CN112409487B

CN112409487B - 抗可溶性转铁蛋白受体抗体及其应用

Info

Publication number: CN112409487B
Application number: CN202011356429.6A
Authority: CN
Inventors: 吴振兴; 赖思慧; 王剑
Original assignee: Ningbo Saipo Biotechnology Co ltd
Current assignee: Ningbo Saipo Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-11-27
Filing date: 2020-11-27
Publication date: 2022-04-29
Anticipated expiration: 2040-11-27
Also published as: CN112409487A

Abstract

本发明公开了一种可溶性转铁蛋白受体抗体或其抗原结合片段，制备它们的方法，以及包含它们的试剂盒。本发明进一步涉及所述抗体或其抗原结合片段用于检测人血清中可溶性转铁蛋白受体含量的用途。

Description

抗可溶性转铁蛋白受体抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及抗体及体外检测领域。具体而言，本发明涉及抗可溶性转铁蛋白受体抗体或其抗原结合片段，制备它们的方法，以及包含它们的试剂盒。本发明进一步涉及所述抗体或其抗原结合片段的应用。

背景技术

转铁蛋白受体(transferrin receptor，TfR)是一种单次跨膜的糖蛋白，分子量约为190kDa。它由两个相同的、以二硫键桥连结在一起的次单元组成。蛋白质分解作用会使转铁蛋白受体成为可溶性转铁蛋白受体(soluble transferrin receptor，sTfR)。sTfR是存在血清中完整的转铁蛋白受体单体的截断形式，其缺少了转铁蛋白受体的前100个氨基酸。

组织细胞摄取铁是通过血液中携带铁的转铁蛋白与细胞表面的转铁蛋白受体介导的。铁以不同的方式分布于人体，只有约0.1％的铁在血液循环中被运输，它们与转铁蛋白结合，被运往目的地。转铁蛋白受体可介导结合了铁的转铁蛋白进入红细胞样细胞前体，即携带铁的转铁蛋白受体与细胞表面的转铁蛋白受体结合形成复合体，以胞饮的形式进入细胞。

研究表明血清中的sTfR浓度变化能比较准确地反映组织内转铁蛋白受体数目的变化。人体内80％的转铁蛋白存在于骨髓幼红细胞膜上，在幼红细胞成熟过程中，膜上的转铁蛋白逐渐被释放入血。当机体铁缺乏时，幼红细胞内缺铁，此时通过铁的转录后调节使转铁蛋白增多，sTfR水平明显升高。

采用重组sTfR蛋白作为免疫原，经免疫、筛选、鉴定后获得的特异性结合可溶性转铁蛋的白受体单克隆抗体，可应用于检测可溶性转铁蛋白受体含量。但是，目前国内市场尚未有特异性结合sTfR的单克隆抗体。

发明内容

本发明的目的是提供高亲和力和高特异性的抗人可溶性转铁蛋白受体的单克隆抗体，为具有优良性质的鼠源抗体，其能够特异性识别和结合人血清中的可溶性转铁蛋白受体。

本发明的抗体

在一个方面，本发明提供了能够特异性结合可溶性转铁蛋白受体的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：

(1)包含下述3个互补决定区(CDR)的重链可变区(VH)：

(i)VH CDR1，其由选自下列的序列组成：SEQ ID NO.1或9所示的序列；

(ii)VH CDR2，其由选自下列的序列组成：SEQ ID NO.2或10所示的序列；

(iii)VH CDR3，其由选自下列的序列组成：SEQ ID NO.3或11所示的序列；

和/或，

(2)包含下述3个互补决定区(CDR)的轻链可变区(VL)：

(iv)VL CDR1，其由选自下列的序列组成：SEQ ID NO.4或12所示的序列；

(v)VL CDR2，其由选自下列的序列组成：SEQ ID NO.5或13所示的序列；

(vi)VL CDR3，其由选自下列的序列组成：SEQ ID NO.6或14所示的序列。

在最优先的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：

(1)SEQ ID NO.1所示的VH CDR1、SEQ ID NO.2所示的VH CDR2、SEQ ID NO.3所示的VH CDR3；SEQ ID NO.4所示的VL CDR1、SEQ ID NO.5所示的VL CDR2、SEQ ID NO.6所示的VL CDR3；或

(2)SEQ ID NO.9所示的VH CDR1、SEQ ID NO.10所示的VH CDR2、SEQ ID NO.11所示的VH CDR3；SEQ ID NO.12所示的VL CDR1、SEQ ID NO.13所示的VL CDR2、SEQ ID NO.14所示的VL CDR3。

在另一个方面，本发明提供了能够特异性结合转铁蛋白的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中，

所述重链可变区包含SEQ ID NO.7或15所示的重链可变区中含有的3个CDR；并且，

所述轻链可变区包含SEQ ID NO.8或16所示的轻链可变区中含有的3个CDR。

在优选的实施方案中，所述重链可变区中含有的3个CDR，和/或所述轻链可变区中含有的3个CDR，由Chothia编号系统定义。

在优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：

(1)SEQ ID NO.7所示的重链可变区中含有的3个CDR；以及，SEQ ID NO.8所示的轻链可变区中含有的3个CDR；或

(2)SEQ ID NO.15所示的重链可变区中含有的3个CDR；以及，SEQ ID NO.16所示的轻链可变区中含有的3个CDR。

在优选的实施方案中，所述重链可变区中含有的3个CDR和/或所述轻链可变区中含有的3个CDR由Chothia编号系统定义。

在另一个方面，本发明提供了能够特异性结合可溶性转铁蛋白受体的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：

(1)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO.7或15所示的氨基酸序列：

和，

(2)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO.8或16所示的氨基酸序列。

在优选的实施方案中，所述的抗体或其抗原结合片段包含：

(1)具有SEQ ID NO.7所示的序列的VH和具有SEQ ID NO.8所示的序列的VL；或

(2)具有SEQ ID NO.15所示的序列的VH和具有SEQ ID NO.16所示的序列的VL。

在优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段进一步包含来源于哺乳动物(例如，鼠或人)免疫球蛋白的恒定区序列或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加。在优选的实施方案中，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的保守置换。

在进一步的实施方案中，本发明的抗体是嵌合抗体、人源化抗体。在优选的实施方案中，本发明的抗原结合片段选自Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、双特异抗体(diabody)和单域抗体(sdAb)。

在本发明中，抗体或其抗原结合片段可以包括这样的变体，所述变体与其所源自的抗体或其抗原结合片段相比差异仅在于一个或多个(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换)氨基酸残基的保守置换，或者与其所源自的抗体或其抗原结合片段具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，且基本保留了其所源自的抗体或其抗原结合片段的上述生物学功能。

抗体的制备

本发明的抗体可以采用本领域已知的各种方法来制备，例如通过基因工程重组技术来获得。例如，通过化学合成或PCR扩增获得编码本发明抗体的重链和轻链基因的DNA分子。将所得DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞。然后，在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本发明的抗体。

本发明的抗原结合片段可以通过水解完整的抗体分子获得(参见Morimoto etal.,J.Biochem.Biophys.Methods 24:107-117(1992)and Brennan et al.,Science 229:81(1985))。另外，这些抗原结合片段也可以直接由重组宿主细胞产生(reviewedinHudson,Curr.Opin.Immunol.11:548-557(1999)；Little et al.,Immunol.Today,21:364-370(2000))。比如，Fab’片段可以直接从宿主细胞中获得；可以将Fab’片段化学偶联形成F(ab’)2片段(Carter et al.,Bio/Technology,10:163-167(1992))。另外，Fv、Fab或F(ab’)2片段也可以直接从重组宿主细胞培养液中直接分离得到。一般而言，本领域的普通技术人员知晓制备这些抗原结合片段的其它技术。

因此，在另一个方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区的核苷酸序列。在优选的实施方案中，所述分离的核酸分子编码本发明的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区。

在另一个方面，本发明提供了一种载体(例如克隆载体或表达载体)，其包含本发明的分离的核酸分子。在优选的实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体等。在优选的实施方案中，所述载体能够在受试者(例如哺乳动物，例如人)体内表达本发明的抗体或其抗原结合片段。

在另一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含本发明的分离的核酸分子或本发明的载体。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。在优选的实施方案中，本发明的宿主细胞是哺乳动物细胞，例如CHO(例如CHO-K1、CHO-S、CHO DG44)。

在另一个方面，提供了制备本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养本发明的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。

衍生的抗体

本发明的抗体或其抗原结合片段可进行衍生化，例如被连接至另一个分子(例如另一个多肽或蛋白)。通常，抗体或其抗原结合片段的衍生化(例如，标记)不会不利影响其对可溶性转铁蛋白受体(特别是人源可溶性转铁蛋白受体)的结合。因此，本发明的抗体或其抗原结合片段还意欲包括此类衍生化的形式。例如，可以将本发明的抗体或其抗原结合片段功能性连接(通过化学偶合、基因融合、非共价连接或其它方式)于一个或多个其它分子基团，例如另一个抗体(例如，形成双特异性抗体)，检测试剂，药用试剂，和/或能够介导抗体或抗原结合片段与另一个分子结合的蛋白或多肽(例如，抗生物素蛋白或多组氨酸标签)。此外，本发明的抗体或其抗原结合片段还可以用化学基团进行衍生，例如聚乙二醇(PEG)，甲基或乙基，或者糖基。这些基团可用于改善抗体的生物学特性，例如增加血清半衰期。

因此，在优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段与乳胶颗粒偶联。本发明的抗体或其抗原结合片段可偶联可检测的标记，例如酶、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质)或生物素。本发明所述的可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。这类标记是本领域熟知的，其实例包括但不限于，酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)、放射性核素(例如，3H、125I、35S、14C或32P)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、藻红蛋白(PE)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如Cy7、Alexa 750))、发光物质(例如化学发光物质，如吖啶酯类化合物)、磁珠(例如，

)、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶，等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如，链霉亲和素)的生物素。教导该标记物的使用的专利包括，但不限于，美国专利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；及4,366,241(全部通过引用并入本文)。如上所述的可检测的标记可通过本领域已知的方法检测。例如，放射性标记可使用摄影胶片或闪烁计算器检测，荧光标记物可使用光检测器检测，以检测发射的光。酶标记物一般通过给酶提供底物及检测通过酶对底物的作用产生的反应产物来检测，及测热标记物通过简单可视化着色标记物来检测。在某些实施方案中，此类标记能够适用于免疫学检测(例如，酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等)。在某些实施方案中，可通过不同长度的接头(linker)将如上所述的可检测的标记连接至本发明的抗体或其抗原结合片段，以降低潜在的位阻。

检测方法和试剂盒

本发明的抗体或其抗原结合片段能够特异性结合可溶性转铁蛋白受体，从而可用于检测可溶性转铁蛋白受体在样品中的存在或其水平。

因此，在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括本发明的抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒包括两种本发明的抗体。优选地，所述试剂盒包含第一单克隆抗体和第二单克隆抗体，其中所述第一单克隆抗体和第二单克隆抗体与乳胶颗粒偶联。在另一个方面，提供了本发明的抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测可溶性转铁蛋白受体在样品中的存在或其量。在优选的实施方案中，所述可溶性转铁蛋白受体是人可溶性转铁蛋白受体。

在优选的实施方式中，本发明提供了一种人血清可溶性转铁蛋白受体双抗体夹心免疫比浊检测试剂盒，其中，该试剂盒包括：试剂R1、试剂R2。

为了提高定量检测的准确性并提高试剂盒的易用性，优选地，该试剂盒还含有人可溶性转铁蛋白受体标准品。

其中，试剂R1为常见缓冲液，例如pH7.4的0.05mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液，可以如下制备：Tris 6.057g；先加入800mL去离子水，加入浓盐酸调节pH值至7.4；去离子水定容至1L。

其中，试剂R2为一定比例的偶联复合物1和偶联复合物2混合配制而成；其中偶联复合物1为第一单克隆抗体与乳胶颗粒偶联形成，偶联复合物2为第二单克隆抗体与乳胶颗粒偶联形成。优选地，所述第一单克隆抗体为8E11，其包含：SEQ ID NO.1所示的VH CDR1、SEQ ID NO.2所示的VH CDR2、SEQ ID NO.3所示的VH CDR3；和SEQ ID NO.4所示的VL CDR1、SEQ ID NO.5所示的VL CDR2、SEQ ID NO.6所示的VL CDR3。所述第二单克隆抗体为10F2，其包含：SEQ ID NO.9所示的VH CDR1、SEQ ID NO.10所示的VH CDR2、SEQ IDNO.11所示的VHCDR3；和SEQ ID NO.12所示的VL CDR1、SEQ ID NO.13所示的VL CDR2、SEQID NO.14所示的VL CDR3。

本发明的试剂盒的使用方法可以包括：使用试剂R1稀释被测样品，并加入上述试剂R2反应；使用生化分析仪，测定570nm波长下吸光值变化；利用可溶性转铁蛋白受体标准品制备标准曲线，根据标准曲线计算被测样品中可溶性转铁蛋白受体含量。

本发明的试剂盒的可能原理包括：当样品中存在相应抗原时，第一单克隆抗体与乳胶颗粒偶联的偶联复合物1和第二单克隆抗体与乳胶颗粒偶联的复合物2能够同时与抗原结合，发生聚集反应。单个偶联复合物在入射光波长之内，光线可通过。当两个偶联复合物聚集时，则使透射光减少，这种减少程度与偶联复合物聚集成正比，也与抗原量成正比。由此进行可溶性转铁蛋白受体的定性和定量分析。

其中，用于构建本发明的试剂盒的第一单克隆抗体和第二单克隆抗体分别针对人可溶性转铁蛋白受体的不同抗原表位并且具有配对检测效果。

术语定义

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、生物化学、核酸化学、免疫学实验室等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，术语“抗体”是指，通常由两对多肽链(每对具有一条轻链(LC)和一条重链(HC))组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，如可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合部位。氨基酸在各区域或结构域的分配可遵循Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1987and 1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature342:878-883的定义。

如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。在重链和轻链的可变区中各含有三个CDR，命名为CDR1、CDR2和CDR3。这些CDR的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照Kabat编号系统(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)、Chothia编号系统(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)或IMGT编号系统(Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)中的定义。对于给定的抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的CDR。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如，可参见Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)。

在本发明中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR可根据本领域已知的各种编号系统确定。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR优选地通过Kabat、Chothia或IMGT编号系统确定。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR优选地通过Kabat编号系统确定。

如本文中所使用的，术语“构架区”或“FR”残基是指，抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。

术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。

如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。抗原结合片段的非限制性实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、互补决定区(CDR)片段、scFv、双抗体(diabody)、单域抗体(single domain antibody)、嵌合抗体、线性抗体(linear antibody)、纳米抗体(技术来自Domantis)、probody和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。工程改造的抗体变体综述于Holliger等，2005；Nat Biotechnol,23:1126-1136中。

如本文中所使用的，术语“全长抗体”意指，由两条“全长重链”和两条“全长轻链”组成的抗体。其中，“全长重链”是指这样的多肽链，其在N端到C端的方向上由重链可变区(VH)、重链恒定区CH1结构域、铰链区(HR)、重链恒定区CH2结构域、重链恒定区CH3结构域组成；并且，当所述全长抗体为IgE同种型时，任选地还包括重链恒定区CH4结构域。优选地，“全长重链”是在N端到C端方向上由VH、CH1、HR、CH2和CH3组成的多肽链。“全长轻链”是在N端到C端方向上由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成的多肽链。两对全长抗体链通过在CL和CH1之间的二硫键和两条全长重链的HR之间的二硫键连接在一起。本发明的全长抗体可以来自单一物种，例如人；也可以是嵌合抗体或人源化抗体。本发明的全长抗体包含分别由VH和VL对形成的两个抗原结合部位，这两个抗原结合部位特异性识别/结合相同的抗原。

如本文中所使用的，术语“Fd”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段；术语“dAb片段”意指由VH结构域组成的抗体片段(Ward等人，Nature 341:544 546(1989))；术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段；术语“F(ab’)2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段；术语“Fab’片段”意指还原连接F(ab’)2片段中两个重链片段的二硫键后所获片段，由一条完整的轻链和重链的Fd片段(由VH和CH1结构域组成)组成。

如本文中所使用的，术语“Fv”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段。Fv片段通常被认为是，能形成完整的抗原结合位点的最小抗体片段。一般认为，六个CDR赋予抗体的抗原结合特异性。然而，即便是一个可变区(例如Fd片段，其仅仅含有三个对抗原特异的CDR)也能够识别并结合抗原，尽管其亲和力可能低于完整的结合位点。

如本文中所使用的，术语“Fc”意指，由抗体的第一重链的第二、第三恒定区与第二重链的第二、第三恒定区经二硫键结合而形成的抗体片段。抗体的Fc片段具有多种不同的功能，但不参与抗原的结合。

如本文中所使用的，术语“scFv”是指，包含VL和VH结构域的单个多肽链，其中所述VL和VH通过接头(linker)相连(参见，例如Bird等人，Science 242:423-426(1988)；Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883(1988)；和Pluckthun，The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies，第113卷，Roseburg和Moore编，Springer Verlag，纽约，第269-315页(1994))。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31:94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。在一些情况下，scFv的VH与VL之间还可以存在二硫键。

如本文中所使用的，术语“双抗体”意指，其VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如Holliger P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)，和Poljak R.J.等人，Structure 2:1121-1123(1994))。

如本文中所使用的，术语“单域抗体(single-domain antibody,sdAb)”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指由单个单体可变抗体结构域(例如单个重链可变区)所组成的抗体片段，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力。单域抗体也称为纳米抗体(nanobody)。单域抗体可以通过将常规IgG的可变结构域

上述各个抗体片段均保持了特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合。

可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如本发明提供的抗体)获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。

在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。

如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”、“单抗”、“mAb”具有相同的含义且可互换使用可互换，其是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段，也即，除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。此外，修饰语“单克隆”仅表明该抗体的特征为从高度同源的抗体群中获得，不能理解为需要通过任何特定方法来制备所述抗体。

本发明的单克隆抗体可以通过多种技术进行制备，例如杂交瘤技术(参见，例如Kohler等人.Nature,256:495,1975)，重组DNA技术(参见，例如美国专利申请4,816,567)，或噬菌体抗体库技术(参见，例如Clackson等.Nature 352:624-628,1991，或Marks等.J.Mol.Biol.222:581-597,1991)。

抗体可通过公知的技术，例如使用蛋白A或蛋白G的亲和层析进行纯化。随后或作为替代，可将特异性抗原(该抗体识别的靶分子)或其抗原表位固定在柱上，并通过免疫亲合层析法来纯化免疫特异性抗体。免疫球蛋白的纯化可参考例如D.Wilkinson(TheScientist,published by The Scientist,Inc.,Philadelphia Pa.,Vol.14,No.8(Apr.17,2000),pp.25-28)。

如本文中所使用的，术语“嵌合抗体(Chimeric antibody)”是指，这样的抗体，其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体(其可以源自某一特定物种或属于某一特定抗体类或亚类)，且轻链或/和重链的另一部分源自另一个抗体(其可以源自相同或不同的物种或属于相同或不同的抗体类或亚类)，但无论如何，其仍保留对目标抗原的结合活性(U.S.P4,816,567to Cabilly et al.；Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:68516855(1984))。例如，术语“嵌合抗体”可包括这样的抗体(例如人鼠嵌合抗体)，其中抗体的重链和轻链可变区来自第一抗体(例如鼠源抗体)，而抗体的重链和轻链可变区来自第二抗体(例如人抗体)。

如本文中所使用的，术语“人源化抗体”是指，经基因工程改造的非人源抗体，其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常而言，人源化抗体的全部或部分CDR区来自于非人源抗体(供体抗体)，全部或部分的非CDR区(例如，可变区FR和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。人源化抗体通常保留了供体抗体的预期性质，包括但不限于，抗原特异性、亲和性、反应性等。供体抗体可以是有预期性质(例如，抗原特异性、亲和性、反应性等)的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物(例如，食蟹猴)抗体。

本发明的嵌合抗体或人源化抗体可以根据上述制备的鼠单克隆抗体的序列进行制备。编码重链和轻链的DNA可以从目标鼠杂交瘤中获得，并且使用标准分子生物学技术进行工程改造以包含非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。

为制备嵌合抗体，可使用本领域已知的方法将鼠免疫球蛋白可变区连接至人免疫球蛋白恒定区(参见例如Cabilly等人的美国专利No.4,816,567)。例如，将编码VH的DNA可操作的连接至编码重链恒定区的另一DNA分子以获得全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and HumanServices,NIH Publication No.91-3242)，包含这些区的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是通常优选为IgG1或IgG4恒定区。例如，将编码VL的DNA可操作的连接至编码轻链恒定区CL的另一DNA分子以获得全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIH PublicationNo.91-3242)，包含这些区的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，但通常优选为κ恒定区。

为制备人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠CDR区插入人源框架序列(参见Winter的美国专利No.5,225,539；Queen等人的美国专利Nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370；以及Lo,Benny,K.C.,editor,in Antibody Engineering:Methodsand Protocols,volume 248,Humana Press,New Jersey,2004)。或者，还可以利用转基因动物，其能够在免疫后不产生内源性免疫球蛋白、并且能够产生完整人抗体库。例如，已有报道在嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失可以完全抑制了内源性抗体产生，然后将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到所述种系突变小鼠中将导致该小鼠在遇到抗原刺激时产生人抗体(参见例如，Jakobovits等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：2551；Jakobovits等，1993，Nature362：255-258；Bruggermann等，1993，Year in Immunology 7：33；和Duchosal等，1992，Nature 355:258)。上述转基因动物的非限制性实例包括，HuMAb小鼠(Medarex,Inc.)，其含有编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因微型基因座(miniloci)，加之使内源μ和κ链基因座失活的靶向突变(参见例如Lonberg等人(1994)Nature 368(6474):856-859)；或携带人重链转基因和人轻链转染色体的“KM小鼠TM”(参见专利申请WO02/43478)。其他抗体人源化改造的方法还包括噬菌体展示技术(Hoogenboom等，1991，J.Mol.Biol.227:381；Marks等，J.Mol.Biol.1991,222:581-597；Vaughan等，1996,Nature Biotech 14:309)。

如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(K_D)表示。在本发明中，术语“K_D”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于约10^-9M，例如小于约10^-9M、10^-10M、10^-11M或10^-12M或更小的亲和力(K_D)结合该抗原。两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定，例如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定。

如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48:443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.,4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(JMoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。

如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.NatlAcad.Set USA94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。

本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，Immunology-ASynthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。

本发明的有益效果

本发明的单克隆抗体能够与sTfR蛋白特异性结合，本发明能够通过双抗体夹心免疫比浊检测方法，能有效地检测人血清中sTfR蛋白的含量，灵敏度高，最低限达0.5mg/L，检测线性宽，为0.5-14mg/L，能够满足临床检测的需要。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得可实施。

附图说明

图1是本发明实施例2的sTfR的线性范围测定图；

图2是本发明实施例2的sTfR检测方法与国际某知名品牌比对试剂/检测方法相关性图。

序列信息

本发明涉及的部分序列信息提供与下面表1中。

表1：序列的描述

具体实施方式

如果没有特殊说明，以下实施例中使用的试剂和仪器都是本领域常规试剂和仪器，可以通过商购方式获得；所使用的方法均为常规实验方法。

主要试剂和仪器分别见表2和表3：

表2：主要试剂

表3：主要仪器：

名称	厂家	型号
			移液器	Eppendorf	/
恒温培养箱	普和希PHC	MCO-170AICL-PC
			洗板机	山东博科	ST-96W
酶标仪	美国伯腾	ELX800
			生化仪	HITACHI	7180

实验动物：

Balb/C小鼠：SPF(Specific Pathogen Free)级别的Balb/C小鼠购自上海灵畅生物科技有限公司。

缓冲液的配制：

磷酸盐缓冲液(PBS)配方为：NaCl，8g；KCl，0.2g；Na₂HPO₄·12H₂O，2.9g；KH₂PO₄，0.2g；H₂O定容至1L

10×PBST洗液配方为：NaCl，80g；KCl，2g；Na₂HPO₄·12H₂O，29g；KH₂PO₄，2g；TWEEN-20，5ml；H₂O定容至1L

pH 2.7的甘氨酸洗脱液配方为：甘氨酸1.9g，H₂O定容至500mL，pH值2.68～2.72。

pH 1.9的甘氨酸洗脱液配方为：甘氨酸1.9g，H₂O定容至500mL，pH值1.88～1.92。

实施例1：sTfR单克隆抗体的制备和筛选

将sTfR重组蛋白(1mg/ml)与佐剂CFA和IFA混合，制备免疫原。即，重组蛋白先与CFA按体积比1:1混合，作为免疫原A，重组蛋白再与IFA按体积比1:1混合作为免疫原B。免疫原A是初次免疫，免疫原B是第二次、第三次和第四次加强免疫。皮下免疫小鼠2只，第四次加强免疫后在第14天抽取小鼠尾血，使用间接ELISA方法进行尾血抗体效价的评价。

使用sTfR重组蛋白包被酶标板(2μg/mL)，每孔加入100μL，4℃过夜反应；使用PBST溶液洗板3次，使用5％BSA在37℃封闭2h；然后使用PBST溶液洗板3次后，加入使用5％BSA溶液梯度稀释的小鼠尾血，37℃反应2h；然后使用PBST溶液洗板3次，加入1:5000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗，37℃反应1h；用PBST溶液洗板5次后，拍干，加入100μL TMB显色液，37℃避光反应15min；然后加入50μL终止液(2M H₂SO₄)，混匀后在酶标仪上读取OD450值。免疫后第14天小鼠尾血间接ELISA评价结果见表4。

表4：四次免疫后第14天小鼠尾血抗体效价评价

注：NC为阴性对照，PBS。

从结果中看出，两只小鼠尾血识别sTfR重组蛋白的抗体滴度均超过1:160000，其中1号小鼠的抗体滴度最高。因此选择1号小鼠取脾脏与骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14进行细胞融合。融合后共挑取1025个杂交瘤细胞群落在96孔板中进行培养，通过之前所描述的间接ELISA方法对96孔板中的细胞培养上清进行评价，筛选能够分泌识别蛋白的单克隆抗体的单克隆细胞株，从筛选结果中，挑选了32个阳性克隆进行筛选的确认实验，实验过程如下：使用sTfR重组蛋白包被酶标板(2μg/mL)，每孔加入100μL，4℃过夜反应；使用PBST溶液洗板3次，使用5％BSA在37℃封闭2h；然后使用PBST溶液洗板3次后，加入使用PBS溶液50倍稀释的细胞培养上清，37℃反应2h；然后使用PBST溶液洗板3次，加入1:5000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗，37℃反应1h；用PBST溶液洗板5次后，拍干，加入100μL TMB显色液，37℃避光反应15min；然后加入50μL终止液(2M H₂SO₄)，混匀后在酶标仪上读取OD450值，结果见表5。

表5：阳性克隆的确认结果

注：NC为阴性对照，PBS；PC为阳性对照，1号小鼠血清1/5000稀释。

根据表5阳性克隆复筛结果，挑选出23个阳性克隆继续进行灵敏度检测实验，使用sTfR重组蛋白包被酶标板(2μg/mL)，每孔加入100μL，4℃过夜反应；使用PBST溶液洗板3次，使用5％BSA在37℃封闭2h；然后使用PBST溶液洗板3次后，加入使用PBS溶液梯度稀释的细胞培养上清，37℃反应2h；然后使用PBST溶液洗板3次，加入1:5000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗，37℃反应1h；用PBST溶液洗板5次后，拍干，加入100μL TMB显色液，37℃避光反应15min；然后加入50μL终止液(2M H₂SO₄)，混匀后在酶标仪上读取OD450值，结果见表6。

表6：灵敏度测试结果

注：NC为阴性对照，PBS；PC为阳性对照，1号小鼠血清。

根据表6结果，选取4C1,6C1,8E11和10F2进行纯化抗体制备和筛选。

2、纯化抗体的制备和筛选

1)腹水制备

将4C1,6C1,8E11和10F2抗体进行腹水制备，分别将约1×107个细胞注射入2只预先注射了IFA佐剂的Balb/C小鼠的腹腔，然后约10天后，分别抽取每个阳性克隆产生的腹水，然后4℃、12000rpm离心15min，收取上清进行下一步的G蛋白纯化。

2)小鼠单克隆抗体的纯化

取1mL的偶联有G蛋白的柱料加入一根空柱子中，使用PBS溶液清洗后，将2mL腹水用8mL的PBS稀释后上柱，然后将流过液重新上柱一次；然后使用pH 2.7的甘氨酸洗脱液进行洗脱，每1mL洗脱液收集一管(预先加入100μL中和液，中和液成分为1M Tris-HCl、10mMEDTA、1.5M NaCl，pH 8.0-8.38)，共收集5管；紧接着使用pH1.9的甘氨酸洗脱液进行洗脱，每1mL洗脱液收集一管(预先加入300μL中和液)，共收集3管；然后分别对每一管洗脱液进行OD280读数，将OD280大于0.5的洗脱液进行混合，混合后再重新测定混合液的OD280，按照1.4的系数计算抗体浓度：抗体浓度＝OD280/1.4。

将G蛋白纯化的鼠单抗使用间接ELSIA方法进行评价，使用sTfR重组蛋白包被酶标板(2μg/mL)，每孔加入100μL，4℃过夜反应；使用PBST溶液洗板3次，使用5％BSA在37℃封闭2h；然后使用PBST溶液洗板3次后，加入使用5％BSA溶液梯度稀释的G蛋白纯化后的鼠单抗，37℃反应2h；然后使用PBST溶液洗板3次，加入1:5000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG二抗，37℃反应1h；用PBST溶液洗板5次后，拍干，加入100μL TMB显色液，37℃避光反应15min；然后加入50μL终止液(2M H₂SO₄)，混匀后在酶标仪上读取OD450值。纯化抗体的评价结果见表7。

表7：鼠单抗纯化抗体的评价结果

注：NC为阴性对照，PBS。

根据表7的结果，选取抗体4C1,6C1,8E11和10F2进行配对，将抗体4C1,6C1,8E11,10F2按照不同的组合方式两两配对偶联乳胶颗粒；将偶联后的胶乳颗粒配制成检测试剂R2用于后续校准品检测，检测结果见表8；

检测方法为：

检测仪器为：全自动生化分析仪7180

分析方法为：两点终点法

反应方向为：上升反应

校准方式为：Spline

测定波长：570nm

测定温度：37℃

校准品：试剂R1：试剂R2＝2μL:120μL:120μL

表8：不同抗体组合方式制备sTfR检测试剂检测校准品OD570nm读数

根据表8结果，选取抗体8E11和10F2作为sTfR含量双抗体夹心法免疫比浊检测试剂原料。

经测序分析，鼠单克隆抗体8E11的可变区氨基酸序列为：

重链可变区氨基酸序列：

轻链可变区氨基酸序列：

进一步，使用Immunolobin BLAST(IG Blast)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/giblast/)在线分析，确定了该抗体的CDR序列，其氨基酸序列分别为：VH CDR1为GYAFTNYW(SEQ ID NO.1)；VH CDR2为IFPGSSNT(SEQ ID NO.2)；VH CDR3为ARVKDYYAMGY(SEQ IDNO.3)；VL CDR1为SSVSY(SEQ ID NO.4)；VL CDR2为DTF(SEQ ID NO.5)；VL CDR3为FQGSGYPYT(SEQ ID NO.6)。

经测序分析，鼠单克隆抗体10F2的可变区氨基酸序列为：

重链可变区氨基酸序列：

轻链可变区氨基酸序列：

进一步，使用Immunolobin BLAST(IGBlast)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/giblast/)在线分析，确定了该抗体的CDR序列，其氨基酸序列分别为：VH CDR1为GYTFTSYW(SEQ ID NO.9)；VH CDR2为SPGNSDT(SEQ ID NO.10)；VH CDR3为TPLYYFDY(SEQ ID NO.11)；VL CDR1为QDINSY(SEQ ID NO.12)；VL CDR2为RAN(SEQ ID NO.13)；VL CDR3为LQYDEFPYT(SEQ ID NO.14)。

实施例2

双抗体夹心免疫比浊法检测样本sTfR蛋白

检测可溶性转铁蛋白受体(sTfR)含量的方法，利用可溶性转铁蛋白受体检测试剂R1、R2及校准品，进行可溶性转铁蛋白受体检测。

其中，检测试剂主要组成成分如下：

试剂R1：三羟甲基氨基甲烷缓冲液

试剂R2：一定比例的8E11与乳胶颗粒偶联形成的偶联复合物1和10F2与乳胶颗粒偶联形成的偶联复合物2混合配制而成。

校准品：人可溶性转铁蛋白受体。

检测方法如下：

所用检测仪器为：全自动生化分析仪7180

分析方法：两点终点法。

反应方向为：上升反应；

校准方式为：Spline；

测定波长：570nm；

测定温度：37℃；

样本：试剂R1：试剂R2＝2μL:120μL:120μL；

方法步骤：

步骤一，取2μL样本和120μL试剂R1加入反应杯，混匀并孵育3min；

步骤二，取120μL试剂R2加入上述混合溶液中，并混合均匀；

步骤三，通过全自动生化分析仪7180在570nm处分别读取第一读数点透射吸光度A1和第二读数点透射吸光度A2；

步骤五，通过软件计算出ΔA＝A2-A1并根据校准曲线计算出被测样本中可溶性转铁蛋白受体的浓度。

对可溶性转铁蛋白受体试剂线性范围测定：用sTfR校准品配制成高浓度样本，用生理盐水按常规比例分别进行倍比稀释，使用实施例2中sTfR试剂R1、R2重复测定每个样本3次，计算均值，求出回归方程，并通过回归方程计算出理论值，所得结果详见图1。从结果可以得出，可溶性转铁蛋白受体试剂线性范围为0.50-14.00mg/L，检测灵敏度高且线性宽，满足临床高灵敏度、宽线性的检测需求。

将本发明sTfR检测方法与国内某知名品牌比对试剂检测方法进行相关性试验，对60例血清样本进行测定，对测定值进行相关性分析，结果如图2，本发明sTfR检测方法与国内某知名品牌比对试剂检测方法相关系数R2＝0.9981，表明本发明检测方法与国内某知名品牌比对试剂检测方法具有良好的相关性。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 宁波赛珀生物技术有限公司

<120> 抗可溶性转铁蛋白受体抗体及其应用

<130> 2020-11-26

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr Trp

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

Ile Phe Pro Gly Ser Ser Asn Thr

1 5

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

Ala Arg Val Lys Asp Tyr Tyr Ala Met Gly Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

Ser Ser Val Ser Tyr

1 5

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

Asp Thr Phe

1

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 7

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Phe Pro Gly Ser Ser Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Ser Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Val Lys Asp Tyr Tyr Ala Met Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Ile Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Phe Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp

1 5

<210> 10

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

Ser Pro Gly Asn Ser Asp Thr

1 5

<210> 11

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

Thr Pro Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1 5

<210> 12

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

Gln Asp Ile Asn Ser Tyr

1 5

<210> 13

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 13

Arg Ala Asn

1

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 14

Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 15

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 15

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Pro Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Ser Pro Gly Asn Ser Asp Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Pro Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 16

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 16

Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ile Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Asn Thr Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr

65 70 75 80

Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

Claims

1.抗可溶性转铁蛋白受体抗体或其抗原结合片段，其特征在于：

(1)重链可变区(VH)包含SEQ ID NO.1所示的VH CDR1、SEQ ID NO.2所示的VH CDR2、SEQ ID NO.3所示的VH CDR3；轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO.4所示的VL CDR1、SEQ IDNO.5所示的VL CDR2、SEQ ID NO.6所示的VL CDR3；或

(2)重链可变区(VH)包含SEQ ID NO.9所示的VH CDR1、SEQ ID NO.10所示的VH CDR2、SEQ ID NO.11所示的VH CDR3；轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO.12所示的VL CDR1、SEQ IDNO.13所示的VL CDR2、SEQ ID NO.14所示的VL CDR3。

2.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于：

(1)重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO.8所示；或

(2)重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO.16所示。

3.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于：所述抗体或其抗原结合片段还包含：

(1)人源免疫球蛋白的重链恒定区(CH)或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加；和

(2)人源免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有至多20个氨基酸的保守置换。

4.权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于：所述重链恒定区是IgG重链恒定区。

5.权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于：所述轻链恒定区是κ轻链恒定区。

6.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于：所述抗体或其抗原结合片段带有标记。

7.分离的核酸分子，其特征在于：所述分离的核酸分子编码为权利要求1至6任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区。

8.载体，其特征在于：所述载体包含权利要求7所述的分离的核酸分子。

9.根据权利要求8所述的载体，其特征在于：所述载体为克隆载体或表达载体。

10.宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞包含权利要求7所述的分离的核酸分子或权利要求8所述的载体。

11.制备权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其特征在于：所述方法包括：在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。

12.用于检测可溶性转铁蛋白受体在人血清样品中的存在或其水平的试剂盒，其包含权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其作为双抗体夹心免疫比浊方法检测的第一单克隆抗体；和另外一种权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其作为双抗体夹心免疫比浊方法检测的第二单克隆抗体，其中所述第一单克隆抗体和第二单克隆抗体分别针对人可溶性转铁蛋白受体不同的抗原决定簇；所述第一单克隆抗体包含：SEQ ID NO.1所示的VHCDR1、SEQ ID NO.2所示的VH CDR2、SEQ ID NO.3所示的VH CDR3；和SEQ ID NO.4所示的VLCDR1、SEQ ID NO.5所示的VL CDR2、SEQ ID NO.6所示的VL CDR3，并且所述第二单克隆抗体包含：SEQ ID NO.9所示的VH CDR1、SEQ ID NO.10所示的VH CDR2、SEQ ID NO.11所示的VHCDR3；和SEQ ID NO.12所示的VL CDR1、SEQ ID NO.13所示的VL CDR2、SEQ ID NO.14所示的VL CDR3。

13.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括人可溶性转铁蛋白受体标准品。