TWI761869B

TWI761869B - 包含抗cd47/pd-l1雙特異性抗體的製劑及其製備方法和用途

Info

Publication number: TWI761869B
Application number: TW109121575A
Authority: TW
Inventors: 朱興貴; 馬一冬; 汪音爵; 周凱松
Original assignee: 大陸商信達生物製藥（蘇州）有限公司
Priority date: 2019-06-25
Filing date: 2020-06-24
Publication date: 2022-04-21
Also published as: JP2022540781A; BR112021026414A2; US20220251210A1; TW202104270A; CA3144244A1; AU2020304112A1; CN114040777A; KR20220036998A; WO2020259605A1; EP3991745A1

Abstract

本發明涉及包含抗CD47/PD-L1雙特異性抗體的製劑，尤其涉及包含抗CD47/PD-L1雙特異性抗體、緩衝劑、穩定劑和表面活性劑的藥物製劑。此外，本發明還涉及這些製劑的疾病治療或預防用途。

Description

包含抗CD47/PD-L1雙特異性抗體的製劑及其製備方法和用途

本發明涉及抗體製劑領域。更具體而言，本發明涉及包含重組的抗分化抗原簇47(CD47)和抗程序性死亡配體1(PD-L1)雙特異性抗體(也稱為抗CD47/PD-L1雙特異性抗體)的藥物製劑，尤其是穩定的高濃度抗體液體製劑，以及用於製備該藥物製劑的方法，以及該藥物製劑的治療和/或預防用途。

PD-L1(也稱為分化抗原簇274(CD274)或B7同源物1(B7-H1))，是40kDa I型跨膜蛋白。PD-L1與活化的T細胞上存在的其受體PD-1結合，下調T細胞活化(Latchman等人，2001 Nat Immunol 2：261-8；Carter等人，2002 Eur J Immunol 32：634-43)。已經在許多癌中發現了PD-L1表達，包括人肺癌、卵巢癌、結腸癌和多種骨髓瘤等，並且PD-L1表達經常與癌的預後不良相關(Iwai等人(2002)PNAS 99：12293-7；Ohigashi等人(2005)Clin Cancer Res 11：2947-53；Okazaki等人(2007)Intern.Immun.19：813-24；Thompson等人(2006)Cancer Res.66：3381-5)。已經提出藉由抑制PD1與PD-L1的局部相互作用可以在一部分腫瘤患者中逆轉免疫抑制。

羅氏(Roche)研發的抗PD-L1抗體Atezolizumab、德國默克(Merck KGaA)和美國輝瑞(Pfizer)合作開發的抗PD-L1抗體Avelumab、阿斯利康研發的Durvalumab顯示了對部分腫瘤患者的治療效果。其它抗PD-L1抗體包括YW243.55.S70(重鏈和輕鏈可變區顯示在WO2010/077634中的SEQ ID NOs 20和21中)和WO2007/005874中公開的抗PD-L1抗體等。

分化抗原簇47(CD47)，也被稱為整聯蛋白相關蛋白(IAP)，是免疫球蛋白超家族成員。CD47與主要由巨噬細胞和樹突細胞表達的一種作為其配體的細胞表面免疫球蛋白SIRP α相互作用，產生一系列的級聯反應，並由此抑制巨噬細胞和樹突細胞對表達CD47的細胞的攝取和吞噬作用。在腫瘤中觀察到存在CD47的過度表達。但是CD47在許多正常組織中也有表達，這導致僅以CD47為靶點的抗體通常與正常血液系統細胞的非特異性結合，引起了抗原沉默(antigen sink)現象。

抗CD47/PD-L1雙特異性抗體由於能夠同時靶向CD47和腫瘤細胞上的PD-L1，藉由與腫瘤細胞上PD-L1的特異性結合促進了抗CD47/PD-L1雙特異性抗體對腫瘤細胞的選擇性結合，避免了與許多正常組織中表達的CD47結合，因此，抗CD47/PD-L1雙特異性抗體具有在增強抗腫瘤作用的同時減少副作用的優勢。

PCT/CN2018/123886的PCT申請(申請日：2018年12月26日)公開了一種新型的抗體樣式，並構建和表達了具有所述新型抗體樣式的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體。對使用Raji-PD-L1細胞接種NOD-SCID小鼠產生的荷瘤小鼠施用抗CD47/PD-L1雙特異性抗體，結果表明，與施用抗CD47單株抗體和抗PD-L1單株抗體相比較，抗CD47/PD-L1雙特異性抗體具有顯著提高的抗腫瘤活性，能夠顯著抑制腫瘤的生長，甚至能使得腫瘤完全消失。此外，抗CD47/PD-L1雙特異性抗體還表現出顯著降低的血細胞凝集作用，因此在臨床治療中將具有顯著降低的副作用。本領域中需要能夠用來治療、預防或延緩各種與SIRP α/CD47信號傳導通路和PD1/PD-L1信號傳導通路相關的疾病的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體製劑。

抗體製劑除了需要以使抗體適於施用給受試者的方式調配之外，還需要以在儲存以及後續使用期間維持其穩定性的方式來調配。例如，如果抗體沒有適當地在液體中得以調配，則液體溶液中的該抗體傾向於分解、聚集或發生不希望的化學修飾等。抗體在抗體製劑中的穩定性取決於製劑中所使用的緩衝劑、穩定劑和表面活性劑等。

儘管已知一些抗CD47/PD-L1雙特異性抗體，但在本領域中對於含有足夠穩定且適於施用給受試者的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體的新穎藥物製劑仍存在需要。因此，需要合適的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體製劑，以用來治療或預防疾病。

[發明概述]

本發明藉由提供含有特異結合CD47和PD-L1的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白的藥物製劑來滿足上述需求。

在一個方面，本發明提供了一種液體抗體製劑，其包含(i)抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白；(ii)緩衝劑，(iii)穩定劑，和(iv)表面活性劑。

本發明抗體製劑中包含的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白是一種三鏈抗體，該三鏈抗體包含第一多肽鏈和第二多肽鏈上的特異性結合CD47的VH/VL對作為第一抗原結合位點，以及第三多肽鏈上的特異性結合PD-L1的第一VHH作為單結構域第二抗原結合位點和第二VHH作為單結構域第三抗原結合位點；或者包含第一多肽鏈和第二多肽鏈上的特異性結合PD-L1的VH/VL對作為第一抗原結合位點，以及第三多肽鏈上的特異性結合CD47的第一VHH作為單結構域第二抗原結合位點和第二VHH作為單結構域第三抗原結合位點。在一些實施方案中，該抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白能夠以至少約10⁷M^-1、較佳地約10⁸M^-1和更較佳地約10⁹M^-1或更強的親和力常數與腫瘤細胞表面的CD47結合，由此阻斷CD47與巨噬細胞表面SIRP α的結合，促進腫瘤組織浸潤區的巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬作用；並以至少約10⁷M^-1、較佳地約10⁸M^-1和更佳地約10⁹M^-1或更強的親和力常數與腫瘤細胞表面的PD-L1結合，由此抑制T細胞上的PD-1與腫瘤細胞表面PD-L1的結合，誘導T細胞活化並發揮抗腫瘤作用。

在一個實施方案中，該抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白為PCT/CN2018/123886的PCT申請(申請日：2018年12月26日)中公開的重組抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白。為了本申請的目的，該PCT申請的全部內容特此併入本文作為參考。在一個實施方案中，抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白是一種三鏈抗體，該三鏈抗體包含第一多肽鏈和第二多肽鏈上的特異性結合CD47的VH/VL對作為第一抗原結合位點，以及第三多肽鏈上的特異性結合PD-L1的第一VHH作為單結構域第二抗原結合位點和第二VHH作為單結構域第三抗原結合位點，其中第一多肽鏈和第二多肽鏈上的特異性結合CD47的VH/VL 對作為第一抗原結合位點包含衍生自抗CD47抗體ADI-29341的GSIEHYYWS(SEQ ID NO：3)所示的VH CDR1、YIYYSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO：4)所示的VH CDR2、ARGKTGSAA(SEQ ID NO：5)所示的VH CDR3、RASQGISRWLA(SEQ ID NO：10)所示的VL CDR1、AASSLQS(SEQ ID NO：11)所示的VL CDR2和QQTVSFPIT(SEQ ID NO：12)所示的VL CDR3，或與該6個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列；該第三多肽鏈上的特異性結合PD-L1的單結構域第二和第三抗原結合位點均包含AYTISRNSMG(SEQ ID NO：17)所示的CDR1、IESDGST(SEQ ID NO：18)所示的CDR2和AAPKVGLGPRTALGHLAFMTLPALNY(SEQ ID NO：19)所示的CDR3，或者與該3個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列，

在一個實施方案中，抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白的該第一多肽鏈和第二多肽鏈上的特異性結合CD47的VH/VL對作為第一抗原結合位點包含衍生自抗CD47抗體ADI-29341的SEQ ID NO：2/9的成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列，或與該成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性的序列，該第三多肽鏈上的特異性結合PD-L1的單結構域第二和第三抗原結合位點均包含SEQ ID NO：15和/或SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列，或與之基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更多同一)的序列：

(SEQ ID NO：2)；

(SEQ ID NO：9)；

(SEQ ID NO：15)；

(SEQ ID NO：16)。

在一個實施方案中，抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白包含SEQ ID NO：1所示的第一多肽鏈、SEQ ID NO：8所示的第二多肽鏈、和SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：22所示的第三多肽鏈，或與任一所述序列基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一)的序列。

(SEQ ID NO：1)；

(SEQ ID NO：8)；

(SEQ ID NO：14)；

(SEQ ID NO：22)。

在一個實施方案中，該抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白是在HEK293細胞或CHO細胞中重組表達的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白。

在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白的濃度為約1-200mg/ml。在另一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白的濃度為約5-150mg/mL。在其他實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白的濃度為約5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150mg/ml。

在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的緩衝劑的濃度為約1-30mM。在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的緩衝劑的濃度為約5-25mM，例如，約5、10、15、20、25mM。

在一個實施方案中，該緩衝劑選自組胺酸、鹽酸組胺酸和它們的組合。

在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的穩定劑的濃度為約50-500mM。在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的穩定劑的濃度為約100-400mM，例如，約100、150、200、250、300、350、400mM。

在一個實施方案中，該穩定劑選自山梨醇、蔗糖、海藻糖、精胺酸、鹽酸精胺酸和它們的任意組合，更佳為蔗糖、精胺酸和/或鹽酸精胺酸。在一個實施方案中，該液體抗體製劑包含鹽酸精胺酸作為穩定劑，較佳地鹽酸精胺酸以約50-250mM，較佳地約100-200mM(例如，約100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200mM)的量存在；和/或包含蔗糖作為穩定劑，較佳地蔗糖以約50-250mM，較佳地約100-200mM(例如，約100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200mM)的量存在。

在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的表面活性劑的濃度為約0.1-1mg/ml。在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的表面活性劑的濃度為約0.2-0.8mg/ml，例如約0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mg/ml。

在一個實施方案中，該表面活性劑是非離子型表面活性劑。在一個實施方案中，該表面活性劑選自聚山梨酯類表面活性劑。在一個具體實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的表面活性劑是聚山梨酯-80。

在一些實施方案中，該液體製劑還包含金屬螯合劑(例如，EDTA)，例如，約0.002-0.2mg/ml的金屬螯合劑(例如，EDTA)。在一個實施方案中，該液體製劑還包含約0.01-0.1mg/ml，例如約0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.08、0.1mg/ml的金屬螯合劑(例如，EDTA)。

在一個實施方案中，該液體製劑的pH值為約6.4-7.0。在一些實施方案中，該液體製劑的pH值為約6.4-7.0中的任意值，例如約6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0。

在一個實施方案中，該液體製劑為藥物製劑，較佳為注射劑，更佳為皮下注射劑或靜脈內注射劑。在一個實施方案中，該液體製劑為靜脈輸注劑。

在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑包含：

(i)約1-200mg/ml的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白；

(ii)約1-30mM的組胺酸和/或鹽酸組胺酸；

(iii)約50-500mM的蔗糖、精胺酸和/或鹽酸精胺酸，和

(iv)約0.1-1mg/ml聚山梨醇酯80；

視需要地，該液體製劑還包含0.002-0.2mg/ml金屬螯合劑(例如，EDTA)；其中該液體製劑的pH為約6.4-7.0，較佳地約6.5。

在一個較佳的實施方案中，本發明的液體抗體製劑包含：

(i)約50-150mg/ml的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白；

(ii)約3-25mM的組胺酸和/或鹽酸組胺酸；

(iii)約150-300mM的蔗糖、精胺酸和/或鹽酸精胺酸，和

(iv)約0.2-0.8mg/ml聚山梨醇酯80；

視需要地，該液體製劑還包含約0.01-0.1mg/ml金屬螯合劑(例如，EDTA)；其中該液體製劑的pH為約6.4-7.0，較佳地約6.5。

在一個較佳的實施方案中，本發明的液體抗體製劑包含

(i)約100mg/ml的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白；

(ii)約20mM組胺酸；

(iii)約180mM鹽酸精胺酸，和

(iv)約0.2mg/ml聚山梨醇酯80；

視需要地，該液體製劑還包含金屬螯合劑(例如，EDTA)，例如約0.02mg/ml EDTA；

其中該液體製劑的pH為約6.4-7.0，較佳地約6.5。

在一個較佳的實施方案中，本發明的液體抗體製劑包含

(i)約100mg/ml的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白；

(ii)約20mM組胺酸；

(iii)約100mM鹽酸精胺酸和4%蔗糖，和

(iv)約0.2mg/ml聚山梨醇酯80；

其中該液體製劑的pH為約6.4-7.0，較佳地約6.5。

在一個較佳的實施方案中，本發明的液體抗體製劑包含

(i)約100mg/ml的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白；

(ii)約2.52mg/ml組胺酸和約0.79mg/ml鹽酸組胺酸；

(iii)約37.92mg/ml鹽酸精胺酸，和

(iv)約0.5mg/ml聚山梨醇酯80；

其中該液體製劑的pH為約6.4-7.0，較佳地約6.5。

另一方面，本發明提供了一種固體抗體製劑，其是藉由將本發明的液體抗體製劑經固化處理而獲得的。該固化處理是藉由例如結晶法、噴霧乾燥法、冷凍乾燥法實施的。在一個較佳的實施方案中，該固體抗體製劑例如是凍乾粉針劑形式。固體抗體製劑可在使用前，藉由重構於適當的溶媒中，形成本發明的重構製劑。該重構製劑也是一種本發明的液體抗體製劑。在一個實施方案中，該適當的溶媒選自注射用水、注射用有機溶劑，包括但不限於注射用油、乙醇、丙二醇等，或其組合。

本發明的液體製劑可以長期穩定儲存，例如至少24個月或更長時間。在一個實施方案中，本發明的液體製劑可以在約-80℃至約45℃，例如-80℃、約-30℃、約-20℃、約0℃、約5℃、約25℃、約35℃、約38℃、約40℃、約42℃或約45℃的條件下，儲存至少10天、至少20天、至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9個月、至少10個月、至少11個月、至少12個月、至少18個月、至少24個月，至少36個月，或更長時間，是穩定的。

在一個實施方案中，本發明的液體製劑可以穩定儲存至少24個月。在再一實施方案中，本發明的液體製劑在至少40℃是穩定的。在再一實施方案中，本發明的液體製劑在約2℃-8℃保持穩定至少12個月，較佳至少24個月。在一個實施方案中，本發明的液體製劑在室溫或例如約25℃保持穩定至少3個月，較佳至少6個月。在再一實施方案中，本發明的液體製劑在約40℃保持穩定至少1個月。

在一個實施方案中，可以藉由檢測製劑的外觀、可見異物、蛋白含量、純度、和/或電荷變異體的變化，來指示儲存後製劑的穩定性。在一個實施方案中，可以在高溫脅迫試驗中，例如在40℃±2℃儲存至少1週、2週或較佳地1個月後，或在25℃±2℃儲存至少1個月或2個月後，檢測本發明液體製劑的穩定性。

在一個實施方案中，在儲存後，藉由目視檢查本發明液體製劑的穩定性，其中本發明液體製劑在外觀上保持為澄明至微乳光，為無色至淡黃色液體，且無異物。在一個實施方案中，在澄明度檢測儀下目視檢查，製劑中無可見異物存在。在一個實施方案中，在儲存後，藉由測定蛋白含量變化，檢查本發明液體製劑的穩定性，其中例如藉由紫外分光光度(UV)法，相對於儲存第0天的初始值，蛋白含量變化率不超過20%，較佳不超過10%，例如7-8%，較佳不超過5%。在一個實施方案中，在儲存後，藉由測定本發明液體製劑的濁度變化，檢查本發明液體製劑的穩定性，其中例如藉由OD_350mm法檢測，相對於儲存第0天的初始值，變化值不超過0.04，更佳地不超過0.03，更佳地不超過0.02。在一個實施方案中，在儲存後，藉由測定本發明液體製劑的純度變化，檢查本發明液體製劑的穩定性，其中藉由尺寸排阻高效液相色譜法(SEC-HPLC)，相對於儲存第0天的初始值，單體純度的變化值不超過10%，例如不超過5%、4%、3%、例如1-2%，較佳不超過1%。在一個實施方案中，在儲存後，藉由測定本發明液體製劑的純度變化，檢查本發明液體製劑的穩定性，其中藉由非還原型和/或還原型十二烷基硫酸鈉毛細管電泳(CE-SDS)法，單體純度的變化值下降不超過10%，例如不超過9.5%、8.5%、7.5%、6.5%。在一個實施方案中，在儲存後，藉由成像毛細管等電聚焦電泳(iCIEF)檢測本發明液體製劑的穩定性，其中相對於儲存第0天的初始值，抗體的電荷變異體(主成分、酸性組分和鹼性組分)的變化值總和不超過50%，例如不超過45%、40%、35%、30%、25%。在一個實施方案中，在儲存後，藉由陽離子交換高效液相色譜法(CEX-HPLC法)檢測本發明液體製劑的穩定性，其中相對於儲存第0天的初始值，抗體的電荷變異體(主成分、酸性組分和鹼性組分)的變化值總和不超過40%，例如不超過38%、36%、34%、32%、30%。

在一個實施方案中，製劑在儲存後，例如在2-8℃儲存至少24個月後，或在室溫儲存至少3個月後，或在40℃±2℃儲存1個月後，是穩定的，較佳地具有如下特徵之一或多項：

(i)藉由SEC-HPLC法測量，製劑具有大於90%的純度，較佳大於95%、96%、97%、98%、99%的純度；

(ii)藉由還原型或非還原型CE-SDS法測量，製劑具有大於85%的純度，較佳大於86%、87%、88%、89%的純度；

(iii)藉由iCIEF法測量，相對於儲存第0天的初始值，製劑中抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白的各組分(主成分、酸性組分和鹼性組分)的變化值總和不超過50%，例如不超過45%、40%、35%、30%、25%；

(iv)藉由CEX-HPLC法測量，相對於儲存第0天的初始值，製劑中抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白的各組分(主成分、酸性組分和鹼性組分)的變化值總和不超過40%，例如不超過38%、36%、34%、32%、30%；

(v)藉由ELISA法測量，相對於儲存第0天的初始值，製劑中抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白的相對結合活性為70%-130%，例如，為70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%。

在一個方面，本發明提供了一種遞送裝置，其包含本發明的液體抗體製劑或固體抗體製劑。在一個實施方案中，本發明的遞送裝置以包含本發明的液體抗體製劑或固體抗體製劑的預填裝注射器形式提供，例如用於靜脈內、皮下、皮內或者肌內注射、靜脈內輸注。

在又一方面，本發明提供向受試者，例如哺乳動物遞送抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白的方法，包括給予該受試者本發明的液體抗體製劑或固體抗體製劑的步驟，該遞送是例如藉由使用預填裝注射器的遞送裝置實施的。

在又一方面，本發明提供本發明的液體抗體製劑或固體抗體製劑的用途，用於製備在受試者中治療、預防或延緩與SIRP α/CD47信號傳導通路和PD1/PD-L1信號傳導通路相關的病症的遞送裝置(如，預填裝注射器)或藥物，該病症例如各種血液病和實體瘤，包括但不限於急性骨髓性白血病(AML)，慢性骨髓性白血病，急性淋巴細胞白血病(ALL)，非霍奇金淋巴瘤(NHL)，多發性骨髓瘤(MM)、淋巴瘤、乳腺癌、胃癌、肺癌、食管癌、腸癌、卵巢癌、宮頸癌、腎癌、胰腺癌、膀胱癌、神經膠質瘤、黑色素瘤和其他實體瘤；自身免疫病和炎性病症，例如，過敏性哮喘或潰瘍性結腸炎；細胞或組織或器官移植物排斥，包括非人組織移植物(異種移植物)排斥。

本發明的其它實施方案將藉由參閱此後的詳細說明而清楚明瞭。

結合以下圖式一起閱讀時，將更好地理解以下詳細描述的本發明的較佳實施方案。出於說明本發明的目的，圖中顯示了目前較佳的實施方案。然而，應當理解本發明不限於圖中所示實施方案的精確安排和手段。

圖1例示了一種抗CD47/PD-L1雙特異性抗體的結構，其中第一多肽鏈與第二多肽鏈配對形成第一抗原結合位點，第三多肽鏈包含單結構域第二抗原結合位點和單結構域第三抗原結合位點，且在第三多肽鏈的單結構域第二抗原結合位點和單結構域第三抗原結合位點之間具有柔性連接肽。

圖2顯示了抗CD47/PD-L1雙特異性抗體製劑在pH 6.4、6.5、6.8和7.0於40℃±2℃放置不同時間後，藉由SEC-HPLC法測定的各樣品中蛋白純度變化趨勢圖。圖中橫坐標上的T0表示0天；2W表示2週；1M表示1個月。

圖3顯示了抗CD47/PD-L1雙特異性抗體製劑在pH 6.4、6.5、6.8 和7.0於40℃±2℃放置不同時間後，藉由非還原型CE-SDS法測定的各樣品中蛋白純度變化趨勢圖。圖中橫坐標上的T0表示0天；2W表示2週；1M表示1個月。

圖4顯示了抗CD47/PD-L1雙特異性抗體製劑在pH 6.4、6.5、6.8和7.0於40℃±2℃放置不同時間後，藉由iCIEF法測定的各樣品中電荷變異體主成分的變化趨勢圖。圖中橫坐標上的T0表示0天；2W表示2週；1M表示1個月。

圖5顯示了將具有不同穩定劑的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體製劑(處方2-5)置於40℃±2℃儲存0天、1週、2週、和4週後，藉由SEC-HPLC法測定的主峰純度隨時間的變化圖。圖中橫坐標上的T0表示0天；1W表示1週；2W表示2週；4W表示4週。

圖6顯示了將具有不同穩定劑的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體製劑(處方2-5)置於40℃±2℃儲存0天、1週、2週、和4週後，藉由非還原型CE-SDS法測定的主峰純度隨時間的變化圖。圖中橫坐標上的T0表示0天；1W表示1週；2W表示2週；4W表示4週。

圖7顯示了將具有不同穩定劑的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體製劑(處方2-5)置於40℃±2℃儲存0天、1週、2週、和4週後，藉由iCIEF法測定的電荷變異體主成分隨時間的變化圖。圖中橫坐標上的T0表示0天；1W表示1週；2W表示2週；4W表示4週。

[發明詳述]

在詳細描述本發明之前，應瞭解，本發明不受限於本說明書中的特定方法及實驗條件，因為該方法以及條件是可以改變的。另外，本文所用術語僅是供說明特定實施方案之用，而不意欲為限制性的。

定義

除非另有定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語均具有與本領域一般技術人員通常所理解的含義相同的含義。為了本發明的目的，下文定義了以下術語。

術語“約”在與數字數值聯合使用時意為涵蓋具有比指定數字數值小5%的下限和比指定數字數值大5%的上限的範圍內的數字數值。

術語“和/或”當用於連接兩個或多個可選項時，應理解為意指可選項中的任一項或可選項中的任意兩項或多項。

如本文中所用，術語“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整數或步驟，但是不排除任意其他要素、整數或步驟。在本文中，當使用術語“包含”或“包括”時，除非另有指明，否則也涵蓋由所述及的要素、整數或步驟組成的情形。例如，當提及“包含”某個具體序列的抗體可變區時，也旨在涵蓋由該具體序列組成的抗體可變區。

在本文中，術語“抗體”以最廣意義使用，指包含抗原結合位點的蛋白質，涵蓋各種結構的天然抗體和人工抗體，包括但不限於三鏈抗體、完整抗體和抗體的抗原結合片段。

術語“全抗體”、“全長抗體”、“完全抗體”和“完整抗體”在本文中可互換地用來指包含由二硫鍵相互連接的至少兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)的糖蛋白。每條重鏈由重鏈可變區(本文中縮寫為VH)和重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由3個結構域CH1、CH2和CH3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)和輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。VH區和VL區可以進一步再劃分為超變區(為互補決定區(CDR)，其間插有較保守的區域(為構架區(FR))。每個VH和VL由三個CDR和4個FR組成，從胺基端到羧基端以如下順序排列：FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4。恆定區不直接參與抗體與抗原的結合，但是顯示出多種效應子功能。

術語“抗體製劑”指一種製備物，該製備物處於允許作為活性成分的抗體的生物活性可以有效發揮的形式，並且不含有對於待施用該製劑的受試者而言具有不可接受毒性的其它組分。這類抗體製劑通常是無菌的。通常，抗體製劑中包含可藥用賦形劑。“可藥用”賦形劑是可以合理地施用至受試哺乳動物以便製劑中所用活性成分的有效劑量可以遞送至受試者的試劑。賦形劑的濃度與施用模式相適應，例如可以是注射可接受的。

術語“抗CD47/PD-L1雙特異性抗體製劑”在本文中也簡稱為“本發明的抗體製劑”，意指包含抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白作為活性成分並包含可藥用賦形劑的製備物。將抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白與可藥用賦形劑組合後，作為活性成分的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白適於治療性或預防性施與人類或非人類動物。本發明的抗體製劑可以例如製備成水性形式的液體製劑，例如，即用式預填裝注射器，或者製備成凍乾製劑，在即將使用前藉由溶解和/或懸浮於生理可接受的溶液中進行重構(即，複溶)。在一些實施方案中，抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白製劑是液體製劑形式。

“穩定的”抗體製劑是製劑中的抗體在儲存於特定條件下之後保有可接受程度的物理穩定性和/或化學穩定性。儘管抗體製劑中所含的抗體在儲存特定時間之後可能不會100%維持其化學結構，但通常在儲存特定時間之後維持約90%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%的抗體結構或功能，則認為抗體製劑是“穩定的”。在一些具體的實施方案中，本發明的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白製劑在製造、製備、運輸和長期儲存過程中表現出低至檢測不到的抗體聚集或降解或化學修飾，從而極少或甚至是沒有抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白的生物活性損失，表現出高度穩定性。在一些實施方案中，本發明的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白製劑在儲存後，基本上保留其物理和化學穩定性。較佳地，本發明液體製劑可以在室溫或在40℃穩定至少1個月，和/或在2-8℃穩定至少24個月。

本領域已知多種分析技術可以用於測定蛋白質的穩定性，參見例如Peptide and Protein Drug Delivery,247-301,Vincent Lee Ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs(1991)and Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10：29-90(1993)。可以在選定的溫度和選定的儲存時間測量穩定性。例如，可以基於預期的製劑貨架期來選擇儲存時間。備選地，可以使用加速穩定性試驗。在一些實施方案中，藉由對抗體製劑進行各種脅迫測試來進行穩定性測試。這些測試可以代表調配的抗體製劑在製造、儲存或運輸期間可能遭遇到的極端條件，也可以代表在非製造、儲存或運輸期間可能使抗體製劑中的抗體的不穩定性加速的條件。例如，可以將經調配的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白製劑充填至玻璃小瓶中以檢驗在高溫脅迫下的抗體穩定性。

經一段儲存時間後，製劑不顯示聚集、沉澱、混濁和/或變性；或顯示非常少的聚集、沉澱、混濁和/或變性，則可以認為抗體在製劑中“保持其物理穩定性”。由於製劑中抗體的聚集可以潛在地導致患者增加的免疫反應，從而導致安全性問題。因此，需要使在製劑中的抗體聚集最小化或防止聚集。光散射法可以用於測定製劑中的可見聚集物。SEC可以用於測定製劑中的可溶性聚集物。此外，可以藉由目視檢查製劑的外觀、顏色和/或澄清度、或者藉由OD_350nm法檢測製劑的濁度、或者藉由非還原型CE-SDS法測定製劑的純度，來指示製劑的穩定性。在一個實施方案中，藉由測定在特定溫度下儲存特定時間之後製劑中的抗體單體的百分比來測量製劑的穩定性，其中製劑中的抗體單體的百分比越高，則製劑的穩定性越高。

“可接受程度的”物理穩定性可以表示於特定溫度下儲存特定時間之後，在製劑中檢測到至少約92%的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白單體。在一些實施方案中，在特定溫度儲存至少2週、至少28天、至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9個月、至少10個月、至少11個月、至少12個月、至少18個月、至少24個月或更久後，可接受程度的物理穩定性表示至少約88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白單體。當評估物理穩定性時，藥物製劑儲存的特定溫度可為約-80℃至約45℃的任一溫度，例如儲存於約-80℃、約-30℃、約-20℃、約0℃、約4℃-8℃、約5℃、約25℃、約35℃、約37℃、約40℃、約42℃或約45℃。例如，若儲存於約40℃±2℃ 1個月或4週之後，檢測到至少約88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白單體，則藥物製劑視為是穩定的。若儲存於約25℃ 2個月之後，檢測到至少約88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白單體，則藥物製劑視為是穩定的。若儲存於約5℃ 9個月之後，檢測到至少約88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白單體，則藥物製劑視為是穩定的。

經一段儲存時間後，如果製劑中的抗體不顯示顯著的化學改變，則可以認為抗體在製劑中“保持其化學穩定性”。大多數化學不穩定性源自於形成了抗體的共價修飾形式(例如，抗體的電荷變異體)。例如由天冬胺酸異構化、N和C末端修飾，可以形成鹼性變異體；由脫醯胺化、唾液酸化和糖化，可以產生酸性變異體。化學穩定性可以藉由檢測和/或定量抗體的化學改變形式來評估。例如，可以藉由陽離子交換色譜(CEX)或成像毛細管等電聚焦電泳(iCIEF)檢測製劑中抗體的電荷變異體。在一個實施方案中，藉由測定在特定溫度下儲存特定時間之後製劑中抗體的電荷變異體百分比變化值來測量製劑的穩定性，其中該變化值越小，則製劑的穩定性越高。

“可接受程度”的化學穩定性可以表示於特定溫度下儲存特定時間之後製劑中電荷變異體(例如主成分或酸性組分或鹼性組分)的百分比變化值不超過30%，例如20%。在一些實施方案中，在特定溫度儲存至少2週、至少28天、至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9個月、至少10個月、至少11個月、至少12個月、至少18個月、至少24個月或更久後，可接受程度的化學穩定性可以表現為酸性組分電荷變異體的百分比變化值不超過約25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、或1%。當評估化學穩定性時，儲存藥物製劑的溫度可為約-80℃至約45℃的任一溫度，例如儲存於約-80℃、約-30℃、約-20℃、約0℃、約4℃-8℃、約5℃、約25℃或約45℃。例如，若在儲存於5℃ 24個月之後，酸性組分電荷變異體的百分比變化值少於約25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.1%，則藥物製劑可被視為是穩定的。若在儲存於25℃ 2個月後，酸性組分電荷變異體的百分比變化值少於約20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.1%，則藥物製劑亦可被視為是穩定的。若在儲存於40℃ 1個月之後，酸性組分電荷變異體的百分比變化值少於約25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.1%，則藥物製劑亦可被視為是穩定的。

術語“凍幹製劑”是指藉由液體製劑的冷凍乾燥處理得到或能夠得到的組合物。較佳地，其為具有少於5%、較佳少於3%水含量的固體組合物。

術語“重構製劑”是指將固體製劑(例如凍乾製劑)溶解和/或懸浮於生理可接受的溶液中得到的液體製劑。

文中使用的術語“室溫”是指15℃至30℃、較佳20℃至27℃、更佳25℃的溫度。

“脅迫條件”是指在化學和/或物理上不利於抗體蛋白的環境，該環境可以導致不可接受的抗體蛋白失穩定。“高溫脅迫”是指，將抗體製劑置於室溫或甚至於更高溫度(例如40℃±2℃)儲存一段時間。藉由高溫脅迫加速試驗，可以檢查抗體製劑的穩定性。

如本文所使用，術語“腸胃外施用”意指腸內和局部給藥以外的給藥方式，通常藉由注射或輸注方式，並且包括但不限於，靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下(subcuticular)、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內、硬膜外和胸骨內注射以及輸注。在一些實施方案中，本發明的穩定抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白製劑腸胃外施用於受試者。在一個實施方案中，本發明的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白製劑以皮下、皮內、肌內或靜脈內注射方式施用於受試者。

I.抗體製劑

本發明提供穩定的液體抗體製劑，其包含(i)抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白，(ii)緩衝劑，(iii)穩定劑，和(iv)表面活性劑，視需要地，還包含(v)其它賦形劑，該抗體製劑的pH為約6.4-7.0。在一個較佳方案中，本發明的液體抗體製劑是注射製劑形式。

(i)抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白

本發明抗體製劑中的“抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白”是一種三鏈抗體，該三鏈抗體包含第一多肽鏈和第二多肽鏈上的特異性結合CD47的VH/VL對作為第一抗原結合位點，以及第三多肽鏈上的特異性結合PD-L1的第一VHH作為單結構域第二抗原結合位點和第二VHH作為單結構域第三抗原結合位點；或者包含第一多肽鏈和第二多肽鏈上的特異性結合PD-L1的VH/VL對作為第一抗原結合位點，以及第三多肽鏈上的特異性結合CD47的第一VHH作為單結構域第二抗原結合位點和第二VHH作為單結構域第三抗原結合位點。該抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白能夠以至少約10⁷M^-1、較佳地約10⁸M^-1和更佳地約10⁹M^-1或更強的親和力常數與CD47結合，且能夠以至少約10⁷M^-1、較佳地約10⁸M^-1和更佳地約10⁹M^-1或更強的親和力常數與PD-L1結合，以致該抗體可以用作雙特異性靶向CD47分子和PD-L1分子的治療劑和/或預防劑。

對於該特異性結合PD-L1或CD47的VH/VL對，其包含衍生自任何現有技術中報導的抗PD-L1抗體和將來研發出的抗PD-L1抗體VH/VL對的6個CDR或與該6個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列；或者包含衍生自任何現有技術中報導的抗CD47抗體和將來研發出的抗CD47抗體VH/VL對的6個CDR或與該6個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列。

對於該特異性結合PD-L1或CD47的第一VHH和第二VHH，它們均衍生自天然缺乏輕鏈的抗體的重鏈可變結構域(如駱駝科(Camelidae)物種中天然存在的重鏈抗體的重鏈可變結構域)。第一VHH和第二VHH可以相同或者不同。該第一VHH和第二VHH可以源自駱駝科物種(例如駱駝、羊駝、單峰駝、駝羊和原駝)中產生的抗體。除駱駝科之外的其他物種也可以產生天然缺乏輕鏈的重鏈抗體，這類VHH也處於本發明抗體蛋白的範圍內。該第一VHH和第二VHH包含衍生自任何現有技術中報導的抗PD-L1抗體和將來研發出的抗PD-L1抗體VHH的3個CDR或與該3個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列；或者包含衍生自任何現有技術中報導的抗CD47抗體和將來研發出的抗CD47抗體VHH的3個CDR或與該3個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列。

在一個實施方案中，抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白的該第一多肽鏈和第二多肽鏈上的特異性結合CD47的VH/VL對包含衍生自中國專利申請號CN201710759828.9報導的抗CD47抗體ADI-29341的GSIEHYYWS(SEQ ID NO：3)所示的VH CDR1、YIYYSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO：4)所示的VH CDR2、ARGKTGSAA(SEQ ID NO：5)所示的VH CDR3、RASQGISRWLA(SEQ ID NO：10)所示的VL CDR1、AASSLQS(SEQ ID NO：11)所示的VL CDR2和QQTVSFPIT(SEQ ID NO：12)所示的VL CDR3，或與該6個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列。

在一個實施方案中，抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白的該第三多肽鏈上的特異性結合PD-L1的第一VHH和第二VHH均包含AYTISRNSMG(SEQ ID NO：17)所示的CDR1、IESDGST(SEQ ID NO：18)所示的CDR2和AAPKVGLGPRTALGHLAFMTLPALNY(SEQ ID NO：19)所示的CDR3，或者與該3個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列。

術語“CDR”或“互補決定區”或“CDR區”(在本文中與超變區“HVR”可以互換使用)，是抗體可變區中主要負責與抗原表位結合的胺基酸區域。重鏈和輕鏈的CDR通常被稱作CDR1、CDR2和CDR3，從N-端開始順序編號。本領域公知多種用於在一個給定的VH或VL或VHH胺基酸序列中確定其CDR序列的方案。例如，Kabat互補決定區(CDR)是基於序列變異性確定的並且是最常用的(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。而Chothia指的是結構環的位置(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。AbM HVR是Kabat HVR和Chothia結構環之間的折中，並且由Oxford Molecular 的AbM抗體建模軟體使用。“接觸性”(Contact)HVR基於對可獲得的複雜晶體結構的分析。HVR也可以基於與參考CDR序列(例如本文公開的示例性CDR)具有相同的Kabat編號位置而確定。

該胺基酸變化，例如，胺基酸置換較佳地是保守胺基酸取代。“保守胺基酸取代”是指導致某個胺基酸置換為化學上相似的胺基酸的胺基酸改變。提供功能上相似胺基酸的保守性置換表是本領域熟知的。在本發明任一實施方案中，在一個較佳的方面，保守取代殘基來自以下的保守替代表A，較佳地為表A中所示較佳置換殘基。

在一個實施方案中，抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白的該第一多肽鏈和第二多肽鏈上的特異性結合CD47的VH/VL對包含衍生自抗CD47抗體ADI-29341的SEQ ID NO：2/9的成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列，或與該成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性的序列。

在一個實施方案中，抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白的該第三多肽鏈上的特異性結合PD-L1的第一VHH和第二VHH包含SEQ ID NO：15和/或SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列，或與之基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更多同一)的序列。

不特別地限制抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白中第一多肽鏈和第三多肽鏈中免疫球蛋白的重鏈恆定區的類型，較佳地是IgG1、IgG2或IgG4免疫球蛋白的重鏈恆定區，或與之基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更多同一)的序列。更佳地，該重鏈恆定區是人IgG1免疫球蛋白的重鏈恆定區，或與之基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更多同一)的序列。

在一個實施方案中，抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白包含IgG4(例如，人IgG4)中使用的重鏈恆定區。在又一個實施方案中，抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白包含用於IgG1(例如，人IgG1)的重鏈恆定區。例如，在三鏈抗體的第一多肽鏈和第三多肽鏈的Fc結構域中分別包含具有“CPPC”胺基酸殘基的鉸鏈區，和/或分別包含Y349C和S354C(根據Kabat的“EU編號”)，由此，第一多肽鏈和第三多肽鏈在Fc區形成鏈間二硫鍵，由此，穩定第一多肽鏈和第三多肽鏈的正確配對。

在一個實施方案中，抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白的第一多肽鏈和/或第三多肽鏈在Fc結構域中包含影響抗體效應子功能的胺基酸突變。在一個具體實施方案中，該效應子功能是抗體依賴的細胞介導的細胞毒性(ADCC)。在一個實施方案中，該胺基酸突變存在於Fc區的CH2結構域，例如，該抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白包含在第一多肽鏈和/或第三多肽鏈第234和235位置(EU編號)處的胺基酸置換。在一個具體實施方案中，該胺基酸置換是L234A和L235A(也稱為“LALA突變”)。

在又一個實施方案中，抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白的第二多肽鏈包含κ輕鏈恆定區或者λ輕鏈恆定區，例如，人κ輕鏈恆定區或者人λ輕鏈恆定區。

在一個實施方案中，抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白的第一多肽鏈和第三多肽鏈各自的Fc結構域中分別包含凸起(“結(knob)”)或空穴(“扣(hole)””)，並且第一多肽鏈Fc結構域中的該凸起或空穴可分別置於第三多肽鏈Fc結構域中的該空穴或凸起中，由此該第一多肽鏈和第三多肽鏈彼此形成“結入扣(knob-in-hole)”的穩定締合。在一個實施方案中，在該第一多肽鏈和第三多肽鏈之一條鏈中包含胺基酸置換T366W，並且在該第一多肽鏈和第三多肽鏈之另一條鏈中包含胺基酸置換T366S、L368A和Y407V(EU編號)。由此一條鏈中的凸起能夠置於另一條鏈中的空穴中，促進第一多肽鏈和第三多肽鏈的正確配對。

在一個實施方案中，抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白的第一多肽鏈和第二多肽鏈的免疫球蛋白CH1結構域和CL結構域中分別包含凸起或空穴，並且CH1結構域中的該凸起或空穴可分別置於CL結構域中的該空穴或凸起中，從而該第一多肽鏈和第二多肽鏈彼此也形成“結入扣”的穩定締合。

在一個實施方案中，抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白包含SEQ ID NO：1所示的第一多肽鏈、SEQ ID NO：8所示的第二多肽鏈、和SEQ ID NO：14所示的第三多肽鏈，或與任一該序列基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一)的序列。

又在一個實施方案中，抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白包含SEQ ID NO：1所示的第一多肽鏈、SEQ ID NO：8所示的第二多肽鏈、和SEQ ID NO：22所示的第三多肽鏈，或與任一該序列基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一)的序列。

在本文中，“序列同一性”是指在比較窗中以逐個核苷酸或逐個胺基酸為基礎的序列相同的程度。可以藉由以下方式計算“序列同一性百分比”：將兩條最佳比對的序列在比較窗中進行比較，確定兩條序列中存在相同核酸鹼基(例如，A、T、C、G、I)或相同胺基酸殘基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的數目以得到匹配位置的數目，將匹配位置的數目除以比較窗中的總位置數(即，窗大小)，並且將結果乘以100，以產生序列同一性百分比。為了確定序列同一性百分數而進行的最佳比對，可以按本領域已知的多種方式實現，例如，使用可公開獲得的計算機軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。本領域技術人員可以確定用於比對序列的適宜參數，包括為實現正在比較的全長序列範圍內或目標序列區域內最大比對所需要的任何算法。

本發明抗體製劑中的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白能夠同時與PD-L1和CD47蛋白結合，且維持了各親本抗體的親和力常數，由此，能夠阻斷SIRP α/CD47信號傳導通路和阻斷PD1/PD-L1信號傳導通路，從而用於治療、預防或延緩各種與SIRP α/CD47信號傳導通路和/或與PD1/PD-L1信號傳導通路相關的疾病或病症。

在一個較佳的實施方案中，本發明的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白是PCT/CN2018/123886的PCT申請(申請日：2018年12月26日)中公開的重組抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白，其具有SEQ ID NO：1所示的第一多肽鏈、SEQ ID NO：8所示的第二多肽鏈、和SEQ ID NO：14所示的第三多肽鏈。在一個實施方案中，該抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白由HEK293細胞或CHO細胞重組表達產生並經純化。較佳地，在本發明液體製劑中的該抗體表現出顯著的抗腫瘤活性。對使用Raji-PD-L1細胞接種NOD-SCID小鼠產生的荷瘤小鼠施用抗CD47/PD-L1雙特異性抗體，結果表明，與施用抗CD47單株抗體和抗PD-L1單株抗體相比較，施用抗CD47/PD-L1雙特異性抗體具有顯著提高的抗腫瘤活性，可以導致腫瘤生長抑制率達到約90%或更高，例如100%；和/或腫瘤消失率達到50%以上。此外，抗CD47/PD-L1雙特異性抗體還表現出顯著降低的血細胞凝集作用，因此在臨床治療中將具有顯著降低的副作用。

本發明的抗體製劑中所包含的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白的量可隨著製劑的特定目的特性、特定環境、和使用製劑的特定目的而改變。在一些實施方案中，抗體製劑為液體製劑，其可含有約5-150mg/mL，例如約5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150mg/ml的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白。

(ii)緩衝劑

緩衝劑是可以將溶液的pH維持在可接受範圍的試劑。在一些實施方案中，用於本發明製劑中的緩衝劑可以將本發明製劑的pH控制在大約6.4-7.0的pH範圍，例如約6.5的pH。在一些具體的實施方案中，本發明的抗體製劑具有約6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0的pH。

在一些實施方案中，用於本發明製劑中的緩衝劑選自組胺酸、鹽酸組胺酸和它們的組合。在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的緩衝劑的濃度為約1-30mM。在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的緩衝劑的濃度為約5-25mM，例如，約5、10、15、20、25mM。

在一個實施方案中，用於本發明製劑中的緩衝劑是約16.3mM組胺酸和約3.77mM鹽酸組胺酸的組合。

(iii)穩定劑

用於本發明的合適的穩定劑可以選自糖、多元醇和胺基酸及其組合。對於作為穩定劑的糖包括但不限於蔗糖和海藻糖。對於作為穩定劑的多元醇包括但不限於山梨醇。對於作為穩定劑的胺基酸包括但不限於精胺酸、鹽酸精胺酸。在一些實施方案中，該穩定劑在本發明的液體製劑中以約50-500mM，更佳地約100-400mM，例如，約100、150、200、250、300、350、400mM的濃度存在。

在一個實施方案中，本發明液體製劑包含蔗糖作為穩定劑。蔗糖在本發明液體製劑中的量可以是約50-250mM，較佳地約100-200mM(例如，約100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200mM)。

在一個實施方案中，本發明液體製劑包含精胺酸和/或鹽酸精胺酸作為穩定劑。精胺酸和/或鹽酸精胺酸在本發明液體製劑中的量可以是約50-250mM，較佳地約100-200mM(例如，約100、110、120、130、140、150、160、 170、180、190、200mM)。

在一個實施方案中，本發明液體製劑包含蔗糖、精胺酸和/或鹽酸精胺酸的組合作為穩定劑。該組合中，蔗糖可以以約50-250mM，較佳地約100-200mM(例如，約100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200mM)的量存在。在該組合中，精胺酸和/或鹽酸精胺酸可以以約50-250mM，較佳地約100-200mM(例如，約100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200mM)的量存在。

(iv)表面活性劑

如本文所使用的，術語“表面活性劑”是指具有兩親結構的有機物質；即，它們由相反的溶解性傾向的基團所組成，通常是油溶性的烴鏈和水溶性的離子基團。

在一個實施方案中，本發明的液體製劑中的表面活性劑是非離子型表面活性劑，例如，烷基聚(環氧乙烯)。可包括在本發明製劑中的特定非離子型表面活性劑包括，例如聚山梨酯，諸如聚山梨酯-20、聚山梨酯-80、聚山梨酯-60、或聚山梨酯-40；普洛尼克等。在一個較佳實施方案中，本發明的液體製劑中包含聚山梨酯-80作為表面活性劑。

本發明抗體製劑中所含的表面活性劑的量可隨製劑的特定目的特性、特定環境、和使用製劑的特定目的而改變。在較佳的一些實施方案中，製劑可含有約0.1-1mg/ml，較佳地約0.2-0.8mg/ml，例如約0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mg/ml的聚山梨酯類表面活性劑(例如，聚山梨酯-80)。

(v)其它賦形劑

本發明的抗體液體製劑中可以包含或不包含其它賦形劑。

在一個實施方案中，本發明的抗體液體製劑包含金屬螯合劑(例如，EDTA或其鹽)作為一種賦形劑。在另一實施方案中，本發明的抗體液體製劑不包含金屬螯合劑(例如，EDTA或其鹽)。在一個實施方案中，與不添加金屬螯合劑(例如，EDTA或其鹽)的相應製劑相比，添加金屬螯合劑(例如，EDTA或其鹽)的本發明抗體液體製劑具有更高的穩定性。

出於其他考慮，也可在本發明製劑中使用其它的賦形劑。該賦形劑包括，例如，調味劑、抗微生物劑、甜味劑、抗靜電劑、抗氧化劑、明膠等等。這些和另外已知的藥物賦形劑和/或適用於本發明製劑的添加劑是本領域公知的，例如，列出於“The Handbook of Pharmaceutical Excipients，第4版，Rowe等人編，American Pharmaceuticals Association(2003)；和Remington：the Science and Practice of Pharmacy，第21版，Gennaro編，Lippincott Williams & Wilkins(2005)”。

II.製劑的製備

本發明提供了包含抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白的穩定製劑。在本發明製劑中使用的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白可以使用本領域已知的用於生產抗體的技術進行製備。例如，可以重組製備抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白。在一個較佳的實施方案中，本發明的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白藉由在HEK293細胞或CHO細胞中重組表達而製備，例如，如PCT/CN2018/123886中所述，重組製備抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白。

抗體作為藥物的活性成分的應用現在已經很廣泛。用於將治療性抗體純化至藥用級的技術是本領域公知的。例如，Tugcu等(Maximizing productivity of chromatography steps for purification of monoclonal antibodies, Biotechnology and Bioengineering 99(2008)599-613.)描述在蛋白A捕獲步驟後使用離子交換色譜(陰離子IEX和/或陽離子CEX色譜)的抗體三管柱純化方法。Kelley等(Weak partitioning chromatography for anion exchange purification of monoclonal antibodies,Biotechnology and Bioengineering 101(2008)553-566)描述了兩管柱純化法，其中在蛋白A親和色譜後使用弱分配陰離子交換樹脂。

一般地，重組產生的抗體可以利用常規的純化方法純化，以提供具有足夠的可重複性和適度純度的藥物物質用於抗體製劑的配製。例如，在抗體從重組表達細胞分泌至培養基中後，可以使用商業可得的蛋白濃縮過濾器例如Amicon的超濾裝置，濃縮來自該表達系統的上清液。之後，可以使用例如色譜、透析和親和純化等方式進行抗體的純化。蛋白A適應於作為親和配體用於純化IgG1、IgG2和IgG4型抗體。也可以使用其它抗體純化方法，例如離子交換色譜。在獲得足夠純度的抗體後，可以按照本領域已知的方法，製備包含抗體的製劑。

例如，可以採用如下步驟進行製備：(1)在發酵結束後將發酵液離心澄清去除細胞等雜質以獲得上清；(2)使用親和層析(例如對IgG1、IgG2和IgG4型抗體具有特異親和力的蛋白A管柱)捕獲抗體；(3)進行病毒滅活；(4)精製純化(一般可以採用CEX陽離子交換層析)，以去除蛋白中的雜質；(4)病毒過濾(使病毒滴度降低例如4 log10以上)；(5)超濾/滲濾(可以用於將蛋白置換於利於其穩定的製劑緩衝液中並濃縮至合適的濃度供注射用)。參見例如，B.Minow,P.Rogge,K.Thompson,BioProcess International,Vol.10,No.6,2012,pp.48-57。

III．製劑的分析方法

在抗體製劑的儲存過程中，抗體可能會發生聚集、降解或化學修飾，導致抗體異質性(包括大小異質性和電荷異質性)以及聚集物和片段等，從而影響抗體製劑的質量。因此，有必要進行抗體製劑穩定性的監測。

在本領域中已知多種方法可以用於檢測抗體製劑的穩定性。例如，可以藉由還原型CE-SDS、非還原型CE-SDS和SEC-HPLC等方法，分析抗體製劑的純度和評估抗體的聚集水平；可以藉由毛細管等電聚焦電泳(cIEF)、成像毛細管等電聚焦電泳(iCIEF)和離子交換色譜(IEX)等，分析抗體製劑中的電荷變異體。此外，可以藉由目視檢測製劑外觀，快速地判斷製劑的穩定性。也可以使用OD_350nm法檢測製劑的濁度改變，該方法可以給出有關可溶性和不溶性聚集物量的信息。此外，可以使用紫外分光光度法(UV法)檢測製劑中的蛋白質含量變化。

非還原型CE-SDS法是一種以毛細管為分離通道進行的單株抗體純度測定方法。在CE-SDS中，蛋白遷移由SDS結合引起的表面電荷來驅動，而該表面電荷與蛋白質的分子量成正比。由於所有的SDS-蛋白質複合物都具有相似的質量-電荷比，故可以在毛細管的分子篩凝膠基質中，實現基於分子的大小或流體動力學半徑的電泳分離。該方法已經被廣泛地用於監測變性的完整抗體的純度。一般，在非還原型CE-SDS法中，供試樣品與SDS樣品緩衝液和碘乙醯胺混合。之後，混合物可以於68-72℃孵育約10-15分鐘，冷卻至室溫後離心的上清液用於分析。採用紫外檢測器檢測蛋白的遷移，獲得電泳譜圖。抗體製劑純度可以計算為IgG主峰的峰面積占所有峰面積之和的百分比。關於CE-SDS法的進一步描述，可以參見例如Richard R.等，Application of CE SDS gel in development of biopharmaceutical antibody-based products,Electrophoresis,2008,29,3612-3620。

尺寸排阻高效液相色譜法，即SEC-HPLC法，是用於單株抗體標準和質控的另一重要方法。該方法主要依據分子的尺寸大小或流體動力學半徑差異來進行分子的分離。藉由SEC-HPLC，抗體可以分離出三種主要形式：高分子量形式(HMMS)、主峰(主要是抗體單體)、和低分子量形式(LMMS)。抗體純度可以計算為色譜圖上主峰面積占所有峰面積之和的百分比。藉由SEC-HPLC法，可以測量製劑產品中抗體單體的百分數，給出可溶性聚集物和剪切物的含量信息。關於SEC-HPLC法的進一步描述，可以參見例如，J.Pharm.Scien.,83：1645-1650,(1994)；Pharm.Res.,11：485(1994)；J.Pharm.Bio.Anal.,15：1928(1997)；J.Pharm.Bio.Anal.,14：1133-1140(1986)。此外，也可以參見例如，R.Yang等，High resolution separation of recombinant monoclonal antibodies by size exclusion ultra-high performance liquid chromatography(SE-UHPLC),Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis(2015),http：//dx.doi.org/10.1016/j.jpba.2015.02.032；和Alexandre Goyon等，Protocols for the analytical characterization of therapeutic monoclonal antibodies.I-Non-denaturing chromatographic techniques,Journal of Chromatography，http：//dx.doi.org/10.1016/j.jchromb.2017.05.010。

成像毛細管等電聚焦電泳(iCIEF)可以用於分析單株抗體的電荷異質性。該方法可以提供電荷變異體的定量分佈情況。iCIEF基於分子在pH梯度中的電荷差異(表觀pI值)來實現分子分離的目的。在iCIEF中，分離管柱通常是短毛細管(例如，5cm長，100μm內徑的二氧化矽毛細管)，蛋白質在高電壓下在毛細管管柱中聚焦，並藉由在280nM操作的全管柱成像檢測系統對聚焦進行實時在線監測。該技術的一個優點是，可以藉由該全管柱檢測系統同時記錄抗體樣品的各種電荷變異體。一般而言，在icIEF中，將樣品與尿素和icIEF緩衝液混合，其中該緩衝液含有甲基纖維素、pI分子量標準和ampholytes。然後，可以在iCIEF分析儀例如iCE280分析儀(Protein Simple,Santa Clara,CA)上，使用iCIEF管柱例如ProtionSimple組裝的iCIEF管柱，在樣品聚焦一定時間後，測定280nm的吸光度，獲得聚焦mAb電荷變異體的譜圖。在iCEIF譜圖中，在主峰(即主成分)之前沖提的蛋白相關峰被分類為酸性組分；相對地，在主峰之後沖提的蛋白相關峰被分類為鹼性組分。主成分、酸性組分和鹼性組分的相對量可以表示為占總峰面積的百分數。關於iCIEF的進一步描述，可以參見例如，Salas-Solano O等，Robustness of iCIEF methodology for the analysis of monoclonal antibodies：an interlaboratory study,J Sep Sci.2012 Nov；35(22)：3124-9.doi：10.1002/jssc.201200633.Epub 2012 Oct 15；和Dada OO等，Characterization of acidic and basic variants of IgG1 therapeutic monoclonal antibodies based on non-denaturing IEF fractionation,Electrophoresis.2015 Nov；36(21-22)：2695-2702.doi：10.1002/elps.201500219.Epub 2015 Sep 18.

也可以藉由陽離子交換高效液相色譜法(CEX-HPLC)測定抗體製劑中抗體的電荷變異體。在該測定法中，以比主峰的保留時間更早從CEX-HPLC管柱沖提出的峰被標記為“酸性峰”，而那些以比主峰的保留時間更晚從CEX-HPLC管柱沖提出的峰被標記為“鹼性峰”。

加速穩定性研究可以用於檢查產品的穩定性性質，有利於篩選穩定藥物製劑形式。例如，可以將製劑樣品放置於升高的溫度，例如約40℃±2℃、25℃±2℃條件下進行加速穩定性研究。檢測指標可以包括外觀、可見異物、蛋白含量、濁度、純度(SEC-HPLC法、非還原型CE-SDS法)和電荷變異體(iCIEF法、CEX-HPLC法)。

此外，可以檢測抗體的功效或生物活性。例如，可以檢測製劑中抗體與其抗原分子(CD47分子和PD-L1分子)的結合能力。本領域技術人員已知多種方法可以用於定量抗體與抗原的特異性結合，例如免疫測定試驗，ELISA等。

本發明的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白製劑是穩定的。在一個實施方案中，於約25℃、37℃、40℃、或45℃儲存至少1個月或2個月後，例如，在40℃±2℃儲存1個月後，本發明的抗體製劑中的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白純度是至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%以上，如藉由尺寸排阻色譜法或藉由非還原型CS-SDS所測定。在一個實施方案中，於約25℃、37℃、40℃、或45℃儲存至少1個月或2個月後，例如，在40℃±2℃儲存1個月後，本發明的抗體製劑中抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白的至少50%，較佳至少55%是非鹼性及非酸性形式(亦即，主峰或主要電荷形式)，如藉由CEX-HPLC法所測定。

IV．製劑的用途

本發明的包含抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白的本發明的抗體製劑可以用於治療、預防或延緩各種與SIRP α/CD47信號傳導通路和/或與PD1/PD-L1信號傳導通路相關的疾病或病症。“與SIRP α/CD47信號傳導通路相關的疾病或病症”和/或“與PD1/PD-L1信號傳導通路相關的疾病或病症”在本文中指可以用本發明抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白製劑進行治療(例如改善)或預防的疾病或病症。任何可以得益於本發明抗體製劑治療的疾病或病症都適用於本發明。

在一個方面，包含抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白的本發明製劑能夠用於預防或治療受試者的各種血液病和實體瘤，包括但不限於急性骨髓性白血病(AML)，慢性骨髓性白血病，急性淋巴細胞白血病(ALL)，非霍奇金淋巴瘤(NHL)，多發性骨髓瘤(MM)、淋巴瘤、乳腺癌、胃癌、肺癌、食管癌、腸癌、卵巢癌、宮頸癌、腎癌、胰腺癌、膀胱癌、神經膠質瘤、黑色素瘤和其他實體瘤。另外，藉由阻斷SIRP α/CD47信號傳導通路能夠增進NOD小鼠系中的人幹細胞植入(WO 2009/046541)，因此，包含抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白的本發明製劑還具有用於人幹細胞移植中的潛在益處。

在另一方面，包含抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白的本發明製劑能夠用於治療、預防或診斷受試者中由SIRP α+細胞介導的自身免疫病和炎性病症，例如，過敏性哮喘或潰瘍性結腸炎。這些病症包括急性和慢性炎性病症、變態反應和過敏性疾病、自身免疫病、局部缺血性病症、嚴重感染、和細胞或組織或器官移植物排斥，包括非人組織移植物(異種移植物)排斥等。

本發明也提供本發明的製劑在製備藥物中的用途，其中該藥物用於向哺乳動物遞送抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白，或用於治療、預防或改善上述疾病和病症中的一種或多種。較佳地，哺乳動物是人。

可以以多種途徑將本發明的抗體製劑施用於受試者或患者。例如，施用可以藉由輸注或藉由注射器進行。因此，在一個方面，本發明提供了一種遞送裝置(例如注射器)，其包含本發明的抗體製劑(例如，預填裝注射器)。患者將接受有效量的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白作為主要活性成分，即足以治療、改善或預防目的疾病或病症的量。

治療效果可包括減少生理症狀。用於任何特定受試者的抗體的最佳有效量和濃度將取決於多種因素，包括患者的年齡、體重、健康狀況和/或性別、疾病的性質和程度、特定抗體的活性，身體對其清除率，並且也包括與該抗體製劑組合施用的任何可能的其它治療。對於具體的情況，所遞送的有效量可以在臨床醫師的判斷範圍內來確定。取決於待治療的適應症，有效劑量可為約0.005mg/kg體重至約50mg/kg體重，或約0.1mg/kg體重至約20mg/kg體重。在這方面，已知的基於抗體的藥物的應用可以提供一定的指導。劑量可以是單劑量方案或多劑量方案。

描述以下實施例以輔助對本發明的理解。不意在且不應當以任何方式將實施例解釋成限制本發明的保護範圍。

縮略詞描述

CE-SDS：十二烷基硫酸鈉毛細管凝膠電泳

CEX-HPLC：陽離子交換高效液相色譜法

ELISA：酶聯免疫吸附測定法

FLD-HPLC：螢光檢測-高效液相色譜法

iCIEF：成像毛細管等電聚焦電泳

SEC-HPLC：尺寸排阻高效液相色譜法

[實施例]

為了開發出重組抗分化抗原簇47(CD47)和抗程序性死亡配體1(PD-L1)雙特異性抗體注射液長期穩定儲存的製劑處方，確保產品在有效期內(至少24個月)的質量可控，設計了處方篩選試驗，考察了不同輔料對抗CD47/PD-L1雙特異性抗體製劑穩定性的影響。試驗所用材料和方法如下：

材料和方法

1.1.本發明的製劑研究中使用的材料

1.2.本發明的製劑研究中使用的儀器設備

1.3．製劑穩定性的檢測項目和檢測方法

對抗體製劑檢測了以下項目：(1)檢測外觀以及是否存在可見異物；(2)藉由紫外法(UV法)測定製劑中的蛋白質含量；(3)藉由尺寸排阻色譜法，例如，尺寸排阻高效液相色譜法(size-exclusion chromatography-HPLC；SEC-HPLC)測定抗體製劑的純度，表示為單體的面積占所有峰面積之和的百分數；(4)藉由還原型十二烷基硫酸鈉毛細管電泳(還原型CE-SDS)和/或非還原型十二烷基硫酸鈉毛細管電泳(非還原型CE-SDS)測定抗體製劑的純度，表示為單體的面積占所有峰面積之和的百分數；(5)藉由成像毛細管等電聚焦電泳法(iCIEF法)測定抗體製劑中電荷變異體，表示為主成分、酸性組分和鹼性組分的百分數；(6)藉由免疫測定法，例如，直接ELISA法測定抗體製劑中抗CD47/PD-L1雙特異性抗體對CD47抗原和PD-L1抗原的相對結合活性。

可見異物檢測

按照國家藥典委員會，中華人民共和國藥典(2015年版，四部通則0904“可見異物檢查法”).北京：中國醫藥科技出版社.2015中所記載的方法，採用澄明度檢測儀(天津天大天發生產，型號YB-2)，檢查樣品中的可見異物。

蛋白含量測定

使用紫外分光光度計(日本島津生產，型號UV-1800)測定樣品中的蛋白質含量。

純度(SEC-HPLC法)

使用體積排阻色譜管柱分離，流動相為磷酸鹽緩衝液(稱取3.12g二水合磷酸二氫鈉，8.77g氯化鈉和34.84g精胺酸，超純水溶解後用鹽酸調節pH至6.8並定容至1000ml)，色譜管柱保護液為0.05%(w/v)NaN₃，進樣量50μl，流速0.5ml/分鐘，採集時間30分鐘，管柱溫25℃，檢測波長280nm。取待測樣品用超純水稀釋至2mg/ml，作為供試品溶液。取製劑緩衝液用上述相同處理方式稀釋後做為空白溶液。取空白溶液、供試品溶液各50μl注入液相色譜儀，開始檢測。

純度(還原型CE-SDS法)

採用毛細管凝膠電泳法檢測。毛細管為無塗層毛細管，內徑50μm，總長30.2cm，有效長度20.2cm。電泳前分別使用0.1mol/L氫氧化鈉、0.1mol/L鹽酸、超純水、電泳膠70psi沖洗毛細管管柱。將待測樣品用適量超純水稀釋至2.0mg/ml，取以上稀釋後的樣品50μl於1.5ml離心管中，分別向其中加入45μl pH 6.5的樣品緩衝液(稱取一水檸檬酸0.32g，十二水合磷酸氫二鈉2.45g，溶於45ml超純水中，定容至50ml，製得檸檬酸-磷酸鹽緩衝液，精密量取該緩衝液200μl，加10%(w/v)十二烷基硫酸鈉溶液80μl，加水至1ml，混勻，即得)、1μl內標(10kDa蛋白質，5mg/mL)(Beckman Coulter，貨號：390953)和5μl β-巰基乙醇，充分混勻後70±2℃加熱10±2分鐘，冷卻至室溫後轉移至樣品瓶作為供試品溶液。取與供試品相同體積的製劑緩衝液，按上述方法同樣操作，製得空白溶液。樣品進樣條件：-5kV 20秒；分離電壓：-15kV 35分鐘。毛細管管柱溫控制在25℃，檢測波長為220nm。

純度(非還原型CE-SDS法)

採用毛細管凝膠電泳法檢測。毛細管為無塗層毛細管，內徑50μm，總長30.2cm，有效長度20.2cm。電泳前分別使用0.1mol/L氫氧化鈉、0.1mol/L鹽酸、超純水、電泳膠70psi沖洗毛細管管柱。將待測樣品用適量超純水稀釋至2.0mg/ml，取以上稀釋後的樣品50μl於1.5ml離心管中，分別向其中加入45μl pH 6.5的樣品緩衝液(稱取一水檸檬酸0.32g，十二水合磷酸氫二鈉2.45g，溶於45ml超純水中，定容至50ml，製得檸檬酸-磷酸鹽緩衝液，精密量取該緩衝液200μl，加10%(w/v)十二烷基硫酸鈉溶液80μl，加水至1ml，混勻，即得)、1μl內標(10kDa蛋白質，5mg/mL)(Beckman Coulter，貨號：390953)和5μl 250mmol/L NEM溶液(稱取N-乙基順丁稀二醯亞胺62mg，溶於2ml超純水中)，充分混勻後70±2℃加熱10±2分鐘，冷卻至室溫後轉移至樣品瓶作為供試品溶液。取與供試品相同體積的製劑緩衝液，按上述方法同樣操作，製得空白溶液。樣品進樣條件：-5kV 20秒；分離電壓：-15kV 35分鐘。毛細管管柱溫控制在25℃，檢測波長為220nm。

電荷變異體(iCIEF法)

採用成像毛細管等電聚焦電泳(iCIEF法)檢測。毛細管內徑100μm，總長5cm。樣品電泳前需分別使用0.5%甲基纖維素溶液(下文中也縮寫為MC溶液)、超純水沖洗毛細管管柱。採用真空進樣方法進樣55秒，預聚焦電壓及時間為1.5kV 1分鐘，聚焦電壓及時間為3kV 8分鐘，進樣時間55秒，樣品盤溫度為10℃，毛細管管柱溫為室溫，檢測波長為280nm。陰極穩定劑(Cathodic Stabilizer)為500mmol/L精胺酸溶液，陽極穩定劑(Anodic Stabilizer)為200mmol/L亞胺基乙二酸，3mol/L尿素提高蛋白溶解性，0.5% MC溶液降低蛋白與毛細管之間的黏附。將供試品用水稀釋至0.5mg/ml，取上述稀釋後的供試品溶液20μl，向其中加入83μl預混液充分混勻製得待測樣品溶液。使用製劑緩衝液同法操作，製得空白溶液。

相對結合活性(直接ELISA法)

用1×PBS稀釋鏈親和素(Thermo，貨號：21125)至1μg/ml，100μl/孔，37℃ 2h包被於96孔酶標板上。洗板後加封閉液(5% FBS，300μl/孔)37℃封閉2h。用1×PBS稀釋生物素化的抗原(檢測抗CD47/PD-L1雙特異性抗體的抗CD47 端對CD47的相對結合活性時，使用購自北京Sino biological的人CD47蛋白(His標簽)，貨號：12283-H08H-200；檢測抗CD47/PD-L1雙特異性抗體的抗PD-L1端對PD-L1的相對結合活性時，使用購自ACRO BIOSYSTEMS的重組人PDL1/CD274蛋白，貨號：PD1-H5229-1MG)至0.5μg/ml，100μl/孔，37℃ 0.5h包被於96孔酶標板上。100μl/孔以2% FBS稀釋抗CD47/PD-L1雙特異性抗體至40μg/ml，4倍梯度稀釋至第12個濃度(0.01~10000ng/ml)。將梯度稀釋的供試品以100μl/孔加入到洗過的酶標板中，37℃恆溫培養箱中孵育30min。洗板後加入以2% FBS稀釋的HRP綴合山羊抗人IgG-Fc片段(美國BETHYL，貨號A80-104P)作為二抗(30000倍稀釋，100μl/孔)37℃反應20min。洗板後加入100μl TMB顯色液，顯色10min後，每孔加入100μl的1mol/L H₂SO₄終止反應。以620nm為參比波長，測450nm處的OD值。以各濃度梯度樣品的濃度值作為橫坐標，各梯度樣品的OD450nm-OD620nm值為縱坐標，應用Prism四參數擬合計算EC₅₀反映抗體與各抗原的結合活性。

實施例1.製備和純化抗CD47/PD-L1雙特異性抗體

根據PCT/CN2018/123886該，藉由在HEK293細胞(購自INVITROGEN公司)中重組表達和純化了抗CD47/PD-L1雙特異性抗體Kh2NF-PC。該抗CD47/PD-L1雙特異性抗體Kh2NF-PC抗體由3條多肽鏈組成，每條多肽鏈從N端至C端分別具有如下胺基酸序列：

肽鏈#1：

(SEQ ID NO：1)

其中，該肽鏈#1包含衍生自抗CD47抗體ADI29341的如下VH胺基酸序列：

(SEQ ID NO：2)；

在該VH胺基酸序列C端的衍生自人IgG1的如下CH1胺基酸序列：

(SEQ ID NO：6)；以及

在該CH1胺基酸序列C端的衍生自人IgG1的如下Fc區胺基酸序列：

(SEQ ID NO：7)

肽鏈#2：

(SEQ ID NO：8)

其中，該肽鏈#2包含衍生自抗CD47抗體ADI29341的如下VL胺基酸序列：

(SEQ ID NO：9)；以及

在該VL胺基酸序列C端的如下人κ輕鏈恆定區(CL)胺基酸序列：

(SEQ ID NO：13)

肽鏈#3

(SEQ ID NO：14)

其中，該肽鏈#3包含如下的第一和第二抗PD-L1 VHH胺基酸序列：

(SEQ ID NO：16)；

在該第一和第二抗PD-L1 VHH胺基酸序列之間的連接肽胺基酸序列：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：20)；以及

在該第二抗PD-L1 VHH胺基酸序列C端的衍生自人IgG1的如下Fc區胺基酸序列：

(SEQ ID NO：21)。

實施例2. pH對製劑的穩定性影響試驗之一

本實施例考察了包含抗CD47/PD-L1雙特異性抗體的製劑在pH 5.0至6.5的穩定性。共設計了4個pH值，分別為5.0、5.5、6.0和6.5。

2.1 實驗步驟

配製10mM組胺酸，5%(w/v)山梨醇緩衝液，用稀鹽酸將pH分別調節為5.0、5.5、6.0和6.5，將經純化的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體Kh2NF-PC蛋白(7.3mg/ml)超濾置換到該不同pH值的溶液中。置換完成後，調節樣品中的雙特異性抗體蛋白含量至約100.0mg/ml；然後加入聚山梨酯80，使其終濃度為0.70mg/ml；過濾分裝至2R西林瓶中，加塞、軋蓋。將各樣品於40℃±2℃條件下進行穩定性考察，具體實驗方案見表1。

2.2 判斷標準

根據對產品的認識以及儀器和方法的精密度，設定了樣品檢測指標數值與初始值相比質量未發生變化的判定標準，用以判斷樣品是否發生了變化，具體見表2。

2.3 處方篩選試驗之一的實驗結果

(1)外觀和可見異物

在40℃±2℃條件下放置一個月後，pH 5.0、pH 5.5和pH 6.0樣品外觀均出現不同程度的渾濁和沉澱；僅有pH 6.5樣品外觀和可見異物均合格。

(2)蛋白含量

在pH 5.0、5.5、6.0和6.5於40℃±2℃放置不同時間後，各樣品的蛋白含量檢測結果見表3。結果表明，在40℃±2℃條件下放置1個月，pH 6.5樣品蛋白含量未發生顯著變化。

(3)純度

在pH 5.0、5.5、6.0和6.5於40℃±2℃放置不同時間後，藉由SEC-HPLC法測定各樣品的蛋白純度。結果見表4。結果表明，在40℃±2℃條件下考察1個月，pH 6.5值的樣品中蛋白純度較0天的樣品相比下降了4.1%。

在pH 5.0、5.5、6.0和6.5於40℃±2℃放置不同時間後，藉由非還原型CE-SDS法和還原型CE-SDS法分別測定各樣品的蛋白純度。結果見表5和表6。結果表明，在40℃±2℃條件下考察1個月，pH 6.5值的樣品中蛋白純度較0天的樣品相比分別下降了7.7%和3.7%。

(4)電荷變異體

在pH 5.0、5.5、6.0和6.5於40℃±2℃放置不同時間後，藉由iCIEF法測定各樣品的電荷變異體。結果見表7。結果表明，在40℃±2℃條件下考察1個月，pH 6.5的樣品主成分和酸組分均發生明顯變化。與0天樣品相比，酸性組分從36.6%上升至60.1%，增加了23.5%；主成分從62.5%下降至39.1%，降低了23.4%；鹼性組分無明顯變化。

(5)相對結合活性

在pH 5.0、5.5、6.0和6.5於40℃±2℃放置不同時間後，藉由直接ELISA法測定各樣品的相對結合活性。結果見表8。結果表明，在40℃±2℃條件下考察1個月，pH 6.5的樣品中，蛋白的抗CD47端和抗PD-L1端對CD47和PD-L1的相對結合活性均未發生變化。

上述實驗結果表明，對於pH 5.0、5.5、6.0和6.5的製劑，抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白(例如，Kh2NF-PC蛋白)在pH 6.5時較為穩定。為了研究製劑在pH 6.5附近的pH範圍內的穩定性，進行了進一步的實驗。

實施例3. pH對製劑的穩定性影響試驗之二

本實施例考察了pH 6.2至7.0對抗CD47/PD-L1雙特異性抗體製劑中的蛋白穩定性的影響，共設計了5個pH值，分別為6.2、6.4、6.5、6.8和7.0。

3.1 實驗步驟

具體操作步驟與實施例2中的“2.1實驗步驟”相同，除了pH值不同之外。

3.2 判斷標準

參見實施例2中的表2。

3.3 實驗結果

(1)外觀和可見異物

在40℃±2℃條件下放置一個月後，僅有pH 6.2樣品外觀呈乳白色；而pH 6.4、6.5、6.8和7.0樣品外觀和可見異物均合格。

(2)蛋白含量

在pH 6.4、6.5、6.8和7.0於40℃±2℃放置不同時間後，各樣品的蛋白含量檢測結果見表9。結果表明，在40℃±2℃條件下放置1個月，pH 6.4、6.5、6.8和7.0樣品蛋白含量均未發生顯著變化。

(3)純度

在pH 6.4、6.5、6.8和7.0於40℃±2℃放置不同時間後，藉由SEC-HPLC法測定各樣品的蛋白純度。結果見表10，純度的變化趨勢見圖2。結果表明，在40℃±2℃條件下考察1個月，pH 6.4、6.5、6.8和7.0樣品的純度均有所下降，與0天比較分別下降了3.0%、3.7%、4.9%和5.6%。

在pH 6.4、6.5、6.8和7.0於40℃±2℃放置不同時間後，藉由非還原型CE-SDS法分別測定各樣品的蛋白純度。結果見表11，純度的變化趨勢見圖3。結果表明，在40℃±2℃條件下考察1個月，pH 6.4、6.5、6.8和7.0樣品的純度均下降，與0天比較分別下降了7.0%、6.1%、6.7%和7.3%。

(4)電荷變異體

在pH 6.4、6.5、6.8和7.0於40℃±2℃放置不同時間後，藉由iCIEF法測定各樣品的電荷變異體。結果見表12，純度的變化趨勢見圖4。結果表明，在40℃±2℃條件下考察1個月，不同pH值樣品主成分和酸組分均發生變化。pH值越高其主成分下降越快，酸性組分上升越快。

(5)相對結合活性

在pH 6.4、6.5、6.8和7.0於40℃±2℃放置不同時間後，藉由直接ELISA法測定各樣品的相對結合活性。結果見表13。結果表明，在40℃±2℃條件下考察1個月，pH 6.4、pH 6.5和pH 7.0樣品中蛋白的抗CD47端和抗PD-L1端對CD47和PD-L1的相對結合活性均未發生明顯變化。

實施例2和實施例3的pH對製劑的穩定性影響試驗結果表明，抗CD47/PD-L1雙特異性抗體(例如，Kh2NF-PC)蛋白在pH 5.0~6.2於40℃±2℃放置一個月，隨著時間的延長，樣品外觀會出現渾濁或乳白色沉澱；而在pH 6.4-7.0於40℃±2℃放置一個月，樣品外觀和可見異物均合格，蛋白含量未發生顯著變化，且對CD47和PD-L1的相對結合活性也未發生明顯變化。因此，在隨後的實施例中，從pH 6.4-7.0中選擇pH 6.5進行後續實驗。

實施例4. 處方篩選試驗

4.1 穩定劑篩選試驗

考察了不同穩定劑：山梨醇、蔗糖、海藻糖、鹽酸精胺酸等對包含抗CD47/PD-L1雙特異性抗體製劑穩定性的影響。

4.1.1 穩定劑篩選試驗步驟

共設計了5個處方，詳細處方信息見表14。按照表14配製各個處方的緩衝液，將抗CD47/PD-L1雙特異性抗體Kh2NF-PC蛋白(3.6mg/ml)超濾置換至各自的處方溶液中。置換完成後，調節各處方的蛋白含量至約100.0mg/ml；加入聚山梨酯80，使聚山梨酯80的終濃度為0.20mg/ml；過濾分裝至西林瓶，加塞、軋蓋。將各樣品於40℃±2℃條件下進行穩定性考察，具體方案見表15。檢測指標為外觀、可見異物、蛋白含量、純度(SEC-HPLC法)和電荷變異體(iCIEF法)。

4.1.2 判定標準

判定標準具體參見實施例2中的表2。

4.1.3 穩定劑篩選試驗

(1)外觀、可見異物

在40℃±2℃條件下觀察至4週，處方1考察一週後有渾濁或沉澱；其他處方樣品外觀、可見異物均合格。

(2)蛋白含量

在40℃±2℃條件下觀察至4週，蛋白含量結果見表16。從表16可見，在40℃±2℃條件下放置4週，處方2、處方3、處方4和處方5的蛋白含量均未發生變化。

(3)純度

純度(SEC-HPLC法)：在40℃±2℃條件下觀察4週的結果見表17，純度變化趨勢見圖5。結果表明，在40℃±2℃條件下考察4週，處方2、處方3、處方4和處方5樣品純度均有下降，與0天樣品純度相比，分別下降了2.6%、3.0%、0.7%和0.7%。

純度(非還原型CE-SDS法)：在40℃±2℃條件下觀察4週的結果見表18，純度變化趨勢見圖6。結果表明，在40℃±2℃條件下考察4週，各處方樣品純度均有下降；與0天樣品純度相比，處方2、處方3、處方4和處方5分別下降了6.8%、7.2%、9.1%和9.2%。

(4)電荷變異體(iCIEF法)

在40℃±2℃條件下觀察4週的電荷變異體結果見表19，電荷變異體主成分變化趨勢見圖7。

結果表明，40℃±2℃條件下考察4週，各處方電荷變異體主成分及酸性組分均發生明顯變化，主成分下降，酸性組分上升，其變化趨勢基本一致。

穩定劑篩選試驗結果表明，處方2、處方3、處方4和處方5在40 ℃±2℃條件下放置4週，樣品外觀、可見異物均合格，蛋白含量均未發生變化，樣品純度略有下降，其中處方4和處方5在純度(SEC-HPLC法)和電荷變異體(iCIEF法)方面表現出明顯的優勢。

4.2 滲透壓試驗

4.2.1 滲透壓試驗步驟

利用多通道滲透壓計對處方4和處方5的0時(T0)樣品測定了滲透壓。每組樣品測量2次，結果取平均值。

4.2.2 滲透壓試驗結果

對處方4和處方5的0時(T0)樣品進行滲透壓測定的結果見表20。

由於人類血漿滲透壓約為285-310mOsmol/kg，因此，處方4和處方5的滲透壓在藥物製劑滲透壓的可接受範圍內。另外，考慮到處方4的滲透壓更接近人類血漿滲透壓，較佳使用處方4的製劑。

實施例5：金屬螯合劑對製劑穩定性的影響

EDTA是一種代表性的金屬螯合劑。本實施例研究了EDTA對抗CD47/PD-L1雙特異性抗體Kh2NF-PC蛋白穩定性的影響。

5.1 EDTA對製劑穩定性的考察方案：

共設計了2個處方，其中處方6是未添加EDTA的對照組；處方7是終濃度為0.02mg/ml EDTA的組。詳細處方信息見表21。按照表21配製各個處方的緩衝液，將抗CD47/PD-L1雙特異性抗體Kh2NF-PC蛋白超濾置換至各自的處方溶液中。置換完成後，調節各處方的蛋白含量至約100.0mg/ml。

EDTA對製劑穩定性影響的詳細實驗條件及取樣計劃見表22。

5.2 實驗結果

在40℃±2℃的條件下觀察至4週，結果見表23。

表23的結果顯示，從電荷變異體(CEX-HPLC法)的檢測結果來看，處方7相比於處方6的電荷變異體主峰表現出更好的優勢；從聚山梨酯80(FLD-HPLC法)的檢測結果來看，處方6的聚山梨酯80含量隨時間而降低；處方7中由於加入了金屬螯合劑EDTA，從而抑制了因金屬離子引起的聚山梨酯80的降解，故處方7要優於處方6。EDTA作為金屬螯合劑的一個例子，能夠結合金屬離子，其至少可從以下兩個方面抑制聚山梨酯80的降解。其一是，在蛋白的整個生產過程中，包括細胞培養、純化等相關操作步驟中，可能會引入一些金屬離子，由此在有氧和金屬離子共同存在的條件下，引起聚山梨酯80發生氧化降解；其二是，處方中的蛋白可能會殘留一些宿主細胞蛋白，這些雜蛋白中可能存在使聚山梨酯80降解的相關酶，而酶需要金屬離子作為輔因子來發揮催化功能，因此，處方中加入的金屬螯合劑能夠藉由結合金屬離子來抑制聚山梨酯80的降解，並提高處方的穩定性。

由此，確定最較佳的製劑方案為：約100.0mg/ml重組抗分化抗原簇47(CD47)和抗程序性死亡配體1(PD-L1)雙特異性抗體、約2.52mg/ml組胺酸、0.79mg/ml鹽酸組胺酸、37.92mg/ml鹽酸精胺酸、0.50mg/ml聚山梨酯80，0.02mg/ml EDTA，pH 6.5。

實施例6：500L製備物的穩定性考察

採用實施例5的製劑方案(約100.0mg/ml重組抗分化抗原簇47(CD47)和抗程序性死亡配體1(PD-L1)雙特異性抗體、約2.52mg/ml組胺酸、0.79mg/ml鹽酸組胺酸、37.92mg/ml鹽酸精胺酸、0.50mg/ml聚山梨酯80，0.02mg/ml EDTA，pH 6.5)製備500L製備物，進行穩定性考察。

6.1 待考察穩定性的製備物及考察方案

配製了500L的如下製備物：101.8mg/ml重組抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白、2.52mg/ml組胺酸、0.79mg/ml鹽酸組胺酸、37.92mg/ml鹽酸精胺酸、0.50mg/ml聚山梨酯80，0.02mg/ml EDTA，pH 6.5，用於考察其穩定性。

2.在SEC-HPLC法中，主峰+聚合體+片段=100%，只要主峰滿足

95%的條件，剩下的

5%就是片段和聚合體的量，因此，片段和聚合體的量這兩者分別的數據以報告數據給出。下同。

3.在非還原型CE-SDS法中，主峰+片段=100%，只要主峰滿足

90%的條件，剩下的

10%就是片段的量，因此，片段的量以報告數據給出。下同。

4.在還原型CE-SDS法中，重鏈和輕鏈含量+非糖基化重鏈+片段=100%，只要重鏈和輕鏈含量滿足

90%的條件，剩下的

10%就是非糖基化重鏈和片段的量，因此，非糖基化重鏈的量和片段的量這兩者分別的數據以報告數據給出。下同。

5.在CEX-HPLC法中，主成分+酸性組分+鹼性組分=100%，只要主成分的量滿足

44.9%的條件，剩下的

55.1%就是酸性組分和鹼性組分的量，因此，酸性組分的量和鹼性組分的量這兩者分別的數據以報告數據給出。下同。

6.該規定是：《中華人民共和國藥典》(2015年版，三部)的有關規定，下同，例如，通則0904“可見異物檢查法”規定了可見異物的檢查。

6.2 穩定性考察結果

對500L製備物的穩定性考察結果如下表中所示。

2.在還原型CE-SDS法中，主峰+NGHC_CD47+片段=100%，只要主峰滿足

90%的條件，剩下的

10%就是NGHC_CD47鏈和片段的量，因此，NGHC_CD47的量和片段的量這兩者分別的數據以報告數據給出。

由表26中的檢測結果可見，製備物在6個月後，滿足質量標準。

由表27中的檢測結果可見，在加速穩定性實驗中，製備物在6個月後，各指標均符合要求。

由表28中的檢測結果可見，在強制穩定性實驗中，製備物在8週後，各指標均符合要求。

總之，藉由上述實驗得出，本發明的製劑方案在放大生產中是滿足對製劑的穩定性要求的。

以上描述了本發明的示例性實施方案，本領域技術人員應當理解的是，這些公開內容僅是示例性的，在本發明的範圍內可以進行各種其它替換、適應和修改。因此，本發明不限於文中列舉的具體實施方案。

<110> 信達生物製藥(蘇州)有限公司(INNOVENT BIOLOGICS(SUZHOU)CO.,LTD.)

<120> 包含抗CD47/PD-L1雙特異性抗體的製劑及其製備方法和用途

<130>

<150> CN 202010550660.2

<151> 2020-06-16

<150> CN 201910554231.X

<151> 2019-06-25

<160> 22

<170> PatentIn版本3.3

<210> 1

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD47/PDL1雙特異性抗體的第一多肽鏈

<400> 1

<210> 2

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD47抗體ADI29341 VH

<400> 2

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD47抗體ADI-29341的VH CDR1

<400> 3

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD47抗體ADI-29341的VH CDR2

<400> 4

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD47抗體ADI-29341的VH CDR3

<400> 5

<210> 6

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 衍生自人IgG1的CH1胺基酸序列

<400> 6

<210> 7

<211> 221

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 衍生自人IgG1的Fc區胺基酸序列

<400> 7

<210> 8

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD47/PDL1雙特異性抗體的第二多肽

<400> 8

<210> 9

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD47抗體ADI29341的VL胺基酸序列

<400> 9

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD47抗體ADI-29341的VL CDR1

<400> 10

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD47抗體ADI-29341的VL CDR2

<400> 11

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD47抗體ADI-29341的VL CDR3

<400> 12

<210> 13

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人κ輕鏈恆定區(CL)胺基酸序列

<400> 13

<210> 14

<211> 510

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 雙特異性抗體的第三多肽鏈(VHH之間具連接肽)

<400> 14

<210> 15

<211> 132

<212> PRT

<213> 駱駝(Camelus Linnaeus)

<220>

<223> 駱駝VHH

<400> 15

<210> 16

<211> 132

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化VHH

<400> 16

<210> 17

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VHH的CDR1

<400> 17

<210> 18

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VHH的CDR2

<400> 18

<210> 19

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VHH的CDR3

<400> 19

<210> 20

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接肽

<400> 20

<210> 21

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 衍生自人IgG1的Fc區胺基酸序列

<400> 21

<210> 22

<211> 490

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 雙特異性抗體的第三多肽鏈(VHH之間不具連接肽)

<400> 22

Claims

一種具有pH為6.4-7.0的液體抗體製劑，包含(i)抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白；(ii)緩衝劑，該緩衝劑選自組胺酸、鹽酸組胺酸和它們的組合；(iii)穩定劑，該穩定劑選自山梨醇、蔗糖、海藻糖、精胺酸、鹽酸精胺酸和它們的任意組合；(iv)表面活性劑，該表面活性劑選自聚山梨酯類表面活性劑；和視需要地，(v)金屬螯合劑其中該抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白是一種三鏈抗體，該三鏈抗體包含：第一多肽鏈和第二多肽鏈上的特異性結合CD47的VH/VL對作為第一抗原結合位點，該特異性結合CD47的VH/VL對包含GSIEHYYWS(SEQ ID NO：3)所示的VH CDR1、YIYYSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO：4)所示的VH CDR2、ARGKTGSAA(SEQ ID NO：5)所示的VH CDR3、RASQGISRWLA(SEQ ID NO：10)所示的VL CDR1、AASSLQS(SEQ ID NO：11)所示的VL CDR2和QQTVSFPIT(SEQ ID NO：12)所示的VL CDR3，以及第三多肽鏈上的特異性結合PD-L1的第一VHH作為單結構域第二抗原結合位點和第二VHH作為單結構域第三抗原結合位點，該特異性結合PD-L1的第一VHH和第二VHH均包含AYTISRNSMG(SEQ ID NO：17)所示的CDR1、IESDGST(SEQ ID NO：18)所示的CDR2和AAPKVGLGPRTALGHLAFMTLPALNY(SEQ ID NO：19)所示的CDR3。
如請求項1所述的液體抗體製劑，其中，該液體抗體製劑中的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白的濃度為5-150mg/mL。
如請求項1所述的液體抗體製劑，其中，該緩衝劑的濃度為5-25mM。
如請求項1所述的液體抗體製劑，其中，該穩定劑選自蔗糖、精胺酸和/或鹽酸精胺酸；該穩定劑的濃度為100-400mM。
如請求項1所述的液體抗體製劑，其中，該液體抗體製劑包含鹽酸精胺酸作為穩定劑，且鹽酸精胺酸以100-200mM的量存在；和/或包含蔗糖作為穩定劑，且蔗糖以100-200mM的量存在。
如請求項1所述的液體抗體製劑，其中，該液體抗體製劑中的表面活性劑為聚山梨酯-80，且該表面活性劑的濃度為0.2-0.8mg/ml。
如請求項1所述的液體抗體製劑，其中，該液體製劑還包含金屬螯合劑EDTA，且EDTA以0.01-0.1mg/ml的量存在。
如請求項1所述的液體抗體製劑，其中，該第一多肽鏈和第二多肽鏈上的特異性結合CD47的VH/VL對作為第一抗原結合位點包含SEQ ID NO：2/9的成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列，該第三多肽鏈上的特異性結合PD-L1的單結構域第二和第三抗原結合位點均包含SEQ ID NO：15和/或SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列。
如請求項1所述的液體抗體製劑，其中，該三鏈抗體包含SEQ ID NO：1所示的第一多肽鏈、SEQ ID NO：8所示的第二多肽鏈、和SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：22所示的第三多肽鏈。
如請求項1至9中任一項所述的液體抗體製劑，其中，該抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白在HEK293細胞或CHO細胞中重組表達。
如請求項1至9中任一項所述的液體抗體製劑，其中，該液體製劑為注射劑或者為輸注劑。
如請求項1所述的液體抗體製劑，其包含：(i)50-150mg/ml的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白；(ii)3-25mM的組胺酸和/或鹽酸組胺酸；(iii)150-300mM的蔗糖、精胺酸和/或鹽酸精胺酸，和(iv)0.2-0.8mg/ml聚山梨醇酯80；視需要地，該液體製劑還包含0.01-0.1mg/ml EDTA；其中該液體製劑的pH為6.4-7.0。
如請求項12所述的液體抗體製劑，其包含：(i)100mg/ml的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白；(ii)20mM組胺酸；(iii)180mM鹽酸精胺酸，和(iv)0.2mg/ml聚山梨醇酯80；視需要地，該液體製劑還包含0.02mg/ml EDTA；其中該液體製劑的pH為6.4-7.0；或者，該液體抗體製劑包含(i)100mg/ml的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白；(ii)20mM組胺酸；(iii)100mM鹽酸精胺酸和4%蔗糖，和(iv)0.2mg/ml聚山梨醇酯80；視需要地，該液體製劑還包含0.02mg/ml EDTA；其中該液體製劑的pH為6.4-7.0；或者，該液體抗體製劑包含(i)100mg/ml的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體蛋白；(ii)2.52mg/ml組胺酸和0.79mg/ml鹽酸組胺酸；(iii)37.92mg/ml鹽酸精胺酸，和(iv)0.5mg/ml聚山梨醇酯80；視需要地，該液體製劑還包含0.02mg/ml EDTA；其中該液體製劑的pH為6.4-7.0。
一種固體抗體製劑，其藉由固化請求項1至13中任一項所述的液體抗體製劑而獲得。
一種遞送裝置，其包含請求項1至13中任一項所述的液體抗體製劑或請求項14所述的固體抗體製劑。
一種預填裝注射器，其包含請求項1至13中任一項所述的液體抗體製劑或請求項14所述的固體抗體製劑，用於靜脈內注射或者肌內注射。
一種請求項1至13中任一項所述的液體抗體製劑或請求項14所述的固體抗體製劑的用途，其用於製備治療、預防或延緩與SIRPα/CD47信號傳導通路和PD1/PD-L1信號傳導通路相關的病症的藥物，該病症選自各種實體瘤和血液病；自身免疫病、急性和慢性炎性病症、感染性疾病和轉移性病灶。