KR101329342B1 - 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 검출용 항체 및 이의 용도 - Google Patents
돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 검출용 항체 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제(neuraminidase)의 항원결정부위(epitope), 이를 사용하여 제조된 항체, 상기 항체를 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 타입별 검출 키트, 상기 항체를 이용하는 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 타입별 검출 방법, 및 상기 항원결정부위를 포함하는 백신 조성물이 제공되며, 상기 검출 키트 및 검출 방법은 돼지인플루엔자 바이러스 감염에 따른 뉴라미니다아제 항원형 1형 또는 2형을 감별 검출하여 돼지인플루엔자 감염 타입을 진단할 수 있는 것을 특징으로 한다.
Description
본 발명은 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제(Neuraminidase)의 항원결정부위(epitope), 이를 사용하여 제조된 항체, 상기 항체를 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 타입별 검출 키트, 상기 항체를 이용하는 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 타입별 검출 방법, 및 상기 항원결정부위를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.
돼지 인플루엔자(Swine Influenza)는 influenza type A H1N1 virus가 1930년도에 처음 확인 되었으며, 현재 유행하고 있는 신종 인플루엔자바이러스를 미 질병예방통제센터(CDC)가 미국인 신종인플루 감염자로부터 추출한 H1N1 바이러스 샘플을 분석한 결과 이번 바이러스는 지금까지 돼지, 조류, 인간에서 발견되지 않은 혼합종으로 밝혀졌다. 기존 돼지 인플루엔자 바이러스에 조류 인플루엔자와 사람 인플루엔자가 합쳐지는 과정에서 유전체 변형이 일어나 돼지끼리 퍼지던 바이러스가 사람 간에도 전파되고 있는 상황이다.
현재 세계보건기구(WHO)도 경보단계를 현재 대유행 경고(Pandemic alert) 단계로 사람과 사람 간의 감염에 대한 의미 있는 증거가 존재하는 5단계에서 최고 수준인 대유행(Pandemic) 단계인 효율적이고 지속적인 사람과 사람 간의 감염의 6단계로 상향할 것을 검토하는 등 국제적으로 신종인플루엔자의 위력이 여전하다. 이러한 인플루엔자바이러스(Influenza virus)는 사람, 말, 조류, 돼지 등의 동물에서 질병을 일으키고 있으며, 이들 종간에도 서로 감염된다는 보고되고 있다.
특히, 돼지의 tracheal epithelium은 조류 인플루엔자바이러스의 수용체(receptor, α-2,3-N-acetylneuraminic acid-galactose linkages)와 사람 인플루엔자바이러스의 수용체(receptor, α-2,6-N- acetylneuraminic acid-galactose linkages)가 모두 발현되며, 이러한 이중 감수성은 인간에게 대유행 잠재력을 갖는 새로운 인플루엔자바이러스의 출현에 대한 mixing vessel로서 돼지와 연관이 있다.
인플루엔자바이러스의 종간 전파여부는 많이 연구되어 왔고, life cycle이 짧은 돼지의 인플루엔자바이러스가 human strain보다 항원성의 변화가 적고, 변이원성이 적어 reservoir 역할을 하는지에 관해 지대한 관심을 가지고 연구하고 있으며, 1918년의 pandemic도 최근의 연구에 의하면 돼지와 유사한 인플루엔자바이러스가 원인체였고, 이후에도 사람이 돼지 인플루엔자바이러스에 감염 된 보고가 있다.
반대로 돼지가 사람의 인플루엔자바이러스에 의해 감염된 예로 human H1N1 subtype variants에 대한 항체가 돼지 혈청 중에서 검출된 예도 있으며, 이런 보고를 통해서 인플루엔자바이러스의 종간 전파여부가 많이 연구되어 있음을 알 수 있다.
Influenza A strain의 대유행은 human strain과 non-human strain의 인플루엔자바이러스가 공통숙주에 복합 감염되어 reassortment 가 자연적으로 생겨 발생한 것이라는 추측도 있다. 돼지는 사람 인플루엔자바이러스에 감수성이 있어 H1N1, H3N2 subtype의 잠재적인 reservoir 역할을 할 수 있다. Scholtissek et al 은 돼지에 서로 다른 subtype의 virus가 감염되어 이들이 증식과정에서 서로 유전자를 교환하여 reassortment virus의 출현 및 새로운 pandemic이 일어나는데 중요하다고 제안하였다. 이러한 사실들은 사람 인플루엔자 바이러스의 발생과정에서 돼지 인플루엔자바이러스가 중요한 위치를 차지한다고 볼 수 있다.
현재 다년간의 경험에 따라 조류 인플루엔자 바이러스의 감시체계 및 진단시스템은 이미 구축되어 있으나, 돼지 인플루엔자 바이러스의 감시체계 및 진단시스템은 개발이 미미한 실정이다. 또한 기존의 상용화된 조류 인플루엔자 바이러스 진단 키트의 경우 낮은 민감도(104.5 ~105.5 EID/mL)와 돼지 가검물의 비특이 반응발생 등의 가능성으로 사용여부가 불확실한 상태이다.
따라서, 돼지인플루엔자 바이러스의 지속적인 현장 모니터링 시스템을 구축하는 것이 시급하며, 돼지 인플루엔자바이러스의 지역별, 시기별 혈청형의 변화양상 및 감염정도를 분석하여 돼지로부터 발생될 수 있는 신종 인플루엔자바이러스 지속적인 감시 체계를 구축할 것이 요구된다.
이러한 요구에 부응하여, 본 발명의 일례는 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제(Neuraminidase) 서열의 특정 부분을 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 단백질의 항원형 특이 항원결정부위(epitope)를 제공한다.
다른 예는 상기 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 단백질의 항원형 특이 항원결정부위(epitope)를 항원으로 하여 제조된 항체를 제공한다.
또 다른 예는 상기 항체를 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 타입별 검출용 키트를 제공한다.
또 다른 예는 상기 항체를 돼지인플루엔자를 포함하는 시료에 반응시키고, 상기 항체에 대하여 양성반응을 탐지하여 돼지인플루엔자 뉴라미니다아제 항원형 타입을 검출하는 방법을 제공한다.
또 다른 예는 상기 항체를 포함하는 돼지인플루엔자 감염의 예방 및/또는 치료용 조성물을 제공한다.
또 다른 예는 상기 항원결정부위, 이를 코딩하는 DNA 분자, 이를 포함하는 발현 벡터, 및/또는 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환 세포를 포함하는 돼지인플루엔자에 대한 백신 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제(Neuraminidase) 서열의 일부이며 뉴라미니다아제 항원형 타입별 특이성을 갖는 12개의 아미노산 서열을 탐색하고(표 1 및 도 1 참조), 이들의 항원결정부위(epitope)로서의 용도를 확인하여 본 발명을 완성하였다. 본 발명에서 항원결정부위로서 탐색된 아미노산 서열은 뉴라미니다아제 항원형 타입별, 특히 뉴라미니다아제 항원형 1형 또는 2형에 대하여 특이적인 것을 특징으로 한다.
따라서, 본 발명의 일례는 표 1의 SEQ ID NO: 1 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제의 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 제공한다.
| SEQ ID NO. | 아미노산 서열 | 길이(aa) | Type |
| 1 | FFLTQGALLNDK | 12 | NA1 |
| 2 | IITDTIKSWRNNILR | 15 | NA1 |
| 3 | NLEYQIGYICSG | 12 | NA1 |
| 4 | GSFVQHPELTG | 11 | NA1 |
| 5 | TQGALLNDKHSNGT | 14 | NA1 |
| 6 | TDTIKSWRNNILRTQES | 17 | NA1 |
| 7 | RPCFWVELIRGRPKE | 15 | NA1 |
| 8 | ITGFAPFSKDNS | 12 | NA2 |
| 9 | SSYVCSGLVGDTPR | 14 | NA2 |
| 10 | SNSIVVFCGTSGTYGTGSWPD | 21 | NA2 |
| 11 | NRCFYVELIRGR | 12 | NA2 |
| 12 | GTSGTYGTGSWPDG | 14 | NA2 |
한 구체예에서, 상기 항원결정부위 폴리펩타이드 분자는 SEQ ID NO: 1 내지 7로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형 단백질의 항원결정부위 폴리펩타이드 분자일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 항원결정부위 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 8 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 2형 단백질의 항원결정부위 폴리펩타이드 분자일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바로서, '항원결정부위 폴리펩타이드 분자'는 SEQ ID NO: 1 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드의 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형 또는 2형 단백질의 항원결정부위로서의 용도의 물질적 표현이다.
본 발명의 다른 예는 상기 SEQ ID NO: 1 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 항원결정부위를 특이적으로 인식하는(또는 특이적으로 결합하는) 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제에 대한 항체를 제공한다. 일례에서, 상기 항체는 SEQ ID NO: 1 내지 7로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 1종 이상의 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는, 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형 단백질에 특이적인 항체일 수 있다. 또 다른 예에서, 상기 항체는 SEQ ID NO: 8 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 1종 이상의 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 2형 단백질에 특이적인 항체일 수 있다.
상기 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형 단백질에 특이적 항체는 SEQ ID NO: 1 내지 7로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형 단백질의 항원결정부위를 포함하는 폴리펩타이드 분자를 항원으로 하여 통상의 방법으로 제조된 것일 수 있다. 또한, 상기 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 2형 단백질에 특이적 항체는 SEQ ID NO: 8 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 2형 단백질의 항원결정부위를 포함하는 폴리펩타이드 분자를 항원으로 하여 통상의 방법으로 제조된 것일 수 있다.
예컨대, 상기 SEQ ID NO: 1 내지 7로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형 단백질의 항원결정부위 또는 SEQ ID NO: 8 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 2형 단백질의 항원결정부위를 포함하는 펩타이드 분자를 항원으로 토끼 또는 마우스 등과 같이 통상적으로 사용되는 동물에 주입하여 제조된 항체일 수 있다.
상기 항체는 다클론 항체 또는 단클론 항체인 항체일 수 있다. 한 구체예에서, 상기 항체 즉, 상기 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형 단백질에 특이적 항체 또는 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 2형 단백질에 특이적 항체는 상기 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형 또는 2형 단백질의 항원결정부위를 포함하는 폴리펩타이드를 주입한 마우스로부터 통상적인 방법으로 얻어진 하이브리도마 세포에 의하여 통상적인 방법으로 생산된 단클론 항체일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 항체는 SEQ ID NO: 1 내지 7로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 2종 이상의 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형 단백질의 항원결정부위 또는 SEQ ID NO: 8 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 2종 이상의 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 2형 단백질의 항원결정부위를 혼합하여, 토끼 또는 마우스 등의 통상적으로 사용되는 동물에 투여하여 통상적인 방법으로 제조되는 다클론 항체일 수 있다.
상기와 같이 얻어진 항체는 돼지인플루엔자 바이러스, 바람직하게는 돼지인플루엔자 바이러스의 뉴라미니다아제 항원형 유형별로 특이적인 항원결정부위를 특이적으로 인식하므로, 이를 이용하여 돼지인플루엔자 바이러스의 검출, 바람직하게는 돼지인플루엔자 바이러스의 뉴라미니다아제 항원형 유형별 (제1형 또는 제2형) 검출이 가능하다.
따라서, 본 발명의 다른 예는 상기 항체를 1종 이상 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스 검출용 키트를 제공한다. 한 구체예에서, 상기 키트는 SEQ ID NO: 1 내지 7로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 항체를 1종 이상 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형 검출용(또는 뉴라미니다아제 항원형 1형의 돼지인플루엔자 바이러스 검출용) 키트일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 키트는 SEQ ID NO: 8 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 항체를 1종 이상 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 2형 검출용(또는 뉴라미니다아제 항원형 2형의 돼지인플루엔자 바이러스 검출용) 키트일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 키트는 SEQ ID NO: 1 내지 7로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 항체 1종 이상; 및 SEQ ID NO: 8 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 항체 1종 이상을 포함하는, 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형과 2형의 동시 검출용 키트일 수 있다.
상기 키트는 포함된 항체와 여기에 적용될 시료 중의 항원(항원결정부위)과의 반응을 확인할 수 있는 표지 수단을 추가로 포함할 수 있다. 상기 반응 확인 표지 수단은 특별한 제한이 없으며, 예컨대, 면역크로마토그래피(Immunochromatography), 유세포측정, 면역조직화학염색, 효소결합 면역흡착 분석(enzyme liked immunosorbent assay: ELISA), 방사선 면역측정법(radioimmunoassay: RIA), 효소 면역분석(enzyme immunoassay: EIA), 형광면역분석(Floresence immunoassay: FIA), 발광면역분석(luminescence immunoassay: LIA)으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 실시하기 위하여 통상적으로 사용되는 모든 수단일 수 있다.
상기 표지 수단을 검출하는 방법은 표지인자의 종류에 따라 당업자에게 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 구체적으로는 육안, 검출장비, 검출시약 등을 이용할 수 있다. 상기 검출시약은 검사하고자 하는 표지 인자(analyte)의 존재를 육안 또는 기타 기구를 통해 외부에서 식별이 가능하도록 해 주는 소정의 표지 시약(labeled reagent), 보조적 특이결합부재, 및/또는 신호발생 시스템의 구성 성분을 포함할 수 있다. 표지된 검출시약은 이미 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있다. 이러한 표지의 예는 촉매, 효소(예를 들어, 포스파타제, 퍼옥시다제 등으로서, 보다 구체적인 예로는 효소 기질과 결합하여 함께 사용되는 염기성 포스파타제와 양고추 퍼옥시다제 등), 효소기질(예를 들어, 니트로블루테트라졸리움, 3,5',5,5'-테트라니트로벤지딘, 4-메톡시1나프톨, 4클로로1나프톨, 5-브로모-4-클로로-3-인돌일포스페이트, 화학발광 효소기질로는 디옥세탄, 및 유도체와 이들의 유사체), 형광화합물(예를 들면, 플로우레세인(fluorescein),피코빌리프로틴(phycobiliprotein),로다민(rhodamine)등과 이들 유도체 및 유사체), 화학발광화합물, 금속졸(Metal sol), 염료졸(Dye sol), 미립자 라텍스(Particulate latex), 칼라인디케이터(Color Indicator), 리포좀에 포함된 색재료(Color matter), 탄소졸 및 셀레늄과 같은 비금속졸 등이 있다. 일예로, 표지수단으로는 효소의 경우 HRP(horse radishperoxidase)가 있으며, 형광물질로는 FITC(Fluoresceinthiocarbamyl ethylenediamine)가, 발광물질로는 루미놀(luminol), 이소루미놀 및 루시게닌(lucigenin)이, 방사선 동위원소로는 125I, 3H, 14C 및 131I가 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 표지 수단에 의한 표지 여부는 효소의 기질이나, 형광, 발광 또는 방사선을 측정하기 위한 도구를 이용하여 확인 가능하다. 일예로 상기 항체는 ELISA 키트 또는 스트립 키트로 제조될 수 있다.
상기한 항체의 돼지인플루엔자 바이러스의 검출, 바람직하게는 돼지인플루엔자 바이러스의 뉴라미니다아제 항원형 유형별 (제1형 또는 제2형) 검출 용도에 근거하여, 본 발명의 또 다른 예는 상기 항체를 이용한 돼지인플루엔자 바이러스의 검출 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 상기 검출 방법은
생물 시료를 준비하는 단계;
상기 시료에 SEQ ID NO: 1 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 1종 이상의 항체를 적용하는 단계; 및
항원-항체 반응을 검사하는 단계
를 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 상기 검출 방법은 시료에 SEQ ID NO: 1 내지 7로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 1종 이상의 항체를 적용하는 단계를 포함하는, 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형 검출 (또는 뉴라미니다아제 항원형 1형의 돼지인플루엔자 바이러스 검출) 방법일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 검출 방법은 시료에 SEQ ID NO: 8 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 1종 이상의 항체를 적용하는 단계를 포함하는, 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 2형 검출 (또는 뉴라미니다아제 항원형 2형의 돼지인플루엔자 바이러스 검출) 방법일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 검출 방법은 시료에 SEQ ID NO: 1 내지 7로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 1종 이상의 항체 및 SEQ ID NO: 8 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 1종 이상의 항체를 적용하는 단계를 포함하는, 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형 및 2형의 동시 검출 (또는 뉴라미니다아제 항원형 1형 및 2형의 돼지인플루엔자 바이러스의 동시 검출) 방법일 수 있다.
상기 시료는 돼지인플루엔자 바이러스 존재 여부 및/또는 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 유형별 조사를 필요로 하는 모든 생물학적 또는 환경적 시료를 의미한다. 예컨대, 상기 시료는 동물, 바람직하게는 조류 또는 포유류로부터 분리된 타액, 혈액 등의 체액, 세포, 조직, 가검물 등의 생물학적 시료 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항원-항체 반응에서 양성반응이 검출되면 해당 유형의 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 이 존재하는 것으로 판단할 수 있다. 상기 항원-항체 반응의 양성 반응은 통상적인 효소 반응, 형광, 발광 및/또는 방사선 검출을 통하여 하여 탐지될 수 있다. 보다 구체적으로, 면역크로마토그래피(Immunochromatography), 유세포측정, 면역조직화학염색, 효소결합 면역흡착 분석(enzyme liked immunosorbent assay: ELISA), 방사선 면역측정법(radioimmunoassay: RIA), 효소 면역분석(enzyme immunoassay: EIA), 형광면역분석(Floresence immunoassay: FIA), 발광면역분석(luminescence immunoassay: LIA) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법일 수 있다. 여기에 사용되는 표지 인자는 상기 키트 부분에서 설명한 바와 같다.
또 다른 예에서, 본 발명은 상기 SEQ ID NO: 1 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 1종 이상의 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 항체를 유효성분으로 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스 감염 예방 및/또는 치료용 조성물을 제공한다. 한 구체예에서, 상기 조성물은 SEQ ID NO: 1 내지 7으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 1종 이상의 항체를 포함하는 뉴라미니다아제 항원형 1형의 돼지인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료용 조성물일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 조성물은 SEQ ID NO: 8 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 1종 이상의 항체를 포함하는 뉴라미니다아제 항원형 2형의 돼지인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료용 조성물일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 조성물은 SEQ ID NO: 1 내지 7로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 1종 이상의 항체와 SEQ ID NO: 8 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 1종 이상의 항체를 포함하는 뉴라미니다아제 항원형 1형의 돼지인플루엔자 바이러스 및 뉴라미니다아제 항원형 2형의 돼지인플루엔자 바이러스 감염 예방 및/또는 치료용 조성물일 수 있다.
또한, 본 발명의 SEQ ID NO: 1 내지 12의 아미노산 서열을 갖는 항원결정부위는 돼지인플루엔자 바이러스, 바람직하게는 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형 또는 2형에 특이적인 부위이고, 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 유형에 특이적인 항체를 효과적으로 생성시키므로, 상기 항원결정부위는 돼지인플루엔자 바이러스, 바람직하게는 뉴라미니다아제 항원형 1형의 돼지인플루엔자 바이러스 또는 뉴라미니다아제 항원형 2형의 돼지인플루엔자 바이러스에 대한 백신으로서도 유용하다.
따라서, 본 발명의 또 다른 예는 SEQ ID NO: 1 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 항원결정부위 폴리펩타이드 분자, 상기 폴리펩타이드 분자를 코딩하는 DNA 분자, 상기 DNA 분자를 포함하는 발현벡터, 및 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스에 대한 백신 조성물를 제공한다. 한 구체예에서, 상기 백신 조성물은 SEQ ID NO: 1 내지 7로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 항원결정부위 폴리펩타이드 분자, 상기 폴리펩타이드 분자를 코딩하는 DNA 분자, 상기 DNA 분자를 포함하는 발현벡터, 및 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 뉴라미니다아제 항원형 1형의 돼지인플루엔자 바이러스에 대한 백신 조성물일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 백신 조성물은 SEQ ID NO: 8 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 항원결정부위 폴리펩타이드 분자, 상기 폴리펩타이드 분자를 코딩하는 DNA 분자, 상기 DNA 분자를 포함하는 발현벡터, 및 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 뉴라미니다아제 항원형 2형의 돼지인플루엔자 바이러스에 대한 백신 조성물일 수 있다.
또 다른 구체예에서, 상기 백신 조성물은 SEQ ID NO: 1 내지 7로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 항원결정부위 폴리펩타이드 분자, 상기 폴리펩타이드 분자를 코딩하는 DNA 분자, 상기 DNA 분자를 포함하는 발현벡터, 및 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상; 및 SEQ ID NO: 8 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 항원결정부위 폴리펩타이드 분자, 상기 폴리펩타이드 분자를 코딩하는 DNA 분자, 상기 DNA 분자를 포함하는 발현벡터, 및 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 뉴라미니다아제 항원형 1형 돼지인플루엔자 바이러스 및 뉴라미니다아제 항원형 2형의 돼지인플루엔자 바이러스에 대한 백신 조성물일 수 있다.
상기 돼지인플루엔자 바이러스 감염 예방 및/또는 치료용 조성물, 및 백신 조성물은 통상적인 경로, 예컨대, 혈관(정맥) 내 투여, 피하 투여, 복막 투여 등으로 투여 가능하지만 이에 제한되는 것은 아니며, 통상적으로 정해진 용량으로 투여 가능하다. 또한 상기 조성물들은 통상적으로 사용되는 부형제 등의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 이와 같은 조성물의 투여 경로, 투여량, 첨가제 등은 관련 기술분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 결정할 수 있는 사항이다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명에서, 국내 및 국외에서 유행하는 돼지인플루엔자 바이러스의 염기서열을 이용하여 펩타이드 항원을 인공적으로 제조하고, 토끼와 쥐를 이용하여 돼지인플루엔자 바이러스에 특이적으로 반응할 수 있는 단클론 및 다클론 항체를 제작하였다. 확보된 돼지인플루엔자 바이러스의 각각의 항원형 별로 아미노산 서열을 생물정보학 도구를 사용하여 비교 분석하였다. 특히 돼지인플루엔자 바이러스의 항원형과 밀접하게 연관이 있는 뉴라미니다아제 단백질의 아미노산서열을 생물정보학 도구 프로그램을 이용하여 multiple alignment를 수행하고 뉴라미니다아제의 항원형별 변이 및 보존적인 부분을 규명하였다. 그리고 항원성 및 친수성(hydrophilicity)의 특성을 분석하여 타입별로 약 10개의 아미노산 부위를 선정하였으며, 이중 친수성이 강하고 항원성이 높은 타입별 5 내지 7개의 펩타이드를 선정하여 제작하였다.
또한 상기 펩타이드 항원을 사용하여, 토끼와 쥐에서 각각 다클론 항체 및 단클론 항체를 제조하였다. 본 발명에 따라 제작된 단클론 및 다클론항체의 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 단백질과의 반응성을 평가하기 위하여, 합성된 항원형별 펩타이드와 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 타입 1에서 8까지 13종의 바이러스(표 2) 등과 제조된 항체와의 면역학적 반응을 ELISA를 사용하여 평가하였다. 본 발명에서 제작된 펩타이드 단클론 및 다클론항체는 모두 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형 및 2형 타입에 각각 특이적으로 반응하는 것을 ELISA 분석법으로 모두 확인하였다.
항체를 이용한 검출법은 이러한 분자생물학적 분석법의 한계를 극복하고 빠르고 간편하며 상대적으로 낮은 수준의 정도 관리가 필요한 검출법이라고 할 수 있다. 항체를 사용하여 새로운 돼지인플루엔자 바이러스 진단기법을 개발하기 위해서는 민감하고 특이적인 단클론 및 다클론 항체가 반드시 필요하며 기반이라고 할 수 있다. 그러므로 다양한 유전형의 돼지인플루엔자 바이러스와 반응하는 항체를 개발하는 것이 면역학적 분석방법의 핵심이다. 이러한 돼지인플루엔자 바이러스와 반응하는 특이적인 단클론 및 다클론 항체의 개발은 진단법뿐 만이 아니라 바이러스의 전사, 복제 등의 연구에 사용될 수 있는 중요한 연구재료로 사용이 가능하다.
돼지 인플루엔자는 influenza type A H1N1 virus가 1930년도에 처음 확인 되었으며, 최근 유행하고 있는 신종인플루엔자바이러스를 미 질병예방통제센터(CDC)가 미국인 신종인플루 감염자로부터 추출한 H1N1 바이러스 샘플을 분석한 결과 이번 바이러스는 지금까지 돼지, 조류, 인간에서 발견되지 않은 혼합 종으로 밝혀지고 있다. 기존 돼지 인플루엔자 바이러스에 조류 인플루엔자와 사람 인플루엔자가 합쳐지는 과정에서 유전체 변형이 일어나 돼지끼리 퍼지던 바이러스가 사람 간에도 전파되고 있는 상황이다. 최근 신종인플루엔자 바이러스의 대유행으로 세계보건기구(WHO)도 경보단계를 최고 수준인 대유행(Pandemic) 단계인 효율적이고 지속적인 사람과 사람 간의 감염의 6단계로 상향하였다.
이와 같이 돼지 인플루엔자 바이러스는 국내외의 신종 인플루엔자의 대유행의 중요한 원인체로 중요성이 점차 증대되고 있으나, 민감하고 특이적으로 반응하는 항체가 개발되어 있지 않고 표준화된 진단법이 부재하여 진단 및 연구에 매우 어려움이 있다.
본 발명은 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 특이 항원결정부위를 선택적으로 인지하는 항체를 생산하는 방법과, 상기 항체를 생산하는 생산주를 제공한다.
일례로, 상기 항체 생산주는 본 발명에 따른 항원결정부위를 발현하는 세포를 항원으로 이용하여 통상의 방법으로 제조 가능하다.
예컨대, 상기 항체 생산주 제조방법은 (a) 상기 항원결정부위 폴리펩타이드 분자 또는 상기 항원결정부위를 발현하는 세포를 마우스 또는 토끼 등의 동물에 주입하여 면역화시키는 단계, (b) 상기 항원결정부위에 특이적인 항체를 생산하는 비장세포를 수득하는 단계, 및 (c) 상기 비장세포를 골수종세포와 융합시켜, 상기 특이적 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 선별하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 항체 생산주는 생체외(in vitro)에서 배양하거나, 생체내 주입하여 항체를 분리할 수 있다. 일례로, 마우스의 복강내에 상기 항체 생산주를 삽입하고 생산되는 항체를 복수로부터 분리, 정제할 수 있다. 항체의 분리 및 정제는 배양 상층액 또는 복수를 이온교환 크로마토그래피(DEAE 또는 DE52 등), 항 면역글로불린 칼럼 또는 프로테인 A 컬럼 등의 친화성 크로마토그래피를 이용하여 실시할 수 있다.
본 발명에서, 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형 및 2형 타입 단백질의 보존적이고 항원성을 나타내는 12-21개의 펩타이드 항원을 제조하고 쥐와 토끼를 사용하여 단클론 항체 및 다클론 항체를 제조하였다. 제조된 단클론 및 다클론 항체는 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형을 신속하고 정확하게 검체를 확인할 수 있는 도구로써 사용이 가능하다. 이러한 항체는 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 분석을 위한 생물학적 특성을 연구할 수 있는 기본적인 도구를 제공할 뿐만 아니라 진단 등에 응용이 가능한 중요한 기능을 가지고 있다.
본 발명에서, 국내에서 분리된 돼지인플루엔자 바이러스 유행주의 뉴라미니다아제 아미노산의 서열과 Genebank에 등록된 국외 돼지인플루엔자 바이러스주의 돼지인플루엔자 바이러스 아미노산 서열을 생물정보학 도구를 이용하여 보존적이면서 뉴라미니다아제의 1형 및 2형의 항원형을 감별할 수 있는 아미노산 부위를 성공적으로 확보해 내었으며, 이와 함께 항원적인 특성이 있는지 표면에 존재가 가능한 지를 연구하였다. 본 발명에서 보존적이고 항원형 1형과 2형만을 감별할 수 있는 뉴라미니다아제 아미노산서열 부위는 친수성과 소수성을 분석하여 강한 소수성을 나타낸 부위를 제외하고 1형 및 2형 외의 다른 타입의 항원형과의 교차반응을 유발할 수 있는 아미노산서열의 일치도를 분석하여 항원형 감별을 위한 항체생산에 제약이 있는 부위를 배제하였다.
그러므로 12개의 후보 펩타이드 서열을 확보, 제조 및 투입하여 단클론 및 다클론 항체를 쥐와 토끼를 이용하여 제조하고 평가하였다. 제조된 단클론 및 다클론 항체의 면역학적 반응성을 보기 위하여 먼저 제조한 펩타이드와의 반응성을 테스트하였다. 그 결과를 보면 모든 종류의 단클론 및 다클론 항체의 경우 각기 투입한 펩타이드와 특이적으로 강하게 반응하는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 다음 단계로 제작된 항체와 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제와의 반응성 및 교차반응을 분석하기 위하여, 표 2의 돼지인플루엔자바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1 내지 8형의 돼지인플루엔자 바이러스로 직접 효소면역측정법 (ELISA, Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay)를 수행한 결과 뉴라미니다아제 항원형 1형과 2형을 감별할 수 있는 최소 8개의 단클론 항체를 제조하였다.
그리고 본 발명에서 제작한 뉴라미니다아제 항원형 1형에 반응하는 2개의 다클론 항체와 뉴라미니다아제 항원형 2형에 반응하는 2개의 다클론 항체의 강한 반응성을 나타내었고 항원형을 구분이 가능하였다.
이러한 결과로부터 본 발명의 단클론 및 다클론 항체 모두가 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형과 2형에 매우 민감하고 특이적으로 반응하는 것을 알 수 있다. 그러므로 본 발명에서 개발된 단클론 항체 및 다클론 항체는 앞으로 돼지인플루엔자 감염 검진 및 모니터링에 사용될 수 있는 중요한 진단의 기초재료이며, 앞으로 빠르고 신속한 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형과 2형을 감별하는 진단 키트의 개발로 이용될 것으로 예상된다.
본 발명은 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 단백질의 항원형 1형 및 2형의 항원결정부위(epitope), 이를 이용하여 제조된 항체, 및 상기 항체를 이용한 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제의 감별검출 기술에 관한 것으로서, 상기 항체는 매우 민감하고 특이적으로 반응하므로, 돼지의 인플루엔자 바이러스 감염 검진 및 모니터링에 사용될 수 있는 중요한 진단의 기초재료로 이용될 수 있으며, 앞으로 빠르고 신속하게 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형 및 2형을 감별 검출하여 진단하는 키트의 개발에 이용될 수 있을 것이다.
도 1a 및 1b는 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형(1a) 및 2형(1b)의 Predicted transmembrane segments for sequence 결과 얻어진 그래프이다.
도 2a 및 2b는 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형 및 2형 단백질의 친수성(2a)/소수성(2b) 파라미터를 보여주는 그래프이다.
도 3a는 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형의 antigenic peptide를 나타내고, 도 3b는 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 2형의 antigenic peptide를 나타낸다.
도 4a 내지 4c는 단클론/다클론 항체를 제조를 위해 최종적으로 선정된 뉴라미니다아제 항원형 1형 및 2형의 항원결정부위를 보여주는 것이다 (붉은색 및 밑줄로 표시).
도 5는 실시예에서 단클론/다클론 항체를 제조하는 방법을 보여주는 개략도이다.
도 6a 내지 6d는 서열번호 1 내지 4를 혼합하여 제조한 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형의 다클론 항체의 반응성 시험결과를 나타내고, 도 6e 내지 6g는 서열번호 5 내지 7을 혼합하여 제조한 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형의 다클론 항체의 반응성 시험결과를 나타내는 그래프이다.
도 7a 내지 7c는 서열번호 8 내지 10을 혼합하여 제조한 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 2형의 다클론 항체의 반응성 시험결과를 나타내고, 도 7d 내지 7f는 서열번호 8, 11 및 12를 혼합하여 제조한 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 2형의 다클론 항체의 반응성 시험결과를 나타내는 그래프이다.
도 8a는 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형의 단클론 항체의 반응성 시험결과를 나타내고, 도 8b는 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 2형의 단클론 항체의 반응성 시험결과를 나타낸다.
도 9는 본 발명에 따른 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형과 2형 진단 키트의 분해 사시도이다.
도 10은 본 발명의 진단 키트를 구성하는 스트립의 구조를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명에 따른 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형과 2형 감별 진단 키트를 촬영한 사진이다.
도 2a 및 2b는 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형 및 2형 단백질의 친수성(2a)/소수성(2b) 파라미터를 보여주는 그래프이다.
도 3a는 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형의 antigenic peptide를 나타내고, 도 3b는 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 2형의 antigenic peptide를 나타낸다.
도 4a 내지 4c는 단클론/다클론 항체를 제조를 위해 최종적으로 선정된 뉴라미니다아제 항원형 1형 및 2형의 항원결정부위를 보여주는 것이다 (붉은색 및 밑줄로 표시).
도 5는 실시예에서 단클론/다클론 항체를 제조하는 방법을 보여주는 개략도이다.
도 6a 내지 6d는 서열번호 1 내지 4를 혼합하여 제조한 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형의 다클론 항체의 반응성 시험결과를 나타내고, 도 6e 내지 6g는 서열번호 5 내지 7을 혼합하여 제조한 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형의 다클론 항체의 반응성 시험결과를 나타내는 그래프이다.
도 7a 내지 7c는 서열번호 8 내지 10을 혼합하여 제조한 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 2형의 다클론 항체의 반응성 시험결과를 나타내고, 도 7d 내지 7f는 서열번호 8, 11 및 12를 혼합하여 제조한 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 2형의 다클론 항체의 반응성 시험결과를 나타내는 그래프이다.
도 8a는 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형의 단클론 항체의 반응성 시험결과를 나타내고, 도 8b는 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 2형의 단클론 항체의 반응성 시험결과를 나타낸다.
도 9는 본 발명에 따른 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형과 2형 진단 키트의 분해 사시도이다.
도 10은 본 발명의 진단 키트를 구성하는 스트립의 구조를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명에 따른 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형과 2형 감별 진단 키트를 촬영한 사진이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1>
펩타이드
항원결정부위 결정
돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형 및 2형의 감별을 위하여, 바이오인포메틱스 프로그램(DNAMAN version 6 (Lynnon Corporation) 또는 Vector NTI Suite 7.1 (informax, Inc.)을 이용하여 multialign으로 상동성 지역을 조사하고, 그 부위에 항원성이 높게 나타나는 지역을 선정하는 절차로 진행하였다.
먼저, 인플루엔자바이러스 뉴라미니다아제(neuraminidase, NA) 항원의 감별을 위한 타입별 항체 개발을 위하여, 국내외 돼지 및 인체 감염 인플루엔자바이러스의 염기 및 아미노산서열을 해외 GenBank(미국), 유전체 데이터베이스에서 확보하고 각 혈청형별 multialign을 실행하여 각 뉴라미니다아제 단백질 부위의 도메인별로 약 10개 이상의 보존적인 아미노산서열을 상동성 지역으로 선정하였다. 이와 동시에 동일 인플루엔자바이러스 동일 또는 타입간의 분리연도 및 지역별 바이러스 변이(mutation) 양상을 분석하여 고변이부위(hyper variable region)와 고보존 부위(highly conserved region)으로 구분하여 분석하였다.
상기 결과를 바탕으로 항원성 에피토프(epitope) 선정은 고보존 부위(highly conserved region)를 대상으로 바이오인포메틱스 프로그램(DNAMAN version 6 (Lynnon Corporation) 또는 Vector NTI Suite 7.1 (informax, Inc.)) 시뮬레이션을 통해 2차 구조 및 항원성 부위의 순위를 결정하고, 5개 이상의 항원결정부위 (에피토프, epitope)를 결정하여 항체제작에 사용하였다. 상기 순위 결정방법은 보존부위중 항원형간의 차별화 가능부위를 선정하고 유사도의 정도, 에피토프로써의 기능 수행여부, 친수성, 또는 소수성 특성 분석 등의 특징을 나열한 후 순위를 결정하는 것으로 수행하였다. 상기 DNAMAN 프로그램에 포함되어 있는 기능을 이용하여 Predicted transmembrane segments for sequence, 친수성 및 소수성 파라미터, antigenic peptide의 결과를 도출하여, 각각 도 1a, 도 1b (이상 Predicted transmembrane segments for sequence), 도 2a, 도 2b (이상 친수성 및 소수성 파라미터) 및, 도 3a, 3b (antigenic peptide) 에 나타내었다.
뉴라미니다아제 항원형별 인플루엔자바이러스 아미노산 서열의 상동성 및 감별가능 부위를 선정하기 위해 비교된 GenBank 등재된 타입별 단백질서열은 아래의 표 3에 나타낸 바와 같다.
| No. | NA Type | Accession Number |
| 1 | NA1 | EU296600 |
| 2 | NA2 | EU296608 |
| 3 | NA3 | AB546182 |
| 4 | NA4 | HM849002 |
| 5 | NA6 | CY073454 |
| 6 | NA7 | HM849014 |
| 7 | NA8 | HM589207 |
최종적으로 선정된 뉴라미니다아제 항원형 1형 및 2형의 항원결정부위를 도 4a 내지 4c에 나타내었다 (붉은색 및 밑줄로 표시).
도 4a 내지 4c에 나타낸 12 종의 항원결정부위를 아래에 나타내었다.
SEQ ID NO. 아미노산 서열 길이(aa) Type
1 FFLTQGALLNDK 12 NA1
2 IITDTIKSWRNNILR 15 NA1
3 NLEYQIGYICSG 12 NA1
4 GSFVQHPELTG 11 NA1
5 TQGALLNDKHSNGT 14 NA1
6 TDTIKSWRNNILRTQES 17 NA1
7 RPCFWVELIRGRPKE 15 NA1
8 ITGFAPFSKDNS 12 NA2
9 SSYVCSGLVGDTPR 14 NA2
10 SNSIVVFCGTSGTYGTGSWPD 21 NA2
11 NRCFYVELIRGR 12 NA2
12 GTSGTYGTGSWPDG 14 NA2
<
실시예
2>
돼지인플루엔자 바이러스
펩타이드
단/
다클론
항체의 제작
상기 표 1에서 나타낸 뉴라미니다아제 항원형 1형과 2형 특이 펩타이드는 pre-activated KLH(Keyhole limpet hemocyanin, Pierce)와 pre-activated BSA(bovine serum albumine, Pierce)에 conjugation을 시켜서 면역학적 반응성이 나타나도록 하였다. 이와 같이 제조된 conjugated 펩타이드를 쥐와 토끼에 투입하여 단클론 항체 및 다클론 항체를 각각 제조하였다. 단클론 항체 및 다클론 항체를 성공적으로 생성하였다. 각 펩타이드에서 생성된 단클론 항체 및 다 클론 항체에 관한 사항을 아래의 표 4에 기술하였다. 다클론 항체의 경우 토끼를 사용하여 뉴라미니다아제 항원형 1형 2종과 2형 2종을 각각 제조하였으며, 단클론 항체는 1형 4 가지 종류 4개, 2형 4가지 종류 4개의 단클론 항체세포를 조사하였다.
<2-1> 마우스에서
단클론
항체의 제작
항원형 1형에 특이적인 항체를 제조하기 위해 상기에서 언급한 서열번호 1 내지 4의 펩타이드 항원을 혼합하여 마우스에 투입하여 단클론 항체를 제조하였고, 항원형 2형에 특이적인 항체를 제조하기 위해 상기에서 언급한 서열번호 8 내지 10의 펩타이드 항원을 혼합하여 마우스에 투입하여 단클론 항체를 제조하였다.
보다 구체적으로, 첫 번째 면역화로서, 상기 표 1의 서열을 갖도록 합성된 펩타이드 250μℓ를 동량(250μℓ)의 complete Freund's adjuvant (Sigma)를 혼합하여 유화체를 만든 후, 생후 6 내지 8주령의 암컷 BALB/c 마우스의 복강 내 (intraperitoneal injection, ip)에 주입하였다. 1 마리당 500μg의 합성된 펩타이드를 주사하며 6 마리를 대상으로 실시하였다. 두 번째 면역화로서 2주 후에 같은 요령으로 주사하였다. 단, incomplete Freund's adjuvant (Sigma)를 사용하며, 항원의 양을 첫 번째 면역화와 동일한 양으로 하여 동일한 방법으로 두 번째 면역화 및 세 번째 면역화(두 번째 면역화로부터 2주 후)를 실시하여 투여하였다.
그리고, 마지막으로 2주 후에 항원(3차 투여 시와 동일한 양)을 PBS에 혼합하여 이를 꼬리의 정맥 (미정맥, intravenous injection, iv)에 주사하였다. 마지막 면역화 후 3일 뒤에 세포융합과정을 수행하여 단클론 항체를 생산하는 세포를 제조하였다 (실시예 <2-3> 및 <2-4> 참조). 단클론 항체를 제조하는 구체적인 방법을 도 5에 모식적으로 나타내었다.
<2-2>
토끼에서
다클론
항체의 제조
상기에서 제조된 서열번호 1 내지 7의 1형 7종류와 서열번호 8 내지 12의 2형 5종류를 각각 3~4종류씩의 펩타이드 항원을 혼합하여 토끼에 투여하여 다클론 항체를 제조하였다. 상기에서 확보된 합성 펩타이드를 토끼 (뉴질랜드 화이트, 암컷, 2 ~ 2.2 kg)에 투여하였다.
1차 투여 시에는 항원을 1mg/400μℓ PBS로 준비하여 동량의 complete Freund's adjuvant (Sigma)를 혼합 후 유화체를 만들어 한 부위당 투여량 약 30-50 ul 정도로 소량씩 등의 여러 부위 (10여 부위, 한 부위에 많이 양이 투여되면 화농-pus가 형성될 수 있으며, 심할 경우 육아종이 유발된다)에 피하 주사 하였다. 2주 후 2차 투여부터는 1차 투여와 방법은 같으나 incomplete Freund's adjuvant (Sigma)를 이용하였다. 3차 투여는 2차 투여 시와 동일하며, 마지막 4차 투여 시 이정맥에 100μℓ 정도로 혈관 내 직접 투여하였다.
마지막 투여 후 이정맥을 통하여 채혈하여 아래와 같은 방법으로 항체가를 검사한 뒤 높은 수준에 이르면(ELISA 테스트 결과 해당 혈청을 1000배 이상 희석하여 측정이 가능한 역가가 나옴을 확인) 토끼를 마취한 후 전혈을 채혈하여 37℃에서 30분 내지 60분간 정치시키면 혈액 세포들이 응고되어 혈병을 형성하며, 이를 제거한 후 혈장을 확보하였다. 준비된 혈장은 4℃, 10000g, 10분간 원심분리 후 상층액을 취하여 아래와 같이 항체를 분리 및 정제하였다
상기 얻어진 상층액으로부터 면역친화성 크로마토그래피 (immunoaffinity chromatogarphy) 법을 사용하여 항체를 정제하였다. 즉, 상층액은 비드의 5배 부피의 인산화염(PBS)으로 Equilibrate된 단백질(Protein) A가 콘쥬게이션 되어있는 아가로스 비드(peptron) 컬럼(empty column, Pierce)에 로드되었다. 5층용적(bed volumn)의 인산화염(PBS)로 컬럼을 세척한 후에, 다클론항체는 0.1M Glycine, pH3.0의 버퍼용액으로 용출하였다. 용출된 다클론항체는 중화를 위해 다시 1/10 부피의 1M Tris, pH8.0을 가하였다. 최종적으로 순수한 다클론항체를 분리한 다음 인산화염 완충액(PBS)에 투석하여 항체를 분리 및 정제하였다.
<2-3> 항원 투여 중의 혈청 항체가 검사 (항체
titering
)
3차 면역화 후 4일 뒤에 꼬리 미정맥에서 채혈하여 혈청을 얻은 뒤 인산염 완충액 (PBS)에 부피 기준으로 1/100000, 1/5000, 1/1000 및 1/100 농도로 연속 희석하여 효소면역측정법 (ELISA, Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay)을 사용하여 항체가 형성되는 것을 결정하였다. 측정된 흡광도 (optical density, O.D)값이 음성대조군의 마우스(항원을 주입하지 않은 쥐의 혈청)의 흡광도와 비교하여 양호하고 1/100 희석배율에서 흡광도 2이상 보일 경우 면역화가 성공한 것으로 보고 세포 간 융합 준비를 하였다. 항체가가 낮으면 2주 후에 다시 면역화를 시도하였다.
<2-4>
비장세포와
골수종세포의 융합 (
Cell
fusion
)
최종 면역 3-4일 후 마우스의 비장을 무균적으로 적출하고, 적출한 비장을 26-gauge 주사바늘로 세절한 후, 혈청이 첨가되지 않은 차가운 DMEM(Dulbecco's Modified ed Eagle's medium, Gibco)에 부유시켰다. 부유액을 50㎖ 튜브에 수집하여 1-2분간 정치시킨 후 상층액을 모아 이를 DMEM으로 1,000rpm, 10분씩 3번 원심세척하였다. 침전된 림프구를 마우스 골수종 세포(myeloma, Sp2/0-Ag14, 한국세포주은행)와 세포 개수 기준으로 7:1 내지 10:1 정도의 비율로 혼합하고, 37℃로 미리 가온한 DMEM으로 1회 원심세척한 후, pasteur pipet을 이용하여 상층액을 완전히 제거하였다.
이 혼합세포에 37℃로 미리 가온한 50%(w/v) polyethylene glycol 1,500 (PEG 1,500; Boehringer Mannheim) 1㎖를 1분에 걸쳐 첨가하였다. PEG를 가한 후 혼합 세포가 들어있는 시험관을 1분 내지 2분간 흔들어주며 세포 융합을 유도하였다. 여기에 DMEM 5㎖를 5분에 걸쳐 첨가한 후, 다시 DMEM 10㎖를 천천히 첨가하고 나서, 37℃ 항온수조에서 5분간 정치시켰다. 혼합액을 1,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 제거하였다. 침전된 세포를 HAT supplement (0.1mM hypoxanthine, 0.4μM aminopteri, 16μM thymidine, Sigma)와 20% 우태아혈청(Gibco)이 첨가된 DMEM에 106 cell/㎖의 농도로 부유시켰다. 이 부유액을 96-well microplate (Nunc)에 well당 100㎕씩 분주하였다. 준비된 well을 37℃ 항온 항습 배양기에서 배양하며, 3일 내지 4일마다 배지를 교환하였다. 융합 2주 후부터는 HT supplement (100μ hypoxanthine, 16μM thymidine, Sigma)와 10% 우태아혈청이 첨가된 DMEM으로 배양하고, 3주 후부터는 10% 우태아혈청만 첨가된 DMEM으로 배양하였다.
하이브리도마 선별은 하기 실시예 <2-5>에 특이성 및 반응성결과로 선별하였다 (흡광도 기준).
단클론 항체는 면역친화성 크로마토그래피 (immunoaffinity chromatogarphy) 법을 사용하여 정제하였다. 즉, 상층액은 비드의 5배 부피의 인산화염(PBS)으로 Equilibrate된 단백질(Protein) A가 콘쥬게이션 되어있는 아가로스 비드(peptron) 컬럼(empty column, Pierce)에 로드되었다. 5층용적(bed volumn)의 인산화염(PBS)로 컬럼을 세척한 후에, 단클론항체는 0.1M Glycine, pH3.0의 버퍼용액으로 용출하였다. 용출된 단클론항체는 중화를 위해 다시 1/10 부피의 1M Tris, pH8.0을 가하였다. 최종적으로 순수한 단클론항체를 분리한 다음 인산화염 완충액(PBS)에 투석하여 항체를 분리 및 정제하였다.
<2-5> 단/
다클론
항체의
ELISA
을 이용한 특이성 검사
단/다클론항체의 특이성 분석을 위하여, 합성된 펩타이드를 각각 coating buffer(KOMA BIOTECH INC, K0331021)에 1 ㎍/㎖ 농도로 희석하여 well 당 200 ㎕씩 첨가 하고 4 ℃에서 overnight incubation하여 코팅시켰다. 코팅된 플레이트를 washing solution (PBST, KOMA BIOTECH INC, K0331041, K0331051)으로 5회 반복 세척하고, Blocking solution (1% BSA/PBS, KOMA BIOTECH INC, K0331032)을 well 당 250 ㎕씩 첨가 후 상온에서 1시간 동안 반응하여 blocking을 수행하였다.
blocking된 플레이트는 다시 세척용액을 이용하여 5회 반복하여 세척하고 다/단클론 항체 배양 용액(배지: DMEM)을 well당 200μℓ씩 분주하고, 음성대조군용 well에 희석액(세포 배양 배지 DMEM)을 200μℓ 분주한 다음 상온에서 60분간 반응시켰다.
시료의 반응이 완료된 플레이트는 세척용액을 이용하여 5회 반복하여 세척하고 항-마우스 IgG에 HRP (Horse reddish peroxidase)가 융합된 시약(1:5,000 (v/v), Antibody Incorporated, USA) 을 well 당 200 ㎕씩 첨가 후 상온에서 1시간 동안 반응시키고, 세척액 (PBST, 137 mM NaCl, 2.68 mM KCl, 10.14 mM Na2HPO4, 1.76 mM K2HPO4, 0.5% Tween)으로 세척하였다. 얻어진 반응액을 TMB Substrate kit (KOMA BIOTECH INC, K0331060)로 발색반응을 유도하고 stop solution (2 M, H2SO4)으로 반응을 정지한 후, ELISA reader(TECAN) 로 450nm 파장에서의 흡광도를 측정하여 분석하였다.
음성대조군의 흡광도의 3배 이상 되는 흡광도 값을 양성 반응의 최소치로 기준하여 음성, 양성으로 판정하였다. 각 펩타이드에서 생성된 단/다클론 항체들 중 O.D(Optical Density) 값이 1이 초과되는 것만을 선정하였다.
<
실시예
3>
단/
다클론
항체의
ELISA
을 선별 및 특성분석
<3-1>
ELISA
를 통한 항체 선별
상기 실시예 <2-5>에서 선정된 펩타이드 항체를 아래의 표 4에 정리하였다. 표 4에 기재된 바와 같은 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형에 대한 단클론 펩타이드 항체 4종 (NA1M#1-NA1M#4) 및 2형에 대한 단클론 펩타이드 항체 4종(NA2M#1-NA2M#4), 항원형 1형에 대한 다클론 펩타이드 항체 2종(NA1P#1, NA1P#2)과 2형에 대한 다클론 펩타이드 항체 2종(NA2P#1, NA2P#2)의 총 12종의 항체를 대상을 항원-항체반응을 수행하였다.
상기 단/다클론항체 선정을 위한 항원-항체 반응은, 105 TCID50의 Influenza A/Korea/01/2009 H1N1 (국내분리주, 최초로 국내 사람에서 분리된 신종인플루엔자 A(H1N1)바이러스로, 질병관리본부 국립보건원 인프루엔자바이러스팀에서 분양받음, NCBI Taxonomy ID: 644289)와 Influenza A/Swine/Korea/Can04/2005 H3N2 (국내분리주, 국립수의과학검역원, NCBI Taxonomy ID: 538544, 현재 돼지인플루엔자 3종 불활화백신주생산에 사용되고 있음)를 각각 coating buffer(KOMA BIOTECH INC, K0331021)에 1/10로 희석하여 well 당 200 ㎕씩 첨가 하고 4 ℃에서 overnight incubation하여 코팅시키는 것을 제외하고, 상기 실시예 <2-5>와 동일한 방법으로 수행하였다.
이와 같이 얻어진 결과를 아래의 표 4에 나타내었다.
| 항체 클론 | H1N1 | H3N2 | 항원결정부위 펩타이드 | |
| 450nm O.D | 450nm O.D | |||
| 단클론 펩타이드 항체 |
NA1M#1 | 1.312 | 0.110 | N1-1 (SEQ ID NO: 1) |
| NA1M#2 | 1.426 | 0.103 | N1-2 (SEQ ID NO: 2) | |
| NA1M#3 | 1.82 | 0.109 | N1-4 (SEQ ID NO: 4) | |
| NA1M#4 | 1.78 | 0.101 | N1-4 (SEQ ID NO: 4) | |
| NA2M#1 | 0.102 | 1.87 | N2-1 (SEQ ID NO: 8) | |
| NA2M#2 | 0.103 | 1.91 | N2-1 (SEQ ID NO: 8) | |
| NA2M#3 | 0.102 | 1.781 | N2-2 (SEQ ID NO: 9) | |
| NA2M#4 | 0.102 | 1.902 | N2-2 (SEQ ID NO: 9) | |
| 다클론 펩타이드 항체 |
NA1P#1 | 1.42 | 0.99 | N1-1~4 (SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4) |
| NA1P#2 | 1.37 | 0.98 | N1-5~7 (SEQ ID NOs: 5, 6, 7) | |
| NA2P#1 | 0.102 | 1.53 | N2-1~3 (SEQ ID NOs: 8, 9, 10) | |
| NA2P#2 | 0.103 | 1.61 | N2-1,4~5 (SEQ ID NOs: 8, 11, 12) | |
표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형과 2형 특이 항체를 각각 이용하여 뉴라미니다아제 항원형 1형과 2형간의 감별탐지가 가능하였다. 그러나, 서열번호 3 및 서열번호 10에 대한 항체는 만들어지지 않았다. 반응성이 확인된 우수한 단클론 항체는 뉴라미니다아제 항원형 1형 내지 8형까지 감별가능여부를 확인하는데 사용하였다. 항원형 1형에 대한 선정된 단클론은 N1-1 (SEQ ID NO: 1)에 반응하는 NA1M#1, N1-2 (SEQ ID NO: 2)에 반응하는 NA1M#2, N1-4 (SEQ ID NO: 4)에 반응하는 NA1M#3 및 NA1M#4이고, 항원형 2형에 대한 선정된 단클론은 N2-1 (SEQ ID NO: 8)에 반응하는 NA2M#1 및 NA2M#2, N2-2 (SEQ ID NO: 9)에 반응하는 NA2M#3 및 NA2M#4 이다. 항원형 1형과 2형의 각각의 다클론항체(NA1P#1, NA1P#2, NA2P#1, NA2P#2)는 모두 반응성이 좋아 모두 선정하였다.
<3-2>
ELISA
를 통한 항체 특성분석
선정된 단/다클론항체의 특성 분석을 위하여, 합성된 펩타이드를 각각 coating buffer(KOMA BIOTECH INC, K0331021)에 1 ㎍/㎖ 농도로 희석하여 well 당 200 ㎕씩 첨가 하고 4 ℃에서 overnight incubation하여 코팅시켰다. 코팅된 플레이트를 washing solution (PBST, KOMA BIOTECH INC, K0331041, K0331051)으로 5회 반복 세척하고, Blocking solution (1% BSA/PBS, KOMA BIOTECH INC, K0331032)을 well 당 250 ㎕씩 첨가 후 상온에서 1시간 동안 반응하여 blocking을 수행하였다.
blocking된 플레이트는 다시 세척용액을 이용하여 5회 반복하여 세척하고 다/단클론 항체는 1mg/ml으로 조정하고 인산화 완충용액(PBS)으로 1/100, 1/1,000, 1/5,000, 1/10,000, 1/50,000 및 1/100,000으로 희석하여 well당 200μℓ씩 분주하고, 음성대조군은 마우스 IgG(1mg/ml, ARISTA BIOLOGICALS INC.)을 인산화 완충용액(PBS)으로 1/1,000으로 희석하여 well에 200μℓ 분주한 다음 상온에서 60분간 반응시켰다.
시료의 반응이 완료된 플레이트는 세척용액을 이용하여 5회 반복하여 세척하고 항-마우스 IgG 또는 항-토끼 IgG에 HRP (Horse reddish peroxidase)가 융합된 시약(1:5,000(v/v), Antibody Incorporated, USA) 을 well 당 200 ㎕씩 첨가 후 상온에서 1시간 동안 반응시키고, 세척액 (PBST, 137 mM NaCl, 2.68 mM KCl, 10.14 mM Na2HPO4, 1.76 mM K2HPO4, 0.5% Tween)으로 세척하였다. 얻어진 반응액을 TMB Substrate kit (KOMA BIOTECH INC, K0331060)로 발색반응을 유도하고 stop solution (2 M, H2SO4)으로 반응을 정지한 후, ELISA reader(TECAN) 로 450nm 파장에서의 흡광도를 측정하여 분석하였다.
이와 같이 얻어진 흡광도 결과를 상기 표 4, 도 6a 내지 6g, 7a 내지 7f, 8a 및 8b 에 나타내었다.
<
실시예
4>
돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제
항원형
1형과 2형 특이 특이항체를 이용한 진단 스트립 및 진단
키트의
제조
<4-1> 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제
항원형
1형과 2형 특이 항체가 코팅된 멤브레인(
membrane
)의 준비
상기 <실시예 3>에서 항원형 1형에 대한 선정된 단클론은 N1-1 (SEQ ID NO: 1)에 반응하는 NA1M#1, N1-2 (SEQ ID NO: 2)에 반응하는 NA1M#2, N1-4 (SEQ ID NO: 4)에 반응하는 NA1M#3 및 NA1M#4이고, 항원형 2형에 대한 선정된 단클론은 N2-1 (SEQ ID NO: 8)에 반응하는 NA2M#1 및 NA2M#2, N2-2 (SEQ ID NO: 9)에 반응하는 NA2M#3 및 NA2M#4 이다.
항원형 1형과 2형의 각각의 다클론 항체는 NA1P#1, NA1P#2, NA2P#1, NA2P#2 이다.
이와 같이 선별된 단/다클론 항체는 0.5 내지 2.5 ㎎/㎖ 농도로 맞추어 검사선으로 사용하고, 대조선은 염소 항-마우스 IgG(Goat anti-mouse IgG, Arista Biologicals Inc.)를 사용하였다.
상기 검사선의 단/다클론 항체 및 대조선의 대조 용액은 디스펜싱 기구(KINAMETICS, USA)를 사용하여 니트로 셀룰로오스 막(Millipore) 에 코팅하고, 낮은 습도의 실험실에서 밤새 건조하거나 적어도 5시간 이상 팬에서 건조시켰다. 상기 제조된 막의 플레이트는 건조제(Silica gel, TPG)와 함께 밀봉된 컨테이너 또는 낮은 습도의 실험실에서 보관하였다.
<4-2> 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제
항원형
1형과 2형 특이 항체-금(
Gold
) 접합체 제조
상기 <실시예 3>에서 선별된 단/다클론 항체를 최종 농도가 4 내지 20㎍/㎖가 되도록 교반하면서 잘 섞어주고, 금 용액(colloidal Gold, 1 O.D.)에 한 방울씩 첨가한 후, 이 용액을 다시 15분간 교반하였다. 그 후, 금 입자 부유 물에 10%의 BSA 용액을 첨가하였다. 다시 15분간 교반한 후, 결합된 금용액을 6,000g에서 30분간 원심분리하여, 결합되지 않은 재조합 단백질을 제거하기 위해서 상등액은 버리고, 결합된 금 용액 펠렛에, 펠렛용량의 3배의 1%의 BSA가 첨가된 5 mM 소디움 보레이트 (Sodium Tetraborate, pH7.2)를 첨가한 후 상기 펠렛을 재부유하였다. 상기 부유물을 다시 원심분리하고, 최종 펠렛을 1%의 BSA가 첨가된 5 mM 소디움 테트라보레이트 (Sodium Tetraborate, pH7.2)에서 스펙트로포토메타 530nm에서 흡광도가 10+/-1이 되게 조정함으로써, 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형과 2형 특이 특이 항체-금 (Gold) 접합체를 제조하였다.
<4-3> 금 접합체 처리 패드의 준비
금 접합체 처리 패드는 상기 <실시예 4-2>에서 제조된 금 접합체에 트레할로스 (Trehalose, SIGMA)를 최종 농도가 5%(v/v)가 되도록 첨가하여 다음과 같이 제조하였다.
구체적으로 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형과 2형 특이 특이항체를 이용한 진단 스트립 (strip)을 위해, 0.5 x 20 cm 유리섬유에 상기 <실시예 4-2>에서 제조한 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형과 2형 특이 항체-금 (Gold) 접합체가 최종농도 1.0 내지 2.5 OD (Optical Density)가 되게 제조하였다.
<4-4> 흡수패드 및
검체패드
제조
흡수패드 및 검체패드는 반응용액이 잘 흡수될 수 있도록 건조하여 당업계에 공지된 방법에 따라 패드의 절단, 반응용액 처리(일반적으로 dipping), 건조, 및 보관 등의 과정으로 제조하였다.
<4-5>
디바이스
조립
상기에서 제조된 각각의 멤브레인과 패드들을, 오른쪽부터 검체패드, 골드패드(금 접합체 처리패드), 니트로셀룰로오스 멤브레인, 마지막으로 흡수패드를 각각 중첩되게 결합하고 면역분석장치(디바이스)에 크기에 맞는 스트립 크기로 절단하였다 (도 10 참조). 이렇게 절단된 스트립을 최종적으로 동시 진단용 면역분석장치(콤보 디바이스, 출원번호 10-2008-0075645)의 하판에 각각 넣고 상판을 덮어 동시 진단용 키트를 제조하였다 (도 9 참조).
<4-6> 제품 구성
상기에서 설명된 면역분석장치와 검체 전개액 (PBS, 50mM KCl, 300mM NaCl, 0.5% Tween20, 0.1% NaN3)을 최종 제품으로 구성하였다 (도 11 참조).
<
시험예
1>
돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제
항원형
1형과 2형 특이항체를 사용한 뉴라미니다아제 감별 진단 스트립의 효능 시험
상기의 <실시예 4>에 의해 제조된 감별 진단 키트를 이용하여 상기 표 2의 12종의 항원형별 인플루엔자바이러스를 대상으로 감별여부를 진단하였다.
상기 <실시예 4>에서 제조된 감별 진단 키트와 항원형별 바이러스의 유전자염기서열 결과를 가지고 각각 검사하여 그 결과를 표 5에 나타냈다.
| 항원형 | 균주 | HA Titer | 반응결과 | |
| NA1 | NA2 | |||
| H1N1 | A/hvPR8/34(H1N1) | 8 | + | - |
| H2N2 | A/Singapore/1/57 (H2N2) | 3 | - | + |
| H3N8 | A/duck/Ukraine/1/63 (H3N8) | 4~5 | - | - |
| H4N6 | A/duck/Czechoslovakia/1956 (H4N6) | 7 | - | - |
| H5N3 | A/duck/Hong Kong/820/80 (H5N3) | 5 | - | - |
| H6N5 | A/shearwater/Australia/1/1972 (H6N5) | 6~7 | - | - |
| H7N1 | A/duck/Hong Kong/301/78 (H7N1) | 6 | + | - |
| H8N4 | A/turkey/Ontario/6118/1968 (H8N4) | 4~5 | - | - |
| H9N2 | A/turkey/Wisconsin/66 (H9N2) | 5 | - | + |
| H10N7 | A/chicken/Germany/N'/49 (H10N7) | 8 | - | - |
| H11N6 | A/duck/England/1/1956 (H11N6) | 7~8 | - | - |
| H12N5 | A/duck/Alberta/60/1976 (H12N5) | 6 | - | - |
| H13N6 | A/gull/Maryland/704/77 (H13N6) | 6 | - | - |
상기 표 5에 기재한 바와 같이, 본 발명의 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형과 2형 특이항체를 이용한 진단 키트는, 유전자염기서열 결과와 일치하는 결과를 보여주었다.
따라서, 본 발명의 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형과 2형 특이항체는 인플루엔자바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형과 2형을 감별하는 진단키트를 개발하는데 매우 유용함을 알 수 있다.
도 9에 있어서, 각 부호는 하기와 같다.
1: 면역분석장치 2: 분석 스트립
3: 하부 케이스 4: 상부 케이스
3A, 3B: 제1, 제2 스트립 지지부
4A, 4B: 제1, 제2 스트립 대응부
21: 검체 패드 22: 멤브레인
221: 검사선 222: 대조선
23: 흡수 패드 24: 단변
25: 장변 31: 단변 고정부
32: 장변 고정부 33: 하부 차단부
41: 검체 투입구 42: 결과 표시창
43: 문자 표시구
1: 면역분석장치 2: 분석 스트립
3: 하부 케이스 4: 상부 케이스
3A, 3B: 제1, 제2 스트립 지지부
4A, 4B: 제1, 제2 스트립 대응부
21: 검체 패드 22: 멤브레인
221: 검사선 222: 대조선
23: 흡수 패드 24: 단변
25: 장변 31: 단변 고정부
32: 장변 고정부 33: 하부 차단부
41: 검체 투입구 42: 결과 표시창
43: 문자 표시구
서열목록 전자파일 첨부
Claims (27)
- 삭제
- SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열로 이루어진, 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형 단백질의 항원결정부위인 폴리펩타이드 분자.
- 삭제
- 제2항의 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 항체.
- 삭제
- 삭제
- 제4항에 있어서,
상기 항체는 단클론 항체 또는 다클론 항체인, 항체. - 제4항의 항체를 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스 검출용 키트.
- 삭제
- 삭제
- 제8항에 있어서,
SEQ ID NO: 8 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 항체 1종 이상을 더욱 포함하는,
돼지인플루엔자 바이러스 검출용 키트. - 인간을 제외한 동물 시료를 준비하는 단계;
상기 시료에 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열로 이루어진 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 항체를 적용하는 단계; 및
항원-항체 반응을 검사하는 단계
를 포함하는, 돼지인플루엔자 바이러스 검출 방법. - 삭제
- 삭제
- 제12항에 있어서, 상기 항체 적용단계는
상기 시료에 SEQ ID NO: 8 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 1종 이상의 항체를 추가로 적용하는 것을 특징으로 하는,
돼지인플루엔자 바이러스 검출 방법. - 제2항의 항원결정부위 폴리펩타이드 분자, 상기 폴리펩타이드 분자를 코딩하는 DNA 분자, 상기 DNA 분자를 포함하는 발현벡터, 및 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스에 대한 백신 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 제16항에 있어서,
SEQ ID NO: 8 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 1종 이상의 폴리펩타이드 분자, 상기 폴리펩타이드 분자를 코딩하는 DNA 분자, 상기 DNA 분자를 포함하는 발현벡터, 및 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더욱 포함하는 백신 조성물. - 제4항의 항체를 유효성분으로 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스 감염 예방 또는 치료용 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 제20항에 있어서,
SEQ ID NO: 8 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 1종 이상의 항체를 더욱 포함하는,
돼지인플루엔자 바이러스 감염 예방 또는 치료용 조성물. - 제8항에 있어서, 상기 키트는
SEQ ID NO: 1 내지 3 및 SEQ ID NO: 5 내지 7로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 1종 이상의 항체를 더욱 포함하고, 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형을 검출하는 것을 특징으로 하는,
돼지인플루엔자 바이러스 검출용 키트. - 제12항에 있어서, 상기 항체 적용단계는
상기 시료에 SEQ ID NO: 1 내지 3 및 SEQ ID NO: 5 내지 7로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 1종 이상의 항체를 추가로 적용하는 것이고, 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 항원형 1형을 검출하는 것을 특징으로 하는,
돼지인플루엔자 바이러스 검출 방법. - 제16항에 있어서,
SEQ ID NO: 1 내지 3 및 SEQ ID NO: 5 내지 7로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 1종 이상의 폴리펩타이드 분자, 상기 폴리펩타이드 분자를 코딩하는 DNA 분자, 상기 DNA 분자를 포함하는 발현벡터, 및 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더욱 포함하고, 뉴라미니다아제 항원형 1형의 돼지인플루엔자 바이러스에 대하여 효과를 갖는 것을 특징으로 하는,
백신 조성물. - 제20항에 있어서,
SEQ ID NO: 1 내지 3 및 SEQ ID NO: 5 내지 7로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 항원결정부위 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 1종 이상의 항체를 더욱 포함하고, 뉴라미니다아제 항원형 1형의 돼지인플루엔자 바이러스에 대하여 효과를 갖는 것을 특징으로 하는,,
돼지인플루엔자 바이러스 감염 예방 또는 치료용 조성물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020100090654A KR101329342B1 (ko) | 2010-09-15 | 2010-09-15 | 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 검출용 항체 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
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Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20120028665A KR20120028665A (ko) | 2012-03-23 |
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| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101329342B1 (ko) |
-
2010
- 2010-09-15 KR KR1020100090654A patent/KR101329342B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Journal of Virological Methods, Vol. 102, pp. 53-59 (2002.04.) * |
| PNAS, Vol. 106, No. 48, pp. 20365-20370 (2009.12.01.) * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20120028665A (ko) | 2012-03-23 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| AMND | Amendment | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
| GRNT | Written decision to grant |