TWI715587B - Ｔｉｇｉｔ結合劑和彼之用途 - Google Patents

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Abstract

本發明揭示特異性結合TIGIT之劑。該TIGIT結合劑可包括多肽、抗體及/或雙特異性劑。本發明亦揭示使用該劑以增強免疫反應及/或治療疾病(諸如癌症)之方法。

Description

TIGIT結合劑和彼之用途 相關申請案之交叉參考
本申請案主張在2015年5月28日提出申請之美國臨時申請案號62/167,582、2015年8月14日提出申請之美國臨時申請案號62/205,279及2016年3月25日提出申請之美國臨時申請案號62/313,487之優先權，將各案以其完整內容特此併入本文以供參考。 本發明概括關於結合TIGIT之劑，特別為特異性結合TIGIT的細胞外結構域之抗體，以及使用該劑調節免疫反應及/或治療疾病(諸如癌症)之方法。
免疫療法的基礎在於操控及/或調節免疫系統，包括先天免疫反應及後天免疫反應二者。免疫療法的概括目標為藉由控制對〝外來劑〞(例如病原體或腫瘤細胞)之免疫反應來治療疾病。然而，在一些事例中，免疫療法係用於治療可自對抗正常存在於體內的蛋白質、分子 及/或組織之異常免疫反應引起的自體免疫疾病。免疫療法可包括誘發或增強特異性免疫反應或抑制或降低特異性免疫反應之劑及方法。
免疫系統係由眾多細胞類型所組成之高度複雜系統，該等細胞包括但不限於T細胞、B細胞、自然殺手細胞、抗原呈現細胞、樹突細胞、單核球和巨噬細胞。該等細胞具有控制彼等交互作用及反應之複雜且細微的系統。細胞係利用活化和抑制機轉及回饋環路二者來維持查核反應且不容許不受控制之免疫反應的負面結果(例如自體免疫疾病)。
癌免疫監測之概念係建基於免疫系統可辨識腫瘤細胞、啟動免疫反應及抑制腫瘤發展及/或進展之理論。然而，明確的是許多癌細胞已發展出逃避免疫系統之機制，其可容許不受抑制之腫瘤生長。癌/腫瘤免疫療法著重於發展可活化及/或激勵免疫系統的新型且新穎之劑，以達成更有效的抗腫瘤細胞攻擊，導致增加殺死腫瘤細胞及/或抑制腫瘤生長。
本發明概述
本發明提供結合具有Ig及ITIM結構域之T細胞免疫受體(TIGIT)的各種劑，包括但不限於特異性結合TIGIT的細胞外結構域之抗體。在特定的實施態樣中，該劑為TIGIT拮抗劑。本發明提供使用該劑之方法。在一 些實施態樣中，本發明提供該劑於免疫療法之方法。在一些實施態樣中，本發明提供使用該劑於癌症免疫療法之方法。在一些實施態樣中，該劑係用於誘發、活化、促進、增強、提高或延長免疫反應之方法中。在一些實施態樣中，該劑係用於誘發、活化、促進、增強、提高或延長對癌及/或腫瘤的免疫反應之方法中。在一些實施態樣中，該劑係用於抑制腫瘤或腫瘤細胞生長之方法中。在一些實施態樣中，該劑係用於治療癌症之方法中。在一些實施態樣中，該方法包含抑制癌細胞生長。在一些實施態樣中，該劑係與至少一種額外治療劑組合使用。
本發明亦提供包含本文所述之劑的組成物，諸如醫藥組成物。亦提供編碼該劑之多核苷酸及/或載體及製造該劑之方法。提供包含或生產本文所述之劑的細胞，以及包含本文所述之多核苷酸及/或載體的細胞。
在一個態樣中，本發明提供結合TIGIT之劑。在一些實施態樣中，該劑結合小鼠TIGIT。在一些實施態樣中，該劑結合人類TIGIT。在一些實施態樣中，該劑結合小鼠TIGIT及人類TIGIT。在一些實施態樣中，該劑為抗體。在一些實施態樣中，該劑為結合小鼠TIGIT之抗體。在一些實施態樣中，該劑為結合人類TIGIT之抗體。在一些實施態樣中，該劑為結合小鼠TIGIT及人類TIGIT之抗體。在一些實施態樣中，該劑為結合人類TIGIT及不結合小鼠TIGIT之抗體。
在一些實施態樣中，該劑為特異性結合TIGIT 的細胞外結構域之抗體，該抗體包含：包含GSSLSSSYMS(SEQ ID NO：7)或GFSLSSSYMS(SEQ ID NO：13)之重鏈CDR1、包含IIGSNGNTYYANWAKG(SEQ ID NO：8)之重鏈CDR2及包含GGYRTSGMDP(SEQ ID NO：9)之重鏈CDR3；及/或包含QASQSISSYLNW(SEQ ID NO：10)、QASQSNIYSDLAW(SEQ ID NO：14)或QASQNIYSDLAW(SEQ ID NO：81)之輕鏈CDR1、包含DALKLAS(SEQ ID NO：11)或RASTLAS(SEQ ID NO：15)之輕鏈CDR2及包含QQEHSVGNVDN(SEQ ID NO：12)或QQEHLVAWIYN(SEQ ID NO：16)之輕鏈CDR3。在一些實施態樣中，該劑為包含下列者之抗體：包含GSSLSSSYMS(SEQ ID NO：7)之重鏈CDR1、包含IIGSNGNTYYANWAKG(SEQ ID NO：8)之重鏈CDR2及包含GGYRTSGMDP(SEQ ID NO：9)之重鏈CDR3；及/或包含QASQSISSYLNW(SEQ ID NO：10)之輕鏈CDR1、包含DALKLAS(SEQ ID NO：11)之輕鏈CDR2及包含QQEHSVGNVDN(SEQ ID NO：12)之輕鏈CDR3。在其他的實施態樣中，該劑為包含下列者之抗體：包含GFSLSSSYMS(SEQ ID NO：13)之重鏈CDR1、包含IIGSNGNTYYANWAKG(SQ ID NO：8)之重鏈CDR2及包含GGYRTSGMDP(SEQ ID NO：9)之重鏈CDR3；及/或包含QASQSNIYSDLAW(SEQ ID NO：14)之輕鏈CDR1、包含RASTLAS(SEQ ID NO：15)之輕鏈CDR2及包含QQEHLVAWIYN(SEQ ID NO：16)之輕鏈CDR3。在其他 的實施態樣中，該劑為包含下列者之抗體：包含GFSLSSSYMS(SEQ ID NO：13)之重鏈CDR1、包含IIGSNGNTYYANWAKG(SQ ID NO：8)之重鏈CDR2及包含GGYRTSGMDP(SEQ ID NO：9)之重鏈CDR3；及/或包含QASQNIYSDLAW(SEQ ID NO：81)之輕鏈CDR1、包含RASTLAS(SEQ ID NO：15)之輕鏈CDR2及包含QQEHLVAWIYN(SEQ ID NO：16)之輕鏈CDR3。
在一些實施態樣中，該劑為特異性結合TIGIT的細胞外結構域之抗體，其中抗體包含與SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：32具有至少90%之序列一致性的重鏈可變區；及/或與SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20具有至少90%之序列一致性的輕鏈可變區。在一些實施態樣中，抗體包含與SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：32具有至少95%之序列一致性的重鏈可變區；及/或與SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20具有至少95%之序列一致性的輕鏈可變區。在一些實施態樣中，抗體包含：包含SEQ ID NO：17之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：18之輕鏈可變區；包含SEQ ID NO：19之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：20之輕鏈可變區；或包含SEQ ID NO：32之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：20之輕鏈可變區。
在一些實施態樣中，該劑為特異性結人類TIGIT的細胞外結構域之抗體，該抗體包含：包含TSDYAWN(SEQ ID NO：57)之重鏈CDR1、包含 YISYSGSTSYNPSLRS(SEQ ID NO：58)之重鏈CDR2及包含ARRQVGLGFAY(SEQ ID NO：59)之重鏈CDR3；及/或包含KASQDVSTAVA(SEQ ID NO：60)之輕鏈CDR1、包含SASYRYT(SEQ ID NO：61)之輕鏈CDR2及包含QQHYSTP(SEQ ID NO：62)之輕鏈CDR3。
在一些實施態樣中，該劑為特異性結合TIGIT的細胞外結構域之抗體，該抗體包含與SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：67具有至少90%之序列一致性的重鏈可變區；及/或與SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：68具有至少90%之序列一致性的輕鏈可變區。在一些實施態樣中，抗體包含與SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：67具有至少95%之序列一致性的重鏈可變區；及/或與SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：68具有至少95%之序列一致性的輕鏈可變區。在一些實施態樣中，抗體包含：包含SEQ ID NO：63之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：64之輕鏈可變區，或包含SEQ ID NO：67之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：68之輕鏈可變區。
在一些實施態樣中，該劑為抗體，其為單克隆抗體、人源化抗體、人類抗體、重組抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、包含抗原結合部位之抗體片段、IgG抗體、IgG1抗體、IgG2抗體或IgG4抗體。在一些實施態樣中，抗體為單價。在一些實施態樣中，抗體為雙價。在一些實施態樣中，抗體為單特異性。在一些實施態樣中，抗體為雙特異性。
在一些實施態樣中，該劑為特異性結合TIGIT之抗體，其中抗體包含選自由下列所組成之群組的重鏈胺基酸序列：SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：56；及選自由下列所組成之群組的輕鏈胺基酸序列：SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：30。在一些實施態樣中，抗體包含SEQ ID NO：265之重鏈胺基酸序列和SEQ ID NO：28之輕鏈胺基酸序列；SEQ ID NO：27之重鏈胺基酸序列和SEQ ID NO：28之輕鏈胺基酸序列；SEQ ID NO：29之重鏈胺基酸序列和SEQ ID NO：30之輕鏈胺基酸序列；SEQ ID NO：34之重鏈胺基酸序列和SEQ ID NO：30之輕鏈胺基酸序列；或SEQ ID NO：56之重鏈胺基酸序列和SEQ ID NO：30之輕鏈胺基酸序列。
在一些實施態樣中，特異性結合人類TIGIT之抗體包含SEQ ID NO：70之重鏈胺基酸序列和SEQ ID NO：72之輕鏈胺基酸序列。在一些實施態樣中，特異性結合人類TIGIT之抗體包含SEQ ID NO：82之重鏈胺基酸序列和SEQ ID NO：72之輕鏈胺基酸序列。
在一些實施態樣中，特異性結合人類TIGIT之抗體不結合小鼠TIGIT。在一些實施態樣中，特異性結合人類TIGIT之抗體不結合大鼠TIGIT。在一些實施態樣中，特異性結合人類TIGIT之抗體不結合兔子TIGIT。在一些實施態樣中，特異性結合人類TIGIT之抗體不結合狨猴TIGIT。在一些實施態樣中，特異性結合人類TIGIT之 抗體不結合狗TIGIT。在一些實施態樣中，特異性結合人類TIGIT之抗體不結合豬TIGIT。在一些實施態樣中，特異性結合人類TIGIT之抗體不結合食蟹獼猴TIGIT。在一些實施態樣中，特異性結合人類TIGIT之抗體不結合恆河猴TIGIT。
在一些實施態樣中，該劑為特異性結合TIGIT之抗體，其中抗體包含來自選自由下列所組成之群組的抗體之重鏈可變區和輕鏈可變區：313R11、313R12、313R14、313R19和313R20。在一些實施態樣中，抗體係選自由下列所組成之群組：313R11、313R12、313R14、313R19和313R20。在一些實施態樣中，抗體為313R19。在一些實施態樣中，抗體包含由寄存於ATCC編號為PTA-122180之質體編碼的重鏈可變區。在一些實施態樣中，抗體包含由寄存於ATCC編號為PTA-122181之質體編碼的輕鏈可變區。在一些實施態樣中，抗體包含重鏈，其包含由寄存於ATCC編號為PTA-122180之質體編碼的重鏈可變區。在一些實施態樣中，抗體包含輕鏈，其包含由寄存於ATCC編號為PTA-122181之質體編碼的輕鏈可變區。在一些實施態樣中，抗體包含由寄存於ATCC編號為PTA-122180之質體編碼的重鏈可變區及由寄存於ATCC編號為PTA-122181之質體編碼的輕鏈可變區。在一些實施態樣中，抗體包含由寄存於ATCC編號為PTA-122180之質體編碼的多肽及由寄存於ATCC編號為PTA-122181之質體編碼的多肽。
在另一態樣中，本發明提供寄存於ATCC且分配之指定編號為PTA-122180之質體及寄存於ATCC且分配之指定編號為PTA-122181之質體。
在一些實施態樣中，特異性結合人類TIGIT之抗體包含來自抗體313M32之重鏈可變區和輕鏈可變區。在一些實施態樣中，抗體包含由寄存於ATCC編號為PTA-122346之質體編碼的重鏈可變區。在一些實施態樣中，抗體包含多肽，其包含由寄存於ATCC編號為PTA-122346之質體編碼的重鏈可變區。在一些實施態樣中，抗體包含由寄存於ATCC編號為PTA-122347之質體編碼的輕鏈可變區。在一些實施態樣中，抗體包含由寄存於ATCC編號為PTA-122347之質體編碼的輕鏈。在一些實施態樣中，抗體包含由寄存於ATCC編號為PTA-122346之質體編碼的重鏈可變區及由寄存於ATCC編號為PTA-122347之質體編碼的輕鏈可變區。在一些實施態樣中，抗體包含由寄存於ATCC編號為PTA-122346之質體編碼的多肽及由寄存於ATCC編號為PTA-122347之質體編碼的多肽。
在另一態樣中，本發明提供寄存於ATCC且分配之指定編號為PTA-122346之質體及寄存於ATCC且分配之指定編號為PTA-122347之質體。
在前述態樣及實施態樣，以及本文所述之其他態樣及實施態樣中之各者的一些實施態樣中，該劑為單價。在一些實施態樣中，該劑為雙價。在一些實施態樣 中，該劑為單特異性。在一些實施態樣中，該劑為雙特異性。在一些實施態樣中，雙特異性劑為異質二聚體劑或異質二聚體分子。在一些實施態樣中，異質二聚體劑包含特異性結合TIGIT的本文所述之抗體。
在另一態樣中，本發明提供單離抗體，其與本文所述之劑(例如抗體)競爭與人類TIGIT特異性結合。在一些實施態樣中，單離抗體與本文所述之劑(例如抗體)結合人類TIGIT之相同的抗原決定區。在一些實施態樣中，單離抗體結合人類TIGIT的抗原決定區，該抗原決定區與以本文所述之劑(例如抗體)結合之TIGIT的抗原決定區重疊。在一些實施態樣中，特異性結合人類TIGIT之抗體結合抗原決定區，其包含在SEQ ID NO：79內的胺基酸。在一些實施態樣中，特異性結合人類TIGIT之抗體結合抗原決定區，其包含在SEQ ID NO：80內的胺基酸。在一些實施態樣中，特異性結合人類TIGIT之抗體結合抗原決定區，其包含在SEQ ID NO：79和SEQ ID NO：80內的胺基酸。在一些實施態樣中，特異性結合人類TIGIT之抗體結合抗原決定區，其包含SEQ ID NO：4的胺基酸Q62和I109。在一些實施態樣中，特異性結合人類TIGIT之抗體結合抗原決定區，其包含SEQ ID NO：4的胺基酸Q62和T119。在一些實施態樣中，特異性結合人類TIGIT之抗體結合抗原決定區，其包含SEQ ID NO：4的胺基酸Q64和I109。在一些實施態樣中，特異性結合人類TIGIT之抗體結合抗原決定區，其包含SEQ ID NO：4的胺基酸 Q64和T119。在一些實施態樣中，特異性結合人類TIGIT之抗體結合抗原決定區，其包含SEQ ID NO：4的胺基酸Q62、Q64和I109。在一些實施態樣中，特異性結合人類TIGIT之抗體結合抗原決定區，其包含SEQ ID NO：4的胺基酸Q62、Q64和T119。在一些實施態樣中，特異性結合人類TIGIT之抗體結合抗原決定區，其包含SEQ ID NO：4的胺基酸Q62、I109和T119。在一些實施態樣中，特異性結合人類TIGIT之抗體結合抗原決定區，其包含SEQ ID NO：4的胺基酸Q64、I109和T119。在一些實施態樣中，特異性結合人類TIGIT之抗體結合抗原決定區，其包含SEQ ID NO：4的胺基酸Q62、Q64、I109和T119。在一些實施態樣中，特異性結合人類TIGIT之抗體結合抗原決定區，其包含至少一種選自由下列所組成之群組：SEQ ID NO：4的胺基酸N58、E60、Q62、Q64、L65、F107、I109、H111、T117、T119、G120和R121。在一些實施態樣中，抗原決定區為構形抗原決定區。在一些實施態樣中，特異性結合人類TIGIT之抗體結合抗原決定區，其不包含SEQ ID NO：4的胺基酸V100。
在前述態樣及實施態樣，以及本文所述之其他態樣及實施態樣中之各者的一些實施態樣中，特異性結合TIGIT之劑為抗體，其中抗體為雙特異性劑的一部分。在一些實施態樣中，雙特異性劑包含結合TIGIT之第一臂及結合第二標靶之第二臂(second arm)。在一些實施態樣中，雙特異性劑包含特異性結合TIGIT之第一臂及第二 臂，其中第一臂包含本文所述之抗TIGIT抗體。在一些實施態樣中，雙特異性劑包含結合TIGIT之第一臂及包含來自抗體的抗原結合部位之第二臂。在一些實施態樣中，雙特異性劑包含結合TIGIT之第一臂及特異性結合PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM-3、LAG-3、OX-40或GITR之第二臂。在一些實施態樣中，雙特異性劑包含結合TIGIT之第一臂及特異性結合腫瘤抗原之第二臂。在一些實施態樣中，雙特異性劑包含結合TIGIT之第一臂及包含免疫反應刺激劑之第二臂。在一些實施態樣中，免疫反應刺激劑係選自由下列所組成之群組：顆粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、顆粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、介白素2(IL-2)、介白素3(IL-3)、介白素12(IL-12)、介白素15(IL-15)、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、4-1BB配體、GITRL、OX-40L、抗CD3抗體、抗CTLA4抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗GITR抗體、抗OX-40抗體、抗LAG-3抗體和抗TIM-3抗體。
在一些實施態樣中，雙特異性劑為異質二聚體劑或異質二聚體分子。在一些實施態樣中，雙特異性劑為同質二聚體劑或同質二聚體分子。在一些實施態樣中，異質二聚體分子包含結合人類TIGIT之第一臂及結合第二標靶之第二臂。在一些實施態樣中，異質二聚體分子包含特異性結合人類TIGIT之第一臂及第二臂，其中第一臂包含本文所述之抗TIGIT抗體。在一些實施態樣中，異質二 聚體分子包含結合人類TIGIT之第一臂及特異性結合第二標靶之第二臂，該第二臂包含來自抗體的抗原結合部位。在一些實施態樣中，異質二聚體分子為雙特異性抗體。在一些實施態樣中，異質二聚體分子包含結合人類TIGIT之第一臂及特異性結合腫瘤抗原之第二臂。在一些實施態樣中，異質二聚體分子包含結合人類TIGIT之第一臂及特異性結合PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、OX-40、4-1BB或GITR之第二臂。在一些實施態樣中，異質二聚體分子包含結合TIGIT之第一臂及第二臂，該第二臂包含免疫治療劑。在一些實施態樣中，免疫治療劑係選自由下列所組成之群組：顆粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、顆粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、介白素2(IL-2)、介白素3(IL-3)、介白素12(IL-12)、介白素15(IL-15)、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、4-1BB配體、GITRL、OX-40L、抗CD3抗體、抗CTLA-4抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗4-1BB抗體、抗GITR抗體、抗OX-40抗體、抗LAG-3抗體和抗TIM-3抗體。
在一些實施態樣中，本文所述之異質二聚體分子包含第一臂及第二臂，該第一臂包含第一CH3結構域且該第二臂包含第二CH3結構域，其中各CH3結構域經修飾以促進異質二聚體的形成。在一些實施態樣中，CH3結構域係建基於靜電效應而修飾。在一些實施態樣中，CH3結構域係利用孔中突點(knobs-into-holes)技術而 修飾。
在一些實施態樣中，本文所述之雙特異性劑包含第一臂及第二臂，該第一臂包含第一CH3結構域，該第二臂包含第二CH3結構域，其中各CH3結構域經修飾以促進異質二聚體的形成。在一些實施態樣中，CH3結構域係建基於靜電效應而修飾。在一些實施態樣中，CH3結構域係利用孔中突點技術而修飾。
在前述態樣及實施態樣，以及本文所述之其他態樣及實施態樣中之各者的一些實施態樣中，本文所述之劑特異性結合TIGIT且抑制TIGIT與脊髓灰白質病毒受體(PVR)結合。在一些實施態樣中，該劑特異性結合TIGIT且抑制或阻斷TIGIT與PVR之間的交互作用。在一些實施態樣中，該劑特異性結合TIGIT且抑制TIGIT與PVR-L2結合。在一些實施態樣中，該劑特異性結合TIGIT且抑制或阻斷TIGIT與PVR-L2之間的交互作用。在一些實施態樣中，該劑特異性結合TIGIT且抑制TIGIT與PVR-L3結合。在一些實施態樣中，該劑特異性結合TIGIT且抑制或阻斷TIGIT與PVR-L3之間的交互作用。在一些實施態樣中，該劑為TIGIT拮抗劑。在一些實施態樣中，該劑特異性結合TIGIT且抑制TIGIT傳訊。在一些實施態樣中，該劑特異性結合TIGIT且為經TIGIT媒介之傳訊的拮抗劑。在一些實施態樣中，該劑特異性結合TIGIT且抑制TIGIT活化。在一些實施態樣中，該劑特異性結合TIGIT且抑制TIGIT磷酸化。在一些實施態樣中， 該劑特異性結合TIGIT且降低TIGIT之細胞表面表現。
在前述態樣及實施態樣，以及本文所述之其他態樣及實施態樣中之各者的一些實施態樣中，本文所述之劑特異性結合TIGIT且誘發、活化、促進、增強、提高及/或延長免疫反應。在一些實施態樣中，免疫反應係針對腫瘤或腫瘤細胞。在一些實施態樣中，免疫反應係針對病毒或病毒感染細胞。在一些實施態樣中，該劑增加細胞媒介之免疫力。在一些實施態樣中，該劑增加T細胞活性。在一些實施態樣中，該劑增加溶胞性T細胞(CTL)活性。在一些實施態樣中，該劑增加自然殺手(NK)細胞活性。在一些實施態樣中，該劑增加IL-2生產及/或IL-2生產細胞的數目。在一些實施態樣中，該劑增加IFN-γ生產及/或IFN-γ生產細胞的數目。在一些實施態樣中，該劑增強Th1型免疫反應。在一些實施態樣中，該劑降低IL-4生產及/或IL-4生產細胞的數目。在一些實施態樣中，該劑降低IL-10及/或IL-10生產細胞的數目。在一些實施態樣中，該劑降低IL-6及/或IL-6生產細胞的數目。在一些實施態樣中，該劑降低IL-5及/或IL-5生產細胞的數目。在一些實施態樣中，該劑降低Th2型免疫反應。在一些實施態樣中，該劑降低Treg細胞的數目。在一些實施態樣中，該劑降低Treg活性。在一些實施態樣中，該劑抑制及/或降低Treg之抑制活性。在一些實施態樣中，該劑降低MDSC的數目。在一些實施態樣中，該劑抑制及/或降低骨髓衍生性抑制細胞(MDSC)之抑制活性。
在前述態樣及實施態樣，以及本文所述之其他態樣及實施態樣中之各者的一些實施態樣中，本文所述之劑特異性結合TIGIT且抑制腫瘤生長。在一些實施態樣中，該劑降低腫瘤生長。在一些實施態樣中，該劑降低腫瘤生長至不可檢測的大小。在一些實施態樣中，該劑誘發長期抗腫瘤免疫性。
在另一態樣中，本發明提供包含本文所述之劑的組成物。亦提供使用包含本文所述之劑的組成物之方法。
在另一態樣中，本發明提供本文所述之劑及醫藥上可接受的載劑之醫藥組成物。亦提供治療個體(例如人類)的癌症及/或抑制腫瘤生長之方法，其包含對個體投予有效量的包含本文所述之劑的組成物。亦提供治療個體(例如人類)的病毒感染之方法，其包含對個體投予有效量的包含本文所述之劑的組成物。
在前述態樣，以及本文別處所述之其他態樣/實施態樣中之各者的特定實施態樣中，該劑經分離。在特定的實施態樣中，該劑實質上是純的。
在另一態樣中，本發明提供多核苷酸，其包含編碼本文所述之劑的多核苷酸。在一些實施態樣中，多核苷酸經分離。在一些實施態樣中，本發明提供包含多核苷酸之載體，以及包含載體及/或多核苷酸之細胞。在一些實施態樣中，本發明亦提供包含或生產本文所述之劑的細胞。在一些實施態樣中，細胞為單克隆細胞系。
在另一態樣中，本發明提供調節個體的免疫反應之方法。在一些實施態樣中，調節免疫反應之方法包含誘發、活化、促進、增強、提高或延長個體的免疫反應之方法。在一些實施態樣中，誘發、活化、促進、增強、提高或延長個體的免疫反應之方法包含投予治療有效量的本文所述之抗體、雙特異性劑或多肽。在一些實施態樣中，誘發、活化、促進、增強、提高或延長個體的免疫反應之方法包含投予治療有效量的本文所述之異質二聚體雙特異性劑或同質二聚體雙特異性劑。在一些實施態樣中，誘發、活化、促進、增強、提高或延長個體的免疫反應之方法包含投予治療有效量的本文所述之抗體，該抗體特異性結合TIGIT。在一些實施態樣中，誘發個體中的免疫反應之方法包含投予本文所述之劑。在一些實施態樣中，活化個體的免疫反應之方法包含投予本文所述之劑。在一些實施態樣中，促進個體的免疫反應之方法包含投予本文所述之劑。在一些實施態樣中，增加個體的免疫反應之方法包含投予本文所述之劑。在一些實施態樣中，增強個體的免疫反應之方法包含投予本文所述之劑。在一些實施態樣中，延長個體的免疫反應之方法包含投予本文所述之劑。在一些實施態樣中，免疫反應係針對抗原刺激。在一些實施態樣中，抗原刺激為腫瘤或腫瘤細胞。在一些實施態樣中，抗原刺激為病原體。在一些實施態樣中，抗原刺激為病毒。在一些實施態樣中，抗原刺激為病毒感染細胞。在一些實施態樣中，免疫反應係對抗腫瘤或癌。
在一些實施態樣中，本發明提供增加免疫細胞活性之方法。在一些實施態樣中，增加免疫細胞活性之方法包含將細胞與有效量的本文所述之劑接觸。在一些實施態樣中，免疫細胞為T細胞、NK細胞、單核球、巨噬細胞、骨髓衍生性細胞、抗原呈現細胞(APC)及/或B細胞。在一些實施態樣中，增加個體的NK細胞活性之方法包含對個體投予治療有效量的本文所述之劑。在一些實施態樣中，增加個體的T細胞活性之方法包含對個體投予治療有效量的本文所述之劑。在一些實施態樣中，增加個體的T細胞及/或NK細胞活化之方法包含對個體投予治療有效量的本文所述之劑。在一些實施態樣中，增加個體的T細胞反應之方法包含對個體投予治療有效量的本文所述之劑。在一些實施態樣中，增加個體的CTL細胞活性之方法包含對個體投予治療有效量的本文所述之劑。在一些實施態樣中，抑制個體的Treg活性之方法包含對個體投予治療有效量的本文所述之劑。在一些實施態樣中，抑制個體的Treg之抑制活性之方法包含對個體投予治療有效量的本文所述之劑。在一些實施態樣中，抑制個體的MDSC活性之方法包含對個體投予治療有效量的本文所述之劑。在一些實施態樣中，抑制個體的MDSC之抑制活性之方法包含對個體投予治療有效量的本文所述之劑。
在一些實施態樣中，本發明提供誘發、活化、促進、增強、提高或延長個體的免疫反應之方法，其包含對個體投予治療有效量的結合人類TIGIT之劑。在一 些實施態樣中，誘發、活化、促進、增強、提高或延長個體的免疫反應之方法包含對個體投予治療有效量的抑制或降低TIGIT活性之劑。在一些實施態樣中，誘發、活化、促進、增強、提高或延長個體的免疫反應之方法包含對個體投予治療有效量的抑制或降低TIGIT傳訊之劑。在一些實施態樣中，免疫反應係對抗腫瘤細胞、腫瘤或癌。在一些實施態樣中，免疫反應係對抗病毒感染、病毒抗原或病毒感染細胞。
在另一態樣中，本發明提供抑制腫瘤細胞或腫瘤生長之方法，其包含將腫瘤或腫瘤細胞與有效量的本文所述之劑接觸。在一些實施態樣中，抑制腫瘤生長之方法包含將腫瘤或腫瘤細胞與有效量的結合人類TIGIT之劑接觸。
在另一態樣中，本發明提供抑制個體的腫瘤生長之方法，其包含對個體投予治療有效量的本文所述之劑。在一些實施態樣中，抑制個體的腫瘤生長之方法包含對個體投予治療有效量的結合人類TIGIT之劑。在一些實施態樣中，抑制個體的腫瘤生長之方法包含對個體投予治療有效量的結合人類TIGIT之抗體。在一些實施態樣中，抑制個體的腫瘤生長之方法包含對個體投予治療有效量的結合人類TIGIT之雙特異性劑。在一些實施態樣中，腫瘤係選自由下列所組成之群組：結腸直腸腫瘤、結腸腫瘤、卵巢腫瘤、胰腫瘤、肺腫瘤、肝腫瘤、乳房腫瘤、腎腫瘤、前列腺腫瘤、胃腸道腫瘤、黑色素瘤、子宮頸腫瘤、 膀胱腫瘤、神經膠質母細胞瘤和頭與頸腫瘤。
在另一態樣中，本發明提供治療個體的癌症之方法，其包含對個體投予治療有效量的本文所述之劑。在一些實施態樣中，治療個體的癌症之方法包含對個體投予治療有效量的結合人類TIGIT之劑。在一些實施態樣中，治療個體的癌症之方法包含對個體投予治療有效量的結合人類TIGIT之抗體。在一些實施態樣中，治療個體的癌症之方法包含對個體投予治療有效量的結合人類TIGIT之雙特異性劑。在一些實施態樣中，癌症係選自由下列所組成之群組：結腸直腸癌症、卵巢癌症、胰臟癌、肺癌、肝癌、乳癌、腎臟癌、前列腺癌、胃腸道癌症、黑色素瘤、子宮頸癌症、膀胱癌症、神經膠質母細胞瘤和頭與頸癌症。
在另一態樣中，本發明提供刺激及/或誘發個體的長期抗腫瘤免疫性之方法，其包含將治療有效量的本文所述之劑投予個體。
在另一態樣中，本發明提供刺激個體中的保護反應之方法，其包含對個體投予治療有效量的本文所述之劑與關注之抗原組合。在一些實施態樣中，關注之抗原為腫瘤抗原。在一些實施態樣中，關注之抗原為癌細胞生物標記。在一些實施態樣中，關注之抗原為癌幹細胞標記。
在前述態樣及實施態樣，以及本文所述之其他態樣及實施態樣中之各者的一些實施態樣中，該方法包 含對個體投予免疫反應刺激劑。在一些實施態樣中，免疫反應刺激劑係選自由下列所組成之群組：GM-CSF、M-CSF、G-CSF、IL-3、IL-12、IL-1、IL-2、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、抗CD3抗體、抗CTLA-4抗體、抗CD28抗體、抗PD-L1抗體和抗PD1抗體。
在前述態樣及實施態樣，以及本文所述之其他態樣及實施態樣中之各者的一些實施態樣中，該方法進一步包含投予至少一種額外治療劑。在一些實施態樣中，額外治療劑為化療劑。在一些實施態樣中，額外治療劑為抗體。在一些實施態樣中，額外治療劑為抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗CTLA4抗體、抗LAG-3抗體或抗TIM-3抗體。在一些實施態樣中，額外治療劑為Notch途徑、Wnt途徑或RSPO/LGR途徑之抑制劑。
在一些實施態樣中，額外治療劑為免疫治療劑。如本文所使用的詞句〝免疫治療劑〞係以最廣義使用且係指直接或間接影響或調節免疫系統之物質。在一些實施態樣中，免疫治療劑為藉由誘發免疫系統組份中之任一者活化或增加免疫系統組份中之任一者的活性而直接或間接刺激免疫系統之劑。當考慮TIGIT結合劑為免疫治療劑時，則可將此額外的免疫治療劑視為〝第二〞免疫治療劑。在一些實施態樣中，第二免疫治療劑係選自由下列所組成之群組：GM-CSF、M-CSF、G-CSF、IL-2、IL-3、IL-12、IL-15、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、4-1BB配體、GITRL、OX-40配體、抗CD3抗體、抗CTLA-4抗體、抗 CD28抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗4-1BB抗體、抗GITR抗體、抗OX-40抗體、抗LAG-3抗體和抗TIM-3抗體。在一些實施態樣中，第二免疫治療劑為包含下列之融合蛋白：GM-CSF、M-CSF、G-CSF、IL-2、IL-3、IL-12、IL-15、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、4-1BB配體、GITRL、OX-40配體或其片段。在一些實施態樣中，第二免疫治療劑為包含GITRL、OX40配體或4-1BB配體之至少一種複製的細胞外結構域之融合蛋白。
在前述態樣及實施態樣，以及本文所述之其他態樣及實施態樣中之各者的一些實施態樣中，個體為人類。在一些實施態樣中，個體曾患有至少已部分移除的腫瘤或癌。
在前述態樣及實施態樣，以及本文所述之其他態樣及實施態樣中之各者的一些實施態樣中，腫瘤或癌表現PD-L1。在一些實施態樣中，該方法另外包含測定腫瘤或癌中的PD-L1表現量之步驟。在一些實施態樣中，測定PD-L1表現量係在以本文所述之劑治療或接觸之前進行。在一些實施態樣中，若腫瘤或癌具有上升的PD-L1表現量，則將本文所述之劑投予個體。在一些實施態樣中，若腫瘤或癌具有上升的PD-L1表現量，則將腫瘤或癌與本文所述之劑接觸。
在此本發明的態樣或實施態樣係按照馬庫西(Markush)群組或其他替代群組說明，本發明不僅包含以全體列示之整個群組，並亦個別包含群組的每一成員及主 要群組中所有可能的亞群組，且亦包含群組成員中之一或多者不存在的主要群組。本發明亦展望明確排除於所主張之本發明以外的任何群組成員中之一或多者。
圖1A和1B. 對小鼠TIGIT所產生之兔子抗體的FACS分析。(A)將HEK-293T細胞以編碼小鼠TIGIT ECD-CD4TM-GFP(綠螢光蛋白)或人類TIGIT ECD-CD4TM-GFP之cDNA表現載體過渡性轉染。將轉染之細胞以兔子抗體培育且以流動式細胞測量術分析。特異性結合係以各FACS圖內存在的對角線信號表示。(B)將HEK-293T細胞以編碼小鼠TIGIT-CD4TM-GFP之cDNA表現載體過渡性轉染。將轉染之細胞與可溶性小鼠PVR-Fc融合蛋白在對小鼠TIGIT所產生之兔子抗體或沒有抗體的存在下培育且以流動式細胞測量術分析。特異性結合係以各FACS圖內存在的對角線信號表示。結合阻斷係由失去之特異性結合來證明且以FACS圖上的圓圈表示。
圖2A和2B. 在TIGIT-PVR交互作用之後的蛋白質磷酸化之西方墨點分析。將人類Jurket T細胞以FLAG-標籤化之小鼠TIGIT-GFP穩定地轉導及將E.G7-OVA細胞以小鼠PVR-GFP穩定地轉導。(A)TIGIT磷酸化。(B)SHP1及Erk1/2磷酸化。
圖3. 在抗TIGIT抗體不存在或存在下的TIGIT-PVR交互作用之後的TIGIT磷酸化之西方墨點分 析。
圖4. 在抗TIGIT抗體不存在或存在下的TIGIT-PVR交互作用之後的SHP1及Erk1/2磷酸化之西方墨點分析。
圖5A和5B. 細胞激素生產之TIGIT抑制作用。(A)在表現TIGIT之B3Z T細胞及B3Z T細胞中的IL-2分泌。(B)在以抗TIGIT抗體預處理之後，在表現TIGIT之B3Z T細胞及B3Z T細胞中的IL-2分泌。
圖6A和6B. 自然殺手細胞活性之TIGIT抑制作用。(A)表現TIGIT之親代NK-92細胞及NK-92細胞之細胞毒性。(B)在以抗TIGIT抗體預處理之後，表現TIGIT之親代NK-92細胞及NK-92細胞之細胞毒性。
圖7A和7B. 以抗TIGIT抗體之腫瘤生長抑制。將結腸腫瘤系CT26.WT經皮下植入Balb/c小鼠中(n=10隻小鼠/組)。小鼠係在第10、15、18、22、25和29天以0.25毫克/小鼠之抗TIGIT抗體313R11、抗TIGIT抗體313R12、小鼠IgG1對照抗體和小鼠IgG2對照抗體注射。監測腫瘤生長且以電子式卡尺在指示之時間點測量腫瘤體積。數據係以注射後幾天內的腫瘤體積(立方毫米)顯示。(A)圖顯示各組之平均值±SEM。(B)以抗TIGIT抗體313R12及對照抗體之額外研究。
圖8. 以抗TIGIT抗體之腫瘤生長抑制。將結腸腫瘤系CT26.WT經皮下植入Balb/c小鼠中(n=10隻小鼠/組)。小鼠係在第10、14、17和21天以0.25毫克/小 鼠之抗TIGIT抗體313R12、抗TIGIT抗體313R13和小鼠IgG2對照抗體注射。監測腫瘤生長且以電子式卡尺在指示之時間點測量腫瘤體積。數據係以注射後幾天內的腫瘤體積(立方毫米)顯示。圖顯示各組之平均值±SEM。
圖9A至9D. 用於IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10之ELISpot檢定法。細胞係自以抗TIGIT抗體313R12或同型匹配之對照抗體治療之攜CT26.WT腫瘤的小鼠之脾收獲。細胞係在AH-1肽的存在或不存在下培育且接著使用ELISpot套組分析。(A)顯示細胞生產之IFN-γ的總光學密度(TOD)。(B)顯示細胞生產之IL-2的TOD。(C)顯示細胞生產之IL-4的TOD。(B)顯示細胞生產之IL-10的TOD。
圖10. 在來自以抗TIGIT抗體治療之小鼠的脾細胞群中之自然殺手細胞活性。
圖11. 在來自以抗TIGIT抗體治療之小鼠的脾細胞群中之Treg活性。
圖12A至12E. 來自以抗TIGIT抗體治療之小鼠的脾細胞之FACS分析。(A)總活細胞中之CD3+細胞百分比。(B)總活細胞中之CD4+細胞百分比。(C)總活細胞中之CD8+細胞百分比。(D)總CD4+群中之CD4+中心記憶T細胞百分比。(E)總CD8+群中之CD8+中心記憶T細胞百分比。
圖13A至13D. 在來自以抗TIGIT抗體治療之小鼠的脾細胞群中之TIGIT陽性或陰性Treg的FACS 分析。(A)總活細胞中之TIGIT-陽性細胞百分比。(B)總CD4+細胞中之FoxP3+細胞百分比(鑑別Treg)。(C)總Treg細胞中之TIGIT-陽性細胞百分比。(D)總Treg細胞中之TIGIT-陰性細胞百分比。
圖14A至14D. 在來自以抗TIGIT抗體治療之小鼠的脾細胞群中之MDSC的FACS分析。(A)總活細胞中之CD11b+細胞百分比。(B)總CD11b+細胞中之MDSC百分比。(C)總CD11b+細胞中之G-MDSC百分比。(D)總CD11b+細胞中之M-MDSC百分比。
圖15. 以抗TIGIT抗體之腫瘤生長抑制。將腎癌細胞(鼠類腎腺癌)經皮下植入Balb/c小鼠中(n=10隻小鼠/組)。小鼠係在第7、10、14、17、21和24天以0.25毫克/小鼠之抗TIGIT抗體313R12及小鼠IgG2對照抗體注射。監測腫瘤生長且以電子式卡尺在指示之時間點測量腫瘤體積。數據係以注射後幾天內之腫瘤體積(立方毫米)顯示。圖顯示各組之平均值±SEM。
圖16. 以抗TIGIT抗體313R12之腫瘤生長抑制-劑量研究。將鼠類結腸腫瘤系CT26.WT經皮下植入Balb/c小鼠中(n=10隻小鼠/組)。將小鼠以係0.5、1、3、5、10、15或30毫克/公斤之抗TIGIT抗體313R12或以對照抗體治療。小鼠係以每週兩次經腹膜內注射給藥，總共6次劑量。監測腫瘤生長且以電子式卡尺測量腫瘤體積。
圖17A至17F. 以抗TIGIT抗體313R12和抗 PD-L1抗體之活體內腫瘤生長抑制。鼠類結腸腫瘤系CT26.WT係經皮下植入(30,000個細胞/小鼠)Balb/c小鼠中。將小鼠以0.25毫克/小鼠之抗TIGIT抗體313R12、抗PD-L1抗體、313R12與抗PD-L1抗體之組合或對照抗體治療(每組n=10)。將小鼠以每週兩次投予抗體經3週。監測腫瘤生長且以電子式卡尺在指示之時間點測量腫瘤體積。(A)在以對照抗體治療之組內的個別小鼠之腫瘤體積。(B)在以抗TIGIT抗體313R12治療之組內的個別小鼠之腫瘤體積。(C)在以抗PD-L1抗體治療之組內的個別小鼠之腫瘤體積。(D)在以抗TIGIT抗體313R12與抗PD-L1抗體治療之組內的個別小鼠之腫瘤體積。(E)四個治療組之平均腫瘤生長。(F)存活率曲線。
圖18A至18E. 以抗TIGIT抗體313R12和抗PD-1抗體之活體內腫瘤生長抑制。將鼠類結腸腫瘤系CT26.WT經皮下植入(30,000個細胞/小鼠)Balb/c小鼠中。將小鼠以0.25毫克/小鼠之抗TIGIT抗體313R12、抗PD-1抗體、313R12與抗PD-1抗體之組合或對照抗體(每組n=15)治療。將小鼠以每週兩次投予抗體經3週。監測腫瘤生長且以電子式卡尺在指示之時間點測量腫瘤體積。(A)在以對照抗體治療之組內的個別小鼠之腫瘤體積。(B)在以抗TIGIT抗體313R12治療之組內的個別小鼠之腫瘤體積。(C)在以抗PD-1抗體治療之組內的個別小鼠之腫瘤體積。(D)在以抗TIGIT抗體313R12與抗PD-1抗體治療之組內的個別小鼠之腫瘤體積。(E)四個治療組之 平均腫瘤生長。
圖19A和19B. 阻斷人類TIGIT與PVR結合之抗TIGIT抗體的FACS分析。(A)將HEK-293T細胞以編碼人類TIGIT ECD-CD4TM-GFP(綠螢光蛋白)或人類TIGIT ECD-CD4TM-GFP之cDNA表現載體過渡性轉染。將轉染之細胞與可溶性人類PVR-Fc融合蛋白在對TIGIT所產生之10、2或0.4微克/毫升濃度之抗體(313R19、313M26或313M32)或沒有抗體的存在下培育且以流動式細胞測量術分析。特異性結合係以FACS圖內存在的對角線信號表示。結合阻斷係由FACS圖上以深黑色框內的失去之特異性結合來證明。(B)將HEK-293T細胞以編碼人類TIGIT ECD-CD4TM-GFP(綠螢光蛋白)或人類TIGIT ECD-CD4TM-GFP之cDNA表現載體過渡性轉染。將轉染之細胞與可溶性人類PVR-兔子Fc融合蛋白在對TIGIT所產生之10、5、2.5或1.25微克/毫升濃度之抗體(313R19或313M32)或在沒有抗體的存在下培育且以流動式細胞測量術分析。特異性結合係以FACS圖內存在的對角線信號表示。結合阻斷係由FACS圖上以深黑色框內的失去之特異性結合來證明。
圖20. 在抗TIGIT抗體313R19、313M26和313M32不存在或存在下的TIGIT-PVR交互作用之後，TIGIT磷酸化之西方墨點分析。
圖21. 人類TIGIT(SEQ ID NO：4)、食蟹獼猴TIGIT(SEQ ID NO：77)及恆河猴TIGIT(SEQ ID NO： 78)之序列比對。
圖22. 藉由抗TIGIT抗體與含有特異性胺基酸取代之變體人類TIGIT蛋白質結合的FACS分析之抗原決定區定位。hTIGIT變體為(1)E36K和I41V；(2)T51M；(3)Q62H和Q64H；(4)D72E；(5)S78Y和S80A；(6)V100M；(7)I109T和T119R；及(8)G135S。
圖23. 代表與TIGIT結合之PVR的圖形。人類TIGIT之結構係以球圖像顯示及PVR之結構係以帶狀圖像提供。包含313M32抗原決定區之至少一部分的胺基酸以黑球顯示。包含313M34/10A7抗原決定區之至少一部分的胺基酸以灰球顯示。
圖24A和24B. 在抗TIGIT抗體之間的競爭結合研究。(A)以313R19與313M26之競爭研究。(B)與313M34/10A7及313R19或313M34/10A7與313M32之競爭研究。
圖25. 以抗TIGIT抗體反轉經PVR-媒介之細胞激素分泌抑制。
圖26. 抗體依賴性細胞毒性檢定法。
圖27. 在人源化小鼠模式中以抗TIGIT抗體313R19和313M32之腫瘤生長抑制。將人源化小鼠以源自患者之黑色素瘤腫瘤細胞經皮下注射(OMP-M9，75,000個細胞/小鼠)。容許腫瘤生長19天，直到其達到約50立方毫米之平均體積。將攜腫瘤的小鼠隨機分組(每組n=8)。將攜腫瘤的小鼠以對照抗體、抗TIGIT抗體313R19或抗 TIGIT抗體313M32治療。將小鼠每5天以1或5毫克/公斤給藥。監測腫瘤生長且以電子式卡尺在指示之時間點測量腫瘤體積。
本發明的詳細說明
本發明提供調節免疫反應之新穎劑，其包括但不限於多肽、抗體和異質二聚體分子。該劑包括特異性結合TIGIT之多肽、抗體和異質二聚體分子及調節TIGIT活化及/或傳訊之劑。該劑包括抑制TIGIT活化及/或傳訊之多肽、抗體和異質二聚體分子，由此增強免疫反應。亦提供相關的多肽和多核苷酸，包含該劑之組成物，及製造該劑之方法。提供篩選用於調節免疫反應之劑的方法。提供使用新穎劑之方法，諸如抑制腫瘤生長之方法及/或治療癌症之方法。亦提供治療病毒感染之方法。進一步提供使用新穎劑之方法，諸如活化免疫反應之方法、刺激免疫反應之方法、促進免疫反應之方法、增強免疫反應之方法、活化自然殺手(NK)細胞及/或T細胞之方法、增加NK細胞及/或T細胞活性之方法、促進NK細胞及/或T細胞活性之方法、降低及/或抑制T細胞抑制因子之方法、及/或降低及/或抑制骨髓衍生性抑制細胞之方法。另外，可將本文所述之新穎劑用於抑制免疫反應之方法、抑制免疫反應之方法、降低T細胞活性之方法及/或治療自體免疫疾病之方法中。
I. 定義
為了有助於對本發明的瞭解，將許多術語及詞句定義於下。
如本文所使用的術語〝促效劑〞和〝促效性〞係指或說明能夠直接或間接地、實質地誘發、活化、促進、增加或增強標靶及/或途徑的生物活性之劑。本文所使用的術語〝促效劑〞包括部分或完全誘發、活化、促進、增加或增強蛋白質活性之任何劑。
如本文所使用的術語〝拮抗劑〞和〝拮抗性〞係指或說明能夠直接或間接地、部分或完全地阻斷、抑制、降低或中和標靶及/或途徑的生物活性之劑。本文所使用的術語〝拮抗劑〞包括部分或完全地阻斷、抑制、降低或中和蛋白質活性之任何劑。
如本文所使用的術語〝調節(modulation)〞和〝調節(modulate)〞係指生物活性之改變或變化。調節包括但不限於刺激活性或抑制活性。調節可為增加或降低活性、改變結合特徵或與蛋白質、途徑、系統或其他關注的生物標靶之活性相關聯的生物、功能或免疫性質之任何其他改變。
如本文所使用的術語〝抗體〞係指辨識及透過至少一個抗原結合部位特異性結合標靶之免疫球蛋白分子。標靶可為蛋白質、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂質或前述中任一者之組合。如本文所使用的術語包 含完整多克隆抗體、完整單克隆抗體、抗體片段(諸如Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段)、單鏈Fv(scFv)抗體、多特異性抗體、雙特異性抗體、單特異性抗體、單價抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人類抗體、包含抗體之抗原結合部位的融合蛋白及任何其他包含抗原結合部位的經修飾之免疫球蛋白分子，只要抗體展現所欲生物活性。抗體可為五種建基於彼等分別稱為α、δ、ε、γ及μ之重鏈恆定結構域的一致性之主要類別的免疫球蛋白中之任一者：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或其子類別(同型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。不同類別的免疫球蛋白具有不同且熟知的子單位結構及三維構型。抗體可為未經修飾(naked)或與其他分子共軛，該等其他分子包括但不限於毒素及放射性同位素。
術語〝抗體片段〞係指完整抗體的一部分且通常係指完整抗體的抗原性決定可變區。抗體片段的實例包括但不限於Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、線性抗體、單鏈抗體及自抗體片段所形成之多特異性抗體。如本文所使用的〝抗體片段〞包含抗原結合部位或抗原決定區結合部位。
術語抗體之〝可變區〞係指單獨或組合之抗體輕鏈可變區或抗體重鏈可變區。重鏈可變區或輕鏈可變區通常係由以三個互補決定區(CDR)連接之四個架構區(FR)所組成，亦稱為〝超級可變區〞。在各鏈中的CDR係由架構區以緊密鄰接的方式固定在一起且與來自其他鏈 的CDR一起促成抗體之抗原結合部位的形成。有至少兩種用於測定CDR之技術：(1)建基於跨物種序列變異性之方法(亦即Kabat等人之1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Edition,National Institutes of Health,Bethesda MD.)，及(2)建基於抗原-抗體複合物之結晶學研究之方法(Al Lazikani等人之1997,J.Mol.Biol.,273：927-948)。另外，在本技術中有時使用該兩種方法之組合來測定CDR。
如本文所使用的術語〝單克隆抗體〞係指涉入其高度特異性辨識及結合單一抗原決定子或抗原決定區之同源性抗體群。這與多克隆抗體相反，多克隆抗體通常包括辨識不同的抗原決定子之不同的抗體之混合物。術語〝單克隆抗體〞包含完整及全長單克隆抗體二者，以及抗體片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、單鏈(scFv)抗體、包含抗體片段之融合蛋白及任何其他包含抗原結合部位的經修飾之免疫球蛋白分子。此外，〝單克隆抗體〞係指由任何多種技術所製成的此等抗體，包括但不限於融合瘤生產、噬菌體選擇、重組表現和基因轉殖動物。
如本文所使用的術語〝人源化抗體〞係指含有最少的非人類序列之特異性免疫球蛋白鏈、嵌合性免疫球蛋白或其片段之抗體。人源化抗體通常為其中CDR之胺基酸殘基以來自具有所欲特異性、親和性及/或結合能力的非人類物種(例如小鼠、大鼠、兔子或倉鼠)之CDR的胺基酸殘基取代的人類免疫球蛋白。在一些情況中，人類 免疫球蛋白之架構可變區胺基酸殘基可以來自非人類物種之抗體中的對應胺基酸殘基取代。人源化抗體可藉由取代在架構可變區及/或經取代之非人類胺基酸殘基內的額外胺基酸殘基而進一步修飾，以進一步精進及最優化抗體特異性、親和性及/或結合能力。人源化抗體可包含可變結構域，其含有所有或實質上所有對應於非人類免疫球蛋白之CDR，而所有或實質上所有的架構可變區為那些人類免疫球蛋白序列之架構區可變區。在一些實施態樣中，可變結構域包含人類免疫球蛋白序列之架構區。在一些實施態樣中，可變結構域包含人類免疫球蛋白共有序列之架構區。人源化抗體亦可包含至少一部分的免疫球蛋白恆定區或結構域(Fc)，通常為至少一部分的人類免疫球蛋白。
如本文所使用的術語〝人類抗體〞係指由人類所生產之抗體或使用本技術中已知的技術中之任一者所製得的具有對應於由人類所生產之抗體的胺基酸序列之抗體。
如本文所使用的術語〝嵌合抗體〞係指其中免疫球蛋白分子之胺基酸序列係衍生自二或更多物種之抗體。輕鏈可變區和重鏈可變區通常對應於自一種哺乳動物物種(例如小鼠、大鼠、兔子等等)所衍生之具有所欲特異性、親和性及/或結合能力之抗體的可變區，而恆定區係與自另一物種所衍生之抗體的序列為同源性。恆定區通常為人類，以避免在抗體中誘出免疫反應。
術語〝抗原決定區〞與〝抗原決定子〞在本 文可交換使用，且係指能夠以特別的抗體辨識且特異性結合之抗原或標靶部分。當抗原或標靶為多肽時，則抗原決定區可自連續胺基酸及自以蛋白質三級折疊並列之非連續胺基酸二者形成。自連續胺基酸所形成之抗原決定區(亦稱線性抗原決定區)通常在蛋白值變性時仍被保留，而三級折疊所形成之抗原決定區(亦稱為構形抗原決定區)通常在蛋白值變性時失去。抗原決定區通常包括至少3個胺基酸，且更常為至少5、6、7或8-10個胺基酸於獨特的空間構形中。
術語〝選擇性結合〞或〝特異性結合〞意指劑對抗原決定區、蛋白質或標靶分子比與替代物質(包括相關和不相關蛋白質)更頻繁、更快速、具有更長持續期間、具有更高親和性或與以上文的某些組合交互作用。在特定的實施態樣中，〝特異性結合〞意指例如該劑以約0.1mM或更小，但是更經常以小於約1μM之KD與蛋白質或標靶結合。在特定的實施態樣中，〝特異性結合〞意指該劑以至少約0.1μM或更小，至少約0.01μM或更小，或至少約1nM或更小之KD與標靶結合。因為在不同物種中的同源性蛋白質之間的序列一致性，所以特異性結合可包括辨識在超過一種以上的物種中之蛋白質或標靶之劑(例如小鼠TIGIT和人類TIGIT)。同樣地，因為在不同的蛋白質之多肽序列的特定區域內的同源性，所以特異性結合可包括辨識超過一種以上的蛋白質或標靶之劑。應瞭解在特定的實施態樣中，特異性結合第一標靶之劑可以或不可 以特異性結合第二標靶。確切而言，〝特異性結合〞不一定需要(雖然可包括)排他性結合，亦即與單一標靶結合。因此，在特定的實施態樣中，該劑特異性結合超過一種以上的標靶。在特定的實施態樣中，多重標靶可以相同的抗原結合部位與劑結合。例如，抗體可在特定的情況下包含兩個相同的抗原結合部位，各者特異性結合二或更多個蛋白質之相同的抗原決定區。在特定的可替代實施態樣中，抗體可為雙特異性且包含至少兩個具有不同的特異性之抗原結合部位。述及之結合通常(但不必然)意指特異性結合。
術語〝多肽〞和〝肽〞和〝蛋白質〞可於本文交換使用且係指任何長度的胺基酸之聚合物。聚合物可為線性或分支，其可包含經修飾之胺基酸，且其可經非胺基酸中斷。該等術語亦包含經天然或干預修飾之胺基酸聚合物；例如雙硫鍵形成、糖化、脂化、乙醯化、磷酸化或任何其他操控或修飾，諸如與標記之成份共軛。該定義亦包括例如含有一或多個胺基酸類似物(包括例如非天然胺基酸)以及本技術中已知的其他修飾物之多肽。應瞭解因為本發明的多肽可建基於抗體或免疫球蛋白超級家族的其他成員，所以在特定的實施態樣中，〝多肽〞可以單鏈或二或更多個締合鏈出現。
術語〝多核苷酸〞和〝核酸〞和〝核酸分子〞可於本文交換使用且係指任何長度的核苷酸之聚合物，且包括DNA和RNA。核苷酸可為去氧核糖核苷酸、 核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼及/其類似物，或任何可藉由DNA或RNA聚合酶併入聚合物中的任何受質。
在述及的二或更多個核酸或多肽中，術語〝一致〞或〝一致性〞百分比係指當比較及比對(若必要時導入間格)二或更多個序列或子序列以達最高對應性，不考慮任何保守性胺基酸取代為序列一致性的一部分時，該二或更多個序列或子序列為相同的或具有相同的特定百分比之核苷酸或胺基酸殘基。一致性百分比可使用序列比較軟體或演算法測量，或以目視檢查測量。可用於獲得胺基酸或核苷酸序列比對之各演算法及軟體為本技術中所熟知。該等包括但不限於BLAST、ALIGN、Megalign、BestFit、GCG Wisconsin套裝軟體及其變化產品。在一些實施態樣中，本發明的兩個核酸或多肽實質上一致，當比較及比對以達最高對應性時，如使用序列比較演算法或目視檢查所測量，彼等具有至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，且在一些實施態樣中至少95%，96%，97%，98%，99%之核苷酸或胺基酸殘基一致性。在一些實施態樣中，一致性存在於至少約10，至少約20，至少約40-60個核苷酸或胺基酸殘基，至少約60-80個核苷酸或胺基酸殘基長度或介於之間的任何整數值之序列區域內。在一些實施態樣中，一致性存在於比60-80個核苷酸或胺基酸殘基更長的區域內，諸如至少約80-100個核苷酸或胺基酸殘基，且在一些實施態樣中，序列實質上與比較之全長序列一致，諸如核苷酸序列之編碼區 域。
〝保守性胺基酸取代〞為其中一個胺基酸殘基經具有類似側鏈的另一胺基酸殘基取代之取代。具有類似側鏈之胺基酸殘基家族已於本技術中概括定義，包括鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電之極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯基丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β-分支側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如酪胺酸、苯基丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。例如，以苯基丙胺酸取代酪胺酸被視為保守性取代。在本發明的多肽及/或抗體之序列中的保守性取代通常不廢除含有胺基酸序列之多肽或抗體結合至標靶結合部位。鑑別不消除結合之核苷酸及胺基酸保守性取代之方法為本技藝中所熟知。
如本文所使用的術語〝載體〞意指建構體，其能夠在宿主細胞中遞送及經常表現一或多個關注的基因或序列。載體的實例包括但不限於病毒載體、裸DNA或RNA表現載體、質體載體、黏質體載體、噬菌體載體、與陽離子縮合劑締合之DNA或RNA表現載體，及包封在脂質體中的DNA或RNA表現載體。
經〝分離〞之多肽、可溶性蛋白質、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組成物為呈未於自然中發現的形式之多肽、可溶性蛋白質、抗體、多核苷酸、載體、細胞 或組成物。經分離之多肽、可溶性蛋白質、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組成物包括那些經純化至使彼等不再呈於自然中發現的形式之程度者。在一些實施態樣中，經純化之多肽、可溶性蛋白質、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組成物為實質上純的。
如本文所使用的術語〝實質上純的〞係指為至少50%純的(亦即不含污染物)，至少90%純的，至少95%純的，至少98%純的或至少99%純的材料。
如本文所使用的術語〝免疫反應〞包括來自先天免疫系統及後天免疫系統二者之反應。其包括細胞媒介及/或體液之免疫反應二者。其包括但不限於T細胞及B細胞反應，以及來自免疫系統的其他細胞之反應，諸如自然殺手(NK)細胞、單核球、巨噬細胞等等。
如本文所使用的術語〝癌〞和〝癌性〞係指或說明哺乳動物之生理病況，其中細胞群係以不受調節之細胞生長為特徵。癌的實例包括但不限於癌(carcinoma)、胚細胞瘤、肉瘤和血液性癌症，諸如淋巴瘤和白血病。
如本文所使用的術語〝腫瘤〞和〝贅瘤〞係指任何由過度細胞生長或增生所導致的任何組織團塊，其為包括癌前病灶之良性(非癌性)或惡性(癌性)。
如本文所使用的術語〝轉移〞係指癌症藉此自起源位置擴散或轉變至身體的其他區域，在新部位發展類似的癌性病灶之過程。〝轉移(metastatic)或(metastasizing)之〞細胞為與鄰接的細胞喪失黏著接觸且 自疾病的原發部位經由血流或淋巴移動至全身的繼發部位之細胞。
術語〝癌幹細胞〞和〝CSC〞和〝腫瘤幹細胞〞和〝腫瘤初始細胞〞在本文可交換使用且係指來自癌或腫瘤之細胞，其：(1)具有擴大的增生能力；(2)能夠不對稱的細胞分裂以產生一或多種類型的經分化之細胞後代，其中經分化之細胞具有降低之增生或發育潛力，及(3)能夠對稱的細胞分裂以自我更新或自我維持。與無法形成腫瘤的大部分腫瘤細胞相比，該等性質賦予癌幹細胞在連續移植至適當的宿主(例如小鼠)時能夠形成或建立腫瘤或癌之能力。癌幹細胞係以混亂方式進行相對於分化的自我更新，以形成具有異常的細胞類型之腫瘤，該細胞類型可在突變發生時而隨時間改變。
術語〝癌細胞〞和〝腫瘤細胞〞係指源自癌或腫瘤或癌前病灶之整體細胞族群，包括非致瘤細胞(其包含大部分的癌細胞群)及致瘤幹細胞(癌幹細胞)二者。如本文所使用的術語〝癌細胞〞或〝腫瘤細胞〞在僅用於指稱該等缺乏更新及分化能力之細胞時以術語〝非致瘤〞修飾，以區別該等腫瘤細胞與癌幹細胞。
如本文所使用的術語〝致瘤(tumorigenic)〞係指癌幹細胞之功能特性，包括自我更新(引起額外的致瘤幹細胞)及增生之特性，以產生所有其他的腫瘤細胞(引起經分化及因此非致瘤腫瘤細胞)。
如本文所使用的術語〝致瘤性(tumorigenicity )〞係指來自腫瘤之隨機細胞樣品在連續移植至適當的宿主(例如小鼠)中時形成明顯的腫瘤之能力。
術語〝個體〞係指成為特定治療之接受者的任何動物(例如哺乳動物)，包括但不限於人類、非人靈長類動物、犬、貓、兔子、囓齒動物及類似者。關於人類個體的術語〝個體〞及〝患者〞通常在本文可交換使用。
術語〝醫藥上可接受的〞係指經聯邦或州政府之管理局核准或可核准或經美國藥典或其他普遍公認之藥典中用於動物(包括人類)而列示之材料。
術語〝醫藥上可接受的賦形劑、載劑或佐劑〞或〝可接受的醫藥載劑〞係指可與本發明的至少一種劑一起投予個體之賦形劑、載劑或佐劑，且其不破壞本發明的劑之藥理活性及在以足以遞送治療效應之劑量投予時沒有毒性。那些熟習本技術領域者及美國FDA通常認為醫藥上可接受的賦形劑、載劑或佐劑為任何調配物的無活性成分。
術語〝有效量〞或〝治療有效量〞或〝治療效應〞係指本文所述之劑、抗體、多肽、多核苷酸、小有機分子或有效〝治療〞個體(諸如哺乳動物)中的疾病或病症之其他藥物的量。在癌或腫瘤的例子中，劑(例如多肽或抗體)之治療有效量具有治療效應且因此可增強或激勵免疫反應、增強或激勵抗腫瘤反應、增強免疫細胞之溶胞活性、增強殺死腫瘤細胞、增加以免疫細胞殺死腫瘤細胞、減少腫瘤細胞數目、降低致瘤性、降低致瘤頻率或降 低腫瘤發生能力、減少癌幹細胞數目或頻率、減少腫瘤大小、減少癌細胞群、抑制或停止癌細胞浸潤至週邊器官中，包括例如癌擴散至軟組織和骨中、抑制且停止腫瘤或癌細胞轉移、抑制且停止腫瘤或癌細胞生長、緩解一或多種與癌相關之症狀至某種程度、降低發病率和死亡率、改進生活品質、或此等效應之組合。
術語〝治療(treating或treatment或to treat)〞或〝緩和(alleviating或to alleviate)〞係指下列二者：(1)治療性措施，其治癒、減緩、減輕經診斷之病理狀況或病症症狀，及/或終止經診斷之病理狀況或病症的進展，及(2)預防性(prophylactic或preventative)措施，其預防或減緩靶定之病理狀況或病症的發展。因此，那些需要治療者包括那些已患有病症者、那些易患有病症者及那些欲預防其病症者。在癌或腫瘤的例子中，若患者顯示下列中之一或多者，則根據本發明的方法成功地〝治療〞個體：增加免疫反應、增加抗腫瘤反應、增加免疫細胞之溶胞活性、增加殺死腫瘤細胞、增加以免疫細胞殺死腫瘤細胞、減少或完全沒有癌細胞數目、減少腫瘤大小、抑制或沒有癌細胞浸潤至週邊器官中，包括癌擴散至軟組織和骨中、抑制或沒有腫瘤或癌細胞轉移、抑制或沒有癌生長、緩解一或多種與特定的癌相關之症狀、降低發病率和死亡率、改進生活品質、降低致瘤性、減少癌幹細胞數目或頻率、或此等效應之組合。
如本發明及申請專利範圍中所使用的單數形 式〝a〞、〝an〞和〝the〞包括複數形式，除非上下文另外清楚地說明。
應瞭解無論何時以文字〝包含〞說明實施態樣時，亦提供以〝由...組成〞及/或〝實質上由...組成〞之術語所說明的其他方面類似的實施態樣。亦應瞭解無論何時以文字〝實質上由...組成〞說明實施態樣時，亦提供以〝由...組成〞之術語所說明的其他方面類似的實施態樣。
如本文所使用述及之〝約(about或approximately)〞某數值或參數包括(且說明)針對該數值或參數之實施態樣。例如，述及〝約X〞的說明包括〝X〞的說明。
如本文於詞句中所使用的術語〝及/或〞(諸如〝A及/或B〞)意欲包括A和B二者；A或B；A(單獨)；及B(單獨)。同樣地，如詞句中所使用的術語〝及/或〞(諸如〝A、B及/或C〞)意欲包含下列實施態樣中之各者：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(單獨)；B(單獨)；及C(單獨)。
II. TIGIT結合劑
具有Ig及ITIM結構域(TIGIT)之T細胞免疫受體為含有免疫球蛋白可變(IgV)結構域之第I型跨膜糖蛋白。TIGIT屬於脊髓灰白質病毒受體(PVR)家族且與脊髓灰白質病毒受體(PVR；CD155)以高親和性結合及與 PVRL-2(CD112)和PVRL-3(CD113)以低親和性結合。TIGIT表現在T細胞上，包括調節性T細胞和記憶性T細胞，以及表現在NK細胞上且在原生CD4+ T細胞活化之後向上調節。小鼠TIGIT(UniProtKB No.P86176)及人類TIGIT(UniProtKB No.Q495A1)之全長胺基酸(aa)序列為本技術中已知且在本文分別以SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：4提供。如本文所使用的述及之胺基酸位置係指全長胺基酸序列(包括信號序列)之編號。
本發明提供特異性結合TIGIT之劑。該劑在本文稱為〝TIGIT結合劑〞。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為抗體。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為多肽。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑結合小鼠TIGIT。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑結合人類TIGIT。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑結合小鼠TIGIT及人類TIGIT。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑結合人類TIGIT及不結合小鼠TIGIT。
在一些實施態樣中，該劑結合TIGIT且干擾TIGIT與第二蛋白質之交互作用。在一些實施態樣中，該劑結合TIGIT且干擾TIGIT與PVR之交互作用。在一些實施態樣中，該劑結合TIGIT且干擾TIGIT與PVRL-2之交互作用。在一些實施態樣中，該劑結合TIGIT且干擾TIGIT與PVRL-3之交互作用。在一些實施態樣中，該劑特異性結合TIGIT且該劑阻擾TIGIT與PVR結合及/或阻擾TIGIT傳訊之PVR活化。
在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑為特異性結合TIGIT的細胞外結構域之抗體或其片段。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑為特異性結合小鼠TIGIT的細胞外結構域之抗體或其片段。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑為特異性結合人類TIGIT的細胞外結構域之抗體或其片段。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑為特異性結合小鼠TIGIT及人類TIGIT的細胞外結構域之抗體或其片段。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為特異性結合TIGIT的似Ig結構域之抗體。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為特異性結合TIGIT的IgV結構域之抗體。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為在人類TIGIT的胺基酸22-141及/或小鼠TIGIT胺基酸29-148內結合之抗體。在一些實施態樣中，TIGIT劑為在SEQ ID NO：4的胺基酸22-141及/或SEQ ID NO：1的胺基酸29-148內結合之抗體。在一些實施態樣中，該劑為在人類TIGIT的胺基酸22-124及/或小鼠TIGIT胺基酸29-127內結合之抗體。在一些實施態樣中，該劑係在SEQ ID NO：4的胺基酸22-124及/或SEQ ID NO：1的胺基酸29-127內結合。在特定的實施態樣中，TIGIT劑係在SEQ ID NO：3或其片段內結合。在特定的實施態樣中，TIGIT劑係在SEQ ID NO：6或其片段內結合。在一些實施態樣中，TIGIT劑為在人類TIGIT的胺基酸22-141內結合之抗體。在一些實施態樣中，TIGIT劑為在SEQ ID NO：4的胺基酸22-141內結合之抗體。在一些實施態樣中，TIGIT劑為在人類 TIGIT的胺基酸50-124內結合之抗體。在一些實施態樣中，TIGIT劑為在SEQ ID NO：4的胺基酸50-124內結合之抗體。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑係在SEQ ID NO：6或其片段內結合。
在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為結合抗原決定區之抗體，該抗原決定區包含在SEQ ID NO：79內的胺基酸。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為結合抗原決定區之抗體，該抗原決定區包含在SEQ ID NO：80內的胺基酸。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為結合抗原決定區之抗體，該抗原決定區包含在SEQ ID NO：79及SEQ ID NO：80內的胺基酸。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為結合抗原決定區之抗體，該抗原決定區包含SEQ ID NO：4的胺基酸Q62和I109。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為結合抗原決定區之抗體，該抗原決定區包含SEQ ID NO：4的胺基酸Q62和T119。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為結合抗原決定區之抗體，該抗原決定區包含SEQ ID NO：4的胺基酸Q64和I109。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為結合抗原決定區之抗體，該抗原決定區包含SEQ ID NO：4的胺基酸Q64和T119。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為結合抗原決定區之抗體，該抗原決定區包含SEQ ID NO：4的胺基酸Q62、Q64和I109。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為結合抗原決定區之抗體，該抗原決定區包含SEQ ID NO：4的胺基酸Q62、Q64和T119。在一些實施態樣中，TIGIT結合 劑為結合抗原決定區之抗體，該抗原決定區包含SEQ ID NO：4的胺基酸Q62、I109和T119。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為結合抗原決定區之抗體，該抗原決定區包含SEQ ID NO：4的胺基酸Q64、I109和T119。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為結合抗原決定區之抗體，該抗原決定區包含SEQ ID NO：4的胺基酸Q62、Q64、I109和T119。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為結合抗原決定區之抗體，該抗原決定區包含至少一種選自由下列所組成之群組：SEQ ID NO：4的胺基酸N58、E60、Q62、Q64、L65、F107、I109、H111、T117、T119、G120和R121。在一些實施態樣中，抗原決定區為構形抗原決定區。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為結合抗原決定區之抗體，該抗原決定區不包含SEQ ID NO：4的胺基酸V100。
在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑(例如抗體)係以約1μM或更小，約100nM或更小，約40nM或更小，約20nM或更小，約10nM或更小，約1nM或更小，約0.1nM或更小，50pM或更小，10pM或更小或1pM或更小的離解常數(KD)結合TIGIT。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑係以約20nM或更小之KD結合TIGIT。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑係以約10nM或更小之KD結合TIGIT。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑係以約1nM或更小之KD結合TIGIT。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑係以約0.5nM或更小之KD結合TIGIT。在一些實 施態樣中，TIGIT結合劑係以約0.1nM或更小之KD結合TIGIT。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑係以約50pM或更小之KD結合TIGIT。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑係以約25pM或更小之KD結合TIGIT。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑係以約10pM或更小之KD結合TIGIT。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑係以約1pM或更小之KD結合TIGIT。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑係以約10nM或更小之KD結合人類TIGIT及小鼠TIGIT二者。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑係以約1nM或更小之KD結合人類TIGIT及小鼠TIGIT二者。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑係以約0.1nM或更小之KD結合人類TIGIT及小鼠TIGIT二者。在一些實施態樣中，結合劑(例如抗體)對TIGIT之離解常數係使用固定在Biacore晶片上的包含TIGIT蛋白質之至少一部分的細胞外結構域之TIGIT融合蛋白測定之離解常數。在一些實施態樣中，結合劑(例如抗體)對TIGIT之離解常數係使用在Biacore晶片上以抗人類IgG抗體及可溶性TIGIT蛋白質所捕獲之結合劑測定之離解常數。
在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含特異性結合TIGIT之第一抗原結合部位及特異性結合第二標靶之第二抗原結合部位。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為包含特異性結合TIGIT之第一抗原結合部位及特異性結合第二標靶之第二抗原結合部位的雙特異性劑。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑係以約100nM或更小之KD結合 TIGIT及第二標靶二者。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑係以約50nM或更小之KD結合TIGIT及第二標靶二者。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑係以約20nM或更小之KD結合TIGIT及第二標靶二者。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑係以約10nM或更小之KD結合TIGIT及第二標靶二者。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑係以約1nM或更小之KD結合TIGIT及第二標靶二者。在一些實施態樣中，抗原結合部位中之一者的親和性比其他的抗原結合部位的親和性更弱。例如，一個抗原結合部位之KD可為約1nM及第二抗原結合部位之KD可為約10nM。在一些實施態樣中，在兩個抗原結合部位之間的親和性差別可為約2倍或更大，約3倍或更大，約5倍或更大，約8倍或更大，約10倍或更大，約15倍或更大，約20倍或更大，約30倍或更大，約50倍或更大或約100倍或更大。兩個抗原結合部位的親和性調節可影響雙特異性抗體之生物活性。例如，降低對TIGIT或第二標靶之抗原結合部位的親和性可具有所欲校應，例如降低結合劑毒性及/或增加治療指數。
在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑(例如抗體)係以約1μM或更低，約100nM或更低，約40nM或更低，約20nM或更低，約10nM或更低，約1nM或更低或約0.1nM或更低的一半最大有效濃度(EC50)結合TIGIT。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑係以約1μM或更低，約100nM或更低，約40nM或更低，約20nM或更低，約 10nM或更低，約1nM或更低或約0.1nM或更低的一半最大有效濃度(EC50)結合人類TIGIT。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑係以約40nM或更低，約20nM或更低，約10nM或更低，約1nM或更低或約0.1nM或更低的EC50結合小鼠TIGIT及/或人類TIGIT。
在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑為抗體。在一些實施態樣中，抗體為重組抗體。在一些實施態樣中，抗體為單克隆抗體。在一些實施態樣中，抗體為嵌合抗體。在一些實施態樣中，抗體為人源化抗體。在一些實施態樣中，抗體為人類抗體。在一些實施態樣中，抗體為IgA、IgD、IgE、IgG或IgM抗體。在特定的實施態樣中，抗體為IgG1抗體。在特定的實施態樣中，抗體為IgG2抗體。在一些實施態樣中，抗體為IgG4抗體。在特定的實施態樣中，抗體為包含抗原結合部位之抗體片段。在一些實施態樣中，抗體為雙特異性抗體或多特異性抗體。在一些實施態樣中，抗體為單價抗體。在一些實施態樣中，抗體為單特異性抗體。在一些實施態樣中，抗體為雙價抗體。在一些實施態樣中，抗體係與細胞毒性部分共軛。在一些實施態樣中，將抗體分離。在一些實施態樣中，抗體為實質上純的。
在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為多克隆抗體。多克隆抗體可以任何已知的方法製備。在一些實施態樣中，多克隆抗體係藉由以關注之抗原(例如純化之肽片段、全長重組蛋白或融合蛋白)使用多次皮下或腹膜內注 射使動物免疫(例如兔、大鼠、小鼠、山羊、驢)而製得。抗原可隨意地與載劑共軛，諸如鑰孔狀帽貝血藍素(KLH)或血清白蛋白。抗原(具有或不具有載劑蛋白質)係在無菌鹽水中稀釋且通常與佐劑(例如完全或不完全弗氏(Freund’s)佐劑)組合以形成穩定的乳液。在充足的時期之後，自經免疫之動物(通常自血液或腹水)回收多克隆抗體。多克隆抗體可根據本技術中的標準方法自血清或腹水純化，該等方法包括但不限於親和性層析術、離子交換層析術、膠體電泳和透析。
在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為單克隆抗體。單克隆抗體可使用本技術中已知的融合瘤方法製備。在一些實施態樣中，將小鼠、大鼠、兔子、倉鼠或其他適當的宿主動物使用融合瘤方法如上述免疫，以引誘生產特異性結合免疫抗原之抗體。在一些實施態樣中，可將淋巴細胞於試管內免疫。在一些實施態樣中，免疫抗原可為人類蛋白質或其片段。在一些實施態樣中，免疫抗原可為小鼠蛋白質或其片段。
在免疫之後，將淋巴細胞分離且使用例如聚乙二醇與適合的骨髓瘤細胞系融合。融合瘤細胞係使用本技術中已知的專用培養基挑選且未融合之淋巴細胞及骨髓瘤細胞在挑選過程不會存活。生產尤其針對挑選之抗原的單克隆抗體之融合瘤可以多種方法鑑別，包括但不限於免疫沉澱、免疫轉漬和試管內結合檢定法(例如流動式細胞測量術、FACS、ELISA和放射性免疫檢定法)。融合瘤可 使用標準方法於試管內培養而繁殖或於動物活體內繁殖成腹水腫瘤。單克隆抗體可根據本技術中的標準方法自培養基或腹水液體純化，該等方法包括但不限於親和性層析術、離子交換層析術、膠體電泳和透析。
在特定的實施態樣中，單克隆抗體可使用熟習本技術領域者已知的重組DNA技術製得。編碼單克隆抗體之多核苷酸係自成熟B細胞或融合瘤細胞分離，諸如藉由使用特異性擴增編碼抗體重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸引子之RT-PCR，且多核苷酸序列係使用標準技術測定。接著將經分離之編碼重鏈及輕鏈的多核苷酸選殖至適合的表現載體中，其在轉染至不以另外方式生產免疫球蛋白之宿主細胞時(諸如大腸桿菌、類人猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞)生產單克隆抗體。
在特定的其他實施態樣中，重組單克隆抗體或其片段可自表現所欲物種的可變結構域或CDR之噬菌體展示庫分離。
編碼單克隆抗體之多核苷酸可藉由例如使用重組DNA技術來修飾，以產生替代抗體。在一些實施態樣中，例如小鼠單克隆抗體之輕鏈及重鏈恆定結構域可經例如人類抗體之恆定區取代以產生嵌合抗體，或經非免疫球蛋白多肽取代以產生融合抗體。在一些實施態樣中，將恆定區截短或移除以產生所欲單克隆抗體之抗體片段。可變區的部位引導之突變形成或高密度突變形成可用於使單克隆抗體之特異性、親和性等等最優化。
在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為人源化抗體。人源化抗體通常為人類免疫球蛋白，其中CDR之胺基酸殘基係使用熟習本技術領域者已知的方法以來自非人類物種(例如小鼠、大鼠、兔子、倉鼠等等)之具有所欲特異性、親和性及/或結合能力的CDR之胺基酸殘基取代。在一些實施態樣中，人類免疫球蛋白的一些架構可變區胺基酸殘基係以非人類物種之抗體中的對應胺基酸殘基取代。在一些實施態樣中，人源化抗體可藉由取代架構可變區及/或經取代之非人類殘基內的額外殘基而進一步修飾，以進一步精進及最優化抗體特異性、親和性及/或能力。人源化抗體通常包含可變結構域，其含有所有或實質上所有對應於非人類免疫球蛋白之CDR，而所有或實質上所有的架構可變區為那些人類免疫球蛋白序列之架構區。在一些實施態樣中，架構區為人類免疫球蛋白共有序列之架構區。在一些實施態樣中，人源化抗體亦可包含至少一部分的免疫球蛋白恆定區或結構域(Fc)，通常為至少一部分的人類免疫球蛋白。在特定的實施態樣中，此等人源化抗體係用於治療，因為彼等在投予人類個體時可降低抗原性及HAMA(人類抗小鼠抗體)反應。
在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑為人類抗體。人類抗體可使用本技術中已知的各種技術直接製備。在一些實施態樣中，人類抗體可自試管內免疫之不朽人類B淋巴細胞或自免疫個體分離之淋巴細胞產生。在任一例子中，可產生且分離用於生產針對標靶抗原之抗體的細 胞。在一些實施態樣中，人類抗體可選自噬菌體庫，其中噬菌體庫表現人類抗體。另一選擇地，噬菌體展示技術可用於自未免疫之給予體的免疫球蛋白可變結構域基因譜系(gene repertoire)於試管內生產人類抗體及抗體片段。用於產生及使用抗體噬菌體庫之技術為本技術中所熟知。一經鑑別出抗體，則可使用本技術中已知的親和性成熟策略來產生較高的親和性人類抗體，包括但不限於鏈替換(chain shuffling)及部位引導之突變形成。
在一些實施態樣中，人類抗體可於含有人類免疫球蛋白基因座之基因轉殖小鼠中製得。一經免疫時，該等小鼠能夠生產人類抗體的全譜系，而不生產內源性免疫球蛋白。
在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體。因此，本發明包含特異性辨識TIGIT及至少一種額外標靶之雙特異性抗體。雙特異性抗體能夠特異性辨識及結合至少兩種不同的抗原或抗原決定區。不同的抗原決定區可在相同的分子內(例如兩個抗原決定區在TIGIT上)或在不同的分子上(例如一個抗原決定區在TIGIT上及一個抗原決定區在不同的蛋白質上)。在一些實施態樣中，與個別抗體或一種以上的抗體之組合相比，雙特異性抗體具有增強的效力。在一些實施態樣中，與個別抗體或一種以上的抗體之組合相比，雙特異性抗體具有降低的毒性。那些熟習本技術領域者已知任何治療劑可具有獨特的藥物動力學(PK)(例如循環半衰期)。在一些實施態樣中，雙特異 性抗體具有使兩種活性結合劑之PK同步的能力，其中兩種個別的結合劑具有不同的PK分布。在一些實施態樣中，雙特異性抗體具有使兩種劑之作用集中在相同區域中(例如腫瘤及/或腫瘤微環境)的能力。在一些實施態樣中，雙特異性抗體具有使兩種劑之作用集中在相同標靶(例如腫瘤或腫瘤細胞)的能力。在一些實施態樣中，雙特異性抗體具有使兩種劑之作用靶定至一種以上的生物途徑或功能的能力。在一些實施態樣中，雙特異性抗體具有靶定兩種不同的細胞且使彼等更緊密在一起(例如免疫細胞及腫瘤細胞)的能力。
在一些實施態樣中，雙特異性抗體為單克隆抗體。在一些實施態樣中，雙特異性抗體為人源化抗體。在一些實施態樣中，雙特異性抗體為人類抗體。在一些實施態樣中，雙特異性抗體為IgG1抗體。在一些實施態樣中，雙特異性抗體為IgG2抗體。在一些實施態樣中，雙特異性抗體為IgG4抗體。在一些實施態樣中，雙特異性抗體具有降低的毒性及/或副作用。在一些實施態樣中，與兩種個別抗體之混合物或成為單一劑之抗體相比，雙特異性抗體具有降低的毒性及/或副作用。在一些實施態樣中，雙特異性抗體具有增加的治療指數。在一些實施態樣中，與兩種個別抗體之混合物或成為單一劑之抗體相比，雙特異性抗體具有增加的治療指數。
在一些實施態樣中，抗體可特異性辨識及結合第一抗原標靶(例如TIGIT)以及第二抗原標靶，諸如在 免疫細胞上的效應子分子(例如CD2、CD3、CD28、CTLA4、PD-1、PD-L1、CD80或CD86)或Fc受體(例如CD64、CD32或CD16)，以便使細胞防禦機制聚集在表現及/或生產第一抗原標靶之細胞。在一些實施態樣中，抗體可用於引導胞毒劑至表現特別的標靶抗原之細胞。該等抗體具有抗原結合臂及結合胞毒劑或放射性核種螯合劑(諸如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA)之臂。
用於製備雙特異性抗體之技術為那些熟習本技術領域者已知。在一些實施態樣中，雙特異性抗體包含具有胺基酸修飾之重鏈恆定區，該胺基酸為兩個重鏈之間的介面之一部分。在一些實施態樣中，雙特異性抗體可使用〝孔中突點〞策略產生。在一些例子中，將術語〝突點〞和〝孔〞以術語〝隆凸〞和〝腔室〞取代。在一些實施態樣中，雙特異性抗體可包含不能夠在重鏈之間形成雙硫鍵聯之可變絞鏈區。在一些實施態樣中，修飾可包含導致靜電交互作用改變的胺基酸變化。在一些實施態樣中，修飾可包含導致疏水性/親水性交互作用改變的胺基酸變化。
雙特異性抗體可為包含抗原結合部位的完整抗體或抗體片段。亦預期具有超過兩價的抗體。例如，可製備三特異性抗體。因此，在特定的實施態樣中，對TIGIT之抗體具有多特異性。
在特定的實施態樣中，本文所述之抗體(或其他的多肽)可為單特異性。在特定的實施態樣中，抗體含 有的一或多個抗原結合部位中之各者能夠結合(binding)(或結合(bind))TIGIT之同源性抗原決定區。
在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑為抗體片段。抗體片段可具有與完整抗體不同的功能或能力；例如抗體片段可具有增加的腫瘤穿透。已知用於生產抗體片段的各種技術，包括但不限於完整抗體之蛋白水解消化。在一些實施態樣中，抗體片段包括由胃蛋白酶消化抗體分子所生產之F(ab')2片段。在一些實施態樣中，抗體片段包括藉由還原F(ab')2片段之雙硫橋所產生之Fab片段。在其他的實施態樣中，抗體片段包括藉由以木瓜酶及還原劑處理抗體分子所產生之Fab片段。在特定的實施態樣中，抗體片段係以重組方法生產。在一些實施態樣中，抗體片段包括Fv或單鏈Fv(scFv)片段。Fab、Fv及scFv抗體片段可表現在大腸桿菌或其他的宿主細胞中且自大腸桿菌或其他的宿主細胞分泌，容許大量生產該等片段。在一些實施態樣中，抗體片段係自抗體噬菌體庫分離，如本文所討論。例如，可使用方法建構Fab表現庫，容許快速且有效的鑑別對TIGIT或其衍生物、片段、類似物或同源物具有所欲特異性之單克隆Fab片段。在一些實施態樣中，抗體片段為線性抗體片段。在特定的實施態樣中，抗體片段為單特異性或雙特異性。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑為scFv。可使用各種技術來生產對TIGIT具有特異性的單鏈抗體。
在一些實施態樣中，尤其在抗體片段的例子 中，抗體經修飾以改變(例如增加或降低)其血清半衰期。這可藉由例如使抗體片段中的適當區域突變而使救援受體結合抗原決定區併入抗體片段中來達成，或藉由將抗原決定區併入肽標籤中，接著與抗體片段在末端或中間融合(例如藉由DNA或肽合成)來達成。
異質共軛抗體亦屬於本發明的範圍內。異質共軛抗體係由二個共價連接之抗體所組成。經提出的此等抗體用於例如使免疫細胞靶定不希望的細胞(例如腫瘤細胞)。亦可預期以合成蛋白質化學中已知的方法於試管內製備異質共軛抗體，包括那些涉及交聯劑之方法。例如，免疫毒素可使用雙硫交換反應或藉由形成硫醚鍵來建構。適合於此目的之試劑的實例包括亞胺基硫醇鹽及甲基-4-巰基丁亞胺酸酯。
就本發明的目的而言，應理解經修飾之抗體可包含提供抗體與標靶(亦即TIGIT)締合的任何類型之可變區。關於此點，可變區可包含或源自可經誘發以啟動體液反應及產生對抗所欲抗原之免疫球蛋白的任何類型之哺乳動物。確切而言，經修飾之抗體的可變區可源自例如人類、鼠類、兔子、非類靈長類動物(例如食蟹獼猴、獼猴等等)或兔子。在一些實施態樣中，經修飾之免疫球蛋白的可變區及恆定區二者為人類。在其他的實施態樣中，可相容抗體的可變區(通常源自非人類來源)可經工程化或經特定設計以改進分子的結合特性或降低免疫原性。關於此點，可將本發明中有用的可變區人源化或透過輸入之胺基 酸序列的加入而以另外的方式改變。
在特定的實施態樣中，在重鏈及輕鏈二者中的可變結構域係藉由至少部分取代一或多個CDR及若必要時藉由部分的架構區取代及序列修飾及/或變異而改變。雖然CDR可能源自與架構區起源之抗體相同類型或甚至相同亞型之抗體，但是設想CDR可能源自不同類型之抗體且常常源自不同物種之抗體。可能沒必要將所有的CDR以給予體可變區的所有CDR取代以轉移一個可變結構域之抗原結合能力至另一可變結構域。反而可能只需要轉移那些維持抗原結合部位活性所需之殘基。
儘管改變可變區，那些熟習本技術領域者應理解本發明的經修飾之抗體還是包含其中恆定結構域中之一或多者的至少一部分已刪除或以其他方式改變之抗體(例如全長抗體或彼之免疫反應性片段)，以提供所欲生化特徵，諸如與包含原生或未改變之恆定區約相同的免疫原性之抗體相比時具有增加的腫瘤定位或增加的血清半衰期。在一些實施態樣中，經修飾之抗體的恆定區包含人類恆定區。與本發明可相容的恆定區修飾包含添加、刪除或取代在一或多個結構域中的一或多個胺基酸。本文所揭示的經修飾之抗體可包含對三個重鏈恆定結構域中之一或多者(CH1、CH2或CH3)及/或對輕鏈恆定結構域(CL)之改變或修飾。在一些實施態樣中，一或多個結構域係自經修飾之抗體的恆定區部分或全部刪除。在一些實施態樣中，經修飾之抗體包含其中整個CH2結構域經移除之結構域刪 除之建構體或變體(△CH2建構體)。在一些實施態樣中，將刪去之恆定區結構域以短胺基酸間隔子(例如10個胺基酸殘基)取代，以提供通常由缺少的恆定區所賦予之某些分子柔韌性。
在一些實施態樣中，經修飾之抗體經工程化以直接融合CH3結構域與抗體之絞鏈區。在其他的實施態樣中，將肽間隔子插入絞鏈區與經修飾之CH2及/或CH3結構域之間。例如，可表現其中CH2結構域經刪除且剩餘的CH3結構域(經修飾或未經修飾)以5至20個胺基酸間隔子與絞鏈區連結之建構體。可添加此間隔子以確保恆定區之調節元件維持自由且易利用，或絞鏈區維持柔韌。然而，應注意胺基酸間隔子可在一些情況中證實具有免疫原性且引誘對抗建構體之不希望的免疫反應。因此，在特定的實施態樣中，添加至建構體的任何間隔子為相對非免疫原性，以維持經修飾之抗體的所欲生物品質。
在一些實施態樣中，經修飾之抗體可能僅具有部分刪除之恆定結構域或少數或甚至單一個胺基酸取代。例如，在CH2結構域之選擇區域中的單一胺基酸突變可能足以實質地降低Fc結合。在一些實施態樣中，在CH2結構域之選擇區域中的單一胺基酸突變可能足以實質地降低Fc結合且增加癌細胞定位及/或腫瘤穿透。同樣地，可能希望單純地刪除一或多個控制欲調節之特異性效應子功能(例如補體C1q結合)之恆定區結構域的部分。恆定區的此等部分刪除可改進經選擇之抗體特徵(血清半衰 期)，同時保留與目標恆定區結構域完整性相關聯的其他所欲功能。而且，如上所提及，所揭示之抗體的恆定區可透過一或多個胺基酸之突變或取代而修飾，以增強所得建構物的分布。關於此點，有可能阻擾由保守之結合部位所提供的活性(例如Fc結合)，且實質地維持經修飾之抗體的構型及免疫原性分布。在特定的實施態樣中，經修飾之抗體包含添加一或多個胺基酸至恆定區以增強所欲特徵，諸如降低或增加效應子功能或提供更多的細胞毒素或碳水化合物連接部位。
在本技術中已知恆定區媒介數種效應子功能。例如，以補體之C1組份與IgG或IgM抗體(與抗原結合)之Fc區結合使補體系統活化。補體活化在細胞病原體之調理及溶解中具有重要性。補體活化亦刺激發炎反應，且亦可涉入自體免疫超敏反應。另外，抗體之Fc區可結合表現Fc受體(FcR)之細胞。有一些Fc受體對不同類別之抗體具有特異性，包括IgG(γ受體)、IgE(ε受體)、IgA(α受體)及IgM(μ受體)。抗體與細胞表面上的Fc受體結合觸發許多重要且多變的生物反應，包括吞噬且破壞抗體包覆粒子、清除免疫複合物、以殺手細胞溶解經抗體包覆之標靶細胞(稱為抗體依賴性細胞毒性或ADCC)、釋放發炎媒介物、胚胎轉移及控制免疫球蛋白生產。
在特定的實施態樣中，經修飾之抗體提供經改變之效應子功能，該功能依次影響所投予之抗體的生物 分布。例如，在一些實施態樣中，恆定區結構域之刪除或不活化(透過點突變或其他手段)可降低循環修飾之抗體的Fc受體結合。在一些實施態樣中，恆定區結構域之刪除或不活化(透過點突變或其他手段)可降低循環修飾之抗體的Fc受體結合，由此增加癌細胞定位及/或腫瘤穿透。在其他的實施態樣中，恆定區修飾增加抗體之血清半衰期。在其他的實施態樣中，恆定區修飾降低抗體之血清半衰期。在一些實施態樣中，恆定區經修飾以消除雙硫鍵聯或寡糖部分。依照本發明的恆定區修飾可使用熟知的生化或分子工程技術輕易進行。
在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑(其為抗體)不具有一或多個效應子功能。例如，在一些實施態樣中，抗體不具有ADCC活性及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)活性。在特定的實施態樣中，抗體不結合Fc受體及/或補體因子。在特定的實施態樣中，抗體不具有效應子功能。
本發明另外包含實質上與本文所述之重組、單克隆、嵌合、人源化和人類抗體或彼之抗體片段同源的變體及相等物。該等變體可含有例如保守性取代突變，亦即以類似的胺基酸取代一或多個胺基酸。
本發明提供用於生產結合TIGIT的抗體之方法，該抗體包括特異性結合TIGIT及第二標靶二者的雙特異性抗體。在一些實施態樣中，用於生產結合TIGIT的抗體之方法包含使用融合瘤技術。在一些實施態樣中，提供 用於生產結合人類TIGIT的抗體之方法。在一些實施態樣中，該方法包含使用包含小鼠TIGIT或其片段的細胞外結構域之多肽作為抗原。在一些實施態樣中，該方法包含使用包含人類TIGIT或其片段的細胞外結構域之多肽作為抗原。在一些實施態樣中，該方法包含使用包含小鼠TIGIT的胺基酸29-148之多肽作為抗原。在一些實施態樣中，該方法包含使用包含人類TIGIT的胺基酸22-141之多肽作為抗原抗原。在一些實施態樣中，該方法包含使用包含SEQ ID NO：1的胺基酸29-148之多肽作為抗原。在一些實施態樣中，該方法包含使用包含SEQ ID NO：4的胺基酸22-141作為抗原。在一些實施態樣中，該方法包含使用包含SEQ ID NO：3或其片段之多肽作為抗原。在一些實施態樣中，該方法包含使用包含SEQ ID NO：6或其片段之多肽作為抗原。在一些實施態樣中，用於產生結合TIGIT的抗體之方法包含篩選噬菌體庫。在一些實施態樣中，用於產生結合TIGIT的抗體之方法包含篩選人類噬菌體庫。本發明另外提供用於鑑別結合TIGIT的抗體之方法。在一些實施態樣中，抗體係藉由FACS篩選對TIGIT或其片段之結合來鑑別。在一些實施態樣中，抗體係藉由使用ELISA篩選對TIGIT或其片段之結合來鑑別。在一些實施態樣中，抗體係藉由以FACS篩選用於阻斷TIGIT與PVR之結合來鑑別。
在一些實施態樣中，用於產生對TIGIT的抗體之方法包含以包含小鼠TIGIT的胺基酸29-148之多肽 使哺乳動物免疫。在一些實施態樣中，用於產生對TIGIT的抗體之方法包含以包含人類TIGIT的胺基酸22-141之多肽使哺乳動物免疫。在一些實施態樣中，用於產生對TIGIT的抗體之方法包含以包含小鼠TIGIT的胺基酸29-148之片段(例如部分)的多肽使哺乳動物免疫。在一些實施態樣中，用於產生對TIGIT的抗體之方法包含以包含人類TIGIT的胺基酸22-141之片段的多肽使哺乳動物免疫。在一些實施態樣中，該方法另外包含自哺乳動物分離抗體或抗體生產細胞。在一些實施態樣中，用於產生結合TIGIT的單克隆抗體之方法包含：(a)以包含小鼠TIGIT的胺基酸29-148之片段的多肽使哺乳動物免疫；(b)自經免疫之哺乳動物分離抗體生產細胞；及(c)將抗體生產細胞與骨髓瘤細胞系之細胞融合，以形成融合瘤細胞。在一些實施態樣中，用於產生結合TIGIT的單克隆抗體之方法包含：(a)以包含人類TIGIT的胺基酸22-141之片段的多肽使哺乳動物免疫；(b)自經免疫之哺乳動物分離抗體生產細胞；及(c)將抗體生產細胞與骨髓瘤細胞系之細胞融合，以形成融合瘤細胞。在一些實施態樣中，該方法另外包含(d)選擇表現結合TIGIT之抗體的融合瘤細胞。在特定的實施態樣中，哺乳動物為小鼠。在一些實施態樣中，哺乳動物為大鼠。在一些實施態樣中，哺乳動物為兔子。在一些實施態樣中，抗體係使用包含小鼠TIGIT的胺基酸29-148或其片段之多肽選擇。在一些實施態樣中，抗體係使用包含人類TIGIT的胺基酸22-141或其片段之多肽選 擇。在一些實施態樣中，抗體結合人類TIGIT及小鼠TIGIT二者。在一些實施態樣中，抗體不結合小鼠TIGIT。在一些實施態樣中，抗體不結合食蟹獼猴TIGIT。在一些實施態樣中，抗體不結合恆河猴TIGIT。在一些實施態樣中，抗體不結合大鼠TIGIT。在一些實施態樣中，抗體結合人類TIGIT及不結合小鼠TIGIT。在一些實施態樣中，抗體結合人類TIGIT及不結合食蟹獼猴TIGIT。在一些實施態樣中，抗體結合人類TIGIT及不結合恆河猴TIGIT。在一些實施態樣中，抗體結合人類TIGIT及不結合大鼠TIGIT。
在一些實施態樣中，用於生產結合TIGIT的抗體之方法包含使用包含單一抗原結合部位的膜結合之異質二聚體分子鑑別抗體。在一些非限制性實施態樣中，抗體係使用國際專利公開案WO 2011/100566中所述之方法及多肽來鑑別。
在一些實施態樣中，用於生產結合TIGIT的抗體之方法包含篩選抗體表現庫。在一些實施態樣中，抗體表現庫為噬菌體庫。在一些實施態樣中，篩選包含揀選(panning)。在一些實施態樣中，抗體表現庫為哺乳動物細胞庫。在一些實施態樣中，抗體表現庫係使用小鼠TIGIT或其片段的胺基酸29-148來篩選。在一些實施態樣中，抗體表現庫係使用人類TIGIT或其片段的胺基酸22-141來篩選。在一些實施態樣中，以篩選鑑別之抗體結合人類TIGIT及小鼠TIGIT二者。在一些實施態樣中，以篩選鑑 別之抗體為TIGIT拮抗劑。
在一些實施態樣中，以本文所述之方法產生的抗體為TIGIT拮抗劑。在一些實施態樣中，以本文所述之方法產生的抗體抑制TIGIT傳訊。在一些實施態樣中，以本文所述之方法產生的抗體抑制TIGIT磷酸化。
在特定的實施態樣中，將本文所述之抗體分離。在特定的實施態樣中，本文所述之抗體為實質上純的。
本發明的TIGIT結合劑(例如抗體)可以本技術中已知的任何方法檢定特異性結合。可使用的免疫檢定法包括但不限於使用下列技術的競爭性及非競爭性檢定系統：諸如Biacore分析、FACS分析、免疫螢光、免疫細胞化學、西方墨點分析、放射性免疫檢定、ELISA、〝三明治〞式免疫檢定、免疫沉澱檢定、沉澱反應、凝膠擴散沉澱反應、免疫擴散檢定、凝集檢定、補體固定檢定、免疫放射檢定、螢光免疫檢定和蛋白質A免疫檢定。此等檢定為慣例程序且為本技術中所熟知(參見例如Ausubel等人之Editors,1994-present,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,New York,NY)。
在非限制性實例中，用於抗體與人類TIGIT之特異性結合的篩選可使用ELISA測定。ELISA包含製備抗原(例如TIGIT或其片段)，以抗原包覆96槽孔微量滴定盤之槽孔，添加與可檢測的化合物(諸如酵素受質，例如辣根過氧化酶或鹼性磷酸酶)共軛之試驗抗體至槽孔 中，培育一段時期且檢測與抗原結合之抗體的存在。在一些實施態樣中，試驗抗體不與可檢測的化合物共軛，反而將辨識抗體(例如抗Fc抗體)且與可檢測的化合物共軛之二級抗體添加至槽孔中。在一些實施態樣中，不以抗原包覆槽孔，反而以試驗抗體包覆槽孔，添加抗原(例如TIGIT)至槽孔，接著添加與可檢測的化合物共軛之二級抗體。熟習本技術領域者能具有關於可修改以增加檢測信號的參數以及本技術中已知的ELISA之其他變數的知識。
在另一非限制性實例中，用於抗體與人類TIGIT之特異性結合可使用FACS測定。FACS篩選檢定法可包含產生表現成為全長蛋白質(TIGIT)或融合蛋白(例如TIGIT-CD4TM)之抗原的建構體，將建構體轉染至細胞中，使抗原表現在細胞表面上，將試驗抗體與經轉染之細胞混合且培育一段時期。以試驗抗體結合之細胞可使用與可檢測的化合物共軛之二級抗體(例如經PE共軛之抗Fc抗體)及流動式細胞測量計鑑別。熟習本技術領域者能具有關於可修改而使檢測信號最優化的參數以及可增強篩選(例如阻斷抗體之篩選)的FACS之其他變數的知識。
抗體或其他結合劑對抗原(例如TIGIT)的結合親和性及抗體-抗原交互作用之解離速率(off-rate)可藉由競爭性結合檢定法測定。競爭性結合檢定法的一個實例為放射性免疫檢定法，其包含將經標記之抗原(例如3H或125I-TIGIT)或其片段或變體與關注之抗體在增量的未標記之抗原存在下培育，接著檢測與經標記之抗原結合的抗 體。抗體對抗原的親和性及結合解離速率可自斯卡查德(Scatchard)圖分析之數據測定。在一些實施態樣中，Biacore動力學分析係用於測定結合抗原(例如TIGIT)之抗體或劑之結合及解離速率。在一些實施態樣中，Biacore動力學分析包含分析抗體與晶片表面上固定之抗原(例如TIGIT)的結合及自晶片的解離。在一些實施態樣中，Biacore動力學分析包含分析抗原(例如TIGIT)與晶片表面上固定之抗體(例如抗TIGIT抗體)的結合及自晶片的解離。
在特定的實施態樣中，本發明提供特異性結合TIGIT之TIGIT結合劑(例如抗體)，其中TIGIT結合劑包含抗體313R11、313R12、313R14或313R19的CDR中之一、二、三、四、五及/或六者(參見表1)。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含13R11、313R12、313R14或313R19或彼之人源化變體的CDR中之一或多者；313R11、313R12、313R14或313R19或彼之人源化變體的CDR中之二或更多者；313R11、313R12、313R14或313R19或彼之人源化變體的CDR中之三或更多者；313R11、313R12、313R14或313R19或彼之人源化變體的CDR中之四或更多者；313R11、313R12、313R14或313R19或彼之人源化變體的CDR中之五或更多者；或313R11、313R12、313R14或313R19或彼之人源化變體的CDR中之全部六者。
Figure 105116461-A0202-12-0069-1
在特定的實施態樣中，本發明提供特異性結合TIGIT之TIGIT結合劑(例如抗體)，其中TIGIT結合劑包含：包含GSSLSSSYMS(SEQ ID NO：7)或GFSLSSSYMS(SEQ ID NO：13)之重鏈CDR1、包含IIGSNGNTYYANWAKG(SEQ ID NO：8)之重鏈CDR2及包含GGYRTSGMDP(SEQ ID NO：9)之重鏈CDR3。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑另外包含：包含QASQSISSYLNW(SEQ ID NO：10)、QASQSNIYSDLAW(SEQ ID NO：14)或QASQNIYSDLAW(SEQ ID NO：81)之輕鏈CDR1、包含DALKLAS(SEQ ID NO：11)或RASTLAS(SEQ ID NO：15)之輕鏈CDR2及包含QQEHSVGNVDN(SEQ ID NO：12)或QQEHLVAWIYN(SEQ ID NO：16)之輕鏈CDR3。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含：包含QASQSISSYLNW(SEQ ID NO：10)、QASQSNIYSDLAW(SEQ ID NO：14)或QASQNIYSDLAW(SEQ ID NO：81)之輕鏈CDR1、包含DALKLAS(SEQ ID NO：11)或RASTLAS(SEQ ID NO： 15)之輕鏈CDR2及包含QQEHSVGNVDN(SEQ ID NO：12)或QQEHLVAWIYN(SEQ ID NO：16)之輕鏈CDR3。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含：(a)包含GSSLSSSYMS(SEQ ID NO：7)或GFSLSSSYMS(SEQ ID NO：13)之重鏈CDR1、包含IIGSNGNTYYANWAKG(SEQ ID NO：8)之重鏈CDR2及包含GGYRTSGMDP(SEQ ID NO：9)之重鏈CDR3；及(b)包含QASQSISSYLNW(SEQ ID NO：10)、QASQSNIYSDLAW(SEQ ID NO：14)或QASQNIYSDLAW(SEQ ID NO：81)之輕鏈CDR1、包含DALKLAS(SEQ ID NO：11)或RASTLAS(SEQ ID NO：15)之輕鏈CDR2及包含QQEHSVGNVDN(SEQ ID NO：12)或QQEHLVAWIYN(SEQ ID NO：16)之輕鏈CDR3。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含：(a)包含GSSLSSSYMS(SEQ ID NO：7)之重鏈CDR1、包含IIGSNGNTYYANWAKG(SEQ ID NO：8)之重鏈CDR2及包含GGYRTSGMDP(SEQ ID NO：9)之重鏈CDR3；及(b)包含QASQSISSYLNW(SEQ ID NO：10)之輕鏈CDR1、包含DALKLAS(SEQ ID NO：11)之輕鏈CDR2及包含QQEHSVGNVDN(SEQ ID NO：12)之輕鏈CDR3。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含：(a)包含GFSLSSSYMS(SEQ ID NO：13)之重鏈CDR1、包含IIGSNGNTYYANWAKG(SEQ ID NO：8)之重鏈CDR2及包含GGYRTSGMDP(SEQ ID NO：9)之重鏈CDR3；及(b)包含QASQSNIYSDLAW(SEQ ID NO：14)之輕鏈CDR1、 包含RASTLAS(SEQ ID NO：15)之輕鏈CDR2及包含QQEHLVAWIYN(SEQ ID NO：16)之輕鏈CDR3。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含：(a)包含GFSLSSSYMS(SEQ ID NO：13)之重鏈CDR1、包含IIGSNGNTYYANWAKG(SEQ ID NO：8)之重鏈CDR2及包含GGYRTSGMDP(SEQ ID NO：9)之重鏈CDR3；及(b)包含QASQNIYSDLAW(SEQ ID NO：81)之輕鏈CDR1、包含RASTLAS(SEQ ID NO：15)之輕鏈CDR2及包含QQEHLVAWIYN(SEQ ID NO：16)之輕鏈CDR3。
在特定的實施態樣中，本發明提供特異性結合人類TIGIT之TIGIT結合劑(例如抗體)，其中TIGIT結合劑包含：(a)包含GSSLSSSYMS(SEQ ID NO：7)、GFSLSSSYMS(SEQ ID NO：13)或包含1、2、3或4個胺基酸取代的其變體之重鏈CDR1；(b)包含IIGSNGNTYYANWAKG(SEQ ID NO：8)或包含1、2、3或4個胺基酸取代的其變體之重鏈CDR2；(c)包含GGYRTSGMDP(SEQ ID NO：9)或包含1、2、3或4個胺基酸取代的其變體之重鏈CDR3；(d)包含QASQSISSYLNW(SEQ ID NO：10)、QASQSNIYSDLAW(SEQ ID NO：14)、QASQNIYSDLAW(SEQ ID NO：81)或包含1、2、3或4個胺基酸取代的其變體之輕鏈CDR1；(e)包含DALKLAS(SEQ ID NO：11)、RASTLAS(SEQ ID NO：15)或包含1、2、3或4個胺基酸取代的其變體之輕鏈CDR2；及(f)包含QQEHSVGNVDN(SEQ ID NO：12)、 QQEHLVAWIYN(SEQ ID NO：16)或包含1、2、3或4個胺基酸取代的其變體之輕鏈CDR3。在特定的實施態樣中，胺基酸取代為保守性取代。在一些實施態樣中，取代構成人源化過程的一部份。在一些實施態樣中，取代構成種系人源化過程的一部份。
在特定的實施態樣中，本發明提供特異性結合TIGIT之TIGIT結合劑(例如抗體)，本發明提供TIGIT結合劑(例如抗體)，其中TIGIT結合劑包含與SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：32具有至少約80%之序列一致性的重鏈可變區及/或與SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20具有至少約80%之序列一致性的輕鏈可變區。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含與SEQ ID NO：17具有至少約85%，至少約90%，至少約95%，至少約97%或至少約99%之序列一致性的重鏈可變區。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含與SEQ ID NO：19具有至少約85%，至少約90%，至少約95%，至少約97%或至少約99%之序列一致性的重鏈可變區。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含與SEQ ID NO：32具有至少約85%，至少約90%，至少約95%，至少約97%或至少約99%之序列一致性的重鏈可變區。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含與SEQ ID NO：18具有至少約85%，至少約90%，至少約95%，至少約97%或至少約99%之序列一致性的輕鏈可變區。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含與SEQ ID NO：20具有至少約85%，至少約 90%，至少約95%，至少約97%或至少約99%之序列一致性的輕鏈可變區。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含與SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：32具有至少約95%之序列一致性的重鏈可變區及/或與SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20具有至少約95%之序列一致性的輕鏈可變區。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：32及/或該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：32且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區基本上由SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：32所組成且該輕鏈可變區基本上由SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20所組成。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區係由SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：32所組成且該輕鏈可變區係由SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20所組成。
在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：17且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：18。在特定的實施態樣 中，TIGIT結合劑包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區基本上由SEQ ID NO：17所組成且該輕鏈可變區基本上由SEQ ID NO：18所組成。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區係由SEQ ID NO：17所組成且該輕鏈可變區係由SEQ ID NO：18所組成。
在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：19且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：20。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區基本上由SEQ ID NO：19所組成且該輕鏈可變區基本上由SEQ ID NO：20所組成。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區係由SEQ ID NO：19所組成且該輕鏈可變區係由SEQ ID NO：20所組成。
在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：32且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：20。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區基本上由SEQ ID NO：32所組成且該輕鏈可變區基本上由SEQ ID NO：20所組成。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區係由SEQ ID NO：32所組成且該輕鏈可變區係由SEQ ID NO：20所組成。
在特定的實施態樣中，本發明提供特異性結合TIGIT之TIGIT結合劑(例如抗體)，其中TIGIT結合劑包含：(a)與SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：56具有至少90%之序列一致性的重鏈；及/或(b)與SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：30具有至少90%之序列一致性的輕鏈。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含：(a)與SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：56具有至少95%之序列一致性的重鏈；及/或(b)與SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：30具有至少95%之序列一致性的輕鏈。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含重鏈和輕鏈，該重鏈包含SEQ ID NO：26及/或該輕鏈包含SEQ ID NO：28。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含重鏈和輕鏈，該重鏈包含SEQ ID NO：27及/或該輕鏈包含SEQ ID NO：28。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含重鏈和輕鏈，該重鏈包含SEQ ID NO：29及/或該輕鏈包含SEQ ID NO：30。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含重鏈和輕鏈，該重鏈包含SEQ ID NO：34及/或該輕鏈包含SEQ ID NO：30。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含重鏈和輕鏈，該重鏈包含SEQ ID NO：56及/或該輕鏈包含SEQ ID NO：30。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含重鏈和輕鏈，該重鏈基本上由SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：27所組成且該輕鏈基本上由SEQ ID NO：28所組成。在一些實施態樣中， TIGIT結合劑包含重鏈和輕鏈，該重鏈基本上由SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：56所組成且該輕鏈基本上由SEQ ID NO：30所組成。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含重鏈和輕鏈，該重鏈基本上由SEQ ID NO：26所組成且該輕鏈基本上由SEQ ID NO：28所組成。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含重鏈和輕鏈，該重鏈係由SEQ ID NO：27所組成且該輕鏈係由SEQ ID NO：28所組成。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含重鏈和輕鏈，該重鏈係由SEQ ID NO：29所組成且該輕鏈係由SEQ ID NO：30所組成。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含重鏈和輕鏈，該重鏈係由SEQ ID NO：34所組成且該輕鏈係由SEQ ID NO：30所組成。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含重鏈和輕鏈，該重鏈係由SEQ ID NO：56所組成且該輕鏈係由SEQ ID NO：30所組成。
在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含313R11抗體之重鏈可變區和輕鏈可變區。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含313R11抗體之可變區，其中來自313R11抗體之重鏈可變區及/或輕鏈可變區經親和性成熟。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含313R11抗體(具有或不具有前導序列)之重鏈和輕鏈。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑為313R11抗體。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含313R11抗體之重鏈可變區及/或輕鏈可變區，其中重鏈可變區及/或輕鏈可變區經人源 化。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含313R11抗體的人源化形式之重鏈可變區及/或輕鏈可變區。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含成為1gG1、IgG2或IgG4重鏈之一部分的313R11抗體之重鏈可變區。
在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含、基本上由或由抗體313R11所組成。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含、基本上由或由抗體313R11之變體所組成。
在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含313R12抗體之重鏈可變區和輕鏈可變區。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含313R12抗體之可變區，其中來自313R12抗體之重鏈可變區及/或輕鏈可變區經親和性成熟。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含313R12抗體(具有或不具有前導序列)之重鏈和輕鏈。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑為313R12抗體。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含313R12抗體之重鏈可變區及/或輕鏈可變區，其中重鏈可變區及/或輕鏈可變區經人源化。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含313R12抗體的人源化形式之重鏈可變區及/或輕鏈可變區。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含成為IgG1、IgG2或IgG4重鏈之一部分的313R12抗體之重鏈可變區。
在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含、基本上由或由抗體313R12所組成。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含、基本上由或由抗體313R12之變體所 組成。
在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含313R14抗體之重鏈可變區和輕鏈可變區。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含313R14抗體之可變區，其中來自313R14抗體之重鏈可變區及/或輕鏈可變區經親和性成熟。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含313R14抗體(具有或不具有前導序列)之重鏈和輕鏈。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑為313R14抗體。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含313R14抗體之重鏈可變區及/或輕鏈可變區，其中重鏈可變區及/或輕鏈可變區經人源化。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含313R14抗體的人源化形式之重鏈可變區及/或輕鏈可變區。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含成為IgG1、IgG2或IgG4重鏈之一部分的313R14抗體之重鏈可變區。
在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含、基本上由或由抗體313R14所組成。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含、基本上由或由抗體313R14之變體所組成。
在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含313R19抗體之重鏈可變區和輕鏈可變區。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含313R19抗體之可變區，其中來自313R19抗體之重鏈可變區及/或輕鏈可變區經親和性成熟。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含313R19抗體(具有或不具有前導序列)之重鏈和輕鏈。在特定的實施 態樣中，TIGIT結合劑為313R19抗體。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含313R19抗體之重鏈可變區及/或輕鏈可變區，其中重鏈可變區及/或輕鏈可變區經人源化。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含313R19抗體的人源化形式之重鏈可變區及/或輕鏈可變區。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含成為IgG1、IgG2或IgG4重鏈之一部分的313R19抗體之重鏈可變區。
在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含、基本上由或由抗體313R19所組成。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含、基本上由或由抗體313R19之變體所組成。
在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含在2015年5月27日依照布達佩斯條約(Budapest Treaty)之條款寄存於美國菌種保存中心(ATCC)，10801 University Boulevard,Manassas,VA,USA且以PTA-122180編號之質體所編碼之重鏈可變區。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含在2015年5月27日依照布達佩斯條約之條款寄存於ATCC，10801 University Boulevard,Manassas,VA,USA且以PTA-122181編號之質體所編碼之輕鏈可變區。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含由寄存於ATCC且以PTA-122180編號之質體所編碼之重鏈可變區和由寄存於ATCC且以PTA-122181編號之質體所編碼之輕鏈可變區。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含重鏈，該重鏈包含由寄存於ATCC且以PTA-122180編號之質體所編碼 之重鏈可變區。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含輕鏈，該輕鏈包含由寄存於ATCC且以PTA-122181編號之質體所編碼之輕鏈可變區。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含重鏈和輕鏈，該重鏈包含由寄存於ATCC且以PTA-122180編號之質體所編碼之重鏈可變區且該輕鏈包含由寄存於ATCC且以PTA-122181編號之質體所編碼之輕鏈可變區。
在特定的實施態樣中，本發明提供特異性結合TIGIT之TIGIT結合劑(例如抗體)，其中TIGIT結合劑包含抗體313M26或313M32的CDR中之一、二、三、四、五及/或六者(參見表2)。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含313M26或313M32的CDR中之一或多者；313M26或313M32的CDR中之二或更多者；313M26或313M32的CDR中之三或更多者；313M26或313M32的CDR中之四或更多者；313M26或313M32的CDR中之五或更多者；或313M26或313M32的CDR中之全部六者。
Figure 105116461-A0202-12-0080-2
在特定的實施態樣中，本發明提供特異性結合TIGIT之TIGIT結合劑(例如抗體)，其中TIGIT結合劑包含：包含TSDYAWN(SEQ ID NO：57)之重鏈CDR1、包含YISYSGSTSYNPSLRS(SEQ ID NO：58)之重鏈CDR2及包含ARRQVGLGFAY(SEQ ID NO：59)之重鏈CDR3。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑另外包含：包含KASQDVSTAVA(SEQ ID NO：60)之輕鏈CDR1、包含SASYRYT(SEQ ID NO：61)之輕鏈CDR2及包含QQHYSTP(SEQ ID NO：62)之輕鏈CDR3。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含：包含KASQDVSTAVA(SEQ ID NO：60)之輕鏈CDR1、包含SASYRYT(SEQ ID NO：61)之輕鏈CDR2及包含QQHYSTP(SEQ ID NO：62)之輕鏈CDR3。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含：(a)包含TSDYAWN(SEQ ID NO：57)之重鏈CDR1、包含YISYSGSTSYNPSLRS(SEQ ID NO：58)之重鏈CDR2及包含ARRQVGLGFAY(SEQ ID NO：59)之重鏈CDR3；及(b)包含KASQDVSTAVA(SEQ ID NO：60)之輕鏈CDR1、包含SASYRYT(SEQ ID NO：61)之輕鏈CDR2及包含QQHYSTP(SEQ ID NO：62)之輕鏈CDR3。
在特定的實施態樣中，本發明提供特異性結合人類TIGIT之TIGIT結合劑(例如抗體)，其中TIGIT結合劑包含：(a)包含TSDYAWN(SEQ ID NO：57)或包含1、2、3或4個胺基酸取代的其變體之重鏈CDR1；(b)包含YISYSGSTSYNPSLRS(SEQ ID NO：58)或包含1、2、3 或4個胺基酸取代的其變體之重鏈CDR2；(c)包含ARRQVGLGFAY(SEQ ID NO：59)或包含1、2、3或4個胺基酸取代的其變體之重鏈CDR3；(d)包含KASQDVSTAVA(SEQ ID NO：60)或包含1、2、3或4個胺基酸取代的其變體之輕鏈CDR1；(e)包含SASYRYT(SEQ ID NO：61)或包含1、2、3或4個胺基酸取代的其變體之輕鏈CDR2；或(f)包含QQHYSTP(SEQ ID NO：62)或包含1、2、3或4個胺基酸取代的其變體之輕鏈CDR3。在特定的實施態樣中，胺基酸取代為保守性取代。在一些實施態樣中，在一些實施態樣中，取代構成人源化過程的一部份。在一些實施態樣中，取代構成種系人源化過程的一部份。在一些實施態樣中，取代構成結合最優化過程的一部份。
在特定的實施態樣中，本發明提供特異性結合TIGIT之TIGIT結合劑(例如抗體)，其中TIGIT結合劑包含與SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：67具有至少約80%之序列一致性的重鏈可變區及/或與SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：68具有至少80%之序列一致性的輕鏈可變區。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含與SEQ ID NO：63具有至少約85%，至少約90%，至少約95%，至少約97%或至少約99%之序列一致性的重鏈可變區。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含與SEQ ID NO：67具有至少約85%，至少約90%，至少約95%，至少約97%或至少約99%之序列一致性的重鏈可變區。在特定的實施 態樣中，TIGIT結合劑包含與SEQ ID NO：64具有至少約85%，至少約90%，至少約95%，至少約97%或至少約99%之序列一致性的輕鏈可變區。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含與SEQ ID NO：68具有至少約85%，至少約90%，至少約95%，至少約97%或至少約99%之序列一致性的輕鏈可變區。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含與SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：67具有至少約95%之序列一致性的重鏈可變區及/或與SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：68具有至少約95%之序列一致性的輕鏈可變區。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：67及/或該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：68。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：67且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：68。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區基本上由SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：67所組成且該輕鏈可變區基本上由SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：68所組成。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區係由SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：67所組成且該輕鏈可變區係由SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：68所組成。
在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含重鏈 可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：63且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：64。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區基本上由SEQ ID NO：63所組成且該輕鏈可變區基本上由SEQ ID NO：64所組成。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區係由SEQ ID NO：63所組成且該輕鏈可變區係由SEQ ID NO：64所組成。
在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：67且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：68。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區基本上由SEQ ID NO：67所組成且該輕鏈可變區基本上由SEQ ID NO：68所組成。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區係由SEQ ID NO：67所組成且該輕鏈可變區係由SEQ ID NO：68所組成。
在特定的實施態樣中，本發明提供特異性結合TIGIT之TIGIT結合劑(例如抗體)，其中TIGIT結合劑包含：與SEQ ID NO：70具有至少90%之序列一致性的重鏈及/或與SEQ ID NO：72具有至少90%之序列一致性的輕鏈。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含：與SEQ ID NO：70具有至少95%之序列一致性的重鏈及/或與SEQ ID NO：72具有至少95%之序列一致性的輕鏈。在一 些實施態樣中，TIGIT結合劑包含：包含SEQ ID NO：70之重鏈及/或SEQ ID NO：72之輕鏈。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含重鏈和輕鏈，該重鏈基本上由SEQ ID NO：70所組成且該輕鏈基本上由SEQ ID NO：72所組成。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含重鏈和輕鏈，該重鏈係由SEQ ID NO：70所組成且該輕鏈係由SEQ ID NO：72所組成。
在特定的實施態樣中，本發明提供特異性結合TIGIT之TIGIT結合劑(例如抗體)，其中TIGIT結合劑包含：與SEQ ID NO：82具有至少90%之序列一致性的重鏈及/或與SEQ ID NO：72具有至少90%之序列一致性的輕鏈。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含：與SEQ ID NO：82具有至少95%之序列一致性的重鏈及/或與SEQ ID NO：72具有至少95%之序列一致性的輕鏈。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含重鏈和輕鏈，該重鏈包含SEQ ID NO：82及/或該輕鏈包含SEQ ID NO：72。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含重鏈和輕鏈，該重鏈基本上由SEQ ID NO：82所組成且該輕鏈基本上由SEQ ID NO：72所組成。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含重鏈和輕鏈，該重鏈係由SEQ ID NO：82所組成且該輕鏈係由SEQ ID NO：72所組成。
在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含313M26抗體之重鏈可變區和輕鏈可變區。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含313M26抗體之可變區，其中來 自313M26抗體之重鏈可變區及/或輕鏈可變區經親和性成熟。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含313M26抗體(具有或不具有前導序列)之重鏈和輕鏈。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑為313M26抗體。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含313M26抗體之重鏈可變區及/或輕鏈可變區，其中重鏈可變區及/或輕鏈可變區經人源化。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含313M26抗體的人源化形式之重鏈可變區及/或輕鏈可變區。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含成為IgG1、IgG2或IgG4重鏈之一部分的313M26抗體之重鏈可變區。
在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含、基本上由或由抗體313M26所組成。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含、基本上由或由抗體313M26之變體所組成。
在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含313M32抗體之重鏈可變區和輕鏈可變區。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含313M32抗體之可變區，其中來自313M32抗體之重鏈可變區及/或輕鏈可變區經親和性成熟。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含313M32抗體(具有或不具有前導序列)之重鏈和輕鏈。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑為313M32抗體。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含成為IgG1、IgG2或IgG4重鏈之一部分的313M32抗體之重鏈可變區。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含成為IgG1重鏈之一部分的313M32 抗體之重鏈可變區。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含成為IgG2重鏈之一部分的313M32抗體之重鏈可變區。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含成為IgG4重鏈之一部分的313M32抗體之重鏈可變區。
在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含、基本上由或由抗體313M32所組成。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑包含、基本上由或由抗體313M32之變體所組成。
在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含由2015年8月11日依照布達佩斯條約之條款寄存於美國菌種保存中心(ATCC)，10801 University Boulevard,Manassas,VA,USA且以PTA-122346編號之質體所編碼之重鏈可變區。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含由2015年5月27日依照布達佩斯條約之條款寄存於ATCC，10801 University Boulevard,Manassas,VA,USA且以PTA-122347編號之質體所編碼之輕鏈可變區。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含由寄存於ATCC且以PTA-122346編號之質體所編碼之重鏈可變區及由寄存於ATCC且以PTA-122347編號之質體所編碼之輕鏈可變區。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含重鏈，該重鏈包含由寄存於ATCC且以PTA-122346編號之質體所編碼之可變區。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含輕鏈，該輕鏈包含由寄存於ATCC且以PTA-122347編號之質體所編碼之可變區。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含 重鏈和輕鏈，該重鏈包含由寄存於ATCC且以PTA-122346編號之質體所編碼之可變區且該輕鏈包含由寄存於ATCC且以PTA-122347編號之質體所編碼之可變區。
本發明亦包含同質二聚體劑/分子及異質二聚體劑/分子。在一些實施態樣中，同質二聚體劑為多肽。在一些實施態樣中，異質二聚體分子為多肽。同質二聚體分子通常包含兩個相同的多肽。異質二聚體分子通常包含至少兩個不同的多肽。在一些實施態樣中，異質二聚體分子能夠結合至少兩個標靶，例如雙特異性劑。標靶可為例如在單一細胞上之兩個不同的蛋白質或在兩個單獨的細胞上之兩個不同的蛋白質。術語〝臂〞可於本文用於說明同質二聚體劑、異質二聚體劑及/或雙特異性劑之結構。在一些實施態樣中，各臂包含至少一個多肽。異質二聚體分子之各臂通常具有不同的功能，例如結合兩個不同的標靶。在一些實施態樣中，一個臂可包含來自抗體的抗原結合部位。在一些實施態樣中，一個臂可包含受體之結合部分。在一些實施態樣中，一個臂可包含配體。在一些實施態樣中，一個臂可包含配體之結合部分。在一些實施態樣中，同質二聚體劑包含兩個相同的臂。在一些實施態樣中，異質二聚體劑包含兩個不同的臂。在一些實施態樣中，雙特異性劑包含兩個不同的臂。
在一些實施態樣中，本發明提供TIGIT結合劑，其為同質二聚體分子。在一些實施態樣中，同質二聚體分子包含兩個相同的多肽。在一些實施態樣中，本發明 提供TIGIT結合劑，其為異質二聚體分子。在一些實施態樣中，異質二聚體分子包含至少兩個不同的多肽。在一些實施態樣中，本發明提供TIGIT結合劑，其為異質二聚體劑。在一些實施態樣中，本發明提供TIGIT結合劑，其為雙特異性劑。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體。
在一些實施態樣中，異質二聚體劑(例如雙特異性劑)包含本文所述之TIGIT結合劑。在特定的實施態樣中，異質二聚體劑包含免疫反應刺激劑或其功能性片段。在一些實施態樣中，異質二聚體分子包含至少兩個功能：(i)與TIGIT結合，及(ii)與第二標靶結合。在一些實施態樣中，異質二聚體劑包含至少兩個功能：(i)與TIGIT結合，及(ii)〝不結合〞的功能。在特定的實施態樣中，異質二聚體分子包含第二免疫治療劑或其功能性片段。在一些實施態樣中，異質二聚體分子的一個臂包含本文所述之TIGIT結合劑及異質二聚體分子的一個臂包含第二免疫治療劑。在一些實施態樣中，異質二聚體劑的一個臂包含本文所述之TIGIT結合劑及異質二聚體劑的一個臂包含免疫反應刺激劑。如本文所使用的詞句〝免疫反應刺激劑〞係以最廣義使用且係指藉由誘發免疫系統組份中之任一者活化或增加免疫系統組份中之任一者的活性而直接或間接刺激免疫系統之物質。例如，免疫反應刺激劑可包括細胞激素，以及各種抗原，包括腫瘤抗原及源自病原體之抗原。在一些實施態樣中，第二免疫治療劑(例如免疫反應 刺激劑)包括但不限於集落刺激因子(例如顆粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、顆粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、幹細胞因子(SCF))、介白素(例如IL-1、IL2、IL-3、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18)、細胞激素(例如γ-干擾素)、阻斷免疫抑制功能之抗體(例如抗CTLA4抗體、抗CD28抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體)、類鐸受體(例如TLR4、TLR7、TLR9)或B7家族成員(例如CD80、CD86)。在一些實施態樣中，免疫治療劑包括但不限於促效劑抗體(例如抗GITR抗體、抗OX40抗體)或促效劑配體(例如GITRL或OX40L)。
在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為異質二聚體分子(例如雙特異性劑)，其包含第一CH3結構域及第二CH3結構域，各結構域經修飾以促進異質多聚體的形成。在一些實施態樣中，第一及第二CH3結構域係使用孔中突點技術修飾。在一些實施態樣中，第一及第二CH3結構域包含導致靜電交互作用改變的胺基酸變化。在一些實施態樣中，第一及第二CH3結構域包含導致疏水性/親水性交互作用改變的胺基酸變化。
在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性劑，其包含選自由下列所組成之群組的重鏈恆定區：(a)第一人類IgG1恆定區，其中對應於IgG1(SEQ ID NO：41)之位置253和292的胺基酸經麩胺酸或天冬胺酸取代，及第二人類IgG1恆定區，其中對應於IgG1(SEQ ID NO： 41)之位置240和282的胺基酸經離胺酸取代；(b)第一人類IgG2恆定區，其中對應於IgG2(SEQ ID NO：42)之位置249和288的胺基酸經麩胺酸或天冬胺酸取代，及第二人類IgG1恆定區，其中對應於IgG2(SEQ ID NO：42)之位置236和278的胺基酸經離胺酸取代；(c)第一人類IgG3恆定區，其中對應於IgG3(SEQ ID NO：43)之位置300和339的胺基酸經麩胺酸或天冬胺酸取代，及第二人類IgG1恆定區，其中對應於IgG3(SEQ ID NO：43)之位置287和329的胺基酸經離胺酸取代；及(d)第一人類IgG4恆定區，其中對應於IgG4(SEQ ID NO：44)之位置250和289的胺基酸經麩胺酸或天冬胺酸取代，及第二人類IgG1恆定區，其中對應於IgG4(SEQ ID NO：44)之位置237和279的胺基酸經離胺酸取代。
在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性劑，其包含具有對應於IgG1(SEQ ID NO：41)之位置253和292上的胺基酸取代之第一人類IgG1恆定區，其中在對應於IgG1(SEQ ID NO：41)之位置253和292上的胺基酸經麩胺酸或天冬胺酸取代，及包含具有對應於IgG1(SEQ ID NO：41)之位置240和282上的胺基酸取代之第二人類IgG1恆定區，其中對應於IgG1(SEQ ID NO：41)之位置240和282上的胺基酸經離胺酸取代。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其包含具有對應於IgG2(SEQ ID NO：42)之位置249和288上的胺基酸取代之第一人類IgG2恆定區，其中在對應於IgG2(SEQ ID NO：42)之位置249和288上的胺基酸經麩胺酸或天冬胺酸取代，及包含具有對應於IgG2(SEQ ID NO：42)之位置236和278上的胺基酸取代之第二人類IgG2恆定區，其中對應於IgG2(SEQ ID NO：42)之位置236和278上的胺基酸經離胺酸取代。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其包含具有對應於IgG3(SEQ ID NO：43)之位置300和339上的胺基酸取代之第一人類IgG3恆定區，其中在對應於IgG3(SEQ ID NO：43)之位置300和339上的胺基酸經麩胺酸或天冬胺酸取代，及包含具有對應於IgG3(SEQ ID NO：43)之位置287和329上的胺基酸取代之第二人類IgG1恆定區，其中對應於IgG3(SEQ ID NO：43)之位置287和329上的胺基酸經離胺酸取代。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其包含具有對應於IgG4(SEQ ID NO：44)之位置250和289上的胺基酸取代之第一人類IgG4恆定區，其中在對應於IgG4(SEQ ID NO：44)之位置250和289上的胺基酸經麩胺酸或天冬胺酸取代，及包含具有對應於IgG4(SEQ ID NO：44)之位置237和279上的胺基酸取代之第二人類IgG4恆定區，其中對應於IgG4(SEQ ID NO：44)之位置237和279上的胺基酸經離胺酸取代。
在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性劑，其包含具有對應於IgG1(SEQ ID NO：41)之位置253和292上的胺基酸取代之第一人類IgG1恆定區，其中胺基酸經麩胺酸取代，及包含具有對應於IgG1(SEQ ID NO：41)之位置240和282上的胺基酸取代之第二人類IgG1恆定區，其中胺基酸經離胺酸取代。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性劑，其包含具有對應於IgG1(SEQ ID NO：41)之位置253和292上的胺基酸取代之第一人類IgG1恆定區，其中胺基酸經天冬胺酸取代，及包含具有對應於IgG1(SEQ ID NO：41)之位置240和282上的胺基酸取代之第二人類IgG1恆定區，其中胺基酸經離胺酸取代。
在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性劑，其包含具有對應於IgG2(SEQ ID NO：42)之位置249和288上的胺基酸取代之第一人類IgG2恆定區，其中胺基酸經麩胺酸取代，及包含具有對應於IgG2(SEQ ID NO：42)之位置236和278上的胺基酸取代之第二人類IgG2恆定區，其中胺基酸經離胺酸取代。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性劑，其包含具有對應於IgG2(SEQ ID NO：42)之位置249和288上的胺基酸取代之第一人類IgG2恆定區，其中胺基酸經天冬胺酸取代，及包含具有對應於IgG2(SEQ ID NO：42)之位置236和278上的胺基酸取代之第二人類IgG2恆定區，其中胺基酸經離胺酸取代。
在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性劑，其包含SEQ ID NO：45之重鏈恆定區。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其包含SEQ ID NO：46之重鏈恆定區。在一些實施態樣中，TIGIT結合 劑為雙特異性抗體，其包含SEQ ID NO：47之重鏈恆定區。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其包含SEQ ID NO：48之重鏈恆定區。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其包含SEQ ID NO：45之第一重鏈恆定區及SEQ ID NO：46之第二重鏈恆定區。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其包含SEQ ID NO：47之第一重鏈恆定區及SEQ ID NO：48之第二重鏈恆定區。
在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性劑，其包含SEQ ID NO：49之重鏈恆定區。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其包含SEQ ID NO：50之重鏈恆定區。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其包含SEQ ID NO：51之重鏈恆定區。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其包含SEQ ID NO：52之重鏈恆定區。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其包含SEQ ID NO：49之第一重鏈恆定區及SEQ ID NO：50之第二重鏈恆定區。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其包含SEQ ID NO：51之第一重鏈恆定區及SEQ ID NO：52之第二重鏈恆定區。
在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其包含特異性結合人類TIGIT之第一抗原結合部位。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其包含特異性結合人類TIGIT之第一抗原結合部位及結合 第二標靶之第二抗原結合部位。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其包含：特異性結合人類TIGIT之第一抗原結合部位，其中第一抗原結合部位包含：包含GSSLSSSYMS(SEQ ID NO：7)或GFSLSSSYMS(SEQ ID NO：13)之重鏈CDR1、包含IIGSNGNTYYANWAKG(SEQ ID NO：8)之重鏈CDR2及包含GGYRTSGMDP(SEQ ID NO：9)之重鏈CDR3。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其包含：特異性結合人類TIGIT之第一抗原結合部位，其中第一抗原結合部位包含：包含GSSLSSSYMS(SEQ ID NO：7)之重鏈CDR1、包含IIGSNGNTYYANWAKG(SEQ ID NO：8)之重鏈CDR2及包含GGYRTSGMDP(SEQ ID NO：9)之重鏈CDR3。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其包含：特異性結合人類TIGIT之第一抗原結合部位，其中第一抗原結合部位包含：包含GFSLSSSYMS(SEQ ID NO：13)之重鏈CDR1、包含IIGSNGNTYYANWAKG(SEQ ID NO：8)之重鏈CDR2及包含GGYRTSGMDP(SEQ ID NO：9)之重鏈CDR3。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其包含：特異性結合人類TIGIT之第一抗原結合部位，其中第一抗原結合部位包含(a)包含GSSLSSSYMS(SEQ ID NO：7)或GFSLSSSYMS(SEQ ID NO：13)之重鏈CDR1、包含IIGSNGNTYYANWAKG(SEQ ID NO：8)之重鏈CDR2及包含GGYRTSGMDP(SEQ ID NO：9)之重鏈CDR3；及(b) 第二抗原結合部位，其中第一抗原結合部位及第二抗原結合部位包含共同的(亦即相同的)輕鏈。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其包含：特異性結合人類TIGIT之第一抗原結合部位，其中第一抗原結合部位包含(a)包含GSSLSSSYMS(SEQ ID NO：7)或GFSLSSSYMS(SEQ ID NO：13)之重鏈CDR1、包含IIGSNGNTYYANWAKG(SEQ ID NO：8)之重鏈CDR2及包含GGYRTSGMDP(SEQ ID NO：9)之重鏈CDR3；包含QASQSISSYLNW(SEQ ID NO：10)、QASQSNIYSDLAW(SEQ ID NO：14)或QASQNIYSDLAW(SEQ ID NO：81)之輕鏈CDR1、包含DALKLAS(SEQ ID NO：11)或RASTLAS(SEQ ID NO：15)之輕鏈CDR2及包含QQEHSVGNVDN(SEQ ID NO：12)或QQEHLVAWIYN(SEQ ID NO：16)之輕鏈CDR3；及(b)第二抗原結合部位。在一些實施態樣中，雙特異性抗體包含第一抗原結合部位，該第一抗原結合部位包含：包含QASQSISSYLNW(SEQ ID NO：10)、QASQSNIYSDLAW(SEQ ID NO：14)或QASQNIYSDLAW(SEQ ID NO：81)之輕鏈CDR1、包含DALKLAS(SEQ ID NO：11)或RASTLAS(SEQ ID NO：15)之輕鏈CDR2及包含QQEHSVGNVDN(SEQ ID NO：12)或QQEHLVAWIYN(SEQ ID NO：16)之輕鏈CDR3。
在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其包含與SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：32具有至少約80%之序列一致性的第一重鏈可變區。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其包含與SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：32具有至少約85%，至少約90%，至少約95%，至少約97%或至少約99%之序列一致性的第一重鏈可變區。在一些實施態樣中，雙特異性抗體包含與SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20具有至少約80%之序列一致性的輕鏈可變區。在一些實施態樣中，雙特異性抗體包含與SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20具有至少約85%，至少約90%，至少約95%，至少約97%或至少約99%之序列一致性的輕鏈可變區。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為包含第一重鏈可變區之雙特異性抗體，該第一重鏈可變區包含SEQ ID NO：17。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為包含第一重鏈可變區之雙特異性抗體，該第一重鏈可變區包含SEQ ID NO：19。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為包含第一重鏈可變區之雙特異性抗體，該第一重鏈可變區包含SEQ ID NO：32。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為包含第一輕鏈可變區之雙特異性抗體，該第一輕鏈可變區包含SEQ ID NO：18。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為包含第一輕鏈可變區之雙特異性抗體，該第一輕鏈可變區包含SEQ ID NO：20。
在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其包含第一重鏈可變區和第一重鏈恆定區，該第一重鏈可變區包含SEQ ID NO：17且該第一重鏈恆定區包 含SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：52。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其包含第一重鏈可變區和第一重鏈恆定區，該第一重鏈可變區包含SEQ ID NO：19且該第一重鏈恆定區包含SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：52。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其包含第一重鏈可變區和第一重鏈恆定區，該第一重鏈可變區包含SEQ ID NO：32且該第一重鏈恆定區包含SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：52。
在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其包含特異性結合人類TIGIT之第一抗原結合部位。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其包含特異性結合人類TIGIT之第一抗原結合部位及結合第二標靶之第二抗原結合部位。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其包含：特異性結合人類TIGIT之第一抗原結合部位，其中第一抗原結合部位包含：包含TSDYAWN(SEQ ID NO：57)之重鏈CDR1、包含YISYSGSTSYNPSLRS(SEQ ID NO：58)之重鏈CDR2及包含ARRQVGLGFAY(SEQ ID NO：59)之重鏈CDR3。 在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其包含：特異性結合人類TIGIT之第一抗原結合部位，其中第一抗原結合部位包含(a)包含TSDYAWN(SEQ ID NO：57)之重鏈CDR1、包含YISYSGSTSYNPSLRS(SEQ ID NO：58)之重鏈CDR2及包含ARRQVGLGFAY(SEQ ID NO：59)之重鏈CDR3；及(b)第二抗原結合部位，其中第一抗原結合部位及第二抗原結合部位包含共同的(亦即相同的)輕鏈。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其包含：特異性結合人類TIGIT之第一抗原結合部位，其中第一抗原結合部位包含(a)包含TSDYAWN(SEQ ID NO：57之重鏈CDR1、包含YISYSGSTSYNPSLRS(SEQ ID NO：58)之重鏈CDR2及包含ARRQVGLGFAY(SEQ ID NO：59)之重鏈CDR3；包含KASQDVSTAVA(SEQ ID NO：60)之輕鏈CDR1、包含SASYRYT(SEQ ID NO：61)之輕鏈CDR2及包含QQHYSTP(SEQ ID NO：62)之輕鏈CDR3；及(b)第二抗原結合部位。在一些實施態樣中，雙特異性抗體包含第一抗原結合部位，其包含：包含KASQDVSTAVA(SEQ ID NO：60)之輕鏈CDR1、包含SASYRYT(SEQ ID NO：61)之輕鏈CDR2及包含QQHYSTP(SEQ ID NO：62)之輕鏈CDR3。
在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其包含與SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：67具有至少約80%之序列一致性的第一重鏈可變區。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其包含與SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：67具有至少約85%，至少約90%，至少約95%，至少約97%或至少約99%之序列一致性的第一重鏈可變區。在一些實施態樣中，雙特異性抗體包含與SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：68具有至少約80%之序列一致性的輕鏈可變區。在一些實施態樣中，雙特異性抗體包含與SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：68具有至少約85%，至少約90%，至少約95%，至少約97%或至少約99%之序列一致性的輕鏈可變區。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為包含第一重鏈可變區之雙特異性抗體，該第一重鏈可變區包含SEQ ID NO：63。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為包含第一重鏈可變區之雙特異性抗體，該第一重鏈可變區包含SEQ ID NO：67。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為包含第一輕鏈可變區雙之特異性抗體，該第一輕鏈可變區包含SEQ ID NO：64。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為包含第一輕鏈可變區之雙特異性抗體，該第一輕鏈可變區包含SEQ ID NO：68。
在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其包含第一重鏈可變區和第一重鏈恆定區，該第一重鏈可變區包含SEQ ID NO：63且該第一重鏈恆定區包含SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：52。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其包含第一重鏈可變區和第一重鏈恆定區，該第一重鏈可變區包含SEQ ID NO：67 之第一重鏈可變區且該第一重鏈恆定區包含SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：52。
在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑為特異性結合人類TIGIT及第二標靶之雙特異性抗體。在一些實施態樣中，第二標靶為腫瘤抗原。在一些實施態樣中，雙特異性抗體包含本文所述之TIGIT結合劑及包含特異性結合腫瘤抗原之抗體的第二多肽。對腫瘤抗原具有結合特異性之雙特異性抗體可用於引導TIGIT結合劑至腫瘤。這可有用於誘發及/或增強腫瘤微環境附近或內的腫瘤反應。在一些實施態樣中，雙特異性抗體可用於誘發或增強腫瘤浸潤免疫細胞之活性。在一些實施態樣中，雙特異性抗體可用於誘發或增強腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)之活性。在一些實施態樣中，雙特異性抗體可用於抑制或降低Treg細胞活性。在一些實施態樣中，雙特異性抗體可用於抑制或降低MSDC活性。
在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其中第一標靶為TIGIT及第二標靶為對免疫反應細胞。在一些實施態樣中，第二標靶為T細胞、NK細胞、B細胞、巨噬細胞、樹狀細胞或骨髓細胞。在一些實施態樣中，第二標靶為PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM-3、LAG-3、GITR、OX-40、GITRL或OX-40L。在一些實施態樣中，第二標靶為CD28或4-1BB。
在一些實施態樣中，雙特異性抗體包含第一臂和第二臂，該第一臂包含本文所述之TIGIT結合劑且該第二臂包含特異性結合PD-1之抗體。在一些實施態樣中，雙特異性抗體包含第一臂和第二臂，該第一臂包含本文所述之TIGIT結合劑且該第二臂包含特異性結合PD-L1之抗體。在一些實施態樣中，雙特異性抗體包含第一臂和第二臂，該第一臂包含本文所述之TIGIT結合劑且該第二臂包含特異性結合GITR之抗體。在一些實施態樣中，雙特異性抗體包含第一臂和第二臂，該第一臂包含本文所述之TIGIT結合劑且該第二臂包含特異性結合OX-40之抗體。在一些實施態樣中，雙特異性抗體包含第一臂和第二臂，該第一臂包含本文所述之TIGIT結合抗體且該第二臂包含特異性結合CD40之抗體。在一些實施態樣中，雙特異性抗體包含第一臂和第二臂，該第一臂包含本文所述之TIGIT結合劑且該第二臂包含特異性結合CTLA4之抗體。在一些實施態樣中，雙特異性抗體包含第一臂和第二臂，該第一臂包含本文所述之TIGIT結合抗體且該第二臂包含特異性結合CD28之抗體。在一些實施態樣中，雙特異性抗體包含第一臂和第二臂，該第一臂包含本文所述之TIGIT結合劑且該第二臂包含特異性結合GITRL之抗體。在一些實施態樣中，雙特異性抗體包含第一臂和第二臂，該第一臂包含本文所述之TIGIT結合劑且該第二臂包含特異性結合OX-40L之抗體。
在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性 抗體，其包含來自抗TIGIT抗體313R11之重鏈可變區。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其包含來自抗TIGIT抗體313R12之重鏈可變區。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其包含來自抗TIGIT抗體313R14之重鏈可變區。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其包含來自抗TIGIT抗體313R19或313R20之重鏈可變區。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其包含來自抗TIGIT抗體313R11或313R12之輕鏈可變區。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其包含來自抗TIGIT抗體313R14、313R19或313R20之輕鏈可變區。
在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其包含來自抗TIGIT抗體313M26之重鏈可變區。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其包含來自抗TIGIT抗體313M26之輕鏈可變區。
在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其包含來自抗TIGIT抗體313M32之重鏈可變區。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性抗體，其包含來自抗TIGIT抗體313M32之輕鏈可變區。
在一些實施態樣中，雙特異性劑包含第一臂和第二臂，該第一臂包含本文所述之TIGIT結合劑且該第二臂包含多肽，該多肽包含特異性結合GITR之GITRL。在一些實施態樣中，第二臂包含多肽，該多肽包含GITRL之至少一個複製的細胞外結構域。在一些實施態樣中，雙 特異性劑包含第一臂和第二臂，該第一臂包含本文所述之TIGIT結合劑且該第二臂包含多肽，該多肽包含特異性結合OX-40之OX-40L。在一些實施態樣中，第二臂包含多肽，該多肽包含OX-40L之至少一個複製的細胞外結構域。在一些實施態樣中，雙特異性劑包含第一臂和第二臂，該第一臂包含本文所述之TIGIT結合劑且該第二臂包含多肽，該多肽包含特異性結合CD40之CD40L。在一些實施態樣中，第二臂包含多肽，該多肽包含CD40L之至少一個複製的細胞外結構域。在一些實施態樣中，雙特異性劑包含第一臂和第二臂，該第一臂包含本文所述之TIGIT結合劑且該第二臂包含多肽，該多肽包含特異性結合4-1BB之4-1BB配體。在一些實施態樣中，第二臂包含多肽，該多肽包含4-1BB配體之至少一個複製的細胞外結構域。
在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性劑，其以約50nM或更小，約25nM或更小，約10nM或更小，約1nM或更小或約0.1nM或更小之KD結合TIGIT。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性劑，其以約50nM或更小，約25nM或更小，約10nM或更小，約1nM或更小或約0.1nM或更小之KD結合第二標靶。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性劑，其以約50nM或更小之KD結合TIGIT及以約50nM或更小之KD結合第二標靶。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性劑，其以約25nM或更小之KD結合TIGIT及 以約25nM或更小之KD結合第二標靶。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性劑，其以約10nM或更小之KD結合TIGIT及以約10nM或更小之KD結合第二標靶。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性劑，其以約1nM或更小之KD結合TIGIT及以約1nM或更小之KD結合第二標靶。
在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為雙特異性劑，其包含一個具有結合親和性比第二抗原結合部位的結合親和性更弱的抗原結合部位。例如，在一些實施態樣中，雙特異性劑可以從約0.1nM至1nM之範圍內的KD結合TIGIT及可以從約1nM至10nM之範圍內的KD結合第二標靶。或者，雙特異性劑可以從約1nM至10nM之範圍內的KD結合TIGIT及可以從約0.1nM至1nM之範圍內的KD結合第二標靶。在一些實施態樣中，雙特異性劑可以從約0.1nM至1nM之範圍內的KD結合TIGIT及可以從約1nM至10nM之範圍內的KD結合第二標靶。或者，雙特異性劑可以從約1nM至10nM之範圍內的KD結合TIGIT及可以從約0.1nM至1nM之範圍內的KD結合第二標靶。在一些實施態樣中，在兩個抗原結合部位之間的親和性差異可為約2倍或更高，約3倍或更高，約5倍或更高，約8倍或更高，約10倍或更高，約15倍或更高，約30倍或更高，約50倍或更高或約100倍或更高。在一些實施態樣中，將用於TIGIT的抗原結合部位之至少一個CDR中的至少一個胺基酸殘基以不同的胺基酸取代，使得 TIGIT結合部位之親和性改變。在一些實施態樣中，使TIGIT結合部位之親和性增加。在一些實施態樣中，使TIGIT結合部位之親和性降低。在一些實施態樣中，將用於第二標靶抗原結合部位之至少一個CDR中的至少一個胺基酸殘基以不同的胺基酸取代，使得第二抗原結合部位之親和性改變。在一些實施態樣中，使第二抗原結合部位之親和性增加。在一些實施態樣中，使第二抗原結合部位之親和性降低。在一些實施態樣中，使TIGIT及第二抗原結合部位二者之親和性改變。
本發明提供特異性結合TIGIT之多肽，其包括但不限於抗體。在一些實施態樣中，多肽結合人類TIGIT。在一些實施態樣中，多肽結合小鼠TIGIT。在一些實施態樣中，多肽結合小鼠TIGIT及人類TIGIT。在一些實施態樣中，多肽結合人類TIGIT及不結合小鼠TIGIT。在一些實施態樣中，多肽結合人類TIGIT及不結合大鼠TIGIT。在一些實施態樣中，多肽結合人類TIGIT及不結合兔子TIGIT。在一些實施態樣中，多肽結合人類TIGIT及不結合狨猴TIGIT。在一些實施態樣中，多肽結合人類TIGIT及不結合狗TIGIT。在一些實施態樣中，多肽結合人類TIGIT及不結合豬TIGIT。在一些實施態樣中，多肽結合人類TIGIT及不結合食蟹獼猴TIGIT。在一些實施態樣中，多肽結合人類TIGIT及不結合恆河猴TIGIT。
在特定的實施態樣中，多肽包含抗體 313R11、313R12、313R14或313R19的CDR中之一、二、三、四、五及/或六者(參見本文表1)。抗體313R20包含與抗體313R19相同的CDR及重鏈和輕鏈可變結構域，但是313R20包含IgG4型式。在一些實施態樣中，多肽包含每一CDR具有至多4個(亦即0、1、2、3或4)胺基酸取代之CDR。在特定的實施態樣中，重鏈CDR容納在重鏈可變區內。在特定的實施態樣中，輕鏈CDR容納在輕鏈可變區內。
在一些實施態樣中，本發明提供特異性結合TIGIT之多肽，其中多肽包含與SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：32具有至少約80%之序列一致性的胺基酸序列及/或與SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20具有至少約80%之序列一致性的胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包含與SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：32具有至少約85%，至少約90%，至少約95%，至少約97%或至少約99%之序列一致性的胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包含與SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20具有至少約85%，至少約90%，至少約95%，至少約97%或至少約99%之序列一致性的胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包含與SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：32具有至少約95%之序列一致性的胺基酸序列及/或與SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20具有至少約95%之序列一致性的胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包含：包含SEQ ID NO： 17之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包含包含：包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO之胺基酸序列：20。在特定的實施態樣中，多肽包含：包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列。
在一些實施態樣中，多肽包含：包含SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20及/或SEQ ID NO：32之胺基酸序列。如本文所定義，多肽可以單鏈或二或更多個締合鏈出現。在特定的實施態樣中，多肽包含：包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列及包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包含：包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列及包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包含：包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列及包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包含基本上由SEQ ID NO：17所組成之胺基酸序列及基本上由SEQ ID NO：18所組成之胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包含基本上由SEQ ID NO：19所組成之胺基酸序列及及基本上由SEQ ID NO：20所組成之胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包含基本上由SEQ ID NO：32所組成之胺基酸序列及基本上由SEQ ID NO：20所組成之胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包含基本上由SEQ ID NO：17所組成之 胺基酸序列及基本上由SEQ ID NO：18所組成之胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包含基本上由SEQ ID NO：19所組成之胺基酸序列及基本上由SEQ ID NO：20所組成之胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包含基本上由SEQ ID NO：32所組成之胺基酸序列及基本上由SEQ ID NO：20所組成之胺基酸序列。
在一些實施態樣中，多肽包含：包含SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：55及/或SEQ ID NO：56之胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包含：包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列及包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包含：包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列及包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包含：包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列及包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包含：包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列及包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包含：包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列及包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包含：包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列及包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列。在特定的實施態樣 中，多肽包含：包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列及包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包含：包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列及包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包含：包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列及包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包含：包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列及包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列。
在一些實施態樣中，TIGIT結合劑包含多肽，其包含選自由下列所組成之群組的序列：SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：56。
在特定的實施態樣中，多肽包含：包含由SEQ ID NO：21所組成之胺基酸序列及包含由SEQ ID NO：23所組成之胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包含：包含由SEQ ID NO：22所組成之胺基酸序列及包含由SEQ ID NO：23所組成之胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包含：包含由SEQ ID NO：24所組成之胺基酸序列及包含由SEQ ID NO：25所組成之胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包含：包含由SEQ ID NO：33所組成之胺基酸序列及包含由SEQ ID NO：25所組成之胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包含：包 含由SEQ ID NO：55所組成之胺基酸序列及包含由SEQ ID NO：25所組成之胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包含：包含由SEQ ID NO：26所組成之胺基酸序列及包含由SEQ ID NO：28所組成之胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包含：包含由SEQ ID NO：27所組成之胺基酸序列及包含由SEQ ID NO：28所組成之胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包含：包含由SEQ ID NO：29所組成之胺基酸序列及包含由SEQ ID NO：30所組成之胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包含：包含由SEQ ID NO：34所組成之胺基酸序列及包含由SEQ ID NO：30所組成之胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包含：包含由SEQ ID NO：56所組成之胺基酸序列及包含由SEQ ID NO：30所組成之胺基酸序列。
在特定的實施態樣中，多肽包含抗體313M26或313M32的CDR中之一、二、三、四、五及/或六者(參見本文表2)。在一些實施態樣中，多肽包含每一CDR具有至多4個(亦即0、1、2、3或4)胺基酸取代之CDR。在特定的實施態樣中，重鏈CDR容納在重鏈可變區內。在特定的實施態樣中，輕鏈CDR容納在輕鏈可變區內。
在一些實施態樣中，本發明提供特異性結合TIGIT之多肽，其中多肽包含與SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：67具有至少約80%之序列一致性的胺基酸序列及/或與SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：68具有至少約80%之序列一致性的胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽 包含與SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：67具有至少約85%，至少約90%，至少約95%，至少約97%或至少約99%之序列一致性的胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包含與SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：68具有至少約85%，至少約90%，至少約95%，至少約97%或至少約99%之序列一致性的胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包含與SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：167具有至少約95%之序列一致性的胺基酸序列及/或與SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：68具有至少約95%之序列一致性的胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包含：包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包含：包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：68之胺基酸序列。
在一些實施態樣中，多肽包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72及/或SEQ ID NO：82。如本文所定義，多肽可以單鏈或二或更多個締合鏈出現。在特定的實施態樣中，多肽包含：包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列及包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包含：包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列及包含SEQ ID NO：68之胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包 含：包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列及包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包含：包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列及包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包含：包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列及包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列。
在特定的實施態樣中，多肽包含由SEQ ID NO：63所組成之胺基酸序列及由SEQ ID NO：64所組成之胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包含由SEQ ID NO：67所組成之胺基酸序列及由SEQ ID NO：68所組成之胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包含由SEQ ID NO：69所組成之胺基酸序列及由SEQ ID NO：71所組成之胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包含由SEQ ID NO：70所組成之胺基酸序列及由SEQ ID NO：72所組成之胺基酸序列。在特定的實施態樣中，多肽包含由SEQ ID NO：82所組成之胺基酸序列及由SEQ ID NO：72所組成之胺基酸序列。
許多蛋白質(包括抗體)含有引導蛋白質運送至不同地區的信號序列。信號序列(又稱信號肽或前導序列)通常位於新生多肽之N端。該等信號序列靶定多肽至內質網且將蛋白質分類至彼等的目的地，例如至胞器的內部空間、至細胞內膜、至細胞外膜或經由分泌至細胞外部。在蛋白質運送至內質網之後，大部分的信號序列係藉由信號肽酶與蛋白質切割。自多肽切割信號序列通常發生在胺基 酸序列的特定部位，且取決於信號序列內的胺基酸殘基而定。雖然通常有一個特定的切割部位，但是可藉由信號肽酶辨識及/或使用一個以上之切割部位，導致多肽的不均勻N端。例如，使用在信號序列內不同的切割部位可導致以不同的N端胺基酸表現之多肽。因此，在一些實施態樣中，如本文所述之多肽可包含具有不同的N端之多肽的混合物。在一些實施態樣中，N端的長度相差1、2、3、4或5個胺基酸。在一些實施態樣中，多肽為實質上均勻的，亦即多肽具有相同的N端。在一些實施態樣中，與〝原生〞或〝親代〞信號序列，多肽的信號序列包含一或多個(例如一、二、三、四、五、六、七、八、九、十等等)胺基酸取代及/或刪除。在一些實施態樣中，多肽之信號序列包含容許一個切割部位佔優勢的胺基酸取代及/或刪除，由此導致具有一個N端之實質上均勻的多肽。在一些實施態樣中，多肽之信號序列影響多肽的表現程度，例如增加表現或降低表現。
在特定的實施態樣中，抗體與本文所述之TIGIT結合劑競爭與TIGIT特異性結合。在一些實施態樣中，抗體與TIGIT結合劑競爭與TIGIT特異性結合，該TIGIT結合劑包含：(a)包含GSSLSSSYMS(SEQ ID NO：7)或GF SLSSSYMS(SEQ ID NO：13)之重鏈CDR1、包含IIGSNGNTYYANWAKG(SEQ ID NO：8)之重鏈CDR2及包含GGYRTSGMDP(SEQ ID NO：9)之重鏈CDR3；及(b)包含QASQSISSYLNW(SEQ ID NO：10)、 QASQSNIYSDLAW(SEQ ID NO：14)或QASQNIYSDLAW(SEQ ID NO：81)之輕鏈CDR1、包含DALKLAS(SEQ ID NO：11)或RASTLAS(SEQ ID NO：15)之輕鏈CDR2及包含QQEHSVGNVDN(SEQ ID NO：12)或QQEHLVAWIYN(SEQ ID NO：16)之輕鏈CDR3。
在特定的實施態樣中，抗體與TIGIT結合劑競爭與TIGIT特異性結合，該TIGIT結合劑包含：(a)包含SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：32之重鏈可變區；及(b)包含SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20之輕鏈可變區。在特定的實施態樣中，抗體與TIGIT結合劑競爭與TIGIT特異性結合，該TIGIT結合劑包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：17且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：18。在特定的實施態樣中，抗體與TIGIT結合劑競爭與TIGIT特異性結合，該TIGIT結合劑包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：19且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：20。在特定的實施態樣中，抗體與TIGIT結合劑競爭與TIGIT特異性結合，該TIGIT結合劑包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：32且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：20。
在特定的實施態樣中，抗體與TIGIT結合劑競爭與TIGIT特異性結合，該TIGIT結合劑包含：包含SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：56之重鏈及包含SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：30之輕鏈。在特定的實施態樣中，抗體與TIGIT結合劑競爭與TIGIT特異性結合，該TIGIT結合劑包含重鏈和輕鏈，該重鏈包含SEQ ID NO：26且該輕鏈包含SEQ ID NO：28。在特定的實施態樣中，抗體與TIGIT結合劑競爭與TIGIT特異性結合，該TIGIT結合劑包含重鏈和輕鏈，該重鏈包含SEQ ID NO：27且該輕鏈包含SEQ ID NO：28。在特定的實施態樣中，抗體與TIGIT結合劑競爭與TIGIT特異性結合，該TIGIT結合劑包含重鏈和輕鏈，該重鏈包含SEQ ID NO：29且該輕鏈包含SEQ ID NO：30。在特定的實施態樣中，抗體與TIGIT結合劑競爭與TIGIT特異性結合，該TIGIT結合劑包含重鏈和輕鏈，該重鏈包含SEQ ID NO：34且該輕鏈包含SEQ ID NO：30。在一些實施態樣中，抗體與TIGIT結合劑競爭與TIGIT特異性結合，該TIGIT結合劑包含重鏈和輕鏈，該重鏈包含SEQ ID NO：56且該輕鏈包含SEQ ID NO：30。
在特定的實施態樣中，抗體與抗體313R11競爭與TIGIT特異性結合。在特定的實施態樣中，抗體與抗體313R12競爭與TIGIT特異性結合。在特定的實施態樣中，抗體與抗體313R14競爭與人類TIGIT之特異性結合。在特定的實施態樣中，抗體與抗體313R19競爭與人類TIGIT之特異性結合。在特定的實施態樣中，抗體與抗體313R20競爭與人類TIGIT之特異性結合。
在一些實施態樣中，抗體與參考抗體競爭與 TIGIT特異性結合，其中參考抗體為抗體313R11。在一些實施態樣中，抗體與參考抗體競爭與TIGIT特異性結合，其中參考抗體為抗體313R12。在一些實施態樣中，抗體與參考抗體競爭與TIGIT特異性結合，其中參考抗體為抗體313R14。在一些實施態樣中，抗體與參考抗體競爭與TIGIT特異性結合，其中參考抗體為抗體313R19。在一些實施態樣中，抗體與參考抗體競爭與TIGIT特異性結合，其中參考抗體為抗體313R20。
在特定的實施態樣中，抗體與本發明的TIGIT結合劑結合TIGIT之相同的抗原決定區或基本上相同的抗原決定區。在特定的實施態樣中，抗體與抗體313R11結合TIGIT之相同的抗原決定區或基本上相同的抗原決定區。在特定的實施態樣中，抗體與抗體313R12結合TIGIT之相同的抗原決定區或基本上相同的抗原決定區。在特定的實施態樣中，抗體與抗體313R14結合TIGIT之相同的抗原決定區或基本上相同的抗原決定區。在特定的實施態樣中，抗體與抗體313R19結合TIGIT之相同的抗原決定區或基本上相同的抗原決定區。在特定的實施態樣中，抗體與抗體313R20結合TIGIT之相同的抗原決定區或基本上相同的抗原決定區。
在另一實施態樣中，抗體結合TIGIT的抗原決定區，其與本發明的TIGIT結合劑結合之TIGIT的抗原決定區重疊。在一些實施態樣中，抗體結合TIGIT的抗原決定區，其與抗體313R11結合之TIGIT的抗原決定區重 疊。在另一實施態樣中，抗體結合TIGIT的抗原決定區，其與抗體313R12結合之TIGIT的抗原決定區重疊。在一些實施態樣中，抗體結合TIGIT的抗原決定區，其與抗體313R14結合之TIGIT的抗原決定區重疊。在特定的實施態樣中，抗體結合TIGIT的抗原決定區，其與抗體313R19結合之TIGIT的抗原決定區重疊。在特定的實施態樣中，抗體結合TIGIT的抗原決定區，其與抗體313R20結合之TIGIT的抗原決定區重疊。
在特定的實施態樣中，抗體與本文所述之TIGIT結合劑競爭與TIGIT特異性結合。在一些實施態樣中，抗體與TIGIT結合劑競爭與TIGIT特異性結合，該TIGIT結合劑包含：(a)包含TSDYAWN(SEQ ID NO：57)之重鏈CDR1、包含YISYSGSTSYNPSLRS(SEQ ID NO：58)之重鏈CDR2及包含ARRQVGLGFAY(SEQ ID NO：59)之重鏈CDR3；及(b)包含KASQDVSTAVA(SEQ ID NO：60)之輕鏈CDR1、包含SASYRYT(SEQ ID NO：61)之輕鏈CDR2及包含QQHYSTP(SEQ ID NO：62)之輕鏈CDR3。
在特定的實施態樣中，抗體與TIGIT結合劑競爭與TIGIT特異性結合，該TIGIT結合劑包含(a)包含SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：67之重鏈可變區，及(b)包含SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：68之輕鏈可變區。在特定的實施態樣中，抗體與TIGIT結合劑競爭與TIGIT特異性結合，該TIGIT結合劑包含重鏈可變區和輕鏈可變 區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：63且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：64。在特定的實施態樣中，抗體與TIGIT結合劑競爭與TIGIT特異性結合，該TIGIT結合劑包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：167且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：68。在特定的實施態樣中，抗體與TIGIT結合劑競爭與TIGIT特異性結合，該TIGIT結合劑包含重鏈和輕鏈，該重鏈包含SEQ ID NO：70且該輕鏈包含SEQ ID NO：72。在特定的實施態樣中，抗體與TIGIT結合劑競爭與TIGIT特異性結合，該TIGIT結合劑包含重鏈和輕鏈，該重鏈包含SEQ ID NO：82且該輕鏈包含SEQ ID NO：72。
在特定的實施態樣中，抗體與抗體313M26競爭與TIGIT特異性結合。在特定的實施態樣中，抗體與抗體313M32競爭與TIGIT特異性結合。在特定的實施態樣中，抗體與抗體313M32競爭與人類TIGIT之特異性結合。在一些實施態樣中，抗體與參考抗體競爭與TIGIT特異性結合，其中參考抗體為抗體313M26。在一些實施態樣中，抗體與參考抗體競爭與TIGIT特異性結合，其中參考抗體為抗體313M32。在一些實施態樣中，抗體與參考抗體競爭與人類TIGIT之特異性結合，其中參考抗體為抗體313M32。
在特定的實施態樣中，抗體與本文所述之TIGIT結合劑結合TIGIT之相同的抗原決定區或基本上相同的抗原決定區。在特定的實施態樣中，抗體與抗體 313M26結合TIGIT之相同的抗原決定區或基本上相同的抗原決定區。在特定的實施態樣中，抗體與抗體313M32結合TIGIT之相同的抗原決定區或基本上相同的抗原決定區。在特定的實施態樣中，抗體與抗體313M32結合人類TIGIT之相同的抗原決定區或基本上相同的抗原決定區。
在另一實施態樣中，抗體結合TIGIT的抗原決定區，其與本文所述之TIGIT結合劑結合之TIGIT的抗原決定區重疊。在一些實施態樣中，抗體結合TIGIT的抗原決定區，其與抗體313M26結合之TIGIT的抗原決定區重疊。在另一實施態樣中，抗體結合TIGIT的抗原決定區，其與抗體313M32結合之TIGIT的抗原決定區重疊。在另一實施態樣中，抗體結合TIGIT的抗原決定區，其與抗體313M32結合之人類TIGIT的抗原決定區重疊。
在一些實施態樣中，抗體與本文所述之TIGIT結合劑競爭與抗原決定區之結合，該抗原決定區包含在SEQ ID NO：79內的胺基酸。在一些實施態樣中，抗體與本文所述之TIGIT結合劑競爭與抗原決定區之結合，該抗原決定區包含在SEQ ID NO：80內的胺基酸。在一些實施態樣中，抗體與本文所述之TIGIT結合劑競爭與抗原決定區之結合，該抗原決定區包含在SEQ ID NO：79及SEQ ID NO：80內的胺基酸。在一些實施態樣中，抗體與本文所述之TIGIT結合劑競爭與抗原決定區之結合，該抗原決定區包含SEQ ID NO：4之胺基酸Q62和I109。在一些實施態樣中，抗體與本文所述之TIGIT結合劑競爭與抗 原決定區之結合，該抗原決定區包含SEQ ID NO：4之胺基酸Q62和T119。在一些實施態樣中，抗體與本文所述之TIGIT結合劑競爭與抗原決定區之結合，該抗原決定區包含SEQ ID NO：4之胺基酸Q64和I109。在一些實施態樣中，抗體與本文所述之TIGIT結合劑競爭與抗原決定區之結合，該抗原決定區包含SEQ ID NO：4之胺基酸Q64和T119。在一些實施態樣中，抗體與本文所述之TIGIT結合劑競爭與抗原決定區之結合，該抗原決定區包含SEQ ID NO：4之胺基酸Q62、Q64和I109。在一些實施態樣中，抗體與本文所述之TIGIT結合劑競爭與抗原決定區之結合，該抗原決定區包含SEQ ID NO：4之胺基酸Q62、Q64和T119。在一些實施態樣中，抗體與本文所述之TIGIT結合劑競爭與抗原決定區之結合，該抗原決定區包含SEQ ID NO：4之胺基酸Q62、I109和T119。在一些實施態樣中，抗體與本文所述之TIGIT結合劑競爭與抗原決定區之結合，該抗原決定區包含SEQ ID NO：4之胺基酸Q64、I109和T119。在一些實施態樣中，抗體與本文所述之TIGIT結合劑競爭與抗原決定區之結合，該抗原決定區包含SEQ ID NO：4之胺基酸Q62、Q64、I109和T119。在一些實施態樣中，抗體與本文所述之TIGIT結合劑競爭與抗原決定區之結合，該抗原決定區包含至少一種選自由下列所組成之群組：SEQ ID NO：4的胺基酸N58、E60、Q62、Q64、L65、F107、I109、H111、T117、T119、G120和R121。
在特定的實施態樣中，本文所述之TIGIT結合劑(例如抗體)結合TIGIT及調節TIGIT活性。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為TIGIT拮抗劑且降低TIGIT活性。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑抑制至少約10%，至少約20%，至少約30%，至少約50%，至少約75%，至少約90%或約100%之TIGIT活性。在特定的實施態樣中，抑制TIGIT活性之TIGIT結合劑為抗體313R11、抗體313R12、抗體313R14、抗體313R19、或抗體313R20。在特定的實施態樣中，抑制人類TIGIT活性之TIGIT結合劑為抗體313R11、抗體313R12、抗體313R14、抗體313R19、或抗體313R20之人源化變型。在特定的實施態樣中，抑制TIGIT活性之TIGIT結合劑為抗體313M26或抗體313M32。在特定的實施態樣中，抑制人類TIGIT活性之TIGIT結合劑為抗體313M26(例如抗體313M32)之人源化變型。在特定的實施態樣中，抑制TIGIT活性之TIGIT結合劑為抗體313M32。
在一些實施態樣中，本文所述之TIGIT結合劑結合TIGIT及抑制或降低TIGIT傳訊。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑(例如抗體)抑制至少約10%，至少約20%，至少約30%，至少約50%，至少約75%，至少約90%或約100%之TIGIT傳訊。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑抑制小鼠TIGIT傳訊。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑抑制人類TIGIT傳訊。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑抑制小鼠及人類TIGIT傳訊。在特定的實施態樣 中，抑制TIGIT傳訊之TIGIT結合劑為抗體313R11、抗體313R12、抗體313R14、抗體313R19或抗體313R20。在特定的實施態樣中，抑制TIGIT傳訊之TIGIT結合劑為抗體313M26或抗體313M32。在特定的實施態樣中，抑制TIGIT傳訊之TIGIT結合劑為抗體313M32。
TIGIT係在與其相反受體(counter-receptor)PVR交互作用之後在其胞質尾區磷酸化。TIGIT之磷酸化為級聯的開始，該級聯包括影響其他已知的傳訊途徑之下游事件。因此，評估TIGIT磷酸化可給出關於TIGIT活性及TIGIT傳訊之訊息。
磷酸化檢定法為那些熟習本技術領域者已知且常被用於監測蛋白質活化及/或途徑活化。檢定法可用於監測各種治療對標靶蛋白質及/或標靶途徑之活化的效應。例如，試管內磷酸化檢定法可用於評估TIGIT拮抗劑對PVR誘發之TIGIT活化的效應。
在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑(例如抗體)抑制TIGIT與受體結合。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑抑制TIGIT與PVR結合。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑抑制TIGIT與PVR-L2、PVR-L3及/或PVR-L4結合。在特定的實施態樣中，抑制TIGIT結合劑與PVR之結合為至少約10%，至少約25%，至少約50%，至少約75%，至少約90%或至少約95%。在特定的實施態樣中，抑制TIGIT結合劑與PVR-L2、PVR-L3及/或PVR-L4之結合為至少約10%，至少約25%，至少約50%，至少約 75%，至少約90%或至少約95%。在特定的實施態樣中，抑制TIGIT與PVR結合之TIGIT結合劑為抗體313R11、抗體313R12、抗體313R14、抗體313R19或抗體313R20。在特定的實施態樣中，抑制TIGIT與PVR-L2、PVR-L3及/或PVR-L4結合之TIGIT結合劑為抗體313R11、抗體313R12、抗體313R14、抗體313R19或抗體313R20。在特定的實施態樣中，抑制TIGIT與PVR結合之TIGIT結合劑為抗體313M26或抗體313M32。在特定的實施態樣中，抑制TIGIT與PVR結合之TIGIT結合劑為抗體313M32。在特定的實施態樣中，抑制TIGIT與PVR-L2、PVR-L3及/或PVR-L4結合之TIGIT結合劑為抗體313M26或抗體313M32。在特定的實施態樣中，抑制TIGIT與PVR-L2、PVR-L3及/或PVR-L4結合之TIGIT結合劑為抗體313M32。
在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑(例如抗體)阻斷TIGIT與受體結合。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑阻斷TIGIT與PVR結合。在特定的實施態樣中，阻斷TIGIT結合劑與PVR之結合為至少約10%，至少約25%，至少約50%，至少約75%，至少約90%或至少約95%。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑阻斷TIGIT與PVR-L2、PVR-L3及/或PVR-L4結合。在特定的實施態樣中，阻斷TIGIT結合劑與PVR-L2、PVR-L3及/或PVR-L4之結合為至少約10%，至少約25%，至少約50%，至少約75%，至少約90%或至少約95%。在特定的實施態樣中， 阻斷TIGI與PVR結合之TIGIT結合劑為抗體313R11、抗體313R12、抗體313R14、抗體313R19或抗體313R20。在特定的實施態樣中，阻斷TIGIT與PVR-L2、PVR-L3及/或PVR-L4結合之TIGIT結合劑為抗體313R11、抗體313R12、抗體313R14、抗體313R19或抗體313R20。在特定的實施態樣中，阻斷TIGIT與PVR結合之TIGIT結合劑為抗體313M26或抗體313M32。在特定的實施態樣中，阻斷TIGIT與PVR結合之TIGIT結合劑為抗體313M32。在特定的實施態樣中，阻斷TIGIT與PVR-L2、PVR-L3及/或PVR-L4結合之TIGIT結合劑為抗體313M26或抗體313M32。在特定的實施態樣中，阻斷TIGIT與PVR-L2、PVR-L3及/或PVR-L4結合之TIGIT結合劑為抗體313M32。
結合檢定法為那些熟習本技術領域者已知且於本文說明。結合檢定法監測試驗劑對標靶蛋白質與蛋白質結合夥伴(例如受體或配體)之間的交互作用之效應。例如，試管內結合檢定法可用評估TIGIT拮抗劑是否阻斷TIGIT對PVR之交互作用。
在特定的實施態樣中，本文所述之TIGIT結合劑具有下列效應中之一或多者：抑制腫瘤細胞增生、抑制腫瘤生長、降低腫瘤之致瘤性、藉由減少腫瘤中的癌幹細胞頻率而降低腫瘤之致瘤性、觸發腫瘤細胞之細胞死亡、增強或激勵免疫反應增強或激勵抗腫瘤反應、增加免疫細胞之溶胞活性、增加殺死腫瘤細胞、藉由免疫細胞 增加殺死腫瘤細胞、誘發腫瘤的細胞分化、分化致瘤細胞至非致瘤狀態、誘發腫瘤細胞中的分化標記表現、預防腫瘤細胞轉移、降低腫瘤細胞存活、增加細胞接觸依賴性生長抑制、增加腫瘤細胞凋亡、降低上皮間質轉變(EMT)或降低腫瘤細胞存活。在一些實施態樣中，該劑具有下列效應中之一或多者：抑制病毒感染、抑制慢性病毒感染、減少病毒載量、觸發經病毒感染之細胞的細胞死亡或減少經病毒感染之細胞的數目或百分比。
在特定的實施態樣中，本文所述之TIGIT結合劑抑制腫瘤生長。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑抑制活體內腫瘤生長(例如在小鼠模式中及/或在患有癌症之人類中)。在特定的實施態樣中，與未經處理之腫瘤相比，使腫瘤生長抑制至少約2倍，約3倍，約5倍，約10倍，約50倍，約100倍或約1000倍。
在特定的實施態樣中，本文所述之TIGIT結合劑降低致瘤性。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑在動物模式中(諸如小鼠模式)降低致瘤性。在一些實施態樣中，小鼠模式為小鼠異種移植模式。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑不結合小鼠TIGIT且在小鼠模式中無效。在一些實施態樣中，在小鼠模式中使用替代之TIGIT結合劑結合小鼠TIGIT。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑降低在動物模式中(諸如小鼠模式)的腫瘤(包含癌幹細胞)發生性。在特定的實施態樣中，使腫瘤中的癌幹細胞數目或頻率減少至少約2倍，約3倍，約5倍，約10倍，約50 倍，約100倍或約1000倍。在特定的實施態樣中，減少的癌幹細胞數目或頻率係藉由使用動物模型之限制稀釋試驗檢定法測定。關於使用限制稀釋檢定法測定腫瘤中減少的癌幹細胞數目或頻率之額外實例及指南可見於例如國際公開案號WO 2008/042236、美國專利公開案號2008/0064049及美國專利公開案號2008/0178305。
在特定的實施態樣中，本文所述之劑(例如多肽及/或抗體)結合TIGIT及調節免疫反應。在一些實施態樣中，本文所述之TIGIT結合劑活化及/或增加免疫反應。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑增加、促進或增強細胞媒介之免疫力。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑增加、促進或增強先天細胞媒介之免疫力。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑增加、促進或增強後天細胞媒介之免疫力。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑增加、促進或增強T細胞活性。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑增加、促進或增強溶胞性T細胞(CTL)活性。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑增加、促進或增強NK細胞活性。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑增加、促進或增強淋巴激素活化之殺手細胞(LAK)活性。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑增加、促進或增強腫瘤浸潤之淋巴細胞(TIF)活性。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑抑制或降低Treg細胞活性。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑抑制或降低MDSC活性。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑增加、促進或增強殺死腫瘤細胞。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑增 加、促進或增強腫瘤生長抑制。
在特定的實施態樣中，本文所述之劑為人類TIGIT拮抗劑。在一些實施態樣中，該劑為TIGIT拮抗劑且活化及/或增加免疫反應。在一些實施態樣中，該劑為TIGIT拮抗劑且活化及/或增加NK細胞活性。在特定的實施態樣中，該劑增加至少約10%，至少約20%，至少約30%，至少約50%，至少約75%，至少約90%或約100%之活性。在一些實施態樣中，該劑為TIGIT拮抗劑且活化及/或增加T細胞活性(例如T細胞溶胞活性)。在特定的實施態樣中，該劑增加至少約10%，至少約20%，至少約30%，至少約50%，至少約75%，至少約90%或約100%之活性。在一些實施態樣中，該劑為TIGIT拮抗劑且誘發及/或增強Th1型免疫反應。Th1型免疫反應通常包括生產干擾素-γ(IFN-γ)、IL-2和腫瘤壞死因子-β(TNF-β)。比較之Th2型免疫反應通常包括生產IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13。在一些實施態樣中，該劑為TIGIT拮抗劑且誘發及/或增加細胞激素或淋巴激素生產。在一些實施態樣中，誘發及/或增加細胞激素或淋巴激素生產可為間接效應。
在特定的實施態樣中，本文所述之TIGIT結合劑增加NK細胞活化。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑增加T細胞活化。在特定的實施態樣中，以TIGIT結合劑活化NK細胞及/或T細胞導致增加至少約10%，至少約25%，至少約50%，至少約75%，至少約90%或至少 約95%之NK細胞及/或T細胞活化程度。在特定的實施態樣中，增加NK細胞活化之TIGIT結合劑為抗體313R11、抗體313R12、抗體313R14、抗體313R19或抗體313R20。在特定的實施態樣中，增加NK細胞活化之TIGIT結合劑為抗體313M26或抗體313M32。在特定的實施態樣中，增加NK細胞活化之TIGIT結合劑為抗體313M32。
在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑(例如抗體)為調節性T細胞(Treg)活性之拮抗劑。在特定的實施態樣中，本文所述之TIGIT結合劑抑制或降低Treg活性。在特定的實施態樣中，以TIGIT結合劑抑制Treg活性導致抑制至少約10%，至少約25%，至少約50%，至少約75%，至少約90%，至少約95%或約100%之Treg細胞抑制活性。在特定的實施態樣中，抑制Treg活性之TIGIT結合劑為抗體313R11、抗體313R12、抗體313R14、抗體313R19或抗體313R20。在特定的實施態樣中，抑制Treg活性之TIGIT結合劑為抗體313M26或抗體313M32。在特定的實施態樣中，抑制Treg活性之TIGIT結合劑為抗體313M32。
在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑(例如抗體)為骨髓衍生性抑制細胞(MDSC)之拮抗劑。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑抑制MDSC活性。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑抑制至少約10%，至少約20%，至少約30%，至少約50%，至少約75%，至少約90%或約 100%之MDSC活性。在特定的實施態樣中，抑制MDSC活性之TIGIT結合劑為抗體313R11、抗體313R12、抗體313R14、抗體313R19或抗體313R20。在特定的實施態樣中，抑制MDSC活性之TIGIT結合劑為抗體313M26或抗體313M32。在特定的實施態樣中，抑制MDSC活性之TIGIT結合劑為抗體313M32。
在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑(例如抗體)增加自然殺手(NK)細胞活性。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑增加至少約10%，至少約20%，至少約30%，至少約50%，至少約75%，至少約90%或約100%之NK細胞活性。在特定的實施態樣中，增加NK細胞活性之TIGIT結合劑為抗體313R11、抗體313R12、抗體313R14、抗體313R19或抗體313R20。在特定的實施態樣中，增加NK細胞活性之TIGIT結合劑為抗體313M26或抗體313M32。在特定的實施態樣中，增加NK細胞活性之TIGIT結合劑為抗體313M32。
在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑(例如抗體)增加腫瘤浸潤之淋巴細胞(TIL)活性。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑增加至少約10%，至少約20%，至少約30%，至少約50%，至少約75%，至少約90%或約100%之TIL活性。在特定的實施態樣中，增加TIL細胞活性之TIGIT結合劑為抗體313R11、抗體313R12、抗體313R14、抗體313R19或抗體313R20。在特定的實施態樣中，增加TIL細胞活性之TIGIT結合劑為抗體313M26或 抗體313M32。在特定的實施態樣中，增加TIL細胞活性之TIGIT結合劑為抗體313M32。
在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑(例如抗體)增加或增強淋巴激素活化之殺手細胞(LAK)活性。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑增加至少約10%，至少約20%，至少約30%，至少約50%，至少約75%，至少約90%或約100%之LAK活性。在特定的實施態樣中，增加LAK細胞活性之TIGIT結合劑為抗體313R11、抗體313R12、抗體313R14、抗體313R19或抗體313R20。在特定的實施態樣中，增加LAK細胞活性之TIGIT結合劑為抗體313M26或抗體313M32。在特定的實施態樣中，增加LAK細胞活性之TIGIT結合劑為抗體313M32。
用於測定TIGIT結合劑(或候選結合劑)是否調節免疫反應之活體內及試管內檢定法為本技術中已知或正在發展中。在一些實施態樣中，可使用功能檢定法檢測T細胞活化。在一些實施態樣中，可使用功能檢定法檢測T細胞增生。在一些實施態樣中，可使用功能檢定法檢測NK活性。在一些實施態樣中，可使用功能檢定法檢測CTL活性。在一些實施態樣中，可使用功能檢定法檢測Treg活性。在一些實施態樣中，可使用功能檢定法檢測MDSC活性。在一些實施態樣中，可使用功能檢定法檢測細胞激素或淋巴激素之生產或細胞生產之細胞激素或淋巴激素。在一些實施態樣中，ELISpot檢定法係用於測量抗原特異性T細胞頻率。在一些實施態樣中，ELISpot檢定 法係用於測量細胞激素釋放/生產及/或用於測量細胞激素生產之細胞數目。在一些實施態樣中，細胞激素檢定法係用於鑑別Th1型反應。在一些實施態樣中，細胞激素檢定法係用於鑑別Th2型反應。在一些實施態樣中，細胞激素檢定法係用於鑑別Th17-型反應。在一些實施態樣中，FACS分析係用於測量在免疫細胞上的活化標記，該免疫細胞包括但不限於T細胞、B-細胞、NK細胞、巨噬細胞及/或骨髓細胞。
在特定的實施態樣中，本文所述之TIGIT結合劑在小鼠、大鼠、食蟹獼猴或人類中具有至少約2小時、至少約5小時、至少約10小時、至少約24小時、至少約3天、至少約1週或至少約2週之循環半衰期。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑為IgG(例如IgG1、IgG2或IgG4)抗體，其在小鼠、食蟹獼猴或人類中具有至少約2小時、至少約5小時、至少約10小時、至少約24小時、至少約3天、至少約1週或至少約2週之循環半衰期。增加(或降低)該劑(諸如多肽和抗體)的半衰期之方法為本技術中已知。例如，增加IgG抗體的循環半衰期之方法包括引入突變至Fc區中，其在pH 6.0增加抗體與新生Fc受體(FcRn)之pH依賴性結合。增加缺乏Fc區之抗體片段的循環半衰期之已知方法包括諸如聚乙二醇化(PEGylation)之技術。
在本文所述之一些實施態樣中，TIGIT結合劑為多肽。在一些實施態樣中，多肽為包含抗體或其片段之 重組多肽、天然多肽或合成多肽，其結合TIGIT。在本技術中承認可改變本發明的一些胺基酸序列而不實質地影響蛋白質的結構或功能。因此，本發明另外包括結合TIGIT之多肽的變異，其顯示實質的活性或包括抗體或其片段區域。在一些實施態樣中，TIGIT結合多肽之胺基酸序列變異包括刪除、插入、反轉、重複及/或其他的取代類型。
多肽、類似物及其變體可經另外修飾而含有不是多肽的正常部分之額外的化學部分。經衍生之部分可改進或在其他方面調節多肽的溶解性、生物半衰期及/或吸收。該部分亦可降低或消除多肽及變體的非所欲副作用。化學部分的評論可見於Remington：The Science and Practice of Pharmacy,22st Edition,2012,Pharmaceutical Press,London中。
在特定的實施態樣中，本文所述之多肽經分離。在特定的實施態樣中，本文所述之多肽為實質上純的。
本文所述之多肽可以本技術中已知任何適合的方法生產。此等方法可在從直接的蛋白質合成方法至建構編碼多肽序列之DNA序列及在適合的宿主內表現該等序列之範圍內。在一些實施態樣中，DNA序列係使用藉由分離或合成編碼關注之野生型蛋白質的DNA序列之重組技術而建構。序列可藉由部位特異性突變形成而隨意地突變，以提供其功能性類似物。
在一些實施態樣中，編碼關注之多肽的DNA 序列可藉由使用寡核苷酸合成器之化學合成而建構。寡核苷酸可建基於所欲多肽之胺基酸序列及選擇在其中生產關注的重組多肽之宿主細胞中得利的那些密碼子來設計。標準方法可應用於合成編碼經分離之關注多肽的多核苷酸序列。例如，完全胺基酸序列可用於建構反轉譯基因。另外，可合成含有編碼特別的經分離之多肽的核苷酸序列之DNA寡聚體。例如，可合成且接著接合編碼所欲多肽部分的許多小型寡核苷酸。個別的寡核苷酸通常含有用於互補組裝之5'或3'懸突。
一經組裝(藉由合成、部位引導之突變形成或其他方法)，可將編碼特別的關注多肽之多核苷酸序列插入表現載體中且經操作地連結至適合於所欲宿主內的蛋白質表現之表現控制序列。適當的組裝可藉由在適合的宿主內之核苷酸定序、限制酵素定位及/或生物活性多肽的表現來確認。如本技術所熟知，為了在宿主內獲得高表現程度之轉染基因，基因必須經操作地連結至所選定之表現宿主內具有功能的轉錄及轉譯表現控制序列。
在特定的實施態樣中，重組表現載體係用於擴增及表現編碼對抗人類TIGIT之抗體或其片段的DNA。例如，重組表現載體可為可複製的DNA建構體，其具有合成或經cDNA-衍生之編碼TIGIT結合劑的多肽鏈(諸如抗TIGIT抗體或其片段)之DNA片段，其經操作地連結至源自哺乳動物、微生物、病毒或昆蟲基因之適合的轉錄及/或轉譯調節元件。轉錄單位通常包含下列的組 裝：(1)在基因表現中具有調節角色之基因元件，例如轉錄啟動子或增強子，(2)轉錄成mRNA及轉譯成蛋白質之結構或編碼序列，及(3)適當的轉錄及轉譯初始及終止序列。調節元件可包括操作子序列以控制轉錄。可另外併入通常由複製起點賦予之宿主內複製的能力及有助於轉形物辨識的選擇基因。DNA區彼此在功能性相關時，將該等〝經操作地連結〞。例如，若信號肽之DNA(分泌前導序列)經表現為參與多肽分泌之前驅體，則將其經操作地連結至多肽之DNA；若啟動子控制序列轉錄，則將其經操作地連結至編碼序列；或若核糖體結合部位係位於允許轉譯之位置，則該結合部位經操作地連結至編碼序列。在一些實施態樣中，意欲用於酵母菌表現系統之結構元件包括使宿主細胞能細胞外分泌轉譯之蛋白質的前導序列。在其他的實施態樣中，在表現重組蛋白而沒有前導或運送序列的情況中，重組蛋白可包括N端甲硫胺酸殘基。此殘基接著可隨意地自經表現之重組蛋白切割以提供最終產物。
表現控制序列及表現載體的選擇取決於宿主的選擇。可使用各種廣泛的表現宿主/載體組合。有用於真核宿主的表現載體包括例如包含來自SV40、牛乳頭狀瘤病毒、腺病毒及巨細胞病毒之表現控制序列的載體。有用於細菌宿主的表現載體包括已知的細菌質體，諸如來自大腸桿菌的質體(包括pCR1、pBR322、pMB9和其衍生物)，及廣泛的宿主範圍質體，諸如M13及其他的絲狀單股DNA噬菌體。
本發明的TIGIT結合劑(例如多肽或抗體)可由一或多個載體表現。例如，在一些實施態樣中，一個重鏈多肽係由一個載體表現，第二重鏈多肽係由第二載體表現，及輕鏈多肽係由第三載體表現。在一些實施態樣中，第一重鏈多肽及輕鏈多肽係由一個載體表現及第二重鏈多肽係由第二載體表現。在一些實施態樣中，兩個重鏈多肽係由一個載體表現及輕鏈多肽係由第二載體表現。在一些實施態樣中，三個多肽係由一個載體表現。因此，在一些實施態樣中，第一重鏈多肽、第二重鏈多肽及輕鏈多肽係由單一載體表現。
適合於TIGIT結合多肽或抗體(用作為抗原之TIGIT蛋白質)表現之宿主細胞包括原核生物、酵母菌細胞、昆蟲細胞或在適當的啟動子控制下之高級真核細胞。原核生物包括革蘭(gram)陰性或革蘭陽性有機體，例如大腸桿菌或桿菌(Bacillus)。高級真核細胞包括如下文所述之哺乳動物來源的確立細胞系。亦可使用無細胞的轉譯系統。用於細菌、真菌、酵母菌及哺乳動物細胞宿主之適當的選殖及表現載體，以及蛋白質生產(包括抗體生產)方法為本技術中所熟知。
各種哺乳動物培養系統可用於表現重組多肽。可能希望哺乳動物細胞中的重組蛋白表現，因為該等蛋白質通常經恰當地折疊、適當地修飾且具有生物功能。適合的哺乳動物宿主細胞系的實例包括但不限於COS-7(源自猴腎)、L-929(源自小鼠纖維母細胞)、C127(源自小 鼠乳房腫瘤)、3T3(源自小鼠纖維母細胞)、CHO(源自中國倉鼠卵巢)、HeLa(源自人類子宮頸癌)、BHK(源自倉鼠腎纖維母細胞)、HEK-293(源自人類胚胎腎)細胞系及其變體。哺乳動物表現載體可包含非轉錄元件(諸如複製起點、連結至欲表現基因之適合的啟動子和增強子、及其他的5'或3'側翼非轉錄序列)及5'或3'非轉譯序列(諸如必要的核糖體結合部位、聚腺苷酸化部位、剪接施予和受體部位，及轉錄終止序列)。
在昆蟲細胞培養系統(例如桿狀病毒)中的重組蛋白表現亦供給用於生產恰當地摺疊及具有生物功能蛋白質之有效方法。用於昆蟲細胞中生產異源性蛋白質的桿狀病毒系統為那些熟習本技領域者所熟知。
因此，本發明提供包含本文所述之TIGIT結合劑的細胞。在一些實施態樣中，細胞生產本文所述之TIGIT結合劑。在特定的實施態樣中，細胞生產抗體。在一些實施態樣中，細胞生產結合小鼠TIGIT之抗體。在一些實施態樣中，細胞生產結合人類TIGIT之抗體。在一些實施態樣中，細胞生產結合小鼠TIGIT及人類TIGIT之抗體。在特定的實施態樣中，細胞生產抗體313R11。在特定的實施態樣中，細胞生產抗體313R12。在特定的實施態樣中，細胞生產抗體313R14。在特定的實施態樣中，細胞生產抗體313R19。在特定的實施態樣中，細胞生產抗體313R20。在特定的實施態樣中，細胞生產抗體313M26。在特定的實施態樣中，細胞生產抗體313M32。 在一些實施態樣中，細胞生產結合TIGIT之雙特異性抗體。在一些實施態樣中，細胞生產結合TIGIT及第二標靶之雙特異性抗體。在一些實施態樣中，細胞為融合瘤細胞。在一些實施態樣中，細胞為哺乳動物細胞。在一些實施態樣中，細胞為原核細胞。在一些實施態樣中，細胞為真核細胞。
由轉型宿主所生產之蛋白質可根據任何適合的方法純化。標準的方法包括層析術(例如離子交換、親和性及篩分管柱層析術)、離心、差別性溶解度或用於蛋白質純化之任何其他的標準技術。可將親和性標籤(諸如六組胺酸、麥芽糖結合結構域、流感外套序列和麩胱甘肽-S-轉移酶)連接至蛋白質，容許通過適當的親和性管柱而輕易地純化。用於純化免疫球蛋白之親和性層析術可包括蛋白質A、蛋白質G和蛋白質L層析術。經分離之蛋白質亦可使用下列技術經物理特徵化，諸如蛋白水解、尺寸排阻層析術(SEC)、質譜術(MS)、核磁共振(NMR)、等電集聚(IEF)、高性能液相層析術(HPLC)和x光結晶術。經分離之蛋白質純度可使用那些熟習本技領域者已知的技術測定，包括但不限於SDS-PAGE、SEC，毛細管膠體電泳、IEF和毛細管等電集聚(cIEF)。
在一些實施態樣中，來自分泌重組蛋白至培養基之表現系統的上清液可使用市場上可取得的蛋白質濃縮過濾器先濃縮，例如Amicon或Millipore Pellicon超過濾單位。在濃縮步驟之後，可將濃縮液施加至適合的純化 基質中。在一些實施態樣中，可使用陰離子交換樹脂，例如具有二乙基胺基乙基(DEAE)側鏈的之基質或受質。基質可為丙烯醯胺、洋菜糖、葡聚糖、纖維素或常用於蛋白質純化的其他類型。在一些實施態樣中，可使用陽離子交換步驟。適合的陽離子交換劑包括各種包含磺丙基或羧甲基的不可溶基質。在一些實施態樣中，可採用羥磷灰石基質，包括但不限於陶瓷羥磷灰石(CHT)。在特定的實施態樣中，一或多種使用疏水性RH-HPLC基質(例如具有側鏈甲基或其他脂族基團之矽膠)的逆相HPLC步驟可用於進一步純化重組蛋白(例如TIGIT結合劑)。可使用一些或所有的前述純化步驟之各種組合來提供均勻的重組蛋白。
在一些實施態樣中，異質二聚體蛋白質(諸如雙特異性抗體)係根據本文所述之方法中之任一者純化。在一些實施態樣中，抗TIGIT雙特異性抗體係使用至少一種層析步驟分離及/或純化。在一些實施態樣中，至少一種層析步驟包含親和性層析術。在一些實施態樣中，至少一種層析步驟另外包含陰離子交換層析術。在一些實施態樣中，經分離及/或純化之抗體產物包含至少90%之異質二聚體抗體。在一些實施態樣中，經分離及/或純化之抗體產物包含至少95%，96%，97%，98%或99%之異質二聚體抗體。在一些實施態樣中，經分離及/或純化之抗體產物包含約100%之異質二聚體抗體。
在一些實施態樣中，可將細菌培養物中所生產之多肽分離，例如藉由自沉澱細胞的初步萃取，接著以 一或多次濃縮、鹽析、水性離子交換或尺寸排阻層析步驟。HPLC可用於最終純化步驟。用於表現重組蛋白之微生物細胞可以任何習知的法破碎，包括冷凍解凍循環、超音波震盪、機械破碎或使用細胞溶解劑。
在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑為多肽，其不為抗體或不包含免疫球蛋白Fc區。用於鑑別及生產以高親和性結合至蛋白質標靶之非抗體多肽的各種方法為本技術中已知。在特定的實施態樣中，噬菌體或哺乳動物展示技術可用於生產及/或鑑別TIGIT結合多肽。在特定的實施態樣中，多肽包含選自由下列所組成之群組類型的蛋白質支架：蛋白質A、蛋白質G、脂質運載蛋白(lipocalin)、纖維黏連蛋白(fibronectin)結構域、錨蛋白(ankyrin)共有重複結構域和硫氧還原蛋白(thioredoxin)。用於鑑別及生產以高親和性與蛋白質標靶結合之非抗體多肽的各種方法為本技術中已知。在特定的實施態樣中，噬菌體展示技術可用於生產及/或鑑別結合多肽。在特定的實施態樣中，哺乳動物細胞展示技術可用於生產及/或鑑別結合多肽。
可另外希望修飾多肽，以便增加(或降低)其血清半衰期。這可藉由例如以多肽中的適當區域之突變而使救援受體結合抗原決定區以併入多肽來達成，或藉由將抗原決定區併入肽標籤中，接著與多肽在末端或中間融合(例如藉由DNA或肽合成)來達成。
異質共軛分子亦在本發明的範圍內。異質共 軛分子係由兩個共價連接之多肽所組成。經提出的此等分子例如用於使免疫細胞靶定不希望的細胞(例如腫瘤細胞)。亦可預期以使用合成蛋白質化學中已知的方法於試管內製備異質共軛分子，包括那些涉及交聯劑之方法。例如，免疫毒素可使用雙硫交換反應或藉由形成硫醚鍵來建構。適合於此目的之試劑的實例包括亞胺基硫醇鹽及甲基-4-巰基丁亞胺酸酯。
在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑可以數種共軛(即免疫共軛物或放射共軛物)或非共軛形式中之任一者使用。在特定的實施態樣中，該劑可以非共軛形式使用以駕馭個體的天然防禦機制，包括補體依賴性細胞毒性(CDC)及抗體依賴性細胞毒性(ADCC)，以消除惡性或癌細胞。
在一些實施態樣中，TIGIT結合劑與胞毒劑共軛。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑為與胞毒劑共軛成ADC(抗體-藥物共軛物)之抗體。在一些實施態樣中，胞毒劑為化學治療劑，包括但不限於甲胺喋呤(methotrexate)、甲烯土黴素(adriamicin)/多柔比星(doxorubicin)、黴法蘭(melphalan)、絲裂黴素C(mitomycin C)、氯芥苯丁酸(chlorambucil)、正定黴素(daunorubicin)、吡咯並苯並二氮呯或其他嵌入劑。在一些實施態樣中，胞毒劑為細菌、真菌、植物或動物來源之酵素活性毒素及其片段，包括但不限於白喉毒素A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈、蓖麻毒素A鏈、 相思豆毒素(abrin)A鏈、莫迪素(modeccin)A鏈、α-次黃嘌呤(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白質、石竹素(dianthin)蛋白質、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白質(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、瀉果素(curcin)、巴豆素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹毒素(gelonin)、絲裂膠素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)和新月毒素(tricothecene)。在一些實施態樣中，胞毒劑為放射性同位素以生產放射共軛物或經放射共軛之抗體。各種放射性核種可用於生產經放射共軛之抗體，包括但不限於90Y、125I、131I、123I、111In、131In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re、188Re和212Bi。亦可使用抗體與一或多種小分子毒素之共軛物，諸如卡利奇黴素(calicheamicin)、類美坦素(maytansinoids)、新月毒素(trichothene)、CC1065及該等毒素之具有毒素活性的衍生物。抗體與胞毒劑之共軛物可使用各種雙官能性蛋白偶合劑製得，諸如N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶二硫醇)丙酸酯(SPDP)、二亞胺環硫丁烷(IT)、醯亞胺酯之雙官能性衍生物(諸如己二亞胺酸二甲酯HCl)、活性酯(諸如辛二酸二琥珀醯亞胺)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對-疊氮苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙-(對-重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如2,6-二異氰酸甲苯酯)和雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝苯)。
III. 多核苷酸
在特定的實施態樣中，本發明包含多核苷酸，其包含編碼本文所述之劑的多核苷酸。術語〝編碼多肽之多核苷酸〞包含僅包括多肽之編碼序列的多核苷酸，以及包括額外的編碼及/或未編碼序列之多核苷酸。本發明的多核苷酸可呈RNA形式或呈DNA形式。DNA包括cDNA、cDNA、基因組DNA和合成性NA；且若單股可為編碼股或非編碼(反義)股，則該多核苷酸可為雙股或單股。
在特定的實施態樣中，多核苷酸包含編碼多肽之多核苷酸(例如核苷酸序列)，該多肽包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56。
在特定的實施態樣中，多核苷酸包含具有與編碼選自由下列所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56之多核苷酸至少約80%之一致性，至少約85%之一致性，至少約90%之一致性，至少約95%之一致性，且在一些實施態樣中，至少約96%，97%，98%或99%之一致性的核苷酸序列之多核苷酸。亦提供多核苷酸，其包含與編碼選自由下列所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56的多核苷酸雜交之多核苷酸。在特定的實施態樣中，雜交係於高嚴格條件下。高嚴格條件為那些熟習本技術領域者已知且可包括但不限於：(1)使用低離子強度及高溫清洗，例如在50℃下以具有0.1%十二烷基硫酸鈉之15mM氯化鈉/1.5mM檸檬酸鈉(1x SSC)；(2)在雜交期間使用變性劑，諸如甲醯胺，例如在42℃下使用於5x SSC(0.75M NaCl，75mM檸檬酸鈉)中具有0.1%牛血清白蛋白/0.1% Ficoll/0.1%聚乙烯基吡咯啶酮/50mM磷酸鈉緩衝液，pH 6.5之50%(體積/體積)甲醯胺；或(3)在42℃下使用50%甲醯胺、5x SSC、50mM磷酸鈉(pH 6.8)、0.1% 焦磷酸鈉、5x丹哈德(Denhardt’s)溶液、經音波化之鮭魚精子DNA(50微克/毫升)、0.1% SDS及10%硫酸葡聚糖，在55℃下以含有50%甲醯胺之0.2x SSC清洗，接著在55℃下以含有EDTA之0.1x SSC高嚴格清洗。
在特定的實施態樣中，多核苷酸包含編碼多肽之多核苷酸，該多肽包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：82。
在特定的實施態樣中，多核苷酸包含具有與編碼選自由下列所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72和SEQ IDNO：82之多核苷酸至少約80%之一致性，至少約85%之一致性，至少約90%之一致性，至少約95%之一致性，且在一些實施態樣中，至少約96%，97%，98%或99%之一致性的核苷酸序列之多核苷酸。亦提供多核苷酸，其包含與編碼選自由下列所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：82的多核苷酸雜交之多核苷酸。
在一些實施態樣中，多核苷酸包含選自由下 列所組成之群組的多核苷酸序列：SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：76。在特定的實施態樣中，多核苷酸包含具有與選自由下列所組成之群組的核苷酸序列：SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：76至少約80%之一致性，至少約85%之一致性，至少約90%之一致性，至少約95%之一致性，且在一些實施態樣中，至少約96%，97%，98%或99%之一致性的核苷酸序列之多核苷酸。亦提供多核苷酸，其包含與選自由下列所組成之群組的多核苷酸序列：SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：76雜交之多核苷酸。在特定的實施態樣中，雜交技術係在如上述之高嚴格條件下進行。
在特定的實施態樣中，多核苷酸包含在相同的閱讀框架中與多核苷酸融合之成熟多肽的編碼序列，該多核苷酸協助例如來自宿主細胞之多肽的表現及分泌(例如作為控制來自細胞之多肽運送的分泌序列功能之前導序列)。具有前導序列之多肽為前蛋白質且可具有以宿主細胞切割之前導序列，以形成多肽之成熟形式。多核苷酸亦可編碼原蛋白質，其為成熟蛋白加上額外的5'胺基酸殘基。具有原序列(pro-sequence)之成熟蛋白為原蛋白質且為蛋白質的不活化形式。原序列一經切割，則剩下活性成熟蛋白。
在特定的實施態樣中，多核苷酸包含在相同的閱讀框架中與標記序列融合之成熟多肽的編碼序列，該標記序列容許例如純化編碼之多肽。例如，標記序列可為由pQE-9載體供給之六組胺酸標籤，以提供在細菌宿主之例子中用於純化與標記融合之成熟多肽，或當使用哺乳動物宿主(例如COS-7細胞)時，標記序列可為源自流感血球凝集素蛋白質之血球凝集素(HA)標籤。在一些實施態樣中，標記序列為FLAG-標籤，序列DYKDDDDK之肽(SEQ ID NO：40)，其可與其他的親和性標籤聯合使用。
本發明另外關於本文所述之多核苷酸之變體，其中變體編碼例如片段、類似物及/或衍生物。
在特定的實施態樣中，本發明提供多核苷酸，其包含具有與編碼包含本文所述之TIGIT結合劑的多肽之多核苷酸至少約80%之一致性，至少約85%之一致性，至少約90%之一致性，至少約95%之一致性，且在一些實施態樣中，至少約96%，97%，98%或99%之一致性的核苷酸序列之多核苷酸。
如本文所使用的詞句具有與參考核苷酸序列例如95%之〝一致性〞的核苷酸序列之多核苷酸意欲指多核苷酸之核苷酸序列與參考序列相同，除了多核苷酸序列可包括以參考核苷酸序列的每100個核苷酸計最多5點突變。換言之，為了獲得具有核苷酸序列與參考核苷酸序列至少95%之一致性的多核苷酸，可將參考序列中最多5%之核苷酸刪除或以另一核苷酸取代，或可將參考序列中的 總核苷酸之最多5%之核苷酸數目插入參考序列。參考序列的該等突變可發生在參考核苷酸序列的5'或3'末端位置上或那些末端位置之間的任何位置，該等任何位置個別地散置在參考序列中的核苷酸之間或參考序列內的一或多相鄰群組中。
多核苷酸變體可含有在編碼區、非編碼區或兩者中之變化。在一些實施態樣中，多核苷酸變體含有產生靜默取代、添加或刪除之變化，但不改變經編碼之多肽的性質或活性。在一些實施態樣中，多核苷酸變體包含不導致多肽之胺基酸序列改變的靜默取代(由於基因密碼之簡併性)。多核苷酸變體可就各種原因而生產，例如使特定的宿主之密碼子表現最優化(例如將人類mRNA中的密碼子改變成細菌宿主(諸如大腸桿菌)偏好之密碼子)。在一些實施態樣中，多核苷酸變體包含至少一個在序列的非編碼或編碼區中之靜默突變。
在一些實施態樣中，生產多核苷酸變體以調節或改變經編碼之多肽的表現(或表現量)。在一些實施態樣中，生產多核苷酸變體以增加經編碼之多肽的表現。在一些實施態樣中，生產多核苷酸變體以降低經編碼之多肽的表現。在一些實施態樣中，與親代多核苷酸序列相比，多核苷酸變體增加經編碼之多肽的表現。在一些實施態樣中，與親代多核苷酸序列相比，多核苷酸變體降低經編碼之多肽的表現。
在一些實施態樣中，生產至少一種多核苷酸 變體(不改變經編碼之多肽的胺基酸序列)以增加異質二聚體分子之生產。在一些實施態樣中，生產至少一種多核苷酸變體(不改變經編碼之多肽的胺基酸序列)以增加雙特異性抗體之生產。
在特定的實施態樣中，多核苷酸經分離。在特定的實施態樣中，多核苷酸為實質上純的。
亦提供包含本文所述之多核苷酸的載體及細胞。在一些實施態樣中，表現載體包含多核苷酸分子。在一些實施態樣中，宿主細胞包含表現載體，其包含多核苷酸分子。在一些實施態樣中，宿主細胞包含多核苷酸分子。
IV. 使用方法及醫藥組成物
本發明的TIGIT結合劑有用於各種應用，包括但不限於治療性治療方法，諸如癌症治療。在一些實施態樣中，治療性治療方法包含癌症之免疫治療。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑有用於活化、促進、增強及/或提高免疫反應、抑制腫瘤生長、減少腫瘤體積、增加腫瘤細胞凋亡及/或降低致瘤性。在一些實施態樣中，本發明的TIGIT結合劑亦有用於對抗病原體(諸如病毒)之免疫治療。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑有用於活化、促進、增強及/或提高免疫反應、抑制病毒感染、降低病毒感染、增加病毒感染細胞凋亡及/或增加殺死病毒感染細胞。使用方法可為試管內、活體外或活體內方法。
本發明提供使用本文所述之TIGIT結合劑活化個體的免疫反應之方法。在一些實施態樣中，本發明提供使用本文所述之TIGIT結合劑促進個體的免疫反應之方法。在一些實施態樣中，本發明提供使用本文所述之TIGIT結合劑增加個體的免疫反應之方法。在一些實施態樣中，本發明提供使用本文所述之TIGIT結合劑增強個體的免疫反應之方法。在一些實施態樣中，活化、促進、增強及/或提高免疫反應包含增加細胞媒介之免疫力。在一些實施態樣中，活化、促進、增強及/或提高免疫反應包含增加T細胞活性。在一些實施態樣中，活化、促進、增強及/或提高免疫反應包含增加CTL活性。在一些實施態樣中，活化、促進、增強及/或提高免疫反應包含增加NK細胞活性。在一些實施態樣中，活化、促進、增強及/或提高免疫反應包含增加T細胞活性及增加NK細胞活性。在一些實施態樣中，活化、促進、增強及/或提高免疫反應包含增加CTL活性及增加NK細胞活性。在一些實施態樣中，活化、促進、增強及/或提高免疫反應包含抑制或降低Treg之抑制活性。在一些實施態樣中，活化、促進、增強及/或提高免疫反應包含抑制或降低MDSC之抑制活性。在一些實施態樣中，免疫反應為抗原刺激的結果。在一些實施態樣中，抗原刺激為腫瘤細胞。在一些實施態樣中，抗原刺激為癌。在一些實施態樣中，抗原刺激為病原體。在一些實施態樣中，抗原刺激為病毒。在一些實施態樣中，抗原刺激為病毒感染細胞。在一些實施態樣 中，在本文所述之方法中之任一者中，TIGIT結合劑為抗TIGIT抗體。在一些實施態樣中，在本文所述之方法中之任一者中，TIGIT結合劑為抗體313M32。
在一些實施態樣中，增加個體的免疫反應之方法包含對個體投予治療有效量的本文所述之TIGIT結合劑，其中該劑為特異性結合TIGIT的細胞外結構域之抗體。在一些實施態樣中，增加個體的免疫反應之方法包含對個體投予治療有效量的本文所述之TIGIT結合劑，其中該劑為特異性結合人類TIGIT的細胞外結構域之抗體。在一些實施態樣中，增加個體的免疫反應之方法包含對個體投予治療有效量的抗體313M32。
在一些實施態樣中，本發明提供本文所述之TIGIT結合劑之用途，其製造或製備用於活化、促進、增強及/或提高免疫反應之藥劑。在一些實施態樣中，本發明提供本文所述之TIGIT結合劑之用途，其製造或製備用於增加細胞媒介之免疫力之藥劑。在一些實施態樣中，本發明提供本文所述之TIGIT結合劑之用途，其製造或製備用於增加T細胞活性之藥劑。在一些實施態樣中，本發明提供本文所述之TIGIT結合劑之用途，其製造或製備用於增加CTL活性之藥劑。在一些實施態樣中，本發明提供本文所述之TIGIT結合劑之用途，其製造或製備用於增加NK活性之藥劑。在一些實施態樣中，本發明提供本文所述之TIGIT結合劑之用途，其製造或製備用於抑制或降低Treg之抑制活性之藥劑。在一些實施態樣中，本發明提供 本文所述之TIGIT結合劑之用途，其製造或製備用於抑制或降低MDSC之抑制活性之藥劑。
本發明亦提供抑制及/或降低細胞的TIGIT傳訊之方法，其包含將細胞與有效量的本文所述之TIGIT結合劑接觸。在一些實施態樣中，抑制及/或降低細胞的TIGIT傳訊之方法包含將細胞與有效量的抗體313M32接觸。在一些實施態樣中，本發明提供本文所述之TIGIT結合劑之用途，其製造或製備用於抑制及/或降低細胞的TIGIT傳訊之藥劑。在特定的實施態樣中，細胞為T細胞。在一些實施態樣中，細胞為活化之T細胞。在一些實施態樣中，細胞為NK細胞。在一些實施態樣中，細胞為Treg。在一些實施態樣中，細胞為MDSC。在特定的實施態樣中，該方法為活體內方法，其中細胞與該劑接觸之步驟包含對個體投予治療有效量的TIGIT結合劑。在一些實施態樣中，該方法為試管內或活體外方法。
本發明亦提供使用本文所述之TIGIT結合劑抑制腫瘤生長之方法。在一些實施態樣中，抑制腫瘤生長之方法包含使用抗體313M32。在特定的實施態樣中，抑制腫瘤生長之方法包含將細胞混合物與TIGIT結合劑於試管內接觸。例如，將與免疫細胞(例如T細胞或NK細胞)混合的不朽細胞系或癌細胞系在添加結合TIGIT之試驗劑的培養基中培育。在一些實施態樣中，將腫瘤細胞自患者樣品(諸如組織生檢、胸膜滲液或血液樣品)分離，與免疫細胞(例如T細胞及/或NK細胞)混合且在添加結合TIGIT 之試驗劑的培養基中培育。在一些實施態樣中，本發明提供本文所述之TIGIT結合劑之用途，其製造或製備用於抑制腫瘤或腫瘤細胞生長之藥劑。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑增加、促進及/或增強免疫細胞活性。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑抑制腫瘤細胞生長。
在一些實施態樣中，抑制腫瘤生長之方法包含將腫瘤或腫瘤細胞與本文所述之TIGIT結合劑在活體內接觸。在特定的實施態樣中，腫瘤或腫瘤細胞與TIGIT結合劑接觸係在動物模式中進行。例如，試驗劑可投予患有腫瘤的小鼠。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑增加、促進及/或增強小鼠的免疫細胞活性。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑抑制腫瘤生長。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑引起腫瘤消退。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑係在腫瘤細胞引入動物的同時或之後旋即投予，以預防腫瘤生長(〝預防性模式〞)。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑係在腫瘤已生長至特定大小或已〝確立〞之後作為治療投予(〝治療性模式〞)。
在特定的實施態樣中，抑制腫瘤生長之方法包含對個體投予治療有效量的本文所述之TIGIT結合劑。在特定的實施態樣中，個體為人類。在特定的實施態樣中，個體具有腫瘤或個體已有至少部分移除之腫瘤。在一些實施態樣中，抑制腫瘤生長之方法包含對個體投予治療有效量的抗體313M32。
另外，本發明提供抑制個體的腫瘤生長之方 法，其包含對個體投予治療有效量的本文所述之TIGIT結合劑。在一些實施態樣中，本發明提供本文所述之TIGIT結合劑之用途，其製造或製備用於抑制腫瘤或腫瘤細胞生長之藥劑。在特定的實施態樣中，腫瘤包含癌幹細胞。在特定的實施態樣中，在腫瘤中的癌幹細胞頻率係藉由投予該劑而降低。在一些實施態樣中，提供降低個體腫瘤的癌幹細胞頻率之方法，其包含對個體投予治療有效量的TIGIT結合劑。
另外，本發明提供降低個體的致瘤性之方法，其包含對個體投予治療有效量的本文所述之TIGIT結合劑。在特定的實施態樣中，腫瘤包含癌幹細胞。在一些實施態樣中，致瘤性係藉由降低腫瘤的癌幹細胞頻率而降低。在一些實施態樣中，該方法包含使用本文所述之TIGIT結合劑。在特定的實施態樣中，腫瘤的癌幹細胞頻率係藉由投予本文所述之TIGIT結合劑而降低。在一些實施態樣中，降低個體的致瘤性之方法包含對個體投予治療有效量抗體313M32。
在一些實施態樣中，腫瘤為實體腫瘤。在特定的實施態樣中，腫瘤為選自由下列所組成之群組的腫瘤：結腸直腸腫瘤、胰腫瘤、肺腫瘤、卵巢腫瘤、肝腫瘤、乳房腫瘤、腎腫瘤、前列腺腫瘤、神經內分泌腫瘤、胃腸道腫瘤、黑色素瘤、子宮頸腫瘤、膀胱腫瘤、神經膠質母細胞瘤和頭與頸腫瘤。在特定的實施態樣中，腫瘤為結腸直腸腫瘤。在特定的實施態樣中，腫瘤為卵巢腫瘤。 在一些實施態樣中，腫瘤為肺腫瘤。在特定的實施態樣中，腫瘤為胰腫瘤。在特定的實施態樣中，腫瘤為黑色素腫瘤。
本發明提供治療癌症之方法，其包含對個體(例如需要治療之個體)投予治療有效量的本文所述之TIGIT結合劑。在一些實施態樣中，本發明提供本文所述之TIGIT結合劑之用途，其製造或製備用於治療癌症之藥劑。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑結合人類TIGIT且抑制或降低癌生長。在特定的實施態樣中，個體為人類。在特定的實施態樣中，個體具有癌性腫瘤。在特定的實施態樣中，個體已有至少部分移除的腫瘤。在一些實施態樣中，用於治療個體的癌症之方法包含對個體投予治療有效量的抗體313M32。
在特定的實施態樣中，癌症為選自由下列所組成之群組的癌症：結腸直腸癌、胰臟癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、乳癌、腎臟癌、前列腺癌、胃腸道癌、黑色素瘤、子宮頸癌、神經內分泌癌、膀胱癌、神經膠質母細胞瘤和頭與頸癌。在特定的實施態樣中，癌症為胰臟癌。在特定的實施態樣中，癌症為卵巢癌。在特定的實施態樣中，癌症為結腸直腸癌。在特定的實施態樣中，癌症為乳癌。在特定的實施態樣中，癌症為前列腺癌。在特定的實施態樣中，癌症為肺癌。在特定的實施態樣中，癌症為黑色素瘤。
在一些實施態樣中，癌症為血液性癌。在一 些實施態樣中，癌症係選自由下列所組成之群組：急性骨髓性白血病(AML)、霍奇金氏(Hodgkin)淋巴瘤、多發性骨髓瘤、T細胞急性淋巴胚細胞白血病(T-ALL)、慢性淋巴細胞性(CLL)、毛細胞白血病、慢性骨髓性白血病(CML)、非霍奇金氏淋巴瘤、瀰漫性大型B細胞淋巴瘤(DLBCL)、套細胞淋巴瘤(MCL)和皮膚T細胞淋巴瘤(CTCL)。
在本文所述之方法的一些實施態樣中，該方法另外包含測定腫瘤或癌中的PD-L1表現量之步驟。在一些實施態樣中，測定PD-L1表現量係在以本文所述之TIGIT結合劑治療之前進行。在一些實施態樣中，若腫瘤或癌具有上升的PD-L1表現量，則將TIGIT結合劑投予個體。在一些實施態樣中，該方法包含(i)獲得個體的癌或腫瘤樣品；(ii)測量樣品中的PD-L1表現量；及(iii)若腫瘤或癌具有上升的PD-L1表現量，則對個體投予有效量的TIGIT結合劑。在一些實施態樣中，樣品為生檢樣品。在一些實施態樣中，樣品包含腫瘤細胞、腫瘤浸潤之免疫細胞、基質細胞及其任何組合。在一些實施態樣中，樣品為經福馬林固定之石蠟包埋(FFPE)樣品。在一些實施態樣中，樣品為歸檔、新鮮或冷凍組織。在一些實施態樣中，將樣品中的PD-L1表現量與預測定之PD-L1表現量比較。在一些實施態樣中，預測定之PD-L1表現的表現量為參考腫瘤樣品、參考正常組織樣品、一系列的參考腫瘤樣品或一系列的參考正常組織樣品中的PD-L1表現量。在一 些實施態樣中，PD-L1表現量係使用免疫組織化學(IHC)檢定法測定。在一些實施態樣中，PD-L1表現量係使用包含H-分數評估的檢定法測定。在一些實施態樣中，PD-L1表現量係使用特異性結合PD-L1之抗體測定。在一些實施態樣中，PD-L1係在腫瘤細胞上檢測。在一些實施態樣中，PD-L1係在腫瘤浸潤之免疫細胞上檢測。
以二或更多種治療劑之組合療法常使用以不同作用機轉運作之劑，雖然並非必要。使用具有不同的作用機轉之劑的組合療法可能導致加成或協同效應。組合療法可容許單一劑之劑量比單一療法使用之劑量更低，由此降低該劑之毒性副作用及/或增加治療指數。組合療法可降低抗藥性癌細胞發生的可能性。在一些實施態樣中，組合療法包含影響免疫反應(例如增強或活化反應)之治療劑及影響(例如抑制或殺死)腫瘤/癌細胞之治療劑。
在一些實施態樣中，本文所述之劑與至少一種額外治療劑之組合導致加成或協同效應。在一些實施態樣中，組合療法導致本文所述之劑的治療指數增加。在一些實施態樣中，組合療法導致額外治療劑的治療指數增加。在一些實施態樣中，組合療法導致本文所述之劑的毒性及/或副作用降低。在一些實施態樣中，組合療法導致額外治療劑的毒性及/或副作用降低。
在特定的實施態樣中，除了投予本文所述之TIGIT結合劑以外，該方法或治療另外包含投予至少一種額外治療劑。額外治療劑可在投予TIGIT結合劑之前、同 步及/或之後投予。在一些實施態樣中，至少一種額外治療劑包含1、2、3或更多個額外治療劑。
治療劑可與本文所述之劑組合投予，包括化療劑。因此，在一些實施態樣中，該方法或治療包含本發明之劑與化療劑組合或與化療劑混合液組合投予。以本發明之劑治療可發生在投予化療劑之前、同步或之後。組合投予可包括以單一醫藥調配物或使用分開的調配物共同投予，或以任何順序連續投予，但是通常在一段期間內，使得所有的活性劑可同時發揮彼等生物活性。該等化療劑的準備及投予時程可根據製造商的指示使用或由熟習的醫師憑經驗決定。該等化療劑的準備及投予時程亦說明於The Chemotherapy Source Book,4th Edition,2008,M.C.Perry,Editor,Lippincott,Williams & Wilkins,Philadelphia,PA中。
有用的治療劑類別包括例如抗微管蛋白劑、奧立他汀(auristatin)、DNA小溝結合劑(minor groove binder)、DNA複製抑制劑、烷化劑(例如鉑複合物，諸如順鉑(cisplatin)、單(鉑)、二(鉑)和三核鉑複合物，及卡鉑(carboplatin))、蒽環類(anthracycline)、抗生素、抗葉酸劑、抗代謝物、化療致敏劑、倍癌黴素(duocarmycin)、依托泊苷(etoposide)、氟化嘧啶、離子載體、萊克西托素(lexitropsin)、亞硝基尿素、普拉汀諾(platinol)、嘌呤抗代謝物、嘌呤黴素(puromycin)、放射致敏劑、類固醇、紫杉烷、拓撲異構酶抑制劑、長春花生物鹼或類似者。在特 定的實施態樣中，第二治療劑為烷化劑、抗代謝物、抗有絲分裂劑、拓撲異構酶抑制劑或血管生成抑制劑。
在本發明中有用的化療劑包括但不限於烷化劑，諸如噻替派(thiotepa)和環磷醯胺(cyclosphosphamide)(CYTOXAN)；烷基磺酸鹽，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，諸如苯多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、甲基優瑞多巴(meturedopa)和優瑞多巴(uredopa)；伸乙亞胺(ethylenimines)及甲基三聚氰胺(methylamelamines)，包括阿草特胺(altretamine)、三亞乙基三聚氰胺(triethylenemelamine)、三乙烯磷醯胺(trietylenephosphoramide)、三乙烯硫磷醯胺(triethylenethiophosphaoramide)和三羥甲基三聚氰胺(trimethylolomelamime)；氮芥子氣，諸如氯芥苯丁酸(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷醯胺(cholophosphamide)、雌二醇氮芥(estramustine)、異環磷酸胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、氧氮芥(mechlorethamine oxide)鹽酸鹽、黴法蘭(melphalan)、新氮芥(novembichin)、膽甾醇苯乙酸氮芥(phenesterine)、松龍苯芥(prednimustine)、氯乙環磷醯胺(trofosfamide)、尿嘧啶芥(uracil mustard)；亞硝基脲(nitrosureas)，諸如卡氮芥(carmustine)、吡葡亞硝脲(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、羅氮芥(lomustine)、尼氮芥(nimustine)、雷諾氮芥(ranimustine)；抗生素，諸如阿克拉黴素 (aclacinomysins)、放線菌素(actinomycin)、安曲黴素(authramycin)、氮絲胺酸(azaserine)、博來黴素(bleomycins)、放線菌素(cactinomycin)、卡利奇黴素(calicheamicin)、卡拉比辛(carabicin)、洋紅黴素(caminomycin)、嗜癌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycins)、達克黴素(dactinomycin)、正定黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-側氧基-L-正白胺酸、多柔比星(doxorubicin)、表阿黴素(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycins)、黴酚酸、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、波弗黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黴黑素(streptonigrin)、鏈脲佐菌素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、鳥苯美司(ubenimex)、新制癌菌素(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如甲胺喋呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、甲胺喋呤、蝶羅呤(pteropterin)、三甲蝶呤(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-硫唑脲嘧啶(6-azauridine)、卡莫氟 (carmofur)、胞嘧啶阿拉伯糖苷、二去氧尿苷、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-FU；雄性素，諸如卡魯睪酮(calusterone)、屈他雄酮(dromostanolone)丙酸鹽、硫雄甾醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內酮(testolactone)；抗腎上腺劑，諸如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如亞葉酸；醋葡醛內酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；胺基酮戊酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；貝斯特氮芥(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)；磷胺氮芥(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾氟米辛(elformithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；依托格魯(etoglucid)；硝酸鎵(gallium nitrate)；羥基脲；香菇糖(lentinan)；氯尼達明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；噴司他丁(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基醯肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK；雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofuran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺(2,2',2"-trichlorotriethylamine)；烏拉坦(urethan)；長春地辛 (vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿拉伯糖苷(Ara-C)；類紫杉醇(taxoids)，例如太平洋紫杉醇(TAXOL)和多西紫杉醇(TAXOTERE)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他濱(gemcitabine)；6-硫鳥嘌呤；巰嘌呤(mercaptopurine)；鉑類似物，諸如順鉑(cisplatin)和卡鉑(carboplatin)；長春鹼(vinblastine)；鉑(platinum)；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；異環磷醯胺(ifosfamide)；絲裂黴素C；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新鹼(vincristine)；長春瑞濱(vinorelbine)；溫諾平(navelbine)；米托蒽醌(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道諾黴素(daunomycin)；胺喋呤(aminopterin)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；CPT11；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；視黃酸；埃斯培拉黴素(esperamicins)；卡培他濱(capecitabine)(XELODA)及上述任一劑之醫藥上可接受的鹽、酸或衍生物。化療劑亦包括調節或抑制荷爾蒙對腫瘤作用之抗荷爾蒙劑，諸如抗雌激素劑，包括例如它莫西芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羥基它莫西芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(FARESTON)；及抗雄性素劑，諸如氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、柳普林 (leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；及上述任一劑之醫藥上可接受的鹽、酸或衍生物。在特定的實施態樣中，額外治療劑為順鉑。在特定的實施態樣中，額外治療劑為卡鉑。
在特定的實施態樣中，化療劑為拓撲異構酶抑制劑。拓撲異構酶抑制劑為干擾拓撲異構酶(例如拓撲異構酶I或II)活性之化療劑。拓撲異構酶抑制劑包括但不限於多柔比星(doxorubicin)HCl、正定黴素檸檬酸鹽(daunorubicin citrate)、米托蒽醌(mitoxantrone)HCl、放線菌素D、依托泊苷(etoposide)、拓撲替康(topotecan)HCl、替尼泊苷(teniposide)(VM-26)及伊立替康(irinotecan)，以及該等中任一劑之醫藥上可接受的鹽、酸或衍生物。在一些實施態樣中，額外治療劑為伊立替康。
在特定的實施態樣中，化療劑為抗代謝物。抗代謝物為化學物質，其結構類似正常生化反應所需之代謝物，但仍有足以干擾一或多種細胞正常功能之差別，諸如細胞分裂。抗代謝物包括但不限於吉西他濱(gemcitabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、卡培他濱(capecitabine)、甲胺喋呤鈉、雷替曲塞(ralitrexed)、培美曲塞(pemetrexed)、替加氟(tegafur)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside)、硫鳥嘌呤、5-氮雜胞苷、6-巰基嘌呤、硫唑嘌呤、6-硫鳥嘌呤、噴司他丁(pentostatin)、氟達拉濱(fludarabine)鹽酸鹽和克拉屈濱(cladribine)，以及該等中任一劑之醫藥上可接受的鹽、酸或衍生物。在特定 的實施態樣中，額外治療劑為吉西他濱。
在特定的實施態樣中，化療劑為抗有絲分裂劑，包括但不限於結合微管蛋白之劑。在一些實施態樣中，該劑為紫杉烷。在特定的實施態樣中，該劑為太平洋紫杉醇(paclitaxel)或多西紫杉醇(docetaxel)，或太平洋紫杉醇或多西紫杉醇之醫藥上可接受的鹽、酸或衍生物。在特定的實施態樣中，該劑為太平洋紫杉醇(TAXOL)、多西紫杉醇(TAXOTERE)、白蛋白結合之太平洋紫杉醇(ABRAXANE)、DHA-太平洋紫杉醇或PG-太平洋紫杉醇。在特定的可替代實施態樣中，抗有絲分裂劑包含長春花生物鹼，諸如長春新鹼(vincristine)、長春鹼(binblastine)、長春瑞濱(vinorelbine)或長春地辛(vindesine)或其醫藥上可接受的鹽、酸或衍生物。在一些實施態樣中，抗有絲分裂劑為驅動蛋白(kinesin)Eg5之抑制劑或有絲分裂激酶(諸如AuroraA或Plk1)之抑制劑。在特定的實施態樣中，額外治療劑為太平洋紫杉醇。
在一些實施態樣中，額外治療劑包含諸如小分子之劑。例如，治療可包含本發明之劑與作為抗腫瘤相關性抗原(包括但不限於EGFR、HER2(ErbB2)及/或VEGF)之抑制劑作用的小分子之組合投予。在一些實施態樣中，本發明之劑係與選自由下列所組成之群組的蛋白激酶抑制劑組合投予：吉非替尼(gefitinib)(IRESSA)、埃羅替尼(erlotinib)(TARCEVA)、舒尼替尼(sunitinib)(SUTENT)、拉帕替尼(lapatanib)、凡德他尼(vandetanib) (ZACTIMA)、AEE788、CI-1033、西地尼布(cediranib)(RECENTIN)、索拉非尼(sorafenib)(NEXAVAR)和帕唑帕尼(pazopanib)(GW786034B)。在一些實施態樣中，額外治療劑包含mTOR抑制劑。
在特定的實施態樣中，額外治療劑為抑制癌幹細胞途徑之劑。在一些實施態樣中，額外治療劑為Notch途徑之抑制劑。在一些實施態樣中，額外治療劑為Wnt途徑之抑制劑。在一些實施態樣中，額外治療劑為BMP途徑之抑制劑。在一些實施態樣中，額外治療劑為Hippo途徑之抑制劑。在一些實施態樣中，額外治療劑為RSPO/LGR途徑之抑制劑。在一些實施態樣中，額外治療劑為mTOR/AKR途徑之抑制劑。
在一些實施態樣中，額外治療劑包含生物分子，諸如抗體。例如，治療可包含本發明之劑與抗腫瘤相關性抗原之抗體(包括但不限於結合EGFR、HER2/ErbB2及/或VEGF之抗體)之組合投予。在特定的實施態樣中，額外治療劑為對癌幹細胞標記特異性之抗體。在一些實施態樣中，額外治療劑為結合Notch途徑的組份之抗體。在一些實施態樣中，額外治療劑為結合Wnt途徑的組份之抗體。在特定的實施態樣中，額外治療劑為抑制癌幹細胞途徑之抗體。在一些實施態樣中，額外治療劑為Notch途徑之抑制劑。在一些實施態樣中，額外治療劑為Wnt途徑之抑制劑。在一些實施態樣中，額外治療劑為BMP途徑之抑制劑。在一些實施態樣中，額外治療劑為抑制β-連環蛋 白傳訊之抗體。在特定的實施態樣中，額外治療劑為血管生成抑制劑之抗體(例如抗VEGF或VEGF受體抗體)。在特定的實施態樣中，額外治療劑為貝伐珠單抗(bevacizumab)(AVASTIN)、雷莫蘆單抗(ramucirumab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)(HERCEPTIN)、帕妥珠單抗(pertuzumab)(OMNITARG)、帕尼單抗(panitumumab)(VECTIBIX)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、扎魯木單抗(zalutumumab)或西妥昔單抗(cetuximab)(ERBITUX)。
在特定的實施態樣中，除了投予本文所述之TIGIT結合劑以外，該方法或治療另外包含投予至少一種額外的免疫治療劑。在一些實施態樣中，額外的免疫治療劑為免疫反應刺激劑。在一些實施態樣中，免疫治療劑(例如免疫反應刺激劑)包括但不限於集落刺激因子(例如顆粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、顆粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、幹細胞因子(SCF))、介白素(例如IL-1、IL2、IL-3、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18)、阻斷免疫抑制功能之抗體(例如抗CTLA4抗體、抗CD28抗體、抗CD3抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體)、增強免疫細胞功能之抗體(例如抗GITR抗體或抗OX-40抗體)、類鐸受體(例如TLR4、TLR7、TLR9)、可溶性配體(例如GITRL或OX-40L)或B7家族成員(例如CD80、CD86)。額外的免疫治療劑(例如免疫反應刺激劑)可在投予TIGIT結合劑之前、同步及/或之後投予。亦提供包含TIGIT結合劑及額外的免疫治療劑 (例如免疫反應刺激劑)之醫藥組成物。在一些實施態樣中，免疫治療劑包含1、2、3或更多種免疫治療劑。在一些實施態樣中，免疫反應刺激劑包含1、2、3或更多種免疫反應刺激劑。
在一些實施態樣中，額外治療劑為免疫檢查點抑制劑之抗體。在一些實施態樣中，免疫檢查點抑制劑為抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗CTLA4抗體、抗CD28抗體、抗LAG3抗體、抗TIM3抗體、抗GITR抗體或抗OX-40抗體。在一些實施態樣中，免疫檢查點抑制劑為抗4-1BB抗體。在一些實施態樣中，額外治療劑為選自由下列所組成之群組的抗PD-1抗體：尼沃單抗(nivolumab)(OPDIVO)、派姆單抗(pembrolizumab)(KEYTRUDA)或皮狄單抗(pidilzumab)。在一些實施態樣中，額外治療劑為選自由下列所組成之群組的抗PD-1抗體：MEDI0680、REGN2810、BGB-A317和PDR001。在一些實施態樣中，額外治療劑為選自由下列所組成之群組的抗PD-L1抗體：BMS935559(MDX-1105)，阿替索單抗(atexolizumab)(MPDL3280A)、德瓦魯單抗(durvalumab)(MEDI4736)或阿維單抗(avelumab)(MSB0010718C)。在一些實施態樣中，額外治療劑為選自由下列所組成之群組的抗CTLA-4抗體：伊匹單抗(ipilimumab)(YERVOY)或曲美木單抗(tremelimumab)。在一些實施態樣中，額外治療劑為選自由下列所組成之群組的抗LAG-3抗體：BMS-986016和LAG525。在一些實施態樣中，額外治療劑為選 自由下列所組成之群組的抗OX-40抗體：MEDI6469、MEDI0562和MOXR0916。在一些實施態樣中，額外治療劑為選自由下列所組成之群組的抗4-1BB抗體：PF-05082566。
此外，以本文所述之TIGIT結合劑治療可包括與其他的生物分子之組合治療，諸如一或多種細胞激素(例如淋巴激素、介白素、干擾素、腫瘤壞死因子及/或生長因子)，或可伴隨手術移除腫瘤、移除癌細胞或由治療醫師認為必要的任何其他療法。
在一些實施態樣中，TIGIT結合劑可與選自由下列所組成之群組的生物分子組合投予：腎上腺髓質素(AM)、血管生成素(Ang)、BMPs、BDNF、EGF、紅血球生成素(EPO)、FGF、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GDF9、HGF、HDGF、IGF、移動刺激因子、肌肉抑制素(GDF-8)、NGF、神經生長激素、PDGF、血小板生成素、TGF-α、TGF-β、TNF-α、VEGF、P1GF、γ-IFN、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15和IL-18。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑可與選自由下列所組成之群組的生物分子組合投予：巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)和幹細胞因子(SCF)。
在一些實施態樣中，以本文所述之TIGIT結合劑治療可伴隨手術移除腫瘤、移除癌細胞或由治療醫師認為必要的任何其他手術療法。
在特定的實施態樣中，治療包含投予本發明 的TIGIT結合劑與放射療法之組合。以TIGIT結合劑治療可發生在投予放射療法之前、同步或之後。此放射治療之給量時程可由熟習的醫師決定。
在特定的實施態樣中，治療包含投予本發明的TIGIT結合劑與抗病毒療法組合。以TIGIT結合劑治療可發生在投予抗病毒療法之前、同步或之後。在組合療法中所使用的抗病毒藥物係取決於個體感染之病毒而定。
組合投予可包括以單一醫藥調配物或使用分開的調配物共同投予，或以任何順序連續投予，但是通常在一段期間內，使得所有的活性劑可同時發揮彼等生物活性。
應理解本文所述之TIGIT結合劑與至少一種額外治療劑之組合可以任何順序投予或同步投予。在一些實施態樣中，將TIGIT結合劑投予先前已接受第二治療劑治療之患者。在特定的其他實施態樣中，TIGIT結合劑與第二治療劑實質上同時或同步投予。例如，個體可在接受第二治療劑(例如化療法)期間同時給予TIGIT結合劑。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑係在以第二治療劑治療的1年內投予。在特定的可替代實施態樣中，TIGIT結合劑係在以第二治療劑之任何治療的10、8、6、4或2個月內投予。在特定的其他實施態樣中，TIGIT結合劑係在以第二治療劑之任何治療的4、3、2或1週內投予。在一些實施態樣中，結合劑係在以第二治療劑之任何治療的5、4、3、2或1天內投予。應進一步理解兩種(或更多種)劑 或治療可在數小時或數分鐘內(亦即實質上同時)投予個體。
用於疾病治療之本發明的TIGIT結合劑之適當劑量係取決於所欲治療之疾病類型、疾病的嚴重性和病程、疾病的反應性、結合劑是否以治療或預防目的投予、先前治療、患者的臨床病史等等而定，所有皆由主治醫師斟酌。TIGIT結合劑可投予一次或從數天持續至數月的治療系列投予，或直到完成療效或達到疾病狀態的縮減(例如減少腫瘤大小)。最優化給藥時程可自藥物累積於患者體內的測量值計算，且取決於個別劑之相對效力而改變。投藥醫師可決定最優化劑量、給藥方法及重複頻率。在特定的實施態樣中，劑量為0.01微克至100毫克/公斤體重，從0.1微克至100毫克/公斤體重，從1微克至100毫克/公斤體重，從1毫克至100毫克/公斤體重，1毫克至80毫克/公斤體重，從10毫克至100毫克/公斤體重，從10毫克至75毫克/公斤體重，或從10毫克至50毫克/公斤體重。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑之劑量為從約0.1毫克至約20毫克/公斤體重。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑劑量為約0.5毫克/公斤體重。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑之劑量為約1毫克/公斤體重。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑之劑量為約1。5毫克/公斤體重。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑之劑量為約2毫克/公斤體重。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑之劑量為約2.5毫克/公斤體重。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑之 劑量為約5毫克/公斤體重。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑之劑量為約7。5毫克/公斤體重。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑之劑量為約10毫克/公斤體重。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑之劑量為約12.5毫克/公斤體重。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑之劑量為約15毫克/公斤體重。在特定的實施態樣中，劑量可以每天、每週、每月或每年給予一或多次。在特定的實施態樣中，TIGIT結合劑可以每週給予一次、每兩週給予一次、每三週給予一次或每四週給予一次。
在一些實施態樣中，TIGIT結合劑可以最初較高的〝加載(loading)〞劑量投予，隨後以一或多個較低劑量投予。在一些實施態樣中，亦可改變投予頻率。在一些實施態樣中，給藥方案可包含以初始劑量投予，隨後以每周一次、每二周一次、每三周一次或每月一次額外劑量(或〝維持〞劑量)投予。例如，給藥方案可包含以初始加載劑量投予，隨後以例如一半初始劑量的每周維持劑量投予。或者，給藥方案可包含以初始加載劑量投予，隨後每隔一周以例如一半的初始劑量之維持劑量投予。或者，給藥方案可包含經3週投予三次初始劑量，隨後每隔一周以例如相同量的維持劑量投予。
如那些熟習本技領域者已知，投予任何治療劑可引起副作用及/或毒性。在一些例子中，副作用及/或毒性非常嚴重以至於無法投予治療有效劑量的特定劑。在一些例子中，藥物療法必須中斷，且可嘗試其他劑。然 而，許多相同治療類別之劑時常展現類似的副作用及/或毒性，意指患者必須停止治療，或若可能，則忍受與治療劑相關聯的之不適副作用。
在一些實施態樣中，給藥時程可限制成特定次數的投予或〝週期〞。在一些實施態樣中，TIGIT結合劑係經3、4、5、6、7、8或更多個週期投予。例如，TIGIT結合劑係以每2週經6個週期投予，TIGIT結合劑係以每3週經6個週期投予，TIGIT結合劑係以每2週經4個週期投予，TIGIT結合劑係以每3週經4個週期投予等等。給藥時程可考慮後決定且隨後由那些熟習本技術領域者修改。
本發明提供對個體投予本文所述之TIGIT結合劑之方法，其包含使用間歇性給藥策略投予一或多種劑，這可降低與投予結合劑、化療劑等等相關聯的副作用及/或毒性。在一些實施態樣中，治療人類個體的癌症之方法包含對個體投予治療有效劑量之結合劑與治療有效劑量之化療劑的組合，其中劑中之一或二者係根據間歇性給藥策略投予。在一些實施態樣中，間歇性給藥策略包含對個體投予初始劑量之結合劑且約每2周投予一次結合劑之後續劑量。在一些實施態樣中，間歇性給藥策略包含對個體投予初始劑量之結合劑且約每3周投予一次結合劑之後續劑量。在一些實施態樣中，間歇性給藥策略包含對個體投予初始劑量之結合劑且約每4周投予一次結合劑之後續劑量。在一些實施態樣中，結合劑係使用間歇性給藥策略 投予及化療劑係每周投予。
本發明提供包含本文所述之TIGIT結合劑之組成物。本發明亦提供包含本文所述之TIGIT結合劑及醫藥上可接受的媒劑之醫藥組成物。在一些實施態樣中，發現醫藥組成物在免疫治療之用途。在一些實施態樣中，發現組成物在抑制腫瘤生長之用途。在一些實施態樣中，發現醫藥組成物在抑制個體(例如人類患者)的腫瘤生長之用途。在一些實施態樣中，發現組成物在治療癌症之用途。在一些實施態樣中，發現醫藥組成物在治療個體(例如人類患者)的癌症之用途。
製備用於貯存及藉由組合純化之抗體或本發明的TIGIT結合劑與醫藥上可接受的媒劑(例如載劑或賦形劑)而使用之調配物。那些熟習本技術領域者通常考慮成為調配物或醫藥組成物的無活性成分之醫藥上可接受的載劑、賦形劑及/或穩定劑。
適合的醫藥上可接受的媒劑包括但不限於無毒性緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他的有機酸；鹽，諸如氯化鈉；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；保存劑，諸如氯化十八烷基二甲基苯甲銨、氯化六烴季銨、氯化苯甲烴銨、氯化苯甲乙氧銨、酚、丁醇或苯甲醇、對羥苯甲酸烷酯(諸如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯)、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇和間甲酚；低分子量多肽(例如少於約10個胺基酸殘基)；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸 如聚乙烯基吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；碳水化合物，諸如單醣、雙醣、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；鹽形成之相對離子，諸如鈉；金屬複合物(例如Zn-蛋白質複合物)；及非離子性界面活性劑，諸如TWEEN或聚乙二醇(PEG)。(Remington：The Science and Practice of Pharmacy,22st Edition,2012,Pharmaceutical Press,London)。
本發明的醫藥組成物可以任何數種方式經局部或全身性投予。投予可為藉由表皮或透皮貼片、軟膏、洗劑、乳膏、凝膠、滴劑、栓劑、噴劑、液體及粉劑的局部投予；藉由吸入或噴入粉劑或氣霧劑之經肺投予，包括藉由噴霧器、氣管內或鼻內投予；經口；或非經腸，包括靜脈內、動脈內、腫瘤內、皮下、腹膜內、肌肉內(例如注射或輸注)或顱內(例如脊椎鞘內或心室內)。
治療調配物可呈單位劑量形式。此等調配物包括錠劑、丸劑、膠囊、粉劑、顆粒、在水或非水性介質中的溶液或懸浮液、或栓劑。在固態組成物中，諸如錠劑，主要活性成分係與醫藥載劑混合。習知的製錠成分包括玉米澱粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣或膠和稀釋劑(例如水)。該等可用於形成含有本發明化合物或其無毒性之醫藥上可接受的鹽之均勻混合物的固體預調配組成物。固體預調配組成物接著細分 成上述類型之單位劑量型式。可將調配物或組成物的錠劑、丸劑等等可包膜或以其他方式化合，以提供給予延長作用之優點的劑型。例如，錠劑或丸劑可包含以外部組份包覆之內部組成物。此外，兩種組份可以腸溶層分開，腸溶層適合於抵抗崩解且允許內部組份完整通過胃或延遲釋放。可以各種材料用於此等腸溶層或包膜，此等材料包括多種聚合酸及聚合酸與諸如蟲膠、鯨臘醇和乙酸纖維素之材料的混合物。
本文所述之TIGIT結合劑亦可包封於微膠囊中。此等微膠囊係藉由例如凝聚技術或藉由界面聚合反應來製備，例如分別於膠體藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球、微乳液、奈米粒子和奈米微囊)或於巨乳液中的羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊，如Remington：The Science and Practice of Pharmacy,22st Edition,2012,Pharmaceutical Press,London中所述。
在特定的實施態樣中，醫藥調配物包括與脂質體複合之本發明的TIGIT結合劑。生產脂質體之方法為那些熟習本技領域者已知。例如，一些脂質體可藉包含磷脂醯膽鹼、膽固醇及PEG-衍生性磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)之脂質組成物的反相蒸發而產生。脂質體可經擠壓通過限定孔徑之過濾器，得到具有所欲直徑之脂質體。
在特定的實施態樣中，可生產包含本文所述之TIGIT結合劑的持續釋放型製劑。持續釋放型製劑之適合的實例包括含有TIGIT結合劑的固相疏水性聚合物之半 透性基質，其中基質係呈成形物件(例如膜或微膠囊)形式。持續釋放型基質的實例包括聚酯、水凝膠(諸如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚乙烯醇)、聚交酯、L-麩胺酸與7乙基-L-麩胺酸酯之共聚物、不可降解之乙烯-乙酸乙烯酯、可降解之乳酸-乙醇酸共聚物，諸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物及柳菩林(leuprolide acetate)所組成之注射微球)、蔗糖乙酸異丁酸酯和聚-D-(-)-3-羥丁酸。
V. 實施態樣
在實施態樣1中，特異性結合TIGIT的細胞外結構域之單離抗體，其包含：(a)包含GSSLSSSYMS(SEQ ID NO：7)或GFSLSSSYMS(SEQ ID NO：13)之重鏈CDR1、包含IIGSNGNTYYANWAKG(SEQ ID NO：8)之重鏈CDR2及包含GGYRTSGMDP(SEQ ID NO：9)之重鏈CDR3；及/或(b)包含QASQSISSYLNW(SEQ ID NO：10)、QASQSNIYSDLAW(SEQ ID NO：14)或QASQNIYSKLAW(SEQ ID NO：81)之輕鏈CDR1、包含DALKLAS(SEQ ID NO：11)或RASTLAS(SEQ ID NO：15)之輕鏈CDR2及包含QQEHSVGNVDN(SEQ ID NO：12)或QQEHLVAWIYN(SEQ ID NO：16)之輕鏈CDR3。
在實施態樣2中，實施態樣1之抗體包含：(a)包含GSSLSSSYMS(SEQ ID NO：7)之重鏈CDR1、包含IIGSNGNTYYANWAKG(SEQ ID NO：8)之重鏈CDR2 及包含GGYRTSGMDP(SEQ ID NO：9)之重鏈CDR3；及/或(b)包含QASQSISSYLNW(SEQ ID NO：10)之輕鏈CDR1、包含DALKLAS(SEQ ID NO：11)之輕鏈CDR2及包含QQEHSVGNVDN(SEQ ID NO：12)之輕鏈CDR3。
在實施態樣3中，實施態樣1之抗體包含：(a)包含GFSLSSSYMS(SEQ ID NO：13)之重鏈CDR1、包含IIGSNGNTYYANWAKG(SQ ID NO：8)之重鏈CDR2及包含GGYRTSGMDP(SEQ ID NO：9)之重鏈CDR3；及/或(b)包含QASQNIYSKLAW(SEQ ID NO：81)之輕鏈CDR1、包含RASTLAS(SEQ ID NO：15)之輕鏈CDR2及包含QQEHLVAWIYN(SEQ ID NO：16)之輕鏈CDR3。
在實施態樣4中，特異性結合TIGIT之單離抗體，其包含：(a)與SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：32具有至少90%之序列一致性的重鏈可變區；及/或(b)與SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20具有至少90%之序列一致性的輕鏈可變區。
在實施態樣5中，實施態樣1至4中任一者之抗體包含：(a)與SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：32具有至少95%之序列一致性的重鏈可變區；及/或(b)與SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20具有至少95%之序列一致性的輕鏈可變區。
在實施態樣6中，實施態樣5之抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：17之重鏈可變區；及(b)包含SEQ ID NO：18之輕鏈可變區。
在實施態樣7中，實施態樣5之抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：19之重鏈可變區；及(b)包含SEQ ID NO：20之輕鏈可變區。
在實施態樣8中，實施態樣5之抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：32之重鏈可變區；及(b)包含SEQ ID NO：20之輕鏈可變區。
在實施態樣9中，實施態樣1至8中任一者之抗體為單克隆抗體。
在實施態樣10中，實施態樣1至9中任一者之抗體為人源化抗體。
在實施態樣11中，實施態樣1至10中任一者之抗體為人類抗體。
在實施態樣12中，根據實施態樣1至10中任一者之抗體為重組抗體或嵌合抗體。
在實施態樣13中，實施態樣1至12中任一者之抗體為雙特異性抗體。
在實施態樣14中，實施態樣1至13中任一者之抗體為包含抗原結合部位之抗體片段。
在實施態樣15中，實施態樣1至13中任一者之抗體為IgG抗體。
在實施態樣16中，實施態樣15之抗體為IgG1抗體、IgG2抗體或IgG4抗體。
在實施態樣17中，抗體包含(a)選自由下列所組成之群組的重鏈胺基酸序列：SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：56；及(b)選自由下列所組成之群組的輕鏈胺基酸序列：SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：30。
在實施態樣18中，實施態樣17之抗體包含SEQ ID NO：26之重鏈胺基酸序列和SEQ ID NO：28之輕鏈胺基酸序列。
在實施態樣19中，實施態樣17之抗體包含SEQ ID NO：27之重鏈胺基酸序列和SEQ ID NO：28之輕鏈胺基酸序列。
在實施態樣20中，實施態樣17之抗體包含SEQ ID NO：29之重鏈胺基酸序列和SEQ ID NO：30之輕鏈胺基酸序列。
在實施態樣21中，實施態樣17之抗體包含SEQ ID NO：34之重鏈胺基酸序列和SEQ ID NO：30之輕鏈胺基酸序列。
在實施態樣22中，實施態樣17之抗體包含SEQ ID NO：56之重鏈胺基酸序列和SEQ ID NO：30之輕鏈胺基酸序列。
在實施態樣23中，抗體包含來自選自由下列所組成之群組的抗體之重鏈可變區和輕鏈可變區：313R11、313R12、313R14、313R19和313R20。
在實施態樣24中，抗體係選自由下列所組成之群組：313R11、313R12、313R14、313R19和313R20。
在實施態樣25中，抗體包含由寄存於ATCC 編號為PTA-122180之質體編碼的重鏈可變區。
在實施態樣26中，抗體包含由寄存於ATCC編號為PTA-122181之質體編碼的輕鏈可變區。
在實施態樣27中，抗體包含多肽，該多肽包含由寄存於ATCC編號為PTA-122180之質體編碼的重鏈可變區。
在實施態樣28中，抗體包含多肽，該多肽包含由寄存於ATCC編號為PTA-122181之質體編碼的輕鏈可變區。
在實施態樣29中，抗體包含由寄存於ATCC編號為PTA-122180之質體編碼的重鏈可變區和由寄存於ATCC編號為PTA-122181之質體編碼的輕鏈可變區。
在實施態樣30中，抗體包含由寄存於ATCC編號為PTA-122180之質體和由寄存於ATCC編號為PTA-122181之質體編碼的多肽。
在實施態樣31中，單離抗體與實施態樣1至30中任一者之抗體競爭與TIGIT特異性結合。
在實施態樣32中，單離抗體與實施態樣1至30中任一者之抗體結合TIGIT之相同的抗原決定區。
在實施態樣33中，單離抗體結合TIGIT的抗原決定區，該抗原決定區與實施態樣1至30中任一者之抗體結合之TIGIT的抗原決定區重疊。
在實施態樣34中，實施態樣1至33中任一者之抗體，其抑制TIGIT與脊髓灰白質病毒受體(PVR)結 合。
在實施態樣35中，實施態樣1至33中任一者之抗體，其抑制或阻斷TIGIT與PVR之間的交互作用。
在實施態樣36中，實施態樣1至33中任一者之抗體，其抑制TIGIT傳訊。
在實施態樣37中，實施態樣1至33中任一者之抗體，其為經TIGIT媒介之傳訊的拮抗劑。
在實施態樣38中，實施態樣1至33中任一者之抗體，其抑制TIGIT活化。
在實施態樣39中，實施態樣1至33中任一者之抗體，其抑制TIGIT之磷酸化。
在實施態樣40中，實施態樣1至33中任一者之抗體，其降低TIGIT之細胞表面表現。
在實施態樣41中，實施態樣1至33中任一者之抗體，其誘發及/或增強免疫反應。
在實施態樣42中，實施態樣41之抗體，其中免疫反應係針對腫瘤或腫瘤細胞。
在實施態樣43中，實施態樣41之抗體，其中免疫反應係針對病毒或病毒感染細胞。
在實施態樣44中，實施態樣1至33中任一者之抗體，其增加細胞媒介之免疫力。
在實施態樣45中，實施態樣1至33中任一者之抗體，其增加T細胞活性。
在實施態樣46中，實施態樣1至33中任一者之抗體，其增加溶胞性T細胞(CTL)活性。
在實施態樣47中，實施態樣1至33中任一者之抗體，其增加自然殺手(NK)細胞活性。
在實施態樣48中，實施態樣1至33中任一者之抗體，其增加IL-2生產及/或IL-2生產細胞的數目。
在實施態樣49中，實施態樣1至33中任一者之抗體，其增加IFN-γ生產及/或IFN-γ生產細胞的數目。
在實施態樣50中，實施態樣1至33中任一者之抗體，其增強Th1型免疫反應。
在實施態樣51中，實施態樣1至33中任一者之抗體，其降低IL-4生產及/或IL-4生產細胞的數目。
在實施態樣52中，實施態樣1至33中任一者之抗體，其降低IL-10及/或IL-10生產細胞的數目。
在實施態樣53中，實施態樣1至33中任一者之抗體，其降低Th2型免疫反應。
在實施態樣54中，實施態樣1至33中任一者之抗體，其抑制及/或降低調節性T細胞(Treg)之抑制活性。
在實施態樣55中，實施態樣1至33中任一者之抗體，其抑制及/或降低骨髓衍生性抑制細胞(MDSC)之抑制活性。
在實施態樣56中，實施態樣1至55中任一 者之抗體，其抑制腫瘤生長。
在實施態樣57中，異質二聚體劑包含實施態樣1至33中任一者之抗體。
在實施態樣58中，雙特異性劑包含a)特異性結合TIGIT之第一臂，及b)第二臂，其中第一臂包含實施態樣1至33中任一者之抗體。
在實施態樣59中，實施態樣58之雙特異性劑，其中第二臂包含來自抗體的抗原結合部位。
在實施態樣60中，實施態樣58之雙特異性劑，其中第二臂特異性結合PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM-3、LAG-3、OX-40或GITR。
在實施態樣61中，實施態樣58之雙特異性劑，其中第二臂特異性結合腫瘤抗原。
在實施態樣62中，實施態樣58之雙特異性劑，其中第二臂包含免疫反應刺激劑。
在實施態樣63中，實施態樣62之雙特異性劑，其中免疫反應刺激劑係選自由下列所組成之群組：顆粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、顆粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、介白素2(IL-2)、介白素3(IL-3)、介白素12(IL-12)、介白素15(IL-15)、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、4-1BB配體、GITRL、OX-40L、抗CD3抗體、抗CTLA4抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗GITR抗體、抗OX-40抗體、抗LAG-3抗體和抗TIM-3抗體。
在實施態樣64中，實施態樣58至63中任一者之雙特異性劑，其中第一臂包含第一CH3結構域及第二臂包含第二CH3結構域，各CH3結構域經修飾以促進異質二聚體的形成。
在實施態樣65中，實施態樣64之雙特異性劑，其中第一及第二CH3結構域係建基於靜電效應而修飾。
在實施態樣66中，實施態樣58至63中任一者之雙特異性劑，其中第一臂包含在對應於SEQ ID NO：41之位置253和292上具有胺基酸取代之第一人類IgG1恆定區，其中胺基酸係經麩胺酸或天冬胺酸取代，及第二臂包含在對應於SEQ ID NO：41之位置240和282上具有胺基酸取代之第二人類IgG1恆定區，其中胺基酸係經離胺酸取代。
在實施態樣67中，實施態樣58至63中任一者之雙特異性劑，其中第一臂包含在對應於SEQ ID NO：41之位置240和282上具有胺基酸取代之第一人類IgG1恆定區，其中胺基酸係經離胺酸取代，及第二臂包含在對應於SEQ ID NO：41之位置253和292上具有胺基酸取代之第二人類IgG1恆定區，其中胺基酸係經麩胺酸或天冬胺酸取代。
在實施態樣68中，實施態樣58至63中任一者之雙特異性劑，其中第一臂包含在對應於SEQ ID NO：42之位置249和288上具有胺基酸取代之第一人類IgG2 恆定區，其中胺基酸係經麩胺酸或天冬胺酸取代，及第二臂包含在對應於SEQ ID NO：42之位置236和278上具有胺基酸取代之第二人類IgG2恆定區，其中胺基酸係經離胺酸取代。
在實施態樣69中，實施態樣58至63中任一者之雙特異性劑，其中第一臂包含在對應於SEQ ID NO：42之位置236和278上具有胺基酸取代之第一人類IgG2恆定區，其中胺基酸係經離胺酸取代，及第二臂包含在對應於SEQ ID NO：42之位置249和288上具有胺基酸取代之第二人類IgG2恆定區，其中胺基酸係經麩胺酸或天冬胺酸取代。
在實施態樣70中，實施態樣64之雙特異性劑，其中第一及第二CH3結構域係使用孔中突點技術修飾。
在實施態樣71中，實施態樣58至70中任一者之雙特異性劑，其抑制TIGIT與PVR結合。
在實施態樣72中，實施態樣58至70中任一者之雙特異性劑，其抑制或阻斷TIGIT與PVR之間的交互作用。
在實施態樣73中，實施態樣58至70中任一者之雙特異性劑，其抑制TIGIT傳訊。
在實施態樣74中，實施態樣58至70中任一者之雙特異性劑，其為經TIGIT媒介之傳訊的拮抗劑。
在實施態樣75中，實施態樣58至70中任一 者之雙特異性劑，其抑制TIGIT活化。
在實施態樣76中，實施態樣58至70中任一者之雙特異性劑，其抑制TIGIT之磷酸化。
在實施態樣77中，實施態樣58至70中任一者之雙特異性劑，其降低TIGIT之細胞表面表現。
在實施態樣78中，實施態樣58至70中任一者之雙特異性劑，其誘發及/或增強免疫反應。
在實施態樣79中，實施態樣78之雙特異性劑，其中免疫反應係針對腫瘤或腫瘤細胞。
在實施態樣80中，實施態樣78之雙特異性劑，其中免疫反應係針對病毒或病毒感染細胞。
在實施態樣81中，實施態樣58至70中任一者之雙特異性劑，其增加細胞媒介之免疫力。
在實施態樣82中，實施態樣58至70中任一者之雙特異性劑，其增加T細胞活性。
在實施態樣83中，實施態樣58至70中任一者之雙特異性劑，其增加CTL活性。
在實施態樣84中，實施態樣58至70中任一者之雙特異性劑，其增加NK細胞活性。
在實施態樣85中，實施態樣58至70中任一者之雙特異性劑，其增加IL-2生產及/或IL-2生產細胞的數目。
在實施態樣86中，實施態樣58至70中任一者之雙特異性劑，其增加IFN-γ生產及/或IFN-γ生產細胞 的數目。
在實施態樣87中，實施態樣58至70中任一者之雙特異性劑，其增強Th1型免疫反應。
在實施態樣88中，實施態樣58至70中任一者之雙特異性劑，其降低IL-4生產及/或IL-4生產細胞的數目。
在實施態樣89中，實施態樣58至70中任一者之雙特異性劑，其降低IL-10及/或IL-10生產細胞的數目。
在實施態樣90中，實施態樣58至70中任一者之雙特異性劑，其降低Th2型免疫反應。
在實施態樣91中，實施態樣58至70中任一者之雙特異性劑，其抑制及/或降低Treg之抑制活性。
在實施態樣92中，實施態樣58至70中任一者之雙特異性劑，其抑制及/或降低MDSC之抑制活性。
在實施態樣93中，實施態樣58至92中任一者之雙特異性劑，其抑制腫瘤生長。
在實施態樣94中，多肽包含選自由下列所組成之群組的序列：SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、 SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56。
在實施態樣95中，細胞包含或生產實施態樣1至94中任一者之抗體、雙特異性劑或多肽。
在實施態樣96中，組成物包含實施態樣1至94中任一者之抗體、雙特異性劑或多肽。
在實施態樣97中，醫藥組成物包含實施態樣1至94中任一者之抗體、雙特異性劑或多肽及醫藥上可接受的載劑。
在實施態樣98中，單離多核苷酸分子包含編碼實施態樣1至94中任一者之抗體、雙特異性劑或多肽之多核苷酸。
在實施態樣99中，載體包含實施態樣98之多核苷酸。
在實施態樣100中，單離細胞包含實施態樣98之多核苷酸或實施態樣99之載體。
在實施態樣101中，誘發、活化、促進、增強、提高或延長個體的免疫反應之方法，其包含投予治療有效量的實施態樣1至94中任一者之抗體、雙特異性劑或多肽。
在實施態樣102中，誘發、活化、促進、增強、提高或延長個體的免疫反應之方法，其包含投予治療有效量的實施態樣1至33中任一者之抗體。
在實施態樣103中，實施態樣101或實施態樣102之方法，其中免疫反應係對抗腫瘤或癌。
在實施態樣104中，抑制腫瘤細胞生長之方法，其中該方法包含將腫瘤細胞與有效量的實施態樣1至94中任一者之抗體、雙特異性劑或多肽接觸。
在實施態樣105中，抑制個體的腫瘤生長之方法，其中該方法包含對個體投予治療有效量的實施態樣1至94中任一者之抗體、雙特異性劑或多肽。
在實施態樣106中，抑制個體的腫瘤生長之方法，其中該方法包含對個體投予治療有效量的實施態樣1至33中任一者之抗體。
在實施態樣107中，實施態樣103至106中任一者之方法，其中腫瘤或腫瘤細胞係選自由下列所組成之群組：結腸直腸腫瘤、卵巢腫瘤、胰腫瘤、肺腫瘤、肝腫瘤、乳房腫瘤、腎腫瘤、前列腺腫瘤、胃腸道腫瘤、黑色素瘤、子宮頸腫瘤、膀胱腫瘤、神經膠質母細胞瘤和頭與頸腫瘤。
在實施態樣108中，治療個體的癌症之方法，其中該方法包含對個體投予治療有效量的實施態樣1至94中任一者之抗體、雙特異性劑或多肽。
在實施態樣109中，治療個體的癌症之方法，其中該方法包含對個體投予治療有效量的實施態樣1至33中任一者之抗體。
在實施態樣110中，實施態樣108或實施態樣109之方法，其中癌症係選自由下列所組成之群組：結腸直腸癌、卵巢癌、胰臟癌、肺癌、肝癌、乳癌、腎臟 癌、前列腺癌、胃腸道癌、黑色素瘤、子宮頸癌、膀胱癌、神經膠質母細胞瘤和頭與頸癌。
在實施態樣111中，實施態樣101至100中任一者之方法，其另外包含投予至少一種額外治療劑。
在實施態樣112中，實施態樣111之方法，其中額外治療劑為化療劑。
在實施態樣113中，實施態樣111之方法，其中額外治療劑為抗體。
在實施態樣114中，實施態樣111之方法，其中額外治療劑為抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗CTLA4抗體、抗LAG-3抗體、或抗TIM-3抗體。
在實施態樣115中，實施態樣111之方法，其中額外治療劑為免疫反應刺激劑。
在實施態樣116中，實施態樣115之方法，其中免疫反應刺激劑係選自由下列所組成之群組：GM-CSF、M-CSF、G-CSF、IL-2、IL-3、IL-12、IL-15、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、4-1BB配體、GITRL、OX-40配體、抗CD3抗體、抗CTLA4抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗GITR抗體、抗OX-40抗體、抗LAG-3抗體和抗TIM-3抗體。
在實施態樣117中，實施態樣111之方法，其中額外治療劑為Notch途徑、Wnt途徑或RSPO/LGR途徑之抑制劑。
在實施態樣118中，實施態樣101至103或 105至117中任一者之方法，其中個體為人類。
在實施態樣119中，實施態樣101至103或105至118中任一者之方法，其中個體具有腫瘤或移除之癌。
在實施態樣120中，實施態樣101至119中任一者之方法，其中腫瘤或癌表現PD-L1。
在實施態樣121中，實施態樣101至120中任一者之方法，其另外包含測定腫瘤或癌中的PD-L1表現量之步驟。
在實施態樣122中，實施態樣121之方法，其中測定PD-L1表現量係在治療或與抗體接觸之前進行。
在實施態樣123中，實施態樣121或實施態樣122之方法，其中若腫瘤或癌具有上升的PD-L1表現量，則將抗體、雙特異性劑或多肽：(a)投予個體；或(b)與腫瘤或腫瘤細胞接觸。
在實施態樣124中，寄存於ATCC且分配之指定編號為PTA-122180之質體。
在實施態樣125中，寄存於ATCC且分配之指定編號為PTA-122181之質體。
在實施態樣126中，特異性結合人類TIGIT的細胞外結構域之單離抗體，其包含：(a)包含TSDYAWN(SEQ ID NO：57)之重鏈CDR1、包含YISYSGSTSYNPSLRS(SEQ ID NO：58)之重鏈CDR2及包含ARRQVGLGFAY(SEQ ID NO：59)之重鏈CDR3；及/ 或(b)包含KASQDVSTAVA(SEQ ID NO：60)之輕鏈CDR1、包含SASYRYT(SEQ ID NO：61)之輕鏈CDR2及包含QQHYSTP(SEQ ID NO：62)之輕鏈CDR3。
在實施態樣127中，特異性結合人類TIGIT之單離抗體，其包含：(a)與SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：67具有至少90%之序列一致性的重鏈可變區；及/或(b)與SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：68具有至少90%之序列一致性的輕鏈可變區。
在實施態樣128中，實施態樣126或實施態樣127之抗體，其包含：(a)與SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：67具有至少95%之序列一致性的重鏈可變區；及/或(b)與SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：68具有至少95%之序列一致性的輕鏈可變區。
在實施態樣129中，實施態樣128之抗體，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：63且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：64。
在實施態樣130中，實施態樣128之抗體，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：67且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：68。
在實施態樣131中，實施態樣126至130中任一者之抗體，其為單克隆抗體。
在實施態樣132中，實施態樣126至128、130或131中任一者之抗體，其為人源化抗體。
在實施態樣133中，實施態樣126之抗體， 其為人類抗體。
在實施態樣134中，實施態樣126至133中任一者之抗體，其為重組抗體或嵌合抗體。
在實施態樣135中，實施態樣126至134中任一者之抗體，其為雙特異性抗體。
在實施態樣136中，實施態樣126至135中任一者之抗體，其為包含抗原結合部位之抗體片段。
在實施態樣137中，實施態樣126至136中任一者之抗體，其為IgG抗體。
在實施態樣138中，實施態樣137之抗體，其為IgG1抗體、IgG2抗體或IgG4抗體。
在實施態樣139中，抗體包含SEQ ID NO：70之重鏈胺基酸序列和SEQ ID NO：72之輕鏈胺基酸序列。
在實施態樣140中，抗體包含與抗體313M32相同的重鏈可變區和輕鏈可變區胺基酸序列。
在實施態樣141中，抗體包含由寄存於ATCC編號為PTA-122346之質體編碼的重鏈可變區。
在實施態樣143中，抗體包含由寄存於ATCC編號為PTA-122347之質體編碼的輕鏈可變區。
在實施態樣143中，抗體包含由寄存於ATCC編號為PTA-122347之質體編碼的輕鏈。
在實施態樣144中，抗體包含由寄存於ATCC編號為PTA-122346之質體編碼的重鏈可變區和由寄存於 ATCC編號為PTA-122347之質體編碼的輕鏈可變區。
在實施態樣145中，抗體包含由寄存於ATCC編號為PTA-122346之質體編碼的重鏈可變區和由寄存於ATCC編號為PTA-122347之質體編碼的輕鏈。
在實施態樣146中，實施態樣126至145中任一者之抗體，其不結合：(a)小鼠TIGIT；(b)大鼠TIGIT；(c)食蟹獼猴TIGIT；及/或(d)恆河猴TIGIT。
在實施態樣147中，單離抗體與實施態樣126至146中任一者之抗體競爭與TIGIT特異性結合。
在實施態樣148中，單離抗體與實施態樣126至146中任一者之抗體結合TIGIT之相同的抗原決定區。
在實施態樣149中，單離抗體結合TIGIT的抗原決定區，該抗原決定區與實施態樣126至146中任一者之抗體結合之TIGIT的抗原決定區重疊。
在實施態樣150中，特異性結合人類TIGIT之單離抗體，其中抗體結合抗原決定區，該抗原決定區包含：(a)在SEQ ID NO：79內之胺基酸；(b)在SEQ ID NO：80內之胺基酸；(c)在SEQ ID NO：79及SEQ ID NO：80內之胺基酸；(d)SEQ ID NO：4之胺基酸Q62和I109；(e)SEQ ID NO：4之胺基酸Q62和T119；(f)SEQ ID NO：4之胺基酸Q64和I109；(g)SEQ ID NO：4之胺基酸Q64和T119；(h)SEQ ID NO：4之胺基酸Q62、Q64和I109；(i)SEQ ID NO：4之胺基酸Q62、Q64和T119；(j)SEQ ID NO：4之胺基酸Q62、I109和T119； (k)SEQ ID NO：4之胺基酸Q64、I109和T119；或(l)SEQ ID NO：4之胺基酸Q62、Q64、I109和T119。
在實施態樣151中，實施態樣150之抗體，其中抗體結合包含在SEQ ID NO：79及SEQ ID NO：80內之胺基酸的抗原決定區。
在實施態樣152中，實施態樣150之抗體，其中抗體結合抗原決定區，該抗原決定區包含下列中之至少一者：SEQ ID NO：4的胺基酸N58、E60、Q62、Q64、L65、F107、I109、H111、T117、T119和G120。
在實施態樣153中，實施態樣150至152中任一者之抗體，其中抗原決定區為構形抗原決定區。
在實施態樣154中，實施態樣126至153中任一者之抗體，其抑制TIGIT與脊髓灰白質病毒受體(PVR)結合。
在實施態樣155中，實施態樣126至153中任一者之抗體，其抑制或阻斷TIGIT與PVR之間的交互作用。
在實施態樣156中，實施態樣126至153中任一者之抗體，其抑制TIGIT傳訊。
在實施態樣157中，實施態樣126至153中任一者之抗體，其為經TIGIT媒介之傳訊的拮抗劑。
在實施態樣158中，實施態樣126至153中任一者之抗體，其抑制TIGIT活化。
在實施態樣159中，實施態樣126至153中 任一者之抗體，其抑制TIGIT之磷酸化。
在實施態樣160中，實施態樣126至153中任一者之抗體，其降低TIGIT之細胞表面表現。
在實施態樣161中，實施態樣126至153中任一者之抗體，其誘發及/或增強免疫反應。
在實施態樣162中，實施態樣161之抗體，其中免疫反應係針對腫瘤或腫瘤細胞。
在實施態樣163中，實施態樣126至153中任一者之抗體，其增加細胞媒介之免疫力。
在實施態樣164中，實施態樣126至153中任一者之抗體，其增加T細胞活性。
在實施態樣165中，實施態樣126至153中任一者之抗體，其增加溶胞性T細胞(CTL)活性。
在實施態樣166中，實施態樣126至153中任一者之抗體，其增加自然殺手(NK)細胞活性。
在實施態樣167中，實施態樣126至153中任一者之抗體，其增加IL-2生產及/或IL-2生產細胞的數目。
在實施態樣168中，實施態樣126至153中任一者之抗體，其增加IFN-γ生產及/或IFN-γ生產細胞的數目。
在實施態樣169中，實施態樣126至153中任一者之抗體，其增強Th1型免疫反應。
在實施態樣170中，實施態樣126至153中 任一者之抗體，其降低IL-4生產及/或IL-4生產細胞的數目。
在實施態樣171中，實施態樣126至153中任一者之抗體，其降低IL-10生產及/或IL-10-生產細胞的數目。
在實施態樣172中，實施態樣126至153中任一者之抗體，其降低Th2型免疫反應。
在實施態樣173中，實施態樣126至153中任一者之抗體，其抑制及/或降低調節性T細胞(Treg)之抑制活性。
在實施態樣174中，實施態樣126至153中任一者之抗體，其抑制及/或降低骨髓衍生性抑制細胞(MDSC)之抑制活性。
在實施態樣175中，實施態樣126至153中任一者之抗體，其抑制腫瘤生長。
在實施態樣176中，異質二聚體劑包含實施態樣126至146中任一者之抗體。
在實施態樣177中，雙特異性劑包含：a)特異性結合TIGIT之第一臂，及b)第二臂，其中第一臂包含實施態樣126至146中任一者之抗體。
在實施態樣178中，實施態樣177之雙特異性劑，其中第二臂包含來自抗體的抗原結合部位。
在實施態樣179中，實施態樣177之雙特異性劑，其中第二臂特異性結合PD-1、PD-L1、CTLA-4、 TIM-3、LAG-3、OX-40或GITR。
在實施態樣180中，實施態樣177之雙特異性劑，其中第二臂特異性結合腫瘤抗原。
在實施態樣181中，實施態樣177之雙特異性劑，其中第二臂包含免疫治療劑。
在實施態樣182中，實施態樣181之雙特異性劑，其中免疫治療劑係選自由下列所組成之群組：顆粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、顆粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、介白素2(IL-2)、介白素3(IL-3)、介白素12(IL-12)、介白素15(IL-15)、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、4-1BB配體、GITRL、OX-40L、抗CD3抗體、抗CTLA4抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗GITR抗體、抗OX-40抗體、抗4-1BB抗體、抗LAG-3抗體和抗TIM-3抗體。
在實施態樣183中，實施態樣177至182中任一者之雙特異性劑，其中第一臂包含第一CH3結構域及第二臂包含第二CH3結構域，各CH3結構域經修飾以促進異質二聚體的形成。
在實施態樣184中，實施態樣183之雙特異性劑，其中第一及第二CH3結構域係建基於靜電效應而修飾。
在實施態樣185中，實施態樣177至182中任一者之雙特異性劑，其中第一臂包含在對應於SEQ ID NO：41之位置253和292上具有胺基酸取代之第一人類 IgG1恆定區，其中胺基酸係經麩胺酸或天冬胺酸取代，及第二臂包含在對應於SEQ ID NO：41之位置240和282上具有胺基酸取代之第二人類IgG1恆定區，其中胺基酸係經離胺酸取代。
在實施態樣186中，實施態樣177至182中任一者之雙特異性劑，其中第一臂包含在對應於SEQ ID NO：41之位置240和282上具有胺基酸取代之第一人類IgG1恆定區，其中胺基酸係經離胺酸取代，及第二臂包含在對應於SEQ ID NO：41之位置253和292上具有胺基酸取代之第二人類IgG1恆定區，其中胺基酸係經麩胺酸或天冬胺酸取代。
在實施態樣187中，實施態樣183之雙特異性劑，其中第一及第二CH3結構域係使用孔中突點技術修飾。
在實施態樣188中，實施態樣177至187中任一者之雙特異性劑，其抑制TIGIT與PVR結合。
在實施態樣189中，實施態樣177至187中任一者之雙特異性劑，其抑制或阻斷TIGIT與PVR之間的交互作用。
在實施態樣190中，實施態樣177至187中任一者之雙特異性劑，其抑制TIGIT傳訊。
在實施態樣191中，實施態樣177至187中任一者之雙特異性劑，其為經TIGIT媒介之傳訊的拮抗劑。
在實施態樣192中，實施態樣177至187中任一者之雙特異性劑，其抑制TIGIT活化。
在實施態樣193中，實施態樣177至187中任一者之雙特異性劑，其抑制TIGIT之磷酸化。
在實施態樣194中，實施態樣177至187中任一者之雙特異性劑，其降低TIGIT之細胞表面表現。
在實施態樣195中，實施態樣177至187中任一者之雙特異性劑，其誘發及/或增強免疫反應。
在實施態樣196中，實施態樣195之雙特異性劑，其中免疫反應係針對腫瘤或腫瘤細胞。
在實施態樣197中，實施態樣177至187中任一者之雙特異性劑，其增加細胞媒介之免疫力。
在實施態樣198中，實施態樣177至187中任一者之雙特異性劑，其增加T細胞活性。
在實施態樣199中，實施態樣177至187中任一者之雙特異性劑，其增加CTL活性。
在實施態樣200中，實施態樣177至187中任一者之雙特異性劑，其增加NK細胞活性。
在實施態樣201中，實施態樣177至187中任一者之雙特異性劑，其增加IL-2生產及/或IL-2生產細胞的數目。
在實施態樣202中，實施態樣177至187中任一者之雙特異性劑，其增加IFN-γ生產及/或IFN-γ生產細胞的數目。
在實施態樣203中，實施態樣177至187中任一者之雙特異性劑，其增強Th1型免疫反應。
在實施態樣204中，實施態樣177至187中任一者之雙特異性劑，其降低IL-4生產及/或IL-4生產細胞的數目。
在實施態樣205中，實施態樣177至187中任一者之雙特異性劑，其降低IL-10生產及/或IL-10-生產細胞的數目。
在實施態樣206中，實施態樣177至187中任一者之雙特異性劑，其降低Th2型免疫反應。
在實施態樣207中，實施態樣177至187中任一者之雙特異性劑，其抑制及/或降低Treg之抑制活性。
在實施態樣208中，實施態樣177至187中任一者之雙特異性劑，其抑制及/或降低MDSC之抑制活性。
在實施態樣209中，實施態樣177至208中任一者之雙特異性劑，其抑制腫瘤生長。
在實施態樣210中，多肽包含選自由下列所組成之群組的序列：SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：82。
在實施態樣211中，細胞包含或生產實施態 樣126至210中任一者之抗體、雙特異性劑或多肽。
在實施態樣212中，組成物包含實施態樣126至210中任一者之抗體、雙特異性劑或多肽。
在實施態樣213中，醫藥組成物包含實施態樣126至210中任一者之抗體、雙特異性劑或多肽及醫藥上可接受的載劑。
在實施態樣214中，單離多核苷酸分子包含編碼實施態樣126至210中任一者之抗體、雙特異性劑或多肽之多核苷酸。
在實施態樣215中，單離多核苷酸包含選自由下列所組成之群組的多核苷酸序列：SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：76。
在實施態樣216中，載體包含實施態樣214或實施態樣215之多核苷酸。
在實施態樣217中，單離細胞包含實施態樣214或實施態樣215之多核苷酸。
在實施態樣218中，單離細胞包含實施態樣216之載體。
在實施態樣219中，誘發、活化、促進、增強、提高或延長個體的免疫反應之方法，其包含投予治療有效量的實施態樣126至210中任一者之抗體、雙特異性劑或多肽。
在實施態樣220中，誘發、活化、促進、增 強、提高或延長個體的免疫反應之方法，其包含投予治療有效量的實施態樣126至153中任一者之抗體。
在實施態樣221中，實施態樣219或實施態樣220之方法，其中免疫反應係對抗腫瘤或癌症。
在實施態樣222中，抑制腫瘤細胞生長之方法，其中該方法包含將腫瘤細胞與有效量的實施態樣126至210中任一者之抗體、雙特異性劑或多肽接觸。
在實施態樣223中，抑制個體的腫瘤生長之方法，其中該方法包含對個體投予治療有效量的實施態樣126至210中任一者之抗體、雙特異性劑或多肽。
在實施態樣224中，抑制個體的腫瘤生長之方法，其中該方法包含對個體投予治療有效量的實施態樣126至153中任一者之抗體。
在實施態樣225中，實施態樣221至224中任一者之方法，其中腫瘤或腫瘤細胞係選自由下列所組成之群組：結腸直腸腫瘤、卵巢腫瘤、胰腫瘤、肺腫瘤、肝腫瘤、乳房腫瘤、腎腫瘤、前列腺腫瘤、胃腸道腫瘤、黑色素瘤、子宮頸腫瘤、膀胱腫瘤、神經膠質母細胞瘤和頭與頸腫瘤。
在實施態樣226中，治療個體的癌症之方法，其中該方法包含對個體投予治療有效量的實施態樣126至210中任一者之抗體、雙特異性劑或多肽。
在實施態樣227中，治療個體的癌症之方法，其中該方法包含對個體投予治療有效量的實施態樣 126至153中任一者之抗體。
在實施態樣228中，實施態樣226或實施態樣227之方法，其中癌症係選自由下列所組成之群組：結腸直腸癌、卵巢癌、胰臟癌、肺癌、肝癌、乳癌、腎臟癌、前列腺癌、胃腸道癌、黑色素瘤、子宮頸癌、膀胱癌、神經膠質母細胞瘤和頭與頸癌。
在實施態樣229中，實施態樣219至228中任一者之方法，其另外包含投予至少一種額外治療劑。
在實施態樣230中，實施態樣229之方法，其中額外治療劑為化療劑。
在實施態樣231中，實施態樣229之方法，其中額外治療劑為抗體。
在實施態樣232中，實施態樣229之方法，其中額外治療劑為免疫治療劑。
在實施態樣233中，實施態樣232之方法，其中免疫治療劑係選自由下列所組成之群組：GM-CSF、M-CSF、G-CSF、IL-2、IL-3、IL-12、IL-15、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、4-1BB配體、GITRL、OX-40配體、抗CD3抗體、抗CTLA-4抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗GITR抗體、抗OX-40抗體、抗4-1BB抗體、抗LAG-3抗體和抗TIM-3抗體。
在實施態樣234中，實施態樣229之方法，其中額外治療劑為Notch途徑、Wnt途徑或RSPO/LGR途徑之抑制劑。
在實施態樣235中，實施態樣219至221或223至234中任一者之方法，其中個體已患有移除之腫瘤或癌。
在實施態樣236中，實施態樣221至235中任一者之方法，其中腫瘤或癌症表現PD-L1。
在實施態樣237中，實施態樣221至236中任一者之方法，其另外包含測定腫瘤或癌中的PD-L1表現量之步驟。
在實施態樣238中，實施態樣237之方法，其中測定PD-L1表現量係在以抗體治療或接觸之前進行。
在實施態樣239中，實施態樣236或實施態樣237之方法，其中若腫瘤或癌具有上升的PD-L1表現量，將抗體、雙特異性劑或多肽：(a)投予個體；或(b)與腫瘤或腫瘤細胞接觸。
在實施態樣240中，質體係寄存於ATCC且編號為PTA-122346。
在實施態樣241中，質體係寄存於ATCC且編號為PTA-122347。
VI. 篩選
本發明提供鑑別調節免疫反應的TIGIT結合劑之篩選方法。在一些實施態樣中，本發明提供篩選調節免疫反應的候選劑之方法，該劑包括但不限於多肽、抗體、肽、擬肽、小分子、化合物或其他藥物。
在一些實施態樣中，篩選用於調節免疫反應的候選TIGIT結合劑之方法包含測定該劑對免疫細胞是否有影響。在一些實施態樣中，篩選用於調節免疫反應的候選TIGIT結合劑之方法包含測定該劑是否能夠增加免疫細胞活性。在一些實施態樣中，篩選用於調節免疫反應的候選TIGIT結合劑之方法包含測定該劑是否能夠增加溶胞性細胞(諸如CTL及/或NK細胞)之活性。在一些實施態樣中，篩選用於調節免疫反應的候選TIGIT結合劑之方法包含測定該劑是否能夠降低免疫抑制因子細胞(諸如Treg或MDSC)之活性。
VII. 包含本文所述之劑的套組
本發明提供包含本文所述之TIGIT結合劑的套組，其可用於進行本文所述之方法。在特定的實施態樣中，套組包含至少一種經純化之TIGIT結合劑於一或多個容器中。在一些實施態樣中，套組含有所有必要及/或足以進行檢測檢定法的組份，包括所有的對照物、進行檢定的用法說明及用於分析和呈現結果之任何必要的軟體。熟習本技術領域者可輕易地辨識本發明所揭示之TIGIT結合劑可輕易地併入本技術中熟知的經確立之套組型式之一者中。
另外提供包含TIGIT結合劑以及至少一種額外治療劑之套組。在特定的實施態樣中，第二(或更多)治療劑為化療劑。在特定的實施態樣中，第二(或更多)治療 劑為抗體。
本發明的實施態樣可參考下列的非限制性實施例而進一步定義，其詳細說明本發明的特定抗體之製備及使用本發明的抗體之方法。那些熟習本技術領域者將明白可對材料及方法二者實施許多修改而不脫離本發明的範圍。
實施例
實施例1
產生抗TIGIT抗體
抗TIGIT抗體係使用小鼠TIGIT的細胞外結構域而產生，使兔子免疫。以流動式細胞測量術篩選用於抗體與小鼠TIGIT及人類TIGIT結合之上清液，且選擇用於進一步特徵化的9種抗體克隆(圖1)。篩選來自該等抗體之上清液特異性阻斷小鼠TIGIT與其相反受體小鼠PVR之交互作用的彼之能力。四種抗體顯示出阻斷TIGIT/PVR交互作用。重要的是該等抗體中之二者能夠結合人類TIGIT(313Rb1和313Rb2)。
將313Rb1之重鏈和輕鏈可變區選殖至小鼠IgG1型式中以產生嵌合抗體313R11及至小鼠IgG2a型式中以產生嵌合抗體313R12。313R11和313R12之CDR序列為(i)重鏈CDR1 GSSLSSSYMS(SEQ ID NO：7)，(ii)重鏈CDR2 IIGSNGNTYYANWAKG(SEQ ID NO：8)，(iii)重鏈CDR3 GGYRTSGMDP(SEQ ID NO：9)，(iv)輕鏈CDR1 QASQSISSYLNW(SEQ ID NO：10),(v)輕鏈CDR2 DALKLAS(SEQ ID NO：11)，及(vi)輕鏈CDR3 QQEHSVGNVDN(SEQ ID NO：12)。313R11和313R12之重鏈可變區序列為SEQ ID NO：17及313R11和313R12之輕鏈可變區序列為SEQ ID NO：18。313R11之重鏈序列為SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：26(沒有信號序列)。313R12之重鏈序列為SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：27(沒有信號序列)。313R11和313R12之輕鏈序列為SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：28(沒有信號序列)。
將313Rb2之重鏈和輕鏈可變區選殖至人類IgG1型式中以產生抗體313R14。CDR經修飾以增加對人類TIGIT之親和性且使架構區最優化及/或人源化以產生數種變體，包括313R19。313R14和313R19之CDR序列為(i)重鏈CDR1 GFSLSSSYMS(SEQ ID NO：13)，(ii)重鏈CDR2 IIGSNGNTYYANWAKG(SEQ ID NO：8)，(iii)重鏈CDR3 GGYRTSGMDP(SEQ ID NO：9)，(iv)輕鏈CDR1 QASQSNIYSDLAW(SEQ ID NO：14)，(v)輕鏈CDR2 RASTLAS(SEQ ID NO：15)，及(vi)輕鏈CDR3 QQEHLVAWIYN(SEQ ID NO：16)。313R14之重鏈可變區序列為SEQ ID NO：19及313R14之輕鏈可變區序列為SEQ ID NO：20。313R19之重鏈可變區序列為SEQ ID NO：32及313R19之輕鏈可變區序列為SEQ ID NO：20。313R14之重鏈序列為SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：29(沒有信號序列)。313R19之重鏈序列為SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：34(沒有信號序列)。313R14和313R19之輕鏈序列為SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：30(沒有信號序列)。
編碼包含313R19抗體之重鏈可變區的多肽之質體係在2015年5月27日依照布達佩斯條約之條款寄存於美國菌種保存中心(ATCC)，10801 University Boulevard,Manassas,VA,USA且以PTA-122180編號。編碼包含313R19抗體之輕鏈可變區的多肽之質體係在2015年5月27日依照布達佩斯條約之條款寄存於ATCC，10801 University Boulevard,Manassas,VA,USA且以PTA-122181編號。
實施例2
TIGIT傳訊及TIGIT磷酸化
如本文所述，TIGIT係在與其相反受體PVR交互作用之後在其胞質尾區磷酸化。TIGIT之磷酸化為級聯的開始，該級聯包括影響其他已知的傳訊途徑之下游事件。因此，評估TIGIT磷酸化以及下游蛋白質之磷酸化狀態可給出關於TIGIT功能及TIGIT拮抗劑效應之訊息。
Jurkat CD4+人類T細胞系缺乏人類或鼠類TIGIT表現，如以即時PCR及FACS所測定(未顯示數據)。為了產生TIGIT表現之細胞系，將Jurkat細胞以表現以FLAG及綠螢光蛋白(GFP)標籤化之鼠類TIGIT(mTIGIT)的慢病毒建構體感染。E.G7-OVA鼠類淋巴瘤細 胞系缺乏人類或鼠類PVR之表現，如以即時PCR及/或FACS所測定。E.G7-OVA細胞組成性地合成且分泌卵白蛋白(OVA)且以E.G7-OVA細胞免疫之C57BL/6小鼠引起對OVA 258-276肽具有特異性的經H-2 Kb限制之細胞毒性淋巴細胞。為了產生PVR表現之細胞系，將E.G7-OVA細胞以表現鼠類PVR(mPVR)及GFP的慢病毒建構體感染。將來自各感染之細胞系的GFP-陽性細胞使用FACSAria II儀器(BD Biosciences)分類至96槽孔盤中且將分離之單細胞擴展成克隆。在源自單細胞的克隆中的GFP陽性及mTIGIT或mPVR表現係以FACS分析及即時PCR確認(未顯示數據)。
為了評估反應PVR之TIGIT磷酸化，將細胞系在37℃下於無血清培養基中培育2小時。將Jurkat-mTIGIT細胞與親代E.G7-OVA細胞或E.G7-OVA-mPVR細胞以5：1之細胞比混合且在37℃下於酪胺酸磷酸酶抑制劑(10mM釩酸鈉，New England Biolabs)的存在下培育5分鐘。製備細胞溶解物且以捕獲經FLAG-標籤化之mTIGIT蛋白質的經抗FLAG-包覆之磁珠免疫沉澱。將免疫沉澱物以西方墨點分析評估。使用抗磷酸酪胺酸抗體(Cell Signaling Technology)評估存在的磷酸化TIGIT。使用抗FLAG抗體(Cell Signaling Technology)評估存在的總TIGIT。
與未表現PVR之細胞相比，觀察出TIGIT在反應mPVR表現之腫瘤細胞的T細胞中高度磷酸化(圖 2A)。
為了評估可能受TIGIT影響的其他傳訊途徑，將細胞系在37℃下於無血清培養基中培育2小時。將Jurkat-mTIGIT細胞與親代E.G7-OVA細胞或E.G7-OVA-mPVR細胞以5：1之細胞比混合且在37℃下培育0、5、15、45或60分鐘。製備細胞溶解物且以西方墨點分析評估。磷酸化SHP1(含SH2之酪胺酸磷酸酶1)及Erk1/2之含量分別使用抗磷酸SHP1(Tyr564)抗體及抗磷酸Erk1/2(Thr202/Tyr204)抗體(二者皆來自Cell Signaling Technology)測定。總Erk1/2含量係使用抗Erk1/2抗體(Cell Signaling Technology)測定。SHP1為經細胞激素媒介之信號轉導途徑(包括JAK/STAT途徑)之重要的負調節劑，而Erk1/2為參與Ras-Raf-MEK-ERK信號轉導級聯之蛋白激酶。
如圖2B中所示，當TIGIT表現之T細胞與mPVR表現之腫瘤細胞培育時，則SHP1及Erk1/2經特異性活化。如以磷酸化指示之活化係在早至5分鐘時間點觀察到且以45分鐘出現開始降低的Erk1/2及以60分鐘出現開始降低的SHP1。SHP1及Erk1/2在未表現mTIGIT之親代Jurkat T細胞中對mPVR沒有活化反應(未顯示數據)。
為了研究TIGIT拮抗劑是否會抑制TIGIT活性，在抗TIGIT抗體的存在下進行TIGIT磷酸化檢定。如上文所述，將Jurkat-mTIGIT細胞與親代E.G7-OVA細胞 或E.G7-OVA-mPVR細胞以5：1之細胞比混合且在37℃下於10mM釩酸鈉及20微克/毫升之對照抗體(多克隆鼠類IgG；Sigma)、抗TIGIT抗體313R11、抗TIGIT抗體313R12或抗TIGIT抗體313Rb1的存在下培育5分鐘。製備細胞溶解物且以捕獲經FLAG-標籤化之mTIGIT蛋白質的經抗FLAG-包覆之磁珠免疫沉澱。將免疫沉澱物以西方墨點分析評估。使用抗磷酸酪胺酸抗體(Cell Signaling Technology)評估存在的磷酸化TIGIT。使用抗FLAG抗體(Cell Signaling Technology)評估存在的總TIGIT。
如先前所示，當mTIGIT表現之Jurkat T細胞與mPVR表現之腫瘤細胞組合時，則mTIGIT高度磷酸化。當細胞在抗TIGIT抗體的存在下培育時，則反應與mPVR交互作用的mTIGIT磷酸化降低及/或廢除。TIGIT磷酸化的降低係以抗TIGIT抗體313R12最顯著(圖3)。
進行研究TIGIT拮抗劑是否會抑制TIGIT傳訊的額外實驗。類似於上文所述之研究，將Jurkat-mTIGIT細胞與親代E.G7-OVA細胞或E.G7-OVA-mPVR細胞以5：1之細胞比混合且在37℃下於濃度增加的(0-40微克/毫升)抗TIGIT抗體313R11、抗TIGIT抗體313R12或抗TIGIT抗體313Rb1的存在下培育15分鐘。製備細胞溶解物且以西方墨點分析評估。磷酸化之SHP1(含有SH2之酪胺酸磷酸酶1)及磷酸化之Erk1/2分別使用抗磷酸SHP1(Tyr562)抗體及抗磷酸Erk1/2(Thr202/Tyr204)抗體測定。使用抗SHP1抗體評估總SHP1含量。使用抗 Erk1/2抗體評估總Erk1/2含量。
反應mTIGIT-mPVR交互作用之Erk1/2磷酸化明確地由抗TIGIT抗體以劑量依賴方式抑制(圖4)。反應mTIGIT-mPVR交互作用之SHP1磷酸化係由抗TIGIT抗體313Rb1及313#11以劑量依賴方式抑制。在所顯示的研究中，抗體313R12似乎對SHP1磷酸化僅具有弱的反應。
該等結果強力示意抗TIGIT抗體抑制TIGIT功能且影響下游傳訊途徑。
實施例3
TIGIT抑制細胞激素生產
T細胞融合瘤B3Z86/90.14(B3Z)穩定地表現OVA-特異性H-2Kb T細胞受體(TCR)。將B3Z細胞以表現鼠類TIGIT(mTIGIT)之慢病毒建構體感染且產生源自單細胞之mTIGIT克隆(B3Z-mTIGIT)。E.G7-OVA鼠類淋巴瘤細胞系穩定地表現OVA且可活化對B3Z細胞之OVA-特異性TCR，導致IL-2分泌。為了測定mTIGIT/mPVR交互作用對抗原特異性IL-2分泌的效應，將親代B3Z細胞或B3Z-mTIGIT細胞與親代E.G7-OVA或E.G7-OVA-mPVR細胞(上文所述，參見實施例2)以2：1之比在12槽孔盤中培育。在24小時之後，以ELISA(R&D Systems)測量在無細胞培養物上清液中的IL-2濃度。數據係以反應mPVR表現之腫瘤細胞的親代B3Z或B3Z-mTIGIT T細胞之IL-2 分泌與比較反應mPVR陰性腫瘤細胞之IL-2分泌的比來表示。
親代B3Z T細胞有類似的IL-2分泌，無關於mPVR對OVA呈現之腫瘤細胞的表現(亦即約1.0之比)。相反地，來自B3Z-mTIGIT T細胞的IL-2分泌在mPVR表現之腫瘤細胞的存在下比在mPVR陰性腫瘤細胞的存在下更低(亦即<1.0之比)(圖5A)。當B3Z-mTIGIT T細胞在與E.G7-OVA細胞共培育之前以20微克/毫升之抗TIGIT抗體313R11或313R12預處理時，則不再抑制IL-2生產(圖5B)。
該等結果示意以mPVR活化mTIGIT會抑制反應抗原的T細胞活化，如以降低的IL-2生產所證實。此外，以TIGIT拮抗劑阻斷TIGIT會抑制TIGIT活化且出現降低與TIGIT相關聯的T細胞活性抑制，如所觀察到大量生產的IL-2。該等數據支持抑制TIGIT可〝釋放對T細胞抑制的約束〞及增強免疫反應的理論。
實施例4
TIGIT抑制NK細胞之細胞毒性
將NK-92人類自然殺手(NK)細胞系以表現經FLAG及GFP標籤化之mTIGIT的慢病毒建構體感染且衍生出選殖之細胞系(NK-92-mTIGIT)，如上文所述。將721.221人類B-細胞系以表現mPVR及GFP的慢病毒建構體感染且產生選殖之細胞系(721.221-mPVR)。以FACS及 即時PCR確認親代721.221細胞缺乏人類或鼠類PVR表現(未顯示數據)。親代NK-92細胞或NK-92-mTIGIT細胞溶解親代721.221或721.221-mPVR腫瘤細胞之能力係在標準的4小時鈣黃綠素釋放檢定法中測試。將NK-92或NK-92-mTIGIT細胞平鋪於96槽孔V形底盤中。將標靶721.221或721.221-mPVR細胞在37℃下以10μM鈣黃綠素AM(Life Technologies)經1小時標記且接著與NK-92細胞以25：1或12：1的效應子：標靶之比組合。在37℃下培育4小時之後，收獲無細胞上清液且在螢光計上以485奈米激發及535奈米放射下定量鈣黃綠素釋放。在隨後的實驗中，將NK-92細胞及NK-92-mTIGIT在20微克/毫升之抗TIGIT抗體313R11、抗體313R12或對照抗體的存在下培育X分鐘。接著將細胞用於鈣黃綠素釋放檢定法中，如上文所述。
特異性細胞溶解百分比係如下測定：溶解%=100 x(ER-SR)/(MR-SR)，其中ER、SR及MR分別代表實驗、自發性及最大鈣黃綠素釋放。自發性釋放為在培養基中單獨培育的標靶細胞發射之螢光(亦即在沒有效應子細胞的存在下)，而最大釋放係藉由以等體積的10% SDS溶解標靶細胞來測定。數據係以NK-92細胞(親代或NK-92-mTIGIT)對抗721.221-mPVR標靶細胞之細胞毒性相對NK-92細胞(親代或NK-92-mTIGIT)對抗親代(mPVR陰性)721.221標靶細胞之細胞毒性的比呈示。
如圖6A中所示，親代NK-92細胞具有類似 的對抗mPVR陽性及mPVR陰性721.221標靶細胞之細胞毒性(亦即約1.0之比)。相反地，與對抗mPVR陰性親代721.221細胞系之細胞毒性相比，NK-92-mTIGIT細胞對抗721.221-mPVR細胞之細胞毒性降低(亦即<1.0之比)。當效應子：標靶之比為25：1或12：1時，結果沒有差別。當NK-92或NK-92-mTIGIT細胞在用於細胞毒性檢定法之前以抗TIGIT抗體313R11或抗體313R12處理時，則降低及/或廢除經細胞媒介之細胞毒性的抑制作用(圖6B)。
該等結果示意以mPVR活化mTIGIT會抑制經細胞媒介之細胞毒性。重要的是結果證明TIGIT拮抗劑可干擾PVR-TIGIT交互作用且造成NK細胞修復或〝釋放對NK細胞之細胞毒性能力的約束〞。
實施例5
以抗TIGIT抗體抑制活體內腫瘤生長
鼠類結腸腫瘤系CT26.WT係經皮下植入(30,000個細胞/小鼠)6-8週齡Balb/c小鼠的後脅腹中。容許腫瘤生長10天，直到其達到約50立方毫米體積為止。將小鼠以0.25毫克/小鼠之抗TIGIT抗體313R11(mIgG1抗體)、抗TIGIT抗體313R12(mIgG2a抗體)、mIgG1對照抗體或mIgG2a對照抗體治療(每組對照抗體的n=10及每組試驗抗體的n=20)。將小鼠以每週兩次經腹膜內注射給藥三週。監測腫瘤生長且在第10、15、18、22、25和29天以電子式卡尺測量腫瘤體積。
如圖7A中所示，與同型匹配之對照抗體相比，抗TIGIT抗體313R12抑制幾乎75%之腫瘤生長。9隻小鼠中的腫瘤以第29天消退至不可檢測的程度。與同型匹配之對照抗體相比，抗TIGIT抗體313R11僅抑制約15%之腫瘤生長。抗體313R11及313R12之差別僅為彼之IgG同型物，因為313R12為IgG2a抗體及313R11為IgG1抗體。該等結果示意抗體同型物對抗TIGIT抗體之治療效能可具有顯著的效應。與小鼠IgG1抗體(等同於人類IgG2)相比，已知小鼠IgG2抗體(等同於人類IgG1抗體)具有增加的ADCC活性，且這生物特徵可在抗體313R12之強力抗腫瘤效應中扮演一角色。
以抗TIGIT抗體313R12及對照mIgG2a抗體重複實驗。如上文所述，將CT26.WT細胞同時植入(30,000個細胞/小鼠)6-8週齡Balb/c小鼠的後脅腹中。容許腫瘤生長7天，直到其達到約55立方毫米體積為止。將小鼠以0.25毫克/小鼠之抗TIGIT抗體313R12或mIgG2a對照抗體治療(每組n=10)。將小鼠以每週兩次經腹膜內注射給藥三週。監測腫瘤生長且在第7、14、17、21、25、28和31天以電子式卡尺測量腫瘤體積。
如先前研究中所觀察，抗TIGIT抗體313R12抑制CT26.WT腫瘤生長，在所有10隻小鼠中皆察看到腫瘤生長抑制(圖7B)。此外，在以抗體313R12治療的10隻中有9隻小鼠的腫瘤自原來的腫瘤大小消退，在治療2週之後以8隻小鼠的腫瘤消退至不可檢測的程度。在這研 究中，在IgG2抗體對照組中有3隻小鼠的腫瘤消退，但是已知腫瘤消退可發生在未經治療之免疫活性小鼠中，尤其若具有少的腫瘤細胞初始數目。然而，以抗體313R12治療組中的完全生長抑制及/或腫瘤消退證明以抗TIGIT抗體治療具有顯著的治療效應且這可歸因於個體免疫反應的調節及/或增強。
成功的抗癌免疫治療包括產生長期抗腫瘤免疫性。為了研究是否已確立長期免疫性，將來自本文所述之研究的小鼠(其具有在以抗TIGIT抗體治療後消退至不可檢測程度的CT26.WT腫瘤)以新鮮CT26.WT腫瘤細胞挑戰。將腫瘤完全消退的11隻小鼠在第132天(在抗TIGIT抗體313R12的最後劑量之後102天)以增加的CT26.WT細胞數目(60,000個細胞/小鼠)注射。將10隻原生小鼠以相同的CT26.WT細胞數目之CT26.WT細胞注射，作為對照組。不治療小鼠，監測腫瘤生長且以電子式卡尺測量腫瘤體積。
在對照組中，全部10隻小鼠皆於第23天發展出腫瘤且予以安樂死。相反地，先前已排除CT26.WT腫瘤的小鼠中有10隻沒有長出腫瘤。剩餘的小鼠在注射後14天發展出小的腫瘤生長，但是腫瘤在第21天完全消退。該等小鼠接著再以150,000個CT26.WT細胞(5倍的初始量的細胞數目)挑戰第二次。將10隻原生小鼠以相同的CT26.WT細胞數目(150,000個細胞/小鼠)之CT26.WT細胞注射，再作為對照組。如之前的實驗，在對照組中的 全部10隻小鼠皆發展出腫瘤且在第22天予以安樂死。小鼠中有6隻沒有長出腫瘤及另外2隻小鼠發展出小的腫瘤生長，其在第22天完全消退。其他3隻小鼠有小的腫瘤，其似乎正在消退或穩定。該等結果總結於表3中且以各組中的無腫瘤小鼠之百分比呈示。
Figure 105116461-A0202-12-0219-3
該等結果指出以抗TIGIT抗體治療可產生強力且有效的抗腫瘤反應。重要的是抗腫瘤反應似乎導致長期免疫性及免於腫瘤細胞。
實施例6
抗TIGIT IgG2抗體之效應子活性
已顯示出IgG-Fc區之糖化作用為透過補體(亦即ADCC和CDC)之FcγRI、FcγII、FcγRIII和C1q組份媒介之生物活性最優化表現所必要的。例如，小鼠IgG2a抗體重鏈的糖化部位係在SEQ ID NO：22之天冬醯胺酸314上。以丙胺酸殘基取代天冬醯胺酸導致抗體去糖化且降低ADCC活性。產生抗TIGIT抗體313R12抗體之去糖化變體，其包含在位置314上的丙胺酸殘基且稱為313R13。
比較抗TIGIT抗體313R13與抗TIGIT抗體313R12之活性以研究去糖化對抗腫瘤活性的效應。將CT26.WT細胞植入(30,000個細胞/小鼠)6-8週齡Balb/c小鼠的後脅腹中。容許腫瘤生長10天，直到其達到約50立方毫米體積為止。將小鼠以0.25毫克/小鼠之抗TIGIT抗體313R12、抗TIGIT抗體313R13或mIgG2a對照抗體治療(每組對照抗體的n=10及每組試驗抗體的n=20)。將小鼠以每週兩次經腹膜內注射給藥三週。監測腫瘤生長且在第7、10、14、17和21天以電子式卡尺測量腫瘤體積。
如圖8中所示，與同型匹配之對照組相比，抗TIGIT抗體313R12顯示顯著的腫瘤生長抑制。相反地，去糖化之抗TIGIT抗體313R13未顯示顯著的抗腫瘤活性。
因為咸信去糖化抗體可具有受限或沒有ADCC活性，所以該等結果示意ADCC可在抗TIGIT抗體313R12之強力抗腫瘤效應中扮演顯著的角色。
實施例7
IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10之ELISpot檢定法
ELISpot為檢測細胞激素分泌細胞的高敏性免疫檢定法。簡言之，ELISpot檢定法係使用預包覆在微盤槽孔上之對所欲細胞激素具有特異性的捕獲抗體。將經刺激之細胞分散在槽孔中且使緊鄰任何細胞激素分泌細胞附 近的固定抗體結合經分泌之細胞激素。接著進行標準的清洗步驟及以適當的檢測試劑培育。例如，最常使用生物素化檢測抗體，接著使用與鹼性磷酸酶共軛之鏈親和素及有色的受質溶液之組合。有色的沉澱物係在細胞激素所在部位上形成且以點顯現，每一個別的點代表個別的細胞激素分泌細胞。可以自動化讀取系統或使用顯微鏡的手動方式計數點。在一些實施態樣中，使用自動化讀取系統捕獲每一槽孔的影像，且使用總點數、點面積或總光學密度(TOD)定量。
IFN-γ分泌細胞係使用小鼠IFN-γ ELISpot套組(MabTech)檢測。細胞係自以抗TIGIT抗體313R12(n=6)或同型匹配之對照抗體(n=6)治療之攜CT26.WT腫瘤的小鼠之脾分離而來(參見實施例5)。將來自各治療組的各小鼠之脾細胞(5×105個/槽孔)分配至以對小鼠IFN-γ具有特異性之抗體包覆之96槽孔盤中。將細胞在腫瘤特異性CD8+ T細胞肽AH-1的存在或不存在下培養且培育48小時。AH-1肽(SPSYVYHQF；SEQ ID NO：31)為內源於CT26.WT細胞系的鼠類白血病親嗜性原病毒之gp70套膜蛋白質的經H2-Ld-限制之抗原決定區。細胞分泌之IFN-γ係依照製造商指示檢測。使用Bioreader 6000-F-z儀器(BioSys)捕獲影像，且測定點數、點面積或總光學密度。結果係以總光學密度顯示且數據係以平均±S.E.M表示。
如圖9A中所示，與以對照抗體治療之小鼠相比，以抗TIGIT抗體313R12治療之小鼠中的IFN-γ分泌 細胞顯著地增加。重要的是IFN-γ分泌細胞僅在AH-1肽的存在下增加。該等結果指出抗TIGIT抗體313R12活化腫瘤特異性CD8+ T細胞。活化可為直接或間接，亦即抑制因子細胞之抑制作用。
IL-2分泌細胞係使用小鼠IL-2 ELISpot套組(MabTech)檢測。細胞係自以抗TIGIT抗體313R12(n=6)或同型匹配之對照抗體(n=6)治療之攜腫瘤的小鼠之脾分離而來。將來自各治療組的各小鼠之脾細胞(5×105個/槽孔)分配至以對小鼠IL-2具有特異性的抗體包覆之96槽孔盤中。將細胞培育48小時。細胞分泌之IL-2係依照製造商指示檢測。使用Bioreader 6000-F-z儀器(BioSys)捕獲影像，且測定點數、點面積或總光學密度。結果係以總光學密度顯示且數據係以平均±S.E.M表示。
如圖9B中所示，與以對照抗體治療之小鼠相比，在以抗TIGIT抗體313R12治療之小鼠中的IL-2分泌細胞略微降低。在AH-1肽存在或不存在下降低的IL-2分泌細胞量相等。
IL-4分泌細胞係使用小鼠IL-4 ELISPOT套組(MabTech)檢測。細胞係自以抗TIGIT抗體313R12(n=6)或同型匹配之對照抗體(n=6)治療之攜腫瘤的小鼠之脾分離而來。將來自各治療組的各小鼠之脾細胞(5×105個/槽孔)分配至以對小鼠IL-4具有特異性的抗體包覆之96槽孔盤中。將細胞培育48小時。細胞分泌之IL-4係依照製造商指示檢測。使用Bioreader 6000-F-z儀器(BioSys)捕獲 影像，且測定點數、點面積或總光學密度。結果係以總光學密度顯示且數據係以平均±S.E.M表示。
如圖9C中所示，與以對照抗體治療之小鼠相比，在以抗TIGIT抗體313R12治療之小鼠中的IL-4分泌細胞顯著地降低。
IL-10分泌細胞係使用小鼠IL-10 ELISPOT套組(MabTech)檢測。細胞係自以抗TIGIT抗體313R12(n=6)或同型匹配之對照抗體(n=6)治療之攜腫瘤的小鼠之脾分離而來。將來自各治療組的各小鼠之脾細胞(5×105個/槽孔)分配至以對小鼠IL-10具有特異性的抗體包覆之96槽孔盤中。將細胞培育48小時。細胞分泌之IL-10係依照製造商指示檢測。使用Bioreader 6000-F-z儀器(BioSys)捕獲影像，且測定點數、點面積或總光學密度。結果係以總光學密度顯示且數據係以平均±S.E.M表示。
如圖9D中所示，與以對照抗體治療之小鼠相比，在以抗TIGIT抗體313R12治療之小鼠中的IL-10分泌細胞顯著地降低。
IFN-γ通常係由NK細胞、Th1 CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、抗原呈現細胞和B-細胞產生。研究示意IFN-γ在腫瘤免疫性中的角色且其可為以其他的細胞激素(特別為IL-12和IL-2)媒介之抗腫瘤活性的調節劑。因此，以導致IFN-γ增加的抗TIGIT抗體治療應該增強抗腫瘤免疫性。
IL-4係由CD4+ Th2細胞生產且誘發原生 CD4+ T細胞分化成Th2細胞。另外，IL-4抑制Th1細胞產生、抑制Th1細胞激素(諸如TNF-α和IL-12)生產及抑制巨噬細胞活化。IL-10通常係由Treg和輔助T細胞生產。IL-10原來經辨識為Th2細胞激素，其調節先天免疫細胞生長及/或分化且抑制T細胞(特別為細胞毒性T細胞)之活化及效應子功能。最近，IL-10已顯示出具有一些免疫刺激效應及因此被視為具有多向性功能。在本發明的研究中，顯著降低來自以抗TIGIT抗體治療之小鼠的IL-4和IL-10-生產細胞示意靶定TIGIT可導致Th2反應抑制且可抑制Treg及/或Treg功能。
實施例8
細胞之細胞毒性檢定法
用於T細胞之細胞毒性檢定法的細胞係自上述攜CT26.WT腫瘤之小鼠的脾收獲(實施例5)。將細胞平鋪於96槽孔V形底盤中的以10%(v/v)胎牛血清(FBS)、2mM L-麩醯胺酸、100U/毫升之青黴素及100微克/毫升之鏈黴素(Gibco)補充之RPMI 1640培養基(Gibco/Life Technologies，Grand Island,NY)中。將CT26.WT標靶細胞在37℃下以10μM鈣黃綠素AM(Life Technologies)經1小時標記且接著與脾細胞以50：1的效應子：標靶(E：T)之比組合。在37℃下培育4小時之後，收獲無細胞上清液且在螢光計上以485奈米激發及535奈米放射下定量鈣黃綠素釋放。特異性細胞溶解百分比係如下測定：溶解%= 100 x(ER-SR)/(MR-SR)，其中ER、SR及MR分別代表實驗、自發性及最大鈣黃綠素釋放。自發性釋放為在培養基中單獨培育的標靶細胞發射之螢光(亦即在沒有效應子細胞的存在下)，而最大釋放係藉由以等體積的10% SDS溶解標靶細胞來測定。
如圖10中所示，與來自以對照抗體治療之小鼠的細胞相比，當小鼠以抗TIGIT抗體313R12治療時，證明來自攜CT26.WT腫瘤之小鼠的CD8+細胞毒性T細胞增加殺死CT26.WT標靶細胞的能力。
該等結果示意抗TIGIT抗體可增加抗原特異性細胞毒性T細胞活性及因此增強抗腫瘤免疫反應。這增加之細胞毒性T細胞活性可能由於抗TIGIT抗體之直接或間接效應，亦即抑制了抑制因子細胞效應。
實施例9
T調節性細胞(Treg)檢定法
T調節性細胞(Treg)在維持衡定及防止自體免疫反應中扮演必要的角色。Treg為T細胞的小子集，其大部分為CD4+細胞且表現CD25(IL-2受體α鏈)及其他的Treg細胞相關之分子標記。Foxp3(轉錄因子)經辨識為Treg細胞發展及功能因子。Foxp3被認為是界定且鑑別Treg細胞及分離Treg與其他的T細胞亞群之特異性標記。然而，已在人類細胞中挑戰Foxp3對Treg之特異性。除了CD4+ Treg細胞以外，CD8+ Treg細胞代表另一 細胞亞群，且與CD4+ Treg細胞相比時，Foxp3對彼等的發展及功能可能不如此重要。
Treg在以抗TIGIT抗體治療之小鼠中的功能性係藉由測定Treg對原生CD4+或CD8+ T細胞增生之效應來評估。原生T細胞係來自未經治療之小鼠的脾使用小鼠CD3+ T細胞富集管柱(R&D Systems)純化而來。將該等純化之T細胞以5μM紫色追蹤染料(VTD；Life Technologies)標記。將2×105個經VTD標記之T細胞與以抗CD3及抗CD28抗體包覆之珠培育，以刺激細胞增生。使用小鼠Treg分離套組(Miltenyi Biotec)自以抗TIGIT抗體313R12(n=6)或同型匹配之對照抗體(n=5)治療之攜CT26.WT腫瘤的小鼠(參見實施例5)之脾分離出Treg。為了測定Treg對T細胞增生之衝擊，將經刺激之經VTD標記之T細胞(效應子)與來自以抗TIGIT抗體313R12治療之小鼠及以對照抗體治療之小鼠的經分離之脾Treg共同培養(1：0.5之效應子：Treg之比)。在第4天，清洗細胞且將細胞與抗小鼠CD4或抗小鼠CD8抗體培育。細胞係使用FACSCanto II儀器及FACSDiva軟體v6.1.3(BD Biosciences)的FACS分析來評估。VTD信號係由於標記之細胞分裂而減半，因此將分析閘設定在以檢定中沒有Treg細胞所獲得的最大信號與以沒有抗CD3/CD28刺激所獲得的最小信號之間。使用在此區內對CD4+ T細胞及CD8+ T細胞之細胞百分比(降低之VTD表現)來計算CD4+及CD8+ T細胞增生。抑制百分比係如下 計算[最大信號-(樣品信號/最大信號)]X 100。
如圖11中所示，以抗TIGIT抗體313R12治療對源自脾之Treg對CD4+ T細胞增生之抑制功能沒有任何可觀察的效應。相反地，以抗TIGIT抗體313R12治療降低約30%之源自脾之Treg對CD8+ T細胞增生的抑制功能。
該等結果示意以抗TIGIT抗體治療可造成降低的Treg功能及/或抑制，亦即〝取消約束〞免疫反應。降低Treg功能或Treg抑制可增強總體抗腫瘤免疫反應。
實施例10
使抗TIGIT抗體313R12治療之攜CT26.WT腫瘤的小鼠之免疫細胞特徵化
為了使抗TIGIT抗體313R12治療之攜CT26.WT腫瘤的小鼠中之免疫細胞更佳地特徵化，以FACS分析自個別小鼠分離的脾細胞。將CT26.WT細胞(20,000個細胞/小鼠)注射至6-8週齡Balb/c小鼠的後脅腹中。容許腫瘤生長10天，直到其達到約50立方毫米體積為止。將小鼠以0.25毫克/小鼠之抗TIGIT抗體313R12或同型匹配之對照抗體治療(每組n=10-20)。將小鼠以每週兩次經腹膜內注射給藥。監測腫瘤生長且以電子式卡尺測量腫瘤體積。使用各治療組的6隻小鼠進行分析。在細胞注射後第32天(在最後抗體劑量後1天)分離脾細胞。將脾細胞(1×106)與重組Fc蛋白質培育10分鐘，以阻斷非 特異性結合，且接著與螢光染料共軛之抗體在100微升FACS染色緩衝液(HBSS加上2%之熱失活之小牛血清)中於冰上培育20分鐘。以清洗移除未結合之抗體且將死細胞以可固定的存活性染料標記。將細胞在室溫下固定在2%聚甲醛中20分鐘且使用FACSCanto II儀器及FACSDiva軟體v6.1.3(BD Biosciences)分析。
總T細胞係使用抗小鼠CD3e抗體鑑別，CD4+ T細胞係使用抗小鼠CD4抗體鑑別，及CD8+ T細胞係使用抗小鼠CD8抗體鑑別。中心記憶細胞係使用抗小鼠/人類CD44抗體鑑別及效應子記憶細胞係使用抗人類CD62L抗體鑑別。FACS染色係如上述使用抗小鼠CD8b抗體(克隆53-5.8，BioLegend)、抗小鼠CD4抗體(克隆GK1.5，BioLegend)、抗小鼠CD62L抗體(克隆MEL-14，BioLegend)和抗小鼠CD44抗體(克隆1M7，BioLegend)進行。細胞係以代表中心記憶細胞的CD44高CD62L高表現及代表效應子記憶細胞(閘控CD8+ T細胞)之CD44高CD62L低表現來分析。
與來自以對照抗體治療之小鼠的T細胞群相比，FACS分析指出以抗TIGIT抗體313R12治療之攜CT26.WT腫瘤的小鼠具有增加的總活脾細胞之T細胞群(圖12A)。與以對照抗體治療之小鼠相比，在以抗體313R12治療之小鼠中的(總活細胞之)CD4+ T細胞百分比以及(總活細胞之)CD8+ T細胞百分比增加(圖12B和圖12C)。另外，在CD4+ T細胞群內的中心記憶細胞百分比 增加(圖12D)。然而，在CD8+ T細胞群內的中心記憶細胞百分比未增加(圖12E)。
該等數據指出以抗TIGIT抗體治療增加CD4+和CD8+ T細胞群二者的百分比。結果與增強的免疫反應一致。
為了評定抗TIGIT抗體對標靶表現的效應，以流動式細胞測量術分析對Treg之TIGIT表現。如本文所述，Treg為抑制因子細胞及已知CD4+ Treg表現轉錄因子Foxp3。如上文所述，自以抗TIGIT抗體313R12或對照抗體治療之攜CT26.WT腫瘤的小鼠分離出脾細胞。將脾細胞(1×106)與重組Fc蛋白質培育10分鐘，以阻斷非特異性結合，且接著與抗TIGIT抗體313R12及抗小鼠CD4抗體在100微升FACS染色緩衝液(HBSS加上2%之熱失活之小牛血清)中於冰上培育20分鐘。在以FACS染色緩衝液清洗之後，將細胞以可固定的細胞存活性染料標記、固定且滲透隔夜。在滲透之後，將細胞以1X滲透緩衝液清洗兩次。將細胞在冰上使用抗小鼠Foxp3抗體經30分鐘染色，清洗且在室溫下以2%甲醛固定20分鐘。使用FACSCanto II儀器進行流動式細胞測量術且數據分析係使用FACSDiva軟體v6.1.3(BD Biosciences)進行。
如圖13A中所示，與來自以對照抗體治療之攜腫瘤的小鼠之脾細胞相比，在以抗TIGIT抗體313R12治療之攜CT26.WT腫瘤的小鼠中之表現TIGIT之總脾細胞百分比降低。兩組小鼠的總CD4+細胞之Foxp3+CD4+ 細胞百分比(代表Treg)為約22-23%且似乎不受以抗TIGIT抗體治療的影響(圖13B)。然而，與以對照抗體治療之攜腫瘤的小鼠相比，在來自以抗TIGIT抗體313R12治療之攜CT26.WT腫瘤的小鼠之脾細胞群中的(總Treg之)TIGIT-陽性Treg百分比戲劇性地降低(圖13C)。相反地，與以對照抗體治療之攜腫瘤的小鼠相比，在來自以抗TIGIT抗體313R12治療之攜CT26.WT腫瘤的小鼠之脾細胞群中的TIGIT-陰性Treg百分比略微增加(圖13D)。
該等結果示意抗TIGIT抗體313R12耗盡TIGIT-陽性細胞，特別為Treg。然而，如以FACS評定之降低的TIGIT-陽性細胞可能由於TIGIT蛋白質之內化作用及/或TIGIT細胞表面表現之向下調節，而不是真正耗盡細胞。
骨髓衍生性抑制細胞(MDSC)為骨髓細胞之異質化家族且已顯示為有效力的後天及先天二者免疫性抑制因子。MDSC抑制CD4+ T細胞和CD8+ T細胞增生及活化且加速產生Treg。咸信MDSC係藉由抑制抗腫瘤免疫反應、促進血管生成及創造轉移前環境而加速癌發展。MDSC係以骨髓細胞系分化抗原Gr1和CD11b之細胞表面表現特徵化。Gr1主要受限於顆粒細胞系之細胞上的表現及CD11b為在巨噬細胞、顆粒細胞、NK細胞和T細胞表面上發現的細胞表面整合素。在小鼠中，MDSC可部分建基於該等標記而分裂成兩個亞群：顆粒細胞MDSC(G-MDSC)及單細胞MDSC(M-MDSC)。G-MDSC通常具有多 葉形細胞核及CD11b+Gr1高表現型，而M-MDSC具有單細胞形態及CD11b+Gr1低表現型。MDSC的兩種群已顯示出以多重機制抑制T細胞反應，包括增加精胺酸酶、可誘發的氧化氮合成酶(iNOS)、氧化氮和反應性氧種類之生產。因此，MDSC促成免疫抑制腫瘤微環境且可限制抗腫瘤免疫反應效應。
來自以抗TIGIT抗體313R12或對照抗體治療之攜CT26.WT腫瘤的小鼠之骨髓細胞(特別為MDSC)係以FACS分析。將脾細胞(1×106)與重組Fc蛋白質培育10分鐘，以阻斷非特異性結合，且接著與螢光染料共軛之抗體在100微升FACS染色緩衝液(HBSS加上2%之熱失活之小牛血清)中於冰上培育20分鐘。接著將細胞與抗小鼠CD11b抗體及抗小鼠Gr1抗體培育。以清洗移除未結合之抗體且將細胞以可固定的存活性染料標記。將細胞在室溫下固定在2%聚甲醛中20分鐘且使用FACSCanto II儀器及FACSDiva軟體v6.1.3(BD Biosciences)分析。
如圖14A中所示，與來自以對照抗體治療之攜腫瘤的小鼠之CD11b+骨髓細胞相比，來自以抗TIGIT抗體313R12治療之攜CT26.WT腫瘤的小鼠之脾的(總活細胞)CD11b+骨髓細胞百分比降低約25%。與來自以對照抗體治療之攜腫瘤的小鼠之CD11b+Gr1+MDSC相比，來自以抗TIGIT抗體313R12治療之攜腫瘤的小鼠之脾的(總CD11b+骨髓細胞)CD11b+Gr1+MDSC百分比降低約45%(圖14B)。在MDSC群內，來自以抗TIGIT抗體 313R12治療之攜CT26.WT腫瘤的小鼠之脾的G-MDSC(經鑑別為CD11b+Gr1高)百分比降低約66%，但是來自以抗TIGIT抗體313R12治療之攜CT26.WT腫瘤的小鼠之脾的M-MDSC(經鑑別為CD11b+Gr1低)增加約30%(分別為圖14C和14D)。
該等結果示意以抗TIGIT抗體治療可藉由降低特異性免疫細胞(亦即MDSC)之抑制活性而增強抗腫瘤反應。
實施例11
以抗TIGIT抗體之活體內腫瘤生長抑制
腎癌細胞為自ATCC獲得的源自Balb/c之腎腺癌細胞系。將腎癌細胞(5×105個細胞/小鼠)經皮下植入6-8週齡Balb/c小鼠的後脅腹中。容許腫瘤生長7天，直到其達到約43立方毫米體積為止。將小鼠以0.25毫克/小鼠之抗TIGIT抗體313R12(mIgG2a抗體)或mIgG2a對照抗體治療(每組n=10)。將小鼠以每週兩次經腹膜內注射給藥三週。監測腫瘤生長且在第7、10、14、17、21和24天以電子式卡尺測量腫瘤體積。
如圖15中所示，與同型匹配之對照抗體相比，抗TIGIT抗體313R12強力抑制腫瘤生長。所有對照小鼠由於腫瘤尺寸而於第28天予以安樂死。相反地，以抗體313R12治療之10隻小鼠中之8隻的腫瘤在第28天消退及該等小鼠中之5隻沒有可檢測的腫瘤。原來10隻 小鼠中之5隻維持不變且直到注射後至少100天沒有可檢測的腫瘤。該等結果顯示抗TIGIT抗體313R12之抗腫瘤活性在數種不同的腫瘤類型中皆有效。
實施例12
以抗TIGIT抗體之活體內腫瘤生長抑制-劑量研究
因為抗TIGIT抗體已顯示出有效抑制腫瘤生長，所以進行劑量範圍研究。將鼠類結腸腫瘤系CT26.WT經皮下植入(30,000個細胞/小鼠)Balb/c小鼠中且容許腫瘤生長至約35立方毫米平均尺寸。將小鼠以30、15、10、5、3、1或0.5毫克/公斤之抗TIGIT抗體313R12或以對照抗體治療(每組n=10)。將小鼠以每週一次經腹膜內注射給藥，共三次劑量。監測腫瘤生長且以電子式卡尺在指示之時間點測量腫瘤體積。
圖16顯示各治療組的平均腫瘤體積。以各劑量(包括0.5毫克/公斤之最低量)的抗TIGIT抗體313R12治療皆強力抑制CT26.WT腫瘤生長。如表4中所示，以每個劑量值使至少40%之小鼠的腫瘤在第20天消退。在每個治療組中，有個別的小鼠之腫瘤消退至不可檢測的程度。未於此實驗看到劑量反應曲線，其可能由於在開始治療時的腫瘤尺寸。
Figure 105116461-A0202-12-0234-4
該等結果證明抗TIGIT抗體313R12作為免疫治療劑之效力。關於看到顯著的抗腫瘤效應所需之少量抗TIGIT抗體的該等結果通常令人驚訝。
實施例13
以抗TIGIT抗體及抗PD-L1抗體之活體內腫瘤生長抑制
將鼠類結腸腫瘤系CT26.WT經皮下植入(30,000個細胞/小鼠)Balb/c小鼠中，且在治療的第1天(植入後第10天)，腫瘤具有約105立方毫米平均尺寸。將小鼠以0.25毫克/小鼠之抗TIGIT抗體313R12、抗PD-L1抗體、313R12與抗PD-L1抗體之組合或對照抗體治療(每組n=10-20)。將小鼠以每週兩次投予抗體經3週。監測腫瘤生長且以電子式卡尺測量腫瘤體積。
如圖17B中所示，抗TIGIT抗體313R12係以高百分比強力抑制小鼠中的CT26.WT腫瘤生長。應注意的是以抗TIGIT抗體313R12治療不僅能夠抑制大部分小 鼠中的腫瘤生長，並且能夠誘發個別的腫瘤消退，時常至不可檢測的程度。以抗PD-L1抗體作為單一劑治療很少成功抑制腫瘤生長(圖17C)。以抗TIGIT抗體313R12與抗PD-L1抗體之組合治療抑制腫瘤生長的程度比任一單獨的劑更大(圖17D)。平均腫瘤體積顯示於圖17E中及來自各組的小鼠之存活百分比顯示於圖17F中。
一種評估抗腫瘤記憶細胞群的存在及/或功能性之方法為以新鮮腫瘤細胞再挑戰先前治療之小鼠。以先前經抗TIGIT抗體313R12、抗mPD-L1抗體或313R12與抗mPD-L1抗體之組合治療之小鼠(來自上述研究)用於再挑戰研究。將腫瘤在第一次腫瘤注射後至少128天完全消退且不可檢測出腫瘤的小鼠再以CT26.WT腫瘤細胞(30,000細胞)挑戰。施予腫瘤再挑戰之小鼠係在再挑戰前100天接受最後的治療劑量。將原生Balb/c小鼠(n=10)以CT26.WT腫瘤細胞(30,000細胞)注射，作為對照組。監測腫瘤生長且以電子式卡尺在指示之時間點測量腫瘤體積。數據係以平均±S.E.M表示。
在原生小鼠中的CT26.WT腫瘤之平均腫瘤體積穩定地生長至第28天，具有約1750立方毫米平均腫瘤體積。來自先前實驗的小鼠中僅有2隻先前已以抗PD-L1抗體治療之小鼠具有完全消退的腫瘤，但是該2隻小鼠證明對腫瘤再挑戰的完全免疫性。有4隻先前已以抗TIGIT抗體治療之小鼠具有完全消退的腫瘤，且該等小鼠在再挑戰之後沒有長出腫瘤及證明對腫瘤再挑戰的完全免疫性。 另外，有7隻先前已以313R12與抗PD-L1抗體之組合治療之小鼠具有完全消退的腫瘤，且該等小鼠證明對腫瘤挑戰的完全免疫性。
以作為單一劑或與抗PD-L1抗體組合之抗TIGIT抗體治療之小鼠似乎受到免於CT26.WT腫瘤細胞之再挑戰的強力保護。該等結果示意在以作為單一劑或與檢查點抑制劑組合之抗TIGIT抗體治療之後存在的免疫原性記憶。
實施例14
以抗TIGIT抗體及抗PD-1抗體之活體內腫瘤生長抑制
將鼠類結腸腫瘤系CT26.WT經皮下植入(30,000個細胞/小鼠)Balb/c小鼠中，且在治療的第1天(植入後第7天)，腫瘤具有約62立方毫米平均尺寸。將小鼠(n=15)以12.5毫克抗TIGIT抗體313R12、抗PD-1抗體、313R12與抗PD-1抗體之組合或對照抗體治療(每組n=15)。將小鼠以每週兩次經腹膜內注射投予抗體經3週。監測腫瘤生長且以電子式卡尺測量腫瘤體積。
如圖18B中所示，以抗TIGIT抗體313R12治療強力抑制腫瘤生長。如前面的實施例中所見，以313R12治療不僅能夠抑制腫瘤生長，並且能夠誘發一些腫瘤消退。以抗TIGIT抗體313R12與抗PD-1抗體之組合治療抑制腫瘤生長的程度比任一單獨的劑更大(圖18D)。在第24天的四組中之平均腫瘤體積顯示於圖18E 中。
以先前經抗TIGIT抗體313R12、抗mPD-L1抗體或313R12與抗mPD-L1抗體之組合治療之小鼠(來自上述研究)用於再挑戰研究。將腫瘤在第一次腫瘤注射後至少100天完全消退且不可檢測出腫瘤的小鼠再以CT26.WT腫瘤細胞(60,000細胞)挑戰。將原生Balb/c小鼠(n=10)以CT26.WT腫瘤細胞(60,000細胞)注射，作為對照組。監測腫瘤生長且以電子式卡尺在指示之時間點測量腫瘤體積。數據係以平均±S.E.M表示。
在原生小鼠中的CT26.WT腫瘤之平均腫瘤體積穩定地生長，在第21天具有約1250立方毫米平均腫瘤體積。來自先前實驗的小鼠中有13隻先前已以313R12與抗PD-1抗體之組合治療之小鼠具有完全消退的腫瘤，且該等小鼠證明對腫瘤挑戰的完全免疫性。
該等結果進一步支持抗TIGIT抗體313R12為非常有效力的免疫治療劑之構想，即使以單一劑投予時。另外，抗TIGIT抗體之效能可藉由其與其他的免疫治療劑之組合而進一步增強。
實施例15
產生抗TIGIT單克隆抗體
抗體係對抗重組人類TIGIT胺基酸22-141(R&D Systems)及/或重組人類TIGIT胺基酸22-138(Sino Biological Inc.)而產生。小鼠(n=3)係使用標準的技術以 TIGIT免疫。在最初免疫之後約70天使用FACS分析來篩選對抗人類TIGIT之個別小鼠的血清。在分離出動物脾細胞用於融合瘤生產之後，選擇具有最高的抗體效價之動物用於最終的抗原激勵。使用SP2/0作為小鼠脾細胞之融合夥伴。融合瘤細胞以每一槽孔1個細胞平鋪於96槽孔盤中且以FACS分析篩選對抗人類TIGIT之上清液。
建構用於抗TIGIT抗體之FACS篩選的嵌合融合蛋白(FLAG-hTIGIT-CD4TM-GFP)，該嵌合融合蛋白賦予人類TIGIT的細胞外結構域之細胞表面表現且將嵌合融合蛋白轉染至HEK-293T細胞中。在48小時之後，將轉染之細胞懸浮在含有2% FBS及肝素之冰冷的PBS中且在50微升融合瘤上清液的存在下於冰上培育30分鐘。以100微升PE共軛之抗人類Fc二級抗體進行第二次培育，以檢測以抗體結合之細胞。將細胞與作為正對照物的抗FLAG抗體(Sigma-Aldrich)及作為負對照物的抗PE抗體培育。以FACSCalibur儀器(BD Biosciences)分析細胞且使用FlowJo軟體處理數據。
鑑別出數種結合人類TIGIT之融合瘤且選擇抗體313M26。313M26的重鏈可變區和輕鏈可變區之胺基酸序列分別為SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64。313M26的重鏈可變區和輕鏈可變區之核苷酸序列分別為SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：66。
313M26抗體係使用那些熟習本技領域者已知的標準技術人源化。313M26之人源化變型在本文稱為 313M32且為IgG1抗體。313M32的重鏈可變區和輕鏈可變區之胺基酸序列分別為SEQ ID NO：67和SEQ ID NO：68。313M32的重鏈可變區和輕鏈可變區之核苷酸序列分別為SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：74。將313M26/313M32之重鏈和輕鏈CDR列示於本文的表2中(SEQ ID NO：57-62)。具有預測信號序列之313M32的重鏈之胺基酸序列為SEQ ID NO：69及不具有預測信號序列之313M32的重鏈之胺基酸序列為SEQ ID NO：70；具有預測信號序列之313M32的輕鏈之胺基酸序列為SEQ ID NO：71及不具有預測信號序列之313M32的輕鏈之胺基酸序列為SEQ ID NO：72。313M32的重鏈和輕鏈之核苷酸序列分別為SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：76。
編碼313M32抗體的重鏈可變區之質體係在2015年8月11日依照布達佩斯條約之條款寄存於美國菌種保存中心(ATCC)，10801 University Boulevard,Manassas,VA,USA且以PTA-122346編號。編碼313M32抗體的輕鏈可變區之質體係在2015年8月11日依照布達佩斯條約之條款寄存於美國菌種保存中心(ATCC)，10801 University Boulevard,Manassas,VA,USA且以PTA-122347編號。
篩選與來自許多不同物種的TIGIT蛋白質結合之人源化抗TIGIT抗體313M32。測定出313M32強力結合人類TIGIT及不結合來自任何其他測試之物種的TIGIT，包括小鼠、大鼠、天竺鼠、兔子、狨猴、豬、 狗、恆河猴和食蟹獼猴。這與在OncoMed Pharmaceuticals所產生的另一抗TIGIT抗體：313R19相反，其與除了天竺鼠以外的所有該等物種之TIGIT結合。抗體313R19為原來經鑑別為與小鼠及人類TIGIT二者結合之兔子抗TIGIT抗體(313R12)的人源化變型。表5總結抗TIGIT抗體及與小鼠、人類、食蟹獼猴和恆河猴TIGIT之結合。
Figure 105116461-A0202-12-0240-5
實施例16
阻斷人類TIGIT與PVR結合之抗TIGIT抗體的FACS分析
細胞表面人類TIGIT蛋白質係藉由使用標準的重組DNA技術接合人類TIGIT之胺基酸22-141與CD4之跨膜結構域及C-端GFP蛋白質標籤(hTIGIT-CD4TM-GFP)而產生。PVR-Fc建構體係使用標準的重組DNA技術而產生。人類PVR的細胞外結構域尤其於框內與兔子Fc區接合且重組hPVR-rbFc蛋白質表現在CHO細胞中。融合蛋白係來自細胞培養基使用蛋白質A層析術純化而來。
將HEK-293T細胞以TIGIT-CD4TM-GFP建構體過渡性轉染。在16小時之後，將轉染之細胞懸浮在含有2% FBS及肝素之冰冷的HBSS中且與50微克/毫升之hPVR-rbFc融合蛋白在抗TIGIT抗體313R19、313M26或313M32的存在下於冰上培育60分鐘。抗體313R19為兔子抗TIGIT抗體之人源化變型。313R19結合小鼠及人類TIGIT。抗體係以10、2和0.4微克/毫升濃度測試。細胞不與抗體或不與hPVR-rbFc培育，作為對照物。以100微升PE共軛之抗兔子Fc二級抗體進行第二次培育，以檢測以hPVR-rbFc融合蛋白結合之細胞。以FACSCanto儀器(BD Biosciences)分析細胞且使用FlowJo軟體處理數據。
如圖19A中所示，hPVR-rbFc在沒有任何抗TIGIT抗體的存在下與表現在HEK-293T細胞表面上的hTIGIT強力結合。所有三種抗TIGIT抗體在10微克/毫升之最高濃度下阻斷hPVR-rbFc與hTIGIT結合。然而，313R19抗體在2微克/毫升和0.4微克/毫升抗體之較低濃度下不阻斷hPVR-rbFc與hTIGIT結合。相反地，抗hTIGIT抗體313M32在2微克/毫升下強力阻斷hPVR-rbFc與hTIGIT結合且阻斷程度比親代小鼠抗體313M26更高。該等結果示意人源化313M32抗體對hTIGIT之親和性比親代抗體313M26和抗體313R19更高。使用10、5、2.5和1.25微克/毫升濃度的抗體313R19和抗體313M32進行額外的實驗(圖19B)。自該兩個研究的結果示意抗體313M32對hTIGIT之親和性比抗體313R19高約5 倍。另外，初步Biacore結果顯示313R19之親和性為2nM及313M32之親和性為0.4nM。
實施例17
TIGIT傳訊及TIGIT磷酸化
TIGIT係在與其相反受體PVR交互作用之後於其胞質尾區磷酸化。TIGIT磷酸化為級聯的開始，該級聯包括影響其他已知的傳訊途徑之下游事件。因此，評估TIGIT磷酸化可給出關於TIGIT功能及TIGIT拮抗劑效應之訊息。
Jurkat CD4+人類T細胞系缺乏人類TIGIT表現，如以即時PCR及FACS所測定(未顯示數據)。為了產生TIGIT表現之細胞系，將Jurkat細胞以表現以FLAG及綠螢光蛋白(GFP)標籤化之人類TIGIT(hTIGIT)的慢病毒建構體感染。將GFP-陽性細胞使用FACSAria II細胞分類器(BD Biosciences)分類至96槽孔盤中，將單細胞擴展成克隆且選擇克隆細胞系(Jurkat-hTIGIT)。
721.221人類B細胞淋巴瘤系缺乏PVR表現，如以即時PCR及FACS所測定(未顯示數據)。為了產生PVR表現之細胞系，將721.221細胞以表現人類PVR(hPVR)及GFP之慢病毒建構體感染。將GFP-陽性細胞使用FACSAria II細胞分類器(BD Biosciences)分類至96槽孔盤中，將單細胞擴展成克隆且選擇克隆細胞系(721.221-hPVR)。
為了評估反應PVR之TIGIT磷酸化，將Jurkat-hTIGIT細胞在37℃下於無血清培養基中培育2小時。接著將細胞在室溫下以20微克/毫升之抗TIGIT抗體313R19、313M26或313M32或對照抗體預處理20分鐘。將Jurkat-hTIGIT細胞與親代721.221細胞或721.221-mPVR細胞以5：1之細胞比混合且在37℃下於酪胺酸磷酸酶抑制劑(10mM釩酸鈉，New England Biolabs)的存在下培育5分鐘。製備細胞溶解物且以捕獲經FLAG-標籤化之hTIGIT蛋白質的經抗FLAG-包覆之磁珠免疫沉澱。將免疫沉澱物在4-12% Bis-Tris凝膠(Novex/Life Technologies)上分離且使用iBlot 2裝置(Life Technologies)轉移至硝化纖維薄膜。將薄膜與辣根過氧化酶共軛之抗酪胺酸抗體培育且使用標準的檢測試劑觀察磷酸化之TIGIT(pTIGIT)。使用抗FLAG抗體(Cell Signaling Technology)評估存在的總TIGIT。
觀察出hTIGIT在反應hPVR表現之腫瘤細胞的Jurkat細胞中高度磷酸化。此磷酸化係在抗TIGIT抗體(尤其為313M32抗體)的存在下受到抑制(圖20)。
實施例18 抗原決定區定位 抗hTIGIT抗體之抗原決定區定位
為了鑑別抗體313M32之結合抗原決定區，以具有特異性胺基酸取代之一系列人類TIGIT變體進行分 析。變體係建基於人類TIGIT與食蟹獼猴TIGIT分別為SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：77之胺基酸序列之間的差別。恆河猴TIGIT之胺基酸序列(SEQ ID NO：78)與食蟹獼猴TIGIT相同(圖21)。將胺基酸變體引入在食蟹獼猴TIGIT中存在的胺基酸殘基至人類TIGIT中的對應位置中。所產生之hTIGIT變體具有在(1)E36K和I41V；(2)T51M；(3)Q62H和Q64H；(4)D72E；(5)S78Y和S80A；(6)V100M；(7)I109T和T119R；及(8)G135S上的取代。各變體hTIGIT係使用實施例12中所述之hTIGIT(aa 22-141)-CD4TM-GFP建構體而產生。
TIGIT變體係藉由FACS以抗hTIGIT抗體評估。將HEK-293T細胞以hTIGIT-CD4TM-GFP、mTIGIT-CD4TM-GFP或變體hTIGIT-CD4TM-GFP建構體中之一者過渡性轉染。在16小時之後，將轉染之細胞懸浮在含有2% FBS之冰冷的HBSS中且與1微克/毫升之抗hTIGIT抗體313R12、313M32或313M34/10A7於冰上培育30分鐘。313M34為建基於美國公開案2009/0258013中所述之10A7抗體的胺基酸序列所產生之抗hTIGIT抗體。10A7抗體為結合小鼠TIGIT及人類TIGIT二者之抗小鼠TIGIT抗體。以50微升PE共軛之抗Fc二級抗體進行第二次培育，以檢測以抗體結合之細胞。以FACSCalibur儀器(BD Biosciences)分析細胞且使用FlowJo軟體處理數據。
如圖22中所示，抗體313M32不與在胺基酸殘基62和64上具有取代之TIGIT變體3及在胺基酸殘基 109和119上具有取代之TIGIT變體7結合。抗體保留其與hTIGIT及TIGIT變體1、2、4、5、6和8之強力結合。在與PVR結合之TIGIT的晶體結構之圖像上以黑色強調胺基酸殘基62、64、109和119(圖23)。人類TIGIT的結構係以球形圖像顯示及PVR的結構係以條狀圖像提供。胺基酸的位置揭露抗體313M32係在應該以PVR結合來阻斷及/或干擾之區域內結合hTIGIT。值得注意的是抗體313R12亦損失與在胺基酸殘基109和119上具有取代之TIGIT變體7之結合，示意313R12結合與以313M32結合之抗原決定區重疊的抗原決定區。有趣的是抗體313M34/10A7與TIGIT之結合不受TIGIT變體3或變體7之胺基酸取代的衝擊，但是受到在TIGIT變體6的殘基100之胺基酸取代的衝擊。這結果顯示抗體313M34/10A7不結合與抗體313M32相同的抗原決定區。抗體313M32和313M34/10A7對TIGIT之關鍵結合殘基的相對位置顯示於圖23的圖像上。
為了確認抗體313M26(313M32之親代鼠類抗hTIGIT抗體)及313R19(自313M32所產生的人源化兔子抗hTIGIT抗體)結合共同的抗原決定區，所以進行競爭研究。因為313M26及313R19抗體之Fc部分不同，亦即分別為鼠類Fc及人類Fc，所以可測定一種抗體(313R19)在第二種抗體(313M26)的存在或不存在下之結合。簡言之，將HEK-293T細胞以編碼人類TIGIT-CD4TM-GFP之表現載體過渡性轉染。將細胞與0.5微克抗體313M19及過量 抗體313M26(從50至0.78微克/毫升，2倍稀釋)培育1小時。清洗細胞且與對人類Fc具有特異性的經螢光標記之二級抗體培育，且以流動式細胞測量術分析。
如圖24A中所示，抗體313M26與313R19競爭與hTIGIT結合且過量313M26有效地阻斷313R19與hTIGIT結合。該等數據表示313M26/313M32及313R12/313R19結合至重疊之抗原決定區且與圖23中所呈示之抗原決定區分析一致。在並行的實驗中檢查313R19或313M32與313M34/10A7競爭與TIGIT結合的能力。如圖24B中所示，觀察到313R19或313M32抗體不與313M34/10A7競爭與hTIGIT結合。該等結果表示313R19及313M32結合至與以313M34/10A7結合之抗原決定區不同的抗原決定區。該等結果亦與圖23中所呈示之抗原決定區分析一致。
實施例19
細胞激素生產
TIGIT與表現在腫瘤細胞或抗原呈現細胞上的PVR(CD155)之接合已顯示出向下調節T細胞效應子功能且抑制抗腫瘤免疫反應(參見例如Joller等人之2014,Immunity,40：569-581)。研究抗TIGIT抗體313R19及313M32阻斷經PVR媒介之抑制T細胞激素分泌的能力。活化之人類T細胞芽係藉由初代人類T細胞與植物血球凝集素(PHA，2微克/毫升)及IL-2(4毫微克/毫升)培養10天 而產生。將細胞芽靜置於無PHA/IL-2培養基中24小時，以5×105個細胞/毫升再懸浮且在室溫下以10或25微克/毫升之對照抗體(多克隆人類IgG，25微克/毫升)、抗TIGIT抗體313R19或313M32處理15分鐘。接著將細胞平鋪於已在4℃下以抗CD3抗體(Ebioscience)、人類PVR-Fc或抗CD3抗體及hPVR-Fc(各以10微克/毫升)包覆隔夜之槽孔中。在48小時之後收獲無細胞培養物上清液且以ELISA(R&D Systems)測定IFN-γ及IL-2細胞激素。結果係以相對於單獨的抗CD3活化之細胞所產生的細胞激素來表示，其中抗CD3細胞激素量設定在1.0。
如圖25中所見，hPVR-Fc不在活化之細胞中誘發IFN-γ或IL-2生產。然而，hPVR-Fc強力抑制藉由抗CD3接合而誘發之細胞激素生產。這抑制係以抗TIGIT抗體313R19及313M32反轉，且以25微克/毫升之較高劑量生產之IFN-γ或IL-2實際上比以抗CD3所產生的量更大。活化之T細胞表現TIGIT及CD226二者，且二者可與PVR交互作用，但是TIGIT/PVR交互作用是受抑制的及CD226/PVR交互作用經活化。不想受到理論的束縛，示意當活化之T細胞與PVR接觸時，以TIGIT/PVR交互作用〝勝出〞，因為TIGIT比CD226更強力結合PVR。另外，似乎在活化之T細胞上的TIGIT量比CD226更高，所以整體交互作用是受抑制的。例如，在圖25中比較單獨的抗CD3與抗CD3加上PVR。當TIGIT以313R19或313M32阻斷時，則經TIGIT媒介之抑制作用 反轉，但是理論上仍發生CD226/PVR交互作用，且該交互作用經活化。因此，如圖25中所見，當阻斷TIGIT且以抗CD3加上PVR刺激T細胞時，則IFN-γ量實際上比以單獨的抗CD3刺激時更高。
該等結果證明以抗TIGIT抗體阻斷人類TIGIT可阻擾TIGIT/PVR交互作用且修復有益於抗腫瘤反應之細胞激素生產。
實施例20
經抗體依賴性細胞媒介之細胞毒性檢定法
經抗體依賴性細胞媒介之細胞毒性(ADCC)係指藉由細胞毒性效應子細胞通過非噬菌細胞過程殺死以抗體包覆之標靶細胞，通常以釋放細胞毒性顆粒或表現細胞死亡誘發分子為特徵。媒介ADCC之效應子細胞包括自然殺手(NK)細胞、單核球、巨噬細胞、嗜中性細胞、嗜酸性細胞和樹突細胞。研究抗TIGIT抗體313R19及313M32媒介NK細胞ADCC的能力。ADCC係在使用初代人類NK細胞作為效應子及親代Jurkat細胞或Jurkat-hTIGIT細胞作為標靶之標準的4小時鈣黃綠素釋放檢定法測試。在Ficoll-Hypaque(Sigma)密度梯度離心之前，藉由與RosetteSep混合液(Stem Cell Technologies)培育30分鐘而自新鮮周圍血液膚色血球層(Stanford Blood Center,Palo Alto,CA)直接分離出人類NK細胞。將標靶親代Jurkat或Jurkat-hTIGIT細胞在37℃下以10μM鈣黃綠素AM(Life Technologies)經1小時標記且接著在室溫下以對照多克隆IgG抗體、抗TIGIT抗體313R19或抗TIGIT抗體313M32(全部皆以10微克/毫升)處理15分鐘。在培育之後，將Jurkat或Jurkat-hTIGIT細胞與NK細胞以20：1之效應子：標靶比於96槽孔V形底盤中組合。在37℃下培育4小時之後，收獲無細胞上清液血液且在螢光計上以485奈米激發及535奈米放射下定量鈣黃綠素釋放。特異性細胞溶解百分比係如下測定：溶解%=100×(ER-SR)/(MR-SR)，其中ER、SR及MR分別代表實驗釋放、自發性釋放及最大鈣黃綠素釋放。自發性釋放為在培養基中單獨培育的標靶細胞發射之螢光(亦即在沒有效應子細胞的存在下)，而最大釋放係藉由以等體積的10% SDS溶解標靶細胞來測定。Jurkat及Jurkat-hTIGIT細胞系二者的ADCC百分比係以在實驗抗體(313R19或313M32)存在下的特異性溶解百分比減去在對照抗體存在下的特異性溶解百分比來測定。
如圖26中所示，當標靶細胞表現TIGIT時，ADCC百分比在抗TIGIT抗體313R19及313M32的存在下顯著地增加。以抗TIGIT抗體誘發ADCC的能力能示意抗TIGIT抗體可具有多重機制用於增強對腫瘤細胞的免疫反應。
實施例21
在人源化小鼠中以抗TIGIT抗體於活體內腫瘤生長抑制
使用人源化小鼠模式研究抗TIGIT抗體對人類腫瘤的治療效能。人源化小鼠係自Jackson Laboratories獲得。該等小鼠係藉由以人類造血幹細胞(CD34+細胞)注射至經照射之NSG小鼠中而產生。在15週之後，以流動式細胞測量術確認存在的成熟人類淋巴細胞。將各小鼠經皮下注射源自患者的黑色素瘤腫瘤細胞(OMP-M9，75,000個細胞/小鼠)。容許腫瘤生長19天，直到其達到約50立方毫米平均體積。將攜腫瘤的小鼠隨機分組(每組n=8)。將攜腫瘤的小鼠以對照抗體、抗TIGIT抗體313R19或抗TIGIT抗體313M32治療。小鼠係以每5天給藥1毫克/公斤或5毫克/公斤。監測腫瘤生長且以電子式卡尺在指示之時間點測量腫瘤體積。
如圖27中所示，與對照組相比，在以抗體313R19及抗體313M32治療之小鼠中的腫瘤生長受到抑制。該等結果顯示靶定之TIGIT有效於提高人類淋巴細胞的抗腫瘤免疫反應且促成於活體內抑制人類腫瘤生長。在此實驗中，抗TIGIT抗體313R19或313M32與抗hPD-1抗體之組合不抑制腫瘤生長至任何比作為單一劑之抗TIGIT抗體更大的程度(未顯示數據)。
頃發現抗體313M32及313R19抑制人類淋巴細胞環境的腫瘤生長且具有類似的活體內效力。該等結果證明可以攜源自患者的異種移植物之人源化小鼠模式用於研究抗TIGIT抗體313M32(其僅結合人類TIGIT)，同時用於以抗TIGIT抗體313R12及313R19和鼠類腫瘤模式 進行的臨床前研究。
實施例22
抗TIGIT抗體之藥物動力學
如本文所述，抗TIGIT抗體313R12優先與小鼠TIGIT結合且其為大部分的臨床前效能研究所使用的小鼠替代分子。在C57BL-6J小鼠中以0.1、1和10毫克/公斤之劑量測定抗TIGIT抗體313R12之藥物動力學(PK)。採集21天內的血液樣品。
313R12在所研究之劑量值下展現非線性2室PK特徵。咸信此濃度依賴性清除為單克隆抗體之典型特性，當標靶豐富且以藥物可輕易接近時，經標靶媒介之清除可能為整體消除機制的重要成分。10毫克/公斤之313R12的濃度時間分布於21天內接近於線性，示意可及的標靶分子飽和。終末半衰期的評估不適用於非線性PK數據。
抗TIGIT抗體313R19之PK係在Balb/c小鼠中測定。將10毫克/公斤之單一劑量經IV或IP給予各小鼠。採集21天內的血液樣品。
313R19展現具有典型的IgG清除之線性2室PK特徵。在小鼠中的10毫克/公斤之終末半衰期經評估為7.6天。
亦在食蟹獼猴中測定抗TIGIT抗體313R19之PK。將10、30和100毫克/公斤之劑量以每週兩次給予各 動物，經四次劑量。各劑量組為4隻雄性動物且研究係在第四劑量之後終止，沒有回復期。
在食蟹獼猴中的313R19展現具有典型的IgG清除之線性2室PK特徵。在食蟹獼猴中的終末半衰期經評估為15.3天。
抗TIGIT抗體313M32之藥物動力學係在Balb/c小鼠中測定。將1或10毫克/公斤之單一劑量經IV或將10毫克/公斤經IP給予各小鼠。採集21天內的血液樣品。
在小鼠中的313M32展現線性2室PK特徵，這與313M32與小鼠TIGIT具有不可檢測的結合之事實一致。清除緩慢且初步證明典型的IgG PK行為。在小鼠中的終末半衰期經評估為11.7天。
應瞭解本文所述之實施例及實施態樣僅以例證為目的，且根據該等的各種修改或變化建議給熟習本技術領域者，且各種修改或變化包括在本申請案的精神及權限內。
本文所引用之所有公開資料、專利、專利申請案、網站及編號/資料庫序列(包括多核苷酸和多肽序列)全部皆以相同程度的目的以彼之完整內容特此併入本文以供參考，如同每一個別的公開資料、專利、專利申請案、網站及編號/資料庫序列係經具體且個別地指示而因此併入以供參考。
下列為本申請案所揭示之序列：
小鼠TIGIT胺基酸序列(SEQ ID NO：1)
Figure 105116461-A0202-12-0253-6
不具有預測信號序列之小鼠TIGIT胺基酸序列(SEQ ID NO：2)
Figure 105116461-A0202-12-0253-7
小鼠TIGIT細胞外結構域胺基酸序列(SEQ ID NO：3)
Figure 105116461-A0202-12-0253-8
人類TIGIT胺基酸序列(SEQ ID NO：4)
Figure 105116461-A0202-12-0253-9
不具有預測信號序列之人類TIGIT胺基酸序列(SEQ ID NO：5)
Figure 105116461-A0202-12-0253-10
人類TIGIT細胞外結構域胺基酸序列(SEQ ID NO：6)
Figure 105116461-A0202-12-0253-11
313R11/313R12重鏈CDR1(SEQ ID NO：7)GSSLSSSYMS
313R11/313R12/313R14/313R19重鏈CDR2(SEQ ID NO：8)IIGSNGNTYYANWAKG
313R11/313R12/313R14/313R19重鏈CDR3(SEQ ID NO：9)GGYRTSGMDP
313R11/313R12輕鏈CDR1(SEQ ID NO：10)QASQSISSYLNW
313R11/313R12輕鏈CDR2(SEQ ID NO：11)DALKLAS
313R11/313R12輕鏈CDR3(SEQ ID NO：12)QQEHSVGNVDN
313R14/313R19重鏈CDR1(SEQ ID NO：13)GFSLSSSYMS
313R14/313R19輕鏈CDR1(SEQ ID NO：14)QASQSNIYSDLAW
313R14/313R19輕鏈CDR2(SEQ ID NO：15)RASTLAS
313R14/313R19輕鏈CDR3(SEQ ID NO：16)QQEHLVAWIYN
313R11/313R12重鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：17)QVQLESEGGLFKPTDTLTLTCTVSGSSLSSSYMSWVRQAPGKGLEWIGIIGSNGNTYYANWAKGRFTISKTSTTVELKITSPTTEDTATYFCARGGYRTSGMDPWGPGTLVTVSS
313R11/313R12輕鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：18)DIVMTQTPASVEVAVGGTVTIKCQASQSISSYLNWYQQKPGQPPKLLIYDALKLASGVPSRFSGSGSGTEYTLTISGVESADAATYYCQQEHSVGNVDNVFGGGTEVVVKR
313R14重鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：19)QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLSSSYMSWIRQPPGKGLEWIGIIGSNGNTYYANWAKGRVTISKTSTTVELKLSSVTAADTAVYYCARGGYRTSGMDPWGQGTLVTVSS
313R14/313R19/313R20輕鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：20)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQNIYSDLAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQEHLVAWIYNVFGQGTKVEIKR
具有畫底線的信號序列之313R11重鏈(mIgG1)胺基酸序列(SEQ ID NO：21)
Figure 105116461-A0202-12-0255-12
具有畫底線的信號序列之313R12重鏈(mIgG2)胺基酸序列(SEQ ID NO：22)
Figure 105116461-A0202-12-0255-13
具有畫底線的信號序列之313R11/313R12輕鏈胺基酸序列(SEQ ID NO：23)
Figure 105116461-A0202-12-0255-14
具有畫底線的信號序列之313R14重鏈(hIgG1)胺基酸序列(SEQ ID NO：24)
Figure 105116461-A0202-12-0255-15
具有畫底線的信號序列之313R14/313R19/313R20輕鏈胺 基酸序列(SEQ ID NO：25)
Figure 105116461-A0202-12-0256-16
不具有信號序列之313R11重鏈(mIgG1)胺基酸序列(SEQ ID NO：26)
Figure 105116461-A0202-12-0256-17
不具有信號序列之313R12重鏈(mIgG2)胺基酸序列(SEQ ID NO：27)
Figure 105116461-A0202-12-0256-18
不具有信號序列之313R11/313R12輕鏈胺基酸序列(SEQ ID NO：28)
Figure 105116461-A0202-12-0256-19
不具有信號序列之313R14重鏈(hIgG1)胺基酸序列(SEQ ID NO：29)
Figure 105116461-A0202-12-0256-20
不具有預測信號序列之313R14/313R19/313R20輕鏈胺基 酸序列(SEQ ID NO：30)
Figure 105116461-A0202-12-0257-21
AH-1肽(SEQ ID NO：31)SPSYVYHQF
313R19/313R20重鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：32)QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLSSSYMSWIRQPPGKGLEWIGIIGSNGNTYYANWAKGRVTISKSSNQVSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYRTSGMDPWGQGTLVTVSS
具有畫底線的信號序列之313R19重鏈(IgG1)胺基酸序列(SEQ ID NO：33)
Figure 105116461-A0202-12-0257-22
不具有信號序列之313R19重鏈(IgG1)胺基酸序列(SEQ ID NO：34)
Figure 105116461-A0202-12-0257-23
連接子(SEQ ID NO：35)ESGGGGVT
連接子(SEQ ID NO：36)LESGGGGVT
連接子(SEQ ID NO：37)GRAQVT
連接子(SEQ ID NO：38)WRAQVT
連接子(SEQ ID NO：39)ARGRAQVT
FLAG標籤(SEQ ID NO：40)DYKDDDDK
人類IgG1重鏈恆定區(SEQ ID NO：41)
Figure 105116461-A0202-12-0258-24
人類IgG2重鏈恆定區(SEQ ID NO：42)
Figure 105116461-A0202-12-0258-25
人類IgG3重鏈恆定區(SEQ ID NO：43)
Figure 105116461-A0202-12-0258-26
人類IgG4重鏈恆定區(SEQ ID NO：44)
Figure 105116461-A0202-12-0258-27
人類IgG1 Fc區(13A變型)(SEQ ID NO：45)
Figure 105116461-A0202-12-0258-28
人類IgG1 Fc區(13B變型)(SEQ ID NO：46)
Figure 105116461-A0202-12-0259-29
人類IgG1 Fc區(13A變型)(SEQ ID NO：47)
Figure 105116461-A0202-12-0259-30
人類IgG1 Fc區(13B變型)(SEQ ID NO：48)
Figure 105116461-A0202-12-0259-31
人類IgG2 Fc區(13A變型)(SEQ ID NO：49)
Figure 105116461-A0202-12-0259-32
人類IgG2 Fc區(13B變型)(SEQ ID NO：50)
Figure 105116461-A0202-12-0259-33
人類IgG2 Fc區(13A變型)(SEQ ID NO：51)
Figure 105116461-A0202-12-0259-34
人類IgG2 Fc區(13A變型)(SEQ ID NO：52)
Figure 105116461-A0202-12-0259-35
人類IgG2 Fc區(13B變型)(SEQ ID NO：53)
Figure 105116461-A0202-12-0259-36
人類IgG2 Fc區(13B變型)(SEQ ID NO：54)
Figure 105116461-A0202-12-0260-37
具有畫底線的信號序列之313R20重鏈(IgG4)胺基酸序列(SEQ ID NO：55)
Figure 105116461-A0202-12-0260-38
不具有信號序列之313R20重鏈(IgG4)胺基酸序列(SEQ ID NO：56)
Figure 105116461-A0202-12-0260-39
313M26/313M32重鏈CDR1(SEQ ID NO：57)TSDYAWN
313M26/313M32重鏈CDR2(SEQ ID NO：58)YISYSGSTSYNPSLRS
313M26/313M32重鏈CDR3(SEQ ID NO：59)ARRQVGLGFAY
313M26/313M32輕鏈CDR1(SEQ ID NO：60)KASQDVSTAVA
313M26/313M32輕鏈CDR2(SEQ ID NO：61)SASYRYT
313M26/313M32輕鏈CDR3(SEQ ID NO：62)QQHYSTP
313M26重鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：63)DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWVRQFPGNKLEWMGYISYSGSTSYNPSLRSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARRQVGLGFAYWGQGTLVTVSS
313M26輕鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：64)DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYSTPWTFG
313M26重鏈可變區核苷酸序列(SEQ ID NO：65)
Figure 105116461-A0202-12-0261-40
313M26輕鏈可變區核苷酸序列(SEQ ID NO：66)
Figure 105116461-A0202-12-0261-41
313M32重鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：67)QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGSTSYNPSLRSRVTISRDTSKNQFFLKLSSVTAADTAVYYCARRQVGLGFAYWGQGTLVTVSS
313M32輕鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：68)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYSTPWTFG
具有畫底線的預測信號序列之313M32重鏈(IgG1)胺基酸序列(SEQ ID NO：69)
Figure 105116461-A0202-12-0261-42
不具有信號序列之313M32重鏈(IgG1)胺基酸序列(SEQ ID NO：70)
Figure 105116461-A0202-12-0262-43
具有畫底線的預測信號序列之313M32輕鏈胺基酸序列(SEQ ID NO：71)
Figure 105116461-A0202-12-0262-44
不具有信號序列之313M32輕鏈胺基酸序列(SEQ ID NO：72)
Figure 105116461-A0202-12-0262-45
313M32重鏈可變區核苷酸序列(SEQ ID NO：73)
Figure 105116461-A0202-12-0262-46
313M32輕鏈可變區核苷酸序列(SEQ ID NO：74)
Figure 105116461-A0202-12-0262-47
313M32重鏈(IgG1)核苷酸序列(SEQ ID NO：75)
Figure 105116461-A0202-12-0263-48
313M32輕鏈核苷酸序列(SEQ ID NO：76)
Figure 105116461-A0202-12-0263-49
食蟹獼猴TIGIT(SEQ ID NO：77)
Figure 105116461-A0202-12-0263-50
恆河猴TIGIT(SEQ ID NO：78)
Figure 105116461-A0202-12-0263-51
人類TIGIT胺基酸55-70(SEQ ID NO：79) TQVNWEQQDQLLAICN
人類TIGIT胺基酸105-122(SEQ ID NO：80)EYFCIYHTYPDGTYTGRI
313R14/313R19輕鏈CDR1(SEQ ID NO：81)QASQNIYSDLAW
不具有信號序列之313M33重鏈(IgG4)Ver2胺基酸序列(SEQ ID NO：82)
Figure 105116461-A0202-12-0264-52
<110> 安可美德藥物股份有限公司(ONCOMED PHARMACEUTICALS,INC.)
<120> TIGIT結合劑和彼之用途
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<150> US 62/167,582
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<150> US 62/205,279
<151> 2015-08-14
<150> US 62/313,487
<151> 2016-03-25
<160> 82
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠TIGIT
<400> 1
Figure 105116461-A0202-12-0265-53
Figure 105116461-A0202-12-0266-54
<210> 2
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠TIGIT
<400> 2
Figure 105116461-A0202-12-0266-55
Figure 105116461-A0202-12-0267-56
<210> 3
<211> 120
<213> 人工序列
<212> PRT
<220>
<223> 小鼠TIGIT細胞外功能域
<400> 3
Figure 105116461-A0202-12-0268-57
<210> 4
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類TIGIT
<400> 4
Figure 105116461-A0202-12-0268-58
Figure 105116461-A0202-12-0269-59
Figure 105116461-A0202-12-0270-60
<210> 5
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類TIGIT
<400> 5
Figure 105116461-A0202-12-0270-61
Figure 105116461-A0202-12-0271-62
<210> 6
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠TIGIT細胞外功能域
<400> 6
Figure 105116461-A0202-12-0271-63
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313R11/313R12重鏈CDR1
<400> 7
Figure 105116461-A0202-12-0272-64
<210> 8
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313R11/313R12/313R14/313R19重鏈CDR2
<400> 8
Figure 105116461-A0202-12-0272-65
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313R11/313R12/313R14/313R19重鏈CDR3
<400> 9
Figure 105116461-A0202-12-0272-66
<210> 10
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313R11/313R12輕鏈CDR1
<400> 10
Figure 105116461-A0202-12-0272-67
Figure 105116461-A0202-12-0273-68
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313R11/313R12輕鏈CDR2
<400> 11
Figure 105116461-A0202-12-0273-69
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313R11/313R12輕鏈CDR3
<400> 12
Figure 105116461-A0202-12-0273-70
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313R14/313R19重鏈CDR1
<400> 13
Figure 105116461-A0202-12-0273-71
<210> 14
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313R14/313R19輕鏈CDR1
<400> 14
Figure 105116461-A0202-12-0274-72
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313R14/313R19輕鏈CDR2
<400> 15
Figure 105116461-A0202-12-0274-73
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313R14/313R19輕鏈CDR3
<400> 16
Figure 105116461-A0202-12-0274-74
<210> 17
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313R11/313R12重鏈可變區
<400> 17
Figure 105116461-A0202-12-0274-75
Figure 105116461-A0202-12-0275-76
<210> 18
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313R11/313R12輕鏈可變區
<400> 18
Figure 105116461-A0202-12-0275-77
<210> 19
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313R14重鏈可變區
<400> 19
Figure 105116461-A0202-12-0276-78
<210> 20
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313R14/313R19/313R20輕鏈可變區
<400> 20
Figure 105116461-A0202-12-0276-79
Figure 105116461-A0202-12-0277-80
<210> 21
<211> 458
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313R11重鏈(mIgG1)
<220>
<221> 訊號肽
<222> (1)..(19)
<400> 21
Figure 105116461-A0202-12-0277-81
Figure 105116461-A0202-12-0278-82
Figure 105116461-A0202-12-0279-83
<210> 22
<211> 464
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313R12重鏈(mIgG2)
<220>
<221> 訊號肽
<222> (1)..(19)
<400> 22
Figure 105116461-A0202-12-0280-84
Figure 105116461-A0202-12-0281-85
Figure 105116461-A0202-12-0282-86
<210> 23
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313R11/313R12輕鏈
<220>
<221> 訊號肽
<222> (1)..(19)
<400> 23
Figure 105116461-A0202-12-0282-87
Figure 105116461-A0202-12-0283-88
<210> 24
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313R14重鏈(hIgG1)
<220>
<221> 訊號肽
<222> (1)..(19)
<400> 24
Figure 105116461-A0202-12-0283-89
Figure 105116461-A0202-12-0284-90
Figure 105116461-A0202-12-0285-91
Figure 105116461-A0202-12-0286-92
<210> 25
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313R14/313R19/313R20輕鏈
<220>
<221> 訊號肽
<222> (1)..(20)
<400> 25
Figure 105116461-A0202-12-0286-93
Figure 105116461-A0202-12-0287-94
<210> 26
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313R11重鏈(mIgG1)
<400> 26
Figure 105116461-A0202-12-0287-95
Figure 105116461-A0202-12-0288-96
Figure 105116461-A0202-12-0289-97
<210> 27
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313R12重鏈(mIgG2)
<400> 27
Figure 105116461-A0202-12-0289-98
Figure 105116461-A0202-12-0290-99
Figure 105116461-A0202-12-0291-100
<210> 28
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313R11/313R12輕鏈
<400> 28
Figure 105116461-A0202-12-0292-101
Figure 105116461-A0202-12-0293-102
<210> 29
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313R14重鏈(hIgG1)
<400> 29
Figure 105116461-A0202-12-0293-103
Figure 105116461-A0202-12-0294-105
Figure 105116461-A0202-12-0295-106
<210> 30
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313R14/313R19/313R20輕鏈
<400> 30
Figure 105116461-A0202-12-0295-107
Figure 105116461-A0202-12-0296-108
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AH-1肽
<400> 31
Figure 105116461-A0202-12-0296-109
<210> 32
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313R19/313R20重鏈可變區
<400> 32
Figure 105116461-A0202-12-0296-110
Figure 105116461-A0202-12-0297-111
<210> 33
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313R19重鏈(IgG1)
<220>
<221> 訊號肽
<222> (1)..(19)
<400> 33
Figure 105116461-A0202-12-0297-112
Figure 105116461-A0202-12-0298-113
Figure 105116461-A0202-12-0299-115
<210> 34
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313R19重鏈(IgG1)
<400> 34
Figure 105116461-A0202-12-0300-116
Figure 105116461-A0202-12-0301-117
Figure 105116461-A0202-12-0302-118
<210> 35
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 35
Figure 105116461-A0202-12-0302-119
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 36
Figure 105116461-A0202-12-0302-120
<210> 37
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 37
Figure 105116461-A0202-12-0302-121
<210> 38
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 38
Figure 105116461-A0202-12-0303-122
<210> 39
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 39
Figure 105116461-A0202-12-0303-123
<210> 40
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FLAG Tag
<400> 40
Figure 105116461-A0202-12-0303-124
<210> 41
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IgG1重鏈恆定區
<400> 41
Figure 105116461-A0202-12-0303-125
Figure 105116461-A0202-12-0304-126
Figure 105116461-A0202-12-0305-127
<210> 42
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IgG2重鏈恆定區
<400> 42
Figure 105116461-A0202-12-0305-128
Figure 105116461-A0202-12-0306-129
Figure 105116461-A0202-12-0307-130
<210> 43
<211> 377
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IgG3重鏈恆定區
<400> 43
Figure 105116461-A0202-12-0307-131
Figure 105116461-A0202-12-0308-132
Figure 105116461-A0202-12-0309-133
<210> 44
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IgG4重鏈恆定區
<400> 44
Figure 105116461-A0202-12-0309-134
Figure 105116461-A0202-12-0310-135
<210> 45
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IgG1 Fc區(13A變型)
<400> 45
Figure 105116461-A0202-12-0310-136
Figure 105116461-A0202-12-0311-137
<210> 46
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IgG1 Fc區(13B變型)
<400> 46
Figure 105116461-A0202-12-0312-138
Figure 105116461-A0202-12-0313-139
<210> 47
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IgG1 Fc區(13A變型)
<400> 47
Figure 105116461-A0202-12-0313-140
Figure 105116461-A0202-12-0314-141
<210> 48
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IgG1 Fc區(13B變型)
<400> 48
Figure 105116461-A0202-12-0314-142
Figure 105116461-A0202-12-0315-143
<210> 49
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IgG2 Fc區(13A變型)
<400> 49
Figure 105116461-A0202-12-0316-144
Figure 105116461-A0202-12-0317-145
<210> 50
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IgG2 Fc區(13B變型)
<400> 50
Figure 105116461-A0202-12-0317-146
Figure 105116461-A0202-12-0318-147
<210> 51
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IgG2 Fc區(13A變型)
<400> 51
Figure 105116461-A0202-12-0318-148
Figure 105116461-A0202-12-0319-149
<210> 52
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IgG2 Fc區(13A變型)
<400> 52
Figure 105116461-A0202-12-0319-150
Figure 105116461-A0202-12-0320-151
<210> 53
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IgG2 Fc區(13B變型)
<400> 53
Figure 105116461-A0202-12-0320-152
Figure 105116461-A0202-12-0321-153
Figure 105116461-A0202-12-0322-154
<210> 54
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IgG2 Fc區(13B變型)
<400> 54
Figure 105116461-A0202-12-0322-155
Figure 105116461-A0202-12-0323-156
<210> 55
<211> 462
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313R20重鏈(IgG4)
<220>
<221> 訊號肽
<222> (1)..(19)
<400> 55
Figure 105116461-A0202-12-0323-157
Figure 105116461-A0202-12-0324-158
Figure 105116461-A0202-12-0325-159
<210> 56
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313R20重鏈(IgG4)
<400> 56
Figure 105116461-A0202-12-0325-160
Figure 105116461-A0202-12-0326-161
Figure 105116461-A0202-12-0327-162
<210> 57
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313M26/313M32重鏈CDR1
<400> 57
Figure 105116461-A0202-12-0328-163
<210> 58
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313M26/313M32重鏈CDR2
<400> 58
Figure 105116461-A0202-12-0328-164
<210> 59
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313M26/313M32重鏈CDR3
<400> 59
Figure 105116461-A0202-12-0328-165
<210> 60
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313M26/313M32 Light chain CDR1
<400> 60
Figure 105116461-A0202-12-0328-166
<210> 61
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313M26/313M32輕鏈CDR2
<400> 61
Figure 105116461-A0202-12-0329-167
<210> 62
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313M26/313M32輕鏈CDR3
<400> 62
Figure 105116461-A0202-12-0329-168
<210> 63
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313M26重鏈可變區
<400> 63
Figure 105116461-A0202-12-0329-169
Figure 105116461-A0202-12-0330-170
<210> 64
<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313M26輕鏈可變區
<400> 64
Figure 105116461-A0202-12-0330-171
<210> 65
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 313M26重鏈可變區
<400> 65
Figure 105116461-A0202-12-0331-172
<210> 66
<211> 297
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 313M26輕鏈可變區
<400> 66
Figure 105116461-A0202-12-0331-173
<210> 67
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313M32重鏈可變區
<400> 67
Figure 105116461-A0202-12-0331-174
Figure 105116461-A0202-12-0332-175
<210> 68
<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313M32輕鏈可變區
<400> 68
Figure 105116461-A0202-12-0332-176
Figure 105116461-A0202-12-0333-177
<210> 69
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313M32重鏈(IgG1)
<220>
<221> 訊號肽
<222> (1)..(19)
<400> 69
Figure 105116461-A0202-12-0333-178
Figure 105116461-A0202-12-0334-179
Figure 105116461-A0202-12-0335-180
<210> 70
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313M32重鏈(IgG1)
<400> 70
Figure 105116461-A0202-12-0335-181
Figure 105116461-A0202-12-0336-182
Figure 105116461-A0202-12-0337-183
<210> 71
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313M32輕鏈
<220>
<221> 訊號肽
<222> (1)..(20)
<400> 71
Figure 105116461-A0202-12-0338-184
Figure 105116461-A0202-12-0339-185
<210> 72
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313M32輕鏈
<400> 72
Figure 105116461-A0202-12-0339-186
Figure 105116461-A0202-12-0340-187
<210> 73
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 313M32重鏈可變區
<400> 73
Figure 105116461-A0202-12-0340-188
<210> 74
<211> 297
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 313M32輕鏈可變區
<400> 74
Figure 105116461-A0202-12-0340-189
Figure 105116461-A0202-12-0341-190
<210> 75
<211> 1404
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 313M32重鏈(IgG1)
<400> 75
Figure 105116461-A0202-12-0341-191
Figure 105116461-A0202-12-0342-192
<210> 76
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 313M32輕鏈
<400> 76
Figure 105116461-A0202-12-0342-193
<210> 77
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹獼猴
<400> 77
Figure 105116461-A0202-12-0343-194
Figure 105116461-A0202-12-0344-195
<210> 78
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 恆河猴
<400> 78
Figure 105116461-A0202-12-0344-196
Figure 105116461-A0202-12-0345-197
<210> 79
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類TIGIT胺基酸55-70
<400> 79
Figure 105116461-A0202-12-0345-198
<210> 80
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類TIGIT胺基酸105-122
<400> 80
Figure 105116461-A0202-12-0345-199
Figure 105116461-A0202-12-0346-200
<210> 81
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313R14/313R19輕鏈CDR1
<400> 81
Figure 105116461-A0202-12-0346-201
<210> 82
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 313M33重鏈(IgG4)Ver2
<400> 82
Figure 105116461-A0202-12-0346-202
Figure 105116461-A0202-12-0347-203
Figure 105116461-A0202-12-0348-204

Claims (21)

  1. 一種特異性結合人類TIGIT的細胞外結構域之單離抗體，其包含：(a)包含TSDYAWN(SEQ ID NO：57)之重鏈CDR1、包含YISYSGSTSYNPSLRS(SEQ ID NO：58)之重鏈CDR2及包含ARRQVGLGFAY(SEQ ID NO：59)之重鏈CDR3；及(b)包含KASQDVSTAVA(SEQ ID NO：60)之輕鏈CDR1、包含SASYRYT(SEQ ID NO：61)之輕鏈CDR2及包含QQHYSTP(SEQ ID NO：62)之輕鏈CDR3。
  2. 根據申請專利範圍第1項之抗體，其包含：(a)與SEQ ID NO：67具有至少90%之序列一致性的重鏈可變區及與SEQ ID NO：68具有至少90%之序列一致性的輕鏈可變區；或(b)與SEQ ID NO：63具有至少90%之序列一致性的重鏈可變區及與SEQ ID NO：64具有至少90%之序列一致性的輕鏈可變區。
  3. 根據申請專利範圍第2項之抗體，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：67且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：68。
  4. 根據申請專利範圍第1至3項中任一項之抗體，其為單克隆抗體、人源化抗體、人類抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、包含抗原結合部位之抗體片段、IgG1抗 體、IgG2抗體或IgG4抗體。
  5. 根據申請專利範圍第1項之抗體，其包含：(a)SEQ ID NO：70之重鏈胺基酸序列和SEQ ID NO：72之輕鏈胺基酸序列；或(b)SEQ ID NO：82之重鏈胺基酸序列和SEQ ID NO：72之輕鏈胺基酸序列。
  6. 一種雙特異性劑，其包含：a)特異性結合TIGIT之第一臂；及b)第二臂(second arm)，其中該第一臂包含根據申請專利範圍第1至5項中任一項之抗體。
  7. 根據申請專利範圍第6項之雙特異性劑，其中該第二臂特異性結合PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM-3、LAG-3、OX-40或GITR。
  8. 根據申請專利範圍第1至3項中任一項之抗體，其：(a)抑制TIGIT與脊髓灰白質病毒受體(PVR)結合；(b)抑制或阻斷TIGIT與PVR之間的交互作用；(c)抑制TIGIT傳訊；(d)為經TIGIT媒介之傳訊的拮抗劑；(e)抑制TIGIT活化；(f)抑制TIGIT之磷酸化；及/或(g)降低TIGIT之細胞表面表現。
  9. 根據申請專利範圍第1至3項中任一項之抗體， 其：(a)誘發及/或增強免疫反應；(b)增加細胞媒介之免疫力；(c)增加T細胞活性；(d)增加溶胞性T細胞(CTL)活性；(e)增加自然殺手(NK)細胞活性；(f)增加IL-2生產及/或IL-2生產細胞的數目；(g)增加IFN-γ生產及/或IFN-γ生產細胞的數目；(h)增強Th1型免疫反應；(i)降低IL-4生產及/或IL-4生產細胞的數目；(j)降低IL-10及/或IL-10生產細胞的數目；(k)降低Th2型免疫反應；(l)抑制及/或降低調節性T細胞(Treg)之抑制活性；及/或(j)抑制及/或降低骨髓衍生性抑制細胞(MDSC)之抑制活性。
  10. 一種細胞，其包含或生產根據申請專利範圍第1至5項中任一項之抗體或根據申請專利範圍第6至7項中任一項之雙特異性劑。
  11. 一種醫藥組成物，其包含根據申請專利範圍第1至5項中任一項之抗體或根據申請專利範圍第6至7項中任一項之雙特異性劑及醫藥上可接受的載劑。
  12. 一種單離多核苷酸分子，其包含編碼根據申請專利範圍第1至5項中任一項之抗體或根據申請專利範圍第 6至7項中任一項之雙特異性劑的多核苷酸。
  13. 一種根據申請專利範圍第1至5項中任一項之抗體或根據申請專利範圍第6至7項中任一項之雙特異性劑於製備用於誘發、活化、促進、增強、提高或延長個體的免疫反應的藥物之用途。
  14. 根據申請專利範圍第13項之用途，其中該免疫反應係對抗腫瘤或癌症。
  15. 一種根據申請專利範圍第1至5項中任一項之抗體或根據申請專利範圍第6至7項中任一項之雙特異性劑於製備用於抑制腫瘤生長的藥物之用途。
  16. 根據申請專利範圍第15項之用途，其中該腫瘤係選自由下列所組成之群組：結腸直腸腫瘤、卵巢腫瘤、胰臟腫瘤、肺腫瘤、肝腫瘤、乳房腫瘤、腎臟腫瘤、前列腺腫瘤、胃腸道腫瘤、黑色素瘤、子宮頸腫瘤、膀胱腫瘤、神經膠質母細胞瘤和頭與頸腫瘤。
  17. 一種根據申請專利範圍第1至5項中任一項之抗體或根據申請專利範圍第6至7項中任一項之雙特異性劑於製備用於治療癌症的藥物之用途。
  18. 根據申請專利範圍第17項之用途，其中該癌症係選自由下列所組成之群組：結腸直腸癌、卵巢癌、胰臟癌、肺癌、肝癌、乳癌、腎臟癌、前列腺癌、胃腸道癌、黑色素瘤、子宮頸癌、膀胱癌、神經膠質母細胞瘤和頭與頸癌。
  19. 根據申請專利範圍第13至18項中任一項之用 途，其中該藥物進一步包含至少一種額外治療劑。
  20. 根據申請專利範圍第19項之用途，其中該額外治療劑為化療劑、抗體或免疫治療劑。
  21. 根據申請專利範圍第19項之用途，其中該額外治療劑為選自由下列所組成之群組的免疫治療劑：GM-CSF、M-CSF、G-CSF、IL-2、IL-3、IL-12、IL-15、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、4-1BB配體、GITRL、OX-40配體、抗-PD-1抗體、抗-PD-L1抗體、抗-CTLA4抗體、抗-LAG-3抗體、抗-CD3抗體、抗-GITR抗體、抗-OX-40抗體和抗-TIM-3抗體。
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