KR102371173B1 - 인간화된 항-인간-pd-1 항체 - Google Patents
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Abstract
인간화된 항-PD-1 항체, 이를 코딩하는 핵산, 및 T 세포 활성화에 의한 면역 반응 향상 및 암 및 감염성 질환과 같은 질병 치료에서 이의 용도가 본원에서 기술된다.
Description
본 발명은 특히 인간 질환의 치료에 있어서 면역학 및 면역요법의 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 인간 질환 치료에서 유용한 인간화된 항-인간 PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
예정된 세포 사멸 단백질 1(PD-1: Programmed cell death protein, CD279로도 공지됨)은 면역글로불린 수퍼패밀리에 속하는 세포 표면 단백질 분자이다. PD-1은 T 및 B 림프구 및 대식세포 상에서 발현되며, 세포 운명 및 분화에 중요한 역할을 한다. 특히, 면역 체크포인트로서 기능하는 PD-1은 T-세포의 활성화를 방지하여 면역계를 하향-조절하는 중요한 역할을 하여, 이어서 자가면역을 감소시키고 자가-관용(self-tolerance)을 촉진한다. PD-1에 대한 2개의 리간드인 PD-L1 및 PD-L2가 확인되었으며, 이는 T 세포 활성화를 하향조절하여, PD-1에 결합 시 T 세포에서 동시-억제 신호를 유도하고 이들의 아폽토시스, 무반응(anergy), 및 기능 고갈(functional exhaustion)을 유도하는 것으로 밝혀졌다(문헌[Freeman et al. (2000) J Exp Med 192: 1027-34]; 문헌[Latchman et al. (2001) Nat Immunol 2:261-8]; 문헌[Carter et al. (2002) Eur J Immunol 32:634-43)]). 리간드 PD-L1 및 PD-L2는 정상 인간 세포에서는 발현되지 않으나, 다양한 인간 암에서 풍부할 수 있다(문헌[Dong et al. (2002) Nat Med 8:787-9, Brahmer et al., N Eng J Med, 366(26), 2012]; 문헌[Topalian et al., N Eng J Med, 366(26), 2012]; 문헌[Wolchok et al., N Engl J Med. 2013 Jul 11; 369(2): 122-133).]). PD-L1은 PD-L2보다 광범위하게 발현되며 다양한 조혈 및 비-조혈 세포에 의해 발현된다.
종양, 미생물 및 바이러스는 PD-L1/PD-1과 같은 동시-억제 경로를 이용하여 면역 억제 미세환경을 생성하여 면역 방어 및 감시를 회피한다. 특히, 종양, 미생물 또는 바이러스에 의해 유발되는 PD-L1/PD-1 경로는 T 세포 불활성화 촉진, 피로, 비반응성 및 아폽토시스를 촉진하는 것을 포함하여 다양한 기작을 통해 숙주 면역학적 감시에서 벗어날 수 있으며, 이는 T-reg 세포 증폭을 유도하고, 사멸 및 아폽토시스에 저항하는 종양의 내재적 능력을 향상시킨다. 종양 세포에 의해 매개되는 PD-1과 PD-L1의 상호작용은 또한 TCR의 하류 신호를 감소시킴으로써 종양 침윤 림프구의 감소 및 T 세포 수용체에 의해 매개되는 T 세포 증식의 억제를 유도하여, 활성화 및 사이토카인 생성을 감소시킨다(문헌[Dong et al. J. Mol. Med. 2003, 81: 281-7]; 문헌[Blank et al. Cancer Immunol. Immunother. 2005, 54: 307-314]; 문헌[Konishi et al. Clin. Cancer Res. 2004, 10: 5094-100]). 종양 침윤 림프구 또는 종양 세포에서 PD-1의 발현이 다수의 원발성 종양 생검에서 발견되었다(문헌[Ribas A. Cancer Discov. 2015, 5(9):915-9]).
면역억제 역할을 감안할 때, PD-1 억제제는 인간 면역계에 대한 이러한 해로운 영향에 대응하기 위해 개발되었다. 이러한 PD-1 억제제는 종양이나 감염된 세포를 공격하기 위해 면역계를 활성화하는 것으로 여겨지며 따라서 암 및 질병 치료에 사용될 수 있다. 실제로, 이들의 상호작용을 방해하기 위해 PD-1 또는 PD-L1의 억제제를 사용하는 전략은 암 면역요법을 개선할 수 있는 잠재력을 보여주었다(문헌[Brahmer et al., N Eng J Med, 366(26), 2012]; 문헌[Powles et al., Nature, 515(7528), 2014]; 문헌[Topalian et al., N Eng J Med, 366(26), 2012]; 문헌[Ansell, Curr Opin Hematol, 22(4), 2015]). 특히, PD-1과 이의 리간드 사이의 상호작용을 차단하면 종양 세포를 제거할 수 있는 종양-특이적 CD8 T-세포 면역이 향상된다(문헌[Topalian S. et al. Curr Opin Immunol. 2012, 24(2):207-12]). PD-1의 억제 효과는 또한 림프절의 항원 특이적 T-세포에서 아폽토시스를 촉진하는 동시에 조절 T 세포에서 아폽토시스를 감소시키는 이중 메커니즘을 통해 달성된다.
PD-1/PD-L1 차단에 특이적인 모노클로날 항체("mAbs")의 사용은 PD-1/PD-L1 신호전달 경로의 면역억제 효과를 상쇄하기 위해 당업계에 공지되어 있다. 그러나, 인간의 생체 내에서 광범위하게 사용되는 데에는 상당한 실제 문제가 있다. 주요 우려는 비-인간 기원의 모노클로날 항체가 종종 면역원성이므로, 그 효과를 제한하고, 경우에 따라 위험한 알러지 반응을 유발한다는 것이다. 이러한 외래 mAb에 대한 면역 반응은 mAb에 결합하여 그 제거에 영향을 미치는, 특이적인 고 친화도 항체의 생산을 포함하는 것이며, 이에 따라 신체로부터 이의 제거를 촉진하고 표적화된 항원에 결합하는 능력을 억제함으로써 mAb의 효과를 실질적으로 감소시킨다. 이 문제를 극복하기 위해, 관심의 비-인간 항체를 인간화하여 인간에 대한 면역원성을 감소시키면서, 모(parental) 비-인간 항체(전통적으로 쥐(murine) 항체)의 특이성과 친화도를 유지하는 것이 가능하다. 이러한 인간화된 항체는 전형적으로 항원 결합 도메인 상기 비-인간 항체로부터 유도된 하나 이상의 가변 도메인, 및 인간 또는 인간화된 항체 서열로부터 유도된 프레임워크 영역을 포함한다.
따라서, 인간 PD-1을 표적으로하는, 특히 암에 대한, 안전한 면역요법을 위한 개선된 제제를 제공하기 위해 인간화된 항체를 개발할 필요가 있다.
본 발명은 인간 PD-1을 특이적으로 표적화하는 인간화된 항체의 개발에 기반하며, 이는 PD-1에 대한 높은 결합 친화도 및 이의 리간드 PDL-1 및/또는 PDL-2와 강한 경쟁을 나타낸다. 이러한 인간화된 항체는 포유류 세포-기반 생산 시스템에서 높은 제조가능성(manufacturability) 및 생산 수율을 나타내도록 조작되었다. 이러한 인간화된 항체는 본원에서 특히 "HKLD"로 지칭된다.
또한, 본 출원인은 PD-L1을 발현하지 않는 종양 세포에 대한 대식세포의 식세포 작용을 야기하는 항체의 실질적으로 예기치 못한 효과를 관찰하였으며, 특히 PD-L1 음성 종양 및/또는 T 세포 면역 반응의 결핍을 앓고 있는 환자를 치료하기 위한 이러한 항체의 유망한 효과를 관찰하였다.
강력한 유익하고 예기치 못한 효과는 상세한 설명의 시작 부분과 실시예에서 특히 표시되고 설명된다.
제1 양태에서, 다음을 포함하는, 인간화된 모노클로날 항-인간-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
(i) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 HCDR1, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 HCDR2 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및
(ii) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 LCDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 LCDR2 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 LCDR3,
여기서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2의 결합의 길항제이다.
제2 양태에서, 인간화된 모노클로날 항-인간-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 (a) 서열번호 21로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 VH; 및 (b) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 VL을 포함한다.
바람직하게는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2의 결합의 길항제이다.
특정 양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음을 포함한다 - (a) 선택적으로 서열번호 31의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에서 치환(들), 부가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 가진, 서열번호 31로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄, 및 (b) 선택적으로 서열번호 34의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에서 치환(들), 부가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 변형(들)을 가진, 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄.
특정 양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 카파 경쇄 불변 도메인으로부터 유도된 경쇄 불변 도메인 및 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중쇄 불변 도메인으로부터 유도된 중쇄 불변 도메인을 포함한다.
보다 특정한 양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 선택적으로 T250Q/M428L; M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F; E233P/L234V/L235A/G236A + A327G/A330S/P331S; E333A; S239D/A330L/I332E; P257I/Q311; K326W/E333S; S239D/I332E/G236A; N297A; L234A/L235A; N297A + M252Y/S254T/T256E; K322A 및 K444A로 이루어진 군으로부터 선택된, 바람직하게는 선택적으로 M252Y/S254T/T256E, 및 L234A/L235A와 조합하여 N297A로 이루어진 군으로부터 선택된 치환 또는 치환의 조합을 가진, 인간 카파 경쇄 불변 도메인으로부터 유도된 경쇄 불변 도메인 및 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인으로부터 유도된 중쇄 불변 도메인을 포함한다.
또 다른 보다 특정한 양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 S228P; L234A/L235A, S228P + M252Y/S254T/T256E 및 K444A로 이루어진 군으로부터 선택된 치환 또는 치환의 조합을 선택적으로 가진, 인간 카파 경쇄 불변 도메인으로부터 유도된 경쇄 불변 도메인 및 인간 IgG4 중쇄 불변 도메인으로부터 유도된 중쇄 불변 도메인을 포함한다.
바람직하게는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 10-7 M 이하인 인간 PD-1에 대한 결합 친화도 상수(KD)로 인간 PD-1에 특이적으로 결합하고, 상기 친화도는 바람직하게는 바이오센서 분석에 의해 결정된다.
특히, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 85% 이상, 바람직하게는 88% 이상 및/또는 포유류 세포에서 높은 생산 수율을 가진 인간화(humanness)(T20)를 갖는다.
제2 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산 분자 또는 단리된 핵산 분자의 군에 관한 것이다.
제3 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 단리된 핵산 분자 또는 단리된 핵산 분자의 군을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 단리된 핵산 분자 및/또는 단리된 핵산 분자의 군 및/또는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 숙주 세포를 배양하는 단계 및 선택적으로 항체 또는 항원-결합 단편을 단리하는 단계를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 생산 방법에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및/또는 단리된 핵산 분자 및/또는 단리된 핵산 분자의 군 및/또는 벡터 및/또는 숙주 세포 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
선택적으로, 약학 조성물은 바람직하게는 알킬화제, 신혈관생성 억제제, 항체, 특히 항-종양 표적화 항체, 항대사물질, 항유사분열제, 항증식제, 항바이러스제, 오로라 키나제 억제제, 아폽토시스 촉진제(예컨대, Bcl-2 패밀리 억제제), 사멸 수용체 경로 활성화제, Bcr-Abl 키나제 억제제, BiTE(이-특이적(Bi-Specific) T 세포 관여체(Engager)) 항체, 항체 약물 접합체, 생물학적 반응 변형제, 브루톤 티로신 키나제(BTK: Bruton's tyrosine kinase) 억제제, 사이클린-의존적 키나제 억제제, 세포 사이클 억제제, 사이클로옥시게나제-2 억제제, DVD, 백혈병 바이러스 종양유전자 동족체(leukemia viral oncogene homolog)(ErbB2) 수용체 억제제, 성장 인자 억제제, 열 충격 단백질(HSP)-90 억제제, 히스톤 디아세틸라제(HDAC) 억제제, 호르몬 요법, 면역학적 제제, 아폽토시스 단백질 억제제(IAP: inhibitors of apoptosis protein)의 억제제, 인터칼레이팅(intercalating) 항생제, 키나제 억제제, 키네신 억제제, Jak2 억제제, 라파마이신 억제제의 포유류 표적, 마이크로RNA, 미토젠-활성화된 세포 외 신호-조절된 키나제 억제제, 다가 결합 단백질, 비-스테로이드성 항-염증 약물(NSAID), 폴리 ADP(아데노신 디포스페이트)-리보스 폴리머라제(PARP) 억제제, 백금 화학요법제, 폴로-유사 키나제(Plk: polo-like kinase) 억제제, 포스포이노시티드-3 키나제(PI3K) 억제제, 프로테아좀 억제제, 퓨린 유사체, 피리미딘 유사체, 수용체 티로신 키나제 억제제, 레티노이드/델토이드 식물 알칼로이드, 소간섭 리보핵산(siRNA: small inhibitory ribonucleic acid), 토포이소머라제 억제제, 유비퀴틴 리가제 억제제, 저메틸화제(hypomethylating agent), 체크포인트 억제제, 펩티드 백신 등, 종양 항원 유래의 에피토프 또는 네오에피토프, 및 이러한 제제들의 하나 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 추가 치료제를 추가로 포함한다.
특히, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 약학 조성물, 단리된 핵산 분자 또는 단리된 핵산 분자의 군, 벡터, 또는 숙주 세포는 약제로서 사용하기 위한 것이다.
선택적으로, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 약학 조성물, 단리된 핵산 분자 또는 단리된 핵산 분자의 군, 벡터, 또는 숙주 세포는 방사선요법 또는 바람직하게는 알킬화제, 신혈관생성 억제제, 항체, 특히 항-종양 표적화 항체, 항대사물질, 항유사분열제, 항증식제, 항바이러스제, 오로라 키나제 억제제, 아폽토시스 촉진제(예컨대, Bcl-2 패밀리 억제제), 사멸 수용체 경로 활성화제, Bcr-Abl 키나제 억제제, BiTE(이-특이적 T 세포 관여체) 항체, 항체 약물 접합체, 생물학적 반응 변형제, 브루톤 티로신 키나제(BTK) 억제제, 사이클린-의존적 키나제 억제제, 세포 사이클 억제제, 사이클로옥시게나제-2 억제제, DVD, 백혈병 바이러스 종양 유전자 동족체(ErbB2) 수용체 억제제, 성장 인자 억제제, 열 충격 단백질(HSP)-90 억제제, 히스톤 디아세틸라제(HDAC) 억제제, 호르몬 요법, 면역학적 제제, 아폽토시스 단백질의 억제제(IAP)의 억제제, 인터칼레이팅 항생제, 키나제 억제제, 키네신 억제제, Jak2 억제제, 라파마이신 억제제의 포유류 표적, 마이크로RNA, 미토젠-활성화된 세포 외 신호-조절된 키나제 억제제, 다가 결합 단백질, 비-스테로이드성 항-염증 약물(NSAID), 폴리 ADP(아데노신 디포스페이트)-리보스 폴리머라제(PARP) 억제제, 백금 화학요법제, 폴로-유사 키나제(Plk) 억제제, 포스포이노시티드-3 키나제(PI3K) 억제제, 프로테아좀 억제제, 퓨린 유사체, 피리미딘 유사체, 수용체 티로신 키나제 억제제, 레티노이드/델토이드 식물 알칼로이드, 소간섭 리보핵산(siRNA), 토포이소머라제 억제제, 유비퀴틴 리가제 억제제, 저메틸화제, 체크포인트 억제제, 펩티드 백신 등, 종양 항원 유래의 에피토프 또는 네오에피토프, 및 이러한 제제들의 하나 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 추가 치료제의 병용에서 사용하기 위한 것이다.
일 양태에서, 약제로서 사용하기 위한 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 약학 조성물, 단리된 핵산 분자 또는 단리된 핵산 분자의 군, 벡터, 또는 숙주 세포는 암의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 것이다. 바람직하게는, 암은 PD-1 및/또는 PD-L1의 발현을 가진 혈액암(hematologic malignancy) 또는 고형 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암 예컨대 혈액림프 신생물(hematolymphoid neoplasm), 혈관면역모세포 T 세포 림프종(angioimmunoblastic T cell lymphoma), 골수이형성 증후군(myelodysplasic syndrome), 및 급성 골수성 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암, 바이러스에 의해 유도되거나 면역결핍 관련 암 예컨대 카포시 육종(예컨대, 카포시 육종 헤르페스 바이러스 관련); 자궁경부, 항문, 음경 및 외음부 편평 세포 암 및 구강인두암(예컨대, 인간 유두종 바이러스 관련); 미만성 거대 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma), 버킷 림프종(Burkitt lymphoma), 형질모세포성 림프종(plasmablastic lymphoma), 원발성 중추 신경계 림프종, HHV-8 원발성 삼출 림프종, 고전적 호지킨 림프종, 및 림프구증식 장애(예컨대, 엡스타인-바 바이러스(EBV: Epstein-Barr virus) 및/또는 카포시 육종 헤르페스 바이러스 관련)를 포함하는 B 세포 비-호지킨 림프종(NHL); 간세포 암종(예컨대, B형 간염 및/또는 C형 간염 바이러스 관련); 메르켈 세포 암종(예컨대, 메르켈 세포 폴리오마 바이러스(MPV: Merkel cell polyoma virus) 관련); 및 인간 면역결핍 바이러스 감염(HIV: human immunodeficiency virus infection) 감염 관련 암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암, 및 전이성 또는 비전이성, 흑색종, 악성 중피종, 비-소세포 폐암, 신세포 암종, 호지킨 림프종, 두경부암, 요로상피세포 암종, 대장암, 간세포 암종, 소세포 폐암, 전이성 메르켈 세포 암종, 위 또는 위식도암 및 자궁경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암이다.
특정 양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 약학 조성물, 단리된 핵산 분자 또는 단리된 핵산 분자의 군, 벡터, 또는 숙주 세포는 암 치료 용도이며 여기서 상기 종양 세포는 PD-L1 음성이다. 바람직하게는, 약제로서 사용하기 위한 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 약학 조성물, 단리된 핵산 분자 또는 단리된 핵산 분자의 군, 벡터, 또는 숙주 세포는 감염성 질환, 바람직하게는 만성 감염성 질환, 보다 더 바람직하게는 HIV, 간염 바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스, 에코바이러스, 리노바이러스, 콕사키 바이러스, 코로나바이러스, 호흡기 세포융합(respiratory syncytial) 바이러스, 멈프스 바이러스, 로타바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 파보바이러스, 우두 바이러스, HTLV 바이러스, 뎅기 바이러스, 유두종바이러스, 물사마귀 바이러스, 폴리오바이러스, 광견병(rabies) 바이러스, JC 바이러스 및 아르보바이러스 뇌염(arboviral encephalitis) 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스에 의해 유발된 것의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 것이다.
특정 양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 약학 조성물, 단리된 핵산 분자 또는 단리된 핵산 분자의 군, 벡터, 또는 숙주 세포는 림프구 감소증(lymphopenic) 장애를 가진 환자의 치료에서 사용하기 위한 것이다.
특정 양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 약학 조성물, 단리된 핵산 분자 또는 단리된 핵산 분자의 군, 벡터, 또는 숙주 세포는 면역억제된(immunosuppressed), 면역손상된(immunocompromised) 또는 면역저하된(immunodepressed) 대상을 치료하기 위한 약물로서 사용하기 위한 것이다. 또 다른 특정 양태에서, 상기 대상은 높은 돌연변이 부담 및 신생항원 밀도를 갖는다.
도 1: ELISA 및 FACS에 의한 인간 PD1 상의 상이한 인간화된 항-PD1 변이체 항체의 결합: 도 1a: 상이한 농도(ng/ml)에서 항체의 결합에 대한 ELISA 분석: 키메라(●) 및 LD 경쇄 변이체와 결합된 HC(■), HE(▲), HG(▼), HH(◆), HJ(○), HI(□), HK(△) 내지 HL(ⓧ) 중쇄 변이체 유래의 인간화된 항-PD1 변이체 항체. 퍼옥시다제와 결합된 당나귀 항-인간 항체로 검출을 수행하고 TMB 기질을 사용하여 450 nm에서 비색법으로 발현(revelation)을 수행하였다. ED50은 상기 분석에서 신호의 50%에 도달하는데 필요한 농도를 지칭한다. 도 1b: CD3/CD28 자극된 인간 PBMC에 대한 세포형광측정법(cytofluorometry)에 의한 항체 결합 평가. HELC(■), HELD(▼)의 연속 희석액(μg/ml)을 첨가하고 PE 표지된 마우스 항-인간 Fc mAb 및 Canto II 세포 측정기를 사용하여 밝혔다. 데이터는 PD1+ 양성 CD3+ T 세포 집단에서 평균 형광 강도(MFI: Mean Fluorescence Intensity) 염색으로 표시된다. 도 1c: CD3/CD28 자극된 T 세포에 대한 세포형광측정법에 의한 항체 결합 평가. 인간화된 항체의 연속 희석액(μg/ml)을 첨가하고 PE 표지된 마우스 항-인간 Fc mAb 및 Canto II 세포 측정기를 사용하여 밝혔다. 데이터는 PD1+ 양성 CD3+ T 세포 집단에서 평균 형광 강도(MFI) 염색으로 표시된다.
도 2: 인간화 과정 동안 아미노산 돌연변이 후 인간 PD1에 대한 일부 인간화된 항-PD1 항체의 결합 손실: Kabat 위치 97(즉 통상적인 아미노산 위치 101)에서 중쇄 가변 사슬에서 돌연변이 후 인간화된 항-PD1 변이체의 ELISA 결합. (도 2a): 여기서 HC(E97)LB2(●) 및 HC(D97)LB2(□)는 Kabat 위치 R96에서 키메라(△)와 비교된다 (도 2b): 여기서 HELD(●) 및 HE(K96)LD(□)는 키메라(△)와 비교된다.
(도 2c), (도 2d) 및 (도 2e) : Kabat 위치 N28에서 경쇄 가변 사슬에서 돌연변이 후 인간화된 항-PD1 변이체의 ELISA 결합 (도 2c) : 여기서 HCLw(N28)(□) 및 HCLw(Q28)(●)은 Kabat 위치 V94에서 키메라(△)와 비교된다 (도 2d): 여기서 Hwt-LA(E34)(■) 및 HwtLA(N34)(◇)는 키메라(△)와 비교된다 (도 2e): 여기서 HELD(V94) 및 HELD(L94)는 Kabat 위치 E34에서 키메라(△)와 비교된다. 중쇄의 경우, Kabat 위치 96은 서열 위치 100에 해당하고 Kabat 위치 97은 서열 위치 101에 해당한다. 경쇄의 경우, Kabat 위치 28은 서열 위치 33에 해당하고, Kabat 위치 34는 서열 위치 39에 해당하고 Kabat 위치 94는 서열 위치 99에 해당한다.
도 3: ELISA에 의한 PD1 결합에 대해 4℃ 또는 37℃에서 7일 후 인간화된 항-PD1 변이체 항체의 안정성 측정. 0일차(●), 4℃에서 7일차(■) 및 37℃에서 7일차(▲)
도 4: PD1-PDL1 상호작용에 대한 인간화된 항-PD1 변이체 항체의 길항제 활성:
도 4a: Biacore에 의해 측정된 PD1의 결합에 대한 PDL1과 인간화된 항-PD1 변이체 항체 사이의 경쟁
도 4b: Blitz에 의해 측정된 PD1에 대한 인간화된 항체와 PDL1 사이의 경쟁. 데이터는 결합 반응의 %로 표시되며 100%는 항체 없이 PD1/PD-L1 상호작용의 Ka를 나타냄(상대적인 반응).
도 4c. ELISA에 의한 증가된 농도의 인간화된 항-PD1 변이체 항체의 존재 하에 PD1 대 PDL1의 결합 연구는 각 변이체 항체의 IC50 값을 측정한다.
도 5: PD1-PDL2에 대한 인간화된 항-PD1 변이체 항체의 길항제 활성
도 5a. Biacore에 의해 측정된 PD1의 결합에 대한 PDL2와 인간화된 항-PD1 변이체 항체 사이의 경쟁:
도 5b. ELISA에 의한 증가된 농도의 인간화된 항-PD1 변이체(HKLD) 항체의 존재 하에 PD1 대 PDL2의 결합 연구
도 6: 포유류 세포에서 키메라 변이체 및 키트루다(Keytruda)에 비해 인간화된 항-PD1 변이체 항체의 더 높은 생산성. 12 웰-플레이트에서 부착된 CHO-K1 세포를 키트루다, HKLD 또는 키메라 항 PD-1 항체를 코딩하는 DNA로 일시적으로 형질감염하였다. 생산성은 (마우스 항 인간 카파 + 퍼옥시다제 접합된 염소 항 마우스 항체로 검출 및 발현을 위한 고정화된 당나귀 항 인간 Rc 항체)를 사용하여 ELISA에 의해 투여하였다. 인간 IvIgG 표준으로 농도를 측정하였다. 데이터를 키메라 항 PD-1 항체의 생산성에 대해 정규화하였다.
도 7: PD1 신호전달을 차단하기 위한 인간화된 항-PD1 변이체 항체의 길항 활성을 측정하는 SHP1-인산화에 대한 생물검정: Discoverx 생물검정을 사용하여 PD-1 신호전달을 시험하였다. 측정된 화학발광(RLU: (상대적 발광 신호)은 PD-1 신호전달 활성화에 비례한다. 도 7a: 상이한 농도(㎍/mL)의 인간화된 항-PD1 변이체 항체를 경쇄의 LD 변이체와 비교한 결과를 나타낸다. 도 7b: 중쇄의 HE 변이체(HELC 또는 HELD 항체)와 결합된 경쇄의 LD 및 LC 변이체를 비교한 결과를 나타낸다. IC50(ng/mL)은 신호 억제의 50%에 도달하는데 필요한 농도를 나타낸다.
도 8: 인간화된 항-PD1 변이체 항체의 존재 하에 T 세포 활성화를 측정하는 생물검정. NFAT 루시퍼라제 리포터 시스템을 사용하여 Promega PD-1/PD-L1 생물검정을 수행하였다. 각 인간화된 항-PD1 변이체 항체의 연속 희석액을 시험하였다. X-축은 μg/mL의 항체 농도를 나타낸다. EC50(μg/mL)은 최대 발광의 50%에 도달하는데 필요한 항체 농도를 나타낸다.
도 9: 혼합 백혈구 반응 분석에서 인간화된 PD-1 항체로 처리한 후 T 세포에 의한 IFN감마 분비. 단핵구 유래 수지상 세포를 5일 동안 동종(allogenic) CD4 T 세포와 함께 공동배양하였다. A. ELISA로 정량화한 상등액 중의 IFNg 수준. HKLD(흑색 ■) 또는 IgG4 이소타입 대조군(회색 ●) 항체의 용량 곡선 반응을 시험하였다. 데이터는 4개의 독립적인 실험을 나타낸다. 통계학적 유의성 *p<0,05는 t-검정 스튜던트로 계산하였다.
도 10: 인간 형태의 PD-1을 발현하는 중피종 마우스 모델에서 인간화된 항 PD-1 변이체의 생체 내 효능. PDCD1 유전자의 엑손 2가 인간 대응물로 대체된 인간 PD-1의 세포외 부분을 발현하도록 유전적으로 변형된 마우스(Oxford University Innovation에 의해 라이선스됨). 중피종 AK7 세포를 흉막강(pleural cavity)에 동소적으로(orthotopically) 주입하고 종양 성장을 Bioluminescence(photo/s/cm2/sr)로 측정하고(도 10a) 전체 생존을 평가하였다(도 10b). 마우스를 PBS(●)(음성 대조군) 또는 항 PD-1 인간화된 형태(HKLD 변이체)(▲) 또는 항 PD-1 대조군(■)으로 처리하였다.
도 11: 인간 형태의 PD-1을 발현하는 이소성(ectopic) MC38 대장 암종 마우스 모델에서 인간화된 항 PD-1 변이체의 생체 내 효능. MC38을 피하로 주사하고 마우스를 PBS(회색 ●)(음성 대조군) 또는 항 PD-1 인간화된 형태(HKLD 변이체)(흑색 ●)로 처리하고 종양 부피(도 11a) 및 전체 생존(도 11b)을 평가하였다.
도 12: 간암종 마우스 모델에서 인간화된 항 PD-1 변이체의 생체 내 효능. 마우스의 간문맥에 접종된 Hepa1.6 세포는 간암종 모델을 형성한다. 마우스를 이소타입 대조군 IgG4(회색 ●)(음성 대조군) 또는 항 PD-1 인간화된 형태(HKLD 변이체)(흑색 ●)로 처리하였다 전체 생존을 평가하였다.
도 13: 단일 주사 후 시노몰구스 원숭이 및 마우스에서 인간화된 항 PD-1 항체의 약동학. 도 13a: Balb/C 마우스에 HKLD 변이체 IgG4 S228P 이소타입(●) 또는 HKLD 변이체 IgG1 N298A 이소타입(■) 또는 키트루다(5 mg/kg에서 1회 용량)(회색 ▲)를 정맥 내 주입으로 처리하였다. 도 13b: Balb/C 마우스에 HKLD 변이체 IgG4 S228P 이소타입(5mg/kg에서 1회 용량)을 정맥 내로 (■) 또는 피하로(●) 주입하였다. 도 13c: 시노몰구스 원숭이에 HKLD 변이체를 1 mg/kg(●) 또는 5 mg/kg(■)를 정맥 내로 주입하였다. 항 PD-1 항체를 자가제조(homemade) ELISA에 의해 또는 MSD 기술을 사용하여 혈청에서 정량화하였다.
도 14: 인간화된 항 PD-1은 대식세포에서 PD-L1/PD-1 음성 상호작용을 차단함으로써 PD-L1 음성 종양 세포의 식세포 작용을 촉진한다. 도 14a. 식세포 작용 분석에서 사용된 Raji 세포, M0, M1 및 대식세포의 PD-1/PD-L1 유동 세포분석 염색; 도 14b. 인간화된 항 PD-1 항체를 사용한 시험관 내 식세포 작용 분석. 인간 M1-대식세포를 세포 증식 염료(Cell Proliferation Dye) eFluor450으로 염색하고 리툭시맙(Rituximab)(10ng/mL) 및 이소타입 대조군 또는 인간화된 항 PD-1(HKLD, 10ug/mL)의 존재 하에 CPDeFluor670 표지된 Raji 세포와 함께 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 데이터는 3개의 개별적인 실험의 식세포 작용을 나타내며 최대 식세포 작용에 대해 정규화하였다. 도 14c. 동일한 식세포 작용 분석을 이소타입 대조군, 인간화된 항 PD-1, 펨브롤리주맙(pembrolizumab) 또는 리볼루맙(nivolumab) 항체(10ug/mL)의 존재 하에 M1 대식세포 및 Raji 세포로 수행하였다. 도 14d. 이소타입 대조군, 인간화된 항 PD-1과 함께 인큐베이션 한 Raji 세포를 사용한 MO 대 M1 대식세포의 식세포 작용 분석. 데이터는 이소타입 대조군에 비해 배수 변화 식세포 작용을 나타낸다.
도 2: 인간화 과정 동안 아미노산 돌연변이 후 인간 PD1에 대한 일부 인간화된 항-PD1 항체의 결합 손실: Kabat 위치 97(즉 통상적인 아미노산 위치 101)에서 중쇄 가변 사슬에서 돌연변이 후 인간화된 항-PD1 변이체의 ELISA 결합. (도 2a): 여기서 HC(E97)LB2(●) 및 HC(D97)LB2(□)는 Kabat 위치 R96에서 키메라(△)와 비교된다 (도 2b): 여기서 HELD(●) 및 HE(K96)LD(□)는 키메라(△)와 비교된다.
(도 2c), (도 2d) 및 (도 2e) : Kabat 위치 N28에서 경쇄 가변 사슬에서 돌연변이 후 인간화된 항-PD1 변이체의 ELISA 결합 (도 2c) : 여기서 HCLw(N28)(□) 및 HCLw(Q28)(●)은 Kabat 위치 V94에서 키메라(△)와 비교된다 (도 2d): 여기서 Hwt-LA(E34)(■) 및 HwtLA(N34)(◇)는 키메라(△)와 비교된다 (도 2e): 여기서 HELD(V94) 및 HELD(L94)는 Kabat 위치 E34에서 키메라(△)와 비교된다. 중쇄의 경우, Kabat 위치 96은 서열 위치 100에 해당하고 Kabat 위치 97은 서열 위치 101에 해당한다. 경쇄의 경우, Kabat 위치 28은 서열 위치 33에 해당하고, Kabat 위치 34는 서열 위치 39에 해당하고 Kabat 위치 94는 서열 위치 99에 해당한다.
도 3: ELISA에 의한 PD1 결합에 대해 4℃ 또는 37℃에서 7일 후 인간화된 항-PD1 변이체 항체의 안정성 측정. 0일차(●), 4℃에서 7일차(■) 및 37℃에서 7일차(▲)
도 4: PD1-PDL1 상호작용에 대한 인간화된 항-PD1 변이체 항체의 길항제 활성:
도 4a: Biacore에 의해 측정된 PD1의 결합에 대한 PDL1과 인간화된 항-PD1 변이체 항체 사이의 경쟁
도 4b: Blitz에 의해 측정된 PD1에 대한 인간화된 항체와 PDL1 사이의 경쟁. 데이터는 결합 반응의 %로 표시되며 100%는 항체 없이 PD1/PD-L1 상호작용의 Ka를 나타냄(상대적인 반응).
도 4c. ELISA에 의한 증가된 농도의 인간화된 항-PD1 변이체 항체의 존재 하에 PD1 대 PDL1의 결합 연구는 각 변이체 항체의 IC50 값을 측정한다.
도 5: PD1-PDL2에 대한 인간화된 항-PD1 변이체 항체의 길항제 활성
도 5a. Biacore에 의해 측정된 PD1의 결합에 대한 PDL2와 인간화된 항-PD1 변이체 항체 사이의 경쟁:
도 5b. ELISA에 의한 증가된 농도의 인간화된 항-PD1 변이체(HKLD) 항체의 존재 하에 PD1 대 PDL2의 결합 연구
도 6: 포유류 세포에서 키메라 변이체 및 키트루다(Keytruda)에 비해 인간화된 항-PD1 변이체 항체의 더 높은 생산성. 12 웰-플레이트에서 부착된 CHO-K1 세포를 키트루다, HKLD 또는 키메라 항 PD-1 항체를 코딩하는 DNA로 일시적으로 형질감염하였다. 생산성은 (마우스 항 인간 카파 + 퍼옥시다제 접합된 염소 항 마우스 항체로 검출 및 발현을 위한 고정화된 당나귀 항 인간 Rc 항체)를 사용하여 ELISA에 의해 투여하였다. 인간 IvIgG 표준으로 농도를 측정하였다. 데이터를 키메라 항 PD-1 항체의 생산성에 대해 정규화하였다.
도 7: PD1 신호전달을 차단하기 위한 인간화된 항-PD1 변이체 항체의 길항 활성을 측정하는 SHP1-인산화에 대한 생물검정: Discoverx 생물검정을 사용하여 PD-1 신호전달을 시험하였다. 측정된 화학발광(RLU: (상대적 발광 신호)은 PD-1 신호전달 활성화에 비례한다. 도 7a: 상이한 농도(㎍/mL)의 인간화된 항-PD1 변이체 항체를 경쇄의 LD 변이체와 비교한 결과를 나타낸다. 도 7b: 중쇄의 HE 변이체(HELC 또는 HELD 항체)와 결합된 경쇄의 LD 및 LC 변이체를 비교한 결과를 나타낸다. IC50(ng/mL)은 신호 억제의 50%에 도달하는데 필요한 농도를 나타낸다.
도 8: 인간화된 항-PD1 변이체 항체의 존재 하에 T 세포 활성화를 측정하는 생물검정. NFAT 루시퍼라제 리포터 시스템을 사용하여 Promega PD-1/PD-L1 생물검정을 수행하였다. 각 인간화된 항-PD1 변이체 항체의 연속 희석액을 시험하였다. X-축은 μg/mL의 항체 농도를 나타낸다. EC50(μg/mL)은 최대 발광의 50%에 도달하는데 필요한 항체 농도를 나타낸다.
도 9: 혼합 백혈구 반응 분석에서 인간화된 PD-1 항체로 처리한 후 T 세포에 의한 IFN감마 분비. 단핵구 유래 수지상 세포를 5일 동안 동종(allogenic) CD4 T 세포와 함께 공동배양하였다. A. ELISA로 정량화한 상등액 중의 IFNg 수준. HKLD(흑색 ■) 또는 IgG4 이소타입 대조군(회색 ●) 항체의 용량 곡선 반응을 시험하였다. 데이터는 4개의 독립적인 실험을 나타낸다. 통계학적 유의성 *p<0,05는 t-검정 스튜던트로 계산하였다.
도 10: 인간 형태의 PD-1을 발현하는 중피종 마우스 모델에서 인간화된 항 PD-1 변이체의 생체 내 효능. PDCD1 유전자의 엑손 2가 인간 대응물로 대체된 인간 PD-1의 세포외 부분을 발현하도록 유전적으로 변형된 마우스(Oxford University Innovation에 의해 라이선스됨). 중피종 AK7 세포를 흉막강(pleural cavity)에 동소적으로(orthotopically) 주입하고 종양 성장을 Bioluminescence(photo/s/cm2/sr)로 측정하고(도 10a) 전체 생존을 평가하였다(도 10b). 마우스를 PBS(●)(음성 대조군) 또는 항 PD-1 인간화된 형태(HKLD 변이체)(▲) 또는 항 PD-1 대조군(■)으로 처리하였다.
도 11: 인간 형태의 PD-1을 발현하는 이소성(ectopic) MC38 대장 암종 마우스 모델에서 인간화된 항 PD-1 변이체의 생체 내 효능. MC38을 피하로 주사하고 마우스를 PBS(회색 ●)(음성 대조군) 또는 항 PD-1 인간화된 형태(HKLD 변이체)(흑색 ●)로 처리하고 종양 부피(도 11a) 및 전체 생존(도 11b)을 평가하였다.
도 12: 간암종 마우스 모델에서 인간화된 항 PD-1 변이체의 생체 내 효능. 마우스의 간문맥에 접종된 Hepa1.6 세포는 간암종 모델을 형성한다. 마우스를 이소타입 대조군 IgG4(회색 ●)(음성 대조군) 또는 항 PD-1 인간화된 형태(HKLD 변이체)(흑색 ●)로 처리하였다 전체 생존을 평가하였다.
도 13: 단일 주사 후 시노몰구스 원숭이 및 마우스에서 인간화된 항 PD-1 항체의 약동학. 도 13a: Balb/C 마우스에 HKLD 변이체 IgG4 S228P 이소타입(●) 또는 HKLD 변이체 IgG1 N298A 이소타입(■) 또는 키트루다(5 mg/kg에서 1회 용량)(회색 ▲)를 정맥 내 주입으로 처리하였다. 도 13b: Balb/C 마우스에 HKLD 변이체 IgG4 S228P 이소타입(5mg/kg에서 1회 용량)을 정맥 내로 (■) 또는 피하로(●) 주입하였다. 도 13c: 시노몰구스 원숭이에 HKLD 변이체를 1 mg/kg(●) 또는 5 mg/kg(■)를 정맥 내로 주입하였다. 항 PD-1 항체를 자가제조(homemade) ELISA에 의해 또는 MSD 기술을 사용하여 혈청에서 정량화하였다.
도 14: 인간화된 항 PD-1은 대식세포에서 PD-L1/PD-1 음성 상호작용을 차단함으로써 PD-L1 음성 종양 세포의 식세포 작용을 촉진한다. 도 14a. 식세포 작용 분석에서 사용된 Raji 세포, M0, M1 및 대식세포의 PD-1/PD-L1 유동 세포분석 염색; 도 14b. 인간화된 항 PD-1 항체를 사용한 시험관 내 식세포 작용 분석. 인간 M1-대식세포를 세포 증식 염료(Cell Proliferation Dye) eFluor450으로 염색하고 리툭시맙(Rituximab)(10ng/mL) 및 이소타입 대조군 또는 인간화된 항 PD-1(HKLD, 10ug/mL)의 존재 하에 CPDeFluor670 표지된 Raji 세포와 함께 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 데이터는 3개의 개별적인 실험의 식세포 작용을 나타내며 최대 식세포 작용에 대해 정규화하였다. 도 14c. 동일한 식세포 작용 분석을 이소타입 대조군, 인간화된 항 PD-1, 펨브롤리주맙(pembrolizumab) 또는 리볼루맙(nivolumab) 항체(10ug/mL)의 존재 하에 M1 대식세포 및 Raji 세포로 수행하였다. 도 14d. 이소타입 대조군, 인간화된 항 PD-1과 함께 인큐베이션 한 Raji 세포를 사용한 MO 대 M1 대식세포의 식세포 작용 분석. 데이터는 이소타입 대조군에 비해 배수 변화 식세포 작용을 나타낸다.
소개(INTRODUCTION)
본 발명의 인간화된 항-hPD1 항체(HKLD)는 다음의 모든 이점을 갖는다:
- 이는 높은 인간화%, 특히 중쇄에 대해 91.07% 및 경쇄에 대해 88.7%의 T20 인간화 점수를 갖는다. 이에 비해, 임상적으로 승인된 항체이고 표준인 키트루다(Keytruda)라고 지칭되는 항-PD1 항체는 중쇄에 대해 75.7% 및 경쇄에 대해 82.7%의 T20 인간화 점수를 갖는다(표 9 참조). T20 인간화 점수는 Gao et al(문헌[BMC Biotechnol, 2013, 13, 55])에 의해 최초로 개시된 항체 인간화 분야에서 일반적으로 사용되는 파라미터이다. T20 인간화 점수는 일반적으로 인간화된 항체를 정의하기 위한 특허 출원에서 사용된다(예컨대, 국제공개 WO15161311호, 국제공개 WO17127664호, 국제공개 WO18136626호, 국제공개 WO18190719호, 국제공개 WO19060750호, 또는 국제공개 WO19170677호).
- 이는 놀랍게도 키메라 항체에 비해 포유류 세포(예컨대, COS, CHO)에서 생산할 때 높은 제조가능성 및 높은 생산성 수율을 나타낸다. 실제로, CHO 세포에서 및 COS 세포에서, 이는 키메라 항체에 비해 3 내지 4배 증가된 생산량을 가지며(표 11 참조) 키트루다에 비해 2배 증가된 생산성을 갖는다(도 6 참조).
- 이는 10 내지 8 M 미만의 인간 PD-1에 대한 결합 친화도(KD)를 제시한다. 본 발명의 인간화된 항체는 상이한 방법에 의해 평가된 바와 같이 키메라 항체와 비교하여 PD-1에 대한 개선된 결합을 나타낸다. 인간화된 항체 HKLD의 친화도는 키트루다라고 지칭되는 항-PD1 항체 중 하나와 유사하다(표 7 참조).
- 이는 길항제 활성을 가지며 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2의 결합을 억제한다(표 13 참조). 보다 특히, 키메라 항체와 비교할 때, 본 발명의 인간화된 항체는 PD1 발현 세포에 대한 개선된 결합(도 1c) 및 길항제 활성(표 14 및 15 참조)을 나타낸다.
- 이는 매우 안정적이다(표 12 참조).
- 이는 PD-1 신호전달(SHP-1 인산화 및 동원(recruitment), 표 15 및 도 7 참조)을 차단하고 T 세포 활성화(NFAT 매개 활성화, 표 16 및 도 8 참조)를 촉진한다.
- 이는 인간 T 세포에 의한 이펙터 사이토카인 분비, 보다 특히 IFNg 사이토카인의 분비를 자극한다(도 9).
- 따라서, 이는 T 세포 활성화를 회복할 수 있다.
- 이는 생체 내 항-종양 면역 반응을 촉진한다. 실제로, 본 발명의 인간화된 항체는 종양 크기를 감소시킬 수 있고 종양의 여러 유형에서 생존을 증가시킬 수 있다(도 10 내지 12).
- 이는 대식세포에서 PDL1/PD-1 결합을 차단하여 PD-L1 음성인 종양 세포의 식세포 작용을 향상시킬 수 있으므로 놀라운 추가적인 이점이 있다(도 14). 이러한 효과는 본 발명의 인간화된 항-PD-1 항체에 특이적인 것으로 다른 항-PD-1 항체, 특히 펨브롤리주맙 및 니볼루맙에서는 관찰되지 않았다(도 14c). 따라서, 본 발명의 인간화된 항-PD-1 항체는 이러한 식세포 작용을 통해 PD-L1을 발현하지 않는 종양 세포에 대한 면역 반응을 유도한다. 이러한 특성은 면역억제된 또는 면역저하된 환자에 대해 및/또는 PD-L1을 발현하지 않는 종양 세포를 포함하는 종양을 치료하는데 특히 관심이 있다. 보다 특히, 이는 적은 수의 T 세포를 가질 수 있는 환자, 특히 종양-침윤된 T 세포 및/또는 고갈된 T 세포가 많은 환자의 치료에 유용하다. 실제로, 항체는 대식세포에 의한 식세포 작용의 활성화를 통해 추가의 항종양 효과를 가질 수 있다. 이론에 의해 구속되지 않고, 본 발명자들은 대식세포에 대한 본 발명의 항체의 특이적 효과가 동일한 세포, 즉, 동일한 대식세포에서 PD-1 및 PD-L1에 결합하는 이의 능력 때문일 수 있다고 여겨진다.
- 마지막으로, 본 발명의 인간화된 항체는 유리한 약동학을 나타낸다(도 13).
전체적으로, 본 발명의 인간화된 항-PD1 항체는 심지어 이미 임상적으로 승인된 항-PD1인 키트루다와 비교 시, 매우 높은 인간화를 나타낸다. 키메라 항체에 비해, 이는 놀랍게도 더 우수한 생산성 수율, 더 우수한 PD-1에 대한 결합 및 더 우수한 길항제 능력을 나타낸다. 이는 안정하고 유리한 약동학을 갖는다. 이는 T 세포 활성화를 향상시키고, 대식세포에 의한 식세포 작용을 활성화시키고 생체 내에서 항-종양 면역 반응을 촉진한다.
정의
본 발명을 보다 용이하게 이해할 수 있도록 하기 위해, 특정 용어가 하기 정의된다. 상세한 설명에 걸쳐 추가 정의가 명시되어 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어, 표기법 및 기타 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우에, 통상적으로 이해되는 의미를 가진 용어는 명확성을 위해 및/또는 용이한 참조를 위해 본원에서 정의되며, 이러한 정의의 포함은 반드시 당해 분야에서 일반적으로 이해되는 것과 차이를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에서 기술되고 인용된 기술 및 절차는 일반적으로 잘 이해되며 당업자에 의해 통상적인 방법론을 사용하여 일반적으로 사용된다.
본원에서 사용된 용어 "예정된 사멸 1(Programmed Death 1)", "예정된 세포 사멸 1(Programmed Cell Death 1)", "PD1", "PD-1", "PDCD1", "PD-1 항원", "인간 PD-1", "hPD-1" 및 "hPD1"은 상호교환적으로 사용되며 CD279로도 공지된 예정된 사멸-1 수용체(Programmed Death-1 receptor)를 지칭하고, 인간 PD-1의 변이체 및 이소형, 및 PD-1과 적어도 하나의 공통 에피토프를 가진 유사체를 포함한다. PD-1은 면역 반응의 역치 및 말초 면역 관용의 주요 조절자이다. 이는 활성화된 T 세포, B 세포, 단핵구, 및 수지상 세포 상에서 발현되고 이의 리간드 PD-L1 및 PD-L2에 결합한다. 인간 PD-1은 PDCD1 유전자에 의해 코딩된다. 예로서, 인간 PD-1의 아미노산 서열이 GenBank 접근 번호 NP_005009로 개시되어 있다. PD1은 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC: Peripheral blood mononuclear cell) 상에 발현된 4개의 스플라이스 변이체를 갖는다. 따라서, PD-1 단백질은 전장 PD-1뿐만 아니라, PD-1의 대안적인 스플라이스 변이체, 예컨대 PD-1Aex2, PD-1Aex3, PD-1Aex2,3 및 PD-1Aex2,3,4를 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 상기 용어는 임의의 변이체 및, PBMC에 의해 자연적으로 발현된, 또는 PD-1 유전자로 형질감염된 세포에 의해 발현된 인간 PD-1의 이소형을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "항체"는 면역글로불린 분자의 유형을 기술하며 이의 최광의로 사용된다. 특히, 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 단편, 즉, 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 포함한다. 면역글로불린 분자는 임의의 유형(예컨대, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위부류일 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린에 해당하는 중쇄 불변 도메인은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 지칭된다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 상기 용어 "항체"는 온전한(intact) 면역글로불린 및 "항체 단편" 또는 "항원 결합 단편"(예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 사슬(scFv), 이의 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 분자, 디아바디, 선형 항체, 단일 사슬 항체, 및 항체의 글리코실화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체를 포함하여, 요구되는 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성(configuration)을 포함한다. 바람직하게는, 상기 용어 "항체"는 인간화된 항체를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 항체의 "항원-결합 단편"은 항체의 일부, 즉, 가능하게는 천연 형태의, PD-1에 대한 항원-결합능을 나타내는 본 발명의 항체 구조의 일부에 상응하는 분자를 의미하며; 이러한 단편은 특히 상응하는 4-사슬 항체의 항원-결합 특이성과 비교하여 상기 항원에 대해 동일하거나 실질적으로 동일한 항원-결합 특이성을 나타낸다. 유리하게는, 상기 항원-결합 단편은 상응하는 4-사슬 항체와 유사한 결합 친화도를 갖는다. 그러나, 상응하는 4-사슬 항체에 대해 감소된 항원-결합 친화도를 가진 항원-결합 단편이 또한 본 발명 내에 포함된다. 상기 항원-결합능은 항체와 표적 단편 사이의 친화도를 측정하여 결정될 수 있다. 이러한 항원-결합 단편은 또한 항체의 "기능성 단편"으로도 지정될 수 있다. 항체의 항원-결합 단편은 CDR(상보성 결정 영역(Complementary Determining Region) 또는 항원에 대한 인식 부위(들), 즉, PD1의 세포외 도메인을 포함하여 항원 인식 특이성을 한정하는 이들의 일부로 지정된 이들의 초가변 도메인을 포함하는 단편이다.
"Fab" 단편은 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역 유래의 하나 이상의 시스테인을 포함하여 중쇄 CH1 도메인의 카복실 말단에 몇몇 잔기의 첨가로 인해 Fab 단편과 상이하다. F(ab') 단편은 F(ab')2 펩신 소화 생성물의 힌지 시스테인에서 다이설파이드 결합의 절단에 의해 생성된다. 항체 단편의 부가적인 화학적 커플링이 당업자에게 공지되어 있다. Fab 및 F(ab')2 단편은 온전한 항체의 Fc 단편이 결여되어 있고, 동물의 순환으로부터 보다 신속하게 제거되며, 온전한 항체보다 적은 비-특이적 조직 결합을 가질 수 있다(예컨대, 문헌[Wahl et al, 1983, J. Nucl. Med. 24:316] 참조).
"Fv" 단편은 완전한 표적 인식 및 결합 부위를 함유하는 항체의 최소 단편이다. 이러한 영역은 단단한 비-공유 결합에서 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체(VH-VL 이량체)로 구성되어 있다. 이러한 구성에서 각 가변 도메인의 3개의 CDR이 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상의 표적 결합 부위를 한정한다. 종종, 6개의 CDR은 항체에 표적 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 일부 경우에는 단일 가변 도메인(또는 표적에 특이적인 3개의 CDR만 포함하는 Fv의 절반)조차도 전체 결합 부위보다 낮은 친화도에 있지만 표적을 인식하고 결합하는 능력을 가질 수 있다.
"단일-사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 결합 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 scFv가 표적 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다.
"단일 도메인 항체"는 PD-1에 충분한 친화도를 나타내는 단일 VH 또는 VL 도메인으로 구성된다. 특정 실시형태에서, 단일 도메인 항체는 낙타화된 항체이다{예를 들어, 문헌[Riechmann, 1999, Journal of Immunological Methods 231:25-38] 참조).
구조적 측면에서, 항체는 다이설파이드 결합에 의해 상호연결된 중쇄(H) 및 경쇄(L)를 가질 수있다. 경쇄에는 람다(λ) 및 카파(κ)의 두 가지 유형 있다. 각 중쇄 및 경쇄는 불변 영역과 가변 영역(또는 "도메인")을 함유한다. 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 "상보성-결정 영역" 또는 "CDR"로도 지칭되는 3개의 초가변 영역에 의해 중단된(interrupted) "프레임워크" 영역을 함유한다. 프레임워크 영역 및 CDR의 범위가 정의되어 있다(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, and U.S. Department of Health and Human Services, 1991] 참조, 이는 본원에 인용되어 포함됨). 바람직하게는, CDR은 Kabat 방법에 따라 정의된다. 프레임워크 영역은 사슬 간 비-공유 상호작용에 의해 CDR을 올바른 방향으로 배치하기 위해 제공하는 스캐폴드를 형성하는 역할을 한다. CDR은 주로 항원의 에피토프에 대한 결합을 담당한다. 각 사슬의 CDR은 일반적으로 "상보성 결정 영역 1" 또는 "CDR1", "CDR2" 및 "CDR3"으로 지칭되며, N- 말단부터 시작하여 순차적으로 번호가 매겨진다. 본 발명에 따른 항체의 VL 및 VH 도메인은 당업계 및 본원에서 각각 "프레임워크 영역 1" 또는 "FR1", "FR2", "FR3", 및 "FR4"로 지칭되는 4개의 프레임워크 영역 또는 "FR"을 포함할 수 있다. 이러한 프레임워크 영역 및 상보성 결정 영역은 바람직하게는 다음 순서로 작동가능하게 연결된다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(아미노말단에서 카복시 말단으로).
본원에서 사용된 "항체 중쇄"는 항체 입체형태(conformation)에 존재하는 2가지 유형의 폴리펩티드 사슬 중 더 큰 것을 지칭한다. 항체 중쇄의 CDR은 전형적으로 "HCDR1", "HCDR2" 및 "HCDR3"으로 지칭된다. 항체 중쇄의 프레임워크 영역은 전형적으로 "HFR1", "HFR2", "HFR3" 및 "HFR4"로 지칭된다.
본원에서 사용된 "항체 경쇄"는 항체 입체형태에 존재하는 2가지 유형의 폴리펩티드 사슬 중 더 작은 것을 지칭하고, κ 및 λ 경쇄는 2개의 주요 항체 경쇄 이소타입을 지칭한다. 항체 경쇄의 CDR은 일반적으로 "LCDR1", "LCDR2" 및 "LCDR3"으로 지칭된다. 항체 경쇄의 프레임워크 영역은 일반적으로 "LFR1", "LFR2", "LFR3" 및 "LFR4"로 지칭된다.
표적 분자에 대한 항체의 결합과 관련하여, 용어 "결합하다(bind)" 또는 "결합(binding)"은 항원을 인식하고 접촉하는 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 융합 단백질 및 항체(항체 단편 포함)를 지칭한다. 바람직하게는, 이는 항원-항체 유형 상호작용을 지칭한다. 용어 특정 항원(예컨대 PD-1) 또는 특정 항원(예컨대, PD-1) 상의 에피토프에 대해 "특이적 결합(specific binding)", "특이적으로 결합한다(specifically binds to)", "특이적인(specific for)" "선택적으로 결합한다(selectively binds)" 및 "선택적인(selective for)"은 항체가 특정 항원을 인식하고 결합하지만 샘플 중의 다른 분자는 실질적으로 인식하거나 결합하지 않음을 의미한다. 예컨대, PD-1 또는 PD-1 에피토프에 특이적으로(또는 우선적으로) 결합하는 항체는 예컨대 다른 PD-1 에피토프 또는 비-PD-1 에피토프에 결합하는 항체보다 더 큰 친화도, 결합력, 더 큰 용이성, 및/또는 더 긴 지속기간을 가진 이러한 PD-1 에피토프에 결합하는 항체이다. 바람직하게는, 용어 "특이적으로 결합"은 결합 친화도가 10-7 M 이하인 항체와 항원 사이의 접촉을 의미한다. 특정 양태에서, 항체는10-8 M, 10-9 M 또는 10-10 M이하의 친화도로 결합한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "PD-1 항체," "항-PD-1 항체," "PD-1 Ab," "PD-1-특이적 항체" 또는 "항-PD-1 Ab" 또는 "인간화된 항-PD-1 항체"는 상호교환적으로 사용되며 PD-1, 바람직하게는 인간 PD-1에 특이적으로 결합하는, 본원에 기술된 바와 같은 항체를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 항체는 PD-1의 세포 외 도메인에 결합한다. 특히, 항-PD-1 항체는 PD-1 항원에 결합하여 PD-1-매개 신호전달 경로를 억제하여, T 세포 활성화와 같은 면역 반응을 향상시킬 수 있는 항체이다.
본원에서 사용된 용어 "인간화된 항체"는 마우스와 같은 또 다른 포유류 종의 생식세포(germline)로부터 유도된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 이식된(grafted) 항체(예컨대, 비-인간 항체로부터 유도된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체)를 지칭하는 것으로 의도된다. 항체, 예컨대, 비-인간 항체의 "인간화된 형태"는 또한 인간화를 거친 항체를 지칭한다. 인간화된 항체는 일반적으로 하나 이상의 CDR 유래의 잔기가 비-인간 항체(공여자 항체)의 적어도 하나의 CDR 유래 잔기로 대체되는 동시에 본래 항체의 원하는 특이성, 친화도 및 능력(capacity)을 유지하는 인간 면역글로불린(수여자 항체)이다. 공여자 항체는 원하는 특이성, 친화도, 또는 생물학적 효과를 가진 임의의 적합한 비-인간 항체, 예컨대 마우스, 랫트, 토끼, 닭, 또는 비-인간 영장류 항체일 수 있다. 일부 예에서, 수여자 항체의 선택된 프레임워크 영역 잔기는 공여자 항체의 프레임워크 영역 잔기로 대체된다. 대안적으로, 공여자 항체의 선택된 프레임워크 영역 잔기는 인간 또는 인간화된 항체의 프레임워크 영역 잔기로 대체된다. 추가의 프레임워크 영역 변형이 인간 프레임워크 서열 내에서 이루어질 수 있다. 따라서 인간화된 항체는 또한 수여자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 아미노산 변형은 항체 기능을 추가로 개선하고/하거나 인간화 과정을 증가시키기 위해 이루어질 수 있다. "아미노산 변화" 또는 "아미노산 변형"은 본원에서 폴리펩티드의 아미노산 서열의 변화를 의미한다. "아미노산 변형"은 폴리펩티드 서열에서 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함한다. "아미노산 치환" 또는 "치환"은 본원에서 모 폴리펩티드 서열의 특정 위치의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 대체됨을 의미한다. "아미노산 삽입" 또는 "삽입"은 모 폴리펩티드 서열의 특정 위치에서 아미노산의 부가를 의미한다. "아미노산 결실" 또는 "결실"은 모 폴리펩티드 서열의 특정 위치에서 아미노산의 제거를 의미한다. 아미노산 치환은 보존적일 수 있다. 보존적 치환은 주어진 아미노산 잔기를 유사한 화학적 특성(예컨대, 전하, 벌크 및/또는 소수성)을 가진 측쇄("R-기")를 가진 또 다른 잔기로 대체하는 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "아미노산 위치" 또는 아미노산 위치 번호"는 상호교환적으로 사용되며 일반적으로 아미노산에 대해 1개 문자 코드로 지정된 아미노산 서열에서 특정 아미노산의 위치를 지칭한다. 아미노산 서열의 첫 번째 아미노산(즉, N 말단에서 시작)은 위치 1을 갖는 것으로 간주되어야 한다.
보존적 치환은 주어진 아미노산 잔기를 유사한 화학적 특성(예컨대, 전하, 벌크 및/또는 소수성)을 가진 측쇄("R-기")를 가진 또 다른 잔기로 대체하는 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 특성을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 보존적 치환 및 해당 규칙이 당업계의 최신 기술에 잘 기술되어 있다. 예컨대, 보존적 치환은 다음 표에 반영된 아미노산 군 내의 치환으로 정의될 수 있다:
[표 A]
아미노산 잔기
[표 B]
대안적인 보존적 아미노산 잔기 치환 군
[표 C]
아미노산 잔기의 추가의 대안적인 물리적 및 기능적 분류
본원에서 사용된 바와 같이, "단리된 항체"는 자연 환경의 성분으로부터 분리 및/또는 회수된 항체이다. 단리된 항체는 항체의 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않기 때문에 재조합 세포 내의 제자리(in situ) 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 균질성(homogeneity)으로 및/또는 예컨대 전기영동(예컨대, SDS-PAGE, 등전 포커싱(IEF: isoelectric focusing), 모세관 전기영동) 또는 환원 또는 비-환원 조건 하에서 크로마토그래피(예컨대, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 결정된 바와 같이 90%, 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제된다.
본원에서 사용된 용어 "유도되다(derive from)" 및 "유도된(derived from)"은 모 화합물 또는 단백질의 구조로부터 유도된 구조를 갖고 그 구조가 본원에 개시된 것과 충분히 유사하고 그 유사성에 기초하여 당업자에 의해 청구된 화합물과 동일 또는 유사한 특성, 활성 및 유용성을 나타낼 것이라고 예상되는 화합물을 지칭한다. 예를 들어, 쥐(murine) 항체로부터 유도된 인간화된 항체는 쥐 항체와 유사한 특성을 공유하는, 예컨대 동일한 에피토프를 인식하고, 항체의 인간화에 참여하고/하거나 증가시키는 변형된 잔기와 유사한 VH 및 VL을 공유하는 항체 또는 항체 단편을 지칭한다.
용어 "치료(treatment)"는 질병 또는 질병의 증상의 치료, 방지, 예방 및 지연과 같은 환자의 건강 상태를 개선하기 위한 임의의 행위를 지칭한다. 이는 질병의 치유적 치료 및/또는 예방적 치료를 모두 지정한다. 치유적 치료는 질병 또는 질병의 증상 또는 그것이 직접 또는 간접적으로 야기하는 고통을 완화, 개선 및/또는 제거, 감소 및/또는 안정화시키는 치유 또는 치료를 초래하는 치료로 정의된다. 예방적 치료는 질병의 예방을 초래하는 치료와 질병의 진행 및/또는 발병 또는 발병 위험을 감소 및/또는 지연시키는 치료를 모두 포함한다. 특정 실시형태에서, 이러한 용어는 이와 관련된 질환, 장애, 감염 또는 증상의 개선 또는 근절을 지칭한다. 다른 실시형태에서, 이러한 용어는 암의 확산 또는 악화를 최소화하는 것을 지칭한다. 본 발명에 따른 치료는 반드시 100% 또는 완전한 치료를 의미하는 것은 아니다. 오히려, 당업자가 잠재적인 이점 또는 치료 효과를 갖는 것으로 인식하는 다양한 정도의 치료가 존재한다. 바람직하게는, 용어 "치료"는 예를 들어 PD-1에 의해 매개되는 신호전달 경로와 관련된 장애/질병이 있는 대상체에게 하나 이상의 활성제를 포함하는 조성물의 적용 또는 투여를 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "장애" 또는 "질병"은 유전적 또는 발달적 오류, 감염, 독극물, 영양 결핍 또는 불균형, 독성, 또는 불리한 환경 요인의 영향으로 인해 잘못 기능하는 신체 기관, 일부, 구조, 또는 시스템을 지칭한다. 바람직하게는, 이러한 용어는 건강 장애 또는 질병 예컨대 정상적인 신체적 또는 정신적 기능을 방해하는 질병을 지칭한다. 보다 바람직하게는, 용어 장애는 암과 같은 동물 및/또는 인간에 영향을 미치는 면역 및/또는 염증성 질환을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "면역 질환"은 자신의 세포, 조직 및/또는 기관에 대한 대상체의 면역 반응에 의해 야기되는 세포, 조직 및/또는 기관 손상을 특징으로 하는 대상체의 상태를 지칭한다. 용어 "염증성 질환"은 염증, 예컨대 만성 염증을 특징으로 하는 대상체의 상태를 지칭한다. 자가면역 장애는 염증과 관련이 있을 수도 있고 아닐 수도 있다. 더욱이, 염증은 자가면역 장애에 의해 유발될 수도 있고 아닐 수도 있다.
본원에서 사용된 용어 "암"은 비정상 세포의 신속하고 제어되지 않은 성장을 특징으로 하는 질병으로 정의된다. 암 세포는 국소적으로 또는 혈류 및 림프계를 통해 신체의 다른 부분으로 퍼질 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "PD-1과 관련된(associated with) 또는 관계가 있는(related to) 질환", "PD-1 양성 암" 또는 "PD-1 양성 감염성 질환"은 PD-1 발현에 기인하거나 PD-1 발현의 증상/특징이 있는, 즉, PD-1의 발현 또는 활성의 증가 또는 감소에 의해 유발되거나, 악화되거나 달리 연관된 임의의 상태인 암 또는 염증성 질환(예컨대 바이러스 및/또는 박테리아에 의해 유발된 것)을 지칭하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용된 용어 "대상체", "숙주", "개체", 또는 "환자"는 성인 및 아동을 포함하는 인간을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "약학 조성물"은 본 발명에 따른 인간화된 항-PD1 항체를 포함하는 것과 같은, 하나 이상의 활성제를 선택적인 다른 화학적 성분 예컨대 생리학적으로 적합한 담체 및 부형제와 함께 제조된 것을 지칭한다. 약학 조성물의 목적은 유기체의 활성제의 투여를 용이하게 하는 것이다. 본 발명의 조성물은 임의의 통상적인 투여 경로 또는 사용에 적합한 형태일 수 있다. 일 실시형태에서, "조성물"은 전형적으로 활성제, 예컨대 화합물 또는 조성물, 및 천연-발생 또는 비-천연-발생 담체, 불활성(예컨대, 검출가능한 제제 또는 표지) 또는 활성, 예컨대 보조제, 희석제, 결합제, 안정화제, 완충제, 염, 친유성 용매, 보존제, 보조제 등의 조합을 의도하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "허용되는 비히클" 또는 "허용되는 담체"는 약학 조성물을 제형화하는데 유용한 것으로 당업자에게 공지된 임의의 공지된 화합물 또는 화합물의 조합이다.
본원에서 사용된 바와 같은 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 활성제와 조합하여, 대상체의 치료 효과를 부여하는데 요구되는 활성제의 양, 예컨대 표적 질환 또는 장애를 치료하거나 원하는 효과를 생성하는데 필요한 활성제의 양을 지칭한다. "유효량"은 제제(들), 질병 및 이의 중증도, 연령, 물리적 상태, 크기, 성별 및 체중을 포함하는 치료될 대상체의 특징, 치료 지속기간, 동시발생하는 치료의 특성(존재하는 경우), 특정 투여 경로 및 의료 종사자의 지식 및 전문지식 내의 유사 요소에 따라 달라질 수 있다. 이러한 요소는 당업자에게 잘 공지되어 있으며 일상적인 실험만으로 해결될 수 있다. 일반적으로, 개별 성분 또는 이들의 조합의 최대 용량, 즉, 건전한 의학적 판단에 따라 가장 안전한 용량을 사용하는 것이 바람직하다.
본원에서 사용된 용어 "약제"는 장애 또는 질병에 대한 치유적 또는 예방적 특성을 가진 임의의 물질 또는 조성물을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "병용하여(in combination)"는 하나 초과의 요법(예컨대, 예방적 및/또는 치료적 제제)의 사용을 지칭한다. 용어 "병용하여"의 사용은 질환 또는 장애가 있는 대상체에게 요법(예컨대, 예방적 및/또는 치료적 제제)이 투여되는 순서를 제한하지 않는다.
용어 "폴리뉴클레오티드", "핵산" 및 "핵산 서열"은 동등하며 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태, 예컨대 RNA 또는 DNA 또는 이의 유사체를 지칭한다. 본 발명의 핵산(예컨대, 핵산의 성분, 또는 일부)은 자연 발생이거나, 변형되거나 조작될 수 있다. 조작된 핵산은 재조합 핵산 및 합성 핵산을 포함한다. "항-PD1 항체를 코딩하는 단리된 핵산"은 단일 벡터 또는 개별 벡터에서 이러한 핵산 분자(들)를 포함하는 항체 중쇄 및 경쇄(또는 이들의 단편)를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자(들)를 지칭하며, 이러한 핵산 분자는 숙주 세포에서 하나 이상의 위치에 존재한다. 본원에서 사용된 용어 "핵산 구조물", "플라스미드", 및 "벡터"는 동등하며 DNA 또는 RNA와 같은 패신저(passenger) 핵산 서열을 숙주 세포에 전달하는 역할을 하는 핵산 분자를 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "숙주 세포"는 벡터, 외인성 핵산 분자, 및 본 발명의 항체 구조물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 수용자일 수 있거나 수용자; 및/또는 항체 구조물 그 자체의 수용자일 수 있거나 수용자였던 임의의 개별 세포 또는 세포 배양물을 포함하도록 의도된다. 세포 내로의 각각의 물질의 도입은 형질전환, 형질감염 등의 방법에 의해 수행될 수 있다. 용어 "숙주 세포"는 또한 단일 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 포함하는 것으로 의도된다. 숙주 세포는 박테리아, 미생물, 식물 및 동물 세포를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "면역 세포"는 선천성 및 적응성 면역에 관여하는 세포, 예를 들어 골수에서 생산된 조혈 줄기세포(HSC: hematopoietic stem cell)로부터 유도된 백혈구 세포(백혈구), 림프구(T 세포, B 세포, 자연 살해(NK: natural killer) 세포 및 자연 살해 T 세포(NKT: Natural Killer T cell) 및 골수-유래성 세포(호중구, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포)를 지칭한다. 특히, 면역 세포는 B 세포, T 세포, 특히 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포, NK 세포, NKT 세포, APC 세포, 수지상 세포 및 단핵구를 포함하는 비완전한 목록으로부터 선택될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이 "T 세포"는 예컨대 CD4 + T 세포, CD8 + T 세포, T 헬퍼 1 유형 T 세포, T 헬퍼 2 유형 T 세포, T 헬퍼 17 유형 T 세포 및 억제성 T 세포를 포함한다.
용어 "면역 반응"은 침입하는 병원체, 병원체에 감염된 세포 또는 조직, 암성 세포, 또는 자가면역 또는 병리학적 염증의 경우, 정상 인간 세포 또는 조직의 인체에 선택적인 손상, 파괴, 또는 제거를 초래하는, 예컨대, 림프구, 항원 제시 세포, 식세포, 과립구, 및 상기 세포 또는 간에 의해 생성된 가용성 거대분자(항체, 사이토카인, 및 보체 포함)의 작용을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "길항제"는 다른 물질의 활성 또는 기능을 차단하거나 감소시키는 물질을 지칭한다. 특히, 이러한 용어는 기준 물질(예컨대, PD-L1 및/또는 PD-L2)로서 세포 수용체(예컨대 PD-1)에 결합하여 일반적인 생물학적 효과(예컨대 면역 억제 미세환경의 생성)의 전부 또는 일부의 생성을 차단하는 항체를 지칭한다. 본 발명에 따른 인간화된 항체의 길항제 활성은 경쟁적 ELISA에 의해 평가될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "단리된"은 언급된 물질(예컨대, 항체, 폴리펩티드, 핵산 등)이 자연에서 발생하는 다른 물질로부터 실질적으로 분리되거나, 그에 비해 풍부함을 나타낸다. 특히, "단리된" 항체는 자연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리되고/되거나 회수된 항체이다. 예컨대, 단리된 항체는 (1) Lowry 방법에 의해 결정된 바와 같이 항체의 75 중량% 초과로 정제되거나, (2) 환원 또는 비-환원 조건 하에서 SDS-PAGE에 의해 균질성으로 정제된다. 단리된 항체는 항체의 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내에서 제자리에 항체를 포함한다. 그러나, 일반적으로, 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
본원에서 사용된 용어 "및/또는"은 서로 포함하거나 포함하지 않는 2개의 특정된 특징 또는 성분 각각의 특정 개시로 간주되어야 한다. 예컨대, "A 및/또는 B"는 마치 각각이 개별적으로 설정된 것처럼 (i) A, (ii) B 및 (iii) A 및 B 각각의 특정 개시로 간주된다.
용어 "하나의("a" 또는 "an")"는 요소 중 하나 또는 하나 초과의 요소가 기술되어 있음이 문맥상 명확하지 않는 한 수정하는 요소 중 하나 또는 복수를 지칭할 수 있다(예컨대, "하나의 시약"은 하나 이상의 시약들을 의미할 수 있음).
임의의 모든 값(수치 범위의 하한 및 상한 포함)과 관련하여 본원에서 사용된 용어 "약"은 최대 +/- 10%(예컨대, +/- 0.5%, +/- 1%, +/- 1.5%, +/- 2%, +/- 2.5%, +/- 3%, +/- 3.5%, +/- 4%, +/- 4.5%, +/- 5%, +/- 5.5%, +/- 6%, +/- 6.5%, +/- 7%, +/- 7.5%, +/- 8%, +/- 8.5%, +/- 9%, +/- 9.5%)의 허용가능한 편차 범위를 가진 임의의 값을 의미한다. 값 문자열의 시작 부분에서 용어 "약"의 사용은 각 값을 수정한다(즉, "약 1, 2 및 3"은 약 1, 약 2 및 약 3을 지칭함). 또한, 값의 열거가 본원에서 기술되는 경우(예컨대 약 50%, 60%, 70%, 80%, 85% 또는 86%) 열거는 모든 중간 값 및 분수 값(예컨대, 54%, 85.4%)을 포함한다.
인간 PD-1에 대해 인간화된 항체
인간 PD-1에 대해 결합하는 인간화된 항체가 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 인간화된 항체는 인간 PD-1에, 바람직하게는 인간 PD-1의 세포외 도메인에 특이적으로 결합한다. 일부 양태에서, 인간화된 항체는 전장 인간 PD-1, PD-1Aex2, PD-1Aex3, PD-1Aex2,3 및 PD-1Aex2,3,4 중 하나 이상에 선택적으로 결합한다.
일부 양태에서, 인간화된 항-PD1 항체는 단리된 항체, 특히, 비-천연 단리된 항체이다. 이러한 단리된 인간화된 항-PD1 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 단리된 항체는 중량 기준으로 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%로 정제된다. 일부 실시형태에서, 단리된 항체는 중량 기준으로 적어도 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 내지 100%의 항체를 포함하는 용액으로 제공되고, 중량의 나머지는 용매에 용해된 다른 용질의 중량을 포함한다.
본 발명에 따른 항-PD1 항체의 인간화된 형태는 임의의 부류, 예컨대 IgD, IgE, IgG, IgA, 또는 IgM(또는 이들의 하위 부류), 면역글로불린 사슬 또는 인간 PD-1을 표적으로 하는 비-인간(예컨대, 쥐) 면역글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 함유하는 이들의 단편(예컨대 Fv, Fab, Fab', F(ab')2, scFv 또는 항체의 다른 항원-결합 서열)의 면역글로불린을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 인간화된 항-hPD-1 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터, 바람직하게는 IgG4로부터 유도된다.
바람직하게는, 인간 PD-1에 대해 인간화된 항체는 모노클로날 항체이다.
바람직하게는, 이러한 항체는 PD-1과 적어도 하나의 이의 리간드(예컨대 PD-L1 및/또는 PD-L2) 사이의 상호작용을 차단하거나 억제하는 능력이 있다. 본원에서 사용된 "결합을 차단" 또는 "상호작용을 차단" 또는 "상호작용을 억제"하는 능력은 임의의 검출가능한 정도로 2개 분자(예컨대 PD-1과 이의 리간드 PD-L1 및/또는 PD-L2) 사이의 결합 상호작용을 차단하는 항체 또는 항원-결합 단편의 능력을 지칭한다.
바람직하게는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2의 결합, 보다 바람직하게는 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 및 PD-L2의 결합의 길항제이다.
특정 실시형태에서, 항-hPD1 항체 또는 항원-결합 단편은 PD-1과 적어도 하나의 이의 리간드(예컨대 PD-L1 및/또는 PD-L2, 바람직하게는 PD-L1 및 PD-L2) 사이의 결합 상호작용을 적어도 50% 억제한다. 특정 실시형태에서, 이러한 억제는 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 또는 90% 초과일 수 있다.
"상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 항원 특이성 및 결합 친화도를 부여하는 항체 가변 영역 내의 아미노산의 비연속적인 서열을 지칭하는 것으로 당업계에 공지되어 있다. 주어진 CDR의 정확한 아미노산 서열 경계는 문헌[Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest 5th ed. (1991) "Kabat" numbering scheme)]; 문헌[Al-Lazikani et al.,1997, J. Mol. Biol, 273:927-948 ("Chothia" numbering scheme)]; 문헌[MacCallum et al, 1996, J. Mol. Biol. 262:732-745 ("Contact" numbering scheme)]; 문헌[Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol., 2003, 27:55-77 ("IMGT" numbering scheme)]; 및 문헌[Honegge and Pluckthun, J. Mol. Biol, 2001, 309:657-70 ("AHo" numbering scheme)]에 기술된 것들을 포함하여, 임의의 다수의 잘 알려진 체계를 사용하여 용이하게 결정될 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에서 특정 CDR의 식별에 사용되는 번호매기기 체계는 Kabat 번호매기기 체계이다.
인간화된 항체의 CDR 영역은 쥐 항체로부터 유도되고 다음에 대해 최적화된다: i) 매우 높은 수준의 인간화를 가진 안전한 인간화 항체를 제공하는 것; 및 ii) 항체 특성, 더욱 특히 더 높은 생산성 수율을 증가시키는 것.
일 실시형태에서, 인간화된 항-인간-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다:
(i) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 HCDR1, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 HCDR2 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및
(ii) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 LCDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 LCDR2 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 항-PD1 항체 또는 항원 결합 단편은 프레임워크 영역, 특히 중쇄 가변 영역 프레임워크 영역 (HFR) HFR1, HFR2, HFR3 및 HFR4 및 경쇄 가변 영역 프레임워크 영역 (LFR) LFR1, LFR2, LFR3 및 LFR4를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항-PD1 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 또는 인간화된 프레임워크 영역을 포함한다. 본원의 목적을 위한 "인간 수용체 프레임워크"는 하기 정의된 바와 같은, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스(consensus) 프레임워크로부터 유도된 경쇄 가변 도메인(VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인(VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크로부터 유도된 인간 수용체 프레임워크는 이의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 아미노산 변화 수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하이다. 일부 실시형태에서, VL 수용체 인간 프레임워크는 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열과 서열 상 동일하다. "인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 흔히 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다.
특히, 항-PD1 항체 또는 항원 결합 단편은 각각 서열번호 37, 38, 39 및 40의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 프레임워크 영역 (HFR) HFR1, HFR2, HFR3 및 HFR4를 포함하며, 선택적으로 즉, 서열번호 40의 HFR3의 위치 27, 29 및 32를 제외한 임의의 위치에서 치환(들), 부가(들), 결실(들) 및 이들의 조합으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 변형(들)을 갖는다. 바람직하게는, 항-PD1 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 37의 HFR1, 서열번호 38의 HFR2, 서열번호 39의 HFR3 및 서열번호 40의 HFR4를 포함한다.
대안적으로 또는 추가로, 항-PD1 항체 또는 항원 결합 단편은 각각 EQ ID NOs: 41, 42, 43 및 44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 프레임워크 영역 (LFR) LFR1, LFR2, LFR3 및 LFR4를 포함하며, 선택적으로 치환(들), 부가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 변형(들)을 갖는다. 바람직하게는, 인간화된 항-PD1 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 41의 LFR1, 서열번호 42의 LFR2, 서열번호 43의 LFR3 및 서열번호 44의 LFR4를 포함한다.
본 발명에 따른 항체의 VL 및 VH 도메인은 바람직하게는 다음의 순서로 작동가능하게 연결된 3개의 상보성 결정 영역에 의해 중단된 4개의 프레임워크 영역을 포함할 수 있다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(아미노 말단에서 카복시 말단으로).
제1 실시형태에서, 항-인간-PD-1 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(VH), 선택적으로 서열번호 21의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에 치환(들), 부가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 변형(들)을 가짐;
(b) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역(VL), 선택적으로 서열번호 24의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에 치환(들), 부가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 변형(들)을 가짐.
바람직하게는, 변형은 치환, 특히 보존적 치환이다.
바람직하게는, 항-인간-PD-1 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다: (a) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄 가변 영역(VH); 및 (b) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄 가변 영역(VL).
일 실시형태에서, 중쇄(CH) 및 경쇄(CL)는 상기된 바와 같은 VL 및 VH 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 항-인간-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다: (a) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄, 선택적으로 서열번호 31의 위치 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 및 112를 제외한 임의의 위치에 치환(들), 부가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 변형(들)을 가짐, 및 (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄, 선택적으로 서열번호 34의 위치 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 및 105를 제외한 임의의 위치에 치환(들), 부가(들), 결실(들) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 변형(들)을 가짐.
바람직하게는, 변형은 치환, 특히 보존적 치환이다.
바람직하게는, 항-인간-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다: (a) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄, 및 (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄
Fc 및 힌지 영역
치료용 항체를 개발하기 위한 여러 연구를 통해 Fc 영역을 조작하여 항체 특성을 최적화하여 필요한 약리학적 활성에 더 적합한 분자를 생성할 수 있게 되었다. 항체의 Fc 영역은 보체-의존적 세포독성(CDC: complement-dependent cytotoxicity), 항체-의존적 세포 세포독성(ADCC: antibody-dependent cellular cytotoxicity) 및 항체-의존적 세포 식세포 작용(ADCP: antibody-dependent cell phagocytosis)과 같은 혈청 반감기 및 이펙터 기능을 매개한다. T250Q/M428L 및 M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F와 같은 CH2와 CH3 도메인 사이의 계면에 위치한 여러 돌연변이는 FcRn에 대한 결합 친화도 및 생체 내 IgG1의 반감기를 증가시키는 것으로 나타났다. 그러나, 증가된 FcRn 결합과 개선된 반감기 사이에 항상 직접적인 관계가 있는 것은 아니다. 치료용 항체의 효능을 개선하기 위한 한 가지 접근법은 혈청 지속성을 증가시켜 더 높은 순환 수준, 덜 빈번한 투여 및 감소된 용량을 가능케 하는 것이다. 항체의 이펙터 기능을 감소시키거나 증가시키기 위해 조작된 Fc 영역이 바람직할 수 있다. 세포-표면 분자, 특히 면역 세포에 있는 분자를 표적으로 하는 항체의 경우, 이펙터 기능이 제거되어야 한다. 반대로, 종양학적 사용을 위한 항체의 경우, 이펙터 기능을 증가시키면 치료 활성이 개선될 수 있다. 4개의 인간 IgG 이소타입은 활성화 Fcγ 수용체(FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa), 억제성 FcγRIIb 수용체, 및 서로 다른 친화도를 가진 보체의 첫 번째 성분(C1q)에 결합하여 매우 상이한 이펙터 기능을 생성한다. IgG의 FcγR 또는 C1q에 대한 결합은 힌지 영역과 CH2 도메인에 위치한 잔기에 따라 달라진다. CH2 도메인의 2개의 영역은 FcγR 및 C1q 결합에 중요하며 IgG2 및 IgG4에서 고유한 서열을 가지고 있다.
본 발명에 따른 인간화된 항체는 전형적으로 인간 또는 인간화된 면역글로불린의 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부를 선택적으로 포함한다. 바람직하게는, Fc 영역은 본원에 기술된 인간화된 항-hPD-1 항체의 일부이다. 당업자에게 잘 공지된 바와 같이, 중쇄 불변 도메인의 IgG 이소타입의 선택은 특이적 기능이 필요한지 여부 및 적합한 생체 내 반감기에 대한 필요성에 중점을 둔다. 예컨대, 암세포의 선택적 근절을 위해 설계된 항체는 전형적으로 항체-의존적 세포-매개 세포독성에 의한 보체 활성화 및 이펙터-매개 세포 사멸을 허용하는 활성 이소타입을 필요로 한다. 인간 IgG1 및 IgG3(보다 짧은 반감기) 이소타입 둘 모두는 이러한 기준을 만족하며, 특히 인간 IgG1 이소타입(야생형 및 변이체)이 만족한다. 특히, 중쇄 불변 도메인의 IgG 이소타입(특히 인간 야생형 및 변이체 IgG1 이소타입)에 따라, 본 발명의 인간화된 항-hPD1 항체는 CDC, ADCC 및/또는 ADCP 메커니즘을 통해 PD-1을 발현하는 세포에 대해 세포독성일 수 있다. 실제로, 단편 결정화가능한(Fc) 영역은 다양한 보조 분자와 상호작용하여 항체 의존적 세포 세포독성(ADCC), 항체-의존적 세포 식세포 작용(ADCP) 및 보체-의존적 세포독성과 같은 간접적인 이펙터 기능을 매개한다.
바람직한 실시형태에서, 불변 영역은 인간 면역글로불린 중쇄, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 다른 부류로부터 유도된다. 추가 양태에서, 인간 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 인간화된 항-PD1 항체는 IgG1 또는 IgG4 Fc-영역을 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 인간화된 항-hPD1 항체는 IgG4를 안정화하는 S228P가 있는 IgG4 Fc-영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 항-PD1 항체는 절단된 Fc 영역 또는 Fc 영역의 단편을 포함한다. 일 실시형태에서, 불변 영역은 CH2 도메인을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 불변 영역은 CH2 및 CH3 도메인을 포함하거나 힌지-CH2-CH3을 포함한다. 대안적으로, 불변 영역은 힌지 영역, CH2 도메인 및/또는 CH3 도메인의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 불변 영역은 인간 IgG4 중쇄로부터 유도된 CH2 및/또는 CH3 도메인을 함유한다.
또 다른 실시형태에서, 불변 영역은 CH2 도메인 및 힌지 영역의 적어도 일부를 포함한다. 힌지 영역은 면역글로불린 중쇄, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 다른 부류로부터 유도될 수 있다. 바람직하게는, 힌지 영역은 돌연변이 되었거나 돌연변이 되지 않은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 다른 적합한 부류로부터 유도된다. 보다 바람직하게는 힌지 영역은 인간 IgG1 중쇄로부터 유도된다. 일 실시형태에서, 불변 영역은 제1 항체 이소타입으로부터 유도된 CH2 도메인 및 제2 항체 이소형으로부터 유도된 힌지 영역을 포함한다. 특정 실시형태에서, CH2 도메인은 인간 IgG2 또는 IgG4 중쇄로부터 유도되는 반면, 힌지 영역은 변경된 인간 IgG1 중쇄로부터 유도된다.
일 실시형태에서, 불변 영역은 Fc 수용체에 대한 친화도를 감소시키거나 Fc 이펙터 기능을 감소시키는 돌연변이를 함유한다. 예컨대, 불변 영역은 IgG 중쇄의 불변 영역 내에 글리코실화 부위를 제거하는 돌연변이를 함유할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 불변 영역은 CH2 도메인 및 힌지 영역의 적어도 일부를 포함한다. 힌지 영역은 면역글로불린 중쇄, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 다른 부류로부터 유도될 수 있다. 바람직하게는, 힌지 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 다른 적합한 부류로부터 유도된다. IgG1 힌지 영역은 3개의 시스테인을 가지며, 이 중 2개는 면역글로불린의 2개의 중쇄 사이의 다이설파이드 결합과 관련되어 있다. 이러한 동일한 시스테인은 Fc 부분 사이의 효율적이고 지속적인 다이설파이드 결합 형성을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명의 바람직한 힌지 영역은 IgG1으로부터, 보다 바람직하게는 인간 IgG1으로부터 유도된다. 일부 실시형태에서, 인간 IgG1 힌지 영역 내의 제1 시스테인은 또 다른 아미노산, 바람직하게는 세린으로 돌연변이된다. IgG2 이소타입 힌지 영역은 재조합 시스템에서 분비되는 동안 올리고머화 및 잠재적으로 잘못된 다이설파이드 결합을 촉진하는 경향이 있는 4개의 다이설파이드 결합이 있다. 적합한 힌지 영역은 IgG2 힌지로부터 유도될 수 있다; 처음 2개의 시스테인은 각각 바람직하게는 다른 아미노산으로 돌연변이된다. IgG4의 힌지 영역은 비효율적으로 사슬 간 다이설파이드 결합을 형성하는 것으로 공지되어 있다. 그러나, 본 발명에 대한 적합한 힌지 영역은 바람직하게는 중쇄-유래 모이어티 사이의 다이설파이드 결합의 올바른 형성을 향상시키는 돌연변이를 함유하는 IgG4 힌지 영역으로부터 유도될 수 있다(문헌[Angal S, et al. (1993) Mol. Immunol., 30:105-8]). 보다 바람직하게는 힌지 영역은 인간 IgG4 중쇄로부터 유도된다.
일 실시형태에서, 불변 영역은 제1 항체 이소타입으로부터 유도된 CH2 도메인 및 제2 항체 이소타입으로부터 유도된 힌지 영역을 포함한다. 특정 실시형태에서 CH2 도메인은 인간 IgG4 중쇄로부터 유도되는 반면, 힌지 영역은 변경된 인간 IgG1 중쇄로부터 유도된다.
본 발명에 따라, 불변 영역은 CH2 및/또는 CH3 도메인 및 상이한 항체 이소타입, 즉, 하이브리드 불변 영역으로부터 유도된 힌지 영역을 함유할 수 있다. 예컨대, 일 실시형태에서, 불변 영역은 IgG2 또는 IgG4로부터 유도된 CH2 및/또는 CH3 도메인 및 IgG1로부터 유도된 돌연변이 힌지 영역을 함유한다. 대안적으로, 또 다른 IgG 하위부류로부터 유도된 돌연변이 힌지 영역은 하이브리드 불변 영역에서 사용된다. 예컨대, 2개의 중쇄 사이에 효율적인 다이설파이드 결합을 가능케 하는 IgG4 힌지의 돌연변이 형태가 사용될 수 있다. 돌연변이 힌지는 또한 처음 2개의 시스테인이 또 다른 아미노산으로 각각 돌연변이된 IgG2 힌지로부터 유도될 수 있다. 이러한 하이브리드 불변 영역의 어셈블리가 미국 특허출원공개 US20030044423에 기술되어 있으며, 이의 개시내용은 인용되어 본원에 포함된다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따르면, 불변 영역은 CH2를 함유할 수 있고/있거나 CH3은 하기 표 D에 기술된 돌연변이 중 하나, 또는 이들의 임의의 조합을 갖는다.
[표 D]
항체의 적합한 인간 조작된 Fc 도메인
중쇄 불변 영역의 잔기 번호매김은 EU 번호매김에 른다(문헌[Edelman, G.M. et al., Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85 (1969)]; www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html#refs)
일 특정 양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 카파 경쇄 불변 도메인으로부터 유도된 경쇄 불변 도메인 및 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인으로부터 유도된 중쇄 불변 도메인을 포함하며, 선택적으로 T250Q/M428L; M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F; E233P/L234V/L235A/G236A + A327G/A330S/P331S; E333A; S239D/A330L/I332E; P257I/Q311; K326W/E333S; S239D/I332E/G236A; N297A; L234A/L235A; N297A + M252Y/S254T/T256E; K444A, 및 K322A로 이루어진 군으로부터 선택되는, 바람직하게는 선택적으로 M252Y/S254T/T256E, 및 L234A/L235A와 조합된 N297A로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환 또는 치환의 조합을 갖는다.
또 다른 특정 양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 카파 경쇄 불변 도메인으로부터 유도된 경쇄 불변 도메인 및 인간 IgG4 중쇄 불변 도메인으로부터 유도된 중쇄 불변 도메인을 포함하며, 선택적으로 S228P; L234A/L235A, S228P + M252Y/S254T/T256E, 및 K444A로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환 또는 치환의 조합을 갖는다.
특정 실시형태에서, 아미노산 변형이 본원에 제공된 항체의 Fc 영역에 도입되어 Fc 영역 변이체를 생성할 수 있다. 특정 실시형태에서, Fc 영역 변이체는 전부는 아니지만 일부 이펙터 기능을 보유한다. 이러한 항체는 예컨대 생체 내 항체 반감기가 중요하지만 특정 이펙터 기능이 필요하지 않거나 해로운 적용 분야에서 유용할 수 있다. 이펙터 기능의 예는 보체-의존적 세포독성(CDC) 및 항체-지향성 보체-매개 세포독성(ADCC)을 포함한다. 변경된 이펙터 기능을 가진 다양한 치환 또는 치환 또는 결실이 당업계에 공지되어 있다.
일 실시형태에서, 불변 영역은 Fc 수용체에 대한 친화도를 감소시키거나 Fc 이펙터 기능을 감소시키는 돌연변이를 함유한다. 예컨대, 불변 영역은 IgG 중쇄의 불변 영역 내의 글리코실화 부위를 제거하는 돌연변이를 함유할 수 있다. 바람직하게는, CH2 도메인은 CH2 도메인 내의 글리코실화 부위를 제거하는 돌연변이를 함유한다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 항-hPD1은 서열번호 39의 중쇄 불변 도메인 및/또는 서열번호 40의 경쇄 불변 도메인, 특히 서열번호 39 의 중쇄 불변 도메인 및 서열번호 40의 경쇄 불변 도메인을 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 항-hPD1은 서열번호 47의 중쇄 불변 도메인 및/또는 서열번호 40의 경쇄 불변 도메인, 특히 서열번호 47의 중쇄 불변 도메인 및 서열번호 40의 경쇄 불변 도메인을 갖는다.
[표 E]
본 발명의 인간화된 항체에 적합한 중쇄 불변 도메인 및 경쇄 불변 도메인의 예.
Fc 부분 및 비-Fc 부분의 접합부 근처의 아미노산의 변화는 Fc 융합 단백질의 혈청 반감기를 극적으로 증가시킬 수 있다(국제출원 PCT 공개 WO 01/58957호). 따라서, 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드의 접합 영역은 면역글로불린 중쇄 및 에리트로포이에틴의 자연-발생 서열에 비해, 바람직하게는 접합점의 10개 아미노산 내에 있는 변경을 함유할 수 있다. 이러한 아미노산 변화는 소수성을 증가시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 불변 영역은 C-말단 리신 잔기가 대체된 IgG 서열로부터 유도된다. 바람직하게는, IgG 서열의 C-말단 리신은 비-리신 아미노산, 예컨대 알라닌 또는 류신으로 대체되어 혈청 반감기를 추가로 증가시킨다.
특히, IgG1 또는 IgG4 도메인의 K444 아미노산은 알라닌으로 치환되어 단백질 분해 절단을 감소시킬 수 있다. 이어서, 일 실시형태에서, 항-PD1 항체는 K444A로 구성된 적어도 하나의 추가의 아미노산 치환을 포함한다.
일 실시형태에서, 항-PD1 항체는 IgG의 C-말단 도메인의 추가의 시스테인 잔기를 포함하여 추가 다이설파이드 결합을 생성한다.
특정 실시형태에서, 항체는 글리코실화 정도를 증가시키거나, 감소시키거나 제거하기 위해 변경될 수 있다. 폴리펩티드의 글리코실화는 전형적으로 "N-연결" 또는 "O-연결"이다.
"N-연결" 글리코실화는 탄수화물 모이어티를 아스파라진 잔기의 측쇄에 부착하는 것을 지칭한다. X가 프롤린을 제외한 임의의 아미노산인 트리펩티드 서열 아스파라진-X-세린 및 아스파라진-X-트레오닌은 탄수화물 모이어티를 아스파라진 측쇄에 효소적으로 부착하기 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드의 이러한 트리펩티드 서열의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성한다.
"O-연결" 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스, 또는 자일로스 중 하나를 히드록시아미노산, 가장 일반적으로 세린 또는 트레오닌에 부착하는 것을 지칭하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신도 또한 사용될 수 있다. 항체에 대한 N-연결된 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 하나 이상의 상기 트리펩티드 서열이 생성 또는 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 달성될 수 있다. O-연결 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 항체의 서열 내에 또는 (경우에 따라) 항체의 서열에 대해 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가, 결실, 또는 치환에 의해 달성될 수 있다.
본 발명은 또한 인간화된 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다:
- 이는 85% 초과의 T20 인간화 점수를 갖는다;
- 이는 포유류 세포에서 생성되는 경우 높은 제조가능성을 나타낸다;
- 이는 포유류 세포에서 높은 생산성 수율을 나타낸다;
- 이는 10-7 M 이하의 인간 PD-1에 대한 결합 친화도(KD)를 갖는다;
- 이는 길항제 활성을 가지며 인간 PD-1, 바람직하게는 PD-L1 및 PD-L2에 대한 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2의 결합을 억제한다;
- 이는 PD-1 신호전달(SHP-1 인산화 및 동원)을 차단하거나 억제한다;
- 이는 T-세포 활성화를 향상시킨다, 특히, (억제 pSHP-1 및 TCR 매개 NFAT 활성화, IFN감마 및 IL-2 분비; 및/또는
- 이는 항-종양 면역 반응을 촉진한다.
- 이는 생체 내에서 우수한 약동학 및 약력학을 보여준다.
본 발명의 목적을 위해, "인간화"는 문헌[Gao S H, Huang K, Tu H, Adler A S. BMC Biotechnology. 2013: 13:55]에 기술된 바와 같이 모노클로날 항체의 다양한 영역의 인간화를 정량화하기 위한 T20 점수 분석기를 사용하여 측정된다.
T20 컷오프 인간 데이터베이스를 사용하여 항체 서열의 T20 점수를 계산하기 위해 웹-기반 도구가 제공된다: http://abAnalyzer.lakepharma.com. T20 점수를 계산할 때, 입력 VH, VK, 또는 VL 가변 영역 단백질 서열이 먼저 Kabat 번호매김에 할당되고, CDR 잔기가 식별된다. 전장 서열 또는 오직 프레임워크 서열(CDR 잔기는 제거됨)이 blastp 단백질-단백질 BLAST 알고리즘을 사용하여 각각의 항체 데이터베이스에서 모든 서열과 비교된다. 각 쌍별 비교 사이의 서열 동일성이 단리되고, 데이터베이스의 모든 서열이 분석된 후, 서열은 입력 서열에 대한 서열 동일성을 기반으로 높음에서 낮음으로 정렬된다. Top 20 일치 서열의 동일성 백분율을 평균하여 T20 점수가 수득된다.
"All Human Databases"의 각 사슬 유형(VH, VK, VL) 및 서열 길이(전장 또는 프레임워크만)에 대해, 각 항체 서열은 T20 점수 분석기를 사용하여 각각의 데이터베이스로 점수를 매겼다. T20 점수는 입력 서열 자체가 제외된 상위 20개 일치 서열에 대해 수득되었다(서열 1이 항상 입력 항체 자체이기 때문에 서열 2 내지 21의 동일성 백분율이 평균화됨). 각 군의 T20 점수는 높은 것에서 낮은 것으로 분류되었다. 점수의 감소는 대부분의 서열에서 거의 선형적이었다; 그러나, 항체의 최하 약 15%에 대한 T20 점수는 급격히 감소하기 시작하였다. 따라서, 하위 15%의 서열이 제거되고 잔여 서열이 T20 컷오프 인간 데이터베이스를 형성하였으며, 여기서 T20 점수 컷오프는 새로운 데이터베이스의 서열의 최소 T20 점수를 나타낸다.
본원에서 사용된 "인간화된 항체"는 적어도 80% 또는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 88%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%의 T20 인간화 점수를 가진 것이며, 가장 바람직하게는 T20 인간화 점수는 85% 내지 95% 사이, 바람직하게는 88% 내지 92% 사이를 포함한다.
따라서, 본 발명에 따른 인간화된 항-PD1 항체는 적어도 80% 또는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 88%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%의 T20 인간화 점수를 가지며, 가장 바람직하게는 T20 인간화 점수는 85% 내지 95% 사이, 바람직하게는 88% 내지 92% 사이를 포함한다.
일 실시형태에서, 본원에 개시된 인간화된 항-hPD1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바람직하게는 상응하는 키메라 항체와 비교하여 개선된 생산 수율을 갖는다. 특히, 이러한 인간화된 항-hPD1 항체는 CHO 세포에서 5 mg/L, 6mg/L, 7 mg/L, 8 mg/L 또는 9 mg/L 초과, 바람직하게는 1 또는 2 g/L 초과의 생산 수율을 갖는다. 대안적으로 또는 추가로, 이러한 인간화된 항-hPD1 항체는 COS 세포에서 2 mg/L, 3 mg/L 또는 4 mg/L 초과, 바람직하게는 4 mg/L 초과의 생산 수율을 갖는다.
또 다른 실시형태에서, 이러한 인간화된 항-hPD1 항체는 상응하는 키메라 항체의 생산 수율의 적어도 2배의 생산 수율을 갖는다.
항체의 친화도는 단일 항원-항체 부위에서 특정 항원과의 결합이 측정될 수 있으며 본질적으로 항체의 항원-결합 부위와 특정 에피토프 사이의 상호작용에 존재하는 모든 인력 및 반발력의 합이다. 특정 항원(예컨대 PD-1)에 대한 항체의 친화도는 Kd =[Ag][Ab]/[Ag Ab]의 수학식으로 정의되는 해리의 평형 상수 K로 표현될 수 있으며, 이는 항체-결합 부위의 친화도를 나타내고; 상기 식에서 [Ag]는 유리 항원(M)의 농도이고, [Ab]는 유리 항체(M)의 농도이고 [Ag Ab]는항원-항체 복합체의 농도(M)이다. 항원과 항체가 함께 강하게 반응하는 경우, 유리 항원 또는 유리 항체가 거의 없으므로, 항체의 평형 상수 또는 친화도가 낮을 것이다. 항체에 대한 평균 친화도는 10-7 M 이하이다. 특정 양태에서, 인간화된 항-PD-1 항체는 인간 PD-1에 10-8 M 이하, 바람직하게는 10-9 M 이하의 친화도로 결합한다. 일 양태에서, 친화도는 1,5 × 10-9 M 이하이다. 친화도는 당업자에게 이용가능한 임의의 방법, 예컨대 바이오센서 분석 예컨대 표면 플라즈몬 공명(SPR: surface plasmon resonance) Biacore Analysis, Blitz 분석 및 Scatchard 플롯에 의해 측정될 수 있다. 보다 특히, 결합 친화도는 실시예 2에 보다 상세히 기술된 바와 같이 Biacore에 의해 측정된다. 본 발명의 인간화된 항체는 키메라 항체보다 우수한 친화도를 갖는다.
결합 친화도는 KD 또는 해리 상수로 표현될 수 있으며, 증가된 결합 친화도는 감소된 KD에 해당한다. PD-1에 대한 항체의 결합 친화도를 결정하는 한 가지 방법은 항체의 Fab 단편의 결합 친화도를 측정하는 것이다. Fab 단편을 수득하기 위해, 항체가 파파인으로 절단되고 재조합적으로 발현될 수 있다. 항체의 항-PD-1 Fab 단편의 친화도는 표면 플라즈몬 공명(BIAcore3000TM 표면 플라즈몬 공명(SPR) 시스템, BIAcore, INC, Piscaway N.J.)에 의해 측정될 수 있다. 운동 결합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)(일반적으로 25℃에서 측정됨)가 수득되며; 평형 해리 상수(KD) 값은 koff/kon으로 계산된다.
특히, 본원에서 제공된 항체는 Blitz 분석에 의해 측정될 수 있는 바와 같이, 0.75 내지 1.34 nM 이하, 바람직하게는 0.75 내지 1 nM 이하, 보다 바람직하게는 0.75 내지 0.8 nM 이하의 친화도 상수(KD)로 인간 PD-1에 결합한다. 이러한 시스템은 결합 상호작용(k a, k d, K D)에 대한 속도 및 친화도 상수를 측정할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명은 인간 PD-1에 대한 PDL-1 및/또는 PDL-2의 결합을 부분적으로 또는 완전히, 특히 완전히 억제하는 상기 정의된 바와 같은 인간화된 항-hPD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다.
본 발명의 이러한 인간화된 항체는 hPD-1에 특이적으로 결합하여 PD-1과 PD-L1 및/또는 PD-L2 사이의 상호작용을 길항한다. 특히, 상기 정의된 바와 같은 인간화된 항-hPD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2의 결합, 바람직하게는 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 및 PD-L2의 결합의 길항제이다.
일부 예에서, 본원에 기술된 항-PD-1 항체는 PD-1 신호전달 경로를 적어도 20%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 90%, 적어도 100%, 또는 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배, 또는 적어도 1000배 억제한다. 특히, 인간화된 항-hPD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 경쟁 ELISA 분석에서와 같은 결합 분석에서, 음성 대조군 분자에 비해, PD-1에 대한 PD-L1 및/또는 PD-L2의 결합을 적어도 50%, 60%, 70%, 바람직하게는 80%, 보다 바람직하게는 90% 또는 가장 바람직하게는 100%만큼 감소시키거나 억제할 수 있다. 이러한 분석은 문헌[Sebaugh JL. Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation. Pharm. Stat. 2011; 10: 128-134] 및 실시예 3에 개시되어 있다. 본 발명의 인간화된 항체는 50 ng/ml 미만, 특히 40 ng/ml 미만 및 선택적으로 20 ng/ml 미만의 이러한 분석에 의해 측정된 IC50을 갖는다. 이와 비교하여, 키메라 항체는 50 ng/ml 초과, 즉, 약 60 ng/ml의 IC50을 갖는다. 대안적으로, PD-L1의 PD-1 상으로의 결합을 길항하기 위한 본 발명의 인간화된 항체의 수용능은 또한 실시예 4에 상세히 기술된 바와 같이 Blitz 및 Biacore에 의해 PD-1에 대한 PD-L1의 경쟁 분석에 의해 측정될 수 있다.
경쟁적 억제에 의한 항체 특이성 및 친화도를 결정하는 방법이 당업계에 공지되어 있으며(예컨대, 문헌[Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1998)]; 문헌[Colligan et al., Current Protocols in Immunology, Green Publishing Assoc., NY (1992; 1993)]; 문헌[Muller, Meth. Enzym. 92:589-601 (1983)]) 아래 실시예에 기술되어 있다.
항체의 길항제 활성을 측정하는 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 ELISA, 바이오센서 분석 예컨대 Biacore 및 Blitz이다.
항-PD1 항체, 재조합 발현 벡터 및 숙주 세포를 코딩하는 핵산 분자
본원에 기술된 인간화된 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산, 이의 임의의 경쇄 또는 중쇄, 벡터 예컨대 이러한 핵산을 포함하는 발현 벡터 또는 재조합 바이러스, 및 상기 핵산 및/또는 벡터를 포함하는 숙주 세포가 또한 본원에 개시된다.
핵산 서열
본 발명은 또한 상기 정의된 인간화된 항-hPD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 이의 임의의 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는 핵산 분자 또는 핵산 분자의 군에 관한 것이다.
항체 DNA 서열은 예컨대 면역글로불린을 합성하는 세포의 RNA로부터 증폭될 수 있거나, 클로닝된 면역글로불린과 함께 PCR을 사용하여 합성될 수 있거나, 공지된 신호 펩티드 아미노산 서열을 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 통해 합성될 수 있다. 바람직하게는, 펩티드 신호는 VH 및/또는 CH의 경우 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고/지거나; VL 및/또는 CL의 경우 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 특히, 펩티드 신호는 CH, VH, CL 및/또는 VL의 N-말단에 있다.
이러한 핵산은 항체(예컨대, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩할 수 있다. 이러한 핵산은 통상적인 절차를 통해 용이하게 단리될 수 있고 서열분석될 수 있다.
일 실시형태에서, 인간화된 항-인간 PD-1 항체를 포함하는 핵산 분자는 다음을 포함한다:
- 선택적으로 서열번호 45의 펩티드 신호가 있는, 서열번호 21의 가변 중쇄 도메인을 코딩하는 제1 핵산 분자, 및
- 선택적으로 서열번호 46의 펩티드 신호가 있는, 서열번호 24의 가변 경쇄 도메인을 코딩하는 제2 핵산 분자.
일 실시형태에서, 인간화된 항-인간 PD-1 항체를 코딩하는 핵산 분자는 다음을 포함한다:
- 선택적으로 서열번호 45의 펩티드 신호를 코딩하는 핵산 서열이 있는, 가변 중쇄 도메인을 코딩하는 서열번호 48의 제1 핵산 분자, 및
- 선택적으로 서열번호 46의 펩티드 신호를 코딩하는 핵산 서열이 있는, 가변 경쇄 도메인을 코딩하는 서열번호 49의 제2 핵산 분자.
하나의 특정 실시형태에서, 인간화된 항-인간 PD-1 항체를 코딩하는 핵산 분자는 다음을 포함한다:
- 중쇄를 코딩하는 서열번호 50의 제1 핵산 분자, 및
- 경쇄를 코딩하는 서열번호 51의 제2 핵산 분자.
일 실시형태에서, 핵산 분자는 단리된 것이고; 특히 비-천연의 핵산 분자이다.
본 발명에 따른 인간화된 항-PD1 항체를 코딩하는 핵산 분자 또는 핵산 분자의 군은 바람직하게는 벡터 또는 벡터 군에 포함되어 있다.
벡터
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 핵산 분자 또는 핵산 분자의 군을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "벡터"는 유전 물질을 세포에 전달하기 위한 비히클로서 사용되는 핵산 분자이다. 용어 "벡터"는 플라스미드, 바이러스, 코스미드 및 인공적 염색체를 포함한다. 일반적으로, 조작된 벡터는 복제 원점, 다중클로닝 부위 및 선별 마커를 포함한다. 벡터 그 자체는 일반적으로 삽입물(이식유전자) 및 벡터의 "백본" 역할을 하는 보다 큰 서열을 포함하는, 통상적으로 DNA 서열인 뉴클레오티드 서열이다. 현대 벡터는 이식유전자 삽입물 및 백본 외에 추가 기능을 포함할수 있다: 프로모터, 유전자 마커, 항생제 저항성, 리포터 유전자, 표적화 서열, 단백질 정제 태그. 발현 벡터(발현 구조물)라 지칭되는 벡터는 특히 표적 세포에서 이식유전자의 발현을 위한 것이며, 일반적으로 제어 서열을 가지고 있다.
일 실시형태에서, 인간화된 항-PD1 항체의 중쇄 및 경쇄 코딩 서열 둘 모두 및/또는 불변 영역은 하나의 발현 벡터에 포함된다. 중쇄 코딩 서열 및 경쇄 코딩 서열 각각은 적합한 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, 중쇄 및 경쇄 둘 모두의 발현은 동일한 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 항체의 중쇄 및 경쇄 각각은 개별적인 벡터로 클로닝된다. 후자의 경우, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터는 두 사슬의 발현을 위한 하나의 숙주 세포에 공동-형질감염될 수 있으며, 이는 조립되어 생체 내에서 또는 시험관 내에서 온전한 항체를 형성할 수 있다. 대안적으로, 중쇄를 코딩하는 발현 벡터 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터가 중쇄 및 경쇄 각각을 발현하기 위한 상이한 숙주 세포로 도입될 수 있으며, 이는 이어서 정제되고 조립되어 시험관 내에서 온전한 항체를 형성할 수 있다.
인간화된 항-PD-1 항체 또는 이의 항체 단편을 코딩하는 핵산 분자는 당업자에 의해 벡터로 클로닝될 수 있으며, 이어서 숙주 세포로 형질전환될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 재조합 벡터를 제공하며, 이는 본 발명의 항-PD-1 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 하나의 바람직한 실시형태에서, 발현 벡터는 프로모터 및 분비 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 및 선택적으로 스크리닝을 위한 적어도 하나의 약물-내성 유전자를 추가로 포함한다.
적합한 발현 벡터는 전형적으로 (1) 박테리아 복제 기원을 코딩하는 원핵 DNA 요소 및 박테리아 숙주에서 발현 벡터의 성장 및 선택을 제공하기 위한 항생제 내성 마커; (2) 전사 개시를 제어하는 진핵 DNA 요소, 예컨대 프로모터; 및 (3) 전사 처리를 제어하는 DNA 요소, 예컨대 전사 종결/폴리아데닐화 서열을 함유한다.
당업자에게 공지된 방법을 사용하여 본원에 기술된 항-PD1 항체의 핵산 서열 및 전사/번역을 위한 적합한 조절 성분을 함유하는 발현 벡터를 구축할 수 있다. 이러한 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술, 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. DNA 서열은 발현 벡터의 적합한 프로모터에 효율적으로 연결되어 mRNA의 합성을 지시한다. 발현 벡터는 번역, 전사 종결 등을 개시하기 위한 리보솜-결합 부위를 추가로 포함할 수 있다.
발현 벡터는 칼슘 포스페이트 형질감염, 리보솜-매개 형질감염, 전기천공 등을 포함하는 다양한 기술을 사용하여 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 바람직하게는, 형질감염된 세포는 선별되고 증식되며 상기 발현 벡터는 숙주 세포 게놈에 안정적으로 통합되어 안정한 형질전환체를 생산한다. 벡터를 진핵 세포에 도입하기 위한 기술 및 우세 선별 마커를 사용하여 안정한 형질전환체를 선별하기 위한 기술이 Sambrook, Ausubel, Bebbington에 의한 문헌["Expression of Antibody Genes in Nonlymphoid Mammalian Cells," in 2 METHODS: A companion to methods in enzymology 136 (1991)], 및 Murray (ed.)에 의한 문헌[Gene transfer and expression protocols(Humana Press 1991)]에 기술되어 있다. 적합한 클로닝 벡터가 문헌[Sambrook et al. (eds.), MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second Edition (Cold Spring Harbor Press 1989) (hereafter "Sambrook")]; 문헌[Ausubel et al. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Wiley Interscience 1987) (hereafter"Ausubel")]; 및 문헌[Brown (ed.), MOLECULAR BIOLOGY LABFAX (Academic Press 1991)]에 의해 기술되어 있다.
숙주 세포
본 발명의 핵산 분자, 핵산 분자의 군 및/또는 벡터는 특히 인간화된 항-인간 PD-1 항체 생산 목적을 위해 숙주 세포에 포함될 수 있다. 따라서 본 발명은 상기 기술된 바와 같은 적어도 하나의 핵산 분자 및/또는 핵산 분자의 군 및/또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본원에서 사용된 용어 "숙주 세포"는 벡터, 외인성 핵산 분자, 및 본 발명의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 수용자 및/또는 항체 그 자체의 수용자일 수 있거나 수용자였던 임의의 개별적인 세포 또는 세포 배양물을 포함하도록 의도된다. 세포 내로의 각각의 물질의 도입은 형질전환, 형질감염 등의 방법에 의해 수행될 수 있다. 용어 "숙주 세포"는 또한 단일 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 포함하도록 의도된다. 적합한 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포를 포함하며, 또한 비제한적으로 박테리아, 효모 세포, 진균 세포, 식물 세포, 및 동물 세포 예컨대 곤충 세포 및 포유류 세포, 예컨대 쥐(murine), 랫트, 토끼, 마카크(macaque) 또는 인간을 포함한다.
일 실시형태에서, 숙주 세포는 다음을 포함한다(예컨대, 다음으로 형질전환 되었다): (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열 및/또는 항체의 불변 영역을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터.
인간화된 항-PD1 항체 생산 방법이 또한 본원에서 제공된다. 상기 방법은 항체의 발현에 적합한 조건 하에, 상기 제공된 바와 같이, 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 선택적으로 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 항체를 회수하는 단계를 포함한다. 특히, 인간화된 항-PD1 항체의 재조합 생산을 위해, 예컨대, 상기된 바와 같이, 항체를 코딩하는 핵산이 단리되고 숙주 세포에서 추가 클로닝 및/또는 발현을 위한 하나 이상의 벡터로 삽입된다.
인간화된 항-PD-1 항체 생산에 적합한 숙주 세포는 비제한적으로 진핵 세포 예컨대 포유류 세포, 식물 세포, 곤충 세포 또는 효모 세포를 포함한다. 포유류 세포는 글리코실화와 같은 적합한 번역 후 변형을 제공하기 때문에 포유류 세포가 특히 바람직한 진핵 숙주이다. 바람직하게는, 이러한 적합한 진핵 숙주 세포는 진균 예컨대 피키아 패스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지아(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 곤충 세포 예컨대 멸강 나방(Mythimna separate); 식물 세포 예컨대 담배(tobacco), 및 포유류 세포 예컨대 BHK 세포, 293 세포, CHO 세포, NSO 세포 및 COS 세포일 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 다른 예는 SV40 유전자 세포(COS 세포)를 가진 Origin 내의 CV-1, SV40(COS-7)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계통, 인간 배아 신장 계통(예컨대, 문헌 [Graham, F.L. et al, J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74]에 기술된 293 또는 293 세포); 아기 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 Sertoli 세포(예컨대, 문헌[Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252]에 기술된 바와 같은 TM4 세포); 인간 상피 신장 세포(HEK 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK; 버팔로 랫트 간 세포(BRL 3 A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간 세포(Hep G2); 마우스 유선 종양(MMT 060562); 예컨대, 문헌[Mather, J.P. et al, Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68]에 기술된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유류 숙주 세포주는 DHFR" CHO 세포(Urlaub, 문헌[G. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220])를 포함하는 차이니즈 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포; 및 골수종 세포주 예컨대 Y0, NSO 및 Sp2/0를 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유류 숙주 세포주의 검토를 위해, 예컨대 문헌[Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268]을 참조한다. 예컨대, 현탁으로 성장하도록 적응된 포유류 세포주가 유용할 수 있다.
특히, 본 발명의 숙주 세포는 CHO 세포, COS 세포, NSO 세포, 및 HEK 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
포유류 숙주의 경우, 발현 벡터의 전사 및 번역 조절 신호는 바이러스 공급원, 예컨대 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스, 유인원 바이러스 등으로부터 유도될 수 있으며, 상기 조절 신호는 높은 수준의 발현을 가진 특정 유전자와 결합되어 있다. 적합한 전사 및 번역 조절 서열은 또한 포유류 유전자, 예컨대 액틴, 콜라겐, 미오신, 및 메탈로티오네인 유전자로부터 수득될 수 있다.
본 발명에 따른 인간화 항체를 생산하기 위한 안정한 형질전환체는 다양한 방법을 사용하여 식별될 수 있다. 분자-생성 세포가 식별된 후, 숙주 세포는 성장 및 인간화 항체 발현에 적합한 조건(예컨대 온도, 배지)에서 배양된다. 인간화된 항체는 이어서 임의의 공지된 방법에 의해 단리되고/되거나 정제된다. 이러한 방법은 비제한적으로 통상적인 재생 처리, 단백질 침전제에 의한 처리(예컨대 염 침전), 원심분리, 삼투에 의한 세포 용해, 초음파처리, 초원심분리, 분자 체 크로마토그래피 또는 겔 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, HPLC, 임의의 다른 액체 크로마토그래피, 및 이들의 조합을 포함한다. 예컨대 Coligan에 의해 기술된 바와 같이, 인간화된 항체 단리 기술은 특히 Protein-A Sepharose를 통한 친화도 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 바람직하게는 Protein A가 본 발명의 항체를 단리하기 위해 사용된다.
항체
접합체
본 개시내용은 또한 본원에 기술된 인간화된 항-PD-1 항체 또는 이의 항체 단편 및 치료제 또는 진단제일 수 있는 제2 적합한 제제를 포함하는 “항체 접합체” 소위 "면역접합체"를 제공한다. 본 발명은 또한 하나 이상의 세포독성제, 예컨대 화학요법제 또는 약물(예컨대 면역억제제), 성장 억제제, 독소(예컨대, 단백질 독소, 면역독소, 세포독소, 박테리아, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 이들의 단편), 방사성독소, 방사성 동위원소, 비-단백질 중합체 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌과 접합된 인간화된 항-PD1 항체 또는 이의 항체 단편을 포함하는 면역접합체를 제공한다. 본 발명의 항체 접합체는 주어진 생물학적 반응을 변형하기 위해 사용될 수 있으며, 약물 모이어티는 고전적인 화학 치료제로 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다. 예컨대, 약물 모이어티는 원하는 생물학적 활성을 가진 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 용어 "면역접합된"은 본원에서 재조합 방법에 의한 본 발명에 따른 인간화된 항-PD1 항체에 대한 또 다른 분자/모이어티의 화학적 가교결합 또는 공유적 부착에 관한 것이다. 면역접합체의 제조 방법이 당업계에 잘 공지되어 있다(예컨대, 국제공개 WO 2014/160160호, 미국특허 제5,208,020호 및 제5,416,064호; 문헌[Chari et al., 1992 Cancer Res. 52:127-131] 참조).
약학 조성물
본 발명은 또한 바람직하게는 활성 성분 또는 화합물로서 인간화된 항-인간 PD1 항체 또는 이의 항체 단편, 상기 개시된 바와 같은 항체 접합체, 핵산 분자, 핵산 분자의 군, 상기 기술된 바와 같은 벡터 및/또는 숙주 세포를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 제형은 멸균될 수 있고, 원하는 경우 보조제 예컨대 본 발명의 인간화된 항-인간 PD-1 항체 또는 이의 항체 단편, 항체 접합체, 핵산, 벡터 및/또는 숙주 세포와 유해하게 상호작용하지 않는 약학적으로 허용되는 담체 및 부형제와 함께 혼합될 수 있다. 선택적으로, 약학 조성물은 하기된 바와 같은 추가 치료제를 추가로 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 약학 조성물은 후술되는 바와 같은 하나 이상의 약학적으로 또는 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 염, 및 항산화제와 조합하여, 본원에 기술된 바와 같은 인간화된 항-인간 PD-1 항체 또는 이의 항체 단편, 핵산 분자, 핵산 분자의 군, 벡터 및/또는 숙주 세포를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 인간화된 항-PD1 항체의 원하는 면역 강화 효과에 악영향을 미치지 않는 약학적으로 허용되는 형태가 사용된다. 투여를 용이하게 하기 위해, 본원에 기술된 인간화된 항-인간 PD-1 항체 또는 이의 항체 단편은 생체 내 투여를 위한 약학 조성물로 제조될 수 있다. 이러한 조성물의 제조 수단이 당업계에 기술되어 있다(예컨대, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins, 21st edition (2005)] 참조).
본 발명에 따른 약학 조성물은 국소, 장내, 경구, 비경구, 비강 내, 정맥 내, 동맥 내, 근육 내, 종양 내, 피하 또는 안내 투여 등을 포함하는 임의의 통상적인 투여 경로를 위해 제형화될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 약학 조성물은 장내 또는 비경구 투여 경로를 위해 제형화된다. 비경구 투여를 위한 조성물 및 제형은 완충액, 희석제 및 다른 적합한 첨가제 예컨대 비제한적으로 침투 강화제, 카더 화합물 및 기타 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 또한 함유할 수 있는 멸균 수용액을 포함할 수 있다.
약학 조성물은 원하는 순도를 가진 제제와 선택적인 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제(문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])를 혼합하여 동결건조된 제형 또는 수용액 형태로 제조될 수 있다. 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용되는 용량 및 농도에서 수용자에게 비독성이며, 완충제 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라진, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카라이드, 다이사카라이드, 및 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이트화제 예컨대 EDTA; 당 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-형성 반대-이온 예컨대 소듐; 금속 착화물(예컨대, Zn-단백질 착화물); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예컨대 TWEEN TM, PLURONICS TM 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.
고체의 약학적으로 허용되는 비히클은 향미제, 윤활제, 가용화제, 현탁제, 염료, 충전제, 활택제, 압축 보조제, 불활성 결합제, 감미제, 보존제, 염료, 코팅, 또는 정제-붕해제로도 작용할 수 있는 하나 이상의 물질을 포함할 수 있다. 적합한 고체 비히클은 예컨대 칼슘 포스페이트, 마그네슘 스테아레이트, 활석, 당, 락토스, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 셀룰로스, 폴리비닐피롤리딘, 저융점 왁스 및 이온 교환 수지를 포함한다. 약학적으로 허용되는 담체는 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 화합물과 양립할 수 없는 경우를 제외하고, 본 발명의 약학 조성물에서 이의 사용이 고려된다.
본 발명에 따른 인간화된 항-PD1 항체는 약학적으로 허용되는 액체 비히클 예컨대 물, 유기 용매, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등 둘 모두의 혼합물 또는 약학적으로 허용되는 오일 또는 지방 및 이들의 적합한 혼합물에 용해되거나 현탁될 수 있다. 액체 비히클은 다른 적합한 약학적 보조제 예컨대 가용화제, 유화제, 완충액, 보존제, 감미제, 향미제, 현탁제, 습윤제, 증점제, 착화제, 점도 조절제, 안정화제 또는 삼투 조절제를 함유할 수 있다. 경구 및 장내 투여를 위한 액체 비히클의 적합한 예는 물(상기 첨가제, 예컨대 셀룰로스 유도체, 바람직하게는 소듐 카복시메틸 셀룰로스 용액을 부분적으로 함유함), 알코올(모노히드리드 알코올 및 폴리히드리드 알코올, 예컨대 글리콜 포함) 및 이들의 유도체, 및 오일(예컨대 분별된 코코넛 오일 및 땅콩 오일)을 포함한다. 비경구 투여를 위해, 비히클은 또한 유성 에스터 예컨대 에틸 올리에이트 및 이소프로필 미리스테이트일 수 있다. 멸균 액체 비히클은 장내 투여를 위한 멸균 액체 형태 조성물에 유용하다. 가압 조성물을 위한 액체 비히클은 할로겐화된 탄화수소 또는 다른 약학적으로 허용되는 추진제일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 염을 추가로 포함할 수 있다. "약학적으로 허용되는 염"은 모 화합물의 원하는 생물학적 활성을 유지하고 임의의 원치않는 독성 효과를 부여하지 않는 염을 지칭한다. 이러한 염의 예는 산 부가 염 및 염기 부가 염을 포함한다. 산 부가 염은 비독성 무기 산, 예컨대 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드수소산, 인 등으로부터 유도된 것들 및 비독성 유기 산 예컨대 지방족 모노- 및 디카복실산, 페닐-치환된 알카노인산, 히드록시 알카노인산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 황산 등으로부터 유도된 것들을 포함한다. 염기 부가 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속, 예컨대 소듐, 포타슘, 마그네슘, 칼슘 등으로부터 유도된 것들, 및 비독성 유기 아민, 예컨대 N-N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등으로부터 유도된 것들을 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 또한 약학적으로 허용되는 항산화제를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 항산화제의 예는 다음을 포함한다: 수용성 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 히드로클로라이드, 소듐 바이설페이트, 소듐 메타바이설파이트, 소듐 설파이트 등; 지용성 항산화제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화된 히드록시안니솔(BHA), 부틸화된 히드록시톨루엔(BHT) 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 금속 킬레이트화제, 예컨대 시트르산, 에틸렌디아민 테트라-아세트산(EDTA), 솔비톨, 타타르산, 인산 등.
전달을 용이하게 하기 위해, 항-PD-1 항체 또는 이의 코딩 핵산을 샤페론제와 접합시킬 수 있다. 샤페론제는 자연 발생 물질, 예컨대 단백질(예컨대, 인간 혈청 알부민, 저밀도 지질단백질, 또는 글로불린), 탄수화물(예컨대, 덱스트란, 풀루란, 키틴, 키토산, 이눌린, 사이클로덱스트린 또는 히알루론산), 또는 지질일 수 있다. 이는 또한 재조합 또는 합성 분자, 예컨대, 합성 중합체, 예컨대 합성 폴리아미노산일 수 있다. 폴리아미노산의 예는 폴리리신(PLL), 폴리 L 아스파르트산, 폴리 L-글루탐산, 스티렌-말산 무수물 공중합체, 폴리(L-락타이드-co-글리콜라이드) 공중합체, 디비닐 에터-말레 무수물 공중합체, N-(2-히드록시프로필) 메타크릴아미드 공중합체(HMPA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리우레탄, 폴리(2-에틸아크릴산), N-이소프로필아크릴아미드 중합체, 및 폴리포스파진일 수 있다. 일 예에서, 샤페론제는 올리고뉴클레오티드/간섭 RNA가 캡슐화되어 있는 미셀, 리포좀, 나노입자, 또는 미소구체이다. 이러한 미셀, 리포좀, 나노입자, 또는 미소구체의 제조 방법이 당업계에 잘 공지되어 있다. 예컨대, 미국 특허 제5,108,921호; 제5,354,844호; 제5,416,016호; 및 제5,527,5285호를 참조한다.
약학 조성물은 일반적으로 제조 및 저장 조건 하에 멸균되고 안정적이어야 한다. 약학 조성물은 용액, 마이크로-에멀젼, 리포좀, 또는 높은 약물 농도에 적합하고/하거나 주사에 적합한 다른 정렬된 구조로 제형화될 수 있다. 예컨대, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산의 경우 필요한 입자 크기 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 적합한 유동성이 유지될 수 있다.
일 실시형태에서, 약학 조성물은 다양한 담체 예컨대 식물성 유지, 디메틸락타미드, 디메틸포름아미드, 에틸 락테이트, 에틸 카보네이트, 이소프로필 미리스테이트, 에탄올, 및 폴리올(글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 등)을 함유할 수 있다. 정맥 내 주입을 위해, 수용성 항체가 드립법(drip method)에 의해 투여될 수 있으며, 이에 의해 항체 및 생리학적으로 허용되는 부형제를 함유하는 약학 제형이 주입된다. 생리학적으로 허용되는 부형제는, 예컨대 5% 덱스트로스, 0.9% 염수, 링거 용액 또는 다른 적합한 부형제를 포함할 수 있다. 근육 내 제제, 예컨대 항체의 적합한 가용성 염 형태의 멸균 제형이 약학적 부형제 예컨대 주사 용수, 0.9% 염수, 또는 5% 글루코스 용액 중에 용해되어 투여될 수 있다.
멸균 주사 용액은 필요에 따라 상기 열거된 성분의 하나 또는 조합과 함께 적합한 용매에 필요한 양의 활성 화합물을 혼입한 다음, 멸균 미세여과함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 염기성 분산 매질과 위에 열거된 것 들 중에서 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결-건조(freeze-drying)(동결건조(lyophilization))로 활성 성분의 분말과 이전에 멸균-여과된 이의 용액으로부터의 임의의 추가의 원하는 성분을 생성한다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예컨대 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 야기될 수 있다.
미생물 존재의 방지는 살균 절차에 의해, 그리고 다양한 항균제 및 항진균제, 예컨대 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등을 혼입에 의해 보장될 수 있다. 또한, 등장제, 예컨대 당, 소듐 클로라이드 등을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 주사가능한 약학적 형태의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 혼입에 의해 야기될 수 있다.
당업자는 본 발명의 제형이 인간 혈액과 본질적으로 동일한 삼투압을 갖는 인간 혈액과 등장성일 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 등장성 제형은 일반적으로 약 250 mOSm 내지 약 350 mOSm의 삼투압을 갖는다. 등장성은, 예컨대 증기압 또는 빙결식 삼투압계에 의해 측정될 수 있다. 제형의 긴장성은 긴장성 조절제의 사용에 의해 조절된다. "긴장성 조절제"는 제형의 등장성을 제공하기 위해 제형에 첨가될 수 있는 약학적으로 허용되는 불활성 물질이다. 본 발명에 적합한 긴장성 조절제는 비제한적으로 사카라이드, 염 및 아미노산을 포함한다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 활성 성분(예컨대, 본 발명의 인간화된 항-hPD1 항체)을 실질적으로 투여 직후 또는 임의의 사전결정된 시간 또는 투여 후 시간 기간에 방출되도록 제형화될 수 있다. 일부 양태에서 약학 조성물은 시간-방출, 지연 방출, 및 지속 방출 전달 시스템을 사용하여 조성물의 전달이 치료될 부위의 감작을 유발하기에 충분한 시간과 이전에 발생하도록 할 수 있다. 당업계에 공지된 수단을 사용하여 조성물이 표적 조직 또는 기관에 도달할 때까지 조성물의 방출 및 흡수를 방지 또는 최소화하거나 조성물의 시간-방출을 보장할 수 있다. 이러한 시스템은 조성물의 반복 투여를 피할 수 있고, 이에 따라 대상체와 의사의 편의를 증가시킬 수 있다.
단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 대상체, 및 특정 투여 경로에 따라 달라질 것이다. 단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 생성하는 조성물의 양일 것이다.
대상체, 요법 및 투여
본 발명은 약제로서 사용하기 위한, 특히 대상체의 질병 또는 장애의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 본 발명의 인간화된 항-PD1 항체 또는 이의 단편, 약학 조성물, 핵산 분자, 핵산 분자의 군, 벡터 또는 숙주 세포에 관한 것이다. 치료의 예는 하기 "방법 및 용도" 섹션에서 보다 구체적으로 기술된다. 이는 또한, 대상체에서 질병을 치료하기 위한 약제의 제조에서 본 발명의 약학 조성물, 핵산, 벡터 또는 숙주 세포 또는 인간화된 항-PD1 항체 또는 이의 항체 단편의 용도에 관한 것이다. 마지막으로, 이는 치료 유효량의 약학 조성물 또는 인간화된 항-PD1 항체 또는 이의 항체 단편을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 질병 또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다. 치료의 예가 하기 "방법 및 상용" 섹션에서 보다 구체적으로 기술된다.
치료될 대상체는 인간, 특히 산전 단계의 인간, 신생아, 아동, 유아, 청소년 또는 성인, 특히 적어도 30세, 40세의 성인, 바람직하게는 적어도 50세의 성인, 보다 더 바람직하게는 적어도 60세의 성인, 보다 더 바람직하게는 적어도 70세의 성인일 수 있다.
특정 실시형태에서, 대상체는 면역억제되었거나 면역저하되었다. 이러한 대상체는 예컨대 바이러스 예컨대 HIV에 의한 감염, 암, 당뇨병, 영양실조, 및 특정 유전적 장애로 인해, 면역억제 약물을 사용하는 치료에 대해 또는 면역요법, 화학요법 또는 방사선요법에 의한 이전의 치료에 대해 면역억제되거나, 면역손상되거나 면역저하될 수 있다. 본 발명의 대상체는 면역저하될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "면역저하된" 및 "면역결핍된"은 동등하며 상호교환적으로 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 "면역저하된" 또는 "면역손상된"은 대상체가 약화된 면역 방어를 가진 상태를 지칭한다. 면역저하된 개체는 정상적인 조건 하에 위험을 나타내지 않는 미생물을 적절하게 관리할 수 없다. 본 발명의 대상체는 면역억제될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "면역억제된"은 대상체가 더 이상 면역 방어를 갖지 않은 상태를 지칭한다.
따라서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 약학 조성물, 단리된 핵산 분자 또는 단리된 핵산 분자의 군, 벡터, 또는 숙주 세포는 림프구 감소증 장애를 가진 환자의 예방 또는 치료에서의 사용을 위한 것일 수 있다.
특히, 대상체는 PD-1/PDL-1 경로를 수반할 수 있는 질병에 걸리며, 특히 여기서, PD-1(예컨대 PDL-1 및/또는 PDL-2) 또는 PD-1의 리간드 중 적어도 하나가 발현되고, 특히 과발현된다. 바람직하게는, 대상체는 암, 보다 바람직하게는 PD1, PD-L1 및/또는 PD-L2 양성 암 또는 PD-1 양성 암을 앓고 있다. 질병 및 암의 예는 이하 "방법 및 용도" 섹션에서 보다 구체적으로 기술된다.
특정 실시형태에서, 대상체는 본 발명에 따른 인간화된 항-PD1 항체 또는 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 전에, 적어도 한 라인의 치료, 바람직하게는 여러 라인의 치료를 이미 받았다.
의학 분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 방법을 사용하여, 치료될 질병의 종류 또는 질병의 부위에 따라, 본원에 개시된 인간화된 항-PD1 항체 또는 이의 항체 단편 또는 약학 조성물이 대상체에 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 통상적인 경로를 통해 투여될 수 있으며, 예컨대 경구로, 비경구로, 장내로, 분무 흡입에 의해, 국소적으로, 직장으로, 비강으로, 협측으로, 질내로 또는 삽입된 저장소(reservoir)를 통해 투여될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "비경구로"는 피하, 피내, 정맥 내, 근육 내, 관절 내, 동맥 내, 활액 내, 흉골 내, 포막(thecal) 내, 병변 내, 종양 내, 및 두개 내 주사 및 주입 기술을 포함한다. 비경구로 투여되는 경우, 본 발명에 따른 약학 조성물은 바람직하게는 정맥 내 투여 경로로 투여된다. 장내로 투여되는 경우, 본 발명에 따른 약학 조성물은 바람직하게는 경구 투여 경로로 투여된다. 이러한 조성물은 또한 국소적으로 투여될 수 있다.
약학 조성물 형태, 본 발명에 따른 약학 조성물 또는 인간화된 항-PD1 항체 또는 이의 단편의 투여 경로 및 투여 용량은 감염의 유형 및 중증도, 및 환자, 특히 이의 연령, 체중, 성별, 및 일반적인 신체 상태에 따라 당업자에 의해 조정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 국소 또는 전신 치료가 바람직한지에 따라 다양한 방식으로 투여될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 인간화된 항-PD-1 항체 또는 이의 단편 또는 약학 조성물을 사용하는 치료는 규칙적으로, 바람직하게는 매일, 매주, 또는 매월 사이에, 보다 바람직하게는 매일 및 매 1, 2, 3 또는 4주 사이에 투여된다. 특정 실시형태에서, 치료는 1일 수 회, 바람직하게는 1일 2 또는 3회 투여된다.
본 발명에 따른 인간화된 항-PD-1 항체 또는 이의 단편 또는 약학 조성물을 사용하는 치료 기간은 바람직하게는 1일 내지 20주 사이, 보다 바람직하게는 1일 내지 10주 사이, 보다 더 바람직하게는 1일 내지 4주 사이, 보다 더 바람직하게는 1일 내지 2주 사이에 포함된다. 대안적으로, 치료는 질병이 지속되는 한 지속될 수 있다.
본원에 개시된 인간화된 항-hPD1 항체는, 선택적으로 매 1, 2, 3 또는 4주, 바람직하게는 비경구 또는 경구 투여에 의해, 특히 정맥 내 또는 피하 투여에 의해 약 1 ng/kg 체중 내지 약 30 mg/kg 체중, 1 μg/kg 내지 약 20 mg/kg, 10 μg/kg 내지 약 10 mg/kg, 또는 100 μg/kg 내지 5 mg/kg의 유효 투여량 범위로 제공될 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 인간화된 항-hPD1 항체는 치료 이하 용량(subtherapeutic dose)으로 투여될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "치료 이하 용량"은 질병을 치료하는데 통상적으로 사용되는 효과적인 단일요법 용량 수준 미만인 용량, 또는 현재 항-hPD1 항체를 사용하는 효과적인 단일요법에 통상적으로 사용되지 않는 용량을 지칭한다.
방법 및 용도
질병 치료 용도
본 발명의 인간화된 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 핵산, 벡터, 숙주 세포, 조성물 및 방법은 다양한 시험관 내 및 생체 내 용도 및 적용을 갖는다. 예컨대, 본원에 기술된 인간화된 항-PD-1 항체 또는 이의 항체 단편(자유 형태 또는 면역접합체로서), 핵산, 벡터, 숙주 세포, 및/또는 약학 조성물은 치료제, 진단제 및 의료 연구로서 사용될 수 있다. 특히, 본원에 제공된 임의의 인간화된 항-PD1 항체, 핵산, 벡터, 숙주 세포, 또는 약학 조성물은 치료 방법에서 및/또는 치료 목적을 위해 사용될 수 있다. 특히, 본원에 제공된 인간화된 항-PD-1 항체 또는 이의 항체 단편은 PD-1과 연관된 임의의 질병 또는 병태, 예컨대 암 및 감염, 또는 면역 결핍과 관련된 다른 질환, 예컨대 T 세포 기능부전의 치료에 대해 유용할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 PD-1에 대한 PD-L1 및/또는 PD-L2의 결합을 억제함으로써 예방 또는 치료될 수 있는 병리, 질환 및/또는 장애의 치료 방법에 관한 것이다.
보다 더 바람직하게는, 본 발명은, 유효량의 상기 정의된 바와 같은 항-PD1 항체 또는 약학 조성물을 이를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서, 암 및 감염성 질환, 바람직하게는 만성 감염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 및/또는 장애의 치료 방법에 관한 것이다. 이러한 질환의 예가 보다 특히 이하 기술된다.
본 발명은 또한 대상체에서 장애 및/또는 질환의 치료에서 사용하기 위한 및/또는 약제 또는 백신으로서 사용하기 위한 인간화된 항-hPD1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 핵산, 핵산의 군 또는 이를 코딩하는 벡터, 또는 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 이는 또한 대상체에서 질환 및/또는 장애를 치료하기 위한 약제의 제조에서 인간화된 항-hPD1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 핵산 또는 이를 코딩하는 벡터, 또는 이를 포함하는 약학 조성물의 용도에 관한 것이다. 마지막으로, 이는 치료 유효량의 약학 조성물 또는 인간화된 항-PD1 항체 또는 이의 항체 단편을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 질환 또는 장애의 치료 방법에 관한 것이다.
특정 양태에서, 본 발명은 특히 PD-1에 대한 PD-L1 및/또는 PD-L2 결합을 억제함으로써 예방 또는 치료될 수 있는 병리, 질환 및/또는 장애의 치료에서 사용하기 위한, 본원에 개시된 인간화된 항-hPD1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 핵산, 핵산의 군 또는 이를 코딩하는 벡터, 또는 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
따라서, 본원에 기술된 유효량의 항-PD-1 항체 또는 약학 조성물을 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 PD-1 및/또는 PD-1/PD-L1 및/또는 PD-1/PD-L2 신호전달 경로와 관련된 질환을 치료하는 방법이 본원에서 개시된다. 환자의 생리학적 데이터(예컨대, 연령, 크기, 및 체중) 및 투여 경로가 또한 적합한 투여량을 결정하기 위해 고려되며, 이에 따라 치료 유효량이 대상체에 투여될 것이다.
질환 및/또는 장애를 가진 환자의 치료 방법이 본원에서 개시되며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다: (a) 치료를 필요로 하는 환자를 식별하는 단계; 및 (b) 환자에게 본원에 기술된 치료 유효량의 항체, 핵산, 벡터 또는 약학 조성물을 투여하는 단계.
일 특정 양태에서, 치료를 필요로 하는 대상체는 PD-1에 의해 매개되는 신호전달 경로와 관련된 질환에 걸린, 걸릴 위험이 있거나 걸린 것으로 의심이 되는 인간일 수 있다. 이러한 환자는 일상적인 건강 검진에 의해 식별될 수 있다. 예컨대, 치료에 적합한 대상체는 이러한 대상체가 PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2 양성 세포를 지니고 있는지 여부를 조사함으로써 식별될 수 있다. 일 실시형태에서, 치료를 필요로하는 대상체는 질병, 바람직하게는 PD-1, PDL1 및/또는 PDL2 양성 질병, 보다 더 바람직하게는 PD-1 및/또는 적어도 하나의 PD-1 리간드가 과발현된 질환에 걸렸거나, 걸렸을 것으로 의심이 되거나 걸릴 위험이 있는 대상체이다. 이러한 대상체에서, 본 발명에 따른 항체 또는 약학 조성물의 투여로 인한 PD-1/PD-L1 및/또는 PD-1/PD-L2 상호작용의 파괴는 대상체의 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 인간화된 항-PD-1 항체 또는 약학 조성물은 PD-1 양성 세포를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
대안적으로, PD-L1 또는 PD-L2 발현 표적화된 세포에 특이적이지 않은 대식세포에 의한 식세포 작용에 대한 효과로 인해, 치료에 적합한 대상체는 또한 PD-L1 및/또는 PD-L2 음성 표적화된 세포를 가질 수 있다. 일 실시형태에서, 치료를 필요로하는 대상체는 PDL1 및/또는 PDL2 음성인 질병을 가진, 가질 것으로 의심되거나 그럴 위험이 있는 환자이다.
또 다른 양태에서 본원에 기술된 인간화된 항-PD-1 항체 또는 약학 조성물은 대상체에, 바람직하게는 장애 및/또는 질환을 치료하기 위해, 예컨대, 생체 내에 투여되어 면역성을 향상시킬 수 있다. 따라서, 일 양태에서, 본 발명은 대상체에 본 발명의 인간화된 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 핵산, 벡터 또는 약학 조성물을 대상체에 투여하여 대상체에서 면역 반응이 변형되는 단계를 포함하는 대상체에서 면역 반응을 변형하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 면역 반응은 향상, 증가, 자극 또는 상향조절된다. 인간화된 항-hPD-1 항체 또는 약학 조성물은 치료를 필요로 하는 대상체에서 면역 반응 예컨대 T 세포 활성화를 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 면역 반응 향상은 PD-1에 대한 PD-L1 및/또는 PD-L2의 결합을 억제하여 면역억제 환경을 감소시키고, 인간 T-세포의 증식 및/또는 활성화 및/또는 인간 PBMC에 의한 IFNγ 분비를 자극할 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, 면역 반응 향상은 대식세포에 의한 세포의 식세포 작용 활성화로 인해 발생할 수 있다. 이러한 식세포 작용은 PD-L1을 발현하는 식세포로 제한되지 않는다. 실제로, 본 발명의 인간화된 항-hPD-1 항체는 이러한 대식세포, 특히 암세포 또는 감염된 세포에 의해 임의의 세포의 식세포 작용을 활성화할 수 있다.
본 발명은 특히 치료 유효량의 임의의 인간화된 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 핵산, 벡터 또는 약학 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 향상시키는 방법을 제공하며, 이에 따라 본원에 기술된 바와 같이 대상체에서 면역 반응이 향상되는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기술된 인간화된 항-hPD-1 항체의 양은 PD-1 신호전달을 억제하는데(예컨대, 대조군과 비교하여 적어도 20%, 30%, 50%, 80%, 100%, 200%, 400%, 또는 500%만큼 PD-1 신호전달을 감소시키는데) 효과적이다. 다른 실시형태에서, 본원에 기술된 항-PD-1 항체의 양은 면역 반응을 활성화하는데 효과적이다(예컨대, 대조군과 비교하여 적어도 20%, 30%, 50%, 80%, 100%, 200%, 400%, 또는 500% 만큼).
일부 실시형태에서, 본원에 기술된 인간화된 항-hPD-1 항체의 양은 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2의 결합을 억제하는데 효과적이며, 예컨대, 대조군에 비해 적어도 20%, 30%, 50%, 80%, 100%, 200%, 400%, 또는 500% 만큼 결합을 억제한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기술된 인간화된 항-hPD-1 항체의 양은 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2의 결합의 길항제 활성을 갖기에 충분하며, 예컨대, 대조군에 비해 적어도 20%, 30%, 50%, 80%, 100%, 200%, 400%, 또는 500%만큼 결합을 억제한다).
암
항체에 의한 PD-1의 차단이 환자에서 암성 세포에 대한 면역 반응을 향상시킬 수 있음이 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 일 양태에서, 본 발명은 유효량의 항-PD1 항체 또는 약학 조성물을, 바람직하게는 PD1/PD-L1 및/또는 PD1/PD-L2 상호작용을 파괴하거나 억제하기 위해 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 암에 걸린 대상체의 치료에서 사용하기 위한 항-PD1 항체 또는 약학 조성물을 제공한다. 따라서, 일 양태에서, 본 발명은 암에 걸린 대상체의 치료에서 사용하기 위한 항-PD-1 항체 또는 약학 조성물을 제공하며, 여기서 - 항-PD-1 항체는 바람직하게는 PD1/PD-L1 및/또는 PD1/PD-L2 상호작용을 파괴 또는 억제함으로써 고갈된 T 세포를 활성화할 수 있다. 일 양태에서, 본 발명은 암에 걸린 대상체의 치료에서 사용하기 위한 항-PD-1 항체 또는 약학 조성물을 제공하며, 여기서 항-PD-1 항체는 바람직하게는 PD1/PD-L1 및/또는 PD1/PD-L2 상호작용을 파괴 또는 억제함으로써 대식세포를 활성화할 수 있다.
일 실시형태에서, 치료를 필요로하는 대상체는 질환, 바람직하게는 PD-1 또는 PD-L1 양성 암, 보다 더 바람직하게는 PD-1 또는 PD-L1이 발현되거나 과발현된 암에 걸렸거나, 걸렸을 것으로 의심되거나, 걸릴 위험이 있는 환자이다. 예컨대, 치료에 적합한 환자는 이러한 환자가 PD-L1 양성 종양 세포를 지녔는지 여부를 조사하여 식별될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 치료에 적합한 대상체는 PD-1을 발현하거나 과발현하는 종양 침윤 T 세포를 가진 대상체이다.
또 다른 실시형태에서, 대상체는 암 발달, 바람직하게는 PD-L1 및/또는 PD-L2 양성 암에 걸렸거나, 걸렸을 것으로 의심되거나, 걸릴 위험이 있는 대상체이다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 인간화된 항-PD-1 항체 또는 약학 조성물은 PD-L1 및/또는 PD-L2 양성 종양을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예컨대, 치료에 적합한 인간 환자는 이러한 환자가 PD-L1 및/또는 PD-L2 양성 암세포를 지녔는지 여부를 조사함으로써 식별될 수 있다.
추가 양태에서, 암, 바람직하게는 PD-L1 및/또는 PD-L2 양성 암, 보다 더 바람직하게는 PD-L1 및/또는 PD-L2가 과발현된 암의 치료에서 사용하기 위한 인간화된 항-hPD1 항체 또는 이의 항체 단편이 제공된다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 바람직하게는 PD-L1, PD-L2 양성 종양 세포를 가진 대상체에서, 암을 치료하기 위한, 예컨대 종양 세포의 성장을 억제하기 위한 약제의 제조에서 본원에 개시된 인간화된 항-hPD-1 항체, 또는 이의 항원-결합 부분, 또는 약학 조성물의 용도를 제공한다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 치료 유효량의 인간화된 항-PD-1 항체, 또는 이의 항원-결합 부분, 또는 약학 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하기 위한, 예컨대 종양 세포의 성장을 억제하기 위한 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 인간화된 항-PD-1 항체를 사용하여 암성 세포의 성장이 억제되는 대상체의 치료에 관한 것이다.
본 개시내용의 양태에서, 치료될 암은 고갈된 T 세포와 관련이 있다.
바람직하게는, "PD-L1 양성 종양 세포" 또는 "PD-L2 양성 종양 세포"는 PD-L1 또는 PD-L2 각각이 종양 세포의 적어도 10%, 바람직하게는 종양 세포의 적어도 20, 30, 40 또는 50%로 발현되는 종양 세포의 집단을 지칭하는 것으로 의도된다.
대안적으로 또는 추가로, 본 발명의 인간화된 항-hPD-1 항체는 또한 PD-1및/또는 PD-L1의 저발현, 및/또는 T 세포, 특히 종양-침윤된 T 세포의 적은 수, 및/또는 고갈된 T 세포의 다수와 관련될 수 있는 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 실제로, 본 발명의 인간화된 항-hPD-1 항체는 놀랍게도 이러한 대식세포에 의해 임의의 세포(PD-1 및/또는 PD-L1을 발현하거나 발현하지 않는 세포)의 식세포 작용을 활성화할 수 있다. 이러한 맥락에서, 환자는 바이러스 예컨대 HIV에 의한 감염, 암, 당뇨병, 영양실조, 및 특정 유전적 장애, 면역억제제 약물을 사용한 치료 또는 면역요법, 화학요법 또는 방사선요법에 의한 이전의 치료로 인해 면역억제되었거나, 면역손상되었거나 면역저하될 수 있다.
따라서, 본 발명의 인간화된 항-hPD-1 항체는 또한 PD-L1 음성 종양 세포가 있는 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
바람직하게는, "PD-L1 음성 종양 세포" 또는 "PD-L2 음성 종양 세포"는 PD-L1 또는 PD-L2가 각각 종양 세포의 10% 미만, 바람직하게는 종양 세포의 5% 미만, 바람직하게는 종양 세포의 1% 미만으로 발현되는 종양 세포의 집단을 지칭하는 것으로 의도된다.
본원에 제공된 항체로 치료될 수 있는 임의의 적합한 암은 조혈암 또는 고형암일 수 있다. 이러한 암은 암종, 자궁경부암, 대장암, 식도암, 위암(gastric cancer), 위장관암, 두경부암, 신장암, 간암, 폐암, 림프종, 신경교종, 중피종, 흑색종, 위암(stomach cancer), 요도암 환경적으로 유도된 암 및 상기 암의 임의의 조합을 포함한다. 본 발명은 또한 전이성 암, 특히 PD-L1을 발현하는 전이성 암의 치료에 유용하다(문헌[Iwai et al. (2005) Int. Immunol. 17: 133-144]). 추가로, 본 발명은 난치성 또는 재발성 악성 종양을 포함한다.
특정 양태에서, 암은 PD-1 및/또는 PD-L1의 높은 발현을 가진 혈액암 또는 고형 종양이다. 이러한 암은 혈액림프 신생물, 혈관면역모세포 T 세포 림프종, 골수형성이상 증후군, 급성 골수성 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
특정 양태에서, 암은 바이러스에 의해 유도되었거나 면역결핍과 관련된 암이다. 이러한 암은 카포시 육종(예컨대, 카포시 육종 헤르페스 바이러스 연관); 자궁경부, 항문, 음경 및 외음부 편평 세포 암 및 구강인두암(예컨대, 인간 유두종 바이러스 관련); 미만성 거대 B-세포 림프종, 버킷 림프종, 형질모세포성 림프종, 원발성 중추 신경계 림프종, HHV-8 원발성 삼출 림프종, 고전적 호지킨 림프종, 및 림프구증식 장애(예컨대, 엡스타인-바 바이러스(EBV) 및/또는 카포시 육종 헤르페스 바이러스 관련)를 포함하는 B 세포 비-호지킨 림프종(NHL); 간세포 암종(예컨대, B형 간염 및/또는 C형 간염 바이러스 관련); 메르켈 세포 암종(예컨대, 메르켈 세포 폴리오마 바이러스(MPV) 관련); 및 인간 면역결핍 바이러스 감염(HIV) 감염 관련 암으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
바람직하게는, 치료되거나 예방되는 암은 전이성 또는 비전이성, 흑색종, 악성 중피종, 비-소세포 폐암, 신세포 암종, 호지킨 림프종, 두경부암, 요로상피세포 암종, 대장암, 간세포 암종, 소세포 폐암 전이성 메르켈 세포 암종, 위 또는 위식도암 및 자궁경부암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
치료에 바람직한 암은 전형적으로 면역요법에 반응성인 암을 포함한다.
예시이며 이론에 의해 구속되기를 원치 않고, 암세포 사멸을 유도하는 항암 항체 또는 항-암 면역접합체 또는 다른 현재 항-암 요법을 사용하는 치료는 PD-1에 의해 매개되는 면역 반응을 강화할 것이다. 따라서, 과다 증식성 질환(예컨대, 암 종양)의 치료는 숙주에 의한 항-종양 면역 반응을 강화할 수 있는, 항-암 치료와 동시에 또는 순차적으로 또는 임의의 이들의 조합과 병용된 인간화된 항-PD-1 항체 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 항-PD-1 항체는 다른 면역원성 제제(예컨대 ADC), 표준 암 치료, 또는 이후 기술되는 다른 항체와 병용하여 사용될 수 있다.
감염성 질환
본 발명의 인간화된 항-PD1 항체 또는 이의 단편 또는 약학 조성물은 특정 독소 또는 병원체에 노출된 환자를 치료하기 위해 사용된다. 따라서, 본 발명의 양태는 대상체에 인간화된 항-PD-1 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 이를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 감염성 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 바람직하게는 이에 따라 대상체는 감염성 질환에 대해 치료된다.
임의의 적합한 감염이 본원에 제공된 인간화된 항-PD1 항체 또는 항체 단편으로 치료될 수 있다.
본 발명의 방법으로 치료될 수 있는 감염을 야기하는 병원성 바이러스의 일부 예는 HIV, 간염(A, B, 또는 C), 헤르페스 바이러스(예컨대, VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II, 및 CMV, 엡스타인 바 바이러스), 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스, 에코바이러스, 리노바이러스, 콕사키 바이러스, 코로나바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 멈프스 바이러스, 로타바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 파보바이러스, 우두 바이러스, HTLV 바이러스, 뎅기 바이러스, 유두종바이러스, 물사마귀 바이러스, 폴리오바이러스, 광견병 바이러스, JC 바이러스 및 아르보바이러스 뇌염 바이러스를 포함한다.
특히, 본 발명의 항-PD1 항체 또는 약학 조성물은 만성 바이러스 감염을 가진 환자를 치료하기 위해 사용되며, 이러한 감염은 레트로바이러스, 아넬로바이러스, 서코바이러스, 헤르페스바이러스, 수두 대상포진 바이러스(VZV), 사이토메갈로바이러스(CMV), 엡스타인-바 바이러스(EBV), 폴리오마바이러스 BK, 폴리오마바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV), 헤르페스 단순 유형 1(HSV-1), 아데노바이러스, 헤르페스 단순 유형 2(HSV-2), 카포시 육종 헤르페스바이러스(KSHV), B형 간염 바이러스(HBV), GB 바이러스 C, 유두종 바이러스, C형 간염 바이러스(HCV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), D형 간염 바이러스(HDV), 인간 T 세포 백혈병 바이러스 유형 1(HTLV1), 이종 뮤린 백혈병 바이러스-관련 바이러스(XMLV), 풍진 바이러스, 독일 홍역, 파보바이러스 B19, 홍역 바이러스, 콕사키 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스에 의해 야기된다.
본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 감염을 야기하는 병원성 박테리아의 일부 예는 클라미디아, 리케차 박테리아, 마이코박테리아, 스타필로코커스, 스트렙토코커스, 슈도모노코커스, 메닌고코커스 및 코노코커스, 클렙시엘라, 프로테우스, 세라티아, 슈도모나스, 리지오넬라, 디프테리아, 살모넬라, 바실러스, 콜레라, 파상풍, 보툴리누스 중독, 탄저균, 페스트, 렙토스피라증, 및 라임병 박테리아를 포함한다.
본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 감염을 야기하는 병원선 진균의 일부 예는 칸디다(알비칸스, 크루세이, 글라브라타, 트로피칼리스 등), 크립토코커스 네오포만스, 아스퍼질러스(푸미가투스, 니게르 등), 뮤코랄레스 속(뮤코, 압시디아, 리조푸스), 스포로트릭스 센키, 블라스토미세스 더마티티디스, 파라콕시디오이디즈 브라질리엔시스. 콕시디오이데스 이미티스 및 히스토플라스마 캡슐라툼을 포함한다.
본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 감염을 야기하는 병원성 기생충의 일부 예는 엔트아메바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica), 발란티디움 콜라이(Balantidium coli), 네글레리아포울레리(Naegleriafowleri), 아칸트아메바(Acanthamoeba) 종, 지아르디아 람비아(Giardia lambia), 크립토스포리디움(Cryptosporidium) 종, 뉴모시스티스 카리니이(Pneumocystis carinii), 플라스모디움 비박스(Plasmodium vivax), 바베시아 미크로티(Babesia microti), 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei), 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi), 리슈마니아 도노바니(Leishmania donovani), 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondi), 및 니포스트롱길루스 브라실리엔시스(Nippostrongylus brasiliensis)를 포함한다.
상기 모든 방법에서, PD-1 차단은 다른 형태의 면역요법, 예컨대 사이토카인 치료(예를 들어, 인터페론, GM-CSF, G-CSF, IL-2), 또는 종양 항원의 향상된 제시를 제공하는 임의의 요법과 병용될 수 있다.
병용 요법
특히, 본 발명에 따른 인간화된 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 임상 개발중이거나 이미 시판중인 제제를 사용하여 면역 회피 메커니즘을 극복하기 위한 일부 다른 잠재적 전략과 병용될 수 있다(문헌[Antonia et al. Immuno-oncology combinations: a review of clinical experience and future prospects. Clin. Cancer Res. Off. J. Am. Assoc. Cancer Res. 20, 6258-6268, 2014]의 표 1 참조). 본 발명에 따른 인간화된 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 이러한 병용은 특히 다음에 대해 유용할 수 있다:
1- 예컨대 항-CTLA4 분자를 사용하여 적응성 면역의 억제 역전(T-세포 체크포인트 경로 차단);
2- 적응성 면역 켜기(작용제 분자, 특히 항체를 사용하여 T-세포 동시자극 수용체 신호전달 촉진);
3- 선천적 면역 세포 기능 향상;
4- 예컨대 백신-기반 전략을 통해 면역계 활성화(면역-세포 이펙터 기능 강화).
따라서, 인간화된 항-PD-1 항체 또는 이의 항체 단편 또는 본원에 기술된 것과 같은 것 및 추가 치료제를 포함하는 약학 조성물을 사용하여 본원에 기술된 임의의 질병을 위한 병용 요법이 또한 본원에서 제공된다. 일 양태에서, 인간화된 항-PD-1 항체 및 추가 치료제는 상기와 같이 약학 조성물에 존재할 수 있다. 대안적으로, 본원에서 사용된 용어 "병용 요법" 또는 "병용된 요법"은 순차적인 방식으로 이러한 제제(예컨대, 본원에 기술된 항-PD-1 항체 및 제2 또는 추가 적합한 치료제)의 투여를 포함하며, 즉, 여기서 각각의 치료제는 상이한 시간에 투여될 뿐만 아니라, 이러한 치료제, 또는 적어도 2개의 제제는 실질적으로 동시에 투여된다. 각 제제의 순차적 또는 실질적으로 동시 투여는 임의의 적합 경로에 의해 영향을 받을 수 있다. 제제는 동일한 경로 또는 상이한 경로로 투여될 수 있다. 예컨대, 제1 제제(예컨대, 항-PD-1 항체)는 경구로 투여될 수 있고, 추가 치료제(예컨대, 항암제, 항감염제; 또는 면역 조절제)는 정맥 내로 투여될 수 있다. 대안적으로, 선택된 병용 제제는 정맥 내 주사로 투여될 수 있는 반면 병용의 다른 제제는 경구로 투여될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 치료 수단, 특히 병용 생성물 수단에 관한 것으로서, 이는 활성 성분으로서 다음을 포함한다: 상기 정의된 바와 같은 인간화된 항-hPD-1 항체 또는 항원 결합 단편 및 추가 및 치료제, 여기서 상기 활성 성분은 별도의, 순차적 또는 병용된 요법, 특히 병용 또는 순차적 용도를 위해 제형화된다.
본원에서 사용된 용어 "순차적"은 달리 명시되지 않는 한, 규칙적인 순서 또는 차례를 특징으로 하는 것을 의미하며, 예컨대, 투여 요법이 인간화된 항-hPD-1 항체 및 추가 또는 제2 제제의 투여를 포함하는 경우, 순차적 투여 요법은 제2 제제의 투여 전에, 이와 동시에, 이와 실질적으로 동시에, 또는 이 이후에 인간화된 항-hPD-1 항체의 투여를 포함할 수 있으나, 두 제제는 규칙적인 순서 또는 차례로 투여될 것이다.
용어 "별도의"는 달리 명시되지 않는 한, 서로를 분리하는 것을 의미한다. 용어 "동시에"는 달리 명시되지 않는 한, 동시에 발생하거나 수행되는 것을 의미하며, 즉, 본 발명의 제제는 동시에 투여된다. 용어 "실질적으로 동시에"는 제제가 서로 수 분 이내에 투여되는 것을 의미하고(예컨대, 서로 15분 이내에) 공동 투여 및 연속 투여를 포함하도록 의도되지만, 투여가 연속적인 경우 짧은 기간(예컨대, 의사가 두 화합물을 별도로 투여하는데 걸리는 시간) 동안에만 시간 상 분리된다.
본원에 기술된 임의의 병용은 본원에 기술된 장애 또는 질환을 치료하기 위한 임의의 순서로 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 본원에 기술된 병용은 표적 질환 진행을 억제 또는 예방하는 효과, 또 다른 제제의 병용의 부작용을 완화하는 효과, 또는 표적 질환과 관련된 증상을 완화하는 효과를 비제한적으로 포함하는 다양한 인자에 기초하여 선택될 수 있다. 예컨대, 본원에 기술된 병용 치료는 각각의 개별 구성원과 관련된 임의의 부작용을 감소시킬 수 있다.
본 발명은 또한 상기 대상체에 치료 유효량의 본원에 기술된 인간화된 항-hPD-1 항체 또는 약학 조성물 및 치료 유효량의 추가 치료제를 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 질환의 치료 방법에 관한 것이다.
본원에 기술된 인간화된 항-hPD-1 항체 또는 약학 조성물이 추가 치료제와 공동-사용되는 경우, 조성물 또는 제2 치료제의 치료-이하 투여량, 또는 둘 모두의 치료-이하 투여량이 대상체, 바람직하게는, PD-1에 의해 매개되는 세포 신호전달과 관련된 질환 또는 장애의 발달을 가졌거나 발달될 위험이 있는 대상체의 치료에서 사용될 수 있다. 일 양태에서, 추가 치료제는 알킬화제, 신혈관생성 억제제, 항체, 특히 항-종양 표적화 항체, 항대사물질, 항유사분열제, 항증식제, 항바이러스제, 오로라 키나제 억제제, 아폽토시스 촉진제(예컨대, Bcl-2 패밀리 억제제), 사멸 수용체 경로 활성화제, Bcr-Abl 키나제 억제제, BiTE(이-특이적 T 세포 관여체) 항체, 항체 약물 접합체, 생물학적 반응 변형제, 브루톤 티로신 키나제(BTK) 억제제, 사이클린-의존적 키나제 억제제, 세포 사이클 억제제, 사이클로옥시게나제-2 억제제, DVD, 백혈병 바이러스 종양 유전자 동족체(ErbB2) 수용체 억제제, 성장 인자 억제제, 열 충격 단백질(HSP)-90 억제제, 히스톤 디아세틸라제(HDAC) 억제제, 호르몬 요법, 면역학적 제제, 아폽토시스 단백질의 억제제(IAP)의 억제제, 인터칼레이팅 항생제, 키나제 억제제, 키네신 억제제, Jak2 억제제, 라파마이신 억제제의 포유류 표적, 마이크로RNA, 미토젠-활성화된 세포 외 신호-조절된 키나제 억제제, 다가 결합 단백질, 비-스테로이드성 항-염증 약물(NSAID), 폴리 ADP(아데노신 디포스페이트)-리보스 폴리머라제(PARP) 억제제, 백금 화학요법제, 폴로-유사 키나제(Plk) 억제제, 포스포이노시티드-3 키나제(PI3K) 억제제, 프로테아좀 억제제, 퓨린 유사체, 피리미딘 유사체, 수용체 티로신 키나제 억제제, 레티노이드/델토이드 식물 알칼로이드, 소간섭 리보핵산(siRNA), 토포이소머라제 억제제, 유비퀴틴 리가제 억제제, 저메틸화제, 체크포인트 억제제, 펩티드 백신 등, 종양 항원 유래의 에피토프 또는 네오에피토프, 및 이러한 제제들의 하나 이상의 조합을 포함하는 비-제한적인 목록에서 선택될 수 있다.
예컨대, 추가 치료제는 화학요법, 방사선요법, 표적화 요법, 항-종양 표적화 항체, 항신생물제, 저메틸화제, 암 백신, 종양 항원 유래의 에피토프 또는 네오에피토프, 골수성 체크포인트 억제제, 기타 면역요법, 및 HDAC 억제제로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 추가 치료제는 화학요법제, 방사선요법제, 면역요법제, 세포 요법제(예컨대 CAR-T 세포), 항생제 및 프로바이오틱스로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 면역요법제는 또한 특히 항-Her2, 항-EGFR, 항-CD20, 항-CD19 및 항-CD52로 이루어진 군으로부터 선택되는, 종양 항원을 표적으로 하는 항체일 수 있다. 상기 항체는 종양 세포를 표적으로 하는 세포독성 항체 또는 종양 세포에 대해 면역 세포(예컨대 NK 세포, T 세포 또는 대식세포)의 세포용해 활성을 유도하는 항체일 수 있다. 이러한 항체의 비제한적인 목록은 리툭시맙, 퍼투주맙, 알렘투주맙, 아테졸리주맙, 베바시주맙, 세툭시맙, 허셉틴, 파니투무맙, 네시투무맙, 디누툭시맙, 라무시루맙, 올라라투맙, 이필리무맙, 세미플리맙, 트레멜리무맙, CS1001, 렐라틀리맙, 낙시타맙, 마게툭시맙, BAT8001, KN035, 이사툭시맙, 안데칼릭시맙, 베마리투주맙, 트라스투주맙, 항-PD1 항체, 항-PDL-1, 항-CD47 항체, 및 항-SIRPa 항체를 포함한다. 매우 특정한 양태에서, 본 발명의 항-PD-1 항체는 리툭시맙과 병용하여 사용된다.
일 실시형태에서, 본 발명은 상기 정의된 병용 요법에 관한 것이며, 여기서 추가 치료제는 특히 치료 백신, 면역 체크포인트 차단제 또는 활성화제, 특히 적응 면역 세포(T 및 B 림프구) 및 항체-약물 접합체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 인간화된 항-hPD-1 항체 또는 이의 단편과 함께 또는 약학 조성물과 함께 동시-사용하기에 적합한 제제는 동시-자극 수용체(예컨대, OX40, CD40, ICOS, CD27, HVEM 또는 GITR)에 결합하는 항체, 면역원성 세포 사멸을 유도하는 제제(예컨대, 화학요법제, 방사선-요법제, 항-신생혈관제, 또는 표적화 요법용 제제), 체크포인트 분자(예컨대, CTLA4, LAG3, TIM3, B7H3, B7H4, BTLA, 또는 TIGIT)를 억제하는 제제, 암 백신, 면역억제 효소(예컨대, IDO1 또는 iNOS)를 변형하는 제제, Treg 세포를 표적화하는 제제, 적응 세포 요법용 제제, 또는 골수성 세포를 조절하는 제제를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 병용 요법에 관한 것으로서, 여기서 제2 치료제는 항-CTLA4, 항-CD2, 항-CD28, 항-CD40, 항-HVEM, 항-BTLA, 항-CD160, 항-TIGIT, 항-TIM-1/3, 항-LAG-3, 항-2B4, 및 항-OX40, 항-CD40 작용제, CD40-L, TLR 작용제, 항-ICOS, ICOS-L 및 B-세포 수용체 작용제로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 체크포인트 차단제 또는 적응 면역 세포(T 및 B 림프구)의 활성화제이다.
일 실시형태에서, 추가 또는 제2 치료제는 특히 항-Her2, 항-EGFR, 항-CD20, 항-CD19 및 항-CD52로 이루어진 군으로부터 선택되는, 종양 항원을 표적으로 하는 항체이다.
제2 치료제의 특정 예가 국제공개 WO 2018/053106호, 페이지 36 내지 43에 제공되어 있으며, 이의 개시내용은 본원에 인용되어 포함된다.
병용 요법은 또한 수술, 화학요법(예컨대 도세탁셀 또는 디카바진과 같은 것), 방사선요법, 면역요법(예컨대 CD40, CTLA-4를 표적화하는 항체와 같은 것), 유전자 표적화 및 조절 및/또는 기타 제제 예컨대 면역-조절제, 신혈관생성 억제제 및 이들의 임의의 조합과 함께 인간화된 항-PD1 항체 또는 이의 항체 단편의 투여의 병용에 의존할 수 있다.
진단 용도
특정 실시형태에서, 본원에 제공된 항-PD1 항체는 생물학적 샘플에서 PD1의 존재를 검출하는데 유용하다. 본원에서 사용된 용어 "검출"은 정량적 또는 정성적 검출을 포함한다. 특정 실시형태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직, 예컨대 면역 세포 또는 T 세포 침윤물을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 또한 진단의 시험관 내 또는 생체 외 방법, 특히 개인화된 의학에서 보다 특히 동반 진단에서 사용하기에 적합한 진단 방법에 관한 것으로서, 여기서 인간화된 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바람직하게는 대상체에서 이전에 수득된 샘플에서 PD-1 양성 세포의 검출을 위해 그리고 선택적으로 PD-1의 발현의 졍량화를 위해 사용된다.
본 발명은 또한 샘플에서 인간 PD-1 항원의 존재를 검출하거나, 인간 PD-1 항원의 양을 측정하는 방법을 제공하며, 이는 상기 샘플, 및 대조군 샘플을 항체 또는 이의 일부와 인간 PD-1 사이에 착화물을 형성할 수 있는 조건 하에 본 발명에 따른 인간화된 항-PD1 항체와 접촉하는 단계를 포함한다. 이어서 착화물의 형성이 검출되며, 여기서 대조군 샘플과 비교하여 샘플 사이의 상이한 착화물 형성은 샘플에서 인간 PD-1 항원의 존재를 나타낸다. 이러한 방법은 시험관 내 또는 생체 내 방법일 수 있다. 항체는 상기된 바와 같은 적합한 검출될 수 있는 모이어티를 포함하는 면역접합체일 수 있다. 이러한 분석은, 예컨대, 암과 같은 질병의 존재 및/또는 진화를 평가하는데 유용할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 또한 방법에서 본 발명의 인간화된 항-인간 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 특히 시험관 내 또는 생체 외 용도에 관한 것이며, 여기서 PD-1은 대상체, 특히 암 대상체에서 치료에 대한 반응을 예측하는 바이오마커로서 사용된다.
일 양태에서, 본 발명은 또한 특히, 본 발명의 인간화된 항-인간 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용하여 치료할 암 대상체의 반응을 예측하는 시험관 내 또는 생체 외 방법에 관한 것으로서, 다음의 단계를 포함한다:
- 바람직하게는 검출가능한 모이어티와 연결된 본 발명의 인간화된 항-인간 PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용하여, 바람직하게는 대상체로부터 이전에 수득된, 종양 샘플에서 PD-1의 발현 수준을 결정하는 단계, 및
- PD-1의 발현 수준을 비-반응 대상체 집단에서 PD-1의 발현 수준을 나타내는 값과 비교하는 단계.
여기서 대상체의 종양 샘플에서 PD-1의 더 높은 발현 수준은 치료, 바람직하게는 인간화된 항-PD1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 이를 포함하는 약학 조성물을 사용하는 항암 치료에 대해 반응할 대상체의 지표이다.
본 발명은 또한 진단 방법을 제공하며, 예컨대 PD-1이 환자 선별용 바이오마커인 경우, 또는 PD-1이 과발현된 경우, 여기서 인간화된 항-PD1 항체 또는 이의 단편은 인간화된 항-PD1 항체를 사용하는 요법에 적격한 대상체를 선별하는데 사용된다.
키트
본원에 기술된 임의의 항체 또는 조성물은 본 발명에 의해 제공되는 키트에 포함될 수 있다. 본 개시내용은 또한 PD-1 신호전달과 관련된 면역 반응의 향상 및/또는 질환(예컨대 암 및 바이러스 질환) 치료에서 사용하기 위한 키트를 제공한다.
특히, 본 발명에 따른 키트는 다음을 포함할 수 있다:
- 본원에 기술된 항-hPD1 항체 또는 이의 항원-결합 단편,
- 상기 항체를 코딩하는 핵산 분자 또는 핵산 분자의 군,
- 상기 핵산 분자 또는 핵산 분자의 군을 포함하는 벡터, 및/또는
- 상기 벡터, 핵산 분자 또는 핵산 분자의 군을 포함하는 세포.
본 발명의 맥락에서, 용어 "키트"는 용기, 수여체(recipient) 또는 다른 것에 포장된 2개 이상의 구성성분(이 중 하나는 본 발명의 인간화된 항-hPD-1 항체 분자, 핵산 분자, 벡터 또는 세포에 해당함)을 의미한다. 따라서 키트는, 적합한 용기 수단 안에, 인간화된 항-PD1 항체, 및/또는 본 발명의 숙주 세포, 및/또는 본 발명의 핵산 분자 또는 핵산 분자의 군을 코딩하는 벡터, 및/또는 핵산 분자 또는 핵산 분자의 군 또는 본 발명의 시약과 관련된 것을 포함할 수 있다. 따라서 키트는 단일 단위로 판매될 수 있는 특정 목표를 달성하기에 충분한 제품 및/또는 도구 세트로 기술될 수 있다.
일부 실시형태에서, 개인으로부터 샘플을 채취하고/하거나 샘플을 분석하는 수단이 제공될 수 있다. 특정 실시형태에서 키트는 세포, 완충제, 세포 배지, 벡터, 프라이머, 제한 효소, 염 등을 포함한다. 키트는 또한 멸균의, 약학적으로 허용되는 완충제 및/또는 다른 희석제를 함유하기 위한 수단을 포함할 수 있다.
용기는 단위 용량, 벌크 포장(예컨대, 다중-용량 포장) 또는 하위-단위 용량일 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명은 단일-투여량 투여 단위에 대해 상기 정의된 바와 같은 키트에 관한 것이다. 본 발명의 키트는 또한 건조/동결건조된 항체를 포함하는 제1 수여체 및 수성 제형을 포함하는 제2 수여체를 함유할 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 단일-챔버 및 다중-챔버의 사전 충진된 주사기(예컨대, 액체 주사기 및 라이오시린지)를 함유하는 키트가 제공된다.
본 발명의 키트는 적합하게 포장되어 있다. 적합한 포장은 비제한적으로 바이알, 병, 자(jar), 가요성 포장(예컨대, 밀봉된 마일라 또는 플라스틱 백), 등을 포함한다. 특정 장치, 예컨대 흡입기, 비강 투여 장치(예컨대, 분무기) 또는 미니 펌프와 같은 주입 장치와 병용하여 사용하기 위한 포장이 또한 고려된다. 키트는 멸균 접근 포트가 있을 수 있다(예컨대, 용기는 정맥 내 용액 백 또는 피하 주사 바늘로 관통할 수 있는 마개가 있는 바이알일 수 있다). 조성물 중 적어도 하나의 활성제는 본원에 기술된 인간화된 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
본 발명에 따른 키트에 포함된 조성물은 또한 주사기 호환 조성물로 제형화될 수 있다. 이러한 경우, 용기 수단은 그 자체가 주사기, 파이펫, 및/또는 기타 유사한 기구일 수 있으며, 이로부터 제형은 신체의 감염된 부위에 적용될 수 있고/있거나, 심지어는 키트의 다른 성분에 적용되고/되거나 이와 함께 혼합될 수 있다. 키트의 구성성분은 대안적으로 건조 분말(들)로서 제공될 수 있다. 시약 및/또는 구성성분이 건조 분말로 제공되는 경우, 가용성 조성물이 적합한 용매의 첨가에 의해 재구성될 수 있다. 용매가 또한 또 다른 용기 수단에 제공될 수 있고 투여에 적합할 수 있음이 고려된다.
일부 실시형태에서, 키트는 암 또는 감염성 질환의 치료를 위한 추가 제제를 추가로 포함하며, 추가 제제는 인간화된 항-PD1 항체, 또는 본 발명의 키트의 다른 성분과 조합될 수 있거나 키트에 별도로 제공될 수 있다. 특히, 본원에 기술된 키트는 하나 이상의 추가 치료제 예컨대 상기 "병용 요법"에 기술된 것들을 포함할 수 있다. 키트(들)는 개인을 위한 특정 암에 맞춰질 수 있고 전술된 바와 같이 개인을 위한 각각의 제2 암 요법을 포함할 수 있다.
본원에 기술된 항체 분자 또는 약학 조성물의 사용과 관련된 지침은 일반적으로 투여량, 투약 일정, 목적된 치료를 위한 투여 경로, 항체의 재구성 수단 및/또는 본 발명의 항체의 희석 수단에 대한 정보를 포함한다. 본 발명의 키트에 공급된 지침은 전형적으로 라벨 또는 패키지 삽입물(예컨대 전단지 또는 지침 매뉴얼의 형태로 키트에 포함된 종이 시트)에 작성된 지침이다. 일부 실시형태에서, 키트는 본원에 기술된 임의의 방법에 따른 사용 지침을 포함할 수 있다. 포함된 지침은 본원에 기술된 바와 같이 면역 반응을 향상시키고/시키거나 질환을 치료하기 위한 항체를 포함하는 약학 조성물의 투여에 대한 설명을 포함할 수 있다. 키트는 또한 개체가 PD-1 신호전달과 관련된 질환, 예컨대 본원에 기술된 것들을 가졌는지 여부를 식별하는것에 기초한 치료에 적합한 개인을 선별하는 설명을 포함할 수 있다.
실시예
다음의 도면 및 실시예는 당업자에게 본 발명을 제조하고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위해 제시된 것이며, 본 발명자들이 자신의 발명으로 간주하는 범위를 제한하기 위한 것이 아니며 아래의 실험이 모두 또는 수행된 유일한 실험임을 나타내기 위한 것도 아니다. 본 발명이 이의 특정 실시예를 참조하여 기술되었지만, 본 발명의 진정한 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변경이 이루어질 수 있고 등가물이 대체될 수 있음을 당업자는 이해해야 한다. 또한, 본 발명의 목적, 사상 및 범위에 특정 상황, 물질, 물질의 조성, 공정, 공정 단계 또는 단계들을 적용하기 위해 많은 수정이 이루어질 수 있다. 그러한 모든 변형은 본원에 첨부된 청구범위의 범주 내에있는 것으로 의도된다.
실시예 1: 인간 생식세포(인간 프레임워크)를 사용한 CDR-이식
항체를 인간화 하기 위한 첫 번째 단계는 마우스 항 PD-1 CDR 영역을 인간 생식세포로 이식하는 것이었다. 3개의 중쇄 인간 생식세포(IGHV7-4-1*02, IGHV1-46*01, IGHV3-20*01) 및 경쇄에 대한 2개의 생식세포(IGKV2-30*02, IGKV3-11*01)를 시험하였다. 표 1에 나타난 바와 같이, 생식세포 IGHV7-4-1*02 중쇄 및 IGKV2-30*02는 가장 높은 인간화%를 가졌으며, 이는 항체를 인간화로 적격화하는데 요구되는 85%보다 우수한 것이다.
| CDR-이식 | IMGT 인간 생식세포 | 가변 영역 인간화 % |
| 중쇄 | IGHV7-4-1 | 89.8 |
| IGHV1-46*01 | 79.6 | |
| IGHV3-20*01 | 82.7 | |
| 경쇄 | IGKV2-30*02 | 89 |
| IGKV3-11*01 | 80 |
표 1 :컷오프 인간 데이터베이스를 사용하여 결정된 T20 인간화 점수
http://abAnalyzer.lakepharma.com: 일반적으로, 85 컷오프 초과의 점수를 받은 전장 서열은 인간과 유사한 것으로 간주된다.
중쇄 및 경쇄를 부착성 COS 세포에 일시적으로 공동-형질감염시켰다. 샌드위치 ELISA(검출을 위해 당나귀 항 인간 Fc 항체를 고정시키고 마우스 항 인간 카파 + 염소 항 마우스 항체와 접합된 퍼옥시다제를 사용하여 발현을 평가하였음)를 사용하여 COS 세포의 상등액에서 항체 농도를 평가하였다. 인간 IvIgG 표준을 사용하여 농도를 계산하였다(ng/ml 단위). 표 2에 나타난 바와 같이, 생식세포 IGHV7-4-1과 IGKV2-30*02(가장 높은 인간화%를 가진 조합)에 대해 COS 세포에서 우수한 생산성을 수득한 반면, 생식세포 IGHV3-20*01과 IGKV3-11*01의 조합은 인간화된 항-PD-1 항체의 생산성을 상당히 감소하였다. 또한, 다른 조합도 또한 우수한 생산성을 나타내는 것을 확인할 수 있다.
| (ng/ml) |
VH
키메라 wt |
VH
IGHV7-4-1 |
VH
IGHV1-46*01 |
VH
IGHV3-20*01 |
| VL 키메라 wt | 3459.4 | 1377.2 | 1400.9 | 586.7 |
| VL IGKV2-30*02 | 2459.4 | 1959.0 | 2743.2 | 1888.7 |
| VL IGKV3-11*01 | 3166.0 | 1713.4 | 2368.7 | 735.0 |
표 2 : COS 포유류 세포의 상등액에서 생산된 항-PD1 항체의 농도. 인간화된 항-PD1 변이체 항체의 결합 분석을 ELISA에 의해 인간 PD1 단백질 상에서 수행하였다. 재조합 hPD1(Sino Biologicals, Beijing, China; 참조 10377-H08H)을 카보네이트 완충액(pH9.2)에서 0.5 μg/ml로 플라스틱에 고정시키고 COS 세포의 상등액을 여러 농도로 첨가하여 결합 효능을 측정하였다. 인큐베이션 및 세척 후, 퍼옥시다제-표지된 당나귀 항-인간 IgG(Jackson Immunoresearch; USA; 참조 709-035-149)를 첨가하고 통상적인 방법으로 밝혀냈다.
| ED50 (ng/ml) |
VH
키메라 wt |
VH
IGHV7-4-1 |
VH
IGHV1-46*01 |
VH
IGHV3-20*01 |
| VL 키메라 wt | 6.9 | 7.9 | 6.3 | 9.0 |
| VL IGKV2-30*02 | 8.5 | 8.2 | 6.7 | 7.0 |
| VL IGKV3-11*01 | 7.4 | 6.4 | 5.1 | 5.7 |
표 3 : ED50 측정은 각 인간화된 항-PD1 변이체 항체에 대해 이러한 분석에서 신호의 50%에 도달하는데 필요한 농도를 지칭한다. COS 세포에 의해 생산된 비정제 항 PD-1 항체를 본 실험에 대해 사용하였다.
모든 CDR-이식된 생식세포는 키메라 항체(VHwt+VLwt)와 비교하여 PD-1에 대한 유사한 결합을 가지며, 이는 PD-1 항체의 생물학적 특성을 검증해준다(표 3). (1) 각각 89.8% 및 89%의 높은 인간화% (2) 항체의 본래 서열이 비해 더 높은 상보성 서열, (3) 보존된 시험관 내 생물학적 활성 및 (4) 포유류 세포에서 우수한 생산성으로 인해 IGHV7-4-1 프레임워크와 IGKV2-30*02 프레임워크가 있는 VL-CDR을 모두 선택하였다.
인간화의 두 번째 단계는 인간화%를 증가시키고 제조 공정에서 항체를 불안정화할 수 있는 중쇄 및 경쇄에서 탈아미노화 또는 글리코실화 부위를 제거하기 위해 마우스-유도된 CDR 서열을 돌연변이시키는 것으로 구성하였다. 표 4에 열거된 여러 돌연변이된 서열을 생성하였고 이의 생산 및 생물학적 활성을 시험하였다. 경쇄 서열을 또한 제조 공정에서 생산물 안정성을 손상시킬 수 있는 CDR1("NG" 서열)에 글리코실화 부위를 제공하였다. 이러한 글리코실화 부위를 제거하기 위해, G29 아미노산을 "LD" 사슬로 이어지는 T 아미노산으로 치환하였다(아미노산 위치는 Kabat 번호매김으로 결정되며, 서열번호37의 G34에 해당한다). HCLD 항체는 우수한 후보이지만 중쇄의 CDR3 영역에서 탈아미노화 부위(DS 서열)를 제공한다. 이러한 서열은 제조 공정에서 생산물 안정성을 손상시킬 수 있다. 이러한 DS 서열을 제거하기 위해, 본 발명자들은 D105 또는 S106 아미노산을 치환하여 대체 서열 HE, HG, HH, HI, HJ, HK, HL을 생성하였다.
| Seq ID | 명칭 | 아미노산 서열 |
| 29 | HC | QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTHYAMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGEPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREREPGM DS WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| 30 | HE | QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTHYAMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGEPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREREPGM DT WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| 31 | HG | QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTHYAMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGEPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREREPGM ES WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| 32 | HH | QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTHYAMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGEPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREREPGM DH WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| 33 | HI | QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTHYAMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGEPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREREPGM DA WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| 34 | HJ | QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTHYAMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGEPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREREPGM DY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| 35 | HK | QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTHYAMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGEPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREREPGM DN WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| 36 | HL | QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTHYAMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGEPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREREPGM DE WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| 37 | LC | DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHA NG NTYLEWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGTHVPNTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
| 38 | LD | DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHA NT NTYLEWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGTHVPNTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
표 4 : 아래 실시예에서 사용된 인간화된 항-PD1 변이체의 아미노산 서열.
실시예 2: Blitz, ELISA 및 유세포 분석(Flow cytometry)에 의한 인간 PD1 단백질에 대한 인간화된 항-PD1 변이체 항체의 결합 분석.
재조합 hPD1(Sino Biologicals, Beijing, China; 참조 10377-H08H)을 카보네이트 완충액(pH9.2)에서 0.5 μg/ml로 플라스틱에 고정시키고 정제된 항체를 첨가하여 결합을 측정하였다. 인큐베이션 및 세척 후, 퍼옥시다제-표지된 당나귀 항-인간 IgG(Jackson Immunoresearch; USA; 참조 709-035-149)를 첨가하고 통상적인 방법으로 밝혀냈다.
| ED50 ng/ml | |
| 키메라 | 16.79 |
| HCLD | 12.66 |
| HELD | 19.23 |
| HGLD | 14.75 |
| HHLD | 16.39 |
| HILD | 11.55 |
| HJLD | 13.44 |
| HKLD | 11.42 |
| HLLD | 16.58 |
표 5 : 도 1a의 ED50 측정은 각 인간화된 항-PD1 변이체 항체에 대해 이러한 분석에서 신호의 50%에 도달하는데 필요한 농도를 지칭한다. HEK 세포에 의해 생산된 정제된 항 PD-1 항체를 본 실험에 대해 사용하였다.
| KD (nM) | Ka (1/Ms) | Kd (1/s) | |
| 키메라 | 1.29 | 2.26e5 | 2.91e-4 |
| HCLD | 1.34 | 3.19e5 | 4.29e-4 |
| HELD | 1.14 | 4.43e5 | 5.07e-4 |
| HGLD | 1.28 | 2.74e5 | 3.52e-4 |
| HHLD | 0.84 | 4.05e5 | 3.43e-4 |
| HILD | 0.93 | 4.58e5 | 4.27e-4 |
| HJLD | 1.05 | 4.1e5 | 4.32e-4 |
| HKLD | 0.75 | 3.51e5 | 2.62e-4 |
| HLLD | 1.25 | 4.41e5 | 5.54e-4 |
표 6 : Blitz에 의해 측정된 항-PD1 항체의 인간 PD1 재조합 단백질에 대한 결합력 분석.
| Ab | KD (M) | Ka (1/Ms) | Kd (1/s) |
| 키메라 | 1.01E-9 | 2.43E5 | 2.45E-4 |
| HKLD | 4.1E-9 | 3.24E5 | 0.05137 |
| 키트루다 임상 | 4.42e-9 | 4.5e5 | 0.00428 |
표 7 : Biacore에 의해 측정된 항-PD1 항체의 인간 PD1 재조합 단백질에 대한 친화도 분석.
| pM | |
| HGLD | 1543.68523 |
| HHLD | 133.273506 |
| HILD | 118.262072 |
| HJLD | 241.404054 |
| HKLD | 187.312713 |
| HLLD | 223.473437 |
| HELD | 401.699408 |
| HCLD | 278.261503 |
| 키메라 | 611.914193 |
표 8 : 도 1c의 ED50 측정은 각 인간화된 항-PD1 변이체 항체에 대해 이러한 분석에서 신호의 50%에 도달하는데 필요한 농도를 나타낸다.
| 명칭 | 서열번호 | T20 |
| VH_컨센서스 | 17 | 90.86 |
| HC | 18 | 91.28 |
| HE | 19 | 91.06 |
| HG | 20 | 90.3 |
| HH | 21 | 90.94 |
| HI | 22 | 91.06 |
| HJ | 23 | 91.2 |
| HK | 24 | 91.07 |
| HL | 25 | 91.28 |
| VL_컨센서스 | 26 | 89.5 |
| LC | 27 | 89.55 |
| LD | 28 | 88.7 |
표 9 : 컷오프 인간 데이터베이스를 사용하여 측정된 T20 인간화%: http://abAnalyzer.lakepharma.com: 일반적으로, 점수가 85 초과인 전장 서열은 인간과 유사한 항체로 간주된다.
| T20 점수 | VH | VL |
| 키트루다 | 75.7 | 82.7 |
| HKLD | 91.07 | 88.7 |
표 10 : 컷오프 인간 데이터베이스를 사용하여 측정된 T20 인간화%: http://abAnalyzer.lakepharma.com: 일반적으로, 점수가 85 초과인 전장 서열은 인간과 유사 것으로 간주된다.
결과: 마우스 항-인간PD1 항체(본원에서 키메라 항체로 지칭됨)의 인간화 단계 후, 몇몇 인간화된 항-PD1 변이체 항체를 키메라 항체와 비교하여 인간 PD1(재조합 단백질 및 세포 표면 발현된 PD1)에 대한 우수한 결합 능력에 대해 선별하였다. 도 1a 및 표 5는 항체 HKLD가 변이체 항체 중에서도 가장 우수한 결합 활성을 가지며 키메라 항체에 비해 개선된 결합을 가짐을 상이한 방법에 의해 보여준다. 도 1b는 항체가 LC 경쇄 변이체와 조합되는 경우 인간 세포에서 유사한 결합 능력을 확인한다. 표 6에 제시된 결합력 측정은 HKLD가 변이체 항체 중에서도 가장 우수한 KD 및 키메라 항체에 비해 개선된 KD를 나타냄을 나타낸다. 표 7은 키메라, HKLD 및 임상적으로 승인된 항-PD-1 항체인 키트루다와 같은 다른 PD1 항체의 PD1에 대한 친화도 측정을 비교하며, 변이체 HKLD가 키트루다와 비교하여 유사한 친화도를 가짐을 보여준다. 이러한 실험에서 항체의 친화도는 고정화된 PD-1 및 가용성 항체를 사용한 Blitz 실험과 대조적으로, 항-Fc 항체를 고정하여 항체의 친화도를 측정하여 PD-1 항체의 1가의 친화도를 측정할 수 있었다. 항 PD-1 변이체 항체의 친화도는 PD-1 단백질에 대해 유사한 친화도/결합력을 나타냈지만, 세포-기반 시스템에서, 본 발명자들은, 놀랍게도, 도 1c 및 표 8에 나타난 바와 같이, HKLD가 항체의 키메라 형태와 비교하여 더 우수한 PD-1+ T 세포에 결합함을 관찰하였다. 반면, HGLD 변이체는 항 PD-1 키메라 형태와 비교하여 결합 능력을 잃는다. HGLD 외에, 본 발명자들은 또한 인간화 과정 동안 일부 돌연변이가 PD1 결합 능력의 손실을 유도함을 보여주었다. 도 2(a 내지 e)는 중쇄 가변 도메인의 Kabat 방법 96 및 97에 의해 번호가 매겨진 아미노산 및 경쇄 가변 도메인의 28, 34, 94로 Kabat 번호가 매겨진 아미노산이 PD1 결합 능력에 중요하며 따라서 돌연변이되어서는 안됨을 보여준다. 표 9는 중쇄 및 경쇄의 각각 선택된 가변 도메인에 대한 인간화 정도(T20 인간화 점수)를 나타낸다. T20 결정은 선택된 변이체 항체의 각 가변 영역에 대한 매우 강한 인간화 점수, 특히 88 내지 91.28%를 나타낸다. 표 10은 인간화된 항 PD-1(HKLD 변이체)의 T20 점수가 이전에 기술되고 임상적으로 승인된 항 PD-1 서열인 표준 키트루다에 비해 더 우수함을 보여준다(중쇄 75.7 대 91.07% 및 경쇄 82.7 대 88.7%).
실시예 3: 포유류 COS 및 CHO 세포에서 일시적 형질감염 후 항체 생산성
중쇄 및 경쇄를 부착성 COS 세포 또는 CHO 세포에 일시적으로 공동-형질감염시켰다. 항체의 농도를 샌드위치 ELISA(염소 항 마우스 항체에 접합된 마우스 항 인간 카파 + 퍼옥시다제로 검출 및 발현을 위한 고정화된 당나귀 항 인간 Fc 항체)를 사용하여 COS 및 CHO 세포의 상등액에서 평가하였다. 인간 IvIgG 표준으로 농도를 측정하였다. 수집된 배양액 상등액 1 리터 당 정제된 항체의 양으로서 생산성을 계산하였다.
| 생산 CHO (mg/L) | 생산 COS (mg/L) | |
| 키메라 | 4.6 | 1.67 |
| HCLD | 9.58 | 7.21 |
| HELD | 11.71 | 4.03 |
| HGLD | 12.15 | 6.91 |
| HHLD | 12.80 | 4.48 |
| HILD | 11.41 | 5.81 |
| HJLD | 12.67 | 5.80 |
| HKLD | 14.08 | 6.35 |
| HLLD | 14.35 | 4.85 |
표 11 : 포유류 세포(COS 및 CHO)에서 생산될 때 높은 생산성 수율. 키메라 항체에 비해 인간화된 형태의 항체의 더 높은 생산성.
| 0일차 | 37℃에서 인큐베이션한 후 7일차 | |||
| 단량체 형태 % | 응집체 % | 단량체 형태 % | 응집체 % | |
| HCLC | 94.8 | 2.5 | 96.1 | 1.1 |
| HCLD | 91.4 | 6.6 | 90.5 | 7 |
| HELC | 98.7 | 1.3 | 98.8 | 1.2 |
| HELD | 97.2 | 2.1 | 96.4 | 2.4 |
| HGLD | 97.45 | 2.55 | 96.57 | 3.43 |
| HHLD | 97.32 | 2.68 | 97.82 | 2.18 |
| HILD | 96.16 | 3.84 | 96.14 | 3.86 |
| HJLD | 97.74 | 2.26 | 98.28 | 1.72 |
| HKLD | 96.9 | 3.1 | 97.12 | 2.88 |
| HLLD | 96.98 | 3.02 | 96.73 | 3.27 |
표 12 : 7일 동안 37℃에서 배양한 후 항 PD-1 항체의 안정성. 배제 확산 크로마토그래피로부터 단량체 형태 및 응집체의 %를 평가하였다. 0일차는 이러한 실험에서 양성 대조군으로서 사용된다.
결과: 상이한 변이체가 포유류 세포 예컨대 CHO 또는 COS에서 생산되었으며 표 11에 제시된 결과는 두 세포 유형 모두에서 인간화된 항-PD1 변이체 항체가 키메라 항체에 비해 더 우수한 생산성 수율(mg/L)을 가지고 있다는 놀라운 방식을 보여준다. HKLD는 최고 생산성 수율을 나타낸다. CHO 세포에서, 이러한 항체의 생산성 수율은 COS 세포에서 3배, 거의 4배 증가한다. 동시에, 분자의 안정성은 표 12에 나타난 바와 같이 시험관 내에서 평가하였으며, 모든 변이체가 낮은 응집체와 함께 4℃ 및 37℃에서 우수한 안정성을 나타낸다. 이러한 결과는 본 발명의 인간화된 항-PD1 항체가 임상 개발 및 치료 적용의 다음 단계에 매우 중요한 매우 우수한 제조가능성을 제공함을 나타낸다.
CHO 세포 생산 방법을 사용한 두 번째 실험에서, HKLD 변이체의 생산성을 키트루다 및 키메라 항 PD-1 항체의 생산성과 비교하였다. 도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명자들은 키메라 및 키트루다 백본에 비해 HKLD 변이체로 생산성이 증가하는 것을 관찰하였다. 이러한 시험에서, 생산성은 소규모(12-웰 플레이트, 부착성 세포에서 일시적 형질감염) 및 생물반응기(최적화되지 않은 유가식 CHO 세포 생산)에서 시험하였다. HKLD 변이체에 대해 2 g/L의 높은 수율을 수득하였으며, 대규모 생산 공정에서 항체의 높은 생산성을 확인하였다.
실시예 4: PD-PDL1 및 PD1-PDL2 상호작용에 대한 인간화된 항-PD1 변이체 항체의 길항제 활성을 측정하기 위한 경쟁 분석:
| KD (nM) | Ka (1/Ms) | Kd (1/s) | |
| 항체 없음 | 1.83 e-7 | 3.68 E4 | 6.71 E-3 |
| HCLD | 7.15 E-3 | 10.1 | 7.2 E-2 |
| HELD | 5.91 E-3 | 14.9 | 1.04 E4 |
| HGLD | 9.8 E-3 | 28.3 | 5.34 E-2 |
| HHLD | 8.54 E-3 | 112.2 | 1.04E-1 |
| HILD | 1.12 E-3 | 790 | 88.8E-1 |
| HJLD | 2.79 E-3 | 65.4 | 5.67 E4 |
| HKLD | 4.59 E-3 | 18.8 | 8.62 E-2 |
| HLLD | 2.15 E-3 | 99.6 | 2.14 E-1 |
표 13 : 상이한 인간화된 항-PD1 변이체 항체의 존재 하에 PD1-PDL1의 상호작용 억제의 Blitz 측정: ka(1/Ms), kd(1/s) 및 KD(nM)을 측정하였다.
| IC50 ng/mL | |
| 키메라 | 253.15 |
| HCLD | 196.11 |
| HELD | 196.43 |
| HGLD | 177.57 |
| HHLD | 201.4 |
| HILD | 175.4 |
| HJLD | 193.95 |
| HKLD | 205.32 |
| HLLD | 155.72 |
표 14 : PD-L1 결합을 차단하는 PD-1 항체의 길항제 능력. 도 4C에서 이슈화된 상이한 인간화된 항-PD1 변이체 항체로 수득된 IC50(ng/ml)의 측정.
DiscoverX 세포-기반 생물검정을 사용한 PD-1 신호전달 분석
PD-1/pSHP-1 신호전달을 차단하는 항-PD-1 항체의 능력을 DiscoverX PathHunter® Jurkat PD-1(SHP1) 신호전달 분석(참조 93-1104C19)으로 평가하였다. 이러한 분석에서, Jurkat T 세포는 Beta-gal 단편(ED)에 융합된 키메라 PD-1 수용체와 보체 Beta-gal 단편(EA)에 융합된 조작된 SHP1을 안정적으로 발현한다. Jurkat 세포와 PD-L1 제시 세포의 공동배양은 PD-1 인산화, 조작된 SHP-1의 동원 및 ED 및 EA 단편의 보완을 초래하여 기질 추가 후 활성 Beta-gal 효소 및 생물발광 신호를 생성한다. 화학발광은 PD-1 신호전달 활성화에 비례한다. 제조업체 권장사항에 따라 실험을 수행하였다. 간단하게, PD-1+ Jurkat 세포를 상이한 농도의 항 PD-1 항체와 함께 1시간 동안 인큐베이션한 후 PD-L1+ 세포와 추가로 1시간 동안 공동배양하였다. 검출 시약이 첨가된 발광 신호를 TecanTM 플레이트 리더를 사용한 후 180분 후에 판독하였다. 인간화된 항-PD1 변이체 항체를 상이한 농도에서 시험하였다. 데이터를 RLU(상대 발광 신호, Relative luminescence signal)로 표시된다. IC50(ng/mL)은 신호 억제의 50%에 도달하는데 필요한 농도를 나타낸다.
| IC50 ng/mL | |
| 키메라 | 16.79 |
| HCLD | 12.66 |
| HELD | 19.23 |
| HGLD | 14.75 |
| HHLD | 16.92 |
| HILD | 11.55 |
| HJLD | 13.44 |
| HKLD | 11.42 |
| HLLD | 16.58 |
표 15 : PD-1 매개 억제 신호전달을 차단하는 PD-1 항체의 길항제 능력: 도 7a로부터 신호 억제의 50%에 도달하는데 필요한 농도를 지칭하는 IC50(ng/mL)의 측정.
실시예 5: Promega 세포-기반 생물검정을 사용하는 세포 활성화 분석
항-PD-1 항체 복원 T 세포 활성화의 능력을 Promega PD-1/PD-L1 키트(참조 J1250)를 사용하여 시험하였다. 2개의 세포주가 사용된다 (1) 이펙터 T 세포(PD-1, NFAT-유도된 루시퍼라제를 안정적으로 발현하는 Jurkat) 및 (2) 표적 세포 활성화(PDL1을 안정적으로 발현하는 CHO K1 세포 및 항원-의존적 방식으로 동족체 TCR을 자극하도록 설계된 표면 단백질. 세포가 공동배양될 때, PD-L1 /PD-1 상호작용은 TCR 매개된 활성화를 억제하여 NFAT 활성화 및 루시퍼라제 활성화를 차단한다. 항-PD-1 항체의 첨가는 PD-1 매개 억제 신호를 차단하여 NFAT 활성화 및 루시퍼라제 합성 및 생물발광 신호의 방출을 유도한다. 제조업체 권장사항에 따라 실험을 수행하였다. PD-1 항체의 연속 희석액을 시험하였다. PD-L1+ 표적 세포, PD-1 이펙터 세포 및 항 PD-1 항체의 공동 배양 4시간 후, BioGloTM 루시페린 기질을 웰에 첨가하고 TecanTM 발광계를 사용하여 플레이트를 판독하였다. 발광계를 사용하여 정량화된 발광은 T 세포 활성화를 반영한다. 인간화된 항-PD1 변이체 항체의 연속 희석액을 시험하였다. ED50(ug/mL)은 최대 발광의 50%에 도달하는데 필요한 항체 농도를 나타낸다.
| ED50 ug/mL | |
| 키메라 | 0.29 |
| HCLD | 0.41 |
| HELD | 0.46 |
| HGLD | 1.16 |
| HHLD | 0.54 |
| HILD | 0.40 |
| HJLD | 0.90 |
| HKLD | 0.69 |
| HLLD | 0.89 |
표 16 : 항-PD-1 항체는 시험관 내 T 세포 활성화를 강화한다: 도 8에서 최대 발광의 50%에 도달하는데 필요한 항체 농도를 나타내는 ED50(㎍/mL)의 측정.
결과: PD1에 대한 상이한 인간화된 항-PD1 변이체 항체의 결합 능력을 측정한 후, PD1-PDL1 상호작용을 차단하는 각각의 변이체 항체의 억제 능력을 상이한 방법(Biacore, Blitz 및 ELISA)을 사용하여 평가하였다. 도 4a는 변이체의 억제 반응을 나타낸다: PD1-PDL1 상호작용에 대한 키메라 항체와 비교한 HCLC, HCLD 및 HELC, HELD 항체. 도 4b는 PD1에 대한 PDL1 결합에 대한 변이체 HCLD, HELD, HGLD, HILD, HJLD, HKLD 및 HLLD 항체의 억제 반응을 나타낸다. 표 13은 모든 변이체 항체의 존재가 PD1에 대한 PDL1의 결합을 억제함을 보여준다. HCLC 및 HFLD로 수득된 결과는 표 13에 제시된 것과 유사하다(데이터는 나타내지 않음). 도 4c는 각 변이체에 대한 ID50의 결정으로 이어지는 다양한 농도에서 인간화된 항-PD1 항체의 경쟁 효율을 보여준다(도 4c 및 표 14). PD1은 세포 표면에서 발현된 또 다른 리간드인 PDL2에 결합할 수 있다. 도 5a 및 b는 Biacore 분석 및 길항제 PD-L2/PD-1 ELISA에 의해 측정된 바와 같이, 항 PD-1 변이체 항체 HELC, HELD 및 HKLD가 상호작용 PD1-PDL2를 또한 차단함을 보여준다.
이러한 결과를 확인하기 위해, PD-1 경로로부터 신호전달 단백질인 SHP1의 인산화를 평가하는 생물검정을 수행하였다. 도 7a 및 b는 SHP1의 인산화에 대한 상이한 인간화된 항-PD1 변이체 항체로 수득된 억제 용량-반응을 나타낸다. 표 15는 PD1 활성화에 대한 모든 변이체에 대해 유사한 억제 효능을 나타내는 각 변이체 항체에 대한 IC50을 나타낸다. 그럼에도 불구하고, HCLD 및 HKLD 변이체로 지칭되는 2개의 변이체는 예컨대 HELD 변이체에 비해 신호 P-SHP1을 억제하는데 더 효과적이었다. 억제 곡선은 키메라 백본에 가까운 HCLD 및 HKLD에서 더 나은 억제를 나타낸 반면, HLLD 또는 HJLD 인간화된 변이체는 일부 길항제 능력을 상실하였다. 동시에, T 세포 활성화(억제 체크포인트 상호작용의 억제)를 유도하는 PD1-PDL1 상호작용을 억제하는 모든 선택된 인간화된 항-PD1 변이체 항체의 억제 효능에 비해 NFAT 생물발광 생물검정을 사용하여 T 세포 활성화를 평가하였다. 도 8은 시험된 모든 변이체가 TCR 매개된 NFAT 신호전달을 활성화할 수 있었지만 상이한 능력과 효능을 가짐을 나타낸다. 플라크 단계에서 수득된 최대 RLU 신호는 효능을 반영한다. 본 발명자들은 HCLD, HKLD 변이체가 예컨대 HELD 또는 HLLD 변이체에 비해 더 우수한 효능을 가짐을 관찰하였다. 이러한 효능은 EC50으로 측정된다(표 16). 키메라 항체 및 모든 변이체는 NFAT를 활성화시키는데 효과적이고 HCLD, HILD, HKLD, HHLD, HELD 및 HKLD 변이체는 T 세포 활성화에 가장 효과적이었다.
실시예 6: 인간 T 세포에 의한 IFNg 분비
인간 T 세포에 의한 이펙터 사이토카인의 분비를 자극하는 HKLD 변이체의 효능을 입증하기 위해, 본 발명자들은 수지상 세포 및 동종 T 세포를 공동 배양하여 혼합된 백혈구 반응 분석을 수행하였다. 도 9에 나타난 바와 같이, HKLD 변이체는 용량 의존적 방식으로 IFNg 사이토카인의 분비를 증가시킨다.
선택된 모든 인간화된 항-PD1 변이체 항체는 적어도 키메라 항체만큼 우수한 방식으로 PDL1 및 PLD2에 대한 PD1의 결합을 억제할 수 있었다. 모든 변이체는 T 세포를 활성화할 수 있다. PD1 신호전달을 통한 P-SHP1 억제 또는 NFAT 활성화와 같은 생물학적 분석에서, 본 발명자들은 다른 것들에 비해 3가지 변이체 즉, HCLD, HKLD 및 HILD가 더 효과적이라는 것을 관찰하였다. 이들은 다른 변이체에 비해 키메라 결과와 유사한 신호 및 개선된 PD1 차단을 나타낸다. 다른 변이체와 비교하여, HILD 및 HKLD 변이체는 생물학적 활성을 보존하면서 포유류 세포-기반 생산 시스템에서 높은 제조가능성 및 생산성 수율로 최고의 특성을 입증하였다: PD-1에 대한 높은 친화도, PD-L1 및 PD-L2에 대한 길항제 능력 및 T 세포 활성화를 복원하는 능력(pSH-P-1 억제, NFAT 활성화, IFNg 이펙터 사이토카인 분비 촉진).
실시예 7: 인간화된 항-PD1 항체의
생체 내
효능
인간 항 PD-1 항체의 효능을 인간 PD-1(엑손 2)을 발현하는 유전적으로 변형된 면역적격성 마우스에서 다중 생체 내 모델에서 평가하였다. 중피종 모델의 경우, AK7 중피종 세포를 흉막 내 주사(3e6 세포/마우스)한 다음 5/8/12/15일에 항 PD-1 대조군 또는 항-PD1 인간화된 항체(HKLD 변이체)를 1 mg/kg으로 처리하였다. 주입된 AK7 세포는 D-루시페린(3μg/마우스, GoldBio, Saint Louis MO, USA, 참조 115144-35-9)의 복강 내 주입 후 생체 내 생물발광 신호의 생성을 가능케 하는 루시퍼라제를 안정적으로 발현한다. 루시페린 주사 10분 후, 생물발광 신호를 마우스의 등쪽과 복부에서 1분 동안 Biospace Imager로 측정하였다. 데이터를 스테라디안(steradian) 당 cm2 당 초 당 광자로 분석하였으며 등쪽 및 복부 신호의 평균을 나타낸다. 각 군은 군 당 5 내지 7마리의 마우스의 평균 +/- SEM을 나타낸다. MC38 모델의 경우, MC38 결장암 세포에 5e5 세포를 옆구리에 피하로 주사하고 종양 부피를 공식 0.52 × (길이 × 너비)로 계산하였다. 종양이 40 내지 80mm3에 도달했을 때 마우스를 3주 동안 일주일에 3회 10 mg/kg의 항-PD1 인간화된 항체(HKLD 변이체)로 처리하였다. 간암종 동소 모델의 경우, 2.5e6 Hepa1.6 세포를 간문맥에 주입하였다 마우스를 종양 주입 후 4/7/11/14/18/21일에 3 mg/kg의 IgG4 이소형 대조군 또는 항-PD1 인간화된 항체(HKLD 변이체)로 처리하였다.
결과: 도 10은 양성 대조군으로서 대조군 항-PD1 항체 또는 인간화된 항-PD1 변이체 항체(HKLD) 중 하나로 처리한 후 중피종 종양 성장을 나타내며, 음성 대조군은 PBS로 동물을 처리하여 나타낸다. 본 발명의 인간화된 항-PD1은 종양 성장을 제어하는 매우 우수한 효능을 나타낸다. 인간화된 항-PD1 변이체 항체(HKLD)는 도 10a에 도시된 바와 같이 각각 1 또는 3 mg/kg의 항체를 사용하여(도 10b), 77%(13마리 마우스 중 10마리) 또는 100%(7마리)의 완전한 반응으로 AK7 중피종 종양을 근절할 수 있다. 생체 내 효능은 2개의 다른 마우스 모델에서 확인하였다. 이소성 MC38 대장 암종에서, 인간화된 항-PD1 변이체 항체(HKLD)는 중앙 생존율을 유의하게 개선하였고 완전한 반응의 50%를 촉진하였다(10마리 마우스 중 5마리)(도 11a 및 b). 유사하게, 동소 HCC 모델에서, 인간화된 항-PD1 변이체 항체(HKLD)는 42%의 완전한 반응(10마리 마우스 중 3마리)으로 마우스 생존을 개선하였다(도 12).
실시예 8:
생체 내
인간화된 항-PD1 항체의 약동학 및 약력학
생성물의 약동학 및 약력학을 단일 주사 후 시노몰구스 원숭이 및 마우스에서 평가하였다. 마우스에서 약동학을 평가하기 위해, BalbcRJ(암컷 6 내지 9주)를 키메라 형태, 인간화된 항 PD-1 항체(HKLD 변이체) 또는 키트루다 항체의 단일 용량(5mg/kg)으로 안와 내로 또는 피하로 주사하였다. 혈장 약물 농도를 고정화된 항-인간 경쇄 항체(클론 NaM76-5F3)를 사용하여 ELISA에 의해 결정하였으며 희석된 혈청-함유 항-PD-1 항체를 첨가하였다. 퍼옥시다제-표지된 당나귀 항-인간 IgG(Jackson Immunoresearch; USA; 참조 709-035-149)를 첨가하여 검출을 수행하고 통상적인 방법으로 밝혔다.
시노몰구스 원숭이에 1 또는 5 mg/kg의 인간화된 항-PD1 항체(HKLD 변이체)를 정맥 내 주사하였다. ELSIA에 의해 혈청 내 항-PD1 항체를 졍랑화하기 위해 전혈 및 혈청을 여러 시점에서 수집하였다. 당나귀의 혈청에서 항-PD-1 항체, PD-1 재조합 단백질을 고정화하고 희석된 혈청-함유 항-PD-1 항체를 첨가하였다. 설포-태그된 항 인간 카파 항체로 검출을 수행하고 MSD 기술로 밝혔다.
결과: 도 13a, b 및 c는 인간화된 항 PD-1 항체가 선형 운동 곡선을 갖는 마우스 및 원숭이에서 생체 내 유리한 약동학 프로파일을 갖는다는 것을 보여준다. 마우스에서, IgG1 N298A 및 IgG4 S228P 이소타입을 가진 항-PD-1 인간화된 형태(HKLD)는 임상적으로 사용되고 상용화된 항 PD-1 항체인 키트루다와 유사한 프로파일을 가지고 있다. 시노몰구스 원숭이에서, 인간화된 항 PD-1 항체의 혈청에서 더 많은 양이 1mg/kg에 비해 5mg/kg에서 검출됨에 따라 용량 대 노출의 우수한 상관관계가 관찰된다. 이러한 데이터는 모두 인간화된 항 PD-1이 생체 내에서 유리한 약동학 프로파일을 가지고 있음을 보여준다.
실시예 9: 인간화된 항 PD-1 항체는 동일한 세포에서 PD-1/PD-L1 상호작용의 차단을 통해 대식세포-매개된 종양 세포 식세포 작용을 강화한다.
PD-1 발현은 T 세포로 제한되지 않으며, 예컨대, PD-1은 또한 종양-관련 대식세포에서도 발현될 수 있다. 종양 세포에서 PD-L1 발현은 식세포 작용 효능을 차단하는 대식세포로의 전이-억제 신호를 유발할 수 있다(문헌[Gordon et al., Nature. 2017 May 25;545(7655):495-499]). 그러나, PD-1/PD-L1 차단 요법이 PD-L1 음성 종양 세포의 식세포 작용을 향상시킬 수 있는지 여부는 기술되어 있지 않다. M1 대식세포가 표면에서 두 수용체 둘 모두를 발현하기 때문에, PD-1 및 PD-L1이 동일한 세포에 결합하여 대식세포로의 음성 조절 신호전달을 유발할 가능성이 있다. 여기서, 본 발명자들은 인간화된 항-PD-1 항체가 동일한 세포에서 PD-1/PD-L1 상호작용의 차단을 통해 PD-L1 음성 종양 세포에 대한 대식세포의 식세포 작용을 회복시킬 수 있음을 입증하였다.
결과: 도 14a는 M0, M1 대식세포 및 raji 세포에서 PD-1 및 PD-L1의 발현을 나타낸다. M1 대식세포만 두 수용체 PD-1 및 PD-L1 모두를 발현하고 MO 대식세포는 PD-1을 높게 발현하고 PD-L1은 발현하지 않으며, Raji 세포는 PD-L1을 발현하지 않는다. 도 14b는 인간화된 항-PD-1 항체가 놀랍게도 M1-대식세포에 의한 PD-L1 음성 종양의 식세포 작용을 향상시킴을 보여준다. 다른 항-PD-1 항체(펨브롤리주맙 및 니볼루맙)와 비교하여, 인간화된 항-PD-1 항체는 종양 세포의 식세포 작용을 촉진하는데 보다 더 효과적이다(도 14c). 종양 세포는 이러한 분석에서 PD-L1을 발현하지 않고 M1 대식세포는 두 수용체 PD1 및 PDL1 모두를 발현하므로, 이러한 실험은 항-인간화된 항체가 동일한 세포에서 PD-L1 및 PD-1 사이의 상호작용(종양 세포 식세포 작용을 억제하는 상호작용)을 차단할 수 있음을 시사한다. 실제로, PD-L1을 발현하지 않지만 PD-1 수용체를 발현하는 MO 대식세포로 동일한 실험을 수행하였다(도 14a). 도 14d에 나타난 바와 같이, 항 PD-1 인간화된 항체는 M1 대식세포의 식세포 작용을 향상시키는 반면 MO 대식세포에는 영향을 미치지 않으며, 이는 두 수용체 PD-1/PD-L1 둘 모두가 인간화된 항 PD1 항체에 의해 매개되는 향상된 효과에 필요함을 입증한다. 이러한 데이터는 항 PD-1 인간화된 항체가 M1 대식세포에서 PD-1/PD-L1 상호작용을 중화시켜 종양 세포 식세포 작용을 재활성화함을 시사한다.
Raji 세포는 다른 곳에서 기술된 바와 같이(문헌[Andorsky et al, 2011, DOI: 10.1158/1078-0432]) PD-1의 다른 리간드인 PD-L2를 발현하지 않으며, 이는 항-인간화된 항 PD-1 항체가 PD-L1 및 PD-L2 음성 종양 세포의 식세포 작용을 향상시킬 수 있음을 뒷받침한다.
PD-1-PD-L1 차단이 T 세포를 재활성화한다는 것이 잘 알려져 있지만, 본 발명자들은 대식세포의 직접적인 재생을 통해 항-PD-1 항체의 새로운 특성을 보여준다. 이들은 인간화된 항-PD-1 항체가 PD-L1 음성 종양 세포의 식세포 작용을 촉진하는 동일한 대식세포에서 PD-1/PD-L1 상호작용을 차단할 수 있음을 입증하였다. 이러한 양태는 종양 세포 표면에 PD-L1을 발현하는 환자가 PD-1/PD-L1 요법으로 치료되기 때문에 임상에서 특히 관심이 있다. 본원에 제시된 데이터는 PD-L1 음성 종양조차도 재활성화 대식세포 식세포 작용에 의해 인간화된 항-PD-1 항체로부터 이득이 될 수 있음을 보여준다.
재료 및 방법
ELISA 결합 PD1
활성 ELISA 분석을 위해, 재조합 hPD1(Sino Biologicals, Beijing, China; 참조 10377-H08H)을 카보네이트 완충액(pH9.2)에서 0.5μg/ml로 플라스틱에 고정시키고 정제된 항체를 첨가하여 결합을 측정하였다. 인큐베이션 및 세척 후, 퍼옥시다제-표지된 당나귀 항-인간 IgG(Jackson Immunoresearch; USA; 참조 709-035-149)를 첨가하고 통상적인 방법으로 밝혔다.
세포형광측정법에 의한 인간 자극된 T 세포에 대한 PD1 결합 분석
건강한 지원자의 PBMC를 항-CD3/CD28 자극으로 활성화하여 T 세포를 자극하였다. 인간 자극된 T 세포에 대한 항-PD1의 결합을 측정하기 위해, 항체를 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 세척하고 PE-표지된 항-인간 IgG Fc(Biolegend; USA; 참조 409303)와 함께 4℃에서 30분 동안 염색하였다. 샘플을 CD3+ 세포(T 세포)의 게이팅에서 BD LSRII 또는 Canto II 세포형광측정기로 분석하였다.
Blitz 방법으로 PD1에 대한 결합력 측정
결합 친화도/결합력을 Blitz 방법(문헌[Fortι Bio; USA; 참조 C22-2 No 61010-1)을 사용하여 측정하였다. 재조합 hPD1-His(Sino Biologicals, Beijing, China; 참조 10377-H08H)를 히스티딘 꼬리에 의해 Ni-NTA 바이오센서(Forte Bio; USA; 참조 18-0029)에 30초 동안 10 μg/ml으로 고정하였다. 이어서, 항-PD1 항체를 120초 동안 20 μg/mL과 결합시켰다. 항-PD1 항체의 해리는 120초 동안 동역학 완충액에서 이루어졌다. 분석 데이터를 결합 상수(ka) 및 해리 상수(kd)를 계산하고 친화도 상수 KD(ka/kd)를 결정하는 Blitz pro 1.2 소프트웨어로 하였다.
Biacore 방법으로 PD1에 대한 친화도 측정
친화도 측정을 PP2I 플랫폼(Inserm U1194, Universite de Montpellier)으로 수행하였다. 항-인간 Fc 항체(GEHelthcare)를 아세테이트 완충액 pH5에서 25 μg/ml으로 고정하였다. 항-인간 PD1 항체(키트루다(Keytruda), 옵디보(Opdivo), HKLD 변이체, 키메라)를 1.25 nM로 첨가하고 재조합 hPD1-His(Sino Biologicals, Beijing, China; 참조 10377-H08H)를 상이한 용량(6.25 nm 내지 200 nM)으로 결합시켜 결합 상수(ka) 및 해리 상수(kd)를 계산하여 친화도 상수 KD(ka/kd)를 결정하였다.
ELISA 길항제: PDL1 또는 PDL2와 인간화된 항-PD1 사이의 경쟁
경쟁적 ELISA 분석을 PD-1:PD-L1 억제제 스크리닝 ELISA 분석 쌍(AcroBiosystems; USA; 참조 EP-101)으로 수행하였다. 이러한 분석에서, 재조합 hPDL1을 PBS pH 7.4 완충액에서 2 μg/ml로 플라스틱 상에 고정하였다. 정제된 항체(상이한 농도)를 0.66 μg/ml의 최종(고정 농도) 비오티닐화된 인간 PD1(AcroBiosystems; USA; 참조 EP-101)과 함께 혼합하여 37℃에서 2시간 동안 경쟁적 결합을 측정하였다. 인큐베이션 및 세척 후, 퍼옥시다제-표지된 스트렙타비딘(Vector laboratoring; USA; 참조 SA-5004)을 첨가하여 Biotin-PD-1Fc 결합을 검출하고 통상적인 방법으로 밝혔다. 경쟁적 ELISA 분석 PDL-2/PD-1의 경우, PBS pH 7.4 완충액에서 2 μg/mL로 플라스틱 상에 PD-L1 대신 PD-L2(Sinobiological,# 10292-H02H)를 고정화시킨 것을 제외하고 유사한 프로토콜을 수행하였다.
PDL1과 Blitz 방법 경쟁: PD1 + acs + PDL1
이러한 방법을 Blitz(Forte Bio; USA; 참조 C22-2 No 61010-1)로 수행하였다. 재조합 hPD1-His(Sino Biologicals, Beijing, China; 참조 10377-H08H)를 히스티딘 꼬리에 의해 Ni-NTA 바이오센서(Forte Bio; USA; 참조 18-0029)에 30초 동안 10 μg/ml으로 고정하였다. 제2 단계에서, 항-PD1 항체를 120초 동안 20 μg/mL(포화 농도)로 첨가하였다. 이어서, 인간 PDL1(Sino Biologicals, Beijing, China; 참조 10084-H02H)을 120초 동안 항-PD1 항체와 경쟁으로 100 μg/mL로 결합시켰다. PDL1의 해리는 120초 동안 동역학 완충액에서 이루어졌다. 분석 데이터를 결합 상수(ka) 및 해리 상수(kd)를 계산하고 친화도 상수 KD(ka/kd)를 결정하는 Blitz pro 1.2 소프트웨어로 하였다.
인간화된 항-PD1 변이체 항체와 조합된 PDL2와 PD1 사이의 친화도를 측정하기 위한 Biacore에 의한 경쟁 분석
인간 PD-L2 재조합 단백질(Sinobiological, 10292-H08H-B)에 대한 항-PD1 항체와 사전-인큐베이션된 PD-1 재조합 단백질(Sino Biologicals, Beijing, China; 참조 10377-H08H)의 Biacore에 의한 친화도 평가. 인간 재조합 PD-L2를 200 μg/mL의 농도로 바이오센서 칩 상에 고정시켰다. 이어서 바이오센서 칩을 에탄올아민 1M PH 8.4로 10분 동안 처리하여 유리 부위를 비활성화하였다. 복합 항체(200 nM) + 재조합 인간 PD-1(100 nM)을 첨가하고 상대적인 반응을 Biacore로 측정하였다. 데이터를 상호작용의 상대 반응의 %로 계산하였다: 100% = PD-1 상대 반응.
PD1에 대한 PDL1과 인간화된 항-PD1 변이체 항체 사이의 Blitz 방법에 의한 경쟁 분석.
이러한 방법은 Blitz(Forte Bio; USA; 참조 C22-2 No 61010-1)로 수행하였다. 재조합 hPD1-His(Sino Biologicals, Beijing, China; 참조 10377-H08H)를 히스티딘 꼬리에 의해 Ni-NTA 바이오센서(Forte Bio; USA; 참조 18-0029)에 30초 동안 10 μg/ml으로 고정하였다. 제2 단계에서, PD1을 120초 동안 20 μg/mL(포화 농도)로 인간화된 항-PD1 변이체 항체와 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 인간 PDL1(Sino Biologicals, Beijing, China; 참조 10084-H02H)을 120초 동안 인간화된 항-PD1 항체와 경쟁으로 100 μg/mL로 결합시켰다. PDL1의 해리는 120초 동안 동역학 완충액에서 이루어졌다. 분석 데이터를 결합 상수(ka) 및 해리 상수(kd)를 계산하고 친화도 상수 KD(ka/kd)를 결정하는 Blitz pro 1.2 소프트웨어로 하였다.
PDL1 또는 PD-L2에 대한 상이한 농도의 인간화된 항-PD1 변이체 항체와 조합된 PD1 사이의 ELISA에 의한 경쟁 분석
경쟁적 ELISA 분석을 PD-1:PD-L1 억제제 스크리닝 ELISA 분석 쌍(AcroBiosystems; USA; 참조 EP-101)으로 수행하였다. 이러한 분석에서, 재조합 hPDL1을 PBS pH 7.4 완충액에서 2 μg/ml로 플라스틱 상에 고정시켰다. 정제된 항체(상이한 농도)를 0.66 μg/ml의 최종(고정 농도)의 비오티닐화된 인간 PD1(AcroBiosystems; USA; 참조 EP-101)과 함께 혼합하여 37℃에서 2시간 동안 경쟁적 결합을 측정하였다. 인큐베이션 및 세척 후, 퍼옥시다제-표지된 스트렙타비딘(Vector laboratoring; USA; 참조 SA-5004)을 첨가하여 Biotin-PD-1Fc 결합을 검출하고 통상적인 방법으로 밝혔다.
배제 확산 크로마토그래피에 의한 안정성 연구
배제 확산 크로마토그래피에 의한 안정성 연구를 AkTA Prime 정제 시스템(GE healthcare; Sweden) 상에서 크기-배제 컬럼(GE healthcare; Sweden, Superdex 200 10/300 GL; 참조 17-5175-01)을 사용하여 수행하였다. 37℃ 또는 4℃에서 7일동안 인큐베이션된 항-PD1 항체를 이러한 컬럼(부피 100μl)에 주입하고 30 ml 상의 PBS 완충액으로 용리하였다. PrimeView 평가 소프트웨어((GE healthcare; Sweden)를 사용하여 분석하여 응집체 및 단량체의 %를 분석하였다(단량체에 대한 체류 시간 Tm=11.7~12ml).
DiscoverX 세포-기반 생물검정을 사용한 PD-1 신호전달 분석
PD-1/pSHP-1 신호전달을 차단하는 항-PD-1 항체의 능력을 DiscoverX PathHunter® Jurkat PD-1(SHP1) 신호전달 분석(참조 93-1104C19)으로 평가하였다. 이러한 분석에서, Jurkat T 세포는 Beta-gal 단편(ED)에 융합된 키메라 PD-1 수용체 및 보완 Beta-gal 단편(EA)에 융합된 조작된 SHP1을 안정하게 발현한다. Jurkat 세포와 PD-L1 제시 세포의 공동 배양은 PD-1 인산화, 조작된 SHP-1의 동원, ED 및 EA 단편의 보완을 초래하여 기질 추가 후 활성 Beta-gal 효소 및 생물발광 신호를 생성한다. 화학발광은 PD-1 신호전달 활성화와 비례한다. 본 실험을 제조업체의 권장사항에 따라 수행하였다. 간단하게, PD-1+ Jurkat 세포를 상이한 농도의 항 PD-1 항체와 1시간 동안 인큐베이션한 다음 PD-L1+ 세포와 추가 1시간 동안 공동 배양하였다. 검출 시약을 첨가하여 TecanTM 플레이트 리더를 사용하여 180분 후 생물발광 신호를 판독하였다.
Promega 세포-기반 생물검정을 사용한 T 세포 활성화 분석
T 세포 활성화를 회복시키는 항-PD-1 항체의 능력을 Promega PD-1/PD-L1 키트(참조 J1250)를 사용하여 시험하였다. 2개의 세포주가 사용된다 (1) 이펙터 T 세포(PD-1, NFAT-유도된 루시퍼라제를 안정적으로 발현하는 Jurkat) 및 (2) 표적 세포 활성화(PDL1을 안정적으로 발현하는 CHO K1 세포 및 항원-의존적 방식으로 동족체 TCR을 자극하도록 설계된 표면 단백질. 세포가 공동배양될 때, PD-L1 /PD-1 상호작용은 TCR 매개된 활성화를 억제하여 NFAT 활성화 및 루시퍼라제 활성화를 차단한다. 항-PD-1 항체의 첨가는 PD-1 매개 억제 신호를 차단하여 NFAT 활성화 및 루시퍼라제 합성 및 생물발광 신호의 방출을 유도한다. 제조업체 권장사항에 따라 실험을 수행하였다. PD-1 항체의 연속 희석액을 시험하였다. PD-L1+ 표적 세포, PD-1 이펙터 세포 및 항 PD-1 항체의 공동 배양 4시간 후, BioGloTM 루시페린 기질을 웰에 첨가하고 TecanTM 발광계를 사용하여 플레이트를 판독하였다.
시험관 내
혼합된 백혈구 반응 분석
20 ng/ml 과립구-대식세포-콜로니-자극 인자 및 20 ng/ml IL-4를 6일 동안 배양하여 인간 PBMC(Miltenyi 단핵구 비터치된 고전적 키트 단리 # 130-117-337)로부터 단리된 CD14+ 단핵구로부터 수지상 세포를 분화시킨 다음, 건강한 혈액 제공자(Miltenyi 단리 키트, #130-096-533)로부터 단리된 동족 CD4+ T-세포와 1:10 비율로 혼합하였다. 공동-배양 5일 후, 상등액을 수확하였다; IFN-γ 수준을 ELISA로 정량화하였다.
마우스 모델에서
생체 내
인간화된 PD1 노크(Knock)
인간 항 PD-1 항체의 효능을 인간 PD-1(엑손 2)을 발현하는 유전적으로 변형된 면역적격성 마우스에서 동소 중피종 마우스 모델에서 생체 내 평가하였다. AK7 중피종 세포를 흉막 내 주사(3e6 세포/마우스)한 다음 5/8/12/15일에 항 PD-1 대조군 또는 항-PD1 인간화된 항체(HKLD 변이체)를 1 mg/kg으로 처리하였다. 주입된 AK7 세포는 D-루시페린(3 μg/마우스, GoldBio, Saint Louis MO, USA, 참조 115144-35-9)의 복강 내 주입 후 생체 내 생물발광 신호의 생성을 가능케 하는 루시퍼라제를 안정적으로 발현한다. 루시페린 주사 10분 후, 생물발광 신호를 마우스의 등쪽과 복부에서 1분 동안 Biospace Imager로 측정하였다. 데이터를 스테라디안(steradian) 당 cm2 당 초 당 광자로 분석하였으며 등쪽 및 복부 신호의 평균을 나타낸다. 각 군은 군 당 5 내지 7마리의 마우스의 평균 +/- SEM을 나타낸다. MC38 모델의 경우, MC38 결장암 세포에 5e5 세포를 왼쪽 옆구리에 피하로 주사하였다. 종양 부피를 공식 0.52 × (길이 × 너비)1.5로 계산하였다. 종양이 80 내지 100 mm3에 도달했을 때 마우스를 3주 동안 일주일에 3회 10mg/kg의 항-PD1 인간화된 항체(HKLD 변이체)로 처리하였다. Hepa1.6 간암종의 경우, 2.5e6 Hepa1.6 간암종 세포를 간문맥에 주사하였다. 마우스를 종양 주입 후 4/7/11/14/18/21일에 3 mg/kg의 IgG4 이소타입 대조군 또는 항-PD1 인간화된 항체(HKLD 변이체)로 처리하였다.
마우스 및 원숭이에서 인간화된 항-PD1 항체의 약동학 및 약력학
시노몰구스 원숭이에 단일 용량의 인간화된 항-PD1 항체(HKLD 변이체) 1 또는 5 mg/kg을 정맥 내로 주사하였다. 수용체 점유를 평가하고 혈청에서 항-PD1 항체를 정량화하기 위해 전혈 및 혈청을 여러 시점에서 수집하였다. 원숭이의 혈청에서 인간화된 항-PD-1 항체의 약동학을 평가하기 위해, PD-1 재조합 단백질(인간 PD-1-his 태그 재조합 단백질(Sino Biological, #10377-H08H)을 고정시키고 희석된 혈청-함유 항-PD-1 항체를 첨가하였다. 설포-태그된 마우스 항-인간 카파 항체(클론 NaM76-5F3, 염색된 sulfloTag)를 첨가하여 검출을 수행하고 MSD Gold Read 완충액(MSD # R92TG-2 및 MESO QUICKPLEX SQ 120 판독기에 의해 밝혔다.
마우스에서 약동학을 평가하기 위해, BalbcRJ(암컷 6 내지 9주)에 단일 용량(5 mg/kg)의 키메라 형태, 인간화된 항 PD-1 항체(HKLD 변이체) 또는 키트루다 항체를 안와 내 또는 피하 주사하였다. 혈장 약물 농도를 고정화된 항-인간 경쇄 항체(클론 NaM76-5F3)를 사용하여 ELISA에 의해 결정하고 희석된 혈청-함유 항-PD-1 항체를 첨가하였다. 퍼옥시다제-표지된 당나귀 항-인간 IgG(Jackson Immunoresearch; USA; 참조 709-035-149)를 첨가하여 검출을 수행하고 통상적인 방법으로 밝혔다.
식세포 작용 분석
건강한 지원자의 인간 단핵구를 완전한 RPMI 배지에서 5일 동안 M-CSF(100ng/mL)를 사용하여 M0-대식세포로 시험관 내에서 분화시켰다. M0 대식세포를 인간 IFNg(70 ng/mL)로 2일 동안 배양하여 M1-대식세포를 생성하였다. M0/M1-대식세포 및 Raji 세포주를 각각 세포 증식 염료(Cell Proliferation Dye) eFluor450(Invitrogen) 및 세포 증식 염료 eFluor670(Invitrogen)으로 염색하였다. 초저부착(ULA: Ultra Low attachment) 96-웰 바닥 원형 플레이트를 사용하여, Raji CPDe670+를 항체 및 리툭시맙과 함께 1시간 동안 사전-인큐베이션하고 M0 또는 M1-대식세포 CPDe450+를 2:1의 이펙터 대 표적 비율로 첨가하였다. 세포는 모두 1시간 또는 2시간 동안 배양하였다. 식세포 작용 분석은 유동 세포분석에 의해 수행하였으며 식세포 작용의 백분율을 총 CPDe450+ 세포에서 CPDe670+ 세포의 백분율(즉, 이중-양성 세포의 백분율(CPDe670+/ CPDe450+))로 계산하였다.
유동 세포형광측정법에 의한 인간 자극된 CD3+ PBMC에 대한
생체 외
결합 분석
인간 말초 T 세포에 대한 항-PD1의 결합을 측정하기 위해, 항체를 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 세척하고 PE-표지된 항-인간 IgG Fc(Biolegend; USA; 참조 409303) + Pacific Blue 표지된 항-인간 CD3(BD Biosciences 클론 SP34-2 # 558124)으로 4℃에서 30분 동안 염색하였다 샘플을 CD3+ T 세포 상의 게이팅에서 Cytoflex(Beckman Coulter) 세포형광측정기에서 분석하였다.
인간 T 세포에 의한 IFNg 분비
IFNg 이펙터 사이토카인의 분비를 자극하는 인간화된 항 PD-1의 능력을 혼합 동종 백혈구 반응에서 평가하였다. 단핵구 유도된 수지상 세포를 CD14+ 단리된 인간 말초혈액 단핵구 + GM-CSF 및 IL-4로부터 생성하였고 CD4+ 단리된 동종 인간 T 세포(1 대 10 비율) 및 상이한 용량의 HKLD 변이체 또는 이소타입 대조군과 함께 5일 동안 공동배양하였다. IFNg 사이토카인을 함유하는 상등액을 수확하고 ELISA(BD Bioscience, 참조 555142 및 555190)에 의해 투여하였다.
SEQUENCE LISTING
<110> OSE IMMUNOTHERAPEUTICS
<120> HUMANIZED ANTI-HUMAN-PD-1 ANTIBODY
<130> B2911PC
<160> 51
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> HC CDR1
<400> 1
His Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> HC CDR2
<400> 2
Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe Thr
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> HC CDR3
<400> 3
Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Ser
1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> HC CDR3
<400> 4
Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Thr
1 5
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> HC CDR3
<400> 5
Glu Arg Glu Pro Gly Met Glu Ser
1 5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> HC CDR3
<400> 6
Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp His
1 5
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> HC CDR3
<400> 7
Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Ala
1 5
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> HC CDR3
<400> 8
Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Tyr
1 5
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> HC CDR3
<400> 9
Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Asn
1 5
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> HC CDR3
<400> 10
Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Glu
1 5
<210> 11
<211> 16
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> LC CDR1
<400> 11
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ala Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 12
<211> 16
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> LC CDR1
<400> 12
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ala Asn Thr Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> LC CDR2
<400> 13
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> LC CDR3
<400> 14
Phe Gln Gly Thr His Val Pro Asn Thr
1 5
<210> 15
<211> 117
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> HC variable domain
<400> 15
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
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355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 31
<211> 444
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> HC
<400> 31
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305 310 315 320
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
325 330 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
340 345 350
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 32
<211> 444
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> HC
<400> 32
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Glu Pro Gly Met Asp Glu Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305 310 315 320
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
325 330 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
340 345 350
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 33
<211> 219
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> LC
<400> 33
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ala
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
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100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
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130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 34
<211> 219
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> LC
<400> 34
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ala
20 25 30
Asn Thr Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Thr His Val Pro Asn Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 35
<211> 327
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> HC constant domain
<400> 35
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 36
<211> 107
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> LC contant domain
<400> 36
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 37
<211> 30
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> HFR1
<400> 37
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
<210> 38
<211> 14
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> HFR2
<400> 38
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10
<210> 39
<211> 32
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> HFR3
<400> 39
Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 40
<211> 11
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> HFR4
<400> 40
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 41
<211> 23
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> LFR1
<400> 41
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys
20
<210> 42
<211> 15
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> LFR2
<400> 42
Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 43
<211> 32
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> LFR3
<400> 43
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 44
<211> 10
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> LFR4
<400> 44
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 45
<211> 19
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> signal peptide
<400> 45
Met Asp Trp Leu Trp Asn Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser
1 5 10 15
Ile Gln Ala
<210> 46
<211> 19
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> signal peptide
<400> 46
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala
1 5 10 15
Ser Ser Ser
<210> 47
<211> 330
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> IgG1m-N298A
<400> 47
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 48
<211> 351
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> VH HK
<400> 48
cagatccagc tggtgcagag cggctctgag ctgaagaagc caggcgcttc tgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta caccttcaca cactatgcta tgaattgggt gagacaggct 120
ccaggacagg gactggagtg gatgggctgg atcaacacca atacaggcga gcctacctac 180
gctcagggct ttacaggccg cttcgtgttt tctctggata cctccgtgag cacagcctat 240
ctgcagatct ccagcctgaa ggctgaggac accgccgtgt actattgtgc tagggagagg 300
gagccaggaa tggataactg gggacagggc accctggtga cagtgtcttc c 351
<210> 49
<211> 336
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> VL LD
<400> 49
gacgtggtca tgacacagag cccactgtct ctgcctgtga ccctgggaca gccagcctct 60
atctcctgca gatccagcca gtctctggtg cacgctaaca ccaatacata cctggagtgg 120
tatcagcaga ggccaggaca gtccccaagg ctgctgatct acaaggtgtc caacagattc 180
agcggagtgc cagaccgctt tagcggatct ggatccggaa ccgacttcac cctgaagatc 240
tccagggtgg aggctgagga tgtgggcgtg tactattgtt tccagggcac ccatgtgcct 300
aatacatttg gccagggcac caagctggag atcaag 336
<210> 50
<211> 1335
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> CH HK
<400> 50
cagatccagc tggtgcagag cggctctgag ctgaagaagc caggcgcttc tgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta caccttcaca cactatgcta tgaattgggt gagacaggct 120
ccaggacagg gactggagtg gatgggctgg atcaacacca atacaggcga gcctacctac 180
gctcagggct ttacaggccg cttcgtgttt tctctggata cctccgtgag cacagcctat 240
ctgcagatct ccagcctgaa ggctgaggac accgccgtgt actattgtgc tagggagagg 300
gagccaggaa tggataactg gggacagggc accctggtga cagtgtcttc cgctagcacc 360
aagggcccat cggtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcc 420
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacgaagac ctacacctgc 600
aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagtc caaatatggt 660
cccccatgcc caccatgccc agcacctgag ttcctggggg gaccatcagt cttcctgttc 720
cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 780
gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 840
gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagttca acagcacgta ccgtgtggtc 900
agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 960
tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1020
cgagagccac aggtgtacac cctgccccca tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1080
agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1140
aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1200
ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc 1260
tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag cctctccctg 1320
tctccgggta aatga 1335
<210> 51
<211> 660
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> CL LD
<400> 51
gacgtggtca tgacacagag cccactgtct ctgcctgtga ccctgggaca gccagcctct 60
atctcctgca gatccagcca gtctctggtg cacgctaaca ccaatacata cctggagtgg 120
tatcagcaga ggccaggaca gtccccaagg ctgctgatct acaaggtgtc caacagattc 180
agcggagtgc cagaccgctt tagcggatct ggatccggaa ccgacttcac cctgaagatc 240
tccagggtgg aggctgagga tgtgggcgtg tactattgtt tccagggcac ccatgtgcct 300
aatacatttg gccagggcac caagctggag atcaagcgta cggtggctgc accatctgtc 360
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 660
Claims (24)
- 인간화된 모노클로날 항-인간-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
(a) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 VH; 및 (b) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하거나 이루어진 VL을 포함하고, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 또는 PD-L2의 결합의 길항제인, 인간화된 모노클로날 항-인간-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편. - 제1항에 있어서,
(a) 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 중쇄, 및 (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 경쇄를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편. - 제1항에 있어서,
상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 카파 경쇄 불변 도메인으로부터 유도된 경쇄 불변 도메인 및 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중쇄 불변 도메인으로부터 유도된 중쇄 불변 도메인을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편. - 제1항에 있어서,
상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 카파 경쇄 불변 도메인으로부터 유도된 경쇄 불변 도메인 및 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인으로부터 유도된 중쇄 불변 도메인을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편. - 제4항에 있어서, 상기 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인으로부터 유도된 중쇄 불변 도메인은 T250Q/M428L; M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F; E233P/L234V/L235A/G236A + A327G/A330S/P331S; E333A; S239D/A330L/I332E; P257I/Q311; K326W/E333S; S239D/I332E/G236A; N297A; L234A/L235A; N297A + M252Y/S254T/T256E; K322A 및 K444A로 이루어진 군으로부터 선택된 치환 또는 치환의 조합을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항에 있어서,
인간 카파 경쇄 불변 도메인으로부터 유도된 경쇄 불변 도메인 및 인간 IgG4 중쇄 불변 도메인으로부터 유도된 중쇄 불변 도메인을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편. - 제6항에 있어서,
상기 인간 IgG4 중쇄 불변 도메인으로부터 유도된 중쇄 불변 도메인은 S228P; L234A/L235A, S228P + M252Y/S254T/T256E 및 K444A로 이루어진 군으로부터 선택된 치환 또는 치환의 조합을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편. - 제1항에 있어서,
표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 10-7 M 이하인 인간 PD-1에 대한 결합 친화도 상수(KD)로 인간 PD-1에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편. - 제1항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산 분자 또는 단리된 핵산 분자의 군.
- 제9항의 단리된 핵산 분자 또는 단리된 핵산 분자의 군을 포함하는 벡터.
- 제10항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산 분자 또는 단리된 핵산 분자의 군을 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계 및 항체 또는 항원-결합 단편을 단리하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생산하는 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제13항에 있어서,
알킬화제, 신혈관생성 억제제, 항체, 항대사물질, 항유사분열제, 항증식제, 항바이러스제, 오로라 키나제 억제제, 아폽토시스 촉진제, 사멸 수용체 경로 활성화제, Bcr-Abl 키나제 억제제, BiTE(이-특이적 T 세포 관여체) 항체, 항체 약물 접합체, 생물학적 반응 변형제, 브루톤 티로신 키나제(BTK) 억제제, 사이클린-의존적 키나제 억제제, 세포 사이클 억제제, 사이클로옥시게나제-2 억제제, DVD, 백혈병 바이러스 종양 유전자 동족체(ErbB2) 수용체 억제제, 성장 인자 억제제, 열 충격 단백질(HSP)-90 억제제, 히스톤 디아세틸라제(HDAC) 억제제, 호르몬 요법, 면역학적 제제, 아폽토시스 단백질의 억제제(IAP)의 억제제, 인터칼레이팅 항생제, 키나제 억제제, 키네신 억제제, Jak2 억제제, 라파마이신 억제제의 포유류 표적, 마이크로RNA, 미토젠-활성화된 세포 외 신호-조절된 키나제 억제제, 다가 결합 단백질, 비-스테로이드성 항-염증 약물(NSAID), 폴리 ADP(아데노신 디포스페이트)-리보스 폴리머라제(PARP) 억제제, 백금 화학요법제, 폴로-유사 키나제(Plk) 억제제, 포스포이노시티드-3 키나제 (PI3K) 억제제, 프로테아좀 억제제, 퓨린 유사체, 피리미딘 유사체, 수용체 티로신 키나제 억제제, 레티노이드/델토이드 식물 알칼로이드, 소간섭 리보핵산(siRNA), 토포이소머라제 억제제, 유비퀴틴 리가제 억제제, 저메틸화제, 체크포인트 억제제, 펩티드 백신, 종양 항원 유래의 에피토프 또는 네오에피토프, 및 이러한 제제들의 하나 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 추가 치료제를 추가로 포함하는, 약학 조성물. - 제13항에 있어서,
상기 암은 PD-1 또는 PD-L1을 발현하는 혈액암(hematologic malignancy) 또는 고형 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약학 조성물. - 제15항에 있어서,
상기 PD-1 또는 PD-L1을 발현하는 혈액암(hematologic malignancy) 또는 고형 종양은 혈액림프 신생물(hematolymphoid neoplasm), 혈관면역모세포 T 세포 림프종(angioimmunoblastic T cell lymphoma), 골수이형성 증후군(myelodysplasic syndrome), 급성 골수성 백혈병, 바이러스에 의해 유도되거나 면역결핍 관련 암, 자궁경부암, 항문암, 음경암, 외음부 편평 세포 암, 구강인두암, 미만성 거대 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma), 버킷 림프종(Burkitt lymphoma), 형질모세포성 림프종(plasmablastic lymphoma), 원발성 중추 신경계 림프종, HHV-8 원발성 삼출 림프종, 고전적 호지킨 림프종, 림프구증식 장애를 포함하는 B 세포 비-호지킨 림프종(NHL), 간세포 암종, 메르켈 세포 암종, 인간 면역결핍 바이러스 감염 관련 암, 흑색종, 악성 중피종, 비-소세포 폐암, 신세포 암종, 호지킨 림프종, 두경부암, 요로상피세포 암종, 대장암, 간세포 암종, 소세포 폐암, 전이성 메르켈 세포 암종, 위 또는 위식도암 및 자궁경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 약학 조성물. - 제13항에 있어서,
상기 암은 PD-L1 음성인 종양 세포를 갖는, 약학 조성물. - 제13항에 있어서,
상기 조성물은 방사선 요법과 병용하거나 알킬화제, 신혈관생성 억제제, 항체, 항대사물질, 항유사분열제, 항증식제, 항바이러스제, 오로라 키나제 억제제, 아폽토시스 촉진제, 사멸 수용체 경로 활성화제, Bcr-Abl 키나제 억제제, BiTE(이-특이적(Bi-Specific) T 세포 관여체(Engager)) 항체, 항체 약물 접합체, 생물학적 반응 변형제, 브루톤 티로신 키나제(BTK: Bruton's tyrosine kinase) 억제제, 사이클린-의존적 키나제 억제제, 세포 사이클 억제제, 사이클로옥시게나제-2 억제제, DVD, 백혈병 바이러스 종양유전자 동족체(leukemia viral oncogene homolog)(ErbB2) 수용체 억제제, 성장 인자 억제제, 열 충격 단백질(HSP)-90 억제제, 히스톤 디아세틸라제(HDAC) 억제제, 호르몬 요법, 면역학적 제제, 아폽토시스 단백질 억제제(IAP: inhibitors of apoptosis protein)의 억제제, 인터칼레이팅(intercalating) 항생제, 키나제 억제제, 키네신 억제제, Jak2 억제제, 라파마이신 억제제의 포유류 표적, 마이크로RNA, 미토젠-활성화된 세포 외 신호-조절된 키나제 억제제, 다가 결합 단백질, 비-스테로이드성 항-염증 약물(NSAID), 폴리 ADP(아데노신 디포스페이트)-리보스 폴리머라제(PARP) 억제제, 백금 화학요법제, 폴로-유사 키나제(Plk: polo-like kinase) 억제제, 포스포이노시티드-3 키나제(PI3K) 억제제, 프로테아좀 억제제, 퓨린 유사체, 피리미딘 유사체, 수용체 티로신 키나제 억제제, 레티노이드/델토이드 식물 알칼로이드, 소간섭 리보핵산(siRNA: small inhibitory ribonucleic acid), 토포이소머라제 억제제, 유비퀴틴 리가제 억제제, 저메틸화제(hypomethylating agent), 체크포인트 억제제, 펩티드 백신, 종양 항원 유래의 에피토프 또는 네오에피토프, 및 이러한 제제들의 하나 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 추가 치료제와 병용하여 사용하기 위한, 약학 조성물. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제19항에 있어서,
상기 감염성 질환은 HIV, 간염 바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스, 에코바이러스, 리노바이러스, 콕사키 바이러스, 코로나바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 멈프스 바이러스, 로타바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 파보바이러스, 우두 바이러스, HTLV 바이러스, 뎅기 바이러스, 유두종바이러스, 물사마귀 바이러스, 폴리오바이러스, 광견병 바이러스, JC 바이러스 및 아르보바이러스 뇌염 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스에 의해 야기된 질환인, 약학 조성물. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 림프구 감소증 장애의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제21항에 있어서,
상기 조성물로 예방 또는 치료될 대상체는 면역억제되었거나, 면역손상되었거나 면역저하된 것인 약학 조성물. - 삭제
- 삭제
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