CN115925908A - 抗狂犬病毒的抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抗狂犬病毒的抗体及其应用，具体地，本发明涉及特异性结合狂犬病毒G蛋白的抗体或其抗原结合片段(例如，单抗05‑2F10、06‑2A12、07‑4D8‑1C1和14‑4E8‑1E3)，本发明所述抗体或其抗原结合片段对狂犬病毒中和活性好、敏感性离散程度小。在此基础上，本发明进一步提供一种酶联免疫试剂盒及定量检测狂犬病毒G蛋白的方法，有良好的特异性、精密度、准确性和适用性。应用本发明所述试剂盒以及检测方法检测不同毒株和细胞系生产的狂犬病疫苗的G蛋白含量具有良好的线性，可用于狂犬病疫苗效力评价。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及抗狂犬病毒(尤其是狂犬病毒G蛋白)的抗体，及其在制备酶联免疫试剂盒以及定量检测狂犬病毒中的应用。
背景技术
目前，用于评估人用狂犬病疫苗效力的试验是美国国立卫生研究院(NIH)建立的小鼠体内试验方法。该方法检测周期长，成本高，操作人员有感染病毒的风险。实验动物的质量、动物的个体差异和性别、操作员的熟练程度都会影响测定结果。此外，NIH法更不适合监测疫苗生产过程中的各个步骤比如疫苗浓缩、灭活和冻干等过程。近年来，国内外开展了一系列体外试验，以寻找替代目前使用动物检测疫苗效力的方法。其中，双抗体夹心ELISA定量检测具有灵敏度高、特异性强、省时省力等优点，被认为是最有希望取代动物试验的方法。
狂犬病毒G蛋白是诱导细胞免疫和体液免疫的关键，能刺激机体产生中和抗体并有效刺激T淋巴细胞增殖。因为G蛋白是一种诱导产生中和抗体的保护性抗原，所以狂犬病疫苗的抗原含量可以通过检测G蛋白的含量来评估。另外抗原含量也是评价狂犬病疫苗有效性的主要指标之一，与疫苗的实际有效性密切相关。
发明内容
本发明筛选得到四株特异性结合狂犬病毒G蛋白的单抗05-2F10、06-2A12、07-4D8-1C1和14-4E8-1E3，它们对狂犬病毒中和活性好、敏感性离散程度小。在此基础上，本发明开发了酶联免疫试剂盒及定量检测狂犬病毒G蛋白的方法，有良好的特异性、精密度、准确性和适用性。应用本发明所述试剂盒以及检测方法检测不同毒株和细胞系生产的狂犬病疫苗的G蛋白含量具有良好的线性，可用于狂犬病疫苗效力评价。
在第一个方面，本发明提供特异性结合狂犬病毒G蛋白的抗体或其抗原结合片段，选自(1)-(4)：
(1)含有下述的VH和/或VL的抗体或其抗原结合片段：
(1-1)：包含如下3个CDRs的VH，和/或，包含如下3个CDRs的VL：
CDR-H1：按Chothia编号系统定义，序列为SEQ ID No：1，按Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：25；
CDR-H2：按Chothia编号系统定义，序列为SEQ ID No：2，按Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：26；和
CDR-H3：按Chothia或Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：3；
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CDR-L2：按Chothia或Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：5；
CDR-L3：按Chothia或Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：6；
或，
(1-2)：与(1-1)中所述的VH或VL相比，至少一个CDR含有突变，所述突变为一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)；所述含有突变的抗体或其抗原结合片段仍然能特异地结合狂犬病毒G蛋白；
(2)含有下述的VH和/或VL的抗体或其抗原结合片段：
(2-1)：包含如下3个CDRs的VH，和/或，包含如下3个CDRs的VL：
CDR-H1：按Chothia编号系统定义，序列为SEQ ID No：7，按Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：27；
CDR-H2：按Chothia编号系统定义，序列为SEQ ID No：8，按Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：28；和
CDR-H3：按Chothia或Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：9；
CDR-L1：按Chothia或Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：10；
CDR-L2：按Chothia或Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：11；
CDR-L3：按Chothia或Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：12；
或，
(2-2)：与(2-1)中所述的VH或VL相比，至少一个CDR含有突变，所述突变为一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)；所述含有突变的抗体或其抗原结合片段仍然能特异地结合狂犬病毒G蛋白；
(3)含有下述的VH和/或VL的抗体或其抗原结合片段：
(3-1)：包含如下3个CDRs的VH，和/或，包含如下3个CDRs的VL：
CDR-H1：按Chothia编号系统定义，序列为SEQ ID No：13，按Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：29；
CDR-H2：按Chothia编号系统定义，序列为SEQ ID No：14，按Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：30；和
CDR-H3：按Chothia或Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：15；
CDR-L1：按Chothia或Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：16；
CDR-L2：按Chothia或Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：17；
CDR-L3：按Chothia或Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：18；
或，
(3-2)：与(3-1)中所述的VH或VL相比，至少一个CDR含有突变，所述突变为一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)；所述含有突变的抗体或其抗原结合片段仍然能特异地结合狂犬病毒G蛋白；
和，
(4)含有下述的VH和/或VL的抗体或其抗原结合片段：
(4-1)：包含如下3个CDRs的VH，和/或，包含如下3个CDRs的VL：
CDR-H1：按Chothia编号系统定义，序列为SEQ ID No：19，按Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：31；
CDR-H2：按Chothia编号系统定义，序列为SEQ ID No：20，按Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：32；和
CDR-H3：按Chothia或Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：21；
CDR-L1：按Chothia或Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：22；
CDR-L2：按Chothia或Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：23；
CDR-L3：按Chothia或Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：24；
或，
(4-2)：与(4-1)中所述的VH或VL相比，至少一个CDR含有突变，所述突变为一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)；所述含有突变的抗体或其抗原结合片段仍然能特异地结合狂犬病毒G蛋白；
优选地，所述的置换为保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段的VH和/或VL中包括来自人或鼠的免疫球蛋白的构架区(FRs)。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段选自(1)-(4)：
(1)含有下述的VH和/或VL的抗体或其抗原结合片段：
(1-1)SEQ ID NO：33所示的VH；和/或，SEQ ID NO：34所示的VL；
(1-2)所述抗体或其抗原结合片段所包含的VH与(1-1)中所述的VH相比，具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的同一性；和/或，所述抗体或其抗原结合片段所包含的VL与(1-1)中所述的VL相比，具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的同一性；
或者，
(1-3)所述抗体或其抗原结合片段所包含的VH与(1-1)中所述的VH相比，具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)；和/或，所述抗体或其抗原结合片段所包含的VL与(1-1)中所述的VL相比，具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)；优选地，所述的置换是保守置换；
(2)含有下述的VH和/或VL的抗体或其抗原结合片段：
(2-1)SEQ ID NO：35所示的VH；和/或，SEQ ID NO：36所示的VL；
(2-2)所述抗体或其抗原结合片段所包含的VH与(2-1)中所述的VH相比，具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的同一性；和/或，所述抗体或其抗原结合片段所包含的VL与(2-1)中所述的VL相比，具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的同一性；
或者，
(2-3)所述抗体或其抗原结合片段所包含的VH与(2-1)中所述的VH相比，具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)；和/或，所述抗体或其抗原结合片段所包含的VL与(2-1)中所述的VL相比，具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)；优选地，所述的置换是保守置换；
(3)含有下述的VH和/或VL的抗体或其抗原结合片段：
(3-1)SEQ ID NO：37所示的VH；和/或，SEQ ID NO：38所示的VL；
(3-2)所述抗体或其抗原结合片段所包含的VH与(3-1)中所述的VH相比，具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的同一性；和/或，所述抗体或其抗原结合片段所包含的VL与(3-1)中所述的VL相比，具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的同一性；
或者，
(3-3)所述抗体或其抗原结合片段所包含的VH与(3-1)中所述的VH相比，具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)；和/或，所述抗体或其抗原结合片段所包含的VL与(3-1)中所述的VL相比，具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)；优选地，所述的置换是保守置换；
和，
(4)含有下述的VH和/或VL的抗体或其抗原结合片段：
(4-1)SEQ ID NO：39所示的VH；和/或，SEQ ID NO：40所示的VL；
(4-2)所述抗体或其抗原结合片段所包含的VH与(4-1)中所述的VH相比，具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的同一性；和/或，所述抗体或其抗原结合片段所包含的VL与(3-1)中所述的VL相比，具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的同一性；
或者，
(4-3)所述抗体或其抗原结合片段所包含的VH与(4-1)中所述的VH相比，具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)；和/或，所述抗体或其抗原结合片段所包含的VL与(4-1)中所述的VL相比，具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)；优选地，所述的置换是保守置换。
在一些实施方案中，所述抗体包含：
1)人免疫球蛋白的CH(重链恒定区)或其变体，所述变体与其所源自的野生型序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；
和/或，
2)人免疫球蛋白的CL(轻链恒定区)或其变体，所述变体与其所源自的野生型序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；
优选地，所述CH是IgG重链恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区；
优选地，所述抗体包含人IgG1的重链恒定区；
优选地，所述抗体包含如SEQ ID NO：41所示的CH或其变体，所述变体与SEQ IDNO：41相比具有至多20个氨基酸的保守置换(例如至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的保守置换)；
优选地，所述CL是κ轻链恒定区；
优选地，所述抗体包含如SEQ ID NO：42所示的CL或其变体，所述变体与SEQ IDNO：42相比具有至多20个氨基酸的保守置换(例如至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的保守置换)；
更优选的，所述抗体包含如SEQ ID NO：41所示的CH和/或如SEQ ID NO：42所示的CL。
在一些实施方案中，所述抗体为：
(1)包括SEQ ID NO：33所示序列的VH和SEQ ID NO：41所示序列的CH的重链，和，包括SEQ ID NO：34所示序列的VL和SEQ ID NO：42所示序列的CL的轻链；
(2)包括SEQ ID NO：35所示序列的VH和SEQ ID NO：41所示序列的CH的重链，和，包括SEQ ID NO：36所示序列的VL和SEQ ID NO：42所示序列的CL的轻链；
(3)包括SEQ ID NO：37所示序列的VH和SEQ ID NO：41所示序列的CH的重链，和，包括SEQ ID NO：38所示序列的VL和SEQ ID NO：42所示序列的CL的轻链；
或者，
(4)包括SEQ ID NO：39所示序列的VH和SEQ ID NO：41所示序列的CH的重链，和，包括SEQ ID NO：40所示序列的VL和SEQ ID NO：42所示序列的CL的轻链。
前文任意第(1)项中所述的抗体或其抗原结合片段主要识别狂犬病毒G蛋白上表位I，特别是K226、G229E。
前文任意第(2)项中所述的抗体或其抗原结合片段特主要识别狂犬病毒G蛋白上表位IIa，特别是C35、L38和F41。
前文任意第(3)项中所述的抗体或其抗原结合片段主要识别狂犬病毒G蛋白上表位IIa，特别是G34、C35和T36。
前文任意第(4)项中所述的抗体或其抗原结合片段主要识别狂犬病毒G蛋白上表位IIb，特别是K198，另外还识别表位IIa和I。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段选自ScFv、Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、双抗体(diabody)、双特异性抗体和多特异性抗体。
在另一个方面，本发明提供编码前述任一项所述的抗体的重链可变区和/或轻链可变区的多核苷酸。
在另一个方面，本发明提供一种包括前述多核苷酸的载体。
在另一个方面，本发明提供一种包括前述多核苷酸或载体的宿主细胞。
在另一个方面，本发明提供一种检测狂犬病毒的酶联免疫试剂盒，包括包被抗体和/或酶标抗体，所述包被抗体和酶标抗体独立选自前文任一项所述的抗体或其抗原结合片段中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述包被抗体为下述两个抗体的混合物：1)包括SEQ ID NO：33所示序列的VH和SEQ ID NO：41所示序列的CH的重链，和，包括SEQ ID NO：34所示序列的VL和SEQ ID NO：42所示序列的CL的轻链；以及2)包括SEQ ID NO：35所示序列的VH和SEQ IDNO：41所示序列的CH的重链，和，包括SEQ ID NO：36所示序列的VL和SEQ ID NO：42所示序列的CL的轻链。在一些实施方案中，所述混合物中1)和2)所述抗体的混合比率为1：1；
在一些实施方案中，所述酶标抗体为包括SEQ ID NO：37所示序列的VH和SEQ IDNO：41所示序列的CH的重链，和，包括SEQ ID NO：38所示序列的VL和SEQ ID NO：42所示序列的CL的轻链。
在一些实施方案中，所述酶标抗体上的标记酶选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶。
在一些实施方案中，所述酶联免疫试剂盒中包括包被有所述包被抗体的酶标板、所述酶标抗体和阳性对照，其中，所述阳性对照为狂犬病毒G蛋白标准品。
在另一个方面，本发明提供检测狂犬病毒G蛋白在生物样品中的存在或其水平的方法，其包括使用前文任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或者试剂盒的步骤。
在一些实施方案中，所述生物样品为疫苗。
在另一个方面，本发明提供前文所述的抗体或其抗原结合片段、酶联免疫试剂盒在定性或定量检测狂犬病毒G蛋白中的用途。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、生物化学、核酸化学、免疫学等实验操作除非特殊说明为相应领域内常规使用的操作。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语“抗体”是指，通常由两对多肽链(每对具有一条轻链(LC)和一条重链(HC))组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，如可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合部位。氨基酸在各区域或结构域的分配可遵循Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1987and 1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883，或AbM，Martin的相关研究(Martin ACR,Cheetham JC,Rees AR(1989)Modelling antibody hypervariableloops:A combined algorithm.Proc Natl Acad Sci USA 86:9268–9272)的定义。在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。
如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。这些氨基酸残基的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照Kabat编号系统(Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)、Chothia编号系统(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)，IMGT编号系统(Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)，或，Martin的相关研究(Martin ACR,CheethamJC,Rees AR(1989)Modelling antibody hypervariable loops:A combinedalgorithm.Proc Natl Acad Sci USA 86:9268–9272)，此定义方法整合了Kabat及Chothia两者的部分定义，最早应用在Oxford Molecular抗体建模软件中(Martin A C R.Proteinsequence and structure analysis of antibody variable domains[M]//Antibodyengineering.Springer,Berlin,Heidelberg,2010:33-51.)中的定义。对于给定的抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的CDR。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如，可参见Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)。
在本发明中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR可根据本领域已知的各种编号系统确定。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR优选地通过IMGT或AbM编号系统确定。
如本文中所使用的，术语“构架区”或“FR”残基是指，抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。
如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指抗体的片段的多肽,例如全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，FundamentalImmunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。抗原结合片段的非限制性实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)、线性抗体(linearantibody)、纳米抗体(技术来自Domantis)、结构域抗体(技术来自Ablynx)、和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。工程改造的抗体变体综述于Holliger等,2005；Nat Biotechnol,23:1126-1136中。
如本文中所使用的，术语“全长抗体”意指，由两条“全长重链”或“重链”和两条“全长轻链”或“轻链”组成的抗体。其中，“全长重链”或“重链”是指这样的多肽链，其在N端到C端的方向上由重链可变区(VH)、重链恒定区CH1结构域、铰链区(HR)、重链恒定区CH2结构域、重链恒定区CH3结构域组成；并且，当所述全长抗体为IgE同种型时，任选地还包括重链恒定区CH4结构域。优选地，“全长重链”是在N端到C端方向上由VH、CH1、HR、CH2和CH3组成的多肽链。“全长轻链”或“轻链”是在N端到C端方向上由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成的多肽链。两对全长抗体链通过在CL和CH1之间的二硫键和两条全长重链的HR之间的二硫键连接在一起。本发明的全长抗体可以来自单一物种，例如人；也可以是嵌合抗体或人源化抗体。本发明的全长抗体包含分别由VH和VL对形成的两个抗原结合部位，这两个抗原结合部位特异性识别/结合相同的抗原。
如本文中所使用的，术语“Fd片段”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段；术语“dAb片段”意指由VH结构域组成的抗体片段(Ward等人,Nature 341:544 546(1989))；术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段；术语“F(ab’)2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段；术语“Fab’片段”意指还原连接F(ab’)2片段中两个重链片段的二硫键后所获片段，由一条完整的轻链和重链的Fd片段(由VH和CH1结构域组成)组成。
如本文中所使用的，术语“Fv片段”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段。Fv片段通常被认为是，能形成完整的抗原结合位点的最小抗体片段。一般认为，六个CDR赋予抗体的抗原结合特异性。然而，即便是一个可变区(例如Fd片段，其仅仅含有三个对抗原特异的CDR)也能够识别并结合抗原，尽管其亲和力可能低于完整的结合位点。
如本文中所使用的，术语“Fc片段”意指，由抗体的第一重链的第二、第三恒定区与第二重链的第二、第三恒定区经二硫键结合而形成的抗体片段。抗体的Fc片段具有多种不同的功能，但不参与抗原的结合。
如本文中所使用的，术语“scFv”是指，包含VL和VH结构域的单个多肽链，其中所述VL和VH通过接头(linker)相连(参见，例如,Bird等人,Science 242:423-426(1988)；Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)；和Pluckthun，ThePharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Roseburg和Moore编，Springer-Verlag，纽约，第269-315页(1994))。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31:94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。在一些情况下，scFv的VH与VL之间还可以存在二硫键。如本文中所使用的，术语“di-scFv”是指，由两个scFv连接形成的抗体片段。
如本文中所使用的，术语“双抗体(diabody)”意指，其VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如,Holliger P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)，和Poljak R.J.等人,Structure 2:1121-1123(1994))。
上述各个抗体片段均保持了特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合。
如本文中所使用的，“双特异性抗体”，指由第一抗体(片段)和第二抗体(片段)或抗体类似物通过偶联臂所形成的缀合物，偶联的方式包括但不限于化学反应、基因融合，蛋白融合，多肽融合和酶促。“多特异性抗体”包括例如：三特异性抗体和四特异性抗体，前者是具有三种不同抗原结合特异性的抗体，而后者是具有四种不同抗原结合特异性的抗体。
如本文中所使用的，“抗体类似物(antibody mimetics)”，指与抗体一样特异性结合抗原，但却没有抗体结构。它们通常是人工肽或蛋白质，摩尔质量约为3至20kDa。例如，锚蛋白重复蛋白(DARPin)和fynomer。经设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)，与IgG抗体，scFv-Fc抗体片段相连或其组合，如CN104341529A。抗IL-17a的fynomer与抗IL-6R抗体结合，如WO2015141862A1。
在本文中，获得抗体的技术可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如本发明提供的抗体)获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。
如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”、“单抗”、“mAb”具有相同的含义且可互换使用可互换，其是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段，也即，除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。此外，修饰语“单克隆”仅表明该抗体的特征为从高度同源的抗体群中获得，不能理解为需要通过任何特定方法来制备所述抗体。
本发明的单克隆抗体可以通过多种技术进行制备，例如杂交瘤技术(参见，例如Kohler等人.Nature,256:495,1975)，重组DNA技术(参见，例如美国专利申请4,816,567)，或噬菌体抗体库技术(参见，例如Clackson等.Nature352：624-628,1991，或Marks等.J.Mol.Biol.222：581-597,1991)。
例如，可以如下来制备单克隆抗体。首先用免疫原(必要时候添加佐剂)免疫注射小鼠或其它合适的宿主动物。免疫原或佐剂的注射方式通常为皮下多点注射或腹腔注射。可将免疫原预先偶联到某些已知蛋白，如血清白蛋白或大豆胰酶抑制剂上，以增强抗原在宿主内的免疫原性。佐剂可以是弗氏佐剂或MPL-TDM等。动物在接受免疫后，体内将产生分泌特异性结合免疫原的抗体的淋巴细胞。另外，淋巴细胞也可以利用体外免疫获得。收集目的淋巴细胞，并用合适的融合剂，如PEG，使其与骨髓瘤细胞融合以获得杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103,AcademicPress,1996)。上述制备的杂交瘤细胞可以接种到合适的培养液中生长，培养液中优选含有一种或多种能够抑制未融合的、母体骨髓瘤细胞生长的物质。例如，对于缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶(HGPRT或HPRT)的母体骨髓瘤细胞，在培养液中添加次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶(HAT培养基)等物质将可以抑制HGPRT-缺陷细胞的生长。优选的骨髓瘤细胞应该具有融合率高，抗体分泌能力稳定，对HAT培养液敏感等特征。其中，骨髓瘤细胞首选鼠源骨髓瘤，如MOP-21或MC-11小鼠肿瘤衍生株(THE Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,Calif.USA)，和SP-2/0或X63-Ag8-653细胞株(American Type CultureCollection,Rockville,Md.USA)。另外也有研究报道，利用人骨髓瘤和人鼠异源骨髓瘤细胞株制备人单抗(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur et al.,MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications,pp.51-63,Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)。生长杂交瘤细胞的培养液用于检测针对特异抗原的单抗的产生。测定杂交瘤细胞产生的单抗的结合特异性的方法包括例如，免疫沉淀或体外结合试验，如放射免疫试验(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)。例如，可利用Munson等在Anal.Biochem.107:220(1980)描述的Scatchard分析法来测定单抗的亲和力。当确定了杂交瘤产生的抗体的特异性、亲和力和反应性之后，目的细胞株可以通过(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103,Academic Press,1996)所描述的标准的有限稀释法进行亚克隆化。合适的培养液可以是DMEM或RPMI-1640等。另外，杂交瘤细胞还可以腹水瘤的形式在动物体内生长。利用传统的免疫球蛋白纯化方法，如蛋白A琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析等，可以将亚克隆细胞分泌的单抗从细胞培养液、腹水或血清中分离出来。
还可以通过基因工程重组技术获得单克隆抗体。利用特异性结合单抗重链和轻链基因的核酸引物进行PCR扩增，可以从杂交瘤细胞中分离得到编码单抗重链和轻链基因的DNA分子。将所得的DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞(如E.coli细胞、COS细胞、CHO细胞、或其它不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞)，并在合适的条件下进行培养，可以获得重组表达的目标抗体。
抗体可通过公知的技术，例如使用蛋白A或蛋白G的亲和层析进行纯化。随后或作为替代，可将特异性抗原(该抗体识别的靶分子)或其抗原表位固定在柱上，并通过免疫亲合层析法来纯化免疫特异性抗体。免疫球蛋白的纯化可参考例如D.Wilkinson(TheScientist,published by The Scientist,Inc.,Philadelphia Pa.,Vol.14,No.8(Apr.17,2000),pp.25-28)。
如本文中所使用的，术语“表位”是指，抗原上被免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。“表位”在本领域内也称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸，其可以是“线性的”或“构象的”。参见，例如，EpitopeMapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质氨基酸残基而存在。
如本文中所使用的，术语“表位肽”是指，抗原上能够用作表位的肽段。在一些情况下，单独的表位肽即能够被针对所述表位的抗体特异性识别/结合。在另一些情况下，可能需要将表位肽与载体蛋白融合，以便表位肽能够被特异性抗体识别。
如本领域中已知，狂犬病毒G蛋白属于以同源三聚体形式存在的Ⅰ型跨膜蛋白，由1575个碱基组成，可编码524个氨基酸，其中N端第1-19位氨基酸为信号肽，在病毒转录过程中被切除，切除信号肽的G蛋白还需经过在粗面内质网、高尔基体和胞质膜上发生糖基化等内在化修饰才能成为成熟的G蛋白；其中最主要的糖基化位点存在于第37和319位氨基酸上。成熟的G蛋白不含信号肽，由505个氨基酸组成，相对分子质量为56000，等电点为6.7，包括3个区域(膜外区，跨膜区和膜内区)。膜外区由第1-439位氨基酸构成，该区域可识别宿主细胞上的受体，介导病毒膜与宿主膜融合并含有最主要的抗原位点，具有强免疫原性和抗原性。跨膜区由第440-461位氨基酸构成，位于病毒颗粒表面，参与G蛋白嵌入病毒包膜中。膜内区由第462-505位氨基酸构成，位于病毒包膜内，可与M和N蛋白相互作用。成熟G蛋白上主要抗原位点有GⅠ、GⅡ、GⅢ、G5及aG，其中GI位于第226-231位氨基酸残基区段，既包括空间构象抗原位点又包括线性抗原位点；GⅡ是典型的不连续性的空间构象表位，2个主要抗原位点GⅡa(第34-42位氨基酸)和GⅡb(第198-200位氨基酸)通过二硫键相互连接；GⅢ作为最主要的抗原位点，位于第330-338位氨基酸区段，为构象依赖性表位，另外此区域R333是狂犬病毒神经毒性相关位点；次要位点aG，位于第342-343位氨基酸区段，与GⅢ相邻；G5位于261-264位氨基酸区段，是高度保守的线性表位，免疫原性较弱。表位信息见图1。近年来随着分子生物学及计算生物学的发展，G蛋白上其他抗原表位被分离鉴定出，如第14-19位氨基酸区段表位序列为WxxxDI的N-末端线性表位，围绕第251位氨基酸残基的GV及GVI表位(位于第264位氨基酸)。
如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(KD)或半最大效应浓度(EC50)表示。
两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。“结合速率常数”(ka或kon)和“解离速率常数”(kdis或koff)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出(参见Malmqvist M,Nature,1993,361:186-187)。kdis/kon的比率等于解离常数KD(参见Davies等人,Annual Rev Biochem,1990；59:439-473)。可用任何有效的方法测量KD、kon和kdis值。在某些实施方案中，可以使用生物发光干涉测量法(例如ForteBio Octet法)来测量解离常数。除此以外还可用表面等离子共振技术(例如Biacore)或Kinexa来测量解离常数。
如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换，通过保守置换氨基酸得到的抗体的变体保留其来源序列的生物学活性，如特异性地与CLDN18.2结合。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.Natl Acad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，Immunology-ASynthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
附图说明
图1为狂犬病毒G蛋白上抗原位点示意图。
图2显示10株单克隆抗体对疫苗株假病毒的中和结果。
图3显示对狂犬病毒基因进化规律分析；其中，上图显示基于PCoA方法的k-均值聚类分析结果，下图显示利用ML法构建狂犬病毒进化树。
图4显示10株单克隆抗体对59个假病毒的中和活性。
图5显示突变株假毒对四株单抗敏感性变化。其中，X轴代表以CVS-N2C为参考，突变体质粒对单抗中和敏感性变化倍数，Y轴代表的是氨基酸突变位点，自下而上分别是表位I(第226-231位氨基酸)，表位II(第34-42位和198-200位氨基酸)，表位III(330-338位氨基酸)，表位a(第342-343位氨基酸)和表位G5(第261-264位氨基酸)的氨基酸位点。
图6显示四株单抗对12份免疫血清的抑制率。其中，采用阻断ELISA(block ELISA，b/ELISA)方法，利用含狂犬病疫苗原液包板，随后加入单克隆抗体，然后与豚鼠免疫血清反应，探讨了4株单克隆抗体对血清的阻断率。Y轴为阻断率，用Mean±SEM表示；X轴为单抗名称。
图7显示不同单抗配对方案构建的ELISA试剂盒对A、B、C、D四个厂家疫苗的检测结果。根据表7的配对方案，分别制备ELISA检测试剂盒，检测A、B、C、D四个厂家的疫苗，检测结果的X轴为疫苗的稀释倍数，Y轴为OD值。
图8显示06-2A12+07-4D8-1C1作为包被单抗，05-2F10-HRP作为标记单抗，对7个厂家疫苗G蛋白含量测定结果。其中，07-4D8-1C1和06-2A12单抗混合作为包被单抗，混合比率为1:1；05-2F10单抗作为标记单抗；制备试剂盒，检测7个厂家的人用狂犬病疫苗；Y轴为吸光光度值(OD)，X轴为疫苗的稀释倍数。
图9显示ELISA试剂盒的灵敏度测定结果。其中，图a是ELISA试剂盒对抗原标准品的检测结果，X轴为抗原标准浓度，Y轴为OD值。图b是通过将图a的X、Y轴均取对数获得。
图10显示ELISA方法的特异性检测结果。
图11显示本发明ELISA试剂盒与市售G蛋白含量测定试剂盒的灵敏度比较结果。
图12显示本发明ELISA试剂盒对7个不同厂家的人用狂犬病疫苗的测定结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
序列信息简表
实施例1抗体的制备
通过对BALB/c小鼠分别进行蛋白免疫和DNA免疫，获取脾脏进行融合期望筛选到具有广谱中和活性的狂犬单抗。
免疫试剂：
步骤：
1.动物免疫
用中国食品药品检定研究院提供的DNA免疫BALB/c小鼠。DNA质粒60ug/只，与佐剂1:1混合，共免疫3次，每次间隔21天。免疫后第7天采血流式检测血清效价。
2.制备过表达G蛋白的CHO-K1细胞
使用中国食品药品检定研究院提供的DNA质粒瞬转CHO-K1细胞。
3.杂交瘤融合
将小鼠脾脏与SP2/0细胞系融合并将融合后的细胞置于37℃、8％CO2环境中培养。在第12天，通过流式细胞术初步筛选获得与G蛋白结合的阳性克隆。经过多轮检测以及亚克和小规模等培养扩增操作，我们获得了12个具有阻断作用的单克隆抗体。
4.嵌合抗体制备
提取杂交瘤细胞RNA，反转录成cDNA。PCR获得目的片段。将目的片段连接到人的载体上，获得抗体轻链质粒和抗体重链质粒(轻重链V区为鼠源抗体序列，C区为人源抗体序列，抗体亚型为IgG1)。获得的质粒瞬时转移到CHO-S细胞中，通过AKTA获得纯化的抗体，共得到10株单抗，05-2F10、06-2A12、14-4E81-E3、09-2F8、09-3B10-1G11、05-2C12、09-1G11、15-2G4-1F2和07-4D8-1C1，其中，05-2F10、06-2A12、14-4E81-E3和07-4D8-1C1的序列信息见序列信息简表。
实施例2狂犬病毒糖蛋白含量测定的ELISA方法建立
1.单克隆抗体的中和活性
通过建立双抗体夹心ELISA方法来测定人用狂犬病疫苗G蛋白含量，首先通过基于假病毒的中和实验测定了实施例1中获得的10株单克隆抗体(05-2F10、06-2A12、14-4E81-E3、09-2F8、09-3B10-1G11、05-2C12、09-1G11、15-2G4-1F2和07-4D8-1C1)对五种类型疫苗株的假病毒(具体见下表)体外中和活性。
1.1基于狂犬病毒假病毒的中和实验步骤
(1)样品准备：单抗的浓度调节至1000ng/ml。
(2)96孔细胞培养板四周围的36孔均加入265μL的高压灭菌水，以减少边缘效应引起的实验误差。
(3)单抗初始浓度为1000ng/ml，5倍倍比稀释，共5个稀释度，在B4-B11孔加入125μL的浓度为1000ng/ml的单抗。
(4)将B4-B11孔中的液体，轻柔的反复吹吸6-8次，然后转移25μL液体至对应的C4-C11孔，以此类推进行5倍倍比稀释；直到第G行混匀后弃掉25μL。
(5)将分装冻存的假病毒从-80℃冰箱取出，利用DMEM完全培养基稀释至合适的滴度，第3～11列加入50μL/孔。
(6)将96孔细胞培养板置于37℃，5％CO2条件下中和1小时。
(7)在等待的时间将生长状态良好的293T细胞进行消化并细胞浓度稀释至4×105cells/mL。
(8)孵育结束后，每孔加入100μL细胞，即每孔细胞为4×104个。
(9)放入37℃、5％CO2细胞培养箱中培养24小时(表1)。
(10)24小时后，吸弃150μL细胞培养上清，孔内剩余100ul细胞培养上清，加入100μL底物，室温避光反应2min后，反复吹打，转移150μL液体至白板中。
(11)使用PerkinElmer EnSight多功能成像酶标仪读取RLU。
(12)抗体滴度计算：以病毒对照孔中的平均发光值为参考，计算每个样品孔中抑制率，用Reed-Muench公式计算样品的ID50，计算公式如下：
ID50＝10lg(X)+lg(1/K)×(0.5-B)/(A-B)
A：高于50％荧光值比例孔的抑制率
B：低于50％荧光值比例孔的抑制率
X：低于50％荧光值比例的稀释倍数
K：倍比稀释倍数
表1基于假病毒中和实验96孔板排布
实验结果
结果显示(图2)，05-2F10、14-4E8-1E3和07-4D8-1C1单抗对5个疫苗株中和活性最好，离散程度最低，IC50分别在0.68～5.02ng/ml，3.46～32.76ng/ml和1.52～7.05ng/ml的范围。06-2A12和15-2G4-1F2单抗虽然均能有效中和5个疫苗株，但是中和活性离散程度较大，IC50分别在0.16～539ng/ml和0.45～700ng/ml范围。12-2A12、05-2C12、09-3B10-1G11和09-2F8单抗均不能有效中和疫苗株aGV，对其余4个疫苗株中和活性差异大，IC50分别在1.89～36.48ng/ml和4.02～163ng/ml，2.47～28.93ng/ml和3.29～33.71ng/ml的范围。09-1G11单抗的中和活性最差，不能中和疫苗株aGV、CTN-1V和PV，对疫苗株Flury-LEP和PM中和活性较好，IC50分别是3.22ng/ml和2.1ng/ml。
1.2对狂犬病街毒株中和活性
对NCBI网站中狂犬病毒G蛋白的基因序列进行下载，过滤掉不完整、冗余序列后，共得到了2896条狂犬病毒G蛋白基因，基因序列成对比较后通过基于PCoA方法的k-均值聚类将毒株分成了10个簇和利用ML法构建进化树，经过分析发现狂犬病毒的基因进化具有地域特异性和宿主依赖性(图3)；根据毒株基因进化规律挑选80个毒株，其中74个街毒株，用于下一步的研究。
结合文献和流行趋势选取其中的58个街毒和CVS-N2C在内的59个毒株制备成假病毒(见表2)。参照前述1.1中实验操作测定10株单克隆抗体对59个假病毒的中和活性。
结果显示(图4)，06-2A12单抗的中和活性最好，能有效中和所有狂犬病毒株，IC50值在0.065～303.83ng/ml(中位数为2.43ng/ml)；07-4D8-1C1单抗对2株病毒株失去了中和活性，对剩下的48个毒株的具有很好的中和活性，IC50值在0.06～675.37ng/ml之间(中位数为0.96ng/ml)；14-4E8-1E3单抗可有效中和54个病毒株，IC50在0.67～768ng/ml(中位数为19.44ng/ml)；05-2C12单抗对其中53个病毒株具有中和活性，IC50在0.13～659ng/ml(中位数为10.13ng/ml)；09-1G11、15-2G4-1F2和12-2A12单抗可有效中和59个病毒株中的49个，IC50值分别在3.36～902ng/ml(中位数为86.98ng/ml),0.17～790ng/ml(中位数为3.16ng/ml)，0.10～839.70ng/ml之间(中位数为15.69ng/ml)；05-2F10、09-2F8和09-3B10-1G11单抗能成功中和48、45和42个病毒株，IC50值是0.19～882ng/ml(2.18ng/ml)0.24～891ng/ml(中位数为9.56ng/ml)和0.16～782.96ng/ml(中位数3.99ng/ml)。
综上所述，综合单克隆抗体对街毒和疫苗株假病毒的中和结果，挑选05-2F10、06-2A12、07-4D8-1C1和14-4E8-1E3单抗用于后续研究。
2.单克隆抗体的识别表位
为了探寻05-2F10、06-2A12、07-4D8-1C1和14-4E8-1E3单克隆抗体识别的表位，以CVS-N2C为骨架质粒采用定点突变技术将狂犬病毒G蛋白表位内的位点进行氨基酸逐一突变。G蛋白表位内的位点主要包括表位I(第226-231位氨基酸)，表位II(第34-42位和198-200位氨基酸)，表位III(330-338位氨基酸)，表位a(第342-343位氨基酸)和表位G5(第261-264位氨基酸)。将得到的突变体质粒制备成假病毒，在所有突变体中，C228Y/S/Q/R/W显著降低了病毒的感染性或假病毒的形成但其他突变显示出与CVS-N2C相当的病毒感染性。具体操作见下述。
2.1点突变
本研究中共涉及74个单点氨基酸突变，均以CVS-N2C为骨架质粒，利用表3内的引物物进行点突变的扩增，来构建突变体质粒。点突变的PCR扩增反应体系和条件如下表4和5所示。
表3单点突变引物
表4 PCR反应体系
表5 PCR扩增条件
将扩增完成PCR产物取出8μL，加入1μL Dpn I和1μL cutsmart混匀在37℃细菌培养箱酶切≥5h。
2.2狂犬病毒假病毒的制备
(1)将生长状态良好，长满的293T细胞利用胰酶进行消化细胞，将细胞浓度调整为5×105-7×105cell/mL，取出5ml接种至T25的细胞培养瓶中，置于37℃，5％CO2培养条件下培养24h左右，待细胞长至80％～90％左右，进行转染。
(2)取1.5ml EP管标记为A管：依次加入250μL opti-MEM、10μg质粒、10μL P3000，混匀后室温放置5分钟。
(3)取1.5ml EP管标记为B管:依次加入250μL opti-MEM、10μL Lipofectamine3000，混匀后放置5分钟(注：步骤2和3均进行完，同时计时)。
(4)把B管内的液体逐滴加入A管内，室温放置20分钟。
(5)在等待的20分钟内，利用DMEM完全培养基将G*ΔG-luciferase假病毒(VSV假病毒)稀释为7.0×104TCID50/mL。
(6)20分钟后，轻轻弃掉293T的培养基，加入10mL含VSV假毒的完全培养基，随后将转染试剂混合物样品加入到293T细胞内，轻轻混匀，放置于5％CO2，37℃孵箱中培养。
(7)培养3-5小时后，吸出培养基，使用10-15mL PBS(含1％FBS)轻柔、彻底清洗3遍。
(8)加入15mL新鲜的DMEM完全培养基，继续培养。
(9)培养24h后，将细胞上清液吸出，放至50mL离心管中，于4℃冰箱中过夜，另外加15mL新鲜的DMEM完全培养基于293T细胞中继续培养24h，收获细胞上清液。
(10)将2次收获得到的上清混合，4℃，1000rpm离心10min，上清用0.45μm滤器过滤，分装至1.5mlEP管中，-80℃冰箱保存。
2.3狂犬病毒假病毒的滴度测定
(1)病毒稀释：将分装冻存的假病毒从-80℃冰箱取出，在96孔细胞培养板的B2-G2加入150μL假病毒(加入前先稀释10倍)。
(2)B3-G11共54孔加入100μL/孔的DMEM完全培养基。
(3)从B2-G2取出50μL液体加入B3-G3混匀后再取出50μL加入C3-G3，依次类推，进行3倍倍比稀释，8个梯度，到B10-G10混匀后弃掉50μL液体，B11-G11作为细胞对照。
(4)将消化好的细胞悬液稀释到5×105细胞/ml,B2-G11共60个孔，100μL/孔。
(5)在96孔板四周的36孔均加入250μL高压灭菌水封边，减少边缘效应引起的实验误差。
(6)将96孔放于5％CO2、37℃孵箱中，培养24小时。
(7)吸弃100μL/孔培养基上清(孔内剩余100ul细胞上清)，加入100μL荧光检测试剂，避光室温放置2min后，反复吹打后转移150μL液体至白板中。
(8)使用PerkinElmer EnSight多功能成像酶标仪读取发光值(RLU)。
(9)以细胞对照的3倍为cut-off值，大于cut-off值为阳性，低于cut-off值为阴性，用Reed-Muench法计算假病毒的滴度，用TCID50表示。
表6假病毒滴定96孔板排布
2.4基于狂犬病毒假病毒的中和实验参照前述实施例2的1.1中基于狂犬病毒假病毒的中和实验步骤。
通过基于假病毒的中和实验来探究4个单克隆抗体识别的表位和结合的关键氨基酸位点。结果显示，与参考株CVS-N2C相比，突变体C34V、C35W和T36D对05-2F10单抗的敏感性下降均超过100倍，分别下降143倍、214倍和177倍；突变体C35S、T36S和L38Q对05-2F10单抗的敏感性分别下降78倍、25倍和71倍(图5)。
突变体K226Q和G229E对06-2A12单抗的敏感性下降明显，分别下降75倍和123倍。
突变体C35S、L38Q、L38R和F41S对07-4D8-1C1单抗敏感性下降超过100倍，分别下降149倍、107倍、193倍和172倍；突变体C35W和F41Y对07-4D8-1C1单抗的敏感性分别下降31倍和12倍。
突变K198Q对14-4E8-1E3单抗的敏感性下降最明显，下降了417倍；突变体C35S/W、L38Q/R、和E40K对14-4E8-1E3单抗的敏感性下降均超过25倍，其中C35S敏感性下降27倍，C35W敏感性下降29倍，L38Q敏感性下降32倍，L38R敏感性下降30倍，F40K下降38倍，F41下降20倍；突变体K226Q、V230F和L231P/H对14-4E8-1E3单抗敏感性下降10倍、17倍和11倍。
因此，综上所述，单抗05-2F10识别的G蛋白上表位IIa，其中结合的关键氨基酸位点G34、C35、T36；单抗06-2A12识别G蛋白上的表位I，结合的关键氨基酸位点是K226、G229E；单抗07-4D8-1C1单抗识别G蛋白上的表位IIa，结合的关键性氨基酸位点是C35、L38和F41；单抗14-4E8-1E3单抗的Fab与G蛋白结合后形成的占位比较大，主要识别G蛋白上的表位IIb，其中关键的氨基酸位点是K198，另外还识别表位IIa和I，因为氨基酸位点C35，L38、F40以及K226，V230和L231均能不同程度的影响单抗与G蛋白的结合。
3.单克隆抗体在抗狂犬病血清中优势
为了探究4株单克隆抗体(05-2F10、06-2A12、07-4D8-1C1和14-4E8-1E3)在免疫血清中是否是优势表位，我们采用阻断ELISA(block ELISA，b/ELISA)方法，利用含狂犬病疫苗原液包板，随后加入单克隆抗体，然后与豚鼠免疫血清反应，探讨了4株单克隆抗体对血清的阻断率。阻断率越高，说明阻断效力越明显，单抗结合的抗原位点是血清抗体与抗原结合的优势位点，单抗是血清中的优势抗体。本研究我们共选用12份免疫豚鼠血清，其中CTN-1V、Flury-LEP、aGV、PM、PV和CVS-N2C免疫血清各2份。
具体操作步骤如下：
(1)包被：用PBS将狂犬病疫苗原液稀释70倍，以100μL/孔的体积加入到酶标板中，4℃过夜；
(2)封闭：利用洗板机洗板5次，扣干，用1％BSA PBST封闭，37℃孵育1小时，甩掉封闭液；
(3)条件摸索：将血清以1:10为起始进行倍比稀释(稀释液按照材料方法1.7.5提到的进行配置)，观察可以与抗原产生剂量效应关系的稀释度；将单抗以100μg/mL为起始浓度倍比稀释，确定单抗与抗原结合的饱和浓度；
(4)加入单抗与血清：分别加入100μL不同的过饱和单抗，以血清稀释液作为未阻断对照，37℃孵育1小时；
(5)洗板机洗板5次扣干，加入倍比稀释好的待检血清，37℃孵育1小时后洗板扣干；
(6)加入二抗：每孔加入100μL稀释好的抗豚鼠lgG-HRP，37℃孵育1小时洗板后扣干；
(7)显色：洗板5次，扣干，将显色A、B液等比例混合后，100μL/孔，37℃避光孵育15分钟；
(8)终止：每孔加入50μL终止液，酶标仪设置检测波长450nm，参比波长620nm；
(9)阻断率计算：以未阻断孔OD值在0.8～1.5之间的稀释度计算阻断率
阻断率＝(1-OD样品/OD自身对照)×100％
结果显示，05-2F10和14-4E8-1E3单抗对疫苗免疫血清的抑制率较高，其次是07-4D8-1C1单抗，06-2A12单抗最低。05-2F10单抗对血清抑制率为6.32％～56.32％(平均值为35.84％),其中8份血清的抑制＞30％，而且5份血清被抑制＞50％；14-4E8-1E3单抗对血清的抑制率为18.38％～46.62％(平均值35.15％)其中8份血清抑制率>30％；07-4D8-1C1单抗对血清抑制率为21.03～38.59％(平均值30.01％)其中8份血清被抑制＞30％；06-2A12单抗对血清的抑制率为-3.33％～40.71％(平均值25.04％)其中4份血清被抑制＞30％(图6)。
4.包被和标记单抗的确定
通过上述研究结果我们选定了05-2F10、06-2A12、07-4D8-1C1和14-4E8-1E3单抗。为了进一步确定可用于ELISA试剂盒的包被和标记单抗，利用正交实验的方式将四株单抗进行配对，确定包被和标记单抗。在标记单抗时发现14-4E8-1E3在标记HRP后活性受到影响，所以14-4E8-1E3单抗仅作为包被单抗。利用下表内的30种配对方案制备ELISA试剂盒，(表7)。
表7包被和检测单抗配对结果
具体实验操作步骤如下：
(1)平衡：将试剂盒平衡至室温(约30分钟)；
(2)配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释；
(3)稀释：按需求对标准品及待测样品进行稀释。如采用WHO标准品建议，起始稀释比例为1:200，梯度稀释至少共4个浓度，作为标准曲线；
(4)加样：分别在相应孔中加入样品100μL,每板应设1孔空白对照(用双波长检测，可不设空白对照孔)；
(5)温育：用封板膜封板后，置37℃温育30分钟；
(6)洗板：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干；
(7)加酶标试剂：每孔加入酶标试剂100μL，空白孔除外；
(8)温育：用封板膜封板后，置37℃温育30分钟；
(9)洗板：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干；
(10)显色：每孔加入显色剂A、B混合液100μL，轻轻振荡混匀，37℃避光显色15分钟；
(11)测定：每孔加终止液50μL，轻轻振荡混匀，10分钟内测定结果，设定酶标仪波长于450nm处(建议用双波长450nm/600～650nm检测)，用空白孔调零后测定各孔A值；
(12)结果计算：以标准品的抗原含量及其对应的吸光度A值做双对数曲线，求出线性回归方程，将待测样品吸光度的对数值代入回归方程，求得相应样品中抗原含量。
根据表7的单抗配对方案，制备ELISA检测试剂，检测A、B、C和D等四个厂家生产的狂犬病疫苗。从检测结果来看，07-4D8-1C1单抗无论是单独作为包被单抗还是作为标记单抗对A和D公司疫苗检测反应性极低；06-2A12单抗无论是作为包被单抗还是标记单抗对四个厂家疫苗的结合活性均很高；14-4E8-E3单抗由于识别表位占位大，可能会影响标记单抗的结合，所以当14-4E8-1E3单抗作为包被单抗时试剂盒的灵敏度均比较低，几乎不能识别A和D公司生产的狂犬病疫苗内的G蛋白；相比于其他三株单抗，05-2F10单抗更适合用作标记单抗(图7)。此外根据检测结果，06-2A12包被，05-2F10-HRP标记；05-2F10+06-2A12包被，05-2F10-HRP标记；07-4D8-1C1+06-2A12包被，05-2F10-HRP标记的配对方案均可成功高效的检测四个厂家的疫苗。
为了实现所构建的ELISA方法对不同毒株的疫苗检测结果灵敏度相当，结合前期中和实验结果和对人用狂犬病疫苗G蛋白含量测定结果，优选使用07-4D8-1C1+06-2A12包被，05-2F10-HRP标记方法。利用该配对方法检测了7个厂家生产的狂犬病疫苗，结果显示，06-2A12+07-4D8-1C1包被，05-2F10-HRP标记方法可成功检测出7个厂家的疫苗，并且对7个厂家疫苗检测灵敏度相当(图8)。
实施例3ELISA方法学验证
参照实施例2中实验方法，对本发明建立的ELISA检测方法的灵敏度、特异性、精密度、准确度以及适用性进行验证。
1.灵敏度
将WHO抗原标准品从5IU/ml稀释至0.1IU/ml，然后进行2倍梯度稀释，以测定A450的吸光度值(OD值)。抗原参考浓度作为横坐标，OD值作为纵坐标，并进行四个参数拟合(图9)。最终确定线性范围为0.05～0.003125IU/ml，最低检测限为0.003125IU/ml。标准曲线方程为Y＝64.81X-0.08275，R2＝0.9994。
2.特异性
建立的ELISA方法用于检测人用狂犬病疫苗和狂犬病假病毒，结果呈强阳性，检测值随样品稀释率的增加呈下降趋势(图10)；流感疫苗、Vero细胞培养基和牛血清的结果均为阴性。结果表明，该方法特异性强，仅能用于检测狂犬病毒，非狂犬病毒成分不干扰检测。
3.精密度
精密度评估标准为变异系数(CV)≤15％。CV＝SD/平均值×100％。用ELISA方法检测高浓度(0.0125IU/ml)和低浓度(0.00625IU/ml)疫苗标准品。在5天内，每天对每个样品重复测试10次，结果如表8所示。两种浓度标准试剂的日内和日间精密度的变异系数均在15％以内，因此精密度良好。
4.准确度
准确度评定标准为测量偏差小于15％。测量偏差＝∣(测量值-理论值)/理论值∣×100％。将抗原标准品从5IU/ml稀释至0.00625IU/ml(低浓度)和0.0125IU/ml(高浓度)。试验结果表明，两种浓度三次测定标准结果的相对偏差不超过15％，说明该方法的准确度符合要求(表9)。
表9 ELISA方法的准确度结果
5.ELISA试剂盒的适用性
本实施例比较了本发明构建的ELISA方法与其他两家(N和W公司)市售G蛋白含量测定试剂盒的灵敏度，将WHO抗原标准品从5IU/ml稀释至0.1IU/ml，然后进行2倍梯度稀释，以测定A450的吸光度值(OD值)，本试剂盒的灵敏度明显高于其他两家公司G蛋白含量定量试剂盒(图11)。在本研究构建的ELISA方法的灵敏度在0.05～0.003125IU/ml范围内，其他两家公司的试剂盒与抗原标准品的结合能力极低。
本实施例进一步比较了本发明的ELISA方法和其他两个市售试剂盒对7个厂家(A-G公司)疫苗检测灵敏度。结果显示，本发明构建的ELISA方法可高效检测这七个厂家的人用狂犬病疫苗的G蛋白疫苗抗原含量(图12)。而N和W公司生产G蛋白定量试剂盒均不能用于测定A公司生产的人用狂犬病疫苗的G蛋白含量。此外，本发明构建的ELISA方法对七个家生产的疫苗内G蛋白含量反应的敏感性均高于N和W公司的G蛋白定量试剂盒(图12)，而且该ELISA方法对七个厂家疫苗内G蛋白检测灵敏度相当。因此，本发明建立的ELISA方法可用于检测来自不同生产商、病毒株和培养细胞系生产的狂犬病疫苗的G蛋白含量。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (12)
1.特异性结合狂犬病毒G蛋白的抗体或其抗原结合片段，选自(1)-(4)：
(1)含有下述的VH和/或VL的抗体或其抗原结合片段：
(1-1)：包含如下3个CDRs的VH，和/或，包含如下3个CDRs的VL：
CDR-H1：按Chothia编号系统定义，序列为SEQ ID No：1，按Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：25；
CDR-H2：按Chothia编号系统定义，序列为SEQ ID No：2，按Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：26；和
CDR-H3：按Chothia或Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：3；
CDR-L1：按Chothia或Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：4；
CDR-L2：按Chothia或Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：5；
CDR-L3：按Chothia或Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：6；
或，
(1-2)：与(1-1)中所述的VH或VL相比，至少一个CDR含有突变，所述突变为一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)；所述含有突变的抗体或其抗原结合片段仍然能特异地结合狂犬病毒G蛋白；
(2)含有下述的VH和/或VL的抗体或其抗原结合片段：
(2-1)：包含如下3个CDRs的VH，和/或，包含如下3个CDRs的VL：
CDR-H1：按Chothia编号系统定义，序列为SEQ ID No：7，按Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：27；
CDR-H2：按Chothia编号系统定义，序列为SEQ ID No：8，按Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：28；和
CDR-H3：按Chothia或Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：9；
CDR-L1：按Chothia或Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：10；
CDR-L2：按Chothia或Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：11；
CDR-L3：按Chothia或Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：12；
或，
(2-2)：与(2-1)中所述的VH或VL相比，至少一个CDR含有突变，所述突变为一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)；所述含有突变的抗体或其抗原结合片段仍然能特异地结合狂犬病毒G蛋白；
(3)含有下述的VH和/或VL的抗体或其抗原结合片段：
(3-1)：包含如下3个CDRs的VH，和/或，包含如下3个CDRs的VL：
CDR-H1：按Chothia编号系统定义，序列为SEQ ID No：13，按Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：29；
CDR-H2：按Chothia编号系统定义，序列为SEQ ID No：14，按Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：30；和
CDR-H3：按Chothia或Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：15；
CDR-L1：按Chothia或Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：16；
CDR-L2：按Chothia或Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：17；
CDR-L3：按Chothia或Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：18；
或，
(3-2)：与(3-1)中所述的VH或VL相比，至少一个CDR含有突变，所述突变为一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)；所述含有突变的抗体或其抗原结合片段仍然能特异地结合狂犬病毒G蛋白；
和，
(4)含有下述的VH和/或VL的抗体或其抗原结合片段：
(4-1)：包含如下3个CDRs的VH，和/或，包含如下3个CDRs的VL：
CDR-H1：按Chothia编号系统定义，序列为SEQ ID No：19，按Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：31；
CDR-H2：按Chothia编号系统定义，序列为SEQ ID No：20，按Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：32；和
CDR-H3：按Chothia或Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：21；
CDR-L1：按Chothia或Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：22；
CDR-L2：按Chothia或Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：23；
CDR-L3：按Chothia或Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID No：24；
或，
(4-2)：与(4-1)中所述的VH或VL相比，至少一个CDR含有突变，所述突变为一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)；所述含有突变的抗体或其抗原结合片段仍然能特异地结合狂犬病毒G蛋白；
优选地，所述的置换为保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段的VH和/或VL中包括来自人或鼠的免疫球蛋白的构架区(FRs)。
2.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，选自(1)-(4)：
(1)含有下述的VH和/或VL的抗体或其抗原结合片段：
(1-1)SEQ ID NO：33所示的VH；和/或，SEQ ID NO：34所示的VL；
(1-2)所述抗体或其抗原结合片段所包含的VH与(1-1)中所述的VH相比，具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的同一性；和/或，所述抗体或其抗原结合片段所包含的VL与(1-1)中所述的VL相比，具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的同一性；
或者，
(1-3)所述抗体或其抗原结合片段所包含的VH与(1-1)中所述的VH相比，具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)；和/或，所述抗体或其抗原结合片段所包含的VL与(1-1)中所述的VL相比，具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)；优选地，所述的置换是保守置换；
(2)含有下述的VH和/或VL的抗体或其抗原结合片段：
(2-1)SEQ ID NO：35所示的VH；和/或，SEQ ID NO：36所示的VL；
(2-2)所述抗体或其抗原结合片段所包含的VH与(2-1)中所述的VH相比，具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的同一性；和/或，所述抗体或其抗原结合片段所包含的VL与(2-1)中所述的VL相比，具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的同一性；
或者，
(2-3)所述抗体或其抗原结合片段所包含的VH与(2-1)中所述的VH相比，具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)；和/或，所述抗体或其抗原结合片段所包含的VL与(2-1)中所述的VL相比，具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)；优选地，所述的置换是保守置换；
(3)含有下述的VH和/或VL的抗体或其抗原结合片段：
(3-1)SEQ ID NO：37所示的VH；和/或，SEQ ID NO：38所示的VL；
(3-2)所述抗体或其抗原结合片段所包含的VH与(3-1)中所述的VH相比，具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的同一性；和/或，所述抗体或其抗原结合片段所包含的VL与(3-1)中所述的VL相比，具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的同一性；
或者，
(3-3)所述抗体或其抗原结合片段所包含的VH与(3-1)中所述的VH相比，具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)；和/或，所述抗体或其抗原结合片段所包含的VL与(3-1)中所述的VL相比，具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)；优选地，所述的置换是保守置换；
和，
(4)含有下述的VH和/或VL的抗体或其抗原结合片段：
(4-1)SEQ ID NO：39所示的VH；和/或，SEQ ID NO：40所示的VL；
(4-2)所述抗体或其抗原结合片段所包含的VH与(4-1)中所述的VH相比，具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的同一性；和/或，所述抗体或其抗原结合片段所包含的VL与(3-1)中所述的VL相比，具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的同一性；
或者，
(4-3)所述抗体或其抗原结合片段所包含的VH与(4-1)中所述的VH相比，具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)；和/或，所述抗体或其抗原结合片段所包含的VL与(4-1)中所述的VL相比，具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)；优选地，所述的置换是保守置换。
3.权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体包含：
1)人免疫球蛋白的CH(重链恒定区)或其变体，所述变体与其所源自的野生型序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；
和/或，
2)人免疫球蛋白的CL(轻链恒定区)或其变体，所述变体与其所源自的野生型序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；
优选地，所述CH是IgG重链恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区；
优选地，所述抗体包含人IgG1的重链恒定区；
优选地，所述抗体包含如SEQ ID NO：41所示的CH或其变体，所述变体与SEQ ID NO：41相比具有至多20个氨基酸的保守置换(例如至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的保守置换)；
优选地，所述CL是κ轻链恒定区；
优选地，所述抗体包含如SEQ ID NO：42所示的CL或其变体，所述变体与SEQ ID NO：42相比具有至多20个氨基酸的保守置换(例如至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的保守置换)；
更优选的，所述抗体包含如SEQ ID NO：41所示的CH和/或如SEQ ID NO：42所示的CL。
4.权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体为：
(1)包括SEQ ID NO：33所示序列的VH和SEQ ID NO：41所示序列的CH的重链，和，包括SEQ ID NO：34所示序列的VL和SEQ ID NO：42所示序列的CL的轻链；
(2)包括SEQ ID NO：35所示序列的VH和SEQ ID NO：41所示序列的CH的重链，和，包括SEQ ID NO：36所示序列的VL和SEQ ID NO：42所示序列的CL的轻链；
(3)包括SEQ ID NO：37所示序列的VH和SEQ ID NO：41所示序列的CH的重链，和，包括SEQ ID NO：38所示序列的VL和SEQ ID NO：42所示序列的CL的轻链；
或者，
(4)包括SEQ ID NO：39所示序列的VH和SEQ ID NO：41所示序列的CH的重链，和，包括SEQ ID NO：40所示序列的VL和SEQ ID NO：42所示序列的CL的轻链。
5.权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段选自ScFv、Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、双抗体(diabody)、双特异性抗体和多特异性抗体。
6.编码权利要求1-5中任一项所述的抗体的重链可变区和/或轻链可变区的多核苷酸。
7.一种包括权利要求6所述的多核苷酸的载体。
8.一种包括权利要求6所述的多核苷酸或权利要求7所述的载体的宿主细胞。
9.一种检测狂犬病毒的酶联免疫试剂盒，包括包被抗体和/或酶标抗体，所述包被抗体和酶标抗体独立选自权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段中的一种或多种；
优选的，所述包被抗体为下述两个抗体的混合物：1)包括SEQ ID NO：33所示序列的VH和SEQ ID NO：41所示序列的CH的重链，和，包括SEQ ID NO：34所示序列的VL和SEQ ID NO：42所示序列的CL的轻链；以及2)包括SEQ ID NO：35所示序列的VH和SEQ ID NO：41所示序列的CH的重链，和，包括SEQ ID NO：36所示序列的VL和SEQ ID NO：42所示序列的CL的轻链；优选的，所述混合物中1)和2)所述抗体的混合比率为1：1；
优选的，所述酶标抗体为包括SEQ ID NO：37所示序列的VH和SEQ ID NO：41所示序列的CH的重链，和，包括SEQ ID NO：38所示序列的VL和SEQ ID NO：42所示序列的CL的轻链；
优选的，所述酶标抗体上的标记酶选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶。
10.权利要求9所述的酶联免疫试剂盒，包括包被有所述包被抗体的酶标板、所述酶标抗体和阳性对照，其中，所述阳性对照为狂犬病毒G蛋白标准品。
11.检测狂犬病毒G蛋白在生物样品中的存在或其水平的方法，其包括使用权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或者权利要求9或10所述的试剂盒的步骤；
优选的，所述生物样品为疫苗。
12.权利要求1-5所述的抗体或其抗原结合片段、或权利要求6或7所述的酶联免疫试剂盒在定性或定量检测狂犬病毒G蛋白中的用途。
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