EA036368B1 - Анти-ck8 антитела для применения в лечении рака - Google Patents
Анти-ck8 антитела для применения в лечении рака Download PDFInfo
- Publication number
- EA036368B1 EA036368B1 EA201790341A EA201790341A EA036368B1 EA 036368 B1 EA036368 B1 EA 036368B1 EA 201790341 A EA201790341 A EA 201790341A EA 201790341 A EA201790341 A EA 201790341A EA 036368 B1 EA036368 B1 EA 036368B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- seq
- antibody
- cdr
- sequence
- cancer
- Prior art date
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 78
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 173
- 108010070511 Keratin-8 Proteins 0.000 claims abstract description 115
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims abstract description 61
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims abstract description 61
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 24
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 22
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 7
- 101000975496 Homo sapiens Keratin, type II cytoskeletal 8 Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 102000005712 Keratin-8 Human genes 0.000 claims abstract 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 108
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 40
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 35
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 35
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 35
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 28
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 15
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 15
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 15
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 13
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 12
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 claims description 7
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 7
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 201000011682 nervous system cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 7
- 208000024313 Testicular Neoplasms Diseases 0.000 claims description 6
- 206010057644 Testis cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 6
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 201000010453 lymph node cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- 101100370002 Mus musculus Tnfsf14 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 claims 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 15
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 15
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 15
- 102100023972 Keratin, type II cytoskeletal 8 Human genes 0.000 description 108
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 70
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 42
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 41
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 40
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 35
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 34
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 description 26
- 102000003952 Caspase 3 Human genes 0.000 description 23
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 23
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 22
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 21
- OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 Chemical compound C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N 0.000 description 20
- 101710176384 Peptide 1 Proteins 0.000 description 20
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 19
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 19
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 19
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 18
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 15
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 13
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 13
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 13
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 10
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 9
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 9
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 9
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 8
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 7
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 7
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102100033421 Keratin, type I cytoskeletal 18 Human genes 0.000 description 6
- 108010066327 Keratin-18 Proteins 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 5
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 5
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 5
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 5
- QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O[Si](C)(C)C(C)(C)C)C1 QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 0.000 description 4
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 4
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 4
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 4
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 4
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 4
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 4
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 4
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 4
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 3
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 102000004039 Caspase-9 Human genes 0.000 description 3
- 108090000566 Caspase-9 Proteins 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 3
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 3
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 3
- 201000010897 colon adenocarcinoma Diseases 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 230000003436 cytoskeletal effect Effects 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000004968 inflammatory condition Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 description 3
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 3
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VZQHRKZCAZCACO-PYJNHQTQSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]propanoyl]amino]prop-2-enoylamino]-3-methylbutanoyl]amino]propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N VZQHRKZCAZCACO-PYJNHQTQSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 101800004419 Cleaved form Proteins 0.000 description 2
- 206010052358 Colorectal cancer metastatic Diseases 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000699762 Homo sapiens RNA 3'-terminal phosphate cyclase Proteins 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 102000002151 Microfilament Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010040897 Microfilament Proteins Proteins 0.000 description 2
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 102100029143 RNA 3'-terminal phosphate cyclase Human genes 0.000 description 2
- IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N Ribavirin Chemical compound N1=C(C(=O)N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 2
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000036782 biological activation Effects 0.000 description 2
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 238000012054 celltiter-glo Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000003632 microfilament Anatomy 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 2
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 2
- JPOKAKNGULMYHZ-UILVTTEASA-N (2s)-6-amino-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]hexanoyl]amino]hexanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]hexanoyl]amino]-3-(4-hydroxyp Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N)C1=CC=C(O)C=C1 JPOKAKNGULMYHZ-UILVTTEASA-N 0.000 description 1
- MUSGYEMSJUFFHT-UWABRSFTSA-N 2-[(4R,7S,10S,13S,19S,22S,25S,28S,31S,34R)-34-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-4-[[(2S,3S)-1-amino-3-methyl-1-oxopentan-2-yl]-methylcarbamoyl]-25-(3-amino-3-oxopropyl)-7-(3-carbamimidamidopropyl)-10-(1H-imidazol-5-ylmethyl)-19-(1H-indol-3-ylmethyl)-13,17-dimethyl-28-[(1-methylindol-3-yl)methyl]-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-decaoxo-31-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-decazacyclopentatriacont-22-yl]acetic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@H](N)Cc1ccc(O)cc1)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](Cc2cnc[nH]2)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN(C)C(=O)[C@H](Cc2c[nH]c3ccccc23)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](Cc2cn(C)c3ccccc23)NC(=O)[C@@H](NC1=O)C(C)C)C(=O)N(C)[C@@H]([C@@H](C)CC)C(N)=O MUSGYEMSJUFFHT-UWABRSFTSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 3,3'-diaminobenzidine Chemical compound C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 1
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 1
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 102000043139 CK2 family Human genes 0.000 description 1
- 108091054872 CK2 family Proteins 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 1
- ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N D-alpha-tocopherylacetate Chemical compound CC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N 0.000 description 1
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 101710101803 DNA-binding protein J Proteins 0.000 description 1
- 102000036292 Death effector domains Human genes 0.000 description 1
- 108091010866 Death effector domains Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 1
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 1
- 239000004097 EU approved flavor enhancer Substances 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000975474 Homo sapiens Keratin, type I cytoskeletal 10 Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102100023970 Keratin, type I cytoskeletal 10 Human genes 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 208000031671 Large B-Cell Diffuse Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 241001421711 Mithras Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 238000011795 OF1 mouse Methods 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 108091027568 Single-stranded nucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- SCJNCDSAIRBRIA-DOFZRALJSA-N arachidonyl-2'-chloroethylamide Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(=O)NCCCl SCJNCDSAIRBRIA-DOFZRALJSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 201000008274 breast adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000004709 cell invasion Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 239000008298 dragée Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 235000019264 food flavour enhancer Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000007902 hard capsule Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229940102223 injectable solution Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 210000003963 intermediate filament Anatomy 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N irinotecan Chemical compound C1=C2C(CC)=C3CN(C(C4=C([C@@](C(=O)OC4)(O)CC)C=4)=O)C=4C3=NC2=CC=C1OC(=O)N(CC1)CCC1N1CCCCC1 UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N 0.000 description 1
- 229960004768 irinotecan Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 238000007422 luminescence assay Methods 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000110 microvilli Anatomy 0.000 description 1
- 230000004898 mitochondrial function Effects 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 description 1
- 229940097496 nasal spray Drugs 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 229940100688 oral solution Drugs 0.000 description 1
- 229960001756 oxaliplatin Drugs 0.000 description 1
- DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L oxaliplatin Chemical compound O1C(=O)C(=O)O[Pt]11N[C@@H]2CCCC[C@H]2N1 DWAFYCQODLXJNR-BNTLRKBRSA-L 0.000 description 1
- 101800002712 p27 Proteins 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 210000001948 pro-b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 201000006845 reticulosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 208000029922 reticulum cell sarcoma Diseases 0.000 description 1
- -1 sachets Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000011218 segmentation Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007901 soft capsule Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000007940 sugar coated tablet Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4741—Keratin; Cytokeratin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3015—Breast
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3046—Stomach, Intestines
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3061—Blood cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57419—Specifically defined cancers of colon
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2410/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving peptides of less than 20 animo acids
Abstract
Изобретение относится к антителу, фрагменту антитела, гуманизированному антителу и фрагменту антитела, специфически связывающемуся с человеческим цитокератином-8 (CK8), а также антигенному пептидному эпитопу для получения указанных антител и их фрагментов, применению таких антител или их фрагментов для лечения опухолей, клетки которых экспрессируют на своей поверхности белок CK8, и фармацевтическим композициям, содержащим указанные антитела или их фрагменты.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области антител, которые можно применять в терапевтических целях. В частности, настоящее изобретение относится к антителу против цитокератина-8. Эти антитела являются полезными для лечения рака, экспрессирующего цитокератин-8 (CK8), например колоректального рака.
Сведения о предшествующем уровне техники
Цитокератин-8 (CK8) представляет собой белковый компонент промежуточных филаментов цитоскелета эпителиальных клеток.
Различные исследования показали, что белок CK8 связан с цитоплазматической мембраной различных раковых клеток. Например, в работе Godfroid et al. (Journal of Cell Science, 99: 595-607, 1991) описано, что белки CK8 присутствуют на поверхности культивированных клеток рака молочной железы. В работе Hembrough et al. (Journal of Cell Science, 108: 1071-1082, 1995) описано, что белок CK8 или белок, подобный CK8, присутствует на поверхности гепатоцитов, клеток HepG2 и клеток рака молочной железы.
Белок CK8 также был детектирован на поверхности карциномы других типов рака, например рака верхних отделов пищеварительного тракта (Gires et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 328: 1154-1162, 2005). Также было показано, что белок CK8 экспонирован на поверхности инвазивных и неинвазивных опухолевых клеток в колоректальном раке (WO 2010/136536). В частности, было показано, что в колоректальном раке появление инвазивных и/или метастатических клеток сопровождается расщеплением человеческого белка CK8, экспонированного на поверхности этих клеток. Nконцевая часть белка CK8 остается экспонированной на поверхности клеток аденокарциномы толстой кишки, а C-концевая часть белка частично или полностью исчезает с поверхности этих клеток.
Колоректальный рак является особенно инвазивным раком. Хотя были достигнуты значительные успехи в лечении пациентов с метастатическим колоректальным раком (CRC), данный тип рака остается значительной глобальной проблемой для общественного здравоохранения (Weitz et al. Lancet 2005; 365: 153-65). Колоректальный рак (CRC) является третьим наиболее диагностируемым раком у пациентов обоих полов с предполагаемыми 940000 случаями в год и второй самой распространенной причиной смертности от рака, составляющей примерно 500000 случаев в год (Weitz et al. Lancet 2005; 365: 153-65). Во Франции каждый год диагностируется 37000 новых пациентов с CRC, из которых около половины умрут от метастатического заболевания. Однако на момент постановки диагноза примерно у 50% из новых 36000 пациентов уже имеются или будут развиваться метастазы (Weitz et al. Lancet 2005; 365: 15365; Cunningham et al. Lancet 2010; Chevreul Eur J Health Econ 2010).
Разработка более эффективных лекарственных средств (иринотекан, оксалиплатин) позволила значительно улучшить способы лечения пациентов с CRC. В последнее десятилетие также наблюдалась острая потребность в терапиях на основе молекул -моноклональных антител (Mab), направленных против специфических мишеней, сверхэкспрессирующихся (рецепторы EGF или VEGF) в опухолевых клетках по сравнению со здоровыми клетками. Эти молекулы значительно улучшают способы лечения.
Цитокератин-8 проявляет множество функций, таких как, например, модулирование клеточной инвазии и/или клеточного апоптоза благодаря уникальному отличительному свойству его структуры. При клеточной инвазии CK8 связывается с плазминогеном и тканевым активатором плазминогена (t-PA) и ускоряет активацию плазминогена на поверхностях раковых клеток (J Protein Chem. 1998 Nov; 17(8):84554). Участок связывания с плазминогеном локализован на C-конце CK8.
Кроме того, оказывая влияние на систему плазминогена, CK8 может быть вовлечен в модулирование сигнальной трансдукции раковых клеток (outside-in signal - передача сигнала в клетки) в ответ на изменения в микроокружении (Deryugina and Quigley, J. Biomed Biotechnol, 2012; 2012:564259).
При клеточном апоптозе цитоскелетная сеть цитокератина 8/18 (CK8/18) является ранней мишенью для расщепления каспазами во время апоптоза. В недавних публикациях было сделано предположение о том, что высококонсервативный и убиквитарный эффекторный домен смерти, содержащий ДНКсвязывающий белок (DEDD), участвует в рекрутинге прокаспазы-9 и -3 в каркасе этого CK8/18. DEDD взаимодействует с сетью промежуточных микрофиламентов CK8/18, а также с прокаспазой-3 и прокаспазой-9 (Apoptosis (2006) 11:1561-1572). Предполагается, что фибриллы CK8/18 могут обеспечивать каркас для индуцированного близостью ауторасщепления и активации прокаспазы-9 в тесной связи с каспазой-3.
Описаны различные моноклональные антитела, связывающиеся с человеческим белком CK8. В частности, в работе Erlandsson et al. (J. of Molecular Recognition, 16: 157-163, 2003; Johansson et al. Cancer Res 1999, 59, 48-51) описано моноклональное антитело TS1, направленное против человеческого белка CK8, его антиидиотип aTS1 и его применение в иммунотерапии карцином. В работе Doljak et al. (Cancer Letters, 267: 75-84, 2008) описано моноклональное антитело, связывающееся с мотивом VKIALEVEIATY, консервативным среди различных цитокератинов. Это моноклональное антитело связывается, в частности, с белками CK2, CK8, CK10 и CK18 в клетках рака молочной железы MCF-7. Это антитело ингибирует активацию плазминогена на клетках MCF-7 in vitro. Антитело M20 под торговой
- 1 036368 маркой Sigma® описано Van Muijen, G. et al. (Lab. Invest., 57: 359, 1987; Waseem et al. Biochemistry 2004, 43, 1283-1295). Было показано, что это антитело, специфически связываясь с белком CK8, ингибирует рост и инвазивную способность опухолевых клеток колоректального рака в тестах, проводимых in vitro и in vivo (WO 2010/136536). В частности, в международной патентной публикации WO 2010/136536 показано, что это антитело специфически связывается с нерасщепленной частью человеческого белка CK8, присутствующего на поверхности опухолевых клеток аденокарциномы толстой кишки. Очищенное антитело M20 было продуцировано мышиной асцитической жидкостью. Гуманизированный формат Mab не был описан для этого конкретного антитела.
Несмотря на прогресс, достигнутый в отношении идентификации антигенов на поверхности опухолевых клеток и в отношении понимания механизмов, связанных с развитием рака, и хотя этот прогресс позволил разработать моноклональные антитела, которые могут значительно улучшить способы лечения, эффективность и специфичность указанных моноклональных антител может быть дополнительно улучшена. Разумеется, многие из белков, используемых для разработки таргетных терапий, сверхэкспрессируются в раковых клетках, но также экспрессируются на различных уровнях и в здоровых тканях. Таким образом, лекарственные средства, нацеленные на ключевой эпитоп белка, который более специфически экспрессируется на клеточной поверхности в раковой ткани, представляют многообещающий подход к улучшению специфичности противораковых терапий в отношении рака. Таким образом, сохраняется потребность в разработке терапевтических средств для лечения опухолей, клетки которых экспрессируют внешний белок CK8 (eCK8) на своей поверхности, в частности, для лечения, например, колоректального рака. В частности, сохраняется потребность в разработке моноклональных антител, которые не только нацелены на CK8, но и более специфически нацелены на эпитоп, связанный с раком, который препятствует способностям клеток к онкогенезу путем модулирования хорошо описанных важных процессов прогрессирования опухоли, таких как процессы, вовлеченные в клеточную инвазию и клеточный апоптоз.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к антителу или фрагменту антитела, специфически связывающемуся с пептидом, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 29. Антитело содержит тяжелую цепь, содержащую следующие три CDR, соответственно CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, где
CDR-H1 содержит последовательность SEQ ID NO: 37 или последовательность по меньшей мере с 80%-й, предпочтительно 85, 90, 95 и 98%-й идентичностью после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID NO: 37; и
CDR-H2 содержит последовательность SEQ ID NO: 38 или последовательность по меньшей мере с 80%-й, предпочтительно 85, 90, 95 и 98%-й идентичностью после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID NO: 38; и
CDR-H3 содержит последовательность SEQ ID NO: 39 или последовательность по меньшей мере с 80%-й, предпочтительно 85, 90, 95 и 98%-й идентичностью после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID NO: 39; и легкую цепь, содержащую следующие три CDR, соответственно CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где
CDR-L1 содержит последовательность SEQ ID NO: 34 или последовательность по меньшей мере с 80%-й, предпочтительно 85, 90, 95 и 98%-й идентичностью после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID NO: 34; и
CDR-L2 содержит последовательность SEQ ID NO: 35 или последовательность по меньшей мере с 70%-й, предпочтительно 80, 85, 90, 95 и 98%-й идентичностью после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID NO: 35;
CDR-L3 содержит последовательность SEQ ID NO: 36 или последовательность по меньшей мере с 80%-й, предпочтительно 85, 90, 95 и 98%-й идентичностью после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID NO: 36.
Изобретение также относится к гуманизированному антителу или фрагменту антитела, специфически связывающемуся с пептидом, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 29. Гуманизированное антитело содержит тяжелую цепь, содержащую следующие три CDR, соответственно CDR-H1', CDR-H2' и CDR-H3', где
CDR-H1' содержит последовательность SEQ ID NO: 40 или последовательность по меньшей мере с 80%-й, предпочтительно 85, 90, 95 и 98%-й идентичностью после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID NO: 37; и
CDR-H2' содержит последовательность SEQ ID NO: 41 или последовательность по меньшей мере с 80%-й, предпочтительно 85, 90, 95 и 98%-й идентичностью после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID NO: 38;
CDR-H3' содержит последовательность SEQ ID NO: 39 или последовательность по меньшей мере с 80%-й, предпочтительно 85, 90, 95 и 98%-й идентичностью после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID NO: 39; и
- 2 036368 легкую цепь, содержащую следующие три CDR, соответственно CDR-L1', CDR-L2' и CDR-L3', где
CDR-L1' содержит последовательность SEQ ID NO: 42 или последовательность по меньшей мере с
80%-й, предпочтительно 85, 90, 95 и 98%-й идентичностью после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID NO: 34; и
CDR-L2' содержит последовательность SEQ ID NO: 35 или последовательность по меньшей мере с 70%-й, предпочтительно 80, 85, 90, 95 и 98%-й идентичностью после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID NO: 35; и
CDR-L3' содержит последовательность SEQ ID NO: 36 или последовательность по меньшей мере с 80%-й, предпочтительно 85, 90, 95 и 98%-й идентичностью после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID NO: 36.
Антитело или фрагмент антитела согласно настоящему изобретению можно применять для лечения опухолей, клетки которой экспрессируют белок CK8, в частности пептид, имеющий последовательность согласно SEQ ID NO: 29, на своей поверхности.
Также настоящее изобретение относится к человеческому антигенному пептиду CK8, состоящему из полипептида, имеющего от 8 до 16 аминокислот и содержащего последовательность, представленную в SEQ ID NO: 29, в частности человеческому антигенному пептиду CK8, состоящему из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 29.
Также настоящее изобретение относится к указанному человеческому антигенному пептиду CK8 для его применения в качестве лекарственного средства.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело или фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением и подходящий фармацевтический носитель, в частности, для ее применения в лечении или предупреждении рака, аутоиммунного заболевания, воспалительного состояния, вирусной инфекции или вирусного заболевания, и/или в качестве лекарственного средства для индукции апоптоза опухолевой клетки, в частности, для применения в лечении опухолей, клетки которых экспрессируют на своей поверхности белок CK8, в частности пептид с последовательностью согласно SEQ ID NO: 29.
В заключение, настоящее изобретение относится к набору, включающему контейнер, содержащий молекулу, которая может связываться с эпитопом, при этом указанный эпитоп имеет последовательность по меньшей мере с 60%-й, предпочтительно 65, 70, 75, 80, 85, 90 и 100%-й идентичностью после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID NO: 29. Указанный набор можно применять для обнаружения рака.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1A и 1B показана детекция с помощью Вестерн-блоттинга изоформ CK8 с использованием различных анти-СК8 антител, включая mD-A10 Mab.
На фиг. 2A и 2B показан уровень конкуренции в присутствии неконъюгированного пептида 1 (SEQ ID NO: 1) или неконъюгированного пептида 2 (SEQ ID NO: 2) при мечении клеток анти-CK8 антителами, измеренный с использованием проточной цитометрии.
На фиг. 3A, 3B и 3C показан уровень конкуренции в присутствии неконъюгированного пептида 1 (SEQ ID NO: 1) или неконъюгированного пептида 2 (SEQ ID NO: 2) при детекции изоформ белка CK8 с помощью Вестерн-блоттинга с использованием антитела M20, mD-D6 Mab или mD-A10 Mab.
На фиг. 4 показан эффект анти-CK8 антител (50 мкг/мл), включая mD-A10 Mab, на инвазию клеток Isreco-1, индуцированную 10%-й фетальной бычьей сывороткой (FBS).
На фиг. 5 показан эффект анти-CK8 антител на пролиферацию клеток Isreco-1.
На фиг. 6A и 6B показан эффект in vivo анти-СК8 антител на активацию каспазы-3 в опухолевых клетках Isreco-1.
На фиг. 7 показан эффект анти-СК8 антител, включая mD-A10 Mab, на рост опухоли (Isreco-1) у мышей.
На фиг. 8 показан дозозависимый эффект концентрации mD-A10 Mab на рост опухоли (Isreco-1) у мышей.
На фиг. 9 показан эффект анти-СК8 антител, включая mD-A10 Mab, на рост опухоли (HCT116) у мышей.
На фиг. 10 показан дозозависимый эффект концентрации mD-A10 Mab на рост опухоли (HCT 116) у мышей.
На фиг. 11 показано расположение пептидов 1 (SEQ ID NO: 1), 2 (SEQ ID NO: 2), 3 (SEQ ID NO: 3) и 4 (SEQ ID NO: 4) в последовательности человеческого циторератина-8 (ref: Uni-ProtKB P05787).
На фиг. 12 показана реактивность антитела M20 или mD-A10 Mab в отношении BSAконъюгированного пептида 1 (SEQ ID NO: 1), 2 (SEQ ID NO: 2), 3 (SEQ ID NO: 3), 4 (SEQ ID NO: 4) или 17 (SEQ ID NO: 17) с помощью ELISA.
На фиг. 13A показана реактивность mD-A10 Mab в отношении покрывающих лунки неконъюгированных пептидов 1, 5-28 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 - SEQ ID NO:28) с помощью ELISA.
На фиг. 13B показана реактивность M20 в отношении покрывающих лунки неконъюгированных пептидов 1, 5-28 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 - SEQ ID NO: 28) с помощью ELISA.
- 3 036368
На фиг. 14 показан эффект неконъюгированных пептидов 1 и 5-28 (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 28) в отношении распознавания антителом mD-A10 Mab BSA-конъюгированного пептида 1 (SEQ ID NO: 1) с помощью ELISA.
На фиг. 15 показан эффект неконъюгированных пептидов 1, 5-28 (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 28) в отношении распознавание антителом mD-A10 Mab BSA-конъюгированного пептида 17 (SEQ ID NO: 17) с помощью ELISA.
На фиг. 16 показаны аминокислотные и нуклеотидные последовательности вариабельной области легкой цепи (VL) антитела mD-A10 Mab с описанием FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 и CDR3 согласно IMGT®.
На фиг. 17 показаны аминокислотные и нуклеотидные последовательности вариабельной области тяжелой цепи (VH) антитела mD-A10 Mab с описанием FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 и CDR3 согласно IMGT®.
На фиг. 18 показаны аминокислотные и нуклеотидные последовательности вариабельной области тяжелой цепи (VH) гуманизированного моноклонального антитела, полученного из mD-A10 Mab.
На фиг. 19 показаны аминокислотные и нуклеотидные последовательности вариабельной области легкой цепи (VH) гуманизированного моноклонального антитела, полученного из mD-A10 Mab.
На фиг. 20 показаны аминокислотные и нуклеотидные последовательности константной области тяжелой цепи (CH) гуманизированного моноклонального антитела, полученного из mD-A10 Mab.
На фиг. 21 показаны аминокислотные и нуклеотидные последовательности константной области легкой цепи (CL) гуманизированного моноклонального антитела, полученного из mD-A10 Mab.
Определения.
Термин антитела, используемый в описании настоящего изобретения, относится к моноклональным антителам (Mab) или поликлональным антителам. Антитела могут представлять собой химерные, гуманизированные или конъюгированные антитела. Типичное антитело состоит из двух идентичных тяжелых цепей и двух идентичных легких цепей, которые соединены дисульфидными связями. Каждая тяжелая и легкая цепь содержит константную область и вариабельную область. Каждая вариабельная область содержит три сегмента, называемые участками, определяющими комплементарность (CDR) или гипервариабельными участками, которые ответственны в первую очередь за связывание с эпитопом антигена. Как правило, они называются CDR1, CDR2 и CDR3, пронумерованные последовательно от N-конца. Более высококонсервативные части вариабельных областей называются каркасными участками.
Выражение моноклональные антитела, используемое в описании настоящего изобретения, относится к антителу, полученному из популяции, по существу, гомогенных антител. В частности, индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением нескольких возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Другими словами, моноклональное антитело состоит из гомогенных антител, образовавшихся в результате пролиферации клона единичной клетки (например, гибридома, эукариотическая клетка-хозяин, трансфицированная молекулой ДНК, кодирующей гомогенное антитело, прокариотическая клетка-хозяин, трансфицированная молекулой ДНК, кодирующей гомогенное антитело, и т.д.), как правило, характеризующегося тяжелыми цепями одного класса и подкласса и легкими цепями одного типа. Моноклональные антитела являются высокоспецифическими и направлены против одного антигена. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые в типичном случае включают различные антитела, направленные против разных детерминант или эпитопов, каждое моноклональное антитело направлено против одного эпитопа антигена.
Выражение химерные антитела, используемое в описании настоящего изобретения, относится к антителам, содержащим константные части тяжелых и легких цепей антитела заданных видов, например человеческого антитела, на которое привиты вариабельные части тяжелых и легких цепей антитела гетерологичных видов, например мышиного антитела.
Выражение гуманизированные антитела, используемое в описании настоящего изобретения, относится к человеческим антителам, в которых гипервариабельные участки (CDR) заменены на гипервариабельные участки (CDR) антитела гетерогенного происхождения, например мышиного происхождения, которые составляют антигенсвязывающий участок. Поскольку определенные аминокислоты, локализованные в соседних с CDR (FR) областях, играют роль в структуре антигенсвязывающего участка, человеческие антитела дополнительно могут быть модифицированы (CDR) таким образом, чтобы включать аминокислоты FR антитела гетерогенного происхождения.
Выражение конъюгированные антитела, используемое в описании настоящего изобретения, относится к искусственно смешанным молекулам, в которых компоненты связаны с антителом, способным селективно распознавать антиген. Эти компоненты могут представлять собой цитотоксические лекарственные средства, противораковые агенты, токсины, фрагменты и/или радиоактивные элементы.
Антитела могут представлять собой мультивалентные антитела, то есть они могут содержать более двух антигенсвязывающих участков, или представлять собой мультиспецифические антитела, при усло- 4 036368 вии, что они проявляют желаемую биологическую активность.
Выражение фрагмент(ы) антител, используемое в описании настоящего изобретения, относится к функциональным частям антител (в противоположность целым антителам), то есть частям антител, способным связываться с антигеном (антигенсвязывающий фрагмент). Следует понимать, что фрагменты антитела сохраняют способность связываться с мишенью (также обычно называемой антигеном) антитела, о котором идет речь. Примеры фрагментов антител включают следующие фрагменты: Fv (состоящий из вариабельных областей тяжелых и легких цепей антитела), ScFv (двухвалентный одноцепочечный вариабельный фрагмент), Fab (состоящий из полномерной легкой цепи и части тяжелой цепи), F(ab')2 (состоит из двух Fab-фрагментов, связанных шарнирной областью), или любой фрагмент, период полувыведения которого будет увеличиваться путем химической модификации, такой как добавление полиалкиленгликоля, такого как полиэтиленгликоль (пегилирование) (пегилированные фрагменты, называемые Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')2-PEG или Fab'-PEG) (PEG для полиэтиленгликоля), или путем включения в липосому, при этом указанные фрагменты имеют по меньшей мере один из характерных CDR антитела согласно изобретению. Обычно фрагмент антитела может иметь любой максимальный размер до тех пор, пока он является схожим или обладает иммунологическими свойствами, относящимися к антителу, которое специфически связывается с эпитопом антитела, о котором идет речь. Например, связывающиеся структурные единицы и фрагменты легкой цепи антитела могут иметь по меньшей мере 60 аминокислот, менее чем около 200 аминокислот, менее чем около 175 аминокислот, менее чем около 150 аминокислот или менее чем около 120 аминокислот, если фрагмент антитела относится к субъединице легкой цепи антитела. Кроме того, связывающиеся структурные единицы и фрагменты тяжелой цепи антитела могут иметь менее чем около 425 аминокислот, менее чем около 400 аминокислот, менее чем около 375 аминокислот, менее чем около 350 аминокислот, менее чем около 325 аминокислот или менее чем около 300 аминокислот, если фрагмент антитела относится к субъединице тяжелой цепи антитела.
Термин апоптоз, используемый в описании настоящего изобретения, относится к упорядоченной или контролируемой форме клеточной гибели у млекопитающих, которая обычно сопровождается одним или более характерными клеточными изменениями, такими как конденсация цитоплазмы, утрата микроворсинок плазматической мембраны, сегментация ядра, деградация хромосомной ДНК или утрата митохондриальной функции. Активация цистеиновых протеаз, называемых каспазами, играет важную роль в осуществлении апоптоза.
Термин инвазия, используемый в описании настоящего изобретения, относится к клеточной миграции и определяет способность клеток стать лабильными и перемещаться сквозь внеклеточный матрикс в пределах ткани или инфильтрировать соседние ткани. Раковые клетки, которые стали инвазивными, могут диссеминировать на вторичные участки и формировать метастазы.
Термин агонист или агонистический, используемый в описании настоящего изобретения, относится к молекуле, которая способна прямо или опосредованно индуцировать, стимулировать или усиливать биологическую активность или активацию CK8.
Термин антагонист или антагонистический, используемый в описании настоящего изобретения, относится к молекуле, которая способна прямо или опосредованно противодействовать, снижать или ингибировать биологическую активность или активацию CK8.
Термин рак, используемый в описании настоящего изобретения, относится ко всем злокачественным неопластическим образования, независимо от их гистологической природы. Существует две основные категории злокачественных опухолей: карциномы эпителиального происхождения и саркомы, происходящие из соединительной ткани. Злокачественные опухоли состоят из инвазивных или распространяющихся атипичных клеток, обычно характеризующихся способностью к автономному росту, нечеткими контурами, способностью инвазировать соседние ткани и сосуды и тенденцией к распространению посредством формирования метастаз.
Термин полинуклеотид, используемый в описании настоящего изобретения, относится к одноцепочечной нуклеотидной цепи ДНК или РНК или ее комплементу, или к двухцепочечной нуклеотидной цепи комплементарной ДНК (кДНК), или геномной ДНК.
Термин эпитоп, используемый в описании настоящего изобретения, относится к молекуле, которая может быть распознана паратопом (вариабельной частью антитела).
Термин гомология, используемый в описании настоящего изобретения, относится к сходству между пептидными последовательностями. Пептидные последовательности могут иметь делецию, добавление или замену по меньшей мере одной аминокислоты по сравнению с референсным полипептидом.
Используемый в описании настоящего изобретения процент идентичности между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями определяют посредством сравнения этих двух последовательностей, выровненных оптимальным способом, при этом сравниваемая нуклеотидная или аминокислотная последовательность может содержать добавления или делеции относительно референсной последовательности для осуществления оптимального выравнивания между обеими последовательностями. Процент идентичности рассчитывают, определяя число идентичных положений, в которых нуклеотидный или аминокислотный остаток будет одинаковым в двух последовательностях, предпочти
- 5 036368 тельно в двух полных последовательностях, и деления этого числа идентичных положений на общее число положений в окне сравнения и умножения полученного результата на 100 для получения процента идентичности между обеими этими последовательностями. Например, можно использовать программу BLAST, BLAST 2 sequences (Tatusova et al., Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences, FEMS Microbiol, 1999, Lett. 174:247-250), доступную на сайте http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorfb12.html, с параметрами, используемыми по умолчанию (в частности, что касается параметров штраф за внесение делеции (gap open penalty): 5, и штраф за продолжение делеции (extension gap penalty): 2; при этом выбранной матрицей является, например, матрица BLOSUM 62, предложенная этой программой); процент идентичности между обеими сравниваемыми последовательностями непосредственно вычисляется этой программой.
Мышиное моноклональное антитело D-A10 называется здесь как mD-A10 Mab.
Химерное моноклональное антитело D-A10 называется здесь как chD-A10 Mab. Гуманизированное моноклональное антитело D-A10 называется здесь как HzD-A10Mab. Перечень последовательностей
SEQ ID NO: 1 относится к следующему пептиду:
AEQRGELAIKDANAKLSELEAALQRAKQD-C.
SEQ ID NO: 2 относится к следующему пептиду: AEQRGELAIKDANAKLSELE-C.
SEQ ID NO: 3 относится к следующему пептиду: AALQRAKQD-C.
SEQ ID NO: 4 относится к следующему пептиду: SELEAALQRAKQD-C.
SEQ ID NO: 5 относится к следующему пептиду:
AEQRGELAIKDANAKLSELEAALQRAKQD
SEQ ID NO: 6 относится к следующему пептиду: AALQRAKQD
SEQ ID NO: 7 относится к следующему пептиду: EAALQRAKQD SEQ ID NO: 8 относится к следующему пептиду: LEAALQRAKQD SEQ ID NO: 9 относится к следующему пептиду: ELEAALQRAKQD SEQ ID NO: 10 относится к следующему пептиду: SELEAALQRAKQD SEQ ID NO: 11 относится к следующему пептиду: LSELEAALQRAKQD SEQ ID NO: 12 относится к следующему пептиду: KLSELEAALQRAKQD SEQ ID NO: 13 относится к следующему пептиду: AKLSELEAALQRAKQD SEQ ID NO: 14 относится к следующему пептиду: NAKLSELEAALQRAKQD SEQ ID NO: 15 относится к следующему пептиду: ANAKLSELEAALQRAKQD SEQ ID NO: 16 относится к следующему пептиду: DANAKLSELEAALQRAKQD SEQ ID NO: 17 относится к следующему пептиду: ΟΛΙΚΕ) AN AKL SELEAALQRAKQD
SEQ ID NO: 18 относится к следующему пептиду: AIKDANAKLSELEAALQRAKQ
SEQ ID NO: 19 относится к следующему пептиду: AIKDANAKLSELEAALQRAK
SEQ ID NO: 20 относится к следующему пептиду: AIKDANAKLSELEAALQRA
SEQ ID NO: 21 относится к следующему пептиду: AIKDANAKLSELEAALQR
SEQ ID NO: 22 относится к следующему пептиду: AIKDANAKLSELEAALQ
SEQ ID NO: 23 относится к следующему пептиду: AIKDANAKLSELEAAL
SEQ ID NO: 24 относится к следующему пептиду: AIKDANAKLSELEAA
SEQ ID NO: 25 относится к следующему пептиду: AIKDANAKLSELEA
SEQ ID NO: 26 относится к следующему пептиду: AIKDANAKLSELE
SEQ ID NO: 27 относится к следующему пептиду: AIKDANAKLSEL
SEQ ID NO: 28 относится к следующему пептиду: AIKDANAKLSE
SEQ ID NO: 29 относится к следующему пептиду: LSELEAAL
SEQ ID NO: 30 относится к следующей нуклеотидной последовательности:
AACATTGTTATGACCCAGGCCGCACCCTCTGTACCTGTCACTCCTGGAGAGTC
AGTATCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTTCTGTATAGTAATGGCAACACTTA TTTGTATTGGTTCCTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCGCCTGATATATTATAT GTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGAGGGTCAGGAACTG ATTTCACACTGAGAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTA TGCAAAGTCTAGAATATCCTTTCACG
SEQ ID NO: 31 относится к следующему пептиду:
NIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLYSNGNTYLYWFLQRPGQSPQRLIYY MSNLASGVPDRFSGRGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCMQSLEYPFTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO: 32 относится к следующей нуклеотидной последовательности:
GAAGTGCAGCTGTTGGAGACTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCGGGGGGGTCA
- 6 036368
CGGGGACTCTCTTGTGAAGGCTCAGGGTTTACTTTTAGTGGCTTCTGGATGAGCTGG GTTCGACAGACACCTGGGAAGACCCTGGAGTGGATTGGAGACATTAATTCTGATGG CAGTGCAATAAAATACGCACCATCCATAAAGGATCGATTCACTATCTTCAGAGACA ATGACAAGAGCACCCTGTACCTGCAGATGAGCAATGTGCGATCTGAGGACACAGCC ACGTATTTCTGTATCGCCCATTACTCCGGTGGGGGGTTTGCTTACTGGGGTCAAGGA ACCTCGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO: 33 относится к следующему пептиду:
EVQLLETGGGLVQPGGSRGLSCEGSGFTFSGFWMSWVRQTPGKTLEWIGDINSD GSAIKYAPSIKDRFTIFRDNDKSTLYLQMSNVRSEDTATYFCIAHYSGGGFAYWGQGTS VTVSS
SEQ ID NO: 34 относится к следующему пептиду: KSLLYSNGNTY
SEQ ID NO: 35 относится к следующему пептиду: YMS
SEQ ID NO: 36 относится к следующему пептиду: MQSLEYPFT
SEQ ID NO: 37 относится к следующему пептиду: GFTFSGFW
SEQ ID NO: 38 относится к следующему пептиду: INSDGSAI
SEQ ID NO: 39 относится к следующему пептиду: IAHYSGGGFAY
SEQ ID NO: 40 относится к следующему пептиду: GFTFSSYW
SEQ ID NO: 41 относится к следующему пептиду: INSDGSST
SEQ ID NO: 42 относится к следующему пептиду: KSLLYSNGYNY
SEQ ID NO: 43 относится к следующему пептиду:
DIVMTQAPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLYSNGYNYLYWFLQKPGQSPQLLIYY MSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQSLEYPFTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO: 44 относится к следующему пептиду:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLVWVSDINS DGSSTKYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCIAHYSGGGFAYWGQ GTL VTVSS
SEQ ID NO: 45 относится к следующей нуклеотидной последовательности:
GAAGTACAATTGGTAGAATCAGGTGGTGGTTTGGTTCAGCCAGGAGGATCAC TGAGACTGTCCTGCGCTGCAAGCGGCTTTACCTTCTCTAGCTACTGGATGTCTTGGGT CCGGCAAGCCCCAGGGAAGGGACTGGTGTGGGTGAGCGATATTAATAGTGACGGCT CTTCTACTAAGTATGCTGATAGTGTCAAGGGCCGATTCACCATCTCACGAGACAACG CCAAGAACACCTTGTACCTCCAGATGAACTCTTTGAGAGCTGAGGATACAGCAGTGT ATTACTGTATCGCCCACTACTCAGGGGGAGGCTTTGCTTACTGGGGTCAAGGCACAC TCGTGACAGTCTCCTCT
SEQ ID NO: 46 относится к следующей нуклеотидной последовательности:
GATATTGTAATGACTCAAGCTCCACTCTCCTTGCCTGTAACTCCTGGAGAGCC CGCTTCTATTAGCTGTAGGAGTAGTAAAAGCCTGCTTTACAGTAATGGTTACAATTA CCTGTACTGGTTTTTGCAGAAGCCTGGACAGTCACCCCAGCTCCTCATCTATTATATG TCTAACTTGGCCAGTGGTGTCCCAGACCGTTTTAGTGGCAGCGGCTCAGGCACCGAC TTTACCCTTAAGATCAGCCGAGTCGAGGCTGAAGACGTAGGAGTGTACTACTGTATG CAGAGTCTTGAGTATCCATTCACCTTCGGGCAGGGCACCAAGCTCGAAATAAAG
SEQ ID NO: 47 относится к следующему пептиду:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 48 относится к следующей нуклеотидной последовательности:
GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCAC
С TCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCG GTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCT GTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTCGTGACCGTGCCCTCC AGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAAC ACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCC ACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCA AAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGT GGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGG AGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCG TGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACA AGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAA GCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGA GCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCG ACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCAC GCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGA CAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTC TGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
SEQ ID NO: 49 относится к следующему пептиду:
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
- 7 036368
SEQ ID NO: 50 относится к следующей нуклеотидной последовательности: CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTT
GAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGC CAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTG TCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTG AGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGG CCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG.
Подробное описание изобретения
Антитела и фрагменты антител.
Авторы изобретения разработали антитела и фрагменты антител, которые специфически связываются с пептидом, имеющим аминокислотную последовательность от положения 353 до положения 360 человеческого белка CK8 (ref.: Uni-ProtKB P05787). Аминокислотная последовательность от положения 353 до положения 360 человеческого белка CK8 представлена в SEQ ID NO: 29. Под специфически понимается, что антитела или фрагменты антител связываются только с пептидом человеческого CK8, имеющим указанную последовательность. Должно быть понятно, что антитела или фрагменты антител могут связываться с любым фрагментом белка/пептида, содержащим указанную последовательность.
Таким образом, настоящее изобретение относится к антителам или фрагментам антител, специфически связывающимся с пептидом согласно последовательности SEQ ID NO: 29. Эти антитела или фрагменты антител определяются в описании настоящего изобретения выражением антитела или фрагменты антител по настоящему изобретению.
Антитела согласно настоящему изобретению содержат тяжелую цепь, содержащую следующие три CDR, соответственно CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, где
CDR-H1 содержит последовательность SEQ ID NO: 37 или последовательность по меньшей мере с 80%-й, предпочтительно 85, 90, 95 и 98%-й идентичностью после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID NO: 37; и
CDR-H2 содержит последовательность SEQ ID NO: 38 или последовательность по меньшей мере с 80%-й, предпочтительно 85, 90, 95 и 98%-й идентичностью после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID NO: 38; и
CDR-H3 содержит последовательность SEQ ID NO: 39 или последовательность по меньшей мере с 80%-й, предпочтительно 85, 90, 95 и 98%-й идентичностью после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID NO: 39; и легкую цепь, содержащую следующие три CDR, соответственно CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где
CDR-L1 содержит последовательность SEQ ID NO: 34 или последовательность по меньшей мере с 80%-й, предпочтительно 85, 90, 95 и 98%-й идентичностью после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID NO: 34; и
CDR-L2 содержит последовательность SEQ ID NO: 35 или последовательность по меньшей мере с 70%-й, предпочтительно 80, 85, 90, 95 и 98%-й идентичностью после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID NO: 35; и
CDR-L3 содержит последовательность SEQ ID NO: 36 или последовательность по меньшей мере с 80%-й, предпочтительно 85, 90, 95 и 98%-й идентичностью после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID NO: 36.
Последовательности CDR определены в соответствии с IMGT®, Kabat® или общепринятой системой нумерации, которая содержит последовательности, общие для IMGT® и Kabat® (смотри раздел Примеры). В табл. 1 показаны CDR антител по настоящему изобретению, в частности, антитела mDA10 Mab.
Таблица 1
Последовательности CDR для VH или VL антитела mD-A10 Mab
| SEQ ID NO: | Последов-ть no IMGT® | SEQ ID NO: | Последов-ть no Kabat® | SEQ ID NO: | Последов-ть (Общепринятая система нумерации) | |
| VL mD-A10 | ||||||
| CDRl | 34 | KSLLYSNGNT Y | 34K | RSSKSLLYSNGNTY LY | 34C | KSLLYSNGNTY |
| CDR2 | 35 | YMS | 35K | YMSNLAS | 35C | YMS |
| CDR3 | 36 | MQSLEYPFT | 36K | MQSLEYPFT | 36C | MQSLEYPFT |
| VHmD-A10 | ||||||
| CDRl | 37 | GFTFSGFW | 37K | GFWMS | 37C | GFW |
| CDR2 | 38 | INSDGSAI | 38K | DINSDGSAIKYAPSI KD | 38C | INSDGSAI |
| CDR3 | 39 | IAHYSGGGFA Y | 39K | HYSGGGFAY | 39C | HYSGGGFAY |
Согласно определению эти CDR содержат вариант CDR, полученный путем делеции, замены или добавления одной или более аминокислот, при этом указанный вариант сохраняет специфичность исходного CDR. Общепринятая система нумерации предлагает определение участка CDR как имеющего короткие аминокислотные последовательности или минимального CDR.
Антитела или фрагменты антител согласно настоящему изобретению ^нти-С^ антитела или
- 8 036368 фрагменты анти-СК8 антител) эффективно ингибируют инвазивную способность опухолевых клеток in vitro и эффективно ингибируют рост опухоли in vivo.
Антитела или фрагменты антител согласно настоящему изобретению Φ^ή-ΟΚ^ антитела или фрагменты анти-CK8 антител) эффективно индуцируют гибель ОЕЗ-экспрессирующих раковых клеток in vivo посредством опосредованного каспазой-3 апоптоза. В действительности, антитела или фрагменты антител согласно настоящему изобретению способны индуцировать in vivo расщепление каспазой-3, что является признаком активации апоптоза.
Антитела согласно настоящему изобретению предпочтительно представляют собой моноклональные антитела. Указанные моноклональные антитела могут представлять собой мышиные, химерные или гуманизированные антитела. Они могут быть получены стандартными способами, хорошо известными специалистам в данной области.
Моноклональные антитела, в частности, мышиного происхождения, могут быть получены в соответствии с методиками, описанными в руководстве Antibodies (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988), или получены из гибридом. Такие методики хорошо известны специалисту в данной области.
Альтернативно, моноклональные антитела согласно настоящему изобретению могут быть получены, например, из клеток животного, иммунизированного фрагментом человеческого белка CK8, содержащим пептид, имеющий SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, и последующего скрининга моноклональных антител на связывание с пептидом, имеющим SEQ ID NO: 29, путем картирования эпитопов.
Моноклональные антитела согласно изобретению могут быть, например, очищены на колонке для аффинной хроматографии с предварительно иммобилизованным фрагментом человеческого CK8, содержащим пептид с последовательностью SEQ ID NO: 29. Одновременно или последовательно могут быть использованы другие способы очистки, хорошо известные специалисту в данной области.
Химерные антитела могут быть получены с помощью методик генетической рекомбинации. Например, химерное антитело может быть получено посредством клонирования рекомбинантной ДНК, включающей в себя промотор и последовательность, кодирующую вариабельную область нечеловеческого, в частности, мышиного моноклонального антитела, и последовательность, кодирующую константную область человеческого антитела. Химерное антитело согласно изобретению, кодируемое таким рекомбинантным геном, будет представлять собой, например, человекомышиную конструкцию, причем специфичность этого антитела будет определяться вариабельной областью, происходящей из мышиной ДНК, а его изотипы - константной областью, происходящей из человеческой ДНК. Способы получения химерных антител подробно описаны в литературе.
Гуманизированные антитела могут быть получены с использованием методик, известных специалисту в данной области (таких как, например, описанные в документах Singer et al., J. Immun., 150:28442857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10:1-142, 1992 and Bebbington et al., Bio/Technology, 10:169-175, 1992). Специалисту в данной области также известны и другие методики получения гуманизированных антител, такие как, например, методика CDR-привития, описанная в патентах EP 0451261, EP 0682040, EP 0939127, EP 0566647 или патентах США 5530101, 6180370, 5585089 и 5693761. Также можно упомянуть патенты США 5639641 или еще 6054297, 5886152 и 5877293.
Для сведения к минимуму ответов анти-V области моноклональные гуманизированные антитела могут быть получены путем прививания на человеческие матрицы только определяющих специфичность остатков (SDR), то есть остатков, которые являются важными для комплементарности поверхностей Mab и его антигена. Исходя из этого, мышиные антитела могут быть гуманизированы путем прививания их определяющих комплементарность участков (CDR) на каркасные участки вариабельных областей легкой (VL) и вариабельных областей тяжелых (VH) цепей молекул иммуноглобулина человека, при этом сохраняя те остатки мышиных каркасных участков, которые могут быть важными для целостности антиге^объединяющего участка. Однако, поскольку ксеногенные CDR гуманизированных антител могут спровоцировать антиидиотипический (анти-Id) ответ у пациентов, гуманизированные антитела согласно изобретению или их фрагменты могут быть получены с использованием методик, сводящих к минимуму анти-Id ответ. Примеры таких методик включают прививание на человеческие каркасные участки только определяющих специфичность остатков (SDR), то есть остатков CDR, которые являются наиболее важными для взаимодействия антитело-лиганд. SDR идентифицируют с помощью баз данных трехмерных структур комплексов антиген-антитело известных структур или с помощью мутационного анализа антителообъединяющего участка. Альтернативный подход к гуманизации, который включает удерживание большего количества остатков CDR, основан на прививании укороченных CDR, то есть удлинений остатков CDR, которые включают все SDR.
Фрагменты антитела согласно настоящему изобретению могут быть получены из антител, описанных здесь, путем ферментативного расщепления, например, с помощью пепсина или папаина, и/или посредством расщепления дисульфидных мостиков в результате химического восстановления. Альтернативно, фрагменты антител согласно настоящему изобретению могут быть получены с применением методик генетической рекомбинации или посредством пептидного синтеза. Эти методы хорошо известны специалисту в данной области.
- 9 036368
Антитела или фрагменты антител согласно настоящему изобретению предпочтительно представляют собой антитела или фрагменты антител, выбранные из мышиных, химерных и гуманизированных антител, предпочтительно имеющих оптимизированную последовательность.
Выражение оптимизированная последовательность означает, в частности, что кодоны, кодирующие конститутивные аминокислоты представляющего интерес белка (например, вариабельные домены антитела), могут быть оптимизированы для лучшего распознавания трансляционным механизмом в заданном типе клеток. В этом отношении аминокислотная последовательность белка, кодируемого оптимизированной последовательностью, является идентичной неоптимизированной последовательности, но нуклеотидная последовательность отличается.
Антитела согласно настоящему изобретению или фрагменты этих антител, могут содержать SEQ ID NO: 31 или последовательность по меньшей мере с 80%-й, предпочтительно 85, 90, 95 и 98%-й идентичностью после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID NO: 31 и/или SEQ ID NO: 33, или последовательность по меньшей мере с 80%-й, предпочтительно 85, 90, 95 и 98%-й идентичностью после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID NO: 33.
Антитела согласно настоящему изобретению или фрагменты этих антител могут содержать вариабельные области, кодируемые полинуклеотидами, имеющими нуклеотидную последовательность мышиной вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 30) или последовательность по меньшей мере с 80%-й, предпочтительно 85, 90, 95 и 98%-й идентичностью после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID NO: 30, и/или нуклеотидную последовательность мышиной вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 32) или последовательность по меньшей мере с 80%-й, предпочтительно 85, 90, 95 и 98%-й идентичностью после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID NO: 32.
SEQ ID NO: 30 соответствует нуклеотидной последовательности мышиной вариабельной области легкой цепи антитела согласно настоящему изобретению (mD-A10 Mab с обозначениями FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 и CDR3 согласно IMGT®, представленными на фиг. 16).
SEQ ID NO: 31 соответствует аминокислотной последовательности мышиной вариабельной области легкой цепи антитела согласно настоящему изобретению (mD-A10 Mab с обозначениями FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 и CDR3 согласно IMGT®, представленными на фиг. 16).
SEQ ID NO: 32 соответствует нуклеотидной последовательности мышиной вариабельной области тяжелой цепи антитела согласно настоящему изобретению (mD-A10 Mab с обозначениями FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 и CDR3 согласно IMGT®, представленными на фиг. 17).
SEQ ID NO: 33 соответствует аминокислотной последовательности мышиной вариабельной области тяжелой цепи антитела согласно настоящему изобретению (mD-A10 Mab с обозначениями FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 и CDR3 согласно IMGT®, представленными на фиг. 17).
В некоторых вариантах осуществления антитело согласно настоящему изобретению представляет собой mD-A10 Mab.
Аминокислотные и нуклеотидные последовательности вариабельных областей легких цепей и тяжелых цепей mD-A10 Mab представлены в табл. 2.
Таблица 2
Кодификации последовательностей для CDR VH и CDR VL
| нуклеотидная последовательность mVL | нуклеотидная последовательность mVH | |
| АЮ | SEQ ID NO: 30 | SEQ ID NO: 32 |
| аминокислотная последовательность mVL | аминокислотная последовательность mVH | |
| D- А10 | SEQ ID NO: 31 | SEQ ID NO: 33 |
Антитела или фрагменты антител согласно настоящему изобретению представляют собой предпочтительно гуманизированные антитела или гуманизированные фрагменты антител.
Гуманизированные антитела согласно настоящему изобретению могут содержать тяжелую цепь, содержащую следующие три CDR, соответственно CDR-H1', CDR-H2' и CDR-H3', где:
CDR-H1' содержит последовательность SEQ ID NO: 40 или последовательность по меньшей мере с 80%-й, предпочтительно 85, 90, 95 и 98%-й идентичностью после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID NO: 40; и
CDR-H2' содержит последовательность SEQ ID NO: 41 или последовательность по меньшей мере с 80%-й, предпочтительно 85, 90, 95 и 98%-й идентичностью после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID NO: 41; и
CDR-H3' содержит последовательность SEQ ID NO: 39 или последовательность по меньшей мере с 80%-й, предпочтительно 85, 90, 95 и 98%-й идентичностью после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID NO: 39; и легкую цепь, содержащую следующие три CDR, соответственно CDR-L1', CDR-L2' и CDR-L3', где
CDR-L1' содержит последовательность SEQ ID NO: 42 или последовательность по меньшей мере с 80%-й, предпочтительно 85, 90, 95 и 98%-й идентичностью после оптимального выравнивания последо- 10 036368 вательности SEQ ID NO: 42; и
CDR-L'2 содержит последовательность SEQ ID NO: 35 или последовательность по меньшей мере с
70%-й, предпочтительно 80, 85, 90, 95 и 98%-й идентичностью после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID NO: 35; и
CDR-L'3 содержит последовательность SEQ ID NO: 36 или последовательность по меньшей мере с 80%, предпочтительно 85, 90, 95 и 98%-й идентичностью после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID NO: 36.
Последовательности CDR гуманизированных антител согласно настоящему изобретению, в частности Hz-DA-10 Mab, приведены здесь в табл. 3 ниже.
Таблица 3
Последовательности CDR для VH и VL Hz DA-10 Mab
| SEQ ID NO: | Последов-ть no IMGT® | SEQ ID NO: | Последовательность no Kabat® | SEQ ID NO: | Последов-ть (общепринятая система нумерации) | |
| HzVHD-A10 | ||||||
| CDR1 | 40 | GFTFSSYW | 40K | SYWMS | 40C | SYW |
| CDR2 | 41 | INSDGSST | 41K | DINSDGSSTKYAPSIKD | 41C | INSDGSST |
| CDR3 | 39 | IAHYSGGGFAY | 39K | HYSGGGFAY | 39C | HYSGGGFAY |
| HzVLD-A10 | ||||||
| CDR1 | 42 | KSLLYSNGYNY | 42K | RS SKSLLYSNGYNYLY | 42C | KSLLYSNGYNY |
| CDR2 | 35 | YMS | 35K | YMSNLAS | 35C | YMS |
| CDR3 | 36 | MQSLEYPFT | 36K | MQSLEYPFT | 36C | MQSLEYPFT |
Гуманизированные антитела согласно настоящему изобретению или фрагменты этих антител могут содержать SEQ ID NO: 43 или последовательность по меньшей мере с 80%-й, предпочтительно 85, 90, 95 и 98%-й идентичностью после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID NO: 43, и/или SEQ ID NO: 44 или последовательность по меньшей мере с 80%-ной, предпочтительно 85, 90, 95 и 98%ной идентичностью после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID NO: 44.
Гуманизированные антитела или фрагменты антител согласно настоящему изобретению могут содержать вариабельные области, кодируемые полинуклеотидами, имеющими нуклеотидную последовательность мышиной вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 45) или последовательность по меньшей мере с 80%-й, предпочтительно 85, 90, 95 и 98%-й идентичностью после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID NO: 45, и/или нуклеотидную последовательность мышиной вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 46) или последовательность по меньшей мере с 80%-й, предпочтительно 85, 90, 95 и 98%-й идентичностью после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID NO: 46.
SEQ ID NO: 45 соответствует нуклеотидной последовательности гуманизированной вариабельной области тяжелой цепи антитела согласно настоящему изобретению (Hz D-A10 Mab с обозначениями FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 и CDR3 согласно IMGT®, представленными на фиг. 18).
SEQ ID NO: 46 соответствует нуклеотидной последовательности гуманизированной вариабельной области легкой цепи антитела согласно настоящему изобретению (Hz D-A10 Mab с обозначениями FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 и CDR3 согласно IMGT®, представленными на фиг. 18).
SEQ ID NO: 43 соответствует аминокислотной последовательности гуманизированной вариабельной области легкой цепи антитела согласно настоящему изобретению (Hz D-A10 Mab с обозначениями FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 и CDR3 согласно IMGT®, представленными на фиг. 19).
SEQ ID NO: 44 соответствует аминокислотной последовательности гуманизированной вариабельной области тяжелой цепи антитела согласно настоящему изобретению (Hz D-A10 Mab с обозначениями FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 и CDR3 согласно IMGT®, представленными на фиг. 19).
Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельных областей легкой цепи и тяжелой цепи Hz D-A10 Mab представлены в табл. 4.
Таблица 4
Кодификация последовательностей для CDR VH или CDR VL Hz D-A10 Mab
| нуклеотидная последовательность VL | нуклеотидная последовательность VH | |
| Hz D- A10 | SEQ ID NO: 46 | SEQ ID NO: 45 |
| аминокислотная последовательность VL | аминокислотная последовательность VH | |
| Hz D- A10 | SEQ ID NO: 44 | SEQ ID NO: 43 |
Фрагмент антитела согласно настоящему изобретению может представлять собой фрагмент F(ab')2, Fab, Fv или ScFv.
Антитела или фрагменты антител согласно настоящему изобретению эффективно ингибируют инвазивную способность опухолевых клеток in vitro и эффективно ингибируют рост опухоли in vivo. В частности, авторы изобретения показали, что mD-A10 Mab эффективно ингибирует инвазивную способность клеток Isreco-1 in vitro (фиг. 4) и эффективно ингибирует рост опухолевых клеток Isreco 1 и HCT116 у мышей (фиг. 7-10). В частности, авторы изобретения показали, что mD-A10 Mab ингибирует
- 11 036368 инвазивную способность клеток Isreco-1 in vitro, тогда как антитело mD-D6 не имеет эффекта. Эта антагонистическая активность также наблюдалась у антитела M20 (фиг. 4). In vivo только антитело mD-A10 или M20 также контролирует рост опухоли.
Во время апоптоза клетки подвергаются значительным изменениям в морфологии, отчасти вследствие полной реорганизации их цитоплазматических и ядерных цитоскелетных структур. Этот процесс разрушения хорошо скоординирован и включает постепенную активацию каспаз. Некоторые из цитоскелетных компонентов сохраняют функцию во время различных стадий апоптоза и поэтому являются только деассемблированными на более поздних стадиях процесса. Так как во время раннего апоптоза прокаспазы-3 и -9 являются специфически нацеленными на сеть промежуточных микрофиламентов CK8/18, это может объяснять быстрое разрушение цитокератинового каркаса во время апоптоза.
Авторы изобретения показали, что антитело mD-A10 или M20 проявляет эффект против роста опухоли посредством другого молекулярного механизма. Активацию каспазы 3, которая указывает на эффективность апоптоза, анализировали в опухолях, полученных у мышей, не подвергнутых лечению (NT), и у мышей, подвергнутых лечению mD-A10, M20 или mD-D6. Опухоли, анализируемые в этом эксперименте, представляли собой опухоли, которые были получены и подвергнуты анализу в эксперименте, представленном на фиг. 7. В конце периода лечения (53 дня) опухоли собирали, фиксировали в забуференном формалине и заливали в парафин. Срезы тканей подвергали иммуногистохимическим анализам с использованием кроличьих моноклональных антител против расщепленной формы каспазы-3 (фиг. 6B). Для каждой опухоли подсчитывали число клеток, позитивных по активированной каспазе-3, на поверхности площадью 2 мм2. Как показано на фиг. 6A, число клеток, позитивных по активированной каспазе-3 значительно более высокое в опухолях от животных, получавших mD-A10 Mab, по сравнению с животными, не подвергнутыми лечению, и животными, получавшими M20 или mD-D6.
Этот результат ясно показывает, что mD-A10 Mab способно индуцировать расщепление каспазы-3, связанное с апоптозом Isreco-1 in vivo, тогда как M20 и mD-D6 не проявляют этой способности. Эти результаты демонстрируют, что M20 и mD-A10 Mab проявляют свой эффект против роста опухоли посредством особого механизма. Механизм действия mD-A10 Mab основан на индукции апоптоза посредством расщепления каспазой-3. Схожего эффекта в присутствии M20 не наблюдалось.
Таким образом, в некоторых аспектах настоящее изобретение относится к антителу или фрагменту антитела, проявляющему специфическую агонистическую активность в отношении зависимого от каспазы-3 клеточного апоптоза и специфическую антагонистическую активность в отношении клеточной инвазии. Таким образом, это может быть использовано для лечения заболеваний, в которые вовлечен CK8.
Несмотря на то, что оба mD-A10 Mab и M20 распознают человеческий белок CK8 и обладают антагонистическими свойствами, было показано, что mD-A10 Mab и M20 не распознают один и тот же эпитоп (фиг. 2, 3, 12). В действительности, M20 специфически распознает пептиды, имеющие последовательность, соответствующую аминокислотам в положениях с 338 по 366 человеческого CK8 (SEQ ID NO: 1) или в положениях с 345 по 366 человеческого CK8 (SEQ ID NO: 17), но не детектирует пептиды, имеющие последовательность, соответствующую аминокислотам в положениях с 338 по 357 человеческого белка CK8 (SEQ ID NO: 2), или последовательность, соответствующую аминокислотам в положениях с 358 по 366 человеческого белка CK8 (SEQ ID NO: 3), или последовательность, соответствующую аминокислотам в положении с 354 по 366 человеческого белка CK8 (SEQ ID NO: 4), тогда как mD-A10 распознает пептид, имеющий последовательность, соответствующую аминокислотам в положении с 338 по 366 человеческого CK8 (SEQ ID NO: 1), пептид, имеющий последовательность, соответствующую аминокислотам в положении с 354 по 366 человеческого CK8 (SEQ ID NO: 4), или пептид, имеющий последовательность, соответствующую аминокислотам в положении с 345 по 366 человеческого CK8 (SEQ ID NO: 17), и не детектирует пептиды, имеющие последовательность, соответствующую аминокислотам в положении с 338 по 357 человеческого CK8 (SEQ ID NO: 2), или последовательность, соответствующую аминокислотам в положении с 358 по 366 человеческого CK8 (SEQ ID NO: 3) (фиг. 12).
Кроме того, детекция с использованием проточной цитометрии (фиг. 2) или вестерн-блоттинга (фиг. 3) изоформ человеческого белка CK8 с помощью антитела M20 не ингибируется ни пептидом, имеющим последовательность, соответствующую аминокислотам в положении с 338 по 366 человеческого CK8 (SEQ ID NO: 1), ни пептидом, имеющим последовательность, соответствующую аминокислотам в положении с 338 по 357 человеческого CK8 (SEQ ID NO: 2), тогда как детекция изоформ человеческого CK8 с помощью mD-A10 Mab сильно ингибируется пептидом, имеющим последовательность согласно SEQ ID NO: 1, но не пептидом, имеющим последовательность согласно SEQ ID NO: 2, и детекция MAb D-D6 ингибируется обоими пептидами, имеющими последовательность согласно SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2.
Расположение пептидов (SEQ ID NO: 1), 2 (SEQ ID NO: 2), 3 (SEQ ID NO: 3) и 4 (SEQ ID NO: 4) в последовательности человеческого цитокератина-8 (ref.: Uni-ProtKB P05787) представлено на фиг. 11.
На фиг. 13A описывает реактивность mD-A10 Mab в отношении анти-СК8 пептидов, ограниченных на N- и C-концах (пептид 1, пептид с 5 по 28, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 - SEQ ID NO: 28). Антитело mD-A10 Mab связывается с пептидами 1, 5, 11-23.
Лейцин в положении 353 пептида 11 является важным для распознавания антителом. Фактически,
- 12 036368 связывание mD-A10 Mab с пептидом 10 почти отсутствует по сравнению с пептидом 11. Лейцин в положении 360 пептида 23 является важным для распознавания антителом. Фактически, связывание mD-A10 Mab с пептидом 24 почти отсутствует по сравнению с пептидом 23. Важное присутствие лейцинов в положениях 353 и 360 последовательности эпитопа подтверждается неконкурентностью пептидов 10 (SEQ ID NO: 10) и 24 (SEQ ID NO: 24) в отношении распознавания mD-A10 Mab по данным ELISA (фиг. 14 и 15), когда указанная конкуренция осуществляется с BSA-конъюгированным пептидом 1 или пептидом 17 соответственно. Эпитоп, распознаваемый mD-A10 Mab, разработан, таким образом, в виде последовательности из 8-ми аминокислот LSELEAAL, соответствующей аминокислотам в положениях с 353 по 360 (SEQ ID NO: 29). Как показано на фиг. 13B наблюдается профиль M20, отличающийся от mD-A10 Mab. Напротив, очевидно, что антитело M20 не распознает эпитоп LSELEAAL.
В табл. 8 представлен набор аминокислотных последовательностей, а также распознавание, или низкое распознавание, или отсутствие распознавания пептидов с 5 по 28 (с SEQ ID NO: 5 по SEQ ID NO: 28) антителом mD-A10 Mab.
Также настоящее изобретение относится к антителу или фрагменту антитела, специфически связывающемуся с пептидом, имеющим последовательность, соответствующую аминокислотам в положениях с 353 по 360 человеческого белка CK8, то есть специфически связывающемуся с пептидом, имеющим последовательность, показанную в SEQ ID NO: 29, для применения в лечении опухолей, клетки которых экспрессируют на своей поверхности белок CK8, в частности клетки, которые экспрессируют на своей поверхности пептид с последовательностью согласно SEQ ID NO: 29. Антитело или фрагменты антител могут быть такими, как описано выше.
В частности, антитело или фрагменты антител согласно настоящему изобретению можно применять для лечения колоректального рака, рака яичников, рака молочной железы, рака легких, рака яичка, рака поджелудочной железы, рака нервной системы, рака лимфатических узлов, рака почек и/или рака головы и шеи. Колоректальный рак, рак яичников, рак молочной железы, рак легких, рак яичка, рак поджелудочной железы, рак нервной системы, рак лимфатических узлов, рак почек и/или рак головы и шеи характеризуются присутствием опухолевых клеток, экспрессирующих на своей поверхности белок CK8. В частности, антитела или фрагменты антител согласно настоящему изобретению можно применять для лечения инвазивного и/или метастатического колоректального рака, рака яичников, рака молочной железы, рака легких, рака яичка, рака поджелудочной железы, рака нервной системы, рака лимфатических узлов, рака почек и/или рака головы и шеи.
Предпочтительно антитела или фрагменты антитела, применяющиеся терапевтически, представляют собой гуманизированные антитела.
Пептиды и их применение.
Изобретение также относится к антигенному пептиду человеческого CK8, состоящему из полипептида, имеющего от 8 до 16 аминокислот и содержащего последовательность, представленную в SEQ ID NO: 29. В частности, изобретение относится антигенному пептиду человеческого CK8, состоящему из последовательности согласно SEQ ID NO: 29.
Такой пептид можно применять в качестве терапевтического агента, в частности, в вакцине.
Изобретение также относится к набору, включающему контейнер, содержащий молекулу, специфически связывающуюся с указанным пептидом. Набор, в частности, можно применять для обнаружения рака, в частности рака, характеризующегося присутствием опухолевых клеток, экспрессирующих на своей поверхности белок CK8, например, таких, которые описаны выше.
Полинуклеотиды.
Изобретение также относится к полинуклеотидам, кодирующим пептид, полученный из человеческого CK8, имеющий последовательность, соответствующую аминокислотам в положениях с 353 по 360 человеческого белка CK8 (SEQ ID NO: 29). Предпочтительно полинуклеотиды согласно изобретению относятся к ДНК-типу, в частности типу двухцепочечной ДНК. Термин полинуклеотид также относится к модифицированным полинуклеотидам.
Полинуклеотиды согласно настоящему изобретению выделяют или очищают из их природного окружения. Предпочтительно полинуклеотиды согласно настоящему изобретению получают с помощью общепринятых методов молекулярной биологии, описанных Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989), или путем химического синтеза.
Изобретение также относится к полинуклеотидам, кодирующим вариабельные области mD-A10 Mab, имеющим нуклеотидную последовательность мышиной вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 30) и нуклеотидную последовательность мышиной вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 32). Таким образом, настоящее изобретение также относится к полинуклеотидам, которые включают одну из следующих последовательностей: SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 или последовательности по меньшей мере с 80%-й, предпочтительно 85, 90, 95 и 98%-й идентичностью после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID NO: 30 или SEQ ID NO: 32.
Изобретение также относится к полинуклеотидам, кодирующим вариабельные области Hz DA-10 Mab, имеющим нуклеотидную последовательность гуманизированной вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 46) и нуклеотидную последовательность гуманизированной вариабельной области тяжелой
- 13 036368 цепи (SEQ ID NO: 45). Таким образом, настоящее изобретение также относится к полинуклеотидам, которые включают одну из следующих последовательностей: SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 или последовательности по меньшей мере с 80%-й, предпочтительно 85, 90, 95 и 98%-й идентичностью после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID NO: 45 или SEQ ID NO: 46.
Фармацевтические композиции.
Изобретение также относится к фармацевтической композиции или набору, содержащему антитело или фрагменты антитела согласно настоящему изобретению. Антитело или фрагменты антитела могут быть такими, как описано выше. В частности, антитело или фрагмент антитела представляет собой Fv, Fab, F(ab')2, scFv, антитело, предпочтительно моноклональное антитело.
Фармацевтические композиции могут содержать антитело или фрагмент антитела и подходящий фармацевтический носитель. Примеры подходящего фармацевтического носителя включают растворители, желатин, крахмал, лактозу, стеарат магния, тальк, аравийскую камедь или аналоги. Композиции могут, кроме того, содержать диспергирующие агенты, смачивающие агенты, суспендирующие агенты, солюбилизаторы, стабилизаторы, консерванты, усилители вкуса и/или подсластители.
Набор может включать контейнер, содержащий антитело или фрагменты антитела согласно настоящему изобретению.
Набор, в частности, может быть использован для обнаружения рака, в частности рака, характеризующегося присутствием опухолевых клеток, экспрессирующих на своей поверхности белок CK8, таких, как описанные выше.
Композиции могут быть составлены для введения млекопитающим, в частности человеку. Они могут быть составлены для перорального, сублингвального, подкожного, внутримышечного, внутривенного, трансдермального, местного или ректального введения. Таким образом, композиции могут быть обеспечены во всех подходящих формах в зависимости от желательных способов введения. Таким образом, они могут быть представлены в форме перорального или инъецируемого раствора или жидкой суспензии, или в твердой или полутвердой форме, в форме порошков, таблеток, мягких капсул, гранул, таблеток с сахарной оболочкой, твердых капсул, спреев, саше, пилюль, пластинок или паст. Доза варьирует в зависимости от терапии и заболевания, подлежащего лечению.
Композиции или наборы, кроме того, могут содержать еще одно антитело и/или еще одно противораковое лекарственное средство.
Изобретение также относится к фармацевтической композиции согласно изобретению, предназначенной для применения в лечении или предупреждении рака, аутоиммунного заболевания, воспалительного состояния, вирусной инфекции или вирусного заболевания и/или в качестве лекарственного средства для индукции апоптоза опухолевой клетки.
Также изобретение относится к способу лечения или предупреждения рака, аутоиммунного заболевания, воспалительного состояния, вирусной инфекции или вирусного заболевания и/или способу индукции апоптоза опухолевой клетки, включающему введение млекопитающему, включая человека, эффективного количества антитела или фрагмента антитела согласно настоящему изобретению.
Рак, в частности, характеризуется присутствием опухолевых клеток, экспрессирующих на своей поверхности белок CK8, таких, как описанные выше.
Изобретение также относится к композициям вакцин, содержащим пептид согласно настоящему изобретению и подходящий адъювант. В вакцинах адъюванты определяются как вещества, способные потенцировать или модулировать иммунный ответ против одного или нескольких совместно вводимых антигенов. Вакцины обычно вводят путем инъекции, но могут быть введены перорально или путем назального распыления.
Изобретение относится к фармацевтическим или вакцинным композициям для предупреждения и/или лечения опухолей, клетки которых экспрессируют белок CK8 на своей поверхности, в частности, колоректального рака, рака яичников, рака молочной железы, рака легких, рака яичка, рака поджелудочной железы, рака нервной системы, рака лимфатических узлов, рака почек и/или рака головы и шеи.
Изобретение также относится к способам терапевтического лечения и/или предупреждения опухолей, клетки которых экспрессируют на своей поверхности белок CK8, в частности, колоректального рака, рака яичников, рака молочной железы, рака легких, рака яичка, рака поджелудочной железы, рака нервной системы, рака лимфатических узлов, рака почек и/или рака головы и шеи, включающим введение индивидууму, нуждающемуся в этом, эффективного количества антитела или фрагмента антитела согласно настоящему изобретению. Изобретение относится к способам лечения рака посредством индукции гибели ОН8-экспрессирующих раковых клеток, в частности, путем индукции апоптоза экспрессирующих CK8 раковых клеток путем введения индивидууму, нуждающемуся в этом, эффективного количества антитела или фрагмента антитела согласно настоящему изобретению. Антитело или фрагмент антитела может быть таким, как описано выше.
Изобретение относится к применению антител или фрагмента антитела согласно настоящему изобретению для изготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения или предупреждения развития опухолей, клетки которых экспрессируют на своей поверхности белок CK8, в частности, колоректального рака, рака яичников, рака молочной железы, рака легких, рака яичка, рака поджелудоч- 14 036368 ной железы, рака нервной системы, рака лимфатических узлов, рака почек и/или рака головы и шеи.
Примеры.
Антитело M20, на которое делается обращение ниже, представляет собой коммерчески доступное антитело C5301 (Sigma), и антитело 1E8 представляет собой коммерчески доступное антитело ab28050 (abcam).
Получение анти-CK8 антитела.
Мышиные моноклональные антитела, специфические в отношении CK8, получали с использованием стандартных гибридомных технологий (Zola et al., Aust J. Exp Biol Med Sci. 1981; 59:303-6). Синтезировали два пептида CK8, которые использовали для иммунизации мышей. Последовательности пептидов представляют собой следующие:
Пептид 1: AEQRGELAIKDANAKLSELEAALQRAKQD-C (SEQ ID NO: 1)
Пептид 2: AEQRGELAIKDANAKLSELE-C (SEQ ID NO: 2)
Иммунизацию выполняли на трех мышах OF1 с использованием смеси пептидов 1 и 2, конъюгированных с гемоцианином морского блюдечка (KLH). Были отобраны селезенки мышей, сыворотка которых была позитивной в отношении CK8 по результатам детекции методом ELISA. Спленоциты подвергали слиянию с мышиной линией клеток миеломы X63-Ag8.653. Супернатанты гибридом подвергали скринингу на связывание с CK8 с помощью ELISA и иммунофлуоресцентного окрашивания клеток на ОЕ^-позитивные клеточные линии. После клонирования гибридом получали два мышиных антитела (Mabs), названных mD-A10 и mD-D6. Клон D-A10 или D-D6 инъецировали в перитонеальную полость безтимусных мышей. Асцитическую жидкость очищали аффинной хроматографией на колонке с белком A, а затем IgG элюировали при кислом рН, после чего переносили в PBS. После концентрирования раствор PBS, содержащий IgG, фильтровали, и концентрацию Mab определяли при длине волны 280 нм.
Клеточные линии.
Клетки верифицированного рака толстой кишки человека (CC) Isreco-1, Isreco-2, Isreco-3, HCT116+/+, HCT116-/- или HT29 (CLB) выращивали в среде Игла, модифицированной по способу Дульбекко (Sigma, St Quentin Fallavier, France), дополненной инактивированной нагреванием 10%-й фетальной бычьей сывороткой (FBS) (Sigma, St Quentin Fallavier, France), 4 нМ L-глутамина (Sigma, St Quentin Fallavier, France) и 50 ед./мл, 50 мкг/мл пенициллина-стрептомицина (Sigma, St Quentin Fallavier, France).
Клетки верифицированной аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 (ATCC) выращивали в минимальной эссенциальной среде Игла (Sigma, St Quentin Fallavier, France), дополненной инактивированной нагреванием 10%-й фетальной бычьей сывороткой (FBS), (Sigma, St Quentin Fallavier, France), 2 нМ L-глутамина (Sigma, St Quentin Fallavier, France) и 100 ед./мл, 100 мкг/мл пенициллинастрептомицина (Sigma, St Quentin Fallavier, France).
Лейкозные клетки верифицированного человеческого лейкоза из B-клеток-предшественников Nalm-6 (DSMZ), клетки лимфомы Беркитта человека Raji (ECACC), неходжкинской лимфомы человека RL (DSMZ), гистиоцитарной лимфомы U937 (ECACC), клетки острого лимфобластного лейкоза человека Cem (DSMZ), лейкозные клетки верифицированного острого лимфобластного лейкоза человека Molt4 (DSMZ), человеческие плазматические клетки Fravel (ECACC) выращивали в среде RPMI-1640 (Sigma, St Quentin Fallavier, France), дополненной инактивированной нагреванием 10%-й фетальной бычьей сывороткой (FBS), (Sigma, St Quentin Fallavier, France), 4 нМ L-глутамина (Sigma, St Quentin Fallavier, France) и 100 ед./мл, 100 мкг/мл пенициллина-стрептомицина (Sigma, St Quentin Fallavier, France).
Мечение клеток антителами, анализируемое с помощью проточной цитометрии.
Клеточную экспрессию CK8 на клеточной поверхности анализировали с помощью проточной цитометрии. Вкратце, 2x105 клеток на 96-лунок инкубировали с разведением неконъюгированного антиCK8 мышиного Mab при 10 мкг/мл, затем разбавляли в соотношении 1/10. Несвязанные антитела удаляли, осуществляя промывку с помощью PBS (Invitrogen, Villebon sur Yvette, France), дополненным 1%-м бычьим сывороточным альбумином (Sigma, St Quentin Fallavier, France). Затем клетки центрифугировали (5 мин при 400 г) и связанное антитело детектировали с помощью флуоресцеинизотиоцианат (FITC)конъюгированного козьего (Fab')2 поликлонального антимышиного антитела (MP Biomedical, Illkirch, France) при 4°C в течение 30 мин. Реагент для детекции удаляли путем промывания и клетки центрифугировали (5 мин при 400 г) и суспендировали в 300 мкл PBS. Связанное детектируемое антитело количественно оценивали на FACS CAN (BD Biosciences, Rungis, France), (канал FL1, 2000 событий на запрашивание).
Результаты экспериментов показаны в табл. 5 с концентрацией MAb 5 мкг/мл. Различные раковые клеточные линии, такие как клеточные линии рака толстой кишки или молочной железы, экспрессировали CK8. Экспрессии не наблюдалось в клетках лимфомы или лейкоза.
- 15 036368
Таблица 5
Клеточная реактивность MAb на линиях клеток человека
| Название линии клеток | Тип линии клеток | 1Е8 | М20 | D-D6 | D-A10 | ||||
| % | IFM | % | IFM | % | IFM | % | IFM | ||
| ISRECO-1 | Карцинома толстой кишки человека | 45+/-18 | 562+/-144 | 50+/-11 | 553+/-69 | 50+/-7 | 421+/-32 | 47+/-7 | 421+/-46 |
| ISRECO-2 | Карцинома толстой кишки человека | 23+/-0 | 424+/-28 | 26+/-0 | 473+/-30 | 44+/-26 | 317+/80 | 43+/-27 | 323+/-89 |
| ISRECO-3 | Карцинома толстой кишки человека | 41+/-6 | 402+/-105 | 33+/-6 | 541+/-13 | 43+/-3 | 340+/-40 | 42+/-4 | 351+/-21 |
| нет 116+/+ | Карцинома толстой кишки человека | 35+/-14 | 554+/-62 | 29+/-11 | 527+/-64 | 44+/-19 | 356+/-1 | 36+/-21 | 396+/-16 |
| нет 116-/- | Карцинома толстой кишки человека | 38+/-11 | 530+/-52 | 28+/-10 | 517+/-5 9 | 32+/-6 | 385+/-13 | 33+/-2 | 411+/-11 |
| НТ29 | Аденокарцинома толстой кишки человека | 30+/-7 | 418+/-11 | 17+/-9 | 497+/-52 | 28+/-13 | 365+/-15 | 27+/-13 | 361+/-3 |
| MCF-7 | Карцинома молочной железы | 52+/-1 | 462+/-1 | 66+/-17 | 476+/-10 | 51+/-23 | 388+/-13 | 50+/-23 | 397+/-30 |
| Nalm6 | Лейкоз человека из В-клетокпредшественников | 0+/0 | - | 0+/-0 | - | 0+/0 | - | 0+/-0 | - |
| Raji | Лимфома Беркитта человека | 0+/0 | - | 0+/-0 | - | 0+/0 | - | 0+/-0 | - |
| RL | Неходжкинская лимфома из Вклеток человека | 0+/0 | - | 0+/-0 | - | 0+/0 | - | 0+/-0 | - |
| U937 | Г истиоцитарная лимфома человека | 0+/-0 | - | 0+/-0 | - | 0+/-0 | - | 0+/-0 | - |
| Cem | Острый лимфобластный лейкоз человека | 0+/-0 | - | 0+/-0 | - | 0+/-0 | - | 0+/-0 | - |
| Molt4 | Острый лимфобластный лейкоз человека | 0+/-0 | - | 0+/-0 | - | 0+/-0 | - | 0+/-0 | - |
| Fravel | П лазматиче ски е клетки человека | 0+/0 | - | 0+/-0 | - | 0+/0 | - | 0+/-0 | - |
| PBMNC | Лимфоциты | 0+/-0 | - | 0+/-0 | - | 0+/-0 | - | 0+/-0 | - |
Эксперименты по конкурентному связыванию Mab с помощью проточной цитометрии.
2x105 клеток Isreco-1 на 96-лунок инкубировали с биотинилированным анти-CK8 антителом (12,5 мкг/мл) с пептидом 1 или пептидом 2, или без них, тестируемых при различных концентрациях, и инкубировали при 4°C в течение 30 мин. Несвязанные антитела удаляли, осуществляя промывку с помощью PBS (Invitrogen, Villebon sur Yvette, France), дополненного 1%-м бычьим сывороточным альбумином (Sigma, St Quentin Fallavier, France). Затем клетки центрифугировали (5 мин при 400 г) и связанные антитела детектировали с помощью фикоэритрин-конъюгированного стрептавидина (Interchim, Montlucon, France) при 4°C в течение 30 мин. Реагент для детекции удаляли путем промывки и клетки центрифугировали (5 мин при 400 г) и суспендировали в 300 мкл PBS. Связанное детектируемое антитело количественно оценивали на FACS CAN (BD Biosciences, Rungis, France), (FL2 канал, 2 000 событий на запрашивание). Во время эксперимента включали соответствующие контроли изотипа для исключения любых событий неспецифического связывания. Результаты экспериментов показаны на фиг. 2. Присутствие пептида 1 ингибирует мечение клеток антителом mD-D6 или mD-A10 Mab без какого-либо значительного воздействия на окрашивание клеток M20 Mab.
Детекция изоформ белка CK8 с помощью вестерн-блоттинга.
Различные изоформы, а также их установленные молекулярные массы (кДа) и соответствующие аминокислотные последовательности, показаны в табл. 6.
Таблица 6
Описание различных изоформ CK8
| Белковые формы СК8 | Предполагаемая ММ (кДа) | Соответствующая последовательность (АА) |
| Е’ (более длинная форма, Nконцевые удлинения) | 57 | 1-511 |
| Е (полная) | 54 | 1-483 |
| I (неопределенная) | 51,49,48, 47, 46 | ? |
| С (расщепленная на С-конце) | 43 | Предполагаемая 1-393 |
E - полная форма CK8, I - неопределенная изоформа CK8, C - укороченная с C-конца изоформа CK8.
В экспериментах, проводимых с помощью вестерн-блоттинга (WB), 5 мкг белков из лизата клеток колоректального рака разделяли с помощью SDS-PAGE и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану насыщали раствором TBS-T (Tris-HCl 20 мМ, рН 7, NaCl 130 мМ, Tween 20 при 0,1%), содержащим 5% молока, затем инкубировали с различными анти-CK8 антителами, разбавленными в растворе TBS-T, содержащем 2,5% молока. Антитела M20 (50 мкг/мл), 1E8 (1/500), mD-A10 (1 мкг/мл) или mD-D6 (1 мкг/мл) инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с мембраной. Первичные антитела выявляли с помощью антимышиного вторичного антитела, конъюгированного с пероксидазой хрена (HRP) (ab97040), (Abcam, France). Результаты показаны на фиг. 1. Изоформы белка CK8 детектировали по-разному в зависимости от тестируемого анти-CK8 антитела. Полноразмерную форму белка CK8 (CK8-E) детектировали с использованием всех антител. Укороченную с C-конца форму белка CK8 (CK8С) детектировали в высокой степени только с помощью антитела mD-A10 и в слабой степени с помощью антитела M20. Антитело 1E8 или mD-D6 Mab не распознает форму CK8-C. Эти результаты ясно демон- 16 036368 стрируют, что mD-A10 Mab проявляет специфический профиль реактивности против различных изоформ
CK8 по сравнению с другими тестируемыми антителами против CK8.
Конкурентный вестерн-блот-анализ с пептидами CK8.
Для проведения экспериментов по конкурентному связыванию антитело M20 (1 мкг/мл) или мышиные моноклональные антитела, такие как mD-A10 (1 мкг/мл) или mD-D6 (1 мкг/мл), предварительно инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре с пептидом 1 или пептидом 2 при молекулярном соотношении 1/100 (одна молекула антитела на 100 молекул пептида) в растворе TBS-T. Затем смесь антитело-пептид приводили в контакт с мембранами в растворе TBS-T, содержащем 2,5% молока, в течение 1 ч для детекции с помощью антимышиного вторичного антитела, связанного с HRP. Результаты показаны на фиг. 3. Присутствие пептида 2 уменьшает распознавание всех изоформ CK8 антителом mDD6 Mab и не препятствует распознаванию изоформ CK8 антителом M20 и антителом mD-A10 Mab. Напротив, присутствие пептида 1 сильно уменьшает распознавание всех изоформ CK8 антителами mD-A10 и mD-D6 Mabs, при этом не препятствует распознаванию изоформ CK8 антителом M20.
Эффект мышиного моноклонального антитела D-A10 на инвазивные способности клеток колоректального рака Isreco-1: анализ in cellulo инвазивных способностей раковых клеток путем измерения в режиме реального времени импеданса клеток (система xCELLigence-ACEA Biosciences™).
Прибор для измерения в режиме реального времени xCELLigence (ACEA Biosciences™) основан на величине импеданса, которая пропорциональна фиксации клеток на микроэлектродах. Систему использовали для оценки инвазивных способностей клеток в системе RTCA DP. В этой системе используются планшеты CIM, содержащие 16 лунок. Лунки состоят из нижней и верхней камер. Верхняя камера соединяется с нижней камерой посредством пор с диаметром 8 мкМ, которые расположены над микроэлектродами. При оценке инвазивных способностей клеток Isreco-1 нижняя камера содержит культуральную среду, дополненную 10%-й фетальной бычьей сывороткой (FBS). Клетки Isreco-1 (20 000 клеток) в присутствии культуральной среды без FBS помещали в верхнюю камеру, содержащую или не содержащую инти-СК8 антитело (M20, mD-A10 или mD-D6 при 50 мкг/мл). Дно этой верхней камеры предварительно покрывали слоем матригеля (Matrigel™, BD biosciences). Во время инвазивного процесса клетки притягивались градиентом FBS, установившимся между нижней и верхней камерами, разложение матригеля позволяло клеткам мигрировать через поры и контактировать с микроэлектродами нижней камеры. Показатель импеданса, генерированного клеточным контактом, измеряли каждые 15 мин в течение 70 ч и записывали с помощью компьютера, соединенного с системой RTCA DP. Результаты тестирования инвазивных способностей клеток представлены на фиг. 4. Процент ингибирования инвазивных способностей клеток Isreco-1 представлен со стандартным отклонением, соответствующим 3 независимым экспериментам. Значительное ингибирование инициированных FBS инвазивных способностей клеток Isreco-1 наблюдали в присутствии антитела M20 или mD-A10, при этом какое-либо воздействие в присутствии mD-D6 отсутствовало.
Анализ на жизнеспособность клеток путем измерения уровней аденозинтрифосфата (ATP).
Люминесцентный анализ жизнеспособности клеток CellTiter-Glo® (Promega, Charbonnieres les Bains, France) использовали для определения количества жизнеспособных клеток в культуре на основе количественной оценки присутствующего ATP в качестве индикатора метаболически активных клеток. Детекция основана на использовании реакции фермента люциферазы для измерения содержания ATP, которое соответствует количеству жизнеспособных клеток. Через несколько минут после утраты целостности мембраны клетки утрачивали способность синтезировать ATP и эндогенные АТФазы разрушали любой оставшийся ATP; таким образом, уровни ATP стремительно падали. Клеточные культуры (5х 104 клеток/мл) инкубировали в течение 72 ч отдельно или в присутствии антител (B-Z1, B-E4, M20, 1E8, DD6, D-A10), тестировали при 10 мкг/мл, а затем разбавляли в соотношении 1/10 (фиг. 5). Контроль изотипа Mabs (IgG1-B-Z1, IgG2a-B-E4) получали от фирмы Diaclone (Besancon, France). Реагент CellTiterGlo® добавляли непосредственно в клетки, содержащиеся в культуре, в соотношении 50 мкл реагента к 200 мкл культуральной среды. Аналитические планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин и биолюминесцентный сигнал записывали с помощью стандартного мультилуночного флуориметра Mithras LB940 (Berthold, Thoiry, France). Результаты показаны на фиг. 5. Только антитело Mab 1E8 против CK8 ингибирует пролиферацию клеток Isreco-1.
Количественное определение накопления клеток, позитивных по активированной каспазе-3, в ксенотрансплантате опухоли Isreco-1 путем иммуногистохимического окрашивания.
Ткани изолировали из ксенотрансплантатов опухолей Isreco-1 мышей, подвергнутых или не подвергнутых лечению антителом Mab при 30 мг/кг. Оценивали эффективность антитела M20, mD-A10 или mD-D6 в отношении индукции активации каспазы-3. Для окрашивания образцы тканей фиксировали в 10%-м забуференном формалине и заливали в парафин. Из тканей, фиксированных формалином и залитых в парафин, делали срезы толщиной 4 мкм в соответствии с общепринятыми процедурами. Иммуногистохимический анализ проводили на автоматическом иммуностейнере (Ventana Discovery XT, Roche, Meylan, France) с использованием набора DABmap Kit согласно инструкциям производителя. После проведения процедур демаскировки с помощью буфера Cell Conditioning 1 (CC1) срезы инкубировали с кро- 17 036368 личьим моноклональным антителом к расщепленной форме каспазы-3 (разведение 1:200, клон 5A1E, сигнальная система клетки). Окрашивание визуализировали с помощью раствора DAB, содержащего 3,3'-диаминобензидин, в качестве хромогенного субстрата. В заключение, срезы контрокрашивали гематоксилином Gill. Количество клеток на мм2, позитивных по активированной каспазе-3, определяли с помощью программного обеспечения Histolab, соединенного с камерой, после визуализации с помощью микроскопа. Для каждой опухоли подсчет количества клеток, позитивных по активированной каспазе-3, осуществляли на поверхности площадью 2 мм2. Из анализа исключали некротическую область опухоли и фиброзную капсулу. На фиг. 6A показаны результаты определения количества клеток, позитивных по активированной каспазе-3. Количество клеток, позитивных по активированной каспазе-3, показано со стандартным отклонением, соответствующим трем мышам на группу. На фиг. 6B показан пример иммуногистохимического анализа для толстых срезов тканей, полученных от не подвергнутых лечению животных и животных, подвергнутых лечению антителами mD-A10 Mab, M20 и mD-D6 Mabs. Как видно на фиг. 6A, количество клеток, позитивных по активированной каспазе-3, значительно более высокое в опухолях от животных, получавших антитело mD-A10 Mab, по сравнению с необработанными животными. Значительного эффекта не наблюдалось у животных, получавших антитело M20 или mD-D6 Mabs. Этот результат четко показывает, что антитело mD-A10 Mab способно индуцировать апоптоз, связанный с активацией каспазы-3 в клетках Isreco-1 in vivo, тогда как антитело M20 или mD-D6 Mab не инициирует расщепление каспазой. Эти результаты демонстрируют, что M20 и mD-A10 проявляют свой эффект против роста опухолей посредством особого механизма. Антитело mD-A10 Mab определяется как агонистическое Mab, зависящее от запускаемого каспазой-3 индукции апоптоза, тогда как M20 Mab не зависит от этого пути.
Эффект анти-CK8 антитела на рост опухолевых клеток Isreco-1 колоректального рака, подкожно имплантированных мышам.
Клетки Isreco-1 (10х106) подкожно инъецировали 12 мышам SCID CB17. Через 15 дней опухоли достигали объема 100-150 мм3. В этот момент мышей разделяли на 4 группы по 3 мыши. Каждая группа получала или не получала специфическое лечение путем интраперитонеальной инъекции, выполняемой на противоположной от опухоли стороне. Один раз в неделю в течение 4 недель (дни 15, 22, 29 и 36) мыши получали или не получали инъекцию 30 мкг/кг антитела M20, mD-A10 Mab или mD-D6 (фиг. 7). У каждой мыши два раза в неделю измеряли объем опухоли на протяжении эксперимента. На графике показан средний объем опухоли в каждой группе мышей со стандартным отклонением, соответствующим трем мышам на группу. Как показано на фиг. 7, антитело M20 или mD-A10 ингибировало рост клеток Isreco-1 колоректального рака, подкожно имплантированных мышам, тогда как mD-D6 не контролировало развитие опухоли.
Дозозависимый эффект mD-A10 Mab на рост опухолевых клеток Isreco-1 колоректального рака, подкожно имплантированных мышам.
Фрагменты опухоли Isreco-1, полученной из клеток Isreco-1 колоректального рака, имплантировали подкожно 18 мышам SCID CB17. Через 15 дней опухоли достигали объема 100-150 мм3. В этот момент мышей разделяли на шесть групп по 3 мыши. Каждая группа получала или не получала специфическое лечение путем интраперитонеальной инъекции, выполняемой на противоположной от опухоли стороне. Один раз в неделю в течение 4 недель (дни 15, 22, 29 и 36) мыши получали или не получали инъекцию 1, 3, 10, 30 или 60 мг/кг mD-A10 Mab. У каждой мыши два раза в неделю измеряли объем опухоли на протяжении эксперимента. На графике показан средний объем опухоли в каждой группе мышей со стандартным отклонением, соответствующим трем мышам на группу. Результаты представлены на фиг. 8. Ингибирование роста клеток Isreco-1 колоректального рака, подкожно имплантированных мышам, наблюдалось даже при самой низкой концентрации Mab, составляющей 1 мг/кг.
Эффект mD-A10 Mab на рост опухолевых клеток колоректального рака HCT116, подкожно имплантированных мышам.
Клетки HCT116 (10х106) подкожно инъецировали 12 мышам SCID CB17. Через 6 дней опухоли достигали объема 100-150 мм3. В этот момент мышей разделяли на четыре группы по три мыши. Каждая группа получала или не получала специфическое лечение путем интраперитонеальной инъекции, выполняемой на противоположной от опухоли стороне. Один раз в неделю в течение 3 недель (дни 6, 13 и 20) мыши получали или не получали инъекцию 30 мг/кг анти-CK8 антитела (M20, mD-A10 или mD-D6). У каждой мыши два раза в неделю измеряли объем опухоли на протяжении эксперимента. На графике показан средний объем опухолей для каждой группы мышей со стандартным отклонением, равным 3 мышам на группу. Как показано на фиг. 7, mD-A10 ингибировало на самом высоком уровне рост клеток Isreco-1 колоректального рака, подкожно имплантированных мышам, по сравнению с антителом M20, тогда как mD-D6 не контролировало развитие опухоли.
Дозозависимый эффект концентрации mD-A10 Mab на рост опухолевых клеток колоректального рака HCT116, подкожно имплантированных мышам.
Клетки HCT116 (10х106) подкожно инъецировали 18 мышам SCID CB17. Через 10 дней опухоли достигали объема 100-150 мм3. В этот момент мышей разделяли на шесть групп по три мыши. Каждая
- 18 036368 группа получала или не получала специфическое лечение путем интраперитонеальной инъекции на противоположной стороне от опухоли. Один раз в неделю в течение трех недель (дни 10, 17 и 24) мыши получали или не получали 1, 3, 10, 30 или 60 мг/кг mD-A10 Mab. Для каждой мыши два раза в неделю измеряли объем опухоли на протяжении эксперимента. На графике показан средний объем опухолей в каждой группе мышей со стандартным отклонением, равным трем мышам на группу. Результаты показаны на фиг. 10.
Получение гуманизированного антитела (Mab) против CK8 из mD-A10 Mab.
ДНК, кодирующую антитело, выделяли и секвенировали с использованием общепринятых процедур (например, путем использования олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи мышиных антител). Клетки гибридомы служили в качестве предпочтительного источника такой ДНК.
Превращение мышиного антитела (Mab) в нативное химерное антитело (Mab).
кДНК, соответствующую вариабельной области из гибридомы, получали с использованием двух подходов. Первый подход состоял в использовании в PCR наборе вырожденных праймеров на основе Nконцевой аминокислотной последовательности, созданных после N-концевого секвенирования. Второй подход состоял в использовании в PCR набора вырожденных праймеров, генерированных с помощью базы данных праймеров IMGT®, и специфических праймеров, описанных ранее (Essono et al., J Immunol Methods. 2003; 203: 279:25-66, Wang et al., Mol Immunol. 1991; 28:1387-97). Последовательность Nконцевой вариабельной области определяли с использованием способа деградации Эдмана. Выделение тотальной РНК проводили с использованием набора Tri Reagent kit в соответствии с протоколом, описанным поставщиком Sigma. Амплифицированные фрагменты VL и VH клонировали в клонирующий вектор ТОРО-TA (Invitrogen) для анализов последовательности посредством способа терминации дидеокси (Sanger et al., Nature. 1977; 265:687-95). Затем конструкции вариантов антител амплифицировали с помощью PCR и клонировали в экспрессионный вектор.
Положения пронумерованы в соответствии с IMGT®, индексом Kabat® и общепринятыми системами нумерации (Common Numbering Systems) (Идентичные аминокислотные последовательности в Vобласти и сегменты последовательностей в антителах различных видов). Анализировали относительные вклады генов VH и VL, мини-генов и определяющих комплементарность участков в связывание антителообъединяющих участков (Kabat et al., NIH Publ. 1991; NO: 91-3242, Vol. 1, 647-669).
Нуклеотидные или аминокислотные последовательности химерного D-A10 Mab показаны в перечне последовательностей:
нуклеотидная последовательность вариабельной области мышиной легкой цепи mD-A10 Mab (SEQ ID NO: 30) и ее производная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 31);
нуклеотидная последовательность вариабельной области мышиной тяжелой цепи mD-A10 Mab (SEQ ID NO: 32) и ее производная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 33);
нуклеотидная последовательность константной области человеческой тяжелой цепи chD-A10 Mab (SEQ ID NO: 48) и ее производная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 47);
нуклеотидная последовательность константной области человеческой легкой цепи chD-A10 Mab (SEQ ID NO: 50) и ее производная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 49).
CDR- и FR-области антитела определяли в соответствии с различными подходами к нумерации, такими как IMGT (ImMunoGeneTics Information System® http://imgt.cines.fr), Kabat или Common Numbering System. Однако определенные согласно IMGT CDR для заданного антитела необязательно являются идентичными CDR, определенным с помощью других систем нумерации. CDR и каркасные области вариабельных доменов были идентифицированы автором изобретения с помощью систем нумерации IMGT.
Превращение химерного Mab в гуманизированное Mab.
Гуманизированную H- и L-цепь создавали с использованием прививания CDR с помощью PCR. Для создания гуманизированного антитела, в котором CDR мышиного моноклонального антитела привиты на человеческое антитело, предпочтительно получить высокую гомологию между вариабельной областью мышиного моноклонального антитела и вариабельной областью человеческого антитела. Таким образом, V-области H-цепи и L-цепи мышиного моноклонального антитела против человеческого CK8 сравнивали с V-областью всех известных человеческих антител с использованием программного обеспечения IMGT/DomainGapAlign. Когда мышиное антитело гуманизировано с использованием общепринятых способов, аминокислотная последовательность некоторых каркасных участков (FR) V-области мышиного антитела, поддерживающих CDR, по желанию, может быть привита на FR человеческой V-области.
Для обеих гуманизированных V-областей H-цепи и L-цепи можно выбрать V-области (IGKV228*01, IGHV13-74*01) и J-области (IGKJ2*01, IGHJ4*01) L- и H-цепи соответственно, имеющие высокую гомологию с V-областью и J-областью H- и L-цепи mD-A10. Вариабельные области H- и L-цепи Hz D-A10 амплифицировали с помощью PCR и клонировали в экспрессионный вектор p3U, содержащий константную область человеческого IgG1.
В случае антител с привитыми мышиными CDR активность связывания снижается при прививании
- 19 036368 аминокислотной последовательности CDR только в человеческое антитело. Для того, чтобы избежать этого снижения, поскольку аминокислотные остатки в FR различаются между человеческим антителом и мышиным антителом, вместе с аминокислотной последовательностью CDR прививают аминокислотные остатки, которые, как полагают, оказывают влияние на активность связывания. Таким образом, в этом примере была сделана попытка идентифицировать аминокислотные остатки в FR, которые, как полагают, оказывают влияние на активность связывания.
В табл. 3 показаны последовательности CDR для VH и VL антитела Hz D-A10 Mab после прививания SDR.
Реактивность Mab в отношении пептидов CK8, определенная с помощью ELISA.
Пептиды CK8, конъюгированные или не конъюгированные с бычьим сывороточным альбумином (BSA) через SH-группу C-концевого цистеина, иммобилизовали (0,5 или 1 мкг/мл соответственно) на дне лунок 96-луночного планшета в течение ночи при комнатной температуре. Несвязанные пептиды удаляли, осуществляя промывку очищенной водой, дополненной Tween (Sigma, St Quentin Fallavier, France). Затем лунки насыщали фосфатно-солевым буферным раствором (PBS), содержащим 5% BSA, в течение 2 ч при комнатной температуре (RT). Затем планшеты промывали очищенной водой, дополненной Tween. Связывание Mab с покрывающими лунки пептидами тестировали при различных концентрациях Mab после инкубации в течение 2 ч при RT в PBS (Invitrogen, Villebon sur Yvette, France), дополненном 1%-м бычьим сывороточным альбумином (Sigma, St Quentin Fallavier, France). Несвязанные Mabs удаляли, осуществляя промывку очищенной водой, дополненной Tween. Затем связанные Mab выявляли с помощью козьего антимышиного вторичного IgG-антитела, конъюгированного с пероксидазой хрена (HRP) (Biorad, France). Поглощение считывали при длине волны 450 нм и корректировали при 630 нм. Специфические требования для различных экспериментов подробно описаны ниже.
Реактивность MAb в отношении различных пептидов 1 (SEQ ID № 1), 2 (SEQ ID № 2), 3 (SEQ ID № 3), 4 (SEQ ID № 4) и 17 (SEQ ID № 17) человеческого CK8.
Пептиды 1, 2, 3 или 4 человеческого CK8, модифицированные путем добавления C-концевого цистеина, конъюгировали с BSA через SH-группу C-концевого цистеина и иммобилизовали на дне 96луночного планшета. Полная последовательность человеческого CK8, содержащая 483 аминокислоты (aa) (ref Uni-ProtKB P05787), показана на фиг. 11. Положения последовательностей пептидов 1, 2, 3 и 4 указаны серыми и черными стрелками на последовательности человеческого CK8:
Пептид 1 (SEQ ID № 1): AEQRGELAIKDANAKLSELEAALQRAKQD-C (aa 338-aa 366).
Пептид 2 (SEQ ID № 2): AEQRGELAIKDANAKLSELE-C (aa 338-aa 357).
Пептид 3 (SEQ ID № 3): AALQRAKQD-C (aa 358-aa 366).
Пептид 4 (SEQ ID № 4): SELEAALQRAKQD-C (aa 354-aa 366).
Пептид 17 (SEQ ID № 17): C-AIKDANAKLSELEAALQRAKQD (aa 345-aa 366).
Различные концентрации Mab (от 10 мкг/мл, затем разведенные 1/10) инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре с пептидом 1, пептидом 2, пептидом 3, пептидом 4 или пептидом 17. Величины оптической плотности (OD) считывали при 450 нм и корректировали при 630 нм. Результаты показаны на фиг. 12 и обобщены в табл. 7 ниже. Эти результаты четко демонстрируют профиль реактивности mD-A10, который отличается от профиля реактивности антитела M20.
Таблица 7
Реактивность Mab в отношении покрывающих лунки пептидов 1-4 и пептида 17, конъюгированных с BSA
| Пептид (№) | Последовательность СК8 (аа) | Реактивность МАЬ в отношении покрывающих лунки пептидов, конъюгированных с BSA | |
| М20 | D-A10 | ||
| Пептид 1 | 338-AEQRGELAIKDANAKLSELEAALQRAKQD-C-366 | + | +++ |
| Пептид 2 | 3 3 8-AEQRGELAIKD ANAKLSELE-C-3 5 7 | - | - |
| Пептид 3 | 358-AALQRAKQD-C-366 | - | - |
| Пептид 4 | 354-SELEAALQRAKQD-C-366 | - | ++ |
| Пептид 17 | 345-C-AIKDANAKLSELEAALQRAKQD-366 | + | +++ |
Уровень реактивности Mab в отношении распознавания или не распознавания покрывающих лунки конъюгированных с BSA пептидов 1, 2, 3, 4 или 17 соответственно указан с помощью знаков, таких как +++ (сильная), ++ (средняя), + (слабая) или - (отсутствует).
Реактивность MAb в отношении различных покрывающих лунки неконъюгированных пептидов 1, 5-28 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5-SEQ ID NO: 28) человеческого CK8.
Неконъюгированные пептиды 1, 5-28 человеческого CK8 иммобилизовали (2 мкг/мл) на дне 96луночного планшета. Различные концентрации Mab (от 10 мкг/мл затем разведенные 1/10) инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре отдельно или с каждым тестируемым пептидом. Величины оптической плотности (OD) считывали при 450 нм и корректировали при 630 нм. Результаты показаны на фиг. 13A (относятся к mD-A10) или на фиг. 13B (относятся к M20). Сравнительный анализ показан в
- 20 036368 табл. 8 ниже. Эти результаты ясно демонстрируют отличие профиля реактивности mD-A10 от профиля реактивности антитела M20 в отношении тестируемой панели пептидов.
Таблица 8
Реактивность Mab в отношении различных покрывающих лунки неконъюгированных пептидов
| Пептид (№) | Последовательность СК8 (аа) | Реактивность АЬ в отношении покрывающих лунки свободных пептидов | |
| D- А10 | М20 | ||
| Пептид 1 | 338-AEQRGELAIKDANAKLSELEAALQRAKQD-C-366 | +++ | + |
| Пептид 5 | 33 8-AEQRGELAIKDANAKLSELEAALQRAKQD-3 66 | +++ | + |
| Пептид 6 | 358-AALQRAKQD-366 | - | - |
| Пептид 7 | 357-EAALQRAKQD-366 | - | - |
| Пептид 8 | 356-LEAALQRAKQD-366 | - | - |
| Пептид 9 | 355-ELEAALQRAKQD-366 | ||
| Пептид 10 | 354-SELEAALQRAKQD-366 | ||
| Пептид 11 | 353 -LSELEAALQRAKQD-3 66 | ++ | |
| Пептид 12 | 352-KLSELEAALQRAKQD-366 | ++ | |
| Пептид 13 | 351-AKLSELEAALQRAKQD-366 | ++ | |
| Пептид 14 | 350-NAKLSELEAALQRAKQD-366 | +++ | |
| Пептид 15 | 349-ANAKLSELEAALQRAKQD-366 | +++ | |
| Пептид 16 | 348 -DANAKLSELEAALQRAKQD-366 | +++ | |
| Пептид 17 | 345-C-AIKDANAKLSELEAALQRAKQD-366 | +++ | |
| Пептид 18 | 345-AIKDANAKLSELEAALQRAKQ-365 | +++ | |
| Пептид 19 | 345-AIKD ANAKLSELEAALQRAK-3 64 | +++ | |
| Пептид 20 | 345-AIKDANAKLSELEAALQRA-363 | +++ | |
| Пептид 21 | 345-AIKDANAKLSELEAALQR-362 | +++ | |
| Пептид 22 | 345-AIKDANAKLSELEAALQ-361 | +++ | |
| Пептид 23 | 345-AIKDANAKLSELEAAL-360 | +++ | |
| Пептид 24 | 345 -AIKD ANAKLSELEAA-3 5 9 | ||
| Пептид 25 | 345-AIKDANAKLSELEA-358 | ||
| Пептид 26 | 345-AIKDANAKLSELE-357 | ||
| Пептид 27 | 345-AIKDANAKLSEL-356 | ||
| Пептид 28 | 345-AIKDANAKLSE-355 |
Уровень реактивности Mab в отношении распознавания или не распознавания покрывающих лунки неконъюгированных пептидов соответственно указан с помощью знаков, таких как +++ (сильная), ++ (средняя), + (слабая) или - (отсутствует).
Эффект свободных пептидов 1, 5-28 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5-SEQ ID NO: 28) в отношении распознавания антителом mD-A10 Mab покрывающего лунки BSA-конъюгированного пептида 1 или 17.
При проведении конкурентных анализов mD-A10 Mab с различными пептидами CK8 смесь пептидантитело инкубировали в течение 30 мин перед помещением в присутствие пептида для детекции того, что он был иммобилизован на дне лунок. Антитело mD-A10 Mab помещали в присутствии пептидов 1, 528 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5-SEQ ID NO: 28) либо для распознавания BSA-конъюгированного пептида 1 (SEQ ID NO: 1), либо для распознавания BSA-конъюгированного пептида 17 (SEQ ID NO: 17).
Пептид 1 человеческого CK8, модифицированный путем добавления цистеина в C-концевое положение, конъюгировали с BSA через SH-группу его C-концевого цистеина и иммобилизовали на дне 96луночного планшета. Мышиное моноклональное антитело D-A10 при концентрации 1 нг/мл инкубировали в течение 30 мин в присутствии пептидов 1,5-28 при различных концентрациях (10, 1, 0,1 или 0,01 мкг/мл). Затем добавляли смесь пептид-антитело или только антитело и выдерживали в течение 2 ч при комнатной температуре с покрывающим лунки BSA-конъюгированным пептидом 1 или с покрывающим лунки BSA-конъюгированным пептидом 17 и использовали для детекции с помощью ELISA. Величины оптической плотности (OD) считывали при 450 нм и корректировали при 630 нм. Результаты показаны на фиг. 14 для покрывающего лунки BSA-конъюгированного пептида 1 или на фиг. 15 для покрывающего лунки BSA-конъюгированного пептида 17.
Claims (14)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Моноклональное антитело или фрагмент антитела, где указанное антитело или его фрагмент специфически связывает человеческий цитокератин-8 (CK8), при этом указанное антитело содержит тяжелую цепь, содержащую следующие три CDR, соответственно CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, при этомCDR-H1 содержит последовательность SEQ ID NO: 37; и CDR-H2 содержит последовательность SEQ ID NO: 38; и CDR-H3 содержит последовательность SEQ ID NO: 39; и легкую цепь, содержащую следующие три CDR, соответственно CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, при этом- 21 036368CDR-L1 содержит последовательность SEQ ID NO: 34; и CDR-L2 содержит последовательностьSEQ ID NO: 35; и CDR-L3 содержит последовательность SEQ ID NO: 36.
- 2. Антитело или фрагмент антитела по п.1, отличающееся тем, что указанное антитело представляет собой гуманизированное антитело, сохраняющее свойство связывания с человеческим CK8 родительского антитела.
- 3. Антитело или фрагмент антитела по п.2, отличающееся тем, что содержит указанные CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3.
- 4. Антитело или фрагмент антитела по п.1, отличающееся тем, что оно содержит цепь VL, имеющую последовательность SEQ ID NO: 31, и цепь VH, имеющую последовательность SEQ ID NO: 33.
- 5. Гуманизированное антитело или фрагмент антитела, где указанное антитело или его фрагмент специфически связывают человеческий цитокератин-8 (CK8), при этом указанное антитело содержит тяжелую цепь, содержащую следующие три CDR, соответственно CDR-H1', CDR-H2' и CDR-H3', при этомCDR-H1' содержит последовательность SEQ ID NO: 40; иCDR-H2' содержит последовательность SEQ ID NO: 41; иCDR-H3' содержит последовательность SEQ ID NO: 39; и легкую цепь, содержащую следующие три CDR, соответственно CDR-L1', CDR-L2' и CDR-L3', при этомCDR-L1' содержит последовательность SEQ ID NO: 42; иCDR-L2' содержит последовательность SEQ ID NO: 35; иCDR-L3' содержит последовательность SEQ ID NO: 36.
- 6. Антитело или фрагмент антитела по п.5, отличающееся тем, что оно содержит цепь VH, имеющую последовательность SEQ ID NO: 44, и цепь VL, имеющую последовательность SEQ ID NO: 43.
- 7. Антитело или фрагмент антитела по п.5 или 6, отличающееся тем, что оно содержит вариабельные области, кодируемые полинуклеотидами, имеющими нуклеотидную последовательность вариабельной области мышиной легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 46, и нуклеотидную последовательность вариабельной области мышиной тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 45.
- 8. Антитело или фрагмент антитела по любому из пп.1-7, отличающееся тем, что указанный фрагмент антитела представляет собой Fv, Fab, F(ab')2, scFv.
- 9. Применение моноклонального антитела или фрагмента антитела по любому из предшествующих пунктов для лечения опухолей, клетки которых экспрессируют на своей поверхности белок CK8.
- 10. Применение по п.9, в котором рак выбирают из колоректального рака, рака яичников, рака молочной железы, рака легких, рака яичка, рака поджелудочной железы, рака нервной системы, рака лимфатических узлов, рака почек, рака головы и шеи.
- 11. Применение по п.9, в котором рак представляет собой инвазивный рак.
- 12. Применение по п.11, в котором инвазивный рак представляет собой инвазивный колоректальный рак.
- 13. Антигенный пептидный эпитоп человеческого CK8 для получения антитела или фрагмента антитела по любому из пп.1-8, состоящий из последовательности SEQ ID NO: 29.
- 14. Противораковая фармацевтическая композиция, содержащая антитело или фрагмент антитела по любому из пп.1-8 и подходящий фармацевтический носитель.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR1457704A FR3024731B1 (fr) | 2014-08-08 | 2014-08-08 | Anticorps anti-ck8 pour utilisation dans le traitement des cancers |
| PCT/EP2015/068400 WO2016020553A1 (en) | 2014-08-08 | 2015-08-10 | Anti-ck8 antibodies for use in the treatment of cancers |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201790341A1 EA201790341A1 (ru) | 2017-06-30 |
| EA036368B1 true EA036368B1 (ru) | 2020-10-30 |
Family
ID=51987264
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201790341A EA036368B1 (ru) | 2014-08-08 | 2015-08-10 | Анти-ck8 антитела для применения в лечении рака |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10533046B2 (ru) |
| EP (1) | EP3189078B1 (ru) |
| JP (1) | JP6689847B2 (ru) |
| KR (1) | KR102478986B1 (ru) |
| CN (1) | CN107001452B (ru) |
| CA (1) | CA2959671C (ru) |
| EA (1) | EA036368B1 (ru) |
| FR (1) | FR3024731B1 (ru) |
| IL (1) | IL250507B (ru) |
| WO (1) | WO2016020553A1 (ru) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR3024731B1 (fr) * | 2014-08-08 | 2019-06-14 | International - Drug - Development - Biotech | Anticorps anti-ck8 pour utilisation dans le traitement des cancers |
| EP3444272A1 (en) | 2017-08-17 | 2019-02-20 | International-Drug-Development-Biotech | Treatment of ck8 positive cancers in relation with k-ras gene status |
| CN111018984B (zh) * | 2019-11-26 | 2021-09-21 | 山东立菲生物产业有限公司 | 抗ck8单克隆抗体及其应用 |
| CN113234156B (zh) * | 2021-05-25 | 2022-05-03 | 宁波赛珀生物技术有限公司 | 一种抗肌红蛋白的抗体及其制备方法和应用 |
| CN114874320B (zh) * | 2022-06-28 | 2023-08-04 | 王玉 | 含有外泌体的药物组合物及其制备方法 |
| CN116478285B (zh) * | 2023-01-20 | 2024-03-12 | 上海大格生物科技有限公司 | 诊断性小鼠源化抗人ck抗体及其制备方法和应用 |
| CN117430707B (zh) * | 2023-10-25 | 2024-04-19 | 重庆天科雅生物科技有限公司 | 一种cik细胞的制备方法及其在治疗癌症中的用途 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010136536A1 (fr) * | 2009-05-27 | 2010-12-02 | Universite Claude Bernard Lyon 1 | Anticorps anti-ck8 pour utilisation pour le traitement des cancers colorectaux et identification des phénotypes invasifs et/ou métastatiques |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8168181B2 (en) * | 2006-02-13 | 2012-05-01 | Alethia Biotherapeutics, Inc. | Methods of impairing osteoclast differentiation using antibodies that bind siglec-15 |
| EP2602265A1 (en) * | 2011-12-07 | 2013-06-12 | Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) | Antibodies anti-sPLA2-X and uses thereof |
| FR3024731B1 (fr) * | 2014-08-08 | 2019-06-14 | International - Drug - Development - Biotech | Anticorps anti-ck8 pour utilisation dans le traitement des cancers |
-
2014
- 2014-08-08 FR FR1457704A patent/FR3024731B1/fr active Active
-
2015
- 2015-08-10 US US15/502,469 patent/US10533046B2/en active Active
- 2015-08-10 JP JP2017526766A patent/JP6689847B2/ja active Active
- 2015-08-10 EA EA201790341A patent/EA036368B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2015-08-10 WO PCT/EP2015/068400 patent/WO2016020553A1/en active Application Filing
- 2015-08-10 CA CA2959671A patent/CA2959671C/en active Active
- 2015-08-10 CN CN201580048278.9A patent/CN107001452B/zh active Active
- 2015-08-10 KR KR1020177006409A patent/KR102478986B1/ko active IP Right Grant
- 2015-08-10 EP EP15748040.1A patent/EP3189078B1/en active Active
-
2017
- 2017-02-08 IL IL250507A patent/IL250507B/en unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010136536A1 (fr) * | 2009-05-27 | 2010-12-02 | Universite Claude Bernard Lyon 1 | Anticorps anti-ck8 pour utilisation pour le traitement des cancers colorectaux et identification des phénotypes invasifs et/ou métastatiques |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2959671C (en) | 2023-10-03 |
| KR102478986B1 (ko) | 2022-12-16 |
| EP3189078A1 (en) | 2017-07-12 |
| US20180237508A1 (en) | 2018-08-23 |
| FR3024731A1 (fr) | 2016-02-12 |
| CN107001452B (zh) | 2021-01-08 |
| IL250507B (en) | 2021-10-31 |
| WO2016020553A1 (en) | 2016-02-11 |
| KR20170082495A (ko) | 2017-07-14 |
| JP6689847B2 (ja) | 2020-05-27 |
| CA2959671A1 (en) | 2016-02-11 |
| JP2017534661A (ja) | 2017-11-24 |
| EA201790341A1 (ru) | 2017-06-30 |
| EP3189078B1 (en) | 2020-11-04 |
| CN107001452A (zh) | 2017-08-01 |
| FR3024731B1 (fr) | 2019-06-14 |
| IL250507A0 (en) | 2017-03-30 |
| US10533046B2 (en) | 2020-01-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK2817338T3 (en) | DLL3 modulators and methods of use | |
| US11447551B2 (en) | Binding molecules specific for claudin 18.2, compositions and methods thereof, for the treatment of cancer and other diseases | |
| KR101671039B1 (ko) | 항 ｃｘｃｒ4 항체 및 그들의 암의 치료를 위한 용도 | |
| KR20210109520A (ko) | 항체 및 이의 용도 | |
| US10533046B2 (en) | Anti-CK8 antibodies for use in the treatment of colorectal cancers | |
| CN112566662A (zh) | 针对cd47的阻断抗体及其使用方法 | |
| JP2023134490A (ja) | リンパ球における阻害経路の中和 | |
| JP2021525080A (ja) | ＧＵＣＹ２ｃに特異的な抗体及びその使用 | |
| JP2017520575A (ja) | 二重特異的ヘテロ二量体ダイアボディおよびその使用 | |
| US20220064323A1 (en) | Therapeutic Anti-CD9 Antibody | |
| CN111253488A (zh) | Cd47抗体及其制备方法和应用 | |
| KR20170137073A (ko) | 항-인간 ｎｏｔｃｈ4 항체 | |
| CN111196854A (zh) | Ox40抗体及其制备方法和应用 | |
| TW202016143A (zh) | 全人源的抗ｌａｇ－３抗體及其應用 | |
| KR20230028708A (ko) | 항-b7-h4/항-4-1bb 이중특이적 항체 및 이의 용도 | |
| KR20220070201A (ko) | 항-pd-1 항체 및 이의 용도 | |
| CN113423736A (zh) | 对muc18特异性的抗体 | |
| CA3178855A1 (en) | Anti-claudin18.2 antibody and use thereof | |
| EP3086808B1 (en) | Anti adam17 antibody and its use for the treatment of cancer | |
| CN113423830A (zh) | 对muc18特异性的抗体 | |
| TW202334228A (zh) | B7h6抗體及其應用 | |
| KR20230158058A (ko) | 시알산-결합 ig-유사 렉틴 15에 특이적인 항체 및 이의 용도 | |
| AU2021372706A1 (en) | Anti-tigit antibody, and pharmaceutical composition and use thereof | |
| KR20220050182A (ko) | 항-cd22 항체 및 그의 용도 | |
| KR20220048028A (ko) | 항-cd19 항체 및 그의 용도 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM |