JP2002505086A - 抗体ベースの融合タンパク質の循環半減期の増強 - Google Patents
抗体ベースの融合タンパク質の循環半減期の増強Info
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Abstract
(57)【要約】
増強された循環半減期を有する、抗体ベースの融合タンパク質の遺伝子構築物および発現のための方法が開示される。本発明の融合タンパク質は、融合タンパク質構築のために用いられる抗体アイソタイプ、または通常はＦｃレセプターに結合する抗体アイソタイプの指向された変異誘発のいずれかの結果として、免疫グロブリンＦｃレセプターに結合する能力を欠く。本発明の誘導タンパク質はまた、免疫グロブリン防御レセプターを結合し得る機能的ドメインを含み得る。
Description
【０００１】 （関連出願の引用） これは、１９９８年２月２５日に出願された米国仮特許出願第６０／０７５，
８８７号を参考として援用し、そしてその出願に対する優先権およびその利益を
受けることを主張する。
８８７号を参考として援用し、そしてその出願に対する優先権およびその利益を
受けることを主張する。
【０００２】 （発明の分野） 本発明は、一般に、融合タンパク質に関する。より詳細には、本発明は、抗体
ベースの融合タンパク質の循環半減期を増強する方法に関する。
ベースの融合タンパク質の循環半減期を増強する方法に関する。
【０００３】 （発明の背景） ヒトの疾患を処置するための抗体の使用は、十分に確立されており、そして遺
伝子操作の導入によってより精巧になっている。抗体の有用性を改善するために
いくつかの技術が開発された。これらとしては以下が挙げられる：（１）「ハイ
ブリドーマ」を生成するための細胞融合による、または抗体産生細胞からの抗体
重鎖（Ｈ）および軽鎖（Ｈ）の分子クローニングによる、モノクローナル抗体の
作製；（２）好ましい部位へインビボで送達するための、抗体への他の分子（例
えば、放射性同位体、毒性薬物、タンパク質性毒素、およびサイトカイン）の結
合体化；（３）生物学的活性を増強または低減するための抗体エフェクター機能
の操作；（４）抗体ベースの融合タンパク質を生成するための、他のタンパク質
（例えば、毒素およびサイトカイン）と抗体との、遺伝子レベルでの連結；なら
びに（５）領域を遺伝子レベルで合わせて二重特異性抗体を生成する、１以上の
セットの抗体の連結。
伝子操作の導入によってより精巧になっている。抗体の有用性を改善するために
いくつかの技術が開発された。これらとしては以下が挙げられる：（１）「ハイ
ブリドーマ」を生成するための細胞融合による、または抗体産生細胞からの抗体
重鎖（Ｈ）および軽鎖（Ｈ）の分子クローニングによる、モノクローナル抗体の
作製；（２）好ましい部位へインビボで送達するための、抗体への他の分子（例
えば、放射性同位体、毒性薬物、タンパク質性毒素、およびサイトカイン）の結
合体化；（３）生物学的活性を増強または低減するための抗体エフェクター機能
の操作；（４）抗体ベースの融合タンパク質を生成するための、他のタンパク質
（例えば、毒素およびサイトカイン）と抗体との、遺伝子レベルでの連結；なら
びに（５）領域を遺伝子レベルで合わせて二重特異性抗体を生成する、１以上の
セットの抗体の連結。
【０００４】 化学的操作または遺伝子操作のいずれかによってタンパク質を一緒に連結する
場合、最終産物でどの特性が親分子から保持されるかを予測することはしばしば
困難である。化学的結合体化を用いて、連結プロセスは、分子の異なる部位で生
じ得、そして一般に、一方または両方のタンパク質の機能に影響を与え得る種々
の程度の改変を有する分子をもたらす。一方、遺伝子融合物の使用は、連結プロ
セスをより一貫したものとし、そして両方の構成要素タンパク質の機能を保持す
る一貫した最終産物の生成をもたらす。例えば、Ｇｉｌｌｉｅｓら，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１４２８−１４３２（１９９２）
；および米国特許第５，６５０，１５０号を参照のこと。
場合、最終産物でどの特性が親分子から保持されるかを予測することはしばしば
困難である。化学的結合体化を用いて、連結プロセスは、分子の異なる部位で生
じ得、そして一般に、一方または両方のタンパク質の機能に影響を与え得る種々
の程度の改変を有する分子をもたらす。一方、遺伝子融合物の使用は、連結プロ
セスをより一貫したものとし、そして両方の構成要素タンパク質の機能を保持す
る一貫した最終産物の生成をもたらす。例えば、Ｇｉｌｌｉｅｓら，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１４２８−１４３２（１９９２）
；および米国特許第５，６５０，１５０号を参照のこと。
【０００５】 しかし、組換えにより生成される抗体ベースの融合タンパク質の利用は、循環
からのそれらの迅速なインビボクリアランスによって制限され得る。例えば、抗
体−サイトカイン融合タンパク質は、遊離の抗体よりも有意に短いインビボでの
循環半減期を有することを示した。種々の抗体−サイトカイン融合タンパク質を
試験する場合、Ｇｉｌｌｉｅｓらは、試験した全ての融合タンパク質が、１．５
時間未満のα相（分配相）半減期を有することを報告した。実際、大部分の抗体
ベースの融合タンパク質が、２時間までに遊離抗体の血清濃度の１０％までクリ
アランスされた。Ｇｉｌｉｅｓら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．４：２３０−２
３５（１９９３）を参照のこと。それゆえ、当該分野では、抗体ベースの融合タ
ンパク質のインビボでの循環半減期を増強する方法についての必要性が存在する
。
からのそれらの迅速なインビボクリアランスによって制限され得る。例えば、抗
体−サイトカイン融合タンパク質は、遊離の抗体よりも有意に短いインビボでの
循環半減期を有することを示した。種々の抗体−サイトカイン融合タンパク質を
試験する場合、Ｇｉｌｌｉｅｓらは、試験した全ての融合タンパク質が、１．５
時間未満のα相（分配相）半減期を有することを報告した。実際、大部分の抗体
ベースの融合タンパク質が、２時間までに遊離抗体の血清濃度の１０％までクリ
アランスされた。Ｇｉｌｉｅｓら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．４：２３０−２
３５（１９９３）を参照のこと。それゆえ、当該分野では、抗体ベースの融合タ
ンパク質のインビボでの循環半減期を増強する方法についての必要性が存在する
。
【０００６】 （発明の要旨） 抗体ベースの融合タンパク質のインビボでの循環半減期を増強するための新規
アプローチがここで発見された。具体的には、本発明は、Ｆｃレセプターについ
ての減少した結合親和性を有する免疫グロブリンと、第２の非免疫グロブリンタ
ンパク質との間の融合タンパク質の生成のための方法を提供する。Ｆｃレセプタ
ーについての減少した結合親和性を有する抗体ベースの融合タンパク質は、連結
していない第２の非免疫グロブリンタンパク質よりも有意に長い、インビボでの
循環半減期を有する。
アプローチがここで発見された。具体的には、本発明は、Ｆｃレセプターについ
ての減少した結合親和性を有する免疫グロブリンと、第２の非免疫グロブリンタ
ンパク質との間の融合タンパク質の生成のための方法を提供する。Ｆｃレセプタ
ーについての減少した結合親和性を有する抗体ベースの融合タンパク質は、連結
していない第２の非免疫グロブリンタンパク質よりも有意に長い、インビボでの
循環半減期を有する。
【０００７】 ＩｇＧ分子は、ＩｇＧクラスの抗体に特異的な３つのクラスのＦｃレセプター
（ＦｃＲ）（すなわち、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩ）と
相互作用する。好ましい実施態様では、この融合タンパク質の免疫グロブリン（
Ｉｇ）構成要素は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、またはＦｃγＲＩＩＩの少なく
とも１つについての減少した結合親和性を有するＩｇＧの定常領域の少なくとも
一部分を有する。
（ＦｃＲ）（すなわち、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩ）と
相互作用する。好ましい実施態様では、この融合タンパク質の免疫グロブリン（
Ｉｇ）構成要素は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、またはＦｃγＲＩＩＩの少なく
とも１つについての減少した結合親和性を有するＩｇＧの定常領域の少なくとも
一部分を有する。
【０００８】 本発明の１つの局面では、Ｆｃレセプターについての融合タンパク質の結合親
和性は、重鎖アイソタイプを、細胞上のＦｃレセプターについての減少した結合
親和性を有する融合パートナーとして用いることにより低減される。例えば、ヒ
トＩｇＧ１およびＩｇＧ３の両方は、高親和性でＦｃγＲＩに結合するが、一方
、ＩｇＧ４は１０倍少なく結合し、そしてＩｇＧ２は全く結合しないことが報告
されている。Ｆｃレセプターに対するＩｇＧの結合のために重要な配列は、ＣＨ
２ドメインに存在することが報告されている。従って、好ましい実施態様では、
増強されたインビボでの循環半減期を有する、抗体ベースの融合タンパク質は、
ＩｇＧ２またはＩｇＧ４の少なくともＣＨ２ドメインを、第２の非免疫グロブリ
ンタンパク質に連結することにより得られる。
和性は、重鎖アイソタイプを、細胞上のＦｃレセプターについての減少した結合
親和性を有する融合パートナーとして用いることにより低減される。例えば、ヒ
トＩｇＧ１およびＩｇＧ３の両方は、高親和性でＦｃγＲＩに結合するが、一方
、ＩｇＧ４は１０倍少なく結合し、そしてＩｇＧ２は全く結合しないことが報告
されている。Ｆｃレセプターに対するＩｇＧの結合のために重要な配列は、ＣＨ
２ドメインに存在することが報告されている。従って、好ましい実施態様では、
増強されたインビボでの循環半減期を有する、抗体ベースの融合タンパク質は、
ＩｇＧ２またはＩｇＧ４の少なくともＣＨ２ドメインを、第２の非免疫グロブリ
ンタンパク質に連結することにより得られる。
【０００９】 本発明の別の局面では、Ｆｃレセプターについての融合タンパク質の結合親和
性は、Ｆｃレセプターについてのこれらのアイソタイプの結合親和性を低減させ
るＩｇＧ１重鎖またはＩｇＧ３重鎖の定常領域における１以上のアミノ酸の遺伝
子修飾を導入することにより低減される。このような改変は、Ｆｃレセプターと
接触するために必要な残基の変更、または誘導されるコンホメーションの変化を
介して他の重鎖残基とＦｃレセプターとの間の接触に影響を与える他の残基の変
更を含む。従って、好ましい実施態様では、Ｌｅｕ234、Ｌｅｕ235、Ｇｌｙ236 、Ｇｌｙ237、Ａｓｎ297、およびＰｒｏ331からなる群より選択される１以上の アミノ酸にて、ＩｇＧ１定常領域において変異、欠失、または挿入を最初に導入
し、次いで得られる免疫グロブリンまたはその部分を、第２の非免疫グロブリン
タンパク質に連結することにより、増強されたインビボでの循環半減期を有する
抗体ベースの融合タンパク質が得られる。代替的な好ましい実施態様では、変異
、欠失、または挿入は、Ｌｅｕ281、Ｌｅｕ282、Ｇｌｙ283、Ｇｌｙ284、Ａｓｎ 344 、およびＰｒｏ378からなる群より選択される１以上のアミノ酸にてＩｇＧ３
定常領域に導入され、そして得られる免疫グロブリンまたはその部分が第２の非
免疫グロブリンタンパク質に連結される。得られる抗体ベースの融合タンパク質
は、連結されない第２の非免疫グロブリンタンパク質よりも長いインビボでの循
環半減期を有する。
性は、Ｆｃレセプターについてのこれらのアイソタイプの結合親和性を低減させ
るＩｇＧ１重鎖またはＩｇＧ３重鎖の定常領域における１以上のアミノ酸の遺伝
子修飾を導入することにより低減される。このような改変は、Ｆｃレセプターと
接触するために必要な残基の変更、または誘導されるコンホメーションの変化を
介して他の重鎖残基とＦｃレセプターとの間の接触に影響を与える他の残基の変
更を含む。従って、好ましい実施態様では、Ｌｅｕ234、Ｌｅｕ235、Ｇｌｙ236 、Ｇｌｙ237、Ａｓｎ297、およびＰｒｏ331からなる群より選択される１以上の アミノ酸にて、ＩｇＧ１定常領域において変異、欠失、または挿入を最初に導入
し、次いで得られる免疫グロブリンまたはその部分を、第２の非免疫グロブリン
タンパク質に連結することにより、増強されたインビボでの循環半減期を有する
抗体ベースの融合タンパク質が得られる。代替的な好ましい実施態様では、変異
、欠失、または挿入は、Ｌｅｕ281、Ｌｅｕ282、Ｇｌｙ283、Ｇｌｙ284、Ａｓｎ 344 、およびＰｒｏ378からなる群より選択される１以上のアミノ酸にてＩｇＧ３
定常領域に導入され、そして得られる免疫グロブリンまたはその部分が第２の非
免疫グロブリンタンパク質に連結される。得られる抗体ベースの融合タンパク質
は、連結されない第２の非免疫グロブリンタンパク質よりも長いインビボでの循
環半減期を有する。
【００１０】 好ましい実施態様では、融合タンパク質の第２の非免疫グロブリン構成要素は
、サイトカインである。用語「サイトカイン」は、本明細書中で、細胞によって
生成され、そして放出され、かつそのサイトカインに対するレセプターを有する
細胞における特異的応答を惹起する、タンパク質、そのアナログ、およびそれら
のフラグメントを記載するために用いられる。好ましくは、サイトカインは、イ
ンターロイキン（例えば、インターロイキン２（ＩＬ−２））、造血因子（例え
ば、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））、腫瘍壊死因
子（ＴＮＦ）（例えば、ＴＮＦα）、およびリンホカイン（例えば、リンホトキ
シン）を含む。好ましくは、本発明の抗体−サイトカイン融合タンパク質は、サ
イトカインの生物学的活性を提示する。
、サイトカインである。用語「サイトカイン」は、本明細書中で、細胞によって
生成され、そして放出され、かつそのサイトカインに対するレセプターを有する
細胞における特異的応答を惹起する、タンパク質、そのアナログ、およびそれら
のフラグメントを記載するために用いられる。好ましくは、サイトカインは、イ
ンターロイキン（例えば、インターロイキン２（ＩＬ−２））、造血因子（例え
ば、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））、腫瘍壊死因
子（ＴＮＦ）（例えば、ＴＮＦα）、およびリンホカイン（例えば、リンホトキ
シン）を含む。好ましくは、本発明の抗体−サイトカイン融合タンパク質は、サ
イトカインの生物学的活性を提示する。
【００１１】 代替的な好ましい実施態様では、融合タンパク質の第２の非免疫グロブリン構
成要素は、生物学的活性を有するリガンド結合タンパク質である。このようなリ
ガンド結合タンパク質は、例えば、以下を行い得る：（１）細胞表面でのレセプ
ター−リガンド相互作用のブロック；または（２）血液の液相における分子（例
えば、サイトカイン）の生物学的活性を中和し、それにより、その細胞標的に到
達するのを防止する。好ましくは、リガンド結合タンパク質としては、ＣＤ４、
ＣＴＬＡ−４、ＴＮＦレセプター、またはインターロイキンレセプター（例えば
、ＩＬ−１レセプターおよびＩＬ−４レセプター）が挙げられる。好ましくは、
本発明の抗体レセプター融合タンパク質は、リガンド結合タンパク質の生物学的
活性を提示する。
成要素は、生物学的活性を有するリガンド結合タンパク質である。このようなリ
ガンド結合タンパク質は、例えば、以下を行い得る：（１）細胞表面でのレセプ
ター−リガンド相互作用のブロック；または（２）血液の液相における分子（例
えば、サイトカイン）の生物学的活性を中和し、それにより、その細胞標的に到
達するのを防止する。好ましくは、リガンド結合タンパク質としては、ＣＤ４、
ＣＴＬＡ−４、ＴＮＦレセプター、またはインターロイキンレセプター（例えば
、ＩＬ−１レセプターおよびＩＬ−４レセプター）が挙げられる。好ましくは、
本発明の抗体レセプター融合タンパク質は、リガンド結合タンパク質の生物学的
活性を提示する。
【００１２】 なお別の代替的な好ましい実施態様では、融合タンパク質の第２の非免疫グロ
ブリン構成要素は、タンパク質毒素である。好ましくは、本発明の抗体−毒素融
合タンパク質は、タンパク質性毒素の毒性活性を示す。
ブリン構成要素は、タンパク質毒素である。好ましくは、本発明の抗体−毒素融
合タンパク質は、タンパク質性毒素の毒性活性を示す。
【００１３】 好ましい実施態様では、抗体ベースの融合タンパク質は、標的抗原に特異的な
可変領域、およびペプチド結合を介して第２の非免疫グロブリンタンパク質に結
合した定常領域を含む。定常領域は、通常、可変領域と結合している定常領域、
または異なる定常領域（例えば、異なる種由来の可変領域および定常領域）であ
り得る。重鎖は、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、および／またはＣＨ３ドメ
インを含み得る。用語「融合タンパク質」の中にはまた、例えば、Ｗｉｎｔｅｒ
ら，ＧＢ ２，１８８，６３８により開示される、異なる種由来のフレームワー
ク領域および可変領域（すなわち、相補性決定領域）を含む結合ドメインを有す
る構築物が包含される。可変領域を含む抗体ベースの融合タンパク質は、好まし
くは、抗原結合特異性を示す。なお別の好ましい実施態様では、抗体ベースの融
合タンパク質は、軽鎖をさらに含む。従って、本発明は、抗体の抗原結合特異性
および活性が第２の非免疫グロブリンタンパク質（例えば、サイトカイン）の強
力な生物学的活性と合わされる融合タンパク質を提供する。本発明の融合タンパ
ク質を用いて、第２の非免疫グロブリンタンパク質を標的細胞にインビボで選択
的に送達し得、その結果、この第２の非免疫グロブリンタンパク質は局所化され
た生物学的効果を発揮する。
可変領域、およびペプチド結合を介して第２の非免疫グロブリンタンパク質に結
合した定常領域を含む。定常領域は、通常、可変領域と結合している定常領域、
または異なる定常領域（例えば、異なる種由来の可変領域および定常領域）であ
り得る。重鎖は、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、および／またはＣＨ３ドメ
インを含み得る。用語「融合タンパク質」の中にはまた、例えば、Ｗｉｎｔｅｒ
ら，ＧＢ ２，１８８，６３８により開示される、異なる種由来のフレームワー
ク領域および可変領域（すなわち、相補性決定領域）を含む結合ドメインを有す
る構築物が包含される。可変領域を含む抗体ベースの融合タンパク質は、好まし
くは、抗原結合特異性を示す。なお別の好ましい実施態様では、抗体ベースの融
合タンパク質は、軽鎖をさらに含む。従って、本発明は、抗体の抗原結合特異性
および活性が第２の非免疫グロブリンタンパク質（例えば、サイトカイン）の強
力な生物学的活性と合わされる融合タンパク質を提供する。本発明の融合タンパ
ク質を用いて、第２の非免疫グロブリンタンパク質を標的細胞にインビボで選択
的に送達し得、その結果、この第２の非免疫グロブリンタンパク質は局所化され
た生物学的効果を発揮する。
【００１４】 代替的な好ましい実施態様では、抗体ベースの融合タンパク質は、ペプチド結
合を介して第２の非免疫グロブリンタンパク質に結合した重鎖定常領域を含むが
、重鎖可変領域を含まない。従って、本発明はさらに、第２の非免疫グロブリン
タンパク質の強力な生物学的活性を保持するが、抗体の抗原結合特異性および活
性を欠く、融合タンパク質を提供する。
合を介して第２の非免疫グロブリンタンパク質に結合した重鎖定常領域を含むが
、重鎖可変領域を含まない。従って、本発明はさらに、第２の非免疫グロブリン
タンパク質の強力な生物学的活性を保持するが、抗体の抗原結合特異性および活
性を欠く、融合タンパク質を提供する。
【００１５】 好ましい実施態様では、本発明の抗体ベースの融合タンパク質は、Ｆｃ防御レ
セプター（ＦｃＲｐ）への結合に必要な配列（例えば、β２ミクログロブリン含
有新生児腸輸送レセプター（ＦｃＲｎ））をさらに含む。
セプター（ＦｃＲｐ）への結合に必要な配列（例えば、β２ミクログロブリン含
有新生児腸輸送レセプター（ＦｃＲｎ））をさらに含む。
【００１６】 好ましい実施態様では、融合タンパク質は、重鎖の少なくとも一部分を含む２
つのキメラ鎖を含み、そして第２の非Ｉｇタンパク質は、ジスルフィド結合によ
り連結される。
つのキメラ鎖を含み、そして第２の非Ｉｇタンパク質は、ジスルフィド結合によ
り連結される。
【００１７】 本発明はまた、上記の融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物、およびこれ
らの構築物でトランスフェクトされた細胞株（例えば、骨髄腫）を特徴とする。
らの構築物でトランスフェクトされた細胞株（例えば、骨髄腫）を特徴とする。
【００１８】 これらのおよび他の目的は、本明細書中に開示された本発明の利点および特徴
とともに、以下の説明、図面、および特許請求の範囲からより明らかになる。
とともに、以下の説明、図面、および特許請求の範囲からより明らかになる。
【００１９】 （発明の詳細な説明） 第２のタンパク質（例えば、サイトカイン）を免疫グロブリンに融合すること
が、抗体構造を変更し得、１以上の細胞結合Ｆｃレセプターについての結合親和
性を増加させ、そして循環からのこの抗体ベースの融合タンパク質の迅速なクリ
アランスをもたらすことが現在発見されている。本発明は、増強されたインビボ
での循環半減期を有する抗体ベースの融合タンパク質を記載し、そして組換えＤ
ＮＡ技術を介して、１以上のＦｃレセプターについての低減した結合親和性を有
する抗体ベースの融合タンパク質を生成することを含む。
が、抗体構造を変更し得、１以上の細胞結合Ｆｃレセプターについての結合親和
性を増加させ、そして循環からのこの抗体ベースの融合タンパク質の迅速なクリ
アランスをもたらすことが現在発見されている。本発明は、増強されたインビボ
での循環半減期を有する抗体ベースの融合タンパク質を記載し、そして組換えＤ
ＮＡ技術を介して、１以上のＦｃレセプターについての低減した結合親和性を有
する抗体ベースの融合タンパク質を生成することを含む。
【００２０】 第１に、増強されたインビボでの循環半減期を有する抗体ベースの融合タンパ
ク質は、Ｆｃレセプターについての低減した結合親和性を有するアイソタイプを
有する融合タンパク質を構築すること、およびＦｃレセプターに結合する抗体ア
イソタイプからの配列の使用を回避することにより入手され得る。例えば、４つ
の公知のＩｇＧアイソタイプのうち、ＩｇＧ１（Ｃγ１）およびＩｇＧ３（Ｃγ
３）は、ＦｃＲγＩを高親和性で結合することが公知であり、一方、ＩｇＧ４（
Ｃγ４）は１０倍低い結合親和性を有し、そしてＩｇＧ２（Ｃγ２）はＦｃＲγ
Ｉに結合しない。従って、Ｆｃレセプターについての低減した結合親和性を有す
る抗体ベースの融合タンパク質は、Ｃγ２定常領域（Ｆｃ領域）またはＣγ４
Ｆｃ領域を有する融合タンパク質を構築すること、およびＣγ１ Ｆｃ領域また
はＣγ３ Ｆｃ領域を有する構築物を回避することにより入手され得る。
ク質は、Ｆｃレセプターについての低減した結合親和性を有するアイソタイプを
有する融合タンパク質を構築すること、およびＦｃレセプターに結合する抗体ア
イソタイプからの配列の使用を回避することにより入手され得る。例えば、４つ
の公知のＩｇＧアイソタイプのうち、ＩｇＧ１（Ｃγ１）およびＩｇＧ３（Ｃγ
３）は、ＦｃＲγＩを高親和性で結合することが公知であり、一方、ＩｇＧ４（
Ｃγ４）は１０倍低い結合親和性を有し、そしてＩｇＧ２（Ｃγ２）はＦｃＲγ
Ｉに結合しない。従って、Ｆｃレセプターについての低減した結合親和性を有す
る抗体ベースの融合タンパク質は、Ｃγ２定常領域（Ｆｃ領域）またはＣγ４
Ｆｃ領域を有する融合タンパク質を構築すること、およびＣγ１ Ｆｃ領域また
はＣγ３ Ｆｃ領域を有する構築物を回避することにより入手され得る。
【００２１】 第２に、増強されたインビボでの循環半減期を有する抗体ベースの融合タンパ
ク質は、Ｆｃレセプターについての結合親和性を有するアイソタイプにおけるＦ
ｃレセプターに結合するために必要な配列を改変し、結合を低減または排除する
ことにより入手され得る。上記で言及したように、ＩｇＧ分子は、３つのクラス
のＦｃレセプター（ＦｃＲ）（すなわち、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦ
ｃγＲＩＩＩ）と相互作用する。Ｃγ１およびＣγ３は、ＦｃＲγＩに高親和性
で結合し、一方、Ｃγ４およびＣγ２は、ＦｃＲγＩについての結合親和性が減
少しているかまたは結合親和性を有さない。Ｃγ１およびＣγ３の比較は、Ｃγ
３における伸長したヒンジセグメントを除いて、これらの２つのアイソタイプの
間のアミノ酸配列相同性は非常に高いことを示す。これは、補体のＣ１ｑフラグ
メントおよび種々のＦｃγＲクラスと相互作用することを示したこれらの領域に
おいてさえもあてはまる。図１は、Ｃγ１およびＣγ３のアミノ酸配列のアライ
ンメントを提供する。ヒトＩｇＧの２つの他のアイソタイプ（Ｃγ２およびＣγ
４）は、ＦｃＲ結合に関連した配列の相違を有する。図２は、Ｃγ１、Ｃγ２、
およびＣγ４のアミノ酸配列のアラインメントを提供する。ＦｃγＲ結合につい
て重要な配列は、ヒンジに隣接するＣＨ２ドメインに位置する、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（Ｃγ１における残基２３４〜２３７）である。Ｃａｎｆｉｅ
ｌｄおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１４８３−１４９
１（１９９１）．これらの配列モチーフは、Ｃγ１およびＣγ３において保存さ
れており、それらの類似の生物学的特性と一致しており、そしておそらく、ＩＬ
−２融合タンパク質を構築するために用いる場合の類似の薬物動態挙動の類似性
に関連する。多くの変異分析を行って、残基２３４〜２３７、ならびにＩｇＧ４
においてＳｅｒによって置換されるヒンジの近位の屈曲残基Ｐｒｏ331における 変異を含む、ＦｃＲ結合に対する特定の変異の効果を実証した。有効なＦｃＲ結
合について必要な別の重要な構造的構成要素は、Ａｓｎ297に共有結合したＮ結 合型炭水化物鎖の存在である。この構造の酵素的除去またはＡｓｎ残基の変異は
、全てのクラスのＦｃγＲへの結合を効果的に無くすかまたは少なくとも劇的に
低減する。
ク質は、Ｆｃレセプターについての結合親和性を有するアイソタイプにおけるＦ
ｃレセプターに結合するために必要な配列を改変し、結合を低減または排除する
ことにより入手され得る。上記で言及したように、ＩｇＧ分子は、３つのクラス
のＦｃレセプター（ＦｃＲ）（すなわち、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦ
ｃγＲＩＩＩ）と相互作用する。Ｃγ１およびＣγ３は、ＦｃＲγＩに高親和性
で結合し、一方、Ｃγ４およびＣγ２は、ＦｃＲγＩについての結合親和性が減
少しているかまたは結合親和性を有さない。Ｃγ１およびＣγ３の比較は、Ｃγ
３における伸長したヒンジセグメントを除いて、これらの２つのアイソタイプの
間のアミノ酸配列相同性は非常に高いことを示す。これは、補体のＣ１ｑフラグ
メントおよび種々のＦｃγＲクラスと相互作用することを示したこれらの領域に
おいてさえもあてはまる。図１は、Ｃγ１およびＣγ３のアミノ酸配列のアライ
ンメントを提供する。ヒトＩｇＧの２つの他のアイソタイプ（Ｃγ２およびＣγ
４）は、ＦｃＲ結合に関連した配列の相違を有する。図２は、Ｃγ１、Ｃγ２、
およびＣγ４のアミノ酸配列のアラインメントを提供する。ＦｃγＲ結合につい
て重要な配列は、ヒンジに隣接するＣＨ２ドメインに位置する、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（Ｃγ１における残基２３４〜２３７）である。Ｃａｎｆｉｅ
ｌｄおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１４８３−１４９
１（１９９１）．これらの配列モチーフは、Ｃγ１およびＣγ３において保存さ
れており、それらの類似の生物学的特性と一致しており、そしておそらく、ＩＬ
−２融合タンパク質を構築するために用いる場合の類似の薬物動態挙動の類似性
に関連する。多くの変異分析を行って、残基２３４〜２３７、ならびにＩｇＧ４
においてＳｅｒによって置換されるヒンジの近位の屈曲残基Ｐｒｏ331における 変異を含む、ＦｃＲ結合に対する特定の変異の効果を実証した。有効なＦｃＲ結
合について必要な別の重要な構造的構成要素は、Ａｓｎ297に共有結合したＮ結 合型炭水化物鎖の存在である。この構造の酵素的除去またはＡｓｎ残基の変異は
、全てのクラスのＦｃγＲへの結合を効果的に無くすかまたは少なくとも劇的に
低減する。
【００２２】 Ｂｒｕｍｂｅｌｌらは、抗体のＦｃ部分に結合することにより循環している抗
体の異化速度を遅くして、続いて細胞へのそれらの飲細胞運動を遅くする防御レ
セプター（ＦｃＲｐ）の存在が、それらを循環に再度戻すことを再指向すると仮
定した。Ｂｒｕｍｂｅｌｌら，Ｎａｔｕｒｅ ２０３：１３５２−１３５５（１
９６４）。β２ミクログロブリン含有新生児腸輸送レセプター（ＦｃＲｎ）は、
近年、ＦｃＲｐとして同定された。Ｊｕｎｇｈａｎｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：５５１２−５５１６（１９９６）を参照のこ
と。このレセプターへ結合するために必要な配列は、４つ全てのクラスのヒトＩ
ｇＧにおいて保存されており、そしてＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとの間の
界面に位置する。Ｍｅｄｅｓａｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：２２１１−
２２１７（１９９７）を参照のこと。これらの配列は、抗体のインビボでの循環
半減期について重要であることが報告された。国際ＰＣＴ公開ＷＯ ９７／３４
６３１を参照のこと。従って、本発明の好ましい抗体ベースの融合タンパク質は
、ＦｃＲｐへの結合のために必要な配列を有する。
体の異化速度を遅くして、続いて細胞へのそれらの飲細胞運動を遅くする防御レ
セプター（ＦｃＲｐ）の存在が、それらを循環に再度戻すことを再指向すると仮
定した。Ｂｒｕｍｂｅｌｌら，Ｎａｔｕｒｅ ２０３：１３５２−１３５５（１
９６４）。β２ミクログロブリン含有新生児腸輸送レセプター（ＦｃＲｎ）は、
近年、ＦｃＲｐとして同定された。Ｊｕｎｇｈａｎｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：５５１２−５５１６（１９９６）を参照のこ
と。このレセプターへ結合するために必要な配列は、４つ全てのクラスのヒトＩ
ｇＧにおいて保存されており、そしてＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとの間の
界面に位置する。Ｍｅｄｅｓａｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：２２１１−
２２１７（１９９７）を参照のこと。これらの配列は、抗体のインビボでの循環
半減期について重要であることが報告された。国際ＰＣＴ公開ＷＯ ９７／３４
６３１を参照のこと。従って、本発明の好ましい抗体ベースの融合タンパク質は
、ＦｃＲｐへの結合のために必要な配列を有する。
【００２３】 本発明の有用な実施態様を合成するための方法は、インビトロで、および前臨
床インビボ動物モデルの両方でそれらの薬物動態活性について試験するために有
用なアッセイとともに記載される。キメラ鎖をコードする好ましい遺伝子構築物
は、５’から３’の方向で、免疫グロブリンの少なくとも一部分をコードするＤ
ＮＡセグメント、および第２の非免疫グロブリンタンパク質をコードするＤＮＡ
を含む。代替的な好ましい遺伝子構築物は、５’から３’の方向で、第２の非免
疫グロブリンタンパク質をコードするＤＮＡセグメント、および免疫グロブリン
の少なくとも一部分をコードするＤＮＡを含む。融合された遺伝子は、融合遺伝
子が発現される適切なレシピエント細胞のトランスフェクションのための発現ベ
クターにおいてアセンブルされるか、またはその発現ベクター中に挿入される。
床インビボ動物モデルの両方でそれらの薬物動態活性について試験するために有
用なアッセイとともに記載される。キメラ鎖をコードする好ましい遺伝子構築物
は、５’から３’の方向で、免疫グロブリンの少なくとも一部分をコードするＤ
ＮＡセグメント、および第２の非免疫グロブリンタンパク質をコードするＤＮＡ
を含む。代替的な好ましい遺伝子構築物は、５’から３’の方向で、第２の非免
疫グロブリンタンパク質をコードするＤＮＡセグメント、および免疫グロブリン
の少なくとも一部分をコードするＤＮＡを含む。融合された遺伝子は、融合遺伝
子が発現される適切なレシピエント細胞のトランスフェクションのための発現ベ
クターにおいてアセンブルされるか、またはその発現ベクター中に挿入される。
【００２４】 本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに例示される。
【００２５】 （実施例１ Ｃγ１ ＩｇＧ定常領域からＣγ４ ＩｇＧ定常領域へのクラス
スイッチによる抗体−ＩＬ２融合タンパク質のインビボでの循環半減期の改善） 本発明によって、増強されたインビボでの循環半減期を有する抗体ベースの融
合タンパク質を、Ｆｃレセプターについての結合親和性が低減しているかまたは
結合親和性を有さない抗体アイソタイプからの配列を用いて抗体ベースの融合タ
ンパク質を構築することにより入手し得る。
スイッチによる抗体−ＩＬ２融合タンパク質のインビボでの循環半減期の改善） 本発明によって、増強されたインビボでの循環半減期を有する抗体ベースの融
合タンパク質を、Ｆｃレセプターについての結合親和性が低減しているかまたは
結合親和性を有さない抗体アイソタイプからの配列を用いて抗体ベースの融合タ
ンパク質を構築することにより入手し得る。
【００２６】 抗体ベースの融合タンパク質のインビボでの循環半減期が、Ｆｃレセプターに
ついての結合親和性が低減しているかまたは結合親和性を有さない抗体アイソタ
イプからの配列を用いて増強され得るか否かを評価するために、ヒトＣγ１定常
領域（Ｆｃ領域）を有する抗体−ＩＬ２融合タンパク質を、ヒトＣγ４ Ｆｃ領
域を有する抗体−ＩＬ２融合タンパク質と比較した。
ついての結合親和性が低減しているかまたは結合親和性を有さない抗体アイソタ
イプからの配列を用いて増強され得るか否かを評価するために、ヒトＣγ１定常
領域（Ｆｃ領域）を有する抗体−ＩＬ２融合タンパク質を、ヒトＣγ４ Ｆｃ領
域を有する抗体−ＩＬ２融合タンパク質と比較した。
【００２７】 （１．１ Ｃγ４ ＩｇＧ定常領域を有する抗体−ＩＬ−２融合タンパク質の
構築） Ｃγ１定常領域を有する抗体−ＩＬ２融合タンパク質の構築は、当該分野で記
載されている。例えば、Ｇｉｌｌｉｅｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ８９：１４２８−１４３２（１９９２）；および米国特許第５，
６５０，１５０号（これらの開示は本明細書中に参考として援用される）を参照
のこと。
構築） Ｃγ１定常領域を有する抗体−ＩＬ２融合タンパク質の構築は、当該分野で記
載されている。例えば、Ｇｉｌｌｉｅｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ８９：１４２８−１４３２（１９９２）；および米国特許第５，
６５０，１５０号（これらの開示は本明細書中に参考として援用される）を参照
のこと。
【００２８】 Ｃγ４定常領域を有する抗体−ＩＬ２融合タンパク質を構築するために、ヒト
ＩＬ−２に融合した、ヒト汎癌腫（ｐａｎｃａｒｃｉｎｏｍａ）抗原（ＫＳＡ）
に特異的な可変（Ｖ）領域およびヒトＣγ１重鎖を有するヒト化抗体−ＩＬ２融
合タンパク質を発現し得るプラスミドベクターを、Ｃγ１遺伝子フラグメントを
除去し、そしてヒトＣγ４遺伝子からの対応する配列でそれを置換することによ
り改変した。いくつかの関連する制限部位およびＣγ４遺伝子フラグメントの挿
入部位のマップを、図３に提供する。これらのプラスミド構築物は、マウス抗体
ＫＳ−１／４由来の軽鎖（Ｌ）および重鎖（Ｈ）の可変領域をコードするｍＲＮ
Ａの転写のためのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期プロモーターを含む。マ
ウスＶ領域を、標準的な方法によりヒト化し、そしてそれらをコードするＤＮＡ
配列を化学的に合成した。機能的なスプライスドナー部位を、各々のＶ領域の末
端に付加し、その結果、これを、Ｈ鎖定常領域遺伝子およびＬ鎖定常領域遺伝子
を含有するベクター中で用い得た。ヒトＣκ軽鎖遺伝子を、ＶＬ遺伝子のクロー
ニング部位の下流に挿入し、そしてその内在性３’非翻訳領域およびポリアデニ
ル化部位が続いた。この転写単位には、重鎖−ＩＬ２融合タンパク質についての
第２の独立した転写単位が続いた。これもまた、ＣＭＶプロモーターにより駆動
される。ＶＨコード配列を、ヒトＩＬ−２コード配列に融合した、選り抜きのＣ
γ重鎖遺伝子をコードするＤＮＡの上流に挿入した。このようなＣγ遺伝子は、
全てのヒトＣγ遺伝子に共通な独特なＨｉｎｄＩＩＩのすぐ下流にそれらの最初
の重鎖エキソン（ＣＨ１）についてのスプライスアクセプター部位を含む。ＳＶ
４０ウイルスからの３’非翻訳およびポリアデニル化部位を、ＩＬ−２コード配
列の末端に挿入した。ベクターの残りは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける増殖に必要な細
菌性プラスミドＤＮＡ、および哺乳動物細胞のトランスフェクタントの選択のた
めの選択マーカー遺伝子（ジヒドロ葉酸レダクターゼ−ｄｈｆｒ）を含んでいた
。
ＩＬ−２に融合した、ヒト汎癌腫（ｐａｎｃａｒｃｉｎｏｍａ）抗原（ＫＳＡ）
に特異的な可変（Ｖ）領域およびヒトＣγ１重鎖を有するヒト化抗体−ＩＬ２融
合タンパク質を発現し得るプラスミドベクターを、Ｃγ１遺伝子フラグメントを
除去し、そしてヒトＣγ４遺伝子からの対応する配列でそれを置換することによ
り改変した。いくつかの関連する制限部位およびＣγ４遺伝子フラグメントの挿
入部位のマップを、図３に提供する。これらのプラスミド構築物は、マウス抗体
ＫＳ−１／４由来の軽鎖（Ｌ）および重鎖（Ｈ）の可変領域をコードするｍＲＮ
Ａの転写のためのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期プロモーターを含む。マ
ウスＶ領域を、標準的な方法によりヒト化し、そしてそれらをコードするＤＮＡ
配列を化学的に合成した。機能的なスプライスドナー部位を、各々のＶ領域の末
端に付加し、その結果、これを、Ｈ鎖定常領域遺伝子およびＬ鎖定常領域遺伝子
を含有するベクター中で用い得た。ヒトＣκ軽鎖遺伝子を、ＶＬ遺伝子のクロー
ニング部位の下流に挿入し、そしてその内在性３’非翻訳領域およびポリアデニ
ル化部位が続いた。この転写単位には、重鎖−ＩＬ２融合タンパク質についての
第２の独立した転写単位が続いた。これもまた、ＣＭＶプロモーターにより駆動
される。ＶＨコード配列を、ヒトＩＬ−２コード配列に融合した、選り抜きのＣ
γ重鎖遺伝子をコードするＤＮＡの上流に挿入した。このようなＣγ遺伝子は、
全てのヒトＣγ遺伝子に共通な独特なＨｉｎｄＩＩＩのすぐ下流にそれらの最初
の重鎖エキソン（ＣＨ１）についてのスプライスアクセプター部位を含む。ＳＶ
４０ウイルスからの３’非翻訳およびポリアデニル化部位を、ＩＬ−２コード配
列の末端に挿入した。ベクターの残りは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける増殖に必要な細
菌性プラスミドＤＮＡ、および哺乳動物細胞のトランスフェクタントの選択のた
めの選択マーカー遺伝子（ジヒドロ葉酸レダクターゼ−ｄｈｆｒ）を含んでいた
。
【００２９】 Ｃγ１フラグメントとＣγ４フラグメントとの交換を、元のＣγ１含有プラス
ミドＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩにより消化し、そして大きな７．８
ｋｂのフラグメントをアガロースゲル電気泳動により精製することにより達成し
た。Ｃγ４遺伝子を含有する第２のプラスミドＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩおよび
ＮｓｉＩにより消化し、そして１．７５ｋｂのフラグメントを精製した。ヒトＣ
γ１遺伝子のカルボキシル末端に融合された、ヒトＩＬ−２ ｃＤＮＡおよびＳ
Ｖ４０ポリＡ部位を含有する第３のプラスミドを、ＸｈｏＩおよびＮｓｉＩで消
化し、そして小さな４７０ｂｐのフラグメントを精製した。３つ全てのフラグメ
ントを、ほぼ等しいモル量で一緒に連結し、そして連結産物を用いてコンピテン
トなＥ．ｃｏｌｉを形質転換した。連結産物を用いて、コンピテントなＥ．ｃｏ
ｌｉを形質転換し、そしてアンピシリンを含有するプレート上での増殖によりコ
ロニーを選択した。正確にアセンブルした組換えプラスミドを、単離した形質転
換体からのプラスミドＤＮＡ調製物の制限分析により同定し、そしてＦｓｐＩで
の消化を用いてＣγ１（ＦｓｐＩなし）とＣγ４（１つの部位）遺伝子挿入物と
の間を識別した。Ｃγ４−ＩＬ２重鎖置換物を含有する最終ベクターを、マウス
骨髄腫細胞に導入し、そして形質転換体を、メトトレキサート（０．１μＭ）を
含有する培地における増殖により選択した。高レベルの抗体−ＩＬ２融合タンパ
ク質を発現する細胞コロニーを増殖させ、そしてプロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅクロマトグラフィーを用いて融合タンパク質を培養上清から精製した。Ｃγ
４融合タンパク質の純度および完全性を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動により決定した。ＩＬ−２活性を、Ｔ細胞増殖アッセイにおいて測定し、そ
してＣγ１構築物のＩｌ−２活性と同一であることを見出した。
ミドＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩにより消化し、そして大きな７．８
ｋｂのフラグメントをアガロースゲル電気泳動により精製することにより達成し
た。Ｃγ４遺伝子を含有する第２のプラスミドＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩおよび
ＮｓｉＩにより消化し、そして１．７５ｋｂのフラグメントを精製した。ヒトＣ
γ１遺伝子のカルボキシル末端に融合された、ヒトＩＬ−２ ｃＤＮＡおよびＳ
Ｖ４０ポリＡ部位を含有する第３のプラスミドを、ＸｈｏＩおよびＮｓｉＩで消
化し、そして小さな４７０ｂｐのフラグメントを精製した。３つ全てのフラグメ
ントを、ほぼ等しいモル量で一緒に連結し、そして連結産物を用いてコンピテン
トなＥ．ｃｏｌｉを形質転換した。連結産物を用いて、コンピテントなＥ．ｃｏ
ｌｉを形質転換し、そしてアンピシリンを含有するプレート上での増殖によりコ
ロニーを選択した。正確にアセンブルした組換えプラスミドを、単離した形質転
換体からのプラスミドＤＮＡ調製物の制限分析により同定し、そしてＦｓｐＩで
の消化を用いてＣγ１（ＦｓｐＩなし）とＣγ４（１つの部位）遺伝子挿入物と
の間を識別した。Ｃγ４−ＩＬ２重鎖置換物を含有する最終ベクターを、マウス
骨髄腫細胞に導入し、そして形質転換体を、メトトレキサート（０．１μＭ）を
含有する培地における増殖により選択した。高レベルの抗体−ＩＬ２融合タンパ
ク質を発現する細胞コロニーを増殖させ、そしてプロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅクロマトグラフィーを用いて融合タンパク質を培養上清から精製した。Ｃγ
４融合タンパク質の純度および完全性を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動により決定した。ＩＬ−２活性を、Ｔ細胞増殖アッセイにおいて測定し、そ
してＣγ１構築物のＩｌ−２活性と同一であることを見出した。
【００３０】 （１．２ 抗体ならびにＣγ１ ＩｇＧ定常領域およびＣγ４ ＩｇＧ定常領
域を有する抗体−ＩＬ２融合タンパク質によるＦｃレセプターへの結合） マウスおよびヒトの種々の細胞株は、１以上のＦｃレセプターを発現する。例
えば、マウスＪ７７４マクロファージ様細胞株は、適切なサブクラスのマウスま
たはヒトのＩｇＧに結合し得るＦｃＲγＩを発現する。同様に、ヒトＫ５６２赤
白血病細胞株は、ＦｃＲγＩＩを発現するがＦｃＲγＩを発現しない。循環から
の抗体ベースの融合タンパク質のクリアランスに対するＦｃレセプター結合の潜
在的寄与を評価するために、ＦｃＲγＩについての、抗体、Ｃγ１−ＩＬ２融合
タンパク質、およびＣγ４−ＩＬ２融合タンパク質の結合親和性を、マウスＪ７
７４細胞株において比較した。
域を有する抗体−ＩＬ２融合タンパク質によるＦｃレセプターへの結合） マウスおよびヒトの種々の細胞株は、１以上のＦｃレセプターを発現する。例
えば、マウスＪ７７４マクロファージ様細胞株は、適切なサブクラスのマウスま
たはヒトのＩｇＧに結合し得るＦｃＲγＩを発現する。同様に、ヒトＫ５６２赤
白血病細胞株は、ＦｃＲγＩＩを発現するがＦｃＲγＩを発現しない。循環から
の抗体ベースの融合タンパク質のクリアランスに対するＦｃレセプター結合の潜
在的寄与を評価するために、ＦｃＲγＩについての、抗体、Ｃγ１−ＩＬ２融合
タンパク質、およびＣγ４−ＩＬ２融合タンパク質の結合親和性を、マウスＪ７
７４細胞株において比較した。
【００３１】 実施例１に記載の２つの抗体−ＩＬ２融合タンパク質（ｈｕ−ＫＳγ１−ＩＬ
２およびｈｕ−ＫＳγ４−ＩＬ２）を、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
を２×１０5Ｊ７７４細胞とともに含有するＰＢＳ中に最終容量０．２ｍｌで２ μｇ／ｍｌまで希釈した。氷上で２０分間のインキュベーション後、ＦＩＴＣ結
合体化抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（Ｆａｂ2）を添加し、そしてインキュベーショ ンをさらに３０分間続けた。結合していない抗体を、ＰＢＳ−ＢＳＡでの２回の
洗浄により除去し、そして細胞を蛍光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）により分析
した。コントロール反応物は、ＦＩＴＣ標識二次抗体のみまたはヒト化ＫＳγ１
抗体（ＩＬ−２なし）と混合した同じ細胞を含んでいた。
２およびｈｕ−ＫＳγ４−ＩＬ２）を、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
を２×１０5Ｊ７７４細胞とともに含有するＰＢＳ中に最終容量０．２ｍｌで２ μｇ／ｍｌまで希釈した。氷上で２０分間のインキュベーション後、ＦＩＴＣ結
合体化抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（Ｆａｂ2）を添加し、そしてインキュベーショ ンをさらに３０分間続けた。結合していない抗体を、ＰＢＳ−ＢＳＡでの２回の
洗浄により除去し、そして細胞を蛍光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）により分析
した。コントロール反応物は、ＦＩＴＣ標識二次抗体のみまたはヒト化ＫＳγ１
抗体（ＩＬ−２なし）と混合した同じ細胞を含んでいた。
【００３２】 予測されるように、Ｊ７７４細胞へのＣγ４−ＩＬ２融合タンパク質の結合は
、Ｃγ１−ＩＬ２融合タンパク質の結合よりも有意に高かった。図４を参照のこ
と。しかし、思いがけなく、Ｃγ１−ＩＬ２融合タンパク質およびＣγ４−ＩＬ
２融合タンパク質の両方が、ＫＳγ１抗体（ＩＬ−２なし）よりも有意に高い、
Ｊ７７４細胞に対する結合を有していた。このことは、第２のタンパク質（例え
ば、サイトカイン）を免疫グロブリンに融合することは、抗体の構造を改変し得
、１以上の細胞結合Ｆｃレセプターについての結合親和性の増加をもたらし、そ
れにより、循環からの迅速なクリアランスを導くことを示唆する。
、Ｃγ１−ＩＬ２融合タンパク質の結合よりも有意に高かった。図４を参照のこ
と。しかし、思いがけなく、Ｃγ１−ＩＬ２融合タンパク質およびＣγ４−ＩＬ
２融合タンパク質の両方が、ＫＳγ１抗体（ＩＬ−２なし）よりも有意に高い、
Ｊ７７４細胞に対する結合を有していた。このことは、第２のタンパク質（例え
ば、サイトカイン）を免疫グロブリンに融合することは、抗体の構造を改変し得
、１以上の細胞結合Ｆｃレセプターについての結合親和性の増加をもたらし、そ
れにより、循環からの迅速なクリアランスを導くことを示唆する。
【００３３】 ＩＬ−２融合タンパク質を用いて観察される、より強い結合が、細胞上のＩＬ
−２レセプターまたはＦｃＲγＩレセプターの存在に起因したか否かを決定する
ために、過剰なマウスＩｇＧ（ｍＩｇＧ）を用いて、Ｆｃレセプターでの結合と
競合させた。図４に例示するように、バックグラウンドレベルの結合が、５０倍
モル過剰のｍＩｇＧの存在下で抗体および両方の抗体−ＩＬ２融合タンパク質を
用いて観察された。このことは、抗体−ＩＬ２融合タンパク質のシグナル結合の
増加がＦｃレセプターに対する結合の増加に起因したことを示唆する。
−２レセプターまたはＦｃＲγＩレセプターの存在に起因したか否かを決定する
ために、過剰なマウスＩｇＧ（ｍＩｇＧ）を用いて、Ｆｃレセプターでの結合と
競合させた。図４に例示するように、バックグラウンドレベルの結合が、５０倍
モル過剰のｍＩｇＧの存在下で抗体および両方の抗体−ＩＬ２融合タンパク質を
用いて観察された。このことは、抗体−ＩＬ２融合タンパク質のシグナル結合の
増加がＦｃレセプターに対する結合の増加に起因したことを示唆する。
【００３４】 Ｆｃレセプターを発現する細胞株は、増強されたインビボ半減期を有する抗体
ベースの融合タンパク質を同定するために、Ｆｃレセプターに対する候補融合タ
ンパク質の結合親和性を試験するために有用である。候補抗体ベースの融合タン
パク質を、上記の方法により試験し得る。Ｆｃレセプターについての実質的に減
少した結合親和性を有する候補抗体ベースの融合タンパク質は、増強されたイン
ビボでの半減期を有する抗体ベースの融合タンパク質として同定される。
ベースの融合タンパク質を同定するために、Ｆｃレセプターに対する候補融合タ
ンパク質の結合親和性を試験するために有用である。候補抗体ベースの融合タン
パク質を、上記の方法により試験し得る。Ｆｃレセプターについての実質的に減
少した結合親和性を有する候補抗体ベースの融合タンパク質は、増強されたイン
ビボでの半減期を有する抗体ベースの融合タンパク質として同定される。
【００３５】 （１．３ Ｃγ１ ＩｇＧ定常領域およびＣγ４ ＩｇＧ定常領域を有する抗
体−ＩＬ２融合タンパク質の循環半減期の測定） Ｆｃレセプターについての親和性が減少したＩｇＧアイソタイプのＦｃ領域を
用いて、インビボでの循環半減期を増強するか否かを評価するために、Ｃγ１ア
イソタイプ重鎖を含有する融合タンパク質（すなわち、ｈｕ−ＫＳγ１−ＩＬ２
）を、Ｃγ４アイソタイプ重鎖を含有する融合タンパク質（すなわち、ｈｕ−Ｋ
Ｓγ４−ＩＬ２）に対して比較した。
体−ＩＬ２融合タンパク質の循環半減期の測定） Ｆｃレセプターについての親和性が減少したＩｇＧアイソタイプのＦｃ領域を
用いて、インビボでの循環半減期を増強するか否かを評価するために、Ｃγ１ア
イソタイプ重鎖を含有する融合タンパク質（すなわち、ｈｕ−ＫＳγ１−ＩＬ２
）を、Ｃγ４アイソタイプ重鎖を含有する融合タンパク質（すなわち、ｈｕ−Ｋ
Ｓγ４−ＩＬ２）に対して比較した。
【００３６】 Ｃγ１アイソタイプ重鎖またはＣγ４アイソタイプ重鎖のいずれかを含有する
精製されたヒト化ＫＳ−１／４−ＩＬ２融合タンパク質を、リン酸緩衝化生理食
塩水（ＰＢＳ）中へのダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ
）により緩衝液交換し、そして約１００μｇ／ｍｌの濃度までさらに希釈した。
約２０μｇの抗体ベースの融合タンパク質（０．２ｍｌ）を、６〜８週齢のＢａ
ｌｂ／ｃマウス中に尾静脈中に、スロープッシュ（ｓｌｏｗ ｐｕｓｈ）を用い
て注射した。１群あたり４匹のマウスに注射した。種々の時点で、小さな血液サ
ンプルを、麻酔した動物からの後眼窩出血により採取し、そして凝固を予防する
ためにクエン酸緩衝液を含有するチューブ中に収集した。細胞を、Ｅｐｐｅｎｄ
ｏｒｆ高速卓上型遠心分離機での５分間の遠心分離により除去した。血漿をマイ
クロピペッターで取り出し、そして−７０℃にて凍結した。マウス血液中のヒト
抗体決定基の濃度を、ＥＬＩＳＡにより測定した。ヒトＨおよびＬ抗体鎖に特異
的な捕捉抗体を、希釈した血漿サンプルからの融合タンパク質の捕捉のために用
いた。抗体でコーティングした９６ウェルプレートにおける２時間のインキュベ
ーション後、結合していない材料を、ＥＬＩＳＡ緩衝液（ＰＢＳ中の０．０１％
Ｔｗｅｅｎ ８０）を用いる３回の洗浄により除去した。第２のインキュベー
ション工程は、抗ヒトＦｃ抗体（抗体およびインタクトな融合タンパク質の両方
の検出のため）または抗ヒトＩＬ−２抗体（インタクトな融合タンパク質のみの
検出のため）のいずれかを用いた。両方の抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ
（ＨＲＰ）に結合体化した。１時間のインキュベーション後、結合していない検
出抗体を、ＥＬＩＳＡ緩衝液を用いて洗浄することにより除去し、そして結合し
たＨＲＰの量を、基質とのインキュベーションおよび分光光度計における測定に
より決定した。
精製されたヒト化ＫＳ−１／４−ＩＬ２融合タンパク質を、リン酸緩衝化生理食
塩水（ＰＢＳ）中へのダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ
）により緩衝液交換し、そして約１００μｇ／ｍｌの濃度までさらに希釈した。
約２０μｇの抗体ベースの融合タンパク質（０．２ｍｌ）を、６〜８週齢のＢａ
ｌｂ／ｃマウス中に尾静脈中に、スロープッシュ（ｓｌｏｗ ｐｕｓｈ）を用い
て注射した。１群あたり４匹のマウスに注射した。種々の時点で、小さな血液サ
ンプルを、麻酔した動物からの後眼窩出血により採取し、そして凝固を予防する
ためにクエン酸緩衝液を含有するチューブ中に収集した。細胞を、Ｅｐｐｅｎｄ
ｏｒｆ高速卓上型遠心分離機での５分間の遠心分離により除去した。血漿をマイ
クロピペッターで取り出し、そして−７０℃にて凍結した。マウス血液中のヒト
抗体決定基の濃度を、ＥＬＩＳＡにより測定した。ヒトＨおよびＬ抗体鎖に特異
的な捕捉抗体を、希釈した血漿サンプルからの融合タンパク質の捕捉のために用
いた。抗体でコーティングした９６ウェルプレートにおける２時間のインキュベ
ーション後、結合していない材料を、ＥＬＩＳＡ緩衝液（ＰＢＳ中の０．０１％
Ｔｗｅｅｎ ８０）を用いる３回の洗浄により除去した。第２のインキュベー
ション工程は、抗ヒトＦｃ抗体（抗体およびインタクトな融合タンパク質の両方
の検出のため）または抗ヒトＩＬ−２抗体（インタクトな融合タンパク質のみの
検出のため）のいずれかを用いた。両方の抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ
（ＨＲＰ）に結合体化した。１時間のインキュベーション後、結合していない検
出抗体を、ＥＬＩＳＡ緩衝液を用いて洗浄することにより除去し、そして結合し
たＨＲＰの量を、基質とのインキュベーションおよび分光光度計における測定に
より決定した。
【００３７】 図５に示すように、ｈｕ−ＫＳγ４−ＩＬ２融合タンパク質のα相半減期は、
ｈｕ−ＫＳγ１−ＩＬ２融合タンパク質のα相半減期よりも有意に長かった。増
加した半減期は、２４時間後にマウスにおいて見出されたｈｕ−ＫＳγ１−ＩＬ
２融合タンパク質（６０ｎｇ／ｍｌ）と比較して有意に高い濃度のｈｕ−ＫＳγ
４−ＩＬ２融合タンパク質（３．３μｇ／ｍｌ）によって最良に例示される。
ｈｕ−ＫＳγ１−ＩＬ２融合タンパク質のα相半減期よりも有意に長かった。増
加した半減期は、２４時間後にマウスにおいて見出されたｈｕ−ＫＳγ１−ＩＬ
２融合タンパク質（６０ｎｇ／ｍｌ）と比較して有意に高い濃度のｈｕ−ＫＳγ
４−ＩＬ２融合タンパク質（３．３μｇ／ｍｌ）によって最良に例示される。
【００３８】 ｈｕ−ＫＳγ１−ＩＬ２タンパク質は、キメラ１４．１８−ＩＬ２融合タンパ
ク質について以前に報告されたように、迅速な分散（α）相、続いてより遅い異
化（β）相を有していた。Ｇｉｌｌｉｅｓら，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．４：
２３０−２３５（１９９３）を参照のこと。Ｇｉｌｌｉｅｓらの研究では、抗体
決定基のみを測定したので、クリアランスがインタクトな融合タンパク質のクリ
アランスまたは融合タンパク質の抗体構成要素のクリアランスを表すかは明らか
ではなかった。本実施例では、サンプルを、（１）抗体特異的ＥＬＩＳＡ、およ
び（２）融合タンパク質特異的ＥＬＩＳＡ（すなわち、抗体およびＩｌ−２構成
要素の両方が物理的に連結されていることが必要とされるＥＬＩＳＡ）の両方を
用いてアッセイした。図５に例示されるように、ｈｕ−ＫＳγ１−ＩＬ２融合タ
ンパク質を注射した動物では、特に２４時間の時点で、循環している融合タンパ
ク質の量は、循環している抗体の総量よりも低かった。このことは、この融合タ
ンパク質がインビボでタンパク質分解によって切断されること、および放出され
た抗体が循環し続けることを示唆する。驚くべきことに、ｈｕ−ＫＳγ４−ＩＬ
２融合タンパク質を注射した動物では、循環している融合タンパク質の量と、循
環している抗体の総量との間に有意な差異は存在しなかった。このことは、ｈｕ
−ＫＳγ４−ＩＬ２融合タンパク質が、測定した２４時間の間は、これらの動物
においてタンパク質分解によって切断されなかったことを示唆する。
ク質について以前に報告されたように、迅速な分散（α）相、続いてより遅い異
化（β）相を有していた。Ｇｉｌｌｉｅｓら，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．４：
２３０−２３５（１９９３）を参照のこと。Ｇｉｌｌｉｅｓらの研究では、抗体
決定基のみを測定したので、クリアランスがインタクトな融合タンパク質のクリ
アランスまたは融合タンパク質の抗体構成要素のクリアランスを表すかは明らか
ではなかった。本実施例では、サンプルを、（１）抗体特異的ＥＬＩＳＡ、およ
び（２）融合タンパク質特異的ＥＬＩＳＡ（すなわち、抗体およびＩｌ−２構成
要素の両方が物理的に連結されていることが必要とされるＥＬＩＳＡ）の両方を
用いてアッセイした。図５に例示されるように、ｈｕ−ＫＳγ１−ＩＬ２融合タ
ンパク質を注射した動物では、特に２４時間の時点で、循環している融合タンパ
ク質の量は、循環している抗体の総量よりも低かった。このことは、この融合タ
ンパク質がインビボでタンパク質分解によって切断されること、および放出され
た抗体が循環し続けることを示唆する。驚くべきことに、ｈｕ−ＫＳγ４−ＩＬ
２融合タンパク質を注射した動物では、循環している融合タンパク質の量と、循
環している抗体の総量との間に有意な差異は存在しなかった。このことは、ｈｕ
−ＫＳγ４−ＩＬ２融合タンパク質が、測定した２４時間の間は、これらの動物
においてタンパク質分解によって切断されなかったことを示唆する。
【００３９】 上記のように、Ｃγ１およびＣγ３は、Ｆｃレセプターについての結合親和性
を有するが、一方、Ｃγ４は低減した結合親和性を有し、そしてＣγ２はＦｃレ
セプターについての結合親和性を有さない。本実施例は、Ｃγ４ Ｆｃ領域、Ｆ
ｃレセプターについての低減した親和性を有するＩｇＧアイソタイプを用いて抗
体ベースの融合タンパク質を生成するための方法を記載する。そして、このよう
な抗体ベースの融合タンパク質が増強されたインビボでの循環半減期を有するこ
とを確立した。従って、当業者は、これらの方法を用いて、融合タンパク質の循
環半減期を増強するためにＣγ４ Ｆｃ領域の代わりにＣγ２ Ｆｃ領域を有す
る抗体ベースの融合タンパク質を生成し得る。ヒトＣγ２領域を利用するＨｕ−
ＫＳ−ＩＬ２融合タンパク質は、同じ制限フラグメント置換およびＣγ４−ＩＬ
２融合タンパク質についての上記の方法を用いて構築され得、そして本明細書中
に記載の方法を用いて試験して増加した循環半減期を実証し得る。Ｃγ２ Ｆｃ
領域またはＦｃレセプターについての低減した結合親和性を有するかもしくは結
合親和性を欠く任意の他のＦｃ領域を有する抗体ベースの融合タンパク質は、Ｆ
ｃレセプターについての結合親和性を有する抗体ベースの融合タンパク質と比較
して増強されたインビボでの循環半減期を有する。
を有するが、一方、Ｃγ４は低減した結合親和性を有し、そしてＣγ２はＦｃレ
セプターについての結合親和性を有さない。本実施例は、Ｃγ４ Ｆｃ領域、Ｆ
ｃレセプターについての低減した親和性を有するＩｇＧアイソタイプを用いて抗
体ベースの融合タンパク質を生成するための方法を記載する。そして、このよう
な抗体ベースの融合タンパク質が増強されたインビボでの循環半減期を有するこ
とを確立した。従って、当業者は、これらの方法を用いて、融合タンパク質の循
環半減期を増強するためにＣγ４ Ｆｃ領域の代わりにＣγ２ Ｆｃ領域を有す
る抗体ベースの融合タンパク質を生成し得る。ヒトＣγ２領域を利用するＨｕ−
ＫＳ−ＩＬ２融合タンパク質は、同じ制限フラグメント置換およびＣγ４−ＩＬ
２融合タンパク質についての上記の方法を用いて構築され得、そして本明細書中
に記載の方法を用いて試験して増加した循環半減期を実証し得る。Ｃγ２ Ｆｃ
領域またはＦｃレセプターについての低減した結合親和性を有するかもしくは結
合親和性を欠く任意の他のＦｃ領域を有する抗体ベースの融合タンパク質は、Ｆ
ｃレセプターについての結合親和性を有する抗体ベースの融合タンパク質と比較
して増強されたインビボでの循環半減期を有する。
【００４０】 （実施例２ インビボでの循環半減期を改善するための、抗体ベースの融合タ
ンパク質構築物におけるヒトＣγ１遺伝子またはヒトＣγ３遺伝子の変異） ＩｇＧ分子は、タンパク質の補体系のメンバー（例えば、Ｃ１ｑフラグメント
）ならびに３つのクラスのＦｃＲを含む、循環におけるいくつかの分子と相互作
用する。Ｃ１ｑ結合に重要な残基は、ヒト重鎖のＣＨ２ドメインに位置する残基
Ｇｌｕ318、Ｌｙｓ320、およびＬｙｓ322である。Ｔａｏら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ ｄ．１７８：６６１−６６７（１９９３）。迅速なクリアランスのための機構と
してのＦｃＲ結合とＣ１ｑ結合との間を識別するために、本発明者らは、より劇
的に変更したＣγ２ヒンジ近位セグメントをＣγ１重鎖中で置換した。この変異
は、ＦｃＲ結合に影響を与えるが補体結合に影響を与えないことが期待される。
ンパク質構築物におけるヒトＣγ１遺伝子またはヒトＣγ３遺伝子の変異） ＩｇＧ分子は、タンパク質の補体系のメンバー（例えば、Ｃ１ｑフラグメント
）ならびに３つのクラスのＦｃＲを含む、循環におけるいくつかの分子と相互作
用する。Ｃ１ｑ結合に重要な残基は、ヒト重鎖のＣＨ２ドメインに位置する残基
Ｇｌｕ318、Ｌｙｓ320、およびＬｙｓ322である。Ｔａｏら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ ｄ．１７８：６６１−６６７（１９９３）。迅速なクリアランスのための機構と
してのＦｃＲ結合とＣ１ｑ結合との間を識別するために、本発明者らは、より劇
的に変更したＣγ２ヒンジ近位セグメントをＣγ１重鎖中で置換した。この変異
は、ＦｃＲ結合に影響を与えるが補体結合に影響を与えないことが期待される。
【００４１】 変異を、オーバーラッピングポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて生殖系
列Ｃγ１遺伝子のヒンジとＣＨ２エキソンの始めとの間の小さな領域をクローニ
ングし、そして適合することにより達成した。ＰＣＲプライマーを、Ｐｓｔ Ｉ
からＤｒｄ Ｉのフラグメントへとまたがる２つの隣接するＰＣＲフラグメント
の連結部を新たな配列で置換するように設計した（図６を参照のこと）。第１工
程では、プライマー１およびプライマー２（それぞれ、配列番号５および配列番
号６）、またはプライマー３およびプライマー４（それぞれ、配列番号７および
配列番号８）を用いる２つの別個のＰＣＲ反応物を、Ｃγ１遺伝子をテンプレー
トとして用いて調製した。最初のＰＣＲのサイクル条件は、以下を３５サイクル
であった：９４℃にて４５秒間、４８℃にて４５秒間のアニーリング、および７
２℃にて４５秒間のプライマー伸長。各ＰＣＲ反応の産物を、第２の連結反応工
程のためのテンプレートして用いた。各プライマー反応物の１０分の１を、一緒
に混合し、そしてプライマー１およびプライマー４を用いて合わせて、２つの最
初のＰＣＲ産物が組み合わされた産物のみを増幅した。２回目のＰＣＲの条件は
以下の通りであった：９４℃にて１分間、５１℃にて１分間のアニーリング、お
よび７２℃にて１分間のプライマー伸長。連結は、変性およびアニーリングに続
いて他方の末端と対形成する２つの個々のフラグメントの間での重複の結果とし
て生じる。ハイブリッドを形成するフラグメントをＴａｑポリメラーゼにより伸
長させ、そして完全な変異した産物を、図６に示すように、外側のプライマーの
プライミングにより選択的に増幅した。最終的なＰＣＲ産物を、プラスミドベク
ター中にクローニングし、そしてその配列をＤＮＡ配列分析により確認した。
列Ｃγ１遺伝子のヒンジとＣＨ２エキソンの始めとの間の小さな領域をクローニ
ングし、そして適合することにより達成した。ＰＣＲプライマーを、Ｐｓｔ Ｉ
からＤｒｄ Ｉのフラグメントへとまたがる２つの隣接するＰＣＲフラグメント
の連結部を新たな配列で置換するように設計した（図６を参照のこと）。第１工
程では、プライマー１およびプライマー２（それぞれ、配列番号５および配列番
号６）、またはプライマー３およびプライマー４（それぞれ、配列番号７および
配列番号８）を用いる２つの別個のＰＣＲ反応物を、Ｃγ１遺伝子をテンプレー
トとして用いて調製した。最初のＰＣＲのサイクル条件は、以下を３５サイクル
であった：９４℃にて４５秒間、４８℃にて４５秒間のアニーリング、および７
２℃にて４５秒間のプライマー伸長。各ＰＣＲ反応の産物を、第２の連結反応工
程のためのテンプレートして用いた。各プライマー反応物の１０分の１を、一緒
に混合し、そしてプライマー１およびプライマー４を用いて合わせて、２つの最
初のＰＣＲ産物が組み合わされた産物のみを増幅した。２回目のＰＣＲの条件は
以下の通りであった：９４℃にて１分間、５１℃にて１分間のアニーリング、お
よび７２℃にて１分間のプライマー伸長。連結は、変性およびアニーリングに続
いて他方の末端と対形成する２つの個々のフラグメントの間での重複の結果とし
て生じる。ハイブリッドを形成するフラグメントをＴａｑポリメラーゼにより伸
長させ、そして完全な変異した産物を、図６に示すように、外側のプライマーの
プライミングにより選択的に増幅した。最終的なＰＣＲ産物を、プラスミドベク
ター中にクローニングし、そしてその配列をＤＮＡ配列分析により確認した。
【００４２】 変異した遺伝子のアセンブリを、複数の工程で行った。最初の工程では、ヒト
Ｃγ１遺伝子を含有するクローニングベクターを、ＰｓｔＩおよびＸｈｏＩで消
化して、非変異ヒンジＣＨ２−ＣＨ３コード配列を除去した。ＣＨ２のＤｒｄＩ
からＸｈｏＩフラグメントコード部分、ＣＨ３の全て、および融合したヒトＩＬ
−２コード配列を、上記のＣγ１−ＩＬ２ベクターから調製した。第３のフラグ
メントを、サブクローン化されたＰＣＲ産物から、ＰｓｔＩおよびＤｒｄＩでの
消化により調製した。３つ全てのフラグメントを、アガロースゲル電気泳動によ
り精製し、そして単一の反応混合物中で一緒に連結した。連結産物を用いて、コ
ンピテントなＥ．ｃｏｌｉを形質転換し、そしてコロニーを、アンピシリンを含
有するプレート上での増殖により選択した。正しくアセンブルした組換えプラス
ミドを、単離された形質転換体からのプラスミドＤＮＡ調製物の制限分析により
同定し、そして変異した遺伝子をＤＮＡ配列分析により確認した。変異したＣγ
１−ＩＬ２遺伝子からのＨｉｎｄＩＩＩからＸｈｏＩのフラグメントを用いて、
完全なｈｕ−ＫＳ抗体−ＩＬ２融合タンパク質発現ベクターを再度アセンブリし
た。
Ｃγ１遺伝子を含有するクローニングベクターを、ＰｓｔＩおよびＸｈｏＩで消
化して、非変異ヒンジＣＨ２−ＣＨ３コード配列を除去した。ＣＨ２のＤｒｄＩ
からＸｈｏＩフラグメントコード部分、ＣＨ３の全て、および融合したヒトＩＬ
−２コード配列を、上記のＣγ１−ＩＬ２ベクターから調製した。第３のフラグ
メントを、サブクローン化されたＰＣＲ産物から、ＰｓｔＩおよびＤｒｄＩでの
消化により調製した。３つ全てのフラグメントを、アガロースゲル電気泳動によ
り精製し、そして単一の反応混合物中で一緒に連結した。連結産物を用いて、コ
ンピテントなＥ．ｃｏｌｉを形質転換し、そしてコロニーを、アンピシリンを含
有するプレート上での増殖により選択した。正しくアセンブルした組換えプラス
ミドを、単離された形質転換体からのプラスミドＤＮＡ調製物の制限分析により
同定し、そして変異した遺伝子をＤＮＡ配列分析により確認した。変異したＣγ
１−ＩＬ２遺伝子からのＨｉｎｄＩＩＩからＸｈｏＩのフラグメントを用いて、
完全なｈｕ−ＫＳ抗体−ＩＬ２融合タンパク質発現ベクターを再度アセンブリし
た。
【００４３】 ＦｃＲ結合のために重要なアミノ酸の変異によって誘導されたインビボでの循
環半減期の増強を評価するために、および迅速なクリアランスのための機構とし
てのＦｃＲ結合およびＣ１ｑ結合との間を識別するために、変異したｈｕ−ＫＳ
γ１−ＩＬ２のインビボでの血漿濃度を、種々の特定の時間で、ｈｕ−ＫＳγ１
−ＩＬ２の血漿濃度に対して比較した。図７に例示されるように、変異したｈｕ
−ＫＳγ１−ＩＬ２およびｈｕ−ＫＳγ４−ＩＬ２のインビボでのクリアランス
速度は、ｈｕ−ＫＳγ１−ＩＬ２のクリアランス速度よりも有意に遅かった。こ
れらの結果は、増強されたインビボでの循環半減期を有する抗体ベースの融合タ
ンパク質が、Ｆｃレセプターについての結合親和性を有するアイソタイプにおけ
るＦｃレセプターに対する結合に必要な配列を改変することにより得られ得るこ
とを示唆する。さらに、この結果は、迅速なクリアランスの機構がＣ１ｑ結合で
はなくＦｃＲ結合に関与することを示唆する。
環半減期の増強を評価するために、および迅速なクリアランスのための機構とし
てのＦｃＲ結合およびＣ１ｑ結合との間を識別するために、変異したｈｕ−ＫＳ
γ１−ＩＬ２のインビボでの血漿濃度を、種々の特定の時間で、ｈｕ−ＫＳγ１
−ＩＬ２の血漿濃度に対して比較した。図７に例示されるように、変異したｈｕ
−ＫＳγ１−ＩＬ２およびｈｕ−ＫＳγ４−ＩＬ２のインビボでのクリアランス
速度は、ｈｕ−ＫＳγ１−ＩＬ２のクリアランス速度よりも有意に遅かった。こ
れらの結果は、増強されたインビボでの循環半減期を有する抗体ベースの融合タ
ンパク質が、Ｆｃレセプターについての結合親和性を有するアイソタイプにおけ
るＦｃレセプターに対する結合に必要な配列を改変することにより得られ得るこ
とを示唆する。さらに、この結果は、迅速なクリアランスの機構がＣ１ｑ結合で
はなくＦｃＲ結合に関与することを示唆する。
【００４４】 当業者は、本発明の教示から、Ｃγ１遺伝子またはＣγ３遺伝子に対するいく
つかの他の変異が、ＦｃＲに対する結合を低減するため、および抗体ベースの融
合タンパク質のインビボでの循環半減期を増強するために導入され得ることを理
解する。さらに、変異をまたＣγ４遺伝子に導入して、Ｃγ４融合タンパク質の
ＦｃＲに対する結合を低減し得る。例えば、さらなる可能な変異は、ヒンジの近
位のアミノ酸残基における変異、Ｐｒｏ331の変異、または全てのＩｇＧ Ｆｃ 領域における単一のＮ結合型グリコシル化部位を変異することを含む。後者は、
Ａｓｎ297に規範配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒの一部として位置し、ここで 、第２位は、任意のアミノ酸であり得（可能であればＰｒｏを除く）、そして第
３位はＴｈｒまたはＳｅｒのいずれかである。アミノ酸Ｇｌｎに対する保存的置
換は、例えば、タンパク質に対してほとんど影響を有さないが、任意の炭水化物
側鎖の結合を防止する。この残基を変異させるためのストラテジーは、ヒンジに
近位な領域についてちょうど記載した一般的な手順に従い得る。クローニングし
たＤＮＡ配列において点変異を生成するための方法は、当該分野において十分確
立されており、そして市販のキットがいくつかの販売業者からこの目的のために
利用可能である。
つかの他の変異が、ＦｃＲに対する結合を低減するため、および抗体ベースの融
合タンパク質のインビボでの循環半減期を増強するために導入され得ることを理
解する。さらに、変異をまたＣγ４遺伝子に導入して、Ｃγ４融合タンパク質の
ＦｃＲに対する結合を低減し得る。例えば、さらなる可能な変異は、ヒンジの近
位のアミノ酸残基における変異、Ｐｒｏ331の変異、または全てのＩｇＧ Ｆｃ 領域における単一のＮ結合型グリコシル化部位を変異することを含む。後者は、
Ａｓｎ297に規範配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒの一部として位置し、ここで 、第２位は、任意のアミノ酸であり得（可能であればＰｒｏを除く）、そして第
３位はＴｈｒまたはＳｅｒのいずれかである。アミノ酸Ｇｌｎに対する保存的置
換は、例えば、タンパク質に対してほとんど影響を有さないが、任意の炭水化物
側鎖の結合を防止する。この残基を変異させるためのストラテジーは、ヒンジに
近位な領域についてちょうど記載した一般的な手順に従い得る。クローニングし
たＤＮＡ配列において点変異を生成するための方法は、当該分野において十分確
立されており、そして市販のキットがいくつかの販売業者からこの目的のために
利用可能である。
【００４５】 （実施例３ レセプター−抗体ベースの融合タンパク質の循環半減期の増加） いくつかの参考文献は、生物学的アッセイにより、ヒトＩｇＧのＦｃ領域が、
多くのリガンド結合タンパク質またはレセプターについての有用なキャリアとし
て作用し得ることを報告した。これらのうちのいくつかのリガンド結合タンパク
質（例えば、ＣＤ４、ＣＴＬＡ−４、およびＴＮＦレセプター）は、ＩｇのＦｃ
領域のＮ末端に融合された。例えば、Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３７：５
２５−５３１（１９８９）；Ｌｉｎｓｌｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：
５６１−５６９（１９９１）；Ｗｏｏｌｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：
６６０２−６６０７（１９９３）を参照のこと。レセプター−抗体ベースの融合
タンパク質の循環半減期の増加は、リガンド結合タンパク質パートナー（すなわ
ち、第２の非Ｉｇタンパク質）がより効果的に（１）細胞表面上のレセプター−
リガンド相互作用をブロックすること；または（２）血液の液相における分子（
例えば、サイトカイン）の生物学的活性を中和し、それにより、その分子がその
細胞標的に到達するのを防ぐこと、を可能にし得る。レセプター−抗体ベースの
融合タンパク質がＩｇＧレセプターに結合する能力を低減することが、それらの
インビボでの循環半減期を増強するか否かを評価するために、ヒトＣγ１ Ｆｃ
領域を有するレセプター−抗体ベースの融合タンパク質を、ヒトＣγ４ Ｆｃ領
域を有する抗体ベースの融合タンパク質と比較する。
多くのリガンド結合タンパク質またはレセプターについての有用なキャリアとし
て作用し得ることを報告した。これらのうちのいくつかのリガンド結合タンパク
質（例えば、ＣＤ４、ＣＴＬＡ−４、およびＴＮＦレセプター）は、ＩｇのＦｃ
領域のＮ末端に融合された。例えば、Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３７：５
２５−５３１（１９８９）；Ｌｉｎｓｌｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：
５６１−５６９（１９９１）；Ｗｏｏｌｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：
６６０２−６６０７（１９９３）を参照のこと。レセプター−抗体ベースの融合
タンパク質の循環半減期の増加は、リガンド結合タンパク質パートナー（すなわ
ち、第２の非Ｉｇタンパク質）がより効果的に（１）細胞表面上のレセプター−
リガンド相互作用をブロックすること；または（２）血液の液相における分子（
例えば、サイトカイン）の生物学的活性を中和し、それにより、その分子がその
細胞標的に到達するのを防ぐこと、を可能にし得る。レセプター−抗体ベースの
融合タンパク質がＩｇＧレセプターに結合する能力を低減することが、それらの
インビボでの循環半減期を増強するか否かを評価するために、ヒトＣγ１ Ｆｃ
領域を有するレセプター−抗体ベースの融合タンパク質を、ヒトＣγ４ Ｆｃ領
域を有する抗体ベースの融合タンパク質と比較する。
【００４６】 ＣＤ４−抗体ベースの融合タンパク質を構築するために、ヒトＣＤ４細胞表面
レセプターの外ドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）を、ヒト末梢血単球細胞（Ｐ
ＢＭＣ）からのＰＣＲを用いてクローニングする。クローニングされたＣＤ４レ
セプターは、実施例１に記載の適合可能な制限部位およびスプライスドナー部位
を含む。発現ベクターは、ＣＭＶ初期プロモーターの下流の唯一のＸｂａＩクロ
ーニング部位、およびそれらの内在性ＨｉｎｄＩＩＩ部位の下流のヒトＣγ１遺
伝子またはＣγ４遺伝子を含む。プラスミドの残りは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける増
殖のための細菌の遺伝情報、ならびにｄｈｆｒ選択マーカー遺伝子を含む。連結
されたＤＮＡを用いて、コンピテントな細胞を形質転換し、そして組換えプラス
ミドを個々の細菌コロニーからの制限分析から同定する。２つのプラスミドＤＮ
Ａ構築物が得られる：ＣＤ４−Ｃγ１およびＣＤ４−Ｃγ４。
レセプターの外ドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）を、ヒト末梢血単球細胞（Ｐ
ＢＭＣ）からのＰＣＲを用いてクローニングする。クローニングされたＣＤ４レ
セプターは、実施例１に記載の適合可能な制限部位およびスプライスドナー部位
を含む。発現ベクターは、ＣＭＶ初期プロモーターの下流の唯一のＸｂａＩクロ
ーニング部位、およびそれらの内在性ＨｉｎｄＩＩＩ部位の下流のヒトＣγ１遺
伝子またはＣγ４遺伝子を含む。プラスミドの残りは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける増
殖のための細菌の遺伝情報、ならびにｄｈｆｒ選択マーカー遺伝子を含む。連結
されたＤＮＡを用いて、コンピテントな細胞を形質転換し、そして組換えプラス
ミドを個々の細菌コロニーからの制限分析から同定する。２つのプラスミドＤＮ
Ａ構築物が得られる：ＣＤ４−Ｃγ１およびＣＤ４−Ｃγ４。
【００４７】 発現プラスミドを用いて、エレクトロポレーションによりマウス骨髄腫細胞を
トランスフェクトし、そしてメトトレキサート（０．１μＭ）を含有する培養培
地における増殖によりトランスフェクタントを選択する。融合タンパク質を発現
するトランスフェクタントを、ＥＬＩＳＡにより同定し、そしてプロテインＡ
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅへの結合およびそこからの溶出による精製のための融合タン
パク質を生成するために培養において増殖する。クロマトグラフィー溶出緩衝液
中の精製されたタンパク質を、ＰＢＳ中にダイアフィルトレーションし、そして
１００μｇ／ｍｌの最終濃度に希釈する。Ｂａｌｂ／ｃマウスにＣＤ４−Ｃγ１
融合タンパク質またはＣＤ４−Ｃγ４融合タンパク質のいずれか０．２ｍｌ（２
０μｇ）を注射し、そして薬物動態を実施例１．３に記載されるように試験する
。ＣＤ４−Ｃγ４融合タンパク質は、ＣＤ４−Ｃγ１融合タンパク質よりも有意
に長い半減期を有する。
トランスフェクトし、そしてメトトレキサート（０．１μＭ）を含有する培養培
地における増殖によりトランスフェクタントを選択する。融合タンパク質を発現
するトランスフェクタントを、ＥＬＩＳＡにより同定し、そしてプロテインＡ
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅへの結合およびそこからの溶出による精製のための融合タン
パク質を生成するために培養において増殖する。クロマトグラフィー溶出緩衝液
中の精製されたタンパク質を、ＰＢＳ中にダイアフィルトレーションし、そして
１００μｇ／ｍｌの最終濃度に希釈する。Ｂａｌｂ／ｃマウスにＣＤ４−Ｃγ１
融合タンパク質またはＣＤ４−Ｃγ４融合タンパク質のいずれか０．２ｍｌ（２
０μｇ）を注射し、そして薬物動態を実施例１．３に記載されるように試験する
。ＣＤ４−Ｃγ４融合タンパク質は、ＣＤ４−Ｃγ１融合タンパク質よりも有意
に長い半減期を有する。
【００４８】 （等価物） 本発明は、本発明の精神または必須の特徴から逸脱することなく、他の特定の
形態で具体化され得る。それゆえ、前述の実施態様は、本明細書中に記載される
発明を限定するのではなく、全てがそれぞれ例示であるとみなされるべきである
。従って、本発明の範囲は、前述の説明ではなく、添付の特許請求の範囲に示さ
れ、そして特許請求の範囲の意味およびその等価物の範囲に入る全ての変更は、
本発明の範囲に包含されることが意図される。
形態で具体化され得る。それゆえ、前述の実施態様は、本明細書中に記載される
発明を限定するのではなく、全てがそれぞれ例示であるとみなされるべきである
。従って、本発明の範囲は、前述の説明ではなく、添付の特許請求の範囲に示さ
れ、そして特許請求の範囲の意味およびその等価物の範囲に入る全ての変更は、
本発明の範囲に包含されることが意図される。
【００４９】 本発明の上記および他の目的、特徴、および利点、ならびに本発明自体は、添
付の図面と一緒に読んだ場合、好ましい実施態様の以下の説明からより十分に理
解され得る。
付の図面と一緒に読んだ場合、好ましい実施態様の以下の説明からより十分に理
解され得る。
【配列表】
【図１】 図１は、最大のアミノ酸同一性になるようにアラインメントされた、Ｃγ１お
よびＣγ３の定常領域のアミノ酸配列の相同性アラインメントであり、ここで、
非保存的アミノ酸は四角で同定される。
よびＣγ３の定常領域のアミノ酸配列の相同性アラインメントであり、ここで、
非保存的アミノ酸は四角で同定される。
【図２】 図２は、最大のアミノ酸同一性になるようにアラインメントされた、Ｃγ１、
Ｃγ２、およびＣγ４の定常領域のアミノ酸配列の相同性アラインメントであり
、ここで、非保存的アミノ酸は四角で同定される。
Ｃγ２、およびＣγ４の定常領域のアミノ酸配列の相同性アラインメントであり
、ここで、非保存的アミノ酸は四角で同定される。
【図３】 図３は、関連する制限部位を示す、抗体ベースの融合タンパク質をコードする
遺伝子構築物のマップの模式図である。
遺伝子構築物のマップの模式図である。
【図４】 図４は、抗体ｈｕ−ＫＳ−１／４および抗体ベースの融合タンパク質であるｈ
ｕ−ＫＳγ−ＩＬ２およびｈｕ−ＫＳγ４−ＩＬ２の、過剰のマウスＩｇＧの存
在下（黒棒）または非存在下（点刻棒）でのマウスＪ７７４細胞上のＦｃレセプ
ターに対する結合を示す棒グラフである。
ｕ−ＫＳγ−ＩＬ２およびｈｕ−ＫＳγ４−ＩＬ２の、過剰のマウスＩｇＧの存
在下（黒棒）または非存在下（点刻棒）でのマウスＪ７７４細胞上のＦｃレセプ
ターに対する結合を示す棒グラフである。
【図５】 図５は、ｈｕ−ＫＳγ１−ＩＬ２（黒菱形）およびｈｕ−ＫＳγ４−ＩＬ２（
黒三角）、ならびにｈｕ−ＫＳγ１−ＩＬ２（白菱形）およびｈｕ−ＫＳγ４−
ＩＬ２（白三角）のインタクトな融合タンパク質の総抗体（遊離抗体および融合
タンパク質）のインビボでの血漿濃度を時間の関数として示す折れ線グラフであ
る。
黒三角）、ならびにｈｕ−ＫＳγ１−ＩＬ２（白菱形）およびｈｕ−ＫＳγ４−
ＩＬ２（白三角）のインタクトな融合タンパク質の総抗体（遊離抗体および融合
タンパク質）のインビボでの血漿濃度を時間の関数として示す折れ線グラフであ
る。
【図６】 図６は、Ｆｃレセプターに対する結合親和性を低減させる変異を有する抗体ベ
ースの融合タンパク質を構築するためのプロトコルの模式図である。
ースの融合タンパク質を構築するためのプロトコルの模式図である。
【図７】 図７は、ｈｕ−ＫＳγ１−ＩＬ２（白菱形）；変異させたｈｕ−ＫＳγ１−Ｉ
Ｌ２（白四角）およびｈｕ−ＫＳγ４−ＩＬ２（白三角）のインタクトな融合タ
ンパク質のインビボでの血漿濃度を時間の関数として示す折れ線グラフである。
Ｌ２（白四角）およびｈｕ−ＫＳγ４−ＩＬ２（白三角）のインタクトな融合タ
ンパク質のインビボでの血漿濃度を時間の関数として示す折れ線グラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ０７Ｋ 14/52 // Ｃ０７Ｋ 14/52 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ロ， キン−ミン アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02173， レキシントン， キャロル レ ーン ６ (72)発明者 ラン， ヤン アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02178， ベルモント， ニュートン ス トリート 21 (72)発明者 ウェゾロウスキー， ジョン アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02189， ウェイマウス， リバティ ベ ル サークル 97 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA27 BA29 BA30 BA63 CA07 DA02 EA02 HA01 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA40 DA04 DA11 DA12 DA14 DA50 DA51 DA83 EA20 EA28 FA74 GA26
Claims (26)
- 【請求項１】 増強された循環半減期を有する抗体ベースの融合タンパク質
であって、Ｆｃレセプターに対する実質的に減少した結合親和性を有する、免疫
グロブリン（Ｉｇ）重鎖の少なくとも一部分を含み、重鎖の該部分が第２の非Ｉ
ｇタンパク質に連結されており、該抗体ベースの融合タンパク質が、連結されて
いない第２の非Ｉｇタンパク質よりも長い循環半減期をインビボで有する、抗体
ベースの融合タンパク質。 - 【請求項２】 重鎖の前記部分が、ＩｇＧ２定常領域またはＩｇＧ４定常領
域の少なくともＣＨ２ドメインを含む、請求項１に記載の抗体ベースの融合タン
パク質。 - 【請求項３】 重鎖の前記部分が、Ｌｅｕ234、Ｌｅｕ235、Ｇｌｙ236、Ｇ ｌｙ237、Ａｓｎ297、およびＰｒｏ331からなる群より選択される１以上のアミ ノ酸での変異または欠失を有する、ＩｇＧ１定常領域の少なくとも一部分を含む
、請求項１に記載の抗体ベースの融合タンパク質。 - 【請求項４】 重鎖の前記部分が、Ｌｅｕ281、Ｌｅｕ282、Ｇｌｙ283、Ｇ ｌｙ284、Ａｓｎ344、およびＰｒｏ378からなる群より選択される１以上のアミ ノ酸での変異または欠失を有する、ＩｇＧ３定常領域の少なくとも一部分を含む
、請求項１に記載の抗体ベースの融合タンパク質。 - 【請求項５】 重鎖の前記部分が、免疫グロブリン防御レセプターについて
の結合親和性をさらに有する、請求項１に記載の抗体ベースの融合タンパク質。 - 【請求項６】 重鎖の前記部分が、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃ
γＲＩＩＩからなる群より選択されるＦｃレセプターについての実質的に減少し
た結合親和性を有する、請求項１に記載の抗体ベースの融合タンパク質。 - 【請求項７】 前記第２の非Ｉｇタンパク質が、サイトカイン、リガンド結
合タンパク質、およびタンパク質性毒素からなる群より選択される、請求項１に
記載の抗体ベースの融合タンパク質。 - 【請求項８】 前記サイトカインが、腫瘍壊死因子、インターロイキン、お
よびリンホカインからなる群より選択される、請求項１に記載の抗体ベースの融
合タンパク質。 - 【請求項９】 前記腫瘍壊死因子が、腫瘍壊死因子αである、請求項８に記
載の抗体ベースの融合タンパク質。 - 【請求項１０】 前記インターロイキンがインターロイキン２である、請求
項８に記載の抗体ベースの融合タンパク質。 - 【請求項１１】 前記リンホカインがリンホトキシンまたはコロニー刺激因
子である、請求項８に記載の抗体ベースの融合タンパク質。 - 【請求項１２】 前記コロニー刺激因子が、顆粒球−マクロファージコロニ
ー刺激因子である、請求項１１に記載の抗体ベースの融合タンパク質。 - 【請求項１３】 前記リガンド結合タンパク質が、ＣＤ４、ＣＴＬＡ−４、
ＴＮＦレセプター、およびインターロイキンレセプターからなる群より選択され
る、請求項１に記載の抗体ベースの融合タンパク質。 - 【請求項１４】 抗体ベースの融合タンパク質の循環半減期を増加させる方
法であって、Ｉｇ重鎖の少なくとも一部分を第２の非Ｉｇタンパク質に連結する
工程であって、ここで、重鎖の該部分が、Ｆｃレセプターについて実質的に減少
した結合親和性を有し、それにより、連結していない第２の非Ｉｇタンパク質よ
りも長い循環半減期をインビボで有する抗体ベースの融合タンパク質を形成する
、工程、を包含する、方法。 - 【請求項１５】 重鎖の前記部分が、ＩｇＧ２定常領域またはＩｇＧ４定常
領域の少なくともＣＨ２ドメインを含む、請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１６】 抗体ベースの融合タンパク質の循環半減期を増加させる方
法であって、以下の工程： （ａ）ＩｇＧ１定常領域の１以上のアミノ酸に変異または欠失を導入する工程で
あって、該アミノ酸が、Ｌｅｕ234、Ｌｅｕ235、Ｇｌｙ236、Ｇｌｙ237、Ａｓｎ 297 、およびＰｒｏ331からなる群より選択され、それにより、Ｆｃレセプターに
ついての実質的に減少した結合親和性を有するＩｇ重鎖が生成される、工程；な
らびに （ｂ）工程（ａ）の該重鎖の少なくとも一部分を第２の非Ｉｇタンパク質に連結
する工程であって、それにより、連結していない第２の非Ｉｇタンパク質よりも
長い循環半減期をインビボで有する、抗体ベースの融合タンパク質を形成する、
工程、 を包含する、方法。 - 【請求項１７】 抗体ベースの融合タンパク質の循環半減期を増加させる方
法であって、以下の工程： （ａ）ＩｇＧ３定常領域の１以上のアミノ酸に変異または欠失を導入する工程で
あって、該アミノ酸が、Ｌｅｕ281、Ｌｅｕ282、Ｇｌｙ283、Ｇｌｙ284、Ａｓｎ 344 、およびＰｒｏ378からなる群より選択され、それにより、Ｆｃレセプターに
ついての実質的に減少した結合親和性を有するＩｇ重鎖が生成される、工程；な
らびに （ｂ）工程（ａ）の該Ｉｇ重鎖の少なくとも一部分を第２の非Ｉｇタンパク質に
連結する工程であって、それにより、連結していない第２の非Ｉｇタンパク質よ
りも長い循環半減期をインビボで有する、抗体ベースの融合タンパク質を形成す
る、工程、 を包含する、方法。 - 【請求項１８】 重鎖の前記部分が、免疫グロブリン防御レセプターについ
ての結合親和性をさらに有する、請求項１４、１６、または１７に記載の方法。 - 【請求項１９】 重鎖の前記部分が、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦ
ｃγＲＩＩＩからなる群より選択されるＦｃレセプターについての実質的に減少
した結合親和性を有する、請求項１４、１６、または１７に記載の方法。 - 【請求項２０】 前記第２の非Ｉｇタンパク質が、サイトカイン、リガンド
結合タンパク質、およびタンパク質性毒素からなる群より選択される、請求項１
４、１６、または１７に記載の方法。 - 【請求項２１】 前記サイトカインが、腫瘍壊死因子、インターロイキン、
およびリンホカインからなる群より選択される、請求項１４、１６、または１７
に記載の方法。 - 【請求項２２】 前記腫瘍壊死因子が、腫瘍壊死因子αである、請求項２１
に記載の方法。 - 【請求項２３】 前記インターロイキンがインターロイキン２である、請求
項２１に記載の方法。 - 【請求項２４】 前記リンホカインがリンホトキシンまたはコロニー刺激因
子である、請求項２１に記載の方法。 - 【請求項２５】 前記コロニー刺激因子が、顆粒球−マクロファージコロニ
ー刺激因子である、請求項２４に記載の方法。 - 【請求項２６】 前記リガンド結合タンパク質が、ＣＤ４、ＣＴＬＡ−４、
ＴＮＦレセプター、およびインターロイキンレセプターからなる群より選択され
る、請求項１４、１６、または１７に記載の方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US7588798P | 1998-02-25 | 1998-02-25 | |
| US60/075,887 | 1998-02-25 | ||
| PCT/US1999/003966 WO1999043713A1 (en) | 1998-02-25 | 1999-02-24 | Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins |
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|---|---|
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000533463A Pending JP2002505086A (ja) | 1998-02-25 | 1999-02-24 | 抗体ベースの融合タンパク質の循環半減期の増強 |
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