TW202136287A - 包含il-7變體之雙官能分子 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於一種IL-7變體、包含其之雙官能分子及其用途。
Description
相關申請案的交互參照
本申請主張2019年12月17日提交的歐洲申請案號EP19306671.9的優先權之利益。藉由引用將上述申請案的全部內容併入本文中。
本發明係涉及免疫療法領域，具體係提供一種包含IL-7變體之雙官能分子。
介白素-7(Interleukin-7, IL-7)是IL-2超家族的一種免疫刺激性細胞因子成員，其藉由促進免疫反應，在適應性免疫系統中發揮重要作用。此細胞因子藉由T細胞及B細胞的存活及分化、淋巴細胞的存活及自然殺手(natural killer, NK)細胞活性的刺激來啟動免疫功能。IL-7還藉由淋巴組織誘導劑(lymphoid tissue inducer, LTi)調節淋巴結的發育，並促進初始T細胞(naive T cell)或記憶T細胞(memory T cell)的存活及分化。此外，IL-7藉由促進IL-2及干擾素-γ的分泌來增強人類的免疫反應。IL-7的受體為異二聚體(heterodimeric)，由IL-7Rα(CD127)和共同的γ鏈(CD132)所組成。γ鏈在所有造血細胞類型中表達，而IL-7Rα主要藉由包含B及T淋巴前驅細胞、初始T細胞及記憶T細胞表達。相較於表達較高水平的效應物(effector)/初始T細胞，在調節型T細胞(regulatory T cell)上觀察到的IL-7Rα表達較低。因此，CD127被用於表面標記以區分這兩者群體。IL-7Rα在先天性淋巴細胞上也以NK及腸相關淋巴組織(gut-associated lymphoid tissue, GALT)衍生的T細胞表達。IL-7Rα(CD127)鏈與腫瘤基質淋巴細胞生成素(Tumor stromal lymphopoietin, TSLP)共享，而CD132(γ鏈)與IL-2、IL-4、IL-9、IL-15及IL-21共享。藉由CD127/CD132誘導之兩個主要訊息傳導途徑包含：(1)Janus激酶/STAT途徑(即Jak-Stat-3及Jak-Stat-5)，以及(2)磷脂酰肌醇-3-激酶途徑(即PI3K-Akt)。患者對IL-7的給藥耐受性良好，並導致CD8及CD4細胞擴張以及CD4+T調節細胞相對減少。已在臨床上測試了與抗體Fc的N端結構域(domain)融合的重組裸IL-7或IL-7，其基本原理為藉由Fc結構域的融合來增加IL-7半衰期並增強治療的長期持久效率。
重組IL-7細胞因子的藥代動力學特性較差，限制了其在臨床中的應用。注射後，重組IL-7迅速分散並消耗，導致人體內的IL-7半衰期很短(從6.8~9.5小時不等)( Sportes et al., Clin Cancer Res. 2010 Jan 15;16(2):727-35)或在小鼠中的半衰期很短(2.5小時)(Hyo Jung Nam et al., Eur.J.Immunol.2010, 40：351-358)。IgG Fc結構域與IL-7的融合延長了其半衰期，因IgG可以結合新生兒Fc受體(neonatal Fc receptor, FcRn)並參與分子的胞吞轉送(transcytosis)及內體循環(endosomal recycling)。觀察IL-7 Fc融合分子(半衰期13小時)延長的循環半衰期，在小鼠給藥後長達8天仍維持在可檢測水平(200 pg/mL)( Hyo Jung Nam et al., Eur. J. Immunol. 2010. 40:351-358)。儘管與Fc結構域融合的IL-7細胞因子的半衰期增加，但是其分子需要頻繁的體內注射才可產生生物效應；在免疫細胞因子分子的情況下，細胞因子與抗體融合(例如標靶癌症抗原、免疫檢查點阻斷、共刺激分子等)，以優先將細胞因子濃縮至標靶抗原表達細胞。然而，IL-7細胞因子對其CD127/CD132受體的親和力(奈米(nano)莫耳至皮可(pico)莫耳範圍內)可能高於抗體對其標靶的親和力。因此，由於標靶介導的藥物處置(target-mediated drug disposition, TMDD)機制，細胞因子將驅動產物的藥代動力學，進而導致體內可用藥物的快速消耗。已經針對免疫細胞因子如IL-2或IL-7闡述了此種快速消除作用，表明融合蛋白的藥代動力學特性可能直接影響藥物的性能(List et Neri Clin Pharmacol. 2013; 5(Suppl 1): 29-45)。
因此，在本領域中仍然對可改善分散並減少IL-7產物消耗的新的及改良的IL-7變體有重大需求，特別是包含IL-7之雙官能分子。發明人在此揭露的發明向前邁出了重要的一步。
發明人提供了IL-7突變及優化的Fc框架以改善雙官能分子的分散及消耗，進而增強了體內的生物效應。發明人觀察到IL-7的突變，特別是與IgG同種型(isotpye)及連接子(linker)長度結合使用時，可使雙官能分子更好地分散，並在體內具有更長的半衰期。
本發明提供的雙官能分子，特別是與包含IL-7野生型的雙官能分子相較之下，在體內具有良好的藥代動力學及藥效學。此外，如本案實施方式中實施例的詳細介紹，這些新分子還具有優越及無法預期之特性。
在第一方面，本發明係關於一種包含與一結合部分綴合的介白素-7(IL-7)變體之雙官能分子，其中：
該結合部分與一特異性表達在一免疫細胞表面的標靶結合；
該IL-7變體與野生型人類IL-7(wth-IL-7)具有至少75%的一致性，其包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列或由SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列組成，其中該IL-7變體包含至少一個胺基酸突變，其能夠：i)與wth-IL-7對IL-7的親和力相比，降低IL-7變體對IL-7受體(IL-7 receptor, IL-7R)的親和力，以及ii)與包含wth-IL-7的雙官能分子相比，改善包含IL-7變體的雙官能分子的藥代動力學。
較佳地，上述至少一個突變係選自以下組成之群組中的一胺基酸置換或一組胺基酸置換：(i)C2S-C141S及C47S-C92S、C2S-C141S及C34S-C129S或C47S-C92S及C34S-C129S；(ii)W142H、W142F或W142Y；(iii)D74E、D74Q或D74N；(iv)Q11E、Y12F、M17L、Q22E及/或K81R；或其任意組合(即，胺基酸編號如SEQ ID NO：1所示)。
較佳地，本發明係關於一種包含與一結合部分綴合的介白素-7(IL-7)變體之雙官能分子，其中：
該結合部分與一特異性表達在一免疫細胞表面的標靶結合；
該IL-7變體與野生型人類IL-7(wth-IL-7)具有至少75%的一致性，其包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列或由SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列組成，其中該變體包含至少選自以下組成之群組中至少一種胺基酸突變：(i)W142H、W142F或W142Y；(ii)C2S-C141S及C47S-C92S、C2S-C141S及C34S-C129S或C47S-C92S及C34S -C129S；(iii)D74E、D74Q或D74N；(iv)Q11E、Y12F、M17L、Q22E及/或K81R；或其上述之任意組合，胺基酸編號如SEQ ID NO：1所示；其能夠 i)與wth-IL-7對IL-7的親和力相比，降低IL-7變體對IL-7受體(IL-7 receptor, IL-7R)的親和力，以及ii)與包含wth-IL-7的雙官能分子相比，改善包含IL-7變體的雙官能分子的藥代動力學。
另一方面，該IL-7變體包含選自C2S-C141S及C47S-C92S、C2S-C141S及C34S-C129S和C47S-C92S及C34S-C129S所組成之群組中的一組胺基酸置換(即，胺基酸編號如SEQ ID NO：1所示)。
又一方面，該IL-7變體包含選自W142H、W142F和W142Y所組成之群組中的胺基酸置換(即，胺基酸編號如SEQ ID NO：1所示)。
又一方面，該IL-7變體包含選自D74E、D74Q和D74N所組成之群組中的胺基酸置換(即，胺基酸編號如SEQ ID NO：1所示)。
較佳地，該IL-7變體包含SEQ ID NO：2~15所示之胺基酸序列或由SEQ ID NO：2~15所示的胺基酸序列組成。
另一方面，該結合部分包含人類IgG1的重鏈恆定結構域(heavy chain constant domain)，較佳地為Fc結構域，其任選地選自以下所組成之群組的置換或置換組合：T250Q/M428L、M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F、E233P/L234V/L235A/G236A+A327G/A330S/P331S、E333A、S239D/A330L/I332E、P257I/Q311、K326W/E333S、S239D/I332E/G236A、N297A、L234A/L235A、N297A+M252Y/S254T/T256E、K322A及K444A；較佳地，由N297A與任選地M252Y/S254T/T256E以及L234A/L235A組合所組成。
較佳地，該結合部分包含人類IgG4的重鏈恆定結構域，較佳地為Fc結構域，其任選地選自以下所組成之群組的置換或置換組合：S228P、L234A/L235A、S228P+M252Y/S254T/T256E.17以及K444A。
較佳地，該免疫細胞係為一T細胞；較佳地，該T細胞係為一衰竭T細胞。
另一方面，該標靶由T細胞表達，以及該結合部分與選自以下所組成之群組的標靶結合：PD-1、CD28、CD80、CTLA-4、BTLA、TIGIT、CD160、CD40L、ICOS、CD27、OX40、4-1BB、GITR、HVEM、Tim-1、LFA-1、TIM3、CD39、CD30、NKG2D、LAG3、B7-1、2B4、DR3、CD101、CD44、SIRPG、CD28H、CD38、CXCR5、CD3、PDL2、CD4以及CD8。
較佳地，該標靶由衰竭T細胞表達，以及該結合部分結合優選地與選自以下所組成之群組的標靶結合：PD-1、CTLA-4、BTLA、TIGIT、LAG3以及TIM3。
另一方面，該結合部分係為抗體或其抗原片段，且該IL-7變體的N-端任選地藉由一胜肽連接子與該抗體或其抗原片段的重鏈或輕鏈恆定結構域的C端融合；較佳地，與該重鍊恆定結構域的C端融合。
另一方面，該IL-7變體選自以下所組成之群組的胜肽連接子與該結合部分融合：GGGGS(SEQ ID NO：68)、GGGGSGGGS(SEQ ID NO：67)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO：69)以及GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：70)；較佳地為GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：70)。
另一方面，該分子包含一第一單體，該第一單體包含一第一異二聚體Fc鏈，該第一異二聚體Fc鏈的N端任選地經由一胜肽連接子與一抗原結合結構域的C端共價連接，該第一異二聚體Fc鏈的C端任選地經由一胜肽連接子與該IL-7變體的N端共價連接；以及一第二單體，該第二單體包含沒有抗原結合結構域的一互補第二異二聚體Fc鏈。較佳地，在該第二單體中，該互補第二異二聚體Fc鏈任選地經由一胜肽連接子與該IL-7變體共價連接；較佳地，該互補第二異二聚體Fc鏈的C端任選地藉由一胜肽連接子與該IL-7變體的N端共價連接。
另一方面，該分子包含一第一單體，該第一單體包含一第一異二聚體Fc鏈，該第一異二聚體Fc鏈的N端任選地經由一胜肽連接子與一抗原結合結構域的C端共價連接，該第一異二聚體Fc鏈不含該IL-7變體；以及一第二單體，該第二單體包含沒有抗原結合結構域的一互補第二異二聚體Fc鏈，該互補第二異二聚體Fc鏈任選地經由一胜肽連接子與該IL-7變體共價連接；較佳地，該互補第二異二聚體Fc鏈的C端任選地藉由一胜肽連接子與該IL-7變體的N端共價連接。
另一方面，該分子包含一第一單體，該第一單體包含一第一異二聚體Fc鏈，該第一異二聚體Fc鏈的N端任選地經由一胜肽連接子與一抗原結合結構域的C端共價連接；以及一第二單體，該第二單體包含一互補第二異二聚體Fc鏈，該互補第二異二聚體Fc鏈任選地經由一胜肽連接子與一抗原結合結構域的C端共價連接，其中僅有一個異二聚體Fc鏈的C端可與該IL-7變體的N端共價連接；較佳地，僅有第一異二聚體Fc鏈的C端可與該該IL-7變體的N端共價連接。
較佳地，該雙官能分子的抗原結合結構域可為Fab結構域、Fab’結構域、單鏈可變片段(single-chain variable fragment, scFV)或單結構域抗體(single domain antibody, sdAb)。
較佳地，該抗原結合結構域包含或基本上由以下所組成：(i)一重鏈，該重鏈包含SEQ ID NO：51的CDR1、SEQ ID NO：53的CDR2、以及SEQ ID NO：55、56、57、58、59、60、61或62的CDR3；以及(ii)一輕鏈，該輕鏈包含SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：65的CDR1、SEQ ID NO：66的CDR2以及SEQ ID NO：16的CDR3。
較佳地，該抗原結合結構域包含或基本上由以下所組成：
(a)一重鏈可變區(heavy chain variable region, VH)，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：18、19、20、21、22、23、24或25所示的胺基酸序列或由SEQ ID NO：18、19、20、21、22、23、24或25所示的胺基酸序列組成；
(b)一輕鏈可變區(light chain variable region, VL)，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列或由SEQ ID NO：27或由SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列組成。
較佳地，該抗原結合結構域包含SEQ ID NO：24所示的重鏈可變區或由SEQ ID NO：24所示的重鏈可變區，以及包含SEQ ID NO：28所示的輕鏈可變區或由SEQ ID NO：28所示的輕鏈可變區所組成。
本發明還關於一種分離的核酸序列或一組分離的核酸分子用以編碼雙官能分子。
本發明還關於一種宿主細胞，該宿主細胞包含分離的核酸。
本發明還關於一種藥物組合物，該藥物組合物包含雙官能分子、核酸或宿主細胞，以及任選地包含藥學上可接受的載體。
本發明最後還關於一種作為藥物使用之雙官能分子、核酸、宿主細胞或藥物組合物作為藥物之用途，特別是用於治療癌症或傳染病的藥物之用途。
介紹
根據本發明的分子係為雙官能的，因其結合人類介白素-7變體的特異性功效，該變體與標靶免疫細胞上表達的特定靶標相關。如本領域技術人員所知，由於在許多癌症中皆觀察到一種稱為T細胞衰竭的現象，因此T細胞可能無法充分清除腫瘤細胞。如Jiang, Y., Li, Y.和Zhu, B(Cell Death Dis 6, e1792(2015))所述，腫瘤微環境中衰竭的T細胞可導致抑制性受體的過度表達，效應細胞因子的產生和細胞溶解活性，導致癌症清除失敗，並通常導致癌症免疫逃避，而恢復衰竭T細胞係為一種用於癌症治療的臨床策略。
本領域已知許多衰竭因子，例如程序性細胞死亡蛋白1(PD1)，細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(CTLA-4)，T細胞膜蛋白3(TIM3)和淋巴細胞活化基因3蛋白(LAG3)，在免疫細胞特別是T細胞的表面表達。此種分子與在腫瘤細胞表面表達的對應物的相互作用特別誘導了免疫抑制環境，尤其PD-1是調節T細胞衰竭的主要抑制受體之一；實際上，具有高PD-1表達的T細胞消除癌細胞的能力降低。抗PD-1治療化合物，尤其是抗PD1抗體，在臨床上用於治療癌症，用於阻斷PD1-PDL1相互作用(PD1對T細胞且PDK1對腫瘤細胞)以及對T細胞衰竭的抑制作用；但是，抗PD1抗體並非總是足夠有效以使衰竭的T細胞重新活化。
本案發明人證明了包含IL-7變體的雙官能分子，根據本發明及阻斷免疫抑制相互作用的結合部分(檢查點抑制劑)出乎意料地協同活化NFAT途徑，此為T細胞活化所需的主要途徑。實際上，已觀察到藉由TCR訊息傳導轉導可協同活化T細胞，更具體地說，與單獨的抗PD-1相比，雙官能IL-7變體-抗PD-1分子可更好地活化T細胞，尤其是衰竭的T細胞。
發明人新展示之雙官能分子的相互作用如下：i)在T細胞表面表達的衰竭因子如PD-1、CTLA-4、BTLA、TIGIT、LAG3和TIM3(用於該結合部分)；以及ii)同一T細胞上的IL-7受體(針對IL-7變體側)導致該NFAT途徑(TCR訊息傳導)之意外的活性，並具有活化T細胞之積極效果，特別是衰竭T細胞，否則該些衰竭T細胞將無法消除腫瘤細胞。此種功效於先前並未揭露。
此外，在雙官能分子中使用IL-7變體對於增加體內的藥代動力學很重要。再者，藉由IL-7變體與其受體的親和力，相較於其他細胞增加了雙官能分子優先結合標靶免疫細胞並對這些細胞產生特定功效的能力，而且還可利用與雙官能分子的兩個部分在同一免疫細胞上作用相關的協同效應之優勢；較佳地，其被認為是包含IL-7變體及標靶衰竭因子之結合部分的雙官能分子允許IL-7在T細胞浸潤中的積聚及IL-7在T細胞上的重新定位。IL-7在這些T細胞附近的積聚在衰竭T細胞的情況下尤為重要，這些T細胞需要高劑量的IL-7來活化或重新活化。
令人驚訝地，發明人觀察到，相較於與具有IgG4重鏈恆定結構域的相同分子，具有IgG1種鏈恆定結構域的雙官能分子具有改善IL-7變體(pSTAT5訊息傳導、協同作用及CD127結合)的活性。此種改善係為IL-7突變體所特有的，而野生型IL-7尚未觀察到。此外，在抗體及IL-7之間使用連接子(GGGGS)3
可最大化IL-7變體的活性(pSTAT訊息傳導及CD127結合)。
本發明的雙官能分子特別具有以下一或多項優點：
雙官能分子允許將IL-7變體具體定位在免疫細胞例如T細胞或PD-1(+)細胞附近，特別是進入腫瘤，標靶細胞需要更高濃度的IL-7；
與野生型IL-7相比，IL-7變體中的突變降低了IL-7變體對IL-7R的親和力，且沒有其內在生物學活性的完全或顯著損失；
IL-7變體中的突變改善了體內的藥代動力學及藥效學，特別是與包含IL-7野生型的雙官能分子相比。較佳地，改善分子的藥代動力學及藥效學可使雙官能分子到達標靶細胞並作用於在免疫細胞表面表達的標靶上；
依據本發明的雙官能分子顯示，IL-7突變體具有協同活性(NFAT訊息傳導)；
與包含野生型IL-7的抗體相比，本發明的雙官能分子對PD-1(+)細胞具有比PD-1(-)細胞具有最高的選擇活性；
包含突變的IL-7 W142H分子的雙官能分子，可選擇性地及協同地順式活化(cis-activate)PD-1(+)CD127(+)衰竭T細胞；
IL-7變體可包含在具有1或2個IL-7分子及1或2個抗原結合便段的雙官能分子的幾種結構中，同時保有結合其標靶(例如PD-1)以及活化IL-7R途徑的能力。較佳地，具有1個或2個IL-7 W142H變體的雙官能分子在體內具有良好的藥代動力學特徵；
發明人出乎意料地顯示，就活性及藥代動力學而言，與包含2個IL7變體的建構體相比，包含單個IL-7變體的建構體具有改善的效能。
定義
為了可以更容易地理解本發明，以下將定義特定術語。其附加定義也詳細闡述於整個說明書中。
除非另有定義，否則本文中使用的所有技術術語、符號和其他科學術語旨在具有本發明所屬領域的技術人員通常理解的涵義。在某些情況下，為了清楚和/或易於參考，在此定義了具有通常理解的含義的術語，並且在本文中包含這樣的定義不應該被解釋為表示與本領域通常理解的區別。本文描述或參考的技術和程序基本上可由本領域技術人員充分理解並可採用常規方法來實現。
如本文所用，術語“野生型白介素-7”、“wt-IL-7”和“ wt-IL7”是指哺乳動物內源性分泌糖蛋白，尤其是IL-7多肽、其衍生物和類似物，例如在標準生物測定法或IL-7受體結合親和力測定中，具有與野生型功能性哺乳動物IL-7基本相同的胺基酸序列及生物學活性。例如，wt-IL-7是指具有以下胺基酸序列的重組或非重組多肽的胺基酸序列：i) 天然或自然存在的IL-7多肽；ii)IL-7多肽的生物活性片段；iii)IL-7多肽的生物活性多肽類似物；以及iv) 具有生物活性的IL-7多肽。IL-7可包含或不包含胜肽訊息。此分子的替代名稱為“B前細胞生長因子”及“淋巴細胞生成素-1”。較佳地，術語“ wt-IL-7”是指人類IL-7(wth-IL7)。例如，人類wt-IL-7胺基酸序列為約152個胺基酸(在沒有訊息肽的情況下)，且Genbank登錄號為NP_000871.1，該基因位於染色體8q12-13上。人類IL-7舉例可為UniProtKB-P13232中所描述。
如本文所用，術語“抗體”係指一種免疫球蛋白分子，並且以其最廣泛的意義使用。較佳地，抗體包含免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即包含抗原結合位點的分子。免疫球蛋白分子可以是任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或亞類。對應於不同類別的免疫球蛋白的重鏈恆定結構域分別稱為α、δ、ε、γ和μ。除非另有特別說明，否則術語“抗體”包含完整的免疫球蛋白及“抗體片段”或“抗原結合片段”(例如Fab、Fab'、F(ab')2
、Fv)、單鏈(scFv)，其突變體包含抗體部分的分子、雙抗體、線性抗體、單鏈抗體以及包含所需特異性抗原識別位點的免疫球蛋白分子的任何其他修飾構型，包含抗體的醣基化變體、抗體的胺基酸序列變體。較佳地，術語抗體是指人源化抗體。
如本文所用，“抗體重鏈”是指存在於抗體構造中的兩種類型的多肽鏈中的較大者，抗體重鏈的CDR通常稱為“HCDR1”、“HCDR2”及“HCDR3”，抗體重鏈的框架區通常稱為“HFR1”、“HFR2”、“HFR3”及“HFR4”。
如本文所用，“抗體輕鏈”是指存在於抗體構造中的兩種類型的多肽鏈中的較小者。κ和λ輕鏈是指兩種主要的抗體輕鏈同種型，抗體輕鏈的CDR通常稱為“LCDR1”、“LCDR2”及“LCDR3”，抗體輕鏈的框架區通常稱為“LFR1”、“LFR2”、“LFR3”及“LFR4”。
如本文所用，抗體的“抗原結合片段”是指抗體的一部分，即與本發明抗體的結構的一部分相對應的分子，其表現出對特定抗原的抗原結合能力，可能以其原始形式；與相應的四鏈抗體的抗原結合特異性相比，此種片段尤其對所述抗原表現出相同或基本相同的抗原結合特異性；有利地，抗原結合片段具有與相應的4鏈抗體相似的結合親和力。然而，相對於相應的4-鏈抗體具有降低的抗原結合親和力的抗原結合片段也包含在本發明內。抗原結合能力可以藉由測量抗體與標靶片段之間的親和力來決定，這些抗原結合片段也可以稱為抗體的“功能片段”。抗體的抗原結合片段是包含其稱為CDR(Complementary Determining Regions，互補決定區)或其部分的高變域的片段。
如本文所用，術語“人源化抗體”意指其中衍生自另一哺乳動物物種例如小鼠的種系的CDR序列已嫁接到人類框架序列上的抗體(例如，包含源自非人類抗體的最小序列的嵌合抗體)。抗體例如非人抗體的“人源化形式”也指已經歷人源化的抗體。人源化抗體通常是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中一個或多個CDR的殘基被非人類抗體(供體抗體)的至少一個CDR的殘基所取代，同時保有了原始抗體所需的特異性、親和力及能力。可在人類框架序列內進行其他框架區修飾；較佳地，人源化抗體的T20人性分數大於80%、85%或90%。抗體的“人性”可以例如使用T20分數分析儀來測量，以定量抗體可變區的人性，如Gao S H, Huang K, Tu H, Adler A S. BMC Biotechnology. 2013: 13:55中所述或藉由基於Web的工具使用T20截止人類數據庫來計算抗體序列的T20分數：http://abAnalyzer.lakepharma.com。
“嵌合抗體”是指藉由將來自非人類來源的遺傳物質，較佳地諸如小鼠與來自人類的遺傳物質相結合而製成的抗體，這樣的抗體源自藉由嵌合區連接的人和非人抗體。嵌合抗體通常包含來自人的恆定結構域和來自另一哺乳動物物種的可變結構域，當將它們用於治療時，可降低來自非人類動物的外源抗體反應的風險。
如本文所用，術語“片段可結晶區域”、“Fc區域”或“Fc結構域”是可互換的，且是指與稱為Fc受體的細胞表面受體相互作用的抗體的尾區。Fc區或Fc結構域通常由兩個相同的結構域組成，其源自抗體兩條重鏈的第二和第三恒定結構域(即CH2和CH3結構域)，Fc結構域的部分是指CH2或CH3結構域。任選地，Fc區或Fc結構域可任選地包含CH1和CH2之間的全部或部分鉸鏈區；任選地，Fc結構域是來自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc結構域，任選地具有IgG1鉸鏈-CH2-CH3及IgG4鉸鏈-CH2-CH3。
在IgG抗體的情況下，IgG同種型各自具有三個CH區；因此，在IgG的情況下，“CH”結構域如下：“CH1”是指如Kabat中根據EU index所述的位置118-215。“鉸鏈”是指如Kabat中根據EU index所述的位置216-230；“CH2” 是指如Kabat中根據EU index所述的位置231-340；以及“CH3”是指如Kabat中根據EU index所述的位置341-447。
“胺基酸改變”或“胺基酸修飾”在本文中是指多肽胺基酸序列的改變；“胺基酸修飾”包含多肽序列中的取代、插入及/或缺失。本文中的“胺基酸取代”或“取代”是指用另一種胺基酸置換親本多肽序列(parent polypeptide sequence)中特定位置的胺基酸；“胺基酸插入”或“插入”是指在親本多肽序列的特定位置添加胺基酸；“胺基酸缺失”或“缺失”是指在親本多肽序列中特定位置的胺基酸的去除。胺基酸取代可以是保守的；保守取代是將給定的胺基酸殘基替換為具有類似化學性質(例如電荷、體積及/或疏水性)的具有側鏈(“R-基團”)的另一個殘基。如本文所用，“胺基酸位置”或“胺基酸位置編號”可互換使用，並且是指特定胺基酸在胺基酸序列中的位置，通常用胺基酸的一個字母代碼來指定；胺基酸序列中的第一個胺基酸(即從N端開始)應被認為具有位置1。
通常，保守的胺基酸置換基本上不會改變蛋白質的功能特性。保守取代和相應的規則在習知技術中已被充分描述。例如，保守取代可以藉由下表中反應的胺基酸群組內的取代來定義：
表A-胺基酸殘基
| 胺基酸群組 | 胺基酸殘基 |
| 酸性殘基 | ASP及GLU |
| 鹼性殘基 | LYS、ARG、及HIS |
| 親水性不帶電殘基 | SER、THR、ASN及GLN |
| 脂肪族不帶電殘基 | GLY、ALA、VAL、LEU及ILE |
| 非極性不帶電殘基 | CYS、MET及PRO |
| 芳香族殘基 | PHE、TYR及TRP |
表B-替代性保守胺基酸殘基取代基
| 1 | 丙氨酸 (Alanine, A) | 絲胺酸 (Serine,S) | 蘇胺酸(Threonine, T) |
| 2 | 天門冬胺酸 (Aspartic acid, D) | 麩胺酸 (Glutamic acid, E) | |
| 3 | 天冬醯胺 (Asparagine, N) | 麩醯胺酸 (Glutamine, Q) | |
| 4 | 精胺酸 (Arginine, R) | 賴胺酸 (Lysine, K) | |
| 5 | 異白胺酸 (Isoleucine, I) | 白胺酸 (Leucine, L) | 甲硫胺酸 (Methionine, M) |
| 6 | 苯丙胺酸 (Phenylalanine, F) | 酪胺酸 (Tyrosine, Y) | 色胺酸 (Tryptophan ,W) |
表C-氨基酸殘基的進一步替代的物理及功能分類
| 含醇基之殘基 | S及T |
| 脂肪族殘基 | I、L、V及M |
| 環烯基相關殘基 | F、H、W及Y |
| 疏水殘基 | A、C、F、G、H、I、L、M、R、T、V、W及Y |
| 帶負電荷之殘基 | D及E |
| 極性殘基 | C、D、E、H、K、N、Q、R、S及T |
| 小殘基 | A、C、D、G、N、P、S、T及V |
| 極小殘基 | A、G及S |
| 涉及轉型殘基 | A、C、D、E、G、H、K、N、Q、R、S、P及T |
| 柔性殘基 | E、Q、T、K、S、G、P、D、E及R |
如本文所用，兩個序列之間的“序列一致性”由參數“序列一致性”、“序列相似性”或“序列同源性”描述。為了本發明的目的，兩個序列(A)和(B)之間的“百分比一致性”是藉由比較窗口比較以最佳方式比對的兩個序列來確定的。所述序列的比對可以藉由本領域中眾所周知的方法來進行，例如，使用Needleman-Wunsch的整體比對算法。蛋白質分析軟體使用分配給各種取代、缺失及其他修飾(包含保守胺基酸置換)的相似性度量來匹配相似序列。一旦獲得整體比對，就可以藉由將比對的相同胺基酸殘基的總數除以序列(A)及(B)之間的最長序列中包含之殘基的總數來獲得一致性百分比。通常使用序列分析軟體確定序列一致性。為了比較兩個胺基酸序列，例如，可以使用“EMBOSS針”工具對由EMBL-EBI提供的蛋白質進行成對序列比對，並在以下位置可用：www.ebi.ac.uk/Tools/services/web/toolform.ebi?tool=emboss_needle&context=protein；例如使用預設設置：(i)Matrix : BLOSUM62；(ii)Gap open : 10；(iii)gap extend : 0.5；(iv)output format : pair；(v)end gap penalty : false；(vi)end gap open : 10；(vii)end gap extend : 0.5。
或者，通常也可以使用HHalign算法及其預設設置作為其核心比對引擎，使用序列分析軟體Clustal Omega來確定序列一致性。該算法揭露於Söding, J. (2005)“藉由HMM與HMM比較的蛋白質同源性檢測”中。Bioinformatics 21, 951-960也具有預設設置。
如本文所用，術語“衍生自”和“衍生自”是指具有衍生自母體化合物或蛋白質結構之結構且其結構與本文公開的那些充分相似並且基於該相似性而預期的化合物。由本領域技術人員表現出與要求保護的化合物相同或相似的性質、活性及效用。
如本文所用，“藥物組合物”是指一或多種活性劑的製劑，例如包含根據本發明的雙功能分子以及任選的其他化學組分，例如生理上合適的載體及賦形劑；藥物組合物的目的是促進活性劑給予生物體。本發明的組合物可以是適合於任何常規給藥或使用途徑的形式。在一實施方案中，“組合物”通常是指活性劑例如化合物或組合物的組合，以及天然存在或非天然存在的載體，惰性(例如可檢測的試劑或標記)或活性成分，例如佐劑、稀釋劑、黏合劑、穩定劑、緩沖劑、鹽、親脂性溶劑、防腐劑、佐劑或其類似成分，且包含藥學上可接受的載體。如本文所指，“可接受的媒介物”或“可接受的載體”是本領域技術人員已知可用於配製藥物組合物的任何已知化合物或化合物的組合。
如本文所用，“有效量”或“治療有效量”是指單獨或與一種或多種其他活性劑組合賦予受試者治療效果所需的活性劑的量，例如治療目標疾病或病症或產生所需效果所需之活性劑的量。“有效量”將根據藥劑、疾病及其嚴重程度，待治療受試者的特徵包含年齡身體狀況、大小、性別和體重，治療時間、同步療法性質(如果有)、具體的給藥途徑以及衛生從業人員的知識和專長內的類似因素，這些因素是本領域普通技術人員眾所周知的，並且僅藉由常規實驗即可解決。通常首選使用單個組分或其組合的最大劑量，即根據合理醫學判斷的最高安全劑量。
如本文所用，術語“藥物”是指具有針對病症或疾病的治療或預防性質的任何物質或組合物。術語“治療”是指旨在改善患者健康狀況的任何行為，例如治療、預防及延遲疾病或疾病症狀，其表示疾病的治癒性治療及/或預防性治療，治癒性治療定義為導致治癒、緩解、改善及/或消除、減輕及/或穩定疾病或疾病症狀，或直接或間接引起之痛苦的治療；預防性治療包含導致疾病預防的治療和減少及/或延遲疾病的進展及/或發病率或發生風險的治療。在某些實施例中，這樣的術語是指疾病、病症、感染或與其相關的症狀的改善或根除；在其他實施例中，該術語是指使癌症的擴散或惡化最小化。根據本發明的治療未必意味著100%或完全治療，而是本領域普通技術人員認為具有潛在的益處或治療效果所存在不同程度的治療；較佳地，術語“治療”是指將包含一或多種活性劑的組合物施用或給予患有疾病/病症的受試者。
如本文所用，術語“疾病”是指由於遺傳或發育錯誤、感染、毒藥、營養缺乏或不平衡、毒性或不利的環境因素；較佳地，這些術語指的是健康病症或疾病，例如破壞正常身體或精神功能的疾病；更佳地，術語疾病是指影響動物及/或人類的免疫疾/或炎性疾病，例如癌症。
如本文所用，“免疫細胞”是指參與先天性和適應性免疫的細胞，例如白血細胞(白血球)，其來源於骨髓中產生的造血幹細胞(HSC)，淋巴細胞(T細胞、B細胞、天然殺傷(NK)細胞及天然殺傷性T細胞(NKT))，以及骨髓來源的細胞(嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞)；較佳地，免疫細胞可以選自B細胞、T細胞，特別是CD4+ T細胞和CD8+ T細胞、NK細胞、NKT細胞、APC細胞、樹突狀細胞和單核細胞之非窮舉性列表。如本文所用，“T細胞”包含例如CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、T輔助1型T細胞、T輔助2型T細胞、T輔助17型T細胞及抑制性T細胞。
如本文所用，術語“效應T細胞”、“T eff”或“效應細胞”所述了一組免疫細胞，其包含幾種積極應對刺激例如共刺激的T細胞類型，其較佳地包含具有消除抗原功能的T細胞(例如，藉由產生調節其他細胞活化的細胞因子或藉由細胞毒性活性)；特別包含CD4+、CD8+、細胞毒性T細胞及輔助性T細胞(Th1及Th2)。
如本文所用，術語“調節性T細胞”、“Treg細胞”或“T reg”是指調節免疫系統，維持對自身抗原的耐受性和預防自身免疫性疾病的T細胞的亞群；Treg具有免疫抑制作用，通常抑制或下調效應T細胞的誘導和增殖。Tregs表達生物標誌物CD4、FOXP3及CD25，並被認為與初始的CD4細胞起源於同一譜系。
術語“衰竭T細胞”是指處於功能障礙狀態(即“精疲力竭”)的T細胞群體；T細胞衰竭的特徵是功能逐漸喪失、轉錄譜改變及抑制受體的持續表達。衰竭T細胞失去其細胞因子生產能力、高增殖能力及細胞毒性潛能，最終導致其缺失。衰竭T細胞通常表示較高水平的CD43、CD69及抑制性受體，以及較低的CD62L和CD127表達。
術語“免疫反應”是指例如淋巴細胞、抗原呈遞細胞、吞噬細胞、粒細胞以及上述細胞或肝臟產生的可溶性大分子(包含抗體、細胞因子及補體），從而對入侵的病原體、感染病原體的細胞或組織、癌細胞或在自身免疫或病理性炎症的情況下，正常的人類細胞或組織。
如本文所用，術語“拮抗劑”是指阻止或降低另一種物質的活性或功能的物質；較佳地，該術語是指與作為參考物質(例如PD-L1及/或PD-L2)的細胞受體(例如PD-1)結合的抗體，可阻止其產生全部或部分正常生物學作用(例如創建免疫抑制性微環境)。根據本發明的人源化抗體的拮抗劑活性可以藉由競爭性ELISA來評估。
如本文所用，術語“激動劑”是指活化一活化受體之功能的物質；較佳地，該術語是指與作為參考物質的細胞活化受體結合的抗體，並且具有與生物天然配體至少部分相同的作用(例如誘導受體的活化作用)。藥代動力學(Pharmacokinetic, PK)指藥物在體內的移動，而藥效學(pharmacodynamic, PD)指人體對藥物的生物反應。PK藉由吸收、分佈、生物利用度、代謝及排泄作為時間的函數來描述藥物的暴露情況。PD利用生化或分子相互作用描述藥物反應。PK和PD分析用於表達藥物暴露、預測和評估劑量變化、估計消除率和吸收率、評估製劑的相對生物利用度/生物等效性，表達受試者體內和受試者之間的變異性，了解濃度效應關係，並建立安全係數及功效特徵。“改善PK”是指上述特徵之一得到改善，例如當注射至受試者時，分子的半衰期增加，特別是分子的血清半衰期更長。
如本文所用，術語“分離的”表示所列舉的物質(例如抗體、多肽、核酸等）與自然界中存在的其他物質基本上分離或相對於其富集；較佳地，“分離的”抗體是已經從其天然環境的組分中鑑定、分離及/或回收的抗體。
如本文中所使用的，術語“及/或”將被視為兩個指定的特徵或部件中的每個具有或不具有彼此的特定公開。例如“A及/或B”將被視為(i)A，(ii)B及(iii)A和B中之每一個的具體公開，就像每個單獨地列出一樣。
術語“一”或“一個”可以指代其修改的一或多個元素(例如“一種試劑”可以表示一種或多種試劑)，除非在上下文中清楚描述，否則係指元素中的一個或多個元素。
如本文結合任何及所有值(包含數值範圍的下限及上限)所使用的術語“約”是指具有可接受的偏差範圍最高為+/-10%的任何值，(例如，+/-0.5%、+/-1%、+/-1.5%、+/-2%、+/-2.5%、+/-3%、+/-3.5%、+/-4%、+/-4.5%、+/-5%、+/-5.5%、+/-6%、+/-6.5%、+/-7%、+/-7.5%、+/-8%、+/-8.5%、+/-9%、+/-9.5%)；在一串值的開頭使用術語“大約”會修飾每個值(即“大約1、2及3”是指大約1、大約2即大約3)。此外，當在此描述值列表時(例如約50%、60%、70%、80%、85%或86%)，該列表包含其所有中間值和分數值(例如54%、85.4%)。
IL-7
突變體
本發明提供了介白素-7突變體(IL-7m)及其包含包含介白素-7突變體的第一實體(IL-7m)和包含結合部分的第二實體之雙官能分子。
術語“介白素-7突變體”、“突變的IL-7”、“IL-7突變體”、“IL-7變體”、“IL-7m”或“IL-7v”在本發明中可互換使用。IL-7蛋白的“變體”或“突變體”定義為被一或多個胺基酸改變的胺基酸序列；該變體可以具有“保守的”修飾或“非保守的”修飾，這樣的修飾可以包含胺基酸置換、缺失及/或插入；較佳地，修飾是取代，特別是保守取代。本發明中包含的變體IL-7蛋白特別涉及與野生型IL-7相比不保留基本相等的生物學特性(例如活性、結合能力及/或結構）的IL-7蛋白。IL-7突變體或變體包含至少一種突變；較佳地，至少一種突變降低了IL-7m對IL-7R的親和力，但不會導致IL-7R的識別性喪失。因此，IL-7突變體或變體保留了活化IL-7R的能力，例如藉由pStat5訊息傳導所測量的、例如在Bitar et al., Front. Immunol., 2019, volume 10中所公開的。可以使用體外細胞增殖測定法或藉由ELISA或FACS測定進入T細胞的P-Stat5來測定IL-7蛋白的生物學活性。較佳地，根據本發明的IL-7變體相較於野生型IL-7，較佳為wth-IL7，具有降低的生物學特性(例如活性、結合能力及/或結構)至少2、5、10、20、30、40、50、100、250、500、750、1000、2500、5000或8000倍；更佳地，IL-7變體與IL-7受體的結合減少，但保留活化IL-7R的能力。例如，與野生型IL-7相比，與IL-7受體的結合可以減少至少10%、20%、30%、40%、50%、60%，且與野生型IL-7相比，活化IL-7R的能力維持至少90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%或20%；較佳地，IL-7m是人類野生型IL-7的變體，例如，如SEQ ID NO：1中所述。
在一個實施例中，與野生型人類IL相比，本發明的IL-7變體維持生物活性至少為1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%；較佳地，至少為80%、90%、95%，甚至更佳地為99%。
一方面，IL-7變體或突變體與wt-IL-7的區別在於至少一種胺基酸突變，其中：i)與wt-IL-7對IL-7R的親和力相比，降低了IL-7變體對IL-7受體(IL-7R)的親和力；以及ii) 與wt-IL7相比，改善了IL7變體的藥代動力學。較佳地，IL-7變體或突變體進一步保留活化IL-7R的能力，特別是藉由pStat5訊息傳導。
另一方面，包含IL-7變體或突變體的雙官能分子與wt-IL-7的區別在於至少一個胺基酸突變，所述胺基酸突變為：i) 與包含wt-IL-7的雙官能分子對IL-7R的親和力相比，降低了雙官能分子對IL-7受體(IL-7R)的親和力；以及ii)與包含wt-IL-7的雙官能分子相比，改善了包含IL-7變體或突變體的雙官能分子的藥代動力學。較佳地，包含IL-7變體或突變體的雙官能分子進一步保留了活化IL-7R的能力，特別是藉由pStat5信號；例如，與包含野生型IL-7的雙官能分子相比，包含IL-7變體或IL-7受體突變體的雙官能分子結合可減少至少10%、20%、30%、40%、50%、60%，並保留至少90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%或20%的活化IL-7R的能力。
根據本發明，與wth-IL-7對IL-7R的親和力相比，IL-7m對IL-7受體(IL-7R)的親和力降低；尤其是與wth-IL-7分別對CD127及/或CD132的親和力相比，IL-7m對CD127及/或CD132的親和力降低；較佳地，與wth-IL-7對CD127的親和力相比，IL-7m對CD127的親和力降低。
較佳地，與wt-IL-7對IL-7R的親和力相比，至少一個胺基酸突變使IL-7m對IL-7R，特別是CD132或CD127的親和力降低至少10、100、1000、10000或100000倍。此種親和力比較可以藉由本領域技術人員已知的任何方法進行，例如ELISA或Biacore。
較佳地，與IL-7 wt相比，至少一個胺基酸突變降低IL-7m對IL-7R的親和力，但不降低IL-7m的生物學活性，尤其是藉由pStat5訊息傳導。
或者，與IL-7 wt相比，至少一個胺基酸突變降低了IL-7m對IL-7R的親和力，但沒有顯著降低IL-7m的生物學活性，尤其是藉由pStat5訊息傳導。
另外或替代地，個別地與野生型IL-7或包含野生型IL-7的雙官能分子相比，IL-7m改善了IL-7變體或突變體，或包含IL-7變體的雙官能分子的藥代動力學；較佳地，與wth-IL-7相比，本發明的IL-7m將IL-7變體的藥代動力學提高了至少10、100或1000倍；較佳地，與包含wth-IL-7的雙官能分子相比，本發明的IL-7m將包含IL-7變體或突變體的雙官能分子的藥代動力學提高至少10、100或1000倍。藥代動力學概況比較可以藉由本領域技術人員已知的任何方法進行，例如在多個時間點於體內注射藥物及在血清中對該藥物進行劑量ELISA，例如實施例2所示。
如本文所用，術語“藥代動力學”和“PK”可互換使用，並且是指給予活生物體的化合物、物質或藥物。藥代動力學特別包含ADME或LADME方案，代表釋放(即，物質從組合物中釋放)、吸收(即，物質進入血液循環)、分佈(即，物質通過人體的分散或傳播)、代謝(即物質的轉化或降解)及排泄(即物質從生物體中的移除或清除)；代謝及排泄的兩個階段也可以歸類為消除。本領域技術人員可以監測不同的藥代動力學參數，例如消除半衰期、消除恆定速率、清除率(即每單位時間清除的血漿血漿量)、Cmax(最大血清濃度)以及藥物暴露等(由曲線下的面積確定，請參閱Scheff et al, Pharm Res. 2011 May;28(5):1081-9)。
接著，藉由使用IL-7m，尤其是在雙官能分子中的使用來改善藥代動力學是指至少上述參數之一的改善；較佳地，其係指雙官能分子的消除半衰期的改善，即半衰期持續時間或Cmax的增加。
在一特定的實施例中，與包含IL-7wt的雙官能分子相比，IL-7m的至少一個突變改善了包含IL-7m的雙官能分子的消除半衰期。在一實施例中，IL-7m與擁有152個胺基酸的野生型人類IL-7(wth-IL-7)蛋白，例如SEQ ID NO：1具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%的一致性；較佳地，IL-7m與SEQ ID NO：1具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少9%的一致性。
較佳地，至少一種突變發生在IL-7的氨基酸位置74及/或142。另外或替代地，至少一個突變發生在胺基酸位置2和141、34和129及/或47和92，這些位置是指SEQ ID NO：1所示胺基酸的位置。
較佳地，至少一個突變是胺基酸置換或一組胺基酸置換，選自C2S-C141S和C47S-C92S、C2S-C141S和C34S-C129S、C47S-C92S和C34S-C129S、W142H、W142F、W142Y、Q11E、Y12F、M17L、Q22E、K81R、D74E、D74Q及D74N或其任何組合，這些突變是指SEQ ID NO：1所示胺基酸的位置。再者，舉例而言，突變W142H代表將wth-IL7的色胺酸替換為組胺酸，以獲得在胺基酸位置142具有組胺酸的IL-7m，這樣的突變體可舉例如SEQ ID No：5。
在一實施例中，IL-7m包含一組取代，以便破壞C2和C141、C47和C92以及C34和C129之間的二硫鍵；較佳地，IL-7m包含兩組取代，以便破壞C2和C141以及C47和C92、C2和C141以及C34和C129、或C47和C92以及C34和C129之間的二硫鍵；例如，半胱胺酸殘基可被絲胺酸取代以防止形成二硫鍵。因此，胺基酸置換可以選自C2S-C141S和C47S-C92S(稱為“SS2”)、C2S-C141S和C34S-C129S(稱為“SS1”)，以及C47S-C92S和C34S-C129S(稱為“SS3”)，這些突變是指SEQ ID NO：1所示胺基酸的位置，此類IL-7m特別以SEQ ID No：2-4所示的序列描述(分別為SS1、SS2及SS3)。較佳地，IL-7m包含胺基酸置換C2S-C141S和C47S-C92S；甚至更佳地，IL-7m具有SEQ ID NO：3所示的序列。
在另一實施例中，IL-7m包含選自W142H、W142F及W142Y中的至少一個突變，此類IL-7m分別在SEQ ID NO：5-7所示的序列下進行了具體描述。較佳地，IL-7m包含突變W142H；甚至更佳地，IL-7m具有SEQ ID NO：5所示的序列。
在另一實施例中，IL-7m包含選自D74E、D74Q及D74N，較佳為D74E及D74Q中的至少一個突變，此類IL-7m分別在SEQ ID NO：12-14所示的序列下進行了具體描述。較佳地，IL-7m包含突變D74E；甚至更佳地，IL-7m具有SEQ ID NO：12所示的序列。
在另一實施例中，IL-7m包含選自Q11E、Y12F、M17L、Q22E及/或K81R中的至少一個突變，這些突變是指SEQ ID NO：1所示胺基酸的位置，此類IL-7m分別在SEQ ID NO：8、9、10、11及15所示的序列下特別描述。
在一實施例中，IL-7m包含至少一種突變，該突變由以下組成：i)W142H、W142F或W142Y；及/或ii)D74E、D74Q或D74N，較佳為D74E或D74Q；及/或iii)C2S-C141S和C47S-C92S、C2S-C141S和C34S-C129S或C47S-C92S和C34S-C129S。
在一實施例中，IL-7m包含W142H取代和至少一種突變，所述突變由以下組成：i)D74E、D74Q或D74N，較佳為D74E或D74Q；及/或ii)C2S-C141S和C47S-C92S、C2S-C141S和C34S- C129S或C47S-C92S和C34S-C129S。
在一實施例中，IL-7m包含D74E取代和至少一種突變，所述突變由以下組成：i)W142H、W142F或W142Y；及/或ii)C2S-C141S和C47S-C92S、C2S-C141S和C34S-C129S或C47S- C92S和C34S-C129S。
在一實施例中，IL-7m包含突變C2S-C141S和C47S-C92S以及至少一個由以下組成的取代：i)W142H、W142F或W142Y；及/或ii)D74E、D74Q或D74N，較佳為D74E或D74Q。
在一實施例中，IL-7m包含i)D74E和W142H取代，以及ii)突變C2S-C141S和C47S-C92S、C2S-C141S和C34S-C129S或C47S-C92S和C34S-C129S。
IL-7m蛋白可包含或不包含其肽訊息傳導。IL-7的變體還可包含IL-7的多肽序列改變(例如氧化、還原、脫胺基或截斷形式)。
一方面，本發明中使用的IL-7變體或突變體是重組IL-7。本發明所用的術語“重組”是指該多肽是從重組表達系統獲得或衍生的，即，來自宿主細胞(例如微生物或昆蟲或植物或哺乳動物)的培養物，或來自經工程改造以包含編碼IL-7m多肽的核酸分子的轉基因植物或動物；較佳地，重組IL-7是人類重組IL-7m(例如在重組表達系統中產生的人類IL-7m)。
在一實施例中，IL-7m呈現SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15中列出的序列；較佳地，本發明的雙官能分子包含IL-7變體，該IL-7變體包含或由SEQ ID NO：2-15所示的氨基酸序列組成；甚至更佳地，本發明的雙官能分子包含IL-7變體，其包含SEQ ID NO：3、5或12所示的胺基酸序列或由其組成。
在一實施例中，本發明提供了IL-7變體和包含IL-7變體的雙官能分子，其與野生型IL-7蛋白相比具有降低的免疫原性，尤其是藉由去除IL-7中可能刺激免疫反應的T細胞表位，此類IL-7的實例描述於WO2006061219中。
本發明還關於包含本發明揭露的IL-7變體或突變體的任何融合蛋白，以及關於包含本發明揭露的IL-7變體或突變體的任何綴合物；IL-7變體或突變體可以藉由其N端或C端融合。IL-7變體或突變體可與肽、蛋白質(例如抗體及其片段和衍生物、抗體模擬物、細胞因子或細胞因子受體、腫瘤或病毒抗原、白蛋白或白蛋白結合蛋白)、聚合物(例如PEG)、化合物例如藥物(例如抗癌劑或抗病毒劑)、碳水化合物及核酸分子(例如siRNA、shRNA、反義物、Gapmer)等融合或綴合。
可與IL-7變體或突變體綴合或融合之分子的非窮舉列表包含：抗體，例如抗CD19、抗鈣網蛋白；抗腫瘤抗原；細胞因子或細胞因子受體，例如IL-15或IL-15R；延長IL-7變體半衰期的結構域，例如免疫球蛋白的Fc區或其一部分、白蛋白、結合白蛋白的多肽、Pro/Ala/ Ser(PAS)、人類絨毛膜促性腺激素β亞基的C端肽(CTP)、聚乙二醇(PEG)、長的非結構化胺基酸親水序列(XTEN) 、羥乙基澱粉(HES)、結合白蛋白的小分子及其組合；以及纖連蛋白結合肽。
包含IL-7的融合蛋白或綴合物的特定實例公開於例如WO19222294、WO19215510、WO19178362、WO19178364、WO19144309、WO19046313、WO18215937、WO18201047、WO18064611、WO17216223、US2018319858、WO17158436、WO16200219、WO05063820。
在一特定方面，IL-7變體或突變體可包含在包含結合部分的雙官能分子中。
結合部分
本發明的雙官能分子包含如本發明所揭露的IL-7變體的突變體以及包含結合部分(binding moiety)之額外的或第二實體。
應當理解，包含在雙官能分子中的結合部分不是介白素，尤其不是IL-7，也不是IL-7R。
如本文所用，用語“結合部分”是指具有與標靶結合之能力的任何部分，所述標靶例如肽、多肽、蛋白質、融合蛋白及抗體；較佳地，結合部分包含抗體或其抗原結合片段、以及抗體模擬物或模擬物。結合部分的標靶在下文中更具體地定義。
在一實施例中，結合部分選自抗體或其片段、以及抗體模擬物或模擬物。生物化學領域的技術人員熟悉抗體模擬物或模擬物，如G Gebauer and Skerra, 2009, Curr Opin Chem Biol 13(3): 245-255中所述。抗體模擬物的示例包含：親和體(也稱為Trinectins；Nygren, 2008, FEBS J, 275, 2668-2676)、CTLD(也稱為四聯菌素(Tetranectins)；Innovations Pharmac. Technol.(2006), 27-30)、adnectins(也稱為單抗；Meth. Mol. Biol., 352 (2007), 95-109)、anticalins(Drug Discovery Today(2005), 10, 23-33)、DARPins(ankyrins; Nat. Biotechnol.(2004), 22, 575-582)、avimers(Nat. Biotechnol.(2005), 23, 1556-1561)、微體(microbodies，FEBS J, (2007), 274, 86-95)、適體(aptamers，Expert. Opin. Biol. Ther.(2005), 5, 783-797)、Kunitz結構域(J. Pharmacol. Exp. Ther.(2006) 318, 803-809)、親和素(Trends. Biotechnol.(2005), 23, 514-522)、親和素(Krehenbrink et al, 2008, J. Mol. Biol. 383 (5): 1058–68)、alfabodies(Desmet, J.; et al, 2014, Nature Communications. 5: 5237)、fynomer(Grabulovski D; et al, 2007, J Biol Chem. 282 (5): 3196–3204)以及affimers(Avacta Life Sciences, Wetherby, UK)。
因此，結合部分可選自抗體或其抗體片段所組成之群組；較佳地，例如免疫球蛋白、scFv或VHH、Fab、單結構域抗體和模擬抗體；較佳地，例如親和體、CTLD、adnectin、anticalin、DARPins、親和體、微體、適體、Kunitz結構域、親和素、親和素、親和體、fynomer和affimer。
較佳地，結合部分是抗體或其抗體片段；甚至更佳地，結合部分是人類、人源化或嵌合抗體或其抗原結合片段。
結合部分的標靶
根據本發明，結合部分特異性結合免疫細胞表面上表達的標靶，尤其是僅表達或特異性表達於免疫細胞上的標靶。較佳地，結合部分不針對在腫瘤細胞上表達的標靶。
關於結合部分的“結合”能力，術語“結合”或“鍵結”是指識別並接觸另一種肽、多肽、蛋白質或分子的肽、多肽、蛋白質、融合蛋白、分子及抗體(包含抗體片段和抗體模擬物)。在一實施例中，其係指抗原-抗體類型的相互作用。術語“特異性結合”、“特異性地結合至”、“特異性的為”、“選擇性結合”及“選擇性的為”一特定靶標是指結合部分識別並結合特定靶標，但基本上不識別或結合樣品中的其他分子。舉例而言，特異性地(或優先地)與抗原結合的抗體係指相較與其他分子結合的抗體具有更高的親和力、親和力、更容易及/或持續時間更長之抗體。較佳地，術語“特異性結合”是指抗體與抗原之間的接觸具有等於或低於10-7
M的結合親和力。在某些方面，抗體以等於或低於10-8
M、10-9
M或10-10
M的親和力結合。
如本文所用，術語“靶標”是指碳水化合物、脂質、肽、多肽、蛋白質、抗原或表位，其被依據本發明的結合部分特異性識別或標靶並表達在免疫細胞的外表面上。關於靶標在免疫細胞表面上的表達，術語“表達”是指標靶，例如存在於或呈現在一細胞外表面的碳水化合物、脂質、肽、多肽、蛋白質、抗原或表位。術語“特異性表達”是指標靶在免疫細胞上表達，但基本上不由其他細胞類型表達，尤其是諸如腫瘤細胞。
在一實施例中，標靶在健康受試者或患有疾病，尤其是諸如癌症的受試者中由免疫細胞特異性表達，這意味著標靶在免疫細胞中具有比其他細胞更高的表達水平，或者總免疫細胞表達靶標的免疫細胞的比例高於總其他細胞表達靶標的其他細胞的比例；較佳地，表達水平或比例高於2、5、10、20、50或100倍。更具體地，可確定特定類型的免疫細胞，例如T細胞；更具體地為CD8+ T細胞、效應T細胞或衰竭T細胞，或在特定情況下，例如患有諸如癌症或感染之類的疾病的受試者。
如本文所用，“免疫細胞”是指參與先天性及適應性免疫的細胞，例如白血細胞(白血球)，其來源於骨髓中產生的造血幹細胞(HSC)；淋巴細胞(T細胞、B細胞、自然殺手(NK)細胞及自然殺手T細胞(NKT))，以及骨髓來源的細胞(嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞)。較佳地，所述免疫細胞可選字以下之非窮舉列表，包含：B細胞、T細胞(特別是CD4+ T細胞及CD8+ T細胞)、NK細胞、NKT細胞、APC細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞及單核細胞。
較佳地，結合部分特異性結合至一標靶表達的免疫細胞，所述免疫細胞選自B細胞、T細胞、自然殺手細胞、樹突細胞、單核細胞及先天淋巴細胞(innate lymphoid cell, ILC)。
甚至更佳地，免疫細胞是T細胞。如本文所用，“T細胞”或“T淋巴細胞”包含例如CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、T輔助1型T細胞、T輔助2型T細胞、T調節劑、T輔助17型T細胞及抑制性T細胞。在一非常特定的實施例中，免疫細胞是衰竭T細胞。
標靶可以是在免疫細胞，特別是T細胞的表面表達的受體。該受體可以是一抑制劑受體；或者，該受體可以是一活化受體。
一方面，靶標選自PD-1、CD28、CD80、CTLA-4、BTLA、TIGIT、CD160、CD40L、ICOS、CD27、OX40、4-1BB、GITR、HVEM、Tim-1、LFA-1、TIM3、CD39、CD30、NKG2D、LAG3、B7-1、2B4、DR3、CD101、CD44、SIRPG、CD28H、CD38、CXCR5、CD3、PDL2、CD4及CD8。該等標靶更具體地描述於下表D。
表D-標靶示例
| 名稱 | 官方名稱 | Uniprot 參考 |
| 2B4 | 自然殺手細胞2B4(NK細胞I型受體蛋白2B4，NKR2B4) (非MHC限制性殺傷相關蛋白) (SLAM家族成員4，SLAMF4) (訊息傳導傳導淋巴細胞活化分子4) (CD抗原CD244) | Q07763 |
| 4-1BB | 腫瘤壞死因子受體超家族成員9 (4-1BB配體受體，CD137) | Q07011 |
| BTLA | B和T淋巴細胞弱化子(B和T淋巴細胞相關蛋白) (CD抗原CD272) | Q7Z6A9 |
| CD101 | 免疫球蛋白超家族成員2，IgSF2(細胞表面醣蛋白V7) (含有Glu-Trp-Ile EWI基序的蛋白質101，EWI-101) (CD抗原CD101) | Q93033 |
| CD160 | CD160抗原(自然殺傷細胞受體BY55) | O95971 |
| CD27 | CD27抗原(CD27L受體) (T細胞活化抗原CD27) (T14) (腫瘤壞死因子受體超家族成員7) (CD抗原CD27) | P26842 |
| CD28 | T細胞特異性表面醣蛋白CD28(TP440 | P10747 |
| CD28H | 跨膜和含免疫球蛋白結構域的蛋白2(CD28同源物) (免疫球蛋白和富含脯氨酸的受體1，IGPR-1) | Q96BF3 |
| CD3 | T細胞表面醣蛋白CD3 | P07766 (CD3e) P04234 (CD3d) P09693 (CD3g) |
| CD30 | 腫瘤壞死因子配體超家族成員8(CD30配體，CD30-L) (CD抗原CD153) | P32971 |
| CD38 | ADP-核糖基環化酶/環狀ADP-核糖水解酶1 (ADPRC 1，cADPr水解酶1) | P28907 |
| CD39 | 外核苷三磷酸二磷酸水解酶-1(NTPDase 1，促細胞分裂酶，ATPDase 1或淋巴細胞活化抗原) | P49961 |
| CD4 | T細胞表面醣蛋白CD4 (T細胞表面抗原T4/Leu-3) | P01730 |
| CD40L | CD40配體(T細胞抗原Gp39，TNF相關活化蛋白，腫瘤壞死因子配體超家族成員5，CD154) | P29965 |
| CD44 | CD44抗原(Epican，細胞外基質受體III，GP90淋巴細胞歸巢/黏附受體，HUTCH-I，硫酸乙酰肝素蛋白聚醣，Hermes抗原，透明質酸受體，吞噬糖蛋白1，吞噬醣蛋白I) | P16070 |
| CD8 | T細胞表面醣蛋白CD8 | P01732 (CD8a) P10966 (CD8b) |
| CD80 | T淋巴細胞活化抗原CD80(活化B7-1抗原，BB1，CTLA-4反受體B7.1，B7) | P33681 |
| CTLA-4 | 細胞毒性T淋巴細胞蛋白4(細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4，CTLA-4) (CD抗原CD152) | P16410 |
| CXCR5 | C-X-C趨化因子受體5型(伯基特淋巴瘤受體1，單核細胞衍生受體15，CD185) | P32302 |
| DR3 | 死亡受體3(腫瘤壞死因子受體超家族成員25，WSL，Apo-3，LARD) | Q93038 |
| GITR | 腫瘤壞死因子受體超家族成員18(活化誘導型TNFR家族受體，糖皮質激素誘導的TNFR相關蛋白，CD357) | Q9Y5U5 |
| HVEM | 腫瘤壞死因子受體超家族成員14(皰疹病毒進入介質A，皰疹病毒進入介質A，HveA) (腫瘤壞死因子受體樣2，TR2) (CD抗原CD270) | Q92956 |
| ICOS | 誘導性T細胞共刺激物(活化誘導性淋巴細胞免疫介導分子CD278) | Q9Y6W8 |
| LAG3 | 淋巴細胞激活基因3蛋白，LAG-3(蛋白質FDC) (CD抗原CD223) | P18627 |
| LFA-1 | 白細胞黏附醣蛋白LFA-1α鏈(整合素α-L，CD11抗原樣家族成員A) | P20701 |
| NKG2D | NKG2-D type II integral membrane protein (Killer cell lectin-like receptor subfamily K member 1, NK cell receptor D, NKG2-D-activating NK receptor, CD314) | P26718 |
| OX40 | NKG2-D II型整合膜蛋白(Killer細胞凝集素樣受體亞家族K成員1，NK細胞受體D，NKG2-D活化NK受體，CD314) | P43489 |
| PD-1 | 程序性細胞死亡蛋白1(CD279) | Q15116 |
| PDL2 | 程序性細胞死亡1配體2，PD-1配體2，PD-L2，PDCD1配體2，程序性死亡配體2(Butyrophilin B7-DC，B7-DC) (CD抗原CD273) | Q9BQ51 |
| SIRPG | 訊息傳導調節蛋白γ，SIRP-γ(CD172抗原樣家族成員B) (訊息傳導調節蛋白beta-2，SIRP-b2，SIRP-beta-2) (CD抗原CD172g) | Q9P1W8 |
| TIGIT | 具有Ig和ITIM結構域的T細胞免疫受體(含V集和含免疫球蛋白的蛋白9) (含V集和跨膜結構域的蛋白3) | Q495A1 |
| Tim-1 | 甲型肝炎病毒細胞受體1(T細胞免疫球蛋白和含有黏蛋白結構域的蛋白1，腎臟損傷分子1，KIM-1，T細胞免疫球蛋白黏蛋白受體1，T細胞膜蛋白1，CD365) | Q96D42 |
| TIM3 | 甲型肝炎病毒細胞受體2，HAVcr-2(T細胞免疫球蛋白和含有粘蛋白結構域的蛋白3，TIMD-3) (T細胞免疫球蛋白粘蛋白受體3，TIM-3) (T細胞膜蛋白3) | Q8TDQ0 |
其後，在此方面，結合部分特異性結合至選自以下所組成之群組的標靶：PD-1、CD28、CD80、CTLA-4、BTLA、TIGIT、CD160、CD40L、ICOS、CD27、OX40、4-1BB、GITR、HVEM、Tim-1、LFA-1、TIM3、CD39、CD30、NKG2D、LAG3、B7-1、2B4、DR3、CD101、CD44、SIRPG、CD28H、CD38、CXCR5、CD3、PDL2、CD4及CD8。
在一特定方面，免疫細胞是衰竭T細胞，結合部分的靶標是在衰竭T細胞表面表達的衰竭因子；T細胞衰竭是T細胞功能喪失、增殖能力及細胞毒性潛能的狀態，最終導致其缺失。T細胞衰竭可由多種因素觸發，例如持續的抗原暴露或抑制性受體，抑制性受體包含PD-1、TIM3、CD244、CTLA-4、LAG-3、BTLA、TIGIT及CD160。較佳地，此種衰竭因子選自PD-1、TIM3、CD244、CTLA-4、LAG-3、BTLA、TIGIT及CD160。
在一較佳的實施例中，結合部分對標靶具有拮抗活性。
針對PD-1、TIM3、CD244、CTLA-4、LAG-3、BTLA、TIGIT及CD160的眾多抗體已在本領域中揭露。
幾種抗PD-1已經在臨床上得到批准，其他的仍在臨床開發中。例如，例如，抗PD1抗體可選自以下組成之群組：Pembrolizumab(也稱為Keytruda lambrolizumab, MK-3475)、Nivolumab(Opdivo, MDX-1106, BMS-936558, ONO-4538)、Pidilizumab(CT-011)、Cemiplimab(Libtayo)、Camrelizumab、AUNP12、AMP-224、AGEN-2034、BGB-A317(Tisleizumab)、PDR001(spartalizumab)、MK-3477、SCH-900475、PF-06801591、JNJ-63723283、genolimzumab(CBT-501)、LZM-009、BCD-100、SHR-1201、BAT-1306、AK-103(HX-008)、MEDI-0680(也稱為AMP-514)、MEDI0608、JS001(參閱Si-Yang Liu et al., J. Hematol. Oncol.10:136 (2017))、BI-754091、CBT-501、INCSHR1210(也稱為 SHR-1210)、TSR-042(也稱為ANB011)、GLS-010(也稱為WBP3055)、AM-0001(Armo)、STI-1110(參閱WO2014/194302)、AGEN2034(參閱WO2017/040790)、MGA012(參閱WO2017/19846)或IBI308(參閱WO2017/024465、WO2017/025016、WO2017/132825以及WO2017/133540)、單克隆抗體5C4、17D8、2D3、4H1、4A11、7D3及5F4(參閱WO2006/121168)。標靶PD-1的雙官能或雙特異性分子還已知例如RG7769(Roche)、XmAb20717(Xencor)、MEDI5752(AstraZeneca)、FS118(F-star)、SL-279252(Takeda)以及XmAb23104(Xencor)。
在一特定的實施例中，抗PD1抗體可為Pembrolizumab(也稱為Keytruda lambrolizumab, MK-3475)或Nivolumab(Opdivo, MDX-1106, BMS-936558, ONO-4538)。
還已知針對TIM3的抗體和標靶TIM3的雙官能或雙特異性分子的抗體，例如Sym023、TSR-022、MBG453、LY3321367、INCAGN02390、BGTB-A425、LY3321367、RG7769(Roche)。在一些實施例中，TFM-3抗體如國際專利申請公開號WO2013006490、WO2016/161270、WO2018/085469或WO2018/129553、WO2011/155607、U.S.8,552,156、EP2581113以及U.S2014/044728中所揭露。
還已知針對CTLA-4的抗體和標靶CTLA-4的雙官能或雙特異性分子的抗體，例如ipilimumab、tremelimumab、MK-1308、AGEN-1884、XmAb20717(Xencor)、MEDI5752(AstraZeneca)。抗CTLA-4抗體也揭露於WO18025178、WO19179388、WO19179391、WO19174603、WO19148444、WO19120232、WO19056281、WO19023482、WO18209701、WO18165895、WO18160536、WO18156250、WO18106862、WO18106864、WO18068182、WO18035710、WO18025178、WO17087588、WO16196237、WO16130898、WO16015675、WO12120125、WO09100140以及WO07008463。
還已知針對LAG-3的雙抗體和標靶LAG-3的雙官能或雙特異性分子，例如BMS-986016、IMP701、MGD012或MGD013(雙特異性PD-1及LAG-3抗體)。抗LAG-3抗體也揭露於WO2008132601、EP2320940、WO19152574。
針對BTLA的抗體在本領域中也是已知的，例如hu Mab8D5、hu Mab8A3、hu Mab21H6、hu Mab19A7或hu Mab4C7。目前針對患有末期惡性腫瘤的受試者正在進行針對BTLA的抗體TAB004的臨床試驗。抗BTLA抗體也揭露於WO08076560、WO10106051(例如BTLA8.2)、WO11014438(例如4C7)、WO17096017以及WO17144668(例如629.3)。
針對TIGIT的抗體也是本領域已知的，例如BMS-986207或AB154、BMS-986207、CPA.9.086、CHA.9.547.18、CPA.9.018、CPA.9.027、CPA.9.049、CPA.9.057、CPA.9.059、CPA.9.083、CPA.9.089、CPA.9.093、CPA.9.101、CPA.9.103、CHA.9.536.1、CHA.9.536.3、CHA.9.536.4、CHA.9.536.5、CHA.9.536.6、CHA.9.536.7、CHA.9.536.8、CHA.9.560.1、CHA.9.560.3、CHA.9.560.4、CHA.9.560.5、CHA.9.560.6、CHA.9.560.7、CHA.9.560.8、CHA.9.546.1、CHA.9.547.1、CHA.9.547.2、CHA.9.547.3、CHA.9.547.4、CHA.9.547.6、CHA.9.547.7、CHA.9.547.8、CHA.9.547.9、CHA.9.547.13、CHA.9.541.1、CHA.9.541.3、CHA.9.541.4、CHA.9.541.5、CHA.9.541.6、CHA.9.541.7，以及WO19232484中揭露的CHA.9.541.8。抗TIGIT抗體還揭露於WO16028656、WO16106302、WO16191643、WO17030823、WO17037707、WO17053748、WO17152088、WO18033798、WO18102536、WO18102746、WO18160704、WO18200430、WO18204363、WO19023504、WO19062832、WO19129221、WO19129261、WO19129261、WO19215728。
針對CD160的抗體也是本領域已知的，例如WO06015886中揭露的CL1-R2 CNCM I-3204，或WO10006071、WO10084158、WO18077926中揭露的其他抗體。
在一較佳方面，雙官能分子的結合部分是對PD-1、CTLA-4、BTLA、TIGIT、LAG3以及TIM3具有特異性的抗體、其片段或衍生物或模擬抗體。
在另一個特定方面，標靶是PD-1，且雙官能分子的結合部分是對PD-1特異的抗體、其片段或衍生物或模擬抗體。其後，在一特定實施例中，本發明的雙官能分子中包含的結合部分是抗PD1抗體或其抗原結合片段，較佳為人類、人源化或嵌合的抗PD1抗體或其抗原結合片段；較佳地，結合部分是PD-1的拮抗劑。因此，雙官能分子結合了IL-7變體或突變體對IL-7受體的作用以及對PD-1抑制作用的阻斷，且可能對T細胞，特別是衰竭T細胞，尤其是對TCR訊息傳導的活化具有協同作用。
在另一個特定方面，標靶是CTLA-4，且雙官能分子的結合部分是對CTLA-4具有特異性的抗體、其片段或衍生物或模擬抗體。其後，在一特定實施例中，本發明的雙官能分子中包含的結合部分是抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段，較佳為人類、人源化或嵌合的抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段；較佳地，結合部分是CTLA-4的拮抗劑。因此，雙官能分子結合了IL-7變體或突變體對IL-7受體的作用以及對CTLA-4抑制作用的阻斷，且可能對T細胞，特別是衰竭T細胞，尤其是對TCR訊息傳導的活化具有協同作用。
在另一個特定方面，標靶是BTLA，且雙官能分子的結合部分是對BTLA具有特異性的抗體、其片段或衍生物或模擬抗體。其後，在一特定實施例中，本發明的雙官能分子中包含的結合部分是抗BTLA抗體或其抗原結合片段，較佳為人類、人源化或嵌合的抗BTLA抗體或其抗原結合片段；較佳地，結合部分是BTLA的拮抗劑。因此，雙官能分子結合了IL-7變體或突變體對IL-7受體的作用以及對BTLA抑制作用的阻斷，且可能對T細胞，特別是衰竭T細胞，尤其是對TCR訊息傳導的活化具有協同作用。
在另一個特定方面，標靶是TIGIT，且雙官能分子的結合部分是對TIGIT具有特異性的抗體、其片段或衍生物或模擬抗體。其後，在一特定實施例中，本發明的雙官能分子中包含的結合部分是抗TIGIT抗體或其抗原結合片段，較佳為人類、人源化或嵌合的抗TIGIT抗體或其抗原結合片段；較佳地，結合部分是TIGIT的拮抗劑。因此，雙官能分子結合了IL-7變體或突變體對IL-7受體的作用以及對TIGIT抑制作用的阻斷，且可能對T細胞，特別是衰竭T細胞，尤其是對TCR訊息傳導的活化具有協同作用。
在另一個特定方面，標靶是LAG-3，且雙官能分子的結合部分是對LAG-3具有特異性的抗體、其片段或衍生物或模擬抗體。其後，在一特定實施例中，本發明的雙官能分子中包含的結合部分是抗LAG-3抗體或其抗原結合片段，較佳為人類、人源化或嵌合的抗LAG-3抗體或其抗原結合片段；較佳地，結合部分是LAG-3的拮抗劑。因此，雙官能分子結合了IL-7變體或突變體對IL-7受體的作用以及對LAG-3抑制作用的阻斷，且可能對T細胞，特別是衰竭T細胞，尤其是對TCR訊息傳導的活化具有協同作用。
在另一個特定方面，標靶是TIM3，且雙官能分子的結合部分是對TIM3具有特異性的抗體、其片段或衍生物或模擬抗體。其後，在一特定實施例中，本發明的雙官能分子中包含的結合部分是抗TIM3抗體或其抗原結合片段，較佳為人類、人源化或嵌合的抗TIM3抗體或其抗原結合片段；較佳地，結合部分是TIM3的拮抗劑。因此，雙官能分子結合了IL-7變體或突變體對IL-7受體的作用以及對TIM3抑制作用的阻斷，且可能對T細胞，特別是衰竭T細胞，尤其是對TCR訊息傳導的活化具有協同作用。
Fc
結構域
在本發明的一個特定方面，雙官能分子包含IL-7變體或突變體、結合部分以及Fc結構域。當該結合部分是抗體，特別是IgG免疫球蛋白時，Fc結構域可以是結合部分的一部分；然而，雙官能分子可具有包含Fc結構域的其他結構，例如，其可包含與抗體衍生物如scFv或雙抗體連接的Fc結構域。
改善本發明的雙官能分子之藥代動力學的一種方法是增加其半衰期血清持久性，從而允許更高的循環水平、更少的給藥頻率以及減少的劑量，其需求例如可藉由在本發明的雙官能分子中包含Fc結構域或其一部分來滿足。
接著，在一實施例中，本發明的雙官能分子，特別是結合部分，包含Fc結構域或其一部分。
較佳地，本發明的結合部分包含至少一部分免疫球蛋白恆定區(Fc)，通常是哺乳動物免疫球蛋白的恆定區，甚至更佳為嵌合的、人類的或人源化的免疫球蛋白；結合部分可包含免疫球蛋白的恆定區或恆定區的片段、類似物、變體、突變體或衍生物。如本領域技術人員眾所周知的，重鏈恆定域的IgG同種型的選擇集中於是否需要特定功能以及對合適的體內半衰期的需要。
在較佳的實施例中，結合部分中包含的Fc結構域或其片段包含衍生自人免疫球蛋白重鏈的重鏈恆定結構域，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其他類別。在另一方面，人類恆定結構域選自IgG1、IgG2、IgG2、IgG3及IgG4；較佳地，結合部分包含IgG1或IgG4重鏈恆定結構域。
在一實施例中，結合部分包含截斷的Fc區或Fc區的片段，在這樣的Fc片段中，恆定區包含CH2或CH3結構域。在另一實施例中，恆定區包含CH2和CH3結構域；或者，恆定區可包含鉸鏈區、CH2結構域及/或CH3結構域的全部或一部分。在一些實施例中，恆定區包含衍生自人類IgG4或IgG1重鏈的CH2及/或CH3結構域。
較佳地，恆定區域包含鉸鏈區域的全部或一部分，鉸鏈區可衍生自免疫球蛋白重鏈，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其他類別；較佳地，鉸鏈區衍生自人類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4；更佳地，鉸鏈區衍生自人類或人源化的IgG1或IgG4重鏈。
IgG1鉸鏈區具有三個半胱胺酸，其中兩個參與免疫球蛋白兩條重鏈之間的二硫鍵，這些相同的半胱胺酸允許在Fc部分之間形成有效且一致的二硫鍵。因此，本發明較佳的鉸鏈區衍生自IgG1，更佳地衍生自人類IgG1。在一些實施例中，人類IgG1鉸鏈區中的第一半胱胺酸突變為另一種胺基酸，較佳為絲胺酸。
已知IgG4的鉸鏈區不能有效地形成鏈間二硫鍵；然而，用於本發明的合適鉸鏈區可以衍生自IgG4鉸鏈區，較佳地包含突變以增強在重鏈衍生的部分之間正確形成二硫鍵(Angal S, et al. (1993) Mol. Immunol., 30:105-8)；更佳地，鉸鏈區衍生自人類IgG4重鏈。
對於標靶細胞表面分子的雙官能分子，尤其是免疫細胞上的分子需要消除效應子功能，還可能需要工程改造的Fc區以減少或增加抗體的效應子功能。
在某些實施例中，可將胺基酸修飾引入Fc區以產生Fc區變體。在某些實施例中，Fc區變體具有一些但非全部的效應子功能，此類抗體可能有用，例如在抗體的體內半衰期重要的應用中，但是某些效應子功能是不必要的或有害的。具有改變的效應子功能的多數取代或取代或缺失在本領域中是已知的。
在一實施例中，恆定區包含一種突變以降低對Fc受體的親和力或Fc效應子功能；舉例而言，恆定區可包含消除IgG重鏈恆定區內的醣基化位點的突變；較佳地，CH2結構域包含消除CH2結構域內的醣基化位點的突變。
在一個特定方面，Fc結構域被修飾以增加與FcRn的結合，從而增加雙功能分子的半衰期。在另一方面或又一方面，修飾Fc結構域以減少與FcγR的結合，從而減少ADCC或CDC，或增加與FcγR的結合，從而增加ADCC或CDC。
如WO01/58957中所述，Fc部分和非Fc部分的連接附近的胺基酸的改變可以顯著增加Fc融合蛋白的血清半衰期。因此，本發明的蛋白質或多肽的連接區可包含相對於免疫球蛋白重鍊和促紅細胞生成素的天然存在的序列而言較佳位於連接點的約10個胺基酸內的改變，這些胺基酸的改變可導致疏水性增加。在一個實施例中，恆定區衍生自IgG序列，其中C端賴胺酸殘基被替換；較佳地，將IgG序列的C端賴胺酸替換為非賴胺酸胺基酸，例如丙胺酸或亮胺酸以進一步增加血清半衰期。
在一實施例中，恆定區具有如下表E中所示包含CH2及/或CH3的突變體中之一者或其任何組合。
表E-合適的人類工程化Fc結構域抗體，重鏈恆定區中殘基的編號是根據EU編號(Edelman, G.M. et al., Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85 (1969); www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html#refs)
| 工程化Fc | 同種型 | 突變體 | FcR/C1q 結合 | 效應子功能 |
| hIgG1e1-Fc | IgG1 | T250Q/M428L | 與FcRn的結合增加 | 半衰期增加 |
| hIgG1e2-Fc | IgG1 | M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F | 與FcRn的結合增加 | 半衰期增加 |
| hIgG1e3-Fc | IgG1 | E233P/L234V/L235A/G236A + A327G/A330S/P331S | 與FcγRI的結合減少 | 減少ADCC和CDC |
| hIgG1e4-Fc | IgG1 | E333A | 與FcγRIIIa的結合增加 | 增加ADCC和CDC |
| hIgG1e5-Fc | IgG1 | S239D/A330L/I332E | 與FcγRIIIa的結合增加 | 增加ADCC |
| hIgG1e6-Fc | IgG1 | P257I/Q311 | 與FcRn的結合增加 | 半衰期不變 |
| hIgG1e7-Fc | IgG1 | K326W/E333S | 與C1q的結合增加 | CDC增加 |
| hIgG1e9-Fc | IgG1 | S239D/I332E/G236A | FcγRIIa/FcγRIIb的比例增加 | 巨噬細胞吞噬作用增加 |
| hIgG1e9-Fc | IgG1 | N297A | 與FcγRI的結合減少 | 減少ADCC和CDC |
| hIgG1e9-Fc | IgG1 | LALA (L234A/L235A) | 與FcγRI的結合減少 | 減少ADCC和CDC |
| hIgG1e10-Fc | IgG1 | N297A + YTE (N298A + M252Y/S254T/T256E) | 與FcγRI的結合減少 與FcRn的結合增加 | 減少ADCC和CDC 半衰期增加 |
| hIgG1e11-Fc | IgG1 | K322A | 與C1qe的結合減少 | 減少CDC |
| hIgG1e12-Fc | IgG1 | N297A + YTE (N298A + M252Y/S254T/T256E) + K444A | 減少ADCC和CDC 半衰期增加 抗體C端賴胺酸的裂解 | |
| hIgG4e1-Fc | IgG4 | S228P | - | 減少Fab臂交換 |
| hIgG4e1-Fc | IgG4 | LALA (L234A/L235A) | 與FcRn的結合增加 | 半衰期增加 |
| hIgG4e2-Fc | IgG4 | S228P+ YTE (S228P + M252Y/S254T/T256E) | 與FcRn的結合增加 | 減少Fab臂交換 半衰期增加 |
| hIgG4e3-Fc | IgG4 | N297A + YTE (N298A + M252Y/S254T/T256E) + K444A | 減少ADCC和CDC 半衰期增加 抗體C端賴胺酸的裂解 |
在一個特定方面，雙官能分子較佳地於結合部分包含人類IgG1重鏈恆定結構域或IgG1 Fc結構域，任選地具有選自由以下組成之群組的取代或其組合：T250Q/M428L、M252Y/S254T/T256E+H433K/N434F、E233P/L234V/L235A/G236A+A327G/A330S/P331S、E333A、S239D/A330L/I332E、P257I/Q311、K326W/E333S、S239D/I332E/G236A、N297A、L234A/L235A、N297A+M252Y/S254T/T256E、K322A以及K444A；較佳地由N297A與任選地M252Y/S254T/T256E以及L234A/L235A之組合所組成。
在另一方面，結合部分包含人類IgG4重鏈恆定結構域或人類IgG4Fc結構域，任選地具有選自由以下組成之群組的取代或其組合：S228P、L234A/L235A、S228P+M252Y/S254T/T256E以及K444A。甚至更佳地，雙官能分子較佳地為結合部分包含具有穩定IgG4的S228P的IgG4 Fc區。
人類IgG的所有亞類均帶有抗體重鏈(K444)的C端賴胺酸殘基，容易在循環中裂解，血液中的這種裂解可藉由釋放連接的IL-7與IgG來損害或降低雙官能分子的生物活性。為了解決這個問題，可以用丙胺酸取代IgG結構域中的K444胺基酸以減少蛋白水解裂解，此為抗體通常使用的突變。接著，在一實施例中，當結合部分是抗體時，該抗體包含至少一個由K444A組成的另外的胺基酸置換。
在一實施例中，當結合部分是抗體時，該抗體在IgG的C端結構域包含另外的半胱胺酸殘基以產生另外的二硫鍵，並可能限制雙官能分子的柔性。
在一實施例中，結合部分包含抗體，在這樣的實施例中，這樣的抗體具有SEQ ID NO：39或52的重鏈恆定結構域及/或SEQ ID NO：40的輕鏈恆定結構域；尤其是SEQ ID NO：39或52的重鏈恆定域及SEQ ID NO：40的輕鏈恆定域，特別是如下表F中所述的。
在一較佳實施例中，結合部分包含抗hPD1抗體，其具有SEQ ID NO：52的重鏈恆定結構域及/或SEQ ID NO：40的輕鏈恆定結構域，尤其是SEQ ID NO：52的重鏈恆定結構域及SEQ ID NO：40的輕鏈恆定結構域。
表F-適用於本發明之人源化抗體的重鏈恆定結構域和輕鏈恆定結構域的示例。
| 重鏈恆定域(IgG4m-S228P) SEQ ID NO：39 | ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| 輕鏈恆定域(CLkappa) SEQ ID NO：40 | RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
| 重鏈恆定域(IgG1m-N298A) SEQ ID NO：52 | ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
胜肽連接子
在一個特定的方面，本發明的雙官能分子進一步包含連接結合部分及IL-7m的胜肽連接子。胜肽連接子通常具有足夠的長度和柔性，以確保IL-7m以及與連接子之間連接的結合部分在空間上具有足夠的自由度以發揮其功能。
在本發明的一方面，結合部分較佳為藉由胜肽連接子與IL-7連接。如本文所用，術語“連接子”是指連接IL-7m及結合部分的至少一個胺基酸的序列，這樣的連接子對於防止位阻(hindrances)可能是有用的；連接子的長度通常為3-44個胺基酸殘基；較佳地，連接子具有3-30個氨基酸殘基。在一些實施例中，連接子具有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24 ，25、26、27、28、29或30個胺基酸殘基。
連接子序列可以是天然存在的序列或非天然存在的序列，如用於治療目的，則該連接子較佳地在對其施用之雙官能分子的受試者中是非免疫原性的。一有用的連接子序列群組係如WO96/34103及WO94/04678中所述之衍生自重鏈抗體的鉸鏈區的連接子，其他實施例係為聚丙胺酸連接子序列。連接子序列的進一步較佳實施例是不同長度的Gly/Ser連接子，包含：(Gly4Ser)4
、(Gly4Ser)3
、(Gly4Ser)2、Gly4Ser、Gly3Ser、Gly3、Gly2ser以及(Gly3Ser2)3
，尤其是(Gly4Ser)3
；較佳地，連接子選自(Gly4Ser)4
、(Gly4Ser)3
以及(Gly3Ser2)3
；甚至更佳地，連接子是(GGGGS)3
。
在一實施例中，雙官能分子中包含的連接子選自以下組成之群組：(Gly4Ser)4
、(Gly4Ser)3
、(Gly4Ser)2
、Gly4Ser、Gly3Ser、Gly3、Gly2ser及(Gly3Ser2)3
，較佳為(Gly4Ser)3
；較佳地，連接子選自(Gly4Ser)4
、(Gly4Ser)3
以及(Gly3Ser2)3
。
雙官能分子
本發明特別提供了一種雙官能分子，其包含IL-7m、結合部分、任選地包含Fc片段以及任選地如上所述的胜肽連接子。較佳地，雙官能分子包含或由前文所述的IL-7m組成，結合部分較佳地藉由如前述的胜肽連接子與IL-7共價綴合(例如藉由基因融合或化學耦合)。
較佳地，IL-7m與結合部分係為共價的、直接的或非共價的(例如藉由連接子)及/或化學的、酶促的或遺傳的方式綴合；考慮到結合部分的化學性質，可以藉由本領域已知的任何可接受的鍵結方式進行綴合。在這方面，耦合可以因此藉由一或多個共價鍵、離子鍵、氫鍵、疏水性或凡得瓦氏鍵、可裂解的或不可裂解的在生理介質或在細胞內進行。
較佳地，化學綴合可以藉由暴露的巰基(Cys)、親和標籤(例如6組胺酸、Flag標籤、Strep標籤、SpyCatcher等) 附著於結合部分或IL7-m，或摻入非天然胺基酸或用於鍵擊化學(click chemistry)綴合的化合物來進行。
在一較佳的實施例中，藉由遺傳融合(即藉由在合適的系統中表達編碼結合部分的核酸建構體及作為遺傳融合的IL-7)獲得綴合。
另一方面，本發明的特徵係在於一種融合蛋白，其包含包含免疫球蛋白(Ig)鏈，特別是Fc結構域的第一部分，以及包含介白素7(IL-7)的第二部分。
在一實施例中，本發明係關於一種包含與IL-7m融合之結合部分的雙官能分子。較佳地，在這樣的融合分子中，結合部分是抗體，其中抗體的鏈例如輕鏈或重鏈，較佳地為重鏈；甚至更佳地重鏈或輕鏈的C端與IL-7m連接；較佳地，任選地藉由胜肽連接子連接至IL-7m的N端。
在一個特定的方面，本發明係關於一種包含抗體或其抗原結合片段以及IL-7m的雙官能分子，其中IL-7m連接至所述抗體的重鏈的C端(例如，重鏈恆定結構域的C端)，較佳地藉由胜肽連接子連接。
較佳地，重鏈，較佳地為抗體重鏈的C端，藉由柔性的(Gly4Ser)3
連接子遺傳融合至IL-7m的N端。在融合連接處，可將抗體重鏈的C端賴胺酸殘基突變為丙胺酸以減少蛋白水解裂解(即突變K444A)。
在一實施例中，本發明的雙官能分子包含一或多個IL-7m分子；較佳地，本發明的雙官能分子可包含1、2、3或4個IL-7m分子；較佳地，雙官能分子可僅包含一個IL-7分子，該IL-7分子僅與抗體的一條輕鏈或重鏈連接。較佳地，雙官能分子可僅包含一個IL-7m分子，較佳地僅與抗體的一條重鏈連接，更佳地與康體的Fc結構域的C端連接。雙官能分子還可包含兩個IL-7m分子，其與抗體的輕鏈或重鏈連接。雙官能分子還可包含兩個IL-7m分子，第一個連接至抗體的輕鏈，且第二個連接至抗體的重鏈。
在一實施例中，本發明的雙官能分子包含或由以下組成：
(a)如前文所述免疫細胞表面表達的標靶特異性結合之結合部分，其綴合至
(b)與包含SEQ ID NO：1所示胺基酸序列或由其組成的野生型人類IL-7(wth-IL-7)具有至少75%一致性的IL-7m，此類IL-7變體包含至少一個胺基酸突變，其中i)與wth-IL-7對IL-7R的親和力相比，降低了IL-7變體對IL-7受體(IL-7R)的親和力，以及ii) 與包含wth-IL-7的雙官能分子相比，改善了包含IL-7變體的雙官能分子的藥代動力學。
較佳地，至少一種胺基酸突變如前文在“IL-7突變體”段落中所述。
較佳地，本發明的雙官能分子包含或由以下組成：
(a)如前文所述免疫細胞表面表達的標靶特異性結合之結合部分，其綴合至
(b)與包含SEQ ID NO：1所示胺基酸序列或由其組成的野生型人類IL-7(wth-IL-7)具有至少75%一致性的IL-7m，此類IL-7變體包含至少一種選自以下的突變：(i)C2S-C141S和C47S-C92S、C2S-C141S和C34S-C129S或C47S-C92S和C34S-C129S；(ii)W142H、W142F或W142Y、(iii)D74E、D74Q或D74N，較佳為D74E或D74Q；(iv) Q11E、Y12F、M17L、Q22E及/或K81R；或其任意組合。
較佳地，這樣的突變體i)與wth-IL-7對IL-7R的親和力相比，降低了IL-7變體對IL-7受體(IL-7R)的親和力，以及ii)與包含wth-IL-7的雙官能分子相比，改善了包含IL-7變體的雙官能分子的藥代動力學。更佳地，這樣的突變體i)與wth-IL-7對IL-7R的親和力相比，降低了IL-7變體對IL-7受體(IL-7R)的親和力，ii)保留活化IL-7R的能力；以及iii)與包含wth-IL-7的雙官能分子相比，改善了包含IL-7變體的雙官能分子的藥代動力學。
在一個特定的方面，在免疫細胞表面表達的標靶是在T細胞表面表達的衰竭因子。
較佳地，結合部分是抗體或其抗體片段。
較佳地，所述結合部分藉由遺傳融合與IL-7m綴合，且所述雙官能分子任選地包含至少一個將IL-7m的N端連接至所述抗體之重鏈C端的胜肽連接子，所述胜肽連接子較佳選自以下組成之群組：(GGGGS)3
、(GGGGS)4
、(GGGGS)2
、GGGGS、GGGS、GGG、GGS以及(GGGS)3
，甚至更佳地為(GGGGS)3
。
較佳地，本發明的雙官能分子是融合蛋白，其包含或由以下組成：
(a)如前文所述之特異性結合在免疫細胞表面表達的標靶的抗體或其抗體片段，較佳地為T細胞；
(b)與包含SEQ ID NO：1所示胺基酸序列或由其組成的野生型人類IL-7(wth-IL-7)具有至少75%一致性的IL-7m，此類IL-7變體包含以下的胺基酸置換：(i)C2S-C141S和C47S-C92S、C2S-C141S和C34S-C129S或C47S-C92S和C34S-C129S；(ii) W142H、W142F或W142Y；(iii)D74E、D74Q或D74N，較佳為D74E或D74Q；(iv) Q11E、Y12F、M17L、Q22E及/或K81R；或其任意組合，以及
(c)任選地選自以下組成之群組的胜肽連接子：(GGGGS)3
、(GGGGS)4
、(GGGGS)2
、GGGGS、GGGS、GGG、GGS以及(GGGS)3
，較佳地為(GGGGS)3
。
較佳地，所述抗體是選自以下針對標靶的抗體：PD-1、CD28、CD80、CTLA-4、BTLA、TIGIT、CD160、CD40L、ICOS、CD27、OX40、4-1BB、GITR、HVEM、Tim-1、LFA-1、TIM3、CD39、CD30、NKG2D、LAG3、B7-1、2B4、DR3、CD101、CD44、SIRPG、CD28H、CD38、CXCR5、CD3、PDL2、CD4以及CD8，較佳地為PD-1、TIM3、CD244、LAG-3、BTLA、TIGIT以及CD160。
較佳地，抗體或其抗體片段具有IgG1或IgG4 Fc結構域。
另一方面，抗體或其抗體片段具有IgG1 Fc結構域，任選地具有選自由以下組成之群組的取代或其組合：K444A、T250Q/M428L、M252Y/S254T/T256E+H433K/N434F、E233P/L234V/L235A/G236A+A327G/A330S/P331S、E333A、 S239D/A330L/I332E、P257I/Q311、K326W/E333S、S239D/I332E/G236A、N297A、L234A/L235A、N297A+M252Y/S254T/T256E以及K322A；較佳地，由N297A與任選地M252Y/S254T/T256E以及L234A/L235A組合所組成；甚至更佳地具有如前文所述的N297A突變的IgG1 Fc結構域。
令人驚訝地，發明人觀察到，相較於與具有IgG4重鏈恆定結構域的相同分子，具有IgG1種鏈恆定結構域的雙官能分子具有改善IL-7變體(pSTAT5訊息傳導、協同作用及CD127結合)的活性。此種改善係為IL-7突變體所特有的，而野生型IL-7尚未觀察到。此外，在抗體及IL-7之間使用長連接子如(GGGGS)3
可最大化IL-7變體的活性(pSTAT訊息傳導及CD127結合)。
因此，本發明更具體地關於一種雙官能分子，其中特異性結合在免疫細胞表面表達的標靶之前文所述的抗體或其抗體片段，較佳地為T細胞，更佳地標靶選自以下所組成之群組：PD-1、CD28、CD80、CTLA-4、BTLA、TIGIT、CD160、CD40L、ICOS、CD27、OX40、4-1BB、GITR、HVEM、Tim-1、LFA-1、TIM3、CD39、CD30、NKG2D、LAG3、B7-1、2B4、DR3、CD101、CD44、SIRPG、CD28H、CD38、CXCR5、CD3、PDL2、CD4以及CD8，較佳地為PD-1、TIM3、CD244、LAG-3、BTLA、TIGIT以及CD160；且所述抗體或其抗體片段具有IgG1 Fc結構域，任選地具有選自由以下組成之群組的取代或其組合：T250Q/M428L、M252Y/S254T/T256E+H433K/N434F、E233P/L234V/L235A/G236A+A327G/A330S/P331S、E333A、 S239D/A330L/I332E、P257I/Q311、K326W/E333S、S239D/I332E/G236A、N297A、L234A/L235A、N297A+M252Y/S254T/T256E、K322A以及K444A；較佳地，由N297A與任選地M252Y/S254T/T256E以及L234A/L235A組合所組成；甚至更佳地具有如前文所述的N297A突變的IgG1 Fc結構域。較佳地，所述抗體或其抗體片段藉由選自以下組成之群組的連接子與IL-7或其變體連接：(GGGGS)3
、(GGGGS)4
以及(GGGS)3
，更佳地為(GGGGS)3
。較佳地，IL-7變體包含選自以下組成之群組的一組胺基酸置換：C2S-C141S和C47S-C92S、C2S-C141S和C34S-C129S、C47S-C92S和C34S-C129S、W142H、W142F、W142Y、D74E、D74Q以及D74N；更佳地，IL-7變體包含選自以下組成之群組的一組胺基酸置換：C2S-C141S和C47S-C92S、C2S-C141S和C34S-C129S、W142H、W142F、W142Y、D74E、D74Q以及D74N；又更佳地，IL-7變體包含選自以下組成之群組的一組胺基酸置換：C2S-C141S和C47S-C92S、C2S-C141S和C34S-C129S、W142H以及D74E。
在另一方面，所述抗體或其抗體片段具有IgG4 Fc結構域，任選地具有選自由以下組成之群組的取代或其組合：K444A、S228P、L234A/L235A、S228P+M252Y/S254T/T256E，甚至更佳地具有如前文所述S228P突變的IgG4 Fc結構域。
在一個特定的方面，本發明的雙官能分子是融合蛋白，其包含或由以下組成：
(a)如前文所述之特異性結合在免疫細胞表面表達的標靶的抗體或其抗體片段，較佳地為T細胞；更佳地標靶選自以下所組成之群組：PD-1、CD28、CD80、CTLA-4、BTLA、TIGIT、CD160、CD40L、ICOS、CD27、OX40、4-1BB、GITR、HVEM、Tim-1、LFA-1、TIM3、CD39、CD30、NKG2D、LAG3、B7-1、2B4、DR3、CD101、CD44、SIRPG、CD28H、CD38、CXCR5、CD3、PDL2、CD4以及CD8，較佳地為PD-1、TIM3、CD244、LAG-3、BTLA、TIGIT以及CD160；
(b)與包含SEQ ID NO：1所示胺基酸序列或由其組成的野生型人類IL-7(wth-IL-7)具有至少75%一致性的IL-7m，此類IL-7變體包含以下的胺基酸置換：(i)C2S-C141S和C47S-C92S、C2S-C141S和C34S-C129S或C47S-C92S和C34S-C129S；(ii) W142H、W142F或W142Y；(iii)D74E、D74Q或D74N，較佳地為D74E或D74Q；(iv) Q11E、Y12F、M17L、Q22E及/或K81R；或其任意組合，以及
(c)任選地選自以下組成之群組的胜肽連接子：(GGGGS)3
、(GGGGS)4
、(GGGGS)2
、GGGS、GGG、GGS以及(GGGS)3
，較佳地為(GGGGS)3
。
在該方面的一較佳實施例中，所述抗體或其抗體片段具有IgG1 Fc結構域，其任選地選自由以下組成之群組的取代或其組合：T250Q/M428L、M252Y/S254T/T256E+H433K/N434F、E233P/L234V/L235A/G236A+A327G/A330S/P331S、E333A、 S239D/A330L/I332E、P257I/Q311、K326W/E333S、S239D/I332E/G236A、N297A、L234A/L235A、N297A+M252Y/S254T/T256E、K322A以及K444A；較佳地，由N297A與任選地M252Y/S254T/T256E以及L234A/L235A組合所組成；甚至更佳地具有如前文所述的N297A突變的IgG1 Fc結構域。
或者，本發明的雙官能分子是融合蛋白，其包含或由以下組成：
(a)如前文所述之特異性結合在免疫細胞表面表達的標靶的抗體或其抗體片段，較佳地為T細胞；更佳地標靶選自以下所組成之群組：PD-1、CD28、CD80、CTLA-4、BTLA、TIGIT、CD160、CD40L、ICOS、CD27、OX40、4-1BB、GITR、HVEM、Tim-1、LFA-1、TIM3、CD39、CD30、NKG2D、LAG3、B7-1、2B4、DR3、CD101、CD44、SIRPG、CD28H、CD38、CXCR5、CD3、PDL2、CD4以及CD8，較佳地為PD-1、TIM3、CD244、LAG-3、BTLA、TIGIT以及CD160；
(b)與包含SEQ ID NO：1所示胺基酸序列或由其組成的野生型人類IL-7(wth-IL-7)具有至少75%一致性的IL-7m，此類IL-7變體包含以下的胺基酸置換：W142H、W142F或W142Y，較佳地為W142H；以及
(c)任選地選自以下組成之群組的胜肽連接子：(GGGGS)3
、(GGGGS)4
、(GGGGS)2
、GGGGS、GGGS、GGG、GGS以及(GGGS)3
，較佳地為(GGGGS)3
。
較佳地，所述抗體或其抗體片段具有IgG1或IgG4 Fc結構域，任選地具有前文所述之取代。
在該方面的一較佳實施例中，所述抗體或其抗體片段具有IgG1 Fc結構域，其任選地選自由以下組成之群組的取代或其組合：T250Q/M428L、M252Y/S254T/T256E+H433K/N434F、E233P/L234V/L235A/G236A+A327G/A330S/P331S、E333A、 S239D/A330L/I332E、P257I/Q311、K326W/E333S、S239D/I332E/G236A、N297A、L234A/L235A、N297A+M252Y/S254T/T256E、K322A以及K444A；較佳地，由N297A與任選地M252Y/S254T/T256E以及L234A/L235A組合所組成；甚至更佳地具有如前文所述的N297A突變的IgG1 Fc結構域。
或者，本發明的雙官能分子包含或由以下組成：
(a)如前文所述之特異性結合在免疫細胞表面表達的標靶的抗體或其抗體片段，較佳地為T細胞；更佳地標靶選自以下所組成之群組：PD-1、CD28、CD80、CTLA-4、BTLA、TIGIT、CD160、CD40L、ICOS、CD27、OX40、4-1BB、GITR、HVEM、Tim-1、LFA-1、TIM3、CD39、CD30、NKG2D、LAG3、B7-1、2B4、DR3、CD101、CD44、SIRPG、CD28H、CD38、CXCR5、CD3、PDL2、CD4以及CD8，較佳地為PD-1、TIM3、CD244、LAG-3、BTLA、TIGIT以及CD160；
(b)與包含SEQ ID NO：1所示胺基酸序列或由其組成的野生型人類IL-7(wth-IL-7)具有至少75%一致性的IL-7m，此類IL-7變體包含以下的胺基酸置換：D74E、D74Q或D74N，較佳地為D74E；以及
(c)任選地選自以下組成之群組的胜肽連接子：(GGGGS)3
、(GGGGS)4
、(GGGGS)2
、GGGGS、GGGS、GGG、GGS以及(GGGS)3
，較佳地為(GGGGS)3
。
較佳地，所述抗體或其抗體片段具有IgG1或IgG4 Fc結構域，任選地具有前文所述之取代。
在該方面的一較佳實施例中，所述抗體或其抗體片段具有IgG1 Fc結構域，其任選地選自由以下組成之群組的取代或其組合：T250Q/M428L、M252Y/S254T/T256E+H433K/N434F、E233P/L234V/L235A/G236A+A327G/A330S/P331S、E333A、 S239D/A330L/I332E、P257I/Q311、K326W/E333S、S239D/I332E/G236A、N297A、L234A/L235A、N297A+M252Y/S254T/T256E、K322A以及K444A；較佳地，由N297A與任選地M252Y/S254T/T256E以及L234A/L235A組合所組成；甚至更佳地具有如前文所述的N297A突變的IgG1 Fc結構域。
或者，本發明的雙官能分子包含或由以下組成：
(a)特異性結合PD-1的抗PD-1抗體或其抗體片段；
(b) 與野生型人IL-7(wth-IL-7)具有至少75%一致性的IL-7m，其包含或由SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列組成，此類IL-7變體包含以下的胺基酸置換：D74E、W142H及/或C2S-C141S+C47S-C92S；以及
(c)任選地選自以下組成之群組的胜肽連接子：(GGGGS)3
、(GGGGS)4
、(GGGGS)2
、GGGGS、GGGS、GGG、GGS以及(GGGS)3
，較佳地為(GGGGS)3
。
較佳地，所述抗體或其抗體片段具有IgG1或IgG4 Fc結構域，任選地具有前文所述之置換。
較佳地，抗體重鏈的C端係經由柔性連接子，較佳地為(Gly4Ser)3遺傳融合至IL-7m的N端。在融合連接處，抗體重鏈的C端賴胺酸殘基(即K444)可突變為丙胺酸以減少蛋白水解裂解。
任選地，雙官能分子可進一步包含額外的部分，例如其他細胞因子或其他結合部分。
在一特定方面，分子具有二聚體Fc結構域，在其上連接1個IL-7變體及1個抗原結合結構域。在另一特定方面，所述分子具有二聚體Fc結構域，在其上連接了1個IL-7變體及2個抗原結合結構域。抗原結合結構域與如本發明所揭露之在免疫細胞表面上特異性表達的任何標靶結合。更佳地，所述標靶可選自以下所組成之群組：PD-1、CD28、CD80、CTLA-4、BTLA、TIGIT、CD160、CD40L、ICOS、CD27、OX40、4-1BB、GITR、HVEM、Tim-1、LFA-1、TIM3、CD39、CD30、NKG2D、LAG3、B7-1、2B4、DR3、CD101、CD44、SIRPG、CD28H、CD38、CXCR5、CD3、PDL2、CD4以及CD8；較佳地為PD-1、CTLA-4、BTLA、TIGIT、LAG3以及TIM3；更佳地，抗原結合結構域與PD-1結合。
在一特定方面，所述分子包含第一單體，所述第一單體包含任選地經由胜肽連接子共價連接至第一Fc鏈的抗原結合結構域，所述第一Fc鏈任選地經由胜肽連接子共價連接至IL-7變體，包含互補的第二Fc鏈的第二單體，所述第二Fc鏈較佳地沒有抗原結合結構域及/或IL-7變體，所述第一及第二Fc鏈形成二聚體Fc結構域；任選地，二聚體Fc結構域是異二聚體Fc結構域。更佳地，所述分子包含第一單體，所述第一單體包含任選地藉由胜肽連接子與第一異二聚體Fc鏈的N端共價連接的抗原結合結構域，所述第一異二聚體Fc鏈透過其C端任選地藉由胜肽連接子與IL-7變體共價連接；以及第二單體，所述第二單體包含沒有抗原結合結構域的互補第二異二聚Fc鏈；任選地，所述第二單體包含不含IL-7變體，較佳地不含任何其他分子的互補第二異二聚Fc鏈；任選地，所述第二單體包含與IL-7變體共價連接的互補第二異二聚Fc鏈，所述互補第二異二聚體Fc鏈任選地透過其C端任選地藉由胜肽連接子與IL-7變體的N端共價連接。更佳地，所述分子包含第一單體，所述第一單體包含透過其C端任選地藉由胜肽連接子與第一異二聚體Fc鏈的N端共價連接的抗原結合結構域，所述第一異二聚體Fc鏈透過其C端任選地藉由胜肽連接子與IL-7變體的N端共價連接；以及第二單體，所述第二單體包含不含抗原結合結構域及IL-7變體，較佳地不含任何其他分子的互補第二異二聚體Fc鏈。
在另一特定方面，所述分子包含第一單體，所述第一單體包含透過其C端任選地藉由胜肽連接子與第一異二聚體Fc鏈的N端共價連接的抗原結合結構域，所述第一異二聚體Fc鏈透過其C端任選地藉由胜肽連接子與IL-7變體的N端共價連接；以及第二單體，所述第二單體包含不含抗原結合結構域並與IL-7共體共價連接的互補第二異二聚體Fc鏈，任選地，所述互補第二異二聚體Fc鏈透過其C端任選地藉由胜肽連接子與IL-7變體的N端共價連接。任選地，所述互補第二異二聚體Fc鏈係為透過其C端任選地藉由胜肽連接子與IL-7變體的N端共價連接。
在另一方面，所述分子包含第一單體，所述第一單體包含任選地藉由胜肽連接子與第一Fc鏈共價連接的抗原結合結構域，所述第一Fc鏈任選地不含IL-7變體；以及第二單體，所述第二單體包含不含抗原結合結構域的互補第二Fc鏈，所述互補第二Fc鏈任選地藉由胜肽連接子與IL-7變體共價連接，所述第一及第二Fc鏈形成二聚體Fc結構域。任選地，所述二聚體Fc結構域係為異二聚體Fc結構域。較佳地，所述分子包含第一單體，所述第一單體包含任選地藉由胜肽連接子共價連接至第一異二聚Fc鏈的N端的抗原結合結構域，所述第一異二聚Fc鏈不含IL-7變體；以及第二單體，所述第二單體包含不含抗原結合結構域的互補第二Fc鏈，所述互補第二Fc鏈透過其C端任選地藉由胜肽連接子與IL-7變體共價連接。更佳地，所述分子包含第一單體，所述第一單體包含透過其C端任選地藉由胜肽連接子與第一異二聚體Fc鏈的N端共價連接的抗原結合結構域，所述第一Fc鏈不含IL-7變體；以及第二單體，所述第二單體包含不含抗原結合結構域的互補第二異二聚體Fc鏈，所述互補第二異二聚體Fc鏈透過其C端任選地藉由胜肽連接子與IL-7變體的N端共價連接。
在另一特定方面，所述分子包含第一單體，所述第一單體包含任選地藉由胜肽連接子共價連接至第一Fc鏈，所述第一Fc鏈任選地藉由胜肽連接子與IL-7共價連接；以及第二單體，所述第二單體包含不含IL-7變體並與抗原結合結構域連接的互補第二Fc鏈。任選地，所述二聚體Fc結構域係為異二聚體Fc結構域。較佳地，所述分子包含第一單體，所述第一單體包含任選地藉由胜肽連接子與第一異二聚體Fc鏈的N端共價連接的抗原結合結構域，所述第一異二聚體Fc鏈透過其C端任選地藉由胜肽連接子與IL-7變體共價連接；以及第二單體，所述第二單體包含不含IL-7變體的互補第二異二聚Fc鏈，且包含任選地藉由胜肽連接子與互補第二異二聚Fc鏈的N端共價連接的抗原結合結構域。更佳地，所述分子包含第一單體，所述第一單體包含透過其C端任選地藉由胜肽連接子與第一異二聚Fc鏈的N端共價連接的抗原結合結構域，所述第一異二聚Fc鏈透過其C端任選地藉由胜肽連接子與IL-7變體的N端共價連接；以及第二單體，所述第二單體包含不含IL-7變體的互補第二異二聚Fc鏈，且包含透過其C端任選地藉由胜肽連接子與互補第二異二聚Fc鏈的N端共價連接的抗原結合結構域。
如果所述連接子存在時，則可在本發明揭露之連接子中選擇。
較佳地，二個單體各自包含一條Fc鏈，所述Fc鏈可形成二聚Fc結構域。
另一方面，二聚體Fc融合蛋白是同種型二聚體Fc融合蛋白。又一方面，二聚體Fc融合蛋白是異二聚體Fc融合蛋白。
更具體地，Fc結構域是異二聚體Fc結構域；異二聚體Fc結構域是藉由改變每個單體的胺基酸序列製成的。異二聚體Fc結構域依賴於在每條鏈上不同的恆定區中的胺基酸變體，以促進異二聚體形成及/或使得與同種型二聚體相比更易於純化異二聚體。有許多機制可用於產生本發明的異二聚體。此外，如本領域技術人員可理解的，這些機制可以結合以確保高度異二聚化。因此，導致產生異二聚體的胺基酸變體被稱為“異二聚化變體”。異二聚化變體可包含空間變體(例如下文所述的“旋鈕及孔(knobs and holes)”或“偏斜(skew)”變體，以及下文所述的“電子對(charge pairs)”變體)以及“ pi變體”，其允許將同種型二聚體從異二聚體中純化出來。藉由引用全部併入本文的WO2014/145806揭露了用於異二聚化的有效機制，包含“旋鈕及孔”、“靜電轉向(electrostatic steering)”或“電子對”，pu變體以及一般的其他Fc變體。另參照Ridgway et al., Protein Engineering 9(7):617 (1996)、Atwell et al., J. Mol. Biol. 1997 270:26、美國專利No.8,216,805、Merchant et al., Nature Biotech. 16:677 (1998)，藉由引用將其全部內容併入本文中。關於“靜電轉向”，參照Gunasekaran et al., J. Biol. Chem. 285(25): 19637 (2010)，藉由引用將其全部內容併入本文中。關於pi變體，參照US 2012/0149876，藉由引用將其全部內容併入本文中。
接著，在一較佳方面，異二聚體Fc結構域包含基於“旋鈕及孔”技術的第一Fc鏈及互補的第二Fc鏈。舉例而言，第一Fc鍊是“旋鈕”或K鏈，這意味著其包含特徵為旋鈕鏈的置換，而第二Fc鏈是“孔”或H鏈，這意味著其包含特徵為孔鏈的置換；反之亦然，第一Fc鏈是“孔”或H鏈，這意味著其包含特徵為孔鏈的置換，而第二Fc鍊是“旋鈕”或K鏈，這意味著其包含特徵為旋鈕鏈的置換。在一較佳方面，第一Fc鏈是“孔”或H鏈，且第二Fc鍊是“旋鈕”或K鏈。
第17圖提供了本發明的雙官能分子結構的實例。
任選地，異二聚體Fc結構域可包含一條包含如下表所示置換的異二聚體Fc鏈以及另一條如下表所示置換的異二聚體Fc鏈。
表G(表內編號係依據歐盟index)
| 具有以下置換的Fc鏈 (孔鏈或H鏈) | 具有以下置換的互補Fc鏈 (旋鈕鏈或K鏈) |
| D221E/P228E/L368E | D221R/P228R/K409R |
| C220E/P228E/368E | C220R/E224R/P228R/K409R |
| S364K/E357Q | L368D/K370S |
| L368D/K370S | S364K |
| L368E/K370S | S364K |
| T411T/E360E/Q362E | D401K |
| L368D/K370S | S364K/E357L |
| K370S | S364K/E357Q |
| T366S/L368A/Y407V | T366W |
| T366S/L368A/Y407V/Y349C | T366W/S354C |
| F368D/K370S | S364K |
| F368D/K370S | S364K/E357F |
| F368D/K370S | S364K/E357Q |
| T411E/K360E/Q362E | D401K |
| F368E/K370S | S364K |
| K370S | S364K/E357Q |
| T366S/F368A/Y407V | T366W |
| T366S/L368A/Y407V/Y349C | T366W/S354C |
在一較佳方面，第一Fc鏈是“孔”或H鏈，且包含置換T366S/L368A/Y407V/Y349C，而第二Fc鍊是“旋鈕”或K鏈，且包含置換T366W/S354C。
任選地，Fc鏈可進一步包含額外的置換。
另一方面，本發明的雙官能分子包含Fc結構域的異二聚體，所述異二聚體包含如前文所述“成孔的旋鈕”修飾。較佳地，這樣的Fc結構域是如前文所述的IgG1或IgG4 Fc結構域，甚至更佳地是包含如前文所述的突變N297A的IgG1 Fc結構域。
舉例而言，第一Fc鏈是“孔”或H鏈，且包含置換T366S/L368A/Y407V/Y349C及N297A，而第二Fc鏈是“旋鈕”或K鏈，且包含置換T366W/S354C及N297A。較佳地，第二Fc鏈可包含SEQ ID NO：75或由其組成；及/或第一Fc鏈可包含SEQ ID NO：77或由其組成。
更具體地，本發明的IL7變體與異二聚體Fc結構域的旋鈕鍊及/或孔鏈連接。因此，本發明的雙官能分子可包含i)一個IL-7變異體，連接至Fc結構域的孔鍊或旋鈕鏈，或ii)兩個IL-7變體，一個與Fc結構域的孔鏈連接，而另一個與Fc結構域的旋鈕鏈連接。較佳地，本發明的雙官能分子包含連接至Fc結構域的孔鏈的一個IL-7變體。
在一第一方面，雙官能分子包含連接至旋鈕鏈Fc結構域的C端或N端的IL-7變體。任選地，此種Fc結構域不與抗原結合結構域連接；或者，此種Fc結構域與抗原結合結構域連接。
在一第二方面，雙官能分子包含與孔鏈Fc結構域的C端連接的IL-7變體。較佳地，此種Fc結構域在其N端連接至抗原結合結構域。
任選地，雙官能分子包含連接至Fc結構域孔鏈C端的一個IL-7變體，其中所述雙官能分子僅包含在Fc結構域孔鏈N端連接的一個抗原結合結構域；在此方面，所述旋鈕鏈不含IL-7變體，且也不含抗原結合結構域。
更佳地，雙官能分子包含任選地藉由連接子，較佳地透過其N端與Fc結構域孔鏈C端連接的一個IL-7變體，其中所述雙官能分子僅包含與Fc結構域孔鏈N端連接的一個抗原結合結構域，且不含IL-7變體的旋鈕鏈以及抗原結合結構域。
因此，本發明的目的係關於一種多肽，所述多肽包含從N端至C端的抗原結合結構域(或其至少對應於重鏈的部分)、Fc鏈(旋鈕鏈或孔鏈)，較佳地為Fc結構域的孔鏈；以及IL-7變體。互補鏈包含不含IL-7變體以及抗原結合結構域的互補Fc鏈，較佳地為Fc結構域的旋鈕鏈。
在另一特定方面，雙官能分子包含任選地藉由連接子，較佳地透過其N端與Fc結構域孔鏈C端連接的一個IL-7變體，其中所述雙官能分子包含與Fc結構域孔鏈N端連接的一個抗原結合結構域；不含IL-7變體的旋鈕鏈；以及透過其C端與旋鈕鏈N端連接的抗原結合結構域。
因此，本發明的目的係關於一種多肽，所述多肽包含從N端至C端的抗原結合結構域(或其至少對應於重鏈的部分)、Fc鏈(旋鈕鏈或孔鏈)，較佳地為Fc結構域的孔鏈；以及IL-7變體。互補鏈包含從N端至C端的抗原結合結構域(或至少其對應於重鏈的部分)，以及不含IL-7變體的互補Fc鏈，較佳地為Fc結構域的旋鈕鏈。
在另一特定方面，雙官能分子包含任選地藉由連接子與旋鈕鏈N端或C端連接的一個IL-7變體，以及包含透過其C端與Fc結構域孔鏈N端連接的抗原結合結構域，所述孔鏈不含IL-7變體。
任選地，抗原結合結構域可為Fab結構域、Fab’結構域、單鏈可變片段(scFV)或單結構域抗體(sdAb)。所述抗原結合結構域較佳地包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)。當所述抗原結合結構域是Fab或Fab’時，所述分子進一步包含重鏈核定結構域及輕鏈恆定結構域(即CH和CL)。
當抗原結合結構域是Fab或Fab’時，雙官能分子可進一步包含與所述抗原結合結構域的VL結構域C端連接的IL-7變體。
本發明的雙官能分子可包含一個或兩個抗原結合結構域；任選地，一個抗原結合結構域可與旋鈕Fc鏈的N端連接，而另一個抗原結合結構域可與孔Fc鏈的N端連接。或者，將單個抗原結合結構域連接至旋鈕Fc鏈或孔Fc鏈的N端；較佳地，IL-7變體與連接至抗原結合結構域的Fc鏈連接。在一特定方面，抗原結合結構域標靶PD-1。
舉例而言，標靶PD-1的抗原結合結構域可衍生自抗PD-1抗體，所述抗PD-1抗體選自以下組成之群組：派姆單抗(Pembrolizumab，也稱為Keytruda lambrolizumab、MK-3475)、Nivolumab(Opdivo、MDX-1106、BMS-936558、ONO-4538)、Pidilizumab(CT-011)、Cemiplimab(Libtayo)、Camrelizumab、AUNP12、AMP-224、AGEN-2034、BGB-A317(Tisleizumab)、PDR001(spartalizumab)、MK-3477、SCH-900475、PF-06801591、JNJ-63723283、genolimzumab(CBT-501)、LZM-009、BCD-100、SHR-1201、BAT-1306、AK-103(HX-008)、MEDI-0680(也稱為AMP-514)、MEDI0608、JS001(參見Si-Yang Liu et al., J. Hematol. Oncol.10:136 (2017))、BI-754091、CBT-501、INCSHR1210(也稱為SHR-1210)、TSR-042(也稱為ANB011)、GLS-010(也稱為WBP3055)、AM-0001(Armo)、STI-1110(請參閱WO2014/194302)、AGEN2034(請參閱WO2017/040790)、MGA012(請參閱WO2017/19846)或IBI308(請參閱WO2017/024465、WO2017/025016、WO2017/132825及WO2017/133540)，單克隆抗體5C4、17D8、2D3、4H1、4A11、7D3和5F4於WO2006/121168中所述。標靶PD-1的雙官能或雙特異性分子也可為已知的例如RG7769(Roche)、XmAb20717(Xencor)、MEDI5752(AstraZeneca)、FS118(F-star)、SL-279252(Takeda)以及XmAb23104(Xencor)。較佳地，標靶PD-1的抗原結合結構域包含在所述列表中所選的6個CDR或抗PD-1抗體的VH及VL。這樣的抗原結合結構域可較佳地為源自所述抗體的Fab或svFc結構域。在一較佳方面，標靶PD-1的抗體結合結構域包含選字以下的6個CDR或抗PD-1抗體的VH及VL：Pembrolizumab(也稱為Keytruda lambrolizumab、MK-3475)或Nivolumab(Opdivo、MDX-1106、BMS-936558、ONO-4538)，且可為例如Fab或scFc結構域。
在一具體方面，標靶PD-1的抗原結合結構域衍生自WO2020/127336中所揭露的抗體，其內容藉由引用併入本文中。
接著，抗原結後結構域包含：
(i)包含HCDR1、HCDR2及HCDR3的重鏈可變結構域；以及
(ii)包含LCDR1、LCDR2及LCDR3的輕鏈可變結構域，其中
重鏈CDR1(HCDR1)包含SEQ ID NO：51的胺基酸序列或由其組成，任選地具有一個、兩個或三個修飾選自在SEQ ID NO：51的位置3以外的任何位置進行取代、加成、刪除或其任意組合；
重鏈CDR2(HCDR2)包含SEQ ID NO：53的胺基酸序列或由其組成，任選地具有一個、兩個或三個修飾選自在SEQ ID NO：53的位置13、14及16以外的任何位置進行取代、加成、刪除或其任意組合；
重鏈CDR3(HCDR3)包含SEQ ID NO：54的胺基酸序列或由其組成，其中X1為D或E，且X2選自以下所組成之群組：T、H、A、Y、N、E及S，較佳地選自H、A、Y、N、E；任選地具有一個、兩個或三個修飾選自在SEQ ID NO：54的位置2、3、7及8以外的任何位置進行取代、加成、刪除或其任意組合；
輕鏈CDR1(LCDR1)包含SEQ ID NO：63的胺基酸序列或由其組成，其中X1為G或T；任選地具有一個、兩個或三個修飾選自在SEQ ID NO：63的位置5、6、10、11及16以外的任何位置進行取代、加成、刪除或其任意組合；
輕鏈CDR2(LCDR2)包含SEQ ID NO：66的胺基酸序列或由其組成；任選地具有一個、兩個或三個修飾選自取代、加成、刪除或其任意組合；以及
輕鏈CDR3(LCDR3)包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列或由其組成，其中X1為G或T；任選地具有一個、兩個或三個修飾選自在SEQ ID NO：16的位置1、4及6以外的任何位置進行取代、加成、刪除或其任意組合。
另一方面，抗原結合結構域包含：
(i)包含HCDR1、HCDR2及HCDR3的重鏈可變結構域；以及
(ii)包含LCDR1、LCDR2及LCDR3的輕鏈可變結構域，其中
重鏈CDR1(HCDR1)包含SEQ ID NO：51的胺基酸序列或由其組成，任選地具有一個、兩個或三個修飾選自在SEQ ID NO：51的位置3以外的任何位置進行取代、加成、刪除或其任意組合；
重鏈CDR2(HCDR2)包含SEQ ID NO：53的胺基酸序列或由其組成，任選地具有一個、兩個或三個修飾選自在SEQ ID NO：53的位置13、14及16以外的任何位置進行取代、加成、刪除或其任意組合；
重鏈CDR3(HCDR3)包含SEQ ID NO：54的胺基酸序列或由其組成，其中X1為D，且X2選自以下所組成之群組：T、H、A、Y、N、E及S，較佳地選自H、A、Y、N、E；或X1為E，且X2選自以下所組成之群組：T、H、A、Y、N、E及S，較佳地選自H、A、Y、N、E及S；任選地具有一個、兩個或三個修飾選自在SEQ ID NO：54的位置2、3、7及8以外的任何位置進行取代、加成、刪除或其任意組合；
輕鏈CDR1(LCDR1)包含SEQ ID NO：63的胺基酸序列或由其組成，其中X1為G或T；任選地具有一個、兩個或三個修飾選自在SEQ ID NO：63的位置5、6、10、11及16以外的任何位置進行取代、加成、刪除或其任意組合；
輕鏈CDR2(LCDR2)包含SEQ ID NO：66的胺基酸序列或由其組成；任選地具有一個、兩個或三個修飾選自取代、加成、刪除或其任意組合；以及
輕鏈CDR3(LCDR3)包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列或由其組成，其中X1為G或T；任選地具有一個、兩個或三個修飾選自在SEQ ID NO：16的位置1、4及6以外的任何位置進行取代、加成、刪除或其任意組合。
在另一實施例中，抗原結合結構域包含或基本上由以下組成：(i)重鏈，其包含SEQ ID NO：51的CDR1、SEQ ID NO：53的CDR2以及SEQ ID NO：55、56、57、58、59、60、61或62的CDR3；以及(ii)輕鏈，其包含SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：65的CDR1、SEQ ID NO：66的CDR2以及SEQ ID NO：16的CDR3。
在另一方面，抗原結合結構域包含或基本上由以下組成：
(i)重鏈，其包含SEQ ID NO：51的CDR1、SEQ ID NO：53的CDR2以及SEQ ID NO：55的CDR3；以及(ii)輕鏈，其包含SEQ ID NO：64的CDR1、SEQ ID NO：66的CDR2以及SEQ ID NO：16的CDR3；或者
(i)重鏈，其包含SEQ ID NO：51的CDR1、SEQ ID NO：53的CDR2以及SEQ ID NO：56的CDR3；以及(ii)輕鏈，其包含SEQ ID NO：64的CDR1、SEQ ID NO：66的CDR2以及SEQ ID NO：16的CDR3；或者
(i)重鏈，其包含SEQ ID NO：51的CDR1、SEQ ID NO：53的CDR2以及SEQ ID NO：57的CDR3；以及(ii)輕鏈，其包含SEQ ID NO：64的CDR1、SEQ ID NO：66的CDR2以及SEQ ID NO：16的CDR3；或者
(i)重鏈，其包含SEQ ID NO：51的CDR1、SEQ ID NO：53的CDR2以及SEQ ID NO：58的CDR3；以及(ii)輕鏈，其包含SEQ ID NO：64的CDR1、SEQ ID NO：66的CDR2以及SEQ ID NO：16的CDR3；或者
(i)重鏈，其包含SEQ ID NO：51的CDR1、SEQ ID NO：53的CDR2以及SEQ ID NO：59的CDR3；以及(ii)輕鏈，其包含SEQ ID NO：64的CDR1、SEQ ID NO：66的CDR2以及SEQ ID NO：16的CDR3；或者
(i)重鏈，其包含SEQ ID NO：51的CDR1、SEQ ID NO：53的CDR2以及SEQ ID NO：60的CDR3；以及(ii)輕鏈，其包含SEQ ID NO：64的CDR1、SEQ ID NO：66的CDR2以及SEQ ID NO：16的CDR3；或者
(i)重鏈，其包含SEQ ID NO：51的CDR1、SEQ ID NO：53的CDR2以及SEQ ID NO：61的CDR3；以及(ii)輕鏈，其包含SEQ ID NO：64的CDR1、SEQ ID NO：66的CDR2以及SEQ ID NO：16的CDR3；或者
(i)重鏈，其包含SEQ ID NO：51的CDR1、SEQ ID NO：53的CDR2以及SEQ ID NO：62的CDR3；以及(ii)輕鏈，其包含SEQ ID NO：64的CDR1、SEQ ID NO：66的CDR2以及SEQ ID NO：16的CDR3；或者
(i)重鏈，其包含SEQ ID NO：51的CDR1、SEQ ID NO：53的CDR2以及SEQ ID NO：55的CDR3；以及(ii)輕鏈，其包含SEQ ID NO：65的CDR1、SEQ ID NO：66的CDR2以及SEQ ID NO：16的CDR3；或者
(i)重鏈，其包含SEQ ID NO：51的CDR1、SEQ ID NO：53的CDR2以及SEQ ID NO：56的CDR3；以及(ii)輕鏈，其包含SEQ ID NO：65的CDR1、SEQ ID NO：66的CDR2以及SEQ ID NO：16的CDR3；或者
(i)重鏈，其包含SEQ ID NO：51的CDR1、SEQ ID NO：53的CDR2以及SEQ ID NO：57的CDR3；以及(ii)輕鏈，其包含SEQ ID NO：65的CDR1、SEQ ID NO：66的CDR2以及SEQ ID NO：16的CDR3；或者
(i)重鏈，其包含SEQ ID NO：51的CDR1、SEQ ID NO：53的CDR2以及SEQ ID NO：58的CDR3；以及(ii)輕鏈，其包含SEQ ID NO：65的CDR1、SEQ ID NO：66的CDR2以及SEQ ID NO：16的CDR3；或者
(i)重鏈，其包含SEQ ID NO：51的CDR1、SEQ ID NO：53的CDR2以及SEQ ID NO：59的CDR3；以及(ii)輕鏈，其包含SEQ ID NO：65的CDR1、SEQ ID NO：66的CDR2以及SEQ ID NO：16的CDR3；或者
(i)重鏈，其包含SEQ ID NO：51的CDR1、SEQ ID NO：53的CDR2以及SEQ ID NO：60的CDR3；以及(ii)輕鏈，其包含SEQ ID NO：65的CDR1、SEQ ID NO：66的CDR2以及SEQ ID NO：16的CDR3；或者
(i)重鏈，其包含SEQ ID NO：51的CDR1、SEQ ID NO：53的CDR2以及SEQ ID NO：61的CDR3；以及(ii)輕鏈，其包含SEQ ID NO：65的CDR1、SEQ ID NO：66的CDR2以及SEQ ID NO：16的CDR3；或者
(i)重鏈，其包含SEQ ID NO：51的CDR1、SEQ ID NO：53的CDR2以及SEQ ID NO：62的CDR3；以及(ii)輕鏈，其包含SEQ ID NO：65的CDR1、SEQ ID NO：66的CDR2以及SEQ ID NO：16的CDR3。
另一方面，本發明的抗PD-1抗體或抗原結合片段包含框架區，特別是重鏈可變區框架區(HFR)HFR1、HFR2、HFR3及HFR4，以及輕鏈可變區框架區(LFR)LFR1、LFR2、LFR3及LFR4。
較佳地，本發明的抗PD-1抗體或抗原結合片段包含人類或人源化框架區。就本文而言，“人類受體框架”是包含衍生自人類免疫球蛋白框架或人類共有框架的輕鏈可變結構域(VL)框架或重鏈可變結構域(VH)框架的胺基酸序列的框架，其定義如下。衍生自人類免疫球蛋白框架或人類共有框架的人類受體框架可包含其相同的胺基酸序列，或可包含胺基酸序列的變化。在一些實施例中，胺基酸變化的數目在10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下或2以下。在一些實施例中，VL受體人類框架的序列與VL人類免疫球蛋白框架序列或人類共有框架序列相同。“人類共有框架”是代表人類免疫球蛋白VL或VH框架序列選擇中最常見的胺基酸殘基的框架。
較佳地，抗PD-1抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區框架區(HFR)HFR1、HFR2、HFR3及HFR4，其分別包含SEQ ID NO：41、42、43及44的胺基酸序列，任選地具有一個、兩個或三個修飾選自在HFR3(即SEQ ID NO：43)的位置27、29及32以外的任何位置進行取代、加成、刪除或其任意組合。較佳地，所述抗PD-1抗體或抗原結合片段包含SEQ ID NO：41的HFR1、SEQ ID NO：42的HFR2、SEQ ID NO：43的HFR3以及SEQ ID NO：44的HFR4。
替代地或者額外地，抗PD-1抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區框架區(LFR)LFR1、LFR2、LFR3及LFR4，其分別包含SEQ ID NO：45、46、47及48的胺基酸序列，任選地具有一個、兩個或三個修飾選自取代、加成、刪除或其任意組合。較佳地，人源化抗PD-1抗體或抗原結合片段包含SEQ ID NO：45的LFR1、SEQ ID NO：46的LFR2、SEQ ID NO：47的LFR3以及SEQ ID NO：48的LFR4。
本發明的雙官能分子中包含的抗hPD-1抗體的VL及VH結構域可包含四個框架區，所述框架區被三個互補決定區打斷，較佳地按以下順序可操作地連接：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(從胺基末端至羧基末端)。
在另一方面，抗原結合結構域包含或基本上由以下組成：
(a)重鏈可變區(VH)，其包含或由SEQ ID NO：17的胺基酸序列組成，其中X1為D或E，且X2選自以下所組成之群組：T、H、A、Y、N、E及S，較佳地選自H、A、Y、N、E；任選地具有一個、兩個或三個修飾選自在SEQ ID NO：17的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106以及112以外的任何位置進行取代、加成、刪除或其任意組合；
(b)輕鏈可變區(VL)，其包含或由SEQ ID NO：26的胺基酸序列組成，其中X為G或T；任選地具有一個、兩個或三個修飾選自在SEQ ID NO：26的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99以及105以外的任何位置進行取代、加成、刪除或其任意組合。
在另一方面，抗原結合結構域包含或基本上由以下組成：
(a)重鏈可變區(VH)，其包含或由SEQ ID NO：18、19、20、21、22、23、24或25的胺基酸序列組成；任選地具有一個、兩個或三個修飾選自在SEQ ID NO：18、19、20、21、22、23、24或25的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106以及112以外的任何位置進行取代、加成、刪除或其任意組合；
(b)輕鏈可變區(VL)，其包含或由SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28的胺基酸序列組成；任選地具有一個、兩個或三個修飾選自在SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99以及105以外的任何位置進行取代、加成、刪除或其任意組合。
在另一方面，抗原結合結構域包含或基本上由以下組成：
(a)重鏈可變區(VH)，其包含或由SEQ ID NO：18、19、20、21、22、23、24或25的胺基酸序列組成；
(b)輕鏈可變區(VL)，其包含或由SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28的胺基酸序列組成。
另一方面，抗原結合結構域包含或基本上由以下所述的重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)的任意組合所組成：
| VH (SEQ ID NO:), optionally with one, two or three modification(s) selected from substitution(s), addition(s), deletion(s) and any combination thereof at any position but positions 7, 16, 17, 20, 33, 38, 43, 46, 62, 63, 65, 69, 73, 76, 78, 80, 84, 85, 88, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 105, 106 and 112 of SEQ ID NO: | VL (SEQ ID NO:), optionally with one, two or three modification(s) selected from substitution(s), addition(s), deletion(s) and any combination thereof at any position positions 3, 4, 7, 14, 17, 18, 28, 29, 33, 34, 39, 42, 44, 50, 81, 88, 94, 97, 99 and 105 of SEQ ID NO: |
| 18 | 27 |
| 18 | 28 |
| 19 | 27 |
| 19 | 28 |
| 20 | 27 |
| 20 | 28 |
| 21 | 27 |
| 21 | 28 |
| 22 | 27 |
| 22 | 28 |
| 23 | 27 |
| 23 | 28 |
| 24 | 27 |
| 24 | 28 |
| 25 | 27 |
| 25 | 28 |
在一非常特定的方面，抗原結合結構域包含或基本上由SEQ ID NO：24的重鏈可變區(VH)及SEQ ID NO：28的輕鏈可變區(VL)組成。
在一特定實施例中，雙官能分子包含：
(a)重鏈，其包含或由SEQ ID NO：29、30、31、32、33、34、35或36的胺基酸序列組成；任選地具有一個、兩個或三個修飾選自在SEQ ID NO：29、30、31、32、33、34、35或36的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106以及112以外的任何位置進行取代、加成、刪除或其任意組合，且所述置換對應孔鏈或旋鈕鏈；較佳地為孔鏈，更佳地如表G所述之孔鏈，尤其是在SEQ ID NO：29、30、31、32、33、34、35或36中，T363S/L365A/Y4047V/Y346C或T363W/S351C，較佳地為T363S/L365A/Y4047V/Y346C，以及任選地在SEQ ID NO：29、30、31、32、33、34、35或36中的N294A；
(b)輕鏈，其包含或由SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：38的胺基酸序列組成；任選地具有一個、兩個或三個修飾選自在SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：38的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99以及105以外的任何位置進行取代、加成、刪除或其任意組合。
在另一方面，雙官能分子包含或由以下所述的重鏈(CH)及輕鏈(CL)的任意組合所組成：
| CH(SEQ ID NO：)，任選地具有一個、兩個或三個修飾選自在SEQ ID NO：29、30、31、32、33、34、35或36如下列所示編號之胺基酸序列的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106以及112以外的任何位置進行取代、加成、刪除或其任意組合。 | CL(SEQ ID NO：)，任選地具有一個、兩個或三個修飾選自在如下列所示編號之胺基酸序列的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99以及105以外的任何位置進行取代、加成、刪除或其任意組合。 |
| 27 | 37 |
| 27 | 38 |
| 28 | 37 |
| 28 | 38 |
| 29 | 37 |
| 29 | 38 |
| 30 | 37 |
| 30 | 38 |
| 31 | 37 |
| 31 | 38 |
| 32 | 37 |
| 32 | 38 |
| 33 | 37 |
| 33 | 38 |
| 34 | 37 |
| 34 | 38 |
| 35 | 37 |
| 35 | 38 |
| 36 | 37 |
| 36 | 38 |
重鏈包含對應於孔鏈或旋鈕鏈的置換，較佳地為孔鏈，更具體地係如表G中所述之孔鏈，特別是在SEQ ID NO：29、30、31、32、33、34、35或36中，尤其是T366S/L368A/Y407V/Y349C或T366W/S354C，較佳為T366S/L368A/Y407V/Y349C，以及任選地為SEQ ID NO：29、30、31、32、33、34、35或36中的N297A，所述置換的位置係依據歐盟編號所定義。
因此，另一方面，本發明的雙官能分子包含或由以下組成：
(a)抗人類PD-1抗原結合結構域，其包含(i)具有第一Fc鏈的重鏈；以及(ii)輕鏈；
(b)IL-7變體；以及
(c)互補第二Fc鏈，
其中，所述IL-7變體任選地藉由胜肽連接子共價連接，較佳地藉由其N端共價連接至所述第一Fc鏈的C端及/或所述互補第二Fc鏈的N端或C端。所述IL-7變體可為前文所述的任何IL-7變體。
第一及第二Fc鏈如前文所述，較佳地，Fc鏈較佳為來自IgG1或IgG4抗體的Fc鏈。
抗人類PD-1抗原結合結構域如前文所述。
另一方面，雙官能分子包含單個抗人類PD-1抗原結合結構域(僅一個)。較佳地，雙官能分子包含選自以下組成之群組的單個抗人類PD-1抗原結合結構域：抗人類PD-1 Fab、抗人類PD-1 Fab’、抗人類PD-1 scFV以及抗人類PD-1 sdAb。
雙官能分子包含一或兩個IL-7變體，較佳地為單個IL-7抗體。
雙官能分子包含輕鏈，所述輕鏈包含或由SEQ ID NO：37或38組成。
雙官能分子包含重鏈，所述重鏈包含或由SEQ ID NO：29、30、31、32、33、34、35及36中的任一個組成，其Fc鏈可任選地經修飾以促進Fc鏈的異二聚化形成異二聚體Fc結構域。更具體地，所述重鏈包含對應於孔鏈或旋鈕鏈的置換，較佳地為孔鏈，更具體地係如表G中所述之孔鏈，尤其是T366S/L368A/Y407V/Y349C或T366W/S354C，較佳為T366S/L368A/Y407V/Y349C，以及任選地為SEQ ID NO：29、30、31、32、33、34、35或36中的N297A，所述置換的位置係依據歐盟編號所定義。
在一非常特定的方面，雙官能分子可包含包含或由SEQ ID NO：38組成的輕鏈以及包含或由SEQ ID NO：35組成的重鏈，其Fc鏈可任選地經修飾以促進Fc鏈的異二聚化形成異二聚體Fc結構域。
在一非常特定的方面，雙官能分子可包含SEQ ID NO：75的第一單體；以及包含Fc鏈SEQ ID NO：77的第二單體，在其N端任選地藉由連接子與抗原結合結構域(特別是SEQ ID NO：79)連接，且在其C端任選地藉由連接子與前文所述的任意IL-7變體連接。較佳地，雙官能分子包含SEQ ID NO：75的第一單體；SEQ ID NO：83的第二單體；以及SEQ ID NO：37、38或80，較佳為SEQ ID NO：38或80的第三單體。
在另一非常特定的方面，雙官能分子可包含SEQ ID NO：77的第一單體；以及包含Fc鏈SEQ ID NO：75的第二單體，在其N端任選地藉由連接子與抗原結合結構域(特別是SEQ ID NO：79)連接，且在其C端任選地藉由連接子與前文所述的任意IL-7變體連接。較佳地，雙官能分子包含SEQ ID NO：77的第一單體；SEQ ID NO：82的第二單體；以及SEQ ID NO：37、38或80，較佳為SEQ ID NO：38或80的第三單體。
在另一非常特定的方面，雙官能分子可包含SEQ ID NO：75的第一單體，在其N端任選地藉由連接子與抗原結合結構域(特別是SEQ ID NO：79)連接；以及包含Fc鏈SEQ ID NO：77的第二單體，在其N端任選地藉由連接子與抗原結合結構域(特別是SEQ ID NO：79)連接，且在其C端任選地藉由連接子與前文所述的任意IL-7變體連接。較佳地，雙官能分子包含SEQ ID NO：81的第一單體；SEQ ID NO：83的第二單體；以及SEQ ID NO：37、38或80，較佳為SEQ ID NO：38或80的第三單體。
在另一非常特定的方面，雙官能分子可包含SEQ ID NO：77的第一單體，在其N端任選地藉由連接子與抗原結合結構域(特別是SEQ ID NO：79)連接；以及包含Fc鏈SEQ ID NO：75的第二單體，在其N端任選地藉由連接子與抗原結合結構域(特別是SEQ ID NO：79)連接，且在其C端任選地藉由連接子與前文所述的任意IL-7變體連接。
雙官能分子的製備
-
編碼
IL-7
變體或突變體的核酸分子，或包含其之融合蛋白及雙官能分子、重組表達載體及包含其載體的宿主細胞。
為了產生本發明的IL-7變體或突變體、融合蛋白或雙官能分子，特別是藉由哺乳動物細胞，編碼所述IL-7變體或突變體的核酸序列或核酸序列組，所述融合蛋白或雙官能分子被亞克隆至一或多種表達載體中。此類載體通常用於轉染哺乳動物細胞。產生包含抗體序列分子的慣用技術於Coligan et al. (eds.), Current protocols in immunology, at pp. 10.19.1-10.19.11(Wiley Interscience 1992)中所描述，其內容藉由引用併入本文中，而在“Antibody engineering: a practical guide” from W. H. Freeman and Company(1992)中，其與分子產生相關的論述分散在其中。
通常，此種方法包含以下步驟：
(1)使用多核苷酸或其變體轉染或轉化合適的宿主細胞以編碼本發明的IL-7變體或突變體、融合蛋白或重組雙官能分子，或含有多核苷酸的載體；
(2)在合適的培養基中培養宿主細胞；以及
(3)任選地從培養基或宿主細胞中分離或純化蛋白質。
本發明進一步關於一種編碼如前文所述的IL-7變體或突變體、融合蛋白或雙官能分子的核酸；一載體，較佳為包含本發明核酸的表達載體；一利用本發明載體轉化或直接利用序列編碼IL-7變體或突變體、融合蛋白或重組雙官能分子的序列轉化的基因工程宿主細胞；以及藉由重組技術生產本發明蛋白質的方法。
所述核酸、載體以及宿主細胞更具體地於下文中描述。
核酸序列
本發明還關於一種編碼如前文所述的IL-7變體或突變體、融合蛋白或雙官能分子的一核酸分子，或關於一種編碼如前文所述的IL-7變體或突變體、融合蛋白或雙官能分子的一組核酸分子。可藉由本領域已知的任何技術，例如PCR，擴增編碼本發明揭露的IL-7變體或突變體、融合蛋白或雙官能分子的核酸。此類核酸可使用常規程序輕易地分離及測序。
較佳地，編碼如本發明定義的雙官能分子的核酸分子包含：
編碼本發明揭露的結合部分的第一核酸分子，以及
編碼IL-7m的第二核酸分子，較佳為人類IL-7m。
在一非常具體的實施例中，編碼結合部分的核酸分子包含具有SEQ ID NO：73所示序列的重鏈可變結構域及/或具有SEQ ID NO：74所示序列的輕鏈可變結構域。
在一實施例中，所述第二核酸分子可任選地藉由編碼胜肽連接子的核酸可操作地連接至所述第一核酸。藉由可操作地連接係指利用核酸編碼一融合蛋白。接著，在一特定方面，所述核酸編碼之融合蛋白，其包含本發明所揭露的結合部分，任選地為胜肽連接子以及IL-7變體。較佳地，在此種核酸分子中，當所述結合部分包含Fc結構域時，IL-7變體的N端較佳地藉由胜肽連接子與其重鏈恆定結構域的C端融合。
在一實施例中，所述核酸分子係為分離的，特別是非天然的核酸分子。
另一方面，所述核酸編碼具有SEQ ID NO：2至15所示胺基酸序列的IL-7m。
載體
在另一方面，本發明係關於一種載體，其包含前文所定義的一核酸分子或一組核酸分子。
如本文所用，“載體”是用於將遺傳物質轉移到細胞中的媒介物的核酸分子。術語“載體”涵蓋質粒、病毒、黏粒以及人工染色體。通常，工程化的載體包含複製起點、多克隆位點以及篩選標記。載體本身通常是核苷酸序列，一般為DNA序列，其包含插入片段(轉基因)以及充當載體“骨架”的較大序列。除了轉基因插入物及骨架外，現代載體(Modern vectors)可能還包含其他功能：啟動子(promoter)、遺傳標記、抗生素抗性、報導基因(reporter gene)、標靶序列、蛋白質純化標籤(protein purification tag)。稱為表達載體(表達建構體)的載體係專門用於轉基因在標靶細胞中的表達，且通常具有控制序列。
編碼雙官能分子、融合蛋白、結合部分或IL-7變體的核酸分子可被本領域技術人員克隆至載體中，接著轉化至宿主細胞中。這些方法包含體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。本領域技術人員已知的方法可用於構建表達載體，所述載體包含本文所述的雙官能分子、融合蛋白、結合部分或IL-7變體的核酸序列，以及用於轉錄/轉譯之合適的調控成分。
因此，本發明還提供了一種重組載體，其包含編碼本發明的雙官能分子、融合蛋白、結合部分或IL-7變體的核酸分子。在一較佳實施例中，所述表達載體還包含啟動子及編碼分泌訊息肽的核酸序列，以及任選地至少一種用於篩選的抗藥性基因。所述表達載體可進一步包含用於啟動轉譯、轉錄終止子等的核醣體結合位點。
合適的表達載體通常包含：(1)編碼細菌複製起點的原核DNA元件以及用於提供表達載體在細菌宿主中的生長和選擇的抗生素抗性標記；(2)控制轉錄起始的真核DNA元件，例如啟動子；以及(3)控制轉錄物加工的DNA元件，例如轉錄終止/聚腺苷酸化序列。
可使用多種技術將表達載體引入宿主細胞，包含磷酸鈣轉染、脂質體介導之轉染、電穿孔等。較佳地，選擇並繁殖轉染的細胞，其中表達載體穩定地整合在宿主細胞基因組中以產生穩定的轉化體。
宿主細胞
另一方面，本發明係關於一種宿主細胞，其包含如前文所定義的載體、核酸分子或核酸分子組，例如用於雙官能分子生產的目的。
如本文所用，術語“宿主細胞”旨在包含可以是或已經是載體受體、外源核酸分子，以及編碼本發明的雙官能分子、融合蛋白、結合部分或IL-7變體的多核苷酸的多核苷酸之任何單個細胞或細胞培養物。術語“宿主細胞”還旨在包含單個細胞的後代或潛在後代。合適的宿主細胞包含原核或真核細胞，並且還包含但不限於細菌、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞及動物細胞，例如昆蟲細胞及哺乳動物細胞，例如小鼠、大鼠、兔、獼猴或人類細胞。
合適的宿主細胞尤其是真核宿主細胞，其提供合適的轉譯後修飾，例如醣基化。較佳地，這種合適的真核宿主細胞可以是真菌，例如巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；昆蟲細胞，例如黏蟲(Mythimna separate)；植物細胞，例如煙草；以及哺乳動物細胞，例如BHK細胞、293細胞、CHO細胞、NSO細胞以及COS細胞。
較佳地，本發明的宿主細胞選自CHO細胞、COS細胞、NSO細胞以及HEK細胞。
然後，宿主細胞穩定或瞬時表達本發明的雙官能分子、融合蛋白、結合部分及/或IL-7變體。這樣的表達方法是本領域技術人員已知的。
本發明還提供了產生IL-7變體或突變體、融合蛋白或雙官能分子的方法。所述方法包含在適合於其表達的條件下，培養包含如前文所述的編碼雙官能分子、融合蛋白、結合部分及/或IL-7變體的核酸的宿主細胞，並任選地從宿主細胞(或宿主細胞培養基)中回收雙官能分子、融合蛋白、結合部分及/或IL-7變體。較佳地，為了重組生產雙官能分子，例如，如前文所述，將編碼雙官能分子的核酸分離並插入一或多種載體中，以在宿主細胞中進一步克隆及/或表達，接著藉由本領域已知的任何方法分離及/或純化IL-7變體或突變體、融合蛋白、雙官能分子。這些方法包含但不限於常規的變性處理、蛋白沉澱劑的處理(例例如鹽沉澱)、離心、滲透作用下的細胞裂解、超聲處理、超速離心、分子篩層析或凝膠層析、吸附層析、離子交換層析、HPLC、以及任何其他液相層析法及其組合。如上所述，例如，藉由Coligan，雙官能分子分離技術可特別地包含具有蛋白質A瓊脂糖(Protein-A Sepharose)的親和力層析、尺寸排除層析法以及離子交換層析法。蛋白質A瓊脂糖較佳地用於分離本發明的雙官能分子。
藥物組合物及其給藥方法
本發明還關於一種藥物組合物，其包含本發明所述的任何IL-7變體或突變體、融合蛋白或雙官能分子、核酸分子、核酸分子組、載體及/或宿主細胞；其較佳地作為活性成分或化合物。
所述製劑可以滅菌，且如有需要，可與輔助劑混合，例如藥學上可接受的載體、賦形劑、鹽、抗氧化劑及/或穩定劑，所述輔助劑不會與本發明的雙官能分子、核酸、載體及/或宿主細胞發生有害的交互作用，且不會產生任何不欲的毒理作用。任選地，藥物組合物可進一步包含額外的治療劑。
較佳地，本發明的藥物組合物可配製用於任何常規的給藥途徑，包含局部、腸內、口服、腸胃外、鼻內、靜脈內、肌內、皮下或眼內給藥等。為了促進給藥，可以將本發明所述的雙官能分子製成用於體內給藥的藥物組合物。製備此種組合物的方法已於本領域中揭露(例如，參照Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins, 21st edition (2005))。
可藉由過將具有期望純度的雙官能分子及凍乾製劑或水溶液形式之任選的藥學上可接受的載體、賦形劑、抗氧化劑及/或穩定劑混合來製備藥物組合物。此種合適的載體、賦形劑、抗氧化劑及/或穩定劑在本領域中是眾所周知的，且已在例如Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)中揭露。
為了促進遞送，可將任何雙官能分子或其編碼核酸，與伴護劑(chaperon agent)綴合。伴護劑可為天然存在的物質，例如蛋白質(例如人血清白蛋白、低密度脂蛋白或球蛋白)、碳水化合物(例如右旋糖酐、支鏈澱粉、甲殼素、殼聚醣、菊粉、環糊精或透明質酸)或脂質。伴護劑也可為重組或合成分子，例如合成聚合物，例如合成多肽。
可將本發明的藥物組合物配製成基本上在給藥後立即或在給藥後的任何預定時間或時間段釋放活性成分(例如本發明的雙官能分子)。在某些方面，藥物組合物可採用定時釋放、延遲釋放和持續釋放的遞送系統，使得組合物的遞送發生在欲治療的部位致敏(sensitization)之前，並且有足夠的時間引起其致敏。本領域已知的手段可用於防止或最小化組合物的釋放和吸收，直到其到達靶組織或器官，或確保組合物的定時釋放；這樣的系統可避免組合物的重複施用，進而增加了患者及醫師的便利性。
本領域技術人員將理解，本發明的製劑可與人類血液等滲(isotonic)，即本發明的製劑具有與人類血液基本相同的滲透壓。這樣的等滲製劑通常具有約250mOSm至約350mOSm的滲透壓。等滲性可藉由例如蒸氣壓或冰凍型滲透壓劑來測量。
藥物組合物通常必須在生產和儲存條件下是無菌的及穩定的，可藉由滅菌程序(例如藉由微濾)及/或藉由加入各種抗菌及抗真菌劑以防止微生物的存在。
可與載體材料組合以產生單一劑型的活性成分的量，其取決於所治療的受試者及特定的給藥方式而變化。可與載體材料組合以產生單一劑型的活性成分的量通常為產生治療效果的組合物的量。
受試者、方案及給藥
本發明關於一種本文所述的IL-7變體或突變體、融合蛋白或雙官能分子；編碼此類核酸或載體的宿主細胞或藥物組合物，核酸、載體或宿主細胞，作為藥物或用於治療疾病或給藥予受試者。本發明還關於一種用於治療受試者的疾病或病症的方法，所述方法包含向受試者施用治療有效量的藥物組合物或雙官能分子。下文在“方法和用途”部分中更具體地描述了治療的實例。
待治療的受試者可以是人類，尤其是產前階段的人類、新生兒、兒童、嬰兒、青少年或成人，特別是至少30歲、40歲的成年人，較佳地至少50歲的成年人，更佳地至少60歲的成年人，甚至更佳地至少70歲的成年人。
在一特定方面，所述受試者可以是免疫抑制的或免疫受損的。
醫學領域普通技術人員已知的常規方法，根據待治療疾病的類型或疾病的部位，可用於向受試者施用本發明揭露的雙官能分子或藥物組合物可例如經由口服、腸胃外、腸內、通過吸入噴霧、外用、直腸、鼻腔、頰、陰道或經由植入型藥盒給藥；較佳地，雙官能分子或藥物組合物經由皮下、皮內、靜脈內、肌內、關節內、動脈內、滑膜內、腫瘤內、胸骨內、鞘內、病灶內以及顱內注射或輸液技術給藥。
根據本發明的藥物組合物或雙官能分子的形式、給藥途徑及給藥劑量，可由本領域技術人員根據感染的類型及嚴重程度來調整，尤其是患者的年齡、體重、大小、性別及/或整體身體狀況。本發明的組合物可以多種方式給藥，其取決於是否需要局部或全身治療。
用於疾病治療
本發明的雙官能分子、核酸、載體、宿主細胞、組合物及方法具有許多體外和體內的實用性及應用。較佳地，本發明提供的任何IL-7變體或突變體、融合蛋白或雙官能分子、核酸分子、核酸分子組、載體、宿主細胞或藥物組合物可用於治療方法及/或用於治療目的。
本發明還關於一種IL-7變體或突變體、融合蛋白或雙官能分子，編碼其核酸或載體，或包含其之藥物組合物用於治療受試者的疾病及/或病症及/或作為藥物或疫苗。本發明還關於如本文所述的IL-7變體或突變體、融合蛋白或雙官能分子；編碼其核酸或載體，或包含其之藥物組合物用於治療受試者的疾病及/或病症的用途。最後，本發明關於一種用於治療受試者的疾病或病症的方法，所述方法包含向受試者施用治療有效量的藥物組合物或IL-7變體或突變體、融合蛋白或雙官能分子，或編碼其核酸或載體。
在一實施例中，本發明關於一種治療疾病及/或病症的方法，所述疾病及/或病症選自：需要治療的受試者中的癌症、傳染病及慢性病毒感染，包含向所述受試者施用有效量的上述IL-7變體或突變體、融合蛋白或雙官能分子或藥物組合物。此類疾病的實例在下文中更具體地描述。
在一方面，所述治療方法包含：(a)確認需要治療的患者；以及(b)向患者施用治療有效量的如本文所述的任何IL-7變體或突變體、融合蛋白或雙官能分子、核酸、載體或藥物組合物。
需要治療的受試者可以是患有、處於危險中或被懷疑患有疾病的人，可藉由常規醫學檢查來識別此類患者。
在另一方面，本發明揭露的雙官能分子可例如在體內給予受試者以增強免疫力，較佳地是為了治療疾病及/或疾病。因此，在一方面，本發明提供了一種在受試者中改變免疫應答的方法，其包含向受試者施用本發明的雙官能分子、核酸、載體或藥物組合物，進而修飾受試者中的免疫應答；較佳地，免疫應答被增強、增加、刺激或上調。雙官能分子或藥物組合物可用於在需要治療的受試者中增強免疫應答，例如T細胞活化。在一特定的實施例中，雙官能分子或藥物組合物可用於減少T細胞的衰竭或使衰竭T細胞再活化。
本發明特別提供了一種在受試者中增強免疫應答的方法，所述方法包含向受試者施用治療有效量的包含本文所述的任何雙官能分子、核酸、載體或藥物組合物，進而增強了受試者的免疫反應。在一特定的實施例中，雙官能分子或藥物組合物可用於減少T細胞的衰竭或使衰竭T細胞再活化。本發明的雙官能分子標靶CD127+免疫細胞，特別是CD127+ T細胞。在以下特別感興趣的領域中可以找到這種細胞：淋巴結中的駐留淋巴細胞(主要位於皮層內，偶有卵泡中的細胞)、在扁桃體(小窩間區域)、脾臟(主要在白色牙髓的小動脈周圍淋巴鞘（PALS）和紅色牙髓中的一些零散細胞內)、胸腺(主要在髓質；也在皮層)、骨髓(零散分佈)、在整個消化道(胃、十二指腸、空腸、迴腸、盲腸結腸、直腸）的GALT(腸相關淋巴組織(Gut Associated-Lymphoid-Tissue)，主要在小卵泡間區域和固有層)中、在膽囊的MALT(Mucosa相關淋巴組織(Mucosa-Associated-Lymphoid-Tissue))中。因此，本發明的雙官能分子對於治療位於或涉及這些區域的疾病，特別是癌症特別感興趣。
癌症
在另一實施例中，本發明提供如本文所揭露的IL-7變體或突變體、融合蛋白或雙官能分子或藥物組合物在製備用於治療癌症的藥物中的用途，例如用於抑制受試者中腫瘤細胞的生長。
本文所用的術語“癌症”定義為特徵在於異常細胞快速且不受控制地生長的疾病。癌細胞可以局部擴散，也可以通過血液和淋巴系統擴散到身體的其他部位。
因此，在一實施例中，本發明提供了一種在受試者中治療癌症例如抑制腫瘤細胞生長的方法，所述方法包含向受試者施用治療有效量的本發明的雙官能分子或藥物組合物。較佳地，本發明關於一種使用雙官能分子對受試者的治療，進而抑制癌細胞的生長。
在本發明的一方面，要治療的癌症與衰竭T細胞相關。
可用本發明提供治療的任何合適的癌症可以是造血癌或實質固態瘤。這些癌症包含上皮細胞癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、胃腸道癌、頭頸癌、腎癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、神經膠質瘤、間皮瘤、黑色素瘤、胃癌、尿道癌、環境誘發性癌以及上述癌症的任何組合。此外，本發明包含難治性或複發性惡性腫瘤；較佳地，待治療或預防的癌症選自轉移性或非轉移性癌、黑色素瘤、惡性間皮瘤、非小細胞肺癌、腎細胞癌、霍奇金淋巴瘤、頭頸癌、尿道上皮癌、結直腸癌、肝細胞癌、小細胞肺癌轉移性默克爾細胞癌、胃或胃食管癌以及子宮頸癌。
在一特定方面，所述癌症是血液系統惡性腫瘤或實質固態瘤。這樣的癌症可以選自血淋巴腫瘤、血管免疫母細胞T細胞淋巴瘤、骨髓增生異常綜合症、急性髓細胞性白血病。
在一特定方面，癌症是由病毒誘導或與免疫缺陷有關的癌症。這樣的癌症可以選自以下組成之群組：卡波西肉瘤(例如與卡波西肉瘤皰疹病毒有關)；子宮頸癌、肛門癌、陰莖癌及外陰鱗狀細胞癌及口咽癌(例如與人乳頭瘤病毒有關)；B細胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)，包含瀰漫性大B細胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、漿母細胞淋巴瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、HHV-8原發滲出性淋巴瘤、經典霍奇金淋巴瘤及淋巴增生性疾病(例如，與EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)及/或卡波西肉瘤皰疹病毒有關)；肝細胞癌(例如，與B型及/或C型肝炎病毒有關)；默克爾細胞癌(例如與默克爾細胞多瘤病毒(MPV)相關)；以及與人類免疫缺陷病毒感染(HIV)感染相關的癌症。
較佳的治療癌症包含通常對免疫療法有反應的癌症。或者，較佳的治療癌症是對免疫療法無反應的癌症。
傳染病
本發明的雙官能分子、核酸、核酸組、載體、宿主細胞或藥物組合物可以用於治療已經暴露於特定毒素或病原體的患者。因此，本發明在一方面提供了一種在受試者中治療感染性疾病的方法，其包含向受試者施用本發明的雙官能分子或藥物組合物，所述藥物或藥物組合物包含這樣的化合物；較佳地，使得所述受試者治療感染性疾病。
可用本發明提供的雙官能分子、核酸、核酸組、載體、宿主細胞或藥物組合物治療任何合適的感染。
可藉由本發明的方法治療的引起感染的病原性病毒的一些例子包含HIV、肝炎(A、B或C)、皰疹病毒(例如VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II及CMV、EB病毒)、腺病毒、流感病毒、黃病毒、迴聲病毒、鼻病毒、柯薩奇病毒、冠狀病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、風疹病毒、細小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革熱病毒、乳頭瘤病毒、軟體動物病毒、脊髓灰質炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒以及蟲媒病毒性腦炎病毒。
可藉由本發明的方法治療的引起感染的病原細菌的一些實例包含衣原體、立克次氏菌、分枝桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌、腦膜炎球菌和淋球菌、克雷伯菌、變形桿菌、沙雷氏菌、假單胞菌、軍團菌、白喉、沙門氏菌、桿菌、霍亂、破傷風、肉毒桿菌中毒、炭疽、鼠疫、鉤端螺旋體病及萊姆斯病細菌。可藉由本發明的方法治療的引起感染的病原性真菌的一些實例包含念珠菌(白色念珠菌、克魯斯念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌等)、新型隱球菌、曲黴菌(煙麴黴菌、黑麴黴等)、毛黴菌屬(毛黴菌、腐化米黴菌、根黴菌)、申克氏孢子絲菌、皮膚芽孢桿菌、巴西副球菌、粗球黴菌以及莢膜胞漿菌。
可藉由本發明的方法治療的引起感染的病原性寄生蟲的一些例子包含溶血性變形桿菌、巴氏桿菌、納格氏菌、棘阿米巴菌、賈第鞭毛蟲、隱孢子蟲、卡氏肺孢子蟲、間日瘧原蟲、巴氏桿菌、布魯氏錐蟲、克魯氏錐蟲、布氏利甚曼原蟲、新孢子蟲及弓形蟲。
聯合療法
可根據本發明的雙官能分子與一些其他可能的策略相結合，以在臨床開發中或已經在市場上藉由藥劑克服免疫逃逸機制(參照此文獻表1，Antonia et al. Immuno-oncology combinations: a review of clinical experience and future prospects. Clin. Cancer Res. Off. J. Am. Assoc. Cancer Res. 20, 6258–6268, 2014)。此種與本發明的雙官能分子的組合可特別用於以下方面：
1.逆轉對適應性免疫的抑制(阻斷T細胞檢查點途徑)；
2.開啟適應性免疫(使用激動劑分子，尤其是抗體，促進T細胞共刺激受體訊息傳導)；
3.改善先天免疫細胞的功能；
4. 例如藉由基於疫苗的策略活化免疫系統(增強免疫細胞效應子功能)。
因此，本發明還提供了與任何雙官能分子或藥物組合物的組合療法，所述組合物包含本發明所述的雙官能分子或藥物組合物以及合適的第二試劑，用於治療疾病或病症。在一方面，雙官能分子及第二藥劑可以存在於如前文所述獨特的藥物組合物中。或者，本發明所用的術語“聯合性療法”或“聯合療法”包含以順序方式施用此兩種藥物(例如，本發明所述的雙官能分子及其他或第二種合適的治療劑)，即其中每種治療藥物在不同的時間施用，以及這些藥物的施用 代理或至少兩種代理以基本上同時的方式。每種試劑的順序或基本同時給藥可受到任何適當途徑的影響。可以藉由相同途徑或藉由不同途徑來施用藥劑。例如，可以口服施用第一試劑(例如，雙官能分子)，且可以靜脈內施用另外的治療劑(例如，抗癌劑′抗感染劑或免疫調節劑)。或者，可以藉由靜脈內注射施用所選組合的藥劑，而可以口服施用所述組合的其他藥劑。
在一方面，可在非窮舉性列表中選擇其他治療劑，包含：烷化劑、血管生成抑制劑、抗體、抗代謝物、抗有絲分裂劑、抗增殖劑、抗病毒劑、極光激酶抑制劑、凋亡促進劑(例如Bcl-2家族抑制劑)、死亡受體途徑激活劑、Bcr-Abl激酶抑制劑、BiTE抗體(雙特異性T細胞銜接抗體)、抗體藥物偶聯物、生物應答修飾劑、布魯頓酪氨酸激酶(BTK)抑制劑、細胞週期蛋白依賴性激酶抑制劑、細胞週期抑制劑、環氧合酶-2抑制劑、DVD、白血病病毒癌基因同源物(ErbB2)受體抑制劑、生長因子抑制劑、熱休克蛋白(HSP)-90抑制劑、組蛋白脫乙醯基酶(HDAC)抑制劑、激素療法、免疫藥、抑制凋亡蛋白(IAP)的抑制劑、插層抗生素、激酶抑制劑、驅動蛋白抑制劑、Jak2抑制劑、哺乳動物靶標的雷帕黴素抑制劑、microRNA、絲裂原活化的細胞外訊息傳導調節激酶抑制劑、多價結合蛋白、非甾體抗炎藥(NSAID)、聚ADP(二磷酸腺苷)-核糖聚合酶(PAR)抑制劑、鉑化學療法、polo樣激酶(Plk)抑制劑、磷酸肌醇3激酶(PI3K)抑制劑、蛋白酶體抑制劑、嘌呤類似物、嘧啶類似物、受體酪氨酸激酶抑制劑、類視黃醇/三角肌植物生物鹼、小型抑制性核糖核酸(siRNA)、拓撲異構酶抑制劑、泛素連接酶抑制劑、次甲基化劑、檢查點抑制劑、肽疫苗及其類似物、腫瘤抗原的表位或新表位，以及這些試劑中的一或多種的組合。例如，所述額外的治療劑可以選自化學療法、放射療法、標靶療法、抗血管生成劑、次甲基化劑、癌症疫苗、腫瘤抗原的表位或新表位、髓樣檢查點抑制劑、其他免疫療法以及HDAC抑制劑。
本發明還關於一種用於治療受試者疾病的方法，所述方法包含向受試者施用治療有效量的本發明所述的雙官能分子或藥物組合物以及治療有效量的其他或第二治療劑。
在WO2018/053106，第36-43頁中提供了另外的或第二種治療劑的具體實例。
在一較佳實施例中，第二治療劑選自化學治療劑、放射治療劑、免疫治療劑、細胞治療劑(例如CAR-T細胞)、抗生素以及益生菌。
聯合療法也可依靠雙官能分子的給藥與手術相結合。
試劑盒
本發明所述的任何雙官能分子或組合物均可包含在本發明提供的試劑盒中。本發明特別提供了一種用於增強免疫應答及/或治療疾病或病症(例如癌症及/或感染)的試劑盒。
在本發明的上下文中，術語“試劑盒”是指包裝在容器、受體或其他容器中的兩種或更多種組分(其中一種組分對應於本發明的雙官能分子、核酸分子、載體或細胞)。因此，試劑盒可描述為足以實現特定目標的一組產品及/或器具，可作為單一單元銷售。本發明的試劑盒在合適的包裝中。
較佳地，本發明的試劑盒可包含：
如前文所述的IL-7變體或突變體、融合蛋白或雙官能分子；
編碼所述IL-7變體或突變體、融合蛋白或雙官能分子的核酸分子或一組核酸分子；
包含所述核酸分子或核酸分子組的載體；及/或
包含所述載體或核酸分子或核酸分子組的細胞。
試劑盒因此可在合適的容器方式中包含藥物組合物及/或本發明的IL-7變體或突變體、融合蛋白或雙官能分子及/或宿主細胞、及/或編碼本發明核酸分子的載體、及/或本發明的核酸分子或相關試劑。在一些實施例中，可提供從個體獲取樣品及/或測定樣品的方法。本發明試劑盒中包含的組合物可特別地配製成與注射器相容的組合物。
在一些實施例中，試劑盒進一步包含用於治療癌症或傳染病的額外的試劑，且所述額外的試劑可與IL-7變體或突變體、融合蛋白或雙官能分子或本發明試劑盒的其他組分組合，或者可在試劑盒中單獨提供。較佳地，本發明描述的試劑盒可包含一種或多種額外的治療劑，例如前文所述的“聯合療法”中描述的那些治療劑。試劑盒可針對個體的特定癌症而定製，且包含如前文所述針對個體的相應的第二種癌症療法。
與本發明所述的雙官能分子或藥物組合物使用有關的說明通常包含有關劑量、給藥方案、預期治療的給藥途徑、用於重構雙官能分子的方法及/或用於稀釋本發明的雙官能分子的方法。本發明試劑盒中提供的說明書通常是在標籤或包裝插頁(例如，以傳單或說明書的形式包含在試劑盒中的紙張)上的書面說明書。
實施例
實施例1.Fc融合的IL-7突變體修飾與IL-7R及pSTAT5訊息傳導的結合並改善體內藥代動力學
為了獲得IL-7突變體，將IL7與CD127的相互作用中涉及的胺基酸替換為具有相似性質及特性的胺基酸。產生之數個突變體，即Q11E、Y12F、M17L、Q22E、D74E、D74Q、D74N、K81R、W142H、W142F以及W142Y。
藉由使用絲胺酸殘基取代半胱胺酸殘基來破壞IL-7二硫鍵，導致置換C2S-C141S+C34S-C129S(突變體稱為“SS1”)或C2S-C141S+C47S-C92S(突變體稱為“SS2”)，或C47S-C92S+C34S-C129S(突變體稱為“SS3”)。
表1.第1A圖、第1B圖及第1C圖中的ED50測定係指達到與CD127受體結合的50%所需的濃度。每個表代表一個不同的實驗，可與陽性對照IgG4 G4S3 IL7WT進行比較。
| 樣品 | EC50 ng/mL |
| IgG4 G4S3 IL7 WT | 18.4 |
| IgG4 G4S3 IL7 Q11E | 18.49 |
| IgG4 G4S3 IL7 Y12F | 22.27 |
| IGG4 G4S3 IL7 M17L | 20.96 |
| IGG4 G4S3 IL7 Q22E | 17.44 |
| IgG4 G4S3 IL7 D74E | 103.94 |
| IgG4 G4S3 IL7 K81R | 20.18 |
| IgG4 IL7 G4S3 W142F | 34.86 |
| IgG4 G4S3 IL7 W142H | 136.32 |
| IGG4 G4S3 IL7 W142Y | 44.6 |
表2.相對於突變的IL-7，WT與CD127受體的結合。藉由Biacore對融合的抗PD-1 IL-7對CD127的親和力評估。使用兩態反應模型進行分析。
| 樣品 | Ka(1/Ms) | Kd2(1/s) | KD(M) |
| IgG4 Fc G4S3 IL-7 WT | 5.76E+06 | 1.22E-04 | 4.14E-11 |
| IgG4 Fc G4S3 IL-7 W142H | 5.02E+05 | 2.56E-03 | 5,68E-08 |
| IgG4 Fc G4S3 Fc IL-7 SS2 | 6.11E+05 | 1.55E-03 | 7.22E-09 |
| IgG4 Fc G4S3 Fc IL-7 SS3 | 1962 | 6.02E-4 | 1,36E-6 |
表3.相對於突變的IL-7，WT與CD132受體的結合。藉由Biacore對CD132上複合的CD127+IgG融合的IL-7進行親和力評估。使用穩態反應模型進行分析。
| 樣品 | KD CD132 |
| IgG4 alone | 2.50E-06 |
| IgG4 G4S3 IL-7 WT | 1.18E-07 |
| IgG4 Fc G4S3 IL-7 W142H | 5.72E-07 |
| IgG4 Fc G4S3 Fc IL-7 SS2 | 3.10E-06 |
表4.由第2A圖、第2B圖及第2C圖確定的ED50係指對於每個抗PD-1 IL-7分子，在其測定中達到pSTAT5訊息傳導的50%所需的濃度。每個表代表使用不同供體的不同實驗，並且每個表都可以與陽性對照IgG4 G4S3 IL7WT進行比較。
| 樣品 | EC50 ng/mL | ||
| IgG4 G4S3 IL7 WT | 76 | ||
| IgG4 IL7 Q11E | 77 | ||
| IgG4 G4S3 IL7 Y12F | 66 | ||
| IGG4 G4S3 IL7 M17L | 128 | ||
| IGG4 G4S3 IL7 Q22E | 84 | ||
| IgG4 G4S3 IL7D74E | 389 | ||
| IgG4 G4S3 IL7 K81R | 79 | 樣品 | EC50 ng/mL |
| IgG4 G4S3 IL7 W142F | 102 | IgG4 G4S3 IL7 WT | 0.52 |
| IgG4 G4S3 IL7 W142H | 861 | IgG4 G4S3 IL7 SS2 | 2401 |
| IgG4 G4S3 IL7 W142Y | 208 | IGG4 G4S3 IL7 SS3 | 4348 |
表5.Cmax、曲線下面積及第3圖的半衰期測定。在注射抗PD-1 IL7後15分鐘的時間點計算Cmax。注射抗PD-1 IL-7後的0~144小時計算AUC。
| 樣品 | 獲得的Cmax (nM) | 曲線下面積(AUC) |
| IgG4 G4S3 IL7 WT | 13.22 | 121.4 |
| IgG4 G4S3 IL7D74E | 89.19 | 151.9 |
| IgG4 G4S3 IL7 W142F | 98 | 未定 |
| IgG4 G4S3 IL7 W142H | 141 | 248.2 |
| IgG4 G4S3 IL7 W142Y | 70 | 未定 |
| IgG4 G4S3 SS2 | 69.9 | 361.6 |
| IgG4 G4S3 SS3 | 140.6 | 466.5 |
IL7序列中一個胺基酸的取代並未改變其結合PD-1受體的能力(第1A圖、第1B圖及第1C圖)。然而，這些突變修飾了其生物學活性，如離體T細胞測定法中CD127結合和pSTAT5訊息傳導所示(第2圖、第3圖以及表1和4)。突變D74E及W142H是降低T細胞中IL-7與CD127的結合以及pStat5活化的最有效突變(第2A圖、第2B圖及第3A圖、第3B圖以及表1和5)。在另一實驗中，分析了二硫鍵破壞的影響(第2C圖)。在高濃度(10μg/ml)下，SS2或SS3能夠活化T淋巴細胞中的pStat5，與IL-7 WT的3log偏差(第2C圖及表4)。
為了證實這些突變體的結合能力，進行了Biacore測定以確定KD(受體與其抗原之間的平衡解離常數，參見表2)。突變體SS2和W142H對CD127的親和力較低，KD接近7至57nM；SS3突變體對CD127的親和力最低，KD接近3µM。還評估了對CD132受體的親和力，如表3所示。在此實驗中，由於在沒有IL-7的情況下CD127與CD132二聚化，因此單獨使用IgG4作為基線KD親和力；IL-7突變體W142H與CD132結合，但親和力比IgG IL-7 WT高5倍。此數據表明，突變W142H降低了與CD127的結合，並使IL-7的結合朝向CD132受體重新定向，進而導致T細胞中pSTAT5活化的喪失，如第2圖所示。相較之下，發明人在測試的條件下觀察到SS2突變體失去了與CD132受體結合的能力，這表明SS2突變體比CD132受體優先結合CD127，進而導致T細胞中pSTAT5活性降低(第3圖)。
為了確定體內抗PD-1 IL-7的藥代動力學/藥效學，給小鼠靜脈內注射一劑IgG-IL-7(34.4nM/kg)，藉由特異性針對人IgG的ELISA分析血漿藥物濃度。第3圖及表5顯示IgG4 IL-7 WT分子具有快速分佈，因為獲得的Cmax(注射後15分鐘的最大濃度)比理論濃度低30倍。所有測試的W142Y、W142F、W142H突變體均表現出更好的分佈特徵，其Cmax比IL-7 WT高5至10倍(第3A圖及表5)。W142H突變體表現出最好的Cmax；抗PD-1 IL-7 D74E突變體也顯示出良好的Cmax。突變體SS2及SS3表現出最佳的PK曲線，Cmax比IL-7 WT高7至13倍，並且線性曲線良好。同時，確定了AUC(曲線下的面積，表5及第4D圖)，由AUC可深入了解藥物暴露的程度及其從體內的清除率。這些數據證明IL-7突變體的AUC增加，這意味著IL-7突變體具有改善的藥物暴露。如第4D圖所示，發明人觀察到藥物暴露與突變體的IL-7效力相關(藉由pSTAT5 EC50測量)。綜上所述，IL-7的親和力與產物的藥代動力學相關；IL-7與其受體CD127及CD132的親和力降低，會改善IL-7雙官能分子在體內的吸收和分佈。
實施例2.在IgG的C端結構域添加半胱胺氨酸降低IL7分子的柔性並改善體內藥代動力學
另測試了在IgG的C端結構域添加半胱胺酸以產生額外的二硫鍵並潛在地限制IL-7分子的柔性，其突變體被命名為“C-IL-7”。由第5圖所示，與抗PD-1 IL7 WT雙官能分子相比，在IgG結構中添加二硫鍵會降低IL-7的pSTAT5活性(第5A圖)並在體內藥代動力學分析中提高Cmax(5倍，第5B圖)。
實施例3.用IgG1N298A同種型建構的抗PD-1 IL-7突變體在體內可更好的與IL-7R結合、更高的pSTAT5訊息傳導及良好的藥代動力學特徵
使用IgG4m(S228P)或IgG1m測試抗PD-1 IL-7雙官能分子不同之同種型(N298A或N297A取決於編號方法)。IgG4同種型包含S228P突變以防止體內Fab臂交換，而IgG1同種型包含N298A突變，其突變可廢除IgG1同種型與FcγR受體的結合，進而減少免疫細胞因子的非特異性結合(突變體名為“IgG4m”或“IgG1N298A”)。接著，建構具有2種不同之同種型的抗PD-1 IL-7雙官能分子，即N297A同種型(稱為IgG1m)及IgG4 S288P同種型(稱為IgG4m)突變的IgG1，以確定同種型結構是否改變了IL-7的生物學活性及其藥代動力學特徵。
第6A圖及第6B圖證明了使用IgG4m或IgG1m同種型建構的抗PD-1 IL7雙官能分子與PD-1受體具有相同的結合特性，表明其同種型不會改變VH和VL的構型以及抗PD-1抗體對PD-1的親和力。然而，發明人觀察到，IgG1m同種型出乎意料地改善了IL-7 D74、SS2以及輕微SS3在CD127上的結合(第7A圖、第7B圖、第7C圖及第7D圖)以及對人PBMC的pSTAT5活性(第8A圖、第8B圖及第8C圖)。對於另一種T細胞系(表達PD-1及CD127的Jurkat細胞，請參見第8D圖)上的SS2突變體，pSTAT5訊息傳導的這種增加得到了證實，但是以令人驚訝的是，IgG1m同種型並未改變抗PD-1 IL-7 WT雙官能分子的pSTAT5活性，提示IgG1m同種型只能提高IL-7突變體的活性。為了確定包含抗PD1抗體和IL7突變體的雙官能分子重新活化TCR介導的訊息傳導能力，進行了NFAT生物測定。如第9A圖所示的結果表明，雙官能分子比抗PD1或抗PD1+rIL7(作為分離的化合物)更好地活化TCR介導的訊息傳導(NFAT)，證明了雙官能分子對PD1+ T細胞的協同作用。接下來，發明人評估了包含抗PD-1抗體以及由IgG4m與IgG1m同種型建構的IL-7突變體(具有突變D74E、W142H或SS2)的雙官能分子的協同能力(第9B圖、第9C圖、第9D圖)。所有測試的突變體均以活化水平與其活化pSTAT5訊息的能力相關的活化水平保留了對NFAT訊息的協同作用，特別是對於具有IgG4m的IL-7 D74E的雙官能分子。
小鼠體內的藥代動力學研究表明，IgG1同種型不會改變IL7WT和SS3分子的藥物暴露，並對W142H分子的影響極小(第10A圖)。總而言之，這些數據表明優化的同種型(IgG1m)足以增強突變體的生物學活性，同時在體內保留了其產品的良好藥代動力學。對於IgG1m同種型，另測試了其他IL-7突變體：D74N、D74Q中任一者與D74E+W142H突變的組合。在pSTAT5活化(第9B圖)及藥代動力學(第10B圖)上未觀察到與抗PD-1 IL-7 D74E突變體的差異。
發明人特別測試了包含具有不同胺基酸D74E、D74Q以及D74N取代的IL-7 D74突變體的抗PD-1雙官能分子，這些建構體包含GGGGS連接子及IgG1N298A同種型。如表6所示，與D74E突變體相比，D74Q和D74N突變體使所有建構體具有結合PD-1的相似功效，但是與雙PD-1/CD127的結合降低，提示取代Q及N會稍微削弱突變體對CD127受體的親和力。
表6.ED50測定D74E、D74Q及D74N突變體與PD-1及CD127的結合。ED50(ng/mL)是指藉由ELISA測量達到與PD-1及CD127受體結合的50%所需的濃度。如材料和方法中所述，藉由固定人PD-1受體來測量PD-1結合，以及PD-1/CD127的雙重結合是藉由PD-1的固定與CD127受體的暴露來測量的。所有測試的建構體均包含GGGGS連接子及IgG1 N298A同種型。
| 樣品 | 結合PD-1 (ED50 ng/mL) | 雙重結合PD-1/CD127 (ED50 ng/mL) |
| IgG1m G4S D74E | 6.4 | 4.9 |
| IgG1m G4S D74Q | 5.4 | 15.7 |
| IgG1m G4S D74N | 5.8 | 8.5 |
與W124H IgG1相比，雙突變體D74E+W142H顯示出相似的特徵，且與D74E突變體相比，D74Q表現出相似的特徵。發明人還建構了具有IgG1m同種型+YTE突變的雙官能分子(M252Y/S254T/T256E)。已描述了其突變藉由增加與FcRn受體的結合來增加抗體的半衰期。如第7D圖所示，YTE突變不修飾包含D74或W142H突變體的雙官能分子的pSTAT5訊息傳導。
實施例4.C444賴胺酸殘基突變K444A不影響體內藥代動力學
人類IgG的所有亞類均帶有抗體重鏈(K444)的C端賴胺酸殘基，其可在循環中裂解；血液中的這種裂解可能會藉由釋放與IgG相連的IL-7而損害免疫細胞因子的生物活性。為了避免此問題，將IgG結構域中的K444胺基酸替換為丙胺酸以減少蛋白水解裂解，通常用於抗體的突變。如第11圖所示，在IgG WT IL-7與IgG K444A IL-7之間獲得了相似的曲線，表明其突變不影響藥物的藥代動力學特徵。
實施例5.IgG抗體之間的連接子不會改變體內藥代動力學，但可以改善pSTAT5訊息傳導的活性
測試了IgG Fc結構域及IL-7m之間的不同連接子，以改變柔性。測試了幾種條件(例如無連接子、GGGGS、GGGGSGGGS、GGGGSGGGGS、GGGGSGGGGSGGGGS)。
對於實施例1及2，在Fc的C端結構域及IL-7的N端結構域之間的連接子(G4S)3
分別用於IgG4m-IL7及IgG1m-IL-7建構體，其連接子允許高度的靈活性及IL7活化訊息的改善。為了降低IL7對CD127的親和力並改善藥代動力學，使用不同的連接子長度測試了不同的結構(無連接子、G4S、(G4S)2
或(G4S)3
)。為了比較，還用各種連接子產生了IgG1m或IgG4mFc IL-7 WT。
藥代動力學研究表明，對於所測試的結構，連接子的長度對產品的分佈、吸收及消除沒有影響：抗PD-1 IL7 WT(第12A圖)、抗PD-1 IL-7 D74(第12B圖)及抗PD-1 IL-7 W142H(第12C圖)。然而，連接子的長度會影響pStat5的活性，如第12D圖所示。實際上，與由(G4S)2
或(G4S)3
連接子建構的抗PD-1 IL-7相比，由連接子(G4S)3
建構的抗PD-1 IL7在活化pSTAT5訊息傳導方面更有效，並與沒有連接子構建的抗PD-1 IL-7相比，甚至更有效。這些數據強調了使用(G4S)3
連接子以允許IL-7的柔性而不損害藥物在體內的藥代動力學。
實施例6.抗PD-1 IL-7突變體比PD-1-CD127+細胞更能優先結合PD-1+ CD127+細胞
接下來，發明人評估了抗PD-1 IL-7雙官能分子標靶PD-1+ T細胞的能力。表達CD127+或共表達CD127+和PD-1+的Jurkat細胞以45nM的下述雙官能分子染色：抗PD-1 IL-7 WT、D74、W142H、SS2以及SS3。用抗IgG-PE(iolegend, clone HP6017)檢測結合，並藉由流式細胞儀分析。
結果：第13圖顯示抗PD-1 IL-7 WT及D74突變體與PD-1+/CD127+細胞的結合效果與PD-1-/CD127+細胞相似，而抗PD-1 IL-7突變體SS2、SS3與PD-1+/CD127+細胞的結合效率是PD-1-/CD127+細胞的2至3倍。抗PD-1 IL-7 W142H雙官能分子顯示出中間作用，並與PD-1+/CD127+細胞結合有1.4倍的更高功效。
為了證實異種細胞模型中抗PD-1 IL-7突變體對PD-1+ T細胞的特異性標靶，本發明人接下來將PD-1(+)細胞及PD-1(-)細胞混合並分析了它們在每個細胞亞群上的結合。在其測定中，將共表達人類CD127+的CHO細胞和人類PD-1+細胞與僅表達CHO的人類CD127+受體按1：1比例共培養(第14A圖)，然後用遞增劑量的雙官能抗PD-1 IL-7突變體D74E、W142H、SS2以及SS3分子、單獨的抗PD-1或無關的同種型IL-7抗體進行染色。用抗IgG-PE(Biolegend, clone HP6017)揭示結合，並藉由流式細胞儀分析，以確定每種建構體及每個PD-1(+)及PD-1(-)細胞群體的EC50(nM)結合力(第14B圖)。無關的同種型IL-7作為陰性對照，證明與PD-1(-)細胞具有同等的結合力。儘管在此共培養實驗中，所有雙關能抗PD-1 IL-7分子都優先結合PD-1(+)細胞而不是PD-1(-)細胞，但發明人觀察到IL-7突變改善了分子在PD-1+細胞上的選擇性順式結合。如第14B圖所示，與抗PD-1 IL-7野生型相比，抗PD-1 IL-7 W142H、SS2及SS3突變體在PD-1(-)CD127(+)細胞上顯示出強烈減弱的結合，而抗PD-1 IL-7突變體在與抗PD-1 IL-7野生型相似的PD-1(+)CD127(+)細胞上保留了有效的結合(EC50〜300pM)。較佳地，抗PD-1 IL-7 W142H及SS3突變體顯示出最高的選擇性活性，PD-1(+)細胞與PD-1(-)細胞之間的結合分別為62倍及311倍。
綜上所述，這些數據表明II-7突變不僅允許更好的藥物藥代動力學，而且還允許IL-7優先結合在PD-1+細胞上，即將藥物標靶同一細胞。這方面對藥物在體內的生物學活性感興趣，因為抗PD-1 IL-7會將IL-7集中在PD-1+CD127+衰竭T細胞上，而不是CD127+初始T細胞上的腫瘤微環境。
實施例7.抗PD-1 IL-7突變型雙官能分子可優先活化PD-1+細胞上的IL7R，並協同促進人類活化T細胞的增殖。
實施例7.抗PD-1 IL-7突變型雙官能分子可優先活化PD-1+細胞上的IL7R，並協同促進人類活化T細胞的增殖。
在混合U937 PD-1(+)CD127(+)及PD-1(-)CD127(+)細胞的共培養模型中也測試IL-7R訊息活性(pSTAT5)。U937細胞也表達了轉導IL-7R訊息所需的內源性CD132受體(第15A圖)。pSTAT5訊息數據表明，PD-1 IL-7突變體W142H、SS2以及SS3在PD-1(+)細胞中具有比PD-1(-)細胞中更高的選擇性活性。在具有包含抗IL7突變體的抗PD-1雙官能分子與包含IL-7野生型的抗PD-1雙官能分子的PD-1(-)細胞中觀察到活性降低了10至50倍(第15B圖)。雖然在PD-1(-)細胞中誘導了非常低的pSTAT5活性，但在PD-1(+)細胞中獲得的包含IL-7突變體的抗PD-1雙官能分子的恢復活性與EC50 pSTAT5活性接近10pM的重組IL-7野生型細胞因子相似；較佳地，與PD-1-細胞相比，W142H突變體在PD1+細胞中具有超過450倍的結合/活性。
由於非常有利地設計了抗PD-1 IL-7雙官能分子，尤其是標靶PD-1(+)CD127(+)衰竭T細胞，因此發明人接著分析了抗PD-1 IL-7 W142H雙官能分子優先活化pSTAT5訊息轉導及增殖至原代人類衰竭T細胞的能力。為了產生PD-1(+)CD127(+)衰竭T細胞，對人類外周血T細胞進行體外重複刺激(αCD3/αCD28)，以模擬在腫瘤微環境中發生的慢性抗原刺激。
為了評估雙官能抗PD-1 IL-7分子對PD-1(+)T細胞的標靶作用，將衰竭T細胞與高濃度的抗PD-1競爭性抗體培養，以阻斷抗PD-1 IL-7雙官能分子的抗PD-1部分的結合。於培養後，用抗PD-1 IL-7 W142H雙官能分子或重組IL-7野生型細胞因子處理衰竭T細胞，接著藉由流式細胞儀定量pSTAT5的活性。計算了兩個條件(PD-1阻斷與非阻斷同種型)之間的pSTAT5活化率(EC50)，並在第16A圖中示出。非標靶IL-7重組細胞因子在本實驗中用作陰性對照，並且獲得其比例為1，顯示非標靶IL-7在PD-1(+)以及PD-1(-)T細胞中的活性相似。用抗PD-1 IL-7 W142H分子處理後，獲得了顯著的差異活性(活性降低2至4倍)，提示其分子比PD-1(-)衰竭T細胞優先允許IL-7R訊息傳導至PD-1(+)衰竭原代T細胞的順式活化。
此外，本發明人證明了抗PD-1 IL-7 W142H的特異性順式標靶可以使衰竭T細胞在體外協同增生，而兩種分離的藥物(抗PD-1抗體+同種型IL-7W 142H)誘導了衰竭T細胞的增殖刺激顯著降低(第16B圖)。綜上所述，這些數據證實了包含突變的IL-7 W142H分子及抗PD-1抗體的雙官能分子能夠選擇性及協同作用地活化PD-1(+)CD127(+)衰竭T細胞。
實施例8.具有一個IL-7 W142H細胞因子及一或兩個抗PD-1臂的抗PD-1 IL-7分子具有促進順式活性進入PD-1+IL-7R+細胞的高效率，並在體內刺激IL-7R T細胞增殖，且具有重新活化TCR訊息傳導的協同能力。
接著，發明人設計並比較如第17圖所示的包含一或兩個抗PD-1結合結構域以及一或兩個IL7 W142H突變體的雙官能分子的多個結構的生物活性。
建構體1包含兩個抗PD-1抗原結合結構域及兩個IL-7 W142H變體(建構體1也稱為抗PD-1*2 IL-7 W142H*2)，其分子對應於實施例1至7中測試的結構，其分子也稱為BICKI-IL-7 W142H。在實施例中，稱為BICKI-IL-7 WT的對照分子對應於建構體1，但具有野生型IL-7。
建構體2包含兩個抗PD-1抗原結合結構域及單個IL-7 W142H變體(建構體2也稱為抗PD-1*2 IL-7 W142H*1)。
建構體3包含單個抗PD-1抗原結合結構域及單個IL-7 W142H變體(建構體3也稱為抗PD-1*1 IL-7 W142H*1)。稱為抗PD-1*1的對照建構體與建構體3相似，但是沒有IL-7變體。
建構體4包含單個抗PD-1抗原結合結構域及兩個IL-7 W142H變體(建構體4也稱為抗PD-1*1 IL-W142H*2)。
用IgG1 N298A同種型改造了建構2、3及4，且為了在重鏈A的CH2及CH3上產生一個旋鈕，並在重鏈B的CH2和CH3上產生一個孔，在Fc部分中對胺基酸序列進行了突變。
如ELISA測定所證實的，所有抗PD-1 IL7建構體均具有對PD-1受體的高親和力(第18A圖及表7)，與沒有IL-7的抗PD-1*2相比，具有2個抗PD-1臂的抗PD-1 IL-7分子(抗PD-1*2)具有相同的結合功效(等於EC50)。相似地，具有1個抗PD-1臂的抗PD-1 IL-7分子(抗PD-1*1 IL7 W142H*1及抗PD-1*1 IL7 W142H*2)與沒有IL-7的抗PD-1*1相比表現出相同的結合功效，抗PD-1 IL7的EC50等於86nM及111nM，抗PD-1的EC50等於238nM。這些數據表明，無論測試的結構如何，IL-7的融合似乎都不會干擾PD-1的結合。
表7.第18A圖中ED50的測定係指藉由ELISA針對每種抗PD-1 IL-7分子測量達到PD-1結合訊息的50%所需的濃度。
| 樣品 | EC50(nM) |
| 抗PD-1*2 | 0.021 |
| 抗PD-1*2 IL7 W142H*1 | 0.026 |
| 抗PD-1*2 IL7 W142H*2 | 0.034 |
| 抗PD-1*1 | 0.238 |
| 抗PD-1*1 IL7 W142H*1 | 0.111 |
| 抗PD-1*1 IL7 W142H*2 | 0.086 |
此外，PD-L1/PD-1拮抗劑生物測定法(第18B圖)證明具有1個或2個抗PD-1臂的抗PD-1 IL7分子顯示出高效率來阻斷PD-L1與PD-1受體的結合。儘管將抗PD-1的一臂從建構體3及4中除去，但所有抗PD-1*1 IL7建構體均顯示出高的拮抗劑特性。與抗PD-1*2 IL7構造相比，針對建構體3及4的EC50計算出活性僅降低了2.5倍(表8)。
表8.由第18B圖確定的ED50係指藉由ELISA針對每種抗PD-1 IL-7分子測量達到PD1/PDL1拮抗劑活性的50%所需的濃度。
| 樣品 | EC50(nM) |
| 抗PD-1*2 IL7 W142H*1 | 2.168 |
| 抗PD-1*2 IL7 W142H*2 | 2.792 |
| 抗PD-1*1 | 5.014 |
| 抗PD-1*1 IL7 W142H*1 | 5.839 |
| 抗PD-1*1 IL7 W142H*2 | 7.235 |
接著，本發明人使用Biacore測定法和ELISA測定法評估了不同建構體對CD127受體的親和力。由於從建構體2及3中除去了一個IL-7分子，與IL-7異二聚體建構體相比，這些分子與CD127受體的結合能力較低，而pSTAT5活化預計較低。然而，發明人觀察到，與抗PD-1*2 IL-7 W142H*2(BICKI-IL-7 W142H)相比，抗PD-1*2 IL-7 W142H*1分子與CD127受體具有相似的親和力，且與包含IL-7野生型形式的抗PD-1 IL7雙官能分子相比，親和力較低(第19A圖及表9)。令人驚訝地，抗PD-1*2IL7W142H*1分子表現出高的pSTAT5活性，類似於包含IL-7野生型形式的PD-1IL7雙官能分子(第19B圖)。基於這些觀察，可以假設IL-7的單體形式與W142H IL-7突變相結合可以使IL-7分子達到最佳構象，進而促進IL-7訊息轉入人類T細胞。即使只有一種IL7，具有W142H IL-7突變的分子也具有與具有兩種細胞因子的IL7 WT分子一樣好的活化作用(pSTAT5)。在其受體的親和力低於野生型IL-7的IL-7變體的條件下，其結果是令人驚訝的。
用抗PD-1 IL7分子得到相似的結論，所述抗PD-1 IL7分子的一個抗PD-1臂與一個IL-7 W142H突變體融合。使用抗PD-1*2 IL-7WT*2構件體、抗PD-1*2 IL-7 W142H*1構件體以及抗PD-1*1 IL-7 W142H*1構件體獲得了相似且較高的pSTAT5活性(第19C圖)。
表9.使用1或2個IL7建構的抗PD 1 IL 7野生型或抗PD1 IL7 W142H突變體的結合。將CD127固定在傳感器晶片上，並以遞增劑量添加抗PD-1 IL-7雙官能分子以測量親和力。
| KD CD127(M) | |
| 抗PD-1*2 IL7 wild type*2 | 8.7 E-10 |
| 抗PD-1*2 IL7 W142H*2 | 3.73 E-8 |
| 抗PD-1*2 IL7 W142H*1 | 4.52 E-8 |
進行體內實驗以確定不同的抗PD-1 IL-7建構物的功效。將一劑抗PD-1 IL-7分子以相等的莫耳濃度(34nM/kg)注射到小鼠體內，在處理後的第4天，使用Ki67標記藉由流式細胞儀對CD4和CD8 T細胞的增殖進行定量。第20圖顯示具有單個W142H突變體(抗PD-1*2 IL-7 W142H*1及抗PD-1*1 IL-7 W142H*1)或具有單個PD-1價及兩種IL7 W142H細胞因子(抗PD-1*1IL7W142H*2)在促進CD8和CD4 T細胞的增殖方面顯示出高效率。
為了確定包含抗PD1抗體(一種或兩種價)以及一種或兩種IL7突變型細胞因子的雙官能分子重新活化TCR介導的訊息傳導能力，進行了NFAT生物測定。第21A圖顯示，與單獨的抗PD-1抗體相比，由2個抗PD-1臂及1個IL-7細胞因子構成的雙官能分子可增強NFAT的活性，證明其藥物增強TCR介導的訊息傳導的協同活性與僅由一種IL-7細胞因子建構的抗PD-1 IL-7雙官能分子是保守的。如第9A圖所示，當使用抗PD1加IL7的組合處理細胞時，沒有這種協同作用。
此外，發明人接著評估了僅設計有一種抗PD-1價的抗PD-1 IL-7分子的活性(抗PD-1*1)，並證明了抗PD-1*1 IL-7 W142H的建構(抗PD-1*1 IL7 W142H*1及*2)保留了它們的協同活性，而PD-1*1+同種型IL-7 W142H*2的組合治療在刺激TCR訊息傳導(NFAT活化)方面顯示出較小的功效(第21B圖)。
最後，在共培養測定法中分析了不同抗PD-1 IL-7建構物的特異性順式標靶及順式活性。將U937 PD-1+CD127+細胞與PD-1-CD127+細胞混合(比例1：1)，然後以遞增劑量將其與不同的建構體一起培養，藉由流式細胞儀定量結合及IL-7R訊息轉導(pSTAT5)。對於每種建構體以及每個PD-1+和PD-1-細胞群體，確定結合及pSTAT5活化的EC50(nM)(第22A圖及第22B圖)。發明人證實了抗PD-1 IL-7突變分子的多樣性(抗PD-1*2 IL7 W142H*1、抗PD-1*1 IL7 W142H*1以及抗PD-1*1 IL7 W142H*2)優先將IL-7R結合至PD-1+細胞中，並藉由IL7R訊息活化pSTAT5進入PD-1+細胞，進而形成不同的代表性結構。
實施例9.由1或2個抗PD-1臂以及1或2個IL7 W142H細胞因子組成的抗PD-1 IL-7分子在體內具有良好的藥代動力學特徵
評估了抗PD-1 IL-7雙官能分子結構2、3及4的藥代動力學研究，如第17圖所示。向人源化的PD1 KI小鼠腹膜內注射一劑抗PD-1 IL-7分子(34.4nM/kg)，藉由特異性針對人類IgG的ELISA分析血漿藥物濃度(第23圖)，且計算了曲線下的面積(見表10)，並表示每種結構在整個時間內的總藥物暴露量。與抗PD-1*2 IL7 WT*1相比，抗PD-1*2 IL-7 W142H*1、抗PD-1*1 IL-7 W142H*1以及抗PD-1*1 IL-7 W142H*2建構體顯示了非常有利的增強的PK特徵。與抗PD-1*1 IL7 WT*2相比，觀察到的Cmax高出2.8至19倍。重要的是，用抗PD-1*1 IL7 W142H*1、抗PD-1*1 IL7 W142H*2分子維持相當於體內令人滿意的PK值的高藥物濃度(11-15nM)至少96小時，而在血漿中僅檢測到2nM的抗PD-1*2 IL7WT*2分子，抗PD-1*2 IL-7 W142H*1的殘留藥物濃度是抗PD-1*2 IL7WT*2濃度的2.5倍。血漿藥物暴露通常與體內功效相關；在此，發明人證明了用抗PD-1的一個臂建構的所有抗PD-1 IL-7 W142H分子允許在單次注射後長期暴露於藥物，此表明這些建構體將在體內誘導更高的生物學活性。
表10.根據第23圖確定曲線下的面積。在腹膜內注射一劑抗PD-1 IL-7(34nM/kg)後0至96小時計算AUC。
| AUC | Cmax(nM) | |
| 抗PD1*1 IL7W142H*1 | 1597 | 42.4 |
| 抗PD-1*1 IL7W142H*2 | 2024 | 248.6 |
另也提及，即使與IL7 W142H相比，某些具有IL7野生型的分子PD-1*2 IL7WT*2也可能具有良好的PK(特別是對於靜脈注射)，具有IL7 W142H的分子具有更好的其他性能：T細胞的增殖更好(如第20圖所示的CD4、CD8)、PD1+細胞的特異性標靶性要好於PD1-細胞(如第15B圖解釋的10至50倍)。
綜上所述，已獲得了多個具有突變的IL7(特別是W142H)的雙官能分子建構體，具有非常令人滿意的有效藥物使用的PK(較佳為24小時後至少為10nM)，且進一步具有：
對LT增殖有實質性的有利影響；
由於雙官能分子的抗PD1部分與雙官能分子的IL7部分之間對T細胞具有協同出乎意料的協同作用，因此藉由IL7R將pSTAT5訊息傳導至PD-1+細胞實現了LT活化方面的高性能；
對PD1+ T細胞和PD1- T細胞的高特異性標靶(遠高於沒有突變的IL7的雙官能分子)，且與PD-1- T細胞相比，向PD-1+衰竭原代T細胞中IL-7R訊息的順式活化，這對於腫瘤治療是一個很大的優勢；以及
PD-1/PD-L1相互作用的有效拮抗作用(不僅限於與PD1的結合)。
材料及方法
ELISA
結合
PD1
為了進行活性ELISA分析，將重組hPD1(Sino Biologicals, Beijing, China; reference 10377-H08H)以0.5μg/ml的濃度固定在碳酸鹽緩衝液(pH9.2)中的塑料上，並加入純化的抗體以測量結合。培養及洗滌後，加入過氧化物酶標記的驢抗人IgG(Jackson Immunoresearch; USA; reference 709-035-149)，並藉由常規方法揭示(reveal)。
使用
Biacore
方法進行親和力測量
藉由Biacore評估與重鏈上的IL-7融合的IgG對CD127(A)或CD132(B)的親和力。將CD127(Sinobiological, 10975-H03H-50)以20μg/ml的濃度固定在CM5生物晶片上，並以系列濃度(0.35、1.1、3.3、10、30nM)添加指定蛋白質，使用兩種狀態反應模型分析親和力。為了評估IL-7對CD132的親和力，將CD127固定在CM5生物晶片上，並以30nM的濃度注射每種IL-7建構體，加入CD132受體(Sinobiological 10555-H08B)的濃度不同，例如31.25、52.5、125、250、500nM，使用穩態親和力模型進行分析。
CD127
結合
ELISA
藉由夾心(sandwich)ELISA方法評估CD127結合。固定由抗體骨架標靶的重組蛋白，接著培養與CD127重組蛋白(組胺酸標記，Sino ref 10975-H08H)預培養的融合IL-7的抗體。用與生物素耦合的抗組胺酸抗體(MBL＃D291-6)及與過氧化物酶耦合的鏈黴親和素(JI 016-030-084)的混合物進行揭示。使用TMB基質在450nm處進行比色。
pSTAT5
分析
從人類健康志願者的外周血中分離出的PBMC與重組IL-7或IgG融合的IL-7培養15分鐘。為了確定順式活性，將用CD127+PD-1+轉導的U937細胞與僅用CD127+轉導的U937細胞混合，以1：1的比例混合細胞，並用重組IL-7或與本發明所述的IL-7建構體融合的不同IgG處理。共培養前，將每個細胞亞群用細胞增殖染料(CPDe450或CPDe670)標記，接著將細胞固定、透化並用AF647標記的抗pSTAT5(clone 47/Stat5(pY694))染色，藉由計算CD3+ T細胞群體中的MFI pSTAT5獲得數據。
細胞結合分析
為了確定與IL-7分子融合的IgG的順式結合，將CD127+PD-1+轉導的U937或CHO細胞與僅CD127+轉導的CHO或U937混合，以1：1的比例混合細胞，並用與本發明所述的IL-7建構體融合的不同IgG進行處理；共培養前，將每個細胞亞群用細胞增殖染料(CPDe450或CPDe670)標記，培養20分鐘後，用抗IgG-PE抗體(Biolegend, clone HP6017)檢測不同IgG融合分子的結合，並藉由流式細胞儀進行分析。
IgG
融合的
IL-7
在體內的藥代動力學
為了分析IL-7免疫細胞因子的藥代動力學，將單劑量的分子經眶內或腹膜內注射給BalbcRJ小鼠(雌性6-9週)或C57bl6JrJ小鼠(雌性6-9週)。使用含有IgG融合的Il67的固定化抗人輕鏈抗體(clone NaM76-5F3)稀釋的血清通過ELISA測定血漿中的藥物濃度。使用過氧化物酶標記的驢抗人IgG(Jackson Immunoresearch; USA; reference 709-035-149)進行檢測，並藉由常規方法進行揭示。
使用基於
Promega
細胞的生物測定法進行
T
細胞活化測定
使用Promega PD-1/PD-L1試劑盒(參考J1250)測試了抗PD-1抗體恢復T細胞活性的能力。使用了兩種細胞系(1)效應T細胞(Jurkat穩定表達PD-1，NFAT誘導的螢光素酶)以及(2)活化標靶細胞(CHO K1細胞穩定表達PDL1和表面蛋白)，旨在刺激抗原中的同源TCRs-獨立的方法)。共培養細胞時，PD-L1/PD-1相互作用抑制TCR介導的活化，進而阻斷NFAT活化以及螢光素酶活性。抗PD-1抗體的添加阻斷了PD-1介導的抑制訊息，導致NFAT活化與螢光素酶合成以及生物發光訊息的發射。根據製造商的建議進行實驗，測試了PD-1抗體的系列稀釋液；將PD-L1+標靶細胞、PD-1效應細胞以及抗PD-1抗體共培養4小時後，將BioGloTM螢光素基質添加至孔中，並使用TecanTM
發光計讀取平板。
體內增殖
將單劑量的雙功能分子(34nM/kg)腹膜內注射至帶有皮下MC38腫瘤的C57bl6JrJ小鼠(雌性6-9週)中。治療後第4天，收集血液中的MC38腫瘤，並用抗CD3、抗CD8、抗CD4抗體以及抗ki67抗體對T細胞進行染色，以藉由流式細胞儀量化增殖。
抗體及雙官能分子
以下抗體及雙官能分子已用於本發明揭露的不同實驗中：Pembrolizumab(Keytrudra, Merck)、Nivolumab(Opdivo, Bristol-Myers Squibb)以及本發明揭露的雙官能分子，其包含抗PD-1人源化抗體，所述抗PD-1人源化抗體包含如SEQ ID NO：24所定義的可變重鏈(VH)以及如SEQ ID NO：28所定義的可變輕鏈(VL)，或包含抗PD-1嵌合抗體，其包含如SEQ ID NO：71所定義的重鍊及如SEQ ID NO：72所定義的輕鏈。
建構體1包含兩個抗PD-1抗原結合結構域及兩個IL-7 W142H變體(建構體1也稱為抗PD-1*2 IL-7 W142H*2)，所述分子對應於實施例1至7中測試的結構，所述分子也稱為BICKI-IL-7 W142H；較佳地，建構體1包含如SEQ ID NO：24所定義的可變重鏈(VH)及如SEQ ID NO：28所定義的可變輕鏈(VL)，或包含抗PD-1嵌合抗體，其包含如SEQ ID NO：71所定義的重鍊及如SEQ ID NO：72所定義的輕鏈。所述分子還包含IL7變體，例如SEQ ID No：5。
在實施例中，稱為BICKI-IL-7 WT的對照分子對應於建構體1，但具有野生型IL-7；其包含如SEQ ID NO：24所定義的可變重鏈(VH)及如SEQ ID NO：28所定義的可變輕鏈(VL)。所述分子具有IgG4 S288P同種型。
另一個對照分子是抗PD1*2(無任何IL7)，所述分子包含如SEQ ID NO：79所定義的重鍊及如SEQ ID NO：80所定義的輕鏈。
建構體2包含兩個抗PD-1抗原結合結構域及單個IL-7 W142H變體(建構體2也稱為抗PD-1*2 IL-7 W142H*1)，較佳地，建構體2包含如SEQ ID NO：24所定義的可變重鏈(VH)及如SEQ ID NO：28所定義的可變輕鏈(VL)；所述分子特別包含結合至如SEQ ID NO：83定義的IL-7 W142H的重鏈(孔)或如SEQ ID NO：81定義的重鏈(旋鈕)，以及如SEQ ID NO：80定義的輕鏈。
建構體3包含單個抗PD-1抗原結合結構域和單個IL-7 W142H變體(建構體3也稱為抗PD-1*1 IL-7 W142H*1) ，較佳地，建構體3包含如SEQ ID NO：24所定義的可變重鏈(VH)及如SEQ ID NO：28所定義的可變輕鏈(VL)；所述分子包含結合至如SEQ ID NO：83所定義的IL-7 W142H的重鏈、如SEQ ID NO：75所定義的Fc區，以及如SEQ ID NO：80所定義的輕鏈。
稱為抗PD-1*1的對照建構體與建構體3相似，但是不含IL-7變體，這樣的對照包含如SEQ ID NO：24所定義的可變重鏈(VH)及如SEQ ID NO：28所定義的可變輕鏈(VL)；所述分子包含如SEQ ID NO：81所定義的重鏈、如SEQ ID NO：75所定義的Fc區，以及如SEQ ID NO：80所定義的輕鏈。
建構體4包含單個抗PD-1抗原結合結構域及兩個IL-7 W142H變體(建構體4也稱為抗PD-1*1 IL-W142H*2)，較佳地，建構體4包含如SEQ ID NO：24所定義的可變重鏈(VH)及如SEQ ID NO：28所定義的可變輕鏈(VL)；所述分子包含與如SEQ ID NO：83所定義的IL-7 W142H結合的重鏈、如SEQ ID NO：76所定義的IL-7 W142H結合的Fc區，以及如SEQ ID NO：80所定義的輕鏈。
用IgG1 N298A同種型改造了建構體2、3及4，並在Fc部分突變了胺基酸序列，以便在重鏈A的CH2和CH3上創建一個旋鈕，以及在重鏈B的CH2和CH3上創建一個孔。所有抗PD-1 IL-7和抗PD-1*1結構均包含：IgG1N298A突變的同種型，但抗PD-1*2結構除外(缺少IL-7)；以及使用IgG4 S288P同種型構建的抗PD-1*2 IL7wt*2(BICKI-IL-7 WT)。
無
第1圖係為PD-1結合之ELISA試驗。將人類重組PD-1(rPD-1)蛋白固定並添加不同濃度之抗體，使用與過氧化物酶耦合的抗人類Fc抗體進行揭示(revelation)，並使用TMB基質在450nm處進行比色。A. PD-1與包含抗PD-1抗體且在胺基酸D74、Q22、M17、Q11、K81上發生IL-7突變的雙官能分子結合；B. PD-1與包含在胺基酸W142上發生IL-7突變的雙官能分子結合；C. PD-1與在IL-7的二硫鍵發生突變(SS1、SS2以及SS3突變體)的雙官能分子結合。該圖中試驗的所有分子均在Fc結構域及IL-7結構域之間具有IgG4m同種型及GGGGSGGGGSGGGGS連接子。
第2圖係為IgG融合突變IL-7的CD127結合之ELISA試驗。將PD-1重組蛋白固定在板上，接著將雙官能抗PD-1 IL-7分子與CD127重組蛋白(組胺酸標記，Sino ref 10975-H08H)一起預培養並加至孔中。使用抗組胺酸抗體耦合生物素以及鏈親和素(streptavidin)耦合過氧化物酶之混合物進行揭示，並使用TMB基質在450nm處進行比色。A. CD127與包含在胺基酸D74、Q22、M17、Q11、K81上發生IL-7突變的雙官能分子結合；B. CD127與包含在胺基酸W142上發生IL-7突變的雙官能分子結合。
第3圖係為藉由STAT5磷酸化測定不同雙官能分子之IL-7R訊息傳導途徑。從健康志願者之外周血中分離出的PBMC與雙功能抗PD-1 IL-7分子培養15分鐘，接著將細胞固定、透化並用AF647標記的抗pSTAT5(clone 47/Stat5(pY694))染色，藉由計算CD3 T細胞中的MFI pSTAT5獲得數據。A. 包含在胺基酸D74、Q22、M17、Q11、K81上發生IL-7突變的雙官能分子的pSTAT5活化；B. 包含在胺基酸W142上發生IL-7突變的雙官能分子的pSTAT5活化；C. 抗PD-1 IL-7 WT(灰●)的pSTAT5活化與包含在IL-7、SS2(黑●)以及SS3(▲)的二硫鍵上發生IL-7突變的雙官能分子的pSTAT5活化比較。該圖中試驗的所有分子均在Fc結構域及IL-7結構域之間具有IgG4m同種型及GGGGSGGGGSGGGGS連接子。
第4圖係為抗PD-1 IL-7雙官能分子在小鼠體內的藥代動力學。於小鼠靜脈內注射一劑IgG融合之IL-7野生型或與IgG融合之IL-7突變型，注射後在多個時間點藉由ELISA評估血清中分子的濃度。A. 注射IgG4-G4S3 IL-7 WT(灰■)或IgG4-G4S3 IL-7 D74E(黑●)；B. 注射IgG4-G4S3 IL-7 WT(灰■)或IgG4-G4S3 IL-7 W142H(黑●)；C. 注射IgG4-G4S3 IL-7 WT(灰■)、IgG4-G4S3 IL-7 SS2(●)或IgG4-G4S3 IL-7 SS3(▲)；D. 依據每個分子的PK對ED50 pSTAT5(nM)計算曲線下面積(AUC)之間的相關性。該圖中試驗的所有分子均在Fc結構域及IL-7結構域之間具有IgG4m同種型及GGGGSGGGGSGGGGS連接子。
第5圖係為在抗PD-1及IL-7之間添加二硫鍵可減少pSTAT5活化，同時增加體內藥物暴露。A. 使用抗PD-1 IL-7 WT雙官能分子(灰●)或帶有添加二硫鍵的抗PD-1 IL-7雙官能分子(黑●)處理後，藉由在人類PBMC的pSTAT5活化來測量IL-7R訊息傳導；B. 抗PD-1 IL-7 WT雙官能分子(灰●)或具有添加二硫鍵的抗PD-1 IL-7雙官能分子(黑●)在小鼠中的藥代動力學。於小鼠靜脈內注射一劑抗PD-1 IL-7雙官能分子，注射後在多個時間點藉由ELISA評估血清中分子的濃度。該圖中試驗的所有分子均在Fc結構域及IL-7結構域之間具有IgG4m同種型及GGGGSGGGGSGGGGS連接子。
第6圖係為PD-1結合之ELISA試驗。將人類重組PD-1(rPD-1)蛋白固定並添加不同濃度之抗體，使用與過氧化物酶耦合的抗人類Fc抗體進行揭示(revelation)，並使用TMB基質在450nm處進行比色。A. PD-1與具有IgG4m的抗PD-1 IL-7 WT雙官能分子(灰●)、具有IgG1m的抗PD-1 IL-7 WT雙官能分子(黑▲)、具有IgG1m同種型的抗PD-1 IL-7 D74E雙官能分子(■)或具有IgG1m的抗PD-1 IL-7 W142H雙官能分子結合；B. 另一實驗中，PD-1與具有IgG4m同種型的抗PD-1 IL-7 SS2雙官能分子(■)或具有IgG1m的抗PD-1 IL-7 SS2雙官能分子(▲)結合進行測試。
第7圖係為利用IgG1N298A或IgG4同種型構建之抗PD-1 IL-7雙官能分子的CD127結合之ELISA試驗。藉由抗體框架固定以標靶重組蛋白，接著將與IL-7融合之抗體與CD127重組蛋白(Histidine tagged, Sino ref 10975-H08H)進行預培養，使用抗組胺酸抗體耦合生物素以及鏈親和素耦合過氧化物酶之混合物進行揭示，並使用TMB基質在450nm處進行比色。A. CD-127與具有IgG4m同種型的抗PD-1 IL-7 W142H雙官能分子(灰●)、具有IgG1m的抗PD-1 IL-7 W142H雙官能分子(黑▲)或具有IgG1m同種型的抗PD-1 IL-7 WT雙官能分子(黑●)結合；B. CD-127與具有IgG4m同種型的抗PD-1 IL-7 SS2雙官能分子(灰●)、具有IgG1m的抗PD-1 IL-7 SS2雙官能分子(黑▲)或具有IgG1m同種型的抗PD-1 IL-7 WT雙官能分子(黑●)結合；C. CD-127與具有IgG4m同種型的抗PD-1 IL-7 SS3雙官能分子(灰●)、具有IgG1m的抗PD-1 IL-7 SS3雙官能分子(黑▲)或具有IgG1m同種型的抗PD-1 IL-7 WT雙官能分子(黑●)結合；D. CD-127與具有IgG4m同種型的抗PD-1 W142H雙官能分子(黑●)或IgG1m同種型+YTE(灰●)結合，也測試了CD-127與具有IgG1m同種型的抗PD-1 D74E雙官能分子(黑▲)或IgG1m同種型+YTE(灰▲)結合。該圖中試驗的所有分子均在Fc結構域及IL-7結構域之間使用GGGGSGGGGSGGGGS連接子構建。
第8圖係為使用IgG1N298A或IgG4同種型建構之抗PD-1 IL-7雙官能分子的IL-7R訊息傳導分析。將人類PBMC或Jurkat PD-1+CD127+細胞，與抗PD-1 IL-7雙官能分子一起培養15分鐘，接著將細胞固定、透化並用AF647標記的抗pSTAT5(clone 47/Stat5(pY694))染色，藉由計算CD3 T細胞中的pSTAT5百分比以獲得數據。A.使用具有IgG4m同種型(灰●)或IgG1m同種型(黑▲)的D74E突變的抗PD-1 IL-7雙官能分子處理後，人類PBMC上的pSTAT5訊息傳導；B. 使用具有IgG4m同種型(灰●)或IgG1m(黑▲)的抗PD-1 IL-7 SS2雙官能分子處理後，人類PBMC上的pSTAT5訊息傳導；C. 使用具有IgG4m同種型(灰●)或IgG1m(黑▲)的抗PD-1 IL-7 SS3雙官能分子處理後，人類PBMC上的pSTAT5訊息傳導；D.(左圖) 使用抗PD-1 IL-7雙官能分子、具有IgG4m(灰●)或IgG1m同種型(黑▲)的抗PD-1 IL-7 SS2雙官能分子處理後，Jurkat PD-1+CD127+細胞上的pSTAT5訊息傳導；D.(右圖) 使用具有IgG4m同種型(灰●)或IgG1m(黑▲)的抗PD-1 IL-7 SS2雙官能分子處理後，人類PBMC上的pSTAT5訊息傳導。
第9圖係為抗PD-1 IL-7突變的雙官能分子在體外增強T細胞活性。Promega PD-1/PD-L1生物試驗：(1)效應T細胞(Effector T cell)(Jurkat恆定表達PD-1，NFAT介導的螢光素酶)，以及(2)將活化標靶細胞(恆定表達PDL1和表面蛋白的CHO K1細胞被設計為以抗原獨立的方式活化同源TCR)共同培養。加入BioGloTM
螢光素後，定量發光並反應T細胞活性，測試抗PD-1抗體+/-重組IL-7(rIL-7)或抗PD-1 IL-7雙官能分子的連續莫耳濃度，每個點代表一個實驗的EC50。A. 具有IgG4m同種型(灰●)、抗PD-1(▲)或抗PD-1+rIL-7的抗PD-1 IL-7 WT雙官能分子的NFAT活性；B. 具有IgG4m(●)或IgG1m(▲虛線)的抗PD-1 IL-7 D4E雙官能分子，以及單獨抗PD-1(黑▲)的NFAT活性；C. 具有IgG4m(●)或IgG1m(▲虛線)的抗PD-1 IL-7 W142H雙官能分子，以及單獨抗PD-1(黑▲)的NFAT活性；D. 具有IgG4m的抗PD-1 IL-7 SS2雙官能分子(●)以及單獨抗PD-1(黑▲)的NFAT活性。
第10圖係為具有IgG1m或IgG4m同種型建構的抗PD-1 IL-7雙官能分子的藥代動力學。於小鼠靜脈內注射一劑IgG融合之IL-7野生型或與IgG融合之IL-7突變型，注射後在多個時間點藉由ELISA評估血清中分子的濃度。A. 具有IgG4m的抗PD-1 IL-7 WT雙官能分子(●灰色實線)、具有IgG1m的抗PD-1 IL-7 WT雙官能分子(●灰色虛線)、具有IgG1m的抗PD-1 IL-7 D74E雙官能分子(▲黑色虛線)、具有IgG4m的抗PD-1 IL-7 W142H雙官能分子(○黑色實線)、具有IgG1m的抗PD-1 IL-7 W142H雙官能分子(●黑色實線)、具有IgG4的抗PD-1 IL-7 SS3雙官能分子(■實線)以及具有IgG1m的抗PD-1 IL-7 SS3雙官能分子(■虛線)之藥代動力學；B. 具有IgG1m且分別具有D74E、D74Q、W142H、D74E+W142H的抗PD-1 IL-7雙功能分子的藥代動力學。
第11圖係為具有IgG1+N298A同種型或IgG1+K444A同種型建構的抗PD-1 IL-7雙功能分子的藥代動力學。於小鼠靜脈內注射一劑具有IgG1+N298A同種型(■)或IgG1+K444A突變同種型(●)的抗PD-1 IL-7雙功能分子，注射後在多個時間點藉由ELISA評估抗體的濃度。
第12圖係為連接子長度部會顯著影響藥代動力學，但減少IL-7R訊息傳導的刺激示意圖。A. 具有GGGGS、(GGGGS)2
或(GGGGS)3
等不同連接子建構的抗PD-1 IL-7 WT雙功能分子的藥代動力學；B. 具有GGGGS、(GGGGS)2
或(GGGGS)3
等不同連接子建構的抗PD-1 IL-7 D74雙功能分子的藥代動力學；C. 具有(GGGGS)2
或(GGGGS)3
等不同連接子建構的抗PD-1 IL-7 W142H雙功能分子的藥代動力學，於小鼠靜脈內注射一劑IgG融合之IL-7野生型或與IgG融合之IL-7突變型，注射後在多個時間點藉由ELISA評估與IL-7融合之IgG的濃度；D. 具有或未具有GGGGS、(GGGGS)2
或(GGGGS)3
等不同連接子建構的抗PD-1 IL-7 WT雙功能分子的STAT5訊息傳導。
第13圖係為抗PD-1 IL-7突變體相較於PD-1-CD127+細胞，優先標靶PD-1+CD127+細胞。將表達CD127+或共表達CD127+及PD-1+的Jurkat細胞，使用45nM的抗PD-1 IL-7雙官能分子染色，並用抗IgG-PE(Biolegend, clone HP6017) 進行揭示。數據代表PD-1+CD127+的Jurkat細胞上的中位數螢光以及PD-1-CD127+Jurkat細胞上的中位數螢光的比值。在此試驗中，具有IgG1m的抗PD-1 IL-7 WT雙功能分子、具有IgG1m的抗PD-1 IL-7 D74E雙功能分子、具有IgG1m的抗PD-1 IL-7 W124H雙功能分子、具有IgG4m的抗PD-1 IL-7 SS2雙功能分子、具有IgG1m的抗PD-1 IL-7 SS3雙功能分子皆被測試。
第14圖係為共培養試驗中，抗PD-1 IL-7突變體相較於PD-1-CD127+細胞，優先標靶PD-1+CD127+細胞。A. 藉由流式細胞儀(flow cytometry)在僅用CD127或同時用CD127及PD-1受體轉導的CHO細胞上分析人類CD127及人類PD-1；B. 在共培養試驗中，抗PD-1 IL-7突變體在表達CD127+或共表達CD127+及PD-1+的CHO細胞上結合。使用細胞增殖染料(CPDe450或CPDe670)對細胞進行染色，接著在不同濃度的抗PD-1 IL-7雙官能分子培養前以1：1的比例共培養。使用抗IgG-PE(Biolegend, clone HP6017)進行揭示，並藉由流式細胞儀進行分析。計算並報告每種構建體在每種細胞類型(CHO PD-1+CD127+(白色直方圖)及CHO PD-1-CD127+(黑色直方圖))上結合的EC50(nM)。直方圖代表3個獨立實驗的平均值+/- SD。在此試驗中，無關的具有IgG4m的mAb IL-7 WT(同種型對照)分子、具有IgG1m的抗PD-1 IL-7 W142H雙官能分子、具有IgG4m的抗PD-1 IL-7 SS2雙官能分子，具有IgG1m的抗PD-1 IL-7 SS3雙官能分子皆被測試，並在Fc結構域及IL-7結構域之間包含GGGGSGGGGSGGGGSGS連接子。
第15圖係為共培養試驗中，抗PD-1 IL-7突變體相較於PD-1-CD127+細胞，優先活化pSTAT5訊息傳導轉入PD-1+CD127+細胞。A. 藉由人類CD127、人類PD-1以及人類CD132的流式細胞儀分析在僅用CD127或CD127及PD-1受體轉導的U937細胞上的表達；B. 在培養表達CD127+或共表達CD127+及PD-1+的U937自細胞的共培養試驗中，抗PD-1 IL-7突變體的PSTAT5活性。在與不同濃度的抗PD-1 IL-7雙官能分子一起培養之前，使用細胞增殖染料(CPDe450或CPDe670)對細胞進行染色，並以1：1的比例共培養(15分鐘，37°C)。接著將細胞固定、透化並用AF647標記的抗pSTAT5(clone 47/Stat5(pY694))染色。針對每種構建體和每種細胞類型(CHO PD-1+CD127+(白色直方圖)和CHO PD-1-CD127+(黑色直方圖))計算pSTAT5活性EC50(nM)。直方圖代表4個獨立實驗的平均值+/- SD。在此試驗中，rIL-7(重組人類IL-7細胞因子)、無關的具有IgG4m的mAb IL-7 WT(同種型對照)分子，具有IgG1m的抗PD-1 IL-7 D74E雙官能分子、具有IgG1m的抗PD-1 IL-7 W142H雙官能分子、具有IgG4m的抗PD-1 IL-7 SS2雙官能分子、具有IgG1m的抗PD-1 IL-7 SS3雙關能分子皆被測試，並在Fc結構域及IL-7結構域之間包含GGGGSGGGGSGGGGSGS連接子。
第16圖係為抗PD-1 IL-7 W142H突變體優先活化pSTAT5訊息傳導轉入PD-1+CD127+人類T細胞，且協同增加PD-1CD127+人類衰竭T細胞。在PB3 / CD28塗層（3 µg / mL OK3和CD28.2抗體）上刺激人PBMC以誘導PD-1表達，然後用抗PD-1 IL-7 W142H雙功能分子IgG1m評估pSTAT5活性和增殖。在CD3/CD28塗層(3 µg/mL OK3及CD28.2抗體)上刺激人類PBMC誘導PD-1表達，接著用具有IgG1m的抗PD-1 IL-7 W142H雙官能分子評估pSTAT5活性及增殖。A.(左圖) 藉由流式細胞儀分析人類CD127、人類PD-1在活化的人類T細胞(CD3+群體)上的代表性表達；A.(右圖) 將活化的人類T細胞與同種型對照或抗PD-1競爭性抗體(200 µg/mL)預培養，接著與重組IL-7或抗PD-1 IL-7 W142H突變分子培養。固定並用AF647標記的抗pSTAT5(clone 47/Stat5(pY694))染色後，藉由流式細胞儀對IL-7R訊息傳導轉導的pSTAT5進行定量。在具有同種型對照的條件下及具有抗PD-1競爭性抗體的條件下計算pSTAT5活性(EC50)。數據代表此2個條件之間的倍數變化差異；n = 5為在獨立實驗中測試的不同供體；B. 同種型對照、具有IgG1m的抗PD-1+同種型IL-7 W142H雙官能分子或具有IgG1m(3nM)的抗PD-1 IL-7 W142H雙官能分子的人類衰竭PD-1+T細胞的增殖。在用αCD3/PD-L1重組蛋白塗層板再刺激後的第5天測量增殖。使用點擊式EDU試驗法藉由流式細胞儀對增殖進行定量(geomean及點擊式EDU百分率+細胞)；在獨立實驗中測試了n = 4個獨立的T細胞供體。所有建構體在Fc結構域及IL-7結構域之間包含GGGGSGGGGSGGGGSGS連接子下測試。
第17圖係為實施例8及實施例9中使用不同分子的示意圖。
第18圖係為證明抗PD-1 IL-7 W142H突變體對PD-1的高結合效率並拮抗PDL1的結合。A. PD-1結合之ELISA試驗。將人類重組PD-1(rPD-1)蛋白固定並添加不同濃度之抗體，使用與過氧化物酶耦合的抗人類Fc抗體進行揭示，使用TMB基質在450nm處進行比色。測試具有1個抗PD-1臂(抗PD-1*1為灰▲)或2個抗PD-1臂(抗PD-1*2為◆)的抗PD-1作為對照。包含IL-7變體的雙官能分子(抗PD-1*2 IL-7 W142H*2(黑●)、抗PD-1*2 IL-7 W142H*1(黑■)、抗PD-1*1 IL-7 W142H*2(灰●)、抗PD-1*1 IL-7 W142H*1(灰▼)皆被測試；B. 藉由ELISA測量阻斷PD-1/PD-L1的拮抗能力。將PD-L1固定並添加抗體+生物素化的人類重組PD-1的複合物，該複合物係由固定濃度的PD-1(0.6 µg/mL)及不同濃度的抗PD-1*2 IL-7 W142H*1(■實線)、抗PD-1*2 IL-7 W142H*2(○虛線)、抗PD-1*1(灰▲灰虛線)、抗PD-1*1 IL-7 W142H*2(灰▲灰實線)或抗PD-1*1 IL-7 W142H*1(灰▼灰實線)所產生。所有建構體在Fc結構域及IL-7結構域之間包含GGGGSGGGGSGGGGSGS連接子下測試。
第19圖係為利用1價或2價的抗PD-1以及一IL-7 W142H細胞因子建構的抗PD-1 IL-7分子可以高效率活化pSTAT5。A. PD-1/CD127與抗PD-1 IL-7 W142H雙官能分子的結合。將PD-1重組蛋白固定，接著添加不同濃度的雙官能分子及定量的CD127重組蛋白(組胺酸標靶，Sino ref 10975-H08H)，使用與生物素耦合的抗組胺酸抗體以及與過氧化物酶耦合的鏈親和素之混合物進行揭示，使用TMB基質在450nm處進行比色。抗PD-1*2 IL-7 W142H*1(■)或抗PD-1*2 IL-7 W142H*2(灰●)被測試。B. 抗PD-1*2框架融合IL-7 W142H*1細胞因子的pSTAT5訊息傳導試驗。從健康志願者的外周血中分離出的人類PBMC與抗PD-1*2 IL-7 WT*2(▼)或抗PD-1*2 IL-7 W142H*1(■虛線)培養15分鐘，接著將細胞固定、透化並用抗CD3-BV421及抗pSTAT5 AF647(clone 47/Stat5(pY694))染色，藉由計算MFI pSTAT5百分比+細胞進入CD3+群體獲得數據。C. 使用抗PD-1*1 IL-7 W142H*1(●)、抗PD-1*2 IL-7 W142H*1(▲)處理後的pSTAT5訊息傳導試驗。所有W142H建構體均在包含IgG1m以及在Fc結構域及IL-7結構域之間包含GGGGSGGGGSGGGGSGS連接子下測試。
第20圖係為利用1價或2價建構的抗PD-1 IL-7分子在體內顯著促進T細胞增殖。於小鼠腹膜內注射一劑(34 nM/kg)的抗PD-1 IL-7 W142H分子(抗PD-1*2 IL-7 W142H*1、抗PD-1*1 IL-7 W142H*1、抗PD-1*1 IL-7 W142H*2)或一劑同種型對照，在第4天收集血液，並使用抗CD3、抗CD8、抗CD4及Ki67增殖標記物對T細胞染色，在CD3 CD4+群體以及CD3 CD8+群體中定量Ki67的百分比。使用單向ANOVA試驗計算與對照組小鼠的多次比較的統計學顯著性(* p ＜0.05)，2個獨立實驗中，每組有n = 2至8隻小鼠。
第21圖係為抗PD-1*2 IL-7*1、抗PD-1*1 IL-7*1、抗PD-1*1 IL-7*2協同活化TCR訊息傳導。Promega PD-1/PD-L1生物試驗：(1)效應T細胞(Jurkat恆定表達PD-1，NFAT介導的螢光素酶)，以及(2)將活化標靶細胞(恆定表達PDL1和表面蛋白的CHO K1細胞被設計為以抗原獨立的方式活化同源TCR)共同培養。加入BioGloTM
螢光素後，定量發光並反應T細胞活性。A. 以連續濃度添加抗PD-1*2(黑●)、抗PD-1*2 IL-7 W142H*1(白○)，同種型抗體作為活性之陰性對照(■)；B. 以連續濃度添加抗PD-1*1+同種型IL-7 W142H*2對照(白○虛線)、抗PD-1*1 IL-7 W142H*2(灰●)、抗PD-1*1 IL-7 W142H*1(灰○)等組合。所有W142H建構體均在包含IgG1m以及在Fc結構域及IL-7結構域之間包含GGGGSGGGGSGGGGSGS連接子下測試。
第22圖係為抗PD-1*2 IL-1 W142H *1、抗PD-1*1 IL-7 W142H *1、抗PD-1*1 IL-7 W142H *2突變體相較於PD-1-CD127+細胞，優先活化pSTAT5訊息傳導轉入PD-1+CD127+細胞。在與不同濃度的抗PD-1 IL-7雙官能分子一起培養之前，使用細胞增殖染料(CPDe450或CPDe670)對表達CD127+或共表達CD127+及PD-1+細胞的U937細胞進行染色，並以1：1的比例共培養。藉由流式細胞儀培養後，以抗人類IgG PE染色並定量活化的pSTAT5。A. 計算每種細胞類型及其構建體結合的EC50(nM)；B. 計算每種細胞類型及其構建體的pSTAT5的EC50(nM)。使用雙官能分子處理後，將細胞固定、透化並用AF647標記的抗pSTAT5(clone 47/Stat5(pY694))染色。將pSTAT5活化，在n = 2的獨立實驗中，計算每種建構體及每種細胞類型，即U937 PD-1+CD127+(白色直方圖)及U937 PD-1-CD127+(黑色直方圖)的EC50(nM)。在此試驗中，抗PD-1*2 IL-7 W142H*1、抗PD-1*1 IL-7 W142H*1以及抗PD-1*1 IL-7 W142H*2均在包含IgG1m以及在Fc結構域及IL-7結構域之間包含GGGGSGGGGSGGGGSGS連接子下測試。
第23圖係為腹膜內注射後，抗PD-1*2 IL-7 W142H*1、抗PD-1*1 IL-7 W142H*1、抗PD-1*1 IL-7 W142H*2突變分子的藥代動力學。於人源化PD1小鼠腹膜內注射一劑(34 nM/kg)的具有IgG4m的抗PD-1*2 IL-7 WT*2(△)、具有IgG1m的抗PD-1*2 IL-7 W142H*1(▼)、具有IgG1m的抗PD-1*1 IL-7 W142H*1(灰●)或具有IgG1m的抗PD-1*2 IL-7 W142H*2(灰○)，注射直至48小時後，藉由ELISA評估血清中藥物的濃度。
Claims (24)
- 一種雙官能分子，其包含與結合部分綴合的介白素7(IL-7)變體，其中： 該結合部分係與特異性表達在免疫細胞表面的標靶結合； 該IL-7變體與包含或由SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列組成的野生型人類IL-7(wth-IL-7)具有至少75%的一致性，其中該IL-7變體包含至少一種選自以下群組的胺基酸突變：(i)W142H、W142F或W142Y、(ii)C2S-C141S及C47S-C92S、C2S-C141S及C34S-C129S或C47S-C92S及C34S-C129S、(iii)D74E、D74Q或D74N、(iv)Q11E、Y12F、M17L、Q22E及/或K81R，或其任意組合；胺基酸編號如SEQ ID NO：1所示，其能夠：i)與該wth-IL-7對IL-7受體(IL-7R)的親和力相比，降低該IL-7變體對該IL-7R的親和力，以及ii)與包含wth-IL-7的雙官能分子相比，改善包含該IL-7變體的雙官能分子的藥代動力學。
- 如請求項1所述之雙官能分子，其中該IL-7變體包含選自W142H、W142F及W142Y的胺基酸置換，胺基酸編號如SEQ ID NO：1所示。
- 如請求項1或2所述之雙官能分子，其中該IL-7變體包含選自由C2S-C141S及C47S-C92S、C2S-C141S及C34S-C129S以及C47S-C92S及C34S-C129S所組成之群組的胺基酸置換，胺基酸編號如SEQ ID NO：1所示。
- 如請求項1至3中任一項所述之雙官能分子，其中該IL-7變體包含選自由D74E、D74Q及D74N所組成之群組的胺基酸置換，該胺基酸如SEQ ID NO：1所示。
- 如請求項1至4中任一項所述之雙官能分子，其中該IL-7變體包含或由SEQ ID NO：2-15所示的胺基酸序列組成。
- 如請求項1至5中任一項所述之雙官能分子，其中該結合部分包含人類IgG1的重鏈恆定結構域，較佳為Fc結構域，任選地具有選自以下群組的置換或其組合：T250Q/M428L、M252Y/S254T/T256E+H433K/N434F、E233P/L234V/L235A/G236A+A327G/A330S/P331S、E333A、S239D/A330L/I332E、P257I/Q311、K326W/E333S、S239D/I332E/G236A、N297A、L234A/L235A、N297A+M252Y/S254T/T256E、K322A以及K444A；較佳地選自由N297A與任選地M252Y/S254T/T256E以及L234A/L235A之組合所組成。
- 如請求項1至5中任一項所述之雙官能分子，其中該結合部分包含人類IgG4的重鏈恆定結構域，較佳為Fc結構域，任選地具有選自以下群組的置換或其組合：S228P、L234A/L235A、S228P+M252Y/S254T/T256E.17以及K444A。
- 如請求項1至7中任一項所述之雙官能分子，其中該免疫細胞為T細胞，較佳地為衰竭T細胞。
- 如請求項8所述之雙官能分子，其中該標靶由該T細胞表達，且該結合部分與選自以下組成之群組的標靶結合：PD-1、CD28、CD80、CTLA-4、BTLA、TIGIT、CD160、CD40L、ICOS、CD27、OX40、4-1BB、GITR、HVEM、Tim-1、LFA-1、TIM3、CD39、CD30、NKG2D、LAG3、B7-1、2B4、DR3、CD101、CD44、SIRPG、CD28H、CD38、CXCR5、CD3、PDL2、CD4及CD8。
- 如請求項8所述之雙官能分子，其中該標靶由衰竭T細胞表達，且該結合部分較佳地與選自以下組成之群組的標靶結合：PD-1、CTLA-4、BTLA、TIGIT、LAG3及TIM3。
- 如請求項1至10中任一項所述之雙官能分子，其中該結合部分是抗體或其抗原片段，且該IL-7變體的N端任選地藉由胜肽連接子與該抗體或其抗原片段的重鏈恆定結構域或輕鏈恆定結構域的C端融合，較佳地胜肽連接子與重鏈恆定結構域的C端融合。
- 如請求項11所述之雙官能分子，其中該IL-7變體藉由以下組成之群組的胜肽連接子與該結合部分融合：GGGGS(SEQ ID NO：68)、GGGGSGGGS(SEQ ID NO：67)、GGGGSGGGGSGS(SEQ ID NO：69)及GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：70)，較佳地為(GGGGS)3 。
- 如請求項1至12中任一項所述之雙官能分子，其中該雙官能分子包含： 第一單體，該第一單體包含透過其C端任選地藉由胜肽連接子與第一異二聚體Fc鏈的N端共價連接的抗原結合結構域，該第一異二聚體Fc鏈透過其C端任選地藉由胜肽連接子與該IL-7變體的N端共價連接；以及 第二單體，該第二單體包含不含抗原結合結構域的互補第二異二聚體Fc鏈。
- 如請求項13所述之雙官能分子，其中在該第二單體中，該互補第二異二聚體Fc鏈任選地藉由胜肽連接子與該IL-7變體共價連接。
- 如請求項1至12中任一項所述之雙官能分子，其中該雙官能分子包含： 第一單體，該第一單體包含透過其C端任選地藉由胜肽連接子與第一異二聚體Fc鏈的N端共價連接的抗原結合結構域，該第一異二聚體Fc鏈不含該IL-7變體；以及 第二單體，該第二單體包含不含抗原結合結構域的互補第二異二聚體Fc鏈，該互補第二異二聚體Fc鏈任選地藉由胜肽連接子與該IL-7變體共價連接，較佳地透過其C端任選地藉由胜肽連接子與該IL-7變體的N端共價連接。
- 如請求項1至12中任一項所述之雙官能分子，其中該雙官能分子包含： 第一單體，該第一單體包含透過其C端任選地藉由胜肽連接子與第一異二聚體Fc鏈的N端共價連接的抗原結合結構域；以及 第二單體，該第二單體包含透過其C端任選地藉由胜肽連接子與互補第二異二聚體Fc鏈的N端共價連接的抗原結合結構域，其中 僅有一個異二聚體Fc鏈的C端可與該IL-7變體的N端共價連接，較佳地為該第一異二聚體Fc鏈。
- 如請求項13至16中任一項所述之雙官能分子，其中該抗原結合結構域為Fab結構域、Fab’結構域、單鏈可變片段(scFV)或單結構域抗體(sdAb)。
- 如請求項13至17中任一項所述之雙官能分子，其中該抗原結合結構域包含或基本上由以下所組成： (i)重鏈，該重鏈包含SEQ ID NO：51的CDR1、SEQ ID NO：53的CDR2以及SEQ ID NO：55、56、57、58、59、60、61或62的CDR3；以及 (ii)輕鏈，該輕鏈包含SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：65的CDR1、SEQ ID NO：66的CDR2以及SEQ ID NO：16的CDR3。
- 如請求項13至17中任一項所述之雙官能分子，其中該抗原結合結構域包含或基本上由以下所組成： (a)重鏈可變區(VH)，該重鏈可變區包含或由SEQ ID NO：18、19、20、21、22、23、24或25的胺基酸序列組成； (b)輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區包含或由SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28的胺基酸序列組成。
- 如請求項13至19中任一項所述之雙官能分子，其中該抗原結合結構域包含或基本上由SEQ ID NO：24的重鏈可變區(VH)及SEQ ID NO：28的輕鏈可變區(VL)組成。
- 一種分離的核酸序列或一組分離的核酸分子用以編碼如請求項1至請求項20中任一項所述的雙官能分子。
- 一種宿主細胞，其包含如請求項21所述分離的核酸。
- 一種藥物組合物，其包含如請求項1至請求項20中任一項所述的雙官能分子、如請求項21所述的核酸或如請求項22所述的宿主細胞，以及任選地包含藥學上可接受的載體。
- 一種如請求項1至請求項20所述的雙官能分子、如請求項21所述的核酸、如請求項22所述的宿主細胞或如請求項23所述的藥物組合物作為藥物之用途，特別是用於治療癌症或傳染病的藥物之用途。
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| EP1626059A1 (en) | 2004-08-09 | 2006-02-15 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Angiogenic and immunologic applications of anti-CD160 specific compounds obtainable from mAb CL1-R2 |
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| KR101498834B1 (ko) | 2005-05-09 | 2015-03-05 | 오노 야꾸힝 고교 가부시키가이샤 | 예정 사멸 인자 1(ｐｄ-1)에 대한 인간 모노클로날 항체, 및 항-ｐｄ-1 항체를 단독 사용하거나 기타 면역 요법제와 병용한 암 치료 방법 |
| SG163583A1 (en) | 2005-07-07 | 2010-08-30 | Coley Pharm Group Inc | Anti-ctla-4 antibody and cpg-motif-containing synthetic oligodeoxynucleotide combination therapy for cancer treatment |
| JP2009542592A (ja) * | 2006-07-06 | 2009-12-03 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | Ｉｌ−２媒介性免疫応答の有効性を高める組成物および方法 |
| NZ577085A (en) | 2006-11-15 | 2012-06-29 | Medarex Inc | Human monoclonal antibodies to btla and methods of use |
| EP1987839A1 (en) | 2007-04-30 | 2008-11-05 | I.N.S.E.R.M. Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale | Cytotoxic anti-LAG-3 monoclonal antibody and its use in the treatment or prevention of organ transplant rejection and autoimmune disease |
| WO2009100140A1 (en) | 2008-02-04 | 2009-08-13 | Medarex, Inc. | Anti-clta-4 antibodies with reduced blocking of binding of ctla-4 to b7 and uses thereof |
| US9700606B2 (en) | 2008-07-08 | 2017-07-11 | La Jolla Institute For Allergy And Immunology | HVEM/BTLA, HVEM/CD 160 and HVEM/gD cis complexes and methods of use |
| AR072999A1 (es) | 2008-08-11 | 2010-10-06 | Medarex Inc | Anticuerpos humanos que se unen al gen 3 de activacion linfocitaria (lag-3) y los usos de estos |
| EP2210903A1 (en) | 2009-01-21 | 2010-07-28 | Monoclonal Antibodies Therapeutics | Anti-CD160 monoclonal antibodies and uses thereof |
| EP2408818A1 (en) | 2009-03-17 | 2012-01-25 | Université de la Méditerranée | Btla antibodies and uses thereof |
| AR077594A1 (es) | 2009-07-31 | 2011-09-07 | Organon Nv | Anticuerpos completamente humanos para btla (atenuante de linfocitos b y t) |
| PL2581113T3 (pl) | 2010-06-11 | 2018-11-30 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Przeciwciało anty-tim-3 |
| DK2635607T3 (da) | 2010-11-05 | 2019-11-18 | Zymeworks Inc | Stabilt heterodimert antistofdesign med mutationer i fc-domænet |
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| CN111423511B (zh) | 2013-05-31 | 2024-02-23 | 索伦托药业有限公司 | 与pd-1结合的抗原结合蛋白 |
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| MY184288A (en) | 2014-08-19 | 2021-03-30 | Merck Sharp & Dohme Llc | Anti-tigit antibodies |
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| EP3949984A1 (en) | 2015-02-13 | 2022-02-09 | Sorrento Therapeutics, Inc. | Antibody therapeutics that bind ctla4 |
| MA41867A (fr) | 2015-04-01 | 2018-02-06 | Anaptysbio Inc | Anticorps dirigés contre l'immunoglobuline de cellule t et protéine 3 de mucine (tim-3) |
| TWI715587B (zh) | 2015-05-28 | 2021-01-11 | 美商安可美德藥物股份有限公司 | Ｔｉｇｉｔ結合劑和彼之用途 |
| MA44594B1 (fr) | 2015-05-29 | 2020-09-30 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Anticorps anti-ctla-4 et méthodes d'utilisation de ceux-ci |
| CA2986388C (en) | 2015-06-11 | 2024-02-27 | Genexine, Inc. | Modified interleukin-7 protein and uses thereof |
| EP3328419B1 (en) | 2015-07-30 | 2021-08-25 | MacroGenics, Inc. | Pd-1-binding molecules and methods of use thereof |
| WO2017024465A1 (en) | 2015-08-10 | 2017-02-16 | Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. | Pd-1 antibodies |
| EP3334757A4 (en) | 2015-08-14 | 2019-04-03 | Merck Sharp & Dohme Corp. | ANTI-TIGIT ANTIBODIES |
| CN107949573B (zh) | 2015-09-01 | 2022-05-03 | 艾吉纳斯公司 | 抗-pd-1抗体及其使用方法 |
| JP6861418B2 (ja) | 2015-09-02 | 2021-04-28 | イッサム リサーチ デベロップメント カンパニー オブ ザ ヘブリュー ユニバーシティー オブ エルサレム リミテッド | ヒトｔ細胞免疫グロブリン及びｉｔｉｍドメイン（ｔｉｇｉｔ）に特異的な抗体 |
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| WO2018200430A1 (en) | 2017-04-26 | 2018-11-01 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods of antibody production that minimize disulfide bond reduction |
| CA3059769A1 (en) | 2017-04-28 | 2018-11-01 | Elstar Therapeutics, Inc. | Multispecific molecules comprising a non-immunoglobulin heterodimerization domain and uses thereof |
| US11021537B2 (en) | 2017-05-01 | 2021-06-01 | Agenus Inc. | Anti-TIGIT antibodies and methods of use thereof |
| CA3060618A1 (en) | 2017-05-19 | 2018-11-22 | Wuxi Biologics (Shanghai) Co. Ltd. | Novel monoclonal antibodies to cytotoxic t-lymphocyte-associated protein 4 (ctla-4) |
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| WO2019046313A1 (en) | 2017-08-28 | 2019-03-07 | Altor Bioscience Llc | IL-15 BASED FUSIONS WITH IL-7 AND IL-21 |
| AU2017432728A1 (en) | 2017-09-21 | 2020-02-27 | Eucure (Beijing) Biopharma Co. Ltd. | Anti-CTLA4 antibodies and uses thereof |
| CN111051347B (zh) | 2017-09-29 | 2021-12-21 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | Tigit抗体、其抗原结合片段及医药用途 |
| EP4295915A2 (en) | 2017-12-20 | 2023-12-27 | Harbour Biomed (Shanghai) Co., Ltd | Antibodies binding ctla-4 and uses thereof |
| KR20200104333A (ko) | 2017-12-28 | 2020-09-03 | 난징 레전드 바이오테크 씨오., 엘티디. | Tigit에 대한 단일-도메인 항체 및 이의 변이체 |
| TW202400654A (zh) | 2017-12-30 | 2024-01-01 | 英屬開曼群島商百濟神州有限公司 | 抗tigit抗體及其作為治療和診斷的用途 |
| EP3740508A4 (en) | 2018-01-15 | 2022-03-23 | Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. | ANTIBODIES AND ASSOCIATED VARIANTS DIRECTED AGAINST TIGIT |
| WO2019144309A1 (en) | 2018-01-24 | 2019-08-01 | Beijing Percans Oncology Co. Ltd. | Cytokine Fusion Proteins |
| US20210363243A1 (en) | 2018-02-01 | 2021-11-25 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Methods for treating cancer or infection using a combination of an anti-pd-1 antibody, an anti-lag3 antibody, and an anti-tigit antibody |
| WO2019148444A1 (en) | 2018-02-02 | 2019-08-08 | Adagene Inc. | Anti-ctla4 antibodies and methods of making and using the same |
| CA3086936C (en) | 2018-02-06 | 2022-11-29 | I-Mab Biopharma Us Limited | Antibodies to t cell immunoreceptor with ig and itim domains (tigit) and uses thereof |
| MX2020008795A (es) | 2018-02-28 | 2020-10-08 | Yuhan Corp | Anti cuerpos anti tigit y usos de los mismos. |
| WO2019178362A1 (en) | 2018-03-14 | 2019-09-19 | Elstar Therapeutics, Inc. | Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof |
| CN110272490B (zh) | 2018-03-14 | 2021-05-14 | 上海开拓者生物医药有限公司 | 靶向ctla-4抗体、其制备方法和用途 |
| WO2019178364A2 (en) | 2018-03-14 | 2019-09-19 | Elstar Therapeutics, Inc. | Multifunctional molecules and uses thereof |
| WO2019179391A1 (en) | 2018-03-19 | 2019-09-26 | Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. | Novel bispecific pd-1/ctla-4 antibody molecules |
| US20230167177A1 (en) | 2018-03-19 | 2023-06-01 | WuXi Biologics Ireland Limited | Novel anti-ctla-4 antibody polypeptide |
| AU2019266406A1 (en) | 2018-05-09 | 2020-11-26 | Legochem Biosciences, Inc. | Compositions and methods related to anti-CD19 antibody drug conjugates |
| CN112088167A (zh) | 2018-05-09 | 2020-12-15 | 耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展有限公司 | 特异性针对人类连接蛋白4的抗体 |
| JP2021524756A (ja) | 2018-05-14 | 2021-09-16 | ウェアウルフ セラピューティクス， インコーポレイテッド | 活性化可能なサイトカインポリペプチド及びその使用方法 |
| MX2020012797A (es) | 2018-06-01 | 2021-03-25 | Compugen Ltd | Anticuerpos biespecificos anti-pvrig/anti-tigit y métodos de uso. |
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