ES2902150T3

ES2902150T3 - Agentes aglutinantes de TIGIT y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2902150T3
Application number: ES16800775T
Authority: ES
Inventors: Austin Gurney; Ming-Hong Xie
Original assignee: Mereo Biopharma 5 Inc
Current assignee: Mereo Biopharma 5 Inc
Priority date: 2015-05-28
Filing date: 2016-05-27
Publication date: 2022-03-25
Anticipated expiration: 2036-05-27
Also published as: SI3303379T1; IL255577B; MD3303379T2; RS62815B1; EP3303379B1; JP2021118719A; US10544219B2; CL2017003021A1; WO2016191643A4; LT3303379T; AU2016267577A1; WO2016191643A2; MA42622A; PT3303379T; WO2016191643A3; JP6875295B2; US10112997B2; CO2017012342A2; BR112017025529A2; CY1125260T1

Abstract

Un anticuerpo que se une específicamente al dominio extracelular de TIGIT humano, que comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende TSDYAWN (SEQ ID NO: 57), una CDR2 de cadena pesada que comprende YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 58), y una CDR3 de cadena pesada que comprende ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 59), y una CDR1 de cadena ligera que comprende KASQD 80 VSTAVA (SEQ ID NO: 60), una CDR2 de cadena ligera que comprende SASYRYT (SEQ ID NO: 61) y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQHYSTP (SEQ ID NO: 62).

Description

DESCRIPCIÓN

Agentes aglutinantes de TIGIT y usos de los mismos

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención se refiere en general a agentes aglutinantes de TIGIT, particularmente anticuerpos que específicamente se unen al dominio extracelular de TIGIT, así como a métodos de uso de los agentes para la modulación de la respuesta inmunitaria y/o el tratamiento de la enfermedades como el cáncer.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] La base de la inmunoterapia es la manipulación y/o la modulación del sistema inmunitario, incluyendo tanto las respuestas inmunes innatas como las respuestas inmunes adaptativas. El objetivo general de la inmunoterapia es tratar enfermedades controlando la respuesta inmunitaria a un "agente extraño", por ejemplo, un patógeno o una célula tumoral. Sin embargo, en algunos casos, la inmunoterapia se usa para tratar enfermedades autoinmunes que pueden surgir de una respuesta inmunitaria anormal contra proteínas, moléculas y/o tejidos normalmente presentes en el cuerpo. La inmunoterapia puede incluir agentes y métodos para inducir o mejorar respuestas inmunes específicas o para inhibir o reducir respuestas inmunes específicas.

[0003] El sistema inmunitario es un sistema muy complejo compuesto de un gran número de tipos de células, incluyendo, pero no limitado a células T, células B, células asesinas naturales, células presentadoras de antígeno, células dendríticas, monocitos, y macrófagos. Estas células poseen sistemas complejos y sutiles para controlar sus interacciones y respuestas. Las células utilizan tanto mecanismos de activación inhibidores y circuitos de retroalimentación para mantener las respuestas bajo control y no permitir las consecuencias negativas de una respuesta inmunitaria incontrolada (p. ej., enfermedades autoinmunes).

[0004] El concepto de vigilancia inmunológica del cáncer se basa en la teoría de que el sistema inmunitario puede reconocer las células tumorales, montar una respuesta inmunitaria, y suprimir el desarrollo y/o progresión de un tumor. Sin embargo, está claro que muchas células cancerosas han desarrollado mecanismos para evadir el sistema inmunológico que pueden permitir el crecimiento desinhibido de tumores. La inmunoterapia contra el cáncer/tumores se centra en el desarrollo de agentes nuevos y novedosos que pueden activar y/o estimular el sistema inmunológico para lograr un ataque más eficaz contra las células tumorales, lo que da como resultado una mayor destrucción de las células tumorales y/o la inhibición del crecimiento tumoral.

El documento WO2015/009856 describe métodos para tratar el cáncer usando antagonistas de unión al eje PD-1 e inhibidores de TIGIT. Chauvin et al. discuten TIGIT y PD-1 alteran las células T CD8 específicas del antígeno tumoral en pacientes con melanoma. Johnston et al. informan que el inmunorreceptor TIGIT regula la función efectora antitumoral y antiviral de las células T CD8 . Levin et al. informan del Vstm3, que es un miembro de la familia CD28 y un modulador importante de la función de las células T. Yu et al. discuten que la proteína de superficie TIGIT suprime la activación de las células T al promover la generación de células dendríticas inmunorreguladoras maduras. Bi et al. discuten que el dominio ITIM y lg de células T regulan la activación de las células asesinas naturales en la hepatitis viral aguda murina. CN103073644 describe un anticuerpo monoclonal anti-TIGIT de ratón específico y un método de preparación, identificación y aplicación del mismo. El documento US2009/258013 describe composiciones y métodos para el tratamiento de enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0005] Las formas de realización que no tienen cabida dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas deben considerarse meramente como ejemplos adecuados para la comprensión de la invención.06*

[0006] La presente invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente al dominio extracelular de TIGIT humano, que comprende una cadena pesada CDR1 que comprende TSDYAWN (SEQ ID NO: 57), una CDR2 de cadena pesada que comprende YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 58), y una CDR3 de cadena pesada que comprende ARr Qv GLGFAY (SEQ ID NO: 59) y una CDR1 de cadena ligera que comprende KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 60), una CDR2 de cadena ligera que comprende SASYRYT (SEQ ID NO: 61) y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQHYSTP (SEQ ID NO: 62). La presente invención proporciona además anticuerpos que se unen específicamente al dominio extracelular de TIGIT humano, que comprende (a) la región variable de la cadena pesada codificada por el plásmido depositado con ATCC como PTA-122346 y la región variable de la cadena ligera codificada por el plásmido depositado con ATCC como PTA-122347; o (b) la cadena pesada codificada por el plásmido depositado en ATCC como PTA-122346 y la cadena ligera codificada por el plásmido depositado en ATCC como PTA-122347.

La invención proporciona agentes heterodiméricos que comprenden los anticuerpos descritos en este documento. La invención también proporciona agentes biespecíficos que comprenden a) un primer brazo que se une específicamente a TIGIT, y b) un segundo brazo, en donde el primer brazo comprende el anticuerpo descrito en el presente documento. La invención proporciona células que comprenden o producen los anticuerpos descritos en este documento o los agentes biespecíficos descritos en este documento.

La invención proporciona los anticuerpos o agentes biespecíficos descritos en el presente documento para su uso en métodos de tratamiento del cáncer. En algunas formas de realización, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer colorrectal, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de mama, cáncer de riñón, cáncer de próstata, cáncer gastrointestinal, melanoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de vejiga, glioblastoma y cáncer de cabeza y cuello. En algunas formas de realización, la invención proporciona los anticuerpos o agentes biespecíficos descritos en el presente documento para su uso en inmunoterapia. En algunas formas de realización, los anticuerpos o agentes biespecíficos se utilizan en inmunoterapia contra el cáncer. En algunas formas de realización, los anticuerpos o agentes biespecíficos se utilizan en métodos para inducir, activar, promover, aumentar, potenciar o prolongar una respuesta inmunitaria. En algunas formas de realización, los anticuerpos o agentes biespecíficos se utilizan en métodos para inducir, activar, promover, aumentar, potenciar o prolongar una respuesta inmunitaria al cáncer y/o un tumor. En algunas formas de realización, los anticuerpos o agentes biespecíficos se utilizan en métodos para inhibir el crecimiento de un tumor o células tumorales. En algunas formas de realización, los anticuerpos o agentes biespecíficos se utilizan en métodos para el tratamiento del cáncer. En algunas formas de realización, los métodos comprenden inhibir el crecimiento de células cancerosas. En algunas formas de realización, los anticuerpos o agentes biespecíficos se utilizan en combinación con al menos un agente terapéutico adicional.

[0007] La invención también proporciona composiciones, tales como composiciones farmacéuticas, que comprenden los anticuerpos o agentes biespecíficos descritos en este documento. Polinucleótidos y/o vectores que codifican los anticuerpos o agentes biespecíficos descritos en este documento. Se proporcionan células que comprenden o producen los anticuerpos o agentes biespecíficos descritos en este documento, así como células que comprenden los polinucleótidos y/o los vectores descritos en este documento.

[0008] En un aspecto, la presente descripción proporciona agentes aglutinantes de TIGIT. En algunos casos, el agente se une a TIGIT de ratón. En algunos casos, el agente se une a TIGIT humano. En algunos casos, el agente se une a TIGIT de ratón y TIGIT humano. En algunas formas de realización, el agente es un anticuerpo. En algunos casos, el agente es un anticuerpo que se une a TIGIT de ratón. En algunos casos, el agente es un anticuerpo que se une a TIGIT humano. En algunos casos, el agente es un anticuerpo que se une a TIGIT de ratón y TIGIT humano. En algunos casos, el agente es un anticuerpo que se une a TIGIT humano y no se une a TIGIT de ratón.

[0009] En algunos casos, el agente es un anticuerpo que se une específicamente al dominio extracelular de TIGIT, que comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende GSSLSSSYMS (SEQ ID NO: 7) o GFSLSSSYMS (SEQ ID NO: 13), una CDR2 de cadena pesada que comprende IIGSNGNTYYANWAKG (SEQ ID NO: 8), y una Cd R3 de cadena pesada que comprende GGYRTSGMDP (SEQ ID NO: 9), y/o una CDR1 de cadena ligera que comprende QASQSISSYLNW (SEQ ID NO: 10), QASQSNIYSDLAW (SEQ ID NO: 14), o QASQNIYSDLAW (SEQ ID NO: 81), una CDR2 de cadena ligera que comprende DALKLAS (SEQ ID NO: 11) o rAs TLAS (SEQ ID NO: 15), y una Cd R3 de cadena ligera que comprende QQEHSVGNVDN (SEQ ID NO: 12) o QQEHLVAWIYN (SEQ ID NO: 16). En algunos casos, el agente es un anticuerpo que comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende GSSLSSSYMS (SEQ ID NO: 7), una CDR2 de cadena pesada que comprende IIGSNGNTYYANWAKG (SeQ ID NO: 8) y una CDR3 de cadena pesada que comprende GGYRTSGMDP (SEQ ID NO: 9) y/o una CDR1 de cadena ligera que comprende QASQSISSYLNW (SEQ ID NO: 10), una CDR2 de cadena ligera que comprende DALKLAS (SEQ ID NO: 11) y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQEHSVGNVDN (SEQ ID NO: 12). En otros casos, el agente es un anticuerpo que comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende GFSLSSSYMS (SEQ ID NO: 13), una CDR2 de cadena pesada que comprende IIGSNGNTYYANWAKG (SQ ID NO: 8) y una CDR3 de cadena pesada que comprende GGYRTSGMDP (SEQ ID NO: 9); y/o una CDR1 de cadena ligera que comprende QASQSNIYSDLAW (SEQ ID NO: 14), una CDR2 de cadena ligera que comprende RASTLAS (SEQ ID NO: 15) y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQEHLVAWIYN (SEQ ID NO: 16). En otros casos, el agente es un anticuerpo que comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende GFSLSSSYMS (SEQ ID NO: 13), una CDR2 de cadena pesada que comprende IIGSNGNTYYANWAKG (SQ ID NO: 8) y una CDR3 de cadena pesada que comprende GGYRTSGMDP (SEQ ID NO: 9); y/o una CDR1 de cadena ligera que comprende QASQNIYSDLAW (SEQ ID NO: 81), una CDR2 de cadena ligera que comprende RASTLAS (SEQ ID NO: 15) y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQEHLVAWIYN (SEQ ID NO: 16).

[0010] En algunos casos, el agente es un anticuerpo que se une específicamente al dominio extracelular de TIGIT, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, o SEQ ID NO: 32; y/o una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 20. En algunos casos, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con SeQ ID n O: 17, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 32; y/o una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 20. En algunos casos, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 17 y una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 18; una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 19 y una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 20; o una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 32 y una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 20.01

[0011] La invención proporciona un anticuerpo que se une específicamente al dominio extracelular de TIGIT humano y comprende una cadena pesada CDR1 que comprende TSDYAWN (SEQ ID NO: 57), una CDR2 de cadena pesada que comprende YISYSg St SYNPSLRS (SEQ ID NO: 58), y una pesada CDR3 de cadena ligera que comprende ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 59), y/o una CDR1 de cadena ligera que comprende KASQDVSTAv A (SEQ ID NO: 60), una CDR2 de cadena ligera que comprende SASYRYT (SEQ iD NO: 61) y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQHYSTP (SEQ ID NO: 62). En algunas formas de realización de la invención, el anticuerpo que se une específicamente al dominio extracelular de TIGIT humano, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 63 o SEQ ID NO: 67; y/o una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 64 o SEQ ID NO: 68. En algunas formas de realización, un anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 63 o SEQ ID NO: 67; y/o una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 64 o SEQ ID NO: 68. En algunas formas de realización, un anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 63 y una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 64, o una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 67 y una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 68.

[0012] En algunas formas de realización, el anticuerpo que es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo biespecífico, un fragmento de anticuerpo que comprende un sitio de unión al antígeno, un anticuerpo IgG, un anticuerpo IgG 1, un anticuerpo IgG2 o un anticuerpo IgG4. En algunas formas de realización, el anticuerpo es monovalente. En algunas formas de realización, el anticuerpo es bivalente. En algunas formas de realización, el anticuerpo es monoespecífico. En algunas formas de realización, el anticuerpo es biespecífico.

[0013] En algunos casos de la descripción, el agente es un anticuerpo que se une específicamente a TIGIT, donde el anticuerpo comprende una cadena pesada de secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 56; y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 28 y SEQ ID NO: 30. En algunos casos, el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 26 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 28; una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 27 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 28; una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 29 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 30; una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 34 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 30; o una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 56 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 30.

[0014] En algunas formas de realización de la invención, un anticuerpo que se une específicamente a TIGIT humana comprende una cadena pesada de secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70 y una cadena ligera de secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 72. En algunas formas de realización, un anticuerpo que se une específicamente a TIGIT humano comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 82 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 72.

[0015] En algunos casos de la descripción un anticuerpo que se une específicamente a TIGIT humano, no se une a TIGIT de ratón. En algunos casos, un anticuerpo que se une específicamente a TIGIT humano, no se une a TIGIT de rata. En algunos casos, un anticuerpo que se une específicamente a TIGIT humano, no se une a TIGIT de conejo. En algunos casos, un anticuerpo que se une específicamente a TIGIT humano, no se une a TIGIT de tití. En algunos casos, un anticuerpo que se une específicamente a TIGIT humano, no se une a TIGIT de perro. En algunos casos, un anticuerpo que se une específicamente a TIGIT humano, no se une a TIGIT de cerdo. En algunos casos, un anticuerpo que se une específicamente a TIGIT humano, no se une a TIGIT de mono cynomolgus. En algunos casos, un anticuerpo que se une específicamente a TIGIT humano, no se une a TIGIT de mono rhesus.

[0016] En algunos casos de la descripción, el agente es un anticuerpo que se une específicamente a TIGIT, donde el anticuerpo comprende la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: 313R11, 313R12, 313R14, 313R19 y 313R20. En algunos casos, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en: 313R11,313R12, 313R14, 313R19 y 313R20. En algunos casos, el anticuerpo es 313R19. En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende la región variable de la cadena pesada codificada por el plásmido depositado con ATCC como PTA-122180. En algunos casos, el anticuerpo comprende la región variable de la cadena ligera codificada por el plásmido depositado en ATCC como PTA-122181. En algunos casos, el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la región variable de la cadena pesada codificada por el plásmido depositado con ATCC como PTA-122180. En algunos casos, el anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende la región variable de cadena ligera codificada por el plásmido depositado con ATCC como PTA-122181. En algunos casos, el anticuerpo comprende la región variable de cadena pesada codificada por el plásmido depositado con ATCC como PTA-122180 y la región variable de la cadena ligera codificada por el plásmido depositado con ATCC como PTA-122181. En algunos casos, el anticuerpo comprende un polipéptido codificado por el plásmido depositado en ATCC como PTA-122180 y un polipéptido codificado por el plásmido depositado en At Cc como Pt A-122181.017

[0017] Otro ejemplo de la descripción proporciona un plásmido depositado en la ATCC y número de designación asignado PTA-122 180 y un plásmido depositado en la ATCC y se le asigna el número de designación PTA-122181.

[0018] En algunas formas de realización de la invención, un anticuerpo que se une específicamente a TIGIT humano comprende la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera de anticuerpo 313M32. En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende la región variable de la cadena pesada codificada por el plásmido depositado con ATCC como PTA-122346. En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende un polipéptido que comprende la región variable de la cadena pesada codificada por el plásmido depositado con ATCC como PTA-122346. En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende la región variable de cadena ligera codificada por el plásmido depositado con ATCC como PTA-122347. En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende la cadena ligera codificada por el plásmido depositado con ATCC como PTA-122347. En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende la región variable de cadena pesada codificada por el plásmido depositado en ATCC como PTA-122346 y la región variable de cadena ligera codificada por el plásmido depositado en ATCC como PTA-122347. En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende un polipéptido codificado por el plásmido depositado en ATCC como PTA-122346 y un polipéptido codificado por el plásmido depositado en ATCC como PTA-122347.

[0019] En otro aspecto, la invención proporciona un plásmido depositado en la ATCC y número de designación asignado PTA-122 346 y un plásmido depositado en la ATCC y se le asignó el número de designación PTA-122347.

[0020] En algunos casos de la descripción, el agente es monovalente. En algunos casos, el agente es bivalente. En algunos casos, el agente es monoespecífico. En algunos casos, el agente es biespecífico. En algunos casos, el agente biespecífico es un agente heterodimérico o una molécula heterodimérica. En algunos casos, un agente heterodimérico comprende un anticuerpo descrito en el presente documento que se une específicamente a TIGIT.

[0021] Otro ejemplo de la descripción proporciona un anticuerpo aislado que compite por la unión específica a TIGIT humano con un agente (p. ej., anticuerpo) descrito en el presente documento. En algunos casos, un anticuerpo aislado se une al mismo epítopo en TIGIT humano como un agente (p. ej., un anticuerpo) descrito en el presente documento. En algunos casos, un anticuerpo aislado se une a un epítopo en TIGIT humano que se solapa con el epítopo en TIGIT unido por un agente (p. ej., anticuerpo) descrito en el presente documento. En algunos casos, un anticuerpo que se une específicamente a TIGIT humano se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 79. En algunos casos, un anticuerpo que se une específicamente a TIGIT humano se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 80. En algunos casos, un anticuerpo que se une específicamente a TIGIT humano se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de SEQ ID NO: 79 y SEQ ID NO: 80. En algunos casos, un anticuerpo que se une específicamente a TIGIT humano se une a un epítopo que comprende los aminoácidos Q62 y 1109 de SEQ ID NO: 4. En algunos casos, un anticuerpo que se une específicamente a TIGIT humano se une a un epítopo que comprende los aminoácidos Q62 y T119 de SEQ ID NO: 4. En algunos casos, un anticuerpo que se une específicamente a TIGIT humano se une a un epítopo que comprende los aminoácidos Q64 y 1109 de SEQ ID NO: 4. En algunos casos, un anticuerpo que se une específicamente a TIGIT humano se une a un epítopo que comprende los aminoácidos Q64 y T119 de s Eq ID NO: 4. En algunos casos, un anticuerpo que se une específicamente a TIGIT humano se une a un epítopo que comprende los aminoácidos Q62, Q64 y 1109 de SEQ ID NO: 4. En algunos casos, un anticuerpo que se une específicamente a TIGIT humano se une a un epítopo que comprende los aminoácidos Q62, Q64 y T119 de SEQ ID NO: 4. En algunos casos, un anticuerpo que se une específicamente a TIGIT humano se une a un epítopo que comprende los aminoácidos Q62, 1109 y T119 de SEQ ID NO: 4. En algunos casos, un anticuerpo que se une específicamente a TIGIT humano se une a un epítopo que comprende los aminoácidos Q64, 1109 y T119 de SEQ ID NO: 4. En algunos casos, un anticuerpo que se une específicamente a TIGIT humano se une a un epítopo que comprende los aminoácidos Q62, Q64, 1109 y T119 de SEQ ID NO: 4. En algunos casos, un anticuerpo que se une específicamente a TIGIT humano se une a un epítopo que comprende al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: N58, E60, Q62, Q64, L65, F107, 1109, H111, T117, T119, G120 y R121 de SEQ ID NO: 4. En algunos casos, el epítopo es un epítopo conformacional. En algunas formas de realización, un anticuerpo que se une específicamente a TIGIT humano se une a un epítopo que no comprende el aminoácido V100 de SEQ ID NO: 4.02*

[0022] En algunas formas de realización de cada uno de los aspectos y formas de realización de la invención mencionadas anteriormente, así como otros aspectos y formas de realización descritos en el presente documento, el anticuerpo es parte de un agente biespecífico que comprende un primer brazo que se une específicamente a TIGIT y un segundo brazo, en donde el primer brazo comprende un anticuerpo anti-TIGIT descrito en el presente documento. En algunas formas de realización, el segundo brazo comprende un sitio de unión a antígeno de un anticuerpo. En algunas formas de realización, el segundo brazo se une específicamente a PD-1, PD-L1, CTLA4, TIM-3, LAG-3, OX-40 o GITR. En algunas formas de realización, el segundo brazo se une específicamente a un antígeno tumoral. En algunas formas de realización, el segundo brazo comprende un agente estimulante de la respuesta inmunitaria. En algunas formas de realización, el agente estimulante de la respuesta inmunitaria se selecciona del grupo que consiste en: factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), interleucina 2 (IL-2), interleucina 3 (IL-3), interleucina 12 (IL-12), interleucina 15 (IL-15), B7-1 (CD80), B7-2 (c D86), ligando 4-1 b B, GITRL, OX-40L, anticuerpo anti-CD3, anticuerpo anti-CTLA4, anticuerpo anti-PD-1, anticuerpo anti-PD-Ll, anticuerpo anti-GITR, anticuerpo anti-OX-40, anticuerpo anti-LAG-3 y anticuerpo anti-TIM-3.

[0023] En algunas formas de realización, el agente biespecífico es un agente heterodimérico o molécula heterodimérica. En algunas formas de realización, el agente biespecífico es un agente homodimérico o una molécula homodimérica. En algunas formas de realización, una molécula heterodimérica comprende un primer brazo que se une a TIGIT humano y un segundo brazo que se une a una segunda diana. En algunas formas de realización, una molécula heterodimérica comprende un primer brazo que se une específicamente a TIGIT humano y un segundo brazo, en donde el primer brazo comprende un anticuerpo anti-TIGIT descrito en el presente documento. En algunas formas de realización, una molécula heterodimérica comprende un primer brazo que se une a TIGIT humano y un segundo brazo que comprende un sitio de unión a antígeno de un anticuerpo que se une específicamente a una segunda diana. En algunas formas de realización, una molécula heterodimérica es un anticuerpo biespecífico. En algunas formas de realización, una molécula heterodimérica comprende un primer brazo que se une a TIGIT humano y un segundo brazo que se une específicamente a un antígeno tumoral. En algunas formas de realización, una molécula heterodimérica comprende un primer brazo que se une a TIGIT humano y un segundo brazo que se une específicamente a PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, OX-40, 4-1BB, o GITR. En algunas formas de realización, una molécula heterodimérica comprende un primer brazo que se une a TIGIT y un segundo brazo que comprende un agente inmunoterapéutico. En algunas formas de realización, el agente inmunoterapéutico se selecciona del grupo que consiste en: factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), interleucina 2 (IL-2), interleucina 3 (IL-3), interleucina 12 (IL-12), interleucina 15 (IL-15), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), ligando 4-1BB, GITRL, OX-40L, anticuerpo anti-CD3, anticuerpo anti-CTLA-4, anticuerpo anti-PD-1, anticuerpo anti-PD-Ll, anticuerpo anti-4-1BB, anticuerpo anti-GITR, anticuerpo anti-OX-40, anti -Anticuerpo LAG-3 y anticuerpo anti-TIM-3.

[0024] En algunas formas de realización, una molécula heterodimérica descrita en este documento comprende un primer brazo comprende un primer dominio CH3 y un segundo brazo que comprende un segundo dominio CH3 en donde cada dominio CH3 se modifica para promover la formación de heterodímeros. En algunas formas de realización, los dominios CH3 se modifican basándose en efectos electrostáticos. En algunas formas de realización, los dominios CH3 se modifican usando una técnica de protuberancias en agujeros.

[0025] En algunas formas de realización, un agente biespecífico descrito en este documento comprende un primer brazo comprende un primer dominio CH3 y un segundo brazo que comprende un segundo dominio CH3 en donde cada dominio CH3 se modifica para promover la formación de heterodímeros. En algunas formas de realización, los dominios CH3 se modifican basándose en efectos electrostáticos. En algunas formas de realización, los dominios CH3 se modifican usando una técnica de protuberancias en agujeros.

[0026] En algunas formas de realización de cada uno de los aspectos y formas de realización mencionados anteriormente, así como otros aspectos y formas de realización descritas en este documento, el anticuerpo inhibe la unión de TIGIT al receptor de poliovirus (PVR). En algunas formas de realización, el anticuerpo inhibe o bloquea la interacción entre TIGIT y PVR. En algunas formas de realización, el anticuerpo inhibe la unión de TIGIT a PVR-L2. En algunas formas de realización, el anticuerpo inhibe o bloquea la interacción entre TIGIT y PVR-L2. En algunas formas de realización, el anticuerpo inhibe la unión de TIGIT a PVR-L3. En algunas formas de realización, el anticuerpo inhibe o bloquea la interacción entre TIGIT y PVR-L3. En algunas formas de realización, el anticuerpo es un antagonista de TIGIT. En algunas formas de realización, el anticuerpo inhibe la señalización de TIGIT. En algunas formas de realización, el anticuerpo es un antagonista de la señalización mediada por TIGIT. En algunas formas de realización, el anticuerpo inhibe la activación de TIGIT. En algunas formas de realización, el anticuerpo inhibe la fosforilación de TIGIT. En algunas formas de realización, el anticuerpo disminuye la expresión de TIGIT en la superficie celular.027*

[0027] En algunas formas de realización de cada uno de los aspectos y formas de realización mencionados anteriormente, así como otros aspectos y formas de realización descritos en este documento, el anticuerpo induce, activa, promueve, aumenta, mejora, y/o prolonga una respuesta inmunitaria. En algunas formas de realización, la respuesta inmunitaria se dirige a un tumor o célula tumoral. En algunas formas de realización, la respuesta inmunitaria se dirige a un virus o una célula infectada por virus. En algunas formas de realización, el anticuerpo aumenta la inmunidad mediada por células. En algunas formas de realización, el anticuerpo aumenta la actividad de las células T. En algunas formas de realización, el agente aumenta la actividad de las células T citolíticas (CTL). En algunas formas de realización, el anticuerpo aumenta la actividad de las células asesinas naturales (NK). En algunas formas de realización, el anticuerpo aumenta la producción de IL-2 y/o el número de células productoras de IL-2. En algunas formas de realización, el anticuerpo aumenta la producción de IFN-gamma y/o el número de células productoras de IFN-gamma. En algunas formas de realización, el anticuerpo aumenta una respuesta inmunitaria de tipo Th1. En algunas formas de realización, el anticuerpo disminuye la producción de IL-4 y/o el número de células productoras de IL-4. En algunas formas de realización, el anticuerpo reduce la IL-10 y/o el número de células productoras de IL-10. En algunas formas de realización, el anticuerpo disminuye la producción de IL-6 y/o el número de células productoras de IL-6. En algunas formas de realización, el anticuerpo disminuye la producción de IL-5 y/o el número de células productoras de IL-5. En algunas formas de realización, el anticuerpo disminuye una respuesta inmunitaria de tipo Th2. En algunas formas de realización, el anticuerpo reduce el número de células Treg. En algunas formas de realización, el anticuerpo disminuye la actividad de Treg. En algunas formas de realización, el anticuerpo inhibe y/o disminuye la actividad supresora de Tregs. En algunas formas de realización, el anticuerpo reduce el número de MDSC. En algunas formas de realización, el anticuerpo inhibe y/o disminuye la actividad supresora de las células supresoras derivadas de mieloides (MDSC).

[0028] En algunas formas de realización de cada uno de los aspectos y formas de realización mencionados anteriormente, así como otros aspectos y formas de realización descritos en este documento, el anticuerpo inhibe el crecimiento del tumor. En algunas formas de realización, el agente reduce el crecimiento tumoral. En algunas formas de realización, el agente reduce el crecimiento tumoral a un tamaño indetectable. En algunas formas de realización, el agente induce inmunidad antitumoral a largo plazo.

[0029] En otro aspecto, la invención proporciona composiciones que comprenden un agente descrito aquí.

[0030] En otro aspecto, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo descrito en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La invención proporciona los anticuerpos o agentes biespecíficos descritos en el presente documento para su uso en métodos para tratar el cáncer y/o inhibir el crecimiento tumoral en un sujeto (p. ej., un ser humano) o métodos para tratar una infección viral en un sujeto (p. ej., un ser humano).

[0031] En ciertas formas de realización de la invención, cada uno de los aspectos antes mencionados, así como otros aspectos y/o realizaciones descritas aquí en otra parte, se aísla el anticuerpo. En determinadas formas de realización, el anticuerpo es sustancialmente puro.

[0032] En otro aspecto, la invención proporciona polinucleótidos que comprenden un polinucleótido que codifica un anticuerpo descrito en el presente documento. En algunas formas de realización, se aísla el polinucleótido. En algunas formas de realización, la invención proporciona vectores que comprenden los polinucleótidos, así como células que comprenden los vectores y/o los polinucleótidos. En algunas formas de realización, la invención también proporciona células que comprenden o producen un anticuerpo o agente biespecífico descrito en el presente documento. En algunas formas de realización, la célula es una línea celular monoclonal.

[0033] En otro aspecto, la invención proporciona el anticuerpo o agente biespecífico descrito en el presente documento para su uso en métodos para modular la respuesta inmunitaria de un sujeto. En algunas formas de realización, el método para modular la respuesta inmunitaria comprende un método para inducir, activar, promover, incrementar, potenciar o prolongar una respuesta inmunitaria en un sujeto. En algunas formas de realización, un método para inducir, activar, promover, incrementar, potenciar o prolongar una respuesta inmunitaria en un sujeto, comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo, agente biespecífico o polipéptido descrito en el presente documento. En algunas formas de realización, un método para inducir, activar, promover, aumentar, potenciar o prolongar una respuesta inmunitaria en un sujeto, comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente biespecífico heterodimérico o un agente biespecífico homodimérico descrito en el presente documento. En algunas formas de realización, un método para inducir, activar, promover, incrementar, potenciar o prolongar una respuesta inmunitaria en un sujeto, comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo descrito en el presente documento. En algunas formas de realización, un método para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto comprende administrar un anticuerpo o agente biespecífico descrito en el presente documento. En algunas formas de realización, un método para activar una respuesta inmunitaria en un sujeto comprende administrar un anticuerpo o agente biespecífico descrito en el presente documento. En algunas formas de realización, un método para promover una respuesta inmunitaria en un sujeto comprende administrar un anticuerpo o agente biespecífico descrito en el presente documento. En algunas formas de realización, un método para aumentar una respuesta inmunitaria en un sujeto comprende administrar un anticuerpo o agente biespecífico descrito en el presente documento. En algunas formas de realización, un método para potenciar una respuesta inmunitaria en un sujeto comprende administrar un anticuerpo o agente biespecífico descrito en el presente documento. En algunas formas de realización, un método para prolongar una respuesta inmunitaria en un sujeto comprende administrar un anticuerpo o agente biespecífico descrito en el presente documento. En algunas formas de realización, la respuesta inmunitaria es a una estimulación antigénica. En algunas formas de realización, la estimulación antigénica es un tumor o una célula tumoral. En algunas formas de realización, la estimulación antigénica es un patógeno. En algunas formas de realización, la estimulación antigénica es un virus. En algunas formas de realización, la estimulación antigénica es una célula infectada por virus. En algunas formas de realización, la respuesta inmunitaria es contra un tumor o cáncer.034*

[0034] En algunas formas de realización, la invención proporciona el anticuerpo o agente biespecífico descrito en este documento para su uso en métodos para aumentar la actividad de las células inmunes. En algunas formas de realización, un método para aumentar la actividad de las células inmunes comprende poner en contacto las células con una cantidad eficaz de un anticuerpo o agente biespecífico descrito en el presente documento. En algunas formas de realización, las células inmunes son células T, células NK, monocitos, macrófagos, células derivadas de mieloides, células presentadoras de antígenos (APC) y/o células B. En algunas formas de realización, un método para aumentar la actividad de las células NK en un sujeto comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente descrito en el presente documento. En algunas formas de realización, un método para aumentar la actividad de las células T en un sujeto comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente descrito en el presente documento. En algunas formas de realización, un método para aumentar la activación de células T y/o células NK en un sujeto comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente descrito en el presente documento. En algunas formas de realización, un método para aumentar la respuesta de las células T en un sujeto comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente descrito en el presente documento. En algunas formas de realización, un método para aumentar la actividad de los CTL en un sujeto comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente descrito en el presente documento. En algunas formas de realización, un método para inhibir la actividad de Tregs en un sujeto comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente descrito en el presente documento. En algunas formas de realización, un método para inhibir la actividad supresora de Tregs en un sujeto comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente descrito en el presente documento. En algunas formas de realización, un método para inhibir la actividad de las MDSC en un sujeto comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente descrito en el presente documento. En algunas formas de realización, un método para inhibir la actividad supresora de las MDSC en un sujeto comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente descrito en el presente documento.

[0035] Algunos casos de la descripción proporcionan métodos para inducir, activar, promover, aumentar, mejorar o prolongar una respuesta inmunitaria en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente que se une a TIGIT humano. En algunos casos, un método para inducir, activar, promover, aumentar, potenciar o prolongar una respuesta inmunitaria en un sujeto comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente que inhibe o reduce la actividad de TIGIT. En algunos casos, un método para inducir, activar, promover, aumentar, potenciar o prolongar una respuesta inmunitaria en un sujeto comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente que inhibe o reduce la señalización de TIGIT. En algunos casos, la respuesta inmunitaria es contra una célula tumoral, un tumor o un cáncer. En algunas formas de realización, la respuesta inmunitaria es contra una infección viral, un antígeno viral o una célula infectada por virus.

[0036] En otro aspecto, la invención proporciona el anticuerpo o agente biespecífico descrito en este documento para su uso en métodos de inhibición de crecimiento de células tumorales o de un tumor comprende poner en contacto el tumor o las células tumorales con una cantidad eficaz del anticuerpo o agente biespecífico descrito aquí. En algunas formas de realización, un método para inhibir el crecimiento de un tumor comprende poner en contacto un tumor o una célula tumoral con una cantidad eficaz del anticuerpo.

[0037] En otro aspecto, la invención proporciona el anticuerpo o agente biespecífico descritos en este documento para su uso en métodos de inhibición de crecimiento de un tumor en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o agente biespecífico descrito en el presente documento. En algunas formas de realización, un método para inhibir el crecimiento de un tumor en un sujeto comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo que se une a TIGIT humano. En algunas formas de realización, un método para inhibir el crecimiento de un tumor en un sujeto comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente biespecífico que se une a TIGIT humano. En algunas formas de realización, el tumor se selecciona del grupo que consiste en tumor colorrectal, tumor de colon, tumor de ovario, tumor de páncreas, tumor de pulmón, tumor de hígado, tumor de mama, tumor de riñón, tumor de próstata, tumor gastrointestinal, melanoma, tumor de cuello uterino, tumor de vejiga, glioblastoma y tumor de cabeza y cuello.

[0038] En otro aspecto, la invención proporciona el anticuerpo o agente biespecífico descrito en este documento para su uso en métodos de tratamiento de cáncer en un sujeto que comprende la administración al sujeto. En algunas formas de realización, un método para tratar el cáncer en un sujeto comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o agente biespecífico. En algunas formas de realización, un método para tratar el cáncer en un sujeto comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente biespecífico que se une a TIGIT humano. En algunas formas de realización, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer colorrectal, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de mama, cáncer de riñón, cáncer de próstata, cáncer gastrointestinal, melanoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de vejiga, glioblastoma, y cáncer de cabeza y cuello.

[0039] En otro aspecto, la invención proporciona el anticuerpo o agente biespecífico descritos en este documento para su uso en métodos para estimular y/o inducir a largo plazo la inmunidad anti-tumoral en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o agente biespecífico descrito en el presente documento.

[0040] En otro aspecto, la invención proporciona el agente anticuerpo o biespecífico descrito en este documento para su uso en métodos para estimular una respuesta protectora en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del agente anticuerpo o biespecífico descrito en este documento en combinación con un antígeno de interés. En algunas formas de realización, el antígeno de interés es un antígeno tumoral. En algunas formas de realización, el antígeno de interés es un biomarcador de células cancerosas. En algunas formas de realización, el antígeno de interés es un marcador de células madre cancerosas.041*

[0041] En algunas formas de realización de cada uno de los aspectos y formas de realización mencionados anteriormente, así como otros aspectos y formas de realización descritos en este documento, los métodos comprenden administrar al sujeto un agente estimulante de respuesta inmunitaria. En algunas formas de realización, el agente estimulante de la respuesta inmunitaria se selecciona del grupo que consiste en GM-CSF, M-CSF, G-CSF, IL-3, IL12, IL-1, IL-2, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), anticuerpos anti-CD3, anticuerpos anti-CTLA-4, anticuerpos anti-CD28, anticuerpos anti-PD-Ll y anticuerpos anti-PD1.

[0042] En algunas formas de realización de cada uno de los aspectos y formas de realización mencionados anteriormente, así como otros aspectos y formas de realización descritos en este documento, un método comprende además administrar al menos un agente terapéutico adicional. En algunas formas de realización, el agente terapéutico adicional es un agente quimioterapéutico. En algunas formas de realización, el agente terapéutico adicional es un anticuerpo. En algunas formas de realización, el agente terapéutico adicional es un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-Ll, un anticuerpo anti-CTLA4, un anticuerpo anti-LAG-3 o un anticuerpo anti-TIM-3. En algunas formas de realización, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de la vía Notch, la vía Wnt o la vía RSPO/LGR.

[0043] En algunas formas de realización, el agente terapéutico adicional es un agente inmunoterapéutico. Como se usa en este documento, la frase "agente inmunoterapéutico" se usa en el sentido más amplio y se refiere a una sustancia que afecta o modula directa o indirectamente el sistema inmunológico. En algunas formas de realización, un agente inmunoterapéutico es un agente que estimula directa o indirectamente el sistema inmunológico induciendo la activación o aumentando la actividad de cualquiera de los componentes del sistema inmunológico. Como los anticuerpos se consideran agentes inmunoterapéuticos, este agente inmunoterapéutico adicional puede considerarse un "segundo" agente inmunoterapéutico. En algunas formas de realización, el segundo agente inmunoterapéutico se selecciona del grupo que consiste en: GM-CSF, M-CSF, G-CSF, IL-2, IL-3, IL-12, IL-15, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), ligando 4-1BB, GITRL, ligando OX-40, anticuerpo anti-CD3, anticuerpo anti-CTLA-4, anticuerpo anti-CD28, anticuerpo anti-PD-1, anticuerpo anti-PD-Ll, anticuerpo anti-4-1BB, anticuerpo anti-GITR, anticuerpo anti-OX-40, anticuerpo anti-LAG-3 y anticuerpo anti-TIM-3. En algunas formas de realización, el segundo agente inmunoterapéutico es una proteína de fusión que comprende: GM-CSF, MCSF, G-CSF, IL-2, IL-3, IL-12, IL-15, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), ligando 4-1BB, ligando GITRL, OX-40 o un fragmento de los mismos. En algunas formas de realización, el segundo agente inmunoterapéutico es una proteína de fusión que comprende al menos una copia del dominio extracelular de GITRL, ligando OX40 o ligando 4-1 BB.

[0044] En algunas formas de realización de cada uno de los aspectos y formas de realización mencionados anteriormente, así como otros aspectos y formas de realización descritos en este documento, el sujeto es humano. En algunas formas de realización, al sujeto se le ha extirpado un tumor o un cáncer, al menos parcialmente.0456

[0045] En algunas formas de realización de cada uno de los aspectos y formas de realización mencionados anteriormente, así como otros aspectos y formas de realización descritos en este documento, el tumor o el cáncer expresa PD-L1. En algunas formas de realización, un método comprende además un paso para determinar el nivel de expresión de PD-L1 en el tumor o cáncer. En algunas formas de realización, la determinación del nivel de expresión de PD-L1 se realiza antes del tratamiento o contacto con un agente descrito en el presente documento. En algunas formas de realización, si el tumor o cáncer tiene un nivel de expresión elevado de PD-L1, se administra al sujeto un agente descrito en el presente documento. En algunas formas de realización, si el tumor o el cáncer tiene un nivel de expresión elevado de PD-L1, se pone en contacto el tumor o el cáncer con un agente descrito en el presente documento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

[0046]

Figura 1A y 1B. Análisis FACS de anticuerpos de conejo generados contra TIGIT de ratón. (A) Las células HEK-293T se transfectaron transitoriamente con un vector de expresión de ADNc que codificaba TIGIT ECD-CD4TM-GFP de ratón (proteína verde fluorescente) o TIGIT ECD-CD4TM-GFP humana. Las células transfectadas se incubaron con anticuerpos de conejo y se analizaron mediante citometría de flujo. La unión específica está indicada por la presencia de la señal diagonal dentro de cada gráfico FACS. (B) Se transfectaron transitoriamente células HEK-293T con un vector de expresión de ADNc que codifica TIGIT CD4TM-GFP de ratón. Las células transfectadas se incubaron con proteína de fusión PVR-Fc de ratón soluble en presencia de anticuerpos de conejo generados contra TIGIT de ratón o sin anticuerpo y se analizaron mediante citometría de flujo. La unión específica está indicada por la presencia de la señal diagonal dentro de cada gráfico FACS. El bloqueo de la unión se demuestra por la pérdida de la unión específica y se indica mediante un círculo sobre el gráfico FACS.

Figura 2A y 2B. Análisis de transferencia de Western de la fosforilación de proteínas después de la interacción TIGIT PVR. Se transdujeron de forma estable células T de Jurket humanas con TIGIT GFP de ratón marcadas con FLAG y se transdujeron de forma estable células E.G7-OVA con PVR-GFP de ratón. (A) fosforilación de TIGIT. (B) fosforilación de SHP1 y Erk1/2.

Figura 3. Análisis de transferencia Western de la fosforilación de TIGIT después de la interacción TIGIT PVR en ausencia o presencia de anticuerpos anti-TIGIT.

Figura 4. Análisis de transferencia Western de la fosforilación de SHP1 y Erk1/2 después de la interacción TIGIT PVR en ausencia o presencia de anticuerpos anti-TIGIT.

Figura 5A y 5B. Inhibición de TIGIT de la producción de citocinas. (A) Secreción de IL-2 en células T B3Z y células T B3Z que expresan TIGIT. (B) Secreción de IL-2 en células T B3Z y células T B3Z que expresan TIGIT después del tratamiento previo con anticuerpos anti-TIGIT.

Figura 6A y 6B. Inhibición de TIGIT de la actividad de las células asesinas naturales. (A) Citotoxicidad de células NK-92 parentales y células NK-92 que expresan TIGIT. (B) Citotoxicidad de las células NK-92 parentales y las células NK-92 que expresan TIGIT después del pretratamiento con anticuerpos anti-TIGIT. Figura 7A y 7B. Inhibición del crecimiento tumoral por anticuerpos anti-TIGIT. La línea de tumor de colon CT26.WT se implantó por vía subcutánea en ratones Balb/c (n=10 ratones/grupo). Los ratones se inyectaron los días 10, 15, 18, 22, 25 y 29 con 0,25 mg/ratón de anticuerpo anti-TIGIT 313R11, anticuerpo anti-TIGIT 313R12, anticuerpo de control IgG1 de ratón y anticuerpo de control IgG2 de ratón. Se controló el crecimiento tumoral y se midieron los volúmenes tumorales con calibradores electrónicos en los puntos de tiempo indicados. Los datos se muestran como volumen tumoral (mm 3) durante los días posteriores a la inyección. (A) La Figura muestra los valores medios ± SEM para cada grupo. (B) Un estudio adicional con anticuerpo anti-TIGIT 313R12 y un anticuerpo de control.

Figura 8. Inhibición del crecimiento tumoral por anticuerpos anti-TIGIT. La línea de tumor de colon CT26.WT se implantó por vía subcutánea en ratones Balb/c (n=10 ratones/grupo). Los ratones se inyectaron los días 10, 14, 17 y 21 con 0,25 mg/ratón de anticuerpo anti-TIGIT 313R12, anticuerpo anti-TIGIT 313R13 y anticuerpo de control IgG2 de ratón. Se controló el crecimiento tumoral y se midieron los volúmenes tumorales con calibradores electrónicos en los puntos de tiempo indicados. Los datos se muestran como volumen tumoral (mm3) durante los días posteriores a la inyección. La Figura muestra los valores medios ± SEM para cada grupo.

Figura 9A a 9D. Los ensayos ELISpot para IFN-gamma, IL-2, IL-4 e IL-10. Se recogieron células de los bazos de ratones portadores de tumor CT26.WT tratados con anticuerpo anti-TIGIT 313R12 o un anticuerpo de control de isotipo coincidente. Las células se incubaron en presencia o ausencia del péptido AH-1 y luego se analizaron usando kits ELISpot. (A) Se muestra la densidad óptica total (TOD) de las células que producen IFN-gamma. (B) Se muestra TOD de células que producen IL-2. (C) Se muestra TOD de células que producen IL-4. (B) Se muestra TOD de células que producen IL-10.

Figura 10. Actividad de células asesinas naturales en la población de esplenocitos de ratones tratados con anticuerpo anti-TIGIT.

Figura 11. Actividad Treg en la población de esplenocitos de ratones tratados con anticuerpo anti-TIGIT. Figura 12A a 12E. Análisis FACS de esplenocitos de ratones tratados con anticuerpo anti-TIGIT. (A) Porcentaje de células CD3+ del total de células vivas. (B) Porcentaje de células CD4+ del total de células vivas. (C) Porcentaje de células CD8+ del total de células vivas. (D) Porcentaje de células T de memoria central CD4+ de la población total de CD4+. (E) Porcentaje de células T de memoria central CD8+ de la población total de CD8+.

Figura 13A a 13D. Análisis FACS de Tregs TIGIT positivos o negativos en una población de esplenocitos de ratones tratados con anticuerpo anti-TIGIT. (A) Porcentaje de células TIGIT positivas del total de células vivas. (B) Porcentaje de células FoxP3 del total de células CD4+ (identificación de Tregs). (C) Porcentaje de células TIGIT positivas del total de células Treg. (D) Porcentaje de células TIGIT negativas del total de células Treg.

Figura 14A a 14D. Análisis FACS de MDSC en la población de esplenocitos de ratones tratados con anticuerpo anti-TIGIT. (A) Porcentaje de células CD11b+ del total de células vivas. (B) Porcentaje de MDSC del total de células CD11b+. (C) Porcentaje de G-MDSC del total de células CD11 b+. (D) Porcentaje de M-MDSC del total de células CD11b+.

Figura 15. Inhibición del crecimiento tumoral por anticuerpos anti-TIGIT. Se implantaron células Renca (adenocarcinoma renal murino) por vía subcutánea en ratones Balb/c (n=10 ratones/grupo). Los ratones se inyectaron los días 7, 10, 14, 17, 21 y 24 con 0,25 mg/ratón de anticuerpo anti-TIGIT 313R12 y un anticuerpo de control IgG2 de ratón. Se controló el crecimiento tumoral y se midieron los volúmenes tumorales con calibradores electrónicos en los puntos de tiempo indicados. Los datos se muestran como volumen tumoral (mm3) durante los días posteriores a la inyección. La figura muestra los valores medios ± SEM para cada grupo.

Figura 16. Inhibición del crecimiento tumoral por el anticuerpo anti-TIGIT 313R12 - un estudio de dosis. La línea de tumor de colon murino CT26.WT se implantó por vía subcutánea en ratones Balb/c (n=10 ratones/grupo). Los ratones se trataron con 0,5, 1,3, 5, 10, 15 o 30 mg/kg de anticuerpo anti-TIGIT 313R12 o se trataron con un anticuerpo de control. A los ratones se les administró una inyección intraperitoneal dos veces por semana hasta un total de 6 dosis. Se controló el crecimiento del tumor y se midieron los volúmenes de los tumores con calibradores electrónicos.

Figura 17A a 17F. Inhibición del crecimiento tumoral in vivo por el anticuerpo anti-TIGIT 313R12 y un anticuerpo anti-PD-L1. La línea de tumor de colon murino CT26.WT se implantó por vía subcutánea (30.000 células/ratón) en ratones Balb/c. Los ratones se trataron con 0,25 mg/ratón de anticuerpo anti-TIGIT 313R12, un anticuerpo anti-PD-Ll, una combinación de 313R12 y un anticuerpo anti-PD-Ll, o un anticuerpo de control (n=10 por grupo). A los ratones se les administraron anticuerpos dos veces por semana durante 3 semanas. Se controló el crecimiento tumoral y se midieron los volúmenes tumorales con calibradores electrónicos en los puntos de tiempo indicados. (A) Los volúmenes tumorales de ratones individuales dentro del grupo tratado con anticuerpo de control. (B) Los volúmenes tumorales de ratones individuales dentro del grupo tratado con anticuerpo anti-TIGIT 313R12. (C) Los volúmenes tumorales de los ratones individuales dentro del grupo tratado con anticuerpo anti-PD-Ll. (D) Los volúmenes tumorales de ratones individuales dentro del grupo tratado con anticuerpo anti-TIGIT 313R12 y anticuerpo anti-PD-Ll. (E) Crecimiento tumoral promedio de los cuatro grupos de tratamiento. (F) Curva de supervivencia.

Figura 18A a 18E. Inhibición del crecimiento tumoral in vivo por el anticuerpo anti-TIGIT 313R12 y el anticuerpo anti-PD-1. La línea de tumor de colon murino CT26.WT se implantó por vía subcutánea (30.000 células/ratón) en ratones Balb/c. Los ratones se trataron con 0,25 mg/ratón de anticuerpo anti-TIGIT 313R12, un anticuerpo anti-PD-1, una combinación de 313R12 y anticuerpo anti-PD-1, o un anticuerpo de control (n=15 por grupo). A los ratones se les administraron anticuerpos dos veces por semana durante 3 semanas. Se controló el crecimiento tumoral y se midieron los volúmenes tumorales con calibradores electrónicos en los puntos de tiempo indicados. (A) Los volúmenes tumorales de ratones individuales dentro del grupo tratado con anticuerpo de control. (B) Los volúmenes tumorales de ratones individuales dentro del grupo tratado con anticuerpo anti-TIGIT 313R12. (C) Los volúmenes tumorales de ratones individuales dentro del grupo tratado con anticuerpo anti-PD-1. (D) Los volúmenes tumorales de ratones individuales dentro del grupo tratado con anticuerpo anti-TIGIT 313R12 y anticuerpo anti-PD-1. (E) Crecimiento tumoral promedio de los cuatro grupos de tratamiento.

Figura 19A y 19B. Análisis FACS del anticuerpo anti-TIGIT que bloquea la unión de TIGIT humano a PVR. (A) Las células HEK-293T se transfectaron transitoriamente con un vector de expresión de ADNc que codifica T iG iT ECD-CD4TM-GFP (proteína verde fluorescente) humana o TIGIT ECD-CD4TM-GFP humana. Las células transfectadas se incubaron con proteína de fusión PVRFc humana soluble en presencia de anticuerpos generados para TIGIT (313R19, 313M26 o 313M32) a concentraciones de 10, 2 o 04 pg/ml o sin anticuerpo y se analizaron mediante citometría de flujo. La unión específica está indicada por la presencia de una señal diagonal dentro de un gráfico FACS. El bloqueo de la unión se demuestra por la pérdida de la unión específica dentro de la caja negra oscura sobre el gráfico FACS. (B) Las células HEK-293T se transfectaron transitoriamente con un vector de expresión de ADNc que codificaba TIGIT ECD-CD4TM-GFP (proteína verde fluorescente) humana o TIGIT ECD-CD4TM-GFP humana. Las células transfectadas se incubaron con proteína de fusión PVR humana soluble-Fc de conejo en presencia de anticuerpos generados para TIGIT (313R19 o 313M32) a concentraciones de 10, 5, 2,5 o 1,25 pg/ml o sin anticuerpo y se analizaron mediante citometría de flujo. La unión específica está indicada por la presencia de una señal diagonal dentro de un gráfico FACS. El bloqueo de la unión se demuestra por la pérdida de la unión específica dentro de la caja negra oscura sobre el gráfico FACS.

Figura 20. Análisis de transferencia Western de la fosforilación de TIGIT después de la interacción TIGIT PVR en ausencia o presencia de anticuerpos anti-TIGIT 313R19, 313M26 y 313M32.

Figura 21. Un alineamiento de secuencia de TIGIT humano (SEQ ID NO: 4), TIGIT de mono cynomolgus (SEQ ID NO: 77) y TIGIT de mono rhesus (SEQ ID NO: 78).

Figura 22. Mapeo de epítopos mediante análisis FACS de la unión del anticuerpo anti-TIGIT a proteínas TIGIT humanas variantes que contienen sustituciones de aminoácidos específicas. Las variantes de hTIGIT son (1) E36K e I41V; (2) T51M, (3) Q62H y Q64H, (4) D72E, (5) S78Y y S80A, (6) V100M, (7) I109T y T119R, y (8) G135S.

Figura 23. Un diagrama que representa PVR vinculado a TIGIT. La estructura del TIGIT humano se muestra en representación de esfera y la estructura de PVR se proporciona en representación de cinta. Los aminoácidos que comprenden al menos parte del epítopo 313M32 se muestran como esferas negras. El aminoácido que comprende al menos parte del epítopo 313M34 se muestra como esferas grises.

Figura 24A y 24B. Estudios de unión competitiva entre anticuerpos anti-TIGIT. (A) Estudio de competencia con 313R19 y 313M26. (B) Estudio de competencia con 313M34 y 313R19 o 313M34 y 313M32.

Figura 25. Reversión de la inhibición de la secreción de citocinas mediada por PVR por anticuerpos anti-TIGIT.

Figura 26. Ensayo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos.

Figura 27. Inhibición del crecimiento tumoral por anticuerpos anti-TIGIT 313R19 y 313M32 en un modelo de ratón humanizado. Se inyectaron subcutáneamente a ratones humanizados células tumorales de melanoma derivadas del paciente (OMP-M9, 75.000 células/ratón). Los tumores se dejaron crecer 19 días hasta que alcanzaron un volumen promedio de aproximadamente 50 mm3. Los ratones portadores de tumores se asignaron al azar en grupos (n=8 ratones por grupo). Los ratones portadores de tumores se trataron con un anticuerpo de control, un anticuerpo anti-TIGIT 313R19 o un anticuerpo anti-TIGIT 313M32. Los ratones se dosificaron cada 5 días a 1 o 5 mg/kg. Se controló el crecimiento tumoral y se midieron los volúmenes tumorales con calibradores electrónicos en los puntos de tiempo indicados.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0047] La presente divulgación proporciona nuevos agentes, incluyendo, pero no limitado a polipéptidos, anticuerpos, y moléculas heterodiméricas que modulan la respuesta inmunitaria. Los agentes incluyen polipéptidos, anticuerpos y moléculas heterodiméricas que se unen específicamente a TIGIT y agentes que modulan la activación y/o señalización de TIGIT. Los agentes incluyen polipéptidos, anticuerpos y moléculas heterodiméricas que inhiben la activación y/o señalización de TIGIT, mejorando así una respuesta inmunitaria. También se proporcionan polipéptidos y polinucleótidos relacionados, composiciones que comprenden los agentes y métodos para preparar los agentes. Se proporcionan métodos de cribado de agentes que modulan la respuesta inmunitaria. Se proporcionan métodos para usar los nuevos agentes, tales como métodos para inhibir el crecimiento tumoral y/o métodos para tratar el cáncer. También se proporcionan métodos para tratar infecciones virales. Métodos para utilizar los nuevos agentes, tales como métodos para activar una respuesta inmunitaria, métodos para estimular una respuesta inmunitaria, métodos para promover una respuesta inmunitaria, métodos para incrementar una respuesta inmunitaria, métodos para activar las células asesinas naturales (NK) y/o células T, métodos para aumentar la actividad de las células NK y/o células T, métodos para promover la actividad de las células NK y/o células T, métodos de disminución y/o inhibición de células T supresoras, y/o métodos para disminuir y/o inhibir células supresoras derivadas de mieloides se proporcionan adicionalmente. Además, los nuevos agentes descritos en el presente documento pueden usarse en métodos para inhibir una respuesta inmunitaria, métodos para suprimir una respuesta inmunitaria, métodos para disminuir la actividad de las células T y/o métodos para tratar enfermedades autoinmunes.

I. Definiciones

[0048] Para facilitar la comprensión de la presente invención, se define a continuación una serie de términos y frases.

[0049] Los términos "agonista" y "agonistas" como se usan en el presente documento se refieren o describen un agente que es capaz de, directa o indirectamente, inducir sustancialmente, activar, promover, aumentar o mejorar la actividad biológica de una diana y/o ruta. El término "agonista" se usa en el presente documento para incluir cualquier agente que induzca, active, promueva, aumente o mejore parcial o totalmente la actividad de una proteína.

[0050] Los términos "antagonista" y "antagonistas" como se usa en el presente documento se refieren o describen un agente que es capaz de, directa o indirectamente, parcial o totalmente bloquear, inhibir, reducir, o neutralizar una actividad biológica de una diana y/o ruta. El término "antagonista" se usa en el presente documento para incluir cualquier agente que bloquee, inhiba, reduzca o neutralice parcial o totalmente la actividad de una proteína.

[0051] Los términos "modulación" y "modular" tal como se utiliza aquí se refieren a un cambio o una alteración en una actividad biológica. La modulación incluye, pero no se limita a estimular una actividad o inhibir una actividad. La modulación puede ser un aumento o una disminución de la actividad, un cambio en las características de unión o cualquier otro cambio en las propiedades biológicas, funcionales o inmunológicas asociadas con la actividad de una proteína, una vía, un sistema u otras dianas biológicas de interés.

[0052] El término "anticuerpo" tal como se utiliza aquí se refiere a una molécula de inmunoglobulina que reconoce y se une específicamente un objetivo a través de al menos un sitio de unión a antígeno. La diana puede ser una proteína, polipéptido, péptido, carbohidrato, polinucleótido, lípido o una combinación de cualquiera de los anteriores. Como se usa en este documento, el término abarca anticuerpos policlonales intactos, anticuerpos monoclonales intactos, fragmentos de anticuerpos (tales como fragmentos Fab, Fab’, F(ab')2 y Fv), anticuerpos Fv monocatenarios (scFv), anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos monoespecíficos, anticuerpos monovalentes, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, proteínas de fusión que comprenden un sitio de unión al antígeno de un anticuerpo y cualquier otra molécula de inmunoglobulina modificada que comprenda un sitio de unión al antígeno siempre que los anticuerpos presenten la actividad biológica deseada. Un anticuerpo puede ser cualquiera de las cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, o subclases (isotipos) de las mismas (p. ej., IgG 1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2), según la identidad de sus dominios constantes de cadena pesada denominados alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente. Las diferentes clases de inmunoglobulinas tienen estructuras de subunidades y configuraciones tridimensionales diferentes y bien conocidas. Los anticuerpos pueden estar desnudos o conjugados con otras moléculas, que incluyen, pero no se limitan a toxinas y radioisótopos.

[0053] El término "fragmento de anticuerpo" se refiere a una porción de un anticuerpo intacto, y generalmente se refiere a las regiones variables determinantes antigénicos de un anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a fragmentos Fab, Fab’, F(ab')2 y Fv, anticuerpos lineales, anticuerpos monocatenarios y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. "Fragmento de anticuerpo", como se usa en este documento, comprende un sitio de unión a antígeno o un sitio de unión a epítopo.

[0054] El término "región variable" de un anticuerpo se refiere a la región variable de una cadena ligera de anticuerpo o la región variable de una cadena pesada de anticuerpo, ya sea sola o en combinación. Generalmente, la región variable de una cadena pesada o una cadena ligera consta de cuatro regiones marco conectadas por tres regiones determinantes de complementariedad (CDR), también conocidas como "regiones hipervariables". Las CDR de cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por las regiones marco y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio o sitios de unión al antígeno del anticuerpo. Hay al menos dos técnicas para determinar las CDR: (1) un enfoque basado en la variabilidad de secuencia entre especies (es decir, Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, National Institutes of Health, Bethesda MD.) y (2) un enfoque basado en estudios cristalográficos de complejos antígeno-anticuerpo (Al Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol., 273: 927-948). Además, en ocasiones se utilizan combinaciones de estos dos enfoques en la técnica para determinar las CDR.

[0055] El término "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza aquí se refiere a una población de anticuerpos homogénea involucrada en el reconocimiento altamente específico y la unión de un único determinante antigénico o epítopo. Esto contrasta con los anticuerpos policlonales que típicamente incluyen una mezcla de diferentes anticuerpos que reconocen diferentes determinantes antigénicos. El término "anticuerpo monoclonal" abarca tanto anticuerpos monoclonales intactos como de longitud completa, así como fragmentos de anticuerpos (p. ej., Fab, Fab’, F(ab')2, Fv), anticuerpos monocatenarios (scFv), proteínas de fusión que comprenden un fragmento de anticuerpo, y cualquier otra molécula de inmunoglobulina modificada que comprenda un sitio de unión al antígeno. Además, "anticuerpo monoclonal" se refiere a dichos anticuerpos fabricados mediante diversas técnicas, que incluyen, entre otras, producción de hibridomas, selección de fagos, expresión recombinante y animales transgénicos.

[0056] El término "anticuerpo humanizado", como se usa aquí se refiere a anticuerpos que son cadenas de inmunoglobulinas específicas, inmunoglobulinas quiméricas, o fragmentos de los mismos que contienen secuencias mínimas no humanas. Normalmente, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas en las que los residuos de aminoácidos de las CDR se reemplazan por residuos de aminoácidos de las CDR de una especie no humana (p. ej., ratón, rata, conejo o hámster) que tienen la especificidad, afinidad, y/o capacidad vinculante. En algunos casos, los residuos de aminoácidos de la región variable del marco de una inmunoglobulina humana pueden reemplazarse con los residuos de aminoácidos correspondientes en un anticuerpo de una especie no humana. El anticuerpo humanizado puede modificarse adicionalmente mediante la sustitución de residuos de aminoácidos adicionales en la región variable del marco y/o dentro de los residuos de aminoácidos no humanos reemplazados para refinar y optimizar aún más la especificidad, afinidad y/o capacidad de unión del anticuerpo. El anticuerpo humanizado puede comprender dominios variables que contienen todas o sustancialmente todas las CDR que corresponden a la inmunoglobulina no humana, mientras que todas o sustancialmente todas las regiones variables marco son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. En algunas formas de realización, los dominios variables comprenden las regiones marco de una secuencia de inmunoglobulina humana. En algunas formas de realización, los dominios variables comprenden las regiones marco de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también puede comprender al menos una parte de una región o dominio constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana.

[0057] El término "anticuerpo humano", como se usa aquí se refiere a un anticuerpo producido por un humano o un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a un anticuerpo producido por un humano hecho usando cualquiera de las técnicas conocidas en la técnica.

[0058] El término "anticuerpo quimérico" tal como se utiliza aquí, se refiere a un anticuerpo en donde la secuencia de aminoácidos de la molécula de inmunoglobulina se deriva de dos o más especies. Normalmente, las regiones variables de las cadenas ligera y pesada corresponden a las regiones variables de un anticuerpo derivado de una especie de mamífero (p. ej., ratón, rata, conejo, etc.) con la especificidad, afinidad y/o capacidad de unión deseadas. mientras que las regiones constantes son homólogas a la secuencia en un anticuerpo derivado de otra especie. Las regiones constantes suelen ser humanas para evitar provocar una respuesta inmunitaria en el anticuerpo.

[0059] Los términos "epítopo" y "determinante antigénico" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a la porción de un antígeno o diana capaz de ser reconocida y unida específicamente por un anticuerpo particular. Cuando el antígeno o la diana es un polipéptido, los epítopos pueden formarse tanto a partir de aminoácidos contiguos como de aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por plegamiento terciario de la proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos (también denominados epítopos lineales) se retienen típicamente tras la desnaturalización de proteínas, mientras que los epítopos formados por plegamiento terciario (también denominados epítopos conformacionales) típicamente se pierden tras la desnaturalización de proteínas. Un epítopo incluye típicamente al menos 3, y más usualmente, al menos 5, 6, 7 u 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única.

[0060] Los términos "se une selectivamente" o "se une específicamente" significa que un agente interactúa con mayor frecuencia, más rápidamente, con mayor duración, con mayor afinidad, o con alguna combinación de los anteriores para el epítopo, proteína o molécula diana que con sustancias alternativas, incluidas proteínas relacionadas y no relacionadas. En determinadas formas de realización, "se une específicamente" significa, por ejemplo, que un agente se une a una proteína o diana con una K^dde aproximadamente 0,1 mM o menos, pero más habitualmente menos de aproximadamente 1 pM. En ciertas formas de realización, "se une específicamente" significa que un agente se une a una diana con una K^dde al menos aproximadamente 0,1 pM o menos, al menos aproximadamente 0,01 pM o menos, o al menos aproximadamente InM o menos. Debido a la identidad de secuencia entre proteínas homólogas en diferentes especies, la unión específica puede incluir un agente que reconoce una proteína o diana en más de una especie (p. ej., TIGIT de ratón y TIGIT humano). Asimismo, debido a la homología dentro de ciertas regiones de secuencias polipeptídicas de diferentes proteínas, la unión específica puede incluir un agente que reconoce más de una proteína o diana. Se entiende que, en determinadas formas de realización, un agente que se une específicamente a una primera diana puede o no unirse específicamente a una segunda diana. Como tal, la "unión específica" no requiere necesariamente (aunque puede incluir) unión exclusiva, es decir, unión a un solo objetivo. Por tanto, un agente puede, en determinadas formas de realización, unirse específicamente a más de un objetivo. En ciertas formas de realización, múltiples dianas pueden estar unidas por el mismo sitio de unión al antígeno en el agente. Por ejemplo, un anticuerpo puede, en ciertos casos, comprender dos sitios de unión a antígeno idénticos, cada uno de los cuales se une específicamente al mismo epítopo en dos o más proteínas. En determinadas formas de realización alternativas, un anticuerpo puede ser biespecífico y comprender al menos dos sitios de unión al antígeno con diferentes especificidades. Generalmente, pero no necesariamente, la referencia a unión significa unión específica.

[0061] Los términos "polipéptido" y "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede estar interrumpido por ácidos no amino. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que se ha modificado de forma natural o por intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, como la conjugación con un componente de marcaje. También se incluyen dentro de la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluidos, por ejemplo, aminoácidos no naturales), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Se entiende que, debido a que los polipéptidos de esta invención pueden basarse en anticuerpos u otros miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas, en ciertas formas de realización, un "polipéptido" puede aparecer como una cadena sencilla o como dos o más cadenas asociadas.

[0062] Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" y "molécula de ácido nucleico" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud, e incluyen ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos o bases modificados y/o sus análogos, o cualquier sustrato que pueda incorporarse a un polímero por ADN o ARN polimerasa.

[0063] Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad" en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son la misma o tienen un porcentaje especificado de nucleótidos o residuos de aminoácidos que son lo mismo, cuando se comparan y alinean (introduciendo huecos, si es necesario) para una correspondencia máxima, sin considerar ninguna sustitución conservadora de aminoácidos como parte de la identidad de secuencia. El porcentaje de identidad se puede medir usando software o algoritmos de comparación de secuencias o mediante inspección visual. Se conocen bien en la técnica diversos algoritmos y software que pueden usarse para obtener alineamientos de secuencias de aminoácidos o nucleótidos. Estos incluyen, pero no se limitan a BLAST, ALIGN, Megalign, BestFit, GCG Wisconsin Package y variantes de los mismos. En algunas formas de realización, dos ácidos nucleicos o polipéptidos de la invención son sustancialmente idénticos, lo que significa que tienen al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% y en algunas formas de realización al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de residuos de nucleótidos o aminoácidos, cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima, según se mide utilizando un algoritmo de comparación de secuencias o mediante inspección visual. En algunas formas de realización, existe identidad sobre una región de las secuencias que tiene al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 40 60 nucleótidos o residuos de aminoácidos, al menos aproximadamente 60-80 nucleótidos o residuos de aminoácidos de longitud o cualquier valor integral entre ellos. En algunas formas de realización, existe identidad en una región más larga que 60-80 nucleótidos o residuos de aminoácidos, como al menos aproximadamente 80-100 nucleótidos o residuos de aminoácidos, y en algunas formas de realización las secuencias son sustancialmente idénticas en toda la longitud de las secuencias. comparándose, por ejemplo, la región codificante de una secuencia de nucleótidos.

[0064] Una "sustitución de aminoácidos conservativa" es una en donde un residuo de aminoácido se sustituye por otro residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido generalmente en la técnica, incluidas las cadenas laterales básicas (p. ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (p. ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (p. ej., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (p. ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta ramificadas (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por ejemplo, la sustitución de una fenilalanina por una tirosina se considera una sustitución conservadora. Generalmente, las sustituciones conservadoras en las secuencias de polipéptidos y/o anticuerpos de la invención no anulan la unión del polipéptido o anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos al sitio de unión diana. Los métodos para identificar sustituciones conservadoras de nucleótidos y aminoácidos que no eliminan la unión son bien conocidos en la técnica.

[0065] El término "vector", como se usa en este documento significa una construcción, que es capaz de suministrar, y por lo general expresar, uno o más gen(es) o secuencia(s) de interés en una célula huésped. Los ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a vectores virales, vectores de expresión de ADN o ARN desnudos, vectores de plásmidos, cósmidos o fagos, vectores de expresión de ADN o ARN asociados con agentes de condensación catiónicos y vectores de expresión de ADN o ARN encapsulados en liposomas.

[0066] Un polipéptido, proteína soluble, anticuerpo, polinucleótido, vector, célula, o la composición que está "aislada" es un polipéptido, proteína soluble, anticuerpo, polinucleótido, vector, célula, o composición que está en una forma no encontrada en la naturaleza. Los polipéptidos aislados, proteínas solubles, anticuerpos, polinucleótidos, vectores, células o composiciones incluyen aquellos que se han purificado hasta un grado en donde ya no están en la forma en que se encuentran en la naturaleza. En algunas formas de realización, un polipéptido, proteína soluble, anticuerpo, polinucleótido, vector, célula o composición que se aísla es sustancialmente pura.

[0067] El término "sustancialmente puro" como se usa aquí se refiere a material que es al menos 50% pura (es decir, libre de contaminantes), al menos 90% puro, al menos 95% puro, al menos 98% puro, o por lo menos 99% puro.

[0068] El término "respuesta inmunitaria", como se usa en el presente documento incluye respuestas de tanto el sistema inmunitario innato como el sistema inmunitario adaptativo. Incluye respuestas inmunitarias tanto mediadas por células como humorales. Incluye, pero no se limita tanto a respuestas de células T como de células B, así como las respuestas de otras células del sistema inmunitario tales como células asesinas naturales (NK), monocitos, macrófagos, etc.

[0069] Los términos "cáncer" y "canceroso", como se usan en el presente documento, se refieren o describen la condición fisiológica en mamíferos en donde una población de células se caracteriza por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a carcinoma, blastoma, sarcoma y cánceres hematológicos tales como linfoma y leucemia.

[0070] Los términos "tumor" y "neoplasma", como se usa en el presente documento se refieren a cualquier masa de tejido que resulta de un crecimiento celular excesivo o la proliferación, ya sea benigno (no canceroso) o maligno (canceroso), incluyendo lesiones pre-cancerosas.

[0071] El término "metástasis" como se usa en el presente documento se refiere al proceso por el cual se propaga un cáncer o se transporta desde el sitio de origen a otras regiones del cuerpo con el desarrollo de una lesión cancerosa similar en una nueva ubicación. Generalmente, una célula "metastásica" o "metastatizante" es aquella que pierde contactos adhesivos con las células vecinas y migra a través del torrente sanguíneo o linfático desde el sitio primario de la enfermedad a sitios secundarios en todo el cuerpo.

[0072] Los términos "cáncer de células madre" y "CSC" y "célula madre tumoral" y "célula que inicia tumor" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a células de un cáncer o tumor que: (1) tienen una amplia capacidad de proliferación; 2) son capaces de una división celular asimétrica para generar uno o más tipos de progenie de células diferenciadas en las que las células diferenciadas tienen un potencial de desarrollo o de proliferación reducido; y (3) son capaces de divisiones celulares simétricas para autorrenovación o auto-mantenimiento. Estas propiedades confieren a las células madre cancerosas la capacidad de formar o establecer un tumor o cáncer tras un trasplante en serie en un huésped apropiado (p. ej., un ratón) en comparación con la mayoría de las células tumorales que no logran formar tumores. Las células madre cancerosas experimentan autorrenovación versus diferenciación de una manera caótica para formar tumores con tipos de células anormales que pueden cambiar con el tiempo a medida que ocurren las mutaciones.

[0073] Los términos "célula de cáncer" y "célula tumoral" se refieren a la población total de células derivadas de un cáncer o tumor o la lesión pre-cancerosa, incluyendo tanto las células no tumorigénicas, que comprenden la mayor parte de la población de células cancerosas, y células madre tumorigénicas (células madre cancerosas). Como se usa en este documento, los términos "célula cancerosa" o "célula tumoral" serán modificados por el término "no tumorigénico" cuando se refieran únicamente a aquellas células que carecen de la capacidad de renovarse y diferenciarse para distinguir esas células tumorales de las células madre cancerosas.

[0074] El término "tumorigénico" tal como se utiliza aquí se refiere a las características funcionales de una célula madre de cáncer incluyendo las propiedades de auto-renovación (dando lugar a células madre de cáncer tumorigénicas adicionales) y la proliferación de generar todas las otras células tumorales (dando lugar a células tumorales diferenciadas y, por tanto, no tumorigénicas).

[0075] El término "tumorigenicidad" tal como se utiliza aquí se refiere a la capacidad de una muestra aleatoria de células del tumor para formar tumores palpables tras el trasplante en serie en huéspedes apropiados (p. ej., ratones).

[0076] El término "sujeto" se refiere a cualquier animal (p. ej., un mamífero), incluyendo, pero no limitado a seres humanos, primates no humanos, caninos, felinos, conejos, roedores, y similares, que es ser el destinatario de un tratamiento particular. Normalmente, los términos "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente en el presente documento en referencia a un sujeto humano.

[0077] El término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sustancia aprobada o aprobable por una agencia reguladora del gobierno Federal o un gobierno estatal o enumerado en la Farmacopea de Estados Unidos u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en animales, incluyendo seres humanos.

[0078] Los términos "excipiente, vehículo o adyuvante farmacéuticamente aceptable" o "vehículo farmacéutico aceptable" se refieren a un excipiente, vehículo o adyuvante que se puede administrar a un sujeto, junto con al menos un agente de la presente divulgación, y que no destruye su actividad farmacológica y no es tóxico cuando se administra en dosis suficientes para proporcionar un efecto terapéutico. En general, los expertos en la técnica y la FDA de EE. UU. Consideran que un excipiente, vehículo o adyuvante farmacéuticamente aceptable es un ingrediente inactivo de cualquier formulación.

[0079] Los términos "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" o "efecto terapéutico" se refieren a una cantidad de un agente descrito en el presente documento, un anticuerpo, un polipéptido, un polinucleótido, una molécula orgánica pequeña, u otro fármaco eficaz para "tratar" una enfermedad o trastorno en un sujeto como, por ejemplo, un mamífero. En el caso de cáncer o un tumor, la cantidad terapéuticamente eficaz de un agente (p. ej., polipéptido o anticuerpo) tiene un efecto terapéutico y, como tal, puede potenciar o potenciar la respuesta inmunitaria, potenciar o potenciar la respuesta antitumoral, incrementar la actividad citolítica de las células inmunitarias, aumentar la destrucción de las células tumorales, aumentar la destrucción de las células tumorales por las células inmunitarias, reducir el número de células tumorales; disminuir la tumorigenicidad, la frecuencia tumorigénica o la capacidad tumorigénica; reducir el número o la frecuencia de células madre cancerosas; reducir el tamaño del tumor; reducir la población de células cancerosas; inhibir o detener la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos que incluyen, por ejemplo, la propagación del cáncer a tejidos blandos y huesos; inhibir y detener la metástasis de células tumorales o cancerosas; inhibir y detener el crecimiento de células tumorales o cancerosas; aliviar hasta cierto punto uno o más de los síntomas asociados con el cáncer; reducir la morbilidad y la mortalidad; mejorar la calidad de vida; o una combinación de tales efectos.

[0080] Los términos "tratar" o "tratamiento" o "tratar" o "aliviar" o "para aliviar" se refieren tanto a (1) las medidas terapéuticas que curan, reducen la velocidad, disminuyen los síntomas, y/o detienen la progresión de una afección o trastorno patológico diagnosticado y (2) medidas profilácticas o preventivas que previenen o retrasan el desarrollo de una afección o trastorno patológico específico. Por tanto, los que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya padecen el trastorno; aquellos propensos a tener el trastorno; y aquellos en quienes se debe prevenir el trastorno. En el caso de cáncer o un tumor, un sujeto se "trata" con éxito de acuerdo con los métodos de la presente invención si el paciente muestra uno o más de los siguientes: una respuesta inmunitaria aumentada, una respuesta antitumoral aumentada, una actividad citolítica aumentada de células inmunitarias, aumento de la destrucción de células tumorales, aumento de la destrucción de células tumorales por parte de las células inmunitarias, reducción del número 0 ausencia completa de células cancerosas; una reducción del tamaño del tumor; inhibición o ausencia de infiltración de células cancerosas en órganos periféricos, incluida la diseminación de células cancerosas en tejidos blandos y huesos; inhibición o ausencia de metástasis de células tumorales o cancerosas; inhibición o ausencia de crecimiento del cáncer; alivio de uno o más síntomas asociados con el cáncer específico; reducción de la morbilidad y la mortalidad; mejora de la calidad de vida; reducción de la tumorigenicidad; reducción del número o la frecuencia de células madre cancerosas; o alguna combinación de efectos.

[0081] Tal como se utiliza en la presente descripción y las reivindicaciones, las formas singulares “un”, “una”, “el” y “ella” incluyen las formas plurales a menos que el contexto claramente dicte otra cosa.

[0082] Se entiende que siempre que se describen formas de realización en este documento con la expresión "que comprende", también se proporcionan en caso contrario formas de realización análogas descritas en términos de "que consiste en" y/o "consiste esencialmente en". También se entiende que siempre que se describen formas de realizaciónen en el presente documento con el lenguaje "que consiste esencialmente en", también se proporcionan formas de realización análogas descritas en términos de "que consiste en".

[0083] Como se usa en el presente documento, la referencia a "alrededor de" o "aproximadamente" un valor o parámetro incluye (y describe) formas de realización que se dirigen a ese valor o parámetro. Por ejemplo, la descripción que hace referencia a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X".

[0084] El término "y/o", como se usa en una frase tal como "A y/o B" en el presente documento se pretende que incluya tanto A como B; A o B; A (solo); y B (solo). Asimismo, el término "y/o" tal como se utiliza en una frase como "A, B y/o C" está destinado a abarcar cada una de las siguientes formas de realización: A, B y C; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo); y C (solo).

II. Agentes de unión a TIGIT

[0085] El inmunoreceptor de células T con Ig y dominios ITIM (TIGIT) es una glicoproteína de transmembrana de tipo 1 que contiene una variable de inmunoglobulina (IGV) de dominio. TIGIT pertenece a la familia de receptores de poliovirus (PVR) y se une al receptor de poliovirus (pV r ; CD155) con alta afinidad y a PVRL-2 (CD112) y PVRL-3 (CD113) con menor afinidad. TIGIT se expresa en las células T, incluidas las células T reguladoras y las células T de memoria, así como en las células NK y se regula al alza tras la activación de las células T CD4+ vírgenes. Las secuencias de aminoácidos (aa) de longitud completa para TIGIT de ratón (UniProtKB No. P86176) y TIGIT humano (UniProtKB N° Q495A1) son conocidas en la técnica y se proporcionan aquí como SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO: 4, respectivamente. Como se usa en este documento, la referencia a las posiciones de los aminoácidos se refiere a la numeración de las secuencias de aminoácidos de longitud completa que incluyen la secuencia señal.

[0086] La presente descripción proporciona agentes aglutinantes específicamente a TIGIT. Estos agentes se denominan en el presente documento "agentes de unión a TIGIT". En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un polipéptido. En ciertos casos, el agente de unión a TIGIT se une a TIGIT de ratón. En ciertos casos, el agente de unión a TIGIT se une a TIGIT humano. En ciertos casos, el agente de unión a TIGIT se une a TIGIT de ratón y TIGIT humano. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT se une a TIGIT humano y no se une a TIGIT de ratón.

[0087] En algunos casos, un agente se une a TIGIT e interfiere con la interacción de TIGIT con una segunda proteína. En algunos casos, un agente se une a TIGIT e interfiere con la interacción de TIGIT con PVR. En algunos casos, un agente se une a TIGIT e interfiere con la interacción de TIGIT con PVRL-2. En algunos casos, un agente se une a TIGIT e interfiere con la interacción de TIGIT con PVRL-3. En algunos casos, un agente se une específicamente a TIGIT y el agente interrumpe la unión de TIGIT a PVR y/o interrumpe la activación de PVR de la señalización de TIGIT.

[0088] En ciertos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo que se une específicamente al dominio extracelular de TIGIT, o un fragmento del mismo. En ciertos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo que se une específicamente al dominio extracelular de TIGIT de ratón, o un fragmento del mismo. En ciertos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo que se une específicamente al dominio extracelular de TIGIT humano, o un fragmento del mismo. En ciertos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo que se une específicamente al dominio extracelular de TIGIT de ratón y TIGIT humano, o un fragmento de los mismos. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo que se une específicamente al dominio similar a Ig de TIGIT. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo que se une específicamente al dominio IgV de TIGIT. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo que se une a los aminoácidos 22-141 de TIGIT humano y/o los aminoácidos 29-148 de TIGIT de ratón. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo que se une dentro de los aminoácidos 22-141 de SEQ ID NO: 4 y/o los aminoácidos 29-148 de SEQ ID NO:1. En algunos casos, el agente se une a los aminoácidos 22-124 de TIGIT humano y/o los aminoácidos 29-127 de TIGIT de ratón. En algunos casos, el agente se une dentro de los aminoácidos 22-124 de SEQ ID NO: 4 y/o los aminoácidos 29-127 de SEQ ID NO:1. En ciertos casos, el agente de unión a TIGIT se une dentro de la SEQ ID NO: 3, o un fragmento de la misma. En ciertos casos, el agente de unión a TIGIT se une dentro de la SEQ ID NO: 6, o un fragmento de la misma. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo que se une a los aminoácidos 22-141 de TIGIT humano. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo que se une dentro de los aminoácidos 22-141 de SEQ ID NO: 4. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo que se une a los aminoácidos 50-124 de TIGIT humano. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo que se une dentro de los aminoácidos 50-124 de SEQ ID NO: 4. En ciertos casos, el agente de unión a TIGIT se une dentro de la SEQ ID NO: 6, o un fragmento de la misma.

[0089] En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo que se une a un epítopo que comprende los aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 79. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo que se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 80. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo que se une a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de SEQ ID NO: 79 y SEQ ID NO: 80. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo que se une a un epítopo que comprende los aminoácidos Q62 y 1109 de SEQ ID NO: 4. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo que se une a un epítopo que comprende los aminoácidos Q62 y T119 de SEQ ID NO: 4. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo que se une a un epítopo que comprende los aminoácidos Q64 y 1109 de SEQ ID NO: 4. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo que se une a un epítopo que comprende los aminoácidos Q64 y T119 de SEQ ID NO: 4. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo que se une a un epítopo que comprende los aminoácidos Q62, Q64 y 1109 de SEQ ID NO: 4. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo que se une a un epítopo que comprende los aminoácidos Q62, Q64 y T119 de SEQ ID NO: 4. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo que se une a un epítopo que comprende los aminoácidos Q62, 1109 y T119 de SEQ ID NO: 4. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo que se une a un epítopo que comprende los aminoácidos Q64, 1109 y T119 de SEQ ID NO: 4. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo que se une a un epítopo que comprende los aminoácidos Q62, Q64, 1109 y T119 de SEQ ID NO: 4. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo que se une a un epítopo que comprende al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: N58, E60, Q62, Q64, L65, F107, 1109, H111, T117, T119, G120 y R121 de SEQ ID NO: 4. En algunos casos, el epítopo es un epítopo conformacional. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo que se une a un epítopo que no comprende el aminoácido V100 de SEQ ID NO: 4.

[0090] En ciertos casos, el agente de unión a TIGIT (p. ej., un anticuerpo) se une TIGIT con una constante de disociación (K^d) de aproximadamente 1 pM o menos, aproximadamente 100 nM o menos, aproximadamente 40 nM o menos, aproximadamente 20 nM o menos, aproximadamente 10 nM o menos, aproximadamente 1 nM o menos, aproximadamente 0,1 nM o menos, 50 pM o menos, 10 pM o menos, o 1 pM o menos. En algunos casos, un agente de unión a TIGIT se une a TIGIT con una K^dde aproximadamente 20 nM o menos. En algunas formas de realización, un agente de unión a TIGIT se une a TIGIT con una K^dde aproximadamente 10 nM o menos. En algunos casos, un agente de unión a TIGIT se une a TIGIT con una K^dde aproximadamente 1 nM o menos. En algunos casos, un agente de unión a TIGIT se une a TIGIT con una K^dde aproximadamente 0,5 nM o menos. En algunos casos, un agente de unión a TIGIT se une a TIGIT con una K^dde aproximadamente 0,1 nM o menos. En algunos casos, un agente de unión a TIGIT se une a TIGIT con una K^dde aproximadamente 50 pM o menos. En algunos casos, un agente de unión a TIGIT se une a TIGIT con una K^dde aproximadamente 25 pM o menos. En algunos casos, un agente de unión a TIGIT se une a TIGIT con una K^dde aproximadamente 10 pM o menos. En algunos casos, un agente de unión a TIGIT se une a TIGIT con una K^dde aproximadamente 1 pM o menos. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT se une tanto a TIGIT humano como a TIGIT de ratón con una K^dde aproximadamente 10 nM o menos. En algunos casos, un agente de unión a TIGIT se une tanto a TIGIT humano como a TIGIT de ratón con una K^dde aproximadamente 1 nM o menos. En algunos casos, un agente de unión a TIGIT se une tanto a TIGIT humano como a TIGIT de ratón con una K^dde aproximadamente 0,1 nM o menos. En algunos casos, la constante de disociación del agente de unión (p. ej., un anticuerpo) a TIGIT es la constante de disociación determinada usando una proteína de fusión TIGIT que comprende al menos una porción del dominio extracelular de la proteína TIGIT inmovilizada en un chip Biacore. En algunos casos, la constante de disociación del agente de unión (p. ej., un anticuerpo) a TIGIT es la constante de disociación determinada usando el agente de unión capturado por un anticuerpo IgG antihumano en un chip Biacore y una proteína TIGIT soluble.

[0091] En algunos casos, un agente de unión a TIGIT comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIGIT y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente una segunda diana. En algunos casos, un agente de unión a TIGIT es un agente biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIGIT y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a una segunda diana. En algunos casos, un agente de unión a TIGIT se une tanto a TIGIT como al segundo objetivo con una K^dde aproximadamente 100 nM o menos. En algunos casos, un agente de unión a TIGIT se une tanto a TIGIT como al segundo objetivo con una K^dde aproximadamente 50 nM o menos. En algunos casos, un agente de unión a TIGIT se une tanto a TIGIT como al segundo objetivo con una K^dde aproximadamente 20 nM o menos. En algunos casos, un agente de unión a TIGIT se une tanto a TIGIT como al segundo objetivo con una K^dde aproximadamente 10 nM o menos. En algunos casos, un agente de unión a TIGIT se une tanto a TIGIT como al segundo objetivo con una KD de aproximadamente 1 nM o menos. En algunos casos, la afinidad de uno de los sitios de unión al antígeno puede ser más débil que la afinidad del otro sitio de unión al antígeno. Por ejemplo, la K^dde un sitio de unión al antígeno puede ser aproximadamente 1 nM y la K^ddel segundo sitio de unión al antígeno puede ser aproximadamente 10 nM. En algunas formas de realización, la diferencia de afinidad entre los dos sitios de unión al antígeno puede ser aproximadamente 2 veces o más, aproximadamente 3 veces o más, aproximadamente 5 veces o más, aproximadamente 8 veces o más, aproximadamente 10 veces o más, aproximadamente 15 veces o más, aproximadamente 20 veces o más, aproximadamente 30 veces o más, aproximadamente 50 veces o más, o aproximadamente 100 veces o más. La modulación de las afinidades de los dos sitios de unión al antígeno puede afectar la actividad biológica del anticuerpo biespecífico. Por ejemplo, la disminución de la afinidad del sitio de unión al antígeno por TIGIT o la segunda diana puede tener un efecto deseable, por ejemplo, disminución de la toxicidad del agente de unión y/o aumento del índice terapéutico.

[0092] En ciertas formas de realización de la invención, el anticuerpo como se describe en el presente documento se une a TIGIT humano con una concentración efectiva media máxima (CE50) de aproximadamente 1 pM o menos, aproximadamente 100 nM o menos, aproximadamente 40 nM o menos, aproximadamente 20 nM o menos, aproximadamente 10 nM o menos, aproximadamente 1 nM o menos, o aproximadamente 0,1 nM o menos. En ciertas formas de realización, el anticuerpo descrito en este documento se une a TIGIT humano con una concentración eficaz semimáxima (CE50) de aproximadamente 1 pM o menos, aproximadamente 100 nM o menos, aproximadamente 40 nM o menos, aproximadamente 20 nM o menos, aproximadamente 10 nM o menos, aproximadamente 1 nM o menos, o aproximadamente 0,1 nM o menos.

[0093] En algunas formas de realización, el anticuerpo es un anticuerpo recombinante. En algunas formas de realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas formas de realización, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico. En algunas formas de realización, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. En algunas formas de realización, el anticuerpo es un anticuerpo humano. En algunas formas de realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgA, IgD, IgE, IgG o IgM. En determinadas formas de realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgG1. En determinadas formas de realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgG2. En algunas formas de realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgG4. En determinadas formas de realización, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo que comprende un sitio de unión al antígeno. En algunas formas de realización, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo multiespecífico. En algunas formas de realización, el anticuerpo es un anticuerpo monovalente. En algunas formas de realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoespecífico. En algunas formas de realización, el anticuerpo es un anticuerpo bivalente. En algunas formas de realización, el anticuerpo se conjuga con un resto citotóxico. En algunas formas de realización, se aísla el anticuerpo. En algunas formas de realización, el anticuerpo es sustancialmente puro.

[0094] En algunas formas de realización, los anticuerpos son anticuerpos policlonales. Los anticuerpos policlonales se pueden preparar mediante cualquier método conocido. En algunas formas de realización, los anticuerpos policlonales se producen inmunizando un animal (p. ej., un conejo, rata, ratón, cabra, burro) con un antígeno de interés (p. ej., un fragmento de péptido purificado, proteína recombinante de longitud completa o proteína de fusión) usando múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. El antígeno se puede conjugar opcionalmente con un vehículo tal como hemocianina de lapa californiana (KLH) o albúmina de suero. El antígeno (con o sin una proteína transportadora) se diluye en solución salina estéril y normalmente se combina con un adyuvante (p. ej., adyuvante de Freund completo o incompleto) para formar una emulsión estable. Después de un período de tiempo suficiente, los anticuerpos policlonales se recuperan del animal inmunizado, generalmente de sangre o ascitis. Los anticuerpos policlonales se pueden purificar a partir de suero o ascitis de acuerdo con métodos estándar en la técnica que incluyen, entre otros, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, electroforesis en gel y diálisis.

[0095] En algunas formas de realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando métodos de hibridomas conocidos por un experto en la técnica. En algunas formas de realización, usando el método de hibridoma, se inmuniza un ratón, rata, conejo, hámster u otro animal huésped apropiado, como se describió anteriormente para provocar la producción de anticuerpos que se unen específicamente al antígeno inmunizante. En algunas formas de realización, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro. En algunas formas de realización, el antígeno inmunizante puede ser una proteína humana o un fragmento de la misma. En algunas formas de realización, el antígeno inmunizante puede ser una proteína de ratón o un fragmento de la misma.

[0096] Después de la inmunización, los linfocitos se aíslan y se fusionan con una línea adecuada de células de mieloma usando, por ejemplo, polietilenglicol. Las células de hibridoma se seleccionan usando medios especializados como se conoce en la técnica y los linfocitos no fusionados y las células de mieloma no sobreviven al proceso de selección. Los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales dirigidos específicamente contra un antígeno elegido pueden identificarse mediante una variedad de métodos que incluyen, entre otros, inmunoprecipitación, inmunotransferencia y ensayos de unión in vitro (p. ej., citometría de flujo, FACS, ELISA y radioinmunoensayo). Los hibridomas se pueden propagar en cultivo in vitro usando métodos estándar o in vivo como tumores de ascitis en un animal. Los anticuerpos monoclonales se pueden purificar del medio de cultivo o del fluido ascítico de acuerdo con métodos estándar en la técnica que incluyen, entre otros, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, electroforesis en gel y diálisis.

[0097] En ciertas formas de realización, los anticuerpos monoclonales se pueden hacer utilizando técnicas de ADN recombinante como se conoce por un experto en la técnica. Los polinucleótidos que codifican un anticuerpo monoclonal se aíslan de células B maduras o células de hibridoma, como mediante RT-PCR utilizando cebadores oligonucleotídicos que amplifican específicamente los genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo, y su secuencia se determina utilizando técnicas estándar. Los polinucleótidos aislados que codifican las cadenas pesada y ligera se clonan luego en vectores de expresión adecuados que producen los anticuerpos monoclonales cuando se transfectan en células huésped como E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de lo contrario no producirán proteínas de inmunoglobulina.

[0098] En ciertas otras formas de realización, los anticuerpos monoclonales recombinantes, o fragmentos de los mismos, pueden aislarse a partir de bibliotecas de presentación de fagos que expresan dominios variables o CDR de una especie deseada.

[0099] El (los) polinucleótido(s) que codifica(n) un anticuerpo monoclonal se puede(n) modificar, por ejemplo, mediante el uso de tecnología de ADN recombinante para generar anticuerpos alternativos. En algunas formas de realización, los dominios constantes de la cadena ligera y la cadena pesada de, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal de ratón pueden sustituirse por regiones constantes de, por ejemplo, un anticuerpo humano para generar un anticuerpo quimérico, o por un polipéptido que no sea inmunoglobulina para generar un anticuerpo de fusión. En algunas formas de realización, las regiones constantes se truncan o eliminan para generar un fragmento de anticuerpo deseado de un anticuerpo monoclonal. Puede usarse mutagénesis dirigida a sitio o de alta densidad de la región o regiones variables para optimizar la especificidad, afinidad, etc. de un anticuerpo monoclonal.

[0100] En algunas formas de realización, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. Normalmente, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas en las que los residuos de aminoácidos de las CDR se reemplazan por residuos de aminoácidos de las CDR de una especie no humana (p. ej., ratón, rata, conejo, hámster, etc.) que tienen la especificidad deseada, afinidad y/o capacidad de unión usando métodos conocidos por un experto en la técnica. En algunas formas de realización, algunos de los residuos de aminoácidos de la región variable del marco de una inmunoglobulina humana se reemplazan con los residuos de aminoácidos correspondientes en un anticuerpo de una especie no humana. En algunas formas de realización, un anticuerpo humanizado puede modificarse adicionalmente mediante la sustitución de residuos adicionales en la región variable marco y/o dentro de los residuos no humanos reemplazados para refinar y optimizar aún más la especificidad, afinidad y/o capacidad del anticuerpo. En general, un anticuerpo humanizado comprenderá regiones de dominio variable que contienen todas, o sustancialmente todas, las CDR que corresponden a la inmunoglobulina no humana, mientras que todas, o sustancialmente todas, las regiones marco son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. En algunas formas de realización, las regiones marco son las de una secuencia de inmunoglobulina consenso humana. En algunas formas de realización, un anticuerpo humanizado también puede comprender al menos una porción de una región o dominio constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. En determinadas formas de realización, dichos anticuerpos humanizados se utilizan terapéuticamente porque pueden reducir la antigenicidad y las respuestas HAMA (anticuerpo anti-ratón humano) cuando se administran a un sujeto humano.

[0101] En ciertas formas de realización, el anticuerpo es un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanos se pueden preparar directamente usando diversas técnicas conocidas en la técnica. En algunas formas de realización, los anticuerpos humanos pueden generarse a partir de linfocitos B humanos inmortalizados inmunizados in vitro o de linfocitos aislados de un individuo inmunizado. En cualquier caso, se pueden generar y aislar células que producen un anticuerpo dirigido contra un antígeno diana. En algunas formas de realización, el anticuerpo humano puede seleccionarse de una biblioteca de fagos, donde esa biblioteca de fagos expresa anticuerpos humanos. Alternativamente, la tecnología de presentación de fagos puede usarse para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos in vitro, a partir de repertorios de genes de dominio variable de inmunoglobulina de donantes no inmunizados. Las técnicas para la generación y uso de bibliotecas de fagos de anticuerpos son bien conocidas en la técnica. Una vez que se identifican los anticuerpos, se pueden emplear estrategias de maduración por afinidad conocidas en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a barajado de cadenas y mutagénesis dirigida al sitio, para generar anticuerpos humanos de mayor afinidad.

[0102] En algunas formas de realización, los anticuerpos humanos se pueden hacer en los ratones transgénicos que contienen loci de inmunoglobulina humana. Tras la inmunización, estos ratones son capaces de producir el repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de la producción de inmunoglobulina endógena.

[0103] En algunas formas de realización, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico. Por tanto, esta invención abarca anticuerpos biespecíficos que reconocen específicamente TIGIT y al menos una diana adicional. Los anticuerpos biespecíficos son capaces de reconocer y unirse específicamente al menos a dos antígenos o epítopos diferentes. Los diferentes epítopos pueden estar dentro de la misma molécula (p. ej., dos epítopos en TIGIT) o en diferentes moléculas (p. ej., un epítopo en TIGIT y un epítopo en una proteína diferente). En algunas formas de realización, un anticuerpo biespecífico tiene una potencia mejorada en comparación con un anticuerpo individual o con una combinación de más de un anticuerpo. En algunas formas de realización, un anticuerpo biespecífico tiene una toxicidad reducida en comparación con un anticuerpo individual o con una combinación de más de un anticuerpo. Los expertos en la técnica saben que cualquier agente terapéutico puede tener una farmacocinética (PK) única (p. ej., semivida circulante). En algunas formas de realización, un anticuerpo biespecífico tiene la capacidad de sincronizar la PK de dos agentes de unión activos en los que los dos agentes de unión individuales tienen diferentes perfiles de PK. En algunas formas de realización, un anticuerpo biespecífico tiene la capacidad de concentrar las acciones de dos agentes en un área común (p. ej., un tumor y/o microambiente tumoral). En algunas formas de realización, un anticuerpo biespecífico tiene la capacidad de concentrar las acciones de dos agentes en un objetivo común (p. ej., un tumor o una célula tumoral). En algunas formas de realización, un anticuerpo biespecífico tiene la capacidad de dirigir las acciones de dos agentes a más de una ruta o función biológica. En algunas formas de realización, un anticuerpo biespecífico tiene la capacidad de dirigirse a dos células diferentes y acercarlas (p. ej., una célula inmunitaria y una célula tumoral).

[0104] En algunas formas de realización, el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo monoclonal. En algunas formas de realización, el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo humanizado. En algunas formas de realización, el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo humano. En algunas formas de realización, el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo IgG1. En algunas formas de realización, el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo IgG2. En algunas formas de realización, el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo IgG4. En algunas formas de realización, el anticuerpo biespecífico tiene menor toxicidad y/o efectos secundarios. En algunas formas de realización, el anticuerpo biespecífico tiene menor toxicidad y/o efectos secundarios en comparación con una mezcla de los dos anticuerpos individuales o los anticuerpos como agentes individuales. En algunas formas de realización, el anticuerpo biespecífico tiene un índice terapéutico aumentado. En algunas formas de realización, el anticuerpo biespecífico tiene un índice terapéutico aumentado en comparación con una mezcla de los dos anticuerpos individuales o los anticuerpos como agentes individuales.

[0105] En algunas formas de realización, los anticuerpos pueden reconocer específicamente y se unen a TIGIT humano, así como un segundo antígeno diana, tal como una molécula efectora en una célula inmune (p. ej., CD2, CD3, c D28, CTLA4, PD-1, PD-L1, CD80 o CD86) o un receptor Fc (p. ej., CD64, CD32 o CD16) para enfocar los mecanismos de defensa celular a la célula que expresa y/o produce el primer antígeno diana. En algunas formas de realización, los anticuerpos pueden usarse para dirigir agentes citotóxicos a células que expresan un antígeno diana particular. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión a antígeno y un brazo que se une a un agente citotóxico o un quelante de radionúclido, como EOTUBE, DPTA, DOTA o TETA.

[0106] Los expertos en la técnica conocen técnicas para preparar anticuerpos biespecíficos. En algunas formas de realización, los anticuerpos biespecíficos comprenden regiones constantes de cadena pesada con modificaciones en los aminoácidos que son parte de la interfaz entre las dos cadenas pesadas. En algunas formas de realización, los anticuerpos biespecíficos se pueden generar usando una estrategia de "protuberancias en agujeros". En algunos casos, la terminología de "pomos" y "agujeros" se sustituye por los términos "protuberancias" y "cavidades". En algunas formas de realización, los anticuerpos biespecíficos pueden comprender regiones de bisagra variantes incapaces de formar enlaces disulfuro entre las cadenas pesadas. En algunas formas de realización, las modificaciones pueden comprender cambios en los aminoácidos que dan como resultado interacciones electrostáticas alteradas. En algunas formas de realización, las modificaciones pueden comprender cambios en los aminoácidos que dan como resultado interacciones hidrofóbicas/hidrofílicas alteradas.

[0107] Los anticuerpos biespecíficos pueden ser anticuerpos intactos o fragmentos de anticuerpo que comprenden los sitios de unión a antígeno. También se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos específicos. Por tanto, en determinadas formas de realización, los anticuerpos contra TIGIT son multiespecíficos.

[0108] En ciertas formas de realización, los anticuerpos (u otros polipéptidos) descritos en este documento pueden ser monoespecíficos. En determinadas formas de realización, cada uno de los uno o más sitios de unión a antígeno que contiene un anticuerpo es capaz de unirse (o ligarse) a un epítopo homólogo en TIGIT.

[0109] En ciertas formas de realización, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpos pueden tener diferentes funciones o capacidades que los anticuerpos intactos; por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos pueden tener una mayor penetración tumoral. Se conocen varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos que incluyen, pero no se limitan a digestión proteolítica de anticuerpos intactos. En algunas formas de realización, los fragmentos de anticuerpos incluyen un fragmento F(ab’)2 producido por digestión con pepsina de una molécula de anticuerpo. En algunas formas de realización, los fragmentos de anticuerpos incluyen un fragmento Fab generado reduciendo los puentes disulfuro de un fragmento F(ab’)2. En otras formas de realización, los fragmentos de anticuerpos incluyen un fragmento Fab generado por el tratamiento de la molécula de anticuerpo con papaína y un agente reductor. En determinadas formas de realización, los fragmentos de anticuerpos se producen mediante métodos recombinantes. En algunas formas de realización, los fragmentos de anticuerpos incluyen Fv o fragmentos de Fv de cadena sencilla (scFv). Los fragmentos de anticuerpos Fab, Fv y scFv pueden expresarse y secretarse a partir de E. coli u otras células huésped, lo que permite la producción de grandes cantidades de estos fragmentos. En algunas formas de realización, los fragmentos de anticuerpos se aíslan de bibliotecas de fagos de anticuerpos como se describe en el presente documento. Por ejemplo, se pueden usar métodos para la construcción de bibliotecas de expresión de Fab para permitir la identificación rápida y eficaz de fragmentos de Fab monoclonales con la especificidad deseada para TIGIT o derivados, fragmentos, análogos u homólogos de los mismos. En algunas formas de realización, los fragmentos de anticuerpos son fragmentos de anticuerpos lineales. En determinadas formas de realización, los fragmentos de anticuerpos son monoespecíficos o biespecíficos. En determinadas formas de realización, el anticuerpo es un scFv. Se pueden utilizar varias técnicas para la producción de anticuerpos monocatenarios específicos de TIGIT.

[0110] En algunas formas de realización, especialmente en el caso de fragmentos de anticuerpos, un anticuerpo se modifica con el fin de alterar (p. ej., aumento o disminución) su vida media en suero. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante la incorporación de un epítopo de unión al receptor de rescate en el fragmento de anticuerpo por mutación de la región apropiada en el fragmento de anticuerpo o incorporando el epítopo en una etiqueta de péptido que luego se fusiona con el fragmento de anticuerpo en cualquier extremo o en el medio (p. ej., mediante síntesis de péptidos o ADN).

[0111] Los anticuerpos heteroconjugados también están dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos por dos anticuerpos unidos covalentemente. Se ha propuesto, por ejemplo, que tales anticuerpos dirijan células inmunes a células no deseadas. También se contempla que los anticuerpos heteroconjugados se pueden preparar in vitro usando métodos conocidos en la química de proteínas sintéticas, incluidos los que implican agentes de reticulación. Por ejemplo, las inmunotoxinas se pueden construir usando una reacción de intercambio de disulfuro o formando un enlace tioéter. Los ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato.

[0112] Para los fines de la presente invención, se debe apreciar que los anticuerpos modificados pueden comprender cualquier tipo de región variable que permite la asociación del anticuerpo con el objetivo (es decir, TIGIT humano). A este respecto, la región variable puede comprender o derivarse de cualquier tipo de mamífero que pueda inducirse a montar una respuesta humoral y generar inmunoglobulinas contra el antígeno deseado. Como tal, la región variable de los anticuerpos modificados puede ser, por ejemplo, de origen humano, murino, rata, conejo, primate no humano (p. ej., monos cynomolgus, macacos, etc.) o conejo. En algunas formas de realización, tanto las regiones variables como las constantes de las inmunoglobulinas modificadas son humanas. En otras formas de realización, las regiones variables de anticuerpos compatibles (normalmente derivados de una fuente no humana) se pueden diseñar o adaptar específicamente para mejorar las propiedades de unión o reducir la inmunogenicidad de la molécula. A este respecto, las regiones variables útiles en la presente invención se pueden humanizar o alterar de otro modo mediante la inclusión de secuencias de aminoácidos importadas.

[0113] En ciertas formas de realización, los dominios variables en las cadenas tanto pesada como ligera son alterados por al menos una sustitución parcial de una o más CDR y, si es necesario, mediante el reemplazo de región marco parcial y la modificación y/o alteración de la secuencia. Aunque las CDR pueden derivarse de un anticuerpo de la misma clase o incluso subclase que el anticuerpo del que se derivan las regiones marco, se prevé que las CDR pueden derivarse de un anticuerpo de diferente clase y, a menudo, de un anticuerpo de una diferente especie. Puede que no sea necesario reemplazar todas las CDR con todas las CDR de la región variable donante para transferir la capacidad de unión al antígeno de un dominio variable a otro. Más bien, puede que solo sea necesario transferir aquellos residuos que se requieren para mantener la actividad del sitio de unión al antígeno.

[0114] A pesar de las alteraciones de la región variable, los expertos en la técnica apreciarán que los anticuerpos modificados de esta invención comprenderán anticuerpos (p. ej., anticuerpos de longitud completa o fragmentos inmunorreactivos de los mismos) en los que al menos una fracción de uno o más de los dominios de la región constante se han eliminado o alterado de otro modo para proporcionar las características bioquímicas deseadas tales como una mayor localización del tumor o una mayor semivida en suero cuando se compara con un anticuerpo de aproximadamente la misma inmunogenicidad que comprende una región constante nativa o inalterada. En algunas formas de realización, la región constante de los anticuerpos modificados comprenderá una región constante humana. Las modificaciones de la región constante compatibles con esta invención comprenden adiciones, deleciones o sustituciones de uno o más aminoácidos en uno o más dominios. Los anticuerpos modificados descritos en este documento pueden comprender alteraciones o modificaciones en uno o más de los tres dominios constantes de cadena pesada (CH1, CH2 o CH3) y/o en el dominio constante de cadena ligera (CL). En algunas formas de realización, uno o más dominios se eliminan parcial o totalmente de las regiones constantes de los anticuerpos modificados. En algunas formas de realización, los anticuerpos modificados comprenderán construcciones o variantes de dominio eliminado en las que se ha eliminado todo el dominio CH2 (construcciones ACH2). En algunas formas de realización, el dominio de región constante omitido se reemplaza por un espaciador de aminoácidos corto (p. ej., 10 residuos de aminoácidos) que proporciona algo de la flexibilidad molecular impartida típicamente por la región constante ausente.

[0115] En algunas formas de realización, los anticuerpos modificados están diseñados para fusionar el dominio CH3 directamente a la región bisagra del anticuerpo. En otras formas de realización, se inserta un espaciador de péptidos entre la región de bisagra y los dominios CH2 y/o CH3 modificados. Por ejemplo, pueden expresarse construcciones en las que el dominio CH2 se ha eliminado y el dominio CH3 restante (modificado o no modificado) se une a la región bisagra con un espaciador de 5-20 aminoácidos. Puede añadirse un espaciador de este tipo para garantizar que los elementos reguladores del dominio constante permanezcan libres y accesibles o que la región de bisagra permanezca flexible. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que los espaciadores de aminoácidos pueden, en algunos casos, resultar inmunogénicos y provocar una respuesta inmunitaria no deseada contra la construcción. Por consiguiente, en determinadas formas de realización, cualquier espaciador añadido a la construcción será relativamente no inmunogénico para mantener las cualidades biológicas deseadas de los anticuerpos modificados.

[0116] En algunas formas de realización, los anticuerpos modificados pueden tener sólo una deleción parcial de un dominio constante o la sustitución de unos pocos o incluso un único aminoácido. Por ejemplo, la mutación de un solo aminoácido en áreas seleccionadas del dominio CH2 puede ser suficiente para reducir sustancialmente la unión de Fc. En algunas formas de realización, la mutación de un solo aminoácido en áreas seleccionadas del dominio CH2 puede ser suficiente para reducir sustancialmente la unión de Fc y aumentar la localización de las células cancerosas y/o la penetración del tumor. De manera similar, puede ser deseable eliminar simplemente la parte de uno o más dominios de región constantes que controlan una función efectora específica (p. ej., unión del complemento C1q) que se va a modular. Tales deleciones parciales de las regiones constantes pueden mejorar las características seleccionadas del anticuerpo (vida media en suero) mientras dejan intactas otras funciones deseables asociadas con el dominio de la región constante sujeto. Además, como se mencionó anteriormente, las regiones constantes de los anticuerpos descritos pueden modificarse mediante la mutación o sustitución de uno o más aminoácidos que mejoran el perfil de la construcción resultante. A este respecto, puede ser posible interrumpir la actividad proporcionada por un sitio de unión conservado (p. ej., unión de Fc) mientras se mantiene sustancialmente la configuración y el perfil inmunogénico del anticuerpo modificado. En ciertas formas de realización, los anticuerpos modificados comprenden la adición de uno o más aminoácidos a la región constante para mejorar las características deseables tales como disminuir o aumentar la función efectora o proporcionar más sitios de unión de citotoxinas o carbohidratos.

[0117] Es conocido en la técnica que la región constante actúa de mediador en varias funciones efectoras. Por ejemplo, la unión del componente C1 del complemento a la región Fc de los anticuerpos IgG o IgM (unidos al antígeno) activa el sistema del complemento. La activación del complemento es importante en la opsonización y lisis de patógenos celulares. La activación del complemento también estimula la respuesta inflamatoria y también puede estar involucrada en la hipersensibilidad autoinmune. Además, la región Fc de un anticuerpo puede unirse a una célula que expresa un receptor Fc (FcR). Hay varios receptores Fc que son específicos para diferentes clases de anticuerpos, incluidos IgG (receptores gamma), IgE (receptores épsilon), IgA (receptores alfa) e IgM (receptores mu). La unión del anticuerpo a los receptores Fc en la superficie celular desencadena una serie de respuestas biológicas importantes y diversas que incluyen la absorción y destrucción de partículas recubiertas de anticuerpos, la eliminación de complejos inmunes, la lisis de las células diana recubiertas de anticuerpos por las células asesinas (lo que se denomina citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos o ADCC), liberación de mediadores inflamatorios, transferencia placentaria y control de la producción de inmunoglobulinas.

[0118] En ciertas formas de realización, los anticuerpos modificados proporcionan para las funciones efectoras alteradas que, a su vez, afectan el perfil biológico del anticuerpo administrado. Por ejemplo, en algunas formas de realización, la deleción o inactivación (a través de mutaciones puntuales u otros medios) de un dominio de región constante puede reducir la unión al receptor Fc del anticuerpo modificado circulante. En algunas formas de realización, la deleción o inactivación (a través de mutaciones puntuales u otras medios) de un dominio de región constante puede reducir la unión al receptor Fc del anticuerpo modificado circulante aumentando así la localización de las células cancerosas y/o la penetración del tumor. En otras formas de realización, las modificaciones de la región constante aumentan la vida media en suero del anticuerpo. En otras formas de realización, las modificaciones de la región constante reducen la vida media en suero del anticuerpo. En algunas formas de realización, la región constante se modifica para eliminar enlaces disulfuro o restos oligosacáridos. Las modificaciones de la región constante de acuerdo con esta invención pueden realizarse fácilmente usando técnicas de ingeniería bioquímica o molecular bien conocidas.

[0119] En ciertos casos de la descripción, un agente de unión a TIGIT que es un anticuerpo no tiene una o más funciones efectoras. Por ejemplo, en algunos casos, el anticuerpo no tiene actividad ADCC y/o no tiene actividad de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). En ciertos casos, el anticuerpo no se une a un receptor de Fc y/o factores del complemento. En ciertos casos, el anticuerpo no tiene función(es) efectora(s).

[0120] La presente descripción comprende además variantes y equivalentes que son sustancialmente homólogos a los anticuerpos recombinantes, monoclonales, quiméricos, humanizados, y humanos, o fragmentos de anticuerpos de los mismos, descritos en el presente documento. Estas variantes pueden contener, por ejemplo, mutaciones de sustitución conservativas, es decir, la sustitución de uno o más aminoácidos por aminoácidos similares.

[0121] La presente divulgación proporciona métodos para producir un anticuerpo que se une a TIGIT, incluidos anticuerpos biespecíficos que se unen específicamente tanto a TIGIT como a una segunda diana. En algunos casos, el método para producir un anticuerpo que se une a TIGIT comprende el uso de técnicas de hibridomas. En algunos casos, se proporciona un método para producir un anticuerpo que se une a TIGIT humano. En algunos casos, el método comprende usar un polipéptido que comprende el dominio extracelular de TIGIT de ratón o un fragmento del mismo como antígeno. En algunos casos, el método comprende usar un polipéptido que comprende el dominio extracelular de TIGIT humano o un fragmento del mismo como antígeno. En algunos casos, el método comprende usar un polipéptido que comprende los aminoácidos 29-148 de TIGIT de ratón como antígeno. En algunos casos, el método comprende usar un polipéptido que comprende los aminoácidos 22-141 de TIGIT humano como antígeno. En algunos casos, el método comprende usar un polipéptido que comprende los aminoácidos 29-148 de SEQ ID NO:1 como antígeno. En algunos casos, el método comprende usar un polipéptido que comprende los aminoácidos 22-141 de SEQ ID NO: 4 como antígeno. En algunos casos, el método comprende usar un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 3 o un fragmento del mismo como antígeno. En algunos casos, el método comprende usar un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 6 o un fragmento del mismo como antígeno. En algunos casos, el método de generar un anticuerpo que se une a TIGIT comprende el cribado de una biblioteca de fagos. En algunos casos, el método de generar un anticuerpo que se une a TIGIT comprende el cribado de una biblioteca de fagos humanos. La presente invención proporciona además métodos para identificar un anticuerpo que se une a TIGIT. En algunos casos, el anticuerpo se identifica mediante exploración FACS para la unión a TIGIT o un fragmento del mismo. En algunos casos, el anticuerpo se identifica mediante cribado usando ELISA para la unión a TIGIT, o un fragmento del mismo. En algunos casos, el anticuerpo se identifica mediante cribado por FACS para el bloqueo de la unión de TIGIT a PVR.

[0122] En algunos casos, un método para generar un anticuerpo para TIGIT comprende la inmunización de un mamífero con un polipéptido que comprende amino ácidos 29 a 148 de ratón TIGIT. En algunos casos, un método para generar un anticuerpo contra TIGIT comprende inmunizar a un mamífero con un polipéptido que comprende los aminoácidos 22-141 de TIGIT humano. En algunos casos, un método para generar un anticuerpo contra TIGIT comprende inmunizar a un mamífero con un polipéptido que comprende un fragmento (p. ej., una porción) de aminoácidos 29-148 de ratón TIGIT. En algunos casos, un método para generar un anticuerpo contra TIGIT comprende inmunizar a un mamífero con un polipéptido que comprende un fragmento de los aminoácidos 22-141 de TIGIT humano. En algunos casos, el método comprende además aislar anticuerpos o células productoras de anticuerpos del mamífero. En algunos casos, un método para generar un anticuerpo monoclonal que se une a TIGIT comprende: (a) inmunizar a un mamífero con un polipéptido que comprende un fragmento de los aminoácidos 29-148 de TIGIT de ratón; (b) aislar células productoras de anticuerpos del mamífero inmunizado; y (c) fusionar las células productoras de anticuerpos con células de una línea celular de mieloma para formar células de hibridoma. En algunos casos, un método para generar un anticuerpo monoclonal que se une a TIGIT comprende: (a) inmunizar a un mamífero con un polipéptido que comprende un fragmento de los aminoácidos 22-141 de TIGIT humano; (b) aislar células productoras de anticuerpos del mamífero inmunizado; y (c) fusionar las células productoras de anticuerpos con células de una línea celular de mieloma para formar células de hibridoma. En algunos casos, el método comprende además (d) seleccionar una célula de hibridoma que expresa un anticuerpo que se une a TIGIT. En ciertos casos, el mamífero es un ratón. En algunos casos, el mamífero es una rata. En algunos casos, el mamífero es un conejo. En algunos casos, el anticuerpo se selecciona usando un polipéptido que comprende los aminoácidos 29-148 o un fragmento del mismo de TIGIT de ratón. En algunos casos, el anticuerpo se selecciona usando un polipéptido que comprende los aminoácidos 22-141 o un fragmento del mismo de TIGIT humano. En algunos casos, el anticuerpo se une tanto al TIGIT humano como al TIGIT de ratón. En algunos casos, el anticuerpo no se une a TIGIT de ratón. En algunos casos, el anticuerpo no se une a TIGIT de mono cynomolgus. En algunos casos, el anticuerpo no se une al TIGIT del mono rhesus. En algunos casos, el anticuerpo no se une a TIGIT de rata. En algunos casos, el anticuerpo se une a TIGIT humano y no se une a TIGIT de ratón. En algunos casos, el anticuerpo se une a TIGIT humano y no se une a TIGIT de mono cynomolgus. En algunos casos, el anticuerpo se une al TIGIT humano y no al TIGIT del mono rhesus. En algunos casos, el anticuerpo se une a TIGIT humano y no se une a TIGIT de rata.

[0123] En algunos casos, un método de producción de un anticuerpo que se une a TIGIT comprende identificar un anticuerpo usando una molécula heterodimérica unida a la membrana que comprende un solo sitio de unión a antígeno. En algunas formas de realización no limitantes, el anticuerpo se identifica usando métodos y polipéptidos descritos en la Publicación Internacional WO 2011/100566.

[0124] En algunos casos, un método de producción de un anticuerpo que se une a TIGIT comprende seleccionar una biblioteca de expresión de anticuerpos. En algunos casos, la biblioteca que expresa anticuerpos es una biblioteca de fagos. En algunos casos, el cribado comprende un barrido. En algunos casos, la biblioteca que expresa anticuerpos es una biblioteca de células de mamífero. En algunos casos, la biblioteca que expresa anticuerpos se rastrea usando los aminoácidos 29-148 de TIGIT de ratón o un fragmento del mismo. En algunos casos, la biblioteca que expresa anticuerpos se rastrea usando los aminoácidos 22-141 de TIGIT humano o un fragmento del mismo. En algunos casos, el anticuerpo identificado en el cribado se une tanto al TIGIT humano como al TIGIT de ratón. En algunos casos, el anticuerpo identificado en la selección es un antagonista de TIGIT.

[0125] En algunos casos, el anticuerpo generado por los métodos descritos en el presente documento es un antagonista TIGIT. En algunos casos, el anticuerpo generado por los métodos descritos en este documento inhibe la señalización de TIGIT. En algunos casos, el anticuerpo generado por los métodos descritos en este documento inhibe la fosforilación de TIGIT.

[0126] En ciertos casos, están aislados los anticuerpos descritos en este documento. En ciertos casos, los anticuerpos descritos en este documento son sustancialmente puros.

[0127] Los anticuerpos de la presente invención pueden ensayarse para la unión por cualquier método conocido en la técnica específica. Los inmunoensayos que se pueden utilizar incluyen, entre otros, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos que utilizan técnicas como análisis Biacore, análisis FACS, inmunofluorescencia, inmunocitoquímica, análisis de transferencia Western, radioinmunoensayo, ELISA, inmunoensayo "sándwich", ensayo de inmunoprecipitación, reacción de precipitación, reacción de precipitación de difusión en gel, ensayo de inmunodifusión, ensayo de aglutinación, ensayo de fijación del complemento, ensayo inmunorradiométrico, inmunoensayo fluorescente e inmunoensayo de proteína A. Dichos ensayos son rutinarios y bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel et al., Editors, 1994-presente, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, NY).

[0128] En un ejemplo no limitante, el cribado de la unión específica de un anticuerpo a TIGIT humano puede determinarse usando ELISA. Un ELISA comprende preparar antígeno (p. ej., TIGIT o un fragmento del mismo), recubrir pocillos de una placa de microvaloración de 96 pocillos con antígeno, añadir los anticuerpos de prueba conjugados a un compuesto detectable como un sustrato enzimático (p. ej., peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina) para el pocillo, incubando durante un período de tiempo y detectando la presencia de un anticuerpo unido al antígeno. En algunas formas de realización, los anticuerpos de prueba no se conjugan con un compuesto detectable, sino que se añaden a los pocillos un anticuerpo secundario que reconoce el anticuerpo (p. ej., un anticuerpo anti-Fc) y se conjuga con un compuesto detectable. En algunas formas de realización, en lugar de revestir el pocillo con el antígeno, los anticuerpos de prueba se pueden revestir en los pocillos, se añade el antígeno (p. ej., TIGIT) a los pocillos, seguido de un anticuerpo secundario conjugado con un compuesto detectable. Un experto en la técnica conocerá los parámetros que pueden modificarse para aumentar la señal detectada, así como otras variaciones de ELISA conocidas en la técnica.

[0129] En otro ejemplo no limitante, la unión de un anticuerpo a TIGIT específico se puede determinar usando FACS. Un ensayo de cribado FACS puede comprender la generación de una construcción de ADNc que exprese un antígeno como una proteína de longitud completa (TIGIT) o una proteína de fusión (p. ej., TIGIT CD4TM), transfectar la construcción en células, expresar el antígeno en la superficie de las células, mezclando los anticuerpos de prueba con las células transfectadas e incubando durante un período de tiempo. Las células unidas por los anticuerpos de prueba pueden identificarse usando un anticuerpo secundario conjugado con un compuesto detectable (p. ej., 23 anticuerpo anti-Fc conjugado con PE) y un flujo citómetro. Un experto en técnica conocerá los parámetros que pueden modificarse para optimizar la señal detectada así como otras variaciones de FACS que pueden mejorar la detección (p. ej., detección de anticuerpos bloqueantes).

[0130] La afinidad de unión de un anticuerpo u otro agente de unión a un antígeno (p. ej., TIGIT) y la velocidad de una interacción anticuerpo-antígeno se puede determinar mediante ensayos de unión competitiva. Un ejemplo de un ensayo de unión competitiva es un radioinmunoensayo que comprende la incubación de antígeno marcado (p. ej., 3H o 125I-TIGIT), o un fragmento o variante del mismo, con el anticuerpo de interés en presencia de cantidades crecientes de antígeno no marcado seguido de la detección del anticuerpo unido al antígeno marcado. La afinidad del anticuerpo por el antígeno y las tasas de desvinculación de la unión se pueden determinar a partir de los datos mediante análisis de gráfico de Scatchard. En algunas formas de realización, el análisis cinético de Biacore se usa para determinar las velocidades de activación y desactivación de anticuerpos o agentes aglutinantes a un antígeno (p. ej., TIGIT). En algunas formas de realización, el análisis cinético de Biacore comprende analizar la unión y disociación de anticuerpos de chips con antígeno inmovilizado (p. ej., TIGIT) en su superficie. En algunas formas de realización, el análisis cinético de Biacore comprende analizar la unión y disociación del antígeno (p. ej., TIGIT) de chips con anticuerpo inmovilizado (p. ej., anticuerpo anti-TIGIT) en su superficie.

[0131] En ciertos casos, la descripción proporciona un agente de unión a TIGIT (p. ej., un anticuerpo) que se une específicamente a TIGIT, en donde el agente de unión a TIGIT comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco, y/o seis de los CDRs del anticuerpo 313R11, 313R12, 313R14 o 313R19 (ver Tabla 1). En algunos casos, el agente de unión a TIGIT comprende una o más de las CDR de 313R11, 313R12, 313R14 o 313R19, o variantes humanizadas de las mismas; dos o más de las CDR de 313R11,313R12, 313R14 o 313R19, o variantes humanizadas de las mismas; tres o más de las CDR de 313R11, 313R12, 313R14 o 313R19, o variantes humanizadas de las mismas; cuatro o más de las CDR de 313R11, 313R12, 313R14 o 313R19, o variantes humanizadas de las mismas; cinco o más de las CDR de 313R11,313R12, 313R14 o 313R19, o variantes humanizadas de las mismas; o las seis CDR de 313R11,313R12, 313R14 o 313R19, o variantes humanizadas de las mismas.

Tab la 1

[0132] En ciertos casos, la descripción proporciona un agente de unión a TIGIT (p. ej., un anticuerpo) que se une específicamente a TIGIT, en donde el agente de unión a TIGIT comprende una cadena pesada CDR1 que comprende GSSLSSSYMS (SEQ ID NO: 7) o GFSLSSSYMS (SEQ ID NO: 13), una CDR2 de cadena pesada que comprende IIGSNGNTYYANWAKG (SEQ ID NO: 8), y una CDR3 de cadena pesada que comprende GGYRTSGMDP (SEQ ID NO: 9). En algunos casos, el agente de unión a TIGIT comprende además una CDR1 de cadena ligera que comprende QASQSISSYLNW (SEQ ID NO: 10), QASQSNIYSDLAW (SEQ ID NO: 14) o QASQNIYSDLAW (SEQ ID NO: 81), una CDR2 de cadena ligera que comprende DALKLAS (SEQ ID NO: 11) o RASTLAS (SEQ ID NO: 15), y una Cd R3 de cadena ligera que comprende QQEHSVGNVDN (SEQ ID NO: 12) o QQEHLVAWIYN (SEQ ID NO: 16). En algunos casos, el agente de unión a TIGIT comprende una CDR1 de cadena ligera que comprende QASQSISSYLNW (SEQ ID NO: 10), QASQSNIYSDLAW (SEQ ID NO: 14) o QASQNIYSDLAW (SEQ ID NO: 81), una CDR2 de cadena ligera que comprende DALKLAS (SeQ ID NO: 11) o RASTLAS (SEQ ID NO: 15), y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQEHSVGNVDN (SEQ ID NO: 12) o QQEHLVAWIYN (SEQ ID NO: 16). En algunos casos, el agente de unión a TIGIT comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende GSSLSSSYMS (SEQ ID NO: 7) o GFSLSSSYMS (SEQ ID NO: 13), una CDR2 de cadena pesada que comprende IIGSNGNTYYANWAKG (SEQ ID NO: 8), y una CDR3 de cadena pesada que comprende GGYRTSGMDP (SEQ ID NO: 9) y (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende QASQSISSYLNW (SEQ ID NO: 10), QASQSNIYSDLAW (SEQ ID NO: 14) o QASQNIYSDLAW (SEQ ID NO: 81), una CDR2 de cadena ligera que comprende DALKLAS (SEQ ID NO: 11) o RASTLAS (SEQ ID NO: 15), y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQEHSVGNVDN (SEQ ID NO: 12) o QQEHLVAWIYN (SEQ ID NO: 16). En algunos casos, el agente de unión a TIGIT comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende GSSLSSSYMS (SEQ ID NO: 7), una CDR2 de cadena pesada que comprende IIGSNGNTYYANWAKG (SEQ ID NO: 8) y una CDR3 de cadena pesada que comprende GGYRTSGMDP (SEQ ID NO: 9) y (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende QASQSISSYLNW (SEQ ID NO: 10), una CDR2 de cadena ligera que comprende DALKLAS (SEQ ID NO: 11) y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQEHSVGNVDN (SEQ ID NO: 12). En algunos casos, el agente de unión a TIGIT comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende GFSLSSSYMS (SEQ ID NO: 13), una CDR2 de cadena pesada que comprende IIGSNGNTYYANWAKG (SEQ ID NO: 8) y una CDR3 de cadena pesada que comprende GGYRTSGMDP (SEQ ID NO: 9) y (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende QASQSNIYSDLAW (SEQ ID NO: 14), una CDR2 de cadena ligera que comprende RASTLAS (SEQ iD NO: 15) y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQEHLVAWIYN (SEQ ID NO: 16). En algunos casos, el agente de unión a TIGIT comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende GFSLSSSYMS (SEQ ID NO: 13), una CDR2 de cadena pesada que comprende IIGSNGNTYYANWAKG (SEQ ID NO: 8) y una CDR3 de cadena pesada que comprende GGy Rt SGm Dp (SEQ ID NO: 9) y (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende QASQNIYSDLAW (SeQ ID NO: 81), una CDR2 de cadena ligera que comprende RASTLAS (SEQ iD NO: 15) y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQEHLVAWIYN (SEQ ID NO: 16).

[0133] En ciertos casos, la descripción proporciona un agente de unión a TIGIT (p. ej., un anticuerpo) que se une específicamente a TIGIT humano, en donde el agente de unión a TIGIT comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende GSSLSSSYMS (SEQ ID NO: 7), GFSLSSSYMS (SEQ ID NO: 13), o una variante de los mismos que comprende 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos; (b) una CDR2 de cadena pesada que comprende IIGSNGNTYYANWAKG (SEQ ID NO: 8), o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos; (c) una CDR3 de cadena pesada que comprende GGYRTSGMDP (SEQ ID NO: 9), o una variante de la misma que comprende sustituciones de 1, 2, 3 o 4 aminoácidos; (d) una CDR1 de cadena ligera que comprende QASQSISSYLNW (SEQ ID NO: 10), QASQSNIYSDLAW (SEQ ID NO: 14), QASQNIYSDLAW (SEQ ID NO: 81), o una variante de las mismas que comprende 1,2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos; (e) una CDR2 de cadena ligera que comprende DALKLAS (SeQ ID NO: 11), RASTLAS (SEQ ID NO: 15), o una variante de las mismas que comprende 1,2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos; y (f) una CDR3 de cadena ligera que comprende QQEHSVGNVDN (SEQ ID NO: 12), QQEHLVAWIYN (SEQ ID NO: 16), o una variante de las mismas que comprende 1,2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos. En ciertos casos, las sustituciones de aminoácidos son sustituciones conservadoras. En algunos casos, las sustituciones se realizan como parte de un proceso de humanización. En algunos casos, las sustituciones se realizan como parte de un proceso de humanización de la línea germinal.

[0134] En ciertos casos, la descripción proporciona un agente de unión a TIGIT (p. ej., un anticuerpo) que se une específicamente a TIGIT, en donde el agente de unión a TIGIT comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 32 y/o una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 20. En ciertos casos, el agente de unión a TIGIT comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 97% o al menos aproximadamente un 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 17. En ciertos casos, el agente de unión a TIGIT comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 97% o al menos aproximadamente un 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 19. En ciertos casos, el agente de unión a TIGIT comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 97% o al menos aproximadamente un 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 32. En ciertos casos, el agente de unión a TIGIT comprende una región variable de cadena ligera que tiene al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 97% o al menos aproximadamente un 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 18. En ciertos casos, el agente de unión a TIGIT comprende una región variable de cadena ligera que tiene al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 97% o al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 20. En ciertos casos, el agente de unión a TIGIT comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos aproximadamente un 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 32 y/o una región variable de cadena ligera que tiene al menos aproximadamente un 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 20. En ciertos casos, el agente de unión a TIGIT comprende una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 32 y/o una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 20. En ciertos casos, el agente de unión a TIGIT comprende una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 32 y una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 20. En ciertos casos, el agente de unión a TIGIT comprende una región variable de cadena pesada que consta esencialmente de SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 32 y una región variable de cadena ligera que consta esencialmente de SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 20. En ciertos casos, el agente de unión a TIGIT comprende una región variable de cadena pesada que consta de SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 32 y una región variable de cadena ligera que consta de SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 20.

[0135] En ciertos casos, el agente de unión a TIGIT comprende una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 17 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 18. En ciertos casos, el agente de unión a TIGIT comprende de una región variable de cadena pesada que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 17 y una región variable de cadena ligera que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 18. En ciertos casos, el agente de unión a TIGIT comprende una región variable de cadena pesada que consiste en SEQ ID NO: 17 y una región de cadena ligera variable que consiste en SEQ ID NO: 18.

[0136] En ciertos casos, el agente de unión a TIGIT comprende una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 19 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 20. En ciertos casos, el agente de unión a TIGIT comprende una región variable de cadena pesada que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 19 y una región variable de cadena ligera que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 20. En ciertos casos, el agente de unión a TIGIT comprende una región variable de cadena pesada que consta de SEQ ID NO: 19 y una región variable de cadena ligera que consta de SEQ ID NO: 20.

[0137] En ciertos casos, el agente de unión a TIGIT comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 32 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 20. En ciertos casos, el agente de unión a TIGIT comprende una región variable de cadena pesada que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 32 y una región variable de cadena ligera que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 20. En ciertos casos, el agente de unión a TIGIT comprende una región variable de cadena pesada que consta de SEQ ID NO: 32 y una región variable de cadena ligera que consta de SEQ ID NO: 20.

[0138] En ciertos casos, la invención proporciona un agente de unión a TIGIT (p. ej., un anticuerpo) que se une específicamente a TIGIT, en donde el agente de unión a TIGIT comprende: (a) una cadena pesada que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 56; y/o (b) una cadena ligera que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 30. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT comprende: (a) una cadena pesada que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 34, o SEQ ID NO: 56; y/o (b) una cadena ligera que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 30. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT comprende una cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 26 y/o una cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 28. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT comprende una cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 27 y/o una cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 28. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT comprende una cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 29 y/o una cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 30. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT comprende una cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 34 y/o una cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 30. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT comprende una cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 56 y/o una cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 30. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT comprende una cadena pesada que consta esencialmente de SEQ ID NO: 26 o SEQ ID NO: 27, y una cadena ligera que consta esencialmente de SEQ ID NO: 28. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT comprende una cadena pesada que consta esencialmente de SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 56 y una cadena ligera que consta esencialmente de SEQ ID NO: 30. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT comprende una cadena pesada que consta de SEQ ID NO: 26 y una cadena ligera que consta de SEQ ID NO: 28. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT comprende una cadena pesada que consta de SEQ ID NO: 27 y una cadena ligera que consta de SEQ ID NO: 28. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT comprende una cadena pesada que consta de SEQ ID NO: 29 y una cadena ligera que consta de SEQ ID NO: 30. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT comprende una cadena pesada que consta de SEQ ID NO: 34 y una cadena ligera que consta de SEQ ID NO: 30. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT comprende una cadena pesada que consta de SEQ ID NO: 56 y una cadena ligera que consta de SEQ ID NO: 30.

[0139] En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT comprende la región variable de la cadena pesada y ligera de la región variable de la cadena del anticuerpo 313R11. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT comprende las regiones variables del anticuerpo 313R11 en las que la región variable de la cadena pesada y/o la región variable de la cadena ligera del anticuerpo 313R11 han madurado por afinidad. En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT comprende la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo 313R11 (con o sin la secuencia líder). En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT es el anticuerpo 313R11. En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT comprende la región variable de la cadena pesada y/o la región variable de la cadena ligera del anticuerpo 313R11 en donde la región variable de la cadena pesada y/o la región variable de la cadena ligera se han humanizado. En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT comprende la región variable de la cadena pesada y/o la región variable de la cadena ligera del anticuerpo 313R11 en una forma humanizada. En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT comprende la región variable de la cadena pesada del anticuerpo 313R11 como parte de una cadena pesada de IgG 1, IgG2 o IgG4.

[0140] En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT comprende, consiste esencialmente en, o consiste en el anticuerpo 313R11. En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una variante del anticuerpo 313R11.

[0141] En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT comprende la región variable de la cadena pesada y ligera de la región variable de la cadena del anticuerpo 313R12. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT comprende las regiones variables del anticuerpo 313R12 en las que la región variable de la cadena pesada y/o la región variable de la cadena ligera del anticuerpo 313R12 han madurado por afinidad. En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT comprende la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo 313R12 (con o sin la secuencia líder). En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT es el anticuerpo 313R12. En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT comprende la región variable de la cadena pesada y/o la región variable de la cadena ligera del anticuerpo 313R12 en donde la región variable de la cadena pesada y/o la región variable de la cadena ligera se han humanizado. En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT comprende la región variable de la cadena pesada y/o la región variable de la cadena ligera del anticuerpo 313R12 en una forma humanizada. En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT comprende la región variable de la cadena pesada del anticuerpo 313R12 como parte de una cadena pesada de IgG 1, IgG2 o IgG4.

[0142] En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT comprende, consiste esencialmente en, o consiste en el anticuerpo 313R12. En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una variante del anticuerpo 313R12.

[0143] En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT comprende la región variable de la cadena pesada y ligera de la región variable de la cadena del anticuerpo 313R14. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT comprende las regiones variables del anticuerpo 313R14 en las que la región variable de la cadena pesada y/o la región variable de la cadena ligera del anticuerpo 313R14 han madurado por afinidad. En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT comprende la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo 313R14 (con o sin la secuencia líder). En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT es el anticuerpo 313R14. En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT comprende la región variable de la cadena pesada y/o la región variable de la cadena ligera del anticuerpo 313R14 en donde la región variable de la cadena pesada y/o la región variable de la cadena ligera se han humanizado. En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT comprende la región variable de la cadena pesada y/o la región variable de la cadena ligera del anticuerpo 313R14 en una forma humanizada. En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT comprende la región variable de la cadena pesada del anticuerpo 313R14 como parte de una cadena pesada de IgG1, IgG2 o IgG4.

[0144] En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT comprende, consiste esencialmente en, o consiste en el anticuerpo 313R14. En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una variante del anticuerpo 313R14.

[0145] En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT comprende la región variable de la cadena pesada y ligera de la región variable de la cadena del anticuerpo 313R19. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT comprende las regiones variables del anticuerpo 313R19 en las que la región variable de la cadena pesada y/o la región variable de la cadena ligera del anticuerpo 313R19 han madurado por afinidad. En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT comprende la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo 313R19 (con o sin la secuencia líder). En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT es el anticuerpo 313R19. En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT comprende la región variable de la cadena pesada y/o la región variable de la cadena ligera del anticuerpo 313R19 en donde la región variable de la cadena pesada y/o la región variable de la cadena ligera se han humanizado. En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT comprende la región variable de la cadena pesada y/o la región variable de la cadena ligera del anticuerpo 313R19 en una forma humanizada. En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT comprende la región variable de la cadena pesada del anticuerpo 313R19 como parte de una cadena pesada de IgG1, IgG2 o IgG4.

[0146] En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT comprende, consiste esencialmente en, o consiste en el anticuerpo 313R19. En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una variante del anticuerpo 313R19.

[0147] En algunos casos, el agente de unión a TIGIT comprende una región variable de cadena pesada codificada por el plásmido depositado en la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, EE. UU, bajo las condiciones del Tratado de Budapest de 27 de mayo de 2015 y designado PTA-122180. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT comprende una región variable de cadena ligera codificada por el plásmido depositado en ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA, EE. UU, bajo las condiciones del Tratado de Budapest de 27 de mayo de 2015, y designado como PTA-122181. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT comprende una región variable de cadena pesada codificada por el plásmido depositado con ATCC y denominada PTA-122180 y una región variable de cadena ligera codificada por el plásmido depositado con ATCC y denominada PTA-122181. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT comprende una cadena pesada que comprende la región variable de la cadena pesada codificada por el plásmido depositado con ATCC y designado PTA-122180. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT comprende una cadena ligera que comprende la región variable de la cadena ligera codificada por el plásmido depositado con ATCC y designado PTA-122181. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT comprende una cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada codificada por el plásmido depositado con ATCC y designado PTA-122180 y una cadena ligera que comprende la región variable de cadena ligera codificada por el plásmido depositado con ATCC y designado PTA-122181.

[0148] La invención proporciona un anticuerpo que se une específicamente a TIGIT humano, en donde el anticuerpo comprende seis de los CDR de anticuerpo 313M26 o 313M32 (véase la Tabla 2).

Tabla 2

[0149] La invención proporciona un anticuerpo que se une específicamente a TIGIT humano que comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende TSDYAWN (SEQ ID NO: 57), una CDR2 de cadena pesada que comprende YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 58), y una CDR3 de cadena pesada que comprende ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 59); y (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende KASq Dv STAv A (SEQ ID NO: 60), una CDR2 de cadena ligera que comprende SASYRYT (SEQ ID NO: 61) y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQHYSTP (SEQ ID NO: 62).

[0150] En ciertos casos, la descripción proporciona un agente de unión a TIGIT (p. ej., un anticuerpo) que se une específicamente a TIGIT humano, en donde el agente de unión a TIGIT comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende TSDYAWN (SEQ ID NO: 57) o una variante del mismo que comprende 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos; (b) una CDR2 de cadena pesada que comprende YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 58) o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos; (c) una CDR3 de cadena pesada que comprende ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 59) o una variante de la misma que comprende sustituciones de 1, 2, 3 o 4 aminoácidos; (d) una CDR1 de cadena ligera que comprende KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 60) o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos; (e) una CDR2 de cadena ligera que comprende SASYRYT (SEQ ID NO: 61) o una variante de la misma que comprende 1,2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos; y (f) una CDR3 de cadena ligera que comprende QQHYSTP (SEQ ID NO: 62) o una variante de la misma que comprende 1, 2, 3 o 4 sustituciones de aminoácidos. En ciertos casos, las sustituciones de aminoácidos son sustituciones conservadoras. En algunos casos, las sustituciones se realizan como parte de un proceso de humanización. En algunos casos, las sustituciones se realizan como parte de un proceso de humanización de la línea germinal. En algunos casos, las sustituciones se realizan como parte de un proceso de optimización de enlace.

[0151] En ciertas formas de realización, la invención proporciona un anticuerpo que se une específicamente a TIGIT humano, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 63 o SEQ ID NO: 67 y/o una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 64 o SEQ ID NO: 68. En ciertas formas de realización, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 97% o al menos aproximadamente un 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 63. En ciertas formas de realización, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 97% o al menos aproximadamente un 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 67. En ciertas formas de realización, el anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera que tiene al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 97% o al menos aproximadamente un 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 64. En determinadas formas de realización, el anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera que tiene al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 97% o al menos aproximadamente un 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 68. En determinadas formas de realización, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos aproximadamente un 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 63 o SEQ ID NO: 67 y/o una región variable de cadena ligera que tiene al menos aproximadamente un 95% de identidad de secuencia con SEQ. ID NO: 64 o SEQ ID NO: 68. En determinadas formas de realización, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 63 o SEQ ID NO: 67 y/o una región variable de cadena ligera que comprende s Eq ID n O: 64 o SEQ ID NO: 68. En determinadas formas de realización, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 63 o SEQ ID NO: 67 y una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 64 o SEQ ID NO: 68. En determinadas formas de realización, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que consta esencialmente de SEQ ID NO: 63 o SEQ ID NO: 67 y una región variable de cadena ligera que consta esencialmente de SEQ ID NO: 64 o SEQ ID NO: 68. En determinadas formas de realización, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que consta de SEQ ID NO: 63 o SEQ ID NO: 67 y una región variable de cadena ligera que consta de SEQ ID NO: 64 o SEQ ID NO: 68.

[0152] En ciertas formas de realización, el anticuerpo comprende una región de cadena pesada variable que comprende la SEQ ID NO: 63 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 64. En ciertas formas de realización, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 63 y una región variable de cadena ligera que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 64. En determinadas formas de realización, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que consta de SEQ ID NO: 63 y una región variable de cadena ligera que consta de SEQ ID NO: 64.

[0153] En ciertas formas de realización, el anticuerpo comprende una región de cadena pesada variable que comprende la SEQ ID NO: 67 y una región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 68. En determinadas formas de realización, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 67 y una región variable de cadena ligera que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 68. En determinadas formas de realización, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que consta de SEQ ID NO: 67 y una región variable de cadena ligera que consta de SEQ ID NO: 68.

[0154] En ciertas formas de realización, la invención proporciona un anticuerpo (p. ej., un anticuerpo) que se une específicamente a TIGIT, en donde anticuerpo comprende: una cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 70 y/o una cadena ligera que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 72. En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende: una cadena pesada que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 70 y/o una cadena ligera que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 72. En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 70 y/o una cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 72. En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende una cadena pesada que consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 70 y una cadena ligera que consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 72. En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende una cadena pesada que consta de SEQ ID NO: 70 y una cadena ligera que consta de SEQ ID NO: 72.

[0155] En ciertas formas de realización, la invención proporciona un anticuerpo (p. ej., un anticuerpo) que se une específicamente a TIGIT, en donde anticuerpo comprende: una cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 82 y/o una cadena ligera que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 72. En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende: una cadena pesada que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 82 y/o una cadena ligera que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 72. En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 82 y/o una cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 72. En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende una cadena pesada que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 82 y una cadena ligera que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 72. En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende una cadena pesada que consta de SEQ ID NO: 82 y una cadena ligera que consta de SEQ ID NO: 72.

[0156] En ciertas formas de realización, un anticuerpo comprende la región variable de la cadena pesada y ligera de la región variable de la cadena del anticuerpo 313M26. En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende las regiones variables del anticuerpo 313M26 en las que la región variable de la cadena pesada y/o la región variable de la cadena ligera del anticuerpo 313M26 han madurado por afinidad. En determinadas formas de realización, un anticuerpo comprende la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo 313M26 (con o sin la secuencia líder). En determinadas formas de realización, un anticuerpo es el anticuerpo 313M26. En determinadas formas de realización, un anticuerpo comprende la región variable de la cadena pesada y/o la región variable de la cadena ligera del anticuerpo 313M26 en donde la región variable de la cadena pesada y/o la región variable de la cadena ligera se ha humanizado. En determinadas formas de realización, un anticuerpo comprende la región variable de la cadena pesada y/o la región variable de la cadena ligera del anticuerpo 313M26 en una forma humanizada. En determinadas formas de realización, un anticuerpo comprende la región variable de cadena pesada del anticuerpo 313M26 como parte de una cadena pesada de IgG1, IgG2 o IgG4.

[0157] En ciertas formas de realización, un anticuerpo comprende, consiste esencialmente en, o consiste en el anticuerpo 313M26. En determinadas formas de realización, un anticuerpo comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una variante del anticuerpo 313M26.

[0158] En ciertas formas de realización, un anticuerpo comprende la región variable de la cadena pesada y ligera de la región variable de la cadena del anticuerpo 313M32. En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende las regiones variables del anticuerpo 313M32 en las que la región variable de la cadena pesada y/o la región variable de la cadena ligera del anticuerpo 313M32 han madurado por afinidad. En determinadas formas de realización, un anticuerpo comprende la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo 313M32 (con o sin la secuencia líder). En determinadas formas de realización, un anticuerpo es el anticuerpo 313M32. En determinadas formas de realización, un anticuerpo comprende la región variable de cadena pesada del anticuerpo 313M32 como parte de una cadena pesada de IgG1, IgG2 o IgG4. En determinadas formas de realización, un anticuerpo comprende la región variable de cadena pesada del anticuerpo 313M32 como parte de una cadena pesada de IgG1 humana. En determinadas formas de realización, un anticuerpo comprende la región variable de cadena pesada del anticuerpo 313M32 como parte de una cadena pesada de IgG2 humana. En determinadas formas de realización, un anticuerpo comprende la región variable de la cadena pesada del anticuerpo 313M32 como parte de una cadena pesada de IgG4 humana. En determinadas formas de realización, un anticuerpo que comprende la región variable de la cadena pesada del anticuerpo 313M32 como parte de una cadena pesada de IgG4 humana se denomina anticuerpo 313M33.

[0159] En ciertas formas de realización, un anticuerpo comprende, consiste esencialmente en, o consiste en el anticuerpo 313M32. En determinadas formas de realización, un anticuerpo comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una variante del anticuerpo 313M32.

[0160] En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada codificada por el plásmido depositado en la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, EE. UU, bajo las condiciones del Tratado de Budapest el 11 de agosto, 2015 y designado PTA-122346. En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera codificada por el plásmido depositado en ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA, EE. UU, bajo las condiciones del Tratado de Budapest el 11 de agosto de 2015, y designado PTA-122347. En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada codificada por el plásmido depositado con ATCC y designado PTA-122346 y una región variable de cadena ligera codificada por el plásmido depositado con ATCC y designado PTA-122347. En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende una región variable codificada por el plásmido depositado con ATCC y designado PTA-122346. En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende una cadena ligera codificada por el plásmido depositado con ATCC y designado PTA-122347. En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende una región variable codificada por el plásmido depositado con ATCC y designado PTA-122346 y una cadena ligera codificada por el plásmido depositado con ATCC y designado PTA-122347.

[0161] Esta divulgación también abarca agentes/moléculas homodiméricas y agentes/moléculas homodiméricas. En algunos casos, los agentes homodiméricos son polipéptidos. En algunos casos, las moléculas heterodiméricas son polipéptidos. Generalmente, la molécula homodimérica comprende dos polipéptidos idénticos. Generalmente, la molécula heterodimérica comprende al menos dos polipéptidos diferentes. En algunos casos, la molécula heterodimérica es capaz de unirse al menos a dos dianas, por ejemplo, un agente biespecífico. Los objetivos pueden ser, por ejemplo, dos proteínas diferentes en una sola célula o dos proteínas diferentes en dos células separadas. El término "brazo" puede usarse en el presente documento para describir la estructura de un agente homodimérico, un agente heterodimérico y/o un agente biespecífico. En algunos casos, cada brazo comprende al menos un polipéptido. Generalmente, cada brazo de una molécula heterodimérica tiene una función diferente, por ejemplo, unir dos dianas diferentes. En algunos casos, un brazo puede comprender un sitio de unión a antígeno de un anticuerpo. En algunos casos, un brazo puede comprender una porción de unión de un receptor. En algunos casos, un brazo puede comprender un ligando. En algunos casos, un brazo puede comprender una región de unión de un ligando. En algunos casos, un agente homodimérico comprende dos brazos idénticos. En algunos casos, un agente heterodimérico comprende dos brazos diferentes. En algunos casos, un agente biespecífico comprende dos brazos diferentes.

[0162] En algunos casos, la descripción proporciona un agente de unión a TIGIT que es una molécula homodimérica. En algunos casos, la molécula homodimérica comprende dos polipéptidos idénticos. En algunos casos, la divulgación proporciona un agente de unión a TIGIT que es una molécula heterodimérica. En algunos casos, la molécula heterodimérica comprende al menos dos polipéptidos diferentes. En algunos casos, la divulgación proporciona un agente de unión a TIGIT que es un agente heterodimérico. En algunos casos, la divulgación proporciona un agente de unión a TIGIT que es un agente biespecífico. En ciertos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico.

[0163] En algunos casos, un agente heterodimérico (p. ej., un agente biespecífico) comprende un agente de unión a TIGIT descrito en este documento. En ciertos casos, un agente heterodimérico comprende un agente estimulante de la respuesta inmunitaria o un fragmento funcional del mismo. En algunos casos, una molécula heterodimérica comprende al menos dos funciones (i) que se unen a TIGIT y (ii) se unen a una segunda diana. En algunos casos, un agente heterodimérico comprende al menos dos funciones, (i) se unen a TIGIT y (ii) una función "no vinculante". En ciertos casos, una molécula heterodimérica comprende un segundo agente inmunoterapéutico o un fragmento funcional del mismo. En algunos casos, un brazo de la molécula heterodimérica comprende un agente de unión a TIGIT descrito en este documento y un brazo de la molécula heterodimérica comprende un segundo agente inmunoterapéutico. En algunos casos, un brazo del agente heterodimérico comprende un agente de unión a TIGIT descrito en el presente documento y un brazo del agente heterodimérico comprende un agente estimulante de la respuesta inmunitaria. Como se usa en este documento, la frase "agente estimulante de la respuesta inmunitaria" se usa en el sentido más amplio y se refiere a una sustancia que estimula directa o indirectamente el sistema inmunitario induciendo la activación o aumentando la actividad de cualquiera de los componentes del sistema inmunitario. Por ejemplo, los agentes estimulantes de la respuesta inmunitaria pueden incluir citocinas, así como varios antígenos, incluidos antígenos tumorales y antígenos derivados de patógenos. En algunos casos, el segundo agente inmunoterapéutico (p. ej., un agente estimulante de la respuesta inmunitaria) incluye, pero no se limita a un factor estimulante de colonias (p. ej., factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor de células madre (SCF), una interleucina (p. ej., IL-1, IL2, IL-3, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18), una citocina (p. ej., Gammainterferón), un anticuerpo que bloquea las funciones inmunosupresoras (p. ej., un anticuerpo anti-CTLA4, un anticuerpo antiCD28, un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-Ll), un receptor similar (p. ej., TLR4, TLR7, TLR9), o un miembro de la familia B7 (p. ej., CD80, CD86). En algunos casos, el agente inmunoterapéutico incluye, pero no se limita a un anticuerpo agonista (p. ej., un anticuerpo anti-GITR, un anticuerpo anti-OX40) o un ligando agonista (p. ej., GITRL u OX40L).

[0164] En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es una molécula heterodimérica (p. ej., un agente biespecífico) que comprende un primer dominio CH3 y un segundo dominio CH3, cada uno de los cuales está modificado para promover la formación de heteromultímeros. En algunos casos, los dominios CH3 primero y segundo se modifican usando una técnica de perillas en agujeros. En algunos casos, los dominios CH3 primero y segundo comprenden cambios en los aminoácidos que dan como resultado interacciones electrostáticas alteradas. En algunos casos, los dominios CH3 primero y segundo comprenden cambios en los aminoácidos que dan como resultado interacciones hidrofóbicas/h id rofíl icas alteradas.

[0165] En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un agente biespecífico que comprende regiones constantes de cadena pesada seleccionadas del grupo que consiste en: (a) una primera región constante de IgG 1 humana, en donde los aminoácidos correspondientes a las posiciones 253 y 292 de IgG1 (SEQ ID NO: 41) se reemplazan con glutamato o aspartato, y una segunda región constante de IgG 1 humana, en donde los aminoácidos correspondientes a las posiciones 240 y 282 de IgG 1 (SEQ ID NO: 41) se reemplazan con lisina; (b) una primera región constante de IgG2 humana, en donde los aminoácidos correspondientes a las posiciones 249 y 288 de IgG2 (SEQ ID NO: 42) se reemplazan con glutamato o aspartato, y una segunda región constante de IgG2 humana en donde los aminoácidos correspondientes a las posiciones 236 y 278 de IgG2 (SEQ ID NO: 42) se reemplazan con lisina; (c) una primera región constante de IgG3 humana, en donde los aminoácidos correspondientes a las posiciones 300 y 339 de IgG3 (SEQ ID NO: 43) se reemplazan con glutamato o aspartato, y una segunda región constante de IgG3 humana en donde los aminoácidos correspondientes a las posiciones 287 y 329 de IgG3 (SEQ ID NO: 43) se reemplazan con lisina; y (d) una primera región constante de IgG4 humana, en donde los aminoácidos correspondientes a las posiciones 250 y 289 de IgG4 (SEQ ID NO: 44) se reemplazan con glutamato o aspartato, y una segunda región constante de IgG4 en donde los aminoácidos correspondientes a las posiciones 237 y 279 de IgG4 (SEQ ID NO: 44) se reemplazan con lisina.

[0166] En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un agente biespecífico que comprende una primera región constante de IgG 1 humana con sustituciones de aminoácidos en posiciones correspondientes a las posiciones 253 y 292 de IgG 1 (SEQ ID NO: 41), en donde los aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 253 y 292 de IgG1 (SEQ ID NO: 41) se reemplazan con glutamato o aspartato, y una segunda región constante de IgG1 humana con sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 240 y 282 de IgG 1 (SEQ ID NO: 41), en donde los aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 240 y 282 de IgG1 (SEQ ID NO: 41) se reemplazan con lisina. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una primera región constante de IgG2 humana con sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 249 y 288 de IgG2 (SEQ ID NO: 42), donde los aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 249 y 288 de IgG2 (SEQ ID NO: 42) se reemplazan con glutamato o aspartato, y una segunda región constante de IgG2 humana con sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 236 y 278 de IgG2 (SEQ ID NO: 42), en donde los aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 236 y 278 de IgG2 (SEQ ID NO: 42) se reemplazan con lisina. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una primera región constante de IgG3 humana con sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 300 y 339 de IgG3 (SEQ ID NO: 43), donde los aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 300 y 339 de IgG3 (SEQ ID NO: 43) se reemplazan con glutamato o aspartato, y una segunda región constante de IgG3 humana con sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 287 y 329 de IgG3 (SEQ ID NO: 43), donde los aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 287 y 329 de IgG3 (SEQ ID NO: 43) se reemplazan con lisina. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una primera región constante de IgG4 humana con sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 250 y 289 de IgG4 (SEQ ID NO: 44), donde los aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 250 y 289 de IgG4 (SEQ ID NO: 44) se reemplazan con glutamato o aspartato, y una segunda región constante de IgG4 humana con sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 237 y 279 de IgG4 (SEQ ID NO: 44), en donde los aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 237 y 279 de IgG4 (SEQ ID NO: 44) se reemplazan con lisina.

[0167] En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un agente biespecífico que comprende una primera región constante de IgG1 humana con sustituciones de aminoácidos en posiciones correspondientes a las posiciones 253 y 292 de IgG1 (SEQ ID NO: 41), en donde los aminoácidos se reemplazan con glutamato, y una segunda región constante de IgG1 humana con sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 240 y 282 de IgG 1 (SEQ ID NO: 41), donde los aminoácidos se reemplazan con lisina. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una primera región constante de IgG1 humana con sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 253 y 292 de IgG 1 (SEQ ID NO: 41), donde los aminoácidos se reemplazan con aspartato y una segunda región constante de IgG1 humana con sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 240 y 282 de IgG 1 (SEQ ID NO: 41) , en donde los aminoácidos se reemplazan con lisina.

[0168] En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un agente biespecífico que comprende una primera región constante de IgG2 humana con sustituciones de aminoácidos en posiciones correspondientes a las posiciones 249 y 288 de IgG2 (SEQ ID NO: 42), en donde los aminoácidos se reemplazan con glutamato y una segunda región constante de IgG2 humana con sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 236 y 278 de IgG2 (SEQ ID NO: 42), en donde los aminoácidos se reemplazan con lisina. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una primera región constante de IgG2 humana con sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 249 y 288 de IgG2 (SEQ ID NO: 42) , donde los aminoácidos se reemplazan con aspartato y una segunda región constante de IgG2 humana con sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 236 y 278 de IgG2 (SEQ ID NO: 42), en donde los aminoácidos se reemplazan con lisina.

[0169] En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un agente biespecífico que comprende una región constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 45. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una región constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 46. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una región constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 47. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una región constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 48. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una primera región constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 45 y una segunda región constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 46. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una primera región constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 47 y una segunda región constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 48.

[0170] En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un agente biespecífico que comprende una región constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 49. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una región constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 50. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una región constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 51. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una región constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 52. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una primera región constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 49 y una segunda región constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 50. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una primera región constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 51 y una segunda región constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 52.

[0171] En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIGIT humano. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIGIT humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une a una segunda diana. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende: un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIGIT humano, en donde el primer sitio de unión a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende GSSLSSSYMS (SEQ iD NO: 7) o GFSLSSSYMS (SEQ ID NO: 13), una CDR2 de cadena pesada que comprende IIGSNGNTYYa Nw AKG (SEQ ID NO: 8) y una c Dr 3 de cadena pesada que comprende GGYRTSGMDP (SEQ ID NO: 9). En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende: un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIGIT humano, en donde el primer sitio de unión a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende GSSLSSSYMS (SEQ ID NO: 7), una CDR2 de cadena pesada que comprende IIGSNGNTYYANWAKG (SEQ ID NO: 8) y una CDR3 de cadena pesada que comprende GGYRTSGMDP (SEQ ID NO: 9). En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende: un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIGIT humano, en donde el primer sitio de unión a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende GFSLSSSYMS (SEQ ID NO: 13), una CDR2 de cadena pesada que comprende IIGSNGNTYYANWAKG (SEQ ID NO: 8) y una CDR3 de cadena pesada que comprende GGYRTSGMDP (SEQ ID NO: 9). En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende: un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIGIT humano, en donde el primer sitio de unión a antígeno comprende (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende GSSLSSSYMS (SEQ ID NO: 7) o GFSLSSSYMS (SEQ ID NO: 13), una CDR2 de cadena pesada que comprende IIGSNGNTYYANWAKG (SEQ ID NO: 8), y una CDR3 de cadena pesada que comprende GGYRTSGMDP (SEQ ID NO: 9), y (b) un segundo sitio de unión al antígeno, donde el primer sitio de unión al antígeno y el segundo sitio de unión al antígeno comprenden una cadena ligera común (es decir, idéntica). En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende: un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIGIT humano, en donde el primer sitio de unión a antígeno comprende (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende GSSLSSSYMS (SEQ ID NO: 7) o GFSLSSSYMS (SEQ ID NO: 13), una CDR2 de cadena pesada que comprende IIGSNGNTYYANWAKG (SEQ iD NO: 8) y una CDR3 de cadena pesada que comprende GGYRTSGMDP (SEQ ID NO: 9), una CDR1 de cadena ligera que comprende QASQSISSYLNW (SEQ ID NO: 10), QASQSNIYSDLAW (SEQ ID NO: 14), o QASQNIYSDLAW (SEQ ID NO: 81), una CDR2 de cadena ligera que comprende DALKLAS (SEQ ID NO: 11) o RASTLAS (SEQ ID NO: 15), y una cadena ligera CDR3 que comprende QQEHSVGNVDN (SEQ ID NO: 12) o QQEHLVAWIYN (SEQ ID NO: 16) y (b) un segundo sitio de unión al antígeno. En algunos casos, el anticuerpo biespecífico comprende un primer sitio de unión al antígeno que comprende una CDR1 de cadena ligera que comprende QASQSISSYLNW (SEQ ID NO: 10), QASQSNIYSDLAW (SEQ ID NO: 14), o QASQNIYSDLAW (SEQ ID NO: 81), una CDR2 de cadena ligera que comprende DALKLAS (SEQ ID NO: 11) o RASTLAS (SEQ ID NO: 15), y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQEHSVGNVDN (SEQ ID NO: 12) o QQEHLVAWIYN (SEQ ID NO: 16).

[0172] En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una primera región variable de cadena pesada que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, o SEQ ID NO: 32. En ciertos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una primera región variable de cadena pesada que tiene al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 97% o al menos aproximadamente el 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 17, SEQ iD NO: 19 o SEQ ID NO: 32. En algunos casos, el anticuerpo biespecífico comprende una región variable de cadena ligera con al menos aproximadamente un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 18 o la SEQ ID NO: 20. En algunos casos, el anticuerpo biespecífico comprende una región variable de cadena ligera al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 97% o al menos aproximadamente el 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 20. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una primera región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 17. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una primera región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 19. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una primera región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 32. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una primera región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 18. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una primera región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 20.

[0173] En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una región variable de primera cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 17 y una primera región constante de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, o SEQ ID NO: 52. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una primera región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 19 y una primera región constante de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 o SEQ ID NO: 52. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una primera región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 32 y una primera región constante de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 o SEQ ID NO: 52.

[0174] En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIGIT humano. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIGIT humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une a una segunda diana. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende: un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIGIT humano, en donde el primer sitio de unión a antígeno comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende TSDYAWN (SEQ ID NO: 57), una CDR2 de cadena pesada que comprende YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 58) y una CDR3 de cadena pesada que comprende ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 59). En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende: un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIGIT humano, en donde el primer sitio de unión a antígeno comprende (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende TSDYAWN (SEQ ID NO: 57), una CDR2 de cadena pesada que comprende YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 58), y una CDR3 de cadena pesada que comprende ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 59); y (b) un segundo sitio de unión a antígeno, en donde el primer sitio de unión a antígeno y el segundo sitio de unión a antígeno comprenden una cadena ligera común (es decir, idéntica). En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende: un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TIGIT humano, en donde el primer sitio de unión a antígeno comprende (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende TSDYAWN (SEQ ID NO: 57), una CDR2 de cadena pesada que comprende YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 58), y una CDR3 de cadena pesada que comprende ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 59), una CDR1 de cadena ligera que comprende KASQDVSt Av A (SeQ ID NO: 60), una CDR2 de cadena ligera que comprende SASYRYT (SEQ ID NO: 61) y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQHYSTP (SEQ ID NO: 62); y (b) un segundo sitio de unión al antígeno. En algunos casos, el anticuerpo biespecífico comprende un primer sitio de unión al antígeno que comprende una CDR1 de cadena ligera que comprende KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 60), una CDR2 de cadena ligera que comprende SASYRYT (SEQ ID NO: 61) y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQHYSTP (SEQ ID NO: 62).

[0175] En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una primera región variable de cadena pesada que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 63 o SEQ ID NO: 67. En ciertos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una primera región variable de cadena pesada que tiene al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 97% o al menos aproximadamente un 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 63 o SEQ ID NO: 67. En algunos casos, el anticuerpo biespecífico comprende una región variable de cadena ligera con al menos aproximadamente un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 64 o SEQ ID NO: 68. En algunos casos, el anticuerpo biespecífico comprende una región variable de cadena ligera al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 97% o al menos aproximadamente el 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 64 o SEQ ID NO: 68. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una primera región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 63. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una primera región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 67. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una primera región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 64. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una primera región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 68.

[0176] En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una primera región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 63 y una primera región constante de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, o SEQ ID NO: 52. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una primera región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 67 y una primera región constante de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 o SEQ ID NO: 52.

[0177] En ciertos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a TIGIT humano y un segundo objetivo. En algunos casos, la segunda diana es un antígeno tumoral. En algunos casos, el anticuerpo biespecífico comprende un agente de unión a TIGIT descrito en el presente documento y un segundo polipéptido que comprende un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno tumoral. Puede usarse un anticuerpo biespecífico con una especificidad de unión para un antígeno tumoral para dirigir el agente de unión a TIGIT a un tumor. Esto puede ser útil para inducir y/o potenciar una respuesta inmunitaria cerca o dentro del microambiente tumoral. En algunos casos, se puede usar un anticuerpo biespecífico para inducir o mejorar la actividad de las células inmunes que se infiltran en el tumor. En algunos casos, se puede usar un anticuerpo biespecífico para inducir o mejorar la actividad de los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL). En algunos casos, se puede usar un anticuerpo biespecífico para inhibir o disminuir la actividad de las células Treg. En algunos casos, se puede usar un anticuerpo biespecífico para inhibir o disminuir la actividad de las MSDC.

[0178] En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico, en donde el primer objetivo es TIGIT y el segundo objetivo en una célula de respuesta inmunitaria. En algunos casos, el segundo objetivo está en una célula T, una célula NK, una célula B, un macrófago, una célula dendrítica o una célula mieloide. En algunos casos, el segundo objetivo es PD-1, PD-L1, CTLA4, TIM-3, LAG-3, GITR, OX-40, GITRL u OX-40L. En algunos casos, el segundo objetivo es CD28 o 4-1BB.

[0179] En algunos casos, un anticuerpo biespecífico comprende un primer brazo que comprende un agente de unión a TIGIT descrito en este documento y un segundo brazo que comprende un anticuerpo que se une específicamente PD-1. En algunos casos, un anticuerpo biespecífico comprende un primer brazo que comprende un agente de unión a TIGIT descrito en el presente documento y un segundo brazo que comprende un anticuerpo que se une específicamente a PD-L1. En algunos casos, un anticuerpo biespecífico comprende un primer brazo que comprende un agente de unión a TIGIT descrito en el presente documento y un segundo brazo que comprende un anticuerpo que se une específicamente a GITR. En algunos casos, un anticuerpo biespecífico comprende un primer brazo que comprende un agente de unión a TIGIT descrito en el presente documento y un segundo brazo que comprende un anticuerpo que se une específicamente a OX-40. En algunos casos, un anticuerpo biespecífico comprende un primer brazo que comprende un anticuerpo de unión a TIGIT descrito en el presente documento y un segundo brazo que comprende un anticuerpo que se une específicamente a CD40. En algunos casos, un anticuerpo biespecífico comprende un primer brazo que comprende un agente de unión a TIGIT descrito en el presente documento y un segundo brazo que comprende un anticuerpo que se une específicamente a CTLA4. En algunos casos, un anticuerpo biespecífico comprende un primer brazo que comprende un anticuerpo de unión a TIGIT descrito en el presente documento y un segundo brazo que comprende un anticuerpo que se une específicamente a CD28. En algunos casos, un anticuerpo biespecífico comprende un primer brazo que comprende un agente de unión a TIGIT descrito en el presente documento y un segundo brazo que comprende un anticuerpo que se une específicamente a GITRL. En algunos casos, un anticuerpo biespecífico comprende un primer brazo que comprende un agente de unión a TIGIT descrito en el presente documento y un segundo brazo que comprende un anticuerpo que se une específicamente a OX-40L.

[0180] En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-TIGIT 313R11. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-TIGIT 313R12. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-TIGIT 313R14. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-TIGIT 313R19 o 313R20. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una región variable de cadena ligera del anticuerpo anti-TIGIT 313R11 o 313R12. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una región variable de cadena ligera del anticuerpo anti-TIGIT 313R14, 313R19 o 313R20.

[0181] En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-TIGIT 313M26. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una región variable de cadena ligera del anticuerpo anti-TIGIT 313M26.

[0182] En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-TIGIT 313M32. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo biespecífico que comprende una región variable de cadena ligera del anticuerpo anti-TIGIT 313M32.

[0183] En algunos casos, un agente biespecífico comprende un primer brazo que comprende un agente de unión a TIGIT descrito en este documento y un segundo brazo que comprende un polipéptido que comprende GITRL que se une específicamente GITR. En algunos casos, el segundo brazo comprende un polipéptido que comprende al menos una copia del dominio extracelular de GITRL. En algunos casos, un agente biespecífico comprende un primer brazo que comprende un agente de unión a TIGIT descrito en el presente documento y un segundo brazo que comprende un polipéptido que comprende OX-40L que se une específicamente a OX-40. En algunos casos, el segundo brazo comprende un polipéptido que comprende al menos una copia del dominio extracelular de OX-40L. En algunos casos, un agente biespecífico comprende un primer brazo que comprende un agente de unión a TIGIT descrito en el presente documento y un segundo brazo que comprende un polipéptido que comprende CD40L que se une específicamente a CD40. En algunos casos, el segundo brazo comprende un polipéptido que comprende al menos una copia del dominio extracelular de CD40L. En algunos casos, un agente biespecífico comprende un primer brazo que comprende un agente de unión a TIGIT descrito en el presente documento y un segundo brazo que comprende un polipéptido que comprende el ligando 4-1BB que se une específicamente a 4-1BB. En algunos casos, el segundo brazo comprende un polipéptido que comprende en al menos una copia del dominio extracelular del ligando 4-1BB.

[0184] En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un agente biespecífico que se une a TIGIT con una K ^dde aproximadamente 50 nM o menos, aproximadamente 25 nM o menos, aproximadamente 10 nM o menos, aproximadamente 1 nM o menos, o aproximadamente 0,1 nM o menos. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un agente biespecífico que se une a una segunda diana con una K ^dde aproximadamente 50 nM o menos, aproximadamente 25 nM o menos, aproximadamente 10 nM o menos, aproximadamente 1 nM o menos, o aproximadamente 0,1 nM o menos. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un agente biespecífico que se une a TIGIT con una K ^dde aproximadamente 50 nM o menos y se une a una segunda diana con una K ^dde aproximadamente 50 nM o menos. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un agente biespecífico que se une a TIGIT con una K ^dde aproximadamente 25 nM o menos y se une a una segunda diana con una K ^dde aproximadamente 25 nM o menos. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un agente biespecífico que se une a TIGIT con una K ^dde aproximadamente 10 nM o menos y se une a una segunda diana con una K ^dde aproximadamente 10 nM o menos. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un agente biespecífico que se une a TIGIT con una K ^dde aproximadamente 1 nM o menos y se une a una segunda diana con una K ^dde aproximadamente 1 nM o menos.

[0185] En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un agente biespecífico que comprende un sitio de unión a antígeno con una afinidad de unión que es más débil que la afinidad de unión del segundo sitio de unión a antígeno. Por ejemplo, en algunos casos, el agente biespecífico puede unirse a TIGIT con una K ^den el intervalo de aproximadamente 0,1 nM a 1 nM y puede unirse a una segunda diana con una K ^den el intervalo de aproximadamente 1 nM a 10 nM. O el agente biespecífico puede unirse a TIGIT con una K^den el intervalo de aproximadamente 1 nM a 10 nM y puede unirse a una segunda diana con una K^den el intervalo de aproximadamente 0,1 nM a 1 nM. En algunos casos, el agente biespecífico puede unirse a TIGIT con una K^den el intervalo de aproximadamente 0,1 nM a 1 nM y puede unirse a una segunda diana con una K^den el intervalo de aproximadamente 1 nM a 10 nM. O el agente biespecífico puede unirse a TIGIT con una K^den el intervalo de aproximadamente 1 nM a 10 nM y puede unirse a una segunda diana con una K^den el intervalo de aproximadamente 0,1 nM a 1 nM. En algunos casos, la diferencia de afinidad entre los dos sitios de unión al antígeno puede ser aproximadamente 2 veces o más, aproximadamente 3 veces o más, aproximadamente 5 veces o más, aproximadamente 8 veces o más, aproximadamente 10 veces o más, aproximadamente 15 veces o más, aproximadamente 30 veces o más, aproximadamente 50 veces o más, o aproximadamente 100 veces o más. En algunos casos, al menos un residuo de aminoácido en al menos una CDR del sitio de unión al antígeno para TIGIT se sustituye con un aminoácido diferente de modo que se altera la afinidad del sitio de unión a TIGIT. En algunos casos, aumenta la afinidad del sitio de unión de TIGIT. En algunos casos, disminuye la afinidad del sitio de unión a TIGIT. En algunos casos, al menos un residuo de aminoácido en al menos una CDR del sitio de unión al antígeno para la segunda diana se sustituye por un aminoácido diferente de modo que se altera la afinidad del segundo sitio de unión al antígeno. En algunos casos, aumenta la afinidad del segundo sitio de unión al antígeno. En algunos casos, disminuye la afinidad del segundo sitio de unión al antígeno. En algunos casos, se alteran las afinidades tanto de TIGIT como del segundo sitio de unión al antígeno.

[0186] La descripción proporciona polipéptidos, incluyendo, pero no limitado a los anticuerpos que específicamente se unen a TIGIT. En algunos casos, un polipéptido se une a TIGIT humano. En algunas formas de realización, un polipéptido se une a TIGIT de ratón. En algunos casos, un polipéptido se une a TIGIT de ratón y TIGIT humano. En algunos casos, un polipéptido se une a TIGIT humano y no se une a TIGIT de ratón. En algunos casos, un polipéptido se une a TIGIT humano y no se une a TIGIT de rata. En algunos casos, un polipéptido se une a TIGIT humano y no se une a TIGIT de conejo. En algunos casos, un polipéptido se une a TIGIT humano y no se une a TIGIT en tití. En algunos casos, un polipéptido se une a TIGIT humano y no se une a TIGIT de perro. En algunos casos, un polipéptido se une a TIGIT humano y no se une a TIGIT de cerdo. En algunos casos, un polipéptido se une a TIGIT humano y no se une a TIGIT de mono cynomolgus. En algunos casos, un polipéptido se une a TIGIT humano y no se une a TIGIT de mono rhesus.

[0187] En ciertos casos, un polipéptido comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco, y/o seis de las CDR de anticuerpo 313R11,313R12, 313R14, o 313R19 (véase la Tabla 1 en el presente documento). El anticuerpo 313R20 comprende las mismas CDR y dominios variables de cadena pesada y ligera que el anticuerpo 313R19, pero 313R20 comprende un formato IgG4. En algunos casos, un polipéptido comprende CDR con hasta cuatro (es decir, 0, 1, 2, 3 o 4) sustituciones de aminoácidos por CDR. En ciertos casos, las CDR de cadena pesada están contenidas dentro de una región variable de cadena pesada. En ciertos casos, las CDR de cadena ligera están contenidas dentro de una región variable de cadena ligera.

[0188] En algunos casos, la descripción proporciona un polipéptido que se une específicamente a TIGIT, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, o SEQ ID NO: 32, y/o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 20. En ciertos casos, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 97% o al menos aproximadamente un 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 32. En ciertos casos, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 97% o al menos aproximadamente un 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 18. o SEQ ID NO: 20. En ciertos casos, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 32, y/o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 20. En ciertos casos, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 17 y/o una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 18. En ciertos casos, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 19 y/o una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 20. En ciertos casos, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 32 y/o una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 20.

[0189] En algunos casos, un polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 17, s Eq ID NO: 19, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 y/o SEQ ID NO: 32. Como se define en el presente documento, un polipéptido puede aparecer como una sola cadena o como dos o más cadenas asociadas. En ciertos casos, un polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 17 y una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 18. En ciertos casos, un polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 19 y una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 20. En ciertos casos, un polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 32 y una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 20. En ciertos casos, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 17 y una secuencia de aminoácidos que consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 18. En ciertos casos, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 19 y una secuencia de aminoácidos que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 20. En ciertos casos, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 32 y una secuencia de aminoácidos que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 20. En ciertos casos, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que consta de SEQ ID NO: 17 y una secuencia de aminoácidos que consta de SEQ ID NO: 18. En ciertos casos, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que consta de SEQ ID NO: 19 y una secuencia de aminoácidos que consta de SEQ ID NO: 20. En ciertos casos, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que consta de SEQ ID NO: 32 y una secuencia de aminoácidos que consta de SEQ ID NO: 20.

[0190] En algunos casos, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 55 y/o SEQ ID NO: 56. En ciertos casos, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 21 y una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 23. En ciertos casos, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 22 y una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 23. En ciertos casos, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 24 y una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 25. En ciertos casos, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 33 y una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 25. En ciertos casos, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 55 y una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 25. En ciertos casos, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 26 y una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 28. En ciertos casos, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 27 y una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 28. En ciertos casos, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 29 y una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 30. En ciertos casos, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 34 y una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 30. En ciertos casos, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 56 y una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 30.

[0191] En algunos casos, un agente de unión a TIGIT comprende un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 17, SEQ iD NO: 18, SEQ ID n O: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 56.

[0192] En ciertos casos, un polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO: 21 y una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO: 23. En ciertos casos, un polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que consta de SEQ ID NO: 22 y una secuencia de aminoácidos que consta de SEQ ID NO: 23. En ciertos casos, un polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que consta de SEQ ID NO: 24 y una secuencia de aminoácidos que consta de SEQ ID NO: 25. En ciertos casos, un polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que consta de SEQ ID NO: 33 y una secuencia de aminoácidos que consta de SEQ ID NO: 25. En ciertos casos, un polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que consta de SEQ ID NO: 55 y una secuencia de aminoácidos que consta de SEQ ID NO: 25. En ciertos casos, un polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que consta de SEQ ID NO: 26 y una secuencia de aminoácidos que consta de SEQ ID NO: 28. En ciertos casos, un polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que consta de SEQ ID NO: 27 y una secuencia de aminoácidos que consta de SEQ ID NO: 28. En ciertos casos, un polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que consta de SEQ ID NO: 29 y una secuencia de aminoácidos que consta de SEQ ID NO: 30. En ciertos casos, un polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que consta de SEQ ID NO: 34 y una secuencia de aminoácidos que consta de SEQ ID NO: 30. En ciertos casos, un polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que consta de SEQ ID NO: 56 y una secuencia de aminoácidos que consta de SEQ ID NO: 30.

[0193] En ciertos casos, un polipéptido comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco, y/o seis de las CDR de anticuerpo 313M26 o 313M32 (véase la Tabla 2 en el presente documento). En algunos casos, un polipéptido comprende CDR con hasta cuatro (es decir, 0, 1, 2, 3 o 4) sustituciones de aminoácidos por CDR. En ciertos casos, las CDR de cadena pesada están contenidas dentro de una región variable de cadena pesada. En ciertos casos, las CDR de cadena ligera están contenidas dentro de una región variable de cadena ligera.

[0194] En algunos casos, la descripción proporciona un polipéptido que se une específicamente a TIGIT, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 63 o SEQ ID NO: 67, y/o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 64 o SEQ ID NO: 68. En ciertos casos, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 97% o al menos aproximadamente un 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 63 o SEQ ID NO: 67. En ciertos casos, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 97% o al menos aproximadamente un 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 64. o SEQ ID NO: 68. En ciertos casos, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 63 o la SEQ ID NO: 167 y/o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 64 o SEQ ID NO: 68. En ciertos casos, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 63 y/o una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 64. En ciertos casos, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 67 y/o una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 68.

[0195] En algunos casos, un polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68 , SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 82 y/o SEQ ID NO: 83. Como se define en el presente documento, un polipéptido puede aparecer como una sola cadena o como dos o más cadenas asociadas. En ciertos casos, un polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 63 y una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 64. En ciertos casos, un polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 67 y una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 68. En ciertos casos, un polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 69 y una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 71. En ciertos casos, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 70 y una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 72. En ciertos casos, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 82 y una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 72.

[0196] En ciertos casos, un polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO: 63 y una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO: 64. En ciertos casos, un polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que consta de SEQ ID NO: 67 y una secuencia de aminoácidos que consta de SEQ ID NO: 68. En ciertos casos, un polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que consta de SEQ ID NO: 69 y una secuencia de aminoácidos que consta de SEQ ID NO: 71. En ciertos casos, un polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que consta de SEQ ID NO: 70 y una secuencia de aminoácidos que consta de SEQ ID NO: 72. En ciertos casos, un polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que consta de SEQ ID NO: 82 y una secuencia de aminoácidos que consta de SEQ ID NO: 72.

[0197] Muchas proteínas, incluyendo anticuerpos, contienen una secuencia señal que dirige el transporte de las proteínas a diversos lugares. Generalmente, las secuencias señal (también denominados péptidos señal o secuencias líder) se localizan en el extremo N-terminal de los polipéptidos nacientes. Dirigen el polipéptido al retículo endoplásmico y las proteínas se clasifican en sus destinos, por ejemplo, en el espacio interior de un orgánulo, en una membrana interior, en la membrana externa de la célula o en el exterior de la célula mediante secreción. La mayoría de las secuencias señal son escindidas de la proteína por una peptidasa señal después de que las proteínas se transportan al retículo endoplásmico. La escisión de la secuencia señal del polipéptido normalmente se produce en un sitio específico de la secuencia de aminoácidos y depende de los residuos de aminoácidos dentro de la secuencia señal. Aunque normalmente hay un sitio de escisión específico, puede reconocerse más de un sitio de escisión y/o puede usarse por una peptidasa señal que da como resultado un extremo N-terminal no homogéneo del polipéptido. Por ejemplo, el uso de diferentes sitios de escisión dentro de una secuencia señal puede dar como resultado un polipéptido expresado con diferentes aminoácidos N-terminales. Por consiguiente, en algunas formas de realización, los polipéptidos como se describen en el presente documento pueden comprender una mezcla de polipéptidos con diferentes N-terminales. En algunas formas de realización, los extremos N-terminales difieren en longitud en 1,2, 3, 4 o 5 aminoácidos. En algunas formas de realización, el polipéptido es sustancialmente homogéneo, es decir, los polipéptidos tienen el mismo N-terminal. En algunas formas de realización, la secuencia señal del polipéptido comprende una o más (p. ej., uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, etc.) sustituciones y/o deleciones de aminoácidos en comparación con una secuencia señal "nativa" o "parental". En algunas formas de realización, la secuencia señal del polipéptido comprende sustituciones y/o deleciones de aminoácidos que permiten que un sitio de escisión sea dominante, dando como resultado un polipéptido sustancialmente homogéneo con un N-terminal. En algunas formas de realización, una secuencia señal del polipéptido afecta el nivel de expresión del polipéptido, por ejemplo, expresión aumentada o expresión disminuida.

[0198] En ciertos casos, un anticuerpo compite por la unión específica a TIGIT con un agente de unión a TIGIT descrito en este documento. En algunos casos, un anticuerpo compite por la unión específica a TIGIT con un agente de unión a TIGIT que comprende: (a) una c Dr 1 de cadena pesada que comprende GSSLSSSYMS (SEQ ID NO: 7) o GFSLSSSYMS (SEQ ID NO: 13), una CDR2 de cadena pesada que comprende IIGSNGNTYYANWAKG (SEQ ID NO: 8), y una CDR3 de cadena pesada que comprende GGYRTSGMDP (SEQ ID NO: 9) y (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende QASQSISSYLNW (SEQ ID NO: 10), QASQSNIYSDLAW (SEQ ID NO: 14), o QASQNIYSDLAW (SEQ ID NO: 81), una CDR2 de cadena ligera que comprende DALKLAS (SEQ ID NO: 11) o rAs TLAS (SEQ ID NO: 15), y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQEHSVGNVDN (SEQ ID NO: 12) o QQEHLVAWIYN (SEQ ID NO: 16).

[0199] En ciertos casos, un anticuerpo compite por la unión específica a TIGIT con un agente de unión a TIGIT que comprende (a) una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 32 y (b) una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 20. En ciertos casos, un anticuerpo compite por la unión específica a TIGIT con un agente de unión a TIGIT que comprende una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 17 y una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 18. En ciertos casos, un anticuerpo compite por la unión específica a TIGIT con un agente de unión a TIGIT que comprende una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 19 y una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 20. En ciertos casos, un anticuerpo compite por la unión específica a TIGIT con un agente de unión a TIGIT que comprende una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 32 y una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 20.

[0200] En ciertos casos, un compite de anticuerpos para la unión a TIGIT con un agente de unión a TIGIT comprende una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO específica: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID n O: 34 o SEQ ID NO: 56 y una cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 30. En ciertos casos, un anticuerpo compite por la unión específica a TIGIT con un agente de unión a TIGIT que comprende una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 26 y una cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 28. En ciertos casos, un anticuerpo compite por la unión específica a TIGIT con un agente de unión a TIGIT que comprende una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 27 y una cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 28. En ciertos casos, un anticuerpo compite por la unión específica a TIGIT con un agente de unión a TIGIT que comprende una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 29 y una cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 30. En ciertos casos, un anticuerpo compite por la unión específica a TIGIT con un agente de unión a TIGIT que comprende una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 34 y una cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 30. En algunos casos, un anticuerpo compite por la unión específica a TIGIT con un agente de unión a TIGIT que comprende una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 56 y una cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 30.

[0201] En ciertos casos, un anticuerpo compite con el anticuerpo 313R11 para la unión a TIGIT específico. En ciertos casos, un anticuerpo compite con el anticuerpo 313R12 por la unión específica a TIGIT. En ciertos casos, un anticuerpo compite con el anticuerpo 313R14 por la unión específica a TIGIT humano. En ciertos casos, un anticuerpo compite con el anticuerpo 313R19 por la unión específica a TIGIT humano. En ciertos casos, un anticuerpo compite con el anticuerpo 313R20 por la unión específica a TIGIT humano.

[0202] En algunos casos, un anticuerpo compite con un anticuerpo de referencia para la unión a TIGIT específico, en donde el anticuerpo de referencia es un anticuerpo 313R11. En algunos casos, un anticuerpo compite con un anticuerpo de referencia por la unión específica a TIGIT, en donde el anticuerpo de referencia es el anticuerpo 313R12. En algunos casos, un anticuerpo compite con un anticuerpo de referencia por la unión específica a TIGIT, en donde el anticuerpo de referencia es el anticuerpo 313R14. En algunos casos, un anticuerpo compite con un anticuerpo de referencia por la unión específica a TIGIT, en donde el anticuerpo de referencia es el anticuerpo 313R19. En algunos casos, un anticuerpo compite con un anticuerpo de referencia por la unión específica a TIGIT, en donde el anticuerpo de referencia es el anticuerpo 313R20.

[0203] En ciertos casos, se une un anticuerpo el mismo epítopo, o esencialmente el mismo epítopo, en TIGIT como agente de unión a TIGIT de la descripción. En ciertos casos, un anticuerpo se une al mismo epítopo, o esencialmente al mismo epítopo, en TIGIT que el anticuerpo 313R11. En ciertos casos, un anticuerpo se une al mismo epítopo, o esencialmente al mismo epítopo, en TIGIT que el anticuerpo 313R12. En ciertos casos, un anticuerpo se une al mismo epítopo, o esencialmente al mismo epítopo, en TIGIT que el anticuerpo 313R14. En ciertos casos, un anticuerpo se une al mismo epítopo, o esencialmente al mismo epítopo, en TIGIT que el anticuerpo 313R19. En ciertos casos, un anticuerpo se une al mismo epítopo, o esencialmente al mismo epítopo, en TIGIT que el anticuerpo 313R20.

[0204] En otro ejemplo, se une un anticuerpo a un epítopo en TIGIT que se solapa con el epítopo en TIGIT unido por un agente de unión a TIGIT de la divulgación. En algunos casos, el anticuerpo se une a un epítopo en TIGIT que se superpone con el epítopo en TIGIT unido por el anticuerpo 313R11. En otra forma de realización, el anticuerpo se une a un epítopo en TIGIT que se solapa con el epítopo en TIGIT unido por el anticuerpo 313R12. En algunos casos, el anticuerpo se une a un epítopo en TIGIT que se superpone con el epítopo en TIGIT unido por el anticuerpo 313R14. En ciertos casos, el anticuerpo se une a un epítopo en TIGIT que se superpone con el epítopo en TIGIT unido por el anticuerpo 313R19. En ciertos casos, el anticuerpo se une a un epítopo en TIGIT que se superpone con el epítopo en TIGIT unido por el anticuerpo 313R20.

[0205] En ciertos casos, un anticuerpo compite para la unión específica a TIGIT con un agente de unión a TIGIT descrito en este documento. En algunos casos, un anticuerpo compite por la unión específica a TIGIT con un agente de unión a TIGIT que comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende TSDYAWN (SEQ ID NO: 57), una CDR2 de cadena pesada que comprende YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 58), y una Cd R3 de cadena pesada que comprende a Rr QVGLGFAY (SeQ ID NO: 59) y (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 60), una CDR2 de cadena ligera que comprende SASYRYT (SEQ ID NO: 61), y una CDR3 de cadena que comprende Qq HYSTP (SEQ ID NO: 62).

[0206] En ciertos casos, un anticuerpo compite por la unión a TIGIT con un agente de unión a TIGIT que comprende (a) una región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 63 o SEQ ID NO: 67 y (b) una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 64 o SEQ ID NO: 68. En ciertos casos, un anticuerpo compite por la unión específica a TIGIT con un agente de unión a TIGIT que comprende una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 63 y una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 64. En ciertos casos, un anticuerpo compite por la unión específica a TIGIT con un agente de unión a TIGIT que comprende una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 167 y una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 68. En ciertos casos, un anticuerpo compite por la unión específica a TIGIT con un agente de unión a TIGIT que comprende una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 70 y una cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 72. En ciertos casos, un anticuerpo compite por la unión específica a TIGIT con un agente de unión a TIGIT que comprende una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 82 y una cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 72.

[0207] En ciertos casos, un anticuerpo compite con anticuerpo 313M26 para la unión a TIGIT específico. En ciertos casos, un anticuerpo compite con el anticuerpo 313M32 por la unión específica a TIGIT. En ciertos casos, un anticuerpo compite con el anticuerpo 313M32 por la unión específica a TIGIT humano. En algunos casos, un anticuerpo compite con un anticuerpo de referencia por la unión específica a TIGIT, en donde el anticuerpo de referencia es el anticuerpo 313M26. En algunos casos, un anticuerpo compite con un anticuerpo de referencia por la unión específica a TIGIT, en donde el anticuerpo de referencia es el anticuerpo 313M32. En algunos casos, un anticuerpo compite con un anticuerpo de referencia por la unión específica a TIGIT, en donde el anticuerpo de referencia es el anticuerpo 313M33. En algunos casos, un anticuerpo compite con un anticuerpo de referencia por la unión específica a TIGIT humano, en donde el anticuerpo de referencia es el anticuerpo 313M32. En algunos casos, un anticuerpo compite con un anticuerpo de referencia por la unión específica a TIGIT humano, en donde el anticuerpo de referencia es el anticuerpo 313M33.

[0208] En ciertos casos, un anticuerpo se une el mismo epítopo, o esencialmente el mismo epítopo, en TIGIT como agente de unión a TIGIT descrito en este documento. En ciertos casos, un anticuerpo se une al mismo epítopo, o esencialmente al mismo epítopo, en TIGIT que el anticuerpo 313M26. En ciertos casos, un anticuerpo se une al mismo epítopo, o esencialmente al mismo epítopo, en TIGIT que el anticuerpo 313M32. En ciertos casos, un anticuerpo se une al mismo epítopo, o esencialmente al mismo epítopo, en TIGIT que el anticuerpo 313M33. En ciertos casos, un anticuerpo se une al mismo epítopo, o esencialmente al mismo epítopo, en TIGIT humano que el anticuerpo 313M32. En ciertos casos, un anticuerpo se une al mismo epítopo, o esencialmente al mismo epítopo, en TIGIT humano que el anticuerpo 313M33.

[0209] En otro ejemplo, se une un anticuerpo a un epítopo en TIGIT que se solapa con el epítopo en TIGIT unido por un agente de unión a TIGIT descrito en este documento. En algunos casos, el anticuerpo se une a un epítopo en TIGIT que se superpone con el epítopo en TIGIT unido por el anticuerpo 313M26. En otro caso, el anticuerpo se une a un epítopo en TIGIT que se superpone con el epítopo en TIGIT unido por el anticuerpo 313M32. En otro caso, el anticuerpo se une a un epítopo en TIGIT que se superpone con el epítopo en TIGIT unido por el anticuerpo 313M33. En otro caso, el anticuerpo se une a un epítopo en TIGIT que se superpone con el epítopo en TIGIT humano unido por el anticuerpo 313M32. En otro caso, el anticuerpo se une a un epítopo en TIGIT que se superpone con el epítopo en TIGIT humano unido por el anticuerpo 313M33.

[0210] En algunos casos, un anticuerpo compites para la unión a un epítopo que comprende los aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 79 con un agente de unión a TIGIT descrito en este documento. En algunos casos, un anticuerpo compite por unirse a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 80 con un agente de unión a TIGIT descrito en el presente documento. En algunos casos, un anticuerpo compite por unirse a un epítopo que comprende aminoácidos dentro de SEQ ID NO: 79 y SEQ ID NO: 80 con un agente de unión a TIGIT descrito en este documento. En algunos casos, un anticuerpo compite por unirse a un epítopo que comprende los aminoácidos Q62 y 1109 de SEQ ID NO: 4 con un agente de unión a TIGIT descrito en el presente documento. En algunos casos, un anticuerpo compite por unirse a un epítopo que comprende los aminoácidos Q62 y T119 de SEQ ID NO: 4 con un agente de unión a TIGIT descrito en el presente documento. En algunos casos, un anticuerpo compite por unirse con un epítopo que comprende los aminoácidos Q64 y 1109 de SEQ ID NO: 4 con un agente de unión a TIGIT descrito en el presente documento. En algunos casos, un anticuerpo compite por unirse a un epítopo que comprende los aminoácidos Q64 y T119 de SEQ ID NO: 4 con un agente de unión a TIGIT descrito en el presente documento. En algunos casos, un anticuerpo compite por unirse a un epítopo que comprende los aminoácidos Q62, Q64 y 1109 de SEQ ID NO: 4 con un agente de unión a TIGIT descrito en el presente documento. En algunos casos, un anticuerpo compite por unirse a un epítopo que comprende los aminoácidos Q62, Q64 y T119 de SEQ ID NO: 4 con un agente de unión a TIGIT descrito en el presente documento. En algunos casos, un anticuerpo compite por unirse a un epítopo que comprende los aminoácidos Q62, 1109 y T119 de SEQ ID NO: 4 con un agente de unión a TIGIT descrito en el presente documento. En algunos casos, un anticuerpo compite por unirse a un epítopo que comprende los aminoácidos Q64, 1109 y T119 de SEQ ID NO: 4 con un agente de unión a TIGIT descrito en el presente documento. En algunos casos, un anticuerpo compite por unirse a un epítopo que comprende los aminoácidos Q62, Q64, 1109 y T119 de SEQ ID NO: 4 con un agente de unión a TIGIT descrito en el presente documento. En algunos casos, un anticuerpo compite por unirse a un epítopo que comprende al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: N58, E60, Q62, Q64, L65, F107, I109, H111, T117, T119, G120 y R121 de SEQ ID NO: 4 con un agente de unión a TIGIT descrito en el presente documento.

[0211] En ciertos casos, el agente de unión a TIGIT (p. ej., un anticuerpo) descrito en este documento se une TIGIT y modula la actividad de TIGIT. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un antagonista de TIGIT y disminuye la actividad de TIGIT. En ciertos casos, el agente de unión a TIGIT inhibe la actividad de TIGIT en al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 75%, al menos aproximadamente un 90% o aproximadamente 100%. En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT que inhibe la actividad de TIGIT es el anticuerpo 313R11, el anticuerpo 313R12, el anticuerpo 313R14, el anticuerpo 313R19 o el anticuerpo 313R20. En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT que inhibe la actividad de TIGIT humana es una versión humanizada del anticuerpo 313R11, anticuerpo 313R12, anticuerpo 313R14, anticuerpo 313R19 o anticuerpo 313R20. En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT que inhibe la actividad de TIGIT es el anticuerpo 313M26 o el anticuerpo 313M32. En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT que inhibe la actividad de TIGIT humano es una versión humanizada del anticuerpo 313M26 (p. ej., el anticuerpo 313M32). En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT que inhibe la actividad de TIGIT es el anticuerpo 313M32.

[0212] En algunos casos, los agentes de unión a TIGIT descrito en el presente documento se unen a TIGIT e inhiben o reducen la señalización de TIGIT. En ciertos casos, el agente de unión a TIGIT (p. ej., un anticuerpo) inhibe la señalización de TIGIT en al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 75%, al menos aproximadamente al menos aproximadamente el 90%, o aproximadamente el 100%. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT inhibe la señalización de TIGIT de ratón. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT inhibe la señalización de TIGIT humano. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT inhibe la señalización de TIGIT de ratón y humano. En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT que inhibe la señalización de TIGIT es el anticuerpo 313R11, el anticuerpo 313R12, el anticuerpo 313R14, el anticuerpo 313R19 o el anticuerpo 313R20. En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT que inhibe la señalización de TIGIT es el anticuerpo 313M26 o el anticuerpo 313M32. En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT que inhibe la señalización de TIGIT es el anticuerpo 313M32.

[0213] TIGIT se fosforila en su cola citoplásmica después de la interacción con su PVR contra-receptor. La fosforilación de TIGIT es el comienzo de una cascada que incluye eventos posteriores que afectan a otras vías de señalización conocidas. Por lo tanto, la evaluación de la fosforilación de TIGIT puede proporcionar información sobre la actividad de TIGIT y la señalización de TIGIT.

[0214] Los ensayos de fosforilación son conocidos por los expertos en la técnica y se utilizan comúnmente para controlar la activación de proteínas y/o activación de la vía. Los ensayos pueden usarse para controlar el efecto de varios tratamientos sobre la activación de una proteína diana y/o una ruta diana. Por ejemplo, puede usarse un ensayo de fosforilación in vitro para evaluar el efecto de un antagonista de TIGIT sobre la activación de TIGIT inducida por PVR.

[0215] En ciertos casos, el agente de unión a TIGIT (p. ej., anticuerpo) inhibe la unión de TIGIT a un receptor. En ciertos casos, el agente de unión a TIGIT inhibe la unión de TIGIT a PVR. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT inhibe la unión de TIGIT a PVR-L2, PVR-L3 y/o PVR-L4. En ciertos casos, la inhibición de la unión de un agente de unión a TIGIT a PVR es al menos aproximadamente el 10%, al menos aproximadamente el 25%, al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 90% o al menos alrededor del 95%. En ciertos casos, la inhibición de la unión de un agente de unión a TIGIT a PVR-L2, PVR-L3 y/o PVR-L4 es al menos aproximadamente el 10%, al menos aproximadamente el 25%, al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 90% o al menos aproximadamente el 95%. En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT que inhibe la unión de TIGIT a PVR es el anticuerpo 313R11, el anticuerpo 313R12, el anticuerpo 313R14, el anticuerpo 313R19 o el anticuerpo 313R20. En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT que inhibe la unión de TIGIT a PVR-L2, PVR-L3 y/o PVR-L4 es el anticuerpo 313R11, el anticuerpo 313R12, el anticuerpo 313R14, el anticuerpo 313R19 o el anticuerpo 313R20. En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT que inhibe la unión de TIGIT a PVR es el anticuerpo 313M26 o el anticuerpo 313M32. En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT que inhibe la unión de TIGIT a PVR es el anticuerpo 313M32. En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT que inhibe la unión de TIGIT a PVR-L2, PVR-L3 y/o PVR-L4 es el anticuerpo 313M26 o el anticuerpo 313M32. En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT que inhibe la unión de TIGIT a pVr -L2, PVR-L3 y/o PVR-L4 es el anticuerpo 313M32.

[0216] En ciertos casos, el agente de unión a TIGIT (p. ej., anticuerpo) bloquea la unión de TIGIT a un receptor. En ciertos casos, el agente de unión a TIGIT bloquea la unión de TIGIT a PVR. En ciertos casos, el bloqueo de la unión de un agente de unión a TIGIT a PVR es al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 90%, o al menos aproximadamente alrededor del 95%. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT bloquea la unión de TIGIT a PVR-L2, PVRL3 y/o PVR-L4. En ciertos casos, el bloqueo de la unión de un agente de unión a TIGIT a PVR-L2, PVR-L3 y/o PVR-L4 es al menos aproximadamente el 10%, al menos aproximadamente el 25%, al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 90% o al menos aproximadamente el 95%. En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT que bloquea la unión de TIGIT a PVR es el anticuerpo 313R11, el anticuerpo 313R12, el anticuerpo 313R14, el anticuerpo 313R19 o el anticuerpo 313R20. En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT que bloquea la unión de TIGIT a PVR-L2, PVR-L3 y/o PVR-L4 es el anticuerpo 313R11, el anticuerpo 313R12, el anticuerpo 313R14, el anticuerpo 313R19 o el anticuerpo 313R20. En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT que bloquea la unión de TIGIT a PVR es el anticuerpo 313M26 o el anticuerpo 313M32. En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT que bloquea la unión de TIGIT a PVR es el anticuerpo 313M32. En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT que bloquea la unión de TIGIT a PVR-L2, PVR-L3 y/o PVR-L4 es el anticuerpo 313M26 o el anticuerpo 313M32. En ciertos casos, un agente de unión a TIGIT que bloquea la unión de TIGIT a PVR-L2, PVR-L3 y/o PVR-L4 es el anticuerpo 313M32.

[0217] Los expertos en la técnica conocen los ensayos de unión y se describen en el presente documento. Los ensayos de unión pueden usarse para controlar el efecto de un agente de prueba sobre la interacción entre una proteína diana y la pareja de unión de la proteína (p. ej., receptor o ligando). Por ejemplo, se puede usar un ensayo de unión in vitro para evaluar si un antagonista de TIGIT bloquea la interacción de TIGIT con PVR.

[0218] En ciertas formas de realización de la invención, los anticuerpos descritos en la presente memoria tienen uno o más de los siguientes efectos: la proliferación de inhibición de las células tumorales, el crecimiento del tumor de inhibición, reducir la tumorigenicidad de un tumor, reducir la tumorigenicidad de un tumor mediante la reducción de la frecuencia de células madre cancerosas en el tumor, desencadenar la muerte celular de las células tumorales, mejorar o estimular la respuesta inmunitaria, mejorar o estimular la respuesta antitumoral, aumentar la actividad citolítica de las células inmunes, aumentar la destrucción de las células tumorales, aumentar la destrucción de las células tumorales por células inmunitarias, inducir la diferenciación de las células en un tumor, diferenciar las células tumorigénicas a un estado no tumorigénico, inducir la expresión de marcadores de diferenciación en las células tumorales, prevenir la metástasis de las células tumorales, disminuir la supervivencia de las células tumorales, aumentar la inhibición del crecimiento dependiente del contacto celular, aumentan la apoptosis de las células tumorales, reducen la transición epitelial mesenquimal (EMT) o disminuyen la supervivencia de las células tumorales. En algunas formas de realización, los anticuerpos descritos en este documento tienen uno o más de los siguientes efectos: inhiben la infección viral, inhiben la infección viral crónica, reducen la carga viral, desencadenan la muerte celular de las células infectadas por virus o reducen el número o porcentaje de células infectadas por virus.

[0219] En ciertas formas de realización, los anticuerpos descritos en el presente documento inhiben el crecimiento del tumor. En determinadas formas de realización, los anticuerpos descritos en el presente documento inhiben el crecimiento tumoral in vivo (p. ej., en un modelo de ratón y/o en un ser humano que tiene cáncer). En determinadas formas de realización, el crecimiento tumoral se inhibe al menos aproximadamente dos veces, aproximadamente tres veces, aproximadamente cinco veces, aproximadamente diez veces, aproximadamente 50 veces, aproximadamente 100 veces o aproximadamente 1000 veces en comparación con un tumor no tratado.

[0220] En ciertas formas de realización, los anticuerpos descritos en el presente documento reducen la tumorigenicidad de un tumor. En determinadas formas de realización, los anticuerpos descritos en el presente documento reducen la tumorigenicidad de un tumor en un modelo animal, como un modelo de ratón. En algunas formas de realización, el modelo de ratón es un modelo de xenoinjerto de ratón. En algunas formas de realización, los anticuerpos descritos en el presente documento no se unen a TIGIT de ratón y no son eficaces en un modelo de ratón. En algunas formas de realización, se usa un agente de unión a TIGIT sustituto que se une a TIGIT de ratón en un modelo de ratón. En determinadas formas de realización, los anticuerpos descritos en el presente documento reducen la tumorigenicidad de un tumor que comprende células madre cancerosas en un modelo animal, tal como un modelo de ratón. En determinadas formas de realización, el número o la frecuencia de células madre cancerosas en un tumor se reduce al menos aproximadamente dos veces, aproximadamente tres veces, aproximadamente cinco veces, aproximadamente diez veces, aproximadamente 50 veces, aproximadamente 100 veces, o alrededor de 1000 veces. En ciertas formas de realización, la reducción en el número o frecuencia de células madre cancerosas se determina limitando el ensayo de dilución usando un modelo animal. Se pueden encontrar ejemplos y orientación adicionales con respecto al uso de ensayos de dilución limitante para determinar una reducción en el número o la frecuencia de células madre cancerosas en un tumor, por ejemplo, en la Publicación Internacional N° WO 2008/042236; Publicación de Patente de Estados Unidos N° 2008/0064049; y Publicación de Patente de Estados Unidos N° 2008/0178305.

[0221] En ciertas formas de realización, los anticuerpos descritos en este documento modulan una respuesta inmunitaria. En algunas formas de realización, un anticuerpo descrito en el presente documento activa y/o aumenta una respuesta inmunitaria. En algunas formas de realización, un anticuerpo descrito en el presente documento aumenta, promueve o mejora la inmunidad mediada por células. En algunas formas de realización, un anticuerpo descrito en el presente documento aumenta, promueve o mejora la inmunidad innata mediada por células. En algunas formas de realización, un anticuerpo descrito en el presente documento aumenta, promueve o mejora la inmunidad adaptativa mediada por células. En algunas formas de realización, un anticuerpo descrito en el presente documento aumenta, promueve o mejora la actividad de las células T. En algunas formas de realización, un anticuerpo descrito en el presente documento aumenta, promueve o mejora la actividad de las células T citolíticas (CTL). En algunas formas de realización, un anticuerpo descrito en el presente documento aumenta, promueve o mejora la actividad de las células NK. En algunas formas de realización, un anticuerpo descrito en el presente documento aumenta, promueve o mejora la actividad de las células asesinas activadas por linfocinas (LAK). En algunas formas de realización, un anticuerpo descrito en el presente documento aumenta, promueve o mejora la actividad de linfocitos infiltrantes de tumores (TIF). En algunas formas de realización, un anticuerpo descrito en el presente documento inhibe o disminuye la actividad de las células Treg. En algunas formas de realización, un anticuerpo descrito en el presente documento inhibe o disminuye la actividad de MDSC. En algunas formas de realización, un anticuerpo descrito en el presente documento aumenta, promueve o mejora la destrucción de células tumorales. En algunas formas de realización, un anticuerpo descrito en el presente documento aumenta, promueve o mejora la inhibición del crecimiento tumoral.

[0222] En ciertos casos de la descripción, un agente descrito aquí es un antagonista de TIGIT humano. En algunos casos, el agente es un antagonista de TIGIT y activa y/o aumenta una respuesta inmunitaria. En algunos casos, el agente es un antagonista de TIGIT y activa y/o aumenta la actividad de las células NK. En ciertos casos, el agente aumenta la actividad en al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 75%, al menos aproximadamente un 90% o aproximadamente un 100%. En algunos casos, el agente es un antagonista de TIGIT y activa y/o aumenta la actividad de las células T (p. ej., la actividad citolítica de las células T). En ciertos casos, el agente aumenta la actividad en al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 75%, al menos aproximadamente un 90% o aproximadamente un 100%. En algunos casos, el agente es un antagonista de TIGIT e induce y/o potencia una respuesta inmunitaria de tipo Th1. En general, una respuesta inmunitaria de tipo Th1 incluye la producción de interferón-gamma (IFN- y), IL-2 y factor de necrosis tumoral-beta (TNF-p). En comparación, una respuesta inmunitaria de tipo Th2 generalmente incluye la producción de IL-4, IL-5, IL-6 , IL-9, IL-10 e IL-13. En algunos casos, el agente es un antagonista de TIGIT e induce y/o aumenta la producción de citocinas o linfocinas. En algunos casos, la inducción y/o el aumento de la producción de citocinas o linfocinas puede ser un efecto indirecto.

[0223] En ciertas formas de realización, un anticuerpo descrito en el presente documento aumenta la activación de las células NK. En determinadas formas de realización, un anticuerpo descrito en el presente documento aumenta la activación de las células T. En ciertas formas de realización, la activación de células NK y/o células T por un anticuerpo descrito en este documento da como resultado un aumento en el nivel de activación de células NK y/o células T de al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 90% o al menos aproximadamente el 95%. En determinadas formas de realización, un anticuerpo que aumenta la activación de las células NK es el anticuerpo 313M26 o el anticuerpo 313M32. En determinadas formas de realización, un anticuerpo que aumenta la activación de las células NK es el anticuerpo 313M32.

[0224] En ciertas formas de realización, el anticuerpo descrito en el presente documento es un antagonista de actividad reguladora de las células T (Treg). En ciertas formas de realización, el anticuerpo descrito en este documento inhibe o disminuye la actividad de Tregs. En ciertas formas de realización, la inhibición de la actividad de Tregs por un anticuerpo descrito en este documento da como resultado una inhibición de la actividad supresora de una célula Treg de al menos aproximadamente el 10%, al menos aproximadamente el 25%, al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95% o aproximadamente el 100%. En determinadas formas de realización, un anticuerpo que inhibe la actividad de Treg es el anticuerpo 313M26 o el anticuerpo 313M32. En determinadas formas de realización, un anticuerpo que inhibe la actividad de Treg es el anticuerpo 313M32.

[0225] En ciertas formas de realización, el anticuerpo descrito en el presente documento es un antagonista de las células supresoras de origen mieloide (MDSCs). En determinadas formas de realización, el anticuerpo descrito en el presente documento inhibe la actividad de MDSC. En ciertas formas de realización, el anticuerpo descrito en este documento inhibe la actividad de MDSC en al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 75%, al menos aproximadamente un 90% o aproximadamente 100%. En determinadas formas de realización, un anticuerpo que inhibe la actividad de MDSC es el anticuerpo 313M26 o el anticuerpo 313M32. En determinadas formas de realización, un anticuerpo que inhibe la actividad de MDSC es el anticuerpo 313M32.

[0226] En ciertas formas de realización, el anticuerpo descrito en el presente documento aumenta la actividad de células asesinas naturales (NK). En ciertas formas de realización, el anticuerpo descrito en este documento aumenta la actividad de las células NK en al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 75%, al menos aproximadamente un 90% o aproximadamente un 100%. En determinadas formas de realización, un anticuerpo que aumenta la actividad de las células NK es el anticuerpo 313M26 o el anticuerpo 313M32. En determinadas formas de realización, un anticuerpo que aumenta la actividad de las células NK es el anticuerpo 313M32.

[0227] En ciertas formas de realización, el anticuerpo descrito en el presente documento aumenta la actividad de linfocitos infiltrantes de tumor (TIL). En ciertas formas de realización, el anticuerpo descrito en este documento aumenta la actividad de TIL en al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 90% o aproximadamente 100%. En determinadas formas de realización, un anticuerpo que aumenta la actividad de las células TIL es el anticuerpo 313M26 o el anticuerpo 313M32. En determinadas formas de realización, un anticuerpo que aumenta la actividad de las células TIL es el anticuerpo 313M32.

[0228] En ciertas formas de realización, el anticuerpo descrito en el presente documento aumenta o potencia la actividad de células asesinas activada por linfoquinas (LAK). En ciertas formas de realización, el anticuerpo descrito en este documento aumenta la actividad LAK en al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 75%, al menos aproximadamente un 90% o aproximadamente un 100%. En determinadas formas de realización, un anticuerpo que aumenta la actividad de las células LAK es el anticuerpo 313M26 o el anticuerpo 313M32. En determinadas formas de realización, un anticuerpo que aumenta la actividad de las células LAK es el anticuerpo 313M32.

[0229] Ensayos in vivo y in vitro para determinar si un anticuerpo descrito en este documento modula una respuesta inmunitaria son conocidos en la técnica o se están desarrollando. En algunas formas de realización, puede usarse un ensayo funcional que detecta la activación de células T. En algunas formas de realización, puede usarse un ensayo funcional que detecta la proliferación de células T. En algunas formas de realización, puede usarse un ensayo funcional que detecta la actividad de NK. En algunas formas de realización, puede usarse un ensayo funcional que detecta la actividad de CTL. En algunas formas de realización, puede usarse un ensayo funcional que detecta la actividad de Treg. En algunas formas de realización, puede usarse un ensayo funcional que detecta la actividad de MDSC. En algunas formas de realización, se puede usar un ensayo funcional que detecta la producción de citocinas o linfocinas o células que producen citocinas o linfocinas. En algunas formas de realización, se usa un ensayo ELISpot para medir la frecuencia de células T específicas de antígeno. En algunas formas de realización, se usa un ensayo ELISpot para medir la liberación/producción de citocinas y/o se usa para medir el número de células productoras de citocinas. En algunas formas de realización, se utilizan ensayos de citocinas para identificar una respuesta de tipo Th1. En algunas formas de realización, se utilizan ensayos de citocinas para identificar una respuesta de tipo Th2. En algunas formas de realización, se usan ensayos de citocinas para identificar una respuesta de tipo Th17. En algunas formas de realización, el análisis FACS se usa para medir marcadores de activación en células inmunes, que incluyen, pero no se limitan a células T, células B, células NK, macrófagos y/o células mieloides.

[0230] En ciertas formas de realización, los anticuerpos descritos en este documento tienen una vida media circulante en ratones, ratas, monos cynomolgus o humanos de al menos aproximadamente 2 horas, al menos aproximadamente 5 horas, al menos aproximadamente 10 horas, al menos aproximadamente 24 horas, al menos aproximadamente 3 días, al menos aproximadamente 1 semana o al menos aproximadamente 2 semanas. En ciertas formas de realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgG (p. ej., IgG1, IgG2 o IgG4) que tiene una vida media circulante en ratones, monos cynomolgus o humanos de al menos aproximadamente 2 horas, al menos aproximadamente 5 horas, al menos aproximadamente 10 horas, al menos aproximadamente 24 horas, al menos aproximadamente 3 días, al menos aproximadamente 1 semana o al menos aproximadamente 2 semanas. Se conocen en la técnica métodos para aumentar (o disminuir) la vida media de agentes tales como polipéptidos y anticuerpos. Por ejemplo, los métodos conocidos para aumentar la vida media circulante de los anticuerpos IgG incluyen la introducción de mutaciones en la región Fc que aumentan la unión del anticuerpo dependiente del pH al receptor Fc neonatal (FcRn) a pH 6,0. Los métodos conocidos para aumentar la vida media circulante de los fragmentos de anticuerpos que carecen de la región Fc incluyen técnicas como la PEGilación.

[0231] En algunos casos de la descripción, los agentes de unión a TIGIT son polipéptidos. En algunos casos, los polipéptidos son polipéptidos recombinantes, polipéptidos naturales o polipéptidos sintéticos que comprenden un anticuerpo, o fragmento del mismo, que se une a TIGIT. Se reconocerá en la técnica que algunas secuencias de aminoácidos de la divulgación se pueden variar sin un efecto significativo de la estructura o función de la proteína. Por tanto, la divulgación incluye además variaciones de los polipéptidos que muestran una actividad sustancial o que incluyen regiones de un anticuerpo, o fragmento del mismo, que se une a TIGIT. En algunos casos, las variaciones de la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos que se unen a TIGIT incluyen deleciones, inserciones, inversiones, repeticiones y/u otros tipos de sustituciones.

[0232] Los polipéptidos, análogos y variantes de los mismos pueden ser modificados adicionalmente para contener restos químicos adicionales que normalmente no forman parte del polipéptido. Los restos derivatizados pueden mejorar o modular de otro modo la solubilidad, la vida media biológica y/o la absorción del polipéptido. Los restos también pueden reducir o eliminar efectos secundarios indeseables de los polipéptidos y variantes. Se puede encontrar una descripción general de las fracciones químicas en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22a edición, 2012, Pharmaceutical Press, Londres.

[0233] En ciertos casos, descritos en este documento están aislados los polipéptidos. En ciertos casos, los polipéptidos descritos en este documento son sustancialmente puros.

[0234] Los polipéptidos descritos en este documento pueden producirse mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. Dichos métodos van desde métodos de síntesis de proteínas directos hasta la construcción de una secuencia de ADN que codifica secuencias polipeptídicas y la expresión de esas secuencias en un huésped adecuado. En algunos casos, se construye una secuencia de ADN usando tecnología recombinante aislando o sintetizando una secuencia de ADN que codifica una proteína de interés de tipo salvaje. Opcionalmente, la secuencia puede mutagenizarse mediante mutagénesis específica de sitio para proporcionar análogos funcionales de la misma.

[0235] En algunos casos, una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de interés puede ser construida mediante síntesis química usando un sintetizador de oligonucleótidos. Los oligonucleótidos pueden diseñarse basándose en la secuencia de aminoácidos del polipéptido deseado y seleccionando aquellos codones que se favorecen en la célula huésped en donde se producirá el polipéptido recombinante de interés. Se pueden aplicar métodos estándar para sintetizar una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido de interés aislado. Por ejemplo, se puede usar una secuencia de aminoácidos completa para construir un gen retrotraducido. Además, se puede sintetizar un oligómero de ADN que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido aislado particular. Por ejemplo, varios oligonucleótidos pequeños que codifican porciones del polipéptido deseado pueden sintetizarse y luego ligarse. Los oligonucleótidos individuales contienen típicamente salientes 5’ o 3' para el ensamblaje complementario.

[0236] Una vez ensamblada (por síntesis, mutagénesis dirigida al sitio, o cualquier otro método), las secuencias de polinucleótidos que codifican un polipéptido particular de interés se pueden insertar en un vector de expresión y operativamente unido a una secuencia de control de expresión apropiada para la expresión de la proteína en un huésped deseado. El ensamblaje adecuado se puede confirmar mediante secuenciación de nucleótidos, mapeo de enzimas de restricción y/o expresión de un polipéptido biológicamente activo en un huésped adecuado. Como es bien conocido en la técnica, para obtener altos niveles de expresión de un gen transfectado en un hospedador, el gen debe estar operativamente ligado a secuencias de control de la expresión transcripcional y traduccional que sean funcionales en el hospedador de expresión elegido.

[0237] En ciertos casos, los vectores de expresión recombinantes se usan para amplificar y expresar ADN que codifican anticuerpos, o fragmentos de los mismos, contra TIGIT humano. Por ejemplo, los vectores de expresión recombinantes pueden ser construcciones de ADN replicables que tienen fragmentos de ADN sintéticos o derivados de ADNc que codifican una cadena polipeptídica de un agente de unión a TIGIT, tal como un anticuerpo anti-TIGIT, o un fragmento del mismo, unido operativamente a transcripcional y/o elementos reguladores de traducción derivados de genes de mamíferos, microbianos, virales o de insectos. Una unidad transcripcional generalmente comprende un ensamblaje de (1 ) un elemento o elementos genéticos que tienen un papel regulador en la expresión génica, por ejemplo, promotores o potenciadores transcripcionales, (2 ) una secuencia estructural o codificante que se transcribe en ARNm y se traduce en proteína, y (3) secuencias apropiadas de iniciación y terminación de la transcripción y traducción. Los elementos reguladores pueden incluir una secuencia de operador para controlar la transcripción. Se puede incorporar adicionalmente la capacidad de replicarse en un hospedador, normalmente conferida por un origen de replicación, y un gen de selección para facilitar el reconocimiento de transformantes. Las regiones de ADN están "operativamente unidas" cuando están funcionalmente relacionadas entre sí. Por ejemplo, el ADN de un péptido señal (líder secretor) se une operativamente al ADN de un polipéptido si se expresa como un precursor que participa en la secreción del polipéptido; un promotor está operativamente ligado a una secuencia codificante si controla la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma está operativamente ligado a una secuencia codificante si está posicionado para permitir la traducción. En algunas formas de realización, los elementos estructurales previstos para su uso en sistemas de expresión de levadura incluyen una secuencia líder que permite la secreción extracelular de la proteína traducida por una célula huésped. En otras formas de realización, en situaciones en las que la proteína recombinante se expresa sin una secuencia líder o de transporte, puede incluir un residuo de metionina N-terminal. Opcionalmente, este residuo se puede escindir posteriormente de la proteína recombinante expresada para proporcionar un producto final.

[0238] La elección de una secuencia de control de expresión y un vector de expresión depende de la elección del huésped. Puede emplearse una amplia variedad de combinaciones de vector/huésped de expresión. Los vectores de expresión útiles para huéspedes eucariotas incluyen, por ejemplo, vectores que comprenden secuencias de control de expresión de SV40, virus del papiloma bovino, adenovirus y citomegalovirus. Los vectores de expresión útiles para hospedadores bacterianos incluyen plásmidos bacterianos conocidos, tales como plásmidos de E. coli, que incluyen pCR1, pBR322, pMB9 y sus derivados, y plásmidos de rango de hospedador más amplio, tales como M13 y otros fagos de ADN monocatenario filamentoso.

[0239] Los anticuerpos o agentes biespecíficos de la presente se pueden expresar a partir de uno o más vectores. Por ejemplo, en algunas formas de realización, un polipéptido de cadena pesada es expresado por un vector, un segundo polipéptido de cadena pesada es expresado por un segundo vector y un polipéptido de cadena ligera es expresado por un tercer vector. En algunas formas de realización, un primer polipéptido de cadena pesada y un polipéptido de cadena ligera es expresado por un vector y un segundo polipéptido de cadena pesada es expresado por un segundo vector. En algunas formas de realización, un vector expresa dos polipéptidos de cadena pesada y un segundo vector expresa un polipéptido de cadena ligera. En algunas formas de realización, se expresan tres polipéptidos a partir de un vector. Por tanto, en algunas formas de realización, un primer polipéptido de cadena pesada, un segundo polipéptido de cadena pesada y un polipéptido de cadena ligera se expresan mediante un único vector.

[0240] Las células huésped adecuadas para la expresión de un anticuerpo o un agente biespecífico incluyen procariotas, células de levadura, células de insecto, o células eucariotas superiores bajo el control de promotores apropiados. Los procariotas incluyen organismos gramnegativos o grampositivos, por ejemplo, E. coli o Bacillus. Las células eucariotas superiores incluyen líneas celulares establecidas de origen mamífero como se describe a continuación. También se pueden emplear sistemas de traducción sin células. Los vectores de clonación y expresión apropiados para su uso con huéspedes celulares de bacterias, hongos, levaduras y mamíferos, así como los métodos de producción de proteínas, incluida la producción de anticuerpos, son bien conocidos en la técnica.

[0241] Diversos sistemas de cultivo de mamíferos se pueden usar para expresar polipéptidos recombinantes. La expresión de proteínas recombinantes en células de mamíferos puede ser deseable porque estas proteínas generalmente se pliegan correctamente, se modifican apropiadamente y son biológicamente funcionales. Ejemplos de líneas celulares huésped de mamíferos adecuadas incluyen, pero no se limitan a COS-7 (derivado de riñón de mono), L-929 (derivado de fibroblasto murino), C127 (derivado de tumor mamario murino), 3T3 (derivado de fibroblasto murino), líneas celulares CHO (derivadas de ovario de hámster chino), HeLa (derivadas de cáncer de cuello uterino humano), BHK (derivadas de fibroblastos de riñón de hámster), HEK-293 (derivadas de riñón embrionario humano) y variantes de las mismas. Los vectores de expresión de mamíferos pueden comprender elementos no transcritos tales como un origen de replicación, un promotor y potenciador adecuado ligado al gen que se va a expresar, y otras secuencias no transcritas flanqueantes 5’ o 3’ y secuencias no transcritas traducidas 5’ o 3', tales como sitios de unión de ribosomas necesarios, un sitio de poliadenilación, sitios donantes y aceptores de empalme y secuencias de terminación de la transcripción.

[0242] La expresión de proteínas recombinantes en sistemas de cultivo de células de insectos (p. ej., baculovirus) también ofrece un método robusto para producir proteínas correctamente plegadas y biológicamente funcionales. Los sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insectos son bien conocidos por los expertos en la técnica.

[0243] Así, la presente invención proporciona células que comprenden los anticuerpos o agentes biespecíficos descritos en este documento. En determinadas formas de realización, las células producen el anticuerpo 313R20. En determinadas formas de realización, las células producen el anticuerpo 313M26. En determinadas formas de realización, las células producen el anticuerpo 313M32. En algunas formas de realización, la célula es una célula de hibridoma. En algunas formas de realización, la célula es una célula de mamífero. En algunas formas de realización, la célula es una célula procariota. En algunas formas de realización, la célula es una célula eucariota.

[0244] Las proteínas producidas por un hospedador transformado pueden purificarse según cualquier método adecuado. Los métodos estándar incluyen cromatografía (p. ej., cromatografía en columna de intercambio iónico, afinidad y tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. Las etiquetas de afinidad tales como hexa-histidina, dominio de unión a maltosa, secuencia de cubierta de influenza y glutatión-S-transferasa se pueden unir a la proteína para permitir una fácil purificación mediante el paso sobre una columna de afinidad apropiada. La cromatografía de afinidad utilizada para purificar inmunoglobulinas puede incluir cromatografía de proteína A, proteína G y proteína L. Las proteínas aisladas se pueden caracterizar físicamente utilizando técnicas como proteólisis, cromatografía de exclusión de tamaño (SEC), espectrometría de masas (MS), resonancia magnética nuclear (RMN), enfoque isoeléctrico (IEF), cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y rayos X cristalografía. La pureza de las proteínas aisladas se puede determinar usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica, que incluyen, entre otras, SDS-PAGE, SEC, electroforesis en gel capilar, IEF y enfoque isoeléctrico capilar (clEF).

[0245] En algunas formas de realización, los sobrenadantes de sistemas de expresión que secretan la proteína recombinante en los medios de cultivo pueden ser concentrados primero utilizando un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Después del paso de concentración, el concentrado se puede aplicar a una matriz de purificación adecuada. En algunas formas de realización, se puede emplear una resina de intercambio aniónico, por ejemplo, una matriz o sustrato que tiene grupos dietilaminoetilo (DEAE) colgantes. Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos comúnmente empleados en la purificación de proteínas. En algunas formas de realización, se puede emplear una etapa de intercambio catiónico. Los intercambiadores de cationes adecuados incluyen diversas matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. En algunas formas de realización, se puede emplear un medio de hidroxiapatita, que incluye pero no se limita a hidroxiapatita cerámica (CHT). En determinadas formas de realización, se pueden emplear una o más etapas de HPLC de fase inversa que emplean medio RP-HPLC hidrófobo, por ejemplo, gel de sílice que tiene metilo colgante u otros grupos alifáticos, para purificar adicionalmente una proteína recombinante (p. ej., un agente de unión a TIGIT). Algunas o todas las etapas de purificación anteriores, en diversas combinaciones, pueden emplearse para proporcionar una proteína recombinante homogénea.

[0246] En algunas formas de realización, las proteínas heterodiméricas, tales como anticuerpos biespecíficos se purifican según la cualquiera de los métodos descritos en el presente documento. En algunas formas de realización, los anticuerpos biespecíficos anti-TIGIT se aíslan y/o purifican usando al menos una etapa de cromatografía. En algunas formas de realización, la al menos una etapa de cromatografía comprende cromatografía de afinidad. En algunas formas de realización, la al menos una etapa de cromatografía comprende además cromatografía de intercambio aniónico. En algunas formas de realización, el producto de anticuerpo aislado y/o purificado comprende al menos un 90% de anticuerpo heterodimérico. En algunas formas de realización, el producto de anticuerpo aislado y/o purificado comprende al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de anticuerpo heterodimérico. En algunas formas de realización, el producto de anticuerpo aislado y/o purificado comprende aproximadamente un 100 % de anticuerpo heterodimérico.

[0247] En algunas formas de realización, un polipéptido producido en un cultivo bacteriano puede aislarse, por ejemplo, por extracción inicial a partir de sedimentos celulares, seguida de una o más etapas de concentración, precipitación por sales, los pasos de intercambio iónico acuoso, o cromatografía de exclusión por tamaño. Puede emplearse HPLC para las etapas finales de purificación. Las células microbianas empleadas en la expresión de una proteína recombinante pueden romperse mediante cualquier método conveniente, incluyendo ciclos de congelacióndescongelación, sonicación, alteración mecánica o uso de agentes de lisis celular.

[0248] En ciertos casos de la descripción, el agente de unión a TIGIT es un polipéptido que no es un anticuerpo o no comprende una región Fc de inmunoglobulina. Se conocen en la técnica una variedad de métodos para identificar y producir polipéptidos que no son anticuerpos que se unen con alta afinidad a una proteína diana. En ciertos casos, se puede usar tecnología de presentación en fagos o mamíferos para producir y/o identificar un polipéptido de unión a TIGIT. En ciertos casos, el polipéptido comprende un armazón proteico de un tipo seleccionado del grupo que consiste en proteína A, proteína G, una lipocalina, un dominio de fibronectina, un dominio de repetición consenso de anquirina y tiorredoxina. Se conocen en la técnica una variedad de métodos para identificar y producir polipéptidos no anticuerpos que se unen con alta afinidad a una proteína diana. En ciertos casos, la tecnología de presentación de fagos puede usarse para producir y/o identificar un polipéptido de unión. En ciertos casos, la tecnología de presentación de células de mamíferos puede usarse para producir y/o identificar un polipéptido de unión.

[0249] Puede ser además deseable modificar un polipéptido con el fin de aumento (o disminución) de su vida media en suero. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante la incorporación de un epítopo de unión al receptor de rescate en el polipéptido por mutación de la región apropiada en el polipéptido o incorporando el epítopo en una etiqueta peptídica que luego se fusiona con el polipéptido en cualquier extremo o en el medio (p. ej., mediante síntesis de péptidos o ADN).

[0250] Las moléculas heteroconjugadas también están dentro del alcance de la presente divulgación. Las moléculas heteroconjugadas están compuestas por dos polipéptidos unidos covalentemente. Se ha propuesto, por ejemplo, que tales moléculas dirijan las células inmunes a células no deseadas, como las células tumorales. También se contempla que las moléculas de heteroconjugados se pueden preparar in vitro usando métodos conocidos en la química de proteínas sintéticas, incluidos los que implican agentes de reticulación. Por ejemplo, las inmunotoxinas se pueden construir usando una reacción de intercambio de disulfuro o formando un enlace tioéter. Ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato.

[0251] En ciertos casos, los agentes de unión a TIGIT se pueden utilizar en cualquiera de una serie de conjugado (es decir, un inmunoconjugado o radioconjugado) o formas no conjugadas. En ciertos casos, los agentes pueden usarse en forma no conjugada para aprovechar los mecanismos de defensa naturales del sujeto, incluida la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) para eliminar células malignas o cancerosas.

[0252] En algunos casos, el agente de unión a TIGIT se conjuga a un agente citotóxico. En algunos casos, el agente de unión a TIGIT es un anticuerpo que se conjuga con un agente citotóxico como un ADC (conjugado anticuerpofármaco). En algunos casos, el agente citotóxico es un agente quimioterapéutico que incluye, pero no se limita a metotrexato, adriamicina/doxorrubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina, pirrolobenzodiazepinas (PBD) u otros agentes intercalantes. En algunos casos, el agente citotóxico es una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma, que incluyen, entre otros, cadena A de difteria, fragmentos activos no vinculantes de toxina diftérica, cadena A de exotoxina, cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y tricotecenos. En algunos casos, el agente citotóxico es un radioisótopo para producir un radioconjugado o un anticuerpo radioconjugado. Hay una variedad de radionucleidos disponibles para la producción de anticuerpos radioconjugados que incluyen, entre otros, 90Y, 125I, 131I, 123I, 111In, 131In, 105Rh, 153Sm, 67CU, 67Ga, 166Ho, 177Lu, 186Re, 188Re y 212Bi. También pueden usarse conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de molécula pequeña, tales como caliqueamicinas, maitansinoides, tricotenos y CC1065, y los derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina. Pueden prepararse conjugados de un anticuerpo y un agente citotóxico usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-pirididitiol) propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCl), ésteres activos (como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (como glutaraldehído), compuestos bis-azido (como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (como bis-(p-diazoniummbenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (como tolueno 2 ,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno).

III. Polinucleótidos

[0253] En ciertas formas de realización, la invención abarca polinucleótidos que comprenden polinucleótidos que codifican los anticuerpos o agentes biespecíficos descritos en este documento. El término "polinucleótidos que codifican un polipéptido" abarca un polinucleótido que incluye solo secuencias codificantes del polipéptido así como un polinucleótido que incluye secuencias codificantes y/o no codificantes adicionales. Los polinucleótidos de la invención pueden estar en forma de ARN o en forma de ADN. El ADN incluye ADNc, ADN genómico y ADN sintético; y puede ser bicatenario o monocatenario, y si es monocatenario puede ser la hebra codificante o la hebra no codificante (antisentido).

[0254] En ciertos casos de la descripción, el polinucleótido comprende un polinucleótido (p. ej., una secuencia de nucleótidos) que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 56.

[0255] En ciertos casos, un polinucleótido que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente 80% idéntica, al menos aproximadamente 85% idéntica, al menos aproximadamente 90% idéntica, al menos aproximadamente 95% idéntica, y en algunos casos, en al menos aproximadamente 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 56. También se proporciona un polinucleótido que comprende un polinucleótido que se hibrida con un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 , SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID N229, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 56. En ciertos casos, la hibridación se realiza en condiciones de alta rigurosidad. Las condiciones de alta rigurosidad son conocidas por los expertos en la técnica y pueden incluir, entre otras, (1 ) emplear una fuerza iónica baja y una temperatura alta para el lavado, por ejemplo, cloruro de sodio 15 mM/citrato de sodio 1,5 mM (1x SSC) con dodecilsulfato de sodio al 0,1% a 50°C; (2) emplear durante la hibridación un agente desnaturalizante, como formamida, por ejemplo, 50% (v/v) de formamida con 0,1% de albúmina de suero bovino/0,1% de Ficoll/0,1% de polivinilpirrolidona/tampón de fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5 en 5x SSC (NaCl 0,75 M, citrato de sodio 75 mM) a 42°C; o (3) emplear formamida al 50%, 5x SSC, fosfato de sodio 50 mM (pH 6 ,8), pirofosfato de sodio al 0,1%, solución de Denhardt 5x, ADN de esperma de salmón sonicado (50 pg/ml), SDS al 0,1% y sulfato de dextrano al 10% a 42°C, con lavados en 0,2x SSC que contiene formamida al 50% a 55°C, seguido de un lavado de alta rigurosidad que consta de 0,1x SSC que contiene EDTA a 55°C.

[0256] En ciertos casos, el polinucleótido comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: s Eq ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68 , SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 82, y SEQ ID NO: 83.

[0257] En ciertos casos, un polinucleótido que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente 80% idéntica, al menos aproximadamente 85% idéntica, al menos aproximadamente 90% idéntica, al menos aproximadamente 95% idéntica, y en algunos casos, en al menos aproximadamente 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68 , SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 82 y SEQ ID NO: 83. También se proporciona un polinucleótido que comprende un polinucleótido que se hibrida con un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68 , SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 82 y SEQ ID NO: 83.

[0258] En algunos casos, el polinucleótido comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66 , SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76 y SEQ ID NO: 84. En ciertos casos, un polinucleótido comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente un 80% idéntica, al menos aproximadamente un 85% idéntica, al menos aproximadamente un 90% idéntica, al menos aproximadamente un 95% idéntica y, en algunos casos, al menos aproximadamente un 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66 , SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76 y SEQ ID NO: 84. También se proporciona un polinucleótido que comprende un polinucleótido que se hibrida con una secuencia de polinucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66 , SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76 y SEQ ID NO: 84. En ciertos casos, las técnicas de hibridación se llevan a cabo en condiciones de alta rigurosidad como se describe anteriormente.

[0259] En ciertos casos, un polinucleótido que comprende la secuencia de codificación para el polipéptido maduro fusionado en el mismo marco de lectura a un polinucleótido que ayuda, por ejemplo, en la expresión y secreción de un polipéptido a partir de una célula huésped (p. ej., una secuencia líder que funciona como una secuencia secretora para controlar el transporte de un polipéptido desde la célula). El polipéptido que tiene una secuencia líder es una preproteína y la célula huésped puede escindir la secuencia líder para formar la forma madura del polipéptido. Los polinucleótidos también pueden codificar una pro-proteína que es la proteína madura más residuos de aminoácidos 5’ adicionales. Una proteína madura que tiene una pro-secuencia es una pro-proteína y es una forma inactiva de la proteína. Una vez que se escinde la pro-secuencia, queda una proteína madura activa.

[0260] En ciertos casos, un polinucleótido que comprende la secuencia de codificación para el polipéptido maduro fusionado en el mismo marco de lectura con una secuencia marcadora que permite, por ejemplo, para la purificación del polipéptido codificado. Por ejemplo, la secuencia marcadora puede ser una etiqueta de hexahistidina suministrada por un vector pQE-9 para proporcionar la purificación del polipéptido maduro fusionado al marcador en el caso de un hospedador bacteriano, o la secuencia marcadora puede ser una etiqueta de hemaglutinina (HA) derivada de la proteína hemaglutinina de la influenza cuando se usa un huésped mamífero (p. ej., células COS-7). En algunos casos, la secuencia marcadora es una etiqueta FLAG, un péptido de secuencia DYKDDDDK (SEQ ID NO: 40) que puede usarse junto con otras etiquetas de afinidad.

[0261] La presente descripción se refiere además a variantes de los polinucleótidos descritos en este documento, en donde la variante codifica, por ejemplo, fragmentos, análogos, y/o derivados.

[0262] En ciertos casos, la presente invención proporciona un polinucleótido que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente 80% idéntica, al menos aproximadamente 85% idéntica, al menos aproximadamente 90% idéntica, al menos aproximadamente 95% idéntica, y en algunos casos, al menos aproximadamente 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende un agente de unión a TIGIT descrito en el presente documento.

[0263] Tal como se utiliza aquí, la frase un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos, por ejemplo, 95% "idéntica" a una secuencia de nucleótidos de referencia se pretende que signifique que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia de polinucleótidos puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos en un 95% idéntica a una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta el 5% de los nucleótidos en la secuencia de referencia se pueden eliminar o sustituir con otro nucleótido, o un número de nucleótidos hasta el 5% del total de nucleótidos en la secuencia de referencia se puede insertar en la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia pueden ocurrir en las posiciones terminales 5’ o 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.

[0264] Las variantes de polinucleótidos pueden contener alteraciones en las regiones codificantes, regiones no codificantes o ambas. En algunas formas de realización, una variante de polinucleótido contiene alteraciones que producen sustituciones, adiciones o deleciones silenciosas, pero no altera las propiedades o actividades del polipéptido codificado. En algunas formas de realización, una variante de polinucleótido comprende sustituciones silenciosas que no dan como resultado ningún cambio en la secuencia de aminoácidos del polipéptido (debido a la degeneración del código genético). Las variantes de polinucleótidos pueden producirse por diversas razones, por ejemplo, para optimizar la expresión de codones para un huésped particular (es decir, cambiar los codones en el ARNm humano por los preferidos por un huésped bacteriano como E. coli). En algunas formas de realización, una variante de polinucleótido comprende al menos una mutación silenciosa en una región no codificante o codificante de la secuencia.

[0265] En algunos casos, una variante de polinucleótido se produce para modular o alterar expresión (o niveles de expresión) del polipéptido codificado. En algunos casos, se produce una variante de polinucleótido para aumentar la expresión del polipéptido codificado. En algunos casos, se produce una variante de polinucleótido para disminuir la expresión del polipéptido codificado. En algunos casos, una variante de polinucleótido tiene una expresión aumentada del polipéptido codificado en comparación con una secuencia de polinucleótido parental. En algunos casos, una variante de polinucleótidos tiene una expresión disminuida del polipéptido codificado en comparación con una secuencia de polinucleótidos parental.

[0266] En algunos casos, se produce al menos una variante de polinucleótido (sin cambiar la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado) para aumentar la producción de una molécula heterodimérica. En algunos casos, se produce al menos una variante de polinucleótido (sin cambiar la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado) para aumentar la producción de un anticuerpo biespecífico.

[0267] En ciertas formas de realización de la invención, se aíslan los polinucleótidos. En determinadas formas de realización, los polinucleótidos son sustancialmente puros.

[0268] También se proporcionan vectores y células que comprenden los polinucleótidos descritos en el presente documento. En algunas formas de realización, un vector de expresión comprende una molécula de polinucleótido. En algunas formas de realización, una célula huésped comprende un vector de expresión que comprende la molécula de polinucleótido. En algunas formas de realización, una célula huésped comprende una molécula de polinucleótido.

IV. Métodos de uso y composiciones farmacéuticas

[0269] Los anticuerpos y agentes biespecíficos de la invención son útiles en una variedad de aplicaciones, incluyendo, pero no limitados a los métodos de tratamiento terapéuticos, tales como tratamiento del cáncer. En algunas formas de realización, los métodos de tratamiento terapéutico comprenden inmunoterapia para el cáncer. En ciertas formas de realización, los anticuerpos y agentes biespecíficos descritos en este documento son útiles para activar, promover, aumentar y/o mejorar una respuesta inmunitaria, inhibir el crecimiento tumoral, reducir el volumen del tumor, aumentar la apoptosis de las células tumorales y/o reducir la tumorigenicidad de un tumor. En algunas formas de realización, los anticuerpos y agentes biespecíficos de la invención también son útiles para inmunoterapia contra patógenos, tales como virus. En determinadas formas de realización, un anticuerpo o un agente biespecífico descrito en el presente documento es útil para activar, promover, aumentar y/o mejorar una respuesta inmunitaria, inhibir la infección viral, reducir la infección viral, aumentar la apoptosis de células infectadas por virus y/o aumentar la destrucción de células infectadas por virus. Los métodos de uso pueden ser métodos in vitro, ex vivo o in vivo.

[0270] La presente invención proporciona los anticuerpos y agentes biespecíficos descritos en este documento para uso en métodos para la activación de una respuesta inmunitaria en un sujeto. En algunas formas de realización, la invención proporciona los anticuerpos y agentes biespecíficos descritos en el presente documento para su uso en métodos para promover una respuesta inmunitaria en un sujeto. En algunas formas de realización, la invención proporciona los anticuerpos y agentes biespecíficos descritos en el presente documento para su uso en métodos para aumentar una respuesta inmunitaria en un sujeto. En algunas formas de realización, la invención proporciona los anticuerpos y agentes biespecíficos descritos en el presente documento para su uso en métodos para potenciar una respuesta inmunitaria en un sujeto. En algunas formas de realización, la activación, promoción, aumento y/o potenciación de una respuesta inmunitaria comprende aumentar la inmunidad mediada por células. En algunas formas de realización, la activación, promoción, aumento y/o potenciación de una respuesta inmunitaria comprende el aumento de la actividad de las células T. En algunas formas de realización, la activación, promoción, aumento y/o potenciación de una respuesta inmunitaria comprende aumentar la actividad de CTL. En algunas formas de realización, la activación, promoción, aumento y/o potenciación de una respuesta inmunitaria comprende el aumento de la actividad de las células NK. En algunas formas de realización, la activación, promoción, aumento y/o potenciación de una respuesta inmunitaria comprende aumentar la actividad de las células T y aumentar la actividad de las células NK. En algunas formas de realización, la activación, promoción, aumento y/o potenciación de una respuesta inmunitaria comprende aumentar la actividad de CTL y aumentar la actividad de las células NK. En algunas formas de realización, la activación, promoción, aumento y/o potenciación de una respuesta inmunitaria comprende inhibir o disminuir la actividad supresora de Tregs. En algunas formas de realización, la activación, promoción, aumento y/o potenciación de una respuesta inmunitaria comprende inhibir o disminuir la actividad supresora de las MDSC. En algunas formas de realización, la respuesta inmunitaria es el resultado de la estimulación antigénica. En algunas formas de realización, la estimulación antigénica es una célula tumoral. En algunas formas de realización, la estimulación antigénica es cáncer. En algunas formas de realización, la estimulación antigénica es un patógeno. En algunas formas de realización, la estimulación antigénica es un virus. En algunas formas de realización, la estimulación antigénica es una célula infectada por virus. En algunas formas de realización de cualquiera de los métodos descritos en este documento, el anticuerpo es 313M32.

[0271] En algunas formas de realización, los anticuerpos y agentes biespecíficos descritos en esta memoria son para uso en un método para aumentar una respuesta inmunitaria en un sujeto comprende la administración al sujeto. En algunas formas de realización, el método para aumentar una respuesta inmunitaria en un sujeto comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de anticuerpo 313M32.

[0272] En algunos casos de la descripción proporcionar el uso de un agente de unión a TIGIT descrito en este documento en la fabricación o preparación de un medicamento para activar, promover, aumentar y/o potenciar una respuesta inmunitaria. En algunos casos, la invención proporciona el uso de un agente de unión a TIGIT descrito en el presente documento en la fabricación o preparación de un medicamento para aumentar la inmunidad mediada por células. En algunos casos, la invención proporciona el uso de un agente de unión a TIGIT descrito en el presente documento en la fabricación o preparación de un medicamento para aumentar la actividad de las células T. En algunos casos, la invención proporciona el uso de un agente de unión a TIGIT descrito en el presente documento en la fabricación o preparación de un medicamento para aumentar la actividad de CTL. En algunos casos, la invención proporciona el uso de un agente de unión a TIGIT descrito en el presente documento en la fabricación o preparación de un medicamento para aumentar la actividad de NK. En algunos casos, la invención proporciona el uso de un agente de unión a TIGIT descrito en el presente documento en la fabricación o preparación de un medicamento para inhibir o disminuir la actividad supresora de Tregs. En algunos casos, la invención proporciona el uso de un agente de unión a TIGIT descrito en el presente documento en la fabricación o preparación de un medicamento para inhibir o disminuir la actividad supresora de las MDSC.

[0273] La invención también proporciona el anticuerpo o los agentes biespecíficos descritos en este documento para su uso en métodos de inhibición y/o reducción de la señalización de TIGIT en una célula. En algunas formas de realización, el método para inhibir y/o reducir la señalización de TIGIT en una célula comprende poner en contacto la célula con una cantidad eficaz de anticuerpo 313M32. En determinadas formas de realización, la célula es una célula T. En algunas formas de realización, la célula es una célula T activada. En algunas formas de realización, la célula es una célula NK. En algunas formas de realización, la célula es una Treg. En algunas formas de realización, la célula es una MDSC. En algunas formas de realización, el método es un método in vitro o ex vivo.

[0274] La presente invención también proporciona el anticuerpo o los agentes biespecíficos descritos en este documento para uso en métodos para inhibir el crecimiento de un tumor utilizando los anticuerpos descritos en este documento. En algunas formas de realización, el método para inhibir el crecimiento de un tumor comprende usar el anticuerpo 313M32. En determinadas formas de realización, el método para inhibir el crecimiento de un tumor comprende poner en contacto una mezcla de células con un agente de unión a TIGIT in vitro. Por ejemplo, una línea celular inmortalizada o una línea celular cancerosa mezclada con células inmunes (p. ej., células T o células NK) se cultiva en un medio al que se agrega un agente de prueba que se une a TIGIT. En algunas formas de realización, las células tumorales se aíslan de una muestra de paciente como, por ejemplo, una biopsia de tejido, derrame pleural o muestra de sangre, se mezclan con células inmunes (p. ej., células T y/o células NK) y se cultivan en medio al cual se le agrega un agente de prueba que se une a TIGIT. En algunas formas de realización, el anticuerpo o el agente biespecífico aumenta, promueve y/o potencia la actividad de las células inmunes. En algunas formas de realización, el anticuerpo o el agente biespecífico inhibe el crecimiento de células tumorales.

[0275] En algunas formas de realización, el método para inhibir el crecimiento de un tumor comprende poner en contacto el tumor o las células tumorales con un anticuerpo o un agente biespecífico descrito en el presente documento in vivo. En determinadas formas de realización, el contacto de un tumor o una célula tumoral con un anticuerpo o un agente biespecífico se realiza en un modelo animal. Por ejemplo, se puede administrar un agente de prueba a ratones que tienen tumores. En algunas formas de realización, un anticuerpo o un agente biespecífico aumenta, promueve y/o mejora la actividad de las células inmunes en los ratones. En algunas formas de realización, un anticuerpo o un agente biespecífico inhibe el crecimiento tumoral. En algunas formas de realización, un anticuerpo o un agente biespecífico provoca la regresión de un tumor. En algunas formas de realización, se administra un anticuerpo o un agente biespecífico al mismo tiempo o poco después de la introducción de células tumorales en el animal para prevenir el crecimiento tumoral ("modelo preventivo"). En algunas formas de realización, se administra un anticuerpo o un agente biespecífico como terapéutico después de que los tumores hayan crecido hasta un tamaño especificado o se hayan "establecido" ("modelo terapéutico").

[0276] En ciertas formas de realización, el método de inhibir el crecimiento de un tumor comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o un agente biespecífico descrito en este documento. En determinadas formas de realización, el sujeto es un ser humano. En determinadas formas de realización, el sujeto tiene un tumor o el sujeto tenía un tumor que se extirpó al menos parcialmente. En algunas formas de realización, el método para inhibir el crecimiento de un tumor comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de anticuerpo 313M32.

[0277] Además, la invención proporciona el anticuerpo o los agentes biespecíficos descritos en este documento para su uso en un método para inhibir el crecimiento de un tumor en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o un agente biespecífico descrito en este documento. En algunas formas de realización, la invención proporciona el uso de un anticuerpo o un agente biespecífico descrito en el presente documento en la fabricación o preparación de un medicamento para inhibir el crecimiento de un tumor o una célula tumoral. En determinadas formas de realización, el tumor comprende células madre cancerosas. En determinadas formas de realización, la frecuencia de células madre cancerosas en el tumor se reduce mediante la administración del agente. En algunas formas de realización, se proporciona un método para reducir la frecuencia de células madre cancerosas en un tumor en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o un agente biespecífico.

[0278] Además, la invención proporciona los anticuerpos o los agentes biespecíficos descritos en este documento para uso en un método para reducir la tumorigenicidad de un tumor en un sujeto. En determinadas formas de realización, el tumor comprende células madre cancerosas. En algunas formas de realización, la tumorigenicidad de un tumor se reduce reduciendo la frecuencia de células madre cancerosas en el tumor. En algunas formas de realización, los métodos comprenden el uso de anticuerpos o agentes biespecíficos descritos en este documento. En determinadas formas de realización, la frecuencia de células madre cancerosas en el tumor se reduce mediante la administración de un anticuerpo o un agente biespecífico descrito en el presente documento. En algunas formas de realización, un método para reducir la tumorigenicidad de un tumor en un sujeto comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de anticuerpo 313M32.

[0279] En algunas formas de realización, el tumor es un tumor sólido. En determinadas formas de realización, el tumor es un tumor seleccionado del grupo que consiste en: tumor colorrectal, tumor pancreático, tumor de pulmón, tumor de ovario, tumor de hígado, tumor de mama, tumor de riñón, tumor de próstata, tumor neuroendocrino, tumor gastrointestinal, melanoma, tumor de cuello uterino, tumor de vejiga, glioblastoma y tumor de cabeza y cuello. En determinadas formas de realización, el tumor es un tumor colorrectal. En determinadas formas de realización, el tumor es un tumor de ovario. En algunas formas de realización, el tumor es un tumor de pulmón. En determinadas formas de realización, el tumor es un tumor pancreático. En determinadas formas de realización, el tumor es un melanoma.

[0280] La presente invención proporciona el agente anticuerpo o biespecífico descrito en este documento para su uso en métodos de tratamiento de cáncer que comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de unión a TIGIT descrito en el presente documento (p. ej., un sujeto que necesita tratamiento). En algunas formas de realización, el anticuerpo o agente biespecífico inhibe o reduce el crecimiento del cáncer. En determinadas formas de realización, el sujeto es un ser humano. En determinadas formas de realización, el sujeto tiene un tumor canceroso. En determinadas formas de realización, al sujeto se le ha extirpado un tumor al menos parcialmente. En algunas formas de realización, un método para tratar el cáncer en un sujeto comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de anticuerpo 313M32.

[0281] En ciertas formas de realización, el cáncer es un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de mama, cáncer de riñón, cáncer de próstata, cáncer gastrointestinal, melanoma, cáncer de cuello uterino, cáncer neuroendocrino, cáncer de vejiga, glioblastoma y cáncer de cabeza y cuello. En determinadas formas de realización, el cáncer es cáncer de páncreas. En determinadas formas de realización, el cáncer es cáncer de ovario. En determinadas formas de realización, el cáncer es cáncer colorrectal. En determinadas formas de realización, el cáncer es cáncer de mama. En determinadas formas de realización, el cáncer es cáncer de próstata. En determinadas formas de realización, el cáncer es cáncer de pulmón. En determinadas formas de realización, el cáncer es melanoma.

[0282] En algunas formas de realización, el cáncer es un cáncer hematológico. En algunas formas de realización, el cáncer hematológico es una leucemia. En otras formas de realización, el cáncer hematológico es un linfoma. En alguna forma de realización, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en: leucemia mielógena aguda (LMA), linfoma de Hodgkin, mieloma múltiple, leucemia linfoblástica aguda de células T (T-ALL), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia de células pilosas, leucemia mielógena crónica (LMC), linfoma no Hodgkin, linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), linfoma de células del manto (LCM) y linfoma cutáneo de células T (LCCT).

[0283] En algunas formas de realización de los métodos descritos en el presente documento, un método comprende además una etapa de determinar el nivel de expresión de PD-L1 en el tumor o el cáncer. En algunas formas de realización, la determinación del nivel de expresión de PD-L1 se realiza antes del tratamiento con un anticuerpo o agente biespecífico descrito en el presente documento. En algunas formas de realización, si un tumor o cáncer tiene un nivel de expresión elevado de PD-L1, se administra al sujeto un anticuerpo o agente biespecífico. En algunas formas de realización, un método comprende (i) obtener una muestra del cáncer o tumor de un sujeto; (ii) medir el nivel de expresión de PD-L1 en la muestra; y (iii) administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo o agente biespecífico al sujeto si el tumor o cáncer tiene un nivel de expresión elevado de PD-L1. En algunas formas de realización, la muestra es una muestra de biopsia. En algunas formas de realización, la muestra comprende células tumorales, células inmunes que se infiltran en el tumor, células estromales y cualquier combinación de las mismas. En algunas formas de realización, la muestra es una muestra embebida en parafina fijada con formalina (FFPE). En algunas formas de realización, la muestra es tejido de archivo, fresco o congelado. En algunas formas de realización, el nivel de expresión de PD-L1 en la muestra se compara con un nivel de expresión predeterminado de PD-L1. En algunas formas de realización, el nivel de expresión predeterminado de la expresión de PD-L1 es un nivel de expresión de PD-L1 en una muestra de tumor de referencia, una muestra de tejido normal de referencia, una serie de muestras de tumor de referencia o una serie de muestras de tejido normal de referencia. En algunas formas de realización, el nivel de expresión de PD-L1 se determina usando un ensayo de inmunohistoquímica (IHC). En algunas formas de realización, el nivel de expresión de PD-L1 se determina usando un ensayo que comprende una evaluación de puntuación H. En algunas formas de realización, el nivel de expresión de PD-L1 se determina usando un anticuerpo que se une específicamente a PD-L1. En algunas formas de realización, PD-L1 se detecta en células tumorales. En algunas formas de realización, PD-L1 se detecta en células inmunes que se infiltran en el tumor.

[0284] La terapia de combinación con dos o más agentes terapéuticos a menudo utiliza agentes que trabajan por diferentes mecanismos de acción, aunque esto no es necesario. La terapia combinada con agentes con diferentes mecanismos de acción puede producir efectos aditivos o sinérgicos. La terapia de combinación puede permitir una dosis más baja de cada agente que la que se usa en monoterapia, reduciendo así los efectos secundarios tóxicos y/o aumentando el índice terapéutico del agente o agentes. La terapia combinada puede disminuir la probabilidad de que se desarrollen células cancerosas resistentes. En algunas formas de realización, la terapia de combinación comprende un agente terapéutico que afecta la respuesta inmunitaria (p. ej., mejora o activa la respuesta) y un agente terapéutico que afecta (p. ej., inhibe o mata) las células tumorales/cancerosas.

[0285] En algunas formas de realización, la combinación de un anticuerpo o un agente biespecífico descritos en este documento y al menos un agente terapéutico adicional resulta en los resultados de aditivos o sinérgicos. En algunas formas de realización, la terapia de combinación da como resultado un aumento en el índice terapéutico del agente. En algunas formas de realización, la terapia de combinación da como resultado un aumento en el índice terapéutico del agente o agentes terapéuticos adicionales. En algunas formas de realización, la terapia de combinación da como resultado una disminución de la toxicidad y/o los efectos secundarios del agente. En algunas formas de realización, la terapia de combinación da como resultado una disminución de la toxicidad y/o los efectos secundarios del agente o agentes terapéuticos adicionales.

[0286] En ciertas formas de realización, además de la administración de un anticuerpo o un agente biespecífico describto en el presente documento, el método o tratamiento comprende además administrar al menos un agente terapéutico adicional. Puede administrarse un agente terapéutico adicional antes, al mismo tiempo y/o posteriormente a la administración del agente. En algunas formas de realización, el al menos un agente terapéutico adicional comprende 1, 2, 3 o más agentes terapéuticos adicionales.

[0287] Los agentes terapéuticos que se pueden administrar en combinación con los anticuerpos y agentes biespecíficos descritos en este documento incluyen agentes quimioterapéuticos. Por lo tanto, en algunas formas de realización, el método o tratamiento implica la administración de un anticuerpo o un agente biespecífico de la presente invención en combinación con un agente quimioterapéutico o en combinación con un cóctel de agentes quimioterapéuticos. El tratamiento con un anticuerpo o un agente biespecífico puede ocurrir antes, al mismo tiempo o después de la administración de quimioterapias. La administración combinada puede incluir la coadministración, ya sea en una única formulación farmacéutica o usando formulaciones separadas, o la administración consecutiva en cualquier orden pero generalmente dentro de un período de tiempo tal que todos los agentes activos puedan ejercer sus actividades biológicas simultáneamente. Los programas de preparación y dosificación para tales agentes quimioterapéuticos se pueden usar de acuerdo con las instrucciones del fabricante o según lo determine empíricamente el médico experto. La preparación y los programas de dosificación para dicha quimioterapia también se describen en The Chemotherapy Source Book, 4a edición, 2008, M. C. Perry, Editor, Lippincott, Williams & Wilkins, Filadelfia, PA.

[0288] Clases útiles de agentes terapéuticos incluyen, por ejemplo, agentes anti-tubulina, auristatinas, ligantes del surco menor de ADN, inhibidores de la replicación del ADN, agentes alquilantes (p. ej., complejos de platino tales como cisplatino, mono(platino), bis(platino) y complejos trinucleares de platino y carboplatino), antraciclinas, antibióticos, antifolatos, antimetabolitos, sensibilizadores de quimioterapia, duocarmicinas, etopósidos, pirimidinas fluoradas, ionóforos, lexitropsinas, nitrosoureas, platinoles, antimetabolitos purínicos, puromicinas, esteroides, sensibilizadores a la radiación inhibidores, alcaloides de la vinca o similares. En determinadas formas de realización, el segundo agente terapéutico es un agente alquilante, un antimetabolito, un antimitótico, un inhibidor de la topoisomerasa o un inhibidor de la angiogénesis.

[0289] Los agentes quimioterapéuticos útiles en la presente invención incluyen, pero no se limitan a agentes tales como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXAN); alquil sulfonatos tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucil, clornafazina, cloofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxina, idarxorubicina, 6-diazo-5-oxino-L-epidirubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos del ácido fólico como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, arabinósido de citosina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reponedores de ácido fólico como ácido folínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elformitina; acetato de eliptinio; etoglucid; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; phenamet; pirarubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK; razoxano; sizofurano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2 ,2 ’,2 ”-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido (Ara-C); taxoides, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL) y docetaxel (TAXOTERE); clorambucil; 6-tioguanina; mercaptopurina; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinoico; esperamicinas; capecitabina (XELODA); y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. Los agentes quimioterapéuticos también incluyen agentes anti-hormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal en tumores tales como antiestrógenos que incluyen, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles que inhiben la aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno (FARESTON); y antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. En determinadas formas de realización, el agente terapéutico adicional es cisplatino. En determinadas formas de realización, el agente terapéutico adicional es carboplatino.

[0290] En ciertas formas de realización, el agente quimioterapéutico es un inhibidor de la topoisomerasa. Los inhibidores de la topoisomerasa son agentes de quimioterapia que interfieren con la acción de una enzima topoisomerasa (p. ej., topoisomerasa I o II). Los inhibidores de la topoisomerasa incluyen, entre otros, doxorrubicina HCl, citrato de daunorrubicina, mitoxantrona HCl, actinomicina D, etopósido, topotecán HCl, tenipósido (VM-26) e irinotecán, así como sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquier de estos. En algunas formas de realización, el agente terapéutico adicional es irinotecán.

[0291] En determinadas formas de realización, el agente quimioterapéutico es un antimetabolito. Un antimetabolito es una sustancia química con una estructura similar a un metabolito requerido para reacciones bioquímicas normales, pero lo suficientemente diferente como para interferir con una o más funciones normales de las células, como la división celular. Los antimetabolitos incluyen, entre otros, gemcitabina, fluorouracilo, capecitabina, metotrexato sódico, ralitrexed, pemetrexed, tegafur, citosina arabinósido, tioguanina, 5-azacitidina, 6-mercaptopurina, azatioprina, 6-tioguanina, pentosina-fosfato y cladribina, así como sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de estos. En determinadas formas de realización, el agente terapéutico adicional es gemcitabina.

[0292] En ciertas formas de realización, el agente quimioterapéutico es un agente antimitótico, incluyendo, pero no limitado a los agentes que se unen a tubulina. En algunas formas de realización, el agente es un taxano. En determinadas formas de realización, el agente es paclitaxel o docetaxel, o una sal, ácido o derivado farmacéuticamente aceptable de paclitaxel o docetaxel. En determinadas formas de realización, el agente es paclitaxel (TAXOL), docetaxel (TAXOTERE), paclitaxel unido a albúmina (ABRAXANE), DHA-paclitaxel o PG-paclitaxel. En determinadas formas de realización alternativas, el agente antimitótico comprende un alcaloide de la vinca, tal como vincristina, vinblastina, vinorelbina o vindesina, o sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos. En algunas formas de realización, el agente antimitótico es un inhibidor de la quinesina Eg5 o un inhibidor de una quinasa mitótica como Aurora A o Plk1. En determinadas formas de realización, el agente terapéutico adicional es paclitaxel. En determinadas formas de realización, el agente terapéutico adicional es paclitaxel unido a albúmina (ABRAXANE).

[0293] En algunas formas de realización, un agente terapéutico adicional comprende un agente tal como una molécula pequeña. Por ejemplo, el tratamiento puede implicar la administración combinada de un agente de la presente invención con una molécula pequeña que actúa como inhibidor contra antígenos asociados a tumores que incluyen, pero no se limitan a EGFR, HER2 (ErbB2) y/o VEGF. En algunas formas de realización, un agente de la presente invención se administra en combinación con un inhibidor de proteína quinasa seleccionado del grupo que consiste en: gefitinib (IRESSA), erlotinib (TARCEVA), sunitinib (SUTENT), lapatanib, vandetanib (ZACTIMA), AEE788, CI-1033, cediranib (RECENTIN), sorafenib (NEXAv AR) y pazopanib (GW786034B). En algunas formas de realización, un agente terapéutico adicional comprende un inhibidor de mTOR.

[0294] En ciertas formas de realización, el agente terapéutico adicional es un agente que inhibe una vía de células madre de cáncer. En algunas formas de realización, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de la ruta Notch. En algunas formas de realización, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de la vía Wnt. En algunas formas de realización, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de la ruta de BMP. En algunas formas de realización, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de la vía Hippo. En algunas formas de realización, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de la ruta RSPO/LGR. En algunas formas de realización, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de la ruta mTOR/AKR.

[0295] En algunas formas de realización, un agente terapéutico adicional comprende una molécula biológica, como un anticuerpo. Por ejemplo, el tratamiento puede implicar la administración combinada de un agente de la presente invención con anticuerpos contra antígenos asociados a tumores que incluyen, pero no se limitan a anticuerpos que se unen a EGFR, HER2/ErbB2 y/o VEGF. En determinadas formas de realización, el agente terapéutico adicional es un anticuerpo específico para un marcador de células madre cancerosas. En algunas formas de realización, el agente terapéutico adicional es un anticuerpo que se une a un componente de la ruta Notch. En algunas formas de realización, el agente terapéutico adicional es un anticuerpo que se une a un componente de la vía Wnt. En determinadas formas de realización, el agente terapéutico adicional es un anticuerpo que inhibe una ruta de células madre cancerosas. En algunas formas de realización, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de la ruta Notch. En algunas formas de realización, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de la vía Wnt. En algunas formas de realización, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de la ruta de BMP. En algunas formas de realización, el agente terapéutico adicional es un anticuerpo que inhibe la señalización de p-catenina. En determinadas formas de realización, el agente terapéutico adicional es un anticuerpo que es un inhibidor de la angiogénesis (p. ej., un anticuerpo anti-VEGF o receptor de VEGF). En determinadas formas de realización, el agente terapéutico adicional es bevacizumab (Av As TIN), ramucirumab, trastuzumab (HERCEPTIN), pertuzumab (OMNITARG), panitumumab (VECTIBIX), nimotuzumab, zalutumumab o cetuximab (ERBITUX).

[0296] En ciertas formas de realización, además de la administración de un anticuerpo o agente biespecífico descrito en este documento, el método o tratamiento comprende además administrar al menos un agente inmunoterapéutico adicional. En algunas formas de realización, el agente inmunoterapéutico adicional es un agente estimulante de la respuesta inmunitaria. En algunas formas de realización, el agente inmunoterapéutico (p. ej., agente estimulante de la respuesta inmunitaria) incluye, pero no se limita a un factor estimulante de colonias (p. ej., factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de macrófagos (MCSF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor de células madre (SCF), una interleucina (p. ej., IL-1, IL2, IL-3, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18), un anticuerpo que bloquea las funciones inmunosupresoras (p. ej., un anticuerpo anti-CTLA4, un anticuerpo anti-CD28, un anticuerpo anti-CD3, un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-Ll), un anticuerpo que mejora las funciones de las células inmunitarias (p. ej., un anticuerpo anti-GITR o un anticuerpo anti-OX-40), un receptor tipo toll (p. ej., TLR4, TLR7, TLR9), un ligando soluble (p. ej., G iTRL u OX-40L) o un miembro de la familia B7 (p. ej., CD80, CD86). Puede administrarse un agente inmunoterapéutico adicional (p. ej., un agente estimulante de la respuesta inmunitaria) antes, al mismo tiempo y/o posteriormente a la administración del agente de unión a TIGIT. También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden un agente de unión a TIGIT y un agente inmunoterapéutico adicional (p. ej., un agente estimulante de la respuesta inmunitaria). En algunas formas de realización, el agente inmunoterapéutico comprende 1,2, 3 o más agentes inmunoterapéuticos. En algunas formas de realización, el agente estimulante de la respuesta inmunitaria comprende 1,2, 3 o más agentes estimulantes de la respuesta inmunitaria.

[0297] En algunas formas de realización, el agente terapéutico adicional es un anticuerpo que es un inhibidor de punto de control inmune. En algunas formas de realización, el inhibidor del punto de control inmune es un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-Ll, un anticuerpo anti-CTLA4, un anticuerpo anti-CD28, un anticuerpo anti-LAG3, un anticuerpo anti-TIM3, un anticuerpo anti-GITR, o un anticuerpo anti-OX-40. En algunas formas de realización, el inhibidor del punto de control inmune es un anticuerpo anti-4-1BB. En algunas formas de realización, el agente terapéutico adicional es un anticuerpo anti-PD-1 seleccionado de los grupos que consisten en: nivolumab (OPDIVO), pembrolizumab (KEYTRUDA) o pidilzumab. En algunas formas de realización, el agente terapéutico adicional es un anticuerpo anti-PD-1 seleccionado de los grupos que consisten en: MEDI0680, REGN2810, b Gb -A317 y PDR001. En algunas formas de realización, el agente terapéutico adicional es un anticuerpo anti-PD-Ll seleccionado del grupo que consiste en: BMS935559 (MDX-1105), atexolizumab (MPDL3280A), durvalumab (MEDI4736) o avelumab (MSB0010718C). En algunas formas de realización, el agente terapéutico adicional es un anticuerpo anti-CTLA-4 seleccionado del grupo que consiste en: ipilimumab (YERVOY) o tremelimumab. En algunas formas de realización, el agente terapéutico adicional es un anticuerpo anti-LAG-3 seleccionado del grupo que consiste en: BMS-986016 y LAG525. En algunas formas de realización, el agente terapéutico adicional es un anticuerpo anti-OX-40 seleccionado del grupo que consiste en: MEDI6469, MEDI0562 y MOXR0916. En algunas formas de realización, el agente terapéutico adicional es un anticuerpo anti-4-1 BB seleccionado del grupo que consiste en: PF-05082566.

[0298] Además, el tratamiento con un anticuerpo o un agente biespecífico descrito en este documento puede incluir el tratamiento de combinación con otras moléculas biológicas, tales como una o más citoquinas (p. ej., linfoquinas, interleuquinas, interferones, factores de necrosis tumoral, y/o factores de crecimiento) o puede ir acompañado de la extirpación quirúrgica de tumores, la extirpación de células cancerosas o cualquier otra terapia que el médico tratante considere necesaria.

[0299] En algunas formas de realización, el anticuerpo o agente biespecífico se pueden administrar en combinación con una molécula biológica seleccionada del grupo que consiste en: adrenomedulina (AM), la angiopoyetina (Ang), BMPs, BDNF, EGF, eritropoyetina (EPO), FGF, GDNF, G-CSF, GM-CSF, GDF9, HGF, HDGF, IGF, factor estimulante de la migración, miostatina (GDF-8), NGF, neurotrofinas, PDg F, trombopoyetina, TGF-a, TGF-p, TNF-a, VEGF, PlGF, gamma-IFN, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6 , IL-7, IL-12, IL-15 e IL-18. En algunas formas de realización, el agente de unión a TIGIT se puede administrar en combinación con una molécula biológica seleccionada del grupo que consiste en: factor estimulante de colonias de macrófagos (MCSF) y factor de células madre (SCF).

[0300] En algunas formas de realización, el tratamiento con un anticuerpo o un agente biespecífico descrito en el presente documento puede ir acompañado de la extirpación quirúrgica de tumores, la extirpación de células cancerosas o cualquier otra terapia quirúrgica que el médico tratante considere necesaria.

[0301] En ciertas formas de realización, el tratamiento implica la administración de un anticuerpo o un agente biespecífico de la presente invención en combinación con radioterapia. El tratamiento con un agente puede ocurrir antes, al mismo tiempo o después de la administración de la radioterapia. Los programas de dosificación para dicha radioterapia pueden ser determinados por un médico experto.

[0302] En ciertas formas de realización, el tratamiento implica la administración de un anticuerpo o un agente biespecífico de la presente invención en combinación con la terapia anti-viral. El tratamiento con un agente puede ocurrir antes, al mismo tiempo o después de la administración de la terapia antiviral. El fármaco antivírico utilizado en la terapia de combinación dependerá del virus con el que esté infectado el sujeto.

[0303] La administración combinada puede incluir la coadministración, ya sea en una única formulación farmacéutica o usando formulaciones separadas, o la administración consecutiva en cualquier orden pero generalmente dentro de un período de tiempo tal que todos los agentes activos puedan ejercer sus actividades biológicas simultáneamente.

[0304] Se apreciará que la combinación de un anticuerpo o un agente biespecífico descritos en este documento y al menos un agente terapéutico adicional pueden administrarse en cualquier orden o simultáneamente. En algunas formas de realización, el agente se administrará a pacientes que se hayan sometido previamente a un tratamiento con un segundo agente terapéutico. En ciertas otras formas de realización, el anticuerpo o el agente biespecífico y un segundo agente terapéutico se administrarán sustancialmente de forma simultánea o simultánea. Por ejemplo, a un sujeto se le puede administrar un agente mientras se somete a un curso de tratamiento con un segundo agente terapéutico (p. ej., quimioterapia). En determinadas formas de realización, se administrará un anticuerpo o un agente biespecífico dentro de 1 año del tratamiento con un segundo agente terapéutico. En ciertas formas de realización alternativas, se administrará un anticuerpo o un agente biespecífico dentro de los 10, 8 , 6 , 4 o 2 meses de cualquier tratamiento con un segundo agente terapéutico. En algunas otras formas de realización, se administrará un anticuerpo o un agente biespecífico dentro de las 4, 3, 2 o 1 semanas de cualquier tratamiento con un segundo agente terapéutico. En algunas formas de realización, se administrará un agente dentro de los 5, 4, 3, 2 o 1 días de cualquier tratamiento con un segundo agente terapéutico. Se apreciará además que los dos (o más) agentes o tratamientos pueden administrarse al sujeto en cuestión de horas o minutos (es decir, sustancialmente de forma simultánea).

[0305] Para el tratamiento de una enfermedad, la dosificación apropiada de un anticuerpo o un agente biespecífico de la presente invención depende del tipo de enfermedad a tratar, la gravedad y curso de la enfermedad, la capacidad de respuesta de la enfermedad, si el agente se administra con fines terapéuticos o preventivos, terapia previa, historial clínico del paciente, etc, todo a criterio del médico tratante. El anticuerpo o un agente biespecífico se puede administrar una vez o durante una serie de tratamientos que duran desde varios días hasta varios meses, o hasta que se efectúe una curación o se logre una disminución del estado patológico (p. ej., reducción del tamaño del tumor). Los programas de dosificación óptimos se pueden calcular a partir de las mediciones de la acumulación de fármaco en el cuerpo del paciente y variarán dependiendo de la potencia relativa de un agente individual. El médico que realiza la administración puede determinar las dosis óptimas, las metodologías de dosificación y las tasas de repetición. En determinadas formas de realización, la dosis es de 0,01 gg a 100 mg/kg de peso corporal, de 0,1 gg a 100 mg/kg de peso corporal, de 1 gg a 100 mg/kg de peso corporal, de 1 mg a 100 mg/kg de peso corporal, de 1 mg a 80 mg/kg de peso corporal de 10 mg a 100 mg/kg de peso corporal, de 10 mg a 75 mg/kg de peso corporal o de 10 mg a 50 mg/kg de peso corporal. En determinadas formas de realización, la dosis del agente es de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal. En algunas formas de realización, la dosis del agente es de aproximadamente 0,5 mg/kg de peso corporal. En algunas formas de realización, la dosis del agente es de aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal. En algunas formas de realización, la dosis del agente es de aproximadamente 1,5 mg/kg de peso corporal. En algunas formas de realización, la dosis del agente es de aproximadamente 2 mg/kg de peso corporal. En algunas formas de realización, la dosis del agente es de aproximadamente 2,5 mg/kg de peso corporal. En algunas formas de realización, la dosis del agente es de aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal. En algunas formas de realización, la dosis del agente es de aproximadamente 7,5 mg/kg de peso corporal. En algunas formas de realización, la dosis del agente es de aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal. En algunas formas de realización, la dosis del agente es de aproximadamente 12,5 mg/kg de peso corporal. En algunas formas de realización, la dosis del agente es de aproximadamente 15 mg/kg de peso corporal. En determinadas formas de realización, la dosis se puede administrar una o más veces al día, semanalmente, mensualmente o anualmente. En determinadas formas de realización, el agente se administra una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez cada cuatro semanas.

[0306] En algunas formas de realización, un anticuerpo o un agente biespecífico se puede administrar en una dosis de "carga" inicial más alta, seguido por una o más dosis inferiores. En algunas formas de realización, la frecuencia de administración también puede cambiar. En algunas formas de realización, un régimen de dosificación puede comprender administrar una dosis inicial, seguida de dosis adicionales (o dosis de "mantenimiento") una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez al mes. Por ejemplo, un régimen de dosificación puede comprender la administración de una dosis de carga inicial, seguida de una dosis de mantenimiento semanal de, por ejemplo, la mitad de la dosis inicial. O un régimen de dosificación puede comprender la administración de una dosis de carga inicial, seguida de dosis de mantenimiento de, por ejemplo, la mitad de la dosis inicial cada dos semanas. O un régimen de dosificación puede comprender la administración de tres dosis iniciales durante 3 semanas, seguidas de dosis de mantenimiento de, por ejemplo, la misma cantidad cada dos semanas.

[0307] Como es conocido por los expertos en la técnica, la administración de cualquier agente terapéutico puede conducir a efectos secundarios y/o toxicidades. En algunos casos, los efectos secundarios y/o toxicidades son tan graves que impiden la administración del agente particular a una dosis terapéuticamente eficaz. En algunos casos, se debe suspender la terapia con medicamentos y se pueden probar otros agentes. Sin embargo, muchos agentes de la misma clase terapéutica a menudo muestran efectos secundarios y/o toxicidades similares, lo que significa que el paciente debe interrumpir la terapia o, si es posible, sufrir los efectos secundarios desagradables asociados con el agente terapéutico.

[0308] En algunas formas de realización, el programa de dosificación puede estar limitado a un número específico de administraciones o "ciclos". En algunas formas de realización, el agente se administra durante 3, 4, 5, 6 , 7, 8 o más ciclos. Por ejemplo, el agente se administra cada 2 semanas durante 6 ciclos, el agente se administra cada 3 semanas durante 6 ciclos, el agente se administra cada 2 semanas durante 4 ciclos, el agente se administra cada 3 semanas durante 4 ciclos, etc. Los expertos en la técnica pueden decidir y modificar posteriormente los calendarios de dosificación.

[0309] Los anticuerpos o agentes biespecíficos descritos en este documento pueden administrarse usando una estrategia de dosificación intermitente, que puede reducir los efectos y/o toxicidades secundarios asociados con la administración de un agente, agente quimioterapéutico, etc. En algunas formas de realización, la estrategia comprende intermitente de dosificación administrar una dosis inicial de un agente al sujeto y la administración de dosis posteriores del agente aproximadamente una vez cada 2 semanas. En algunas formas de realización, la estrategia de dosificación intermitente comprende administrar una dosis inicial de un agente al sujeto y administrar dosis posteriores del agente aproximadamente una vez cada 3 semanas. En algunas formas de realización, la estrategia de dosificación intermitente comprende administrar una dosis inicial de un agente al sujeto y administrar dosis posteriores del agente aproximadamente una vez cada 4 semanas. En algunas formas de realización, el agente se administra usando una estrategia de dosificación intermitente y el agente quimioterapéutico se administra semanalmente.

[0310] La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos o agentes biespecíficos descritos en este documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas formas de realización, las composiciones farmacéuticas encuentran uso en inmunoterapia. En algunas formas de realización, las composiciones encuentran uso para inhibir el crecimiento tumoral. En algunas formas de realización, las composiciones farmacéuticas encuentran uso para inhibir el crecimiento tumoral en un sujeto (p. ej., un paciente humano). En algunas formas de realización, las composiciones encuentran uso en el tratamiento del cáncer. En algunas formas de realización, las composiciones farmacéuticas encuentran uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto (p. ej., un paciente humano).

[0311] Las formulaciones se preparan para almacenamiento y uso combinando un anticuerpo o agente purificado de la presente invención con un vehículo farmacéuticamente aceptable (p. ej., un vehículo o excipiente). Los expertos en la técnica generalmente consideran que los vehículos, excipientes y/o estabilizadores farmacéuticamente aceptables son ingredientes inactivos de una formulación o composición farmacéutica.

[0312] Los vehículos adecuados farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a tampones no tóxicos tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; sales como cloruro de sodio; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes tales como cloruro de octadecil dimetilbencil amonio, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, fenol, alcohol butílico o bencílico, alquilo parabenos, tales como metil o propil parabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol y m-cresol; polipéptidos de bajo peso molecular (p. ej., menos de aproximadamente 10 residuos de aminoácidos); proteínas tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; carbohidratos tales como monosacáridos, disacáridos, glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes como EDTA; azúcares como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos tales como complejos Zn-proteína; y tensioactivos no iónicos como TWEEN o polietilenglicol (PEG). (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22a edición, 2012, Pharmaceutical Press, Londres).

[0313] Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse de diversas formas para el tratamiento local o sistémico. La administración puede ser tópica mediante parches epidérmicos o transdérmicos, ungüentos, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, aerosoles, líquidos y polvos; pulmonar por inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, incluso por nebulizador, intratraqueal e intranasal; oral; o parenteral incluyendo intravenoso, intraarterial, intratumoral, subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular (p. ej., inyección o infusión) o intracraneal (p. ej., intratecal o intraventricular).

[0314] La formulación terapéutica puede estar en forma de dosificación unitaria. Tales formulaciones incluyen tabletas, píldoras, cápsulas, polvos, gránulos, soluciones o suspensiones en agua o medios no acuosos, o supositorios. En composiciones sólidas tales como tabletas, el ingrediente activo principal se mezcla con un vehículo farmacéutico. Los ingredientes convencionales para formar comprimidos incluyen almidón de maíz, lactosa, sacarosa, sorbitol, talco, ácido esteárico, estearato de magnesio, fosfato dicálcico o gomas y diluyentes (p. ej., agua). Estos pueden usarse para formar una composición de preformulación sólida que contiene una mezcla homogénea de un compuesto de la presente invención, o una sal no tóxica farmacéuticamente aceptable del mismo. La composición de preformulación sólida se subdivide luego en formas de dosificación unitaria de un tipo descrito anteriormente. Los comprimidos, píldoras, etc. de la formulación o composición pueden recubrirse o componerse de otro modo para proporcionar una forma de dosificación que ofrezca la ventaja de una acción prolongada. Por ejemplo, la tableta o píldora puede comprender una composición interna cubierta por un componente externo. Además, los dos componentes pueden estar separados por una capa entérica que sirve para resistir la desintegración y permite que el componente interno pase intacto a través del estómago o se retrase su liberación. Puede usarse una variedad de materiales para tales capas o recubrimientos entéricos, tales materiales incluyen varios ácidos poliméricos y mezclas de ácidos poliméricos con materiales tales como goma laca, alcohol cetílico y acetato de celulosa.

[0315] Los anticuerpos o agentes biespecíficos descritos en este documento también pueden ser atrapados en microcápsulas. Tales microcápsulas se preparan, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (p. ej., liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, etc.). nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones como se describe en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22 a edición, 2012, Pharmaceutical Press, Londres.

[0316] En ciertas formas de realización, las formulaciones farmacéuticas incluyen un agente de la presente invención acomplejado con liposomas. Los expertos en la técnica conocen métodos para producir liposomas. Por ejemplo, algunos liposomas pueden generarse mediante evaporación en fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada por PEG (PEG-PE). Los liposomas pueden extruirse a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado.

[0317] En ciertas formas de realización, las preparaciones de liberación sostenida que comprenden los anticuerpos o agentes biespecíficos descritos en este documento pueden ser producidos. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen un agente, donde las matrices están en forma de objetos moldeados (p. ej., películas o microcápsulas). Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles como poli(2 -hidroxietilmetacrilato) o alcohol poli(vinílico), polilactidas, copolímeros de ácido L-glutámico y 7 etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), acetato isobutirato de sacarosa y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.

VI. Cribado

[0318] La presente divulgación proporciona métodos de cribado para identificar agentes TIGIT de unión que modulan la respuesta inmunitaria. En algunos casos, la presente divulgación proporciona métodos para seleccionar agentes candidatos, que incluyen, entre otros, polipéptidos, anticuerpos, péptidos, peptidomiméticos, moléculas pequeñas, compuestos u otros fármacos, que modulan la respuesta inmunitaria.

[0319] En algunos casos, un método de cribado de un agente de unión a TIGIT candidato que modula la respuesta inmunitaria comprende la determinación de si el agente tiene un efecto sobre las células inmunes. En algunos casos, un método de cribado de un agente de unión a TIGIT candidato que modula la respuesta inmunitaria comprende determinar si el agente es capaz de aumentar la actividad de las células inmunes. En algunos casos, un método de cribado de un agente de unión a TIGIT candidato que modula la respuesta inmunitaria comprende determinar si el agente es capaz de aumentar la actividad de las células citolíticas, tales como CTL y/o células NK. En algunos casos, un método de cribado de un agente de unión a TIGIT candidato que modula la respuesta inmunitaria comprende determinar si el agente es capaz de disminuir la actividad de las células inmunosupresoras, tales como Tregs o MDSC.

VII. Kits que comprenden agentes descritos en el presente documento

[0320] La presente descripción proporciona kits que comprenden los agentes de unión a TIGIT descritos en el presente documento y que se pueden utilizar para realizar los métodos descritos en este documento. En ciertos casos, un kit comprende al menos un agente purificado que se une a TIGIT en uno o más recipientes. En algunos casos, los kits contienen todos los componentes necesarios y/o suficientes para realizar un ensayo de detección, incluidos todos los controles, las instrucciones para realizar los ensayos y cualquier software necesario para el análisis y la presentación de resultados. Un experto en la técnica reconocerá fácilmente que los agentes de unión a TIGIT descritos de la presente invención pueden incorporarse fácilmente en uno de los formatos de kit establecidos que son bien conocidos en la técnica.

[0321] Además, se proporcionan kits que comprenden un agente de unión a TIGIT así como al menos un agente terapéutico adicional. En determinadas formas de realización, el segundo (o más) agente terapéutico es un agente quimioterapéutico. En determinadas formas de realización, el segundo (o más) agente terapéutico es un anticuerpo.

[0322] Las formas de realización de la presente divulgación se pueden definir adicionalmente mediante referencia a los siguientes ejemplos no limitantes, que describen en detalle la preparación de ciertos anticuerpos de la presente divulgación y métodos para usar anticuerpos de la presente divulgación. Resultará evidente para los expertos en la técnica que se pueden poner en práctica muchas modificaciones, tanto de materiales como de métodos, sin apartarse del alcance de la presente divulgación.

EJEMPLOS

Ejemplo 1

Generación de anticuerpos anti-TIGIT

[0323] Los anticuerpos anti-TIGIT se generaron utilizando el dominio extracelular de ratón TIGIT para inmunizar conejos. Los sobrenadantes se seleccionaron mediante citometría de flujo para determinar la unión de anticuerpos a TIGIT de ratón y TIGIT humano y se eligieron 9 clones de anticuerpos para una caracterización adicional (Figura 1). Los sobrenadantes de estos anticuerpos se examinaron por su capacidad para bloquear específicamente la interacción de TIGIT de ratón con su contrarreceptor, PVR de ratón. Se demostró que cuatro anticuerpos bloquean la interacción TIGIT/PVR. Es importante destacar que dos de estos anticuerpos pudieron unirse a TIGIT humano (313Rb1 y 313Rb2).

[0324] Las regiones variables de 313Rb1 de cadena pesada y de cadena ligera se clonaron en un formato de IgG1 de ratón para generar anticuerpo quimérico 313R11 y en un formato de IgG2a de ratón para generar anticuerpo quimérico 313R12. Las secuencias de las CDR de 313R11 y 313R12 son (i) CDR1 GSSLSSSYMS de cadena pesada (SEQ ID NO: 7), (ii) CDR2 IIGSNGNTYYANWAKG de cadena pesada (SEQ ID NO: 8), (iii) CDR3 GGYRTSGMDP de cadena pesada (SEQ ID NO: 9), (iv) CDR1 QASQSISSYLNW de cadena ligera (SEQ ID NO: 10), (v) CDR2 DALKLAS de cadena ligera (SEQ ID NO: 11) y (vi) CDR3 QQEHSVGNVDN de cadena ligera (SEQ ID n O: 12). La secuencia de la región variable de la cadena pesada de 313R11 y 313R12 es la SEQ ID NO: 17 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de 313R11 y 313R12 es la SEQ ID NO: 18. La secuencia de la cadena pesada de 313R11 es SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 26 (sin secuencia señal). La secuencia de la cadena pesada de 313R12 es SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 27 (sin secuencia señal). La secuencia de la cadena ligera de 313R11 y 313R12 es SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 28 (sin secuencia señal).

[0325] Las regiones variables de 313Rb2 de cadena pesada y de cadena ligera se clonaron en un formato de IgG1 humana para generar anticuerpo 313R14. Las CDR se modificaron para aumentar la afinidad por TIGIT humano y las regiones marco se optimizaron y/o humanizaron generando varias variantes, incluyendo 313R19. Las secuencias de las CDR de 313R14 y 313R19 son (i) CDR1 GFSLSSSYMS de cadena pesada (SEQ ID NO: 13), (ii) CDR2 IIGSNGNTYYANWAKG de cadena pesada (SEQ ID NO: 8), (iii) CDR3 GGYRTSGMDP de cadena pesada (SEQ ID NO: 9), (iv) CDR1 QASQSNIYSDLAW de cadena ligera (SEQ ID NO: 14) o QASQNIYSDLAW (SEQ ID NO: 81), (v) CDR2 RASTLAS de cadena ligera (SEQ ID NO: 15) y (vi) CDR3 QQEHLVAWIYN de cadena ligera (SEQ ID NO: 16). La secuencia de la región variable de la cadena pesada de 313R14 es la SEQ ID NO: 19 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de 313R14 es la SEQ ID NO: 20. La secuencia de la región variable de la cadena pesada de 313R19 es la SEQ ID NO: 32 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de 313R19 es la SEQ ID NO: 20. La secuencia de la cadena pesada de 313R14 es SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 29 (sin secuencia señal). La secuencia de la cadena pesada de 313R19 es SEQ ID NO: 33 o SEQ ID NO: 34 (sin secuencia señal). La secuencia de la cadena ligera de 313R14 y 313R19 es SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 30 (sin secuencia señal).

[0326] Se depositó un plásmido que codifica un polipéptido que comprende la región variable de la cadena pesada del anticuerpo 313R19 en la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, EE. UU, bajo las condiciones del Tratado de Budapest el 27 de mayo. 2015 y designado PTA-122180. Un plásmido que codifica un polipéptido que comprende la región variable de cadena ligera del anticuerpo 313R19 se depositó en ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA, EE. UU, en las condiciones del Tratado de Budapest el 27 de mayo de 2015, y se denominó PTA-122181.

Ejemplo 2

Señalización de TIGIT y fosforilación de TIGIT

[0327] Como se describe en el presente documento, TIGIT se fosforila en su cola citoplásmica después de la interacción con su contrarreceptor PVR. La fosforilación de TIGIT es el comienzo de una cascada que incluye eventos corriente abajo que afectan a otras vías de señalización conocidas. Por lo tanto, la evaluación de la fosforilación de TIGIT, así como el estado de fosforilación de las proteínas posteriores, puede proporcionar información sobre la función de TIGIT y el efecto de un antagonista de TIGIT.

[0328] La línea de células T humana Jurkat CD4+ carece de expresión TIGIT humano o murino como se determinó por PCR en tiempo real y por FACS (datos no mostrados). Para generar una línea celular que expresa TIGIT, se infectaron células Jurkat con un constructo de lentivirus que expresa TIGIT murino (mTIGIT) marcado con FLAG y proteína verde fluorescente (GFP). La línea celular de linfoma murino E.G7-OVA carece de expresión de PVR humano o murino según se determina por PCR en tiempo real y/o por FACS. Las células E.G7-OVA sintetizan y secretan ovoalbúmina (OVA) constitutivamente y C57BL/6 ratones inmunizados con células E.G7-OVA dan lugar a linfocitos citotóxicos restringidos a H-2 Kb específico para el péptido OVA 258-276. Para generar una línea celular que expresa PVR, se infectaron células E.G7-OVA con una construcción de lentivirus que expresa PVR murino (mPVR) y GFP. Las células positivas para GFP de cada línea celular infectada se clasificaron en placas de 96 pocillos usando un instrumento FACSAria II (BD Biosciences) y las células individuales aisladas se expandieron en clones. La positividad de GFP y la expresión de mTIGIT o mPVR se confirmaron en los clones derivados de células individuales mediante análisis FACS y PCR en tiempo real (datos no mostrados).

[0329] Para evaluar la fosforilación de TIGIT en respuesta a PVR, las líneas celulares se incubaron en medio sin suero durante 2 horas a 37°C. Se mezclaron células Jurkat-mTIGIT con células E.G7-OVA parentales o células E.G7-OVA-mPVR en una proporción celular de 5:1 y se incubaron durante 5 minutos a 37°C en presencia de un inhibidor de tirosina fosfastasa (10 mM ortovanadato de sodio, New England Biolabs). Se prepararon lisados celulares y se inmunoprecipitaron con cuentas magnéticas recubiertas con anti-FLAG que capturaron las proteínas mTIGIT marcadas con FLAG. Los inmunoprecipitados se evaluaron mediante análisis de transferencia Western. La presencia de TIGIT fosforilado se evaluó utilizando un anticuerpo anti-fosfotirosina (Cell Signaling Technology). La presencia de TIGIT total se evaluó utilizando un anticuerpo anti-FLAG (tecnología de señalización celular).

[0330] Se observó TIGIT estar fuertemente fosforilada en las células T en respuesta a las células tumorales MPVR expresan en comparación con células que no expresan PVR (Figura 2A).

[0331] Para evaluar otras vías de señalización potencialmente afectadas por TIGIT, las líneas celulares se incubaron en medio libre de suero durante 2 horas a 37°C. Las células Jurkat-mTIGIT se combinaron con células E.G7-OVA parentales o células E.G7-OVA-mPVR en una proporción de células 5:1 y se incubaron a 37°C durante 0, 5, 15, 45 o 60 minutos. Se prepararon lisados celulares y se evaluaron mediante análisis de transferencia Western. Los niveles de SHP1 fosforilado (tirosina fosfatasa 1 que contiene SH2) y Erk1/2 se determinaron utilizando un anticuerpo antifosfo SHP1 (TyR564) y un anticuerpo anti-fosfo Erk1/2 (Thr202/Tyr204), respectivamente (ambos de Cell Signaling Technology). El nivel de Erk1/2 total se evaluó utilizando un anticuerpo anti-Erk1/2 (tecnología de señalización celular). SHP1 es un importante regulador negativo de las vías de transducción de señales mediadas por citocinas, incluida la vía JAK/STAT, mientras que Erk1/2 son proteínas quinasas que participan en la cascada de transducción de señales Ras-Raf-MEK-ERK.

[0332] Como se muestra en la Fig. 2B, SHP1 y Erk1/2 se activaron específicamente cuando se incubaron células T de expresión de TIGIT con células tumorales de expresión de MPVR. La activación indicada por la fosforilación se observó ya en el punto de tiempo de 5 minutos y pareció comenzar a disminuir en 45 minutos para Erk1/2 y en 60 minutos para SHP1. SHP1 y Erk1/2 no se activaron en respuesta a mPVR en las células T Jurkat parentales que no expresaban mTIGIT (datos no mostrados).

[0333] Para estudiar si los antagonistas TIGIT inhibirían la actividad TIGIT, un ensayo de fosforilación TIGIT se llevó a cabo en la presencia de anticuerpos anti-TIGIT. Como se describió anteriormente, las células Jurkat-mTIGIT se mezclaron con células E.G7-OVA parentales o células E.G7-OVA-mPVR en una proporción celular de 5:1 y se incubaron durante 5 minutos a 37°C en presencia de ortovanadato de sodio 10 mM y 20 pg/ml de anticuerpo de control (IgG policlonal murina; Sigma), anticuerpo anti-TIGIT 313R11, anticuerpo anti-TIGIT 313R12 o anticuerpo anti-TIGIT 313Rb1. Se prepararon lisados celulares y se inmunoprecipitaron con cuentas magnéticas recubiertas con anti-FLAG que capturaron las proteínas mTIGIT marcadas con FLAG. Los inmunoprecipitados se evaluaron mediante análisis de transferencia Western. La presencia de TIGIT fosforilado se evaluó utilizando un anticuerpo anti-fosfotirosina. La presencia de TIGIT total se evaluó utilizando un anticuerpo anti-FLAG.

[0334] Como se muestra anteriormente, mTIGIT fue fuertemente fosforilado cuando se combinaron las células T Jurkat que expresan mTIGIT con células tumorales que expresan MPVR. La fosforilación de mTIGIT en respuesta a la interacción con mPVR se redujo y/o anuló cuando las células se incubaron en presencia de los anticuerpos anti-TIGIT. La disminución de la fosforilación de TIGIT fue más sorprendente con el anticuerpo anti-TIGIT 313R12 (Figura 3).

[0335] Se llevaron a cabo experimentos adicionales para estudiar si antagonistas TIGIT inhibirían la señalización TIGIT. De manera similar a los estudios descritos en este documento, las células Jurkat-mTIGIT se mezclaron con células E.G7-OVA parentales o células E.G7-OVA-mPVR en una proporción celular de 5:1 y se incubaron durante 15 minutos a 37°C en presencia de concentraciones crecientes (0-40 pg/ml) de anticuerpo anti-TIGIT 313R11, anticuerpo anti-TIGIT 313R12 o anticuerpo anti-TIGIT 313Rb1. Los lisados celulares se prepararon y evaluaron mediante análisis de transferencia Western. Se determinaron SHP1 fosforilada (tirosina fosfatasa 1 que contiene SH2) y Erk1/2 fosforilada usando un anticuerpo anti-fosfo SHP1 (TyR562) y un anticuerpo anti-fosfo Erk1/2 (Thr202/Tyr204), respectivamente. El nivel de SHP1 total se evaluó usando un anticuerpo anti-SHP1. El nivel de Erk1/2 total se evaluó usando un anticuerpo anti-Erk1/2.

[0336] La fosforilación de Erk1/2 en respuesta a la interacción mTIGIT-mPVR fue claramente inhibida por los anticuerpos anti-TIGIT de una manera dependiente de la dosis (Figura 4). La fosforilación de SHP1 en respuesta a la interacción mTIGIT-mPVR fue inhibida por el anticuerpo anti-TIGIT 313Rb1 y 313#11 de una manera dependiente de la dosis. En el experimento mostrado, el anticuerpo 313R12 pareció tener solo un efecto débil sobre la fosforilación de SHP1.

[0337] Estos resultados sugieren fuertemente que los anticuerpos anti-TIGIT inhiben la función TIGIT y afectan las vías de señalización corriente abajo.

Ejemplo 3

Inhibición de TIGIT de la producción de citoquinas

[0338] Hibridoma de células T B3Z86/90.14 (B3Z) expresa de forma estable un receptor de células T (TCR) específico de OVA H-2Kb. Se infectaron células B3Z con una construcción de lentivirus que expresaba TIGIT murino (mTIGIT) y se generó un clon de mTIGIT derivado de una única célula (B3Z-mTIGIT). La línea celular de linfoma murino E.G7-OVA expresa OVA de manera estable y puede activar el TCR específico de OVA en las células B3Z, lo que da como resultado la secreción de IL-2. Para determinar el efecto de las interacciones mTIGIT/mPVR sobre la secreción de IL-2 específica de antígeno, se incubaron células B3Z parentales o células B3Z-mTIGIT con células E.G7-OVA o E.G7-OVA-mPVR parentales (descritas anteriormente, ver Ejemplo 2) en una proporción de 2:1 en placas de 12 pocillos. Después de 24 horas, se midieron las concentraciones de IL-2 en sobrenadantes de cultivos libres de células mediante ELISA (R&D Systems). Los datos se expresan como la proporción de secreción de IL-2 por las células T B3Z o B3Z-mTIGIT parentales en respuesta a células tumorales que expresan mPVR en comparación con la secreción de IL-2 en respuesta a células tumorales negativas para mPVR.

[0339] Para las células T B3Z parentales, la secreción de IL-2 era similar, independientemente de la expresión de MPVR sobre las células tumorales OVA presentadoras (es decir, una relación de aproximadamente 1,0). Por el contrario, la secreción de IL-2 de las células T B3Z-mTIGIT fue menor en presencia de células tumorales que expresan mPVR que en presencia de células tumorales negativas para mPVR (es decir, una proporción <1,0) (Figura 5A). Cuando se pretrataron células T B3Z-mTIGIT con 20 pg/ml de anticuerpo anti-TIGIT 313R11 o 313R12 antes del cocultivo con células E.G7-OVA, la producción de IL-2 ya no se inhibió (Figura 5B).

[0340] Estos resultados sugieren que la activación de mTIGIT por la activación de células T MPVR inhibe en respuesta al antígeno como se evidencia por la disminución de la producción de IL-2. Además, el bloqueo de TIGIT con un antagonista de TIGIT inhibe la activación de TIGIT y parece reducir la inhibición asociada a TIGIT de la actividad de las células T como se ve por la fuerte producción de IL-2. Estos datos apoyan la teoría de que la inhibición de TIGIT puede "liberar el freno" de la supresión de células T y mejorar las respuestas inmunes.

Ejemplo 4

Inhibición de TIGIT de citotoxicidad de células NK

[0341] La línea de células asesinas humanas NK-92 (NK) se infectó con un mTIGIT de expresión del constructo de lentivirus etiquetado con FLAG y GFP y una línea celular clonal (NK-92-mTIGIT) se derivó como se describió anteriormente. La línea de células B humanas 721,221 se infectó con una construcción de lentivirus que expresaba mPVR y GFP y se generó una línea celular clonal (721,221-mPVR). Se confirmó que las células 721,221 parentales carecen de expresión de PVR humano o murino mediante FACS y PCR en tiempo real (datos no mostrados). La capacidad de las células NK-92 parentales o las células NK-92-mTIGIT para lisar las células tumorales 721,221 o 721,221-mPVR parentales se ensayó en un ensayo estándar de liberación de calceína de 4 horas. Las células NK-92 o NK-92-mTIGIT se sembraron en placas con fondo en V de 96 pocillos. Las células diana 721,221 o 721 -221 -mPVR se marcaron con calceína AM 10 pM (Life Technologies) durante 1 hora a 37°C y luego se combinaron con las células NK-92 en una relación efector:diana de 25:1 o 12:1. Después de una incubación de 4 horas a 37°C, se recogieron los sobrenadantes libres de células y se cuantificó la liberación de calceína en un fluorímetro a una excitación de 485 nm y una emisión de 535 nm. En un experimento de seguimiento, las células NK-92 y la NK-92-mTIGIT se incubaron en presencia de 20 pg/ml de anticuerpo anti-TIGIT 313R11, anticuerpo 313R12 o un anticuerpo de control durante X minutos. A continuación, las células se utilizaron en un ensayo de liberación de calceína como se describió anteriormente.

[0342] El porcentaje de lisis celular específica se determina como: % de lisis = 100 X (ER-SR)/(MR-SR), donde ER, SR, y MR representan liberación de calceína experimental, espontánea y máxima, respectivamente. La liberación espontánea es la fluorescencia emitida por las células diana incubadas en medio solo (es decir, en ausencia de células efectoras), mientras que la liberación máxima se determina lisando las células diana con un volumen igual de SDS al 10%. Los datos se presentan como la relación entre la citotoxicidad de las células NK-92 (parentales o NK-92-mTIGIT) frente a las células diana 721,221-mPVR y la citotoxicidad de las células NK-92 (parentales o NK-92-mTIGIT) frente a las células diana parentales 721,221 (mPVR-negativas).

[0343] Como se muestra en la Figura 6A, para células parentales NK-92, la citotoxicidad contra células diana 721,221 MPVR-positivas y MPVR-negativas fue similar (es decir, una relación de aproximadamente 1,0). Por el contrario, para las células NK-92-mTIGIT, la citotoxicidad frente a las células 721,221-mPVR disminuyó en comparación con la citotoxicidad frente a la línea de células parentales 721,221 mPVR-negativas (es decir, una relación de <1,0). No hubo diferencia en los resultados cuando la relación efector: objetivo fue de 25:1 o 12:1. Cuando se trataron células NK-92 o NK-92-mTIGIT con anticuerpo anti-TIGIT 313R11 o anticuerpo 313R12 antes de su uso en ensayos de citotoxicidad, la inhibición de la citotoxicidad mediada por células se redujo y/o anuló (Figura 6B).

[0344] Estos resultados sugieren que la activación de mTIGIT por MPVR inhibe la citotoxicidad mediada por células NK. Es importante destacar que los resultados demuestran que un antagonista de TIGIT puede interferir con la interacción PVR-TIGIT y conducir a una restauración o "liberar el freno" de las capacidades citotóxicas de las células NK.

Ejemplo 5

La inhibición del crecimiento tumoral in vivo por el anticuerpo anti-TIGIT

[0345] La línea de tumor de colon murino CT26.WT se implantó por vía subcutánea (30.000 células/ratón) en los flancos posteriores de ratones Balb/c de 6-8 semanas de edad. Los tumores se dejaron crecer durante 10 días hasta que alcanzaron un volumen de aproximadamente 50 mm3. Los ratones se trataron con 0,25 mg/ratón de anticuerpo anti-TIGIT 313R11 (anticuerpo mIgG1), anticuerpo anti-TIGIT 313R12 (anticuerpo mIgG2a), un anticuerpo de control mIgG1 o un anticuerpo de control mIgG2a (n=10 por grupo para anticuerpos de control y 20 por grupo para la prueba de anticuerpos). A los ratones se les administró una inyección intraperitoneal dos veces por semana durante tres semanas. El crecimiento tumoral se controló y los volúmenes tumorales se midieron con calibradores electrónicos en los días 10, 15, 18, 22, 25, y 29.

[0346] Como se muestra en la Figura 7A, crecimiento tumoral inhibido por anticuerpo anti-TIGIT 313R12 en casi un 75% en comparación a un anticuerpo de control de isotipo coincidente. Los tumores en nueve ratones habían retrocedido a niveles indetectables el día 29. El anticuerpo anti-TIGIT 313R11 inhibió el crecimiento tumoral solo en aproximadamente un 15% en comparación con un anticuerpo de control de isotipo coincidente. Los anticuerpos 313R11 y 313R12 difieren solo por sus isotipos IgG, ya que 313R12 es un anticuerpo IgG2a y 313R11 es un anticuerpo IgG1. Estos resultados sugieren que el isotipo del anticuerpo puede tener un efecto significativo sobre la eficacia terapéutica de los anticuerpos anti-TIGIT. Se sabe que los anticuerpos IgG2 de ratón (equivalentes a los anticuerpos IgG 1 humanos) tienen una actividad ADCC aumentada en comparación con los anticuerpos IgG1 de ratón (equivalente a IgG2 humana) y esta característica biológica puede desempeñar un papel en el fuerte efecto antitumoral del anticuerpo 313R12.

[0347] El experimento se repitió con el anticuerpo anti-TIGIT 313R12 y un anticuerpo de control mIgG2a. Como se describió anteriormente, se implantaron células CT26.WT por vía subcutánea (30.000 células/ratón) en los flancos traseros de ratones Balb/c de 6-8 semanas de edad. Los tumores se dejaron crecer durante 7 días hasta que alcanzaron un volumen de aproximadamente 55 mm3. Los ratones se trataron con 0,25 mg/ratón de anticuerpo anti-TIGIT 313R12 o un anticuerpo de control mIgG2a (n=10 por grupo). Los ratones se dosificaron mediante inyección intraperitoneal dos veces por semana durante 3 semanas. El crecimiento tumoral se controló y los volúmenes tumorales se midieron con calibradores electrónicos en los días 7, 14, 17, 21,25, 28, y 31.

[0348] Como se observa en el estudio anterior, el anticuerpo de anti-TIGIT inhibió el crecimiento 313R12 de los tumores CT26.WT, con inhibición del crecimiento tumoral observada en los diez ratones (Figura 7B). Además, los tumores en 9 de los 10 ratones tratados con el anticuerpo 313R12 retrocedieron del tamaño del tumor original con 8 tumores retrocediendo a niveles indetectables después de 2 semanas de tratamiento. En este estudio, hubo tres tumores que retrocedieron en el grupo de control de anticuerpos IgG2, pero se sabe que la regresión tumoral puede ocurrir en ratones inmunocompetentes no tratados, especialmente si el número inicial de células tumorales es bajo. Sin embargo, la inhibición completa del crecimiento y/o la regresión del tumor en el grupo tratado con el anticuerpo 313R12 demostró que el tratamiento con un anticuerpo anti-TIGIT tuvo un efecto terapéutico significativo y que esto puede atribuirse a la modulación y/o mejora de la respuesta inmunitaria del sujeto.

[0349] La inmunoterapia exitosa contra el cáncer incluirá la generación de inmunidad anti-tumor a largo plazo. Para estudiar si se había establecido la inmunidad a largo plazo, los ratones de los estudios descritos en el presente documento que tenían tumores CT26.WT que retrocedían a niveles indetectables después del tratamiento con anticuerpos anti-TIGIT se desafiaron con células tumorales CT26.WT frescas. Se inyectaron once ratones con regresión tumoral completa con un número aumentado de células CT26.WT (60.000 células/ratón) el día 132 (102 días después de la última dosis de anticuerpo anti-TIGIT 313R12). Como control, se inyectaron 10 ratones sin tratamiento previo con células CT26.WT con el mismo número de células CT26.WT. Los ratones no se trataron, se controló el crecimiento del tumor y se midieron los volúmenes de los tumores con calibradores electrónicos.

[0350] En el grupo de control, los 10 ratones desarrollaron tumores grandes antes del día 23 y fueron sacrificados. Por el contrario, no crecieron tumores en 10 de los ratones que habían rechazado previamente los tumores CT26.WT. El ratón restante desarrolló un pequeño crecimiento tumoral 14 días después de la inyección, pero el tumor había retrocedido por completo el día 21. Estos 11 ratones fueron reexpuestos por segunda vez con 150.000 células CT26.WT (5 veces el número de células de la dosis inicial). De nuevo como control, se inyectaron 10 ratones sin tratamiento previo con células CT26.WT con el mismo número de células CT26.WT (150.000 células/ratón). Como en el experimento anterior, los 10 ratones del grupo de control desarrollaron tumores grandes y fueron sacrificados el día 22. No crecieron tumores en 6 de los ratones y 2 ratones adicionales desarrollaron tumores pequeños que retrocedieron por completo el día 22. Los otros 3 ratones habían pequeños tumores que parecían estar retrocediendo o estabilizados. Estos resultados se resumen en la Tabla 3 y se presentan como el porcentaje de ratones libres de tumor en cada grupo.

Tabla 3

[0351] Estos resultados indican que el tratamiento con un anticuerpo anti-TIGIT puede generar una respuesta antitumoral fuerte y eficaz. Es importante destacar que la respuesta antitumoral pareció dar como resultado una inmunidad y protección a largo plazo contra las células tumorales.

Ejemplo 6

Actividad efectora de anticuerpos anti-TIGIT IgG2

[0352] Se ha demostrado que la glicosilación de la región IgG-Fc es esencial para la expresión óptima de actividades biológicas mediadas por FcyRI, FcyII, FcyRIII y el componente C1q del complemento (es decir, ADCC y CDC). Por ejemplo, el sitio de glicosilación de la cadena pesada de un anticuerpo lgG2a de ratón está en la asparagina 314 de SEQ ID NO: 22. La sustitución de la asparagina por un residuo de alanina da como resultado la desglicosilación del anticuerpo y una actividad de ADCC reducida. Se generó una variante desglicosilada del anticuerpo anti-TIGlT 313R12 que comprendía un residuo de alanina en la posición 314 y se denominó 313R13.

[0353] La actividad de anticuerpo anti-TIGlT 313R13 se comparó con anticuerpo anti-TIGlT 313R12 para estudiar el efecto de la desglicosilación en la actividad anti-tumor. Se implantaron células CT26.WT (30.000 células/ratón) en los flancos posteriores de ratones Balb/c de 6-8 semanas de edad. Los tumores se dejaron crecer durante 10 días hasta que alcanzaron un volumen de aproximadamente 50 mm3. Los ratones se trataron con 0,25 mg/ratón de anticuerpo anti-TIGlT 313R12, anticuerpo anti-TIGlT 313R13 o un anticuerpo de control mlgG2a (n=10 por grupo para el anticuerpo de control y 20 por grupo para los anticuerpos de prueba). A los ratones se les administró una inyección intraperitoneal dos veces por semana durante tres semanas. El crecimiento tumoral se controló y los volúmenes tumorales se midieron con calibradores electrónicos en los días 7, 10, 14, 17, y 21.

[0354] Como se muestra en la Figura 8, el anticuerpo anti-TIGlT 313R12 mostró una inhibición significativa del crecimiento tumoral en comparación con el isotipo control emparejado. Por el contrario, el anticuerpo anti-TIGlT desglicosilado 313R13 no mostró actividad antitumoral significativa.

[0355] Como se cree que el anticuerpo desglicosilado habría limitado o no la actividad de ADCC, estos resultados sugieren que ADCC puede jugar un papel importante en la fuerte actividad anti-tumoral de anticuerpo anti-TIGlT 313R12.

Ejemplo 7

Ensayos de ELISpot para IFN-gamma, lL-2, lL-4 e lL-10

[0356] ELISpot es un inmunoensayo altamente sensible para la detección de células secretoras de citocinas. Brevemente, un ensayo ELISpot emplea un anticuerpo de captura específico para una citoquina deseada, recubierta previamente en los pocillos de una microplaca. Las células estimuladas se dispersan en los pocillos y el anticuerpo inmovilizado en la vecindad inmediata de cualquier célula secretora de citocinas se une a la citocina secretada. A continuación, siguen los pasos de lavado estándar y la incubación con los reactivos de detección adecuados. Por ejemplo, se usa comúnmente una combinación de un anticuerpo de detección biotinilado seguido de estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina y una solución de sustrato coloreada. Se forma un precipitado coloreado en los sitios de localización de las citocinas y aparece como una mancha, y cada mancha individual representa una célula secretora de citocinas individual. Los puntos pueden contarse con un sistema de lectura automatizado o manualmente usando un microscopio. En algunas formas de realización, se captura una imagen de cada pocillo usando un sistema de lector automatizado, y los puntos totales, el área del punto o la densidad óptica total (TOD) se utilizan para la cuantificación.

[0357] Se detectaron células secretoras de IFN-gamma utilizando un kit IFN-gamma ELISpot de ratón (Mabtech). Se aislaron células de los bazos de ratones portadores de tumor CT26.WT tratados con anticuerpo anti-TIGlT 313R12 (n=6) o un anticuerpo de control de isotipo emparejado (n=6) (ver Ejemplo 5). Se dispensaron esplenocitos (5 X 105/pocillo) de cada ratón en cada grupo de tratamiento en una placa de 96 pocillos recubierta con un anticuerpo específico para IFN-gamma de ratón. Las células se cultivaron en presencia o ausencia del péptido AH-1 de células T c D8+ específico de tumor y se incubaron durante 48 horas. El péptido AH-1 (SPSYVYHQF; SEQ ID NO: 31) es un epítopo restringido por H2-Ld de la proteína de la envoltura gp70 de un provirus ecotrópico de leucemia murina endógeno a la línea celular CT26.WT. Las células que secretan IFN-gamma se detectaron siguiendo las instrucciones del fabricante. Las imágenes se capturaron utilizando un instrumento Bioreader 6000-Fz (BioSys) y el número de punto, el área del punto y se determinó la densidad óptica total. Los resultados se muestran como densidad óptica total y los datos se expresan como media ± S.E.M.

[0358] Como se muestra en la Figura 9A, las células secretoras de IFN-gamma aumentaron significativamente en ratones tratados con anticuerpo anti-TIGlT 313R12 en comparación con ratones tratados con anticuerpo de control. Es importante destacar que las células secretoras de IFN-gamma aumentaron solo en presencia del péptido AH-1. Estos resultados indican que el anticuerpo anti-TIGlT 313R12 activó células T CD8+ específicas de tumor. La activación puede ser directa o indirecta, es decir, una inhibición de las células supresoras.

[0359] Se detectaron células secretoras de lL-2 usando un kit de ELISpot ratón lL-2 (Mabtech). Se aislaron células de los bazos de ratones portadores de tumores tratados con anticuerpo anti-TIGlT 313R12 (n=6) o un anticuerpo de control de isotipo coincidente (n=6). Se dispensaron esplenocitos (5 X 105/pocillo) de cada ratón en cada grupo de tratamiento en una placa de 96 pocillos recubierta con un anticuerpo específico para lL-2 de ratón. Las células se incubaron durante 48 horas. Las células que secretan lL-2 se detectaron siguiendo las instrucciones del fabricante. Las imágenes se capturaron utilizando un instrumento Bioreader 6000-Fz (BioSys) y se determinaron el número de puntos, el área de puntos y la densidad óptica total. Los resultados se muestran como densidad óptica total y los datos se expresan como media ± S.E.M. Como se muestra en la Figura 9B, las células secretoras de lL-2 disminuyeron ligeramente en los ratones tratados con el anticuerpo anti-TIGIT 313R12 en comparación con los ratones tratados con un anticuerpo de control. Las células secretoras de IL-2 disminuyeron a un nivel equivalente en presencia o ausencia del péptido AH-1.

[0361] Se detectaron células secretoras de IL-4 usando un kit IL-4 ELISPOT de ratón (Mabtech). Se aislaron células de los bazos de ratones portadores de tumores tratados con anticuerpo anti-TIGIT 313R12 (n=6) o un anticuerpo de control de isotipo coincidente (n=6). Se dispensaron esplenocitos (5 X 105/pocillo) de cada ratón dentro de cada grupo de tratamiento en una placa de 96 pocillos recubierta con un anticuerpo específico para IL-4 de ratón. Las células se incubaron durante 48 horas. Las células que secretan IL-4 se detectaron siguiendo las instrucciones del fabricante. Las imágenes se capturaron utilizando un instrumento Bioreader 6000-Fz (BioSys) y se determinaron el número de puntos, el área de puntos y la densidad óptica total. Los resultados se muestran como densidad óptica total y los datos se expresan como media ± S.E.M. Como se muestra en la Figura 9C, las células secretoras de IL-4 disminuyeron significativamente en los ratones tratados con el anticuerpo anti-TIGIT 313R12 en comparación con los ratones tratados con un anticuerpo de control.

[0363] Se detectaron células secretoras de IL-10 usando un kit IL-10 ELISPOT de ratón (Mabtech). Se aislaron células de los bazos de ratones portadores de tumores tratados con anticuerpo anti-TIGIT 313R12 (n=6) o un anticuerpo de control de isotipo coincidente (n=6). Se dispensaron esplenocitos (5 X 105/pocillo) de cada ratón dentro de cada grupo de tratamiento en una placa de 96 pocillos recubierta con un anticuerpo específico para IL-10 de ratón. Las células se incubaron durante 48 horas. Las células que secretan IL-10 se detectaron siguiendo las instrucciones del fabricante. Las imágenes se capturaron utilizando un instrumento Bioreader 6000-Fz (BioSys) y se determinaron el número de puntos, el área de puntos y la densidad óptica total. Los resultados se muestran como densidad óptica total y los datos se expresan como media ± S.E.M.

[0364] Como se muestra en la Figura 9D, las células secretoras de IL-10 disminuyeron significativamente en los ratones tratados con el anticuerpo anti-TIGIT 313R12 en comparación con los ratones tratados con un anticuerpo de control.

[0365] El IFN-gamma es producido generalmente por células NK, células T Th1 CD4+, células T CD8+, células presentadoras de antígenos y células B. Los estudios han sugerido un papel del IFN-gamma en la inmunidad tumoral y que puede ser un regulador de la actividad antitumoral mediada por otras citocinas, en particular IL-12 e IL-2. Por tanto, el tratamiento con un anticuerpo anti-TIGIT que da como resultado un aumento de IFN-gamma debería potenciar la inmunidad antitumoral.

[0366] La IL-4 es producida por células Th2 CD4+ e induce la diferenciación de células T CD4+ vírgenes a células Th2. Además, IL-4 inhibe la generación de células Th1, inhibe la producción de citocinas Th1 como TNF-alfa e IL-12 e inhibe la activación de macrófagos. La IL-10 generalmente es producida por Treg y células T auxiliares. La IL-10 se reconoció originalmente como una citocina Th2 que modula el crecimiento y/o la diferenciación de las células inmunitarias innatas y que suprime la activación y las funciones efectoras de las células T, particularmente las células T citotóxicas. Más recientemente, se ha demostrado que la IL-10 tiene algunos efectos inmunoestimuladores y, por tanto, se considera que tiene funciones pleiotrópicas. La disminución significativa en las células productoras de IL-4 e IL-10 de ratones tratados con un anticuerpo anti-TIGIT en el presente estudio sugiere que dirigirse a TIGIT puede resultar en la inhibición de las respuestas Th2 y puede inhibir las funciones de Tregs y/o Treg.

Ejemplo 8

Ensayos de citotoxicidad celular

[0367] Para ensayos de citotoxicidad de células T, se recogieron las células de los bazos de los ratones portadores de tumores CT26.WT descritos anteriormente (Ejemplo 5). Las células se sembraron en placas con fondo en V de 96 pocillos en medio de cultivo RPMI 1640 (Gibco/Life Technologies, Grand Island, NY) suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10% (v/v), L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina (Gibco). Las células diana CT26.WT se marcaron con calceína AM 10 pM (Life Technologies) durante 1 hora a 37°C y luego se combinaron con los esplenocitos en una relación efector:diana (E:T) de 50:1. Después de una incubación de 4 horas a 37°C, se recogieron los sobrenadantes libres de células y se cuantificó la liberación de calceína en un fluorómetro a una excitación de 485 nm y una emisión de 535 nm. El porcentaje de lisis celular específica se determinó como: % de lisis = 100 X (ER-SR)/(MR-SR), donde ER, SR y MR representan la liberación de calceína experimental, espontánea y máxima, respectivamente. La liberación espontánea es la fluorescencia emitida por las células diana incubadas en medio solo (es decir, en ausencia de células efectoras), mientras que la liberación máxima se determina lisando las células diana con un volumen igual de SDS al 10%.

[0368] Como se muestra en la Figura 10, las células T citotóxicas CD8+ a partir de ratones portadores de tumor CT26.WT demostraron un aumento de la capacidad de matar células diana CT26.WT cuando los ratones habían sido tratados con anticuerpo anti-TIGIT 313R12 en comparación con células de ratones tratados con anticuerpo de control.

[0369] Estos resultados sugieren que un anticuerpo anti-TIGIT puede aumentar la actividad de células T citotóxicas específicas de antígeno y por lo tanto mejorar las respuestas inmunes anti-tumorales. Este aumento de la actividad de las células T citotóxicas puede deberse a un efecto directo o indirecto del anticuerpo anti-TIGIT, es decir, inhibiendo el efecto de las células supresoras.

Ejemplo 9

Ensayo de células T reguladoras (Treg)

[0370] Las células T reguladoras (Tregs) desempeñan un papel esencial en el mantenimiento de la homeostasis y la prevención de respuestas autoinmunes. Las Treg son un pequeño subconjunto de células T, la mayoría de las cuales son células CD4+ y expresan CD25 (una cadena alfa del receptor de IL-2) y otros marcadores moleculares relacionados con las células Treg. Se ha reconocido que Foxp3, un factor de transcripción, es un factor para el desarrollo y la función de las células Treg. Foxp3 se ha considerado un marcador específico para definir e identificar células T reg y para separar T regs de otras subpoblaciones de células T. Sin embargo, la especificidad de Foxp3 para Tregs ha sido desafiada en células humanas. Además de las células Treg CD4+, las células Treg CD8+ representan otra subpoblación celular y Foxp3 puede no ser tan crucial para su desarrollo y función en comparación con las células Treg CD4+.

[0371] La funcionalidad de Tregs en ratones tratados con un anticuerpo anti-TIGIT se evaluó determinando el efecto Tregs tenía sobre la proliferación de células T naive CD4+ o CD8+. Se purificaron células T naive de los bazos de ratones no tratados usando una columna de enriquecimiento de células T CD3+ de ratón (R&D Systems). Estas células T purificadas se marcaron con colorante de seguimiento violeta 5 pM (VTD; Life Technologies). Se incubaron 2 X 105 células T marcadas con VTD con cuentas recubiertas con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 para estimular la proliferación celular. Se aislaron T reg de los bazos de ratones portadores de tumor CT26.WT (ver Ejemplo 5) tratados con anticuerpo anti-TIGIT 313R12 (n=6) o un anticuerpo de control de isotipo emparejado (n=5) usando un kit de aislamiento de Treg de ratón (Miltenyi Biotec). Para determinar el impacto de las Treg en la proliferación de células T, las células T marcadas con VTD estimuladas (efectores) se cocultivaron con Treg esplénicas aisladas de los ratones tratados con el anticuerpo anti-TIGIT 313R12 y los ratones tratados con el anticuerpo de control (relación efector:Treg de 1:0,5). El día 4, las células se lavaron y se incubaron con anticuerpos anti-CD4 de ratón o anti-CD8 de ratón. Las células se evaluaron mediante análisis FACS utilizando un instrumento FACSCanto II y el software FACSDiva v6,1,3 (BD Biosciences). Las señales de VTD se reducen a la mitad cuando las células marcadas se dividen, por lo tanto, la puerta de análisis se estableció entre la señal máxima obtenida sin células Treg en el ensayo y la señal mínima obtenida sin estimulación anti-CD3/CD28. El porcentaje de células dentro de esta región (expresión de VTD reducida) en células T CD4+ y células T CD8+ se utilizó para calcular la proliferación de células T CD4+ y CD8+. El porcentaje de supresión se calculó como [señal máxima -(señal de muestra/señal máxima)] X 100.

[0372] Como se muestra en la Figura 11, el tratamiento con anticuerpo anti-TIGIT 313R12 no tenía ningún efecto observable sobre la función supresora de derivados de bazo Tregs sobre la proliferación de células T CD4+. Por el contrario, el tratamiento con el anticuerpo anti-TIGIT 313R12 redujo la función supresora de las Treg derivadas del bazo sobre la proliferación de células T CD8+ en aproximadamente un 30%.

[0373] Estos resultados sugieren que el tratamiento con un anticuerpo anti-TIGIT puede conducir a la reducción de la función Treg y/o supresión, es decir, "retirando el freno" la respuesta inmunitaria. Una reducción de la función de Treg o supresión de Treg podría mejorar las respuestas inmunes antitumorales totales.

Ejemplo 10

Caracterización de las células inmunes de ratones portadores de tumor CT26.WT tratados con anticuerpo anti-TIGIT 313R12

[0374] Para caracterizar mejor las células inmunes en ratones portadores de tumor CT26.WT tratados con esplenocitos de anticuerpo anti-TIGIT 313R12 aislados de ratones individuales fueron analizados por FACS. Se inyectaron células CT26.WT (20.000 células/ratón) por vía subcutánea en los flancos traseros de ratones Balb/c de 6 8 semanas de edad. Los tumores se dejaron crecer durante 10 días hasta que alcanzaron aproximadamente 50 mm3. Los ratones se trataron con 0,25 mg/ratón de anticuerpo anti-TIGIT 313R12 o un anticuerpo de control de isotipo coincidente (n=10-20 por grupo). A los ratones se les administró una inyección intraperitoneal dos veces por semana. Se controló el crecimiento del tumor y se midieron los volúmenes de los tumores con calibradores electrónicos. Se utilizaron para el análisis seis ratones de cada grupo de tratamiento. El día 32 después de la inyección celular (1 día después de la última dosis de anticuerpo) se aislaron los esplenocitos. Los esplenocitos (1 X 106) se incubaron durante 10 minutos con una proteína Fc recombinante para bloquear la unión no específica, y luego se incubaron con anticuerpos conjugados con fluorocromo en 100 ml de tampón de tinción FACS (HBSS más suero de ternera inactivado por calor al 2%) durante 20 min en hielo. Los anticuerpos no unidos se eliminaron mediante lavado y las células muertas se marcaron con un tinte de viabilidad fijable. Las células se fijaron en paraformaldehído al 2% durante 20 min a temperatura ambiente y se analizaron utilizando un instrumento FACSCanto II y el software FACSDiva v6,1,3 (BD Biosciences).

[0375] Se identificaron células T totales usando un anticuerpo anti-CD3e de ratón, células T CD4+ usando un anticuerpo anti-CD4 de ratón y células T CD8+ que utilizan un anticuerpo anti-CD8 de ratón. Las células de memoria central se identificaron usando un anticuerpo anti-CD44 humano/anti-ratón y las células de memoria efectoras se identificaron usando un anticuerpo anti-CD62L humano. La tinción FACS se realizó como se describió anteriormente usando anticuerpo anti-CD8b de ratón (clon 53-5,8, BioLegend), anticuerpo anti-CD4 de ratón (clon GK1,5, BioLegend), anticuerpo anti-CD62L de ratón (clon MEL-14, BioLegend), y anticuerpo anti-CD44 de ratón (clon 1M7, BioLegend). Las células se analizaron en busca de CD44 de alta expresión de CD62L alta, lo que indica células de memoria central, y expresión CD44altaCD62Lbaja, lo que indica células de memoria efectoras (controladas en células T CD8+).

[0376] El análisis FACS indicó que los ratones portadores de tumores CT26.WT tratados con anticuerpo anti-TIGIT 313R12 tenían una población de células T aumentada de esplenocitos vivos totales en comparación con la población de células T de ratones tratados con un anticuerpo de control (Figura 12A). El porcentaje de células T CD4+ (del total de células vivas) así como el porcentaje de células T CD8+ (del total de células vivas) aumentó en los ratones tratados con el anticuerpo 313R12 en comparación con los ratones tratados con el control (Figura 12B y Figura 12C). Además, se incrementó el porcentaje de células de memoria central dentro de la población de células T CD4+ (Figura 12D). Sin embargo, el porcentaje de células de memoria central dentro de la población de células T CD8+ no aumentó (Figura 12E).

[0377] Estos datos indicaron que el tratamiento con un anticuerpo anti-TIGIT aumentó el porcentaje de poblaciones de células T CD4+ y CD8+. Los resultados son consistentes con una respuesta inmunitaria mejorada.

[0378] Para evaluar el efecto del anticuerpo anti-TIGIT sobre la expresión diana, la expresión TIGIT en Tregs se analizó por citometría de flujo. Como se describe en el presente documento, las T reg son células supresoras y se sabe que las Treg CD4+ expresan el factor de transcripción Foxp3. Como se describió anteriormente, se aislaron esplenocitos de ratones portadores de tumor CT26.WT tratados con anticuerpo anti-TIGIT 313R12 o anticuerpo de control. Los esplenocitos (1 X 106) se incubaron durante 10 minutos con una proteína Fc recombinante para bloquear la unión no específica y luego se incubaron con el anticuerpo anti-TIGIT 313R12 y un anticuerpo anti-CD4 de ratón en 100 pl de tampón de tinción FACS (HBSS más 2% suero de ternera inactivado por calor) durante 20 min en hielo. Después de lavar con tampón de tinción FACS, las células se marcaron con un tinte de viabilidad celular fijable, se fijaron y se permeabilizaron durante la noche. Después de la permeabilización, las células se lavaron dos veces con tampón de permeabilización IX. Las células se tiñeron usando un anticuerpo anti-Foxp3 de ratón durante 30 minutos en hielo, se lavaron y se fijaron con formaldehído al 2% durante 20 minutos a temperatura ambiente. La citometría de flujo se realizó con un instrumento FACSCanto II y los análisis de datos se realizaron con el software FACSDiva v6,1,3 (BD Biosciences).

[0379] Como se muestra en la Figura 13A, el porcentaje de esplenocitos totales que expresan TIGIT se redujo en ratones portadores de ratón CT26.WT tratados con el anticuerpo anti-TIGIT 313R12 en comparación con los esplenocitos de ratones portadores de tumores tratados con anticuerpo de control. El porcentaje de células Foxp3 CD4+ (indicando Tregs) del total de células CD4+ fue aproximadamente 22-23% para ambos grupos de ratones y no pareció verse afectado por el tratamiento con el anticuerpo anti-TIGIT (Figura 13B). Sin embargo, el porcentaje de TIGIT positivos (de Treg totales) se redujo drásticamente en la población de esplenocitos de ratones portadores de tumores CT26.WT tratados con anticuerpo anti-TIGIT 313R12 en comparación con ratones portadores de tumores tratados con anticuerpo de control (Figura 13C). Por el contrario, el porcentaje de TIG TIGIT negativo aumentó ligeramente en la población de esplenocitos de ratones portadores de tumores CT26.WT tratados con anticuerpo anti-TIGIT 313R12 en comparación con ratones portadores de tumores tratados con anticuerpo de control (Figura 13D).

[0380] Estos resultados sugieren que las células TIGIT positivas con agotamiento de anticuerpos 313R12 anti-TIGIT, en particular Tregs. Sin embargo, la reducción de las células TIGIT positivas según lo evaluado por FACS puede deberse a una internalización de las proteínas TIGIT y/o una regulación negativa de la expresión de la superficie de las células TIGIT y no a un agotamiento real de las células.

[0381] Las células supresoras derivadas de mieloide (MDSCs) son una familia heterogénea de células mieloides y han demostrado ser potentes supresores de la inmunidad tanto adaptativa como innata. Las MDSC suprimen la proliferación y activación de células T CD4+ y células T CD8+ y facilitan la generación de Tregs. Se cree que las MDSC facilitan la progresión del cáncer al inhibir las respuestas inmunitarias antitumorales, promover la angiogénesis y crear un entorno premetastásico. Las MDSC se caracterizan por la expresión en la superficie celular de los antígenos de diferenciación del linaje mieloide Gr1 y CD11 b. Gr1 se limita principalmente a la expresión en células de un linaje granulocítico y CD11b es una integrina de la superficie celular que se encuentra en la superficie de macrófagos, granulocitos, células NK y células T. En ratones, las MDSC se pueden dividir en dos subpoblaciones, MDSC granulocíticas (G-MDSC) y MDSC monocíticas (M-MDSC), parcialmente basadas en estos marcadores. Las G-MDSC suelen tener núcleos multilobulados y un fenotipo alto CD11 b+ Gr1, mientras que las M-MDSC tienen una morfología monocítica y un fenotipo CD11b+ Gr1 bajo. Se ha demostrado que ambas poblaciones de MDSC suprimen las respuestas de las células T mediante múltiples mecanismos que incluyen una mayor producción de arginasa, óxido nítrico sintasa inducible (iNOS), óxido nítrico y especies reactivas de oxígeno. Por tanto, las MDSC contribuyen a un microambiente tumoral inmunosupresor y pueden limitar los efectos de las respuestas inmunitarias antitumorales.

[0382] Las células mieloides, particularmente MDSCs de ratones portadores de tumor CT26.WT tratados con anticuerpo anti-TIGIT 313R12 o anticuerpo de control se analizaron por FACS. Los esplenocitos (1 X 106) se incubaron durante 10 minutos con una proteína Fc recombinante para bloquear la unión no específica, y luego se incubaron con anticuerpos conjugados con fluorocromo en 100 pl de tampón de tinción FACS (HBSS más suero de ternera inactivado por calor al 2%) durante 20 min en hielo. Las células se incubaron posteriormente con un anticuerpo anti-CD11b de ratón y un anticuerpo anti-Gr1 de ratón. Los anticuerpos no unidos se eliminaron mediante lavado y las células se marcaron con un tinte de viabilidad fijable. Las células se fijaron en paraformaldehído al 2% durante 20 min a temperatura ambiente y se analizaron usando un instrumento FACSCanto II y Software FACSDiva v6,1,3 (BD Biosciences).

[0383] Como se muestra en la Figura 14A, el porcentaje de células mieloides CD11b+ (de células vivas totales) de los bazos de ratones portadores de tumores CT26WT tratados con anticuerpo anti-TIGIT 313R12 se redujo aproximadamente un 25% en comparación con células mieloides CD11 b+ de ratones portadores de tumores tratados con anticuerpo de control. El porcentaje de CD11b+Gr1+ MDSC (del total de células mieloides CD11b+) en los bazos de ratones portadores de tumores tratados con anticuerpo anti-TIGIT 313R12 se redujo aproximadamente un 45% en comparación con CD11b+Gr1+ MDSC de ratones portadores de tumores tratados con anticuerpo de control (Figura 14B). Dentro de la población de MDSC, el porcentaje de G-MDSC (identificado como CD11b+ Gr1 alto) de los bazos de ratones portadores de tumor CT26.WT tratados con anticuerpo anti-TIGIT 313R12 se redujo aproximadamente en un 66%, pero el porcentaje de M-MDSC (identificadas como CD11b+Gr1bajo) de los bazos de ratones portadores de tumores CT26.WT tratados con anticuerpo anti-TIGIT 313R12 aumentaron aproximadamente un 30% (Figura 14C y 14D, respectivamente).

[0384] Estos resultados sugieren que el tratamiento con un anticuerpo anti-TIGIT puede mejorar las respuestas antitumorales mediante la reducción de la actividad supresora de las células inmunitarias específicas, es decir, MDSCs.

Ejemplo 11

Inhibición del crecimiento tumoral in vivo por anticuerpo anti-TIGIT

[0385] Renca es una línea celular de adenocarcinoma renal derivada de Balb/c obtenida de ATCC. Se implantaron células Renca (5 X 105 células/ratón) por vía subcutánea en los flancos traseros de ratones Balb/c de 6 8 semanas de edad. Los tumores se dejaron crecer durante 7 días hasta que alcanzaron un volumen de aproximadamente 43 mm3. Los ratones se trataron con 0,25 mg/ratón de anticuerpo antiTIGIT 313R12 (anticuerpo mIgG2a) o un anticuerpo de control mIgG2a (n=10 por grupo). Los ratones se dosificaron mediante inyección intraperitoneal dos veces por semana durante 3 semanas. El crecimiento tumoral se controló y los volúmenes tumorales se midieron con calibradores electrónicos en los días 7, 10, 14, 17, 21, y 24.

[0386] Como se muestra en la Figura 15, un anticuerpo anti-TIGIT 313R12 inhibió fuertemente el crecimiento del tumor en comparación con el anticuerpo de control emparejado a isotipo. Todos los ratones de control fueron sacrificados el día 28 debido al tamaño del tumor. Por el contrario, en el día 28, los tumores de 8 de 10 ratones tratados con el anticuerpo 313R12 habían retrocedido y 5 de esos ratones no tenían tumores detectables. Se mantuvieron cinco de los diez ratones originales y no se detectaron tumores hasta al menos 100 días después de la inyección. Estos resultados muestran que la actividad antitumoral del anticuerpo anti-TIGIT 313R12 fue eficaz en varios tipos de tumores diferentes.

Ejemplo 12

La inhibición del crecimiento tumoral in vivo por el anticuerpo anti-TIGIT - Estudio de dosis

[0387] Dado que el anticuerpo anti-TIGIT había demostrado ser eficaz en la inhibición del crecimiento tumoral, se realizó un estudio del intervalo de dosis. La línea de tumor de colon murino CT26.WT se implantó por vía subcutánea (30.000 células/ratón) en ratones Balb/c y se dejó que los tumores crecieran a un tamaño medio de aproximadamente 35 mm3. Los ratones se trataron con 30, 15, 10, 5, 3, 1 o 0,5 mg/kg de anticuerpo anti-TIGIT 313R12 o con un anticuerpo de control (n=10 por grupo). A los ratones se les administró una inyección intraperitoneal una vez a la semana hasta un total de 3 dosis. Se controló el crecimiento tumoral y se midieron los volúmenes tumorales con calibradores electrónicos en los puntos de tiempo indicados.

[0388] La figura 16 muestra el volumen tumoral medio de cada grupo de tratamiento. El tratamiento con el anticuerpo anti-TIGIT 313R12 inhibió fuertemente el crecimiento de tumores CT26.WT en cada dosis, incluido el nivel más bajo de 0,5 mg/kg. Como se muestra en la Tabla 4, en el día 20 los tumores habían retrocedido en al menos el 40% de los ratones con cada nivel de dosis. En cada grupo tratado hubo ratones individuales en los que el tumor había retrocedido a un nivel indetectable. En este experimento no se observó una curva de respuesta a la dosis, lo que puede deberse al tamaño de los tumores al comienzo del tratamiento.

Tabla 4

[0389] Estos resultados demuestran la potencia del anticuerpo anti-TIGIT 313R12 como un agente inmunoterapéutico. En general, estos resultados son sorprendentes con respecto a la pequeña cantidad de anticuerpo anti-TIGIT necesaria para ver un efecto antitumoral significativo.

Ejemplo 13

La inhibición del crecimiento tumoral in vivo por el anticuerpo anti-TIGIT y el anticuerpo anti-PD-Ll

[0390] La línea de tumor de colon murino CT26.WT se implantó por vía subcutánea (30.000 células/ratón) en ratones Balb/c y en el primer día de tratamiento (día 10 después de la implantación) los tumores tenían un tamaño medio de aproximadamente 105 mm3. Los ratones se trataron con 0,25 mg/ratón de anticuerpo anti-TIGIT 313R12, un anticuerpo anti-PD-Ll, una combinación de 313R12 y un anticuerpo anti-PD-Ll, o un anticuerpo de control (n=10-20 por grupo). A los ratones se les administraron anticuerpos dos veces por semana durante 3 semanas. Se controló el crecimiento del tumor y se midieron los volúmenes de los tumores con calibradores electrónicos.

[0391] Como se muestra en la Figura 17B, el tratamiento con anticuerpo anti-TIGIT 313R12 inhibió fuertemente el crecimiento de los tumores CT26.WT en un alto porcentaje de los ratones. Cabe señalar que el tratamiento con el anticuerpo anti-TIGIT 313R12 no solo puede inhibir el crecimiento de tumores en la mayoría de los ratones, sino que también puede inducir la regresión de tumores individuales, a menudo a niveles indetectables. El tratamiento con el anticuerpo anti-PD-L1 fue mucho menos exitoso para inhibir el crecimiento tumoral como agente único (Figura 17C). El tratamiento con la combinación de anticuerpo anti-TIGIT 313R12 y un anticuerpo anti-PD-Ll inhibió el crecimiento tumoral en mayor medida que cualquier agente solo (Figura 17D). El volumen tumoral medio se muestra en la Figura 17E y el porcentaje de supervivencia de los ratones de cada grupo se muestra en la Figura 17F.

[0392] Un método para evaluar la presencia y/o funcionalmente de una población de células de memoria antitumorales es reexponer a ratones tratados previamente con células tumorales frescas. Se utilizaron ratones (de los estudios descritos anteriormente) tratados previamente con anticuerpo anti-TIGIT 313R12, anticuerpo anti-mPD-Ll o una combinación de anticuerpo 313R12 y anti-mPD-L1 para un nuevo estudio de exposición. Los ratones cuyos tumores habían retrocedido por completo y eran indetectables al menos 128 días después de la primera inyección tumoral se volvieron a desafiar con células tumorales CT26.WT (30.000 células). Los ratones sometidos a una nueva exposición al tumor habían recibido una última dosis de tratamiento 100 días antes de la nueva exposición. Se inyectaron ratones Balb/c sin tratamiento previo (n=10) con células tumorales CT26.WT (30.000 células) como grupo de control. Se controló el crecimiento tumoral y se midieron los volúmenes tumorales con calibradores electrónicos en los puntos de tiempo indicados. Los datos se expresan como media ± S.E.M.

[0393] El volumen tumoral medio de tumores CT26.WT en ratones sin tratamiento previo creció de forma constante hasta el día 28 con un volumen tumoral medio de aproximadamente 1750 mm3. En el experimento anterior, solo había dos ratones con tumores en regresión completa que habían sido tratados previamente con el anticuerpo anti-PD-Ll, pero estos dos ratones demostraron inmunidad completa a la nueva provocación del tumor. Hubo 4 ratones con tumores completamente en regresión que habían sido tratados previamente con anticuerpo anti-TIGIT y los tumores no crecieron en ninguno de estos ratones después de la reexposición y demostraron inmunidad completa a la reexposición al tumor. Además, había 7 ratones con tumores en regresión completa que habían sido tratados previamente con la combinación de 313R12 y un anticuerpo anti-PD-Ll y estos ratones demostraron inmunidad completa al desafío tumoral.

[0394] Los ratones tratados con el anticuerpo anti-TIGIT, ya sea como agente único o en combinación con un anticuerpo anti-PD-Ll, parecían estar fuertemente protegidos de la re-estimulación con las células tumorales CT26.WT. Estos resultados sugieren la existencia de memoria inmunogénica después del tratamiento con un anticuerpo anti-TIGIT, ya sea como agente único o en combinación con un inhibidor del punto de control.

Ejemplo 14

La inhibición del crecimiento del tumor in vivo por un anticuerpo anti-TIGIT y un anticuerpo anti-PD-1

[0395] La línea de tumor de colon murino CT26.WT se implantó por vía subcutánea (30.000 células/ratón) en ratones Balb/c y en el primer día del tratamiento (día 7 después de la implantación) los tumores tenían un tamaño medio de aproximadamente 62 mm3. Los ratones (n=15) se trataron con 12,5 mg de anticuerpo anti-TIGIT 313R12, un anticuerpo anti-PD-1, una combinación de 313R12 y anticuerpo anti-PD-1, o un anticuerpo de control (n=15 por grupo). A los ratones se les administraron los anticuerpos mediante inyección intraperitoneal dos veces por semana durante 3 semanas. Se controló el crecimiento del tumor y se midieron los volúmenes de los tumores con calibradores electrónicos.

[0396] Como se muestra en la Figura 18B, el tratamiento con anticuerpo anti-TIGIT 313R12 fue fuertemente inhibido por el crecimiento tumoral. Como se observa en los ejemplos anteriores, el tratamiento con 313R12 no solo puede inhibir el crecimiento de los tumores, sino que también puede inducir la regresión de algunos tumores. El tratamiento con la combinación de anticuerpo anti-TIGIT 313R12 y un anticuerpo anti-PD-1 inhibió el crecimiento tumoral en mayor medida que cualquier agente solo (Figura 18D). El volumen tumoral medio en los cuatro grupos el día 24 se muestra en la Figura 18E.

[0397] Se usaron ratones tratados previamente con anticuerpo anti-TIGIT 313R12, anticuerpo anti-mPD-1 o una combinación de 313R12 y anticuerpo anti-mPD-Ll para un nuevo estudio de exposición. Los ratones cuyos tumores habían retrocedido completamente y eran indetectables al menos 100 días después de la primera inyección tumoral se volvieron a exponer con células tumorales CT26.WT (60.000 células). Se inyectaron ratones sin tratamiento previo Balb/c (n=10) con células tumorales CT26.WT (60.000 células) como grupo de control. Se controló el crecimiento del tumor y se midieron los volúmenes de los tumores con calibradores electrónicos en los puntos de tiempo indicados. Los datos se expresan como media ± S.E.M.

[0398] El volumen tumoral medio de tumores CT26.WT en ratones sin tratamiento previo creció de forma constante con un volumen tumoral medio en el día 21 de aproximadamente 1250 mm3. Del experimento anterior había 13 ratones con tumores en regresión completa que habían sido tratados previamente con la combinación de 313R12 y un anticuerpo anti-PD-1 y estos ratones demostraron inmunidad completa a la exposición del tumor.

[0399] Estos resultados apoyan adicionalmente la idea de que el anticuerpo anti-TIGIT 313R12 es un agente inmunoterapéutico muy potente, incluso cuando se administra como agente único. Además, la eficacia de un anticuerpo anti-TIGIT puede mejorarse aún más combinándolo con otros agentes inmunoterapéuticos.

Ejemplo 15

Generación de anticuerpos anti-TIGIT monoclonales

[0400] Los anticuerpos fueron generados contra aminoácidos TIGIT humanos recombinantes 22 a 141 (R&D Systems) y/o aminoácidos TIGIT humanos recombinantes 22 a 138 (Sino Biological Inc.). Los ratones (n=3) se inmunizaron con TIGIT usando técnicas estándar. Se cribaron sueros de ratones individuales frente a TIGIT humano aproximadamente 70 días después de la inmunización inicial usando análisis FACS. El animal con el título de anticuerpos más alto se seleccionó para un refuerzo de antígeno final después de lo cual se aislaron las células del bazo para la producción de hibridoma. Se utilizaron células SP2/0 como parejas de fusión para las células del bazo de ratón. Las células de hibridoma se cultivaron en placas a razón de 1 célula por pocillo en placas de 96 pocillos, y los sobrenadantes se cribaron frente a TIGIT humano mediante análisis FACS.

[0401] Para el cribado de FACS de anticuerpos anti-TIGIT se construyó una expresión de la superficie celular que permite proteína de fusión quimérica del dominio extracelular de TIGIT humano (FLAG-hTIGIT-CD4TM-GFP) y se transfectó en células HEK-293T. Después de 48 horas, las células transfectadas se suspendieron en PBS helado que contenía FBS al 2% y heparina y se incubaron en hielo en presencia de 50 pl de sobrenadantes de hibridoma durante 30 minutos. Se realizó una segunda incubación con 100 pl de anticuerpo secundario anti-Fc humano conjugado con PE para detectar las células unidas por el anticuerpo. Las células se incubaron con un anticuerpo anti-FLAG (Sigma-Aldrich) como control positivo y un anticuerpo anti-PE como control negativo. Las células se analizaron en un instrumento FACSCalibur (BD Biosciences) y los datos se procesaron utilizando el software FlowJo.

[0402] Se identificaron varios hibridomas que unieron TIGIT humano y se seleccionó el anticuerpo 313M26. Las secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera de 313M26 son SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 64, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos de la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera de 313M26 son SEQ ID NO: 65 y SEQ ID NO: 66, respectivamente.

[0403] El anticuerpo 313M26 se humanizó utilizando técnicas estándar conocidas por los expertos en la técnica. La versión humanizada de 313M26 se denomina en el presente documento 313M32 y es un anticuerpo IgG1. La región variable de la cadena pesada humanizada de 313M32 se reformateó en un esqueleto de IgG4, y en combinación con la cadena ligera de 313M32 se denomina 313M33. Las secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera de 313M32 (y 313M33) son SEQ ID NO: 67 y SEQ ID NO: 68, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos de la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera de 313M32 son SEQ ID NO: 73 y SEQ ID NO: 74, respectivamente. Las c Dr de cadena pesada y cadena ligera de 313M26/313M32 se enumeran en la Tabla 2 de este documento (SEQ ID NO: 57-62). La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de 313M32 con la secuencia señal predicha es SEQ ID NO: 69 y sin una secuencia señal es SEQ ID NO: 70; la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de 313M32 con la secuencia señal predicha es SEQ ID NO: 71 y sin una secuencia señal es SEQ ID NO: 72. Las secuencias de nucleótidos de la cadena pesada y la cadena ligera de 313M32 son SEQ ID NO: 75 y SEQ ID NO: 76, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de 313M33 con la secuencia señal predicha es SEQ ID NO: 83 y sin una secuencia señal es SEQ ID NO: 82; la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de 313M33 con la secuencia señal predicha es SEQ ID NO: 71 y sin una secuencia señal es SEQ ID NO: 72. Las secuencias de nucleótidos de la cadena pesada y la cadena ligera de 313M33 son SEQ ID NO: 84 y SEQ ID NO: 76, respectivamente.

[0404] Un plásmido que codifica la región variable de la cadena pesada del anticuerpo 313M32 se depositó en la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, EE. UU, bajo las condiciones del Tratado de Budapest el 11 de agosto de 2015, y se designó PTA-122346. Un plásmido que codifica la cadena ligera del anticuerpo 313M32 se depositó en ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA, EE. UU, según las condiciones del Tratado de Budapest sobre 11 de agosto de 2015 y se designó PTA-122347.

[0405] El anticuerpo humanizado anti-TIGIT 313M32 se proyectó para la unión a proteínas TIGIT de varias especies diferentes. Se determinó que 313M32 se une fuertemente a TIGIT humano y no se une a TIGIT de ninguna otra especie que se haya probado, incluido el ratón, la rata, el conejillo de indias, el conejo, el tití, el cerdo, el perro, el mono rhesus y el mono cynomolgus. Esto contrasta con otro anticuerpo anti-TIGIT generado en OncoMed Pharmaceuticals, 313R19, que se unió a TIGIT de todas estas especies excepto el conejillo de indias. El anticuerpo 313R19 es una versión humanizada de un anticuerpo anti-TIGIT de conejo (313R12) que se identificó originalmente como de unión a TIGIT de ratón y humano. La Tabla 5 resume los anticuerpos anti-TIGIT y la unión a TIGIT de ratón, humano, mono cynomolgus y mono rhesus.

Tabla 5

Ejemplo 16

Análisis FACS de anticuerpos anti-TIGIT que bloquen la unión de TIGIT humano a PVR

[0406] Una proteína humana de superficie celular TIGIT fue generada por ligación de los aminoácidos 22-141 de TIGIT humano al dominio transmembrana de CD4 y una etiqueta de proteína GFP C-terminal utilizando técnicas estándar de ADN recombinante (hTIGITCD4TM-GFP). Se generaron construcciones de PVR-Fc usando técnicas estándar de ADN recombinante. Específicamente, el dominio extracelular de PVR humano se ligó en marco a una región Fc de conejo y la proteína hPVR-rbFc recombinante se expresó en células CHO. Las proteínas de fusión se purificaron del medio de cultivo celular usando cromatografía de proteína A.

[0407] Las células HEK-293T fueron transfectadas transitoriamente con el constructo hTIGIT-CD4TM-GFP. Después de 16 horas, las células transfectadas se suspendieron en HBSS helado que contenía FBS al 2% y heparina y se incubaron en hielo con 0,5 pg/ml de proteína de fusión hPVR-rbFc en presencia de anticuerpos anti-TIGIT 313R19, 313M26 o 313M32 durante 60 minutos. El anticuerpo 313R19 es una versión humanizada de un anticuerpo anti-TIGIT de conejo. 313R19 se une a TIGIT de ratón y humano. Los anticuerpos se probaron a concentraciones de 10, 2 y 0,4 ug/ml. Las células se incubaron sin anticuerpo o sin hPVR-rbFc como controles. Se realizó una segunda incubación con 100 pl de anticuerpo secundario anti-Fc de conejo conjugado con PE para detectar células unidas por la proteína de fusión hPVR-rbFc. Las células se analizaron en un instrumento FACSCanto (BD Biosciences) y los datos se procesaron utilizando el software FlowJo.

[0408] Como se muestra en la Figura 19A, en ausencia de cualquier anticuerpo anti-TIGIT, hPVR-rbFc ligada fuertemente a hTIGIT expresado en la superficie de las células HEK-293T. Los tres anticuerpos anti-TIGIT bloquearon la unión de hPVR-rbFc a hTIGIT a la concentración más alta de 10 pg/ml. Sin embargo, a las concentraciones más bajas de 2 ug/ml y 0,4 pg/ml de anticuerpo, el anticuerpo 313R19 no bloqueaba la unión de hPVR-rbFc a TIGIT. En contraste, el anticuerpo anti-hTIGIT 313M32 bloqueó fuertemente la unión de hPVR-rbFc a hTIGIT a 2 pg/ml y el nivel de bloqueo fue mayor que el del anticuerpo de ratón parental 313M26. Estos resultados sugirieron que la afinidad del anticuerpo 313M32 humanizado por hTIGIT era mayor que la del anticuerpo parental 313M26 y el anticuerpo 313R19. Se realizó un experimento adicional usando el anticuerpo 313R19 y el anticuerpo 313M32 a concentraciones de 10, 5, 2,5 y 1,25 pg/ml (Figura 19B). Los resultados de estos dos estudios sugieren que la afinidad del anticuerpo 313M32 por hTIGIT es aproximadamente 5 veces mayor que la del anticuerpo 313R19. Además, los resultados preliminares de Biacore mostraron que la afinidad de 313R19 era 2 nM y la afinidad de 313M32 era 0,4 nM.

Ejemplo 17

Señalización de TIGIT y fosforilación de TIGIT

[0409] TIGIT se fosforila en su cola citoplasmática después de la interacción con su contrarreceptor PVR. La fosforilación de TIGIT es el comienzo de una cascada que incluye eventos posteriores que afectan a otras vías de señalización conocidas. Por lo tanto, la evaluación de la fosforilación de TIGIT puede proporcionar información sobre la función de TIGIT y el efecto de un antagonista de TIGIT.

[0410] La línea de células T humanas Jurkat CD4+ carece de expresión de TIGIT humana determinada por PCR en tiempo real y por FACS (datos no mostrados). Para generar una línea celular que expresa TIGIT, se infectaron células Jurkat con un constructo de lentivirus que expresa TIGIT humano (hTIGIT) marcado con FLAG y proteína verde fluorescente (GFP). Las células positivas para GFP se clasificaron en placas de 96 pocillos usando un clasificador de células FACSAria II (BD Biosciences), las células individuales se expandieron en clones y se seleccionó una línea celular clonal (Jurkat-hTIGIT).

[0411] La línea de linfoma de células B humanas 721,221 carece de expresión PVR según lo determinado por PCR en tiempo real y por FACS (datos no mostrados). Para generar una línea celular que expresa PVR, se infectaron células 721,221 con una construcción de lentivirus que expresa PVR humano (hPVR) y GFP. Las células positivas para GFP se clasificaron en placas de 96 pocillos usando un clasificador de células FACSAria II (BD Biosciences), las células individuales se expandieron en clones y se seleccionó una línea celular clonal (721,221 -hPVR).

[0412] Para evaluar la fosforilación TIGIT en respuesta a PVR, las células Jurkat-hTIGIT se incubaron en medio libre de suero durante 2 horas a 37°C. A continuación, las células se pretrataron con 20 pg/ml de anticuerpos anti-TIGIT 313R19, 313M26 o 313M32, o un anticuerpo de control durante 20 minutos a temperatura ambiente. Se mezclaron células Jurkat-hTIGIT con células 721,221 parentales o células 721,221-mPVR en una proporción celular de 5:1 y se incubaron durante 5 minutos a 37°C en presencia de un inhibidor de tirosina fosfastasa (ortovanadato de sodio 10 mM, New England Biolabs). Se prepararon lisados celulares y se inmunoprecipitaron con cuentas magnéticas recubiertas con anti-FLAG que capturaron las proteínas hTIGIT marcadas con FLAG. Los inmunoprecipitados se resolvieron en geles Bis-Tris al 4-12% (Novex/Life Technologies) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa usando un aparato iBlot 2 (Life Technologies). Las membranas se incubaron con un anticuerpo antitirosina conjugado con peroxidasa de rábano picante y se visualizó TIGIT fosforilado (pTIGIT) usando reactivos de detección estándar. La presencia de TIGIT total se evaluó utilizando un anticuerpo anti-FLAG (tecnología de señalización celular).

[0413] Se observó que hTIGIT era altamente fosforilada en las células Jurkat en respuesta a las células tumorales que expresan hPVR. Esta fosforilación se inhibió en presencia de anticuerpos anti-TIGIT, especialmente el anticuerpo 313M32 (Figura 20).

Ejemplo 18

Mapeo de epítopos

Mapeo de epítopos de anticuerpos anti-hTIGIT

[0414] Para identificar el epítopo de unión de anticuerpo 313M32, un análisis se realizó con una serie de variantes de TIGIT humano con sustituciones específicas de aminoácidos. Las variantes se basaron en las diferencias entre las secuencias de aminoácidos de TIGIT humana y TIGIT de cynomolgus, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 77, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de TIGIT de mono rhesus (SEQ ID NO: 78) es idéntica a la de TIGIT de cynomolgus (Figura 21). Las variantes de aminoácidos introducen residuos de aminoácidos presentes en TIGIT de mono cynomolgus en posiciones correspondientes en TIGIT humano. Las variantes de hTIGIT generadas tienen sustituciones en (1) E36K e I41V; (2) T51M, (3) Q62H y Q64H, (4) D72E, (5) S78Y y S80A, (6) V100M, (7) I109T y T119R, y (8) G135S. Cada variante hTIGIT se generó usando el constructo hTIGIT (aa 22-141)-Cd4TM-g Fp descrito en el Ejemplo 15.

[0415] Las variantes TIGIT fueron evaluadas por FACS con anticuerpos anti-hTIGIT. Las células HEK-293T se transfectaron transitoriamente con hTIGIT-CD4TM-GFP, mTIGIT-CD4TM-GFP, o una de las variantes de construcciones hTIGIT-CD4TM-GFP. Después de 16 horas, las células transfectadas se suspendieron en HBSS helado que contenía FBS al 2% y se incubaron en hielo con 1 pg/ml de anticuerpos anti-hTIGIT 313R12, 313M32 o 313M34 durante 30 minutos. 313M34 es un anticuerpo anti-hTIGIT que se generó basándose en las secuencias de aminoácidos del anticuerpo 10A7 descrito en la publicación de EE. UU. 2009/0258013. El anticuerpo 10A7 es un anticuerpo anti-TIGIT de ratón que se une tanto a TIGIT de ratón como a TIGIT humano. Se realizó una segunda incubación con 50 gl de anticuerpo secundario anti-Fc conjugado con PE para detectar células unidas por los anticuerpos. Las células se analizaron en un instrumento FACSCanto (BD Biosciences) y los datos se procesaron utilizando el software FlowJo.

[0416] Como se muestra en la Figura 22, el anticuerpo 313M32 no se unió a la variante TIGIT 3 con sustituciones en residuos de aminoácidos 62 y 64 y la variante TIGIT 7 con sustituciones en residuos de aminoácidos 109 y 119. El anticuerpo conservó su fuerte unión a hTIGIT y variantes de TIGIT 1,2, 4, 5, 6 y 8. Los residuos de aminoácidos 62, 64, 109 y 119 están resaltados en negro en una representación de la estructura cristalina de TIGIT unida a PVR (Figura 23). La estructura del TIGIT humano se muestra en representación de esfera y la estructura de PVR se proporciona en representación de cinta. Las posiciones de los aminoácidos revelan que el anticuerpo 313M32 se une a hTIGIT en un área que debería bloquear y/o interferir con la unión de PVR. Es de destacar que el anticuerpo 313R12 también perdió la unión a la variante 7 de TIGIT con sustituciones en los residuos de aminoácidos 109 y 119, lo que sugiere que 313R12 se une a un epítopo que se solapa con el epítopo unido por 313M32. Curiosamente, la unión del anticuerpo 313M34 a TIGIT no se vio afectada por las sustituciones de aminoácidos de la variante 3 o la variante 7 de TIGIT, sino por la sustitución de aminoácidos en el residuo 100 de la variante TIGIT 6. Este resultado muestra que el anticuerpo 313M34 no se une al mismo epítopo como anticuerpo 313M32. Las posiciones relativas de los residuos de unión críticos para anticuerpos 313M32 y 313M34 en TIGIT se indican en la representación de la figura 23.

[0417] Para confirmar que el anticuerpo 313M26 (anticuerpo anti-hTIGIT murino parental de 313M32) y 313R19 (anticuerpo anti-hTIGIT de conejo humanizado generado a partir de 313R12) se une a un epítopo común, se realizaron estudios de competencia. Dado que las porciones Fc de los anticuerpos 313M26 y 313R19 son diferentes, es decir, Fc murino y Fc humano, respectivamente, se puede determinar la unión de un anticuerpo (313R19) en presencia o ausencia del segundo anticuerpo (313M26). Brevemente, las células HEK-293T se transfectaron transitoriamente con un vector de expresión que codifica TIGIT CD4TM-GFP humano. Las células se incubaron durante 1 hora con 0,5 gg de anticuerpo 313M19 y un exceso de anticuerpo 313M26 (de 50 a 0,78 gg/ml, diluciones al doble). Las células se lavaron e incubaron con un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia específico para Fc humano y se analizaron mediante citometría de flujo.

[0418] Como se muestra en la Figura 24A, el anticuerpo 313M26 compitió con 313R19 para la unión a hTIGIT y un exceso de 313M26 efectivamente bloqueó la unión de 313R19 a hTIGIT. Estos datos indican que 313M26/313M32 y 313R12/313R19 se unen a epítopos superpuestos y son consistentes con el análisis de epítopos presentado en la Figura 23. En experimentos paralelos, se examinó la capacidad de 313R19 o 313M32 para competir con 313M34 para unirse a TIGIT. Como se muestra en la Figura 24B, no se observó que los anticuerpos 313R19 ni 313M32 compitieran con 313M34 por la unión a hTIGIT. Estos resultados indican que 313R19 y 313M32 se unen a un epítopo distinto del epítopo unido por 313M34. Estos resultados también son consistentes con el análisis de epítopo presentado en la Figura 23.

Ejemplo 19

Producción de citoquinas

[0419] Se ha demostrado que el acoplamiento de TIGIT con PVR (CD155) expresado en células tumorales o células presentadoras de antígeno regula a la baja las funciones efectoras de células T e inhibe las respuestas inmunes antitumorales (véase, por ejemplo, Joller et al, 2014, Immunity, 40: 569-581). Se investigó la capacidad de los anticuerpos anti-TIGIT 313R19 y 313M32 para bloquear la inhibición mediada por PVR de la secreción de citocinas de células T. Se generaron blastos de células T humanas activadas mediante cultivo de 10 días de células T humanas primarias con fitohemaglutinina (PHA, 2 gg/ml) e IL-2 (4 ng/ml). Los blastos se dejaron en reposo en medio libre de PHA/IL-2 durante 24 horas, se resuspendieron a 5 X 105 células/ml y se trataron con un anticuerpo de control (IgG policlonal humana, 25 gg/ml), anticuerpo anti-TIGIT 313R19 o 313M32 a 10 o 25 gg/mL durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, las células se sembraron en placas en pocillos que se habían revestido durante la noche a 4°C con anticuerpo anti-CD3 (Ebioscience), PVR-Fc humano o anticuerpo anti-CD3 y hPVRFc (cada uno a 10 gg/m). Los sobrenadantes de cultivos libres de células se recogieron después de 48 horas y las citocinas de IFN-Y e IL-2 se determinaron mediante ELISA (R&D Systems). Los resultados se expresan en relación con la producción de citocinas por las células activadas con antiCD3 solo, en donde el nivel de citocinas anti-CD3 se establece en 1,0.

[0420] Como se ve en la Figura 25, HPVR-Fc no induce la producción de IFN-gamma o IL-2 en las células activadas. Sin embargo, hPVR-Fc inhibe fuertemente la producción de citocinas inducida por la participación de anti-CD3. Esta inhibición es revertida por los anticuerpos anti-TIGIT 313R19 y 313M32 y a la dosis más alta de 25 ug/ml la producción de IFN-gamma o IL-2 es en realidad mayor que la cantidad generada por anti-CD3. Las células T activadas expresan tanto TIGIT como CD226, y ambos pueden interactuar con PVR, pero la interacción TIGIT/PVR es inhibitoria y se activa la interacción CD226/PVR. Sin desear ceñirse a la teoría, se sugiere que cuando las células T activadas están en contacto con PVR, la interacción TIGIT/PVR "gana", porque TIGIT se une a PVR con más fuerza que CD226. Además, parece haber niveles más altos de TIGIT en las células T activadas que CD226, por lo que la interacción general es inhibitoria. Por ejemplo, en la Figura 25, compare anti-CD3 solo con anti-CD3 más PVR. Cuando TIGIT se bloquea con 313R19 o 313M32, la inhibición mediada por TIGIT se invierte, pero teóricamente todavía se produce la interacción CD226/PVR y esa interacción se activa. Por lo tanto, como se ve en la Figura 25, cuando se bloquea TIGIT y se estimulan las células T con anti-CD3 más PVR, los niveles de IFN-gamma son en realidad más altos que cuando se estimula con anti-CD3 solo.

[0421] Estos resultados demuestran que el bloqueo de TIGIT humano con un anticuerpo anti-TIGIT puede interrumpir interacciones TIGIT/PVR y restaurar la producción de citoquinas que es beneficioso para una respuesta anti-tumor.

Ejemplo 20

Ensayo de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos

[0422] La citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) se refiere a la muerte de una célula diana recubierta de anticuerpo por una célula efectora citotóxica a través de un proceso no fagocítico, caracterizándose por lo general por la liberación de gránulos citotóxicos o por la expresión de moléculas que inducen la muerte celular. Las células efectoras que median en la ADCC incluyen células asesinas naturales (NK), monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos y células dendríticas. Se investigó la capacidad de los anticuerpos anti-TIGIT 313R19 y 313M32 para mediar en la ADCC de células NK de células NK. La ADCC se probó en un ensayo estándar de liberación de calceína de 4 horas usando células NK humanas primarias como efectoras y células Jurkat parentales o células JurkathTIGIT como dianas. Se aislaron células NK humanas directamente de capas leucocíticas de sangre periférica reciente (Stanford Blood Center, Palo Alto, CA) mediante incubación de 30 minutos con cóctel RosetteSep (Stem Cell Technologies) antes de la centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Hypaque (Sigma). Se marcaron células Jurkat o Jurkat-hTIGIT parentales diana con 10 gM de calceína AM (Life Technologies) durante 1 hora a 37°C y luego se trataron con un anticuerpo policlonal IgG de control, anticuerpo anti-TIGIT 313R19 o anticuerpo anti-TIGIT 313M32 (todos a 10 gg/ml) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, las células Jurkat o JurkathTIGIT se combinaron con las células NK en una relación efector:diana de 20:1 en placas de fondo en V de 96 pocillos. Después de una incubación de 4 horas a 37°C, se recogieron los sobrenadantes libres de células y se cuantificó la liberación de calceína en un fluorómetro a una excitación de 485 nm y una emisión de 535 nm. El porcentaje de lisis celular específica se determinó como: % de lisis = 100 X (ERSR)/(MR-SR), donde ER, SR y MR representan liberación experimental, liberación espontánea y liberación máxima de calceína, respectivamente. La liberación espontánea es la fluorescencia emitida por las células diana incubadas en medio solo (es decir, en ausencia de células efectoras), mientras que la liberación máxima se determina lisando las células diana con un volumen igual de SDS al 10%. Para las líneas celulares Jurkat y Jurkat-hTIGIT, el porcentaje de ADCC se determina como el porcentaje de lisis específica en presencia de anticuerpo experimental (313R19 o 313M32) menos el porcentaje de lisis específica en presencia del anticuerpo de control.

Como se muestra en la Figura 26, el porcentaje de ADCC aumentó significativamente en presencia de anticuerpos anti-TIGIT 313R19 y 313M32 cuando las células diana expresaron TIGIT. La capacidad de los anticuerpos anti-TIGIT para inducir ADCC sugeriría que los anticuerpos anti-TIGIT pueden tener múltiples mecanismos para mejorar la respuesta inmunitaria a las células tumorales.

Ejemplo 21

La inhibición del crecimiento tumoral in vivo en ratones humanizados por un anticuerpo anti-TIGIT

[0423] Un modelo de ratón se utilizó para estudiar la eficacia del tratamiento con un anticuerpo anti-TIGIT en un tumor humano. Los ratones humanizados se obtuvieron de Jackson Laboratories. Estos ratones se crean inyectando células madre hematopoyéticas humanas (células CD34+) en ratones NSG irradiados. Después de 15 semanas, la presencia de linfocitos humanos maduros se confirma mediante citometría de flujo. Cada ratón se inyectó por vía subcutánea con células tumorales de melanoma derivadas del paciente (OMP-M9, 75.000 células/ratón). Los tumores se dejaron crecer 19 días hasta que alcanzaron un volumen promedio de aproximadamente 50 mm3. Los ratones portadores de tumores se asignaron al azar en grupos (n=8 ratones por grupo). Los ratones portadores de tumores se trataron con un anticuerpo de control, un anticuerpo anti-TIGIT 313R19 o un anticuerpo anti-TIGIT 313M32. Los ratones se dosificaron cada 5 días a 1 mg/kg o 5 mg/kg. Se controló el crecimiento tumoral y se midieron los volúmenes tumorales con calibradores electrónicos en los puntos de tiempo indicados.

[0424] Como se muestra en la Figura 27, el crecimiento tumoral se inhibió en los ratones tratados con anticuerpo 313R19 y el anticuerpo 313M32 comparado con el control. Estos resultados muestran que la selección de TIGIT fue eficaz para aumentar la respuesta inmunitaria antitumoral de los linfocitos humanos y contribuir a inhibir el crecimiento de tumores humanos in vivo. En este experimento, la combinación del anticuerpo anti-TIGIT 313R19 o 313M32 y un anticuerpo anti-hPD-1 no inhibió el crecimiento tumoral en mayor medida que los anticuerpos anti-TIGIT como agentes individuales (datos no mostrados).

[0425] Se encontró que los anticuerpos 313M32 y 313R19 inhibieron el crecimiento del tumor en el contexto de los linfocitos humanos y tuvieron potencias in vivo similares. Estos resultados demostraron que los modelos de ratón humanizados que portan xenoinjertos derivados de pacientes pueden usarse para estudiar el anticuerpo anti-TIGIT 313M32 (que solo se une a TIGIT humano) en paralelo con estudios preclínicos llevados a cabo con los anticuerpos anti-TIGIT 313R12 y 313R19 y modelos de tumores murinos.

Ejemplo 22

Farmacocinética de los anticuerpos anti-TIGIT

[0426] Como se describe en el presente documento, el anticuerpo anti-TIGIT 313R12 se une preferentemente a TIGIT de ratón y es la molécula de sustituto del ratón utilizado en la mayoría de los estudios de eficacia preclínicos. La PK del anticuerpo anti-TIGIT 313R12 se determinó en ratones C57BL-6J a dosis de 0,1, 1 y 10 mg/kg. Se tomaron muestras de sangre durante 21 días. 313R12 exhibió características farmacocinéticas de 2 compartimentos no lineales a los niveles de dosis estudiados. Se cree que tal aclaramiento dependiente de la concentración es una característica típica de los anticuerpos monoclonales para los que el aclaramiento mediado por la diana puede ser un componente significativo del mecanismo de eliminación general cuando la diana es abundante y fácilmente accesible por el fármaco. A 10 mg/kg, el perfil de concentración-tiempo de 313R12 se aproximó a la linealidad durante 21 días, lo que sugiere la saturación de moléculas diana accesibles. La estimación de la vida media terminal no es aplicable a los datos PK no lineales.

[0427] El PK de anticuerpo anti-TIGIT 313R19 se determinó en ratones Balb/c. Se administró una dosis única de 10 mg/kg a cada ratón por vía intravenosa o intraperitoneal. Se tomaron muestras de sangre durante 21 días. 313R19 exhibió características de PK lineal de 2 compartimentos con un aclaramiento de IgG típico. La vida media terminal en ratones a 10 mg/kg se estimó en 7,6 días.

[0428] El PK de anticuerpo anti-TIGIT 313R19 también se determinó en monos cynomolgus. Se administraron dosis de 10, 30 y 100 mg/kg a cada animal, dos veces por semana para 4 dosis. Cada grupo de dosis fue de 4 animales machos y la finalización del estudio fue después de la cuarta dosis sin período de recuperación. 313R19 en monos cynomolgus exhibió características de PK lineal de 2 compartimentos con un aclaramiento de IgG típico. La vida media terminal en los monos cynomolgus se estimó en 15,3 días.

[0429] Se determinó la farmacocinética de anticuerpo 313M32 anti-TIGIT en ratones Balb/c. Se administró una dosis única de 1 o 10 mg/kg a cada ratón IV o 10 mg/kg IP. Se tomaron muestras de sangre durante 21 días. 313M32 en ratones exhibió características PK lineales de 2 compartimentos, lo que era consistente con el hecho de que 313M32 no tenía unión detectable a TIGIT de ratón. El aclaramiento fue lento y demostró preliminarmente el comportamiento típico de PK de IgG. La vida media terminal en ratones se estimó en 11,7 días.

[0430] Las siguientes son las secuencias descritas en la solicitud:

Secuencia de aminoácidos de TIGIT de ratón (SEQ ID NO: 1)

MHGWLLLVWVQGLIQAAFLATAIGATAGTIDTKRNISAEEGGSVILQCHFSSDTAEVTQV

DWKQQDQLLAIYSVDLGWHVASVFSDRWPGPSLGLTFQSLTMNDTGEYFCTYHTYPGGI

YKGRIFLKVQESSDDRNGLAQFQTAPLGGTMAAVLGLICLMVTGVTVLARKDKSIRMHSI

_{ESGLGRTEAEPQEWNLRSLSSPGSPVQTQTAPAGPCGEQAEDDYADPQEYFNVLSYRSLE}

SFIAVSKTG

Secuencia de aminoácidos de TIGIT de ratón sin secuencia señal predicha (SEQ ID NO: 2)

TIDTKRNISAEEGGSVILOCHFSSDTAEVTOVDWKOODOLLAIYSVDLGWHVASVFSDRV

VPGPSLGLTFOSLTMNDTGEYFCTYHTYPGGIYKGRIFLKVOESSDDRNGLAOFOTAPLG

GTMAAVLGLICLMVTGVTVLARKDKSIRMHSIESGLGRTEAEPQEWNLRSLSSPGSPVQT

OTAPAGPCGEOAEDDYADPOEYFNVLSYRSLESFIAVSKTG

Secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de TIGIT de ratón (SEQ ID NO: 3)

TIDTKRNISAEEGGSVILOCHFSSDTAEVTOVDWKOODOLLAIYSVDLGWHVASVFSDRV

VPGPSLGLTFOSLTMNDTGEYFCTYHTYPGGIYKGRIFLKVOESSDDRNGLAOFOTAPLG

Secuencia de aminoácidos de TIGIT humana (SEQ ID NO: 4)

MRWCLLLIWAOGLROAPLASGMMTGTIETTGNISAEKGGSIILOCHLSSTTAOVTOVNWE

OODOLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLOSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTG

RIFLEVLESSVAEHGARFOIPLLGAMAATLWICTAVIVWALTRKKKALR1HSVEGDLR

RKSAGOEEWSPSAPSPPGSCVOAEAAPAGLCGEORGEDCAELHDYFNVLSYRSLGNCSFF

TF.TG

S e cu e n c ia de am in o á c id o s de T IG IT h u m a n a sin s e cu e n c ia seña l p re d ich a (S E Q ID NO : 5)

MMTGTIETTGNISAEKGGSIILOCHLSSTTAOVTOVNWEOODOLLAICNADLGWHISPSF KDRVAPGPGLGLTLOSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFOIP LLGAMAATLVVICTAVIVWALTRKKKALRIHSVEGDLRRKSAGOEEWSPSAPSPPGSCV OAEAAPAGLCGEORGEDCAELHDYFNVLSYRSLGNCSFFTETG

Secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de TIGIT humano (SEQ ID NO: 6)

MMTGTIETTGNISAEKGGSIILOCHLSSTTAOVTOVNWEOODOLLAICNADLGWHISPSF

KDRVAPGPGLGLTLOSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFOIP

313R11/313R12 CDR1 de cadena pesada (SEQ ID NO: 7)

GSSLSSSYMS

313R11/313R12/313R14/313R19 CDR2 de cadena pesada (SEQ ID NO: 8)

IIGSNGNTYYANWAKG

313R11/313R12/313R14/313R19 CDR3 de cadena pesada (SEQ ID NO: 9)

GGYRTSGMDP GDPGYR

313R11/313R12 CDR1 de cadena ligera (SEQ ID NO: 10)

QASQSISSYLNW

313R11/313R12 CDR2 de cadena ligera (SEQ ID NO: 11)

DALKLAS

313R11/313R12 CDR3 de cadena ligera (SEQ ID NO: 12)

QQEHSVGNVDN

313R14/313R19 CDR1 de cadena pesada (SEQ ID NO: 13)

GFSLSSSYMS

313R14/313R19 Variante 1 de CDR1 de cadena ligera (SEQ ID NO: 14)

QASQSNIYSDLAW

313R14/313R19 CDR2 de cadena ligera (SEQ ID NO: 15)

RASTLAS

313R14/313R19 CDR3 de cadena ligera (SEQ ID NO: 16)

QQEHLVAWIYN

313R11/313R12 Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (SEQ ID NO: 17)

QVQLESEGGLFKPTDTLTLTCTVSGSSLSSSYMSWVRQAPGKGLEWIGIIGSNGNTYYAN

WAKGRFTISKTSTTVELKITSPTTEDTATYFCARGGYRTSGMDPWGPGTLVTVSS

313R11/313R12 Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera (SEQ ID NO: 18)

DIVMTQTPASVEVAVGGTVTIKCQASQSISSYLNWYQQKPGQPPKLLIYDALKLASGVPS

RFSGSGSGTEYTLTISGVESADAATYYCQQEHSVGNVDNVFGGGTEWVKR

313R14 Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (SEQ ID NO: 19)

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLSSSYMSWIRQPPGKGLEWIGIIGSNGNTYYA

NWAKGRVTISKTSTTVELKLSSVTAADTAVYYCARGGYRTSGMDPWGQGTLVTVSS

313R14/313R19/313R20 Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera (SEQ ID NO: 20)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQNIYSDLAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGVPS

RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQEHLVAWIYNVFGQGTKVEIKR

313R11 Secuencia de aminoácidos de cadena pesada (mIgG1) con secuencia señal subrayada (SEQ ID NO: 21)

MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLESEGGLFKPTDTLTLTCTVSGSSLSSSYMSWVRQAPG

KGLSWIGTTGSNGNTYYANWAKGRFTTSKTSTTVELKTTSPTTFOTATYFCARGGYRTSG

MDPWGPGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSL

SSGVHTFPAVLESDLYTLSSSVTVPSSPRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKP

CICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVWDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQT

QPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVY

TIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSK

LNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK

313R12 Secuencia de aminoácidos de cadena pesada (mIgG2) con secuencia señal subrayada (SEQ ID NO: 22)

MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLESEGGLFKPTDTLTLTCTVSGSSLSSSYMSWVRQAPG

KGLEWIGIIGSNGNTYYANWAKGRFTISKTSTTVELKITSPTTEDTATYFCARGGYRTSG

MDPWGPGTLVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSL

SSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKP

CPPCKC PAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVWDVSEDDPDVQISWFVNNVE

VHTAQTQTHREDYNSTLRWSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSV

RAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGS

YFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSWHEGLHNHHTTKSFSRTPGK

313R11/313R12 Secuencia de aminoácidos de cadena ligera con secuencia señal subrayada (SEQ ID NO: 23)

MKHLWFFLLLVAAPRWVLSDIVMTQTPASVEVAVGGTVTIKCQASQSISSYLNWYQQKPG

QPPKLLIYDALKLASGVPSRFSGSGSGTEYTLTISGVESADAATYYCQQEHSVGNVDNVF

GGGTEVWKRTDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASWCFLNN FYPKDINVKWKIDGSERQNG

VLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC

313R14 Secuencia de aminoácidos de cadena pesada (hIgG1) con secuencia señal subrayada (SEQ ID NO: 24)

MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLSSSYMSWIRQPP

GKGLEWIGIIGSNGNTYYANWAKGRVTISKTSTTVELKLSSVTAADTAVYYCARGGYRTS

GMDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA

LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDK

THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGV

EVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ

PREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG

SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

313R14/313R19/313R20 Secuencia de aminoácidos de cadena ligera con la secuencia señal subrayada (SEQ ID NO: 25)

MVLQTQVFISLLLWISGAYGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQNIYSDLAWYQQKP

GKAPKLLIYRASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQEHLVAWIYNV

FGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSG

NSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

313R11 Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada (mIgG1) sin secuencia señal (SEQ ID NO: 26)

QVQLESEGGLFKPTDTLTLTCTVSGSSLSSSYMSWVRQAPGKGLEWIGIIGSNGNTYYAN

WAKGRFTISKTSTTVELKITSPTTEDTATYFCARGGYRTSGMDPWGPGTLVTVSSAKTTP

PSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLESDLYTLS

SSVTVPSSPRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPK

DVLTITLTPKVTCVWDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPI

MHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCM

ITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVL

HEGLHNHHTEKSLSHSPGK

313R12 Secuencia de aminoácidos de cadena pesada (mIgG2) sin secuencia señal (SEQ ID NO: 27)

QVQLESEGGLFKPTDTLTLTCTVSGSSLSSSYMSWVRQAPGKGLEWIGIIGSNGNTYYAN

WAKGRFTISKTSTTVELKITSPTTEDTATYFCARGGYRTSGMDPWGPGTLVTVSSAKTTA

PSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLS

SSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFI

FPPKIKDVLMISLSPIVTCVWDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRV

VSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQ

VTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNS

Y SCS WHEGLHNHHTTKS FSRT PGK

313R11/313R12 Secuencia de aminoácidos de cadena ligera sin secuencia señal (SEQ ID NO: 28)

DIVMTQTPASVEVAVGGTVTIKCQASQSISSYLNWYQQKPGQPPKLLIYDALKLASGVPS

RFSGSGSGTEYTLTISGVESADAATYYCQQEHSVGNVDNVFGGGTEVWKRTDAAPTVSI

FPPSSEQLTSGGASWCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSS

TLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC

313R14 Secuencia de aminoácidos de cadena pesada (hIgG1) sin secuencia señal (SEQ ID NO: 29)

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLSSSYMSWIRQPPGKGLEWIGIIGSNGNTYYA

NWAKGRVTISKTSTTVELKLSSVTAADTAVYYCARGGYRTSGMDPWGQGTLVTVSSASTK

GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS

LSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF

LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR

WSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN

QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

313R14/313R19/313R20 Secuencia de aminoácidos de cadena ligera sin secuencia señal predicha (SEQ ID NO: 30)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQNIYSDLAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGVPS

RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQEHLVAWIYNVFGQGTKVEIKRTVAAPSVFI

FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS

TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Péptido AH-1 (SEQ ID NO: 31)

SPSYVYHQF

313R19/313R20 Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (SEQ ID NO: 32)

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLSSSYMSWIRQPPGKGLEWIGIIGSNGNTYYA

NWAKGRVTISKSSNQVSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYRTSGMDPWGQGTLVTVSS

313R19 Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada (IgG 1) con la secuencia señal subrayada (SEQ ID NO: 33)

MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLSSSYMSWIRQPP

GKGLEWIGIIGSNGNTYYANWAKGRVTISKSSNQVSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYRTS

GMDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA

LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDK

THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGV

EVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ

PREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG

SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

313R19 Secuencia de aminoácidos de cadena pesada (IgG1) sin secuencia señal (SEQ ID NO: 34)

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLSSSYMSWIRQPPGKGLEWIGIIGSNGNTYYA

NWAKGRVTISKSSNQVSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYRTSGMDPWGQGTLVTVSSASTK

GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS

LSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF

LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR

WSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN

QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Enlazador (SEQ ID NO: 35)

ESGGGGVT

Enlazador (SEQ ID NO: 36)

LESGGGGVT

Enlazador (SEQ ID NO: 37)

GRAQVT

Enlazador (SEQ ID NO: 38)

WRAQVT

Enlazador (SEQ ID NO: 39)

ARGRAQVT

Etiqueta FLAG (SEQ ID NO: 40)

DYKDDDDK

Región constante de cadena pesada IgG1 humana (SEQ ID NO: 41)

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS

GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG

PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN

STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE

LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW

QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Región constante de la cadena pesada de IgG2 humana (SEQ ID NO: 42)

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS

GLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVF

LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFR

WSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN

QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN

VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Región constante de la cadena pesada de IgG3 humana (SEQ ID NO: 43)

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS

GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSC

DTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT

LMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRWSVLTVLH

QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK

GFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHE

ALHNRFTQKSLSLSPGK

Región constante de la cadena pesada de IgG4 humana (SEQ ID NO: 44)

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS

GLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSV

FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTY

RWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTK

NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEG

NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

R eg ión Fc de IgG1 hu m a n a (V ers ión 13A) (S E Q ID NO : 45)

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD

GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK

GQPREPQVYTLPPSRDKLTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKS

DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Región Fe de IgG 1 humana (Versión 13B) (SEQ ID NO: 46)

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD

GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK

GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS

DGSFFLYSELTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Región Fc de IgG1 humana (13A Versión) (SEQ ID NO: 47)

EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKF

NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT

ISKAKGQPREPQVYTLPPSRDKLTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP

PVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Región Fc de IgG1 humana (Versión 13B) (SEQ ID NO: 48)

EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKF

NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT

ISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP

PVLDSDGSFFLYSELTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Región Fc de IgG2 humana (Versión 13A) (SEQ ID NO: 49)

CVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVE

VHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQP

REPQVYTLPPSREKMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLKSDGS

FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Región Fc de IgG2 humana (Versión 13B) (SEQ ID NO: 50)

CVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVE

VHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQP

REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGS

FFLYSELTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Región Fc de IgG2 humana (Versión 13A) (SEQ ID NO: 51)

TKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPE

VQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPI

EKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREKMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK

TTPPMLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Región Fc de IgG2 humana (Versión 13A) (SEQ ID NO: 52)

TKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPE

VQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPI

EKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREKMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK

TTPPMLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Región Fc de IgG2 humana (Versión 13B) (SEQ ID NO: 53)

TKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPE

VQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPI

EKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK

TTPPMLDSDGSFFLYSELTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

R eg ión Fc de IgG 2 hu m an a (V ers ión 13B) (S E Q ID NO : 54)

TKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPE

VQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPI

EKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK

TTPPMLDSDGSFFLYSELTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

313R20 Secuencia de aminoácidos de cadena pesada (IgG4) con secuencia señal subrayada (SEQ ID NO: 55)

MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLSSSYMSWIRQPP

GKGLEWIGIIGSNGNTYYANWAKGRVTISKSSNQVSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYRTS

GMDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA

LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPP

CP PC PAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVH

NAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPRE

PQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF

LYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

313R20 Secuencia de aminoácidos de cadena pesada (IgG4) sin señal se secuencia (SEQ ID NO: 56)

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLSSSYMSWIRQPPGKGLEWIGIIGSNGNTYYA

NWAKGRVTIS KSSNQVSLKLS SVTAADTAVYYCARGGY RT S GMDPWGQGTLVTVSSAST K

GPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS

LSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFP

PKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWS

VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVS

LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFS

CSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

313M26/313M32 CDR1 de cadena pesada (SEQ ID NO: 57)

TSDYAWN

313M26/313M32 CDR2 de cadena pesada (SEQ ID NO: 58)

YISYSGSTSYNPSLRS

313M26/313M32 CDR3 de cadena pesada (SEQ ID NO: 59)

ARRQVGLGFAY

313M26/313M32 CDR1 de cadena ligera (SEQ ID NO: 60)

KASQDVSTAVA

313M26/313M32 CDR2 de cadena ligera (SEQ ID NO: 61)

SASYRYT

313M26/313M32 CDR3 de cadena ligera (SEQ ID NO: 62)

QQHYSTP

313M26 Secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 63)

DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWVRQFPGNKLEWMGYISYSGSTSY

NPSLRSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARRQVGLGFAYWGQGTLVTVSS

313M26 Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera (SEQ ID NO: 64)

DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPD

RFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYSTPWTFG

313M26 Secuencia de nucleótidos de la región variable de la cadena pesada (SEQ ID NO: 65)

GATGTGCAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCCCTC

ACCTGCACTGTCACTGGCTACTCAATCACCAGTGATTATGCCTGGAACTGGGTCCGGCAG

TTTCCAGGAAACAAACTGGAGTGGATGGGCTACATAAGCTACAGTGGTAGCACTAGCTAC

AACCCATCTCTCAGAAGTCGAATCTCTATCACTCGAGACACATCCAAGAACCAGTTCTTC

CTGCAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGCAAGGAGACAG

GTCGGGCTGGGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCAGCTCA

313M26 Secuencia de nucleótidos de la región variable de la cadena ligera (SEQ ID NO: 66)

GACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTTGGAGACAGGGTCAGC

ATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGAGTACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCA

GGACAATCTCCTAAACTACTGATTTACTCGGCATCCTACCGGTACACTGGAGTCCCTGAT

CGCTTCACTGGCAGTGGATCTGGGACGGATTTCACTTTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCT

GAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAACATTATAGTACTCCGTGGACGTTCGGT

313M32 Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (SEQ ID NO: 67)

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGSTSY

NPSLRSRVTISRDTSKNQFFLKLSSVTAADTAVYYCARRQVGLGFAYWGQGTLVTVSS

313M32 Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera (SEQ ID NO: 68)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPS

RFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYSTPWTFG

313M32 Secuencia de aminoácidos de cadena pesada (IgG1) con la secuencia señal predicha subrayada (SEQ ID NO: 69)

MDWTWRILFLVAAATGAHSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITSDYAWNWIRQP

PGKGLEWIGYISYSGSTSYNPSLRSRVTISRDTSKNQFFLKLSSVTAADTAVYYCARRQV

GLGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS

GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD

GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK

GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS

DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

313M32 Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada (IgG1) sin señal se secuencia (SEQ ID NO: 70)

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGSTSY

NPSLRSRVTISRDTSKNQFFLKLSSVTAADTAVYYCARRQVGLGFAYWGQGTLVTVSSAS

TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL

YSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS

VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST

YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT

KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ

GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

313M32 Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera con la secuencia señal predicha subrayada (SEQ ID NO: 71)

MVLQTQVFISLLLWISGAYGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKP

GKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYSTPWTFGQ

GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ

ESVTEQDSKDSTYSLSNTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

313M32 Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera sin secuencia señal (SEQ ID NO: 72)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPS

RFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYSTPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPP

SDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSNTLT

LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

313M32 Secuencia de nucleótidos de la región variable de la cadena pesada (SEQ ID NO: 73)

CAGGTCCAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCTGAGACCCTGTCCCTC

ACCTGCGCTGTCTCTGGTTACTCCATCACCTCCGATTATGCCTGGAACTGGATTCGGCAG

CCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGTACATAAGCTACTCTGGTAGCACTAGCTAC

AACCCATCTCTCCGGTCACGGGTCACAATATCACGGGACACATCCAAGAACCAGTTCTTC

CTGAAGCTGTCCTCTGTGACCGCCGCTGACACCGCCGTGTATTACTGTGCAAGGAGACAG

GTCGGGCTGGGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCAGCTCA

313M32 Secuencia de nucleótidos de la región variable de la cadena ligera (SEQ ID NO: 74)

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTTGGAGACAGAGTCACC

ATCACTTGCAAGGCTTCTCAGGATGTGTCTACTGCTGTTGCCTGGTATCAGCAGAAACCA

GGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTACTCTGCATCCTATCGGTACACTGGGGTCCCATCA

AGGTTCTCCGGATCTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCT

GAAGATATTGCAACATATTACTGTCAGCAACATTATTCTACTCCTTGGACATTCGGC

313M32 Secuencia de nucleótidos de la cadena pesada (IgG1) (SEQ ID NO: 75)

ATGGACTGGACCTGGAGGATACTCTTTCTCGTGGCTGCAGCCACAGGAGCCCACTCCCAG

GTCCAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCTGAGACCCTGTCCCTCACC

TGCGCTGTCTCTGGTTACTCCATCACCTCCGATTATGCCTGGAACTGGATTCGGCAGCCC

CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGTACATAAGCTACTCTGGTAGCACTAGCTACAAC

CCATCTCTCCGGTCACGGGTCACAATATCACGGGACACATCCAAGAACCAGTTCTTCCTG

AAGCTGTCCTCTGTGACCGCCGCTGACACCGCCGTGTATTACTGTGCAAGGAGACAGGTC

GGGCTGGGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCAGCTCAGCCAGCACA

AAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTCCTCCAAGTCCACCTCCGGCGGCACCGCC

GCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCT

GGCGCCCTGACCTCTGGCGTGCACACCTTCCCAGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTAC

TCCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGC

AACGTGAACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAGCCTAAGTCCTGC

GACAAGACCCACACCTGCCCTCCCTGCCCTGCCCCTGAGCTGCTGGGCGGACCTTCCGTG

TTCCTGTTCCCTCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTGACC

TGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGATCCTGAGGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGAC

GGCGTGGAGGTGCACAACGCTAAGACCAAGCCAAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTAC

CGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAG

TGCAAGGTCTCCAACAAGGCCCTGCCCGCTCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAGGCCAAG

GGCCAGCCTCGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCACCCAGCCGGGAGGAGATGACCAAG

AACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAG

TGGGAGTCTAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTGTGCTGGACTCC

GACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGC

AACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGC

CTGTCTCTGTCTCCTGGCAAGTGA

313M32 Secuencia de nucleótidos de la cadena ligera (SEQ ID NO: 76)

ATGGTGCTCCAGACCCAGGTCTTCATTTCCCTGCTGCTCTGGATCAGCGGAGCCTACGGG

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTTGGAGACAGAGTCACC

ATCACTTGCAAGGCTTCTCAGGATGTGTCTACTGCTGTTGCCTGGTATCAGCAGAAACCA

GGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTACTCTGCATCCTATCGGTACACTGGGGTCCCATCA

AGGTTCTCCGGATCTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCT

GAAGATATTGCAACATATTACTGTCAGCAACATTATTCTACTCCTTGGACATTCGGCCAA

GGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCTCCA

TCTGATGAGCAGCTCAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTAT

CCCAGAGAGGCCAAAGTCCAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCGGCAACTCCCAG

GAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAACACCCTGACA

CTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTATGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGC

CTGTCTTCCCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGCTAA

TIGIT de mono cynomolgus (SEQ ID NO: 77)

MRWCLFLIWAQGLRQAPLASGMMTGTIETTGNISAKKGGSVILQCHLSSTMAQVTQVNWE

QHDHSLLAIRNAELGWHIYPAFKDRVAPGPGLGLTLQSLTMNDTGEYFCTYHTYPDGTYR

GRIFLEVLESSVAEHSARFQIPLLGAMAMMLW ICIAVIW W LARKKKSLRIHSVESGL

QRKSTGQEEQIPSAPSPPGSCVQAEAAPAGLCGEQQGDDCAELHDYFNVLSYRSLGSCSF

FTETG

TIGIT de mono Rhesus (SEQ ID NO: 78)

MRWCLFLIWAQGLRQAPLASGMMTGTIETTGNISAKKGGSVILQCHLSSTMAQVTQVNWE

QHDHSLLAIRNAELGWHIYPAFKDRVAPGPGLGLTLQSLTMNDTGEYFCTYHTYPDGTYR

GRIFLEVLESSVAEHSARFQIPLLGAMAMMLW ICIAVIW W LARKKKSLRIHSVESGL

QRKSTGQEEQIPSAPSPPGSCVQAEAAPAGLCGEQQGDDCAELHDYFNVLSYRSLGSCSF

FTETG

Aminoácidos de TIGIT humanos 55-70 (SEQ ID NO: 79)

TQVNWEQQDQLLAICN

Aminoácidos TIGIT humanos 105-122 (SEQ ID NO: 80)

EYFCIYHTYPDGTYTGRI

313R14/313R19 CDR1 de cadena ligera (SEQ ID NO: 81)

QASQNIYSDLAW

313M33 Secuencia de aminoácidos de cadena pesada sin secuencia señal (SEQ ID NO: 82)

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGSTSY

NPSLRSRVTISRDTSKNQFFLKLSSVTAADTAVYYCARRQVGLGFAYWGQGTLVTVSSAS

TKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL

YSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFL

FPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRV

VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQ

VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVF

SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

313M33 Secuencia de aminoácidos de cadena pesada (IgG4) sin secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 83)

MDWTWRILFLVAAATGAHSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITSDYAWNWIRQP

PGKGLEWIGYISYSGSTSYNPSLRSRVTISRDTSKNQFFLKLSSVTAADTAVYYCARRQV

GLGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS

GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYG

PPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVE

VHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQP

REPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS

FFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

313M33 Secuencia de nucleótidos de cadena pesada (IgG4) (SEQ ID NO: 84)

ATGGACTGGACCTGGAGGATACTCTTTCTCGTGGCTGCAGCCACAGGAGCCCACTCCCAG GTCCAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCTGAGACCCTGTCCCTCACC TGCGCTGTCTCTGGTTACTCCATCACCTCCGATTATGCCTGGAACTGGATTCGGCAGCCC CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGTACATAAGCTACTCTGGTAGCACTAGCTACAAC CCATCTCTCCGGTCACGGGTCACAATATCACGGGACACATCCAAGAACCAGTTCTTCCTG AAGCTGTCCTCTGTGACCGCCGCTGACACCGCCGTGTATTACTGTGCAAGGAGACAGGTC GGGCTGGGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCAGCTCAGCCAGCACA AAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCACCCTGCTCCCGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCC GCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCCGTTACCGTGTCTTGGAACTCC GGCGCACTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCTGCTGTCCTCCAATCCTCTGGACTCTAC TCCCTCTCCTCCGTGGTGACAGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACTAAGACCTACACCTGC AACGTCGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGA CCCCCATGCCCACCTTGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTC CCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACTTGCGTGGTG GTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTATGTGGATGGCGTGGAG GTTCATAATGCCAAGACAAAGCCTCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACCTACCGGGTGGTC AGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTC TCCAACAAAGGGCTCCCATCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCC CGGGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAAGTG TCCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGC AATGGGCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACTCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCC TTCTTCCTCTACTCCCGGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGCAATGTCTTC TCCTGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTG TCTCTGGGCAAATGA

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo que se une específicamente al dominio extracelular de TIGIT humano, que comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende TSDYAWN (SEQ ID NO: 57), una CDR2 de cadena pesada que comprende YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 58), y una CDR3 de cadena pesada que comprende ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 59), y una CDR1 de cadena ligera que comprende KASQD 80 VSTAv A (SEQ ID NO: 60), una CDR2 de cadena ligera que comprende SASYRYT (SEQ ID NO: 61) y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQHYSTP (SEQ ID NO: 62).

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, que comprende una región variable de cadena pesada que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 67 y una región variable de cadena ligera que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 68; en donde opcionalmente el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 67 y una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 68.

3. El anticuerpo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo IgG1, un anticuerpo IgG2, un anticuerpo IgG4 o un fragmento de anticuerpo que comprende un sitio de unión al antígeno.

4. El anticuerpo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 70 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 72.

5. Un anticuerpo que se une específicamente al dominio extracelular de TIGIT humano, que comprende:

(a) la región variable de cadena pesada codificada por el plásmido depositado con ATCC como PTA-122346 y la región variable de cadena ligera codificada por el plásmido depositado con ATCC como PTA-122347; o (b) la cadena pesada codificada por el plásmido depositado en ATCC como PTA-122346 y la cadena ligera codificada por el plásmido depositado en ATCC como PTA-122347.

6. El anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que:

(a) inhibe la unión de TIGIT al receptor de poliovirus (PVR);

(b) inhibe o bloquea la interacción entre TIGIT y PVR;

(c) inhibe la señalización TIGIT;

(d) inhibe la activación de TIGIT;

(e) inhibe la fosforilación de TIGIT; y/o

(f) disminuye la expresión de TIGIT en la superficie celular.

7. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que induce y/o potencia una respuesta inmunitaria.

8. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que:

(a) aumenta la inmunidad mediada por células;

(b) aumenta la actividad de las células T ;

(c) aumenta la actividad de las células T citolíticas (CTL);

(d) aumenta la actividad de las células asesinas naturales (NK);

(e) aumenta la producción de IL-2 y/o el número de células productoras de IL-2;

(f) aumenta la producción de IFN-gamma y/o el número de células productoras de IFN-gamma;

(g) aumenta una respuesta inmunitaria de tipo Th1;

(h) disminuye la producción de IL-4 y/o el número de células productoras de IL-4;

(i) disminuye la producción de IL-10 y/o el número de células productoras de IL-10;

(j) disminuye una respuesta inmunitaria de tipo Th2;

(k) inhibe y/o disminuye la actividad supresora de las células T reguladoras (Tregs); y/o

(l) inhibe y/o disminuye la actividad supresora de las células supresoras derivadas de mieloides (MDSC).

9. Un agente heterodimérico que comprende el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

10. Un agente biespecífico que comprende:

a) un primer brazo que se une específicamente a TIGIT, y

b) un segundo brazo,

en donde el primer brazo comprende un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

11. El agente biespecífico de la reivindicación 10, en donde el segundo brazo:

(a) comprende un sitio de unión al antígeno de un anticuerpo; o

(b) se une específicamente a PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, OX-40 o GITR; o

(c) se une específicamente a un antígeno tumoral; o

(d) comprende un agente inmunoterapéutico; opcionalmente donde el agente inmunoterapéutico se selecciona del grupo que consiste en: factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), interleucina 2 (IL- 2), interleucina 3 (IL-3), interleucina 12 (IL-12), interleucina 15 (IL-15), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), ligando 4-1 Bb , GITRL, OX- 40L, anticuerpo anti-CD3, anticuerpo anti-CTLA4, anticuerpo anti-PD-1, anticuerpo anti-PD-L1, anticuerpo anti-GITR, anticuerpo anti-OX-40, anticuerpo anti-4-1BB, anticuerpo anti-LAG-3, y anticuerpo anti-TIM-3.

12. Una célula que comprende o produce el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1-8 o el agente biespecífico según la reivindicación 10 o la reivindicación 11.

13. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1-8 o el agente biespecífico de acuerdo con la reivindicación 10 o la reivindicación 11, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. Una molécula de polinucleótido aislada que comprende un polinucleótido que codifica el anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 o el agente biespecífico según la reivindicación 10 o la reivindicación 11.

15. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 14.

16. Una célula que comprende el polinucleótido de la reivindicación 14 o el vector de la reivindicación 15.

17. El anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 o el agente biespecífico según la reivindicación 10 o la reivindicación 11, para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto, en donde el cáncer se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en cáncer colorrectal, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de mama, cáncer de riñón, cáncer de próstata, cáncer gastrointestinal, melanoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de vejiga, glioblastoma y cáncer de cabeza y cuello.

18. El anticuerpo o agente biespecífico para su uso según la reivindicación 17, en donde el tratamiento comprende además administrar al menos un agente inmunoterapéutico adicional; opcionalmente donde el agente inmunoterapéutico se selecciona del grupo que consiste en: GM-CSF, M-CSF, G-CSF, IL-2, IL-3, IL-12, IL-15, B7-1 (CD80), B7- 2 (CD86), ligando 4-1 BB, G iTr L, ligando OX-40, anticuerpo anti-CD3, anticuerpo anti-CTLA-4, anticuerpo anti-PD-1, anticuerpo anti-PD-L1, anticuerpo anti-GITR, anticuerpo OX-40, anticuerpo anti-4-1BB, anticuerpo anti-LAG-3 y anticuerpo anti-TIM-3.