WO2023234748A1 - 항-tigit 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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tigit
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antigen
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조홍석
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    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • It relates to a novel anti-TIGIT antibody and its use in enhancing immunity, preventing cancer, and preventing and/or treating immune-related diseases.
  • Cancer immunotherapy is a method of treating cancer using the body's immune system, and is called the fourth treatment for cancer following chemotherapy, surgery, and radiation therapy. Cancer immunotherapy requires mechanisms to activate the immune system to increase recognition and response to tumor cells. Immune system activation is a complex mechanism involving the functions of a variety of cells, such as antigen-presenting cells, which are important for the initiation of antigen-specific responses, and effector cells, which are responsible for tumor cell destruction.
  • effector cells include cytotoxic T cells.
  • TIGIT T cell immunoglobulin and ITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif) domain
  • WUCAM WUCAM
  • VSIG9 Vstm3
  • TIGIT is a transmembrane protein containing an intracellular ITIM domain, a transmembrane domain, and an immunoglobulin variable domain.
  • TIGIT expression is increased in disease settings such as tumor infiltrating lymphocytes (TIL) and infections.
  • TIGIT expression may be a marker of exhausted T cells with lower effector function compared to TIGIT negative cells. Additionally, Treg cells expressing TIGIT exhibit enhanced immunosuppressive activity compared to the TIGIT negative Treg population.
  • drugs that have an antagonistic effect on TIGIT e.g., antagonistic anti-TIGIT antibodies, etc.
  • TIGIT drugs that have an antagonistic effect on TIGIT
  • drugs that have an antagonistic effect on TIGIT induce immune system activation and enhance immune responses in disease states such as cancer, thereby providing a beneficial effect in disease treatment. It is expected to show.
  • Anti-TIGIT antibodies that bind to TIGIT and medicinal uses thereof are provided.
  • One example provides an anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to TIGIT.
  • the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof is provided.
  • the heavy chain variable region may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 14. Additionally, the light chain variable region may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 16.
  • the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof is the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 14, and
  • Light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 16
  • Another example is one or more selected from the group consisting of the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof, a nucleic acid molecule encoding the same, a recombinant vector containing the nucleic acid molecule, and a recombinant cell containing the nucleic acid molecule or the recombinant vector.
  • an immune-enhancing agent or pharmaceutical composition for immune-enhancing containing it as an active ingredient.
  • Another example is one or more selected from the group consisting of the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof, a nucleic acid molecule encoding the same, a recombinant vector containing the nucleic acid molecule, and a recombinant cell containing the nucleic acid molecule or the recombinant vector.
  • a pharmaceutical composition for the prevention and/or treatment of immune-related diseases containing it as an active ingredient.
  • Another example is one or more selected from the group consisting of the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof, a nucleic acid molecule encoding the same, a recombinant vector containing the nucleic acid molecule, and a recombinant cell containing the nucleic acid molecule or the recombinant vector.
  • an anticancer agent containing an active ingredient or a pharmaceutical composition for the prevention and/or treatment of cancer.
  • Another example is one or more pharmaceuticals selected from the group consisting of the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof, a nucleic acid molecule encoding the same, a recombinant vector containing the nucleic acid molecule, and a recombinant cell containing the nucleic acid molecule or the recombinant vector.
  • a method for enhancing immunity comprising the step of administering an effective amount to a subject in need of immune enhancement.
  • Another example is one or more pharmaceuticals selected from the group consisting of the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof, a nucleic acid molecule encoding the same, a recombinant vector containing the nucleic acid molecule, and a recombinant cell containing the nucleic acid molecule or the recombinant vector.
  • a method for preventing and/or treating an immune-related disease comprising administering an effective amount of the immune-related disease to a subject in need of prevention and/or treatment.
  • Another example is one or more pharmaceuticals selected from the group consisting of the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof, a nucleic acid molecule encoding the same, a recombinant vector containing the nucleic acid molecule, and a recombinant cell containing the nucleic acid molecule or the recombinant vector.
  • a method for preventing and/or treating cancer comprising the step of administering an effective amount to a subject in need of cancer prevention and/or treatment.
  • Another example is one or more types of immunity selected from the group consisting of the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof, a nucleic acid molecule encoding the same, a recombinant vector containing the nucleic acid molecule, and a recombinant cell containing the nucleic acid molecule or the recombinant vector.
  • a use for enhancing use or for manufacturing an immune adjuvant is provided.
  • Another example is one or more types of immunity selected from the group consisting of the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof, a nucleic acid molecule encoding the same, a recombinant vector containing the nucleic acid molecule, and a recombinant cell containing the nucleic acid molecule or the recombinant vector. It provides use for the prevention and/or treatment of related diseases or for the manufacture of drugs for the prevention and/or treatment of immune-related diseases.
  • Another example is one or more types of cancer selected from the group consisting of the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof, a nucleic acid molecule encoding the same, a recombinant vector containing the nucleic acid molecule, and a recombinant cell containing the nucleic acid molecule or the recombinant vector. It provides a use for the prevention and/or treatment of or for the production of a drug for the prevention and/or treatment of cancer.
  • the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof targets another immune checkpoint protein, such as PD-1, PD-L1, or both. It can be used in combination with drugs (antagonists).
  • the drug that can be used in combination may be an anti-PD-1 antibody, an anti-PD-L1 antibody, or all of these, but is not limited thereto.
  • Another example provides a nucleic acid molecule encoding the heavy chain complementarity determining region, heavy chain variable region, or heavy chain of an anti-TIGIT antibody.
  • Another example provides a light chain complementarity determining region, a light chain variable region, or a nucleic acid molecule encoding a light chain of an anti-TIGIT antibody.
  • nucleic acid molecule encoding the heavy chain complementarity determining region, heavy chain variable region or heavy chain of the anti-TIGIT antibody and the nucleic acid molecule encoding the light chain complementarity determining region, light chain variable region or light chain of the anti-TIGIT antibody together in one vector.
  • the recombinant vector may be an expression vector for expressing the nucleic acid molecule.
  • Another example provides a recombinant cell containing the above recombinant vector.
  • Another example provides a method for producing an anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof, including the step of expressing the nucleic acid molecule in a host cell.
  • the step of expressing the nucleic acid molecule in a host cell may include culturing a cell containing the nucleic acid molecule or a recombinant vector containing the same.
  • the method may further include the step of isolating and/or purifying the antibody from the medium after the expressing step.
  • anti-TIGIT antibodies or antigen-binding fragments thereof that bind to TIGIT and their medicinal uses are provided.
  • the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof has the function of activating immunity (e.g., strengthening effector T cell function, controlling Treg activity, increasing cytokine secretion, etc.) by blocking the action of TIGIT, and various immune activators and/ Alternatively, it may be applied as an immunotherapeutic agent.
  • One example provides an anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to TIGIT.
  • the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof is provided.
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 (CDR-H1),
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 (CDR-H2),
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6 (CDR-H3),
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8 (CDR-L1),
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10 (CDR-L2), and
  • Polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 12 (CDR-L3)
  • the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof More specifically, the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof,
  • a heavy chain variable region comprising CDR-H1 of SEQ ID NO: 1, CDR-H2 of SEQ ID NO: 3, and CDR-H3 of SEQ ID NO: 5, and CDR-L1 of SEQ ID NO: 7, CDR-L2 of SEQ ID NO: 9, and sequences CDR-L3 at number 11; or
  • a heavy chain variable region comprising CDR-H1 of SEQ ID NO: 2, CDR-H2 of SEQ ID NO: 4, and CDR-H3 of SEQ ID NO: 6, and CDR-L1 of SEQ ID NO: 8, CDR-L2 of SEQ ID NO: 10, and sequence CDR-L3 in number 12
  • the complementarity determining region is determined based on the CDR definition according to the kabat system.
  • CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, and CDR-H3 six CDRs (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, and CDR-H3) that can be included in the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein ) are summarized in Table 1 below:
  • CDR-H1, CDR-H2, and CDR-H3 refer to the heavy chain complementarity determining region
  • CDR-L1, CDR-L2, and CDR-L3 refer to the light chain complementarity determining region
  • the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof is,
  • a heavy chain variable region comprising CDR-H1 of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, CDR-H2 of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4, and CDR-H3 of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6, and
  • a light chain variable region comprising CDR-L1 of SEQ ID NO:7 or SEQ ID NO:8, CDR-L2 of SEQ ID NO:9 or SEQ ID NO:10, and CDR-L3 of SEQ ID NO:11 or SEQ ID NO:12
  • the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof More specifically, the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof,
  • a heavy chain variable region comprising CDR-H1 of SEQ ID NO: 1, CDR-H2 of SEQ ID NO: 3, and CDR-H3 of SEQ ID NO: 5, and CDR-L1 of SEQ ID NO: 7, CDR-L2 of SEQ ID NO: 9, and sequences Light chain variable region containing CDR-L3 at number 11; or
  • a heavy chain variable region comprising CDR-H1 of SEQ ID NO: 2, CDR-H2 of SEQ ID NO: 4, and CDR-H3 of SEQ ID NO: 6, and CDR-L1 of SEQ ID NO: 8, CDR-L2 of SEQ ID NO: 10, and sequence Light chain variable region containing CDR-L3 at number 12
  • the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof in another example, the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof,
  • a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 14, and
  • Light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 16
  • the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof More specifically, the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof,
  • a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15; or
  • a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16
  • the heavy chain variable region and/or light chain variable region may additionally include an appropriate signal sequence at the N terminus.
  • amino acid sequences of the heavy chain variable region and light chain variable region that can be included in the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein are shown in Table 2 below:
  • the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein is a TIGIT protein, e.g., a region of amino acid residues 51-70 of human TIGIT protein (NCBI Reference Sequence NP_776160.2; UniProtKB/SwissProt Q495A1-1) ( TAQVTQVNWEQQDQLLAICN; SEQ ID NO: 28) may bind to one or more or two or more (e.g., consecutively located) amino acids, but is not limited thereto.
  • TIGIT protein e.g., a region of amino acid residues 51-70 of human TIGIT protein (NCBI Reference Sequence NP_776160.2; UniProtKB/SwissProt Q495A1-1) ( TAQVTQVNWEQQDQLLAICN; SEQ ID NO: 28) may bind to one or more or two or more (e.g., consecutively located) amino acids, but is not limited thereto.
  • antibody refers to a general term for proteins that specifically bind to a specific antigen, and may be a protein produced by stimulation of an antigen within the immune system or a protein produced chemically or recombinantly. The type is not particularly limited. The antibody may be non-naturally produced, for example, recombinantly or synthetically produced.
  • the antibody may be an animal antibody (e.g., a mouse antibody, etc.), a chimeric antibody (e.g., a mouse-human chimeric antibody, etc.), a humanized antibody, or a human antibody.
  • the antibody may be a monoclonal antibody or polyclonal antibody.
  • the regions other than the heavy chain CDR and light chain CDR regions, or the heavy chain variable region and light chain variable region, as defined above, are used to control immunoglobulins of all subtypes (e.g., IgA, IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4), IgM, etc.), such as the framework region of immunoglobulins of all of the above subtypes, and/or the light chain constant region and/or the heavy chain constant region. It may be derived from the area.
  • the anti-TIGIT antibody provided herein may be a human IgG type antibody, such as IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4, but is not limited thereto.
  • a complete antibody (eg, IgG type) has a structure of two full-length light chains and two full-length heavy chains, and each light chain is connected to the heavy chain by a disulfide bond.
  • the constant region of an antibody is divided into a heavy chain constant region and a light chain constant region, and the heavy chain constant region has gamma ( ⁇ ), mu ( ⁇ ), alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ ), and epsilon ( ⁇ ) types, and subclasses. It has gamma 1 ( ⁇ 1), gamma 2 ( ⁇ 2), gamma 3 ( ⁇ 3), gamma 4 ( ⁇ 4), alpha 1 ( ⁇ 1), and alpha 2 ( ⁇ 2).
  • the constant region of the light chain has kappa ( ⁇ ) and lambda ( ⁇ ) types.
  • the anti-TIGIT antibody provided herein may include an IgG1 constant region as a heavy chain constant region and a kappa constant region as a light chain constant region, but is not limited thereto.
  • variable chain refers to a variable region domain V H containing an amino acid sequence with sufficient variable region sequence to confer specificity to an antigen and three constant region domains C H1 , C H2 and C H3 and a hinge ( It is interpreted to include both the full-length heavy chain including the hinge and fragments thereof.
  • light chain refers to both a full-length light chain and fragments thereof comprising a variable region domain V L and a constant region domain C L containing an amino acid sequence having a sufficient variable region sequence to confer specificity to an antigen. It is interpreted to mean inclusive.
  • CDR complementarity determining region
  • the term “CDR (complementarity determining region)” refers to a region among the variable regions of an antibody that confers antigen-binding specificity, and refers to the amino acid sequence of the hypervariable region of the heavy and light chains of immunoglobulins. .
  • the heavy and light chains may each contain three CDRs (CDRH1, CDRH2, CDRH3 and CDRL1, CDRL2, CDRL3).
  • the CDR may provide key contact residues for the antibody to bind to the antigen or epitope.
  • the term “specifically binds” or “specifically recognizes” has the same meaning commonly known to those skilled in the art, and refers to a condition in which an antigen and an antibody specifically interact to produce an immunological reaction. means that
  • CDR complementarity determining region
  • an antibody may be understood to include an antigen-binding fragment of an antibody that possesses antigen-binding ability.
  • antigen-binding fragment refers to any form of polypeptide containing a portion to which an antigen can bind (e.g., the six CDRs defined herein).
  • the antibody may be scFv, scFv-Fc, (scFv) 2 , Fab, Fab', or F(ab') 2 , but is not limited thereto.
  • Fab has one antigen-binding site with a structure that includes the variable regions of the light and heavy chains, the constant region of the light chain, and the first constant region (C H1 ) of the heavy chain.
  • Fab' differs from Fab in that it has a hinge region containing one or more cysteine residues at the C-terminus of the heavy chain C H1 domain.
  • F(ab') 2 antibody is produced when the cysteine residue in the hinge region of Fab' forms a disulfide bond.
  • Fv is a minimal antibody fragment containing only the heavy chain variable region and the light chain variable region, and recombinant techniques for producing Fv fragments are widely known in the art.
  • Double-chain Fv (two-chain Fv) is a non-covalent bond in which the heavy chain variable region and light chain variable region are connected, and single-chain Fv (single-chain Fv) is generally shared between the heavy chain variable region and the short chain variable region through a peptide linker. They can be connected by a bond or directly connected at the C-terminus to form a dimer-like structure, such as double-chain Fv.
  • the antigen-binding fragment can be obtained using a proteolytic enzyme (for example, Fab can be obtained by restriction digestion of the entire antibody with papain, and F(ab') 2 fragment can be obtained by digestion with pepsin), It can be produced through genetic recombination technology.
  • a proteolytic enzyme for example, Fab can be obtained by restriction digestion of the entire antibody with papain, and F(ab') 2 fragment can be obtained by digestion with pepsin
  • flankinge region refers to a region included in the heavy chain of an antibody, exists between the CH1 and CH2 regions, and functions to provide flexibility of the antigen binding site in the antibody.
  • Antibodies provided herein may be monoclonal antibodies.
  • Monoclonal antibodies can be prepared according to methods well known in the art. For example, it can be manufactured using phage display techniques. Alternatively, the antibody may be prepared as a monoclonal antibody derived from an animal (eg, mouse) by a conventional method.
  • individual monoclonal antibodies can be screened based on their binding ability to the receptor binding domain of TIGIT using a typical ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) format.
  • Conjugates can be tested for inhibitory activity through functional assays such as competitive ELISA or cell-based assays to test molecular interactions.
  • the respective affinities (Kd values) for the receptor binding domain of TIGIT can then be assayed for monoclonal antibody members selected based on their strong inhibitory activity.
  • the final selected antibodies can be prepared and used as humanized antibodies as well as antibodies in which the remaining portion, excluding the antigen-binding site, is a human immunoglobulin antibody.
  • Methods for producing humanized antibodies are well known in the art.
  • the antigen-binding fragment of the anti-TIGIT antibody refers to a fragment derived from the anti-TIGIT antibody and retaining binding ability to the antigen (TIGIT), and includes the six CDRs of the anti-TIGIT antibody described above.
  • Any polypeptide for example scFv, scFv-Fc, scFv-Ck (kappa constant region), scFv-C ⁇ (lambda constant region), (scFv) 2 , Fab, Fab' or F(ab') 2 days. However, it is not limited to this.
  • the antigen-binding fragment is an scFv, or a fusion polypeptide in which an scFv is fused to the Fc region of an immunoglobulin (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, etc.) (scFv-Fc), or a constant region of a light chain (e.g., It may be a fusion polypeptide (scFv-Ck or scFv-C ⁇ ) fused with (kappa or lambda), but is not limited thereto.
  • an immunoglobulin e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, etc.
  • scFv-Fc a constant region of a light chain
  • an antibody e.g., CDR, variable region, or heavy/light chain, antigen-binding fragment, etc.
  • “comprises a specific amino acid sequence, or consists of or is comprised of a specific amino acid sequence” means that the amino acid sequence is essentially the same. Cases where meaningless mutations (e.g., substitution, deletion, and/or addition of amino acid residues) that do not have a significant effect on antibody activity (e.g., antigen affinity, pharmacological activity, etc.) are introduced into the amino acid sequence. It could mean anything.
  • the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein has a binding affinity (K D ) for TIGIT (eg, human TIGIT) measured by, for example, surface plasmon resonance (SPR). Based on the case, it may be 10mM or less, 5mM or less, 1mM or less, 0.5mM or less, 0.2mM or less, 0.1mM or less, 0.05mM or less, 0.01mM or less, 0.005mM or less, or 0.001mM or less, for example.
  • K D binding affinity for TIGIT
  • SPR surface plasmon resonance
  • the heavy chain complementarity determining region (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, or a combination thereof), the light chain complementarity determining region (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3) of the previously described anti-TIGIT antibody , or a combination thereof), or a combination thereof;
  • a polypeptide molecule comprising a heavy chain variable region, a light chain variable region, or a combination thereof is provided.
  • the polypeptide molecule can be used to produce antibodies as a precursor for antibodies, as well as a protein scaffold (e.g., peptibody, nanobody, etc.) with a structure similar to that of an antibody, a component of a bispecific antibody, and a multispecific antibody. (For example, it may be included as a CDR or variable region).
  • a protein scaffold e.g., peptibody, nanobody, etc.
  • peptide + antibody refers to a fusion protein in which all or part of the constant region, such as the Fc portion of a peptide and an antibody, is fused together, and has a framework and function similar to that of an antibody.
  • the peptides previously described herein may serve as an antigen binding site (heavy and/or light chain CDRs or variable regions).
  • nanobody also called a single-domain antibody, refers to an antibody fragment containing a single variable domain of an antibody in monomeric form and selectively binds to a specific antigen, similar to a complete antibody. It has the characteristics of The molecular weight of nanobodies is typically about 12 kDa to about 15 kDa, which is very small compared to the typical molecular weight of a complete antibody (containing two heavy and two light chains) (about 150 kDa to about 160 kDa), and in some cases is smaller than the Fab fragment or scFv fragment.
  • multiple-binding antibody (which includes double-binding antibodies) refers to an antibody that recognizes and/or binds two or more different antigens, or recognizes and/or binds different regions of the same antigen.
  • the antigen-binding site of one of the above-described multiplex antibodies may include a polypeptide, antibody, or antigen-binding fragment that binds to TIGIT as described above.
  • polypeptide, antibody, or antigen-binding fragment that binds to TIGIT may be used in the form of a conjugate conjugated with one or more types selected from the group consisting of useful polymers, labels, etc.
  • the useful polymer may be, for example, a polymer other than a protein that increases the in vivo half-life of a polypeptide, antibody, and/or antigen-binding fragment, and may be polyethylene glycol (PEG) (e.g., 2 kDa, 5 kDa, 10 kDa, 12 kDa, 20 kDa, 30 kDa or 40 kDa PEG), dextran, monomethoxypolyethylene glycol (mPEG), etc. may be selected from the group consisting of one or more hydrophilic polymers. , but is not limited to this.
  • PEG polyethylene glycol
  • mPEG monomethoxypolyethylene glycol
  • the labeling substances include rare earth chelating agents, fluorescein and its derivatives, rhodamine and its derivatives, isothiocyanate, phycoerythrin, phycocyanin, allophycocyanin, o-phthalaldehyde, fluorescein, and 152Eu. , dansyl, umbelliferone, luciferin, luminal label, isoluminal label, aromatic acridinium ester label, imidazole label, acridinium salt label, oxalate ester label, aequorine label, 2,3-label.
  • It may be one or more fluorescent or chemiluminescent small molecule compounds selected from the group consisting of dihydrophthalazinedione, biotin/avidin, spin labels, stable free radicals, etc., or a radioactive isotope, but is not limited thereto.
  • the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof blocks the action of TIGIT (e.g., interaction between TIGIT and its ligand, CD155 (PVR), etc.) to activate immunity (e.g., effector T cells and NK cells). It has the function of strengthening function, controlling Treg activity, increasing cytokine secretion, etc.) Accordingly, the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof can be usefully applied to enhance immunity, prevent and/or treat immune-related diseases, and especially prevent and/or treat cancer.
  • Another example provides an immunostimulant or pharmaceutical composition for immune enhancement comprising the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient.
  • Another example provides a pharmaceutical composition for preventing and/or treating immune-related diseases comprising the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient.
  • Another example provides an anticancer agent or a pharmaceutical composition for the prevention and/or treatment of cancer containing the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient.
  • Another example provides a method for enhancing immunity, including administering a pharmaceutically effective amount of the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof to a subject in need of immune enhancement.
  • the immune enhancement method may further include the step of identifying a subject in need of immune enhancement prior to the administering step.
  • Another example is a method for preventing and/or treating an immune-related disease, comprising administering a pharmaceutically effective amount of the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof to a subject in need of prevention and/or treatment of an immune-related disease.
  • the method of preventing and/or treating an immune-related disease may further include the step of identifying a subject in need of prevention and/or treatment of an immune-related disease before the administering step.
  • Another example provides a method for preventing and/or treating cancer, comprising administering a pharmaceutically effective amount of the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof to a subject in need of cancer prevention and/or treatment.
  • the cancer prevention and/or treatment method may further include the step of identifying a subject in need of cancer prevention and/or treatment before the administering step.
  • Another example provides the use of the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof for enhancing immunity or producing an adjuvant.
  • Another example provides the use of the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof for the prevention and/or treatment of immune-related diseases or for the production of a drug for the prevention and/or treatment of immune-related diseases.
  • Another example provides use of the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof for the prevention and/or treatment of cancer, or for the production of a drug for the prevention and/or treatment of cancer.
  • the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof is a drug (antagonist) that targets another immune checkpoint protein, such as PD-1, PD-L1, or both.
  • the pharmaceutical composition may further include a drug targeting PD-1, PD-L1, or both, in addition to the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the method may further include the step of administering a drug targeting PD-1, PD-L1, or both, in addition to the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the drug that can be used in combination may be an anti-PD-1 antibody, an anti-PD-L1 antibody, or all of these, but is not limited thereto.
  • the anti-PD-1 antibody may be one or more types selected from the group consisting of Pembrolizumab, Nivolumab, etc., but is not limited thereto.
  • immunoenhancement may mean inducing an initial immune response to an antigen or increasing an existing immune response, and is equivalent to terms such as immune stimulation, immune enhancement, and immune activation. They can be interchangeable in meaning.
  • immunoenhancement is the enhancement (activation) and/or proliferation of immune cells (effector T cells, such as cytotoxic T cells; CD3+ T cells, CD4+ T cells, CD8+ T cells, NK cells, etc.), regulatory T cells ( It may mean one or more selected from the group consisting of suppressing and/or depleting (Treg) activity, increasing production and/or secretion of immune proteins (e.g., cytokines, etc.), but is not limited thereto.
  • immune-related disease encompasses all diseases caused by disorders and/or insufficient activity of the immune system, for example, a group consisting of cancer, infectious diseases, autoimmune diseases, inflammatory diseases, etc. It may be one or more selected from , but is not limited thereto.
  • the cancer may be a solid cancer or a hematological cancer, but is not limited to, squamous cell cancer, lung cancer (e.g., small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, adenocarcinoma of the lung, squamous cell carcinoma of the lung, etc.), peritoneal cancer, skin cancer, melanoma ( (e.g., skin or intraocular melanoma, etc.), rectal cancer, esophageal cancer, small intestine cancer, endocrine cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, chronic or acute leukemia, lymphocytic lymphoma, liver cancer, bile duct cancer, stomach cancer, and pancreatic cancer.
  • lung cancer e.g., small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, adenocarcinoma of the lung, squamous cell carcinoma of the lung, etc.
  • peritoneal cancer skin cancer
  • glioblastoma cervical cancer, ovarian cancer, bladder cancer, breast cancer, colon cancer (e.g., colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer, etc.), endometrial cancer, uterine cancer, salivary gland cancer, kidney cancer, prostate cancer, vulva cancer, head and neck cancer, brain cancer, It may be one or more selected from the group consisting of osteosarcoma, etc.
  • the cancer prevention and/or treatment effect includes the effect of removing (killing) cancer cells, the effect of inhibiting the development and/or growth of cancer cells, and the effect of cancer caused by migration, invasion, metastasis, etc. Includes effects that suppress deterioration.
  • infectious diseases, autoimmune diseases, and inflammatory diseases are caused by strengthening the immune system described above (e.g., strengthening the function of immune cells (effector T cells, such as cytotoxic T cells; CD3+ T cells, CD4+ T cells, CD8+ T cells, NK cells, etc.) (activation) and/or proliferation, inhibition and/or depletion of regulatory T cell (Treg) activity, production of immune proteins (e.g., cytokines (IL-2, IFN-gamma, TNF-alpha, etc.)) and/ or increased secretion, etc.) may be selected from among all infectious diseases, autoimmune diseases, and inflammatory diseases that can be treated, alleviated, and/or prevented.
  • immune cells effector T cells, such as cytotoxic T cells; CD3+ T cells, CD4+ T cells, CD8+ T cells, NK cells, etc.
  • Treg regulatory T cell
  • immune proteins e.g., cytokines (IL-2, IFN-gamma, TNF-alpha
  • infectious disease is a general term for diseases that occur when disease-causing pathogens, such as viruses, bacteria, fungi, and parasites, spread and invade living organisms (e.g., animals, including humans). It may be an infection with one or more pathogens selected from the group consisting of parasites, etc., or a disease (infectious disease) caused by the infection.
  • disease-causing pathogens such as viruses, bacteria, fungi, and parasites
  • living organisms e.g., animals, including humans.
  • pathogens selected from the group consisting of parasites, etc.
  • a disease infectious disease caused by the infection.
  • autoimmune diseases include rheumatoid arthritis, type 1 diabetes, Crohn's disease, ulcerative colitis, Behcet's syndrome, lupus, Sjögren's syndrome, myasthenia gravis, scleroderma, hypothyroidism, hyperthyroidism, psoriasis, vitiligo, multiple sclerosis, and autoimmune diseases. It may be selected from the group consisting of hepatitis, autoimmune nephritis, autoimmune pancreatitis, autoimmune encephalitis, cytokine storm, etc., but is not limited thereto.
  • the inflammatory disease refers to inflammation (e.g., chronic inflammation or acute inflammation) or diseases caused by inflammation, such as heart inflammation (e.g., coronary artery disease, angina, myocardial infarction, pericarditis, myocarditis, etc.), vascular disease, etc.
  • inflammation e.g., chronic inflammation or acute inflammation
  • diseases caused by inflammation such as heart inflammation (e.g., coronary artery disease, angina, myocardial infarction, pericarditis, myocarditis, etc.), vascular disease, etc.
  • Inflammation e.g., atherosclerosis, vasculitis, disseminated intravascular coagulation (DIC), immune thrombocytopenic purpura (ITP), thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP), anemia, etc.
  • upper respiratory tract inflammation e.g., acute nasopharyngitis, allergic rhinitis
  • sinusitis e.g., sinusitis, pharyngitis, tonsillitis, laryngitis, etc.
  • lower respiratory tract and/or lung inflammation e.g., bronchitis, bronchiectasis, asthma, chronic pulmonary disease (COPD), pneumonia, interstitial lung disease, tuberculosis, etc.
  • upper gastrointestinal tract inflammation e.g.
  • the subject of administration of the anti-TIGIT antibody, antigen-binding fragment thereof, and/or pharmaceutical composition containing the same provided herein may be any animal or cell, for example, humans, primates such as monkeys, rodents such as rats, mice, etc. It may be an animal selected from mammals including, or cells, tissues, body fluids (e.g., serum), or cultures thereof derived from (isolated) such animals, such as humans or cells, tissues isolated from humans, It may be a bodily fluid (eg, serum).
  • mammals including, or cells, tissues, body fluids (e.g., serum), or cultures thereof derived from (isolated) such animals, such as humans or cells, tissues isolated from humans, It may be a bodily fluid (eg, serum).
  • the pharmaceutical composition may further include a pharmaceutically acceptable carrier, in addition to the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient, and the carrier is commonly used in the formulation of protein drugs, and includes lactose. , dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, gum acacia, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methyl hydroxy. It may be one or more selected from the group consisting of benzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, etc., but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition may further include one or more selected from the group consisting of diluents, excipients, lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, etc. commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions.
  • the anti-TIGIT antibody, antigen-binding fragment thereof, and/or pharmaceutical composition may be administered through oral or parenteral routes.
  • parenteral administration it can be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, endothelial administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, and intrarectal administration.
  • proteins or peptides are digested, so oral compositions must be formulated to coat the active agent or protect it from degradation in the stomach.
  • the anti-TIGIT antibody, its antigen-binding fragment and/or pharmaceutical composition may be in the form of a solution, suspension, syrup or emulsion in oil or aqueous medium, or in the form of extract, powder, powder, granule, tablet or capsule, injection, etc. It may be formulated in a form, and a dispersant or stabilizer may be additionally included for formulation.
  • the content of the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof, which is an active ingredient in the pharmaceutical composition is determined by the formulation method, administration method, patient's age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration interval, administration route, excretion rate, and It can be prescribed in various ways depending on factors such as response sensitivity.
  • the daily dosage of the pharmaceutical composition is 0.00001 to 1000 mg/kg, 0.00001 to 500 mg/kg, 0.00001 to 100 mg/kg, 0.00001 to 50 mg based on the active ingredient (anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof).
  • the daily dosage may be formulated as a single preparation in unit dosage form, may be formulated in appropriate portions, or may be prepared by placing it in a multi-dose container.
  • the pharmaceutically effective amount refers to the amount of the active ingredient that can exhibit the desired pharmaceutical activity, and may be within the dosage range described above.
  • Another example provides a nucleic acid molecule encoding the heavy chain complementarity determining region, heavy chain variable region, or heavy chain of an anti-TIGIT antibody.
  • Another example provides a light chain complementarity determining region, a light chain variable region, or a nucleic acid molecule encoding a light chain of an anti-TIGIT antibody.
  • nucleic acid molecule encoding the heavy chain complementarity determining region, heavy chain variable region or heavy chain of the anti-TIGIT antibody and the nucleic acid molecule encoding the light chain complementarity determining region, light chain variable region or light chain of the anti-TIGIT antibody together in one vector.
  • the recombinant vector may be an expression vector for expressing the nucleic acid molecule.
  • Another example provides a recombinant cell containing the above recombinant vector.
  • vector refers to a means for expressing a gene of interest in a host cell.
  • examples include viral vectors such as plasmid vectors, cosmid vectors and bacteriophage vectors, lentiviral vectors, adenovirus vectors, retroviral vectors and adeno-associated viral vectors.
  • Vectors that can be used as the recombinant vector include plasmids often used in the art (e.g., pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14 , pGEX series, pET series, and pUC19, etc.), phages (e.g., ⁇ gt4 ⁇ B, ⁇ -Charon, ⁇ z1, and M13, etc.), or viruses (e.g., SV40, etc.).
  • plasmids often used in the art (e.g., pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLA
  • the nucleic acid molecule can be operably linked to a promoter.
  • operably linked refers to a functional linkage between a nucleotide expression control sequence (e.g., a promoter sequence) and another nucleotide sequence.
  • the regulatory sequences can be “operatively linked” to regulate transcription and/or translation of other nucleotide sequences.
  • the recombinant vector can typically be constructed as a vector for cloning or a vector for expression.
  • the expression vector may be one commonly used in the art to express foreign proteins in plants, animals, or microorganisms.
  • the recombinant vector can be constructed through various methods known in the art.
  • the recombinant vector can be constructed using prokaryotic cells or eukaryotic cells as hosts.
  • a strong promoter capable of advancing transcription e.g., pL ⁇ promoter, CMV promoter, trp promoter, lac promoter, tac promoter, T7 promoter, etc.
  • a ribosome binding site for initiation of translation e.g., pL ⁇ promoter, CMV promoter, trp promoter, lac promoter, tac promoter, T7 promoter, etc.
  • a ribosome binding site for initiation of translation e.g., pL ⁇ promoter, CMV promoter, trp promoter, lac promoter, tac promoter, T7 promoter, etc.
  • the origin of replication operating in the eukaryotic cell included in the vector includes the f1 origin of replication, the SV40 origin of replication, the pMB1 origin of replication, the adeno origin of replication, the AAV origin of replication, and the BBV origin of replication. It is not limited.
  • promoters derived from the genome of mammalian cells e.g., metallothioneine promoter
  • promoters derived from mammalian viruses e.g., adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, The cytomegalovirus promoter and the tk promoter of HSV
  • adenovirus late promoter vaccinia virus 7.5K promoter
  • SV40 promoter SV40 promoter
  • the cytomegalovirus promoter and the tk promoter of HSV can be used and typically have a polyadenylation sequence as the transcription termination sequence.
  • the recombinant cell may be obtained by introducing the recombinant vector into an appropriate host cell.
  • the host cell is a cell capable of stably and continuously cloning or expressing the recombinant vector, and any host cell known in the art can be used.
  • Prokaryotic cells include, for example, E. coli JM109, E. coli Bacillus genus strains such as BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E.
  • coli Enterobacteriaceae strains such as Tia marcescens and various Pseudomonas species are used as host cells when transformed into eukaryotic cells, such as yeast ( Saccharomyce cerevisiae ), insect cells, plant cells, and animal cells, such as Sp2/0. , CHO (Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, CHO S, CHO DXB11, CHO GS-KO, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK cell lines, etc. It may be, but is not limited to this.
  • the nucleic acid molecule or the recombinant vector containing it can be transported (introduced) into a host cell using a transport method widely known in the art.
  • a transport method widely known in the art.
  • the transport method may be used, such as the CaCl 2 method or electroporation method, and if the host cell is a eukaryotic cell, microinjection method, calcium phosphate precipitation method, electroporation method, etc.
  • Liposome-mediated transfection and gene bombardment may be used, but are not limited thereto.
  • the method of selecting the transformed host cells can be easily performed according to methods well known in the art, using the phenotype expressed by the selection marker.
  • the selection marker is a specific antibiotic resistance gene
  • the transformant can be easily selected by culturing the transformant in a medium containing the antibiotic.
  • Another example provides a method for producing an anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof, including the step of expressing the nucleic acid molecule in a host cell.
  • the step of expressing the nucleic acid molecule in a host cell may include culturing a cell containing the nucleic acid molecule or a recombinant vector containing the same.
  • the production method may optionally further include the step of isolating and/or purifying the antibody or antigen-binding fragment from the culture medium after the culturing step.
  • the anti-TIGIT antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein has the function of activating immunity (e.g., strengthening effector T cell function, controlling Treg activity, increasing cytokine secretion, etc.) by blocking the action of TIGIT, and has various functions. It can be applied as an immune activator and/or immunotherapeutic agent.
  • Figure 1a shows the results of measuring the binding affinity of anti-TIGIT antibodies 2B7 and 3F8 to human TIGIT protein according to an example by ELISA.
  • Figure 1b shows the results of measuring the binding affinity of anti-TIGIT antibodies 2B7 and 3F8 to monkey TIGIT protein according to an example by ELISA.
  • Figure 1c shows the results of measuring the binding affinity of anti-TIGIT antibodies 2B7 and 3F8 to human TIGIT-expressing CHO K1 cells according to an example by flow cytometry.
  • Figures 2a and 2b show the results of measuring the binding affinity of anti-TIGIT antibodies 2B7 and 3F8 to monkey TIGIT-expressing Jurkat cells according to an example using flow cytometry.
  • Figures 3a to 3c are graphs showing the results of TIGIT-PVR interaction blocking analysis between human IgG1 and anti-TIGIT antibodies 2B7 and 3F8 according to one embodiment.
  • Figures 4a to 4f are graphs showing the level of cytokine production in CD4 + T cells treated with anti-TIGIT antibodies 2B7 and 3F8 according to one embodiment.
  • Figures 5a to 5f are graphs showing the level of cytokine production in CD8 + T cells treated with anti-TIGIT antibodies 2B7 and 3F8 according to one embodiment.
  • Figure 6 is a graph showing the level of cytokine production in CD56 + NK cells treated with anti-TIGIT antibodies 2B7 and 3F8 according to one embodiment.
  • Figure 7 is a graph showing the expression level of CD107a on the surface of NK cells treated with anti-TIGIT antibodies 2B7 and 3F8 according to one embodiment.
  • Figure 8 is a graph showing the production level of Granzyme B in NK cells treated with anti-TIGIT antibodies 2B7 and 3F8 according to one embodiment.
  • Figures 9a to 9h are graphs showing the cytotoxicity of PBMCs treated with anti-TIGIT antibodies 2B7 and 3F8 according to an example against cancer cell lines.
  • Example 1 Preparation of monoclonal anti-TIGIT antibody and measurement of binding affinity to TIGIT protein
  • mice Four BALB/c mice were immunized with His-tagged human TIGIT protein (R&D systems, UniProtKB/SwissProt Q495A1-1) by four consecutive cross-injections over 14 days. Lymphocytes were collected from 4 mice, pooled, purified, and fused with SP2/0 myeloma cells. The fused cells were grown in HAT selective single-step cloning media, and the resulting 2X920 hybridoma clones were selected with ClonePix2 (Molecular Devices), transferred to a 96-well plate, and cultured.
  • ClonePix2 Molecular Devices
  • - ELISA plates were coated at 4°C with a coating solution containing 0.1 ⁇ g/well of recombinant human TIGIT (rhTIGIT) protein in Carbonate Coating Buffer (pH 9.6) O/N at a concentration of 100 ⁇ L/well.
  • rhTIGIT recombinant human TIGIT
  • TMB substrate at a concentration of 50uL/well, place under dark conditions (5 ⁇ 10 mins), and terminate with the same amount of 1M HCl.
  • IgM-expressing clones were isolated and removed, and IgG-expressing clones were collected.
  • the collected positive clones were subcloned to confirm stable expression clones.
  • the culture supernatant containing the selected clones was eluted by flowing through a Protein A column, and the buffer was replaced with PBS.
  • Purified antibodies were tested by performing indirect ELISA on the screening antigen (Recombinant Human TIGIT (T103) Fc Chimera Protein; R&D systems) and negative control antigen (His peptide).
  • 2B7 and 3F8 clones (mouse backbone (mIgG1)-based mouse antibody) were selected as lead antibodies.
  • the ELISA plate was coated with recombinant human TIGIT protein (acrobiosystems, China) at a concentration of 1 ⁇ g/ml dissolved in phosphate-buffered saline (PBS) (Gibco) and incubated at 4°C overnight.
  • the coated plate was blocked with blocking buffer (3% (v/v) skim milk in PBS) for 1 hour, and serially diluted mouse anti-TIGIT monoclonal antibodies (2B7, 3F8; starting concentration: 9 ⁇ g/ml, 1: 3 serial dilutions) were added.
  • anti-Mouse-HRP antibody (1:10000 dilution) was added to each well.
  • the plate was developed with TMB solution and stopped with 1N HCL. Absorbance (O.D.) at 450nM was measured with GloMax® Explorer (Promega) Fully Loaded.
  • the ELISA plate was coated with recombinant cynomolgus TIGIT (acrobiosystems, China) at a concentration of 1 ⁇ g/ml dissolved in phosphate-buffered saline (PBS) (Gibco) and incubated at 4°C overnight.
  • the coated plate was blocked with blocking buffer (3% (v/v) skim milk in PBS) for 1 hour, and serially diluted mouse anti-TIGIT monoclonal antibodies (2B7, 3F8; starting concentration: 9 ⁇ g/ml, 1: 3 serial dilutions) were added.
  • anti-Mouse-HRP antibody (1:10000 dilution) was added to each well.
  • the plate was developed with TMB solution and stopped with 1N HCL. Absorbance (O.D.) at 450nM was measured with GloMax® Explorer (Promega) Fully Loaded.
  • HBS-P+ HBS-P+ (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) supplemented with 1% BSA w/v (Sigma, Dorset, UK) was used as a running buffer and also used for dilution of ligands and analytes.
  • the mouse antibodies (2B7, 3F8) were diluted to 1 ⁇ g/mL in running buffer and loaded onto Fc2, Fc3, and Fc4 on an anti-human IgG CM5 sensor chip (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) at the start of each cycle. did.
  • Antibodies were captured at a flow rate of 10 ⁇ l/min, resulting in an immobilization level (RL) of ⁇ 150 RU. Afterwards, the surface was allowed to stabilize.
  • RL immobilization level
  • Table 3 above shows kinetic constants determined from 1:1 model fitted curves. As shown in Table 3, the binding affinity (KD) for human TIGIT protein was 1.89 nM for antibody 2B7 and 0.98 nM for antibody 3F8.
  • mice antibodies 2B7 and 3F8 The binding of the selected mouse antibodies 2B7 and 3F8 to CHO-K1 cells (ATCC, CCL-61) and human TIGIT-expressing CHO-K1 cells (CHO-K1 TIGIT) (Genscript, M00542) was measured by flow cytometry. 1X10 5 cells were placed in a 96-well, and the mouse antibodies (10 ⁇ g/mL, 2 ⁇ g/mL, 0.5 ⁇ g/mL) were added. After 30 minutes of incubation, antibody binding was measured using anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 647 antibody (Sigma A21236) at 4 ⁇ g/mL (protected from light). Flow cytometry was performed using an AccuriC6 Flow Cytometer, and data were analyzed with FlowJo. The obtained results are shown in Figure 1c.
  • Hybridoma cell pellets corresponding to the stable expression clones (2B7, 3F8) selected in Example 1-1 were lysed, mRNA was extracted, and heavy and light chain variable region DNA was cloned into a sequencing vector to produce heavy and light chains.
  • a mouse-human chimeric antibody was prepared by linking the heavy chain constant region and light chain constant region (kappa) of human IgG1 to the heavy chain variable region and light chain variable region, respectively.
  • the sequences of the prepared mouse-human anti-TIGIT chimeric antibodies (clones 2B7 and 3F8) were analyzed, and the results are shown in Tables 4 and 5 below.
  • the binding affinity of the chimeric anti-TIGIT monoclonal antibody produced by clone 2B7 or 3F8 in Example 2.1 was measured for cynomolgus monkey TIGIT-expressing cells.
  • the chimeric anti-TIGIT monoclonal antibody (2B7 or 3F8) and Tiragolumab (Selleckchem; control anti-TIGIT monoclonal antibody) were labeled with Alexa FluorTM 488 ('AF488') using the Alexa FluorTM 488 Antibody Labeling Kit (InvitrogenTM). ) was labeled.
  • Cynomolgus monkey TIGIT-expressing Jurkat cells (Creative Biogene) 0.2M were stained 1:400 (1/400) diluted Zombie AquaTM Fixable Viability Kit dye (BioLegend) on a round bottom 96 well plate for 20 minutes at room temperature. Thus, dead cells were removed. The obtained cells were washed with FACS buffer (phosphate-buffered saline (PBS, Thermo) containing 1% FBS). After washing, cells were stained with the AF488-labeled chimeric anti-TIGIT monoclonal antibody 2B7 or 3F8 for 30 minutes on ice. The amounts of anti-TIGIT antibody used in the staining were 1.72, 3.44, and 6.88 nM.
  • TIGIT effector cells (Promega) were added to cell assay buffer (90% RPMI 1640/10% FBS), and the cell suspension containing the TIGIT effector cells was cultured at 37°C for 16 hours.
  • Anti-TIGIT antibodies (2B7, 3F8; Example 1-1) were prepared in PBS buffer and added to the pre-cultured cell suspension.
  • CD155 aAPC/CHO-K1 cells (Promega) were added to the mixture containing the cells and antibodies, and incubated at 37°C for 6 hours. The degree of luminescence was measured using PromegaTM GloMax® Plate Reader. The EC 50 value of the antibody response was measured using curve fitting software (GraphPad Prism® software).
  • T cell activation signal increased by blocking TIGIT-PVR with anti-TIGIT 2B7 antibody.
  • T cell activation signals were also increased by blocking TIGIT-PVR with anti-TIGIT 3F8 antibody.
  • PBMC Peripheral blood mononuclear cells
  • cytokine production in human PBMCs was measured by treatment with anti-TIGIT monoclonal antibodies (2B7, 3F8; Example 2.1 (chimeric antibody)) or comparative antibodies (4.1D3, 22G2; see Example 4.2). .
  • human PBMC (STEMCELL; Example 4.1; 500,000 cells) were incubated with 10% (v/v) FBS (Gibco), penicillin-streptomycin (Sigma), L-glutamine (Sigma), and HEPES (Sigma). They were resuspended in PRMI1640 medium (Gibco) and seeded in 96-well plates.
  • FBS FBS
  • penicillin-streptomycin Sigma
  • L-glutamine Sigma
  • HEPES HEPES
  • PRMI1640 medium Gibco
  • PBMCs were stimulated with 0.2 ⁇ g/ml anti-CD3 monoclonal antibody (BD Biosciences, clone HIT3) and 1 ⁇ g/ml anti-CD28 monoclonal antibody (BD Biosciences, clone CD28.2).
  • PBMCs Upon stimulation with the anti-CD3/CD28, PBMCs were treated with the anti-TIGIT monoclonal antibody (2B7, 3F8) or the comparison antibody at an amount of 2, 5, or 10 ⁇ g/ml, respectively.
  • PBMCs that were suboptimally activated and not treated with antibodies were used.
  • PBMCs were cultured at 37°C and 5% CO 2 for 4 hours, then Brefeldin A (Sigma) was added and cultured for an additional 15 hours. The cultured cells were spun down by centrifugation (400 xg) for 6 minutes at 4°C and then harvested. The supernatant was removed, and the cells were washed twice with phosphate-buffered saline (PBS) (Thermo) under the same centrifugation conditions.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • cytokine staining the cells were incubated with anti-IL-2 antibody (Biolegend, 1:50), anti-IFN- ⁇ antibody (Biolegend, 1:50), and anti-TNF- ⁇ antibody (Biolegend, 1:50). ) was resuspended in permeabilization wash buffer (Thermo) containing. Afterwards, the cells were incubated for 30 minutes at room temperature and dark conditions. After washing the cells with FACS buffer, the cells were analyzed by measuring fluorescence intensity using a flow cytometer (CytoFLEX, Beckman Coulter), and the data were analyzed using Flowjo software (BD). Cytokine production was measured in CD4 + T cells (CD3 + CD4 + CD8 - ) and CD8 + T cells (CD3 + CD8 + CD4 - ).
  • anti-TIGIT monoclonal antibodies 2B7, 3F8 were used as comparison antibodies (4.1) at the same dose.
  • IL-2 cytokine
  • IFN- ⁇ cytokine
  • TNF- ⁇ + double positive
  • TP triple positive
  • TNF- ⁇ + IL-2 and IFN- ⁇ TNF- ⁇ + IL-2 and IFN- ⁇
  • TNF- ⁇ anti-tumor effect
  • cytokine production was measured in human PBMCs by treatment with anti-TIGIT monoclonal antibodies (2B7, 3F8; Example 1.1 (mouse antibody)) or a comparison antibody (313M32, see Example 4.2).
  • human PBMC (STEMCELL; Example 4.1, 500,000 cells) were incubated with 10% (v/v) FBS (Gibco), penicillin-streptomycin (Sigma), L-glutamine (Sigma), and HEPES (Sigma). They were resuspended in PRMI1640 medium (Gibco) and seeded in 96-well plates.
  • FBS FBS
  • penicillin-streptomycin Sigma
  • L-glutamine Sigma
  • HEPES HEPES
  • PRMI1640 medium Gibco
  • PBMCs were stimulated with 0.2 ⁇ g/ml anti-CD3 monoclonal antibody (BD Biosciences, clone HIT3) and 1 ⁇ g/ml anti-CD28 monoclonal antibody (BD Biosciences, clone CD28.2).
  • PBMCs Upon stimulation with the anti-CD3/CD28, PBMCs were treated with the anti-TIGIT monoclonal antibody (2B7, 3F8) or the comparison antibody at an amount of 5 ⁇ g/ml or 10 ⁇ g/ml, respectively.
  • PBMCs that were suboptimally activated and not treated with antibodies were used.
  • PBMCs were cultured at 37°C and 5% CO 2 for 4 hours, then Brefeldin A (Sigma) was added and cultured for an additional 15 hours. The cultured cells were spun down by centrifugation (400 xg) for 10 minutes at 4°C and then harvested. The supernatant was removed, and the cells were washed twice with phosphate-buffered saline (PBS) (Thermo) under the same centrifugation conditions.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • cytokine staining the cells were resuspended in permeabilization wash buffer (Thermo) containing anti-IFN- ⁇ antibody (Biolegend, 1:50) and anti-TNF- ⁇ antibody (Biolegend, 1:50). Afterwards, the cells were incubated for 30 minutes at room temperature and dark conditions. After washing the cells with FACS buffer, the cells were analyzed by measuring fluorescence intensity using a flow cytometer (CytoFLEX, Beckman Coulter), and the data were analyzed using Flowjo software (BD). Cytokine production was measured in CD56 + NK cells (CD3 - CD56 + ).
  • anti-TIGIT monoclonal antibodies 2B7, 3F8 were used as an equal dose of comparison antibody (313M32).
  • IFN- ⁇ and TNF- ⁇ cytokine production in CD56 + NK cells.
  • PBMCs from healthy human donors were grown in 96-well U-bottom plates at 10% v/v) FBS (Gibco), penicillin-streptomycin (Sigma), and L-glutamine (Sigma) were seeded in RPMI1640 medium containing 500,000 cells per well. The PBMCs were left overnight, and the next day, each antibody clone was added at an amount of 10 ⁇ g/ml under appropriate conditions, and anti-CD107a antibody conjugated with PECy7 (Biolegend, 1:50) was added to each well and left overnight. did.
  • PBMCs were stained with anti-CD56 antibody (Biolegend, 1:50) and eFluor 780 Fixable viability dye (Invitrogen, 1:500) and analyzed by flow cytometry using a flow cytometer (CytoFLEX, Beckman Coulter).
  • PBMCs from healthy human donors were seeded in RPMI1640 medium containing 10% (v/v) FBS (Gibco), penicillin-streptomycin (Sigma), and L-glutamine (Sigma) in 96-well U-bottom plates for each well (100 ⁇ l medium). ) were seeded at an amount of 500,000 cells per cell. The PBMCs were left overnight and then stimulated with 10 ⁇ g/ml of anti-TIGIT antibody clone (2B7 or 3F8; Example 2.1 (chimeric antibody)).
  • the cells were washed once in PBS (400 The cells were incubated in dark conditions for 10 minutes, then centrifuged with PBS (400 x g, 3 minutes) and washed once. All steps after this point were performed under light-blocked conditions. Cells were resuspended in 1x FoxP3 Fix/Perm Buffer (Biolegend) and incubated for 20 minutes at room temperature. The cells were then centrifuged (400 x g, 3 min), resuspended in 1x FoxP3 Perm Buffer (Biolegend), and incubated for an additional 15 min at room temperature.
  • PBS 400 The cells were incubated in dark conditions for 10 minutes, then centrifuged with PBS (400 x g, 3 minutes) and washed once. All steps after this point were performed under light-blocked conditions. Cells were resuspended in 1x FoxP3 Fix/Perm Buffer (Biolegend) and incubated for 20 minutes at room temperature. The cells were then centrifuged (
  • PBMCs from healthy human donors were seeded at 10 pixels in 96-well U-bottom plates. 100,000 cells were seeded per well (50 ⁇ l medium) in RPMI1640 medium containing % (v/v) FBS (Gibco), penicillin-streptomycin (Sigma), and L-glutamine (Sigma).
  • GFP-expressing cancer cell lines were seeded at an amount of 5,000 cells per well (50 ⁇ l medium) in a 96-well flat-bottomed plate and cultured for 2 hours to adhere to the plate; A549-GFP (lung cancer; MERK (ECACC) cat# 86012804-1VL), 786-O-GFP (kidney cancer; ATCC cat# CRL-1932), Colo-205-GFP (colon cancer; MERK (ECACC) cat# 87061208- 1VL), MCF7-GFP (breast cancer; MacroPhox Ltd.).
  • the PBMCs were stimulated with 10 ⁇ g/ml of anti-TIGIT antibody (2B7 or 3F8), and 1 ng/ml of anti-CD3 (HIT3a, Additional stimulation was performed with Biolegend).
  • the cells were then cultured in IncuCyte at 5% CO 2 and 37°C for 5 days. Four images were taken for each well every 2 hours at 10x magnification. Cytotoxicity was evaluated by taking the Log2 Fold value of the number of target cells (cancer cells) per well normalized to the 0h time point.

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Abstract

신규한 항-TIGIT 항체 및 이의 면역증강, 항암 및 면역관련 질병의 예방 및/또는 치료 용도에 관한 것이다.

Description

항-TIGIT 항체 및 이의 용도
관련 출원들과의 상호 인용
본 출원은 2022년 6월 3일자 대한민국 특허출원 제10-2022-0068480호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며, 해당 한국 특허 출원의 문헌에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 일부로서 포함된다.
신규한 항-TIGIT 항체 및 이의 면역증강, 항암 및 면역관련 질병의 예방 및/또는 치료 용도에 관한 것이다.
암 면역요법은 체내 면역작용을 이용해서 암을 치료하는 방법으로, 화학요법, 외과요법, 방사선 요법에 이어 암의 제4 치료법으로 불린다. 암 면역요법은 면역계를 활성화시켜 종양 세포에 대한 인식 및 반응을 증가시키는 메커니즘을 필요로 한다. 면역계 활성화는 항원-특이적 반응의 개시에 중요한 항원-제시 세포 및 종양 세포 파괴를 담당하는 이펙터(effector) 세포 등과 같은 다양한 세포의 기능을 수반하는 복잡한 메카니즘이다.
상기 이펙터 세포의 대표적인 예로서 세포독성 T 세포를 들 수 있다.
한편, TIGIT (T cell immunoglobulin and ITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif) domain)은 WUCAM, VSIG9 또는 Vstm3로도 지칭되며, NK, CD8+ 및 CD4+ T 세포뿐만 아니라 조절 T 세포 (regulatory T　cell; "Treg")에서도 우선적으로 발현되는 공동-억제 수용체이다.　TIGIT는 세포 내의 ITIM 도메인, 막관통 도메인, 및 면역글로불린 가변 도메인을 포함하는 막관통 단백질이다.
TIGIT　발현은 종양 침윤 림프구(tumour infiltrating lymphocyte, TIL) 및 감염과 같은 질병 환경에서 증가된다.　TIGIT　발현은　TIGIT　음성 세포와 비교하여 낮은 이펙터 기능을 갖는 exhausted T 세포의 표지가 될 수 있다. 또한,　TIGIT를 발현하는 Treg 세포는　TIGIT　음성 Treg 집단과 비교하여 향상된 면역억제 활성을 나타낸다.
이러한 점에 기초할 때, TIGIT에 대하여 길항작용을 하는 약물 (예컨대, 길항성 항-TIGIT　항체 등)은 면역계 활성화를 유도하고 암 등의 질병상태에서의 면역 반응을 증진시켜 질병 치료에 유리한 효과를 나타낼 것으로 기대된다.
TIGIT에 결합하는 항-TIGIT　항체 및 이의 의약 용도가 제공된다.
일 예는 TIGIT에 결합하는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편을 제공한다.
상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편은,
서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H1), 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H2), 및 서열번호 5 또는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H3)를 포함하는 중쇄 상보성결정부위 (Complementarity Determining　Regions; CDRs) 또는 상기 중쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 중쇄 가변영역; 및
서열번호 7 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L1), 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L2), 및 서열번호 11 또는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L3)를 포함하는 경쇄 상보성결정부위 또는 상기 경쇄 상보성결정부위를 포함하는 경쇄 가변영역
을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 13 또는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 15 또는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
따라서, 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편은,
서열번호 13 또는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역, 및
서열번호 15 또는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역
을 포함하는 것일 수 있다.
다른 예는 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편, 이를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 핵산 분자 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 면역증강제 또는 면역증강용 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편, 이를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 핵산 분자 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편, 이를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 핵산 분자 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 항암제 또는 암의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편, 이를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 핵산 분자 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 약학적 유효량을 면역증강을 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 면역증강 방법을 제공한다.
다른 예는 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편, 이를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 핵산 분자 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 약학적 유효량을 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다.
다른 예는 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편, 이를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 핵산 분자 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 약학적 유효량을 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다.
다른 예는 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편, 이를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 핵산 분자 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 면역증강 용도 또는 면역증강제 제조를 위한 용도를 제공한다.
다른 예는 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편, 이를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 핵산 분자 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 용도 또는 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료용 약물의 제조를 위한 용도를 제공한다.
다른 예는 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편, 이를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 핵산 분자 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 암의 예방 및/또는 치료를 위한 용도 또는 암의 예방 및/또는 치료용 약물의 제조를 위한 용도를 제공한다.
일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 약학 조성물, 방법, 및 용도에 있어서, 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편은 다른 면역관문 단백질, 예컨대, PD-1, PD-L1, 또는 이들 모두를 표적으로 하는 약물(길항제)와 함께 병용될 수 있다. 상기 병용 가능한 약물은 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 또는 이들 모두일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예는 항-TIGIT 항체의 중쇄 상보성 결정 부위, 중쇄 가변영역 또는 중쇄를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
다른 예는 항-TIGIT 항체의 경쇄 상보성 결정 부위, 경쇄 가변영역 또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
다른 예는 상기 항-TIGIT 항체의 중쇄 상보성 결정 부위, 중쇄 가변영역 또는 중쇄를 암호화하는 핵산 분자 및 항-TIGIT 항체의 경쇄 상보성 결정 부위, 경쇄 가변영역 또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 하나의 벡터 함께 포함하거나 각각 별개의 벡터에 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 상기 핵산 분자의 발현을 위한 발현벡터일 수 있다.
다른 예는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다.
다른 예는 상기 핵산 분자를 숙주세포에서 발현시키는 단계를 포함하는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편의 생산 방법을 제공한다. 상기 핵산 분자를 숙주세포에서 발현시키는 단계는 상기 핵산 분자 또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 방법은 상기 발현시키는 단계 이후에 배지로부터 항체를 분리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에서, TIGIT에 결합하는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편, 및 이들의 의약 용도가 제공된다. 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편은 TIGIT의 작용을 봉쇄하여 면역을 활성화 (e.g., 이펙터 T세포 기능 강화, Treg 활성 제어, 사이토카인 분비 증가 등)시키는 기능을 가지며, 다양한 면역 활성화제 및/또는 면역 치료제로서 적용될 수 있다.
이하, 보다 상세히 설명한다.
항체 또는 항원결합단편
일 예는 TIGIT에 결합하는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편을 제공한다.
상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편은,
서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H1),
서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H2),
서열번호 5 또는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H3),
서열번호 7 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L1),
서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L2), 및
서열번호 11 또는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L3)
를 포함하는 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편은,
서열번호 1의 CDR-H1, 서열번호 3의 CDR-H2, 및 서열번호 5의 CDR-H3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 7의 CDR-L1, 서열번호 9의 CDR-L2, 및 서열번호 11의 CDR-L3; 또는
서열번호 2의 CDR-H1, 서열번호 4의 CDR-H2, 및 서열번호 6의 CDR-H3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 8의 CDR-L1, 서열번호 10의 CDR-L2, 및 서열번호 12의 CDR-L3
을 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에 있어서, 상보성결정부위 (CDR)는 kabat system에 따른 CDR 정의를 기준으로 결정된다.
일 구체예에서, 본 명세서에서 제공되는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편에 포함 가능한 6개 CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3)을 아래의 표 1에 정리하였다:
서열 서열번호
CDR-H1 GSTFTEYTMH 1
CDR-H1 GYSFTDYIMN 2
CDR-H2 GLNPNNGGTSYNQRFKD 3
CDR-H2 LSIPYNGGTSYNQKFEG 4
CDR-H3 GTYYDYSFAY 5
CDR-H3 GIKGYFAMDY 6
CDR-L1 KASHYVSTAVA 7
CDR-L1 RSSQSLVNSFGKTYLS 8
CDR-L2 SPSYRYT 9
CDR-L2 GVSNRFS 10
CDR-L3 HQHYSTPWT 11
CDR-L3 LQGTHQPWT 12
(상기 표 1에서, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3는 중쇄 상보성결정부위를 의미하고, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3는 경쇄 상보성결정부위를 의미한다)
구체예에서, 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편은,
서열번호 1 또는 서열번호 2의 CDR-H1, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 CDR-H2, 및 서열번호 5 또는 서열번호 6의 CDR-H3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및
서열번호 7 또는 서열번호 8의 CDR-L1, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 CDR-L2, 및 서열번호 11 또는 서열번호 12의 CDR-L3를 포함하는 경쇄 가변영역
을 포함하는 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편은,
서열번호 1의 CDR-H1, 서열번호 3의 CDR-H2, 및 서열번호 5의 CDR-H3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 7의 CDR-L1, 서열번호 9의 CDR-L2, 및 서열번호 11의 CDR-L3를 포함하는 경쇄 가변영역; 또는
서열번호 2의 CDR-H1, 서열번호 4의 CDR-H2, 및 서열번호 6의 CDR-H3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 8의 CDR-L1, 서열번호 10의 CDR-L2, 및 서열번호 12의 CDR-L3를 포함하는 경쇄 가변영역
을 포함하는 것일 수 있다.
다른 예에서, 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편은,
서열번호 13 또는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역, 및
서열번호 15 또는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역
을 포함하는 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편은,
서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역; 또는
서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역
을 포함하는 것일 수 있다.
경우에 따라서(예컨대, 재조합적으로 제작시), 상기 중쇄 가변영역 및/또는 경쇄 가변영역은 N 말단에 적절한 신호서열을 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편에 포함 가능한 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 아래의 표 2에 예시하였다:
가변영역 아미노산 서열(N→C) 서열번호
중쇄가변영역 EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGSTFTEYTMHWVKQSHGKSLEWIGGLNPNNGGTSYNQRFKDRATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRGTYYDYSFAYWGQGTLVTVSA 13
중쇄가변영역 EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTDYIMNWVKQSHGKNLEWIGLSIPYNGGTSYNQKFEGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARGIKGYFAMDYWGQGTSVTVSS 14
경쇄가변영역 DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASHYVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSPSYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCHQHYSTPWTFGGGTKLEIK 15
경쇄가변영역 DVVVTQTPLSLPVSFGDQVSISCRSSQSLVNSFGKTYLSWFLHKPGQSPQLIMYGVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISTIKPEDLGMYYCLQGTHQPWTFGGGTKLEIK 16
(표 2에서, 밑줄로 표시된 영역은 순서대로 중쇄 및 경쇄의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 나타냄)
일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편은 TIGIT 단백질, 예컨대, 인간 TIGIT 단백질(NCBI Reference Sequence NP_776160.2; UniProtKB/SwissProt Q495A1-1)의 아미노산 잔기 51-70 영역(TAQVTQVNWEQQDQLLAICN; 서열번호 28) 중 선택되는 하나 이상 또는 2개 이상(예컨대, 연속하여 위치함)의 아미노산에 결합하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[인간 TIGIT 단백질(서열번호 27)]
1 MRWCLLLIWA QGLRQAPLAS GMMTGTIETT GNISAEKGGS IILQCHLSST TAQVTQVNWE
61 QQDQLLAICN ADLGWHISPS FKDRVAPGPG LGLTLQSLTV NDTGEYFCIY HTYPDGTYTG
121 RIFLEVLESS VAEHGARFQI PLLGAMAATL VVICTAVIVV VALTRKKKAL RIHSVEGDLR
181 RKSAGQEEWS PSAPSPPGSC VQAEAAPAGL CGEQRGEDCA ELHDYFNVLS YRSLGNCSFF
241 TETG
본 명세서에서 "항체"라 함은, 특정 항원에 특이적으로 결합하는 단백질을 총칭하는 것으로서, 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 단백질 또는 이를 화학적 합성 또는 재조합적으로 제조한 단백질일 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 상기 항체는 비자연적으로 생성된 것, 예컨대, 재조합적 또는 합성적으로 생성된 것일 수 있다. 상기 항체는 동물 항체 (예컨대, 마우스 항체 등), 키메라 항체 (예컨대, 마우스-인간 키메라 항체 등), 인간화 항체, 또는 인간 항체일 수 있다. 상기 항체는 단클론 항체 또는 다클론 항체일 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편에서 앞서 정의한 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR 부위, 또는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 제외한 나머지 부위는 모든 서브타입의 면역글로불린(예컨대, IgA, IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4), IgM, 등)으로부터 유래한 것일 수 있고, 예컨대, 상기 모든 서브타입의 면역글로불린의 프레임워크 부위, 및/또는 경쇄 불변 영역 및/또는 중쇄 불변 영역으로부터 유래한 것일 수 있다. 일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 항-TIGIT 항체는 인간 IgG형 항체, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 형태의 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
완전한 항체(예컨대, IgG형)는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 항-TIGIT 항체는 중쇄 불변영역으로서 IgG1의 불변영역, 경쇄 불변영역으로서 카파 불변영역을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3과 힌지(hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.
용어, "CDR(complementarity determining region)"은 항체의 가변 부위 중에서 항원과의 결합 특이성을 부여하는 부위를 의미하는 것으로, 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다(CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다. 한편, 본 명세서에 있어서, 용어, "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.
본 명세서에 기재된 상보성결정부위 (CDR)는 kabat system에 따른 CDR 정의를 기준으로 결정된 것이다.
본 명세서에서 항체는, 특별한 언급이 없는 한, 항원 결합능을 보유하는 항체의 항원결합단편을 포함하는 것으로 이해될 수 있다.
용어, "항원결합단편"은 항원이 결합할 수 있는 부분(예컨대, 본 명세서에서 정의된 6개의 CDR)을 포함하는 모든 형태의 폴리펩타이드를 의미한다. 예를 들어, 항체의 scFv, scFv-Fc, (scFv)2, Fab, Fab' 또는 F(ab')2일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 항원결합단편 중, Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다.
Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다.
F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다.
이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 단쇄의 가변영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다.
상기 항원결합단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
용어 "힌지 영역(hinge region)"은 항체의 중쇄에 포함되어 있는 영역으로서, CH1 및 CH2 영역 사이에 존재하며, 항체 내 항원 결합 부위의 유연성(flexibility)를 제공하는 기능을 하는 영역을 의미한다.
본 명세서에서 제공되는　항체는 단클론 항체일 수 있다. 단클론 항체는 당 업계에 널리 알려진 방법대로 제조될 수 있다. 예컨대, phage display 기법을　이용해서 제조될 수 있다. 또는, 상기 항체는 통상의 방법에 의하여 동물 (예컨대, 마우스) 유래의 단클론 항체로 제조될 수 있다.
한편, 전형적인 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 포맷을 이용하여 TIGIT의 수용체 결합 도메인과의 결합능에 기초하여 개별 단클론 항체들을 스크리닝할 수 있다. 결합체들에 대해 분자적 상호작용을 검정하기 위한 경쟁적　ELISA(Competitive ELISA)와 같은 기능성 분석　또는 세포-기반 분석(cell-based assay)과 같은 기능성 분석을 통해 저해 활성에 대해 검정할 수 있다. 그런 다음 강한 저해 활성에 기초하여 선택된 단클론항체 멤버들에 대해TIGIT의 수용체 결합 도메인에 대한 각각의 친화도(Kd values)를 검정할 수 있다.
최종 선택된 항체들은 항원결합부위를 제외한 나머지 부분이 인간의 면역글로블린 항체화된 항체뿐만 아니라, 인간화 항체로서 제조하여 사용할 수 있다. 인간화 항체의 제조방법은 당 업계에 잘 알려져 있다.
본 명세서에서 제공되는 항-TIGIT 항체의 항원결합단편은 상기 항-TIGIT 항체에서 유래하고 항원(TIGIT)에 대한 결합력을 보유하는 단편을 의미하는 것으로, 상기한 항-TIGIT 항체의 6개의 CDR을 포함하는 임의의 폴리펩타이드, 예를 들어 scFv, scFv-Fc, scFv-Ck(카파 불변영역), scFv-Cλ(람다 불변영역), (scFv)2, Fab, Fab' 또는 F(ab')2일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 일 예에서, 상기 항원결합단편은 scFv, 또는 scFv가 면역글로불린 (예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 등)의 Fc 부위와 융합된 융합 폴리펩타이드 (scFv-Fc) 또는 경쇄의 불변 영역 (예컨대, 카파 또는 람다)와 융합된 융합 폴리펩타이드 (scFv-Ck 또는 scFv-Cλ)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 항체(예컨대, CDR, 가변영역, 또는 중쇄/경쇄, 항원결합단편 등)가 "특정 아미노산 서열을 포함한다, 또는 특정 아미노산 서열로 이루어진다 또는 포함된다" 함은 상기 아미노산 서열을 필수적으로 포함하는 경우, 및 상기 아미노산 서열에 항체 활성 (예컨대, 항원 친화도, 약리적 활성 등)에 유의한 영향이 없는 무의미한 변이(예컨대, 아미노산 잔기의 치환, 결실, 및/또는 추가)가 도입된 경우를 모두 의미하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편은 TIGIT (e.g., 인간 TIGIT)에 대한 결합 친화도 (KD)가, 예를 들어, 표면 플라스몬 공명 (Surface plasmon resonance, SPR)으로 측정된 경우를 기준으로, 10mM 이하, 5 mM 이하, 1mM 이하, 0.5mM 이하, 0.2mM 이하, 0.1mM 이하, 0.05mM 이하, 0.01mM 이하, 0.005mM 이하, 또는 0.001mM 이하일 수 있으며, 예를 들어, 0.0001nM 내지 10mM, 0.0005nM 내지 10mM, 0.001nM 내지 10mM, 0.005nM 내지 10mM, 0.01nM 내지 10mM, 0.05nM 내지 10mM, 0.1nM 내지 10mM, 0.5nM 내지 10mM, 1nM 내지 10mM, 0.0001nM 내지 5mM, 0.0005nM 내지 5mM, 0.001nM 내지 5mM, 0.005nM 내지 5mM, 0.01nM 내지 5mM, 0.05nM 내지 5mM, 0.1nM 내지 5mM, 0.5nM 내지 5mM, 1nM 내지 5mM, 0.0001nM 내지 1mM, 0.0005nM 내지 1mM, 0.001nM 내지 1mM, 0.005nM 내지 1mM, 0.01nM 내지 1mM, 0.05nM 내지 1mM, 0.1nM 내지 1mM, 0.5nM 내지 1mM, 1nM 내지 1mM, 0.0001nM 내지 0.5mM, 0.0005nM 내지 0.5mM, 0.001nM 내지 0.5mM, 0.005nM 내지 0.5mM, 0.01nM 내지 0.5mM, 0.05nM 내지 0.5mM, 0.1nM 내지 0.5mM, 0.5nM 내지 0.5mM, 1nM 내지 0.5mM, 0.0001nM 내지 0.2mM, 0.0005nM 내지 0.2mM, 0.001nM 내지 0.2mM, 0.005nM 내지 0.2mM, 0.01nM 내지 0.2mM, 0.05nM 내지 0.2mM, 0.1nM 내지 0.2mM, 0.5nM 내지 0.2mM, 1nM 내지 0.2mM, 0.0001nM 내지 0.1mM, 0.0005nM 내지 0.1mM, 0.001nM 내지 0.1mM, 0.005nM 내지 0.1mM, 0.01nM 내지 0.1mM, 0.05nM 내지 0.1mM, 0.1nM 내지 0.1mM, 0.5nM 내지 0.1mM, 1nM 내지 0.1mM, 0.0001nM 내지 0.05mM, 0.0005nM 내지 0.05mM, 0.001nM 내지 0.05mM, 0.005nM 내지 0.05mM, 0.01nM 내지 0.05mM, 0.05nM 내지 0.05mM, 0.1nM 내지 0.05mM, 0.5nM 내지 0.05mM, 1nM 내지 0.05mM, 0.0001nM 내지 0.01mM, 0.0005nM 내지 0.01mM, 0.001nM 내지 0.01mM, 0.005nM 내지 0.01mM, 0.01nM 내지 0.01mM, 0.05nM 내지 0.01mM, 0.1nM 내지 0.01mM, 0.5nM 내지 0.01mM, 또는 1nM 내지 0.01mM일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예에서, 앞서 설명한 항-TIGIT 항체의 중쇄 상보성 결정 부위 (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, 또는 이들의 조합), 경쇄 상보성 결정 부위 (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, 또는 이들의 조합), 또는 이들의 조합; 또는 중쇄 가변영역, 경쇄 가변영역, 또는 이들의 조합을 포함하는 폴리펩타이드 분자가 제공된다.
상기 폴리펩타이드 분자는 항체의 전구체로서 항체 제작에 사용될 수 있을 뿐 아니라 항체와 유사한 구조를 갖는 단백질 골격체 (protein scaffold; 예컨대 펩티바디, 나노바디, 등), 이중 특이 항체, 다중 특이 항체의 구성 성분 (예컨대, CDR 또는 가변영역)으로 포함될 수 있다.
용어 "펩티바디(peptide + antibody)"는 펩타이드와 항체의 Fc 부분 등의 불변 부위의 전부 또는 일부가 융합된 융합 단백질로서, 항체와 유사한 골격과 기능을 갖는 단백질을 의미한다. 여기서 앞서 설명한 1종 이상의 펩타이드가 항원 결합 부위 (중쇄 및/또는 경쇄 CDR 또는 가변 영역)로서 작용할 수 있다.
용어 "나노바디"는 단일-도메인 항체 (single-domain antibody)라고도 불리며, 항체의 단일 가변 도메인을 모노머 형태로 포함하는 항체 단편을 의미하고, 완전한 구조의 항체와 유사하게 특정 항원에 대하여 선택적으로 결합하는 특성을 갖는다. 나노바디의 분자량은 일반적으로 약 12 kDa 내지 약 15 kDa 정도로, 완전한 항체(두 개의 중쇄와 두 개의 경쇄 포함)의 일반적인 분자량 (약 150 kDa 내지 약 160 kDa)과 비교하여 매우 작으며, 경우에 따라서는 Fab 단편이나 scFv 단편보다 작다.
용어 "다중 결합 항체" (이중 결합 항체를 포함하는 의미임)는 2개 또는 그 이상의 상이한 항원을 인식 및/또는 결합하거나, 동일한 항원의 서로 다른 부위를 인식 및/또는 결합하는 항체를 의미하는 것으로, 상기 다중 결합 항체 중 하나의 항원 결합 부위가 앞서 설명한 TIGIT에 결합하는 폴리펩타이드, 항체, 또는 항원결합단편을 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에 제공되는 TIGIT에 결합하는 폴리펩타이드, 항체, 또는 항원결합단편은 유용한 중합체, 표지물질 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 접합된 접합체 (conjugate) 형태로 사용될 수 있다.
상기 유용한 중합체는, 예를 들어, 폴리펩타이드, 항체, 및/또는 항원결합단편의 체내 반감기를 증가시켜 주는, 단백질 이외의 중합체일 수 있으며, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) (예를 들어, 2 kDa, 5 kDa, 10 kDa, 12 kDa, 20 kDa, 30 kDa 또는 40 kDa의 분자량을 갖는 PEG), 덱스트란, 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜 (mPEG) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 친수성 중합체를 예시할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
상기 표지물질은, 희토류 킬레이트제, 플루오레스세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 이소티오시아네이트, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈알데히드, 플루오레스카민,　152Eu, 댄실, 움벨리페론, 루시페린, 루미날 표지, 이소루미날 표지, 방향족 아크리디늄 에스테르 표지, 이미다졸 표지, 아크리디늄 염 표지, 옥살레이트 에스테르 표지, 아에쿠오린 표지, 2,3-디히드로프탈라진디온, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 안정한 유리 라디칼 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 형광 또는 화학발광성 소분자 화합물(chemical), 방사성동위원소 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
의약 용도
본 명세서에서 제공되는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편은 TIGIT의 작용(예컨대, TIGIT과 이의 리간드인 CD155(PVR)와의 상호작용 등)을 봉쇄하여 면역을 활성화 (e.g., 이펙터 T세포 및 NK세포 기능 강화, Treg 활성 제어, 사이토카인 분비 증가 등)시키는 기능을 갖는다. 따라서, 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편은 면역증강, 면역관련 질병의 예방 및/또는 치료, 특히 암의 예방 및/또는 치료에 유용하게 적용될 수 있다.
다른 예는 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편을 유효성분으로 포함하는 면역증강제 또는 면역증강용 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편을 유효성분으로 포함하는 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편을 유효성분으로 포함하는 항암제 또는 암의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편의 약학적 유효량을 면역증강을 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 면역증강 방법을 제공한다. 상기 면역증강 방법은, 상기 투여하는 단계 이전에, 면역증강을 필요로 하는 대상을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
다른 예는 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편의 약학적 유효량을 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료 방법은, 상기 투여하는 단계 이전에, 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
다른 예는 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편의 약학적 유효량을 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 암의 예방 및/또는 치료 방법은, 상기 투여하는 단계 이전에, 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
다른 예는 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편의 면역증강 용도 또는 면역증강제 제조를 위한 용도를 제공한다.
다른 예는 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편의 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 용도 또는 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료용 약물의 제조를 위한 용도를 제공한다.
다른 예는 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편의 암의 예방 및/또는 치료를 위한 용도 또는 암의 예방 및/또는 치료용 약물의 제조를 위한 용도를 제공한다.
본 명세서에서 제공되는 약학 조성물, 방법, 및 용도에 있어서, 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편은 다른 면역관문 단백질, 예컨대 PD-1, PD-L1, 또는 이들 모두를 표적으로 하는 약물(길항제)와 함께 병용될 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편에 더하여, PD-1, PD-L1, 또는 이들 모두를 표적으로 하는 약물을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편에 더하여, PD-1, PD-L1, 또는 이들 모두를 표적으로 하는 약물을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 병용 가능한 약물은 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 또는 이들 모두일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 예에서, 상기 항-PD-1 항체는 Pembrolizumab, Nivolumab 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 용어 "면역증강(또는 면역강화)"은 항원에 대한 초기 면역반응을 유도하거나 기존의 면역반응을 증가시키는 것을 의미할 수 있으며, 면역자극, 면역강화, 면역활성화 등의 용어와 동등한 의미로 호환될 수 있다. 일 예에서, 면역증강은 면역세포(이펙터 T 세포, 예컨대 세포독성 T 세포; CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, NK 세포 등) 기능 강화(활성화) 및/또는 증식, 조절 T 세포(Treg) 활성 억제 및/또는 소거(depletion), 면역단백질(예컨대, 사이토카인 등) 생산 및/또는 분비 증가 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 용어 "면역 관련 질병"은 면역계의 장애 및/또는 불충분한 활성에 의하여 유발되는 모든 질병을 포괄하는 것으로, 예를 들어, 암, 감염질환, 자가면역질환, 염증성질환 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있으며, 이에 제한되지 않지만, 편평상피세포암, 폐암 (예컨대, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암 등), 복막암, 피부암, 흑색종 (예컨대, 피부 또는 안구내 흑색종 등), 직장암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간암, 담관암, 위암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 방광암, 유방암, 대장암(예컨대, 결장암, 직장암, 결장직장암 등), 자궁내막암, 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 두경부암, 뇌암, 골육종 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 암의 예방 및/또는 치료 효과는 암세포를 제거(사멸)하는 효과, 암세포의 발생 및/또는 성장을 억제하는 효과, 이동(migration), 침습(invasion), 전이(metastasis) 등으로 인한 암의 악화를 억제하는 효과 등을 포함한다.
상기 감염성 질환, 자가면역 질환, 및 염증성 질환은 앞서 설명한 면역 강화(예컨대, 면역세포(이펙터 T 세포, 예컨대 세포독성 T 세포; CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, NK 세포 등) 기능 강화(활성화) 및/또는 증식, 조절 T 세포(Treg) 활성 억제 및/또는 소거(depletion), 면역단백질(예컨대, 사이토카인(IL-2, IFN-gamma, TNF-alpha 등) 등) 생산 및/또는 분비 증가 등)에 의하여 치료, 완화, 및/또는 예방 가능한 모든 감염성 질환, 자가면역 질환, 및 염증성 질환 중에서 선택된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 감염성 질환은 바이러스, 세균, 진균, 기생충과 같이　질병을 일으키는 병원체가 생물체(예, 인간을 포함하는 동물) 내에 전파, 침입하여 발생하는 질병을 총칭하는 것으로, 바이러스, 세균, 진균, 기생충 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 병원체의 감염 또는 상기 감염으로 인한 질병(감염증)일 수 있다. 상기 자가면역 질환은 류마티스 관절염, 1형 당뇨병, 크론병, 궤양성 대장염, 베체트 증후군, 루푸스, 쇼그랜 증후군, 중증근무력증, 경피증, 갑상선기증저하증, 갑상선기능항진증, 건선, 백반증, 다발성경화증, 자가면역성 간염, 자가면역성 신장염, 자가면역성 췌장염, 자가면역성 뇌염, 사이토카인 폭풍 등으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 염증성 질환은 염증(예, 만성 염증 또는 급성 염증) 또는 염증으로 인한 질병을 총칭하는 것으로, 예를 들어, 심장 염증(예, 관상동맥질환, 협심증, 심근경색, 심장막염, 심근염 등), 혈관 염증(예, 죽상경화증, 혈관염, 파종성혈관내응고(DIC), 면역성혈소판감소자반증(ITP), 혈전성혈소판감소자반증(TTP), 빈혈 등), 상기도 염증(예, 급성 비인두염, 알레르기비염, 부비동염, 인두염, 편도염, 후두염 등), 하기도 및/또는 폐 염증(예, 기관지염, 기관지확장증, 천식, 만성폐홰성폐질환(COPD), 폐렴, 간질성 폐질환, 결핵 등), 상부 위장관 염증(예, 위염, 식도염 등), 하부 위장관 염증(예, 소장염, 궤양성 대장염, 크론병, 셀리악병, 게실염, 과민성대장증후군, 맹장염, 치루 등), 간, 담도 및/또는 췌장 염증(예, 간염, 지방간, 담관염, 담낭염, 췌장염, 제1형 당뇨병 등), 신장(상부요로) 염증(예, 신우신염, 사구체신염, 요로감염증 등), 하부요로 염증(예, 요로감염증, 요관염, 요도염, 방광염, 전립선염/만성골반통증후군 등), 갑상선 및/또는 부갑상선 염증(예, 갑상선염, 부갑상선염 등), 부신 염증(예, 부신염 등), 생식기관 염증(예, 골반내 염증성 질환, 난소염, 고환염, 부고환염 등), 뼈 및/또는 관절 염증(예, 골관절염, 류마티스 관절염, 골수염, 활막염 등), 피부 염증(예, 피부: 연조직염, 단독(Erysipelas), 어루러기, 무좀, 여드름 등), 근육 염증(예, 근염 등), 뇌 염증(예, 뇌염, 주요우울장애 등), 신경 염증(예, 눈, 귀 등 다양한 부위의 신경염, 복합부위 통증 증후군, 길랑-바레 증후군 등), 눈 염증(예, 다래끼, 포도막염, 결막염 등), 귀 염증(예, 중이염, 유양돌기염 등), 구강 염증(예, 구내염, 치주염, 치은염 등), 전신성 염증(예, 전신성 염증반응 증후군(패혈증 등), 대사증후군 관련 질환 등), 복막염, 재관류 손상, 이식거부반응, 과민반응 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 제공되는 항-TIGIT 항체, 이의 항원결합단편, 및/또는 이를 포함하는 약학 조성물의 투여 대상은 모든 동물 또는 세포일수 있으며, 예컨대, 인간, 원숭이 등의 영장류, 래트, 마우스, 등의 설치류 등을 포함하는 포유류에서 선택되는 동물, 또는 상기 동물로부터 유래하는(분리된) 세포, 조직, 체액 (예컨대, 혈청), 또는 이의 배양물일 수 있으며, 예컨대, 인간 또는 인간으로부터 분리된 세포, 조직, 체액 (예컨대, 혈청)일 수 있다.
상기 약학적 조성물은, 유효성분으로서의 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편에 더하여, 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 담체는 단백질 약물의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물은 또한 약학 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
상기 항-TIGIT 항체, 이의 항원결합단편 및/또는 약학 조성물의 투여는 경구 또는 비경구 경로를 통할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다.
또한, 상기 항-TIGIT 항체, 이의 항원결합단편 및/또는 약학 조성물은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제, 주사제 등의 형태로 제형화될 수 있으며, 제형화를 위하여 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물 내의 유효성분인 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편의 함유량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 상기 약학 조성물의 1일 투여량은 유효성분(항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편)을 기준으로 0.00001 내지 1000㎎/kg, 0.00001 내지 500㎎/kg, 0.00001 내지 100㎎/kg, 0.00001 내지 50㎎/kg, 0.0001 내지 1000㎎/kg, 0.0001 내지 500㎎/kg, 0.0001 내지 100㎎/kg, 0.0001 내지 50㎎/kg, 0.001 내지 1000㎎/kg, 0.001 내지 500㎎/kg, 0.001 내지 100㎎/kg, 0.001 내지 50㎎/kg, 0.01 내지 1000㎎/kg, 0.01 내지 500㎎/kg, 0.01 내지 100㎎/kg, 0.01 내지 50㎎/kg, 0.1 내지 1000㎎/kg, 0.1 내지 500㎎/kg, 0.1 내지 100㎎/kg, 또는 0.1 내지 50㎎/kg 범위일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 1일 투여량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나, 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 또한 본 명세서에서 약학적 유효량은 유효성분이 목적하는 약학적 활성을 나타낼 수 있는 유효성분의 양을 의미하는 것으로, 상기한 투여량 범위일 수 있다.
폴리뉴클레오타이드, 발현벡터, 및 항체의 제조
다른 예는 항-TIGIT 항체의 중쇄 상보성 결정 부위, 중쇄 가변영역 또는 중쇄를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
다른 예는 항-TIGIT 항체의 경쇄 상보성 결정 부위, 경쇄 가변영역 또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
다른 예는 상기 항-TIGIT 항체의 중쇄 상보성 결정 부위, 중쇄 가변영역 또는 중쇄를 암호화하는 핵산 분자 및 항-TIGIT 항체의 경쇄 상보성 결정 부위, 경쇄 가변영역 또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 하나의 벡터 함께 포함하거나 각각 별개의 벡터에 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 상기 핵산 분자의 발현을 위한 발현벡터일 수 있다.
다른 예는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다.
용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들명, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
상기 재조합 벡터에서 상기 핵산 분자는 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 용어 "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 뉴클레오타이드 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오타이드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 조절 서열은 "작동 가능하게 연결(operatively linked)"됨으로써 다른 뉴클레오타이드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.
상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, pLλ 프로모터, CMV 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
상기 재조합 세포는 상기 재조합 벡터를 적절한 숙주 세포에 도입시킴으로써 얻어진 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 상기 재조합 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 세포로서 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, CHO S, CHO DXB11, CHO GS-KO, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK 세포주 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 핵산 분자 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 운반(도입)은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.
다른 예는 상기 핵산 분자를 숙주세포에서 발현시키는 단계를 포함하는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편의 생산 방법을 제공한다. 상기 핵산 분자를 숙주세포에서 발현시키는 단계는 상기 핵산 분자 또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 제조 방법은, 상기 배양하는 단계 이후에, 임의로, 배양 배지로부터 항체 또는 항원결합단편을 분리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편은 TIGIT의 작용을 봉쇄하여 면역을 활성화 (e.g., 이펙터 T세포 기능 강화, Treg 활성 제어, 사이토카인 분비 증가 등)시키는 기능을 가지며, 다양한 면역 활성화제 및/또는 면역 치료제로서 적용될 수 있다.
도 1a는 일 실시예에 따른 항-TIGIT 항체 2B7 및 3F8의 인간 TIGIT 단백질에 대한 결합 친화도를 ELISA로 측정한 결과를 보여준다.
도 1b는 일 실시예에 따른 항-TIGIT 항체 2B7 및 3F8의 원숭이 TIGIT 단백질에 대한 결합 친화도를 ELISA로 측정한 결과를 보여준다.
도 1c는 일 실시예에 따른 항-TIGIT 항체 2B7 및 3F8의 인간 TIGIT 발현 CHO K1 세포에 대한 결합력을 유세포분석으로 측정한 결과를 보여준다.
도 2a 및 2b는 일 실시예에 따른 항-TIGIT 항체 2B7 및 3F8의 원숭이 TIGIT 발현 Jurkat 세포에 대한 결합력을 유세포분석으로 측정한 결과를 보여준다.
도 3a 내지 3c는 인간 IgG1과 일 실시예에 따른 항-TIGIT 항체 2B7 및 3F8의 TIGIT-PVR 상호작용 차단 분석 결과를 보여주는 그래프이다.
도 4a 내지 4f는 일 실시예에 따른 항-TIGIT 항체 2B7 및 3F8이 처리된 CD4+ T 세포에서의 사이토카인 생산 수준을 보여주는 그래프이다.
도 5a 내지 5f는 일 실시예에 따른 항-TIGIT 항체 2B7 및 3F8이 처리된 CD8+ T 세포에서의 사이토카인 생산 수준을 보여주는 그래프이다.
도 6은 일 실시예에 따른 항-TIGIT 항체 2B7 및 3F8이 처리된 CD56+ NK 세포에서의 사이토카인 생산 수준을 보여주는 그래프이다.
도 7은 일 실시예에 따른 항-TIGIT 항체 2B7 및 3F8이 처리된 NK 세포 표면에서의 CD107a 발현 수준을 보여주는 그래프이다.
도 8은 일 실시예에 따른 항-TIGIT 항체 2B7 및 3F8이 처리된 NK 세포에서의 Granzyme B의 생성 수준을 보여주는 그래프이다.
도 9a 내지 9h는 일 실시예에 따른 항-TIGIT 항체 2B7 및 3F8이 처리된 PBMC의 암세포주에 대한 세포 독성을 보여주는 그래프이다.
이하에서는 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 하나, 이는 예시적인 것에 불과할 뿐 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 아래 기재된 실시예들은 발명의 본질적인 요지를 벗어나지 않는 범위에서 변형될 수 있음은 당 업자들에게 있어 자명하다.
실시예 1: 단클론 항-TIGIT 항체의 제작 및 TIGIT 단백질에 대한 결합친화도 측정
1.1. 마우스 단클론 항-TIGIT 항체의 제작
4 마리의 BALB/c 마우스에 His-tagged 인간 TIGIT 단백질(R&D systems, UniProtKB/SwissProt Q495A1-1)를 14일동안 4회 연속 교차 주입하여 면역화시켰다. 4 마리 마우스로부터 림프구를 수집하고 이를 모아서 정제한 후, SP2/0 골수종 세포와 융합시켰다. 융합된 세포는 HAT 선택적 단일-단계 클로닝 배지(HAT selective single-step cloning media)에서 증식시키고, 얻어진 2X920개의 하이브리도마 클론을 ClonePix2(Molecular Devices)로 선택하고 96-웰 플레이트에 옮겨 담고 배양하였다.
간접(indirect) ELISA를 이용하여, 재조합 인간 TIGIT(His)(R&D systems)에 대하여 효과를 가지는 하이브리도마 조직 배양액의 상청액을 스크리닝하였다. 효과를 가지는 클론(Positive clones)에 대하여 스크리닝 항원(재조합 인간 TIGIT Fc 키메라 단백질(R&D systems)) 및 세포에 대한 indirect ELISA를 추가로 수행하여 Ig 분비 및 특이성을 확인하였다. CHO-K1(ATCC, CCL-61) 세포주를 음성 대조군으로 사용하였다.
ELISA는 다음과 같은 조건 하에서 수행하였다;
- ELISA plates는 0.1μg/well의 재조합 인간 TIGIT (rhTIGIT) 단백질을 Carbonate Coating Buffer (pH 9.6) O/N에 100μL/well 농도로 포함하는 코팅액으로 4℃에서 코팅.
- PBS에 포함된 3% skim milk powder로 1시간 동안 실온에서 차단
- PBS-Tween에 포함된 이차항체 1:10000 Goat anti-mouse IgG/M(H+L)-HRP (100uL/well)를 1시간 동안 처리 (37℃, w/shaking).
- 모든 세척 단계는 PBS-Tween으로 3분동안 수행함.
- TMB 기질을 50uL/well 농도로 첨가, 암조건하에 두고(5~10 mins), 동량의 1M HCl로 종료시킴.
이소타이핑(isotyping)에 의하여, IgM 발현 클론을 분리하여 제거하고, IgG 발현 클론들을 수집하였다.
상기 수집된 양성 클론을 서브클로닝하여 안정적인 발현 클론을 확인하였다. 선택된 클론들을 포함하는 배양 상청액을 Protein A 컬럼에 흘려주며 용출시키고, 버퍼를 PBS로 교체하였다. 스크리닝 항원(Recombinant Human TIGIT (T103) Fc Chimera Protein; R&D systems) 및 음성대조군 항원(His peptide)에 대한 indirect ELISA를 수행하여 정제된 항체를 시험하였다.
수집된 양성 클론 중에서 선도 항체로 2B7 및 3F8 클론(mouse backbone (mIgG1) 기반의 마우스 항체)을 선별하였다.
1.2. 인간 TIGIT에 대한 결합 친화도 측정 (ELISA)
ELISA 플레이트를 인산염완충식염수(PBS)(Gibco)에 용해된 1μg/ml 농도의 재조합 인간 TIGIT 단백질(acrobiosystems, China)로 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이팅 하였다. 상기 코팅된 플레이트를 블로킹버퍼(3%(v/v) skim milk in PBS)로 1시간 동안 차단시키고, 연속 희석시킨 마우스 항-TIGIT 단클론 항체(2B7, 3F8; 시작농도: 9μg/ml, 1:3 연속 희석)를 첨가하였다. 인큐베이션 후, anti-Mouse-HRP antibody (1:10000 dilution)을 각 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 TMB 용액으로 전개하고, 1N HCL로 정지시켰다. GloMax® Explorer(Promega) Fully Loaded로 450nM에서의 흡광도(O.D.)를 측정하였다.
상기 얻어진 결과를 도 1a에 나타내었다. 도 1a에 나타난 바와 같이, 항-TIGIT 단클론 항체(2B7, 3F8)가 용량의존적으로 인간 TIGIT 단백질에 결합함을 확인하였다.
1.3. 원숭이 (cynomolgus monkey) TIGIT에 대한 결합 친화도 측정 (ELISA)
ELISA 플레이트를 인산염완충식염수(PBS)(Gibco)에 용해된 1μg/ml 농도의 재조합 원숭이 TIGIT 단백질(recombinant cynomolgus TIGIT; acrobiosystems, China)로 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이팅 하였다. 상기 코팅된 플레이트를 블로킹버퍼(3%(v/v) skim milk in PBS)로 1시간 동안 차단시키고, 연속 희석시킨 마우스 항-TIGIT 단클론 항체(2B7, 3F8; 시작농도: 9μg/ml, 1:3 연속 희석)를 첨가하였다. 인큐베이션 후, anti-Mouse-HRP antibody (1:10000 dilution)을 각 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 TMB 용액으로 전개하고, 1N HCL로 정지시켰다. GloMax® Explorer(Promega) Fully Loaded로 450nM에서의 흡광도(O.D.)를 측정하였다.
상기 얻어진 결과를 도 1b에 나타내었다. 도 1b에 나타난 바와 같이, 항-TIGIT 단클론 항체(2B7, 3F8)가 용량의존적으로 원숭이 TIGIT 단백질에 결합함을 확인하였다.
1.4. 인간 TIGIT에 대한 결합 친화도 측정 (multi-cycle kinetic analysis)
상기 선택된 마우스 항체(2B7, 3F8)의 인간 TIGIT 항원에 대한 결합 친화도를 측정하기 위하여, 정제된 단백질(항체)에 대한 multi-cycle kinetic analysis를 수행하였다. Kinetic experiments는 25°C에서 Biacore T200 Control software V2.0.1 및 Evaluation software V3.0를 실행하는 Biacore T200(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)를 사용하여 수행하였다.
1% BSA w/v(Sigma, Dorset, UK)이 보충된 HBS-P+(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)를 running buffer로 사용하고, 리간드와 분석물 희석에도 사용하였다. 상기 마우스 항체(2B7, 3F8)를 running buffer에서 1μg/mL까지 희석하고, 각 사이클의 개시 시에, anti-human IgG CM5 sensor chip(GE Healthcare, Little Chalfont, UK) 상의 Fc2, Fc3 및 Fc4에 로딩하였다. 항체들을 10 μl/min 유속으로 캡쳐하여 고정화 수준(RL)이 ~150 RU가 되도록 하였다. 그 후, 표면이 안정화되도록 두었다.
잠재적 mass transfer effect를 최소화하기 위하여 40μl/min 유속으로 주입된 재조합 인간 TIGIT(acrobiosystems, China)을 analyte로 사용하여 Multi-cycle kinetic 데이터를 얻었다. 항원(TIGIT)은 running buffer에 0.406 nM 내지 30 nM 농도 범위에서 2배씩 희석(6개 지점)하였다. 각 농도 사이에 regeneration이 없게 하여 사용하였다. 각 농도에서, 210초 동안 association phases를 모니터링하고, 900초 동안 dissociation phase를 측정하였다. 3 M MgCl2를 2회 injection하여 사이클 사이에 센서칩 표면 재생을 수행하였다. kinetic cycles에 걸쳐 표면과 analyte 모두의 안정성을 확인하기 위하여, blank의 다회 반복 및 단일 농도의 analyte의 반복을 kinetic run으로 프로그래밍하였다.
상기 얻어진 2B7, 3F8 항체에 대한 결과를 표 3에 나타내었다:
Antibody Analyte ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M) RMAX Chi2(RU2)
2B7 hTIGIT 2.35E+05 4.45E-04 1.89E-09 32 0.352
3F8 hTIGIT 2.19E+05 2.16E-04 9.86E-10 29.8 0.12
상기 표 3은 1:1 model fitted curves로부터 결정된 kinetic constants를 보여준다. 표 3 나타난 바와 같이, 인간 TIGIT 단백질에 대한 결합친화도(KD)는 항체 2B7의 경우 1.89 nM이고 항체 3F8의 경우 0.98 nM을 나타내었다.
1.5. 인간 TIGIT 발현 세포에 대한 결합 시험
상기 선별된 마우스 항체 2B7 및 3F8의 CHO-K1 세포(ATCC, CCL-61) 및 인간 TIGIT 발현 CHO-K1 세포(CHO-K1 TIGIT)(Genscript, M00542)에 대한 결합을 유세포 분석으로 측정하였다. 1X105세포를 96-웰에 넣고, 상기 마우스 항체 (10μg/mL, 2 μg/mL, 0.5 μg/mL)를 첨가하였다. 30분 배양 후, 항-mouse IgG(H+L) Alexa Fluor 647 항체(Sigma A21236) 4μg/mL(protected from light)를 사용하여 항체 결합을 측정하였다. 유세포분석은 AccuriC6 Flow Cytometer를 사용하여 수행하고, 데이터는 FlowJo로 분석하였다. 상기 얻어진 결과를 도 1c에 나타내었다.
도 1c에 나타난 바와 같이, 상기 선별된 항-TIGIT 항체들(2B7, 3F8)이 모두 인간 TIGIT을 발현하는 CHO K1 세포에 결합함을 확인하였다.
실시예 2. 마우스-인간 키메라 항체의 제작 및 TIGIT 단백질에 대한 결합 측정
2.1. 마우스-인간 키메라 항체의 제작
상기 실시예 1-1에서 선별된 안정적 발현 클론(2B7, 3F8)에 해당하는 하이브리도마 세포 펠렛을 용해시키고, mRNA를 추출하고, 중쇄 및 경쇄의 가변영역 DNA를 시퀀싱 벡터에 클로닝하여 중쇄 및 경쇄 DNA 서열을 분석한 후, 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역에 각각 인간 IgG1의 중쇄 불변영역 및 경쇄 불변영역 (kappa)을 연결하여 마우스-인간 키메라 항체를 제조하였다. 상기 제조된 마우스-인간 항-TIGIT 키메라 항체 (클론 2B7 및 3F8)의 서열을 분석하고, 그 결과를 하기의 표 4 및 표 5에 기재하였다.
키메라 항-TIGIT 클론 2B7의 서열
아미노산 서열(N→C) 또는 핵산서열 (5'→3') 서열번호
중쇄 중쇄가변영역 EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGSTFTEYTMHWVKQSHGKSLEWIGGLNPNNGGTSYNQRFKDRATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRGTYYDYSFAYWGQGTLVTVSA 13
중쇄불변영역 (인간 IgG1) ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 25
중쇄 EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGSTFTEYTMHWVKQSHGKSLEWIGGLNPNNGGTSYNQRFKDRATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRGTYYDYSFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 17
중쇄 가변영역 코딩 DNA GAGGTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGACTTCTGGATCCACATTCACTGAATATACCATGCACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGGTCTTAATCCTAACAATGGTGGTACTTCCTACAACCAGAGGTTCAAGGACAGGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAAGATTCTGCTGTCTATTACTGTACAAGAGGGACTTACTATGATTACTCGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA 19
경쇄 경쇄가변영역 DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASHYVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSPSYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCHQHYSTPWTFGGGTKLEIK 15
경쇄불변영역 (kappa) RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 26
경쇄 DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASHYVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSPSYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCHQHYSTPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 18
경쇄 가변영역 코딩 DNA GACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCATCACCTGCAAGGCCAGTCATTATGTGAGTACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGACAATCTCCTAAACTACTGATTTACTCGCCATCCTACCGGTACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACTGGCAGTGGATCTGGGACGGATTTCACTTTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCACCAACATTATAGTACTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA 20
키메라 항-TIGIT 클론 3F8의 서열
아미노산 서열(N→C) 또는 핵산서열 (5'→3') 서열번호
중쇄 중쇄가변영역 EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTDYIMNWVKQSHGKNLEWIGLSIPYNGGTSYNQKFEGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARGIKGYFAMDYWGQGTSVTVSS 14
중쇄불변영역 (인간 IgG1) ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 25
중쇄 EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTDYIMNWVKQSHGKNLEWIGLSIPYNGGTSYNQKFEGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARGIKGYFAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 21
중쇄 가변영역 코딩 DNA GAGGTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGAGCTTCAATGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGACTACATCATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAACCTTGAGTGGATTGGACTTAGTATTCCTTATAATGGTGGTACTAGCTACAACCAGAAGTTCGAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCCTCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGGGGGATTAAGGGTTACTTTGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA 23
경쇄 경쇄가변영역 DVVVTQTPLSLPVSFGDQVSISCRSSQSLVNSFGKTYLSWFLHKPGQSPQLIMYGVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISTIKPEDLGMYYCLQGTHQPWTFGGGTKLEIK 16
경쇄불변영역 (kappa) RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 26
경쇄 DVVVTQTPLSLPVSFGDQVSISCRSSQSLVNSFGKTYLSWFLHKPGQSPQLIMYGVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISTIKPEDLGMYYCLQGTHQPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 22
경쇄 가변영역 코딩 DNA GATGTTGTGGTGACTCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGCTTTGGAGATCAAGTTTCTATCTCTTGCAGGTCTAGTCAGAGTCTTGTAAACAGTTTTGGGAAAACCTATTTGTCTTGGTTCCTGCACAAGCCTGGCCAGTCTCCACAGCTCATCATGTATGGGGTTTCCAACAGATTCTCTGGGGTGCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGTTCGGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCACAATAAAGCCTGAAGACTTGGGAATGTATTACTGCTTACAAGGTACACATCAGCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA 24
(표 4 및 표 5에서, 밑줄로 표시된 영역은 순서대로 중쇄 및 경쇄의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 나타내고, 불변영역은 이탤릭체로 나타냄)
2.2. 마우스(cynomolgus monkey) TIGIT 발현 세포에 대한 결합 시험
상기 실시예 2.1에서 클론 2B7 또는 3F8에 의해 생성된 키메라 항-TIGIT 단클론 항체의 cynomolgus monkey TIGIT-발현 세포에 대한 결합 친화도를 측정하였다. 이를 위하여, 상기 키메라 항-TIGIT 단클론 항체(2B7 또는 3F8) 및 Tiragolumab(Selleckchem; 대조 항-TIGIT 단클론 항체)을 Alexa Fluor™ 488 Antibody Labeling Kit (Invitrogen™)를 이용하여 Alexa Fluor™ 488('AF488')로 표지하였다. 원숭이(cynomolgus monkey) TIGIT-발현 Jurkat 세포(Creative Biogene) 0.2M 를 둥근 바닥 96웰 플레이트 상에서 1:400(1/400)로 희석된 Zombie Aqua™ Fixable Viability Kit dye(BioLegend)로 상온에서 20분간 염색하여, 사멸 세포를 제거하였다. 얻어진 세포를 FACS 버퍼(1% FBS 함유 phosphate-buffered saline(PBS, Thermo))으로 세척하였다. 세척 후, 세포를 상기 AF488-표지된 키메라 항-TIGIT 단클론 항체 2B7 또는 3F8로 얼음 위에서 30분 동안 염색하였다. 상기 염색에서의 항-TIGIT 항체의 사용량은 1.72, 3.44 및 6.88 nM로 하였다. 그 후, 상등액을 제거하고 세포를 FACS 버퍼로 400 x g 및 4°C 조건에서 6분 동안 두 번 세척하였다. FACS 버퍼로 세척한 후, 유세포 분석기(CytoFLEX, Beckman Coulter)로 형광 강도를 측정하여 세포를 분석하고 Flowjo software (BD)를 사용하여 데이터를 분석하였다. 항-TIGIT 단클론 항체의 결합은 비율(ratio) 및 평균 형광 강도(mean fluorescence intensity; MFI)에 의해 평가하였다.
상기 얻어진 결과를 도 2a (ratio) 및 2b (MFI)에 나타내었다. 상기 결과에서 보여지는 바와 같이, 시험된 두 종류의 키메라 항-TIGIT 단일클론 항체 (2B7, 3F8)는 모두 원숭이(cynomolgus monkey) TIGIT-발현 Jurkat 세포에 대해 대조 항-TIGIT 단클론 항체(Tiragolumab)와 비교하여 더 높은 결합 친화도를 나타내었다.
본 실시예를 통하여 세포 결합 분석을 통해, 항-TIGIT 항체 클론 2B7 및 3F8는 모두 인간 TIGIT뿐만 아니라 (실시예 1.2~1.5 참조) 원숭이 TIGIT에도 결합할 수 있음을 확인하였다. 이러한 결과는 본 출원에서 제공하는 항-TIGIT 항체가 Monkey 모델을 사용한 전임상 연구에 사용될 수 있음을 의미한다.
실시예 3. 항-TIGIT 항체의 Cell-based reporter assay에 의한 생물학적 활성 측정
항-TIGIT 항체의 TIGIT과 이의 리셉터인 poliovirus receptor (PVR)(CD155)와의 상호작용에 대한 차단 효과(TIGIT-PVR blocking effect)를 cell-based NFAT reporter response bioassay(Promega)로 분석하였다. TIGIT 이펙터 세포(Promega)를 cell assay buffer(90% RPMI 1640/10% FBS)에 첨가하고, 상기 TIGIT 이펙터 세포를 포함하는 세포 현탁액을 37°C에서 16시간 동안 배양하였다. 항-TIGIT 항체(2B7, 3F8; 실시예 1-1)를 PBS 버퍼에 준비하고, 상기 미리-배양된 세포 현탁액에 첨가하였다. CD155 aAPC/CHO-K1 세포(Promega)를 상기 세포와 항체 함유 혼합물에 첨가하고, 37°C에서 6시간동안 배양하였다. Promega™ GloMax® Plate Reader로 발광 정도를 측정하였다. curve fitting software(GraphPad Prism® software)를 사용하여 항체반응의 EC50 값을 측정하였다.
상기 얻어진 결과를 도 3a (hIgG1), 3b (2B7), 및 3c (3F8)에 나타내었다. 도 3a-3c에 보여지는 바와 같이, Control(human IgG1) 대비, 항-TIGIT 2B7 항체의 TIGIT-PVR 차단에 의하여 T 세포 활성화 신호가 증가하였다. 또한, 항-TIGIT 3F8 항체의 TIGIT-PVR 차단에 의하여 T 세포 활성화 신호도 증가하였다.
실시예 4. 항-TIGIT 항체의 면역 강화 효과
4.1. 인간 PBMCs 및 종양 침윤 림프구의 준비
말초혈액 단핵세포(PBMC)는 성인(whole blood leukocyte cones, NHS Blood and Transplant, UK)에게서 얻거나 STEMCELL Technologies로부터 구입하였다. 상기와 같이 얻어진 PBMC에 대하여 다음 분석을 수행하였다.
4.2. 참조예: 비교 항체(reference antibodies)의 준비
하기 실시예에서 비교를 위하여 사용된 비교 항체들(Reference antibodies; 항-TIGIT 단클론 항체)을 각각 대응하는 특허에 기재된 서열정보를 기초로 만들거나 제조사로부터 입수하였다. 각 항체들의 대응 특허 또는 제조사를 아래에 요약하였다:
22G2(BMS): US2016/0176963 A1,
4.1D3(Genentech): WO2017/053748 A2,
313M32(Mereo): US2016/0376365 A1,
4.3. 항-TIGIT 항체의 면역 강화 효과 (인간 T 세포에서의 사이토카인 생산 효과)
본 실시예에서는 항-TIGIT 단클론 항체(2B7, 3F8; 실시예 2.1(키메라 항체)) 또는 비교 항체 (4.1D3, 22G2, 실시예 4.2 참조)의 처리에 의한 인간 PBMC에서의 사이토카인 생산을 측정하였다.
이를 위하여, 인간 PBMC(STEMCELL; 실시예 4.1; 500,000 cells)를 10%(v/v) FBS(Gibco), 페니실린-스트렙토마이신(Sigma), L-글루타민(시그마) 및 HEPES(Sigma)를 포함하는 PRMI1640 배지 (Gibco)에 재현탁시키고, 96웰 플레이트에 시딩하였다. T 세포를 suboptimal activation시키기 위하여, PBMC를 0.2μg/ml의 항-CD3 단클론 항체(BD Biosciences, clone HIT3) 및 1μg/ml의 항-CD28 단클론 항체(BD Biosciences, clone CD28.2)로 자극하였다. 상기 항-CD3/CD28로 자극 시에, 상기 항-TIGIT 단클론 항체(2B7, 3F8) 또는 비교 항체를 각각 2, 5 또는 10μg/ml의 양으로 PBMC에 처리하였다. 대조군(control)으로 suboptimal activation되고 항체가 처리되지 않은 PBMC를 사용하였다. PBMC를 37°C 및 5% CO2 조건에서 4시간 동안 배양한 후, Brefeldin A(Sigma)를 첨가한 뒤 15시간 동안 추가로 배양하였다. 상기 배양된 세포를 4°C에서 6분 동안 원심분리기(400 x g)로 스핀다운하여 배양한 후 수확하였다. 상청액을 제거하고, 동일한 원심분리 조건에서 세포를 PBS(phosphate-buffered saline)(Thermo)로 2회 세척하였다.
세포를 PBS에 1:400(1/400)로 희석된 Zombie Aqua fixable dead cell dye solution (Biolegend)으로 실온에서 20분 동안 염색하였다. 상기 염색된 세포를 1%(v/v) FBS를 포함하는 PBS('FACS 버퍼')로 세척하고, fluorophore-접합 항체(항-CD3 항체(Biolegend, 1:100), 항-CD4 항체(Biolegend, 1:100), 항-CD8 항체(Biolegend, 1:100))로 표지하였다 (in the dark on ice). 세포를 FACS 버퍼로 세척한 후, 실온 및 암실 조건에서 45분 동안 Fixation/perm buffer (Thermo)에 재현탁하였다. 그런 다음, 세포를 permeabilization wash buffer (Thermo)로 두 번 세척하고, 400 x g 조건에서 10분 동안 원심분리하여 펠릿화하였다.
사이토카인 염색을 위해, 상기 세포를 항-IL-2 항체 (Biolegend, 1:50), 항-IFN-γ 항체 (Biolegend, 1:50), 및 항-TNF-α 항체 (Biolegend, 1:50)를 함유하는 permeabilization wash buffer (Thermo)에 재현탁하였다. 그 후, 상기 세포를 실온 및 암실 조건에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 상기 세포를 FACS 버퍼로 세척한 후, 유세포 분석기(CytoFLEX, Beckman Coulter)로 형광 강도를 측정하여 세포를 분석하고, Flowjo software (BD)를 사용하여 데이터를 분석하였다. 사이토카인 생산은 CD4+ T 세포(CD3+CD4+CD8-) 및 CD8+ T 세포(CD3+CD8+CD4-)에서 측정하였다.
상기 얻어진 결과를 도 4a-4f (CD4+ T 세포에서의 사이토카인 생산) 및 도 5a-5f (CD8+ T 세포에서의 사이토카인 생산)에 나타내었다 (이들 도면에서, 각 항체의 결과는 왼쪽부터 순서대로 2 μg/ml, 5μg/ml 및 10μg/ml 용량의 결과임).
상기 결과에서 확인되는 바와 같이, 항-CD3/CD28 단클론 항체로 suboptimal T cell activation시킨 인간 PBMC의 in vitro culture system에 있어서, 항-TIGIT 단클론 항체(2B7, 3F8)는, 동일 용량의 비교항체(4.1D3, 22G2)와 비교하여, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포 모두에서 더 높은 수준의 사이토카인(IL-2, IFN-γ 및 TNF-α) 생산을 유도하였다. 또한, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포 모두에서 이중 양성(DP; IL-2+IFN-γ+, IFN-γ+TNF-α+) 및 삼중 양성(TP; IL-2+IFN-γ+TNF-α+) 세포수가 용량 의존적으로 증가하였다. 이러한 결과는 본 출원에서 제공되는 항-TIGIT 단클론 항체가 T 세포 매개 반응(IL-2 및 IFN-γ)을 강화하고 항종양 효과(TNF-α)를 가짐을 보여준다.
4.4. 항-TIGIT 항체의 면역 강화 효과 (인간 NK 세포에서의 사이토카인 생산 효과)
본 실시예에서는 항-TIGIT 단클론 항체(2B7, 3F8; 실시예 1.1(마우스 항체)) 또는 비교 항체 (313M32, 실시예 4.2 참조)의 처리에 의한 인간 PBMC에서의 사이토카인 생산을 측정하였다.
이를 위하여, 인간 PBMC(STEMCELL; 실시예 4.1, 500,000 cells)을 10%(v/v) FBS(Gibco), 페니실린-스트렙토마이신(Sigma), L-글루타민(시그마) 및 HEPES(Sigma)를 포함하는 PRMI1640 배지 (Gibco)에 재현탁시키고, 96웰 플레이트에 시딩하였다. T 세포를 suboptimal activation시키기 위하여, PBMC를 0.2μg/ml의 항-CD3 단클론 항체(BD Biosciences, clone HIT3) 및 1μg/ml의 항-CD28 단클론 항체(BD Biosciences, clone CD28.2)로 자극하였다. 상기 항-CD3/CD28로 자극 시에, 상기 항-TIGIT 단클론 항체(2B7, 3F8) 또는 비교 항체를 각각 5μg/ml 또는 10μg/ml의 양으로 PBMC에 처리하였다. 대조군(control)으로 suboptimal activation되고 항체가 처리되지 않은 PBMC를 사용하였다. PBMC를 37°C 및 5% CO2 조건에서 4시간 동안 배양한 후, Brefeldin A(Sigma)를 첨가한 뒤 15시간 동안 추가로 배양하였다. 상기 배양된 세포를 4°C에서 10분 동안 원심분리기(400 x g)로 스핀다운하여 배양한 후 수확하였다. 상청액을 제거하고, 동일한 원심분리 조건에서 세포를 PBS(phosphate-buffered saline)(Thermo)로 2회 세척하였다.
세포를 PBS에 1:400(1/400)로 희석된 Zombie Aqua fixable dead cell dye solution (Biolegend)으로 실온에서 20분 동안 염색하였다. 상기 염색된 세포를 1%(v/v) FBS를 포함하는 PBS('FACS 버퍼')로 세척하고, fluorophore-접합 항체(항-CD3 항체(Biolegend, 1:100), 항-CD4 항체(Biolegend, 1:100), 항-CD8 항체(Biolegend, 1:100), 항-CD56 항체(Biolegend, 1:100))로 30분 동안 표지하였다 (in the dark on ice). 세포를 FACS 버퍼로 세척한 후, 실온 및 암실 조건에서 45분 동안 Fixation/perm buffer (Thermo)에 재현탁하였다. 그런 다음, 세포를 permeabilization wash buffer (Thermo)로 두 번 세척하고, 400 x g 조건에서 10분 동안 원심분리하여 펠릿화하였다.
사이토카인 염색을 위해, 상기 세포를 항-IFN-γ 항체 (Biolegend, 1:50) 및 항-TNF-α 항체 (Biolegend, 1:50)를 함유하는 permeabilization wash buffer (Thermo)에 재현탁하였다. 그 후, 상기 세포를 실온 및 암실 조건에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 상기 세포를 FACS 버퍼로 세척한 후, 유세포 분석기(CytoFLEX, Beckman Coulter)로 형광 강도를 측정하여 세포를 분석하고, Flowjo software (BD)를 사용하여 데이터를 분석하였다. 사이토카인 생산은 CD56+ NK 세포 (CD3-CD56+)에서 측정하였다.
상기 얻어진 결과를 도 6에 나타내었다 (이들 도면에서, white bar는 5 μg/ml 용량의 결과를, grey bar는 10 μg/ml 용량의 결과를 각각 나타냄).
상기 결과에서 확인되는 바와 같이, 항-CD3/CD28 단클론 항체로 suboptimal T cell activation시킨 인간 PBMC의 in vitro culture system에 있어서, 항-TIGIT 단클론 항체(2B7, 3F8)는, 동일 용량의 비교항체(313M32)와 비교하여, CD56+ NK 세포에서 더 높은 수준의 사이토카인(IFN-γ 및 TNF-α) 생산을 유도하였다. 이러한 결과는, 상기 in vitro system에 NK 세포에 대한 direct activator가 없음에도, 본 출원에서 제공되는 항-TIGIT 단클론 항체가 종양반응에 대한 세포독성에 중요한 역할을 하는 것으로 잘 알려진 IFN-γ와 TNF-α를 증가시켜 NK 세포의 기능적 활성을 증가시킴을 보여준다.
4.5. 항-TIGIT 항체의 면역 강화 효과 (인간 NK 세포에서의 CD107a 표면 발현 증가)
항-TIGIT 항체(2B7 또는 3F8; 실시예 2.1(키메라 항체))를 사용한 자극이 degranulation을 유도할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 건강한 인간 공여자의 PBMC를 96-웰 U-바닥 플레이트 내의 10%(v/v) FBS(Gibco), 페니실린-스트렙토마이신(Sigma), L-glutamine (Sigma)를 함유 RPMI1640 배지에 각 웰당 500,000 cells의 양으로 시딩하였다. 상기 PBMC를 밤새 그대로 두고, 다음 날, 각 항체 클론을 10 μg/ml의 양으로 적절한 조건에서 첨가하고, PECy7과 접합된 항-CD107a 항체(Biolegend, 1:50)를 각 웰에 첨가하고 밤새 방치하였다. PBMC를 항-CD56 항체(Biolegend, 1:50) 및 eFluor 780 Fixable viability dye (Invitrogen, 1:500)로 염색하고, 유세포 분석기(CytoFLEX, Beckman Coulter)를 사용하여 유세포 분석법으로 분석하였다. 유세포 분석 소프트웨어 FlowJo version 10.8.1 (BD Biosciences)에서 CD56+ NK세포를 게이팅하여 분석하고, GraphPad Prism version 9.5.1 (Dotmatics)에서 그래픽 분석을 수행하였다. (Significance was assessed by One-Way ANOVA corrected for multiple comparisons with a Dunnett’s test (n=8), **** P≤0.0001)
상기 얻어진 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에서 보여지는 바와 같이, 항-TIGIT 항체 클론 2B7 및 3F8 모두, 대조군(unstimulated; 항-TIGIT 항체 무처리군)과 비교하여, CD56+ NK 세포 표면에서의 CD107a 발현이 유의미하게 높게 나타났으며, 이는 상기 항-TIGIT 항체 클론들이 CD56+ NK 세포에서의 degranulation 유발 효과를 가짐을 보여준다.
4.6. 항-TIGIT 항체의 면역 강화 효과 (인간 NK 세포에서의 그랜자임 B 발현 증가)
건강한 인간 공여자의 PBMC를 96-웰 U-바닥 플레이트 내의 10%(v/v) FBS(Gibco), 페니실린-스트렙토마이신(Sigma), L-glutamine (Sigma)를 함유 RPMI1640 배지에 각 웰(100μl 배지) 당 500,000 cells의 양으로 시딩하였다. 상기 PBMC를 밤새 그대로 둔 후, 항-TIGIT 항체 클론 (2B7 또는 3F8; 실시예 2.1(키메라 항체)) 10 μg/ml으로 자극하였다. 다음 날, 상기 세포를 PBS (400 x g, 3 분)에서 1회 세척한 후, eFluor 780 Fixable viability dye (Invitrogen, 1:500)를 포함하는 50 μl PBS에 재현탁시켰다. 상기 세포를 암 조건에서 10분간 인큐베이팅한 후, PBS로 원심분리(400 x g, 3 분)하여 1회 세척하였다. 이 시점 이후의 모든 단계는 빛이 차단된 조건에서 수행하였다. 세포를 1x FoxP3 Fix/Perm Buffer(Biolegend)에 재현탁하고 실온에서 20분 동안 배양하였다. 그 후, 상기 세포를 원심분리(400 x g, 3분)하고, 1x FoxP3 Perm Buffer (Biolegend)에 재현탁한 다음, 실온에서 추가로 15분 동안 배양하였다. 세포를 원심분리(3분 동안 400 x g)하고, 항-CD3 항체 (1:50, Biolegend), 항-CD4 항체 (1:50, Biolegend), 항-CD8 항체(1 :50, Biolegend), 항-CD56 항체 (1:50, Biolegend) 및 항-Granzyme B 항체 (1:50, Biolegend)를 포함하는 50 μl Perm buffer (Biolegend) antibody cocktail에 재현탁하였다. 세포를 실온에서 30분 동안 배양한 다음, CytoFlex flow cytometer (Beckman Coulter)에서 분석하였다. FlowJo 10.8.1(BD Biosciences) 및 GraphPad Prism 9.5.1(Dotmatrics)을 사용하여 데이터를 분석하였다. (Significance was assessed by One-Way ANOVA corrected for multiple comparisons with a Dunnett’s test (n=8), * P≤0.05, ** P≤0.01, *** P≤0.001, **** P≤0.0001)
상기 얻어진 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에서 보여지는 바와 같이, 항-TIGIT 항체(2B7 및 3F8)로 PBMC를 자극하면 NK 세포에서의 Granzyme B 발현이 증가하였으며, 이러한 결과는 2B7 및 3F8 클론 모두 NK 세포의 cytotoxic potential을 증가시킬 수 있음을 보여준다.
4.7. 항-TIGIT 항체의 면역 강화 효과 (종양세포에 대한 PBMC 세포독성 증가)
항-TIGIT 항체(2B7 또는 3F8; 실시예 2.1(키메라 항체))를 사용한 자극이 PBMC 세포독성을 증가시킬 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 건강한 인간 공여자의 PBMC를 96-웰 U-bottom 플레이트 내의 10%(v/v) FBS(Gibco), 페니실린-스트렙토마이신(Sigma), L-glutamine (Sigma)를 함유 RPMI1640 배지에 각 웰(50μl 배지) 당 100,000 cells의 양으로 시딩하였다. 다음의 GFP-발현 암세포주를 96-well flat-bottomed plate 내의 각 웰(50μl 배지) 당 5,000 cells의 양으로 시딩하여 plate에 부착되도록 2시간 동안 배양하였다; A549-GFP(폐암; MERK (ECACC) cat# 86012804-1VL), 786-O-GFP(신장암; ATCC cat# CRL-1932), Colo-205-GFP(결장암; MERK (ECACC) cat# 87061208-1VL), MCF7-GFP(유방암; MacroPhox Ltd.). 앞서 100,000 cells로 시딩한 PBMC를 암세포주가 있는 plate의 각각의 well로 옮겨준 뒤, PBMC를 항-TIGIT 항체(2B7 또는 3F8) 10 μg/ml으로 자극하고, 1 ng/ml 항-CD3(HIT3a, Biolegend)로 추가 자극하였다. 그런 다음 세포를 IncuCyte에서 5% CO2 및 37°C 조건에서 5일 동안 배양하였다. 10x 배율로 2시간마다 각 웰당 4개 이미지를 촬영하였다. 0h 시점으로 normalization한 웰당 표적 세포(암세포) 수의 Log2 Fold 값을 취하여 세포독성을 평가하였다. 유의성을 평가하기 위해 각 조건에 대해 곡선 아래 면적(AUC)을 계산하고(도 9a, 9c, 9e 및 9g), 막대 그래프로 표시하였다(도 9b, 9d, 9f 및 9h). IncuCyte 2021A software를 사용하여 데이터를 처리하고, GraphPad Prism 9(Dotmatrics)에서 그래프를 얻고 통계 처리를 수행하였다 (Significance was assessed by One-Way ANOVA corrected for multiple comparisons with a Dunnett’s test (n=8), * P≤0.05, ** P≤0.01, *** P≤0.001, **** P≤0.0001 (Graphs B, D, F and H).
상기 얻어진 결과를 도 9a~9h에 나타내었다. 상기 결과는 항-TIGIT 항체 2B7 및 3F8 모두 다양한 암세포주에 대한 PBMC의 세포독성을 증가시킴을 보여준다. 이는 본 출원의 항체가 다양한 종류의 암세포에 대하여 우수한 항암 효과를 가짐을 시사한다.

Claims (14)

  1. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H1),
    서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H2),
    서열번호 5 또는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H3),
    서열번호 7 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L1),
    서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L2), 및
    서열번호 11 또는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L3)
    를 포함하는, 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편.
  2. 제1항에 있어서,
    서열번호 1의 CDR-H1, 서열번호 3의 CDR-H2, 서열번호 5의 CDR-H3, 서열번호 7의 CDR-L1, 서열번호 9의 CDR-L2, 및 서열번호 11의 CDR-L3; 또는
    서열번호 2의 CDR-H1, 서열번호 4의 CDR-H2, 서열번호 6의 CDR-H3, 서열번호 8의 CDR-L1, 서열번호 10의 CDR-L2, 및 서열번호 12의 CDR-L3
    를 포함하는, 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편.
  3. 제1항에 있어서,
    서열번호 13 또는 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역, 및
    서열번호 15 또는 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역
    을 포함하는, 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편.
  4. 제1항에 있어서,
    서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역; 또는
    서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역
    을 포함하는, 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항-TIGIT 항체는 동물 항체, 키메라 항체, 또는 인간화 항체인, 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편.
  6. 제1항에 있어서, 상기 항원결합단편은 상기 항-TIGIT 항체의 scFv, scFv-Fc, (scFv)2, Fab, Fab', 또는 F(ab')2인, 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편을 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 암은 고형암 또는 혈액암인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 제7항에 있어서, PD-1, PD-L1, 또는 이들 모두를 표적으로 하는 약물을 추가로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편을 포함하는, 면역 증강용 약학 조성물.
  11. 제10항에 있어서, PD-1, PD-L1, 또는 이들 모두를 표적으로 하는 약물을 추가로 포함하는, 면역 증강용 약학 조성물.
  12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원결합단편을 포함하는, 면역관련 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 면역관련 질병은 감염성 질환, 염증성 질환, 또는 자가면역 질환인, 면역관련 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  14. 제12항에 있어서, PD-1, PD-L1, 또는 이들 모두를 표적으로 하는 약물을 추가로 포함하는, 면역관련 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180014050A (ko) * 2015-05-28 2018-02-07 온코메드 파마슈티칼스, 인크. Tigit-결합제 및 이의 용도
KR20200054133A (ko) * 2018-02-06 2020-05-19 아이-맵 바이오파마 유에스 리미티드 Ig 및 itim 도메인을 갖는 t 세포 면역 수용체 (tigit)에 대한 항체 및 이것의 사용
KR20200143250A (ko) * 2019-06-13 2020-12-23 주식회사 녹십자 Tigit에 대한 항체 및 이의 용도
KR20220072468A (ko) * 2020-11-25 2022-06-02 주식회사 와이바이오로직스 Tigit에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180014050A (ko) * 2015-05-28 2018-02-07 온코메드 파마슈티칼스, 인크. Tigit-결합제 및 이의 용도
KR20200054133A (ko) * 2018-02-06 2020-05-19 아이-맵 바이오파마 유에스 리미티드 Ig 및 itim 도메인을 갖는 t 세포 면역 수용체 (tigit)에 대한 항체 및 이것의 사용
KR20200143250A (ko) * 2019-06-13 2020-12-23 주식회사 녹십자 Tigit에 대한 항체 및 이의 용도
KR20220072468A (ko) * 2020-11-25 2022-06-02 주식회사 와이바이오로직스 Tigit에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE Protein 21 January 2000 (2000-01-21), ANONYMOUS : "Ig kappa chain V region - mouse (fragment)", XP093115914, retrieved from NCBI Database accession no. S32192 *
DATABASE Protein 24 July 2016 (2016-07-24), ANONYMOUS : "immunoglobulin heavy chain variable region, partial [Mus musculus] ", XP093115910, retrieved from NCBI Database accession no. CAQ76888.1 *
DATABASE Protein 26 July 2016 (2016-07-26), ANONYMOUS : "immunoglobulin heavy chain variable region, partial [Mus musculus]", XP093115911, retrieved from NCBI Database accession no. AAD47025.1 *
DATABASE Protein 26 July 2016 (2016-07-26), ANONYMOUS : "immunoglobulin light chain variable region, partial [Mus musculus] ", XP093115916, retrieved from NCBI Database accession no. AAT06084.1 *

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