TW202222345A - 包含抗ｔｉｇｉｔ／ｐｄ－１雙特異性抗體的製劑及其製備方法和用途 - Google Patents

Abstract

本發明係關於包含抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體的製劑，尤其係關於包含抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體、緩衝劑、穩定劑和表面活性劑的藥物製劑。此外，本發明還關於這些製劑的疾病治療或預防用途。

Description

包含抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體的製劑及其製備方法和用途

本發明係關於抗體製劑領域。更具體而言，本發明係關於包含重組的抗含免疫球蛋白基序與免疫受體酪胺酸抑制基序結構域的T細胞免疫受體(TIGIT)和抗程序性死亡受體1(PD-1)雙特異性抗體(也稱為抗TIGIT/PD-1雙特異性抗體)的藥物製劑，尤其是穩定的液體製劑，以及用於製備該藥物製劑的方法，以及該藥物製劑的治療和/或預防用途。

近年來，隨著對免疫檢查點(immune checkpoint)分子的研究，發現免疫檢查點的抑制性信號通路活化導致T淋巴細胞不能有效發揮對腫瘤的殺傷效應(Yao S,Zhu Y和Chen L.，Advances in targeting cell surface signaling molecules for immune modulation.Nat Rev Drug Discov,2013,12(2)：130-146)，這從一個方面導致了僅靶向腫瘤細胞上的靶點的藥物(例如曲妥珠單抗)的抗腫瘤效果不佳。

程序性死亡蛋白-1(PD-1)是一種重要的免疫檢查點蛋白，為55kDa大小的I型跨膜蛋白，主要誘導性表達於活化的T細胞表面，也表達於B細 胞、NK細胞、單核細胞、DC細胞等細胞上。已鑑定到PD-1的兩種細胞表面糖蛋白配體，分別為程序性死亡蛋白配體1(PD-L1)和程序性死亡蛋白配體2(PD-L2)。PD-1的配體在許多癌細胞上高表達。PD-1與PD-1的配體結合後可導致T細胞凋亡、免疫無應答、T細胞“耗竭”和分泌IL-10等，因此，阻斷PD1途徑能在癌症患者中恢復T細胞功能(Sheridan,Nature Biotechnology 30(2012),729-730)。針對PD-1的單株抗體已有記載，例如，百時美施貴寶(BMS)公司的納武單抗(Nivolumab)和默克(Merck)公司的派姆單抗(Pembrolizumab)。納武單抗(商品名OPDIVO^®)為完全人源化的IgG4抗體分子，派姆單抗(商品名KEYTRUDA^®)為人源化IgG4抗體分子。該抗PD-1單株抗體與T淋巴細胞上的PD-1結合後能夠抑制PD-1與其配體PD-L1和PD-L2的結合，由此促進T淋巴細胞活化、增殖和產生免疫活化型細胞因子如IL-2，並解除PD-1對具有抗腫瘤活性的T淋巴細胞免疫監視的抑制。

雖然抗PD-1抗體對PD-1抑制信號的阻斷得到臨床證實，並導致某些癌症治療的顯著臨床進展，但是有許多患者對PD-1治療無反應、復發、獲得抗性，或對治療不耐受。

與PD-1類似，TIGIT是在活化和耗盡的T細胞上表達的共抑制受體。TIGIT結合腫瘤細胞上的脊髓灰質炎病毒受體(PVR，也稱為CD155)，並能夠將信號反向傳遞到腫瘤細胞中，導致T細胞抑制性細胞因子的分泌。儘管CD155被認為是TIGIT的顯性配體，TIGIT也可與CD112和CD113相互作用(Blake et al.,Clin Cancer Res；2016；22(21)：5182-5188)。已經研究了TIGIT作為抑制性免疫檢查點受體的作用。TIGIT是CD226/TIGIT通路的一部分，其中TIGIT不僅與共刺激免疫受體CD226競爭結合CD155，而且也直接與細胞膜中 的CD226相互作用，並阻斷CD226同二聚。(Blake et al.,S,Clin Cancer Res；2016；22(21)：5182-5188；Johnston et al.,Cancer Cell 2014；26：923-937；Mahnke et al,Journal of Investigative Dermatology 2016；136：9-11)。

抗TIGIT抗體是本領域已知的，包括US 2016/0355589、US 2017/143825、US 2017/088613、US 2016/376365、US2018/169238、US 2016/176963、和US 2019/100591中公開的那些抗體。然而，沒有單獨或與抗人PD-L1或抗人PD-1抗體組合的抗人TIGIT抗體已經獲得在人中治療用途的監管批准。此外無靶向TIGIT和PD-1或者TIGIT和PD-L1雙特異性抗體被監管部門批准用於人的治療用途。因此，存在對靶向免疫檢查點通路的另外治療的需要。

本領域需要新的能夠用來治療、預防或延緩與免疫檢查點通路相關疾病的新特異性抗體及包含這類新抗體的製劑。需要的是該製劑具有良好穩定性，當在液體中調配時，液體溶液中的抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體不易分解、聚集或發生不希望的化學修飾等。

本發明藉由提供含有特異結合TIGIT和PD-1的抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白的藥物製劑來滿足上述需求。與其它抗人TIGIT抗體不同，本發明中使用的抗體是效應子功能無效的，即，被工程化以最小化Fc受體結合。因此，與其它抗人TIGIT抗體不同，本發明的抗體不包含可導致T調節細胞耗竭和免疫應答不良事件的天然人IgG1框架。此外，本發明的抗人TIGIT/抗人PD-1雙特異性抗體含有不同類型的輕鏈，其中該抗人TIGIT臂輕鏈是κ輕鏈， 並且該抗人PD-1輕鏈是λ輕鏈，其藉由降低輕鏈-輕鏈二聚化的可能性促進異聚體雙特異性抗體形成。

本發明提供了抗人TIGIT/抗人PD-1雙特異性分子，其最小化Fc受體結合、最小化的氧化、促進性異聚體的組裝，並且與人TIGIT/PD-1和獼猴TIGIT/PD-1交叉反應，並且在已建立的腫瘤模型中展示體內功效。本發明中使用的抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體在抗腫瘤作用方面顯示協同作用。

本發明的抗體製劑除了能夠使抗體以適於施用給受試者的方式調配之外，還能在儲存以及後續使用期間維持其穩定性。

在一個方面，本發明提供了一種液體抗體製劑，其包含(i)抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白；(ii)緩衝劑，(iii)穩定劑，和(iv)表面活性劑，較佳地該抗體製劑的pH為約4.5-6.8。

本發明抗體製劑中的抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白包含第一半抗體和第二半抗體，其中第一半抗體包含特異性結合TIGIT(SEQ ID NO：31)或其胞外結構域(例如SEQ ID NO：32)的第一VH/VL單元並且第二半抗體包含特異性結合PD-1(SEQ ID NO：29)或其胞外結構域(例如SEQ ID NO：30)的第二VH/VL單元。在一些實施方案中，該抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白能夠以低於約10^-7M、較佳地約10^-8M和更佳地約5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.5nM或更低的K _D 與T淋巴細胞表面的PD-1結合，且能夠以低於約10^-7M、較佳地約10^-8M和更佳地約5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.5nM或更低的K _D 與TIGIT結合，以致該抗體可以用作雙特異性靶向PD-1分子和TIGIT分子的治療劑和/或預防劑。

在一實施方案中，該第一VH/VL單元包含重鏈和輕鏈互補決定區(CDR)胺基酸序列SEQ ID NO：1-6或與該6個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列；和/或第二VH/VL單元包含重鏈和輕鏈互補決定區(CDR)胺基酸序列SEQ ID NO：7-12或與該6個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列。

在一個實施方案中，抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白包含第一半抗體和第二半抗體，其中第一半抗體包含特異性結合TIGIT的第一VH/VL單元並且第二半抗體包含特異性結合PD-1的第二VH/VL單元，其中該第一VH/VL單元包含SEQ ID NO：13/SEQ ID NO：14的成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列，或與該成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性的序列，並且其中該第二VH/VL單元包含SEQ ID NO：17/SEQ ID NO：18的成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列，或與該成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性的序列。

在一個實施方案，抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白是異源二聚體，其中第一半抗體和第二半抗體各自形成兩個單價結合臂。在一個實施方案，該兩個單價結合臂是藉由二硫鍵連接的。

在一個具體的實施方案中，第一單價結合臂以低於約10^-7M、較佳地約10^-8M和更佳地約5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.5nM或更低的K_D 結合到TIGIT；在一個具體的實施方案中，第二單價結合臂以低於約10^-7M、較佳地約10^-8M和更佳地約5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.5nM或更低的K _D 結合到PD-1；在另一個實施方案中，與普通的單特異性抗體蛋白相比，雙特異性抗體蛋白具有與其相同或相似的四級結構。

不特別地限制抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白中第一半抗體和第二半抗體的重鏈恆定區的類型，較佳地是IgG1、IgG2或IgG4免疫球蛋白的重鏈恆定區，或與之基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更多同一)的序列。更佳地，該重鏈恆定區是人IgG1免疫球蛋白的重鏈恆定區，或與之基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更多同一)的序列。

在一個實施方案中，抗體的重鏈與抗體的輕鏈形成至少一個二硫鍵，抗體的兩條重鏈形成至少一個二硫鍵。

在另一個實施方案中，抗體是工程化改造以降低抗體與Fcγ受體結合的人IgG1。

在一個實施方案中，抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白包含IgG1(例如，人IgG1)中使用的重鏈恆定區。在又一個實施方案中，抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白包含用於IgG4(例如，人IgG4)的重鏈恆定區。例如，抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體的兩條重鏈的Fc結構域中分別包含具有“CPPC”胺基酸殘基的鉸鏈區，和/或分別包含Y349C和S354C(根據Kabat的“EU編號”)，由此，抗PD-1半抗體和抗TIGIT半抗體在Fc區形成鏈間二硫鍵，由此，穩定抗PD-1半抗體和抗TIGIT半抗體的正確配對。

在一個實施方案中，抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白包含第一半抗體和第二半抗體，其中第一半抗體包含SEQ ID NO：21的重鏈序列或與之具有至少90%、95%、98%或99%同一性的重鏈序列，和SEQ ID NO：22的輕鏈序列或與之具有至少90%、95%、98%或99%同一性的輕鏈序列，並且其中第二半抗體包含SEQ ID NO：23的重鏈序列或與之具有至少90%、95%、98%或99%同一性的重鏈序列，和SEQ ID NO：24的輕鏈序列或與之具有至少90%、95%、98%或99%同一性的輕鏈序列。

在一個實施方案中，該抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白是在HEK293細胞或以HEK293細胞為基礎改造而得到的HEK293T、HEK293F、HEK293E細胞；CHO細胞或以CHO細胞為基礎改造而得到的CHO-S、CHO-dhfr^-、CHO/DG44、ExpiCHO中重組表達的抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白。

在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白的濃度為約1-200mg/ml，較佳地為約1-150mg/ml，更佳地為約10-100mg/mL，例如約5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100mg/ml。

在一個實施方案中，本發明液體製劑中的緩衝劑選自組胺酸、鹽酸組胺酸、谷胺酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽和三羥甲基胺基甲烷和它們的組合，較佳組胺酸、鹽酸組胺酸和它們的組合。在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的緩衝劑的濃度為約0.5-200mM、約1-100mM、約5-50mM、約5-30mM或約5-20mM。

在一個實施方案中，用於本發明製劑中的緩衝劑是約10mM組胺酸。

又在一個實施方案中，用於本發明製劑中的緩衝劑是約5mM組胺酸和約5mM鹽酸組胺酸的組合。

在一些實施方案中，用於本發明制較佳劑中的緩衝劑可以將本發明製劑的pH控制在大約4.5-6.8的pH範圍，較佳大約5.0-6.5，更佳約6.0的pH。在一些具體的實施方案中，本發明的抗體製劑具有約4.5、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.5、6.6、6.7或6.8的pH。

在一個實施方案中，該穩定劑選自糖類、多元醇、胺基酸或其鹽及它們的組合，較佳地，該糖類選自但不限於：蔗糖、右旋糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、環糊精、麥芽糖糊精和葡聚糖，該多元醇選自但不限於：甘露醇、山梨醇和木糖醇，該胺基酸或其鹽選自選自但不限於精胺酸、精胺酸鹽(較佳精胺酸鹽酸鹽)和其組合，較佳精胺酸鹽酸鹽。在一些實施方案中，該穩定劑是山梨醇。在一些實施方案中，該穩定劑是精胺酸鹽酸鹽。在一些實施方案中，該穩定劑是山梨醇、精胺酸、精胺酸鹽(較佳精胺酸鹽酸鹽)或其組合。

在一些實施方案中，本發明的穩定劑在本發明的液體製劑中以約1-1000mM、約10-1000mM，較佳地約20-800mM，例如約50-500、約100-400、約100-300或約100-200mM例如，約10、20、50、80、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000mM的濃度存在。

本發明的穩定劑中還可以包含抗氧化劑、EDTA和/或依地酸二鈉，其選自但不限於：同型半胱胺酸、半胱胺酸、胱硫醚、甲硫胺酸、谷胱甘肽、以及包含同型半胱胺酸、半胱胺酸、胱硫醚、甲硫胺酸和谷胱甘肽中任意一種的肽。在包含抗氧化劑、EDTA和/或依地酸二鈉的情形下，穩定劑的總濃度如前所述，其中抗氧化劑的濃度為約1-50mM，較佳地約5-40mM，例如約5、10、20、 30、40mM；EDTA和/或依地酸二鈉的濃度為約0.001-0.5mg/ml，例如0.005-0.02mg/ml，較佳0.01mg/ml。

在一個實施方案中，本發明的液體製劑中的表面活性劑是非離子型表面活性劑，例如，烷基聚(環氧乙烯)。可包括在本發明製劑中的特定非離子型表面活性劑包括，例如聚山梨酯，諸如聚山梨酯-20、聚山梨酯-80、聚山梨酯-60、或聚山梨酯-40；普洛尼克等。在一個較佳實施方案中，本發明的液體製劑中包含聚山梨酯-80作為表面活性劑。

在較佳的一些實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的表面活性劑的濃度為約0.01-10mg/ml，較佳地約0.05-5、約0.05-2、約0.1-5、0.2-2、0.3-1、0.4-0.8、0.5-0.6mg/ml，例如約0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mg/ml。

在一個實施方案中，該液體製劑為藥物製劑，較佳為注射劑，更佳為皮下注射劑或靜脈內注射劑。在一個實施方案中，該液體製劑為靜脈輸注劑。

在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑包含：

(i)約1-150mg/ml的抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白；

(ii)約5-50mM的組胺酸和/或鹽酸組胺酸；

(iii)約50-500mM的山梨醇；和/或約1-600mM的精胺酸或鹽酸精胺酸；和

(iv)約0.05-2mg/ml聚山梨醇酯80；

其中該液體製劑的pH為約5.0-6.5，較佳地約6.0。

在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑包含：

(i)約10-100mg/ml的抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白；

(ii)約5-20mM的組胺酸和/或鹽酸組胺酸；

(iii)約100-300mM的山梨醇；和/或約50-200mM的精胺酸或鹽酸精胺酸；和

(iv)約0.2-2mg/ml聚山梨醇酯80；

其中該液體製劑的pH為約5.0-6.5，較佳地約6.0。

在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑包含：

(i)約25mg/ml的抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白；

(ii)約5mM的組胺酸和約5mM鹽酸組胺酸；或者約10mM的組胺酸；

(iii)約25mg/ml的山梨醇；和約80mM的精胺酸或鹽酸精胺酸；和

(iv)約0.5mg/ml聚山梨醇酯80；

其中該液體製劑的pH為約5.0-6.5，較佳地約6.0。

另一方面，本發明提供了一種固體抗體製劑，其是藉由將本發明的液體抗體製劑經固化處理而獲得的。該固化處理是藉由例如結晶法、噴霧乾燥法、冷凍乾燥法實施的。在一個較佳的實施方案中，該固體抗體製劑例如是凍乾粉針劑形式。固體抗體製劑可在使用前，藉由重構於適當的溶媒中，形成本發明的重構製劑。該重構製劑也是一種本發明的液體抗體製劑。在一個實施方案中，該適當的溶媒選自注射用水、注射用有機溶劑，包括但不限於注射用油、乙醇、丙二醇等，或其組合。

本發明的液體製劑可以長期穩定儲存，例如至少24個月或更長時間。在一個實施方案中，本發明的液體製劑可以在約-80℃至約45℃，例如-80℃、約-30℃、約-20℃、約0℃、約5℃、約25℃、約35℃、約38℃、約40℃、約42℃或約45℃的條件下，儲存至少10天、至少20天、至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少 8個月、至少9個月、至少10個月、至少11個月、至少12個月、至少18個月、至少24個月，至少36個月，或更長時間，且是穩定的。

在一個實施方案中，本發明的液體製劑可以穩定儲存至少24個月。在再一實施方案中，本發明的液體製劑在至少40℃是穩定的。在再一實施方案中，本發明的液體製劑在約2℃-8℃保持穩定至少3個月，較佳至少12個月，更佳至少24個月。在一個實施方案中，本發明的液體製劑在室溫或例如約25℃保持穩定至少2個月，較佳至少3個月，更佳至少6個月。在再一實施方案中，本發明的液體製劑在約40℃保持穩定至少2週、較佳至少1個月。

在一個實施方案中，可以藉由檢測製劑的外觀、可見異物、蛋白含量、純度、和/或電荷變異體的變化，來指示儲存後製劑的穩定性。在一個實施方案中，可以在高溫脅迫的強制實驗中，例如在40℃±2℃儲存至少1週、2週或較佳地1個月後，或在加速實驗中，例如在25℃±2℃儲存至少1個月或2個月後，或在長期實驗中，例如在5℃±3℃儲存至少2個月或3個月後，檢測本發明液體製劑的穩定性。

在一個實施方案中，在儲存後，藉由目視檢查本發明液體製劑的穩定性，其中本發明液體製劑在外觀上保持為澄明至微乳光，為無色至淡黃色液體，且無異物。在一個實施方案中，在澄明度檢測儀下目視檢查，製劑中無可見異物存在。在一個實施方案中，在儲存後，藉由測定蛋白含量變化，檢查本發明液體製劑的穩定性，其中例如藉由紫外分光光度(UV)法，相對於儲存第0天的初始值，蛋白含量變化率不超過20%，較佳不超過10%，例如7-8%，更佳不超過5%。在一個實施方案中，在儲存後，藉由測定本發明液體製劑的純度變化，檢查本發明液體製劑的穩定性，其中藉由體積排阻高效液相色譜法(SEC-HPLC)， 相對於儲存第0天的初始值，單體純度的變化值不超過10%，例如不超過5%、4%、3%、例如變化值不超過1-2%，較佳不超過1%。在一個實施方案中，在儲存後，藉由測定本發明液體製劑的純度變化，檢查本發明液體製劑的穩定性，其中藉由非還原型和/或還原型十二烷基硫酸鈉毛細管電泳(CE-SDS)法，單體純度的變化值下降不超過10%，例如不超過5%、4%、3%。在一個實施方案中，在儲存後，藉由成像毛細管等電聚焦電泳(iCIEF)檢測本發明液體製劑的穩定性，其中相對於儲存第0天的初始值，抗體的電荷變異體(主成分、酸性組分和鹼性組分)的變化值總和不超過50%，例如不超過40%、30%、20%、10%、5%。

在一個實施方案中，製劑在儲存後，例如在2-8℃儲存至少24個月後，或在室溫儲存至少3個月後，或在40℃±2℃儲存1個月後，是穩定的，較佳地具有如下特徵之一或多項：

(i)藉由SEC-HPLC法測量，製劑具有大於90%的純度，較佳大於95%、96%、97%、98%、99%的純度；

(ii)藉由還原型或非還原型CE-SDS法測量，製劑具有大於90%的純度，較佳大於92%、94%、96%、98%的純度；

(iii)藉由iCIEF法測量，相對於儲存第0天的初始值，製劑中抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白的各組分(主成分、酸性組分和鹼性組分)的變化值總和不超過50%，例如不超過40%、30%、20%、10%、5%；

(iv)藉由ELISA法測量，相對於儲存第0天的初始值，製劑中抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白的相對結合活性為70%-130%，例如，為70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%。

在一個方面，本發明提供了一種遞送裝置，其包含本發明的液體抗體製劑或固體抗體製劑。在一個實施方案中，本發明的遞送裝置以包含本發明的液體抗體製劑或固體抗體製劑的預填充注射器形式提供，例如用於靜脈內、皮下、皮內或者肌內注射、靜脈內輸注。

在又一方面，本發明提供向受試者，例如哺乳動物遞送抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白的方法，包括給予該受試者本發明的液體抗體製劑或固體抗體製劑的步驟，該遞送是例如藉由使用預填充注射器的遞送裝置實施的。

在又一方面，本發明提供本發明的液體抗體製劑或固體抗體製劑用於製備在受試者中治療、預防或延緩與TIGIT信號傳導通路和PD-1信號傳導通路相關的病症的遞送裝置(如，預填充注射器)或藥物的用途，該病症例如各種血液病和實體瘤，包括但不限於白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、腦腫瘤、頭頸癌、頭頸部鱗狀細胞癌、肺癌例如非小細胞肺癌或小細胞肺癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、膽囊癌、膽管癌、肝癌、結直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮內膜癌、子宮肉瘤、前列腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、黑色素瘤。

本發明的其它實施方案將藉由參閱此後的詳細說明而清楚明瞭。

[發明詳述]

在詳細描述本發明之前，應瞭解，本發明不受限於本說明書中的特定方法及實驗條件，因為該方法以及條件是可以改變的。另外，本文所用術語僅是供說明特定實施方案之用，而不意欲為限制性的。

定義

除非另有定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語均具有與所屬技術領域具有通常知識者通常所理解的含義相同的含義。為了本發明的目的，下文定義了以下術語。

術語“約”在與數字數值聯合使用時意為涵蓋具有比指定數字數值小5%的下限和比指定數字數值大5%的上限的範圍內的數字數值。

術語“和/或”當用於連接兩個或多個可選項時，應理解為意指可選項中的任一項或可選項中的任意兩項或多項。

術語“視需要的”或“視需要地”意指其後的成分可以存在或不存在，或著其後的事件可以發生或不發生。

如本文中所用，術語“包含”或“包括”意指包括該要素、整數或步驟，但是不排除任意其他要素、整數或步驟。在本文中，當使用術語“包含”或“包括”時，除非另有指明，否則也涵蓋由該及的要素、整數或步驟組成的情形。例 如，當提及“包含”某個具體序列的抗體可變區時，也旨在涵蓋由該具體序列組成的抗體可變區。

在本文中，術語“抗體”以最廣意義使用，指包含抗原結合位點的蛋白質，涵蓋各種結構的天然抗體和人工抗體，包括但不限於完整抗體和抗體的抗原結合片段。

術語“全抗體”、“全長抗體”、“完全抗體”和“完整抗體”在本文中可互換地用來指包含由二硫鍵相互連接的至少兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)的糖蛋白。每條重鏈由重鏈可變區(本文中縮寫為VH)和重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由3個結構域CH1、CH2和CH3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)和輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。VH區和VL區可以進一步再劃分為超變區(為互補決定區(CDR)，其間插有較保守的區域(為構架區(FR))。每個VH和VL由三個CDR和4個FR組成，從胺基端到羧基端以如下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。恆定區不直接參與抗體與抗原的結合，但是顯示出多種效應子功能。

術語“人源化”抗體指包含來自非人類HVR的胺基酸殘基和來自人FR的胺基酸殘基的嵌合抗體。在一些實施方案中，人源化抗體包含全部或基本上全部的HVR(例如，CDR)與非人抗體的那些HVR對應並且全部或基本上全部的FR區與人抗體的那些FR對應。人源化抗體視需要地可以包含從人抗體衍生的抗體恆定區的至少一部分。抗體(例如非人抗體)的“人源化形式”指已經歷過人源化的抗體。

術語“半抗體”或“半聚物”指單價抗原結合多肽。在一些實施方案中，半抗體或半聚物包含VH/VL單元和視需要地免疫球蛋白恆定結構域的至少 一部分。在一些實施方案中，半抗體或半聚物包含與一條免疫球蛋白輕鏈締合的一條免疫球蛋白重鏈，或其抗原結合片段。在一些實施方案中，半抗體或半聚物是單特異的，即，與單個抗原或表位結合。在一些具體的實施方案中，半抗體與TIGIT結合並且不與PD-1結合。在一些具體的實施方案中，半抗體與PD-1結合並且不與TIGIT結合。所屬技術領域具有通常知識者將會輕易地理解，半抗體可以具有由單一可變結構域組成(例如，源自駱駝屬(Camelidae))的抗原結合結構域。

術語“VH/VL單元”指抗體中包含至少一個VH CDR和至少一個VL CDR的抗原結合區。在一些實施方案中，VH/VL單元包含至少一個、至少兩個或全部三個VH CDR和至少一個、至少兩個或全部三個VL CDR。在某些實施方案中，VH/VL單元還包含構架區(FR)的至少一部分。在一些實施方案中，VH/VL單元包含三個VH CDR和三個VL CDR。在一些實施方案中，VH/VL單元包含至少一個、至少兩個、至少三個或全部四個VH FR和至少一個、至少兩個、至少三個或全部四個VL FR。

在本文中，術語“雙特異性抗體”或“雙特異性抗體蛋白”包含與兩種不同生物分子上的表位特異性結合的抗原結合結構域。除非另外說明，否則列出的雙特異性抗體名稱中雙特異性抗體結合的抗原的順序是任意的。即，在一些實施方案中，術語“抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體”和“抗PD-1 /TIGIT雙特異性抗體”可以互換使用。雙特異性抗體形式包含IgG樣和非IgG樣抗體(Fan等人(2015)Journal of Hematology & Oncology.8：130)。最常見的IgG樣抗體類型包含兩個Fab區域和一個Fc區域，每個Fab的重鏈和輕鏈可以來自單獨的單株抗體。非IgG樣雙特異性抗體缺乏Fc區域，其每一個抗原或靶標結合結構域可以 是Fab，也可以是單鏈可變片段(scFv)，還可以是模擬兩種抗體的可變結構域的融合蛋白，不同的結合結構域藉由肽接頭、化學偶聯、非共價鍵連接或者其他方式連接到一起。這些形式包含雙特異性T-細胞銜接子(BiTE)。

可以使用任何雙特異性抗體形式或技術來製備本發明的雙特異性抗體。例如，具有第一抗原結合特異性的抗體或其片段可以與如具有第二抗原結合特異性的另一種抗體或抗體片段等一種或多種其它分子實體功能性連結(例如，藉由化學偶聯、遺傳融合、非共價締合或以其它方式)，以產生雙特異性抗體。可以在本發明的背景下使用的具體示例性雙特異性形式包含但不限於以下：基於scFv的或雙抗體雙特異性形式、IgG-scFv融合、雙可變域(DVD)-Ig、四融合瘤(Quadroma)、杵臼(knobs-into-holes)、普通輕鏈(例如，具有旋鈕入孔的普通輕鏈等)、CrossMab、CrossFab，(SEED)body、Duobody、IgG1/IgG2、雙作用Fab(DAF)-IgG以及Mab²雙特異性形式。

在一些實施方案中，雙特異性抗體是異源二聚體，其包含兩個由半抗體形成的單價結合臂，其中每個半抗體包含單個重鏈可變區和視需要地重鏈恆定區的至少一部分以及單個輕鏈可變區和視需要地輕鏈恆定區的至少一部分。在一些實施方案中，雙特異性抗體包含兩個半抗體，其中每個半抗體包含單個重鏈可變區和單個輕鏈可變區並且不包含多於一個單個重鏈可變區且不包含多於一個單個輕鏈可變區。在一些實施方案中，雙特異性抗體包含兩個半抗體，其中每個半抗體包含單個重鏈可變區和單個輕鏈可變區，並且其中第一半抗體與第一抗原結合且不與第二抗原結合並且第二半抗體與第二抗原結合且不與第一抗原結合。在一個具體的實施方案中，第一單價結合臂以低於約10^-7M、較佳地約10^-8M和更佳地約5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.5nM或更低的K _D 結 合到TIGIT；在一個具體的實施方案中，第二單價結合臂低於約10^-7M、較佳地約10^-8M和更佳地約5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.5nM或更低的K_D結合到PD-1；在另一個實施方案中，與普通的單特異性抗體蛋白相比，雙特異性抗體蛋白具有與其相同或相似的四級結構。

術語“抗體製劑”指一種製備物，該製備物處於允許作為活性成分的抗體的生物活性可以有效發揮的形式，並且不含有對於待施用該製劑的受試者而言具有不可接受毒性的其它組分。這類抗體製劑通常是無菌的。通常，抗體製劑中包含可藥用賦形劑。“可藥用”賦形劑是可以合理地施用至受試哺乳動物以便製劑中所用活性成分的有效劑量可以遞送至受試者的試劑。賦形劑的濃度與施用模式相適應，例如可以是注射可接受的。

術語“抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體製劑”在本文中也簡稱為“本發明的抗體製劑”，意指包含抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白作為活性成分並包含可藥用賦形劑的製備物。將抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白與可藥用賦形劑組合後，作為活性成分的抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白適於治療性或預防性施與人類或非人類動物。本發明的抗體製劑可以例如製備成水性形式的液體製劑，例如，即用式預填充注射器，或者製備成凍乾製劑，在即將使用前藉由溶解和/或懸浮於生理可接受的溶液中進行重構(即，複溶)。在一些實施方案中，抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白製劑是液體製劑形式。

“穩定的”抗體製劑是製劑中的抗體在儲存於特定條件下之後保有可接受程度的物理穩定性和/或化學穩定性。儘管抗體製劑中所含的抗體在儲存特定時間之後可能不會100%維持其化學結構，但通常在儲存特定時間之後維持約90%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%的抗體結構或功能，則 認為抗體製劑是“穩定的”。在一些具體的實施方案中，本發明的抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白製劑在製造、製備、運輸和長期儲存過程中表現出低至檢測不到的抗體聚集或降解或化學修飾，從而極少或甚至是沒有抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白的生物活性損失，表現出高度穩定性。在一些實施方案中，本發明的抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白製劑在儲存後，基本上保留其物理和化學穩定性。較佳地，本發明液體製劑可以在室溫或在40℃穩定至少2週，和/或在25℃穩定至少2個月，和/或在2-8℃穩定至少24個月。

本領域已知多種分析技術可以用於測定蛋白質的穩定性，參見例如Peptide and Protein Drug Delivery,247-301,Vincent Lee Ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs(1991)and Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10：29-90(1993)。可以在選定的溫度和選定的儲存時間測量穩定性。例如，可以基於預期的製劑貨架期來選擇儲存時間。備選地，可以使用加速穩定性試驗。在一些實施方案中，藉由對抗體製劑進行各種脅迫測試來進行穩定性測試。這些測試可以代表調配的抗體製劑在製造、儲存或運輸期間可能遭遇到的極端條件，也可以代表在非製造、儲存或運輸期間可能使抗體製劑中的抗體的不穩定性加速的條件。例如，可以將經調配的抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白製劑充填至玻璃小瓶中以檢驗在高溫脅迫下的抗體穩定性。

經一段儲存時間後，製劑不顯示聚集、沉澱、混濁和/或變性；或顯示非常少的聚集、沉澱、混濁和/或變性，則可以認為抗體在製劑中“保持其物理穩定性”。由於製劑中抗體的聚集可以潛在地導致患者增加的免疫反應，從而導致安全性問題。因此，需要使在製劑中的抗體聚集最小化或防止聚集。光散射法可以用於測定製劑中的可見聚集物。SEC可以用於測定製劑中的可溶性聚集 物。此外，可以藉由目視檢查製劑的外觀、顏色和/或澄清度、或者藉由非還原型CE-SDS法測定製劑的純度，來指示製劑的穩定性。在一個實施方案中，藉由測定在特定溫度下儲存特定時間之後製劑中的抗體單體的百分比來測量製劑的穩定性，其中製劑中的抗體單體的百分比越高，則製劑的穩定性越高。

“可接受程度的”物理穩定性可以表示於特定溫度下儲存特定時間之後，在製劑中檢測到至少約88%例如至少約92%的抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白單體。在一些實施方案中，在特定溫度儲存至少2週、至少28天、至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9個月、至少10個月、至少11個月、至少12個月、至少18個月、至少24個月或更久後，可接受程度的物理穩定性表示至少約88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白單體。當評估物理穩定性時，藥物製劑儲存的特定溫度可為約-80℃至約45℃的任一溫度，例如儲存於約-80℃、約-30℃、約-20℃、約0℃、約4℃-8℃、約5℃、約25℃、約35℃、約37℃、約40℃、約42℃或約45℃。例如，若儲存於約40℃±2℃ 1個月或4週之後，檢測到至少約88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白單體，則藥物製劑視為是穩定的。若儲存於約25℃ 2個月之後，檢測到至少約88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白單體，則藥物製劑視為是穩定的。若儲存於約5℃ 9個月之後，檢測到至少約88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白單體，則藥物製劑視為是穩定的。

經一段儲存時間後，如果製劑中的抗體不顯示顯著的化學改變，則可以認為抗體在製劑中“保持其化學穩定性”。大多數化學不穩定性源自於形成了抗體的共價修飾形式(例如，抗體的電荷變異體)。例如由天冬胺酸異構化、N和C末端修飾，可以形成鹼性變異體；由脫醯胺化、唾液酸化和糖化，可以產生酸性變異體。化學穩定性可以藉由檢測和/或定量抗體的化學改變形式來評估。例如，可以藉由陽離子交換色譜(CEX)或成像毛細管等電聚焦電泳(iCIEF)檢測製劑中抗體的電荷變異體。在一個實施方案中，藉由測定在特定溫度下儲存特定時間之後製劑中抗體的電荷變異體百分比變化值來測量製劑的穩定性，其中該變化值越小，則製劑的穩定性越高。

“可接受程度”的化學穩定性可以表示於特定溫度下儲存特定時間之後製劑中電荷變異體(例如主成分或酸性組分或鹼性組分)的百分比變化值不超過50%，例如不超過30%、不超過20%。在一些實施方案中，在特定溫度儲存至少2週、至少28天、至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9個月、至少10個月、至少11個月、至少12個月、至少18個月、至少24個月或更久後，可接受程度的化學穩定性可以表現為主成分電荷變異體的百分比變化值不超過約50%、40%、30%、20%、15%。當評估化學穩定性時，儲存藥物製劑的溫度可為約-80℃至約45℃的任一溫度，例如儲存於約-80℃、約-30℃、約-20℃、約0℃、約4℃-8℃、約5℃、約25℃或約45℃。例如，若在儲存於5℃ 24個月之後，主成分電荷變異體的百分比變化值少於約25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.1%，則藥物製劑可被視為是穩定的。若在儲 存於25℃ 2個月後，主成分電荷變異體的百分比變化值少於約20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.1%，則藥物製劑亦可被視為是穩定的。若在儲存於40℃ 1個月之後，主成分電荷變異體的百分比變化值少於約50%、40%、30%、20%、10%、5%或4%，則藥物製劑亦可被視為是穩定的。

術語“凍乾製劑”是指藉由液體製劑的冷凍乾燥處理得到或能夠得到的組成物。較佳地，其為具有少於5%、較佳少於3%水含量的固體組成物。

術語“重構製劑”是指將固體製劑(例如凍乾製劑)溶解和/或懸浮於生理可接受的溶液中得到的液體製劑。

文中使用的術語“室溫”是指15℃至30℃、較佳20℃至27℃、更佳25℃的溫度。

“脅迫條件”是指在化學和/或物理上不利於抗體蛋白的環境，該環境可以導致不可接受的抗體蛋白失穩定。“高溫脅迫”是指，將抗體製劑置於室溫或甚至於更高溫度(例如40℃±2℃)儲存一段時間。藉由高溫脅迫加速試驗，可以檢查抗體製劑的穩定性。

如本文所使用，術語“腸胃外施用”意指腸內和局部給藥以外的給藥方式，通常藉由注射或輸注方式，並且包括但不限於，靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下(subcuticular)、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內、硬膜外和胸骨內注射以及輸注。在一些實施方案中，本發明的穩定抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白製劑腸胃外施用於受試者。在一個實施方案中，本發明的抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白製劑以皮下、皮內、肌內或靜脈內注射方式施用於受試者。

I.抗體製劑

本發明提供一種液體抗體製劑，其包含(i)抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白，(ii)緩衝劑，(iii)穩定劑，和(iv)表面活性劑，較佳地該抗體製劑的pH為約4.5-6.8。在一個較佳方案中，本發明的液體抗體製劑是注射製劑形式。

(i)抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白

本發明抗體製劑中的“抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體”包含第一半抗體和第二半抗體，其中第一半抗體包含特異性結合TIGIT(SEQ ID NO：31)或其胞外結構域(例如SEQ ID NO：32)的第一VH/VL單元並且第二半抗體包含特異性結合PD-1(SEQ ID NO：29)或其胞外結構域(例如SEQ ID NO：30)的第二VH/VL單元。

在一個實施方案中，該抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體”是異源二聚體，其中第一半抗體和第二半抗體各自形成兩個單價結合臂。在一個實施方案，該兩個單價結合臂是藉由二硫鍵連接的。

在另一個實施方案中，與普通的單特異性抗體蛋白相比，雙特異性抗體蛋白具有與其相同或相似的四級結構。

在一個具體的實施方案中，第一單價結合臂低於約10^-7M、較佳地約10^-8M和更佳地約5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.5nM或更低的K _D 與TIGIT結合；在一個具體的實施方案中，第二單價結合臂低於約10^-7M、較佳地約10^-8M和更佳地約5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.5nM或更低的K _D 與T淋巴細胞表面的PD-1結合。

在一些實施方案中，該抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白能夠以至少約10⁷M^-1、較佳地約10⁸M^-1和更佳地約10⁹M^-1或更強的親和力常數與T淋巴細胞表面的PD-1結合，且能夠以至少約10⁷M^-1、較佳地約10⁸M^-1和更佳 地約10⁹M^-1或更強的親和力常數與TIGIT結合，以致該抗體可以用作雙特異性靶向PD-1分子和TIGIT分子的治療劑和/或預防劑。

在一實施方案中，該第一VH/VL單元包含重鏈和輕鏈互補決定區(CDR)胺基酸序列SEQ ID NO：1-6或與該6個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列；和/或第二VH/VL單元包含重鏈和輕鏈互補決定區(CDR)胺基酸序列SEQ ID NO：7-12或與該6個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列。

術語“CDR”或“互補決定區”或“CDR區”(在本文中與超變區“HVR”可以互換使用)，是抗體可變區中主要負責與抗原表位結合的胺基酸區域。重鏈和輕鏈的CDR通常被稱作CDR1、CDR2和CDR3，從N-端開始順序編號。本領域公知多種用於在一個給定的VH或VL或VHH胺基酸序列中確定其CDR序列的方案。例如，Kabat互補決定區(CDR)或互補決定區(CDR)。Kabat互補決定區(CDR)是基於序列變異性確定的(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。而Chothia指的是結構環的位置(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。AbM HVR是Kabat HVR和Chothia結構環之間的折中，並且由Oxford Molecular的AbM抗體建模軟件使用。“接觸性”(Contact)HVR基於對可獲得的複雜晶體結構的分析。對於本發明，使用North CDR定義。North CDR定義(North et al.,“A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations”, Journal of Molecular Biology,406,228-256(2011))是基於利用大量晶體結構的親和力傳播聚類。

該胺基酸變化，例如，胺基酸置換較佳地是保守胺基酸取代。“保守胺基酸取代”是指導致某個胺基酸置換為化學上相似的胺基酸的胺基酸改變。提供功能上相似胺基酸的保守性置換表是本領域熟知的。在本發明任一實施方案中，在一個較佳的方面，保守取代殘基來自以下的保守替代表A，較佳地為表A中所示較佳置換殘基。

在一個實施方案中，抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白包含第一半抗體和第二半抗體，其中第一半抗體包含特異性結合TIGIT的第一VH/VL單元並且第二半抗體包含特異性結合PD-1的第二VH/VL單元，其中該第一VH/VL單元包含SEQ ID NO：13/SEQ ID NO：14的成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列，或與該成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性的序列，並且其中該第二VH/VL單元包含SEQ ID NO：17/SEQ ID NO：18的成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列，或與該成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性的序列。

不特別地限制抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白中第一半抗體和第二半抗體的重鏈恆定區的類型，較佳地是IgG1、IgG2或IgG4免疫球蛋白的重鏈恆定區，或與之基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更多同一)的序列。更佳地，該重鏈恆定區是人IgG1免疫球蛋白的重鏈恆定區，或與之基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更多同一)的序列。

在一個實施方案中，抗體的重鏈與抗體的輕鏈形成至少一個二硫鍵，抗體的兩條重鏈形成至少一個二硫鍵。

在另一個實施方案中，抗體是工程化改造以降低抗體與Fcγ受體結合的人IgG1。

在一個實施方案中，抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白包含IgG1(例如，人IgG1)中使用的重鏈恆定區。在又一個實施方案中，抗TIGIT/ PD- 1雙特異性抗體蛋白包含用於IgG4(例如，人IgG4)的重鏈恆定區。例如，抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體的兩條重鏈的Fc結構域中分別包含具有“CPPC”胺基酸殘基的鉸鏈區，和/或分別包含Y349C和S354C(根據Kabat的“EU編號”)，由此，抗PD-1半抗體和抗TIGIT半抗體在Fc區形成鏈間二硫鍵，由此，穩定抗PD-1半抗體和抗TIGIT半抗體的正確配對。

在一個實施方案中，抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白包含第一半抗體和第二半抗體，其中第一半抗體包含SEQ ID NO：21的重鏈序列或與之具有至少90%、95%、98%或99%同一性的重鏈序列，和SEQ ID NO：22的輕鏈序列或與之具有至少90%、95%、98%或99%同一性的輕鏈序列，並且其中第二半抗體包含SEQ ID NO：23的重鏈序列或與之具有至少90%、95%、98%或99%同一性的重鏈序列，和SEQ ID NO：24的輕鏈序列或與之具有至少90%、95%、98%或99%同一性的輕鏈序列。

在本文中，“序列同一性”是指在比較窗中以逐個核苷酸或逐個胺基酸為基礎的序列相同的程度。可以藉由以下方式計算“序列同一性百分比”：將兩條最佳比對的序列在比較窗中進行比較，確定兩條序列中存在相同核酸鹼基(例如，A、T、C、G、I)或相同胺基酸殘基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的數目以得到匹配位置的數目，將匹配位置的數目除以比較窗中的總位置數(即，窗大小)，並且將結果乘以100，以產生序列同一性百分比。為了確定序列同一性百分數而進行的最佳比對，可以按本領域已知的多種方式實現，例如，使用可公開獲得的計算機軟件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件。所屬技術領域具有通常知識者可以確定用於比對序列的適宜 參數，包括為實現正在比較的全長序列範圍內或目標序列區域內最大比對所需要的任何算法。

本發明抗體製劑中的抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白能夠同時與TIGIT和PD-1蛋白結合，且維持了各親本抗體的親和力常數，由此，能夠阻斷TIGIT信號傳導通路和阻斷PD-1信號傳導通路，從而用於治療、預防或延緩各種與TIGIT信號傳導通路和/或與PD-1信號傳導通路相關的疾病或病症。

本發明使用的抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白還記載於PCT/US20/34158，將其全部內容引入作為參考。

在一個較佳的實施方案中，抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白包含第一半抗體和第二半抗體，其中第一半抗體包含SEQ ID NO：21的重鏈序列，和SEQ ID NO：22的輕鏈序列，並且其中第二半抗體包含SEQ ID NO：23的重鏈序列，和SEQ ID NO：24的輕鏈序列。

在一個實施方案中，該抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白由HEK293細胞或以HEK293細胞為基礎改造而得到的HEK293T、HEK293F、HEK293E細胞；CHO細胞或以CHO細胞為基礎改造而得到的CHO-S、CHO-dhfr^-、CHO/DG44、ExpiCHO重組表達產生並經純化。較佳地，在本發明液體製劑中的該抗體表現出顯著的抗腫瘤活性。對LOVO混合PBMC荷瘤小鼠和MC38荷瘤小鼠施用抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體，結果表明，與施用抗PD-1單株抗體或抗TIGIT單株抗體相比較，施用抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體具有顯著提高的抗腫瘤活性，可以導致腫瘤體積的顯著縮小。

本發明的抗體製劑中所包含的抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白的量可隨著製劑的特定目的特性、特定環境、和使用製劑的特定目的而改變。在 一些實施方案中，抗體製劑為液體製劑，其可含有約1-200mg/ml，較佳地為約1-150mg/ml，更佳地為約10-100mg/mL，例如約5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100mg/ml的抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白。

(ii)緩衝劑

緩衝劑是可以將溶液的pH維持在可接受範圍的試劑。在一些實施方案中，用於本發明制較佳劑中的緩衝劑可以將本發明製劑的pH控制在大約4.5-6.8的pH範圍，較佳大約5.0-6.5，更佳約6.0的pH。在一些具體的實施方案中，本發明的抗體製劑具有約4.5、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.5、6.6、6.7或6.8的pH。

在一些實施方案中，用於本發明製劑中的緩衝劑選自組胺酸、鹽酸組胺酸、谷胺酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽和三羥甲基胺基甲烷和它們的組合，較佳組胺酸、鹽酸組胺酸和它們的組合。在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的緩衝劑的濃度為約0.5-200mM、約1-100mM、約5-50mM、約5-30mM或約5-20mM。在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的緩衝劑的濃度為約5-30mM，例如，約5、10、15、20、25或30mM。

在一個實施方案中，用於本發明製劑中的緩衝劑是約10mM組胺酸。

又在一個實施方案中，用於本發明製劑中的緩衝劑是約5mM組胺酸和約5mM鹽酸組胺酸的組合。

(iii)穩定劑

用於本發明的合適的穩定劑可以選自糖類、多元醇、胺基酸或其鹽及它們的組合。進一步地，本發明的穩定劑還可以包含抗氧化劑。

作為穩定劑的糖類可以是二糖、三糖和多糖，而且糖類可以選自但不限於：蔗糖、右旋糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、環糊精、麥芽糖糊精和葡聚糖。在一個實施方案中，作為穩定劑的糖類是蔗糖和/或海藻糖。

作為穩定劑的多元醇可以選自但不限於：甘露醇、山梨醇和木糖醇。在一個實施方案中，作為穩定劑的多元醇是山梨醇。

作為穩定劑的胺基酸或其鹽可以選自但不限於精胺酸、精胺酸鹽(較佳精胺酸鹽酸鹽)。

在一些實施方案中，該穩定劑是山梨醇。在一些實施方案中，該穩定劑是精胺酸鹽酸鹽。在一些實施方案中，該穩定劑是山梨醇、精胺酸、精胺酸鹽(較佳精胺酸鹽酸鹽)或其組合。

在一些實施方案中，作為穩定劑的糖類和/或多元醇在本發明的液體製劑中以約1-200mg/ml，較佳地約5-150mg/ml，例如約10-100mg/ml、約15-80mg/ml或約20-50mg/ml例如，約1、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200mg/ml的濃度存在。

在一些實施方案中，本發明的穩定劑在本發明的液體製劑中以約1-1000mM、約10-1000mM，較佳地約20-800mM，例如約50-500、約100-400、約100-300或約100-200mM例如，約10、20、50、80、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000mM的濃度存在。

本發明的穩定劑中還可以包含的抗氧化劑選自但不限於：同型半胱胺酸、半胱胺酸、胱硫醚、甲硫胺酸、谷胱甘肽、以及包含同型半胱胺酸、半胱胺酸、胱硫醚、甲硫胺酸和谷胱甘肽中任意一種的肽。在包含抗氧化劑的情形 下，穩定劑的總濃度如前該，其中抗氧化劑的濃度為約1-50mM，較佳地約5-40mM，例如約5、10、20、30、40mM。

(iv)表面活性劑

在一個實施方案中，本發明的液體製劑中含有表面活性劑。在一實施方案中，該表面活性劑是非離子型表面活性劑，例如，烷基聚(環氧乙烯)。可包括在本發明製劑中的特定非離子型表面活性劑包括，例如聚山梨酯，諸如聚山梨酯-20、聚山梨酯-80、聚山梨酯-60、或聚山梨酯-40；普洛尼克等。在一個較佳實施方案中，本發明的液體製劑中包含聚山梨酯-80作為表面活性劑。

本發明抗體製劑中所含的表面活性劑的量可隨製劑的特定目的特性、特定環境、和使用製劑的特定目的而改變。在較佳的一些實施方案中，本發明的液體製劑可含有約0.01-10mg/ml，較佳地約0.05-5、約0.05-2、約0.1-5、0.2-2、0.3-1、0.4-0.8、0.5-0.6mg/ml，例如約0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mg/ml的聚山梨酯類表面活性劑(例如，聚山梨酯-80)。

(v)其它賦形劑

本發明的抗體液體製劑中可以包含或不包含其它賦形劑。例如，本發明的抗體液體製劑還包含張力調節劑。張力調節劑可以選自下組：醋酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀和氯化鈣。

這些和另外已知的藥物賦形劑和/或適用於本發明製劑的添加劑是本領域公知的，例如，列出於“The Handbook of Pharmaceutical Excipients，第4版，Rowe等人編，American Pharmaceuticals Association(2003)；和Remington：the Science and Practice of Pharmacy，第21版，Gennaro編，Lippincott Williams & Wilkins(2005)”。

應當理解，如無特別說明，本發明的液體製劑可使用本領域已知的可藥用的溶劑或溶液來製備或配製。該可藥用的溶劑或溶液包括但不限於例如注射用水、無菌水、雙蒸水、生理鹽水、林格氏溶液、葡萄糖注射液等。

II.製劑的製備

本發明提供了包含抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白的穩定製劑。在本發明製劑中使用的抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白可以使用本領域已知的用於生產抗體的技術進行製備。例如，可以重組製備抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白。在一個較佳的實施方案中，本發明的抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白藉由在HEK293細胞或以HEK293細胞為基礎改造而得到的HEK293T、HEK293F、HEK293E細胞；CHO細胞或以CHO細胞為基礎改造而得到的CHO-S、CHO-dhfr^-、CHO/DG44、ExpiCHO中重組表達而製備，例如，如PCT申請號PCT/US20/34158中所述，重組製備抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白。

抗體作為藥物的活性成分的應用現在已經很廣泛。用於將治療性抗體純化至藥用級的技術是本領域公知的。例如，Tugcu等(Maximizing productivity of chromatography steps for purification of monoclonal antibodies,Biotechnology and Bioengineering 99(2008)599-613)描述了在蛋白A捕獲步驟後使用離子交換色譜(陰離子IEX和/或陽離子CEX色譜)的抗體三管柱純化方法。Kelley等(Weak partitioning chromatography for anion exchange purification of monoclonal antibodies,Biotechnology and Bioengineering 101(2008)553-566)描述了兩管柱純化法，其中在蛋白A親和色譜後使用弱分配陰離子交換樹脂。

一般地，重組產生的抗體可以利用常規的純化方法純化，以提供具有足夠的可重複性和適度純度的藥物物質用於抗體製劑的配製。例如，在抗體 從重組表達細胞分泌至培養基中後，可以使用商業可得的蛋白濃縮過濾器例如Amicon的超濾裝置，濃縮來自該表達系統的上清液。之後，可以使用例如色譜、透析和親和純化等方式進行抗體的純化。蛋白A適應於作為親和配體用於純化IgG1、IgG2和IgG4型抗體。也可以使用其它抗體純化方法，例如離子交換色譜。在獲得足夠純度的抗體後，可以按照本領域已知的方法，製備包含抗體的製劑。

例如，可以採用如下步驟進行製備：(1)在發酵結束後將發酵液離心澄清去除細胞等雜質以獲得上清；(2)使用親和層析(例如對IgG1、IgG2和IgG4型抗體具有特異親和力的蛋白A管柱)捕獲抗體；(3)進行病毒滅活；(4)精製純化(一般可以採用CEX陽離子交換層析)，以去除蛋白中的雜質；(4)病毒過濾(使病毒滴度降低例如4 log10以上)；(5)超濾/滲濾(可以用於將蛋白置換於利於其穩定的製劑緩衝液中並濃縮至合適的濃度供注射用)。參見例如，B.Minow,P.Rogge,K.Thompson,BioProcess International,Vol.10,No.6,2012,pp.48-57。

III．製劑的分析方法

在抗體製劑的儲存過程中，抗體可能會發生聚集、降解或化學修飾，導致抗體異質性(包括大小異質性和電荷異質性)以及聚集物和片段等，從而影響抗體製劑的質量。因此，有必要進行抗體製劑穩定性的監測。

在本領域中已知多種方法可以用於檢測抗體製劑的穩定性。例如，可以藉由還原型CE-SDS、非還原型CE-SDS和SEC-HPLC等方法，分析抗體製劑的純度和評估抗體的聚集水平；可以藉由毛細管等電聚焦電泳(cIEF)、成像毛細管等電聚焦電泳(iCIEF)和離子交換色譜(IEX)等，分析抗體製劑中的電荷變異體。此外，可以藉由目視檢測製劑外觀，快速地判斷製劑的穩定性。也可以 使用OD_350nm法檢測製劑的濁度改變，該方法可以給出有關可溶性和不溶性聚集物量的信息。此外，可以使用紫外分光光度法(UV法)檢測製劑中的蛋白質含量變化。

非還原型CE-SDS法是一種以毛細管為分離通道進行的抗體純度測定方法。在CE-SDS中，蛋白遷移由SDS結合引起的表面電荷來驅動，SDS與蛋白結合，消除蛋白自身電荷的差異，故可以在毛細管的分子篩凝膠基質中，實現基於分子的大小或流體動力學半徑的電泳分離。該方法已經被廣泛地用於監測變性的完整抗體的純度。一般，在非還原型CE-SDS法中，供試樣品與SDS樣品緩衝液和碘乙醯胺混合。之後，混合物可以於68-72℃孵育約10-15分鐘，冷卻至室溫後離心的上清液用於分析。採用紫外檢測器檢測蛋白的遷移，獲得電泳譜圖。抗體製劑純度可以計算為IgG主峰的峰面積占所有峰面積之和的百分比。關於CE-SDS法的進一步描述，可以參見例如Richard R.等，Application of CE SDS gel in development of biopharmaceutical antibody-based products,Electrophoresis,2008,29,3612-3620。

體積排阻高效液相色譜法，即SEC-HPLC法，是用於抗體標準和質控的另一重要方法。該方法主要依據分子的尺寸大小或流體動力學半徑差異來進行分子的分離。藉由SEC-HPLC，抗體可以分離出三種主要形式：高分子量形式(HMMS)、主峰(主要是抗體單體)、和低分子量形式(LMMS)。抗體純度可以計算為色譜圖上主峰面積占所有峰面積之和的百分比。藉由SEC-HPLC法，可以測量製劑產品中抗體單體的百分數，給出可溶性聚集物和剪切物的含量信息。關於SEC-HPLC法的進一步描述，可以參見例如，J.Pharm.Scien.,83：1645-1650,(1994)；Pharm.Res.,11：485(1994)；J.Pharm.Bio.Anal.,15：1928(1997)；J.Pharm. Bio.Anal.,14：1133-1140(1986)。此外，也可以參見例如，R.Yang等，High resolution separation of recombinant monoclonal antibodies by size exclusion ultra-high performance liquid chromatography(SE-UHPLC),Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis(2015),http：//dx.doi.org/10.1016/j.jpba.2015.02.032；和Alexandre Goyon等，Protocols for the analytical characterization of therapeutic monoclonal antibodies.I- Non-denaturing chromatographic techniques,Journal of Chromatography，http：//dx.doi.org/10.1016/j.jchromb.2017.05.010。

成像毛細管等電聚焦電泳(iCIEF)可以用於分析抗體的電荷異質性。該方法可以提供電荷變異體的定量分佈情況。iCIEF基於分子在pH梯度中的電荷差異(表觀pI值)來實現分子分離的目的。在iCIEF中，分離管柱通常是短毛細管(例如，5cm長，100μm內徑的二氧化矽毛細管)，蛋白質在高電壓下在毛細管管柱中聚焦，並藉由在280nM操作的全管柱成像檢測系統對聚焦進行實時在線監測。該技術的一個優點是，可以藉由該全管柱檢測系統同時記錄抗體樣品的各種電荷變異體。一般而言，在icIEF中，將樣品與尿素和icIEF緩衝液混合，其中該緩衝液含有甲基纖維素、pI分子量標準和兩性電解質。然後，可以在iCIEF分析儀例如iCE280分析儀(Protein Simple,Santa Clara,CA)上，使用iCIEF管柱例如ProtionSimple組裝的iCIEF管柱，在樣品聚焦一定時間後，測定280nm的吸光度，獲得聚焦抗體電荷變異體的譜圖。在iCEIF譜圖中，在主峰(即主成分)之前沖提的蛋白相關峰被分類為酸性組分；相對地，在主峰之後沖提的蛋白相關峰被分類為鹼性組分。主成分、酸性組分和鹼性組分的相對量可以表示為占總峰面積的百分數。關於iCIEF的進一步描述，可以參見例如，Salas-Solano O等，Robustness of iCIEF methodology for the analysis of monoclonal antibodies：an interlaboratory study,J Sep Sci.2012 Nov；35(22)：3124-9.doi：10.1002/jssc.201200633.Epub 2012 Oct 15；和Dada OO等，Characterization of acidic and basic variants of IgG1 therapeutic monoclonal antibodies based on non-denaturing IEF fractionation,Electrophoresis.2015 Nov；36(21-22)：2695-2702.doi：10.1002/elps.201500219.Epub 2015 Sep 18.

也可以藉由陽離子交換高效液相色譜法(CEX-HPLC)測定抗體製劑中抗體的電荷變異體。在該測定法中，以比主峰的保留時間更早從CEX-HPLC管柱沖提出的峰被標記為“酸性峰”，而那些以比主峰的保留時間更晚從CEX-HPLC管柱沖提出的峰被標記為“鹼性峰”。

加速穩定性研究可以用於檢查產品的穩定性性質，有利於篩選穩定藥物製劑形式。例如，可以將製劑樣品放置於升高的溫度，例如約40℃±2℃、25℃±2℃條件下進行加速穩定性研究。檢測指標可以包括外觀、可見異物、蛋白含量、濁度、純度(SEC-HPLC法、非還原型CE-SDS法)和電荷變異體(iCIEF法、CEX-HPLC法)。

此外，可以檢測抗體的功效或生物活性。例如，可以檢測製劑中抗體與其抗原分子(TIGIT分子和PD-1分子)的結合能力。所屬技術領域具有通常知識者已知多種方法可以用於定量抗體與抗原的特異性結合，例如免疫測定試驗，ELISA等。

本發明的抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白製劑是穩定的。在一個實施方案中，於約5℃、25℃、37℃、40℃、或45℃儲存至少1個月、2個月或3個月後，例如，在5℃±3℃儲存3個月後，本發明的抗體製劑中的抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白純度是至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%、或99%以上，如藉由體積排阻色譜法或藉由非還原型CS-SDS所測定。在一個實施方案中，於約5℃、25℃、37℃、40℃、或45℃儲存至少1個月、2個月或3個月後，例如，在5℃±3℃儲存3個月後，本發明的抗體製劑中抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白的至少60%，較佳至少65%是非鹼性及非酸性形式(亦即，主峰或主要電荷形式)，如藉由iCIEF法所測定。

IV．製劑的用途

本發明的包含抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白的本發明的抗體製劑可以用於治療、預防或延緩各種與TIGIT信號傳導通路和/或與PD-1信號傳導通路相關的疾病或病症。“與TIGIT信號傳導通路相關的疾病或病症”和/或“與PD-1信號傳導通路相關的疾病或病症”在本文中指可以用本發明抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白製劑進行治療(例如改善)或預防的疾病或病症。任何可以得益於本發明抗體製劑治療的疾病或病症都適用於本發明。

包含抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白的本發明製劑能夠用於預防或治療受試者的各種血液病和實體瘤，包括但不限於白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、腦腫瘤、頭頸癌、頭頸部鱗狀細胞癌、肺癌例如非小細胞肺癌或小細胞肺癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、膽囊癌、膽管癌、肝癌、結直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮內膜癌、子宮肉瘤、前列腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、黑色素瘤。

本發明也提供本發明的製劑在製備藥物中的用途，其中該藥物用於向哺乳動物遞送抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白，或用於治療、預防或改善上述疾病和病症中的一種或多種。較佳地，哺乳動物是人。

可以以多種途徑將本發明的抗體製劑施用於受試者或患者。例如，施用可以藉由輸注或藉由注射器進行。因此，在一個方面，本發明提供了一種遞送裝置(例如注射器)，其包含本發明的抗體製劑(例如，預填充注射器)。患者將接受有效量的抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白作為主要活性成分，即足以治療、改善或預防目的疾病或病症的量。

治療效果可包括減少生理症狀。用於任何特定受試者的抗體的最佳有效量和濃度將取決於多種因素，包括患者的年齡、體重、健康狀況和/或性別、疾病的性質和程度、特定抗體的活性，身體對其清除率，並且也包括與該抗體製劑組合施用的任何可能的其它治療。對於具體的情況，所遞送的有效量可以在臨床醫師的判斷範圍內來確定。在這方面，已知的基於抗體的藥物的應用可以提供一定的指導。劑量可以是單劑量方案或多劑量方案。

文中所提到的序列編號對應於下面表1中所列的SEQ ID NO編號

HCCR：重鏈恆定區；LCCR：輕鏈恆定區；HCVR：重鏈可變區；LCVR：輕鏈可變區；ECD：胞外結構域

描述以下實施例以輔助對本發明的理解。不意在且不應當以任何方式將實施例解釋成限制本發明的保護範圍。

縮略詞描述

圖1.顯示了antibody-A對LOVO混合PBMC荷瘤小鼠體重的影響。

圖2.顯示了antibody-A對LOVO混合PBMC荷瘤小鼠腫瘤組織生長的影響。

圖3.顯示了低劑量antibody-A對LOVO混合PBMC荷瘤小鼠瘤組織生長的影響。

圖4.顯示了高劑量antibody-A對LOVO混合PBMC荷瘤小鼠瘤組織生長的影響。

圖5.顯示了LOVO混合PBMC荷瘤小鼠個體腫瘤曲線圖。

圖6.顯示了antibody-A對LOVO混合PBMC荷瘤小鼠瘤組織生長的影響(腫瘤照片)。

圖7.顯示了antibody-A對LOVO混合PBMC荷瘤小鼠瘤組織重量的影響。

圖8.顯示了antibody-A對MC38荷瘤小鼠體重的影響。

圖9.顯示了antibody-A對MC38荷瘤小鼠瘤組織生長的影響。

圖10.顯示了低劑量antibody-A對MC38荷瘤小鼠瘤組織生長的影響。

圖11.顯示了高劑量antibody-A對MC38荷瘤小鼠瘤組織生長的影響。

圖12.顯示了MC38荷瘤小鼠個體腫瘤曲線圖。

圖13.顯示了antibody-A對MC38荷瘤小鼠瘤組織生長的影響(腫瘤照片)。

圖14.顯示了antibody-A對MC38荷瘤小鼠瘤組織重量的影響。

圖15.顯示了antibody-A阻斷PD-1結合PD-L1及TIGIT結合CD155的活性。

圖16.顯示了T細胞激活活性(memory T cell recall法)。

圖17.顯示了藉由SEC-HPLC法對各樣品測定的蛋白純度純度變化趨勢圖。

圖18.顯示了pH影響實驗中電荷變異體酸性組分變化趨勢圖(iCIEF法)。

圖19.顯示了pH影響實驗中電荷變異體主成分變化趨勢圖(iCIEF法)。

圖20.顯示了pH影響實驗中電荷變異體鹼性組分變化趨勢圖(iCIEF法)。

圖21.顯示了處方篩選實驗純度變化趨勢圖(SEC-HPLC法)。

圖22.顯示了處方篩選實驗純度變化趨勢圖(非還原型CE-SDS法)。

圖23.顯示了處方篩選實驗電荷變異體酸性組分變化趨勢圖(iCIEF法)。

圖24.顯示了處方篩選實驗電荷變異體主成分變化趨勢圖(iCIEF法)。

圖25.顯示了實施例1製備的amtibody-A的結構。

實施例1：重組全人源抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體的表達與純化

本發明的抗體可以基本上如下表達和純化。可以採用最佳的預定的重鏈：輕鏈載體比率或採用同時編碼重鏈和輕鏈的單一載體系統，用分泌抗體的表達系統瞬時或穩定轉染合適的宿主細胞HEK293(也可是其他宿主細胞例如CHO細胞)。具體而言，可以利用編碼以下胺基酸序列的一種或多種DNA分子：具有胺基酸序列SEQ ID NO：21的第一重鏈，具有SEQ ID NO：22的第一輕鏈，具有胺基酸序列SEQ ID NO：23的第二重鏈和具有胺基酸序列SEQ ID NO：24的第二輕鏈，並利用分泌抗體的表達系統瞬時或穩定地轉染，來製備本發明的抗體(在文中也稱為“antibody-A”)。其中，具有胺基酸序列SEQ ID NO：21的第一重鏈和具有SEQ ID NO：22的第一輕鏈共同形成第一半抗體，並且兩者分別構成其VH/VL單元，並且該第一半抗體與TIGIT或其胞外結構域特異性結合；以及，具有胺基酸序列SEQ ID NO：23的第二重鏈和具有胺基酸序列SEQ ID NO：24的第二輕鏈共同形成第二半抗體，並且兩者分別構成其VH/VL單元，並且該第二半抗體與PD-1或其胞外結構域特異性結合；以及，第一半抗體和第二半抗體共同形成本發明的完整的雙特異性抗體。圖25展示了上述抗體的結構示意圖。可以使用多種常用技術之一來純化抗體。例如，可將培養基方便地應用於已用兼容的緩衝液例如磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)平衡的MabSelect管柱(GE Healthcare)或KappaSelect管柱(GEHealthcare)。洗滌管柱以去除非特異性結合組分。結合的抗體可以例如藉由pH梯度沖提(例如20mM Tris緩衝液pH 7.0至10mM檸檬酸鈉緩衝液pH 3.0，或磷酸鹽緩衝鹽水pH 7.4至100mM甘胺酸緩衝液pH 3.0)。例如藉由紫外線吸收或SDS-PAGE檢測抗體級分，然後合併抗體級分。根據預期用途，視需要進一步純化。可以使用常規技術濃縮和/或無菌過濾純化的抗體。可以藉由常規技術有效去除可溶性聚集體和多聚體，該常規技術包括體積排阻、疏水 相互作用、離子交換、多模式或羥磷灰石色譜等。純化的抗體可立即在-30℃以下冷凍或凍乾。

實施例2：重組全人源抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體(antibody-A)對LOVO混合PBMC荷瘤NOG小鼠的藥效研究

採用LOVO(人結/直腸癌細胞)混合PBMC荷瘤的NOG小鼠，研究重組全人源抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體對LOVO混合PBMC荷瘤NOG小鼠的抗腫瘤藥效，並研究了IBI308(PD-1)與anti-TIGIT單藥及聯用的抗腫瘤效應進行對比。

1．體內藥效學研究

1.1 測試溶液配製

將H-IgG注射液(來自Equitech-Bio；貨號：SLH56-0001；規格：7.3mg/ml)、IBI308(信迪利單抗)注射液(商品名達伯舒®，來自信達生物(蘇州)有限公司；批號：DP1911001；規格：10mg/ml)、anti-TIGIT(一種單抗，其重鏈為SEQ ID NO：21；輕鏈為SEQ ID NO：22)注射液(規格：1.761mg/ml)和根據實施例7處方F5製備的antibody-A注射液(濃度：25mg/ml)用PBS(1×)(中國上海生工，貨號：F607008-0500)稀釋，得到以下測試溶液：0.6mg/ml H-IgG注射液；0.03mg/ml IBI308注射液；0.3mg/ml IBI308注射液；0.03mg/ml anti-TIGIT注射液；0.3mg/ml anti-TIGIT注射液；0.06mg/ml antibody-A注射液；0.6mg/ml antibody-A注射液。

1.2.實驗操作

以PBS(1×)(來源同上)按4：1分散LOVO細胞(來源：ATCC；貨號：CCL-229；批號：60380843)和PBMC細胞(來源：AllCells；貨號：LBL-002；批號：3024811)，製備成細胞濃度為12.5×10⁶個/mL：3.125×10⁶個/mL的細胞懸液。

將NOG小鼠(56隻，雌性，14-17g，來源：北京維通利華實驗動 物技術有限公司，合格證號：1100112011044904)右側背部剃毛，皮下注射12.5×10⁶個/mL：3.125×10⁶個/mL的LOVO：PBMC混合細胞懸液0.2mL/隻，即接種量為LOVO 2.5×10⁶個/小鼠：PBMC 0.625×10⁶個/小鼠。

腫瘤細胞接種2天將56隻小鼠隨機分為8組，每組7隻小鼠，按照給藥類型、劑量命名為H-IgG-6mg/kg組、IBI308-0.3mg/kg組、IBI308-3mg/kg組、anti-TIGIT-3mg/kg組、IBI308+anti-TIGIT-0.3+0.3mg/kg組、IBI308+α TIGIT(321)-3+3mg/kg組、antibody-A-0.6mg/kg組和antibody-A-6mg/kg組；給藥方式為腹腔注射，給藥體積10ml/kg，給藥頻率為每3或4天一次，即具體在腫瘤細胞接種後的第2天、第6天、第10天、第13天各給藥1次，監測至24天，於接種後的27天取小鼠腫瘤，並稱重。每週監測小鼠體重、腫瘤組織最大長軸(L)和最大寬軸(W)兩次。在接種後24天計算各組小鼠的相對腫瘤抑制率。

腫瘤接種後第6、10、13、17、20、24天測定小鼠腫瘤體積，腫瘤測量每週兩次，腫瘤測量時稱重，以及每一次給藥前稱重。腫瘤接種27天後取瘤體組織稱重並拍照。

1.3.腫瘤體積測定

採用遊標卡尺測定腫瘤的最大長軸(L)和最大寬軸(W)，腫瘤體積按如下公式計算：V=L×W²/2。

1.4.相對腫瘤抑制率計算

腫瘤抑制率TGI(%)：100%×(Tvol_control-Tvol_treated)/(Tvol_control-Tvol_predose)

T_vol_control-Tvol_treated：對照組給藥後腫瘤終末體積-給藥組給藥後腫瘤終末體積；

Tvol_control-Tvol_predose：對照組給藥後腫瘤終末體積-對照組給藥前腫瘤體積。

2.統計分析

實驗結果採用Two-way ANOVA分析比較各給藥組腫瘤體積大小之間的差異，P<0.05認為具有統計學差異。

給藥後小鼠體重變化不超過10%，判斷該藥物對小鼠體重無影響。給藥後，與對照組相比計算TGI，判斷該藥物對荷瘤的抑瘤效果。

3.實驗結果

3.1 antibody-A對荷瘤小鼠體重的影響

各組小鼠體重變化見圖1、表2和表3。本實驗中，各組小鼠未出現明顯的體重下降情況，小鼠表現正常。由此可見，antibody-A對LOVO混合PBMC荷瘤NOG小鼠的體重沒有影響。

表2. antibody-A對荷瘤小鼠體重的影響-體重絕對值(g,Mean±SD,n=7)

表3. antibody-A對荷瘤小鼠體重的影響-體重變化率(%,Mean,n=7)

3.2 antibody-A對LOVO混合PBMC荷瘤小鼠腫瘤生長的影響

本實驗研究了antibody-A對LOVO混合PBMC荷瘤NOG小鼠的抗腫瘤藥效。各組小鼠在給藥後不同時間的腫瘤抑制率及腫瘤體積如表4至表6和圖2至圖7所示。本藥效學實驗基於接種後第24天的腫瘤體積數據計算相對腫瘤抑制率(如表4)。與H-IgG-6mg/kg組相比，IBI308-0.3mg/kg組、IBI308-3mg/kg組的腫瘤抑制率分別是11.47%、57.25%；anti-TIGIT-3mg/kg組的腫瘤抑制率為57.25%；IBI308+anti-TIGIT-0.3+0.3mg/kg組和IBI308+anti-TIGIT-3+3mg/kg組的腫瘤抑制率是65.42%和35.29%；antibody-A-0.6mg/kg組和antibody-A-6mg/kg組的腫瘤抑制率為92.63%與99.84%。antibody-A-0.6mg/kg組、antibody-A-6mg/kg組的腫瘤抑制率顯著優於anti-TIGIT-3mg/kg單藥組及IBI308+anti-TIGIT-0.3+0.3mg/kg組、IBI308+anti-TIGIT-3+3mg/kg組，顯示本發明的雙特異性抗體的兩抗體部分產生協同作用。

表4.腫瘤抑制率(TGI)和腫瘤消失數目

表5. antibody-A對荷瘤小鼠腫瘤生長的影響(mm ³ ,Mean±SD,n=7)

表6. antibody-A對荷瘤小鼠瘤組織重量的影響(g，Mean±SD，n=7)

本實驗中，antibody-A各劑量組的腫瘤抑制效果均優於IBI308單藥組、anti-TIGIT單藥組及聯合用藥組，具有顯著的抗腫瘤效果，且anti-TIGIT單藥組的腫瘤抑制效果均優於IBI308單藥組。

實施例3：重組全人源抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體(antibody-A)對MC38荷瘤PD-1/TIGIT小鼠的藥效研究

採用MC38(鼠結腸癌細胞)荷瘤的小鼠，研究重組全人源抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體對MC38荷瘤PD1/TIGIT小鼠(即PD1/TIGIT雙敲的轉基因小鼠；來源：百奧賽圖江蘇基因生物技術有限公司；合格證號：3207262011001376，下同)的抗腫瘤藥效。

1．體內藥效學研究

1.1 測試溶液配製

如實施例2該配製如下測試溶液：0.6mg/ml H-IgG注射液；0.03mg/ml IBI308 注射液；0.3mg/ml IBI308注射液；0.03mg/ml anti-TIGIT注射液；0.3mg/ml anti-TIGIT注射液；0.06mg/ml antibody-A注射液；0.6mg/ml antibody-A注射液。

1.2.實驗操作

以PBS(1×)(來源同上)分散MC38細胞(來源：上海和元生物有限公司；批號：HYC0116)，製備成細胞濃度為5×10⁶個/mL細胞懸液。

將PD1/TIGIT小鼠(60隻；雌性，16-20g)右側背部剃毛，皮下注射5×10⁶個/mL的MC38細胞懸液0.2mL/隻，即接種量為1×10⁶個/隻小鼠。

腫瘤細胞接種7天後測量每隻小鼠瘤體積，挑選出瘤體積在一定範圍內(42.75mm³~98.39mm³)的小鼠，共48隻小鼠。按瘤體積平均分為8組，每組6隻小鼠，按照給藥類型、劑量命名為H-IgG-6mg/kg組、IBI308-0.3mg/kg組、IBI308-3mg/kg組、anti-TIGIT-3mg/kg組、IBI308+anti-TIGIT-0.3+0.3mg/kg組、IBI30+α TIGIT(321)-3+3mg/kg組、antibody-A-0.6mg/kg組和antibody-A-6mg/kg組；給藥方式為腹腔注射，給藥體積10ml/kg，給藥頻率為每3或4天一次，即具體地在腫瘤細胞接種後的第7天、第10天、第14天、第17天各給藥1次，監測至24天，於接種後的28天取小鼠腫瘤，並稱重。每週監測小鼠體重、腫瘤組織最大長軸(L)和最大寬軸(W)兩次。在接種後24天計算各組小鼠的相對腫瘤抑制率。

腫瘤接種後第7、10、14、17、21、24天測定小鼠腫瘤體積，腫瘤測量每週兩次，腫瘤測量時稱重，以及每一次給藥前稱重。腫瘤接種28天後取瘤體組織稱重並拍照。

1.3 腫瘤體積測定

採用遊標卡尺測定腫瘤的最大長軸(L)和最大寬軸(W)，腫瘤體積(Tvol)按 如下公式計算：V=L×W²/2。

1.4 相對腫瘤抑制率計算

腫瘤抑制率TGI(%)：100%×(Tvol_對照-Tvol_治療)/(Tvol_對照-Tvol_初始劑量)

Tvol_control-Tvol_treated：對照組給藥後腫瘤終末體積-給藥組給藥後腫瘤終末體積；

TTvol_control-Tvol_predose：對照組給藥後腫瘤終末體積-對照組給藥前腫瘤體積。

2.統計分析

實驗結果採用Two-way ANOVA分析比較各給藥組腫瘤體積大小之間的差異，P<0.05認為具有統計學差異。

給藥後小鼠體重變化不超過10%，判斷該藥物對小鼠體重無影響。給藥後，與對照組相比計算TGI，判斷該藥物對荷瘤的抑瘤效果。

3.實驗結果

3.1 antibody-A對MC38荷瘤小鼠體重的影響

各組小鼠體重變化見圖8和表7、8。本實驗中，各組小鼠未出現明顯的體重下降情況，小鼠表現正常。由此可見，antibody-A對MC38荷瘤PD1/TIGIT轉基因小鼠的體重沒有影響。

表7. antibody-A對MC38荷瘤小鼠體重的影響-體重絕對值(g,Mean±SD,n=6)

表8. antibody-A對MC38荷瘤小鼠體重的影響-體重變化率(%,Mean,n=6)

3.2 antibody-A對MC38荷瘤小鼠腫瘤生長的影響

本實驗研究了antibody-A對MC38荷瘤PD1/TIGIT轉基因小鼠的抗腫瘤藥效。各組小鼠在給藥後不同時間的腫瘤抑制率及腫瘤體積如表9-表11和圖9-圖14所示。本藥效學實驗基於接種後第24天的腫瘤體積數據計算相對腫瘤抑制率(如表9)。與H-IgG-6mg/kg組相比，IBI308-0.3mg/kg組、IBI308-3mg/kg組的腫瘤抑制率分別是44.79%、67.12%；anti-TIGIT-3mg/kg組的腫瘤抑制率為13.83%；IBI308+anti-TIGIT-0.3+0.3mg/kg組和IBI308+anti-TIGIT-3+3mg/kg組的腫瘤抑制率是38.35%和89.60%；antibody-A-0.6mg/kg組和antibody-A-6mg/kg組的腫瘤抑制率為68.77%與95.53%，顯示本發明的雙特異性抗體的兩抗體部分產生協同作用。

本實驗中，相對於H-IgG-6mg/kg組而言，IBI308-0.3mg/kg組、IBI308-3mg/kg組、IBI308+anti-TIGIT-0.3+0.3mg/kg組、IBI308+anti-TIGIT-3+3mg/kg組、antibody-A-0.6mg/kg組和antibody-A-6mg/kg組對MC38荷瘤生長均有一定的抑制效果。antibody-A低劑量組的腫瘤抑制率優於IBI308低劑量的單藥組也勝於IBI308和anti-TIGIT低劑量的聯合組，antibody-A高劑量組的腫瘤抑制作用也要強過IBI308高劑量單藥組且優於IBI308和anti-TIGIT高劑量的聯合組。antibody-A在MC38荷瘤的PD1/TIGIT小鼠中顯示很好的劑量效應。

表9.腫瘤抑制率(TGI)和腫瘤消失數目

表10. antibody-A對MC38荷瘤小鼠腫瘤生長的影響(mm ³ ,Mean±SD,n=6)

表11. antibody-A對MC38荷瘤小鼠瘤組織重量的影響(g，Mean±SD，n=6)

實施例4：antibody-A阻斷PD-1/PD-L1及CD155/TIGIT結合活性研究

本研究藉由PD-1-TIGIT-NFAT-Luc報告系統檢測antibody-A對PD-1/PD-L1及TIGIT/CD155結合的阻斷活性。該檢測方法由2個細胞系組成：膜表面表達PD-L1、CD155和TCR activator的CHO K1細胞(CHOK1-PD-L1-CD155)，以及表達PD-1、TIGIT和NFAT-Luc報告基因的Jurkat細胞(Jurkat-PD1-TIGIT-NFAT-Luc)。這兩種細胞系共孵育後，TCR和NFAT介導的發光可被PD-1/PD-L1及TIGIT/CD155相互作用抑制。藉由阻斷PD-1/PD-L1及TIGIT/CD155相互作用，則可逆轉這種抑制作用，從而使TCR活化並藉由NFAT途徑產生發光。

實驗步驟

培養CHOK1-PD-L1-CD155細胞(美國Promega，貨號J2102)至對數生長 期，調整細胞密度至4x10⁵個/ml。將細胞鋪於96孔平底白板中，100μl/孔(4×10⁴個/孔)，37℃，5% CO₂培養16h。

利用Assay Buffer(RPMI 1640(美國Gibco，貨號22400-089)+1% FBS(美國Hyclone，貨號SH30406.05))配製antibody-A、IBI308、anti-TIGIT、IBI308+anti-TIGIT、hIgG(這些抗體的信息參見實施例2)，配置濃度為2000nM，用Assay Buffer4倍梯度稀釋。

培養Jurkat-PD1-TIGIT-NFAT-Luc(美國Promega，貨號J2102)至對數生長期，利用Assay Buffer(RPMI 1640+1% FBS(來源信息同上))調整細胞密度為1.25×10⁶cells/ml。

將培養CHOK1-PD-L1-CD155的96孔板取出，每孔吸去95μl上清。加入配製好的antibody-A、IBI308、anti-TIGIT、IBI308+anti-TIGIT、hIgG抗體稀釋液，40μl/孔。設置空白對照組，即加入40μl Assay buffer。再加入Jurkat-PD1-TIGIT-NFAT-Luc細胞，40μl/孔(5×10⁴個/孔)。37℃，5% CO₂細胞培養箱中繼續孵育6h。

將96孔板取出，平衡至室溫。加入Bio-Glo^TM Reagent(Bio-Glo^TM Luciferase Assay System,Promega,G7940)，80μl/孔。室溫反應10min。利用多功能酶標儀讀取熒光值。

利用GraphPad Prism 8.0擬合曲線。根據公式倍數誘導(Fold induction)=RLU(抗體組)/RLU(空白對照組)計算阻斷活性倍數，擬合S型曲線，計算並比較EC₅₀值。平行重複三次。

實驗結果

利用NFAT-Luc報告系統檢測antibody-A阻斷PD-1/PD-L1及TIGIT/CD155結合的能力，結果如圖15所示，在0.015259~1000nM的濃度範圍內，antibody-A能夠阻斷PD-1/PD-L1及TIGIT/CD155的結合，從而重新激活T細胞，其阻斷活性明顯強於IBI308和anti-TIGIT。

實施例5：antibody-A對CMV刺激記憶性T細胞再次活化的作用研究

PBMC樣本信息

T細胞激活活性(memory T cell recall法)

PBMC細胞準備：復蘇一個供體的PBMC(stimulator cells)，利用RPMI 1640完全培養基(美國Hyclone，貨號SH30809.01)(含10% FBS(美國Hyclone，貨號SH30406.05))調整細胞密度為6×10⁶個/ml，每孔加入50μl細胞，30萬/孔。

CMV細胞準備：用上述的含PBMC的培養基將CMV(瑞典Mabtech；貨號3619-1)溶解，50μl/孔，終濃度為5μg/ml。

抗體準備：利用RPMI 1640完全培養基(10% FBS)配製hIgG1、antibody-A、IBI308、anti-TIGIT、IBI308+anti-TIGIT(抗體信息參見實施例2)，起始終濃度100nM，用Assay Buffer(來源信息參見實施例4)4倍梯度稀釋共5個濃度，100μl/孔加到細胞中，antibody-A(抗體樣品信息參見實施例2)起始終濃度200 nM，用Assay Buffer 4倍梯度稀釋共5個濃度，100μl/孔加到細胞中，於培養箱中孵育5天。利用Human IFN-gamma DuoSet ELISA Kit(美國R&D systems；貨號：DY285B)測定培養上清中IFN-γ分泌量。實驗中使用Dynabeads® HumanT-Activator CD3/CD₂₈刺激作為陽性對照。

實驗結果及結論

T細胞激活活性

本實驗利用CMV刺激記憶性T細胞再次活化(memory T cell recall)檢測antibody-A對人記憶性T細胞的調控活性。基本原理為篩選對CMV多肽有反應的PBMC批號，復蘇後加入5ug/ml CMV刺激記性T細胞將其再次活化。加入藥物antibody-A，檢測細胞培養上清中IFN-γ的含量，根據IFN-γ的分泌量，來反映antibody-A對記憶性T細胞的激活活性。

結果見圖16。實驗結果表明，在memory T cell recall實驗中，antibody-A在體外能濃度依賴地提高IFN-γ分泌水平，增強記憶性T細胞的功能，且其作用優於抗PD-1單抗(IBI308)、anti-TIGIT單抗以及抗PD-1單抗(IBI308)+anti-TIGIT單抗。

以下實施例係關於重組抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體的穩定製劑的篩選和製備。

藥品穩定性是保證藥品有效性和安全性的重要指標之一。獲得賦予藥品良好穩定性的製劑處方是藥品在貨架期內保持其安全有效的關鍵條件。為了開發出重組抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體注射液長期穩定儲存的製劑處方，確保產品在有效期內(例如至少24個月)的質量可控，設計了處方篩選試驗，考 察了不同輔料對於抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體製劑穩定性的影響。試驗所用材料和方法如下：

材料和方法

1.1.本發明的製劑研究中使用的材料

註：N/A表示“不適用”(Notapplicable)。

1.2．製劑穩定性的檢測項目和檢測方法

對抗體製劑檢測了以下項目：(1)檢測外觀以及是否存在可見異物；(2)藉由紫外法(UV法)測定製劑中的蛋白質含量；(3)藉由體積排阻色譜法，例如，體積排阻高效液相色譜法(size-exclusion chromatography-HPLC；SEC-HPLC)測定抗體製劑的純度，表示為單體的面積占所有峰面積之和的百分數；(4)藉由非還原型十二烷基硫酸鈉毛細管電泳(非還原型CE-SDS)測定抗體製劑的純度，表示為單體的面積占所有峰面積之和的百分數；(5)藉由成像毛細管等電聚焦電泳法 (iCIEF法)測定抗體製劑中電荷變異體，表示為主成分、酸性組分和鹼性組分的百分數。

可見異物檢測

按照國家藥典委員會，中華人民共和國藥典(2020年版，四部通則0904“可見異物檢查法”，北京：中國醫藥科技出版社.2020)中所記載的方法，採用澄明度檢測儀(天津天大天發生產，型號YB-2)，檢查樣品中的可見異物。

蛋白含量測定

使用紫外分光光度計(日本島津生產，型號UV-1800)測定樣品中的蛋白質含量。

純度(SEC-HPLC法)

使用體積排阻色譜管柱分離，流動相為磷酸鹽緩衝液(稱取3.12g二水合磷酸二氫鈉，8.77g氯化鈉和34.84g精胺酸，用800ml超純水溶解後用鹽酸調節pH至6.8並定容至1000ml)，色譜管柱保護液為0.05%(w/v)NaN₃，進樣量50μl，流速0.5ml/分鐘，採集時間30分鐘，管柱溫25℃，檢測波長280nm。取待測樣品用製劑緩衝液稀釋至2mg/ml，作為供試品溶液。取製劑緩衝液用上述相同處理方式稀釋後做為空白溶液。取空白溶液、供試品溶液各50μl注入液相色譜儀，開始檢測。

純度(非還原型CE-SDS法)

採用毛細管凝膠電泳法檢測。毛細管為無塗層毛細管，內徑50μm，總長30.2cm，有效長度20.2cm。電泳前分別使用0.1mol/L氫氧化鈉、0.1mol/L鹽酸、超純水、電泳膠70psi沖洗毛細管管柱。將待測樣品用適量超純水稀釋至2.0mg/ml，取以上稀釋後的樣品50μl於1.5ml離心管中，分別向其中加入45μl pH 6.5的樣品緩衝液(稱取一水檸檬酸0.32g，十二水合磷酸氫二鈉2.45g，溶於45ml超純水中，定容至50ml，製得檸檬酸-磷酸鹽緩衝液，精密量取該緩衝液200μl，加10%(w/v)十二烷基硫酸鈉溶液80μl，加水至1ml，混勻，即得)和5μl 250mmol/L NEM溶液(稱取N-乙基順丁烯二醯亞胺62mg，溶於2ml超純水中)，充分混勻後70±2℃加熱10±2分鐘，冷卻至室溫後轉移至樣品瓶作為供試品溶液。取與供試品相同體積的製劑緩衝液，按上述方法同樣操作，製得空白溶液。樣品進樣條件：-5kV 20秒；分離電壓：-15kV 35分鐘。毛細管管柱溫控制在25℃，檢測波長為220nm。

電荷變異體(iCIEF法)

採用成像毛細管等電聚焦電泳(iCIEF法)檢測。毛細管內徑100μm，總長5cm。樣品電泳前需分別使用0.5%甲基纖維素溶液(下文中也縮寫為MC溶液)、超純水沖洗毛細管管柱。採用真空進樣方式，預聚焦電壓及時間為1.5kV 1分鐘，聚焦電壓及時間為3kV 8分鐘，進樣時間55秒，樣品盤溫度為10℃，檢測波長為280nm。陰極穩定劑(Cathodic Stabilizer)為500mmol/L精胺酸溶液，0.5% MC溶液降低蛋白與毛細管之間的黏附。將供試品用水稀釋至1.0mg/ml，取稀釋後的供試品溶液20μl，向其中加入78μl預混液(預混液配比如下：70μl 3mol尿素-0.5% MC溶液，4μl兩性電解質(pH 3-10)，2μl陰極穩定劑，1μl pI 5.85標誌物，1μl pI 9.99標誌物)，充分混勻制得待測樣品溶液。進樣分析，根據面積歸一化法，計算主成分、酸性組分及鹼性組分含量。

實施例6. pH對製劑的穩定性影響試驗

本實施例考察了包含抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體(antibody-A)的製劑在pH 5.0至7.0的穩定性。

6.1 實驗步驟

用注射用水、組胺酸和山梨醇配製含10mM組胺酸、5%(w/v)山梨醇的緩衝液，分別用鹽酸調節pH至5.0、5.5、6.0、6.5和7.0，將antibody-A蛋白超濾置換至不同pH值的緩衝液中，調節蛋白含量至25mg/ml；加入聚山梨酯80，使其終濃度為0.2mg/ml；過濾分裝至西林瓶，加塞、軋蓋。上述樣品於40±2℃條件下進行穩定性考察，具體方案見表12。

表12. 實驗方案

註：時間點取樣後均先放入超低溫冰箱中凍存待檢，按需化凍送檢。

6.2 判斷標準

根據對產品的認識以及儀器和方法的精密度，設定了樣品檢測指標數值與初始值相比質量未發生變化的判斷標準，具體見表13。

表13.質量未發生變化的判斷標準

6.3 實驗結果

(1)外觀和可見異物

在40±2℃條件下放置2週，除pH 7.0樣品第2週出現渾濁，不進行其他檢測，其他各組樣品外觀和可見異物均合格。

(2)蛋白含量

蛋白含量檢測結果見表14。結果表明，在40±2℃條件下放置2週，不同pH值樣品蛋白含量均未發生顯著變化。

表14. 蛋白含量結果(UV法，mg/ml)

註：“-”表示未進行該項檢測，下同。

(3)純度

純度(SEC-HPLC法)結果見表15。結果表明，在40±2℃條件下考察2週， 不同pH值樣品純度均下降，pH 5.0、pH 5.5、pH 6.0、pH 6.5樣品與0天比較純度分別下降1.1%、1.2%、1.4%和1.9%。

純度(非還原型CE-SDS法)結果見表16，結果表明，在40℃條件下考察2週，各組樣品純度(非還原型CE-SDS法)均未發生變化。

表15. 藉由SEC-HPLC法對各樣品測定的蛋白純度結果(%)

表16. 藉由非還原型CE-SDS法對各樣品測定的純度結果(%)

(4)電荷變異體

電荷變異體(iCIEF法)結果見表17，其變化趨勢見圖18~20。結果表明， 在40±2℃條件下考察2週，pH 5.0、pH 5.5、pH 6.0、pH 6.5樣品與0天比較主成分分別下降9.5%、9.1%、8.7%和9.2%。

表17藉由iCIEF法測定的各樣品的電荷變異體結果(%)

研究結果表明，antibody-A蛋白在pH 6.0較穩定，選定pH 6.0進行處方篩選實驗。

實施例7. 製劑處方篩選實驗

1.實驗步驟

本實驗主要考察依地酸二鈉、山梨醇、鹽酸精胺酸對antibody-A蛋白穩定性的影響，共設計了4個處方，詳細處方信息見表18，詳細實驗條件及取樣計劃見表19。

按照表18配製各個處方的緩衝液，將antibody-A蛋白超濾置換至各自的處方溶液中。置換完成後，調節各處方蛋白含量至25mg/ml；加入聚山梨酯80，使其終濃度為0.5mg/ml；過濾分裝至西林瓶，加塞、軋蓋。上述樣品於40±2℃條件下進行穩定性考察。

表18. 備選處方信息表

註：%是指%w/v；用鹽酸調節pH。

表19.處方篩選實驗方案

2.實驗結果

(1)外觀和可見異物

在40±2℃條件下放置4週，各處方樣品外觀、可見異物均合格。

(2)蛋白含量

蛋白含量結果見表20。結果表明，在40±2℃條件下放置4週，各處方樣品蛋白含量均未發生變化。

表20. 處方篩選實驗蛋白含量結果(UV法，mg/ml)

(3)純度

純度(SEC-HPLC法)結果見表21。結果表明，在40±2℃條件下放置4週，製劑F1~F4純度分別下降2.2%、2.3%、4.8%、3.2%。

純度(非還原型CE-SDS法)結果見表22。結果表明，在40±2℃條件下放置4週，各處方下降趨勢一致，製劑F2~F4發生明顯變化。

表21. 處方篩選實驗純度結果(SEC-HPLC法，%)

表22.處方篩選實驗純度結果(非還原型CE-SDS法，%)

(4)電荷變異體

電荷變異體(iCIEF法)結果見表23。電荷變異體變化趨勢見圖23和圖24。結果表明，40±2℃條件下考察4週，各處方電荷變異體均發生明顯變化。F1~F4酸性組分別增加9.9%、10.4%、8.8%和8.2%，主成分分別下降10.7%、11.3%、9.8%和9.8%。

表23. 處方篩選實驗電荷變異體結果(iCIEF法，%)

(1)F1與F2各項檢測結果表明：處方中添加依地酸二鈉對antibody-A蛋白穩定性獲益有限；(2)山梨醇在antibody-A純度維持上表現較優，添加鹽酸精胺酸的處方在電荷變異體方面表現較優。因此，F4為antibody-A的較優處方。此外，為避免在生產過程中使用鹽酸調節pH，將製劑處方中緩衝體系調整為組胺酸和鹽酸組胺酸。

藉由上述研究結果，確定antibody-A的較佳製劑處方(F5)：25.0mg/ml antibody-A雙特異性抗體、0.79mg/ml組胺酸、1.03mg/ml鹽酸組胺酸、16.85mg/ml鹽酸精胺酸、25.00mg/ml山梨醇和0.50mg/ml聚山梨酯80，pH 6.0。

以上描述了本發明的示例性實施方案，所屬技術領域具有通常知識者應當理解的是，這些公開內容僅是示例性的，在本發明的範圍內可以進行各種其它替換、適應和修改。因此，本發明不限於文中列舉的具體實施方案。

Claims (15)

1. 一種液體抗體製劑，其包含

   (i)抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白；

   (ii)緩衝劑，

   (iii)穩定劑，和

   (iv)表面活性劑，

   其中該抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白包含第一半抗體和第二半抗體，其中第一半抗體包含特異性結合TIGIT(SEQ ID NO：31)或其胞外結構域(例如SEQ ID NO：32)的第一VH/VL單元並且第二半抗體包含特異性結合PD-1(SEQ ID NO：29)或其胞外結構域(例如SEQ ID NO：30)的第二VH/VL單元，其中該第一VH/VL單元包含重鏈和輕鏈互補決定區(CDR)胺基酸序列SEQ ID NO：1-6；且第二VH/VL單元包含重鏈和輕鏈互補決定區(CDR)胺基酸序列SEQ ID NO：7-12，

   較佳地該抗體製劑的pH為約4.5-6.8，較佳大約5.0-6.5，更佳約6.0的pH。
2. 如請求項1所述的液體抗體製劑，其中該第一VH/VL單元包含SEQ ID NO：13/SEQ ID NO：14的成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列，或與該成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性的序列，並且其中該第二VH/VL單元包含SEQ ID NO：17/SEQ ID NO：18的成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列，或與該成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性的序列；

   較佳地，抗體的重鏈與抗體的輕鏈形成至少一個二硫鍵，抗體的兩條重鏈形成至少一個二硫鍵；

   更佳地，抗體是工程化改造以降低抗體與Fcγ受體結合的人IgG1。
3. 如請求項1或2所述的液體抗體製劑，其中該抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白包含第一半抗體和第二半抗體，其中第一半抗體包含SEQ ID NO：21的重鏈序列或與之具有至少90%、95%、98%或99%同一性的重鏈序列，和SEQ ID NO：22的輕鏈序列或與之具有至少90%、95%、98%或99%同一性的輕鏈序列，並且其中第二半抗體包含SEQ ID NO：23的重鏈序列或與之具有至少90%、95%、98%或99%同一性的重鏈序列，和SEQ ID NO：24的輕鏈序列或與之具有至少90%、95%、98%或99%同一性的輕鏈序列。
4. 如請求項1至3中任何一項所述的液體抗體製劑，其中該抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白是在HEK293細胞或以HEK293細胞為基礎改造而得到的HEK293T、HEK293F、HEK293E細胞；CHO細胞或以CHO細胞為基礎改造而得到的CHO-S、CHO-dhfr-、CHO/DG44、ExpiCHO中重組表達的抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白。
5. 如請求項1至4中任何一項所述的液體抗體製劑，其中該抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白的濃度為約1-200mg/ml，較佳地為約1-150mg/ml，更佳地為約10-100mg/mL。
6. 如請求項1至5中任何一項所述的液體抗體製劑，其中該液體製劑中的緩衝劑選自組胺酸、鹽酸組胺酸、谷胺酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽和三羥甲基胺基甲烷和它們的組合，較佳組胺酸、鹽酸組胺酸和它們的組合； 較佳地，該液體抗體製劑中的緩衝劑的濃度為約0.5-200mM、約5-50mM或約5-20mM。
7. 如請求項1至6中任何一項所述的液體抗體製劑，其中該穩定劑選自糖類、多元醇、胺基酸或其鹽及它們的組合，較佳地，該穩定劑選自：蔗糖、右旋糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、環糊精、麥芽糖糊精、葡聚糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、精胺酸、精胺酸鹽(較佳精胺酸鹽酸鹽)，更佳地，該穩定劑是山梨醇、精胺酸、精胺酸鹽或其組合；

   較佳地，該穩定劑在本發明的液體製劑中以約1-1000mM、或約50-500的濃度存在。
8. 如請求項1至7中任何一項所述的液體抗體製劑，其中該穩定劑是山梨醇、精胺酸鹽酸鹽或者山梨醇和精胺酸鹽酸鹽的組合。
9. 如請求項1至8中任何一項所述的液體抗體製劑，其中該表面活性劑選自聚山梨酯-20、聚山梨酯-80、聚山梨酯-60、或聚山梨酯-40；普洛尼克，較佳為聚山梨酯-80；

   較佳地，該液體抗體製劑中的表面活性劑的濃度為約0.01-10mg/ml、約0.05-5、約0.1-5、或0.2-2mg/ml。
10. 如請求項1至9中任何一項所述的液體抗體製劑，其中該液體抗體製劑注射劑，更佳為皮下注射劑、靜脈內注射劑或靜脈輸注劑。
11. 如請求項1至10中任何一項所述的液體抗體製劑，其中該液體抗體製劑包含：

    (i)約1-150mg/ml的抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白；

    (ii)約5-50mM的組胺酸和/或鹽酸組胺酸；

    (iii)約50-500mM的山梨醇；和/或約1-600mM的精胺酸或鹽酸精胺酸；和

    (iv)約0.05-2mg/ml聚山梨醇酯80；

    其中該液體製劑的pH為約5.0-6.5，較佳地約6.0；或者

    該液體抗體製劑包含：

    (i)約10-100mg/ml的抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白；

    (ii)約5-20mM的組胺酸和/或鹽酸組胺酸；

    (iii)約100-300mM的山梨醇；和/或約50-200mM的精胺酸或鹽酸精胺酸；和

    (iv)約0.2-2mg/ml聚山梨醇酯80；

    其中該液體製劑的pH為約5.0-6.5，較佳地約6.0；或者

    該液體抗體製劑包含：

    (i)約25mg/ml的抗TIGIT/ PD-1雙特異性抗體蛋白；

    (ii)約5mM的組胺酸和約5mM鹽酸組胺酸；或者約10mM的組胺酸；

    (iii)約25mg/ml的山梨醇；和約80mM的精胺酸或鹽酸精胺酸；和

    (iv)約0.5mg/ml聚山梨醇酯80；

    其中該液體製劑的pH為約5.0-6.5，較佳地約6.0。
12. 一種固體抗體製劑，其是過藉由將如請求項1至11中任何一項所述的液體抗體製劑經固化處理而獲得的；該固體抗體製劑例如是凍乾粉針劑形式。
13. 一種遞送裝置，其包含如請求項1至11中任何一項該液體抗體製劑或如請求項12所述的固體抗體製劑。
14. 如請求項13所述的遞送裝置，其是預填充注射器形式的，用於靜脈內、皮下、皮內或者肌內注射、靜脈內輸注。
15. 一種如請求項1至11中任何一項所述的液體抗體製劑或如請求項12所述的固體抗體製劑用於製備在受試者中治療、預防或延緩與TIGIT信號傳導通路和pD-1信號傳導通路相關的病症的遞送裝置(如，預填充注射器)或藥物的用途，該病症例如各種血液病和實體瘤，包括但不限於白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、腦腫瘤、頭頸癌、頭頸部鱗狀細胞癌、肺癌例如非小細胞肺癌或小細胞肺癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、膽囊癌、膽管癌、肝癌、結直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮內膜癌、子宮肉瘤、前列腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、黑色素瘤。

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