ES2963700T3 - Anticuerpo humanizado anti-PD-1 humana - Google Patents

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Abstract

En el presente documento se describen anticuerpos anti-PD-1 humanizados, ácidos nucleicos que los codifican y usos de los mismos para mejorar las respuestas inmunitarias mediante la activación de células T y el tratamiento de enfermedades tales como el cáncer y una enfermedad infecciosa. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpo humanizado anti-PD-1 humana
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de la inmunología y la inmunoterapia, particularmente en el tratamiento de enfermedades humanas. Más específicamente, la presente invención se refiere a un anticuerpo humanizado anti-PD-1 humana o a un fragmento de unión al antígeno del mismo, útil en el tratamiento de enfermedades humanas.
Antecedentes de la invención
La proteína de muerte celular programada 1 (PD-1, también conocida como CD279) es una molécula de proteína de superficie celular que pertenece a la superfamilia de inmunoglobulinas. PD-1 se expresa en los linfocitos T y B, y en los macrófagos, y desempeña una función en el destino y en la diferenciación celular. Particularmente, PD-1, que funciona como un punto de control inmunitario, desempeña una importante función en la regulación por disminución del sistema inmunitario al prevenir la activación de linfocitos T, lo que, a su vez, reduce la autoinmunidad y potencia la autotolerancia. Se han identificado dos ligandos para PD-1, PD-L1 y PD-L2, que se ha demostrado que regulan por disminución la activación de linfocitos T, induciendo señales coinhibidoras en los linfocitos T y potenciado su apóptosis, anergia y agotamiento funcional, tras la unión a PD-1 (Freeman et al., (2000) J Exp Med 192: 1027-34; Latchman et al. (2001) Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. (2002) Eur J Immunol 32:634-43). Los ligandos PD-L1 y PD-L2 no se expresan en células humanas normales, pero pueden ser abundantes en una variedad de cánceres humanos (Dong et al. (2002) Nat Med 8:787-9, Brahmer et al., N Eng J Med, 366(26), 2012; Topalian et al., N Eng J Med, 366(26), 2012; Wolchok et al., N Engl J Med. 11 de julio de 2013; 369(2): 122-133).<p>D-L1 se expresa más ampliamente que PD-L2, y es expresado por una variedad de células hematopoyéticas y no hematopoyéticas. Los tumores, los microbios y los virus han aprovechado las vías coinhibidoras, tales como PD-L1/PD-1, para evadir la defensa y la vigilancia inmunitarias, creando un microambiente inmunosupresor. Particularmente, la vía PD-L1/PD-1 causada por los tumores, los microbios o los virus puede lograr escapar de la vigilancia inmunológica del hospedador a través de una variedad de mecanismos, incluyendo la potenciación de la inactivación de los linfocitos T, fatiga, falta de respuesta y apóptosis, induciendo la amplificación de linfocitos T-reg y mejorando la capacidad intrínseca del tumor para resistir la muerte y la apóptosis. La interacción de PD-1 y PD-L1 mediada por las células cancerosas también conduce a la reducción de los linfocitos infiltrantes de tumores y a la inhibición de la proliferación de los linfocitos T mediada por receptores de linfocitos T al reducir las señales aguas abajo de TCR, dando lugar a una disminución de la activación y a la producción de citocinas (Dong et al. J. Mol. Med. 2003, 81: 281-7; Blank et al. Cancer Immunol. Immunother. 2005, 54: 307-314; Konishi et al. Clin. Cancer Res. 2004, 10: 5094 100). Se ha encontrado la expresión de PD-1 en los linfocitos infiltrantes de tumores o células tumorales en varias biopsias tumorales primarias (Ribas A. Cancer Discov. 2015, 5(9):915-9).
Dado su papel inmunosupresor, los inhibidores de PD-1 se han desarrollado para contrarrestar este efecto nocivo sobre el sistema inmunitario humano. Se cree que dichos inhibidores de PD-1 activan el sistema inmunitario para atacar a los tumores o a las células infectadas y, por lo tanto, pueden usarse para tratar el cáncer y enfermedades. De hecho, las estrategias que usan inhibidores de PD-1 o PD-L1 para interrumpir su interacción han mostrado potencial para mejorar la inmunoterapia contra el cáncer (Brahmer et al., N Eng J Med, 366(26), 2012; Powles et al., Nature, 515(7528), 2014; Topalian et al., N Eng J Med, 366(26), 2012; Ansell, Curr Opin Hematol, 22(4), 2015). Particularmente, el bloqueo de las interacciones entre PD-1 y sus ligandos potencia la inmunidad de los linfocitos T CD8 específicos del tumor que es capaz de eliminar las células tumorales (Topalian S. et al. Curr Opin Immunol.
2012, 24(2):207-12). El efecto inhibidor de PD-1 también se logra a través de un mecanismo doble de potenciación de la apóptosis en los linfocitos T específicos del antígeno de los ganglios linfáticos que, simultáneamente, reduce la apóptosis en linfocitos T reguladores.
En la técnica, se conoce el uso de anticuerpos monoclonales (''mAb'') específicos para el bloqueo de PD-1/PD-L1 para contrarrestar el efecto inmunosupresor de la vía de señalización PD-1/PD-L1. Sin embargo, se han interpuesto importantes problemas prácticos en su uso generalizadoin vivoen los seres humanos. Una preocupación importante es que los anticuerpos monoclonales de origen no humano suelen ser inmunogénicos, limitando así su eficacia y, en algunos casos, causando reacciones alérgicas peligrosas. La respuesta inmunitaria a dichos mAb exógenos incluye la producción de anticuerpos de alta afinidad, específicos, que se unen a y eliminan los mAb, reduciendo así sustancialmente la eficacia de los mAb, potenciando su eliminación del organismo e inhibiendo su capacidad de unirse al antígeno diana. Para solucionar este problema, es posible humanizar el anticuerpo no humano de interés para reducir la inmunogenicidad en los seres humanos, mientras se conserva la especificidad y afinidad del anticuerpo parental no humano (clásicamente, un anticuerpo murino). Dicho anticuerpo humanizado normalmente comprende uno o más dominios variables en los que los dominios de unión al antígeno derivan del anticuerpo no humano, y las regiones estructurales derivan de secuencias de anticuerpos humanos o humanizados.
El documento de patente EP3176180 y Chen et al. (Immunity, 2013, 39, 1-10) desvelan anticuerpos humanizados anti-PD-1 y sus usos para el tratamiento de cáncer o enfermedades infecciosas.
Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar anticuerpos humanizados para proporcionar agentes mejorados para la inmunoterapia segura, especialmente, contra el cáncer, dirigida a la PD-1 humana.
Sumario de la invención
La materia de la presente invención se define por las reivindicaciones y cualquier información que no se encuentre dentro de las reivindicaciones se proporciona para información solo.
La presente invención se refiere al desarrollo de un anticuerpo humanizado dirigido específicamente a PD-1 humana, que muestra una alta afinidad de unión a PD-1 y una fuerte competitividad con su ligando PDL-1 y/o PDL-2. Este anticuerpo humanizado ha sido diseñado para presentar una alta capacidad de fabricación y un alto rendimiento de producción en los sistemas de producción basados en células de mamífero. Este anticuerpo humanizado se denomina en particular en el presente documento "HKLD".
Además, el solicitante ha observado un efecto sustancial e inesperado del anticuerpo que conduce a una acción de fagocitosis de los macrófagos hacia las células tumorales que no expresan PD-L1, con una eficacia prometedora de este anticuerpo, especialmente para el tratamiento de tumores PD-L1 negativos y/o pacientes que padecen una respuesta inmunitaria de linfocitos T deficiente.
Se muestran y se explican potentes efectos beneficiosos e inesperados, especialmente al comienzo de la descripción detallada y en los ejemplos.
En un primer aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal humanizado anti-PD-1 humana o un fragmento de unión al antígeno del mismo comprende:
(a) un VH que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; y (b) un VL que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24,
en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo es un antagonista de la unión de PD-L1 y/o PD-L2 humanos a PD-1 humana.
En un aspecto particular, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende: (a) una cadena pesada que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, y (b) una cadena Iigera que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34.
En un aspecto particular, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende un dominio constante de cadena ligera de un dominio constante de cadena ligera kappa humano y un dominio constante de cadena pesada derivado de un dominio constante de cadena pesada de lgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana.
En un aspecto más específico, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende un dominio constante de cadena ligera de un dominio constante de cadena ligera kappa humano y un dominio constante de cadena pesada de un dominio constante de cadena pesada de IgG1 humana, opcionalmente, con una sustitución o una combinación de sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en N297A, T250Q/M428L; M252Y/S254T/T256E H433K/N434F; E233P/L234V/L235A/G236A A327G/A330S/P331S; E333A; S239D/A330L/I332E; P257I/Q311; K326W/E333S; S239D/I332E/G236A; N297A; L234A/L235A; N297A L234A/L235A; N297A M252Y/S254T/T256E; K322A and K444A, preferentemente, seleccionadas del grupo que consiste en N297A, N297A M252Y/S254T/T256E y N297A L234A/L235A (numeración EU).
En otro aspecto más específico, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende un dominio constante de cadena ligera de un dominio constante de cadena ligera kappa humano y un dominio constante de cadena pesada de un dominio constante de cadena pesada de IgG4 humana, con una sustitución o una combinación de sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S228P; L234A/L235A, S228P M252Y/S254T/T256E y K444A (numeración EU).
En un segundo aspecto, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada o un grupo de moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo como se reivindica en el presente documento.
En un tercer aspecto, la invención se refiere a un vector que comprende la molécula de ácido nucleico aislada o el grupo de moléculas de ácido nucleico aisladas como se reivindica en el presente documento.
La invención también se refiere a una célula hospedadora que comprende la molécula de ácido nucleico aislada y/o el grupo de moléculas de ácido nucleico aisladas y/o el vector de acuerdo con la invención.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método de producción del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende una etapa de cultivo de una célula hospedadora como se reivindica en el presente documento y, opcionalmente, una etapa de aislamiento del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno.
En otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo y/o la molécula de ácido nucleico aislada y/o un grupo de moléculas de ácido nucleico aisladas y/o el vector y/o la célula hospedadora como se reivindica en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Opcionalmente, la composición farmacéutica comprende además un agente terapéutico adicional. Particularmente, el anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, la composición farmacéutica, la molécula de ácido nucleico aislada o el grupo de moléculas de ácido nucleico aisladas, el vector o la célula hospedadora son para su uso como un medicamento.
Opcionalmente, el anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, la composición farmacéutica, la molécula de ácido nucleico aislada o el grupo de moléculas de ácido nucleico aisladas, el vector o la célula hospedadora se usan en combinación con radioterapia o un agente terapéutico adicional.
En un aspecto, el anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, la composición farmacéutica, la molécula de ácido nucleico aislada o el grupo de moléculas de ácido nucleico aisladas, el vector, o la célula hospedadora para su uso como un medicamento son para su uso en el tratamiento del cáncer. Preferentemente, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en una neoplasia maligna hematológica o un tumor sólido con expresión de PD-1 y/o PD-L1, un cáncer seleccionado del grupo que consiste en neoplasias hematolinfoides, linfoma angioinmunoblástico de linfocitos T, síndrome mielodisplásico y leucemia mieloide aguda, un cáncer inducido por virus o asociado con inmunodeficiencia, un cáncer seleccionado del grupo que consiste en sarcoma de Kaposi cáncer de células escamosas cervical, anal, de pene y vulvar, y cánceres de orofaringe; linfomas no Hodgkin de linfocitos B (LNH), incluyendo el linfoma difuso de linfocitos B grande, linfoma de Burkitt, linfoma plasmablástico, linfoma primario del sistema nervioso central, linfoma primario de derrame de HHV-8, linfoma de Hodgkin clásico y trastornos linfoproliferativos y/o el virus del herpes del sarcoma de Kaposi); carcinoma hepatocelular; carcinoma de células de Merkel; y cáncer asociado con la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), y un cáncer seleccionado del grupo que consiste en melanoma metastásico o no metastásico, mesotelioma maligno, cáncer de pulmón no microcítico, carcinoma de células renales, linfoma de Hodgkin, cáncer de cabeza y cuello, carcinoma urotelial, cáncer colorrectal, carcinoma hepatocelular, cáncer de pulmón microcítico, carcinoma de células de Merkel metastásico, cánceres gástrico y gastroesofágico, y cáncer cervical.
En un aspecto particular, el anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, la composición farmacéutica, la molécula de ácido nucleico aislada o el grupo de moléculas de ácido nucleico aisladas, el vector, o la célula hospedadora es para su uso en el tratamiento de un cáncer, en donde las células tumorales son negativas para PD-L1. Preferentemente, el anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, la composición farmacéutica, la molécula de ácido nucleico aislada o el grupo de moléculas de ácido nucleico aisladas, el vector, o la célula hospedadora para su uso como un medicamento son para su uso en el tratamiento de una enfermedad infecciosa, preferentemente, una enfermedad infecciosa crónica, incluso más preferentemente, causada por un virus seleccionado del grupo que consiste en VIH, virus de la hepatitis, virus del herpes, adenovirus, virus de la gripe, flavivirus, ecovirus, rinovirus, virus coxsackie, coronavirus, virus sincitial respiratorio, virus de las paperas, rotavirus, virus del sarampión, virus de la rubeola, parvovirus, virus de la variolovacuna, virus HTLV, virus del dengue, virus del papiloma, virus de molusco, virus de la poliomielitis, virus de la rabia, virus JC y virus de Ia encefalitis arboviral.
En un aspecto particular, el anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, la composición farmacéutica, la molécula de ácido nucleico aislada o el grupo de moléculas de ácido nucleico aisladas, el vector, o la célula hospedadora, se usa para el tratamiento de pacientes con un trastorno linfopénico.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: Unión de las diferentes variantes de anticuerpos humanizados anti-PD1 en PD1 humana mediante ELISA y FACS:A: Análisis de ELISA de la unión de anticuerpos a diferentes concentraciones (ng/ml): Anticuerpos quiméricos (•) y variantes de anticuerpos humanizados anti-PD1 de variantes de cadena pesada HC (■), HE (▲), HG (▼), h H (♦), HJ (o), HI (□), HK (A) a HL (®) combinadas con la variante de cadena ligera LD. La detección se realizó con un anticuerpo anti-humano de burro acoplado a peroxidasa, y la revelación se realizó por colorimetría a 450 nm usando sustrato TMB. DE50 se refiere a la concentración necesaria para alcanzar el 50 % de la señal en este ensayo.B: Evaluación de la unión de los anticuerpos mediante citofluorometría en CMSP humanas estimuladas con CD3/CD28. Dilución en serie (pg/ml) de HELC (■), se añadió HELD (▼) y se reveló usando un mAb de Fc de ratón anti-humano marcado con PE y un citómetro Canto II. Los datos están representados por la tinción a intensidad de fluorescencia media (IFM) en la población de linfocitos T CD3+ positiva en PD1+.C: Evaluación de la unión de anticuerpos por citofluorometría en linfocitos T estimulados con CD3/CD28. Se añadieron diluciones en serie (pg/ml) de anticuerpos humanizados y se revelaron usando un mAb de Fc de ratón anti-humano marcado con PE y un citómetro Canto II. Los datos están representados por la tinción a intensidad de fluorescencia media (IFM) en la población de linfocitos T CD3+ positiva en PD1+.
Figura 2: Pérdida de unión de algunos anticuerpos anti-PD1 humanizados contra PD1 humana tras la mutación de aminoácidos durante el proceso de humanización: Unión mediante ELISA de las variantes anti-PD1 humanizadas tras mutaciones en la cadena variable pesada en la posición de Kabat 97 (es decir, la posición de aminoácido convencional 101 ).(A): donde HC(E97)LB2 (•) y HC(D97)LB2 (□) se comparan con el Quimérico (Δ), en la posición de Kabat R96(B): donde HELD (•) y HE(K96)LD (□) se comparan con el quimérico (A).
(C), (D) y (E): Unión mediante ELISA de variantes anti-PD1 humanizadas tras mutaciones en la cadena variable ligera en la posición de Kabat N28(C): donde HCLw(N28) (□) y HCLw(Q28) (•) se comparan con el Quimérico (A), en la posición de Kabat V94(D): donde Hwt-LA(E34) (■) and HwtLA(N34) (o) se comparan con el quimérico (A)(E): donde HELD(V94) y HELD(L94) se comparan con el Quimérico (A), en la posición de Kabat E34. Para la cadena pesada, la posición de Kabat 96 corresponde a la posición secuencial 100, y la posición de Kabat 97 corresponde a la posición secuencial 101. Para la cadena ligera, la posición de Kabat 28 corresponde a la posición secuencial 33, la posición de Kabat 34 corresponde a la posición secuencial 39 y la posición de Kabat 94 corresponde a la posición secuencial 99.
Figura 3: Medición de la estabilidad de las variantes de anticuerpo anti-PD1 humanizado tras 7 días a 4 °C o 37 °C en la unión de PD1 mediante ELISA. Días 0 (•), día 7 a 4 °C (■) y día 7 a 37 °C (▲)
Figura 4: Actividad antagonista de las variantes de anticuerpo humanizado anti-PD1 en la interacción PD1-PDL1:
A: competitividad entre PDL1 y variantes de anticuerpo humanizado anti-PD1 en la unión a PD1 medida mediante Biacore
B: competitividad entre anticuerpos humanizados y PDL1 en PD1 medida mediante Blitz. Los datos se representan en porcentaje de respuesta de unión, donde el 100 % representa Ka de la interacción de PD1/PD-L1 sin anticuerpo (Respuesta relativa).
C. Estudio de unión de PD1 a PDL1 en presencia de una mayor concentración de variantes de anticuerpo humanizado anti-PD1 mediante ELISA, lo que conduce a la medición del valor de Cl50 de cada variante de anticuerpo.
Figura 5: Actividad antagonista de las variantes de anticuerpo humanizado anti-PD1 en PD1-PDL2 A. competitividad entre PDL2 y variantes de anticuerpo humanizado anti-PD1 en la unión a PD1 medida mediante Biacore:
B. Estudio de unión de PD1 a PDL2 en presencia de un aumento de la concentración de variantes de anticuerpo (HKLD) humanizado anti-PD1 mediante ELISA.
Figura 6: Mayor productividad de las variantes de anticuerpo humanizado anti-PD1 en comparación con la variante quimérica y la Keytruda en células de mamífero. Se transfectaron transitoriamente células CHO-K1 adherentes con ADN codificante de anticuerpo Keytruda, HKLD o quimérico anti-PD-1 en placa de 12 pociIIos. La productividad se dosificó mediante ELISA usando (anticuerpo Fc de burro anti-humano inmovilizado para la detección y revelación con un anticuerpo kappa anti-humano de ratón anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa). La concentración se determinó con el patrón de IvIgG humano. Los datos se normalizaron con respecto a la productividad del anticuerpo quimérico anti-PD-1.
Figura 7: Bioensayo sobre la fosforilación de SHP1 que mide la actividad antagonista de las variantes de anticuerpo humanizado anti-PD1 para bloquear la señalización de PD1: Se probó la señalización de PD-1 usando un bioensayo Discoverx. La quimioluminiscencia (URL: (Señal de Iuminiscencia relativa) medida es proporcional a la activación de la señalización de PD-1.A: representa los resultados que comparan diferentes concentraciones (pg/ml) de variantes de anticuerpo humanizado anti-PD1 con la variante LD de la cadena ligera.
B: representa los resultados que comparan las variantes LD y LC de la cadena ligera combinadas con la variante HE de la cadena pesada (anticuerpos HELC o HELD). CI50 (ng/ml) se refiere a la concentración requerida para alcanzar el 50 % de la inhibición de la señal.
Figura 8: Bioensayo que mide la activación de linfocitos T en presencia de una variante de anticuerpo humanizado anti-PD1. Se realizó un bioensayo de PD-1/PD-L1 de Promega usando el sistema indicador de luciferasa NFAT. Se analizó la dilución en serie de cada variante de anticuerpo anti-PD1 humanizado. El eje X representa la concentración del anticuerpo en pg/ml. CE50 (pg/ml) se refiere a la concentración de anticuerpo necesaria para alcanzar el 50 % de la luminiscencia máxima.
Figura 9: Secreción de IFNgamma por los linfocitos T después del tratamiento con el anticuerpo PD-1 humanizado en un ensayo de reacción mixta de leucocitos. Se cultivaron células dendríticas derivadas de monocitos junto con linfocitos T CD4 alógenos durante 5 días.A. Nivel de lFNg en el sobrenadante cuantificado mediante ELISA. Se probó la respuesta a la curva de dosis de los anticuerpos HKLD (negro ■) o de control de isotipo lgG4 (gris •). Los datos representan 4 experimentos independientes. La significación estadística *p < 0,05 se calculó con la prueba de latde Student.
Figura 10: Eficacia in vivo de la variante humanizada anti-PD-1 en un modelo de ratón con mesotelioma que expresa la forma humana de PD-1. Se modificaron genéticamente los ratones para que expresaran la parte extracelular de la PD-1 humana en la que el exón 2 del gen PDCD1 fue reemplazado por el homólogo humano (con permiso de Oxford University Innovation). Se inyectaron células del mesotelioma AK7 ortotópicamente en la cavidad pleural y se midió el crecimiento tumoral por bioluminiscencia (fotón/s/cm2/sr) (A) y se evaluó la supervivencia general (B). Los ratones fueron tratados con PBS (•) (control negativo) o con la forma humanizada anti-PD-1 (variante HKLD) (A) o un control anti-PD-1 (■).
Figura 11: Eficacia in vivo de la variante anti-PD-1 humanizada en el modelo de ratón de carcinoma de colon MC38 ectópico que expresa la forma humana de PD-1. Se inyectaron MC38 por vía subcutánea, y los ratones se trataron con PBS (gris •) (control negativo) o con la forma humanizada anti-PD-1 (variante HKLD) (negro A), y se evaluó el volumen tumoral (A) y la supervivencia general (B).
Figura 12: Eficacia in vivo de Ia variante anti-PD-1 humanizada en el modelo de ratón con hepatocarcinoma. Células Hepa1.6 inoculadas en la vena porta de los ratones forman un modelo de hepatocarcinoma. Se trataron ratones con el IgG4 de control de isotipo (gris •) (control negativo) o con la forma humanizada anti-PD-1 (variante HKLD) (negro •) Se evaluó la supervivencia global.
Figura 13: Farmacocinética del anticuerpo humanizado PD-1 en macaco cangrejero y ratones tras una sola inyección.A: Ratones Balb/C recibieron por vía intravenosa el isotipo IgG4 S228P de la variante HKLD (•) o el isotipo IgG1 N298A de la variante HKLD (■) o Keytruda (1 dosis a 5 mg/kg) (gris 1).B: Los ratones BaIb/C recibieron mediante inyección por vía intravenosa (■) o subcutánea (•) el isotipo IgG4 S228P de la variante HKLD (1 dosis de 5 mg/kg).C: Los macados cangrejeros recibieron mediante inyección por vía intravenosa a 1 mg/kg (•) o 5 mg/kg (■) Ia variante HKLD. El anticuerpo anti-PD-1 se cuantificó en los sueros mediante ELISA interno o usando tecnología MSD.
Figura 14: Anti-PD-1 humanizado potencia la fagocitosis de células tumorales negativas PD-L1 al bloquear la interacción negativa de PD-L1/PD-1 en los macrófagos.A. Tinción de citometría de flujo de PD-1/PD-L1 de células Raji, M0, M1 y macrófagos usados para el ensayo de fagocitosis;B. Ensayo de fagocitosisin vitrocon anticuerpo anti-PD-1 humanizado. Se tiñeron macrófagos M1 humanos con tinte de proliferación celular eFIuor450 y se incubaron con células Raji marcadas con CPDeFIuor670 durante 1 hora en presencia de Rituximab (10 ng/ml) y control de isotipo o anti-PD-1 humanizado (HKLD, 10 ug/ml). Los datos representan la fagocitosis de 3 experimentos independientes y se normalizan con respecto a la fagocitosis máxima.C. se realizó el mismo ensayo de fagocitosis con macrófagos M1 y células Raji en presencia de control de isotipo, anticuerpo anti-PD-1 humanizado, pembrolizumab o nivolumab (10 ug/ml).D. Ensayo de fagocitosis de macrófagos M0 frente a macrófagos M1 con células Raji incubadas con control de isotipo, anti-PD-1 humanizado. Los datos se representan en el factor de cambio de Ia fagocitosis en comparación con el control de isotipo.
Descripción detallada de la invención
Introducción
Los anticuerpos anti-hPD1 humanizados desvelados en el presente documento (HKLD) tiene todas las siguientes ventajas:
- Tienen un alto porcentaje de humanización, particularmente, una puntuación T20 de humanidad del 91,07 % para la cadena pesada y del 88,7 % para la cadena ligera. En comparación, el anticuerpo anti-PD1 denominado Keytruda, que es un anticuerpo clínicamente aprobado y es un patrón, tiene una puntuación T20 de humanidad del 75,7 % para la cadena pesada y del 82,7 % para la cadena ligera (véase la Tabla 9). La puntuación T20 de humanidad es un parámetro comúnmente usado en el campo de la humanización de anticuerpos desvelado por primera vez por Gao et al. (BMC Biotechnol, 2013, 13, 55). La puntuación T20 de humanidad normalmente se usa en la solicitud de patente para definir un anticuerpo humanizado (por ejemplo, documentos de patente WO15161311, WO17127664, WO18136626, WO18190719, WO19060750 o WO19170677).
- Sorprendentemente, presenta una alta capacidad de fabricación y un alto rendimiento de productividad cuando se produce en células de mamíferos (por ejemplo, COS, CHO) en comparación con un anticuerpo quimérico. De hecho, en las células CHO y en las células COS, tiene un aumento de la producción de un factor de cambio de 3 4 en comparación con el anticuerpo quimérico (véase la Tabla 11) y un aumento de la producción del doble en comparación con Keytruda (véase la Figura 6).
- Presenta una afinidad de unión (KD) por una PD-1 humana inferior a 10-8 M. El anticuerpo humanizado de la invención muestra una mejora de la unión a PD-1 en comparación con el anticuerpo quimérico según lo evaluado mediante diferentes métodos. La afinidad del anticuerpo humanizado HKLD es comparable a Ia del anticuerpo anti-PD1 denominado Keytruda (véase la Tabla 7).
- Tiene una actividad antagonista e inhibe la unión de PD-L1 y/o PD-L2 humanas a PD-1 humana (véase la Tabla 13). Más particularmente, en comparación con el anticuerpo quimérico, el anticuerpo humanizado de la invención muestra una mejora en la unión a las células que expresan PD1 (Figura 1C) y capacidad antagonista (véanse las Tablas 14 y 15).
- Es altamente estable (véase la Tabla 12).
- Bloquea la señalización de PD-1 (fosforilación y reclutamiento de SHP-1, véanse la Tabla 15 y la Figura 7) y potencia la activación de los linfocitos T (activación mediada por NFAT, véanse la Tabla 16 y la Figura 8).
- Estimula la secreción de citocina efectora por los linfocitos T humanos, más particularmente, la secreción de citocina IFNg (Figura 9).
- Por consiguiente, es capaz de restablecer la activación de los linfocitos T.
- Potencia la respuesta inmunitaria antitumoralin vivo.De hecho, el anticuerpo humanizado de la invención es capaz de reducir el tamaño del tumor y aumentar la supervivencia en varios tipos de tumores (Figuras 10-12). - Tiene una sorprendente ventaja adicional, porque es capaz de mejorar la fagocitosis de las células tumorales que son negativas en PD-L1 al bloquear la unión de PDL1/PD-1 en los macrófagos (Figura 14). Este efecto es específico del anticuerpo anti-PD-1 humanizado de la invención, pues no se ha observado con otros anticuerpos anti-PD-1, especialmente pembrolizumab y nivolumab (Figura 14C). Por lo tanto, el anticuerpo anti-PD-1 humanizado de la invención induce una respuesta inmunitaria contra las células tumorales que no expresan PD-L1 a través de esta fagocitosis. Esta propiedad es de particular interés para los pacientes inmunosuprimidos o inmunodeprimidos y/o para tratar tumores que comprenden células tumorales que no expresan PD-L1. Más particularmente, es útil para el tratamiento de pacientes que pueden tener un número bajo de linfocitos T, especialmente los linfocitos T infiltrados en tumores y/o que tienen un alto número de linfocitos T agotados. De hecho, el anticuerpo puede tener un efecto antitumoral adicional a través de la activación de la fagocitosis por los macrófagos. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, los inventores creen que el efecto específico del anticuerpo de la presente invención sobre los macrófagos podría deberse a su capacidad para unirse a PD-1 y PD-L1 en la misma célula, concretamente el mismo macrófago.
- Finalmente, el anticuerpo humanizado de la invención presenta una farmacocinética favorable (Figura 13). En conjunto, el anticuerpo anti-PD1 humanizado de la invención presenta una humanización muy alta, incluso en comparación con Keytruda, un anti-PD1 ya aprobado clínicamente. En comparación con el anticuerpo quimérico, presenta sorprendentemente un mejor rendimiento de productividad, una mejor unión a PD-1 y una mejor capacidad antagonista. Es estable y tiene una farmacocinética favorable. Potencia la activación de los linfocitos T, activa la fagocitosis por macrófagos y potencia la respuesta inmunitaria antitumoralin vivo.
Definiciones
Con el fin de que se pueda entender más fácilmente la presente divulgación, a continuación se definen ciertos términos. Se establecen definiciones adicionales a lo largo de la descripción detallada.
A menos que se definan de otra manera, todos los términos de la técnica, anotaciones y otra terminología científica usada en el presente documento pretenden tener los significados comúnmente comprendidos por los expertos en la materia a la que pertenece la presente invención. En algunos casos, los términos con significados comúnmente comprendidos se definen en el presente documento con fines de claridad y/o para tener una referencia inmediata, y la inclusión de dichas definiciones en el presente documento no se ha de considerar necesariamente como representativa de una diferencia frente a lo que se comprende generalmente en la técnica. Las técnicas y los procedimientos descritos o referenciados en el presente documento generalmente se comprenden bien y se emplean comúnmente usando metodologías convencionales por los expertos en la materia
Como se usa en el presente documento, las expresiones "muerte programada 1", "muerte celular programada 1", "PD1", "PD-1", "PDCD1 "antígeno PD-1", "PD-1 humana", "hPD-1" y "hPD1" se usan indistintamente y se refieren al receptor de la muerte programada 1, también conocido como CD279, e incluye variantes e isoformas de PD-1 humana, y análogos que tienen al menos un epítopo común con PD-1. PD-1 es un regulador clave del umbral de la respuesta inmunitaria y la tolerancia inmunitaria periférica. Se expresa en linfocitos T, linfocitos B, monocitos y células dendríticas activados, y se une a sus ligandos PD-L1 y PD-L2. La PD-1 humana está codificada por el gen PDCD1. Como ejemplo, la secuencia de aminoácidos de una PD-1 humana se desvela con el número de acceso de GenBank NP_005009. PD1 tiene cuatro variantes de corte y empalme expresadas en células mononucleares de sangre periférica humana (CMSP). Por consiguiente, las proteínas PD-1 incluyen PD-1 de longitud completa, así como variantes alternativas de corte y empalme de PD-1, tales como PD-1Aex2, PD-1Aex3, PD-1Aex2,3 y PD-1Aex2,3,4. A menos que se especifique lo contrario, los términos incluyen cualquier variante e isoforma de PD-1 humana que es expresada de manera natural por CMSP, o que es expresada por células transfectadas con un gen PD-1.
Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" describe un tipo de molécula de inmunoglobulina, y se usa en su sentido más amplio. En particular, los anticuerpos incluyen moléculas de inmunoglobulina y fragmentos inmunológicamente activos de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión al antígeno. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente. A menos que se indique específicamente lo contrario, el término "anticuerpo" incluye inmunoglobulinas intactas y "fragmento de anticuerpo" o "fragmento de unión al antígeno" (tal como Fab, Fab', F(ab')2, Fv), monocatenario (scFv), mutantes de los mismos, moléculas que comprenden una parte de anticuerpo, diacuerpos, anticuerpos lineales, anticuerpos monocatenarios y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprende un sitio de reconocimiento del antígeno de la especificidad requerida, incluyendo las variantes de glicosilación de anticuerpos, variantes de secuencia de aminoácidos de anticuerpos. Preferentemente, el término "anticuerpo" se refiere a un anticuerpo humanizado.
Como se usa en el presente documento, un "fragmento de unión al antígeno" de un anticuerpo significa una parte de un anticuerpo, es decir, una molécula correspondiente a una parte de la estructura del anticuerpo de la divulgación, que presenta capacidad de unión al antígeno para PD-1, posiblemente en su forma nativa; dicho fragmento presenta especialmente la misma o sustancialmente la misma especificidad de unión al antígeno por dicho antígeno en comparación con la especificidad de unión al antígeno del anticuerpo de cuatro cadenas correspondiente. Ventajosamente, los fragmentos de unión al antígeno tienen una afinidad de unión similar a la de los anticuerpos de 4 cadenas correspondientes. Sin embargo, el fragmento de unión al antígeno que tiene una afinidad de unión al antígeno reducida con respecto a los anticuerpos de 4 cadenas correspondientes también se incluye dentro de la invención. La capacidad de unión al antígeno se puede determinar midiendo la afinidad entre el anticuerpo y el fragmento diana. Estos fragmentos de unión al antígeno también pueden designarse "fragmentos funcionales" de anticuerpos. Los fragmentos de anticuerpos de unión al antígeno son fragmentos que comprenden sus dominios hipervariables designados CDR (regiones determinantes de la complementariedad) o parte(s) de los mismos que abarcan el sitio de reconocimiento para el antígeno, es decir, el dominio extracelular de PD1, definiendo así la especificidad de reconocimiento del antígeno.
Un fragmento "Fab" contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab en la adición de unos pocos restos en el extremo carboxilo del dominio CH1 de cadena pesada incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Los fragmentos F(ab') se producen mediante la escisión del enlace disulfuro en las cisteínas de bisagra del producto de digestión con pepsina F(ab')2. Los expertos en la materia conocen acoplamientos químicos adicionales de fragmentos de anticuerpos. Los fragmentos Fab y F(ab')2 carecen del fragmento Fc de un anticuerpo intacto, se eliminan más rápidamente de la circulación de los animales y pueden tener una unión de tejido menos inespecífica que un anticuerpo intacto (véase, por ejemplo, Wahl et al., 1983, J. Nucl. Med. 24:316).
Un fragmento "Fv" es el fragmento mínimo de un anticuerpo que contiene un sitio de reconocimiento y unión al antígeno completo. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en asociación estrecha, no covalente (dímero VH-VL). Es en esta configuración donde las tres CDR de cada dominio variable interaccionan para definir un sitio de unión a la diana en la superficie del dímero VH-VL. A menudo, las seis CDR confieren al anticuerpo especificidad de unión a la diana. Sin embargo, en algunos casos, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que solo comprende tres CDR específicas de una diana) puede tener la capacidad de reconocer y de unirse a la diana, aunque con una afinidad menor que el sitio de unión completo.
Los fragmentos de unión de anticuerpos "Fv monocatenarios" o "scFv" comprenden los dominios VH y VL de un anticuerpo, donde estos dominios están presentes en una sola cadena polipeptídica. Generalmente, el polipéptido Fv comprende además un conector polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite al scFv formar la estructura deseada para la unión a la diana.
Los "anticuerpos de un solo dominio" están compuestos por un solo dominio VH o VL que presentan suficiente afinidad por PD-1. En un aspecto específico, el anticuerpo de un solo dominio puede ser un anticuerpo camelizado {véase, por ejemplo, Riechmann, 1999, Journal of Immunological Methods 231:25-38).
En términos de estructura, un anticuerpo puede tener cadenas pesadas (H) y cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Hay dos tipos de cadena ligera, lambda (A) y kappa (k). Cada cadena pesada y ligera contiene una región constante y una región variable (o "dominio"). Las regiones variables de la cadena ligera y pesada contienen una región "estructural" interrumpida por tres regiones hipervariables, también denominadas "regiones determinantes de Ia complementariedad" o "CDR". La extensión de la región estructural y las CDR se han definido (véase, Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", y el Departamento Estadounidense de Salud y Servicios Sociales, 1991). Preferentemente, las CDR se definen de acuerdo con el método de Kabat. Las regiones marco estructurales actúan para formar un armazón que proporciona, para situar las CDR en la orientación correcta entre cadenas, interacciones no covalentes. Las CDR son responsables principalmente de la unión a un epítopo de un antígeno. Las CDR de cada cadena se denominan normalmente "región determinante de Ia complementariedad 1" o "CDR1", "CDR2" y "CDR3", numeradas secuencialmente comenzando desde el extremo N. El dominio VL y VH del anticuerpo de acuerdo con la presente divulgación puede comprender cuatro regiones estructurales o "FR", que se denominan en la técnica y en el presente documento "región estructural 1" o "FR1", "FR2", "FR3" y "FR4", respectivamente. Estas regiones estructurales y regiones determinantes de la complementariedad están preferentemente unidas operativamente en el siguiente orden: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (de extremo amino al extremo carboxi).
Una "cadena pesada de anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere al mayor de los dos tipos de cadenas de polipéptido presentes en las conformaciones de anticuerpo. Las CDR de la cadena pesada de anticuerpo normalmente se denominan "HCDR1", "HCDR2" y "HCDR3". Las regiones estructurales de la cadena pesada de anticuerpo normalmente se denominan "HFR1", "HFR2", "HFR3" y "HFR4".
Una "cadena ligera de anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere al menor de los dos tipos de cadenas de polipéptido presentes en las conformaciones de anticuerpos, y las cadenas ligeras<k>y A se refieren a los dos isotipos principales de cadena ligera de los anticuerpos. Las CDR de la cadena ligera de anticuerpo normalmente se denominan "LCDR1", "LCDR2" y "LCDR3". Las regiones estructurales de la cadena ligera de anticuerpo normalmente se denominan "LFR1", "LFR2", "LFR3" y "LFR4".
Con respecto a la unión de un anticuerpo a una molécula diana, los términos "unir" o "unión" se refieren a péptidos, polipéptidos, proteínas, proteínas de fusión y anticuerpos (incluyendo fragmentos de anticuerpo) que reconocen y entran en contacto con un antígeno. Preferentemente, se refiere a una interacción de tipo antígeno-anticuerpo. Las expresiones "unión específica", "se une específicamente a", "específico/a de", "se une selectivamente" y "selectivo/a de" un determinado antígeno (por ejemplo, PD-1) o un epítopo en un determinado antígeno (por ejemplo, PD-1) significan que el anticuerpo reconoce y se une a un antígeno específico, pero no reconoce ni se une sustancialmente a otras moléculas de una muestra. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente (o preferentemente) a PD-1 o a un epítopo de PD-1 es un anticuerpo que se une a este epítopo de PD-1, por ejemplo, con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración de la que se une a otros epítopos de PD-1 o epítopos no de PD-1. Preferentemente, la expresión "unión específica" significa el contacto entre un anticuerpo y un antígeno con una afinidad de unión igual o inferior a 10-7 M. En ciertos aspectos, los anticuerpos se unen con afinidades iguales o inferiores a 10-8 M, 10-9 M o 10-10 M.
Como se usa en el presente documento, "anticuerpo PD-1", "anticuerpo anti-PD-1", "Ab PD-1", "anticuerpo específico de PD-1" o "Ab anti-PD-1" o "anticuerpo anti-PD-1 humanizado" se usan indistintamente y se refieren a un anticuerpo, como se describe en el presente documento, que se une específicamente a PD-1, preferentemente a PD-1 humana. En algunos aspectos, el anticuerpo se une al dominio extracelular de PD-1. Particularmente, un anticuerpo anti-PD-1 es un anticuerpo capaz de unirse a un antígeno PD-1 e inhibir la vía de señalización mediada por PD-1, mejorando así las respuestas inmunitarias, tales como la activación de linfocitos T.
Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo humanizado" se refiere a anticuerpos en los que las secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como de un ratón, se han injertado en secuencias de región estructural humanas (por ejemplo, anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de un anticuerpo no humano). Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, también se refiere a un anticuerpo que ha sido sometido a humanización. En general, un anticuerpo humanizado es una inmunoglobulina humana (anticuerpo receptor) en la que los residuos de una o más CDR están reemplazados por residuos de al menos una CDR de un anticuerpo no humano (anticuerpo donante) mientras se mantiene la especificidad, afinidad y capacidad del anticuerpo original deseados. El anticuerpo donante puede ser cualquier anticuerpo no humano adecuado, tal como de un ratón, una rata, un conejo, un pollo, o anticuerpo de primate no humano que tiene una especificidad, afinidad o efecto biológico deseados. En algunos casos, los residuos de la región estructural seleccionados del anticuerpo receptor están reemplazados por los residuos de la región estructural del anticuerpo donante. Alternativamente, los residuos de la región estructural seleccionada del anticuerpo donante están reemplazados por residuos de la región estructural de un anticuerpo humano o humanizado. Se pueden realizar modificaciones adicionales de la región estructural dentro de las secuencias de la región estructural humana. Por lo tanto, los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donante. Dichas modificaciones de aminoácidos pueden realizarse para perfeccionar aún más la función del anticuerpo y/o aumentar el proceso de humanización. Por "cambio de aminoácidos" o "modificación de aminoácidos" se entiende en el presente documento un cambio en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido. Las "modificaciones de aminoácidos" incluyen la sustitución, inserción y/o eliminación en una secuencia de polipéptido. Por "sustitución de aminoácidos" o "sustitución" en el presente documento se entiende el reemplazo de un aminoácido de una determinada posición de una secuencia de polipéptido parental por otro aminoácido. Por "inserción de aminoácido" o "inserción" se entiende la adición de un aminoácido en una determinada posición de una secuencia de polipéptido parental. Por "eliminación de aminoácido" o "eliminación" se entiende la eliminación de un aminoácido de una determinada posición de una secuencia de polipéptido parental. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser conservativas. Una sustitución conservativa es el reemplazo de un residuo de aminoácido dado por otro residuo que tiene una cadena lateral ("grupo R") con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga, voluminosidad y/o hidrofobia). Como se usa en el presente documento, "posición de aminoácido" o "número de posición de aminoácido" se usan indistintamente y se refieren a la posición de un determinado aminoácido en una secuencia de aminoácidos, en general, especificada con los códigos de una letra para los aminoácidos. Se debe considerar que el primer aminoácido de la secuencia de aminoácidos (es decir, a partir del extremo N) tiene la posición 1.
Una sustitución conservativa es el reemplazo de un residuo de aminoácido dado por otro residuo que tiene una cadena lateral ("grupo R") con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga, voluminosidad y/o hidrofobia). En general, una sustitución de aminoácidos conservativa no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. Las sustituciones conservativas y las reglas correspondientes están bien descritas en el estado de la técnica. Por ejemplo, las sustituciones conservativas se pueden definir mediante sustituciones dentro de los grupos de aminoácidos reflejados en las siguientes tablas:
Tabla A - Resto de aminoácido
Tabla B - Grupos alternativos de sustituciones conservativas de restos de aminoácidos
Tabla C - Otras clasificaciones físicas y funcionales alternativas de los residuos de aminoácidos
Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo aislado" es un anticuerpo que se ha separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Un anticuerpo aislado incluye un anticuerpoin situdentro de células recombinantes, dado que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no está presente. En algunos aspectos, un anticuerpo se purifica hasta la homogeneidad y/o hasta más del 90 %, 95 % o 99 % de pureza según lo determinado por, por ejemplo, medios electroforéticos (por ejemplo, SDS-PAGE, isoelectroenfoque (IEF), electroforesis capilar) o cromatográficos (por ejemplo, intercambio iónico o HPLC de fase inversa) en condiciones reductoras o no reductoras.
Los términos "derivar de" y "derivado de", como se usan en el presente documento, se refieren a un compuesto que tiene una estructura derivada de la estructura de un compuesto o proteína parental y cuya estructura es suficientemente similar a las desveladas en el presente documento y basándose en esa similitud, un experto en la materia esperaría que presentara las mismas propiedades, actividades y utilidades o similares que los compuestos reivindicados. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado derivado de un anticuerpo murino se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comparte propiedades similares con el anticuerpo murino, por ejemplo, reconoce el mismo epítopo, comparte V<h>y VL similares con restos modificados que participan y/o aumentan la humanización del anticuerpo.
El término "tratamiento" se refiere a cualquier acto destinado a mejorar el estado de salud de los pacientes, tales como terapia, prevención, profilaxis y retraso de la enfermedad o de los síntomas de la enfermedad. Designa tanto un tratamiento curativo como un tratamiento profiláctico de una enfermedad. Un tratamiento curativo se define como un tratamiento que produce la cura o un tratamiento que alivia, mejora y/o elimina, reduce y/o estabiliza una enfermedad o los síntomas de una enfermedad o el sufrimiento que causa directa o indirectamente. Un tratamiento profiláctico comprende tanto un tratamiento que produce la prevención de una enfermedad como un tratamiento que reduce y/o retrasa la progresión y/o la incidencia de una enfermedad o el riesgo de que se produzca. Dicho término puede referirse a la mejoría o erradicación de una enfermedad, un trastorno, una infección o síntomas asociados a ella. En otros aspectos, este término se refiere a la reducción al mínimo de la propagación o del empeoramiento de los cánceres. Los tratamientos de acuerdo con la presente invención no implican necesariamente el tratamiento del 100 % o el tratamiento completo. Más bien, existen diversos grados de tratamiento, de los cuales un experto en la materia reconoce que tienen un beneficio potencial o efecto terapéutico. Preferentemente, el término "tratamiento" se refiere a la aplicación o administración de una composición que incluye uno o más agentes activos a un sujeto que tiene un trastorno/una enfermedad, por ejemplo, asociado con la vía de señalización mediada por PD-1.
Como se usan en el presente documento, los términos "trastorno" o "enfermedad" se refieren al funcionamiento incorrecto de un órgano, una parte, una estructura o un sistema del cuerpo como consecuencia del efecto de errores genéticos o de desarrollo, una infección, venenos, deficiencia nutricional o desequilibrio, toxicidad o factores ambientales desfavorables. Preferentemente, estos términos se refieren a un trastorno de salud o una enfermedad, por ejemplo, una enfermedad que interrumpe las funciones físicas o mentales normales. Más preferentemente, el término trastorno se refiere a enfermedades inmunitarias y/o inflamatorias que afectan a animales y/o a seres humanos, tales como cáncer.
La expresión "enfermedad inmunitaria", como se usa en el presente documento, se refiere a una afección de un sujeto caracterizada por una lesión celular, tisular y/u orgánica causada por una reacción inmunitaria del sujeto a sus propias células, tejidos y/u órganos. La expresión "enfermedad inflamatoria" se refiere a una afección de un sujeto caracterizada por inflamación, por ejemplo, inflamación crónica. Los trastornos autoinmunitarios pueden estar asociados o no con la inflamación. Además, la inflamación puede ser provocada o no por un trastorno autoinmunitario.
El término "cáncer", como se usa en el presente documento, se define como una enfermedad caracterizada por el crecimiento rápido e incontrolado de células aberrantes. Las células cancerosas pueden diseminarse localmente o a través del torrente sanguíneo y el sistema linfático a otras partes del cuerpo.
Como se usa en el presente documento, la expresión "enfermedad asociada o relacionada con PD-1", "cáncer positivo en PD-1" o "enfermedad infecciosa positiva en PD-1" se refiere al cáncer o a la enfermedad infecciosa (por ejemplo, causada por un virus y/o una bacteria) que es el resultado de la expresión de PD-1 o que tiene el síntoma/Ia característica de la expresión de PD-1, es decir, cualquier afección que es causada por, agravada por, o vinculada de otro modo al aumento o a la disminución de la expresión o actividades de PD-1.
Como se usa en el presente documento, el término "sujeto", "hospedador", "individuo" o "paciente" se refiere a un ser humano, incluyendo adultos y niños.
Como se usa en el presente documento, una "composición farmacéutica" se refiere a una preparación de uno o más de los agentes activos, tal como que comprende un anticuerpo anti-PD1 humanizado de acuerdo con la divulgación, con otros componentes químicos opcionales, tales como vehículos y excipientes fisiológicamente adecuados. El fin de una composición farmacéutica es facilitar la administración del agente activo a un organismo.
Las composiciones de la presente divulgación pueden estar en una forma adecuada para cualquier vía convencional de administración o uso. En un aspecto, una "composición" normalmente se refiere a una combinación del agente activo, por ejemplo, compuesto o composición, y un vehículo natural o no natural, inerte (por ejemplo, un agente o marcador detectable) o activo, tal como un adyuvante, diluyente, aglutinante, estabilizante, tampones, sales, disolventes Iipófilos, conservante, adyuvante o similar, e incluye vehículos farmacéuticamente aceptables. Un "vehículo aceptable" o "portador aceptable", como se denomina en el presente documento, es cualquier compuesto conocido o combinación de compuestos que los expertos en la materia saben que son útiles para formular composiciones farmacéuticas.
"Una cantidad eficaz" o una "cantidad eficaz terapéutica", como se usa en el presente documento, se refiere a la cantidad de agente activo requerida para conferir un efecto terapéutico al sujeto, bien en solitario, o en combinación con uno o más agentes activos diferentes, por ejemplo, la cantidad de agente activo que se necesita para tratar la enfermedad o el trastorno diana, o para producir el efecto deseado. La "cantidad eficaz" variará dependiendo deI (de Ios) agente(s), la enfermedad y su gravedad, las características del sujeto que se vaya a tratar, incluyendo la edad, el estado físico, el tamaño, el género y el peso, la duración del tratamiento, la naturaleza de la terapia concurrente (si la hay), la vía específica de administración y factores similares dentro del conocimiento y la experiencia del profesional de la salud. Estos factores son bien conocidos por los expertos en la materia y pueden abordarse simplemente con la experimentación de rutina. En general, se prefiere el uso de una dosis máxima de los componentes individuales o combinaciones de los mismos, es decir, la dosis segura más alta de acuerdo con un buen criterio médico.
Como se usa en el presente documento, el término "medicamento" se refiere a cualquier sustancia o composición con propiedades curativas o preventivas contra trastornos o enfermedades.
La expresión "en combinación", como se usa en el presente documento, se refiere al uso de más de una terapia (por ejemplo, agentes profilácticos y/o terapéuticos). El uso de la expresión "en combinación" no restringe el orden en que las terapias (por ejemplo, agentes profilácticos y/o terapéuticos) se administran a un sujeto con una enfermedad o un trastorno.
Los términos "polinucleótido", "ácido nucleico" y "secuencia de ácido nucleico" son equivalentes y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, por ejemplo, ARN o ADN o análogos de los mismos. Los ácidos nucleicos (por ejemplo, componentes o partes, de los ácidos nucleicos) de la presente divulgación pueden ser naturales, modificados o manipulados. Los ácidos nucleicos manipulados incluyen ácidos nucleicos recombinantes y ácidos nucleicos sintéticos. "Ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-PD1" se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos (o fragmentos de los mismos), incluyendo dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico en un solo vector o vectores separados, y dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico presente(s) en una o más ubicaciones de una célula hospedadora. Como se usa en el presente documento, las expresiones "construcción de ácido nucleico", "plásmido" y "vector" son equivalentes, y se refieren a una molécula de ácido nucleico que sirve para transferir una secuencia de ácido nucleico transitoria, tal como ADN o ARN, a una célula hospedadora.
Como se usa en el presente documento, la expresión "célula hospedadora" pretende incluir cualquier célula individual o cultivo celular que pueda ser o haya sido receptor de vectores, moléculas de ácido nucleico exógenas y polinucleótidos codificantes de la construcción de anticuerpo de la presente divulgación; y/o receptores de la propia construcción de anticuerpo. La introducción del material respectivo a la célula puede llevarse a cabo mediante transformación, transfección y similares. La expresión "célula hospedadora" también pretende incluir la progenie o la posible progenie de una sola célula. Las células hospedadoras incluyen células bacterianas, microbianas, vegetales y animales.
"Células inmunitarias", como se usa en el presente documento, se refiere a células que participan en la inmunidad innata y adaptativa, por ejemplo, tal como glóbulos blancos (leucocitos) que derivan de células madre hematopoyéticas (HSC) producidas en la médula ósea, linfocitos (linfocitos T, linfocitos B, células citolíticas naturales (NK) y linfocitos T citolíticos naturales (NKT) y células derivadas de mieloides (neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monocitos, macrófagos, células dendríticas). En particular, la célula inmunitaria puede seleccionarse de la lista no exhaustiva que comprende linfocitos B, linfocitos T, en particular linfocitos T CD4+ y Iinfocitos T CD8+, Iinfocitos NK, linfocitos NKT, células APC, células dendríticas y monocitos. "Linfocito T", como se usa en el presente documento, incluye, por ejemplo, linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+, Iinfocitos T de tipo 1 auxiliar, linfocitos T de tipo 2 auxiliar, linfocitos T de tipo 17 auxiliar y linfocitos T inhibidores.
La expresión "respuesta inmunitaria" se refiere a la acción de, por ejemplo, linfocitos, células presentadoras de antígenos, células fagocíticas, granulocitos y macromoléculas solubles producidas por las células anteriores o el hígado (incluyendo anticuerpos, citocinas y complementos) que da como resultado un daño selectivo sobre, la destrucción de o la eliminación en el cuerpo humano de patógenos invasores, células o tejidos infectados por patógenos, células cancerosas o, en los casos de autoinmunidad o inflamación patológica, células o tejidos humanos normales.
EI término "antagonista", como se usa en el presente documento, se refiere a una sustancia que bloquea o reduce la actividad o funcionalidad de otra sustancia. Particularmente, este término se refiere a un anticuerpo que se une a un receptor celular (por ejemplo, PD-1) como sustancia de referencia (por ejemplo, PD-L1 y/o PD-L2), evitando que produzca todos o parte de sus efectos biológicos habituales (por ejemplo, creación de un microambiente inmunosupresor). La actividad antagonista de un anticuerpo humanizado de acuerdo con la presente divulgación puede evaluarse mediante ELISA competitivo.
Como se usa en el presente documento, el término "aislado" indica que el material mencionado (por ejemplo, anticuerpo, polipéptido, ácido nucleico, etc.) está sustancialmente separado de, o enriquecido en relación con, otros materiales con los que se produce en la naturaleza. Particularmente, un anticuerpo "aislado" es aquel que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno natural. Por ejemplo, el anticuerpo aislado se purifica (1) hasta más del 75 % en peso de anticuerpo según lo determinado por el método de Lowry, o (2) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpoin situen el interior de células recombinantes, ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Habitualmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.
El término "y/o" cuando se usa en el presente documento debe tomarse como divulgación específica de cada una de las dos características o componentes especificados con o sin la otra. Por ejemplo, "A y/o B" debe tomarse como una divulgación específica de cada uno de (i) A, (ii) B e (iii) A y B, como si cada uno de ellos se expusiera individualmente.
El término "un" o "una" puede referirse a uno o a una pluralidad de los elementos que modifica (por ejemplo, "un reactivo" puede significar uno o más reactivos) a menos que sea contextualmente claro que se describe uno de los elementos o más de uno de los elementos.
El término "aproximadamente", como se usa en el presente documento, en relación con cualquiera y todos los valores (incluyendo los extremos inferior y superior de los intervalos numéricos) significa cualquier valor que tenga un intervalo aceptable de desviación de hasta /-10 % (por ejemplo, /- 0.5 %, /- 1 %, /-1,5 %, /- 2 %, /- 2,5 %, /- 3 %, /- 3,5 %, /- 4 %, /- 4,5 %, /- 5 %, /- 5,5 %, /- 6 %, /- 6,5 %, /- 7 %, /- 7,5 %, /- 8 %, /- 8,5 %, /-9 %, /-9,5 %). El uso del término "aproximadamente" al comienzo de una cadena de valores modifica cada uno de los valores (es decir, "aproximadamente 1, 2 y 3" se refiere a aproximadamente 1, aproximadamente 2 y aproximadamente 3). Además, cuando se describe una lista de valores en el presente documento (por ejemplo, aproximadamente el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 % u 86 %), la lista incluye todos los valores intermedios y fraccionarios de los mismos (por ejemplo, 54 %, 85,4 %).
Anticuerpo humanizado contra PD-1 humana
En el presente documento, se proporciona un anticuerpo humanizado que se une a PD-1 humana. En algunos aspectos, el anticuerpo humanizado se une específicamente a PD-1 humana, preferentemente al dominio extracelular de PD-1 humana. En algunos aspectos, el anticuerpo humanizado se une selectivamente a uno o más de PD-1, PD-1 Aex2, PD-1 Aex3, PD-1 Aex2,3 y PD-1 Aex2,3,4 humanas de longitud completa.
En algunos aspectos, el anticuerpo anti-PD1 humanizado es un anticuerpo aislado, particularmente un anticuerpo aislado no natural. Dicho anticuerpo anti-PD1 humanizado aislado puede prepararse mediante al menos una etapa de purificación. En algunos aspectos, un anticuerpo aislado se purifica al menos al 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % en peso. En algunos aspectos, se proporciona un anticuerpo aislado como una disolución que comprende al menos del 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % al 100 % en peso de un anticuerpo, comprendiendo resto del peso el peso de otros solutos disueltos en el disolvente.
Las formas humanizadas del anticuerpo anti-PD1 de acuerdo con la presente divulgación pueden comprender inmunoglobulina de cualquier clase, tal como lgD, IgE, IgG, lgA o IgM (o subclase de las mismas), cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2, scFv u otras subsecuencias de unión al antígeno de anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana (por ejemplo, murina) dirigida a PD-1 humana. Preferentemente, el anticuerpo anti-hPD-1 humanizado de acuerdo con la presente divulgación deriva de una IgG1, IgG2, IgG3 o lgG4, preferentemente de IgG4.
Preferentemente, el anticuerpo humanizado contra PD-1 humana es un anticuerpo monoclonal.
Preferentemente, dicho anticuerpo tiene la capacidad de bloquear o inhibir la interacción entre PD-1 y al menos uno de sus ligandos (por ejemplo, PD-L1 y/o PD-L2). La capacidad de "bloquear la unión" o "bloquear la interacción" o "inhibir la interacción", como se usan en el presente documento, se refiere a la capacidad de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno para evitar la interacción de unión entre dos moléculas (por ejemplo, PD-1 y su ligando PD-L1 y/o PD-L2) en cualquier grado detectable.
Preferentemente, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo es un antagonista de la unión de PD-L1 y/o PD-L2 humanos a PD-1 humana, más preferentemente de PD-L1 y PD-L2 humanos a PD-1 humana.
En determinados aspectos, el anticuerpo anti-hPD1 o el fragmento de unión al antígeno inhibe la interacción de unión entre PD-1 y al menos uno de sus ligandos (por ejemplo, PD-L1 y/o PD-L2, preferentemente PD-L1 y PD-L2) en al menos un 50 %. En determinados aspectos, esta inhibición puede ser superior al 60 %, superior al 70 %, superior al 80 % o superior al 90 %.
Las "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR" se conocen en la técnica como referencias a secuencias no contiguas de aminoácidos dentro de regiones variables de anticuerpos, que confieren especificidad de antígeno y afinidad de unión. Los límites exactos de la secuencia de aminoácidos de una CDR dada se pueden determinar fácilmente usando cualquiera de una serie de esquemas bien conocidos, incluyendo los descritos por Kabat et al. (Sequences of Proteins of lmmunological Interest, 5.a ed. (1991), esquema de numeración de "Kabat"); Al-Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol, 273:927-948 (esquema de numeración de "Chothia"); MacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol. 262:732-745 (esquema de numeración de "Contact"); Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol., 2003, 27:55-77 (esquema de numeración de "IMGT"); y Honegge y Pluckthun, J. Mol. Biol, 2001, 309:657-70 (esquema de numeración de "AHo"). A menos que se especifique lo contrario, el esquema de numeración usado para la identificación de una CDR particular en el presente documento es el esquema de numeración de Kabat.
Las regiones CDR del anticuerpo humanizado derivan de un anticuerpo murino y se han optimizado para ¡) proporcionar un anticuerpo humanizado seguro con un nivel muy alto de humanización; y ii) aumentar las propiedades del anticuerpo, más particularmente un mayor rendimiento de producción.
En un aspecto, el anticuerpo humanizado anti-PD-1 humana o el fragmento de unión al antígeno del mismo comprende:
(i) un dominio variable de cadena pesada que comprende HCDR1 que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y HCDR3 que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; y
(ii) un dominio variable de cadena ligera que comprende LCDR1 que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, LCDR2 que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 y LCDR3 que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.
En una realización, el anticuerpo anti-PD1 o el fragmento de unión al antígeno de acuerdo con la presente divulgación comprende regiones estructurales, particularmente regiones estructurales de la región variable de cadena pesada (HFR) HFR1, HFR2, HFR3 y HFR4, y regiones estructurales de la región variable de la cadena ligera (LFR) LFR1, LFR2, LFR3 y LFR4.
Preferentemente, el anticuerpo anti-PD1 o el fragmento de unión al antígeno de acuerdo con la presente divulgación comprende regiones estructurales humanas o humanizadas. Una "región estructural aceptora humana", para los fines del presente documento, es una región estructural que comprende la secuencia de aminoácidos de una región estructural de dominio variable de cadena ligera (VL) o una región estructural de dominio variable de cadena pesada (VH) derivada de una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana, como se define a continuación. Una región estructural aceptora humana derivada de una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana pueden comprender la misma secuencia de aminoácidos de la misma, o puede contener cambios en la secuencia de aminoácidos. En algunos aspectos, el número de cambios de aminoácidos es 10 o inferior, 9 o inferior, 8 o inferior, 7 o inferior, 6 o inferior, 5 o inferior, 4 o inferior, 3 o inferior, o 2 o inferior. En algunos aspectos, la región estructural humana aceptora de VL es idéntico en secuencia a la secuencia de la región estructural de inmunoglobulina humana de VL o la secuencia de la región estructural consenso humana. Una "región estructural consenso humana" es una región estructural que representa los residuos de aminoácidos más comunes en una selección de secuencias y región estructural VL o VH de inmunoglobulina humana.
Particularmente, el anticuerpo anti-PD1 o el fragmento de unión al antígeno comprende regiones estructurales de región variable de cadena pesada (HFR) HFR1, HFR2, HFR3 y HFR4 que comprenden una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37, 38, 39 y 40, respectivamente, opcionalmente, con una, dos o tres modificaciones seleccionadas entre sustitución (sustituciones), adición (adiciones), eliminación (eliminaciones) y cualquier combinación de las mismas en cualquier posición que no sean las posiciones 27, 29 y 32 de HFR3, es decir, de SEQ ID NO: 40. Preferentemente, el anticuerpo anti-PD1 o el fragmento de unión al antígeno comprende HFR1 de SEQ ID NO: 37, HFR2 de SEQ ID NO: 38, HFR3 de SEQ ID NO: 39 y HFR4 de SEQ ID NO: 40.
Como alternativa o de modo adicional, el anticuerpo anti-PD1 o fragmento de unión al antígeno comprende regiones estructurales de región variable de cadena ligera (LFR) LFR1, LFR2, LFR3 y LFR4 que comprenden una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41,42, 43 y 44, respectivamente, opcionalmente, con una, dos o tres modificaciones seleccionadas de sustitución (sustituciones), adición (adiciones), eliminación (eliminaciones) y cualquier combinación de las mismas. Preferentemente, el anticuerpo humanizado anti-PD1 o el fragmento de unión al antígeno comprende LFR1 de SEQ ID NO: 41, LFR2 de SEQ ID NO: 42, LFR3 de SEQ ID NO: 43 y LFR4 de SEQ ID NO: 44.
El dominio VL y VH del anticuerpo de acuerdo con la presente divulgación puede comprender cuatro regiones estructurales interrumpidas por tres regiones determinantes de la complementariedad preferentemente unidas operativamente en el siguiente orden: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (de extremo amino a extremo carboxi).
En una primera realización, el anticuerpo humanizado anti-PD-1 humana o el fragmento de unión al antígeno del mismo comprende:
(a) una región variable de cadena pesada (VH) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, opcionalmente, con una, dos o tres modificaciones seleccionadas sustitución (sustituciones), adición (adiciones), eliminación (eliminaciones) y cualquier combinación de las mismas en cualquier posición, excepto en las posiciones 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100,101, 105,106 y 112 de SEQ ID NO: 21;
(b) una región variable de cadena ligera (VL) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, opcionalmente, con una, dos o tres modificaciones seleccionadas de sustitución (sustituciones), adición (adiciones), eliminación (eliminaciones) y cualquier combinación de las mismas en cualquier posición, excepto en las posiciones 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 y 105 de SEQ ID NO: 24.
Preferentemente, Ias modificaciones son sustituciones, en particular sustituciones conservativas.
Preferentemente, el anticuerpo humanizado anti-PD-1 humana o el fragmento de unión al antígeno del mismo comprende:
(a) una región variable de cadena pesada (VH) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; y (b) una región variable de cadena ligera (VL) que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos de SeQ ID NO: 24.
En otro aspecto, la cadena pesada (CH) y la cadena ligera (CL) comprenden las secuencias de VL y VH como se han descrito anteriormente.
En un aspecto particular, el anticuerpo anti-PD-1 humana o el fragmento de unión al antígeno del mismo comprende: (a) una cadena pesada que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, opcionalmente, con una, dos o tres modificaciones seleccionadas sustitución (sustituciones), adición (adiciones), eliminación (eliminaciones) y cualquier combinación de las mismas en cualquier posición excepto en las posiciones 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 y 112 de SEQ ID NO: 31; y (b) una cadena Iigera que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, opcionalmente, con una, dos o tres modificaciones seleccionadas de sustitución (sustituciones), adición (adiciones), eliminación (eliminaciones) y cualquier combinación de las mismas en cualquier posición, excepto en las posiciones 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81,88, 94, 97, 99 y 105 de SEQ ID NO: 34.
Preferentemente, Ias modificaciones son sustituciones, en particular sustituciones conservativas.
Preferentemente, el anticuerpo anti-PD-1 humana o el fragmento de unión al antígeno del mismo comprende: (a) una cadena pesada que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, y (b) una cadena Iigera que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34.
Regiones Fc y bisagra
Varias investigaciones para el desarrollo de anticuerpos terapéuticos han conducido a la manipulación de regiones Fc para optimizar propiedades de anticuerpos que permiten la generación de moléculas que se adapten mejor a la actividad farmacológica que se requiere de las mismas. La región Fc de un anticuerpo media en su semivida en suero y sus funciones efectoras, tales como la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP). Varias mutaciones ubicadas en la superficie de contacto entre los dominios CH2 y CH3, tales como T250Q/M428L and M252Y/S254T/T256E H433K/N434F, han demostrado aumentar la afinidad de unión a FcRn y la semivida de IgG1in vivo.Sin embargo, no siempre existe una relación directa entre el aumento de la unión a FcRn y la mejora de Ia semivida. Un enfoque para mejorar la eficacia de un anticuerpo terapéutico es aumentar su persistencia en suero, permitiendo así mayores niveles en circulación, administración menos frecuente y dosis reducidas. Se pueden desear regiones Fc manipuladas para reducir o aumentar la función efectora del anticuerpo. Para los anticuerpos que se dirigen a las moléculas de la superficie celular, especialmente aquellos de las células inmunitarias, se requiere anular las funciones efectoras. A la inversa, para los anticuerpos destinados al uso oncológico, el aumento de las funciones efectoras puede mejorar la actividad terapéutica. Los cuatro isotipos de IgG humana se unen a los receptores Fcy de activación (FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIIa), al receptor FcYRIIb inhibidor y al primer componente del complemento (C1q) con diferentes afinidades, produciendo funciones efectoras muy diferentes. La unión de IgG a los FcyR o C1q depende de los residuos ubicados en la región bisagra y en el dominio CH2. Dos regiones del dominio CH2 son fundamentales para la unión de FcyR y C1q, y tienen secuencias únicas en IgG2 e IgG4.
El anticuerpo humanizado de acuerdo con la presente divulgación comprende opcionalmente al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente, la de una inmunoglobulina humana o humanizada. Preferentemente, la región Fc es una parte del anticuerpo anti-hPD-1 humanizado descrito en el presente documento. Como bien sabe un experto en la materia, la elección de los isotipos IgG del dominio constante de la cadena pesada se centra en si se requieren funciones específicas y en la necesidad de una semividain vivoadecuada. Por ejemplo, los anticuerpos diseñados para la erradicación selectiva de las células cancerosas normalmente requieren un isotipo activo que permita la activación del complemento y la destrucción celular mediada por el efector mediante la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. Los isotipos humanos tanto IgG1 como IgG3 (semivida más corta) cumplen estos criterios, particularmente el isotipo IgG1 humano (natural y variantes). En particular, dependiendo del isotipo IgG del dominio constante de la cadena pesada (particularmente el isotipo natural humano y variantes del isotipo IgG1), el anticuerpo anti-hPD1 humanizado de la presente divulgación puede ser citotóxico para las células que expresan PD-1 a través de un mecanismo de CDC, ADCC y/o ADCP. De hecho, la región del fragmento cristalizable (Fc) interactúa con una variedad de moléculas auxiliares para mediar en funciones efectoras indirectas, tales como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), Ia fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).
En aspectos preferidos, la región constante es de una cadena pesada de inmunoglobulina humana, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 u otras clases. En un aspecto adicional, la región constante humana se selecciona del grupo que consiste en IgG 1, IgG2, IgG2, IgG3 e IgG4. Preferentemente, el anticuerpo anti-PD1 humanizado comprende una región Fc de IgG1 o IgG4. Incluso más preferentemente, el anticuerpo anti-hPD1 humanizado comprende una región Fc de IgG4 con una S228P que estabiliza la IgG4.
En un aspecto, el anticuerpo anti-PD1 comprende una región Fc truncada o un fragmento de la región Fc. En un aspecto, la región constante incluye un dominio CH2. En otro aspecto, la región constante incluye dominios CH2 y CH3 o incluye bisagra-CH2-CH3. Como alternativa, la región constante puede incluir la totalidad o una parte de la región bisagra, del dominio CH2 y/o del dominio CH3. En un aspecto preferido, la región constante contiene un dominio CH2 y/o un dominio CH3 derivado de una cadena pesada de IgG4 humana.
En otro aspecto, la región constante incluye un dominio CH2 y al menos una parte de una región bisagra. La región bisagra puede derivar de una cadena pesada de inmunoglobulina, por ejemplo, IgG 1, IgG2, IgG3, IgG4 u otras clases. Preferentemente, la región bisagra deriva de lgG1, lgG2, IgG3, lgG4 humanas u otras clases adecuadas, mutadas o no. Más preferentemente, la región bisagra deriva de una cadena pesada de lgG1 humana. En un aspecto, la región constante incluye un dominio CH2 derivado de un primer isotipo de anticuerpo y una región bisagra derivada de un segundo isotipo de anticuerpo. En un aspecto específico, el dominio CH2 deriva de una cadena pesada de lgG2 o IgG4 humana, mientras que la región bisagra deriva de una cadena pesada de IgG1 humana alterada.
En un aspecto, la región constante contiene una mutación que reduce la afinidad por un receptor Fc o reduce la función efectora de Fc. Por ejemplo, la región constante puede contener una mutación que elimina el sitio de glicosilación dentro de la región constante de una cadena pesada de IgG.
En otro aspecto, la región constante incluye un dominio CH2 y al menos una parte de una región bisagra. La región bisagra puede derivar de una cadena pesada de inmunoglobulina, por ejemplo, IgG 1 lgG2, IgG3, IgG4 u otras clases. Preferentemente, la región bisagra deriva de la IgG1, lgG2, IgG3, IgG4 humanas u otras clases adecuadas. La región bisagra de IgG1 tiene tres cisteínas, dos de los cuales participan en enlaces disulfuro entre las dos cadenas pesadas de la inmunoglobulina. Estas mismas cisteínas permiten la formación eficaz y consistente de enlaces disulfuro entre las partes Fc. Por lo tanto, una región bisagra preferida de la presente divulgación deriva de IgG 1, más preferentemente, de IgG 1 humana. En algunos aspectos, la primera cisteína de dentro de la región bisagra de lgG1 humana está mutada a otro aminoácido, preferentemente, a serina. La región bisagra del isotipo IgG2 tiene cuatro enlaces disulfuro que tienden a potenciar la oligomerización y posiblemente un enlace disulfuro incorrecto durante la secreción en sistemas recombinantes. Una región bisagra adecuada puede derivar de una bisagra de IgG2; las dos primeras cisteínas están cada una preferentemente mutadas a otro aminoácido. Se sabe que la región bisagra de IgG4 forma enlaces disulfuro entre cadenas de manera ineficaz. Sin embargo, una región bisagra adecuada para la presente divulgación puede derivar de la región bisagra de IgG4, que contiene preferentemente una mutación que potencia la formación correcta de enlaces disulfuro entre restos derivados de la cadena pesada (Angal S., et al. (1993) Mol. Immunol., 30:105-8). Más preferentemente, la región bisagra deriva de una cadena pesada de IgG4 humana.
En un aspecto, la región constante incluye un dominio CH2 derivado de un primer isotipo de anticuerpo y una región bisagra derivada de un segundo isotipo de anticuerpo. En un aspecto específico, el dominio CH2 deriva de una cadena pesada de IgG4 humana, mientras que la región bisagra deriva de una cadena pesada de IgG1 humana alterada.
De acuerdo con la presente divulgación, la región constante puede contener dominios CH2 y/o CH3 y una región bisagra que deriva de diferentes isotipos de anticuerpos, es decir, una región constante híbrida. Por ejemplo, en un aspecto, la región constante contiene dominios CH2 y/o CH3 derivados de lgG2 o IgG4 y una región bisagra mutante derivada de IgG1. Como alternativa, se usa una región bisagra mutante de otra subclase de IgG en una región constante híbrida. Por ejemplo, se puede usar una forma mutante de la bisagra de IgG4 que permita una unión disulfuro eficaz entre las dos cadenas pesadas. Una bisagra mutante también puede derivar de una bisagra de IgG2 en la que las dos primeras cisteínas estén mutadas a otro aminoácido. El ensamblaje de dichas regiones constantes híbridas se ha descrito en la publicación de patente de EE. UU. n.° 20030044423.
En un aspecto, de acuerdo con la presente invención, la región constante que puede contener CH2 y/o CH3 tiene una de las mutaciones descritas en la Tabla D que se presenta a continuación, o cualquier combinación de las mismas.
Tabla D: Dominio Fc diseñado humano adecuado de un anticuerpo Fc
La numeración de los residuos de la región constante de la cadena pesada se realiza de acuerdo con la numeración de la UE (Edelman, G.M. et al., Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85 (1969); www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html#refs)
En un aspecto específico, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende un dominio constante de cadena ligera de un dominio constante de cadena ligera kappa humano y un dominio constante de cadena pesada de un dominio constante de cadena pesada de IgG1 humana, opcionalmente, con una sustitución o una combinación de sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en T250Q/M428L; M252Y/S254T/T256E H433K/N434F; E233P/L234V/L235A/G236A A327G/A330S/P331S; E333A; S239D/A330L/I332E; P257I/Q311; K326W/E333S; S239D/I332E/G236A; N297A; L234A/L235A; N297A L234A/L235A; N297A M252Y/S254T/T256E; K444A y K322A, preferentemente, seleccionadas del grupo que consiste en N297A, N297A M252Y/S254T/T256E, and N297A L234A/L235A.
En otro aspecto específico, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende un dominio constante de cadena ligera de un dominio constante de cadena ligera kappa humano y un dominio constante de cadena pesada de un dominio constante de cadena pesada de IgG4 humana, opcionalmente, con una sustitución o una combinación de sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S228P; L234A/L235A, S228P M252Y/S254T/T256E y K444A. En determinados aspectos, se pueden introducir modificaciones de aminoácidos en la región Fc de un anticuerpo proporcionado en el presente documento para generar una variante de la región Fc. En determinados aspectos, la variante de la región Fc posee algunas, pero no en todas, las funciones efectoras. Dichos anticuerpos pueden ser útiles, por ejemplo, en aplicaciones en las que la semivida del anticuerpoin vivoes importante, sin embargo, ciertas funciones efectoras son innecesarias o perjudiciales. Los ejemplos de funciones efectoras incluyen citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y citotoxicidad mediada por el complemento dirigida por anticuerpos (ADCC). En la técnica, se conocen numerosas sustituciones, o sustituciones o eliminaciones con función efectora alterada.
En un aspecto, la región constante contiene una mutación que reduce la afinidad por un receptor Fc o reduce la función efectora de Fc. Por ejemplo, la región constante puede contener una mutación que elimina el sitio de glicosilación dentro de la región constante de una cadena pesada de IgG. Preferentemente, el dominio CH2 contiene una mutación que elimina el sitio de glicosilación de dentro del dominio CH2.
En un aspecto, el anti-hPD1 de acuerdo con la divulgación tiene un dominio constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 39 y/o un dominio constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 40, particularmente, un dominio constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 39 y un dominio constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 40.
En un aspecto, el anti-hPD1 de acuerdo con la invención tiene un dominio constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 47 y/o un dominio constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 40, particularmente, un dominio constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 47 y un dominio constante de cadena ligera de SEQ ID NO: 40.
Tabla E. Ejemplo de un dominio constante de cadena pesada y un dominio constante de cadena ligera adecuado para el anticuerpo humanizado de acuerdo con la divulgación.
La alteración de los aminoácidos cerca de la unión de la parte Fc y la parte no Fc puede aumentar espectacularmente la semivida en suero de la proteína de fusión de Fc (publicación PCT WO 01/58957). Por consiguiente, la región de unión de una proteína o de un polipéptido de la presente invención puede contener alteraciones que, en relación con las secuencias naturales de una cadena pesada de inmunoglobulina y eritropoyetina, preferentemente, se encuentran dentro de aproximadamente 10 aminoácidos del punto de unión. Estos cambios de aminoácidos pueden causar un aumento en la hidrofobia. En un aspecto, la región constante deriva de una secuencia de IgG en la que se reemplaza el residuo de lisina C-terminal. Preferentemente, la lisina C-terminal de una secuencia de IgG se reemplaza por un aminoácido distinto de Ia lisina, tal como alanina o leucina, para aumentar aún más la semivida en suero.
En particular, el aminoácido K444 del dominio de lgG1 o IgG4 puede estar sustituido por una alanina para reducir la escisión proteolítica. Luego, en un aspecto, el anticuerpo anti-PD1 comprende al menos una sustitución de aminoácidos adicional que consiste en K444A.
En un aspecto, el anticuerpo anti-PD1 comprende un residuo de cisteína adicional en el dominio C-terminal de la IgG para crear un enlace disulfuro adicional.
En determinados aspectos, se puede alterar un anticuerpo para aumentar, disminuir o eliminar el grado en que está glicosilado. Normalmente, la glicosilación de polipéptidos está "unida a N" o "unida a O".
Glicosilación "unida a N" se refiere a la unión de un resto de hidrocarburo a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto de hidrocarburo a la cadena lateral de asparagina. Por lo tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio de glucosilación potencial.
Glicosilación "unida a O" se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también pueden usarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina. La adición o eliminación de sitios de glicosilación unidos a N al anticuerpo se puede lograr alterando la secuencia de aminoácidos de modo que se cree o se elimine una o más de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente. La adición o eliminación de sitios de glicosilación unida a O se puede lograr mediante la adición, eliminación o sustitución de uno o más restos de serina o treonina en o para (según sea el caso) la secuencia de un anticuerpo.
La divulgación también se refiere a un anticuerpo anti-PD-1 humanizado o fragmento de unión al antígeno del mismo:
- que tiene una puntuación T20 de humanidad superior al 85 %;
- que presenta una alta capacidad de fabricación cuando se produce en células de mamíferos;
- que presenta un rendimiento de alta productividad en células de mamíferos;
- que tiene una afinidad de unión (KD) hacia una PD-1 humana igual o inferior a 10-7 M;
- que tiene una actividad antagonista e inhibe la unión de PD-L1 y/o PD-L2 humanos a PD-1 humana, preferentemente, PD-L1 y PD-L2;
- que bloquea o inhibe la señalización de PD-1 (fosforilación y reclutamiento de SHP-1);
- que mejora la activación de los linfocitos T, especialmente (inhibición de la activación de NFAT mediada por pSHP-1 y TCR, secreción de IFNgamma e IL-2; y/o
- que potencia la respuesta inmunitaria antitumoral
- que demuestra una buena farmacocinética y farmacodinámicain vivo.
Para los fines de la presente divulgación, la "humanidad" se mide usando el analizador de puntuación T20 para cuantificar la humanidad de la región variable de anticuerpos monoclonales como se describe en Gao S H, Huang K, Tu H, Adler A S. BMC Biotechnology. 2013: 13:55.
Se proporciona una herramienta basada en la web para calcular la puntuación T20 de las secuencias de anticuerpos usando las bases de datos humanas de corte T20: http://abAnalyzer.Iakepharma.com. Al calcular una puntuación de T20, primero se asigna una secuencia de proteína de la región variable VH, VK o VL a la numeración de Kabat y se identifican los residuos de CDR. Se compara la secuencia de longitud completa o solo la secuencia de región estructural (con los residuos CDR eliminados) con cada secuencia en una base de datos de anticuerpos respectiva usando el algoritmo BLAST de proteína-proteína blastp. Se aísla la identidad de secuencia entre cada comparación por pares, y tras analizar cada secuencia de la base de datos, las secuencias se ordenan de mayor a menor según la identidad de secuencia con la secuencia de entrada. El porcentaje de identidad de las 20 secuencias coincidentes principales se promedia para obtenerla puntuación T20.
Para cada tipo de cadena (VH, VK, VL) y longitud de la secuencia (de longitud completa o solo región estructural) en "Todas las bases de datos humanas", se puntuó cada secuencia de anticuerpos con su respectiva base de datos usando el analizador de puntuación T20. La puntuación T20 se obtuvo para las 20 secuencias coincidentes principales tras la exclusión de la propia secuencia de entrada (se promedió el porcentaje de identidad de las secuencias 2 a 21, ya que la secuencia 1 siempre fue el propio anticuerpo de entrada). Las puntuaciones T20 para cada grupo se ordenaron de mayor a menor. La disminución en la puntuación fue aproximadamente lineal para la mayoría de las secuencias; sin embargo, las puntuaciones T20 para el ~15 % inferior de los anticuerpos comenzaron a disminuir bruscamente. Por lo tanto, se eliminó el 15 por ciento inferior de las secuencias, y las secuencias restantes formaron las bases de datos humanas de corte de T20, donde el punto de corte de la puntuación T20 indica la puntuación T20 más baja de una secuencia en la nueva base de datos.
Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo humanizado" es uno que tiene una puntuación T20 de humanidad de al menos el 80 % o al menos el 85 %, más preferentemente de al menos el 88 %, incluso más preferentemente de al menos el 90 %, lo más preferentemente una puntuación T20 de humanidad comprendida entre el 85 % y el 95 %, preferentemente entre el 88 % y el 92 %.
Por consiguiente, el anticuerpo anti-PD1 humanizado de acuerdo con la invención tiene una puntuación T20 de humanidad de al menos el 80 % o al menos el 85 %, más preferentemente de al menos el 88 %, incluso más preferentemente de al menos el 90 %, lo más preferentemente una puntuación T20 de humanidad comprendida entre el 85 % y el 95 %, preferentemente, entre el 88 % y el 92 %.
En un aspecto, el anticuerpo anti-hPD1 humanizado o el fragmento de unión al antígeno del mismo como se desvela en el presente documento tiene un rendimiento de producción mejorado, preferentemente en comparación con un anticuerpo quimérico correspondiente. Particularmente, dicho anticuerpo anti-hPD1 humanizado tiene un rendimiento de producción superior a 5 mg/l, 6 mg/l, 7 mg/I, 8 mg/I o 9 mg/I en células CHO, preferentemente superior a 1 o 2 g/I. Como alternativa o de modo adicional, dicho anticuerpo anti-hPD1 humanizado tiene un rendimiento de producción superior a 2 mg/I, 3 mg/I o 4 mg/I en células COS, preferentemente superior a 4 mg/I.
En otro aspecto, dicho anticuerpo anti-hPD1 humanizado tiene un rendimiento de producción de al menos el doble del rendimiento de producción de un anticuerpo quimérico correspondiente.
La afinidad de un anticuerpo puede ser una medida de su unión con un antígeno específico en un solo sitio antígenoanticuerpo, y es, en esencia, la suma de todas las fuerzas de atracción y repulsión presentes en la interacción entre el sitio de unión al antígeno de un anticuerpo y un determinado epítopo. La afinidad de un anticuerpo por un antígeno particular (por ejemplo, PD-1) puede expresarse mediante la constante de equilibrio K de disociación, definida por la ecuación Kd = [Ag][Ab]/[Ag Ab], que representa la afinidad del sitio de combinación de anticuerpos; donde [Ag] es la concentración de antígeno libre (M), [Ab] es la concentración de anticuerpo libre (M) y [Ag Ab] es la concentración (M) del complejo antígeno-anticuerpo. Cuando el antígeno y el anticuerpo reaccionan fuertemente entre sí, habrá muy poco antígeno libre o anticuerpo libre y, por lo tanto, la constante de equilibrio o la afinidad del anticuerpo será baja. La afinidad promedio para los anticuerpos es igual o inferior a 10-7 M. En ciertos aspectos, el anticuerpo anti-PD-1 humanizado se une a PD-1 humana con afinidades iguales o inferiores a 10-8 M, preferentemente iguales o inferiores a 10-9 M. En un aspecto, la afinidad es igual o inferior a 1,5 x 10-9 M. La afinidad se puede medir mediante cualquier método disponible para el experto en la materia, por ejemplo, mediante análisis de biosensores, tales como el análisis Biacore de resonancia de plasmón superficial (SPR), análisis de Blitz y diagrama de Scatchard. Más específicamente, Biacore mide la afinidad de unión como se detalla en el Ejemplo 2. El anticuerpo humanizado de la presente divulgación tiene una mejor afinidad que el anticuerpo quimérico.
La afinidad de unión puede expresarse como Kd o constante de disociación, y un aumento de la afinidad de unión corresponde a una reducción de la K<d>. Una forma de determinar la afinidad de unión de los anticuerpos hacia PD-1 es midiendo la afinidad de unión de los fragmentos Fab del anticuerpo. Para la obtención de fragmentos Fab, se puede escindir un anticuerpo con papaína o expresarse de forma recombinante. La afinidad de un fragmento Fab anti-PD-1 de un anticuerpo puede determinarse mediante resonancia de plasmón superficial (sistema de resonancia de plasmón superficial (SPR) BIAcore3000™, BIAcore, INC, Piscaway N.J.). Se obtienen velocidades de asociación (kas) y velocidades de disociación (kdis) cinéticas (en general, medidas a 25 °C); y los valores de la constante de disociación de equilibrio (K<d>) se calculan como kas/kdis.
Particularmente, los anticuerpos proporcionados en el presente documento se unen a PD-1 humana con una constante de afinidad (KD) igual o inferior a 0,75 a 1,34 nM, preferentemente igual o inferior a 0,75 a 1 nM, más preferentemente igual o inferior a 0,75 a 0,8 nM, según lo determinado por el análisis Blitz. Este sistema permite la medición de las constantes de velocidad y afinidad para interacciones de unión (ka,kd,Kd).
En un aspecto, la presente divulgación se refiere a un anticuerpo anti-hPD-1 humanizado o fragmento de unión al antígeno del mismo como se ha definido anteriormente que parcial o completamente, en particular completamente, inhibe la unión de PDL-1 y/o PDL-2 a PD-1 humana.
Dicho anticuerpo humanizado de la presente divulgación se une específicamente a hPD-1 y antagoniza la interacción entre PD-1 y PD-L1 y/o PD-L2. Particularmente, el anticuerpo anti-hPD-1 humanizado o el fragmento de unión al antígeno del mismo como se ha definido anteriormente es un antagonista de la unión de PD-L1 y/o PD-L2 humanos a PD-1 humana, preferentemente de PD-L1 y PD-L2 humanos a PD-1 humana.
En algunos ejemplos, un anticuerpo anti-PD-1 descrito en el presente documento suprime la vía de señalización de PD-1 en al menos un 20 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 75 %, al menos un 90 %, al menos un 100 %, o al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces o al menos 1000 veces. En particular, el anticuerpo anti-hPD-1 humanizado o el fragmento de unión al antígeno del mismo es capaz de reducir o inhibir la unión de PD-L1 y/o PD-L2 a PD-1 en al menos un 50 %, 60 %, 70 %, preferentemente 80 %, más preferentemente, 90 % o lo más preferentemente 100 %, en comparación con una molécula de control negativo, en un ensayo de unión, tal como un ensayo ELISA de competitividad. Dicho ensayo se desvela en Sebaugh JL. Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation. Pharm. Stat. 2011; 10: 128-134 y en el Ejemplo 3. El anticuerpo humanizado de la invención tiene una CI50 medida mediante este ensayo inferior a 50 ng/ml, en particular inferior a 40 ng/ml y opcionalmente inferior a 20 ng/ml. En comparación, el anticuerpo quimérico tiene una CI50 superior a 50 ng/ml, es decir, aproximadamente 60 ng/ml. Como alternativa, la capacidad del anticuerpo humanizado de la invención para antagonizar la unión de PD-L1 en PD-1 también se puede medir mediante un ensayo de competitividad con PD-L1 para PD-1 por Blitz y Biacore como se detalla en el Ejemplo 4. Los métodos de determinación de la especificidad y afinidad de los anticuerpos por inhibición competitiva son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow et al., "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1998); Colligan et al., "Current Protocols in Immunology", Green Publishing Assoc., NY (1992; 1993); Muller, Meth. Enzym. 92: 589-601 (1983)) y se describen en los ejemplos a continuación.
Los métodos de determinación de la actividad antagonista de un anticuerpo son conocidos en Ia técnica, y son, por ejemplo, ELISA, análisis de biosensor, tales como Biacore y Blitz.
Moléculas de ácido nucleico que codifican el anticuerpo anti-PD1, vectores de expresión recombinante y células hospedadoras
También se desvelan en el presente documento ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo anti-PD-1 humanizado o el fragmento de unión al antígeno del mismo descrito en el presente documento, cualquier cadena ligera o pesada del mismo, vectores, tales como vectores de expresión o virus recombinantes que comprenden estos ácidos nucleicos, y células hospedadoras que comprenden los ácidos nucleicos y/o vectores.
Secuencia de ácido nucleico
La presente divulgación también se refiere a una molécula de ácido nucleico o un grupo de moléculas de ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-hPD-1 humanizado o el fragmento de unión al antígeno del mismo como se ha definido anteriormente o cualquier cadena ligera o pesada del mismo.
Las secuencias de ADN de anticuerpos pueden, por ejemplo, amplificarse a partir de ARN de células que sintetizan una inmunoglobulina, sintetizarse mediante PCR con inmunoglobulinas clonadas o sintetizarse mediante oligonucleótidos que codifican secuencias conocidas de aminoácidos de péptidos señal. Preferentemente, Ia señal peptídica comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 para VH y/o CH; y/o en Ia secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 para VL y/o CL. Particularmente, Ia señal peptídica está en el extremo N de CH, VH, CL y/o VL.
Dicho ácido nucleico puede codificar una secuencia de aminoácidos que comprende VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprende VH del anticuerpo (por ejemplo, las cadenas ligera y/o pesada del anticuerpo). Dicho ácido nucleico puede aislarse y secuenciarse fácilmente usando procedimientos convencionales.
En un aspecto, las moléculas de ácido nucleico que codifican el anticuerpo humanizado anti-PD-1 humana comprenden:
- una primera molécula de ácido nucleico que codifica un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 21, opcionalmente con una señal peptídica de SEQ ID NO. 45 y
- una segunda molécula de ácido nucleico que codifica un dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 24, opcionalmente con una señal peptídica de SEQ ID NO. 46.
En un aspecto, las moléculas de ácido nucleico que codifican el anticuerpo humanizado anti-PD-1 humana comprenden:
- una primera molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 48 que codifica un dominio variable de cadena pesada, opcionalmente con una secuencia de ácido nucleico que codifica una señal peptídica de SEQ ID NO. 45 y - una segunda molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 49 que codifica un dominio variable de cadena ligera, opcionalmente con una secuencia de ácido nucleico que codifica una señal peptídica de SEQ ID NO: 46.
En un aspecto específico, las moléculas de ácido nucleico que codifican el anticuerpo humanizado anti-PD-1 humana comprenden:
- una primera molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 50 que codifica una cadena pesada y
- una segunda molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 51 que codifica una cadena ligera.
En un aspecto, la molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico aislada, particularmente no natural. La molécula de ácido nucleico o el grupo de moléculas de ácido nucleico que codifican un anticuerpo anti-PD1 humanizado de acuerdo con la invención está preferentemente comprendido en un vector o un grupo de vectores.
Vectores
En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un vector que comprende la molécula de ácido nucleico o el grupo de moléculas de ácido nucleico como se ha definido anteriormente.
Como se usa en el presente documento, un "vector" es una molécula de ácido nucleico usada como un vehículo para transferir material genético a una célula. El término "vector" engloba plásmidos, virus, cósmidos y cromosomas artificiales. En general, los vectores manipulados comprenden un origen de replicación, un sitio de clonación múltiple y un marcador de selección. En general, el propio vector es una secuencia de nucleótidos, comúnmente una secuencia de ADN que comprende una inserción (transgén) y una secuencia mayor que sirve de "esqueleto" del vector. Los vectores modernos pueden englobar características adicionales además de la inserción transgénica y un esqueleto: un promotor, un marcador genético, resistencia a antibióticos, un gen indicador, una secuencia de dirección, un marcador de purificación de proteínas. Los vectores denominados vectores de expresión (construcciones de expresión) son específicamente para la expresión del transgén en la célula diana, y, en general, tienen secuencias de control.
En un aspecto, las secuencias de codificación tanto de cadena pesada como de cadena ligera y/o la región constante del anticuerpo anti-PD1 humanizado se incluyen en un vector de expresión. Cada secuencia de codificación de cadena pesada y secuencia de codificación de cadena ligera pueden estar unidas operativamente con un promotor adecuado. Como alternativa, la expresión de tanto la cadena pesada como la cadena ligera puede ser impulsada por el mismo promotor. En otro aspecto, cada cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo se clona en un vector individual. En este último caso, los vectores de expresión que codifican las cadenas pesada y ligera pueden transfectarse conjuntamente en una célula hospedadora para la expresión de ambas cadenas, que pueden ensamblarse para formar anticuerpos intactosin vivooin vitro.Como alternativa, el vector de expresión que codifica la cadena pesada y que codifica la cadena ligera se puede introducir en diferentes células hospedadoras para expresar cada una de las cadenas pesada y ligera, que luego se pueden purificar y ensamblar para formar anticuerpos intactosin vitro.Los expertos en la materia pueden clonar en un vector la molécula de ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-PD-1 humanizado o el fragmento de anticuerpo del mismo, y luego transformarlo en células hospedadoras. Por consiguiente, la presente divulgación también proporciona un vector recombinante, que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-PD-1 o fragmento del mismo. En un aspecto preferido, el vector de expresión comprende además un promotor y una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido señal de secreción, y opcionalmente, al menos un gen de resistencia a fármacos para el cribado. Los vectores de expresión adecuados normalmente contienen (1) elementos de ADN procariotas que codifican un origen de replicación bacteriano y un marcador de resistencia a antibióticos para proporcionar el crecimiento y la selección del vector de expresión en un hospedador bacteriano; (2) elementos de ADN eucariotas que controlan el inicio de la transcripción, tales como un promotor; y (3) elementos de ADN que controlan el procesamiento de las transcripciones, tales como una secuencia de terminación de la transcripción/poliadenilación.
Los métodos conocidos por los expertos en la materia pueden usarse para construir un vector de expresión que contenga la secuencia de ácido nucleico del anticuerpo anti-PD1 descrito en el presente documento y los componentes reguladores apropiados para la transcripción/traducción. Estos métodos incluyen técnicas de ADN recombinantein vitro,técnicas de síntesis de ADN, técnicas recombinantesin vivo,etc. La secuencia de ADN se une eficazmente a un promotor adecuado en el vector de expresión para dirigir la síntesis de ARNm. El vector de expresión puede comprender además un sitio de unión al ribosoma para iniciar la traducción, un terminador de la transcripción y similares.
Se puede introducir un vector de expresión en las células hospedadoras usando una variedad de técnicas que incluyen la transfección con fosfato de calcio, la transfección mediada por liposomas, la electroporación, y similares. Preferentemente, se seleccionan y se propagan células transfectadas, en donde el vector de expresión se integra de manera estable en el genoma de la célula hospedadora para producir transformantes estables. Se describen técnicas de introducción de vectores en células eucariotas y técnicas de selección de transformantes estables usando un marcador de selección dominante en Sambrook, Ausubel, Bebbington, "Expression of Antibody Genes in Nonlymphoid Mammalian Cells", en 2 METHODS: "A companion to methods in enzymology" 136 (1991), Murray (ed.), "Gene transfer and expression protocols" (Humana Press 1991). Se describen vectores de clonación adecuados en Sambrook et al. (eds.), "MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL", segunda edición (Cold Spring Harbor Press 1989) (de aquí en adelante "Sambrook"); en Ausubel et al. (eds.), "CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BiOlOgY" (Wiley Interscience 1987) (de aquí en adelante "Ausubel"); y Brown (ed.), "MOLECULAR BIOLOGY LABFAX" (Academic Press 1991).
Células hospedadoras
Las moléculas de ácido nucleico, el grupo de moléculas de ácido nucleico y/o los vectores de la presente divulgación pueden estar comprendidos en una célula hospedadora, particularmente para los fines de producción de anticuerpos humanizados anti-PD-1 humana. La presente divulgación proporciona así células hospedadoras que comprenden al menos una molécula de ácido nucleico y/o un grupo de moléculas de ácido nucleico y/o un vector descrito anteriormente.
Como se usa en el presente documento, la expresión "célula hospedadora" pretende incluir cualquier célula individual o cultivo celular que pueda ser o haya sido receptor de vectores, moléculas de ácido nucleico exógenas y polinucleótidos que codifican el anticuerpo de la presente divulgación y/o receptores del propio anticuerpo. La introducción del material respectivo a la célula puede llevarse a cabo mediante transformación, transfección y similares. La expresión "célula hospedadora" también pretende incluir la progenie o la posible progenie de una sola célula. Las células hospedadoras adecuadas incluyen células procariotas o eucariotas, y también incluyen, pero sin limitación, bacterias, células de levadura, células de hongos, células vegetales y células animales, tales como células de insectos y células de mamíferos, por ejemplo, murinas, de rata, de conejo, de macaco o humanas.
En un aspecto, una célula hospedadora comprende (por ejemplo, se ha transformado con): (1) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende VL del anticuerpo y/o una secuencia de aminoácidos que comprende VH del anticuerpo y/o la región constante del anticuerpo; o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende VH del anticuerpo.
También se proporciona en el presente documento un método de producción de anticuerpos anti-PD1 humanizados. El método comprende cultivar una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, según lo dispuesto anteriormente, en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo, y opcionalmente recuperar el anticuerpo de la célula hospedadora (o del medio de cultivo de la célula hospedadora). Particularmente, para la producción recombinante de un anticuerpo anti-PD1 humanizado, se aísla ácido nucleico que codifica un anticuerpo, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente, y se inserta en uno o más vectores para una mayor clonación y/o expresión en una célula hospedadora.
Las células hospedadoras adecuadas para producir anticuerpos anti-PD-1 humanizados incluyen, pero sin limitación, células eucariotas, tales como células de mamífero, células vegetales, células de insectos o células de levaduras. Las células de mamífero son hospedadores eucariotas especialmente preferidos, debido a que las células de mamífero proporcionan modificaciones posteriores a la traducción adecuadas, tales como glicosilación. Preferentemente, dichas células hospedadoras eucariotas adecuadas pueden ser hongos, tales comoPichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe;célula de insecto, tal comoMythimna sepárate; células vegetales, tales como el tabaco, y células de mamífero, tales como células BHK, células 293, células CHO, células NSO y células COS. Otros ejemplos de estirpes de células hospedadoras de mamífero útiles son CV-1 en origen con células de genes SV40 (célula COS), estirpe CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7); estirpe de riñón embrionario humano (células 293 o 293 como se describen, por ejemplo, en Graham, F.L. et al, J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74); células de riñón de cría de hámster (BHK); células de Sertoli de ratón (células TM4 como se describe, por ejemplo, en Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252); célula de riñón epitelial humana (célula HEK); células de riñón de mono (CV1); células de riñón de mono verde africano (VERO-76); células de carcinoma cervical humano (HELA); células de riñón canino (MDCK; células de hígado de rata búfalo (BRL 3 A); células de pulmón humano (W138); células de hígado humano (Hep G2); tumor de mama de ratón (MMT 060562); células TRI, como se ha descrito, por ejemplo, en Mather, J. P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68; células MCR 5; y células FS4. Otras estirpes celulares de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), que incluyen células CHO DHFR" (Urlaub, G. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); y estirpes celulares de mieloma, tales como Y0, NSO y Sp2/0. Para una revisión de determinadas estirpes celulares de mamífero hospedadoras adecuadas para la producción de anticuerpos, véase, por ejemplo, Yazaki, P. y Wu, A.M., "Methods in Molecular Biology", Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pág. 255-268. Por ejemplo, pueden ser útiles células de mamífero que están adaptadas para crecer en suspensión.
Particularmente, la célula hospedadora de la presente divulgación se selecciona del grupo que consiste en célula CHO, célula COS, célula NSO y célula HEK.
Para un hospedador mamífero, las señales reguladoras de la transcripción y la traducción del vector de expresión pueden derivar de fuentes víricas, tales como adenovirus, virus del papiloma bovino, virus de simio, o similar, en los que las señales reguladoras están asociadas con un gen particular que tiene un alto nivel de expresión. También se pueden obtener secuencias reguladoras de la transcripción y de la traducción adecuadas de genes de mamífero, tales como genes de actina, colágeno, miosina y metalotioneína.
Los transformantes estables que producen un anticuerpo humanizado de acuerdo con la presente divulgación pueden identificarse usando una variedad de métodos. Tras identificar las células productoras de moléculas, las células hospedadoras se cultivan en condiciones (por ejemplo, temperatura, medio) adecuadas para su crecimiento y para la expresión de anticuerpos humanizados. El anticuerpo humanizado se aísla y/o se purifica mediante cualquier método conocido en la técnica. Estos métodos incluyen, pero sin limitación, tratamiento de renaturalización convencional, tratamiento con precipitante proteico (tal como precipitación en sal), centrifugación, lisis celular por ósmosis, tratamiento por ultrasonidos, supercentrifugación, cromatografía de tamiz molecular o cromatografía en gel, cromatografía de adsorción, cromatografía de intercambio iónico, HPLC, cualquier otra cromatografía líquida y la combinación de los mismos. Según lo descrito, por ejemplo, por Coligan, las técnicas de aislamiento de anticuerpos humanizados pueden incluir particularmente la cromatografía de afinidad con proteína A-Sepharose, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio iónico. La proteína A se usa preferentemente para aislar el anticuerpo de la divulgación.
Conjugados de anticuerpos
La presente divulgación también proporciona un "conjugado de anticuerpos" también denominado "inmunoconjugado" que comprende el anticuerpo anti-PD-1 humanizado o fragmento de anticuerpo del mismo descrito en el presente documento y un segundo agente adecuado, que puede ser un agente terapéutico o un agente de diagnóstico. La divulgación también proporciona inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo anti-PD1 humanizado o un fragmento de anticuerpo del mismo conjugado con uno o más agentes citotóxicos, tales como agentes quimioterapéuticos o fármacos (por ejemplo, un inmunosupresor), agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (por ejemplo, toxinas proteicas, inmunotoxinas, citotoxinas, toxinas activas enzimáticamente de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal o fragmentos de las mismas), radiotoxina, isótopos radiactivos, polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos. Los conjugados de anticuerpos de la presente divulgación pueden usarse para modificar una respuesta biológica dada, y el resto de fármaco no debe interpretarse como limitado a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el resto de fármaco puede ser una proteína o un polipéptido que posea una actividad biológica deseada. El término "inmunoconjugado" se refiere en el presente documento al entrecruzamiento químico o unión covalente de otra molécula/resto con el anticuerpo anti-PD1 humanizado de acuerdo con la presente divulgación mediante métodos recombinantes. Los métodos de preparación de un inmunoconjugado son bien conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, el documento de patente WO 2014/160160, las patentes de EE. UU. n.° 5.208.020 y 5.416.064; y Chari et al., 1992 Cancer Res.
52:127-131).
Composición farmacéutica
La presente divulgación también se refiere a una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo humanizado anti-PD1 humana o un fragmento de anticuerpo del mismo, un conjugado de anticuerpos como se ha desvelado anteriormente, la molécula de ácido nucleico, el grupo de moléculas de ácido nucleico, el vector y/o las células hospedadoras como se ha descrito anteriormente, preferentemente como principio activo o compuesto. Las formulaciones se pueden esterilizar y, si se desea, mezclarse con agentes auxiliares, tales como vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables que no interactúen de manera perjudicial con el anticuerpo humanizado anti-PD-1 humana o el fragmento de anticuerpo del mismo, conjugado de anticuerpos, ácido nucleico, vector y/o célula hospedadora de la presente divulgación. Opcionalmente, la composición farmacéutica puede comprender además un agente terapéutico adicional como se detalla a continuación.
Preferentemente, las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden comprender un anticuerpo humanizado anti-PD-1 humana o un fragmento de anticuerpo del mismo, una molécula de ácido nucleico, un grupo de moléculas de ácido nucleico, un vector y/o las células hospedadoras, como se describe en el presente documento, en combinación con uno o más vehículos, diluyentes, excipientes, sales y antioxidantes farmacéutica o fisiológicamente aceptables, como se describe a continuación. De manera deseable, se emplea una forma farmacéuticamente aceptable que no afecte negativamente a los efectos potenciadores inmunitarios deseados del anticuerpo anti-PD1 humanizado de acuerdo con la presente divulgación. Para facilitar la administración, el anticuerpo humanizado anti-PD-1 humana o el fragmento de anticuerpo del mismo como se describe en el presente documento puede convertirse en una composición farmacéutica para su administraciónin vivo.Los medios de fabricación de dicha composición se han descrito en la técnica (véase, por ejemplo, "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", Lippincott Williams & Wilkins, 21.a edición (2005).
La composición farmacéutica de acuerdo con la presente divulgación puede formularse para cualquier vía de administración convencional que incluye una administración tópica, enteral, oral, parenteral, intranasal, intravenosa, intrarterial, intramuscular, intratumoral, subcutánea o intraocular y similares. Preferentemente, la composición farmacéutica de acuerdo con la presente divulgación está formulada para la vía de administración enteral o parenteral. Las composiciones y formulaciones para la administración parenteral pueden incluir disoluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados, tales como, pero sin limitación, potenciadores de la penetración, compuestos portadores y otros vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.
La composición farmacéutica se puede preparar mezclando un agente que tenga el grado de pureza deseado con vehículos, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables opcionales ("Remington’s Pharmaceutical Sciences" 16.a edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o disoluciones acuosas. Los vehículos, excipientes y/o estabilizantes aceptables no son tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas e incluyen tampones, tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos, tales como metilparabeno o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; azúcares, tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo complejos de Znproteína); y/o tensioactivos no iónicos, tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).
Un vehículo sólido farmacéuticamente aceptable puede incluir una o más sustancias que también pueden actuar de aromatizantes, lubricantes, solubilizantes, agentes de suspensión, colorantes, cargas, sustancias de deslizamiento, adyuvantes de la compresión, aglutinantes inertes, edulcorantes, conservantes, colorantes, recubrimientos o agentes disgregantes de comprimidos. Los vehículos sólidos adecuados incluyen, por ejemplo, fosfato de calcio, estearato de magnesio, talco, azúcares, lactosa, dextrina, almidón, gelatina, celulosa, polivinilpirrolidina, ceras de bajo punto de fusión y resinas de intercambio iónico. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones o dispersiones estériles inyectables. Excepto en el caso de que cualquier agente o medio convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso de los mismos en las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación.
EI anticuerpo anti-PD1 humanizado de acuerdo con la presente divulgación puede disolverse o suspenderse en un vehículo líquido farmacéuticamente aceptable, tal como agua, un disolvente orgánico, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares, una mezcla de ambos, o aceites o grasas farmacéuticamente aceptables y mezclas adecuadas de los mismos. El vehículo líquido puede contener otros aditivos farmacéuticos adecuados, tales como solubilizantes, emulsionantes, tampones, conservantes, edulcorantes, aromatizantes, agentes de suspensión, humectantes, espesantes, colorantes, reguladores de la viscosidad, estabilizadores u osmorreguladores. Los ejemplos adecuados de vehículos líquidos para la administración oral y enteral incluyen agua (que contiene parcialmente aditivos como los anteriores, por ejemplo, derivados de celulosa, preferentemente, disolución de carboximetilcelulosa de sodio), alcoholes (incluyendo los alcoholes monohidroxilados y los alcoholes polihidroxilados, por ejemplo, glicoles) y sus derivados, y aceites (por ejemplo, aceite de coco fraccionado y aceite de cacahuete). Para la administración parenteral, el vehículo también puede ser un éster oleoso, tal como oleato de etilo y miristato de isopropilo. Los vehículos líquidos estériles son útiles en composiciones en forma líquida estéril para la administración enteral. El vehículo líquido para las composiciones presurizadas puede ser un hidrocarburo halogenado u otro propulsor farmacéuticamente aceptable.
La composición farmacéutica de la presente divulgación puede comprender además una o más sales farmacéuticamente aceptables. Una "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que conserva la actividad biológica deseada del compuesto precursor y no confiere ningún efecto toxicológico no deseado. Los ejemplos de dichas sales incluyen sales de adición de ácido y sales de adición de base. Las sales de adición de ácido incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como ácido clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fosforoso y similares, así como de ácidos orgánicos no tóxicos, tales como ácidos alifáticos monocarboxílicos y dicarboxílicos, ácidos alcanoicos sustituidos con fenilo, ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos, y similares. Las sales de adición de base incluyen las derivadas de metales alcalinos o metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, así como de aminas orgánicas no tóxicas, tales como N,N'-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaína y similares. Una composición farmacéutica de la presente divulgación también puede incluir un antioxidante farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato sódico, metabisulfito de sodio, sulfito sódico y similares; antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), Iecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y similares; y agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, y similares.
Para facilitar la administración, el anticuerpo anti-PD-1 o sus ácidos nucleicos codificantes se pueden conjugar con un agente acompañante. El agente acompañante puede ser una sustancia natural, tal como una proteína (por ejemplo, albúmina sérica humana, Iipoproteína de baja densidad o globulina), hidrato de carbono (por ejemplo, un dextrano, pululano, quitina, quitosano, inulina, ciclodextrina o ácido hialurónico) o lípido. También puede ser una molécula recombinante o sintética, tal como un polímero sintético, por ejemplo, un poliaminoácido sintético. Los ejemplos de poliaminoácidos incluyen polilisina (PLL), ácido poli-L-aspártico, ácido poli-L-glutámico, copolímero de estireno-anhídrido de ácido maleico, copolímero de poli(L-lactida-co-gIicolizado), copolímero de divinil éter-anhídrido maleico, copolímero de N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (HMPA), polietilenglicol (PEG), poli(alcohol vinílico) (PVA), poliuretano, poli(ácido 2-etiIacríIico), polímeros de N-isopropilacrilamida y polifosfazina. En un ejemplo, el agente acompañante es una micela, un liposoma, una nanopartícula o una microesfera, en el que se encapsula el oligonucleótido/ARN interferente. Los métodos de preparación de dicha micela, liposoma, nanopartícula o microesfera son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 5.108.921; 5.354.844; 5.416.016; y 5.527.5285.
La composición farmacéutica normalmente debe ser estéril y estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición farmacéutica puede formularse como una disolución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para la alta concentración de fármaco y/o adecuada para inyección. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como Iecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos. En un aspecto, la composición farmacéutica es una composición inyectable que puede contener diferentes vehículos, tales como aceites vegetales, dimetilactamida, dimetilformamida, lactato de etilo, carbonato de etilo, miristato de isopropilo, etanol y polioles (glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido y similares). Para inyección intravenosa, pueden administrarse anticuerpos hidrosolubles mediante el método de goteo, mediante el que se infunde una formulación farmacéutica que contiene el anticuerpo y un excipiente fisiológicamente aceptable. Los excipientes fisiológicamente aceptables pueden incluir, por ejemplo, dextrosa al 5 %, solución salina al 0,9 %, solución de Ringer u otros excipientes adecuados. Se pueden disolver preparaciones intramusculares, por ejemplo, una formulación estéril de una forma de sal soluble adecuada del anticuerpo, y administrarse en un excipiente farmacéutico, tal como agua para inyectables, solución salina al 0,9 % o solución de glucosa al 5 %.
Las disoluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el compuesto activo en la cantidad necesaria en un disolvente adecuado con uno o una combinación de los componentes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por microfiltración. En general, las dispersiones se preparan mediante la incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros componentes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son el secado al vacío y el secado en frío (liofilización) que producen un polvo del principio activo más cualquier componente adicional deseado a partir de una disolución del mismo previamente esterilizada por filtración. Puede lograrse la absorción prolongada de las composiciones inyectables incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
La prevención de la presencia de microorganismos se puede garantizar mediante procedimientos de esterilización y mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, clorobutanol, ácido fenolsórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro sódico y similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma inyectable del fármaco se puede llevar a cabo mediante la inclusión de agentes que retrasen la absorción, tales como monoestearato de aluminio y gelatina.
Un experto en la materia entenderá que las formulaciones de la presente divulgación pueden ser isotónicas con la sangre humana, es decir, las formulaciones de la presente divulgación tienen esencialmente la misma presión osmótica que la sangre humana. Dichas formulaciones isotónicas, en general, tienen una presión osmótica de aproximadamente 250 mOSm a aproximadamente 350 mOSm. La isotonicidad se puede medir mediante, por ejemplo, un osmómetro de presión de vapor o de congelación de hielo. La tonicidad de una formulación se ajusta mediante el uso de modificadores de la tonicidad. Los "modificadores de la tonicidad" son aquellas sustancias inertes farmacéuticamente aceptables que se pueden añadir a la formulación para proporcionar una isotonicidad de la formulación. Los modificadores de la tonicidad adecuados para la presente divulgación incluyen, pero sin limitación, sacáridos, sales y aminoácidos.
Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente divulgación pueden formularse para liberar los principios activos (por ejemplo, el anticuerpo anti-hPD1 humanizado de la presente divulgación) sustancialmente inmediatamente después de la administración, o en cualquier momento o periodo predeterminado tras la administración. La composición farmacéutica, en algunos aspectos, puede emplear sistemas de administración de liberación a lo largo del tiempo, de liberación retardada y de liberación sostenida de manera que la administración de la composición se produzca antes de, y con tiempo suficiente para causar, la sensibilización del sitio que se vaya a tratar. Se pueden usar medios conocidos en la técnica para prevenir o reducir al mínimo la liberación y la absorción de la composición hasta que alcance el tejido u órgano diana, o para garantizar la liberación programada de la composición. Dichos sistemas pueden evitar administraciones repetidas de la composición, aumentando así la comodidad para el sujeto y el médico. La cantidad de principio activo que se puede combinar con un material de vehículo para producir una única forma farmacéutica variará dependiendo del sujeto que se esté tratando y del modo particular de administración. La cantidad de principio activo que se puede combinar con un material portador para producir una sola forma farmacéutica, en general, será la cantidad de la composición que produzca un efecto terapéutico.
Sujeto, régimen y administración
La presente divulgación se refiere a un anticuerpo anti-PD1 humanizado o fragmento del mismo, una composición farmacéutica, una molécula de ácido nucleico, un grupo de moléculas de ácido nucleico, un vector o una célula hospedadora de la presente divulgación para su uso como un medicamento, particularmente para su uso en el tratamiento de una enfermedad o un trastorno en un sujeto. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento o diagnósticoin vivose refieren a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en los métodos de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia o para el diagnósticoin vivo.
Los ejemplos de tratamientos se describen más particularmente a continuación en el apartado "Métodos y usos". También se refiere al uso de una composición farmacéutica, un ácido nucleico, un vector o una célula hospedadora de la presente divulgación, o un anticuerpo anti-PD1 humanizado o un fragmento de anticuerpo del mismo en la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad en un sujeto. Finalmente, se refiere a un método de tratamiento de una enfermedad o un trastorno en un sujeto que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica, o un anticuerpo anti-PD1 humanizado o un fragmento de anticuerpo del mismo, al sujeto. Los ejemplos de tratamientos se describen más particularmente a continuación en el apartado "Métodos y usos".
El sujeto que se va a tratar puede ser un ser humano, particularmente un ser humano en la etapa prenatal, un recién nacido, un niño, un lactante, un adolescente o un adulto, en particular un adulto de al menos 30 años, 40 años, preferentemente un adulto de al menos 50 años, aún más preferentemente un adulto de al menos 60 años, incluso más preferentemente un adulto de al menos 70 años.
En un aspecto particular, el sujeto está inmunosuprimido o inmunodeprimido. Dichos sujetos pueden estar inmunosuprimidos, inmunocomprometidos o inmunodeprimidos, por ejemplo, debido a la infección por un virus tal como el VIH, cáncer, diabetes, desnutrición y ciertos trastornos genéticos, a tratamientos con fármacos inmunosupresores o al tratamiento previo por inmunoterapia, quimioterapia o radioterapia. El sujeto de la presente divulgación puede estar inmunodeprimido. Como se usan en el presente documento, los términos "inmunodeprimido" e "inmunodeficiente" son equivalentes y pueden usarse indistintamente. Como se usa en la presente divulgación, el término "inmunodeprimido" o "inmunocomprometido" se refiere a un estado en el que el sujeto tiene debilitadas las defensas inmunitarias. Las personas inmunodeprimidas son incapaces de combatir adecuadamente los microorganismos que, en condiciones normales, no presentan peligro. El sujeto de la presente divulgación puede estar inmunosuprimido. Como se usa en el presente documento, el término "inmunosuprimido" se refiere a un estado en el que el sujeto ya no tiene defensas inmunitarias.
El anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, la composición farmacéutica, la molécula de ácido nucleico aislada o el grupo de moléculas de ácido nucleico aisladas, el vector o la célula hospedadora de acuerdo con la presente divulgación pueden usarse en el tratamiento de pacientes con un trastorno linfopénico.
Particularmente, el sujeto está afectado por una enfermedad que puede implicar la vía PD-1/PDL-1, particularmente, en donde al menos uno de los ligandos de PD-1 (por ejemplo, PDL-1 y/o PDL-2) o PD-1 se expresa/n, en especial, se sobreexpresa/n. Preferentemente, el sujeto padece cáncer, incluso más preferentemente un cáncer positivo en PD1, PD-L1 y/o PD-L2 o un cáncer positivo en PD-1. Los ejemplos de enfermedades y cánceres se describen más particularmente a continuación en el apartado "Métodos y usos". En un aspecto particular, el sujeto ya ha recibido al menos una línea de tratamiento, preferentemente varias líneas de tratamiento, antes de la administración del anticuerpo anti-PD1 humanizado de acuerdo con la presente divulgación o de una composición farmacéutica de acuerdo con la presente divulgación. Se pueden usar métodos convencionales, conocidos por los expertos en el campo de la medicina, para administrar el anticuerpo anti-PD1 humanizado o el fragmento de anticuerpo del mismo, o la composición farmacéutica desvelada en el presente documento al sujeto, dependiendo del tipo de enfermedades que se vayan a tratar o del sitio de la enfermedad. Esta composición se puede administrar a través de vías convencionales, por ejemplo, administrarse por vía oral, parenteral, enteral, mediante aerosol para inhalación, por vía tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal o mediante un depósito implantado. La expresión "vía parenteral", como se usa en el presente documento, incluye técnicas de inyección o infusión subcutánea, intracutánea, intravenosa, intramuscular, intrarticular, intrarterial, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intralesión, intratumoral e intracraneal. Cuando se administra por vía parenteral, la composición farmacéutica de acuerdo con la presente divulgación se administra preferentemente por vía de administración intravenosa. Cuando se administra por vía enteral, la composición farmacéutica de acuerdo con la presente divulgación se administra preferentemente por vía de administración oral. Esta composición también se puede administrar localmente.
La forma de las composiciones farmacéuticas, la vía de administración y la dosis de administración de la composición farmacéutica, o del anticuerpo anti-PD1 humanizado o fragmento del mismo de acuerdo con la presente divulgación pueden ser ajustadas por el experto en la materia de acuerdo con el tipo y la gravedad de la infección, y con el paciente, en particular su edad, peso, sexo y estado físico general. Las composiciones de la presente divulgación pueden administrarse de varias maneras dependiendo de si se desea un tratamiento local o sistémico. Preferentemente, el tratamiento con el anticuerpo anti-PD-1 humanizado o fragmento del mismo, o con una composición farmacéutica de acuerdo con la presente divulgación, se administra regularmente, preferentemente entre todos los días, todas las semanas o todos los meses, más preferentemente entre cada día y cada una, dos, tres o cuatro semanas. En un aspecto particular, el tratamiento se administra varias veces al día, preferentemente, 2 o 3 veces al día.
La duración del tratamiento con el anticuerpo anti-PD-1 humanizado o fragmento del mismo, o con una composición farmacéutica de acuerdo con la presente divulgación, está comprendida preferentemente entre 1 día y 20 semanas, más preferentemente entre 1 día y 10 semanas, aún más preferentemente entre 1 día y 4 semanas, incluso más preferentemente entre 1 día y 2 semanas. Como alternativa, el tratamiento puede durar mientras persista la enfermedad.
El anticuerpo anti-hPD1 humanizado desvelado en el presente documento puede proporcionarse en un intervalo de dosis eficaz de aproximadamente 1 ng/kg de peso corporal a aproximadamente 30 mg/kg de peso corporal, 1 pg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, 10 pg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, o 100 pg/kg a 5 mg/kg, opcionalmente cada una, dos, tres o cuatro semanas, preferentemente mediante administración parenteral u oral, en particular mediante administración intravenosa o subcutánea.
Particularmente, el anticuerpo anti-hPD1 humanizado de acuerdo con la presente divulgación se puede administrar a una dosis subterapéutica. La expresión "dosis subterapéutica", como se usa en el presente documento, se refiere a una dosis que está por debajo de los niveles de dosis monoterapéutica eficaces comúnmente usados para tratar una enfermedad, o una dosis que actualmente no se usa normalmente para la monoterapia eficaz con anticuerpos antihPD1.
Métodos y usos
Uso en el tratamiento de una enfermedad
El anticuerpo anti-PD-1 humanizado o el fragmento de unión al antígeno del mismo, los ácidos nucleicos, los vectores, las células hospedadoras, las composiciones y los métodos de la presente divulgación tienen numerosas utilidades y aplicacionesin vitroein vivo.Por ejemplo, el anticuerpo anti-PD-1 humanizado o su fragmento de anticuerpo (ya sea en forma libre o como inmunoconjugados), los ácidos nucleicos, los vectores, las células hospedadoras y/o las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden usarse como agentes terapéuticos, agentes de diagnóstico e investigaciones médicas. Particularmente, cualquiera de los anticuerpos anti-PD1 humanizados, los ácidos nucleicos, los vectores, las células hospedadoras, o las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento, pueden usarse en métodos terapéuticos y/o con fines terapéuticos. Particularmente, el anticuerpo anti-PD-1 humanizado o el fragmento de anticuerpo del mismo proporcionado en el presente documento puede ser útil para el tratamiento de cualquier enfermedad o afección en la que participe la PD-1, tal como el cáncer y una infección, u otras enfermedades asociadas con la inmunodeficiencia, tales como la disfunción de linfocitos T.
En un aspecto, la presente divulgación se refiere a un método de tratamiento de una patología, enfermedad y/o trastorno que podría prevenirse o tratarse mediante la inhibición de la unión de PD-L1 y/o PD-L2 a PD-1.
Incluso más preferentemente, la presente divulgación se refiere a un método de tratamiento de una enfermedad y/o un trastorno seleccionado del grupo que consiste en un cáncer y una enfermedad infecciosa, preferentemente una infección crónica, en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz del anticuerpo anti-PD1 o de la composición farmacéutica como se ha definido anteriormente. Los ejemplos de dichas enfermedades se describen más particularmente a continuación.
La presente divulgación también se refiere a un anticuerpo anti-hPD1 humanizado o fragmento de unión al antígeno del mismo, un ácido nucleico, un grupo de ácidos nucleicos o un vector que los codifica, o una composición farmacéutica que los comprende para su uso en el tratamiento de un trastorno y/o una enfermedad en un sujeto y/o para su uso como un medicamento o una vacuna. También se refiere al uso de un anticuerpo anti-hPD1 humanizado o un fragmento de unión al antígeno del mismo, un ácido nucleico o un vector que los codifica, o una composición farmacéutica que los comprende en la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad y/o un trastorno en un sujeto. Finalmente, se refiere a un método de tratamiento de una enfermedad o un trastorno en un sujeto que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica, o un anticuerpo anti-PD1 humanizado o un fragmento de anticuerpo del mismo al sujeto.
En un aspecto particular, la presente divulgación se refiere particularmente a un anticuerpo humanizado anti-hPD1 o a un fragmento de unión al antígeno del mismo, un ácido nucleico, un grupo de ácidos nucleicos o un vector que los codifica, o una composición farmacéutica que los comprende, como se desvela en el presente documento, para su uso en el tratamiento de una patología, enfermedad y/o trastorno que podría prevenirse o tratarse mediante la inhibición de la unión de PD-L1 y/o PD-L2 a PD-1.
Por consiguiente, en el presente documento se desvelan métodos de tratamiento de una enfermedad asociada con la vía de señalización PD-1 y/o PD-1/PD-L1 y/o PD-1/PD-L2 que comprende administrar a un sujeto que necesita un tratamiento una cantidad eficaz del anticuerpo anti-PD-1 o de la composición farmacéutica descrita en el presente documento. También se han de tener en cuenta los datos fisiológicos del paciente (por ejemplo, la edad, el tamaño y el peso) y las vías de administración para determinar la dosis apropiada, por la que se administrará una cantidad terapéuticamente eficaz al paciente.
En el presente documento se desvelan métodos de tratamiento de un paciente con una enfermedad y/o un trastorno, comprendiendo el método: (a) identificar a un paciente que necesita tratamiento; y (b) administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo, del ácido nucleico, del vector o de la composición farmacéutica que se describen en el presente documento.
En un aspecto particular, el sujeto que necesita un tratamiento puede ser un ser humano que tenga, que esté en riesgo o que se sospecha de tiene una enfermedad asociada con la vía de señalización mediada por PD-1. Dicho paciente puede identificarse mediante un examen médico de rutina. Por ejemplo, un sujeto adecuado para el tratamiento puede identificarse examinando si dicho sujeto es portador de células positivas en PD-1, PD-L1 y/o PD-L2. En un aspecto, un sujeto que necesita un tratamiento es un paciente que tiene, que es sospechoso de tener o que está en riesgo de una enfermedad, preferentemente una enfermedad positiva en PD-1, PDL1 y/o PDL2, incluso más preferentemente una enfermedad en la que se sobreexpresa PD-1 y/o al menos un ligando de PD-1. En dicho sujeto, la interrupción de la interacción de PD-1/PD-L1 y/o PD-1/PD-L2 gracias a la administración del anticuerpo o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente divulgación puede potenciar la respuesta inmunitaria del sujeto. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 humanizado o la composición farmacéutica que se describen en el presente documento pueden usarse para tratar células positivas en PD-1.
Como alternativa, debido al efecto sobre la fagocitosis de los macrófagos que no son específicos de las células diana que expresan PD-L1 o PD-L2, un sujeto adecuado para el tratamiento también puede tener células negativas en PD-L1 y/o PD-L2. En un aspecto, un sujeto que necesita un tratamiento es un paciente que tiene, es sospechoso de tener o está en riesgo de padecer una enfermedad que es negativa en PDL1 y/o PDL2.
En otro aspecto, el anticuerpo anti-PD-1 humanizado o la composición farmacéutica que se describen en el presente documento se pueden administrar a un sujeto, por ejemplo,in vivo,para potenciar la inmunidad, preferentemente para tratar un trastorno y/o una enfermedad. Por consiguiente, en un aspecto, la presente divulgación proporciona un método de modificación de una respuesta inmunitaria en un sujeto que comprende administrar al sujeto un anticuerpo anti-PD-1 humanizado o un fragmento de unión al antígeno del mismo, ácido nucleico, vector o composición farmacéutica de la presente divulgación de modo que se modifica la respuesta inmunitaria en el sujeto. Preferentemente, la respuesta inmunitaria se potencia, se aumenta, se estimula o se regula por incremento. El anticuerpo anti-hPD-1 humanizado o la composición farmacéutica se pueden usar para potenciar las respuestas inmunitarias, tales como la activación de linfocitos T en un sujeto que necesita un tratamiento. La mejora de la respuesta inmunitaria puede producir la inhibición de la unión de PD-L1 y/o PD-L2 a PD-1, reduciendo así el entorno inmunosupresor, estimulando la proliferación y/o la activación de linfocitos T humanos y/o la secreción de IFNy por CMSP humanas.
Como alternativa o además, la potenciación de la respuesta inmunitaria puede deberse a la activación de la fagocitosis de las células por los macrófagos. Esta fagocitosis no se limita a las células que expresan PD-L1. De hecho, el anticuerpo anti-hPD-1 humanizado de la presente divulgación puede activar la fagocitosis de cualquier célula por parte de estos macrófagos, especialmente células cancerosas o células infectadas.
La presente divulgación proporciona particularmente un método de potenciación de una respuesta inmunitaria en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera del anticuerpo anti-PD-1 humanizado o fragmento de unión al antígeno del mismo, ácido nucleico, vector o composición farmacéutica que los comprende, tal como se describe en el presente documento, de modo se potencie una respuesta inmunitaria en el sujeto.
En algunos aspectos, la cantidad del anticuerpo anti-hPD-1 humanizado descrito en el presente documento es eficaz para suprimir la señalización de PD-1 (por ejemplo, reducir la señalización de PD-1 en al menos un 20 %, 30 %, 50 %, 80 %, 100 %, 200 %, 400 % o 500 % en comparación con un control). En otros aspectos, la cantidad del anticuerpo anti-PD-1 descrito en el presente documento es eficaz en activar las respuestas inmunitarias (por ejemplo, en al menos un 20 %, 30 %, 50 %, 80 %, 100 %, 200 %, 400 % o 500 % en comparación con un control). En algunos aspectos, la cantidad del anticuerpo anti-hPD-1 humanizado descrito en el presente documento es eficaz en la inhibición de la unión de PD-L1 y/o PD-L2 humanos a PD-1 humana, por ejemplo, inhibiendo la unión en al menos un 20 %, 30 %, 50 %, 80 %, 100 %, 200 %, 400 % o 500 % en comparación con un control).
En algunos aspectos, la cantidad del anticuerpo anti-hPD-1 humanizado descrito en el presente documento es suficiente para tener una actividad antagonista de la unión de PD-L1 y/o PD-L2 humanos a PD-1 humana, por ejemplo, inhibiendo la unión en al menos un 20 %, 30 %, 50 %, 80 %, 100 %, 200 %, 400 % o 500 % en comparación con un control).
Cáncer
Se sabe en la técnica que el bloqueo de PD-1 por los anticuerpos puede mejorar la respuesta inmunitaria hacia las células cancerosas en un paciente. Por lo tanto, en un aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo anti-PD1 o una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo anti-PD1 o de la composición farmacéutica, preferentemente para interrumpir o inhibir la interacción de PD1/PD-L1 y/o PD1/PD-L2. Por lo tanto, en un aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo anti-PD-1 o una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer, en donde el anticuerpo anti-PD-1 es capaz de activar los linfocitos T agotados, preferentemente interrumpiendo o inhibiendo la interacción de PD1/PD-L1 y/o PD1/PD-L2. En un aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo anti-PD-1 o una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer, en donde el anticuerpo anti-PD-1 es capaz de activar macrófagos, preferentemente interrumpiendo o inhibiendo la interacción de PD1/PD-L1 y/o PD1/PD-L2.
En un aspecto, un sujeto que necesita un tratamiento es un paciente que tiene, que es sospechoso de tener o que está en riesgo de una enfermedad, preferentemente un cáncer positivo en PD-1 o en PD-L1, incluso más preferentemente un cáncer en el que se expresa o se sobreexpresa PD-1 o PD-L1. Por ejemplo, un paciente adecuado para el tratamiento puede identificarse examinando si dicho paciente es portador de células tumorales positivas en PD-L1. Además o como alternativa, el sujeto adecuado para el tratamiento es un sujeto que tiene linfocitos T infiltrantes en tumores que expresan o sobreexpresan PD-1.
En otro aspecto, un sujeto es un paciente que tiene, que es sospechoso de tener o que está en riesgo de desarrollar un cáncer, preferentemente un cáncer positivo en PD-L1 y/o PD-L2. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-PD-1 humanizado o la composición farmacéutica que se describen en el presente documento se puede usar para tratar tumores positivos en PD-L1 y/o PD-L2. Por ejemplo, se puede identificar un paciente humano adecuado para el tratamiento examinando si dicho paciente es portador de células cancerosas positivas en PD-L1 y/o PD-L2.
En aspectos adicionales, se proporciona un anticuerpo anti-hPD1 humanizado o un fragmento de anticuerpo del mismo para su uso en el tratamiento del cáncer, preferentemente un cáncer positivo en PD-L1 y/o PD-L2, incluso, más preferentemente un cáncer en el que se sobreexpresan PD-L1 y/o PD-L2.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona el uso de un anticuerpo anti-hPD-1 humanizado, o una parte de unión al antígeno del mismo, o una composición farmacéutica según lo desvelado en el presente documento en la fabricación de un medicamento para tratar un cáncer, por ejemplo, para inhibir el crecimiento de células tumorales, en un sujeto, preferentemente que tiene células tumorales positivas en PD-L1 o PD-L2.
Por consiguiente, en un aspecto, la presente divulgación proporciona un método de tratamiento de un cáncer, por ejemplo, de inhibición del crecimiento de células tumorales, en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-PD-1 humanizado, o una parte de unión al antígeno del mismo, o una composición farmacéutica de acuerdo con la presente divulgación. Particularmente, la presente divulgación se refiere al tratamiento de un sujeto que usa un anticuerpo anti-PD-1 humanizado de manera que se inhiba el crecimiento de células cancerosas.
En un aspecto de la divulgación, el cáncer que se va a tratar se asocia con el agotamiento de linfocitos T. Preferentemente, por "células tumorales positivas en PD-L1" o "células tumorales positivas en PD-L2" se entiende una población de células tumorales en las que PD-L1 o PD-L2, respectivamente, se expresan en al menos el 10 % de las células tumorales, preferentemente en al menos el 20, 30, 40 o 50 % de las células tumorales.
Como alternativa o además, el anticuerpo anti-hPD-1 humanizado de la presente divulgación también se puede usar para tratar un cáncer que pueda estar asociado con una baja expresión de PD-1 y/o PD-L1, y/o un bajo número de linfocitos T, especialmente linfocitos T infiltrados en tumores, y/o una gran cantidad de linfocitos T agotados. De hecho, el anticuerpo anti-hPD-1 humanizado de la presente divulgación puede activar sorprendentemente Ia fagocitosis de cualquier célula (células que expresan o no PD-1 y/o PD-L1) por estos macrófagos. En este contexto, los pacientes pueden estar inmunosuprimidos, inmunocomprometidos o inmunodeprimidos debido a la infección por un virus tal como el VIH, cáncer, diabetes, desnutrición y ciertos trastornos genéticos, a tratamientos con fármacos inmunosupresores o al tratamiento previo por inmunoterapia, quimioterapia o radioterapia.
Por consiguiente, el anticuerpo anti-hPD-1 humanizado de la presente divulgación también se puede usar para tratar un cáncer con células tumorales negativas en PD-L1.
Preferentemente, por "células tumorales negativas en PD-L1" o "células tumorales negativas en PD-L2" se entiende una población de células tumorales en la que PD-L1 o PD-L2, respectivamente, se expresan en menos del 10 % de las células tumorales, preferentemente en menos del 5 % de Ias células tumorales, preferentemente, en menos del 1 % de las células tumorales.
Cualquier cáncer adecuado que puede tratarse con el anticuerpo proporcionado en el presente documento puede ser cáncer hematopoyético o cáncer sólido. Dichos cánceres incluyen carcinoma, cáncer de cuello uterino, cáncer colorrectal, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer gastrointestinal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, linfoma, glioma, mesotelioma, melanoma, cáncer de estómago, cáncer de uretra inducido por factores ambientales y cualquier combinación de dichos cánceres. La presente divulgación también es útil para el tratamiento de los cánceres metastásicos, especialmente cánceres metastásicos que expresan PD-L1 (Iwai et al., (2005) Int. Immunol. 17: 133-144). Incluye neoplasias malignas recurrentes o refractarias.
En un aspecto particular, el cáncer es una neoplasia hematológica o un tumor sólido con alta expresión de PD-1 y/o PD-L1. Dicho cáncer se puede seleccionar del grupo que consiste en neoplasias hematolinfoides, linfoma angioinmunoblástico de linfocitos T, síndrome mielodisplásico, leucemia mieloide aguda. En un aspecto particular, el cáncer es un cáncer inducido por virus o asociado con la inmunodeficiencia. Dicho cáncer se puede seleccionar del grupo que consiste en el sarcoma de Kaposi (por ejemplo, asociado con el virus del herpes del sarcoma de Kaposi); cáncer de células escamosas cervical, anal, de pene y vulvar, y cánceres de orofaringe (por ejemplo, asociados con el virus del papiloma humano); linfomas no Hodgkin de linfocitos B (LNH), incluyendo el linfoma difuso de linfocitos B grande, linfoma de Burkitt, linfoma plasmablástico, linfoma primario del sistema nervioso central, linfoma primario de derrame de HHV-8, linfoma de Hodgkin clásico y trastornos Iinfoproliferativos (por ejemplo, asociados con el virus de Epstein-Barr (VEB) y/o el virus del herpes del sarcoma de Kaposi); carcinoma hepatocelular (por ejemplo, asociado con virus de hepatitis B y/o C); carcinoma de células de Merkel (por ejemplo, asociado con el virus del polioma de células de Merkel (MPV); y cáncer asociado con la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Preferentemente, el cáncer que se va a tratar o prevenir se selecciona del grupo que consiste en melanoma metastásico o no metastásico, mesotelioma maligno, cáncer de pulmón no microcítico, carcinoma de células renales, linfoma de Hodgkin, cáncer de cabeza y cuello, carcinoma urotelial, cáncer colorrectal, carcinoma hepatocelular, cáncer de pulmón microcítico, carcinoma de células de Merkel metastásico, cánceres gástrico y gastroesofágico, y cáncer cervical.
Los cánceres preferidos para el tratamiento incluyen cánceres que normalmente responden a la inmunoterapia. A modo de ejemplo y sin el deseo de quedar vinculados a teoría alguna, el tratamiento con un anticuerpo contra el cáncer o un inmunoconjugado contra el cáncer u otra terapia contra el cáncer actual que conduzca a la muerte de células cancerosas potenciaría una respuesta inmunitaria mediada por PD-1. Por consiguiente, un tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa (por ejemplo, un tumor canceroso) puede incluir un anticuerpo anti-PD-1 humanizado o un fragmento del mismo combinado con un tratamiento contra el cáncer, concurrente o secuencialmente, o cualquier combinación de los mismos, que pueda potenciar una respuesta inmunitaria antitumoral por parte del hospedador. Preferentemente, un anticuerpo anti-PD-1 puede usarse en combinación con otros agentes inmunogénicos (por ejemplo, ADC), tratamientos convencionales contra el cáncer u otros anticuerpos como se describe a continuación.
Enfermedad infecciosa
El anticuerpo anti-PD1 humanizado o su fragmento o las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación se usan para tratar pacientes que han sido expuestos a toxinas o patógenos particularmente. Por consiguiente, un aspecto de la presente divulgación proporciona un método de tratamiento de una enfermedad infecciosa en un sujeto que comprende administrar al sujeto un anticuerpo anti-PD-1 humanizado, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, o una composición farmacéutica que los comprende, preferentemente de modo que el sujeto sea tratado por la enfermedad infecciosa.
Cualquier infección adecuada puede tratarse con el anticuerpo anti-PD1 humanizado o el fragmento de anticuerpo proporcionado en el presente documento.
Algunos ejemplos de virus patógenos causantes de infecciones que se pueden tratar mediante los métodos de la presente divulgación incluyen VIH, hepatitis (A, B o C), virus del herpes (por ejemplo, VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II y CMV, virus Epstein Barr), adenovirus, virus de la gripe, flavivirus, ecovirus, rinovirus, virus coxsackie, coronavirus, virus sincitial respiratorio, virus de las paperas, rotavirus, virus del sarampión, virus de la rubeola, parvovirus, virus de la variolovacuna, virus HTLV, virus del dengue, virus del papiloma, virus de molusco, virus de la poliomielitis, virus de la rabia, virus JC y virus de Ia encefalitis arboviral.
Particularmente, el anticuerpo anti-PD1 o las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación se usan para tratar a pacientes que tienen infección vírica crónica, estando dicha infección causada por virus seleccionados del grupo que consiste en retrovirus, anelovirus, circovirus, herpesvirus, virus de la varicela zóster (VZV), citomegalovirus (CMV), virus Epstein Barr (EBV), virus del polioma BK, virus del polioma, virus adenoasociados (AVV), herpes simple de tipo 1 (HSV-1), adenovirus, herpes simple de tipo 2 (HSV-2), virus del herpes del sarcoma de Kaposi (KSHV), virus de la hepatitis B (VHB), virus de GB C, virus del papiloma, virus de la hepatitis C (HCV), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la hepatitis D (VHD), virus de la leucemia de linfocitos T humanos de tipo 1 (HTLV1), virus relacionado con el virus de la leucemia murina xenotrópica (XMLV), virus de la rubeola, sarampión alemán, parvovirus B19, virus del sarampión, virus Coxsackie.
Algunos ejemplos de bacterias patógenas causantes de infecciones que se pueden tratar mediante los métodos de la presente divulgación incluyen clamidia, bacterias rickettsiales, micobacterias, estafilococos, estreptococos, neumonococos, meningococos y conococos, klebsiella, proteus, serratia, pseudomonas, legionella, difteria, salmonela, bacilos, cólera, tétanos, botulismo, ántrax, peste, Ieptospirosis y bacterias de la enfermedad de Lyme. Algunos ejemplos de hongos patógenos que causan infecciones tratables mediante los procedimientos de la presente divulgación incluyenCandida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis,etc.),Oryptococcus neoformans,Aspergillus(fumigatus, niger,etc.), géneroMucorales (mucor, absidia, rhízophus), Sporothríx schenkii,Blastomyoes dermatitidis,Paracoocidioides brasiliensis, Coccidioides immitiseHistoplasma capsularum.
Algunos ejemplos de parásitos patógenos que causan infecciones tratables mediante los procedimientos de la presente divulgación incluyenEntamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleriafowleri, Acanthamoeba sp., Giardia lambía, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondiyNippostrongylus brasiliensis.
En todos los métodos anteriores, el bloqueo de PD-1 puede combinarse con otras formas de inmunoterapia, tales como tratamiento con citocinas (por ejemplo, interferones, GM-CSF, G-CSF, IL-2) o cualquier terapia, que proporcione una presentación de antígenos tumorales potenciada.
Terapia combinada
En particular, el anticuerpo anti-PD-1 humanizado o el fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con la presente divulgación se puede combinar con algunas otras estrategias potenciales para superar los mecanismos de evasión inmunitaria con agentes en desarrollo clínico o ya en el mercado (véase la Tabla 1 de Antonia et al., Immuno-oncology combinations: a review of clinical experience and future prospects. Clin. Cancer Res. Off. J. Am. Assoc. Cancer Res. 20, 6258-6268, 2014). Dicha combinación con el anticuerpo anti-PD-1 humanizado o el fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con la presente divulgación puede ser útil especialmente para:
1- revertir la inhibición de la inmunidad adaptativa (bloqueando las vías del punto de control de los linfocitos T), por ejemplo, usando una molécula anti-CTLA4;
2- activar la inmunidad adaptativa (potenciando la señalización del receptor coestimulador de linfocitos T usando moléculas agonistas, particularmente anticuerpos);
3- mejorar la función de las células inmunitarias innatas;
4- activar el sistema inmunitario (potenciando la función efectora de las células inmunitarias), por ejemplo, a través de estrategias basadas en vacunas.
Por consiguiente, también se proporcionan en el presente documento terapias combinadas para cualquiera de las enfermedades descritas en el presente documento con el anticuerpo anti-PD-1 humanizado o fragmento de anticuerpo del mismo o composición farmacéutica que los comprende como se describe en el presente documento y un agente terapéutico adicional. En un aspecto, el anticuerpo anti-PD-1 humanizado y un agente terapéutico adicional pueden estar presentes en una composición farmacéutica como se ha descrito anteriormente. Como alternativa, la expresión "terapia de combinación" o "terapia combinada" como se usa en el presente documento, engloba la administración de estos agentes (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-1 como se describe en el presente documento y un segundo agente terapéutico adecuado adicional) de manera secuencial, es decir, en donde cada agente terapéutico se administra en un momento diferente, así como la administración de estos agentes terapéuticos, o al menos dos de los agentes, de forma sustancialmente simultánea. La administración secuencial o esencialmente simultánea de cada agente terapéutico puede efectuarse por cualquier vía apropiada. Los agentes pueden administrarse por la misma vía o por vías diferentes. Por ejemplo, un primer agente (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-1) puede administrarse por vía oral, y un agente terapéutico adicional (por ejemplo, un agente contra el cáncer, un agente antiinfeccioso; o un inmunomodulador) puede administrarse por vía intravenosa. Como alternativa, un agente de la combinación seleccionado puede administrarse por inyección intravenosa mientras que los otros agentes de la combinación pueden administrarse por vía oral.
En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un medio terapéutico, particularmente un medio de producto de combinación, que comprende como principios activos: un anticuerpo humanizado anti-hPD-1 o fragmento de unión al antígeno como se ha definido anteriormente y un agente adicional y terapéutico, en donde dichos principios activos se formulan para la terapia separada, secuencial o combinada, particularmente para un uso combinado o secuencial. Como se usa en el presente documento, el término "secuencial" significa, a menos que se especifique lo contrario, caracterizado por una secuencia u orden regular, por ejemplo, si un régimen posológico incluye la administración de un anticuerpo anti-hPD-1 humanizado y el agente adicional o segundo agente, un régimen posológico secuencial podría incluir la administración de un anticuerpo anti-hPD-1 humanizado antes, simultáneamente, sustancialmente simultáneamente o después de la administración del segundo agente, pero ambos agentes se administrarán en una secuencia u orden regular. El término "separado" significa, a menos que se especifique lo contrario, mantenerse separados entre sí. El término "simultáneamente" significa, a menos que se especifique lo contrario, que sucede o que se realiza al mismo tiempo, es decir, los agentes de la presente divulgación se administran al mismo tiempo. La expresión "de manera esencialmente simultánea" significa que los agentes se administran en el transcurso de unos minutos entre sí (por ejemplo, en el transcurso de 15 minutos entre sí) y pretende englobar la administración conjunta, así como la administración consecutiva, pero si la administración es consecutiva, es separada en el tiempo solo por un periodo corto (por ejemplo, el tiempo que requeriría un médico para administrar dos compuestos por separado).
Debe apreciarse que cualquier combinación descrita en el presente documento puede usarse en cualquier orden para tratar el trastorno o la enfermedad que se describe en el presente documento. Las combinaciones descritas en el presente documento pueden seleccionarse en función de una serie de factores, que incluyen, pero sin limitación, la eficacia de inhibir o prevenir la progresión de la enfermedad diana, la eficacia de mitigar los efectos secundarios de otro agente de la combinación, o la eficacia de mitigar los síntomas relacionados con la enfermedad diana. Por ejemplo, una terapia combinada descrita en el presente documento puede reducir cualquiera de los efectos secundarios asociados con cada miembro individual de la combinación.
La presente divulgación también se refiere a un método de tratamiento de una enfermedad en un sujeto que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de los anticuerpos anti-hPD-1 humanizados o la composición farmacéutica descrita en el presente documento y una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente terapéutico adicional.
Cuando el anticuerpo anti-hPD-1 humanizado o la composición farmacéutica que se describen en el presente documento se usa junto con un agente terapéutico adicional, se puede usar una dosis subterapéutica de la composición o del segundo agente, o una dosis subterapéutica de ambos, en el tratamiento de un sujeto, preferentemente, un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar una enfermedad o un trastorno asociado con la señalización celular mediada por PD-1. Ejemplos de terapéuticos adicionales son alquilantes, inhibidores de Ia angiogénesis, anticuerpos, en particular anticuerpos dirigidos contra tumores, antimetabolitos, antimitóticos, antiproliferativos, antivíricos, inhibidores de la aurora quinasa, promotores de Ia apóptosis (por ejemplo, inhibidores de la familia Bcl-2), activadores de la vía del receptor de muerte, inhibidores de la Bcr-Abl quinasa, anticuerpos BiTE (captadores de linfocitos T biespecíficos), conjugados de anticuerpo-fármaco, modificadores de la respuesta biológica, inhibidores de la tirosina quinasa de Bruton (BTK), inhibidores de la quinasa dependientes de la ciclina, inhibidores del ciclo celular, inhibidores de la ciclooxigenasa-2, DVD, inhibidores del receptor del oncogén homólogo vírico de la leucemia (ErbB2), inhibidores de factores de crecimiento, inhibidores de la proteína de choque térmico (HSP)-90, inhibidores de la histona desacetilasa (HDAC), terapias hormonales, agentes inmunológicos, inhibidores de inhibidores de proteínas de la apóptosis (IAP), antibióticos intercalantes, inhibidores de las quinasas, inhibidores de las quinesinas, inhibidores de Jak2, diana de mamífero de inhibidores de rapamicina, microARN, inhibidores de las quinasas reguladas por señales extracelulares activadas por mitógenos, proteínas de unión multivalentes, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), inhibidores de poli-ADP (adenosina difosfato)-ribosa polimerasa (PARP), agentes quimioterapéuticos de platino, inhibidores de la quinasa de tipo polo (Plk), inhibidores de la fosfoinositida-3 quinasa (PI3K), inhibidores del proteosoma, análogos de purina, análogos de pirimidina, inhibidores del receptor de tirosina quinasa, alcaloides de plantas retinoides/deltoides, ácidos ribonucleicos inhibidores pequeños (ARNip), inhibidores de topoisomerasa, inhibidores de ubiquitina ligasa, agentes hipometilantes, inhibidores de puntos de control, vacuna peptídica y similares, epítopos o neoepítopos de antígenos tumorales, así como combinaciones de uno o más de estos agentes.
Por ejemplo, el agente terapéutico adicional se puede seleccionar del grupo que consiste en quimioterapia, radioterapia, terapia dirigida, anticuerpos dirigidos contra tumores, agentes antiangiogénicos, agentes hipometilantes, vacunas contra el cáncer, epítopos o neoepítopos de antígenos tumorales, inhibidores de puntos de control mieloides, otras inmunoterapias e inhibidores de HDAC.
En un aspecto preferido, el agente terapéutico adicional se selecciona del grupo que consiste en agentes quimioterapéuticos, agentes de radioterapia, agentes inmunoterapéuticos, agentes de terapia celular (tales como linfocitos CAR-T), antibióticos y probióticos.
Dicho agente inmunoterapéutico también puede ser un anticuerpo dirigido al antígeno tumoral, particularmente seleccionado del grupo que consiste en anti-Her2, anti-EGFR, anti-CD20, anti-CD19 y anti-CD52. Dichos anticuerpos pueden ser anticuerpos citotóxicos dirigidos a células tumorales o anticuerpos que inducen actividad citolítica de células inmunitarias (tales como linfocitos NK, linfocitos T o macrófagos) contra células tumorales. Una lista no exhaustiva de dichos anticuerpos incluye rituximab, pertuzumab, alemtuzumab, atezolizumab, bevacizumab, cetuximab, herceptin, panitumumab, necitumumab, dinutuximab, ramucirumab, olaratumab, ipilimumab, cemiplimab, tremelimumab, CS1001, relatlimab, naxitamab, margetuximab, BAT8001, KN035, isatuximab, andecaliximab, bemarituzumab, trastuzumab, anticuerpo anti-PD1, anti-PDL-1, anticuerpo anti-CD47 y anticuerpo anti-SIRPa. En un aspecto muy particular de la divulgación, el anticuerpo anti-PD-1 de la presente divulgación se usa en combinación con rituximab.
En un aspecto, la presente divulgación se refiere a una terapia combinada como se ha definido anteriormente, en donde el agente terapéutico adicional se selecciona particularmente del grupo que consiste en vacunas terapéuticas, bloqueadores o activadores del punto de control inmunitario, en particular de células inmunitarias adaptativas (linfocitos T y B) y conjugados de anticuerpo-fármaco. Preferentemente, los agentes adecuados para su uso junto con el anticuerpo anti-hPD-1 humanizado o fragmento del mismo o con la composición farmacéutica de acuerdo con la presente divulgación incluyen un anticuerpo que se une a un receptor coestimulador (por ejemplo, OX40, CD40, ICOS, CD27, HVEM o GITR), un agente que induce la muerte celular inmunogénica (por ejemplo, un agente quimioterapéutico, un agente radioterapéutico, un agente antiangiogénico o un agente para terapias dirigidas), un agente que inhibe una molécula de punto de control (por ejemplo, CTLA4, LAG3, TIM3, B7H3, B7H4, BTLA o T iGiT), una vacuna contra el cáncer, un agente que modifica una enzima inmunosupresora (por ejemplo, IDO1 o iNOS), un agente que se dirige a linfocitos Treg, un agente para la terapia celular adoptiva o un agente que modula las células mieloides.
En un aspecto, la presente divulgación se refiere a una terapia combinada como se ha definido anteriormente, en donde el segundo agente terapéutico es un bloqueador de punto de control inmunitario o activador de células inmunitarias adaptativas (linfocitos T y B) seleccionado del grupo que consiste en anti-CTLA4, anti-CD2, anti-CD28, anti-CD40, anti-HVEM, anti-BTLA, anti-CD160, anti-TIGIT, anti-TlM-1/3, anti-LAG-3, anti-2B4 y anti-OX40, agonista anti-CD40, CD40-L, agonistas de TLR, anti-ICOS, agonistas de los receptores ICOS-L y de linfocitos B.
En una realización, el agente terapéutico adicional o segundo agente terapéutico es un anticuerpo dirigido al antígeno tumoral, particularmente seleccionado del grupo que consiste en anti-Her2, anti-EGFR, anti-CD20, anti-CD19 y anti-CD52.
Se proporcionan ejemplos específicos de segundos agentes terapéuticos en el documento de patente WO 2018/053106, páginas 36-43.
La terapia combinada también podría depender de la combinación de la administración de anticuerpos anti-PD1 humanizados o fragmentos de anticuerpos de los mismos con cirugía, quimioterapia (por ejemplo, como docetaxel o descarcarzina), radioterapia, inmunoterapia (por ejemplo, tal como anticuerpos dirigidos a CD40, CTLA-4), dirección y modulación génica y/u otros agentes tales como inmunomoduladores, inhibidores de la angiogénesis y cualquier combinación de los mismos.
Uso en diagnóstico
En determinados aspectos, el anticuerpo anti-PD1 proporcionado en el presente documento es útil para detectar la presencia de PD1 en una muestra biológica. El término "detectar", como se usa en el presente documento, abarca la detección cuantitativa o cualitativa. En determinados aspectos, una muestra biológica comprende una célula o un tejido, tales como células inmunitarias o infiltrados de linfocitos T.
En un aspecto, la presente divulgación también se refiere a un método de diagnósticoin vitrooex vivo,en particular un método de diagnóstico adecuado para su uso en medicina personalizada, más particularmente en un diagnóstico complementario, en donde un anticuerpo anti-PD-1 humanizado o un fragmento de unión al antígeno del mismo se usa para la detección de células positivas en PD-1 en una muestra, preferentemente obtenidas previamente de un sujeto y, opcionalmente para la cuantificación de la expresión de PD-1.
La presente divulgación proporciona además métodos de detección de la presencia de antígeno PD-1 humano en una muestra, o de medición de la cantidad de antígeno PD-1 humano, que comprenden poner en contacto la muestra y una muestra de control, con el anticuerpo anti-PD1 humanizado de acuerdo con la presente divulgación, en condiciones que permitan la formación de un complejo entre el anticuerpo o la parte del mismo y la PD-1 humana. Entonces, se detecta la formación de un complejo, en donde una formación de complejo diferente entre la muestra en comparación con la muestra de control es indicativa de la presencia de antígeno PD-1 humano en la muestra. Dicho método puede ser un métodoin vitrooin vivo.El anticuerpo puede ser un inmunoconjugado que comprenda un resto detectable adecuado como se ha descrito anteriormente. Estos ensayos pueden ser útiles, por ejemplo, para evaluar la presencia y/o la evolución de una enfermedad, tal como el cáncer.
En otro aspecto, la presente divulgación también se refiere al uso, en particularin vitrooex vivo,de un anticuerpo humanizado anti-PD-1 humana o un fragmento de unión al antígeno del mismo de la presente divulgación en un método en donde PD-1 se usa como un biomarcador que es predictivo de la respuesta a un tratamiento en un sujeto, en particular en un sujeto con cáncer.
En un aspecto, la presente divulgación también se refiere a un métodoin vitrooex vivopara predecir la respuesta de un sujeto con cáncer a un tratamiento, en particular con un anticuerpo humanizado anti-PD-1 humana o un fragmento de unión al antígeno del mismo de la presente divulgación, que comprende:
- determinar el nivel de expresión de PD-1 en una muestra tumoral, preferentemente obtenida previamente de un sujeto, preferentemente con un anticuerpo humanizado anti-PD-1 humana o un fragmento de unión al antígeno del mismo de la presente divulgación unido a un resto detectable; y
- comparar el nivel de expresión de PD-1 con un valor representativo de un nivel de expresión de PD-1 en una población de sujetos que no responden,
en donde un nivel de expresión más alto de PD-1 en la muestra tumoral del sujeto es indicativo de un sujeto que responderá al tratamiento, preferentemente el tratamiento contra el cáncer usando un anticuerpo anti-PD1 humanizado o un fragmento de unión al antígeno del mismo, o una composición farmacéutica que lo comprende. La presente divulgación también proporciona métodos de diagnóstico, en donde un anticuerpo anti-PD1 humanizado o fragmento del mismo se usa para seleccionar sujetos que cumplen los requisitos para terapia con un anticuerpo anti-PD1 humanizado, por ejemplo, donde PD-1 es un biomarcador para la selección de pacientes, o donde PD-1 se sobreexpresa.
Kits
Cualquiera del anticuerpo o composiciones que se describen en el presente documento puede incluirse en un kit proporcionado por la presente divulgación. La presente divulgación también proporciona kits para su uso en la potenciación de las respuestas inmunitarias y/o el tratamiento de enfermedades (por ejemplo, cáncer y enfermedades víricas) asociadas con la señalización de PD-1.
Particularmente, un kit de acuerdo con Ia presente divulgación puede comprender:
- un anticuerpo anti-hPD1 o fragmento de unión al antígeno del mismo como se describe en el presente documento,
- una molécula de ácido nucleico o un grupo de moléculas de ácido nucleico codificantes de dicho anticuerpo, - un vector que comprende dicha molécula de ácido nucleico o un grupo de moléculas de ácido nucleico, y/o - una célula que comprende dicho vector, molécula de ácido nucleico o grupo de moléculas de ácido nucleico. En el contexto de la presente divulgación, el término "kit" significa dos o más componentes (uno de los cuales corresponde a la molécula de anticuerpo anti-hPD-1 humanizado, la molécula de ácido nucleico, el vector o la célula de la presente divulgación) acondicionados en un envase, recipiente o de otra manera. El kit puede incluir, por tanto, en un recipiente adecuado, anticuerpos anti-PD1 humanizados y/o células hospedadoras de la presente divulgación y/o vectores que codifican la molécula de ácido nucleico o el grupo de moléculas de ácido nucleico de la presente divulgación y/o la molécula de ácido nucleico o el grupo de moléculas de ácido nucleico o reactivos relacionados de la presente divulgación. Por lo tanto, un kit puede describirse como un conjunto de productos y/o utensilios que son suficientes para lograr un determinado objetivo, que se puede comercializar como una sola unidad.
En algunos aspectos, se pueden proporcionar medios para tomar una muestra de un individuo y/o analizar la muestra. En ciertos aspectos, el kit incluye células, tampones, medios celulares, vectores, cebadores, enzimas de restricción, sales, etcétera. Los kits también pueden comprender medios para contener un tampón y/u otro diluyente farmacéuticamente aceptable, estéril.
Los recipientes pueden ser dosis unitarias, acondicionamientos a granel (por ejemplo, acondicionamientos multidosis) o dosis subunitarias. En un aspecto, la presente divulgación se refiere a un kit como se ha definido anteriormente para una unidad de administración monodosis. El kit de la presente divulgación también puede contener un primer recipiente que comprenda un anticuerpo seco/liofilizado y un segundo recipiente que comprenda una formulación acuosa. En ciertos aspectos, se proporcionan kits que contienen jeringas precargadas de una o varias cámaras (por ejemplo, jeringas con líquido y Iiojeringas).
Los kits están en un acondicionamiento adecuado. Los acondicionamientos adecuados incluyen, pero sin limitación, viales, botes, frascos, acondicionamientos flexibles (por ejemplo, Mylar sellado o bolsas de plástico) y similares. También se contemplan acondicionamientos para su uso en combinación con un dispositivo específico, tal como un inhalador, dispositivo de administración nasal (por ejemplo, un atomizador) o un dispositivo de infusión, tal como una minibomba. Un kit puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el envase puede ser una bolsa de disolución intravenosa o un vial que tenga un tapón penetrable por una aguja de inyección hipodérmica). El envase también puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el envase puede ser una bolsa de disolución intravenosa o un vial que tenga un tapón penetrable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo de la composición es un anticuerpo anti-PD-1 humanizado o un fragmento de unión al antígeno del mismo como se describe en el presente documento.
Las composiciones comprendidas en el kit de acuerdo con la presente divulgación también pueden formularse en una composición compatible con jeringas. En este caso, el envase puede ser una jeringa, una pipeta y/u otro aparato similar, desde el que la formulación pueda aplicarse a una zona infectada del cuerpo, y/o incluso aplicarse y/o mezclarse con los otros componentes del kit. Como alternativa, los componentes del kit pueden proporcionarse como polvo(s) seco(s). Cuando los reactivos y/o componentes se proporcionan como un polvo seco, se puede reconstituir una composición soluble mediante la adición de un disolvente adecuado. Se prevé que el disolvente también se pueda proporcionar en otro medio de envase y sea adecuado para la administración.
En algunos aspectos, el kit incluye además un agente adicional para tratar el cáncer o una enfermedad infecciosa, y el agente adicional puede combinarse con el anticuerpo anti-PD1 humanizado u otros componentes del kit de la presente divulgación, o puede proporcionarse por separado en el kit. Particularmente, los kits descritos en el presente documento pueden incluir uno o más agentes terapéuticos adicionales, tales como los descritos en la "Terapia combinada" descrita anteriormente. EI (Los) kit(s) puede(n) adaptarse a un determinado cáncer para un individuo y comprender las respectivas segundas terapias contra el cáncer para el individuo como se ha descrito anteriormente.
Las instrucciones relacionadas con el uso de la molécula de anticuerpo o la composición farmacéutica que se describen en el presente documento, en general, incluyen información sobre la dosis, el calendario de dosis, la vía de administración para el tratamiento previsto, medios para reconstituir el anticuerpo y/o medios para diluir el anticuerpo de la presente divulgación. Las instrucciones suministradas en los kits de la presente divulgación normalmente son instrucciones escritas en una etiqueta o en un prospecto (por ejemplo, una hoja de papel incluida en el kit en forma de folleto o un manual de instrucciones). En algunos aspectos, el kit puede comprender instrucciones para el uso de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos en el presente documento. Las instrucciones incluidas pueden comprender una descripción de la administración de la composición farmacéutica que comprende el anticuerpo para potenciar las respuestas inmunitarias y/o tratar una enfermedad según lo descrito en el presente documento. El kit puede comprender además una descripción de la selección de un individuo adecuado para un tratamiento basado en la identificación de si ese individuo tiene una enfermedad asociada con la señalización de PD-1, por ejemplo, las descritas en el presente documento.
EJEMPLOS
Ejemplo 1 : Injerto de CDR con líneas germinales humanas (región estructural humana)
La primera etapa para humanizar el anticuerpo fue injertar la región CDR anti-PD-1 de ratón en líneas germinales humanas. Se probaron tres cadenas pesadas de línea germinal humana (IGHV7-4-1*02, IGHV1-46*01, IGHV3-20*01) y dos líneas germinales para la cadena ligera (IGKV2-30*02, IGKV3-11*01). Como se muestra en la Tabla 1, la cadena pesada de la línea germinal IGHV7-4-1*02 e IGKV2-30*02 tienen el mayor % de humanización, superior al 85 % requerido para calificar un anticuerpo como humanizado.
Tabla 1: Puntuación T20 de humanidad determinada usando las bases de datos humanas de corte. http://abAnaIyzer.Iakepharma.com: En general, las secuencias de longitud completa que puntúan por encima de 85 puntos de corte se consideran similares a las humanas.
Se transfectaron transitoriamente cadenas pesadas y ligeras en células COS adherentes. Se evaluó la concentración de anticuerpo en el sobrenadante de células COS usando un ELISA de tipo sándwich (el anticuerpo Fc anti-humano de burro inmovilizado para detección y revelación se evaluó usando una kappa anti-humana de ratón un anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa). La concentración se calculó usando un patrón de IvIgG humano (en ng/ml). Como se muestra en la Tabla 2, se obtuvo una buena productividad en las células COS para la línea germinal IGHV7-4-1 and lGKV2-30*02 (la combinación con el mayor % de humanización), mientras que la combinación con la línea germinal IGHV3-20*01 and IGKV3-11*01 reduce considerablemente la productividad del anticuerpo anti-PD-1 humanizado. Además, cabe señalar que otras combinaciones también muestran una buena productividad.
Tabla 2: Concentración de anticuerpo anti-PD1 producido en el sobrenadante de células de mamífero COS.
El análisis de unión de variantes de anticuerpo humanizado anti-PD1 se realizó en la proteína PD1 humana mediante ELISA. Se inmovilizó hPD1 recombinante (Sino Biologicals, Pekín, China; referencia 10377-H08H) sobre plástico a 0,5 pg/ml en tampón carbonato (pH 9,2) y se añadió sobrenadante de células COS a concentración múltiple para medir la eficacia de la unión. Tras la incubación y el lavado, se añadió IgG anti-humana de burro marcada con peroxidasa (Jackson Immunoresearch; EE. UU., referencia 709-035-149) y se reveló mediante métodos convencionales.
Tabla 3: La determinación de la DE50 se refiere a la concentración requerida para alcanzar el 50 % de la señal en este ensayo para cada variante de anticuerpo anti-PD1 humanizado. Para este experimento se usaron anticuerpos anti-PD-1 no purificados producidos por células COS.
Todas las líneas germinales con CDR injertada tienen una unión similar a PD-1 en comparación con el anticuerpo quimérico (VHwt VLwt), validando la propiedad biológica del anticuerpo PD-1 (Tabla 3). En total, se seleccionó el marco de IGHV7-4-1 y<v>L-CDR con el marco IG KV2-30*02 debido a (1) su alto porcentaje de humanización, 89,8 % y 89 % respectivamente; (2) la secuencia complementaria más alta en comparación con la secuencia original del anticuerpo; (3) actividad biológicain vitropreservada y (4) buena productividad en células de mamífero.
La segunda etapa de Ia humanización consistió en mutar las secuencias CDR derivadas del ratón para aumentar el porcentaje de humanización y eliminar los sitios de desaminación o glicosilación de las cadenas pesadas y ligeras que pudieran desestabilizar el anticuerpo en el proceso de fabricación. Se han generado y probado múltiples secuencias mutadas enumeradas en Ia Tabla 4 para su producción y actividad biológica. La secuencia de la cadena ligera también presentó un sitio de glicosilación en CDR1 (secuencia "NG"), que podría perjudicar la estabilidad del producto en el proceso de fabricación. Para eliminar este sitio de glicosilación, se sustituyó el aminoácido G29 en el aminoácido T que conduce a la cadena "LD" (la posición del aminoácido se determina mediante la numeración de Kabat, correspondiente a G34 en SEQ ID NO: 37). El anticuerpo HCLD es un buen candidato, pero presenta un sitio de desaminación (secuencia DS) en la región CDR3 de la cadena pesada. Esta secuencia puede afectar a la estabilidad del producto en el proceso de fabricación. Para eliminar esta secuencia DS, los inventores generaron secuencias alternativas HE, HG, HH, Hl, HJ, HK, HL, ya sea sustituyendo los aminoácidos D105 o 8106.
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��Ejemplo 2: Análisis de unión de variantes de anticuerpo humanizado anti-PD1 en la proteína PD1 humana mediante Blitz, ELISA y citometría de flujo.
Se inmovilizó hPD1 recombinante (Sino Biologicals, Pekín, China; referencia 10377-H08H) en plástico a 0,5 pg/ml en tampón de carbonato (pH 9,2) y se añadió anticuerpo purificado para medir la unión. Tras la incubación y el lavado, se añadió IgG anti-humana de burro marcada con peroxidasa (Jackson Immunoresearch; EE. UU., referencia 709 035-149) y se reveló mediante métodos convencionales.
Tabla 5: La determinación de DE50 de la Figura 1A se refiere a la concentración requerida para alcanzar el 50 % de la señal en este ensayo para cada variante de anticuerpo anti-PD1 humanizado. Para este experimento, se usaron anticuerpos anti-PD-1 purificados producidos por células HEK.
Tabla 6: Análisis de la avidez de los anticuerpos anti-PD1 contra la proteína recombinante PD1 humana medida mediante Blitz.
Tabla 7: Análisis de afinidad de anticuerpos anti-PD1 contra la proteína recombinante PD1 humana medida por
Biacore.
Tabla 8: La determinación de DE50 de la Figura 1 C se refiere a la concentración requerida para alcanzar el 50 % de la señal en este ensayo para cada variante de anticuerpo anti-PD1 humanizado.
Tabla 9: Porcentaje de humanidad T20 determinado usando las bases de datos humanas de corte:
http://abAnalyzer.Iakepharma.com: En general, las secuencias de longitud completa con una puntuación superior a 85 se consideran anticuerpos similares a los humanos.
Tabla 10: Porcentaje de humanidad de T20 determinado usando las bases de datos humanas de corte:
http://abAnalyzer.lakepharma.com: En general, las secuencias de longitud completa con una puntuación superior a 85 se consideran similares a las humanas.
Resultados: Siguiendo las etapas de humanización del anticuerpo anti-PD1 humana de ratón (como se hace referencia en el presente documento como anticuerpo quimérico), se seleccionaron varias variantes de anticuerpo anti-PD1 humanizado por su buena capacidad de unión a PD1 humana (proteína recombinante, así como PD1 expresada en la superficie celular) en comparación con el anticuerpo quimérico. La Figura 1 (A) y la Tabla 5 muestran mediante diferentes métodos que el anticuerpo HKLD tiene la mejor actividad de unión entre las variantes de anticuerpos y una unión mejorada en comparación con el anticuerpo quimérico. La Figura 1 B confirma esta capacidad de unión similar en células humanas cuando el anticuerpo se combina con la variante de cadena ligera LC. La medición de la avidez presentada en la Tabla 6 indica que HKLD presenta la mejor KD entre las variantes de anticuerpo y una KD mejorada en comparación con el anticuerpo quimérico. La Tabla 7 compara las mediciones de afinidad con PD1 de anticuerpo quimérico, HKLD y otros anticuerpos PD1 como Keytruda, un anticuerpo anti-PD-1 clínicamente aprobado, y muestra que la variante HKLD tiene una afinidad similar en comparación con Keytruda. En este experimento, la afinidad de los anticuerpos se midió inmovilizando un anticuerpo anti-Fc, permitiendo la medición de la afinidad de una valencia del anticuerpo PD-1, en contraste con el experimento de Blitz que usó PD-1 inmovilizada y anticuerpos solubles. Aunque la afinidad de la variante de anticuerpo anti-PD-1 representaba una afinidad/avidez similares por la proteína PD-1, en un sistema basado en células, los inventores observaron que, sorprendentemente, HKLD se une mejor a los linfocitos T PD-1+ en comparación con la forma quimérica del anticuerpo, como se muestra en la Figura 1 C y la Tabla 8. Por otro lado, la variante HGLD pierde capacidad de unión en comparación con la forma quimérica anti-PD-1. Además de HGLD, los inventores también demostraron que, durante el proceso de humanización, algunas mutaciones indujeron la pérdida de la capacidad de unión a PD1. La Figura 2 (de la A a la E) muestra que los aminoácidos 96 y 97 numerados mediante el método Kabat del dominio variable de cadena pesada y los aminoácidos numerados según Kabat 28, 34, 94 del dominio variable de cadena ligera son cruciales para la capacidad de unión a PD1 y, por lo tanto, no deberían mutarse. La Tabla 9 presenta el grado de humanización (puntuación T20 de humanidad) para cada dominio variable seleccionado de las cadenas pesada y ligera. La determinación de T20 indica una puntuación de humanidad muy potente para cada región variable de las variantes de anticuerpo seleccionadas, particularmente, del 88 al 91,28 %. La Tabla 10 muestra que la puntuación T20 del anti-PD-1 humanizado (variante HKLD) fue superior a la de Keytruda convencional, secuencia anti-PD-1 descrita anteriormente y clínicamente aprobada (cadena pesada 75,7 frente al 91,07 % y cadena ligera 82,7 frente al 88,7 %).
Ejemplo 3: Productividad de anticuerpos tras la transfección transitoria en células COS y CHO de mamífero
Se cotransfectaron transitoriamente cadenas pesadas y ligeras a células COS o células CHO adherentes. Se evaluó la concentración de anticuerpo en el sobrenadante de células COS y CHO usando un ELISA de tipo sándwich (el anticuerpo Fc anti-humano de burro inmovilizado para detección y revelación con una kappa anti-humana de ratón un anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa). La concentración se determinó con el patrón de IvIgG humano. La productividad se calculó como la cantidad de anticuerpo purificado por litro de sobrenadante de cultivo recogido.
Tabla 11: Alto rendimiento de productividad cuando se produce en células de mamífero (COS y CHO). Mayor productividad de la forma humanizada del anticuerpo en comparación con el anticuerpo quimérico.
Tabla 12: Estabilidad del anticuerpo anti-PD-1 tras la incubación a 37 °C durante 7 días. Los anticuerpos se incubaron durante 7 días a 4 °C o 37 °C. A partir de la cromatografía de difusión de exclusión, se evaluó el porcentaje de la forma monomérica y los agregados. El día 0 se usa como control positivo en estos experimentos.
Resultados: Las diferentes variantes se produjeron en células de mamífero, tales como CHO o COS, y los resultados presentados en la Tabla 11 muestran de manera sorprendente que las variantes de anticuerpo anti-PD1 humanizado tienen un mejor rendimiento productivo (mg/I) que el anticuerpo quimérico en ambos tipos de células. HKLD presenta el mejor rendimiento productivo. En las células CHO, el rendimiento productivo de este anticuerpo aumenta 3 veces y casi 4 veces en las células COS. En paralelo, se evaluó la estabilidad de la molécula in vitro, como se muestra en la Tabla 12, todas las variantes presentan una buena estabilidad a 4 °C y a 37 °C con bajaagregación. Esos resultados indican que el anticuerpo anti-PD1 humanizado de la invención presenta una capacidad de fabricación muy buena que es muy importante para las siguientes etapas del desarrollo clínico y las aplicaciones terapéuticas.
En un segundo experimento usando el método de producción de células CHO, se comparó la productividad de la variante HKLD con la productividad de Keytruda y los anticuerpos quiméricos anti-PD-1. Como se muestra en la Figura 6, los inventores observaron un aumento de la productividad con la variante HKLD en comparación con los esqueletos quimérico y de Keytruda. En esta prueba, se probó la productividad a pequeña escala (placa de 12 pocillos, transfección transitoria en células adherentes) y en biorreactor (producción de células CHO alimentadas por lotes sin optimizar). Se obtuvo un alto rendimiento de 2 g/l para la variante HKLD, confirmando la alta productividad del anticuerpo en el proceso de producción a gran escala.
Ejemplo 4: Ensayos competitivos para medir la actividad antagonista de las variantes de anticuerpo anti-PD1 humanizado en las interacciones de PD-PDL1 y PD1-PDL2:
Tabla 13: Determinación mediante Blitz de la inhibición de la interacción de PD1-PDL1 en presencia de las diferentes variantes de anticuerpo humanizado anti-PD1 : se midieron ka (1/Ms), kd (1/s) y KD (nM).
Tabla 14: Capacidad antagonista de los anticuerpos PD-1 para bloquear la unión de PD-L1. Determinación de la CI50 (ng/ml) obtenida con las diferentes variantes de anticuerpo humanizado anti-PD1 emitidas a partir de la Figura
4C.
Análisis de señalización de PD-1 usando el bioensayo basado en células DiscoverX
La capacidad de los anticuerpos anti-PD-1 para bloquear la señalización PD-1/pSHP-1 se evaluó con el ensayo de señalización DiscoverX PathHunter® Jurkat PD-1 (SHP1) (referencia 93-1104C19). En este ensayo, los linfocitos T Jurkat expresan de manera estable un receptor PD-1 quimérico fusionado al fragmento Beta-gal (ED) y un SHP1 manipulado fusionado al fragmento Beta-gal complementario (EA). El cultivo conjunto de células Jurkat con células presentadoras de PD-L1 produce la fosforilación de PD-1, el reclutamiento de SHP-1 manipulado y la complementación del fragmento ED y EA creando una enzima beta-gal activa y una señal de bioluminiscencia tras la adición del sustrato. La quimioluminiscencia es proporcional a la activación de la señalización PD-1. El experimento se realizó según las recomendaciones del fabricante. En resumen, se incubaron células PD-1+ Jurkat con diferente concentración de anticuerpos anti-PD-1 durante 1 hora y luego se cultivaron junto con células PD-L1+ durante otra hora. Se añadió reactivo de detección, y se midió la señal de Iuminiscencia 180 minutos después de usar el lector de placas TecanTM. Las variantes de anticuerpo humanizado anti-PD1 se probaron a diferentes concentraciones. Los datos se representan en ULR (señal de luminiscencia relativa). La CI50 (ng/ml) se refiere a la concentración requerida para alcanzar el 50 % de la inhibición de la señal.
Tabla 15: Capacidad antagonista de anticuerpos PD-1 para bloquear la señalización inhibidora mediada por PD-1: Determinación de la CI50 (ng/ml) que se refiere a la concentración requerida para alcanzar el 50 % de la inhibición de la señal de la Figura 7A.
Ejemplo 5: ensayo de activación celular usando el bioensayo basado en células Promega
Se probó la capacidad de los anticuerpos anti-PD-1 para restablecer la activación de los linfocitos T usando el kit PD-1/PD-L1 de Promega (Referencia J1250). Se usan dos estirpes celulares (1) linfocitos T efectores (Jurkat que expresan de manera estable PD-1 , luciferasa inducida por NFAT) y (2) células diana activadoras (células CHO K1 que expresan de manera estable PDL1 y proteína de superficie diseñada para estimular los TCR afines de una manera independiente del antígeno. Cuando las células se cultivan conjuntamente, la interacción de PD-L1/PD-1 inhibe la activación mediada por TCR, bloqueando así la activación de NFAT y la actividad luciferasa. La adición de un anticuerpo anti-PD-1 bloquea la señal inhibidora mediada por PD-1 que conduce a la activación de NFAT y a la síntesis de la luciferasa y a la emisión de la señal de bioluminiscencia. El experimento se realizó según las recomendaciones del fabricante. Se analizaron las diluciones en serie del anticuerpo PD-1. Cuatro horas después del cultivo conjunto de células diana PD-L1+, células efectoras PD-1 y anticuerpos anti-PD-1, se añadió sustrato de Iuciferina BioGIo™ a los pocillos, y se leyeron las placas usando un Iuminómetro Tecan™. La Iuminiscencia cuantificada usando un Iuminómetro refleja la activación de los linfocitos T. Se probó la dilución en serie de las variantes de anticuerpo anti-PD1 humanizado. DE50 (ug/ml) se refiere a la concentración de anticuerpo requerida para alcanzar el 50 % de Ia Iuminiscencia máxima.
Tabla 16: El anticuerpo anti-PD-1 potencia la activación de los linfocitos Tin vitro: Determinación de la DE50 (pg/ml) que se refiere a la concentración de anticuerpo requerida para alcanzar el 50 % de la luminiscencia máxima de la Figura 8.
Resultados: Tras medir la capacidad de unión de las diferentes variantes de anticuerpo humanizado anti-PD1 contra PD1, se evaluó la capacidad inhibidora de cada variante de anticuerpo para bloquear la interacción de PD1-PDL1 usando diferentes métodos (Biacore, Blitz y ELISA). La Figura 4 A presenta la respuesta inhibidora de las variantes: anticuerpos HCLC, HCLD y HELC, HELD en comparación con el anticuerpo quimérico en la interacción de PD1-PDL1. La Figura 4B presenta la respuesta inhibidora de las variantes HCLD, HeLD, HGLD, HILD, HJLD, HKLD y HLLD en la unión de PDL1 a PD1. La Tabla 13 muestra que la presencia de todas las variantes de anticuerpo inhibe la unión de PDL1 a PD1. Los resultados obtenidos con HCLC y HELC son similares a los presentados en la Tabla 13 (datos no mostrados). La Figura 4C muestra la eficiencia competitiva de los anticuerpos anti-PD1 humanizados a diferentes concentraciones que conducen a la determinación de la CI50 para cada variante (Figura 4C y Tabla 14). Las PD1 pueden unirse a otro ligando expresado en la superficie celular: PDL2. La Figura 5 A y B muestran que las variantes de anticuerpo anti-PD-1 HELC, HELD y HKLD también bloquean la interacción de PD1-PDL2, medida mediante el ensayo de Biacore y el ELISA de PD-L2/PD-1 de antagonista.
Para confirmar esos resultados, se realizó un bioensayo que evalúa la fosforilación de SHP1, una proteína de señalización de la vía PD-1. La Figura 7A y B, presenta la dosis-respuesta inhibidora obtenida con las diferentes variantes de anticuerpo humanizado anti-PD1 en la fosforilación de SHP1. La Tabla 15 presenta la CI50 para cada variante de anticuerpo que muestra una eficacia inhibidora similar para todas las variantes en la activación de PD1. No obstante, dos variantes denominadas variantes HCLD y HKLD fueron más eficaces para inhibir la señal P-SHP1 en comparación con la variante HELD, por ejemplo. Las curvas de inhibición mostraron una mejor inhibición con HCLD y HKLD cerca del esqueleto quimérico, mientras que la variante humanizada HLLD o HJLD pierde algo de capacidad antagonista. En paralelo, se evaluó la activación de los linfocitos T usando un bioensayo de bioluminiscencia NFAT para comparar la eficacia inhibidora de todas las variantes de anticuerpo humanizado anti-PD1 seleccionadas para inhibir la interacción de PD1-PDL1 que conduce a la activación de los linfocitos T (inhibición de la interacción inhibidora del punto de control). La Figura 8 muestra que todas las variantes probadas fueron capaces de activar la señalización de NFAT mediada por TCR, pero con diferente potencia y eficacia. La señal URL máxima obtenida en la fase de meseta refleja la potencia. El inventor observó que las variantes HCLD y HKLD tienen mejor potencia en comparación con las variantes HELD o HLLD, por ejemplo. Esta eficacia está determinada por la CE50 (Tabla 16). El anticuerpo quimérico y todas las variantes son eficaces para activar NFAT, y las variantes HCLD, HILD, HKLD, HHLD, HELD y HKLD fueron las más eficaces para activar los linfocitos T.
Ejemplo 6: Secreción de IFNg por linfocitos T humanos
Para demostrar la eficacia de la variante HKLD para estimular la secreción de citocina efectora por los linfocitos T humanos, los inventores realizaron un ensayo mixto de reacción de leucocitos cultivando conjuntamente células dendríticas y linfocitos T alógenos. Como se muestra en la Figura 9, la variante HKLD aumenta la secreción de citocina IFNg de una manera dependiente de la dosis.
Todas las variantes de anticuerpo humanizado anti-PD1 seleccionadas fueron capaces de inhibir la unión de PD1 a PDL1 y PDL2 de una manera al menos tan buena como el anticuerpo quimérico. Todas las variantes pueden activar los linfocitos T. En ensayos biológicos, como en la inhibición de P-SHP1 o la activación de NFAT a través de la señalización PD1, los inventores observaron que tres variantes eran más eficaces que las otras, en concreto, HCLD, HKLD y HILD. Estas presentan una señal similar a los resultados quiméricos y un bloqueo de PD1 mejorado en comparación con las otras variantes. En comparación con las otras variantes, las variantes HILD y HKLD demostraron las mejores propiedades con una alta capacidad de fabricación y rendimiento de producción en sistemas de producción basados en células de mamífero al tiempo que preservaron su actividad biológica: alta afinidad por PD-1, capacidad antagonista por PD-L1 y PD-L2 y capacidad para restablecer la activación de los linfocitos T (inhibición para pSH-P-1, activación para NFAT, potenciando la secreción de citocinas efectoras lFNg).
Ejemplo 7: Eficacia in vivo de un anticuerpo anti-PD1 humanizado
Se evaluó la eficacia del anticuerpo anti-PD-1 humana en múltiples modelosin vivoen ratones inmunocompetentes genéticamente modificados para expresar PD-1 humana (exón 2). Para el modelo de mesotelioma, se inyectaron células mesoteliales AK7 por vía intrapleural (3e6 células/ratón), luego se trataron el día 5/8/12/15 con un control anti-PD-1 o anticuerpo anti-PD1 humanizado (variante HKLD) a 1 mg/kg. Las células AK7 inyectadas expresan de manera estable la Iuciferasa permitiendo la generación de señal de bioluminiscenciain vivotras la inyección intraperitoneal de D-Iuciferina (3 pg/ratón, GoldBio, Saint Louis MO, EE. UU., Referencia 115144-35-9). Diez minutos después de la inyección de luciferina, se midió la señal de bioluminiscencia mediante Biospace Imager en el lado dorsal y ventral del ratón durante 1 minuto. Los datos se analizaron en fotones por segundo por cm2 por estereorradián, y representan la media de la señal dorsal y ventral. Cada grupo representa la media /- EEM de 5 a 7 ratones por grupo. Para el modelo MC38, se inyectaron células de cáncer de colon MC38 por vía subcutánea con 5e5 células en el costado, y se calculó el volumen del tumor con la fórmula 0,52 x (longitud x anchura). Los ratones fueron tratados cuando el tumor alcanzó 40-80 mm3 con 10 mg/kg de anticuerpo humanizado anti-PD1 (variante HKLD) 3 veces a la semana durante 3 semanas. Para el modelo ortotópico de hepatocarcinoma, se inyectan 2,5e6 células Hepa1.6 en la vena porta. Los ratones se trataron con 3 mg/kg de control de isotipo IgG4 o anticuerpo humanizado anti-PD1 (variante HKLD) el día 4/7/11/14/18/21 tras la inyección del tumor.
Resultados: La Figura 10 muestra el crecimiento del tumor de mesotelioma tras un tratamiento con un anticuerpo anti-PD1 de control como control positivo o con una de las variantes de anticuerpo anti-PD1 humanizado (HKLD), el control negativo se muestra mediante el tratamiento de los animales con PBS. El anti-PD1 humanizado de la invención muestra una muy buena eficacia en el control del crecimiento tumoral. La variante de anticuerpo humanizado anti-PD1 (HKLD) puede erradicar el tumor de mesotelioma AK7 como se muestra en la Figura 10 A con un 77 % (10 de 13 ratones) o 100 % (7 ratones) de respuesta completa, con respectivamente 1 o 3 mg/kg de anticuerpo (Figura 10 B). La eficaciain vivose confirmó en otros 2 modelos de ratón. En el carcinoma de colon ectópico MC38, la variante de anticuerpo humanizado anti-PD1 (HKLD) mejoró significativamente la supervivencia media y potenció el 50 % de la respuesta completa (5 de 10 ratones) (Figura 11 A y B). De manera similar, en el modelo de CHC ortotópico, la variante de anticuerpo humanizado anti-PD1 (HKLD) mejoró la supervivencia de los ratones con un 42 % de respuesta completa (3 de cada 10 ratones) (Figura 12).
Ejemplo 8: Farmacocinética y farmacodinámica del anticuerpo anti-PD1 humanizado in vivo
Se evaluaron la farmacocinética y la farmacodinámica del producto en monos cangrejeros y ratones tras una sola inyección. Para evaluar la farmacocinética en ratones, se inyectó en BalbcRJ (hembras de 6-9 semanas) por vía intraorbital o subcutánea una sola dosis (5 mg/kg) de la forma quimérica, el anticuerpo anti-PD-1 humanizado (variante HKLD) o el anticuerpo Keytruda. La concentración de fármaco en plasma se determinó mediante ELISA usando un anticuerpo de cadena ligera anti-humano inmovilizado (clon NaM76-5F3), se añadió anticuerpo anti-PD-1 diluido que contenía suero. La detección se realizó con una IgG anti-humana de burro marcada con peroxidasa (Jackson Immunoresearch; EE. UU.; referencia 709-035-149) añadida y se reveló mediante métodos convencionales.
Los monos cangrejeros recibieron mediante inyección por vía intravenosa el anticuerpo anti-PD1 humanizado (variante HKLD) con 1 o 5 mg/kg. Se extrajeron sangre completa y suero en múltiples puntos de tiempo para cuantificar el anticuerpo anti-PD1 en el suero mediante ELISA. Anticuerpo anti-PD-1 en el suero de monos, se inmovilizó la proteína recombinante PD-1 y se añadió suero diluido que contenía anticuerpo anti-PD-1. La detección se realizó con un anticuerpo anti-kappa humana marcado con sulfo y se reveló usando tecnología MSD.
Resultados: Las Figura 13 A, B y C muestran que el anticuerpo anti-PD-1 humanizado tiene un perfil farmacocinético favorablein vivoen ratones y monos con una curva cinética lineal. En ratones, la forma humanizada anti-PD-1 (HKLD) con el isotipo IgG1 N298A e IgG4 S228P tienen un perfil similar al de Keytruda, anticuerpo anti-PD-1 usado y comercializado clínicamente. En los monos cangrejeros, se observa una buena correlación de la dosis frente a la exposición a medida que se detecta una mayor cantidad en el suero de anticuerpo anti-PD-1 humanizado a 5 mg/kg en comparación con 1 mg/kg. En conjunto, estos datos muestran que el anti-PD-1 humanizado tiene un perfil farmacocinético favorablein vivo.
Ejemplo 9: Los anticuerpos anti-PD-1 humanizados potencian la fagocitosis de células tumorales mediada por macrófagos a través del bloqueo de la interacción de PD-1/PD-L1 en la misma célula.
La expresión de PD-1 no se limita a los linfocitos T, por ejemplo, PD-1 también se puede expresar en macrófagos asociados a tumores. La expresión de PD-L1 en células tumorales puede desencadenar una señal transinhibidora en macrófagos bloqueando su potencia fagocítica (Gordon et al., Nature. 25 de mayo de 2017;545(7655):495-499). Sin embargo, no se describe si la terapia de bloqueo de PD-1/PD-L1 puede mejorar la fagocitosis de las células tumorales negativas en PD-L1. Como los macrófagos M1 expresan ambos receptores en su superficie, es posible que PD-1 y PD-L1 se unan en la misma célula y generen una señalización reguladora negativa en los macrófagos. En este caso, los inventores demostraron que el anticuerpo anti-PD-1 humanizado puede restablecer la función fagocítica de los macrófagos contra las células tumorales negativas en PD-L1 a través del bloqueo de la interacción de PD-1/PD-L1 en la misma célula.Resultados: La Figura 14A muestra la expresión de PD-1 y PD-L1 en macrófagos M0, macrófagos M1 y células Raji. Solo los macrófagos M1 expresan ambos receptores PD-1 y PD-L1, y los macrófagos M0 expresan PD-1 a un alto nivel y no expresan PD-L1, las células Raji no expresan PD-L1. La Figura 14 B muestra que el anticuerpo anti-PD-1 humanizado potencia sorprendentemente la fagocitosis de los tumores negativos en PD-L1 por los macrófagos M1. En comparación con otros anticuerpos anti-PD-1 (pembrolizumab y nivolumab), el anticuerpo anti-PD-1 humanizado es aún más eficaz para potenciar la fagocitosis de las células tumorales (Figura 14 C). Como las células tumorales no expresan PD-L1 en este ensayo y los macrófagos M1 expresan ambos receptores PD1 y PDL1, este experimento sugiere que el anticuerpo anti humanizado puede bloquear la interacción (interacción que causa la inhibición de la fagocitosis de las células tumorales) entre PD-L1 y PD-1 en la misma célula. De hecho, se realizó el mismo experimento con macrófagos M0 que no expresaban PD-L1, pero expresaban el receptor PD-1 (Figura 14A). Como se muestra en la Figura 14 D, el anticuerpo anti-PD-1 humanizado potencia la fagocitosis de los macrófagos M1, mientras que no tiene ningún efecto sobre los macrófagos M0, lo que demuestra que ambos receptores, PD-1/PD-L1, son necesarios para el efecto potenciado mediado por el anticuerpo anti-PD1 humanizado. Estos datos sugieren que el anticuerpo humanizado anti-PD-1 neutraliza la interacción de PD-1/PD-L1 en los macrófagos M1 conduciendo a la fagocitosis de las células tumorales de reactivación.
Las células Raji tampoco expresaron PD-L2, el otro ligando de PD-1, como se describe en otra parte (Andorsky et al., 2011, DOI: 10.1158/1078-0432), apoyando la idea de que el anticuerpo anti-humanizado anti-PD-1 puede potenciar la fagocitosis de las células tumorales negativas en PD-L1 y en PD-L2.
Aunque está bien establecido que el bloqueo de PD-1-PD-L1 reactiva los linfocitos T, en este caso, los inventores muestran una nueva propiedad del anticuerpo anti-PD-1 a través de la revigorización directa de los macrófagos. Demostraron que el anticuerpo anti-PD-1 humanizado puede bloquear la interacción de PD-1/PD-L1 en los mismos macrófagos que potencian la fagocitosis de las células tumorales negativas en PD-L1. Este aspecto tiene un interés particular en la clínica, ya que los pacientes que expresan PD-L1 en la superficie de las células tumorales se tratan con terapia de PD-1/PD-L1. Los datos presentados en el presente documento muestran que, incluso los tumores negativos en PD-L1, pueden beneficiarse del anticuerpo anti-PD-1 humanizado mediante la fagocitosis de macrófagos de reactivación.
MATERIAL Y MÉTODOS ELISA de unión a PD1
Para el ensayo ELISA de actividad, se inmovilizó hPD1 recombinante (Sino Biologicals, Pekín, China; referencia 10377-H08H) en plástico a 0,5 pg/ml en tampón carbonato (pH 9,2) y se añadió anticuerpo purificado para medir la unión. Tras la incubación y el lavado, se añadió IgG anti-humana de burro marcada con peroxidasa (Jackson Immunoresearch; EE. UU., referencia 709-035-149) y se reveló mediante métodos convencionales.
Ensayo de unión a PD1 en linfocitos T estimulados humanos mediante citofluorometría
Se activaron CMSP de voluntarios sanos mediante estimulación anti-CD3/CD28 para estimular los linfocitos T. Para medir la unión de anti-PD1 en linfocitos T estimulados humanos, el anticuerpo se incubó durante 30 minutos a 4 °C y se lavó antes de teñir 30 min a 4 °C con Fc de IgG anti-humana marcado con PE (Biolegend; EE. UU.; referencia 409303). Las muestras se analizaron en el citofluorómetro BD LSRII o Canto II en la ventana de análisis de las células CD3+ (linfocitos T).
Medición de la avidez por PD1 mediante el método Blitz
La afinidad/avidez de unión se midió usando el método Blitz (Forté Bio; EE. UU.; referencia C22-2 n.° 61010-1). Se inmovilizó hPD1-His recombinante (Sino Biologicals, Pekín, China; referencia 10377-H08H) a 10 pg/ml mediante la cola de histidina en un biosensor Ni-NTA (Forté Bio; EE. UU.; referencia 18-0029) durante 30 segundos. Luego, se asociaron los anticuerpos anti-PD1 con 20 pg/ml durante 120 segundos. Se realizó la disociación del anticuerpo anti-PD1 en tampón cinético durante 120 segundos. Los datos de análisis se realizaron con el software Blitz pro 1.2, que calculó la constante de asociación (ka) y la constante de disociación (kd), y determinó la constante de afinidad KD (ka/kd).
Medición de la afinidad hacia PD1 mediante el método Biacore
La medición de la afinidad se realizó mediante Biacore en la plataforma PP2I (Inserm U1194, Université de Montpellier). El anticuerpo Fc anti-humano (GE HeIthcare) se inmovilizó a 25 pg/ml en tampón de acetato a pH 5. Se añadieron anticuerpos anti-PD1 humana (Keytruda, Opdivo, variante HKLD, quimérico) a 1,25 nM y se asoció hPD1-His recombinante (Sino Biologicals, Pekín, China; referencia 10377-H08H) a diferentes dosis (6,25 nM a 200 nM) para calcular la constante de asociación (ka) y la constante de disociación (kd), y para determinar la constante de afinidad KD (ka/kd).
Antagonista de ELISA: competitividad entre PDL1 o PDL2 y anti-PD1 humanizado
El ensayo competitivo de ELISA se realizó mediante el par de ensayo de ELISA de detección de inhibidores de PD-1:PD-L1 (AcroBiosystems; EE. UU.; Referencia EP-101). En este ensayo, se inmovilizó hPDL1 recombinante sobre plástico a 2 pg/ml en tampón PBS pH 7,4. Se mezcló el anticuerpo purificado (a diferentes concentraciones) con 0,66 pg/ml final (concentración fija) de PD1 humana biotinilada (AcroBiosystems; EE. UU.; referencia EP-101) para medir la unión competitiva durante 2 horas a 37 °C. Tras la incubación y el lavado, se añadió estreptavidina marcada con peroxidasa (Vector Laboratoring; EE. UU.; referencia SA-5004) para detectar la unión de Biotina-PD-1Fc y se reveló mediante métodos convencionales. Para el ensayo de ELISA competitivo de PDL-2/PD-1, se realizó un protocolo similar, excepto que PD-L2 (Sinobiological, n.° 10292-H02H) se inmovilizó en plástico a 2 pg/ml en tampón PBS a pH 7,4 en lugar de PD-L1.
Método de competitividad de Blitz con PDL1: PD1 acs PDL1
Este método se realizó con un Blitz (Forté Bio; EE. UU.; referencia C22-2 n.° 61010-1). Se inmovilizó hPD1-His recombinante (Sino Biologicals, Pekín, China; referencia 10377-H08H) a 10 pg/ml mediante la cola de histidina en un biosensor Ni-NTA (Forte Bio; EE. UU.; referencia 18-0029) durante 30 segundos. En la segunda etapa, se añadieron anticuerpos anti-PD1 a 20 pg/ml (concentración de saturación) durante 120 segundos. Luego, se asoció PDL1 humano (Sino Biologicals, Pekín, China; referencia 10084-H02H) a 100 pg/ml, en competitividad con los anticuerpos anti-PD1, durante 120 segundos. La disociación de PDL1 se realizó en tampón cinético durante 120 segundos. Los datos de análisis se realizaron con el software Blitz pro 1.2, que calculó la constante de asociación (ka) y la constante de disociación (kd), y determinó la constante de afinidad KD (ka/kd).
Ensayo de competitividad realizado por Biacore para medir la afinidad entre PDL2 y PD1 combinados con las variantes de anticuerpo humanizado anti-PD1
Evaluación de afinidad según Biacore de la proteína recombinante PD-1 (Sino Biologicals, Pekín, China; referencia 10377-H08H) incubada previamente con anticuerpos anti-PD1 en la proteína recombinante PD-L2 humana (Sinobiological, 10292-H08H-B). Se inmovilizó PD-L2 recombinante humano en el chip biosensor a una concentración de 200 pg/ml. A continuación, se trató el chip biosensor con etanolamina 1 M a pH 8,4 durante 10 minutos para inactivar el sitio libre. Se añadió el complejo de anticuerpo (200 nM) PD-1 humana recombinante (100 nM), y se midió la respuesta relativa mediante Biacore. Los datos se calcularon en % de respuesta relativa de interacción: 100 % = respuesta relativa de PD-1.
Ensayo de competitividad mediante el método de Blitz entre PDL1 y variantes de anticuerpo humanizado anti-PD1 en PD1
Este método se realizó con un Blitz (Forté Bio; EE. UU.; referencia C22-2 n.° 61010-1). Se inmovilizó hPD1-His recombinante (Sino Biologicals, Pekín, China; referencia 10377-H08H) a 10 pg/ml mediante la cola de histidina en un biosensor Ni-NTA (Forté Bio; EE.UU.; referencia 18-0029) durante 30 segundos. En la segunda etapa, PD1 se incubó con una variante de anticuerpo humanizado anti-PD1 a 20 pg/ml (concentración de saturación) durante 120 segundos. Luego, se asoció PDL1 humano (Sino Biologicals, Pekín, China; referencia 10084-H02H) a 100 pg/ml, en competitividad con el anticuerpo anti-PD1 humanizado, durante 120 segundos. La disociación de PDL1 se realizó en tampón cinético durante 120 segundos. Los datos de análisis se realizaron con el software Blitz pro 1.2, que calculó la constante de asociación (ka) y la constante de disociación (kd), y determinó la constante de afinidad KD (ka/kd).
Ensayo de competitividad mediante ELISA entre PD1 combinado con diferentes concentraciones de variantes de anticuerpo humanizado anti-PD1 contra PDL1 o PD-L2
El ensayo competitivo de ELISA se realizó mediante el par de ensayo de ELISA de detección de inhibidores de PD-1:PD-L1 (AcroBiosystems; EE.UU.; Referencia EP-101). En este ensayo, se inmovilizó hPDL1 recombinante sobre plástico a 2 pg/ml en tampón PBS a pH 7,4. Se mezcló el anticuerpo purificado (a diferentes concentraciones) con 0,66 pg/ml final (concentración fija) de PD1 humana biotinilada (AcroBiosystems; EE. UU.; referencia EP-101) para medir la unión competitiva durante 2 horas a 37 °C. Tras la incubación y el lavado, se añadió estreptavidina marcada con peroxidasa (Vector laboratoring; EE.UU.; referencia SA-5004) para detectar la unión de Biotina-PD-1Fc, y se reveló mediante métodos convencionales.
Estudio de estabilidad mediante cromatografía de difusión y exclusión
El estudio de estabilidad mediante cromatografía de difusión y exclusión se realizó con una columna de exclusión por tamaño (GE Healthcare; Suecia, Superdex 200 10/300 GL; referencia 17-5175-01) sobre el sistema de purificación AkTA Prime (GE Healthcare; Suecia). Se inyectaron en esta columna anticuerpos anti-PD1, incubados 7 días a 37 °C o a 4 °C, (volumen de 100 pl) y se eluyeron con tampón PBS en 30 ml. El análisis se realizó con el software de evaluación PrimeView ((GE healthcare; Suecia) para analizar el porcentaje de agregados y de monómeros (tiempo de retención Tm = 11,7-12 ml para los monómeros).
Análisis de señalización de PD-1 usando el ensayo basado en células DiscoverX
La capacidad de los anticuerpos anti-PD-1 para bloquear la señalización PD-1/pSHP-1 se evaluó con el ensayo de señalización DiscoverX PathHunter© Jurkat PD-1 (SHP1) (referencia 93-1104C19). En este ensayo, los linfocitos T Jurkat expresan de manera estable un receptor PD-1 quimérico fusionado al fragmento Beta-gal (ED) y un SHP1 diseñado fusionado al fragmento Beta-gal complementario (EA). EI cultivo conjunto de células Jurkat con células presentadoras de PD-L1 produce la fosforilación de PD-1, el reclutamiento de SHP-1 manipulado y la complementación del fragmento ED y EA creando una enzima beta-gal activa y una señal de bioluminiscencia tras la adición del sustrato. La quimioluminiscencia es proporcional a la activación de la señalización PD-1. El experimento se realizó según las recomendaciones del fabricante. En resumen, se incubaron células PD-1 Jurkat con diferentes concentraciones de anticuerpos anti-PD-1 durante 1 hora y luego se cultivaron junto con células PD-L1+ durante otra hora. Se añadió reactivo de detección. La señal de luminiscencia se leyó 180 minutos después de usar el lector de placas TecanTM.
Ensayo de activación de linfocitos T usando el bioensayo basado en células Promega
Se probó la capacidad de los anticuerpos anti-PD-1 para restablecer la activación de los linfocitos T usando el kit PD-1/PD-L1 de Promega (Referencia J1250). Se usan dos estirpes celulares (1) linfocitos T efectores (Jurkat que expresan de manera estable PD-1, luciferasa inducida por NFAT) y (2) células diana activadoras (células CHO K1 que expresan de manera estable PDL1 y proteína de superficie diseñada para estimular los TCR afines de una manera independiente del antígeno. Cuando las células se cultivan conjuntamente, la interacción de PD-L1/PD-1 inhibe la activación mediada por TCR, bloqueando así la activación de NFAT y la actividad luciferasa. La adición de un anticuerpo anti-PD-1 bloquea la señal inhibidora mediada por PD-1 que conduce a la activación de NFAT y a la síntesis de la luciferasa y a la emisión de la señal de bioluminiscencia. El experimento se realizó según las recomendaciones del fabricante. Se analizaron las diluciones en serie del anticuerpo PD-1. Cuatro horas después del cultivo conjunto de células diana PD-L1+, células efectoras PD-1 y anticuerpos anti-PD-1 , se añadió sustrato de luciferina BioGIoTM a los pocillos y las placas se leyeron usando un luminómetro TecanTM.
Ensayo de reacción de leucocitos mixta in vitro
Las células dendríticas se diferenciaron de los monocitos CD14+ aislados de las CMSP humanas (aislamiento con el kit clásico sin tocar de monocitos Miltenyi n.° 130-117-337) mediante cultivo durante 6 días con 20 ng/ml de factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos y 20 ng/ml de lL-4, y luego se mezclaron en una proporción de 1:10 con linfocitos T CD4+ alógenos aislados de donantes de sangre sanos (kit de aislamiento Miltenyi, n.° 130-096 533). Tras 5 días de cultivo conjunto, se recogieron los sobrenadantes; se cuantificó el nivel de lFN-y mediante ELlSA.
Desactivación de PD1 humanizada in vivo en modelo de ratón
La eficacia del anticuerpo anti-PD-1 humana se evaluóin vivoen un modelo de ratón de mesotelioma ortotópico en ratones inmunocompetentes modificados genéticamente para expresar PD-1 humana (exón 2). Se inyectaron células mesoteliales AK7 por vía intrapleural (3e6 células/ratón) y luego se trataron el día 5/8/12/15 con un control anti-PD-1 o anticuerpo anti-PD1 humanizado (variante HKLD) a 1 mg/kg. Las células AK7 inyectadas expresan de manera estable la luciferasa permitiendo la generación de señal de bioluminiscenciain vivotras la inyección intraperitoneal de D-luciferina (3 pg/ratón, GoldBio, Saint Louis MO, EE. UU., Referencia 115144-35-9). Diez minutos después de la inyección de luciferina, se midió la señal de bioluminiscencia mediante Biospace lmager en el lado dorsal y ventral del ratón durante 1 minuto. Los datos se analizaron en fotones por segundo por cm2 por estereorradián, y representan la media de la señal dorsal y ventral. Cada grupo representa la media /- EEM de 5 a 7 ratones por grupo. Para el modelo MC38, se inyectaron células de cáncer de colon MC38 por vía subcutánea con 5e5 células en el costado izquierdo. El volumen tumoral se calculó con la fórmula 0,52 x (longitud x anchura)15. Los ratones fueron tratados cuando el tumor alcanzó 80-100 mm3 con 10 mg/kg de anticuerpo humanizado anti-PD1 (variante HKLD) 3 veces a la semana durante 3 semanas. Para el hepatocarcinoma Hepa1.6, se inyectan 2,5e6 células de hepatocarcinoma Hepa1.6 en la vena porta. Los ratones fueron tratados con 3 mg/kg de control de isotipo lgG4 o anticuerpo humanizado anti-PD1 (variante HKLD) el día 4/7/11/14/18/21 tras la inyección del tumor.
Farmacocinética y farmacodinámica del anticuerpo anti-PD1 humanizado en ratones y monos
Monos cangrejeros recibieron mediante inyección por vía intravenosa una sola dosis del anticuerpo anti-PD1 humanizado (variante HKLD), 1 o 5 mg/kg. Se extrajeron sangre completa y sueros en múltiples puntos de tiempo para evaluar la ocupación del receptor y cuantificar el anticuerpo anti-PD1 en los sueros. Para evaluar la farmacocinética del anticuerpo anti-PD-1 humanizado en el suero de los monos, se inmovilizó la proteína recombinante PD-1 (proteína recombinante con marcador de his-PD-1 humana (Sino Biological, n.° 10377-H08H) y se añadió suero diluido que contenía anticuerpo anti-PD-1. La detección se realizó con un anticuerpo kappa antihumano de ratón marcado con sulfo (clon NaM76-5F3, teñido con sulfoTag) añadido, y se reveló mediante el tampón MSD Gold Read (MSD n.° R92TG-2 y el lector MESO QUICKPLEX SQ 120).
Para evaluar la farmacocinética en ratones, se inyectó en BalbcRJ (hembras de 6-9 semanas) por vía intraorbital o subcutánea una sola dosis (5 mg/kg) de la forma quimérica, el anticuerpo anti-PD-1 humanizado (variante HKLD) o el anticuerpo Keytruda. La concentración de fármaco en plasma se determinó mediante ELISA usando un anticuerpo de cadena ligera anti-humano inmovilizado (clon NaM76-5F3), se añadió anticuerpo anti-PD-1 diluido que contenía suero. La detección se realizó con una IgG anti-humana de burro marcada con peroxidasa (Jackson Immunoresearch; EE. UU.; referencia 709-035-149) añadida y se reveló mediante métodos convencionales.
Ensayo de fagocitosis
Se diferenciaronin vitromonocitos humanos de voluntarios sanos en macrófagos M0 con M-CSF (100 ng/ml) en medio RPMI completo durante 5 días. Luego, se cultivaron macrófagos M0 durante 2 días con IFNg humano (70 ng/ml) para generar macrófagos M1. Se tiñeron Ios macrófagos M0/M1 y la estirpe celular Raji con el colorante eFluor450 de proliferación celular (Invitrogen) y el colorante eFluor670 de proliferación celular (lnvitrogen), respectivamente. Usando la placa de fondo redondo de 96 pocillos de fijación ultra baja (ULA), se preincubaron Raji CPDe670+ con anticuerpos y rituximab durante 1 hora y se añadieron los macrófagos M0 o M1 CPDe450+ a una proporción de efector con respecto a diana de 2:1. Las células se incubaron durante 1 o 2 horas. Se realizó el análisis de fagocitosis mediante citometría de flujo y se calculó el porcentaje de fagocitosis mediante el porcentaje de células CPDe670+ en el total de células CPDe450+ (es decir, porcentaje de células doble positivas (CPDe670+/CPDe450+)).
Análisis de unión ex vivo en CMSP CD3+ estimuladas humanas mediante citofluorometría de flujo
Para medir la unión de anti-PD1 en linfocitos T periféricos humanos, el anticuerpo se incubó durante 30 minutos a 4 °C y se lavó antes de teñir 30 minutos a 4 °C con Fc de IgG anti-humana marcado con PE (Biolegend; EE. UU.; referencia 409303) CD3 anti-humano marcado con azul pacífico (clon de BD Biosciences SP34-2 n.° 558124). Las muestras se analizaron en un citofluorómetro Cytoflex (Beckman Coulter) en la ventana de análisis de los linfocitos T CD3+.
Secreción de IFNg por linfocitos T humanos
Se evaluó la capacidad de anti-PD-1 humanizado para estimular la secreción de citocinas efectoras IFNg en una reacción leucocitaria alógena mixta. Se generaron células dendríticas derivadas de monocitos a partir de monocitos de sangre periférica humana aislada CD14+ GM-CSF e lL-4, y se cultivaron conjuntamente con linfocitos T humanos alógenos aislados CD4+ (proporción de 1 a 10) y diferentes dosis de variante HKLD o control de isotipo durante 5 días. El sobrenadante que contenía citocinas IFNg se recogió y se dosificó mediante ELISA (BD Bioscience, referencia 555142 y 555190).

Claims (18)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo monoclonal humanizado anti-PD-1 humana o un fragmento de unión al antígeno del mismo que comprende: (a) un VH que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; y (b) un VL que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo es un antagonista de la unión de PD-L1 y/o PD-L2 humanos a PD-1 humana.
2. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde comprende:
(a) una cadena pesada que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 y (b) una cadena Iigera que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34.
3. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende un dominio constante de cadena ligera de un dominio constante de cadena ligera kappa humano y un dominio constante de cadena pesada de un dominio constante de cadena pesada de lgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humano.
4. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende un dominio constante de cadena ligera de un dominio constante de cadena ligera kappa humano y un dominio constante de cadena pesada de un dominio constante de cadena pesada de IgG1 humana con una sustitución o una combinación de sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en T250Q/M428L; M252Y/S254T/T256E H433K/N434F; E233P/L234V/L235A/G236A A327G/A330S/P331S; E333A; S239D/A330L/1332E; P257I/Q311; K326W/E333S; S239D/1332E/G236A; N297A; L234A/L235A; N297A L234A/L235A; N297A M252Y/S254T/T256E; K322A y K444A, preferentemente seccionado del grupo que consiste en N297A, N297A y M252Y/S254T/T256E, y N297A y L234A/L235A según la numeración EU.
5. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de una cualquiera delas reivindicaciones 1 o 3, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende un dominio constante de cadena ligera de un dominio constante de cadena ligera kappa humano y un dominio constante de cadena pesada de un dominio constante de cadena pesada de IgG4 humana con una sustitución o una combinación de sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en S228P; L234A/L235A, S228P M252Y/S254T/T256E y K444A según la numeración EU.
6. Una molécula de ácido nucleico aislada o un grupo de moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico aislada o el grupo de moléculas de ácido nucleico aisladas de la reivindicación 6.
8. Una célula hospedadora que comprende la molécula de ácido nucleico aislada y/o el grupo de moléculas de ácido nucleico aisladas de la reivindicación 6 y/o el vector de acuerdo con la reivindicación 7.
9. Un método de producción del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende una etapa de cultivo de una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 8 y, opcionalmente, una etapa de aislamiento del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno.
10. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y/o la molécula de ácido nucleico aislada y/o un grupo de moléculas de ácido nucleico aisladas de acuerdo con la reivindicación 6 y/o el vector de acuerdo con la reivindicación 7 y/o la célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 8 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
11. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 10, en donde, además, comprende un agente terapéutico adicional.
12. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, la composición farmacéutica de la reivindicación 10 u 11, la molécula de ácido nucleico aislada o el grupo de moléculas de ácido nucleico aisladas de la reivindicación 6, el vector de acuerdo con la reivindicación 7 o la célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 8, para su uso como un medicamento.
13. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, la composición farmacéutica, la molécula de ácido nucleico aislada o el grupo de moléculas de ácido nucleico aisladas, el vector o la célula hospedadora para su uso de acuerdo con la reivindicación 12 en el tratamiento del cáncer.
14. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, la composición farmacéutica, la molécula de ácido nucleico aislada o el grupo de moléculas de ácido nucleico aisladas, el vector o la célula hospedadora para su uso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en una neoplasia maligna hematológica o un tumor sólido con expresión de PD-1 y/o PD-L1, un cáncer seleccionado del grupo que consiste en neoplasias hematolinfoides, linfoma angioinmunoblástico de linfocitos T, síndrome mielodisplásico y leucemia mieloide aguda, un cáncer inducido por virus o asociado con inmunodeficiencia, un cáncer seleccionado del grupo que consiste en sarcoma de Kaposi; cáncer de células escamosas cervical, anal, de pene y vulvar, y cánceres de orofaringe; linfomas no Hodgkin de linfocitos B (LNH), incluyendo el linfoma difuso de linfocitos B grande, linfoma de Burkitt, linfoma plasmablástico, linfoma primario del sistema nervioso central, linfoma primario de derrame de HHV-8, linfoma de Hodgkin clásico y trastornos linfoproliferativos; carcinoma hepatocelular; carcinoma de células de Merkel; y cáncer asociado con la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), y un cáncer seleccionado del grupo que consiste en melanoma metastásico o no metastásico, mesotelioma maligno, cáncer de pulmón no microcítico, carcinoma de células renales, linfoma de Hodgkin, cáncer de cabeza y cuello, carcinoma urotelial, cáncer colorrectal, carcinoma hepatocelular, cáncer de pulmón microcítico, carcinoma de células de Merkel metastásico, cánceres gástrico y gastroesofágico, y cáncer cervical.
15. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, la composición farmacéutica, la molécula de ácido nucleico aislada o el grupo de moléculas de ácido nucleico aisladas, el vector o la célula hospedadora para su uso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el cáncer tiene células tumorales que son negativas en PD-L1.
16. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, la composición farmacéutica, la molécula de ácido nucleico aislada o el grupo de moléculas de ácido nucleico aisladas, el vector o la célula hospedadora para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12-15, para su uso en combinación con radioterapia o un agente terapéutico adicional.
17. EI anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, la composición farmacéutica, la molécula de ácido nucleico aislada o el grupo de moléculas de ácido nucleico aisladas, el vector o la célula hospedadora para su uso de acuerdo con la reivindicación 12 en el tratamiento de una enfermedad infecciosa, preferentemente una enfermedad infecciosa crónica, incluso más preferentemente causada por un virus seleccionado del grupo que consiste en VIH, virus de la hepatitis, virus del herpes, adenovirus, virus de la gripe, flavivirus, ecovirus, rinovirus, virus coxsackie, coronavirus, virus sincitial respiratorio, virus de las paperas, rotavirus, virus del sarampión, virus de la rubeola, parvovirus, virus de la variolovacuna, virus HTLV, virus del dengue, virus del papiloma, virus de molusco, virus de la poliomielitis, virus de la rabia, virus JC y virus de la encefalitis arboviral.
18. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, la composición farmacéutica, la molécula de ácido nucleico aislada o el grupo de moléculas de ácido nucleico aisladas, el vector o la célula hospedadora para su uso de acuerdo con la reivindicación 12 en el tratamiento de pacientes con trastorno linfopénico.
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