TW202400653A - 一種含抗cd47抗體或其抗原結合片段的製劑及其製備方法和應用 - Google Patents

一種含抗cd47抗體或其抗原結合片段的製劑及其製備方法和應用 Download PDF

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Abstract

本發明公開了一種含抗CD47抗體或其抗原結合片段的製劑及其製備方法和應用，本發明的抗CD47抗體能有效阻斷CD47與SIRPα結合，但其與紅細胞表現出極弱水準結合，展現出與CD47陽性腫瘤細胞的靶向特異性，本發明的製劑具有較高穩定性。

Description

一種含抗CD47抗體或其抗原結合片段的製劑及其製備方法和應用
本發明涉及生物製劑領域，具體而言，涉及一種含抗CD47抗體或其抗原結合片段的製劑及其製備方法和應用。
優先權聲明
本申請請求2022年06月21日向中國國家智慧財產權局提交的、專利申請號為202210709122.2，發明名稱為“一種含抗CD47抗體或其抗原結合片段的製劑及其製備方法和應用”的專利申請的優先權和權益，並且通過參照將其全文併入本申請。
癌症免疫療法是近年來生物科學領域的重頭大戲，基於T細胞的CTLA4抗體、PD-1抗體、PD-L1抗體等的免疫檢查點抑制劑療法和CAR-T、TCR-T等細胞療法皆是近年來大熱的免疫療法。這些都是圍繞如何恢復T細胞功能來進行，換言之，主要圍繞如何提高獲得性免疫系統能力。但是，以免疫檢查點（checkpoint）為靶點，啟動T細胞功能，以提高獲得性免疫系統的能力，進而攻克癌症的道路仍充滿曲折。固有免疫系統在腫瘤免疫治療中的作用長期沒有得到發揮。事實上，在整個腫瘤浸潤區域，巨噬細胞在腫瘤組織約占50%，更重要的是巨噬細胞的數量同腫瘤的預後呈現反向聯繫，這進一步說明巨噬細胞在腫瘤中有很重要的作用。巨噬細胞發揮吞噬效應需要兩個訊號同時起作用：一個是靶向細胞表面的“吃我”訊號的啟動，另一個是相同目標表面“別吃我”訊號的失活。任何一個訊號的缺少都不足以引發吞噬效應的發生。越來越多的證據表明，CD47是一類“別吃我”訊號，它通過與巨噬細胞表面的訊號調節蛋白α（Signal regulatory proteinα，SIRPα）相互結合抑制巨噬細胞的吞噬作用。腫瘤細胞也可以通過CD47的表達逃避巨噬細胞吞噬作用（例如參見EP2242512及其中引用的相關文獻）。
CD47也稱為整聯蛋白相關蛋白（IAP），是具有氨基末端的免疫球蛋白結構域和羧基末端的多重跨膜區的50kDa膜蛋白。它與多種配體相互作用，包括但不限於單調節蛋白α（SIRPα），SIRPγ，整聯蛋白和血小板反應蛋白-1（TSP-1）。SIRPα主要在骨髓細胞上表達，包括巨噬細胞，骨髓樹突細胞（DC），粒細胞，肥大細胞及其前體（前體包括造血幹細胞）。CD47/SIRPα相互作用傳遞“不要吃我”訊號，抑制自體吞噬作用。對患者腫瘤和匹配的鄰近正常（非腫瘤）組織的分析顯示，CD47蛋白在癌細胞上過表達，這有效地說明它們逃避先天免疫監視和消除。阻斷CD47-SIRPα與抗CD47抗體的相互作用已經顯示出有效誘導體外腫瘤細胞的吞噬作用並抑制體內各種血液和實體腫瘤的生長。因此，CD47是癌症治療的有效靶標，並且需要其適當的拮抗劑來製備人類治療劑。
鑒於此，特提出本發明。
本發明的目的在於提供一種含抗CD47抗體或其抗原結合片段的製劑及其製備方法和應用。
本發明是這樣實現的：
第一方面，本發明實施例提供了一種含抗CD47抗體或其抗原結合片段的製劑，其包括以下組分：抗CD47抗體或其抗原結合片段、緩衝液和輔料。所述抗體或其抗原結合片段含有以下CDRs：如SEQ ID NO:1或與SEQ ID NO:1具有至少95%同源性的氨基酸序列所示的LCDR1，如SEQ ID NO:2或與SEQ ID NO:2具有至少95%同源性的氨基酸序列所示的LCDR2，如SEQ ID NO:3或與SEQ ID NO:3具有至少95%同源性的氨基酸序列所示的LCDR3，如SEQ ID NO:10或與SEQ ID NO:10具有至少95%同源性的氨基酸序列所示的HCDR1，如SEQ ID NO:11或與SEQ ID NO:11具有至少95%同源性的氨基酸序列所示的HCDR2，如SEQ ID NO:12或與SEQ ID NO:12具有至少95%同源性的氨基酸序列所示的HCDR3；按組分在所述製劑中的重量體積百分數計，所述輔料包括：1%~20%的糖類和0.01%~0.5%的表面活性劑。
第二方面，本發明實施例提供了如前述實施例所述的含抗CD47抗體或其抗原結合片段的製劑的製備方法，其包括：將所述製劑的組分混合。
第三方面，本發明實施例提供了如前述實施例所述的製劑在製備用於防治CD47陽性腫瘤的產品中的應用。
第四方面，本發明實施例提供了一種含抗CD47抗體或其抗原結合片段的凍乾製劑，其由如前述實施例所述的製劑冷凍乾燥後獲得。
第五方面，本發明實施例提供了一種含抗CD47抗體或其抗原結合片段的製劑，其由如前述任意實施例所述的凍乾製劑複溶後獲得。
本發明具有以下有益效果：
本申請創新性發明了一種含有抗CD47抗體或抗CD47抗體片段的製劑，該製劑中包含的抗CD47抗體或抗CD47抗體片段在體外未發生紅細胞血凝集，其與紅細胞表現出極弱水準的低結合或不結合；且該抗體能有效阻斷CD47與SIRPα結合，啟動介導巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬活性，展現出與CD47陽性腫瘤細胞的靶向特異性，具有高效、安全性好、無藥物副作用等優點。
此外，製劑中其他組分及其配比都是發明人經一系列創造性勞動後提出並驗證的，適用於搭配上述抗CD47抗體或抗CD47抗體片段使用，能夠有效維持抗CD47抗體或抗CD47抗體片段的功能，延長其使用期限，具有較高穩定性，為抗CD47抗體的相關研究和應用提供了途徑。
為使本發明實施例的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或製造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。
以下結合實施例對本發明的特徵和性能作進一步的詳細描述。
具體地，本發明實施例提供了一種含抗CD47抗體或其抗原結合片段的製劑，其包括以下組分：抗CD47抗體或其抗原結合片段、緩衝液和輔料。
在本發明中，“抗體或其抗原結合片段”此技術術語是結合特定抗原的蛋白，其泛指包含互補決定區（CDR區）的蛋白及蛋白片段。“抗體”指全長抗體。
術語“抗原結合片段”是包含抗體CDR的物質，其缺乏至少一些存在於全長鏈中的氨基酸但仍能夠特異性結合至抗原。此類片段具生物活性，因為其結合至靶抗原，且可與其他抗原結合分子(包括完整抗體)競爭結合至給定表位。在一些實施方式中，抗原結合片段具有特異性識別並結合CD47的作用。在一些實施方式中，抗原結合片段是具有阻斷CD47與其配體結合，啟動免疫細胞功能的片段，在一個方面中，此類片段選自Fab(由完整的輕鏈和Fd構成)，Fv(由VH和VL構成)，ScFv(單鏈抗體，VH和VL之間由一連接肽連接而成)或單域抗體(僅由VH組成)。所述片段可通過常規方法製備獲得，例如可通過重組核酸技術產生，或可通過抗原結合分子(包括完整抗體)的酶裂解或化學裂解產生。
術語“互補性決定區”或“CDR”是指免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的高度可變區。有三種重鏈CDR和三種輕鏈CDR。術語“CDR”和“CDRs”用於指包含一種或多種或者甚至全部的對抗體或其抗原結合片段與其識別的抗原或表位的結合親和力起作用的主要氨基酸殘基的區域。
在本發明中，重鏈的互補決定區用HCDR表示，輕鏈的互補決定區用LCDR表示。本領域常用的CDR標示方法包括：Kabat編號方案、IMGT編號方案、Chothia和Lesk編號方案以及1997年Lefranc等人為免疫球蛋白超家族的所有蛋白質序列引入的新的標準化編號系統。Kabat編號方案通常被認為是編號抗體殘基廣泛採用的標準。在本發明具體實施例中，採用Kabat注釋標準標示CDR區，但其他方法標示的CDR區也屬於本發明的保護範圍。在一些實施例中，所述抗體或其抗原結合片段含有以下CDRs：如SEQ ID NO:1或與SEQ ID NO:1具有至少95%同源性的氨基酸序列所示的LCDR1，如SEQ ID NO:2或與SEQ ID NO:2具有至少95%同源性的氨基酸序列所示的LCDR2，如SEQ ID NO:3或與SEQ ID NO:3具有至少95%同源性的氨基酸序列所示的LCDR3，如SEQ ID NO:10或與SEQ ID NO:10具有至少95%同源性的氨基酸序列所示的HCDR1，如SEQ ID NO:11或與SEQ ID NO:11具有至少95%同源性的氨基酸序列所示的HCDR2，如SEQ ID NO:12或與SEQ ID NO:12具有至少95%同源性的氨基酸序列所示的HCDR3，序列資訊如下。
SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:3
KSSQSLLNSRTRKNYLA WASTRES KQSYNLRT
SEQ ID NO:10 SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:12
SNWMN MIHPSDSETRLNQKFKD GTTVVDAFAY
在一些實施例中，與SEQ ID NO:1具有至少95%同源性的氨基酸序列包括但不限於KSSQSLLNTRTRKNYLA（SEQ ID NO:21）。與SEQ ID NO:11具有至少95%同源性的氨基酸序列包括但不限於MIHPSDSETRLNQKFQG（SEQ ID NO:22）。 在一些實施例中，所述抗體或其抗原結合片段包括：如SEQ ID NO:1所示的LCDR1，如SEQ ID NO:2所示的LCDR2，如SEQ ID NO:3所示的LCDR3，如SEQ ID NO:10所示的HCDR1，如SEQ ID NO:11所示的HCDR2，和如SEQ ID NO:12所示的HCDR3；或者所述抗體或其抗原結合片段包括：如SEQ ID NO:21所示的LCDR1，如SEQ ID NO:2所示的LCDR2，如SEQ ID NO:3所示的LCDR3，如SEQ ID NO:10所示的HCDR1，如SEQ ID NO:11所示的HCDR2，和如SEQ ID NO:12所示的HCDR3；或者所述抗體或其抗原結合片段包括：如SEQ ID NO:1所示的LCDR1，如SEQ ID NO:2所示的LCDR2，如SEQ ID NO:3所示的LCDR3，如SEQ ID NO:10所示的HCDR1，如SEQ ID NO:22所示的HCDR2，和如SEQ ID NO:12所示的HCDR3。
在一些實施例中，按組分在所述製劑中的重量體積百分數（w/v）計，所述輔料包括：1%~20%的糖類和0.01%~0.5%的表面活性劑。
本發明提供了抗CD47抗體或其抗原結合片段，該抗體在體外未發生紅細胞血凝集，更難能可貴的是與紅細胞表現出極弱水準的低結合或不結合；能夠有效地阻斷CD47與SIRPα結合、啟動介導巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬活性，展現出了顯著的與CD47陽性腫瘤細胞的靶向特異性，親和力高、特異性強，不會引起紅細胞凝集，且與人類紅細胞、血小板表現出極弱的結合，安全性好。
本發明實施例提供的製劑組合是發明人經一系列創造性勞動，提出並驗證的組合配方，有利於使得上述抗CD47抗體或其抗原結合片段穩定而有效地發揮其作用，有效阻斷CD47與SIRPα結合，使得抗CD47抗體能更好的應用於臨床。
在一些實施例中，表面活性劑的重量體積百分數可以為0.01%、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.1%、0.12%、0.14%、0.16%、0.18%、0.2%、0.22%、0.24%、0.26%、0.28%、0.3%、0.32%、0.34%、0.36%、0.38%、0.4%、0.42%、0.44%、0.46%、0.48%、0.5%中的任意一種或任意兩種之間的範圍。例如，表面活性劑的重量體積百分數0.02%，也即0.02%（w/v）,表示每100mL體積溶液含0.02g的表面活性劑；其它依此類推，下同。
在一些實施例中，所述表面活性劑選自吐溫20（聚山梨酯-20）、吐溫80（聚山梨酯-80）和泊洛沙姆188中的任意一種。
在一些實施例中，當所述表面活性劑為吐溫80時，所述吐溫80在所述製劑中的重量體積百分數為0.01%~0.1%，優選為0.01%~0.04%，更優選為0.02%~0.04%。
當所述表面活性劑為泊洛沙姆188時，所述泊洛沙姆188在所述製劑中的重量體積百分數為0.05%~0.5%，優選為0.1%~0.2%，更優選為0.1%。
在一些實施例中，所述表面活性劑為0.02%（w/v）的吐溫80。
在一些實施例中，糖類的重量體積百分數（w/v）可以為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%中的任意一種或任意兩種之間的範圍。
在一些實施例中，所述糖類包括蔗糖和海藻糖中的至少一種。
在一些實施例中，所述糖類為蔗糖。
在一些實施例中，所述蔗糖的濃度為3%~15%，更優選為6%~10%，更進一步優選為8%。在一些實施例中，所述蔗糖在所述製劑中的重量體積百分數為8%。
在一些實施例中，所述糖類為海藻糖。
在一些實施例中，所述海藻糖的濃度為3%~15%，更優選為6%~10%，更進一步優選為8.8%。
在一些實施例中，所述糖類為8%（w/v）的蔗糖。
“緩衝液”指通過其酸-鹼共軛組分的作用而耐受pH變化的溶液。將pH控制在適當範圍中的緩衝液的例子包括但不限於：包含醋酸鹽、組氨酸、檸檬酸鹽或磷酸鹽等的緩衝液。
在一些實施例中，緩衝液為由檸檬酸一水合物與檸檬酸鈉二水合物配置而成的檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液，由L-組氨酸與L-組氨酸鹽酸鹽一水合物配置而成的組氨酸-組氨酸鹽緩衝液，由冰醋酸與三水醋酸鈉配置而成的醋酸-醋酸鈉緩衝液，或者由磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉配置而成的磷酸-磷酸鹽緩衝液；
在一些實施例中，所述緩衝液選自：檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液、醋酸-醋酸鈉緩衝液、組氨酸-組氨酸鹽緩衝液和磷酸-磷酸鹽緩衝液中的任意一種，pH為4.5~7.5，pH具體可以為4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、和7.5中的任意一種或任意兩種之間的範圍。
在一些實施例中，所述緩衝液選自檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液、組氨酸-組氨酸鹽緩衝液和磷酸-磷酸鹽緩衝液中的任意一種，pH為5.0~7.5。
優選地，所述緩衝液為組氨酸-組氨酸鹽緩衝液，pH為5.5~6.0。
優選地，所述組氨酸-組氨酸鹽緩衝液的pH為5.5。相對於其他緩衝液而言，組氨酸-組氨酸鹽緩衝液能夠更有效地使得抗體分子維持構象穩定。
在一些實施例中，組氨酸-組氨酸鹽緩衝液由L-組氨酸與L-組氨酸鹽酸鹽一水合物配置而成的組氨酸-鹽酸組氨酸緩衝液。
在一些實施例中，所述緩衝液的濃度為10~40mM，具體可以為10mM、12 mM、14 mM、16 mM、18 mM、20 mM、22 mM、24 mM、26 mM、28 mM、30 mM、32 mM、34 mM、36 mM、38 mM、40 mM中的任意一種或任意兩種之間的範圍。
優選地，所述緩衝液的濃度為15~25mM。
更優選地，所述緩衝液的濃度為20mM。
在一些實施例中，所述緩衝液為pH為6.0的20mM的組氨酸-鹽酸組氨酸緩衝液。
在一些實施例中，所述製劑還包括甲硫氨酸。
在一些實施例中，所述甲硫氨酸的濃度為1~20mM，具體可以為1mM、2 mM、4 mM、6 mM、8 mM、10 mM、12 mM、14 mM、16 mM、18 mM、20 mM中的任意一種或任意兩種之間的範圍。
優選地，所述甲硫氨酸的濃度為4.5~5.5mM。
更優選地，所述甲硫氨酸的濃度為5mM。
在一些實施例中，所述抗CD47抗體或其抗原結合片段的濃度為20~60mg/mL具體可以為20mg/mL、25 mg/mL、30 mg/mL、35 mg/mL、40 mg/mL、45 mg/mL、50 mg/mL、55 mg/mL、60 mg/mL中的任意一種或任意兩種之間的範圍。
優選地，所述抗CD47抗體或其抗原結合片段的濃度為45~55mg/mL。
更優選地，所述抗CD47抗體或其抗原結合片段的濃度為50mg/mL。
在一些實施例中，所述抗CD47抗體或其抗原結合片段包括有重鏈可變區和輕鏈可變區。
在一些實施例中，所述重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO:4～9中任一項所示或與SEQ ID NO:4～9任一項所示具有至少95%同源性的序列；所述輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO:13~18中任一項所示或與SEQ ID NO:13～18任一項所示具有至少95%同源性的序列。抗體及其重鏈可變區和輕鏈可變區對應的序列如下：
抗體名稱 VH  VL
7A11H11 SEQ ID NO：14 SEQ ID NO：5
7A11H12 SEQ ID NO：14 SEQ ID NO：6
7A11H22 SEQ ID NO：15 SEQ ID NO：6
7A11H32 SEQ ID NO：16 SEQ ID NO：6
7A11H42 SEQ ID NO：17 SEQ ID NO：6
7A11H52 SEQ ID NO：18 SEQ ID NO：6
7A11H14 SEQ ID NO：14 SEQ ID NO：8
7A11H15 SEQ ID NO：14 SEQ ID NO：9
7A11H33 SEQ ID NO：16 SEQ ID NO：7
7A11H34 SEQ ID NO：16 SEQ ID NO：8
7A11H35 SEQ ID NO：16 SEQ ID NO：9
7A11H55 SEQ ID NO：18 SEQ ID NO：9
SEQ ID NO:4所示序列如下： DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSYNLRTFGGGTKLEIK； SEQ ID NO:5所示序列如下： DIVMTQSPDSLAVSLGERATMNCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYNLRTFGGGTKLEIK； SEQ ID NO:6所示序列如下： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTMTCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYNLRTFGGGTKLEIK； SEQ ID NO:7所示序列如下： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTMTCKSSQSLLNTRTRKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYNLRTFGGGTKLEIK； SEQ ID NO:8所示序列如下： DIVMTQSPDSLAVSLGERATMNCKSSQSLLNTRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYNLRTFGGGTKLEIK； SEQ ID NO:9所示序列如下： EIVMTQSPPTLSLSPGERVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQAPRLLIYWASTRESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCKQSYNLRTFGGGTKLEIK； SEQ ID NO:13所示序列如下： QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGSSFTSNWMNWVKRRPGQGLEWIGMIHPSDSETRLNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYCARGTTVVDAFAYWGQGTLVTVSA； SEQ ID NO:14所示序列如下： QVQLVQPGAEVKKPGASVKLSCKASGSSFTSNWMNWVRQAPGQGLEWIGMIHPSDSETRLNQKFKDRATLTVDKSTSTAYMELSSPRSEDTAVYYCARGTTVVDAFAYWGQGTTVTVSS； SEQ ID NO:15所示序列如下： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGSSFTSNWMNWVRQAPGQGLEWIGMIHPSDSETRLNQKFKDRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGTTVVDAFAYWGQGTTVTVSS； SEQ ID NO:16所示序列如下: QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGSSFTSNWMNWVRQAPGQGLEWIGMIHPSDSETRLNQKFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGTTVVDAFAYWGQGTTVTVSS； SEQ ID NO:17所示序列如下: QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGSSFTSNWMNWVRQAPGQGLEWIGMIHPSDSETRLNQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGTTVVDAFAYWGQGTTVTVSS； SEQ ID NO:18所示序列如下: QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFTSNWMNWVRQAPGQGLEWIGMIHPSDSETRLNQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGTTVVDAFAYWGQGTTVTVSS。
在一些實施例中，所述抗CD47抗體或其抗原結合片段還包括恒定區。
在一些實施例中，所述恒定區包括重鏈恒定區和輕鏈恒定區，所述重鏈恒定區選自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD中的任一種；輕鏈恒定區為κ或λ鏈。
在一些實施例中，所述恒定區的種屬來源選自鼠、兔、羊、猴、或人。
在一些實施例中，所述抗CD47抗體為7A11H14抗體，7A11H14的重鏈如SEQ ID NO:19所示，輕鏈如SEQ ID NO:20所示： 7A11H14的重鏈氨基酸序列（SEQ ID NO:19）： QVQLVQPGAEVKKPGASVKLSCKASGSSFTSNWMNWVRQAPGQGLEWIGMIHPSDSETRLNQKFKDRATLTVDKSTSTAYMELSSPRSEDTAVYYCARGTTVVDAFAYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 7A11H14的輕鏈氨基酸序列（SEQ ID NO:20）： DIVMTQSPDSLAVSLGERATMNCKSSQSLLNTRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYNLRTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
在一些實施例中，所述抗體為CDR移植抗體、多聚體抗體或雙特異性抗體中的任一種或幾種。
在一些實施例中，所述抗原結合片段為F(ab’) 2、Fab、scFv和Fv中的任一種或幾種。
在一些實施方式中，所述CD47為人CD47、鼠CD47或猴CD47。
本發明提供的含抗CD47抗體或其抗原結合片段的製劑適用於申請號為“202011544262.6”、發明名稱為“一種靶向CD47的抗體及其應用”的中國申請（2020年12月23遞交）中公開的多個抗CD47抗體或其抗原結合片段。也適用於以中國專利申請202011544262.6為優先權的PCT專利申請（申請號：PCT/CN2021/140404，申請日：2021-12-22），這些專利申請的全文通過引用併入本發明。
本發明實施例還提供了如前述任意實施例所述的含抗CD47抗體或其抗原結合片段的製劑的製備方法，其包括：將所述製劑的組分混合。
在一些實施例中，當所述製劑中的抗CD47抗體或其抗原結合片段為抗CD47抗體或其抗原結合片段的溶液時，所述製備方法還包括：採用所述製劑中的緩衝液對抗CD47抗體或其抗原結合片段的溶液進行置換；置換後與輔料混合。
本發明實施例還提供了如前述任意實施例所述的製劑在製備用於防治CD47陽性腫瘤的產品中的應用。
本文中的“防治”包括預防和/或治療，治療可以理解為改善病情或治癒。
本文中的“CD47陽性腫瘤”包括表達CD47的腫瘤，具體包括但不限於實體腫瘤和血液腫瘤，例如，血液系統惡性腫瘤、非霍奇金淋巴瘤、多發性骨髓瘤、B細胞淋巴瘤、肝細胞癌、卵巢癌、結直腸癌、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤和腎臟腫瘤等。
本發明實施例還提供了一種含抗CD47抗體或其抗原結合片段的凍乾製劑，所述凍乾製劑由如前述任意實施例所述的製劑冷凍乾燥後獲得。
此外，本發明實施例還提供了一種含抗CD47抗體或其抗原結合片段的製劑，其由如前述任意實施例所述的凍乾製劑複溶後獲得。
實驗材料：實施例1~4以及試驗例1~3中示例性地展示了製劑中的抗CD47抗體為7A11H14時的技術效果，7A11H14來源於申請號為202011544262.6，發明名稱為“一種靶向CD47的抗體及其應用”的中國申請（2020年12月23遞交）中公開的（重鏈可變區的序列如SEQ ID NO:14所示，輕鏈可變區的序列如SEQ ID NO:8所示，恒定區為含有S228P變異的人類IgG4的Fc區），其包括如SEQ ID NO:19所示的重鏈，和如SEQ ID NO:20所示的輕鏈。需要說明的是，在其他實施例中，製劑中的抗CD47抗體或其抗原結合片段也可以採用申請號為202011544262.6，發明名稱為“一種靶向CD47的抗體及其應用”的中國申請中公開的其他抗CD47抗體或抗原結合片段，均可達到相同或相似的技術效果。
實施例 1
一種含抗CD47抗體或其抗原結合片段的製劑，其包括：50mg/mL抗CD47抗體，20 mM組氨酸-組氨酸鹽緩衝體系（pH6.0），8%（w/v）蔗糖以及0.02%（w/v）吐溫80。
可以理解的是，各組分限定的濃度為各組分在製劑中的濃度，本發明中“w/v”是重量體積百分數，例如8%（w/v）蔗糖表示每100mL體積溶液含8g的蔗糖，其它依此類推。
實施例 2
一種含抗CD47抗體或其抗原結合片段的製劑，其包括：50mg/mL抗CD47抗體，20 mM組氨酸-組氨酸鹽緩衝體系（pH6.0），8.8%（w/v）蔗糖以及0.02%（w/v）吐溫80。
實施例 3
一種含抗CD47抗體或其抗原結合片段的製劑，其包括：50mg/mL抗CD47抗體，20 mM組氨酸-組氨酸鹽緩衝體系（pH6.0），8.8%（w/v）蔗糖，0.04%（w/v）吐溫80，以及5mM甲硫氨酸。
實施例 4
一種含抗CD47抗體或其抗原結合片段的製劑，其包括：50mg/mL抗CD47抗體，20 mM組氨酸-組氨酸鹽緩衝體系（pH6.0），8.8%（w/v）蔗糖，以及0.1%（w/v）泊洛沙姆188。
試驗例 1 不同緩衝液和 pH 對抗 CD47 抗體穩定性的影響
將抗CD47抗體分別以50 mg/mL的濃度超濾置換至以下表1配製20mM檸檬酸緩衝液（20 mM Citrate）、20 mM醋酸緩衝液（20 mM acetate）、20 mM組氨酸緩衝液（20 mM histidine）和20 mM磷酸緩衝液（20mM PB）中，分別將各溶液按照表1的 pH調節為 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5。
用配製完成的各個pH緩衝液分別對小試樣品進行超濾置換。置換完成後，將各樣品的濃度稀釋至50 mg/ml過濾分裝西林瓶中加塞軋蓋後放樣（將樣品置於40℃穩定性箱中孵育4周），通過差式量熱掃描（DSC）、分子篩色譜（SEC）和毛細管等電聚焦電泳（CIEF）檢測抗體在40℃放置4周的穩定性。具體試驗方案見表1。
表1 各實驗組的緩衝液和pH資訊
編號 緩衝液 pH
Z01 20 mM檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝體系 5.0
Z02 5.5
Z03 6.0
Z04 20 mM醋酸-醋酸鈉緩衝體系 4.5
Z05 5.0
Z06 5.5
Z07 20 mM組氨酸-組氨酸鹽緩衝體系 5.5
Z08 6.0
Z09 6.5
Z10 20 mM 磷酸-磷酸鹽緩衝液體系 6.5
Z11 7.0
Z12 7.5
備註：檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝體系為由檸檬酸一水合物與檸檬酸鈉二水合物配置而成的檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液；組氨酸-組氨酸鹽緩衝體系為由L-組氨酸與L-組氨酸鹽酸鹽一水合物配置而成的組氨酸-鹽酸組氨酸緩衝液，醋酸-醋酸鈉緩衝體系為由冰醋酸與三水醋酸鈉配置而成的醋酸-醋酸鈉緩衝液，磷酸-磷酸鹽緩衝液體系為由磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉配置而成的磷酸-磷酸鹽緩衝液；
（1）差式量熱掃描（DSC）
採用差式量熱掃描器MicroCal TMVP DSC進行樣品轉變熔點溫度（Tm）和起始解折疊溫度（Tm onset）檢測。設置實驗參數使得掃描溫度以200°C/h 的掃描速率從10°C上升到95°C。數據分析採用MicroCal TMVP DSC自動分析軟體。
表2. DSC結果
編號 Tm onset（°C） T m1（°C） T m（°C）
Z01 54.9 65.3 74.4
Z02 58.7 68.8 76.1
Z03 61.2 71.6 77.9
Z04 51.4 60.7 73.9
Z05 57.0 67.0 76.0
Z06 60.1 70.2 77.9
Z07 56.0 65.1 75.6
Z08 59.5 68.9 77.1
Z09 61.4 71.0 78.6
Z10 63.2 72.2 79.5
Z11 63.6 73.5 80.5
Z12 63.3 72.2 81.3
結果見圖1和表2，實驗結果顯示：在相同緩衝體系中，Tm onset值隨著pH的升高而增加。在磷酸-磷酸鹽緩衝液體系中Tm onset值最高（63.2 ℃~63.6 ℃），在組氨酸-組氨酸鹽緩衝體系和檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝體系Tm onset值分別為56.0 ℃~61.4 ℃和54.9 ℃~61.2 ℃，在醋酸-醋酸鈉緩衝體系中Tm onset值最低（51.4 ℃~60.1 ℃）。
數據表明，在組氨酸-組氨酸鹽緩衝體系、檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝體系和磷酸-磷酸鹽緩衝液體系中抗體構象穩定性較好。
（2）分子篩色譜（SEC-HPLC）
在安捷倫高效液相色譜系統上使用SEC色譜柱（300×7.8 mm, 5 µm）運行的。樣品溫度設置為5°C，柱溫設置為25°C。流動相組成為50 mM PB, 300 mM NaCl, pH 6.8±0.1，流速設置為1.0 mL/min。使用流動相將樣品稀釋至10 mg/mL濃度進樣（100 μg樣品）至系統並運行20 min，檢測波長設置為280 nm。使用安捷倫CDS軟體進行數據分析。
表3. SEC-HPLC檢測結果
編號 主峰 （%） 高聚體 （%） 低分子量 （%）
T0 4 周 T0 4 周 T0 4 周
Z01 99.0 92.3 1.0 7.5 0.0 0.3
Z02 98.8 96.3 1.2 3.6 0.0 0.1
Z03 98.6 96.7 1.4 3.2 0.0 0.1
Z04 99.1 96.2 0.9 3.5 0.0 0.3
Z05 99.0 96.8 1.0 3.0 0.0 0.2
Z06 98.8 96.7 1.2 3.2 0.0 0.1
Z07 99.0 97.1 1.0 2.7 0.0 0.2
Z08 98.9 97.2 1.1 2.6 0.0 0.1
Z09 98.7 96.9 1.3 3.0 0.0 0.1
Z10 98.3 94.6 1.7 5.3 0.0 0.1
Z11 98.1 93.1 1.9 6.8 0.0 0.1
Z12 98.1 91.5 1.9 8.3 0.0 0.1
結果見表3，結果顯示：在檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝體系中SEC-HPLC主峰純度下降1.9%~6.7%；醋酸-醋酸鈉緩衝體系中SEC-HPLC主峰純度下降2.1~2.9%；組氨酸-組氨酸鹽緩衝體系中SEC-HPLC主峰純度下降1.7%~1.9%；磷酸-磷酸鹽緩衝液體系中SEC-HPLC主峰純度下降3.7%~6.6%。
綜上所示，抗CD47抗體在組氨酸-組氨酸鹽緩衝體系中具有較好的穩定性。
（3）毛細管等電聚焦電泳（iCIEF）
採用ProteinSimlpe公司的毛細管等電聚焦電泳分析儀和氟塗層電泳毛細管對CD47抗體進行的測定。預混液為0.5 µL等電點標記物（pI7.05），0.5 µL等電標記物（pI 9.50），4.0 µL兩性電解質3-10，35 µL 1%甲基纖維素，37.5 µL 8 M尿素溶液和2.5 µL超純水。用超純水將樣品稀釋到1.0 mg/mL。取20 µL 稀釋液和80 µL預混液加到離心管中，混合並離心。樣品進樣溫度為10 °C，聚焦第一階段為1500 V一分鐘，第二階段為3000 V八分鐘，報告主峰、酸蜂和鹼峰面積百分比。
表4. iCIEF檢測結果
編號 主峰 （%） 酸性峰 （%） 鹼性峰 （%）
T0 4 周 T0 4 周 T0 4 周
Z01 59.2 36.5 26.1 54.0 13.7 9.4
Z02 61.1 38.6 26.0 52.7 14.2 8.8
Z03 60.3 46.3 24.9 41.1 15.0 12.7
Z04 58.8 47.3 26.2 39.3 13.8 13.3
Z05 60.7 47.4 25.7 37.8 13.0 14.8
Z06 58.5 47.6 27.8 40.4 13.2 11.9
Z07 59.9 48.7 26.5 39.4 13.8 11.6
Z08 56.4 45.0 28.6 40.5 14.5 14.5
Z09 59.4 42.9 25.6 47.1 14.0 9.9
Z10 59.2 無主峰訊號 26.3 無主峰訊號 14.3 無主峰訊號
Z11 58.4 32.2 25.7 28.7 13.8 39.1
Z12 59.5 29.5 28.3 43.9 15.5 26.6
結果見表4，結果顯示：檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝體系中iCIEF主峰下降14%~22.7%，醋酸-醋酸鈉緩衝體系中iCIEF主峰下降10.9%~13.3%，組氨酸-組氨酸鹽緩衝體系中iCIEF主峰下降11.2%~16.5%，磷酸-磷酸鹽緩衝液體系中SEC-HPLC主峰純度下降26.2%~30.0%。
其中，組氨酸-組氨酸鹽緩衝體系中，pH5.5，Ph6.0的條件下，主峰純度下降幅度小（分別下降11.2%，11.4%）。
試驗例 2 不同輔料 對抗 CD47 抗體穩定性的影響
將CD47抗體超濾置換至添加不同輔料的緩衝液中，在40℃條件放置4周，或經振搖（300 rpm，25 ℃）3天，或凍融迴圈（-70 ℃至室溫）5輪，然後分別用外觀、DSC、SEC-HPLC、iCIEF和不溶性微粒測試（HIAC）分析溶液中CD47抗體蛋白的分佈情況，並分別以未經處理的初始樣品和未添加糖類的樣品作為對照。詳細的製劑配方資訊如表5所示。
表5. 詳細的製劑配方資訊
製劑配方編號 抗體濃度 （mg/mL） 緩衝液 輔料
F01 50 20 mM組氨酸-組氨酸鹽緩衝體系 pH6.0 8% (w/v)蔗糖，0.01% (w/v)吐溫80
F02 8% (w/v)蔗糖，0.02% (w/v)吐溫80
F03 8.8% (w/v)海藻糖，0.02% (w/v)吐溫80
F04 4.5 % (w/v)山梨醇，0.02% (w/v)吐溫80
F05 140 mM 精氨酸鹽，0.02% (w/v)吐溫80
F06 8% (w/v)蔗糖，0.04% (w/v)吐溫80
F07 8% (w/v)蔗糖，0.04% (w/v)吐溫80，5 mM甲硫氨酸
F08 8% (w/v)蔗糖，0.1% (w/v)泊洛沙姆188
F09 8% (w/v)蔗糖，0.02% (w/v)吐溫20
F10 6% (w/v)蔗糖，0.02% (w/v)吐溫80
F11 8.8% (w/v)蔗糖，0.02% (w/v)吐溫80
F12 10% (w/v)蔗糖，0.02% (w/v)吐溫80
F13 8% (w/v)海藻糖，0.02% (w/v)吐溫80
F14 10% (w/v)海藻糖，0.02% (w/v)吐溫80
F15 8% (w/v)蔗糖，4.5 % (w/v)山梨醇，0.02% (w/v)吐溫80
F16 8% (w/v)海藻糖，4.5 % (w/v)山梨醇，0.02% (w/v)吐溫80
F17 8% (w/v)蔗糖，140 mM 精氨酸鹽，0.02% (w/v)吐溫80
F18 8% (w/v)海藻糖，140 mM 精氨酸鹽，0.02% (w/v)吐溫80
F19 8% (w/v)蔗糖，0.02% (w/v)吐溫80，4.5 mM甲硫氨酸
F20 8% (w/v)海藻糖， 0.02% (w/v)吐溫80，5.5 mM 甲硫氨酸
F21 8% (w/v)蔗糖，0.02% (w/v)泊洛沙姆188
F22 8% (w/v)蔗糖，0.02% (w/v)吐溫80，0.1% (w/v)泊洛沙姆188
F23 8.8% (w/v)海藻糖，0.02% (w/v)吐溫80，0.1% (w/v)泊洛沙姆188
F24 15 mM組氨酸-組氨酸鹽緩衝體系 pH5.5 8% (w/v)蔗糖，0.02% (w/v)吐溫80
F25 8.8% (w/v)海藻糖，0.02% (w/v)吐溫80
F26 8% (w/v)蔗糖，0.04% (w/v)吐溫80，5 mM甲硫氨酸
F27 8% (w/v)蔗糖，0.1% (w/v)泊洛沙姆188
F28 25 mM醋酸-醋酸鈉緩衝體系 pH6.0 8% (w/v)蔗糖，0.02% (w/v)吐溫80
F29 8.8% (w/v)海藻糖，0.02% (w/v)吐溫80
F30 8% (w/v)蔗糖，0.04% (w/v)吐溫80，5 mM甲硫氨酸
F31 8% (w/v)蔗糖，0.1% (w/v)泊洛沙姆188
（1）外觀
外觀檢測包括顏色、澄明度和有無可見顆粒。
表6. 外觀檢測結果
製劑配方編號 外觀
T0 振搖 (300 rpm, 25 °C) 凍融 (-70 °C至常溫) 40 °C孵育
1天 3天 3輪 5輪 2周 4周
F01 C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF
F02 C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF
F03 C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF
F04 C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF
F05 C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF
F06 C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF
F07 C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF
F08 C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF
F09 C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,P+
F10 C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF
F11 C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF
F12 C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF
F13 C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF
F14 C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF
F15 C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF
F16 C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF
F17 C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF
F18 C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF
F19 C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF
F20 C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF
F21 C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,P
F22 C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF
F23 C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF
F24 C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF
F25 C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF
F26 C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF
F27 C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF
F28 C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF
F29 C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF
F30 C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF
F31 C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF C,SO,PF
顏色：C （無色）/ SY （淺黃）/ Y （黃色） 澄明度：CL （澄明）/ SO （微乳光）/ OL （乳光） 有無可見顆粒：PF （無可見顆粒）/ P （可見顆粒數小於等於5）/ P+ （可見顆粒數大於5）
詳細結果詳見表6，結果顯示：在T0點，製劑配方F01-F31外觀均為無色、微乳光、無可見顆粒。經振搖（300 rpm，25 ℃）3天、或凍融迴圈（-70 ℃至室溫）5輪、或40 ℃孵育2周後，製劑配方F01-F31均無可見顆粒的產生。經40 ℃孵育4周後，製劑配方F01-F08、F10-F20、F22-F31外觀仍為無色、微乳光、無可見顆粒，但製劑配方F21出現小於等於5顆的可見顆粒，製劑配方F09出現5顆以上的可見顆粒。
（2）差式量熱掃描（DSC）
採用差式量熱掃描器MicroCal TMVP DSC進行樣品轉變熔點溫度（Tm）和起始解折疊溫度（Tm onset）檢測。設置實驗參數使得掃描溫度以 200°C/h 的掃描速率從 10°C上升到 95°C。數據分析採用MicroCal TMVP DSC自動分析軟體。
表7. DSC分析結果
製劑配方編號 T m onset（°C） T m1（°C） T m2（°C）
F01 60.3 69.8 77.6
F02 57.0 71.3 76.9
F03 58.7 70.7 76.7
F04 58.2 69.7 76.4
F05 58.3 68.9 76.4
F06 57.9 69.1 76.3
F07 58.0 69.2 76.0
F08 57.9 69.2 76.1
F09 59.7 69.6 75.9
結果見表7和圖2，實驗結果顯示：在相同緩衝體系中，添加不同種類的輔料，製劑配方F01-F09的T m onset值沒有明顯差別，範圍在57.9 °C~60.3 °C。
數據表明CD47抗體蛋白在不同的製劑配方中具有相近的熱穩定性。
（3）不溶性微粒測試（HIAC）
在生物安全櫃中用HACH不溶性微粒分析儀檢測樣品中不溶性微粒的尺寸和顆粒數。使用前先用超純水清洗系統，測試超純水中的不溶性微粒。環境通過測試後（10 μm微粒數小於25粒每25毫升）測試樣品。每個樣品連續進樣4次，每次進樣1 mL，捨棄第1次進樣檢測結果，結果報告後3次連續檢測結果中每毫升粒徑≧ 2 μm，≧ 5μm，≧ 10 μm和≧ 25 μm的粒子數量平均值。
表8. 樣品經振盪處理後的HIAC分析結果
製劑配方編號 T0 振搖3天
≧2 μm ≧5 μm ≧10 μm ≧25 μm ≧2 μm ≧5 μm ≧10 μm ≧25 μm
F01 374 57 12 0 747 98 21 0
F02 528 78 9 3 406 33 12 6
F03 285 80 9 0 472 95 24 0
F04 415 57 27 3 525 89 18 0
F05 1358 469 178 12 1592 584 199 15
F06 2042 252 12 0 323 39 6 0
F07 430 54 15 6 1775 365 83 0
F08 196 66 15 0 996 184 12 0
F09 86 42 24 0 934 196 33 0
表9. 經40°C孵育4周處理後的HIAC分析結果
製劑配方編號 T0 4周
≧2 μm ≧5 μm ≧10 μm ≧25 μm ≧2 μm ≧5 μm ≧10 μm ≧25 μm
F01 374 57 12 0 160 41 14 3
F02 528 78 9 3 107 20 3 1
F03 285 80 9 0 129 47 20 6
F04 415 57 27 3 70 24 7 2
F05 1358 469 178 12 143 37 14 2
F06 2042 252 12 0 205 44 9 2
F07 430 54 15 6 198 57 16 3
F08 196 66 15 0 147 44 9 1
F09 86 42 24 0 638 139 40 3
詳細結果參見表8和表9，結果顯示：經振搖（300 rpm，25 ℃）3天后，製劑配方F05不溶性微粒數在幾種水準上（≧5 μm；≧10 μm）高於其他製劑配方；經40 °C孵育4周後，所有製劑配方微粒數無明顯增長。
（4）分子篩色譜（SEC-HPLC）
在安捷倫高效液相色譜系統上使用SEC色譜柱（300×7.8 mm, 5 µm）運行的。樣品溫度設置為5°C，柱溫設置為25°C。流動相組成為50 mM PB, 300 mM NaCl, pH 6.8±0.1，流速設置為1.0 mL/min。使用流動相將樣品稀釋至10 mg/mL濃度進樣至系統並運行20 min，檢測波長設置為280 nm。使用安捷倫CDS軟體進行數據分析。
表10-1. 40 °C孵育4周SEC-HPLC檢測結果
製劑配方編號 主峰 （%） 高聚體 （%） 低分子量 （%）
T0 4 周 T0 4 周 T0 4 周
F01 98.8 96.9 1.2 2.9 0.0 0.2
F02 98.8 96.4 1.2 3.4 0.0 0.2
F03 98.8 96.5 1.2 3.4 0.0 0.2
F04 98.7 96.4 1.3 3.4 0.0 0.2
F05 98.8 96.4 1.2 3.4 0.0 0.2
F06 98.7 95.7 1.3 4.1 0.0 0.2
F07 98.7 96.9 1.3 3.0 0.0 0.2
F08 98.8 97.5 1.2 2.4 0.0 0.1
F09 98.7 96.8 1.3 3.0 0.0 0.2
備註：表10-1爲將樣品置於40℃穩定性箱中孵育4周後檢測結果 表10-2. 凍融5輪SEC-HPLC檢測結果
製劑配方編號 主峰（%） 高聚體（%） 低分子量（%）
T0 凍融5輪 T0 凍融5輪 T0 凍融5輪
F01 98.8 98.7 1.2 1.3 0.0 0.0
F02 98.8 98.7 1.2 1.3 0.0 0.0
F03 98.8 98.8 1.2 1.2 0.0 0.0
F04 98.7 98.7 1.3 1.3 0.0 0.0
F05 98.8 98.8 1.2 1.2 0.0 0.0
F06 98.7 98.8 1.3 1.2 0.0 0.0
F07 98.7 98.8 1.3 1.2 0.0 0.0
F08 98.8 98.8 1.2 1.2 0.0 0.0
F09 98.7 98.7 1.3 1.3 0.0 0.0
備註：表10-2爲凍融迴圈（-70 ℃至室溫）5輪後檢測結果 表10-3. 振搖3天SEC-HPLC檢測結果
製劑配方編號 主峰（%） 高聚體（%） 低分子量（%）
T0 振搖3天 T0 振搖3天 T0 振搖3天
F01 98.8 95.8 1.2 4.2 0.0 0.0
F02 98.8 98.4 1.2 1.6 0.0 0.0
F03 98.8 98.6 1.2 1.4 0.0 0.0
F04 98.7 97.9 1.3 2.1 0.0 0.0
F05 98.8 98.8 1.2 1.2 0.0 0.0
F06 98.7 98.7 1.3 1.3 0.0 0.0
F07 98.7 98.3 1.3 1.7 0.0 0.0
F08 98.8 98.6 1.2 1.4 0.0 0.0
F09 98.7 98.6 1.3 1.4 0.0 0.0
備註：表10-3爲振搖（300 rpm，25 ℃）3天後檢測結果
詳細結果詳見表10-1、10-2、10-3，結果顯示：經凍融迴圈（-70 ℃至室溫）5輪後，所有製劑配方SEC-HPLC結果均無明顯變化，表明CD47抗體蛋白在所有候選製劑配方中均表現出良好的凍融穩定性。經振搖（300 rpm，25 ℃）3天后，製劑配方F01和F04中SEC-HPLC主峰純度分別下降3.0%和0.8%，其他配方中主峰純度下降0.0%~0.4%。經40 °C孵育4周後，製劑配方F06中SEC-HPLC主峰純度下降3.0%，其他製劑配方中主峰純度下降1.3%~2.4%。
綜上所述，SEC-HPLC分析表明，製劑配方F01、F04和F06中CD47抗體蛋白的穩定性較差。
（5）毛細管等電聚焦電泳（iCIEF）
採用ProteinSimlpe公司的毛細管等電聚焦電泳分析儀和氟塗層電泳毛細管對CD47抗體進行的測定。預混液為0.5 µL等電點標記物（pI7.05），0.5 µL等電標記物（pI 9.50），4.0 µL兩性電解質3-10，35 µL 1%甲基纖維素，37.5 µL 8 M尿素溶液和2.5 µL超純水。用超純水將樣品稀釋到1.0 mg/mL。取20 µL 稀釋液和80 µL預混液加到離心管中，混合並離心。樣品進樣溫度為10 °C，聚焦第一階段為1500 V一分鐘，第二階段為3000 V八分鐘，報告主峰、酸蜂和鹼峰面積百分比。
表11. iCIEF檢測結果
製劑配方編號 主峰 （%） 酸性峰 （%） 鹼性峰 （%）
T0 4 周 T0 4 周 T0 4 周
F01 58.0 45.8 27.9 44.2 14.2 10.0
F02 56.9 44.1 31.1 45.6 12.0 10.3
F03 56.9 45.1 29.4 44.9 13.7 10.1
F04 58.1 44.1 28.2 45.4 13.7 10.4
F05 58.8 47.6 29.5 41.0 11.7 11.5
F06 56.7 41.1 29.3 49.0 14.0 9.9
F07 55.7 42.7 32.1 45.5 12.2 11.8
F08 57.8 45.9 28.9 43.0 13.3 11.1
F09 57.6 44.2 29.5 45.3 13.0 10.5
結果見表11，結果顯示：製劑配方F06的穩定性較差。
試驗例 3 抗 CD47 抗體的生產
將人源化可變結構域與分泌訊號和人類κ以及人類FcIgG4S228P恒定結構域組合，將其克隆到哺乳動物表達系統中，並且轉染到293細胞中以生成人源化mAb。將人源化變體表達為全長IgG分子、分泌到培養基中並使用蛋白質A純化。
在Expi293細胞中暫態表達並純化人源化抗體和陽性對照抗體Hu5F9-G4（Hu5F9-G4序列已在美國專利US2015/ 0183874A1中公開）。
對於Expi293細胞中抗體的暫態表達，使用載體pCDNA3.4，首先將抗體的重鏈和輕鏈克隆到單獨的pCDNA3.4載體中，使用PEI(購自Polysciences)化學轉染試劑、按照化學轉染的方法將帶有抗體分子重鏈和輕鏈的pCDNA3.4載體轉入Expi293細胞中，按照生產商提供的方案暫態轉染培養的Expi293細胞。
暫態轉染前一天Expi293（ThermoFisher Scientific；A14635）細胞傳代，用Dynamis培養基（gibco；A2617502）按2E6的密度接種1L搖瓶（conning；431147），放入細胞培養搖床（Adolf Kuhner；ISF4-XC）中37℃；8%CO2；120rpm培養；
轉染當天，Expi293細胞用細胞計數儀（Countstar；IC1000）計數，用新鮮Dynamis培養稀釋調整細胞密度為2.9E6；準備轉染；PEI：DNA =3:1；混勻 5min，將二者輕柔混勻20次，靜置15～30min。將DNA-PEI混合物加入Expi293細胞中，混勻，放入細胞培養搖床（Adolf Kuhner；ISF4-XC）中37℃；8%CO2；120rpm培養；轉染4h之後補加雙抗（gibco；15140122）和抗凝劑（gibco；0010057）；
收穫上清純化：轉染連續培養7天，之後收樣，先低速1000rpm；10min；4℃離心(湘儀H2050R)，再高速12000rpm；30min；4℃；收集細胞培養上清，0.22um過濾。將培養上清應用於Protein A Sepharose柱(GE Healthcare)。柱用PBS洗滌，然後用洗脫緩衝液(0.1M檸檬酸鈉緩衝液，pH 3.0)洗脫蛋白質。收集的組分用1M Tris pH9.0中和。最後，將純化的樣品與PBS進行透析。
試驗例 4 CD47 抗體親和力測定
1、實驗方法
採用生物膜干涉技術 (ForteBio)測定本發明抗體結合人CD47(hCD47)的平衡解離常數 (KD)。ForteBio親和力測定按照現有的方法(Estep，P等人，High  throughput  solution  Based  measurement  of  antibody-antigen  affinity  and  epitope  binning.MAbs；2013.5(2)：p.270-8)進行，具體為：感測器在分析緩衝液中線下平衡30分鐘，然後線上檢測 60秒建立基線，線上載入試驗例3獲得的經純化的抗體至AHC感測器(ForteBio)上進行ForteBio親和測量，再將具有載入的抗體的感測器暴露於100nM的CD47抗原中作用5分鐘，之後將感測器轉移至分析緩衝液解離5分鐘用於解離速率測量。使用1：1結合模型進行動力學的分析。
2、實驗結果
CD47抗體親和力測定結果如表12所示，結果顯示CD47抗體具有高親和力。
表12  CD47抗體親和力測定結果
抗體名稱 KD (M) kon(1/Ms) kd(1/s)
7A11H11 5.90E-10 5.90E-10 5.90E-10
7A11H12 4.59E-10 4.59E-10 4.59E-10
7A11H14 5.62E-10 5.62E-10 5.62E-10
7A11H15 2.12E-10 1.48E+06 3.13E-04
7A11H35 8.81E-10 8.81E-10 8.81E-10
7A11H22 7.40E-10 7.40E-10 7.40E-10
7A11H33 3.60E-10 3.60E-10 3.60E-10
7A11H42 3.09E-10 3.09E-10 3.09E-10
試驗例 5 抗 CD47 抗體親和力測定
1、實驗方法
在基於流式細胞術的測定法中測量本發明CD47抗體與人CD47的結合。具體步驟為： 採用表達人CD47的癌細胞系CCRF-CEM(上海中國科學院細胞庫)屬於人急性淋巴細胞白血病T淋巴細胞。將CCRF-CEM細胞(0.1×10 6個細胞)與不同濃度（最高濃度為30ug/mL，三倍稀釋，共10個濃度）的實驗抗體(本發明CD47抗體以及Hu5F9-G4抗體)，在含3%牛血清白蛋白(BSA)的PBS中，冰上孵育 30分鐘。然後將細胞洗滌至少兩次，用FCM buffer（1XPBS+3%BSA）配製PE Goat anti human IgG Fc（1:500x稀釋）螢光二抗，按100uL/孔加入對於的96孔板中，4度冰箱孵育30min。取出96孔板，250g離心5min，小心去上清後，加入FCM buffer 200uL/孔，再次250g離心5min，小心去上清，將細胞洗滌至少兩次用 1xPBS 100uL /孔重懸，並通過流式細胞術進行分析，並根據其MFI用GraphPad擬合濃度依賴的曲線。以Hu5F9-G4抗體作為陽性對照抗體。
2、實驗結果
CD47抗體與人CD47結合的EC50結果如表13所示，CD47抗體（7A11H11、7A11H12、7A11H22、7A11H32、7A11H42、陽性對照抗體Hu5F9-G4和hIgG4-同型對照）與人CD47結合的平均螢光強度如圖3所示，CD47抗體（7A11H52、7A11H14、7A11H15、7A11H33、7A11H34、7A11H35、7A11H55、陽性對照抗體Hu5F9-G4和hIgG4-同型對照）與人CD47結合的平均螢光強度如圖4所示，結果顯示，本發明CD47抗體與陽性對照抗體對細胞水準的人CD47具有相當的特異性結合能力。
表13  CD47抗體與人CD47的結合能力測定結果
抗體名稱 EC50（nM）
7A11H11 0.8218
7A11H12 0.7157
7A11H22 0.8202
7A11H32 0.7172
7A11H42 0.7269
7A11H52 0.9148
7A11H14 0.9334
7A11H15 0.7234
7A11H33 0.7598
7A11H34 1.195
7A11H35 0.8623
7A11H55 1.209
Hu5F9-G4 0.7289
試驗例 6 抗 CD47 抗體與猴 CD47 的結合
1、實驗方法
通過轉染攜帶全長猴CD47的pCDNA3.4載體，產生過表達猴CD47的CHO細胞穩定細胞株(CHO-cynoCD47細胞)，將CHO-cynoCD47細胞(0.1×10 6個細胞) 與不同濃度（最高濃度為10ug/mL，三倍稀釋，共10個濃度）的實驗抗體(本發明CD47抗體以及Hu5F9-G4抗體)，在含3%牛血清白蛋白(BSA)的PBS中，冰上孵育30分鐘。然後將細胞洗滌至少兩次，用FCM buffer（1XPBS+3%BSA）配製PE Goat anti human IgG Fc（1:500x稀釋）螢光二抗，按100uL/孔加入對於的96孔板中，4度冰箱孵育30min。取出96孔板，250g離心5min，小心去上清後，加入FCM buffer 200uL/孔，再次250g離心5min，小心去上清，將細胞洗滌至少兩次用 1x PBS 100uL/孔重懸，並通過流式細胞術進行分析，並根據其MFI用GraphPad擬合濃度依賴的曲線。以Hu5F9-G4抗體作為陽性對照抗體。
2、實驗結果
CD47抗體與猴CD47結合的EC50結果如表14所示，CD47抗體（7A11H11、7A11H12、7A11H22、7A11H32、7A11H42、7A11H52、陽性對照抗體Hu5F9-G4和hIgG4-同型對照）與猴CD47結合的平均螢光強度如圖5所示，CD47抗體（7A11H14、7A11H15、7A11H33、7A11H34、7A11H35、7A11H55、陽性對照抗體Hu5F9-G4和hIgG4-同型對照）與猴CD47結合的平均螢光強度如圖6所示，結果顯示，相比，本發明抗體與陽性對照抗體對細胞水準形式猴具有相當的特異性結合能力。
表14  CD47抗體與猴CD47結合的EC50結果
抗體名稱 EC50（nM）
7A11H11 8.932
7A11H12 7.353
7A11H22 8.546
7A11H32 17.12
7A11H42 5
7A11H52 4.506
7A11H14 4.957
7A11H15 7.271
7A11H33 4.847
7A11H34 8.609
7A11H35 4.379
7A11H55 4.616
Hu5F9-G4 5.123
試驗例 7 抗 CD47 抗體對人 CD47 配體 SIRP α 與 CD47 相互作用的阻斷
1、實驗方法
通過流式細胞術測定本發明CD47抗體阻斷人CD47與SIRP α的結合能力。具體步驟為： 抗體稀釋：用FCM buffer（1XPBS+3%BSA）將本發明CD47抗體和對照抗體Hu5F9-G4稀釋成90ug/mL，然後3倍梯度稀釋成10個濃度，將亞型對照hIgG4稀釋成30ug/mL、1.1 ug/mL、0.04 ug/mL，配體hSIRP α-mFC（AcroBiosystems）稀釋至10ug/mL。 將CCRF-CEM(上海中國科學院細胞庫)細胞按0.1×10 6個細胞/孔加入到96孔V型板，並且在CD47抗體量增加的條件下監控hSIRP α-mFC結合。使用PE Goat anti mouse IgG Fc二抗(Biolegend)確定結合的SIRPα。以Hu5F9-G4抗體作為陽性對照抗體。
2、實驗結果
CD47抗體（7A11H11、7A11H12、7A11H22、7A11H32、7A11H42、Hu5F9-G4和hIgG4-同型對照）對人CD47的CD47/SIRP α結合抑制結果如圖7所示，CD47抗體（7A11H52、7A11H14、7A11H15、7A11H33、7A11H34、7A11H35、7A11H55）對人CD47的CD47/SIRP α結合抑制結果如圖8所示，結果顯示，本發明CD47抗體能夠在細胞水準顯著抑制阻斷CD47與SIRPα的結合，與陽性對照抗體相比，本發明CD47抗體表現出相當的阻斷能力。
試驗例 8  CD47 抗體促進巨噬細胞吞噬腫瘤細胞能力的檢測
1、實驗方法
在基於流式細胞術的測定法中測定本發明CD47抗體促進巨噬細胞吞噬腫瘤細胞的能力。具體步驟為： 取捐贈者的新鮮血液，分離得到外周血單核細胞(PBMC)，並通過hCD14磁珠（Miltenyi/130-050-201）從PBMC中分離CD14陽性單核細胞，配置含 rhGM-CSF（R&D；7954-GM-010）的完全培養基，rhGM-CSF終濃度為50ng/mL，CD14陽性單核細胞的濃度為5E5/mL，按20mL/皿加入到細胞培養皿中；轉移至5% CO 237℃細胞培養箱中，每3天對半更換新鮮培養基；（含50ng/mLGM-CSF）繼續培養4天。在第8天將巨噬細胞上清吸到15mL離心管中，同時加入預冷的DPBS，直接用細胞刮刀收集細胞； 選擇人CD47高表達的腫瘤細胞系Jurkat(上海中國科學院細胞庫)作為靶細胞類型，將靶腫瘤細胞按照CellTraceTM  CFSE試劑盒的說明，進行螢光標記。將標記好的腫瘤細胞與上述已經完成分化的巨噬細胞按照1：1的比例共培養，同時加入終濃度10ug/mL、1ug/mL、0.1ug/mL抗體在37℃孵育2小時。然後將細胞洗滌至少兩次，將細胞小心吹下，加入別藻青蛋白 (allophycocyanin，APC)標記的CD14抗體(購自Biolegend；B259538)，在含0.1%BSA的PBS中冰上(避光)孵育30分鐘。將細胞洗滌至少兩次並通過流式細胞術進行分析。被吞噬的細胞群體為活細胞中CD14陽性並且螢光染料CFSE(carboxyfluorescein  diacetate，succinimidyl ester，羧基螢光素雙乙酸鹽，琥珀醯亞胺酯)也為陽性的細胞群體。以Hu5F9-G4抗體作為陽性對照抗體。
2、實驗結果
CD47抗體促進巨噬細胞吞噬腫瘤細胞的能力測定結果如圖9所示，結果顯示，本發明CD47抗體具有促進巨噬細胞吞噬腫瘤細胞的能力，且促進巨噬細胞吞噬腫瘤細胞的能力與陽性對照抗體Hu5F9-G4的能力相當。
試驗例 9  CD47 抗體對人類紅細胞（ RBC ）血凝集分析
1、實驗方法
進行紅細胞血凝集分析來表徵CD47抗體的RBC凝集能力。通過觀察抗體避免人RBC發生沉降的能力就RBC凝集對CD47抗體進行篩選。具體方法為： 人類紅細胞在PBS中稀釋到2%，與滴入的CD47抗體（濃度依次為200ug/mL、100ug/mL、50ug/mL、25ug/mL、12.5ug/mL、6.25ug/mL、1.5625ug/mL、0.78125ug/mL、0.390625ug/mL、0.195313ug/mL、0.097656ug/mL）在圓底96孔板內在37℃孵育2小時。未沉澱的紅細胞的存在是證明紅細胞血凝聚的證據，與未凝聚的紅細胞沉澱形成清晰的紅點相比，未沉澱的紅細胞呈霧狀。以Hu5F9-G4抗體作為陽性對照抗體。
2、實驗結果
CD47抗體的RBC凝集能力測定結果如圖10所示，結果顯示，當CD47抗體濃度達到200ug/mL時均未引起細胞凝聚，表明本發明CD47抗體具有顯著降低紅細胞血凝聚的作用，CD47抗體在臨床治療癌症中能夠顯著降低其副作用、安全性好。
試驗例 10  CD47 抗體與人類紅細胞（ RBC ）結合分析
1、實驗方法
CD47單抗存在與人類紅細胞結合的特性，對CD47抗體抑制劑來說，存在藥效受紅細胞干擾及腫瘤脫靶的潛在風險。若能篩選到與紅細胞結合活性低的抗體則能夠降低脫靶的風險，提高其安全性。具體步驟如下： （1）抗體稀釋：用FACS buffer 將CD47抗體稀釋成初始濃度20μg/mL，體積180uL，3倍梯度稀釋（60+120），11個濃度； （2）細胞計數並鋪板：將RBC細胞離心250g 5min後棄去上清，用FACS buffer調整細胞密度為2E+06，按100uL/管均分到96孔V型板中； （3）將上述稀釋好的抗體加入細胞中，100uL/孔，2℃～8℃孵育0.5h； （4）取出96孔板，250g離心5min，小心去上清後，加入FACS buffer 200uL/孔，再次250g離心5min，小心去上清； （5）用FACS buffer配製PE goat anti-human IgG Fc（biolegend）螢光二抗（1:500稀釋），按100uL/孔加入對應的96孔板中，重懸細胞，2℃～8℃孵育30min； （6）取出96孔板，250g離心5min，小心去上清後，加入FACS buffer 200uL/孔，再次250g離心5min，小心去上清； （7）用1xPBS 100uL/孔重懸，FACS檢測。使用流式細胞儀(Beckman，cytoflex)分析資料，GraphPad Prism作圖。以Hu5F9-G4抗體作為陽性對照抗體。
2、實驗結果
CD47抗體與人類紅細胞結合能力的測定結果如圖11所示，結果顯示，與陽性對照抗體相比，本發明CD47抗體與人類紅細胞的結合活性顯著降低，其作為藥物時的安全性提高。
試驗例 11  CD47 抗體與血小板結合分析
1、實驗方法
同CD47單抗結合人類紅細胞一樣，CD47單抗存在與血小板結合的活性特徵，存在血小板降低帶來的諸多副作用。與血小板結合低的抗體能夠降低脫靶的風險，提高其安全性。具體方法如下： 抗體稀釋：用FACS buffer 將抗體稀釋成20μg/ml，體積240ul； 細胞計數並鋪板：將全血細胞稀釋20倍，按100uL/管均分到96孔V型板中； 將上述稀釋好的抗體加入到細胞中，100uL/孔，2℃-8℃孵育0.5h； 取出96孔板，250g離心5min，小心去上清後，加入FACS buffer 200ul/孔，再次250g離心5min，小心去上清； 用FACS buffer配製PE螢光二抗1:500稀釋（PE goat anti-human IgG Fc；biolegend；409304），按100ul/孔加入對於的96孔板中，同時每孔中加入1ul APC anti human CD61（biolegend；336411）,重懸細胞，2℃-8℃孵育30min； 取出96孔板，250g離心5min，小心去上清後，加入FACS buffer 200ul/孔，再次250g離心5min，小心去上清； 用 1xPBS 200uL /孔重懸，FACS檢測。以Hu5F9-G4抗體作為陽性對照抗體。
2、實驗結果
CD47抗體與血小板結合分析結果如圖12所示，結果顯示本發明的CD47抗體與血小板的結合活性顯著低於陽性對照抗體，顯示出了更優的安全性。
試驗例 12  CD47 抗體對啟動巨噬細胞吞噬紅細胞的作用分析
1、實驗方法
檢測方法同試驗例8，將紅細胞替換為腫瘤細胞作為靶細胞，檢測本發明的CD47抗體是否對巨噬細胞吞噬紅細胞存在啟動作用。以Hu5F9-G4抗體作為陽性對照抗體。
2、實驗結果
CD47抗體對啟動巨噬細胞吞噬紅細胞的作用分析結果如圖13所示，結果顯示本發明的CD47抗體極低介導巨噬細胞對紅細胞的吞噬，且介導作用明顯低於陽性對照抗體，顯示出了更優的安全性。
試驗例 13 抗腫瘤活性分析
1、實驗方法
選用70只NOD SCID雌性小鼠（購於浙江維通利華實驗動物技術有限公司）構建人B淋巴細胞皮下移植瘤模型（Raji）和人惡性黑色素瘤模型（A375），評估本發明的CD47抗體的抗腫瘤活性。以Hu5F9-G4抗體和TJC-4抗體作為陽性對照抗體，hIgG4為同型對照抗體。
2、實驗結果
CD47抗體對人B淋巴細胞皮下移植瘤模型的抗腫瘤結果如圖14所示，結果顯示本發明的CD47抗體在抗人B淋巴細胞皮下移植瘤效果上顯著好於陽性對照抗體。
CD47抗體對人惡性黑色素瘤模型的抗腫瘤結果如圖15所示，結果顯示與陽性對照抗體相比，本發明的CD47抗體在抗人惡性黑色素瘤效果上更加有優勢。
以上所述僅為本發明的優選實施例而已，並不用於限制本發明，對於本領域的技術人員來說，本發明可以有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
無
為了更清楚地說明本發明實施例的技術方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應當理解，以下附圖僅示出了本發明的某些實施例，因此不應被看作是對範圍的限定，對於本領域普通技術人員來講，在不付出進步性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他相關的附圖。 圖1為試驗例1中的DSC圖譜。 圖2為試驗例2中的DSC圖譜。 圖3是試驗例5中CD47抗體（7A11H11、7A11H12、7A11H22、7A11H32、7A11H42、陽性對照抗體Hu5F9-G4和hIgG4-同型對照）與人CD47結合的平均螢光強度。 圖4是試驗例5中CD47抗體（7A11H52、7A11H14、7A11H15、7A11H33、7A11H34、7A11H35、7A11H55、陽性對照抗體Hu5F9-G4和hIgG4-同型對照）與人CD47結合的平均螢光強度。 圖5是試驗例6中CD47抗體（7A11H11、7A11H12、7A11H22、7A11H32、7A11H42、7A11H52、陽性對照抗體Hu5F9-G4和hIgG4-同型對照）與猴CD47結合的平均螢光強度。 圖6是試驗例6中CD47抗體（7A11H14、7A11H15、7A11H33、7A11H34、7A11H35、7A11H55、陽性對照抗體Hu5F9-G4和hIgG4-同型對照）與猴CD47結合的平均螢光強度。 圖7是試驗例7中CD47抗體（7A11H11、7A11H12、7A11H22、7A11H32、7A11H42和hIgG4-同型對照）對人CD47的CD47/SIRP α結合抑制結果。 圖8是試驗例7中CD47抗體（7A11H52、7A11H14、7A11H15、7A11H33、7A11H34、7A11H35、7A11H55）對人CD47的CD47/SIRP α結合抑制結果。 圖9是試驗例8中CD47抗體促進巨噬細胞吞噬腫瘤細胞的能力測定結果。 圖10是試驗例9中CD47抗體的RBC凝集能力測定結果。 圖11是試驗例10中CD47抗體與人類紅細胞結合能力的測定結果。 圖12是試驗例11中CD47抗體與人類血小板結合分析結果。 圖13是試驗例12中CD47抗體對啟動巨噬細胞吞噬紅細胞的作用分析結果。 圖14是試驗例13中CD47抗體對人B淋巴細胞皮下移植瘤模型的抗腫瘤結果。 圖15是試驗例14中CD47抗體對人惡性黑色素瘤模型的抗腫瘤結果。
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Claims (13)

  1. 一種含抗CD47抗體或其抗原結合片段的製劑，其包括以下組分：抗CD47抗體或其抗原結合片段、緩衝液和輔料； 所述抗體或其抗原結合片段含有以下CDRs：如SEQ ID NO:1或與SEQ ID NO:1具有至少95%同源性的氨基酸序列所示的LCDR1，如SEQ ID NO:2或與SEQ ID NO:2具有至少95%同源性的氨基酸序列所示的LCDR2，如SEQ ID NO:3或與SEQ ID NO:3具有至少95%同源性的氨基酸序列所示的LCDR3，如SEQ ID NO:10或與SEQ ID NO:10具有至少95%同源性的氨基酸序列所示的HCDR1，如SEQ ID NO:11或與SEQ ID NO:11具有至少95%同源性的氨基酸序列所示的HCDR2，和如SEQ ID NO:12或與SEQ ID NO:12具有至少95%同源性的氨基酸序列所示的HCDR3； 按組分在所述製劑中的重量體積百分數計，所述輔料包括：1%~20%的糖類和0.01%~0.5%的表面活性劑； 可選地，所述抗體或其抗原結合片段包括：如SEQ ID NO:1所示的LCDR1，如SEQ ID NO:2所示的LCDR2，如SEQ ID NO:3所示的LCDR3，如SEQ ID NO:10所示的HCDR1，如SEQ ID NO:11所示的HCDR2，和如SEQ ID NO:12所示的HCDR3； 所述抗體或其抗原結合片段包括：如SEQ ID NO:21所示的LCDR1，如SEQ ID NO:2所示的LCDR2，如SEQ ID NO:3所示的LCDR3，如SEQ ID NO:10所示的HCDR1，如SEQ ID NO:11所示的HCDR2，和如SEQ ID NO:12所示的HCDR3；或者 所述抗體或其抗原結合片段包括：如SEQ ID NO:1所示的LCDR1，如SEQ ID NO:2所示的LCDR2，如SEQ ID NO:3所示的LCDR3，如SEQ ID NO:10所示的HCDR1，如SEQ ID NO:22所示的HCDR2，和如SEQ ID NO:12所示的HCDR3。
  2. 如請求項1所述的含抗CD47抗體或其抗原結合片段的製劑，其中所述表面活性劑選自吐溫20、吐溫80和泊洛沙姆188中的任意一種； 優選地，所述表面活性劑為吐溫80，所述吐溫80在所述製劑中的重量體積百分數為0.01%~0.1%，優選為0.01%~0.04%，更優選為0.02%；或者 優選地，所述表面活性劑為泊洛沙姆188，所述泊洛沙姆188在所述製劑中的重量體積百分數為0.05%~0.5%，優選為0.1%~0.2%，更優選為0.1%。
  3. 如請求項1或請求項2所述的含抗CD47抗體或其抗原結合片段的製劑，其中所述糖類包括蔗糖和海藻糖中的至少一種； 優選地，所述糖類為蔗糖；所述蔗糖的濃度優選為3%~15% (w/v)，優選為6%~10% (w/v)，更優選為8% (w/v)；或者 優選地，所述糖類為海藻糖；所述海藻糖的濃度優選為3%~15% (w/v)，優選為6%~10% (w/v)，更優選為8% (w/v)。
  4. 如請求項1至請求項3中任一請求項所述的含抗CD47抗體或其抗原結合片段的製劑，其中所述製劑還包括甲硫氨酸； 優選地，所述甲硫氨酸的濃度為1~20mM，優選為4.5~5.5mM，更優選為5mM。
  5. 如請求項1至請求項4中任一請求項所述的含抗CD47抗體或其抗原結合片段的製劑，其中所述緩衝液選自：檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液、醋酸-醋酸鈉緩衝液、組氨酸-組氨酸鹽緩衝液和磷酸-磷酸鹽緩衝液中的任意一種，pH為4.5~7.5； 優選地，所述緩衝液選自檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液、組氨酸-組氨酸鹽緩衝液和磷酸-磷酸鹽緩衝液中的任意一種，pH為5.0~7.5； 優選地，所述緩衝液為組氨酸-組氨酸鹽緩衝液，pH優選為5.5~6.0，pH更優選為6.0； 優選地，所述緩衝液的濃度為10~40mM；優選15~25mM，更優選為20mM。
  6. 如請求項1至請求項5中任一請求項所述的含抗CD47抗體或其抗原結合片段的製劑，其中所述抗CD47抗體或其抗原結合片段的濃度為20~60mg/mL； 優選地，所述抗CD47抗體或其抗原結合片段的濃度為45~55mg/mL； 更優選地，所述抗CD47抗體或其抗原結合片段的濃度為50mg/ mL。
  7. 如請求項1至請求項6中任一請求項所述的含抗CD47抗體或其抗原結合片段的製劑，其中所述抗CD47抗體或其抗原結合片段包括有重鏈可變區和輕鏈可變區； 優選地，所述重鏈可變區的序列如SEQ ID NO:4～9中任一項所示或與SEQ ID NO:4～9任一項所示具有至少95%同源性的序列；所述輕鏈可變區的序列如SEQ ID NO:13~18中任一項所示或與SEQ ID NO:13～18任一項所示具有至少95%同源性的序列； 優選地，所述重鏈可變區包括如SEQ ID NO:8所示的序列，和所述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO:14所示的序列。
  8. 如請求項1至請求項7中任一請求項所述的含抗CD47抗體或其抗原結合片段的製劑，其中所述抗CD47抗體或其抗原結合片段還包括恒定區； 優選地，所述恒定區包括重鏈恒定區和輕鏈恒定區，所述重鏈恒定區選自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD中的任一種；輕鏈恒定區為κ或λ鏈； 優選地，所述恒定區的種屬來源選自鼠、兔、羊、猴、或人； 優選地，所述抗體為CDR移植抗體、多聚體抗體或雙特異性抗體中的任一種或幾種； 優選地，所述抗原結合片段為F(ab’) 2、Fab、scFv和Fv中的任一種或幾種； 更優選地，所述抗CD47抗體包括如SEQ ID NO:19所示的重鏈，和如SEQ ID NO:20所示的輕鏈。
  9. 如請求項8所述的含抗CD47抗體或其抗原結合片段的製劑，其包括： （a）50mg/ mL的抗CD47抗體，所述抗CD47抗體包括如SEQ ID NO:19所示的重鏈，和如SEQ ID NO:20所示的輕鏈； （b）pH為6.0的20mM的組氨酸-鹽酸組氨酸緩衝液； （c）8% (w/v)的蔗糖；和 （d）0.02% (w/v)的吐溫80。
  10. 一種如請求項1至請求項9中任一請求項所述的含抗CD47抗體或其抗原結合片段的製劑的製備方法，其包括：將所述製劑的組分混合； 優選地，當所述製劑中的抗CD47抗體或其抗原結合片段為抗CD47抗體或其抗原結合片段的溶液時，所述製備方法還包括：採用所述製劑中的緩衝液對抗CD47抗體或其抗原結合片段的溶液進行置換；置換後與輔料混合。
  11. 一種如請求項1至請求項9中任一請求項所述的的製劑在製備用於防治CD47陽性腫瘤的產品中的應用。
  12. 一種含抗CD47抗體或其抗原結合片段的凍乾製劑，其由如請求項1至請求項9中任一請求項所述的製劑冷凍乾燥後獲得。
  13. 一種含抗CD47抗體或其抗原結合片段的製劑，其由如請求項12所述的凍乾製劑複溶後獲得。
TW112123134A 2022-06-21 2023-06-20 一種含抗cd47抗體或其抗原結合片段的製劑及其製備方法和應用 TWI859943B (zh)

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