JP4234438B2 - ハイブリッド・イソタイプ抗体部分を含有する蛋白質の発現技術 - Google Patents

Description

本出願は、２００１年３月７日出願の米国特許出願第６０／２７４０９６号を優先権主張し、その特典を請求しており、参照により、その開示を全て、本明細書に組み入れる。

本発明は、一般的に、２種類またはそれ以上のイソタイプに由来する部分を具える抗体のための手法と構成、および、それらから誘導される融合蛋白質に関し、この蛋白質には変更されたエフェクター機能、増強された蛋白質発現及び／または、オリゴマー化の抑制を具えている、抗体部分を含有している蛋白質が含まれる。本発明は、特には、ヒンジ領域は、１つのイソタイプに由来しており、かつＣＨ２ドメインは、異なるイソタイプに由来している、抗体ならびに融合蛋白質に関する。

遺伝子操作した細胞による蛋白質発現の効率は、重要な商業的な関心事である。商業的に、重要な蛋白質の幾つかは、正確な折りたたみと糖付加を確実にするため、真核細胞、例えば、ほ乳類細胞、植物細胞、あるいは酵母細胞から、一番よく産生されている。しかし、真核細胞の大量培養物を維持するコストは、この方法で産生された蛋白質は、生産に大きな経費がかかることを意味している。したがって、当該分野では、真核細胞からの蛋白質発現水準を最大限にすることが、必要となっている。

関連する問題は、真核細胞から産生される治療用蛋白質は、正しい構造状態で発現されなければならないことである。通常、転写および翻訳の機構は、遺伝子操作された細胞が、蛋白質をコードする核酸によって、その配列が決定されている蛋白質を産生することを保証はしている。しかし、転写と翻訳の後、この蛋白質は、適切な折りたたみをし損ない、そして、分解される可能性がある。あるいは、蛋白質は、凝集状態で産生され、そのため、その活性が下がる可能性がある。凝集した蛋白質は、活性であったとしても、凝集していない蛋白質と比較して、増大した免疫原性のため、薬理学的に許容できない可能性がある。従って、一般的に、薬理学的に許容できる蛋白質調製物は、実質的に凝集した蛋白質を含んではならない。

遺伝子操作された真核細胞から発現される蛋白質の量は、コードしている遺伝子の転写速度、ｍＲＮＡスプライシングならびに核からの輸送の効率、および翻訳の効率の関数がある。蛋白質発現における、これらの過程の役割は、十分理解されており、遺伝子操作ならびに蛋白質発現の技術分野の当業者は、一般的に、効果的な転写、スプライシング、ｍＲＮＡ輸送、および翻訳が可能な発現構造物の設計中に、適切な核酸配列を組み込ませることができる。

しかし、真核細胞から産生される、正しく折りたたまれ、凝集していない蛋白質の量は、また、転写、スプライシング、ｍＲＮＡ輸送、翻訳を決定する核酸配列と同様に、蛋白質のアミノ酸配列、ならびに翻訳後の修飾の関数でもある。例えば、細胞中で合成される蛋白質の相当の部分は分解されると考えられる。分解されるか否かを決定する、蛋白質の特性は、現在盛んな研究の対象であるが、現在のところは、単に蛋白質の配列を調べるだけで、蛋白質の折りたたみ、分解または凝集の効率を予測することは、不可能である。天然に存在する蛋白質の幾つかは、効率的に折りたたまれ、蛋白質分解に対して耐性を示し、かつ凝集をすることもない。反対に、他の蛋白質は、効率的な折りたたみがなされず、迅速に分解される、また、凝集を起こす。

抗体ならびに、ここでは、抗体融合蛋白質またはＩｇ融合蛋白質と称する、抗体の一部を含む人工の蛋白質は、抗体の可変領域の標的能力ならびに種々のその他の蛋白質と結合する定常領域の能力に関連する、様々な目的に有用である。抗体および抗体融合蛋白質の調製物は、特に、それらが正しく折りたたまれ、かつ凝集していない際に、有用である。従って、当該技術分野では、低減された凝集性を示す、抗体および抗体融合蛋白質の調製物を製造するための手法と構成が必要とされている。

加えて、抗体および抗体融合蛋白質は、様々なその他の蛋白質と結合する、その能力は、例えば、特異的なエフェクター機能を引き出すことを可能とするので、有用である。場合によっては、特異的なエフェクター機能は、望ましいが、しばしば、エフェクター機能の欠失は好ましい。融合蛋白質の抗体成分を変更して、改変された抗体を利用することによって、エフェクター機能を低減させるか、または除去することも可能である。抗体および抗体融合蛋白質調製物は、また、改変されて、機能性が変更されている際に、有用である。従って、当該技術分野では、変更されたエフェクター機能を有する、改変された抗体および抗体融合蛋白質を産生するため手法と構成が必要とされている。

蛋白質薬剤は、プロテアーゼによって分解される可能性があり、そのため、それらの送達および薬物動態特性は、最適には及ばない。当該技術分野では、特定の蛋白質の有用な特性は有している上に、より高いプロテアーゼ耐性を有する、蛋白質薬剤の改善が必要とされている。

本発明は、本来の抗体、免疫サイトカイン、免疫融合物、免疫リガンド、ならびに、場合によっては、変更された、組み合わされた、あるいは減少されたＦｃのエフェクター機能を具える、所望する融合蛋白質の発現、適切なオリゴマー化、精製およびプロテアーゼ耐性を増強する、その他の抗体とＦｃの融合蛋白質を産生する上で有用な手法と構成を特徴にしている。具体的には、本発明は、本来の抗体ならびに抗体部分を含有している融合蛋白質中で使用するため、場合によっては、変異されたＩｇ成分を使用している、ハイブリッド・イソタイプを有する抗体部分を提供する。

ＩｇＧ／ＩｇＧハイブリッド・イソタイプ
一群の好ましい実施態様では、本発明は、減少したエフェクター機能と、改善された組み立て性を具える融合蛋白質を提供する。かかる融合蛋白質は、特には、該Ｉｇ部分は、発現を増強する、血漿半減期を改善するために役立つが、該Ｉｇ部分の免疫機能は、必要ではない際に、有用である。

これらの実施態様においては、融合蛋白質は、好ましくは、ＩｇＧ１のヒンジ領域あるいはＩｇＧ４のヒンジ領域と組み合わされた、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４のＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを含み、後者のヒンジ領域は、重鎖に由来する部分の間での、正しいジスルフィド結合形成を促進する変異を含んでいることが好ましい（Ａｎｇａｌ Ｓ他、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９３ Ｊａｎ； ３０（１）：１０５〜８）。この実施態様の融合蛋白質は、高レベルの発現を容易となし、かつ完全な抗体ならびにＦｃ領域を含有するＩｇ融合蛋白質の正確な組み立てを向上させる。

より好ましい実施態様では、融合蛋白質は、また、Ｉｇ部分中に一つまたはそれ以上の変異を含有する。例えば、該Ｉｇ部分を変異させて、望ましくない、残存するエフェクター機能をさらに低減させる。例えば、ＩｇＧ２のＣＨ２ドメイン中のＣ１ｑ結合部位を変異させる。例えば、通常のＩｇＧ４は、ＩｇＧ１（Ｅｕ命名法）中の３３１位の対応するプロリンの代わりに、セリンを含有するので、補体と結合しない（Ｔａｏ、 ＭＡ他（１９９３） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７８：６６１〜６６７； Ｂｒｅｋｋｅ、ＯＨ他 （１９９４） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４：２５４２〜２５４７）。ＩｇＧ２中の同様な変異は、Ｃ１ｑ結合を低減する。Ｃ１ｑ結合に関与することが知られているその他の残基、例えは、３１８、３２０、３２２および２９７位の残基を改変して、その結果、Ｃ１ｑ結合を減少させることができる（Ｄｕｎｃａｎ ＡＲ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ：３３２：７３８〜７４０）。

他の一群の好ましい実施態様では、ヒンジ領域中の変異もまた存在する。例えば、抗体の軽鎖もまた存在している場合には、その通常の位置に通常の数のシステイン残基を具えているＩｇＧ１のヒンジ領域の形態が好ましい。しかし、抗体の軽鎖が、別個のペプチド鎖として存在していない場合には、第１のシステインは、他の残基へと変異されている、ＩｇＧ１ヒンジが好ましい。例えば、Ｆｃ−Ｘ蛋白質、Ｘ−Ｆｃ蛋白質中、ならびに、ポリペプチド・リンカーによって、軽鎖の可変領域が重鎖に結び付けられている、１本鎖抗体中においては、かかる変異ヒンジ領域を使用すると有用である。ＩｇＧ１ヒンジ中の第１のシステインは、この場合には、セリンに変異していることが好ましい。

変異ヒンジ領域を伴う、第２の種類の実施態様では、２個の重鎖間における効果的なジスルフィド結合を可能とする、変異型ＩｇＧ４ヒンジを使用する。

変異ヒンジ領域を伴う、第３の種類の実施態様では、最初の２個のシステインがそれぞれ他のアミノ酸へと変異されている、変異型ＩｇＧ２ヒンジが、ハイブリッド・イソイプ抗体またはＩｇ融合蛋白質中で使用される。かかる変異ヒンジは、また、専らＩｇＧ２に由来している、抗体またはＩｇ融合蛋白質中で好適に使用できる。例えば、配列 ＥＲＫＳＳＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号：１）を有する、改変ＩｇＧ２ヒンジを、抗体またはＩｇ融合蛋白質に応じて使用する。他のヒンジの有用な種類は、例えば、その中では、ダッシュより前の５個のアミノ酸は、ＩｇＧ４に由来し、残りのアミノ酸は、ＩｇＧ２に由来している、配列 ＥＳＫＹＧ−ＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号：２）のような、ＩｇＧ２ヒンジとＩｇＧ４ヒンジとのハイブリッドである。これらのヒンジ実施態様は、該蛋白質の正しい組み立てを促進するので、これらの実施態様は、特には、真核細胞から発現し、分泌される抗体およびＩｇ融合蛋白質に関して有用である。これらの実施態様は、ＩｇＧ１ヒンジに対する代替として、使用してもよい。これら抗体ヒンジの実施態様の鍵となる特徴は、それらは、システイン残基２個のみを有している点であることである。

さらに他の実施態様の種類は、Ｉｇと非Ｉｇ部分との間の結合部における、ハイブリッド・イソタイプＩｇ融合蛋白質のＩｇ部分における改変に関連している。一つの実施態様では、融合蛋白質のアミノ酸配列中の変換は、該Ｉｇ部分と非Ｉｇ部分との結合部に選択的であり、好ましくは、結合点の１０個のアミノ酸中に存在する。より好ましくは、該アミノ酸の変更は、抗体部分のＣ末端リジンの、アラニンまたはロイシンなどの疎水性アミノ酸への変更を含んでいる。

他の実施態様は、融合蛋白質の半減期を短縮することが望ましい状況において、有用である。ＩｇＧ３は、ＣＨ３ドメイン中に位置するＦｃＲｎ／ＦｃＲｐ結合部位における変異のため（Ｈ４３５からＲ）、他のＩｇＧイソタイプと比較して、短い半減期を有する（Ｗａｒｄ、ＥＳ．ａｎｄ Ｇｈｅｔｉ、Ｖ （１９９５） Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２：７７〜９４ 参照）。短期間の曝露が望ましい際には、ＩｇＧ３ ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを具える融合蛋白質を、使用することが可能である。この実施態様によれば、ＩｇＧ１ヒンジと組み合わせて、ＩｇＧ３ ＣＨ３ドメインを使用することが有用である。かかるＩｇＧ１（ヒンジ）−ＩｇＧ３（ＣＨ３）融合蛋白質は、ＩｇＧ３ヒンジとＩｇＧ３ ＣＨ３ドメインを含有するＩｇ融合蛋白質と比較して、優れた発現特性と組み立て特性とを有している。

短い血漿半減期、低減されたエフェクター機能、ならびに効率的な組み立て性を有するように、設計されるＩｇ融合蛋白質のより好ましい実施態様では、ヒンジ領域は、ＩｇＧ１に由来し、ＣＨ２ドメインは、ＩｇＧ２に由来し、そして、ＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ３に由来している、ハイブリッドＩｇ領域が使用される。

ＩｇＧ／ＩｇＡハイブリッド・イソタイプ
本発明の別の実施態様は、高められたプロテアーゼ耐性と、増強された血漿半減期を具えたハイブリッド・イソタイプＩｇ融合蛋白質を提供する。この実施態様は、特には、例えば、Ｉｇ融合蛋白質薬剤の経口的な送達において、消化管またはその他の粘膜組織のような、プロテアーゼが豊富な環境に、Ｉｇ融合蛋白質が曝露される状況に、有用である。この実施態様では、ＩｇＧおよびＩｇＡの定常領域の要素を含有しているＩｇ融合蛋白質が提供される。好ましい実施態様では、ＩｇＡ１のヒンジと、ＩｇＧのＣＨ２およびＣＨ３ドメインとが利用される。別の好ましい実施態様では、ＩｇＡのＦｃ領域中のＯ−結合糖鎖形成部位をコードするアミノ酸部分が、ＩｇＧのＦｃ領域中に挿入される。

ＩｇＧ／ＩｇＭハイブリッド・イソタイプ
本発明のさらに他の実施態様は、ＩｇＡまたはＩｇＭのオリゴマー化特性を具えるが、ＩｇＧに特徴的なエフェクター機能を有している、ハイブリッド・イソタイプ抗体ならびにＩｇ融合蛋白質を提供する。例えば、ＩｇＭのＣＨ３およびＣＨ４ドメインに融合されている、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３のヒンジ領域とＣＨ２ドメインを含んている蛋白質が提供される。より好ましい実施態様では、重鎖ならびに軽鎖の可変領域を含み、かつ、ＩｇＭのＣＨ３およびＣＨ４ドメインに融合されている、ＩｇＧヒンジとＣＨ２領域をも含んでいる抗体が、提供される。他のより好ましい実施態様では、その中で、Ｘは、好ましくは細胞表面受容体に対するリガンドであり、また、Ｆｃ部分は、ＩｇＭのＣＨ３およびＣＨ４ドメインを含んでいる、Ｘ−Ｆｃ型のＩｇ融合蛋白質が、提供される。かかる分子は、ＩｇＧのＡＤＣＣエフェクター機能に、ＩｇＭの高い結合価を組み合わせている。

ＩｇＭまたはＩｇＡのＣＨ４ドメインを利用する、ハイブリッド・イソタイプの好ましい実施態様では、該ＣＨ４ドメインのＣ末端システインを変異させて、Ｊ鎖へのジスルフィド結合を阻止する。これは、Ｉｇ融合蛋白質の消化管中へ分泌を抑制している。

好ましい非Ｉｇ部分
本発明の融合蛋白質中における、非Ｉｇ部分の好ましい種類は、Ｉｇ融合蛋白質の一部ではない際には、通常、細胞外にある蛋白質または部分である。例えば、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、分泌酵素、あるいは膜貫通型受容体の細胞外部分である。

好ましい実施態様では、該非イムノグロブリン成分は、抗肥満蛋白質などの蛋白質である。例えば、非イムノグロブリン成分とは、レプチン、ＣＮＴＦ、ＣＬＣ／ＣＬＦ−１、またはＡｃｒｐ３０の一部である。

さらに他の好ましい実施態様では、非イムノグロブリン成分は、エリスロポエチンまたはＥＰＯなどの蛋白質である。

他の好ましい実施態様では、該融合蛋白質の非イムノグロブリン成分は、ホルモンである。例えば、非イムノグロブリン成分は、インシュリン、成長ホルモン、またはグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）である。

他の実施態様では、該融合蛋白質の非イムノグロブリン成分は、サイトカインである。本明細書では「サイトカイン」という用語は、そのサイトカインに対する受容体を有する細胞中で特異的応答を惹起する、天然に存在する、または組換え蛋白質、それらの類縁体、ならびにそれらの断片を記述するために使用する。サイトカインは、細胞によって産生され、分泌されることが可能な蛋白質であることが好ましい。好ましくは、サイトカインには、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、Ｌ−１６およびＩＬ−１８などの、インターロイキン類、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、Ｇ−ＣＳＦおよびエリスロポエチンなどの、造血因子、ＴＮＦαなどの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、リンホトキシンなどのリンホトキシン類、レプチンなどの代謝過程制御因子、インターフェロンα、インターフェロンβ、およびインターフェロンγなどの、インターフェロン類、ならびにケモカインが含まれる。好ましくは、本発明のＩｇ−サイトカイン融合蛋白質は、サイトカインの生物活性を示す。

他の好ましい実施態様では、該融合蛋白質の非イムノグロブリン成分は、生物活性を具えたリガンド結合蛋白質である。かかるリガンド結合蛋白質は、例えば、（１）細胞表面における、受容体−リガンド相互作用を遮断するか、または（２）血液の流体相中の分子（例えば、サイトカイン）の生物活性を中和することで、それによって、それがその細胞標的に到達するのを防ぐことができる。好ましいリガンド結合蛋白質には、ＣＤ４、ＣＴＬＡ−４、ＴＮＦ受容体、またはＩＬ−１やＩＬ−４受容体などのインターロイキン受容体が含まれる。好ましくは、本発明の抗体受容体融合蛋白質は、該リガンド結合蛋白質の生物活性を示す。一つの非常に好ましい実施態様は、蛋白質薬剤 エンブレル中で使用される、細胞外ＴＮＦ受容体ドメイン断片を、ＴＮＦＲ−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３またはヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＴＮＦＲの形態で含んでおり、その中の、該ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４に由来しており、該二量体Ｆｃ中の２個のヒンジ領域それぞれは、３個またはそれ以下のシステイン、さらに好ましくは、２個またはそれ以下のシステインを有する。

好ましいリガンド結合蛋白質の他の種類は、蛋白質よりは、小さい分子と結合する能力を有している。例えば、アビジンを、ハイブリッド・イソタイプＩｇ部分、例えば抗体に融合すると好便である。そして、該ハイブリッド・イソタイプ抗体−アビジン融合体は、マウスまたはヒトなどのほ乳類に投与されると、該抗体のＶ領域の特異性によって決定される、体内の標的組織中に集中する。該抗体−アビジン融合蛋白質が、十分に体内から排除された後、ビオチンと治療分子との複合体が投与される。該ビオチン複合体は、アビジンとの結合によって、該標的組織中に集中し、その結果、非標的組織中における、該治療分子の濃縮によって引き起こされ得る副作用が減少する。この戦略は、その他のリガンド／リガンド結合蛋白質の対によっても、利用することができる。

他の好ましい非イムノグロブリン部分の種類は、酵素である。例えば、独特の特異性を具える酵素を、ハイブリッド・イソタイプＩｇ部分、例えば抗体に融合することができる。そして、該ハイブリッド・イソタイプ抗体−酵素融合体は、マウスまたはヒトなどのほ乳類に投与されると、該抗体のＶ領域の特異性によって決定される、体内の標的組織中に集中する。本発明の一つの好ましい治療方法では、該抗体−酵素融合蛋白質が、十分に体内から排除された後、該酵素によって切断され、活性型になることができる、プロドラッグが投与される。該活性化された薬剤は、標的組織中に集中されていき、その結果、非標的組織中における、活性化された薬剤分子の濃縮によって引き起こされ得る副作用が減少する。この実施態様の非常に好ましい形態では、該活性化された薬剤は、例えば、細胞傷害性薬剤などの、抗癌剤である。他の非常に好ましい実施態様では、該酵素自体が治療活性を有する。例えば、オンコナーゼなどのＲＮアーゼを、ハイブリッド・イソタイプ抗体融合蛋白質と結合させて、抗体Ｖ領域によって、腫瘍を標的とさせる。

核酸
本発明はまた、ハイブリッド・イソタイプを具えるＩｇ融合蛋白質および完全な抗体の発現および分泌を促進する、新規な核酸配列、ならびに、かかる核酸の構築方法を提供する。

抗体蛋白質をコードする遺伝子配列の特に有用な特徴は、その可変領域、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４領域は、別々のエキソンによってコードされることである。この特徴は、「エキソン・シャッフリング」によるハイブリッド・イソタイプＩｇ融合蛋白質の操作を容易としている（Ｚｕｃｋｉｅｒ他、 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （１９９８） ５８：３９０５〜８、Ｐｏｏｎ他、 Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （１９９５） ２７０：８５７１〜７、Ｊｅｆｆｅｒｉｓ Ｒ他、Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９９０） ２７：１２３７〜４０、Ｃｈａｐｐｅｌ Ｍ．Ｓ．、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． （１９９１） ８８：９０３６〜４０、Ｓｅｎｉｏｒ ＢＷ他、 Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． （２０００） ６８：４６３〜９）。

Ｆｃ融合蛋白質の場合、核酸分子は、様々な構造の蛋白質をコードすることができる。一群の好ましい実施態様では、核酸分子は、５’から３’方向に向かって、（ｉ）シグナル配列、イムノグロブリンＦｃ領域および標的蛋白質配列、または（ｉｉ）シグナル配列、標的蛋白質、およびイムノグロブリンＦｃ領域、あるいは（ｉｉｉ）シグナル配列、第１標的蛋白質、イムノグロブリンＦｃ領域、および第２標的蛋白質を順次コードする。それによって、得られた核酸分子は、そのＸおよびＹは、標的蛋白質または蛋白質類である、Ｆｃ−Ｘ、Ｘ−Ｆｃ、またはＸ−Ｆｃ−Ｙ構造をコードする。例えば、ＸおよびＹは、それ自身融合蛋白質であることが可能である。場合によっては、リンカー複数が、これらの部分の間に、コードされていてもよい。

同様に、本発明においては、完全な抗体Ｉｇ融合蛋白質は、重鎖部分のそれぞれおよび軽鎖部分のそれぞれ、そのＮ末端のシグナル配列をコードするように設計する。

本発明の核酸を、複製可能な発現ベクター中に、機能的に関連づけて組み込まれ、そして、それは、融合蛋白質の産生に適した、真核宿主細胞中に導入することができる。得られたＩｇ融合蛋白質は、効率的に産生され、該真核宿主細胞から分泌される。分泌されたＩｇ融合蛋白質は、真核宿主細胞を溶解することなく、培地から収集することができる。該蛋白質産物は、所望する通常の試薬を使用して、活性を測定し、かつ／または、いずれも汎用の技術を使用して、精製し、かつ／または融合パートナーから分離することができる。あるいは、本発明の核酸は、細菌細胞中に導入して、そして、標準的技術に従って、得られたＩｇ融合蛋白質の精製することができる。

本発明はまた、細胞中で産生される抗体およびＩｇ融合蛋白質の濃度を高める方法を提供する。該方法は、真核細胞、好ましくはほ乳類細胞中での産生に適用することが好ましい。例えば、該方法においては、Ｉｇ部分のドメインをコードしている核酸配列を、他の抗体イソタイプのドメインをコードしている対応の配列、または変異配列で交換して、本明細書中で記載するような、改変蛋白質の産生を評価することによって、発現濃度を比較し、最高濃度を与える特定の発現構造物を選択することによって、原料抗体あるいはＩｇ融合蛋白質の産生が向上される。このプロセスは、反復して使用することが可能である。ヒンジ領域を交換することは、特に有用である。

治療
本発明はまた、改変された抗体およびＩｇ融合蛋白質を使用する治療方法を提供する。従って、本発明は、効率的かつ安価である製造方法、ならびにより免疫原性の少ない蛋白質を提供する。

本発明の、前述およびその他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明、図面、ならびに、それに続くクレームによって、さらに明らかとなろう。

定義
本発明においては、イソタイプによって、抗体の機能活性を決定している、イムノグロブリンの重鎖定常（Ｃ）領域の種類を表す。ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥを含む５種類の主なクラスがある。

ＩｇＡは、α重鎖で特徴付けられるイムノグロブリンのクラスを意味する。

ＩｇＤは、β重鎖で特徴付けられるイムノグロブリンのクラスを意味する。

ＩｇＥは、ε重鎖で特徴付けられるイムノグロブリンのクラスを意味する。

ＩｇＭは、μ重鎖で特徴付けられるイムノグロブリンのクラスを意味する。

ＩｇＧは、γ重鎖で特徴付けられるイムノグロブリンのクラスを意味する。

「ガンマ１」または「γ１」は、ＩｇＧ１に由来する重鎖またはその一部分を意味する。同様に、「ガンマ２」または「γ２」は、ＩｇＧ２に由来している。以下同様。

本発明においては、アロタイプによって、イムノグロブリンの同一重鎖Ｃ遺伝子の対立遺伝子多型を意味する。これらの決定素は、全てではないが、いくつかの種において、見出される。

本発明においては、イディオタイプは、抗体の可変（Ｖ）領域上に見出される抗原決定基を意味し、個別的に再編成されている、Ｖ_HおよびＶ_L遺伝子による。

本発明においては、ＦｃＲｐとしても知られる、ＦｃＲｎは、ＩｇＧのクリアランスを調節する、ベータ−２ミクログロブリン含有新生児腸輸送受容体を意味し、また、抗体のｉｎ ｖｉｖｏにおける循環半減期に重要である。

本発明においては、ＦｃγＲI、ＲII、およびＲIIIを含む、ＦｃγＲは、ＩｇＧ分子のＦｃ部分に結合し、そして、エフェクター細胞機能を引き出す、細胞表面受容体を意味する。ＦｃγＲは、食細胞、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞および樹状細胞上で発現する。

本発明においては、「ＩｇＧ１」や「ＩｇＧ２」、あるいはその他のＩｇ分子は、重鎖と軽鎖を含んでいる完全な抗体、またはそれの一部を意味する。

本発明においては、「２価モノマー」は、通常の抗体中で形成されるジスルフィド結合の形成によって、通常二量体化されている、抗体、Ｆｃ融合体、または抗体融合体を意味する。かかるジスルフィド結合の形成は、一般的に、変性・非還元ＳＤＳゲル上では、還元条件で見出される見かけの分子量の約２倍である、見かけの分子量を有する１本のバンドとして移動する、Ｆｃ含有蛋白質の能力によって推定される。２価モノマーの存在は、また、正確な分子量に対応する、限外ゲル濾過クロマトグラフィー中におけるピークの存在によっても推測される。その他の蛋白質サイズを測る方法もまた、２価モノマーの存在を確認するために使用することが可能である。

本発明においては、「Ｉｇ融合蛋白質」とは、好ましくは、非抗体または非イムノグロブリン（非Ｉｇ）蛋白質の一部または全体である、第２の部分に結合した抗体の一部または全体を含有する融合蛋白質を意味する。イムノサイトカイン、Ｆｃ−Ｘ蛋白質、Ｘ−Ｆｃ蛋白質、およびＸ−Ｆｃ−Ｙ蛋白質は、全て、Ｉｇ融合蛋白質の例である。同様に、その中で、非Ｉｇ部分が２個のＩｇ部分またはドメインの間に位置している融合蛋白質は、Ｉｇ融合蛋白質の一種を構成する。

本発明においては、蛋白質の「アセンブリー」とは、蛋白質の適切な折りたたみ、および正しい多量体状態へのオリゴマー化を意味する。組み立ては、当該技術分野において確立されている、多くの手法によってモニターすることができる。実際には、ジスルフィド結合に関して、蛋白質の正しい組み立ては、非還元ならびに還元ＳＤＳゲル上での移動を比較することによって、簡便にモニターすることができる。仮に、所与の蛋白質種が、非還元ゲル上では複数のバンドを形成するが、還元ＳＤＳゲル上では１本のバンドを形成するならば、高々、非還元ＳＤＳゲル上のバンドのうち１本のみが、正しく組み立てられた種であると推測できる。あるいは、限外ゲル濾過クロマトグラフィーを使用して、より高次のオリゴマーならびに正しくないジスルフィド結合または非共有相互作用に因って形成されるかもしれない凝集体から、単位蛋白質を弁別することができる。

本発明においては、抗体部分の「ドメイン」は、ヒト中において、抗体遺伝子中、個々のエキソンによってコードされているアミノ酸部分に対応する、構成上のドメインを意味する。例えば、ＩｇＧの定常ドメインは、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインである。場合によっては、ヒンジおよびＣＨ２ドメインは、同一のエキソンによってコードされている。幾つかの場合には、ヒンジとＣＨ２ドメインとの間の結合部は、他のヒンジ／ＣＨ２結合部との整列対照によって特定される（Ｐａｕｌ、前掲引用、ｐ．４６〜４９）。

本発明においては、ドメイン、蛋白質、領域または分子は、完全なドメイン、蛋白質、領域、または分子、あるいは、それらの部分、変異体または操作された形態、または主にそれらから誘導されている形態を意味する。該部分、変異体、または操作された形態は、完全なドメイン、蛋白質、領域、または分子に特徴的な機能特性を有していることが好ましい。本発明においては、「主に由来している」とは、天然に存在する蛋白質またはドメインの特定の配列に由来する、そのアミノ酸の少なくとも９５％を有することを意味する。例えば、ヒトＩｇＧ２ ＣＨ２ドメインに主に由来している配列は、アミノ酸の整列対比において、ヒトＩｇＧ２ ＣＨ２ドメインと少なくとも９５％同一である。

本発明においては、「改変されたＩｇＧ１ヒンジ」とは、その中のシステイン、好ましくは第１システインが他のアミノ酸に変異されている、ＩｇＧ１由来のヒンジ領域を意味する。このシステインは、通常、抗体軽鎖とジスルフィド結合を形成する。改変されているＩｇＧ１ヒンジは、軽鎖を欠失するか、あるいは、軽鎖に結合できる他のシステインを有する蛋白質において、特に有用である。

本発明においては、「エリスロポエチン分子」は、一般的に、脊椎動物のエリスロポエチンと同一の構造および同様のアミノ酸配列を有する分子を意味する、場合によっては、変異を含んでもよい。例えば、実施例１８は、変異の有していないヒトエリスロポエチンならびに４個の変異を有するヒトエリスロポエチン変種の使用について説明する。

発明の詳細な説明
本発明は、イムノグロブリン融合蛋白質のｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ産生を促進する手法および構成を提供する。特には、本発明は、イムノグロブリン融合蛋白質の発現、凝集、および／または折りたたみ特性を改善するために有用な方法を提供する。本発明は、部分的に、イムノグロブリン融合蛋白質は、融合パートナーとして、野生型イムノグロブリンの代わりに、ハイブリッド・イムノグロブリンを使用する際、凝集および／または折りたたみの問題が少なく、高濃度で発現されるという驚くべき観察に基づいている。ＩｇＧ１やＩｇＧ２などの野生型イムノグロブリンは、ｉｎ ｖｉｖｏとｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれでも効率的に発現される、うまく折りたたまれた蛋白質であると考えられでいるため、ハイブリッド・イムノグロブリンに付随して、改善された融合蛋白質の産生特性は、予想の外である。

従って、本発明の一つの形態には、ハイブリッド・イムノグロブリン（またはハイブリッドＩｇ）部分を含んでいるイムノグロブリン融合蛋白質を発現するために有用な方法および構成が含まれている。好ましいハイブリッド・イムノグロブリンは、ＩｇＧ１ヒンジならびにＩｇＧ２ ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含んでいる。他の好ましいハイブリッドは、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４のドメインを含んでいる。

抗体の構造
抗体は、Ｙ字型の分子であり、２個の重（Ｈ）鎖と２個の軽（Ｌ）鎖とで構成されている。重鎖はそれぞれ、ジスルフィド結合によって軽鎖と結合されており、該２本鎖が互いに対して適切な配向をとるには、共有および非共有相互反応に頼っている。これら２本鎖のアミノ末端にある可変ドメインは、抗原結合部位を含有しており、ＣＨ１ドメインと共に、該分子のＦａｂ末端を定めている。

該４本の鎖は、該複合体を安定化するため、重鎖間の疎水性結合ならびに１個またはそれ以上の鎖間のジスルフィド結合を利用している。従って、完全なイムノグロブリンは、２個の同一の抗原結合部位を具える２価である。ある種のイムノグロブリン、例えば、ＩｇＭおよびＩｇＡでは、通常、更なる多量体化が進行する。

ポリペプチド鎖それぞれは、２個〜５個のドメインを有しており；軽鎖は、２個のドメインを含んでおり、一方、重鎖は、４個または５個を含んでいる。各鎖の単一のアミノ末端ドメインは、極めて大きな配列変動の故、可変と称され、いくつかのカルボキシ末端ドメインは、定常領域と呼ばれている。重鎖の領域は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４と番号を付けされており、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合および補体固定を含む、多くの重要な抗体機能を担っている。

５種類の主要なイソタイプ型の重鎖Ｃ領域があり、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭと分類され、それぞれ、特徴的なエフェクター機能を具えている（ＩｇＧは、４個のγイソタイプサブクラス、γ１、γ２、γ３、γ４に区分される）。軽鎖の定常領域は、ただ一つのＣドメインを有し、別個な機能的特質が判明していない、２種類のクラス、ＣκおよびＣλのうちの何れかである。（Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ著、１９９３、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）。

イムノグロブリンの全ては、該分子のＦａｂとＦｃ領域を分離している、重鎖のＣＨ１ドメインのＣ末端に位置するヒンジ領域を有している。大半の場合、該ヒンジ領域は、該分子の抗原結合（Ｆａｂ末端）成分とエフェクター相互反応（Ｆｃ）成分との間に、大きな度合いの柔軟さを可能としており、それによって、該抗体の２個の鍵となる機能要素を連結している。ＩｇＧイソタイプ中では、鎖間のジスルフィド結合は、一般的にこのヒンジ領域内に形成され、最終的な４量体分子を形成する。

ＩｇＭ以外では、ヒンジ領域では、プロリン、セリンおよびトレオニン、二次構造の形成を防止する傾向を持ち、また、ヒンジに柔軟性を与えると考えられるアミノ酸が支配的である。融合蛋白質にしばしば利用される、ＩｇＧ１イソタイプは、ヒンジ領域中に、重鎖を相互に連結する、２個のジスルフィド結合を有する。対照的に、ＩｇＧ２イソタイプは、４個のジスルフィド結合を有する（図１）。本発明においては、これらのジスルフィド結合は、実施例中の予期せぬ知見で示すように、抗体ならびにＩｇ融合蛋白質の正しくない組み立てを促進する傾向がある。

Ｉｇ融合蛋白質の有用な構造
イムノサイトカインは、本発明の方法および構成が有用である、腫瘍を標的とする融合蛋白質治療の一例に過ぎない。その他の腫瘍毒性分子もまた、本発明に従って、腫瘍特異的抗体との融合によって、腫瘍を標的とすることが可能である。加えて、ウイルス感染細胞などの、他の種類の病変細胞を、本発明にかかる抗体融合蛋白質で攻撃することも可能である。

本発明の方法および構成はまた、Ｆｃ−ＸおよびＸ−Ｆｃ技術の利用と組み合わせると有用である。本発明においては、融合蛋白質中でのハイブリッド抗体イソタイプの利用は、イムノグロブリンのＦｃ部分に連結される、関心のある標的蛋白質あるいはポリペプチドの産生および収集を向上させる。Ｆｃ−Ｘ融合蛋白質では、イムノグロブリン遺伝子のＦｃ断片がその後に続いている、シグナルペプチドは、標的蛋白質に対するＮ末端の融合パートナーである。そして、該融合蛋白質は、宿主細胞、例えば、天然に該イムノグロブリンを発現する細胞などの、ほ乳類細胞中で発現される。Ｎ末端の融合パートナー中のシグナルペプチド−Ｆｃ断片は、該標的蛋白質を分泌経路へと向かわせ、該融合蛋白質は容易に分泌される。加えて、通常、糖鎖が付加され、また、中性ｐＨで強く荷電されている、Ｆｃ断片の使用は、より高い疎水性の蛋白質の可溶化を容易にする。分泌経路を介する、Ｆｃ−Ｘ融合蛋白質の標的化はまた、細胞内部における蛋白質毒性に関連する問題を緩和し、そして、安定した細胞株の単離を容易とする。該融合蛋白質産物は、生物学的活性および酵素的活性をともに保持している、その天然の構造で、培地から簡単に回収されるので、容易に評価ならびに精製できる。この技術の有効性は、Ｆｃ−レプチンならびにＦｃ−エリスロポエチンによって、検証された。これらの利点のいくつかはまた、Ｘ−Ｆｃ蛋白質類に受け継がれている。

本発明においては、抗体部分の有用な融合物の例には、Ｆｃ−Ｘ、Ｘ−Ｆｃ、およびＸ−Ｆｃ−Ｙ蛋白質が含まれる。かかる蛋白質は、そのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端の両方に融合されている非抗体蛋白質または蛋白質断片を具えている、Ｆｃ領域を含有している。Ｆｃ領域との融合の有利な効果の一つは、融合パートナーの血漿半減期を、顕著に延長できることである。第２の有利な効果は、該Ｆｃに連結することによって、「Ｘ」は、効果的に二量体化できることである。例えば、エンブレルは、ＴＮＦ受容体の一部とヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域とで成る融合蛋白質である。

本発明のいくつかの実施態様では、Ｘ−Ｆｃの配向で、ハイブリッド・イソタイプを有する融合蛋白質を設計することが特に有利である。これらの構造をとる、該標的蛋白質は、Ｎ末端の融合蛋白質で、該Ｆｃ断片がそれに続いている。例えば、リンパ球細胞表面糖蛋白質（ＬＨＲ）を用いる（米国特許第５４２８１３０号参照）などの、いくつかの蛋白質には、この方策が有用である。

本発明においては、抗体をベースとした組換え型融合蛋白質の効用は、蛋白質またはサイトカイン治療単独よりも良好であったとしても、抗体融合蛋白質は、遊離抗体よりも著しく短いｉｎ ｖｉｖｏの循環半減期を持つため、循環系からのｉｎ ｖｉｖｏで迅速な排除によって、限定される可能性がある。かかる減少された循環半減期は、おそらくは、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を介した、増加された排除の結果であろう。イソタイプの交換は、半減期などの特徴を変更できる１つの機構であることが証明されている。２個のイムノサイトカインの半減期の向上が、ヒト重鎖Ｃ領域のイソタイプをＩｇＧγ１またはＩｇＧγ３から、低減されたＦｃＲ結合を有するイソタイプの、ＩｇＧγ４へと変更することによって、実証されている（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５９（９）：２１５９〜６６、 １９９９）。該ＩｇＧ４をベースとしたイムノサイトカインおよび融合蛋白質は、１０分の１に低減されたＦｃＲ結合と、減少されたＡＤＣＣなどのＦｃ受容体エフェクター機能とを有しているが、しかし、なお、マウス腫瘍モデルにおいて、元のＩｇＧγ１をベースとした融合蛋白質と同等かまたはそれよりも高い有効性を示す。しかし、本発明は、単一の分子内に、異なる種類の抗体の機能的および構造的特性を組み合わせた、ハイブリッド抗体をベースとした融合蛋白質を提供する。

従って、ある種の適用では、ＩｇＧ２イソタイプは、非常に抑制されたＦｃ受容体結合を有するので、該ＩｇＧ２イソタイプは、抗体融合蛋白質に優れた特性を付与する（Ｈｕｌｅｔｔ他、 （１９９４） Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５７：１１２７）。完全な抗体融合蛋白質にとっては、Ｆｃ領域のみを含有する融合蛋白質中では、γ２イソタイプを使用することが時には有利である。該原理は、完全な抗体の場合にも、同様である。他のイソタイプに由来するＦｃ領域によって媒介される、Ｆｃ受容体への結合を回避することがしばしば望ましい。

しかし、融合蛋白質中におけるＩｇＧ２イソタイプの使用は、本明細書中で記載したように、一般的に、ある程度の不適切な組み立てを引き起こす。本発明の方法および構成は、最小限のＩｇＧ２イソタイプのエフェクター機能を有するが、このイソタイプの凝集特性は有していない抗体融合蛋白質を提供する。

本発明においては、新規ハイブリッド・イソタイプ抗体および融合蛋白質は、ＩｇＧ２をベースとした融合蛋白質よりも、増進された発現と、改善された組み立てを示す。加えて、ハイブリッド・イソタイプ抗体および融合蛋白質は、Ｆｃ受容体エフェクター機能が望ましくない治療においては、増加された効果を有する可能である。

ヒンジの種類
本発明のハイブリッド・イソタイプにはまた、該ヒンジ領域が変異されたヒンジ領域、好ましくは、低減されたシステイン残基の数を持つヒンジ領域、例えば、最初のシステインがセリンへと変異されている、改変されたＩｇＧ１ヒンジ領域である抗体が含まれる。ＩｇＧ１ヒンジ領域の最初のシステインは、通常軽鎖と結合する。Ｆｃ−Ｘ蛋白質またはＸ−Ｆｃ蛋白質、あるいは軽鎖を欠いたその他の抗体融合蛋白質中では、このシステインはその本来の機能を果たさず、従って、変異することができる。しかし、本発明においては、軽鎖は、通常ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメイン内のシステインとジスルフィド結合を形成するので、第１のシステインを欠いたＩｇＧ１ヒンジおよびＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインを有するハイブリッド・イソタイプ抗体は、軽鎖と結合することができる。該ＩｇＧ２ヒンジ内の４個のシステインは、相互にジスルフィド結合を形成していると考えられる。

本発明においては、重鎖−重鎖のホモ二量体化に関与している、該抗体またはＩｇ融合蛋白質のヒンジ領域中のシステインは、抗体またはＩｇ融合蛋白質の発現および組み立てに対して、顕著な影響を有する可能性がある。特には、より高いシステインの数は、正しくないジスルフィド結合形成によって、抗体またはＩｇ融合蛋白質の正しくない組み立てにつながる可能性がある。従って、本発明は、重鎖ホモ二量体化に関与する、１個またはそれ以上のシステインの変異は、抗体またはＩｇ融合蛋白質の発現または組み立ての向上を引き起こすことができることを開示する。好ましい実施態様では、重鎖ホモ二量体化のシステインは、一般的に好ましい順番として、セリン、アラニン、トレオニン、プロリン、グルタミン酸、グルタミン、リジン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、メチオニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファンあるいはセレノシステインへと変異させることができる。

第１の、最もＮ末端のシステインに変異がなされている、ＩｇＧ１ヒンジを使用すると特に好便である。このヒンジ領域の利点は、それは、システインを２個のみ有することである。該ＩｇＧ１ヒンジ中の第１のシステインは、通常軽鎖中のシステインとジスルフィド結合を形成する。しかし、Ｆｃ−Ｘ、Ｘ−ＦｃおよびＸ−Ｆｃ−Ｙ蛋白質などの、軽鎖を欠失したＩｇ融合蛋白質中では、該ＩｇＧ１ヒンジ中の最もＮ末端のシステインは、かかる目的に役に立っておらず、従って、変異させることができる（Ｌｏ他、 Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１：４０５〜５００ （１９９８））。実施例中に記載するように、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインは、軽鎖とジスルフィド結合を形成することができるシステインを有するので、システイン２個のＩｇＧ１ヒンジは、なおはそのＣＨ１ドメインはＩｇＧ２に由来している、完全な抗体また完全な抗体融合蛋白質中で使用することができる。

Ｆｃ受容体
ＩｇＧ分子は、ＩｇＧ型の抗体に特異的な３種類のＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）、すなわち、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲII、およびＦｃγＲIIIを含む、複数種類の細胞受容体と相互作用する。これらの受容体は、抗原抗体複合体の取り込みの任をおっている。Ｆｃ上のＦｃ受容体結合部位は、ヒンジに近隣するＣＨ２ドメイン上に見いだされ、そして、抗原に対するＶ領域の結合が、軽鎖定常領域を移動させ、該ヒンジに対する立体的な遮蔽の解消を助けると考えられる。このように、抗原と結合された抗体は、Ｆｃ受容体に選択的に結合される。

「保護受容体」（ＦｃＲｐ）または「新生児受容体」（ＦｃＲｎ）とも称される、第４の受容体は、抗体抗原複合体のエンドサイトーシスと、そのエンドソーム内で解離の後、エンドソームから抗体を再利用するのに任をおっている。ＦｃＲｐへの結合部位は、３次元抗体構造中のＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとの間の結合部に見いだされる。ＩｇＧ抗体の血漿半減期は、機能的ＦｃＲｐとの相次ぐ相互作用に依存する。その他の種類の抗体、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＡは、ＦｃＲｐに結合しない。

ある種の抗体のその他の結合相手は、補体の固定を媒介する、Ｃ１ｑである。

Ｆｃ受容体とＦｃＲｐとの相互作用はまた、Ｆｃ部分を含有する融合蛋白質の生物学的活性および代謝に影響を及ぼす。

例えば、僅かにしかＦｃＲへ結合しない融合蛋白質は、良くＦｃＲに結合する対応の融合蛋白質よりも、長い血漿半減期を有する。僅かにしかＦｃＲｐへ結合しない融合蛋白質は、良くＦｃＲｐに結合する対応の融合蛋白質よりも短い血漿半減期を有する。

例えば、ＩｇＧ２のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含有しているＩｇ融合蛋白質は、ＩｇＧ１を含有する融合蛋白質よりも長い血漿半減期を有する。同様に、ＩｇＧ３に由来するＦｃ領域を含有している融合蛋白質は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２を含有する対応の融合蛋白質よりも短い血漿半減期を有する。ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＡに由来するＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含有している融合蛋白質も、対応するＩｇＧ由来の融合蛋白質よりも短い血漿半減期を有する。

本発明の効用を説明するために、抗体およびＩｇ融合蛋白質を２つの一般的な種類：その免疫学的エフェクター機能が望まれる蛋白質類、ならびにそのＩｇ部分は、免疫学的に不活性な担体として役立ち、かつエフェクター機能を欠如している蛋白質類に区分すると便利である。前者の分類の蛋白質中では、特定の型のエフェクター機能が創製されているハイブリッド・イソタイプを用いて、蛋白質を構築すると便利である。後者の分類においては、最小のエフェクター機能を具えるある種のイソタイプの領域と、以下で説明するような、蛋白質の組み立てを促進するその他のイソタイプの領域とを含んでいるハイブリッド・イソタイプを用いて、蛋白質を構築すると便利である。

抗体およびＩｇ融合蛋白質の組み立て
本発明は、抗体あるいはＩｇ融合蛋白質のヒンジは、ほ乳類細胞から分泌されるＩｇ融合蛋白質などの、融合蛋白質の適切な組み立て、ならびに凝集の欠如において、重要な役割を果たしているという発見を開示する。例えば、学説に囚われることを望むものではないが、抗体およびＩｇ融合蛋白質の組み立てには、ＣＨ３ドメイン中の疎水性部分によって、２本の重鎖が先ず非共有的に結び付く工程を伴っていると考えられる。この会合の後、ヒンジ領域が整列し、そして、鎖間のジスルフィド結合が形成される。該ヒンジ領域は、ＣＨ３ドメイン中の疎水性部分から約５０オングストロームにある。

抗体またはＩｇ融合蛋白質の構造を設計する際、ヒンジ領域を変化させると有用である。例えば、所与の発現構築物中のヒンジ領域をコードするＤＮＡを、異なるヒンジ領域、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＹに由来するヒンジ領域をコードするＤＮＡで置換すると有用である。

本発明の考えによれば、例えば、より多数のシステインを有するヒンジ領域を含有している、抗体およびＩｇ融合蛋白質は、より少数のシステインを有する、対応の蛋白質ほどには、効率的に組み立てられない。理論に固執することは望まないが、より多数のシステインを有するヒンジ領域は、システインの間違った配列と正しくないジスルフィド結合形成のより高い可能性を示す。結果として、より多数のシステインを含んでいるヒンジ領域を有する抗体およびＩｇ融合蛋白質は、より少数のシステインを含有するヒンジ領域を有する対応び抗体およびＩｇ融合蛋白質と比較して、より強く凝集し、そして、複数の電気泳動種として存在することが判明している。この現象の具体例は、実施例に挙げている。

例えば、４個のシステインを含有するヒンジ領域を含む抗体およびＩｇ融合蛋白質は、３個または２個のシステインを含有する抗体およびＩｇ融合蛋白質よりも、より低い効率で組み立てられる。例えば、ＩｇＧ２由来のヒンジ領域を含有する蛋白質は、ＩｇＧ１由来のヒンジ領域を含有する対応の蛋白質よりも、より低い効率で組み立てられる。異なる例においては、ＩｇＧ３由来のヒンジ領域を含有する蛋白質は、巧くは組み立てられない；ＩｇＧ３ヒンジ領域は、１１個のシステインを含んでいる。

特には、Ｆｃ受容体Ｉに対する最小の結合が望ましい場合について、本発明の効用を例証する。例えば、融合蛋白質に関しては、ＦｃＲへの結合が十分に低減されているので、ＩｇＧ２に由来するＣＨ２およびＣＨ３領域を使用すると便利であり、ＡＤＣＣは、抑制され、そして、血漿半減期は、増大される。しかし、該ＩｇＧ２ヒンジ領域の使用は、得られる抗体またはＩｇ融合物は、巧くは組み立てがなされないものとする。種々の実施例中に示されるように、ＩｇＧ１ヒンジと組み合わせて、ＩｇＧ２ ＣＨ２およびＣＨ３領域を使用することが、特に好便である。

いくつかの実施例中に例示されるように、特定のヒンジあるいはその他のドメインの選択は、抗体またはＩｇ融合蛋白質の産生濃度に影響を及ぼす可能性があることが、並行した発見である。この知見は、完全な抗体などの蛋白質薬剤は、例えば、一患者当たりの、一投与毎に、数百ミリグラムのような、大用量で投与することがしばしば必要となるので、経済的には極めて重要である。一般的に、３個または２個などの、最小のシステインの数を具えるヒンジの選択は、真核細胞発現系による抗体またはＩｇ融合蛋白質の収量を向上することが見出される。システインの数の低減は、変異、あるいは、あるイソタイプのヒンジを他のもので置換すること、または、その両者によって、達成することができる。

プロテアーゼ耐性の増強
ヒンジ領域は、特にプロテアーゼに感受性である。古典的な実験においては、抗体は、ヒンジ領域中でのプロテアーゼ切断によって、Ｆａｂ領域とＦｃ領域とに分断されてさえいた。

ＩｇＡ由来のヒンジ領域と、その他の抗体イソタイプ由来のその他の成分とを用いて、抗体およびＩｇ融合蛋白質を構築すると便利である。例えば、抗体またはＩｇ融合蛋白質が、経口的または、鼻、肺、膣、または直腸の粘膜などの他の粘膜表面を透過して、送達されるものである場合には、存在しているプロテアーゼから、該抗体またはＩｇ融合蛋白質を防御するために、特にプロテアーゼ耐性な蛋白質を有することが便利である。例えば、ＩｇＡヒンジおよびＩｇＧ由来のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含有する抗体またはＩｇ融合蛋白質を構築すると有用であり、そして、このハイブリッド・イソタイプ蛋白質は、該プロテアーゼ耐性の特質、ならびに、一旦蛋白質が循環系に入る際には、延長された血漿半減期を有するものとなる。該ＩｇＡ１ヒンジ中の糖鎖付加部位は、広範なプロテアーゼに対する耐性を付与するので、ＩｇＡ１のヒンジは、好ましいヒンジである。対照的に、ＩｇＡ２のヒンジは、より短くて、ＩｇＡ１ヒンジを特異的に切断する細菌性プロテアーゼに対して耐性である。

その他のイソタイプ重鎖もまた、プロテアーゼ耐性に寄与する、糖鎖付加部位を含有している。例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭは、プロテアーゼ耐性に寄与する糖鎖付加部位を、定常ドメイン中に含有している。例えば、ＩｇＥ ＣＨ１ドメインは、３個のＮ結合型糖鎖付加部位を含有する。ＩｇＥ ＣＨ１ドメインを、例えば、ＩｇＡ由来のヒンジ領域、ならびに、ＩｇＧ由来のＣＨ２とＣＨ３ドメインと組み合わせることが有用である。

あるイソタイプ由来の糖鎖付加部位を、他のイソタイプのＣＨ２またはＣＨ３中に取り込ませることもまた有用である。その際には、一般的に、全体のドメインが、単一のエキソンによってコードされた領域によって定められている、抗体またはＩｇ融合蛋白質を構築することだけでは十分でなく、そのため、ハイブリッド・ドメインを構築すると有用である。例えば、ＩｇＧイソタイプに特徴的なＦｃＲｐ結合特性と、その他のイソタイプに特徴的なプロテアーゼ耐性特性とを組み合わせると有用である。かかる特質の組み合わせを実現するためには、２個の異なるイソタイプに由来するアミノ酸配列を用いて、個々のドメインを構築することが必要である。そして、得られるハイブリッド・ドメインは、非Ｉｇ部分とのＩｇ融合物を構築するために使用される。

例えば、ＶＮＬＴＷ（配列番号：３）を含むＩｇＥ ＣＨ２ドメイン由来の一続きのアミノ酸を、ＩｇＧ ＣＨ２ドメイン中の対応するアミノ酸に対して、置換することが便利である。例えば、ＩｇＧ１中では、これらのアミノ酸は、ＶＫＦＮＷ（配列番号４）であり、ＩｇＧ３中では、これらのアミノ酸は、ＶＱＦＫＷ（配列番号５）である。本発明においては、他のＣＨ２ドメイン中の対応するアミノ酸は、その他のイソタイプの、コンピュータに基づいた、あるいは、構造的な整列によって、あるいは、発表された文献（Ｐａｕｌ、Ｗ．Ｅ． Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、 ｃｈａｐｔｅｒ３、 ｐ．４６〜４７）に基づき、決定することができる。

同様に、その他の糖鎖付加部位をＩｇＧ中に取り込ませることも、また有用である。例えば、ＩｇＤ由来のＮＴＳＧＦ（配列番号６）またはＬＮＡＳＲ（配列番号７）の配列を含む配列部分が、抗体またはＩｇ融合蛋白質中のＩｇＧ由来Ｆｃ領域の対応する配列を置換するために、使用される。本発明においては、抗体定常領域内のその他の有用な糖鎖付加部位は、Ｐａｕｌ（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、 ｃｈａｐｔｅｒ３）ならびにその中の参照文献中に開示されている。

本発明のいくつかの実施態様では、非ＩｇＧの糖鎖付加部位の取り込みは、ＦｃＲｐとの相互作用を減少させる。かかる場合では、プロテアーゼ耐性の増強と、血漿半減期の低減との間には、トレード・オフの関係があり、そして、かかるハイブリッド・イソタイプ蛋白質の有用性は、特定の適用の状況において、検討・評価しなければならない。

本発明においては、特定のハイブリッド・イソタイプ抗体またはＩｇ融合蛋白質のプロテアーゼ耐性は、標準的な方法に従って測定される。プロテアーゼは、市販業者から購入でき、製造元の説明書に従って、特定のハイブリッド・イソタイプ抗体またはＩｇ融合蛋白質の存在下で、インキュベートされる。蛋白質の分解は、例えば、ＳＤＳゲル電気泳動と、出発物質と切断生成物の定量によって測定する。

本発明においては、ハイブリッド・イソタイプ抗体またはＩｇ融合蛋白質の、ＦｃＲｐと相互作用する能力はまた、標準的な方法に従って測定する。例えば、抗体またはＩｇ融合蛋白質の薬物動態学的特性は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、非ヒト霊長類、またはヒトなどのほ乳類中で測定される。抗体またはＩｇ融合蛋白質の薬物動態学的特性は、ＦｃＲｐ結合の実際的な示唆であり、そして一般的に、ＦｃＲｐ結合特性を抗体またはＩｇ融合蛋白質中に取り込ませる目的は、抗体の薬物動態学的特性を改善することである。特定のハイブリッド・イソタイプ抗体またはＩｇ融合蛋白質が、ＦｃＲｐと相互作用するらしか否かを決定するために、ＦｃＲｐ−Ｆｃ複合体の３次元構造を調べることもまた便利である（Ｍａｒｔｉｎ、Ｗ．Ｌ．他、 Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｔ ２．８Å ｏｆ ａｎ ＦｃＲｎ／Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ Ｆｃ Ｃｏｍｐｌｅｘ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｐＨ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｂｉｎｄｉｎｇ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ ７ ｐｐ．８６７ （２００１）、ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ＩＤ １Ｉ１Ａ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／）。

本発明のこの形態では、そのＦｃ領域は、ＩｇＡ１由来のヒンジ領域、ＦｃＲｐへの結合を媒介する、ＩｇＧ２の要素を含有するＣＨ２およびＣＨ３領域、およびその他のＩｇＧと比較して、低減されたエフェクター機能が有するＣＨ２の要素を含有している、Ｆｃ−Ｘ型の蛋白質を構築することが特に有用である。

抗体またはＩｇ融合蛋白質の結合価の増加
本発明においては、高い結合価を有し、また、より低い結合価の抗体に特徴的な、エフェクター機能またはその他の特性をも有する、ハイブリッド・イソタイプ抗体またはＩｇ融合蛋白質を構築することが、時には有用である。ＩｇＡおよびＩｇＭは、ＣＨ３領域中の鎖間ジスルフィド結合を介した、オリゴマー化によって、高い結合価を有する。ＩｇＡおよびＩｇＭはまた、ＣＨ４のＣ末端近くのシステインからＪ鎖へのジスルフィド結合を有する。ＩｇＡは、二量体であり、またＩｇＭは、５量体または６量体であり、そのため、ＩｇＡは、４個の抗原結合部位を有し、また、ＩｇＭは、１０個または１２個の抗原結合部位を有する。

しかし、ＩｇＭおよびＩｇＡは、ＡＤＣＣを媒介しない。ＡＤＣＣを媒介する、多価抗体またはＩｇ融合物を構築するためには、ＩｇＧのＣＨ２ドメインおよびＩｇＭまたはＩｇＡのＣＨ３およびＣＨ４ドメインを有する蛋白質を構築することが有用である。一般に、得られるハイブリッド・イソタイプ蛋白質は、対応するＩｇＡ含有ハイブリッド・イソタイプ蛋白質よりも結合価が高いので、ＩｇＭ ＣＨ３およびＣＨ４ドメインを使用することが好ましい。

以下の応用は、増加した結合価を具えるハイブリッド・イソタイプ蛋白質の効用を例示する。多くの腫瘍細胞は、その細胞表面上にＥＧＦ受容体を過剰発現している。該ＥＧＦ−受容体はまた、多くの正常な細胞表面上でも発現されており、従って、正常細胞と腫瘍細胞の間でのＥＧＦ受容体発現の差違は、単に量的なものである。本発明の一態様においては、有用なＩｇＧ−ＩｇＭハイブリッド・イソタイプ蛋白質は、ヒトＥＧＦ受容体と弱く相互作用するＶ領域を含む。該Ｖ領域の親和性を選択することで、融合蛋白質は、正常細胞上のＥＧＦ−Ｒとは効率的に相互作用しないが、集積効果の結果として、腫瘍細胞上の過剰発現したＥＧＦ受容体とは相互作用する。ＩｇＧのＣＨ２ドメイン、例えばＩｇＧ１のＣＨ２ドメインの使用は、腫瘍細胞に対するＡＤＣＣを媒介する。

腫瘍細胞に対する特異的殺傷を増大するために、サイトカインなどの、抗腫瘍活性を有する蛋白質に、抗ＥＧＦ−Ｒ ＩｇＧ−ＩｇＭハイブリッド・イソタイプ蛋白質を融合することもまた有用である。例えば、ＩＬ−２を使用することが可能である。あるいは、放射活性原子をハイブリッド・イソタイプ蛋白質に結合することも有用であり、それにより、腫瘍領域中へのハイブリッド・イソタイプ蛋白質の集中は、腫瘍への選択的な照射を引き起こされる。例えば、イットリウム−９０を、ＩｇＧ−ＩｇＭハイブリッド・イソタイプ蛋白質と結合することが可能である。ＡＤＣＣとＩＬ２の作用またはＡＤＣＣと照射の組み合わせは、腫瘍細胞を殺傷する上で、特に有用である。

ＩｇＧ−ＩｇＭ融合蛋白質、例えば前述の抗腫瘍蛋白質中では、一般的に、ＩｇＧ、好ましくはＩｇＧ１由来のヒンジ領域を使用することもまた有用である。ＩｇＧ３由来のヒンジ領域は、このヒンジ領域は、様々な組み立てを引き起こす傾向があり、さらには、ＩｇＧ３ヒンジは、容易に蛋白質分解される（Ｂａｉｃｉ Ａ他、 Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９８０） １２、４１〜５０）ので、多くの適用で、余り好ましくはないＩｇＧヒンジ領域である。

前述の例は、本発明のこの形態の一般的な原理：正常細胞よりも標的細胞種で強く発現する抗原は、高い結合価ではあるものの、比較的低い単価親和性を有する、抗体またはＩｇ融合蛋白質によって、より効率的に標的とされる可能性がある点を説明している。

例えば、自己免疫疾患では、Ｔ細胞などのある種の免疫細胞は、より高い濃度で、サイトカイン受容体など細胞表面蛋白質を発現している。該アップ・レギュレートされている表面蛋白質を指向されている、高い結合価のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４−ＩｇＭ抗体またはＩｇ融合蛋白質を用いて、かかる免疫細胞を攻撃することは有用である。この方法では、該細胞表面蛋白質は存在するが、アップ・レギュレートはされていない細胞を標的とすることは、最小限に抑えられる。例えば、自己免疫疾患の発症中は、該Ｖ領域は、例えばＩＬ−２受容体、ＩＬ−１２受容体、またはその他のアップ・レギュレートされた受容体を指向している、ＩｇＧ−ＩｇＭ融合蛋白質で患者を処置すると有用である。ヒンジ領域およびＣＨ２ドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４に由来することが好ましく、ＣＨ３およびＣＨ４ドメインは、ＩｇＭに由来することが好ましい。該Ｖ領域は、自己免疫疾患の治療においては、ＩＬ−２またはＩＬ−１２受容体に弱く結合することが好ましい。この治療は、Ｔ細胞の部分群を殺傷するが、Ｔ細胞の全ての類は殺傷しない効果を有する。

ハイブリッド・イソタイプを有する抗体およびＩｇ融合蛋白質を発現する発現ベクターの構築
本発明はまた、本発明の抗体および融合蛋白質をコードする核酸を提供する。本発明は、コードしている核酸は、また、転写、翻訳に際して、シグナル・ペプチドを生じさせる、分泌カセットをコードする場合に、最も良好に実施される。該シグナル・ペプチドは、一般的に、成熟した産物から切断される。分泌された融合蛋白質は、宿主細胞を溶解する必要なく、培地から収集することができ、また、活性の評価、あるいは、必要に応じて、通常の試薬を使用して、精製することができる。場合によっては、ある種の融合パートナー、例えばサイトカインＣＮＴＦの存在は、分泌カセット無しでも、Ｉｇ融合蛋白質の分泌を可能とする。

天然に存在しているイントロンは、ＣＨ１およびＣＨ２ドメインをコードするＤＮＡからヒンジをコードするＤＮＡを分離するので、当業者は、イントロンを有するＤＮＡを使用して、かかる組換えＤＮＡの構築を実施することができる。イントロン内の制限部位を使用することができる。あるいは、該ヒンジ領域は、一般的に、ほんの約１５から７０のアミノ酸長であるので、例えば、オリゴヌクレオチド合成、ＰＣＲ、あるいはそれらの組み合わせを用いて、ヒンジ領域全体をコードする合成ＤＮＡを構築することも可能である。そして、該合成ヒンジ・コード領域は、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して、Ｉｇ融合蛋白質をコードする発現プラスミド中に配置することができる。

以下の非限定的な実施例によって、さらに本発明を説明する。

実施例１： 異なる抗体イソタイプに由来するヒンジ領域とＣＨ２領域を有するＦｃ−Ｘ融合蛋白質を発現するプラスミドの構築
ＨｕＦｃγ１−レプチンを発現するプラスミドの構築は、ＰＣＴ公開公報 ＷＯ ００／０４０６１５Ａ２中に記載されている。

ＩｇＧ２由来のＦｃとＣ末端の融合パートナーとの融合物を発現するプラスミドは、以下のようにして構築した。

先ず、ヒトγ２Ｆｃの遺伝子配列を獲得した。ヒトＦｃγ２をコードしている、ゲノムＤＮＡは、ヒトＰＢＭＣから単離された、細胞ＤＮＡに対するＰＣＲによって獲得した。フォワード側プライマーは、配列 ５’ ＣC TTA AGＣ ＧＡＧ ＣＧＣ ＡＡＡ ＴＧＴ ＴＧＴ ＧＴＣ ＧＡＧ（配列番号８）を有し、ＡｆｌII制限部位 C TTA AGが、該γ２ヒンジ・コード領域 ＧＡＧ ＣＧＣ ＡＡＡ ＴＧＴ ＴＧＴ ＧＴＣ ＧＡＧ（配列番号９）のすぐ上流に導入されている。リバース側プライマーは、配列 ５’ ＣCTCGAG ＴＣＡ ＴＴＴ ＡCC CGG GＧＡ ＣＡＧ ＧＧＡ Ｇ（配列番号１０）を有し、ＸｈｏＩ制限部位 CTCGAGが、翻訳終止コドン（アンチコドンＴＣＡ）の直後に導入されている。加えて、リバース側プライマーにはまた、サイレント変異（下線を付したＡからＧへの置換）によって、ＳｍａＩ CCCGG Gを導入した。配列確認のために、９１０ｂｐのＰＣＲ断片を、ＴＯＰＯ ＴＡクローニング・ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中にクローニングした。

第２に、該ヒトγ２Ｆｃを発現ベクター中に配置された。上部ＣＨ３領域をコードするＤＮＡ配列 ＣＴＧ ＣＣＣ ＣＣＡ ＴCC CGG GＡＧ ＧＡＧ ＡＴＧ ＡＣＣ ＡＡＧ（配列番号１１）中の天然のＳｍａＩ制限部位を、重複ＰＣＲ技術（Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ、Ｂ．Ｌ．他、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：２４７１〜６、 １９９１）で導入したサイレント変異によって除去した。フォワード側プライマーは、配列 ５’ ＣＴＧ ＣＣＣ ＣＣＡ ＴＣＡ ＣＧＧ ＧＡＧ ＧＡＧ ＡＴＧ ＡＣＣ ＡＡＧ（配列番号１２）を有し、その中の、ＣからＡへの置換には下線が付してある。リバース側プライマーは、配列 ５’ ＧＧＴ ＣＡＴ ＣＴＣ ＣＴＣ ＣＣＧ ＴＧＡ ＴＧＧ ＧＧＧ ＣＡＧ ＧＧＴ ＧＴＡ Ｃ（配列番号１３）を有し、その中の、ＧからＴへの置換には下線が付してある。配列を確認したところ、γ２のＦｃをコードしている、得られたＡｆｌII−ＸｈｏＩ制限断片は、翻訳終止コドンの上流に、単一のＳｍａＩ部位、ならびに、終止コドンの下流にＸｈｏＩ部位を含有していた。そして、Ｆｃγ２をコードする、該ＡｆｌII−ＳｍａＩ断片は、ｐｄＣｓ−ｈｕＦｃγ１−レプチン（ＰＣＴ公開公報 ＷＯ ００／０４０６１５Ａ２）中のＦｃγ１をコードする対応する制限断片を置換するために使用して、ｐｄＣｓ−ｈｕＦｃγ２−レプチンを得た。

第３に、Ｆｃγ２のヒンジをコードするＤＮＡは、γ１の改変ヒンジによって置換された。該γ２ヒンジ領域は、４個のシステイン・ジスルフィド結合を含有している。該γ２ヒンジのエキソンを含有するＡｆｌII−ＳｔｕＩ断片を、下に示す。ＡｆｌII部位（C TTA AG）の前には、シグナル・ペプチドをコードするＤＮＡ配列がある。グルタミン酸（Ｅ）は、γ２ヒンジの最初のアミノ酸残基である。小文字は、γ２ヒンジのエキソンに続くイントロン配列を示す。配列ｃｃａｇｇおよび逆向き鎖ｃｃｔｇｇ中のＣ−メチル化のため、該ＳｔｕＩ制限部位（ａｇｇｃｃｔ）は、ＤＣＭメチラーゼによって、ほとんどのＥ．ｃｏｌｉ菌株中においては、Ｃ−メチル化されている。メチル化された際には、この部位は、ＳｔｕＩでは切断不可能である。

ｐｄＣｓ−ｈｕＦｃγ２−レプチン中のγ２ヒンジのエキソンを含有する、該ＡｆｌII−ＳｔｕＩ断片は、以下に示す、ｐｄＣｓ−ｈｕＦｃγ１−レプチン由来のγ１ヒンジのエキソンを含有する対応のＡｌII−ＳｔｕＩ断片によって置換した。

ｐｄＣｓ−ｈｕＦｃγ１−レプチン中のγ１ヒンジ配列は、ＩｇＧ１の軽鎖とジスルフィド結合を形成するＣｙｓ残基を除去する、（下線を付している）ＣｙｓからＳｅｒへの変異を含有する（Ｌｏ他、 （１９９８） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１：４９５〜５００）。γ１およびγ２の両エキソン中のＳｔｕＩ部位は、Ｃ−メチル化されており、ＳｔｕＩ制限エンドヌクレアーゼは、メチル化に感受性であるので、ＳｔｕＩ酵素による消化に先立ち、両プラスミドは、ＤＣＭ陰性の細菌株から単離された。ｐｄＣｓ−ｈｕＦｃγ１由来のヒンジ領域を有する、得られたｐｄＣｓ−ｈｕＦｃγ２−レプチンは、ｐｄＣｓ−ｈｕＦｃγ２ｈ−レプチンと称する（γ２ｈ：改変されたヒンジを有するγ２）。

実施例２： ｈｕＦｃγ２−レプチンおよびｈｕＦｃγ２ｈ−レプチン免疫融合物のオリゴマー化状態の特定
γ１、γ２およびγ２ｈイソタイプを具える、発現ベクター ｐｄＣｓ−ｈｕＦｃ−ｈｕレプチンを使用して、ＮＳ／０細胞からの蛋白質発現を評価した。ｈｕＦｃ部分がγ１、γ２およびγ２ｈイソタイプに由来している、異なる形態のｈｕＦｃ−ｈｕレプチンの物理的状態を評価した。

前述のように、およびＬｏ他の中に記載されたように、生成されたＤＮＡ構成物は、ＮＳ／０細胞中にトランスフェクトされ、そして、標準的手法に従って、安定した発現細胞株を創製した。

この実施例および以下の実施例では、安定したトランスフェクタントは、以下のように創製した。プラスミドＤＮＡは、エレクトロポレーションによって、マウス・ミエローマＮＳ／０細胞中に導入した。ＮＳ／０細胞は、１０％ウシ胎児血清、グルタミン２ｍＭおよびペニシリン／ストレプトマイシンを添加した、ダルベッコ改良イーグル培地中で増殖させた。約５×１０⁶細胞を、ＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳ ０．５ｍｌ中に懸濁した。次いで、氷冷したＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ キュベット（電極間隙０．４ｃｍ、ＢｉｏＲａｄ）内で、線状プラスミドＤＮＡ１０μｇを細胞とともに１０分間インキュベートした。エレクトロポレーションは、０．２５Ｖで５００μＦの設定において、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用して実施した。細胞は、氷冷下１０分間回復させ、その後、増殖培地に再懸濁して、次に９６ウェルプレート上に撒いた。安定にトランスフェクトされたクローンは、トランスフェクションの２日後に導入した、メトトレキセート（ＭＴＸ）１００ｎＭ存在下における増殖によって選択された。細胞には、３日毎に、２から３倍を供給して、そして、ＭＴＸ耐性クローンは、２から３週間のうちに出現した。高い産生のものを同定するため、クローンの上清は、抗ＦｃＥＬＩＳＡで評価した。高い産生を示すクローンは、単離され、ＭＴＸ１００ｎＭを含有する増殖培地中で増殖させた。

上清中のＨｕＦｃ−ｈｕレプチンの濃度は、抗ｈｕＦｃ抗体（西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ複合ヤギ抗ｈｕＩｇＧ、Ｆｃγ１またはＦｃγ２、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ製）を使用して、抗ｈｕＦｃＥＬＩＳＡにより測定した。比較的低い発現濃度は、γ２構築物の上清中で検出されたが、一方、γ１およびγ２ｈ構築物では、一過性および安定トランスフェクションのいずれでも、高濃度の発現を与えている、
ｈｕＦｃγ２−ｈｕレプチンおよびｈｕＦｃγ２ｈ−ｈｕレプチンをコードする同等の発現ベクターによる、一過性のトランスフェクションの場合、ｈｕＦｃγ２ｈ−ｈｕレプチンは、８倍高い濃度で産生されていた。

精製のために、組織培養上清中の融合蛋白質は、プロテインＡ・セファロースに結合させ、その後、リン酸ナトリウム緩衝液（ＮａＨ₂ＰＯ₄ １００ｍＭ、ｐＨ３およびＮａＣｌ １５０ｍＭ）で溶出した。次いで、該溶出液は、０．１容の２Ｍ Ｔｒｉｓ−塩酸塩、ｐＨ８で中和され、ならびに、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびＨＰＬＣ限外ゲル濾過クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で鑑定された。

融合蛋白質は、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析された。クーマシー・ブルー染色により可視化された、蛋白質バンドは、見かけ上のＭＷ ９６ｋＤを有する、ｈｕＦｃγ１−ｈｕレプチンを示しており、２価モノマーであることを示唆している。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析は、ｈｕＦｃγ２−ｈｕレプチン融合蛋白質の多くは、Ｆｃ−レプチンよりも、さらに大きな見かけ上の分子量を具えた、はしご状のバンド群として泳動する、高分子型であることを示した。対照的に、ｈｕＦｃγ２ｈ−ｈｕレプチンは、主に、９６ｋＤに移動する、単一の種であった。

ｈｕＦｃγ２ｈ構築物の限外ゲル濾過クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果と良い相関があり、ｈｕＦｃγ２ｈ−レプチンおよびｈｕＦｃγ１−レプチンはともに、約８３％がモノマーであり、一方、対比されるｈｕＦｃγ２−ｈｕレプチン融合蛋白質は、約５５％がモノマーであることを示した。

ＦｃγＲ型の受容体が豊富である、固定されたＪ７７４細胞を用いた研究は、ｈｕＦｃγ１−ｈｕレプチン融合蛋白質のみがＦｃ結合性を示すことを示した。加えて、その増殖をレプチンによって誘発できるように、レプチン受容体を発現するためのトランスフェクトがなされている、ＢＡＦ−３細胞（Ｇａｉｎｓｆｏｒｄ、Ｔ．他、ＰＮＡＳ（１９９６）９３：１４５６４〜１４５６８）を使用した。ＢＡＦ３／レプチン受容体細胞を用いた研究は、ｈｕＦｃγ１−ｈｕレプチン、ｈｕＦｃγ２−ｈｕレプチンおよびｈｕＦｃγ２ｈ−ｈｕレプチンは、レプチン生物活性については、同等であることを示した。

ｈｕＦｃγ２−ｈｕレプチンおよびｈｕＦｃγ２ｈ−ｈｕレプチンを発現するほ乳類細胞の安定クローンもまた同定した。細胞のトランスフェクションは、本質的に同一の条件下で実施し、そして、同数の安定したトランスフェクト細胞をクローンし、ｈｕＦｃγ２−ｈｕレプチンおよびｈｕＦｃγ２ｈ−ｈｕレプチンの産生について、試験した。ｈｕＦｃγ２ｈ−ｈｕレプチンについて、最も発現するクローンは、ｈｕＦｃγ２−ｈｕレプチンについて、最も発現するクローンよりも、約５倍も多くのｈｕＦｃ−ｈｕレプチンを生産した。

実施例３： 異なる抗体イソタイプ由来のヒンジ領域およびＣＨ２領域を具えるＸ−Ｆｃ融合蛋白質を発現するプラスミドの構築
グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）のアミノ酸残基７から３７（配列番号１９）をコードする合成ＤＮＡ配列（配列番号１８）を以下に示す。

該ＧＬＰ−１ペプチドをコードするＤＮＡの前には、C TTA AGCがあり、シグナル配列をコードするＤＮＡ断片に、このＤＮＡ断片を結合させるために、該ＡｆｌＩＩ制限部位を使用した（Ｌｏ他、 Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｇ）。３’末端において、該ＧＬＰ−１をコードするＤＮＡには、ＢａｍＨＩ制限部位（GGA TCC、これは、アミノ酸残基ＧおよびＳをコードしている）、ならびにＡｆｌII制限部位が続いており、それは、翻訳終止コドンを具えている、Ｆｃγ２（またはＦｃγ２ｈ）をコードするＡｆｌII−ＸｈｏＩ制限断片（実施例１参照）と連結するために使用した。

実施例４： ＧＬＰ１−ｈｕＦｃγ２およびＧＬＰ１−ｈｕＦｃγ２ｈ免疫融合物のオリゴマー化の特定
実施例３に基づき得られたベクター、ｐｄＣｓＧＬＰ−１ ｈｕＦｃγ１、ｐｄＣｓＧＬＰ−１ ｈｕＦｃγ２、およびｐｄＣｓＧＬＰ−１ ｈｕＦｃγ２ｈは、ＧＬＰ−１（７〜３７）ｈｕＦｃγ１、ＧＬＰ−１（７〜３７）ｈｕＦｃγ２およびＧＬＰ−１（７〜３７）ｈｕＦｃγ２ｈを発現するために、ほ乳類細胞を一過性および安定トランスフェクトするために使用した。

各ＧＬＰ−１ｈｕＦｃ融合蛋白質の凝集状態および全蛋白質発現量の評価は、実施例２に記載した一般的手法を使用して、プロテインＡ・セファロースで精製した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨＰＬＣ−ＳＥＣによって実施した。蛋白質バンドは、クーマジー・ブルー染色で可視覚化した。ＧＬＰ１ ｈｕＦｃγ２およびＧＬＰ−１ ｈｕＦｃγ２ｈは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、約６０ｋＤの見かけ上の分子量を有していた。上清中のＧＬＰ−１ ｈｕＦｃ変異体の濃度は、抗ｈｕＦｃＥｌＩＳＡによって測定した。ＧＬＰ１−ｈｕＦｃγ２およびＧＬＰ１−ｈｕＦｃγ２ｈをコードする同等の発現ベクターによる一過性トランスフェクションにおいては、ＧＬＰ１−ｈｕＦｃγ２ｈは、約１．５倍の高い濃度で産生された。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる全細胞溶解物の分析は、１００から２００ｋＤの見かけ上の分子量で移動する、いくつかの高分子量型の存在により示されるように、ＧＬＰ１−ｈｕＦｃγ２融合蛋白質の約半分は、正しくないジスルフィド結合を有していた。対照的に、検出可能なＧＬＰ１−ｈｕＦｃγ２ｈ融合蛋白質の本質的に全ては、約６０ｋＤの見かけ上の分子量で移動した。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ前に還元する際には、該ＧＬＰ１−ｈｕＦｃγ２およびＧＬＰ１−ｈｕＦｃγ２ｈ蛋白質は、約３４ｋＤの本質的に同一な見かけ上の分子量で移動した。

該γ１、γ２およびγ２ｈ融合蛋白質のＨＰＬＣ−ＳＥＣによる比較分析は、改変されているγ２ｈ融合蛋白質は、その他の融合蛋白質よりも、有意により多く、モノマーとなっていることを示した。単一ピークとして示されるように、改変されているＧＬＰ１−ｈｕＦｃγ２ｈ融合蛋白質は、８４％が２価のモノマーであり、一方、ＧＬＰ１−ｈｕＦｃγ１とＧＬＰ１−ｈｕＦｃγ２融合蛋白質はともに、それぞれ、約４２％と約３３％の２価のモノマーに対応する、複数のピークを有していた。

従って、ＩｇＧ１のヒンジおよびＩｇＧ２のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを保持しているＧＬＰ−１−Ｆｃ融合蛋白質は、その中の全Ｆｃ領域がＩｇＧ１またはＩｇＧ２のいずれかに由来しているＧＬＰ１−Ｆｃ融合蛋白質よりも、驚くほど良好な組み立て特性を示した。

実施例５： ＩｇＧ２ ＣＨ１、ＣＨ２とＣＨ３ドメインおよびＩｇＧ１ヒンジを含有する、疾患細胞に特異的な、完全な抗体の構築
イムノグロブリンγ２の定常領域（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードするゲノムＤＮＡは、ヒトＰＢＭＣから単離した細胞ＤＮＡを使用して、ＰＣＲによって得た。フォワード側プライマーは、配列 ５’ ＣAAGCTTＴＣＴＧＧＧＧＣＧＡＧＣ（配列番号２０）を有し、ＨｉｎｄIII制限部位 AAGCTT が、ＣＨ１エキソンの約２２０ｂｐ上流のイントロン配列に導入された。リバース側プライマーは、配列 ５’ ＣCTCGAG ＴＣＡ ＴＴＴ ＡCC CGG GＧＡ ＣＡＧ ＧＧＡ Ｇ（配列番号２１）を有し、ＸｈｏＩ制限部位 CTCGAG が、翻訳終止コドン（アンチコドンＴＣＡ）の直後に導入されており、また、ＳｍａＩ CC CGGG が、実施例１で既に記載したように、サイレント変異によって作製されている。上部ＣＨ３領域をコードするＤＮＡ配列中の天然のＳｍａＩ制限部位はまた、実施例１で記載したように、重複ＰＣＲで導入されたサイレント変異によって除去された。当業者はまた、実施例１で得られたＦｃγ２をコードする制限断片を利用することによって、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域をコードし、単一のＳｍａＩ制限部位を含んでいる、約１８１０塩基対（ｂｐ）のＨｉｎｄIII−ＸｈｏＩ制限断片が、容易に構築できることを認識するだろう。配列確認の後、γ２定常領域をコードする、該ＨｉｎｄIII−ＸｈｏＩ断片を、ｐｄＨＬ７−ｈｕＫＳγ１−ＩＬ２のγ１中の定常領域−ＩＬ２をコードしているＨｉｎｄIII−ＸｈｏＩ断片を置換するために使用して、ｐｄＨＬ７−ｈｕＫＳγ２抗体を与える。

該ｈｕＫＳγ２ｈ抗体の発現ベクターは、以下の通りに構築した。プラスミドｐｄＣｓ−ｈｕＦｃγ２ｈ−レプチンは、システインをセリンに改変されているγ１ヒンジ領域のみをコードする、約１３０ｂｐのＰｓｔＩ−ＰｖｕII制限断片を作製するためのＰＣＲ用鋳型として使用された。フォワード側プライマーは、配列 ５’ CTGCAGＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＣ（配列番号２２）を有し、γ１ヒンジ・エキソン（前述のＣからＳへの改変を有する）の始めに、天然のＰｓｔＩ（CTGCAG）制限部位を復元する。リバース側プライマーは、配列 ５’ CAGCTGＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧ（配列番号２３）を有し、ヒンジとＣＨ２エキソンとの間のイントロン中のＰｖｕＩＩ部位（CAGCTG）に対応する。配列確認の後、この約１３０ｂｐのＰｓｔＩ−ＰｖｕII制限断片を、使用して、ｐｄＨＬ７−ｈｕＫＳγ２抗体中の対応する断片と置換するために使用して、ｐｄＨＬ７−ｈｕＫＳγ２ｈ抗体を与える。

実施例６： 疾患細胞を指向している、γ２抗体および対応するγ２ｈ抗体の非還元状態の特定
一過性トランスフェクションのためには、ＩｇＧγ１、γ２、およびγ２ｈイソタイプを有するＫＳ抗体のベクター、ｐｄＨＬ７は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｐｌｕｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して、供給元の手順に従って、リポフェクションによりほ乳類細胞中に導入した。安定トランスフェクタントは、実施例２で記載したように、創製された。

該改良培地（１０％血清）中のＫＳ抗体は、プロテインＡ・セファロース（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）に捕捉し、次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる特定に先立ち、２−メルカプトエタノールを添加した、または添加していない蛋白質試料緩衝液中で煮沸することによって溶出した。クーマジー・ブルー染色による可視化は、非還元ＫＳγ２抗体は、約１５０ｋＤの分子量複数を有する、いくつかの種として移動することを示した。対照的に、ＫＳγ２ｈ抗体は、見かけ上の分子量が１５０ｋＤの主要なバンドとして移動した。ＫＳγ２抗体およびＫＳγ２ｈ抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ前にメルカプトエタノールで還元すると、重鎖と軽鎖とに対応する、同一のバンド・パターンが、ＫＳγ２抗体およびＫＳγ２ｈ抗体の双方ともに観測された。

学説に囚われることを望むものではないが、これらの観察は、ＫＳγ２において、見出だされた、該個別的に移動する種は、ジスルフィド結合のパターンのバラツキによることを示唆する。

ＫＳγ２抗体およびＫＳγ２ｈ抗体を発現する、ほ乳類細胞の安定したクローンもまた、同定した。細胞のトランスフェクションは、本質的に同一の条件下で実施され、同様の数の安定にトランスフェクトされた細胞をクローニングし、ｈｕＦｃ ＫＳγ２抗体およびＫＳγ２ｈ抗体の産生を試験した。ＫＳγ２ｈ抗体を最も良く発現する４個のクローンは、組織培養上清の１ｍｌ当たり、約１１４、９８、８５および４９マイクログラムの抗体を生産し、一方、同じ条件下で、ｈｕＦｃ ＫＳγ２抗体を最も発現する４個のクローンは、組織培養上清の１ｍｌ当たり、約３６、３４、１５および１３マイクログラムの抗体を生産した。

実施例７： ＩｇＧ２ ＣＨ１、ＣＨ２、とＣＨ３ドメインおよびＩｇＧ１ヒンジを含有する、完全な抗体を含む融合蛋白質の構築
この実施例では、抗体部分がハイブリッド・イソタイプを有する抗体融合蛋白質の有用性を検証した。

ｈｕＫＳγ２−ＩＬ２用の発現ベクター、ｐｄＨＬ７−ｈｕＫＳγ２−ＩＬ２は、配列 ＧＧＧＴＡＡＡＴＧＡ （配列番号２４）とそれに続くＸｈｏＩ付着末端を含有する、ｐｄＨＬ７−ｈｕＫＳγ２抗体中のＳｍａＩ−ＸｈｏＩ制限断片を、ｐｄＨＬ７−ｈｕＫＳ−ＩＬ２から単離されたＳｍａＩ−ＸｈｏＩ制限断片で置換することによって構築した。この後者の断片は、翻訳終止コドンを含んでいる、成熟ＩＬ２をコードするＤＮＡ配列が、その直後に続いている、配列 ＧＧＧＴＡＡＡ を含有する。得られる発現ベクター、ｐｄＨＬ７−ｈｕＫＳγ２−ＩＬ２は、蛋白質発現のため細胞をトランスフェクトするために使用した。

同様に、ｈｕＫＳγ２ｈ−ＩＬ２用の発現ベクター、ｐｄＨＬ７−ｈｕＫＳγ２ｈ−ＩＬ２は、配列 ＧＧＧＴＡＡＡＴＧＡ （配列番号２４）とそれに続くＸｈｏＩ付着末端を含有するｐｄＨＬ７−ｈｕＫＳγ２ｈ抗体中のＳｍａＩ−ＸｈｏＩ制限断片を、前段落で説明した、ｐｄＨＬ７−ｈｕＫＳ−ＩＬ２から単離されたＳｍａＩ−ＸｈｏＩ制限断片で置換することによって構築した。得られる発現ベクター、ｐｄＨＬ７−ｈｕＫＳγ２ｈ−ＩＬ２は、蛋白質発現のため細胞をトランスフェクトするために使用した。

実施例８： γ２抗体融合蛋白質および対応するγ２ｈ抗体融合蛋白質の非還元状態の特定
一過性トランスフェクションのため、ＫＳγ２−ＩＬ２およびＫＳγ２ｈ−ＩＬ２をコードするプラスミドは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｐｌｕｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して、供給元の手順に従って、リポフェクションによりほ乳類細胞中に導入した。

安定にトランスフェクトされたクローンを得るために、プラスミドＤＮＡは、実施例２で記載したように、エレクトロポレーションによってマウス・ミエローマＮＳ／０細胞中に導入した。

γ２およびγ２ｈイソタイプを有するＫＳ−ＩＬ２融合蛋白質は、実施例６で記載したように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって同定した。該改良培地（１０％血清）中の抗体融合蛋白質を、プロテインＡ・セファロース（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）に捕捉し、次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる特定に先立ち、２−メルカプトエタノールを添加した、または添加していない蛋白質試料緩衝液中で煮沸することによって溶出した。クーマジー・ブルー染色による可視化は、非還元ＫＳγ２−ＩＬ２は、約１８０ｋＤの分子量を有する、いくつかの種として移動することを示した。対照的に、ＫＳγ２ｈ−ＩＬ２は、約１８０ｋＤの見かけ上の分子量を有する主要なバンドとして移動した。ＫＳγ２−ＩＬ２およびＫＳγ２ｈ−ＩＬ２をＳＤＳ−ＰＡＧＥ前にメルカプトエタノールで還元すると、重鎖−ＩＬ２および軽鎖に対応する、同一のバンド・パターンがＫＳγ２−ＩＬ２およびＫＳγ２ｈ−ＩＬ２の両方ともで観測された。

学説に囚われることを望むものではないが、これらの観察は、ＫＳγ２−ＩＬ２において、見出だされた、該個別的に移動する種は、ジスルフィド結合のパターンのバラツキによることを示唆する。

改変されているγ２ｈイムノサイトカインは、動物で試験され、そして、元のＩｇＧγ１をベースとしたイムノサイトカインと対比して、動物腫瘍モデルにおいてより効果を有する、延長された半減期を有する。

ＫＳγ２−ＩＬ２およびＫＳγ２ｈ−ＩＬ２を発現するほ乳類細胞の安定なクローンもまた同定した。細胞のトランスフェクションは、本質的に同一の条件下で実施され、同様の数の安定にトランスフェクトした細胞をクローニングし、ＫＳγ２−ＩＬ２およびＫＳγ２ｈ−ＩＬ２の産生を試験した。ＫＳγ２ｈ−ＩＬ２を最も良く発現する４個のクローンは、組織培養上清の１ｍｌ当たり、約５２、３７、３１および３０マイクログラムの融合蛋白質を生産し、一方、同じ条件下で、ＫＳγ２−ＩＬ２を最も発現する４個のクローンは、組織培養上清の１ｍｌ当たり、約３１、２７、２７および１７マイクログラムの融合蛋白質を生産した。

実施例９： ハイブリッド・イソタイプおよび融合蛋白質活性に影響を及ぼす第２の変異を有する抗体融合蛋白質を発現するプラスミドの構築
ＨｕＫＳγ２−Ａｌａ−ＩＬ２ 対 ｈｕＫＳγ２ｈ−Ａｌａ−ＩＬ２
発現ベクターｐｄＨＬ７−ｈｕＫＳγ２−Ａｌａ−ＩＬ２およびｐｄＨＬ７−ｈｕＫＳγ２ｈ−Ａｌａ−ＩＬ２（前述）はそれぞれ、配列 ＧＧＧＴＡＡＡＴＧＡ （配列番号２４）とそれに続くＸｈｏＩ付着末端を含有する、ｐｄＨＬ７−ｈｕＫＳγ２抗体およびｐｄＨＬ７−ｈｕＫＳγ２ｈ抗体それぞれのＳｍａＩ−ＸｈｏＩ制限断片を、ｐｄＨＬ７−ｈｕＫＳγ１−Ａｌａ−ＩＬ２から単離された対応するＳｍａＩ−ＸｈｏＩ制限断片によって置換することによって構築した。この後者の断片は、配列 ＧＧＧＴＧＣＡ およびその直後に、翻訳終止コドンを含んでいる成熟ＩＬ２をコードするＤＮＡ配列を含有する。該ＧＣＡは、融合蛋白質の連結部のリジンからアラニンへの置換をコードする。得られるベクターは、ｈｕＫＳγ２−Ａｌａ−ＩＬ２およびｈｕＫＳγ２ｈ−Ａｌａ−ＩＬ２産生のため、細胞をトランスフェクトするために使用した。

実施例１０： 融合蛋白質の機能に影響を与える第２の変異を有するγ２抗体融合蛋白質および対応するγ２ｈ抗体融合蛋白質の非還元状態の特定
一過性のトランスフェクションのため、ＫＳγ２−Ａｌａ−ＩＬ２およびＫＳγ２ｈ−Ａｌａ−ＩＬ２をコードするプラスミドは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｐｌｕｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して、供給元の手順に従って、リポフェクションによりほ乳類細胞中に導入した。

ＫＳγ２−Ａｌａ−ＩＬ２およびＫＳγ２ｈ−Ａｌａ−ＩＬ２を発現するほ乳類細胞の安定なクローンもまた実施例２のように同定した。細胞のトランスフェクションは、本質的に同一な条件下で実施し、同様の数の安定なトランスフェクト細胞をクローニングし、ＫＳγ２−Ａｌａ−ＩＬ２およびＫＳγ２ｈ−Ａｌａ−ＩＬ２の産生を試験した。ＫＳγ２ｈ−Ａｌａ−ＩＬ２を最も良く発現する３個のクローンは、組織培養上清の１ｍｌ当たり、約３９、３８、および２９マイクログラムの融合蛋白質を生産し、一方、同し条件下で、ＫＳγ２−Ａｌａ−ＩＬ２を最も発現する３個のクローンは、組織培養上清の１ｍｌ当たり、約２２、１７および６マイクログラムの融合蛋白質を生産した。γ２およびγ２ｈイソタイプを有するＫＳ−Ａｌａ−ＩＬ２融合蛋白質は、実施例６で記載したように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって特定した。該改良培地（１０％血清）中のＫＳ−Ａｌａ−ＩＬ２融合蛋白質を、プロテインＡ・セファロース（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）で捕捉し、次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる特定に先立ち、２−メルカプトエタノールを添加した、または添加していない蛋白質試料緩衝液中で煮沸することによって溶出した。クーマジー・ブルー染色による可視化は、非還元ＫＳγ２−Ａｌａ−ＩＬ２はいくつかの種として移動することが示した。対照的に、ＫＳγ２ｈ−Ａｌａ−ＩＬ２は、１本の主要なバンドとして移動した。ＫＳγ２−Ａｌａ−ＩＬ２およびＫＳγ２ｈ−Ａｌａ−ＩＬ２抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ前にメルカプトエタノールで還元すると、重鎖−ＩＬ−２および軽鎖に対応する、同一のバンド・パターンがＫＳγ２−Ａｌａ−ＩＬ２およびＫＳγ２ｈ−Ａｌａ−ＩＬ２の両方ともに観測された。

学説に囚われることを望むものではないが、これらの観察は、ＫＳγ２−Ａｌａ−ＩＬ２において、見出だされた、該個別的に移動する種は、ジスルフィド結合のパターンのバラツキによることを示唆する。

実施例１１： 異なるイソタイプに由来する定常領域を有する抗体融合蛋白質の発現
場合によっては、その中において、ヒンジ領域に加えて、異なる定常領域が異なる重鎖イソタイプに由来している、Ｉｇ融合蛋白質を構築することが望ましい。この類の分子の特性を調べるために、以下の実験を実施した。

ＫＳ ＶＨ、ＩｇＧ１由来のＣＨ１とヒンジ領域、ならびにそれの後にＩＬ−２が続いているＩｇＧ２由来のＣＨ２−ＣＨ３領域（前述のように、その融合結合部のリジンがアラニンへと置換されている）を含むＩｇＧ重鎖を有する抗体−ＩＬ２融合蛋白質である、ｈｕＫＳ（γ１：ＣＨ１−Ｈ）（γ２：ＣＨ２−ＣＨ３）−Ａｌａ−ＩＬ２蛋白質を、以下のように発現させた。発現ベクター ｐｄＨＬ７−ｈｕＫＳ（γ１：ＣＨ１−Ｈ）（γ２：ＣＨ２−ＣＨ３）−Ａｌａ−ＩＬ２は、ｐｄＨＬ７−ｈｕＫＳγ２−Ａｌａ−ＩＬ２中のＨｉｎｄIII−ＡｆｌIII制限断片を、ＣＨ１およびヒンジ領域を含有する、ｐｄＨＬ７−ＫＳ−ＩＬ２由来の対応するＨｉｎｄIII−ＡｆｌIII制限断片と置換することによって構築した。この発現ベクターを、前述のように培養ほ乳類細胞中にトランスフェクトすると、ハイブリッド・イソタイプを有する抗体融合蛋白質が産生した。

ＨｕＫＳ（γ１：ＣＨ１−Ｈ）（γ２：ＣＨ２−ＣＨ３）−Ａｌａ−ＩＬ２ハイブリッドおよびＨｕＫＳγ２（Ａｌａ）−ＩＬ２抗体−サイトカイン融合蛋白質は、実施例６で記載したように、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって特定された。ＨｕＫＳ（γ１：ＣＨ１−Ｈ）（γ２：ＣＨ２−ＣＨ３）（Ａｌａ）−ＩＬ２ハイブリッド・イソタイプ蛋白質は、約１８０ｋＤの分子量を有する主要なバンドとして移動した。対照的に、ＨｕＫＳγ２（Ａｌａ）−ＩＬ２抗体−サイトカイン融合蛋白質は、１８０ｋＤのサイズ範囲において、複数のバンドとして移動した。

ＨｕＫＳ（γ１：ＣＨ１−Ｈ）（γ２：ＣＨ２−ＣＨ３）（Ａｌａ）−ＩＬ２ハイブリッドおよびＨｕＫＳ（γ２）（Ａｌａ）−ＩＬ２抗体−サイトカイン融合蛋白質を、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって特定した際には、両蛋白質は、軽鎖および重鎖−ＩＬ２融合ポリペプチドに対応する、同一のバンド・パターンを示した。

学説に囚われることを望むものではないが、ＨｕＫＳ（γ２）（Ａｌａ）−ＩＬ２抗体−サイトカイン融合蛋白質は、少なくとも２種類の異なる立体構造で存在し、その間の相違は、ジスルフィド結合のパターンの違いに起因しているようである。

実施例１２： 非蛋白質抗原特異性ならびに複数サブユニット融合パートナーを有するハイブリッド・イソタイプ抗体融合蛋白質の発現
１４．１８抗体は、グリコシド抗原ＧＤ２に結合する。インターロイキン−１２は、ジスルフィド結合によって共有結合的に連結された、ｐ３５およびｐ４０サブユニットを含むヘテロ二量体サイトカインである。

前述のように、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ハイブリッドなどのハイブリッド・イソタイプの使用は、ＩｇＧ２などの天然のイソタイプと比較して、促進された組み立てをもたらす。促進された組み立ては、上昇した発現濃度によって証明が可能である。

一例では、１４．１８（γ２）−Ａｌａ−ＩＬ１２および１４．１８（γ２ｈ）−Ａｌａ−ＩＬ１２発現プラスミドを構築し、前述、ならびにＧｉｌｌｉｅｓ他（ＷＯ ０９ ９２９７３２）中に記載されたように、同一の条件下で、並行して細胞中に一過性にトランスフェクトされた。ヒトＩＬ−１２を使用した。組織培養上清中の蛋白質濃度は、１４．１８（γ２）−Ａｌａ−ＩＬ１２発現プラスミドをトランスフェクトした培養物よりも、１４．１８（γ２ｈ）−Ａｌａ−ＩＬ１２発現プラスミドをトランスフェクトした培養物からのものでは、約４０％高かった。

１４．１８（γ２）−Ａｌａ−ＩＬ１２および１４．１８（γ２ｈ）−Ａｌａ−ＩＬ１２発現プラスミドはまた、前述のように、細胞中に安定にトランスフェクトし、それぞれのトランスフェクションによる、最も発現の高いクローン４個についてさらに研究した。１４．１８（γ２ｈ）−Ａｌａ−ＩＬ１２について、最も発現の高い４個のクローンの平均は、１４．１８（γ２）−Ａｌａ−ＩＬ１２発現プラスミドに由来する、最も発現の高い４個のクローンよりも、約４５％高かった。

第２の例では、１４．１８（γ２）−ＩＬ１２および１４．１８（γ２ｈ）−ＩＬ１２発現プラスミドを構築し、前述のように、同一の条件下で、並行して、細胞中に一過性にトランスフェクトされた。マウスＩＬ−１２を使用した。組織培養上清中の蛋白質濃度は、１４．１８（γ２）−ＩＬ１２発現プラスミドをトランスフェクトした培養物よりも、１４．１８（γ２ｈ）−ＩＬ１２発現プラスミドをトランスフェクトした培養物からのものが、約４０％高かった。

マウスのＩＬ−１２を使用した、１４．１８（γ２）−ＩＬ１２および１４．１８（γ２ｈ）−ＩＬ１２発現プラスミドはまた、前述のように、細胞中に安定にトランスフェクトし、それぞれのトランスフェクションによる、最も発現の高いクローン４個についてさらに研究した。１４．１８（γ２ｈ）−ＩＬ１２について、最も発現の高い４個のクローンの平均は、１４．１８（γ２）−ＩＬ１２発現プラスミドに由来する、最も発現の高い４個のクローンよりも、約３５％高かった。

これらの結果は、前の実施例におけるものとは異なる抗体および異なる非Ｉｇ部分を使用する際にも、融合蛋白質中における、ハイブリッド・イソタイプの使用は、増大した発現をもたらすことを示唆した。この実施例では、非Ｉｇ部分としてＩＬ−１２の使用は、ＩＬ−１２はヘテロ二量体であるため、該Ｉｇ融合蛋白質の組み立てを著しく複雑とすると予期される。それにもかかわらず、ハイブリッド・イソタイプの使用は、有益な効果を有していた。

実施例１３： ＩｇＡ由来のヒンジ領域を使用したハイブリッド・イソタイプ抗体融合蛋白質の発現
増強されたプロテアーゼ耐性を具えるＩｇ融合蛋白質を構築するため、ＩｇＡ／ＩｇＧ融合蛋白質を作製する。

例えば、ヒトＩｇＡ１のヒンジ領域およびＩｇＧ２のＣＨ２およびＣＨ３領域を含有するＦｃ−Ｘ融合蛋白質を構築する。

ヒトＩｇＡ１由来のヒンジ領域およびＩｇＧ２のＣＨ２およびＣＨ３領域を含む、Ｆｃ−Ｘ融合蛋白質を生産するための発現ベクターの構築例は以下の通りである。実施例１のプラスミドｐｄＣｓ−ｈｕＦｃγ２−レプチンを、ベクターとして使用する。

ｐｄＣｓ−ｈｕＦｃγ２−レプチン中のγ２ヒンジ・エキソンを含有するＡｆｌII−ＳｔｕＩ断片を、以下に示す、対応するＩｇＡヒンジ・エキソンを含有するＡｆｌII−ＳｔｕＩ断片（配列番号２５）と置換する。

具体的には、以下のオリゴヌクレオチドを合成する。

上部鎖：

下部鎖：

これらのオリゴヌクレオチドを、アニールして、ｐｄＣｓ−ｈｕＦｃγ２−レプチン中の対応する断片と置換するために使用する。

γ２エキソン中のＳｔｕＩ部位は、Ｃ−メチル化されており、また、ＳｔｕＩ制限エンドヌクレアーゼは、メチル化に感受性であるので、ＳｔｕＩ酵素で消化する前に、該プラスミドをＤＣＭ陰性細菌株から単離する。ＩｇＡ１由来のヒンジ領域を有する、得られるｐｄＣｓ−ｈｕＦｃγ２−レプチンは、ｐｄＣｓ−ｈｕＦｃα１／γ２−レプチンと称する。

プラスミド ｐｄＣｓ−ｈｕＦｃα１／γ２−レプチンは、真核細胞中にトランスフェクトされ、α１（ヒンジ）−γ２（ＣＨ２、ＣＨ３）−レプチン型のＦｃ−Ｘ蛋白質は、分泌蛋白質として発現される。例えば、実施例２の細胞および手法を使用する。得られるα１−γ２−レプチン蛋白質は、精製し、特定され、そして、レプチン活性を有し、かつヒンジ領域中におけるプロテアーゼ切断に対しては、比較的感受性がないことが見出された。

実施例１４： ＩｇＧおよび多価イムノグロブリンの成分を使用したハイブリッド・イソタイプ抗体融合蛋白質の発現
ＩｇＧ１またはＩｇＧ３などの、ＩｇＧのエフェクター機能ならびに、増加した結合価を具える抗体融合蛋白質を構築するために、ＩｇＧのＣＨ１、ヒンジ、およびＣＨ２領域およびＩｇＧＡまたはＩｇＭのＣＨ３およびＣＨ４領域を使用した、ハイブリッド・イソタイプＩｇ融合蛋白質を構築する。図４は、ＩｇＧ−ＩｇＭハイブリッド・イソタイプ融合蛋白質の構造を示す。非Ｉｇ部分を、ＩｇＡまたはＩｇＭ ＣＨ４ドメインのＣ末端に融合すると便利である。

特には、ＩｇＧ／ＩｇＡまたはＩｇＧ／ＩｇＭハイブリッド・イソタイプ融合蛋白質をＪ鎖無しで発現する際には、最もＣ末端のシステインの前で、ＩｇＡまたはＩｇＭ重鎖を切断するか、あるいは、このシステインを変異させることもまた便利である。このＣ末端システインの通常の役割は、Ｊ鎖とのジスルフィド結合を形成することである。特には、非Ｉｇ部分を重鎖のＣ末端に融合する際には、しばしば、同時発現するＪ鎖無しで、ＩｇＧ／ＩｇＡまたはＩｇＧ／ＩｇＭハイブリッド・イソタイプ融合蛋白質を発現することが望ましい。

例えば、ＩｇＧ−ＩｇＭハイブリッド・イソタイプ融合蛋白質は、以下の通りに構築する。プラスミド ｐｄＨＬ７−ｈｕＫＳγ１−ＩＬ２は、上皮細胞接着分子に結合する可変領域およびヒトＩｇＧ１の定常領域を有する抗体を発現することができる。このプラスミドは、ＩｇＧ１ ＣＨ２とＣＨ３コード配列との間のイントロン中に、単一のＮｇｏ Ｍ ＩＶ部位を含有し、また、ＩｇＧ１ ＣＨ３とＩＬ−２部分のコーディング配列間の結合部に、単一のＸｍａＩ部位もまた含有する。ヒトＩｇＭ ＣＨ３およびＣＨ４配列をコードするＤＮＡ断片は、以下のプライマーを使用して、ヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅によって作製する。

および

あるいは、以下のプライマーを使用する。これらは、ＩｇＭ部分中の最もＣ末端のシステインは、セリンに変異されているという特徴を有する。

および

得られたＤＮＡ断片を、Ｎｇｏ Ｍ ＩＶおよびＸｍａＩで切断し、次に直接的に、または間接的に、Ｎｇｏ Ｍ ＩＶおよびＸｍａＩで切断した、ｐｄＨＬ７−ｈｕＫＳγ１−ＩＬ２に連結する。例えば、ＩｇＭ ＣＨ３およびＣＨ４ドメインをコードする、該ＰＣＲ断片を、まずＴＡクローニング・ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）などのベクター中にサブクローニングし、挿入部の配列を確認し、次に、Ｎｇｏ Ｍ ＩＶおよびＸｍａＩを使用して挿入部を除去し、ｐｄＨＬ７−ｈｕＫＳγ１−ＩＬ２中に連結する。ヒトＩＬ−２に融合されている、得られたハイブリッド・イソタイプ重鎖のアミノ酸配列を、配列番号３３に示す。融合蛋白質のＩｇＭ部分には、下線を引いてある。ヒトＩｇＭ重鎖においては、遺伝子多型が天然に生じるので、機能的には類似する、近縁している配列を作製することもまた可能である。

それに代わる、多くのＤＮＡ構築方法が可能である。例えば、ＩｇＭ ＣＨ３およびＣＨ４ドメインをコードするＤＮＡ配列は、ＩｇＭ発現細胞株または細胞群からＲＴ−ＰＣＲによって作製することが可能である。３’ＰＣＲプライマーは、前記に示したものと同一であってよいが、５’プライマーは、Ｎｇｏ Ｍ ＩＶ部位とＩｇＭ ＣＨ３のコーディング配列の初めとの間に、人為的な５’スプライス部位を取り込む。

次に、真核細胞を得られたプラスミドｐｄＨＬ７−ｈｕＫＳγ１／μ−ＩＬ２で形質転換し、そして、得られた蛋白質は、発現され、細胞から分泌させた。例えば、前記の実施例中に記載された、細胞および方法を使用する。精製された蛋白質を、例えば、電子顕微鏡または限外ゲル濾過クロマトグラフィーによって試験され、そして、多量体構造であることが見出された。精製された蛋白質は、例えばペプチドマッピングによってさらに研究され、そして、配列…ＡＳＩＣＥＤＤ…（配列番号３４）中のシステインは、他のＩｇＧ／ＩｇＭハイブリッド・イソタイプ・サブユニットと鎖間ジスルフィド結合を形成することが判明した。このような連結の例を、図４に例示する。図４の５量体構造に加えて、ＩｇＧ／ＩｇＭハイブリッド・イソタイプ蛋白質の最終形態は、６量体またはさらに他の種類の多量体構造であってもよい。

得られたＩｇＧ／ＩｇＭハイブリッド・イソタイプ融合蛋白質は、Ｆｃγ受容体に結合することが見いだされた。例えば、この融合蛋白質は、ヒトＩｇＧと競合する様式でＪ７７４細胞に結合する。

実施例１５： ＩｇＧ１およびＩｇＧ４の成分を使用したハイブリッド・イソタイプ抗体の発現
実施例１５〜１７における実験の目的は、一部は、主にＩｇＧ４から成る分子の組み立ての改善における、ハイブリッド・イソタイプ抗体の効用を示すことである。一般的に、ＩｇＧ分子の通常好ましい形態は、２本の重鎖および２本の軽鎖を具えている、Ｈ₂Ｌ₂形態である。しかし、ＩｇＧ４抗体の重要な画分は、１本の重鎖および１本の軽鎖を具えた、ＨＬ「半分子」として合成される。Ａｎｇａｌ他（１９９３、 Ｍｏｌｅｃ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３０：１０５）は、分泌されたヒトＩｇＧ４において見出される「半分子」の量を減少させる、セリンからプロリンへの置換について記載している。

この例は、同じＶ領域を含有する、３種類の抗体、ＩｇＧ４型、ＩｇＧ１由来のヒンジおよびＩｇＧ４ ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを有する型、およびヒンジ領域中に変異を有するＩｇＧ４型の組み立て特性を比較している（Ａｎｇａｌ他、同文献）。

標準的なプラスミド構築技術を使用して、ｐｄＨＬ７−ＫＳ−γ４と称するプラスミドを構築した。このプラスミドは、ＩｇＧ２重鎖の定常領域の代わりに、ＩｇＧ４重鎖の定常領域をコードしていること以外は、実施例５中に記載したプラスミドｐｄＨＬ７−ｈｕＫＳγ２と同一である。

ｐｄＨＬ７−ＫＳ−γ４ｈを構築するために、ｐｄＨＬ７−ＫＳ−γ２ｈプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉのｄｃｍ（−）株中で増殖させ、プラスミドＤＮＡを単離し、改変されたＩｇＧ１ヒンジ領域をコードする６０ｂｐのＰｓｔＩ−ＳｔｕＩ断片を単離し、ｐｄＨＬ７−ＫＳ−γ４中の対応する断片を置換するために使用した。

比較のために、ヒンジ領域に変異を有するＩｇＧ４型（Ａｎｇａｌ他、同文献）を以下の通りに構築した。セリンからプロリンへの置換、５’ＰｓｔＩ付着末端および３’ＳｔｕＩ平滑末端を有する、γ４ヒンジをコードするオリゴヌクレオチド２本鎖を以下の通りに設計した。

このオリゴヌクレオチド２本鎖を使用して、ｐｄＨＬ７−ＫＳ−γ４中の対応するＤＮＡ断片を置換して、ｐｄＨＬ７−ＫＳ−γ４（ＳｔｏＰ）を与えた。

ｐｄＨＬ７−ＫＳ−γ４、ｐｄＨＬ７−ＫＳ−γ４ｈおよびｐｄＨＬ７−ＫＳ−γ４（ＳｔｏＰ）プラスミドを、例えばＬｏ他（１９９８、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１：４９５〜５００）中に記載されるような、標準的方法に従って、ほ乳類細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞の上清から、ｐｄＨＬ７−ＫＳ−γ４、ｐｄＨＬ７−ＫＳ−γ４ｈ、およびｐｄＨＬ７−ＫＳ−γ４（ＳｔｏＰ）によってコードされた抗体蛋白質は、精製され、そして、ＳＤＳゲル電気泳動によって特定し、還元試料および非還元試料が比較された。

非還元分子を調べることによって、ＫＳ−γ４抗体群は、約５０％がＨＬ「半分子」、５０％がＨ₂Ｌ₂分子として存在することが見出された。対照的に、ＫＳ−γ４ｈ抗体群およびＫＳ−γ４（ＳｔｏＰ）抗体群は、ほとんど全部、Ｈ₂Ｌ₂分子として存在していた。ＨＬ半分子の部分は、ＫＳ−γ４ｈ抗体群およびＫＳ−γ４（ＳｔｏＰ）抗体群において、ほぼ同じである。還元した分子を調べた際には、ＫＳ−γ４、ＫＳ−γ４ｈ、およびＫＳ−γ４（ＳｔｏＰ）において、見出される重鎖および軽鎖のパターンは、区別がつかなかった。

実施例１６： ＩｇＧ１およびＩｇＧ４の成分を使用したハイブリッド・イソタイプ抗体融合蛋白質の発現
プラスミド ｐｄＨＬ７−ＫＳ−γ４−ＩＬ２は、Ｇｉｌｌｉｅｓ他（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９９）５９：２１５９）中に記載されている。このプラスミドは、ＥｐＣＡＭ抗原を認識し、かつそのＣ末端に融合したインターロイキン−２を有するＩｇＧ４の重鎖を含有する、Ｖ領域を具える抗体融合蛋白質をコードする。

実施例１５で使用したものと類似した組換えＤＮＡ方法によって、プラスミド ｐｄＨＬ７−ＫＳ−γ４ｈ−ＩＬ２およびｐｄＨＬ７−ＫＳ−γ４（ＳｔｏＰ）−ＩＬ２を構築した。プラスミド ｐｄＨＬ７−ＫＳ−γ４−ＩＬ２、ｐｄＨＬ７−ＫＳ−γ４ｈ−ＩＬ２およびｐｄＨＬ７−ＫＳ−γ４（ＳｔｏＰ）−ＩＬ２を、ほ乳類細胞中にトランスフェクトし、そして、対応する蛋白質は、発現され、例えばＬｏ他（文献）中に記載されるような、標準的方法に従って、精製された。トランスフェクトした細胞の上清から、ｐｄＨＬ７−ＫＳ−γ４−ＩＬ２、ｐｄＨＬ７−ＫＳ−γ４ｈ−ＩＬ２およびｐｄＨＬ７−ＫＳ−γ４（ＳｔｏＰ）−ＩＬ２によってコードされた融合蛋白質は、精製され、そして、ＳＤＳゲル電気泳動によって特定され、そこで、還元試料および非還元試料が比較された。

非還元分子を調べることによって、ＫＳ−γ４−ＩＬ−２融合蛋白質群は、約５０％がＨＬ「半分子」、５０％がＨ₂Ｌ₂分子として存在することが見出された。対照的に、ＫＳ−γ４ｈ−ＩＬ−２融合蛋白質群およびＫＳ−γ４（ＳｔｏＰ）−ＩＬ−２融合蛋白質群は、ほとんど全部、Ｈ₂Ｌ₂分子として存在していた。ＨＬ半分子の部分は、ＫＳ−γ４ｈ融合蛋白質群およびＫＳ−γ４（ＳｔｏＰ）−ＩＬ−２融合蛋白質群とにおいては、ほぼ同じである。還元した分子を調べた際、ＫＳ−γ４−ＩＬ−２、ＫＳ−γ４ｈ−ＩＬ−２、およびＫＳ−γ４（ＳｔｏＰ）−ＩＬ−２において観測された、重鎖および軽鎖のパターンは、区別がつかなかった。

実施例１７： ＩｇＧ１およびＩｇＧ４の成分を使用したハイブリッド・イソタイプＦｃ融合蛋白質の発現
ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、および非Ｉｇ部分を含有し、該Ｉｇ部分は、ＩｇＧ４およびＩｇＧ１に由来している、融合蛋白質の発現のための一連のプラスミドを創製するために、以下の工程を試みた。

最初に、実施例１中に記載したものと類似した方法を使用して、ＩｇＧ４由来のＦｃ領域をコードする発現ベクターは、ｐｄＣｓ−ｈｕＦｃγ１のＩｇＧ１由来のＤＮＡ配列（Ｌｏ他、（１９９８） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１：４９５〜５００）を、ＩｇＧ４の対応する部分をコードする配列で置換することによって作製した。具体的には、その５’末端にＡｆｌII部位をコードする以下のオリゴヌクレオチドを、

ＩｇＧ４ ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域をコードするＤＮＡ部分を増幅するための５’プライマーとして使用した。３’プライマーは、ＩｇＧ２ Ｆｃ領域を増幅するために実施例１中で使用したプライマーと類似して、ＸｈｏＩ部位を、その５’末端に含有していた。得られたＡｆｌII−ＸｈｏＩ断片を、ＸｈｏＩ＋ＡｆｌII切断ｐｄＣｓ−ｈｕＦｃγ１中に挿入して、ｐｄＣｓ−ｈｕＦｃγ４を作製した。

Ｆｃγ４のＣ末端への非ＩｇＧ部分をコードする核酸の挿入を容易にするために、以下のように、ｐｄＣｓ−ｈｕＦｃγ４中のＦｃγ４コード領域のＣ末端近隣に、以下のＬｅｕからＰｒｏへの変化を導入することによって、ＳｍａＩ部位を作製した。

が、

へと変えられた。

標準的な部位特異的変異技術を使用して、ｐｄＣｓ−ｈｕＦｃγ４中にＳｍａＩ部位を導入した。

改変されたＩｇＧ１ヒンジとそれに続くＩｇＧ４ ＣＨ２およびＣＨ３ドメインをコードする、ｐｄＣｓ−ｈｕＦｃγ４ｈと称する、プラスミドを作製するために、ＩｇＧ２ ＣＨ２およびＣＨ３ドメインをコードしている、ｐｄＣｓ−ｈｕＦｃγ２ｈのＳｔｕＩ−ＸｈｏＩ断片（実施例１）を、ｐｄＣｓ−ｈｕＦｃγ４由来の対応する断片で置換した。この構築物においては、親プラスミドは、いずれも、Ｅ．ｃｏｌｉのｄｃｍ（−）株に由来している。γ４をコードするＤＮＡ中に付加的なＳｔｕＩ部位があるので、ｐｄＣｓ−ｈｕＦｃγ４プラスミドは、ＸｈｏＩによって完全に消化し、そして、ＳｔｕＩによって部分的に消化し、約３００、５００および８００塩基対の断片を生じた。約８００塩基対の断片を使用して、ｐｄＣｓ−ｈｕＦｃγ２ｈの対応する断片を置換した。

ＩＦＮβ ｃＤＮＡは、ＡＴＧは、成熟蛋白質のＮ末端残基で、ＣＣＣＧＧＧは、導入されたＳｍａＩ制限部位である、センスプライマー ＣＣＣＧＧＧＴ ＡＴＧ ＡＧＣ ＴＡＣ ＡＡＣ ＴＴＧ ＣＴＴ ＧＧＡ ＴＴＣ（配列番号４３）と、ＴＣＡは翻訳終止コドンのアンチコドンで、ＣＴＣＧＡＧは導入されたＸｈｏＩ制限部位である、リバース側プライマー ＣＴＣＧＡＧ ＴＣＡ ＧＴＴ ＴＣＧ ＧＡＧ ＧＴＡ ＡＣＣ ＴＧＴ ＡＡＧ（配列番号４４）とを使用して、ＰＣＲによってクローニングした。鋳型ＤＮＡは、ｐＬＧ１１７Ｒ（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ他、 （１９８０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：５２３０〜５２３３）であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより（ＡＴＣＣ 番号 ３１９０３）入手した。配列確認の後、クローニングしたＳｍａＩ−ＸｈｏＩ断片を、ｐｄＣｓ−ｈｕＦｃγ４発現ベクターのＳｍａＩおよびＸｈｏＩ部位に連結し、ｐｄＣｓ−ｈｕＦｃγ４−ＩＦＮβを与えた。同様の方法によって、類似のｐｄＣｓ−ｈｕＦｃγ４ｈ−ＩＦＮβ発現プラスミドもまた構築した。

ｐｄＣｓ−ｈｕＦｃγ４（ＳｔｏＰ）−ＩＦＮβ発現プラスミドを構築するために、セリンがプロリンへと置換され、５’ＡｆｌII付着末端および３’ＳｔｕＩ平滑末端を有するγ４ヒンジをコードするオリゴヌクレオチド二本鎖を、以下の通りに合成した。

このＤＮＡを使用して、ｐｄＣｓ−Ｆｃ−ｇ４−ＩＦＮβ中の対応するＤＮＡ断片を置換し、ｐｄＣｓ−ｈｕＦｃγ４（ＳｔｏＰ）−ＩＦＮβを与えた。

プラスミド ｐｄＣｓ−ｈｕＦｃγ４−ＩＦＮβ、ｐｄＣｓ−ｈｕＦｃγ４ｈ−ＩＦＮβおよびｐｄＣｓ−ｈｕＦｃγ４（ＳｔｏＰ）−ＩＦＮβを、それぞれほ乳類細胞中にトランスフェクトした。発現したＦｃ含有蛋白質を精製し、そして、還元および非還元ＳＤＳゲル電気泳動によって調べた。ほ乳類細胞から発現されたｈｕＦｃγ４−ＩＦＮβ蛋白質の大部分は、通常の二量体抗体ではなく、モノマーの半分子であった。しかし、発現されたｈｕＦｃγ４ｈ−ＩＦＮβおよびｈｕＦｃγ４（ＳｔｏＰ）−ＩＦＮβ融合蛋白質は、ほとんど全てが、正しく組み立てられた二量体であった。ｈｕＦｃγ４ｈ−ＩＦＮβ、およびｈｕＦｃγ４（ＳｔｏＰ）−ＩＦＮβ融合蛋白質の双方に関して、モノマーの比率は、ほぼ同じであった。

総合すると、実施例１５、１６および１７の結果は、主にＩｇＧ４から成るが、改変されたＩｇＧ１ヒンジを有する、ハイブリッド・イソタイプ抗体およびＩｇ融合蛋白質は、完全にＩｇＧ４に由来している対応する蛋白質と比較して、優れた組み立て特性を有することを示唆している。加えて、実施例１５〜１７の結果は、その他の実施例と組み合わせると、ハイブリッド・イソタイプ蛋白質の改善された組み立ては、いくつかの異なる方法で証明できることを示している。例えば、いくつかの場合では、ハイブリッド・イソタイプ抗体または融合蛋白質は、対応する単一イソタイプ抗体またはＩｇ融合蛋白質と比較して、低減された凝集を示し、また、他の場合には、ハイブリッド・イソタイプ抗体または融合蛋白質は、単一イソタイプ抗体またはＩｇ融合蛋白質と比較して、促進された正しいオリゴマー化を示す。

実施例１８： ＩｇＧ１およびＩｇＧ４の成分を使用したハイブリッド・イソタイプＦｃ融合蛋白質の発現
ほ乳類細胞から発現された際、最小の凝集しか起こさない、Ｆｃエリスロポエチン融合蛋白質を作製するために、以下の発現プラスミドを、標準的な分子生物学的技術を使用して構築した。ＷＯ ０１／３６４８９中に開示されているように、アミノ酸置換、Ｈｉｓ３２Ｇｌｙ、Ｃｙｓ３３Ｐｒｏ、Ｔｒｐ８８Ｃｙｓ、およびＰｒｏ９０Ａｌａを得られる変異を有する、ヒト・エリスロポエチン・コーディング配列の形態を含有している、ＸｍａＩ−ＸｈｏＩ ＤＮＡ断片を使用した。対応する蛋白質配列を、配列番号４７に示す。

このＸｍａＩ−ＸｈｏＩ ＤＮＡ断片を、ＣＨ３ Ｃ末端の領域中にアミノ酸置換をもたらす、２組の変異があり、その結果、ＣＨ３ Ｃ末端およびＥｐｏ Ｎ末端の結合部の配列が以下の通りである以外は、実施例１中で構築したベクターと本質的に同一である、ＩｇＧ１由来のヒンジ領域およびＩｇＧ２由来のＣＨ２およびＣＨ３領域をコードするプラスミドベクター中に挿入した。

ＩｇＧ２ ＣＨ３領域の配列 ＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号４９）を、ＫＳＡＴＡＴＰＧ（配列番号４５）に変更する第１組の変異は、米国特許出願 第６０／２８０６２５号に開示されている。Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号４９の位置３から位置６）を、Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号５０の位置３から位置６）に置換する効果は、ヒトＦｃとヒト・エリスロポエチンとの間の結合部は、非自己ペプチド配列を有するために生じる可能性のある、潜在的なヒト非自己Ｔ細胞エピトープを除去することである。ＣＨ３領域のＣ末端アミノ酸のＫからＡへの単一のアミノ酸置換からなる、第２組は、米国特許出願第０９／７８０６６８号に開示されている。

実施例１および２の手順に従って、得られたプラスミドを、ＮＳ／０細胞中にトランスフェクトし、そして、Ｆｃ−Ｅｐｏ融合蛋白質を、発現、精製した。プロテインＡへの結合に基づく精製の後、ＩｇＧ２ ＣＨ３および前述のエリスロポエチン置換物を含有している、ｈｕＦｃγ２ｈ−ｈｕＥｐｏ蛋白質は、ゲル濾過クロマトグラフィーによって特定し、そして、２種類の異なる調製物において、９７％および９０％のモノマーから構成されることが見出された。ＩｇＧ２ ＣＨ３および前述のエリスロポエチン置換物を含有するｈｕＦｃγ２ｈ−ｈｕＥｐｏ蛋白質は、分子ベースで、エリスロポエチンのＴＦ−１細胞分化刺激能力を測定する、細胞をベースとしたアッセイにおいて、ヒト・エリスロポエチンとほぼ同じ活性があることが見出された。このアッセイは、ＷＯ ０１／３６４８９中に記載されるように、実施した。

加えて、ＩｇＧ１（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）、ＩｇＧ２（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）、またはＩｇＧ１（ヒンジ）−ＩｇＧ２（ＣＨ２−ＣＨ３）のいずれかから構成されるＦｃ領域のＣ末端へに、非変異ヒト・エリスロポエチンを融合したものも、特定した。非変異ヒトＦｃ配列および非変異エリスロポエチン配列を含む発現プラスミドは、前述および実施例１中に記載されるプラスミドに類似して、構築した。ＮＳ／０細胞に、Ｆｃγ１−Ｅｐｏ、Ｆｃγ２−Ｅｐｏ、およびＦｃγ２ｈ−Ｅｐｏ発現プラスミドをトランスフェクトし、そして、各プラスミドについて、ほぼ同数のクローンをスクリーニングした後、安定なクローンを単離した。最も多く産生するクローンは、Ｆｃγ１−Ｅｐｏに関しては、５０μｇ／ｍｌを、Ｆｃγ２−Ｅｐｏに関しては、２０μｇ／ｍｌを、また、Ｆｃγ２ｈ−Ｅｐｏに関しては、１２０μｇ／ｍｌを産生した。

均等物
本発明は、それらの本質および必須の特徴を逸脱することなく、他の特定の形態で実施することが可能である。従って、全ての点において、前述の実施態様は、本明細書中に記載した本発明を限定するものではなく、例示するものと考えるべきものである。すなわち、本発明の技術的範囲は、前述の記載よりも、寧ろ添付したクレームによって示され、そして、クレームの均等の意味するものおよび範囲内に入る、変更の全ては、それに含まれると意味する。

参考文献の援用
本明細書中で上述した、特許、特許出願、および科学的発行物の全ては、参照することで、その全体を、本出願中に組み入れられえる。

図１のＡ〜Ｄは、本発明のいくつかの形態にかかる融合蛋白質を調製するために使用する、ＩｇＧハイブリッド・イソタイプの模式的な図示である。太線は、システイン残基を結合している、ジスルフィド結合を表す。抗体のドメインは、図１ Ａに示す。ＩｇＧ１ドメインは、黒で、ＩｇＧ２ドメインは、白で、可変ドメインおよび軽鎖ドメインは、縞模様で示す。

図１ Ａは、ＩｇＧ１イソタイプを示す。

図１ Ｂは、ＩｇＧ２イソタイプを示す。

図１ Ｃは、ＩｇＧ２と、第１のシステインに変異を有するＩｇＧ１ヒンジとのイソタイプ・ハイブリッドを示す。

図１ Ｄは、ＩｇＧハイブリッド γ１（ＣＨ１−Ｈ）γ２（ＣＨ２−ＣＨ３）を示す。
図２ Ａ〜Ｃは、ハイブリッド・イソタイプを含む、Ｆｃ領域を含むＩｇ融合蛋白質の模式的な図示である。「Ｘ」および「Ｙ」は、いずれの非Ｉｇ部分であってもよい。

図２ Ａは、一つの抗体イソタイプに由来するヒンジ、ならびに、第２のイソタイプに由来するＣＨ２およびＣＨ３ドメインから成るＦｃ部分を含む、Ｆｃ−Ｘ構造のＩｇ融合蛋白質を示す。該Ｆｃ部分のＣ末端には、蛋白質部分「Ｘ」がある。

図２ Ｂは、一つの抗体イソタイプに由来するヒンジ、ならびに、第２のイソタイプに由来するＣＨ２およびＣＨ３ドメインから成るＦｃ部分を含む、Ｘ−Ｆｃ構造のＩｇ融合蛋白質を示す。該Ｆｃ部分のＮ末端には、蛋白質部分「Ｘ」がある。

図２ Ｃは、一つの抗体イソタイプに由来するヒンジ、ならびに、第２のイソタイプに由来するＣＨ２およびＣＨ３ドメインから成るＦｃ部分を含む、Ｘ−Ｆｃ−Ｙ構造のＩｇ融合蛋白質を示す。該Ｆｃ部分のＮ末端には、いずれの蛋白質でもよい、「Ｘ」があり、そして、該Ｆｃ部分のＣ末端には、蛋白質部分「Ｙ」がある。
図３ Ａ〜Ｄは、可変領域を含み、かつ、ハイブリッド・イソタイプを含んでいる、Ｉｇ融合蛋白質の模式的な図示である。「Ｘ」および「Ｙ」は、いずれの非Ｉｇ部分であってもよい。

図３ Ａは、一つの抗体イソタイプに由来するヒンジ（黒）ならびに異なるイソタイプに由来するＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含むＩｇ融合蛋白質を示す。非Ｉｇ蛋白質「Ｘ」は、重鎖のＣ末端に融合されている。

図３ Ｂは、一つの抗体イソタイプに由来するヒンジ（黒）ならびに異なるイソタイプに由来するＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含むＩｇ融合蛋白質を示す。非Ｉｇ蛋白質「Ｘ」は、重鎖のＣ末端に融合されている。矢印は、本明細書中に記載される、抗体部分中において、変異が可能な部位の部分群を示す。

図３ Ｃは、一つの抗体イソタイプに由来するヒンジとＣＨ１領域（黒）ならびに異なるイソタイプに由来するＣＨ２とＣＨ３領域を含むＩｇ融合蛋白質を示す。非Ｉｇ蛋白質「Ｘ」は、重鎖のＣ末端に融合されている。該ヒンジから出ている枝分かれ構造は、糖鎖付加部分を表す。

図３ Ｄは、一つの抗体イソタイプに由来するヒンジ（黒）ならびに異なるイソタイプに由来するＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含むＩｇ融合蛋白質を示す。非Ｉｇ蛋白質「Ｘ」は、重鎖のＣ末端に融合されている。第二の非Ｉｇ蛋白質「Ｙ」は、軽鎖のＮ末端に融合されている。

図３ Ｅは、一つの抗体イソタイプに由来するヒンジ（黒）ならびに異なるイソタイプに由来するＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含むＩｇ融合蛋白質を示す。非Ｉｇ蛋白質「Ｘ」は、重鎖のＣ末端に融合されている。第二の非Ｉｇ蛋白質「Ｙ」は、重鎖のＮ末端に融合されている。
複数のイソタイプを含んでいる、可変領域複数を含み、かつＩｇＧと比較して、増加した結合価を有するＩｇ融合蛋白質の模式的な図示である。黒色の楕円は、ＩｇＭに由来するＣＨ３およびＣＨ４ドメインを表し、白色の楕円は、ＩｇＧに由来するＣＨ１、ヒンジおよびＣＨ２ドメインを表し、縞模様の楕円は、可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを表し、太線は、ＩｇＧ１中で通常見い出されるジスルフィド結合を表し、「ｓ」の符号を付してある細い線は、ＩｇＭ中で通常見い出されるジスルフィド結合を表す。

配列表

Claims (8)

1. 非イムノグロブリン部分と融合されたイムノグロブリン部分を含んでなる融合蛋白質であって、
   前記イムノグロブリン部分は、第１の抗体イソタイプに由来する第１の領域と、第２の抗体イソタイプに由来する第２の領域とを含んでおり、
   前記第１の抗体イソタイプに由来する第１の領域は、改変されたヒトＩｇＧ１由来のヒンジ領域であり、該改変されたヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１の軽鎖とのジスルフィド結合を形成するシステイン残基の少なくとも一つに対するアミノ酸置換による改変を含んでおり、
   前記第２の抗体イソタイプに由来する第２の領域は、ヒトＩｇＧ２由来のＣＨ２とＣＨ３ドメイン、または、ヒトＩｇＧ４由来のＣＨ２とＣＨ３ドメインであり、
   前記第１の抗体イソタイプに由来する第１の領域のＣ末端に、前記第２の抗体イソタイプに由来する第２の領域が連結されている
   ことを特徴とする融合蛋白質。
2. 前記イムノグロブリン部分は、抗原結合部位を欠失している
   ことを特徴とする請求項１に記載の融合蛋白質。
3. 前記イムノグロブリン部分は、抗原結合部位を含んでいる
   ことを特徴とする請求項１に記載の融合蛋白質。
4. 前記非イムノグロブリン部分は、該イムノグロブリン部分の重鎖のＣ末端に、遺伝子操作によって融合されている
   ことを特徴とする請求項１に記載の融合蛋白質。
5. 前記非イムノグロブリン部分は、該イムノグロブリン部分の重鎖のＮ末端に、遺伝子操作によって融合されている
   ことを特徴とする請求項１に記載の融合蛋白質。
6. 腫瘍に関連する抗原に対するＶドメインを含むイムノグロブリン部分であって、
   第１の抗体イソタイプに由来する第１の領域と、第２の抗体イソタイプに由来する第２の領域とを含んでおり、
   前記第１の抗体イソタイプに由来する第１の領域は、改変されたヒトＩｇＧ１由来のヒンジ領域であり、該改変されたヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１の軽鎖とのジスルフィド結合を形成するシステイン残基の少なくとも一つに対するアミノ酸置換による改変を含んでおり、
   前記第２の抗体イソタイプに由来する第２の領域は、ヒトＩｇＧ２由来のＣＨ２とＣＨ３ドメイン、または、ヒトＩｇＧ４由来のＣＨ２とＣＨ３ドメインであり、
   前記第１の抗体イソタイプに由来する第１の領域のＣ末端に、前記第２の抗体イソタイプに由来する第２の領域が連結されている
   ことを特徴とするイムノグロブリン部分。
7. 前記非イムノグロブリン部分は、エリスロポエチン分子を含む
   ことを特徴とする請求項１に記載の融合蛋白質。
8. 前記第２の抗体イソタイプに由来する第２の領域は、ヒトＩｇＧ２由来のＣＨ２とＣＨ３ドメインであり、そのヒトＩｇＧ２由来のＣＨ３ドメイン部分は、該ＣＨ３ドメインのＣ−末端アミノ酸のＬｙｓをＡｌａに置換する、単一のアミノ酸置換を含んでいる
   ことを特徴とする請求項１に記載の融合蛋白質。

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