CN1204147C - 提高以抗体为基础的融合蛋白的循环半衰期的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于具有提高的循环半衰期的以抗体为基础的融合蛋白的遗传构建和表达的方法。本发明的融合蛋白缺乏结合免疫球蛋白Fc受体的能力，这是由于用于融合蛋白构建的抗体同种型或通过通常结合Fc受体的抗体同种型的定向诱变所导致的结果。本发明的融合蛋白还可以含有能够结合免疫球蛋白保护受体的功能域。
Description
相关申请的相互参照
本文作为参考文献引用了1998年2月25日提交的美国临时专利申请顺序号60/075,887并要求了其优先权和利益。
发明领域
本发明一般涉及融合蛋白。更具体地说，本发明涉及提高以抗体为基础的融合蛋白的循环半衰期的方法。
发明背景
抗体用于治疗人体疾病的用途是非常确定的且已经与遗传工程的引入密切相关。已经开发了几种技术来增加抗体的用途。它们包括：(1)通过细胞融合创建“杂交瘤”或通过从产生抗体的细胞中分子克隆抗体重(H)链和轻(L)链来生成单克隆抗体；(2)将其它分子与抗体接合以便将它们转运至优选体内部位，所述的分子例如放射性同位素、毒性药物、蛋白毒素和细胞因子；(3)操作抗体效应器功能以便增加或减小生物活性；(4)将其它蛋白质诸如毒素类和细胞因子类在遗传水平上与抗体结合以便产生以抗体为基础的融合蛋白；和(5)将一组或多组抗体结合区在遗传水平上结合以便产生双特异性抗体。
当蛋白质通过化学或遗传操作相互结合时，通常难以预计终产物从母体分子中保留了何种特性。随着化学接合，结合过程可以在分子上的不同部位发生，且一般导致分子具有不同程度的可以影响一种或两种蛋白质的功能的改变。另一方面，遗传融合的应用使得连接过程更为协调一致并导致可保留两种成分蛋白质功能的稳定的终产物的产生。参见例如Gillies等《美国国家科学院学报》(PROC.NATL.ACAD.SCI.USA)89：1428-1432(1992)和美国专利5,650,150。
然而，重组产生的以抗体为基础的融合蛋白的应用可以受到其在体内从循环中快速清除的限制。例如已经证实抗体-细胞因子融合蛋白在体内比游离抗体具有显著更低的循环半衰期。当检测各种抗体-细胞因子融合蛋白时，Gillies等报导所有受检测的融合蛋白具有的α相(分布相)半衰期均低于1.5小时。实际上，截至到2小时时，大多数以抗体为基础的融合蛋白均被清除至10％的游离抗体血清浓度。参见Gillies等《生物接合物化学》(BIOCOJ.CHEM.)4：230-235(1993)。因此，本领域中存在对提高以抗体为基础的融合蛋白在体内的循环半衰期的方法的需求。
发明概括
目前已经发现了一种提高以抗体为基础的融合蛋白在体内的循环半衰期的新型方法。特别地，本发明提供了用于生产对Fc受体具有降低的结合亲和性的免疫球蛋白与第二种非免疫球蛋白蛋白质之间的融合蛋白的方法。对Fc受体具有降低的结合亲和性的以抗体为基础的融合蛋白比未连接的第二种非免疫球蛋白蛋白质在体内具有显著更长的循环半衰期。
IgG分子与三类对IgG类抗体具有特异性的Fc受体(FcR)即FcγRI、FcγRII和FcγRIII发生相互作用。在优选的实施方案中，融合蛋白的免疫球蛋白(Ig)成分具有至少部分IgG的恒定区，该区对FcγRI、FcγRII和FcγRIII中的至少一种具有降低的结合亲和性。
在本发明的一个方面中，通过使用重链同种型作为对细胞上Fc受体具有降低的结合亲和性的融合配偶体来降低融合蛋白对Fc受体的结合亲和性。例如，据报导人IgG1和IgG3与具有高亲和性的FcγRI结合，而IgG4与其在10倍以下结合良好，且IgG2完全不与其结合。据报导将IgG与Fc受体结合的重要的序列位于CH2域中。因此，在一个优选的实施方案中，通过将至少IgG2或IgG4中的CH2域与第二种非免疫球蛋白蛋白质连接而获得在体内具有提高的循环半衰期的以抗体为基础的融合蛋白。
在本发明的另一个方面中，通过在IgG1或IgG3重链的恒定区中引入一个或多个氨基酸的遗传修饰来降低融合蛋白对Fc受体的结合亲和性，所述的恒定区可降低这些同种型对Fc受体的结合亲和性。这类修饰包括改变接触Fc受体或通过诱导的构象变化改变影响其它重链残基与Fc受体之间的接触的其它因素所必须的残基。因此，在一个优选的实施方案中，通过下列步骤来获得在体内具有提高的循环半衰期的以抗体为基础的融合蛋白：首先在IgG1恒定区中的一个或多个氨基酸上引入突变、缺失或插入，所述的氨基酸选自Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Asn297和Pro331；且然后将所得的免疫球蛋白或其部分与第二种非免疫球蛋白蛋白质连接。在另一个优选的实施方案中，在IgG3恒定区的一个或多个氨基酸上引入突变、缺失或插入，所述的氨基酸选自Leu281、Leu282、Gly283、Gly284、Asn344和Pro378；并将所得的免疫球蛋白或其部分与第二种非免疫球蛋白蛋白质连接。所得的以抗体为基础的融合蛋白在体内比未连接的第二种非免疫球蛋白蛋白质具有更长的循环半衰期。
在一个优选的实施方案中，融合蛋白的第二种非免疫球蛋白成分是细胞因子。本文所用的术语“细胞因子”用来描述由细胞产生并分泌的蛋白质、其类似物及其片段，且它们引起具有对该细胞因子受体的细胞内的特异性反应。优选的情况是，细胞因子包括：白细胞介素诸如白细胞介素-2(IL-2)；造血因子诸如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；肿瘤坏死因子(TNF)诸如TNFα和淋巴因子诸如淋巴毒素。优选的情况是，本发明的以抗体为主的融合蛋白显示出细胞因子的生物活性。
在另一个优选的实施方案中，融合蛋白的第二种非免疫球蛋白成分是具有生物活性的配体结合蛋白。例如，这类配体结合蛋白可以：(1)在细胞表面阻断受体-配体相互作用；或(2)在血液的液相中抵消分子(例如细胞因子)的生物活性，由此防止它达到其细胞靶向物。优选的情况是，配体结合蛋白包括CD4、CTLA-4、TNF受体或白细胞介素受体诸如IL-1和IL-4受体。优选的情况是，本发明的以抗体为基础的融合蛋白显示出配体结合蛋白的生物活性。
在另一个可选择的优选实施方案中，第二种所述融合蛋白的非免疫球蛋白成分是一种蛋白毒素。优选的情况是，本发明的抗体-毒素融合蛋白显示出蛋白毒素的毒性活性。
在一个优选的实施方案中，以抗体为基础的融合蛋白包括对靶抗原具有特异性的可变区和通过与第二种非免疫球蛋白蛋白质结合的肽连接的恒定区。所述的恒定区可以是通常与可变区相关的恒定区或一种不同的区例如来自不同种类的可变区和恒定区。重链可以包括CH1、CH2和/或CH3域。术语“融合蛋白”的含义还包括具有结合域的构建体，所述的结合域包括来自诸如由Winter等在GB2,188,638中所公开的不同种类的构架区和可变区(即互补性决定区)。包括可变区的以抗体为基础的融合蛋白更好地显示出抗原结合特异性。在另一个优选的实施方案中，以抗体为主的融合蛋白进一步包括一种轻链。本发明由此提供了将抗原结合特异性和抗体的活性与第二种非免疫球蛋白蛋白质诸如一种细胞因子的有效生物活性结合起来的融合蛋白。可以将本发明的融合蛋白用于在体内选择性地将第二种非免疫球蛋白蛋白质转运至靶细胞以便第二种非免疫球蛋白蛋白质可以发挥定位的生物作用。
在一个可选择的优选实施方案中，以抗体为基础的融合蛋白包括通过与第二种非免疫球蛋白蛋白质结合的肽连接的重链恒定区而不包括重链可变区。本发明由此进一步提供了保留第二种非免疫球蛋白蛋白质有效生物活性而缺乏抗原结合特异性和抗体活性的融合蛋白。
在优选的实施方案中，本发明的以抗体为基础的融合蛋白包括结合Fc保护受体(FcRp)所必须的序列，所述的受体诸如含β-2微球蛋白的新生期肠转运受体(FcRn)。
在优选的实施方案中，所述包括两种含有至少部分重链的嵌合链和第二种非-Ig蛋白的融合蛋白通过二硫键连接。
本发明的特征还在于可编码上述融合蛋白的DNA构建体和用这些构建体转染的细胞系例如骨髓瘤。
本文所公开的本发明的这些和其它目的以及优点和特征从下面的描述、附图和权利要求中可以更明显地观察到。
附图的简要说明
如果结合附图阅读，那么从下列优选实施方案的描述中可以更完整地理解本发明的上述和其它目的，特征和优点以及本发明本身，其中：
附图1是Cγ1和Cγ3恒定区的氨基酸序列的同源序列对比图，进行的序列对比使氨基酸的相同性达到最大限度，且其中非保守氨基酸以方框表示；
附图2是Cγ1、Cγ2和Cγ4恒定区的氨基酸序列的同源性序列对比图进行序列对比使氨基酸的相同性达到最大限度，且其中非保守氨基酸以方框表示；
附图3是显示出相关限制位点的编码以抗体为基础的融合蛋白的遗传构建体的图谱的示意图；
附图4是描绘抗体hu-KS-1/4和以抗体为基础的融合蛋白hu-KSγ1-IL-2和hu-KSγ4-IL-2在有(实心条)或没有(带点的条)过量小鼠IgG存在的情况下在小鼠J774细胞上与Fc受体结合的棒形示意图；
附图5是描绘体内hu-KSγ1-IL-2(实心菱形)和hu-KSγ4-IL-2(实心三角形)与hu-KSγ1-IL-2(空心菱形)和hu-KSγ4-IL-2(空心三角形)完整融合蛋白的总抗体(游离抗体和融合蛋白)的血浆浓度作为时间函数的线性示意图；
附图6是用于构建具有降低与Fc受体结合亲和性的突变的以抗体为基础的融合蛋白的技术方案的图解表示；
附图7是描绘体内hu-KSγ1-IL-2(◇)、突变的hu-KSγ1-IL-2
和hu-KSγ4-IL-2(Δ)的完整融合蛋白的血浆浓度作为时间函数的线性示意图。
发明详述
目前已经发现将第二种蛋白质诸如细胞因子与免疫球蛋白融合可以改变抗体结构，从而导致对一种或多种细胞结合的Fc受体的结合亲和性增加并导致以抗体为基础的融合蛋白从循环中快速清除。本发明描述了在体内具有提高的循环半衰期的以抗体为基础的融合蛋白并包括通过重组DNA技术生产对一种或多种Fc受体具有降低的结合亲和性的以抗体为基础的融合蛋白的方法。
首先，通过下列步骤可以获得在体内具有提高的循环半衰期的以抗体为基础的融合蛋白：使用具有对Fc受体具有降低的结合亲和性的同种型构建融合蛋白并避免使用来自结合Fc受体的抗体同种型的序列。例如，在4种公知的IgG同种型中，公知IgG1(Cγ1)和IgG3(Cγ3)可结合具有高亲和性的FcRγI，而IgG4(Cγ4)的结合亲和性则低10倍，且IgG2(Cγ2)不结合FcRγI。因此，通过构建具有Cγ2恒定区(Fc区)或Cγ4 Fc区的融合蛋白并避免使用具有Cγ1 Fc区或Cγ3 Fc区的构建体可以获得对Fc受体具有降低的结合亲和性的以抗体为基础的融合蛋白。
第二，通过修饰在对Fc受体具有结合亲和性的同种型中结合Fc受体所必须的序列可以获得在体内具有提高的循环半衰期的以抗体为基础的融合蛋白，从而降低或消除了结合作用。如上所述，IgG分子与三类Fc受体(FcR)即FcγRI、FcγRII和FcγRIII发生相互作用。Cγ1和Cγ3结合具有高亲和性的FcγRI，而Cγ4和Cγ2对FcγRI具有降低的或没有结合亲和性。对Cγ1和Cγ3的比较表明：除Cγ3中延伸的铰合区段外，这两种同种型之间的氨基酸序列同源性是很高的。甚至在那些已经证实与补体Clq片段和各种FcγR类发生相互作用的区中这也是正确的。附图1提供了Cγ1和Cγ3氨基酸序列的序列对比图。人IgG的其它两种同种型(Cγ2和Cγ4)具有与FcγR结合相关的序列差异。附图2提供了Cγ1、Cγ2和Cγ4的氨基酸序列的序列对比图。用于FcγR结合的重要序列是位于与铰合部邻接的CH2域中的Leu-Leu-Gly-Gly(Cγ1中残基234至237)。Canfield和Morrison《实验药物杂志》(J.EXP.MED.)173：1483-1491(1991)。这些序列的基序在Cγ1和Cγ3中是保守的，与其相似的生物特性相一致；并且当将它们用于构建IL-2融合蛋白时可能与药物动力学特性的相似性相关。已经进行了许多突变分析来证明特异性突变对FcR结合、包括残基234-237以及被IgG4中Ser取代的铰合近端弯曲残基Pro331中的那些的作用。另一种用于有效FcR结合所必须的重要结构成分是存在的以共价键方式与Asn297结合的N-连接的碳水化合物链。酶促去除Asn残基的这种结构或突变可有效地消除或至少显著地减少与FcγR所有类型的结合。
Brumbell等假定存在通过结合抗体的Fc部分使循环抗体的分解代谢速率减缓且在其胞饮入细胞后可将其重新定向返回循环中的保护受体(FcRp)。Brumbell等《自然》(NATURE)203：1352-135(1964)。近来已经将含β-2微球蛋白的新生期肠转运受体(FcRn)鉴定为FcRp。参见Junghans等《美国国家科学院学报》(PROC.NATL.ACAD.SCI.USA)93：5512-5516(1996)。结合这种受体所必须的序列在所有四类人IgG中是保守的且它们位于CH2与CH3域之间的界面上。参见Medesan等《免疫学杂志》(J.IMMUBOL.)158：2211-2217(1997)。已经报导这些序列对于抗体在体内的循环半衰期来说是重要的。参见国际PCT申请WO 97/34631。因此，本发明优选的以抗体为基础的融合蛋白具有结合FcRp所必须的序列。
描述了本发明合成用实施方案的方法以及用于检测其药物动力学活性的检测方法，包括使用体外和临床前期的体内动物模型。编码嵌合链的优选的基因构建体包括5’-3’方向的编码至少部分免疫球蛋白的DNA片段和编码第二种非免疫球蛋白蛋白质的DNA。另一种优选的基因构建体包括5’-3’方向的编码第二种非免疫球蛋白蛋白质的DNA片段和编码至少部分免疫球蛋白的DNA。将融合基因装配并插入用于转染合适受体细胞的表达载体中，在其中它被表达。
本发明进一步通过下列非限制性实施例来解释：
实施例1通过从Cγ1至Cγ4 IgG恒定区进行类别转换来增加抗体-
IL2融合蛋白在体内的循环半衰期
根据本发明，通过使用来自已经减少与Fc受体结合亲和性或与之没有结合亲和性的抗体同种型的序列构建以抗体为基础的融合蛋白可以获得具有提高的体内循环半衰期的以抗体为基础的融合蛋白。
为了评估通过使用来自已经减少与Fc受体结合亲和性或与之没有结合亲和性的抗体同种型的序列是否可以提高以抗体为基础的融合蛋白的体内循环半衰期，将具有人Cγ1恒定区(Fc区)的抗体-IL2融合蛋白与具有人Cγ4 Fc区的抗体-IL2融合蛋白进行比较。
1.1具有Cγ4 IgG恒定区的抗体-IL2融合蛋白的构建
现有技术中已经描述了具有Cγ1恒定区的抗体-IL2融合蛋白的构建。参见例如，Gillies等《美国国家科学院学报》(PROC.NATL.ACAD.SCI.USA)89：1428-1432(1992)和美国专利5,650,150，将该文献引入本文作为参考。
为了构建具有Cγ4恒定区的抗体-IL2融合蛋白，通过除去Cγ1基因片段并用来自人Cγ4基因的相应的序列取代它来修饰一种质粒载体，该质粒载体能够表达具有对人全癌抗原(KSA)特异性的可变(V)区和与人IL-2融合的人Cγ1重链的人源化抗体-IL2融合蛋白。在附图3中提供了某些相关限制位点和Cγ4基因片段的插入位点的图谱。这些质粒构建体含有用于转录mRNA的巨细胞病毒(CMV)早期启动子，所述的mRNA可编码来源于小鼠抗体KS-1/4的轻(L)和重(H)链可变(V)区。通过标准方法使小鼠V区人源化并将其编码的DNA序列以化学方式来合成。将功能性剪接供体位点添加到各V区的末端以便可以将它用于含有H和L链恒定区基因的载体中。将人Cγ轻链基因插入到用于VL基因的克隆位点的下游且在它之后是其内源性3’非翻译区和聚腺苷酸化位点。在这种转录单位之后是用于重链-IL2融合蛋白的第二种独立转录单位。它还通过CMV启动子来启动。将VH编码序列插入到编码特定的与人IL-2编码序列融合的Cγ重链基因的DNA的上游。这类Cγ基因含有用于第一种重链外显子(CH1)的剪接受体位点，恰好是来自为所有人Cγ基因所共有的唯一的Hind III的下游。将来自SV40病毒的3’非翻译和聚腺苷酸化位点插入到IL-2编码序列的末端。载体的剩余物含有大肠杆菌中繁殖所必须的细菌质粒DNA和用于选择哺乳动物细胞转染子的选择性标记基因(二氢叶酸还原酶-dhfr)。
通过用Hind III和Xho I消化含原始Cγ1的质粒DNA并通过琼脂糖凝胶电泳纯化大的7.8kb片段来完成Cγ1和Cγ4片段的互换。用HindIII和Nsi I来消化含Cγ4基因的第二种质粒DNA并纯化1.75kb的片段。用Xho I和Nsi I来消化含有人IL-2 cDNA和SV40多聚A位点的与人Cγ1基因的羧基末端融合的第三种质粒并纯化小的470bp的片段。将所有三种片段以大约等摩尔量彼此连接并将连接产物用于转化感受态的大肠杆菌。将这种连接产物用于转化感受态大肠杆菌并通过在含有氨苄青霉素的平板上生长来选择克隆。通过对来自分离的转化子的质粒DNA制备物进行限制分析来鉴定正确装配的重组质粒并将使用Fsp I的消化物用于区分Cγ1(无Fsp I)与Cγ4(一个位点)的基因插入片段。将含有Cγ4-IL2重链取代的最终的载体引入小鼠骨髓瘤细胞并通过在含有氨甲喋呤(0.1μM)的培养基中生长来选择转化体。将表达高水平抗体-IL2融合蛋白的细胞克隆扩增并使用蛋白质ASepharose色谱法从培养物上清液纯化融合蛋白。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳来测定Cγ4融合蛋白的纯度和完整性。在T-细胞增殖检测试验中测定I1-2活性并发现它与Cγ1构建体的活性相同。
1.2通过抗体和具有Cγ1和Cγ4 IgG恒定区的抗体-IL2融合蛋白结合Fc受体
各种小鼠和人细胞系可表达一个或多个Fc受体。例如，小鼠J774巨噬细胞样细胞系表达能够结合合适亚类的小鼠或人IgG的FcRγI。同样，人K562红白血病细胞系表达FcRγII而不表达FcRγI。为了评估Fc受体结合对从循环中清除的以抗体为基础的融合蛋白的潜在贡献，在小鼠J774细胞系中比较抗体、Cγ1-IL2融合蛋白和Cγ4-IL2融合蛋白对FcRγI的结合亲和性。
将实施例1中所述的两种抗体-IL2融合蛋白hu-KSγ1-IL2和hu-KSγ4-IL2在含有0.1％牛血清清蛋白(BSA)与终体积为0.2ml的2×105J774细胞的PBS中稀释成2μg/ml。在冰上培养20分钟后添加FITC接合的抗人IgG Fc抗体(Fab2)并将培养再持续进行30分钟。通过用PBS-BSA洗涤两次来除去未结合的抗体并用荧光激活细胞分选仪(FACS)来分析细胞。对照反应物中含有恰好混有FITC标记的第二抗体或混有人源化KSγ1抗体(不含IL-2)的相同细胞。
正如所预计的，Cγ4-IL2融合蛋白与J774细胞的结合明显低于Cγ1-IL2融合蛋白与J774细胞的结合。参见附图4。然而，令人意外的是Cγ1-IL2和Cγ4-IL2融合蛋白与J774细胞的结合明显高于KSγ1抗体(不含IL-2)。这提示将第二种蛋白质诸如一种细胞因子与免疫球蛋白融合可以改变抗体的结构，从而导致对一种或多种细胞结合的Fc受体的结合亲和性增加，由此导致从循环中的快速清除。
为了确定使用IL-2融合蛋白所观察到的较强的结合作用是否是由于细胞上存在的IL-2受体或FcRγI受体所造成的，将过量的小鼠IgG(mIgG)用于竞争Fc受体上的结合。正如附图4中所说明的，在有50倍摩尔的过量mIgG存在的情况下使用抗体和两种抗体-IL2融合蛋白可以观察到背景水平的结合。这提示抗体-IL2融合蛋白的增加的信号结合是由于与Fc受体结合增加所造成的。
将表达Fc受体的细胞系用于检测候选融合蛋白与Fc受体的结合亲和性以便鉴定具有提高的体内半衰期的以抗体为基础的融合蛋白。通过上述方法可以检测候选的以抗体为基础的融合蛋白。将对Fc受体具有极大地降低的结合亲和性的以抗体为基础的融合蛋白的候选物鉴定为具有提高的体内半衰期的以抗体为基础的融合蛋白。
1.3测定具有Cγ1和Cγ4 IgG恒定区的抗体-IL2融合蛋白的循环半衰期
为了评估使用对Fc受体具有降低的亲和性的IgG同种型的Fc区是否会提高体内的循环半衰期，将含有Cγ1同种型重链的融合蛋白(即hu-KSγ1-IL2)与含有Cγ4同种型重链的融合蛋白(即hu-KSγ-IL2)进行比较。
通过渗滤入磷酸缓冲盐水(PBS)来对含有Cγ1或Cγ4同种型重链的纯化的人源化KS-1/4-IL2融合蛋白进行缓冲液更换并进一步稀释到～100μg/ml的浓度。使用缓慢推注的方法将约20μg的以抗体为基础的融合蛋白(0.2ml)注入6-8周龄的Balb/c小鼠的尾静脉。每组注射4只小鼠。在不同的时间点处，通过从麻醉动物的眼眶后放血来取少量的血样并将其收集到盛有柠檬酸盐缓冲液的管中以防止血液凝块。通过用Eppendorf高速台式离心机离心5分钟来除去细胞。用微量移液管取出血浆并在-70℃下冷冻。通过ELISA测定小鼠血液中的人抗体决定簇的浓度。将对人H和L抗体链具有特异性的捕捉抗体用于捕捉来自稀释的血浆样品的融合蛋白。在抗体包被的96孔平板中培养2小时后，通过用ELISA缓冲液(0.01％Tween 80的PBS溶液)洗涤三次来除去未结合的物质。第二种培养步骤使用抗人Fc抗体(用于检测抗体和完整的融合蛋白)或抗人IL-2抗体(仅用于检测完整的融合蛋白)。将两种抗体与辣根过氧化物酶(HRP)连接。在培养1小时后，通过用ELISA缓冲液洗涤来除去未结合的检测抗体并通过用底物培养和用分光光度计测定来确定结合的HPR的量。
正如附图5中所描绘的，hu-KSγ4-IL2融合蛋白的α相半衰期显著低于hu-KSγ1-IL2融合蛋白的α相半衰期。增加的半衰期以24小时后在小鼠中发现的hu-KSγ4-IL2融合蛋白的浓度(3.3μg/ml)显著高于hu-KSγ1-IL2融合蛋白的浓度(60ng/ml)为最佳典型。
正如早期对嵌合14、18-IL2融合蛋白所报导的，hu-KSγ1-IL2蛋白具有快速分布(α)相、其后是较缓慢分解代谢(β)相。参见Gillies等《生物接合物化学》(BIOCONJ.CHEM.)4：230-235(1993)。在Gillies等的研究中，仅测定了抗体决定簇，于是还不清楚清除率是否代表了清除的完整融合蛋白或清除的融合蛋白的抗体成分。在本实施例中，使用(1)抗体特异性ELISA和(2)融合蛋白特异性ELISA(即需要以物理方式连接的抗体和IL-2成分的ELISA)来检测样品。。正如附图5中所说明的，在使用hu-KSγ1-IL2融合蛋白注射的动物中，循环的融合蛋白的量低于循环抗体的总量，特别是在24小时的时间点处更是如此。这提示融合蛋白在体内以蛋白水解方式裂解且释放的抗体持续循环。令人意外的是，在使用hu-KSγ4-IL2融合蛋白注射的动物中，在循环的融合蛋白的量与循环的抗体的总量之间不存在显著性差异。这提示在所测定的24小时的期限中在这些动物体内hu-KSγ4-IL2融合蛋白不以蛋白水解的方式裂解。
如上所述，Cγ1和Cγ3对Fc受体具有结合亲和性，而此时Cγ4具有降低的结合亲和性且Cγ2对Fc受体没有结合亲和性。本实施例描述了使用Cγ4 Fc区生产以抗体完整的融合蛋白(一种对Fc受体具有降低的亲和性的IgG同种型)的方法并确定了这类具有提高的体内循环半衰期的以抗体为基础的融合蛋白。因此，本领域技术人员可以使用这些方法来生产具有以Cγ2 Fc区替代Cγ4 Fc区的以抗体为基础的融合蛋白以便提高融合蛋白的循环半衰期。使用相同的限制片段取代和用于Cγ4-IL2融合蛋白的上述方法可以构建应用人Cγ2区的hu-KS-IL2融合蛋白并使用本文所述的方法进行检测以便证明增加的循环半衰期。具有Cγ2 Fc区的以抗体为基础的融合蛋白或任何其它的对Fc受体具有结合亲和性或缺乏结合亲和性的Fc区在体内比对Fc受体具有结合亲和性的以抗体为基础的融合蛋白具有提高的循环半衰期。
实施例2在以抗体为基础的融合蛋白构建体中使人Cγ1或Cγ3
基因发生突变以增加其在体内的循环半衰期
IgG分子与循环中的几种分子包括蛋白质的补体系统的成员(例如Clq片段)以及三类FcR发生相互作用。用于Clq结合的重要残基是位于人重链CH2域中的残基Glu318、Lys320和Lys322。Tao等《实验药物杂志》(J.EXP.MED.)178：661-667(1993)。为了区分FcR与Clq结合之间的差异作为快速清除机理，我们将更为彻底改变的Cγ2铰合近端片段取代成Cγ1重链。预计这种突变会影响FcR结合而不影响补体结合。
通过克隆并采用种系Cγ1基因CH2外显子的铰合部与起始部之间的小区、使用重叠聚合酶链反应(PCR)来完成突变。将PCR引物设计成在跨越Psi I至Drd I片段的两个相邻PCR片段的接点处取代新的序列(参见附图6)。在第一步中，使用Cγ1基因作为模板制备使用引物1和2(分别为SEQ ID NOS：5和6)或引物3和4(分别为SEQ IDNOS：7和8)的两个独立PCR反应物。用于一级PCR的循环条件是下列条件的35个循环：94℃、45秒；在48℃下退火45秒；和在72℃下引物延伸45秒。将各PCR反应的产物用作二级连接反应步骤的模板。将各一级反应的十分之一彼此混合并与引物1和4合并以便仅扩增两个初始PCR产物的合并产物。用于次级PCR的条件是：94℃、1分钟；在51℃下退火1分钟；和在72℃下引物延伸1分钟。在变性和退火之后，连接反应作为在与另一个片段末端配对的两个独立片段之间产生重叠的结果发生。正如附图6中所示，形成由Taq聚合酶扩增的杂交体的片段并通过外引物的引导来选择性地扩增完全突变的产物。在质粒载体中克隆最终的PCR产物且其序列通过DNA序列分析来鉴定。
在多个步骤中进行突变基因的装配。在第一步中，用Psi I和XhoI消化含有人Cγ1基因的克隆载体以便除去未突变的铰合-CH2-CH3编码序列。如上所述，由Cγ1-IL2载体制备编码部分CH2、所有CH3和融合的人IL-2编码序列的Drd I至Xho I片段。由通过用Psi I和DrdI消化亚克隆的PCR产物来制备第三个片段。通过琼脂糖凝胶电泳来纯化全部三个片段并在一种单一反应混合物中将它们彼此连接。将连接产物用于转化感受态大肠杆菌并通过在含有氨苄青霉素的平板上生长来选择克隆。通过对来自分离的转化体的质粒DNA制备物进行限制分析来鉴定正确装配的重组质粒并通过DNA序列分析来证实突变的基因。将来自突变Cγ1-IL2的Hind III至Xho I片段用于重新装配完整的hu-KS抗体-IL2融合蛋白表达载体。
为了评估由用于FcR结合的重要氨基酸突变而诱导的体内循环半衰期的提高情况并在FcR与Clq结合之间进行区分作为快速清除的机理，将体内突变的hu-KSγ1-IL2的血浆浓度与不同特定时间时的hu-KSγ1-IL2的血浆浓度进行比较。正如附图7中所说明的，突变的hu-KSγ1-IL2和hu-KSγ4-IL2的体内清除率显著低于hu-KSγ1-IL2的清除率。这些结果提示通过修饰结合对Fc受体具有结合亲和性的同种型内的Fc受体所必须的序列可以获得具有提高的体内循环半衰期的以抗体为基础的融合蛋白。此外，这些结果提示快速清除的机理包括FcR结合而非Clq结合。
从本发明的教导中，本领域技术人员可以理解可以引入对Cγ1或Cγ3基因的几种其它突变以便减少与FcR的结合并提高以抗体为基础的融合蛋白的体内循环半衰期。此外，还可以将突变引入Cγ4基因以便进一步减少Cγ4融合蛋白与FcR的结合。例如，另外可能的突变包括铰合近端氨基酸残基中的突变：使Pro331发生突变或通过在所有IgGFc区中使N-连接的糖基化位点发生突变。后者定位于作为部分规范序列的Asn287：Asn-X-Thr/Ser，其中第二位上可以是任意的氨基酸(可能除Pro外)且第三位上是Thr或Ser。例如，对氨基酸Gln的保守突变几乎对蛋白质没有影响，但可以防止连接任意碳水化合物侧链。使该残基发生突变的策略可以采用如上所述的用于铰合近端区的一般的程序。本领域中充分建立了用于在克隆DNA序列中生成点突变的方法且商品试剂盒可以从一些卖主那里得到用于该目的。
实施例3增加受体-抗体为基础的融合蛋白的循环半衰期
几种参考文献已经报导人IgG的Fc部分可以用作许多具有生物活性的配体结合蛋白或受体的有用的载体。已经将这些配体结合蛋白中的某些诸如CD4、CTLA-4和TNF受体与Ig的Fc部分的N-末端融合。参见例如，Capon等《自然》(NATURE)337：525-531(1989)；Linsley等《实验药物杂志》(J.EXP.MED.)174：561-569(1991)；Wooley等《免疫学杂志》(J.IMMUNOL.)151：6602-6607(1993)。增加受体-抗体为主的融合蛋白的循环半衰期可以使得配体结合蛋白配偶体(即第二种非Ig蛋白)更有效地：(1)阻断细胞表面的受体-配体相互作用；或(2)抵消血液流体相中的分子(例如细胞因子)的生物活性，由此防止它到达其细胞靶向物。为了评估降低受体-抗体为基础的融合蛋白结合IgG受体的能力是否会提高其体内的循环半衰期，将具有人Cγ1 Fc区的受体-抗体为基础的融合蛋白与具有人Cγ4 Fc区的以抗体为基础的融合蛋白进行比较。
为了构建CD4-抗体为基础的融合蛋白，使用来自人外周血单核细胞(PBMC)的PCR来克隆人CD4细胞表面受体的胞外域。所述克隆的CD4受体包括实施例1中所述的相容性限制位点和剪接供体位点。表达载体含有CMV早期启动子的唯一Xba I克隆位点下游及其内源性HindIII位点的人Cγ1或Cγ4基因下游。质粒的剩余物含有用于在大肠杆菌中繁殖的细菌遗传信息以及dhfr选择性标记基因。将连接的DNAs用于转化感受态细菌并根据来自各个细菌克隆的限制分析来鉴定重组质粒。获得了两种质粒DNA构建体：CD4-Cγ1和CD4-Cγ4。
通过电穿孔将表达质粒用于转染鼠骨髓瘤细胞并通过在含有氨甲喋呤(0.1μM)的培养基中生长来选择转化体。通过ELISA分析来鉴定表达融合蛋白的转染子并在培养基中扩增以便生成用于通过结合并从蛋白质A Sepharose洗脱来纯化的融合蛋白。将用色谱洗脱缓冲液纯化的蛋白质渗滤入PBS并稀释成100μg/ml的终浓度。用0.2ml(20μg)的CD4-Cγ1或CD4-Cγ4融合蛋白给Balb/c小鼠注射并如实施例1.3中所述进行药物动力学试验。CD4-Cγ4融合蛋白具有显著高于CD4-Cγ1融合蛋白的半衰期。
等价方式
本发明可以包括在其它特定形式中而不会脱离其实质或主要特征。上述实施方案由此在所有方面均被看作是解释性的而非对本文所述的本发明起限定作用。因此，本发明的范围由所附的权利要求而非由上述描述来表明，且包括在权利要求范围内的等价方式的含义和范围的所有改变均包括在其中。
<110>GILLIES，Stephen D
LO，Kin-Ming
LAN，Yan
WESOLOWSKI，John
<120>提高以抗体为基础的融合蛋白的
循环半衰期的方法
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Claims (8)
1.一种对一种或多种Fc受体具有降低的结合亲和性的融合蛋白，包括免疫球蛋白(Ig)重链或其一部分，以及与所述免疫球蛋白重链相连接的第二种非免疫球蛋白蛋白，其中所述的免疫球蛋白重链包括：
(i)一种IgG2或IgG4恒定区但不是IgG1或IgG3恒定区，其中，对Fc受体降低的结合亲和性是与包括IgG1或IgG2恒定区的相应融合蛋白相比；
(ii)修饰的IgG1，其中的修饰对于与未修饰的融合蛋白相比，所述融合蛋白的降低的对于Fc受体的结合亲和性负责，该修饰是在一个或多个氨基酸位点上发生突变或缺失，所述的氨基酸选自Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Asn297和Pro331组成的组，或
(iii)修饰的IgG3，其中的修饰对于与未修饰的融合蛋白相比，所述融合蛋白的降低的对于Fc受体的结合亲和性负责，该修饰是在一个或多个氨基酸位点上发生突变或缺失，所述的氨基酸选自Leu281、Leu282、Gly283、Gly284、Asn344和Pro378组成的组。
2.权利要求1的融合蛋白，其中所述IgG2或IgG4恒定区至少包含CH2域。
3.权利要求1或2的融合蛋白，其中免疫球蛋白(Ig)重链或其一部分进一步对免疫球蛋白保护受体具有结合亲和性。
4.权利要求1或2的融合蛋白，其中所述的第二种非免疫球蛋白蛋白选自细胞因子、配体结合蛋白和蛋白毒素组成的组。
5.权利要求1或2的融合蛋白，进一步包含一个可变区因而展示抗原结合特异性。
6.一种增加抗体融合蛋白的体内循环半衰期的方法，该融合蛋白包含与非免疫球蛋白蛋白相连的IgG1或IgG3重链恒定区或其一部分，该方法包括下列步骤：
(i)用IgG2或IgG4恒定区代替IgG1或IgG3重链恒定区；
(ii)向IgG1重链恒定区一个或多个氨基酸位点上引入突变或缺失，所述的氨基酸选自Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Asn297和Pro331组成的组，或
(iii)向IgG1重链恒定区一个或多个氨基酸位点上引入突变或缺失，所述的氨基酸选自Leu281、Leu282、Gly283、Gly284、Asn344和Pro378组成的组。
7.权利要求6的方法，其中所述IgG2或IgG4恒定区至少包含CH2域。
8.权利要求6或7的方法，其中非免疫球蛋白蛋白选自细胞因子、配体结合蛋白和蛋白毒素组成的组。
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