TW202413428A - 靶向cd47的抗體、編碼其的核酸、包含其的載體、細胞、藥物組合物、其應用及其試劑盒 - Google Patents

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Abstract

本發明關於生物醫藥領域，具體而言，關於一種靶向CD47的抗體及其應用。本發明提供的抗CD47抗體能特異性結合腫瘤細胞，並阻斷人SIRPa與人CD47訊號，可以促進巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬作用，該抗體的親和力高、特異性強，安全性好，不會引起紅血球凝集，且與RBC、血小板表現出極弱的結合。

Description

靶向CD47的抗體、編碼其的核酸、包含其的載體、細胞、藥物組合物、其應用及其試劑盒
本發明屬於生物醫藥技術領域。具體地，關於一種靶向CD47的抗體及其應用，更具體地，關於抗CD47抗體或其抗原結合片段、核酸、載體、細胞、組合物、應用以及試劑盒。
癌症免疫療法是近年來生物科學領域的重頭大戲，基於T細胞的CTLA4抗體、PD-1抗體、PD-L1抗體等的免疫檢查點抑制劑療法和CAR-T、TCR-T等細胞療法皆是近年來大熱的免疫療法。這些無一例外是圍繞如何恢復T細胞功能來進行，換句話說，主要圍繞如何提高獲得性免疫系統能力。但是，以免疫檢查點(checkpoint)為靶點，啟動T細胞功能，以提高獲得性免疫系統的能力，進而攻克癌症的道路仍充滿曲折。然而，固有免疫系統在腫瘤免疫治療中的作用卻長期沒有得到發揮。事實上在整個腫瘤浸潤區域，巨噬細胞在腫瘤組織約占50%，更重要的是巨噬細胞的數量同腫瘤的預後呈現反向聯繫，這進一步說明巨噬細胞在腫瘤中有很重要的作用。巨噬細胞發揮吞噬效應需要兩個訊號同時起作用：一個是靶向細胞表面的“吃我”訊號的啟動，另一個是相同目標表面“別吃我”訊號的失活。任何一個訊號的缺少都不足以引發吞噬效應的發生。越來越多的證據表明，CD47是一類“別吃我”訊號，它通過與巨噬細胞表面的訊號調節蛋白α(Signal regulatory proteinα，SIRPα)相互結合抑制巨噬細胞的吞噬作用。腫瘤細胞也可以通過CD47的表達逃避巨噬細胞吞噬作用(例如參見EP2242512及其中引用的相關文獻)。
CD47也稱為整聯蛋白相關蛋白（IAP），是具有胺基末端免疫球蛋白結構域和羧基末端多重跨膜區的50kDa膜蛋白。它與多種配體相互作用，包括但不限於單調節蛋白α（SIRPα），SIRPγ，整聯蛋白和血小板反應蛋白-1（TSP-1）。SIRPα主要在骨髓細胞上表達，包括巨噬細胞，骨髓樹突細胞（DC），粒細胞，肥大細胞及其前體，包括造血幹細胞。CD47/SIRPα相互作用傳遞“不要吃我”訊號，阻止自體吞噬作用。對患者腫瘤和匹配的鄰近正常（非腫瘤）組織的分析顯示CD47蛋白在癌細胞上過表達，這有效地説明它們逃避先天免疫監視和消除。阻斷CD47-SIRPα與抗CD47抗體的相互作用已經顯示出有效誘導體外腫瘤細胞的吞噬作用並抑制體內各種血液和實體腫瘤的生長。因此，CD47是癌症治療的有效靶標，並且需要其適當的拮抗劑來製備人類治療劑。
CD47單株抗體與紅血球有較高的靶向結合性，易引發紅血球凝集，使相應抗體在治療效果上大打折扣、並引發藥物副作用，本發明旨在提供一種靶向CD47抗體，所述抗體能夠阻斷CD47與SIRPα結合，促進巨噬細胞發揮吞噬作用，更難能可貴的是，能在一定程度上避免紅血球血發生凝集，安全性好。
本發明的目的是提供抗CD47抗體或其抗原結合片段，所述抗體含有以下CDRs： 如SEQ ID NO:1或與SEQ ID NO:1具有至少95%同源性的胺基酸序列所示的LCDR1，如SEQ ID NO:2或與SEQ ID NO:2具有至少95%同源性的胺基酸序列所示的LCDR2，如SEQ ID NO:3或與SEQ ID NO:3具有至少95%同源性的胺基酸序列所示的LCDR3； 如SEQ ID NO:10或與SEQ ID NO:10具有至少95%同源性的胺基酸序列所示的HCDR1，如SEQ ID NO:11或與SEQ ID NO:11具有至少95%同源性的胺基酸序列所示的HCDR2，如SEQ ID NO:12或與SEQ ID NO:12具有至少95%同源性的胺基酸序列所示的HCDR3。
本發明的另一目的是提供所述抗CD47抗體或其抗原結合片段相關的核酸、載體、細胞或藥物組合物。
本發明還涉及所述抗CD47抗體或其抗原結合片段、及其相關的核酸、載體、細胞或藥物組合物在製備治療和/預防CD47陽性腫瘤的藥物中的應用。
本發明還涉及所述抗CD47抗體或其抗原結合片段，及其相關的核酸、載體或細胞在製備檢測CD47或診斷CD47相關疾病的試劑盒中的應用。
本發明還提供了一種檢測CD47的試劑盒，所述試劑盒含有所述抗CD47抗體或其抗原結合片段。
本發明還提供了一種診斷CD47相關疾病的試劑盒，所述試劑盒含有所述抗CD47抗體或其抗原結合片段。
以下結合具體實施例來進一步說明本發明，但實施例並不對本發明做任何形式的限定。除非特別說明，本發明採用的試劑、方法和設備為本技術領域常規試劑、方法和設備。
除非特別說明，以下實施例所用試劑和材料均為市購。
本發明涉及抗CD47抗體或其抗原結合片段，所述抗體含有以下CDRs： 如SEQ ID NO:1或與SEQ ID NO:1具有至少95%同源性的胺基酸序列所示的LCDR1，如SEQ ID NO:2或與SEQ ID NO:2具有至少95%同源性的胺基酸序列所示的LCDR2，如SEQ ID NO:3或與SEQ ID NO:3具有至少95%同源性的胺基酸序列所示的LCDR3； 如SEQ ID NO:10或與SEQ ID NO:10具有至少95%同源性的胺基酸序列所示的HCDR1，如SEQ ID NO:11或與SEQ ID NO:11具有至少95%同源性的胺基酸序列所示的HCDR2，如SEQ ID NO:12或與SEQ ID NO:12具有至少95%同源性的胺基酸序列所示的HCDR3。
該抗體或其抗原結合片段的一個重要優點在於其與CD47具有高親和力。
該抗體或其抗原結合片段的一個重要優點在於其具有阻斷CD47與SIRPα結合的活性。
該抗體或其抗原結合片段的一個重要優點在於其具有促進巨噬細胞吞噬腫瘤細胞的能力。
該抗體或其抗原結合片段的一個重要優點在於其具有顯著降低紅血球血凝聚的作用。
該抗體或其抗原結合片段的一個重要優點在於其與紅血球表現出極弱水平的低結合或不結合。
因具有上述特性，該抗體或其抗原結合片段較佳可作為抗體藥物使用。
在本發明中，“抗體或其抗原結合片段”此技術術語是結合特定抗原的蛋白，其泛指包含互補決定區（CDR區）的一切蛋白及蛋白片段。“抗體”特別指全長抗體。“全長抗體”此用語包括多株抗體及單株抗體。
術語“抗原結合片段”是包含抗體CDR的一部分或全部的物質，其缺乏至少一些存在于全長鏈中的胺基酸但仍能夠特異性結合至抗原。此類片段具生物活性，因為其結合至靶抗原，且可與其他抗原結合分子(包括完整抗體)競爭結合至給定表位。在一些實施方式中，抗原結合片段具有特異性識別並結合CD47的作用。在一些實施方式中，抗原結合片段是具有阻斷CD47與其配體結合，啟動免疫細胞功能的片段，在一個方面中，此類片段選自Fab(由完整的輕鏈和Fd構成)，Fv(由VH和VL構成)，ScFv(單鏈抗體，VH和VL之間由一連接肽連接而成)或單域抗體(僅由VH組成)。所述片段可通過重組核酸技術產生，或可通過抗原結合分子(包括完整抗體)的酶裂解或化學裂解產生。
術語“互補性決定區”或“CDR”是指免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的高度可變區。有三種重鏈CDR和三種輕鏈CDR。此處，取決於情況，術語“CDR”和“CDRs”用於指包含一種或多種或者甚至全部的對抗體或其抗原結合片段與其識別的抗原或表位的結合親和力起作用的主要胺基酸殘基的區域。在另一具體實施方式中，CDR區或CDR是指IMGT定義的免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的高度可變區。
在本發明中，重鏈的互補決定區用HCDR表示，輕鏈的互補決定區用LCDR表示。本領域常用的CDR標示方法包括：Kabat編號方案、Chothia和Lesk編號方案以及1997年Lefranc等人為免疫球蛋白超家族的所有蛋白質序列引入的新的標準化編號系統。Kabat等人是第一個為免疫球蛋白可變區提出標準化編號方案的人。在他們的“免疫學蛋白質序列”（Sequences of Proteins of Immunological Interest）的彙編中，輕鏈（λ，κ）可變區和抗體重鏈的胺基酸序列，以及T細胞受體的可變區（α，β， γ，δ）對齊並編號。在過去的幾十年中，序列的積累導致了KABATMAN資料庫的創建，Kabat編號方案通常被認為是編號抗體殘基廣泛採用的標準。本發明採用Kabat注釋標準標示CDR區，但其他方法標示的CDR區也屬於本發明的保護範圍。
術語“特異性識別”、“選擇性結合”、“選擇性地結合”和“特異性地結合”或其類似表述是指抗體或其抗原結合片段對預先確定的抗原上的表位的結合。通常，抗體或其抗原結合片段以大約小於10 -6M，例如大約小於10 -7M 、10 -8M、10 -9M或10 -10M或更小的親和力(K D)結合。
在本發明中，所提供的抗體或其抗原結合片段特異性識別的物件可以為多種屬來源的CD47，例如人、鼠、猴（如食蟹猴cynomolgus monkey）。
在一些實施方式中，所述抗體含有重鏈可變區序列和輕鏈可變區序列的至少之一，所述重鏈可變區序列和輕鏈可變區序列的至少之一的至少一部分來自鼠源抗體、人源化抗體、靈長目源抗體或其突變體的至少之一。
在一些實施方式中，所述輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:5～9任一項所示或與SEQ ID NO:5～9任一項所示具有至少95%同源性的序列。
在一些實施方式中，所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:14～18任一項所示或與SEQ ID NO:14～18任一項所示具有至少95%同源性的序列。
在一些實施方式中，所述輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:5所示、重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:14所示；或所述輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:6所示、重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:14所示；或所述輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:6所示、重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:15所示；或所述輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:6所示、重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:16所示；或所述輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:6所示、重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:17所示；或所述輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:6所示、重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:18所示；或所述輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:8所示、重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:14所示；或所述輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:9所示、重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:14所示；或所述輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:7所示、重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:16所示；或所述輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:8所示、重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:16所示；或所述輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:9所示、重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:16所示；或所述輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:9所示、重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:18所示。
在一些實施方式中，所述抗體具有恆定區，重鏈恆定區選自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD中的任一種；輕鏈恆定區為κ或λ鏈。
在一些實施方式中，所述恆定區的種屬來源選自鼠、兔、羊、猴、或人。
在一些實施方式中，所述抗體為CDR移植抗體、多聚體抗體或雙特異性抗體中的任一種或幾種。
在一些實施方式中，所述抗原結合片段為F(ab’) 2、Fab、scFv、Fv及單域抗體中的任一種或幾種。
在一些實施方式中，所述CD47為人CD47、鼠CD47或猴CD47。
本發明還涉及核酸，所述核酸編碼所述抗CD47抗體或其抗原結合片段。
核酸通常是RNA或DNA，核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但較佳是雙鏈DNA。當將核酸與另一個核酸序列置於功能關係中時，核酸是“有效連接的”。例如，如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，那麼啟動子或增強子有效地連接至所述編碼序列。當其連入載體時較佳採用DNA核酸。
此外，鑒於抗體為膜蛋白，所以核酸通常帶有訊號肽序列。
本發明還涉及載體，所述載體攜帶上述核酸。
術語“載體(vector)”是指，可將多聚核苷酸插入其中的一種核酸運載工具。當載體能使插入的多核苷酸編碼的蛋白獲得表達時，載體稱為表達載體。載體可以通過轉化，轉導或者轉染導入宿主細胞，使其攜帶的遺傳物質元件在宿主細胞中獲得表達。載體是本領域技術人員公知的，包括但不限於：質粒；噬菌粒；柯斯質粒；人工染色體，例如酵母人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)或P1來源的人工染色體(PAC)；噬菌體如λ噬菌體或M13噬菌體及動物病毒等。可用作載體的動物病毒包括但不限於，逆轉錄酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒(如單純皰疹病毒)、痘病毒、杆狀病毒、乳頭瘤病毒、乳頭多瘤空泡病毒(如SV40)。在一些實施方式中，本發明所述載體中包含基因工程中常用的調控元件，例如增強子、啟動子、內部核糖體進入位點（IRES）和其他表達控制元件（例如轉錄終止訊號，或者多腺苷酸化訊號和多聚U序列等）。
本發明還涉及細胞，所述細胞攜帶上述核酸或含有上述載體。利用編碼抗CD47抗體或其抗原結合片段的核酸與載體連接後，在細胞表達能夠獲得相應抗體。可以將上述載體導入到真核細胞、尤其是哺乳動物細胞中，構建獲得能夠表達本發明所述抗CD47抗體或其抗原結合片段的細胞。
本文使用的表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用，並且所有這類名稱都包括後代。因此，單詞“轉化體”和“轉化細胞”包括原代受試細胞和由其衍生的培養物，而不考慮轉移數目。還應當理解的是，由於故意或非有意的突變，所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。在意指不同名稱的情況下，其由上下文清楚可見。
本發明還涉及藥物組合物，所述組合物含有所述抗CD47抗體或其抗原結合片段、所述核酸、所述載體或所述細胞。
在一些實施方式中，所述組合物還含有藥學可接受的載體。“藥學可接受的載體”可以包括生理學上相容的任何和所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和延遲吸收劑等，用來延長抗體的保存限期或效力。
所述抗CD47抗體或其抗原結合片段、所述核酸、所述載體、所述細胞或所述組合物在製備治療和/預防CD47陽性腫瘤的藥物中的應用，也應在本發明的保護範圍之內。
所述藥物能夠降低紅血球血凝集、降低其與紅血球的結合活性。
所述抗CD47抗體或其抗原結合片段、所述核酸、所述載體或所述細胞在製備檢測CD47或診斷CD47相關疾病的試劑盒中的應用，也應在本發明的保護範圍之內。
本發明還提供了一種檢測CD47的試劑盒，所述試劑盒含有所述抗CD47抗體或其抗原結合片段。
本發明還提供了一種診斷CD47相關疾病的試劑盒，所述試劑盒含有所述抗CD47抗體或其抗原結合片段。
本發明具有以下有益效果：
本發明提供了抗CD47抗體或其抗原結合片段，該抗體在體外未發生紅血球血凝集，更難能可貴的是與紅血球表現出極弱水平的低結合或不結合；能夠有效地阻斷CD47與SIRPα結合、啟動介導巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬活性，展現出了顯著的與CD47陽性腫瘤細胞的靶向特異性，親和力高、特異性強，不會引起紅血球凝集，且與人類紅血球、血小板表現出極弱的結合，安全性好；因此，所述抗CD47抗體或其抗原結合片段可以作為腫瘤免疫治療系統中非常有前景的靶點，在人類腫瘤治療方面發揮強有力作用，在製備治療CD47陽性腫瘤的藥物中具有廣泛的應用前景。
下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述。
實施例1  抗CD47鼠單抗的篩選
1、hCD47-ECD-HIS重組表達質粒的構建
以GenBank提供的序列為範本(CEJ 95640.1)，全基因合成人CD47胞外區(hCD47-ECD)全長編碼DNA序列並且在3’端添加6個HIS標籤序列，通過5’端EcolI和3’端HindIII雙酶切位點選殖入表達載體pCDNA3.4 (thermo公司)，建立CD47胞外全長蛋白的重組真核表達質粒，即 hCD47-ECD-HIS重組質粒DNA。
2、hCD47-ECD-HIS重組蛋白的表達與純化
hCD47-ECD-HIS重組蛋白的表達與純化，包括以下步驟：
（1）暫態轉染前一天Expi293（ThermoFisher Scientific；A14635）細胞傳代，用Dynamis培養基（gibco；A2617502）按2*10 6的密度接種1L搖瓶（conning；431147），放入細胞培養搖床（Adolf Kuhner；ISF4-XC）中37℃；8%CO 2；120rpm培養。
轉染當天，Expi293細胞用細胞計數儀（Countstar；IC1000）計數，用新鮮Dynamis培養稀釋調整細胞密度為2.9*10 6；準備轉染；PEI：DNA =3:1；混勻 5min，將二者輕柔混勻20次，靜置15～30min。將DNA-PEI混合物加入Expi293細胞中，混勻，放入細胞培養搖床（Adolf Kuhner；ISF4-XC）中37℃；8%CO 2；120rpm培養；轉染4h之後補加雙抗（gibco；15140122）和抗凝劑（gibco；0010057）。
（2）收穫上清：轉染連續培養7天，之後收樣，先低速1000rpm；10min；4℃離心(湘儀H2050R)，再高速12000rpm；30min；4℃；收集細胞培養上清，0.22um過濾。
（3）HisTrap親和層析柱純化：將上清以1mL/min速度上樣HisTrap親和層析柱，完成上樣後，用5個柱體積的20mM Tris-HCl，150mM NaCl pH8.0平衡液沖洗層析柱；用5個柱體積的20mM Tris-HCl，150mM NaCl，0～500mM咪唑pH8.0洗脫液沖洗層析柱，收集洗脫峰。純化後的CD47-ECD蛋白用聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定。
3、抗CD47鼠單抗的篩選
將步驟2純化得到的hCD47-ECD-HIS重組蛋白（以下簡稱為hCD47抗原）用於BALB/C小鼠（購於廣東省實驗動物中心）免疫。具體方法如下。
（1）動物免疫：經過純化的hCD47抗原以完全弗氏佐劑乳化，採用皮下或腹腔注射方法免疫6～8周齡BALB/C小鼠，免疫劑量為25μg/隻，每組5隻；間隔1周後進行第二次免疫，以不完全弗氏佐劑乳化，免疫劑量為25μg/隻。免疫4次後取尾血以ELISA法梯度稀釋測定血清效價；融合前三天加強免疫，選取抗體效價最高的小鼠進行細胞融合。
（2）細胞融合：骨髓瘤細胞採用BALB/C來源的sp2/0（ATCC® CRL-1581），融合時處於對數生長期；取已免疫小鼠脾臟，製成淋巴細胞單細胞懸液；小鼠脾淋巴細胞與骨髓瘤細胞以1∶5～1∶10混合，滴加37℃的50% PEG1500(pH 8.0)1mL，加入不完全培養基DMEM及其餘終止液，離心棄上清後加入HAT 培養基懸浮混勻，鋪板96孔，置於37℃、5% CO 2恆溫培養箱中進行培養。培養一周後，用HT培養基進行第一次換液，再培養三天后，用HT培養基進行第二次換液。
（3）篩選和選殖：融合2周，取細胞上清進行ELISA試驗檢測，檢測細胞上清與純化的CD47-ECD-His重組蛋白的結合情況，篩選出ELISA結果為陽性的細胞後，進行第二次ELISA試驗複測；
對陽性孔細胞進行有限稀釋，每次有限稀釋後7天測定ELISA值，挑取OD280陽性值較高的單選殖孔進行有限稀釋，直至ELISA測定96孔板全板結果為陽性。挑取陽性值高的單選殖株。
（4）細胞上清單抗的製備和純化：將陽性選殖用含15%血清的DMEM培養基培養于 T25培養瓶中培養，擴培時，800rpm/min離心5min，棄上清並將細胞轉移到500mL搖瓶中，加入無血清培養基(Hybridoma-SFM Complete DPM；Gibco；12300-067)，使細胞密度約為3×10 5個/mL。繼續培養1～2周後，當細胞死亡率達到60%～70%時，收取細胞懸液8000rpm/min高速離心20min，取上清，親和層析法進行上清純化，採用Protein A親和層析進行抗體純化。上樣；流洗；pH7.4、2.5M PBS流洗，沖至UV280基線為0；洗脫：pH3.5、0.1M檸檬酸溶液，每段2mL收集洗脫管，每管加入100uL1M Tris 溶液；濃縮收集液；純化後的單抗濃度測定、SDS-PAGE膠核實抗體純度；分裝(100uL/管)，保存在-80℃。
實施例2  鼠單抗人源化設計及組合
鼠抗體輕鏈CDR的胺基酸序列如SEQ ID NO:1～3所示：
7A11D3D3-LCDR1 7A11D3D3-LCDR2 7A11D3D3-LCDR3
SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:3
KSSQSLLNSRTRKNYLA WASTRES KQSYNLRT
鼠抗體重鏈CDR的胺基酸序列如SEQ ID NO:10～12所示：
7A11D3D3-HCDR1 7A11D3D3-HCDR2 7A11D3D3-HCDR3
SEQ ID NO:10 SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:12
SNWMN MIHPSDSETRLNQKFKD GTTVVDAFAY
鼠抗體輕鏈可變區（＞7A11D3D3-VL）的胺基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
鼠抗體重鏈可變區（＞7A11D3D3-VH）的胺基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
對鼠抗體進行人源化設計，7A11D3D3鼠單抗輕鏈設計5條人源化序列，分別為7A11-L01～05，人源化輕鏈可變區（7A11-L01～05）的胺基酸序列如SEQ ID NO:5～9所示；重鏈設計5條人源化序列，分別為7A11-H01～05，人源化重鏈可變區（7A11-H01～05）的胺基酸序列如SEQ ID NO:14～18所示。
對以上胺基酸序列進行組合，所得抗體及其重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL）對應的序列如表1所示。
表1  抗體及其重鏈可變區和輕鏈可變區對應的序列
抗體名稱 VH  VL
7A11H11 SEQ ID NO：14 SEQ ID NO：5
7A11H12 SEQ ID NO：14 SEQ ID NO：6
7A11H22 SEQ ID NO：15 SEQ ID NO：6
7A11H32 SEQ ID NO：16 SEQ ID NO：6
7A11H42 SEQ ID NO：17 SEQ ID NO：6
7A11H52 SEQ ID NO：18 SEQ ID NO：6
7A11H14 SEQ ID NO：14 SEQ ID NO：8
7A11H15 SEQ ID NO：14 SEQ ID NO：9
7A11H33 SEQ ID NO：16 SEQ ID NO：7
7A11H34 SEQ ID NO：16 SEQ ID NO：8
7A11H35 SEQ ID NO：16 SEQ ID NO：9
7A11H55 SEQ ID NO：18 SEQ ID NO：9
實施例3  CD47抗體的生產
將人源化可變結構域與分泌訊號和人類κ以及人類FcIgG4S228P恆定結構域組合，將其選殖到哺乳動物表達系統中，並且轉染到293細胞中以生成人源化mAb。將人源化變體表達為全長IgG分子、分泌到培養基中並使用蛋白質A純化。
在Expi293細胞中暫態表達並純化人源化抗體和陽性對照抗體Hu5F9-G4（Hu5F9-G4序列已在美國專利US2015/ 0183874A1中公開）。
對於Expi293細胞中抗體的暫態表達，使用載體pCDNA3.4，首先將抗體的重鏈和輕鏈選殖到單獨的pCDNA3.4載體中，使用PEI(購自Polysciences)化學轉染試劑、按照化學轉染的方法將帶有抗體分子重鏈和輕鏈的pCDNA3.4載體轉入Expi293細胞中，按照生產商提供的方案暫態轉染培養的Expi293細胞。
暫態轉染前一天Expi293（ThermoFisher Scientific；A14635）細胞傳代，用Dynamis培養基（gibco；A2617502）按2E6的密度接種1L搖瓶（conning；431147），放入細胞培養搖床（Adolf Kuhner；ISF4-XC）中37℃；8%CO 2；120rpm培養；
轉染當天，Expi293細胞用細胞計數儀（Countstar；IC1000）計數，用新鮮Dynamis培養稀釋調整細胞密度為2.9E6；準備轉染；PEI：DNA =3:1；混勻 5min，將二者輕柔混勻20次，靜置15～30min。將DNA-PEI混合物加入Expi293細胞中，混勻，放入細胞培養搖床（Adolf Kuhner；ISF4-XC）中37℃；8%CO 2；120rpm培養；轉染4h之後補加雙抗（gibco；15140122）和抗凝劑（gibco；0010057）；
收穫上清純化：轉染連續培養7天，之後收樣，先低速1000rpm；10min；4℃離心(湘儀H2050R)，再高速12000rpm；30min；4℃；收集細胞培養上清，0.22um過濾。將培養上清應用於Protein A Sepharose柱(GE Healthcare)。柱用PBS洗滌，然後用洗脫緩衝液(0.1M檸檬酸鈉緩衝液，pH 3.0)洗脫蛋白質。收集的組分用1M Tris pH9.0中和。最後，將純化的樣品與PBS進行透析。
實施例4  CD47抗體親和力測定
1、實驗方法
採用生物膜干涉技術 (ForteBio)測定本發明抗體結合人CD47(hCD47)的平衡解離常數 (KD)。ForteBio親和力測定按照現有的方法(Estep，P等人，High  throughput  solution  Based  measurement  of  antibody-antigen  affinity  and  epitope  binning.MAbs；2013.5(2)：p.270-8)進行，具體為：感測器在分析緩衝液中線下平衡30分鐘，然後線上檢測 60秒建立基線，線上載入實施例3獲得的經純化的抗體至AHC感測器(ForteBio)上進行ForteBio親和測量，再將具有載入的抗體的感測器暴露於100nM的CD47抗原中作用5分鐘，之後將感測器轉移至分析緩衝液解離5分鐘用於解離速率測量。使用1：1結合模型進行動力學的分析。
2、實驗結果
CD47抗體親和力測定結果如表2所示，結果顯示CD47抗體具有高親和力。
表2  CD47抗體親和力測定結果
抗體名稱 KD (M) kon(1/Ms) kd(1/s)
7A11H11 5.90E-10 5.90E-10 5.90E-10
7A11H12 4.59E-10 4.59E-10 4.59E-10
7A11H14 5.62E-10 5.62E-10 5.62E-10
7A11H15 2.12E-10 1.48E+06 3.13E-04
7A11H35 8.81E-10 8.81E-10 8.81E-10
7A11H22 7.40E-10 7.40E-10 7.40E-10
7A11H33 3.60E-10 3.60E-10 3.60E-10
7A11H42 3.09E-10 3.09E-10 3.09E-10
實施例5  CD47抗體與人CD47的結合
1、實驗方法
在基於流式細胞術的測定法中測量本發明CD47抗體與人CD47的結合。具體步驟為：
採用表達人CD47的癌細胞系CCRF-CEM(上海中國科學院細胞庫)屬於人急性淋巴細胞白血病T淋巴細胞。將CCRF-CEM細胞(0.1×106個細胞)與不同濃度（最高濃度為30ug/mL，三倍稀釋，共10個濃度）的實驗抗體(本發明CD47抗體以及Hu5F9-G4抗體)，在含3%牛血清白蛋白(BSA)的PBS中，冰上培養 30分鐘。然後將細胞洗滌至少兩次，用FCM buffer（1XPBS+3%BSA）配製PE Goat anti human IgG Fc（1:500x稀釋）螢光二抗，按100uL/孔加入對於的96孔板中，4度冰箱培養30min。取出96孔板，250g離心5min，小心去上清後，加入FCM buffer 200uL/孔，再次250g離心5min，小心去上清，將細胞洗滌至少兩次用 1xPBS 100uL /孔重懸，並通過流式細胞術進行分析，並根據其MFI用GraphPad擬合濃度依賴的曲線。以Hu5F9-G4抗體作為陽性對照抗體。
2、實驗結果
CD47抗體與人CD47結合的EC50結果如表3所示，CD47抗體（7A11H11、7A11H12、7A11H22、7A11H32、7A11H42、陽性對照抗體Hu5F9-G4和hIgG4-同型對照）與人CD47結合的平均螢光強度如圖1所示，CD47抗體（7A11H52、7A11H14、7A11H15、7A11H33、7A11H34、7A11H35、7A11H55、陽性對照抗體Hu5F9-G4和hIgG4-同型對照）與人CD47結合的平均螢光強度如圖2所示，結果顯示，本發明CD47抗體與陽性對照抗體對細胞水平的人CD47具有相當的特異性結合能力。
表3  CD47抗體與人CD47的結合能力測定結果
抗體名稱 EC50（nM）
7A11H11 0.8218
7A11H12 0.7157
7A11H22 0.8202
7A11H32 0.7172
7A11H42 0.7269
7A11H52 0.9148
7A11H14 0.9334
7A11H15 0.7234
7A11H33 0.7598
7A11H34 1.195
7A11H35 0.8623
7A11H55 1.209
Hu5F9-G4 0.7289
實施例6  CD47抗體與猴CD47的結合
1、實驗方法
通過轉染攜帶全長猴CD47的pCDNA3.4載體，產生過表達猴CD47的CHO細胞穩定細胞株(CHO-cynoCD47細胞)，將CHO-cynoCD47細胞(0.1×10 6個細胞) 與不同濃度（最高濃度為10ug/mL，三倍稀釋，共10個濃度）的實驗抗體(本發明CD47抗體以及Hu5F9-G4抗體)，在含3%牛血清白蛋白(BSA)的PBS中，冰上培養30分鐘。然後將細胞洗滌至少兩次，用FCM buffer（1XPBS+3%BSA）配製PE Goat anti human IgG Fc（1:500x稀釋）螢光二抗，按100uL/孔加入對於的96孔板中，4度冰箱培養30min。取出96孔板，250g離心5min，小心去上清後，加入FCM buffer 200uL/孔，再次250g離心5min，小心去上清，將細胞洗滌至少兩次用 1x PBS 100uL/孔重懸，並通過流式細胞術進行分析，並根據其MFI用GraphPad擬合濃度依賴的曲線。以Hu5F9-G4抗體作為陽性對照抗體。
2、實驗結果
CD47抗體與猴CD47結合的EC50結果如表4所示，CD47抗體（7A11H11、7A11H12、7A11H22、7A11H32、7A11H42、7A11H52、陽性對照抗體Hu5F9-G4和hIgG4-同型對照）與猴CD47結合的平均螢光強度如圖3所示，CD47抗體（7A11H14、7A11H15、7A11H33、7A11H34、7A11H35、7A11H55、陽性對照抗體Hu5F9-G4和hIgG4-同型對照）與猴CD47結合的平均螢光強度如圖4所示，結果顯示，相比，本發明抗體與陽性對照抗體對細胞水平形式猴具有相當的特異性結合能力。
表4  CD47抗體與猴CD47結合的EC50結果
抗體名稱 EC50（nM）
7A11H11 8.932
7A11H12 7.353
7A11H22 8.546
7A11H32 17.12
7A11H42 5
7A11H52 4.506
7A11H14 4.957
7A11H15 7.271
7A11H33 4.847
7A11H34 8.609
7A11H35 4.379
7A11H55 4.616
Hu5F9-G4 5.123
實施例7  CD47抗體對人CD47配體SIRP α與CD47相互作用的阻斷
1、實驗方法
通過流式細胞術測定本發明CD47抗體阻斷人CD47與SIRP α的結合能力。具體步驟為。
抗體稀釋：用FCM buffer（1XPBS+3%BSA）將本發明CD47抗體和對照抗體Hu5F9-G4稀釋成90ug/mL，然後3倍梯度稀釋成10個濃度，將亞型對照hIgG4稀釋成30ug/mL、1.1 ug/mL、0.04 ug/mL，配體hSIRP α-mFC（AcroBiosystems）稀釋至10ug/mL。
將CCRF-CEM(上海中國科學院細胞庫)細胞按0.1×10 6個細胞/孔加入到96孔V型板，並且在CD47抗體量增加的條件下監控hSIRP α-mFC結合。使用PE Goat anti mouse IgG Fc二抗(Biolegend)確定結合的SIRPα。以Hu5F9-G4抗體作為陽性對照抗體。
2、實驗結果
CD47抗體（7A11H11、7A11H12、7A11H22、7A11H32、7A11H42、Hu5F9-G4和hIgG4-同型對照）對人CD47的CD47/SIRP α結合抑制結果如圖5所示，CD47抗體（7A11H52、7A11H14、7A11H15、7A11H33、7A11H34、7A11H35、7A11H55）對人CD47的CD47/SIRP α結合抑制結果如圖6所示，結果顯示，本發明CD47抗體能夠在細胞水平顯著抑制阻斷CD47與SIRPα的結合，與陽性對照抗體相比，本發明CD47抗體表現出相當的阻斷能力。
實施例8  CD47抗體促進巨噬細胞吞噬腫瘤細胞能力的檢測
1、實驗方法
在基於流式細胞術的測定法中測定本發明CD47抗體促進巨噬細胞吞噬腫瘤細胞的能力。具體步驟為。
取捐贈者的新鮮血液，分離得到外周血單核細胞(PBMC)，並通過hCD14磁珠（Miltenyi/130-050-201）從PBMC中分離CD14陽性單核細胞，配置含 rhGM-CSF（R&D；7954-GM-010）的完全培養基，rhGM-CSF終濃度為50ng/mL，CD14陽性單核細胞的濃度為5E5/mL，按20mL/皿加入到細胞培養皿中；轉移至5% CO 237℃細胞培養箱中，每3天對半更換新鮮培養基；（含50ng/mLGM-CSF）繼續培養4天。在第8天將巨噬細胞上清吸到15mL離心管中，同時加入預冷的DPBS，直接用細胞刮刀收集細胞。
選擇人CD47高表達的腫瘤細胞系Jurkat(上海中國科學院細胞庫)作為靶細胞類型，將靶腫瘤細胞按照CellTraceTM CFSE試劑盒的說明，進行螢光標記。將標記好的腫瘤細胞與上述已經完成分化的巨噬細胞按照1：1的比例共培養，同時加入終濃度10ug/mL、1ug/mL、0.1ug/mL抗體在37℃培養2小時。然後將細胞洗滌至少兩次，將細胞小心吹下，加入別藻青蛋白 (allophycocyanin，APC)標記的CD14抗體(購自Biolegend；B259538)，在含0.1%BSA的PBS中冰上(避光)培養30分鐘。將細胞洗滌至少兩次並通過流式細胞術進行分析。被吞噬的細胞群體為活細胞中CD14陽性並且螢光染料CFSE(carboxyfluorescein diacetate，succinimidyl ester，羧基螢光素雙乙酸鹽，琥珀醯亞胺酯)也為陽性的細胞群體。以Hu5F9-G4抗體作為陽性對照抗體。
2、實驗結果
CD47抗體促進巨噬細胞吞噬腫瘤細胞的能力測定結果如圖7所示，結果顯示，本發明CD47抗體具有促進巨噬細胞吞噬腫瘤細胞的能力，且促進巨噬細胞吞噬腫瘤細胞的能力與陽性對照抗體Hu5F9-G4的能力相當。
實施例9  CD47抗體對人類紅血球（RBC）血凝集分析
1、實驗方法
進行紅血球血凝集分析來表徵CD47抗體的RBC凝集能力。通過觀察抗體避免人RBC發生沉降的能力就RBC凝集對CD47抗體進行篩選。具體方法為。
人類紅血球在PBS中稀釋到2%，與滴入的CD47抗體（濃度依次為200ug/mL、100ug/mL、50ug/mL、25ug/mL、12.5ug/mL、6.25ug/mL、1.5625ug/mL、0.78125ug/mL、0.390625ug/mL、0.195313ug/mL、0.097656ug/mL）在圓底96孔板內在37℃培養2小時。未沉澱的紅血球的存在是證明紅血球血凝聚的證據，與未凝聚的紅血球沉澱形成清晰的紅點相比，未沉澱的紅血球呈霧狀。以Hu5F9-G4抗體作為陽性對照抗體。
2、實驗結果
CD47抗體的RBC凝集能力測定結果如圖8所示，結果顯示，當CD47抗體濃度達到200ug/mL時均未引起細胞凝聚，表明本發明CD47抗體具有顯著降低紅血球血凝聚的作用，CD47抗體在臨床治療癌症中能夠顯著降低其副作用、安全性好。
實施例10  CD47抗體與人類紅血球（RBC）結合分析
1、實驗方法
CD47單抗存在與人類紅血球結合的特性，對CD47抗體抑制劑來說，存在藥效受紅血球干擾及腫瘤脫靶的潛在風險。若能篩選到與紅血球結合活性低的抗體則能夠降低脫靶的風險，提高其安全性。具體步驟如下：
（1）抗體稀釋：用FACS buffer 將CD47抗體稀釋成初始濃度20μg/mL，體積180uL，3倍梯度稀釋（60+120），11個濃度。
（2）細胞計數並鋪板：將RBC細胞離心250g 5min後棄去上清，用FACS buffer調整細胞密度為2E+06，按100uL/管均分到96孔V型板中。
（3）將上述稀釋好的抗體加入細胞中，100uL/孔，2℃～8℃培養0.5h。
（4）取出96孔板，250g離心5min，小心去上清後，加入FACS buffer 200uL/孔，再次250g離心5min，小心去上清。
（5）用FACS buffer配製PE goat anti-human IgG Fc（biolegend）螢光二抗（1:500稀釋），按100uL/孔加入對應的96孔板中，重懸細胞，2℃～8℃培養30min。
（6）取出96孔板，250g離心5min，小心去上清後，加入FACS buffer 200uL/孔，再次250g離心5min，小心去上清。
（7）用1xPBS 100uL/孔重懸，FACS檢測。使用流式細胞儀(Beckman，cytoflex)分析資料，GraphPad Prism作圖。以Hu5F9-G4抗體作為陽性對照抗體。
2、實驗結果
CD47抗體與人類紅血球結合能力的測定結果如圖9所示，結果顯示，與陽性對照抗體相比，本發明CD47抗體與人類紅血球的結合活性顯著降低，其作為藥物時的安全性提高。
實施例11  CD47抗體與血小板結合分析
1、實驗方法
同CD47單抗結合人類紅血球一樣，CD47單抗存在與血小板結合的活性特徵，存在血小板降低帶來的諸多副作用。與血小板結合低的抗體能夠降低脫靶的風險，提高其安全性。具體方法如下：
抗體稀釋：用FACS buffer 將抗體稀釋成20μg/ml，體積240ul。
細胞計數並鋪板：將全血細胞稀釋20倍，按100uL/管均分到96孔V型板中。
將上述稀釋好的抗體加入到細胞中，100uL/孔，2℃-8℃培養0.5h。
取出96孔板，250g離心5min，小心去上清後，加入FACS buffer 200ul/孔，再次250g離心5min，小心去上清。
用FACS buffer配製PE螢光二抗1:500稀釋（PE goat anti-human IgG Fc；biolegend；409304），按100ul/孔加入對於的96孔板中，同時每孔中加入1ul APC anti human CD61（biolegend；336411）,重懸細胞，2℃-8℃培養30min；
取出96孔板，250g離心5min，小心去上清後，加入FACS buffer 200ul/孔，再次250g離心5min，小心去上清。
用 1xPBS 200uL /孔重懸，FACS檢測。以Hu5F9-G4抗體作為陽性對照抗體。
2、實驗結果
CD47抗體與血小板結合分析結果如圖10所示，結果顯示本發明的CD47抗體與血小板的結合活性顯著低於陽性對照抗體，顯示出了更優的安全性。
實施例12  CD47抗體對啟動巨噬細胞吞噬紅血球的作用分析
1、實驗方法
檢測方法同實施例8，將紅血球替換為腫瘤細胞作為靶細胞，檢測本發明的CD47抗體是否對巨噬細胞吞噬紅血球存在啟動作用。以Hu5F9-G4抗體作為陽性對照抗體。
2、實驗結果
CD47抗體對啟動巨噬細胞吞噬紅血球的作用分析結果如圖11所示，結果顯示本發明的CD47抗體極低介導巨噬細胞對紅血球的吞噬，且介導作用明顯低於陽性對照抗體，顯示出了更優的安全性。
實施例13  抗腫瘤活性分析
1、實驗方法
選用70隻NOD SCID雌性小鼠（購於浙江維通利華實驗動物技術有限公司）構建人B淋巴細胞皮下移植瘤模型（Raji）和人惡性黑色素瘤模型（A375），評估本發明的CD47抗體的抗腫瘤活性。以Hu5F9-G4抗體和TJC-4抗體作為陽性對照抗體，hIgG4為同型對照抗體。
2、實驗結果
CD47抗體對人B淋巴細胞皮下移植瘤模型的抗腫瘤結果如圖12所示，結果顯示本發明的CD47抗體在抗人B淋巴細胞皮下移植瘤效果上顯著好於陽性對照抗體。
CD47抗體對人惡性黑色素瘤模型的抗腫瘤結果如圖13所示，結果顯示與陽性對照抗體相比，本發明的CD47抗體在抗人惡性黑色素瘤效果上更加有優勢。
上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。
無
圖1是CD47抗體（7A11H11、7A11H12、7A11H22、7A11H32、7A11H42、陽性對照抗體Hu5F9-G4和hIgG4-同型對照）與人CD47結合的平均螢光強度。
圖2是CD47抗體（7A11H52、7A11H14、7A11H15、7A11H33、7A11H34、7A11H35、7A11H55、陽性對照抗體Hu5F9-G4和hIgG4-同型對照）與人CD47結合的平均螢光強度。
圖3是CD47抗體（7A11H11、7A11H12、7A11H22、7A11H32、7A11H42、7A11H52、陽性對照抗體Hu5F9-G4和hIgG4-同型對照）與猴CD47結合的平均螢光強度。
圖4是CD47抗體（7A11H14、7A11H15、7A11H33、7A11H34、7A11H35、7A11H55、陽性對照抗體Hu5F9-G4和hIgG4-同型對照）與猴CD47結合的平均螢光強度。
圖5是CD47抗體（7A11H11、7A11H12、7A11H22、7A11H32、7A11H42和hIgG4-同型對照）對人CD47的CD47/SIRP α結合抑制結果。
圖6是CD47抗體（7A11H52、7A11H14、7A11H15、7A11H33、7A11H34、7A11H35、7A11H55）對人CD47的CD47/SIRP α結合抑制結果。
圖7是CD47抗體促進巨噬細胞吞噬腫瘤細胞的能力測定結果。
圖8是CD47抗體的RBC凝集能力測定結果。
圖9是CD47抗體與人類紅血球結合能力的測定結果。
圖10是CD47抗體與人類血小板結合分析結果。
圖11是CD47抗體對啟動巨噬細胞吞噬紅血球的作用分析結果。
圖12是CD47抗體對人B淋巴細胞皮下移植瘤模型的抗腫瘤結果。
圖13是CD47抗體對人惡性黑色素瘤模型的抗腫瘤結果。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
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Figure 12_A0101_SEQ_0015

Claims (14)

  1. 一種抗CD47抗體或其抗原結合片段，所述抗體含有以下CDRs： a.如SEQ ID NO:19的胺基酸序列所示的LCDR1，如SEQ ID NO:2的胺基酸序列所示的LCDR2，如SEQ ID NO:3的胺基酸序列所示的LCDR3； 如SEQ ID NO:10的胺基酸序列所示的HCDR1，如SEQ ID NO:11的胺基酸序列所示的HCDR2，如SEQ ID NO:12的胺基酸序列所示的HCDR3；或 b.如SEQ ID NO:1的胺基酸序列所示的LCDR1，如SEQ ID NO:2的胺基酸序列所示的LCDR2，如SEQ ID NO:3的胺基酸序列所示的LCDR3； 如SEQ ID NO:10的胺基酸序列所示的HCDR1，如SEQ ID NO:20的胺基酸序列所示的HCDR2，如SEQ ID NO:12的胺基酸序列所示的HCDR3。
  2. 如請求項1所述之抗CD47抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗體含有重鏈可變區和輕鏈可變區的至少之一，所述重鏈可變區和所述輕鏈可變區的至少之一的至少一部分來自鼠源抗體、人源化抗體、靈長目源抗體或其突變體的至少之一。
  3. 如請求項2所述之抗CD47抗體或其抗原結合片段，其中，所述輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:5～9任一項所示或與SEQ ID NO:5～9任一項所示具有至少95%同源性的序列； 較佳地，所述重鏈可變區的胺基酸序列為SEQ ID NO:14～18任一項所示或與SEQ ID NO:14～18任一項所示具有至少95%同源性的序列。
  4. 如請求項2或3所述之抗CD47抗體或其抗原結合片段，其中，所述輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:5所示、所述重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:14所示；或所述輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:6所示、所述重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:14所示；或所述輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:6所示、所述重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:15所示；或所述輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:6所示、所述重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:16所示；或所述輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:6所示、所述重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:17所示；或所述輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:6所示、所述重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:18所示；或所述輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:8所示、所述重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:14所示；或所述輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:9所示、所述重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:14所示；或所述輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:7所示、所述重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:16所示；或所述輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:8所示、所述重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:16所示；或所述輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:9所示、所述重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:16所示；或所述輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:9所示、所述重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO:18所示。
  5. 如請求項1至4中任一項所述之抗CD47抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗體具有恆定區，重鏈恆定區選自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD中的任一種；輕鏈恆定區為κ或λ鏈； 較佳地，所述恆定區的種屬來源選自鼠、兔、羊、猴、或人。
  6. 如請求項1至5中任一項所述之抗CD47抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗體為CDR移植抗體、多聚體抗體或雙特異性抗體中的任一種或幾種； 較佳地，所述抗原結合片段為F(ab’) 2、Fab、scFv、Fv及單域抗體中的任一種或幾種； 較佳地，所述CD47為人CD47、鼠CD47或猴CD47。
  7. 一種核酸，所述核酸編碼如請求項1至6中任一項所述之抗CD47抗體或其抗原結合片段。
  8. 一種載體，所述載體包含如請求項7所述之核酸。
  9. 一種細胞，所述細胞包含如請求項7所述之核酸或如請求項8所述之載體。
  10. 一種藥物組合物，所述藥物組合物含有如請求項1至6中任一項所述之抗CD47抗體或其抗原結合片段、如請求項7所述之核酸、如請求項8所述之載體或如請求項9所述之細胞； 較佳地，所述藥物組合物還含有藥學可接受的載體。
  11. 一種如請求項1至6中任一項所述之抗CD47抗體或其抗原結合片段、如請求項7所述之核酸、如請求項8所述之載體、如請求項9所述之細胞或如請求項10所述之藥物組合物在製備治療和/預防CD47陽性腫瘤的藥物中的應用； 較佳地，所述藥物能夠降低紅血球血凝集； 較佳地，所述藥物能夠降低其與紅血球的結合活性。
  12. 一種如請求項1至6中任一項所述之抗CD47抗體或其抗原結合片段、如請求項7所述之核酸、如請求項8所述之載體或如請求項9所述之細胞在製備檢測CD47或診斷CD47相關疾病的試劑盒中的應用。
  13. 一種檢測CD47的試劑盒，所述試劑盒含有如請求項1至6中任一項所述之抗CD47抗體或其抗原結合片段。
  14. 一種診斷CD47相關疾病的試劑盒，所述試劑盒含有如請求項1至6中任一項所述之抗CD47抗體或其抗原結合片段。
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