TWI764097B

TWI764097B - 包含抗ｃｄ４７抗體的製劑及其製備方法和用途

Info

Publication number: TWI764097B
Application number: TW109106041A
Authority: TW
Inventors: 謝瑞霞; 馬麗強; 汪音爵; 周凱松
Original assignee: 大陸商信達生物製藥（蘇州）有限公司
Priority date: 2019-02-26
Filing date: 2020-02-25
Publication date: 2022-05-11
Also published as: WO2020173431A3; JP2022521624A; EP3932426A4; KR20210134926A; AU2020227770A1; EP3932426A2; CA3131307A1; US20220143180A1; CN113453719A; TW202045136A; WO2020173431A2

Abstract

本發明涉及包含抗CD47抗體的製劑，尤其涉及包含抗體、緩衝劑、穩定劑和表面活性劑的藥物製劑。此外，本發明還涉及這些製劑的疾病治療或預防用途。

Description

包含抗CD47抗體的製劑及其製備方法和用途

本發明涉及抗體製劑領域。更具體而言，本發明涉及包含重組全人源抗分化抗原簇47(CD47)單株抗體的藥物製劑，尤其是穩定的高濃度抗體液體製劑，以及用於製備所述藥物製劑的方法，以及所述藥物製劑的治療和/或預防用途。

分化抗原簇47(CD47)，也被稱為整聯蛋白相關蛋白(IAP)，是免疫球蛋白超家族成員。不同的研究表明，幾乎所有的腫瘤細胞和組織都高表達CD47。目前已經報導了多個抗CD47抗體被開發用於各種腫瘤和/或癌症的治療中。

在CN201710759828.9的中國申請(2017年8月29遞交)中，公開了一系列重組全人源抗分化抗原簇47(CD47)單株抗體。這些抗體能夠改善巨噬細胞的吞噬作用，並具有顯著的抗腫瘤活性，能夠顯著抑制腫瘤的生長，甚至能使得腫瘤完全消失。此外，這些抗體還表現出顯著降低的血細胞凝集作用，因此在臨床治療中將具有顯著降低的副作用。

單株抗體對靶標具有高度的特異性，並且一般而言比小分子藥物更為有效。然而，基於單株抗體的藥品開發具有其自身的挑戰性。單株抗體比傳統的有機和無機藥物更為複雜，並且通常具有與其它蛋白質類生物藥相似的降解模式。廣義上，抗體蛋白的降解可以分為兩種主要的類型：物理不穩定性(涉及蛋白質高級結構的改變)和化學不穩定性(涉及蛋白質的各種化學修飾)。化學不穩定性可以由脫醯胺、外消旋、水解、氧化、β-消除或二硫鍵交換等引起，其中最常見的是片段化、脫醯胺和氧化。物理不穩定性可以因變性、聚集、沉澱或吸附等引起。

單株抗體的降解可以發生在各個階段，包括抗體製劑的配製、存儲和遞送過程中。而基於單株抗體的藥品的生物學活性與其結構、構象和化學穩定性密切相關。因此，抗體製劑的開發是抗體產品開發的一個重要方面，並常常是成功臨床生產的一個關鍵步驟。抗體藥品的穩定性是保證藥品有效性和安全性的一個重要指標。獲得賦予抗體藥品良好穩定性的製劑處方是藥品在貨架期內保持其有效性和安全性的關鍵條件。因此，抗體製劑必須以不僅使抗體適於施用給受試者的方式調配，還要以在儲存以及後續使用期間維持其穩定性的方式來調配。如果抗體沒有適當地在液體中得以調配，則液體溶液中的該抗體傾向於分解、聚集或發生不希望的化學修飾等。

目前，單株抗體正在以增高的劑量被開發用於各種適應症的治療。例如cetuximab以250-400mg/m²的劑量施用；efalizumab以大約1mg/kg的劑量的施用。此外，考慮施用的方便性和患者依從性，對皮下注射抗體製劑的需求也日益增多。因此，開發高濃度的穩定單株抗體液體製劑是本領域的一個方向，其中蛋白質濃度需要達到100mg/ml或更高。

除了滿足穩定性和純度等質量要求外，抗體製劑的靈活性也是生物醫藥領域考慮的一個因素。有利地是，製劑形式滿足在寬範圍的劑量水平上(典型地，取決於目標適應症，單株抗體的用量可以為0.1-20mg/kg)以及在多種施用途徑上(典型地是皮下和靜脈內)給藥的靈活性。

因此，在本領域中對於含有抗CD47抗體的足夠穩定新藥物製劑存在需要，尤其是對適用於抗體高濃度(如大約100mg/ml)的穩定液體製劑存在需要。

為了開發重組全人源抗CD47單株抗體的長期穩定儲存的製劑處方，確保產品在有效期內(例如，至少24個月)的質量可控，本申請發明人設計了處方前和處方篩選兩個階段的試驗，考察了不同pH、表面活性劑、穩定劑以及抗氧化劑對抗CD47抗體製劑穩定性的影響。藉由該深入的研究，本發明人提供了含有重組全人源抗分化抗原簇47(CD47)單株抗體的藥物製劑，尤其是穩定的高濃度抗體液體製劑。

在一個方面，本發明提供了一種液體抗體製劑，其包含(i)重組全人源抗CD47單株抗體(以下也簡稱“抗CD47抗體”)；(ii)緩衝劑，(iii)穩定劑，和(iv)表面活性劑。

在一個實施方案中，抗CD47抗體為在中國申請CN201710759828.9(2017年8月29遞交)中公開的重組全人源抗分化抗原簇47(CD47)單株抗體。為本申請的目的，該中國申請的全部內容特此併入本文作為參考。在一個實施方案中，抗CD47抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中重鏈可變區包含SEQ ID NO：1的序列或與其具有至少90% 同一性的序列，且輕鏈可變區包含SEQ ID NO：2的序列或與其具有至少90%同一性的序列：

(SEQ ID NO：1)；

(SEQ ID NO：2)。

在一個實施方案中，所述抗CD47抗體包含：

-GSISSYYWS(SEQ ID NO：3)或SYYWS(SEQ ID NO：11)的重鏈VH CDR1；

-YIYYSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO：4)的重鏈VH CDR2；

-ARGKTGSAA(SEQ ID NO：5)或GKTGSAA(SEQ ID NO：12)的重鏈VH CDR3；

-RASQGISRWLA(SEQ ID NO：6)的輕鏈VL CDR1；

-AASSLQS(SEQ ID NO：7)的輕鏈VL CDR2；和

-QQTVSFPIT(SEQ ID NO：8)的輕鏈VL CDR3。

在一個實施方案中，所述抗CD47抗體是包含重鏈和輕鏈的IgG4抗體，其中所述重鏈包含SEQ ID NO：9的序列或與其具有至少90%同一性的序列，且其中所述輕鏈包含SEQ ID NO：10的序列或與其具有至少90%同一性的序列：

(SEQ ID NO：9)

(SEQ ID NO：10)。

較佳地，所述抗CD47抗體是中國申請CN201710759828.9(於2017年8月29遞交)中公開的抗CD47單株抗體ADI-26630，該抗體由SEQ ID NO：9的重鏈序列和SEQ ID NO：10的輕鏈序列組成。在移植人源伯基特氏淋巴瘤細胞的小鼠腫瘤模型中，該抗體表現出顯著的抗腫瘤活性，例如腹腔注射5mg/kg，兩天一次連續兩週，該抗體可以導致腫瘤生長抑制率達到約100%或更高；且腫瘤消失比例可以達到60%以上。

在一個實施方案中，液體抗體製劑中的抗CD47抗體的濃度為約1-150mg/mL，例如20mg/ml以上，尤其是50mg/ml以上，較佳100mg/ml或120mg/ml。例如，液體抗體製劑中的抗CD47抗體的濃度可以是約15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、75、80、85mg/ml、或90mg/mL以上，例如，90、95、100、105、110、或120mg/ml。

在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑具有pH 5.0-6.0，例如pH5.2±0.2、pH5.5±0.2、pH5.7±0.2，較佳pH5.5。

在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑包含約5-100mM的緩衝劑。在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的緩衝劑的濃度為約10mM、20mM、30mM、40mM、或50mM。在一個實施方案中，所述緩衝劑為組胺酸緩衝劑。在一個較佳實施方案中，本發明液體抗體製劑包含約10-20mM，尤其是10mM組胺酸緩衝劑。在再一實施方案中，組胺酸緩衝劑由組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝體系構成。在再一較佳實施方案中，本發明液體抗體製劑包含0.4mg/ml組胺酸和1.5mg/ml鹽酸組胺酸。

在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑包含穩定劑，較佳地所述穩定劑選自山梨醇、蔗糖、海藻糖、精胺酸及其組合，更佳為山梨醇或山梨醇和精胺酸的組合。在一個較佳實施方案中，本發明液體製劑包含山梨醇作為穩定劑，較佳地山梨醇的濃度為約1-10%w/v，例如，1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%或6%w/v，或者以約10-60mg/ml，例如約15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml，30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml、50mg/ml、55mg/ml的量存在，較佳約40mg/ml。在再一較佳實施方案中，本發明的液體抗體製劑包含山梨醇和精胺酸的穩定劑組合。較佳地，在所述組合中，山梨醇的量為約10-30mg/ml，尤其是15mg/ml，精胺酸的量為80-110mM，尤其是約100mM。在再一較佳實施方案中，本發明的液體抗體製劑包含約15mg/ml山梨醇和約21.1mg/ml鹽酸精胺酸的穩定劑組合。

在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑包含表面活性劑，較佳地，所述表面活性劑是非離子型表面活性劑。在一個實施方案中，所述表面活性劑選自聚山梨酯類表面活性劑，較佳為聚山梨酯-20。在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑包含約0.1-1mg/ml，例如0.1-0.5mg/ml聚山梨酯-20。在一個較佳的實施方案中，本發明的液體抗體製劑包含約0.1-0.4mg/ml的聚山梨酯-20。在再一較佳實施方案中，本發明的液體抗體製劑中聚山梨酯-20的量為約0.3mg/ml。

在一個實施方案中，本發明液體製劑還包含抗氧化劑。在再一實施方案中，本發明液體製劑不包含抗氧化劑。在一個實施方案中，抗氧化劑是依地酸(EDTA)或其鹽，例如EDTA-2Na鹽。

在一個實施方案中，所述液體製劑為穩定的液體藥物製劑，較佳為注射劑。在一個實施方案中，本發明的藥物製劑用於皮下、皮內、肌內、或靜脈注射。

在一個較佳的實施方案中，本發明的液體抗體製劑包含：

(i)約10-150mg/mL的抗CD47抗體；

(ii)約5-50mM的組胺酸緩衝劑；

(iii)約1-10%w/v山梨醇，或約1-5%w/v山梨醇和約80-110mM精胺酸的穩定劑組合，和

(iv)約0.01-0.1% w/v的聚山梨酯-20；

其中所述液體製劑的pH為約5.0-6.0，較佳地pH5.5±0.2。

在一個較佳的實施方案中，本發明的液體抗體製劑包含

(i)90-150mg/mL，尤其是90-120mg/ml的抗CD47抗體；

(ii)約10-20mM組胺酸緩衝劑；

(iii)約20-60mg/ml(例如，40-50mg/ml)山梨醇，或約5-40mg/ml(例如，10-20mg/ml)山梨醇和約80-110mM(例如約100mM)精胺酸的組合，和

(iv)約0.1-0.4mg/ml的聚山梨酯-20；

其中所述液體製劑的pH為約5.0-6.0，較佳地pH5.5±0.2。

在一個較佳的實施方案中，本發明的液體抗體製劑包含：

(i)約100mg/mL的抗CD47抗體；

(ii)約0.4mg/ml組胺酸和約1.5mg/ml鹽酸組胺酸；

(iii)約15.0mg/ml山梨醇和21.1mg/ml鹽酸精胺酸，和

(iv)約0.3mg/ml的聚山梨酯-20；

其中所述液體製劑的pH為約5.5。

另一方面，本發明提供了一種固體抗體製劑，其是藉由將本發明的液體抗體製劑經固化處理而獲得的。所述固化處理是藉由例如結晶法、噴霧乾燥法、冷凍乾燥法實施的。在一個較佳的實施方案中，所述固體抗體製劑例如是凍乾製劑，例如凍乾粉針劑形式。固體抗體製劑可在使用前，藉由重構於適當的溶媒中，形成本發明的重構製劑。所述重構製劑也是一種本發明的液體抗體製劑。在一個實施方案中，所述適當的溶媒選自注射用水、注射用有機溶劑，包括但不限於注射用油、乙醇、丙二醇等，或其組合。

本發明的液體製劑可以長期穩定儲存，尤其是以高濃度(例如50mg/ml以上，較佳90-150mg/ml，例如100mg/ml或120mg/ml)穩定儲存，例如至少24個月或更長時間。在一個實施方案中，本發明的液體製劑可以在約-80℃至約45℃，例如-80℃、約-30℃、約-20℃、約0℃、約5℃、約25℃、約35℃、約38℃、約40℃、約42℃或約45℃的條件下，儲存至少10天、至少20天、至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9 個月、至少10個月、至少11個月、至少12個月、至少18個月、至少24個月，至少36個月，或更長時間，是穩定的。

在一個實施方案中，本發明的液體製劑可以穩定儲存至少24個月。在再一實施方案中，本發明的液體製劑在至少40℃是穩定的。在再一實施方案中，本發明的液體製劑在約2℃-8℃保持穩定至少12個月，較佳至少24個月。在一個實施方案中，本發明的液體製劑在室溫或例如約25℃保持穩定至少3個月，較佳至少6個月。在再一實施方案中，本發明的液體製劑在約40℃保持穩定至少1個月。在再一實施方案中，本發明的液體製劑在約5℃至40℃的溫度，例如在25℃的溫度，在振盪下可以保持穩定至少1天，例如3天或5天。

在一個實施方案中，可以藉由檢測製劑的外觀、可見異物、蛋白含量、純度、和/或電荷變異體的變化，來指示儲存後製劑的穩定性。在一個實施方案中，可以在高溫加速試驗中，例如在40℃±2℃儲存至少1周、2周或較佳地1個月後，或在25℃±2℃儲存至少1個月或2個月後，檢測本發明液體製劑的穩定性。在一個實施方案中，藉由振盪試驗檢測本發明液體製劑的振盪穩定性。

在一個實施方案中，在儲存後，藉由目視檢查本發明液體製劑的穩定性，其中本發明液體製劑在外觀上保持為澄明、無色或微黃色的液體，無異物、無絮狀物及沉澱。在一個實施方案中，在自然光下目視檢查，製劑中無可見異物存在。在一個實施方案中，在儲存後，藉由測定蛋白含量變化，檢查本發明液體製劑的穩定性，其中例如藉由紫外分光光度(UV)法，相對於儲存第0天的初始值，蛋白含量變化率不超過20%，較佳不超過10%，例如7-8%，較佳不超過5%。在一個實施方案中，在儲存後，藉由測定本發明液體製劑的濁度變化，檢查本發明液體製劑的穩定性，其中例如藉由OD350mm法檢測，相對於儲存第0天的初始值，變化值不超過0.04，更佳地不超過0.03，更佳地不超過0.02。在一個實施方案中，在儲存後，藉由測定本發明液體製劑的純度變化，檢查本發明液體製劑的穩定性，其中藉由尺寸排阻高效液相色譜法(SEC-HPLC)，相對於儲存第0天的初始值，主峰純度的變化值不超過10%，例如不超過5%、4%、3%、例如1-2%，較佳不超過1%，且較佳地，聚體的增幅不超過2%，較佳地不超過1%、0.5%或0.1%。在一個實施方案中，在儲存後，藉由測定本發明液體製劑的純度變化，檢查本發明液體製劑的穩定性，其中藉由非還原型十二烷基硫酸鈉毛細管電泳(CE-SDS)法，主峰純度的變化值下降不超過10%，例如不超過5%、4%、3%、較佳不超過2%、1%、0.5%或0.1%。在一個實施方案中，在儲存後，藉由成像毛細管等電聚焦電泳(iCIEF)檢測本發明液體製劑的穩定性，其中相對於儲存第0天的初始值，抗體的電荷變異體(主成分、酸性組分或鹼性組分)的變化值不超過30%，較佳地不超過20%、或不超過10%，例如不超過5%、4%、3%、或2%，例如，在一個實施方案中，主成分或酸性組分的變化值不超過20%，且鹼性組分的變化值不超過3%。

在一個實施方案中，製劑在儲存後，例如在2-8℃儲存至少24個月後，或在室溫儲存至少3個月後，或在40℃±2℃儲存1個月後，是穩定的，較佳地具有如下特徵之一或多項：

(i)藉由SEC測量，製劑中抗體單體的百分數大於90%，較佳大於95%，且較佳地聚體增幅不超過2%；

(ii)藉由非還原型CE-SDS測量，製劑具有大於90%的純度，較佳大於95%的純度；

(iii)藉由iCIEF測量，相對於儲存第0天的初始值，製劑中抗CD47抗體的至少50%，較佳至少55%是非鹼性及非酸性形式，且較佳地抗體的酸性組分電荷變異體的增加不超過20%。

在再一實施方案中，製劑在儲存後，例如在2-8℃儲存至少24個月後，或在室溫儲存至少3個月後，或在40℃±2℃儲存1個月後，是穩定的，較佳地具有以下特徵之一或多項：

(i)外觀澄明，無可見異物；

(ii)用紫外分光光度(UV)法檢測，相對於儲存第0天的初始值，蛋白含量變化率不超過10%；

(iii)用OD350mm法檢測，相對於儲存第0天的初始值，浊度變化值不超過0.04，較佳地不超過0.02；

(iv)用SEC-HPLC檢測，相對於儲存第0天的初始值，主峰純度的變化值不超過5%、較佳不超過1%；

(v)用非還原型CE-SDS檢測，相對於儲存第0天的初始值，主峰純度的變化值下降不超過5%、較佳不超過3%；

(vi)用iCIEF檢測，相對於儲存第0天的初始值，製劑中抗CD47抗體的至少50%，較佳至少55%是非鹼性及非酸性形式，且較佳地抗體的酸性組分電荷變異體的增加不超過20%。

在一個方面，本發明提供了一種遞送裝置，其包含本發明的液體抗體製劑或固體抗體製劑。在一個實施方案中，本發明的遞送裝置以包含本發明的液體抗體製劑或固體抗體製劑的預填裝注射器形式提供，例如用於靜脈內、皮下、皮內或者肌內注射。

在再一方面，本發明提供向受試者，例如哺乳動物遞送抗CD47抗體的方法，包括給予所述受試者本發明的液體抗體製劑或固體抗體製劑的步驟，所述遞送是例如藉由使用預填裝注射器的遞送裝置實施的。

在再一方面，本發明提供本發明的液體抗體製劑或固體抗體製劑的用途，用於製備在受試者中治療CD47相關疾病的遞送裝置(如，預填裝注射器)或藥物，特別地用於治療CD47相關癌症，例如各種血液腫瘤，如淋巴瘤，例如伯基特氏淋巴瘤。

本發明的其它實施方案將藉由參閱此後的詳細說明而清楚明瞭。

結合以下圖式一起閱讀時，將更好地理解以下詳細描述的本發明的較佳實施方案。出於說明本發明的目的，圖中顯示了目前較佳的實施方案。然而，應當理解本發明不限於圖中所示實施方案的精確安排和手段。

第1圖顯示，在實施例所述的pH篩選試驗中，將不同pH(pH5.0、5.5、6.0和6.5)的抗體製劑在40℃±2℃的溫度條件下儲存0天、1週、2週和1個月後，用OD350nm法測定的製劑濁度隨時間的變化圖。

第2圖顯示，在實施例所述的pH篩選試驗中，將不同pH(pH5.0、5.5、6.0和6.5)的抗體製劑在40℃±2℃的溫度條件下儲存0天、1週、2週和1個月後，用SEC-HPLC法測定的製劑主峰純度隨時間的變化圖。

第3圖顯示，在實施例所述的pH篩選試驗中，將pH6.5的抗體製劑在40℃±2℃儲存1個月後，藉由SEC-HPLC法測定的抗體製劑純度圖譜。

第4圖顯示，在實施例所述的穩定劑篩選試驗中，將具有不同穩定劑的抗體製劑(處方1-4)置於40℃±2℃儲存0天、1週、2週、和1月後，藉由SEC-HPLC法測定的主峰純度隨時間的變化圖。

第5圖顯示，在實施例所述的穩定劑篩選試驗中，將具有不同穩定劑的抗體製劑(處方1-4)置於40℃±2℃儲存0天、1週、2週、和1月後，藉由非還原型CE-SDS法測定的主峰純度隨時間的變化圖。【0042】第6圖顯示，在實施例所述的穩定劑篩選試驗中，將具有不同穩定劑的抗體製劑(處方1-4)置於40℃±2℃儲存0天、1週、2週、和1月後，藉由iCIEF法測定的電荷變異體主成分隨時間的變化圖。【0043】第7圖顯示，在實施例所述的穩定劑篩選試驗中，將具有不同穩定劑的抗體製劑(處方1-4)置於40℃±2℃儲存0天、1週、2週、和1月後，藉由iCIEF法測定的電荷變異體酸性組分隨時間的變化圖。【0044】第8圖顯示，在實施例所述的抗氧化劑篩選試驗中，將添加或不添加EDTA的抗體製劑(處方A和B)置於40℃±2℃儲存0天、1週、2週、和1月後，藉由OD350nm法測定的濁度隨時間的變化圖。【0045】第9圖顯示，在實施例所述的抗氧化劑篩選試驗中，將添加或不添加EDTA的抗體製劑(處方A和B)置於40℃±2℃儲存0天、1週、2週、和1月後，藉由iCIEF法測定的電荷變異體(主成分、酸性組分和鹼性組分)隨時間的變化圖。

發明詳述

在詳細描述本發明前，應瞭解，本發明不受限於所述的特定方法及實驗條件，因為所述方法以及條件是可以改變的。另外，本文所用術語僅是供說明特定實施方案之用，而不意欲為限制性的。

定義

除非另有定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語均具有與本領域一般技術人員通常所理解的含義相同的含義。為了本發明的目的，下文定義了以下術語。

術語“約”在與數字數值聯合使用時意為涵蓋具有比指定數字數值小5%的下限和比指定數字數值大5%的上限的範圍內的數字數值。

術語“和/或”當用於連接兩個或多個可選項時，應理解為意指可選項中的任一項或可選項的任意兩項或多項。

如本文中所用，術語“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整數或步驟，但是不排除任意其他要素、整數或步驟。在本文中，當使用術語“包含”或“包括”時，除非另有指明，否則也涵蓋由所述及的要素、整數或步驟組成的情形。例如，當提及“包含”某個具體序列的抗體可變區時，也旨在涵蓋由該具體序列組成的抗體可變區。

在本文中，術語“抗體”是指包含輕鏈和重鏈免疫球蛋白可變區的多肽，所述免疫球蛋白可變區特異性識別並結合抗原。較佳地，本發明的抗體是全長抗體，由兩條重鏈和兩條輕鏈組成，其中每條重鏈由重鏈可變區(本文中縮寫為VH)和重鏈恆定區組成，每條輕鏈由輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)和輕鏈恆定區組成。在一些實施方案中，本發明的抗體也可以指抗體的抗原結合片段。

術語“抗體製劑”指一種製備物，所述製備物處於允許作為活性成分的抗體的生物活性可以有效發揮的形式，並且不含有對於待施用該製劑的受試者而言具有不可接受毒性的其它組分。這類抗體製劑通常是無菌的。通常，抗體製劑中包含可藥用賦形劑。“可藥用”賦形劑是可以合理地施用至受試哺乳動物以便製劑中所用活性成分的有效劑量可以遞送至受試者的試劑。賦形劑的濃度與施用模式相適應，例如可以是注射可接受的。

術語“抗CD47抗體製劑”，在本文中也簡稱為“本發明的抗體製劑”，意指包含抗CD47抗體作為活性成分和可藥用賦形劑的製備物。經所述組合後，作為活性成分的抗CD47抗體適於治療性或預防性施與人類或非人類動物。本發明的抗體製劑可以例如製備成水性形式的液體製劑，例如，即用式預填裝注射器，或者製備成凍乾製劑，在即將使用前藉由溶解和/或懸浮於生理可接受的溶液中進行重構(即，複溶)。在一些實施方案中，抗CD47抗體製劑是液體製劑形式。

“穩定”抗體製劑是製劑中的抗體在儲存於特定條件下之後保有可接受程度的物理穩定性和/或化學穩定性。儘管抗體製劑中所含的抗體在儲存特定時間之後可能不會100%維持其化學結構，但通常在儲存特定時間之後維持約90%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%的抗體結構或功能，則認為抗體製劑是“穩定的”。在一些具體的實施方案中，本發明的抗CD47抗體製劑在製造、製備、運輸和長期儲存過程中表現出低至檢測不到的抗體聚集或降解或化學修飾，從而極少或甚至是沒有抗CD47抗體的生物活性損失，表現出高度穩定性。在一些實施方案中，本發明的抗CD47抗體製劑在儲存後，基本上保留其物理和化學穩定性。較佳地，本發明液體製劑可以在室溫或在40℃穩定至少1個月，和/或在2-8℃穩定至少24個月。

本領域已知多種分析技術可以用於測定蛋白質的穩定性，參見例如Peptide and Protein Drug Delivery,247-301,Vincent Lee Ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs(1991)and Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10：29-90(1993)。可以在選定的溫度和選定的儲存時間測量穩定性。例如，可以基於預期的製劑貨架期來選擇儲存時間。或者可以使用加速穩定性試驗。在一些實施方案中，藉由對抗體製劑進行各種脅迫測試來進行穩定性測試。這些測試可以代表調配的抗體製劑在製造、儲存或運輸期間可能遭遇到的極端條件，也可以代表在非製造、儲存或運輸期間可能使抗體製劑中的抗體的不穩定性加速的條件。例如，可以將經調配的抗CD47抗體製劑充填至5mL玻璃瓶中用於振盪脅迫以檢測抗體的振盪/剪切穩定性；或者可以將經調配的抗CD47抗體製劑充填至玻璃小瓶中以檢驗在高溫脅迫下的抗體穩定性。

經一段儲存時間後，製劑不顯示聚集、沉澱、混濁和/或變性；或顯示非常少的聚集、沉澱、混濁和/或變性，則可以認為抗體在製劑中“保持其物理穩定性”。由於製劑中抗體的聚集可以潛在地導致患者增加的免疫反應，從而導致安全性問題。因此，需要使在製劑中的抗體聚集最小化或防止聚集。光散射法可以用於測定製劑中的可見聚集物。SEC可以用於測定製劑中的可溶性聚集物。此外，可以藉由目視檢查製劑的外觀、顏色和/或澄清度、或者藉由OD350nm法檢測製劑的濁度、或者藉由非還原型CE-SDS法測定製劑的純度，來指示製劑的穩定性。在一個實施方案中，藉由測定在特定溫度下儲存特定時間之後製劑中的抗體單體的百分比來測量製劑的穩定性，其中製劑中的抗體單體的百分比越高，則製劑的穩定性越高。

“可接受程度的”物理穩定性可以表示於特定溫度下儲存特定時間之後，在製劑中檢測到至少約92%的抗CD47抗體單體。在一些實施方案中，在特定溫度儲存至少2週、至少28天、至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9個月、至少10個月、至少11個月、至少12個月、至少18個月、至少24個月或更久後，可接受程度的物理穩定性表示至少約92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的抗CD47抗體單體。當評估物理穩定性時，藥物製劑儲存的特定溫度可為約-80℃至約45℃的任一溫度，例如儲存於約-80℃、約-30℃、約-20℃、約0℃、約4℃-8℃、約5℃、約25℃、約35℃、約37℃、約40℃、約42℃或約45℃。例如，若儲存於約40℃±2℃ 1個月之後，檢測到至少約92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的抗CD47抗體單體，則藥物製劑視為是穩定的。若儲存於約25℃2個月之後，檢測到至少約92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的抗CD47抗體單體，則藥物製劑視為是穩定的。若儲存於約5℃ 9個月之後，檢測到至少約92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的抗CD47抗體單體，則藥物製劑視為是穩定的。

經一段儲存時間後，如果製劑中的抗體不顯示顯著的化學改變，則可以認為抗體在製劑中“保持其化學穩定性”。大多數化學不穩定性源自於形成了抗體的共價修飾形式(例如，抗體的電荷變異體)。例如由天冬胺酸異構化、N和C末端修飾，可以形成鹼性變異體；由脫醯胺化、唾液酸化和糖化，可以產生酸性變異體。化學穩定性可以藉由檢測和/或定量抗體的化學改變形式來評估。例如，可以藉由陽離子交換色譜(CEX)或成像毛細管等電聚焦電泳(icIEF)檢測製劑中抗體的電荷變異體。在一個實施方案中，藉由測定在特定溫度下儲存特定時間之後製劑中抗體的電荷變異體百分比變化值來測量製劑的穩定性，其中該變化值越小，則製劑的穩定性越高。

“可接受程度”的化學穩定性可以表示於特定溫度下儲存特定時間之後製劑中電荷變異體(例如主成分或酸性組分或鹼性組分)的百分比變化值不超過30%，例如20%。在一些實施方案中，在特定溫度儲存至少2週、至少28天、至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9個月、至少10個月、至少11個月、至少12個月、至少18個月、至少24個月或更久後，可接受程度的化學穩定性可以表現為酸性組分電荷變異體的百分比變化值不超過約25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、或1%。當評估化學穩定性時，儲存藥物製劑的溫度可為約-80℃至約45℃的任一溫度，例如儲存於約-80℃、約-30℃、約-20℃、約0℃、約4℃-8℃、約5℃、約25℃或約45℃。例如，若在儲存於5℃ 24個月之後，酸性組分電荷變異體的百分比變化值少於約25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.1%，則藥物製劑可被視為是穩定的。若在儲存於25℃ 2個月後，酸性組分電荷變異體的百分比變化值少於約20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.1%，則藥物製劑亦可被視為是穩定的。若在儲存於40℃ 1個月之後，酸性組分電荷變異體的百分比變化值少於約25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、 16%、15%、14%、13%、12%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.1%，則藥物製劑亦可被視為是穩定的。

術語“凍乾製劑”是指藉由液體製劑的冷凍乾燥處理得到或能夠得到的組合物。較佳地，其為具有少於5%、較佳少於3%水含量的固體組合物。

術語“重構製劑”是指將固體製劑(例如凍乾製劑)溶解和/或懸浮於生理可接受的溶液中得到的液體製劑。

文中使用的術語“室溫”是指15℃至30℃、較佳20℃至27℃、更佳25℃的溫度。

“脅迫條件”是指在化學和/或物理上不利於抗體蛋白的環境，所述環境可以導致不可接受的抗體蛋白失穩定。“高溫脅迫”是指，將抗體製劑置於室溫或甚至於更高溫度(例如40℃±2℃)儲存一段時間。藉由高溫脅迫加速試驗，可以檢查抗體製劑的穩定性。

如本文所使用，術語“腸胃外施用”意指腸內和局部給藥以外的給藥方式，通常藉由注射或輸注方式，並且包括但不限於，靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下(subcuticular)、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內、硬膜外和胸骨內注射以及輸注。在一些實施方案中，本發明的穩定抗CD47抗體製劑腸胃外施用於受試者。在一個實施方案中，本發明的抗CD47抗體製劑以皮下、皮內、肌內或靜脈內注射方式施用於受試者。

I.抗體製劑

本發明提供穩定的液體抗體製劑，其包含(i)重組全人源抗CD47單株抗體；(ii)緩衝劑，(iii)穩定劑，和(iv)表面活性劑，所述抗體製劑的pH為約5.0-6.0。在一個較佳方案中，本發明的液體抗體製劑是注射製劑形式。

(i)抗CD47抗體

“抗CD47抗體”是指這樣的抗體，所述抗體能夠以足夠的親和力結合CD47分子，以致所述抗體可以用作靶向CD47分子的治療劑和/或預防劑。

本發明的抗體是重組全人源抗體。術語“全人源抗體”或“人抗體”在本文中可以互換使用，指該抗體包括其中構架區和CDR區二者均源自人種系免疫球蛋白序列的可變區，而且如果抗體含有恆定區，恆定區也源自人種系免疫球蛋白序列。本發明的人抗體可包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸(例如，藉由體外隨機或點特異誘變或體內體細胞突變引入的突變)。然而，如本文所使用的，術語“人抗體”不意欲包括其中的CDR序列衍生自其他哺乳動物物種(如，小鼠)的種系而移植入人構架序列的抗體。如本文所用，術語“重組人抗體”包括所有藉由重組方式製備、表達、產生或分離的人抗體。這些重組人抗體具有構架區和CDR區源自人種系免疫球蛋白序列的可變區。然而，在某些實施方案中，可以對重組人抗體進行體外誘變(或使用人Ig序列轉基因動物時為體內體細胞誘變)，由此得到的重組抗體的VH和VL區的胺基酸序列，儘管源自人種系VH和VL序列並與之相關、但是並不天然存在於體內的人抗體種系庫中。

在一些實施方案中，如藉由生物光干涉法測量，所述抗CD47抗體能夠以高的親和力，例如以10^-7M或更小、較佳地以10^-9M至10^-10M的K_D特異性結合人CD47，並由此介導對CD47及其配體結合的高效阻斷作用。

在一些實施方案中，本發明抗體CD47抗體包含：SEQ ID NO：1或與之具有至少90%同一性的重鏈可變區(VH)；和SEQ ID NO：2或與之具有至少90%同一性的輕鏈可變區(VL)。“可變區”或“可變結構域”是抗體的重鏈或輕鏈中參與抗體與其抗原的結合的結構域。一般，重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)可以進一步再劃分為高變區(HVR，又稱作互補決定區(CDR))，其間插有較保守的區域(即，構架區(FR))。每個VH和VL由三個CDR和4個FR組成，從胺基端到羧基端以如下順序排列：FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4。

在一些實施方案中，本發明的抗CD47抗體包含SEQ ID NO：1的重鏈可變區的HCDR1、2和3序列和SEQ ID NO：2的輕鏈可變區的LCDR1、2和3序列。“互補決定區”或“CDR區”或“CDR”(在本文中與超變區“HVR”可以互換使用)，是抗體可變區中主要負責與抗原表位結合的胺基酸區域。重鏈和輕鏈的CDR通常被稱作CDR1、CDR2和CDR3，從N-端開始順序編號。位於抗體重鏈可變結構域內的CDR被稱作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位於抗體輕鏈可變結構域內的CDR被稱作LCDR1、LCDR2和LCDR3。本領域公知多種用於在一個給定的VH或VL胺基酸序列中確定其CDR序列的方案。例如，Kabat互補決定區(CDR)是基於序列變異性確定的並且是最常用的(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。而Chothia指的是結構環的位置(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。AbM HVR是Kabat HVR和Chothia結構環之間的折中，並且由Oxford Molecular的AbM抗體建模軟體使用。“接觸性”(Contact)HVR基於對可獲得的複雜晶體結構的分析。HVR也可以基於與參考CDR序列(例如本文公開的示例性CDR)具有相同的Kabat編號位置而確定。

在一個實施方案中，本發明抗體的CDR藉由Kabat規則確定邊界，例如下文表A(1)所示。

在一個實施方案中，本發明抗體的CDR藉由結合Kabat、AbM、Chothia及經驗性等綜合因素確定邊界。例如下文表A(2)所示：HCDR1是在kabat編號系統中位置H27-H35的序列，HCDR3是在kabat編號系統中位置H93-H102的序列，以及HCDR2和LCDR1、LCDR2和LCDR3藉由Kabat規則確定。

然而，應該注意，基於不同的指派系統獲得的同一抗體的可變區的CDR的邊界可能有所差異。即不同指派系統下定義的同一抗體可變區的CDR序列有所不同。因此，在涉及用本發明定義的具體CDR序列限定抗體時，所述抗體的範圍還涵蓋了這樣的抗體，其可變區序列包含所述的具體CDR序列，但是由於應用了不同的方案(例如不同的指派系統規則或組合)而導致其所聲稱的CDR邊界與本發明所定義的具體CDR邊界不同。

具有不同特異性(即，針對不同抗原的不同結合位點)的抗體具有不同的CDR。然而，儘管CDR在抗體與抗體之間是不同的，但是CDR內只有有限數量的胺基酸位置直接參與抗原結合。使用Kabat,Chothia,AbM、Contact和North方法中的至少兩種，可以確定最小重疊區域，從而提供用於抗原結合的“最小結合單位”。最小結合單位可以是CDR的一個子部分。正如本領域技術人員明瞭，藉由抗體的結構和蛋白折疊，可以確定CDR序列其餘部分的殘基。因此，本發明也考慮本文所給出的任何CDR的變體。例如，在一個CDR的變體中，最小結合單位的胺基酸殘基可以保持不變，而根據Kabat或Chothia定義的其餘CDR殘基可以被保守胺基酸殘基替代。

在一些實施方案中，本發明的抗CD47抗體可以包含與SEQ ID NO：1具有至少90%、95%或98%或更高同一性的重鏈可變區(VH)；和/或與SEQ ID NO：2具有至少90%、95%或98%或更高同一性的輕鏈可變區(VL)。在本文中，“序列同一性”是指在比較窗中以逐個核苷酸或逐個胺基酸為基礎的序列相同的程度。可以藉由以下方式計算“序列同一性百分比”：將兩條最佳比對的序列在比較窗中進行比較，確定兩條序列中存在相同核酸鹼基(例如，A、T、C、G、I)或相同胺基酸殘基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的數目以得到匹配位置的數目，將匹配位置的數目除以比較窗中的總位置數(即，窗大小)，並且將結果乘以100，以產生序列同一性百分比。為了確定序列同一性百分數而進行的最佳比對，可以按本領域已知的多種方式實現，例如，使用可公開獲得的計算機軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。本領域技術人員可以確定用於比對序列的適宜參數，包括為實現正在比較的全長序列範圍內或目標序列區域內最大比對所需要的任何算法。

在一些實施方案中，本發明抗體的VH序列與SEQ ID NO：1相比具有不超過10個，較佳地不超過5個、4個或3個不同殘基，較佳地所述不同殘基為保守胺基酸替代。在一些實施方案中，本發明抗體的VL序列與SEQ ID NO：2相比具有不超過10個，較佳地不超過5個、4個或3個不同殘基，較佳地所述不同殘基為保守胺基酸替代。“保守性取代”是指導致某個胺基酸置換為化學上相似的胺基酸的胺基酸改變。提供功能上相似胺基酸的保守性置換表是本領域熟知的。在本發明任一實施方案中，在一個較佳的方面，保守取代殘基來自以下的保守替代表X，較佳地為表X中所示較佳置換殘基。

在一些實施方案中，本發明的抗體是IgG4形式的抗體。“IgG形式的抗體”是指抗體的重鏈恆定區所屬於的IgG形式。所有同一型的抗體的重鏈恆定區都是相同的，不同型的抗體之間的重鏈恆定區不同。例如，IgG4形式的抗體是指其重鏈恆定區Ig結構域為IgG4的Ig結構域。

在一個較佳的實施方案中，本發明的抗CD47抗體是中國申請CN201710759828.9(2017年8月29)中公開的抗CD47單株抗體ADI-26630，其具有SEQ ID NO：9的重鏈和SEQ ID NO：10的輕鏈。在一個實施方案中，該抗CD47抗體是由CHO細胞重組表達產生並經純化的IgG4型抗體。較佳地，在本發明液體製劑中所述抗體表現出顯著的抗腫瘤活性。例如，在移植人源伯基特氏淋巴瘤細胞的小鼠腫瘤模型中，例如腹腔注射5mg/kg，兩天一次連續兩週，該抗體可以導致腫瘤生長抑制率達到約50%或更高，例如100%；和/或腫瘤消失率達到60%以上。

本發明的抗體製劑中所包含的抗體或其抗原結合片段的量可隨著製劑的特定目的特性、特定環境、和使用製劑的特定目的而改變。在一些實施方案中，抗體製劑為液體製劑，其可含有約1-150mg/mL，較佳地為約10-100mg/mL，例如，約15、20、25、30、35、40、45、50、55、60mg/mL抗CD47抗體。在一個實施方案中，本發明涉及具有高濃度的抗CD47抗體的製劑，例如，含有50-150mg/mL的抗CD47抗體。本領域已知這樣的高濃度抗體製劑可以在注射前進行稀釋，例如，如果特定的治療性或預防性干預需要較低的抗體濃度或者當治療包括兒童的較小體重患者時。適合的濃度可以是25mg/mL或10mg/mL。備選地，可以以這樣的低濃度生產原始製劑。

(ii)緩衝劑

緩衝劑是可以將溶液的pH維持在可接受範圍的試劑。在一些實施方案中，用於本發明製劑中的緩衝劑可以將本發明製劑的pH控制在大約5.0-6.0的pH範圍，例如約5.2-5.8的pH，較佳地5.3-5.7的pH。在一個具體的實施方案中，本發明的抗體製劑具有約5.0、5.2、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0的pH，較佳地約5.5的pH。較佳地，用於本發明的緩衝劑是組胺酸緩衝劑，例如由組胺酸和鹽酸組胺酸組成的緩衝體系。

在一個實施方案中，本發明的抗體製劑中緩衝劑的濃度為約5-100mM，較佳地為約10-50mM，例如，約10-20mM。較佳地，緩衝劑為約10-20mM的組胺酸緩衝劑。

(iii)穩定劑

用於本發明的合適的穩定劑可以選自糖、多元醇和胺基酸及其組合。對於作為穩定劑的糖包括但不限於蔗糖和海藻糖。對於作為穩定劑的多元醇包括但不限於山梨醇。對於作為穩定劑的胺基酸包括但不限於精胺酸。

在一個實施方案中，本發明液體製劑包含蔗糖作為穩定劑。蔗糖在本發明液體製劑中的量可以是約50-100mg/ml，較佳地70-90mg/ml，例如80mg/ml。

在一個實施方案中，本發明液體製劑包含海藻糖作為穩定劑。海藻糖在本發明液體製劑中的量可以是約50-100mg/ml，較佳地70-90mg/ml，例如80mg/ml。

在一個實施方案中，本發明液體製劑包含精胺酸作為穩定劑。精胺酸在本發明液體製劑中的量可以是約80-110mM，尤其是約100mM，例如約21.1mg/ml鹽酸精胺酸。

在一個實施方案中，本發明液體製劑包含山梨醇作為穩定劑。山梨醇在本發明液體製劑中的量可以是約10-100mg/ml，較佳地20- 70mg/ml，例如30-60mg/ml。例如，山梨醇可以以約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或70mg/ml的量存在，較佳地以約40mg/ml的量存在。

在一個實施方案中，本發明液體製劑包含山梨醇和精胺酸的組合作為穩定劑。該組合中，山梨醇可以以約5-60mg/ml，較佳地10-30mg/ml，例如10-20mg/ml的量存在，例如可以為5、10、12、15、17、20、22、25mg/ml。在該組合中，精胺酸可以以約80-110mM，尤其是約100mM的量存在。較佳地，本發明液體製劑包含約10-20mg/ml的山梨醇和約10-30mg/ml的鹽酸精胺酸。更較佳地，本發明液體製劑包含約15mg/ml的山梨醇和約21.1mg/ml的鹽酸精胺酸。

(iv)表面活性劑

如本文所使用的，術語“表面活性劑”是指具有兩親結構的有機物質；即，它們由相反的溶解性傾向的基團所組成，通常是油溶性的烴鏈和水溶性的離子基團。

在一個實施方案中，本發明的液體製劑中的表面活性劑是非離子型表面活性劑，例如，烷基聚(環氧乙烯)。可包括在本發明製劑中的特定非離子型表面活性劑包括，例如聚山梨酯，諸如聚山梨酯-20、聚山梨酯-80、聚山梨酯-60、或聚山梨酯-40；普洛尼克等。在一個較佳實施方案中，本發明的液體製劑中包含聚山梨酯-20作為表面活性劑。

本發明抗體製劑中所含的表面活性劑的量可隨製劑的特定目的特性、特定環境、和使用製劑的特定目的而改變。在較佳的一些實施方案中，製劑可含有約0.01-5mg/ml，較佳地為約0.1-2mg/ml，例如約 0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mg/ml的聚山梨酯-20，較佳地約0.3mg/ml的聚山梨酯-20。

(v)其它賦形劑

本發明的抗體液體製劑中可以包含或不包含其它賦形劑。在一個實施方案中，本發明的抗體液體製劑包含EDTA或其鹽。在另一實施方案中，本發明的抗體液體製劑不包含EDTA或其鹽。在一個實施方案中，添加EDTA或其鹽的本發明抗體液體製劑，與不添加EDTA或其鹽的相應製劑相比，具有相當的穩定性。

出於其他考慮，也可在本發明製劑中使用其它的賦形劑。所述賦形劑包括，例如，調味劑、抗微生物劑、甜味劑、抗靜電劑、抗氧化劑、明膠等等。這些和另外已知的藥物賦形劑和/或適用於本發明製劑的添加劑是本領域公知的，例如，列出於“The Handbook of Pharmaceutical Excipients，第4版，Rowe等人編，American Pharmaceuticals Association(2003)；和Remington：the Science and Practice of Pharmacy，第21版，Gennaro編，Lippincott Williams & Wilkins(2005)”。

II.製劑的製備

本發明提供包含抗體的穩定製劑。在本發明製劑中使用的抗體可以使用本領域已知的用於生產抗體的技術進行製備。例如，可以重組製備抗體。在一個較佳的實施方案中，本發明的抗體在CHO細胞中重組製備。

抗體作為藥物的活性成分的應用現在已經很廣泛。用於將治療性抗體純化至藥用級的技術是本領域公知的。例如，Tugcu等 (Maximizing productivity of chromatography steps for purification of monoclonal antibodies,Biotechnology and Bioengineering 99(2008)599-613.)描述在蛋白A捕獲步驟後使用離子交換色譜(陰離子IEX和/或陽離子CEX色譜)的單株抗體三柱純化方法。Kelley等(Weak partitioning chromatography for anion exchange purification of monoclonal antibodies,Biotechnology and Bioengineering 101(2008)553-566)描述了兩柱純化法，其中在蛋白A親和色譜後使用弱分配陰離子交換樹脂。

一般，重組產生的單株抗體可以利用常規的純化方法純化，以提供具有足夠的可重複性和適度純度的藥物物質用於抗體製劑的配製。例如，在抗體從重組表達細胞分泌至培養基中後，可以使用商業可得的蛋白濃縮過濾器例如Amicon的超濾裝置，濃縮來自該表達系統的上清液。之後，可以使用例如色譜、透析和親和純化等方式進行抗體的純化。蛋白A適應於作為親和配體用於純化IgG1,IgG2和IgG4型抗體。也可以使用其它抗體純化方法，例如離子交換色譜。在獲得足夠純度的抗體後，可以按照本領域已知的方法，製備包含抗體的製劑。

例如，可以採用如下步驟進行製備：(1)在發酵結束後將發酵液離心澄清去除細胞等雜質以獲得上清；(2)使用親和層析(例如對IgG1、IgG2和IgG4型抗體具有特異親和力的蛋白A柱)捕獲抗體；(3)進行病毒滅活；(4)精製純化(一般可以採用CEX陽離子交換層析)，以去除蛋白中的雜質；(4)病毒過濾(使病毒滴度降低例如4 log10以上)；(5)超濾/滲濾(可以用於將蛋白置換於利於其穩定的製劑緩衝液中並濃縮至合適的濃度供注射用)。參見例如，B.Minow,P.Rogge,K.Thompson,BioProcess International,Vol.10,No.6,2012,pp.48-57。

III．製劑的分析方法

在抗體製劑的儲存過程中，抗體可能會發生聚集、降解或化學修飾，導致抗體異質性(包括大小異質性和電荷異質性)以及聚集物和片段等，從而影響抗體製劑的質量。因此，有必要進行抗體製劑穩定性的監測。在本領域中已知多種方法可以用於檢測抗體製劑的穩定性。例如，可以藉由非還原型CE-SDS和SEC-HPLC等方法，分析抗體製劑的純度和評估抗體的聚集水平；可以藉由毛細管等電聚焦電泳(cIEF)、成像毛細管等電聚焦電泳(iCIEF)和離子交換色譜(IEX)等，分析抗體製劑中的電荷變異體。此外，可以藉由目視檢測製劑外觀，快速地判斷製劑的穩定性。也可以使用OD350nm法檢測製劑的濁度改變，該方法可以給出有關可溶性和不溶性聚集物量的信息。此外，可以使用紫外分光光度法(UV法)檢測製劑中的蛋白質含量變化。

非還原型CE-SDS法是一種以毛細管為分離通道進行的單株抗體純度測定方法。在CE-SDS中，蛋白遷移由SDS結合引起的表面電荷來驅動，而該表面電荷與蛋白質的分子量成正比。由於所有的SDS-蛋白質複合物都具有相似的質量-電荷比，故可以在毛細管的分子篩凝膠基質中，實現基於分子的大小或流體動力學半徑的電泳分離。該方法已經被廣泛地用於監測變性的完整抗體的純度。一般，在非還原CE-SDS法中，供試樣品與SDS樣品緩衝液和碘乙醯胺混合。之後，混合物可以於68-72℃孵育約10-15分鐘，冷卻至室溫後離心的上清液用於分析。採用紫外檢測器檢測蛋白的遷移，獲得電泳譜圖。抗體製劑純度可以計算為IgG主峰的峰面積占所有峰面積之和的百分比。關於CE-SDS法的進一步描述，可以參見例如Richard R.等，Application of CE SDS gel in development of biopharmaceutical antibody-based products,Electrophoresis,2008,29,3612-3620。

尺寸排阻高效液相色譜法，即SEC-HPLC法，是用於單株抗體標準和質控的另一重要方法。該方法主要依據分子的尺寸大小或流體動力學半徑差異來進行分子的分離。藉由SEC-HPLC，抗體可以分離出三種主要形式：高分子量形式(HMMS)、主峰(主要是抗體單體)、和低分子量形式(LMMS)。抗體純度可以計算為色譜圖上主峰面積占所有峰面積之和的百分比。藉由SEC-HPLC法，可以測量製劑產品中抗體單體的百分數，給出可溶性聚集物和剪切物的含量信息。關於SEC-HPLC法的進一步描述，可以參見例如，J.Pharm.Scien.,83：1645-1650,(1994)；Pharm.Res.,11：485(1994)；J.Pharm.Bio.Anal.,15：1928(1997)；J.Pharm.Bio.Anal.,14：1133-1140(1986)。此外，也可以參見例如，R.Yang等，High resolution separation of recombinant monoclonal antibodies by size exclusion ultra-high performance liquid chromatography(SE-UHPLC),Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis(2015),http：//dx.doi.org/10.1016/j.jpba.2015.02.032；和Alexandre Goyon等，Protocols for the analytical characterization of therapeutic monoclonal antibodies.I-Non-denaturing chromatographic techniques,Journal of Chromatography，http：//dx.doi.org/10.1016/j.jchromb.2017.05.010。

成像毛細管等電聚焦電泳(iCIEF)可以用於分析單株抗體的電荷異質性。該方法可以提供電荷變異體的定量分佈情況。iCIEF基於分子在pH梯度中的電荷差異(表觀pI值)來實現分子分離的目的。在iCIEF中，分離柱通常是短毛細管(例如，5cm長，100μm內徑的二氧化矽毛細管)，蛋白質在高電壓下在毛細管柱中聚焦，並藉由在280nM操作的全柱成像檢測系統對聚焦進行實時在線監測。該技術的一個優點是，可以藉由該全柱檢測系統同時記錄抗體樣品的各種電荷變異體。一般而言，在icIEF中，將樣品與尿素和icIEF緩衝液混合，其中所述緩衝液含有甲基纖維素、pI分子量標準和ampholytes。然後，可以在iCIEF分析儀例如iCE280分析儀(Protein Simple,Santa Clara,CA)上，使用iCIEF柱例如ProtionSimple組裝的iCIEF柱，在樣品聚焦一定時間後，測定280nm的吸光度，獲得聚焦mAb電荷變異體的譜圖。在iCEIF譜圖中，在主峰(即主成分)之前洗脫的蛋白相關峰被分類為酸性組分；相對地，在主峰之後洗脫的蛋白相關峰被分類為鹼性組分。主成分、酸性組分和鹼性組分的相對量可以表示為占總峰面積的百分數。關於iCIEF的進一步描述，可以參見例如，Salas-Solano O等，Robustness of iCIEF methodology for the analysis of monoclonal antibodies：an interlaboratory study,J Sep Sci.2012 Nov；35(22)：3124-9.doi：10.1002/jssc.201200633.Epub 2012 Oct 15；和Dada OO等，Characterization of acidic and basic variants of IgG1 therapeutic monoclonal antibodies based on non-denaturing IEF fractionation,Electrophoresis.2015 Nov；36(21-22)：2695-2702.doi：10.1002/elps.201500219.Epub 2015 Sep 18.

也可以藉由陽離子交換高效液相色譜法(CEX-HPLC)測定抗體製劑中抗體的電荷變異體。在該測定法中，以比主峰的保留時間更早從CEX-HPLC柱洗脫出的峰被標記為“酸性峰”，而那些以比主峰的保留時間更晚從CEX-HPLC柱洗脫出的峰被標記為“鹼性峰”。

加速穩定性研究可以用於檢查產品的穩定性性質，有利於篩選穩定藥物製劑形式。例如，可以將製劑樣品放置於升高的溫度，例如約40℃±2℃、25℃±2℃條件下進行加速穩定性研究。檢測指標可以包括外觀、可見異物、蛋白含量、濁度、純度(SEC-HPLC法、非還原型CE-SDS法)和電荷變異體(iCIEF法)。

可以進行振盪試驗，考察製劑的振盪/剪切穩定性。例如，將製劑樣品分裝至西林瓶，加塞軋蓋後放樣，進行振盪試驗，例如650r/min振盪3-5天，之後檢測製劑的外觀、蛋白含量、濁度和純度。

此外，可以檢測抗體的功效或生物活性。例如，可以檢測製劑中抗體與其抗原的結合能力。本領域技術人員已知多種方法可以用於定量抗體與抗原的特異性結合，例如免疫測定試驗，ELISA等。

本發明的抗CD47抗體製劑是穩定的。在一個實施方案中，於約25℃、37℃、40℃、或45℃儲存至少1個月或2個月後，例如，在40℃±2℃儲存1個月後，本發明的抗體製劑中的抗CD47抗體純度是至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%以上，如藉由尺寸排阻色譜法或藉由非還原型CS-SDS所測定。在一個實施方案中，於約25℃、37℃、40℃、或45℃儲存至少1個月或2個月後，例如，在40℃±2℃儲存1個月後，本發明的抗體製劑中抗CD47抗體的至少50%，較佳至少55%是非鹼性及非酸性形式(亦即，主峰或主要電荷形式)，如藉由成像毛細管聚焦電泳法所測定。

IV．製劑的用途

本發明的包含抗CD47抗體的本發明的抗體製劑可以用於治療、改善或預防多種CD47相關疾病或病症。“CD47相關疾病或病症”在本文中指可以用本發明抗CD47抗體進行治療(例如改善)或預防的疾病或病症。任何可以得益於本發明抗體治療的疾病或病症都適用於本發明。

CD47是一個多能分子，在腫瘤細胞逃避免疫監視過程中扮演重要角色。阻斷CD47信號通路能夠有效激發巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬作用，從而用於腫瘤免疫治療。因此，包含抗CD47抗體的本發明製劑尤其可用於治療、改善或預防CD47相關癌症。所述癌症包括例如但不限於：各種血液腫瘤和實體瘤，例如白血病，包括急性髓樣白血病，B淋巴細胞慢性白血病和急性淋巴細胞白血病；非霍奇金淋巴瘤；骨髓瘤；平滑肌肉瘤；星形細胞瘤；乳腺癌；卵巢癌；膠質母細胞瘤。參見例如，國際腫瘤學雜誌，2013年11月40卷第11期，817-819頁。在一些實施方案中，本發明的抗體製劑用於治療、改善或預防與CD47相關的淋巴瘤，例如伯基特淋巴瘤。

本發明也提供本發明的製劑在製備藥物中的用途，其中所述藥物用於向哺乳動物遞送抗CD47抗體，或用於治療、預防或改善上述疾病和病症中的一種或多種。較佳地，哺乳動物是人。

可以以多種途徑將本發明的抗體製劑施用於受試者或患者。例如，施用可以藉由輸注或藉由注射器進行。因此，在一個方面，本發明提供了一種遞送裝置(例如注射器)，其包括本發明的抗體製劑(例如，預填裝注射器)。患者將接受有效量的抗CD47抗體作為主要活性成分，即足以治療、改善或預防目的疾病或病症的量。

治療效果可包括減少生理症狀。用於任何特定受試者的抗體的最佳有效量和濃度將取決於多種因素，包括患者的年齡、體重、健康狀況和/或性別、疾病的性質和程度、特定抗體的活性，身體對其清除率，並且也包括與所述抗體製劑組合施用的任何可能的其它治療。對於具體的情況，所遞送的有效量可以在臨床醫師的判斷範圍內來確定。取決於待治療的適應症，有效劑量可為約0.005mg/kg體重至約50mg/kg體重，或約0.1mg/kg體重至約20mg/kg體重。在這方面，已知的基於抗體的藥物的應用可以提供一定的指導。劑量可以是單劑量方案或多劑量方案。

描述以下實施例以輔助對本發明的理解。不意在且不應當以任何方式將實施例解釋成限制本發明的保護範圍。

實施例

為了開發出重組全人源抗分化抗原簇47(CD47)單株抗體注射液長期穩定儲存的製劑處方，確保產品在有效期內(至少24個月)的質量可控，設計了處方前和處方篩選兩個階段的試驗。試驗所用材料和方法如下：

材料和方法

1.1.製劑研究中使用的化學品

1.2.使用的儀器設備

1.3．製劑穩定性的檢測項目和檢測方法

對抗體製劑檢測了以下項目：(1)檢測外觀以及是否存在可見異物；(2)藉由紫外法(UV法)測定製劑中的蛋白質含量；(3)藉由OD350nm法檢測製劑的濁度；(4)藉由尺寸排阻高效液相色譜法(SEC-HPLC)測定抗體製劑的純度，表示為主峰的面積占所有峰面積之和的百分數；(5)藉由非還原型十二烷基硫酸鈉毛細管電泳(非還原型CE-SDS)測定抗體製劑的純度，表示為主峰的面積占所有峰面積之和的百分數；(6)藉由成像毛細管等電聚焦電泳法(icIEF法)測定抗體製劑中電荷變異體，表示為主成分、酸性組分和鹼性組分的百分數。

蛋白含量測定

使用紫外分光光度計(日本島津生產，型號UV-1800)測定樣品中的蛋白質含量。

濁度測定

使用多通道微量分光光度計(美國Thermo生產，型號Nanodrop8000)，測定樣品在350nm的吸光度，確定樣品濁度。

可見異物檢測

按照國家藥典委員會，中華人民共和國藥典(2015年版，四部通則0904“可見異物檢查法”).北京：中國醫藥科技出版社.2015中所記載的方法，採用澄明度檢測儀(天津天大天發生產，型號YB-2)，檢查樣品中的可見異物。

尺寸排阻高效液相色譜法(SEC-HPLC)法

在用於分析抗體製劑的SEC-HPLC法中，可以使用以下參數：

色譜柱：TSK-gel SuperSW mAb HR(7.8×300mm，4μm)型分析柱，TSK-gel SuperSW(6.0×40mm，4μm)保護柱

流動相：20mmol/L磷酸緩衝液+200mmol/L NaCl，pH6.8

流速：0.5ml/min

柱溫度：25℃

檢測波長：280nm

進樣體積：50μl

進樣盤溫度：約10℃

運行時間：30分鐘

上樣濃度：2.0mg/mL

非還原型十二烷基硫酸鈉毛細管電泳(CE-SDS)法

可以按如下進行非還原型CE-SDS測定：將大約2μl的樣品(蛋白含量：1mg/ml)加入14ul非還原型樣品Buffer(包括取700ul pH 6.5樣品緩衝液，加入31.3ul 250mM NEM(N-乙基順丁烯二醯亞胺))，再加28ul超純水，混勻，之後在70℃孵育10分鐘。孵育後，樣品冷卻至室溫，然後轉移至96孔板中。CE-SDS分離在LabChip GXIITouch(PerkinElmer)上進行，使用Protein芯片。分析方法選擇HT Antibody Analysis 200，樣品盤類型選擇BioRad 96 HSP-96xx(Sip 4mm)。藉由螢光監測蛋白遷移。

成像毛細管等電聚焦電泳法(icIEF法)

可以如下進行icIEF檢測：將抗體樣品稀釋(或脫鹽)至大約1mg/ml。取20μl樣品加入78μl icIEF緩衝液，所述緩衝液含有尿素、精胺酸(Protein Simple)、pI marker標準(Protein Simple,Santa Clara,CA)和Pharmalytes(GE Healthcare Bio-Science,Pittsburgh,PA)。在Maurice C.分析儀(Protein Simple,Santa Clara,CA)上，使用FC塗層iCIEF柱，產生成像毛細管等電聚焦譜圖。樣品聚焦總共8分鐘，使用Empower版本3軟體(Waters,Milford,MA)，對280nm聚焦蛋白的吸光度進行積分。

實施例1.製備和純化抗CD47抗體

根據CN201710759828.9所述製備和純化了抗CD47抗體ADI-26630。該抗體由SEQ ID NO：9的重鏈序列和SEQ ID NO：10的輕鏈序列組成，為IgG4型抗體。簡言之，抗體在CHO細胞中重組表達並進行純化。對於用於處方前試驗的樣品，藉由CEX(陽離子交換色譜)純化，樣品具有12.2mg/ml的蛋白含量。對於用於處方篩選試驗的樣品，藉由CEX(陽離子交換色譜)純化獲得15.7mg/ml的蛋白含量後，藉由滲濾濃縮至100mg/ml。

實施例2.處方前試驗

2.1.pH影響試驗

2.1.1 pH影響試驗步驟

配製10mM組胺酸，5%山梨醇緩衝液，分別將pH調節為5.0、5.5、6.0和6.5。用配製完成的各個pH緩衝液分別對小試樣品進行超濾置換。置換完成後，將各樣品的濃度稀釋至20mg/ml。過濾分裝至西林瓶，加塞軋蓋後放樣，進行40℃加速穩定性試驗。具體試驗方案見表1。

2.1.2 判斷標準

根據對產品的認識以及儀器和方法的精密度，設定了樣品檢測指標數值與初始值相比質量未發生變化的判定標準，用以判斷樣品是否發生了變化，具體見表2。

2.1.3 pH影響試驗結果

(1)外觀

在40℃±2℃的條件下放置1月，各組樣品外觀均合格。

(2)蛋白含量

在40℃±2℃條件下，各組樣品的蛋白含量均未發生變化(見表3)。

(3)濁度

在40℃±2℃條件下，各組樣品的濁度均升高，且pH越高，變化速率越快(見表4、第1圖)。

(4)純度

純度(SEC-HPLC法)：40℃±2℃條件下加速1個月，pH5.0、pH5.5、pH6.0各樣品的純度均未發生明顯變化，pH6.5條件下，樣品純度下降，變化原因主要是在加速後發生聚集。且隨著pH升高，樣品初始純度有降低趨勢。(見表5、第2圖至第3圖)。

純度(非還原型CE-SDS法)：40℃±2℃條件下加速1個月，各pH條件下樣品的純度均未發生明顯變化。(見表6)。

pH影響試驗結果表明隨著pH升高，樣品濁度變化速率越快；pH6.5時，樣品純度降低，發生聚集。綜合以上結果，pH 5.0~6.0間產品穩定性良好。

2.2.表面活性劑影響試驗

2.2.1 表面活性劑影響試驗步驟

配製10mM組胺酸，5%山梨醇，pH6.0緩衝液，超濾置換小試樣品，濃度稀釋至20mg/ml後，分別不添加聚山梨酯20以及加入終濃度為0.3mg/ml聚山梨酯20。過濾分裝至西林瓶，加塞軋蓋後放樣，進行振盪試驗。檢測項目包括外觀、蛋白含量、濁度和純度(SEC-HPLC法、非還原型CE-SDS法)。具體試驗方案見表7。

2.2.2 判斷標準

見2.1.2節。

2.2.3 表面活性劑影響試驗結果

650r/min振盪3天，不添加聚山梨酯20的樣品發生混濁，其他檢測項目均不再進行檢測；添加0.3mg/ml聚山梨酯20樣品振盪5天各檢測結果均無變化，表明聚山梨酯20能夠保證製劑具有良好的振盪穩定性。具體結果見表8。

綜合處方前研究結果，將製劑處方定為組胺酸-鹽酸組胺酸緩衝體系，選定pH為5.5，表面活性劑為聚山梨酯20，在此基礎上進行接下來的處方篩選試驗。

實施例3.處方篩選試驗

3.1 穩定劑篩選試驗

3.1.1 穩定劑篩選試驗步驟

共設計了4個處方，詳細處方信息見表9。按照表9配製各個處方的緩衝液，將抗體蛋白超濾置換到各自的處方溶液中。置換完成後，將各處方蛋白濃度稀釋至約120mg/ml，並加入聚山梨酯20，使終濃度為0.3mg/ml。過濾分裝至西林瓶，加塞軋蓋後在40℃±2℃、25℃±2℃條件下進行加速穩定性考察。檢測指標為外觀、可見異物、蛋白含量、濁度、純度(SEC-HPLC法、非還原型CE-SDS法)和電荷變異體(iCIEF法)。

詳細試驗條件及取樣計劃見表10。

3.1.2 判定標準

根據對產品的認識以及儀器和方法的精密度，設定了樣品檢測指標數值與初始值相比質量未發生變化的判定標準，用以判斷樣品是否發生了變化，具體見表11。

3.1.3 穩定劑篩選試驗結果

(1)外觀、可見異物

在40℃±2℃的條件下觀察至1個月，25℃±2℃條件下觀察至2個月，四組處方外觀、可見異物均合格。

(2)蛋白含量

在40℃±2℃和25℃±2℃條件下，4組處方的蛋白含量均未發生變化(見表12)。

(3)純度

純度(SEC-HPLC法)：40℃±2℃條件下1個月，處方1(山梨醇)純度未發生明顯變化，其餘處方均超出了擬定的判斷標準，主要表現為聚體增多，但增長幅度均<2%；在25℃±2℃條件下，各處方純度沒有發生明顯變化。詳見表13、第4圖。

純度(非還原型CE-SDS法)：40℃±2℃條件下，各處方純度均有下降趨勢，處方間無差異；25℃±2℃條件下，各處方純度沒有發生明顯變化。詳見表14、第5圖。

(4)電荷變異體

40℃±2℃和25℃±2℃條件下，各處方電荷變異體-酸性組分和主成分均發生明顯變化，鹼性組分變化較小，各處方間趨勢一致，無明顯差異，且變化幅度均可接受。(見表15、第6圖至第7圖)

從純度(SEC-HPLC法)的檢測結果看，山梨醇有優勢，能夠更有效抑制蛋白在40℃高溫下聚體的產生，其他檢測項無明顯差別；考慮到有文獻報道精胺酸能降低高濃度蛋白產品的粘度(Borwankar A U,Dear B J,Twu A,et al.Viscosity reduction of a concentrated monoclonal antibody with arginine．HCl and arginine．glutamate[J].Industrial & Engineering Chemistry Research,2016,55(43)：11225-11234.)，故選取山梨醇和精胺酸的穩定劑組合處方用於下一輪抗氧化劑的考察。

3.2 抗氧化劑試驗

3.2.1 抗氧化劑試驗步驟

將樣品分為兩份，一份加入EDTA-2Na使終濃度為0.01mg/ml；另一份不添加EDTA-2Na。各處方蛋白濃度為約100mg/ml。過濾分裝至西林瓶，加塞軋蓋後在40℃±2℃條件下進行加速穩定性考察，於1週、2週和1月取樣檢測。檢測指標為外觀、可見異物、蛋白含量、濁度、純度(SEC-HPLC法、非還原型CE-SDS法)和電荷變異體(iCIEF法)。

3.2.2 判定標準

見3.1.2節。

3.2.3 抗氧化劑試驗結果

在40℃±2℃條件下考察1個月，兩個處方樣品的外觀、可見異物、蛋白含量、純度(SEC-HPLC法)均未發生變化；兩個處方樣品的濁度均升高，變化速率保持一致；純度(非還原型CE-SDS法)1個月均降低2.1%；電荷變異體-主成分降低，酸性組分升高，變化速率保持一致。具體見表17、第8圖和第9圖。

各檢測指標數據表明兩個處方均有良好的穩定性，且處方間無差異，即是否添加EDTA-2Na對產品穩定影響不大。從處方簡單化和安全化出發，最終選定處方B作為抗體製劑的最終處方。

結論

綜合上述各個試驗結果，抗體蛋白在pH 5.0~6.0時表現穩定；表面活性劑聚山梨酯20能夠保證產品具有良好的振盪穩定性；穩定劑中山梨醇效果較好，能更有效抑制蛋白在40℃高溫下聚體的產生；高溫抗氧化試驗發現處方中無需添加EDTA-2Na；另外，加入適量精胺酸能降低高濃度蛋白產品的粘度。由此，確定較佳的製劑方案為：100mg/ml重組全人源抗分化抗原簇47(CD47)單株抗體、0.4mg/ml組胺酸、1.5mg/ml鹽酸組胺酸、15.0mg/ml山梨醇、21.1mg/ml鹽酸精胺酸、0.3mg/ml聚山梨酯20，pH 5.5。

以上描述了本發明的示例性實施方案，本領域技術人員應當理解的是，這些公開內容僅是示例性的，在本發明的範圍內可以進行各種其它替換、適應和修改。因此，本發明不限於文中列舉的具體實施方案。

<110> 信達生物製藥(蘇州)有限公司

<120> 包含抗CD47抗體的製劑及其製備方法和用途

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 抗體序列

<400> 1

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Claims

一種具有pH為5.0-6.0的液體抗體製劑，該液體抗體製劑包含(i)抗CD47抗體；(ii)緩衝劑，(iii)穩定劑，和(iv)表面活性劑，其中，該緩衝劑為組胺酸緩衝劑；該穩定劑選自山梨醇、蔗糖、海藻糖、精胺酸及其組合；該表面活性劑選自聚山梨酯-20、聚山梨酯-80、聚山梨酯-60、和聚山梨酯-40；其中，該抗CD47抗體包含：-SYYWS(SEQ ID NO：11)的重鏈VH CDR1；-YIYYSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO：4)的重鏈VH CDR2；-GKTGSAA(SEQ ID NO：12)的重鏈VH CDR3；-RASQGISRWLA(SEQ ID NO：6)的輕鏈VL CDR1；-AASSLQS(SEQ ID NO：7)的輕鏈VL CDR2；和-QQTVSFPIT(SEQ ID NO：8)的輕鏈VL CDR3。
如申請專利範圍第1項所述的液體抗體製劑，其中該液體抗體製劑中的抗CD47抗體的濃度為10-120mg/mL。
如申請專利範圍第1項所述的液體抗體製劑，其中該緩衝劑的濃度為5-100mM。
如申請專利範圍第1項所述的液體抗體製劑，其中該液體抗體製劑包含山梨醇作為穩定劑，該山梨醇以10-80mg/ml的量存在。
如申請專利範圍第1項所述的液體抗體製劑，其中該液體抗體製劑包含山梨醇和精胺酸的穩定劑組合，該山梨醇的量為10-30mg/ml且該精胺酸的量為80-110mM。
如申請專利範圍第1項所述的液體抗體製劑，其中該液體抗體製劑中的表面活性劑為聚山梨酯-20。
如申請專利範圍第1項所述的液體抗體製劑，其中該表面活性劑的濃度為0.1-1mg/ml。
如申請專利範圍第1項所述的液體抗體製劑，其中該液體製劑不包含依地酸(EDTA)或其鹽。
如申請專利範圍第1項所述的液體抗體製劑，其中該抗CD47抗體包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，其中重鏈可變區包含SEQ ID NO：1的序列或與其具有至少90%同一性的序列，且輕鏈可變區包含SEQ ID NO：2的序列或與其具有至少90%同一性的序列。
如申請專利範圍第1項所述的液體抗體製劑，其中該抗CD47抗體是IgG4型抗體。
如申請專利範圍第1項所述的液體抗體製劑，其中該抗CD47抗體包含SEQ ID NO：9或與之具有至少90%同一性的重鏈序列以及SEQ ID NO：10或與之具有至少90%同一性的輕鏈序列。
如申請專利範圍第1項所述的液體抗體製劑，其中該抗CD47抗體在CHO細胞中重組表達。
如申請專利範圍第1項所述的液體抗體製劑，其中該液體製劑為用於皮下或靜脈注射的注射劑。
如申請專利範圍第1項所述的液體抗體製劑，包含：(i)90-120mg/ml的抗CD47抗體；(ii)10-20mM組胺酸緩衝劑；(iii)20-60mg/ml山梨醇，或5-40mg/ml山梨醇和80-110mM精胺酸的組合，和(iv)0.1-0.4mg/ml的聚山梨酯-20；其中所述液體製劑的pH為pH5.5±0.2。
如申請專利範圍第1至14項中任何一項所述的液體抗體製劑，其包含：(i)100mg/mL的抗CD47抗體；(ii)0.4mg/ml組胺酸和1.5mg/ml鹽酸組胺酸；(iii)15.0mg/ml山梨醇和21.1mg/ml鹽酸精胺酸，和(iv)0.3mg/ml的聚山梨酯-20；其中所述液體製劑的pH為5.5。
如申請專利範圍第1項所述的液體抗體製劑，其中，該製劑在2-8℃儲存至少24個月後，或在室溫儲存至少3個月後，或在40℃±2℃儲存1個月後，是穩定的，且具有如下特徵之一或多項：(i)藉由SEC測量，製劑中抗體單體的百分數大於90%，且聚體增幅不超過2%；(ii)藉由非還原型CE-SDS測量，製劑具有大於90%的純度； (iii)藉由iCIEF測量，相對於儲存第0天的初始值，製劑中抗CD47抗體的至少50%是非鹼性及非酸性形式，且其中該抗體的酸性組分電荷變異體的增加不超過20%。
一種固體抗體製劑，其藉由固化申請專利範圍第1至16項中任何一項所述的液體抗體製劑而獲得。
一種遞送裝置，其包含申請專利範圍第1至16項中任何一項所述的液體抗體製劑或申請專利範圍第17項所述的固體抗體製劑。
一種預填裝注射器，其包含如申請專利範圍第1至16項中任何一項所述的液體抗體製劑或申請專利範圍第17項所述的固體抗體製劑，用於靜脈內注射或者肌內注射。
一種申請專利範圍第1至16項中任何一項所述的液體抗體製劑或申請專利範圍第17項所述的固體抗體製劑的用途，用於製備在受試者中誘導抗腫瘤活性或抗癌症活性的藥物。
如申請專利範圍第20項所述的用途，其中，該腫瘤或癌症選自急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴細胞白血病(ALL)、慢性淋巴細跑性白血病(CLL)、多發性骨髓瘤(MM)、淋巴瘤、乳腺癌、頭頸癌、胃癌、肺癌、食管癌、腸癌、卵巢癌、宮頸癌、肝癌、腎癌、胰腺癌、膀胱癌、結直腸癌、神經膠質瘤和黑素瘤。