JP7454044B2 - Ｃｄ４７を標的とする抗体及びその使用 - Google Patents

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Description

(関連出願の相互参照)
本開示は、２０２０年１２月２３日に中国国家知識産権局へ提出された出願番号がＣＮ２０２０１１５４４２６２.６で発明の名称が「ＣＤ４７を標的とする抗体及びその使用」である中国特許出願の優先権を主張し、それを全体として参照により本開示に組み込む。
本開示は、バイオ医薬品の技術分野に属する。具体的には、ＣＤ４７を標的とする抗体及びその使用に関し、より具体的には、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント、核酸、ベクター、細胞、組成物、使用及びキットに関する。
がん免疫療法はバイオテクノロジー分野における近年の重要な発見であり、Ｔ細胞ベースのＣＴＬＡ４抗体、ＰＤ－１抗体、ＰＤ－Ｌ１抗体などによる免疫チェックポイント阻害剤療法とＣＡＲ－Ｔ、ＴＣＲ－Ｔなどによる細胞療法はいずれも近年大きな注目を集める免疫療法である。これらはいずれもＴ細胞の機能回復に着眼し、言い換えれば、主に獲得免疫系の能力向上を中心に行うものである。
しかし、免疫チェックポイント(checkpoint)を標的とし、Ｔ細胞の機能を活性化させることによって、獲得免疫系の能力を向上させ、さらにがんを完治するという過程は紆余曲折に満ちている。
一方、長い間、自然免疫系は腫瘍免疫療法で役割が発揮されていない。実際には、腫瘍浸潤領域の全体で、マクロファージは腫瘍組織に約５０％を占めており、さらにマクロファージの数量が腫瘍の予後と負の相関にあり、これは腫瘍の中でマクロファージが重要な役割を果たすことを示している。マクロファージが食作用を発揮するには２つのシグナルが同時に作用する必要がある。
１つは細胞表面を標的とする「私を食べて(eat me)」シグナルの活性化であり、もう１つは同じ表面を標的とする「私を食べないで」シグナルの不活化である。いずれかのシグナルが欠けると食作用は起こらない。ＣＤ４７は「私を食べないで」シグナルであり、マクロファージの表面のシグナル調節タンパク質α(Signal regulatory proteinα、ＳＩＲＰα)と互いに結合してマクロファージの食作用を阻害することは多くの証拠から示されている。腫瘍細胞はまたＣＤ４７の発現によりマクロファージの食作用を回避できる(例えば、特許ＥＰ２２４２５１２とその中の引用文献を参照する)。
ＣＤ４７はインテグリン関連タンパク質(ＩＡＰ)とも呼ばれ、アミノ末端の免疫グロブリンドメインとカルボキシ末端の複数の膜貫通領域を有する５０ｋＤａの膜タンパク質である。シグナル調節タンパク質α(ＳＩＲＰα)、ＳＩＲＰγ、インテグリン、トロンボスポンジン－１(ＴＳＰ－１)を含みそれらに限定されない様々なリガンドと相互作用する。ＳＩＲＰαは主に、造血幹細胞を含め、マクロファージ、骨髄系樹状細胞(ＤＣ)、顆粒球、肥満細胞とその前駆細胞などの骨髄細胞に発現される。
ＣＤ４７／ＳＩＲＰα相互作用は「私を食べないで」シグナルを伝達し、オートファジーを阻止する。患者の腫瘍と隣接する正常(非腫瘍)組織を分析したところ、ＣＤ４７タンパク質ががん細胞において過剰に発現され、これは自然免疫の監視と排除からの効果的な回避に役立つことが判明される。ＣＤ４７－ＳＩＲＰαと抗ＣＤ４７抗体の相互作用を遮断することにより、インビトロでは腫瘍細胞の食作用が効果的に誘導されインビボでは様々な血液・固形腫瘍の成長が阻害されることが示される。
したがって、ＣＤ４７はがん治療の有効な標的であり、そしてヒト用治療剤を製造するには適切な拮抗剤を必要とする。
ＣＤ４７モノクローナル抗体は赤血球と高い標的結合性を有し、赤血球凝集を引き起こしやすいため、関連の抗体の治療効果を大幅に低下させ、薬物の副作用まで引き起こす。本開示はＣＤ４７を標的とする抗体を提供することを目的とし、前記抗体はＣＤ４７とＳＩＲＰαの結合を遮断して、マクロファージの食作用の発揮を促進することができ、さらには、赤血球凝集をある程度避けることができ、安全性に優れる。
本開示の目的は抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントを提供することであり、前記抗体は、ＣＤＲとして、
配列番号１又は配列番号１と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列に示されるＬＣＤＲ１、配列番号２又は配列番号２と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列に示されるＬＣＤＲ２、配列番号３又は配列番号３と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列に示されるＬＣＤＲ３と、
配列番号１０又は配列番号１０と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列に示されるＨＣＤＲ１、配列番号１１又は配列番号１１と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列に示されるＨＣＤＲ２、配列番号１２又は配列番号１２と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列に示されるＨＣＤＲ３とを含む。
本開示の別の目的は、前記抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントに関連する核酸、ベクター、細胞又は医薬組成物を提供することである。
本開示は、さらに、ＣＤ４７陽性腫瘍を治療及び／又は予防する薬物の製造における前記抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント、及び関連する核酸、ベクター、細胞又は医薬組成物の使用に関する。
本開示は、さらに、ＣＤ４７検出又はＣＤ４７関連疾患診断キットの製造における前記抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント、及び関連する核酸、ベクター又は細胞の使用に関する。
本開示は、さらに、前記抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントを含むＣＤ４７検出キットを提供する。
本開示は、さらに、前記抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントを含むＣＤ４７関連疾患診断キットを提供する。
本開示は次の有益な効果を有する。
本開示は抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントを提供し、当該抗体はインビトロにおいて赤血球凝集が起こらず、さらには赤血球とは非常に弱いレベルの低結合を示し又は結合しない。ＣＤ４７とＳＩＲＰαの結合を効果的に遮断し、腫瘍細胞に対するマクロファージの食作用活性への媒介を活性化することができ、ＣＤ４７陽性腫瘍細胞との明らかな標的特異性を示しており、親和性が高く、特異性が高く、赤血球凝集を引き起こさず、しかもヒト赤血球、血小板とは非常に弱い結合を示し、安全性に優れる。したがって、前記抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントは腫瘍免疫療法で大変要望な標的として利用することができ、ヒト腫瘍の治療において大きな役割を果たし、ＣＤ４７陽性腫瘍を治療する薬物の製造で幅広い利用が見込まれる。
以下、本開示の実施例に係る技術的解決手段を明瞭に説明するために、実施例で使用する図面を簡単に紹介する。なお、次の図面は本開示のいくつかの実施例を示すものに過ぎず、範囲の限定とは見なされないということは理解できる。当業者は、新規性のある作業をしなくても、これらの図面から他の関連の図面を得ることができる。
ＣＤ４７抗体(７Ａ１１Ｈ１１、７Ａ１１Ｈ１２、７Ａ１１Ｈ２２、７Ａ１１Ｈ３２、７Ａ１１Ｈ４２、陽性コントロール抗体Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４及びｈＩｇＧ４アイソタイプコントロール)とヒトＣＤ４７の結合の平均蛍光強度である。 ＣＤ４７抗体(７Ａ１１Ｈ５２、７Ａ１１Ｈ１４、７Ａ１１Ｈ１５、７Ａ１１Ｈ３３、７Ａ１１Ｈ３４、７Ａ１１Ｈ３５、７Ａ１１Ｈ５５、陽性コントロール抗体Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４及びｈＩｇＧ４アイソタイプコントロール)とヒトＣＤ４７の結合の平均蛍光強度である。 ＣＤ４７抗体(７Ａ１１Ｈ１１、７Ａ１１Ｈ１２、７Ａ１１Ｈ２２、７Ａ１１Ｈ３２、７Ａ１１Ｈ４２、７Ａ１１Ｈ５２、陽性コントロール抗体Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４及びｈＩｇＧ４アイソタイプコントロール)とサルＣＤ４７の結合の平均蛍光強度である。 ＣＤ４７抗体(７Ａ１１Ｈ１４、７Ａ１１Ｈ１５、７Ａ１１Ｈ３３、７Ａ１１Ｈ３４、７Ａ１１Ｈ３５、７Ａ１１Ｈ５５、陽性コントロール抗体Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４及びｈＩｇＧ４アイソタイプコントロール)とサルＣＤ４７の結合の平均蛍光強度である。 ＣＤ４７抗体(７Ａ１１Ｈ１１、７Ａ１１Ｈ１２、７Ａ１１Ｈ２２、７Ａ１１Ｈ３２、７Ａ１１Ｈ４２及びｈＩｇＧ４アイソタイプコントロール)のヒトＣＤ４７のＣＤ４７／ＳＩＲＰα結合に対する阻害結果である。 ＣＤ４７抗体(７Ａ１１Ｈ５２、７Ａ１１Ｈ１４、７Ａ１１Ｈ１５、７Ａ１１Ｈ３３、７Ａ１１Ｈ３４、７Ａ１１Ｈ３５、７Ａ１１Ｈ５５)のヒトＣＤ４７のＣＤ４７／ＳＩＲＰα結合に対する阻害結果である。 ＣＤ４７抗体の腫瘍細胞に対するマクロファージの食作用を促進する能力の測定結果である。 ＣＤ４７抗体のＲＢＣ凝集能力の測定結果である。 ＣＤ４７抗体のヒト赤血球との結合能力の測定結果である。 ＣＤ４７抗体とヒト血小板の結合アッセイの結果である。 ＣＤ４７抗体の赤血球に対するマクロファージの食作用の活性化アッセイの結果である。 ＣＤ４７抗体のヒトＢリンパ球皮下移植腫瘍モデルに対する抗腫瘍結果である。 ＣＤ４７抗体のヒト悪性黒色腫モデルに対する抗腫瘍結果である。
以下、特定の実施例を用いて本開示を一層説明し、ただし実施例は決して本開示への限定ではない。特段の説明がない限り、本開示で使用する試薬、方法と装置は本技術分野の通常の試薬、方法と装置である。
特段の説明がない限り、次の実施例で使用する試薬と材料はいずれも市販品である。
本開示は、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントに関し、前記抗体は、ＣＤＲとして、
配列番号１又は配列番号１と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列に示されるＬＣＤＲ１、配列番号２又は配列番号２と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列に示されるＬＣＤＲ２、配列番号３又は配列番号３と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列に示されるＬＣＤＲ３と、
配列番号１０又は配列番号１０と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列に示されるＨＣＤＲ１、配列番号１１又は配列番号１１と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列に示されるＨＣＤＲ２、配列番号１２又は配列番号１２と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列に示されるＨＣＤＲ３とを含む。
当該抗体又はその抗原結合フラグメントの大きな利点はＣＤ４７と高い親和性を有することである。
当該抗体又はその抗原結合フラグメントの大きな利点はＣＤ４７とＳＩＲＰαの結合を遮断する活性を有する。
当該抗体又はその抗原結合フラグメントの大きな利点は腫瘍細胞に対するマクロファージの食作用を促進する能力を有することである。
当該抗体又はその抗原結合フラグメントの大きな利点は赤血球凝集を明らかに低減する効果を有することである。
当該抗体又はその抗原結合フラグメントの大きな利点は赤血球とは非常に弱いレベルの低結合を示し又は結合しない。
上記の特性を有するため、当該抗体又はその抗原結合フラグメントは、抗体薬物として使用することが好ましい。
本開示において、用語「抗体又はその抗原結合フラグメント」は特定の抗原と結合するタンパク質であって、一般に、相補性決定領域(ＣＤＲ領域)を含むあらゆるタンパク質とタンパク質フラグメントを指す。「抗体」とは特に全長抗体を指す。用語「全長抗体」はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体を含む。
用語「抗原結合フラグメント」は抗体ＣＤＲの一部又は全体を含む物質であり、全長鎖に存在するアミノ酸の少なくともいくつかを欠いているが、抗原と特異的に結合することができる。このようなフラグメントは、標的抗原と結合し、且つ他の抗原結合分子(無傷抗体を含む)と競合的に特定のエピトープと結合できるため、生理活性を有する。いくつかの実施形態において、抗原結合フラグメントはＣＤ４７と特異的に認識して結合する機能を有する。
いくつかの実施形態において、抗原結合フラグメントはＣＤ４７のそのリガンドの結合を遮断し、免疫細胞を活性化させる機能を有するフラグメントであり、一態様において、このようなフラグメントはＦａｂ(無傷の軽鎖とＦｄとからなる)、Ｆｖ(ＶＨとＶＬとからなる)、ＳｃＦｖ(ＶＨとＶＬが結合ペプチドによって結合される一本鎖抗体)、単一ドメイン抗体(ＶＨだけからなる)から選ばれる。前記フラグメントは組換え核酸技術により、又は抗原結合分子(無傷抗体を含む)の酵素分解又は化学分解により生成されてもよい。
用語「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」とは免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の超可変領域を指す。３種の重鎖ＣＤＲと３種の軽鎖ＣＤＲがある。なお場合によっては、用語「ＣＤＲ」と「ＣＤＲ」とは抗体又はその抗原結合フラグメントとそれによって認識される抗原又はエピトープの結合親和性に役割を果たす１つ若しくは複数又は全ての主要アミノ酸残基を含む領域を指す。別の特定の実施形態において、ＣＤＲ領域又はＣＤＲとはＩＭＧＴ定義の免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の超可変領域を指す。
本開示において、重鎖の相補性決定領域はＨＣＤＲと、軽鎖の相補性決定領域はＬＣＤＲと表す。本分野で一般的に用いられるＣＤＲ定義方法は、Ｋａｂａｔ番号付けスキーム、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ番号付けスキーム、Ｌｅｆｒａｎｃらが１９９７年に発表した免疫グロブリンスーパーファミリーの全タンパク質配列を対象とする新規な標準化番号付けシステムを含む。
Ｋａｂａｔらは初めて免疫グロブリンの可変領域を対象とする標準化番号付けスキームを提案した。彼らの著作「Sequences of Proteins of Immunological Interest」によると、軽鎖(λ、κ)可変領域と抗体重鎖のアミノ酸配列、及びＴ細胞受容体の可変領域(α、β、γ、δ)が整列され番号が付けられている。過去の数十年に配列が次々と解明されることでＫＡＢＡＴＭＡＮデータベースが作成され、一般にＫａｂａｔ番号付けスキームは抗体残基の番号付けで一般的に使用する基準と見なされる。本開示ではＫａｂａｔ注釈基準で定義されるＣＤＲ領域を採用するが、他の方法で定義されるＣＤＲ領域も本開示の保護範囲に含まれる。
用語「特異的な認識」、「選択的な結合」、「選択的に結合」、「特異的に結合」又は類似の用語とは抗体又はその抗原結合フラグメントが予め確定した抗原のエピトープとの結合を指す。一般に、抗体又はその抗原結合フラグメントは約１０-6Ｍ未満、例えば、約１０-7Ｍ、１０-8Ｍ、１０-9Ｍ若しくは１０-10Ｍ未満、又はより低い親和性(ＫD)で結合する。
本開示に係る抗体又はその抗原結合フラグメントが特異的に認識する対象はは複数の種属、例えば、ヒト、ネズミ、サル(例えば、カニクイザル(cynomolgus monkey))由来のＣＤ４７であってもよい。
いくつかの実施形態において、前記抗体は重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域配列の少なくとも一方を含み、前記重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域配列の少なくとも一方の少なくとも一部はネズミ抗体、ヒト化抗体、霊長目抗体又はその変異体の少なくとも一方に由来する。
いくつかの実施形態において、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号５～９のいずれかに示されるものであり又は配列番号５～９のいずれかに示されるものと少なくとも９５％の相同性を有する配列である。
いくつかの実施形態において、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１４～１８のいずれかに示されるものであり又は配列番号１４～１８のいずれかに示されるものと少なくとも９５％の相同性を有する配列である。
いくつかの実施形態において、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号５に示されるものであり、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１４に示されるものであり、又は前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号６に示されるものであり、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１４に示されるものであり、又は前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号６に示されるものであり、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１５に示されるものであり、又は前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号６に示されるものであり、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１６に示されるものであり、又は前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号６に示されるものであり、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１７に示されるものであり、又は前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号６に示されるものであり、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１８に示されるものであり、又は前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８に示されるものであり、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１４に示されるものであり、又は前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号９に示されるものであり、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１４に示されるものであり、又は前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７に示されるものであり、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１６に示されるものであり、又は前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８に示されるものであり、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１６に示されるものであり、又は前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号９に示されるものであり、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１６に示されるものであり、又は前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号９に示されるものであり、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１８に示されるものである。
いくつかの実施形態において、前記抗体は定常領域を有し、重鎖定常領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤから選ばれるいずれか１つであり、軽鎖定常領域はκ鎖又はλ鎖である。
いくつかの実施形態において、前記定常領域の由来種属はネズミ、ウサギ、ヒツジ、サル、ヒトから選ばれる。
いくつかの実施形態において、前記抗体はＣＤＲ移植抗体、多量体抗体と二重特異性抗体のうちのいずれか１つ又は複数である。
いくつかの実施形態において、前記抗原結合フラグメントはＦ(ａｂ’)2、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ及び単一ドメイン抗体のうちのいずれか１つ又は複数である。
いくつかの実施形態において、前記ＣＤ４７はヒトＣＤ４７、ネズミＣＤ４７又はサルＣＤ４７である。
本開示は、さらに、前記抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸に関する。
核酸は一般にＲＮＡ又はＤＮＡであり、核酸分子は一本鎖でも二本鎖でもよいが、二本鎖ＤＮＡが好ましい。核酸が別の核酸配列と機能的な関係にある場合に、核酸は「作動可能に連結」される。例えば、プロモーター又はエンハンサーがコード配列の転写に影響を与える場合に、プロモーター又はエンハンサーは前記コード配列に作動可能に連結される。ベクターと連結する場合にはＤＮＡ核酸を用いるのが好ましい。
また、抗体が膜タンパク質であるため、核酸は一般にシグナルペプチド配列を備える。
本開示は、さらに、上記の核酸を備えるベクターに関する。
用語「ベクター(vector)」とは、ポリヌクレオチドをその中に挿入可能な核酸送達ビヒクルを指す。挿入されたポリヌクレオチドがコードするタンパク質がベクターにおいて発現される場合に、ベクターは発現ベクターと呼ばれる。ベクターを形質転換、形質導入、又はトランスフェクションにより宿主細胞に導入することで、それが備える遺伝物質エレメントを宿主細胞において発現することができる。
ベクターは当業者に周知されるものであり、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体(ＹＡＣ)や細菌人工染色体(ＢＡＣ)、Ｐ１由来人工染色体(ＰＡＣ)などの人工染色体、λファージ又はＭ１３ファージなどのファージ、動物ウイルスなどを含み、ただしそれらに限定されない。ベクターとして利用可能な動物ウイルスは、レトロウイルス(レンチウイルスを含む)、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス(例えば、単純ヘルペスウイルス)、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポーバウイルス(例えば、ＳＶ４０)を含み、ただしそれらに限定されない。
いくつかの実施形態において、本開示に記載のベクターには、エンハンサー、プロモーター、内部リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)、他の発現制御エレメント(例えば、転写終結シグナル、又はポリアデニル化シグナル、ポリＵ配列など)など、遺伝子工学でよく利用する調節エレメントが含まれる。
本開示は、さらに、上記の核酸を備え又は上記のベクターを含む細胞に関する。抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸をベクターに結合させた後、細胞における発現で関連の抗体を得ることができる。上記のベクターを真核細胞、特に哺乳動物細胞に導入して、本開示に記載の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントを発現できる細胞を構築してもよい。
本明細書で用語「細胞」、「細胞株」と「細胞培養物」は入れ替えて使用され、且つそのいずれも子孫を含む。そのため、用語「形質転換体」と「形質転換細胞」は形質転換の回数に関係なく、初代の試験細胞とそれに由来する培養物を含む。なお、変異には意図的ものと意図的でないものがあるため、全ての子孫はＤＮＡ含有量が全く同じにはならないということは理解できる。最初の形質転換細胞においてスクリーニングされたのと同じ機能又は生物学的活性有する変異子孫を含む。名称が同じでも意味は異なる場合に、文脈からそれが明らかになる。
本開示は、さらに、前記抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント、前記核酸、前記ベクター又は前記細胞を含む医薬組成物に関する。
いくつかの実施形態において、前記組成物は薬学的に許容される担体をさらに含む。「薬学的に許容される担体」は抗体の保存期限又は機能を延長させるために、生理学的に適合性のあるありとあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤と抗真菌剤、等張剤と吸収遅延剤などを含んでもよい。
ＣＤ４７陽性腫瘍を治療及び／又は予防する薬物の製造における前記抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント、前記核酸、前記ベクター、前記細胞又は前記組成物の使用も、本開示の保護範囲に含まれる。
前記薬物は赤血球凝集を低減し、赤血球との結合活性を低減することができる。
ＣＤ４７検出又はＣＤ４７関連疾患診断キットの製造における前記抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント、前記核酸、前記ベクター又は前記細胞の使用も、本開示の保護範囲に含まれる。
本開示は、さらに、前記抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントを含むＣＤ４７検出キットを提供する。
本開示は、さらに、前記抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントを含むＣＤ４７関連疾患診断キットを提供する。
以下、実施例を用いて本開示の実施形態を詳細に説明する。
実施例１:抗ＣＤ４７ネズミモノクローナル抗体のスクリーニング
１. ｈＣＤ４７－ＥＣＤ－ＨＩＳ組換え発現プラスミドの構築
ＧｅｎＢａｎｋから提供される配列をテンプレート(ＣＥＪ ９５６４０.１)として、ヒトＣＤ４７細胞外領域(ｈＣＤ４７－ＥＣＤ)完全長コーディングＤＮＡ配列を遺伝子合成し３’末端に６つのＨＩＳタグ配列を追加し、５’末端ＥｃｏｌＩと３’末端ＨｉｎｄＩＩＩの二重制限部位により発現ベクターｐＣＤＮＡ３．４(ｔｈｅｒｍｏ社)にクローニングすることにより、ＣＤ４７細胞外全長タンパク質の組換え真核発現プラスミド、即ちｈＣＤ４７－ＥＣＤ－ＨＩＳ組換えプラスミドＤＮＡを確立した。
２. ｈＣＤ４７－ＥＣＤ－ＨＩＳ組換えタンパク質の発現と精製
ｈＣＤ４７－ＥＣＤ－ＨＩＳ組換えタンパク質の発現と精製は、次のステップを含む。
(１)一過性トランスフェクションの前日に、Ｅｘｐｉ２９３(ThermoFisher Scientific、Ａ１４６３５)細胞を継代し、Ｄｙｎａｍｉｓ培地(ｇｉｂｃｏ、Ａ２６１７５０２)を使用して２×１０6の密度で１Ｌ振盪フラスコ(ｃｏｎｎｉｎｇ、４３１１４７)に接種し、細胞培養シェーカー(Adolf Kuhner、ＩＳＦ４－ＸＣ)に入れて３７℃下８％ＣＯ2と１２０回転／分で培養した。
トランスフェクション当日に、Ｅｘｐｉ２９３細胞をセルカウンター(Ｃｏｕｎｔｓｔａｒ、ＩＣ１０００)でカウントし、用時調製したＤｙｎａｍｉｓで培養、希釈して細胞密度を２.９×１０6に調整した。トランスフェクションに備え、ＰＥＩ:ＤＮＡ＝３:１で５分間均一に混合し、両者を２０回軽やかに均一に混合して、１５～３０分間静置した。
ＤＮＡ－ＰＥＩ混合物をＥｘｐｉ２９３細胞に加えて、均一に混合し、細胞培養シェーカー(Adolf Kuhner、ＩＳＦ４－ＸＣ)に入れて３７℃下８％ＣＯ2と１２０回転／分で培養した。４時間トランスフェクションした後に、ペニシリン・ストレプトマイシン溶液(ｇｉｂｃｏ、１５１４０１２２)と抗凝固剤(ｇｉｂｃｏ、００１００５７)を追加した。
(２)上清の取得である。トランスフェクションして７日間連続培養し、次にサンプルを取得し、最初に低速１０００回転／分で４℃下１０分間遠心分離し(湘儀Ｈ２０５０Ｒ)、次に高速１２０００回転／分で４℃下３０分間とし、細胞培養上清を収集して、０.２２μm濾過した。
(３)ＨｉｓＴｒａｐアフィニティークロマトグラフィー精製である。上清を１mL/分の速度でＨｉｓＴｒａｐアフィニティークロマトグラフィーにロードし、ロードを完了した後、カラム５個分の体積の２０mM Ｔｒｉｓ－ＨＣｌと１５０mM ＮａＣｌのｐＨ８.０の平衡溶液でカラムを洗い流した。カラム５個分の体積の２０mM Ｔｒｉｓ－ＨＣｌと１５０mM ＮａＣｌと０～５００mM イミダゾールのｐＨ８.０の溶離液でカラムを洗い流し、溶離ピークを収集した。精製後のＣＤ４７－ＥＣＤタンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ－ＰＡＧＥ)により同定した。
３．抗ＣＤ４７ネズミモノクローナル抗体のスクリーニング
ステップ２で精製したｈＣＤ４７－ＥＣＤ－ＨＩＳ組換えタンパク質(以下、ｈＣＤ４７抗原という)をＢＡＬＢ／Ｃマウス(広東省実験動物センターから購入)の免疫化に使用する。方法は具体的に次のとおりである。
(１)動物の免疫化である。完全フロイントアジュバントで精製後のｈＣＤ４７抗原を乳化し、皮下又は腹腔内注射により６～８週齢のＢＡＬＢ／Ｃマウスを免疫し、免疫化のための用量は２５μg/匹であり、１群当たり５匹である。１週間をあけて２回目の免疫を行い、不完全フロイントアジュバントで乳化し、免疫化のための用量は２５μg/匹であった。４回の免疫後に尾静脈から採血してＥＬＩＳＡ法で勾配希釈により血清の力価を測定した。融合の３日前に追加免疫し、細胞融合のために抗体力価最高のマウスを選択した。
(２)細胞融合である。骨髄腫細胞としてＢＡＬＢ／Ｃ由来のｓｐ２／０(ＡＴＣＣ(登録商標)ＣＲＬ－１５８１)を使用し、融合時は対数増殖期であった。免疫後マウスから脾臓を摘出して、リンパ球単細胞懸濁液を調製した。マウス脾臓リンパ球と骨髄腫細胞を１:５～１:１０で混合し、３７℃の５０％ＰＥＧ１５００(ｐＨ８.０)１mLを滴加し、不完全培地ＤＭＥＭと残りの停止溶液を加え、遠心分離して上清を捨てた後、ＨＡＴ培地を加えて懸濁させ均一に混合し、９６ウェルプレートにプレーティングして、５％ＣＯ2の３７℃恒温インキュベーターに入れて培養した。培養１週間後、ＨＴ培地と１回目に培地を交換し、さらに３日間培養後、ＨＴ培地と２回目に培地を交換した。
(３)スクリーニングとクローニングである。２週間融合後、細胞上清を採取してＥＬＩＳＡ試験で検出し、細胞上清と精製ＣＤ４７－ＥＣＤ－Ｈｉｓ組換えタンパク質の結合状況を検出し、ＥＬＩＳＡ結果陽性の細胞をスクリーニングした後、２回目にＥＬＩＳＡ試験を行い再検出した。
陽性ウェルの細胞を限界希釈し、各限界希釈後７日目にＥＬＩＳＡにおいて値を測定し、ＯＤ２８０陽性値の高い方のモノクローナルウェルを選択して、ＥＬＩＳＡにより９６ウェルプレート全体が結果陽性となるまで限界希釈を行った。陽性値の高い方のモノクローナル株を選択した。
(４)細胞上清モノクローナル抗体の調製と精製である。１５％血清含有ＤＭＥＭ培地を使用してＴ２５培養フラスコにおいて陽性クローンを培養し、拡大培養する時は、８００回転／分で５分間遠心分離し、上清を捨て細胞を５００mL振盪フラスコに移し、無血清培地(Hybridoma-SFM Complete DPM、Ｇｉｂｃｏ、１２３００－０６７)を加えて、細胞密度を約３×１０5個/mLとした。
引き続き１～２週間培養した後、細胞死亡率が６０％～７０％になると、細胞懸濁液を収集して８０００回転／分で２０分間高速遠心分離し、上清を取得し、アフィニティークロマトグラフィーにより上清を精製し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーにより抗体を精製した。
ロードして、ＵＶ２８０ベースラインが０となるまで、ｐＨ７．４の２.５Ｍ ＰＢＳで洗い流した。ｐＨ３.５の０.１Ｍ クエン酸溶液で溶離し、２mLごとに溶離管に収集し、１管当たり１００μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ溶液を加えた。収集液を濃縮した。精製後のモノクローナル抗体の濃度を測定し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより抗体の純度を検証した。分注し(１００μＬ／管)、－８０℃で保存した。
実施例２:ネズミモノクローナル抗体のヒト化設計と組み合わせ
ネズミ抗体の軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列は配列番号１～３に示すとおりである。
Figure 0007454044000001
ネズミ抗体の重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列は配列番号１０～１２に示すとおりである。
Figure 0007454044000002
ネズミ抗体の軽鎖可変領域(＞７Ａ１１Ｄ３Ｄ３－ＶＬ)のアミノ酸配列は配列番号４に示すとおりである。
ネズミ抗体の重鎖可変領域(＞７Ａ１１Ｄ３Ｄ３－ＶＨ)のアミノ酸配列は配列番号１３に示すとおりである。
ネズミ抗体のヒト化設計を行い、７Ａ１１Ｄ３Ｄ３ネズミモノクローナル抗体の軽鎖に５つのヒト化配列を設計し、それぞれが７Ａ１１－Ｌ０１～０５であり、ヒト化軽鎖可変領域(７Ａ１１－Ｌ０１～０５)のアミノ酸配列は配列番号５～９に示すとおりである。重鎖に５つのヒト化配列を設計し、それぞれが７Ａ１１－Ｈ０１～０５であり、ヒト化重鎖可変領域(７Ａ１１－Ｈ０１～０５)のアミノ酸配列は配列番号１４～１８に示すとおりである。
上記のアミノ酸配列を組み合わせて得た抗体及びその重鎖可変領域(ＶＨ)と軽鎖可変領域(ＶＬ)に対応する配列は表１に示すとおりである。
Figure 0007454044000003
実施例３:ＣＤ４７抗体の産生
ヒト化可変ドメインと分泌シグナルをヒトκとヒトＦｃＩｇＧ４Ｓ２２８Ｐの定常ドメインと組み合わせて、哺乳動物発現系にクローニングし、２９３細胞にトランスフェクションしてヒト化ｍＡｂを得た。ヒト化変異体を完全長ＩｇＧ分子として発現させて、培地に分泌させてタンパク質Ａで精製した。
Ｅｘｐｉ２９３細胞においてヒト化抗体、陽性コントロール抗体Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４(Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４配列は米国特許ＵＳ２０１５／０１８３８７４Ａ１に開示されている)を一過性発現し、精製した。
Ｅｘｐｉ２９３細胞における抗体の一過性発現としては、ベクターｐＣＤＮＡ３．４を用い、最初に抗体の重鎖と軽鎖を単独のｐＣＤＮＡ３.４ベクターにクローニングし、化学トランスフェクション試薬としてＰＥＩ(Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓから購入)を使用して、化学的なトランスフェクション法で抗体分子の重鎖と軽鎖を備えるｐＣＤＮＡ３.４ベクターをＥｘｐｉ２９３細胞に導入し、メーカーの説明に従い、培養したＥｘｐｉ２９３細胞を一過性トランスフェクションした。
一過性トランスフェクションの前日に、Ｅｘｐｉ２９３(ThermoFisher Scientific、Ａ１４６３５)細胞を継代し、Ｄｙｎａｍｉｓ培地(ｇｉｂｃｏ、Ａ２６１７５０２)を使用して２Ｅ６の密度で１Ｌ振盪フラスコ(ｃｏｎｎｉｎｇ、４３１１４７)に接種し、細胞培養シェーカー(Adolf Kuhner、ＩＳＦ４－ＸＣ)に入れて３７℃下８％ＣＯ２と１２０回転/分で培養した。
トランスフェクション当日に、Ｅｘｐｉ２９３細胞をセルカウンター(Ｃｏｕｎｔｓｔａｒ、ＩＣ１０００)でカウントし、用時調製したＤｙｎａｍｉｓで培養、希釈して細胞密度を２．９Ｅ６に調整した。トランスフェクションに備え、ＰＥＩ:ＤＮＡ＝３:１で５分間均一に混合し、両者を２０回軽やかに均一に混合して、１５～３０分間静置した。ＤＮＡ－ＰＥＩ混合物をＥｘｐｉ２９３細胞に加えて、均一に混合し、細胞培養シェーカー(Adolf Kuhner、ＩＳＦ４－ＸＣ)に入れて３７℃下８％ＣＯ2と１２０回転／分で培養した。４時間トランスフェクションした後に、ペニシリン・ストレプトマイシン溶液(ｇｉｂｃｏ、１５１４０１２２)と抗凝固剤(ｇｉｂｃｏ、００１００５７)を追加した。
上清の取得と精製である。トランスフェクションして７日間連続培養し、次にサンプルを取得し、最初に低速１０００回転／分で４℃下１０分間遠心分離し(湘儀Ｈ２０５０Ｒ)、次に高速１２０００回転／分で４℃下３０分間とし、細胞培養上清を収集して、０．２２μｍ濾過した。培養上清をProteinA Sepharoseカラム(ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ)に使用する。カラムをＰＢＳで洗浄し、その後、溶離バッファー(０.１Ｍ クエン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ３.０)でタンパク質を溶離した。収集した画分をｐＨ９.０の１Ｍ Ｔｒｉｓで中和した。最後に、精製サンプルをＰＢＳと透析した。
実施例４:ＣＤ４７抗体親和性測定
１．実験方法
バイオレイヤー干渉法(ＦｏｒｔｅＢｉｏ)で本開示の抗体のヒトＣＤ４７(ｈＣＤ４７)と結合する平衡解離定数(ＫＤ)を測定した。ＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定は従来の方法(Estep,P et al.,High throughput solution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.MAbs;2013.5(2):p.270-8)で行い、具体的には次のとおりである。
アッセイバッファーにおいてセンサーをオフラインで３０分間平衡化し、その後６０秒間オンラインで検出してベースラインを確立し、オンラインにおいて実施例３で精製した抗体をＡＨＣセンサー(ＦｏｒｔｅＢｉｏ)にロードしてＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定を行い、次に、ロードした抗体を有するセンサーを１００ｎＭ ＣＤ４７抗原に曝露させて５分間作用させ、次に解離速度の測定に備え、センサーをアッセイバッファーに移して５分間解離した。１:１結合モデルを用いて速度論的解析を行った。
２．実験結果
ＣＤ４７抗体親和性測定結果は表２に示される。結果が示すように、ＣＤ４７抗体は高い親和性を有する。
Figure 0007454044000004
実施例５:ＣＤ４７抗体とヒトＣＤ４７の結合
１．実験方法
フローサイトメトリーベースのアッセイにおいて本開示のＣＤ４７抗体とヒトＣＤ４７の結合を測定する。ステップは具体的に次のとおりである。
ヒトＣＤ４７を発現するがん細胞株ＣＣＲＦ－ＣＥＭ(上海中国科学院セルバンク、ヒト急性リンパ芽球性白血病Ｔリンパ球)を使用する。ＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞(０.１×１０6個の細胞)と異なる濃度(最大濃度３０μg/mL、３倍希釈、合計１０濃度)の実験抗体(本開示のＣＤ４７抗体及びＨｕ５Ｆ９－Ｇ４抗体)を、３％ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)含有ＰＢＳにおいて、氷上で３０分間インキュベートした。その後、細胞を少なくとも２回洗浄し、ＦＣＭバッファー(１×ＰＢＳ＋３％ＢＳＡ)でＰＥヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ(１:５００×希釈)蛍光二次抗体を調製し、１００μL/ウェルで対応の９６ウェルプレートに加え、４℃下冷蔵庫で３０分間インキュベートした。
９６ウェルプレートを取り出し、２５０ｇで５分間遠心分離し、丁寧に上清を除去した後、ＦＣＭバッファーを２００μL/ウェルで加え、再び２５０ｇで５分間遠心分離し、丁寧に上清を除去し、細胞を少なくとも２回洗浄して１×ＰＢＳを用いて１００μL/ウェルで再懸濁させ、フローサイトメトリーより分析し、そのＭＦＩに基づいてＧｒａｐｈＰａｄで濃度依存曲線を当てはめした。Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４抗体を陽性コントロール抗体とした。
２．実験結果
ＣＤ４７抗体とヒトＣＤ４７の結合のＥＣ50結果は表３に示され、ＣＤ４７抗体(７Ａ１１Ｈ１１、７Ａ１１Ｈ１２、７Ａ１１Ｈ２２、７Ａ１１Ｈ３２、７Ａ１１Ｈ４２、陽性コントロール抗体Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４及びｈＩｇＧ４アイソタイプコントロール)とヒトＣＤ４７の結合の平均蛍光強度は図１に示され、ＣＤ４７抗体(７Ａ１１Ｈ５２、７Ａ１１Ｈ１４、７Ａ１１Ｈ１５、７Ａ１１Ｈ３３、７Ａ１１Ｈ３４、７Ａ１１Ｈ３５、７Ａ１１Ｈ５５、陽性コントロール抗体Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４及びｈＩｇＧ４アイソタイプコントロール)とヒトＣＤ４７の結合の平均蛍光強度は図２に示され、結果が示すように、本開示のＣＤ４７抗体は細胞レベルにおいてヒトＣＤ４７に対し陽性コントロール抗体と相当な特異的結合能力を有する。
Figure 0007454044000005
実施例６:ＣＤ４７抗体とサルＣＤ４７の結合
１．実験方法
完全長サルＣＤ４７を備えるｐＣＤＮＡ３．４ベクターをトランスフェクションすることにより、サルＣＤ４７を過剰発現するＣＨＯ細胞安定細胞株(ＣＨＯ－ｃｙｎｏＣＤ４７細胞)を生成し、ＣＨＯ－ｃｙｎｏＣＤ４７細胞(０.１×１０6個の細胞)と異なる濃度(最大濃度１０μg/mL、３倍希釈、合計１０濃度)の実験抗体(本開示のＣＤ４７抗体及びＨｕ５Ｆ９－Ｇ４抗体)を、３％ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)含有ＰＢＳにおいて、氷上で３０分間インキュベートした。
その後、細胞を少なくとも２回洗浄し、ＦＣＭバッファー(１×ＰＢＳ＋３％ＢＳＡ)でＰＥヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ(１:５００×希釈)蛍光二次抗体を調製し、１００μL/ウェルで対応の９６ウェルプレートに加え、４℃下冷蔵庫で３０分間インキュベートした。
９６ウェルプレートを取り出し、２５０ｇで５分間遠心分離し、丁寧に上清を除去した後、ＦＣＭバッファーを２００μL/ウェルで加え、再び２５０ｇで５分間遠心分離し、丁寧に上清を除去し、細胞を少なくとも２回洗浄して１×ＰＢＳを用いて１００μL/ウェルで再懸濁させ、フローサイトメトリーより分析し、そのＭＦＩに基づいてＧｒａｐｈＰａｄで濃度依存曲線を当てはめした。Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４抗体を陽性コントロール抗体とした。
２．実験結果
ＣＤ４７抗体とサルＣＤ４７の結合のＥＣ50結果は表４に示され、ＣＤ４７抗体(７Ａ１１Ｈ１１、７Ａ１１Ｈ１２、７Ａ１１Ｈ２２、７Ａ１１Ｈ３２、７Ａ１１Ｈ４２、７Ａ１１Ｈ５２、陽性コントロール抗体Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４及びｈＩｇＧ４アイソタイプコントロール)とサルＣＤ４７の結合の平均蛍光強度は図３に示され、ＣＤ４７抗体(７Ａ１１Ｈ１４、７Ａ１１Ｈ１５、７Ａ１１Ｈ３３、７Ａ１１Ｈ３４、７Ａ１１Ｈ３５、７Ａ１１Ｈ５５、陽性コントロール抗体Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４及びｈＩｇＧ４アイソタイプコントロール)とサルＣＤ４７の結合の平均蛍光強度は図４に示され、結果が示すように、本開示に係る抗体は細胞レベルにおいてサル陽性コントロール抗体と相当な特異的結合能力を有する。
Figure 0007454044000006
実施例７:ヒトＣＤ４７リガンドＳＩＲＰαとＣＤ４７の相互作用に対するＣＤ４７抗体の遮断
１．実験方法
フローサイトメトリーにより本開示のＣＤ４７抗体のヒトＣＤ４７とＳＩＲＰαの結合を遮断する能力を測定する。ステップは具体的に次のとおりである。
抗体の希釈である。ＦＣＭバッファー(１×ＰＢＳ＋３％ＢＳＡ)で本開示のＣＤ４７抗体とコントロール抗体Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４を９０μg/mLに希釈し、その後、３倍勾配希釈で１０の濃度とし、サブタイプコントロールｈＩｇＧ４を３０μg/mL、１.１μg/mL、０.０４μg/mLに希釈し、リガンドｈＳＩＲＰα－ｍＦＣ(ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ)を１０μg/mLに希釈した。
ＣＣＲＦ－ＣＥＭ(上海中国科学院セルバンク)細胞を０.１×１０6個の細胞／ウェルでＶ底９６ウェルプレートに加え、ＣＤ４７抗体の量が増加する条件下でｈＳＩＲＰα－ｍＦＣ結合を監視した。ＰＥヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ二次抗体(Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ)を用いて結合ＳＩＲＰαを確認した。Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４抗体を陽性コントロール抗体とした。
２．実験結果
ＣＤ４７抗体(７Ａ１１Ｈ１１、７Ａ１１Ｈ１２、７Ａ１１Ｈ２２、７Ａ１１Ｈ３２、７Ａ１１Ｈ４２、Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４及びｈＩｇＧ４アイソタイプコントロール)のヒトＣＤ４７のＣＤ４７／ＳＩＲＰα結合に対する阻害結果は図５に示され、ＣＤ４７抗体(７Ａ１１Ｈ５２、７Ａ１１Ｈ１４、７Ａ１１Ｈ１５、７Ａ１１Ｈ３３、７Ａ１１Ｈ３４、７Ａ１１Ｈ３５、７Ａ１１Ｈ５５)のヒトＣＤ４７のＣＤ４７／ＳＩＲＰα結合に対する阻害結果は図６に示され、結果が示すように、本開示のＣＤ４７抗体は細胞レベルにおいて明らかな阻害でＣＤ４７とＳＩＲＰαの結合を遮断することができ、陽性コントロール抗体と比べたところ、本開示のＣＤ４７抗体は相当な遮断能力を示している。
実施例８:ＣＤ４７抗体の腫瘍細胞に対するマクロファージの食作用を促進する能力の検出
１．実験方法
フローサイトメトリーベースのアッセイにおいて本開示のＣＤ４７抗体の腫瘍細胞に対するマクロファージの食作用を促進する能力を測定する。ステップは具体的に次のとおりである。
ドナーから採取し立ての血液を分離して末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を得て、ｈＣＤ１４磁気ビーズ(Ｍｉｌｔｅｎｙｉ／１３０－０５０－２０１)によりＰＢＭＣからＣＤ１４陽性単球を分離して、ｒｈＧＭ－ＣＳＦ(Ｒ＆Ｄ、７９５４－ＧＭ－０１０)を含む完全培地を調製し、ｒｈＧＭ－ＣＳＦの最終濃度は５０ng/mLであり、ＣＤ１４陽性単球の濃度は５Ｅ５/mLであり、２０mL/皿でシャーレに加えた。５％ＣＯ2と３７℃の細胞インキュベーターに移し、３日ごとに用時調製した培地と半分交換した。(５０ng/mL ＧＭ－ＣＳＦ含有で)引き続き４日間培養した。８日目にマクロファージの上清を１５ｍＬ遠心分離管に取り分けると同時に、予冷したＤＰＢＳを加え、セルスクレーパーで直接的に細胞を収集した。
ヒトＣＤ４７を高発現する腫瘍細胞株Ｊｕｒｋａｔ(上海中国科学院セルバンク)を標的細胞種とし、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ(商標)ＣＦＳＥキットの説明に従って、標的腫瘍細胞を蛍光標識した。標識した腫瘍細胞を上記のとおりに分化させたマクロファージと１:１の割合で共培養すると同時に、最終濃度１０μg/mL、１μg/mL、０.１μg/mLの抗体を加えて３７℃下２時間インキュベートした。
その後、細胞を少なくとも２回洗浄し、丁寧にパージして細胞を落とし、アロフィコシアニン(ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ、ＡＰＣ)で標識したＣＤ１４抗体(Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入、Ｂ２５９５３８)を加え、０.１％ＢＳＡ含有ＰＢＳにおいて氷上(遮光)で３０分間インキュベートした。細胞を少なくとも２回洗浄しフローサイトメトリーにより分析した。貪食された細胞集団は生細胞のうちＣＤ１４陽性で且つ蛍光色素ＣＦＳＥ(carboxyfluorescein diacetate、カルボキシフルオレセインジアセテート、succinimidyl ester、スクシンイミジルエステル)も陽性の細胞集団である。Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４抗体を陽性コントロール抗体とした。
２．実験結果
ＣＤ４７抗体の腫瘍細胞に対するマクロファージの食作用を促進する能力の測定結果は図７に示され、結果が示すように、本開示のＣＤ４７抗体は腫瘍細胞に対するマクロファージの食作用を促進する能力を有し、腫瘍細胞に対するマクロファージの食作用を促進する能力は陽性コントロール抗体Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４と同等であった。
実施例９:ＣＤ４７抗体によるヒト赤血球(ＲＢＣ)凝集アッセイ
１．実験方法
赤血球凝集アッセイを行ってＣＤ４７抗体のＲＢＣ凝集能力を特徴づけた。抗体がヒトＲＢＣの沈降を避ける能力を観察しＲＢＣ凝集に関してＣＤ４７抗体をスクリーニングした。方法は具体的に次のとおりである。
ＰＢＳにおいてヒト赤血球を２％に希釈し、滴加したＣＤ４７抗体(濃度は２００μg/mL、１００μg/mL、５０μg/mL、２５μg/mL、１２.５μg/mL、６.２５μg/mL、１.５６２５μg/mL、０.７８１２５μg/mL、０.３９０６２５μg/mL、０.１９５３１３μg/mL、０.０９７６５６μg/mL)と丸底９６ウェルプレートにおいて３７℃下２時間インキュベートした。未沈殿の赤血球が存在することは赤血球凝集の証拠であり、未凝集の赤血球が沈殿して鮮明な赤いスポットを形成するが、未沈殿の赤血球が霧状となっている。Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４抗体を陽性コントロール抗体とした。
２．実験結果
ＣＤ４７抗体のＲＢＣ凝集能力の測定結果は図８に示され、結果が示すように、ＣＤ４７抗体濃度が２００μg/mLとなった以降はいずれも細胞凝集を引き起こさないことから、本開示のＣＤ４７抗体が明らかな赤血球凝集低減効果を有することが示され、ＣＤ４７抗体はがんの臨床治療で副作用を明らかに低減することができ、安全性に優れる。
実施例１０:ＣＤ４７抗体とヒト赤血球(ＲＢＣ)の結合アッセイ
１．実験方法
ＣＤ４７モノクローナル抗体はヒト赤血球と結合する特性を有し、ＣＤ４７抗体阻害剤の場合は、薬効が赤血球から干渉され腫瘍がオフターゲットとなるというリスクはある。スクリーニングにより赤血球との結合活性が低い抗体を特定できればオフターゲットのリスクを低減して、その安全性を向上させることができる。ステップは具体的に次のとおりである。
(１)抗体の希釈である。ＦＡＣＳバッファーでＣＤ４７抗体を初期濃度が２０μg/mLとなるよう希釈し、体積は１８０μLであり、３倍勾配希釈(６０＋１２０)により、１１の濃度とした。
(２)細胞をカウントしプレーティングする。ＲＢＣ細胞を２５０ｇで５分間遠心分離した後、上清を捨て、ＦＡＣＳバッファーで細胞密度を２Ｅ＋０６に調整し、１００μL/管でＶ底９６ウェルプレートに等分した。
(３)上記のように希釈した抗体を細胞に加え、１００μL/ウェルで、２℃～８℃下３０分間インキュベートした。
(４)９６ウェルプレートを取り出し、２５０ｇで５分間遠心分離し、丁寧に上清を除去した後、ＦＡＣＳバッファーを２００μL/ウェルで加え、再び２５０ｇで５分間遠心分離し、丁寧に上清を除去した。
(５)ＦＡＣＳバッファーでＰＥヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ(ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ)蛍光二次抗体(１:５００希釈)を調製し、１００μL/ウェルで対応の９６ウェルプレートに加え、細胞を再懸濁させ、２℃～８℃下３０分間インキュベートした。
(６)９６ウェルプレートを取り出し、２５０ｇで５分間遠心分離し、丁寧に上清を除去した後、ＦＡＣＳバッファーを２００μL/ウェルで加え、再び２５０ｇで５分間遠心分離し、丁寧に上清を除去した。
(７)１×ＰＢＳを用いて１００μL/ウェルで再懸濁させ、ＦＡＣＳで検出した。フローサイトメーター(Ｂｅｃｋｍａｎ、ｃｙｔｏｆｌｅｘ)でデータを解析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで製図した。Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４抗体を陽性コントロール抗体とした。
２．実験結果
ＣＤ４７抗体のヒト赤血球との結合能力の測定結果は図９に示され、結果が示すように、陽性コントロール抗体と比べ、本開示のＣＤ４７抗体のヒト赤血球との結合活性は明らかに低下し、薬物としての安全性が向上している。
実施例１１:ＣＤ４７抗体と血小板の結合アッセイ
１．実験方法
ＣＤ４７モノクローナル抗体とヒト赤血球の結合と同じように、ＣＤ４７モノクローナル抗体は血小板と結合する活性を有し、血小板の低減による多くの副作用はある。血小板と低結合する抗体はオフターゲットのリスクを低減して、その安全性を向上させることができる。方法は具体的に次のとおりである。
抗体の希釈である。ＦＡＣＳバッファーで抗体を２０μg/mLに希釈し、体積は２４０μＬであった。
細胞をカウントしプレーティングする。全血細胞を２０倍希釈し、１００μL/管でＶ底９６ウェルプレートに等分した。
上記のように希釈した抗体を細胞に加え、１００μL/ウェルで、２℃～８℃下３０分間インキュベートした。
９６ウェルプレートを取り出し、２５０ｇで５分間遠心分離し、丁寧に上清を除去した後、ＦＡＣＳバッファーを２００μL/ウェルで加え、再び２５０ｇで５分間遠心分離し、丁寧に上清を除去した。
ＦＡＣＳバッファーでＰＥ蛍光二次抗体を調製して１:５００希釈し(ＰＥヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ、ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４０９３０４)、１００μL/ウェルで対応の９６ウェルプレートに加えると同時に、各ウェルには１μLのＡＰＣ抗ヒトＣＤ６１(ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３３６４１１)を加えて、細胞を再懸濁させ、２℃～８℃下３０分間インキュベートした。
９６ウェルプレートを取り出し、２５０ｇで５分間遠心分離し、丁寧に上清を除去した後、ＦＡＣＳバッファーを２００μL/ウェルで加え、再び２５０ｇで５分間遠心分離し、丁寧に上清を除去した。
１×ＰＢＳを用いて２００μL/ウェルで再懸濁させ、ＦＡＣＳで検出した。Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４抗体を陽性コントロール抗体とした。
２．実験結果
ＣＤ４７抗体と血小板の結合アッセイの結果は図１０に示され、結果が示すように、本開示のＣＤ４７抗体は血小板との結合活性が陽性コントロール抗体より明らかに弱く、より優れた安全性を示している。
実施例１２:ＣＤ４７抗体の赤血球に対するマクロファージの食作用の活性化アッセイ
１．実験方法
検出方法は実施例８と同じであり、標的細胞として赤血球を腫瘍細胞に置き換え、本開示のＣＤ４７抗体は赤血球に対するマクロファージの食作用を活性化させる効果があるかどかを検出した。Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４抗体を陽性コントロール抗体とした。
２．実験結果
ＣＤ４７抗体の赤血球に対するマクロファージの食作用の活性化アッセイの結果は図１１に示され、結果が示すように、本開示のＣＤ４７抗体は非常に弱いレベルで赤血球に対するマクロファージの食作用を媒介し、しかも媒介効果が陽性コントロール抗体より明らかに弱く、より優れた安全性を示している。
実施例１３:抗腫瘍活性アッセイ
１．実験方法
７０匹のＮＯＤ ＳＣＩＤ雌マウス(浙江維通利華実験動物技術有限公司から購入)を用いてヒトＢリンパ球皮下移植腫瘍モデル(Ｒａｊｉ)及びヒト悪性黒色腫モデル(Ａ３７５)を構築して、本開示のＣＤ４７抗体の抗腫瘍活性を評価した。Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４抗体とＴＪＣ－４抗体を陽性コントロール抗体とし、ｈＩｇＧ４をアイソタイプコントロール抗体とした。
２．実験結果
ＣＤ４７抗体のヒトＢリンパ球皮下移植腫瘍モデルに対する抗腫瘍結果は図１２に示され、結果が示すように、本開示のＣＤ４７抗体は陽性コントロール抗体より抗ヒトＢリンパ球皮下移植腫瘍効果が明らかに優れている。
ＣＤ４７抗体のヒト悪性黒色腫モデルに対する抗腫瘍結果は図１３に示され、結果が示すように、陽性コントロール抗体と比べ、本開示のＣＤ４７抗体は抗ヒト悪性黒色腫効果がより優れている。
上記の実施例は本開示の好ましい実施形態であり、本開示の実施形態は上記の実施例に限定されず、本開示の趣旨を逸脱せず他に変更、改変、置き換え、組み合わせ、簡略化を行った場合に、いずれも同等な置換として本開示の保護範囲に含まれる。

Claims (23)

  1. ＣＤＲｓとして、
    ａ）配列番号１のアミノ酸配列に示されるＬＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列に示されるＬＣＤＲ２、配列番号３のアミノ酸配列に示されるＬＣＤＲ３、配列番号１０のアミノ酸配列に示されるＨＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列に示されるＨＣＤＲ２、配列番号１２のアミノ酸配列に示されるＨＣＤＲ３と、
    ｂ）ＫＳＳＱＳＬＬＮＴＲＴＲＫＮＹＬＡに示されるＬＣＤＲ１、配列番号２に示されるＬＣＤＲ２、配列番号３に示されるＬＣＤＲ３、配列番号１０に示されるＨＣＤＲ１、配列番号１１に示されるＨＣＤＲ２、配列番号１２に示されるＨＣＤＲ３であって、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、軽鎖可変領域の配列番号８におけるＣＤＲｓであり、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、重鎖可変領域の配列番号１４におけるＣＤＲｓである、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３と、
    ｃ）配列番号１に示されるＬＣＤＲ１、配列番号２に示されるＬＣＤＲ２、配列番号３に示されるＬＣＤＲ３、配列番号１０に示されるＨＣＤＲ１、ＭＩＨＰＳＤＳＥＴＲＬＮＱＫＦＱＧに示されるＨＣＤＲ２、配列番号１２に示されるＨＣＤＲ３であって、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、軽鎖可変領域の配列番号６におけるＣＤＲｓであり、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、重鎖可変領域の配列番号１８におけるＣＤＲｓである、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３と、のうちのいずれか一方を含む、ことを特徴とする抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント。
  2. 抗体は重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域配列を含み、前記重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域配列の少なくとも一部はネズミ抗体、ヒト化抗体、霊長目抗体又はその変異体の少なくとも一方に由来する、ことを特徴とする請求項１に記載の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント。
  3. 前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号５～９のいずれかに示されるものであり又は配列番号５～９のいずれかに示されるものと少なくとも９５％の同一性を有する配列である、ことを特徴とする請求項２に記載の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント。
  4. 前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１４～１８のいずれかに示されるものであり又は配列番号１４～１８のいずれかに示されるものと少なくとも９５％の同一性を有する配列である、ことを特徴とする請求項２に記載の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント。
  5. 前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号５に示されるものであり、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１４に示されるものであり、又は、
    前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号６に示されるものであり、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１４に示されるものであり、又は、
    前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号６に示されるものであり、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１５に示されるものであり、又は、
    前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号６に示されるものであり、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１６に示されるものであり、又は、
    前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号６に示されるものであり、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１７に示されるものであり、又は、
    前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号６に示されるものであり、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１８に示されるものであり、又は、
    前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８に示されるものであり、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１４に示されるものであり、又は、
    前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号９に示されるものであり、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１４に示されるものであり、又は、
    前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７に示されるものであり、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１６に示されるものであり、又は、
    前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８に示されるものであり、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１６に示されるものであり、又は、
    前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号９に示されるものであり、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１６に示されるものであり、又は、
    前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号９に示されるものであり、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１８に示されるものである、ことを特徴とする請求項２～４のいずれか１項に記載の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント。
  6. 抗体は定常領域を有し、重鎖定常領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤから選ばれるいずれか１つであり、軽鎖定常領域はκ鎖又はλ鎖である、ことを特徴とする請求項１～５のいずれか１項に記載の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント。
  7. 前記定常領域の由来種属はネズミ、ウサギ、ヒツジ、サル、ヒトから選ばれる、ことを特徴とする請求項６に記載の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント。
  8. 前記軽鎖定常領域はヒトのκ鎖であり、前記重鎖定常領域はヒトＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ変異体の重鎖定常領域である、ことを特徴とする請求項７に記載の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント。
  9. 前記軽鎖定常領域はヒトのκ鎖であり、かつ前記軽鎖可変領域は、配列番号８に示される配列を含み、前記重鎖定常領域はヒトＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ変異体の重鎖定常領域であり、かつ前記重鎖可変領域は、配列番号１４に示される配列を含む、ことを特徴とする請求項８に記載の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント。
  10. 抗体はＣＤＲ移植抗体、多量体抗体と二重特異性抗体のうちのいずれか１つ又は複数である、ことを特徴とする請求項１～７のいずれか１項に記載の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント。
  11. 前記抗原結合フラグメントはＦ(ａｂ’)2、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、及びＦｖのうちのいずれか１つ又は複数である、ことを特徴とする請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント。
  12. 前記ＣＤ４７はヒトＣＤ４７、ネズミＣＤ４７又はサルＣＤ４７である、ことを特徴とする請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント。
  13. 請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする、ことを特徴とする核酸。
  14. 請求項１３に記載の核酸を含む、ことを特徴とするベクター。
  15. 請求項１３に記載の核酸又は請求項１４に記載のベクターを含む、ことを特徴とする細胞。
  16. 請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項１３に記載の核酸、請求項１４に記載のベクター又は請求項１５のいずれか１項に記載の細胞を含む、ことを特徴とする医薬組成物。
  17. 薬学的に許容される担体をさらに含む、ことを特徴とする請求項１６に記載の医薬組成物。
  18. ＣＤ４７陽性腫瘍を治療及び／又は予防する薬物の製造における請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項１３に記載の核酸、請求項１４に記載のベクター、請求項１５に記載の細胞又は請求項１６に記載の組成物の使用。
  19. 前記薬物は赤血球凝集を低減できる、ことを特徴とする請求項１８に記載の使用。
  20. 前記薬物は赤血球との結合活性を低減できる、ことを特徴とする請求項１８に記載の使用。
  21. ＣＤ４７検出又はＣＤ４７関連疾患診断キットの製造における請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項１３に記載の核酸、請求項１４に記載のベクター又は請求項１５に記載の細胞の使用。
  22. 請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、ことを特徴とするＣＤ４７検出キット。
  23. 請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、ことを特徴とするＣＤ４７関連疾患診断キット。
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