CN113234156B - 一种抗肌红蛋白的抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种抗肌红蛋白的抗体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种抗肌红蛋白的抗体及其制备方法和应用，其中，所述抗肌红蛋白的抗体包括：抗体IE6和抗体9B2；其中，所述抗体IE6的氨基酸序列为：VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3分别如SEQ ID NO.1‑3所示；VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3分别如SEQ ID NO.4‑6所示；所述抗体9B2的氨基酸序列为：VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3分别如SEQ ID NO.9‑11所示；VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3分别如SEQ ID NO.12‑14所示。本发明提供的抗体具有高亲和力和高特异性，可以应用于抗肌红蛋白试剂盒。

Description

一种抗肌红蛋白的抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及抗体及体外检测领域。具体而言，本发明涉及一种抗肌红蛋白的抗体及其制备方法和应用。
背景技术
肌红蛋白(Myoglobin,Mb)是一种由一条肽链和一个血红素辅基组成的结合蛋白，属于球蛋白家族。Mb的多肽链由8个α-螺旋组成，分子量约为16kD，含153个氨基酸残基。
Mb是一种储氧蛋白，其结合氧的亲和力比血红蛋白高六倍，由肌红蛋白储存的氧气由血红蛋白输送。Mb主要分布于心肌和骨骼肌组织。在肌细胞内有转运和贮存氧的作用，在心肌受损时即从心肌细胞中弥散出来进入血液循环。任何导致横纹肌溶解的情况都会增加血液中的肌红蛋白值，两个常见的例子是心脏病发作与肌肉损伤。
Mb可以用于诊断心肌和骨骼肌损伤，确定损伤程度。因为Mb是个较小分子的球蛋白，心肌或骨骼肌损伤时Mb可以从肌肉组织漏到循环血中去，而且能通过肾小球滤过，出现在尿中。因此血清和尿中Mb测定可用于某些肌病和心脏病的诊断，如急性肌损伤、急慢性肾衰竭、严重的充血性心力衰竭、长时间休克，神经肌肉病如肌营养不良、肌萎缩、皮肌炎，及各种原因引起的肌病。但是目前对于抗肌红蛋白抗体的研究中，单克隆抗体的数量较少，可用于检测人血清中肌红蛋白的抗体适配性较差。
发明内容
本发明的目的是提供高亲和力和高特异性的抗人肌红蛋白的单克隆抗体，为具有优良性质的鼠源抗体，其能够特异性识别和结合人血清中的肌红蛋白。
一方面，本发明提供一种抗肌红蛋白的抗体，包括：(1)包含下述3个互补决定区(CDR)的重链可变区(VH)：(i)VH CDR1，其由选自下列的序列组成：SEQ ID NO.1或9所示的序列；(ii)VH CDR2，其由选自下列的序列组成：SEQ ID NO.2或10所示的序列；(iii)VHCDR3，其由选自下列的序列组成：SEQ ID NO.3或11所示的序列；和/或，(2)包含下述3个互补决定区(CDR)的轻链可变区(VL)：(iv)VL CDR1，其由选自下列的序列组成：SEQ ID NO.4或12所示的序列；(v)VL CDR2，其由选自下列的序列组成：SEQ ID NO.5或13所示的序列；(vi)VL CDR3，其由选自下列的序列组成：SEQ ID NO.6或14所示的序列。
在优选的实施方案中，所述重链可变区中含有的3个CDR和/或所述轻链可变区中含有的3个CDR由Chothia编号系统定义。
进一步地，所述抗体包括：重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7或NO.15所示；和/或，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8或NO.16所示。
进一步地，所述抗体为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体或多特异性抗体；所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、双抗体(diabody)或单域抗体(sdAb)。
进一步地，所述抗体还包括：哺乳动物免疫球蛋白的重链恒定区(CH)或其变体1，所述变体1与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加；以及，哺乳动物免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)或其变体2，所述变体2与其所源自的序列相比具有至多20个氨基酸的保守置换。
在本发明中，抗体可以包括这样的变体，所述变体与其所源自的抗体相比差异仅在于一个或多个氨基酸残基的保守置换；例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换；或者与其所源自的抗体具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，且基本保留了其所源自的抗体的上述生物学功能。
进一步地，所述重链恒定区是IgG重链恒定区；所述轻链恒定区是κ轻链恒定区。
进一步地，所述抗体带有标记。
另一方面，本发明还提供一种所述抗肌红蛋白的抗体的制备方法，包括：在允许所述抗体表达的条件下，培养宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体。
本发明的抗体可以采用本领域已知的各种方法来制备，例如通过基因工程重组技术来获得。例如，通过化学合成或PCR扩增获得编码本发明抗体的重链和轻链基因的DNA分子。将所得DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞。然后，在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本发明的抗体。
本发明的抗原结合片段可以通过水解完整的抗体分子获得。另外，这些抗原结合片段也可以直接由重组宿主细胞产生。比如，Fab’片段可以直接从宿主细胞中获得；可以将Fab’片段化学偶联形成F(ab’)2片段。另外，Fv、Fab或F(ab’)2片段也可以直接从重组宿主细胞培养液中直接分离得到。一般而言，本领域的普通技术人员知晓制备这些抗原结合片段的其它技术。
另一方面，本发明还提供一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子用于编码所述抗体。
另一方面，本发明还提供一种载体，包括所述分离的核酸分子。
进一步地，所述载体为克隆载体或表达载体。在优选的实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体等。在优选的实施方案中，所述载体能够在受试者，例如哺乳动物，体内表达所述抗体。
另一方面，本发明还提供一种宿主细胞，包括所述分离的核酸分子或所述载体。所述宿主细胞包括但不限于：原核细胞例如大肠杆菌细胞，真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞，动物细胞例如哺乳动物细胞等。在优选的实施方案中，本发明的宿主细胞是哺乳动物细胞，例如CHO，具体包括CHO-K1、CHO-S和CHO DG44。
另一方面，本发明还提供一种检测肌红蛋白的试剂盒，包括所述抗体。优选地，所述试剂盒包含第一单克隆抗体和第二单克隆抗体，其中所述第一单克隆抗体和第二单克隆抗体分别与乳胶颗粒偶联形成致敏源。
其中，试剂R1为常见缓冲液，可以是pH7.4的0.05mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液，制备方法如下：取Tris 6.057g；先加入800mL去离子水，加入浓盐酸调节pH值至7.4；去离子水定容至1L。
试剂R2由第一单克隆抗体与乳胶颗粒偶联形成的致敏源1和第二单克隆抗体与乳胶颗粒偶联形成的致敏源2混合配制而成。优选地，所述第一单克隆抗体为IE6，其包含：SEQID NO.1所示的VH CDR1、SEQ ID NO.2所示的VH CDR2、SEQ ID NO.3所示的VH CDR3；和SEQID NO.4所示的VL CDR1、SEQ ID NO.5所示的VL CDR2、SEQ ID NO.6所示的VL CDR3。所述第二单克隆抗体为9B2，其包含：SEQ ID NO.9所示的VH CDR1、SEQ ID NO.10所示的VH CDR2、SEQ IDNO.11所示的VH CDR3；和SEQ ID NO.12所示的VL CDR1、SEQ ID NO.13所示的VLCDR2、SEQID NO.14所示的VL CDR3。
另一方面，本发明还提供一种所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：使用试剂R1稀释被测样品，并加入试剂R2反应；然后使用生化分析仪，测定570nm波长下吸光值；利用肌红蛋白标准品制备标准曲线，根据所述标准曲线和所述吸光值计算被测样品中肌红蛋白的含量。
本发明的试剂盒的可能原理包括：当样品中存在相应抗原时，第一单克隆抗体与乳胶颗粒偶联的致敏源1和第二单克隆抗体与乳胶颗粒偶联的复合物2能够同时与抗原结合，发生聚集反应。单个致敏源在入射光波长之内，光线可通过。当两个致敏源聚集时，则使透射光减少，这种减少程度与致敏源聚集成正比，也与抗原量成正比。由此进行肌红蛋白的定性和定量分析。
其中，用于构建本发明的试剂盒的第一单克隆抗体和第二单克隆抗体分别针对人肌红蛋白的不同抗原表位并且具有配对检测效果。
本发明的抗体可进行衍生化，例如被连接至另一个分子。通常，抗体的衍生化不会不利影响其对肌红蛋白的结合。因此，本发明的抗体还意欲包括此类衍生化的形式。例如，可以将本发明的抗体功能性连接于一个或多个其它分子基团，例如另一个抗体，检测试剂，药用试剂，和/或能够介导抗体或抗原结合片段与另一个分子结合的蛋白或多肽。此外，本发明的抗体还可以用化学基团进行衍生，例如聚乙二醇(PEG)，甲基或乙基，或者糖基。这些基团可用于改善抗体的生物学特性，例如增加血清半衰期。
因此，在优选的实施方案中，本发明的抗体与乳胶颗粒偶联。本发明的抗体可偶联可检测的标记，例如酶、放射性核素、荧光染料、发光物质或生物素。本发明所述的可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。这类标记是本领域熟知的，其实例包括但不限于，酶、放射性核素、荧光染料、发光物质、磁珠、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素的生物素。教导该标记物的使用的专利包括，但不限于，美国专利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；及4,366,241。如上所述的可检测的标记可通过本领域已知的方法检测。例如，放射性标记可使用摄影胶片或闪烁计算器检测，荧光标记物可使用光检测器检测，以检测发射的光。酶标记物一般通过给酶提供底物及检测通过酶对底物的作用产生的反应产物来检测，及测热标记物通过简单可视化着色标记物来检测。在某些实施方案中，此类标记能够适用于免疫学检测，例如，酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等。在某些实施方案中，可通过不同长度的接头将如上所述的可检测的标记连接至本发明的抗体，以降低潜在的位阻。
术语定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、生物化学、核酸化学、免疫学实验室等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语“抗体”是指，通常由两对多肽链组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，如可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合部位。氨基酸在各区域或结构域的分配可遵循Kabat,Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature342:878-883的定义。
如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。在重链和轻链的可变区中各含有三个CDR，命名为CDR1、CDR2和CDR3。这些CDR的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照Kabat编号系统、Chothia编号系统或IMGT编号系统中的定义。对于给定的抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的CDR。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的。
在本发明中，本发明的抗体含有的CDR可根据本领域已知的各种编号系统确定。在某些实施方案中，本发明的抗体含有的CDR优选地通过Kabat、Chothia或IMGT编号系统确定。在某些实施方案中，本发明的抗体含有的CDR优选地通过Kabat编号系统确定。
如本文中所使用的，术语“构架区”或“FR”残基是指，抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。
术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。抗原结合片段的非限制性实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、互补决定区(CDR)片段、scFv、双抗体、单域抗体、嵌合抗体、线性抗体、纳米抗体、probody和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。工程改造的抗体变体综述于Holliger等，2005；Nat Biotechnol,23:1126-1136中。
如本文中所使用的，术语“全长抗体”意指，由两条“全长重链”和两条“全长轻链”组成的抗体。其中，“全长重链”是指这样的多肽链，其在N端到C端的方向上由重链可变区(VH)、重链恒定区CH1结构域、铰链区(HR)、重链恒定区CH2结构域、重链恒定区CH3结构域组成；并且，当所述全长抗体为IgE同种型时，任选地还包括重链恒定区CH4结构域。优选地，“全长重链”是在N端到C端方向上由VH、CH1、HR、CH2和CH3组成的多肽链。“全长轻链”是在N端到C端方向上由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成的多肽链。两对全长抗体链通过在CL和CH1之间的二硫键和两条全长重链的HR之间的二硫键连接在一起。本发明的全长抗体可以来自单一物种，例如人；也可以是嵌合抗体或人源化抗体。本发明的全长抗体包含分别由VH和VL对形成的两个抗原结合部位，这两个抗原结合部位特异性识别/结合相同的抗原。
如本文中所使用的，术语“Fd”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段；术语“dAb片段”意指由VH结构域组成的抗体片段；术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段；术语“F(ab’)2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段；术语“Fab’片段”意指还原连接F(ab’)2片段中两个重链片段的二硫键后所获片段，由一条完整的轻链和重链的Fd片段(由VH和CH1结构域组成)组成。
如本文中所使用的，术语“Fv”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段。Fv片段通常被认为是，能形成完整的抗原结合位点的最小抗体片段。一般认为，六个CDR赋予抗体的抗原结合特异性。然而，即便是一个可变区(例如Fd片段，其仅仅含有三个对抗原特异的CDR)也能够识别并结合抗原，尽管其亲和力可能低于完整的结合位点。
如本文中所使用的，术语“Fc”意指，由抗体的第一重链的第二、第三恒定区与第二重链的第二、第三恒定区经二硫键结合而形成的抗体片段。抗体的Fc片段具有多种不同的功能，但不参与抗原的结合。
如本文中所使用的，术语“scFv”是指，包含VL和VH结构域的单个多肽链，其中所述VL和VH通过接头相连。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头，但也可使用其变体，可用于本发明的其他接头。在一些情况下，scFv的VH与VL之间还可以存在二硫键。
如本文中所使用的，术语“双抗体”意指，其VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位。
如本文中所使用的，术语“单域抗体”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指由单个单体可变抗体结构域所组成的抗体片段，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力。单域抗体也称为纳米抗体。
上述各个抗体片段均保持了特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合。
可使用本领域技术人员已知的常规技术从给定的抗体获得抗体的抗原结合片段，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式特异性筛选抗体的抗原结合片段。
在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。
如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”、“单抗”、“mAb”具有相同的含义且可互换使用，其是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段，也即，除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。此外，修饰语“单克隆”仅表明该抗体的特征为从高度同源的抗体群中获得，不能理解为需要通过任何特定方法来制备所述抗体。
本发明的单克隆抗体可以通过多种技术进行制备，例如杂交瘤技术，重组DNA技术，或噬菌体抗体库技术。
抗体可通过公知的技术，例如使用蛋白A或蛋白G的亲和层析进行纯化。随后或作为替代，可将特异性抗原或其抗原表位固定在柱上，并通过免疫亲合层析法来纯化免疫特异性抗体。
如本文中所使用的，术语“嵌合抗体”是指，这样的抗体，其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体，且轻链或/和重链的另一部分源自另一个抗体，但无论如何，其仍保留对目标抗原的结合活性。例如，术语“嵌合抗体”可包括这样的抗体(例如人鼠嵌合抗体)，其中抗体的重链和轻链可变区来自第一抗体，而抗体的重链和轻链可变区来自第二抗体。
如本文中所使用的，术语“人源化抗体”是指，经基因工程改造的非人源抗体，其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常而言，人源化抗体的全部或部分CDR区来自于非人源抗体，全部或部分的非CDR区来自于人源免疫球蛋白。人源化抗体通常保留了供体抗体的预期性质，包括但不限于，抗原特异性、亲和性、反应性等。供体抗体可以是有预期性质的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物抗体。
本发明的嵌合抗体或人源化抗体可以根据上述制备的鼠单克隆抗体的序列进行制备。编码重链和轻链的DNA可以从目标鼠杂交瘤中获得，并且使用标准分子生物学技术进行工程改造以包含非鼠免疫球蛋白序列。
为制备嵌合抗体，可使用本领域已知的方法将鼠免疫球蛋白可变区连接至人免疫球蛋白恒定区。例如，将编码VH的DNA可操作的连接至编码重链恒定区的另一DNA分子以获得全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的，包含这些区的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是通常优选为IgG1或IgG4恒定区。例如，将编码VL的DNA可操作的连接至编码轻链恒定区CL的另一DNA分子以获得全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的，包含这些区的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，但通常优选为κ恒定区。
为制备人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠CDR区插入人源框架序列。或者，还可以利用转基因动物，其能够在免疫后不产生内源性免疫球蛋白、并且能够产生完整人抗体库。例如，已有报道在嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失可以完全抑制了内源性抗体产生，然后将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到所述种系突变小鼠中将导致该小鼠在遇到抗原刺激时产生人抗体。上述转基因动物的非限制性实例包括，HuMAb小鼠，其含有编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因微型基因座，加之使内源μ和κ链基因座失活的靶向突变；或携带人重链转基因和人轻链转染色体的“KM小鼠TM”。其他抗体人源化改造的方法还包括噬菌体展示技术。
如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以由该相互作用的平衡解离常数(KD)表示。在本发明中，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于约10-9M，例如小于约10-9M、10-10M、10-11M或10-12M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定，例如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定。
如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序方便地进行Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48:443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl Biosci.,4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链、酸性侧链、不带电荷的极性侧链、非极性侧链、β分支侧链和芳香族侧链的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的。
本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
采用本发明提供的技术方案，能达到的有益效果为：所述抗体能够与Mb蛋白特异性结合；通过双抗体夹心免疫比浊检测方法，能有效地检测人血清中Mb蛋白的含量，灵敏度高，最低限达10μg/L，检测线性宽，为10-600μg/L，能够满足临床检测的需要。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例2的Mb的线性范围测定图；
图2是本发明实施例2的Mb检测方法与某品牌比对试剂/检测方法相关性图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
【实施例1】
本实施例的主要试剂和仪器分别见表1和表2：
表1：主要试剂
Figure GDA0003517727090000111
表2：主要仪器：
名称 厂家 型号
移液器 Eppendorf /
恒温培养箱 普和希PHC MCO-170AICL-PC
洗板机 山东博科 ST-96W
酶标仪 美国伯腾 ELX800
生化仪 HITACHI 7180
实验动物：
Balb/C小鼠：SPF(Specific Pathogen Free)级别的Balb/C小鼠购自上海灵畅生物科技有限公司。
缓冲液的配制：
磷酸盐缓冲液(PBS)配方为：NaCl，8g；KCl，0.2g；Na2HPO4·12H2O，2.9g；KH2PO4，0.2g；H2O定容至1L
10×PBST洗液配方为：NaCl，80g；KCl，2g；Na2HPO4·12H2O，29g；KH2PO4，2g；TWEEN-20，5ml；H2O定容至1L
pH 2.7的甘氨酸洗脱液配方为：甘氨酸1.9g，H2O定容至500mL，pH值2.68～2.72。
pH 1.9的甘氨酸洗脱液配方为：甘氨酸1.9g，H2O定容至500mL，pH值1.88～1.92。
实施例1：Mb单克隆抗体的制备和筛选
将Mb重组蛋白(1mg/ml)与佐剂CFA和IFA混合，制备免疫原。即，重组蛋白先与CFA按体积比1:1混合，作为免疫原A，重组蛋白再与IFA按体积比1:1混合作为免疫原B。免疫原A是初次免疫，免疫原B是第二次、第三次和第四次加强免疫。皮下免疫小鼠2只，第四次加强免疫后在第14天抽取小鼠尾血，使用间接ELISA方法进行尾血抗体效价的评价。
使用Mb重组蛋白包被酶标板(2μg/mL)，每孔加入100μL，4℃过夜反应；使用PBST溶液洗板3次，使用5％BSA在37℃封闭2h；然后使用PBST溶液洗板3次后，加入使用5％BSA溶液梯度稀释的小鼠尾血，37℃反应2h；然后使用PBST溶液洗板3次，加入1:5000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗，37℃反应1h；用PBST溶液洗板5次后，拍干，加入100μL TMB显色液，37℃避光反应15min；然后加入50μL终止液(2M H2SO4)，混匀后在酶标仪上读取OD450值。免疫后第14天小鼠尾血间接ELISA评价结果见表3。
表3：四次免疫后第14天小鼠尾血抗体效价评价
Figure GDA0003517727090000121
Figure GDA0003517727090000131
注：NC为阴性对照，PBS。
从结果中看出，两只小鼠尾血识别Mb重组蛋白的抗体滴度均超过1:160000，其中2号小鼠的抗体滴度较高。因此选择2号小鼠取脾脏与骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14进行细胞融合。融合后有3000个以上杂交瘤细胞群落在96孔板中生长，通过之前所描述的间接ELISA方法对96孔板中的细胞培养上清进行评价，筛选能够分泌识别蛋白的单克隆抗体的单克隆细胞株，从筛选结果中，挑选了30个阳性克隆进行筛选的确认实验，实验过程如下：使用Mb重组蛋白包被酶标板(2μg/mL)，每孔加入100μL，4℃过夜反应；使用PBST溶液洗板3次，使用5％BSA在37℃封闭2h；然后使用PBST溶液洗板3次后，加入使用PBS溶液50倍稀释的细胞培养上清，37℃反应2h；然后使用PBST溶液洗板3次，加入1:5000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗，37℃反应1h；用PBST溶液洗板5次后，拍干，加入100μL TMB显色液，37℃避光反应15min；然后加入50μL终止液(2M H2SO4)，混匀后在酶标仪上读取OD450值，结果见表4。
表4：阳性克隆的确认结果
克隆号 1E6 2D10 2F8 3C4 4C3 4F5 4H10 5B6
OD450 1.732 1.069 0.817 0.981 1.223 1.716 1.042 0.881
克隆号 7D6 9B2 9F5 10G6 13C2 13E10 13F8 14A4
OD450 0.992 1.698 0.817 0.981 1.293 1.416 1.042 1.212
克隆号 15G2 15B5 16D2 16G10 17B8 17D9 18A7 18D5
OD450 1.351 1.207 1.183 1.252 1.718 0.852 0.946 1.226
克隆号 18F10 19D9 19F12 20A4 20D10 20G9 NC PC
OD450 1.171 0.937 0.996 1.032 0.958 0.982 0.046 1.726
注：NC为阴性对照，PBS；PC为阳性对照，1号小鼠血清1/5000稀释。
根据表4阳性克隆复筛结果，挑选出14个阳性克隆继续进行灵敏度检测实验，使用Mb重组蛋白包被酶标板(2μg/mL)，每孔加入100μL，4℃过夜反应；使用PBST溶液洗板3次，使用5％BSA在37℃封闭2h；然后使用PBST溶液洗板3次后，加入使用PBS溶液梯度稀释的细胞培养上清，37℃反应2h；然后使用PBST溶液洗板3次，加入1:5000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗，37℃反应1h；用PBST溶液洗板5次后，拍干，加入100μL TMB显色液，37℃避光反应15min；然后加入50μL终止液(2M H2SO4)，混匀后在酶标仪上读取OD450值，结果见表5。
表5：灵敏度测试结果
克隆号 1E6 4C3 4F5 4H10 9B2 13C2 13E10 14A4
1/50 1.692 1.269 1.717 1.081 1.693 1.316 1.442 1.11
1/100 1.332 0.996 1.431 0.693 1.629 0.99 1.162 0.856
1/200 1.181 0.798 1.23 0.492 1.463 0.719 0.909 0.669
1/400 0.857 0.513 0.888 0.297 1.272 0.493 0.639 0.454
克隆号 15G2 15B5 16D2 16G10 17B8 18D5 NC PC
1/50 1.371 0.907 1.196 1.052 1.748 1.452 0.046 1.726
1/100 1.092 0.59 0.978 0.684 1.425 1.137 0.058 1.415
1/200 1.042 0.432 0.869 0.541 1.192 0.869 0.049 1.202
1/400 0.803 0.321 0.725 0.393 0.879 0.605 0.048 0.845
注：NC为阴性对照，PBS；PC为阳性对照，2号小鼠血清。
根据表5结果，选取IE6，4F5，9B2和17B8进行纯化抗体制备和筛选。
2、纯化抗体的制备和筛选
1)腹水制备
将IE6，4F5，9B2和17B8抗体进行腹水制备，分别将约1×107个细胞注射入2只预先注射了IFA佐剂的Balb/C小鼠的腹腔，然后约10天后，分别抽取每个阳性克隆产生的腹水，然后4℃、12000rpm离心15min，收取上清进行下一步的G蛋白纯化。
2)小鼠单克隆抗体的纯化
取1mL的偶联有G蛋白的柱料加入一根空柱子中，使用PBS溶液清洗后，将2mL腹水用8mL的PBS稀释后上柱，然后将流过液重新上柱一次；然后使用pH 2.7的甘氨酸洗脱液进行洗脱，每1mL洗脱液收集一管(预先加入100μL中和液，中和液成分为1M Tris-HCl、10mMEDTA、1.5M NaCl，pH 8.0-8.38)，共收集5管；紧接着使用pH 1.9的甘氨酸洗脱液进行洗脱，每1mL洗脱液收集一管(预先加入300μL中和液)，共收集3管；然后分别对每一管洗脱液进行OD280读数，将OD280大于0.5的洗脱液进行混合，混合后再重新测定混合液的OD280，按照1.4的系数计算抗体浓度：抗体浓度＝OD280/1.4。
将G蛋白纯化的鼠单抗使用间接ELSIA方法进行评价，使用Mb重组蛋白包被酶标板(2μg/mL)，每孔加入100μL，4℃过夜反应；使用PBST溶液洗板3次，使用5％BSA在37℃封闭2h；然后使用PBST溶液洗板3次后，加入使用5％BSA溶液梯度稀释的G蛋白纯化后的鼠单抗，37℃反应2h；然后使用PBST溶液洗板3次，加入1:5000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG二抗，37℃反应1h；用PBST溶液洗板5次后，拍干，加入100μL TMB显色液，37℃避光反应15min；然后加入50μL终止液(2M H2SO4)，混匀后在酶标仪上读取OD450值。纯化抗体的评价结果见表6。
表6：鼠单抗纯化抗体的评价结果
Figure GDA0003517727090000151
注：NC为阴性对照，PBS。
根据表6的结果，选取抗体4C1,6C1,IE6和9B2进行配对，将抗体4C1,6C1,IE6,9B2按照不同的组合方式两两配对偶联乳胶颗粒；将偶联后的胶乳颗粒配制成检测试剂R2用于后续校准品检测，检测结果见表7；
检测方法为：
检测仪器为：全自动生化分析仪7180
分析方法为：两点终点法
反应方向为：上升反应
校准方式为：Spline
测定波长：570nm
测定温度：37℃
校准品：试剂R1：试剂R2＝2μL:120μL:120μL
表7：不同抗体组合方式制备Mb检测试剂检测校准品OD570nm读数
Figure GDA0003517727090000161
根据表7结果，选取抗体IE6和9B2作为Mb含量双抗体夹心法免疫比浊检测试剂原料。
经测序分析，鼠单克隆抗体IE6的可变区氨基酸序列为：
重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；轻链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO.8所示。
进一步，使用Immunolobin BLAST(IG Blast)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/giblast/)在线分析，确定了该抗体的CDR序列，其氨基酸序列分别为：VH CDR1如SEQ IDNO.1所示；VH CDR2如SEQ ID NO.2所示；VH CDR3如SEQ ID NO.3所示；VL CDR1如SEQ IDNO.4所示；VL CDR2如SEQ ID NO.5所示；VL CDR3如SEQ ID NO.6所示。
经测序分析，鼠单克隆抗体9B2的可变区氨基酸序列为：
重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；轻链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO.16所示。
进一步，使用Immunolobin BLAST(IGBlast)在线分析，确定了该抗体的CDR序列，其氨基酸序列分别为：VH CDR1如SEQ ID NO.9所示；VH CDR2如SEQ ID NO.10所示；VH CDR3如SEQ ID NO.11所示；VL CDR1如SEQ ID NO.12所示；VL CDR2如SEQ ID NO.13所示；VLCDR3如SEQ ID NO.14所示。
【实施例2】
双抗体夹心免疫比浊法检测样本Mb蛋白
检测肌红蛋白(Mb)含量的方法，利用肌红蛋白检测试剂R1、R2及校准品，进行肌红蛋白检测。
其中，检测试剂主要组成成分如下：
试剂R1：三羟甲基氨基甲烷缓冲液
试剂R2：一定比例的IE6与乳胶颗粒偶联形成的致敏源1和9B2与乳胶颗粒偶联形成的致敏源2混合配制而成。
校准品：人肌红蛋白。
检测方法如下：
所用检测仪器为：全自动生化分析仪7180
分析方法：两点终点法。
反应方向为：上升反应；
校准方式为：Spline；
测定波长：570nm；
测定温度：37℃；
样本：试剂R1：试剂R2＝2μL:120μL:120μL；
方法步骤：
步骤一，取2μL样本和120μL试剂R1加入反应杯，混匀并孵育3min；
步骤二，取120μL试剂R2加入上述混合溶液中，并混合均匀；
步骤三，通过全自动生化分析仪7180在570nm处分别读取第一读数点透射吸光度A1和第二读数点透射吸光度A2；
步骤五，通过软件计算出△A＝A2-A1并根据校准曲线计算出被测样本中肌红蛋白的浓度。
对肌红蛋白试剂线性范围测定：用Mb校准品配制成高浓度样本，用生理盐水按常规比例分别进行倍比稀释，使用实施例2中Mb试剂R1、R2重复测定每个样本3次，计算均值，求出回归方程，并通过回归方程计算出理论值，所得结果详见图1。从结果可以得出，肌红蛋白试剂线性范围为10-600μg/L，检测灵敏度高且线性宽，满足临床高灵敏度、宽线性的检测需求。
将本发明Mb检测方法与国内某知名品牌比对试剂检测方法进行相关性试验，对50例血清样本进行测定，对测定值进行相关性分析，结果如图2，本发明Mb检测方法与国内某知名品牌比对试剂检测方法相关系数R2＝0.9989，表明本发明检测方法与国内某知名品牌比对试剂检测方法具有良好的相关性。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 宁波赛珀生物技术有限公司
<120> 一种抗肌红蛋白的抗体及其制备方法和应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
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Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr
1 5
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<212> PRT
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Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr
1 5
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Ala Arg Val Asp Gly Ser Arg Asp Phe Asp Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
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Lys Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
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Arg Met Ser
1
<210> 6
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<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
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Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Leu Thr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Glu Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Asp Gly Ser Arg Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Thr Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 9
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<212> PRT
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Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr Leu
1 5
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
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Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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Glu Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 16
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105

Claims (9)

1.一种抗肌红蛋白的抗体，其特征在于，包括：抗体IE6和抗体9B2；
其中，所述抗体IE6的氨基酸序列为：VH CDR1如SEQ ID NO.1所示；VH CDR2如SEQ IDNO.2所示；VH CDR3如SEQ ID NO.3所示；VL CDR1如SEQ ID NO.4所示；VL CDR2如SEQ IDNO.5所示；VL CDR3如SEQ ID NO.6所示；
所述抗体9B2的氨基酸序列为：VH CDR1如SEQ ID NO.9所示；VH CDR2如SEQ ID NO.10所示；VH CDR3如SEQ ID NO.11所示；VL CDR1如SEQ ID NO.12所示；VL CDR2如SEQ IDNO.13所示；VL CDR3如SEQ ID NO.14所示。
2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，
所述抗体IE6的可变区氨基酸序列为：重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；
所述抗体9B2的可变区氨基酸序列为：重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。
3.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，重链恒定区是IgG重链恒定区；轻链恒定区是κ轻链恒定区。
4.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体带有标记。
5.一种如权利要求1所述的抗肌红蛋白的抗体的制备方法，其特征在于，包括：在允许所述抗体表达的条件下，培养宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体。
6.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述分离的核酸分子用于编码制备如权利要求1至4任一项所述的抗体。
7.一种载体，其特征在于，包括如权利要求6所述的分离的核酸分子。
8.根据权利要求7所述的载体，其特征在于，所述载体为克隆载体或表达载体。
9.一种检测肌红蛋白的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1至4任一项所述的抗体。
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