JP2011160681A - Ａ型インフルエンザのヘマグルチニンに対する抗体およびその利用 - Google Patents

Abstract

【課題】Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンの各サブタイプを網羅的に認識する抗体を提供する。
【解決手段】Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンに対する抗体であって、Ａ型インフルエンザウイルスのＨ１、Ｈ３、およびＨ５型のヘマグルチニンを何れも認識する抗体、抗体断片、当該抗体または抗体断片を利用するＡ型インフルエンザウイルスの検出試薬、検出キット、検出器具、および検出方法、当該抗体または抗体断片をコードする遺伝子。
【選択図】なし

Description

本発明は、Ａ型インフルエンザのヘマグルチニンに対する抗体に関するものであり、特に、Ａ型インフルエンザのヘマグルチニンの複数のサブタイプを認識する抗体に関するものである。

インフルエンザウイルスには、３つの型（Ａ、ＢおよびＣ）が存在することがよく知られている。これらのうちＡ型のウイルスは、広範囲の鳥類および哺乳類に対して感染する。一方、Ｂ型およびＣ型のウイルスは、基本的には、ヒトに限定的である。近年、インフルエンザウイルスに対する研究は、Ａ型にフォーカスされている。これは、そう遠くない将来において、Ａ型のウイルスの大流行（パンデミック）が起きる可能性があるためである。

Ａ型のインフルエンザウイルスは、その表面上の抗原であるヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）分子の血清学的な反応性によって、いくつかのサブタイプに分類される（非特許文献１、２）。すなわち、１６個のＨＡサブタイプ（ＨＡ１〜ＨＡ１６）および９個のＮＡサブタイプ（ＮＡ１〜ＮＡ９）が存在し、それゆえ、１４４（１６×９）種類のインフルエンザＡウイルスが存在し得る。例えば、Ｈ１Ｎ１（本明細書において、ＮＡサブタイプを省略して、単に、Ｈ１サブタイプと表記することがある。）、Ｈ２Ｎ２（同様に、Ｈ２サブタイプと表記することがある。）、Ｈ３Ｎ２（同様に、Ｈ３サブタイプと表記することがある。）、Ｈ５Ｎ１（同様に、Ｈ５サブタイプと表記することがある。）等が挙げられる。前三者（Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３）は、１９１８年のヨーロッパ、１９５７年のアジア、１９６８年の香港において、それぞれ大流行を引き起こした。Ｈ５は、トリインフルエンザウイルスとして注目されている。

インフルエンザウイルスがヒトの細胞に感染するときの最も重要な過程の一つは、ウイルスの表面上のヘマグルチニン分子が、ヒトの細胞の細胞膜に結合し、融合する過程である。この過程では、ヘマグルチニン（ＨＡ₀）分子の全体が、ホスト細胞のプロテアーゼによって、二つのサブユニット（ＨＡ₁およびＨＡ₂）に分割される。一方、ノイラミニダーゼ分子は、感染細胞からのウイルスの出芽に関与する。

このように、ヘマグルチニン分子は、感染において主要な役割を有し、ワクチン防御の複雑性の原因となる多数のサブタイプを有している。また、ヘマグルチニン分子に対する抗体がいくつか報告されている（非特許文献３、４）。また、本発明者らは、ヘマグルチニンを認識するとともに分解する抗体酵素を報告している（特許文献１）。

特開２００６−３４７９２２（平成１８年１２月２８日公開）

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しかし、Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンの各サブタイプを網羅的に認識する抗体は知られていない。これは、以下の理由による。図９は、Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンの系統樹を示す図である（非特許文献１、２）。示すように、各サブタイプは、Ｈ１グループと、Ｈ３グループとに分類される。多くの場合、Ｈ１サブタイプのヘマグルチニンを認識する抗体は、Ｈ２サブタイプのヘマグルチニンとも反応する。これは、Ｈ１サブタイプおよびＨ２サブタイプのヘマグルチニンのアミノ酸配列が互いに類似しているためである。また、図９に示すように、Ｈ５サブタイプおよびＨ１サブタイプもまた近縁であり、両者を認識する抗体もあり得る。しかし、図９に示すように、Ｈ３サブタイプは、Ｈ１グループとは非常に異なる。それゆえ、Ｈ１グループ（例えば、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ５サブタイプ）のヘマグルチニンと反応する抗体は、Ｈ３サブタイプの抗体をほとんど認識しない（非特許文献３、４）。したがって、これまで、一つの抗体を用いて、Ａ型インフルエンザウイルスを網羅的に検出することは困難であった。

本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンの各サブタイプを網羅的に認識する抗体を提供することを主たる目的とする。

本発明者らは、鋭意検討の結果、独自に設計した配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるエピトープ（ＩｎｆＡペプチド）を用いて取得した抗体（ＩｎｆＡ−１５抗体）が、驚くべきことに、少なくとも、Ｈ１サブタイプ（Ｈ１グループの）、Ｈ３サブタイプ（Ｈ３グループ）、およびＨ５サブタイプ（Ｈ１グループ）のヘマグルチニンおよびインフルエンザウイルスを認識することを見出し、発明を完成させた。

すなわち、本発明に係る抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンに対する抗体であって、Ａ型インフルエンザウイルスのＨ１、Ｈ３、およびＨ５型のヘマグルチニンを何れも認識することを特徴としている。

上記抗体は、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるエピトープを認識することが好ましい。

上記抗体は、また、重鎖可変領域におけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第３１〜３５番目、第５０〜６５番目、第９８〜１０６番目であり、軽鎖可変領域におけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ、配列番号３に示されるアミノ酸配列の第２４〜３９番目、第５５〜６１番目、第９４〜１０２番目であることが好ましい。

上記抗体は、また、重鎖可変領域が、以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、以下の（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列からなることが好ましい：（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の、第１〜３０番目、第３６〜４９番目、第６６〜９７番目、および／または第１０７〜１１６番目において、１個または数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列；（ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列；（ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列の、第１〜２３番目、第４０〜５４番目、第６２〜９３番目、第１０３〜１１４番目において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列。

本発明に係る抗体断片は、上記抗体の少なくとも一つの可変領域を含み、Ａ型インフルエンザウイルスのＨ１、Ｈ３、およびＨ５型のヘマグルチニンを何れも認識することを特徴としている。

本発明に係るＡ型インフルエンザウイルスの検出試薬は、上記抗体または上記抗体断片を含有していることを特徴としている。

本発明に係るＡ型インフルエンザウイルスの検出キットは、上記抗体または上記抗体断片を備えていることを特徴としている。

本発明に係るＡ型インフルエンザウイルスの検出器具は、上記抗体または上記抗体断片が固定されていることを特徴としている。

本発明に係るＡ型インフルエンザウイルスの検出方法は、検査対象物を上記抗体または上記抗体断片とともにインキュベートする工程を包含することを特徴としている。

本発明に係る遺伝子は、上記抗体または上記抗体断片をコードすることを特徴としている。

上記遺伝子は、配列番号２または４に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有していることが好ましい。

本発明に係る発現ベクターは、上記遺伝子を含んでいることを特徴としている。

本発明に係る形質転換体は、上記遺伝子が導入されていることを特徴としている。

本発明に係る抗体または抗体断片を生産する方法は、上記遺伝子を宿主に発現させることによって、上記抗体または上記抗体断片を生産することを特徴としている。

本発明に係る抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスの、少なくとも、Ｈ１、Ｈ３、およびＨ５サブタイプのヘマグルチニンを認識し、Ａ型インフルエンザウイルスの重要なサブタイプのほとんどを検出することができる。

図１は、Ａ型インフルエンザウイルスの４つのサブタイプにおけるヘマグルチニン分子のＨＡ₂サブユニットのアミノ酸配列のアライメントを示す図である。 図２は、ヘマグルチニン分子の立体構造を示す図であり、（ａ）は、ヘマグルチニン分子の三量体を示し、（ｂ）は、単量体を示す。 図３は、抗原ペプチドによって免疫したマウスから得られた血清の力価を示すグラフであり、（ａ）は、ＩｎｆＡペプチドによって免疫した場合を示し、（ｂ）は、ＩｎｆＢペプチドによって免疫した場合を示し、（ｃ）は、ＩｎｆＣペプチドによって免疫した場合を示す。 図４は、各モノクローナル抗体の結合定数を、等温適定熱量測定（ＩＴＣ）により測定した結果を示す図であり、（ａ）は、ＩｎｆＡ−１８モノクローナル抗体についての典型的な熱量的な滴定結果を示し、（ｂ）は、生データから計算された積分点および適合線を示す。 図５は、ＩｎｆＡシリーズモノクローナル抗体の推定アミノ酸配列のアライメントを示す図である。 図６は、分子モデリングにより推定されたＩｎｆＡシリーズモノクローナル抗体の可変領域の立体的なコンホメーションを示す図である。 図７は、インフルエンザウイルスの各サブタイプに対する各ＩｎｆＡシリーズモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロットの結果を示す図であり、（ａ）および（ｂ）は、対照試験の結果を示し、（ｃ）は、Ｈ１Ｎ１サブタイプについての結果を示し、（ｄ）は、Ｈ３Ｎ１サブタイプについての結果を示し、（ｅ）は、Ｈ５サブタイプについての結果を示す。 図８は、Ｈ１、Ｈ３、およびＨ５サブタイプのインフルエンザウイルスおよび組換えＨＡ₂に対する各ＩｎｆＡシリーズモノクローナル抗体の反応性を示すグラフであり、（ａ）は、Ｈ１サブタイプのＨＡ₂タンパク質に対する反応性を示し、（ｂ）は、Ｈ３サブタイプのＨＡ₂タンパク質に対する反応性を示し、（ｃ）は、Ｈ５サブタイプのＨＡ₂タンパク質に対する反応性を示し、（ｄ）は、Ｈ１Ｎ１サブタイプのインフルエンザウイルスに対する反応性を示し、（ｅ）は、Ｈ３Ｎ２サブタイプのインフルエンザウイルスに対する反応性を示す。 図９は、Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンの系統樹を示す図である。

〔１：本発明の抗体およびその断片〕
本発明者は、Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのＨＡ₂サブユニットの各サブタイプのアミノ酸配列に基づき独自に設計したエピトープ（ＩｎｆＡペプチド）を用いてマウスを免疫し、得られた複数のモノクローナル抗体について検討した結果、そのうちの一つ（ＩｎｆＡ−１５抗体）が、少なくとも、Ｈ１サブタイプ（Ｈ１グループの）、Ｈ３サブタイプ（Ｈ３グループ）、およびＨ５サブタイプ（Ｈ１グループ）のヘマグルチニンおよびインフルエンザウイルスを認識することを見出した。また、このＩｎｆＡ−１５抗体における、相補性決定領域（ＣＤＲ）、Ｈ鎖およびＬ鎖の可変領域のアミノ酸配列およびそれらをコードする遺伝子の塩基配列を同定した。

配列番号１には、ＶＨ鎖のアミノ酸配列が示される。配列番号１に示すＶＨ鎖のアミノ酸配列において、３１番目〜３５番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１、５０番目〜６５番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２、９８番目〜１０６番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３に対応している。

一方、配列番号３は、ＶＬ鎖のアミノ酸配列を示している。配列番号３に示すＶＬ鎖のアミノ酸配列において、２４〜３９番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１、５５番目〜６１番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２、９４番目〜１０２番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３に対応している。

本発明の抗体およびその断片は、上記ＶＨ鎖およびＶＬ鎖、並びにそれらのＣＤＲとして、配列番号１および３に示される配列に限定されるものではなく、それらの一部が改変された変異ポリペプチドであってもよい。

すなわち、ＶＨ鎖可変領域としては、（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、のみならず、（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣＤＲ１〜３以外の部分、すなわち、ＦＲ１（１〜３０番目）、ＦＲ２（３６〜４９番目）、ＦＲ３（６６〜９７番目）、および／またはＦＲ４（１０７〜１１６番目）において、１またはそれ以上（好ましくは数個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ａ型インフルエンザウイルスのＨ１、Ｈ３、およびＨ５型のヘマグルチニンに対するＨ鎖可変領域となるポリペプチド、も含まれる。

同様に、ＶＬ鎖可変領域は、（ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、のみならず、（ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列のＣＤＲ１〜３以外の部分、すなわち、ＦＲ１（１〜２３番目）、ＦＲ２（４０〜５４番目）、ＦＲ３（６２〜９３番目）、および／またはＦＲ４（１０３〜１１４番目）において、１またはそれ以上（好ましくは数個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ａ型インフルエンザウイルスのＨ１、Ｈ３、およびＨ５型のヘマグルチニンに対するＬ鎖可変領域となるポリペプチド、も含まれる。

ここで、上記「１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、及び／又は付加できる程度の数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されることを意味する。したがって、例えば、上記（ｂ）のポリペプチドは、上記（ａ）のポリペプチドの変異ペプチドであり、ここにいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異ポリペプチドを単離精製したものであってもよい。

なお、上記「変異」は、検出器具や検出キットなどとして利用する場合には、特に制限されないが、本発明の抗体またはその断片を、治療薬として利用する場合（ヒトに投与する場合）には、ヒト由来の構造またはヒトが免疫反応を起こさない範囲で行う。

また、本発明に係る抗体およびその断片は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。このようなポリペプチドが付加される場合としては、例えば、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等によって本発明のタンパク質がエピトープ標識されるような場合が挙げられる。

なお、ＣＤＲは抗原を認識する領域であるため、Ａ型インフルエンザウイルスのＨ１、Ｈ３、およびＨ５型のヘマグルチニンは相補性決定領域に認識される。したがって、少なくとも上記ＣＤＲを有する抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスのＨ１、Ｈ３、およびＨ５型のヘマグルチニンを特異的に認識できる。すなわち、上記ＶＨ鎖およびＶＬ鎖は、少なくとも前記ＶＨ鎖およびＶＬ鎖のＣＤＲを含んでいればよく、それ以外は、イムノグロブリンのＶＨ鎖およびＶＬ鎖のアミノ酸配列であればよい。これにより、Ａ型インフルエンザウイルスのＨ１、Ｈ３、およびＨ５型のヘマグルチニンに対する特異性は保持される。

なお、「抗体」または「抗体断片」は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびこれらのＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、Ｆｃフラグメント）を意味し、例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体およびヒト化抗体が挙げられるがこれらに限定されない。

また、「或る抗体が或る抗原を認識する」という表現は、「或る抗体が或る抗原に特異的に結合する」、または「或る抗体は、或る抗原に対する抗体である」といった表現と交換可能に用いられる。

さらに、本発明の抗体およびその断片には、安定性や抗体価を向上させるために、修飾剤が結合されていてもよい。すなわち、本発明の抗体およびその断片は、修飾抗体であってもよい。この修飾剤としては、例えば、糖鎖や高分子などが挙げられる。糖鎖修飾を行った場合には、その糖鎖が何らかの生理活性を有する可能性があるが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの単純な高分子修飾を行った場合にはそれ自体生理活性を示さない。さらに、ＰＥＧ化によって肝臓での吸収を抑制したり、血中での安定性を向上したりする可能性がある。つまり、修飾剤としては、ＰＥＧなどの単純高分子が好ましい。

なお、本発明の抗体およびその断片の修飾剤による修飾は、前述の変異ペプチドの作製と同様に、治療薬として利用する場合には、ヒトが免疫反応を起こさない範囲で行い、検出器具や診断キットなどとして利用する場合には、特に制限されない。

また、後述する実施例に示すように、本発明に係る抗体について、本発明者らは以下の知見を得ている：（あ）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるエピトープを認識する；（い）Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのほとんどのサブタイプ（Ｈ１、Ｈ３、およびＨ５）のＨＡ₂サブユニットおよびウイルス本体を認識する。

後述するように、本発明に係る抗体は、ＩｎｆＡペプチド（ＧＭＶＤＧＷＹＧ：配列番号５）をエピトープとして用いてマウスを免疫することにより取得されたものであり、ＩｎｆＡペプチドを認識することが実証されている。また、非特許文献５には、ＩｎｆＡペプチドの１番目および５番目のアミノ酸に相当する二つのグリシンが、細胞融合の際に重要な働きをすることが示されている。本発明に係る抗体を得るために用いたＩｎｆＡペプチド（配列番号５）は、上記二つのグリシンを含み、後述するように高い抗原性を示した。

また、後述する様に、本発明に係る抗体（ＩｎｆＡ−１５）は、ＩｎｆＡ−１５ペプチドを用いて取得した６つのモノクローナル抗体のうち、最も低い結合定数を示した（１０^-6Ｍオーダー、他の５つは１０^-8Ｍオーダー）。ＩｎｆＡペプチドは短いペプチド（８アミノ酸）であるが、本発明に係る抗体が認識する領域は、他とは異なり、立体構造も異なることが示唆される。また、ＩＴＣ試験の結果（エンタルピーおよびエントロピー）によれば、本発明に係る抗体は、抗原に対して弱く結合し、結合によるコンホメーションの変化は少ないと考えられる。

本発明に係る抗体または抗体断片は、例えば、後述する実施例のように、配列番号５に示されるエピトープで免疫したマウス等の免疫動物の脾臓細胞と、マウスのミエローマ細胞等の融合パートナーとを融合させてなるハイブリドーマにより、モノクローナル抗体を産生した後に、得られたモノクローナル抗体を、本明細書において開示した本発明に係る抗体に関する知見（交叉反応性、アミノ酸配列等）に基づいて選別することにより製造してもよい。

上記モノクローナル抗体の産生は、当該分野において公知の技術（例えば、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５−４９７（１９７５））、トリオーマ法、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４，７２（１９８３））およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７−９６（１９８５））などを参照のこと）を用いればよい。

ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）_２ならびに本発明に係る抗体の他の抗体断片が、本明細書中で開示される方法に従って使用され得ることは、当業者には明白である。このようなフラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生じる）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントを生じる）のような酵素を使用するタンパク質分解による切断によって産生され得る。

また、本発明に係る抗体または抗体断片は、後述するように、本発明の組換え発現ベクターを用いて作製した、本発明の形質転換体によっても生産することが可能である。

また、本発明に係る抗体は、ポリクローナル抗体であってもよい。

〔２：本発明にかかる遺伝子〕
本発明にかかる遺伝子は、上記〔１：本発明の抗体およびその断片〕で説明した抗体またはその断片をコードする遺伝子であり、配列番号２または４に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域として有する遺伝子、およびその塩基配列の一部を改変した改変遺伝子が含まれる。

上記の遺伝子は、本発明の抗体またはその断片をコードしているので、適当な宿主（例えば細菌、酵母）に導入して、本発明の抗体またはその断片を発現させることができる。

さらに、上記「遺伝子」は、上記〔１：本発明の抗体およびその断片〕に記載の抗体またはその断片をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。例えば、配列番号２または４に記載の配列をベクター配列につないで本発明の遺伝子を構成し、これを適当な宿主で増幅させることにより、本発明の遺伝子を所望に増幅させることができる。また、本発明の遺伝子の一部配列をプローブに用いてもよい。

〔３：本発明の組換え発現ベクター等〕
本発明の組換え発現ベクターは、前記〔２：本発明にかかる遺伝子〕に記載の遺伝子、すなわち、上記〔１：本発明の抗体およびその断片〕に記載の抗体またはその断片をコードする遺伝子を含むものであり、例えば、配列番号２または４に示される何れかの塩基配列を有するｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターが挙げられる。組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。

このように、組換え発現ベクターは、本発明の遺伝子を含むものである。ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、ホスト細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、ホスト細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係る遺伝子を各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。

本発明の遺伝子がホスト細胞に導入されたか否か、さらにはホスト細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。例えば、ホスト細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーと本発明の遺伝子とを含むプラスミド等を発現ベクターとしてホスト細胞に導入する。これによってマーカー遺伝子の発現から本発明の遺伝子の導入を確認することができる。あるいは、本発明に係る抗体またはその断片を融合タンパク質として発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰをマーカーとして用い、本発明に係る抗体またはその断片をＧＦＰ融合タンパク質として発現させてもよい。

上記ホスト細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、上記〔２：本発明にかかる遺伝子〕に記載の遺伝子が全長ＤＮＡの場合のホスト細胞としては、ヒト又はマウス由来の細胞をはじめとして、線虫、アフリカツメガエルの卵母細胞、各種哺乳動物（ラット、ウサギ、ブタ、サル等）の培養細胞、あるいは、キイロショウジョウバエ、カイコガ等の昆虫の培養細胞等などの動物細胞が挙げられ、ＤＮＡフラグメントの場合のホスト細胞としては、例えば、大腸菌等の細菌、酵母（出芽酵母や分裂酵母）などを挙げることができるが、特に限定されるものではない。

上記発現ベクターをホスト細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。

本発明の形質転換体は、前記〔２：本発明にかかる遺伝子〕に記載の遺伝子、すなわち、上記〔１：本発明の抗体およびその断片〕に記載の抗体またはその断片をコードする遺伝子が導入された形質転換体である。ここで、「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味する。

〔４：本発明の抗体およびその断片の利用方法〕
（４−１）Ａ型インフルエンザウイルスの検出試薬、検出キット、検出器具および検出方法
上記〔１：本発明の抗体およびその断片〕の抗体、その抗体断片、または修飾抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンの各サブタイプに対して網羅的に結合するため、Ａ型インフルエンザウイルスの検出・測定などに利用することができる。

本発明に係るＡ型インフルエンザウイルスの検出器具によれば、例えば、飲用水、下水、水槽水、浴槽水、血液、尿、被検試料の懸濁液などに含まれるＡ型インフルエンザウイルスを高精度に検出できる。それゆえ、Ａ型インフルエンザウイルスの検査、研究、調査等に利用することができる他、疾患の判定や治療効果の評価を行うための診断用、治療用としても利用できる。

なお、本発明のＡ型インフルエンザウイルスの検出器具は、本発明の抗体における少なくともＣＤＲのアミノ酸配列を用いればよい。Ａ型インフルエンザウイルスの検出器具は、種々の条件下でのＡ型インフルエンザウイルスの検出・測定などに利用できる。本発明のＡ型インフルエンザウイルスの検出器具としては、例えば、Ａ型インフルエンザウイルスと特異的に結合する本発明の抗体またはその断片を基盤（担体）上に固定化した抗体チップや抗体カラム等が挙げられる。

また、本発明の抗体またはその断片は、イムノアフィニティークロマトグラフィーによるＡ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンの精製にも極めて有用である。この精製方法は、本発明の抗体またはその断片をヘマグルチニンとそれ以外の物質の混合物に接触させて抗体またはその断片にヘマグルチニンを吸着させる工程と、吸着したヘマグルチニンを抗体またはその断片から脱着させ、採取する工程を含むものである。この精製方法によれば、ヘマグルチニンを短時間かつ高精度に精製できる。

本発明の抗体またはその断片、およびそれらの修飾抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスを検出するための試薬（Ａ型インフルエンザウイルスの検出試薬）としても広範な用途を有する。すなわち、これらの抗体またはその断片によるラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイなどの標識イムノアッセイを適用するときには、被検試料中のＡ型インフルエンザウイルス、Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニン、またはそのＨＡ₂サブユニットを迅速且つ正確に定性又は定量分析することができる。この標識イムノアッセイでは、上記抗体またはその断片は、例えば、放射性物質、酵素及び／又は蛍光物質により標識して用いられる。また、これらの抗体およびその断片は、Ａ型インフルエンザウイルスに特異的に反応し、免疫反応を呈するので、その免疫反応を標識物質を指標に測定すれば、被検試料中のごく微量のＡ型インフルエンザウイルス（または、ヘマグルチニンもしくはそのＨＡ₂サブユニット）を精度良く検出することができる。標識イムノアッセイは、バイオアッセイと比較して、一度に数多くの被検試料を分析できるうえに、分析に要する時間と労力が少なくてすみ、しかも、分析が高精度であるという特徴がある。

また、本発明の抗体またはその断片は、Ａ型インフルエンザウイルスを検出するためのキット（Ａ型インフルエンザウイルスの検出キット）に備えられた形態で提供されてもよい。用語「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図される。「備えた（備えている）」は、キットを構成する個々の容器のいずれかの中に内包されている状態が意図される。

このように、本発明のＡ型インフルエンザウイルスの検出試薬、検出キット、検出器具および検出方法は、各サブタイプのＡ型インフルエンザウイルスを網羅的に検出することができるために極めて有用である。すなわち、従来の季節性のインフルエンザだけでなく、鳥型や新型のインフルエンザにも対応することができる可能性がある。

（４−２）その他
なお、本発明の抗体またはその断片は、各サブタイプのＡ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンに対して結合する。ヘマグルチニンは、インフルエンザウイルスがヒトの細胞に感染する際に重要な働きをすることが知られており、本発明の抗体またはその断片を用いれば、Ａ型インフルエンザウイルスの治療または予防を行える可能性がある。よって、Ａ型インフルエンザウイルスの治療または予防のための薬学的組成物として、本発明の抗体またはその断片を含むものを使用してもよい。

上記薬学的組成物は、直接注入により投与され得る。本発明に係る薬学的組成物はまた、非経口投与、粘膜投与、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与、眼内投与または経皮的投与のために処方され得る。代表的には、組成物中に含まれるタンパク質は、０．０１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重の用量、好ましくは、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは、０．１〜１ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与され得る。

上記薬学的組成物は、本発明に係る抗体以外に、薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤（それらの組み合わせを含む）を含み得る。また、本発明に係る抗体は、修飾抗体であってもよい。このとき、本発明に係る抗体は、他の薬剤をインフルエンザウイルスと特異的に反応させるための送達剤として働くものであり得る。

上記薬学的組成物は、ヒトまたは動物についての使用のためのものであり、そして代表的には、薬学的に受容可能な希釈剤、キャリア、または賦形剤の任意の１つ以上を含む。治療的使用のための薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤は、薬学分野で周知であり、そして例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９８５）に記載される。薬学的に需要可能なキャリア、賦形剤または希釈剤の選択は、意図された投与経路および標準的薬学的慣行に従って、当業者によって容易に選択され得る。また、本発明に係る薬学的組成物は、任意の適切な結合剤、滑沢剤、懸濁剤、被覆剤または可溶化剤をさらに含み得る。

異なる送達系に依存して、組成／処方の必要条件は、異なり得る。例示として、本発明に係る薬学的組成物は、ミニポンプを使用してまたは粘膜経路により、例えば、吸入のための鼻スプレーまたはエアロゾルとして、あるいは非経口的に送達するために処方され得る（ここで本発明に係る薬学的組成物は、例えば、静脈内経路、筋肉内経路もしくは皮下経路による送達のために注射可能形態として処方される）。あるいは、この処方物は、両方の経路により送達されるように設計され得る。

本明細書中の記載に基づけば、当業者は、本発明に係る薬学的組成物の別の形態（例えば、キット）、および、本発明に係る薬学的組成物を用いて疾患を処理（予防および／または治療）する方法もまた本発明の範囲内であることを、容易に理解する。

〔１：抗原ペプチドの配列の抽出および抗原ペプチドの合成〕
ヘマグルチニン分子（ＨＡ₀：６１ｋＤａ）は、二つのサブユニットＨＡ₁およびＨＡ₂から構成される。前者の分子量は約３８ｋＤａであり、後者の分子量は約２５ｋＤａである。本発明者らは、まず、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のデータベースを参照し、ＨＡ₂サブユニットに注目してヘマグルチニン分子のアミノ酸配列を調査した。

図１は、Ａ型インフルエンザウイルスの４つの重要なサブタイプ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、およびＨ５：それぞれ、スペイン、アジア、ホンコンにおける大流行、およびトリインフルエンザに対応する。）におけるヘマグルチニン分子のＨＡ₂サブユニットのアミノ酸配列のアライメントを示す図である。なお、図中、「−」で示されているのは、同列の最も上段（Ｈ１）に記載されたアミノ酸と同一のアミノ酸を指す。

本発明者らは独自に、上記アライメントから３つの短い配列（ＧＭＶＤＧＷＹＧ（配列番号５、ＩｎｆＡ）、ＹＮＡＥＬＬＶ（配列番号６、ＩｎｆＢ）、およびＮＧＴＹＤ（配列番号７、ＩｎｆＣ））を抽出した（図１枠囲み内）。これら３つの配列は、上記サブタイプ間において完全に保存されていた。

図２は、ヘマグルチニン分子の立体構造を示す図であり、（ａ）は、ヘマグルチニン分子の三量体を示し、（ｂ）は、単量体を示す。図２（ｂ）において、「ＨＡ₂」はＨＡ₂サブユニットの位置を、「Ａ」はＩｎｆＡの位置を、「Ｂ」はＩｎｆＢの位置を、「Ｃ」はＩｎｆＣの位置をそれぞれ示す。図２（ｂ）に示すように、ＩｎｆＡペプチド配列は、膜貫通領域の近傍に位置し、外部に向かっている。ＩｎｆＢペプチド配列は、ＨＡ₂サブユニットの上部においてヘリックス構造を有している。ＩｎｆＣペプチド配列は、ＨＡ₂サブユニットの膜貫通領域の近傍に位置する。

続いて、本発明者らは、ＩｎｆＡペプチド、ＩｎｆＢペプチド、およびＩｎｆＣペプチドを、Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫するための抗原ペプチドとして合成した。具体的には、Ｆｍｏｃ固相法を用いて、ＧＭＶＤＧＷＹＧ（配列番号５、ＩｎｆＡペプチド）、ＹＮＡＥＬＬＶ（配列番号６、ＩｎｆＢペプチド）、およびＮＧＴＹＤ（配列番号７、ＩｎｆＣペプチド）のそれぞれのアミノ酸配列を有するペプチドを合成した。各ペプチドには、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と結合させるため、Ｎ末端にＣｙｓ残基を付加した。また、Ｃｙｓ残基を付加していないペプチドを、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法、Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）に供するため合成した。各合成ペプチドは質量分析により同定した。また、ＨＰＬＣ分析による結果は、９５％を超える純度を示した。Ｂａｌｂ／ｃマウスの免疫のため、各ペプチドに対し、Ｎ末端に付加したＣｙｓ残基を介して、ＢＳＡを結合した。

〔２：血清の力価の測定〕
ＢＳＡと結合された上記合成ペプチド（ＩｎｆＡ、ＩｎｆＢ、またはＩｎｆＣペプチド）を用いて、Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫した。２週間後、免疫したマウスから血液を採集し、ＥＬＩＳＡにより、血清の力価を決定した。これを４回繰り返した。

ＥＬＩＳＡは、次のように行った。ＰＢＳに溶解した抗原ＩｎｆＡペプチド、ＩｎｆＢペプチド、またはＩｎｆＣペプチド（４μｇ／ｍｌ、１ウェル当たり１００μｌ）を、４℃において、一晩、マイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）上にコートした。続いて、上記プレートを、３０分間、室温において、２％のゼラチンおよび０．０５％のＮａＮ₃を含むＰＢＳによってブロッキングし、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）によって洗浄した。洗浄バッファーにより作成した血清の希釈系列を、上記プレートの各ウェルに加え、１時間、室温においてインキュベートした。洗浄後、各ウェルを５０μｌの１０００倍に希釈したアルカリホスファターゼ標識抗マウスＩｇ（Ｇ＋Ａ＋Ｍ）抗体（Ｃａｐｐｅｌ、ＣＡ、ＵＳＡ）とともに、１時間、室温においてインキュベートした。ＰＢＳ−Ｔによるさらなる４回の洗浄の後、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（Ｓｉｇｍａ、ＳＴ Ｌｏｕｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を含む溶液を、発色のための基質として加えた。６０分間のインキュベーションの後、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＵＳＡ）を用いて４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。

第１回目の免疫時から、第４回目の免疫時までの結果を図３に示す。図３において、（ａ）は、ＩｎｆＡペプチドによって免疫した場合を示し、（ｂ）は、ＩｎｆＢペプチドによって免疫した場合を示し、（ｃ）は、ＩｎｆＣペプチドによって免疫した場合を示す。また、図３の横軸は、力価の測定に供した血清の希釈率を示し、縦軸は、４０５ｎｍにおける吸光度を示す。

図３に示すように、ＩｎｆＡペプチドは、免疫に用いた３つの抗原のうちで最も高い力価を示した。２番目は、ＩｎｆＢペプチドであった。ＩｎｆＣペプチドについては、免疫を４回繰り返したにもかかわらず、力価の上昇はほとんど観察されなかった。

〔３：モノクローナル抗体の作製〕
ＢＳＡと結合されたＩｎｆＡペプチド（ＧＭＶＤＧＷＹＧ（配列番号５））を用いて、以下のようにモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を調製した。

まず、１匹当たり１００μｇの上述のＢＳＡ結合ペプチド（濃度１．０ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液）を、同容量のフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ；Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ、ＵＳＡ）とともにエマルジョン化し、雌Ｂａｌｂ／ｃマウスに対して皮下免疫した。さらに、第２回目の免疫（第１回目の免疫の２週間後、ＦＣＡとともに）、第３回目の免疫（第１回目の免疫の４週間後、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ；Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とともに）、第４回目の免疫（第１回目の免疫の６週間後、ＦＩＡとともに）をそれぞれ、マウス１匹当たり１００μｇの上記ＢＳＡ結合ペプチドを皮下注射することにより実施した。細胞融合の３日前（第１回目の免疫の６３日後）に、最終投与量がマウス１匹当たり１００μｇとなるように２００μｌのＰＢＳに溶解された上記ＢＳＡ結合ペプチドを腹腔内注射した。

そして、血清の力価が高かった（５８０および９４０）マウスから脾臓細胞を取り出し、５０％ＰＥＧ１５００（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、当該脾臓細胞と、ミエローマＳＰ／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）とを、５：１の比率で融合させた。得られた融合細胞を、９６ウェル培養プレート（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ ＣＯ．、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）の各ウェルに移し、ＨＡＴ培地中で培養した。改変ＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）を用いて、上記融合細胞から、抗体を分泌する細胞をスクリーニングした。上記改変ＥＬＩＳＡでは、抗原として（ｉ）ＢＳＡと結合されたＧＭＶＤＧＷＹＧ（配列番号５）ペプチド（ＩｎｆＡペプチド）、（ｉｉ）ペプチドのみ、または（ｉｉｉ）ＢＳＡのみを用いた。スクリーニングにより得られたハイブリッド細胞を、限界希釈法を用いてクローニングした。結果的に、上記ペプチドに対して特異的な抗体を分泌するハイブリドーマとして、６つのクローン（ＩｎｆＡ−３、−６、−９、−１０、−１５、−１８ｍＡｂ：ＩｎｆＡシリーズモノクローナル抗体）を確立した。

さらに、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＰｒｏｔｅｉｎＡ ＭＡＰＳ−ＩＩ ｋｉｔ（日本バイオラッドラボラトリーズ、東京）を用いて、製造者の指示に従い、モノクローナル抗体を精製した。まず、ハイブリドーマ細胞株をプリスタン注入した雌のＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に注射することにより、モノクローナル抗体を含む腹水を得た。５ｍｌの腹水を、同容量の硫酸アンモニウムの飽和溶液と混合した。混合物を遠心分離し、沈殿を回収して５ｍｌのＰＢＳを加えた。遠心分離および沈殿の回収を３回繰り返した後、ＰＢＳに対して２回透析を行った。モノクローナル抗体を含むＰＢＳ溶液を分注し、同容量のＭＡＰＳ−ＩＩの結合バッファーと混合した。得られた混合物を、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｇｅｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を充填したカラムベッドにアプライし、結合したモノクローナル抗体を溶出させた。溶出したモノクローナル抗体を、４℃において、２回、ＰＢＳに対して透析した。得られた抗体を、３回、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０（Ａｍｉｃｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて限外ろ過した。

〔４：モノクローナル抗体の解析〕
得られたモノクローナル抗体について、マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（ＩｓｏＳｔｒｉｐ（商標）、Ｒｃｈｅ１４９３０２７、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）を用いてアイソタイピングを行った。モノクローナル抗体のアイソタイプは、ＩｎｆＡ−１５以外はＩｇＧ₁であり、ＩｎｆＡ−１５はＩｇＧ_2bであった。また、全ての抗体において、軽鎖はκ型であった。

（交叉反応性）
ＴＰ４１−１（ＴＰＲＧＰＤＲＰＥＧＩＥＥＥＧＧＥＲＤＲＤ（配列番号８）、ＨＩＶ−１のｇｐ４１の保存領域）、ＩＡＨ（ＴＧＬＲＮＧＩＴＮＫＶＮＳＵＩＥＫＡＡ（配列番号９）、Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡ₁およびＨＡ₂における保存配列を組み合わせた配列のペプチド）、ＨＡｃ（ＷＧＩＨＨＰＧＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥ（配列番号１０）、Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡ₁およびＨＡ₂の部分を組み合わせた配列のペプチド）、ならびに、ＢＳＡ、ＨＳＡ、およびヒトヘモグロビン等の無関係なタンパク質を用いて、モノクローナル抗体の交叉反応性を調査した。

ＩｎｆＡペプチド、無関係なペプチド、および他のタンパク質が溶解したＰＢＳ溶液（４μｇ／ｍｌ）５０μｌを、４℃において、一晩、イムノプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）上に固定した。２％のゼラチンを用いて、室温において、３０分間ブロッキングした。ＰＢＳ−Ｔによりプレートを洗浄した後、モノクローナル抗体を免疫反応させた。続いて、アルカリホスファターゼ標識抗マウスＩｇ（Ｇ＋Ａ＋Ｍ）抗体（Ｃａｐｐｅｌ）を反応させた。ｐ−ニトロフェニルホスフェート（Ｓｉｇｍａ）を用いた基質反応の後、イムノプレートリーダー（ＩｍｍｎｏＭｉｎｉ、ＮＪ−２３００、Ｎａｌｇｅｎ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｋ．Ｋ．、東京）を用いて４０５ｎｍの吸光バンドを測定した。

結果、すべてのモノクローナル抗体は、免疫に用いたＩｎｆＡペプチドに対して特異的に反応し、他の供試分子に対しては反応しなかった（データ示さず）。

また、後述するように、ウエスタンブロッティングでは、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン分子以外に濃いバンドは検出されなかった（図７）。これは、得られたモノクローナル抗体が高い特異性を有していることを示している。

（抗原ペプチドへの親和性）
各モノクローナル抗体の結合定数を、等温適定熱量測定（ＩＴＣ）により測定した。すなわち、ＩｎｆＡシリーズモノクローナル抗体の各々と抗原性のペプチドとの間の相互作用の熱力学的なパラメーターを、微小滴定熱量計（ＭｉｃｒｏＣａｌ，Ｉｎｃ、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）により決定した。測定条件は以下のとおりである：熱量計のセルに、４．３μＭのＩｎｆＡモノクローナル抗体および１３５ｍＭのＮａＣｌを含む１５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）を注入し、２５℃において、同一バッファー（ｐＨ７．５）に溶解した１２５μＭのＩｎｆＡ（ＧＭＶＤＧＷＹＧ、配列番号５）抗原ペプチド溶液により滴定した。リガンド（ペプチド）溶液は、２８秒の間に、１４μｌずつ、１４回注入した。サーモグラフのデータは、ＭｉｃｒｏＣａｌ，Ｉｎｃより提供されたコンピューターソフトウェア（Ｏｒｉｇｉｎ）により解析した。

図４（ａ）に、ＩｎｆＡ−１８モノクローナル抗体についての典型的な熱量的な滴定結果を示し、図４（ｂ）に、生データから計算された積分点、および最小二乗解析により得られた適合線を示す。また、全てのＩｎｆＡモノクローナル抗体についての解析結果を表１にまとめた。

表１に示すように、ＩｎｆＡ−３、−６、および−９の結合定数は、互いにほぼ同等の〜１．８×１０⁸Ｍ^-1という値を示した。一方、ＩｎｆＡ−１０、−１５、および−１８の結合定数は、それよりも低い１０⁷〜１０⁶Ｍ^-1という値を示した。特に、ＩｎｆＡ−１５の結合定数は、とても低い値（８．６×１０⁶Ｍ^-1）を示した。対照的に、ＩｎｆＡ−１５のエンタルピー（ΔＨ）およびエントロピー（ΔＳ）は、一連のモノクローナル抗体のうちで最も高い値を示した。

（コンホメーション）
ＩｎｆＡシリーズモノクローナル抗体の各々について、定法に基づいて抗体のｃＤＮＡを取得し、ｃＤＮＡからアミノ酸配列を推定した。図５（ａ）は、重鎖におけるアミノ酸配列を示し、図５（ｂ）は、軽鎖におけるアミノ酸配列を示す。なお、図中、「−」で示されているのは、同列の最も上段（ＩｎｆＡ−３）に記載されたアミノ酸と同一のアミノ酸を指し、「・」は、その位置のアミノ酸が欠損していること（ギャップ）を示す。

上記アミノ酸配列を用いて、分子モデリングを行い、モノクローナル抗体の可変領域の立体的なコンホメーションを推定した（図６）。図６（ａ）はＩｎｆＡ−３の、図６（ｂ）はＩｎｆＡ−６の、図６（ｃ）はＩｎｆＡ−９の、図６（ｄ）はＩｎｆＡ−１０の、図６（ｅ）はＩｎｆＡ−１５の、図６（ｆ）はＩｎｆＡ−１８の可変領域のコンホメーションをそれぞれ示す。また、「Ｈ」は重鎖の、「Ｌ」は軽鎖の、「１」はＣＤＲ１の、「２」はＣＤＲ２の、「３」はＣＤＲ３の位置をそれぞれ示す。図６に示すように、重鎖および軽鎖の構造は、それぞれ、二つにグループ分けし得ることが認められた。

ＩｎｆＡ−３、−６、−９、および−１０（グループＨ−１）の重鎖のコンホメーションは、互いに類似していた。一方、ＩｎｆＡ−１５および−１８（グループＨ−２）の重鎖のコンホメーションは、ＩｎｆＡ−３、−６、−９、および−１０のものとは異なっており、ＩｎｆＡ−１５および−１８の間で似たようなコンホメーションを示した。このことは、各々のアミノ酸配列を比較することで、よく理解し得る。すなわち、図５（ａ）に示すように、ＩｎｆＡ−３および−６の配列は、互いに非常に類似していた。また、ＩｎｆＡ−９および−１０は、１０アミノ酸を超える変異を示し、変異したアミノ酸はほぼ同一であった。これら４つの重鎖（グループＨ−１）は、同一の生殖細胞系列(germline)遺伝子（ＶＨＪ６０６）に属していた。上記４つの重鎖と、ＩｎｆＡ−１５および−１８の重鎖と見比べれば、後２者の重鎖の配列は、前４者の重鎖の配列とかなり異なっており、当該２者の重鎖は、同一のグループ（グループＨ−２）に分類され得る。

軽鎖については、ＩｎｆＡ−３、−６、−９、−１０、および−１５（グループＬ−１）におけるＣＤＲのコンホメーションは互いに類似しており、ＩｎｆＡ−１８（グループＬ−２）のそれとは異なっていた。アミノ酸配列において、ＩｎｆＡ−３、−６、−９、および−１０は、ＣＤＲ１、２、および３において、いくつかの変異を有していた。図５（ｂ）に示すように、ＩｎｆＡ−１５のＣＤＲにおける変異は少しであった。すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３において、それぞれ４つ、１つ、４つの変異を有していた。ＩｎｆＡ−１５モノクローナル抗体における変異の数は、ＩｎｆＡ−３、−６、−９、および−１０モノクローナル抗体のそれよりも大きいが、ＩｎｆＡ−１８の配列は、他の５つのモノクローナル抗体に対してさらに大きく異なっていた。ＩｎｆＡ−１８は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３において、それぞれ８つ、５つ、５つの変異を有していた。フレームワーク（ＦＲ）領域を比較すると、ＩｎｆＡ−１８は、多くの変異を有していたが、他のＩｎｆＡモノクローナル抗体は、そのような変異を有していなかった。したがって、ＩｎｆＡ−１５モノクローナル抗体の軽鎖は、ＩｎｆＡ−３、−６、−９、および−１０と同じグループに属していると認められた。

以上のように、ＩｎｆＡ−３、−６、−９、および−１０では、可変領域の構造は、グループＨ−１およびグループＬ−１から構成されていた。ＩｎｆＡ−１８は、グループＨ−２およびグループＬ−２から構成されていた。ＩｎｆＡ−１５は、グループＨ−２およびグループＬ−１の組み合わせからなる特徴的な構成を有していた。

構造についてより詳細に見れば、軽鎖のＣＤＲ２およびＣＤＲ１のコンホメーションは、ＩｎｆＡ−３、−６、−９、および−１０（グループＬ−１）の間で非常に類似していた。これらの抗体において、重鎖のＣＤＲ３のコンホメーションは、ＩｎｆＡ−３と−６との間、および、ＩｎｆＡ−９とＩｎｆＡ−１０との間で類似していた。ＩｎｆＡ−１８の軽鎖のＣＤＲ１のコンホメーションは、特徴的であり、他の５つのモノクローナル抗体から大きく異なっていた。

〔４：インフルエンザウイルスの各サブタイプへの各モノクローナル抗体の反応性〕
（Ｈ１Ｎ１サブタイプ）
１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有ＰＢＳに溶解したＡ型インフルエンザ（Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ／７３／２００１ＣＬ−４（Ｈ１Ｎ１））を用いて試験を行った。精製されたインフルエンザウイルスとしては、卵中で培養されたものを用いた。組換えＨＡ₂（ｒＨＡ₂）は、次のように調製したものを用いた：インフルエンザウイルス（Ａ／Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ／３７／２００１（Ｈ１Ｎ１））由来のヘマグルチニン（Ｈ１サブタイプ）のＨＡ₂ドメインのｃＤＮＡを、以下のプライマーを用いたＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により合成した：ＮｄｅＩサイトを含むフォワードプライマー（５’−ＡＣＡＣＡＣＡＴＡＴＧＧＧＴＴＴＧＴＴＴＧＧＡＧＣＣＡＴ−３’：配列番号１１）；および、ＸｈｏＩサイトを含むリバースプライマー（５’−ＡＡＡＡＡＡＣＴＣＧＡＧＧＡＴＧＣＡＴＡＴＴＣＴＡＣＡＣＴ−３’：配列番号１２）。ＰＣＲ成果物の一部を、アガロースゲル電気泳動により解析した。組換えＨＡ₂ドメインタンパク質の発現のためのプラスミドを構築するため、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡフラグメントを、発現ベクターｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）と連結させた。Ｅ．Ｃｏｌｉ（Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ（ＤＥ３））を、形質転換し、最終濃度が１ｍＭであるイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加えることにより、ＨＡ₂ドメインタンパク質を誘導した。得られたタンパク質の分子量は、アガロースゲル電気泳動により、２７ｋＤａと推定された。

まず、組換えＨＡ₂に対するポリクローナル抗体を用いた対照試験を行った。図７（ａ）は、不活性化したインフルエンザウイルスのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（銀染色）の結果を示し、図７（ｂ）は、上記ポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロットの結果を示す。それぞれ、還元条件（Ｒｅｄｕｃｅｄ）および非還元条件（Ｎｏｎ Ｒｅｄｕｃｅｄ）での結果を示す。図７（ｂ）において、Ｈ１Ｎ１ウイルスのＨＡ₂に対応する濃いバンド（２６〜２９ｋＤａ）が（特に、還元条件下において）見られた。

次に、ＩｎｆＡシリーズモノクローナル抗体を用いた試験を行った。還元条件下において、精製したモノクローナル抗体（ＩｎｆＡシリーズ）を３μｇ／ｍｌの濃度で用いてウェスタンブロットを実施した。詳細には：染色無しでＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％ゲル）を実施した後、タンパク質をゲルからＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ ＰＶＤＦメンブレンへと転写した（転写条件：２ｍＡ／ｃｍ²、９０分間）。ＰＶＤＦメンブレンを、３％スキムミルクおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳによりブロッキングした。続いて、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）により洗浄し、室温において、１時間、モノクローナル抗体（３μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした。さらに、ＴＢＳ−Ｔにより洗浄した後、ペルオキシダーゼに結合している二次抗体（抗マウスＩｇ（Ｇ＋Ａ＋Ｍ）ウサギ抗体）と、室温において、１時間反応させた。そして、ＴＢＳ−Ｔによる洗浄の後、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）を用いて発色させた。

結果を図７（ｃ）に示す。レーン１は、マーカーを示し、レーン２は、ウイルス全体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（銀染色、還元条件下）の結果を示し、レーン３、４、５、６、７、および８は、それぞれ、ＩｎｆＡ−３、−６、−９、−１０、−１５、および−１８モノクローナル抗体を用いたウェスタンブロットの結果を示す。

図７（ｃ）に示すように、レーン７（ＩｎｆＡ−１５モノクローナル抗体）において、Ｈ１Ｎ１種のウイルスのヘマグルチニン分子のＨＡ₂サブユニットに対応する分子量約２８ｋＤａの濃いバンドが観察された。なお、ＨＡ₂サブユニットは、２５ｋＤａとして現れるべきとも考えられるが、約２８ｋＤａに検出された。これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを還元条件下において実施したために、バンドが少し高分子側にシフトしたものと考えられる。約２８ｋＤａのバンドは、ＨＡ₂サブユニットに対して、ポリクローナル抗体を用いた試験においても確認された（データ示さず）。

また、同じ分子量において、非常に弱いバンドが、レーン３、４、５、および６（それぞれ、ＩｎｆＡ−３、−６、−９、および−１０に対応）でも検出された。レーン８（ＩｎｆＡ−１８）では、肉眼ではバンドが検出されなかった。なお、約８０ｋＤａのかすかなバンドは、糖鎖が結合したヘマグルチニン分子全体（ＨＡ₀)と考えられる。

（Ｈ３Ｎ１サブタイプ）
同様に、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有ＰＢＳに溶解したインフルエンザウイルス（Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ／７１／２００１（Ｈ３Ｎ１））を用いた試験を行った。結果を、図７（ｄ）に示す。示すように、レーン７（ＩｎｆＡ−１５）において、Ｈ３サブタイプのヘマグルチニンのＨＡ₂サブユニットの単量体に対応する約２８ｋＤａの濃いバンドが、明確に確認された。なお、本試験でもまた、約８０ｋＤａのバンドが観察された。

（Ｈ５Ｎ２サブタイプ）
本発明者らはさらに、Ｈ５サブタイプに対応するＨＡ₂サブユニットに対するモノクローナル抗体の反応性を調査した。試験の安全性のため、Ｈ５Ｎ２サブタイプのインフルエンザウイルスそのものの代わりに、Ｅ．Ｃｏｌｉにおいて発現させたＨ５サブタイプのＨＡ₂サブユニット（ｒＨＡ₂；膜貫通領域が除かれた２１ｋＤａ）を用いた。その他については、Ｈ１Ｎ１サブタイプおよびＨ３Ｎ１サブタイプについての試験と同様に行った。結果を、図７（ｅ）に示す。なお、レーン２には、Ｈ５サブタイプのＨＡ₂サブユニットを発現するＥ．Ｃｏｌｉの細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（銀染色、還元条件下）の結果を示す。

示すように、すべてのモノクローナル抗体がＨ５サブタイプの組換えＨＡ₂（２１ｋＤａ）と反応した。また、モノクローナル抗体のうち、ＩｎｆＡ−１５（レーン７）が、最も濃いバンドを示した。

以上のように、ＩｎｆＡ−１５モノクローナル抗体のみが、Ｈ１、Ｈ３、およびＨ５サブタイプのＨＡ₂サブユニットのすべてに対して強く反応した。

〔５：Ｈ１、Ｈ３、およびＨ５サブタイプのインフルエンザウイルスおよび組換えＨＡ₂についてのＥＬＩＳＡ〕
ＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）の実施のため、各ＩｎｆＡシリーズモノクローナル抗体（５μｇ／ｍＬ）を、イムノプレート（ＮｕｎｃＦ９６）にコートし、４℃において、一晩、インキュベートした。そこに、Ｈ１、Ｈ３、またはＨ５サブタイプのインフルエンザウイルスまたはＨＡ₂タンパク質（組換えＨＡ₂）の希釈系列を、室温において反応させた。反応後、市販のインフルエンザウイルスＡＢ型に対するウサギポリクローナル抗体（Ｔａｋａｒａ Ｍ１４８／００３ＦＤＦ、京都、日本）をウェルにアプライした。続いて、ウサギＩｇＧに対するＰＯＤ標識アフィニティー精製ヤギ抗体（Ｃａｐｐｅｌ）を上記ウサギポリクローナル抗体と反応させた。その後、ｏ−フェニレンジアミンを用いた発色反応を行い、吸光度（４９０ｎｍ）を測定した。

図８に結果を示す。なお、図８の各グラフの縦軸は４９０ｎｍにおける吸光度を示し、横軸は（図８（ａ）〜（ｃ））ＨＡ₂タンパク質の濃度［Ｍ］、または（図８（ｄ）および（ｅ））ウイルス粒子の数［ｐｆｕ／ｍＬ］を示す。

図８（ａ）は、Ｈ１サブタイプのＨＡ₂タンパク質に対する各ＩｎｆＡシリーズモノクローナル抗体の反応性を示すグラフである。示すように、６種のモノクローナル抗体はすべてＨ１サブタイプのＨＡ₂タンパク質に反応した。

図８（ｂ）は、Ｈ３サブタイプのＨＡ₂タンパク質に対する各ＩｎｆＡシリーズモノクローナル抗体の反応性を示すグラフである。示すように、ＩｎｆＡ−１５モノクローナル抗体は、Ｈ３サブタイプのＨＡ₂タンパク質に対して強く反応した。ＩｎｆＡ−３、−６、−９、および−１０モノクローナル抗体は、わずかな反応性しか示さなかった。ＩｎｆＡ−１８モノクローナル抗体の反応性はそれらの中間であった。

図８（ｃ）は、Ｈ５サブタイプのＨＡ₂タンパク質に対する各ＩｎｆＡシリーズモノクローナル抗体の反応性を示すグラフである。示すように、ＩｎｆＡ−１５、および−１８モノクローナル抗体は、ＨＡ₂タンパク質に対して、ほぼ同様の強い反応性を示した。他の４つのモノクローナル抗体は、抗原に対して小さな反応性を示した。

図８（ｄ）は、Ｈ１Ｎ１サブタイプのインフルエンザウイルスに対する各ＩｎｆＡシリーズモノクローナル抗体の反応性を示すグラフである。示すように、Ｈ１Ｎ１ウイルス（Ａ／Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ／３７／２００１）を用いた場合、ＩｎｆＡ−１５のみが当該ウイルスに対して反応した。他の５つのモノクローナル抗体は、ほとんど反応しなかった（検量線は、〜１０⁹ｐｆｕ／ｍｌを超えたあたりで、少し落ち込んでいる。なお、図８におけるすべての検量線は、ポジティブデータからバックグラウンドを減算した結果を示している。）。

図８（ｅ）は、Ｈ３Ｎ２サブタイプのインフルエンザウイルスに対する各ＩｎｆＡシリーズモノクローナル抗体の反応性を示すグラフである。示すように、Ｈ３Ｎ２ウイルス（Ａ／Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ／７１／２００１）を用いた場合、ＩｎｆＡ−１５モノクローナル抗体のみが、当該ウイルスに対して強力に反応する一方、他の抗体は反応しなかった。

つまり、ＩｎｆＡ−１５モノクローナル抗体は、試験に用いられたすべてのタイプの組換えＨＡ₂タンパク質およびウイルスに対して反応するという特徴的な特性を有する。上述のＥＬＩＳＡの結果は、ＩｎｆＡ−１５モノクローナル抗体が、Ｈ１、Ｈ３、およびＨ５株のヘマグルチニンの何れのサブタイプについても検出し得ることを示している。ＨＡ₂タンパク質は、１０^-1〜１０^-6Ｍの範囲において検出された。ウイルスは、約１０⁸ｐｆｕ／ｍｌあたりにおいて、低いレベルで検出された。

本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

本発明は、試験、研究、検査等において用いる試薬および器具の製造分野において利用することができる。

Claims (14)

1. Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンに対する抗体であって、
   Ａ型インフルエンザウイルスのＨ１、Ｈ３、およびＨ５型のヘマグルチニンを何れも認識することを特徴とする抗体。
2. 配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるエピトープを認識することを特徴とする請求項１に記載の抗体。
3. 重鎖可変領域におけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第３１〜３５番目、第５０〜６５番目、第９８〜１０６番目であり、
   軽鎖可変領域におけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ、配列番号３に示されるアミノ酸配列の第２４〜３９番目、第５５〜６１番目、第９４〜１０２番目であることを特徴とする請求項１または２に記載の抗体。
4. 重鎖可変領域が、以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなり、
   軽鎖可変領域が、以下の（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１〜３の何れか一項に記載の抗体：
   （ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；
   （ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の、第１〜３０番目、第３６〜４９番目、第６６〜９７番目、および／または第１０７〜１１６番目において、１個または数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列；
   （ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列；
   （ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列の、第１〜２３番目、第４０〜５４番目、第６２〜９３番目、第１０３〜１１４番目において、１個または数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列。
5. 請求項１〜４の何れか一項に記載の抗体の少なくとも一つの可変領域を含み、Ａ型インフルエンザウイルスのＨ１、Ｈ３、およびＨ５型のヘマグルチニンを何れも認識することを特徴とする抗体断片。
6. 請求項１〜４の何れか一項に記載の抗体または請求項５に記載の抗体断片を含有していることを特徴とするＡ型インフルエンザウイルスの検出試薬。
7. 請求項１〜４の何れか一項に記載の抗体または請求項５に記載の抗体断片を備えていることを特徴とするＡ型インフルエンザウイルスの検出キット。
8. 請求項１〜４の何れか一項に記載の抗体または請求項５に記載の抗体断片が固定されていることを特徴とするＡ型インフルエンザウイルスの検出器具。
9. 検査対象物を請求項１〜４の何れか一項に記載の抗体または請求項５に記載の抗体断片とともにインキュベートする工程を包含することを特徴とするＡ型インフルエンザウイルスの検出方法。
10. 請求項１〜４の何れか一項に記載の抗体または請求項５に記載の抗体断片をコードすることを特徴とする遺伝子。
11. 配列番号２または４に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有していることを特徴とする請求項１０に記載の遺伝子。
12. 請求項１０または１１に記載の遺伝子を含んでいることを特徴とする組換え発現ベクター。
13. 請求項１０または１１に記載の遺伝子が導入されていることを特徴とする形質転換体。
14. 請求項１０または１１に記載の遺伝子を宿主に発現させることによって、請求項１〜４の何れか一項に記載の抗体または請求項５に記載の抗体断片を生産する工程を包含することを特徴とする抗体または抗体断片を生産する方法。