KR20130142874A - B형 만성 간염의 검출 방법 및 검출 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 간편하고 고정밀도로 B형 만성 간염인지의 여부를 판정하는 방법을 제공한다.
<해결 수단>
본 발명의 B형 만성 간염의 검출 방법으로는, 피검자로부터 분리된 검체 중 IgG형 항 HBc 항체량을 측정하고, IgG형 항 HBc 항체량의 측정값이 미리 정해진 컷오프 값 이상인 경우에 B형 만성 간염이 검출된다. 컷오프 값은 40 IU/mL 이상인 값, 예를 들면 100 내지 200 IU/mL의 범위에서 선택되는 값이 될 수 있다. 본 발명에 따르면, IgM형 항 HBc 항체를 포함시킨 총 HBc 항체량을 조사하지 않고, IgG형 항 HBc 항체량에 기초하여 B형 만성 간염을 검출할 수 있다.

Description

B형 만성 간염의 검출 방법 및 검출 키트 {METHOD AND KIT FOR DETECTION OF CHRONIC HEPATITIS B}

본 발명은 B형 만성 간염의 검출 방법 및 검출 키트에 관한 것이다.

B형 간염은 현재 간질환 중에서 가장 많은 질환으로, B형 간염 바이러스(HBV)가 인간에게 감염됨으로써 야기되는 바이러스성 간염이다.

이 B형 간염 바이러스의 본체는, 직경 42 nm인 이중 구조의 구형 입자의 형상을 띄고 있는 「데인(dane) 입자」라 불리는 입자이다. 데인 입자는, 그 표면이 HBs 항원이라 불리는 표면 항원으로 덮여 있고, 또한 내부에는 HBc 항원(코어 항원), HBe 항원 및 바이러스 유전자를 코딩하는 환상 이중쇄 DNA를 포함하는 직경 27 nm의 코어 구조가 존재하는 것이 알려져 있다.

이들 항원이나 항원에 대한 자기항체는, 바이러스 감염의 진단을 위한 표적이 되어 왔다. 특히, HBc 항원에 대한 항체(이하, 항 HBc 항체라 함)는, HBV 감염의 초기부터 양성화되어, 감염 후 장기간에 걸쳐 양성으로 지속되기 때문에, HBV 감염을 폭넓게 검출할 수 있는 마커로서 이용되고 있다. 항 HBc 항체에는 IgM형이나 IgG형 등이 있다. IgM형의 항 HBc 항체는 B형 급성 간염의 감염 초기에 3 내지 12개월 정도, 일과성에 고역가로 출현하며, IgG형의 항 HBc 항체는 장기간에 걸쳐 양성이 된다.

B형 급성 간염과 B형 만성 간염은 그의 임상 경과나 예후가 다르다는 점에서, B형 간염을 진단함에 있어서 양자를 감별하는 것이 중요하다. 일반적으로, IgM형의 항 HBc 항체와 IgG형의 항 HBc 항체를 포함하는 항 HBc 항체의 총량(이하, 총 HBc 항체라 함)은, B형 급성 간염의 경우에는 저역가이고, B형 만성 간염의 경우에는 고역가이기 때문에, 종래 B형 급성 간염과 B형 만성 간염의 감별에는, 총 HBc 항체의 고역가, 저역가 판정이 응용되고 있다. 이 방법에 의해, 어느 정도 B형 급성 간염과 B형 만성 간염의 감별은 가능하지만, 정확한 진단율의 추가적인 향상이 요구되고 있었다.

상기한 바와 같이, IgM형의 항 HBc 항체는 B형 급성 간염의 감염 초기에 일과성에 고역가로 출현하기 때문에, B형 급성 간염의 진단에는 IgM형의 항 HBc 항체의 측정이 임상 응용되고 있다(비특허문헌 1). 그러나 본 방법에서는, 건강한 정상인과 B형 만성 간염 환자를 구별할 수 없기 때문에, B형 만성 간염의 진단을 위해서는, IgM형 항 HBc 항체의 측정 이외에 HBs 항원이나 총 HBc 항체 등을 측정할 필요가 있었다. 이 때문에, 보다 간편하게 B형 급성 간염과 B형 만성 간염을 감별하여, B형 만성 간염을 진단하기 위한 방법이 요구되고 있었다.

나카오 루미꼬 외, 의학과 약학 52(5): 847-858, 2004

본 발명의 목적은, 간편하고 고정밀도로 B형 만성 간염인지의 여부를 판정하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 B형 간염 바이러스 감염에 관한 연구를 거듭한 결과, 놀랍게도 검체 중 IgG형의 항 HBc 항체를 측정함으로써, B형 만성 간염을 B형 급성 간염과 구별하여 고정밀도로 검출할 수 있는 것을 발견하여, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 피검자로부터 분리된 검체 중 IgG형 항 HBc 항체량을 측정하는 것을 포함하는 B형 만성 간염의 검출 방법이며, IgG형 항 HBc 항체량의 측정값이 미리 정해진 컷오프(cut-off) 값 이상인 경우에 B형 만성 간염이 검출되는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 HBc 항원과, 항 IgG 항체 또는 그의 항원 결합성 단편을 포함하는, 상기 본 발명의 방법에 의해 B형 만성 간염을 검출하기 위한 B형 만성 간염 검출 키트를 제공한다.

본 발명에 따르면, 간편하고 고정밀도로 B형 만성 간염인지의 여부를 판정하는 방법이 제공된다. 본 발명에 따른 방법을 이용함으로써, 간편하고 고정밀도로 B형 급성 간염과 구별하여 B형 만성 간염을 진단할 수 있다.

도 1은 비 B형 간염 환자, B형 급성 간염 환자 및 B형 만성 간염 환자 유래의 검체에 있어서의 IgG형 항 HBc 항체 측정값을 도시한 도면이다.

본 발명에서는, 피검 개체로부터 분리된 검체 중 IgG형 항 HBc 항체량을 측정하고, 상기 항체량 측정값을 미리 정해진 컷오프 값과 대비하여 B형 만성 간염을 검출한다. 하기 실시예에 도시된 바와 같이, B형 간염 환자 유래의 검체 중 IgG형 항 HBc 항체의 농도는, 비 B형 간염 환자 유래의 검체 중 그 농도보다도 높고, 게다가 B형 만성 간염 환자 유래의 검체 중 IgG형 HBc 항체의 농도는, B형 급성 간염 환자 유래의 검체 중 그 농도보다도 높다. 따라서, B형 만성 간염 환자군과 B형 급성 간염 환자군을 충분한 정밀도로 구별할 수 있는 IgG형 항 HBc 항체량을 컷오프 값으로서 정해두면, 검체 중 IgG형 항 HBc 항체량의 측정값이 상기 컷오프 값 이상인지의 여부에 기초하여 피검 개체가 B형 만성 간염인지의 여부를 판정할 수 있다. 본 발명에 따르면, IgM형 항 HBc 항체량이나, IgM형 항 HBc 항체를 포함하는 총 HBc 항체량, 즉 IgM형 항 HBc 항체량을 조사하지 않고, IgG형 항 HBc 항체량에 기초하여 B형 만성 간염을 검출할 수 있다.

항체의 측정 방법 자체는 주지된 통상법이다. 본 발명에서는, IgG형의 항 HBc 항체를 특이적으로 검출할 수 있는 방법이면, 어떠한 수법을 이용할 수도 있다. 예를 들면, 화학 발광 면역 측정법(CLIA법), 화학 발광 효소 면역 측정법(CLEIA법), 라디오 면역 검정법(RIA법), ELISA법 및 형광 면역 측정법 등의 각종 면역 측정 방법을 사용할 수 있지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다.

예를 들면, 2스텝 샌드위치법에 기초하는 CLEIA법을 이용하여 검체 중 IgG형 항 HBc 항체를 측정하는 경우, 담체에 고상화된 HBc 항원을 이용한다. 고상화된 HBc 항원과 검체 중에 포함되는 항 HBc 항체를 접촉시킴으로써, HBc 항원과 항 HBc 항체를 반응시켜, HBc 항원을 통해 IgG형 항 HBc 항체를 포함하는 항 HBc 항체를 담체에 결합시킨다. 반응 후 B/F 분리를 행하여 세정한다. 이어서, 표지된 항 IgG 항체를 계 내에 첨가하고, HBc 항원에 결합한 IgG형 항 HBc 항체와 표지 항 IgG 항체를 반응시킨 후에 B/F 분리를 행하고, 세정에 의해 미반응된 표지 항 IgG 항체를 제거한다. 그 후, HBc 항원 및 IgG형 항 HBc 항체를 통해 담체에 결합한 표지 항 IgG 항체로부터의 시그널을 적당한 방법으로 검출함으로써, 검체 중에 포함되는 IgG형 항 HBc 항체를 특이적으로 측정하는 것이 가능해진다. 여기서는 2스텝법에 대해서 설명했지만, 1스텝법으로 행해질 수도 있다. 또한, 고상으로 항 IgG 항체를 결합시키고, 표지된 HBc 항원을 이용하여 측정을 행할 수도 있다. 또한, 경합법에 의해 IgG형 항 HBc 항체를 검출할 수도 있다.

IgG형 항 HBc 항체의 측정에 사용하는 HBc 항원으로는, 항 HBc 항체와 특이적으로 결합하는 것이면 어떠한 것이어도 좋다. 시판되고 있는 재조합 HBc 항원을 사용할 수 있으며, 주지된 유전자 공학적 수법에 의해 재조합 HBc 항원을 제조하여 이용할 수도 있다. B형 간염 바이러스 감염 세포로부터 HBc 항원을 추출하여 얻을 수도 있다.

HBc 단백질의 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 뉴클레오티드 배열은, NCBI의 GenBank 등의 데이터 베이스로부터 입수할 수 있기 때문에, 당업자이면 주지된 유전자 공학적 수법을 이용하여 재조합 HBc 항원을 용이하게 제조할 수 있다. 서열목록의 서열번호 1 및 2에 나타낸 배열은, 공지된 HBc 유전자 및 이것에 코딩되는 HBc 단백질의 배열의 일례이고, GenBank에 등록번호 AF324125.1로 등록되어 있는 배열이다. 지금까지 공지되어 있는 HBc 단백질의 아미노산 서열의 대부분은, 서열번호 2의 아미노산과 95％ 정도 이상의 동일성을 갖거나, 또는 1 내지 수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 갖고 있고, 그러한 아미노산 서열의 HBc 단백질이면 IgG형 항 HBc 항체 측정을 위한 HBc 항원으로서 바람직하게 사용 가능하다. 특히, HBc 항원의 배열은 이것으로 한정되는 것은 아니며, 서열번호 2의 아미노산 서열과 동일성이 95％ 미만인 것이나, N 말단 또는 C 말단에 태그 배열 등의 여분의 아미노산 서열이 부가된 것이어도, HBV에 감염된 개체의 체 내에서 유도되는 항 HBc 항체와의 반응성을 갖는 한, HBc 항원으로서 사용 가능하다. 본 발명에서 「HBc 항원」과 같은 경우에는, 상기한 각종 HBc 단백질이 포함된다.

또한, 아미노산 서열의 동일성이란, 비교하여야 할 2개의 아미노산 서열의 아미노산 잔기가 가능한 한 많이 일치하도록 양 아미노산 서열을 정렬시키고, 일치된 아미노산 잔기수를 전체 아미노산 잔기수로 나눈 것을 백분율로 나타낸 것이다. 상기 정렬시에는, 필요에 따라 비교하는 2개의 배열 중 한쪽 또는 양쪽에 적절하게 갭을 삽입한다. 이러한 배열의 정렬화는, 예를 들면 BLAST, FASTA, CLUSTAL W 등의 주지된 프로그램을 이용하여 행할 수 있다. 갭이 삽입되는 경우, 상기 전체 아미노산 잔기수는, 하나의 갭을 하나의 아미노산 잔기로서 계산한 잔기수가 된다. 이와 같이 하여 계산한 전체 아미노산 잔기수가, 비교하는 2개의 배열 사이에서 다른 경우에는, 동일성(％)은 긴 쪽 배열의 전체 아미노산 잔기수에서, 일치한 아미노산 잔기수를 나눠서 산출된다. 다만, 비교하여야 할 배열이 다른 임의의 배열(예를 들면 태그 배열, 링커 배열, 다른 단백질의 배열 등)과 연결된 상태에 있는 경우에는, 그와 같은 임의의 배열은 제외하고 동일성이 산출된다.

천연의 단백질을 구성하는 20종류의 아미노산은, 저극성 측쇄를 갖는 중성 아미노산(Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro), 친수성 측쇄를 갖는 중성 아미노산(Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr, Cys), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(Arg, Lys, His), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp)과 같이 유사한 성질을 갖는 것으로 그룹화할 수 있다. 이들 그룹 내에서의 치환이면 단백질의 성질이 많이 변화하지 않는 것이 알려져 있다. 따라서, 서열번호 2에 예시한 공지된 HBc 단백질과 아미노산 서열이 일부 차이가 있는 단백질이어도, 이들 그룹 내에서의 치환이면, 항 HBc 항체와의 결합성도 유지될 가능성이 높다.

고상용 담체는, 면역 측정용으로 종래 이용되고 있는 것으로, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 플라스틱 플레이트, 미립자, 섬유상 물질 등을 사용할 수 있다. 이들 담체의 재질로는 종래 공지된 것을 사용할 수 있으며, 특별히 한정되지 않지만, 미립자이면, 예를 들면 유리 비드, 폴리스티렌 등의 각종 플라스틱 비드, 라텍스 입자 및 각종 페라이트 입자(예를 들면, 일본 특허 공개 (평)3-115862호 공보 참조) 등을 들 수 있다. 또한, 섬유상 물질로는, 예를 들면 셀룰로오스, 니트로셀룰로오스, 키토산, 폴리에틸렌글리콜 중합체, 실란 중합체 등을 구성 성분으로 하는 것을 들 수 있다.

이들 담체에 대한 HBc 항원의 고상화는, 물리 흡착, 가교제를 이용한 화학 결합 등 공지된 방법을 적절하게 사용할 수 있다.

본 발명에 사용하는 항 IgG 항체로는, IgG형의 항체에 특이적으로 결합하는 것이면 되고, 항 IgG 항체 또는 그의 항원 결합성 단편을 사용할 수 있다. 검체의 유래에서 적합한 항 IgG 항체가 바람직하게 사용되며, 예를 들면 인간 유래의 검체를 이용하는 경우에는, 항 인간 IgG 항체 또는 그의 항원 결합성 단편을 이용하는 것이 바람직하다. 항 IgG 항체 또는 그의 항원 결합성 단편의 구체예로는, 마우스, 토끼, 닭, 염소, 양, 소 등의 실험 동물을 면역하여 얻어지는 폴리클로날 항체; 면역된 실험 동물로부터 비장 세포를 분리하고, 미엘로마 세포와 융합시킴으로써 얻어지는 하이브리도마가 생산하는 모노클로날 항체; 면역된 실험 동물로부터 분리된 비장 세포 또는 혈중 백혈구를 EB 바이러스에 의해 불사화시킨 세포가 생산하는 모노클로날 항체; 재조합 항체; IgG에의 결합성을 갖는 상기 항체의 단편(예를 들면, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, scFv) 등, IgG형 항체에 높은 특이성, 친화성을 나타내는 분자이면 어떠한 것이어도 사용할 수 있다. 항 IgG 항체 또는 그의 항원 결합성 단편은 시판품을 이용할 수도 있고, 주지된 통상법에 의해 항 IgG 항체 또는 그의 항원 결합성 단편을 제작하여 이용할 수도 있다.

항 IgG 항체 또는 그의 항원 결합성 단편 또는 HBc 항원의 표지에 이용하는 표지 물질로는, 예를 들면 효소, 형광 물질, 화학 발광 물질, 염색 물질, 방사성 물질 등을 들 수 있다. 효소로는, 알칼리포스파타아제(ALP), 퍼옥시다아제, β갈락토시다아제 등 공지된 것을 사용할 수 있지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 높은 검출 감도의 측정계를 제공하기 위해서는, ALP를 이용하는 것이 바람직하다.

표지 물질로서 효소를 이용하는 경우, 이 효소에 대응한 발색 기질, 형광 기질 또는 발광 기질 등의 기질을 측정계 내에 첨가하고, 효소 반응에 의해 발생되는 발색이나 발광 등의 시그널을 흡광 광도계나 루미노미터(lumino meter) 등을 이용하여 측정할 수 있다. 예를 들면, 표지 물질로서 ALP를 이용하는 경우, 3-(4-메톡시스피로(1,2-디옥세탄-3,2'-트리시클로[3.3.1.1^3,7]데칸)-4-일)페닐포스페이트2나트륨(예를 들면 상품명 AMPPD(등록상표)) 등의 발광 기질을 사용할 수 있다. 표지 물질로서 비오틴 또는 합텐이 이용되는 경우에는, 효소, 형광 물질, 화학 발광 물질, 염색 물질, 또는 방사성 물질 등을 결합한 스트렙트아비딘 또는 합텐 항체 등을 이용할 수 있다.

항 IgG 항체의 표지는, 공지된 공유결합법 등에 의해 직접 표지할 수도 있고, 비오틴-아비딘 등 다른 결합쌍을 이용하여 간접적으로 표지할 수도 있다.

IgG형 항 HBc 항체를 다양한 농도로 포함하는 농도 기지의 표준 시료에 대해서, HBc 항원을 이용하여 IgG형 항 HBc 항체의 측정을 행하여, 표지로부터의 시그널의 양과 표준 시료 중 IgG형 항 HBc 항체 농도와의 상관 관계를 플롯하여 표준 곡선을 제조해 둔다. IgG형 항 HBc 항체 농도가 미지의 대상 검체에 대해서 동일한 조작을 행하여 표지로부터의 시그널량을 측정하고, 측정된 시그널량을 이 표준 곡선에 적용시킴으로써, 검체 중 IgG형 항 HBc 항체를 정량할 수 있다. 항 HBc 항체용 WHO 제1 국제 표준품(WHO International Standard First International Standard for anti-Hepatitis B core antigen(anti-HBc), plasma, human. NIBSC code: 95/522)을 이용하여 표준 곡선을 제조하고, 이 표준 곡선에 기초하여 피검 개체 유래의 검체 중 IgG형 항 HBc 항체량을 산출하면, 국제 단위에 의한 농도(IU/mL)로 항체량을 표시할 수 있다. 또는, 상기한 국제 표준품에 대하여 교정된 다른 표준품을 이용하여도, 국제 단위에 의한 농도(IU/mL)로 항체량을 구할 수 있다.

본 발명의 방법으로는, 상기한 바와 같이 하여 검체 중 IgG형 항 HBc 항체량을 측정한 후, 측정값을 미리 정해진 컷오프 값과 대비한다. 이 컷오프 값은, 피검 개체가 B형 만성 간염인지의 여부를 판정하는 지표가 되는 값으로, 항체량 측정값이 이 컷오프 값 이상이었던 경우에 피검 개체가 B형 만성 간염이라 판정할 수 있다. 즉, IgG형 항 HBc 항체량의 측정값이 미리 정해진 해당 컷오프 값 이상인 경우에 B형 만성 간염이 검출된다.

B형 만성 간염의 지표가 되는 컷오프 값은, 다음과 같이 정할 수 있다. 기지의 B형 급성 간염 환자군 및 B형 만성 간염 환자군에서 유래되는 복수의 검체(가능한 한 다수가 바람직함)에 대해서, IgG형 항 HBc 항체의 면역 측정을 행하여, 상기한 바와 같이 하여 제조한 검량 곡선에 시그널 측정량을 적용시켜 각 검체의 IgG형 항 HBc 항체량을 산출하여, 항체량의 측정값을 얻는다. 얻어진 측정값에 기초하여, B형 급성 간염 환자군 및 B형 만성 간염 환자군을 충분하고 정확한 진단율로 구별할 수 있는 값을 선택하고, 이를 B형 만성 간염의 지표가 되는 컷오프 값으로서 사용할 수 있다.

항 HBc 항체용 WHO 제1 국제 표준품 또는 상기 국제 표준품에 대하여 교정된 다른 표준품을 이용하여 제조한 표준 곡선에 기초하여 항체량을 산출하면, 컷오프 값을 국제 단위에 의한 항체 농도(IU/mL)로 나타낼 수 있다. 국제 단위로 표현된 컷오프 값은 사용하는 측정계(시약, 장치)나 실시하는 장소를 막론하고, 국제적으로 공통되어 사용할 수 있다.

또는, 컷오프 값은 항체 측정계마다 설정된 계산식에 기초하여 구해지는 상대값(Cut Off Index(C.O.I.))으로서 나타낼 수도 있다. 상대값으로서 산출하는 경우도, 항체 농도로서의 컷오프 값을 구한 경우와 마찬가지로, 기지의 B형 급성 간염 환자군 및 B형 만성 간염 환자군에서 유래되는 복수의 검체에 대해서, 검체 중 IgG형 항 HBc 항체를 측정하고, 각 측정계에서 설정된 계산식에 기초하여 C.O.I.를 산출한다. 그리고, B형 급성 간염 환자군 및 B형 만성 간염 환자군을 충분하고 정확한 진단율로 구별할 수 있는 값(C.O.I.)을 컷오프 값으로서 채용할 수 있다.

어떤 임의의 값으로 컷오프 값을 설정했을 때, IgG형 항 HBc 항체량이 그 컷오프 값 이상인 개체를 「B형 만성 간염 양성」, 그 컷오프 값 미만인 개체를 「B형 급성 간염 양성」으로 하면, 그 컷오프 값에서의 정확한 진단율은 (B형 급성 간염 전체 개체수-B형 급성 간염 양성수+B형 만성 간염 양성수)/(B형 급성 간염 전체 개체수+B형 만성 간염 전체 개체수)로 산출할 수 있다. 본 발명에서의 컷오프 값은, B형 급성 간염과 B형 만성 간염을 감별할 때의 정확한 진단율이 80％ 이상, 85％ 이상, 86％ 이상, 87％ 이상, 88％ 이상, 89％ 이상, 90％ 이상, 91％ 이상, 92％ 이상, 93％ 이상, 94％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상, 99％ 이상 또는 100％가 되도록 설정할 수 있다.

본 발명에서 이용하는 컷오프 값은, 구체적으로는 40 IU/mL 이상의 값이 될 수 있다. 바람직하게는, 40 내지 470 IU/mL 사이의 값, 보다 바람직하게는 80 내지 320 IU/mL 사이의 값, 더욱 바람직하게는 100 내지 200 IU/mL 사이의 값이다. 컷오프 값이 40 내지 470 IU/mL의 범위에서 선택되는 경우, 85.0％ 이상의 정확한 진단율로 B형 급성 간염과 B형 만성 간염을 감별할 수 있다(하기 실시예 참조). 또한, 컷오프 값이 80 내지 320 IU/mL, 또는 100 내지 200 IU/mL의 범위에서 선택되는 경우, 각각 90.0％ 이상, 93.8％ 이상이라는 더욱 높고 정확한 진단율로 B형 급성 간염과 B형 만성 간염을 감별할 수 있다. 따라서, 상기한 바와 같은 컷오프 값과 비교함으로써, 고정밀도로 B형 급성 간염과 구별하여 B형 만성 간염을 검출할 수 있다.

본 발명에서는 추가로 건강한 정상인과 B형 간염 환자(구체적으로는 B형 급성 간염 환자)를 감별하는 제2 컷오프 값을 설정할 수도 있다. 이하, 제2 컷오프 값과 구별하여, 상기한 B형 만성 간염인지 여부의 지표가 되는 컷오프 값을 「제1 컷오프 값」이라 한다. 제2 컷오프 값은 제1 컷오프 값과 마찬가지로, 예를 들면 다음과 같이 하여 설정할 수 있다. 기지의 B형 급성 간염 환자군 및 비 B형 간염 환자군에서 유래되는 복수의 검체(가능한 한 다수가 바람직함)에 대해서, IgG형 항 HBc 항체의 면역 측정을 행하여, 상기한 바와 같이 하여 제조한 표준 곡선에 시그널 측정량을 적용시켜 각 검체의 IgG형 항 HBc 항체량을 산출하여, 항체량의 측정값을 얻는다. 얻어진 측정값에 기초하여, 건강한 정상인군 및 B형 급성 간염 환자군을 충분하고 정확한 진단율로 구별할 수 있는 값을 선택하고, 이를 건강한 정상인과 B형 간염 환자(보다 구체적으로는 B형 급성 간염 환자)를 구별하는 지표가 되는 제2 컷오프 값으로서 사용할 수 있다.

제2 컷오프 값도 제1 컷오프 값과 마찬가지로, 국제 단위에 의한 항체 농도(IU/mL)나 C.O.I.로 표현할 수 있다.

제2 컷오프 값은, 건강한 정상인과 B형 급성 간염 환자를 감별할 때의 정확한 진단율이 80％ 이상, 85％ 이상, 86％ 이상, 87％ 이상, 88％ 이상, 89％ 이상, 90％ 이상, 91％ 이상, 92％ 이상, 93％ 이상, 94％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상, 99％ 이상 또는 100％가 되도록 설정할 수 있다. 구체적으로는, 제2 컷오프 값은 0.7 내지 0.9 IU/mL의 범위에서 선택되는 값이 될 수 있지만, 이것으로 한정되지 않는다. 또한, 이 경우의 정확한 진단율은 (건강한 정상 전체 개체수-건강한 정상 양성수+B형 급성 간염 양성수)/(건강한 정상 전체 개체수+B형 급성 간염 전체 개체수)로 산출할 수 있다.

본 명세서에 있어서 「건강한 정상인」 및 「비 B형 간염 환자」라는 단어는 HBV에 감염되지 않고, B형 간염을 앓고 있지 않은 개체를 가리킨다. B형 간염의 기왕력이 없는 건강한 정상인은, 통상 HBs 항원 및 항 HBs 항체 등을 비롯한 각종 HBV 단백질 및 항 HBV 단백질 항체가 음성이다. 제2 컷오프 값을 결정할 때는, 건강한 정상인 내지는 비 B형 간염 환자에서 유래되는 검체를 복수 사용하지만, 건강한 정상인 또는 비 B형 간염 환자인 것은, 임상 증상 및 각종 혈액 검사 소견에 의해 판단할 수 있다. 예를 들면, 하기 실시예에 기재한 바와 같이, 간염 증상이 없고, HBs 항원 음성 또한 항 HBs 항체 음성의 개체에서 유래되는 검체를, 제2 컷오프 값을 결정할 때의 건강한 정상인 검체 내지는 비 B형 간염 환자 검체로서 사용할 수 있다.

또한, 제1 및 제2 컷오프 값은, 상술한 바와 같이 정확한 진단율에 기초하여 결정할 수 있지만, 이것으로 한정되는 것은 아니며, 감도나 특이도 등의 체외 진단약에 있어서 일반적으로 이용되는 다른 지표에 기초하여 적절하게 결정할 수도 있다.

제1 및 제2 컷오프 값은 실시할 때마다 정할 필요는 없으며, IgG형 항 HBc 항체의 측정에 사용하는 측정계가 동일하다면, 그 측정계를 이용하여 일단 정한 컷오프 값을 그 후에 실시할 때에도 그대로 사용할 수 있다. 컷오프 값이 국제 단위로 표시되고 있으면, 어떠한 측정계를 이용하는 경우에도 동일한 컷오프 값을 사용할 수 있다. 본 발명에서는, 예를 들면 상기한 국제 단위에 의한 항체 농도로 나타낸 바람직한 컷오프 값을 그대로 이용할 수 있다.

본 발명에서 이용되는 검체로는 전혈, 혈장, 혈청, 뇨, 침, 뇌척수액 등의 생물학적 체액 및 간 조직 등을 들 수 있고, 특히 전혈, 혈청, 혈장 샘플이 바람직하지만, 이들로 한정되지 않는다.

피검 개체는 포유동물이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 인간이다. 피검 개체는 B형 간염이 의심되는 환자, 또는 간염(특히 B형 간염)이 발병한 환자일 수 있다. 예를 들면, 간염이 발병한 환자로부터 분리된 검체에 대하여 본 발명의 방법을 실시한 경우, 상기 환자가 B형 급성 간염 또는 B형 이외의 간염을 앓고 있을 때는, 검체 중 IgG형 항 HBc 항체량은 제1 컷오프 값 이상은 되지 않기 때문에, 이러한 경우에도 본 발명의 방법에 의해 B형 만성 간염의 검출이 가능하다.

또한, 예를 들면 B형 간염이 발병한 환자 내지는 B형 간염이 의심되는 환자에 대하여 본 발명의 방법을 실시하면, 제1 컷오프 값만을 이용하여, 상기 환자가 B형 급성 간염인지 B형 만성 간염인지를 감별할 수 있다. 구체적으로는, 검체 중 IgG형 항 HBc 항체량이 제1 컷오프 값 이상이면 B형 만성 간염, 제1 컷오프 값 미만이면 B형 급성 간염이라 진단하는 것이 가능하다.

제1 컷오프 값과 함께 제2 컷오프 값을 이용하는 경우에는, 건강한 정상인(주로 B형 간염 기왕력이 없는 건강한 정상인), B형 급성 간염 및 B형 만성 간염의 3자의 판별도 가능하다 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 본 발명의 방법으로 B형 만성 간염을 검출하기 위한 검출 키트도 제공한다. 상기 키트는 HBc 항원과, 항 IgG 항체 또는 그의 항원 결합성 단편을 포함하여, 검체 중 IgG형 항 HBc 항체를 면역 측정법에 의해 측정한다. 면역 측정 방법, HBc항원 및 항 IgG 항체 또는 그의 항원 결합성 단편에 대한 조건 등은 상기와 마찬가지이다. 예를 들면, HBc 항원은 플레이트나 입자(예를 들면 자성 입자, 라텍스 입자 등) 등의 고상으로 결합된 형태일 수도 있고, 항 IgG 항체 또는 그의 항원 결합성 단편은 임의의 표지 물질로 표지된 형태일 수도 있다. 또는, 이것과는 반대로 항 IgG 항체 또는 그의 항원 결합성 단편이 고상으로 결합된 형태이면서, HBc 항원이 표지된 형태일 수도 있다.

B형 만성 간염 검출 키트에는, B형 만성 간염 검출의 지표가 되는 제1 컷오프 값이 기재된 지시서도 추가로 포함될 수 있다. 상기 지시서에는, 건강한 정상인과 B형 급성 간염과의 판별 지표가 되는 제2 컷오프 값도 기재될 수 있다. 본 발명의 방법으로는 IgM형의 항 HBc 항체를 측정할 필요가 없기 때문에, 본 발명의 검출 키트에는, 항 IgM 항체 및 그의 항원 결합성 단편이 모두 포함되지 않아도 된다. 그 밖에 상기 키트는 사용하는 표지 물질에 따라 적당한 기질액이나, 검체 희석액, 세정액 등의, 면역 측정 키트에 일반적으로 포함되어 있는 시약류 등도 포함하고 있어도 좋다.

[실시예]

이하, 실시예에 의해 본 발명에 대해서 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예: IgG형 항 HBc 항체의 측정에 의한 B형 간염의 감별

(1) HBc 항원 결합 입자의 제작

재조합 HBc 항원 결합 입자를 다음과 같이 제조하였다.

자성 페라이트 입자(니혼페인트사 제조) 1 mg에 재조합 HBc 항원(후지레비오사 제조) 1.5 ㎍을 첨가하였다. 25℃에서 1시간 동안 완만히 교반하면서 인큐베이트하였다. 반응 후, 페라이트 입자를 자석으로 모아 반응액으로부터 분리하고, 입자를 완충액 A(50 mM 트리스 완충액 pH 7.2, 0.15％ NaCl, 0.1％ 아지드화나트륨, 2％ BSA)로 세정하여, 재조합 HBc 항원 결합 입자를 얻었다.

(2) ALP 표지 항 IgG 항체의 제작

마우스 항 인간 IgG 모노클로날 항체(후지레비오사 제조)와 소 소장 유래 알칼리포스파타아제(오리엔탈 코보사 제조)를 요시타케 등의 방법(Yoshitake et al., J. Biochem. 1982, 92(5), p1413-1424)에 의해 결합시켜 ALP 효소 표지 항체를 제조하였다.

구체적으로는, 탈염 처리한 마우스 항 인간 IgG 모노클로날 항체(최종 농도 3 mg/mL)와 펩신(최종 농도 6 ㎍/mL)을 0.1 M 시트르산 버퍼(pH 3.5) 중에서 혼합하고, 37℃에서 1시간 정치하여 펩신 소화를 행하였다. 반응을 정지시킨 후에 겔 여과 정제를 행하여, FC 영역을 제거한 항 인간 IgG 항체를 얻었다. 다음으로, 2-메르캅토에탄올(최종 농도 10 mM)을 첨가하여 37℃에서 3시간 정치하여 티올화를 행하였다. 추가로 탈염 처리하여 항 인간 IgG 항체의 Fab를 얻었다.

한편, 탈염한 알칼리포스파타아제와 N-(4-말레이미드부틸옥시)-숙신이미드(GMBS)(최종 농도 0.3 mg/mL)를 혼합하고, 30℃에서 1시간 정치하여 말레이미드화를 행하였다.

탈염한 후, Fab와 말레이미드화 알칼리포스파타아제를 몰비 1:1의 비율로 혼합하고, 25℃에서 30분간 정치하여 커플링을 행하였다. 커플링액에 2-메르캅토에탄올(최종 농도 10 mM)을 첨가하여 4℃에서 밤새 정치하고, 반응을 정지시켰다. 농축 및 탈염 후, 1％ BSA, 1 mM NaCl, 0.1 mM ZnCl₂를 함유하는 100 mM MES(pH 6.8)를 가하여 200 ㎍/mL로 제조하고, ALP 표지 항 IgG 항체 용액으로 하였다.

(3) IgG형 항 인간 HBc 항체의 측정

표준 곡선의 제조에 이용하는 기준 시료는, 항 HBc 항체용 WHO 제1 국제 표준품(WHO International Standard First International Standard for anti-Hepatitis B core antigen (anti-HBc), plasma, human NIBSC code: 95/522)을 기초로 IgG형 항 HBc 항체 농도(IU/ml)를 결정한 B형 만성 간염 환자 유래 검체를 적절하게 희석하여 준비하였다.

항 HBc 항체용 WHO 제1 국제 표준품 상당으로 0, 1, 20, 50, 100, 200, 400, 600, 800, 1000 IU/ml의 항 HBc 항체(IgG형) 농도로 조정한 기준 시료를 루미펄스(등록상표) 검체 희석액(후지레비오사 제조)으로 19배 희석하였다. 희석한 각 기준 시료의 10 ㎕를, (1)에서 제작한 HBc 항원 결합 입자 용액 0.25 mL에 첨가하고, 37℃에서 10분간 반응시켰다. 자석을 이용하여 B/F 분리하고, 세정 후 (2)에서 제조한 ALP 표지 항 IgG 항체 용액을 0.25 mL 가하고, 다시 37℃에서 10분간 반응시켰다. 자석을 이용하여 B/F 분리하고, 세정 후 화학 발광 기질인 3-(2'-스피로아다만탄)-4-메톡시-4-(3"-포스포릴옥시)페닐-1,2-디옥세탄·2나트륨염(AMPPD(등록상표))을 포함하는 루미펄스(등록상표) 기질액(후지레비오사 제조) 200 ㎕를 가하고, 37℃, 5분간 반응시켜 발광량을 루미노미터로 측정하였다. 실제 측정은 전자 동화학 발광 효소 면역 측정 시스템(루미펄스(등록상표) G1200(후지레비오사 제조))로 행하였다.

항 HBc 항체용 WHO 제1 국제 표준품의 각 농도에 상당하는 기준 시료의 측정 결과로부터, 스플라인 곡선을 제조하여 표준 곡선으로 하였다.

(4) 검체 측정

(3)에 기재한 측정 방법에 따라 검체를 측정하였다. 측정 대상은 나가사키 의료 센터에서 임상 증상 및 각종 혈액 검사 소견에 의해 B형 급성 간염이라 진단된 30예, B형 만성 간염이라 진단된 130예, 및 HBs 항원·항체 모두 음성인 비 B형 간염의 30예였다. 검체로서, -20℃에서 보관된 상기 190예의 혈청을 측정 전에 용해시켜 이용하였다.

(3)에 기재한 방법에 의해 검체를 측정하고, (3)에서 작성한 표준 곡선에 기초하여 각 항체 농도(IU/mL)를 구하였다. 결과를 도 1 및 하기 표 1에 나타내었다. 또한, 도 1에서는, 1000 IU/mL 이상의 농도의 검체는 1000 IU/mL로서 나타났다.

그 결과, 놀랍게도 IgG형 항 HBc 항체의 측정값은, 급성 간염 환자가 낮은 값의 영역, 만성 간염 환자가 높은 값의 영역에 분포하는 경향을 볼 수 있었다.

도 1 및 표 1에 나타낸 바와 같이, 40 내지 470 IU/mL의 범위의 값을 컷오프 값으로 했을 때, 정확한 진단율 85.0％ 이상으로 B형 급성 간염과 B형 만성 간염을 감별하는 것이 가능하다는 것이 분명해졌다. 또한, 80 내지 320 IU/mL 범위의 값을 컷오프 값으로 했을 때의 정확한 진단율은 90.0％ 이상, 100 내지 200 IU/mL 범위의 값을 컷오프 값으로 했을 때의 정확한 진단율은 93.8％ 이상으로 매우 높은 정확한 진단율로 B형 급성 간염과 B형 만성 간염을 감별할 수 있다는 것이 분명해졌다.

이들 결과로부터, 검체 중 IgG형 항 HBc 항체의 농도를 측정함으로써, 고정밀도로 B형 급성 간염 환자와 B형 만성 간염 환자를 감별하는 것이 가능하다는 것이 나타났다. 본 발명의 방법에 따르면, 간편하고 높은 정밀도로 B형 만성 간염인지의 여부를 판정할 수 있다. 구체적으로는, 검체 중 IgG형 항 HBc 항체의 농도를 측정하고, 측정된 IgG형 항 HBc 항체 농도를 B형 만성 간염과 B형 급성 간염 및 비 B형 간염을 감별할 수 있는 컷오프 값과 비교하여, 항체 농도가 상기 컷오프 값 이상인 경우에는, 검체는 B형 만성 환자 유래라고 판정할 수 있다.

또한, 도 1에 나타낸 바와 같이, HBs 항원·항체 모두 음성인 비 B형 간염 환자 유래의 검체에 있어서, IgG형 항 HBc 항체는 거의 검출되지 않으며, 그 측정값을 상기 표준 곡선에 적용시키면 0.4 IU/mL 이하의 수치가 되었다. 한편, B형 간염 환자 유래의 검체에 있어서의 IgG형 항 HBc 항체의 측정값은 18 IU/mL 이상의 수치가 되어, 0.5 내지 17 IU/mL의 범위의 값, 예를 들면 0.7 내지 0.9 IU/mL의 값을 제2 컷오프 값으로 함으로써, HBs 항원·항체 모두 음성인 비 B형 간염 환자와, B형 간염 환자를 식별할 수 있었다. 본 결과로부터, IgG형 항 HBc 항체 농도에 있어서의 상기한 제2 컷오프 값은, 비 B형 간염과 B형 간염을 식별하기 위한 지표가될 수 있는 것이 시사되었다.

참고예: 총 HBc 항체의 측정에 의한 B형 간염의 감별

검체 중 IgG형 항 인간 HBc 항체 및 IgM형 항 인간 HBc 항체를 포함하는 항 인간 HBc 항체의 총량을 측정하고, 고역가, 저역가 판정을 이용함으로써, B형 급성 간염과 B형 만성 간염을 종래법으로 감별하였다. 또한, 총 HBc 항체는, 루미펄스 프레스트(등록상표) HBcAb(후지레비오사 제조)를 이용하여 경합법에 의해 측정하였다. 검체는, 상기 (4)에서 이용한 검체와 동일 검체를 이용하였다.

그 결과, 총 HBc 항체가 50 INH％인 경우, 가장 높고 정확한 진단율로 B형 급성 간염과 B형 만성 간염을 감별할 수 있고, 그의 정확한 진단율은 71.3％였다. 이에 따라, 종래법인 항 인간 HBc 항체의 총량을 이용한 B형 만성 간염과 B형 급성 간염의 감별 방법과 비교하여, IgG형 항 HBc 항체의 양에만 기초하는 본 발명의 방법으로는, 매우 높고 정확한 진단율로 B형 급성 간염 환자와 B형 만성 간염 환자를 감별할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

본 발명의 방법을 이용함으로써, 간편하고 고정밀도로 B형 급성 간염과 B형 만성 간염을 감별하고, B형 만성 간염인지의 여부를 판정할 수 있다. 이 때문에, 본 발명은 HBV 감염의 예방, 진단 및 치료에 유용하다.

SEQUENCE LISTING <110> FUJIREBIO Inc. National Hospital Organization <120> Method and kit for detection of chronic hepatitis B <130> 1432 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 558 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <220> <221> CDS <222> (1)..(558) <400> 1 atg gac att gac cct tat aaa gaa ttt gga gct act gtg gag tta ctc 48 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 tcg ttt ttg cct tct gac ttc ttt cct tcc gtc aga gat ctc cta gac 96 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 acc gcc tca gct ctg tat cga gaa gcc tta gag tct cct gag cat tgc 144 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 tca cct cac cat act gca ctc agg caa gcc att ctc tgc tgg ggg gaa 192 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 ttg atg act cta gct acc tgg gtg ggt aat aat ttg gaa gat cca gca 240 Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala 65 70 75 80 tcc agg gat cta gta gtc aat tat gtt aat act aac atg ggt tta aag 288 Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95 atc agg caa cta ttg tgg ttt cat ata tct tgc ctt act ttt gga aga 336 Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 gag act gta ctt gaa tat ttg gtc tct ttc gga gtg tgg att cgc act 384 Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 cct cca gcc tat aga cca cca aat gcc cct atc tta tca aca ctt ccg 432 Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 gaa act act gtt gtt aga cga cgg gac cga ggc agg tcc cct aga aga 480 Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg 145 150 155 160 aga act ccc tcg cct cgc aga cgc aga tct caa tcg ccg cgt cgc aga 528 Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg 165 170 175 aga tct caa tct cgg gaa tct caa tgt tag 558 Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 180 185 <210> 2 <211> 185 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 2 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala 65 70 75 80 Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95 Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg 145 150 155 160 Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg 165 170 175 Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 180 185

Claims (12)

1. 피검 개체로부터 분리된 검체 중 IgG형 항 HBc 항체량을 측정하는 것을 포함하는 B형 만성 간염의 검출 방법이며, IgG형 항 HBc 항체량의 측정값이 미리 정해진 컷오프 값 이상인 경우에 B형 만성 간염이 검출되는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 컷오프 값이 40 IU/mL 이상인 수치로부터 선택되는 값인 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 컷오프 값이 40 내지 470 IU/mL의 범위에서 선택되는 값인 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 컷오프 값이 80 내지 320 IU/mL의 범위에서 선택되는 값인 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 컷오프 값이 100 내지 200 IU/mL의 범위에서 선택되는 값인 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피검 개체가 인간인 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피검 개체가 B형 간염이 의심되는 환자인 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피검 개체가 간염을 앓고 있는 환자인 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검체가 혈액, 혈청 또는 혈장인 방법.
10. HBc 항원과, 항 IgG 항체 또는 그의 항원 결합성 단편을 포함하는, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 B형 만성 간염을 검출하기 위한 B형 만성 간염 검출 키트.
11. 제10항에 있어서, 항 IgM 항체 및 그의 항원 결합성 단편이 모두 포함되지 않는 키트.
12. 제10항 또는 제11항에 있어서, B형 만성 간염 검출의 지표가 되는 상기 컷오프 값이 기재된 지시서를 추가로 포함하는 키트.

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