові захворювання, асоційовані з нижченаведеними раковими антигенами, можуть бути вилікувані або відвернені з застосуванням способів і композицій відповідно до винаходу, і необмежувальними прикладами таких антигенів є: антиген усіх карцином Кз 1/4 (Реге? еї аї. (1989) "ІзоЇїайоп Апа Спагасіегігайоп ОЇ А Сапа Епсодіпуд Те
Кеві/4 Еріїнеїйа! Сагсіпота МаїКег" У. Іттипої. 142:3662-3667; МоПег еї аї. (1991) "Візресійіс-
Мопосіопа!-Апіїроду-Оігесієй увів ОЇ Омапйап Сагсіпота Се Ву Асіїмаїд Нитап Т
Гутрпосуїевз" Сапсег Іттипої. Іттипоїпег. 33(4):210-216), антиген карциноми яєчника (СА125) (Уи єї аї. (1991) "Соєхргеззіоп ОЇ Оійегепі Апіїдепіс Мажегз Оп Моієїез Тнаї Веаг СА 125
Реїегптіпапів" Сапсег Вев. 51(2):468-475), кисла фосфатаза передміхурової залози (Тайог еї аї. (1990) "Мисієсїіде б5едиеєпсе ОЇ Нитап Ргозіаїйс Асій РпозрНнаїазе Оеїєптіпед Егот А ЕшіІ-І епаїй
СсОМА Сіопе" Мисі. Асіаз Кев5. 18(16):4928), антиген, специфічний для передміхурової залози (Непи еї аї. (1989) "сОМА Содіпд Рог Те Епійїте Нитап Ргозіаїє 5ресіїс Апіїдеп Зпом/5. Нідн
Нотоіодіеєз То Тне Нитап Тіззцє КаїйїКгєїп Сепев5" Віоспет. Віорпузх. Вез. ботт. 10(2):903-910;
Івгавії єї аї. (1993) "МоїІесшаг Сіопіпда ОЇ А Сотріетепіагу ОМА Епсодіпуд А Рговіаів-5ресіїіс
Метьгапе Апіїдеп" Сапсег Ве5. 53:227-230), асоційований з меланомою антиген р9о7 (Езіїйп еї а). (1989) "Ттапеїесієа Моизе Меїапота І іпез5 Тнаї Ехрге55 Магіоси5 І емеі5 ОЇ Нитап Меіапота-
Аввосіаївд Апідеп ро" У). Май. Сапсег Іпвій. 81(6):445-454) антиген меланоми ар75 (Міауазагаані єї аї. (1990) "Тне Меіапота Апіїдеп Ср75 Із Тпе Нитап Нотоіодиє ОЇ Те Моизе В (Вгом/п) Госи5 Сепе Ргодисі" У. Ехр. Мей. 171(4):11375-1380), високомолекулярний антиген меланоми (НММУ-МАА) (Маїаїї єї аї. (1987) "Іттипопівіоспетіса! ЮОеїесіп ОЇ Апіїдеп Іп Нитап
Ргітагу Апа Меїавіаїййс МеІапотазх Ву Те Мопосіопа! Апііроду 140.240 Апа (5 Ров5іріє Ргодповіїс зЗідпітісапсе" Сапсег 59:55-63; МінеІтап еї аї. (1990) "Асіїме Зресіїс Іттипоїпегару Іп Раїїєпів
МУйий Меїапота. А Сіїпіса! Та! МУйН Моизе Апійаіоїуріс Мопосіопа! Апіїродіез Еїїсйей Уйн
Зупдепеїс Апіі-Нідн-МоІесшаг!-У/еіднЕМеіапота-Авззосіаїєд Апіїдеп Мопосіопа! Апііродієв" У. Сіїй.
Іпмеві. 86:2136-2144)) мембранний антиген, специфічний для передміхурової залози, карциноембріональний антиген (СЕА) (Бооп ей аїЇ. (1995) "Ітптипе Кезропбзе То Тпе
Сагсіпоетьгуопіс Апіїдеп Іп Раїйепів Тгєаївд М/Н Ап Апії-Ідіоїуре Апіїроду Массіпе" У. Сііп. Іпмеві. 96(1):334-42), поліморфний епітеліальний антиген муцин, антиген жирової глобули людської молочної залози, антигени, асоційовані з пухлиною прямої й ободової кишки, такі як: СЕА, ТАС- 72 (Мокоїа еї а. (1992) "Варіа Титог Репеїгайоп ОГ А Зіпдіеє-СНаіп Ем Апа Сотрагізоп М/ЙА Огїпег
Іттиподіобиїййп Ропт5" Сапсег Рез. 52:3402-3408), 317-1А (Надпнаттаг еї аї. (1993) "ЕпНесі ОЇ
Мопосіопа! Апіїроду 17-1 А Апа ам-С5Е Іп Раїїєпів М/П Адмапсей Соіогесіа! Сагсіпота-Ї опд-
І авіїпд, Сотрієїе НКетівзіоп5 Сап Ве Іпдисеай" Іпі. У. Сапсег 53:751-758); СІСА 19-9 (Непуп еї а). (1982) "Мопосіопа! Апіїроду Оеїесіїоп ОЇ А Сігсціайпа Титог-А55осіаїєд Апіїдеп. І. Ргезепсе ОЇ
Апіідеп Іп бега ОЇ Раїїєпів МУйй Соіогесіа!, Савійс, Апа Рапстгєаїйс Сагсіпота" У. Сіїп. Іттипої. 2:135-140), СТА-1 і І ЕА, антиген лімфоми Беркітта - 38.13, СО19 (Спеїйіє евї а. (1994) "Апіі-СО 19
Іппібйв Те Стоули ОЇ Нитап В-СеїЇ Титог І іпе5 їй Міто Апа ої Оацаї СеїІ5 п 5СІЮ Місе Ву
Іпдисіпа Сеї! Сусіе АгІтеві" Віоса 83:1329-1336), антиген людської В-лімфоми - СО20 (Веї евї аї. (1994) "Оерієїоп ОЇ В Сеї5 Іп Мімо Ву А Спітегіс Моизе Нитап Мопосіопа! Апіїбоду То СО2О"
Віоса 83:435-445), СО33 (Здоицгоз єї аї. (1993) "Модеїїпуд Апа бовзітейту Ої Мопосіопа! Апіїроду МІ 95 (Апіі-СО33) Іп Асціє МуєіІодепои5 І еиКетіа" ). Мисі. Мей. 34:422-430), специфічні для меланоми антигени, такі як гангліозид 502 (Заїей еї аї. (1993) "Сепегайоп ОЇ А Нитап
Апійаіоїуріс Апіїбоду Тнаї Мітісх Те 102 Апіїдеп" У.Іттипо, 151, 3390-3398), гангліозид СОЮЗ (5Нйага єї аї. (1993) "А Моизе/Нитап Спітетгіс Апіїі-(Сапдіїовзіде 203) Апіроду Мйй Епнапсей
Апійшитог Асіїмйіевз" Сапсег Іттипої. Іттипоїйег. 36:373-380), гангліозид ЗМО (І іміпудєюп еї аї. (1994) "Ітргомед 5Зигміма! Іп їаде І Меїапота Раїїєпів М/Н Ме Апііродієв: А Вападотіеай Тіїаї
ОГ Адіимапі Массіпайоп МУйН саМ2 Сападііозіде" 9). Сіїй. Опсої. 12:1036-1044), гангліозид СМЗ3 (Нооп еї аї. (1993) "МоІєсшаг Сіопіпд ОЇ А Нитап Мопосіопа! Апіроду РНеасіїме То Сападіовзіде
СОМ З3 Апідеп Оп Нитап Сапсеге" Сапсег Ве5. 53:5244-5250), пухлиноспецифічні антигени клітинної поверхні, які продукуються при трансплантації (Т5ТА), такі як індуковані вірусом пухлинні антигени, включаючи Т-антиген пухлинних ДНк-вірусів і антигени оболонок пухлинних
РНК-вірусів, альфа-фетопротеїн онкофетального антигену, такий як СЕА товстої кишки, онкофетальний антиген пухлини сечового міхура (Неїбігот еї аї. (1985) "Мопосіопа! Апіїроадіе5
То СеїЇ Бипйасе Апіїдеп5 5Нагей Ву СпетісавПу Іпдисед Моизе Віадаєг Сагсіпотав" Сапсег. Вев. 45:2210-2188), антиген диференціювання, такий як антиген людської карциноми легень 1.6, І 20 (Неїївігот еї аї. (1986) "Мопосіопаї Моизе Апіїродієх РНаїзей Адаїпвї Нитап І па Сагсіпота"
Сапсег Вез. 46:3917-3923), антигени фібросаркоми, антиген людського Т-клітинного лейкозу -
СрЗ37 (Внанаснпагуа-СНнацегієє еї аї. (1988) "Ідіоїуре Массіпе5 Адаїіп5зі Нитап Т Сеї| І еоКетіа. ІІ. бо Сепегайоп Апа Спагасієгігайноп ОТ А Мопосіопаї Ідіоїтуре Сазсаде (АБІ, АБ2 апа АБЗ)» .-). ІттипоЇї.
141:1398-1403), неоглікопротеїн, сфінголіпіди, антиген раку молочної залози, такий як ЕСЕК (рецептор епідермального фактора росту), антиген НЕКЗ2 (рідвБнНепяг), поліморфний епітеліальний муцин (РЕМ) (НіїКеп5 еї аї. (1992) "Се! Метргапе-Авзосіаївд Мисіпе Апа ТНеїг АдНевіоп-
Моашіайпуд Ргорепу" Ттепів іп Віоспет. сі. 17:359-363), антиген злоякісного людського лімфоцитарного лейкозу -АРО-1 (Ттацій єї аї. (1989) "Мопосіопа! Апіїроду-Медіаїєд Титог
Веагеззіоп Ву Іпдисіоп ОГ Ароріозів" 5сівепсе 245:301-304), антиген диференціювання (ГЕеїлі (1985) "Оетопвігайоп Ву Мопосіопа! Апіїродієз Тнаї Сагропуагате Зігисіитез ОЇ Сіусоргоївїп5 Апа
Спусоїїрідє Агте Опсо-Юемеіортепіа! Апіїдеп5" Маїште 314:53-57), такий як антиген Ії, який присутній у фетальних еритроцитах і в первинній ендодермі; (Ма), який присутній в аденокарциномі кишечнику; М18 і М39, який присутній у епітелії молочної залози; 5ЗЕА-1, який присутній у мієлоїдних клітинах, МЕР8, МЕРО, МУуї, МІМ-О5 ї 0156-22, який присутній у раковій пухлині прямої й ободової кишки; ТКА-1-85 (групи крові Н); С14, який присутній в аденокарциномі ободової кишки; ЕЗ, який присутній в аденокарциномі легень, АНб, який присутній у раковій пухлині кишечнику; гаптен У, І еу, який присутній у клітинах ембріональної карциноми, ТІ 5 (групи крові А), рецептор ЕСЕ, який присутній у клітинах А431; антигени серії Еї (групи крові В), який присутній у раковій пухлині підшлункової залози; ЕС10.2, який присутній у клітинах ембріональної карциноми й в аденокарциномі кишечнику, СО-514 (групи крові І! ег), який присутній в аденокарциномі; М5-10, який присутній в аденокарциномах; СО-43 (групи крові
І е»), 549, рецептор ЕСЕ (групи крові АГег/І єу), який присутній в аденокарциномі ободової кишки; антиген 19.9, який присутній у раковій пухлині товстої кишки, муцини ракової пухлини кишечнику, Т5А?7, який присутній у мієлоїдних клітинах; Кга, який присутній у меланомі; 4.2, Соз, 01.1, ОБА-1, См2, ОРБА-2, Сог, МІ:22:25:8, який присутній у клітинах ембріональної карциноми, і
ЗЗЕА-3, З5ЕА-4, який присутній в ембріонах клітин у фазі 4-8. В інших варіантах винаходу антиген являє собою пептид Т-клітинного рецептора, який походить від Т-клітинної лімфоми шкіри (див. Едеїзоп (1998) "Сшапеоив Т-СеїЇ ГГ утрпота: А Моадеї! Рог ЗеІесіїме ІттипоїНегару"
Сапсег 9. Зсі. Ат. 4:62-71).
Раковими і спорідненими захворюваннями, які можуть бути вилікувані або попереджені із застосуванням способів і композицій відповідно до винаходу, є, але не обмежуються ними: лейкози, включаючи, але не обмежуючись ними, гострий лейкоз, гострий лімфоцитарний
Зо лейкоз, гострий мієлоцитарний лейкоз, такий як мієлобластний, промієлоцитарний, мієломоноцитарний, моноцитарний лейкоз, еритролейкоз і мієлодиспластичний синдром; хронічні лейкози, такі як, але не обмежувані ними, хронічний мієлоцитарний (гранулоцитарний) лейкоз, хронічний лімфоцитарний лейкоз, ретикулоендотеліоз; справжня поліцитемія; лімфоми, такі як, але не обмежувані ними, хвороба Ходжкіна, неходжкінське захворювання; множинні мієломи, такі як, але не обмежувані ними, млявоплинна ("тліюча"" множинна мієлома, несекреторна мієлома, остеосклеротична мієлома, лейкоз клітин плазми, солітарна плазмацитома і екстрамедулярна плазмацитома; макроглобулінемія Вальденстрема; моноклональна гаммопатія незрозумілої етіології; доброякісна моноклональна гаммопатія; хвороба важких ланцюгів; саркоми кісткової і сполучної тканин, такі як, але не обмежувані ними, саркома кістки, остеосаркома, хондросаркома, саркома Юінга, злоякісна гігантоклітинна пухлина, фібросаркома кістки, хордома, періостеальна саркома, саркоми м'яких тканин, ангіосаркома (гемангіосаркома), фібросаркома, саркома Капоші, лейоміосаркома, ліпосаркома, лімфангіосаркома, нейрилемома, рабдоміосаркома, саркома синовія; пухлини головного мозку, включаючи, але не обмежуючись ними, гліому, астроцитому, гліому стовбура головного мозку, епендимому, олігодендрогліому, пухлина негліальних клітин, акустичну нейриному, краніофарингіому, медулобластому, менінгіому, пінеоцитому, пінеобластому, первинну лімфому головного мозку; ракові пухлини молочної залози, включаючи, але не обмежуючись ними, аденокарциному, лобулярну (дрібноклітинну) карциному, інтрадуктальну карциному, медулярну карциному молочної залози, рак слизової оболонки молочної залози, рак канальців молочної залози, папілярний рак молочної залози, хвороба Педжета і рак молочної залози, що супроводжується запаленням; рак кори надниркової залози, включаючи, але не обмежуючись ними, феохромоцитому й адренокортикальну карциному; рак щитовидної залози, такий як, але не обмежуючи ними, папілярний або фолікулярний рак щитовидної залози, медулярний рак щитовидної залози й анапластичний рак щитовидної залози; рак підшлункової залози, включаючи, але не обмежуючись ними, інсуліному, гастриному, глюкагоному, апудому, пухлину, секретуючу соматостатин, і карциноїд або пухлину панкреатичних острівців; ракові пухлини гіпофіза, включаючи, але не обмежуючись ними, хворобу Кушинга, пухлину, секретуючу пролактин, акромегалію і нецукровий діабет; ракові захворювання очей, включаючи, але не обмежуючись ними, меланоми очей, такі як меланома райдужки, хороїдальну меланому, бо меланому війчастого тіла і ретинобластому; рак піхви, включаючи, але не обмежуючись ними,
плоскоклітинний ендотеліоз, аденокарциному і меланому; рак вульви, включаючи, але не обмежуючись ними, плоскоклітинну карциному, меланому, аденокарциному, базальноклітинну карциному, саркому і хворобу Педжета; рак шийки матки, включаючи, але не обмежуючись ними, плоскоклітинну карциному й аденокарциному; рак матки, включаючи, але не обмежуючись ними, карциному ендометрія і саркому матки; рак яєчника, включаючи, але не обмежуючись ними, епітеліальну карциному яєчника, пухлину пограничної тканини, пухлину зародкових клітин і пухлину строми; рак стравоходу, включаючи, але не обмежуючись ними, плоскоклітинний рак, аденокарциному, кістозну аденоїдну карциному, мукоепідермоїдну карциному, аденосквамозну карциному, саркому, меланому, плазмацитому, верукозну карциному й вівсяноклітинну (дрібноклітинну) карциному; рак шлунка, включаючи, але не обмежуючись ними, аденокарциному, грибоподібну (поліпоїдну), вкриваючи виразками, поверхнево розсіяну, дифузно розсіяну, злоякісну лімфому, ліпосаркому, фібросаркому і карциносаркому; рак товстої кишки; рак прямої кишки; рак печінки, включаючи, але не обмежуючись ними, гепатоцелюлярну карциному і гепатобластому; рак жовчного міхура, включаючи, але не обмежуючись ними, аденокарциному; холангіокарциноми, включаючи, але не обмежуючись ними, папілярну, нодулярну і дифузійну карциному; рак легень, включаючи, але не обмежуючись ними, недрібноклітинний рак легень, плоскоклітинну карциному (епідермоїдну карциному), аденокарциному, великоклітинну карциному і дрібноклітинний рак легень; рак яєчок, включаючи, але не обмежуючись ними, пухлину зародкових клітин, семіному, анапластичну карциному, класичну (типову) карциному, сперматоцитому, карциному, що не стосується семіноми, ембріональну карциному, тератомну карциному, хоріокарциному (пухлину жовточного мішка); рак передміхурової залози, включаючи, але не обмежуючись ними, аденокарциному, лейоміосаркому і рабдоміосаркому; рак пенісу; рак ротової порожнини, включаючи, але не обмежуючись ними, плоскоклітинну карциному; базальноклітинний рак; рак слинних залоз, включаючи, але не обмежуючись ними, аденокарциному, мукоепідермоїдну карциному й аденоїдкістозну карциному; рак гортані, включаючи, але не обмежуючись ними, плоскоклітинний рак і верукозний рак; рак шкіри, включаючи, але не обмежуючись ними, базальноклітинну карциному, плоскоклітинну карциному і меланому, поверхнево розсіяну меланому, нодулярну меланому, злоякісну лентиго, периферичну лентиго-подібну меланому;
Зо рак нирок, включаючи, але не обмежуючись ними, нирково-клітинний рак, аденокарциному, гіпернефрому, фібросаркому, перехідно-клітинний рак (ниркової миски і/або сечоводу); пухлину
Вільмса; рак сечового міхура, включаючи, але не обмежуючись ними, перехідно-клітинну карциному, плоскоклітинний рак, аденокарциному, карциносаркому. Крім того, раковими захворюваннями є міксосаркома, остеогенна саркома, саркома ендотелія, лімфангіосаркома ендотелія, мезотеліома, синовіома, гемангіобластома, карцинома епітелію, кістозна аденокарцинома, бронхогенна карцинома, карцинома потових залоз, карцинома сальних залоз, папілярна карцинома і папілярна аденокарцинома (опис таких захворювань можна знайти в публікаціях Ріхптап еї аї. (1985) Медісіпе, 24 Еа., 9У.В. ГПірріпсой Со., РпйПаде!рніа; і Мигрву еї аї. (1997) Іптогтей Оесізіопе5: Тпе Сотрієге ВоокК ої Сапсег Оіадпові5, Тгтеайтепі, і Кесомегу, Мікіпа
Репаціп, Репдиіп Воок5 Ш.5.А., Іпс., Опійей біаїез ої Атегіса).
Відповідно до цього способи і композиції відповідно до винаходу можуть бути також застосовані для лікування або попередження різних ракових або інших захворювань, асоційованих з аномальною проліферацією клітин, включаючи (але не обмежуючи ними), наступні захворювання: саркому, включаючи саркому сечового міхура, молочної залози, товстої кишки, нирок, печінки, легень, яєчника, підшлункової залози, шлунка, передміхурової залози, шийки матки, щитовидної залози, і шкіри; плоскоклітинну карциному; гематопоетичні пухлини лімфоїдної лінії диференціювання, включаючи лейкоз, гострий лімфоцитарний лейкоз, гострий лімфобластний лейкоз, В-клітинну лімфому, Т-клітинну лімфому, лімфому Беркітта; гематопоетичні пухлини мієлоїдної лінії диференціювання, включаючи гострий і хронічний мієлогенний лейкоз і промієлоцитарний лейкоз; пухлини мезенхіми, включаючи фібросаркому і рабдоміосаркому; інші пухлини, включаючи меланому, семіному, тератокарциному, нейробластому і гліому; пухлини центральної і периферичної нервової системи, включаючи астроцитому, нейробластому, гліому і шваноми; пухлини мезенхіми, включаючи фібросаркому, рабдоміосаркому й остеосаркому; і інші пухлини, включаючи меланому, пігментозну пухлину ксенодерми, кератоакантому, семіному, фолікулярний рак щитовидної залози «і тератокарциному. Також вважається, що рак, який викликається порушеннями апоптози, може бути також вилікуваний із застосуванням способів і композицій відповідно до винаходу. Такими раковими захворюваннями можуть бути, але не обмежуються ними, фолікулярні лімфоми, карциноми з мутаціями роз, гормон-залежні пухлини молочної залози, передміхурової залози і 60 яєчника, і передракові ураження, такі як спадковий адономатозний поліпоз і мієлодиспластичні синдроми. У конкретних варіантах винаходу злоякісні або диспроліферативні зміни (такі як метаплазії і дисплазії) або гіперпроліферативні розлади можуть бути вилікувані або відвернені з застосуванням способів і композицій відповідно до винаходу шляхом уведення цих композицій у яєчник, сечовий міхур, молочну залозу, товсту кишку, легені, шкіру, підшлункову залозу або в матку. В інших конкретних варіантах винаходу саркома, меланома або лейкоз можуть бути вилікувані або відвернені з застосуванням способів і композицій відповідно до винаходу.
У конкретному варіанті винаходу молекула відповідно до винаходу (наприклад, діатіло, що містить множину епітоп-зв'язувальних доменів і необов'язково Ес-домен (або його частину)) інгібує або знижує ріст ракових клітин щонайменше на 9995, щонайменше на 95 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 80 95, щонайменше на 75 95, щонайменше на 7095, щонайменше на 60 956, щонайменше на 50 95, щонайменше на 45 95, щонайменше на 40 95, щонайменше на 45 95, щонайменше на 3595, щонайменше на 30 95, щонайменше на 25 95, щонайменше на 20 956 або щонайменше на 10 95 у порівнянні з ростом ракових клітин за відсутністю вказаної молекули згідно з винаходом.
У конкретному варіанті винаходу молекула відповідно до винаходу (наприклад, діатіло, яке містить множину епітоп-зв'язувальних доменів і необов'язково Ес-домен (або його частину)) знищує ракові клітини або інгібує або знижує їхній ріст щонайменше на 5 95, щонайменше на 1095, щонайменше на 20 95, щонайменше на 25 95, щонайменше на 30 95, щонайменше на 3596, щонайменше на 40 95, щонайменше на 45 95, щонайменше на 50 95, щонайменше на 6096, щонайменше на 70 956, щонайменше на 75 95, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 95 95 або щонайменше на 100 95 більш ефективно в порівнянні з батьківською молекулою. 5.5.2. Аутоіїмунне захворювання і запальні захворювання
У деяких варіантах винаходу молекули відповідно до винаходу включають епітоп- зв'язувальний домен, специфічний до ЕсуКІІВ і/або до варіанта Ес-домену (або його частини), і були сконструйовані способами відповідно до винаходу, де Ес-домен має підвищену афінність відносно ЕсСуРІІВ і знижену афінність відносно ЕсугшШЕА і/або ЕсуКІІА в порівнянні з Есе-доменом дикого типу. Молекули відповідно до винаходу, що мають такі зв'язувальні властивості, можуть бути використані для регуляції імунної відповіді, наприклад, для інгібування імунної відповіді, а також для придушення розвитку аутоїмунних або запальних захворювань. Не обмежуючи яким- небудь конкретним механізмом дії, слід зазначити, що молекули відповідно до винаходу, що мають афінність відносно ЕсуКІЇІВ і/або містять Ес-домен з підвищеною афінністю до ЕСУМІІВ і зниженою афінністю до ЕСуУКПША і/або ЕсукІА, можуть знижувати активуючу відповідь на Есук і інгібувати клітинну чутливість, а тому ці молекули є терапевтично ефективними для лікування іабо попередження аутоїмунного розладу.
Даний винахід також стосується способів попередження, лікування або терапії одного або більше симптомів, асоційованих із запальним розладом в індивідуума, де вказані способи також включають уведення вказаному індивідууму терапевтично або профілактично ефективної кількості одного або більше протизапальних засобів. Даний винахід також стосується способів попередження, лікування або терапії одного або більше симптомів, асоційованих з аутоїмунним захворюванням, де вказані способи також включають уведення вказаному індивідууму терапевтично або профілактично ефективної кількості одного або більше імуномодулюючих засобів. Необмежувальні приклади протизапальних і імуномодулюючих засобів приводяться в розділі 5.7.
Прикладами аутоїмунних розладів, які можуть бути вилікувані шляхом уведення молекул відповідно до винаходу, є, але не обмежуються ними, гніздова алопеція, анкілозуючий спондиліт, антифосфоліпідний синдром, аутоїмунна хвороба Аддісона, аутоіїмунні захворювання кори надниркової залози, аутоїмунна гемолітична анемія, аутоїмунний гепатит, аутоїмунний оофорит і орхіт, аутоїмунна тромбоцитопенія, хвороба Бехчета, бульозний пемфігоїд, кардіоміопатія, кишкова спру, дерматит, синдром хронічної утоми, асоційований з імунною дисфункцією (СЕРІЮО5), хронічна запальна демієлінізуюча поліневропатія, синдром Черга-
Штрауса, пемфігоїд, який рубцюється, синдром СКЕБЗТ, хвороба холодових аглютинінів, хвороба Крона, дисковидний вовчак, есенційна змішана кріоглобулінемія, фіброміалгія- фіброміозит, гломерулонефрит, хвороба Грейвса, синдром Гійена-Барре, тиреоїдит Хашимото, ідіопатичний фіброз легень, ідіопатична тромбоцитопенічна пурпура (ІТР), ІдА-невропатія, ювенільний артрит, плоский лишай, системний червоний вовчак, хвороба Меньера, змішана хвороба сполучних тканин, розсіяний склероз, цукровий діабет типу 1 або імуноопосередковуваний цукровий діабет, тяжка міастенія, вульгарна пухирчатка, перніціозна анемія, нодозний поліартеріїт, поліхондрит, полігландулярні синдроми, ревматична поліміалгія, бо поліміозит і дерматоміозит, первинна гаммаглобулінемія, первинний біліарний цироз, псоріаз,
псоріатичний артрит, феномен Рейно, синдром Рейтера, ревматоїдний артрит, саркоїдоз, склеродермія, синдром Шегрена, синдром "негнучкої" людини, системний червоний вовчак, червоний вовчак, артеріїт Такаясу, скроневий артеріїт/гігантоклітинний артеріїт, виразковий коліт, увеїт, васкуліти, такі як герпетиформний дерматит, вітиліго і гранулематоз Вегенера.
Прикладами запальних захворювань є, але не обмежуються ними, астма, енцефаліт, запальне захворювання кишечнику, хронічна обструктивна хвороба легень (ХОХЛ), алергійні розлади, септичний шок, легеневий фіброз, недиференційована спондилоартропатія, недиференційована артропатія, артрит, запальний оостеоліз і хронічне запалення, яке викликається хронічними вірусними або бактеріальними інфекціями. Як описано тут у розділі 2.2.2, деякі аутоїмунні розлади асоціюються із запальним станом. Таким чином, існують ознаки, які є спільними для аутоімунного і запального розладу. Тому деякі аутоїмунні розлади можуть бути також охарактеризовані як запальні розлади. Прикладами запальних розладів, що можуть бути попереджені, вилікувані або усунуті способами відповідно до винаходу, є, але не обмежуються ними, астма, енцефаліт, запальне захворювання кишечнику, хронічна обструктивна хвороба легень (ХОХЛ), алергійні розлади, септичний шок, легеневий фіброз, недиференційована спондилоартропатія, недиференційована артропатія, артрит, запальний остеоліз і хронічне запалення, яке викликається хронічними вірусними або бактеріальними інфекціями.
Молекули відповідно до винаходу, що містять щонайменше один епітоп-зв'язувальний домен, специфічний до ЕсуКІЇІВ, і/або варіант Ес-домену з підвищеною афінністю до ЕсуКІЇІВ і зниженою афінністю до ЕсукША, можуть бути також використані для зниження запалення у тварин, зокрема, у ссавців із запальними розладами. У конкретному варіанті винаходу молекула відповідно до винаходу сприяє зниженню запалення у тварини щонайменше на 99 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 80 95, щонайменше на 7595, щонайменше на 70 95, щонайменше на 60 95, щонайменше на 50 95, щонайменше на 45 95, щонайменше на 40 95, щонайменше на 45 95, щонайменше на 35 95, щонайменше на 30 95, щонайменше на 25 95, щонайменше на 20 95 або щонайменше на 10 95 у порівнянні з запаленням у тварини, якій не вводили вказану молекулу.
Молекули відповідно до винаходу, що містять щонайменше один епітоп-зв'язувальний
Зо домен, специфічний до ЕсуКІЇІВ, і/або варіант Ес-домену з підвищеною афінністю до ЕсуКІЇІВ і зниженою афінністю до ЕсукША, можуть бути також використані для попередження відторгнення трансплантатів. 5.5.3. Інфекційне захворювання
Даний винахід також охоплює способи лікування або попередження інфекційного захворювання в індивідуума, де вказані способи включають уведення терапевтично або профілактично ефективної кількості однієї або більше молекул відповідно до винаходу, що містять щонайменше один епітоп-зв'язувальний домен, специфічний до інфекційного агента, асоційованого з вказаним інфекційним захворюванням. У деяких варіантах винаходу молекули відповідно до винаходу є токсичними для інфекційного агента, сприяють підвищенню імунної відповіді проти вказаного агента або підсилюють ефекторну функцію проти вказаного агента в порівнянні з імунною відповіддю, яка продукується під час відсутності вказаної молекули.
Інфекційні захворювання, що можуть бути вилікувані або попереджені з використанням молекул відповідно до винаходу, викликаються інфекційними агентами, включаючи, але не обмежуючись ними, віруси, бактерії, гриби, найпростіші і віруси.
Вірусними захворюваннями, які можуть бути вилікувані або попереджені з використанням молекул відповідно до винаходу і з застосуванням способів відповідно до винаходу, є, але не обмежуються ними, захворювання, які викликаються вірусом гепатиту типу А, гепатиту типу В, гепатиту типу С, вірусом грипу, вірусом вітряної віспи, аденовірусом, вірусом простого герпеса типу І (Н5М-Ї), вірусом простого герпеса типу ІЇ (Н5М-ІІ), вірусом чуми великої рогатої худоби, риновірусом, еховірусом, ротавірусом, респіраторно-синцитіальним вірусом, папіломавірусом, паповавірусом, цитомегаловірусом, ехіновірусом, арбовірусом, хантавірусом, вірусом коксакі, вірусом паротиту, вірусом кору, вірусом коревої краснухи, поліовірусом, вірусом натуральної віспи, вірусом Епштейна-Барра, вірусом імунодефіциту людини типу ! (ВІЛ-І), вірусом імунодефіциту людини типу ІЇ (ВІЛ-ІЇ) і збудниками вірусних захворювань, таких як вірусний менінгіт, енцефаліт, лихоманка денге або натуральна віспа.
Бактеріальними захворюваннями, які можуть бути вилікувані або попереджені з використанням молекул відповідно до винаходу і з застосуванням способів відповідно до винаходу, є, але не обмежуються ними, захворювання, які викликаються бактеріями, включаючи, але не обмежуючись ними, захворювання, які викликаються тусобасіеєгіа гіскенвіа, бо тусоріазта, пеіб5б5егпа, 5. рпештопіа, Воітеїйа Бигуддогегі (хвороба Лайма), Васійи5 апігасів
(сибірська виразка); правець; захворювання, які викликаються бактеріями 5ігеріососсив5, «арпуіососси5, тусобасіегішт; правець; коклюш; холера; чуму; дифтерія і захворювання, які викликаються бактеріями спіатуаїйа, 5. аигеиз і ІедіопеПа.
Захворюваннями, які викликаються найпростішими, які можуть бути вилікувані або попереджені з використанням молекул відповідно до винаходу і з застосуванням способів відповідно до винаходу, є, але не обмежуються ними, лейшманіоз, кокцидоз, трипаносомоз або малярія.
Захворюваннями, які викликаються паразитами, що можуть бути вилікувані або попереджені з використанням молекул відповідно до винаходу і з застосуванням способів відповідно до винаходу, є, але не обмежуються ними, захворювання, які викликаються хламідіями і рикетсіями.
Відповідно до одного з аспектів винаходу, молекули відповідно до винаходу, що містять щонайменше один епітоп-зв'язувальний домен, специфічний до інфекційного агента, мають ефекторну функцію антитіла, спрямовану проти вказаного агента, наприклад, патогенного білка.
Прикладами інфекційних агентів є, але не обмежуються ними, бактерії (наприклад, Ез5сПегіспіа соїї, КіерзієІа рпейтопіає, Єгарнуіососсив ацгеив5, Епієгососсив Таеєсіаіє, Сапаїда аїрісапв,
Ргоївиз5 миїЇдагі5, Зарпуіососси5 мігідап5 ії Рзхендотопах аегидіпоза), патоген (наприклад, В- лімфотропний паповавірус (ГРМ); Вогааїеййа регив55і5; вірус хвороби Борна (ВОМ); бичачий коронавірус; вірус хоріоменінгіту; вірус денге; вірус Е. сої; вірус ебола; еховірус 1; еховірус 11 (ЕМ); ендотоксин (ГРЗ); кишкова бактерія; кишковий орфанний вірус; ентеровіруси; вірус котячого лейкозу; вірус ящуру, вірус лейкозу гібонів (САМ); грамнегативні бактерії; Неїобасіег руїогі; вірус гепатиту В (НВМ); вірус простого герпеса; ВІЛ-1; людський цитомегаловірус; людський коронавірус; вірус грипу А, В і С; ГедіопеїМа; І еієптапіа техісапа; ГГ ієїегіа топосуїодепе5; вірус кору; Мепіпдососси5; морбілівіруси; вірус мишачого гепатиту; вірус мишачого лейкозу; вірус мишачого гаммагерпеса; мишачий ретровірус; мишачий коронавірус; вірус мишачого гепатиту; Мусорасіегішт амішт-М; Меїі5ззегіа допоггпоеає; вірус ньюкаслської хвороби; парвовірус В19; Ріабтодіцт ТаіІсірагит; вірус віспи; Рзхепдотопавх; ротавірус;
ЗаіІтопеїйа їуУрпішішт; ЗпідеПа; 5ігеріососсі; Т-клітинний лімфотропний вірус 1; вірус коров'ячої віспи).
Зо 5.5.4. Детоксифікація
Даний винахід також охоплює способи детоксифікації індивідуума, що піддавався впливу токсинів (наприклад, токсичною молекулою лікарського засобу), де вказані способи включають уведення терапевтично або профілактично ефективної кількості однієї або більше молекул відповідно до винаходу, що містять щонайменше один епітоп-зв'язувальний домен, специфічний до токсичної молекули лікарського засобу. У деяких варіантах винаходу зв'язування молекули відповідно до винаходу з токсином приведе до зниження або усунення негативного фізіологічного ефекту, який викликається вказаним токсином. В інших варіантах винаходу зв'язування діатіла відповідно до винаходу з токсином приведе до підвищення або посилення елімінації, розкладання або нейтралізації токсину в порівнянні з елімінацією, розкладанням або нейтралізацією токсину, що спостерігаються під час відсутності вказаного діатіла. Імунодетокситерапія, яка здійснюється способами відповідно до винаходу, може бути проведена для усунення ефектів, яка викликається передозуванням або негативним впливом лікарських засобів, включаючи, але не обмежуючись ними, дигіксин, РСР, кокаїн, колхіцин і трицикличні антидепресанти.
Комбінована терапія
Даний винахід також охоплює введення молекул відповідно до винаходу в комбінації з іншими відомими засобами терапії, звичайно застосовуваними для лікування або попередження раку, аутоїмунного захворювання, інфекційного захворювання або інтоксикації, включаючи, але не обмежуючись ними, сучасну стандартну й експериментальну хіміотерапію, гормональну терапію, біологічну терапію, імунотерапію, променеву терапію або хірургічне втручання. У деяких варіантах винаходу молекули відповідно до винаходу можуть бути введені в комбінації з терапевтично або профілактично ефективною кількістю одного або більше агентів, терапевтичних антитіл або інших відомих агентів для лікування і/або попередження раку, аутоїмунного захворювання, інфекційного захворювання або інтоксикації.
У деяких варіантах винаходу одну або більше молекул відповідно до винаходу вводять ссавцю, переважно людині, одночасно з одним або декількома іншими терапевтичними агентами, використовуваними для лікування раку. Термін "конкурентно" не обмежується введенням профілактичних або терапевтичних агентів точно в той самий час, і може означати, що молекула відповідно до винаходу й інший агент можуть бути введені ссавцю у визначеній 60 послідовності і через визначені інтервали часу так, щоб молекула відповідно до винаходу могла діяти разом з іншим агентом і давати кращий ефект, ніж при якому-небудь іншому уведенні. Так, наприклад, використовувані профілактичні або терапевтичні агенти (наприклад, терапевтичні агенти, використовувані в хіміотерапії, променевій терапії, гормональній терапії або біологічній терапії) можуть бути введені одночасно або послідовно в будь-якому порядку й у різні періоди часу; однак, якщо вони не вводяться в той самий час, то вони повинні бути введені через досить короткий час так, щоб досягався потрібний терапевтичний або профілактичний ефект. Кожен терапевтичний агент може бути введений окремо, у будь-якій придатній формі і будь-яким придатним способом. У різних варіантах винаходу профілактичні або терапевтичні агенти вводять з інтервалом менше ніж 1 година, приблизно 1 година, приблизно 1-2 години, приблизно 2-3 години, приблизно 3-4 години, приблизно 4-5 годин, приблизно 5-6 годин, приблизно 6-7 годин, приблизно 7-8 годин, приблизно 8-9 годин, приблизно 9-10 годин, приблизно 10-11 годин, приблизно 11-12 годин, не більше ніж 24 години або не більше ніж 48 годин. У переважних варіантах винаходу два або більше компонентів вводять пацієнту за один візит.
В інших варіантах винаходу профілактичні або терапевтичні агенти вводять з інтервалом приблизно в 2-4 дні, приблизно в 4-6 днів, приблизно в 1 тиждень, приблизно в 1-2 тижні або більше ніж у 2 тижні. У переважних варіантах винаходу профілактичні або терапевтичні агенти вводять в інтервали часу, протягом яких ці агенти зберігають свою активність. Кожен фахівець у даній галузі може визначити такі інтервали часу шляхом оцінки часу напівжиття агентів, що вводяться.
У деяких варіантах винаходу профілактичні або терапевтичні агенти відповідно до винаходу вводять індивідууму періодично. Циклічна терапія включає введення спочатку першого агента протягом визначеного періоду часу, а потім уведення другого агента і/або третього агента протягом визначеного періоду часу і повторення такого послідовного введення. Циклічна терапія може знижувати ризик розвитку резистентності до однієї або більше терапій, а також усувати або послаблювати побічні ефекти однієї терапії і/або підвищувати ефективність терапії.
У деяких варіантах винаходу профілактичні або терапевтичні агенти вводять циклами, проведеними приблизно менше ніж за З тижні, приблизно кожні 2 тижні, приблизно кожні 10 днів або приблизно щотижня. Один цикл може включати введення терапевтичного або
Зо профілактичного агента шляхом уливання протягом приблизно 90 хвилин, приблизно 1 години, приблизно 45 хвилин за кожен цикл. Кожен цикл може включати перерву щонайменше в 1 тиждень, щонайменше в 2 тижні, щонайменше в З тижні. Число циклів уведення становить приблизно злитих 1 до приблизно 12 циклів, звичайно від приблизно 2 до приблизно 10 циклів, а найчастіше від приблизно 2 до приблизно 8 циклів.
В інших варіантах винаходу терапевтичні і профілактично агенти відповідно до винаходу вводять у режимі метрономного дозування, або шляхом безупинного уливання, або шляхом частого введення без тривалих інтервалів. Таке метрономне введення може включати постійне введення дози протягом інтервалів часу без перерв. Звичайно терапевтичні агенти, зокрема цитотоксичні агенти, вводять у більш низьких дозах. Такі схеми введення доз включають безупинне щоденне введення відносно низьких доз протягом тривалих періодів часу. У переважних варіантах винаходу використання низьких доз буде мінімізувати токсичні побічні ефекти і дозволить проводити лікування без перерв. У деяких варіантах винаходу терапевтичні і профілактичні агенти вводять шляхом безупинного уливання в низьких дозах або постійного уливання протягом періоду часу від приблизно 24 годин до приблизно 2 днів, до приблизно 1 тижня, до приблизно 2 тижнів, до приблизно З тижнів, до приблизно 1 місяця, до приблизно 2 місяців, до приблизно З місяців, до приблизно 4 місяців, до приблизно 5 місяців і до приблизно 6 місяців. Схема такого введення доз може бути оптимізована онкологом.
В інших варіантах винаходу курси лікування ссавця можуть бути проведені конкурентно, тобто, окремі дози терапевтичних агентів уводять окремо, але все-таки в той самий період часу, так, щоб молекули відповідно до винаходу діяли разом з іншим агентом або з іншими агентами.
Так, наприклад, один компонент може бути введений один раз на тиждень у комбінації з іншими компонентами, що можуть бути введені один раз на два тижні або один раз на три тижні.
Іншими словами, уведення доз терапевтичних засобів здійснюють у конкурентному режимі, навіть якщо терапевтичні засоби не вводяться одночасно або за один візит пацієнта.
Молекули відповідно до винаходу і профілактичний і/або терапевтичний агент, якщо вони використовуються в комбінації з іншими профілактичними і/або терапевтичними агентами, можуть діяти адитивно або, більш переважно, синергічно. В одному з варіантів винаходу молекулу відповідно до винаходу вводять одночасно з одним або більше терапевтичними агентами в одній і тій же фармацевтичній композиції. В іншому варіанті винаходу молекулу 60 відповідно до винаходу вводять конкурентно з одним або більше терапевтичними агентами в окремих фармацевтичних композиціях. В іншому варіанті винаходу молекулу відповідно до винаходу вводять до або після введення іншого профілактичного або терапевтичного агента. У даному винаході розглядається введення молекули відповідно до винаходу в комбінації з іншими профілактичними або терапевтичними агентами тим самим способом або різними способами введення, наприклад, перорально і парентерально. У деяких варіантах винаходу, якщо молекулу відповідно до винаходу вводять конкурентно з іншим профілактичним або терапевтичним агентом, що може викликати небажані побічні ефекти, включаючи, але не обмежуючись ними, токсичну дію, то такий профілактичний або терапевтичний агент переважно вводять у дозі нижче граничної дози, при якій може вироблятися небажаний побічний ефект.
Терміни "терапевтично ефективний" і "профілактично ефективний" охоплюють кількості доз і частоту їхнього введення, описані в даній заявці. Такі дози і частота їх введення звичайно варіюються залежно від індивідуальних особливостей, характерних для кожного конкретного пацієнта, а саме, залежно від терапевтичних або профілактичних агентів, які конкретно вводяться, тяжкості і типу ракового захворювання, способу введення, а також від віку, маси тіла, сприйнятливості й історії хвороби пацієнта. Придатні схеми лікування можуть бути вибрані фахівцем у даній галузі з урахуванням вказаних факторів і відповідно до доз, наприклад, описаних в літературі і рекомендованих в посібнику Рпузісіап'є ОезК Реїегепсе (56! єйд., 2002). 5.5.5. Протиракові засоби
У конкретному варіанті винаходу способи відповідно до винаходу включають введення однієї або більше молекул відповідно до винаходу разом з одним або більше терапевтичними агентами, використовуваними для лікування і/або попередження раку. В одному з варіантів винаходу інгібітори ангіогенезу можуть бути введені в комбінації з молекулами відповідно до винаходу. Інгібіторами ангіогенезу, що можуть бути використані в способах і композиціях відповідно до винаходу, є, але не обмежуються ними, ангіостатин (фрагмент плазміногену); антиангіогенний антитромбін І; ангіозим; АВТ-627; Вау 12-9566; бенефін; бевацизумаб; ВМ5- 275291; хрящовий інгібітор (СОЇ); СА!; фрагмент комплементу СО59; СЕР-7055; Со! 3; комбретастатин А-4; ендостатин (фрагмент колагену ХМ); фрагмент фібронектину; сго-бета; галофугінон; гепаринази; гексасахаридний фрагмент гепарину; НММУ833; людський хоріонічний гонадотропін (пос); ІМ-862; інтерферон альфа/бета/гамма, індуцибельний білок інтерферон (ІР-
Зо 10); інтерлейкін-12; Ктгіпдіє 5 (фрагмент плазміногену); маримастат; інгібітори металопротеїнази (ТІМР); 2-метоксіестрадіол; ММІ 270 (СбОо5 27023А); МоАбр ІМО-1С11; неовастат; ММ-3; панзем;
РІ-88; плацентарний інгібітор рибонуклеази; інгібітор активатора плазміногену; тромбоцитарний фактор-4 (РЕ4); приномастат; 16 кДа-фрагмент пролактину; білок, споріднений проліферину (РЕР); РТК 787/2К 222594; ретиноїди; солімастат; скваламін; 55 3304; 5 5416; 506668; 511248; тетрагідрокортизол-5; тетратіомолібдат; талідомід; тромбоспондин-1 (ТОР-1); ТМР- 470; трансформуючий фактор росту-бета (ТОБЕ-Б); васкулостатин; вазостатин (фрагмент кальретикуліну); 206126; 20 6474; інгібітори фарензилтрансферази (ЕТІ); і бісфосфонати.
Протираковими засобами, що можуть бути використані в комбінації з молекулами відповідно до винаходу в різних варіантах винаходу, включаючи фармацевтичні композиції, лікарські форми і набори відповідно до винаходу, є, але не обмежуються ними: ацивіцин; акларубіцин; гідрохлорид акодазолу; акронін; адозелезин; альдеслейкін; альтретамін; амбоміцин; ацетат аметантрону; аміноглютетимід; амсакрин; анастрозол; антраміцин; аспарагіназа; асперлін; азацитидин; азатепа; азотоміцин; батимастат; бензодепа; бікалутамід; гідрохлорид бізантрена; димезилат біснафіду; бізелезин; сульфат блеоміцину; брехінар-натрій; бропіримін; бусульфан; кактиноміцин; калустерон; карацимід; карбетимер; карбоплатин; кармустин; гідрохлорид карубіцину; карзелезин; цедефінгол; хлорамбуцил; циролеміцин; цисплатин; кладрибін; мезилат криснатолу; циклофосфамід; цитарабін; дакарбазин; дактиноміцин; гідрохлорид даунорубіцину; децитабін; дексормаплатин; дезагуанін; мезилат дезагуаніну; діазиквон; доцетаксел; доксорубіцин; гідрохлорид доксорубіцину; дролоксифен; цитрат дролоксифену; пропіонат дромостанолону; дуазоміцин; едатрексат; гідрохлорид ефлорнітину; елзамітруцин; енлопланин; енпромат; епіпропідин; гідрохлорид епірубіцина; ербулозол; гідрохлорид езорубіцину; естрамустин; фосфат естрамустину-натрію; етанідазол; етопозид; фосфат етопозиду; етоприн; гідрохлорид фадрозолу; фазарабин; фенретинід; флоксуридин; фосфат флударабіну; фторурацил; фторцитабін; фосхідон; фостриецин-натрій; гемцитабін; гідрохлорид гемцитабіну; гідроксисечовина; гідрохлорид ідарубіцину; іфосфамід; ілмофозин; інтерлейкін ІЇ (включаючи рекомбінантний інтерлейкін І або п/2); інтерферон-альфа-2а; інтерферон-альфа-2б; інтерферон-альфа-п1!; інтерферон-альфа-п3; інтерферон-бета-їа; інтерферон-гамма-1б; іпроплатин; гідрохлорид іринотекану; ацетат ланреотиду; летрозол; ацетат лейпроліду; гідрохлорид ліарозолу; лометрексол-натрій; ломустин; гідрохлорид лозоксантрону; мазопрокол; бо майтанзин; гідрохлорид мехлоретаміну; ацетат мегестролу; ацетат меленгестролу; мелфалан;
меногарил; меркаптопурин; метотрексат; метотрексат-натрій; метоприн; метуредопа; мітиндомід; мітокарцин; мітокромин; мітогілін; мітомальцин; мітоміцин; мітоспер; мітотан; гідрохлорид мітоксантрону; мікофенолова кислота; нокодазол; ногаламіцин; ормаплатин; оксисуран; паклітаксел; пегаспаргаза; пеліоміцин; пентамустин; сульфат пепломіцину; перфосфамід; піпоброман; піпосульфан; гідрохлорид піроксантрону; плікаміцин; пломестан; порфімер-натрій; порфіроміцин; преднімустин; гідрохлорид прокарбазину; пуроміцин; гідрохлорид пуроміцину; піразофурин; рибоприн; роглетимід; сафінгол; гідрохлорид сафінголу; семустин; симтразен; спарфозат-натрій; спарсомецин; гідрохлорид спірогерманію; спіромустин; спіроплатин; стрептонігрин; стрептозоцин; сулофенур; талізоміцин; текогалан-натрій; тегафур; гідрохлорид телоксантрону; темопорфін; теніпозид; тероксирон; тестолактон; тіаміприн; тіогуанін; тіотепа; тіаазофурин; тирапазамін; цитрат тореміфену; ацетат трестолону; фосфат трицирибіну; триметрексат; глюкуронат триметрексату; трипторелін; гідрохлорид тубулозолу; урациловий аналог гірчичного газу; уредепа; вапреотид; вертепорфин; сульфат вінбластину; сульфат вінкристину; віндезин; сульфат віндезину; сульфат вінепідину; сульфат вінгліцинату; сульфат вінлейрозину; тартрат вінорелбіну; сульфат вінрозидину; сульфат вінзолідину; ворозол; зеніплатин; зиностатин; гідрохлорид зорубіцину. Іншими протираковими лікарськими засобами є, але не обмежуються ними, 20-епі-1,25-дигідроксивітамін 03; 5-етинілурацил; абіратерон; акларубіцин; ацилфульвен; адеципенол; адозелезин; альдеслейкін; антагоністи
АГ -ТК; альтретамін; амбамістин; амідокс і аміфостин; амінолевулінова кислота; амрубіцин; амсакрин; анагрелід, анастрозол; андрографолід; інгібітори ангіогенезу; антагоніст О; антагоніст б; антарелікс; антидорсальний морфогенний білок-1; антиандроген проти карциноми передміхурової залози; антиестроген; антинеопластон; антисмислові олігонуклеотиди; гліцинат афідиколіну; генні модулятори апоптозу; регулятори апоптозу; апуринова кислота; ага-СОР-РІ -
РТВА; аригінін-деаміназа; азулакрин; атаместан; атримустин; аксинастин 1; аксинастин 2; аксинастин 3; азазетрон; азатоксин; азатирозин; похідні баккатину І; баланол; батимастат; антагоністи ВСК/АВІ; бензохлорини; бензоїлстауроспорин; похідні бета-лактаму; бета-алетин; бетакламіцин В; бетулінова кислота; інгібітор БЕСЕ; бікалутамід; бізантрен; бісазиридинілсоспермін; біснафид; бістратен А; бізелезин; брефлат; бропіримін; будотитан; бутіонін-сульфоксимин; кальципотриол; кальфостин С; похідні камптотецину; канарипокс ЇЇ -2;
Зо капецитабін; карбоксамідамінотриазол; карбоксіамінотриазол; СаКевзі М3; САК 700; хрящовий інгібітор; карзелезин; інгібітор казеїнкінази (ІСО5); кастаноспермін; цекропин В; цетрорелікс; хлор; сульфонамід хлорхіноксаліну; цикапрост; цис-порфірин; кладрибін; аналоги кломіфену; клотримазол; колісміцин А; колісміцин В; комбретастатин А4; аналог комбретастатину; конагенін; крамбесцидин 816; криснатол; криптофіцин 8; похідні криптофіцину А; курацин А; циклопентантрахінони; циклоплатам; ципеміцин; окфосфат цитарабіну; цитолітичний фактор; цитостатин; дакліксимаб; децитабін; дегідродидемнін В; деслорелін; дексаметазон; дексифосфамід; декстразоксан; дексверапамил; діазиквон; дидемнін В; дидокс; діетилнорспермін; дигідро-5-азацитидин; дигідротаксол, О9-дигідротаксол; діоксаміцин; дифенілсопіромустин; доцетоксел; докозанол; доласетрон; доксифлуридин; дролоксифен; дронабінол; дуокарміцин 5А; ебселен; екомустин; еделфозин; едреколомаб; ефлорнітин; елемен; емитефур; епірубіцин; епістерид; аналог естрамустину; агоністи естрогену; антагоністи естрогену; етанідазол; фосфат етопозиду; екземестан; фадрозол; фазарабін; фенретинід; філграстим; фінастерид; флавопіридол; флезеластин; флуастерон; флударабін; гідрохлорид фтордауноруніцину; форфенімекс; форместан; фостриецин; фотемустин; тексаферин-гадоліній; нітрат галію; галоцитабін; ганірелікс; інгібітори желатинази; гемцитабін; інгібітори глутатіону; гепсульфам; герегулін; гексаметиленбісацетамід; гіперицин; ібандронова кислота; ідарубіцин; ідоксифен; ідрамантон; ілмофозин; іломастат; імідазоакридони; іміхімод; імуностимулюючі пептиди; інгібітори рецептора інсулінподібного фактора росту 1; агоністи інтерферону; інтерферони; інтерлейкіни; йобенгуан; йододоксорубіцин; іпомеанол, 4-іпомеанол; іроплакт; ірзогладин; ізобенгазол; ізогомогалікондрин В; ітасетрон; ясплакінолід; кагалалід Е; ламеларин-
М-триацетат; ланреотид; лейнаміцин; ленограстим; сульфат лентинану; лептолстатин; летрозол; фактор інгібування лейкозу; лейкоцитарний альфа-інтерферон; лейпролід-естроген- прогестерон; лейпрорелін; левамізол; ліарозол; аналог поліаміну з прямим ланцюгом; ліпофільний дисахаридний пептид; ліпофільні сполуки платини; лісоклінамід 7; лобаплатин; ломбрицин; лометрексол; лонідамін; лозоксантрон; ловастатин; локсорибін; луртотекан; тексафірин-лютецій; лізофілін; літичні пептиди; майтанзин; маностатин А; маримастат; мазопрокол; маспін; інгібітори матрилізину; інгібітори металопротеїнази матрикса; меногарин; мербарон; метерелін; метіоніназа; метоклопрамід; інгібітор МІЕ; міфепристон; мілтефозин; міримостим; дволанцюжкова РНК із помилковим спарюванням основ; мітогуазон; мітолактол; бо аналоги мітоміцину; мітонафид; мітотоксиновий фактор росту фібробластів - сапорин;
мітоксантрон; мофаротен; молграмостим; моноклональне антитіло; людський хоріонічний гонадотропін; монофосфорил-ліпід А ж клітинна стінка міобактерій 5К; мопідамол; інгібітор гена резистентності до багатьох лікарських засобів; терапевтичний засіб на основі інгібітору 1 багатьох пухлин; протираковий засіб на основі гірчичного газу; мікапероксид В; екстракт клітинної стінки мікобактерій; міріапорон; М-ацетилдиналін; М-заміщені бензаміди; нафарелін; нагрестип; налоксонпентазоцин; напавин; нафтерпін; нартограстим; недаплатин; неморубіцин; неридронова кислота; нейтральна ендопептидаза; нілутамід; нізаміцин; модулятори на основі оксиду азоту; антиоксидант нітроксид; нітрулін; О-б-бензилгуанін; октреотид; окиценон; олігонуклеотиди; онапристон; ондансетрон; ондансетрон; орацин; цитокіновий індуктор для перорального введення; ормаплатин; озатерон; оксаліплатин; оксауноміцин; паклітаксел; аналоги паклітакселу; похідні паклітакселу; палауамін; пальмітоїлтізоксин; памідронова кислота; панакситриол; паноміфен; парабіктин; пазеліптин; пегаспаргаза; пелдезин; полісульфат пентозану-натрію; пентостатин; пентрозол; перфлуброн; перфосфамід; периліловий спирт; феназиноміцин; фенілацетат; інгібітори фосфатази; піцибаніл; гідрохлорид пілокарпіну; пірарубіцин; піритрексим; плацетин А; плацетин В; інгібітор активатора плазміногену; платиновий комплекс; сполуки платини; комплекси "платина-триамін"; порфімер-натрій; порфіроміцин; преднізон; пропіл-біс-акридон; простагландин 92; інгібітори протеасоми; імунний модулятор на основі білка А; інгібітор протеїнкінази С; інгібітори протеїнкінази С; мікроалгал; інгібітори протеїнтирозинфосфатази; інгібітори пурин-нуклеозид-фосфорилази; пурпурини; піразолоакридин; кон'югат "піридоксилований гемоглобін-поліоксіетилен"; антагоністи гаї, ралтитрексед; рамосетрон; інгібітори фарнезил-протеїнтрансферази гав; інгібітори гав; інгібітор га5-САР; деметилований ретелліптин; етидронат ренію Ке 186; ризоксин; рибозими; ретинамід
ВІЇ; роглетимід; рохітукін; ромутрид; рохінімекс; рубігінон В1; рубоксил; сафінгол; саїнтопін; за(СМи; саркофітол А; сарграмостим; міметики зЗаї 1; семустин; асоційований зі старінням інгібітор 1; смислові олігонуклеотиди; інгібітори передачі сигналу; модулятори передачі сигналу; одноланцюжковий антигензв'язувальний білок; сизофіран; собузоксан; борокаптат натрію; фенілацетат натрію; сольверол; білок, що зв'язується із соматомідином; сонермін; спарфозинова кислота; спікаміцин О; спіромустин; спленопентин; спонгістатин 1; скваламін; інгібітор стовбурових клітин; інгібітори розподілу стовбурових клітин; стипіамід; інгібітори
Зо стромелізину; сульфінозин; антагоніст суперактивного вазоактивного кишкового пептиду; сурадиста; сурамін; сваінсонін; синтетичні глікозаміноглікани; таллімустин; метйодид тамоксифену; тауромустин; тазаротен; текогалан-натрій; тегафур; телурапірилій; інгібітори теломерази; тенопорфін; темозоломід; теніпозид; тетрахлордекаоксид; тетразомін; талібластин; тіокоралін; тромбопоетин; міметик тромбопоетину; тималфазин; агоніст рецептора тимопоетину; тимотринан; тиреоїдстимулюючий гормон; етилетіопурпуринолово; тирапазамін; біхлорид титаноцену; топсентин; тореміфен; фактор тотипотентних стовбурових клітин; інгібітори трансляції; третиноїн; триацетилуридин; трицирибін; триметрексат; трипторелін; тропісетрон; туростерид; інгібітори тирозинкінази; тирфостини; інгібітори ОВС; убенімекс; фактор інгібування росту, який походить від урогенітального синуса; антагоністи урокіназного рецептора; вапреотид; варіолін В; векторна система; еритроцитарний фактор для генотерапії; веларезол; верамін; вердини; вертепорфін; вінорелбін; вінксалтин; вітаксин; ворозол; занотерон; зеніплатин; зиласкорб і зиностатиновий стималамер. Переважними додатковими протираковими лікарськими засобами є 5-фторурацил і лейковорин.
Прикладами терапевтичних антитіл, які можуть бути використані в способах відповідно до винаходу, є, але не обмежуються ними, 7ЕМАРАХФ (даклізумаб) (Коспе РПагтасеціїсаї5,
Зм/йлегпапа), що являє собою імуносупресорне гуманізоване моноклональне анти-С025 антитіло, використовуване для попередження гострого відторгнення ниркового алотрансплантата; РАМОКЕХ "М, який являє собою мишаче антитіло (дДСбга проти антигену клітинної поверхні 17-1А (Сіахо УМмеЙсоте/Сепіосо); ВЕС2, що являє собою мишаче антиідіотипове антитіло да (проти епітопа 503) (тСіопе Зубіет); ІМСО-С225, що являє собою химерне анти-ЕСЕР антитіло ІДС (ІптСіопе бЗузіет); МІТАХІМ'"М, що являє собою гуманізоване антитіло проти інтегрину УВЗ3 (Арріїеа Моїесшаг Емоїшіоп/МеаІттипе); Зтагі М195, що являє собою гуманізоване анти-СО33 антитіло дае (Ргоївіп Оєзідп Гар/Каперо); СУМРНОСІОЕ М, що являє собою гуманізоване анти-СО22 антитіло ЇдСсї (Іттипотедісв); ІСМЗ3, що являє собою гуманізоване анти-ІСАМЗ антитіло (ІСО5 Ріагт); ІОЕС-114, що являє собою "приматизоване" анти-СО80 антитіло (0ЕС РІапт/Міїзирібхйі); ІОЕС-131, що являє собою гуманізоване анти-
СО40Ї антитіло (ІЮЕС/Еїзаї); ІПОЕС-151, що являє собою "приматизоване" анти-СО4 антитіло (ІЕС); ІОЕС-152, що являє собою "приматизоване" анти-СО23 антитіло ІЮЕС/ЗеїКадаки); анти-
СОЗ антитіло ЗМАКТ, що являє собою гуманізоване анти-СОЗ антитіло да (Ргоївєїп Оєзідп І ар); бо 501.1, що являє собою гуманізоване антитіло проти фактора комплементу 5 (С5) (АЇІехіоп
РПпапгт); 02Е7, що являє собою гуманізоване анти-ТМЕ-а антитіло (САТ/ВАБЕ); СОРВ870, що являє собою гуманізований РГар-фрагмент анти-ТМЕ-с антитіла (СеШесі); ІОЕС-151, що являє собою "приматизоване" анти-СО4 антитіло (951 (І0ЕС РІагт/5тіййКіїпе Вееспат); МОХ-С04, що являє собою людське анти-СО4 антитіло Ід (Медагех/Еізаї//Зептабв); СОР571, що являє собою гуманізоване анти-ТМЕ-а антитіло Іда4 (СеІПесп); ГОР-02, що являє собою гуманізоване анти-а487 антитіло (ГейКко5не/зЗепепіесйп); ОгйпоСіопе ОКТ4А, що являє собою гуманізоване анти-СО4 антитіло ІДС (Огійо Віоїесі); АМТОМА "М, що являє собою гуманізоване анти-СО40І. антитіло Ідеї (Віодеп); АМТЕСАЕМ "М, що являє собою гуманізоване анти-мі А-4 антитіло Іде (ЕІап); і САТ-152, що людське анти-ТОЕ-В2 антитіло (Сатргідде АБ Тесі). Інші приклади терапевтичних антитіл, що можуть бути використані відповідно до даного винаходу, представлені в таблиці 8.
Таблиця 8
Протиракові терапевтичні антитіла
Ардепіх АВХ-ЕСЕ Рак Рецептор ЕСЕ
АнпанНех ОмаВех Рак яєчника Пухлинний антиген СА125
ВгахаНех Метастазуючий рак Пухлинний антиген МОС1
Апіізота ТНнегадуп Рак яєчника Антиген РЕМ (пемтумомаб-ітрій-90)
Тпегех Рак молочної залози Антиген РЕМ
Сепосог/) ву Рапогех Рак прямої й ободової кишки |17-1А
Согіха ВеоРго РТСА др ШБ/Па
ВеоРго Гострий ІМ др ШБ/Па
ВеоРго Ішемічний інсульт др ШБ/Па
Вехосаг нНХл бог20 105А07 вакцина
Стисеїй 00 ЇАнтиЕрСАМ Рак ЕРСАМГ///
Сепепіесн Герцептин Метастазуючий рак молочної |НЕВ-2
Герцептин залози НЕНВ-2
Ритуксан Рання стадія раку молочної бог20
Ритуксан залози бог20
МАБ-ЄМХЕСЕ Рецидивуюча/яка не Угакг
МАБ-УМЕСЕ піддається лікуванню МЕСЕ низькозлоякісна або фолікулярна НХЛ
Середньозлоякісна і високозлоякісна НХЛ
Метастазуюча
МС 5 (недрібно-клітинна карцинома легень)
Метастазуючий рак прямої й ободової кишки
АМО Рар Вікова дегенерація жовтої Сор18
Е-26 (2-ої генерації) плями ІЗЕ деп. ЗЕ Алергійна астма і риніт
ІЕС Зевалин (Ритуксан Низькозлоякісна фолікулярна, | СО2О т ітрій-90) рецидивуюча або яка не піддається лікуванню СО20- позитивна В-клітинна НХЛ і
НХЛ, що не піддається лікуванню ритуксимабом
ІтСіопе Цетуксимаб -- інотекан | Яка не піддається лікуванню |Рецептор ЕСЕ
Цетуксимаб їж карцинома прямої й ободової | Рецептор ЕСЕ цисплатин і променева)| кишки Рецептор ЕСЕ терапія Діагностований де помо або Рецептор ЕСЕ
Цетуксимаб їж рецидивуючий рак голови і Рецептор ЕСЕ гемцитабін шиї Рецептор ЕСЕ
Цетуксимаб їж Діагностована де помо Рецептор ЕСЕ цисплатин ї- 5 або | метастазуюча карцинома Міметик таксол підшлункової залози гангліозиду СОЮЗ
Цетуксимаб їж Рецидивуючий або Міметик карбоплатин їх метастазуючий рак голови і гангліозиду СОЮЗ паклітаксел шиї УЕгаг-рецептор
Цетуксимаб їж Діагностована де помо цисплатин недрібноклітинна карцинома
Цетуксимаб їж легень променева терапія Рак голови і шиї (велике
ВЕС2 яз бацила неоперабельне локально-
Кальметта-Герена регіональне захворювання і
ВЕС2 яз бацила метастази в периферичні
Кальметта-Герена ділянки)
ІМО-1С11 Локально прогресуюча карцинома голови і шиї
Дрібноклітинна карцинома легень
Меланома
Рак прямої й ободової кишки з метастазами в печінку шлунка і підшлункової залози
ІттипоМеаісв5 ГутрпосСіде Неходжкінська лімфома сбор22
ГутрпосСіде Уу-90 Неходжкінська лімфома сбор22
СЕА-Сіає Метастазуючі солідні пухлини | СЕА
СЕА-Сіде х-90 Метастазуючі солідні пухлини | СЕА
СЕА-5сап (То-99т- Рак прямої й ободової кишки |СЕА мічений арцитумомаб) | (рентгенограма) СЕА
СЕА-5сап (То-99т- Рак молочної залози СЕА мічений арцитумомаб) | (рентгенограма) СЕА
СЕА-5сап (То-99т- Рак легень СЕА мічений арцитумомаб) | (рентгенограма) сбор22
СЕА-5сап (То-99т- Післяопераційні пухлини АЕР мічений арцитумомаб) | (рентгенограма)
Ї енкозсап (То-99т- Інфекція м'яких тканин мічений сулесомаб) (рентгенограма)
Ї енкозсап (То-99т- |Лімфоми (рентгенограма) мічений) Рак зародкових клітин печінки
АЕР-5сап (То-99т- 7 мічений) (рентгенограма)
Іпігасе!| НитанвАр-НМ (- Рак голови і шиї МА ітрій-90) Візуалізація прямої й ободової| МА
Нита5РЕСТ кишки
Медагех МОХ-101(СТІ А-4) Рак передміхурової залози й | СТІ А-4
Медіттипе МОХх-210 інших органів НЕНВ-2
Мегек КСад (надекспресія Пег-2) Рак передміхурової залози НЕНВ-2
МОХ-210/МАК Рак амВз
Вітаксин Рак Рецептор ЕСЕ
МАБ 425 Різні ракові захворювання Ер-САМ
І-І 2 Різні ракові захворювання
МіПеппійт Сатрай Хронічний лімфо-цитарний сор52
МеоНх (алемтузумаб) лейкоз бог20
СОг0-стрептавідин (ж | Неходжкінська лімфома МА біотин-ітрій 90) Метастазуючий рак
Авідицин (альбумін їж
МАСО1З
Регедгіпе Онколім (ж йод-131) Неходжкінська лімфома НГА-ОЕ 10 бета
Соїага (ї- йод-131) Неоперабельна злоякісна ДНК-асоційовані гліома білки
Рпагтасіа С215 (ж стафіло- Рак підшлункової залози МА
Согрогайоп коковий ентеротоксин) | Рак легень і нирок МА
МАБ, рак легень/нирок | Рак товстої кишки і МА
Наколомаб підшлункової залози тафенатокс (С242 їх стафіло-коковий ентеротоксин)
Ргоївїп Оеєзідпіарв /|Нувіон Т-клітинні злоякісні пухлини СоЗ
ЗМАВТ М195 АМІ. век)
ЗМАНВТ 1010 нНХхл Антиген НГ А-ОВ
Тіап СЕАМас Прогресуючий рак прямої й СЕА
ТИіСет ободової кишки саОг-гангліозид
Тр Метастазуюча меланома і МиС-1 дрібноклітинний рак легень
Метастазуючий рак молочної залози
Тиех СЕАМас Прогресуючий рак прямої й СЕА
ТИіСет ободової кишки саОг-гангліозид
Тр Метастазуюча меланома і МиС-1 дрібноклітинний рак легень
Метастазуючий рак молочної залози
Мімепійа Віоїтесп Радіоактивно мічене |Неходжкінська лімфома МА
МохомМАБ-Сс2 Карцинома прямої й ободової | Антиген ЗК-1
Мопорнагт С кишки і підшлункової залози МА
СПІОМАБ-Н (Ж токсин Гліома, меланома і гелонін) нейробластома
Хота Ритуксан Рецидивуюча/яка не бог20
Ритуксан піддається лікуванню Сорго
ІМО-1 низькозлоякісна Ер-САМ або фолікулярна НХЛ
Середньозлоякісна і високозлоякісна НХЛ
Аденокарцинома 5.5.6. Імуномодулюючі і протизапальні засоби
Даний винахід стосується способів лікування аутоїмунних і запальних захворювань, які включають уведення молекул відповідно до винаходу в комбінації з іншими терапевтичними агентами. Прикладами імуномодулюючих агентів є, але не обмежуються ними, метотрексат,
ЕМВАЕЇ, КЕМІСАОРЕ М, лефлуномід, циклофосфамід, циклоспорин А, макролідні антибіотики (наприклад, ЕК5Об (такролімус)), метилпреднізолон (МР), кортикостероїди, стероїди, мікофенолят мофетил, рапаміцин (сиролімус), мізорибін, дезоксиспергуалін, брехінар, малононітрилоаміди (наприклад, лефлуномід), модулятори Т-клітинних рецепторів і модулятори цитокінових рецепторів.
Протизапальні засоби можуть бути з успіхом застосовані для лікування запальних і аутоїмунних розладів, і в даний час найбільш часто застосовуються як стандартні засоби для лікування таких розладів. У способах відповідно до винаходу можуть бути використані будь-які протизапальні засоби, добре відомі фахівцям. Необмежувальними прикладами протизапальних засобів є нестероїдні протизапальні засоби (НПЗ33), стероїдні протизапальні засоби, бета- агоністи, антихолінергичні засоби і метилксантини. Прикладами НПЗЗ є, але не обмежуються ними, аспірин, ібупрофен, целекоксиб (СЕГЕВКЕХ М), диклофенак (МОГ ТАКЕМ"М), етодолак (ГОБІМЕ М), фенопрофен (МАГРОМ"М), індометацин (ІМОСОСІМ"М), кеторалак (ТОКАБОЇ тм), оксапрозин (ОАЖМРКО М), набументон (КЕГАРЕМ'"М), суліндак (СГІМОКРКІСТМ), толментин (ТОГЕСТІМ"М), рофекоксиб (МІОХХ"М) внапроксен (АГЕМЕ"М, МАРКОБУМ"М) кетопрофен (АСТКОМ"М) і набуметон (КЕГАРЕМ'М). Такі НПЗЗ функціонують за допомогою інгібування ферменту циклооксигенази (наприклад, СОХ-1 і/або СОХ-2). Прикладами стероїдних протизапальних засобів є, але не обмежуються ними, глюкокортикоїди, дексаметазон (ОЕСАЮКОМ'М), кортизон, гідрокортизон, преднізон (ОБГ ТАБОМЕ"М), преднізолон, триамцинолон, азулфідин і ейкозаноїди, такі як простагландини, тромбоксани і лейкротриєни.
Необмежувальні приклади антитіл, що можуть бути використані для лікування або попередження запальних розладів у комбінації з молекулами відповідно до винаходу, представлені в таблиці 9, а необмежувальні приклади антитіл, що можуть бути використані для лікування або попередження аутоімунного розладу, представлені в таблиці 10.
Таблиця 9
Терапевтичні антитіла, використовувані для лікування запальних захворювань нене лше |тееюунни! сни | неее й й ип продукту | Ізотип Спонсори Показання антитіла мішень (С5) артрит (С5) (С5) (С5) шунтування (С5) (С5)
ОГО де "трансплантат проти хазяїна" (зУнНО) алотрансплан-тата
СОт1т1а
Іттипоїесп алотрансплантата алотрансплантата артрит
СОРВБО (Е-селектин |Гуманізований / |СеШеси (Псоріаз, /-://-О (Согземп М |(Фактор- МІ |Химерний / |Сепюсог // (|Антикоагулянт//З вв ШІ ен артрит нигзг2е (СО11/18 |Гуманізований / СО 5Рпаптійс Розсіяний склероз ст4 //1с014 | 77777771 ПСО5РБатійс 0 |Токсичнийшоку//
ПСМ3 ПСАМ-З 0 |Гуманізований | ДІСО5Рпапттийс 0 |Псоріаз,/З по АшЕ ф|тетнкуТнт сти | пяе й й Тип продукту | Ізотип Спонсори Показання антитіла мішень ве ше, роди ее ванний Міївибів пі 0ОЕС-131 1С0401 |Гуманізований / ІОЕс Рпаптуєіваі (СВ :: :ГРЕ 0ОЕС-131 1С0401 |Гуманізований / ІОЕс; РпаптуЕіваї |Розсіяний склероз ваний ЗтИНКІїпе артрит тек он ше | сорок ваний артрит інтегрин Ї еикозійе Іпс. інтегрин Ї еикозійе Іпс. алотрансплантата
ВОНИ ілі інь НН сі НИЙ нні 7 І еикобіїе Іпс. порту» гематологічні розлади артрит
ОМЕОІ507 |С02 |Гуманізований / |Медіттипес (Псоріаз, //-/-:О/
ОМЕОІ-507 |С02 |Гуманізований / |Медбйїттипемюс (сно (Гу алотрансплантата
ОКТЯА захворювання анти-СОЗ алотрансплантата
ОКктЗ
Арсіхітар коронарної ангіопластики мапів/Тапох
Віозузівт5 5В-240563 15 |Гуманізований / |СіахобтійКіпе (Астма/алергія 5В-240683 14 |Гуманізований / |СіахобтійКіпе (Астма/алергія
ЗСНЬБ700 015 00 |Гуманізований / | СеШесп/бспейпо (|Астма/алергія алотрансплантата
ТЕТ» о ення нене оо анти-СОЗ захворювання
Ен ісінН сс ШИНИ ііі ен анти-СОЗ алотрансплантата анти-СОЗ
Гар/Нойтанп-І а НКоспе)| алотрансплантата
Таблиця 10
Терапевтичні антитіла для лікування аутоімунних розладів
АВХ-СОВІ Антитіло проти антигену СВІ. на Т-клітинах, В-клітинах і МК- клітинах, повністю людське антитіло від Хепотоизе 538 (антитіло проти антигену | Випробування фази ІІ припиняли! СО-40
СОра40) в жовтні 1999 р. і оцінювали "побічні ефекти» (СЧВ) антитіло антитіло антитіло антитіло склероз; хвороба Крона; псоріаз
ГОР-02 (анти-В7 тАбБ) Запальне захворювання Рецептор інтегрину а4607 на кишечнику, хвороба Крона, лейкоцитах виразковий коліт інтерферону гама гамма (Вертепортин 0 |Ревматоїдднийартрит/://О/| //:(КЛ ССС: (
МОох-33 Хвороби крові, які викликаються | Моноклональне антитіло аутоїмунними реакціями, проти рецепторів ЕсСКІ ідіопатична тромбоцитопенічна пурпура (ІТР), аутоїмунна гемолітична анемія мМОох-сра4 Лікування ревматоїдного артриту) Моноклональне антитіло й інших аутоїмунних проти молекули рецептора захворювань Сбор4
УХ-497 Аутоімунні розлади, розсіяний Інгібітори інозин-монофосфат- склероз, ревматоїдний артрит, | дегідрогенази (ферменту, запальне захворювання необхідного для продукування кишечнику, вовчак, псоріаз нової РНК і ДНК, використовуваних для продукування нуклеотидів, необхідних для проліферації лімфоцитів)
Ух-740 Ревматоїдний артрит Інгібітор ІСЕ, інтерлейкіну-1 бета (конвертуючого ферменту шляхів регуляції, що викликають агресивну імунну відповідь)
УХ-745 специфічне до запалення і що Інгібітор кінази РЗ3ВМАР, тобто бере участь у хімічній передачі |активованої мітогеном сигналу запуску імунної відповіді | протеїнкінази і прогресування запалення тен | вену пухлини)
І -8 повністю людське моноклональне антитіло проти 1-8 (інтерлейкіну 8)
Ародеп МРА Рекомбінантний антиген, що селективно руйнує асоційовані з захворюванням
Т-клітини і індукує апоптоз Т- клітин, які елімінуються за допомогою запрограмованої загибелі клітин, що більше не атакують свої власні клітини в організмі, тобто, індукує апоптоз мішень-специфічних
Т-клітин, які зв'язуються з апогеном 5.5.7. Агенти, які можуть бути використані для лікування інфекційного захворювання
У деяких варіантах винаходу молекули відповідно до винаходу можуть бути введені в комбінації з терапевтично або профілактично ефективною кількістю одного або більше додаткових відомих терапевтичних засобів для лікування і/або попередження інфекційного захворювання. У даному винаході розглядається застосування молекул відповідно до винаходу в комбінації з відомими антибіотиками для лікування і/або попередження інфекційного захворювання. Антибіотиками, які можуть бути використані в комбінації з молекулами відповідно до винаходу, є, але не обмежуються ними, макролід (наприклад, тобраміцин (Тобріф))), цефалоспорин (наприклад, цефалексин (КеПехФб), цефрадин (Меіозегкве), цефуроксим (СейіпФф)), цефпрозил (Сейф), цефаклор (Сесіогб), цефіксим (Зиргах?) або цефадроксил (Юигісект)), кларитроміцин (наприклад, кларитроміцин (Віахіп?Ф)), еритроміцин (наприклад, еритроміцин (ЕмусіпФ)), пеніцилін (наприклад, пеніцилін М (М-Сійп КФ або Реп Мее КФ)) або хінолон (наприклад, офлоксацин (Ріохіп?), ципрофлоксацин (Сірго?) або норфлоксацин (МогохіпФ))), аміноглікозидні антибіотики (наприклад, апраміцин, арбекацин, бамберміцини, бутирозин, дибекацин, неоміцин, ундециленат, нетилміцин, паромоміцин, рибостаміцин, сисоміцин і спектиноміцин), амфеніколові антибіотики (наприклад, азидамфенікол, хлорамфенікол, флорфенікол і тіамфенікол), ансаміцинові антибіотики (наприклад, рифамід і рифампін), карбацефеми (наприклад, лоракарбеф), карбапенеми (наприклад, біапенем і іміпенем), цефалоспорини (наприклад, цефаклор, цефадроксил, цефамандол, цефатризин, цефазедон, цефозопран, цефпримізол, цефпірамід і цефпіром), цефаміцини (наприклад, цефбуперазон, цефметазол і цефмінокс), монобактами (наприклад, азтрионам, карумонам і тигемонам), оксацефеми (наприклад, фломоксеф і моксалактам), пеніциліни (наприклад, амдиноцелін, амдиноцилін півоксил, амоксицилін, бакампіцилін, бензилпеницилінова кислота, бензилпеницилін-натрій, епіцилін, фенбеніцилін, флоксацилін, пенамцилін, гідройодид пенетамату, о-бенетамінпеніцилін, пеніцилін 0, пеніцилін М, пеніцилін М-бензатин, пеніцилін М- гідрабамін, пенімепіциклін і фенцигіцилін-калій), лінкозаміди (наприклад, кліндаміцин і лінкоміцин), амфоміцин, бацитрацин, капреоміцин, колістин, ендурацидин, енвіоміцин, тетрацикліни (наприклад, апіциклін, хлортетрациклін, кломоциклін і демеклоциклін), 2,4-
Зо діамінопіримідини (наприклад, бродимоприм), нітрофурани (наприклад, фуралтадон і хлорид фуразолію), хінолони і їхні аналоги (наприклад, циноксацин, клінафлоксацин, флумехін і грепаглоксацин), сульфонаміди (наприклад, ацетилсульфаметоксипіразин, бензилсульфамід, ноприлсульфамід, фталілсульфацетамід, сульфакризоїдин і сульфацетин), сульфони (наприклад, діатимосульфон, глюкосульфон-натрій і соласульфон), циклосерин, мупіроцин і туберин.
У деяких варіантах винаходу молекули відповідно до винаходу можуть бути введені в комбінації з терапевтично або профілактично ефективною кількістю одного або більше протигрибкових засобів. Протигрибковими засобами, які можуть бути використані в комбінації з молекулами відповідно до винаходу, є, але не обмежуються ними, амфотерицин В, ітраконазол, кетоконазол, флуконазол, інтратекал, флуцитозин, міконазол, бутоконазол, клотримазол, ністатин, терконазол, тіоконазол, циклопірокс, еконазол, галопрогрин, нафтифін, тербінафін, ундециленат і гризеофулдин.
У деяких варіантах винаходу молекули відповідно до винаходу можуть бути введені в комбінації з терапевтично або профілактично ефективною кількістю одного або більше противірусних засобів. Придатними противірусними засобами, що можуть бути використані в комбінації з молекулами відповідно до винаходу, є, але не обмежуються ними, інгібітори протеази, нуклеозидні інгібітори зворотної транскриптази, ненуклеозидні інгібітори зворотної транскриптази і нуклеозидні аналоги. Прикладами противірусних засобів є, але не обмежуються ними, зидовудин, ацикловір, ганцикловір, відарабін, ідоксуридин, трифлуридин і рибавірин, а також фоскарнет, амантадин, римантадин, саквинавір, індинавір, ампренавір, лопінавір, ритонавір; альфа-інтерферони; адефовір, клевадин, ентекавір, плеконарил. 5.6. Вакцинна терапія
Даний винахід також охоплює застосування композиції відповідно до винаходу для індукування імунної відповіді проти антигенного або імуногенного агента, включаючи, але не обмежуючись ними, ракові антигени й антигени, що викликають інфекційні захворювання (приклади яких описані нижче). Вакцинні композиції відповідно до винаходу включають один або більш антигенних або імуногенних агентів, проти яких бажане виробляння імунної відповіді, де вказані один або більше антигенних або імуногенних агентів сенсибілізують варіантом антитіла відповідно до винаходу, що має підвищену афінність до ЕсукіІПША. Вакцинні композиції відповідно до винаходу є особливо ефективними для виробляння імунної відповіді, переважно протективної імунної відповіді проти антигенного або імуногенного агента.
У деяких варіантах винаходу антигенний або імуногенний агент у вакцинних композиціях відповідно до винаходу містить вірус, проти якого бажане виробляння імунної відповіді. Віруси можуть бути рекомбінантними або химерними, переважно атенуйованими. Продукування рекомбінантних, химерних і атенуйованих вірусів може бути здійснено стандартними відомими методами. Даний винахід охоплює "живу" рекомбінантну вірусну вакцину або інактивовану рекомбінантну вірусну вакцину, приготовлену відповідно до даного винаходу. "Жива" вакцина може бути переважною, оскільки її розмноження в хазяях приводить до пролонгованої стимуляції імунної відповіді того самого типу і рівня, що спостерігається при природних інфекціях, і тому ця вакцина надає в основному тривалий імунітет. Одержання таких "живих" вакцинних препаратів на основі рекомбінантних вірусів може бути здійснене із застосуванням стандартних методів, що включають розмноження вірусу в клітинній культурі або в алантоїсній рідини курячого ембріона з наступним очищенням.
У конкретному варіанті винаходу рекомбінантний вірус є непатогенним для індивідуума, якому його вводять. Відповідно до цього, для застосування генетично сконструйованих вірусів з метою вакцинування, може знадобитися присутність ознак атенуювання цих штамів. Уведення
Зо відповідних мутацій (наприклад, делецій) у матриці, використовувані для трансфекції, дозволяє одержати нові віруси з ознаками атенуювання. Наприклад, специфічні місенс-мутації, асоційовані з чутливістю до температури або адаптовані до холоду, можуть бути делеційними мутаціями. Ці мутації повинні бути більш стабільними, ніж точкові мутації, асоційовані з чутливими до холоду або до зміни температури мутантами, а кількість реверсивних мутацій повинно бути вкрай мало. Техніка рекомбінантних ДНК, застосовувана для конструювання рекомбінантних вірусів, відома фахівцям і входить в обсяг даного винаходу. Так, наприклад, методи модифікації РНК-вірусов з мінус-ланцюгом відомі фахівцям і описані, наприклад, у патенті США Мо 5166057, що у всій своїй повноті вводиться в даний опис за допомогою посилання.
Альтернативно, химерні віруси з "суїЇцидними" властивостями можуть бути сконструйовані з метою їхнього застосування у вакцинних препаратах для внутрішньошкірного уведення відповідно до винаходу. Такі віруси повинні проходити тільки один або невелике число циклів реплікації в хазяїна. При використанні як вакцини рекомбінантний вірус повинен проходити обмежене число циклів реплікації і індукувати достатній рівень імунної відповіді, але він не повинен розмножуватися у людини і викликати захворювання. Альтернативно, інактивований ("убитий") вірус може бути отриманий відповідно до даного винаходу. Інактивовані вакцинні препарати можуть бути приготовані стандартними методами "знищення" химерних вірусів.
Інактивовані вакцини є "убитими" у тому сенсі, що їхня інфекційність була нейтралізована. В ідеальному випадку інфекційність вірусу повинна бути нейтралізована так, щоб це не впливало на його імуногенність. Для одержання інактивованих вакцин химерні віруси можуть бути культивовані в клітинній культурі або в алантоїсній рідині курячого ембріона, а потім вони можуть бути очищені за допомогою зонального ультрацентрифугування, інактивовані формальдегідом або р-пропіолактоном і зібрані.
У деяких варіантах винаходу повністю чужорідні епітопи, включаючи антигени, які походять від інших вірусних або невірусних патогенів, можуть бути введені у вірус, який може бути використаний у вакцинних препаратах для внутрішньошкірного уведення відповідно до винаходу. Так, наприклад, антигени неспоріднених вірусів, таких як ВІЛ (др160, др120, дра), паразитарні антигени (наприклад, малярійні антигени), бактеріальні, грибкові або пухлинні антигени можуть бути сконструйовані у вигляді атенуйованого штаму.
Фактично, будь-яка послідовність гетерологічного гена може бути сконструйована у вигляді химерних вірусів відповідно до винаходу, що можуть бути використані у вакцинних препаратах для внутрішньошкірного введення. Переважно, послідовностями гетерологічних генів є молекули і пептиди, що діють як модифікатори біологічних відповідей. Переважно, епітопи, які індукують протективну імунну відповідь на кожній з ряду патогенів, або антигени, що зв'язуються з нейтралізуючими антитілами, можуть експресуватися химерними вірусами або як частина цих химерних вірусів. Так, наприклад, послідовностями гетерологічних генів, що можуть бути сконструйовані у вигляді химерних вірусів відповідно до винаходу, є, але не обмежуються ними, гемаглютинін і нейрамінідаза вірусу грипу і парагрипу, і гібридні глікопротеїни, такі як глікопротеїни, які кодуються генами НМ і ЕР людського РІМ3. В іншому варіанті винаходу послідовностями гетерологічних генів, що можуть бути сконструйовані у вигляді химерних вірусів, є послідовності, які кодують білки, що мають імуномодулюючу активність. Прикладами імуномодулюючих білків є, але не обмежуються ними, цитокіни, інтерферон типу 1, гамма- інтерферон, колонієстимулюючі фактори, інтерлейкін-1, -2, -4, -5, -6, -12 і антагоністи цих агентів.
В інших своїх варіантах, даний винахід охоплює патогенні клітини або віруси, переважно атенуйовані віруси, що експресують модифіковане антитіло на своїй поверхні.
В альтернативних варіантах винаходу вакцинні композиції відповідно до винаходу містять злитий поліпептид, де антигенний або імуногенний агент функціонально приєднаний до варіанта антитіла відповідно до винаходу, що має підвищену афінність до ЕсукША.
Конструювання гібридних поліпептидів, використовуваних у вакцинних композиціях відповідно до винаходу, здійснюють із застосуванням рутинної техніки рекомбінантної ДНК, відомої середньому фахівцю в даній галузі.
Даний винахід також охоплює способи індукування в індивідуума толерантності шляхом уведення композиції відповідно до винаходу. Переважно, композиція, що підходить для індукування толерантності в індивідуума, містить антигенний або імуногенний агент, покритий варіантом антитіла відповідно до винаходу, де вказаний варіант антитіла має підвищену афінність до ЕсуКіІІВ. Не обмежуючи яким-небудь конкретним механізмом дії, автори винаходу лише відзначають, що такі композиції є ефективними для індукування толерантності за
Зо допомогою активації ЕсуВІІВ-опосередковуваного інгібуючого шляху. 5.7. Композиції і способи введення
Даний винахід стосується способів і фармацевтичних композицій, що включають молекули відповідно до винаходу (тобто, діатіла), що містять множину епітоп-зв'язувальних доменів і необов'язково Ес-домен (або його частину). Даний винахід також стосується способів лікування, профілактики й ослаблення одного або більше симптомів, асоційованих із захворюванням, розладом або інфекцією, де вказані способи включають введення індивідууму ефективної кількості злитого білка або кон'югованої молекули відповідно до винаходу, або фармацевтичної композиції, що містить злитий білок або кон'юЮюговану молекулу відповідно до винаходу. У переважному аспекті винаходу антитіло, злитий білок або кон'югована молекула є, в основному, очищеними (тобто, по суті, не містять речовин, які можуть обмежувати їхню ефективність або продукування небажаних побічних ефектів). У конкретному варіанті винаходу вказаним індивідуумом є тварина, переважно ссавець, такий як ссавець, що не є приматом (наприклад, корови, свині, коня, кішки, собаки, щура і т. п.), і примат (наприклад, мавпи, такі як собакоподібна мавпа і людина). У переважному варіанті винаходу вказаним індивідуумом є людина. В іншому переважному варіанті винаходу, антитіло відповідно до винаходу походить від організму, що належить до такого ж виду, як і індивідуум.
Фахівцям відомі різні системи доставки, і такими системами доставки, що можуть бути використані для введення композиції, що містить молекули відповідно до винаходу, є, наприклад, капсули типу ліпосом, мікрочастинки, мікрокапсули, рекомбінантні клітини, здатні експресувати антитіло або злитий білок, опосередковуваний рецептором ендоцитоз (див., наприклад, Уми еї аї. (1987) "Кесеріог-Медіаїей Іп Міо Сепе Тгапеіоптайоп Ву А бБоЇшШбіє ОМА
Сатієї БЗувівт" У. Віої. Спет. 262:4429-4432); конструкції нуклеїнової кислоти як частини ретровірусного вектора або іншого вектора і т. п. Способами введення молекули відповідно до винаходу є, але не обмежуються ними, парентеральне введення (наприклад, внутрішньошкірне, внутрішньом'язове, внутрішньоочеревинне, внутрішньовенне і підшкірне введення), епідуральне введення і введення в слизову (наприклад, інтраназальне і пероральне введення). У конкретному варіанті винаходу молекули відповідно до винаходу уводять внутрішньом'язово, внутрішньовенно або підшкірно. Вказані композиції можуть бути введені будь-яким придатним способом, наприклад, шляхом уливання або ін'єкції ударної дози, за допомогою усмоктування бо епітеліальної або шкірно-слизовою вистилкюою (наприклад, слизової порожнини рота, прямої кишки і тонкого кишечнику і т. п.), а також вони можуть бути введені разом з іншими біологічно активними агентами. Уведення може бути системним або місцевим. Крім того, композиції можуть бути також уведені пульмонально, наприклад, з використанням інгалятора або аерозольного розпилювача, і препарату, що містить аерозольний агент. Див., наприклад, патенти США МоМо 6019968; 5985320; 5985309; 5934272; 5874064; 5855913; 5290540 і 4880078; і публікації заявок РСТ МоМо УМО 92/19244; МО 97/32572; УМО 97/44013; УМО 98/31346; і УМО 99/66903, що у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання.
Даний винахід також стосується молекул відповідно до винаходу, упакованих у герметично закритий контейнер, такий як ампула або саше, на яких вказана кількість антитіла, що міститься в них. В одному з варіантів винаходу молекули відповідно до винаходу поставляються у вигляді сухого стерилізованих і ліофілізованого порошку або безводного концентрату в герметично закритому контейнері, і такі препарати можуть бути розведені, наприклад, водою або фізіологічним розчином до відповідних концентрацій, що підходять для введення людині.
Переважно, молекули відповідно до винаходу поставляються у вигляді сухого стерильного ліофілізованого порошку в герметично закритому контейнері в уніфікованій дозі, що становить щонайменше 5 мг, більш переважно, щонайменше 10 мг, щонайменше 15 мг, щонайменше 25 мг, щонайменше 35 мг, щонайменше 45 мг, щонайменше 50 мг або щонайменше 75 мг.
Ліофілізовані молекули відповідно до винаходу повинні зберігатися при температурі від 2 до 8 С у контейнері, у якому вони були приготовані, і ці молекули повинні бути введені протягом 12 годин, переважно протягом б годин, 5 годин, З або годин 1 години після розведення. В альтернативному варіанті винаходу молекули відповідно до винаходу поставляються в рідкій формі в герметично закритому контейнері, де вказані кількість і концентрація молекули, злитого білка або кон'югованої молекули. Переважно, молекули відповідно до винаходу в рідкій формі поставляються в герметично закритому контейнері в кількості, що становить щонайменше 1 мг/мл, більш переважно щонайменше 2,5 мг/мл, щонайменше 5 мг/мл, щонайменше 8 мг/мл, щонайменше 10 мг/мл, щонайменше 15 мг/кг, щонайменше 25 мг/мл, щонайменше 50 мг/мл, щонайменше 100 мг/мл, щонайменше 150 мг/мл, щонайменше 200 мг/мл.
Кількість композиції відповідно до винаходу, ефективна для лікування, або попередження ослаблення одного або більше симптомів, асоційованих з розладом, може бути визначена
Зо стандартними клінічними методами. Точна доза, використовувана в такому препараті, також залежить від способу введення і від тяжкості стану і повинна бути визначена лікуючим лікарем для кожного пацієнта індивідуально. Ефективні дози можуть бути екстрапольовані виходячи з кривих "доза-відповідь", побудованих за даними, отриманим з використанням тест-систем іп міго або на моделях тварин.
Для діатіл, що входять в обсяг винаходу, доза, що вводиться пацієнту, звичайно становить від 0,0001 мг/кг до 100 мг/кг маси тіла пацієнта. Переважно, доза, що вводиться пацієнту, становить від 0,0001 мг/кг до 20 мг/кг, від 0,0001 мг/кг до 10 мг/кг, від 0,0001 мг/кг до 5 мг/кг, від 0,0001 до 2 мг/кг, від 0,0001 до 1 мг/кг, від 0,0001 мг/кг до 0,75 мг/кг, від 0,0001 мг/кг до 0,5 мг/кг, від 0,0001 мг/кг до 0,25 мг/кг, від 0,0001 до 0,15 мг/кг, від 0,0001 до 0,10 мг/кг, від 0,001 до 0,5 мг/кг, від 0,01 до 0,25 мг/кг або від 0,01 до 0,10 мг/кг маси тіла пацієнта. Доза і частота введення діатіл відповідно до винаходу можуть бути знижені або змінені шляхом посилення поглинання і пенетрації діатіл у тканині за допомогою модифікації діатіл, наприклад, такої як ліпідизація.
В одному з варіантів винаходу доза молекул відповідно до винаходу, що вводиться пацієнту, може становити від 0,01 мг до 1000 мг/день, у випадку застосування монотерапії. В іншому варіанті винаходу молекули відповідно до винаходу використовуються в комбінації з терапевтичними композиціями, і в цьому випадку доза, що вводиться пацієнту, нижча, ніж доза вказаних молекул, що вводяться при монотерапії.
У конкретному варіанті винаходу може виявитися бажаним уведення фармацевтичних композицій відповідно до винаходу місцево, тобто на ділянку, що вимагає лікування; і це може бути досягнуто способами, що включають, але не обмежуються ними, наприклад, місцеве уливання, ін'єкцію або імплантацію, де вказаний імплантат приготований з пористого, непористого або гелеподібного матеріалу, включаючи мембрани, такі як силастичні мембрани або волокна. Переважно, при введенні молекули відповідно до винаходу варто дотримуватися застережних заходів у випадку використання матеріалів, на яких не абсорбується вказана молекула.
В іншому варіанті винаходу композиції можуть бути доставлені у вигляді везикули, зокрема, у вигляді ліпосоми (див. І апдег (1990) "Мем Меїподз ОЇ Огид Оеєїїмегу" зсіепсе 249:1527-1533);
Тгеєаї еї аї, іп Прозотез іп Ше ТПегару ої Іптесійои5 Різеазе і Сапсег, І оре7-Вегевзівїп і РїіаІег (єд5.), Гі55, Мем МоїКк, рр. 353-65 (1989); І оре2-Вегезівіп, іріа., рр. 317-327; див., в основному, бо там же).
В іншому варіанті винаходу композиції можуть бути доставлені у вигляді системи з регульованим або пролонгованим вивільненням. Для приготування препаратів пролонгованого вивільнення, що містять одну або більше молекул відповідно до винаходу, може бути застосований будь-який відомий метод. Див., наприклад, патент США Мо 4526938; публікацію заявки РСТ УМО 91/05548; публікацію заявки РСТ УУО 96/20698; Міпу еї аї. (1996) "Іпігашштогаї
Вадіоіттипоїпегарну ОЇ А Нитап Соїоп Сапсег Хеподгай Ов5іпд А Бивіаіпед-ВеІєазе Се!"
Вадіоїегару 5 Опсоіоду 39:179-189, 5опд єї аї. (1995) "Апіїбоду Медіаїтвд І ипд Тагдеїйпу ОЇ
Гопа-Сіксціанпуд Етиївіопе" РОА Чошгта! ої Рпаптасешіса! Зсіеєпсе 5 ТесПпоіоду 50:372-397;
СіеєкК еї аї. (1997) "Віодедгадабіє Роїутегтс Саптієтв Рог А БЕСЕ Апіїроду Рог Сагаіїомазсшаг
Арріїсайоп" Рго. ІпгІ. бутр. Сопіго!Ї. ВеїЇ. Віоасі Маїєег. 24:853-854; і їат еї аї. (1997) "Містоепсарзиїайоп ОЇ Весотбіпапі Нитапігед Мопосіопаї! Апіїбоду Рог Госаї! Оєїїмегу" Ргос. Іпг!.
Зутр. Сопігої! Веї. Віоасі. Маїег. 24:759-760, що у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання. В одному з варіантів винаходу в системі з регульованим вивільненням може бути використаний насос (див. І апдег, див. вище; Зейоп, (1987) "Іпріапіаріє Ритр5" САС
Стій. Аему. Віотей. Епд. 14:201-240; Виспмаїй еї аї. (1980) "Гопд-Тепт, Сопііїписив5 Іпігамепоийв5
Нерагіп Адйтіпівігайоп Ву Ап Ітріапіаріє Іптибіоп Ритр п Атршїайїгту Раїїепів М/йИ Несштепі
Мепоибз Тиготровів" Зигдегу 88:507-516; і Зацаек еї аїЇ. (1989) "А Ргєїїтіпагу Та! ОЇ ТНе
Ргодгаттабіє Ітріапіабіє Медісайоп Зузієт Рог Іпзиїп Оеєїїмегу" М. Епаі. У. Мей. 321:574-579). В іншому варіанті винаходу для досягнення регульованого вивільнення антитіл можуть бути використані полімерні матеріали (див., наприклад, Меадіса! Арріїсайоп5 ої Сопігоїей Кеїеавзе,
І апдег в М/ізе (єд».), СВС Ргез., Воса Вашп, Ріогіда (1974); СопітоїІєд Огид Віоамайаріїйу, Огпа
Ргодисі Оевзідп апа Репогтапсе, 5тоїеп апа Ваї! (едв.), М/Пеу, Мем Моїк (1984); І ему єї аї. (1985) "Іппірйоп Ої Саїсітісаноп ОЇ Віоргозінеїйс Неагі Маїмез Ву І оса! СопігоПеа-Веїєазе Рірпозріопаїе"
Зсіепсе 228:190-192; Юигіпа еї аї. (1989) "СопігоІейа РеїІєазе ОЇ Роратіпе Егот А Роїутетс Вгаїп
Ітріапі: Іп Мімо Спагасієгігайоп" Апп. Мешгої. 25:351-356; Ноулага єї а!. (1989) "Іпігасегебга! Огпа
Оевїїмегу Іп Раїв У/йЙ І евіоп-Іпдисед Метогу Оеєїїісіїв" ). Меийтозига. 7(1):105-112); патент США Мо 5679377; патент США Мо 5916597; патент США Мо 5912015; патент США Мо 5989463; патент
США Мо 5128326; публікацію заявки РСТ Мо УМО 99/15154; і публікацію заявки РСТ Мо УМО 99/20253). Прикладами полімерів, використовуваних у препаратах пролонгованого вивільнення,
Зо є, але не обмежуються ними, полі(2-гідроксіетилметакрилат), поліметилметакрилат, поліакрилова кислота, співполімер етилену і вінілацетату, поліметакрилова кислота, полігліколіди (РІ с), поліангідриди, полі(М-вінілпіролідон), полівініловий спирт, поліакриламід, поліетиленгліколь, полілактиди (РГА), співполімер лактиду і гліколіду (РІ СА) і поліортоефіри. В іншому варіанті винаходу система регульованого вивільнення може бути введена в ділянку, що знаходиться в безпосередній близькості від терапевтичної мішені (наприклад, у легені), і для цього може знадобитися тільки частина системної дози (див., наприклад, сооа5оп, іп Меадісаї
Арріїсайоп5 ої СопігоПей Кеїеазе, див. вище, мої. 2, рр. 115-138 (1984)). В іншому варіанті винаходу полімерні композиції, використовувані як імплантати регульованого вивільнення, застосовуються, як описано Юипп еї аІ. (см. патент США 5945155). Цей конкретний метод оснований на терапевтичному ефекті іп 5йи регульованого вивільнення біологічно активного матеріалу з полімерної системи. Імплантація може бути здійснена, по суті, на будь-якій ділянці тіла пацієнта, який потребує лікування. В іншому варіанті винаходу використовується неполімерна система пролонгованого вивільнення, де неполімерний імплантат організму індивідуума використовується як система доставки лікарського засобу. Після введення імплантату в організм, органічний розчинник імплантату буде дисоціювати, диспергуватися або вивільнятися з композиції в рідину, що оточує тканину, а неполімерний матеріал буде поступово коагулюватися або осаджуватися з утворенням твердої мікропористої матриці (див. патент США 5888533).
Системи регульованого вивільнення обговорюються в публікації І апдег (1990 "Мем Метод»
ОГ Огид Оеєїїмегу" Зсіепсе 249:1527-1533). Для одержання препаратів пролонгованого вивільнення, що містять один або більше терапевтичних агентів відповідно до винаходу, може бути застосований будь-який відомий метод. Див., наприклад, патент США Мо. 4526938; публікації міжнародних заявок МоМо УМО 91/05548 і УМО 96/20698; Міпод еї аї. (1996) "Іпігаїитогаї
Вадіоіттипоїпегарну ОЇ А Нитап Соїоп Сапсег Хеподгай Овіпа А БЗивіаіпед-ВНеІєазе Се!"
Вадіоїегару 5 Опсоіоду 39:179-189, 5опд єї аї. (1995) "Апіїбоду Медіаїтвд І ипд Тагдеїйпу ОЇ
Гопа-Сіксціанпуд Етиївіопе" РОА Чошгта! ої Рпаптасешіса! Зсіеєпсе 5 ТесПпоіоду 50:372-397;
СіеєкК еї аї. (1997) "Віодедгадабіє Роїутегтс Сагтієт5 Бог А БЕСЕ Апіїроду Еог Сагаіомазсшіаг
Арріїсайоп" Рго. Ії. Бутр. СопігоІЇ. Неї. Віоасі. Маїег. 24:853-854; і ат еї аї. (1997) "Містоепсарзиїайоп ОЇ Весотбіпапі Нитапігед Мопосіопаї! Апіїбоду Рог Госаї! Оєїїмегу" Ргос. Іпг!.
Зутр. Сопігої! Веї. Віоасі. Маїег. 24:759-760, що у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання.
У конкретному варіанті винаходу, у якому композицією відповідно до винаходу є нуклеїнова кислота, що кодує діатіло відповідно до винаходу, вказана нуклеїнова кислота може бути введена іп мімо для стимуляції експресії кодованого нею діатіла, за допомогою її конструювання як частини відповідного експресійного вектора нуклеїнової кислоти і її введення таким чином, щоб вона проникала усередину клітини, наприклад, уведення з використанням ретровірусного вектора (див. патент США Мо 4980286), або введення шляхом прямої ін'єкції або шляхом бомбардування мікрочастинками (наприклад, за допомогою "рушниці", використовуваної в генній інженерії; Віоїїєтіє, Юироп), або шляхом сенсибілізації ліпідами або рецепторами клітинної поверхні або трансфікуючими агентами, або шляхом її введення у вигляді молекули, зв'язаної з гомеобоко-подібним пептидом, що, як відомо, проникає в ядро (див., наприклад, чо
Ної сеї аї. (1991) "Апіеппаредіа Нотеорох Рерііїде Недшіагев5 Мешга! Могрподепевів" Ргос. Маї).
Асад. 5сі. ОБА 88:1864-1868), і т. п. Альтернативно, нуклеїнова кислота може бути введена усередину клітини і включена в ДНК клітину-хазяїна для експресії за допомогою гомологічної рекомбінації.
Лікування індивідуума терапевтично або профілактично ефективною кількістю молекул відповідно до винаходу може включати монотерапію або переважно комбіновану терапію. У переважному прикладі індивідууму вводять молекули відповідно до винаходу в дозі, що становить в межах приблизно від 0,1 до 30 мг/кг маси тіла один раз на тиждень, приблизно протягом 1-10 тижнів, більш переважно протягом 2-8 тижнів, ще більш переважно приблизно протягом 3-7 тижнів, а найбільше переважно приблизно протягом 4, 5 або 6 тижнів. В інших варіантах винаходу фармацевтичні композиції відповідно до винаходу вводять один раз на день, два рази на день або три рази на день. В інших варіантах винаходу вказані фармацевтичні композиції вводять один раз на тиждень, два рази на тиждень, раз на два місяці, раз на місяць, раз на шість тижнів, раз на два місяці, два рази на рік або один раз на рік. Слід також зазначити, що ефективна доза молекул, використовуваних для лікування, може бути збільшена або зменшена в порівнянні з дозою, що вводиться протягом курсу індивідуальної терапії.
Зо 5.7.1. Фармацевтичні композиції
Композиції відповідно до винаходу включають нерозфасовану масу лікарського засобу, використовувану для виробництва фармацевтичних композицій (наприклад, неочищених або нестерильних композицій) і фармацевтичних композицій (тобто, композицій, що підходять для введення даному індивідууму або пацієнту), що можуть бути використані для приготування уніфікованих лікарських форм. Такі композиції містять профілактично або терапевтично ефективну кількість описаного тут профілактичного і/або терапевтичного агента або комбінацію цих агентів і фармацевтично прийнятний носій. Переважно, композиції відповідно до винаходу містять профілактично або терапевтично ефективну кількість однієї або більше молекул відповідно до винаходу і фармацевтично прийнятний носій.
Даний винахід також охоплює фармацевтичні композиції, що містять молекулу діатіла відповідно до винаходу і терапевтичне антитіло (наприклад, пухлиноспецифічне моноклональне антитіло), яке є специфічним до конкретного ракового антигену, і фармацевтично прийнятний носій.
У конкретному варіанті винаходу термін "фармацевтично прийнятний" стосується засобів, дозволених Федеральними регуляторними органами або урядами штатів у США, або засобів, перерахованих у Фармакопеї США або в інших відомих Фармакопеях і призначених для уведення тваринам, зокрема людині. Термін "носій" означає розріджувач, ад'ювант (наприклад, ад'ювант Фрейнда (повний або неповний)), ексципієнт або носій, разом з якими вводять вказаний терапевтичний засіб. Такими фармацевтичними носіями можуть бути стерильні рідини, такі як вода й масло, включаючи вазелінове масло, масло тваринного походження, рослинну олію або синтетичне масло, такі як арахісова олія, соєва олія, мінеральне масло, кунжутна олія і т. п. При внутрішньовенному уведенні фармацевтичної композиції, переважним носієм є вода. Як рідкі носії можуть бути також використані фізіологічні розчини і водні розчини декстрози і гліцерину, переважно розчини для ін'єкцій. Придатними фармацевтичними ексципієнтами є крохмаль, глюкоза, лактоза, сахароза, желатин, солод, рис, борошно, крейда, силікагель, стеарат натрію, моностеарат гліцерину, тальк, хлорид натрію, сухе сепароване молоко, гліцерин, пропіленгліколь, вода, етанол і т. п. Композиція, якщо це необхідно, може також містити невелику кількість змочувальних або емульгуючих агентів, або рн- забуферювальних агентів. Такі композиції можуть бути приготовані у формі розчинів, суспензій, бо емульсії, таблеток, драже, капсул, порошків, препаратів пролонгованого вивільнення і т. п.
Загалом, інгредієнти композицій відповідно до винаходу поставляються або окремо, або в суміші в уніфікованій лікарській формі, наприклад, у вигляді сухого ліофілізованого порошку або безводного концентрату в герметично закритому контейнері, такому як ампула або саше, на яких вказана кількість активного агента. Якщо композицію вводять шляхом уливання, то вона може бути розфасована по бутлях для уливання, які містять стерильну воду або стерильний фізіологічний розчин для фармацевтичних цілей. Якщо композицію вводять шляхом ін'єкції, то ампула зі стерильною водою для ін'єкцій або з фізіологічним розчином може бути приготована так, щоб її інгредієнти були змішані до введення.
Композиції відповідно до винаходу можуть бути приготовані в нейтральних або в сольових формах. Фармацевтично прийнятними солями є, але не обмежуються ними, солі, утворені аніонами, такими як аніони соляної кислоти, фосфорної кислоти, оцтової кислоти, щавлевої кислоти, винної кислоти і т. п., Її катіонами, такими як катіони натрію, калію, амонію, кальцію, гідроксиду заліза (3), ізопропіламіну, триетиламіну, 2-етиламіноетанолу, гістидину, прокаїну і т. п. 5.7.2. Генотерапія
У конкретному варіанті винаходу послідовності, що містять нуклеїнові кислоти і кодують молекули відповідно до винаходу, уводять з метою лікування, попередження або ослаблення одного або більше симптомів, асоційованих із захворюванням, розладом або інфекцією, методами генотерапії. Термін "генотерапія" означає терапію, здійснювану шляхом введення індивідууму експресованої або яка експресується нуклеїнової кислоти. У цьому варіанті винаходу нуклеїнові кислоти продукують кодоване ними антитіло або злитий білок, які опосередковують терапевтичний або профілактичний ефект.
У даному винаході можуть бути застосовані будь-які методи генотерапії, відомі фахівцям.
Репрезентативні методи описані нижче.
Загальний опис методів генотерапії можна знайти в публікаціях Соїазрієї еї аї. (1993) "Нитап Сепе Тнегару" Сіїіпіса! Рнаптасу 12:488-505; Ми евї аї. (1991) "Овїїмегу Зузіет5 Рог Сепе
ТНнегару" Віоїйегару 3:87-95; ТоІвіо5зпем (1993), "Сепе ТПнегару, Сопсеріб, Сштепі Тіаіє Апа
Ешиге Оігесіїоп5" Апп. Веу. Рпаптасої. Тохісої. 32:573-596; Миїїдап (1993) "Те Вавзіс Зсіепсе ОЇ
Сепе Тнегару" Зсієпсе 260:926-932; і Могдап еї аІ. (1993) "Нитап Сепе Тпегару" Апп. Кеу.
Віоспет. 62:191-217. Загальновідомі методи рекомбінантних ДНК, що можуть бути застосовані, описані в посібнику А!,5ибеї еї аї. (еаз.), Сиггепі Ргоїосої5 іп Моїіесціаг Віоіоду, допп Уміеу 5 оп,
МУ (1993); і Ктіедієг, Сепе Тгапоїтег апа Ехргев5іоп, А ІГарогаїгу Мапиаї, біосКіоп Ргевз5, МУ (1990).
У переважному аспекті винаходу композиція відповідно до винаходу включає нуклеїнові кислоти, що кодують діатіло відповідно до винаходу, де вказані нуклеїнові кислоти є частиною експресійного вектора, експресуючого антитіло в придатному хазяїні. Зокрема, такі нуклеїнові кислоти мають промотори, переважно гетерологічні промотори, функціонально приєднані до що антитіло-кодуючої ділянки, де вказаний промотор є індуцибельним або конститутивним, і необов'язково, тканиноспецифічним. В іншому конкретному варіанті винаходу використовуються молекули нуклеїнової кислоти, у яких антитіло-кодуючі послідовності і будь-які інші потрібні послідовності фланковані ділянками, які стимулюють гомологічну рекомбінацію в потрібному сайті генома, що дозволяє здійснювати внутрішньохромосомну експресію антитіло-кодуючих нуклеїнових кислот (Коїег еї аї. (1989) "Іпасіїмайпуд Те Веїа 2-Містодіориййй Госиб п Моизе
Етбргуопіс бієт СеїЇє Ву Нотоіодои5 ВНесотріпаййоп" Ргос. МаїЇ. Асад. сі. ОБА 86:8932-8935; і івіга еї а. (1989) "Септ-І іпе Ттапзтіввіоп Ої А Оівгирієйд Веїа 2-Місгодіобийп Сепе Ргодисей Ву
Нотоіодои5 Несотрбіпайоп Іп Етбгуопіс біет СеїІв" Майте 342:435-438).
В іншому переважному аспекті винаходу, композиція відповідно до винаходу включає нуклеїнові кислоти, що кодують злитий білок, де вказані нуклеїнові кислоти є частиною експресійного вектора, експресуючого злитий білок у придатному хазяїні. Зокрема, такі нуклеїнові кислоти мають промотори, переважно гетерологічні промотори, функціонально приєднані до кодуючої ділянки, злитого білка, де вказаний промотор є індуцибельним або конститутивним і необов'язково тканиноспецифічним. В іншому конкретному варіанті винаходу використовуються молекули нуклеїнової кислоти, у яких кодуючі послідовності злитого білка і будь-які інші потрібні послідовності фланковані ділянками, що стимулюють гомологічну рекомбінацію в потрібному сайті генома, що дозволяє здійснювати внутрішньохромосомну експресію злитого білка.
Доставка нуклеїнових кислот індивідууму може бути здійснена безпосередньо, і в цьому випадку індивідууму безпосередньо вводять нуклеїнову кислоту або вектори, що несуть нуклеїнову кислоту, або опосередковано, і в цьому випадку клітини спочатку трансформують нуклеїновими кислотами іп міго, а потім трансплантують індивідууму. Ці два підходи відомі, відповідно, як генотерапія іп мімо або ех мімо.
У конкретному варіанті винаходу послідовності нуклеїнової кислоти безпосередньо вводять іп мімо, де вони експресуються з утворенням кодованого продукту. Це може бути здійснено будь-якими різними методами, відомими фахівцям, наприклад, конструюванням нуклеїнових кислот як частини відповідного експресійного вектора нуклеїнової кислоти і його введенням таким чином, щоб він проникав усередину клітини, наприклад, уведенням з використанням дефектного або атенуйованого ретровірусного вектора або іншого вірусного вектора (див. патент США Мо 4980286); уведенням шляхом прямої ін'єкції "оголеної" ДНК; шляхом бомбардування мікрочастинками (наприклад, за допомогою "рушниці", використовуваної у генній інженерії; Віоїїсііс, биропі); шляхом сенсибілізації ліпідами або рецепторами клітинної поверхні або трансфікуючими агентами; інкапсулюванням з одержанням ліпосом, мікрочастинок або мікрокапсул; введенням у вигляді молекули, зв'язаної з пептидом, що, як відомо, проникає в ядро, або введенням у вигляді молекули, зв'язаної з розглянутим антигеном, що, як відомо, приводить до опосередковуваного рецептором ендоцитозу (див., наприклад, УМи еї аї. (1987) "Весеріог-Медіаїед Іп Міго Сепе Тгапоіоптайоп Ву А б5оЇшріє ОМА Саттіег бЗузівет" У. ВіоІ. Спет. 262:4429-4432) (де вказана нуклеїнова кислота може бути використана для націлювання на клітини конкретних типів, специфічно експресуючі рецептори), і т. п. В іншому варіанті винаходу можуть бути отримані комплекси "нуклеїнова кислота-антиген", у яких антиген містить фузогенний вірусний пептид, необхідний для руйнування ендосом, що дозволяє нуклеїновій кислоті уникнути розкладання під дією лізосом. В іншому варіанті винаходу нуклеїнова кислота може бути доставлена іп мімо у клітину, специфічну до поглинання й експресії, шляхом націлювання на специфічний рецептор (див., наприклад, публікації заявок РСТ УМО 92/06180;
УМО 92/22635; УМО92/20316; М/093/14188; УМО 93/20221). Альтернативно, нуклеїнова кислота може бути введена усередину клітини і включена в ДНК клітину-хазяїна для експресії за допомогою гомологічної рекомбінації (КоПег еї аї. (1989) "Іпасіїмайпуд Те Веїа 2-Містодіориїїп
Госив Іп Моизе Етбгуопіс бієт СеїЇє Ву Нотоіодоив Несотріпаййоп" Ргос. Маї). Асай. 5сі. ОБА 86:8932-8935; і 2І5іга еї аї. (1989) "Септ-і іпе Тгапзтіввіоп ОЇ А Оівзгирієй Веїа 2-Містодіобиїїп
Сепе Ргодисед Ву Нотоіодоизх Весотрбіпайоп Іп Етбгуопіс Єі1ет СеїЇІв" Майте 342:435-438).
Зо У конкретному варіанті винаходу використовуються вірусні вектори, що містять послідовності нуклеїнової кислоти, які кодують молекулу відповідно до винаходу (наприклад, діатіло або злитий білок). Так, наприклад, може бути використаний ретровірусний вектор (див.
МіПег єї аї. (1993) "Ове ОЇ Неїгоміга! Месіог5 Рог Сепе Тгапвіїег Апа Ехргезвіоп" Меїй. Епгутої. 217:581-599). Ці ретровірусні вектори містять компоненти, необхідні для "правильного" упакування вірусного генома й інтеграції в ДНК клітину-хазяїна. Послідовності нуклеїнової кислоти, що кодують антитіло або злитий білок, використовувані в генотерапії, клонують в один або більше векторів, що полегшує доставку нуклеотидної послідовності індивідууму. Більш докладний опис ретровірусних векторів можна знайти в публікації Воезхеп еї аї. (1993) "Сігситмуепіоп ОЇ СНетоїНегару-Іпдисей Муеїіозирргеззіоп Ву Ттапеїег ОГ Те Мапї Сепе"
Віоїштегару 6:291-302, де описане застосування ретровірусного вектора для доставки гена таг 1 у гемопоетичні стовбурові клітини з метою надання цим клітинам ще більшої резистентності до хіміотерапії. Іншими роботами, у яких проілюстроване застосування ретровірусних векторів у генотерапії, є: Сіоме5 еї аї. (1994) "І опд-Тегпт Віоіодіса! Везропзе ОЇ Іпіштейд Раї Сагоїій Апегу
Зеєдеа М/йН Зтооій Мизсіє СеїІв Ехргеззіпа Веїгомігану Іпгодисед Нитап Сепев" .). Сііп. Іпмеві. 93:644-651; Кеїт еї а!. (1994) "Веїгоміги5-Медіаїєд Сепе Тгапздисійп Іпіо Сапіпе Регірнега! Віоса
Вероршіаїййпо СеїІв" Віоса 83:1467-1473; ЗаІтопв єї аї. (1993) "Тагдеїіпу ОЇ Веїгоміга! Месіоге Гог
Сепе ТПегару" Нитап Сепе ТПегару 4:129-141; і Сгоз55тап еї аї. (1993) "Кеїгомігизе5: Оеїїмегу
Мепісіеє То Те Смег" Сит. Оріп. Сепеїйс5 апа Оемеї. 3:110-114.
Іншими вірусними векторами, що можуть бути використані в генотерапії, є аденовіруси.
Аденовіруси є особливо привабливими носіями для доставки генів в епітелій дихальних шляхів.
Аденовіруси звичайно інфікують епітелій дихальних шляхів, що приводить до розвитку захворювання в легкій формі. Іншими мішенями для систем доставки на основі аденовірусів є печінка, центральна нервова система, ендотеліальні клітини і м'язи. Аденовіруси мають ту перевагу, що вони здатні інфікувати клітини, які не діляться. Опис генотерапії на основі аденовірусів можна знайти в публікації Когаг5Ку еї а. (1993 "Сепе Тпегару: Адепоміги5 Месіогв"
Ситепі Оріпіоп іп Сепеїїсв апа Оємеіортепі 3:499-503). У публікації Воші еї аї. (1994 "І ипд Сепе
ТНегару: Іп Мімо Адепоміги5-Медіаїед Сепе Тгапеїег То ВНези5 МопКеу Аіглау Еріпеїїшт" Нитап
Сепе ТНегару, 5:3-10) продемонстроване застосування аденовірусних векторів для перенесення генів в епітелій дихальних шляхів макак-резусів. Інші випадки застосування аденовірусів у бо генотерапії описані в публікаціях КозепіеїЇй еї аї. (1991) "Адепоміги5 -Медіаїей Тгапеїе ОТГ А
Весотбіпапі АІрпа 1-Апійгурзіп Сепе То Те Гипу Еріїнеїййт Іп Мімо" Зсіепсе 252:431-434;
Возепіеїйа еї а. (1992) "Іп Мімо Ттапетег ОЇ Тне Нитап Сувіїс Рібговів Тгапвтетбьгапе Сопдисіапсе
Веашайюг Сепе То ТНе Аіглау Ерійеїїшт" Сеї! 68:143-155; Мазігаподеїї єї а. (1993) "Оімегейу ОЇ
Аїгмау Еріїнеїїа! Сеї! Тагдеїв Рог Іп Мімо Несотбіпапі Адепоміги5-Медіаїед Сепе Тгапетег" У. Сііп.
Іпмеві. 91:225-234; у публікації заявки РСТ УУМО94/12649; і в публікації УМапу еї аїЇ. (1995) "А
РасКавдіпду СеїІ І іпе Рог Ргорадайоп ОЇ Весотрбіпапі Адепоміги5 Месіогз Сопіаіпіпд Гмо І еїНаї!
Сепе-Кедіоп Оеїєїйопв" бепе ТНегару 2:775-783. У переважному варіанті винаходу використовуються аденовірусні вектори.
У генотерапії можуть бути також використані аденоасоційовані віруси (ААМ) (див., наприклад, Умаїх5п еї аїЇ. (1993) "Сепе Тпегару Бог Нитап Нетодіобіпораїніев" Ргос. Бос. Ехр.
Віо!. Мед. 204:289-300 і патент США Мо 5436146).
Інший підхід генотерапії полягає в перенесенні гена в клітини в тканинній культурі з застосуванням таких методів, як електропорація, ліпофекція, трансфекція, опосередковувана фосфатом кальцію або інфікування вірусом. Звичайно метод перенесення включає перенесення селективного маркера в клітини. Потім ці клітини вміщують у відповідні умови відбору для виділення клітин, що поглинають і експресують перенесений ген. Після цього клітини вводять індивідууму.
У цьому варіанті винаходу нуклеїнову кислоту вводять у клітину до введення іп мімо отриманої рекомбінантної клітини. Таке введення може бути здійснено будь-яким відомим методом, включаючи, але не обмежуючись ними, трансфекцію, електропорацію, мікроінжекцію, інфікування вірусним або бактеріофаговим вектором, що містить послідовності нуклеїнової кислоти; злиття клітин, перенесення генів, опосередковуване хромосомою, перенесення генів, опосередковуване мікроклітинами, злиття сферопластів і т. п. Фахівцям у даній галузі відома множина методів уведення чужорідних генів у клітини (див., наприклад, ІГоетег еї аїЇ. (1993) "Сепе Тгапвеїег Іпіо Ргітагу Апа Евіабізнед Маттаїйап Сеї! Гіпе5 М/йНп Ііророїуатіпе-Соаїєй
ОМА" Меїй. Епгутої. 217:599-618, Соцеп єї аї. (1993) "Бесеріогї-Медіаївд Ттапхроїй ОТОМА по
ЕиКагуоііїс СеїІв" Меїй. Еплутої. 217:618-644), і ці методи можуть бути застосовані в даному винаході, за умови, що в даному випадку не будуть порушуватися необхідні еволюційні і фізіологічні функції клітин-реципієнтів. Цей метод повинен забезпечувати стабільне
Зо перенесення нуклеїнової кислоти в клітину, так, щоб така нуклеїнова кислота експресувалась у клітині і переважно успадковувалася і експресувалась у клітинному потомстві.
Отримані рекомбінантні клітини можуть бути введені індивідууму різними відомими методами. Рекомбінантні клітини крові (наприклад, гемопоетичні стовбурові клітини або клітини- попередники) переважно уводять внутрішньовенно. Кількість клітин, що підходять для їхнього використання, залежить від бажаного ефекту, стану здоров'я пацієнта і т. п., їі може бути визначено самим фахівцем.
Клітини, у які може бути введена нуклеїнова кислота для генотерапії, включають клітини будь-яких відомих видів, і такими клітинами є, але не обмежуються ними, епітеліальні клітини, ендотеліальні клітини, кератиноцити, фібробласти, м'язові клітини, гепатоцити, клітини крові, такі як Т-лімфоцити, В-лімфоцити, моноцити, макрофаги, нейтрофіли, еозинофіли, мегакаріоцити, гранулоцити, різні стовбурові клітини або клітини-попередники, зокрема, гемопоетичні стовбурові клітини або клітини-попередники, виділені, наприклад, з кісткового мозку, крові пупкового канатика, периферичної крові, печінки плоду і т. п.
У переважному варіанті винаходу клітини, використовувані для генотерапії, є аутологічними для даного індивідуума.
У варіанті винаходу, у якому рекомбінантні клітини використовуються з метою генотерапії, послідовності нуклеїнової кислоти, які кодують антитіло або злитий білок, вводять у клітини так, щоб вони експресувались цими клітинами або їх потомством, а потім такі рекомбінантні клітини вводять іп мімо для досягнення терапевтичного ефекту. У конкретному варіанті винаходу використовуються стовбурові клітини або клітини-попередники. Відповідно до цього варіанта винаходу, у принципі, можуть бути використані будь-які стовбурові клітини і/або клітини- попередники, що можуть бути виділені і можуть зберігатися іп міїго (див., наприклад, публікацію заявки РСТ УМО 94/08598; 5(етріє еї аї. (1992) "ІзоЇайоп ОА 5(ет Сеї| Гог Мешгоп5 Апа аа
ЕЕгот Те Маттаїїап Меишгаї Стеві" Сеї! 71:973-985; АНеіпма!д (1980) "Зегпа! Сипімайоп ОЇ Моптаї!
Нитап Ерідепта! Кегаїйпосуїез" Меїй. Се! Віо. 21А:229-254; і РіцеіКом/ еї аЇ. (1986) "Мем
Тесппіднез Бог Те Іп Міго Сийиге ОЇ Нитап 5Кіп Кегаїіпосуїєз Апа Регересіїме5 Оп Тнеєїг Ове
Еог Стайіпу ОЇ Раїепів М/ййп Ехіепвзіме Витпв" Мауо Сіїпіс Ргос. 61:771-777).
У конкретному варіанті винаходу нуклеїнова кислота, що вводиться з метою генотерапії, включає індуцибельний промотор, функціонально приєднаний до кодуючої ділянки, таким чином, що експресія нуклеїнової кислоти регулюється залежно від присутності або відсутності відповідного індуктора транскрипції. 5.7.3. Набори
Даний винахід стосується фармацевтичної упаковки або фармацевтичного набору, що містить один або більше контейнерів, заповнених молекулами відповідно до винаходу. Крім того, один або більше інших профілактичних або терапевтичних агентів, що можуть бути використані для лікування захворювання, можуть бути також включені у вказану фармацевтичну упаковку або фармацевтичний набір. Даний винахід також стосується фармацевтичної упаковки або фармацевтичного набору, що містить один або більше контейнерів, заповнених одним або більше інгредієнтами фармацевтичних композицій відповідно до винаходу. До такого (таких) контейнеру(ів) може, але необов'язково, додаватися інструкція у формі призначення, у якому вказане, що виготовлення, застосування або продаж фармацевтичних або біологічних продуктів знаходяться під контролем регуляторних органів, а також вказано, що регуляторні органи дають дозвіл на приготування, застосування або продаж даного лікарського препарату, який може бути введений людині.
Даний винахід також стосується наборів, що можуть бути використані у вищеописаних методах. В одному з варіантів винаходу набір включає одну або більше молекул відповідно до винаходу. В іншому варіанті винаходу набір також включає одне або декілька інших профілактичних або терапевтичних засобів, використовуваних для лікування раку, в одному або більше контейнерах. В іншому варіанті винаходу набір також включає одне або більше цитотоксичних антитіл, що зв'язуються з одним або більше антигенами, асоційованими з раком.
У деяких варіантах винаходу такими іншими профілактичними або терапевтичними засобами є хіміотерапевтичні засоби. В інших варіантах винаходу такими профілактичними або терапевтичними засобами є біологічні або гормональні терапевтичні засоби. 5.8. Характеризація й ілюстрація терапевтичної ефективності
У декількох аспектах даного винаходу фармацевтичні композиції, профілактичні або терапевтичні засоби відповідно до винаходу, перед уведенням таких композицій або засобів людині, тестують, переважно іп міго у системі клітинних культур, і в організмі тварини-моделі, такій як система гризунів, використовуваних як модель, на потрібну терапевтичну активність.
Так, наприклад, аналізами, що можуть бути проведені з метою визначення необхідності введення конкретної фармацевтичної композиції, є аналізи з використанням клітинних культур, у яких зразок тканини пацієнта вирощують у культурі, а потім обробляють фармацевтичною композицією відповідно до винаходу або яким-небудь іншим способом піддають контакту з цією фармацевтичною композицією, після чого оцінюють вплив такої композиції на зразок тканини.
Зразок тканини може бути узятий у пацієнта за допомогою біопсії. Цей тест дозволяє ідентифікувати профілактичну(ї) або терапевтичну(ї) молекулу(и) на найбільшу терапевтичну ефективність для кожного конкретного пацієнта. У різних конкретних варіантах винаходу аналізи іп міго можуть бути здійснені з використанням репрезентативних клітин, що беруть участь у розвитку аутоїмунного або запального розладу (наприклад, Т-клітин), для того, щоб визначити, чи чинить фармацевтична композиція відповідно до винаходу бажаний ефект на клітини таких типів.
Комбінації профілактичних і/або терапевтичних засобів можуть бути протестовані в придатних системах тварин-моделей перед їх уведенням людині. Такими системами тварин- моделей є, але не обмежуються ними, щурі, миші, кури, корови, мавпи, свині, собаки, кролики і т. п. При цьому може бути використана будь-яка система тварини-моделі, добре відома фахівцям. У конкретному варіанті винаходу комбінації профілактичних і/або терапевтичних засобів тестують у системі тварин-моделей. Такі системи-моделі широко застосовуються і добре відомі фахівцям. Профілактичні і/або терапевтичні засоби можуть бути введені повторно.
У деяких аспектах винаходу такі процедури можуть варіюватися. Вказані аспекти включають схему і час уведення профілактичних і/або терапевтичних засобів, незалежно від того, чи вводяться ці засоби окремо або у вигляді суміші.
Переважними тваринами-моделями, застосовуваними в способах відповідно до винаходу, є, наприклад, трансгенні миші, експресуючі людські ЕсуК на мишачих ефекторних клітинах, наприклад, у даному винаході може бути використана будь-яка мишача модель, описана в патенті США 5877396 (який у всій своїй повноті вводиться в даний опис за допомогою посилання). Трансгенними мишами, використовуваними в способах відповідно до винаходу, є, але не обмежуються ними, миші, що несуть людський ЕсукША; миші, що несуть людський
ЕСсУКПА; миші, що несуть людський ЕСУКІІВ і людський ЕсукША; і миші, що несуть людський
ЕсуКІІВ і людський ЕсуКПА. Переважно, мутації, що дають найбільш високі рівні активності в бо описаних вище функціональних аналізах, можуть бути протестовані на їхнє застосування в дослідженнях, проведених на тваринах-моделях перед уведенням людині. Достатні кількості антитіл можуть бути приготовані для їхнього використання на тваринах-моделях із застосуванням вищеописаних методів, наприклад, з використанням систем експресії в ссавців і з застосуванням методів очищення, описаних і проілюстрованих у даній заявці.
Миші з моделлю ксенотрансплантатів можуть бути використані для оцінки ефективності мишачих антитіл проти пухлиноспецифічної мішені виходячи з афінності і специфічності епітоп- зв'язувальних доменів молекули діатіла відповідно до винаходу і здатності діатіла виробляти імунну відповідь (УМи еї аІ. (2001) "Моизе Модеї!5 Бог Мийівіер Титогідепевів" Ттепаз Сеї! Віо). 11:52-9). Трансгенні миші, експресуючі людські ЕсуК на мишачих ефекторних клітинах, є унікальними і являють собою спеціально виведені тварини-моделі для оцінки ефективності взаємодій людських Ес-Есук. Пари ЕсуУКкПША-, ЕсуВІЇІВ- ї ЕсСуУКкПА-трансгенних мишачих ліній, що були отримані з лабораторії Ог. Уейтгеу Камеїсі! (відповідно до ліцензійного договору, укладеного між Університетом Рокфеллера і Раковим центром Слоуна Кеттеринга), можуть бути використані, як описано нижче в таблиці 11.
Таблиця 11
Мишачі клітинні лінії
Протизапальна ефективність комбінованої терапії відповідно до винаходу може бути визначена з використанням різних експериментальних тварин з моделями запального артриту, відомого фахівцям і описаного Стойога Г.). ії УМідег КОС. "Апйпгйй5 і Ашіоійттипку іп Апітаї5" іп
Ап апа Айей Сопайіопег: А Техіроок ої АНешйтаїйоіоду, МеСапу еї а!.(єдз.), СНарієг 30 (І еє 8
Еебідег, 1993). Тварини з моделями експериментального і який спонтанно розвивається запального артриту й аутоїмунного ревматичного захворювання можуть бути також використані для оцінки протизапальної активності комбінованої терапії відповідно до винаходу.
Необмежувальні приклади деяких аналізів приводяться нижче.
Основними тваринами-моделями з артритом або запальним захворюванням, відомими і широко застосовуваними фахівцями, є: щури з моделлю індукованого ад'ювантом артриту, щури і миші з моделлю індукованого колагеном артриту і щуриа, кролики і хом'ячки з моделлю індукованого антигеном артриту, описані в публікаціях Сгойога І... в Мйдег В.Г. "Ап апа
Ашоіттипйу іп Апітаї!5", іп АпНйї5 5 АйПієд Сопайіопе: А ТехірооКк ої ВНештаїйюіоду, МеСапу еї
Зо аІХеаз.), Спарієг 30 (ее 8. Ребрідег, 1993), що у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання.
Протизапальна активність комбінованої терапії відповідно до винаходу може бути оцінена на щурах з моделлю індукованого карагенаном артриту. Індукований карагенаном артрит був також ініційований у кроликів, собак і свиней у дослідженнях хронічного артриту або запалення.
Для визначення терапевтичної ефективності проводять кількісний гістоморфометричний аналіз.
Методи, у яких використовуються такі моделі з індукованим карагенаном артритом, описані в публікації Напега Р. еї аїЇ. (2000) "Саггадеепап-іпдисед Апгййв ій Те Ваї" Іпйаттаї!оп, 24(2):141-155. Також часто використовуються тварини з моделями індукованого зимозаном запалення, і такі тварини відомі фахівцям і описані в літературі.
Протизапальна активність комбінованої терапії відповідно до винаходу може бути оцінена шляхом визначення рівня зниження ступеня набряку подушечки лапи у щурів, індукованого карагенаном, із застосуванням модифікованого методу, описаного УмМіпіег С. А. еї аї. (1962) "Сатадеепап-іпдисед Едета Іп Ніпа Рам/ ОЇ ТНе Ваї Ав Ап Авзау Рог Апії-Іпїаттайогу Огидв"
Ргос. бос. Ехр. Віо! Мед. 111, 544-547. Цей аналіз був проведений як первинний іп мімо скринінг на протизапальну активність більшості НПЗЗ, і є прогностичним аналізом відносно ефективності для людини. Протизапальну активність тестованих профілактичних або терапевтичних засобів виражали як відсоток інгібування збільшення маси подушечки задніх лап у тест-групі в порівнянні з контрольною групою, якій уводили носій.
Крім того, тварини з моделлю запального захворювання кишечнику можуть бути також використані для оцінки ефективності комбінованої терапії відповідно до винаходу (Кіт еї аї. (1992) "Ехрегітепіа! Соїйі5 Іп Апіта! Модеїв" Зсапа. У. Савтоепігої. 27:529-537; Зігорег (1985) "Апіта! Модеї!5 ОЇ Іпїаттайюгу Вомеї! Оізеазе-Ап Омегмієм" ід. Рів. сі. 30012 Зиррі):35-105).
Виразковий коліт і хвороба Крона являють собою людські запальні захворювання кишечнику, що можуть бути індуковані у тварин. Для індукування запальних захворювань кишечнику, тваринам можуть бути перорально введені сульфовані полісахариди, включаючи, але не обмежуючись ними, амілопектин, караген, сульфат амілопектину і сульфат декстрану, або хімічні подразники, включаючи, але не обмежуючись ними, тринітробензолсульфонову кислоту (ТМВ5) і оцтову кислоту.
Тварини з моделями аутоїмунних захворювань можуть бути також використані для оцінки ефективності комбінованої терапії відповідно до винаходу. Були отримані тварини з моделями аутоїмунних захворювань, таких як діабет типу 1, аутоїмунне захворювання щитовидної залози, системний червоний вовчак і гломерулонефрит (Ріапдег5 еї аіІ. (1999) "Ргемепіп ОЇ Туре 1
ОРіареїе5 Егот І арогаїогу То Рибіїс Неайн" Ашоіттипйу 29:235-246; Наб5тив5еп еї аї. (1999) "Модеі5 То 5щшау Те Раїподепевів ОЇ Тнугоїд Ашоіттипйну" Віоспітів 81:511-515; Еовієг (1999) "Веіємапсе ОЇ бЗузієтіс І ирив Егуїетаїйюзив Мернгіїіз Апіта! Модеів То Нитап бізеазе" бетіп.
Мерпгої. 19:12-24).
Крім того, для оцінки описаної тут профілактичної і/або терапевтичної ефективності комбінованої терапії для лікування аутоїмунних і/або запальних захворювань можуть бути проведені будь-які аналізи, відомі фахівцям.
Токсичність і ефективність профілактичного і/або терапевтичного лікування, проведеного відповідно до протоколів відповідно до винаходу, можуть бути визначені за допомогою стандартних фармацевтичних процедур, проведених у клітинних культурах або на експериментальних тваринах, наприклад, для оцінки І Ово (дози, летальної для 50 95 популяції) і
ЕОзбо (дози, терапевтично ефективної для 50 95 популяції). Відношення доз, що дають токсичні і терапевтичні ефекти, називається терапевтичним індексом і може бути виражене як відношення
ЇОБо/ЕЮво. Переважними є профілактичні і/або терапевтичні засоби, що мають високий терапевтичний індекс. Оскільки можуть бути використані профілактичні і/або терапевтичні
Зо агенти, що мають токсичні побічні ефекти, то в даному випадку варто дотримуватися застережних заходів при створенні систем доставки, які націлюють такі агенти на ділянку ураженої тканини для мінімізації можливого ушкодження неінфікованих клітин і, тим самим, зниження побічних ефектів.
Дані, отримані в аналізах клітинних культур і в дослідженнях, проведених на тваринах, можуть бути використані для приготування різних доз профілактичних і/або терапевтичних засобів, що вводяться людині. Дози таких засобів переважно складають у межах концентрацій у кровотоці, що включають ЕЮво з незначною токсичністю або під час відсутності токсичності.
Дози можуть варіюватися в цих межах залежно від використовуваної лікарської форми і від застосовуваного способу введення. Для будь-якого агента, використовуваного в способі відповідно до винаходу, терапевтично ефективна доза може бути обчислена виходячи з аналізів клітинних культур. Доза може бути приготовлена для тварин-моделей з метою досягнення концентрації в плазмі в межах, що включають ІСзхо (тобто, концентрацію тестованої сполуки, при якій досягається напівмаксимальне інгібування симптомів), як було визначено в аналізі клітинної культури. Така інформація може бути використана для більш точного визначення придатних доз, що вводяться людині. Рівні в плазмі можуть бути оцінені, наприклад, за допомогою високоефективної рідинної хроматографії.
Протиракова активність терапії, яка проводиться відповідно до даного винаходу, може бути визначена з використанням різних експериментальних тварин-моделей для вивчення раку, наприклад, ЗСІЮ-мишей або трансгенних мишей або "голих мишей з моделлю людського ксенотрансплантата, і тварин-моделей, таких як хом'ячки, кролики і т. п., відомі фахівцям і описані в публікаціях КеІемапсе ої Титог Модеї5 ог Апіїсапсег Опа ОемеєіІортепі (1999, едв.
Небід є Вигаег); Сопіпршіопв о Опсоіоду (1999, Кагдег); Те Миде Моизе іп Опсоіоду Везеєагсй (1991, еа5. Вомеп апа Уміподгад); і Апіїсапсег Огид ЮОемеІюортепі сціде (1997 ей. Теїіспег), що у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання.
Переважними тваринами-моделями для визначення терапевтичної ефективності молекул відповідно до винаходу є мишачі моделі ксенотрасплантатів. Пухлинними клітинними лініями, що можуть бути використані як джерела для створення пухлин ксенотрансплантатів, є, але не обмежуються ними, клітини ЗКВКЗ і МСЕ7, що можуть походити від клітин пацієнтів з аденокарциномою молочної залози. Такі клітини містять рецептори егбВа2 і пролактину. Клітини бо ЗКВКЗ звичайно використовуються фахівцями як моделі АОСС і моделі пухлинних ксенотрансплантатів. Альтернативно, клітини ОМСАКЗ, які походять від людської аденокарциноми яєчника, можуть бути використані як джерело для створення пухлинних ксенотрансплантатів.
Протоколи лікування і композиції відповідно до винаходу переважно тестують іп міїго, а потім іп мімо на бажану терапевтичну або профілактичну активність перед їхнім застосуванням для людини. Терапевтичні агенти і способи можуть бути скриновані з використанням клітин пухлини або злоякісної клітинної лінії. Для аналізу виживаності і/або росту клітин може бути проведена множина стандартних аналізів, наприклад, проліферація клітин може бути оцінена шляхом вимірювання рівня включення ЗН-тимідину, прямого підрахунку числа клітин, детектування змін рівня транскрипційної активності відомих генів, таких як протоонкогени (наприклад, 705, тус), або маркерів клітинного циклу; життєздатність клітин може бути оцінена по фарбуванню трипановим синім; диференціювання клітин може бути оцінена візуально по зміні морфології, зниженню росту і/або утворенню колоній у м'якому агарі або утворенню судинної мережі в тривимірній базальній мембрані або в препараті позаклітинного матриксу і т. п.
Сполуки для використання в терапії можуть бути протестовані в придатних системах тварин- моделей перед їх уведенням людині, включаючи, але не обмежуючись ними, щурів, мишей, курей, корів, мавп, кроликів, хом'ячків і т. п., наприклад, тварин-моделей, описаних вище. Ці сполуки можуть бути потім використані у відповідних клінічних дослідженнях.
Крім того, будь-які відомі аналізи можуть бути використані для оцінки профілактичної і/або терапевтичної ефективності описаної тут комбінованої терапії, застосовуваної для лікування або попередження раку, запального розладу або аутоїмунного захворювання. 6. ПРИКЛАДИ 6.1. Конструювання і характеризація ковалентно зв'язаних біспецифічних діатіл
Моноспецифічне ковалентно зв'язане діатіло і біспецифічне ковалентно зв'язане діатіло були сконструйовані для оцінки рекомбінантного продукування, очищення і зв'язувальних властивостей кожного з цих діатіл. ДСН-ПААГ- і ЕХ-аналізи афінно очищених молекул діатіл, що були продуковані з використанням описаних тут рекомбінантних експресійних систем, показали, що ці діатіла складаються з однієї димерної молекули. ЕГІ5А- і ППР-аналізи також показали, що ковалентно зв'язане біспецифічне діатіло має афінність відносно обох антигенів-мішеней і може
Зо зв'язуватися одночасно з обома антигенами.
Матеріали і методи:
Конструювання і моделювання поліпептидних молекул: Нуклеїновокислотні експресійні вектори були сконструйовані для створення чотирьох поліпептидних конструкцій, схематично представлених на фіг. 2. Конструкція 1 (5ЕБО ІЮ МО: 9) містила Мі -домен гуманізованого антитіла 286, яке розпізнає ЕСсУуВІІВ, і МН-домен гуманізованого антитіла 308, яке розпізнає
ЕсукІПША. Конструкція 2 (5БО ІО МО: 11) містила Мі-домен Ни3о8 і МН-домен Ни2в6.
Конструкція З (5ЕО ІЮО МО: 12) містила МІ -домен Ни3О8 і МН-домен НизО8. Конструкція 4 (5ЕО
ІО МО: 13) містила МІ -домен Ни286 і МН-домен Ни286.
ПЛР ї конструювання експресійного вектора: кодуючі послідовності, МІ - або МН-доменів ампліфікували з матричної ДНК із використанням прямого і зворотного праймерів, сконструйованих так, щоб вихідні ПЛР-продукти містили послідовності, що перекриваються, що дозволяє проводити ПЛР із перекриванням для одержання послідовностей, які кодують потрібні поліпептидні конструкції.
Попередня ПЛР-ампліфікація матричної ДНК: Приблизно 35 нг матричної ДНК, наприклад, легкого ланцюга і важкого ланцюга антитіла, що представляє інтерес; 1 мкл 10 мкМ прямого і зворотного праймерів; 2,5 мкл 10х буфера рішШнга (5ігагадепе, Іпс.); 1 мкл 10 мМ амтеР; 1 мкл 2,5 одиниць/мкл ДНК-полімерази рішШНга (5ігагадепе, Іпс.); і дистильовану воду в загальному об'ємі 25 мкл обережно перемішували вв мікроцентрифугальній пробірці і швидко центрифугували в мікроцентрифузі, а потім із дна пробірки збирали реакційну суміш. ПЛР- реакції здійснювали на обладнанні СепеАтр РСК Зубзіет 9700 (РЕ Аррієай Віозузіет) у наступних умовах: 942С, 2 хвилини; 25 циклів при 942С, щораз по 15 секунд; 582С, 30 секунд; і 72260, 1 хвилина.
МІ. Ни286 ампліфікували з легкого ланцюга Ни286 з використанням прямого і зворотного праймерів БЕ ОО МО: 55 ії 5ЕО ІЮО МО: 56, відповідно. МН Ни286 ампліфікували з важкого ланцюга Ни286 з використанням прямого і зворотного праймерів 5ЕО ІО МО: 57 і 5ЕО ІЮО МО: 58, відповідно. МІ НиЗзо8 ампліфікували з легкого ланцюга Ни308 з використанням прямого і зворотного праймерів БЕ ІЮО МО: 55 і 5ЕО ІЮО МО: 59, відповідно. МН Ни308 ампліфікували з важкого ланцюга Ни308 з використанням прямого і зворотного праймерів ЗЕО ІЮО МО: 60 і 5ЕО
ІО МО: 61, відповідно.
ПЛР-продукти піддавали електрофорезу в 1 95 агарозному гелі протягом 30 хвилин при 120 вольт. ПЛР-продукти вирізували з гелю й очищали з використанням набору для екстракції з гелю МіпЕЇІше (Оіадеп, Іпо.).
ПЛР із перекриванням: Вихідні ПЛР-продукти об'єднували, як описано нижче, і ампліфікували в тих же самих умовах проведення ПЛР, що були описані для попередньої ампліфікації матричної ДНК. Продукти ПЛР із перекриванням також очищали як описані вище.
Послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує конструкцію 1, ЗЕО ІЮ МО: 9 (схематично показано на фіг. 2), ампліфікували шляхом об'єднання ПЛР-продуктів ампліфікації МІ. Ни286 і
МН НизОо8 їі прямого і зворотного праймерів 5ЕО ІО МО: 55 ії 5БО ІО МО: 61, відповідно.
Послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує конструкцію 2, 5ЕО ІЮ МО: 11 (схематично показано на фіг. 2), ампліфікували шляхом об'єднання ПЛР-продуктів ампліфікації МІ Низс8 і
МН Ни286 ії прямого і зворотного праймерів БЕО І МО: 55 ії 5ЕБО ІО МО: 58, відповідно.
Послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує конструкцію 3, 5ЕО ІЮ МО: 12 (схематично показано на фіг. 2), ампліфікували шляхом об'єднання ПЛР-продуктів ампліфікації МІ Низс8 і
МН НизО8 їі прямого і зворотного праймерів 5ЕО ІО МО: 55 ії 5БО ІО МО: 61, відповідно.
Послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує конструкцію 4, 5ЕО ІЮ МО: 13 (схематично показано на фіг. 2), ампліфікували шляхом об'єднання ПЛР-продуктів ампліфікації МІ. Ни286 і
МН Ниг8в6 і прямого і зворотного праймерів ЗЕО ІЮО МО: 55 і БЕО ІО МО: 58, відповідно.
Прямі праймери для Мі -доменів (тобто, ЗЕО ІЮО МО: 55) і зворотні праймери для МН-доменів (тобто, ЗЕО ІЮ МО: 58 і 5ЕО ІЮО МО: 61) містили унікальні рестрикційні сайти, що дозволяло клонувати кінцевий продукт у експресійний вектор. Очищені продукти ПЛР із перекриванням гідролізували рестриктуючими ендонуклеазами Ме І і Єсой І ії клонували в експресійний вектор ссавців рСіІпео (Рготеда, Іпс.). Плазміди, що кодують конструкції, ідентифіковані в таблиці 12.
Таблиця 12
Плазмідні конструкції
Експресія поліпептиду/діатіла: рМОХОб669, що кодує конструкцію 1, переносили разом з рмоехоО667, що кодує конструкцію 2, у клітини НЕК-293 з використанням ліпофектаміну 2000 відповідно до інструкцій виробників (Іпмігодеп). Спільне перенесення цих двох плазмід у клітини здійснювали так, щоб це приводило до експресії ковалентно зв'язаного біспецифічного діатіла
Зо (СВО), імуноспецифічного до ЕСУуКІІВ і ЕСсуУкПША (діатіла пН286-п308). рМОХОб66 і рМОХОб668, що кодують конструкції З і 4, відповідно, були окремо перенесені в клітини НЕК-293 для експресії ковалентно зв'язаного моноспецифічного діатіла (СМО), імуноспецифічного до ЕсуУКкПА (діатіла
ПЗО8) і ЕсуйКІВ (діатіла п286), відповідно. Після культивування протягом трьох днів, секретовані продукти виділяли з кондиціонованого середовища.
Очищення: Діатіла захоплювали з кондиціонованого середовища з використанням релевантних антигенів, зв'язаних з СМВг-активованою сефарозою 4В. До завантаження афінну сефарозну смолу врівноважували в 20 мМ тріс/НСІ, рН 8,0. Після завантаження смолу промивали врівноважувальним буфером, а потім елюювали. Діатіла елюювали з промитої смоли з використанням 50 мМ гліцину, рН 3,0. Елюйовані діатіла відразу нейтралізували 1М тріс/НСІ, рН 8,0 ї концентрували на концентраторі центрифугального типу. Потім концентровані діатіла очищали за допомогою ексклюзійної хроматографії на колонці з Зирегаех 200, урівноваженій в РВ5.
ЕХ: Ексклюзійну хроматографію проводили для оцінки відповідного розміру і гетерогенності діатіл, елюйованих з колонки. ЕХ-аналіз здійснювали на колонці СЕ пеайпсаге Зирегаех 200НК 10/30, урівноваженій РВ5. Потім проводили порівняння профілів елюювання повнорозмірного
Іс (7150 кДа), Гар-фрагмента (50 кДа) і одноланцюжкового Ем (30 кДа), використовуваного як контроль.
ЕГІЗА: Зв'язування елюйованих і очищених діатіл охарактеризовували за допомогою ЕГІЗА- аналізу, описаного в розділі 5.4.2.50 мкл/ямку 2 мкг/мл розчину 5С0328-Ід наносили на 96- ямковий планшет Махізогр у карбонатному буфері і залишали на ніч при 4 "С. Планшети три рази промивали РВЗ-Т (РВБ, 0,1 95 твіну 20) і блокували 0,5 95 ВЗА у РВ5З-Т протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. Потім СВО п286-п308, СМО п286, або СМО п308 розводили у блокуючому буфері у серійних дворазових розведеннях і одержували діатіла в концентраціях, що становлять від 0,5 мкг/мл до 0,001 мкг/мл. Потім планшет інкубували при кімнатній температурі протягом 1 години. Після триразового промивання РВ5-Т, у кожну ямку додавали 50 мкл/ямку 0,2 мкг/мл 5СО16А-біотину. Після цього планшет знову інкубували при кімнатній температурі протягом 1 години. Після триразового промивання РВ5-Т, 50 мкл/ямку 1:5000- розведення ПХ-кон'югованого стрептавідину (Атегепат РВІагптасіа Віоїтесі) використовували для детектування. ПХ-стрептавідин залишали на 45 хвилин для інкубування при кімнатній температурі. Планшет три рази промивали РВ5-Т і виявляли з використанням 80 мкл/ямку субстрату ТМВ. Після 10-хвилинного інкубування реакцію ПХ-ТМВ припиняли шляхом додавання 40 мкл/ямку 195 Наг5О:. 00450 нм зчитували на 96-ямковому планшет-рідері з використанням програми 5ОБЕТтах, і за отриманими результатами будували графік з використанням програми СгтарпРадРгізт 3.03.
Аналіз ВІАсоге: Кінетичні параметри зв'язування елюйованих і очищених діатіл тестували за допомогою аналізу ВіАсоге (на обладнанні ВіАсоге 1000, ВіАсоге Іпс., Різсайажау, М.9.) з використанням програми, описаної в розділі 5.4.3. 5Ср16А, 500328 або 5С2032А (негативний контроль) іммобілізували на одній з чотирьох протокових кювет (протокова кювета 2) на поверхні сенсорного чипа за допомогою хімічної реакції приєднання аміну (шляхом модифікації карбоксиметильних груп сумішшю МНЗ/ЕОС) так, щоб на поверхні було іммобілізовано приблизно 1000 одиниць відгуку (КО) кожного з рецепторів. Після цього активні складні ефіри, які не прореагували, "звіддеплювали" шляхом ін'єкції ТМ ЕМН». Після одержання придатної поверхні, ковалентно зв'язані біспецифічні діатіла (сво п28в6-п308) або ковалентно зв'язані моноспецифічні діатіла (СМО п286 або пЗс8 СМВ) пропускали над цією поверхнею шляхом 180-секундних інжекцій 6,25-200 нМ розчину при швидкості потоку 70 мл/хвилину. Для порівняння також тестували зсЕМ пЗО8.
Після збору всіх даних будували результуючі загальні криві зв'язуванням з використанням комп'ютерних алгоритмів, що поставляються виробниками, ВіАсоге, Іпс. (Різсайаулау, МУ). Ці алгоритми дозволяють обчислювати Коп і Кої, з яких була виведена позірна константа рівноважного зв'язування Ка, що виражається як відношення двох констант швидкості (тобто,
Ко) Кон/Коп). Більш докладний опис обчислення окремих констант швидкості можна знайти в довідковому посібнику ВіАемаЇІчаійоп Зоймаге Напабоок (ВіАсоге, Іпс., Різсагамау, МУ).
Фази асоціації і дисоціації будували окремо. Константа швидкості дисоціації була отримана через інтервали 32-34 секунд 180-секундної фази дисоціації; а фаза асоціації була побудована по 1:1 ленгмюрівській моделі, і підбір кривої здійснювали за значеннями КЕ тах і відповідно до хіг- критерію для біспецифічних діатіл і 5сЕм, а для зв'язування з СМО був використаний двовалентний аналіт.
Результати
ДСН-ПААГ-аналіз у невідновлювальних умовах показав, що очищений продукт кожної з експресійних систем СМО пЗ3О8, СМО п286 і СМО п286-п308 являють собою одну молекулу з оціненою молекулярною масою, що становить приблизно 50 кДа (фіг. З, доріжки 4, 5 і 6, відповідно). У відновлювальних умовах очищений продукт, що походить від будь-якої 3 цих експресійних СМО-систем, являє собою одну смугу (доріжки 1 і 2), а очищений продукт, що походить від СВО-системи п286-п308, являє собою 2 окремі білки (фіг. З, доріжка 3). Усі поліпептиди, виділені з експресійної системи і візуалізовані за допомогою електрофорезу в
ДСН-ПААГ у відновлювальних умовах, мігрували приблизно при 28 кДа.
ЕХ-аналіз кожного продукту експресійной системи також виявив окремі молекули (фіг. 4В), кожна з який елюювалась приблизно в той же час, як і Раб-фрагмент дае (450 кДа) (фіг. 4А).
Отримані результати показали, що афінно очищений продукт являє собою гомогенний ковалентно зв'язаний гомодимер, у випадку експресійної СМО-системи, і гомогенний ковалентно зв'язаний гетеродимер, у випадку СВО п286-Н3а8. "Сендвіч»-ЕЇ ІЗА-аналіз був проведений з метою тестування зв'язування СВО п286-п308 на його специфічність до одного або до обох СЮОЗ32В і/або СО16А (фіг. 53. СО32В служить як антиген-мішень, а СО16А служить як другий зонд. Позитивний сигнал у ЕГІ5А указував на те, що гомодимерний СВО п286-п308 має специфічність до обох антигенів. В аналогічному тесті для СМО п308 (який не повинний зв'язуватися з СОЗ2В) сигнал не виявлявся.
ППР-аналіз показав, що СМО п308 імуноспецифічно розпізнає 5СО16, але не розпізнає 5020328, СМО п286 імуноспецифічно розпізнає 50328, але не розпізнає 50016, а СВО п286- п3О8 імуноспецифічно розпізнає обох 52016 і 520328 (фіг. бА-В). Жодне з цих тестованих діатіл не зв'язувалося з контрольним рецептором 5СО32А (фіг. 6С).
ППР-аналіз також проводили для обчислення кінетичних констант і констант рівноважного зв'язування СМО і СВО п286-п308 з 52016 і/або 520328. Отримані результати порівнювали з аналогічними константами, обчисленими для 5сЕМ п308. На фіг. 7А-Е представлені графіки, побудовані за результатами ППР-аналіза. Кінетичні константи швидкості асоціації і дисоціації, а також константи рівноваги, обчислені за результатами, представленим на фіг.7, вказані в таблиці 13.
Таблиця 13
Кінетичні константи і константи рівноваги, обчислені но даних аналізу ВіІАсоге
Результати цих досліджень, об'єднані з результатами ЕГІЗА-аналізу, підтвердили, що ковалентно зв'язаний гетеродимер п286-п308 зберігав специфічність до обох СОЗ32В і СО16, і мав здатність зв'язуватися з обома антигенами одночасно. Ця молекула схематично представлена на фіг. 8. 6.2. Конструювання і характеризація ковалентно зв'язаних біспецифічних діатіл, що містять
Ес-домени
З метою створення Ідс-подібної молекули, тобто молекули, що містить Ес-домен, один з поліпептидів, які містять гетеродимерну молекулу СВО, описану в прикладі 6.1, додатково модифікували так, щоб вона містила Ес-домен (для створення "більш важкого" і "більш легкого" ланцюгів, аналогічних важкому і легсому ланцюгам антитіла). Гетеродимерна біспецифічна молекула повинна містити Ес-домен, що буде димеризуватися з гомологічною молекулою з утворенням тетрамерної чотиривалентної ІдО-подібної молекули (тобто, молекули, утвореної за допомогою димеризації Ес-доменів гетеродимерних біспецифічних молекул). Цікаво відзначити, що такі тетрамерні молекули не детектувались у кондиціонованих середовищах рекомбінантних експресійних систем за допомогою функціональних аналізів, наприклад, шляхом тестування кондиціонованого середовища на імуноспецифічне зв'язування з антигенами-мішенями. Замість цього, у таких функціональних аналізах детектувалась тільки димерна молекула, що містила мономери, які складаються з Мі -, МН- і Ес-доменів. Для того щоб визначити, чи має теоретична тетрамерна структура стабільність, поліпептиди, що містять Ес-домен, додатково конструювали так, щоб вони містили шарнірну ділянку, а поліпептиди, що містять "більш легкий ланцюг",
Зо додатково конструювали так, щоб вони містили 6 С-кінцевих амінокислот константного домену людського легкого ланцюга каппа. Якщо такі реконструйовані "більш важкі" і "більш легкі" ланцюги були коекспресовані в рекомбінантних експресійних системах, то в цьому випадку функціональні аналізи дозволяли детектувати молекули діатіл, що мають здатність імуноспецифічно зв'язуватися з антигенами-мішенями і з анти-Ес антитілами.
Матеріали і методи
Конструювання і моделювання поліпептидних молекул: Нуклеїновокислотні експресійні вектори були сконструйовані для створення модифікованих варіантів конструкцій 1 і 2, описаних у прикладі 6.1. Конструкції 5 (ЗЕО ІЮО МО: 14) і 6 (ЗЕО ІО МО: 15) були отримані шляхом створення конструкцій 1 і 2, відповідно, які додатково містять Ес-домен. Конструкція 7 (ЗЕО ІЮ
МО: 16) була отримана шляхом створення конструкції 1, що також містила послідовність
ЕМКОЕС (ЗЕО ІЮ МО: 23) біля свого С-кінця. Конструкція 8 (ЗЕО ІЮО МО: 18) була отримана шляхом створення конструкції 2, що також містила шарнірну ділянку і Ес-домен (имеющие мутацію М215А). Конструкції 5-8 схематично представлені на фіг. 9.
ПЛР ї конструювання експресійного вектора: Усі ПЛР і протоколи очищення ПЛР-продуктів описані в прикладі 6.1. Плазміди рмМОхХОоб66б9 і рмоОхХоО667 служили як матриці для послідовностей, що кодують конструкції 1 і 2, відповідно. Послідовності, які кодують Ес-домен і/або шарнірний домен НиЇдс, представлені як ЗЕО ІЮ МО: 5 або 5ЕО ІЮ МО: 1 ії 5ЕО ІЮ МО: 5, відповідно. Кодуючі послідовності матричних ДНК ампліфікували з використанням прямого і зворотного праймерів так, щоб ПЛР-продукти містили послідовності, що перекриваються, що дозволяє проводити ПЛР із перекриванням для одержання послідовностей, що кодують потрібні продукти.
Кодуючу послідовність конструкції 1 ампліфікували з РМОХОб669 з використанням прямого і зворотного праймерів 5ЕО ІО МО: 55 і 5ЕО ІЮ МО: 62, відповідно. Кодуючу послідовність конструкції 2 ампліфікували з РМОХО667 з використанням прямого і зворотного праймерів зЕО
ІЮО МО: 55 ії 5ЕО ІЮО МО: 63, відповідно. Шарнірний домен-Ес-домен Ниїдо ампліфікували з використанням прямого і зворотного праймерів 5ЕО ІЮО МО: 65 і 5БО ІО МО: 66, відповідно.
Конструкцію 7 (5БО ІЮ МО: 16) ампліфікували з рМОХОбб9 з використанням прямого і зворотного праймерів БЕО ІЮ МО: 55 і БЕО ІО МО: 67.
ПЛР із перекриванням: Вихідні ПЛР-продукти об'єднували, як описано нижче, і ампліфікували й очищали, як описано в прикладі 6.1.
Послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує конструкцію 5, 5ЗЕО ІЮ МО: 14 (схематично показано на фіг. 9), ампліфікували шляхом об'єднання ПЛР-продуктів ампліфікації конструкції 1 і
Ес-домену НиїЇдос і прямого і зворотного праймерів БЕО ІЮО МО: 55 і 5ЕО ІЮО МО: 64, відповідно.
Послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує конструкцію 6, 5ЕО ІЮ МО: 15 (схематично показано на фіг. 9), ампліфікували шляхом об'єднання ПЛР-продуктів ампліфікації конструкції 2 і
Ес-домену НиїЇдос і прямого і зворотного праймерів БЕО ІЮО МО: 55 і 5ЕО ІЮО МО: 66, відповідно.
Послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує конструкцію 8, 5ЕО ІЮ МО: 18 (схематично показано на фіг. 9), ампліфікували шляхом об'єднання ПЛР-продуктів ампліфікації конструкції 2 і шарнірного домену-Рс-домену НиїЇдос і прямого і зворотного праймерів ЗЕО ІО МО: 55 і 5ЕО ІО
МО: 66, відповідно.
Кінцеві продукти клонували в експресійний вектор ссавців рСіІпео (Рготеда, Іпс.), як описано раніше. Плазмідні кодуючі конструкції позначали, як показано в таблиці 14.
Таблиця 14
Плазмідні конструкції конструкція плазміди 6 | рмехоб74 |пизО8МІ по2ВбУННиЕсСЯС////77777777711111111111111сС1 8 | рмехов78 |Низв8МІ-пи2вбУН-людськ. шарнірний домен-Рс-домен (А215М).Ш
Експресія поліпептиду/діатіла: Клітини НЕК-293 котрансфікували з використанням ліпофектаміну 2000, як описано в розділі 6.1, чотирма окремими плазмідами, а саме, плазмідами рмМОехХОо6б6б9 і рмМОехХО674, що кодують конструкції 1 ії б, відповідно; плазмідами рмоехо667 і рМОехХО676, що кодують конструкції 2 ї 5, відповідно; і плазмідами, РМОХО677 і рмохо0678, що кодують конструкції 7 і 8, відповідно.
Спільне перенесення цих плазмід у клітини здійснювали так, щоб це приводило до експресії чотиривалентного біспецифічного діатіла (СВО) з ІдС-подібною структурою, яке є імуноспецифічним до ЕсуУкКІІВ і ЕсуКША. Також здійснювали додаткову котрансфекцію плазмідами рмМоОхХОо674 і рмМоОхХО676, що кодують конструкції б і 5, відповідно. Після культивування протягом трьох днів збирали кондиціоновані середовища. Кількість секретованого продукту в кондиціонованому середовищі оцінювали за допомогою ЕГІЗА- аналізу Ес-фрагмента ІдС;ї з використанням очищеного Ес як стандарту. Потім концентрації продукту в зразках нормалізували по їхній кількості, і нормалізовані зразки використовували в інших аналізах.
ЕГІЗА: Зв'язування молекул діатіл, секретованих у середовище, аналізували за допомогою "сендвіч»-ЕГІЗА, як описано вище. Якщо це не обговорено особливо, то СО328В використовували для сенсибілізації планшета, тобто як білок-мішень, а ПХ-кон'югований СО16 використовували як зонд.
Результати
ЕПІЗА-аналіз проводили для тестування нормалізованих зразків, отриманих з рекомбінантних експресійних систем, що містять конструкції 1 ії 6 (рмохХб669-рмМахб74), конструкції 2 ї 5 (рмохХ667-рМОохХ676) і конструкції 5 і 6 (рмохХб674-ряМОХ676), на експресію молекул діатіл, здатних одночасно зв'язуватися з СОЗ2В і СО16А (фіг. 10). Дані ЕГІЗА-аналізу показали, що котрансфекція конструкціями 1 і б або котрансфекція конструкціями 2 і 5 не дозволяла отримувати продукт, який міг би зв'язуватися з одним з антигенів або з обома антигенами (фіг. 10, с ї А, відповідно). Однак котрансфекція конструкціями 5 і 6 приводила до секреції продукту, здатного зв'язуватися з обома антигенами СОЗ32В і СО16. Останній продукт являє собою димер, що складається з конструкцій 5 і 6 і містить один зв'язувальний сайт для кожного антигену зі структурою, схематично представленою на фіг. 11.
Для індукування утворення Ідс-подібної гетеротетрамерної структури, послідовність, яка кодує шість додаткових амінокислот, приєднували до С-кінця конструкції 1 і одержували конструкцію 7 (5ЕО ІЮ МО: 16, схематично показану на фіг. 9). Ці шість додаткових амінокислот,
ЕМКОЕС (5ЕО ІО МО: 23), походять від С-кінця легкого ланцюга каппа і звичайно взаємодіють з верхнім шарнірним доменом важкого ланцюга в молекулі ІДС. Потім шарнірний домен вбудовували в конструкцію 6 і одержували конструкцію 8 (ЗЕО ІО МО: 18 і фіг. 9). Конструкція 8 додатково містила амінокислотну мутацію у верхній шарнірній ділянці, А215М. Потім експресійні плазміди, що кодують конструкцію 7 і конструкцію 8, рРМОХб77 і рмМохХб678, відповідно, були спільно перенесені в клітини НЕК-293 і експресовані, як описано раніше.
Молекули діатіла, продуковані з рекомбінантної експресійної системи, що містить конструкції 7 і 8 (рмМОХОб677-рмохо0678), порівнювали з молекулами діатіла, продукованими з експресійних систем, що містять конструкції 1 і б (рмМмохб6б9-рмох674), конструкції 2 і 8 (рмохХб669-рмохв678) і конструкції 6 і 7 (рмохХб677-рмох674), у ЕГІ5А-аналізі на зв'язування з сО328 ї СО16А (фіг. 12).
Як було описано раніше, молекула, продукована експресійною системою, що містить конструкції 1 і 6 (рмМОХб6б69»-рмох674), виявилася нездатною зв'язуватися з СОЗ2А і СО16А (фіг. 10 ї фіг. 12). На відміну від цього, продукт, отриманий за допомогою коекспресії будь-якої з конструкцій 7 ії 6 (рмОохХОо677-рмОехХО0674) або коекспресії конструкцій 7 і 8 (рмехо677- рмохо678), мав здатність зв'язуватися з СОЗ2В і СО16 (фіг. 12). Слід зазначити, що конструкція 7 була аналогічна конструкції 1, за винятком того, що конструкція 7 містила С-кінцеву послідовність ЕМКОЕС (5ЕС ІЮ МО:23); а конструкція 8 була аналогічна конструкції 6, за винятком того, що конструкція 8 містила шарнірний домен і мутацію А215М. Ці дані показали, що
Ко) додавання 6 додаткових амінокислот біля С-кінця легкого ланцюга С-каппа (ЕМКОЕС; 5ЕО ІЮ
МО: 23), тобто "більш легкого" ланцюга, що не несе Ес, сприяло стабілізації утворення тетрамерних ІдС-подібних молекул діатіла, незалежно від того, чи містить відповідний "більш важкий" ланцюг шарнірний домен чи ні (тобто, рМОХО677 -рмехо674 і рмохХОо677-рмахоб678, фіг. 12). Додавання шарнірного домену до Ес-несучого "більш важкого" поліпептиду, але без додавання С-кінцевої послідовності ЕМКСОЕС (ЗЕО ІО МО: 23) до відповідного "більш легкого" ланцюга, ймовірно, не приводить до аналогічної стабілізації (тобто, через відсутність зв'язування з продуктами котрансфекції конструкцій 2 і 8 (рмохХб6б9»-рмох678)). Структура тетрамерної молекули діатіла схематично представлена на фіг. 13. 6.3. Вплив порядку розташування доменів і додаткових дисульфідних зв'язків на утворення тетрамерного Ідс-подібного діатіла
Ефект додаткової стабілізації між "більш легким" і "більш важким" поліпептидними ланцюгами тетрамерної Ідс-подібної молекули діатіла досліджували шляхом заміни вибраних залишків на поліпептидних ланцюгах цистеїновими залишками. Додаткові цистеїнові залишки створюють додаткові дисульфідні зв'язки між "більш важким" і "більш легким" ланцюгами. Крім того, вплив розташування доменів на активність зв'язування досліджували шляхом переміщення Ес-домену або шарнірного домену-Ес-домену з С-кінця поліпептидного ланцюга в
М-кінець. Хоча зв'язувальна активність молекули, що містить додаткові дисульфідні зв'язки, не відрізнялася від зв'язувальної активності раніше сконструйованих молекул діатіла з такими зв'язками, однак, несподівано було виявлено, що перенесення Ес-домену або шарнірного домену-Рс-домену в М-кінець "більш важкого" поліпептидного ланцюга, що складає діатіло, приводило до підвищення афінності зв'язування і/або авідності зв'язування біспецифічної молекули з одним з антигенів-мішеней або з обома антигенами.
Матеріали і методи
Конструювання і моделювання поліпептидних молекул: Нуклеїновокислотні експресійні вектори були сконструйовані для створення модифікованих варіантів конструкцій 5, 6 і 8, описаних у прикладі 6.2. Конструкція 9 (ЗЕБО ІО МО: 19) ії конструкція 10 (5ЕБО ІЮО МО: 20) (схематично представлені на фіг. 13) були аналогічні конструкціям 8 і б, за винятком того, що або Рс-домен шарнірний домен-Ес-домен, відповідно, були перенесені з С-кінця поліпептиду в
М-кінець. Крім того, усі використовувані Ес-домени являють собою Ес-домени Ідс1 дикого типу. 60 Конструкція 11, 5ЕО ІЮ МО: 21 (схематично представлена на фіг. 14), була аналогічна конструкції 2, вказаній в прикладі 6.1, за винятком того, що С-кінець цієї конструкції містив послідовність ЕМКОЕС (5БО ІЮ МО: 23). Конструкція 12, 5БО ІО МО: 22 (схематично представлена на фіг. 14), була аналогічна конструкції 5, вказаній в прикладі 6.2, за винятком того, що Ес-домен також містив шарнірну ділянку. Крім того, у конструкціях 11 і 12, Мі -домен 286 і МнН-домен 286 мали одну амінокислотну модифікацію (5105С і 44С, відповідно), тобто, гліцин у кожному домені був замінений цистеїном.
ПЛР ї конструювання експресійного вектора: Усі ПЛР і протоколи очищення ПЛР-продуктів описані в прикладах 6.1 і 6.2.
ПЛР із перекриванням: Кінцеві ПЛР-продукти конструювали, ампліфікували й очищали методами, описаними в прикладах 6.1 і 6.2.
Кінцеві продукти клонували в експресійний вектор ссавців рСіпео (Рготеда, Іпс.), як описано раніше. Плазмідні кодуючі конструкції, позначали, як показано в таблиці 15.
Таблиця 15
Плазмідні конструкції
ШВИ ЗИ й : Вставка конструкція плазміди 777717И79 |рМОХО/19 людсько шарнірнийдомен/гс-пи3зО8МУМІ-пи2ВбУН.ЦШЛШЮ
Експресія поліпептиду/діатіла: Клітини НЕК-293 котрансфікували з використанням ліпофектаміну 2000, як описано в розділі 6.1, трьома окремими плазмідами, а саме, плазмідами рмохо669 і рМмОехХО719, що кодують конструкції 1 і 9, відповідно; плазмідами рМОХО669 і рмохо718, що кодують конструкції 1 і 10, відповідно; і плазмідами рМОеХО617 і рМОХО717, що кодують конструкції 11 і 12, відповідно. Спільне перенесення цих плазмід у клітини здійснювали так, щоб це приводило до експресії чотиривалентного біспецифічного діатіла (СВО) з ІдС- подібною структурою, яке є імуноспецифічним до ЕсукіІІВ і ЕсукІША. Після культивування протягом трьох днів збирали кондиціоновані середовища. Кількість секретованого продукту в кондиціонованому середовищі оцінювали за допомогою ЕЇІЗА-аналізу Ес-фрагмента ІДС з використанням очищеного Ес як стандарту. Потім концентрації продукту в зразках нормалізували по їхній кількості, і нормалізовані зразки використовували в інших аналізах.
ЕГІЗА: Зв'язування молекул діатіл, секретованих у середовище, аналізували за допомогою "сендвіч»-ЕГІЗА, як описано вище. Якщо це не обговорено особливо, то СО328В використовували для сенсибілізації планшета, тобто як білок-мішень, а ПХ-кон'югований СО16 використовували як зонд.
Зо Вестерн-блот-аналіз: Приблизно 15 мл кондиціонованого середовища, отриманого від трьох описаних вище ко-трансфекцій, аналізували за допомогою електрофорезу в ДСН-ПААГ у невідновлювальних умовах. Один гель забарвлювали синім барвником бітріу Вісе Заїезіаїп (Іпмігодеп), а ідентичний гель переносили на ПВДФ-мембрани (Іпмігодеп) стандартними методами перенесення. Після перенесення мембрани блокували 595 сухим сепарованим молоком у їх РВ5. Потім ці мембрани інкубували в 10 мл 1:8000-розведеного ПХ-кон'югованого козячого антитіла проти людських НяЇ. ІдО1 у 2 96 сухому сепарованому молоці в їхРВБ/0,1 Фо твін 20 при кімнатній температурі протягом 1 години при легкому помішуванні. Після промивання 1хРВ5Б/О,3 9о твін 20 два рази, щораз по 5 хвилин, а потім протягом 20 хвилин при кімнатній температурі, мембрану виявляли на детектуючій системі для вестерн-блот-аналіза
ЕХЛ-методом (Атег5пат Віозсіепсев5) відповідно до інструкцій виробників. Плівку виявляли на рентгенівському процесорі.
Результати
Кондиціоноване середовище, отримане від рекомбінантних експресійних систем, що містять конструкції 1 і 9, конструкції 1 ї 10 ї конструкції 11 і 12, було проаналізоване за допомогою електрофорезу в ДСН-ПААГ (у невідновлювальних умовах) і вестерн-блот-аналіза (з використанням анти-ІдС; антитіла як зонду). Вестерн-блот-аналіз показав, що продукт, виділений із систем, що містять конструкції 11 і 12 або конструкції 9 і 1, переважно являв собою одну молекулу розміром приблизно 150 кДа (фіг. 14, доріжки З і 2, відповідно). Обидва ці продукти мали внутрішні дисульфідні зв'язки, розташовані між "більш легким" і "більш важким" ланцюгами діатіла. На відміну від цього, молекула, у якій були відсутні внутрішні дисульфідні зв'язки між "більш легким" і "більш важким" ланцюгами, і яка складалася з конструкцій 10 і 1, утворювала щонайменше дві молекули, що мають молекулярні маси «75 і «100 кДа (фіг. 14, доріжка 1).
Незважаючи на результати вестерн-блот-аналіза, кожний з цих трьох продуктів мав здатність зв'язуватися з СОЗ2А і СО16 (фіг. 15). Несподівано було виявлено, що в порівнянні з продуктом, що містить С-кінцевий шарнірний домен-Ес-домен (утворений конструкціями 11 і 12), продукт від обох систем, у якому Ес-домен (або Ес-домнен-шарнірний домен) був розташований біля аміно-кінця Ес-вмісного поліпептидного ланцюга (тобто, "більш важкого" ланцюга) (конструкції 9-1 і 10-41), мав підвищену афінність і/або авідність до одного з пептидів-мішеней або до обох цих пептидів (тобто, СОЗ2В і/або СО16). 6.4. Вплив внутрішнього/зовнішнього сайту розщеплення на процесинг поліпротеїнового попередника й експресію ковалентно зв'язаного біспецифічного діатіла; конструювання і характеризація біспецифічного діатіла, що містить частини ланцюга лямбда людського Іда і шарнірний домен
Як описано в даній заявці, окремі поліпептидні ланцюги діатіла або молекули діатіла відповідно до винаходу можуть експресуватися у вигляді однієї молекули поліпротеїнового попередника. Здатність рекомбінантних систем, описаних у прикладах 6.1-6.3, "правильно" процесувати і експресувати функціональне СВО з такого поліпротеїнового попередника аналізували шляхом конструювання нуклеїнової кислоти, що кодує перший і другий поліпептидні ланцюги СВО, розділені внутрішнім сайтом розщеплення, зокрема, сайтом розщеплення фурином. Функціональне СВО виділяли з рекомбінантної системи, що містить молекулу поліпротеїнового попередника.
Як обговорювалося в прикладі 6.3, було виявлено, що додавання 6 С-кінцевих амінокислот з людського легкого ланцюга каппа, ЕМКОЕС (5ЕБО ІЮ МО: 23), приводило до стабілізації утворення діатіла, - ймовірно, за допомогою посилення міжланцюгової взаємодії між доменами, що містять ЗЕО ІЮО МО: 23, і доменами, що містять Ес-домен або шарнірний домен-Ес-домен.
Стабілізуючий ефект такої взаємодії ланцюга лямбда/Рс аналізували в СВО, де жоден з поліпептидних ланцюгів не містив Ес-домену. Один поліпептидний ланцюг діатіла був сконструйований так, щоб він містив ЗЕО ІО МО: 23 біля свого С-кінця, а поліпептидний ланцюг-
Зо партнер був сконструйований так, щоб він містив амінокислотну послідовність МЕРК5С (5ЕО ІЮ
МО: 77), що походила від шарнірного домену Ідсї. Порівняння цього СВО з діатілом, що складається з конструкцій 1 і 2 (приклади 6.1), показало, що СВО, що містять домени, які походять від шарнірного домену і ланцюга лямбда, мали дещо більш високу афінність до одного з епітопів-мішеней або до обох епітопів.
Матеріали і методи
Конструювання і моделювання поліпептидних молекул: Поліпротеїновий попередник:
Нуклеїновокислотні експресійні вектори були сконструйовані для створення 2 молекул поліпротеїнових попередників, схематично проілюстрованих на фіг.17. Конструкція 13 (ЗЕО ІЮ
МО: 95) складалася з М-кінця поліпептидного ланцюга, Мі -домену 358, МН-домену 2.402 (який зв'язувався з тСО328), сайту розщеплення фурином, Мі-домену 2.4052 і МН-домену 308.
Нуклеотидна послідовність, яка кодує конструкцію 13, представлена в 5ЕБО ІЮО МО: 96.
Конструкція 14 (5ЕО ІЮО МО: 97) (фіг. 17) складалася з М-кінця поліпептидного ланцюга, Мі - домену 3058, МН-домену 2.4052 (який зв'язувався з тСоО328), сайту розщеплення фурином, сайту ЕМО (протеази СЗ вірусу ящуру), Мі-домену 2.405952 і МН-домену 308. Нуклеотидна послідовність, яка кодує конструкцію 14, представлена в 5ЕО ІЮ МО: 98.
Нуклеїновокислотні експресійні вектори були сконструйовані для створення модифікованих варіантів конструкцій 1 і 2, описаних у прикладі 6.1. Конструкція 15 (ЗЕО ІЮ МО: 99, фіг.17) була аналогічна конструкції 1 (5ЕО ІО МО: 9), представленій в прикладі 6.1, за винятком того, що С- кінець конструкції 15 містив амінокислотну послідовність ЕМАКСЕС (ЗЕБО ІЮ МО: 23).
Послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує конструкцію 15, представлена в 5ЕО ІЮО МО: 100.
Конструкція 16 (ЗЕО ІЮ МО: 101) (фіг. 17) була аналогічна конструкції 2, представленій в прикладі 6.1, за винятком того, що С-кінець конструкції 16 містив амінокислотну послідовність
МЕРКБС (5БО ІЮ МО: 77). Послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує конструкцію 16, представлена в 5ЕО ІЮ МО: 102.
ПЛР ї конструювання експресійного вектора: Усі ПЛР і протоколи очищення ПЛР-продуктів описані в прикладах 6.1 і 6.2.
ПЛР із перекриванням: Кінцеві ПЛР-продукти конструювали, ампліфікували й очищали методами, описаними в прикладах 6.1 і 6.2, з використанням відповідних праймерів.
Кінцеві продукти клонували в експресійний вектор ссавців рСіІпео (Рготеда, Іпс.), як описано бо раніше. Плазмідні кодуючі конструкції позначали, як показано в таблиці 16.
Таблиця 16
Плазмідні конструкції не | атнняни вію 33- й : Вставка конструкція плазміди
Експресія поліпептиду/діатіла: Клітини НЕК-293 трансфікували з використанням ліпофектаміну 2000, як описано в розділі 6.1, шляхом перенесення однієї плазміди РМОХО750, що кодує конструкцію 13, і двох плазмід РМОХО752 і рМОХО 753, які кодують конструкції 15 і 16, відповідно. Після культивування протягом трьох днів збирали кондиціоновані середовища, і секретований продукт піддавали афінному очищенню, як описано в даній заявці.
ЕПІЗА: Зв'язування молекул діатіл, секретованих у середовище, аналізували за допомогою "сендвіч»-ЕГІЗА, як описано вище. Мишачий СО32В використовували для сенсибілізації планшета, тобто, як білок-мішень, а ПХ-кон'югований СО16А використовували як зонд для продукту котрансфекції конструкцій 15 і 16. тСО32В використовували як білок-мішень, а кон'югований з біотином СО1Т6А використовували як зонд для рекомбінантної системи, що містить конструкцію 13.
Результати
Кондиціоноване середовище від рекомбінантних експресійних систем, що містять конструкції 13, аналізували за допомогою "сендвіч»-ЕГ І5А. ЕІ ІЗА-аналіз проводили для оцінки специфічності зв'язування СВО з будь-яким з тСО328В і/або СО16 або з обома цими антигенами (фіг 18). СО32В служив як антиген-мішень, а СО1ТбА використовували як другий зонд.
Позитивний сигнал у ЕГІЗА-аналізі вказував на те, що гетеродимерне СВО п2.4052-НЗав8, продуковане з поліпротеїнового попередника, мало специфічність до обох антигенів.
Аналогічним чином, очищений продукт, продукований за допомогою котрансфекції векторами, що кодують конструкції 15 і 16, тестували в ЕГ ІЗА-аналізі і порівнювали з продуктом, що складається з конструкцій 1 і 2 (приклад 6.1). СО32В служив як антиген-мішень, а СО16А використовували як другий зонд. Було виявлено, що продукт, який складається з конструкцій 1 і 2, а також продукт, який складається з конструкцій 15 і 16, здатні одночасно зв'язуватися з сСОо328 ії СО16А. Дійсно, продукт, що складається з конструкцій 15 і 16, виявляв злегка підвищену афінність відносно одного або обох антигенів-мішеней, тобто до СОЗ2В або СО16А.
Це, ймовірно, обумовлено підвищеною стабільністю і/або точністю (у порівнянні з взаємодією
МН-МІ-домену дикого типу) внутрішньоланцюгового зв'язування, забезпечуваного взаємодією ділянки ланцюга лямбда, ЕМКСОЕС (5ЕО ІЮ МО: 23) і шарнірної ділянки МЕРКЗС (5ЕО ІЮ МО: 717), яка була відсутня в продукті, що складається з конструкцій 1 і 2. 6.5. Застосування перенацілювальних реагентів з подвійною афінністю ("САКТ") для зв'язування з множиною афінностей
В одному зі своїх аспектів даний винахід стосується нових "перенацілювальних реагентів з подвійною афінністю" ("АКТ"), а також нових способів зв'язування з множиною афінностей. "ВАКТ" можуть бути моноспецифічними, біспецифічними, триспецифічними і т. п., тобто, вони мають здатність одночасно зв'язуватися з одним, двома, трьома або більше різними епітопами (які можуть являти собою ті самі або різні антигени). "САКТ" можуть бути також одновалентними, двовалентними, тривалентними, чотиривалентними, п'ятивалентними, шестивалентними і т. п., тобто, вони можуть одночасно зв'язуватися з однією, двома, трьома, чотирма, п'ятьма, шістьма або більше молекулами. Як показано на фіг. 35, ці дві ознаки ОАКТ можуть бути об'єднані, наприклад, для одержання біспецифічних антитіл, які є чотиривалентними і т. п.
Одна з переваг розробки БАКТ полягає в тому, що він має афінність відносно прототипового імунного рецептора, пиСОЗ2В, а також до гаптену, флуоресцеїну. Цей САКТ, що позначається "2886/4420", служить як універсальний адаптер, що має здатність зв'язувати пиСО32В з молекулами, що взаємодіють з партнерами по зв'язуванню, кон'югованими з флуоресцеїном. СО32В являє собою Ес-рецептор, що має здатність гасити активуючі сигнали за допомогою кластеризації з імунними комплексами, що передають активуючі сигнали. Ця технологія, на початковому етапі її здійснення, дозволяє швидко скринувати декілька біологічних мішеней на кластеризацію з пиСОЗ32В і не вимагає одержання нових конструкцій рАКТ. 2886/4420 може бути просто змішаний із флуоресцеїн-кон'юЮгованим антитілом, спрямованим проти рецептора клітинної поверхні, що дозволяє імітувати дію АКТ з афінністю до цього рецептора (фіг. 20). Крім того, за допомогою цього реагенту можна здійснювати ефективне зв'язування афінних реагентів, які важко піддаються експресії або продукуванню, що дозволяє вирішити існуючі технічні проблеми. 286/4420-вмісні ПОАКТ можуть бути з успіхом використані як інструменти для досліджень, а також як кандидати на їхнє застосування в клінічних цілях. 2886/4420, продукований із клітин НЕК293, може одночасно зв'язуватися з
СО328 і з флуоресцеїном у ЕГ ІЗА-аналізі. Крім того, він може інгібувати проліферацію клітин за допомогою рекрутинга СОЗ32В у комплекс ВСЕ завдяки спільному зв'язуванню з СО79. 286-гілка рАКТ може бути замінена іншою послідовністю антитіла або зв'язувальною послідовністю, що має іншу релевантну специфічність.
Матеріали і методи:
Плазмідні конструкції: 286/4420 одержували з послідовностей гуманізованого МАр 286 (пи286, МОАЗ21) і химерного мишачого Ем/людського Ес-варіанту МАБ проти флуоресцеїну, 4420. Повністю зібраний САКТ складається з двох поліпептидів, ковалентно зв'язаних із двома
Ем-ділянками. Перший поліпептид складається із секреторної сигнальної послідовності, за якою йде пи2ВбМІ, продукована у вигляді злитого білка з 4420МН, розділених лінкером, що складається з амінокислотних залишків ((0(3565(5(3055. Послідовність ЕМКОЕС, що походить від
С-кінця легкого ланцюга каппа, приєднували до С-кінця цього поліпептиду. Інший поліпептид складається із сигнальної послідовності-4420МІ -'б4СО5ИасСИсС-пои2ВбМН, де послідовність
МЕРКЗС, що походить від С-кінця Ба-фрагмента людського Ідс1, була приєднана до С-кінця.
Цистеїни в двох ланцюгах утворюють дисульфідний зв'язок, ковалентно з'єднуючу два поліпептиди (фіг. 20). Послідовності ДНК, що кодують описані поліпептиди, піддавали ПЛР- амплификації з наявних плазмід, об'єднували за допомогою ПЛР із перекриванням і клонували в рСІпео (Рготеда) між Мпе!І- і ЕсоКіІ-сайтами. І нарешті, ОАКТ з афінністю до пиСОЗ328В і пиСО16 (2886/3058), що був попередньо сконструйований методами, аналогічними методам, описаним вище, використовували як контроль.
Антитіла. Мишачі моноклональні антитіла проти людських СО79р, СВ3.1 і СВ3.2 (гібридоми) одержували в Ог. Соорег МО, у Бірмінгемському університеті в Алабамі (Опімегейу ої АіІабата аї
Зо Віппіпопат, Вігтіпуопат АГ.) СВ3.1 ї СВ3.2 були позначені флуоресцеїн-ізотіоціанатом (ФІТЦ) відповідно до інструкцій виробників (Ріегсе, КоскКтога І). Р(абв)2-фрагмент козячого антитіла (САМ), специфічного до Ес-фрагмента мишачого Ідсї (САМ), одержували з лабораторії даскзоп
І арогаїогіез (Ууезі Сгоме, РА). Мишачі анти-пиСО32В8 МАБ, 3Н7, одержували й очищали у власній лабораторії. Козяче анти-286Ем антитіло продукували шляхом імунізації кіз цілим антитілом пи286 і афінного очищення з використанням антитіла проти Рум-ділянки пи286. Ниїдос,
ФІТЦ-пиїдс і ПХ-кон'юговані антитіла проти мишачого Ід одержували з лабораторії Часкхоп
Іптітипогезеагсй. ПХ-кон'юговане антикозяче антитіло одержували з зоцївпегп Віоїесп.
Експресія ОАКТ: Плазміди, що кодують кожен ланцюг, спільно переносили в клітини 293Н (Іпмігодеп) з використанням ліпофектаміну 2000 (Іпмігодеп) відповідно до інструкцій виробників.
Секретований білок збирали 3-4 рази з інтервалами в три дні й очищали за допомогою рідинної хроматографії проти іммобілізованої розчинної форми СОЗ2В.
ЕПІ5ЗА: ОВАКТ 2886/4420 або 2886/3058 іммобілізували на планшетах Махібогр (МаЇде Мипс), покритих ФІТЦ-міченним білком 5 (Момадеп), людським ІДС: або ФІТЦ-пи Ідс. Детектування здійснювали шляхом зв'язування з розчинним ектгодоменом СОЗ2В, а потім з ЗН7 (мишачим моноклональним антитілом, специфічним до СОЗ328), і нарешті, із ПХ-кон'югованим антимишачим антитілом. Альтернативно, детектування здійснювали шляхом зв'язування з афінно очищеною сироваткою, що містить козяче поліклональне антитіло проти Ем 286, а потім із ПХ-кон'6Ютгованим антикозячим антитілом. ПХ-активність детектували з використанням колориметричного субстрату ТМВ (ВіоЕХ) і зчитували на ЕГІЗА-планшет-рідері МегзамМах.
Очищення В-клітин і аналіз на проліферацію: Мононуклеарні клітини периферичної крові брали з крові здорових донорів і розділяли в градієнті фікола-пака Рісої/Радие Ріи5 (Атегпат
Ріпаптасіа Віоїєсн, ОК). В-лімфоцити виділяли з використанням набору Бупа! для негативного відбору В-клітин (Юупа! Віоїесппоіоду Іпс., МУ) відповідно до інструкцій виробників. Чистота виділених В-клітин (С0О20:) на 9095 перевищувала чистоту, оцінену в ЕАСз-аналізі. Для проведення аналізу на проліферацію очищені В-клітини висівали в повне середовище КРМІ 1640, що міститься в плоскодонних 96-ямкових мікротитраціних планшетах, при щільності 1х105 клітин на ямку в кінцевому об'ємі 200 мкл і інкубували протягом 48 годин у присутності або під час відсутності антитіл і діатіл при 372С в 595 СО». Потім додавали 1 мкКі/ямку НіІ-тимідину (Регкіп ЕІтег, М/еПезієу, МА) і інкубування продовжували ще 16-18 годин, після чого клітини бо збирали. Включення І"Н|-тимідину визначали на рідинному сцинтиляційному лічильнику.
Результати
Для того щоб визначити, чи є ОАКТ 2886/4420 активним і специфічним, проводили два
ЕПЗА-експерименти. Спочатку 286/4420 або 286/308 (використовувані як негативний контроль) зв'язували з флуоресцеїн-кон'юЮгованим білком (5-білком), що був нанесений на ЕГІ5А- планшети. Потім 286-гілюу ОАКТ піддавали контактуванню з розчинним СОЗ32В. Зв'язування детектували з використанням іншого антитіла проти СОЗ2В, що має епітоп, що не перекривався з 286, а потім з використанням ПХ-кон'югованого "другого" антитіла. 286/4420-ОАКТ мав здатність одночасно зв'язуватися з флуоресцеїном і СОЗ32В, а 2886/3058 не мав таку здатність (фіг. 21, панель А). Якщо БАКТ був іммобілізований на планшетах, покритих розчинним СОЗ2В, і якщо зв'язування детектували з використанням антитіла, специфічного до пи286 Ем, то обидва рАКТ виявляли гарне зв'язування. Для того, щоб продемонструвати, що 286/4420-ОАКТ був здатний зв'язуватися з флуоресцеїном, кон'югованим з людським Ідс (приймаючи до уваги, що мова йде про початкове застосування цього реагенту), НиЇдо, або немічений, або мічений флуоресцеїном, зв'язували з ЕІ ІЗА-планшетами і використовували для захоплення 2886/4420. в цьому випадку 286/308 використовували як негативний контроль. Зв'язування детектували з використанням антитіла, специфічного до Ем Ни286.286/4420-ВАКТ, ймовірно, зв'язується з
ФІТЦ-НидС, але не зв'язується з неміченим НиЇдсС, що вказує на те, що цей ЮАКТ має здатність зв'язуватися з флуоресцеїном, кон'югованим з антитілом, але не виявляє якого- небудь помітного зв'язування тільки з одним антитілом. Як і очікувалося, якого-небудь зв'язування 286/3018-САКТ у жодному з цих випадків не детектувалось.
Були проведені експерименти для того, щоб продемонструвати, що 286/4420-ОАКТ здатний функціонувати як реагент із подвійною афінністю, що буде впливати на передачу сигналу в клітинному аналізі. Було показано, що коагрегація СО32В з ВСК приводить до інгібування активації В-клітин. Була досліджена здатність 286/4420-0ОАКТ до спільного контактування з
СО328 ї з ВСК, покритими анти-СО79Б6 антитілами, міченими флуоресцеїном, і до запуску механізму інгібування проліферації клітин. В-клітини були узяті з людських клітин крові шляхом негативного відбору й активовані шляхом обробки зростаючими концентраціями ФІТЦ-мічених мишачих антитіл проти людського СЮО79Б, клонів СВ3.1 і СВ3.2, і шляхом додавання Е(аб')»- фрагмента Ес-специфічного САМ як другого реагенту для перехресного зв'язування ВСЕ, разом
Зо з фіксованою концентрацією (5 мкг/мл) 286/4420-ОАКТ або з еквівалентною кількістю 286/3058-
БАКТ, тобто з молекулою, що не націлена на флуоресцеїн, а тому використовується як контроль. Проліферація клітин, оцінювана по включенню (НІ-тимідину, зростала в міру збільшення концентрацій ФІТЦ-кон'югованого моноклонального анти-СО79р антитіла- активатора під час відсутності ЮАКТ або в присутності контрольного 286/358-ОАВТ.
Присутність 286/4420-ОАКТ приводила до значного зниження рівня проліферації В-клітин при всіх концентраціях ФІТЦ-кон'югованого антитіла проти людського СЮО79Б (фіг. 22, панелі А ів, ї фіг. 23, панель А).
Інгібування проліферації не спостерігалося в тому випадку, якщо В-клітини були покриті неміченими СВ3.2 і були активовані в тих же самих експериментальних умовах, що були використані при обробці агентом 286/4420-ВОАКТ, що підтверджувало його специфічність до мішені (фіг. 23, панель В). Ці дані показали, що 286/4420-0ОАКТ має здатність перехресно зв'язуватися з СОЗ32В і ВСК і передавати інгібуючий сигнал, здатний блокувати активацію клітин, індуковану антигенним рецептором. 6.6. САКТ, що має імунотерапевтичні властивості відносно СОЗ32В-експресуючих В- клітинних злоякісних пухлин
В даний час В-клітинні злоякісні пухлини піддають лікуванню з використанням анти-СО20 антитіла КпихапФ). Однак деякі В-клітинні злоякісні пухлини не експресують СО20 або стають резистентними до ритуксану. ЮАКТ відповідно до винаходу мають альтернативні імунотерапевтичні властивості, що можуть бути використані при вирішенні проблем, що виникають при проведенні лікування анти-СО20 антитілом КйихапФф).
МО0261 являє собою перенацілювальну молекулу з подвійною афінністю (АКТ), що зв'язується з ПСОЗ32В (за допомогою антитіла п286) і з АНСО16А ії пСО16В (за допомогою антитіла ПЗ3О8).
Ефективність (виснаження В-клітин) і безпеку МО0О261 тестували на тсО327пСО16А:- мишах С5781/6, тср327пСО0328:-мишах С57В1/6 і тсО327 пСр16АСОЗ28:-мишах С57В1/6.
У цьому експерименті з повторними дозами, мишам уводили 6 і.м.-ін'єкцій (два рази на тиждень протягом З тижнів). Потім проводили моніторинг виснаження В-клітин за допомогою ЕАС5.
Безпеку оцінювали за допомогою моніторингу побічних ефектів шляхом спостереження мишей, що містяться в клітинах.
Ці дані показали, що МО0261 мав здатність виснажувати В-клітини в трансгенних мишей із двома генними мутаціями без індукування яких-небудь серйозних побічних ефектів.
Дані: тоО32"пСО16А--мишам С5781/6, тосОр32"7пС032В'-мишам С5781/6 і тсорз327- пСО16АТСОЗ2В'-мишам о С57В1/6, отриманим від Масгобепісї і виведеним шляхом схрещування, і.м. ін'єктували на дні 0, 3, 7, 10, 14 ії 17 МОо0р261 (10, 3, 1 або 0,3 мг/кг) або нерелевантне антитіло (ПЕ16, 10 мг/кг). Кров брали на дні -19 (до узяття крові) і на дні 4, 11, 18, 25132 для ЕАСзЗ-аналізу. Стан здоров'я й активність тварин реєстрували три рази на тиждень.
Схема експерименту:
Група Тварини Тестований Доза прозуки (нік) 28..1..5 | юс СОІбАнЬСОЮВь | Моров: | юю 1 З шо О32-- ВСАА ВСТЗ2 В МИ 0.3
Метод ЕАСсзЗ-аналізу: Проби цільної крові брали за 18 днів до введення п286-п368 і через 4, 11, 18, 25 ї 32 дні після введення. Проби крові аналізували для визначення впливу п286-п3Оа8 на число В-клітин за допомогою ЕАСз-аналізу. Для підрахунку числа В-клітин, Т-клітин і РММ проводили аналіз за відповідною схемою, що не включала промивання, але включала використання сфер Біож/Соцпі, отриманих від ВесКтап СоциМег Панель антитіл, використовуваних у цьому аналізі, являє собою 1А8-ФІТЦ для РММ, СОЗ-РЕ для Т-клітин, СЮО19-
АРС для В-клітин і СО45-РегсР для всіх лейкоцитів.
Результати
Миші, оброблені ПЕ16 або МОО261 (у будь-якій концентрації), не мали яких-небудь ознак дискомфорту за весь період проведення експерименту.
Виснаження В-клітин спостерігалося в мишей, трансгенних по двох пСО16А ії пСОЗ2В.
Діатіло пП286-308 зв'язувалося з ПСО16А-експресуючими ефекторними клітинами і з НСО328В- експресуючими В-клітинами, де таке зв'язування було необхідно для знищення В-клітин.
Виснаження В-клітин не спостерігалося в трансгенних мишей з однією мутацією (фіг. 24). Під час дослідження яких-небудь значимих змін рівнів Т-клітин і РММ не спостерігалося.
Для додаткової ілюстрації альтернативних імунотерапевтичних властивостей відповідно до винаходу був сконструйований сурогатний МО0О261, позначений "2.452-3028 ОВ". 2.442-308 ОВ являє собою перенацілювальну молекулу з подвійною афінністю (ОАКТ), що зв'язується з тсОоЗ328 (за допомогою антитіла 2.4052) і з НСО16А і НСО168 (за допомогою антитіла пПЗ(О8).
Зо Ефективність (виснаження В-клітин) і безпеку 2.452-3058 ОВ тестували на тСО167, тС0167 пПСО16Аз-мишах С5781/6, тоОр167 пСО168: і тср167 пСр16бАСО16Б'-мишах. У цьому експерименті з повторними дозами, мишам уводили 9 і.р.-ін'єкцій (три рази на тиждень протягом
З тижнів). Потім проводили моніторинг виснаження В-клітин за допомогою ЕБАС5. Безпеку оцінювали за допомогою моніторингу побічних ефектів шляхом спостереження мишей, що містяться в клітинах.
Ці дані показали, що 2.452-3058 ОВ мав здатність виснажувати В-клітини в пСО16- трансгенних мишей без індукування яких-небудь серйозних побічних ефектів.
Дані: тсО167, тбОр167- пСОр16Аз-мишам С5781/6, тсОр16- нСО0168: і тср16 пСрІбАСО168:-мишам, отриманим від МасгобСепісх і виведеним шляхом схрещування, і.р. ін'єктували на дні 0, 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16 і 18 2.452-3058 ОВ (75 мкг/миша) або РВ5. Кров брали на дні -19 (до узяття крові) ії на дні 4, 11 і 18 для ГАС5-аналізу. Стан здоров'я й активність тварин реєстрували три рази на тиждень.
Група Й Доза | 1 Й (Спосіб Час руна Ж тварин мкг/миша СОГПродДукт |ввеле-! забору крові ння й кр кто пет 1177601 лют ние НИ ОН ЕС ВЕУ
ВЕ Ес ШИ НО УНН НАСНИ НЕ
Метод БАСсСзЗ-аналізу: Проби цільної крові брали за 10 днів до введення 2.4052-3(08 і через 4, 11 ї 18 днів після введення. Проби крові аналізували для визначення впливу 2.4052-308 на 5 число В-клітин за допомогою ЕГАСз-аналізу. Для підрахунку числа В-клітин, Т-клітин і РММ проводили аналіз за відповідною схемою, що не включала промивання, але включала використання пробірок ТТИСОШМТ, отриманих від ВО Іттипосуїтеїйгу бузіет. Панель антитіл, використовуваних для аналізу, являла собою 1А8-ФІТЦ для РММ, СОЗ-РЕ для Т-клітин, СО19-
АРС для В-клітин і СО45-РегсР для всіх лейкоцитів.
Результати
Миші, оброблені ПЕ16 або 2.452-3058 ОВ, не мали яких-небудь ознак дискомфорту за весь період проведення експерименту.
Виснаження В-клітин спостерігалося в тСО167- пСО16А" або в тСсО167- пСр1бАНСО168:- мишей, але не в тСО167-мишей. Ці дані показали, що пСО16бА-несучі ефекторні клітини необхідні для знищення В-клітин (фіг. 25). Під час дослідження яких-небудь значимих змін рівнів
Т-клітин і РММ не спостерігалося.
Модель внутрішньовенного (і.м.) уведення: Протипухлинну активність МО0261 тестували з використанням внутрішньовенної (і.м.) моделі людської пухлинної клітинної лінії Каїї. Каїрі являє собою людську клітинну лінію лімфоми Беркітта, експресуючу НСО32В. При внутрішньовенному введенні пухлинних клітин тСО167, НСО16А:, НАС1---мишам, ці клітини локалізуються в хребті і викликають параліч задніх кінцівок.
Отримані дані показали, що МО0О261 має здатність блокувати ріст пухлинних клітин Каїї іп ммо у тоО167, пСр16Ах, ВАС1-мишей. Отримані дані показали, що МО0О261 може бути використаний для лікування СОЗ2В-експресуючих В-клітинних злоякісних пухлин у людини.
Дані: 12-20--тижневим тсСО167, йПСО1бА:, ВАСбі--мишам С5781/6б6, отриманим від
Масгосепісз і виведеним шляхом схрещування, внутрішньовенно вводили 5хіб05 клітин Каїї на день 0. Потім мишам на дні 6, 9, 13, 16, 20, 23, 27 ї 30 також внутрішньоочеревинно (і.р.) уводили 250, 25 або 2,5 мкг МО0261 або РВ5 (негативний контроль). Після цього мишей щодня спостерігали і реєстрували масу тіла два рази на тиждень. Мишей, у яких розвивався параліч
Зо задніх кінцівок, умертвляли.
Результати: РВ5З-оброблені миші гинули на дні 25-50. МЕ0О261-оброблені миші виживали щонайменше до дня 90 (фіг. 26). Таке підвищення виживаності було статистично значущим.
Порівняння кривих виживаності, проведене з використанням логрангового критерію, давало величину Х2-96,46 (аї-9; величина Р«0,0001). 6.7. Експресія ОАКТ у прокаріотах
Були проведені експерименти для оцінки здатності продукування БАКТ у хазяїнів, що не є ссавцями. Відповідно до цього, клітини Е5сПегіспіа соїї трансформували ОСАКТ -експресуючою плазмідою, і проводили моніторинг експресії ОАКТ.
Матеріали і методи:
Конструювання плазміди: 3038 являє собою гуманізоване моноклональне антитіло проти
НисСО16. Описаний тут САКТ складається з двох ковалентно зв'язаних ланцюгів, кожен з яких має МІ, за якою розташований спейсер, а за ним йде МН, за якою розташований Суб, де вказане розташування є сприятливим для утворення дисульфідного зв'язку з протилежним ланцюгом. Послідовність ОАКТ, що кодує ЗО8МІ--СіустуєтУузЗетстустуєтуєіу (ЗЕБЕО ІО МО: 10)-
Завун-І еисіусіІуСуз5, піддавали ПЛР-ампліфікації з наявною еукаріотичною експресійною конструкцією і гідролізували ферментами Мсо І ії ЕсоК І. Націлювальний вектор являє собою рЕТ25Б (жк) (Момадеп), що містить лідерну послідовність реВ для секреції в Е. соїї. Перед убудовуванням послідовностей 3058/3058 БАКТ, цей вектор модифікували в такий спосіб.
Спочатку, промотор Т7 заміняли промотором ас з більш низькою активністю для полегшення продукування розчинного білка, який хоча і експресується під його контролем на більш низькому рівні. Крім того, були введені дві точкові мутації з метою елімінації двох внутрішніх кодонів Меї, які присутні на початку сайту множинного клонування (МС5) для того, щоб забезпечити перевагу ініціації Меї, який присутній на початку лідерної послідовності реїВ. ФАКТ, що був продукований з використанням цієї конструкції, складався з двох гілок М-ділянки, що мають одну і ту ж специфічність, а саме, специфічність до НиСО 16.
Експресія: Клітини В 210ЕЗ (Момадеп) були трансформовані плазмідою рЕТ25Б(в) Т7-
Іас-308/308, і атр-резистентні колонії використовували для засіву бульйонної культури. Коли культура досягала 200600-0,5 одиниць додавали 0,5 мМ ІРТО для індукування експресії.
Культуру вирощували при 30 "С протягом 2 годин і збирали безклітинне середовище.
Очищення: 3(08/358-ОАКТ очищали в дві стадії за допомогою афінної і ексклюзійної хроматографії. САКТ захоплювали з кондиціонованого середовища за допомогою афінної хроматографії. Зокрема, СО16А зв'язували з СМВг-активованою сефарозою 4В (СЕ Неаїйсаге).
Ср1б6А-сефарозну смолу врівноважували в 20 мМ тріс/НСІ, рН 8,0, а потім завантажували на колонку. Після завершення завантаження смолу промивали врівноважувальним буфером, після чого зв'язаний ОСАКТ елюювали 50 мМ гліцину, рН 3,. Елюйований ОАКТ відразу нейтралізували 1М тріс/НСІ, рН 8,0, і концентрували на концентраторі центрифугального типу (Мімазріп 20, ОК МУУСО РЕ5, Мімазсієпсе Іпс.). Потім концентрований ЮСАКТ очищали за допомогою ексклюзійної хроматографії на колонці з Зирегдех 200 (СЕ Неайвсагеє), урівноваженій в РВ5.
Результати 1,7 літра кондиціонованого середовища для культивування Е. соїї пропускали через колонку з СО16А-сефарозою. Вихід ОАКТ становив 0,12 мг. Аналіз очищеного ОАКТ за допомогою електрофорезу в ДСН-ПААГ і ЕХ-хроматографії продемонстрував його сумісність із клітинами
Зо ссавців (СНО), які експресували контрольний САКТ (фіг. 27).
ЕПІЗА-аналіз на зв'язування експресованих у Е. соїї п3058-п328-БАКТ: Експресію п3О8- пЗзав8-рАКТ у Е. соїї вимірювали за допомогою ЕГІБА. 50 мкл/ямку 2 мкг/мл Ем-специфічного анти-п308 антитіла 2311 наносили на 96-ямковий планшет Махізогр у карбонатному буфері при 4 С протягом ночі. Цей планшет три рази промивали РВ5-Т (РВ5, 0,1 95 твін 20), а потім блокували 0,595 ВЗА у РВ5-Т протягом 30 хвилин при кімнатній температурі, після чого додавали тестований АКТ. Під час блокування експресовані в Е. соїї п3058-п3са8 АВТ, п286- пзо8 АКТ ії п286-п286 БАКТ (негативний контроль) розводили в 1 мкг/мл і 0,3 мкг/мл у
РВЗТ/В5А. У кожну ямку додавали 50 мкл/ямку розведених ОАКТ. Планшет інкубували при кімнатній температурі протягом 1 години. Після триразового промивання РВ5-Т, у планшет додавали 50 мкл/ямку 0,1 мкг/мл гібрида "біотинільований 5СО16-Ес". Планшет інкубували при кімнатній температурі протягом 1 години. Після триразового промивання РВЗ-Т, 50 мкл/ямку 1:5000-розведення ПХ-кон'югованого стрептавідину (АтегзПпат Рпагптасіа Віотеспі) використовували для детектування і інкубували при кімнатній температурі протягом 1 години.
Планшет три рази промивали РВ5-Т і виявляли з використанням 80 мкл/ямку субстрату ТМВ.
Після 5-хвилинного інкубування реакцію припиняли шляхом додавання 40 мкл/ямку 1 95 Н25О. 00450 нм зчитували на 96-ямковому планшет-рідері з використанням програми ЗОЕТтах. За отриманими результатами будували графік з використанням програми СгарпРааР'гізт 3.03. (фіг. 28). 6.8. ПОАВТ-індукована загибель людських В-клітин
БО Людські МКІК інкубували протягом ночі з конструкціями "С016-С0328В-пиз(са8-пи2гБ6" (описаними вище); "сп286-адіус - неглікозиловане химерне антитіло 286" (описаними в одночасно розглянутій заявці на патент США, реєстраційний Мо 11/108135, опублікованій як
О52005/0260213, що вводиться в даний опис за допомогою посилання) і з СО16-СО079. Нижче приводяться послідовності ДНК і кодовані послідовності білків СО16-С079: нзавмі-свзл1ин
Нуклеотидна послідовність (ЗЕО ІЮ МО: 226): дасаїсадїда Ідасссааїс Іссадасісі Нддсідоі сістїадддда 50 дададссасс аїсаасідса аддссадсса аадідчнодаї Шодащдаї 100 агадішаї даасіддіас саасадааас саддасадсс асссааасіс 150 бо сісаїсіава сіасаїссаа ісіадааїсі ддддісєсссад асаддшад 200 щасавдідду ісдддасад асісасссі сассаїсадс адссідсадад 250 сюаддатшюі ддсадщшаї їасідісадс ааадіаацда оддаїссаїас 300 асодйнсддас аддаддассаа дсндадаїс аааддадосо даїссддада 350 сддаддссад діссаасідс адсадссда досідадсід дщдадаоссід 400 ддоасісадії даадсідієс дсааддсії сіддсіасас сисассадс 450 тасюдайда асіддаїдаа дсададдссі ддасааддсс пдаадаї 500 даїгаодії даїсснсад асадюааас ісасіасааї саааднса 550 аддасаададс сасайдасі дндасаааї ссіссадсас адссіасаїд 600 садсісадса дссідасаїс даддасісії дсддісіай асіідсаад 650 адсіа(дддс їасіддддіс ааддаассіс адісассдіс іссісаано 700 адсссаааїс Наї 714
Амінокислотна послідовність (ЗЕО ІЮО МО: 227):
РІММТО5РОЗБ ГАМ5І ЧЕВАТ ІМСКАБОЗМО ГОСОБЕММУМ ООКРИаюОРРКІ. 50
ПУТТ5МЕЗ СМРОВЕЗаЗОа ато ТІВ БІІОАЕОМАМУ УСООБМЕОРМУ 100 тТРвОаТткКІ ЕІ КОСОазОСИСО МОГ ООРСАЕЇ МАРОАБЗМУКІ 5 СКАБИаМТЕтТ5 150
УМ ММУУКОВР ОСІ ЕУЛОММУ ОРБОБЕТНУМ ОМЕКОКАТІ Т МОКЗ5ЗТАМУМ 200
ОО 551 Т5ЕО5 АМУУСАВАМО УМУСОСТОМУТМ 55МЕРКЗО 238
Св3.1мМІ-нзавуУн
Нуклеотидна послідовність (ЗЕО ІЮ МО: 228): чаюйнаїда дасссадас Іссасісасі Ндісдуна асайддаса 50 ассадссісс аїсісноїа адісаадіса дадссісна дагасіда 100 дааадасата Шоаайод понасада ддссадосса дісіссааас 150 сдсстааїсі аїсіддідіс їааасіддас іІсіддадісєс стасадаїй 200 сасюдсавдї ддаїсадодда садашсас асідааааїс адсадаадчідо 250 адодсідадаа Шодддаай їайацосі ддсаадаїас асайнссд 300 сісасонсд дідсідддас саадсюдад сідаааадад дсоддаїссда 350 аддсддадас садайассс дададацдіс (ддсссюсо сіддадаадс 400 ссасасадас ссісасасід асіїдіассі ісістддай йсасідадс 450 аснсіддіа дадідіаду сюдайсаї садссісссу ддааддсісї 500
Зо ададіддсід дсасасай ддадддаюда дасаадсодс їагїааіссад 550 сссідаадад ссдасідаса аїсіссаада аїассіссаа ааассаддіа 600 діссісасаа дассаасаї ддасссідід даїасідсса саїасіасід 650
Ідсісаааїа аассссдссі ддашосна сюдоддссаа додасісідо 700 їсасіюююад сісайсаас ададаадацді аї 732
Амінокислотна послідовність (ЗЕО ІЮО МО: 229):
ОМ/МТОТРІТ ГГ ЗММІЖОРАБЗ ІЗСКЗЗОБІ І ЮТрактмі мм п'ОвдРООБРМ 50 вим УБКГО ЗаУРєРОоВЕТаз а5аТОгТІКІ 5АУМЕАБОІ СІ УУСУМОСТНЕР 100
ГгтТРоадаткКІ Е Її Касавасассї ОМтТІ ВЕЗОаРА І УКРТОТІ ТІ. ТСТЕБаИЕ5І 5 150 тТБамМаТмаУ ІА ОРРОКАГЕМІ. АНІМ/МУОБОКА УМРАЇ КОВІ Т ІЗКОТеКМОМ 200
МІ ТМТЯММОРМ ОТАТУУСАОЇ МРАМЕБАММУСО СТІ МТУ55ЕМ ВИС 244
Апоптоз оцінювали за допомогою ЕАС5-аналізу як відсоток Рітанексин-Мпопуляція В- клітин (СО20:-клітин) від усієї популяції, що не пройшла стадію відбору на ЕЗС/555 (фіг. 29). 6.9. 885-С83.1-ВЮАВТ 88В5МІ-СВ3.1УМН-МЕРКОС 8В5МІ. ампліфікували з використанням НО і 19п630ОК як праймери, і сп8В51! с як матрицю.
СВЗ.1МН ампліфікували з використанням Іднба2вЕ і ІдДпб629К як праймери, і сСп8В5Нс як матрицю.
Лінкерна послідовність була включена в праймери ІдНеЗзОм і ІдЧпб28Р. С-кінцевий лінкер і стоп- кодон були включені в праймер дп629К. ПЛР-продукти очищали на гелі і змішували разом у однакових молярних відношеннях, а потім ампліфікували з використанням НО ії І9п629К як праймерів. Продукт ПЛР із перекриванням гідролізували рестриктуючими ендонуклеазами
Мпе/ЕсокіІ і клонували у вектор рСіІпео.
СВ3.1МІ -4ВБМН-ЕРМАСЕС
СВЗ.1МІ. ампліфікували з використанням НО і ІДиб3ЗОК, що мають спільні послідовності, аналогічні послідовностям 8В5МІ у ЕК4, як праймерів, і спСВ3.1Їс як матриці. 8В5УН ампліфікували з використанням Ідп631Е ії Ідп640К як праймерів, і сСп8В5Нс як матриці. Лінкерна послідовність була включена в праймери ІднбзОок і ІдпбЗ1Р. С-кінцевий лінкер і стоп-кодон були включені в праймер ІЧп640Кк. ПЛР-продукти очищали на гелі і змішували разом у однакових молярних відношеннях, а потім ампліфікували з використанням НО і д9п640Кк як праймерів.
Продукт ПЛР із перекриванням гідролізували рестриктуючими ендонуклеазами МПпе1/Есокі і бо клонували у вектор рСіпео.
Антитіло проти мітки РІад-8В5МІ -СВ3.1МН-МЕРКЗС
Антитіло проти мітки Ріад убудовували між сигнальною послідовністю і 8В5МІ. за допомогою
ПЛР із перекриванням. Сигнальну послідовність і мітку Ріад ампліфікували з використанням НО і
Ідпб47 як праймерів і сп8В5І с як матриці. 8В85МІ -СВ3.1МН-МЕРКЗС знову ампліфікували з використанням ІЧпб647Е і І(9п629Е як праймерів і 885МІ -СВ3.1МН-МЕРКЗС як матриці. ПЛР- продукти очищали на гелі і змішували разом у однакових молярних відношеннях, а потім ампліфікували з використанням НО і Ідпб629К як праймерів. Продукт ПЛР із перекриванням гідролізували рестриктуючими ендонуклеазами Мпеї1/Есокі і клонували у вектор рСіІпео. 8во5МІ-СвЗ.1Ун- Сас
Для одержання іншого С-кінцевого лінкера в конструкції 885МІ-СВ3.1МН-МЕРКЗС, цю конструкцію знову ампліфікували з використанням НО і Ідп646Е як праймерів. С-кінцевий лінкер
ОС овбудовували в праймер /дпб46К. ПЛР-продукт гідролізували рестриктуючими ендонуклеазами Мпе!//Есокі і клонували у вектор рСіІпео.
Ссв3.1МІ -8В5Мн- Сас
Ту ж саму стратегію застосовували для створення СВ3.1МІ -8В5УН-І (0. С-кінцевий лінкер
ІСОС вбудовували в праймер ІдЧпб48К і СВ3.1МІ -4ВБМН-ЕМКОЕС використовували як матрицю. Потім ПЛР-продукт гідролізували рестриктуючими ендонуклеазами Мпе/І/Есокі і клонували у вектор рСіпео.
Антитіло проти мітки РІад-8ВВ5МІ -СВ3.1УН- ас
Ту ж саму стратегію застосовували для створення конструкції "антитіло проти мітки Ріад- 88в5МІ-СВ3.1МН- 40". б-кінцевий лінкер ОС овбудовували в праймер /Ідп648Е, а конструкцію "антитіло проти мітки РІад-8ВВ5МІ -СВ3.1МН-МЕРК5С" використовували як матрицю.
Потім ПЛР-продукт гідролізували рестриктуючими ендонуклеазами Мпеі/ЕсокКіІ і клонували у вектор реСіІпео.
Нуклеотидна послідовність 8Б5-СВ3.1-МЕРКВОС (БЕО ІВ МО: 230): часасссзуз счасасасос бссаєсстсс стассчусах ссссадчавав зо часатьсвує стсасткчЕс сучсвачеся чозваавеєвов удстбаствад 100 чоссЧастссз ссаччавасса чассуавста ссзазвзсусоб дасстасчсс 155 певвссасьс сачаввстча буссссвзнак вочссвзурч чсазчачьс Об вБоччссвчах вастстсвса ссвісадсач сттчачьст чаацарсту 250 сачастасєта сосестасвза такссстазтє асссасосас достесдасусе З00 пччассавус содчачстова вчуазассчча ссоувучса чазачссатеа 350 севастусєсвуа сачесісчочоа сруачевоспі заучсссодчу дсгссачь са 4100 ачстоссссу саасоствст ччстасвосто ксассваств спочаєсоває 450 сасЧчсЧавус ачасасстуд асваЧосоєї ЧазсздчасстУ сдбахачкслв 500 сесггсачЧас азчгсвавстс астгасавеоса вабоугссавач чЧчасаатоссв з50 саєезчасьЧі Бчасававатсс гссвзусасач ссрасаєуєа Чдевсачеває ва стісвсавксгка восастссас зЗссотаєстас стососзвову стасосудсга 250 сіачачЯаїсаз сцавссссвоа сбсоассоасстс сесазосчвч ссосааатсюе 700
Амінокислотна послідовність 885-283.1-МЕРКБО (5ЕО ІО МО: 231):
РІОМТО5РББ ГААЇ СЕУ І ТСААБОБЇІЗ СМ УМ ОКР СИтІКАТІМА 50
Коо) АТ ОБОМРК АЕБОаБЕЗИаБО МУ5І ТЗІ ЕЗ ЕОБАОУУСІГО МЕБУРІТЕСА 100 аткКЕ Каса заспасоОоМО о ОРСОАЕЇ МАРО АЗУКІ БСКАЗ СМТЕТЗУМММ 150
МУКОАРООСІ ЕУММЯММОРБО БЕТНУМОМЕК ОКАТІ ТОК 5БТАММОЇ 55 200
ГТ5ЕОБАМУМУ САВВАМОУМССО Т5МТУ5ЗМЕ РКО 234
Нуклеотидна послідовність / СВ3.1-885-ЕМНОЕС (ЗБОЮ МО: 232): час асча суасссачас сссастсаєх сссапсозіса асастуцаса 20 ассацестсс вЕстеєкува асссавцїса чацдесіссвЕа Затасецчата 190 чааацасаєа гісддвабсоЗ сус асада ууссазусса зчесессаває 150 счостваєсст асстадчідвс газастоцас сстачадчссс стідасаоов 290 сасізусдає зучассасуза сачаєссссас астувааааєс апсачасіув 250 ачцчсечачча КСсСлЧсчавз басгассосс сддсвзаччтаєс асассскесоа 390 скЕсвсзся зЗзезЗскасчас савдсїозва созазззчач зчсазахєстеяа Зо ааусозуазує дчаачідавас гсдаздазіс Саддаузазас Єгудтдсвас 459 скЕачачуаєс савбувавсс бесбсзсдавс сссстодвеє сасеееєтбаде 350 часстссіуча басавстозаЕ сеубсаЗзестї ссачавуавоя зостідчазеу оо жасЕЧчсісва з8Егауаваса аздссвававаа гсасусавсвя гассаєссово зо анпстідісві задддаочісс ассассгсвза ччачапссавєсс сазавоатсачі 50 чФстасссас азагдазсач соїазадчаосї одзачасастч ссасттаєта 650 сЕчУЕсчЧЧаст сідоЗсссвса астастодоас ссазвудсаєсс астстсавсва 790
Хстссосасо сзасасадудча сао 726
Амінокислотна послідовність СВ3.1-885-ЕМАС ЕС (ЗЕО ІО МО: 233):
ОМУМТОТРІТ І 5ММІСЖОРАБ ІЗСКЗЗОБІИЇ ОЮТракти ММ П'ОАРСООБРМ 50 вим УБКГО ЗаУРєРОоВЕТаз а5аТОгТІКІ 5АУМЕАБОІ СІ УУСУМОСТНЕР 100
ГтРадаткКіГЕ г касаваасцс ЕМКІГЕЕБОСИ І МОРаСЗМКІ. 5СЕАБИОЕТЕЗ 150 рРАМУМОМУВОБ РЕК ЕМ/МАЕ ІВМКАКМНАТ УМАЕБЗМІСАВЕ ТІЗНОЮ5ЗК5 200
МУ ОММ5І ВА ЕОТИаіммСаА І СІ ЮОМУМУсСОСтТ ТІ ТУ5БЕМАа ЕС 242 8во5МІ-СвЗ.1Ун- Сас 8В5МІ. ампліфікували з використанням НО ії Ідп694К як праймерів і сп8В5І с як матриці. 8В5МН ампліфікували з використанням ІдНпбе5Е і ІдЧиб96К як праймерів і сСп8В5Нс як матриці.
Лінкерна послідовність була включена в праймери ІднбЗаАкК і Ідпб95Р. Ниїдс1 с ампліфікували з використанням Ідп355БЕ і ІЧп366К як праймерів і сСп8В5Нс як матриці. ПЛР-продукти очищали на гелі і змішували разом у однакових молярних відношеннях, а потім ампліфікували з використанням НУ і дпЗббК як праймерів. Продукт ПЛР із перекриванням гідролізували рестриктуючими ендонуклеазами МПпе1/ЕсокіІ і клонували у вектор рСіІпео.
Нуклеотидна послідовність вве -СсвЗлУНА ОС (БЕ ИЮ МО: 234): часаєЕсача Ссасасватс Ессаїссксс стасеЕсусса сачсічасадча 5 авчачісвуєЄ сісастієЄцзбо сузчсвазчіса ззаваїттазо зуггтассєда 190 зсЕЗЧсгса чЧесаавассв сабзуваєта сЄразасустст дабстасчсос 150 чсасссаєстє гачассстоу сассссаава взУчусісвоагУ ссачсчачее 200 сузЗксачає Каїсхускстсв ссабсвосає секклчазчест чувазаеетї 250 сацчаєтаєва стаєЄсгасав саБбЕстачев десстстсаєс зоб Уусі за чусассавчс Годуазстдаа азцауссуза сссузаччсу дазуссауує 350 ссесаастцсвзоа сачссосчоазч сізадерУУг чаччостососУу зссгсвоагуя 450 ачетуєсста саадуцчстїсї чустасассь ссассачста ссезЗуатсаває 450 їзоазсуавує завузсестазч асвазчесстї завсоздаїтта зЕагузсваа 200
Ессбєсачаєс ачідавасьс асьаспаєса вач ссавч часавочзесса 550 сагсЧдассУуЄ ссчасавассс бссачсасвоа ссгасатоаса чссбсавчсвчс во стчасаєсосу зодасістос садсстасбсас гобдсвачач стасоЧоаста по сісоччесава пдовзассссза Ссассостссс сісзстдоасча сЯссУус о56
Амінокислотна послідовність 8В5МІ-СВ3.1МН-Г сс (5ЕО ОО МО: 235):
РІОМТО5РББ ГГ ААЇСЕВМУ5 ГГ ТОВАБОБЇІЗ МІ УМ ОКР РаИатіІКВАИМА 50
АТ ОБОМРК АЕБОаБЕЗИаБО МУ5І ТЗІ ЕЗ ЕОБАОУУСІГО МЕБУРІТЕСА 100 аткКЕ Каса заспасоОоМО о ОРСОАЕЇ МАРО АЗУКІ БСКАЗ СМТЕТЗУМММ 150
МУКОАРООСІ ЕУММЯММОРБО БЕТНУМОМЕК ОКАТІ ТОК 5З5ТАММОЇ 5 200
ГТ5ЕОБАМУМ САВАМСУМССО ТУТ Ос ас 232
Нуклеотидна послідовність СВ3.1-885-Д556 (5601 МО: 236); часте ов гсасоссазчає Єссастсвосї ггУуссЧчасса всасєєзовса 5о ассвчсстсс атсгсссоса аЧчгсаачоса садсстстга чатастсавіє 19 чаавчасата сттцЧааттаЗ сої асавча дессачуєсса зЕстосаває 150 сзсстаавтстї аєстоуїаєс гааастууає сстозачесс ссзасасуєе ОО сасьспсвоеЄ созссвасчача свааврісавс астздаззаєс вусачачеься ЗО ацчсісвача Кгбосчаасс Кастстассодсї сссаадуєбає зсасфсюсссса 300 соісаєцьовч зоускузччаєс саачосіочаз січаввучеач чозчзахнд 350 зодсачацчоцс саачідавчс Сгозоацачс Ссддвоадачас сСроЧчсосзас 400 стзччаачакс саїзЗазаєте стук адай сскстадаве сасЕееквок Ба часзссгуда бсчастозує ссзссазсстї ссавчзачааучу засЕЕЧазса зва чЧчеагтссрчЧав астадааваса засставааа свіссозаса бастагбосід зо вазсстзЧтЧаї асзчузаучаєсєс о вссаєстсва сазаєчаєтс сваавотач 290 чЕстассісс азабцчавасво сігаадачеї савчзасастя чсаттбатта зо стчіссдчачсі стідоцассоіто астассоддас ссвладдсаєс зсгсбсясад 7 ссЕсстсусЕ зочазаевос тео
Амінокислотна послідовність СВ3.1-885-, ОС (БО Ю МО: 237)
РУУМТОТЕЬТ ГБУМІСОРАБ ІБСКББОВБІЇ. БТрОКТЖОЬМИ ГОВРООВРМ 5
ВІІХІЧЯКІб аУрРОВЕТОВЯ ОБОТОЕТІКІ ЗВУБАБОТСЇ УУСХОСТНЕР 100
ГТЕСАСТКЬВ ТКОобоБОСоо ЕУКІБЕБОСО БУОРССЯМКІ ЗСЕАБОЕТЕВ 155
РАНМОМУКОВ РЕКСПЕМУАЕ ІВБМКАКМНАТ УХАББУТСВЕ ТІвВрОоВКАВ 200
УЖТОММи5ІвА БВОТСІХУССА БОБОУМООстТ тТітТУЗБІССС 249
Праймери:
І анбв28Е (5ЕО І МО: 238): ддаддсддаї ссддадасод9 аддссаддіс саасідсадс адссідао 47
Ганбв298 (5ЕО ІЮ МО: 239): шоаайсі аасаадаїйй ддосісаасі даддадасода асідада 49
Г9и63ОА (ЗЕО І МО: 240): дссіссдссії ссодаїссдс сіссшсад сіссадсно діссс 45
Га9п6З1Е (5ЕО ІЮО МО: 241): ддаддсддаї ссддадасдаа аддсдааадід аадсндада адісіда 47
Г 916408 (5ЕО ІЮ МО: 242): шоаайсі аасасісісс ссідйдаас даддадасіюд дадавчіда 49
Г 96448 (5ЕО ІЮ МО: 243): шаїсдіса ісаїсдісії юІадісода діддасассї дюддадазд 48
Г 96468 (5ЕО ІЮ МО: 244): шоаайсі адсадссісс садщаддад асддюасід ад 42
Г 9647 (5ЕО І МО: 245): сааадасодаї даїдасдаса аадасайса даїдасасад ісісс 45
Гап6488 (5ЕО І МО: 246): шоаайсі адсадссісс садсдаддад асідідадаад ща 43
Експресія: Конструкції 5 іб, або б і 7, або 8 і 9, або 9 і 10, які кодуються експресійними плазмідами (фіг. 30), спільно переносили в клітини НЕК-293 для експресії 885-783.1-САКТ у присутності або під час відсутності антитіла проти мітки Яад з використанням ліпофектаміну 2000 (Іпийгодеп). Кондиціоноване середовище збирали три рази через кожні три дні. Потім кондиціоноване середовище очищали на СОЗ32В-афінній колонці.
ЕПІЗА: ЕГ ІЗА-аналіз проводили в такий спосіб: 50 мкл/ямку 2 мкг/мл СЮО32В-Ес наносили на 9б-ямковий планшет Махізогр у карбонатному буфері і залишали на ніч при 4 "С. Планшет три рази промивали РВЗ-Т (РВБ, 0,1 95 твіну 20) і блокували 0,5 95 ВЗА у РВ5З-Т протягом 30 хвилин при кімнатній температурі, а потім додавали тестований злитий білок одноланцюжкового Ес. Під час блокування 885-С8В3.1-САКТ розводили серією дворазових розведень, починаючи з 2 мкг/мл. 25 мкл/ямку розведеного САКТ, змішаного з 25 мкл/ямку 50 нг/мл сп8В5, переносили з планшета для розведення в ЕГІЗА-планшет. Планшет інкубували при кімнатній температурі протягом 1 години. Після триразового промивання РВ5-Т, у планшет додавали 50 мкл/ямку 110000-розведеного ПХ-кон'югованого Е(абБ)»:-фрагмента козячого антитіла проти Е(аб)»- фрагмента людського ІдС: (Часкбзоп ІттипоКезеагсі). Планшет інкубували при кімнатній температурі протягом 1 години. Планшет три рази промивали РВ5-Її і виявляли з використанням 80 мкл/ямку субстрату ТМВ. Після 5-хвилинного інкубування реакцію припиняли шляхом додавання 40 мкл/ямку 1 95 Нг5Ох. 00450 нм зчитували на 96-ямковому планшет-рідері з використанням програми 5ОБЕТтах. За отриманими результатами будували графік з використанням програми СгтарпРааРгіхт 3.03 (фіг.31). 6.10. Конструювання і характеризація Ід-подібного чотиривалентного ОАКТ
Чотири поліпептидні ланцюги використовували для продукування Ід-подібних молекул рАКТ, що мають чотиривалентні антигензв'язувальні сайти (фігура 32; фігура 33). Ід-подібні молекули ВСАКТ мають унікальні властивості, а тому їх домени можуть бути сконструйовані так, щоб вони зв'язувалися з тим самим епітопом (з утворенням чотиривалентного і специфічного до одного епітопу Ід-подібного ОАКТ, здатного зв'язуватися з чотирма ідентичними молекулами антигенів) або з різними епітопами або антигенами. Так, наприклад, домени цих молекул можуть бути сконструйовані так, щоб вони зв'язувалися з двома епітопами того самого антигену (з утворенням чотиривалентного специфічного до одного антигену і специфічного до двох епітопів ІдС-подібного ЮАКТ), або з епітопами різних молекул антигенів (з утворенням чотиривалентного ІдсС-подібного ЮОАКТ, що має пари зв'язувальних сайтів, специфічних до першого антигену, і другу пару зв'язувальних сайтів, специфічних до другого антигену). Гібридні молекули, що мають комбінації таких ознак, можуть бути легко отримані фахівцем.
Для ілюстрації властивостей таких ІдС-подібних молекул ОАКТ були отримані репрезентативні чотиривалентні Ідс-подібні молекули АКТ, що мають пари зв'язувальних сайтів, специфічних до СОЗ2, і другу пару зв'язувальних сайтів, специфічних до СО16А. Ці Ідо- подібні молекули АКТ були отримані з використанням нижченаведених чотирьох поліпептидних ланцюгів.
Нуклеотидна послідовність // 2-2052-3058-пКарра (ЗЕО ІЮ МО: 247); чаєсіссача гзасосазїєс бсосаєЄєстєтваї ссєзсбосс стсссозуаза 0 зачтсесвсосс абсвастаса адосаачесса зачсаїттачс зазтавттаз ї00 ссрсоабассі асячуааассє зосСавласчсва абавосреЕсв габурассає 150 зччЧісвзастї тТасвагстоз ааттссаєсоз азчггїсазсз усазезЧаїєс 200 счтіасазчає ТЕсасістса ссаєсачавазч ссгачазчессь чаачуаьтттту 259 засістаєта сізссаасач састатзаає абссадссас сс соаЧбсх 309
Чочассаацчєс сосдасавбтсаз адцчачосоцча Сесодвоачос чачасесво 359 бассссЗава чазЕстазсс стзочаєатєе зсвасссвсс сазассстся 400
Чісгсчасеба сс ссссе са рссас гаоцястіс Сеотасоцоцу 459 чівоазсвзцЧа БгЕсуїсвасс гбслазувай аа стівадуї чЧасгЧусаса азпо сасЕєчосоЗ чаїстчасуаса ачусустатаа їссазссста зацазссзає 555
Гсасазсстсс сазвасчатасс сссачдсавсс асасбассссо сааавтсяЯсе 00 ажосбацяаса стосачатає соЧдссасатас бассубосос заасаавнссо во счесіосчссг ссоттасгадоа ассзачачас ссгодЧдссясо ЗзсЧачестсаєс 700 тЧчддасччсга сачсчаазчуч асссетасод счЯдстосаос абсо 750 аксіїсссуе сагоїчЧабуза чсадссчЧава гсгудавдсву себссЧчі т Во чЕЧсстУусту азабавстсст вісссацада чуссвзавуєа саусччавоз в5о пасасазсоас ссіссзассоа чдосвассоссс заздачачсоа сасачаосач зо часадсавоуч асацчесвсста сацестсаує зусасессцва сосгчавосва З50 зчсачастатс сдазуазасвса зачістасчє сгоасчавчсс асссзісвацч 1000 честчачессс чдсоссдчдссаса зачазсббся зсадасовоа са 1044
Колована амінокислотна послідовність 2.4052-368-нКарра (ЗБОЮ МО: 248);
ПУОМТОЗРУМ ГААБРОБЯУВ ІМСКАБЕБІЯ КУБАЖТТОКР ОКАМКЕБЬМУВ БО
С5ТООЗСІРЕ ВЕБОБОБОТО ЕТЬТІБКОТЕР БОКОБТУСОО БУЕХРАТКОВ 1650
ІКТ КОосо БобоссОоУТеЕ шеОСРОТБОКВ СОТІБІТСВвКВ ЕОМ 150 чУафЕворРБИК СБУ БаНІМИ ОоОКВУМРАС КЕБВГТІБВКОТ ББМОУКИКІА би 5УВТАРТАТУ УСАОІМРАМЕ АУКСОСТІУВ УББІЄСССОСО 5ВТУААРБУК 250
ІЕРРЕОБОГИК БОТАБУУСЬ ММЕХРЕБАКУ СЯКУЮМИАКВОВ СМБОББУТЕО за разко5Тх5рВ БТІТЬЗКАЮХ ЕКНКУХАСЕУ ТВОСІВБРУТ КВЕМВОКС з50
Нуклеотидна послідовність / 308-2.405352-ВОИ5ЕО ТО МО: 249): часасузсус гуасссявіс босадсьвсг сіодсграсог сгсгвудаса зо зачодчссасс згсгссгдуса адодссзосса засісгіЧай гбогозісціє 150 асазсіссак даастодтіас свасадаааєсє садсчасадсс асосаваєссе 150 стсаєстата стасабссаа сстасваїсї додаїсссач ссаочаї стає 290 сїзссачісда сссіуадсасач астїсаєсссї сайасаєссаїє сстатусвада 250 асачазсчасас Сасвасстає бассоссачс ааачтаасся сцчасссобас 30 асуєссоезаз чузадассваа зстачаласа впаауаачеса чабссдацче 350 сечазусава зЗбсзалессач созассессвс зла ся ссЗсачесКя 400 заззчссссї уаавсестсу бЗсзсвзосї сазуаєссас ЕБЕсауєчас 450
ГвдЕсясасує ссгуусьссу цсвоодстсса зсзассоачьс гозчачсочиї. БЕН) сзсаєссаєе вустаєуаєу ссузєуасас ссастаєста засеіссуєча 550 ачзчучссзакЕ ЄасЕвдЕсЕсСс ауазаєаасс сааааачсач сстатасстїу БО0 сазаєчцласа чісотачуєс гузоасвсасо здссвсстагг асісгуєсваєс вза ачасастасо чдадаатассга своастЧчісаї дсабосстод сдісазаосдад то стсадссас тасстссоса стдосасасї адсодсодасЯ сачсасссос 50 ассвачадес сассчасесу сссессуссаса ссоссссссса адацеасссе о
Ссодоосдсаса чдсеавдесссісвч осстасссаде саваччаєтає СтТсссосочвас оо счасдасочі Чісагоадаас ссваздоасачссс сЧчассадесча сабасасасо зопо штксосузсто сгостасвуєс стсазчасто сгассоостсв чозоасагаче з5о зассзсчссс гссвусауєт гоузсвсоса часстасавєс гусазвсугча 1050 ассасвазцос саецсвзасасс агчцтічсаса зчачацссоа сосссазацс 1950
ЕЗзтЗасаааа сгсасасагбуа сссасозбуєс ссачсаєсту азебссгочу 1190 зчуассзєса усі сстсї Ессссссавза асссаачуає асесстсатуа 1150 їсісссозас состідаууєс асвіособуєс содіосасої завуссвсува іо зассскчауо псазабісва сіустасого чЧасуссуєзу ауусусаєза 1250 їдосавцаса взацесоусузду аудуацсацта саасаєсасу гассутотує із00 їсазсуєсссї сассЯїссту савссаусаєсї засесавтач свасуватас 1350 вазчсзсааче Сссбссавсаа ачссссссса чдоссссассч ачадавассах 1450 сіссавацчес вайдуєсвос ссссачадсс асачосасас асосгдсосс 1450 саїоссозза гуазссчасс аадаяссязе гсадостчаєс сбаоссєзаєес 1550 аааечцсьЕсЕ вЕсосачусова сасбсаросяєт чачсзчочача зовгасочечса ї580 чЧссодачавс вастасСсааца ссасоассгос согосгаЧчас госоасочсі 1600 сетгстгесг сгасаосвач стсассогбує зсазсадчсач осбодзссазосад 1650 зччаасзссі бсгсарчсіс сугсагосаі чазусссстос асваєсаєста 1720 сасоссадазо зусстсгссс габсіссосдо гаавз 1734
Кодована амінокислотна послідовність 308-2.4052-пПОЇ (ЗЕОІЮ МО: 250: аТУГТОоВРАВ САУВБСОКАТ ТБСКАБОБУО КОбО5ЕММИМХ ООКРООРРК, 50
БІЖТТБМОКЕ СІРАКЕБАБО БОТОЄТИМІВ РУБЕБОТАТХУ ХСООБМЕОБУ 100 тТкОоботТЕТвІ кКособососе УБОУБОбебі. УРОКОВ СААБОКТЕБО 1590
ЗУМАМУВОАР ТТСЬЕНУАВІ БУООСОТИХА ОБУКОКЕТІ5 КОМАХ 200
ОМОоЗЦАЗБОТ АТУХСАТЕТТ ЗІРТсСУМОАН СосУВУТУЄа ГОосССососвАВ 2О
ТКОРБУЕРІА РЕБКЕТ5ОСТ ААБШСЬУКРУ ЕРЕРУТУБКМ 5САГІВОМУНТ 00
ЕРАМІОВЗВОЇ їБІ5ЕБУУТУР БББІОТОТУІ СМУМНКЕРЕМТ КУрКЕУВРКО зо
СІКТНТІСВРС РАРЕТІЇСНавВ УКПЖРРКРКО ТІМІБЕтТРЕУ ТоУУрУВНя 00 пПРЕУКЕМИЖяУ ГХЗУВУНМАКТ КРЕЕВКОТМВТ УВУУЕВУБТУ: НОрЖІМОКЕУ 350
КСКУБМКАТР АРІБКТІБКА КОСОРВЕРОУТ ТІРРБОВОБІВ КМОУВІТСТУ Зо
КОКУРБОТАМ ВЕМЕБМООРЕМ МУКТТВРУТЬ БрОоБЕКОтБК СтТУрКВВлОС 550
СМУЕВСсеУМИ МАСНМНУТОоК 5О5ОБРОК 578
Препарати ІдО-подібних молекул САКТ, що мають вищевказані послідовності, одержували з різних плазмідних ізолятів і позначали "Ід БАКТ 1" і "ІЗ САКТ 2". Здатність цих ІдО-подібних молекул ОАКТ зв'язуватися з тСО32-пСО16А у ЕГІЗА-аналізі порівнювали у випадку використання тільки середовища, ОАКТ, що має один СОЗ32 і один СО16бА-зв'язувальний сайт
(ОАКТ"), і контрольного анти-сн-тСО32 тАБ (фігура 34). Було виявлено, що Ід-подібна молекула ОАКТ відповідно до винаходу має набагато більш високу афінність зв'язування з антигеном, ніж САКТ або контрольне антитіло. 6.11. Конструювання і характеризація СО328-С079-1- і СО328-С2079-2-біспецифічних діатіл
Гени, що кодують СО79МІ -СО32ВМН (послідовність 1), СОЗ2ВМІ -С079МУН-1 (послідовність 2) і С0328МІ -С079УН-2 (послідовність 3), були клоновані в експресійний вектор рЕЕ1З з одержанням експресійних конструкцій 1, 2 і 3, відповідно. Плазміда, експресуюча конструкцію 1, була перенесена разом з експресійними плазмідами 2 або З у клітини НЕК-293 з одержанням
Со328-С2079-1- і СО328-С0079-2-біспецифічних діатіл, відповідно. Кондиціоноване середовище збирали три рази через кожні три дні. Потім кондиціоноване середовище очищали на СО32В- афінній колонці.
ЕПІЗА-аналіз проводили в такий спосіб: 50 мкл/ямку 2 мкг/мл СО32В-Ес наносили на 96- ямковий планшет Махізогр у карбонатному буфері і залишали на ніч при 4 "С. Планшет три рази промивали РВЗ-Т (РВ5Б, 0,1 95 твін 20) і блокували 0,5 95 ВЗА у РВЗ-Т протягом 30 хвилин при кімнатній температурі, а потім додавали тестований злитий білок одноланцюжкового Ес. Під час блокування СО328-С079-1- або СО328-С079-2-біспецифічне діатіло розводили серією дворазових розведень, починаючи з 2 мкг/мл. 25 мкл/ямку розведеного біспецифічного діатіла змішували з 25 мкл/ямку 50 нг/мл анти-СОЗ32В антитіла і додавали в ЕІ ІЗА-планшет. Планшет інкубували при кімнатній температурі протягом 1 години. Після триразового промивання РВ5З-Т, у планшет додавали 50 мкл/ямку 1:10000-розведеного ПХ-кон'югованого Е(аб)2-фрагмента козячого антитіла проти Е(аб)2-фрагмента людського Ід (даскзоп ІттипоКезеагсі). Планшет інкубували при кімнатній температурі протягом 1 години. Планшет три рази промивали РВО-1 і виявляли з використанням 80 мкл/ямку субстрату ТМВ. Після 5-хвилинного інкубування реакцію припиняли шляхом додавання 40 мкл/ямку 1 95 Наг5О:. 00450нм зчитували на 96-ямковому планшет-рідері з використанням програми ЗОЕТтах. За отриманими даними будували графік з використанням програми СгарпРааРгіз:т 3.03. Цей експеримент показав, що СО328-С079-1- і
Срз28-С079-2-біспецифічні діатіла мають здатність імуноспецифічно зв'язуватися з СЮОЗ32-Ес з афінністю, еквівалентною афінності контрольного анти-СОЗ2В антитіла. Нуклеотидні послідовності і кодовані ними амінокислотні послідовності вищеописаних конструкцій представлені нижче.
Послідовність |! - нуклеотидна послідовність
СО079М-С032ВУН (ЕС ОО МО: 251): часзЕєуєса сЧастсачіс бссаоссїсс сгдссосуєся ссестброчасв Зо чесачестсс ассоссгцса ачсосааочсса чаЧчсссссга часа дЧчасца 100 чайачасака сг злзасссос гсбсвезсачЧа допссачасосз вссссосваає 155 сусставіїЄ дЕсеЕузчіЗЕс гавастсзовс бебазадесс сазчвсавчЧатє ОО сачсдоасасїі чадссазаса содаїсїбсас асічазазаєс вчсаЧчоЧіоз 255 вучстзасоча ЧІ гоазЗаУВЕ габтасвЕчсії дасвзаччутаєс асаєтстссу 300 сісвсУуєЕсЯч ссззазцачЧас саазосїозаз агсвавучач чЧесассоца 359 зачдоасчцвоаце свазсдааос гіЧасчазсс гочасчачас біс осаас по стччЧчачдаєс саговаавасто спр осчаву сесстачаєь сассгсбазє 450 часчосроса Соаочастодеє ссодбсвасог ссваачаачя асчссговога з0о чзасгудсрсав абтадаваса задсівзасвза псвсчсозаса Тастагсаста Зо вуєстуїсає ачодазасЕо ассаєсесва чауаєчаїїс свзаваціазе 600 чЧЕСіассвас авагсдяаасавуо сттдауачеї даауаєсастЯ чсаєтсавеа 650 сідсадЧасі стодасогто астассоддд ссзасцсасс асістсясаєч то
Естсстссосї сузачоаскоє В:
Послідовність 2 - амінокислотна послідовність
СОо79М -СО32ВУН(БЕО Ю МО: 252): рУУМІОВРЕОБ БЕУТІСОБАВ ЇІБСКББОБЬЬ ЮБІСКТХСМИ КОооВРООВРМ зо вит ОУВвКЦОо 5аУврвт5За5 свостоТикІ вЕУБАБОУсМ тхомОоСТККРе іо
СТКЕсОСТКОКЕ ІКосовосоо БуОрБУБЕСооС БУОРОСЗОЬКО БОСААБОЕТЕБ 155 пАММожУКоА рОКОСЕНУАЕ ТЕМБАККНАТ УУАБеМІВвВЕ ТІБКОСАКМО ие;
ПУБОММЕБКА ЕСТАУТУСОА!А сп УООСТ БУТУББИасоС 249
Послідовність 3 - нуклеотидна послідовність
СОЗ2ВМІ-СО79УН-1 (БЕ Ю МО: 253): часабссзоав СЧасссачес пссассстос сСтасссассі стчгЧодсада ЗО таззвубсвсс абсасісуге досасазуєсз чзчазваєтасе чуссасствда 190 чсЕччЧестоса усацавасса часааууссс стауасучестї заєстасаєс 150 чсаїссасЕї сазавєвстуд Єзбсосаїєєс взчсвЗса чеадічачеес 200 кчочастсчач пібассскса стаковусву ссгтсацчтсесї чаавзаєссску 250 свасстаєса стіусстасва баса агссусєссас зссузачи 300 почлчассаачч сбсслааатаваа азчзчастастча бесозвезсз чазассаФте 30
Ссвоассосіо сачсстосач стовозтчай сазвосстадес Чдссссачтов 400 аччісгсстЯ саачеасуссо чЧчеасбасассс срассачеба сізчабчдаає 459 їтачусуєтас зоусссстзу асаачччесекк чачсзуасся чааєсуаєсса 5ОЮ
ЕссіссСсазчас азгуаваасес астасдаєса аабовЕгсаво чзасацчачесв 55О ссассвосас зодасасассс асчачсасає сстасатозча чесгбдасзаче во сечачаєссточ ассасассцс сеготагтає сзбпсчазчво статазаста БО стассаучусва зчосассасцзу бсассцїістєс сеісастісоуа частас За
Послідовність 3 амінокислотна послідовність
Соз28М-Сс079УН-1(562010 МО: 254);
ОоІОоМмтТовеБ5 ПБАБУСОКУТ ІТСВАВОВИБ зх ОКР ОСКАРА. о
АвЕТор5БУуке КЕБсСеБеОоТЕ КТЕТІ5ТОВ БОЖАТХСТО ХЕБЖРОТЕО 1095
ОТЕУБІКОСО ВОСОСОУСІМ ОБОСАЕУККРО АБУКУВСКА ОУТЕТБУХММ 150 «УВОАРОСОСІ БМІОМІСРЕБО БЕТНУМОМЕК ПВУТМТТІОТО ТЯТАХУМЕТВЕ 200
ІВБПОТАУХ САВАМОїНСО сттУуТтУВВЬС ОС 235
Послідовність 5 - нуклеотидна послідовність
Ссоз2вМм-сп75УН- (5ЕО О МО: 255); часатссача Сбзасссвзєс сссатсстсс гтатстзсст стаз Чаца 25
Бачачісвасс врозвсссос чдопсватьса поваваевачі песбасегам по чссзустаса чзсауаввасса чзусавоассс ставчсасзосстї дчабсвбасзсс 150 зсвіссасєте Бачаїбєсссч гудтсссабсс азубссатія дсачі счазес 200 бсчЧдасссаач ггсасссвсв ссаєсаусвс сосстсвасесю уаачассєсу ЗО савстсктакта спокстасвава ай Бато акбсесцестсас десанту по
Чочассаачо Содазабава ачсчачосуза сбососацасс часуссаот 50 їсазсточато сазтсгоадаЗз стосачоасчаа чавасстзчо десесача 200 азчссосспо саачасБссс чдасбтасассь ббассвазсга сбозчабчдаас 450 сачідссзас вадссссточ асавчечогсо сазчссчасбсоя зчайсчацсов ЗО0о їссібсазас азїуавасто астасваєса азазчсссаво засачаукся 550 ссовічасєсво авуасасарсос асзачсасає сосбасвісдча зсбчасЗачо 600 січасас сто ассасасслас сасостастас сстссчасаоч стабцоадесса ЗО скіудачасза дадассазсоу їсассобстс стсасізаЧа чекає ва
Послідовність б -- амінокислотна послідовність сСоз25М-60079УН-2 (ЗО 1 МО: 256): вІзМмтове5 ББАБУСОКУТ ТТСМНАБОКІБ ОХ ЦОСКР ЗБАРВНКІХА 50
АВТІРЕОУРУ ВЕБОБЕБОТЕ ЕТЬТІ5БВІОР БРЕАТУХСЬО УЕБУРТЕСО 110 сТКУБІКсСЄ вобОоСБОМОцуУ ОБСОАКУККРО АБУКУВСКАВ СТЕКТИ 150
ХУВОАРСОСІ, БИТОМІСРВО БЕТНІМОКЕК ОБУТМЕТТІЖ5 ТБТАХМЕЦКО 2а0
ІВЕПОТАУХХ САВАМОТМЯСО сСТТУТУЄВІС ОС 232 6.12. Конструювання й оптимізація біофункціональних діатіл НВВ5-НВСВС
Діатіло конструювали так, щоб воно містило варіабельні ділянки, здатні зв'язуватися з СОЗ32 і комплексом В-клітинного рецептора ("ВСКС").
Клонування. За допомогою стандартної ПЛР/ПЛР із перекриванням були отримані наступні конструкції: п8в5МІ -с3502:4-НВСАСМУН Ма8І-І (ОО:
Повністю гуманізовану МІ. 885 (яка розпізнає СОЗ32) ампліфікували з використанням Ідп321Е і Іцп788К як праймерів. ЯВСКСУН Ма48І ампліфікували з використанням Ідп784Е і дпЗ8бК як праймерів. ПЛР-продукти очищали на гелі, змішували разом і ампліфікували з використанням
ІЧА321Е ї дп386К. Потім фрагмент, отриманий у ПЛР із перекриванням, клонували в рЕЕЄ у
Храї!-ЕсоВі-сайт. "53504" являє собою лінкер, що має послідовність: (0505000 (5ЕБО ІЮ МО: 10); яВсСАСМІ пА5М-с35024-н8В5УН- пас
ПВСКСМІ. К45М ампліфікували з використанням ІдпЗ21Е ї Ідп785К як праймерів. ПНВВ5МН ампліфікували з використанням Ідп787Е і Іцп786Е як праймерів. ПЛР-продукти очищали на гелі, змішували разом і ампліфікували з використанням Ідп321Е і Ідп786бкК. Потім фрагмент, отриманий у ПЛР із перекриванням, клонували в рРЕЕ1З у ХраІ-ЕсоВіІ-сайт.
Конструювання одного вектора. РЕЕЄПНВСКСМІ К45М-НВВ5МН гідролізували в Ваї ІІ-заї І- сайтах, і 3,3 т. п.н--фрагмент очищали і вбудовували в РЕЕ13 ННВСКСМІ. 45М-п8В5МН у Ватні-
заїІ-сайтах. ВоІП- ії ВатНі-сайти мають сумісні "липкі" кінці. Послідовності ОАКТ і праймерів, використовуваних для конструювання РАКТ, описані нижче:
Нуклеотидна послідовність / ПНВСЕСМІ.. НА5М-паВ5УНА ОС (ЗБОЮ МО: 257): частесгІобЧа ссчасгсвоссо гесассобсс сбодсссурса ссосссдЧчаса 20 чесзассісс абсісстцсяа ді свадеса зЗвассЄсЕга часазеуЧаєу 109 чавачасата Ес ЗЧавісзч сг сазсаза сассвччеса весвтссвавсе ї50 пазссгаайцієї асстосдсасс гааастачас сесоЧучуосс сачЧасадчату 200 сацсччсвас дачссвчаса сочатсбсас астоззавасс зосзодасЧУу ап ачустдвача саптсЧач гастастосі сзсазудїавс асзекутесУ з00 спиасчсгсо чЧсзччачацЧас свачсессчач апсавазччад дсоазчзасссое 50 ачусучаччс давуєчааде ссуаводазєс гоЗадуаучє сту усаас 400 стччачовіс сабуавассс ссісзлочЧаау сессобазчаві сСсассесбате 455 часочссіодда годчасбодас ссобсадчісо ссазачазає чессгавоса зоб зчЕЕчЧсідва абтасцаваса авацствадав гсвсдсавса бастабоуєся за ачсебЧугдааї зчачадуїсс ассаєсксаз осозчаєчаєіссавзадтадчь во чЕсЕзсстЯчс завссдасзу стсзазвуєс чаззавсаєсєта зЗсазбесаєта 650 сЕугЧчаспасЕ сгччассЕву астасбЧузу ссаачусдсс астстсасау то
ЕстесссЯась дочачасвос тай
Амінокислотна послідовність ПНВСЕСМ. М45М-пВВ5УнНівосС (ЗЕО ІЮ МО: 258): пУУМТОБРОВ БРУХІСОРАВ їБСКЗВОоБІ ЮБООКТХОМиУ КООКрООо5РИ за врІхамаКкоео закрита светоетТикКІ ЗВУБАКИУЄМ ХУСТ 10о
ТТЕСССТКІВ ;ІКОССОВОоСОС вУСГУББОСЮ БУСРСКЗІВІ БСААВОЕТЕБ5 150
ОАЯМОНУКОА РОКСГЕМУАВ ІБМВКАКБВНАТ УУАББУТОВЕ ТІЗКЕОВАКМ5 2пО
ТУХІОМЕОВА ЕРТАУУСОА ПОГ СТ БУТУВВООСС 280
Нуклеотидна послідовність / НВВ5МІ-ПНВСМСМН М48І-І оо (5ЕО О МО: 259): часаєссача бчасссовуєс бсосаєссстос сСбасстуссе стубузузчача 5О
Езчласісзазсс авгсвстїЯсс содеавачісв ззазвзасіазче соггасегав 150 чогсосЕзса чсатчааваєсв сусавззчосс стачасуєсся паїстасЧсс 150 зсахссастї ТтТазавггстазу гЧтсссаєсс азс сазбу зсазЕєчачис ой
Сасдсассовоа СІсасссссв ссабсвосво сесгбсачессо осаачассгса ЗО саассотаєба стідбстасаз баб стадс вісссстсас осссоуазадеа 300 чччассваауу сзузаатваз аччачусуча Єссудчачуєсу чдачазссаччє 350
Ссозвоастозто сачіссачач срлачасова чаздсссчцс сосссзоагодаа 400 ачадЕстессто саачоссссо сассасассс сСгассачессз стачагбоваєс ЗО
БчЧчсатасодас воазчсессстоач асаачУччессї чаддсаавкЕсу сдвасуавссода ОО
Есссбсазас азеЕЧавасвс астасааїса зафуєсссаау засауацчеса 250 севізвссас вуасасвссс асзчдусаєво сстасагоЗа зссзаЧавчс мов) січачассіс всзасаєсчас сусагагіас сЗзгЧссавзач стабууоєта 550 стцзоачасесва деачассасау гсассуїесєс стсавстаоча за3сеусє вчБ о Амінокислотна послідовність / НЗВО5МІ-НВСКСУН МА8І- ОС (ВЕС Ю МО: 260):
ТІОМТОВеЕБ ББАБУСОВУТ ІТСВАБОБІ5 Ше МСООКВ СКАРККЦІЧХА ЗО азІОЗоУрв КЕБСВБКеОТЕ ЕТОсТІВБМОК ВбЕАТУХСТО ХКБУКОТЕКсСи 100 сІКУВІКОсСс ЗзсСОСсбОУСЬУ ОБСАБУККРВО АБУКУБСКАВ ЗУТЕТВУАММ 150 чУВОврРООСІ ЕКІСОМІВРЕО БЕТНУКОМЕК СЕУТМТТОТВ ТБТАХМЕТНЬ 20
СЕЗРОТАМХУХ САВАМОХОЮ ЗЕМ БІха ос зе
Праймери:
Праймер Г9п321Е (ЗЕО ІЮО МО: 261): сдадсіадсі сіададада ісасаднсі сісіас 36
Праймер Гопз86бк (5ЕО ІО МО: 262): шоаайсі адсадссісс садщаддад асддщдассяо їддіс 45
Праймер Гоп784Е (ЗЕО ІЮО МО: 263): досддаїссд даддсддада ссаддйнсад сіддідсад 39
Праймер Гоп7в5К (5ЕО ІО МО: 264): ссіссддаїс сдссіссій даїсісаадс Подіссс 38
Праймер Гоп7вбК (5ЕО ІО МО: 265): шоаайсі адсадссісс саддсюдад асоддісасса д9 42
Праймер Г9и787Е (5ЕО ІО МО: 266): ддадодсддаї ссддадас9а9 аддсдаадід садсцогщ9 адіс 44
Експресійну плазміду НизО8МІ. 1-435(0214-Ни2ВбМУН 4-І БОС переносили разом з Ни2В6бМІ. 5- саз5а4-низавмн 5-І ос у клітини НЕК-293 з одержанням біспецифічного діатіла Ни286 4.5-
Низав8 5.1, що розпізнає СО32 і СО79. Одночасно з цим, Ни2в6мМІ 5-435(024-Ни2ВбУн 4-І 6ОСс і
Низавмі 1-43504-НизавУНн 5-оосС окремо переносили в клітини НЕК-293 з одержанням діатіла Ни286 4.5 і Ни308 5.1. Після культивування протягом трьох днів, кондиціоноване середовище збирали й охарактеризовували за допомогою ЕГІЗА на зв'язування. Результат цього експерименту представлений на фігурі 36.
Протокол експерименту: 100 нг/ямку розчинного ЕсКІПр-с2-Адіу наносили на 96-ямковий планшет Махізогр у карбонатному буфері і залишали на ніч при 40 "С. Планшет три рази промивали РВБ/О,1 95 твін 20, а потім блокували 0,5 95 ВЗА у РВБЗ/О,1 95 твін 20 протягом 30 хвилин при кімнатній температурі з наступним додаванням діатіл. У кожну ямку додавали серію дворазових розведень кондиціонованого середовища біспецифічного діатіла Ни286 4.5-Низав8 5.1, діатіла Ни286 4.5 і діатіла пи308 5.1, починаючи з 25 нг/ямку. Планшет інкубували при кімнатній температурі протягом 1 години. Після триразового промивання РВЗ/О,1 90 твін 20, у планшет додавали 10 нг/ямку ЕсАПШа-(с2-біотину. Планшет інкубували при кімнатній температурі протягом 1 години. Після триразового промивання РВЗ/0О,1 905 твін 20, 50 мкл 1:5000-розведення ПХ-кон'югованого стрептавідину (АтегзПпат Рагптасіа Віоїтесп) використовували для детектування. Після 45-хвилинного інкубування при кімнатній температурі, планшет три рази промивали РВ5З/О,1 95 твін 20 і виявляли з використанням субстрату ТМВ.
Зо Після 10-хвилинного інкубування реакцію припиняли шляхом додавання 1 95 Н25Ох. 00450 нм зчитували з використанням програми ЗОЕТтах. За отриманими результатами будували графік з використанням програми сгарпРааРгізхт 3.03. 6.13. Конструювання діатіл І4-ОАВТ
Були сконструйовані діатіла ІД-САКТ, які містили варіабельні ділянки, здатні зв'язуватися з
СО32 і з комплексом В-клітинного рецептора ("ВСКС"). Перше діатіло містило лінкер
ГсоСооОо5 (5ЕО ІЮ МО: 267), розташований між послідовностями МУН і послідовностями Ес даної молекули. "Друге" діатіло містило або лінкер І ЕЇК, що має послідовність І ЕІК (ЗЕО ІЮ МО: 268), або лінкер, що має послідовність ТУЗ5З (5ЕО ІЮО МО: 269). Послідовності ланцюгів цих діатіл і кодуючих їх полінуклеотидів представлені нижче. неГво5мІ-пВсСКсСМУн Ма48І, Мб2К оС о35 пКарра (5ЕО ІЮО МО: 270):
РІОМТО5РБЗБ Г5А5ЗУСОВУТ ІТСВАБОВБІбЄ СУГТ5УТООКР СКАРВВІІУА 50
АБТІРБСУРБ ВЕБСОБЕБСТЕ ЕТІТІ55ІОР ЕОКЕАТУУСІО УЕКЕЗУРІТЕСО 100
СТКУКІКСОС 50606О0УОгУ О5САЕУККРО АБУКУБЗБСКА5 СУТЕТОУЙММ 150
ЖУВОАРСОСІ ЕМІСМІРРЗО 5ЕТНУМОКЕК ОВБУТМТТОТ5 Т5ТАУМЕ1В5 200
ІВБ5ООТАУУУ САВАМСУЙСО СТТУТУЗ5Іб бСбОБ5ВТУА АРЗУКІЕРРБ5 250
РЕО1К5СТАБ УУСІЇММЕУР ВЕАКУОЙКУЮ МАТОБСМБОЕ 5УТЕОРеКОБ5 300
ТУ5І55ТІТІ 5БКАРУЕКНКУ УАСЕУТНОСІ 55РУТКбЕМВ СЕС 343
Послідовності НВВ5МІ приєднували до послідовностей НОВСКСМУН за допомогою лінкеру ссвовБоососо (560 1ІЮ МО: 10), розташованого в положеннях 108-115. Послідовності НВСКСУН приєднували до послідовностей с за допомогою лінкеру Осо 5 (5БО ІЮО МО: 267), розташованого в положеннях 229-236 (обидва ці лінкери підкреслені, як показано вище).
Полінуклеотид, що кодує НВВ5МІ --ВСАСУН МА48І, Мб2К І оосСо35 ПпКарра, має послідовність:
(5ЕО І МО: 271): часаєссада ЄдасссадеЕс Ессаєссесс ЕгаєстдссеЕ сЕЧдЕОддада 50 бададесасс аєсасеЕсєдеЕс доддсаадеса ддаааєтадеі ддеЕрасекваа 100
ЧдсЕддсЕдса дсадааасса ддсааддсессс стадасдссЕ даєссасдасс 150 дсаєссасеЕє єадаєєссдд єдессссаєсс аддеЕссадед дсадедадес 200
Бодсодассдад ЕЕєСсСасссеса ссаєсадсад ссЕєСадсся даачЧчаєсссс 250 саасстаєвта сЕдЕСТасаа тгаєєевадеє асссодсеЕсас дЕсСЯдДЧа9д9ад 300 доддассаадуд Єддааасааа аддаддсдда Ессддаддсд даддесаддєс 350
ЕсадсеЕдЧаєда садЕСЕдддад сЕЧаддеЕдаа дчаадссвддс дссісадесда 400 аздЕссссвд сааддсссстЕ ддЕсасассе Єсассадсса ссддаєсдаас 450 гдсодЕдсдас аддсссствдд асааддасЕє дадеЕдодаєсуд дааєсдаєсода 500
ЕссЕєСсСадас адеЕдааасес асрасааєса ааадеЕєсаад дасададсса 55О ссаєдассас адасасаєсс асдадсасад ссрасаєдда дсгдаддадс 6о0 сЕЧчЧачаєсвєд асдасасддс саєдЕаєвтас єдЕЧЯсодадад стасоддаста 650 сЕддоадоасаа дододассасудд Єсассуєссс сесасеЕддда дадсеЕдсддсад 700 чачададссу аассдсддсс дсассаєсуд ЄсЕЕсаєсьс сссдссаєсе 750 чаєдадсаде Єдаааєссдуд аасеЕдссЕСЕ ЧЯЧЕЄЧДЕДЕдесс ЄдсЕДдааєаа 800 сСЕЕСваєссс адададдсса аадеасадед дчааддеЕддає аасдсссісс 850 ааєсдддеЕаа сЕСССаддад адЕдЕСасад адсаддасад сааддасадс 900 асстасадсс Єсадсадсас ссеЕдасудссд адсааадсад асгасдадаа 1000 асасааадес басдсссдсуд аадесассса Есадддсесвєд адсеЕсдсссд 1050
Есасааадад сЕссаасад ддачдадчЕчЧчЕє ад 1082 де послідовності, які кодують лінкери ССО50(0(00 (5ЕО ІО МО: 10) і ГооСооо5 (5ЕО ІО
МО: 267), знаходяться в положеннях 322-345 і 685-708, відповідно (обидві ці послідовності підкреслені, як показано вище).
НВСРЕСМІ. К45М4-пП8В5МУН І СО О5-пО1І (5ЕО ІЮ МО: 272):
РУУМТОБРІБ ГРУТІСОРАб5 ІВБСКБ5Б5ОБІІ РБООКТУПМИ КЕООБРООБРМ 50
КЕГПІУХІУМ5КІО 5ОУРОКЕ5О5 О5ОТОЕТІКІ 5КЕМЕАВБУСУ УУСМОСТНЕР 100
ІТЕОобсТКІв ІКСОСВСОСо ЕМОГУВОСОоС ГМОРОСБІВІ 5БСААБСЕТЕ5 150
РАММОЖМУКОА РОКОГЕМУАВ ІКМКАКМНАТ УУАВЕБМІСКЕ ТІБКОБАКМ5 200
ТУТОММОІВКА ЕПТАМУУССА гСпрУМСОоСстТ гУтТУбБОТОоОоС ббО5АБТКОР 250
ЗМЕРІАРББОБК 5Т50ОТААГгО СІМКОУЕРЕР УТУБИМБОАЇ Т5ОУНТЕРАУ 300
ТОо5Б5сГУ5І5 5МУМТУРББ5І СТОТУІСМУМ НКРОМІКУОК КМЕРКОСОКТ 350
НІСРРСОРАРЕ ІІСОРБМЕТЕ РРЕРКОТІМІ 5КЕТРЕМТСУУ МОУБНЕОРЕУ до
КЕМИУУрОУЕ УНМАКТКРКЕ ВОУМ5ТУКУУ 5МІТУГНОРМ ІМОКЕУКСКУ 450
ЗМКАГРАРІЕ КТІБбБКАКСОР КЕРОМУТІРР 5КРЕПТКМОУМ БІТСІУКОВУ 500
РБ5БРІАМУМЕШЕ5 МООРЕММУКТ ТРРУТО50ОО5 ЕЕГУБКІТУВ К5еМООСМУЕ 55О
ЗС5УМНЕАТН МНУТОК5ІБІ РОК 574
Послідовності ЯНВСКСМІ приєднували до послідовностей НВВО5МН за допомогою лінкеру сссовоососо (5Б6О ІО МО: 10), розташованого в положеннях 113-120. Послідовності НВІВАМН приєднували до послідовностей с за допомогою лінкеру Осо 5 (5БО ІЮО МО: 267), розташованого в положеннях 237-244 (обидва ці лінкери підкреслені, як показано вище).
Полінуклеотид, що кодує НВСКСМІ К45М4-НВВ5УН І ачасСса(ц(а5-п1, має послідовність:
(5ЕО І МО: 273): чаєдЕєдеєда Єдасеісадеіс сссасссссс сгдсссдесса сссеЕсддаса 50 дссддссЕсс ассеЕсстдса адссаадсса дадссеЕссса дасадедаєд 100 чааадасаста ЕЕсдааєсдда ЕЕссадсада ддссаддсса ассгссааас 150 сдссеЕаавгс аєсЕддедеЕс гааасєддас ЕСЕДдДдЕсСсС садасадатєє 200 садсдадсадЕ доаодЕСсаддса сечаєєєсас асеЕдааааєс адсадоаЧчі да 250 аддсєЕдадда ЄЧЯ9ЕЕдоЧддУЄЕ гаєвсасеЕдсеЕ ддсааддсас асаєєєєссд 300 сЕСасдсєсуд дсуддадддас саадсесдад ассаааддад дсодаєссад 350 ачадсддаддс даадсдсадс ЕсдсддадеЕс содаддаддс ЕсоддеЕдсаас 400 сЕдчдаддаєс сседадассс ЕСЕЄЧДЕдссУ ссЕСЕЯДЧдаєс сасеЕєеваде 450 часдсстідда бддассдддЕ ссдЕсаддсесс ссаддсаадда дасЕєсдадед 500
ЧаЕсдсЕдаа ассадаааса аадссаааадв Ссаєбдсааса бастаєсдсгд 55О азЕсСЕЧдчЕЧає адодаддЕєс ассаєсєсаа чачаєдасодс сааааасаде 6о0 сЕЯДЕассвдс аааєдаасад сЕєЄаададсе даадасастд ссаєдеаєсва 650 сСЕЧЕЯсСоЯддЯСсЕ СсСЕСОдЯдСсСсСЕвдЯд астаседоддоа ссааддсасс стодедассад 700
СсеЕсСсадссЕ даддаддсЕдс дадсоддаддда дсдссессас саадддсесса 750
ЕсодЕСЕЕСсС сссЕЯДдсасс сЕССЕССяаЇад адсассеЕСтд доаддсасадс 800 часссгЕдддс ЄдссгддеЕса аддассрасес ссссдаассу дЕдасоадде ді 850 счЕддаасеЕс аддсдсссвд ассадсддсд ЕдсасассЕє сссддсЕдЕС 900 сЕасадЕСсСстЕ саддасеЕсвта сЕСССсСЕСадсС адсдєдаєда ссаєдсссЕС 950 садсадсебд ддсасссада сстасаєссід саасуєдаає сасаадссса 1000 дсаасассаа ддеЕддасаад ададсєдадс ссаааєсьсд Едасаааасе 1050 сасасаєдсс сассдЕдссс адсассідаа сЕссЕддддда дассдеЕсадеі 1100 сЕЄсСсСЕСЕЕсС сссссаааас ссааддасас ссеЕсаєдаєс Есссддассс 1150 сЕдаддеЕсас аєдсдЕдучєд деЕддасудєда дссасдаада сссеЕдаддЕс 1200 аадЕєсаасії додсасуєдда сддсдєддад деЕдсаєсааєд ссаадасааа 1250 дссдсдддад дадсаднаса асадсасуєа ссЧдєЕдЕддЕсС адсдЕссеса 1300 ссдЕссЕдса ссаддасідд сєЕдааєддса аддадсасаа дЕдсааддеіс 1350
Ессаасааад сссЕСссадс ссссаєсдад аааассаєсо ссааадссаа 1400 адддсадссс сдадаассас аддеЕдбасас ссеЕдссссса Єсссдддаєд 1450 адсЕдассаа даассаддес адссеЕдассе дсседдЕСаа аддсеЕєстає 1500 сссадсдаса Єсдссуєдда чЧчЕдодададс аагдддсадс соддадаасаа 1550 сЕасаадасс асдссеЕсссуд ЕдсЕддасес сдасуддсеєсс ЄЕСЕЕССЕСЕ 1600 асадсаадсї сассдЕддас аададсадді ддсадсаддд даасдессЕс 1650
ЕсаєдсеЕссу Єдаєдсаєда додсЕСЕДдсас аассастаса содсадаадад 1700 ссЕСЕССсССсСвд ЕСЕССсСддба аа 1722 де послідовності, які кодують лінкери ССО50(0(00 (5ЕО ІО МО: 10) і ГооСооо5 (5ЕО ІО
МО: 267), знаходяться в положеннях 327-360 і 709-732, відповідно (обидві ці послідовності підкреслені, як показано вище).
НЗВ5МІ-НВСЕСУН МА81І, МО2К. (-2О1 ЕК. пКарра (ЗЕО ІО МО: 274):
РІОМТО5РБОБ5 Г5А5УМООКУТ ІТСКАБОВБІб СУБ ООКР СОКАРККІІУА 5О0
АБТІР5БОУР5 КЕ5ОБЕ5ОТЕ ЕТІТІББГОР ЕПОЕАТУУСІО УЕБУРІТЕОО 100
СТКУБІКООС 56606001 У О5БСАВЕУККРО АБУКУБСКАб СУТЕТО5УЙММ 150
МУВКОАРОСОСІ ЕМІСОМІВРБОО 5ЕТНУМОКЕК ОКУТМІТОТ5 Т5ТАУМЕТК5 200
ІББООТАМУУ САКАМОСУМОСО СТТУТЕІККТ МААРБУМЕІТЕР РБРЕОГКОСТ 250
АБМУСІПММЕ УРКЕАКМУОМК УМОМАТОБОМе ОББУТЕОР5К ОБ5ТУБІБ55ТІ, 300
ТІ5КАВУЕКН КУУХАСЕУТНО СІ55РУТК5Е МКС 335
Послідовності НВВ5МІ. приєднували до послідовностей НВСКСМУН за допомогою лінкеру сосБООСОО (5ЕО ІЮО МО: 10), розташованого в положеннях 108-115. Послідовності НВСКСУН приєднували до послідовностей Ес за допомогою лінкеру І ЕІК (ЗЕО ІЮ МО: 268), розташованого в положеннях 225-228 (обидва ці лінкери підкреслені, як показано вище). Полінуклеотид, що кодує НВВ5МІ -НВСАСУН МА81І, Мб2К (-2)І ЕІК пКарра, має послідовність:
(5ЕО І МО: 275): часаєссада Єдасссадсс сссасєссеєсс єсассєдсся стагоддвадвда 50 бададесасс ассасеЕєдЕСсС доддсаадіса ддаааєсадеЕ ддеЕрасекваа 100
ЧдсЕддссдса дсадааасса додсааддссс ссадасдсст даєстасоасс 150 чдсаєссасеє гадаєєсьдуа ЕдЕСССаєсс аддеЕЕСсадед дсадеЕдадіс 200
Бдодассдад ЕЕсасссіса ссаєссадсад ссЕссадссе даачассссд 250 саасстаєта сеЕдЕСсСасаа сасесєсадьс аєссдсєссас дЕсСОЯдЧад9д 300 чдоддассаадд сддаааєсааа аддаддсдда Ессддаддся даддеса9ддє 350
Есадсєддєд садессддад седаддеЕдаа даадсстіддс дссЕСадеєда 400 аддеЕсЕєсстд сааддсессІ дудєтасассе Евгассадсста сеЕддаєдаас 450 г9до9одЕдсдас аддссссгдуд асаадддсЕс дадеддаєсда дааєдчаєєсда 500
ЕссеЕссадас адесдааасіс асграсаасса ааадсссаад дасададеса 55О ссаєдассас адасасаєссс асдадсасад ссгасаєдда дсеЕдаддадс (109) сеЕдачзаєссд асдасасддс сдЕдсаєсас єдЕдсдадад сгаєдоадсста 650 сЕдддддсаа дддассасдд ЕссЕддадає саадсдаасі дЕддсеЕдсас 700 саєсудЕСЕЄ саєсьссссу ссаєстЕдаєд адсадеЕсєдаа аєсеЕддаасе 750
ЧССЕСЕЧЕСЧ ЕЧдЕЧДСсССсСЕдсСЕ даасаасьсс баєсссадад аддссааадеі 800 асадесдчдаад деЕдчаєсаасуд сссеЕссааєс дддеЕаасеісс саддачадсд 850
Есасададса ддасадсаад дасадсассї асадссісад садсасссід 900 асдсеЕдадса аадсадасса сдадааасас ааадеіссаса ссеЕдсдааде 950 сасссаєсад ддссЕдадсеї сдсссдЕсас ааададсЕсс аасаддоддад 1000 адеЕдЕ 1005 де послідовності, які кодують лінкери ссо(055(05(0505 (5ЕБО ІЮ МО: 10) і І БІК (ЗЕО ІЮ МО: 268), знаходяться в положеннях 322-345 і 673-684, відповідно (обидві ці послідовності підкреслені, як показано вище).
НВСРСМІ. Кк45М4-пвВ5МУН. (-4У7М55-пОІ-НВСКСМІ. к45М-н8В5МН - пО1 (5ЕО ІЮ МО: 276):
РУУМТОБРІБ ГРУТІСОРА5 ІБСК5БОБІІ РБООКТУПМИ гООБРОСОБРМ 50
ЕПІХГУБКІО 5БОУРОВКЕ5О5 СБ5БОТОЕТІКІ 5ЕМЕАВЕПУСУМ УУСМОСТНЕР 100
ТТЕсобОоТКІВ ІКОСОВБОВОС ВЕУОГпУВБОСо ГУМОРОСБІВІ 5СААБСЕТЕ5 150
РАММОЖУКОА РОКОТГЕМУАВ ІКМКАКМНАТ УУАВ5МІСКЕ ТІБбБКРРАКМ5 200
ТУТОММОІВКА ЕПТАМУУССА ГСГОУМСОсСТ ГУТУ55АБ5ТК ОСРБОБУМЕРІАР5 250
ЗКБ5ТБООТАА ГОСІУМКОУЕР ЕРУТУБИМ5О АГПТ5БОУМНТЕР АУМТОБ5ББ5ОГУ5 300
Т5ББММТУМРББ Б5БІСОТОТУІСМ УММНЕРОМТІТКУ ОКЕМЕРКОСО КТНТСРРОРА 350
РЕПІСОРОБМЕ ГЕРРКРКОТІ МІБбБКТРЕУТС УУУМОУБНЕВР ЕУКЕМИУУО до
УМЕУМНМАКТКР КЕВБОУМОТУК УМБУгТУПНОо ОМІМОКЕУКС КУБбБМКАГРАР 450
ІЕКТІБбБКАКО ОРКЕРОМУТІ РРОЬКОЕТТКМ ОМБІТСІМКО ЕУРБОТАМУЕИ 500
ЕБМСОСОРЕММУ КТТІРРУГО5БО СОБЕКГУ5КІТ МОК5вМООСМ МЕБС5УМНЕА 55О
ІНМНУТОК5І 5І5БРОК 566
Послідовності НВСКСМІ. приєднували до послідовностей ПвВ5УН за допомогою лінкеру сссовоососо (5Б6О ІО МО: 10), розташованого в положеннях 113-120. Послідовності НВІВАМН приєднували до послідовностей Ес за допомогою лінкеру ТУ55 (5БО ІО МО: 269), розташованого в положеннях 233-236 (обидва ці лінкери підкреслені, як показано вище).
Полінуклеотид, що кодує НВСКСМІ. К45М-НВВ5ОМН. (-4)УТУ55-Н1, має послідовність:
(5ЕО І КО: 277): чаєсдеЕсдсєда сдасссадес сссасссссс седсссодєса сссттгодаса 50 дссддссссс ассссссдса адссаадсса дадссессса дчатачеЕчатєд 100 чааадасаса Єссдааєсєсда сєсссадсада додссаддсса асегссааас 150 сдссЕааєтє аєсеЕддеЕдЕСсС сСааасеіддас ЕСЕддддЕСсСС садасадаєя 200 садсддсаді доддЕсаддса сеЕдаєєсєєсєсас асгдааааєс адсададасда 250 адодсеЕдадчда ЕЧЕЄООдоЧдЧЕЄ бСасєтаседсе додсааддтас асаєєеєссд 300 сЕсасудєссу дсддадддас саадссєдад аєсаааддад дсддаєссад 350 ачадсададдс даадсдсадс ЕєдЕддадесс сддаддаддс ЄсодеЕдсаас 400 сЕддаддаєс ссеЕдадасеЕс ЄСЕЕЧдЕдссуд ссЕСтДЯдаєст сасЕсЕсадь 450 часоудссідча сддасеЕдддЕ ссдесаддсс ссаддсаадуа доасЕсдадед 5О0
Чаєсдссдаа ассадаааса аадссааааа ссасдсааса гастаєочстд 55О адеЕСЕдеЕЧдає адддаддеЕсєс ассаєсссаа дадаєдасдс сааааасаде 6о0 сЕдгассгдс аааєдаасад сЕсаададсі даадасастд ссдєдсаєса 650 сЕдсдоддоасЕ сЕдддссЕсд асрассдддд ссааддсасс седдсдассд 700
ЕсЕссадсудс сЕсСсассаад ддсссаєсддд ЄсЕЕсссссе ддсасссісс 750
Ессаададса ссЕСсгддддда сасадсддсес сгдддсеЕдсс гдаєсаадвча 800 стасеЕссссс даассуддбЕда сддЕдЕсдсд даасеісаддс дсссеєдасса 850 дсдадсдсєдса сассєссссу дссЕдЕсСссас адсссссадд асеЕстасі сс 900 сЕсадсадсуд ЄддЕдассудс дсссеЕссадс адсеЕсдддса сссадасстга 950 саєсЕдсаас дЕдаассаса адсссадсаа сассааддєд дасаададад 1000
Есдадсссаа ассеЕрдрдас аааасісаса саєдсссасс дЕдсссадса 1050 ссЕдаасєсс єддддддасс дЕСадЕСЕЄсС сЕСЕЄсСсссс саааасссаа 1100 ддасасссєс аєдаєсіссс ддассссєда ддЕСсасаєдс дЕодЧвЕдЧас9а 1150 асдєдадсса судаадасссї даддссаадї Есааседдсра сдєсддасддс 1200 чЧЕдЧчаддЕдс аєааєдссаа дасааадссд сдддаддадс адгасаасад 1250 сасдіассЧдє дЕддЕСсадсу ЄссЕСсСассдЕ ссеЕдсассад даседдседа 1300 асддсаадда діасаадсдс ааддессссса асааадсссе сссадссссс 1350 ассдадаааа ссаєссіссаа адссаааддд садссссдад аассасаддеі 1400
ЧдЕасасссвд сссссаєссс додадаєдадсі дассаадаас саддісадсс 1450
ЕдассєдссЕ дЧдЕСсаааддс СЕСТаєссса дсдасаєсдс соаєодаді да 1500 чададсааєсд ддсадссуда даасаассас аадассасдс сеЕсСссдЕдсеЕ 1550 чддасеЕссдас додсЕсСсЕЕсСЕ ЕССЕСсСсасад саадсссасс деЕддасаада 1600 чдсаддеЕддса дсаддддаас дДдЕСЕСЕСЕСаєЄ дсЕССЯєЧдає дсаєдаддсе 1650 сЕдсасаасс астрасасдса даададссес ЕсссЕдЕСЕСсС соддддеааа 1698 де послідовності, які кодують лінкери сОос5О(О(О(Ое (5БО ІЮ МО: 10) ї ТМ55 (5ЕБЕО ІЮ МО: 269), знаходяться в положеннях і 337-360 і 697-708, відповідно (обидві ці послідовності підкреслені, як показано вище). 6.14. Оптимізація лінкерів
Як обговорювалося вище, діатіла ІДОАКТ відповідно до винаходу переважно містять лінкери, розташовані між послідовностями МН і послідовностями Ес даної молекули.
Експерименти проводили з метою оптимізації лінкерів для досягнення максимального виходу і максимальної активності. Були використані нижченаведені лінкери.
2853 1СБЕб
Вищевказані лінкери вбудовували в плазміди для одержання набору діатіл ІЧОАКТ, що містять різні комбінації лінкерів:
Лічякердля ВЕЖІ 3.4 | лінкердля | РЕКОА | КІД5А Очищшеннії
Тілазміца) ланцюга А, | ланпюгта В. (мкг/мл) білок (після
РМОХ, КО 5ЕО В ЕЮ ко чо (1 літру
Ям. 903 250 зі не я 0557 90501293 978 хро 9069юЯ хх МА 09070989 х10293 ХО МАС 9 29112961 х МА ок хо хро
Була визначена здатність продукованих ІДСАКТ до агрегації.
Лінкери Загальний Олнемер : Мономер Фрагмент
Ів-САВТ білок (мг) 95 о Я п тт 2 о «12 «о о 22 о оо 2 о 1 2 22 «2 2
Отримані дані несподівано показали, що конструкції, які мають лінкери, такі як конструкції, використовувані в 901А/9018, 903А/903В і 908А/9088, давали набагато кращі результати (менший ступінь олігомеризації і/або знижений рівень продукування фрагментів), ніж конструкції, що мають лінкери, такі як 9У10А/9118. 6.15. Е-спіральні/К-спіральні ОАКТ
З усього вищесказаного очевидно, що окремі поліпептиди біспецифічного ОАКТ можуть утворювати дві молекули гомодимерів і одну молекулу гетеродимера. В одному з варіантів даного винаходу, заряджений поліпептид може бути приєднаний до С-кінця одного або, більш переважно, обох поліпептидів ОАКТ. Що стосується вибору поліпептидів із протилежними зарядами для окремих поліпептидів біспецифічного БАКТ, то в даному випадку слід зазначити, що включення таких заряджених поліпептидів буде сприяти утворенню гетеродимерів і знижувати ступінь утворення гомодимерів. Переважно, щоб позитивно заряджений поліпептид містив в основному аргінін, глутамін, гістидин і/або лізин (або суміші таких амінокислот), а негативно заряджений поліпептид містив в основному аспартат або глутамат (або суміш таких амінокислот). Особливо переважними є позитивно заряджені поліпептиди, що містять велику кількість лізинових залишків, і негативно заряджені поліпептиди, що містять велику кількість глутаматних залишків. Для максимізації електростатичних взаємодій між такими протилежно зарядженими поліпептидами, переважно використовувати поліпептиди, здатні до спонтанного утворення спіральної конформації.
Таким чином, у переважному варіанті винаходу, позитивно заряджена "Е-спіраль" може бути приєднана до одного з поліпептидів, використовуваних для утворення біспецифічного САКТ, а негативно заряджена "К-спіраль" може бути приєднана до іншого поліпептиду САКТ (фігура 37).
Особливо переважна Е-спіраль має послідовність: (ЕМААГ ЕК):
ЗЕО ІЮ МО: 299 ЕМААІ ЕКЕМААЇ ЕКЕМААЇ ЕКЕМААЇ ЕК
Особливо переважна К-спіраль має послідовність: (КМААЇ КЕ а:
ЗЕО ІЮ МО: 300 КМААІЇ КЕКУААЇ КЕКМААЇ КЕКМААЇІ КЕ
Переважний поліпептид САКТ, що містить таку Е-спіраль, має загальну послідовність: (МІ - доменІі(асавс(с(|-(МН-домені-КЕМААЇ ЕК)|-СООМ5, де Мі являє собою домен варіабельної ділянки легкого ланцюга Ід АКТ; ссос5ОСООС являє собою 5ЕО ІЮ МО: 10, МН являє собою домен варіабельної ділянки важкого ланцюга Ід АКТ; (ЕМААГ ЕК) являє собою
ЗЕО ІЮ МО: 299, а ООСМ5 представляє собою 5ЕО ІО МО: 301. Переважний поліпептид САКТ, що містить таку К-спіраль, має загальну послідовність: (МІ -домені- (асКиБсас(ас1|-(МН-домені-
ККМААЇ КЕ)4|-СООМ5, де МІ. являє собою домен варіабельної ділянки легкого ланцюга Ід САКТ, сосв5ОсОсосОо являє собою ЗЕО ІЮ МО: 10, МН являє собою домен варіабельної ділянки важкого ланцюга Ід АКТ; (КМААГКЕ): являє собою ЗЕО ІО МО: 300, а ЗОСМ5 представляє собою 5ЕО
ІО МО: 301. 6.15. Е-спіральні/К-спіральні ВАКТ, що містять Ес
В іншому варіанті винаходу Ес-ділянки можуть бути приєднані до Е- і/або К-спіралей Е- спіральних або К-спіральних САКТ.
Додаткове розділення Ес-ділянок і МН-доменів Ес-вмісного ОАКТ може виявитися бажаним у тому випадку, коли структура таких доменів з меншим ступенем розділення приводить до зниження рівня взаємодії між вказаними доменами і зв'язуються з ними лігандами або як-небудь інакше перешкоджає збиранню БАКТ. Хоча можуть бути використані роздільники, що складаються з будь-яких амінокислотних послідовностей, однак, переважно використовувати роздільники, що утворюють а-спіральні структури, так, щоб вони були максимально протяжними і виносили Ес-домен далеко від варіабельних доменів (фігура 37). Оскільки вищеописані спіральні поліпептиди з протилежними зарядами мають додаткову функцію, яка полягає в стимуляції утворення гетеродимера, то такі молекули є особливо переважними роздільниками.
Такі спіраль-вмісні молекули Бс-ОАКТ мають сприятливі властивості, аналогічними властивостям Ес-ОАКТ, включаючи збільшений час напівжиття в сироватці і таку ефекторну функцію, як рекрутинг. Вищеописані Е-спіральні і К-спіральні поліпептиди є особливо переважними для цієї мети.
Таким чином, у переважному варіанті винаходу, Е-спіральний Ес-вмісний ОАКТ має загальну послідовність: (МІ--домені--ассавиа(с(а|-(МН-домені-КЕМААЇГ ЕК) 4|-ас10-Ро-домен, що починається з 0234 (по нумерації Кебата), де МІ являє собою домен варіабельної ділянки легкого ланцюга Ід АКТ; ссос5О(СООС являє собою 5ЕО ІЮО МО: 10, МН являє собою домен варіабельної ділянки важкого ланцюга Ід САКТ, а (ЕМААГ ЕК)» являє собою ЗЕО ІЮ МО: 299.
Аналогічним чином, у переважному варіанті винаходу, К-спіральний Ес-вмісний ОАКТ має загальну послідовність: (МІ-домені-(асавас((1-(МН-домені-ККМААЇ К)4|-йСс1(-Ес-домен, що починається з 0234 (по нумерації Кебата), де МІ являє собою домен варіабельної ділянки легкого ланцюга Ід АКТ; ссос5О(СООС являє собою 5ЕО ІЮО МО: 10, МН являє собою домен варіабельної ділянки важкого ланцюга Ід САКТ, а (КМААГКЕ)» являє собою 5ЕО ІЮ МО: 300.
Як вказано вище, спіраль-вмісна молекула ОАКТ або спіральна Ес-вмісна молекула ОАКТ може включати тільки один такий спіральний роздільник, або він може включати більше ніж один такий роздільник (наприклад, два роздільники, що мають, переважно, протилежні заряди, і один із яких зв'язаний з кожним МН-доменом поліпептидів ОАКТ). Завдяки зв'язуванню Ес- ділянки з такою(ими) молекулою(ами)-роздільником(ами), здатність до утворення двовалентних, чотиривалентних і т. п. варіантів молекул Бо-ЮАКТ може бути посилена за допомогою перестановки ланцюга (фігура 39). Як показано на фігурі 39, можуть бути продуковані молекули
Ес-САКТ, що утворюють мономери або димери залежно від того, чи зв'язується Ес-домен з одним або обома МН-доменами САКТ. 6.17. Функціональна активність Е-спіральних/К-спіральних Ес-вмісних ОАКТ
Е-спіральні і/або К-спіральні молекули Ес-ЮСАКТ були отримані з біспецифічних молекул рАКТ, що мають: (1) варіабельні ділянки легкого і важкого ланцюгів антитіла, що реагує з
Зо СО795 (з комплексом ВСК), СВЗ, і (2) варіабельні ділянки легкого і важкого ланцюгів низькоафінного варіанта (який позначається варіантом "УА") антитіла, що реагує з СОЗ2В, 286.
Ця варіабельна ділянка легкого ланцюга вказаного антитіла відрізняється від варіабельної ділянки легкого ланцюга антитіла 286, тим, що в ній є мутації: М5ОМ ії М51А. Таким чином, антитіло ХА2В6 має нижченаведену послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга:
ЕІММСТО5РОРОЗМТРКЕКМТІТСВАТЗОБІСТМІНМУМООКРООЗРКІ ІКМАЗЕ зІЗМРОВЕБЗОБаБаТОЕТІ ТІМ ЕАЕОААТУУСООМПУРЕТРОССИаткмеї
К (ЗЕО ІЮ МО: 302).
Послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга вказаного антитіла являє собою:
ОМОЇ МОБІАЕУККРОАБУКУЗСКАБОМТЕТММУМІНУМВОАРОСС ЕМ МаМІОР
ЗОТУРМУМККЕКавВУТМТТОТ5ТЗТАММЕЇ А5І В5ООТАУУМСАвМОаррУМо еМрУМУСОатТТУТМУ55 (ЗЕО ІЮ МО: 303).
Низькоафінне антитіло було вибране тому, що воно переважно зв'язується з СОЗ2В іп сі5 на клітинах, експресуючих СО79р (В-клітинах). Така конфігурація сама по собі знижує ступінь взаємодії з іншими СОЗ2В-експресуючими клітинами (моноцитами, ендотеліальними клітинами, клітинами печінки), а також ступінь небажаної транс-взаємодії.
Були отримані Е-спіральні і/або К-спіральні похідні і Е-спіральні і/або К-спіральні Ес-вмісні похідні таких П2В6МАпСВЗ БАКТ. Для приблизної оцінки розміру і гетерогенності продукованих молекул була проведена ексклюзійна хроматографія. Як показано на фігурі 40, димери були отримані з Е-спіральних/К-спіральних САКТ, що мають одну зв'язану Ес-ділянку, приєднану до
К-спірального домену, а також до Е-спірального/К-спіральних ВАКТ, які мають одну зв'язану Ес- ділянку, приєднану до Е-спірального домену. Бажані мономерні, а також димерні молекули були виділені з препаратів, у яких Ес-ділянки були приєднані до обох Е- і К-спіралей однієї і тієї ж молекули ОСАКТ, де більшість із усіх продуктів, що утворюються, складав мономер. На фігурі 41 показана можлива структура продукованих димерних молекул.
Фракції, проаналізовані за допомогою ексклюзійної хроматографії, додатково аналізували за допомогою електрофорезу в поліакриламідном гелі з ДСН для більш точної оцінки структур отриманих молекул (фігура 42). Е-спіральні/К-спіральні похідні ПАКТ (без Ес-ділянки) мігрували як дві переважні смуги, кожна з який мала розмір приблизно 28 кД (відповідні КЕс-вмісному поліпептиду і дещо меншому ЕЕс-вмісному поліпептиду), і як менш явно виражена смуга бо розміром приблизно 49 кД (відповідна Е-спіральному/К-спіральному ОАКТ). Мономерні фракції
Е-спіральних/К-спіральних Ес-вмісних похідних СОАКТ (ЕЕс/К або Е/КЕс), проаналізовані за допомогою ексклюзійної хроматографії, виявляли тільки одну смугу, з більшою або з меншою молекулярною масою приблизно в 28 кД (відповідну або КЕс-вмісному САКТ (смуга з більшою молекулярною масою), або ЕЕРо-вмісному ЮАКТ (смуга з меншою молекулярною масою)).
Продукт переважно мігрував при масі приблизно 49 кД (відповідний Е-спіральному/К- спіральному ЮАКТ). Спостерігалися також смуги зі значно більш високими молекулярними масами.
Був проведений ЕГІ5А-аналіз на біспецифічне зв'язування для характеризації продукованих молекул. СО79 наносили на ЕГІЗА-планшет. У результаті цього, ЮАКТ зв'язувалися з планшетом. Зв'язування ОБАКТ детектували з використанням 5СО032В-біотину, а потім інкубували зі стрептавідином-ПХ. Як показано на фігурі 43, Е-спіральні/К-спіральні Ес-вмісні похідні ОЗАКТ п2В6ХАпСВЗ (ЕКЕсС/К або Е/КЕс) виявляли значне підвищення рівня зв'язування в порівнянні з ОАЕТ пП2В6ХАЙпСВУІ, або в порівнянні з ЕЕС/КЕс-похідним ОАКТ пП2Вб6ХАпСВІ.
Перехресне зв'язування антитіл, що зв'язуються з СО79р, приводило до активації В-клітин (Мап Кооївп, б. єї а. (1997) "Сто55-І іпКіпуд ОЇ Апіїдеп Весеріог Міа Ід-В (829, СО79Б) Сап Іпдисе
Воїй Розіййме Апа Медаїме Бідпаіїє п СО40-Асіїмаєей Нитап В СеїЇ5, » Сііп. Ехр. Іттипої. 110:509-515). Оскільки молекули ОАКТ пП2Вб6УАпСВІЗ мають здатність зв'язуватися з СО79р- і
СозЗа2В-інгібуючим рецептором, то вони мають здатність здійснювати "рекрутинг" СОЗ32В у сайти зв'язування в СО790, і тим самим блокувати проліферацію В-клітин. Для ілюстрації такої здатності, ПОАКТ інкубували з В-клітинами, що обробляли антитілами, здатними перехресно зв'язуватися зі зв'язаними анти-СО790 антитілами. Результати цього експерименту представлені на фігурі 44. Ці результати показали, що антитіла, спрямовані тільки проти СЮО79Б або СО328 (Сп2в6бМ2970 і СпСВ3.1М2970, відповідно), не мали здатність |інгібувати проліферацію В-клітин. Похідні ЕБс/КЕс п2вбУАХхиСВЗ ОАКТ були, в основному, більш ефективними відносно інгібування проліферації В-клітин, у порівнянні із самим П2Вб6УАХПСВЗ
РАВТ ї контрольним пП2Вб6МАХхпСВЗ МЕ. Було виявлено, що Е-спіральні/К-спіральні ОАКТ, що мають тільки одну зв'язану Ес-ділянку (Е/КЕс п2В6УАхпСВЗ-похідні ОАКТ і ЕРс/Жж п2в6уАХпСВЗ-похідні ОАКТ), чинять найбільшу інгібуючу дію на проліферацію В-клітин. 6.18. Модифікації АКТ, що вводяться з метою зміни часу напівжиття в сироватці іп мімо
Зо Як обговорювалося вище, невеликі рекомбінантні молекули антитіла, такі як біспецифічні одноланцюжкові молекули (наприклад, що мають молекулярну масу приблизно 55 кДа), швидко виводяться з кровотоку. Фармакокінетичні дослідження молекул САКТ у мишей іп мімо показали, як і очікувалося, короткий час напівжиття, що становить приблизно 2 години.
У деяких варіантах винаходу, які стосуються, наприклад, лікування гострого запального стану, такий короткий час напівжиття є бажаним, однак, в інших варіантах винаходу, які стосуються, наприклад, лікування раку і хронічних захворювань і станів, переважно, щоб молекули БАКТ відповідно до винаходу мали більш тривалий час напівжиття.
Для поліпшення фармакокінетичних властивостей молекул ОСАКТ іп мімо, використовуваних у цих цілях, ці молекули АКТ можуть бути модифіковані так, щоб вони містили поліпептидну частину білка, що зв'язується із сироваткою, біля одного або більше кінців молекули БАКТ.
Найбільше переважно, щоб така поліпептидна частина білка, що зв'язується із сироваткою, була приєднана біля С-кінця молекули АКТ. Особливо переважною поліпептидною частиною білка, що зв'язується із сироваткою, використовуваного в цих цілях, є альбумін-зв'язувальний домен (АВО), який походить від стрептококового С-білка. Особливо переважним є альбумін- зв'язувальний домен З (АВОЗ) С-білка стрептококового штаму 5148.
Альбумін-зв'язувальний домен З (АВОЗ) сС-білка стрептококового штаму с148 складається з 46 амінокислотних залишків, що утворюють стабільний триспіральний пучок і мають широку специфічність зв'язування з альбуміном (допапезоп, М.О. еї аї. (2002) "Бігисіиге, Зресійску, Апа
Моде ОГ Іпіегасіп Рог Васівїа! АІритіп-Віпаїпд Модшіев" У. Віої. Спет. 277(10):8114-8120). Альбумін є найбільш поширеним білком у плазмі людини і має час напівжиття 19 днів. Альбумін має декілька низькомолекулярних зв'язувальних сайтів, що дозволяють йому нековалентно зв'язуватися з іншими білками і сприяють збільшенню їхнього часу напівжиття в сироватці.
Для ілюстрації здатності поліпептидної частини сироваткового білка збільшувати час напівжиття БАКТ, домен АВОЗ стрептококові (з-білюи приєднували до рекомбінантного біспецифічного ЮАКТ (що вступає в імунну реакцію з антигенами пСО16 і пСО328) з одержанням рекомбінантної молекули антитіла НСО16-НСО328 АВО-БАКТ (фігура 45). Цей комплекс АВО-БАКТ мав специфічність зв'язування з обома антигенами, а також з альбуміном людської сироватки (НБЗА), і здатністю перенацілювати ефекторні клітини іп міго. Цей АВО- рАКТ, у порівнянні з контрольним ВАКТ, мав значно більш тривалий час напівжиття в сироватці 60 мишей. Такий підхід може бути застосований як практично здійсненний спосіб збільшення часу напівжиття потенційно цінних фармацевтичних препаратів, таких як ПАКТ, більше ніж на 90 хвилин, більше ніж на 2 години, більше ніж на 5 годин, більше ніж на 10 годин, більше ніж на 20 годин і, найбільше переважно, більше ніж на 30 годин.
Матеріали і методи:
Моделювання і конструювання АВО-ОАВТ. пСОр16-нСО32В АВО-ОАКТ одержували з використанням як ланцюга 1: пСр1і1вмі-сз5а4-нСрзавмун-К-спіраль (КМААЇ КЕ) 4, де СО16МІ означає 338 СО16МІ, 53504 означає 5ЕО ІЮ МО: 10, НСО32ВМУН означає 286
СОЗ32ВМН, а (КМААГ КЕ)» означає 5ЕО ІЮ МО: 300; і як ланцюга 2: посОоз2вмМІ-а35024-пСр16МнН-саСОецо-Е-спіраль КЕМААГЕК)-сссМ5-АВО, де СОЗ2ВМІ. означає СОЗ2ВМІ, 53504 означає 5ЕО ІЮ МО: 10, НСО16МН означає СЮО1Є6УН, ССО являє собою залишки 2-7 5ЕО ІЮ МО: 267, Е-спіраль КЕМААГЕК)л| являє собою 5ЕО ІЮ МО: 299,
СООМ5 являє собою 5ЕО ІЮ МО: 301, а АВО являє собою:
ГАЄАКМІАМА ЕГОКМОаУБОМ УКМІІММАКТ МЕСМУКАІОЕ ІІ ААГР (5ЕО І МО: 304).
Відповідно до цього, послідовність ланцюга 1 (п38М І(335(014-Н2Вб6УНА-К-спіраль-сСцСаМ5) являє собою: пІУМтТОоВроВ ПАУБІСВКАТ ІМСКдшОВУЄВ КБОПОБЕММАяхХ СОМ рООВеК,
ПІТ ТВМОКОо пУБВОВЕНсСсСо сг ЕТОТІВ БЕОАБІЧАЧУ СООБМЕОСУ
ТЕСЕМУРКТВІ Коссслошсоо УСБУ ОАВУ ККРОдаЕУКУВ СКАТ ТТ
УМІННЯ УКОАВ си ВАМ ПеБОТУВМУМ КЕКСУ ТМТ УСТА
КІВАЛОВ АУХЖСАВМОЇ Оу ХсОМОЖ СОУ ТУТоВи сосок УдДА
ПКЕКУУААБКЕ КУААБКЕКУВ АКСІОМ (ВКО І МО: 305)
Переважний полінуклеотид, що кодує ланцюг 1 (пЗ3О8М І-235(2:4-Н2ВбУНаІ-К-спіраль-
СОСМ5), являє собою: (зКО І МО: 306)
Відповідно до цього, послідовність ланцюга 2 (п286МмІ5-2435(24-пЗа8МН5-Е-спіраль- ссасам5-АВО), являє собою: шу тОоБЕоВ ОБУТРКЕКУТ ТОК ТОВІс БМК ГОРА КЕ
УВІ КО КЕШ ЕТЕТІМСЬКА СОААТУСТА СИТЕТУ
МІ ВОвРОК АТ ОАШІЯщ СООКВУМЕАІ кавотІБКІ т шКМОУЄТМІ
ММІВУБТАТУ ПАСОК МеАЖЕ АХ КУГОУТ УДШВБО СН УААБЕКЕУАХ
КТУБУКАТІ ОСБТІААІе (КО І МО: 307)
Переважний полінуклеотид, що кодує ланцюг 2 (п286МІ5-4350(24-нЗа8УН5-Е-спіраль- сасм5-АВО), являє собою: чадаптерохт подоптувокт псадасніш Сас паа поссазаєса аа со пппассооса сопшсостчКсв огов'іготоо всаавляепво лосося брова што плсассо бозпсооаКо посопаосвоак бгстостоово о ссвооваа остова, спспуаствааця позаплатовиа впозаочопча ппопосссч беасоусаЄс баси чалжосточосст спосо о псааочстловосв са стлогсвя саопоувосттє басом спасе Зоаспосиов сані оосох паза плевов аосеспатяа попа звлапосаст сто тчапвет пеовтанпеатс паопоатосто вдапеазастто сети чека стооо пстпавоови пото оте осте пшчовгсоповр сера ся чЧаспопсосптад пеосітіповлав зодпососчо взапгооптотсоз сслазутадва обсте оту (5БЕО І МО: 308)
Кожний з МІ- і МН-сегментів ампліфікували за допомогою ПЛР із використанням пПСО16- пСО328 БАКТ як матриці. Для ланцюга 2 нуклеотидні послідовності, що містять Е-спіраль і
АВО, одержували з використанням димерного праймера, а потім субклонували біля С-кінця МН- ділянки ПСО16 шляхом гідролізу рестриктуючими ферментами і лігування. Обидва сайти клонували у вектор рСіпео (Рготеда, іпс.) у Мпе1І-Моїй-сайтах. Окремі плазміди, що мають відповідні експресійні кластери для ланцюга 1, гідролізованого в МОоМІМ-МНе|-сайтах, і ланцюга 2, гідролізованого у В5ІВІ-РітеІ-сайтах, клонували в одну плазміду для перенесення в клітини
СНО і одержували стабільні клітинні лінії.
Експресія й очищення білка: Для стабільної трансфекції клітини СНО-5 трансфікували плазмідною ДНК пСО16-НСО32В ЕК АВО-ОАКТ. Білок АВО-ОАКТ очищали за допомогою афінної хроматографії з використанням розчинного варіанта антигену ЕсСКІІВ, зв'язаного з СМВГг- активованою сефарозою 4В. Потім концентрований білок знову очищали за допомогою ексклюзійної хроматографії на Зирегадех 20ОНК 10/30.
ЕПІЗА-аналіз на зв'язування: Для СО-16-захоплення планшети сенсибілізували антигеном
ЕсРІІВ у концентрації 2 мкг/мл і залишали на ніч при 42С. Потім планшети блокували 0,5 95 пептону в РВ5-ЇТ. Очищені білки, розведені шляхом серійного дворазового розведення, зв'язувалися з планшетом протягом 1 години при кімнатній температурі. І нарешті, здійснювали детектування з використанням біотинільованого СОЗ3З2В (50 нг/мл), а потім ПХ-кон'югованого стрептавідину (1/1000, ВО-РПагт). ПХ-активність вимірювали шляхом додавання ТМВ, і планшет зчитували на планшет-рідері при 00 450 нм.
Для захоплення альбуміну людської сироватки (НБА), планшети сенсибілізували Н5А у концентрації 2 мкг/мл і залишали на ніч при 42С. Після цього, ті ж самі процедури були проведені для ЕГІЗА-аналізу з подвійною афінністю.
Зо Аналіз на АЮСС, опосередковувану мононуклеарними клітинами периферичної крові:
Цитотоксичність вимірювали за допомогою аналізу на вивільнення І ОН. Мононуклеарні клітини периферичної крові (МКПК) виділяли з цільної людської крові (Гопла УмМаїКегеміМе, пс,
Сайпегериго, МО) шляхом центрифугування в градієнті щільності фікола-гіпака (Атег5пат
Віозсіепсе5, Різсаїамау, МУ) відповідно до інструкцій виробників. 2х107 клітин-мішеней висівали 35 в кожну ямку круглодонного 96-ямкового планшета для культивування тканини. До клітин, що міститься в планшеті, додавали 1-4-кратні серійні розведення різних молекул ЮСАКТ або молекул антитіла. Після цього, у ті ж самі ямки додавали бх105 МКПК. Потім планшет інкубували в інкубаторі при 37 "С у 595 СО». Після цього, планшет центрифугували при 1200 об/хв. протягом 5 хвилин, і 50 мкл супернатанта переносили в плоскодонний ЕЇГ ІЗзА-планшет. У 40 кожну ямку додавали 50 мкл розчину субстрату ІОН (Рготеда), і планшет інкубували протягом хвилин у темряві при кімнатній температурі. Потім у кожну ямку додавали 50 мкл блокуючого розчину, і планшет зчитували при 490 нм протягом однієї години. Відсоток цитотоксичності для кожної ямки обчислювали виходячи з оптичної густини (00) по формулі: (Проба - АІСС)/Клітини-мішені, максимальний вихід - Клітини-мішені, спонтанний вихід)х100, де АЇСС являє собою антитіло-незалежну клітинну цитотоксичність. Криву «-відповідь" будували за допомогою програми Ргізт.
Фармакокінетичне дослідження: Мишам С57В81/6 вводили одну внутрішньовенну ін'єкцію пСр16-пс0328 бБАКТ у дозі 5 мг/кг. Мишачу сироватку брали перед уведенням дози, через 2 хвилини, 30 хвилин і через 1, 3, 6, 24 і 72 год. Потім оцінювали концентрацію НСО16-пНСО32В рАКТ у сироватці. Фармакокінетичні аналізи НСО16-пСО328 АКТ здійснювали за допомогою пакета програм для фармакокінетичних досліджень М/пМопіїп Ргоїезвіопа! 5.1 (РНагзідні
Согрогайоп, ОБА). Параметри визначали за допомогою не камерного аналізу (МСА). Не камерний аналіз оснований на моделі (Моде! 201), що вимагає внутрішньовенної ін'єкції лікарського засобу. Для обчислення параметрів застосовували лінійний трапецеїдальний метод.
Результати
Дослідження експресії і зв'язування за допомогою ЕГІ5БА: пСО16-пСО0328 АВО-ПАВТ ефективно експресувався при концентрації 6,5 мг/літр у клітинах ссавців СНО-5. Активність зв'язування очищеного білеа АВО-САКТ з відповідними антигенами оцінювали за допомогою
ЕІЗА. Результати показали, що пСО16-НСО32В АВО-ОАКТ зв'язується з обома антигенами одночасно, тобто з СО16 і з СОЗ32В (фігура 46А). Профіль зв'язування збігався з профілем зв'язування контрольного білка НСО16-пСО32В БАКТ. Афінність зв'язування очищеного ПСО16- пСрз2в АВО-БАКТ з альбуміном людської сироватки (НЗА) також була продемонстрована за допомогою ЕГІЗА (фігура 468). Отриманий результат указував на сильне зв'язування гібрида
АВО-ОАКТ з НФЗА, тоді як зв'язування з контрольним НСО16-пСОЗ32В БАКТ не спостерігалося.
Для того, щоб продемонструвати, що молекула АВО-САКТ здатна одночасно зв'язуватися з
СсО328, СО16А їі НЗА, на поверхню з іммобілізованим НЗА упорскували АВО-БАКТ, а потім упорскували 200 нМ СОЗ328В їі 200 нМ СО16А (РЕ158) (фігура 46С, суцільна лінія). У контрольному експерименті (фігура 46С, пунктирна лінія) антигени заміняли буфером. Результати показали, що молекула АВО-ВОАКТ має здатність одночасно зв'язуватися з СОЗ32В, СО16А і НА.
Ко) Було виявлено, що пСО16-нСО328 АВО-САКТ і його АВО-гібридне похідне мають еквівалентну здатність зв'язуватися з розчинним СОЗ32В (500328) і з розчинним СО16А (158БЕ) (5СО16А); САВТ можуть бути легко ідентифіковані по здатності гібрида АВО-БАКТ зв'язуватися з альбуміном людської сироватки (НЗА); (фігури 460-461). ПАКТ інкубували на СО16А-покритих планшетах, і зв'язування детектували з використанням біотинільованого 5С032В у присутності або під час відсутності З мг/мл НЗА (блокування здійснювали з використанням 0,5 95 пептону в
РВ5-Т). Було виявлено, що гібрид АВО-БСАКТ зберігав свою здатність до біспецифічного зв'язування з батьківським ЮАКТ і був здатний зв'язуватися з 5СО16А і СО32В, і на це зв'язування не впливала присутність альбуміну людської сироватки (фігура 46).
Іп міго цитотоксичність АВО-ОАКТ: Для того, щоб продемонструвати одночасне зв'язування такого біспецифічного АВО-ЮСАКТ із двома антигенами, тобто, з одним антигеном на ефекторних клітинах і з одним антигеном на клітинах-мішенях, був проведений аналіз на їх перенацілений кілінг. У присутності людських МКПК, використовуваних як ефекторні клітини, пСр16-нСрз2в АВО-бАКТ індукував сильну дозозалежну цитотоксичність СОЗ2В-позитивних В- клітинних ліній Дауді (фігура 47А). Отриманий результат показав, що активність АВО-ОАВТ була еквівалентна активності батьківського ОАКТ. СО16хСО328 БАКТ може зв'язуватися з
СО016В-експресуючими ефекторними клітинами і може здійснювати рекрутинг таких клітин для знищення (шляхом перенаціленого кілінгу) клітин, що експресують СОЗ32В. Таким чином, було виявлено, що СО16хСО32В БАКТ має здатність ефективно знищувати клітини Каїї (фігура 478).
Фармакокінетичні властивості АВО-БАКТ: Фармакокінетичні властивості пСО16-НСОЗ2В
АВО-ОАКТ аналізували за допомогою ЕГІБА проб сироватки після введення і.м. однієї дози мишам С57В1/6 (фігура 48). Обидва біли АКТ і АВО-ОАКТ виводилися з кровотоку в дві фази. Фармакокінетичні дослідження АВО-БАКТ указували на більш тривале знаходження цієї молекули в кровотоці, тобто, її кінцевий час напівжиття становив 35,1 години, тоді як час напівжиття стандартного ЮАКТ становив 1,2 години (фігура 48, таблиця 17). Поліпшення фармакокінетичних властивостей було також продемонстроване шляхом порівняння площі під кривої (АОС). У випадку конструкції АВО-ВАКТ, АОС майже в 30 разів перевищувала АОС для
АВО-гібрида (таблиця 17).
Таблиця 17 11111111 АВО-ОАНТ | бАВТССС
Біологічна активність АВО-СОАКТ іп мімох Для того, щоб продемонструвати, що пСО16- пСорз2в АВО-БАКТ зберігав біологічну активність іп мімо, ТадтСО16-/-пСр16А-328-)-мишам була введена одна доза АВО-ОАКТ або батьківського САКТ, а потім був проведений моніторинг зміни концентрацій В-клітин, Т-клітин і РМ-клітин. Результати показали, що ОАКТ мали здатність знижувати концентрації В-клітин (фігура 49А), і отримані дані були інтерпретовані як доказ того, що спрямований перенацілений кілінг В-клітин досягався іп мімо ще до видалення
БАКТ із кровотоку в мишей. Концентрації Т-клітин (фігура 498) і ПМ-клітин (фігура 49С) не знижувалися з використанням САКТ, що підтверджувало специфічність ОАКТ.
У цілому, конструювання і продукування альбумін-зв'язувального домену, приєднаного до білка САКТ (що позначається АВО-ОАКТ), пройшло успішно. Було виявлено, що пСО16- пСрзагв АВО-БАКТ зберігав специфічність до двох розпізнаваних антигенних детермінантів: сОр16 ії СО328. Було виявлено, що АВО-ОАКТ зв'язується з альбуміном людської сироватки з високою афінністю. АВО-гібрид не виявляв зниження біологічної активності (тобто, активності
АКТ відносно перенаціленого знищення пухлинних клітин). Приєднання молекули САКТ до
АВО приводило до значного збільшення часу напівжиття іп мімо, і така ціль була досягнута без істотного збільшення розміру молекули. Здатність ЮАКТ зберігати невеликий розмір є важливою і переважною властивістю, оскільки це дозволяє молекулі ПОАКТ дифундувати в пухлинні тканини. 6.19. САКТ, зв'язані з Нег2/В-клітинним рецептором
Було сконструйовано діатіло ІЦФСАКТ, що містить варіабельні ділянки, здатні зв'язуватися з
Негг/пеши і з Т-клітинним рецептором ("ТС").
Як обговорювалося вище, ТСК, по своїй природі, експресується СО4:- або СО8:-Т- клітинами, що дозволяє цим клітинам розпізнавати антигенні пептиди, що зв'язуються і презентуються більюьами МНС класу І або класу ІІ антигенпрезентуючих клітин. Розпізнавання комплексу РрРМНОС (пептид-МНОС) ТСК ініціює поширення клітинної імунної відповіді, що приводить до продукування цитокінів і до лізису антигенпрезентуючих клітин. Оскільки
НЕК2г/пеи, як важливий член сімейства ЕгрВ, відіграє певну роль у розвитку деяких людських
Зо карцином і в еволюції ссавців, то він був підданий ретельному дослідженню. (Нупе5 5 Зегп (1994) Віоспіт. єї Віорпувз. Асіа 1198:165-184; і Боцдаї! еї а. (1994) Опсодепе 9:2109-2123; І ве єї а!. (1995) Маїшге 378:394-398). Людський ген НЕК2/пеи і білок НЕК2/пеи описані в Зетрва еї а). (1985) Ргос. Маї). Асад. 5сі. (0О.5.А.) 82:6497-6501 і Мататоїйо еї аї. (1986) Майшге 319:230-234, а їхні послідовності є в базі даних СсепВапк під реєстраційним номером ХО3363. НЕК2/пеи містить чотири домени: позаклітинний домни, з яким зв'язується ліганд; ліпофільний трансмембранний домен; консервативний внутрішньоклітинний тирозинкіназний домен; і карбокси-кінцевий сигнальний домен, що має декілька тирозинових залишків, які можуть бути фосфориловані. (Ріомтап сеї аї. (1993) Ргос. Маї!. Асад. 5сі. (0.5.А.) 90:1746-1750). Послідовність позаклітинного домену НЕК2/пеи (ЕСО) описана Ргапкіїп еї аї. (2004) Сапсег Сеїї. 5(4):317-328, і є в базі даних білків (Ргоївіп багаВапк) під реєстр. Мо 1578 (2004).
НЕК2/пеи функціонує як рецептор фактора росту і, у більшості випадків, експресується пухлинами, такими як рак молочної залози, товстої кишки, сечового міхура, яєчника і легень.
НЕК2/пеи надекспресується в 25-30 95 випадків раку молочної залози і яєчника в людини, і асоціюється зі швидким прогресуванням і з поганим прогнозом захворювання в цих пацієнтів. (батоп еї а). (1987) Зсієпсе 235:177-182; біатоп сеї а). (1989) Зсіепсе 244:707-712).
Надекспресія НЕКг/пеи також спостерігалася й в інших карциномах, включаючи карциному шлунка, ендометрія, слинних залоз, легень, нирок, товстої кишки, щитовидної залози, підшлункової залози і сечового міхура. (Див., наприклад, Кіпод еї аїЇ. (1985) Зсіеєпсе 229:974;
МссСаптп евї а!. (1990) Сапсег 65:88-92; Мопетига евї а!. (1991) Сапсег Везєагсі 51:1034).
Був отриманий ряд моноклональних антитіл і низькомолекулярних тирозинкіназних інгібіторів, націлених на НЕК-1 або НЕКг/пеи, включаючи, зокрема, гуманізований варіант мишачого моноклонального антитіла, відомого як 405 (НЕКСЕРТІМЕ),, Сепепіесп, Іпс.), що розпізнає позаклітинний епітоп (амінокислоти 529-627) у багатому цистеїном домені І
НЕК2/пеи, розташованому дуже близько від трансмембранної ділянки білка. Дослідження показали, що у випадку НЕК2/пеи-надекспресуючих ракових клітин молочної залози, лікування антитілами, специфічними до НЕК2г/пеи у комбінації з хіміотерапевтичними засобами (наприклад, з цисплатином, доксорубіцином, таксолом), дає більш високий цитотоксичний відповідь, ніж лікування з застосуванням тільки однієї хіміотерапії (Напсоск еї аї. (1991) Сапсег
Вез. 51:4575-4580; Апеада єї аїЇ. (1994) Сапсег 54:3758-3765; Рівїга5 еї аІ. (1994) Опсодепе 9:1829-1838). Одним з можливих механізмів, за допомогою яких анти-НЕК2/пеи антитіла можуть підсилювати відповідь на хіміотерапевтичні агенти, є модуляція експресії білка НЕК2/пеи або запобігання репарації ДНК. (Запсоубхкі еї аї. (1991) Ргос. Маї). Асай. 5сі. (0Ш.5.А.) 88:8691-8695;
Васиз єї аї. (1992) СеїЇ Стоулп 4 рій. 3:401-411; Васиз єї аі. (1993) Сапсег Рез. 53:5251-5261;
Кіаррег єї аї. (1997) Опсодепе 14:2099-2109; Кіаррег єї аї. (2000) Сапсег Невз. 60:3384-3388;
Апеєада еї а!. (2001) У Сіїіпіса! Опсоіоду 19(185):325-405). Хоча в деяких випадках анти-НЕНг/пеи антитіла, такі як НЕКСЕРТІМФ, дають терапевтичний ефект при лікуванні пацієнтів, однак, більшість пацієнтів з раком молочної залози й інших пухлин не піддаються лікуванню такими антитілами. Ці відповіді, почасти, указують на розходження рівнів надекспресії НЕК2/пеий раковими клітинами пацієнтів.
Оскільки ОАКТ містить варіабельні ділянки, здатні зв'язуватися з Негг/пеи і з Т-клітинним рецептором ("ТОК"), то він має здатність зв'язуватися з НЕК2-експресуючими клітинами, і тим самим приєднувати до цих клітин домен, здатний зв'язуватися з Т-клітинним рецептором. Якщо такі Т-клітини зв'язуються з цим доменом, то вони ініціюють імунну відповідь, що приводить до знищення НЕК2-експресуючих клітин.
Амінокислотні послідовності і послідовності нуклеїнової кислоти для такого АКТ представлені нижче, де послідовності МІ і МН вказані звичайним шрифтом, МІ -МН-лінкери підкреслені, а послідовність, яка кодує С-кінцевий мотив гетеродимеризації (ЗЕ ІЮ МО: 313:
СЕМЕАСЕС або 5ЕО ІО МО: 314: СМЕРКЗС), показана жирним шрифтом і курсивом.
Амінокислотна послідовність ТСЕМІ-НЕК2УН (ЗЕО ІЮ МО: 315)
ЕТУПТОБРАТ ББББРОВКАТ ГЗСБАТОБУЄЮ УМПКИХОСКРО КАРИ ЗККАВОУРАВ
КБсзсовоТВвЕ ТтОтТІБОГОРЕ ПЕКАТУСОСТ БОМРІТЕСсСЬ ТКЕБІКОЇїЗсСО (ЗсесОУСТОС
ООВЕЕБУКРЗА БІКІТБСТАБО ЕМІКОТУІНК УКОВБРЕОСІЮЕ МІОБІТЕТМО УТІК КОг
КАТІТАБТЗВ МТАхІУОВЬ ТІЕОТАМУУС БЕЩОСОСЕчА МОЖНА ВУ ТУБОСЕМНОСВЕ с
ТЄРМІ-НЕК2МН--кодуюча послідовність нуклеїнової кислоти (ЗЕСІВ МО: 310) чавасссоє суасасачіс бссачессасс сс саї стссаузлуча аачачесасс стссссгсса чгдссасстс зазчсусзаче тасасусєвсу зосассачса савассовоуя ваасоссостїв вЧчсускозчат стасчасаса посавастчч стЕстЧчУуччє сссассаавчу
Есасесоеса усучагстісчо засачавт її ассесссасада гсаусазчосо зчсачсстсаа частстгссав сгтастаста ссачсачсссо азпбавусвасс сттсасУєе сслссачосау вссаввачсссч зуарсвзавтє всепестевсос засачеттач дссвоеса зстссвусву поесбзссассач зусссассава сссачдоцасс тсасссвасу бабессаїаво азсстоссоує жжсавдсаєта звдасасста бакасасточ Чтдавзсвааава здасебуавса Чдадесстдова гзЧагсосаз ччаветатсс о тасуваєсооасє тасасьзуає ассвссесчай чер есачевес звоччссаста гзасачсачая сасвтссссс засасвуєссть асскачасвчує саспсеоЧчесса асатстсазча асастчссЯяї сптастатсоє стачабоса сасусуасоад ссбссасасї вкчусастасєс чзчуучксаасост вчсстсустос восстрчачої соддаєссваа сачоодчачед ас
Амінокислотна послідовність НЕКФМІ-ТСКУН (ЗЕ МО: 317)
СІУМТОБНКЕ М5Т5УБОВУБ ІТСКАБОБУМ ТАУАМУСОКе ОВеЕКОІхО АБКЕХТОУвО
БЕТОВЗВБЗСТО ЕТЕТІББУСА ЕОБАУХУСОЮ НЕТТВРТІКОЮ СТКУБІКОСЯ псОСООУОБУ
ОБЗАБУККРО АБУКУВСКАВ ОСХКЕТВУУМВ ЖУКОАрРОСЯСІ ВМІОУТМРУМ рУТКУМЕКЖиК
СОВУТІТАбКВ ТЕТАУМЕСОВ БЕБЕОТАУНІ САОБУХОУО ОКУТИСОСТЬ УТУБОСУЕРК
С
НЕВ2М -ТОВУН-Кодуюча послідовність нуклеїнової кислоти (ЗЕ Ю МО: 318) часаїсчЕчЧча гуасссачіс ссасазчєвс агціссасст січтісдусда пасочгсавуєс ассасстчса атчоссатесва счасзусуавт астостує во сстчуївіса зсзазазвсса спчасаєтстс ссазастост сатттастсс ссатостксс Чогасастач астссостдах счсттсастоа ссазчсачаєс сосцасазак бссастесса ссассвасас Сосросачосе свацчассьяч сачібагта срогсвосва сабєдівста сасстсссас сЕбсупасоч счутассвачч тоадчасатсаяаа вчспавччссуа Бесозуечоасоа Чачассасу бсадегчстт сапзссбудчаУ стааоассза зазчсстосдоа осссбсачєуа ачубсоссто сазоуссвус чу асазуУє стассацчсеба счгзаїсбцевс сс следвс ауцсессстчє асвауласье часта сч сдасасагтла вессттвсаве дасоєтасга вУугзсавтча зва свав счсачачьса счаттассзчс счасаавосс асчачесвсас сстасасоча сстосзвосаче січачасссу адчасасоЯос счусчсастас сотодсочвазач зучЧачстаста сдЧастасзас часа вастддсозсса вачоуасісва сесасечсчЧа чдсгссодЧауе бЄдадессаав гсСегах
У переважному варіанті винаходу такі конструкції були модифіковані так, щоб вони містили
Е-спіральний або К-спіральний домен, що полегшує утворення гетеродимерів (тобто, димерів
ТОВМІ-НЕК2УМНХ НЕК2МІ-ТОВМН). Амінокислотні послідовності і послідовності нуклеїнової кислоти для таких ЮОАКТ представлені нижче, де послідовності МІ ї МН вказані звичайним шрифтом, МІ -МН-лінкери підкреслені, а послідовність, яка кодує Субз-вмісний лінкер для димеризації (50500500; залишки 2-7 5ЕБО ІЮО МО: 267), показана курсивом. Е-спіраль К- спірального домену гетеродимеризації підкреслена подвійною лінією (переважна "Е-спіральна" послідовність являє собою 4 гептамерних повтори ЕМААГЕК; ЗЕО ІЮО МО: 299; а переважна "К- спіральна" послідовність являє собою 4 гептамерних повтори КМААЇКЕ (5ЕБО ІЮ МО: 300).
Послідовність, що йде за Е-спіраллю або К-спіраллю, не має точно визначеної функції.
Амінокислотна послідовність ТЄСВКМ-НЕКОМН- Е-страль (ЕС ОО МО: 319)
БІУБТОШПРАТ ГЗІОЗРОВКАТ БОСОАТОЗУЄ УМНЯХООКРО КАРКВМІУОТ ОКІАВОУРвОВ кваВБсБОатТЕЕ ТОЬТІББТОРЕ ОКАТХХСОСТ 5МРЬОТЕСОС ТКІЕІКСЗОЄ БОСООМОГТОЮ
ЗОРЕ УКРЗА БІКИЦБСТАВО ЕМІВОТЖІНе УКОВРЕС СЕ МІСТУ РТМО ТЕБЕ
КАТІТАОІТВБ МТАУКОМБВЕ ЖБЕОТАУТУС БАКОЗОСКТА МОуУЖСсОоСсЬВУ Туввсосесо
ЕУВвАшЕКВУД АЦЕКЕУВАВЕ КЕУВАЦЕКОСЮ ОМ
Послідовність нуклеїнової кислоти. яка кодує
ТеВМІ-НЕК2УН-Е-спираль(5ЕО Ю МО: 320) чЧааатссатоаї їуасасастсосссауссасс са сгтує стссвосзоауа засачсисасе сЕсСвсстоаса чкоссасстс авугатавуї тасатозсаст осотассазсв чдаваассачоо апацесесста адсоустасає севтдасасяа бссавассЗу стістаоззує сесаєсавод шЕСсСасезуса абззасссоо сасвачаавке астессасава гсасдсаздссі чсачссгдай чаккктосав сттахстсасса сацсвастда ацівчсавсс о састсасаз: садЧдссазчува ассавусЕсоа зоазісавачо адусучавсс состчсаову соссаззїсса устосвоасаєч
Сссовсадссзу аасісстозаа сссаччозсс бсасссзачу бТесгсосгобас аЧчсссогадс
ЕЕскасаєса вачасасста сабасастоао чЕзавасвча чассісавса ууосстоачаа тсчасїсзаз зчаєстассс стасазавліочу їаїтастззаї абуассссаа зетссадчас авосссаста їайсасасаза сасаєссгос дасасачест ассгосазує саосседссба атасссзваЧч асастассої стаеавтах:саї їстздасцуцч свадоссчасчч спістасдесе акзсзчастаст зуузассаасо ачостоссоїс ассопсауск ссосадсасо боууссучлсада авочачоався сяусссвода Зазачасос здоаасесю
Амінокислотна послідовність НЕВ2МІ-ТСВУН- К-спіраль (ЗЕО1О МО: 321)
ОІУМТОШНЕЕ МОТБУСОВУВ ІТСКАБОПУМ ТАМАМУСООКЕ СНЕРКТБІїШ АБЕВУТОУРО
КЕТОВИБСРВ ЕТЕТІВББУСА БОКАМуХСОЮ НУСТВеУКОов ОЖКУВІКссЬ ББоБсСОУдКУ
ОББАБУККРО АВУКУВСКАВ СКЕТОУУМН хУКОАРООСІ ЕМІСЖІТМРУМ ПУТКЕІМКЕКЕК
ОБУТІТАНВКО ТЗТАХМЕБЗО БЕБЗКЕІТАМУМНУ САБО свУїЖОСОСТІ УТУВООСИОСО
СКУААЦКВКУ ААСКЕКУААС КЕКУААЦКВИЗ сно
Послідовність нуклеїнової кислоти , яка кодує
НЕВ2МІ-ТЕВУН-К-спираль (БЕО 10 МО: 322) часаїсуєса счасссауїс ссасваауєтсе абуєссасстї сезсуосоасса гаузсі сао збсассізса аччссаусса дсасзгузає асгусбобас сосгучьасса зсвдавасса пчасашЕсвс о ссааастост зЧчавЕвастсс ссавсетктсос чагвсаєстзеа азгесотаде счсттсаско дсачсадатс ісласачає сссаствсся ссазсазчсвч ТоБосвучох чаавчасстсз сачестаїтта стоагсвоусвна савітатаста свсстспссас сіпссувоча чУусассаасоа Сучазатсва асзадцоасуча Єссосссосея дасуссачаЄ Есвястусва сечісізЗззаз сіуаззіаеа Зваеюссісеаво сш сезіча взасос савассшмеци часІвсавт ггавстсвзчска согсаечсас года сасаас вадсссстоо дсваадчуст чачісчаєса чатататва постітасзає чзаїтзгтаста аутасазеда зчаззгсава чЧасасачеіса сптаїбїассос дсасвнаавбсс асгуасцсасавє сстасагуса зсгоадсадео стчасатосоз адчасасчучус сстссастас бусзсдЧацаа ччачстаста сзасбтбассас зччачихКУ астозуучусса всосастсба зсассоеча чстососдасоа агави вайлаавазо БедсачесеВ Яниаауадаас сосоздааєс сх
Молекули БАКТ, що мають домени, які зв'язуються з Нега2 і Т-клітинним рецептором (ТОК), тестували на їхню здатність опосередковувати цитотоксичність у багатьох клітинних лініях раку молочної залози, товстої кишки і сечового міхура, що були попередньо охарактеризовані як клітинні лінії з низькими рівнями експресії НЕК2 (а тому не піддавалися лікуванню анти-
Негг/пеи антитілом, Негсеріїп?т)). Тестованими клітинними лініями раку молочної залози є 2К75- 1 (НЕВ2 2-5) (фігура 50А), МСЕ-7 (НЕВ2 1-5) (фігура 508) і МОА-МВ4А68 (НЕВ2-ме) (фігура 50С).
Тестованими клітинними лініями раку, що не є раком молочної залози, були НТ-29 (клітинна лінія раку товстої кишки) (фігура 5003) і 5М/У780 (клітинна лінія раку сечового міхура) (фігура 5ОЕ). Як показано на фіг. 49А-Е, такі молекули ЮАКТ по суті є більш ефективними, ніж
НЕКСЕРТІМФЕ,, відносно опосередкування цитотоксичності пухлинних клітинних ліній у концентраціях, необхідних для досягнення еквівалентної цитотоксичності і максимальних рівнів цитотоксичності, яка спостерігається. 6.20. Іп міго приєднання САКТ до АВО за допомогою Е- і К-спіралей
Як обговорювалося вище, молекули АКТ відповідно до винаходу можуть бути сконструйовані так, щоб вони мали здатність біспецифічно зв'язуватися з рецептором МКСО20 і афінністю до гаптену, флуоресцеїну, і тим самим могли служити як універсальні адаптери, і мали здатність зв'язувати рецептор МКОС2О з молекулами, взаємодіючими з партнерами по зв'язуванню, кон'югованими з флуоресцеїном. Для додаткової ілюстрації застосування АВО, рАКТ конструювали з використанням поліпептидних ланцюгів: (1) КУК2МІ -4420унН-ССЕМАСЕС (5ЕО ОО МО: 313) - Е-спіраль: Цей поліпептид конструювали з використанням Мі-домену вищеописаного антитіла КУК 2.0 (Куопо, КМУ еї аї. (2008) "Сепегайоп, Айніппу Маїшгайоп, Апа СНагасієгігайоп ОЇ А Нитап Апіі-Нитап МКИа2О Мопосіопаї!
Апіроду МУйп Оца!/ Апіадопібїс Апа Адопівіїс Асіїмпу" У. Мої. Віої. 384:1143-1156; і
РСТ/О509/54911) і МнН-домену вищеописаного МАБ проти флуоресцеїну, 4420. (2) 4420МІ-КУК2МН-ОМЕРКЗС (5БО 10 МО: 314). Цей поліпептид конструювали з використанням Мі -домену вищеописаного МАБ проти флуоресцеїну, 4420, і МН-домену антитіла
КУК 2.0. "Е-спіраль" означає Е-спіральну амінокислотну послідовність 4 гептамерних повторів
ЕМААЇГ ЕК; ЗЕО І МО: 299.
Поліпептиди КУК2МІ -4420УН-СЕМАСЕС (5ЕО ІО МО: 313) - Е-спіраль і 4420МІ-КУК2гУН-
СМЕРКЗС (5ЕО ІЮ МО: 314) переносили в клітини СНО для експресії ПАКТ, позначеного "КУК2 4420 МЕ Е-спіраль". Очищення цих молекул проілюстровані на фігурах 91А і 518. Афінність
АКТ "КУК2 4420 МЕ Е-спіраль" визначали шляхом детектування здатності МКО20О Ес 012210 зв'язувати ЮАКТ з іммобілізованим антигеном ФІТЦ. Отримані результати експерименту продемонстрували, що САКТ має здатність зв'язуватися з обома молекулами (фігура 52).
Крім того, був отриманий гібрид "К-спіраль-сЯ4сиИМе (5ЕО ІЮ МО: 301)-АВО", де "К-спіраль" означає К-спіральну амінокислотну послідовність 4 гептамерних повторів КМААЇ КЕ (5ЕО ІЮ МО:
Зо 300). На фігурі 53 проілюстрована рестрикційна карта плазміди рРАГ-7 і конструювання плазміди рРАЇ7 К-сої АВО, що експресує гібрид "К-спіраль-АВО", з використанням мітки РКОРІМІТУ
ЕХАСТ"М (Віо-Вай, Негсцієзх, СА) для полегшення очищення. Вектор рРАЇ7 К-сої АВО переносили в клітини ВІ 210ЕЗ Е. соїї. Експресію міченого гібрида "К-спіраль-АВО" індукували шляхом додавання 2 мМ ІРТО протягом 4 годин. Експресію білка підтверджували за допомогою електрофорезу в ДСН-ПААГ і вестерн-блот-аналіза. Коротко, система конструювання гібридної мітки РКОРІМІТМ ЕХАСТ"М включає опосередкування лізису клітин, зв'язування білків, що вивільняються, з афінною колонкою, яка містить іммобілізовану субтилізин-протеазу, промивання колонки для елюювання незв'язаних білків, додавання фторид-вмісного елююючого буфера з метою ініціації активності субтилізину для швидкого і точного відщеплення мітки від злитого білка після відщеплення розпізнавальної послідовності, видалення неміченого білка з колонки після такого відщеплення шляхом промивання і діаліз елюйованого білка в РВ5. На фігурі 54 проілюстрований вестерн-блот-аналіз злитого білка "К-спіраль АВО", очищеного на смолі для очищення РЕОРІМІТМ ЕХАСТ"М (у лабораторному масштабі виходячи з 10 мл культури).
Білок "К-спіраль-АЕО", отриманий на смолі для очищення РКОРІМІТУ ЕХАСТ М, додатково очищали за допомогою електрофорезу в ДСН-ПААГ (фігура 55). З 250 мл культури Е. сої одержували 6,523 мг очищеного білка (таблиця 18).
Таблиця 18 716 77777777 17 РО | 042 | 6 | 206...ЩЦГЦЩ ннин"?":6ЩФишШНшІТнНнннинниншнн шини ши хни рАВТ КУКа2 4420 МЕ-Е-спіраль і білок "К-спіраль-АВО" інкубували в РВЗ протягом 30 хвилин при кімнатній температурі й одержували ЮАКТ "Е-спіраль-К-спіраль АВО" з поліпшеними властивостями. Результати ЕГІЗА-аналізу показали, що всі домени в цьому комплексі здатні зв'язуватися з їх відповідними лігандами (фігури 56А-56С). При бажанні, додаткове очищення комплексу КУК2 4420 МЕ-Е-спіраль і К-АВО може бути проведене на колонці з анти-ЕК антитілом.
Оскільки утворення комплексу не залежить від конкретних зв'язувальних доменів САКТ, то вищевказаний спосіб може бути застосований для одержання САКТ "Е-спіраль-К-спіраль АВО", що мають інші специфічності зв'язування (наприклад, за допомогою утворення комплексу анти-
СО328 (наприклад, антитіла 286)/"анти-СО16А (наприклад, антитіла 3058) МЕ-Е-ОАКТ з гібридом "К-спіраль АВО").
Таким чином, як показано вище, в одному з варіантів винаходу обидва поліпептиди САКТ, що містять антигензв'язувальний домен, можуть включати додаткову послідовність, що служить для ініціації утворення гетеродимера (наприклад, К-спіралі або Е-спіралі), і необов'язково один з таких поліпептидів може містити поліпептидну частину білка, що зв'язується із сироваткою, здатну зв'язуватися із сироватковим білком (наприклад, фігура 45). В альтернативному варіанті винаходу один, а переважно тільки один поліпептид САКТ, що містить антигензв'язувальний домен, може включати таку додаткову послідовність для ініціації утворення гетеродимера (наприклад, або К-спіралі, або Е-спіралі), і вказаний ОАКТ може включати комплекс з іншим (наприклад, третім) поліпептидом, що не містить антигензв'язувального сайту, але містить поліпептид, що має комплементуючу послідовність для запуску утворення гетеродимера (наприклад, К-спіралі, де поліпептид САКТ, що містить антигензв'язувальний домен, включає Е- спіраль; або Е-спіралі, де поліпептид САКТ, що містить антигензв'язувальний домен, включає К- спіраль) і необов'язково поліпептидну частину білка, що зв'язується із сироваткою, здатну зв'язуватися із сироватковим білком. Поліпептидна частина вказаного додаткового (наприклад, третього) поліпептиду такого білка, що зв'язується із сироваткою, може бути локалізована або біля М-кінця, або біля С-кінця відносно поліпептиду, що має таку комплементуючу послідовність. 6.21. Деімунізація альбумін-зв'язувального домену
Як обговорювалося вище, молекули АКТ відповідно до винаходу можуть бути сконструйовані так, щоб вони містили альбумін-зв'язувальний домен (АВО), такий як АВО, що походить від стрептококового С-білка, а більш переважно, альбумін-зв'язувальний домен З (АВОЗ) с-білка стрептококового штаму 5148.
Зо Для зниження імуногенності АВО були введені амінокислотні модифікації в положення залишків 60-79 амінокислотної послідовності АВОЗ: (ЗЕО ІЮ МО: 304):
ІГАЕГАКМІ АМА ЕГОКУСсУЗОУ МУКМСММАКТ МЕСУКАПОЕ І ААЇ Р 41 50 бо 70 80 86 і був оцінений вплив таких модифікацій на зв'язування з НЗА (таблиця 19).
УПА
Ум Ул хв
ЛШ ян
АЕН ЕН
ФУ
! ше 0.26 кер
ЗА воли ВИ їо4Уу о. кас І 0.35 т9М 0.6 потст ВЕ вл и кт пи ам ри і65У 1 Ус ІВ УК Е сі нн ши
ІТ 0.6 УТО од
Для додаткового поліпшення властивостей АВО може виявитися бажаним зменшення або придушення зв'язування з МНС класу ІІ. Пептиди, які походять від Уб0 і 61, мають загальний залишок у "кишені" у положенні Мб6б (Рб/Р7), а 1 64 і І65 мають загальний залишок у "кишені"
Рб/Р7 у положенні 770. Тому було висловлене припущення, що заміна Мбб на О або Е у комбінації з заміною Т70О0 буде ефективно придушувати зв'язування з МНС класу ЇЇ.
Альтернативно, було висловлене припущення, що зв'язування з МНС класу ЇЇ може інгібуватися за допомогою мутації в чотирьох якорях рі Уб0, Уб61, 164 і Іб65. Відповідно до цього було проведено два раунди мутаційного аналізу. У таблиці 20 представлені результати першого раунду мутаційного аналізу.
таблиця 20
В 7 фрмавізні Високоафіннь ої) ролия дпіни Зв'язування
Якір ві пе ліганди чле ня Середня онінка з НА» « 10 0.6176
РІ ОА І) 0 т
РІ тео о 0 ше
РІ 60 ня
Убо РІ 605 Ж
РІ ос (- в7 Меобр 2 05591 вини
Р7 МОБ 3 05967 в
Р7 Моб 4 - 12 06577
РІ ХО1А 0 0 нин
РІ 01Н 0 0 пиши
РІ Уві я хе РІ х615 я
РІ 7010 нки
Ро Ме 4 0.6120 ВЕК
Ро МОбЕ 3 0.5940 плей
Ро МобЗ 0 - Ів 0.606067
РІ ОЗА НІ) 0 щи
РІ 64Т плини ї64 РІ Голо я
РІ То ВЕК р? 1700 5 05905 (-)
Р7 705 4 - 20 06235
РІ 165А І) 0 ки
РІ165Т ва 165 РІ 1655 т
РІ 1650 ни 7700 0 0 - 7705 3 щи - 8 061430 вв(07- 103-04-03, В - 0-0,
Отримані результати показали, що мутація М71 » А якоря рі являє собою найбільш ефективний варіант, але може також розглядатися комбінація (1-3) або комбінація (2-3). Усі протестовані комбінації є ефективними, за винятком 1700 і 600.
Результати другого раунду мутаційного аналізу представлені в таблиці 21 і в таблиці 22.
Таблиця 21
У61А/М665/1705 нини нини
Таблиця 22
Результат
Зв'язування з НБА 665/705 61А/665 705 ню
У таблиці 23 приводяться систематизовані результати, отримані в двох раундах мутаційного аналізу.
Амінакнслотні пед І що Амінокислатні дз алін аттади
Зв'язування з НЗА мутанії Зв'язування з НЗА"
АВІА
ПОМ Ас тА И у А АКА Я ес КОМ ві ДК 01А/6О й о0АЛІА/ЛЛА о. 61л/665 ОТ с ВАВ пт ет АЗАТА осуе5А 54066 бБАТА ОЇ 000000 7 бе с 65АБОУТА я
УБІАЛВВВТТОВ
МІНА звязувались МНС потирвох використовуваних класів: зі 007 10) Я отв бою
Виходячи з результатів комбінаторного мутаційного аналізу можна зробити висновок, що нижченаведені комбінації замін являють собою переважні заміни для утворення деїімунізованого альбумін-зв'язувального домену: 665/7055471А; 665/7055-79А; 64А/65А/71А665; 64А/65А/71А-660; 64А/65А/71А-66Е; 64А/65А/79А-665; 64А/65А/79А-660; 64А/65А/79-66Е.
Зірочка («7») означає положення 71 -» Р1 і положення 79 -» РО.
Як показано на фігурі 57, варіанти АВО, що мають модифікації І 64А, ІЄ5А і 079А або модифікації Меб65, 71705 і 079А:
ГАЄАКМІАМА ЕГОКМаУБОМ УКМАваАєММАКТ МЕСУКАПІА?»Е ІГААЇ Р (ЗЕО ІЮ МО: 323),
ГАЄАКМІАМА ЕГОКУСУБОМ УКМІ ІЗввМАКо?о МЕСМКАПІА?Е ІГААЇГР (ЗЕО ІО МО: 324), по суті, здатні зв'язуватися з молекулами дикого типу.
АВО-варіанти 61А/65А, 61А/66О, 64А/65А" і 64А/66О були оцінені разом з молекулами дикого типу на їхню здатність зв'язуватися з альбуміном. Результати таких аналізів представлені на фігурі 58. АВО-варіанти 6405/6600, 65А/660, 6665/7057 і 61А/665/705 були оцінені разом з молекулами дикого типу на їхню здатність зв'язуватися з альбуміном. Результати таких аналізів представлені на фігурі 59. На фігурі 60 представлені результати аналізів на зв'язування
АВО-варіантів УбОА/Уб1А, УбОТ/У61А, Іб5А/М66ОЛ//1А, Мб1А/ЛбБ5АЛ//1А, І64А/М66О/Л/ЛА і молекул дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 304) з альбуміном. На фігурі 61 представлені результати аналізів на зв'язування АВО-варіантів УбОА/У61АЛ/ТА, УбОТ/и61А/Л/71А, І 64А/65АЛ/ЛА і молекул дикого типу з альбуміном. На фігурі 62 представлені результати аналізів на зв'язування
АВО-варіантів І640Б/65А/Л/71А, 1640/М66О/Л/71А, МУб1А/1705, М665, 7705, Уб1А/М665,
І 64А/65А і молекул дикого типу з альбуміном. 6.22. Підтвердження деїімунізації альбумін-зв'язувального домену
АВО-варіанти, включаючи, зокрема, варіанти в положенні М71 (наприклад, М71А), мали знижену імуногенність. Для ілюстрації такої деїімунізації три зразки пептиду оцінювали на імуногенний потенціал протягом визначеного періоду часу за допомогою Т-клітинних аналізів
ЕрізЗсгееп'"мМм залежно від часу. Оцінені зразки являли собою 21-вимірні фрагменти (У60-Е80)
АВО-пептиду дикого типу (5ЕО ІЮ МО: 304):
БАБАКУБАМВ БІркКусУуВОХ УКМІММАКТ УБОСУКАБІВЕ 41 5 во 79 чо
АВЮО У60-Е50О дикого типу («Зразок 1») (5БО 10 МО: 525): «КІМ МАКТ УКОСУ КАГТЮВ
У60-ЕВО-варідзнт АВ МЕ ТОБА/ЛЛА («Зразок 2») (5ЕО І МО: 326);
У УКМИВеМАКЬ » АН ЕОСУКАТОВЕ і
У6О- ЕКО -варіднт АВОТОЗАЛОХАУ ЛА («Зразок 3») (5ЕО І МО: 327):
Ух сКМАаАЄММАКТ АЗЕСУКАГШЕ
Мононуклеарні клітини периферичної крові (МКПК) виділяли з лейкоцитарної плівки в групи здорових донорів (із крові, узятої протягом 24 годин). МКПК виділяли з лейкоцитарної плівки шляхом центрифугування в градієнті щільності Гутрпоргер м (Ахіз-5півеіа, Оипаее, ОК), і СО8:-
Т-клітини виснажували з використанням СО8"Козецезер м (щЖетсеї! Тесппо!іодієв Іпс, Гопаоп,
ОК). Донори були обстежені шляхом ідентифікації НІ А-ОВ-гаплотипів з використанням набору для типування тканини на основі ПЛР НГА 55Р (Віогевзі, БоїїпийІ, ОК). Також оцінювали Т-клітинні відповіді на контрольні антигени (гемоціанін лімфи равлика (КІН) (|Рієегсе (Регбріо), Статіїпооп,
К)) і на пептиди, які походять від вірусів грипу А і Епштейна-Барра. Потім МКПК заморожували і зберігали в рідкому азоті до їхнього використання. Була обстежена група з 50 донорів, що мали алотипи, що охоплюють 280 95 усіх алотипів, які зустрічаються в природі, де всі основні алотипи
НГА-ОК (окремі алотипи, експресовані з частотою »5 95 у населення усього світу) добре описані в літературі.
МКПК, узяті від кожного донора, відморожували, підраховували, а потім оцінювали їхню життєздатність. Клітини індукували при кімнатній температурі в культуральному середовищі
АІМ-МФ), промивали і ресуспендували в АЇМ-М до об'єму 4-6х106 МКПК/мл. Для кожного донора брали культури в їхній загальній масі, а потім у відповідні ямки 24-ямкового планшета додавали 1 мл маточного розчину проліферуючих клітин. До МКПК додавали культуральне середовище (0,5 мл) і тестований пептид (0,5 мл) до кінцевої концентрації 5 мкМ. Для кожного донора використовували репродукований контроль (клітини, інкубовані з 100 мкг/мл КІН) і "тільки одне культуральне середовище", що також цілком достатньо. Культури інкубували всі 8 днів при 37"С у 595 СО». На дні 5, 6, 7 і 8 клітини в кожній ямці злегка ресуспендували, і 3х100 мкл аліквот переносили в кожну ямку круглодонного 96-ямкового планшета. Культури піддавали імпульсному міченню 0,75 мкКі НіІ-тимідину (РегКіп ЕІтег?), Веасопзпйей, ОК) у 100 мкл
Зо культурального середовища АІМ-МО і інкубували протягом ще 18 годин, а потім збирали на фільтрах-матах (Регкіп ЕІтег) з використанням збирача клітин ТотТес Мас Птм,. Число імпульсів на хвилину (ім./хв.) для кожної ямки визначали шляхом підрахунку сцинтиляційних імпульсів на приладі Мейіех"м (Регкіп ЕІтеге), приєднаному до рідинного сцинтиляційному лічильнику 1450 Місгобеїа УМайНас Ттийих (Регкіп ЕІтегфт)), у біноклі Паралюкс, і було виявлено, що ці клітини мали низький тіньовий фенотип.
Для оцінки впливу такої обробки на життєздатність клітин, на день 7, культури в загальній масі можуть бути злегка ресуспендовані, а потім 20 мкл кожного зразка брали у всіх донорів і змішували з 20 мкл трипанового синього. Потім ці зразки можуть бути оцінені на життєздатність по витисненню барвника трипанового синього на автоматичному пристрої для підрахунку клітин
Соцпіез5Ф (Іпмігодеп). Життєздатність переважно виражали як відсоток витиснення трипанового синього/загальне число клітин. В експериментах, проведених з використанням зразка 1 (дикого типу) і різних тестованих пептидів, що не є зразком 2 або зразком 3, було виявлено, що культивовані клітини, узяті у всіх обстежуваних донорів, зберігали свою життєздатність у середньому більш ніж на 8795. Відповідно до обчислень, середня життєздатність клітин, інкубованих тільки із середовищем, становила 9095, а середня життєздатність клітин, інкубованих з тестованими пептидами, становила 88, 88 і 87 95, відповідно. Життєздатність КІ Н-оброблених клітин становила 83 95, що значно не відрізнялася від життєздатності клітин, оброблених пептидом. Отже, можна зробити висновок, що інкубування клітин (МКПК) з пептидами не приводило до якої-небудь помітної токсичності протягом усього періоду культивування клітин.
В аналізі на І/-2 ЕГІЗрої"М брали участь ті ж донори. які брали участь в аналізі на проліферацію. Клітини відморожували й активували, як описано вище. Планшети ЕГ ІзРрої (Мійїроге, М/анога, ОК) попередньо зволожували, сенсибілізували 100 мкл/ямку антитілом для захоплення 1-2 (КО Зузіет5, Аріпддоп, ОК) у РВ5 і залишали на ніч. Потім планшети З рази промивали в РВ5, інкубували протягом ночі у блокувальному буфері (1 95 ВЗА (альбуміну бичачої сироватки, Зідта) у РВ5) і промивали в середовищі АЇМ-МФ. Щільність клітин для кожного донора доводили до 4-6х106 МКПК/мл у культуральному середовищі АЇМ МФ і в кожну ямку додавали 100 мкл клітин. У відповідні ямки додавали 50 мкл тестованого пептиду і контроль.
Пептиди (АВО Уб60-Е8О ("Зразок 1"), У60-ЕВО-варіант АВО М660/1705//71А ("Зразок 2") (ЗЕО І МО: 326) або у60-ЕВО-варіант АВО І 64А/ЛбБАЛ//1А ("Зразок 37 (ЗЕО ІЮ МО: 327) додавали до СО8"-виснажених культур МКПК у своїй загальній масі. Після інкубування зі зразками проліферацію СО4--Т-клітин вимірювали по включенню |"НІ-тимідину в різні періоди часу одночасно з вимірюванням рівня секреції І -2 за допомогою аналізу ЕГІЗрої М (аналіз на
І -2 ЄЕІЗрої"м включає попереднє покриття мембрани антитілом для захоплення, що зв'язується із секретованим цитокіном). Пептиди розводили в культуральному середовищі АЇМ-
МО (Іпмігодеп, РаїзІіеєу, ОК) безпосередньо перед їхнім застосуванням, і кінцева аналітична концентрація становила 5 мкМ. КІН використовували як репродукований контроль і зберігали при -20"С у вигляді 10 мг/мл маточного розчину у воді. Для дослідження аліквоти КІН відморожували, а потім відразу розводили до 400 мкг/мл у АІЇМ-МФ) (у кінцевій концентрації 100 мкг/мл). Фітогемаглютинін (РНА, Зідта, РооїЇе, ОК) використовували як позитивний контроль у
ЕсІЗрої М ї 1 мг/мл маточного розчину зберігали при -20 "С, а потім розводили до кінцевої концентрації 2,5 мкг/мл у клітинних культурах.
Тестовані пептиди аналізували в культурах із шістьма повторностями, і для кожного донора, у кожен планшет також уключали негативний контроль (тільки середовище АЇІМ-МФ), безклітинний контроль і мітоген-позитивний контроль (РНА при 2,5 мкг/мл - використовували як
Зо внутрішній тест на функцію ЕГІЗрої М і життєздатність клітин, Зідта). Після 8-денного періоду інкубування планшети ЕГІбЗрої"М виявляли шляхом наступного промивання в ангО і РВ5 (ХЗ) і додавання 100 мкл фільтрованого біотинільованого детектучого антитіла (КО Зузіетв5) у
РВБЛ 95 ВЗА. Після інкубування при 37 "С протягом 1,5 години, планшети знову промивали в
РВБЗ (х3), і протягом 1,5 години додавали 100 мкл фільтрованого стрептавідину-АР (НО зЗузівт5) у РВБ/195 ВБА при кімнатній температурі. Потім стрептавідин-АР відкидали, і планшети промивали в РВ5 (х4). У кожну ямку додавали субстрат ВСІР/МВТ (КО Зу«етв) (100 мкл) і інкубували протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. Розвиток плями припиняли шляхом промивання ямок, і дно ямок три рази промивали ЯНгО. Осушені планшети сканували на аналізаторі Іттипозсап? Апаїузег, і число плям на ямку (з5зрму) визначали за допомогою програми Іттипозсапф Мегзіоп 4.
Для проведення аналізів на проліферацію і І/-2 ЕГІЗрої м, зразки, індукуючі відповіді, дорівнюють або в два рази перевищуючі емпіричний поріг індексу стимуляції (51) (51І22,00), розглядалися як позитивні. Для серії даних аналізів на проліферацію (п-3) і аналізів на 1-2
ЕГІЗрої (п-6), позитивні відповіді визначали по статистичних і емпіричних порогах: значимість (р-0,05) відповіді визначали шляхом порівняння величин імп./хв... або плям/ямку для тест-ямок з такими величинами для контрольних ямок (середовище) з використанням непарного Т- критерію Стьюдента для двох зразків; причому індекс стимуляції дорівнює 2 або вище (5122,00), де Бі-середнє для тест-ямок (імп./хв. або плям/ямку)/фон (імп./хв. або плям/ямку). Дані, отримані таким способом, представлені як 51І22,00, р«0,05. Крім того, розходження між даними одного аналізу оцінювали шляхом обчислення коефіцієнта варіації і стандартного відхилення (50) вихідних даних від даних культур, отриманих у дубльованих аналізах.
Було виявлено, що пептид дикого типу індукує позитивні проліферативні відповіді в аналізі
Ерізсгееп'м на проліферацію Т-клітин залежно від часу, а саме, СО4--Т-клітинні відповіді з
ЗІ»2,00 (р-0,05) у семи донорів, включаючи одну граничну відповідь (5І121,90 (р«е0,05)), яка давала частоту позитивної відповіді 14 95. Середня величина (51) позитивних (5122,00, р«е0,05)
Т-клітинних проліферативних відповідей у порівнянні з відповіддю пептиду дикого типу становила 51-2,55, тобто, була дещо вища, ніж величина для двох деїімунізованих пептидів (таблиця 24). У таблиці 24 приводяться систематизовані величини (4-50 (порівн. кв. відх.)) позитивних Т-клітинних проліферативних відповідей у порівнянні з відповідями, що 60 спостерігаються для тестованих пептидів і КІН. Середнє значення 51 обчислювали виходячи із середньої величини всіх позитивних відповідей, що спостерігаються в донорів за весь курс лікування (дні 5-8). Отримані дані включають граничні проліферативні відповіді (511,90), р-0,05).
Таблиця 24 111 164АЛВЕБАЛУЙТА.ЇГ//| 77727 | 77771024 | 6
Таким чином, виходячи з аналізу на проліферацію, величини (51) Т-клітинної відповіді і частота (95) донорів, що відповідають, в експериментальній групі вказували на те, що загальна імуногенність пептидів дикого типу в даному дослідженні може розглядатися як помірна, а імуногенность деімунізованих пептидів може розглядатися як низька. Ці дані підтвердили, що видалення специфічних Т-клітинних епітопів дикого типу шляхом уведення мутацій
М660/1705//71А і І 64А/65АЛ//1А було успішним.
Загальний хронометраж проліферативних відповідей може служити показником імуногенного потенціалу, типу Т-клітинної відповіді (первинного або вторинного). Максимальна
Т-клітинна проліферація, детектована на 5-ий день, указувала на те, що є велике число Т- клітин-попередників, а максимальна проліферація на 8-ий день указувала на те, що є невелике число Т-клітин-попередників. Високий імуногенний потенціал повинний відповідати стимуляції Т- клітин на ранній фазі проведення аналізу. Тестований пептид варіанта АВО Уб60-ЕВО
МебО/705//71А ("Зразок 2") (ЗЕО ІО МО: 326) давав 1, 0, 1 і 1 відповідь на дні 5,6, 7 і 8, відповідно. Тестований пептид варіанта АВО У60-Е80 І 64А/65АЛ//1А ("Зразок 3") (ЗЕО ІЮО МО: 327) давав 0, 1, 2 і 1 відповідь на дні 5, 6, 7 і 8, відповідно. Низьке число реагуючих донорів, що спостерігаються у випадку Мб660/1705//71А ії І 64А/65АЛ//1А, утруднювало інтерпретацію кінетичного аналізу Т-клітинної проліферативної відповіді цього типу, хоча декілька відповідей, що спостерігалися для цих зразків, відбувалися пізніше за часом і підтвердили ту думку, що здорові індивідууми не були примовані Т-клітинними епітопами, які присутні у цих послідовностях.
Аналогічно аналізу на проліферацію, позитивні відповіді реєстрували в донорів, що мали зІ22,00 зі значимим (р«0,05) розходженням, що спостерігається між тестованим числом плям/ямку (5рм/) і фоном (необроблений контроль, середовище). Пептид Мб6О/1705//71А у 6 95 донорів індукував позитивну відповідь в аналізі на І/-2 ЕГІЗрої а пептид І64А/65А/Л/7/1А
Зо індукував позитивні відповіді в 490 донорів. Ці результати суперечать результатам, що спостерігаються для послідовності дикого типу, де позитивні відповіді в аналізі на І -2 ЕГ ІБрої були зареєстровані в 20 95 донорів у групі. Середня величина позитивних Т-клітинних відповідей для обох деімунізованих пептидів була низькою і становила 2,02 і 2,43 (таблиця 25), відповідно, і ця величина була аналогічна величині, отриманій для пептиду дикого типу. У таблиці 25 представлені систематизовані величини (450) позитивних Т-клітинних відповідей відносно секреції І/-2 (5122,00, р«0,05) для тестованих пептидів і для КІН. Середню величину 51 обчислювали виходячи із середніх значень для всіх донорів, що спостерігаються, з позитивними відповідями. Ці дані включають граничні проліферативні відповіді (5121,90, р«е0,05).
Таблиця 25 о Мебр/т70БЛУЛА | 7777/2027 | 7 057 1777716 (01111 КіНсюнтрольд//.// | 7777/4247 | 77777202 | 962щ
Для двох тестованих пептидів загальна кореляція між даними аналізу на проліферацію і на
І -2 ЕГІБрої! М була високою і мала місце в 100 95 ії 67 95 донорів, що позитивно відповідають в аналізі на проліферації, а також в аналізі на І/-2 ЕГІЗрої. Така висока кореляція між двома аналізами також спостерігалася у випадку КІ Н-контролю по відтворюваності аналізу, де в 98 95 донорів, що відповідають в аналізі на проліферацію, також спостерігалися відповіді в аналізі на
І-2 ЕСіБрої м (звичайно в межах 85-100 95 для Т-клітинного аналізу Ерізсгеєп'"Мм залежно від часу). Таким чином, в аналізах на проліферацію і на І/-2 ЕГІЗрої М, частота і величини Т- клітинних відповідей для пептидів Мб60/1705/Л/71А і І64А/Лб5АЛ//1А дають підставу припустити, що вони можуть розглядатися як низький потенціал клінічної імуногенності в порівнянні з високим ризиком клінічної імуногенності у випадку використання пептиду дикого типу.
Дані аналізу на проліферацію й аналізу на І/-2 ЕГІЗрої показали, що позитивні Т-клітинні відповіді детектувались у випадку тестованих пептидів у ряду донорів. Загальна кореляція між даними аналізу на проліферацію і на І--2 ЕГІЗрої М становила 98 9о для КІН, 70 95 для пептиду дикого типу і 100 95 і 67 965 для Мб66О/1705//74А і І 64А/65АЛ/74А, відповідно. Тому донори, які відповідають, були визначені як донори, у яких вироблялася позитивна відповідь на кожен зразок в аналізах на 1-2 ЕГІЗро! м і на проліферацію. У всіх донорів продукувалася позитивна
Т-клітинна відповідь на РНА, що вказувало на те, що клітини в культурах ех мімо були функціональними. Аналіз об'єднаних наборів даних, отриманих при проведенні цих двох аналізів, показав, що загальна частота і величини відповідей в аналізах і на проліферацію, і в аналізах ЕГІЗрої! М є низькими для двох деїімунізованих пептидів у 4 95 донорів, що відповідають на М660/1705//71А і І 64А/65А//71А. Ці результати відрізняються від результатів, отриманих у випадку пептиду дикого типу (який давав значно більш високе число позитивних відповідей (у 14 95 донорів, що відповідають в аналізах на 1-2 ЕГІЗрої і на проліферацію)). НІ А-аналіз не проводили, оскільки відповіді на два тестовані пептиди були нижчі мінімального граничного значення для аналізу цього типу.
У цілому, Т-клітинний аналіз ЕрізЗсгееп'Мм залежно від часу проводили для визначення потенційної клінічної імуногенності для двох тестованих пептидів. Здатність пептидів індукувати браг-Т-клітинні відповіді, оцінені в аналізі на проліферацію і на 1-2 ЕІ! ІЗрої, тестували для групи з 50 НІ А-типованих донорів. Дані, отримані в дослідженні пептиду дикого типу, показали, що загальний ризик виробляння імуногенності, у випадку використання пептиду дикого типу, був помірним, оскільки загальна частота проліферативних відповідей і ІІ -2-відповідей спостерігалася в 14 95 донорів, що беруть участь у дослідженні. Однак загальна частота проліферативних відповідей і ІІ -2-відповідей на два деімунізованих пептиди в цьому дослідженні була низькою і спостерігалася в 4 95 донорів, що відповідають на М660О/71705//71А, і в 6 95 донорів, що відповідають на І 64А/65АЛ//1А.
Т-клітинні аналізи Ерібсгееп'Мм залежно від часу для множини комерційних біологічних препаратів указували на явну кореляцію між відсотками Т-клітинних відповідей у донорів в аналізі Ерібсгеєеп'"м і рівнем імуногенності (гуморальних відповідей, тобто, виробляння терапевтичного антитіла проти білка), що спостерігається в клінічних умовах. Висока частота відповідей у донорів спостерігалася в аналізах Ерібзсгееп'"м на імуногенні антитіла, такі як
Сатрацш, тоді як відносно низька частота відповідей у донорів спостерігалася для неімуногенних антитіл, таких як ксолаїр і герцептин. Загалом, терапевтичні білки, індукуючі »1095 позитивних відповідей в аналізі Ерібсгееп'М, асоціювалися з високим ризиком імуногенності в клінічних умовах. Ці дані показали, що в порівнянні з терапевтичними білками, протестованими в аналізах Ерібсгееп'м, деімунізовані пептиди Мб660/1705//71А і
ІЇ64А/Л65А//71А давали СО4--Т-клітинні відповід, що входили в той же інтервал рівнів відповідей, продукованих антитілами ксолаїром (Хоїаїг), герцептином (Негсеріїп) і авастином (Амазійп), а тому вони повинні розглядатися як пептиди з низьким ризиком імуногенності. Таким чином, можна зробити висновок, що деімунізовані пептиди мали сприятливий профіль імуногенності в аналізі на імуногенність Ерізсгееп м 6.23. Поліпшені фармакокінетичні властивості АВО-БАНТ іп мімо
Як обговорювалося вище, альбумін-зв'язувальний домен (АВО) стрептококового с-білка був приєднаний до С-кінця САКТ (на відстані від антигензв'язувальних сайтів) (АВО-БАКТ") з метою поліпшення фармакокінетичних властивостей ОАКТ іп мімо. Фармакокінетичні дослідження таких АВО-ЮСАКТ виявили, що вони мають більш тривалий час напівжиття в кровотоці, що становить 35,1 години, тоді як кінцевий час напівжиття звичайних САКТ (без АВО) у кровотоці становив 1,2 години. Аналіз іп 5іїсо виявив, що мається п'ять положень якоря р1 у послідовності АВО, у яких існує висока імовірність зв'язування з МНС класу ІІ. Для продукування деімунізованого варіанта АВО були введені мутації методом сайт-направленого мутагенезу, проведеного на основі передвіщених даних, отриманих в аналізі іп 5ійсо. Після проведення декількох раундів введення однієї мутації і комбінації цих мутацій були отримані два варіанти
АВО, "АВО (ААА)» і "АВО (О5А)», що мають афінність зв'язування із сироватковим альбуміном, аналогічну афінності зв'язування АВО дикого типу із сироватковим альбуміном, або більш низьку афінність такого зв'язування. (510)
163АЛЬБЗАЛУЯА («АВІА ААІ ЗЕО ТП МО: 328):
РТАБАКУТГАМЕ БЕІЖУтСсУВОХ УКМАдАСММАКТІ АБЕСУКАТОЕ
ПААЇР
Моб» 705 У71А («АВР ОБА)Ю ЗБО ОО МО: 329;
ТАБАКУТАМЕ БЕОКУСУЗОХ УКМИІВОМАКУ»ю АЗЕСУКАГШЕ
ПААГР
Ці два варіанти давали найнижчу оцінку рівня зв'язування з пептидами МНС класу ІЇ (таблиця 26).
Таблиця 26
Комбінанія Адей ААвІ ААв4 Ав ААЛ
Днкоготншю 0е21 12 065771 1 06067 06143 -АВр(ААУ В Втон
АВР (БА) 2 05891 4 106120 7 бе 2 105776 о
Ті. з Літандн 00 бсоге «Бали
Для оцінки часу напівжиття цих двох варіантів АВО у сироватці було проведено фармакокінетичне дослідження іп мімо на мишах С57В1/6, яким вводили одну і.м. ін'єкцію білків у концентрації 5 мг/кг. Фармакокінетичні дослідження показали, що час напівжиття мутантного
АВО (ОА) був таким же тривалим, як і час напівжиття АВО дикого типу (фігура 63). Інший мутант, ПСО16хпСО32В АВО (ААА) ВАКТ, мав на декілька годин більш тривалий час напівжиття в сироватці, ніж вихідний пСО1бхиИСО328 ЕК АКТ. Таким чином, ці дослідження продемонстрували, що, незважаючи на знижену афінність зв'язування з альбуміном, гібрид деїмунізованого варіанта АВО (тобто, АВО (О5А)) значно збільшував час напівжиття білків рАКТ у сироватці. Такий збільшений час напівжиття в сироватці дає ті переваги, що цей менш імуногенний АВО-САКТ може бути використаний як потенційний кандидат на терапевтичний засіб, який, зокрема, може бути введений з меншою частотою іабо в меншій дозі.
Фармакокінетичні профілі НСр1бхпСО32В8 АВО бАКТ представлені в таблиці 27.
Таблиня 27
Фармакокінетичні профілі ПСВ16хСОЗаВ АВО ВАТ
ЕК-ПАКТ АВ) АВП(АДАА) АВО
ФА)
Пояснення: 155 бета (кінцевий час онапівжнтІтя); Єтзх максимальна концентрація во сироватці); Жудх (КІЛЬКІСТЬ часу, за який досягається максимальна концентрація в сироватці, тобто Ст АЄЄС (пива під кривою (величина, пропорційна загальній кількості в крові пацієнта) 6.24. Вплив підвищеної валентності АВО на час напівжиття рекомбінантних АВО-БАНТ іп мімо
Різні біли АВО АКТ були сконструйовані або шляхом приєднання АВО до кінця обох ланцюгів (фігура 64А), або шляхом приєднання тандемних АВО до кінця одного ланцюга (фігура 648). Одна конструкція була також отримана шляхом приєднання АВО (ААА) до С-кінця обох ланцюгів. У цьому дослідженні одержували пНСО16хпиСО32В Ес АКТ для порівняння часу напівжиття в сироватці. Усі АВО-варіанти мали здатність біспецифічни зв'язуватися з обома антигенами (фігура 65). Для визначення часу напівжиття всіх цих АВО БАКТ і Ес ВСАКТ у сироватці було проведено фармакокінетичне дослідження іп мімо на мишах С57В1/6, яким вводили одну внутрішньовенну (і.м.) ін'єкцію вказаних білків у концентрації 5 мг/кг. Отриманий результат показав, що на збільшення часу напівжиття АВО у сироватці впливає валентність зв'язування АВО з альбуміном (фігура 66). Кінцевий час напівжиття молекули САКТ, приєднаної до двох АВО, несподівано виявився в три рази вищим, ніж час напівжиття ОАКТ з одним АВО (таблиця 28).
Таблиця 28
Фармакокінетичні профілі ВСО16хіСІЗ32В АВ) і Бе БА КЕ
КЕ АВК Е Е АВО- Е Бе/ДО
АВІ АВІНАААУК | АВІЖ
АВІКААА)
Спах (мкг/мл) 111,50 130,00
Пояснення: ГТ» бета (кінпевий час онапівжиття) бнзу максимальна концентрація в сироватці); о Будх (КІЛЬКІСТЬ часу, за який лосягається максимальна концентрація в сироватці, тобто Спах); АСЄ (площа під кривою (величина, пропорнійна загальній кількості в крові пацієнта)
Для фахівця в даній галузі очевидно, що в даний винахід можуть бути внесені різні модифікації і зміни, що не виходять за рамки суті й обсягу даного винаходу. Описані тут конкретні варіанти винаходу приводяться лише з метою ілюстрації, і при цьому слід зазначити, що даний винахід обмежений тільки прикладеною формулою винаходу, а також повним обсягом еквівалентів об'єктів заявленого винаходу. Такі модифікації входять в обсяг прикладеної формули винаходу. Усі цитовані тут публікації, патенти і непатентні заявки у всій своїй повноті і у всіх цілях вводяться в даний опис за допомогою посилання, так, ніби кожна публікація, патент або патентна заявка у всій своїй повноті і у всіх цілях були конкретно й окремо включені в опис даної заявки за допомогою посилання.
"0 ка Га Як х ек -х список пОосЛлІДОВНОСТЕИ «10» Мастснзецісв, По.
Вахає. Впазмаєь мавлЯ, Бір
Чзопазогп, БПздіїє зопезпі, йо у г нич ох шої м о о тиж: - о тех ще жк -о зу и «їййх помени, кі сдтуУЮТтТьЬсСяЯ :З пезмумізовамою сироваткою, ії Ххвнже: застосуваним для снзітліваняя зале напібзжитта йо сяровяаиці «1 їЗаяї пай МУг «Рій ЕМО ОПОВ «іййв пз али ЯН, «512 ВПР -5-У «102 З ли прим вт зер ит ТІ «АТОз гаскерств Ууєкніст 3.9 «в10 з я «її 13 «хід РТ соя яву; тку ках3х Нотпо шарієнлае «дО 1 сів вВкКОо Був век Су зво був ТК Нав ТтВвХх Суд рхо ВКо ї 5 ї1о «10 «каїмі» 10 «21йз БЕт «813» Воші сврізла - шо «ПО 5 сіб Ак був о Сув Сує Уві сій Сув Ето Бо їі З хо «105 1 «її БО «Ві1йз БЕЖ «вій» пошта варієпе «4002 бі їше Муз ТЕЖ Кхсо зе Зі АвботТеах СХ Вів твх Суб рко Да Су
У 5 І 15
БЕЗ осі Бкс мув Зак Су Ар ОтбМЕ РКО Рто РЕ Сув Бко Аку Су Вко ха т 0 сь Бо ук Бех Сув АВОо тах Рюа рко Бхо СуБ РЕа Бка4 Суш реа 03 п5 о 15 зт Буш чаш Сув зар отах Вто Бк? Бко Сук Бо лу
Зо З о «піп» 4 «1іх а кій» ВВЕ «8Аї3» блю варів «00 я бід Бех Був Тук пім то Бго Суд бо бат 1 З уп «їй З «3112 317 «лій» ВАТ «Вій» попе Зврієпйе хаб 5 діа рхо Сіз Пе рез біу сіу ВкшоВек сСаї рве ей Рпе Бгро ру Пув 1 5 19 ХУ хо Мув Дер оТпх Пе Меб її: Бек Акз тТнУ ко бій Уві Ту Сув Маї зу 5 30 і4 Золух дек й Ста Бек т сх. с. ий тр чех м т. є а
ЗЧві Узі бар маії бе із сіб ВБЮ ро бій ах о їме Бі вна бо ТУК 44 ак тущї п я -х - г ле МІ ще сх. Чет ях з зу ШИ
Зв вар опіу маї січ баз Ніє два Аїа Був Тих їм Без бху бі о а 55 ЗО кн сти В пут у ую ви а ШУ. туї с. тран ту ЕК іє бЗіпотух Ав) бех Тах тУукК Ако Уві Уві Зек Ма) Кк: ТВх Маі Темі Нів 55 72 75 Б біз Авр отр без дев Ту пув бій о тТух ую Суб Буз Чаї ех Ап був ча зо ЗУ
Аїа сез бто Ада Бко Їзе біа пуд тж Гі бек був Біл Буш ФУ СІЛ 15 ха о ко Бха бій Ву со Ма тує ства ім Рко рхо Бех дує авнро бій пед 115 120 123 тих їув Ава сіб Уві пех обей Сп обує Сем о Уві бує П1у Бпе о Туло вка 150 175 тай ча ше ля лих "1; р т к Фени де У лих ния ї . г -
Бек Ав ї3же діа Уєі біз Ткробі бек Ада щі сіє Бге 013 Ав Ал
Кен 155 ї50 тут їм так отижЖ ко Ба Маї Пец Азробет Авропшію Бех Пав Бе без 1655 то ї75 тля Му со ти зало аа и й Туга кру уж тек Се лах га "ки
Тук Бах пу ша ТВу Уві Азройуй би Бха Ту діє піз біс бвдо хв що 1на 158
Бе ет Су Зак Уа мя Ніз бі о Аїз Пец Нів Ав Мі Тук Ту піп лю по 205 мУв Нет Рози дет Сен) цех рхо су Суб 20 їх «ВМ» о «вії 215 «102 РЕТ «ВЩ3» пошжо еврієвла -400х
Аза вже Ркз Уві Віа су Ббко Нек Мяї бйе бе) Різ Бхо ВгОо буй Бто і ту 12 15 їж Ав отих інма Мет Кзє Цех обл бах Б сіб чві Те був Маї чаї 2 5 КТ) з ха др я Ме Мах уже У ук кання Є т с "ЧМажк о хг чаї взр о уаї бек МіЗз піз БВ хо ім мМаї бід РіФе бай ТТ Тук хлаї 42 45 вавробіу хаї бі Уві Ніз двм оАіа ме Тахо ПУ РКО АхЯ біль сі сік ча 55 0
Ріг дви бек Так Різ ха Мах Маї Зак Уві їм Тву Уві маї ів сл звороту пе» Аавосіу Був обі тук о пув о Сев о Був аз дев о АВо Мув ЗІ1у я5 Зо з5 х аа НИ а нн 1 й х же с 1-2 пу то; тугі ток МЕ А їни пей РІЗ Аза Вко Ті піч буш тк о Гіє базу Був Тає Ту щі Сів Бо і59 105 по дже сій Бго Бій Ууаі тує ТБ Бей бро Буо Щек Аже Піо бій мМеб тих учи Б ак
МУ т17хо 155 пу АТ ть Чаї Мет Маю» оЖжвк Суб їжа Уді Був бі ве Тую Бхо бер я Мук за
Аврогія АтвоМаї біз ттрох)уз ек два Сі Пій ото З1Їч Ашп АВ Тут 145 155 15 150
Був тая Твлобко Бро Меб Мо» АБО бех ВБИ Сіу йежЕ Бе Влє Феї Тер 183 172 75
Зех ме ем Тахо уві Авробув За діт тво Біл оо піу Ай МАК Бе їво 185 їІЗО
Шек Суз Бех уаї Ме о Нів оси Лія рем нів Аа Бів Тух таж під Гмй і 00 25
Сік Та Лю Там сруй їйзеи ПУбхя точити дак обео пед о Бей опех Бус ле щи й її
М Ач хі а Се ах кі «хз Вт «-2513» Бошо зарієпа -400»5 7 ке пу полк о тин: Тор «11 ку тат ре А т. прі Жора Каик пк пихи
Аза шко Фім їєкі Гео біу Біу Руб Жет Ууаії Бе Тан це Бо БхоОїУв 3 5 їй 15 па дує тм - ЖІ се им ту. гл Н р ер 1 о їв Ар ТВ Гео Ме бів Зек ко ТНХ хо щі уві Тих Сук У
Ки Ба 30 та ду шує ЗЖА АХ тен вт зжї пре гу ти я в чав уаі йвроуві Бех Нів Зі Авуд Риб бій Маї сіб Впе буд ТЕ Тур ік й 15 щи ска гУ ля ж У тал дя йщ-а З ж «к пряної ик Імя щ тка КУ чаї Ввр обі Уві піп ув мів Ав вія Був ТВЖт Ду рко хе бів бій
Ехо У Бо ті ін Кл Фо СИ Слосуттгч 21 т 5 тс ї пар р Ту токах 11 біп о РБеа АвБлобек Так де Ак баї Уві дек уаї Пей; Тмх ві Їжа: пів 55 7 75 но сій Аза оттв бе АбросьуУу був ій Ту пух Сув був Уді бок АБО Був ва чо 35
Віз бо вхо Ліва во Ті біб Був ТМ Хі Бек цуз Трх Був жі бій хо 15 112 пут ка Зі Бк с МАМ тує ж рев» Бка рхо хЗажх лу ціа піл Меє 1х5 120 ї2ї тр о Буш бли іп оУаії бек оїеєб Ту Сув їм Ууді Пув ОЗу Рпестмк рхо 1580 135 Я
Зек вав їі АТбТа Уа пі тко обі бах Зах сі ій Ркба 03) п Ат. Вп
Кч лаг ще Не
У 153 53 ЕВ
Тух Ав Тк тах БКа Ба Ме Пед АвробЗек Ав осіу Пех Ра же пе; 170 іа
Тух Фах Був Це Та обУаі Хна Муз Бех Ах Ттв опіка піп о З1у Ажж бю пн з ялак їни Не 155 реТЬ п бат очи г мЕтко Що (34 Аїд ото ЩА но діт пюучж Ух пух ГУ уч пс бек СУд бет баї Ме: Ні оси Аїа паб Ніб о вЗи Во ББае тає (і 155 по зи туя ех Бучі Пе їж; Чбжу ра я ох мех оч ІМАМ Ам ООешМ КК хх еВ
М 21 те, Гей
ЯМІ з «Мі х17 «вад БЕТ хі. пами» шеф лімах «Ні» В пу за пр їсУ п м нене шу зм (К Ко БТ пити ЗК Ти під вхо ФфМи тн інеа СІ фу Бк Цех зві Ре бен бе бо ко Бжд 1 го 18 15 пе ее не ЛЬ СУ ри бидло пуля У ши но Цен
Ехо бив Аво Тахо Туга Ме тла Бех бБКс Лпх хо см Уві ть Суд УВЛ. хо 5 30 хи 1 дк до рук А ФЛ ко хізу злі суєту Щи лег Пат
Уві маії Аме Уві беж сао із Ар о рко бі аз сів пбе Аваоткр о тухд хе ай 5 4 5 ке яки о тя спи (тк дл тля ХУ Я и у А зро є тяг йо - ВІ с чаї Ач сім Уді Змі баії Ніз два Азз бує Тс був ВКко Ак Ма шуй
Зо а Бо пу 1 зту Жюує ум стчУює Мом тла УДАЛ ОО фік ЗІ темі гру дкщ тодуз Рі сів Бра бнцп бек Ту ЖУх Бк Уа о шаї пек оуаі Пец ХХ бах Хей НіВ де мує ЗЕ до
ЗУ го їй во ик гу пон см Лос їі бо Ту Ск тик би тд але дм бик сів аворожхр оба деп су Му оїхім ТУК (хз СУув Був Уві Зех до сх
З5 20 Зх із тим ян, ие тує 1 З. тро озера оз лу АТ жк ПУ ких р пу бпем бхо Хек Бех їі ОЗРм о Сже ТВЖ о ї1з бех Буш Аза пу щу Сів чай гає яв їо0 195 110
Тухт не Р. Ля т ря сю У ихую Уеи Си реч не паж чу виш хо дюч Пе ско Зіз уві тмк Ту бед го бо щех З піл сід Мес 115 152 ї135 паж тля пе ли їх вух Том Ти Сх У т; туго бю Тувох сла пічех
Тв Буш Заг оці Уві Бех їм тах о туув бшм Ууаі пу Піу Ра тує йтб уза щ 140
Зех Ав отіє Ав Мак бій тую о сіо Нек аа Пі Біло Бхо п3мч Авт бЕть 145 їв 15 ТО лялауи Кох п рн них у ЛИШ тадат дуже емо поту Зм З зи; Спи тіки тух був ТИХ Тих БІО пхо щі їн А йех о Авросіу ех Епе Бе ей 157 іа ї75 пу ши й жначк Бостру гУюруює ЛО дик сток ет Лу учи ж М пл голою ами 1-1 дух Зак тус і-щ Та УЗ Ав оцув ПекК вк ТХхроЗіп Бій у Ал о Маї ди ви Зв.
Е пу меж жи ХА дин 1 и М г опція й рія селу Мамо ТУТ ве пет Су ек уаі Ме пів Зіч Аха їні Вів Авт нів бух Як шт 135 па ОБ тло білу Тоизмі удує тою шоде тека б'ухю тм
МзжвоптХ май ФУ Сем о шає сао ЗУ Був 2 518 «ВІЗ «Вії» 217 зі піт «шій Ки «Аа» Збнхло варзатня «АІх З туя т шо ху ще: АВ УТ а дам тек: і ФНІВ (Злуки їз рих пра тт мах бен ТНХ бід оЗаЄ боб вврорРіна бік ех бак отТаЄ б Бех х х ло 15 -. АЛ ї ее нас пгт пух сю пл у Син т ПУ зн ще сЬо був Уаї ТнНу пБе о сбиж був АКо ЄЗх бек опію пед ліве щШіУ ТЗ Зал ва з зи
Зо У За тер шо бити ля у ти и подо ху шини Те Тож тому така СТ сх
ТТ ів тео ТУух Зіпобзій Був Бо вво бій бес Бко Був ем їм Хі
ЦЕ ще як 35 С ЗУ почни нн и но п и В НН НА дови схе іжв бо Упаі бБет бю зе тіж бех бЗЕу баз Бо Беж АкУ Різ пек бу
Зо Ух ко х ит т уні в 00 сп НН с ше кт Дію лік Уа хе
Ппех о блу ех і1у так Ав орі Тв Бем ТВ Ті Ба дело жій Аіз ек мо ЗЕ -х 1 а пи їз дк діа й ть вк бмуж бе алі вм бує й ке тку ут СЕЛ піз Ар Аза Аза тв о тТух ЖУХ був ші ст бах лае Ту тТкОвоБхО жве : ле це
ЗВ зо з тілах Шчом «ху М ди А Ми дит зу я ТЛ тлу біла Уфі 1, ок
Лв вве обі щі ШУУ ТВ Буд аз БУ із Був Зі щіу Сіу бек шу пря «ак дя 190 їч5 Мо зЗім бі Сім Шія Уві ТБ Ге Аллу ЗАЧ Бе пі шехо Від Бей Май бух як ат тк 115 1270 ха ка тв бій аж бах вк бе Бу Сув тах Бе Бех сім бе Беж Меви
МІ 15 148
Чен шити Кк йно хну лим ф ре их м, ВН Шен мохи лит
Зек отТвжЖ Зек ху Ме СТУ Удіу бі ТЕО Кіз вху бій Кка!орха сім був їх ЩО 145 їБо я У я он о ин о в На КН сі Дида л Ти доми Му
Атїа Хжие сі тко Пе) віж Плв о1їїіе Тсо ТКроМБр оба дво о Зуд АХЩОГМК 155 Вт іл
Аве Бто Аза їде; ПувБ бех Бл Хшбм отв Тї1е Бех Ту дво ЖМх Зет шу жо хи ЕК лож гл тд тд томі бік аку см луг ВУХ До пи ле лою ЩО
Ади сій Маї УвУ еп тах ВН. Тих вза) Ме зве КхЗ УЩА АЮ ТХ Від 155 й лк 155 Б М тку хи Тем о гемо Кз тт Фтро дні Від стук Ме ї паж Ми Дух
Фбвт лук тех СЖв Вів бій Бі Авп о Бк Зія ТхЕ ББе Аівз тук тк Ту
ЕН пре яз й хх 2 тя ета ра тоди дуд пз яє З Кк щує Там) 313 у мох біп бху тах бач Уві тих Мах Бех шех пе біУ СУ Сув чи яла як мих КО хі
ЩІ те «10» 10
Вік В «йійз ВАХ «813» пошо карізив сад пах КІ тку КУТ хи їли бах (їлч: УТ я гУ ху гляк сіу зЗім Щіу бек осуу О1уУ О1У У ї З
Кр ЩЕ
ДІЯ М
«1 А 4, «ММ Ай чати ОВАЛ «13М їла ваврпояма
Нас 1 пап 1 и 1. її-щ с "жає КМ гру ря ча я же хай шен такої у;
АвротіФг мні Мей тах Осій пех бго Зв Зак бе Аза уд) дак ої З1у і 5 ще ї5 у й -ї пляж мл Фо гм чо ччН Фа СТИКУ Ми зе січ; дха діа тах Її: ЗШ оСув СУ Діа Бек бла бек Ма Аа БМе Бар пк «цк аг
КІ 5 КН ик . Перуує хі ще т «се 21 тезу т ук почну ших Ви е ях, ску ввробет Бце Мек Авт тТкротбутх Зій бій Пух хо Злу се о Бго Бо
Б У
Ту о їимаі інв ів оСтукю ТВу ТВ Бех Дай о бем січ дек біб Уві хо Азр 539 а ви одн пд дл ТУТ уч ху Медея я нн он А ОН о ПИ
Ожхш свв Нпех о сіу Зет ім Зає луу ТЬьх ав оба Тву ісха Сну 12 Бех
Б та ТЕ БИ хек оБбеа дім Міа зібз Ав Чаї вів о Мві Тут тУк Сув піп осі ЩШех ви 85 зп 5 її: буд ТУєсу Чі бе НІ» Кох кт (хх ти т хе мо тщо гли ху сСіш ВзробхоОо Тух Тих РН шіУ біп обі Тв Пув схем щі: їз Буд бІУ -йп -дх 1 199 125 я;
ТУРІ» ут зх Що ія (11 0 1 МІ Зв їх см Ли птах дя ші (Му Шевт бу слу сху Іду сімй щі пів Гей Що м ше сі Бій 115 їй т і: я ти хи біжи; ГУ Чом ууж ї лзнвк суд дехує гає бли Мі до бу па очаМ Був Шу ж плу Ха Бет УЖЕ Буш Маї Бех Сув їУув Лія деух
136 МА НЕНВ блу ЖТух Хр рда тв Аа Тех хв ща нів охо УМА АжхО Сів Аза ро 145 155 ТАКУ 150
О1у ій лу ем сло тов Кіш ім Уаї хів бер осто Щек Ар Тих тух 155 Ки 175 го взпоТух Ввлп оПую Сук о різ Був о бу дв Уві ТрЕ оМек тех Ууду Уаї ів 185 ха
Уві Ват Тк беУу тНя Аїа тТух МБ Пі Тен зх лек бе Ак беж Аве о Ох я гр» Тл Пічне стих їчем ін у дме Кт - ач граю дер тах від Маю Тут Тух Сув Віа Ах Авт Сі зво ех Аро Жук Тут ій ра ша пек біу Меї ввротук тез біУ Бій бум тах Те Уа) тах Уві Бех Зої 225 73 235 а епосі у Сув «ВМ Ох «Вів» о г24й «Ки УР хаї3» Бощо зарівна ха Ов 18 сів їієе уві цей Тих бі Бек Бко АВ Бе спіп бех Уві Тахо Бо Був т ч Кк 5 ї З Що ї5 сі: пу чві ТБ Ве о тпх сив вху тт хек біп Зег 7ів о пьУ ТВ дай ї1іе Ні тро Ту шій спіяа цу то дво обіб ех Бус їв ої Бем 118 ст 5 їв січ Узі шек СІі1ц Зех Ї1е ех Зі Мі бий йпех вка Біда Шах Сж
БУ ЗЕ аб пше їз3їзр пшду фгзфю із о дат ін ву сум Пі мо Ху у Мш по хи ти: дія цех О1Уу Бех Оіу ТД Аве бе ХБХ Меп тйх тів Бай олдех їі ій дід
Б тв п но пло авроаза одіж ХК Тут ук Пув Бій Зі Бех бл ТВХу Тхровбух Без ва ча З перу Хі бли 1, Зокж тах хх хукт хІ 1133 т козу ух) птахи пл кутах тУпх ота пі Піу МУ тах був чаї БТ їі їмвБ о О1фу Б1Уу пьу Бех Оу їй 15 110 о лк піл ж Ер їх и яму ув а аю ЕХ ря 1 115 ЗЕД сит Ти пі сі бу із Уві Зій бео Мах ій Бех щі із Зіц Уві Був був 115 120 118
Бко бу діа бета ів Уві Зеж був був Афа Жек Сіу Тух Пк Без хо 135 140
ТВ Ази Тух тт о ї1ї-е Ні Тк Уді Ака бЗіп ліва ко п3іу Сів об1уУ бе 145 10 155 155 са тжроїіе о з1у чаї Тів зво Бхо Беж АвротвйсотТук о Бка ВБаА Жук дай
ІББ ї70 175 ув Був ББе бу спі1Уу ДЕ Уві ТВх Меї їлЕ Уві Маз Чаї Бех ВЕ дес 18 ву мо
Трж Аіа Тут Мей сію іжн вка Бех Бе Ака Зах АвроАшие Тих Аївз Маї 135 00 205
Тух Пух Су Аїв Аку би Оіу бвр дех АвроТук Тук Бех СІУ Моб дев 219 215 зЕО тТух їТхр піу бЗіп Шіу Тих Тк Уві Тнх Маі беж Бех цей СіУ П1у Суд жах за 23 240 «ій» 13 «Вії: 41 «т пе тиїИх РУ «13» полю варісде «00» 15 дви лів Уві Ме тиж Сів Бех Бко двробБех у Аза уаї бек бе) 01у 1 зу ННІ 15 бСіа ба Авіа тих гу о дае ПУЕ уж Від Бет біп Зах що Ар о БНа аю хо 5 35 піУу ввробех Впе Меб Аза отТхо ТУк п) с був Бхо Зі Пій бе Ки 35 за 28 уд Бей ей їі Тук Тахо Тв Бех Авт ей бій Ве піу Уді ха Ар з ЗУ КО йка ВКе Зах су Щек сім Щек пі Тах авр о вне Ту Без тик тів Шее 7 п що
ПекоБец бід Віа бів Аве о аї Аївоуаії ТУух Тух Сув о бій Збій Жах лап 33 26 по піб авроБха тухк Тахо вав оО1У Зіпосім тах пев ба б Тіз Був 1у ро 105 115 біу піж чех біу Сіу Му ку сіл осві ТВ їФу йкЗ Сі Зв сту Бк ха їх ВУ
Віа тез уаї Пуш Бжа Чи ЄМО БьХ Бем тво ее ТВХ о Сув Тих би Бас ї30 ї35 128
З1у вВпя Чек цей Вер Тл Зек сіу Ме: 01іу чаї Сі ТКр 18 АкУ Пій 145 152 ТУ їв хо кто сіУ Був вія Бенц біз Ткроів)о Аіш нів Тіз Ткр о ТкЕр Адр дя 165 їта 175
ВЕвр бує Ах ТУукК Вп о Бко Аза іш буз бе Ах їжі ТБ їі дек Сув но ї55 135 вне отийк бек ув йнп о Сіп уві Уві реа Ж Мек тах зво о Меб АвБровто 135 о щу мві Ашор ту Від Те тує тух Сув Віа ОІВ 118 Ан Бго віх ТЕр о Ве по ха КІ
Міа тик о ткр у бід лу тех Бе) мах ие Уаї Бех пет пем осі б1У 225 235 тУВ ко пух «810 14 «112 470 «Вій х БТ «Й» Лихмео варієйв «Ох 14 ін ків Уві їни ТНе б юи ек ко Азр оце сій бШехт уді Так о Буш Був ї 5 хо їх сі зу Уа) тв Біне ХижЖ Сув Ах тих бек о біп ех гзіє 03Уу ТВху йод
ХО й за хів Нів Тхровук ЗМ Сів Був Кто АБО Сів Бек БкО був Цей їн) Х12г
У сжвосів Уві дех піл: бек КіФф пек бу Уа ро пет Ат ває Бех щу п цех бу ат ою ТК одн ін Ту ТО Так отіз Ай беж Бай ПіЩ МА 75 75 йо сіз АБоровів Від ствах Тух Тк Сув піп бід дак Адут ТБХ о тТхо БО Ба 85 зо зу
ТвковВбе сСіу піу СІМ тлу Мув Уві біз Ті буд Бі1Уу ЗЕ біу Зах СУ 50 155 18 сум бі сСіу бСіп УДК ОТаХ цей Ач сіб о Пех Піу Бо АТа ба Маїф їуя 115 ї7о 155 то Таксі ТВ Пец ТБ Би Св Суб Тих Уіе Зежт ЗВУ рібе Ве ем 175 145 зек так Бек піу мес піу Мі Зі їжу Ге» вка бій обо РЕ П1у Бу її 150 115 18
Аїа їже; СІ Ткр оцей Аза Ні Тіє тТжо ТргрозвроАхр АБО Був Ву тТук 155 17 ут
Ап Бко Вія зе) Був Беж бущ їн о ТВх Їїз бак Му Ашо Зх Зак був 185 ін 190
Ачпап бЗіп о уві уві Бей тах Ме Тих АБО Меб Авр ово Уаї Ар о тах А18 135 що 205 тиху Тух Тук був Аза осі Кі ВЕ орхе Ала сто Бабзе Аза тбух б бі 310 213 йо
Сіп біу тах гей маї тк уай Бех Бех за Зіу біу Сув Уаї 05Мм вка
ТУ 230 ЗА ло : Іеуж їн ях "осики Мах хг стр у ж ичткх мк пу ки ж ітув Бех Сук барв ому Тахо МУ ТоХх СУув Бхо кхо бує Бк дід вто и 545 5 52 їж їв біу Піу Бхо дек Маї ЕБе їде Пре рро Руо Був Во ув о блю 850 25 ва! тплопец Ме її ШЩЕК Ат Тахо Бже Сі уві ТУ пуб дії стві Мак дАЕб 75 ЗО зах сві ВЗех Вів бі Ав Бус ім УВІ БУВ Ба Вип Туротую Заї Взю пі
З 235 по чаї бій мат ЗіБ Авиі й Су Так оту РКО Ака би піл сіє бує дам
УУ 31 МУ ЕН си ТАКУ сти ут я сл сим бло томі СУМ Ат аама Міопія с тек еко Жну бук Буш о Уаї Уггі Пс Маз їшч тЕ Уді Без ноші двротхю 328 Зо 338 зу й края конання на НА ША КИ 2 Тих я Се шия
Пецй Ав слі Бей би тук Її Су Буд УАЗ Жак бвМ о Пув Аза їі Бк за за за кл дик Тк б: 1 ре их уз тих Жов (ліз тім у Дон Б
Віа їз Тіз сід пу ТВ тб Бех буз АЛ буУВ СЛУ ПІ Бхо диху п асп зап здх 355 зепй 355
ТЕ -я, ми гпічує т мі Шчет без Духу дух шу 1: т з глухі т дя кто дз уаї Ту бах Пем оба Бго бек Ву Авросіч Бе) Ж Був Ав 3то ук зно г га Фуко Товт бує тя томи: 41 змд ки пи мс УЮ. бек дехує Кл півоуаї Як о пеа ЧЖЛх у сі Чі був б1іуУ ре Жх РКО Зеу Ав ої) хв5 30 135 00 -к - - суку і Куда а тю у ач хг що слу Ж ма
Ма маї спі) тТкробідї ак Ач о Зіу бі ржО пу) Авоп ов бух МБТ 0 щі 15 тає Бо Бо Уві бен Ашв о бех дав осіу Бак Бо Бце ем Тук БЕЖ ПУ доп ях 44: р ах 30 сш тн 4їх ди ж хм дл сп)» йів під о йіз Для ді ве» о бСктогбуд їм ТТН Узі азр оз БЕК вка ТЕ ів дів Сіу Азй о Маї Евпе о Бек осСув
У 449 ї45
Бвкомаї Маї Шів сі; Віа ген Мі Ава о Нів Фут Тих Щі їж5 Бех пед аа 55 50
Чех Бред Заб бо бСіу Буд 185 470 «210з 15 «их 477 «вій ПАТ «213» Божо Барієди «ап 15 авр о їїів Мщаї Мес Тну бій бек Бу Ввробет Пец Аза Уаї бек гец біу ї х 12 15 па. дич Ех зи ни шо ШИ пити У и На Ди ДІА Ту кв. а поту піз Ак Аїфв ЗМ ї1їе дав о Су Сузв Аіа Зат Мк Бех о саї азр ге Аду
Зо 5 Кх
ЗМУ Авробезх Рпе о Мек ан тир отУХ ЗМУ М Суд о Бхо піу іп о бЕОо Би
БИ 5 пиво їйа цена же чик ТВх бл пах Аве ей сій; пет бі ах бу дно
Б а п дж Різ Щек біУу дак су ех і» тТНЖ Авюр Біне Ух Меа тах 16 ек
КЕ ло щ- що ек Сей сії АТв осів ВаБИ ЗАМ Аза о че1ї Тех тую Сув Сіл БІЙ ек вх яв зо п
ЗМ; Ар о Бто Тух тах Вниз біу б)п о шіу ТИЖ Буш Кез сі: х1е їв су 125 п М сіу піу Євк ш1іу С1Уу ПіУ З1у бів Уаї ій мем оМаї зб бех шу Віа те ї20 125 іч Уаї пуб пу ба Сіу Від ВЗежх Ма! був Узі беж Сув о Мцув Аза ет 135 155 що сіуУу Тухк тах ге ТНК о Аки ТУух Тур Тіз Нів то о Маї зах Пій о Аїа бко 1 159 155 155
Зіу Пів о с1Уу їм 014 блто лів сіуУу Уа) їі АвО Руш бек о Авр о Тах тТух 165 іо 175 про Ана отук Дей ПУ був пе бує СІ1У вка Маї Так оМес тп Уггі Уві 150 185 чо
Чаї Бех ТНх о Пех тн діа тую Ме ОЛй )Їви джу ех й Ака Бек дер 155 з0о 205 роя Зх 125 ех тра лук зм од гу З о. де пи г авротнхІ Аа ні Тух тує Сув вів Бо вВли ім Ар о бех вврогух ТУХ
РОВІ їх зо дз 3 о Ман Деу ту інн, 0 он збо брни ту е чеки ти шмат їз
Чех Оіу Мес йвротух ТЕрошімМ сіб б/у ЩБЄ тТпх уд Тнх Уді Чек Бех зач 30 235 йо
Пец біу біу був Уві бій рЕОа ГПпуБ беху бущ Аз цув ТСВх Вів ТвроСУув 2435 450 КО йжа Бк Сув Бкй Ада рез 314 Бей їч сбТУ біу рко Бек уаії ВБе Коха в 5 ан)
РНе ро РКО був БХО Буд Ав о й Без ес сів йек дже т то см шу ВО 255
САМ тик Су мах Заї Уві Авроуаії бу Нів 105 АвроБко Зі: Уа, Її ув я служ й: рЕсж ЗО пе АвпотТкротух Уаі Авзроцує Уві бій уах Ньнодеп Вій Бу Таж бУуВ
ХУ Що Я 32 зга пах 010 біс бій тую Авт Бек о Тв ТУуг Ат Уві Уві дозу Маї Цечз
КУ І 315 яма ія т имі М до сте Ви діл тя зе ур зе Тім чн ти паче Ж т
ТакоЧаї іїмі Мія сіє дво СКробммі Ав СБУ ув опіш УЮ Ббуз був їв 345 345 з5а га тло м годи В, чно ЧОН пе ух КК 4 7 - ті: бимих тт
Чаї бек вва був Афон) БуО Вів вто із 03 Був ТБу їз Зак був за5 БО за5 віз ув о Сіу бій Бо Ак пад Бхо бій маї Тух Тих оіза ро Ко Щек 370 375 зно джип АвБр обі без тах пуб Аби білпоуві Мек оів) ТЕ Су іва мМаї ук ча: й з9з ха
Зя5 380 335 о 1іу віє Тут бто Чех ЗБЮ Хі1з Аіяа Ущі со Тгр бій Бех бами обпіу СІЯ за 1 аа
Фіто КУЇх до З «чем т г пк я Меиу ха (У дез важ «іх
Вк іа ви еп о Тух Був ТБЕ ТУ Бто Бкб Уаф ва Бр оБет Аврозух 125 А А
Бех Ре Бе гец тТух Би Пув ем тТвЕж УУаї дер обжв Бех бку тТтвоція
Ах 44й 245 кури 1 пот че У Тег «зх Ми ле ФІЇ 1 (1 п ще пл ес щу
О1п обі блхп о чаї Бне бех Сув Зежх ді Месб Ні бій Віа теми Нів Ано зва ї55 185 пів тТУух тп са мив Бех Пец баб сю Чех БКо Біу Був заз ати 375 «10» 15 «ахих иа «З10з ОВТ іо БЕ ета ве сій зу «13 Бпомео карізда
Ах, 15 «ах що ж ті ли та; Мк літ дом з дажу. их тт пе ли раю бен току іш Тіз УЮ са Тек Сі Божх рко Авро пре бій Бех Уа) Тк Бхо був з « ле 5 ря Є м що біз Муш май ЖОх Ра очне лу Ажтч о тйх бех бій! оЗеє зе ім тТВх аБО та зи 4: в) вх 3 їх о НівБ'тТкю ЖУК ММ був Бжт Ввробій деки Бо ме іно о Пяем ї12
СІЯ зх пу чів Уві Зетожм Хек їі Бех Пі Уаїк о Ббто Щек Ак раз бах З1у
За Ух 5
Зако ск Пех о бім Тит двробвв о тчЗу інш ТВ 118 Авт ех без Бра дід
Б та та на чі - тд су стек руч лу т шию бе сечи рія, те. хо сіз Ао дів вів ТБ Ту тує Су Зіп бій дак ода Жжпж тв БКо кла ча па тах вав сі іу ШУ Ту Муз Уаї ші 12 му Сіу (Му с0хіж ех бу іс 195 їхо ро и з яки то по не и и НИ: хрщіо тд піу пі пі пів уві Тех Бец ба щі пех бьу кл Дія Бе аз Буд ле Зі т 115 15о їх зу Ти ПР уче тів А ю Тов Січ й Між ї Ск гія пер ие пд хо тах щіо таж цеоб ТОК їх Та Су ТБ пе шШех щу Блеа Бек Бе) 130 а 140 ває Таж Жах сі мес Зіу Чаї і Тр Хі Аху спів Бхо Бо сію Був 145 15 МУ5 15
Віа їєчь піз ткю їжи Вів нів Ті То ТКр Аве Атю АБЮропуй Аку тТУх 165 а 175 у жо АТ тах бик Ж Же же пло лем так сту пу кут : да їйїто Аза їм о ПСувз бЯех Вко їм ТбЄьу їі бек уз АБО Тву Зак Був 195 1855 155 т лій 723515 1 тумз пи р сптрох їх Гени зх с тк ЩІ
Дат ів уві Уві гема тру Мес тах дяи Меб лед Бк Уві Ав» тах Вів 195 200 05
Таж о Ту ТуУух Сув Віз бій 11е йвшо Бка Біа Ст Біне Від бук Ткродіш 210 їх РЯСНІ піп піу Тнх обейц Маїф фа маї йех Бех Бей сі О1у Сув Кре дво Вху . 4 зак щі 230 235 4 ліз, Літ лих сім піц Су «жа «М
ЛУ Кн «15 ЕКО «кій: Штуузна послідовність «їх «МЙ3з ЛПінкар о бекінець люДИМИКОЇО данцюга Таб кали «Хо
Тих 1зи зх чаю и дом де гля КТ пох їжу бі бЗіу бува пе Аво АкЗ п3У бій бу 1 ту 10 «ВІ 18 «Му 477 «шій» вет сиМів їйхио сабіспд
«ім ІК пе Стою тт дно ся хи сту Зам іму КТ пай дах ток її
Аврої1є заї Мес Тв бій ожЗет кто дБроБех Мей Хіа УщА Щек інн ім 1 с 16 75 71 чн жи лм меж я Зм шк 1 лою мі Де іх ДІ ліц Ахп Ала так о ї1с Ави Суш Сує вія пвх бл дат Ух Ав БРИЗ Авр о 25 а ох о я Мк о мг Аж сни Ср ет вто їУене пряжу у крити. Тури піу ВвроЗех Фбйе Меп о авлаожкр обує шуп сіб пуб Вко б1у бій жу Бро 25 АЙ З
Бувоїзи реа т1іе Тук Тих НЕ Зак Ав о Себз сіб Бех (Му Уві вто авр за З ве ка ре Зах зі бек О1у Зеж йіу ТВ оАвОо РБе вх ей ТНе т3є бек то та що ще щи є З КА пі» ї1Кщ КУ я к саморуху п у и в
Бек опей бій Аза сій бвиомаіїі Аіа уаї Тук тТух Сув БІЛ Ол оЖехк дви як зо 25 1. токах кити рик . «ех и ку зум дик тт пл тля з ек піз двроВто тТУхХ ЖЛрх Віа обі між сбСіу ТВ о МЗуд мед 010 Туз пув ОДУ 100 105 116 т т ие і у т хх пла уд бі т хи пл шоую різу п ім ослім Чек бі З1іу пі бі Пій Уві бід пем уві бій Бе сіу А1їа 115 5 же 115 179 ї25 они ши ше що тую іх ді - под дит ЛІД ліхує (тля «й 1 бах
Зі аї цу ПУБ Бхо 01 Аза ек ові мев уві Бсх був Був Аізвз беу
Ах зе щи
ЗО 135 159 3 т ті іє г МН зи п Зла мя тло ТІ дроту біу тТжЕ тах ВБзе Ту Азпобтук Тк о їіз із тТхо Уві люд сів Ввід схо 145 ї5о ї55 ї50 афиша ни шин т тУміях їх 1 де жує же с фа уж зу зів пі пйеза сій тТтр оз біу мі ї1Ба АБЮ рто ек АвротТНх тує 155 та 5 вка Ави Жук АвБП їв ПУ КВНе Буз С1У Ах Ууаї Тк о Мек Ту Уві У
ХО їв чо уві Жех т»ж о Бет Ту Азїва о тТух ВЕ Сі сей дКа Зак Оз Ауоп Бех Ар 1545 Оп Ка
Ав отТзх віз ММ тую тує Сув вів ху Ба З1м АвО дат Авто бух слух яв лак дя й16 пі15 КІ, дек су Мет Ввротує ху Щі піп о біу СБх Де уд ти уві Цех Зах па 238 5 пай емо сіу пу Ск ВІВ ім жу уз Пех Пух ВароМмув БК Ніз тТБу пух жах ШУ й
І у пт, з лих М зокжет о Фошщия ТУТ я чн шу їй фе: шт гтто вхо Сув ко дія Бо Пій без глну СТУ бі Ба Бех мі ВЕ беб;
За Ра КІ на ро хо Суб о йеєб ув дВвротак беб Ме їі Зеж Аа б ре Вуо с ет - й зец 75 288 З чн хна їКх 1 щ та т. 15 жде Ми и дош они на а ше
Заї тТвх о Сув ді мах Майї Авромаі Бак ців Сіза бвробео пай МАК ТВ
ВІ ча 2:10 у жу Ту 1 ще тат худ (ут: лиці же Аїд о іди тан ху пев дви ТЕротух уаі Аво сМ1у Май мі Уа нів дво Аза був НЄ МуУВ ще де Зк ро 305 310 115 КК пе - НІ а т У ж. жати свя Ми ку І г тка її в ту
Бкз о Вха Іі см сія гтуУух вв о За тах о Тух Бу Май чаї Беж ут) Хом 330 345 ту Маї дей Вів сіб д5ротТхрогам Ав слу Мув піч ТУух ув Сув пу зай заз 35 хх ІВ хх ше Я щої ТУ ді дич З у т коугдо Має Ж них хокют
Маві Пет блю Му Аїв в; Бко Аза Бжо хіз 03 Хо Твх Хі: Зехє ув 255 355 355
ВН гу НН пошже зо жчх МЯКІ пен м кл бяятих р Така ПН я их сли
Ма муз жу ліп ро АхЧ о бМма жо сів о УвВМ Ту ТВх Пец бе рко ме
ТО Ух КЕН) х соди ФІ тону ря тя» як таж р, Ач Ярі жк уж тет вх Заросіч цЕб ТтТВХх ПУ Ап оси ві боу Пец ТЕ Сув ви Ма щу 285 БАЧ За5 25 т п пюкк о Шк З пе Тл зво хх Й Ум КУ пох до пі дк Лк бЗіш впеотТух РкО Бех пр 118 Ата Уа1 0 тер о зіа Бет бвподіу іп 405 319 БУ хо сім АБО АБ ТУЖХ Був бик тах Бко хо аз їі АБО Зежх АвроіуУ й аз аа
Фр ПМ їУ ГЯ ми тома Те пи ХА : ее модер п зва цех ВБе бле Пез ТУух Бех Су їй тих Уві АБ Був бек АжоО тка бід аз 40 її ста обїу дв Уві РБе Бех Сую Бех гаї Меб Мів 5Ма Мія Ми Біш Ал мя ЗЕ чай
Кіш тую отих ім му ай дамі Чех о з»зи Зех то ЗМУ пуд дв 470 475 «Щі хм 19 «вії АВ «дій» Ву «Ви бойо зарієтв
«апп У 15
Ін тт деки Туш (ау бін ху т охеш. Х ція сю у те ря
Уві сш рз був Бех був блдролув ТЕ НІВ о ТаХ Суш буо БУ Суз РІО
Н х 12 хо
Аіз вго бЗій без і іу Сі Вхо бепоуаі Бе бец РІВ Бхо во Мує п У ХО ес му Ввроїлж їм; Мах Тіз бех Ахе їблх бтЗ сїч Уві тах бущш Уді 30 їх 42 їх? ве Моє щі ті й їжи (3: тд Зо ди пул чу
Таї Уві АБО Маї Шек Нів Пій бе то 53» Заі Пув Бе два ожЖЕо Тук п: ет дл 50 хо о зд дл гл як Чт: ді ців дим АТ зи бат тям М У їла гла 7аї Авовозі Чак січ Заї Ні о бва) Аза бує ТК о Ппуз ВКОо АкЯ бли с 55 7 та зе йпій тлеу й Фе и ик пи лйд оо ша тоді М жк томі Мі
СіпотТух Ава бах Тео Тук Вуд ах у Бек Уаі ша Тнх МВЮ без НІВ ях за ЗУ
Сіп о Аво Тв без АвпосіУ Був бій Тут був Сув о Пув о Уаї Бех АБО ув 1 їпа м віза без Бо Віз Бхо 18 бі бує ТИЖ ї3е» беж Був іа му слу СІВ хо 175
Его Ах бі реко Сів уві тує теж їм Рей Рко Беж жд АВ СВО Б 3 155 ТАЙ
Бе Хв вв» бів саАЗ Зех їв тах СБ ОБ, Уві Му Зі Же о тух БЖ 145 155 ЛУ 188
Штих лож КІ АФ АЧН ИН Чі ух ж Ск бот хе р м жк СУТ ут 7:
Зат Ашр Хі Аз Маї Бій ТЕО) сп бех авпоїМу бій рхо ЗМР АщВ Вел
Ех У У 1еУ тт їТ5 тЖЕ зу Таж ит бто бто ай іже ВБроБет двропку дає б» Вре гей ї8о 185 ї90 тут ех пуб іні; ХХ Уві бвропув деж Ахор тю схв бій Зі Ава ай 155 тло 05 ле бек Суз дах Уаї Ме: чів Фі Аа о іїжиї Нів о АвиОНів бСбуж тек оОпівб їтпе бак Суз Зву зд мес іш я Дів їхні Нів двпй їв тТух тк опіп зап ре чи
Хо 1ї5 вай
У о шими лини мо т их ке пихи бу я из и б Лк и кт
Пуш дек та Пежо бсу Зеу бро сім пу о пуУу слу біу пву пі ім (1
Зх 3 235 зай ту АвБу Тіз ові Мес тв бій бек бус ДЮ бе о плеа піз щі Шеко їж
За І 55 іш січ Ак Вів Та тів Ат Сжв Був Аіа ех біл оЗехт Уві АБрокБке 25 БУ 70
ВврозіуУ Авройек Біне Мес пам обтхув ТтТУХ ЗМО ОТи Її; Бго Бім спо Бка 275 т78о зних
Колкк ще т - ж Бр Не нак тах суч Кіз идх КУ чу тт Дія хо був шо ї- ТЗіє Тут ТИХ вк цех вшМ З шо» пех Б1іУу уді Бе йЗа зп 500 . дон стік тд тю пУую СХ хи трьом аг ру се пу 1 Ні - "су
ВзродтЯ вв о чех с1у це бу Шех су ТКУ Авр о Бе Зх рем отв її 05 210 115 Зх
Зст Зак без бід віз сій Авроуаі Зіа Уді тук тух Суд Зіпйп бій Бех 35 230 33 ля: щих Тих жує річ че Жука Іл шо ун ОН ня Шасья Са а и НІ .
Авиошмо АБО Біху бух Ва вве су бій бі Тахо буд бе си пів пуд 3 345 50 п ІРчУ (г лу Зак Й пила Іа, (11 уд роби м п ух 3 пьуУ ск су Чех Зі1У і щі пуу бід зді ща Бей Уувь пла Зв 1у дев ц ке 355 ї60 355 а кітч ху тим її хх хі бік. 13 рух баби в хи гієкщо ххх г
АМа см чаї Пук ому то сжіу вів Бех Ма) (ув Уаї Ват Пув ув МА ди ач щу 370 3175 зва
Сб ил тя чив й я лУри ЧУутях сабо пря лу Тл ра пану ЛЯ т м щ дак обіу ТУХ Жпх о Бде Тож АБО Ух бкр лів Кіз ХКр о УахМ Ажщ сів Від 385 о 355 0 тю зх тя ін КУТИ - ТІ ла Як щу хи СК. хе тр жа пі біп бБіу реп біб Тк о ї1із бі таї хів Авр орто Бех дев о тах а: 10 315 тух Вко Авип ух АБИ Мужв о Був Бе був Су Вк мях тк мет Тпх Мах 425 435 30 чаї чаї ек тах бек ТВу Віа Ту Меї Сій іа дкс о Шек ей Аго бак 35 4410 245 сс ФІ Ол 1 ри ех якою КІ Де Вам пзяи у р Не» ень
Ар Ав ОТИХ діа Ууді рук ТУуХ Су Аі Ат дБ ОСіУу Бр оБежЖ Авротух шк и АКО
Тух Зах піУу Меї АБО ТуЖ ЖХХроуУ щік суу УБх жде мах о лТх чаї Зеу 37 мя ао цех ме піУу щі Су 15 сій 23 яю зп каїї» ВТ «8132 бю завісйх кА ТО
Аа РБкс Оїц о їзвм Хевросуу ЗКУ РК дех уві Же Талі Ббе Рко Бу) і ч ч 12 13
Буг Був оАнр тах Мем Мей Бі бех бху ст хо зм; уаї ТБХх о Сув Ууді о 5 За чаї зві Ввр ув бек Мі Фк о веМ Бхо й маї їли Біне вна оттю тТук 315 Фо 15 уві ВБИ обіу Мав озіч аї Мів Вямй вія Був ик Був Бк Вко Зі осілі
Ст Ух 5 піп тух зви бет тах Тук Ак Уві мі бвеу Маї сем Твх Уві бем Мів то пу за
Оіп ввроттробез Ап сту пу Сійа тут був Су ув тУаї пет Авто пу 85 чо пу
Від мем о рхо Аіа Ро їі бій Був ЖВУ Ж3Зе дажк пує вів Ммув їж СУП по ІП 113
Бко Ах іа жо сіб уаї Ушму Тпу їй бо то Яелобги Ввуогмі Сеч 315 128 175 пвж о гув Ав слів Уві Бех бзи Так о Сув ей о Уаї був бі где тТух РІЗ 136 М 140 зак Ті жЧд о лід Сію оку гі и їхіяя т мех з ек Атротіє дід Уві Сі Тхр обо бех АвпошіУ Сів Бко бі лап одн 135 і52 185 162 бух ук ТВх тТну рхо Бхо Мах їм о Ашо Зах вер Ом Зеж Ве біма БУХ 155 179 ї75 бук Бах Му ХшУя Ту Уугі Аврозуз бЗех бху тТхросієй сіб піу Ахо Уа)
І80 185 1за
Зпе дех Су Чех Мі Меї нів ом АтТа без Нів о Ави нів о стух Тйк 1 155 200 205 . скоє з: ФіщдкоТймо Пік 1Ук:у УЗ ук оокушо с сжх ія ік ли І ги
Ку шщех спез Чек Пчи ех Вхо ЗіУу пув обі су сху БЕХ Зі бух щу ті 2ї5 хо пеян йшли А ся плин тя Шоу піну йоду ду чи що їкш Дрлиюх Стака
Ем АвроТМяз За Ме тТЗх біл оба го Ажю йавкоїн) ЗА МАМО ЛЕМ ійлі --и т реч зле пя ай МУЗ ях
Зі Сі» йха Міа о твжк тів ав оСув пу Аів Бпех із Зв уві аБЮ вна 24 250 иа вро Аво»обпех Біма Мет де тяо Хух бій оспме їу5 о Бсо Оіу же Бк лаб Р 279 я сочуки М охах Тех Мк лаки кун ру их хм ко кі. кру 33 у та тіия вхо см Хе ее хів хух ти тих пех вим о Хамв опМмо хек о ОіУу май во
ВТа зо яка
Авр лІЯ тв ех БІ ет У Ябвх О1У ТУ Аво о бив ТВзЖ Мей вк тів за 25 300
Зе2х Щек беи сів дів 0 Бр Уа) дія баї Тух Тук Сув О1йп сій Зо 05 Ах15 НТКВ ЗО
Азпобіз Ар оБтз ТукК ТБХ Бпе шуж Суп білу жк був Пеб 013 тле бує 355 33о 335
Зі сім сіж Бех Зі 1у Зі Ту бій уві бів без Уаї бів Бек бу 320 145 150 діа сіб баї Був мув РрРхо ху ві Бет Мазі тує уві Єви Сув цу Аа
Уха зай за5
Ззає чу ух тОЗх БіаЖЩ сну Ав тжх хр о ї18 а тео Уві вх о Аза 37 375 зо тлуи г ті чя т С ях ря 1 я ха в «і У беж й сказу їхо піУу бів бліу бе бліц тк о Хі б51іУу щі їж Акробго Зсек дВщротеве 385 ЗО 385 ря па 2 спчюен о в чик т тоне Хаутет яку ян яке ЛЬ Те
ТтТук вх деп о Тух зви Пуй Пув Бе бу Бім Ак уаії Ту МеЄ Так оуаї 305 19 15
Чаї Уві Бек МУ Хек таж Аїв тТух Май сі їлмі вк ет сем Ак Ше ри ак я
АХ 425 30
КА превую Е чор спуску сли В хо ска ам Дари: Сашко Мах ру
Азов оАвротоК Аз очі тУХ Тк СУув ді вка вва опіУ Ао бек Берогух до Боже зла
СИ 140 45 тУук Бек спіу Мей дво тТук спр о ОАУу бій обі так отак УзЬ ТБх Маі бає а щоки зас дек їн сі ПЦ1у Пуз «ХОМ АХ сеї» ВЕ ри ие
КК Я
«1» 0 Меийсх велів
Бор 4 піз Тіз уді ем таж осів; Бек оБхо Авробве сп Бех ЗАХОТваК ОБЖ Був х З а їх см; ж о Ууаї Спх Вде таж осСУуз АКа пу бек сза Бех їі Зі Та АБИ 0 Кі ке тів нів Клр оТух спол лій пу РКО бу бал оЖек Бо пу Оу г тії за 0 45 - ста чі ук б Фтилк що Пе ся лу кокі ках ке вч соди бу Січ Маї Зех бін чек Ті пех О1у МВА. то бпех вха Ка ех Су
БІ Ух во ех бСбіу Бву Зі тах Аво Бтне ХВЖ Мем ТИ 11іе Ав» о Бех іїМмаи М він ва т 75 зо піз Азровіа Аза тйхоЖух ТжЕ Суш бла біз Шех Апйп о лвж Тир око Бе 85 за а5 сть (5 МАЯМІ Кт чим зе їли 1 НК - тю ' з фл ди ГО ср Є жк
Тни вав піу Сув ШУУ ЗХ пуд УМ мМ о Яі (був О1у біу йіу мех у 150 185 115 . нн нн и и и зн й томі лід тує пі су біу п3Мп узі ТВХ ей БхЯ сім Бек о сіУу ро Аза ем УВІ Бу 115 128 Не хо тп ом ТК о зед тат рем талосСув Ух Ве Зеас сдуу Ббе Беж Кеш 335 135 140
Зек тах бек пі Меб бі Уущі у тв о х1з Вку Зір бо Бо 01У Був 145 150 155 150
Аівз пев ЗК ТЕО їм Віа Вів її6 ТжротТко вно дво о лвб пу Дхщ тує 155 17 НИ
ВдпоїхОо Аза Хомі їм пПех Ака Пей тн 13 Щек о був Ввротнх двлопув
ТВО 185 і35о нетрі хв (23 тод пуху я Су в тк Н щей ко Дамо я «де шт ші Чай Май їн бл Ме го оАжа мес вро БхОЗ уах Аво тих вів їза по тп тТвлотул ТухХ Су Віа бій ців дяк о БУ Алвоткр о Бце бі тух Тк ому 210 215 ТЕЙ дм спі Тахо їмо ЗАМ ОТлЕ Зах ек шех Мазі піц о рхо зу дак Суд БЕ ха 235 р: 243
Кк ЯМ гі с Ж хи шжти: Уже еле - Ол тійстин З оф и ит
Буш ТВХ Нів Тих бу рЕО Бк Св Бхо Аза Бо б зма Ба Бу пу 235 ВІЙ Ух ть зи да: фо УЖ Вау у «одну тд пн око ха пс пок УуУаї Бе їі Бпе БжО вхо Суб Бк Був АЮ ТВХ їй Ме Я Це 850 ша РАКУ с ї сяє рен, 0711 17д пня сх 1 уд дж, а пек мі мол
Пех ах пк Ехо піз УвЬ бак обу Уві Уві ві Авш о Уаі Бех нів с ах у 5 - Е что д по няня х 1 ла пт жк А пл щ3 сх
Ано Бо біз УВІ пуз БНе Авп оту Тук уві двропію чаї сі АХ Бі -в як за
За 235 зо тах 1 лх бля тт ке Б піз 31. ге ле жо йог Ст трах Де дві Віа був ТЕЖ їв РКО АкЯ сб Зівз сій бух бви Бак ТЕ ТУуХ Зх 305 ах 1 каче таї АХ Зат Уаї їжи) ну Мав їм Нів сій Азв отТтв ої Аа сіу був 325 Узо 155 бі ту їув Суз Буз Уві бек Ав був діа Бей рт Зіа Рка ї13іе и зай 345 355 то чинне тю Вуз їли пі т СУТ ЖІ М ТУ, х тс йкгу г но ли пли
Був тих Біз Бех мЗуш Біа Су слу СІЙ рКко Ах піч Бхо бів Уущі тук 355 ЗО ЗУ пк оку Ве з ду Я . 23113 тим) ау ух пе янь
Жах їн; Ркз Брка Бех Аха Авросій іїна ТМЖ Сже авл осі Ул Зах (и
У З зап тя й гм лм ти пи КЛ лак -г их щу Же їжи у щі тек осСжвоБза Уущі був ск Бре бух Бхо ет Авор Хі іа ак січ то зва зо 385 що ще па ст я ТУ прути ТТ, пт Жаму бач Тим я ств Ох ус че ут
Зі дех вад о О1у бій хе сію вв бяд тує ув Тахо СВУ Ре Кто Уві щи ро ках
АП й дах ї-щ-ті Авробех Ввроіу йеЕлоБве Бе Ти тує Ше оМБув Би Тих Уді Ащо з2й їх 436
Пув Вас АкУу Ткропій білу депо оуга БМе шву Сув бах Уві Меп Бі 115 40 45 сла 18 тем ща що Мову ЗМУ що бр ях зу тихо бори пило их тема шт тачих м; дів бе) нів дво Міз тТух жнх бід Лу бер оБси беу цей Бек Бо 355 Зо су ув 155 «ЕП 0 «рії зав «ТЕ их шоп «13 Момо звауріста
«Ох я ази їіе раї Меб дж їй Хат Бо Авробек бе Аза Уві Зах бе піу т й 10 ї5
Оки с в НН НИ Зо буує я лучан 174 долуч лУНії пл сіб Вха вів Тьх іа Ада Суз уз Вів бе пі Шев УЗ Аду ШВсе бор ру Ж їй сх жаху Лкк ІУНе сут й Фут кино їн шен нок а сте ТюеЄ ціу йвроПек ве Мої йди Тко» тТУухК бід бій бує вто бі 01 со Бра т БУ 35 ї т Тищії Ко тіккає гри ТА лк пт поем штат ж лу рейх ще пжвоіна інна хів Тут ЖМл Тбж чву ав оре) бе ех ОДу МАХ Ко ВБо 0 35 50
СУ І. Пе; їх как аку неон ник кає ую Зо дар ти СГ дк вка Кіма Бех Пі Зет Пп1Уу Жак о сліУу ТБ БвЕ ог вх Би ТД пле Бех о ти У що ек ї бява дій пі. Деу злії дід ді Че тек ому тоб бек жо ек бей бід Віа б АБО Уугі вія Маіф Ту ТУК См; бій З)іб бек ад вх ча 25 пі да зу сту ЛИ жизуз ат п яю сти ти Ток: 1 З коти
Зі вар охо Тук Таб їпа бук Під! бі Тв пуб пе) Зі Ті пув іу г 5 15
Мо 10п5 15 - пк тини ФА У піс (и бін ла лЖ їи "ві ліз вс ім із пі пу Бех йіуУу шіуУу щЩУ Сім бів маї біб Па Узі бЗіа Жег Сіу Віз
ЗІ 122 13х сі уаї був ув Рхз З1у Від йет Уві був чаї ех бує Су Віз ЗЕ і130 115 145 буж тТук тиж Бе Тох дБ Тух Тхв 118 МНіБ Ткр Уві Ахо іп дід вхо: 145 150 5 150 гій гл ля ма Кр те - НК Соч ТЯ се їн виду РУ, я рн піж «лі Сувз ї-щб Зуб Тср о т1із бі Мах гіє Аво о Бго Бек Ашеб бвх о свух 155 170 ТУ
Бус вл охух Бала Му Му Ейе їув (1у Бхяа Мі тах Меб ХВ Маї ах 139 183 ї19й мах чек тик ойек Твх ад ЖКух Ме ім рей Або Чву іїва Ахо беж БЕр ха па МУ пе ню Ал Толя їрклю тк дз о ду о чин НН двоотьк Аіа Уаі Тук тух Суд Аза дк АвВо Сім вар цех Ав офбук тТКЕ 218 Ух Бе ех піу Мек дер о тТух Ткроу зіп сіу Тахо Тих Уві Трк вах бек ех 355 х13 235 й тов о Аво жд ла с ОСУВ заз х45 іп»
КЕ й «Мії2 8 сих БЕК «діл» йпожо зарієна «400 33
Бче авд оБка ім ша Су і У «Ве 84 «-хіїМ 5
Авіа Би ель п- тт фі та феис пр дя «213 Штучда поспліловміуте «аддх «В СО 1 варівсстпьвої збтласукі важкого павниюув КВ «400 34
Аг мух ЛхЮ о 1іж ів 4 Кк «10 5 слкйх 5 «Вій ОвНтТ «іа» бтучна послінсвнісьь «ай» отут еру чада чи о и поету пло пянж «й» СОА1 запізоздьиої сбблясті важкого паицюга 3 «В» 25
ФУ ві гне х е-
Звр діа тт мех АБр «810 76 яти «аз 17 «МИ» 0ОщУг «Ві3» о щтУучна послідовністе «вай» сту о ТУ гля польс уми пачдчитит учи ух уста ЛУ «ШЕУ СОВЛ взарізбеньвнох стманйто нАжисто панцокв йпе «ах 5 пал дл й : А с пе поек соту жд т: - от:
Чві 112 АвроБєо бех о вво свт ЛуєЄ то Ав БжХ ВЕ Зуд був ВЕБ ГУ 1 5 10 МУ ліУ зЗіу
ЧНН А НИ ав за «ух 19 «П1й» ОВЕТ ква» птуєид посдьдУвщлить сяеюдіу дат «Ва» СПАТ варіасельної сбдалть важеско ндввиютя З «ап 87 ї їх ни д поч. хх ча Для у тс уж зу З що ТУ суч іа тіз вк Ав) Буб Азія АшІ зБИ Гм ів Тахо Тух ук Аза сій Зо 1 ч зв та
Чаї Був Щіу яз ча «102 28 1 Я «-й1ї2 15 «ВА ВКт «-й135 Штузнав поспідоаніст» «ай» «Вй3т СОПВЗ3 варіабеальних сМмівплі важестоз павиюга й «М» В
Авпоіу Авр обек Ашо Тух Тух Пех сі Мес Бр Оотує 1 5 16 не - «010» 29 «2112: 6 ил, Та «їли РЕ «213» йхучна лпослілсвністе «ай» пей3їх СОВОЇ замізабальної сбласті важкссго панцюхз ЗН7 кали 25
Тук Бек Бто Різ дія Тук 1 У «пі0х 30 х»1ї2 «лій ВЕЖ «йї3и штучна послідсвньйть селен айох «2 СПАЗМ дпарізбеониї обдачех пФгкоїє; п"амиюта й «АдОх 30 япфее хи КІ ес мі УНК "тут о дош шк ях
Ат твє Шелл осів Чех хів 1уУу ТА Аво Хе нів ї У 19 «К10х 31
ТУТ я чи Кох яко «ій» ВЕтТ ур Пвжлиті А жахи пет ит 13 фрУична постукати «ЙО» «ШЕУ» СПОКІ схарілстдьї обаастмі сракого чірилівутя ЗБ
«400 ЗІ
К йду їз їх Жльша «ниж ТУ ую пу ух медтих ха Азіш Бех бів опім їв обех Слу Тут їм ех 1 В 13 свійх 35 ха «ВК ВЖТ їз щеуцна послАдичнлати»
НЯ
ЕТ ЕТИКЕТ утри тт т, ти сте ил т зу А пд «ВИ НИ васталналтьної сббопмлті легкого пзнсиюка яв «щі 0 35
ЗЕ Мах лек сл чех Чі Ле і гЯ «в1йх
АЙ
«й1їйх КТ их аМипнтумоя зичимо іх,
АЙ ху УпОСЛАХИІВНЛАТУХ
Ей ста ТТУЖТУ дит ут густих кл тяучя тки чай тут у «пай х СОНЯ варіабальнох сблашхі псткого ланцюта ЯВЕ «ПО» 35 моз и и и ни нн ВА тТук уУаї бЗек бій Бек Те шу
Бо Б и «сли 34 «115 7 су ше «їх ВЕЖ
З це це ІЗ рр тифі м Ух «їі» Штучна послідовна ть «й» «а3з СПОВХ еврівоелької сблалті петксото ланцюта о аце «ай» 14 тус вів песх бід дає фМеа цех ї х «вій У «її 7 ил - «пай БЕТ «13 Штучна слепліуовАтить «вжи тату», Кинь яд ку ге бксгттт, ку нку тай - ее гшчті лю «й3з ЩОБ» азрозбальтомі сгпудаєж! десжоКо лпамиюдта 37 «вай» 35 7 бАО бю юю тсУ дов Хию іа Ахе пед сКпЖ і АдО ле - п і ; єп гум, Ічня «яву УЕ ях БУ сля 0 шр кЕїде ГКІ «212 Штучна послідовність «ах «кам СОВ3 ззрівйельної облайтА лелколпо ламіиюта ЗВ
СН К
«ах ЗЕ
Пій ди; беж Ап тат Тр овто пе Тх 4 к, сах 3 хйії» З
Сина о. 2307 РЕТ «ІЗ»: Штучна послімдсаніств ех хи «ав ух СОНЗ взріадельної сбласті лпеехога паниюта 3Н7 «Ох У
Ж отв я бує Па нич, - -
Без пік ТУук Уві дсу ух РЕ ТУук Ту
ЩІ -
Б - до» 285 но «хЩіїх І2ї кад» РЕЖ «13 Штучна послідоваілть «вх
АВйІїІ» Варізбельна побласть» важкого лавнютеа а «00» ЗВ біт яз 1-0 Там Злі За юн 31 ля СУ дО Тихе тля Пи ля дл
Сіп Узі бій її Увазі йех ЗіУу Віза із уаї пу їжв БЖ біх Аза 4 5 че 15 і З 15 МУ пр їди за ля шко бхх їй за є ФУТсу тб о пйяяи дихо пкт пех о Маї ПУБ Уві Бех Св цу біа Зех сіу ТУух ТВх Рве ТБ лав отук о зх о
Тк її нів тТтр уві йха Зійп лЛіа Би у Сів обі ей сій То Меї 30 5 -
Зх Чаі Хі аБр охо лах Ащео ТНХх бух БО Ашж Тух бла о БУВ Пув Бнае
За 55 о тв біж Ахеа уаї Тих Ме СБ тах Ашву Тахо бЕХ Те ех Тех Аза туу ще а --щ ЗА
Ви мо 15 БІ мес бій дей бул оШех о пеб йо ех Аву Ашро тих Зліва узі тТух тую Су ца зо 25 в'я Бк АБИ піу йо чех вер Тут пує чек О1у Меї дав тТук тЕвОоЗІуУ
Мо МІ 16 піп піу Трх тат удї тає уаї ех Бех 155 120 «ВМіх 53 «ів 07 «182 ВАТ емо Певуцма мйотмліпесцмісУве ж я шЩщижУпМи попі лОоВнатКо «ддх «вві» ВчавеУюі1 ззріабольнеї облясті лескзго памнюга СБ «в» 35 січ біз аж без бСїпк сіб бек Рхз зАвровпе зб бек о таї ТБЖ БКо ЗуВ 1 У 10 15 ери т у шин ач кі и (у Фіат ва рах» бля ще сів Був Маю о тах тів так оСув о вхяа Таж беж за Жак ї1Зже СТУ ТБЕ Аєп за еВ 10 я м ие шко Шо хх іх Фу жін Тих Ти лота
Тіе Ні ТЕв Тухк піп сі ДУ бро Аво» бій бе кв ЦУуВ Сем Бе Її ах
ГПУув зво оУуаі Бек бі бек 118 За Зіу Чаї Бжо Бек ВкЗ Бне бек сі
Зо 5 о
Бех бі Бех біУ ТВ АБО БЗе ТВ Бен ТЛ Її деп о бех Гей сід Аї5 «5 76 та я піп Азр о Аїз аїв тТвВК оТую Тут Суб ій піп Бех Меп тву Ткр охо Ба» на за 55 тм ввозу біу біу бах Був УМХ щі Тхв оСув нн хп5 «213» «чо «йів «дій: ЖЖ «віз Блучна псслідовніств «ай «вом нчаВауО-а Берізйельна платять перкоги ланцюєюа гпуманівзсвановко
Не «4002 40 ші 1 тд сом у стату дзиию Ірите М тую ха бидує жч че гУ тд
Фіз Хі ві без таж пів Шеко Бо АзроБба біло обшет УЗ тв Бка БПуз ій у за Я -- - кА ло пи тохоєх Зидо траю ж є пт ж Я х паик ім З чл гі вк п паз був УВІ тру їла тп був Ак тах о Пех бій Бех біта п1іу ТВх ВЕБ о 25 ха яю ці щоку слу ТЛ (І зе Шічикт ваш (ри бум ІМесу Тло У мя хо т
Тіз нів бТкр отут бій ліва Су вже АБО Сійп Пежо Бпуо Буш о їмі Хмті Х1а 45 зо КЕ
Пет о ТуУх Уві Зек біб» Бех хів Беж сіу Уві бко Бек дж Різ Зак О1у
ЗЕ во дек опію Бех ОС1Уу ТАЖ Аво Без Му йез Тих КІ Аа бйед опе О1а Аїа
Ух 75 75 да піч днровів Віва тв тую Тух Сув ПУ сій Цех бде тик Тк Бус! окКВе
БК) зо 35 так Рівз піу біу з1іу твх о Сже МАМ сіл; Те був 106 105 «810» 4у тії 307
СІ ех пит пе йкнож пок «213 Штучна послідом сУкх хау «ВХ нсшвулЗ Варівбельна область лепжсг яваиююа гумавізовавого
ВУ
«400 січ тів уаїф ред Тйс бій дек вхо вар обов біп Бех змжі та ка Був 1 З 10 їз січ тує Уаі тіж ї1зе тк суб вхо чує дек бів Пех тів с) БЕ АБИ 15 33 тів Нів Тр отух бій пів пуз бхо Аввошів Бек Вто Був ем о Бео І1Ф 35 30 ЕІ цуз тук Віз беж бін бек Тіз бек сїУу уаі рко бек ку Еде йех Б1уУ
ЗО 55 50 пек Сіу бют сі Тахо АБИ Бе тик см). ББх о Їле дво бек бен Пі діа та 78 за
Зіз Аво віз Віа Че тує Тух Суш пло Чех ввлоОслрл оче вжо Ре 25 зо 35 тТнЕ ве піу ліу сту ТНХ о Пуз УЖЕ сім Ї1е Гув о 15 «12 42 «ВЕ с «від РЕЖ тйї3м Мав пивної чАПОх ах авроїїв зі Мет ТМу бій Бех бхо ек Жек ої Ву АЇв ек бе у 4 У їа їх
У пе хх ся т яні и Мені Ма ум (У пу су су и ч - сів Ако уаї ех пед Таж Сує йка Віз Вех бій біб Тіє Бех бу тТух 2 х5 їй
Б ше чин боках УТ п кс ик; Тщ, Ті ТАває тлу й ит Тім Ше
Мамо цех тиЗ йо; Сі піп бу ВЗ Авросіу Сну ї11е Ат Ако Бема Те 35 30 їх бЧзиук дід вів бик спа те дені Ше 11 д тою Тит діт р беж хх гтух азів Азв пе Ла Га Ашрошех іх Уаї хо Су АкОоББе беж сі 50 ту ва «дн мин зно ня: джу тт Фу гару нн тих ни ше Ту 1 су
Хек отТксор обек П1у ВЗет Азов тує Шер обло Ту їЇ1іФ Беж ех Пше фа Жех 55 7 5 до
Ви Аврорпе» Мід во отут Тут СУуБ шу сі дух МАЮ жає о Тух рха тує зо сх ям 34» туз чу ПИРАИ Має Ток Така ах ж тю
Тако Рінав с1у Су м таж мВ Себ біо хів Був 109 ня «10» 4 «йМіж З «с 15 «Да БЕЖ «аВах о Штузня посМР ДОВнН гум «ад «йййх усе зв'юувальний свх решоетиосуа КОСТІВ «400» 43
Бу суб Брю Зех АхЧ ех Аво» Рто де 1 Е ач «вх 44 «лі» З поь їх «авіїх ГВт «хІї1З2з Шеичид послідовність «Ма»
ОМ ичьо Ум св зу Зх о и не их т очи «ай і п-зв'язувальний сайт рецептора ЕсуВІІВ «Ап 44
Флб5 бує Ріна Зеу Ак Сен АвроВко Ав
Х З тих а2ц
А МІХ т «Мк З сліз прт
Мою ЕХ та1Ев о Штумивз послідовність «ШИ» тай Дедшелв'цжувавиьвний сізУуй снмезІіувта ЖІУЮХХИ м дух, ц сах 45
СН оби су Ск пут ЧИ сих Те Ер яи
Зій Гув Бе пех вха Сей Або песо Ду ії З «102 ав -01їх З «Вій ОБНЛ -йМУх йтучна послідовність «йййх «ай3М Гойеозв'язувалвними сайт манера ЖсувхІв «Ох 45
Вуз Був Впе чех Вхц Май Авю вко ТБХ 1 г, «ВМ а «вів З «ММ ЖКТ «й шууцна пгнллідави ух
АЙЙИз «3» Їсй-зв'язувальним сайт репептсора Ко В «4005 47 сі Пув Бе Зех НівБ Пес дно о Бко ТВх 1 5 «Вій: АХ «йМіх З сатири «іа ВНТ «иї3» Штучна послідовність «вий» «ві» тТосеза'яжазувальниМм пейт снацертвома БОЖАХІВ «Оп» ай пУушжоМув о Ейе Чело нів ієма Авю Бе ТИХ
І п - я задо 43 «хі02т З «її» 8 «й1й» ОМ «3» о прлучиай МЛ АЛАТВНЛ
Б ЬЛЬи
Хешейі и «ВІЗ» їдСезв'яшувальний сайт сецептова БсУКХІВ «400 ач бій обу Бо Шех Бху 0вм де Бо БЕ Ви 1 КІ
«пійм 50 ут «81 З нти но твійх ТК «ІЗ» штучна послідовність пік, лей м «ий» тку зв'язувальнимй саРж рецептора БОУВІХВ «45025 5
Пуш пу БНе хек Ату Бех АБО Бо АвИо ї 5 «їз 51 «йіїм З «1 їрт «ді3мМ штучна погпійови сти «пай» «й83х аб-зв'юзувальний сайт рецемнторва КОЖВІВ «а0Оох 51 са ув Бай Ппех Ак ва Зав о дтОо Так 4 с ї З сечі шт в «Мі» З сту пе «их ВК «2ЗМ3 Шхуанв посліаністиь «ап тай3ї» Хл-зв'взувальний сайх рензптора ЕишувлІВ «й» 32 1 Б Ка че пок тою т Те. Бе їі був Ре бах Нів їі Авробхо Тпу 1 У ти10з 3 хат З «йМ» ОБНТ «В13» цштуцчма похлідьзмиїсеь
ЩИХ
«вай» Хо зв'язувальчив сплйт прейептора ЖсУКІЇВ «ацох ЗІ3 їз су пе ек Вжч їжі ВБроОрКОо СрМх я т - ІЮЕК
У - щи «дій 54 «12 9 се двь я и «ВХ» СТ «1 0 прути дуоденіт с» «сли 0 Тобі летить щх слина титцютітсх УЗ ХВ
«пог За
Пув Був Ре Шех Ніз Без Ащоа руб тТНХ 1 т «810» 55 «Ті» 8 «1 лЛЯК «віЗ» штучна подпідовність «авОх «8232 Праймеаюр БщчнаЗІЖ «0» 55 стуачзстіваск стазасцача псасзавкої сбсгас 36 «Вій» 55 «її 87 «81й2 ДЕК «ВіЗ- Шручна послідовність «ай «вай» Праймер попліва «40025 56 чдистосчссу спосздаесосус сосок св стбсассевоя сист 7 -910з 57 ха1Юе 87 «2125 ДНК «йіЗ» йтузна послідовнітв ах кхвайх Праймерв ЛавзЗІЗЕ хх 57 пчацзчепчає сстсодавною асадоссацячео сацстстсойс асозад 7 «8102 58 -1їі» 43 «Вій» НК хай Штучна послідовність «Вайм «да3» праймер о банани в. хай» 8 ксісдлавсост аусацсссос свокзефуз асалоцастм соч 83 «вій» 58 «Віз 45 «їй» Вик «їж 0 прууєчма пли вні св «ВО «йди Пюдямер Соп315В «аа ОЗ цисілинашсок сездакошою схе пооваЧчевоу дписстех 45
Чи педа с, зара ср Клеї ие Е З. г о «Вій» во «211 ав «ВІ ДНК «13» Штучна послідовність «хх иа3 праймер ПпупзібЕ хай» бо зум жзсоасас посусчасос взчопсвоще апсосодачат зчпососе 8 «ка 1 «х1ї 47 «їй» ДНЕ «13з Штучна послідовнаістт» «ий «ВЗ Прайееюр ЩИТА «Об» ву кпсЗзаавсхос сасствспсосй ссацсоваст сасзасдчасс зчсачесо 47 «10 б «вух хйійв ДНК -213з Штучна послідсвнітль «вух каві» пПравмеш ОБ ЗК «аб би посазсзсач соебсссапеа впдскове хї ха 6 «її» 31 «віх» ОДНЕ «15м штучна послідовність «ЙО» «03» Праймер ШупЗАОВ «апр звасоусачесь стсосвус-звЗзп зчасччове с 31 «хї10з в «ЕЩі1» 87 «Вій ик «Мі руучяа полі клевнІісутк «ВА: «ай» Праймер То БаБ «ай» 53 тгзавстов апроатситзУ айзлачо ї7 «їх 5 «В її ське, пк лаки Ап -йійз шШуУмчная послали имААть «02Их «иа3м Прапмер лю хабах кі січсабацаєх зопосвцаслес саваксккиак дат КІ «10 45 пахьз 3 ся1йз ДНК «132 Мтучниа послідавність «апа «ий» Пранмер ЛІВА «Зх 55 стсавсазцчаєс сосодекслоя сеспаспесссо са 33 «1» 57 «і ВО «212» ДУХ «ВІЗ» Штучна послідовність хай «раї» Прабмер ілі -0йх 57 спрсазсїсс аасасосссс ссоопсбспвзац сапоскссста зЗкпажррауає і єв БЕ «її 18 свій» ВКЕ ха» Штучна послідовність «ЖИ х «даЗ» паріабеньна область зажксло ланцюга гуманішсваното щи М.Є Є диутаті ум ЗІЗ К анти- сіб актихійе НИЗУ Х «93 В 3 м лух ги то: ми 1335 ще пан ри тк ші ду чле шум спі у зі вх чне їм; вха Під Зех сб Бу Аза огжнх Зв му вхо Тек осі ї з 10 15
Таж їм ТВу Бей Таж Сув ТВу Бпе пех О4у КБе бат ем бек тних дек 2 25 30 піу Мес біу маї «(Му тр охіз Вхц пів йо Бо сту Ппув Вів їмам 3 ди 15 тжо пай іа Бів ле Тр ТХхр азо вар АвВов о їуз Аже Тук ав Бхо Аза 5 5 їжнк; Му пах Ахц о цез Тк о Кі Бех Мув бзротиє лек обув Ав Сім мах що г ле пл зо та 75 п тА пір я мо їйк подо вих їх Ії жк зл ще ле 1 УПУу бро Вуж
Ммаї Себе тах Вес бле Аа Мек дБ хо Уа Аа ПЕ Аіа стало тух туз
З 3) 35 був йіа вх її АплоБко Віа тую ББа Відостух тю слу тв о УВХ 105 155 118 пла маї ду Ууах цех пах
МЕ
«1» 53 «пів» 1М8 о. «ЗИ ОМУК «пІ3» Штучна далслідоввАсне «ИВ» тачй» Заріабеальца зОйпасхь взжкотео данцеєв Буманітованоиво сами тех здачі з се гли. зати- співав амтитіма МИЗЧВУщ-5 «апоз Ка бів Ууаї Так йец Аха ба лек осіу вхо АїВ без Заї Буш хо ТК бій х З 15 18
Тк о йва Теж Пец бл Су тех ра бБеєб шум ББе о бех гемо йех ХМ Зех ря ча 39
Ся іс лік лих ІЛ при си й уки п Б «кое ре ТБ Н сію Меб сі аз опо м ТквВ о тіз Аха а ко Бо біу ув Аза Бей ла
Зо в є і. т Мі їх КН чу Є су Кан третя т ж пляжу ли ж й З тТтроїем піз піз Т1і2 Ткв Тк вар АБО Ар о пув зкчЯ Тух Авт Рко Ма 0 З5 5 педа Був Бех Аха гей так хів ЗеуУу бує Авро тих Зв був Айва обід Уа й то та НІ)
Уві Пец тТнх Ме твк Авт Мес дДвроБто Уаї ВБО Тв Азфа так о тТух Тут
У Зо ЗЕ ту Ака За Кі ВБи Бхо Аза тт» Різ Від бук тт щіУу біп Зі ТОК об ня Та пяд УВІ тр мак ек пек 115 «яп т «аміно 7 «РИ БЕЖ «кій Штучна пПОСсНідовнМштах «КП «Ви Самійтемьна сизлйалтвн даже ловиюуа гУуМманізсвацої дви А антижлли ВИМИЙМНОХИ чадо ЛО п тн Тіт дних СТ Фен філ» пр щі у лк сти є хм іп о У«ї ТВкК зу Вха бій Бек Су Бко Від бе; Уаї Гуз Бк ТМ: пу хЕ й 35 їз
Тахо Хемі тах Бо ЖБу Сув МУ ве Як Плу Біж пет Їма Зах МЕ ех йо А КВ піу маї бу ді ПпіУ Тхв лів Ах спо ро РКО О1Уу Був Аза Пец ій 4) ЗЕ
Тк без Аза нів Тіз тТхб о ткКр ОА АБО Аво о Му вка тТуУХ Зеу Бкйп Бек з 5 С
Тік очко КЕ, ода хо СИ, ж, «с СиьшІ Її» з-ду 4 бен Кл з 2-1 ів Пуз Бех Ак їні ТКБх їі Бсу Му Ав так Бех Був Авлошіюв Уві 55 го 15 50 чт тому пах дек е Муз ди зе. стро су МІ сптьрує же екую
Маї Пе Тих Мех ТвВкК оЗвп о Мої Або Буо Чаї Ав ТВК лів Тай тТУуК ТУХ я: Зо За був Аїа Ах Тіз ба ро діа сгук вав ойів ТК Сто піу посту ТНК
Що їо5 Мо
Іеми маї тпЕж уаї Бех 115 «вх 71 що «41
Уже ин 2 тре секих ЕКЕ сла Низ і зачаті ее так «Й Штучна поспідовнісль «да ай3» Взрізбельна область леркого ланцюта гукманізованого хіт ст М о дімиті мА МИХ Я анти-СТВА антитіла НИЗУ -ї «аз 71
Ввр оті увЩі мех тпх сіб Зех Кхо Авройек о бе» дії чаї Вех цем У 1 5 хо х5 см Ак віж Свт ів Аа Су Сув Щ4я пех БЗілоЗеє Узі Ав Бра Бве «о р 30 трек вв под пи дня сер о сбкю 1 тн ни я Тр них туя сіу ввробету зле Мех АвпотТкм тую Зір оЗій обу Ро сім Бій Бо рхо зи й до и ка томі тою т зі 1 тю паж виз, їх т Тік виш нау т Те о їв ПемМ їз) Хі Тух Тк тах бак АБИ Пе) біц бе бі Мак Буо зар 4 ц ще и 59 За Би джч вВие Бек біу дек фу Чех О1У ХМЖ бвроЕБе лак обем тих хіс ЗУ
С чи ТЕ по дого тиму С дід тів п лі ді с: ча сю іх Кр і пи Ме
Беж га Зі Аза біб ввроМві Аа Уві Жук Тує Сув іп б Бек Ап
ЗА Зо 5
Ар оБсо ТУух ТВ Бас сім Пій бі Тк Був Пец сі Тіз пу 159 то 110 «ВІй0х 78 «21 МИ хаКйх ВНТ «Й1Тй» Штучна поплідови)лть са» «23» Нарійбнмьніа снулайть движоеко плив гуманіаснвакиго анти-сІ16А зажитіса НОВЕЛ Я «ай» 7
Вврої1іе уаї Ме твх бід Зак хо АвроВех їй Аза Уві бек Тан су - що їє і 5 16 15 біц вжи Аїа ТьК їі дай обу пу бох Зеж біз бех Узі Авр о яоєе Ар хо 25 Зо із йо Фо з ду р . о тки я, -- пет біУу аву Бах Бо Ме Аза ТЕ тТУук бій мі Був БКо біу піп ро Ко
Су Пем ої Х15 Тук Тих Тахо Бех бех 0ез бій Бех Зіу уаї ро АВЮ за ва «0
Аха вв Чех 01У Зако сім бах ЗіуУ лм Аво Рінз ТБЖ їм о тьи ї1з Зех то та я кі - ср КТ ої вч хг Чи Пуриї й ма пі С сік мч
Щек їхні бі від 10 Ав Уві вів Маї Тує ТУХ Сув ПМ ій ЯеЕ дей 85 зо а дек о Авр о Бжке бек тТас спе сік від бі тв, оБжв ій З1Й 1Тже буд
То іч 110 «вій» 73 «ії» У «тійм ВНТ «Й» Штучна посділсвнзлта «кп «ВЕ3»м барівоздькив подайть лего) пзанюта сУумзваАзОованвого анти БА виатитьиз НеЛОВУтнЯ «ап лу вв охіе маї Ме тих піп дсу Вуз Ай бохо 0) Аза Уді Бех іму у ї КЗ 15 15
Ж Ас Аів БІ їі да Су Ппув Чех йех бЗ3й Ще Мак АЮ ББша йду
Іо 2 30
Зі вро дех ве Мас дв буру (Чл и пу рро Оіу бі ше Ба о4уУу вер ооОшт тп ОоМмес ФвТ КЛЕЮ СХЖУЖХ схід? б ув КО о озАУу ОзІМ окт КА и жа їв й ін 18 Тук Тех Тахо Бех вам Боб о біч Тахо Уїу Уві Рхо АБ
Ух Б
Зка Бе Зех біу Бех ЗУ Бех СіУ ТВт Авор овбе тах Бе) Ти 53 бек ох па ту до
Шек Її Сіп о біа Ззій Аве Заї віз Уді Тут Тух Сув ші сій беж Або ва чо 5
Бек Ав оБко Тут ТДдх Бе су іп осіу ТВжЕ Пуш їм ща бів Був 1850 135 115 «10» та
СН за вач Мк «й1И28 ОДНЕ «ІЗ Моще звриєйв «ВО «шві шівсоЇвабита «й» Поспідсеність ДНЖ БЕК ОТ МО: 0 «40» 074 иазуразчах соозчазалц ви 74 «10 75 «віїх 18 «Від ЛК 143 ер щи «813ю Боше зарано «апйх 7 кксаасвоту дзцаачсух 15 «10 75 «ВІ «ій» ДЯК «В112 йрруцма мослідовнісве сви. чих «ВІ3х бінкер ож бпекінадь пюлськогоОо паімпама Труб кана «арх ЛЕ сщюшатане зосссвасвс песалвотоє зо яи 777 хау» 5 «шій Кт «тії» йошо зарієпеЕ
«хай 7 тар біс го Був Зеж СУБ ї Бо «за «ії» 18 -а17з пПНХ хріїе йожо нарісйе «пов й чсгчазссса ватсосеух 18 «діб 79 «Віїх У каз» БЕ «БІВ пото варішхих «ехо мех доль тв тд зе шШорує (11, я. пе Тр ду тори 1 ку бе т ій увазі ТВк їні муз бО2д Бек іму по бі тів їно Під ро ек (їв
У 5 їв ї15 тп хо он нон зи ох пе (З хР перу Сріу - де пл прю
СбЄ се Жак іа) Ох буз Жак Ре беу 01 Вдє Шек Пец БАХ тВх Бех о В з п ті кт га Ач таня т ясся їх же Фо Тлгк (би тол КІ пі Меї щі уаї Б1іу бр тів Ака бід орто бат спіу Був бі бар ЛО 35 50 за тувБ їі Ліва нів Х12 тТув тТкр АБО з5Зо Ав Був дк ТУх Авйп вхо Від
За 55 б пев був Шах джу Пеи тк їїз Шеу БуУуБ АвБр отак бек о Зе»у Аза біп Уві
У та 75 ко ве їн: був Ї1з Аіа Зеж уаї Вер ог Аїа Ашо Бх о Бія тТвЕ Тух Тук 85 НІ Зх
Сув Віа ІЛ о ї1їе деп ой діз бю о бпе АТЗ тую Кв оЗКу із сбіу ТЕ їй її 115 : тал оче хі де дет ви Мал таж Упаії озш пе «пі0х Во «112 ЗУ «діЗзМ ДЕК «Вій» Зомо варів «ані» ща сацчтхвисс садна Сеапсстудиу збастсшпєсвдх спиоссвудас сстсватиму «0 дет катери Векесвунне Куейааскай досерозеній Божпуєт дені сів висе еп шт цьУюттх скрпоусожаВо бососоЗаса асо а Сич уато поси МИ хащеспксса ЗЗзазатсо валом оя посвовпжеми смола пазах У какаагсваз спсобцвацзоа пезассааса вегстспавою азасстоспяо сдпассвузчка як вестетсадай боспосасіУ ссср сарлуєтсш Секвиви теці авіа зай стссоспзай ссоосачсцх дувсатеета спраасоческ семвсбасі усі саввса ЗНО здапоссшесї соппЕссота стривосав осопсаєссстат ссзсозодаз сиза ча «100: пу «її УА «при пиХх х8135 Кото паріввЕ «аю 81 сазчібярссс счадачайсе бодссестоаса сбудсднвадс ссвсасадас побсасаскя рум асксшквось Мосстодацо бусастдвнос ястісмчсета соска санса сода тсає 122 сазвисооосу зерадочивос зчазсацст сстасбвасвики зпеоєтлавов бчасвецецо 1859 тззівацисас сссочагзва содасоцвсеа Впсссзажв асссссства вдалсвазса 140 цісотїсасав пзассвасво зчаассссса сапастноса сасавсаска бастсаваєта по азссоцеєсо заоссосьса стодаоассаа сахвотсоде бсвопосівно сооа 354 «10х ВХ «вк З «ахкйх ВК «13» нНоло заріств «ой» 82
АвротбкЕ УЗІ це) ТВХ сій Зех ВКо Ала Бех цей Вів Уві ЗК без біу їх во З 15 піп Аха Аза ТВ ої1з Бех Сув Бу дія Бек бій Зв Уві Ав Бе Аве 2 ї5 Зо сЗіу АЮ бШек Різ Мес Белотхю Тут ЗУ сій Був вко пі біп ркб вхо
За З 45 ув о бвма Бей їіе тшх так ток Бех вай Бей обіє дек БІіу Хі вто дід.
Ки що
Ахса ре бек Аув бек су пек б1іу пжх дав ба Тпх Пе) ззп оїїз нів
У ти 735 ко
Їхо Маії суб щі ій ВБеробнх Віа тс отпук Тук Сука Зіпй бій ех ВЕ ха зо За
Зіи дво о Бо Тух ЖТВх Бе о піу Зі щіЖ тТВК обу пни; Бі їіе їує ї50 МБ межи «ЕВ о ях
«й112 334 «кіз ДНК «КУ» домо зарівма «00» 3 ласаскосчос созсссаакс стсосазчсскої ссузобЗече сусп зЗАчгцесАио Бо зиссссглса зоссвоєств есе сСроцалтеалия зуваакоекАЄ чзазссощеат їх саасезчаває сазсасацес зсссавастьс сосабссага сувасатосеуА слрадавцох і5о посцассссац ссовсчхсівиа саосацізаш бососзуасаз асссєсвоссосо базове ай сатотдсасу зозазсатас пзчсавсстає сапссстсвос азатзаєтла зспавосслеає 0 зпициспочац соудазасозв погсочзавнса вай 33 «102 ві «ії» 345 «й1Ххз лик «213» Штучна посдідавністю «ах «йййз Ззріасбальна с0Міаить пежого права гуманізовзисхо акти СВІ дктитія НИЗ УТЄХ «ах НА цпвсаврсзьзча счасслпавсо сосздааси ссеЗессаса ссср ча чадоцсгасе що арсазстзса задссадсса вазсзтодає посцасцзсх абазастрсає чазссостас 155 сзасачазас сазЗзласассс зпосагавево соісасстаба скасаквссай сселззассе їв зчладосссву вовочеЕсаз бозсазечеч сссаоцесва аскбсассосу сдссвксвоє вало гшсапсссвач ссчасоаечи сосвекесзх гастчесяцу азвціовасов засос ЗО ссчсссповс зоолсассва чого зацао ав 33 к«Еі02 БУ «вію 171 «йфшт ВНТ «315» Шеуцща поплідовнасть ай «ВЕ» двріздбвльна область важЕсте падцюга гУМмваїїмуванитт» МЕ яп» ВЗ мл уаї бів Пец уаї сів Бек ЗІ1У Атіа 313 Уві Пуз зу Ко су ДІВ ї 5 Та їх бекобві Мувш МаАї Мер Суя був Віа беж щу Тух ЖНе це ти АБ ТУХ їй х5 3
Тр оїіа нів тхр уві Аж сіб Біда руб лім бід БіУ ема м о тжо ї1е
ЗВ 10 З шіу вах їіе вноробто ек о Аво Уну Тут Кто АБО ТуХУ зва оБув Цув ПМ
БІ 5 що цув о щіу ку Уві тане Меї тк обві Уві Уві бек Тпх Бех Те Аїн бух
Я то КЕ Су
Меб біз їж АКЯ їех бе Аг бек Аве Азротах АїВ ові Тук туУЮХ Суд к5 НІ ЗЕ
Ака Асач Ап пі Ав беї АБО» Ту ТУух пах бу Май АБО Тух ТЕВ ОІю 100 195 М сіль дуу тТпроїх Уві ТпХх Уві дер бах 118 159 «ВАб: б І «й1ї» 353 «Вій» ДНК тил Таз зугя «Чет чі ії и «ка и шуй паслудовнаістуо» «ай» «йй3» Варізбендьна область» важеоро мпанцем' гуманівсванит ВЕ ха: Не паздусссаче Бозбасаес содасисзай сгжзацаазс сопуузсалссе варчаноус БО косстсосавою соїссациса сзестскасс згассастоца бвсасозЗсесі чозасвоає Т7о стекзЗасвас зпоскссачся засстосоаоеЗ апкзчаєссеке ссдасазснеа ссозавссас 185 зваїваваавас ссавзцоесач вубсвосстаса ассзсвусо сабпсвствоа сасадесеас 245 вхссассхза ззазосксац віссраєсуає асзусстчєае воссассатоєс Зазавасоух по зайкссзвує вісвсборЗу сапоцаєсає спзоорзасаза счастасоує сарсотсвсо 50 пса 753 «й105 «йїї» 411 «ВИ вНт «ВУ» Штучна посаді ловалтть «опе хай3к Барізбецьна область лебкзКго лавнюта туманізсваного еБб «апс» В до Ха Узі Мес ТВЖ піп олеє Бо Ввробех їхгиа йАіа уаї сешж Без сіу 1 З 10 15
Оіз Акт вів Тит бів зз»п Су дув дів йех бі) ес За1ї ар оБйє Авр й 25 35 сію Варопеву бБе Меб бази тус Туюк Пій бів Буш Буо Щі Сіп Бхо та о У пув мем оїмви Гі ТУухХ ХХ ХДт ел Ав Пе) сід беж пі УАі Бго впр ч5 п «о
Атл о БМме пех Пп1іу Жак спіж йох біу ТлжЖ Аво ве Тну Бец Тож її Бек то та зо щас ойни бід о віа іч Авроуві Віа МаЗ тує Тук Сув Під обід Бах Деп 23 Чо 5 бу оАво Бо бут Тв брв о спіу Ом обу Не Хв беб Ппіа їЗіа був 100 125 118 «Ві НЕ «8112 «М пих «їй ДНК «213» Штучна послідов к «й2И» «ПВ3з БКаріайельна бОласть легкого лвацюга гумавізаваноюо Вб каАпо»х НВ чвдассцізо сцеасбсовеїос песацвоМоо свазестабза боссваачча давзящбсяитє во
Кграсстоса здодессацісв дазпасслаи всваавзсамай вого асла зизцдаваисв. 150
Звосвекссо сазвацстсспо сассавойза зчсстогаває стасестосов апссссвса 188 вспчорсачсо сеасезсато бзУузуасацас сбсассоков ссасбсозавац ссссзаедие 245 пвацтаезчссЯ саасчтвосса сстчесзаєва ацпсаавсоассї сфепоськсат пис оча по псасвссваач Содаавссав а 181 «ій» З «иїїх й «ій ВВЕ «ій о еусцвна потлідосвмась «ВпОхм «ЙХИ» лай розліМанАВамвя 0. воспимзанми місМоїномМ «хадйм БВ рем чаї Бо БхУ См дек 1 У сялпу йй
Бе хо «їїїм й «ВТ» ОВет «ау» о Цемчма посплідовність «АЩх «й Лайт розднанавания з тихашеллевня фактогили Ха «Ей «КМ вишштТинитл
«йййе 81.42 ет Могли я. гри пе типа» Хайесій або де «00» 5 тів Кай ПіУу Аку «а 5 «»її» 5 «в шт кхахюи ЕК Е
Ат Ічяатлігтя ті ситі те, чем» жЖжучна послідовна шті» мс ре тс»а3з Сайт розпізнавання і ровшеплидня евтерокіназвою ява , таз 1 й Ди й т АЕМ
Ар АБО АБО Аверодув 1 У «вій» 35 «311» 4 «вії» БВАУ
З, Міра у хичаиттй тіл тної я «Хі3» Штучна послідовність зад. кю «вва» Ппзйт розпізнавання і сбозшщепоеина йУрином «пвИм «ай» ЖАВТАНТ кави (8У..131 лу Жду шрам муку неон «ї83М Хаатйудь-яка пмімокислаха «4п0х З
Ато хав Хай Вко ї ча ри ха з «вії 4 са ее ТКУ «Мих СЕКТ «й Птучзназ послідовність спе «ЕЙ «80 Псревножний лайт резик»наевминн ої шосрзщеатлання фЕрином ся «й «й ВВБІВНТ у ІЧ У слі х Жах в МЕ газ ти як ліани диА ка Мамо а саша» хІкіїін БАБІДНТ кт рах «ч пекйх 31,1 «ба» дайхсУув по Ка «Не З дж жЖаз дав Ах ря ча «41 53 «ії 7 праця сли» ЖКК «МАЯ Шекчна печі давиодь ау я ами «вай» зах розпізаавинин ії ролідвплання СТУ таз» 3 ій Ав їм ТУухХ Раз піл у
У У
«к1йх За «Т112 487 «йі1ймМ УК «др Штузнв пласпідсвністух кавО» шт мих одер зей гукає Х Коен тержинан в «чаша птидатнмууно заеязздмия гл проаштінтоЕиМм пЗзпередник дити Ай хаос» 35 и . тущ ще яп її пе тку Аз твх щі щдоліщі ще ие
АЮ ТИХ Уві Бем тах са о Шех Ро Аза Бек опе; Віа уві Зеб рей сту 1 Б 15 15 зе дину ДІА Ин. Ус би че долу ік им ла дет ЖИ а сід вху Аіїа та; Тіз бех Сез дув Аіз пек обід Бех Маї дво; Ей др хо 35 ха «Ту су ий які пах золу ет бр от Пд ТУ 4 Іл Кот пе
Сіу бді Бе фе Мес ввБдоЖжхр ОТ іп піп Буд ВХО бРу ска жах; Ба 35 С У
Тдутш Тема; Тмі Тіз ее пе спфчу тек йо ри 113 Жак тако пит дід чув Бец бем тів ТУуХ ТБ тру Бак Ай Мко; 01) бек ві її бо віз
За лу БО вхо ра Чех Вій Бех йіу Беж Зіу ТБж АвроКце Тит їм Ав тів пів 7 75 ЩО луєич с аа ку дод тлі дроти лу ТТ їЗ па у бен о Уиу то Уаї піч Зіц бла Аярв отак Аів Ту тую Ту Сув шій піп цех два ва Зо З тлі Му хат бю є ІХНоМ хті тляк т «т Фиягх ласн 1к зако (чи піз Звр орто Тук тих гне піу бпіУу шуу тТВж був бе) Пі хі був слух
М 195 її ім оаху ех сху му і ім сСуз чаї Ср із МЕ бій ех слу ОДУ
ІЗ їі 175
Сіж без чаї бі рхо сіу Ат бек пені Пув оінкзі Зеу Су А1Та Аїа пеу 130 МУ 140 пім Ве ТВ вна Шеху Бвротух туп Мет вів бхо Хві ба ій Аза вки
145 ММІ КУ 15 тнЕотнх З1іУу Бей сї» Жкр о уві іа Бек Тіз Бек Тут АшОо Піу У АБО за лк 165 їв Мт тек о Ніз бух Вху Авообек о туаї Був сіб Ат РБе ток Хів Бех ВтФб аво їВо їв чо
Аща вів ПВ бек бек їни ТУукК їв) бі Меїт Акр обеж бен Ак бек ші 145 аа зп що тр їдо опа гли бе ук Зі соя Фу Мі шлях І че, пре
Авто Тих о діз тпу бух Тук Сув дів Так обся ТЬХх Жипк бу Кіз Бко тд 210 215 ах січ сві Мас Азр ові Тхр о щу СІ Зі Уві Бех Ув3 тах о Уваї бек бек
ЗАВ. 230 535 й
Пей Сіу біу Суд бу «(3уУ Ак Віа пу дкц АБО Ма) щік Мес ТБбу са 245 250 віка
С ян, Гь 53 Кот ЩІ (я а ж м т у т ри М р»
Чних о Буо Бех Зв їстмі Аіз Азв бех рхО слі бі бек Уаі бех Х1іе Ано сао зв ато
СУБ Пув Ліа Зак О1з Бек Тіз За бує Тук Мей Аза тТкЕротТую без сії
У 28 вни5
Пув рхо біу буй Аіз дДяй Пув ем без мех Тух Аввосіу Бех вк без за ва за її ЧИ ттротуки, че С 15 ка тд УТА Мун КАТЯ лк Ту с сту піп бек б1у ті ро Бех ВБху Же цех сіу Зех Му бпех О1у Тис Аво зп 1 15 Зо пе тах Сем так о Хіеа йка пе сем діб вко па Ав ге біУу Меч тує зт 335 тТУх СуУув бів бій нже тує сіль Тух БхОо Віа тал ра лу деаж сау ЦХ 345 345 350
Гу бем сіб її пув Сіу Біу Му Хех і Бі у сту біб ча) Так 155 о ЗВ
Тео їм ші Чек Су БХОо бЗіу 11 Її бій БВхОо Хек піз Ту Пец шШех 170 ТУ 350
Без» ота Су дек віз пох Зіу ва ес оїже; ВхФ ТАЄ бак о спіу Ме у 85 зб ЗУ 00
Сяі ім тв пів ак біл о БКОо лех пі Пув осаду Бей оса тКо ей Алта
ЕН го 15
Бів Кіз Тро Тув зр Ал ББв Був АФ тук лет Бко ід Бей Був ЦЕХ «7 Кая 185 ж ик її дк Пт) Тахо її Бех у АБЮ Тв щей Бек Ав Сіл ові вне опе пук 38 мч 445 тів ліз бБеу бах о АвВор тих Азв овБО Тих вла тах тУукК ТУЮ СУБ АТЗ о ва 5 6о ті АБО Рко Аза ттр о вве Аза Кух тк ой піп о щу ТВХ Бе) У тах 454 ло 475 450
Чаї Бех Бех Тем су су ПУБ «Ло» 55 «831» 1464 хай дих «13» Штучна мислі ловвмттх «аайх «йй3з поспідовазост» ЛЕК ОБКО Ї0 МО:37 (дка коду ковалантно ї вч х я, н я. звазамий полпіпрствіновий лоперейник диаатитілаї «пп 35
Часаєсцтус ссасссавве бссвсстосе стзпссзоог сісівоцдоєа ЗаповесАси ва ашіссстсз зидосзасса заз есає сстспасзатз ахгвакомхає зЗавскачат 12 саасацаавс саваззасвцсх зсповавомо стсваєссатв сувсвопсва собвчавих їва чЧоцассссви ссзнаьссач сцссачитєч зеосуочасаоцч асстеацссе сагсатесає 230 поета опзап адовозяисас пдсвасство пвотессаче авачтзаєта ззасепетай по зосцсосповаоа зпусцассаз деподаввава свацсвацес зас ссоЗаца созувацечах з
Чрсзчазсстазч словоссктою озазащехтта зсспсвососа свазуссоеї павасисото аВо їчодсвиспи бвапастовоа обоз засй газбносавсца сподецсоя псвацсспсоа 4ва ассласлацсс садезеоЗс спсасссвах гаискайтаба ато засаєс бсасхаода 540 часлспосЗа вдчслочако басоастосос згчзаасвах сзвазвасво сбобвоало 50 лтлавасосзса абоспачато Мззоадавсгоя песаєсстасс асссасанвна вал асу вед задавиатсоста сазЗцтоосай сбаоцссзс поса воцеч Зсбоспзссвое субсслегма Ж пенали зизпосоУсач вуссавзоаоз десоакосаца бовлссовуєс попасикаАт ТЕ питан сбусоцпевда владу воссто аксваєовса гочсеазаеоя чадо тай тнадтватмяд сСсачсчаслвост щпоздазщаєсо пучназвосаз вемшеоопои пасе ЗО пазссавикь босаанстяз авгвоссесоц вузстсядка Чопа спорта за сгЕсасісоса ссвссваваз сосспваесос зчаалахосва сесспевлов сс оат вра2о твікабсоваї вссслассас птссуЧексо зчадассвзацо сесазабсва зспвозсада Мо посічоче чадспссачет сатеосеслааа зазсссвосп ссрвзатаве чесати 1159 свдассспоса чостчасеоя сокосстосксу зччсеексвс с5завастке баса іо зказччиеточа ставало сллазацаво зЗагосачва песисочсати схо 178 заклвусвса задсзссесва ссасадосока зауечилсє свсевслін: пдачаайнис їз гасазрсавци зддхвНоласх сазагсощесл залоза спопацаввна пуповопвоат 138 тайпосзсто даасдазсспсо сесіях чехоалонр поса ве Сет ї5Ап чиЗачотсвос сеанс ство 454 «10097 «її 51 «ій» вт «аїі3» Штучна попліноївнісстль кох зу г ц : я дин ТЯ сут котів мити ти ще "ж аа м 1 «гІ3х Ковалентно звоазавий поліпрожхвімовий попередмних диантитіла «хапОох 57
Ані отак уві Гео тик бій бек Вко Азіа Бех Па) Аіва Уві вх цей б1уУ ї й їо НК дів Ак АТа тм тів чек о Сув ув Аза цех бів бЗех удаі Аво КНце зво
КІ 25 Зо спіу абБробех Ре о Меб Ав Тр обук і бій був Рха ші Зіп рЕо хо за 40 15 їм оБжні ма їз1а тує тво Тих Вех АЩб ії; бі Ве фу Тл Рхуз Аза з за дхд вон Шекг Аіз Бех лі Бех слу ТУ Бдороїає ТЗ о Бецд Аши тіє Нів 85 а а що то Уві піц За сліз деротмйх Аза тах туУК ТУхХ Су ЗМО піп Бек Ада ву зо Ж січ дв оБКо бух ТАЄ Бра осіу біу пе ТВкЕ о Пуб Бец бів ті Був опію 100 135 119
ЛЕ слу Бех сіу піу ші піу Біц УСІ шій пез Залобів Шек бО1у ЗІ з 178 зе
ІК ше ЕІ у їеви мі біл овко іх ко Бех Бек був цем Шек Суд Вів Аза о пех їза 135 їло 1 Бе зх Бе Бех Азротує Тук Мес Віа Сто УЩі АкЗ сій Віа ско 1435 ї5а 15У 55 тнп ть біу йеза бід тти Маї Аза пех Кле Бех тує Ар осі 01 Аду
БУХ то 17 тако нів Тух йкуз Авзр ойех маї був ПІ1у Вч Бце Тих гі йпех вха Авур 189 На 150
Ап від Ммуш Бех дівж емо тує йео СОЇ1Дд Ме Алло ес їжа Аке бек ШК тд ро дак 125 ОО хо ж паче тиху руде тис Я оп т п та тях 1 ме те ляротну від Ту Тут тує Стув вів Тбнх бр тиж тв обі тів Бхоа тв 313 18 2 яку у Зоні дк дл п ську шоки озна виш р спа лід би ту сіу уві мех» вро Аїа Те о сіж сіб Оіу уві Бе Ууді т Узі За пек з25 235 235 240 ей бі ші Суб сфе сі каз діа пу Ах Аів Рка уві Був бі ТЕХ та 250 35 їм Ав о вае Авродез без Пуз Бе ліа зіу Авз Уві біз Зв АвповВта
Бо їх што
Зі Бхо йшо ЧУаі бій мес сну пій Жек Беб Чех Авд оМец Діва Азв о бех 7 Іва ту то сіУу 01 Чех Мн3і дех ї1іа Аза був пув вів Ппех бій Бек тіє ех 230 «ЧУ за був бук інже; Від Тур отух мец дій Муз Но ПУ Буш Віа Ави їв ін зо05 зі ЗУ зо
Пец Мет Тук Ав о сію беж Вк б бій о беї ім Бк ко Бех ка же 355 Зо 235 ж ж їж фун За ру тя Жук СЯ таїна ті боже Му Ти пек су бек лу пе піу ХХ Аврован о тає лет ТВХх ХАФ Вид Жак бе 240 з45 0 щі Во пі; др оБіа біу Ра Тух Тут Сув (і Ліп нія Тук ка Тех 3 КО 385 м ї птн Мп єм ин Зх сти Ток тому Ті» Таб їду ту УТ вто Ада тек пп (Му без бА4х Тв Мую оба ФМ Тая пев Сім ям с сХу 3ута 375 зво
Векопіу біу бі біУу Сів Уві так цей Пув 3106 Бех Бі рЖо ЗКУ Щія 385 з1ча 185 сяк) йез біпоБко бек (ів тек Пед бек їз ТЕ Сув Шах без Щек піу вав 455 та 515
Хек йо Влоя СБУ Бас спі мес бі Ууді СіУу Лкроїіж Акз піп оБпхо Заї
ЕН 425 30 сіу іш о Піу Мем с) Те бе) Ма Мів Ті Тхротхр Аворо двр авр Гу ах5 440 345
Ага бех вна огбто Аза їж; Уа Зак Ал зи ТБ їїМєе Щек опув вво ота зо аа 455
Хек Чех аб о Зіп Уущі Ре па Муз Гхе Аза Пет Мі Авб Тих вій вдо за 47 275 АВ тако Від Сни бує тук Суя зіа бл о їіє ввлорхо Аза тер Бпеа Аза тук ав 455 425
Тер Бі піа піу твх о Ме Уві тах оУаї бву Бек без Чі Біу Суд 500 зо о «8102 38 «кіз 1535 «Аа ОпЕх «ВРУ» штучна поплідлавнаістів» «ЙО «ЙО Послідовність ДН БОЛІ ЩО: ЯЗ їккаи ходує кпезиантио
І , : Н ке г зважззвний поліпрохетновий сподерапних дититиул ла «Ох Зя часваскчівс спассовасо соспвуЄєктЄ Зросла соссадчела зазацссвсо ВИ аксеесоецев овзасовадлова вависатоЗас зооцавсодчсоа зсазитвосяах зазвстоечеає 122 шптвапацазвас саззасвупх впссеавассс сесвсссвеа спвсвапссав ссказдаєте 189 чадвгсссау ссаацалЕаз бчссвабосу ссбзодцасає асубезоепло лавок свх. БО сестзіззасо зузаззаєвос сцозжестає баствсвос зхачизватча тзагссохкає Зо
Щв"сослоацаз позпчвноства чпобецазата давдцвзвса чЧабосолзою сдоевацоса За зиздачилаз Маезссков Зцазоащоста діссашилооя сриаорісстї сим сце МУЗ такосвиосу сзацвовсво Сік сяцдкчає Кебсасвілрі собцоісо поодеусев НО зспасоаццьє разу цаче сурзосбаг. ацурсвсчахо чордозасяє соептотагстуа М цаптссоитла аоддосивоо Саппястгтє ашпвчаснайои; сававацеєвУ сапвеасск ХНИ сезвілсчась чиссчацдесо гзасУуасваой зосвстваво аспасесазе абпрашаскасу пай цодавсасста сазоаслрстах чаавсйссісла пзссвавуєсва соспосашково Состоскса тий сепзуазцеї чедессочат адссазовцо цеопестахяа ядозовосиМ Зевстсицва ВИ сезстоавос ссосстосавца ссрозовавос азсостлов содасцсоз зарості вай сстссоввсса асскісскас ссстсскЗаа саввасаеКеІ ссабозватесо саводтваце зош чЧададеаста псаецса вчсстозптах сплвосзйзвавс сосоудаавас завтавцикх зо сеттасзчіасо згсуцссвас ссбзсавзетї сЗвасєкссасє сзазасссво Седесауєто 105250 ксгчуссасац дос саєсссї свссассовав азосоззазе сотавсаїхс соетчасссове МІво сзспучісзас дасавссасза зсасссвдес апусссоако стсузаства зесодеадано 114595 ззвазсаодсо чабссосоувоч ссоувсоссай сктастеобув азосвасстоо ссстоослайа ї2200 сктідсздессо сосафаєсос сачестласх сбоесбапесоє ско ос весдацсаоть 1255 состочіаст зсасазусся часксзуссвай ссссвцоца мч сссача чещостаюя 1350 сасасекоче зечеассасоа сапдеспссах гатссвоссо сЄдавоасксоя васудасаане ї38о0 сесзадозсва ссбссзосза ссвзасассс стоваватся ссачсзозча сало 1450 встдесасаї астассзЗсіас ссзватаваєс сссосзсоеочах Коосссвоссу чпуЗссдвааот 1590 аскссЗасса ссуслахтсос встзучацоає баса ї545 «шій» З3 «811» 33 «212» БЕ «ВІЗ Бощо зарієв «4002 59 ств їі Уві Пец о бру бій Бех бко Аво Ббе піл Зах чаї тТвВу Рхуа їв 1 5 10 15 сіб Був уві ТвВх Бпа Тбу бу Ах Тк о Мек Під о бек її пу ЖБу вда зо 25 10 її: Ніш Тув Тук сі Пів Мув БкКо Бзробіп;ршеює тю Гуз їм їез Х3є зп 45 муз піз Уві Бех Сі беу Хі Бек сту Уаї рко бехг БіФф бе Пеу б1у
ЗО В Б
Бек с(1Уу Бех Ііу Тих длробре вх пен Тахо ті внпобех Гем Пі 18 ви ло т зо сія Аве віз дів ТУ Тух Туу Суш СІ Пів обшк Ана ТМх бкуМ БУує РІ я: за 5 тв вве шіу О1у Му так опув ві за зе був с Зіу Сфу О1У Зв осфу 1 МОЗ о біУу щіУ бі ін Заі Ту Пе Атц ос паж бі то Ава їла; Уві Був
М 155 ї5а
Бо ТІ бій вк обеб Сх й жЖвк Сує Так о РБе Зежє 5ім Бий Шех Бей 159 15 142
Бек Трх йеу Чу Мет ОС1у УМ ЗіУу бр гів Вк ів Ето руб О1у Був 150 155 ї50
Аїз й бій Теропйєв дід Ніз їі Терогурд авр о Аз Азросув дк їтЄ 185 ї70 ру
АвпоВко діа Пец Су бек ВКФ оби Тих їі Шех Буш АдО тах Бек Був 1вО 185 і55
Ав осів Уві Ма) без ТК о мМеЄ тТВЕ Авт; Мех АБр РКО Узі Ав тк від їзУ ой 205
Тих Тут Тут Сув Аза бій ї1їе Ав Ркз віз Тхр о гпе Ах о Тук о Ткробіу
Кая ах Б
Зіп біУ Не ем За ТНх Маї дес Чек Впе бала Атч бі бін Сев 255 ат 215 «й10з 105 «Мі» ий «війт ДИК «Жі3У»х пощо каріслв «400 100 чазаксчєсю ппасссачелт совок салосбсиясва сотпозазоча савадисато 5о сссасссусва тсапсоалоьса чазсасозцис созавсатаєс зстдсівсса ссдоаласоя 1720 тахтетватет сбсававдсбуоо пзулалаєва зе чнах сбвтсвостоє ачссповти їв азлпасспавцез чесвскзавагс сепзасатавї брпассссся стассавсвц поса зай зазоассасьц сявсзсацса ссуссавсая ашсваннооо зоосцовпова зопподеоца зай чузассевзц хдаздассав зоасаєсзосоя птесовауоо заззссазчає батесковад зва свусплудоцсс пестастачх цавоусссата свцассстсва саплповостая батесскосию зай сич ссхс стпазсвссос ксзсатсопчи зчивсазссоза кхстесаусс ссосододаах що спсствувоє зЧастдуєвсв засутозеоя чесласцтата ззсзсптахвна сепавососсу 540 зззациссвос кЗапствайстос савосцвЗзсвло бтеважаатес вадтжоксост сатвакєовс ВІ авсайсцалто стдхчцатаєт о сомлтасямваєс лес увецо ваапеавеасос суто хво
Екс орду Ззебавоцевий комуцісас Япоаадессво ссазсгуто у со а ай «йМия МІ «112 346 «йКах ЖЕТ «дРаз Бопо взріздя «400: 181 а Ї1а уві Ме те сл беж Ббо ЗБрозає цем Аїд Уа ек їси ОП1у 4 В Що 15
Сіно йка Віа ТЕ ї1їе Аз Сув Муз Біа Жак піз беху Ма) АвроБве зве 0 че 30 "зл са Пуми ЗУ ТА рек; Чі он пу не онук я, те
Сіу вкороЗех ре Мах АвпотСтв Тух біло був РКО бі ій Бго Ехо 35 з а
Н 1 т Е Чиаче Чу Чу Фред суху С ру (Зла Ук дош цУув рей опва (Та Тує Тип Тс оЗях бла цем сі) Яєх Зіу Уаї ро Ази за 55 ЕЙ зка Ре бе бі Бах Сім бер о біу Таж Ар Бе Тайк Сей ТК Хі бек
Я то т ва
ВЗек Їм піл Аза піс Ар уві Аза уві) тую ТУХ Су Зі Сів Бек Авт 85 30 У січ Аве оБто Тух ТЬЕ Ре Пі ій сіу ТБх Був без із Тіз бує Зі 120 ї25 110 сі сту бек опйіу Зіу Біу Зі шій Узі Бім опе) Заї бай бек сіу Вів 115 128 125 із чаї Був Пмз Бго 01у Ма бек уаї Му Уві Бек Сул Був Аза цех ї30 135 155 слу Жух ТНу БЧз о тТйх Авпотук Ткр їі Бів тт Уві Мк біо Ах Бхо ау хо х5а МО лі сіз ім бе) біб; бхр о їз Зіу Уаї КЗ» вврогсо йеж дво тм тук то 175 тжо Ав ТукК АвпоМув Му Рве уує П1У дкч Уві ТВж Мас Тл о Маї уаї 180 ік 1ча чаї Шев тс бек Твх дія тую Меф спі: їз Во Зах Її Ака Бе Аву 185 210 ау дво отТвжІ дів Уві бух туї Су Аїа Аку джпобду лво Зах Бр отбук Тук зах ях, за
Коя чн «КАМ дек о бпіу мес вавотук Тхо сбіу біа жі Таб отв Уві тих Узі бек Бек дах 73о 235 340 маю січ Ба був ех бує 145 «їй 103 «ВІ: 741 «ЗЕ ДЕК «13» Ното зарієйн кАОО 105 жасассссоа счассеваако Сссазасксо стпщобасеВ сбссатина залоаосовасо во зуісвасссса волосассса аєезчсосссзво собозсозба згазтесстсак давства 120 саасацазас садсасвоуєс асосаваєссс сцсгсасствса стасасссова сспадезвос 185 дадпссссаз всечассбач Спосечсоюч сскцоцасац зсбтсасось савсаковзує а апспссопсевсп сплаучасне стсазеокає кастоїсвос вевзсповеса падестуає о асчссссттстас заЗспдассва зсссзазакс азашозоцез чассстала сао 5 лоессазссос гозсазсссоц азстсаззчя зазаачостя ччзссксаяЕ пава сю 420 зпеваазчсої сочутсасас собебвесавс хассзазкає асо апвацовесх. ав злавсавапчс ЗсЗазітаво пуЗасосзчатУ заксстуєтн апазсипяатсос ава»івааз ЗФо веваачитов аупсвщасі пвоссвідвис зпачтосчеас псвозчвалаєс галопвласоу по зачстазвилв зоссоспазасс саасчасасо зоспчбясайо алозбноЗазч авлсзчеах вк тссзеастацт есссшцкає чусастсіасече сучсдата ссловчссає стссксикса 729 чзісцепсста азестоЗзка т 741 «йї0х 105 хі» ЗО «їИх РТ «ВМ» ши мчна пПІСМІХ ЯК «Ву» «пі» Псолідовногті МИ, пкі походить діло ЗОВ УК жі саййрж біпоуаі Тк Меи пЦуф ім Зек сі Бкз обі 118 Без Зі) Рко бек дій
ІН ц 1 че
У ВУ о іх
Тиж без Бек ій СНО Суш Жет Бл Бек О1У Баг бек обеги Ахд хо 25 за ям 114 «21ї» ЗВ птетугу пий «тій» гЕх
ВХ пігучна посвадовнімжь «ех пух ктичиетт й фтеутьвич ст ї тн зі крім мих : ЗК охді ж «яй» Чослідовмостіо УНК. дкі сруухомичь від Зо но кКі -5пх 53 й нн о п 11 Деу 0 АЯ спрюих лотом сте фАКЩО (уки ин КІ зі МаА Тай їн АЄу «о бек пу Б віх їм Уа був рхо тйк сів ї У то 15 так обея Тл Бте ТВх СувоЖпЕ був цех (Му Бле же оця) беж ту ЗЕ за то Т5 Зо а КІ «вх 105 «ВЕЖ 0 пи тд «ах САТ «813» Штучда дослідлавіль «ай сЕйіз Послідовності МВ, цжі походить дтп ЗО МНОкВІ «арах 105 пл грн шарі тА 113 тиху б я ти т те ту гук тую гіч (т лів чаї тах те Св піз беж пу бо вій Мец ах пу вка би сів 1 5 15 15 тах їжа тТВх їде; ТМ Суз Спу Бде Бек піу да Бак бкаі ех зо 2 т
ЗО 25 30 «іа 106 «ДМ ЗИ «830 ВТ «йїМа» Штучна послалоувнастув де «0 я, пику вия чути хи зах мому ги 1-89 їм п «вй3в Послідсвастлті МН. яка походить відо УНН ЕКі кхайоз 106 дів ува тк Її ак От, беж Му Бо від Кем май Був рус пак сій ї 5 10 Ех плічяє томі Ми сте "Ніж дляищо СпПЬК ІМееу Зруб с Іа Пежо Мих до. тик Бей жлрЕ Бей таж сСмеа бик Біма БЗетб с1ім зе Бех Мпей лЕФб а 45 зо хвайх 07 «хм ОО «шій РЕХ тя прик ихг ки юю і зи і и хХю вит чтУзЗзид ПОдшлЕДОша ли «ЕМ вах послідовно а МВ. пде о гпоМодитье ваш Зп чНОКБ
На Тл вена; піп огТів ТЕ ем ому Пій пеу бу бка тру Бец ії уз по ТрБЖ сл
Е в 10 15 трізяя порту ю тки пря зу сти шичіо лю КМрая ЩИХ ух Кот» сеууи тлу пемзм Так осез Тих Су Трк о бае Бек Сі ББе бек обеа пу хо 25 хо уча їв
Се НО Кя «им ше НИ «хі» щЩтуУучна поплідовмістте «ай «В 3в Послішовності МН, пхь о пойсдлть вів ЗОНОМН Ох СпдУ хай 10К . дду й дво пгче щі КУ зу тьх пеї бі Меб о зку таї сіу ї 5 «ВІ 103 «ві 7 прак ро пу докт Рв «ВЗ Штучна послідавність «ЗИ «Ва» пПоспідовномті МЕ, нкі поисдять від Зп оМЕох сСПудІ «апйх 1655
Т;х ек ому уаї сіу Уві Ш1У 4 зу «війх 110
Ах їй -ї КІ 14 «й1йз РТ «Е13» Шуучна послідовність
АЙВА я ЧАН кізимитя ЗАЙ а чеком щі о ла ж Бра «вай» послідовцост. УК, акі походлть від ЗОВ ЗНО КО «30йх 110 тТтр Іїе Ато бів Рко бет СЕУ був ШіУ їеб б)іч Ткр іно діа ї Бо 1 «ЙО» ОСЬ «В 1 «ЖАБА Т «ВАХ Штучна послодашиісті «ВХ «дапіх ТУ кривим А їжі мем вій ЗОН Хр Бе
І ясла кМІ г ми, АКА ЙпОплсдить вод осн У пи «ВН 11 тхв орі Ах суп Рко рхЗ Му Му Аза їж ьо тТЕроїйнкі Віа 1 5 їв «1» 315 «116 «МИ» РЕТ
Си» прячмтяхрцо иижа і тим реч, чих Штучна ЛОТА ДОСВНАКИХіВ нь «ЕЙ» гля йлопіропцивті ЩО дмі птуємихи шлол ЗД ООщЩО є пух «віт послідовності УМ, які походить відобОВ УЯ 9 СО ния Кк «аа 0119
Нв Хі бкроскр о вАвр АВо Аво Був йМоц о ТУук дви БІ два пло Бум дає ї т 18 15 як. 44 «Яра 113 п 15 «ліїм 16 «и ВЕЖ - ін. пемзи Тита «Кум пцречня споаслідовамттм «вх
АВй3» Послідбвмості УМ, ниж походять від ЗОВ УВО пра сдптья 1 л «40п» 113 4 т пасту жу ААУ х тм Ну « Южк; яко бід: їТуско рє
Нів тів тТук ТК Ав Аво о АБО Був Ахц о тТух АБО Бхо Аіа іо Буш бу ї 5 То ІВ сія чи «810 млі «ВМіМ ії
АВІд» ВЕ «13 Штучна гослідови пт «вх «Й» Постліпсвності МН, які покодятв від СВО х ПА «апп» 18 ші во тїру тт ту Детр встр о йщуу Тло дет тя бах тут Фен їм Тло бо ніш тіе Тур о Тхр Аж АБО двр дух Акщ тУух беу Ето Ех Гео бу мех 1 З 10 15
ЩО че «810 315 «віх . «иїйз СЕТ хЕ13» штучна посціновнасть «вах хай» Пзолідовнайті ММ, ні походить вад пФ У Є Спр «ап» 15 с Кг біо пт Щогуч ут де Тата думу уч пи їн іх вка ду нів хів бух бхр о АвуроАшо Або пуд Бу Ту Ащло вхо Віа фе Буш Зах й З 19 ї5 «їй» 116 т тя, 18 меч і «Вій» рЕтТ пий Штучна посплідлама вх
НЯ
«йдЯ Пенхпійдсяномиті. ММ, пхі похоеть відо ОВ МЕ ох огпевИ «Ні» ТЕ із Ії Тр Тк овай дев дар о Був джу Тух вва Бхо Аз ем (ув Зех ї 5 15 ха «ві» ОМ «ії 16 «ЙІйв РЕЕ «ММ Штучна послідовність «ВХ «йаХе послідовності У, які походять вадою Моз сову «40 оку?
Пен Тіз двротТхр о Авр олАво зАвБбосСув ака Тух Зеу бо бех Ба Був зви 1 З 15 15
ИН т1д «ВА 11й «211 15 «ях ОБЖ
У ІНдеедіїхо рим) м ЗК юу «М» Штучиз послідовні штм оч «ких «Ві Посдідовності ЗА, які походать вій ЗОВ УМ ОХ СБУ «аа 118
Нік їіз Бе ттр о Аво Ар оАБа був йху Тут Важ Бто Бех це Був Бек і 5 Та 15
СУ нЯтЕИШНИЧе: «іїм 16 «ай» вот «135» ШеуУчна послідовністю «сх хай» Паслідовності УНН. пі походять» від 38 УНН ох СПВО
А тт «400 119 прот єю титулу Ми сто йе зо дж ТЕ : Перо Щезу Торі ото Св
Пса їіе тТхо Тр о АвроаБр до ЗУБ ато Тук чех хо бех ред душ Бех 1 5 Кк їх дсекМах 150 ххії ЧЕ «ШІде ВЕЖ «її Штучна послі допиту «вашу» «Ва» Послідсовності УВ, йлюї псходать відм ЗБ УК ОЗ СОВА «Ой» 0030 ків ї12з лвроїттюр о АБО Ав о аБИ Му Акщ Тут Звжк БО Бех зей Буш Бех ї 5 Нв, 15 «ВІ 151
ТІМ 18 «йійм БТ ння ціезяччм лем: пов ї пт лк У. сих
ТІ Тіиуретії гистдта кінні І поетику ми ім т ее теж «айУмМ ПослідовнОкУКІ УНН, ві похоладжхе зім МУ МН СЕ «ай їх
Бем їіе туз ТЕ Ап Авр оАво Су дк ТУух Бех ЕЖО Пех Ге; Пух ек 1 5 12 15 а ж 3 «ВІ їх «11» 25 «Мій ВАТ «3 о Штмчма піндьдевністте сту «ий» «й Послідовності МН, нх) походять вій ЗОВ ОЗВ ох КЯЗ сало 29 «00 19
Ака Пец тик їі Бех цув АброТлж Шех Бех Авдоцшівй Уві Бе ма ув ї У 15 15 1 тА її ее Щ тем, їх чн т ери тс й пі -
Ті Авр отв Аза АвротТах лйіа тах тек Тех Су Ата піт за 35 жк) мо «и 123 каіх «10» БВ «813з Шлзущна послідсвність «Ве ее ва арк тир у хи 2-3 пику у 1 Зо ве МУ «ййі» Лослідоввості У, ві мохолать від МВ М Ох КЗ
За лу «40пз 153 ох хо ін і боях ; дозу СТ аа тах ло те Ід Іа ще ие
Аха Пец тах Тіз пех був Ащю Так обеах пув о Ао ся уеї ві їхвм о Вк
У Б І) 15
У ин ША І щ яп длто ей могти їли Мо уже
Ме Аво БЕЗ Узі вБвротТвхУ Аза ТБ ТУух Тук Сув Ах дко ву 45 рід 158 «піїх За «ЯК ВВ «13 0 Шелчуєсмиа спіл пеідуіст я штучна поМЛУКНОМам М ств «23 «й» Послідовнотті МУ, акі похопать шід ЗОВ но кщЗ «апйх 124 вт Мей тп її Бех Був азроїйк о бех Був Аза оса Уві Укі ту ТЕ 1 5 15 15
Мей йвр ото Чаї йвротвх Від ТЕ Тух Тух Сув діа сіл за ЗЕ
ВЕН З
«ах їй «Кі» а «ВМйМ РВК 3» Штучна послідсовимоть «сад " Тіто гати КД ве у стих ж рат аб Еш ж ші «ЙйЗв Полцділовискурі У, вмі тїтахопдти від ЗОВ Но ККЗ «Ов 15 лето Та р жу дув тла Дт, пк бе яко Ффшту Фа тА тм уч ва бе бу Хі Зех їтя Аво Тех о бех Був аздосбм Уайї ел ім твх ії З 16 15 гла с т А Де 4 чи зво я и НИ За мес авроБго Мах АБО о тТаг Аза Ту ТЖух ух Су Аза ТУ - РІЗ о 8 «102 155 спря «Ту» З «лій БЕ шк ч Б и в А НН -акі» Штучна послідсзнУсть
ВИХ т Трач пе вач ЗМІ ті пече чн І хо фу кхЕвй» Честлідсвності МН, ЯКА походаАть Від ОО УМ ОХ РН «а» 155 дпкц обема ТВт ї1іє Зех зуб дер о ТВХх бет дув Ава бід Маї уві дез ТОК ї З 10 1 - суч пи щі дя ти Ім спра пази ем фу АТ дО о
Мет Ар огта Уаі Ав Ту Віз пк ух тут Су Аїв о Ммуд то Ко щих ли каМах 177 «112 25 «вій ВАХ «кйї0» Щеучна посділовність «во «паЗх Ппослідоввнопті МН. пжхь походять від ЗБ УНО? вві реч «40017 ха їзва ТЬ»х їіз бек цу Авр о тах Шех їув АБп бій Ууаї май їжи тТву і й 10 кЗ дме щезту укусу ер и Ву р но ми чих п п
Место аз» оРхо МаЮ о Аво Тв АМе тех бух Хух Су Аза Аха о КЕ я«щїйх 128 «Віз й к«Кйх РКК «Е132 Шеьучва подибдовність «ЕЙ»
ЧеШЯ» Поспадотномухі МБ, шкі срувосуєтв від ЗОВ УМ Ох КНЗ «ап» Ай
АкФосбеб Тих хів беж дув Авробтню ву Буш о АВо Зіп о Заї УвЗ ей бак 1 У 12 15 кйкіюо Ще ля оди Ин МО ся чт пли жи рин гео ке сеї АБИ Оржо УВА АЮ ЖХЛХ Ага стає туУхХ ТУЮ Суд йміаонів 2 к «Рій» 125 «ММ 29 «лій БЕ «війк щШвучцва поплідовнасть «й «Ваз Поспхдавжнохі ММ, ней опойаднть вт о ЗОВ ОЗ вд «4002 155 - тома Чичи Ср щу но голяко Мизку тує сту фл еОаН пи АЛ тому Те
Ва ій тла тБіе тех оБув Бр оОчлдя ехо був ЗБ ба Уді Маї Пец тах ї 5 15 138 ї - Ду іях шо нн о Не нь кеш о кої ма дл, ду
Ме: Айр обто Ма) АБр о Тпх Віа Та тТух ТУХ Суд Аа Ах ре 4
КВ 25 «піп» 130
ДУ
«їв 83 2 нок «ий» ЇКТ «132 Штучна послідовність «их етюу уч сет сеімізичиннї І ще ееумиу ми він лили рою око «йЙ3х Послідоввосуві УНН, вії ссукомать від Ух Уч є КЗ «по У жу ток пи Ши Ук ска Мр у а од ло з ро ши БьНечни
Ахщоїшеу Тахо Те Сх ТИВ Аву тах Бех Мбув Аши сб о Уаі Уві рем о тек 1 ї 10 15 -. - дід ск ппуза Мід тя гу ху че 1 тік
Мет Авровко Уаї Авор тах Аїз ТУ Туху Тух Су Аза Нів
КВ. 35 «и 151 «її» 29 «Ел йз ВАТ «12 ШтУуцма потдіпсовність
АЙЛИх «айв доспіжовисмоті МН. аа походить віл БВ чно ККЗ «ро» Му
Аххройача Тло їїіваЩ тах шув Авт Тих беху Був АЛЕ т іп ові Уві Бем отв 1 ш НН) ї5
Мек АвроБхо Уві ввротас о Аїа Тв Ту Тух Сук дія сп за 15
БаЯНЕНК Я ЗИ 1 З аЕжах ВКТ «132 Щтучща досліоавність пд ен «ЙЖЯ» Полі ловноистті МВ, ямі тумодяхс» від ЗВ МНС БК «м Ох ко ім тах 018 Бек бу Аврд жМмх еж Беж Авт ОЗП о Мі Ве бекд БУВ з З зп НЕ
Її 15 15
ЩІ мл пу я дою пре тд леж ча Лю зксї ру ух
Аія Взротнх Біа Аве Так Аза Твх Тех Туюк бу Аза ій й 5 «МО 153 сах В поршня «кій» БЕ «813» Штучна послідовності «ай» ку Те Ме аїічія З т стих куа сю спехо СВИТИ сао кхаййз Посдішсовності УА. які походить віл ЗОВ МН ОЇ БКЗ «4002: 133 хе дю твоя т сил чес; й т Ян див То де и Ід їх там: т
Аже ри ТВІ Тіе бБет Був Ав оту Бех пу Ази сіб уі Уві їде Тех й в ще ї о 1 5 твх зво рхо Уаі Авро тах ліз Тих Тут Тух був Аза ЕФ но мк а мя «вій» ї34 «811 29 «-31їх БЕ ях Мах чинні мірі и «813 ЩШежчна послідсоввійть «швах «ай3» Послілдовиоссті УВ, «кі похомать від ЗОВ УВО вва «ах 134 4 Й чих, ст с о А и ср АК ля ши Кх и и дуг ак Б - се вка їм ча ї1е дек о їув Ар оСБХ За муз Ат Зіп Уві щі бен отьу 1 5 1 їх пе шт (нич (37 ху ТАКУ ху та им жиє чи - гак оавроБио УНІ бБврохнх пів ПИйЄ ТУ тУух Суд Віа ій о те 22 25 «10 55 «Вії» З «ВТ» пот хи щтучЧий ПпОлліШЩеВАЛлХХх й «вййз ПосліцевногжаА У. зі бпохопите» взлоЗОВ УМ Ох КЗ «ап 1035
Зжшса па ву їла Бе пуй Др ТК опПех ря вв ОС Майї Уві гм о тве ї У Ач 15 со мг жук, Арон хо сіяє Міка бе бе
Тк ово о БхОо У) Ашю ТОК віз лю Ту тТух Суз діа Ту
Ка ї5 «Мій 115 «Вії» 23 згрчсучу вт «-81йх БК «13» Штумна плолідовниьть «Во «й» Послідовистті УМ, дкі пзходатеь втд ЗОВ МОУ ЕВ «300» 136 дон - т Тих им тот Дону ЧИЯ ан рі Тако ду пря ЗА Ід Тідх па. ака їец таж Ті бе Буй Азю» ТОК о Яег пуд бо» жів Уаї Уві Га ТНХ і БІ 10 її тру Доля бічну 3753 дю ль й лиУую бю пчм б й А т їх о Авробко Угі Ввротвх йла Так ОоОтТУхХ ТУух Су Ада пу5 шк НН -М хб «вій» 137 ках п «їй» вит хїі32 Шеучна послідовність са чу х «Еш послідовності МН, кі похолятв від ЗБ УМ ох ЕВЗ «00 1 що, хи бро т лу Тло Ден ях шою Где дл сі тА пар ку
Ахч Пео тах Тіз псу Був Адротак бех Був ба спо Уді Уві Гц ТКх ї 5 10 ї5 -- ща Ух Пет, 7 пс року же ДІ те кої ях є й. УК,
Твх Азр ого Ууаі АвроїТнж Ліва так тук Ту Суй Аза дід а5 сп сте «піз 136 «її» 89 «ЖРй» РЕТ «их преучмна послілевність «пай» чиаї» ослідзеності УЧ, які похопять від ЗБ УК ОЗ ЕКЗ «А 8 аку Бей тиж Тіз Бек о Пуз Аве оїнпу хек був ап біду Мак їі Тех
Н к чі Кк : ї жу о
Тих Ввробхо УА фвЬ тиж дів чат ує Тух Сум Аза Мій пл ах «Ве 0139
ЧА Фо І, «их ШЕ «ВІ 0 пибичноя соломі кАдг мМ
«ЙО «шах Поаснішевноюті УЖ, акі походить звід о ЗсЯ УОЗ БРЗ «ах 133 пе хв Пезж ги Ям о гаки шину пух ве сваті М Ан ния
Вка Мей отит її ТВ був авроїтах Жак обув ви бій ах о Ууяі Бей отих ї З 15 У ле пт пе зт Ден м. жду йти тим о йчгд 7 Док: ту аврорко Узі Зшо Тих дід Та о тук о тук сСув БМіа АлІФ т зи гг «10 340 ми суд «ії» ЯЗ «дій ВЕ хріїк Штучна послодланість сина «ех
ТУТ Трисмі нулі ті М што мем ун дім ЗЛУ хосю хол «Вих Ппеосмідовності МЕ, кі мокодять від ЗА УОЗ ЕКО «400» 140 чу ту ств Тл т вк ту шт ПИ - - як тео тору паче
Вахо о пей Тих їі Тахо Му ВБроТну бек МУ Ал обі чаї Уаї ред ТЕ
Н 5 о 15 пра й - ва ех - Щі пе мк жо ро З сі т
ТВу Аср» рхо і дер От віз тиж Тук Тух Сув Аза нів а й -2310х5 1 «ВТ 29 етвїйх БРАТ «132 Штучна попладовмість суздя хехИ -ййЗм сбраслідсовасстті МЩ, пк опзисдять від ЗОВ УВО як ем 13 пуч т ян Код пря чи пе Та лан Тит Дину у хгу КУТ ТЬшШЬе «рсучия
Ах Тк оз ТВХх Муз Ваю тах ек їма Зза са Уаі о Уєї ву сте ї У 10 15 сте Ф їх 374 пух ну Яни бю сб жи ох Ура тТВг овзороВхо Уві АзоротТМх Аза тах тує Тух Сув Аіа сів
КІ Ки зів тах «10 жк «Я. ха «їй БЖ пр- Злити алатуйтях ї сгвилстх тс, «ди Мьриутаиа ЛІМА У ху «20 «їз ПосліддяностО УЖ, вд походахь впля ЗИП8 УКо є ЖЖ
НМ пал ях 155 сло ще зртяния Тс уза тд В ти у их ує ше ше й ях ув жи темі її вху пев о тдє Фіє бег цпуУув о апрожпх ек 5 Авоп біді Жпш пед о Мув
Б я 15 хЕ З ха 15 піно жу СЕ СА я шу нн Кк Фердує сяк спас ж о їхни Від о сУТУ пек дво ТЖБІ Авіа АБротТвк Віа ВЕ Тух ТУХ Суб Ді СІ
З й «810 143 хвії» ІЗ сум о «їй» вЕТ «Щ142 ВШжуяна послідовності «ля «аз ПоспідснніМміІтМ МН. хк3і походать віп ЗБ УОЗ вЕДЯ «ап» 143
КА ся ве поб зи сер Тк я Та. 2 бля г 1 Тіуах. ле
Зх Таб Тр Ті бек Пув даю ТЕХ бех пбув зва Зів Уаї Маї рей так 1 5 19 15 ду до зн Я ї г тя дО ля як її кає ще ее
ВЕ оАво роз Ууаї Ввроїтну Аа твйлогух Шух був АТа Ахх 7 их «шт 144 хі: 29 р аг - «ий РТ «13 щучна поОслАдДоВНісти»х й ких «Ві» Поспідовноксті МН. вкі походять о звід 308 У ох ЕКЗ «п» 145 че свує Же Та бога, доуч Ин дено Її чиє їн п я г тк - йха пехм тах Те беї був АвзротТвВу пех орев Бад біп Уа уаа Гей бу ї : "й 1: 1 е 10 15
Ав Аврора Уві Авротспж ліз ТВх ТУХ Тух Сув діа сів «10» 145 «51ї» 23 стату г «ким Кт «Вій» йтучмна послідовність «ВО
У, ти. пристати т док сгитежаті тп тт Зв ІМ зи кхаї3х послпазавосжА УК, кті кожкодатз» влад З ММ хх Ка «0» 155 б тих тк те бе тд в лизяє Фе тд ті іпроля лк годи:
Зха тем тах її Бех Бу Аве о тТвжЖ Шех був дДвпобій Уві Маї їі ТЬьх 1 Б 10 15
КУ шрот 2 А жиму рю тю щи то їле В пла бами оАво Боо Уаї Бор олт віє твху ух Тех був Аза стих й па есшуйх 46 «83125 а м ру пек о ІТ «132 лучна посдплідаувніт слух «до
«із о Посдлпеватсуєу УА, які походить» під 3 УНН о" КВ «а0пйх 145 до, з тих Тк Люко гдут де три пек Тут Ат І ові дО т рон
Ах ТМ ТАЄ її: бшк о Був авроїТвУ бас ув вал оса уаї Уві Зуей Так 1 5 10 ГУ йва авробхо МАМ Аво Тл для ТБ Ух Тмк Сув Віа пух т У «ЗМ» 147 «Ві» о «вій» ВВ «13» Штучна дпоппідовнілуть «й «Ва» послідовності ЗН, які походять від 308 ЗНО? БЕЗ «ай» 147 вка о Бео тву ї1і6є Зек ув АБроїБтІ ЗвжЕ дув Аа Піп Ммаї Уаії їз) ТИХ 1 З ї0 15 два оАвр око Маї Ар отак ід ТБ бук тТух Сув Аза А1а 2 ї5 «Щі1йх 148 «1 1 «азам РВЕ «Віл шШеучва поспідсвнаств «ВД» «ха3» послідовності У, нхі лоКодить діл 308 У ох ВЗ «30ах 148 ря р і тод кт т и. -чу С АННА Є - ех че Ше тре
Аха пе тля Ізче Чех СУув Авр о Тйж Хех ув Бвлдобійп Маї Уві Бе) тце 1 в не 15
АвпоАврорхо Уаі дав Тих Віа ТпПж Тух Тук Су біа нів хи 23 «хаМі» 153 в ш «-й1йз ОВБИТ «13» Штучна послідовиїсте
АЙ
«дум Ппослідоввності УМ. нкі пеомодять від За Зно? вКу «АйОм В вхшоцем БВ 11- Так о іув Звроїну Бек був дип Сію Уві Уаї йеб тах ї 5 То 15 гЕаИ Авробхо Ууаз Авротьзх дія Ту Сбук Тук Сук ВІВ БЖ
М КІ
«ах 150 ву «йіїв З
Кт, пУве «вій Кт «хві3е ШруУзиа послідовна сХь «алу» «вай Послідовно сте УК, які пополет» від о зла мно КпЗ «а0п» 155 дужит тТодума ре СТ до он щ гаку СИРуче схема тус - жі. п лю сажу пк ака пемй о тлдж пі ТБх Був Блротаж дак пув Ап сіп Мал хв мем ТЕХ
З 5 хо М деп во орто маї АБО тах Віа тв тТуУЄ Тук Суб дів Нів ло 15 «Вій» 5 «лихі 49 «ВІЙ вк
Клие перу зи і мем хі АТХ шщшвтУчма ЛОоплиднмАа тв
АЙ» що Фтилті мозеозичен ії 4пУ п муха ї Бик тип «АВайх послідовності МА, яко пшходать від ЗО МН о ЕКЗ ей» 0 ї5і кто Ме чи тр до мо гг, ен меду Жоухкя щ пли кА и зд ях вка їна ТИ тіж ТвВХ Пух ЗБОЮ ТВУ Ве цу Аве оп Уві чаї рем очних 3 У М 15 п що - щі сі пре В сек тк ке іл Ярило ави зво орхо Уві Ашю Тех Вій б тТух бук Сув АВ ХО го а «810з 155 «їх кій ВАТ «13 Штучна послідовиіште ча хЕшх «ий» о Леммувлтамаста УМ, япЕБ пехолеть дія ЗО0й Уч о" КкАЇ «й їх
Зх Бем тах гія цех Пуд Бкроснх Зв деж Ав сія Заї Бе ем Бу
Н У ТІ 15
Зйв дак, чн У мо хом пан япіучя чи я ка и Шин ак о АЕО Тих дія ввОо ТІ Біа тає тує Тук Сув вів під
РЕ 5 «гм її «2115 28 «їй» ВКЕ «Й ручна пооліаність
АЙВИ» «сЕй послідовності УМ. пмі покодить від ЗБ УМ З ВЗ
«ля 35 кас О15У сх ока «ит СУ из ФУ стоиих довую Мі Те Ти ку Гу ен нн: М ИНА доп цем тах та о дех муз Варогнє цех буд Бай ся У МАХ Хе ПУ й й ще це
У 5 15 15
Меї Ажробто Маі АБроїпах Віа тиж Тух Тех Сук Аїв о вку о їх «вм Іа «иїЕе 25 сту з тот «ай БТ ие Не пит З уретри «13» тучий послідов ти «вий лах, те ро дуть ик те рулет чит Кк п Я з ска «а» ПеолідзвностУ ММ. мні гпбхолите від ЗВ Но КЗ дО», 4-й ча мож
Вч. с І ле лк до тм. м тощо уся 1 худ ті такт п
Аж їжі тТБх Тіз Бех душ Аве ТК о бех бує Ав Спів У) уаї Мей тах 4 с з 45 х ія та да со де зе Мак фею дя лю бує о пуєу гук їх 3 мех Ар обез Уаї Аввр отих Аза ТК отТУуД Тух був Аза бід 2 28 яв хц хВі0» 155 «вії» 83 «ій БЕТ «ІЗ» Штучна послідовність «Вих «о Тем ті пневмо ни есумучит : ТИВ ЗМІ ж у «йаї- Послідовності ЗА, які посхомать від 30 НО ЕВ «аппь кв
АЯх 155 дм ін тТпх Хізвз пехї бує АшЕ ТВх Бек му Авт бів Уве Майї йей ТЕ ї й 10 їч
Мек Аврора Уві ВвкроТвх Аза тах Тух Тух Су Від чне кА люд са» ї55
ХЕ 49 «вій» вт «віїх Шхучма пеослюдешнаістть «ах «Й пролити МБ, чі пихолите від ЗБ Мох Бра кА 155 дамо Ліну мн жу кує я фрлуч М им їн дом КЛ тк, ж У у
Ажщ їй суми Хі паю МуУуб АвюотвьК о Бех Був Ащу ЧУ св Мі тем БеХ 1 їй ло 15
Мет Ашвоїто Уа вв охпх Аза отих гуК Тух Сув Аза був ло У
«ША МУ «Вк да «рій рит «ЙРйх 0 Шалчніяй тил до ВНЛЛТТ» «ях «йй3» пПопмліллвмоті УНН, «кі тюиходать Валя ЗЕ УМХ ти «АП 157
Аха пем Тпхохів Зеат тв Аво Тих Бех був Ав би аі Чаї Бем'вво 1 п У 15
Меб Авю ржха Мі БвротТвЕ Аза таготТух Тут був АТВ АТа
Ж Ка
САН НІ
С
«й З «їй ВВЕ «Вії» помчна послідовність «их ера" кричи сіні я чин зві зр х а 703 будь ндовВності ЗВ, дкі походять вад СВ ов Оох кВ «400» 158 джу їни Трх о Тівз ех пу Аж тТпх Шех ув дви обс)ма Уаї Уві Бе о тне 1 т ій ї5 вода ІУмту їх зу піч АХ що о пу па нь в
Ме; аврорко Маї АвЮ ТВ Аза бах бух бух Суз Аза Мів за «вій лай «115 3 яйХЙйк БЕ «МИ Штучна послідовна ре «ее»
Ма «т погризти лі ті пет утеих та и чпІ хх ОХ «йХ3» Посліловності УББ, хкБі походять нптлоЗОВ лі я ККУ «40п2 155 я тла строї «їв Ач ту боау тТихв о йдіз (и А ЧЛ зна
Ахч бец ТОЖ о Тіс Те уз ар о Хву бе Був йди «сій у«ї Маї Мей тве х п То 15 ще сет Женя уж ле с тачу й Чу тк тик тяги 15 ще
Мах дев Бко УЗ) Азову Аза тах тел отУух Св Віа Ба в х5 «йо» 159 хдій» ЙйЗ «ах БиЖ кава Штучна мпосплідовність «о ап ту ії тех дІ Паша газ вухо щі ті пт ж ри айУу» поплідовмстА ММ. дкі понсодять від ЗВ УК Зх ву
«Ай 18 дхч бен тах їіз ТВ Буз Ар отпх беї Му дво Сі о Ожь маї бе ЖНУ 1 З 13 її
Мет Азор обгто чаї Вар оба Віа тах ТУуХ Жух Суй Аіїв Мід зо 5 «Вій» 161 «ві «Вих Бе -0ї3У щтусна пошлідивнать ай «Вів Цесліцавності УВ, пкх опойсднть втд яп УВ ох ЖК хай 151
Ажч Бе; ТВх Ті тах бує Ар тлу Бах їжв АБИ біп отаї Уві Бев отак ї КІ хо 15
Ме Азробго УзУ Авротах Афа ТВу Тук Тук Суз Аза зга
Кв 25 ха» 189 ситі 8 кій» ВВЕ «іа» щтучна посідати пох «З» ПЗеліловності ЗВ, які походать вів Зла УВО" СЮ «а» 165 т1е Бай Бго Аза сткр о вп Від тує
Н З
«Війх 153 тиВМіх й «йо вот «ве ВЕ «пї13» Шеучна послідовну ть хво «ва3м послідсгвнссти. УМ, пкі походлть вілоЗОВ УК ОЗ ШОКА «ап» 1853 тів деп Бто Ліва то Ба АвротТух ї З
ВІ» ї5 «Мі й «ЙХИк ВЖЕ «815» штучна послідовна сті» ех, ша «шій» Плолівовності МК. яко походять відо щШ УК о? по «ар о хва
ХіФ дви Бк Аза Тук рпз Аїд жу ї ЗХ «ЙО 188 «ії» В «Вій ВЕУ «Зі» Штучна послідсвність «В ав послідовиосте МК, які походи» від 308 УВО? СІ) «43005 185
Її АвБ Ехо дід Тут Не двр отут 1 ї -8ї4х 166 «Вк 1 «їз РТ зал тла тки ку ги мі ит «8115 Штучма подліповначте а крх
Не
СА Піч 1 жила ідея 41ле ст пд ол, їм пе тА и свй Послідовногиі МН, які походажь відо Кох ВА -0005 166 пи С я Му Туя: (ж) пре лаз сере Влд ту сіу сій сту ТНК ск) уві ТВх аз бек лів 1 Ку їа «їй 167 «Вії» 1 «Війх СКУ «13» штучна послідовні сте
ЯМИ» «ВЗ Послідовно сті ММ. нкЕвопокоадяихе» Від ЗОВ ОУН ВВА «Апох 167 ткрозім вів су Тих їн) бві Ту Ухжі Звж Бех 1 х 10 «віспа 1858 я«аїім Щ5 «Ел РТ «й131» Штучна послідоависть нау «Й «вйах послідовнисті МЕ, й гощоцать ЗВАДОЗОВ УТ" КВ «-40йх І15К
Вворотнт МАВ бво твлоців чек обка Від Бех Пец Аза у Бек Пе 1 З 15 15 «1 153 «їм 15 «1320 пит
«13» тУсва после Укь хи» или де Тичина гри тися сети п у р сті гу. п, ОжИрл «03 Гоплідосдності М, ямі походато» відо оЗши М КВ «хх 163 йжр діє уаї Мес Тк бій Бек ого ВвроВеє еч Аза Уві Бек Тем у з 1 15 «вій 17 ее х «ш1їх 11 «2122 РВтТ «213» Штучма послідовність иа кад «піз о ПпПослідовної:ті М, дкі поколять віл ЗО8 УТ" сові «ап 0 170 з вл Таднит Фени КТ с Семи Ка пи щи
Су від Ват осів АБО пі Ввройах Бра шес АЗИ 1 З 15 27 я «10 ут с ше 11 «Гу» ях «йРійз РА. ко з» пе тич я писати. «рух Чтучда послідовністі» «ах 7 Ти и гм? їт яещої о улитх тя яти плов пу «й Послідовності М, дкі помколять дія ЗП У? СОБІ «00з 171 все іа бех піз Ар ос1у Лаз бах різ Меї Ав ї 5 їй «102 175 «5і1т 11 «Вій» ВЕУ 5413» Штучна послідовність «ЙО «Я» Послідовнопті МО. які походить вид За УМ? соВЛ «апа 17 ч ке ту пи 15 пу пе т - гу зла : - птув цех пех ЗВІД вв о іУу АвроЗех йде Мак Авт 1 зу 10 «Віа ОЦ «вії ЛІ «і» Вт кару певхецща питні вимі хакі» щтУучва попльдОвнмаА сть ся т пабі «ИЙ» Піхлпідоавноштї У, НЕ о псклдить Від оо ол. соку «400» 173 тво Вів Цех піл бжросіх вв оЗзу Ток Ме Ав ї З їй «вій» 274 «дії» 11 ля ТЕТ «кій» шШтуцна попложовнавь «ях «ВІ3» послідовності Му. кх3 пориздяить від 30 Б Сов «ах 174 пув Аза Зак осія вшросіу ВЕ Зах де без Ав ї З Мо ев ТТ хйіїх М «Вій» ВАК «В13» Штучна Послідовність» запа «ВІ ат Бе же пеня Кай щі ит, т, тії З доли х НІ «ваім Посслідовності М, які похопять від ЗО УПУ СОПДІ «дм 175 голу Й Же даху пк Ак ре - ве
Був Аза дек сі) Ар Оу Ар оБех Бе Моб Аїа х 5 хо «ка10х Дт «?1ї1з: 31 «аїймМ ВА «аз шШучуцвна послідов ість «Й» «лі» Песлзідавності У», чЧкї похохлать від ЖЕ міх СОд3 займ 7 «пап» 175
І т. пут ду «С Да Їх бік «з Ка пу Аїа Бек жі АВ лу Авюо Бех жхУух Ме лів 1 В 8 -ій» 177 «її 11 «дій ОВК Х «2338 Штучна послідує «айох зва т - - : Й НИ ще я «й» ПобліновнотА Мі. зхі походдть» від ЗОВ лох ср «00 007 їтя віз Бех Бех бароїу Бар зах бпе Мек доп 1 в їо «ї10 178 «Мі 11 «Ей ВЖЕ нем тн ачу м зчистити паста» шжУЧНИЯ ПУЛ ИОСщИЛМ сих Боглідосйносості УМ, ві похедахь відо ваз ме сок «Оз 78
Атоа віза Зях ет Аво ім ВвроЗех ЕВе Ме деп 1 У 10 «Я 1773 «іх 4 ее ЦО «йї3а Штучна пепліловністм «Й» «83 послідовності УЮ, кі походить від ЗОВ мих СПК «4а0пх УЗ тн сви боти бл дя з йст бю М дод пух ек век бех зер Зіу АБО Бек Рава Мей Ай ї В хо «еїйх 180 «Віїв 1 «їй» РЕТ хів Штучна послідзвиаьсем «ав и» хх, перу т шен і жилу мч тен Се пт ей» Лослідавності їз, йкі тпоходяжь від ЗО ЕХ сову «4йп»У 1850
Му Ада Бех бевІ ЛЕВ СУу Аби Бех тТУух Мей Авт 1 В о «їх 181 «їх М «чиїх КТ «Вії» штучна послідовність ей
АВ
«ай послідовності УМ, дкі птзхорить від ЗО лу сні сапох Ну їн Від Зет Зеж Ав 1іу Бо пек Бе бен Акпй ії З їз «рій ЗУ «ів М «Вій» БЕтТ «хї3 ручмна песпліцаеносте «два «бул НАЕК Я учи ие мамо из ох пу чай послідсжаелті Мб, ака поОлодните ЗДО Ух спі «МН ХВ ув Вів Зет дек ввр З3у Вр оЖох бве Мес дід ї З ї9
«Вій» 183 тах т «хіїх її «ід» рат «вів Штуєсяа доплатою чий» «ва» Пласлішавноасті УМ, дкі походяхж» від ЗО уп сові «ННІ» 1853
Му ліз Бе Зак АБ су Ада Бек Тук о бец Аа ї З 18 2 де пд «2102 184 «ефіх 1 асан п «наді ну «йїї Штучна поспідаанісстуе» «пах ау пл Тит грилі ЗИ ямі жив Не потуг - хі Поспаповності Ум, ВКА похидять вл й Ух пЮДУ дай зд «4002 184 - 1 шую Тк фо зн от сум ІУЄ. ін й муз дів бах Узі Авробіу Авзр оШек пе Меї Аве 1 5 10 гляди дк х2102 185 «115 аа сте тету «хі ЩЕ «213 Штузна послідзвнасть ай
Тло тик спреї т як ячичли грі жої т СК лут ою ке 1 «лів Посльйзанусту Ум, які походльть від ЗБ ме со «00» 155 - 1 Зную 17 ях 1 пок счей м. ч т -Я с, Ії ака вів бек Уві Авропіу Аве Бех ро Меб вла і п 180 «йо» 185 «ам Хі з : ей ВЕ т хВіМ» Штучна поспідовнусть уз. «й ха» послідсеності М, виз спохомахь від ЗОВ хл.є СстАї «апп їни
Су Беї ек Уаі Вей осплУ АБр о дех вда Мей ДВП 1 Б та чом 187 «ії» 31 «п од яхАхМо КАХ «й1йз штучна послідовна сть
ЛУ
НІ
«ВИД» о пооелідосвиолплті ЗІ, кі пбчиспдтв Ввід ЗБ М спі
«00» 187 пув Аква Шех Уві Азр о Сіу Ашрроцех Тех Меї Ада 1 хх ее ї Я 10 «10» ПВ хів 1 «їй ЕКтТ «813» ШеУцна послІцшиВНнасть гуде ий» и Пиммя як цігуєяї п ооичах и діє п У У т «вий Послідоввості м, акі походить відоЗоОВ УубУ СсВНі «Ой ї1ВБ тує хі ла ла тех ттрію пуху би Фіз То - цуУуз діа бек Уаії АБЮ СіУу АЗвр обек пе Їдо дей - є щи ії З хо «Йзй ТЯ «й1іх 1 «1028 ВЖЕ -233» Штучна послідовність тих гл Приз зечіенні 1 пі гчужше рен щі У г х СІ «ах послідовності МО, вкі покосдать зід 358 У СОКАХ «0» З ти сети геї ке не т ау пи, -- З мУув Аіа бек Уаї АБЮ сСіу двр бек раз Меє діа 1. У о «іх 130 тя, 11 «Дів 1Х з ше «їй» РКК «ІЗ» штучна послідовність «ках «дах послідовілсті Му. нжі дойадять відоЗсв мих (МЖщ1 «ай» І т щі Сдлтих 7. Мети де жо ще Меч щі Зх цувз да Зек уві Азробіу Ввробем кує (сен; Вів. х т 15 «ВТО 91 «к1їх ХІІ «Міо» ОВ «ій щтУсаа дослідна «лах «жа Полі) дотвнюсять М, ЕУ походать відо по м" сові «00 ЗУ їз вій Зсу Аз оАВО СЛУЖ дню опех Мйа Мах Ади ї 5 М те ме ти ММ
«лит» 1 «Зійх Кт як ж ТенЯіанкя чу Кі грві ик
БИК че Ка штучна попшлаьлешшнаикскк «ай «Ва Ппотлідсвмоті М, нка походить» відо ЗОВ СУЮУ спі «апа 195 йкч Віа Зех ЛЮ Аве сіу Бр обет Бе Мег дл і В їз хаї0х зу сут я -4 «иїїз А хвійв КЕ -й14з Шетузна послідовність
Уч «АКУ» поллідовниоюштУ Мі, дкі походить відо й мех Ср «Ай» 153 пу о дек Чех Авровавр Зі Авродек Бе Мей Авт ї 5 То -йї0х 1954 «12 11 «ій» Вт «9132 дптузна послідовність «пай «ВЗ» Послідовності МБ, вкі похаците від ЗБ МИХ СІ сопе з «й00ю 154 с З т г ст лу. 1 й у г хе ог їуїт Аза Бек Ар ово біу Зврошах ТУух Меб Аде ї 5 10 «пах СНУ «21ї» 41 сен ак ває -и1ї7 ВВЕ х2і3З» Штучна посліловніств «лах «йшов Пеолінеовиссті МБ, які походять відома усе ОсСоАХ «ВОМ ї134
Кома тити дош сир - рн у нач Фе
Мув Аза Бех Ав Аво пу авроЗет ВМе це вБА 1 ї хо -саій» 195 «Вії» М -312» БВт «Вій йжУЯчна посльдсзЕНІіСТЬ вад ка ей Песлідовиспті МУ, шкі ссцзжоравив ВІіДОИВ ме" Со «іх 176 муз віз пеї давролат сі АЮ оБек рае Ммеї діа 1 З 1 «зму 197 «ТЕ 11 ках ВТ «13» Штузда посліпсовністе
Киев а «ва3» послідовною т: Мі, ЗкЕ походять відо ЗВ УКЯ СПВі «4005 0137
Іво Вів дет дзр о АБИ Сіу аби Бех бух Тзиа діа і 5 18 «ЙО» 135 «іїМ 11 «ЙТИ» ВЕ т «13» Штучна послідовність п кам «ай Поллі доазвнасті 9, йкі походить від ЗВ У? СсрВі «4002 ІК їув Вів бет Бе АБО о сіУу АБроЗвх Ре Меб дви і З 10 «10» 129 «й1їж 31 «пд ОВТ ел» тя ен - си су ги ут є чаш ох штучна посладоввітлтх «ах «З Послідовно і Зу., які походи звід ЗОВ ОЗ» соеКї хай: 199
Ака віз Бех ББе вврощ1Уу Авробек Блє Ще В5Д 1 В 15 «шій» 990 «8112 М «кій» СЕТ хвій» Щтучна послідовність г «ЗП яппйІ о посплпадовисстти Мі, вМі доходах» від ЗщВ М Сов «пом о
І Жек Пех їн Звроблу лу лат їВйе Мей Авя х 5 18 «ву вої «йі1ї1з 11 «вій ЖЕ или Пт сизим гуд тах ях штучна посоплідавнист гу «Ж «3х Посялідоваолтть Мі; яка спехомиать відоЗспй ув сп «ах 801 ол, З и с тових, ба ож вк «Дю м СС У Ке уз іа Бех пе Аво Сі лвбоЖех ТУХ Ме ов ї У 15 «Вп» 209 чахіМ «вій ОРБ' «ВАЗ» штучна паплідеоваАтю «ах туту тних і ігумен плести тут ото ЗИ ОМ чих «вва пПочтлідсаеності УМ, цпЕі похожить вл'дожаОшОМа Спа Хх «00 Оп
Ппув Міа Бех Бе Авбо сСіу ЗБродпех бе ей вав ї З 19 хіп 0
КО: І «1 ВЕЖ ейпх)м штучна поОоплідоваліен й «3» ПоОослідсвноєсті Увб, яЯякю походити вед айв ох сві
Дт ил
Ап пу їв Віа Бех рце Аво зі АБроЗех вве мер Ат ї й 15 сля тпй «їз па «из Хі ромен «Йде ВН «81аз Штучна спол ліховді сть «а дйх «Я поспіловноюті М. мякі пожодчхув» вів ЗОВ Чт СшН ад е 7 «Вп» х0Х
Тит й сих те ше ік ще ге си ки ти у пут Аза бек ВЗ Азросіу бах Шек Тек Бец Бій і ї 10
Зк З
ВЩо ВОЗ -431ї2 6 Д (015 «Мїйт ВХ «213» Жтузнз попслідовні сть «ВД» «Є Урі ря ськ тдлажитяї ЗУ по пи щі но й хи ст «йИЗх Послідовкності Мі, зі боходците вдо ма А Ки яПйх до теювотутошжМа с мУув Вів Бхо пім ій пло Бо їме мі; інша лома ле
1 5 НО; 5 -х 306 «Вії 7 «ву РТ «Вії Штучна посліцєсвність хх «йа3з поспідовзності ММ. яю похоадяль відо ЗБ Ох СОАй «0» 0235 пУцу тануУ пу йщуу болт Ж Силу
Мах охо пет ВТ аитІ хлі пшХ 1 5 «Вб» ло «їв 7 «В ВЕ «813» Щтучва поплідоввність «Ем «Тйй2 Послідоавносчі б,, які сеахоОодлаже від ЗИ УТ СВІ «4002 70 авр овма Зех Ави Сер з ко Беу 1 5 «ві0б» ап «вМіх 7 «йо» ВЕЖ «аї3мМ ПптУчна послідовно «йлйх тя Хіти ян гетто с с а НН їн лек . т дй «ий» Цосбмашувноюті У, кі походивь влдожух БУ СО «ай» 58 тк діз бех Ава меми Я шж
А 5 «ЕоО 208 сих ОВК «В132 Щеучвна полслкллвиа ять «Й» «ЕВ3ю о Послдідовкнонуві М, вка. пйпжллять від 308 сл. СоОКІ «ап» 55 тас отих Бех овзи Бей бій ТНх х т «кій» 10 «ВМ 7 «ши» БЕТ «ША» шЕумчиа послушовиА сти я «йаа» Послідовнестіь Мі, ЗкА походить вки ОЗ миє шов У зайти че хай» 1 я від б дахотому гі ти
АшОо вів їжу Вей обам опо тих ї З «Вій 211 хаїї» 7 стру де «війх РЕТ «1» Штучна послідовне теь тим «да» «Ва» посліцовності У, яке понодать від ЗА У Сов «ВО 1 сне 1х зу дит см бдо тв
Амо Аів Бех ав огем Аза тих х З «п 215 с 7 сах 7 «дій» ВВЕ «їз Штучна поснідовнхттх ек сих «83 Поспіловмонтуві МО, яка вожодяув віх ЗОВ ме порно «Аг З кАйоз 21У
Же Ада ЯЧеу ап блем піз чек х й зай «ВИТ» 513 ал . «віх ? кві» РВЕ иа свя 0 Нчезеридо ситі мем і аа. штучна поплудовиаштуть «220» ши би тра трктід вікі 4 ні попит такт. о Не ни х еуЖв т «ВЗ» Послідсвнзоті У, Які похослать ВАіДдДОЗПЙ М СПЕ «оп ТЗ ех ЖНт Бек Звпобеч 3 Бех 1 х «зі1б» 218 бек ой «117 ся в -013х РЕ хВі3» ЩтУучня пусвідсевість «ря чахИх сах послідсвисста Му, вка позисдять віл ЗП М ОЄПРІ см» 814
Бек лк дет Аа Би сій Зех
«й» 715 зятя паміх ! «й РВЖ «213 Штучна гпаплідовнистх са» и, Тік рута тет у т ди тки жит тої Ів ле дигю пт чав поблільзвихопту Ми, акі походяшь ві 55 Му Ок хапо» дій
У р ж тн вх Те ин Аж
Тих ОТИХ бек одни БПез бЗідйошех 1 ї спеш и Ід
ННЯ жа «3115 7 пори «кйх ВАХ «Вій» йбуцна послаАдивніссуь «У30» «тА, жи УКяя мч Учя А їх «ел кул ке шле УК т поету яЗаЗх послідовності У, дкі походять вій ЗОВ лу Оки «адОх 9515 тих Тих Жех Бех Ме бій Бех
І ш
Х я «ххійх 5317 ся за «217» 37 «їй ЖК «Вій Бтучзнма послудовність 23 «йеп ее стече дими КОТ ді тугу миттєвий, аогр ВИМ дО іч «03» ЛПосмізаовиссті У, вкі похопнята вдос у» ЕЖЗ ак Піч т
Я» ричЕ пчах тт : же аж сих оз т лу Й 1 ме - Ул тр пі Кіз вка дів буб рпеа Зеї Аза Бек сіу бах бі Таж АБО Ре тну ї 5 15 15 темі шт Ж щі люту Зх их ту З Машу Тен Моя ТАТУ пе у утри цей Авт Тіз нів РКО Уві бій бли и АвротмЕ Бі блю Сук о Тук Суд
Зо 5 39 «вій» 318 «й їй «ДІТИ» ОБЖ «Ва» Штучна послідовністю хІяОк
ЗТ ях, ит мі лити поле пити жо. дім В сг Х Ук х«йаїх послідзвмистсть УК. пи покудато» від оЗшА Ух о Ква оду «арх 518 пім Ма) жо дар Ака Ба пех слу Пех бі Ше Суб Тих Ввробве Тек х КІ 1 ху таму Жви їл-е бак о йеи сті ЇУрв Від 115 дя др А лу рик цем вдж Ті бек Бек овоч Пів іа бій Азов оУщі Аза уві тТеу Тує Сук хи зи 75
То ха зи са тв «сам 219
Ах 8 «Вій» БЕт -813» Штуцпма послідовність сх ій т Тричихуєт ти гетто ї сте печу пп ок нн пор мкитеж «ййЯт Послідсвності У, яхі походять вип ЗИ У сСОКа «4002 215 сій Бій беж два слі АЕО БО стує тТВх 1 5 «2105 220 «Вії З «Від» пит «213» Штучна послідсвнатсте
АТ
«хай х «ВЖИ» Потлідовності М, які походять від оЗоВ Че ПОЗ «АФ» 250 бів бій оЗех тТук Чек Тахо Вко сут ТЕ ї З «Ві» 821 «Віїх З «210» вв «віЗх Штучна послідовність «Ох «ВЗ» Песлідовності МЕ, нкі похслять взяв ол СОН
ДИ як «005 пп сій бій Бех тук по двр охо Тук ТЕ 1 З сятв я «210» пий «ах З ха ВАТ
АЙМИ Штучна полпамОевВнлаать «впейх ай3» ПпПосльшеовності УМ, як. покоддтьв від ЗВ УМ СоАй ка й
Сів Зід оЗеу АБО пек Ащо Бо тут ТВЕ ї 5 «210 323 «Кі З «ри вт тЕМах штучна поснідсовнісит пах
«йЕл ПосмтьпсатнУтМ Мі. які похолпитьв від ЗБ МБ СОКО лад» й бідобій ех дав осі Ти бко бук ТАК ' к «й102 па ок КО
Ол рих «війт БЕЖ «шу ШтУЧчЧНА пПОсСЛіДдевниьить ай х «Вла» Послілсвихсті З, які походашь вій 38 Ух КЕКА «4002 84
Та піу пі піу ТБ бує беч Сі) 18 бу ї 5 10 «10» пе «Ві1їх 15 хиз1й» ВНТ «213 Штучна послідовно сть «ОЙ «і» Посліповності У, які похомдяхе» від ЗОВ УМ" БКА «002 825
Рне біу під бі ТВЕ пуб їз бій Хі Кув 1 5 12 «23» 76 «Віз» 714 «йїй лИиЖ «Ві3» Штучна послідов утк «ИЙ» «вай» Зав -СсВа УК «ИЙ» 285 часзісотца сгщеасосадтл ссбвщдетсест бра соцтце стспвачада деадцчоласе 5 звпгсавстоя зуЗссяуєся авабзскав битва вив пІлеї чваселоатає 1 лзазасзавевс свосасазоес зсссзагссо сосвзсссасяа сгасассова сосзодасит 18у здсстусстас всазЗскими подат алеа ссооцаасва ессбовспої сатеовитаце ДЖ вцапудевоц сопвацдагаї сдсвас9роак бассозссазо задача списи 0 вості соавс вичоуивщетав чоброачніс ваводпвацеоя часа спаде 15 щессааєттци вубавоосо сцисдассито зочаззсоа чузососгсвоаи чавцстипо РУХИ гадсзадептт сблесстасяєс стбсвисяде бассшчалчяа асгрозЗасодаа чизоаоси ца чцасавдчапо ссзавзочсах сецзаєчев зассапоиссвоа асвзсопавяця соло ча свасевовдМоса зопзвосвпадеє свв авиМ зпсаладат псрсадляий пупегасаа о пеесссаота Зосозатвес сепушасеесх зсуессасе сах усвах здесалецоє Бо з вокалу стек ве 4 патсоцоуєт вацанвосотй зерлавоапусо сопосачсса аслссеадаюи Кох 114 «108 597 «аю» ІЗ хи БЕХ «ЙІ3» Штучна понліновМість «а» хиді» НСНУ СВ, УК ха 87
Аво тів Маї Ме таплосій бех Рхо Аврощеак пе Ввід Уві Зх їж Ту 1 У 13 15 сю; Ак; Від Та 138 Аа СУБ зу Віа ває суп пах Уві Бзв вл Авр
КВ «5 Кк сі ввробеї рРлє Меб дв ТЖкрожут піп ошьн лпув Бко Піу 010 ро Бжко 35 0 45 їм Га Ге Яке тух ТВЖЕ ЖВлх бсх Ап о дез сліз бех піу Мді рез АБО 50 5а в
Ажа Бе бсту Зі Бех плу Бах б1Уу ТаЄ Аз оБре тТМх зу ТЕ їїе цер 85 70 т 30
Шек опе) бій о йліа Пі АБв о Уві діа магії Тухк тух Сув бід обі Бех Ав
За З5 піз АБО оБко тТух тах о вйз спіу ОБ о бім тає був їжшо 01 іа був щ1Х 106 125 119 щу пі бах бі біУу шіу ЩІУ біп о Умаі сів без Піп сій Ко біу Аза 115 170 Ту зЗіч Бец уаї вх бто 1у Аза Бех Уві Був Мем бек Сув Був вія ПЦех
ЗО 155 НО піу Тук ТБх Бе Тахо Бех Тух Ткр о Мес зва Турдроуаі був Зір вх рхо їа45 150 155 во ші піп су Беца Тр отї1із су Меї ВМ Авробко бех др обех 61 ї5х Та 175
Так оНує тТУХ АзпосІій Ме Бпе Був БЮ о Був Віа Тахо їжі ТК Узі Впр ін 15
Шпук БШех Бек обПех ТВі Ма тТук о Мек біл обей бак шцЕХ Би ТАЖ Бех 01 їЗ5 РІ 205 вв оЗат Дія уві тТуУух Тук Су Віа АУщ Аїз Мес о пі Тук тка бі щі ах ві КТ сіу Тахо Вес уді тах Заї МЖехк бе Ммаї ЗМ; РЕОа Був хв су
ВЕУ 835 У «8102 оУВ вивих
Бо ин ких «кій дик «КУ щтучна посяйдовнаьсись «их «й» Св. їУпЦ вуса
ЕЗУНа ЧТ чакаустяссла спасесвогмі сосспастсапь соасбопезса зсассузчаса асовзосокес що вгстстізрта забодауоса чащессств сзгасоЗася зчаазчасакта сосзЗавсоЗ іхо седпссасвоа асо цсса сссоссвайс сусосваксе зососазезчкс пвавссваас іо
Я ща ях зх Бе їз чех ю пакоачачссо содасаєче сапсооцсваячс засво ча сазвогЕсас ассзЗзавасо 40 взсвузчсд ачдссомюда плода сзобастас счсзазчсас аппатотосу 350 сксвоЗзросу чсуссдшсас сазвссьсдай содазводва чпоерпзассест азасочачеай 350
З оч ЗМ чичУча я де Ме зЯя аяжснчаче сасчетасес ссазчаЗавако сбазчсолссЗост пссодсплавцс ссесвсвдає побсзсассу й зсксцітвсох сосссЗеапе сссвскчазс всобсосзуЗса сззчоЗсасу ска осЕ зво сацесстоссо завачасьсх заацізаста бсасвсвсв слава соасзачеое 40 сагзактссад ссстсвацай созчастласв віссссавуч вуасскишсва ззвассвазеа оо плиЕссосасва црсзвсат: спзассссчку пахассочссеа саптаскасно пзстсвзавса ЗО
У - а ао Я: м з - запсосчоссі засос ка сіпцарссава сподасостоз сосзсбзсслав сесвІссвао т заззиваак з ТА
АЙ» ОпИЗ «еїйї» 954 «йо ББТ «813» Штучна поплудовааьсть
АЙИИх «хижі» СОВА, УМО- БУМ «0» 99
Блю уві уві Мей тах бах тах о Бго Бей освж їні Шех о Уді дв Тіз 0Ііу 1 В З Кк
Пій Бе лід дет пз чат См ПувоЗехк ек біз Чек Мей їм Ав о тТБх
КВ; її за і ож пі я Тік тт ідеях, я тим Юм пу, бік Кім ду
АвробіУ був ТАК ОТУухХ пер АБд ОТтТІвЕ Б це) Сів АрФб БКо б0Ііу іп пек 35 ща 35 гхо Ап оджч Боо їі1ї2 Тух їси Уві Зсеу Буш ем Ав Бех С1у Уві Ро
Зо 55 Зо
Авю Аж Бїме жк Бім Жеє шу пезх піу бркЕ ваше раз Так оце) був ЇХ та т во
Зек Ач Уаї бі; Бас АВробені 0М1у їТ1а Тут гук був Ткро бід ЗБІіУ я за 5 тТвж нів Бай Ро їй Тв ав сіу Віа біу Трж Му Хез щі ей муд по 18 КН см суу суу Бех б1У піу шу піу СТ Мі ти мем Ак ОХ; Бех у її15 їі: х85
Бко діз без уаї пуб вхо тйжЖ сій тТвх о йем ТЕ Сей тТвлосСує ТВжЖ ре 130 135 . ко
Зак слу Бпе Бех ри дет тах бех сіу Ммеб 01у уаї сі Ттр їі Бк їх 158 МУ 150 слроржо бо З1у Був о йла їі піс Тхроем Аза мів її Ттротхв Звр 155 175 175
АзроАВо їуз АкЧобук аа бо Дів Бе Був Бей Ак їм Тех Ті бех і80 185 150 мув Ав) оТьх бех буз ЗБ зів о Уаі Уві Бед о жбилх Ме тат оАвБп Ме 5; 135 200 315
Бкго ба) вав о ТиЖ Ака тих о Тух бух Сув Аза сіб ї1з АБИ Бко Віа хр ха 315 Рижи пе Аза тут Тео Оіу ЗійобБіу Таж йо Ууаії Тих Уві ех Зех бе Авт 225 з3 15 да вЗущосім зі СуУВ ей З30 «вії ОВ люту, щі од мл «Вї132 Штучна послідовність
ШИНА вче ини
«ща Вина. 1 МЕР ха» Іо часасісзоа сдасвасвосо ссовкостос ссаєссттост спосужфуауа заувсксвое о поивасісяоо здодсайммасса здедайовує чзастзахсай сапооавсссса чЗсеалаалсстя НК затеадвасса соразасчсеє чапстасуєс Ффсайолдаєсть соазчеаглссще пебоссевай їв зациссачов чоазодачио союочбсадес каекотостеа созесеєсає побичащесх ай чагавісст) садзвоисасса сіаусовсав башта втсозсцово згопацо по задсдатсвачс сЗсдпайссзва вучвдесеца сссповсцосд зазассвацх стаасєциво 360 сазчесссдоп сссадесозс звачсскзус спстссацсзча асскЗсскя саводескКеоє 350 жссасасто ссассовуєка стос созаслезс вавдоассооз впала спех зо чазсззаєтоа зсакощчссиза песессвцас задксвавссс ассвсавссз засзстрсвави 5340 зчзасайдчассв сассоастяс паесзвзавссс спсадовсвт сссвсасчеа стос огде ЩО сссаєсвістса зздассстас зсгссассас сзсасвауве ссгсоста сссоессадв еко
Чезассессоге бозаспсзсорс сосадековеа сеєзвавосто с тай «Ві» 531 «дії» 234 «Від ВВЕ -«513з Штучна послідовність «ий х «а232 8В5-СВ3.3- УКРА «аа 3
Ар тів сіл оМесє Те біла дек Рка Зех дет бе беч дів діа бен су 1 ке 15 І5 сьо дк Маї ех ред бат Сув йку Від ето обі зі Їїз Зеу Зіу Ту
КЖ рес 10
Бай оЗет троси біпосіз Був о Бхо АвропіУу Тахо ді Буз Зущ без їі мі 45
Тук Аза Аза ЖШеж ТВК о Гті Квродех сзу Ма Бко Був бхщ Ейе пех б1Уу
Зо в 50
Щек піч чех Зіу ек ойвр тує деаб їм БОС І18 бек Шех їм ПіЄ беж
Ук та ла КО сіль Ав Бра дів Зв; о тух Жут був демо с) тТух Бе дах тТух РЕЄ ГПеу щх Зо 5 пвх вв ось Аївосьу бик іув Мей би їн; жа п1у З1у ск вк осСту
Мо МУ 1 бім біж Шіу біа ужі бій без дів осів Бко лу вла сім й) баї ху 115 де ї25 рхо Зі Аза дек оуаї Буд оїти бак Сув Гуз Лія Веу Піу Тух ТК БМ
НІ 135 140
ТнЕ Зекотую гтв Ме бЗеп о сСхр мак Хмтув жів Ак РКО О1у ідо Пд 145 НБН 155 180 сі тТкЕр їі піу Меї Уаї йвр о Бхо Зк Аж Бех сій Ту Вів тух АБ 155 що 5
Сів мес Ре ув Авзроїув Ді тв Бей Тк Узі АБО о буУуз бех дек Бек ї55 85 їз тих діа тух Ме Пі це) бої Зву без Тахо обек Си ВБроЗеає Аве тв 135 а 505 тУк Тух Су Аза Ака дія Меб біу Тук Тур шу пів піу бле бек чаї ах У зай
Тнх Уві бек бах Уві сій бхо дув Бех Сує 85 ЗО «вай» 235 «аї» 726 «вва ДНК «813 штузма послідовність «Ей х «да» стві. -БВа-ЕМЕОВС «Ні» 237 засзскссв суасссвовс посасссвеї спосо: са всвукпчася вссвопосио її акстсрсвтв ачссвауіса чвоссссрта свтвскувох саевваєсяаа Єподввомча ї2О скЗкхасвча зуссжузсма цепуссвяат пасе ато мо пет 1
Мссдсвацуси соЧвсачч састдзсаиь Зазісзсзца сачахксстсвнос зстпудаави ай хасзцпазсот ачуссосвоов сіссозвате сассвотоасо озсавоутас весвоотхссо па сесвсутссо чсоЗссісадес свзадессочвЗ соцавасуза ЗоесдавсссЗш вас зва свазссвасс сковосяшис Зозачзвасо кіЗахочсавс сода саплааестт р тро взаво сстосзячау свобустас чводессоєта суупасосцочі сочссаох Во ссатцадчвацоа зосустая осот ва ахсапявасяа звпстваваа повоцевасв. по таствіпсосз взексозоідаї азузазусто ассаксссза узщшатуактс сзавзадчивае її зсспхасстсс вевілдвасау спідасадих своя лслакотаста соч йо стос вспвогуєу сосвазуеено япоетоспедтає посслоссвко сазсаоя та пзвайяє тав вас їй «ій» 13 «Лізї пай «Хійхм вдЕ «21» Шеуцна послідовність «Ох хйр3х СВЗ,1-5ВЗ-ЕМОКО «300 533
Аве» Чаї уаї Мет хну бій ВЕ Без Бе; Му їв Бех Уві Авт о БТів Ту 1 З 1 її біп вхо Аїа Бех Х18 Зезх був ув Бех Бех б) ех іа Бзм о Авротну 2 5 о зво осі Су Тахо Тук Меп Аа ла Пекі їва Зі о дка РКО біу біп БК 35 да 35 вхо Ашп о Аку їні Ті Тух Без уаї Беж Був Са вро оБех біу Уаї рка 5о 55 50
Ав оАко Бпє Тих о біу бетст сіу Пех Б1іУ ТБ Авр о Ріва ТКУ Км опув Х1і2 55 КВ) 5 зо
Зежх Ако Чай сіб Віа З1й Авройеб б1Уу хіе стук тТух Сув Тхр осів Оу за ах
Тк о Нів Байе Бго інва Тих Впе су Аза б1У тик Був Би сім бе; Пув 150 105 це піж сім ші бек о й1Уу пу ім шіюу 10 Ууаї му бе) За З Зело осі 115 ї20 її
Зі бІіу ей увЗ са бо слу біу бе Меї (ма ій Веб Су ЗІ Від їз 135 140 зах бзіУу пе тв рідне Зех ве Аза тр Мет ввЮ БТ Фа вка ій же 145 159 155 ї6о0 чина ня яма пр 133 ги їж; тд джут ше їдумо І голи вхо хім був зум їщ Під Тхюр о Уах АхМз о сАш 18 Ак Аве БУВ о Ба Був ї6б5 ї70 175
Бви Мів віа тає огмх тТух Вів ім Жек чаї Хе Ху Атеа ре ХХ Ті 180 хв а ек о Акоа бзр о авро бек пув бех беї мазі бук їшиу біз Меї дБ) Зак їн 155 дО оз
Ах Лід Піза АБО так бі гізів стук Тух Сув Б1уУу дія Бей сь Мей дер лі ЗІ 220
Тук ткю пфу 1 о б1у их Жах Тез тТвК Уві Бех дор пе Аво Ак ощу 225 за 2735 ай
Зі су «їй» 5134 «А1ї» 965 «їй НК «ВП Я уузна спенутішевнаств
АВ
«ВИ3м вими -СВІ. ГУНОКОС «а0пох 534 засацисовця повевмлацис Кссапсттосл стастіслсоу саспзачвдєе дезацилетх. БИ птсеассеЕдко зЧоедевапса зчаазвстацї зчабоваЗБива спалив зсадаваста 120 засцтавассв ссвавощост чесссвлевст спасспаєсс сазвососме бзЯспосавна 150 зач рсадко човна ий Мчошссацяє пасбрсеглоиса ссабсадчсви Кошова 740 чавцес ка свдасстайсв псамоссгаства свекстацзт втшеелкодо било. 05 пидассваце пуцачостлява азазазчосчча пососвчоЗ чадослача»х сспяасстасва 1655 папшпоссоача спцечцеокеаче чааспостсачиа чстксазоча заомосемичу сазвтло 425 застасайто псассдоєта созсасЗавс сосцякЧавос здазссссоу апа 480 заасусассс збаєчпитча ссоссссзазас загузавстос зстасвевса засзссаза 5359 чпасаєстосса саставслтяс сласаватос сссадсасву сстасапаса чессеарсацо вп пічатасстоз задавосмтіІвп зЗУусптовасквас спопеоеватва спаксчасста соцпшчесамх аг тчавсоссва созссйесго ссіозсбва пусухи за «йМх 235 «Вії»: 235 сих РК «Ві» йтучнз пуслідовніств «ай» «айїх ВУ СВІ, УНеБО «айох 255
Вво Іїе спа омМек ТК сі пех гКо Зеу Зеу Мей Кем діа Аїв Би ПІіУ
А є А "Кк р ЩЕ Ку (ще.
бій дта вах бас ем ТМКоСуй Ас Аза Шек Сіла Ії Бех ЗУ Тук
Ка 5 30 ї2а ЕХ ТкКроїва бій зва Гук Бго бвробіу Тахо Тіз був Ата їжа ї12 35 30 45 т, А і» пе яти дол пк ік пути Ми До Ток От сх
Тут А1а Ата щем Ту Пец АзврочЧех О1у Мі руб пу вич бе ех сіу
Зеає см ех су Бех Беротує Чех Ба Тв іє пех бек Бей сих Пед а 75 во
Аж чу до Мет а на НН ЯН зяж ІМчЧез бик о бкачих Спретих ші ли Авр й Азв о авробух Ту СУБ Бец о бімй чук Біне ех бух шу От 5 що 5 ту вве бі Аіз бі ТБ Муш їже Сі їеи бує і б1іу лу Щек сіж 100 15 Мо піу бі піу сїіп уві Щій Бем СМ Ста рхо бі лів 510 гео маї зго 115 хх 25 вхо ЗіУу Аза Бек уві Му їм ББЖ Сув о мув Аза Беу Оу тує ТЕ Ре 150 ї55 150 ча дат тух тло Мес АБИ ТхЮ УВІ му бій Ата рко сіу пів жу бе 155 150 155 жаб бій тур тів сі Бест Зв3і Ашо о Бо пех др озвх ій Ж нів ух Авт 165 179 іт сами Мабї шив їУує Впо Був Ма ту їм ЗБ ща дво БУв дожх Ше ць хів Май ке зу ВБр Був йма Тих їм) Ха УВА АВ Був Беж дах Нею іно 185 150
Тр о Ала Туж Мер біл оїжка ЗК Шех ви) тд Бек слід Авробех Аза Уві у35 2по и тра би би по дя Зд жте з бі жир и г паче Сашу «т
Тух Тух Сув Ма де Аза мес бі бСеж тур біу Обід оЗіМм РйжЖ Яну Ма 21й ух 222
Тл ді Бех шШех зво піУу бі СУБ
ЗИ
«а1й» 335
Не ИН «2185 лях яаЩУю ощтучща риллідіанаістю «Ед «ийїх С5Б3З.1- ВЗ
«Ам Зб часов вопвоссвдає писавессасе потсїтошиіа всассоцяєсв атовоекос й ахскстозса затсвацчеса чалостосів звізда пааоасаса Сус авВеояХ її зсвшртїасзца зчпсадусоа чбесссвзас сдоствзбос аеро саввотодас 155 птстччає підасачоь саспчусвиа здвосезауз сзоариксвза зоддавнато 240 ззсапачсза запстдсазоа гсбоЗзлтавс стахтвікась сдоусазвяцта ввахьстит о пісасвсксс Зспсізазас саазссошас ссузхвауеау созувиссто вочсдаве 155 зчаезчсоаацо посазучазсс гулазсашае ссузсосвас сктосаууато слоіцЗАаасо 482 «сЕКЦоЧава сосспЗавої спасссссате чЧасосесочв сузасктоєує соечковексе 4185 псвзвсааса частксассо осшетасісва зсгхсаваса агпесваавв кгсакосдася БЖ тасівсзссзч ачсстасове озсавсаквс вссасстова зчатасовсосо свававотаєх БОЮ шстрассотчс ваазвойаасвс сставсвосс заадасасоя пока ств спот ччечех п зпкгсзесстів аповоисес сплажчесасос зоекепеасяю соспешнессх фуда ВАН) «Ме 537 «11: 850 «ій» ВТ «х13» Шеучна цеслідсвність «МИ «й» сдВа. 1-85 «пох Оу
Аве з Чаї Уаї Мебї То бід тах РХо печу Тахо без боех УВІ Аво о тЗе біуУ ї во її 5
Сі вра Дів Бех їЇле Зв був Був Жек беж бів Веб бом бем дю Тих хо 5 КН
Аве о шШіу пув їпк Тух Ме) ВБИи Тур без без Сі вхо Бго Зі сів цех
З 4 45
Бхо Ази Аху би Ті Тує спе Уукі ек Був Пец о ввродет жі Уаї ро вай 55 5
АВ оАжУ Кіжз Мах Сіу Бех іу пет біу пюжЖ Аг пре» тих Бе пу її й то та о
Зеї Ату Маї сій вів піп Вр о еа біу ів бук Тух Суд ТВ пів У їх В, ж тат мів ве бо сен тах Рав бі вія сіу Жак пукобем біб рей зуб ток У ЩІ кт - І с Ки 2 зе пк ту їх отих сток ка, их бхадси и піу піу Зіу бШех Ту біу ім сте Офіц МБЬ Мме ве біб 24 ЗЕ су чЕ з нс
М15 ік хе пли кі) Тома тим ря ри бУїах т3Л я меш ЕКО тео Тер іууй (букс р. іх сЕж шіУу Пец Мак Ма Бго біу лу Зак Ме пуб іа Заг Сум сій Від
КУ ї35 147) бика й єю то сю Факс тро де тично 1 тр ОбФіч шк дек му ро Ту Бпе Бех шо дів Тр Меї Ар отТтр уві хо біп ББХ 145 Мб Жь5 не зу ТМ тд тя гол хо ау 1 ж ох. ж, рен а и Б НЯ
Ву осле пу су пт Олі Тур оуі Віа ОБ Ті Акоа ави Був Аа ї2г5 пре 19 -к 155 17 ї75
Ма Я шо Воло тан криє ту т ія бджолу Ло; (тіл, пу ЗВУ пн Те пава Мін Аїаз ТК оОЖух Тух Аїа со пе Уві її слі ВКЯ На ЖДЕ те ак й ї80 185 190
Зв Аж о АвроАво Бех Мудозаєс бек а тТуХ їм суб Мет: ЖвБи БЗевт лю 135 200 за пох й шо й сш шин арк - Є: Ж рожа 3) їх
ХУ Аза зм; Авро тах Зі лі тмк Жух Су ЗМУ Аїа їше О1іУу їз АяЮ ми зас ех зх їХ5 ЕР ке труну ки 1 Ка кю тя я К БУ Що кут «ую Тікати гтУрш тухк тв осі пів біу ТК ОТАК лай) МН МвІ бБет Чек пе; Зд4у 01 ув з за За 225 235 235 в «вій» 938 «ії 7 сут се «йїхх ЛИЖ «3 Штучна послідсвність 2 х хи «ваз МЛ ЗЕ Праймаю «вари 2138 сзатчсанав сеччачасяс аповсовучес савссзсаоє аИпсекоач а кій» 39 «ака Аз ся мит я«йМйг ДНК віх Штучна послідовзимсть «дих «пйіз БапаВяЖ Праммєр хо» ТУ Й скссзваттсх асвазвесте споусписсвесо лазпадчасоє свою 45
І 240 сві х 45 хВїйв ДИК свій» БтУучна висів хсяь тІаИх «вуха до ОЯ Подиймех
АС часрсожес ссФфувсоссас сстосотрсеат скоса ЗсЄ 45 «іо» 24Х «х1їз 47 «йїшх ДНК «піЗз Штучна посліпсвніств «ай «ДЗ» БеВЕЗІК Прамер «апп» зах павупсацеах пссспоалсооч аспецзацса зарессцдаоу ахес 47 «аМм)ум її ср. ни «811: 48 «ММ ДЯК «ві13- Штучна паслідовмастк «вче «хйп3м їовпБасе Праймею хі н)м ах тосчавтівик ааститстос пспогабцазс чЧацддвсааєсоя паз В «аїйм ха «8112 48 «їй» ДЕК «йРаз о фтучна послідовність «а пейї» Балан Праймеє «400» 543 тЕсЯсссосв ссассуске сУбаЗссУуца пед сасоб чобота 48 кам» 254 ха1ї2 49 «ах ЯК хаїй»2 щтузма послідсвність «ах «хи» їн Праймео «г зай штлллчщаци зицоваслусо сачсчаззач апозЗбоавоско ау ах «п10х вах «1.» 45 «вій дик «ВІЗ» Штуцна послідовнМсть «ВО «дай ВАТ Е Праймер «00 ак савдсатаах заптасувса васзсахтссв чакллалтвсвЗ пос 45
«ІЙ хА5 - «іх а «ДІЙ дих І «13 цшітмчна послідавністю «Май» «еВУх їв вавя Прайеер «ах жа ттсцуавткос: засазосссес сапссчасазч ассагозаза си 43 «вх а «81» 0 1045 «Ай ДНК «213з Штучна послідиаи ость «Кай» «скййм й. а ха лКкарра «ВО» 547 засзЗкпсазча повассосаяиот посвоспвак сусп опсо сопло усача авОкешекоо БО апсвассцсв споисвзачсча часа квос везчсасссаєч сскзесатст асазчзватосх 150 чисаадзоасва зоаечи тех сабзусасзає чзочспзапио бзсазсотяс азвектососаоу ї1850 ацчссацьс чсацчсичавс сбоусасвзсак бісаосскся ссагстадава ссср х4о завцчацсітьа зчзассстаста сішссазсач сасстассзваї ассспассао ЗЕбсаЧкКсї 00 дрсчассвазс Козачатсаа всоЗаслоусиса босоувчуєо двопссацУс свосссувава 350 чечсссспцосс султатас оацесссосо сацасостся сссбдвоти пости 42 четческисас кчазнаєкос ссисаїоацут часа а кесЯксватс сісазпоаау 155
ЧчЗзЕстатасе сусізпчсаса сапттолече зчастахєтлаєса засоессаква поса зад авзастсцвс кзЗасвантокс сзазцатасс Меосачодеасти зааїеесессе сваваеспос чо азішколаса сопосвчвовс сеаптасвозо Засочесо здабвдассо пасок Се слпссоівссчозу ЗссзаспщУжс ссіпцесасх пковасссво бсцеваасто сопе зх адиптзчутаств счшсещшевос віслтувстеєс апсжксссЗо пессплозвизя зтазкстада ко тствчавссо спе стх спосо осо зжевесохс всслсовдача зчапозавнтса. 40 сачсрузашя сзчасястс полова оспвайосос адууувзцчачсиї сасадаєзиау по часзусагдоз зсачсвсста саспесесвче зосасссооа сусоЧацовае зпсадасоас чай падвазсвасяа зашшкєтатас содечазаїо ассодесазея зссецацеох дпоосуксатя їх запвисіссв асдочцевзев З точ4 «ам» аб
АйЛіт лав сти вит «Я У» Крручня песлідевністе
ШО
«Ва» й. 3О08-пеЕврра за «зі «а 48
Аве чаї бів Мес Ту Зід о Зає їїєй Чех бал оги Аза о від Беж жо у ї У 10 ї5 зЗім Бек Уві цех їзе аБИа Суж Буш Азво ех бій шек т1е пек пу Тух за 25 10 ем Аза тур тУух ей Оій був Ето Сі Був Віа Авп о Буб інва Бе; Мет
Су. зх
Тук Аве о сСьу бах Так за Зій Беж сіу їЗеа Бхо Бек овЗло Бізе Затв сіу
Зо 5 БО
Зак 01іж Бек пі Тахо АвооБМе Фах Бей ТК о Тіе Аку Бех цем 01 ЕКО 53 70 тв ва сі АБО Рпе о сіу (ні ух Ту Суш Зп бі нів ук іч тук БО Аї8.
За зо 5 їз з п ук у гаях - тих ще ау ах те жур сю ГУ пт 4
ТвВж рпе сіу Бех бу ТЕ Пуж Мед са Хі Сув сху піу Оу Звак оду «ди Ак па о їо5 10 сіу сту біу Сі уаї Тр демо був Сн Бех Сіу во біб Те без суп 115 120 125
Ето Бех схо ТВх іншо Зех їжа вах сив бех Бе ойеак пу Біма Зв ит. 130 115 ї4й яти МТ. ар и Му Є ж хз фл я бити іх дов, 1 Та Сі ди т І
Аже тк одер о піу Ме о біу Ма осіу Тер Хі АкКУ Мб Бко бЗау Зі (УЗ 155 159 155 ї5а сх тим ія ПФесуу їі З щі З ух и єр с дону Ве Тло Дт и
Уж ее сіл: То пе) Ві НІ Ті Тео Тр о аЗБв АЩО Аво МУЗ Бхш ТУ
Та 170 175 зва обхо йіа ей бує Бах Ак Пед лм ї16 шекК о Був Бсуротах цех Пех ува УВУ 150
Ав одів Уаії Ре Пец Був 112 бій бек Маї Взр ЛАК Аза АБО ТВУ Аза 135 ОЗ 225 тд Тут ТУЄ Сув ДІВ Ос хів ВвдОБІа Азїз ТКе о Ба Аза тую Тр о у 1 ІВ КееО -о тік лев тові я Мн худ сумо Ху їх серях жар нях тут тк УЗ піжх ім тах лам Заї Тх Зеї бех ек їде: пуу б1Уу був пу пі у
Ха 30 35 «Ло
Це Аа тв УвТ Азїа дів Бк обеї УВЕ вне 1іе вав Ре Бро Бек Авр 235 шуй зх сій лу бе Був Ввт біу тах Азз Цех Уві Узі Су Бецй іс Ави бай хво те ато
Ше Ту руо с Ахе сій Віа був УВІ сі ТЕ Сув Мві Ар о Авиа дія Пей
ТВ 250 ВУ сліпо бет пі Ап бек бій бій Бе уаі твх піз бій о Авлр дек Гу вЕр
ЗО ЗУ мо
Пех ТК о Тух Шех бе) Зеу Зеу лак дез ТВу о їши) Зех уз Аза деротТух 3505 312 315 325
Сі пПув Пів ув Уаії ух Ввід бух пе» Уа: тах нів бід бі Бе йеу
БУ 335 Ух
Бек рхо чаї о твлосжЙив о Зех Ре Ай Ажщ шу піз СУ 149 345 «8102 549 «ВА 1734 «Вій» дик «Щі13» щшлучва послідовність «ай «вай За -х апа ВиХ «00» с7аз слдасвскеЧо сЗасосавсс хесадопесх боззоКоеслк сотссвзопаса паза осасе с азакссстіса азцресвачисв валпизсковЕ солов'озся воза окає часа во 120 свасазавас сапйцеасвазстс вссосжавассс стсвЕскаєа совсвссова спстадчавосх 1850 почвкоссаз ссвазсекат сцесаеяюя сссоодасад вскссатосе савсатосає о астчешшваозз аспчазчатас соспажсстає свстзсппвцс зазасвасса зчЧчавозає ВІ зсеехссовмач зсешисассам ссотасеазала засос чеосспеацяа соппаеасояе З50 зчиерадесивя сдчвцстеч Зччащесі а чодпвооссо спреацтерюисту звати ме састлсесатлест сапспасосво стІссатчопас пзвоіхасаєтеа соболя леФф псвапеплоса зна зсцвсоачцот озуасевко слоасосве аз Часо пос сласає ссассацода За члпасссистзса аозссссако свссасстос азазасаатс сававзасвт сотвоатосу ОЙ саавІствса октезасеко сазосасаст посассбахтс ассусссаво зсатаскасіу БИ чотевасатоса сазжчезЕкак спасосстол пчссваловя сосссацісвс счбсссосса жо сшмучсазУс псзаесзцеастя зашевосос ассаощотс сахсоцеве сеососстса твИ ссшксскіссо завдовссто птодрозсаєв пооссостуа Зоо сааслчаниао кап ссппесповає соЗсодсасця чсоцізчавс ссвпчсЗсос будесвасчЯ счсчевсасе по полосодесва песбвсаЗіє сссвщивамс бваМБпеошеса запас часта зап плевасазос бподсасссой чЧасускатахс сбозасчізча зесдодачес сасдовасасе 105 авслдктосаса зпацессклпа доссгавассї суссасавав сісвсоасвбя стоаосаго То псацтвсссоз аассссосол содасоЗссв зкососсісс сссосспозаз асопавомаєс 1135 алтессксвастча Гссссоушас состпруєес асасзсосч ссобоазасах засссастаа 10 дасссссатлч бсзацсссза ссспсасто сасадссатдса авсзсоасасаз спослацаса їТикО азчссизесдоа апзазсвачса сзасвоасвотїя сасесасосза псадеобессь сасочсиосо 1379 сассадчаєсх зисторзвахоч сзайзазсво аачооваце Зосссазсва вашесоссипод 1180 цессосабса ацававоссво босовзаазчос давсцдоесавас спсопвЗавос вовча 1450 астотасист сапоссоича пзвустдвоси вачвщасстио бососогчвс очоскишо 1500 азацисцштє акпбсесвзозча свІпчесоЗуш чаподосасв сдовасопоса поесоучцвиано 1555 гастасадза совоцусопос сасдсудас сцпавасовсеь сосростссі повосаочсава 1620 преассутод асвацзчваєва зсодсядсвх зоачаасчсь Бобовецесо сосуакцове 1580 чзаЗессоетус апваєссатса свовсадзац адостссоєос бчабецминицу апа 1734 «ах ВО «ХУ 578 «хіх ЕТ «й1із Штучна послідовніств хи» «аа» ЗОВ-Я, ЗО -пОХ «аа 55
Авт тах оЗаї Сей ТІ бій дея хо дід бах ем Дів Узі бек без (Ту ї З 19 і5 піп Ажч ліа Жчзу ї12а Бех Суб уз Аза бек Пі бех ува) Аво оББе ввр а 25 за сіу йве бек ре Мес о Ава о Ткр о Тук о Зіб піл Був Ехо КУ СЇдоБхо то 35 40 35 ув сем сем тів ТУуК ТЬХ ТБ Бек Ап ої 010 Шах СУ Хі Бус Аза ба дсп спе 58 Аза бек сіу ет ЗВу тах Анд о Бое Так Ті Ак Ії Мі 5 7о 75 За туо мав озім Ме сіб ар ТЗХ Віа тТвк Туд ТК Суб Сі сій Псх Аа зе за що сСіа ввровко тТУХ НЕ Бпе су Зі Ш3У тих уч й Ц1К Ії6 цуз Щіу 100 105 118 су сім чех о суу СТУ Зіу біш ст Чаї Пій їх; Маї сій ех бу у її 175 їх сіУу без уві Біб Вко О1у вх дек йеч Муз їв) Бех Сув Віз діа бах 1359 155 45 бі Ро Так Бпе Бех Авроїут Тух Мех віз Ткр Уві Акт бій Ата бко 135 їз МУ 186 тТдж так обі Тв сліз тТкроуві 8іа Бек Тіз пес Тух дв ліу бі Агро 185 ї7О 175 таж ніш Тук Ако Анробек Уві Був іу йхщ ББе так Тіз Шех За Ав 186 її ї55
Ав о Аїа ув чех Бе іа Тут ем сіп Мес вро оЗех БГекі Аху бек бі ї35 об (5
АворотТах Аїа Тахо Тух Тухк був Аза тік СОЇ Ту тах ці Ті Руо тах 710 вух го сіу баї Мей Авр Віа Тк бу із сбзу Уві ет Маї Тахо Уві) Вес бек 725 230 235 236 йцвцсСіу піу Сув З1у біу Зі шех дів бек Тл ув сіу Бхо Шек Уугаі1 дах ай 255 ре Бо пі Віз бхо бо БЗес цув Бех тТпї бек пі пі ЖНуУ А1А дів 5 ЯН зеа Зі був зей Маї ув Ашо Хух Бде Ехо сліз Рко Мві бак уз Бе ат ва 285
Ти о Аже песо пу ЗіБ пз) бу Зах су Уаї Бів Чвж бе рло віза Уа хз 295 зп й Сі чех Зех біу зи Тук Бех цей Пе беу Уаії Уаї ТЬх бах сто 3а5 310 315 20
Бех обах бек їхні Сіу Тк бій Так отух ті Суз Аз) о УдА Ап оНів Му 125 зх зав
Бкпошахк Авт Тахо Мув чаї Авропув Ак уві піз хо пув Пет Суд Адо зай за іа
Гуз ЖИих Ні Так о Сеув БКо Бо Су Бо Аза са С їГви Ббец су ІМ 55 зво Зав то Бех бі Еце бем о впе о Бко Рко Був рто Туш Авто Тахо іні Ме Ії 370 375 здо
Мек Акт о тпх ко бій Зах тк о Сувз Уві бах баз) до Маї Шев Ніз 01
З85 ЗО Зз5 па
АвроВка біз уві пуб РП АЕвн Ткр о тТух Уа) Авросту Май сіз Ууаї ніш яп 318 У ся Від оту - зе у дич их лі к ху ох он не -
Ахи Аіфв Туз Тйху Пуз Руз Аж (і) 1) бід бухт Ази Зежт Тк отух вхо за ах 330 тя 1 Шу ВНС 153 21 Тк її т таж ту СЕ Толя ЕІ Ічих чаї Уві пек чаї бе) Тих Маїі бе) Вів бій Азроїхр обФиа дво СіУу ЗУ 435 450 445 пл ТтуХ Мув був цу Уві) щех Авап Був Віа ей хо Аза то їі ба 155 АБО ге я ї бл "ж пуд тя їз» хи збу вому М ки що ге
Ммув тлу тіє бЗех їуї Аза Уа П1у бід о Рхо бху під орто бій Маї тех аа5 70 475 482 тТпх о ім Рхо Бо Бек Ако АБЮ бі пей ТвЖ ув Авп осі Уаї ех Бец їх 430 95 «х ятво Ти: у со г3л и І1УМнНІх Труну и Ду ті що А що ху 13 паж
Тих оСуж Меиа Уаї пу су Рівз Тут Рхо Зеж АвБ оті Аїа Уаі біо Ттр п дя Зі сіб бек одял у ій то Зі Вп бал тує Бу ТвЕЖ Так о бто рка Ууді тк шт гр 5:15 КІ их ка Аср о дех дор ошпіУу бек Бе ре Брец рух ек їм їз Зх Узі Аве
УЗ Ух зай
Бук о бек дк ТтЕробЗіп бів сту Ашоа Уві Ба йех був Пех Уві Мет ЦІВ п щу 55 зво
Кз Ав ої Вів вза оНЩівБ бух Ті бів Пув Зеху Бе) Зах Бред Шек о Бк
І УТ пу ув їй ЗУ «81 то
«ій ДЕК «Вів Шеучна гелідовністе
ЙІО» «диЗз см мл.-СпІВУВ «аб0з 25 чачзстясоа сдассслвюто босалоштєє стессопсшв сссочадаса дососсоо С вЕксоссраса ацлодаесссв Шасспопуса спагвалсаточ давагтасасга себоазссяо 125 пксацовоаа зассаочесв всстсосазвил сциставтве абсбзабчей сававсодає 188 папазчаатос сепдславчапйо садссчизче зацспееєа сочассбосво вибоаннавьс 340 мив вого патч чич саптаос посазодкає вивчи Уо по задсвучиасос всщсєчаов песпозусчозо» сатптассЗєс дисавовкай воволюсєтится ср стісвочиссо зезчацацат савустідву вісвавачаей посошаусосяа вичсцчвао зве чавочєлавис стзадчвцвс позасовоци сот оасвдає сптудаадацо сагзвавико 450 теапоутлоавасч сепотачахо свист азч свпзсокода подастцевю сага 480 ссзчачвайе зас чацко зчстоастзва вгпвдевасв авЗспвавзда соводовалА 540 тапсапоотч васоссочзосЗас езадасиуко всосвіссосав о слвЗасзакти сазваацсац по - А г, чо 3. зе 2. х т "і Б, зкссгасстцс аавсбзасвоа согазоачии зЗазвзасвстоя зсахБгссавста спо хх 50 таззцеса ассассзцаа ссдазчасвсп вапоебсвлас Мбекессати одовмскя Тай «їй» 54 «1» 240 «дії РЕЖ «211 Шен» пі повіт ка штучна послідовнисть «ЖИ «паз» спозаУБ-сраВУє І «00 55
АшвочЗаї Уаї Ме тв З1ій дек орга меа беж пбем Ра Уді тТвЕ Бем ПТУ ї ч Но; її сіз Бко Мід Бех Ії беж Сбмз був Век о йес діє бек Бей зм АвроБцох йо У за бар озіу їлйв тТВх ТУХ Пео бл Ту ЕБа Сіп бій дуб со Сіу 010 дає 35 0 45 вто Ази вка зва дів тут меи еф дек муз ем Ар о Бек бу Уві БЕа зи ну во
Аве» о Ажу пз Бех О1у Зет З1Уу щек шіу Ту Авор орла Так оЇїхнір Буш Її 7 ТУ во зас Атя чаї Зі; Ві Ма Ввроуві Ту Зві ТуЄ стук Се тк 010 у ка зо 5 жинк ній у су ока "Чан глчех Зк КЗ узяте стууму ток; 113 Ж Хтуку
Так нів Вр;е дто їемв ос вх ра щіу біу Біу ТИЖ цу без Зі0 їїв Муз зпа 15 16 дО Ме Ів пім сії СіУу Бах БІ1У БіУу ЗУ ЗУ із Уаї піп обед ві сліз бех З1у 115 ї55 їх5 піж сту без сві бій рхо су ЩЗіУу Бех обно Вго Мей Зає Суз Аза віта хЗ 135 149
Ззу сіу не их БРБе бат АвроАжа бсо Мес вер отр Зах Аа бій Мія 145 152 155 і вхо бЗіу був піу Пец бій Тр уві діа сі їіз бу Ави був Аза Цув 155 170 ї75 тії З - ііучн А их зх ож ме до -ї лу хи
Ав оНів дів ТМ тут Тут Аза сіб бек оУаї їіз 31іу Ах Биж ТБу її 155 їнЕ ізо
Зеї Ак АБЮ о ВЛвр о Аіа був Авт Бех ей Тух ісва Зій Меб Авт Бек цей заз зо по вхо аїа сліз вою тах Аіа Узі Тух тТух Сувз ЦЩіу Діва Бе) ЗВУ її АБО ік го тут Ткр Зіу йіп Бі тає без Маї ТЕЖ Ові Беу Бет їбем сі Сіу Сув 325 то 315 й «10: 253 «211» 5836 «пійз ДИК «813 Штучний послідов ть «вай» чИй3- співу СИ ЯКА «Об ха чатвпоалв бчавопсачко бссеаксстоло пруток ссо созлтацзваа пачвулоявиє я апсвскоцтс Зуспсвацуса зчавассазЗе чсаствсвІза ста са спосесааноса 150 чигазццеєсо совувсясеМ сахтоатсс зракросзови СазасоссоЗ сшосссавиє ї8О зчапосачео ссазсвевс соушсасоста стовостуса ссаусємилає состава. 40 часову саесокзоа ссдестасяа сабо вбпортсент шт сиоев по
Увщассазоо соаяаасаає завис на ссбоовочех зачссзоях совдссваа ява сачкпссоорау стпазчштстаз дачею сопрсачеда зчатостеа савдисттох ай тестасассос ссваосазота ссоззласуват саоодоедчас аоуопсссссоч алададиаєхо ВИ чзсазтчатся зхасчацеаа сспоссачах веб зсізсавусп о дацоу в оага 54 т и на и питшук лу жу ситет пуучи тут сі. пф ти вкупі их ви цасацачссз сиза лаьс зчасасвісо восацевовоа сстасанлоза зостдаузац о сесастатссз зезасесусео соусоасехас счеслсзачаз скгвзсзччсха ссчсдуссая 5 зчзувсгасоа сеасецестс ппсассоацча даси ав «Із 2854 ка. 3 «віза ВНТ «КУМ Штучна ил ллдевВноствь «Зах «иа СОЗЖБВУХЄИВУНОЯЇ «аОой» 254
Авроїіз біз Меє Тр осув Бех Вхо Бек Бек іні Бе Аза ех Уі ЗКУ ї З їа ї5
Ар Вха у) ТМ тів ТВЕЖ Суд Ат Аза о бех Сів бій 115 Бех сіу Тух
КЗ 25 35
Їсеї Бех Ткробем сіб біб цув Бо піу був Дія Бо АхяЯ Ак їм ї1є 0 5 тТУуК Аїзв Віа бет тТцк бею дер дет слу Мщаі рко Бех АхФ ває Бпех б1у «о аЕ 50 цех піц бек пі тах біо Бра бає їде; ТВХ Х1е Беж йелоїви Сіл хо
Б то т во піз Азоорпе Аза Тех ТУухХ Жух Пув дез сіб туї Ре Зах Тукх Бхо пох
Зо 5
ЖНж вла біу піУу СІУ ТВх о Ббуя У С Тіз Був Зі ж сту беї щу по 155 116 лі сьу сім Філ мяі ій цечз Уа Сід Бет сі Аїя ші Уві пу Сує 115 їі 155
Вка іУ Від Зеж Маї ме ті Беву Пув був Лів Шек о Зіу тук ТВ Бе 133 їх5 148
ТВЕ Зет Тух Тур ес дал о Ткр Уві Аку ста дів Бо ЗУ се біУ їі 155 150 158 10 січ жур їі біу Меї Тіз Аврогхо дет Авробех 01 СТВ Ні Бук Ай їш5 Мо їта бій Меб баз обуй зд ко Уі бот мес Тих ТЕ АБротВх Зає твк Чех 130 185 178
ТВЕ дія Тух Мес Пій без Акз Бек іо); дк бе зво Аа Тих вата уві їх оо 5
Чукотмк Сув Віз Бк Ма Меб су Тук ЖкроО1у під су Тих Ту Мах тій 215 233 тик чаї Щек Бех Пец біу сі Сх шах 33 -йїйх СБ «Кіїз 595 «їй» ДНК «ВЗ» Штучна послідовність хи «ййАУ брав ВУВ СОТ ЯУНА й «400» 255
Засасссаця Єдасстовосс стосвосстес сбакссуоси скзстучача Гацдачесвос В аксасссасс зщасвачкса ззавзассаас сдесгастова зскзасссоса чесадлавоса 125 зЗасаачаєтс ссазасосос свіссасзсс девсссвоссї Сазасксосоев сзбсосакесс ів заст сазсц повясдако тоцаяссзац косвсссса ссдесвусаЗ побрсацеої 40 завачві ств свасстаста сохостасвав Басова абсощеосао око тп0
Чоденмазиц Зоспава»внва задзоцосчда Бисадачасо Зачапосває беоаоесгоечта зай пазисточва содзазізва зага гадос зесессзчсцв аздісаскоЯ саечаслцо БО чабквсасст спсассазчеста сгзсатзчаас сода косдат азсдопостод зсазущасти їда жчласйссцассу свасчатса соссгсвдас апгпсчаввнсто астстасваєса заазцітсаау ДО здаслсрсадоса ссассаєсас воаасасзссо атавоасвсаз сстасасоача зчесзадиаоє па сіцасатсса зсузвсосалсоє сзспсассає соссстасаз сквабтоеаскв ссозодцсай ви чоучассвоца ссасоакоїо сісястосда дохо Зк «еїи 356 «11 95 чай» БТ «Та» йтумна спенлліданісхю сийих «й» СОпХаВУЮ-СВУ ЗУ хай» 255
Хврої1іе бій Меї тик осів Бах Ркз Бех бах Бем бек Аза Жак Ууаї пі 1 5 Ай 15
ЕВ оВка Уві тТву дів так См Акх Аїв пех бій МО; сі Бек лу Тух
І й 5 зп
Бай Зах Тв ої-еч Сіп осіб Був Бо Сі реа Віа Кто Ася Аа ма 116 4 45 тук Віва ліз Зеїт так Пен Авор одек піУу уві БЕ пет Ака где Бех п1Уу хо 5 бо дек сіз базу бЗіУу Тк уз ББе бу сп тис тів пех деж Ст Сіл о Бко 72 те за
ЗМ; Айр орпе Аза тих Тук Туш Сув Сем піз Тух вБе бає Тує Рло Пец 85 по Зх так оБМме зіу пі іу Тахо їв уві ій Тіз пуб 01у бБіу пі бех біу ї100 405 518 піУу бСіу Зіу бта Уа) піп Пе) Уві біт Бек біу АЗіа біз щі Чуд Буш 11У Мо 175 пкго біу Аза Бек Ма) цувз уві беж Сун гув Віа беж сію тк Тпх па 13а 1135 159
Тих беж Тук ТЕ Меї дБ отр Заї ку Сів Аза бо бі Зіп біу бе 145 153 ї55 158 бід тур отіз су Ме їі дар опо Бех вар Зв Мі ТьлоНів Ту Аква 185 178 175 бів опув Впе дув Авр о Ахоа чаї тк Мас ТпУу Ти Авр отак обех Фу Беж 150 185 130 твк дія тТух Меї Зі ем Ато бек оГеа Ахо Бек Ар оАвю ТІ Аза уд
Та 0) з5 ттк тУХ був іа Ах Азїа Ме піу бук ттв о дію піп слу СУ тк ота вай Я р
Твх о Заї Зає Шехк іже; СТУ 031у Пув ау КІ ам ях 81 790 «дим ДЕ «пі13в о Шеузчна оєспідовніств «82» сей» МИиВСВСУЮ. БлЯМ-вВВУУВ ТИХО «Ой» 857 закчеклусв спвсостасео бсовохапттс содтссзскса солорсултялв «полови ж вссшсссотиася зсіснвачиса алое завдано сплздазвоета тскчависо Мо
Кессадсвоув оспосацеаєсса гпстоссаавс соссбщасек зксбутевко хадасецоеає 18 тасодоессос сазасзаа»о пазоспозсваєс зчоапсомуа ссозвохосас вставав ва аисядчесца ацостчасз засто є свопастесєст сусаатсовс асан за силасчисо дсзЗасоцас свззоєсокоцза зіссзадчай спзчазосза азосоадазУє зва зчавщіснимти сбспацувако сбовозалес судова сооовачахо сов'даааооо 13а ссстсоссовач сетсосузЗзайх сазвойксазо заосспосеча товста ссппстої з сеачацазаш соасссЗачео суссоссдав вісазаваса дачтсаваай сстаїсповата 54)
Кассатлесп досссоссат азосазчєко зстсахтсссва зачвоцвссс сваавуєаце еВ) чессасссос заасузасау сттазвчачєс заасвсасту зсгассівеЕса суцеоацодео зай ссвезчссісо зссвскоодл ссавудсаєсо всобсосасва сепосттуєх сачазоскос 75) «105 ЗЕ «її» Й «Вій пит «313: ЩеУчна посдідоввість «ВІ «вій» внВСвСую. вабщ-вивУУн-юЄ «40» 555 во Уаї Уаї Ме: тн піп беї Бо Пео Зако бе Бо УЖЕ ТЕ Га Му 1 Б хо 15 51 о рЕс Аїа ех Ті Бек Сув Був бек Бек біл Бех Пед бем АБродек 2о ХУ Ки
Аву ЗУ Сув Твжх тТух лей вВямп о тТхр о бе щієя бій З Ехо сПУу ОБ1л Бех
Бе 25 йко АБ овкеа ем їі Тут Бе Уаі Шех був Бей Аво Бек піу Уві то ча У 5 ззроаха рда Ба пу Ша піУу Зех Сіу Ту Б5зв о ВвВе ТВ з) Му Пе
Іще 79 ЩІ о шек Аа маї іш ід Зі; Бвроаі і Мах тую ТУух був Тв біп С1у я 25 5 тв онів Бе по бе) Ту рве бі піу пу тах буд Тед пм о Тіє Був 109 тах Мо ж щі шум ек бі ПІ сіу БіУу бій узі Зм їн Уаї Бій Шак СХ
М т 125 піУу Му бач Узі Зій Вхо МТУ сіу беж зем Акщ ої цех Сув Біа Аїа
Мо 135 1230 д:зкобіу Бкпе тс ВБе беу дз Лія тки МеВ Авроттв За! Акху Пій іа 145 150 155 1855
Во біу пуд фу Хе Піо Тхро Уві Аза п)»; Х1а Бк Ав ув Аід пуд їб55 170 ї75
Авіа нів Від Тих тТух Тух 31 йщій Хек Угі Тіз сім лк рве отих Ті 185 їде їз
Бет йка йо о Авр о Аа бує деп ЯеєЄ демо тук ел біл оМеї Ав оШек цем 1ч5 йо пох
Акту Аа пі) 0азо Тахо лів Уві бує Ту був щщіУу ВІЗ бемобім їні Ащи 219 51ї15 о тує Тжхрошіу Зі іх тах обех УВУ Тк Маії бех беж Бей бЗіУу ліУ Су
ЗЕ ЗА 235 740 «аг 53 «ВВЕ ває кв и» днк «піЗм Штучна посмідедніствь «ТУйх -Й2їх2 НВФ -ВИВСВИЧН МАВТ-КККУ:
АЗОП» 153 часвіссваа спвсспадкс бпосабсомсп тогакосбчсом почоподацв сову се Б випасгтчсо Фозусанаков суаазвстач сачковлссав зоспусоцєв Зпадавявита 129 часаваавоси ствзЧасолос павосовлосс гасло бацаустор сеосоВато хво злухсгазоу сова хо бочиЗесидву стен са ссозссауаац спптливакгох. ха цеязаттоко сдвасстанпуа лощкстасва бБацотбмбеато акосошптсва зплзаанця НІ уучассаазо позавахзаа зоебЗасопсосоа ссосзЗзасла дзашосаєччє богчевоиу зеб свуссіпавоа сідчвоцуцеав цазуссцую зппогсазкзча здоахсспоса савцдескесх о реготу птаспаптз пюсчасагвз пада соеловио ворде огдє вони о В
Я ассе сив часданос кадасеюя щас ца асани чи зазссосасеп сазвсдахств сссопсвовс ассуаваасос вопасазоса вабалосавя ве часвпацтса ссзсдчассао ахасасвлосс воседеасац ссопасароза зосЗазчацо ий сечЧацаєлоч зсотвсаосоас сабо вссзс пзспсчЧазад статора сподаоцова й слсочассаєтч соасеокоїо сповсссоєва соб Зч5 хи лай кам БЕХ «ШІ» Щеучна послідовну сть «Де «й НАВаУ НВІКСМи МеВІ- «002 050 дшв о сзе піп Мес тТлюЕ біп Кех Бхо Зек беж бец Кек Від беж Уаі щу їі 5 1 15
Анш о Акчоуаії Жпх Їіфе тих бук Ака АВ бат біл осім ТіФв безу ЗУ ТуУХ ще Зі ; о 25 ЕН), стоки Шрік й вч й зето ач кт чит КІ друк ни же ен їж пек Ткропео Під обій ув Вко піу Був Ма сто Ажоч АхЯ Тїені Ті 45 40 5 тТук дів віз пех СИХ рей дв ек Піу Узь рхо Мат о Ажу БВПпе Зак спує
ВУ бо сум бір обу якоря М тб. ую еру ТА учує К со, «Як їм мя нет
Пеко обі пех біу Сб бів пе тех Ме) те ї12 Шех ес їнва Пл Ббко в та а 80 бід Азробне Аїа Тв Тух Тук Сув Бец біл тує бе бек о Жух Жже беб 5 о ч5 сен їх ге Мо ниж - - ії 1 ха ТА прах Фе Кб їх Бпе піу біу Зі Тахо Мув Уві біз їЇ1і2а бува слім Піу біУу Шк СКУ їп5 113 слі піу б5іу бій Уві 5Зіб5 їв Уві бій обех б01іу Аза іа Уві був о дув 115 155 125 ко обіу Діаз де Уві Суб баз бек Сув Муз Аза бек Сіу Тух ТАЄ па
Мо 115 145 тк о пеє тут тур Мей Авб Ткр о тві вх бМй Аза БРко Б1іУ ій су їв 135 150 155 МЕП паз тгвохів зу Ме (зе Авроїхо бек аеро Пех бла тиж НІВ тут Ап 155Х 170 175 пай Жеб же ув дже Аж Чаї тах Мек бе бЬУ АБО Тпж Бах Жлх Бе 180 ІН ІІ) тТБх вів тус Мебо бій Сем Абу Жех пені вка Пет Ав Аву Тих зів щі 185 йо зач туї Тух Суз Ата буд Аїа Мах сіу Тук Тхроіу Пій зіу ТИЖ Тих уві зій тА бу тах Уві Бех Зек рен сіу 01 Сук чає за лих 230 «хій» ВК хіт 6 «Е10 пк 134» ручна гпрослідовньох «пп сайт попі УкК пПовиМмер «00. 1 спадазчаласис сппацасцаса продов стпшає зе «й пах «нії» ав «їй» цик «ВІЗ» шеуУуцна послідовні шь чай» «вай» пе вЗВеБ праймер «НІ» З коєцаасссс азвачссьсс сапечазовму всзцочвоха СЗуЄе 35 хі» ву «011 39 «10» пн «ЩІ3» птучна послідовнійть
АВ х «ай» БУйТнАК Поазимер ен» Б засзавси свупеопвад спачовкови стзалисає з «2102 954 ках 38 хі» ПИК «Ві3х ШтуУуцзчма поллідовність «шейх
Ай» ців» праймер «ВО» 0 иа сстссузабт сусоскссвкх двсстоведо сощЕссо ї8 «клі йей
АЙ Ме 8 «жу ДНК «и» Шеецюя вотліцееніснь «ПО» ясайїм ВТ Прзймер «ММК» ївБа смпдваассоВ ацдовуєстос сводєстцява водесоасоя сх 18 сля ек пон й «ШК 44 «пійх ДВК «Щ1У» Штучна послідовність «Ох «пай Бач праймер «а 285 саезчасчеаа ссоштасцасцо зддодевчта свасососту во я «вій» ле «її В «йЙ1йА вв «ВІЗ пщреучніаа оплідавазттх «ай» «Ва» Пінкет «дО0пх 57 ва піу П1Уу Пув о чім чу сіуУу пох ї у «З302 268 й» а «У3й2 ВВЕ «833» Штучна послідовна мтю
АййО» «Ваз підкер «МНіх ден їзва пи тіє Мув «1» сб
КА ж 4
Мини и «Від» ВЕтТ «13 БррУчяаА поєд ЛОВТ АТ «ий» «йллЯт Лізкоер «ар» Бо скл мак ех цеє сві йти «иа 343 сиїй» РЕ «Міли» ШрУзна подлпловниість ех хай «слой» няЕБЗУБ-ЮВОКИУН МаВХ, МІК лАюСсаВ БВидЕшя
«АЮ 7 ч ек Муз ті нич злу хуя уче рах ши ВУ з и зв обівє сій Ме сп біп оЖех рко йву Бех Оу Бек Ака Бех Уві) Оу 1 5 10 15 д гало тк о ха тку сушу дет 5 до сюку 31 ГУ ту шахи («лю тА зви Ахс маї тТеьх хів б Су дж дів бЗех БИ СІ Хі деко лпіу Ух 20 25 Ко їжи Ват тео без йій ій дує Бус Сім й діа гко ВКа дха їхні Її
З 45 тУкК Аза Атїа бах Тк цей АвроЗек сі Уві без Чех Ака Бе Зає У по п 50 цех Зі бек піу Тахо біб бе о тТнк ї2а ТАС отТія Шех йех Пец па вхо 55 70 75 50
Пій Аво рде Аїа ти ТуУух Жух Су обем ій ТУ о Бра пех бух Вус оті 85 В 5 лу їхям КЕ й кі Мао ти ти туда т іч «ЖІ 1 У зу г
Тахо Впеа бі сім сіу Тахо вув Ма) біз 116 пуб СКУ Ху 01у Зак іх 160 х75 11
Фіу пім'у сію тУуаї бій оїем мах сіб бек оспж Аїв о бій Мві му пух 1 ся че 115 ї2о 128 і ли ши ЕІ НЯ кош Кут т ут т важ Р ую рю І ез вхо бі Аза йех Уаі ГУув Маї Бех Суб був Аїзв о йех Сбіу Жук ТВЖ о вва 130 135 140 меди Піко о Ме Я та чі дут плу вл ше, трі 1 тої
ТВх Зет Тук ТЕр оМес Дак) тро Уві Ак сій Аза Бко пі бій оБіу Їдмі 158 150 їх 1650 пів тт їїе О41у Меї ї1і8 Авр о Бгто бок дшр бек Сід ТвБх нів Тух Ап 1855 ї70 175
П - го чн ШО пул мук о бкня я У сАУудуУ Му У ша Мч шу
Ма їв о Біне Був ВБроБЗея МВА тТвВу Ме; їх тпХх ЗврожнуУ де Зх цех їва 185 130 тиж Віа тує Меї ско бе) Вко цех Мей Аха Зах Ав» Ав отах Віз Уді
ПО) лох тут Тут Су Між Вха під Меє біб тух Ту піу біз Пі» ТМ Тех ді в - - - ї Кк к - -7
То 15 хо тат Уві Бек Шех ід БІ» БІУ Шу 5 СВУ сі Бек АкЗз тру Узі) діа
ЕВ т ЗК 249 від Бхо хек ад ріе лів ВБНе о Рго хо Зак Аве о сіц с їнт;р був Пех ла 50 255 зіу Таж Ліз бех Уві Уві пуб бе) цейц о вбви Авп о Бпє Тух Вхо Ак ША йо ХЕ ато вів Ммув МВ ск Тео іГма Уві Адр Ав діа ги біз Жак о бі Дай ет 75 зво 755
Стій обі дет уві Тв осів Ой бар Зак був йБродет ТвжЖ о тух ех уво чо ау по
Сью еру Є я чу те Ос Тл й дж аю т тля іт тик лу
ЦехоЯекх Тьвжу Пец о тТдх 0беи йпех Буз Аіа Ази отУуК ПІ був Бів Буш УМ
Б 315 35 ва
Тук Вів Св о бій У) тах мів 1 бпішж сей ек о пех РКО мак супх пув 325 1360 335
Зак Рів зв оВха сім ім СУБ 340 а нев «Віїхм Ії915
АЙВдж ЦНУ «тійх штучка послідовнУшть «др» туя пав 1ІМЧШеЄНІ МмМийто мкЕСОБУ ЖучЧ Кутя «и»їз навалеввоКсМи МенІ, МК МСА ВКарой «4002 73
І КьмМа тк ее зичутдетвало ув ит и В Кф хг ста т НН НААН кп часпзссзаа пуабосачс собаллтом Зрагстасе ссбзсгосзсадв овуацчпаси ВО деіздивитех лк ач в а о і и о при и крутив Уест их чи віснилоацо сппсвачоса поззавстачо засастова сопозпсосв псапзадлов їхО тапащи ссачаочост заКстасвсс вБсапссалої саше плоско ї8о зашисісеаньу ссачсспвстс софузасоЗац тсассскосв ссассовосах посксвоссю х20 саазаскЕсо саассетасса січоспсасава пастттацчтв дгбсспобсас зогплудау 3050 чазвссзагщр ссздахнйй доз чечи ЗоссдадчсЗ чпашсасивае бод ц 160 пасли сочацссцеА пзадоесчнс чЧостраптдє ач осих сазвоевсох 135 ни ен а ее я пкт чі Ку фетру мутееутете мити гак увеїт ва зУсіасете Ковпсвеєсста бсбазвізаає созотспсосвс гуасосстовз яса аа чвдчозаксоя заабцпаєупа гиспосгсвцаз ачуцазвоко зоЗозсвавосз зва сави и часгаеацазсса ссакоалсову зпдасасаєсєсс асоадсасва ссствсакодца посудвацаце БИ сІзацалтсото зсзЗасасосос сах зссас пстоасчацве ста йсса пподручасяа 5й зпчадассав ссасоисс соісвства ласо срадееося аастшгашо 7по зсассалтсос псбксалосо ссодесвосЕ засдчазчсащчо педавоссад вастдєсстког тво фжещшссчсусс псстоувакаа стіссасопл азздазосся зваївсачо дазипсоЗас па затусспксос вабсусзсла сопссацлау гусолвсазч поовудасацх гезоапаосадо по ще то ст вся у учи з тах зи ве но паж клуні піч ет их ех асссасацес спозусацсас ссрзвсЗзосп апосвазасат апсувсовлня всесвааяєє во рогу ий еуития цер тати ою Кемарттеу и сви Кк озокерит ТІ тасзпстуєсу саублассса пеабзопос вастедсссу спасазазчач потосвааси Тло грон клини сзацзазицих ай 1315 «10» 275 у я КУШИН «аїімМ 57 «З1йх Ор «ЗМ штучна посділодваттю чий М «й» НвсЕСУХ ВАБЗМ- ьДдвЗУН ПО хиа ВХ «ФОП» йти хе Мі луді Мет Кк бір йподт Бус т ШЖат їі БО ча ко тиву г аБИи УАМ МАХ мах ах САН со Кб ме АК м що о Уга Мп Ме сУЄ : « «г 1 У ха 15 бій Во діа дет Кіз беж Суд мув о йеє йеаж зі пех йо іа Авбожек 2 ЖУ Зо
Ввиопіу Був тля ТуУЖ зо; Би ТХхр же ЩТо Зіз Аджч вхо О1у пбе чек 35 дп 15 ре г роках "оз сАхту гу рек НО ме У злих Ля У гних вхс Авй Атб без ХІіз тк Бей Мак ект пу5 їв; АБО зх (іу Майї Бк ай БВ о що а и у о КАК 731 хх я КУрах рих шру пу тим злив Я вБО Ах бпе Чек біу Зех бі Беж Щі тпжЖ оАвр оба Ух ілвма Ху Тв «5 та лк 50 «дух дж ера 1 диху лях кох - а мату пять я
Беж Ах Уаї піз Аівз біс блв уза У Ууаї ТуУух Тк СуУуз ШхЮ ОЗ пуЄ зо З піч дал т з т з мія каз КУ рах гія тя хм 1 ню їх тиж нів Вйє Бко Ммеи Тих Бе біу щу ПЗУ ТВ о Ммув Пи бій її Був 150 155 Та бі шу шу БЕЖ Зі сі Зіу сук Фін ові білої Мяі Зім Жек ПУ 115 і29 М
Сіу Зі Сем і (іп о Бка Бір Піу Звт Їм Ато це бек Сув Віа ліз 135 175 49
Зех щіу Ббе Тех ре 3ех дер Ата Тув Мек дню о тжв о УудЬ вка біо Аза 145 ІІ х55 ї5о
Тухтич УМХ бос 04 ші. ТТ. теку яд дл 3 С о доуч ни нн ШО хо щу му Шу Пе іш о тхр Уві Аза спі іє Ажу Ашп Був Віва ув
Бика от я я ще Мо не бал оНів Аза Тахо тТуУХ ТУХ АІіВ Зіц Беж Заї Ії діУ Акту Бпе ТКУ тів
Це 5 тав -е Ма ная пек Ат Ар о Ажр дід пуд Дт дехопей лук їм М; мес йвй Вас се «хх Б зу: 135 БІО п
Ахоа вів Сі) Взротвх діз Ууаії Тут тТухк Сув спіу Віта Кем ЩШіУ Пец бар ій 215 за хх такі; й: Ж пли мк о бут) ду спра хай о фс идч ту ГІ пу
Тух о тхр бЗзіу біпосліж тк обед МАЮ лпвпє уаї Бех Зет Тем Фу О1у буд ву 23 215 742 сіу Зі Зіу Беїт Аза Бек ТОЖ Був йЗіу бо бах МАЗ бе бо їн) ВІЖ р 250 255 пл кю ї ; я оті фею о уліли "1 пе ен и ин пе речи хо бек бек Мув Бех Так о шех сіу Біу Тл Аіаз діа бе пі Сх Ме
Б "де, ри
ЗО вх ато не м муж плеч дин тут: я. Я ба Ду спеуу Й Фе МУ ак ув Анр отут Ба вже Сіа Бко Уві тах Уаі Зеу Тур о АЛеап Бек о сзу 75 28 вх тд гру лах (Тл ЗЕ Міг па ; ке до дід тім ла бю бу
Аїа іш) тТвх беж бйіу чарб ніз тах де рус: дія Уві пе бій шек пех зи зав зай
Ка 55 Зп при ре чає бурю Темі Шок о Фр дл ля тіє 1 зе р Фах Фк Тв сі їеи Тух пех дей век дек Уві МА) та уаі хо Бер Беж ек іа) за Злі зл рі 355 ЗІ ЗІ 320 сх ма пУхучу Те Ол ду ко пах лах сет дог дико Ук их ст я сліу тах бів тТлх Тух її Св Ав Зак Аж Нів Буш Ро Бех Ана тах
За5 ЗУ 33 їх: Уві ВдБЮ Муз Аж Уаії спіа Бго душ Бек Суз Азроуув Тих ів те 140 Зах 5 сСув рхо Вко Сув руб Аїа ка бій Мем ей сптУ Піу хо бак Заї ра 155 158 185 їікгух хи же паху Ал Мо тд о ому Спекти ие В як -, іїеи раде о ру по був Ба ЗУБ вер оТвьх пе Ме (1їе Зак дже Тих Бкго
ЗТ Кр тва
Кт «ІА мч во лег. й туї вч «важ ТЕ ше т - му 44 Уа л «Мі бах тьх Су Уві Укї маю до Уві пет міш с уз ввроБхо см ув 385 за 395 400 пжв ЕЗе пай Туротук Уві ЕВ СіуУу Мах біз Заї Ні дви йіа пу ТВ ах аї1З ЩЕ спув Вт вка піа ма сів тую ВБа Зеї тик о Тухк дже Зв) Мах Зех уаї
АВ й аз тов тебя пачЬо тодма хх пу аж пу Мо ух іл хі т І плиує У чи їн; ТНже о Заії інха Вів см де те Мем дапосбім Пувосіа тТУуХ уп Су т 4 аа
У. «ді сич, - г щш їх гії Зк кт пе Я Уж: флот тре р, Фк мув мах зап Авто їпув Дів ої РКО Біл пжа і із був ожВвж фе пвх и за ва пуп від Буд бі сі вхо Ак піз ВКо бій уз) бує Так оПеа хо Бо 5655 СК ат то їжЕж о Вко Веробій ей тм Му Ап бій Уві беж бе) так Сув мем Мах 455 жо 955 цу Сіу ве Тут Бгто Ве АвроБіє дан Чаї За Тсрозіз чек вка Сс1У
НН 5а5 ід шій рко Сбіз дДвподАха Тут ую Твх Тахо БЕЗ ка ді бем Авробех ло
КІ 520 Зах ші Вех РБе рпе пес бук бек дує пе) Тих Уві Авр о бує Бех бку Тер з Зах ай сів біб біу Зап о Маї рпе бе був Шех уві Мес Нід ба Аза їз) Нід за5 БЕ 555 збо деп оКів Тут ТИЖ сій Цує Бех їмі Бех їжа) Вех Бо 1Уу ув
І-І чу «й» шт «ШІ11х 1779 «уж и па «10 НК «813 штучна поплідоввність дЕйпх «й» НСС: ваяМ-вНВУИ ХАОС К тн «Ні» 7 частці поїцв Бивостєсваутєс спбСясгмІистис спущопоабов пост едеаса мс БО дкбгрсгпсв вапсаастосв агероптохла пасбваосватя панвивзсаєв Коста 17 аксуссспсв вчссСсазвооопвз защфепостулз Зесбвцічазач цавацдвласа оптова їн схлсодевта попспвцапса зоспвпловави саппсвайтй всостчвеЗос саввстоцах 12 потчзчцуи саЗасадасо сздозастазчо чЧедбсвозса судасіксас впізавААкм тай алсазаЗіча задсосдвата што савсвзсксї Засавозсвс все Зо стпавощшиточ весчачуає свачеьсчат аппвагозач дсозчанпосо зпдоезоацае зво пазів сковує: сузачавчдєс сеча лсває споодацаано собчвдатте з кактус су сопбссоєВех сапу засопссоца гаЗаскавУх стра ЗО совпасвацє зисссзвага заз юва влувоаняла дарліннясайат Біт оаноя За татствщтчсся вукесокчах вроусчацчос востепрова давнє свааваиенх. р стзивссудє аазусавсвау солвадеяосї палудивосси спору слаб ЗИ скцазЗссома зсзасоожм ссваоадсвис српестатоц кстссацесх позадусое тах
Фсазадоов псдесиспво саацавссоз садок сс сепкоадовсст спосбосощад ту ашосвипстоту плодсасале лопосілчци спосо єтса зоЗасталоїх спосуавспо ав сзчасочевс счсдаваєссс зоадсспостя апсацчезиса Боапаєвлосе споудесато по стасачиссї свозфесссса соссиссядє вапозгзасчЧаА стусопсосо пава ЗЕ дасвссствоав ссотвсвісто савсосуває саєдатоста зсвасвесва зпбооасвах 150 зтачетзвас ссааатсско тзасвазвої сеапасасасо сессодсоспос вспасокаща іон пиіспссовзасе сассоссазо сотссстесос сссосазадао сбаадсориас ссотовссвос 1140 сеспоцпцасссп скзаочлосво всіссясоас сточасчеця члеаславаоя ссспаВучо ізо завсссавис пусасосзсв сзасасоза стпсатааку ссадувсава чсошмсоууви їлБо злазсазчивса апдасвсяла соска с воасчесооов ссиоссВся ссазуаосо 1320 пкзваєсзса здався сросазоаєгис сесзабсзвац сстеплосацє ппосносва 13ко0 заазсозсст спзавачссаз азс сЗачавсосат вчена есте мха. 440 ссосочазасе ацеосуассава даарсвоедіс азссосзазсоб зоссузосза есасстоце 1500 сссвасцаса стусптусцра сссозазвас васоосвсасо сесацуазвсва ссасвацасо іо всдссксоссо бзссозуасто суатодекст шеоссссосто аседсвацеє свсодооуаєх 1550 азовсасазуах зсосадсвоза павсосссес ссасчссссЗ Єзабвозкча сбепессосви 1880 заттсастасв споеазвацац ссобстссоссо сспссозоса аа утий «21йх 574 «К115 335 «дій» СЖЖ «ВР дшузнв о пйосліденісті «Й: «йтїх нЯББІУ.-МНВСВСУН МеВт, МБаК (Я ЕХКЕ пЕврра «4а0йах 374
Ако хіз Сід Мет тах с) Чех вка Зак ще їн; Бех Мія бдех Узі ші ї У хо х5
ВвроАхш Ууай Мах хів ЧТБт о Пуз Абу вів Бех біп й3)м її 5ежк ПіУу Тут
ЗО й о ред дек Тр оц Зі бід бує што слу Був Вів буо Ага Ак їла Ї12 30 45
Тух Аза Ата бек ТОЗХ існта Бор о Зак пу баії Рхо беу Ак Бе бек бі
КТ 5 НІ
У 2 п Неруи Й жеаі СПР стае брату ше и г У Дих пек біц БПех біу те пла ав оОтТеК без ТВу ХіФф Мак о шек бе ми БО ке де ек 2
ЗЕ На т Зп іх лу у г тухимо віз боезує Пух р тм. під лев овйе АтТа тих Тух ух Пуш Бамойбів Жук рі Зеж тую Бр Та вх ча ах с - ел пт тем А щі тім т «осла 1» і и У тТзх Бе обіу Зіу зі тах ме уаі Пій тів був с1Уу біу Біу бак СТУ 169 05 ца 1 й є ан ШО - НН спе (ха мот ли гм тя піу пі біу Змій Зуаї бій й2чя Уаї йпій бех спі Ма бій і їм пуд
МІХ 150 1955 ї з з Фе ху: тт гу брак оук тус Ал Юрик (31 пару ть Око зго бі віа Зак Ууаї їув уаі пек Су уз Аза Бек о сіу Туїх Тако вце 130 ТАК 140
Сну Зет тТух ТХхроМа"х Аа отв Уеі ага бід вій жо сСіу ПБІ1Дроу че й чек ще лей 145 155 155 Ав с с - їж - Е я учи гук Му Фоми я, см іх ву Же біз Тв т1іе Зі Маїс тів АвроБко беж Аве бак спі Тех нії ТУК АБИ п - тк 185 172 175 я ши - ще р 1 тр ор птах «т бно Зо ТТ йрл»уУ піп Мбуб Ева бус Ар од Уа) тн Мебс ТлЕ ТАК Ар Тих 58 Тк обох 1850 їв їз30
Так ліз Тух Мек ій їжи ку ех Бец Ах Беж АБвро АвВр о тТкх Аза уві 135 зо ИН з 7: г. а ід що ІЗ Ух пох пиУ пір мо у пре - уд
Тут ТУХ См о Аіївя Ако Вів Ме бі чут ттросСкУ Зі сіУу бле тах Уві шпть сво тів був вко Твх Чаї Віа Біа Ббюо бех Уві Ве 112 Ре РЕ 885 пп 235 хо ; с са их ї ти 2 Пйзяє А хо сен уд. г на ЦИ Ь тто щех Ар осМмІі 1 інт; же цех о біу ТИХ АТ Чех уві МЖК Сув пед
АВ па ва зей жа бай рас тує бо й ро Аїв Був Мві ба то бувоУжЖь Авту во а ато р т йти Фк т се хз ує (М Жах хі твожі м й М
Ат Аза їто Мі ех Сі вет ех Зій бій дак озаї ТиЄ бід бат А пт Но и5
Зає муБ о АвЮ оЗат Тел отук щМек їену Бет Зет тах бе) тТох оїє)ц Зх Бук
ХЗо ах пог
Аїа АвюотУЄ ім Її ув Дів пжв о Уаї бут Від був ям; а Тв ніш ів 135 КІ 115 Зх піу їі так о Пех бро уд фе пев беж Бе Ава Ак ШТУу 01: був 335 345 315
«МАО Та «МЕ 1505 «102 ДНК таїї» ЩтуУчна послідовність «ай «й: нав5УнеВСвоМн мМавІ, МбОК 1-5 БЕТК пКарра «ай п часвоссзца сцдаспосдато посавбсптсй сгакстдест скасапчаса бачадссаєсо о вІсвл оз зддосазаков давазвккачі зУпктвоаксгаз зп саов ЗбСадраваися 155 чисзардесм срачасасо: чассовсцсей зсасссосасс свазсссвУ бсоссовКес 180 заасІсачцівш асзсалтчаутс посавостчвоа сссвссососв ссзосассазч сссбпадосе 250 чаацатисссп сазссраєьз сосптсстасда сассотзотЕ абоссулосао посол 90 чоацвсосзаоу срплааасаза апсладчозсаа сосодчазчссо здачасспвойе безуссохса з5о сацистосіац стовисчооавз Зазацостдасй зпапосазода зазусптсстоа павацстооу 429 чассасвосії сбвоссвоассв сотоЗавІдавс суззсщшссає айчзсолосоууя аслацасоех ви чацчсзсвісял Завсопавеєтла сестссадцас адісаавсто аппсасазвзісз азвавосана За часачачіся сезбовссво здасасаєсс асуадовсе ссбасвзосзша Зсосовозаце 6Боо сіцвуаєстя асцасясуче сесусахтас сусзсувсаєч схабузоска содочпасва 550 соазасовсяз гсстозазае слаевосавск сЕУпескасво сзесучЕске сабо та ссакссцану ззсвастьсва восстодвасе чессстУка совлссточе зЗааквассее тво їзкисссвдаиа асцесвавує всазссуваз стозЗасвазта сосптосавко зоцшиаасксо вій сзосдазазич песасяуачоа счасвосвез пвсацєваси асадостова свдодлсстя збо апаспссвуса задсваасса спазчаавсасб згавахобаса оссасчвааци зола сону пвО щшасстчассс сепосуссво зайчацзсилто засазчаЗаа зас ї1по5 «їй» 76 «її ВВЕ «їй свт «Вій» Пуузна пеослідлсвність» «пах «ЕХ НВСКСУТ ВОБМеЛЕВЯУН (-4РБТУБИ-ВИ о НЕВСВБОУ.
КАБЗМ-пПВВаУВ о -МХ «арх ші лвювоуві мі Ме твк шМмю Бек вто бод Зею Пе йкз Ууаї ТЕ пе б1у ї 5 То 15 біпоВко дія сет фі Бе Сую Сум Зех бек бій Зак Сей пеЗ АБ бех
51 2 і
Аврошіу був Ти Тую Бези Ава лчл)о Рівз ойій біз Аку Рко біу ів пек 35 зп КЗ
Кто Ак оду бі Тіз ТуУухХ ей Майї Бек Буш Пед АшрпоШех піу Уві Бко
Зо У за пзроАте Ева Шек о сіу Бех СРу Бех пу Ту дар оре Тих Без ув Т1є 70 5 хо
Зап Ах Маї біз віз піц зве Маі ПУ Уві Тує ТУК Сув Шк а СТУ ч5 Зо 5 тпс мні пре Бо Ге) Тв Ве ошіу ПпуУу біу Тай пу о їви О1д 112 Гув 150 165 119 сдіУу пі спіУу бпеї Б1у б1іу ЗіЖж шу сіб Уа піп їж; Ууаї бів Шек біуУ 115 29 125 сім пі Її) Маї бід бро бі ЩіюЖ Чек ма бхО йФм Яевху Су Аза Ав. їз 135 150 пех бі Бе Твх бре бек Ави дія Ткр Мей Аер тТкр Уві Ах піп діа 145 152 ї-5 155 рхо йбіу Був біу їм сіб Тр ові Вів о) їзе вка дяка був віх Був
Ута 175
Вам Вів Від тий тує Тук Аів С01ц бет уаі їі Зі Вхщ спе Тих їз хво 185 ї1за
Зек Аха Ав АБ оАвВа їув АБО бет ей Тух Сео) бій Мет Аяз пек Гей 135 80о 205
Ак вів слу вво Тпх від Маї ту Бух СуБ біУ Ді без СлЛу Мем Ако 2іб 2ї5 225 тук тхр обі лій зу Ттвх сем очей Ти Маі дек пек вія йех Твх їжа 5 х3о 35 240 яку буо Зах Маї їн Кко кі вія бхо ех бех був бу тях бех Зіу за 250 ха сіє Тахоліа Аїв їні О1їУ Сув о йец Хаї Суб АБ Тух Ме Вус ій Ко
З 5 ВТО
Чаї тах аії Бех То дет Бек СіУ Аіва без Тьжх Бех біу Маї Ні Тих шт ІК УВУ
Мазі З ля т дух у у уз хи ти зує Кут собу Жах тезу
Же бо іш Мзі емо Чек опех біу ви тТух Щек їв бек Чех Ма. 230 а 130
Уві тн чаї Вко Зеу За Зак без СТУ Тк бів оВвнх тут лів сСуво дя 05 її ЗУ за
Чаї два нів ув Бко йпеї Аза тах ув о Уаї АБробув Вк МАУ ОСП: ОКО 325 330 335 ув о Зет Суб Аво їуя ТВх о Нла тих Су Бо Бо Са про Бій хо суб за в ва ія ім Зі сту Бко Бех Мі Фе дез Беж Реа ка Був рко Куб Аво 158 35 ЗЕЗ тних Мем Мей її бех вк ТНт бхо біз уа3ї Тахо Сув уві Уві Уві Ав ї7а 175 зо
Уві Зежх Чі Сім др око Бій Ууах ув бірж Вей тТкротух УахМ о Аво сі 385 зч0 395 120
Хаї піз чаї Ні ББа Вів Кузов був Бко вка біз Зі ій отук деп 405 30 415
Зет тих Тук вка Мав) Ма) Бах чаї їйжвр ох Мав) рей Нів бій Аво Ткр зп чх5 30
Мей Аве СПУЄ муз бій бЄух МУ СуВЗ Пуя Уаз бех Бай був Віа Їдт) Бк 435 440 145
Ака Вже Тіз сій був Тахо ї1Зе Бех ПСув Віз був Зіу ЗІ рус АЖ 1 50 АВ їв йо бЗімоМв)3 бух бах Сем бує Бхо пет Ах АВЮ см се» ТВЖ Буд й зо 475 28
Збій маї бак без ЖХих Су мем Уві був сСЬу Важ Хух Ркз Бех ввроїтів ан 50 495
Ава сві біз Чи опа беж Аво біу біп Бка 010 Азп о Ази Тук їув о ТЬЕ що 5 ПІ тТвжЖ Ра Вхо Маї за дво Зеж Ав сіу Бек о РБе Бпе Гео Суху Бех Їл 515 Уго ци тема вх о Чаї Ві озув ет Ах тр біб бід пі взий Ха3і Бе Зех Сув
За Ух 40
Зет маї Мей Мів Сі Азз Без Мів Ап о Нів Ту тТвж іє був Беє де 545 50 255 зво
Пес обом беж Бко сту ув
ЗЕ
«ЕЛ 077 «21» 3595 «ат ДНК
Ша» штучна трлниідсвнісотх «хх «ийїз нВсВсУЄ Кази-БЯВеуУН (арфи Веь «апп 00577 част зча буастоваєе сосвстосбет спзоссуєта сссккосявсв зоссодоссвос р аксуссотота забсвачоса паптосства спасачстцакст зчазазасвсв скепеаассоУш хо сЕесвоасвуа зЗссапоесса веслоссзватє сасставехе аа свавзсбосощас 150 кссопачкос сапасаоас сачоздеаах сзузссаасса почессссвас зосслпавцаєс 246 зцеазачсза вачссщесза сттдозеєх свссассеасе сдцсаваозеає асасвсвоса зо пісвповлкоя зосчвузчас сазвзстізаз агсвавучат зсчоасссцоа зузсачадзос ЗБ павачедєсвап сла сочазавачс позсочсаво созчастуавос сослачасте 50 ксккососоч собстдерх сассемиах саспєсесва саовссоЗзаЕ сосзсаачес 80 псечосанов чустуцач зчіщессоав агітачвазта вацсеіванаа ссавссптвасв зас
Капквоосся вабсхонвоа возеаачхос всоакстосва зайвідасяє саваавсецу ВО путдсассошес зазасосчаесац сотвавачиаЄ ЗазЗасвассв содшичтеста спец БО сгпчссссоу зстасізчадо ссзадвсвасс оссчочасов сохосвадсає спопассана 120 ччсосаксоая сспоссбсок побасососпо Збссаадарса собссдоасчш сесацеащєо тва пличскчес соЗбсдеєча стаєсстссоєсб цазопеаЗіса сощкскоссчсх завела най цесотфаоз цездупосев пасотропса зоссцостає вакоссовоз атесквссо зо стісаЗезоаєо босппшзслує зссскссаце звапосооов сстсоацвосов свагсицивн зай зсзавзссвса зопассацепа свповаєсисоу засвачазчез Мідезсоссва вескеЯкоех 1299 зайдсстаса сабосесвсу ЗзсбЗсссзцовз ссбсавскос сопеоадасо чепадлоско ї5850 шпишхшспосс сазазсссвга зЗласасссстов апрабсогсо сбевссопосаа ЗУпсвовто 1140 піз т ясостазссва сопгалеатссо чезчссдаво псвассоузгсва супе ї500 зсвачес жбавсдссваа часавазсоЗ созчаєсацче азсаплайво сдсусетой хв скелет остова ссгосассв пасе соза асодсааший зсовалаацЧуОю За затзискстоа зоавжлисих сесеЗспсес абтслазавайм псоволоссва зопсваазоу ХК сассссспзоа авсласаоце засвасосіЗ ссорссакссо созасЗаасе заставчдає 240 чаччксщєс позасссдссо зссзаседо собессса чощзоассовє соч 1500 часзасявіо сосачосоця чдвасзассає ваавадзвссаєзе сссоскас пеекссова ї5аб
Ччесгстовсх соссбсквсзш савусосвос чсодасавоа зоззченоса певоуочане 1556 ліпсссссак зесспоцеї ссасувехс сгссасовасс зстасасоса саздачсско 1650 тпссбуссто суцчакава 18535 «2105 278 «ії 10 «Вій» пт «йІ3» Штучна посліпавність пав «23» Пійкер «З0й» ля виз дп дуч сіє біз Су« бі ім ім ат
Кіра вп овхщ СУ ба Су оду сім ну 1 І та «аМах 579 «їз 13 «їв ВАТ «йІ132 прручна послідовність
ДЯК. таа3» Лінтзр «4005 779 де Ап ойкЗ у 013 сбув бед сто Узі ТуУх тТух ха мес 4 « НК
А З ---М «їх ЗНО 1, 5 ках о «її РКТ «ВіЗ» Штучна лосліповність «апх «ий опінкЕв «апп» сво печ см о шіУу Ша ла біхУ «їїах сх «Вії «Зах Вт «ії» шШтоучназ песплпудсеністте «ЕП «ййУх лЛівнксо
«дп НІ пез сів сіу 1З бій зіу Суб
Н с «аМіх 982 каЩіх а «В1и28 РЕ «ЕВ3» Штучна посдоАдовнаість хх «иа Лінкер «(з ах ї. тів о їме ву бід їі Був 3 «пійз 483 «їх 5 «війз ВТ «В1У» Щтучий посзслюьдавність «вах «В3е лінкерк «400: 283 талу тях т ка пт зва піУу іш зви ху 1 5 «Ві» Ва «-51ї1х 6 «10» ВЕТ «й13- Штучаа поплілсовка єс» «пох «їз Лінкор «апп» 84 . п а Ди и ївц бі ба січ слу Суд 1 З хай НУ -аїї 8 «Вій» БЖ «ВАЗ» щЩеуєсяа допмізлихвваітю хе тЕйЗ» Ллінкев «Оп хЯ5 пеа біу дію Сув Сі п1іу Біу Бах 3 р каз НЕ «ші» й «108 РАК
«хз штучна послідовна ть «5цз «ВИймМ о лЛінкер «ВО» В пе) бі Буш Сук СІУ х зу «піз 387 «її» б «в18з РА т «й135» штучна послідовність «ВЕЛО «паї лінка «4002 хв ей біу був о Ммув щі Суб 1 з «й10з 88 «дїїх Б «ий ВВтТ «213» Штучна послідовність чадо» «шйаз лінкер «Оп» 858
Пе буяє Щ1Уу Сув Був ОСІ1У 1 в «їй» За хА1 7 «аїймМ ЕКУ «Мі3» дрручва мог ловнасть
АЙ» «вай лівкер «0 28 їжа Пуш бЗіУу Буя Ге ПУ СВ 1 З «дій» ХВО
У БИ
Уж акнни ". сеї» ВАТ «ВІЗ» ше муяа люслідсвністть «х«Вайх -лиййх Лінкор «АП 90 т з га обляєто щік Жир ее ем обіп УА Тух ТУК ДК Ме
1 5 «ямі я «811 8 «Від» ВЕ 13» шШецвя послідовній хе хаа0х чим» Лівнкер «-ЩНх 231 іїеи біз маї Тук Тут Ах Мей су 1 з «810з 985 «21їх 4 «2122 БАР «еї3х Штучна послідовність «ах «гйЗз лінктр «ай» 297 тв Ууаї Бек Еву й
Й
«и105 293 «ВІВ» 1 «ВіїймМ ЕЖТ
АЙ бжузнв послідовність «202 пай3в о Лінкор нАпіУх р «поз очі
Уйлрі я кт дит якожлкет г 1415 іх ін чаї спіа Ро Пуз бек Су піуУу п1у біу 565
Х З 1 «ЙТОж 154 «іі 15 «вВБй» ОБАТ ха» Штучна леслілсовність «В чайах Лівиво «айпфе а уах ста вхо Був бах Суш ту Печ тТУХ Ах Аза ку Уві т п 18 їх 5 19
АШІО дя «Вії» 7
АЖ» БЖ «ШІ» Штучна педлаеняюить
ВП хай Пінкею «аИпйх п увї Зі Маї нів Тук Ату Ме 1 З стара зак «Мій» УЗ -йЩ,ї» В «й1йт вВт «Ух Цеучна послідаенісу «жах хдйї» Ліуінвхей «400 596 чаї 01 хві нія Тут вхо Ме Сув і В «Ві0Оз 897 «її В «дра» ОВБЕт «»іїм Штучна послідовністев «их «ВЗ» ПівкеоО «00: За7 р з Тож тягу тм й че Док 7
ТУК Бец тут дей Ак Аза дух Уув1 ї З «210» ІЗ «811 3 «Вій» ВЕК «813» Штучна послідовніст» «йх «ВШ» ЛПінкау «фар» са пук ем тук меч Дкч Аза жо УВУ був я 5 їх у «Вір 338 леїіїх В «Від ВВЕ «дам Шемчня поснідшеність «ВХ «пий Кеєаграамних лівжее «40: 328
Зі; ря вія тя гом (Урі іл гар тат що гамі 135 тихо г Ал
Зі чаї Віда Віа Ма бід Буш о пім Узі Аїа дія Пе біц пуд с Уаї 1 5 хо 15 т 1 " па: р же МІ лю я щ Зм їн й У
ВЗІіа діа без біо МБув Бій Уді Аівз віз Беа бій Був а Ух авіс» 10п0 «зів Зк
Ііде БЕ тиЩи» йтучна послідовмАсуве хх «ай К-ппіральний пінкер «коп» 300 щ Х віх та хи с-г Та и ие шок но НО ок ха їуя уві Хіз віз ей Був па був У Ата Аїа їм; уз бід бує ува 1 З їз 15
ІН ох Ток тим Й «т АТ 7 З о є са аг С.
Аха Аза їжи Був бій їм о Уаї Бій Біа бец їв су
В
«810» 3З0Х «8115 8 «їй КЕ «-й1йз Штучна послаідавнілть «вай» «хйй3» Лінкер «АйОз Зп сі піу піу Ба Ват х 5 хо» 305 -аМЕз 197 «хВї1йв ВЕ -13з Штучна послідов кот в «во» ух доля тую, розви збрую гдз хаха» Башіабельна збдасть даеркхого памиюга тА хапокм ЗО
ТУ шик йду статі Ук Ук с хв ії аз ІЗ лушї треби т ся
Зі гтіа маї пет ТІ Зід бех ЕХО АВЮ баз Сів Нех о Уві жиє што був ї 5 15 5 ср; був Заї Тр жЖізе Таж Су Аа іх ех Зіп дех ф1іе шу ТНХ Анд о 5 35 те Мао: пе вза ет Сл тожтти Ми п пеня сих кори ни в НИ шк тІ1з Нів Ткор отут біп Фіп Був БКо зво обпіа бЗех йо ув їж Пец тів зи А 5
Аз в І пу ТУукК йіз бек Бій Беж Тіж цех ду Мві бхо Бас вк бе бу 01у з УХ во
Хек сіу ШЗевкосіу Тк зер обае ТВкЕ о їєо тпу ї1і2 Ада оЗає саз «МО від
КЗ ла ть НІ січ дер дів АЗ1з Тв тух ТУухХ був піз ій Зес АВ ТтТевк о Ткрорке Рає
З зо ЗУ тп во обу су сту ТУХ Був Мд) бл зів ув 190 105 «дїОм 305 «8113 1751 «31йм БЕ «Віз пПяжчвда послідовність ай «ЗЕМ» Зарьабальна сбласть зажкоро пвзицюта ТВАВ5 х300О0» 303 біп маї біп гей Заї бів бек СіУу діа біз маї пув був РЕо піУу ліз ї 5 10 15
Зву Маї був уві Бех СуБ ув ХМів бЗеу бЗіу Тух Ту БЗе тах Авротух шо 5 зо тТхр тів Ні Тхб уаї Ак бій Віва Бхо біу Пів о сіу пей бім Ткр Мес 35 46 35 піу маі т1іе бр оркоа Бех Ар о ТНХ Тук Рхо Ашп о тТУХ Ал обу цпувз Не 55 55
Гуз щіу Ах Ууаі ТЗх Мес ТБх Тв Ввротвй, бех Тріо Зетотвк о вія тує то 75 ло ме ім Кем Ату Бех о Бей вКо Бех АвроАву Тахо Віва Уві тТужк Тех Сув 85 зо зе
Віа Атц Аа У АВ Чех авротбух Фут бек ШУуу Метї Вврожбух ТкроПіу 103 185 115 бів біу Жву Жих а) так УЮ бек о бЗех
Мих І30 «каіп» 3п5 «ії: де «уд» ЕАТ «ВА фежчна посиьловаАсть «ВИ» рт р дтп й «ВХ Альсумімнези аауУЮЧИЙ домен «айв ЗО тен Аїв осі» Від Му ак їм Вів ВБИ БХФ Мі че Аво ба бує Му 1 а 18 КУ бах Бех Ввротує бух пув ВБа ем о їїе Ав оби Вл Ззузв БЖ шаї З о 25 о піу Уві Пув лТа ем тів Авробій Ї1ї8 ей лів вія Пе) Бхо 433 45 «віх У «вії» 79 «їй РВЕ «пї3» Штучна послідов ість «ай» са вагВм Я сг ВдІЙхИ кі струм каз діла -ОоЗзБОод-плваУМаАексовій ОСИ «Ай 305
Аню оТіє Уггі Мес Так Сія бех Бко вар оЗеж ті Аза Ууаїй Бех о Гею Зі їх Б 10 х5 зліз вка Віа Тр тів Аа Сув уз Ба Зежх зб пек оуаї ВБИ Се Ар зо піу Авробех вне Мет Ав ТеротТух бій ма су Бо спі бід рхо то 30 за пУуВв іш Пе) І1є Тук ТИХ Тих Бех Ав Гей Пі бу біу Упі Бу Ао 0 5 о дгоа Рие бек біу Зехк сСіу Бех бЗіу ТЕ Ав ре ТК опе) ТВ Іїв дек 53 ли та за чех іс біп діа сіб дер Уві Аіа Маї Тук Рух Сув о Сій Піп беж Ази
ЗУ що ча
Зі Аво отгуо тук тах Бпе П1іу ік ші ТВХх Був дей Бій із їм СіУ
НН! м 110 сі птТУ Бех біу ПбЗЇУу у пу «ІТ Уві бід обме Уж) бій чек Озу Від 115 120 125 шьв о Заї Буш Мув БЖО Січ вів Пет Мжї уп уві Бех Сх Муз Віа Зсх 113 115 а сі ТУЮ Тк ББа тих Ава Тук Тхроїіа нів тур уаї АкЗз Пів іа Бко 145 155 155 160 сіУ біп о біу зем см; те) їх» О1у Бі ів Ар обжо Яех йо ТВу тут 155 їо 1 гу
Бхо дви Тут Аня Туя Буа Бпе пув Су Ака узі Тжл Мек тих Маї маїз їва їх їз чаї бешх Тих Бак о тве Аза тую Ме бій Сей Ак о беу Бе лку Бех дзр 155 208 БАКУ
АвороТнпх вів чаї Тує тує Сжз дія вхо Аза пі Авробає АзротеК ТУух за М 328
Євк Шіу Меї ввротує Тхросієж бід о біу тає тбу Маї ЖпУ Маї Чех ех з3а 235 хай пу щіу Суз 21Уу З1у у ту чаї віз ліз без оїжа зЗіа муз Маї вів. 255 ї50 за ліва реа був Вій був ах Аза віх їм Був осо Був ЗАМ ОАМа лі ей
КІ 255 Ко цуз Пій сІіу Бім піу АБИ Бек жу «Вій» 306 їм 837 «Вій» дик «иї3»М Шеучна пйалладаовість «820 «23» ВвЗшНУТІ-ПЗда-вВІваУнА- оо 1 ОЦИМ «й» 306 часвістуча сцЗасссвасо сосвовстсо позиесЕВкчЕ соптвоиччуа зочочсласе бо влсвалоса визосачосся ваза ЗосЗоспяо агат» дао хоціяво 135 сайсадавайс сашсеасвопо вопссавасєто босарстаса соасвеспсдз осадки 180 азусисссац зсвсчкссаз сбоцпсазеЗче сосоЗзсасва зсоосасосис сзсовисаце 740 заспоссача лочедчактнос засечзотсат сасбасвас ааваовахча запасу сає зай всухЕспояс зопоубдувисва псбучавчяасх аавзадечцсв часто спаде ЗБ чехсадссу стусвакосгач вастдацеєз азовачссьо чЧидссісвує чавцакосє ато тесваччсс сов тзсат спосассвас кзстучатае асгоцакчос вовашссоєсо аВО сазсаачнеас сова нчах сеанс Зассобсорч зсапооакос щвавствзовай 40 зазвафкшсста засо сетсайсало зпвутоЯзас соаоцчпацевас йдроспювсати й пазссзвсоча пессазайт спвасцесату зсечкзсгаїс зссзчЕосчац вайпсучечає во ссзаєсхасв зсосоопзрах повссостЗз Зеапсеасуєва ссасучлово сщубебссото ТУ «Зацоактлоай пив сучав алуассоса сптуааустача азапосслови сбсдасвогі 780 завачисЯсса сасксавода зеаздомка чессгзаваз збчасацсоя ЧаВо аз «Вій 3.7 пвїйх 318 «12» БЕТ «Ух штузна посліаповність «Ай «-вйїз ВІТ - 53535 -вЗавуУнОе кові 1-05 АВ «400: 337 сія ї1із Зах Мебе Тек Сі Єех рко 5зо Бе щія Чек оЗаї Тих рхо їу5 ї 5 НН) 15 сі» Пув уві тв вре Тех Су вх т Зезу іп Чек Тіз біу СНУ Аве
КІ ї5 30
Тіз ніз тхр отут піз сіл опуУув РКО Аввосбій дек Бко пуб Пец БГем ті ай Ух
Пув біз Улі дек 530 бек її Бех Біу Узі Бо бек Ако Різ Зех БЗ1у о 5 5 бек щу ба з3уУ ТОК АвроРіва Тр Меч о їтвк іє АБпобБех ін 31 АТа
Би 70 75 до піц бво» Аіа Аза трх тТУХ Тух Сув ба (із ек о Аво тах бтробхо Бе 20 зу
ТтТзу Ра бі їм сі тах Буд Маї бій тів був слі пу П1у бек піх 130 135 і піу бБіу бі п о Уаї тТвх Пец йхУу Зо бас ші Бо Аза Бей ві Туш 115 130 175
Ехо ТИХ Ме ТИХ ід СТВх Ти таж Суя Тв о ББе Бек о Зіу ББе дак бей 135 1135 140
Шах Тк Бех біу Мей ФіУу Уві З1іУу ТрКр оті Ага бу Ро РІЗ ШіУу Був 145 ї15О МКУ 150 1 ї 1 «ун Хо т ДА г З. жу пику ду Мак, Аа с и дя дів іїнна біа тур хеч Аїв онов Їзе схе тТхр о взр Ав Ар о їув Вко стух і55 170 175
АЕН Бко Віа Беч Був шШек Ак Бе) ХХ Х12а Зеж Лу Авр о тТакобех пух 180 185 хо
Ав сій у зі їср тва Май тних ББдД оОМес Аво Бгто Маї Авюмотеьх від. 135 зов 205
ТВі тук тук Суб Аїв Сів Ті Авт Рко дія тр орав о АївотТУх Ту СТУ ам 515 че
Сія О1у тих це; Мак бля Ууаї пбеу бе ші слу Сув бі чі Зі ЗМ рис: 230 пі 7240 7аї дів Аа пейа сб БУ чАб тА Аа Аза пе) бій пу ФМ ові Аа 235 50 ВУ
Аїа пе січ Був 014 Маф Аза 818 ей сід пув пі піу с1у дя) дех 250 23 270 ен дів Піо віз пу Уві рес діз зп оз ПЧ Пец Авробую Тух 0Б1У 275 е8О 2 тУуаї пех Акр Тух Тух бух АБИ Пе) їі Ап одяп діа буз Тах Ук іц 230 25 за сі чаї туз Віа ем Їіжв Ашо Зі: їІза гей Аза дід Пец рис 305 зів 315 «812 308 «йи1ї» 354 «Зій2 ДНК «213» Штучна послідовність «жах «виі» ВпавБУуБУ-ОІДОВ-пЗшВУНО- сої 1-05 АВ «80002 ЗВ жагассясспсе ссасссвоос ссовдаасско сзабосзсса ссссзазада ззаазтсасо «0
Кссасстоаса сдрассачссв сазсатсовзос зсзавсактас зсокосівсоса зупазазасса 1275 члассзастсбс срзавцексоск сассагадчац зоібсседазе сстесстсеух ачсассакос 155 зпзЕЕсечса зЗсвчроцчако бцдицеталаве Кісзеспскса ссзссзагеат ссср а чаздасєсого сазозсатіа стдковасайа зоакавквссо зУссЗсссас зссссолода Зо чздастсааяу подецаєсма зЗузодсава есе чдвдосовове сапоскцасв. 15 зватствесс ссзсасечак давцеспсяла сезассссома серсгчайьоу дассекустосх ЛЕЙ уазксгксвас ссвдсасссс бузсатзазе зсаасассзсба соспуссачет бпсссосаза во десссацаце зспоцосвсв састсоЗсоз зАсовесаса ваосдесесвова сспсоазоссюа ЗАО зацвдссоас сЗзсватовос савзулвовст босавдавос ведтвакосі сасавссасо По запвкоцасс сопуципвсяєс себсвасвтас свстусщшетс заатаватсс сосок Бо зекпаскоздс Зссвавозаас гстуудлеЕсапи чсзаоссссо зЗааспвочица соачсолачая що
Ччіпзсссптвс годвзаваса зекилиаси бпопоезвасю сдаксзпапло аскодваагу тва часцісосав состозадза зизочосусо лваккокесоц сефацеєва аесассощсс я запосдсзчваєс сздатавакта баса зчаеуаствнов зцавосстиає сбаавпавоцса зо засаспус запуєзсцаз згусатозате чадвакес хициподомом со з54 «й 05 «М» 5 «птах БАТ «пМ3е Шежчвна папи юдоваМств «их «ВВ» пПінкеор «Од зо
Афа Рко бдзї бек БеБЕ і 5 хвїій ЗО «вії 8 хвіїйт РТ «131» Щтучна послідсвнілть «ай «їйаз лідкео «а0йз 310
Чаї вхо дек Мек піу Бек Бех бог 1 Бу «Вій» 311 «Ві 383 «122 БЕТ «ВЗ Ното шаріюна «40 311
Ме: біу пеза бу вхо Уаї Бе бе бе) іа Ма у 11е Без Руо ББа ї В ло 1 іа Бто ро сСіу дів дів вів бій хо На дек їм вк тТух Ббаяп ген зо тиж Уві їжи Зеу Тр Азр Зіу Зехк Уаф осі Бех сі)іУу БМе йдем так шій з о 45
Чаї Ні їжу; Бару й1у іп о жЖтО на бе) дк Су бер овАху пі пу Сув джч дів Ппжа Бко зіва сім іа то Аїв осіб ввроМаі Тед бу Авто Пух т те зи
ТвВкотео авровка бій тає Аа Ав ої ТБ су вві обі» Бу АБО ПЕ ча зе
Ака Меб ТНх ем лів нів ХЗіе Пуз Ав СМ Ммув бін скуУ це) Ніз ет
М шк 110 їжез бів сбіш їіФ Ах таї Сув 01 Т16 Бів Сі) зво АвпоБек Тих Агу т11у 122 125 хо Чех біл пнів Ейе тук Ттух ввроБЗім із бе; РБа їі дек СІЛ Ада 130 135 148 їи дії Тих Пув йбім лтр о тьх Меї сто 5івз Бех Зеу йти Лів с1 Ту ха ї50 5 185 їєев від Мас Бей о ух Атарави ВКе їси Ху біб» Бр оБів Ме о Був ТБ 155 ї70 175 пу отак Ніз Тух ніш діа Мех Ніз Біз Авр оСув ім біб Осло Пез ВЕУ 180 155 їз
Бху Тухк їі Су бЗет З1у таї Уві си АхФ Ак ТНх Уві бто РКО МеЕ їч5 оо 00 уаї вна Уві тв Ахоп ех сія аіа Зек 3 Зіу бай Тіе Твк о Ув3 тку зів зі «20
Сук аку вів бе сім Бе гБух рхо ттр Ав Хіе СК Хем о Євк Тхи БхЗ за 230 2135 ха сів ваБр о біу Ммв3і дет без пех нів Авр»отТвх бін бій отв сп авр ові 245 250 25 іш) ро Бр оОбІіУ АвтосіУ Тбнх Жуков тТвВх Ткроуві Аза тар овха та во 255 275
Пузв па шуУу чїз сі піп Бху ле тах Суд Фут Мех су) нія пет щу 275 тво 25
Ава Нів Зех Тв Вів рто Майї рго Зет ЗіУу пув зЗазї інб) МАї Те іп 9 235 в
Чех нів ткр о біпотлж Впе Нів Уві бе АтТа уаі Віз Аза Аза Аїз хів
Б 15 315 зап
Бе Уаї Хі ї12а їз дп Тук Уві Ака був СВ Був буд о Сув ТВг о бех
ЗІ 30 їз ліз Аїз (п О1у Бо би їше чаї бек цем СП Уа пе; Адропшіб Ні
340 ча5 зх
Бхо маї Ссіу Так о бех дер нів Яку по Аїз ТагосСій ез б1іу Еце Сів 55 ІБ з5
Бко їв Меб бек Аву іні СТУ бех типт Сі Бех ТВк біз ПВ1іМ лід ато ут 185 «ВІ» 513 «МЕ 305 «ай ВЕ «213» Нодо варіння «400» 317
Рхо нів Бек їні Вкз Тух вви зей Мей Уа! ре Бех бій о Авр о З1у Вех 1 5 10 їч уві сій бах б1у Ве пеза Кіз бій бі нів Бен) озАвВОщіу піп вхо Бе дО 25 о пей Ах Тук Ар АК піп оБуз Ах Ахя Аза ма вко піп пі бів Ткр 35 4) 45
Аза сій двроуаї Мей піу йіз Мзуш так тТкр о АБо Тих бім так сід дЕр
ЗО 55 «о пе Тих пі Аби Піу піп Ахроїем Ах вк ТЕ о пей Тв ів ї1з Буд
ЗЗ 7 75 я
Аве Сі о пув біу Ббіу гей Вів йех бе) ої» сій ЇІ1е вху маї Сежвобій 85 за За тіє НіБ С1ц бвр о бех Бах ТИЖ Ажщ су Чек віх; нів рве о тук Тух Вар 1 105 112 с1у піп без Бе дей бек сій є йез бій Та бій зі бек Та Мі ре зд те
КУ а Ка ко ів бек бек Ак Вів іп ТВх би Аза Мек о Анп Уаі Тпх Ада» Бйя 1315 тай то ому 015 азр іа Меб уз ТИХ ув їву Нів ТУух вк Ма Мет ОЇ ї45 159 і175 188
Аза ввр Су Ов) б1д Був меш піл їн Бко вЖЕОо Ммецї Уві Вди Уа) її 155 170 Аа
Сун пек сій Узі бех 052 О1у Бад ї1ве ти уаз тик Сув 5ху Аза бех
І80 155 іч пек оБне бух Бхо Ак о Аво тів ббк ої ЗБЕ ТЕровВха ЗМ Ар оСіу Улі тав о зп5
Зак ен Чех Ніз Азао о Твх бів бЗімйоїтр Піу аврохві рей бо Ав о біу 210 215 еВ
Звлосіу Тіб о тУх бій ТвЕж ТкроуУаі Зіа тТпж Аку Тіз вка бій осіу С01о 225 230 235 25 іа а Аху бе ТБх буй Ту Меб бід Нівя бек біУу два Бі су ТЕ 245 250 255
Ніз ро уаї Бсо бех піж їм дія їнжі2и Мазф без біп Чех їй Аж Так
БО 285 аа
Барвовиє то ТУхХ ЗА ех Аза Від Ме Ріо Сув БВе уУаї Ї18а ів Тіє 85 зна зве
Іза без СжвотУаї БкоО був о сСмя Був Був Був ТВК оЯнх 1 іа сх Ту 250 235 М їхО зп5 каМох 313 «Ії 7 «ЕМйх ВЕК «Вії бтучнз послідовність «лай» «83» Гінкео «400» 0313 бі ріе деп дк зЗіу ва СМв 1 5 хвійз 314
У
«ай» КАТ «ніЗ3» ШрУуцуна послідовніств чих «ай38» Лінкор «а4д0» 314 жі Уа! і реа Був йет Сує ї а тво 315 «й
«ЖИМ АТ
АВЧТіш шручна дпоплідавнасть «ййох «дай ТСЕУЦ-НЕБЛУМ «433: 315 см тів Ууаї пе; ЖНж бід о беє ую Ада о бх Ба За їтіь бах хо сту 1 З ї5 15 сіб дк вів тТвХх о їзиа Зех Су дек о Аїв ТЗ Вет Зах Уві бех Фух Мей о РІЇ 3 нів Тхр о ТУук бій бій пУув Бхо СТУ Ппув Віа бхо Був Аху Ткроїїзе тТук 35 40 45
Аввотх Бех мув Пе Віа Зеву с) Заїф Вухо ВЗех Бхп пе ех бЗіу Бех
Зб 5 ЕЙ сту бех сіу тих бій Бе тах їеи Тех тЗев Беу беж дез бів Бхо бу
НІ 75 на
АвроБівз від Трт тТук Тух був ду Сів о ТЕроЗех Зевс Авт вка цем тах 5 за 25
Віа піУ бід осСіу жах Був йДецч сіл; Ті Бев біу сі зу бех ої уж 17о5 310 п1іу Сіу бід уві сіп Ммеа се сіб Чех біу Бхо б) оїем Маї муш ро 115 120 175
Сіу від Бех мей пу Пейа бек Сув Тнх Від Бех щіу Бе авроїіїе ув 132 ї35 140
З тво пу т Ма що ля яті туге кл до ух пл 34 пух пз ска ТЗ звер олвх Тух 12 ців Тв маі йув Сіп Ака ро пім о шМмУ сбіу б ші 1585 5 185 150 тте їз сіуУу Асе Тіє ТУкК о Бко бр вда обу тУукКотТВх Вкоа бух Ар о Бго 155 ї70 ї75 був Бра бід ЗаО Був Віа бл іо ТЬК о Аїв о азротТну Бах Чек ВБМа 9 183 іБ5 130 від туї уз) бід уві бек Аху ей тьк оБиу Під Вво ТЕ Аза ові тує
І55 200 305 тТух Сув бек Во тхросіу 01У Ар о щу БВпе Тукх Від Меб Аво тТух тур рЯКу 21 зга
Зі під обі Аіа псх хаії Тс оуаї бех пеї 0іу ве Зв дк О1у З та їй ее: й сСув «а10» 316 «12 та «їійх ДНК «Вій» Штучна спаспідовиАлуть «Й» -8йах ПОВ -НЕВАСВ -3305 316 «вача бцасвовио бсбсвишяиоасо бокс срповоцаЗе вадайсоевис о сксссссоса зецссатоїс зазссувазео Звсасусвої зузвосвоаса завасовоуху 170 зазасесста зусостозат сгвсовсата посавастод ссср сссАсстваця 15 сгсадесуса Зкосаїссаз сатсвадаєте вссстсасла ссабсвассї усвасоскуав, 530 ззсссссасава ссгастассз ссвоссазсзп ззсастайстс сопсгсацчеє соппссвоацоУ 200 ассвазсксса здассзазаоач азасозаксс ззсоаспаву песводиеса поссиевоиа 255 кстазассач ачсессосдав досаоузлато псапосаває сцбостасає дестоскоу 42 кссаавсактса зацддсассїв свіастаскосЗ зсіпаавсваа засскдцваса зоазооходав, ВО кпсакхтссаа здасскасст сзсцазвзечиє таїассазає взсадвососсуаа чих ссводай 40 авсоссастств сазсазсвацв свсавнсскос васвсачесо вссктзсецу сачосчосву по звсаксічвоп всвостзосяс ссапкракоче собзчайчоя чацдозцвосуя собор водее ва зсучвоїво» зоаздтсвазч ачестоддио зосзсдвоаст соцоахссая сасуссацає То са З «каб» 317 «а1їх 83 «тій» ВАТ «В1з2 Штуумна спеснідовимоит и «ке» «йЙХУх НЕК УТ ЮІКВАИ «002 317 авр хі ма. Ме Тахо бій Зек Мін те Бре Меб бех Ту Зе Уа)Ї У
І З хи ї15 зво Ба мМаї шел Тіє ТБх оСбуй Му Аза Шек Пій ар оМаї бра тиж Аза хо Ка КУ саї вів бхв тУук пів піп Був бо піж Мів Чер оБає Був Тммі Там о ТМ за 45 тТук Бек Аіїя Бак БМз вкцу Тут ик Сі Уві рхо Аве ка РНе таж Щіу
ЗО 55 5О цех дхщощеє іу тТпг ово Ра тт ав оствк Тіє Веє бах оуаеї ій Аха то те в цій Аве ово А1іа уві тТух Тух Суз Зіп о бМа нів Тух ТМих ТЖТВЕ рхо ро 85 зо 5 тиж влпе біу бзіу біу Тахо Муз МЖРЬ сі Бїе Пув йпіу 31У Ту Беж СКУ ї1па 105 10 біу піу піу пій Маї сщів їв Уві бій Бек спі йіа 510 баї Був ув
Ту і 125 мг бичу В ев лящ бвею 2 ли би зе до пла З хи лю сію ко піу Віа Зеу Маі був чаї бех Сух Буч лі бех піу тУукК о Буй БВае 133 х35 140 се ооттеркаю лег ші ще тт зе пк лі пух, Зх й, ті1х 4
ФрхоЗех Тут Мві Мен. Нів тр уві Зго пів дія Вго ПіУ я бЗіУу гей тай 150 1585 150 бій Тр ті біу Тукє Хі АвпоБро Тух Ав оАвроуві Твх обу Тух вази 1855 170 75
Піч пух Ейе пу сту дк Уві тТнх ї1ї16 Так зіва АвБр обу Бек ТВк Бек 180 185 і таж о Атїа тТук Мей сіб; їжа Бех Зежш Хор Ако БУ З1іч Ав ТПж Міз тай 135 по що
Нів о гук Сув Аза Абе З1у бех Тут Гук Авюо ТУхХ бар ЗУ Різ Мах о тук 210 т во туз сім сів сту ТМУ рей уді тат Чаї Неї бдсхї піу Уді бі ро їУув
Тжррошпум ся су Тих зи Уві Тл аз Вед пвх злу аа са ЕЖОЗ ув ле за ШЕУ х40
Ззх був хавйх 318 «йіУ» 785 я«иїиМ ЛК «й» дружна гилпладоввАТТь «ИЙ Ог «Ех ВЕТО АУВ «Ме ЗВ шчатапцочецеа сдасосрадієс бсолссвачттос апохаєсвато піспотесла свлачзпаос ВО аптсасстоса оздисвдсса зчастозаає асеоссссчоаз сесоцквока зЗсадаавсов їй завсактсус сосвавссбосії чаброассос зоасссктос детапастозч азчбосатаяк іа сассссасіп ссвассвсакс сеслуасаає сссасестсв ссвасвосаЗ сЗечЧпватиї, ща чааздалстсв сассстватта состсвосва сабхабзста сассссссає стссоугєх зп чаїзссвасо сЗобпауассав азчодадссоча сесзасоцоя даспоссалак сСеаастсщу за псепкотоват срсаучсада зааасстсда сспісацеса зацшесососа саваоесацо 420 чугсвсваах сппвесасата сдопасосаа сузсзсзас зудссосссоз апа 480 чачцеавіся зактатастав способ яасаві сабзосгаста аубасавоза чав сава 540 пзсздазіса спвлсасочо доувспваксо всдузоласвац сствовіоза зссдецевче во сечваакссЯч вдуувсасцоає озсдевемво сзбосчачаи здазстаста сві аосдає «50 пачок вспудоцеса ачодаєсесту зватіоа забосвавВ сопводрсссвав 7720 коктщЕ 726 «вій» УТЯ «Я» 873 «18 БВ «2135 йтучна посліновність «хм «па3з» ТОВУБ-ВЕНОУН-К-суИ Вл «АПОоз 313 ча ї1іе уві бОед Таж Сієя Бех Ро Аза ТОЖ ев пес їжі йеу Бу у 1 з 12 15 піз вха Аза тах без Бек Суз бек ліва Тахо Ббех Бех Маії Бех бух ех 2 23 10
Міз Ттр Ту біз іп пув Бхо біу Був ліва Рг Дбув дка Ткр о їіе тТук 35 40 ак вл) отри бек опув Пе Аза бек іу Узі Бко Ззу ЗхЯ Бе Бек піу беу
І Ух кВ сх дех біу Жах січ ббе ТВХ Бе ТВ їі Бе Шек йо са Бо пі то х за
Аврорипе Аза ТК Тух ТУХ Суз бій обі Тр Бех Бех АвпоБто Пец ТАЖ вх зп 5
Бе о Зіу зуп ож тож пу їм (ій п1іе суш У О1у ЗУ Бек ому ЇМ мо хх 119 сту біу Зіполяї со їн; О4побіп зе бі бо с (сечо Уа пу БІО іт 13 ї25 пі» Ма бах їспь їв но бех сх УвВу Віа йеє су біз Вам ру ме
Мо 115 145
Вер їНЕ Тух І11е Нів Ткроуві Муз ій дк ро 515 шим 0й1Уу без Що 145 156 ї55 56 тТкр тів піу Абха її Тук БКоо Тих АБИ піУ ТУх ТЕЖ дку ТУХ Аа рт 1855 170 175
Пув Ра бів вар о Гув лів ТЕХ їїе тах Аза Авротвх Бек бдеХ ВЗва тв 182 185 15850 вів тТух Бей біз) уаї бек АкФ гео Тахо Жек піч дво) отак Лів Уві тує тах ий авг 135 пу 205 хуя т бу ж МУ жи й м й й щі тн тру
ТУх Суд Пех бха Ттр о щі Спіу бвроі їйзе бух Віа Ме» дао тТух то 1 8215 то " -- - та тя шк іх, що іт т зво у, біу пів біу Аза бек Уаї Ту уві бек бех П1іу п1у Сув піу бі піу ах х30 255 2435 їх тел ж я ток КУре х тяту І р 1 томі т ЩЕ вод бі: уві Аза Аза пе; Сі Гу бі Уві дів діа пеб іс Пув бім Чад 245 ЧО За піа Аза реп сіб Ццув осі. Уві Зіа дів сечо біш бу Фу (іУу п1У Дай
БО 5 КН! ех: «810 320 «511315 ВІЗ «їх РТ «ВІЗ» Штучна послідовніств «аййхм «ййй» ТОВУБ- ВЕН УНОКоспірахь «пом З
ТМ Аа Аїа Аїа твх о тйх Сіу Ве сбуж о твх Тих сіу Азз Суб ліва сСуз х 5 195 15
Віа о сіу тає був тих о Суз Су ва шву Сув Сез Віа Су суб Су та хо 25 ча у ме був тих твк тво облу Тпт Су пк Сув Сух Аза біу Ш1Уу ЩУ
СО 45 у Аза ліз віз 01Уу Ав Му Суб Сув Аіз См о Сув Сез тах Су ТЕ ч5 3
СУ Суг Таж пі См Міа біу Хпх Зі Су суч Аіз Смв о СуУуз ТА СУБ вії 76 ТУ 8 лів вів О1Уу таж сйпж Так Ах Віва Зіу ие ує А1їа су дід Бу бі 85 за з сСув Атїа Сув Тих обЗМу сіу Та віз Ту був А1їа пі Су Азівз піу дІ1В 100 105 19 дів лід був Сув ДІ сім мі Сі віз Аіа Ав пім СЮ СУув Сов Гук вів ві Сув сСув лма см шу Сх пів віа пів орсіУу Сую сув о сув су 115 12) 195 тах Аіїа Аза бі Сув сію См о Тр бі 5Зіу Азз8 Типу Суб тах діа типу 133 135 та сі діз Сув Зіз був Аза тах Суз Суд іа Віз Аза Сув так осіу 051уУ 145 І50 155 150
Смв о тНх їх Су Так осіу Сі біу З1іу таУ Сув Су Суб дід Твху Сух 165 179 Мт ів Ввід му спіу тах тах Сув Аза 01у бує ПіЇУу сіу Сує діва ПІ1Уу твЕ 189 185 135 сіу Б1у Віа тих Суб тах ст Шу біу дія Сув Аза сі Аія дів ту 125 оп зач тних Тк Аза Сув тТвх о Сув Тнх Су Аїа був Ва Аза Тих Сув Віа З1У 210 215 хо
Суз віз бі Су Сув ТЕ сім Су Аза біУу був Сув таж пу від Ма хх Зх 249
Зі Аза Тх Тнх ТЕ ТБу 5їу Су діа Аїа Сув Ту Тбх Азба тає ТК за5 50 255
Ма сСув бах бі Таж Сх Аів спіу Св Вів бі сх сю у хім АїВ О1У ви ха то тих дія біу тих Аза Аза Сув Суз Схз Піу Сув Тк о Сув Аза Сув 01У
Мк 28 285 так отв тах біу бі був Сув Аза сту Піх Пуу 01у Ма Сув Сув лід 295 235 зо
Аза сіу Суб Тх ТНІ бі Аїв О1у Аза тк Сує діа йіа Ліз зу 1Уу зо 35 У зо
Ма пі у Сув сіу Зіу Аза тах Сув Суа Бі щіуУу Суб Зіу су Сув
За 330 335 біу зі Аїва пі Су Суш був Аіфа Сіу О1у тлє Тахо Суд Маші Сук ча 345 150 тв бі був ліва сіу Суз діа сзіу ТБх о Сув їйк бу ОС1у слу Суб Сук
ТУЗ 5360 385 діз зіу діа Сі Сув о тбну ТвжЖ о сіу Тих біУу Аза азів б1іу Суз був дів
То т УВе
Піу сту пі б1іу Сув Сув Тк о Сує Дія Суз Тих Сув 3 Аіа су ТК 285 Б зх м
ТБ біу пу був Сув ТБ бБіу тах діа Сув Аза сіу Сув Тих тах См 305 170 5 тиж іу шіу Сув Ту ТпжЕ Суб лі вів Сув Аїа Тих бі діа лів Вів 150 25 450 бі діа Сує Аїя Суз Сув о твг о АЇв Тнх Аза тах оАїв Сув Ма Сув Тпх дл дай АВ 34 че ААУ «сі діє пімє Ту пі Аза Діаз вів Сув діа пі дід 1 ги гл чи яз Зіу су ТО Сі Аза Аха вів Сув А1а спі Від лу сім См Суд 25 зва тіж сіу Аза ліз Пуп Аза ціу ОСІіу бі Сув Сув Тпх о бЗіу бішж Аїз Ліз
А655 ати 75 481 твкосіу пу діа Тл тах о шту ЗІіу Аза Аза спіу бі Зіа тає тах о Жбу зяя з 395 від тих бух Сук ТЬх діз Суз сіу З1а Віз тйк бу піУу ТВ ЖжВУ Аза
За КЖеКІ КЕ тТвх Аіа Су Тах Аїіа пі Діаз Тау Азіа тує пім ліз був був Суд О1У 315 ЗзшИ З
Аза Аїд (у Тек оту Су був Аія бі пі Аза Сув Мі іа шву пуЖ
ЗА 340
Су Су Аїд Сув Ту Аїа та Азія іа був Аза піУу Суз іа пім віз 345 З5о Зав БІ
СУБ авіа Су Аіфз Так Су Св ТВ сбув о сСую А1з Бі Сув А1іа Сув Від 85 тут УТ
Сіу Сув Сух ТНж Ата Су Сув Тих О1у був Аза су Пі Тбх Сув дів
КЕН 5 Б сіУу Сув Сув Піу Су був Тахо сі Від Суз діа тТвк Сує Тх піу Аї8 535 5 ває су піу Віа Суз Аїа Сув Тахо сі Сув Сув З1у Тйж Суб ТИХ Ата ТК 510 вії БИ
Тиу дів тнх тТву біу Таж тах Сук тТнх Віва пбіу Аза Тахо сі біу ШУ
БЖ ві Ба 550
Ії їм лах Дек пл дл чук З; вк ТИ ЯЗ зт г; сдуу вів с1у щЩіу 01У БіУу Аза См сіу слу Се тах Таж Сув ТВХ ліва 550 55 тиху Зіу Сез Жих Аза тах пу СіУу діа СуУув ТПУ Аза був ТИХ пз щу ва ще 870 сіу бЗіу тТвх Су Аза Аїа щїУу СТУ Віз О1у Су Су Тахо Сув бі щіу 75 НО 85 тТнх Суг Віа Су Сув о піУу Так осіу Вів біу Суш тах Сув Су ЗІ Фі «За 5 Так
Віа бі Зіу Аза так біу ТЕ ОБУ ПІ1Уу Сув ЗКУ бу Тк о Сьм Му Дів 755 ТІ 715 ТІВ піУу Аїа Аза хім гак осі БАу Суд був 1 Суб Аів Суб СБх сім Ту та 750 735 від З1У Аїа Аза Аза сіУу Аїв Біу 01у Бе вк б1іУу Суб ТМ о схіу Сук 74 таз о тзж о Хпх тв біуУу біу вів бу Аза Аїів о сіу (1у Від піу щіу ТМж о Сув
Ту тео 55 пі був таж щу Суб Ада Сув тТпх Свт лу діа Аза лів від бі сіє то тв 780 вів і у таж Сув ск Сув дів о С1іу Сув Суз був ТВ сі бім Аіг 785 тах 735 воо піу Аіа Ата Віа пу ШІ) Се сту П1у Суз Б1У у у Аїв Віа те аа5 їй 815 тих Сушо стих чаї 381 хйії» 974 «аїйх ВЕ «а» Штучна послідом «вВО» «ййіх МЕВНОУО-ТІВУНеКппіраде «аопйх 391 вд тів баї мес Тл сто пех нів Пув Ве Мес пеху Су бек о мМаії б1У 1 5 10 15
Вар о Ако уві бех ї1е тає Сув Зуд Аза бек о сСіп впроуві бвпотех дів 30 25 22 чаї дів Ткр Жук іа піп о Був Рхо бу ів бек Бко цу Бей їм Ті 35 46 45 тук Шех Вів пех Епе АгпотТУК Тк пу Ууаї рко ввр о Ага рлшє тк бі
Зо 55 В їек Акч пої ОїіУу ТАК о АвроБбпе То бе Тих Тіз пеху бек чЧаз сліпвп дід 75 75 о шШшМмі Аве осев діз уаі Тук Тут Суб БМ СІВ Ніз Тут ТБт тах ргжо РКО ва зо 35 тих вне піу ЗКУ біу Тих Був маї сіб їїз Був Піу Біу 5Зіу Бех Сіу 125 От 115 ту піУу пьу бій Уа дія Бе) уві зЗій Бек сіу Аіа бім Маї був Був 115 120 195 рхо сту дів Бех МаЖЬ Бук маї ШеЕЖ Суг Буз Аза бек Сіу тТукК о Буз рде 130 135 ї40
Тахо бек ТуУух уві Меї Вів ТтТхв Чаї Бхуу пі Аіа Бо піу бід опм їде з45 150 155 155 са кв ої1е ЗІу Ту їі де БкКо Тук Ав Ав оЧаї ТК о Буз Тух Авт їв 170 Мт чо ув о ВКеа Був о сіх дж Зі Ту іє тТвЕ Ав Ав пу Пет ЖЖ Бех
УВО ї3х 150 так дів тТух Меї бід без Бех Бех ем Ага бек спа Дню Тих Зла Уві
155 йпо а ків тую був Аді Ах Сі Бех тую ту Ав тТУукК ББроху Бвбеочуві тує їй 215 хи тЕр іу бід обтіу Тс їз Уві ТВ МаУ Зеї Бек Сіу Зіу сук сС1у 01 жаЗ 236 235 о
Зіу пув Маї Віа Віа Сем був СА був Уві Аїіа дів Бей Пув са ув 245 25 255
Уві Віа віза Тео був СЛУ о пцув о уаї Віа Ала без був Бій піу сіу О1У 80 ва й7а вва Зехт «21» 352 «11 ВУ «12» НЕ «813 Шеучана послідовність
ХЕ» «лайм НЕВИСОКУ КсдУудвл «Зп» 322 часаєссстйа спасслазто ссспасавойко асохосалої сійсаслесв Зауйсесвас ай апсассодса асессвпасоз ззасЗссавс ассдссоусва сстракасса дпсадааатса ії цизвсассско сосвзассоясс засссасссс псоайссбтсс споапзсасвоз апостола 180 спсстсасет здсассацаєо Сподасвцчає хссассекса сосабсацеву бпепсазоє 2740 човсчатсосзч сзеусбсвкха скцесассва пагтасасеа састобсссово попе 300 досасосвазу коза сза зуцдезусоза соссодсоазсоа Зазассвлє рсгзссоачЕя зо пвазссідчва стуазотсза чзвацессопуц зсспсацтва азутсксспч свачуссявиє ах зЗистасзачі Ксассвоєса себзЗІЗсВма боспчеиЗсЧат зшоссоссяа зсазедучсте 485 зазсссасса заїсзіавпліІва сспобаеастває дчактцпїлтастя авзсатавтва чазустсава ао чицсвдацеісв суаксасоезс зузсвавийт восоащсвося псбасалааа сосаасхаєе по сктчазчвссто воуасвссацо сопсссвсівосо плоосуалас спстацессвсса стЧаскасцас чо зчУцеккаМис астдцозиса ззаупастста зісассіакца зобссзсачяа акдевасиЗе лав повавлваза стосасипаА Човни зосатовоча вачацазидях сзосусаєте то звоацаввачи блосазосоо чваацвадас чЧасозаави се Я хахох З «12 45 токах ЕЕ
«АВМ Шемечна послідовмасть «их «сай3х Пиноєтизна конструкція АНО «пп 35 інец Аза зі Аїв Буш маї їеч дів вв о ВкбЯ блю бек Ав о Бувотує С1Ж 3 5 10 15
Чаї Зек Аво Тух ТУух Був Ав дів Віз беп о вазп Аза пує Так МАТ ЛІ оп ас рй во Кк 30 сіу чаї бу Аів їни 11е Аза із Тіз зе) діа Аза пец РЕ 45 за зх «810» 354 «й1їх 36 «Віз ГВт «йІ13» Штучна послідовність
СУ тай)» Соихетична коцпсторукціяй АВ «апюх 334 ви Аза сіб ія пузв маї їед Вів ББа Вку бім пев лю Пув Тут їж 1 я 18 15 мав вак Ашр о Тух Тукт пу Лат Пі) Х1і2е Бех Авп о дів бує Бек УЖЕЬ щу 2о а 30 пу уві їув іа пей тів Аза 10 їз реа Азіа Аїз бе ра 39 45 «8107» 325 «ії» 21 вій» РЕЖ «13 Штучна послідовних «ап «віз йтузна конструкція АБИ «м ЗИ тТух тук цув авп їжа їзе ВВ Ап Аів був сну Мах сім лю Уві пув
У НІ 15 15
Аіа їнжні Х1з Авропій 23 то 35 «Вів ЕХ свійх БК «1 Шеучна послідов! кать ях «ййй» Синтетична ковструкція АБО ОІВ ЕЛ. ЕВ варіант МЕВОЛЕТИВИ УТІХ хапоОв 385 тиж М - Б 2 ті долу Додуч іх ллє лани Ал, пу и г Тит
Бут тТук їв Ав оПеа Ї12 АвроАша Аївз Муз Беж Аза (іо 01у Маї пуб 1 5 15 15
Міа тей 16 Авробій й едій»х 357 «р1ї» 81 «рій РТ «В1і3»м йтуцзнма послішавністеь «Ох «вайх Синтетична конструкція АВ ОСАВО УБО-ЕВО-варіант ПОЗА ІБбЗАЛУТЕВ «40» 357
Туш тує Бук Ав Ліва Аія Ави АзпоАїа пжв о тТвт діа січ спіу Уулі бує ї 5 1 15
Аза їец тів Авр о сій зо «ій» 328 «Вії» 46 «пій» КТ «ій» йтузчна послідовність «вай «ЯЗ Синтетична конструкція МБО (Це4А/Т65А/УТІА їхав ТАБАТ» «дп» 308 їжєч Аіа піз Віа Був ві рез дів Анп о Акса бід Бей АЮ ПУБ Тбує ФУ ї 5 10 15 "Чаї пек АБротух Тух Пув Ап Аза Азія АВ Азп о Аїа був Тпх Віа с-м ке хи І пі Ух о Ссув Аїіз пев» Її ав спі їі їси зів Від жу бо ї5 ап 35 ші х 329 «хМїх 46 вух ЕКУ 27 тим: жити пики «із» йтучда долліидовністеь «ОО пай» синтетична копитрукицівя АВ ОІЗ58БПИТТНАМТУЬ ЖАВИ СПЩАТ» «оп» 358 тім ДУ зл ДА тт тя статі ут с Мі до тки сіру Без буячим 2Тх
Шк о Ата пай Аза був Ууал їеч Вів Вал ОАХЩ ШУ ев фер о Пбув о ТуУух ПТУ 1 Бе їз ух
Маю кам щих схує ку жк й т сту Ве З їде екю др й зах дах Вар охУХ Тух душ вад озз) хз А дай МБіз БУЗ ШЕХ Аа у й її зі
Фіу Ма іл дів фей тів Бар СХ Тв їм: Аза Мід фе) Бо
Уа 30 45

Claims (2)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Поліпептид, що містить частину білка, який зв'язується з деімунізованою сироваткою, здатну зв'язуватися з вказаним сироватковим білком, де вказана частина білка, що зв'язується із деімунізованою сироваткою, являє собою варіант деімунізованого альбумінзв'язувального домену (АВО) дикого типу стрептококового (з-білка, де вказаний АВО дикого типу має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 304; де вказаний варіант АВО має амінокислотну послідовність, яка відрізняється від ЗЕО ІЮ МО: 304 вмістом: (А) заміни валіну на аланін в положенні 71 АВО, заміни валіну на аланін в положенні 74 АВО або заміни аспартату на аланін в положенні 79 АВО; де вказані положення замін в АВО відповідають положенням 31, 34 і 39 5ЕО ІЮО МО: 304; (В) заміни лейцину на аланін в положенні 64 АВО, заміни ізолейцину на аланін в положенні 65 АВО і заміни валіну на аланін в положенні 71 АВО; де вказані положення замін в АВО відповідають положенням 24, 25 і 31 5ЕО ІЮО МО: 304; або (С) заміни аспарагіну на аспарагінову кислоту в положенні 66 АВО, заміни треоніну на серин в положенні 70 АВО і заміни валіну на аланін в положенні 71 АВО; де вказані положення замін в АВО відповідають положенням 26, 30 і 31 5ЕО ІЮ МО: 304; де вказана деімунізована частина білка, що зв'язується з сироваткою, збільшує час напівжиття вказаного поліпептиду в сироватці в порівнянні з часом напівжиття вказаного поліпептиду в сироватці, у якому відсутня вказана частина вказаного білка, який зв'язується з деімунізованою сироваткою.
2. Поліпептид за п. 1, де вказаний поліпептид містить додаткову частину білка, який зв'язується з деімунізованою сироваткою, і де вказані частини вказаного білка, який зв'язується з деімунізованою сироваткою, мають здатність зв'язуватися з вказаним сироватковим білком.
3. Поліпептид за будь-яким з пп. 1-2, де вказаний варіант АВО містить вказану заміну валіну на аланін в положенні 71 АВО, вказану заміну валіну на аланін в положенні 74 АВО або вказану заміну аспартату на аланін в положенні 79 АВО; де вказані положення замін в АВО відповідають положенням 31, 34 і 39 5ЕО ІЮО МО: 304. Зо 4. Поліпептид за будь-яким з пп. 1-2, де вказаний варіант АВО містить вказану заміну лейцину на аланін в положенні 64 АВО, вказану заміну ізолейцину на аланін в положенні 65 АВО і вказану заміну валіну на аланін в положенні 71 АВО; де вказані положення замін в АВО відповідають положенням 24, 25 і 31 5ЕО ІЮО МО: 304.
5. Поліпептид за будь-яким з пп. 1-2, де вказаний варіант АВО містить вказану заміну аспарагіну на аспарагінову кислоту в положенні 66 АВО, вказану заміну треоніну на серин в положенні 70 АВО і вказану заміну валіну на аланін в положенні 71 АВО; де вказані положення замін в АВО відповідають положенням 26, 30 і 31 5ЕО ІЮО МО: 304.
6. Поліпептид за п. 1 або 2, де вказаний варіант АВО має послідовність ЖЕО ІЮО МО: 323, 5ЕО ІЮ МО: 324, 5ЕО ІЮО МО: 325, 5ЕО ІЮ МО: 326, 5ЕО ІОЮ МО: 327, ЗЕО ІО МО: 328 або 5ЕО ІЮ МО:
329.
7. Поліпептид за будь-яким з пп. 1-6, де вказаний поліпептид містить антигензв'язувальну молекулу.
8. Поліпептид за п. 7, де вказана антигензв'язувальна молекула являє собою діатіло, що складається щонайменше з першого і другого поліпептидних ланцюгів, що взаємодіють один з одним з утворенням двох антигензв'язувальних сайтів, де щонайменше один із вказаних поліпептидних ланцюгів містить вказану другу поліпептидну частину, що включає вказану частину білка, який зв'язується з деімунізованою сироваткою, здатну зв'язуватися з вказаним сироватковим білком.
9. Поліпептид за п. 8, де обидва вказані перший і другий поліпептидні ланцюги включають другу поліпептидну частину, яка містить вказану частину вказаного білка, який зв'язується з деімунізованою сироваткою, здатну зв'язуватися із сироватковим білком.
10. Поліпептид за будь-яким з пп. 8-9, де вказані перший і другий поліпептидні ланцюги ковалентно зв'язані один з одним.
11. Поліпептид за будь-яким з пп. 8-10, де вказане діатіло зв'язується: (А) з рецептором групи 20 (МКО20)) природних кілерів або з Т-клітинним рецептором (ТСК); і (В) з пухлиноасоційованим антигеном.
12. Поліпептид за п. 7, де вказаним антигеном є антиген раку молочної залози, антиген раку яєчника, антиген раку передміхурової залози, антиген раку шийки матки, антиген карциноми підшлункової залози, антиген раку легень, антиген раку сечового міхура, антиген раку товстої 60 кишки, антиген раку яєчок, антиген гліобластоми, антиген, асоційований зі злоякісною пухлиною
В-клітин, антиген, асоційований із множинною мієломою, антиген, асоційований з неходжкінською лімфомою, або антиген, асоційований із хронічним лімфоцитарним лейкозом.
13. Поліпептид за будь-яким з пп. 8-11, де вказане діатіло має антигензв'язувальний сайт, який зв'язується з антигеном раку молочної залози, антигеном раку яєчника, антигеном раку передміхурової залози, антигеном раку шийки матки, антигеном карциноми підшлункової залози, антигеном раку легень, антигеном раку сечового міхура, антигеном раку товстої кишки, антигеном раку яєчок, антигеном гліобластоми, антигеном, асоційованим із злоякісною пухлиною В-клітин, антигеном, асоційованим з множинною мієломою, антигеном, асоційованим з неходжкінською лімфомою, або антигеном, асоційованим з хронічним лімфоцитарним лейкозом.
14. Застосування частини білка, який зв'язується з деімунізованною сироваткою, здатного зв'язуватися з вказаною сироваткою білка, з метою збільшення часу напівжиття ковалентно зв'язаного поліпептиду в сироватці, де вказана частина білка, яка зв'язується з деімунізованою сироваткою, являє собою варіант деімунізованого альбумінзв'язувального домену (АВО) дикого типу стрептококового С-білка, де вказаний АВО дикого типу має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 304; де вказаний варіант АВО має амінокислотну послідовність, яка відрізняється від 5ЕО ІЮ МО: 304 вмістом: (А) заміни валіну на аланін в положенні 71 АВО, заміни валіну на аланін в положенні 74 АВО або заміни аспартату на аланін в положенні 79 АВО; де вказані положення замін в АВО відповідають положенням 31, 34 і 39 5ЕО ІЮО МО: 304; (В) заміни лейцину на аланін в положенні 64 АВО, заміни ізолейцину на аланін в положенні 65 АВО і заміни валіну на аланін в положенні 71 АВО; де вказані положення замін в АВО відповідають положенням 24, 25 і 31 5ЕО ІО МО: 304; або (С) заміни аспарагіну на аспарагінову кислоту в положенні 66 АВО, заміни треоніну на серин в положенні 70 АВО і заміни валіну на аланін в положенні 71 АВО; де вказані положення замін в АВО відповідають положенням 26, 30 і 31 5ЕО ІЮО МО: 304; де відбувається вказане збільшення часу напівжиття в сироватці в порівнянні з часом напівжиття в сироватці вказаної антигензв'язувальної молекули, в якій відсутня вказана частина білка, який зв'язується з деімунізованою сироваткою.
15. Застосування за п. 14, де вказаний поліпептид містить додаткову частину білка, який зв'язується з деімунізованою сироваткою, і де вказані частини вказаного білка, який зв'язується з деімунізованою сироваткою, мають здатність зв'язуватися з вказаним сироватковим білком.
16. Застосування за будь-яким з пп. 14-15, де вказаний варіант АВО містить вказану заміну валіну на аланін в положенні 71 АВО, вказану заміну валіну на аланін в положенні 74 АВО або вказану заміну аспартату на аланін в положенні 79 АВО; де вказані положення замін в АВО відповідають положенням 31, 34 і 39 5ЕО ІЮО МО: 304.
17. Застосування за будь-яким з пп. 14-15, де вказаний варіант АВО містить вказану заміну лейцину на аланін в положенні 64 АВО, вказану заміну ізолейцину на аланін в положенні 65 АВО і вказану заміну валіну на аланін в положенні 71 АВО; де вказані положення замін в АВО відповідають положенням 24, 25 і 31 5ЕО ІЮО МО: 304.
18. Застосування за будь-яким з пп. 14-15, де вказаний варіант АВО містить вказану заміну аспарагіну на аспарагінову кислоту в положенні 66 АВО, вказану заміну треоніну на серин в положенні 70 АВО і вказану заміну валіну на аланін в положенні 71 АВО; де вказані положення замін в АВО відповідають положенням 26, 30 і 31 5ЕО ІЮО МО: 304.
19. Застосування за п. 14, де вказаний варіант АВО має послідовність зЗЕО ІЮ МО: 304, 5ЕО І МО: 323, ЗЕО І МО: 324, 5ЕО ІО МО: 325, 5ЕБЕО ІО МО: 326, 5ЕО І МО: 327, 5ЕО І МО: 328 або 5ЕО ІЮ МО: 329.
20. Застосування за будь-яким з пп. 14-19, де вказаний поліпептид містить антигензв'язувальну молекулу.
21. Застосування за п. 20, де вказана антигензв'язувальна молекула являє собою діатіло, що складається щонайменше з першого і другого поліпептидних ланцюгів, які взаємодіють один з одним з утворенням двох антигензв'язувальних сайтів, де щонайменше один з поліпептидних ланцюгів містить вказану другу поліпептидну частину, що включає вказану частину білка, який зв'язується з деімунізованою сироваткою, здатну зв'язуватися з вказаним сироватковим білком.
22. Застосування за п. 21, де обидва вказані перший і другий поліпептидні ланцюги включають другі поліпептидні частини, що містять вказану частину вказаного білка, який зв'язується з деімунізованою сироваткою, здатну зв'язуватися із сироватковим білком.
23. Застосування за будь-яким з пп. 21-22, де вказані перший і другий поліпептидні ланцюги ковалентно зв'язані один з одним. 60 24. Застосування за будь-яким з пп. 21-23, де вказане діатіло зв'язується:
(А) з рецептором групи 20 (МКО20) природних кілерів або з Т-клітинним рецептором (ТОК); і (В) з пухлиноасоційованим антигеном; для одержання лікарського засобу для лікування раку, експресуючого вказаний пухлиноасоційований антиген.
25. Застосування за п. 20, де вказаним антигеном є антиген раку молочної залози, антиген раку яєчника, антиген раку передміхурової залози, антиген раку шийки матки, антиген карциноми підшлункової залози, антиген раку легень, антиген раку сечового міхура, антиген раку товстої кишки, антиген раку яєчок, антиген гліобластоми, антиген, асоційований зі злоякісною пухлиною В-клітин, антиген, асоційований із множинною мієломою, антиген, асоційований з неходжкінською лімфомою, або антиген, асоційований із хронічним лімфоцитарним лейкозом.
26. Застосування за п. 21-24, де вказане діатіло має антигензв'язувальний сайт, який зв'язується з антигеном раку молочної залози, антигеном раку яєчника, антигеном раку передміхурової залози, антигеном раку шийки матки, антигеном карциноми підшлункової залози, антигеном раку легень, антигеном раку сечового міхура, антигеном раку товстої кишки, антигеном раку яєчок, антигеном гліобластоми, антигеном, асоційованим із злоякісною пухлиною В-клітин, антигеном, асоційованим з множинною мієломою, антигеном, асоційованим з неходжкінською лімфомою, або антигеном, асоційованим з хронічним лімфоцитарним лейкозом.
27. Композиція, яка містить поліпептид за будь-яким з пп. 1-13 і фармацевтично прийнятний носій. 215 м «ккасвс кни: шу их ниж ВЕК о КВ хо ж юю их м ха кю тм х ук Х шк КВ ВО КК ВВ а т вої В вою пою ок я С мот ом Ма НЕ В з вн еВ а че КЗ В В В ЕН п и А п п о п п В и ПТУ в ТТЛ, ФА фауни ав вежу дееі б И лева Юре авг о т93 АвЕВІоб У 230 25о І і , ки а и р и КИ КК и в и а а КН В "гук ЕРОКРКОТЕЬЧІЕІ5АДТРЕУТСсСУМхУрУНЕВРЕУКЕНХ з5УкуЕРЕКР.КОТЗЕ5АТРасУуУТтТСУуУУрУЕНАОРЕУВЕКМУ 25У"БГрЕИКкРЕОГгІІ ТКУ сУУУОУЗУКОРЕУЦЕКИ 25У"ЕЇ т РОКРЕВТтТІЗУуУЗатТЕУуУТСсУУУВУЗДаДсОРЕЧДЕМНИ зво що і Н ! Н Кк в Ки и и М и НИ М в М КН я "УОбУсУуннаАКТЕРЕЕКкЦОАУХЗТУВУч У УТІТІУ.НЦВНЦМИК «УЗИОУЄУННакк»ВЕсЦЕЗІВВУУЗУХТУЖНІИОВІМИК "«УВЦУВдВУННАКТІКРРВЕдОКУстІВнУХ ЗУ тТУіНОВиИхОВоХ УВУ УННАКТКРВЕКОКиИстТтУЗУУЗУ ТУ НОЮ1СТЬМОК хо зо і печей я ДА Ед я вет КУ Я ЯК КВК Ні ря ЕН селян кможттютття я ера кдажиютат я пяти див т ктн т етя ням сюня рУукСсСХУХМмаМіРаАРІЄЕТІЗ Как ЙйкАЕРОУУ ЗА ВНВКХО ТЕУХСКЕУЗМЕВІЗРІЄКІІЗ КУКИ ЕРЦУУТЕЬРВЗИАИНЕ ЕУХхКК»У"ИКАЇРАРІЕКТІІЗКТІКООДРУЕИОУУТЕВВОАЕЕ г" ск ка ік кКаАкоОдрлнЕнНОомМттТьв»ЗзаВЕ зво і ! пунету хан тітотітютту ченко есе пдоеу от суне чани часу Кетткдодртю стх КК Кент Кеті ення зве ітхнач«і"сінкссзЗзпвіІзУєКВОАНцСоуВАВМкУХ ттвих ВТкМОУЗіТсіУКОЕУРІОІАУКККРачСсСОРЕХМУКТТРИЙ чткацУуутсьУквуУРасВІлЛУєКЕУцадрРЕХХхУВТТРвМ чІЕхнНЦччЗА ТУ ХХСукгчІНАІЗзІзлУкЦЦЕНСЯИРТЕНІ ХХ НЬУ кю 336 і : пи вЕРачУЗЗКАІКТУІУЧИНСЙЙ КЗАВМууцОоВУуУ ох МмЕАСМНМВИТ пьу вві" чсоКкІвхддокМуЄтсозчиИнЕАкМНИНИТ сл од п же С ВЕ В В УМ ДЕ В В С ВИХ ВЕ ВЕ АЛ В У ВЕ СЕ НЯ єм уазорозкттуУ5йктчУОКкЗВУОВДОохХУуУКгСсСуУюНЕВАВЮНМИНУ ло І здкеу5ьаРок зкчі15хвОк Чкзиве5Рток дкзгвзЗік
Фіг. ІВ Й нив ВВ Ковалентно п ОСС ЛЮ ВЕНИ ЗА ячЕНе ж пен оАшо дод ! пила му еВ умов ди М очно сво Щек: МИНА ви ее В ЕЕ З НАННЯ НЕ ЯЗ В за АННУ ок ПОН о до ння СЕ КОЛО ен ЕК ВККС тини зо і ! БЕК я АЖ ОК сова левУ тв'язавії Шо ІОВОНОСпеНЯфІНЕ що о а НИ паз, нешКУВ дів ваВ ЄМО Не и с т НВК : і и в Ба; «ЧнНг.
- 2 3 4 5 6 Пн Кт ОК я ЕК ЕЕ о ОО ПДК ПЕК я с ІОАНН ОХ ОКО Кв Ва : і; а ЖК МКК ММТИИКИИМ В ОМ й с 0. : с Ти ПЕ я ОКХ ди же їх ЕН КЕ ії ПЕК ОН ; пр ОО Є ХВ В я шия я ПЕК МОЯ Во я в «д ОН МО Б ОО КК що ее АН ех з У пи п ОО о В Я ОА ПЕВ ОКО З Зк В М що Я КК вен В: ки В ; ОВ п КАК КК КИ ПК ОХ пах ща СИП ОК МЕМ: ОО я в У ОО ОС Я п З шо п пох ки пе оо ще оо г А о ОО Му ХО ЖЕ КО я Б - с ех 0. с с ПЕ ОО ПК ЕК Ох с; ЕКО МК КК УК ОО ее о я их ЗДАКИКК КВ ШО ек ЕК ЕК я Б т я о ЕКО КВ МО У ОК : ОСВИЛИМКЦК КОХ М Ох З їй : ПМ КК Ш й І МИЛА й Невідновле ян Е іде ї і Кк КВК ИКНК я ен Відновлений я о в М В В в ОС У САМ о
Фіг. 3 тАу | 12 151 Бирегдех 200 | ! що 4 І і Що
Е В. рент вав в й БО 4 і І ! оте Пн ! Но | | | Гн і і | що Ії лж-- Одноланцюжковий Гу 204 ! | 15 і о | І й а ан а я «он юс Коста ве 195 із зо 25.0
Фіг. ЗА си НН 15.20 ха зирегдех 200 ї порнлннннаяхкою ДОДДВКЕ МИЛО ЗОВ 200 4 і Н 150 ; ! і І і то я 15,57 Біфункціональне Що І | ДУ лівнюніяо ВІВ Оя ще Ппхд5 59 Не | Дівитихтіив В2В6 ' й ! М З Пенн нини нини нена й аа 50 100 155 20 мл
Фіг. 485
Мак а ВІВ СВО доіфуннннннніф кт жк 308 СМО й з м х е с ж Кі ь Я ай Га) Ше й о ож й шк зник нин -ї :
п.00 ва п 1 Концентрація білка (мкгумл)
Фіг. 5 во зов о ' ; рак 133 ут ДМ дюселкк. Ка :
3. ун енеюнжююттонн» Дівнтитіло ПЗВ ща. й і вл зв В вод пеВавЗОВ в ВК жору ЩЕ зонгепниксоттюснввснноеь Лізи тідО ПОВ Й І ж 3 ще Той Хе І КУ Час пек
Фіг. А ви зобп32В ню ча що. ут Данію пово : жк МК і С . .
Ж і. й Діантитідо певвлЗаВ. о поможе ве Діантитіло п3о8 и вобу в3ОВ аю не ехо 2ю бок Че сек що ЗСОЗзА Чиг. 58
180. 140 7 НК а - и и пп я Щ З ЗІ О. | 15 -а | о Кр, 53 Час тк
ЧНг. оС ви Діантитіло зба 150 Й 120: рин - ва: |; СПД нена ча: а стих Й а ши ши о а о0 5) 00 159 200 250 300 353 400 сяк Час Фіг. 7А ву 5СО1БА и п2ВБ-3О8 СВО 180: 1 за: КТ за рт СІ ее І КО ДЕК о бо00500 100 50 200 353 300 350 400 сок Час Фіг. 78 й «СОВА / ЗОВ хсЕм да: ІДИ о ро : яв фитдее т о лина вах а 7 і -М 050 00 150 200 250 306 350 400 ож І Час ФГ. 7 й тела ЗСПааАЛІОВ Дивічитела ЗСОЗаАтТУ 253 : Дивинтатерка ви с век дося Я ам: ре по МНН Кінні ссоявсьнонья тв дл 1: їй о - : : биннних що -БО ВО ча ню 50 2) ОБО 300 0 00 ок сріг. 7 Час вв рз28по2ве-пзаз сво НЯ Мк 35; ит зо Ми ТТ іа: рт ень г, сви й ОО бо яб 00 150 200 250 300 350 500 ск Час
Фіг. ТЕ
СПЗОВ на В-клітинах і т, п. й ко. ; СОМв на МК-кілерах. МІФ, МКК о К МшежкУ АК 00 ОБУ а КУ я що ГІ З я з
Фіг. 8 Ішов У. ДАН в С ССС Низ, нюх п тк ТТН Ще нИзВЕУ, НеховУй Нв Бе РО Сл НТК ит й Ноя. ШИ НвоВеЖВ 00000 Мвт, Не шнур Мт ЕВ Що НавзаеУН Й п СТ узор ТС по. 00000000 Вени: в 0 Студ рожвововост ми ХУ
Фіг. 9 же ! Й 000о-е-- ВМОХОвІ-рМОХвІ6 14 ра -- рМОХев3-рмМохвгА сш р -й- рМОХБІЯА-рМОХбІв У | Я з (| вий З 04 ДЕ нні і Кк ' Дуже ут тет тт тут тт тест, вд01 01 ди 1 Концентрація білка (мітмл)
Фіг. 10 са рі / взОоВЕу щи М о Б а її чи Жооноо нн а, сиве, с Ше й як сна ї я - ше ши И Ось ТНЕУ пен Сов Фе
075 ' ж ОМОХОВВаноМОХ ОВТ --к-- ВМОХОВВОчОМОХОВТВ З504 А як ІМОХОбБ?7«рМОХОв74 х і й -е-- РМОХОВ77 «рМОХОв?В гй й Е . з ! гл -к- Негативний контроль - 1 Кй А. а ода Йо З я Шо р р в мій вин нн они в ва Концентрація Оілка(мкг/мл)
Фіг. 12 взОВЕУ кн чи, й , я, шт» ЗОМ МВ, о ча б ф ДФ 5 :- " й У : КО ПЕК оо и ОК ч - ду оон й о М пвх і ше та сОооН В ше! і ПЕ КБ МНИХ ШИ ВИ, г Кому о НТ
Фіг. 13
Ес із шварнрннм доменом 04 роковин НаЗОу. назви ще 0 БД ванЯ ОВК НО нн КАК НИ нннннн Я МЖК Те із шарчірним доменом пт чит п ЖЕ. Й пише и іще БСК КК КК НО НКЮ Ес Із шарнірним доменом нювесівь 00000000 НОВА нвнрни ПВ Со НТ МОВ 0 ежжь Нева п СО В КРМВОЄ Фіг, 14 мМ 12 шо ПИ КК а ОК ОК По В вв ОКХ ЕЕ СПИШ КК К КК в с шо
Чиг. 15А 3 7 | М ПО ХХ З с кн ОО НО 5 т с с с о 5 ЗБ ЗХ А її. З хо о с І ВЗ ЗОВ ОО БУ З ЗВО о ХУ З: КОКО, МЕ Б с І о.
Фіг. 158 с-як Конструкції 11 - 12 петля шин Конструкції У в с нн ная е п рай ся-- Конструкції 10 5 1 ве Діантитіно ЗОВ й І А ло пл пз кт М З 4 и ж м й щи Шо Га ще о вдих 0400 рн -ї1 : Й 01 Е! та Концентрація діантитіла (нгимл)
Фіг. 16 М М 00000 нь В заслмі, 1о8Ун вт но ною дужухюї тк й зе 00000000 2юмН ГО оюквовюЯ С ООСКЮВАККАТВКО ПЕОМ КІ АСОМЕВМРОР- ЗК, зажУВ сухо є ва недЬ назоХВ с оваленці: па сновок На Ковалентно Й зн'язане неннемь, ідвеХИ біснецнфічне 16) ХХ) чвКяс ЛО діантетіхо (МО
Фіг. 17
180 ся: Я Канструкщя 13 Ж ЕЕ і : БОМ МИ А : ще НИК В МН Я МОМ ва ОЦ ОЦЯ МОНО ИН КИ В МКМ ОБО о 125 Ва Кратність розведення СВО
Фіг. 18 115 ; ше КЕ Конструкція 15 16 1 ВВ х рукція | 2 і ох Я Ковструкція І БО М не 1254 | Ж РЕЖ х з'ю І Б тн - хе З 7 КО» що БО Шикх о ово І Б 7 Ж рек Б ля; п РК ек КЕ КА дк пу Же АБО СК. НН ев ї5о ов Кратність розвелення СВІ)
фіг. 19
КІ-кон'югована зв'язувальна й р молекула (наприклад, МАВ, ї | ще КЗ В Раб, век, ВАКТ, лігзид, Б о й ринка звечика мале бо хо «ФВБМІ. 4- й я невелика молекула!) проце М Кк ля ь ще че І ран! КУ се, . бот т нт о й Не В нн нт, С й т Мішень І (ваприкляц, 7 Мішень 2 (наприклал, внухрішньоклітнина СОЗОВ, інший імунний кластеризація, внутрішньоклітинний сфектор, редептер або рекрутинг, безклітниний рекрутинг або безклітинна мішень) множини мішеней)
фіг. 20 що 8, є ЗВбаЯой ше , ех ІЙ я 2 й о х. ЗЕбгаЯап нею з я в тВвдх нив в ч -й « МВВАЯ КТС ни . с « ВАВ МСлоЮ ве ще . е й ВЕ. таж я в ага дн ин ПАКТ. німа щі ОдЕТ, ними
Фіг. 21 А в Я опе овалчтюо з пам и ж вдові ЗИ СВХЛ-ЕТО ЕН СОЗАВЗАЯТ ВВЕ вОБОЄНІ шк СВУ ЕМ ЕТО СМ Опант А ке БЕХ ОБРИСИ БІСОЗХВОАНТНОМ х х не за СВІДЧАТЄ ки во по ВОАИтТоАМ Е ЕЕ 5 ПЕН х мою о ОК, що хо І В ро ою ї 7 хі Х в ще: ш- ЛОЮ Б М о ЗО Й гЯ З Ка ШЕУ ж х х х Я 5 20хю КІ У а І З ЕТ 8 ла ББЕ їжба 509 ФІТЦ-кою юговане янтиУСТУТОв "БІС Цков'юговане знтв-СТ795 анкеіло саглжО антитіло (нг/мл)
Фіг. 22 яти СВа КУ я ВАМ кава ВАН В Аравії МИЕОНЗУРІТ «РКС СОЗВВАНТ НІМ в жен актоалозавовнтном ОО дца СВ А- ЕТО зо сої» СОЗ2ВАВТ САМ зіроч СЯ СВУХ сусревь СОЮЗІВ Ти АЙ. ВІК я д в жк боба ї КК !
Ж. я К Як М щш яю х 5 х ШИ. х ; Б обо» НН. ! х -Ш КК Зі х
2. збо | Ех Ї х М зревй КУ хі х ; ЕН Р. ПЕВ Ж 05 І 5 ІБ ш МЖК їх БЕ в пазл Сірі Діві ЗИ! Х ! І І В У з і то 55 600 5009 ме пре я дити СЮ7Ь вититіто (нг/мл) дити-СПТОЬ антитіло (нг/мл)
Фіг. 23
15000 . ше її В А оо г їх " м ! ва , -ае ММ тА т ВО Тк РО яко вовв-3ов 10 між д ж | «вн МЕВВ-3О8 З ме/ке - ен ис " «а МОВВ-ЗОВ 1 мл я шин ДИШШН шин зим шен Я НОВВ-3С8 0.3 мокг 0 7 м мо що ох День т че МУ пдв пСП18Амаша ши ШЕ НЕ: Н -ян МВВ-ЗОВ - НСОТ6А ми І 1500 ; й ік Н с фо МУ АВ - пора миша шин я я пен и ва ст З Пн дн В2ВВ-3ОВ З мок. Фк ж їй в: ТУ 7 СОВА СОЗ2В миша до Зо Ї ще: о вою у шен а 7 ч4 М 280003 цень фіг. 24
Е ши ИН зо: дже яко тсоїв-. РАВ ром х : Манн хх У у в 007 Сов. вСОївА РБВ щ- 53 ос чан АСВ. НОСОВА» РВЕ З Зеннці З яко теорів-. засо до г нс 1 зе псом ВА НСО1ВА» 2402-38 я Ж ши ше | че тсбіва- ВСОТвАНВ я 2 452-358 Ж ов Вот ри "7 ї ср тр День
Фіг. 25 Виживаність мишей з моделлю клітин Кай лі 7 ше пе ТА еВ СМ лнмнввни пишних пн сен» МОВ 250 мкг (Меф) ферит х офі же МОО261 25 мк (МеВ) що ТЯ м «ак МІ 0.25 мкг (МеВ) ж ШЕ о 25 ко 75 109 Дві
Фіг. 26
ЕЄкспресаваннй в Б Я ВАВ ЗВ ую ктрОовВоре У ДЕНУДААГ, ЕХ) тА вв ще Дяреннннняня Б. сої ЗОВаСТНерхнів) зо зваваАйт й ? і БІеЕК ! | ме их ку, туїТка фебретяснсяя СНО МОЄ (ПП ижені Гн 4 щу: ї Як: За кй | Е ЗО: вка ЗО Її ; де ї до Ох ОКХ Я х ли: Го нь ння вик Щ З не ОН ОМА: І |.
: . р і М о пд снення Срна о ПД оон со в ок НКИ В й и Й . : Й те яв НА та 145 153 1щО КК ке па х сх.
Фр. 27 ях КЕ5А вазв'зування З ЗАТ ит є : пк г п і я НОВ АНА - ВОВНУ ОлАВТ ме: ж у ія ше ких Е СК Е к ЕЕ НОВЕ БАК З ї ФОН г Н Се КОДЕК : і щі І с Ге он п а ча п а БУ їх Концентрація АКТ мкр/мА)
Фе. 28
З на СОТ18-СО32В Дж б есств й «весрівсрт и я й РЕ й / ЖК ке: и чо / як 5 й - сп2В6-Адіу хо - за зоя я 40910 1402510 Кацвнентрація (НЕ/Мл)
Фіг. 29
Вау, СВв-»нУн РО СТУК КЕРКНО снів, хВ3Н Й в ТТН ТТ ЕМВ Антугіло проти І! мітка БАС ЗЩ5-Уї. сВ-хН И то СТ тт ТУТ «ве свз-жН ОО СОТ ОККО ВМ, явжУН ди С соль ууквкюст ех Аиатитіло проти. мітка ЕБАС ВІ, СсамьУн сна Сл Ступка ТТ
Чнг. 30 Аналіз на конкурентне зв'язування вА3-СВ3.1 БАКТУСЬІВХ п Й Й І -я- ВЗ. ВВЕ ше З в ож т КК : х З 05 З. т З З | ОН по пі і 36 ЯВ5-СВЯ АКТ (екглат
Фіг. Зі п з ко УК, й я г я Мао дій СБ ОХ Бе Й х я і. ї Є Фет я ХУ В, чш; ке ех в й ов? я а п о. КІШКЕЖЯ ау УЖ в Б Її НИ Фіг, 32
Ів-подібний чотиривалентний ОАКТ Коистантний домся потяг ландюга м ча інаприкивд, С-калта або С-пямбда) чнист т трос ІА) ІВ З Константин домен кажного лакдюта да м (наприклам, (263, 02, 03,08). мн нт Сени 7 соон Фі ФІ Фі (АУНЕ) : Сайт зв'язування з епітопом і (0)4(8) : Сайт зв'язування з епітопом 2 (СУ) х С-капна/лямбла З СНІ (зв'язування, аналогічнезв'язуванню традиційного 18) Шернірна область- СНОІ-СНЗ зв'язуються з утворенням Гс
Фіг. 33 ЕПІБА-аналіз на зв'язування то232-вСрІвА
2. ! / -в- ПАКТ З 5 чі --кк ЮОАКТ 1 х Е й й З / зе ДОКТ а БЖ з «фе тільки середовище ! й ко спо таб
5.5 ; я Пс нин шин нн ж шин ВА В.о пл 1 18 Концентрація ПАКТ (ВМ)
Фіг. 34 ЗА у Фе а І М / УЖ; ї г і до й | | й ( ПІ Ці І. ій ін А В С В; х Ж : у їх УДУДТУАТ Ї; м НІ і І, У Ах У ух і х І; а в Ї у й іх Її р; х М й де ке / ІЙ ї ЩА М Е Е З Н х й іх / і й Її и А ! Я м хка і З дж ! К
Фіг. 35 Е - Кк НазВо АН 5 хи Шк З | Шев 4.5 ко ПИ ЗИВ 5 що і нн З оо пої т і Концентрація бідка (мим)
Фіг. 36
У Сх 7 їх і іх лоша їх иа і х і СІТКИ т бетнту і РОКУ с
В ї. ОК кі. шо й і БЕ-спіраль К-спіраль У Ще а пох і а БО о ОБУ
Фіг. 37 х Ева їй К же ках з їрд її Мій Сей Как ки Бетшраль Ко С У Кабрюь ЯЕОБаЕнЕ» в Ж ях в Урлеюя х с Ка Ка п в К Тон о я ГВКЯ й и и З ка Не УК Я Мій Он ди дО ЖКориня 5 і Бо Ме І М д ча ще їВ її й й во Е.М є к м хК що т3 Ка В Ас Ма Зк пен Ма Янг, 38 сне ЙУ щ -стираль де А Я Б-страль ВА ва І Мету ро і дня З сн: ран ні ій пн а КОН я Ше ту зве зо ЗУ Уа й у її Уа хИХ а В хв в сни: ши А шт ак с як мн НС
Фіг.
Димер А, г мА дня Мономер ; кими 4 400 м зх У д 350 А х й іш ще 300 Й : 250 а і 200 АБУ 150 В. ЧІ її 100 Ж ли ЛЕ й |: ве КЗ й а
| В. ших ша 640 80 100 120 14. 160 15, м КВК Кк у, А у ЕБОК й по шк | ЕБс/КЕс - Іі Е/КЕс Ії
Фіг. 40
ТА їй хі Я і. і й по во ше г У ! ка к х х х ! х Ж Агрегат Димер Мономер
Фіг. Зі
133 4556 7 я у, 1131 ль нн ек а а В Хо в в в КК її: ОВ оно а. З с НН НН ВО а В в М я й: 55 в НН В и и и ООН в
Фіг. 42 с їй : п заг ча «Фе пОВБУАХСВІ ЕКЕо халва др ф пеВвуАЖСВа БСК які р Н ре щ : що Щи ек НЕВОХНВЗ УК Ту ет ; зп - Я І з ВаАВЕЖАХВСВЗ ЕК з 3кій Із ще я ше З ДИ -- НОВБУАХСВЗ ЕБСКЕЄ її зд А щі р Ка Й я, що я тла "о й дн сн і» а одне слой й о 05 2 4 в 15 ощш Концентрація (НМ)
Фіг. 43 щ х а як сн»венО9?О Б се 0 Вей Жоер» - сповна КА зх се ке -а- МОВБУАХЬСВЗ ЕКСЛОРе в х Ж А 4 : -к вовеулхноВЗ ск 8 я З Е: и ге зе ВІВВХАСВЗ УК (хонтроль) т це м - ВВ ; Ка ВК вввуАхнСВа ЕР 8 й Я / т «а ВВЕУАХАСВЗ БКЕС шо КУ " Е. хо НН ке 4 це
М. сша: че ОВ За ж М и я нні Е ЗЕ Га щі ; ре ме Є я ві ит Же я ! ї Неї оч вх -е раки а а мі хо «з р « т «з - я еВ ще «У М с ПАЙ або контроль (ВМ)
Фіг. пСеОЗ2 А Сн НЕ са Ко -4 Б-спіраль бо во ММ й.
кн. ие й. й
Чнг. 45
З з І у 2 Ж Ко) рем о м де ЗИ Я У мо хі Ше: ШИ з а - , Концентрація ВАВТ (мкг/мл
Фіг. 46А
7.5 х 20 Е З 45 й озо д. 5 95 Ме МОВА н: нан Манна син АННА 02 -ка : ща 1 І34 ща У ої че т Я в В я ВІК: З в а ре Концентрація ОАКТ (мкг/мл)
Фіг. 468 то вСО1вА Бо зас т -е | Буфе но Буфер; . уфер оо у - ; вай 4 совок 409 - ; пхжау тож у мою 4 ші бра 41 4 Аоввт «НЕ і у нини нини ванни зи й . я -ю а о а оо оз 000 сек Час
Фіг. С
АКТ АВБО-ДПАНТ І Ноя пу М сгівіи плей. хе шик і ут ам Но ут ств й пе т ов ди з ння е хі ак ок ло) ба же лов оо м а зов 53 мя УяхМ Же Час ек Час сек зСоз2 «оз Каї/ Ма З тав ков 7.48 Кай Ме йзов Ка в 7.йа-З Калме20 кала
Фіг. 460 Фіг. 465 АВТ АВЕ-ВАНТ що ща З: т Й реко Шо 5 турки є Б - З ск в її ншо пф м Ммю дю а ж й Мю У ОО яю МЕ Ж дк Час Й Час Щ вм ЗСТмвА КаїйМеб.тео5 Кей ка Ма З Вай Ккал 0О5и Капійкі5В Коамегі37
Фиг. чо Фіг, 460 ПАКТ АВО-ОВАКТ пк 1 що м мк хо уд Ех ве т - скін тю Я прі ревефееитрн о реніккортвен зва Жоекекикнкнния алу пі зоб аа дю со му хо ку ХРО пФ ОЗ с 5 Би ц де сек хї Їде сек НА НВА кКаї/Ме За Каті ВвЯ Ким
Фнг. 46 Фіг. БІ р ам Е Бак їв й че ПАНІ жк АВ БАКТ ан ИЙ а ОАВТ (НА) « а АВБОТ-ОАВТ (ЗА) Йо СИ 0 ме чн сн Ки і в - че " 5 Я 5 З Концентрація ВАТ (мкг/мл Фіг, 461 304 що г В 1 З 48 | й ж 5 ж Ж вх 109 я З де в я Концентрація ОААКТ (мкг/мл)
Фіг. 47А Аналіз на перенацілений кілінг клітин Кай ЕТ» 20 Е 40 Хе т а й са т спіесозІВ с жи х й т срів-соз2в АВО Е я о ЕН-СВЗІВ ШО КК ож а Ж ож совене ШО Я бен в М ЕЕ ЩЕ з зо аб фе Фони зд: Концентрація (мкг/мл)
Фіг. 478
З 000 їі ян АВО-ПАВТ рі е . -- ОАНТ ги од, ї5 сн а й щ Ше их ї п, кон Ше їх йо г Ше й ве г: Бо 100 зо Час після ін'єкцій (години)
Фіг. ЯК БП-клдітнин нюба оон огеогоговгосоводсоводоотвсвасовневт о пифефедірісювсз й й я кА хе ще МУХА, пляжах ИЙ - Я дви ВШ ШИ ШИ : кт он ОАВТО1 може с «ве АВО-ВАНУ 03 мг ще -ке ВАТ ІО мгйее -е- АЩО-ОАВТ І.О мех З 7 34 2 38 Дні
Фіг. 4ЗА
Т-клітнии 10000 « не пночння ше -Ф РВУ у ПАТО ле Ії : «Ше АВООАКТО за що К І Ж ка иедлня мере, і Е Ера нема ЗИ зних Шен нен --е ПАДТ ІМ ПЄ не АВОДАНТ МО мк 1009 сппктдднкакіннііннннкю В) 30 20 30 Дні
Фіг. 398 РМ М-клітини шк. оо ЧИ А не Шини т сова ї , ку «ее АВТО Мей т -Ше АВО-ЮАВТО мех -- ПАКТ У мВ -ае ВОВНУ ІМ Зах ; ; - сети ун : І 7 14 2 28 Дні
Фіг. 49
2Б5- (НЕО 2 Клітинна лінія раку молочної залози 100 ж немловня р во4Я жо нетощев а з Гарцватин З 504 ко товлам М ф- шо Ж Гі п Ко 20 За а жо нео и зно зо Конпентрація (нг/ми)
Фіг. З0А МСЕ-7 (НЕКО Т-) Клітняна лінія раку молочної залози тк 1, веатотта 1004 жо вихов ; Е ЩО о герцейптин а че З водою вчи 7 б «в ; 2 : о 204 ) З ях о І пн: кон Є ва. ой ярі ай яд зоб я0ї 4: 43 З Концевтрація (вг/мл
Фіг. 508
МОА-МВА468 (НЕК? те) Клітинна лінія раху молочної залози 0 р то насе тотем
--К. ФУ ар жо ннзлевею т гецовит зв " пениалтии д йо тов Ж ; во х шо В А е он ки -0 я сення 0 ка за ди яв 4 Концентрація (нг/мл)
Фіг. ОС Ннт-25 Клісивиа лінія раку мововеї залечи я жо нЕввтевщеЙ хх « неврловекі а зо я о Геровпин са я 7 28 А тсвазл ; 31 5 Я щи: 5 оч й - З 0 ка за ло за ни Но аа Концентрація (ніумлі
Фіг. 5003 :
вщтва Клітинна лінія раку молочної залози 40 - жо нав товще шк - ЗДО фо несо-товЕю 1 , БО Л0Я коса й : ї и " кон ся ї с. ! г ; 05 Ж жен - ; мн. ЗАМ: НИМ Я з зал ож е Концентрація (нг/ми) Фіг, ЗОЕ Афінність очищеного КУКО-4420, захопленого ЗЕЕТС і детектування з використанням поліклонального анти ЕК зититіда 30210 пе 1 -е КУКО З42а МЕ Б сої Б | тан КУКР ЯаЖКУК о а В з гХу -к г з в ; фідфннттттттт т У Кавцентвраців ПАКТ (німи) ЧНнг МА
КУКО-Яа20 МЕ-Е-спіраль РЗ12-009, перенесення у СНО, 0,45 мг очищеного МА (альбумиху мехшачеої сироватки) Тл 1459 вн :
5. ню о «ІНК С ш ЕІ ви алі ялиимосло де п - ЮК МЯХЕсоВВТ І ДУ 0 т КУКА Зовсойрееровій Уа г І ЗВАБЕМ Й Ко па ше ода т пар іл о Кука збесецроревв с ЛУ «| Відновлений фНевілновлений ; ще -і З. ЦУ вив а и ииор ууавв моов иу х дю См м 7 ; ово зі плн жл вд жовтки 1 НИ 150 по ми
Фіг. 51В КУКОАЯЗО УБ-К спіраль ВАКТ, захопленого антигеном ГТС і детектування з використанням вити МКОО Бе 012210 15 й -ке ККУ ЯАО УК ПАКТ Ї Я КУКИ ЗА МЕ БЕ соп ОВТ: й Й - РВБ я і щ оо ш
В. ав - у | - ж; т ; КЯ - ї а в че -5 раї Концентрація ПАКТ (нг/мл)
Фіг. 52 о -щх у оптом тва ТУ ж а і У ХА. Міка в У Реобийу ех
Б. Ше Ї Мт ВРАМ ДТ кя і УВК Бо МОБ 00 до 3 |: ! тет винеке т У | й шо -- т Терміватор іас Т7 Шш-- : у вові Вамянне «фе К-сої ; Менні АВ мон В іннлітнттвтннття | осенма-і шк з-- ЕКАї авОоМм5 РВОРІМТУ ЕХАСТ МіО | К-сой АВО Сайт розшеплення рРА7 Ксой-АВО
Фіг. 55 в в г хожее о ЕМКОН ОК У ООН ОО ПК Ко с пе Ше КК ОК вх С КО о ох г по о КО що я ТИ Кв ОК о МО ПК х у ОХ МОХ о ОХ о т о с Ед о. З я ОВ с ВВ Я В ОКО Кн ЖЕ Б Ко ОХ по ІМ я ОО і с о с с : о ОО а ОО ее т Ох ОО о М СОЯ п с о п о. о т СО с ОКУ Б о ВЕ ОККО ОКО ОО ОО що Ве о т ОО В о ХО ОХ х КК ПО МЕМ о я
Фіг. 54 Фракції. акції, ел Ї х вх, наван: п віз Колонки кто у ЕТ мі з 5 п її -х і о КЕ ж КЕ ОБЖ заз мі ща з В ср ж ОКО Мічений білок Ох ОаШи В во х БОЖОКУЙ вія в БО х За т КОКО о ЖЕ Щ Ех: 5 ХО Сом ет К а. я «апірань-АЕ ШО ше рак АВО ОХ и
ПК... За ко Х
Фіг. 55 ще ! «ж. КУК2 4420 УК й Я Як ОККО 4450 УЄ Єсої Я о -йе КУК? 4420 МЕ Е я КАВОЮ В / « ;
ї 0.8 т 43 (зі рел н З ВВНИ йль МИ КЕ ша 3 млн и чи Б М КІ З т о Концентрація БАВТ (нг/мл
Фіг. 56А 15 й ! за КУК2 4420 УК Е я К-АВО г к жк КУКА 4450 МЕ Єсої я чо 7 - КУК2 4420 УЕ п ма: В; ж ! ї З я | і Ж ! че р ік КИ КО Я ши шк 00 озон че ІК «у З -у « Концентрації ОАКТ (німі
Фіг. 368
1.5 . че че КУК2 4420 МЕ Есой Е в т КУКА Я4ЛО УК Е я К-АВО То у ха ча Ра Кк " Ж йо ще по т ве 2 В е 5 Концентрація АКТ (нт/млі 7 Фіг, 560 ЕТД5А на зв'язування з АВ) 2 -кк БОБОВІ ВА ! й -кек БАЛ: ВБАТОА У 15 А - МТ а З ЗЕ о Ма З г о. Я т бр Ви КВ ун попннннннн наз и щі З 18 Концентрація (нг/мл)
Фнг. 57 дналіз на зн'язування з альбуміном - В1ЛУВБА -- 51ЕВО ів - ВААЮВА х г й -а- ВідвеО з у як МТ чо ж ІФ й п. ї зФюоФогю: сооогог ОРІ соФововд Іва ал щи мл 7 19 Концентрація ВК ТОо5с АВ мкг/мл)
Фіг. 58 Аналіз на зв'язування з зльйуміном 5 --кк ВАСУОВО -к-е БАНЮ 48 -ке ВМТ щх ок Ж -к ВТАВВИ ОХ ї -к жт с й. : щи ща й | 10 Концентрація МЕ1б5скУ-АВО (мкглал)
Фіг. 59
БЕТА ва зв'язування з АВ) -- ВОМЯТА уж -к ВОТІвТА -- 8БАЮВОММА х «же ВТАМБАТА аа я ВІАВВОТА р а ВаАІБЕОИ А 95 кот под па пл 1 10 Концпевтрація білка (мкг/мл)
Фіг. 60 ЕІ45А на зв'язування з АВ) -к БОААМАРЛА зо ке ко ВІТПЕЛАТА ї кот Ж О15 -же ВЗДІВБАНА ї-3 я б з// я й 6» сптжіжліжжукіжіуєньк й пилалкли Алжажлнє Спнтоюввй - ЯН сити ом о а 1 то Концентрація білка (мкюгумл)
фіг. бі
ЕІДВА на зв'язування з АНІ) Вч «ее ВЯОВЗАНТА 2» --к- ВНУВВОГТА к я ке ВІТАТИ ж 4. А -йк МОВ - ща в і д -к 1705 ої у -ае ВАВ з г -а- В1АЮБА о й МИ йо дп. пити Акнлтнннні ісслнсто Ж - шк о оо А 1 КН Коннентрація білка (міг млі фіг. 62 300 г ; че. ВСВЛОЖОЮЗИВ ЕК іх в тан НСОТВЖСОЗІВ АВО Х з ше ен НСОТОЖСОЗОВ АВОСААА) я | Зх че ВСО1НСОЮЗ2В АВІА) г | : чех - Й Я - ш ш | У о я т сон ниннинаннининнивнннннннниннинннниня. й р: 4 є В Часідай
Фіг. 634 хек В В ОБ с о. М Я ОО Ох ОК г п. п. 5-5 К-спіраль чі Е-сніраль ліф; сосМ5 пт» КУ че АВО ший Лу Бу. сви вив. ху фу Аво яв Жах
Фіг. 64А
«сО32В аср16 йо ВЗ З в ОО З КК с Со мя 5-5 Коспірють 4 в Е«спіраць сооме щі я Шу во ск, й м зосча я. я дво с й
Фіг. 648
25 яке ВСО1вХСОЗаВ ЕЕ АВОК АВО В 24 й рі 1. х р що ш 10 КІ З в діння ни чинни є В й : - В Концентрація ОАКТ (вт/млі
Фіг. в5А 48 --кк СОТ СОЗ2В Ех АВО АСК жк ВСБВІВВСОЗУВ ЕЕ АААЖ ЛАДА х ж Е дЕ ЯК и з Я 05 - т " В а ш Концентрація ПАКТ (нг/мл Фіг, 6583
2. - ВОДО Ко САТ Ж зв З ре ве У 28 ва Коннентрація ВАЖКУ (нг/мл)
Фіг. 65 ис Те Же о З у, сс ія Кн ния х - З, ; ЕЕ 1 -ї м Бе я В У 0 КУ а 8 8 Час (дні) «ве: ВСОТВиИНСОЗаВ Е АВОІ КАВИ ко НОТ ЕЕ АВСНАВОСК теє НІВ Е АВЕМААА К АВСНААК) яко СО ТВХВСОДІВЕ Кс Кк фіг. 60
UAA201314984A 2011-05-21 2012-05-16 Домени, які зв'язуються з деімунізованою сироваткою, і їхнє застосування для збільшення часу напівжиття в сироватці UA111612C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161488725P 2011-05-21 2011-05-21
PCT/US2012/038227 WO2012162068A2 (en) 2011-05-21 2012-05-16 Deimmunized serum-binding domains and their use for extending serum half-life

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA111612C2 true UA111612C2 (uk) 2016-05-25

Family

ID=47217981

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201314984A UA111612C2 (uk) 2011-05-21 2012-05-16 Домени, які зв'язуються з деімунізованою сироваткою, і їхнє застосування для збільшення часу напівжиття в сироватці

Country Status (22)

Country Link
US (4) US9376495B2 (uk)
EP (1) EP2714079B2 (uk)
JP (2) JP6145088B2 (uk)
KR (1) KR102030531B1 (uk)
CN (1) CN104080804B (uk)
AU (1) AU2012259162C1 (uk)
BR (1) BR112013029892A2 (uk)
CA (1) CA2836873C (uk)
CL (1) CL2013003328A1 (uk)
CO (1) CO6970559A2 (uk)
EA (1) EA201391753A1 (uk)
EC (1) ECSP13013102A (uk)
ES (1) ES2605784T3 (uk)
HK (1) HK1190341A1 (uk)
IL (1) IL229576B (uk)
MA (1) MA35175B1 (uk)
MX (1) MX347818B (uk)
NZ (1) NZ618016A (uk)
SG (1) SG195073A1 (uk)
UA (1) UA111612C2 (uk)
WO (1) WO2012162068A2 (uk)
ZA (1) ZA201308603B (uk)

Families Citing this family (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9284375B2 (en) * 2005-04-15 2016-03-15 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US11254748B2 (en) 2005-04-15 2022-02-22 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US9963510B2 (en) 2005-04-15 2018-05-08 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
CA2836873C (en) 2011-05-21 2019-10-22 Macrogenics, Inc. Deimmunized serum-binding domains and their use for extending serum half-life
HUE055845T2 (hu) 2013-03-14 2021-12-28 Macrogenics Inc Aktiváló receptort expresszáló immuneffektor sejtekkel immunreaktív bispecifikus molekulák
US11384149B2 (en) 2013-08-09 2022-07-12 Macrogenics, Inc. Bi-specific monovalent Fc diabodies that are capable of binding CD32B and CD79b and uses thereof
UA116479C2 (uk) * 2013-08-09 2018-03-26 Макродженікс, Інк. БІСПЕЦИФІЧНЕ МОНОВАЛЕНТНЕ Fc-ДІАТІЛО, ЯКЕ ОДНОЧАСНО ЗВ'ЯЗУЄ CD32B I CD79b, ТА ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ
EP2839842A1 (en) 2013-08-23 2015-02-25 MacroGenics, Inc. Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding CD123 and CD3 and uses thereof
EP2840091A1 (en) 2013-08-23 2015-02-25 MacroGenics, Inc. Bi-specific diabodies that are capable of binding gpA33 and CD3 and uses thereof
EA035419B9 (ru) 2014-05-29 2020-08-07 Мэкроудженикс, Инк. Триспецифичные связывающие молекулы и способы их применения
TWI693232B (zh) * 2014-06-26 2020-05-11 美商宏觀基因股份有限公司 與pd-1和lag-3具有免疫反應性的共價結合的雙抗體和其使用方法
CN106661119A (zh) 2014-07-01 2017-05-10 辉瑞公司 双特异性异二聚化双抗体及其用途
SG11201701028SA (en) 2014-08-13 2017-03-30 Suppremol Gmbh Novel antibodies directed to fc gamma receptor iib and fc epsilon receptor
WO2016036918A1 (en) 2014-09-03 2016-03-10 Boehringer Ingelheim International Gmbh Compound targeting il-23a and tnf-alpha and uses thereof
JP6839075B2 (ja) * 2014-09-26 2021-03-03 マクロジェニクス，インコーポレーテッド Ｃｄ１９及びｃｄ３に結合できる二重特異性１価ダイアボディ並びにその使用
WO2016054101A1 (en) 2014-09-29 2016-04-07 Duke University Bispecific molecules comprising an hiv-1 envelope targeting arm
SG11201706024YA (en) 2015-01-26 2017-08-30 Macrogenics Inc Multivalent molecules comprising dr5-binding domains
WO2016149698A2 (en) 2015-03-19 2016-09-22 Duke University Hiv-1 neutralizing antibodies and uses thereof (v3 antibodies)
AU2016232693B2 (en) 2015-03-19 2021-08-12 Duke University HIV-1 neutralizing antibodies and uses thereof
WO2016149710A2 (en) 2015-03-19 2016-09-22 Duke University Hiv-1 neutralizing antibodies and uses thereof
WO2016149695A1 (en) 2015-03-19 2016-09-22 Duke University HIV-1 NEUTRALIZING ANTIBODIES AND USES THEREOF (CD4bs ANTIBODIES)
MA43987A (fr) * 2015-05-12 2018-12-19 Regeneron Pharma Détermination de la pureté de protéine multimère
ES2889906T3 (es) 2015-05-21 2022-01-14 Harpoon Therapeutics Inc Proteínas de unión triespecíficas y usos médicos
TWI773646B (zh) 2015-06-08 2022-08-11 美商宏觀基因股份有限公司 結合lag-3的分子和其使用方法
TW201709929A (zh) 2015-06-12 2017-03-16 宏觀基因股份有限公司 治療癌症的聯合療法
TWI833183B (zh) 2015-07-30 2024-02-21 美商宏觀基因股份有限公司 Pd-1結合分子和其使用方法
WO2017053703A2 (en) * 2015-09-24 2017-03-30 Bloodworks Composition and methods for assessing sensitivity and specificity of antibody detection reagents
CN105154400B (zh) * 2015-09-30 2021-02-02 中国人民解放军第三0二医院 多克隆抗乙肝病毒免疫细胞的扩增方法
US20180305453A1 (en) * 2015-10-22 2018-10-25 Canadian Blood Services Monovalent Chimeras
EP3389714A4 (en) 2015-12-14 2019-11-13 MacroGenics, Inc. BISPECIFIC MOLECULES HAVING IMMUNOREACTIVITY TO PD-1 AND CTLA-4 AND METHODS OF USE
US20170233472A1 (en) 2016-02-17 2017-08-17 Macrogenics, Inc. ROR1-Binding Molecules, and Methods of Use Thereof
JP7002467B2 (ja) 2016-04-15 2022-01-20 マクロジェニクス，インコーポレーテッド 新規のｂ７‐ｈ３結合分子、その抗体薬物コンジュゲート、及びその使用方法
MX2018014950A (es) 2016-06-07 2019-04-25 Macrogenics Inc Terapia de combinacion.
AR110424A1 (es) 2016-12-23 2019-03-27 Macrogenics Inc Moléculas de unión a adam9 y métodos de uso de las mismas
KR20190118172A (ko) 2017-02-08 2019-10-17 드래곤플라이 쎄라퓨틱스, 인크. 천연 킬러 세포의 활성화를 위한 다중-특이적 결합 단백질 및 암 치료에서의 그의 치료적 용도
ES2955074T3 (es) 2017-02-20 2023-11-28 Dragonfly Therapeutics Inc Proteínas que se unen a HER2, NKG2D Y CD16
JP7132232B2 (ja) 2017-02-24 2022-09-06 マクロジェニクス，インコーポレーテッド Ｃｄ１３７及び腫瘍抗原に結合できる二重特異性結合分子並びにその使用
FR3065623B1 (fr) 2017-04-28 2021-07-09 Roquette Freres Albumines de pois ameliorees, procede d'obtention et leurs applications
EP3665202A1 (en) 2017-08-09 2020-06-17 Massachusetts Institute Of Technology Albumin binding peptide conjugates and methods thereof
CN109836500A (zh) * 2017-11-25 2019-06-04 深圳宾德生物技术有限公司 一种靶向dr5的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
WO2019118266A1 (en) 2017-12-12 2019-06-20 Macrogenics Inc. Bispecific cd 16-binding molecules and their use in the treatment of disease
BR112020016190A2 (pt) 2018-02-08 2020-12-15 Dragonfly Therapeutics, Inc. Domínios variáveis de anticorpos direcionando o receptor nkg2d
AU2019222666A1 (en) 2018-02-15 2020-09-03 Macrogenics, Inc. Variant CD3-binding domains and their use in combination therapies for the treatment of disease
JP7545894B2 (ja) 2018-03-13 2024-09-05 アフィボディ アクティエボラーグ 新規足場に基づくポリペプチド
WO2020027330A1 (ja) * 2018-08-03 2020-02-06 中外製薬株式会社 互いに連結された２つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子
AU2020275002A1 (en) * 2019-05-14 2021-12-23 Harpoon Therapeutics, Inc. EpCAM binding proteins and methods of use

Family Cites Families (211)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4347935A (en) 1979-05-16 1982-09-07 The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy Method and apparatus for electrostatically sorting biological cells
US4444887A (en) 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
EP0092918B1 (en) 1982-04-22 1988-10-19 Imperial Chemical Industries Plc Continuous release formulations
US4716111A (en) 1982-08-11 1987-12-29 Trustees Of Boston University Process for producing human antibodies
US4741900A (en) 1982-11-16 1988-05-03 Cytogen Corporation Antibody-metal ion complexes
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4752601A (en) 1983-08-12 1988-06-21 Immunetech Pharmaceuticals Method of blocking immune complex binding to immunoglobulin FC receptors
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US5128326A (en) 1984-12-06 1992-07-07 Biomatrix, Inc. Drug delivery systems based on hyaluronans derivatives thereof and their salts and methods of producing same
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5985599A (en) 1986-05-29 1999-11-16 The Austin Research Institute FC receptor for immunoglobulin
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
US4880078A (en) 1987-06-29 1989-11-14 Honda Giken Kogyo Kabushiki Kaisha Exhaust muffler
JP3095168B2 (ja) 1988-02-05 2000-10-03 エル． モリソン，シェリー ドメイン‐変性不変部を有する抗体
US5169933A (en) 1988-08-15 1992-12-08 Neorx Corporation Covalently-linked complexes and methods for enhanced cytotoxicity and imaging
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
WO1990002809A1 (en) 1988-09-02 1990-03-22 Protein Engineering Corporation Generation and selection of recombinant varied binding proteins
US5576184A (en) 1988-09-06 1996-11-19 Xoma Corporation Production of chimeric mouse-human antibodies with specificity to human tumor antigens
EP0359096B1 (en) 1988-09-15 1997-11-05 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Antibodies having modified carbohydrate content and methods of preparation and use
US20040049014A1 (en) 1988-12-28 2004-03-11 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
GB8916400D0 (en) 1989-07-18 1989-09-06 Dynal As Modified igg3
US5166057A (en) 1989-08-28 1992-11-24 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand rna virus expression-systems
US5436146A (en) 1989-09-07 1995-07-25 The Trustees Of Princeton University Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors
WO1991005548A1 (en) 1989-10-10 1991-05-02 Pitman-Moore, Inc. Sustained release composition for macromolecular proteins
WO1991006287A1 (en) 1989-11-06 1991-05-16 Enzytech, Inc. Protein microspheres and methods of using them
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
AU7247191A (en) 1990-01-11 1991-08-05 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
ES2087997T3 (es) 1990-01-12 1996-08-01 Cell Genesys Inc Generacion de anticuerpos xenogenicos.
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
FI85768C (fi) 1990-07-04 1992-05-25 Valtion Teknillinen Foerfarande foer utfoerning av ytplasmonresonansmaetning samt i foerfarandet anvaendbar givare.
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
DK0546073T3 (da) 1990-08-29 1998-02-02 Genpharm Int Frembringelse og anvendelse af transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
WO1992006180A1 (en) 1990-10-01 1992-04-16 University Of Connecticut Targeting viruses and cells for selective internalization by cells
US5364930A (en) 1990-10-16 1994-11-15 Northwestern University Synthetic C1q peptide fragments
ATE164395T1 (de) 1990-12-03 1998-04-15 Genentech Inc Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
GB9105245D0 (en) 1991-03-12 1991-04-24 Lynxvale Ltd Binding molecules
DE69233367T2 (de) 1991-04-10 2005-05-25 The Scripps Research Institute, La Jolla Bibliotheken heterodimerer rezeptoren mittels phagemiden
CA2109528A1 (en) 1991-05-01 1992-11-02 Gregory A. Prince A method for treating infectious respiratory diseases
ES2154637T3 (es) 1991-05-14 2001-04-16 Univ Connecticut Aportacion de genes dirigidos que codifican proteinas inmunogenicas.
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
AU2160992A (en) 1991-06-05 1993-01-12 Board Of Regents Acting For And On Behalf Of The University Of Michigan, The Targeted delivery of genes encoding secretory proteins
DE69110032T2 (de) 1991-06-08 1995-12-21 Hewlett Packard Gmbh Verfahren und Gerät zur Feststellung und/oder Konzentrationsbestimmung von Biomolekülen.
JP4124480B2 (ja) 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
US5223408A (en) 1991-07-11 1993-06-29 Genentech, Inc. Method for making variant secreted proteins with altered properties
US5843749A (en) 1991-07-26 1998-12-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ehk and Ror tyrosine kinases
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
PT1024191E (pt) 1991-12-02 2008-12-22 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
CA2507749C (en) 1991-12-13 2010-08-24 Xoma Corporation Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
AU3434393A (en) 1992-01-17 1993-08-03 Regents Of The University Of Michigan, The Targeted virus
GB9203459D0 (en) 1992-02-19 1992-04-08 Scotgen Ltd Antibodies with germ-line variable regions
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5912015A (en) 1992-03-12 1999-06-15 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Modulated release from biocompatible polymers
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
JPH07505773A (ja) 1992-04-03 1995-06-29 ヤング　アレキサンダー　ティー 標的化されたウイルスベクターを用いた遺伝子治療
CA2118508A1 (en) 1992-04-24 1993-11-11 Elizabeth S. Ward Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
ES2157225T3 (es) 1992-10-09 2001-08-16 Advanced Tissue Sciences Inc Celulas hepaticas de reserva.
DE69232604T2 (de) 1992-11-04 2002-11-07 City Of Hope Duarte Antikörperkonstrukte
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
EP0673431A1 (en) 1992-12-03 1995-09-27 Genzyme Corporation Gene therapy for cystic fibrosis
GB9225453D0 (en) 1992-12-04 1993-01-27 Medical Res Council Binding proteins
US5934272A (en) 1993-01-29 1999-08-10 Aradigm Corporation Device and method of creating aerosolized mist of respiratory drug
EP0682710B1 (en) 1993-02-10 2003-10-29 Unilever Plc Isolation process using immobilized proteins with specific binding capacities
US5877396A (en) 1993-04-23 1999-03-02 Sloan Kettering Institute For Cancer Research Mice mutant for functional Fc receptors and method of treating autoimmune diseases
US5885573A (en) 1993-06-01 1999-03-23 Arch Development Corporation Methods and materials for modulation of the immunosuppressive activity and toxicity of monoclonal antibodies
CA2163345A1 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Susan Adrienne Morgan Antibodies
DE69434520T3 (de) 1993-07-30 2009-10-15 Affymax, Inc., Palo Alto Biotinylierung von proteinen
US5483469A (en) 1993-08-02 1996-01-09 The Regents Of The University Of California Multiple sort flow cytometer
US5464581A (en) 1993-08-02 1995-11-07 The Regents Of The University Of California Flow cytometer
GB9316989D0 (en) 1993-08-16 1993-09-29 Lynxvale Ltd Binding molecules
JPH09506262A (ja) 1993-12-08 1997-06-24 ジェンザイム・コーポレイション 特異的抗体の製造方法
DK1231268T3 (da) 1994-01-31 2005-11-21 Univ Boston Polyklonale antistofbiblioteker
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US5834252A (en) 1995-04-18 1998-11-10 Glaxo Group Limited End-complementary polymerase reaction
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
US5602039A (en) 1994-10-14 1997-02-11 The University Of Washington Flow cytometer jet monitor system
US5643796A (en) 1994-10-14 1997-07-01 University Of Washington System for sensing droplet formation time delay in a flow cytometer
CA2207961A1 (en) 1995-01-05 1996-07-11 Robert J. Levy Surface-modified nanoparticles and method of making and using same
US6019968A (en) 1995-04-14 2000-02-01 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
KR100654645B1 (ko) 1995-04-27 2007-04-04 아브게닉스, 인크. 면역화된 제노마우스 유래의 인간 항체
CA2219486A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
JP2000507912A (ja) 1995-08-31 2000-06-27 アルカームズ コントロールド セラピューティックス，インコーポレイテッド 作用剤の徐放性組成物
US5736152A (en) 1995-10-27 1998-04-07 Atrix Laboratories, Inc. Non-polymeric sustained release delivery system
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
US6750334B1 (en) 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
US5942328A (en) 1996-02-29 1999-08-24 International Business Machines Corporation Low dielectric constant amorphous fluorinated carbon and method of preparation
DK0885002T3 (da) 1996-03-04 2011-08-22 Penn State Res Found Materialer og fremgangsmåder til forøgelse af cellulær internalisering
AU5711196A (en) 1996-03-14 1997-10-01 Human Genome Sciences, Inc. Apoptosis inducing molecule i
AU728657B2 (en) 1996-03-18 2001-01-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
WO1997034911A1 (en) 1996-03-22 1997-09-25 Human Genome Sciences, Inc. Apoptosis inducing molecule ii
US5834597A (en) 1996-05-20 1998-11-10 Protein Design Labs, Inc. Mutated nonactivating IgG2 domains and anti CD3 antibodies incorporating the same
US5985309A (en) 1996-05-24 1999-11-16 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
US5855913A (en) 1997-01-16 1999-01-05 Massachusetts Instite Of Technology Particles incorporating surfactants for pulmonary drug delivery
US5874064A (en) 1996-05-24 1999-02-23 Massachusetts Institute Of Technology Aerodynamically light particles for pulmonary drug delivery
US6699658B1 (en) 1996-05-31 2004-03-02 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
US6300065B1 (en) 1996-05-31 2001-10-09 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
ES2300113T3 (es) 1996-08-02 2008-06-01 Bristol-Myers Squibb Company Un procedimiento para inhibir toxicidad inducida por inmunoglobulinas que resulta del uso de inmunoglobulinas en terapia y diagnostico in vivo.
US6025485A (en) 1997-02-14 2000-02-15 Arcaris, Inc. Methods and compositions for peptide libraries displayed on light-emitting scaffolds
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
GB9623820D0 (en) 1996-11-16 1997-01-08 Secr Defence Surface plasma resonance sensor
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
CA2722378C (en) 1996-12-03 2015-02-03 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that bind tnf.alpha.
DE69732306T2 (de) 1997-01-16 2006-01-12 Massachusetts Institute Of Technology, Cambridge Zubereitung von partikelhaltigen arzneimitteln zur inhalation
AU6054398A (en) 1997-02-11 1998-08-26 Immunomedics Inc. Stimulation of an immune response with antibodies labeled with the alpha-galactosyl epitope
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
CA2286879C (en) 1997-04-14 2003-12-16 Peter Kufer Novel method for the production of anti-human antigen receptors and uses thereof
US20030207346A1 (en) 1997-05-02 2003-11-06 William R. Arathoon Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
DE19721700C1 (de) 1997-05-23 1998-11-19 Deutsches Krebsforsch Mutierter OKT3-Antikörper
US5989463A (en) 1997-09-24 1999-11-23 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Methods for fabricating polymer-based controlled release devices
SE512663C2 (sv) 1997-10-23 2000-04-17 Biogram Ab Inkapslingsförfarande för aktiv substans i en bionedbrytbar polymer
WO1999023105A1 (en) 1997-11-03 1999-05-14 Human Genome Sciences, Inc. Vegi, an inhibitor of angiogenesis and tumor growth
CN1204147C (zh) 1998-02-25 2005-06-01 利思进药品公司 提高以抗体为基础的融合蛋白的循环半衰期的方法
US6211477B1 (en) 1998-02-26 2001-04-03 Becton Dickinson And Company Electrostatic deceleration system for flow cytometer
US6455263B2 (en) 1998-03-24 2002-09-24 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Small molecule library screening using FACS
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6242195B1 (en) 1998-04-02 2001-06-05 Genentech, Inc. Methods for determining binding of an analyte to a receptor
ES2292236T3 (es) 1998-04-02 2008-03-01 Genentech, Inc. Variantes de anticuerpos y sus fragmentos.
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
PT2180007E (pt) 1998-04-20 2013-11-25 Roche Glycart Ag Engenharia de glicosilação de anticorpos para melhorar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
EP1080365A1 (de) 1998-05-20 2001-03-07 Graffinity Pharmaceuticals Aktiengesellschaft Spr-sensor zur gleichzeitigen erfassung einer vielzahl von in fluider form vorliegenden proben
US6289286B1 (en) 1998-05-29 2001-09-11 Biacore Ab Surface regeneration of biosensors and characterization of biomolecules associated therewith
CA2336139C (en) 1998-06-24 2008-10-14 Advanced Inhalation Research, Inc. Large porous particles emitted from an inhaler
WO2000009560A2 (en) 1998-08-17 2000-02-24 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
US6311415B1 (en) 1998-09-14 2001-11-06 Lind Shoe Company Bowling shoe with replaceable tip
US7315786B2 (en) 1998-10-16 2008-01-01 Xencor Protein design automation for protein libraries
NZ539776A (en) 1999-01-15 2006-12-22 Genentech Inc Polypeptide variants with altered effector function
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6676927B1 (en) 1999-01-20 2004-01-13 The Rockefeller University Animal model and methods for its use in the selection of cytotoxic antibodies
CA2704600C (en) 1999-04-09 2016-10-25 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. A method for producing antibodies with increased adcc activity
US7527787B2 (en) 2005-10-19 2009-05-05 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Multivalent immunoglobulin-based bioactive assemblies
DE19937264A1 (de) 1999-08-06 2001-02-15 Deutsches Krebsforsch F¶v¶-Antikörper-Konstrukte
CA2388245C (en) 1999-10-19 2012-01-10 Tatsuya Ogawa The use of serum-free adapted rat cells for producing heterologous polypeptides
CZ20023203A3 (cs) 2000-03-24 2003-08-13 Micromet Ag Multifunkční polypeptidy obsahující vazebné místo k epitopu receptorového komplexu NKG2D
CA2410551A1 (en) 2000-06-30 2002-01-10 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw (Vib) Heterodimeric fusion proteins
AU2001294175A1 (en) 2000-10-06 2002-04-22 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Method of purifying antibody
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
EP3690043A1 (en) 2000-10-06 2020-08-05 Kyowa Kirin Co., Ltd. Antibody composition-producing cell
CA2431600C (en) 2000-12-12 2012-04-17 Medimmune, Inc. Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
WO2002086070A2 (en) 2001-04-18 2002-10-31 Dyax Corp. Binding molecules for fc-region polypeptides
AU2002327704A1 (en) 2001-09-21 2003-04-01 Raven Biotechnologies, Inc. Antibodies that bind to cancer-associated antigen cytokeratin 8 and methods of use thereof
US20030077282A1 (en) 2001-10-12 2003-04-24 Bigler Michael Eric Use of bispecific antibodies to regulate immune responses
ATE524196T1 (de) 2001-10-16 2011-09-15 Macrogenics West Inc An das krebsassoziierte antigen cd46 bindende antikörper und verwendungsverfahren dafür
JP2005532253A (ja) 2001-10-25 2005-10-27 ジェネンテック・インコーポレーテッド 糖タンパク質組成物
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
WO2003074679A2 (en) 2002-03-01 2003-09-12 Xencor Antibody optimization
WO2003087340A2 (en) 2002-04-12 2003-10-23 Raven Biotechnologies, Inc. Antibodies that bind to integrin alpha-v-beta-6 and methods of use thereof
EP1354600A1 (en) 2002-04-19 2003-10-22 Affimed Therapeutics AG Antibody combination useful for tumor therapy
AU2003225294A1 (en) 2002-05-03 2003-11-17 Raven Biotechnologies, Inc. Alcam and alcam modulators
EP1513554B9 (en) 2002-05-30 2011-11-09 Macrogenics, Inc. Cd16a binding proteins and use for the treatment of immune disorders
DK1565489T3 (da) 2002-06-19 2011-03-07 Raven Biotechnologies Inc Internaliserende antistoffer specifikke for RAAG10-celleoverflademålet
US8530627B2 (en) 2002-08-14 2013-09-10 Macrogenics, Inc. FcγRIIB specific antibodies and methods of use thereof
DK1534335T4 (en) 2002-08-14 2015-10-05 Macrogenics Inc FCGAMMARIIB-SPECIFIC ANTIBODIES AND PROCEDURES FOR USE THEREOF
US8187593B2 (en) 2002-08-14 2012-05-29 Macrogenics, Inc. FcγRIIB specific antibodies and methods of use thereof
US8193318B2 (en) 2002-08-14 2012-06-05 Macrogenics, Inc. FcγRIIB specific antibodies and methods of use thereof
US8044180B2 (en) 2002-08-14 2011-10-25 Macrogenics, Inc. FcγRIIB specific antibodies and methods of use thereof
EP2364996B1 (en) 2002-09-27 2016-11-09 Xencor Inc. Optimized FC variants and methods for their generation
AU2003295474B2 (en) 2002-11-13 2009-07-30 Macrogenics West, Inc. Antigen PIPA and antibodies that bind thereto
US7960512B2 (en) 2003-01-09 2011-06-14 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
EP2368578A1 (en) 2003-01-09 2011-09-28 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
EP2272533A1 (en) 2003-01-13 2011-01-12 MacroGenics, Inc. Soluble FcyR fusion proteins and methods of use thereof
DE10303664A1 (de) 2003-01-23 2004-08-12 Nemod Immuntherapie Ag Erkennungsmoleküle zur Behandlung und Detektion von Tumoren
JP5026072B2 (ja) 2003-07-01 2012-09-12 イミューノメディクス、インコーポレイテッド 二重特異性抗体の多価キャリヤー
NZ545968A (en) 2003-09-18 2010-01-29 Raven Biotechnologies Inc KID3 and KID3 antibodies that bind thereto
DK1706424T3 (da) 2004-01-12 2009-11-02 Applied Molecular Evolution FC-region varianter
AU2005231359A1 (en) 2004-03-31 2005-10-20 Centocor, Inc. Human GLP-1 mimetibodies, compositions, methods and uses
EP2380594B1 (en) * 2004-04-06 2019-12-04 Affibody AB Use of a serum albumin binding peptide to reduce the immunogenicity of a protein
JP5367982B2 (ja) 2004-04-16 2013-12-11 マクロジェニクス，インコーポレーテッド ＦｃγＲＩＩＢ特異的抗体とその利用法
EP1761563A4 (en) 2004-05-10 2008-05-14 Macrogenics Inc HUMANIZED gamma RIIB SPECIFIC ANTIBODIES AND METHODS OF USE
EP1765868B1 (en) 2004-06-07 2016-04-20 MacroGenics, Inc. Transferrin receptor antibodies
BRPI0512235A (pt) 2004-06-18 2008-02-19 Ambrx Inc polipeptìdeos ligadores de antìgenos e seus usos
CA2573192C (en) 2004-08-04 2013-09-10 Applied Molecular Evolution Inc. Variant fc regions
AU2005335714B2 (en) 2004-11-10 2012-07-26 Macrogenics, Inc. Engineering Fc antibody regions to confer effector function
EP1833849A4 (en) 2004-12-15 2009-08-05 Macrogenics Inc FC-GAMMA-RIIB-SPECIFIC ANTIBODIES AND METHODS FOR THEIR USE
EP1846767B1 (en) 2005-01-12 2012-06-06 MacroGenics West, Inc. Kid31 and antibodies that bind thereto
US7847070B2 (en) 2005-01-31 2010-12-07 Raven Biotechnologies, Inc. LUCA2 and antibodies that bind thereto
CA2596273C (en) 2005-02-02 2017-11-14 Raven Biotechnologies, Inc. Adam-9 modulators
US20060171952A1 (en) 2005-02-02 2006-08-03 Mather Jennie P JAM-3 and antibodies that bind thereto
US7572896B2 (en) 2005-02-03 2009-08-11 Raven Biotechnologies, Inc. Antibodies to oncostatin M receptor
WO2006084226A2 (en) 2005-02-04 2006-08-10 Raven Biotechnologies, Inc. Antibodies that bind to epha2 and methods of use thereof
US20060193849A1 (en) 2005-02-25 2006-08-31 Antisoma Plc Biological materials and uses thereof
ES2971647T3 (es) 2005-04-15 2024-06-06 Macrogenics Inc Diacuerpos covalentes y usos de los mismos
WO2010080538A1 (en) 2008-12-19 2010-07-15 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US9284375B2 (en) * 2005-04-15 2016-03-15 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
PT2573114T (pt) 2005-08-10 2016-07-13 Macrogenics Inc Identificação e manipulação de anticorpos com regiões fc variantes e métodos de utilização dos mesmos
ES2489646T3 (es) 2006-05-26 2014-09-02 Macrogenics, Inc. Anticuerpos humanizados específicos a Fc gamma RIIB y sus métodos de uso
AU2007325872B2 (en) 2006-11-08 2012-12-13 Macrogenics West, Inc. TES7 and antibodies that bind thereto
KR101599735B1 (ko) 2007-06-21 2016-03-07 마크로제닉스, 인크. 공유결합형 디아바디 및 이것의 사용
DE08786222T1 (de) * 2007-07-31 2010-11-25 Affibody Ab Neue albuminbindende zusammensetzungen, verfahren und anwendungen
TWI523654B (zh) 2007-11-27 2016-03-01 默沙東藥廠 抗生素巨環化合物以及其製造及使用之方法
CN102471378B (zh) 2009-06-26 2014-04-02 瑞泽恩制药公司 容易地分离的具有天然免疫球蛋白形式的双特异性抗体
TR201804897T4 (tr) 2009-10-07 2018-06-21 Macrogenics Inc Fukosi̇lasyon ölçüsünün deği̇şi̇mleri̇nden dolayi geli̇şmi̇ş efektör i̇şlevi̇ sergi̇leyen fc bölgesi̇ni̇ i̇çeren poli̇pepti̇tler ve bunlarin kullanimlarina yöneli̇k yöntemler
MY161679A (en) 2010-07-09 2017-05-15 Affibody Ab Polypeptides
CA2807127C (en) 2010-08-02 2019-02-12 Leslie S. Johnson Covalent diabodies and uses thereof
CA2836873C (en) 2011-05-21 2019-10-22 Macrogenics, Inc. Deimmunized serum-binding domains and their use for extending serum half-life
US11392902B2 (en) 2017-06-06 2022-07-19 United Parcel Service Of America, Inc. Systems, methods, apparatuses and computer program products for providing notification of items for pickup and delivery

Also Published As

Publication number Publication date
IL229576B (en) 2019-11-28
ECSP13013102A (es) 2014-01-31
US20200095333A1 (en) 2020-03-26
ZA201308603B (en) 2014-07-30
CO6970559A2 (es) 2014-06-13
EA201391753A1 (ru) 2014-08-29
CL2013003328A1 (es) 2014-07-04
WO2012162068A2 (en) 2012-11-29
MX347818B (es) 2017-05-15
KR20140053910A (ko) 2014-05-08
HK1190341A1 (zh) 2014-07-04
EP2714079B1 (en) 2016-09-14
JP2017137320A (ja) 2017-08-10
BR112013029892A2 (pt) 2016-12-20
KR102030531B1 (ko) 2019-10-10
SG195073A1 (en) 2013-12-30
JP2014524890A (ja) 2014-09-25
US20180371104A1 (en) 2018-12-27
MX2013013587A (es) 2014-09-22
EP2714079A2 (en) 2014-04-09
WO2012162068A3 (en) 2014-02-20
AU2012259162A1 (en) 2013-12-12
AU2012259162B2 (en) 2016-11-03
MA35175B1 (fr) 2014-06-02
CN104080804A (zh) 2014-10-01
US20150175697A1 (en) 2015-06-25
CA2836873C (en) 2019-10-22
CA2836873A1 (en) 2012-11-29
US20160333111A1 (en) 2016-11-17
CN104080804B (zh) 2017-06-09
NZ618016A (en) 2015-05-29
EP2714079A4 (en) 2015-01-14
EP2714079B2 (en) 2019-08-28
AU2012259162C1 (en) 2020-05-21
US9376495B2 (en) 2016-06-28
ES2605784T3 (es) 2017-03-16
JP6145088B2 (ja) 2017-06-07
IL229576A0 (en) 2014-01-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA111612C2 (uk) Домени, які зв'язуються з деімунізованою сироваткою, і їхнє застосування для збільшення часу напівжиття в сироватці
JP7037218B2 (ja) Ｃｄ３９と結合する抗体及びその使用
ES2835869T3 (es) Anticuerpos anti-PD-L1
KR102410778B1 (ko) 길항성 항-종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 항체
EP3645570B1 (en) Vista antigen-binding molecules
UA126441C2 (uk) Химерні антигенні рецептори, націлені на bcma, та способи їх застосування
UA125611C2 (uk) Біспецифічні молекули, що мають імунореактивність відносно pd-1 і ctla-4, і способи їх застосування
JP2019106995A (ja) ヒト化抗ｃｄ１９キメラ抗原受容体を使用するがんの処置
UA125382C2 (uk) Антитіла проти людського vista та їх застосування
CN107207593A (zh) 抗pd‑1抗体及其使用方法
UA126802C2 (uk) Композиція, що містить антигензв’язуючий домен, який зв'язується з tigit людини
UA121914C2 (uk) Молекула, що зв'язує pd1 і lag3
US11066471B2 (en) Antibodies to MICA and MICB proteins
WO2006088494A9 (en) Identification and engineering of antibodies with variant fc regions and methods of using the same
TW201247705A (en) Anti-CD38 antibodies
CN107847570A (zh) 靶向hpv16‑e7肽/mhc复合体的构建体及其用途
UA127450C2 (uk) Рекомбінантний поліпептид, що зв'язується з cd123
WO2012176765A1 (ja) 抗ヒトｐ－カドへリン（ｃｄｈ３）遺伝子組み換え抗体
US20220249637A1 (en) Combination therapy of a cell-mediated cytotoxic therapy and an inhibitor of a prosurvival bcl2 family protein
UA108201C2 (xx) Антитіла, специфічні для кадгерину-17
CA3201582A1 (en) Compositions of guanylyl cyclase c (gcc) antigen binding agents and methods of use thereof
CN115996953A (zh) 用于调节髓系细胞炎性表型的抗vsig4组合物和方法及其用途
US20220396632A1 (en) Anti-psgl-1 compositions and methods for modulating myeloid cell infalmmatory phenotypes and uses thereof
US20220251233A1 (en) Anti-cd53 compositions and methods for modulating myeloid cell inflammatory phenotypes and uses thereof
EP4141118A1 (en) Technique for preparing universal humanised car19-dnt cells and application therefor