CN114671950A - 一种靶向cd47的人源化抗体及其应用 - Google Patents

一种靶向cd47的人源化抗体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114671950A
CN114671950A CN202011548892.0A CN202011548892A CN114671950A CN 114671950 A CN114671950 A CN 114671950A CN 202011548892 A CN202011548892 A CN 202011548892A CN 114671950 A CN114671950 A CN 114671950A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
seq
amino acid
chain variable
acid sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202011548892.0A
Other languages
English (en)
Inventor
霍永庭
路力生
涂晶晶
张婵
黄运中
张先鹏
芦迪
冯婷
翁源灿
符俊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangdong Fapon Biopharma Inc
Original Assignee
Guangdong Fapon Biopharma Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangdong Fapon Biopharma Inc filed Critical Guangdong Fapon Biopharma Inc
Priority to CN202011548892.0A priority Critical patent/CN114671950A/zh
Publication of CN114671950A publication Critical patent/CN114671950A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及一种靶向CD47的人源化抗体及其应用。本发明提供的抗体该抗体的亲和力高、特异性强，不会引起红细胞凝集，安全性好，能够广泛应用于治疗和/或预防CD47阳性肿瘤。

Description

一种靶向CD47的人源化抗体及其应用
技术领域
本发明属于免疫学技术领域。具体地，涉及一种靶向CD47的人源化抗体及其应用，更具体地，涉及抗CD47抗体或其抗原结合片段、多核苷酸、载体、细胞、组合物以及应用。
背景技术
癌症免疫疗法是近年来生物科学领域的重头大戏，基于T细胞的CTLA4抗体、PD-1抗体、PD-L1抗体等的免疫检查点抑制剂疗法和CAR-T、TCR-T等细胞疗法皆是近年来大热的免疫疗法。这些无一例外是围绕如何恢复T细胞功能来进行，换句话说，主要围绕如何提高获得性免疫系统能力。但是以免疫检查点(checkpoint)为靶点，激活T细胞功能，从而提高获得性免疫系统能力来攻克癌症这一道路仍充满曲折。然而固有免疫系统在肿瘤免疫治疗中的作用，却长期没有得到发挥。事实上在整个肿瘤浸润区域，巨噬细胞在肿瘤组织约占50％，更重要的是巨噬细胞的数量同肿瘤的预后呈现反向联系，这进一步说明巨噬细胞在肿瘤中有很重要的作用。巨噬细胞发挥吞噬效应需要两个信号同时起作用：一个是靶向细胞表面的“吃我”信号的激活，另一个是相同目标表面“别吃我”信号的失活。任何一个信号的缺少都不足以引发吞噬效应的发生。越来越多的证据表明，CD47是一类“别吃我”信号，它通过与巨噬细胞表面的信号调节蛋白α(Signal regulatory proteinα，SIRPα)相互结合抑制巨噬细胞的吞噬作用。肿瘤细胞也可以通过CD47的表达逃避巨噬细胞吞噬作用(例如参见EP2242512及其中引用的相关文献)。
CD47也称为整联蛋白相关蛋白(IAP)，是具有氨基末端免疫球蛋白结构域和羧基末端多重跨膜区的50kDa膜蛋白。它与多种配体相互作用，包括但不限于单调节蛋白α(SIRPα)，SIRPγ，整联蛋白和血小板反应蛋白-1(TSP-1)。SIRPα主要在骨髓细胞上表达，包括巨噬细胞，骨髓树突细胞(DC)，粒细胞，肥大细胞及其前体，包括造血干细胞。CD47/SIRPα相互作用传递“不要吃我”信号，阻止自体吞噬作用。对患者肿瘤和匹配的邻近正常(非肿瘤)组织的分析显示CD47蛋白在癌细胞上过表达，这有效地帮助它们逃避先天免疫监视和消除。阻断CD47-SIRPα与抗CD47抗体的相互作用已经显示出有效诱导体外肿瘤细胞的吞噬作用并抑制体内各种血液和实体肿瘤的生长。因此，CD47是癌症治疗的有效靶标，并且需要其适当的拮抗剂来制备人类治疗剂。在针对各种肿瘤和/或癌症的治疗中，仍然急需开发具有良好的靶点特异性、疗效优异(例如改善巨噬细胞的吞噬作用，抑制肿瘤生长)，且副作用较小的抗CD47抗体。
发明内容
本发明旨在提供一种靶向CD47的人源化抗体，以克服现有阻抗CD47与SIRPα结合的抗体在促进巨噬细胞的吞噬作用的同时，会引起血红细胞的凝集，从而使得相应抗体的治疗效果大打折扣，导致药物副作用产生的缺陷和不足。
本发明的目的是提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，所述抗体LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:1～3所示，HCDR1、HCDR2、HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:9～11所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5～8任一项所示。
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13～17任一项所示。
本发明另一目的是提供编码所述抗CD47抗体或其抗原结合片段的多核苷酸、载体、细胞或药物组合物。
本发明还涉及所述抗CD47抗体或其抗原结合片段、多核苷酸、载体、细胞或组合物在制备治疗和/或预防CD47阳性肿瘤的药物中的应用。
本发明还涉及所述抗CD47抗体或其抗原结合片段、多核苷酸、载体、细胞或所述组合物在制备检测CD47或诊断CD47相关疾病的试剂盒中的应用。
附图说明
图1是CD47抗体(15A1H21、15A1H31、15A1H41、15A1H33、15A1H44以及阳性对照Hu5F9)与人CD47结合的平均荧光强度。
图2是CD47抗体(15A1H12、15A1H32、15A1H11、15A1H51、15A1H34、15A1H4以及阳性对照Hu5F9)与人CD47结合的平均荧光强度。
图3是CD47抗体(15A1H21、15A1H31、15A1H41、15A1H33、15A1H44以及阳性对照Hu5F9)与猴CD47结合的平均荧光强度。
图4是CD47抗体(15A1H12、15A1H32、15A1H11、15A1H51、15A1H34、15A1H43以及阳性对照Hu5F9)与猴CD47结合的平均荧光强度。
图5是CD47抗体(15A1H11、15A1H22、15A1H21、15A1H31以及阳性对照Hu5F9)对人CD47的CD47/SIRPα结合抑制的平均荧光强度结果。
图6是CD47抗体(15A1H51、15A1H54、15A1H34以及阳性对照Hu5F9)对人CD47的CD47/SIRPα结合抑制的平均荧光强度结果。
图7是CD47抗体(15A1H11、15A1H22、15A1H21、15A1H31、15A1H51、15A1H34以及阳性对照Hu5F9)促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力检测结果。
图8是CD47抗体(15A1H11、15A1H22、15A1H12、15A1H21、15A1H31、15A1H41以及阳性对照Hu5F9)对人类红细胞血凝集分析结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明提供了抗CD47抗体或其抗原结合片段，所述抗体LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:1～3所示，HCDR1、HCDR2、HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ IDNO:9～11所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5～8任一项所示。
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13～17任一项所示。
在一些实施方式中，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示、重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；或所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示、重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；或所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示、重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；或所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示、重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:14所示；或所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示、重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；或所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示、重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示；或所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示、重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；或所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示、重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；或所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示、重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示；或所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示、重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；或所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:6所示、重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；或所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示、重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；或所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示、重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。
该抗体或其抗原结合片段的重要优点在于能强结合于肿瘤细胞，并阻断人SIRPa与人CD47信号，可以促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，不会引起红细胞凝集，且与RBC、血小板表现出极弱的结合，安全性好。
在本发明中，“抗体或其抗原结合片段”此技术术语是结合特定抗原的蛋白，其泛指包含互补决定区(CDR区)的一切蛋白及蛋白片段。“抗体”特别指全长抗体。“全长抗体”此用语包括多克隆抗体及单克隆抗体。
术语“抗原结合片段”是包含抗体CDR的一部分或全部的物质，其缺乏至少一些存在于全长链中的氨基酸但仍能够特异性结合至抗原。此类片段具生物活性，因为其结合至靶抗原，且可与其他抗原结合分子(包括完整抗体)竞争结合至给定表位。在一些实施方式中，抗原结合片段具有特异性识别并结合CD47的作用。在一些实施方式中，抗原结合片段是具有阻断CD47与其配体结合，激活免疫细胞功能的片段，在一个方面中，此类片段选自Fab，Fv(由VH和VL构成)，ScFv(单链抗体，VH和VL之间由一连接肽连接而成)或单域抗体(仅由VH组成)。所述片段可通过重组核酸技术产生，或可通过抗原结合分子(包括完整抗体)的酶裂解或化学裂解产生。
术语“特异性识别”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”或其类似表述是指抗体或其抗原结合片段对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体或其抗原结合片段以大约小于10-6M，例如大约小于10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合。
在本发明中，所提供的抗体或其抗原结合片段特异性识别的对象可以为多种属来源的CD47，例如人、鼠、猴(如食蟹猴cynomolgus monkey)。
在本发明中，所述抗体具有恒定区，重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD中的任一种；轻链恒定区为κ或λ链。
在优选实施方式中，所述重链恒定区选自IgG4。
在本发明中，所述恒定区的种属来源选自人、鼠、兔、羊或猴。
在优选实施方式中，所述恒定区的种属来源选自人。
在本发明中，所述抗体为CDR移植抗体、多聚体抗体或双特异性抗体中的任一种或几种；所述抗原结合片段为F(ab’)2、Fab、scFv、Fv及单域抗体中的任一种或几种。
在本发明中，所述CD47为人CD47、鼠CD47或猴CD47。
本发明还提供了编码所述抗CD47抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。
本发明还提供了一种载体，所述载体携带所述多核苷酸。
术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。在一些实施方式中，本发明所述载体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等)。
本发明还提供了一种细胞，所述细胞携带所述多核苷酸、含有所述载体或能够表达所述抗CD47抗体或其抗原结合片段。利用编码抗CD47抗体或其抗原结合片段的核酸与载体连接后，在细胞表达能够获得相应抗体。可以将上述载体导入到真核细胞、尤其是哺乳动物细胞中，构建获得能够表达本发明所述抗CD47抗体或其抗原结合片段的细胞。
本文使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这类名称都包括后代。因此，单词“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物，而不考虑转移数目。还应当理解的是，由于故意或非有意的突变，所有后代在DNA含量方面不可能精确相同。包括具有与最初转化细胞中筛选的相同的功能或生物学活性的突变后代。在意指不同名称的情况下，其由上下文清楚可见。
本发明还提供了一种药物组合物，所述组合物含有所述抗CD47抗体或其抗原结合片段、所述多核苷酸、所述载体或所述细胞。
在优选实施方式中，所述组合物还含有药学上可接受的载体。
本发明中，“药学可接受的载体”可以包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和延迟吸收剂等。具体可以是水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等以及它们的组合物中的任一种或几种。当然，“药学可接受的载体”还可包括微量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，用来延长抗体的保存限期或效力。
另外，所述抗CD47抗体或其抗原结合片段、所述多核苷酸、所述载体、所述细胞或所述组合物在制备治疗和/或预防CD47阳性肿瘤的药物中的应用，以及在制备检测CD47或诊断CD47相关疾病的试剂盒中的应用，也均应在本发明的保护范围之内。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了抗CD47抗体或其抗原结合片段，该抗体的亲和力高、特异性强，能够有效降低其免疫原性，阻断CD47与SIRPα结合，显著促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞，降低红细胞凝集，不会引起红细胞凝集，安全性好，因此该抗体能够在人类肿瘤治疗方面发挥强有力作用，广泛应用于制备治疗和/或预防CD47阳性肿瘤的药物，以及制备检测CD47或诊断CD47相关疾病的试剂盒。
实施例1鼠单抗人源化设计及组合
对5CD47-4鼠抗体(见CN201911335936.9，其LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:1～3所示，HCDR1、HCDR2、HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:9～11所示；其轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:12所示)进行人源化设计，5CD47-4鼠单抗的轻链可变区设计4条人源化序列，分别为15A1-L01～04，人源化轻链可变区(15A1-L01～04)的氨基酸序列如SEQ ID NO:5～8所示；重链设计5条人源化序列，分别为15A1-H01～05，人源化重链可变区(15A1-H01～05)的氨基酸序列如SEQ ID NO:13～17所示。
对以上氨基酸序列进行组合，所得抗体及其重链(VH)和轻链(VL)对应的序列如表1所示。
表1抗体及其重链和轻链对应的序列
抗体名称 VH VL
15A1H11 SEQ ID NO：13 SEQ ID NO：5
15A1H22 SEQ ID NO：14 SEQ ID NO：6
15A1H12 SEQ ID NO：13 SEQ ID NO：6
15A1H21 SEQ ID NO：14 SEQ ID NO：5
15A1H31 SEQ ID NO：15 SEQ ID NO：5
15A1H41 SEQ ID NO：16 SEQ ID NO：5
15A1H51 SEQ ID NO：17 SEQ ID NO：5
15A1H33 SEQ ID NO：15 SEQ ID NO：7
15A1H44 SEQ ID NO：16 SEQ ID NO：8
15A1H54 SEQ ID NO：17 SEQ ID NO：8
15A1H32 SEQ ID NO：15 SEQ ID NO：6
15A1H34 SEQ ID NO：15 SEQ ID NO：8
15A1H43 SEQ ID NO：16 SEQ ID NO：7
实施例2 CD47抗体的生产
将人源化框架区与分泌信号和人类κ以及人类FcIgG4S228P恒定结构域组合，将其克隆到哺乳动物表达系统中，并转染到293细胞中以生成人源化mAb。将人源化变体表达为全长IgG分子、分泌到培养基中并使用蛋白质A纯化。
在Expi293细胞中瞬时表达并纯化人源化抗体和阳性对照抗体Hu5F9-G4(Hu5F9-G4序列已在美国专利US2015/0183874A1中公开)。
对于Expi293细胞中抗体的瞬时表达，使用载体pCDNA3.4，首先将抗体的重链和轻链克隆到单独的pCDNA3.4载体中，使用PEI(购自Polysciences)化学转染试剂、按照化学转染的方法将带有抗体分子重链和轻链的pCDNA3.4载体转入Expi293细胞中，按照生产商提供的方案瞬时转染培养的Expi293细胞。
瞬时转染前一天Expi293(ThermoFisher Scientific)细胞传代，用Dynamis培养基(gibco)按2E6的密度接种1L摇瓶(conning)，放入细胞培养摇床(Adolf Kuhner；ISF4-XC)中37℃；8％CO2；120rpm培养；
转染当天，Expi293细胞用细胞计数仪(Countstar；IC1000)计数，用新鲜Dynamis培养稀释调整细胞密度为2.9E6；准备转染；PEI：DNA＝3:1；混匀5min，将二者轻柔混匀20次，静置15～30min。将DNA-PEI混合物加入Expi293细胞中，混匀，放入细胞培养摇床(AdolfKuhner；ISF4-XC)中37℃；8％CO2；120rpm培养；转染4h之后补加双抗(gibco)和抗凝剂(gibco)；收获上清纯化：转染连续培养7天，之后收样，先低速1000rpm；10min；4℃离心(湘仪H2050R)，再高速12000rpm；30min；4℃；收集细胞培养上清，0.22um过滤。将培养上清应用于Protein A Sepharose柱(GE Healthcare)。柱用PBS洗涤，然后用洗脱缓冲液(0.1M柠檬酸钠缓冲液，pH 3.0)洗脱蛋白质。收集的组分用1M Tris pH9.0中和。最后，将纯化的样品与PBS进行透析。
实施例3 CD47抗体与人CD47的结合
1、实验方法
在基于流式细胞术的测定法中测量本发明CD47抗体与人CD47的结合。具体步骤为：
采用表达人CD47的癌细胞系CCRF-CEM(上海中国科学院细胞库)属于人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞。将CCRF-CEM细胞(0.1×106个细胞)与不同浓度(最高浓度为30ug/mL，三倍稀释，共10个浓度)的实验抗体(本发明CD47抗体以及Hu5F9-G4抗体)，在含3％牛血清白蛋白(BSA)的PBS中，冰上孵育30分钟。然后将细胞洗涤至少两次，用FCM buffer(1XPBS+3％BSA)配制PE Goatt anti human IgG Fc(1:500x稀释)荧光二抗，按100uL/孔加入对于的96孔板中，4度冰箱孵育30min。取出96孔板，250g离心5min，小心去上清后，加入FCMbuffer 200uL/孔，再次250g离心5min，小心去上清，将细胞洗涤至少两次用1xPBS 100uL/孔重悬，并通过流式细胞术进行分析，并根据其MFI用GraphPad拟合浓度依赖的曲线。以Hu5F9-G4抗体作为阳性对照抗体。
2、实验结果
CD47抗体与人CD47结合的EC50结果如表2所示，CD47抗体(15A1H21、15A1H31、15A1H41、15A1H33、15A1H44)与人CD47结合的平均荧光强度如图1所示，CD47抗体(15A1H12、15A1H32、15A1H11、15A1H51、15A1H34、15A1H43)与人CD47结合的平均荧光强度如图2所示，结果显示本发明11种CD47抗体均显示出了很好的特异性结合能力，CD47抗体对细胞水平的人CD47与阳性对照抗体Hu5F9-G4的结合能力相当或比阳性对照抗体Hu5F9-G4的结合能力更好。
表2 CD47抗体与人CD47结合的EC50结果
抗体名称 EC50(nM)
15A1H11 0.4914
15A1H12 0.442
15A1H21 0.345
15A1H31 0.4339
15A1H41 0.5137
15A1H51 0.3264
15A1H33 0.3606
15A1H44 0.3553
15A1H32 0.3925
15A1H34 0.3689
15A1H43 0.4507
Hu5F9-G4 0.422
实施例4 CD47抗体与猴CD47的结合
1、实验方法
通过转染携带全长猴CD47的pCDNA3.4载体，产生过表达猴CD47的CHO细胞稳定细胞株(CHO-cynoCD47细胞)，将CHO-cynoCD47细胞(0.1×106个细胞)与不同浓度(最高浓度为10ug/mL，三倍稀释，共10个浓度)的实验抗体(本发明CD47抗体以及Hu5F9-G4抗体)，在含3％牛血清白蛋白(BSA)的PBS中，冰上孵育30分钟。然后将细胞洗涤至少两次，用FCMbuffer(1XPBS+3％BSA)配制PE Goat anti human IgG Fc(1:500x稀释)荧光二抗，按100uL/孔加入对于的96孔板中，4度冰箱孵育30min。取出96孔板，250g离心5min，小心去上清后，加入FCM buffer 200uL/孔，再次250g离心5min，小心去上清，将细胞洗涤至少两次用1x PBS 100uL/孔重悬，并通过流式细胞术进行分析，并根据其MFI用GraphPad拟合浓度依赖的曲线。以Hu5F9-G4抗体作为阳性对照抗体。
2、实验结果
CD47抗体与猴CD47结合的EC50结果如表3所示，CD47抗体(15A1H21、15A1H31、15A1H41、15A1H33、15A1H44)与人CD47结合的平均荧光强度如图3所示，CD47抗体(15A1H12、15A1H32、15A1H11、15A1H51、15A1H34、15A1H43)与猴CD47结合的平均荧光强度如图4所示，结果显示本发明11种CD47抗体均显示出了很好的特异性结合能力，CD47抗体对细胞水平的猴CD47与阳性对照抗体Hu5F9-G4的结合能力相当或比阳性对照抗体Hu5F9-G4的结合能力更好。
表3 CD47抗体与猴CD47结合的EC50结果
抗体名称 EC50(nM)
15A1H11 5.126
15A1H12 3.003
15A1H21 2.455
15A1H31 2.752
15A1H41 2.504
15A1H51 3.65
15A1H33 1.837
15A1H44 1.926
15A1H32 3.259
15A1H34 3.934
15A1H43 4.016
Hu5F9-G4 4.066
实施例5 CD47抗体对人CD47配体SIRPα与CD47相互作用的阻断
1、实验方法
通过流式细胞术测定本发明CD47抗体阻断人CD47与SIRPα的结合能力。具体步骤为：
抗体稀释：用FCM buffer(1XPBS+3％BSA)将本发明CD47抗体和对照抗体Hu5F9-G4稀释成90ug/mL，然后3倍梯度稀释成10个浓度，将亚型对照hIgG4稀释成30ug/mL、1.11ug/mL、0.041ug/mL，配体hSIRPα-mFC(AcroBiosystems)稀释至10ug/mL。
将CCRF-CEM(上海中国科学院细胞库)细胞按0.1×106个细胞/孔加入到96孔V型板，并且在CD47抗体量增加的条件下监控hSIRPα-mFC结合。使用PE Goat anti mouse IgGFc二抗(Biolegend)确定结合的SIRPα。以Hu5F9-G4抗体作为阳性对照抗体。
2、实验结果
CD47抗体阻断人CD47与SIRPα的结合的EC50结果如表4所示，CD47抗体(15A1H11、15A1H22、15A1H21、15A1H31)对人CD47的CD47/SIRPα结合抑制的平均荧光强度结果如图5所示，CD47抗体(15A1H51、15A1H54、15A1H34)对人CD47的CD47/SIRPα结合抑制的平均荧光强度结果如图6所示，结果显示本发明上述CD47抗体均能够在细胞水平显著抑制阻断CD47与SIRPα的结合，CD47抗体表现出了与阳性对照抗体Hu5F9-G4相当或比阳性对照抗体Hu5F9-G4更好的阻断能力。
表4 CD47抗体阻断人CD47与SIRPα的结合的EC50结果
抗体名称 EC50(nM)
15A1H11 0.5241
15A1H21 0.3523
15A1H22 0.3445
15A1H31 0.4003
15A1H51 0.3008
15A1H54 0.3058
15A1H34 0.3201
Hu5F9-G4 0.4725
实施例6 CD47抗体促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力检测
1、实验方法
在基于流式细胞术的测定法中测定本发明CD47抗体促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力。具体步骤为：
取捐赠者的新鲜血液，分离得到外周血单核细胞(PBMC)，并通过hCD14磁珠(Miltenyi/130-050-201)从PBMC中分离CD14阳性单核细胞，配置含rhGM-CSF(R&D)的完全培养基，rhGM-CSF终浓度为20ng/mL，CD14阳性单核细胞的浓度为5E5/mL，按20mL/皿加入到细胞培养皿中；转移至5％CO2 37℃细胞培养箱中，每3天对半更换新鲜培养基；在第5天加入IFN gamma(R&D)50ng/mL刺激1.5h，然后完全更换培养基(含20ng/mLGM-CSF和LPS(Sigma；L2630-10mg)100ng/mL)连续刺激2天。在第7天将巨噬细胞上清吸到15mL离心管中，同时加入预冷的DPBS，直接用细胞刮刀收集细胞；
选择人CD47高表达的肿瘤细胞系Jurkat(上海中国科学院细胞库)作为靶细胞类型，将靶肿瘤细胞按照CellTraceTM CFSE试剂盒的说明，进行荧光标记。将标记好的肿瘤细胞与上述已经完成分化的巨噬细胞按照1：1的比例共培养，同时加入10ug/mL抗体在37℃孵育2小时。然后将细胞洗涤至少两次，将细胞小心吹下，加入别藻青蛋白(allophycocyanin，APC)标记的CD14抗体(购自Biolegend)，在含0.1％BSA的PBS中冰上(避光)孵育30分钟。将细胞洗涤至少两次并通过流式细胞术进行分析。被吞噬的细胞群体为活细胞中CD14阳性并且荧光染料CFSE(carboxyfluorescein diacetate，succinimidyl ester，羧基荧光素双乙酸盐，琥珀酰亚胺酯)也为阳性的细胞群体。以Hu5F9-G4抗体作为阳性对照抗体。
2、实验结果
CD47抗体促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力检测结果如图7所示，结果显示本发明CD47抗体(15A1H11、15A1H22、15A1H21、15A1H31、15A1H51、15A1H34)具有促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力，且其促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力与阳性对照抗体Hu5F9-G4相当或更好。
实施例7 CD47抗体对人类红细胞血凝集分析
1、实验方法
进行红细胞血凝集分析来表征CD47抗体的RBC凝集能力。通过观察抗体避免人RBC发生沉降的能力就RBC凝集对CD47抗体进行筛选。具体方法为：
人类红细胞在PBS中稀释到2％，与滴入的CD47抗体(浓度依次为200ug/mL、100ug/mL、50ug/mL、25ug/mL、12.5ug/mL、3.125ug/mL、6.25ug/mL、1.5625ug/mL、0.78125ug/mL、0.390625ug/mL、0.195313ug/mL、0.097656ug/mL)在圆底96孔板内在37℃孵育2小时。未沉淀的红细胞的存在是证明红细胞血凝聚的证据，与未凝聚的红细胞沉淀形成清晰的红点相比，未沉淀的红细胞呈雾状。以Hu5F9-G4抗体作为阳性对照抗体。
2、实验结果
CD47抗体对人类红细胞血凝集分析结果如图8所示，结果显示，当CD47抗体(15A1H11、15A1H22、15A1H12、15A1H21、15A1H31、15A1H41)浓度达到200ug/mL时均未引起红细胞凝聚，而阳性对照Hu5F9-G4在0.195313ug/mL及以上浓度已发生红细胞凝聚，说明本发明CD47抗体具有显著降低红细胞凝集的作用，且无副作用、安全性好。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.抗CD47抗体或其抗原结合片段，所述抗体LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:1～3所示，HCDR1、HCDR2、HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:9～11所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5～8任一项所示。
2.根据权利要求1所述抗CD47抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13～17任一项所示。
3.根据权利要求1或2所述抗CD47抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示、重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；或所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示、重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；或所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示、重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；或所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:5所示、重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；或所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示、重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；或所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示、重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示；或所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示、重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；或所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示、重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；或所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示、重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示；或所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示、重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；或所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示、重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:15所示；或所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示、重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；或所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示、重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。
4.根据权利要求1-3任一项所述抗CD47抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体具有恒定区，重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD中的任一种；轻链恒定区为κ或λ链。
5.根据权利要求1-4任一项权利要求所述抗CD47抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为CDR移植抗体、多聚体抗体或双特异性抗体中的任一种或几种；
所述抗原结合片段为F(ab’)2、Fab、scFv、Fv及单域抗体中的任一种或几种。
6.编码权利要求1-5任一项权利要求所述抗CD47抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。
7.一种载体，其特征在于，所述载体携带权利要求6所述多核苷酸。
8.一种细胞，其特征在于，所述细胞携带权利要求6所述多核苷酸、含有权利要求7所述载体或能够表达权利要求1～5任一权利要求所述抗CD47抗体或其抗原结合片段。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物含有权利要求1～5任一所述抗CD47抗体或其抗原结合片段、权利要求6所述多核苷酸、权利要求7所述载体或权利要求8所述细胞。
10.权利要求1～5任一所述抗CD47抗体或其抗原结合片段、权利要求6所述多核苷酸、权利要求7所述载体、权利要求8所述细胞或权利要求9所述组合物在制备治疗和/或预防CD47阳性肿瘤的药物、制备检测CD47或诊断CD47相关疾病的试剂盒中的应用。
CN202011548892.0A 2020-12-24 2020-12-24 一种靶向cd47的人源化抗体及其应用 Pending CN114671950A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011548892.0A CN114671950A (zh) 2020-12-24 2020-12-24 一种靶向cd47的人源化抗体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011548892.0A CN114671950A (zh) 2020-12-24 2020-12-24 一种靶向cd47的人源化抗体及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114671950A true CN114671950A (zh) 2022-06-28

Family

ID=82071287

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011548892.0A Pending CN114671950A (zh) 2020-12-24 2020-12-24 一种靶向cd47的人源化抗体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114671950A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7082620B2 (ja) 抗ｐｄ１モノクローナル抗体、その医薬組成物およびその使用
CN113039205B (zh) 靶向cll1的抗体及其应用
DK1648507T3 (en) PROCEDURES AND COMPOSITIONS FOR INCREASING THE EFFECTIVENESS OF THERAPEUTIC ANTIBODIES USING COMPOUNDS THAT POTENTATE NK CELLS
RU2639553C2 (ru) Модуляция активации макрофагов
WO2017071625A1 (zh) 一种抗pd-1单克隆抗体、其药物组合物及其用途
HUE028363T2 (en) Apoptosis-inducing anti-ICAM antibody
CN116003598B (zh) 靶向人gprc5d的重组人源化单克隆抗体及其应用
KR20220038594A (ko) 항-hvem 항체 및 이의 사용
KR20230166096A (ko) Cldn18.2 항원 결합 단백질 및 이의 적용
JPH07507202A (ja) ヒトｍｄｒ１マルチドラッグ耐性遺伝子産物に対するモノクローナル抗体およびその使用
US20080248011A1 (en) Methods for Isolating Monocytes
JP7454044B2 (ja) Ｃｄ４７を標的とする抗体及びその使用
US20240002544A1 (en) Cd28 bispecific antibodies for targeted t cell activation
CN113416253B (zh) 分离的抗原itpripl1结合蛋白及其用途
CA3099968A1 (en) Use for preventing and treating myeloid-derived suppressor cell-related diseases
CN114671950A (zh) 一种靶向cd47的人源化抗体及其应用
WO2023246790A1 (zh) 一种含抗cd47抗体或其抗原结合片段的制剂及其制备方法和应用
CN117700552B (zh) 抗人cd93蛋白的兔单克隆抗体及其应用
AU2369101A (en) Antibodies against plasma cells
US20240034790A1 (en) Antibody specific for cd47 and uses thereof
CN118005786A (zh) 与cd47特异性结合的抗体或其抗原结合片段及其应用
JP2023535684A (ja) 抗ｇｐｒｃ５ｄ抗体に対する抗イディオタイプ抗体
CN118184798A (zh) 靶向cd19和cd81的双靶点嵌合抗原受体及其应用
CN117510636A (zh) Gprc5d抗体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20220628