JP2014002117A - Ｂ型慢性肝炎の検出方法および検出キット - Google Patents

Abstract

【課題】簡便かつ高精度にＢ型慢性肝炎か否かを判定する方法を提供すること。
【解決手段】本発明のＢ型慢性肝炎の検出方法では、被検者から分離された検体中のＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体量を測定し、ＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体量の測定値が予め定められたカットオフ値以上である場合にＢ型慢性肝炎が検出される。カットオフ値は、40 IU/mL以上の値、例えば100〜200 IU/mLの範囲から選択される値であり得る。本発明によれば、ＩｇＭ型抗ＨＢｃ抗体を含めた総ＨＢｃ抗体量を調べることなく、ＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体量に基づいてＢ型慢性肝炎を検出できる。
【選択図】図１

Description

本発明は、Ｂ型慢性肝炎の検出方法および検出キットに関する。

Ｂ型肝炎は、現在、肝疾患の中で最も多い疾患であり、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）がヒトに感染することにより引き起こされるウイルス性肝炎である。

このＢ型肝炎ウイルスの本体は、直径４２ｎｍの二重構造の球形粒子の形状をとっている「デーン（ｄａｎｅ）粒子」と称される粒子である。デーン粒子は、その表面がＨＢｓ抗原と称される表面抗原で覆われており、さらに内部には、ＨＢｃ抗原（コア抗原）、ＨＢｅ抗原、及びウイルス遺伝子をコードする環状二重鎖ＤＮＡを含む直径２７ｎｍのコア構造が存在することが知られている。

これら抗原や抗原に対する自己抗体は、ウイルス感染の診断のための標的とされてきた。特に、ＨＢｃ抗原に対する抗体（以下、抗ＨＢｃ抗体という）は、ＨＢＶ感染の初期から陽性化し、感染後長期間にわたり陽性であり続けることから、ＨＢＶ感染を広く検出できるマーカーとして用いられている。抗ＨＢｃ抗体にはＩｇＭ型やＩｇＧ型などがある。ＩｇＭ型の抗ＨＢｃ抗体はＢ型急性肝炎の感染初期に３〜１２ヶ月程度、一過性に高力価で出現し、ＩｇＧ型の抗ＨＢｃ抗体は長期にわたり陽性となる。

Ｂ型急性肝炎とＢ型慢性肝炎はその臨床経過や予後が異なることから、Ｂ型肝炎を診断する上で両者を鑑別することが重要である。一般的に、ＩｇＭ型の抗ＨＢｃ抗体とＩｇＧ型の抗ＨＢｃ抗体を含む抗ＨＢｃ抗体の総量（以下、総ＨＢｃ抗体という）は、Ｂ型急性肝炎の場合には低力価であり、Ｂ型慢性肝炎の場合には高力価であることから、従来、Ｂ型急性肝炎とＢ型慢性肝炎の鑑別には、総ＨＢｃ抗体の高力価、低力価判定が応用されている。この方法により、ある程度、Ｂ型急性肝炎とＢ型慢性肝炎の鑑別は可能であるが、正診率の更なる向上が求められていた。

上記したように、ＩｇＭ型の抗ＨＢｃ抗体はＢ型急性肝炎の感染初期に一過性に高力価で出現するため、Ｂ型急性肝炎の診断にはＩｇＭ型の抗ＨＢｃ抗体の測定が臨床応用されている（非特許文献１）。しかしながら本方法では、健常者とＢ型慢性肝炎患者とを区別することができないため、Ｂ型慢性肝炎の診断のためには、ＩｇＭ型抗ＨＢｃ抗体の測定に加えてＨＢｓ抗原や総ＨＢｃ抗体などを測定する必要があった。そのため、より簡便にＢ型急性肝炎とＢ型慢性肝炎を鑑別して、Ｂ型慢性肝炎を診断するための方法が求められていた。

中尾 瑠美子ら、医学と薬学52(5)：847-858，2004

本発明の目的は、簡便かつ高精度にＢ型慢性肝炎か否かを判定する方法を提供することである。

本発明者らは、Ｂ型肝炎ウイルス感染に関する研究を重ねた結果、驚くべきことに、検体中のＩｇＧ型の抗ＨＢｃ抗体を測定することによって、Ｂ型慢性肝炎をＢ型急性肝炎と区別して精度よく検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は、被検者から分離された検体中のＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体量を測定することを含む、Ｂ型慢性肝炎の検出方法であって、ＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体量の測定値が予め定められたカットオフ値以上である場合にＢ型慢性肝炎が検出される、方法を提供する。また、本発明は、ＨＢｃ抗原と、抗ＩｇＧ抗体又はその抗原結合性断片とを含む、上記本発明の方法によりＢ型慢性肝炎を検出するためのＢ型慢性肝炎検出キットを提供する。

本発明によれば、簡便かつ高精度にＢ型慢性肝炎か否かを判定する方法が提供される。本発明に係る方法を用いることにより、簡便且つ高精度に、Ｂ型急性肝炎と区別してＢ型慢性肝炎を診断することができる。

非Ｂ型肝炎患者、Ｂ型急性肝炎患者およびＢ型慢性肝炎患者由来の検体におけるＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体測定値を示す図である。

本発明では、被検個体から分離された検体中のＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体量を測定し、該抗体量測定値を予め定められたカットオフ値と対比してＢ型慢性肝炎を検出する。下記実施例に示されるように、Ｂ型肝炎患者由来の検体中のＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体の濃度は、非Ｂ型肝炎患者由来の検体中のその濃度よりも高く、さらに、Ｂ型慢性肝炎患者由来の検体中のＩｇＧ型ＨＢｃ抗体の濃度は、Ｂ型急性肝炎患者由来の検体中のその濃度よりも高い。従って、Ｂ型慢性肝炎患者群とＢ型急性肝炎患者群とを十分な精度で区別できるＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体量をカットオフ値として定めておけば、検体中のＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体量の測定値が該カットオフ値以上か否かに基づいて被検個体がＢ型慢性肝炎か否かを判定することができる。本発明によれば、ＩｇＭ型抗ＨＢｃ抗体量や、ＩｇＭ型抗ＨＢｃ抗体を含む総ＨＢｃ抗体量、つまりＩｇＭ型抗ＨＢｃ抗体量を調べることなく、ＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体量に基づいてＢ型慢性肝炎を検出できる。

抗体の測定方法自体は周知の常法である。本発明においては、ＩｇＧ型の抗ＨＢｃ抗体を特異的に検出することができる方法であれば、いかなる手法を用いてもよい。例えば、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ法）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法、及び蛍光免疫測定法などの各種の免疫測定方法を用いることができるが、これに限定されるものではない。

例えば、２ステップサンドイッチ法に基づくＣＬＥＩＡ法を用いて検体中のＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体を測定する場合、担体に固相化されたＨＢｃ抗原を用いる。固相化されたＨＢｃ抗原と検体中に含まれる抗ＨＢｃ抗体を接触させることにより、ＨＢｃ抗原と抗ＨＢｃ抗体とを反応させ、ＨＢｃ抗原を介してＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体を含む抗ＨＢｃ抗体を担体に結合させる。反応後、Ｂ／Ｆ分離を行い洗浄する。次いで、標識された抗ＩｇＧ抗体を系内に添加し、ＨＢｃ抗原に結合したＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体と標識抗ＩｇＧ抗体を反応させた後に、Ｂ／Ｆ分離を行い、洗浄により未反応の標識抗ＩｇＧ抗体を除去する。その後、ＨＢｃ抗原およびＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体を介して担体に結合した標識抗ＩｇＧ抗体からのシグナルを適当な方法で検出することにより、検体中に含まれるＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体を特異的に測定することが可能となる。ここでは２ステップ法について説明したが、１ステップ法で行われてもよい。また、固相に抗ＩｇＧ抗体を結合させ、標識されたＨＢｃ抗原を用いて測定を行なうこともできる。また、競合法によってＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体を検出してもよい。

ＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体の測定に使用するＨＢｃ抗原としては、抗ＨＢｃ抗体と特異的に結合するものであればいかなるものであってもよい。市販のリコンビナントＨＢｃ抗原を用いることができるし、また、周知の遺伝子工学的手法によりリコンビナントＨＢｃ抗原を調製して用いることもできる。Ｂ型肝炎ウイルス感染細胞からＨＢｃ抗原を抽出して得ることもできる。

ＨＢｃタンパク質のアミノ酸配列およびこれをコードするヌクレオチド配列は、NCBIのGenBank等のデータベースから入手することができるので、当業者であれば、周知の遺伝子工学的手法を用いてリコンビナントＨＢｃ抗原を容易に調製することができる。配列表の配列番号１および２に示した配列は、公知のＨＢｃ遺伝子およびこれにコードされるＨＢｃタンパク質の配列の一例であり、GenBankにaccession No. AF324125.1で登録されている配列である。これまでに公知となっているＨＢｃタンパク質のアミノ酸配列の大部分は、配列番号２のアミノ酸と９５％程度以上の同一性を有するか、あるいは１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有しており、そのようなアミノ酸配列のＨＢｃタンパク質であればＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体測定のためのＨＢｃ抗原として好ましく使用可能である。もっとも、ＨＢｃ抗原の配列はこれに限定されるものではなく、配列番号２のアミノ酸配列と同一性が９５％未満のものや、Ｎ末端あるいはＣ末端にタグ配列等の余分なアミノ酸配列が付加されたものであっても、ＨＢＶに感染した個体の体内で誘導される抗ＨＢｃ抗体との反応性を有する限り、ＨＢｃ抗原として使用可能である。本発明において、「ＨＢｃ抗原」といった場合には、上記した各種のＨＢｃタンパク質が包含される。

なお、アミノ酸配列の同一性とは、比較すべき２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基ができるだけ多く一致するように両アミノ酸配列を整列させ、一致したアミノ酸残基数を全アミノ酸残基数で除したものを百分率で表したものである。上記整列の際には、必要に応じ、比較する２つの配列の一方又は双方に適宜ギャップを挿入する。このような配列の整列化は、例えばBLAST、FASTA、CLUSTAL W等の周知のプログラムを用いて行なうことができる。ギャップが挿入される場合、上記全アミノ酸残基数は、１つのギャップを１つのアミノ酸残基として数えた残基数となる。このようにして数えた全アミノ酸残基数が、比較する２つの配列間で異なる場合には、同一性（％）は、長い方の配列の全アミノ酸残基数で、一致したアミノ酸残基数を除して算出される。ただし、比較すべき配列が他の任意の配列（例えばタグ配列、リンカー配列、他のタンパク質の配列等）と連結された状態にある場合には、そのような任意の配列は除外して同一性が算出される。

天然のタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸は、低極性側鎖を有する中性アミノ酸（Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro)、親水性側鎖を有する中性アミノ酸（Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr, Cys)、酸性アミノ酸(Asp, Glu)、塩基性アミノ酸(Arg, Lys, His)、芳香族アミノ酸(Phe, Tyr, Trp)のように類似の性質を有するものにグループ分けできる。これらグループ内での置換であればタンパク質の性質が変化しないことが多いことが知られている。従って、配列番号２に例示した公知のＨＢｃタンパク質とアミノ酸配列が一部相違するタンパク質であっても、これらグループ内での置換であれば、抗ＨＢｃ抗体との結合性も維持される可能性が高い。

固相用担体は、免疫測定用に従来用いられているものであり、特に限定されない。例えば、プラスチックプレート、微粒子、繊維状物質等を用いることができる。これら担体の材質としては、従来公知のものを用いることができ、特に限定されないが、微粒子であれば、例えば、ガラスビーズ、ポリスチレン等の各種プラスチックビーズ、ラテックス粒子および各種フェライト粒子（例えば、特開平３−１１５８６２号公報参照）等を挙げることができる。また、繊維状物質としては、例えば、セルロース、ニトロセルロース、キトサン、ポリエチレングリコール重合体、シラン重合体等を構成成分とするものを挙げることができる。

これら担体へのＨＢｃ抗原の固相化は、物理吸着、架橋剤を用いた化学結合等公知の方法を適宜用いることができる。

本発明に使用する抗ＩｇＧ抗体としては、ＩｇＧ型の抗体に特異的に結合するものであればよく、抗ＩｇＧ抗体又はその抗原結合性断片を用いることができる。検体の由来に適した抗ＩｇＧ抗体が好ましく使用され、例えば、ヒト由来の検体を用いる場合は、抗ヒトＩｇＧ抗体またはその抗原結合性断片を用いることが好ましい。抗ＩｇＧ抗体又はその抗原結合性断片の具体例としては、マウス、ウサギ、ニワトリ、ヤギ、ヒツジ、ウシなどの実験動物を免疫して得られるポリクローナル抗体；免疫した実験動物から脾臓細胞を分離し、ミエローマ細胞と融合させることによって得られるハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体；免疫した実験動物から分離した脾臓細胞または血中白血球をＥＢウイルスによって不死化させた細胞が産生するモノクローナル抗体；組換え抗体；ＩｇＧへの結合性を有する上記抗体の断片（例えば、Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv、scFv）など、ＩｇＧ型抗体に高い特異性、親和性を示す分子であればいかなるものでも用いることができる。抗ＩｇＧ抗体又はその抗原結合性断片は、市販品を用いてもよいし、周知の常法により抗ＩｇＧ抗体又はその抗原結合性断片を作製して用いることもできる。

抗ＩｇＧ抗体若しくはその抗原結合性断片又はＨＢｃ抗原の標識に用いる標識物質としては、例えば酵素、蛍光物質、化学発光物質、染色物質、放射性物質などが挙げられる。酵素としては、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、パーオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ等、公知のものを用いることができるが、これに限定されるものではない。高い検出感度の測定系を提供するためには、ＡＬＰを用いることが望ましい。

標識物質として酵素を用いる場合、該酵素に対応した発色基質、蛍光基質又は発光基質等の基質を測定系内に添加し、酵素反応により生じる発色や発光等のシグナルを吸光光度計やルミノメーター等を用いて測定すればよい。例えば、標識物質としてＡＬＰを用いる場合、３−（４−メトキシスピロ（１，２−ジオキセタン−３，２'−トリシクロ［３．３．１．１^３，７］デカン）−４−イル）フェニルホスフェート２ナトリウム（例えば商品名ＡＭＰＰＤ（登録商標））などの発光基質を用いることができる。標識物質としてビオチン又はハプテンが用いられる場合には、酵素、蛍光物質、化学発光物質、染色物質、又は放射性物質などを結合したストレプトアビジン又はハプテン抗体などを用いればよい。

抗ＩｇＧ抗体の標識は、公知の共有結合法等により直接標識してもよいし、ビオチン−アビジン等他の結合対を用いて間接的に標識してもよい。

ＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体を種々の濃度で含む濃度既知の標準試料について、ＨＢｃ抗原を用いてＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体の測定を行ない、標識からのシグナルの量と標準試料中のＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体濃度との相関関係をプロットして標準曲線を作成しておく。ＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体濃度が未知の対象検体について同じ操作を行ない、標識からのシグナル量を測定し、測定されたシグナル量をこの標準曲線に当てはめることにより、検体中のＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体を定量することができる。抗ＨＢｃ抗体用のＷＨＯ第１国際標準品（WHO International Standard First International Standard for anti-Hepatitis B core antigen(anti-HBc), plasma, human. NIBSC code: 95/522）を用いて標準曲線を作成し、この標準曲線に基づいて被検個体由来の検体中のＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体量を算出すれば、国際単位による濃度（IU/mL）で抗体量を表すことができる。あるいは、上記の国際標準品に対して較正された他の標準品を用いても、国際単位による濃度（IU/mL）で抗体量を求めることができる。

本発明の方法では、上記のようにして検体中のＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体量を測定した後、測定値を予め定められたカットオフ値と対比する。このカットオフ値は、被検個体がＢ型慢性肝炎であるか否かを判定する指標となる値であり、抗体量測定値がこのカットオフ値以上であった場合に被検個体がＢ型慢性肝炎であると判定することができる。つまり、ＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体量の測定値が予め定められた当該カットオフ値以上である場合にＢ型慢性肝炎が検出されることになる。

Ｂ型慢性肝炎の指標となるカットオフ値は、次のようにして定めることができる。既知のＢ型急性肝炎患者群およびＢ型慢性肝炎患者群に由来する複数の検体（できる限り多数が望ましい）について、ＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体の免疫測定を行ない、上記のようにして作成した検量曲線にシグナル測定量を当てはめて各検体のＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体量を算出し、抗体量の測定値を得る。得られた測定値に基づいて、Ｂ型急性肝炎患者群およびＢ型慢性肝炎患者群を十分な正診率で区別できる値を選択し、これをＢ型慢性肝炎の指標となるカットオフ値として使用することができる。

抗ＨＢｃ抗体用のＷＨＯ第１国際標準品または該国際標準品に対して較正された他の標準品を用いて作成した標準曲線に基づいて抗体量を算出すれば、カットオフ値を国際単位による抗体濃度（IU/mL）で表現することができる。国際単位で表現されたカットオフ値は、使用する測定系（試薬、装置）や実施する場所を問わず、国際的に共通して使用することができる。

あるいは、カットオフ値は、抗体測定系毎に設定された計算式に基づいて求められる相対値（Cut Off Index (C.O.I.)）として表すこともできる。相対値として算出する場合も、抗体濃度としてのカットオフ値を求めた場合と同様に、既知のＢ型急性肝炎患者群およびＢ型慢性肝炎患者群に由来する複数の検体について、検体中のＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体を測定し、各測定系で設定された計算式に基づいてC.O.I.を算出する。そして、Ｂ型急性肝炎患者群およびＢ型慢性肝炎患者群を十分な正診率で区別できる値（C.O.I.）をカットオフ値として採用することができる。

ある任意の値にカットオフ値を設定したとき、ＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体量がそのカットオフ値以上である個体を「Ｂ型慢性肝炎陽性」、そのカットオフ値未満である個体を「Ｂ型急性肝炎陽性」とすると、そのカットオフ値での正診率は（Ｂ型急性肝炎全個体数−Ｂ型急性肝炎陽性数＋Ｂ型慢性肝炎陽性数）／（Ｂ型急性肝炎全個体数＋Ｂ型慢性肝炎全個体数）で算出することができる。本発明におけるカットオフ値は、Ｂ型急性肝炎とＢ型慢性肝炎とを鑑別する際の正診率が80％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、若しくは100％となるように設定することができる。

本発明で用いるカットオフ値は、具体的には、40 IU/mL以上の値でありうる。好ましくは、40〜470 IU/mLの間の値、より好ましくは80〜320 IU/mLの間の値、さらに好ましくは100〜200 IU/mLの間の値である。カットオフ値が40〜470 IU/mLの範囲から選択される場合、85.0％以上の正診率でＢ型急性肝炎とＢ型慢性肝炎を鑑別することができる（下記実施例参照）。また、カットオフ値が80〜320 IU/mL、又は100〜200 IU/mLの範囲から選択される場合、それぞれ90.0％以上、93.8％以上というさらに高い正診率でＢ型急性肝炎とＢ型慢性肝炎を鑑別することができる。従って、上記のようなカットオフ値と比較することにより、高精度にＢ型急性肝炎と区別してＢ型慢性肝炎を検出することができる。

本発明ではさらに、健常者とＢ型肝炎患者（具体的にはＢ型急性肝炎患者）とを鑑別する第２のカットオフ値を設定することもできる。以下、第２のカットオフ値と区別して、上記したＢ型慢性肝炎か否かの指標となるカットオフ値を「第１のカットオフ値」という。第２のカットオフ値は、第１のカットオフ値と同様に、例えば次のようにして設定することができる。既知のＢ型急性肝炎患者群および非Ｂ型肝炎患者群に由来する複数の検体（できる限り多数が望ましい）について、ＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体の免疫測定を行ない、上記のようにして作成した標準曲線にシグナル測定量を当てはめて各検体のＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体量を算出し、抗体量の測定値を得る。得られた測定値に基づいて、健常者群およびＢ型急性肝炎患者群を十分な正診率で区別できる値を選択し、これを健常者とＢ型肝炎患者（より具体的にはＢ型急性肝炎患者）を区別する指標となる第２のカットオフ値として使用することができる。

第２のカットオフ値も、第１のカットオフ値と同様に、国際単位による抗体濃度（IU/mL）やC.O.I.で表現することができる。

第２のカットオフ値は、健常者とＢ型急性肝炎患者とを鑑別する際の正診率が80％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、若しくは100％となるように設定することができる。具体的には、第２のカットオフ値は、0.7〜0.9 IU/mLの範囲から選択される値であり得るが、これに限定されない。なお、この場合の正診率は、（健常全個体数−健常陽性数＋Ｂ型急性肝炎陽性数）／（健常全個体数＋Ｂ型急性肝炎全個体数）で算出することができる。

本明細書において、「健常者」および「非Ｂ型肝炎患者」という語は、ＨＢＶに感染しておらず、Ｂ型肝炎を患っていない個体を指す。Ｂ型肝炎の既往歴のない健常者は、通常、ＨＢｓ抗原および抗ＨＢｓ抗体等をはじめとする各種ＨＢＶタンパク質および抗ＨＢＶタンパク質抗体が陰性である。第２のカットオフ値を決定する際は、健常者ないしは非Ｂ型肝炎患者に由来する検体を複数使用するが、健常者または非Ｂ型肝炎患者であることは、臨床症状および各種血液検査所見により判断することができる。例えば、下記実施例に記載されるように、肝炎症状がなく、ＨＢｓ抗原陰性かつ抗ＨＢｓ抗体陰性の個体に由来する検体を、第２のカットオフ値を決定する際の健常者検体ないしは非Ｂ型肝炎患者検体として使用することができる。

なお、第１および第２のカットオフ値は、上述のように正診率に基づいて決定することができるが、これに限定されるものではなく、感度や特異度などの体外診断薬において一般的に用いられる他の指標に基づいて適宜決定することもできる。

第１および第２のカットオフ値は、実施の都度定める必要はなく、ＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体の測定に使用する測定系が同一である限り、その測定系を用いて一旦定めたカットオフ値をその後に実施する際にもそのまま用いることができる。カットオフ値が国際単位で示されていれば、いかなる測定系を利用する場合であっても、同じカットオフ値を使用することができる。本発明では、例えば上記した国際単位による抗体濃度で示した好ましいカットオフ値をそのまま利用することができる。

本発明で用いられる検体としては、全血、血漿、血清、尿、唾、脳脊髄液などの生物学的体液、および肝組織などが挙げられ、特に、全血、血清、血漿サンプルが好ましいが、これらに限定されない。

被検個体は、哺乳動物であれば特に限定されないが、好ましくはヒトである。被検個体は、Ｂ型肝炎の疑いのある患者、又は肝炎（特にＢ型肝炎）を発症している患者であり得る。例えば、肝炎を発症している患者から分離された検体に対して本発明の方法を実施した場合、該患者がＢ型急性肝炎又はＢ型以外の肝炎を患っているときは、検体中のＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体量は第１のカットオフ値以上とはならないため、このような場合でも本発明の方法によってＢ型慢性肝炎の検出が可能である。

また、例えばＢ型肝炎を発症している患者ないしはＢ型肝炎の疑いのある患者に対して本発明の方法を実施すれば、第１のカットオフ値のみを用いて、該患者がＢ型急性肝炎かＢ型慢性肝炎かを鑑別することができる。具体的には、検体中のＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体量が第１のカットオフ値以上であればＢ型慢性肝炎、第１のカットオフ値未満であればＢ型急性肝炎と診断することが可能である。

第１のカットオフ値と併せて第２のカットオフ値を用いる場合には、健常者（主としてＢ型肝炎既往歴のない健常者）、Ｂ型急性肝炎およびＢ型慢性肝炎の３者の判別も可能であり得る。

本発明はまた、上記本発明の方法にてＢ型慢性肝炎を検出するための検出キットも提供する。該キットは、ＨＢｃ抗原と、抗ＩｇＧ抗体又はその抗原結合性断片とを含み、検体中のＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体を免疫測定法により測定する。免疫測定方法、ＨＢｃ抗原、および抗ＩｇＧ抗体又はその抗原結合性断片についての条件等は上記と同様である。例えば、ＨＢｃ抗原は、プレートや粒子（例えば磁性粒子、ラテックス粒子など）などの固相に結合された形態であってもよく、抗ＩｇＧ抗体又はその抗原結合性断片は、任意の標識物質で標識された形態であってもよい。あるいは、これとは逆に、抗ＩｇＧ抗体又はその抗原結合性断片が固相に結合された形態であり、かつ、ＨＢｃ抗原が標識された形態であってもよい。

Ｂ型慢性肝炎検出キットには、Ｂ型慢性肝炎検出の指標となる第１のカットオフ値が記載された指示書もさらに含まれ得る。該指示書には、健常者とＢ型急性肝炎との判別の指標となる第２のカットオフ値も記載され得る。本発明の方法ではＩｇＭ型の抗ＨＢｃ抗体を測定する必要がないため、本発明の検出キットには、抗ＩｇＭ抗体及びその抗原結合性断片のいずれも含まれなくてよい。その他、該キットは、使用する標識物質に応じて適当な基質液や、検体希釈液、洗浄液等の、免疫測定キットに一般的に含まれている試薬類等も含んでいてよい。

以下、実施例により本発明について具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

実施例：ＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体の測定によるＢ型肝炎の鑑別
(１) ＨＢｃ抗原結合粒子の作製
リコンビナントＨＢｃ抗原結合粒子を、次の通り調製した。

磁性フェライト粒子（日本ペイント社製）1 mgに、リコンビナントＨＢｃ抗原（富士レビオ社製）1.5μgを添加した。２５℃で１時間ゆるやかに攪拌しながらインキュベートした。反応後、フェライト粒子を磁石で集めて反応液から分離し、粒子を緩衝液Ａ（50 mMトリス緩衝液pH7.2、0.15％NaCl、0.1％アジ化ナトリウム、2％BSA）にて洗浄し、リコンビナントＨＢｃ抗原結合粒子を得た。

(２) ＡＬＰ標識抗ＩｇＧ抗体の作製
マウス抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体（富士レビオ社製）とウシ小腸由来アルカリホスファターゼ（オリエンタル酵母社製）とをヨシタケらの方法（Yoshitakeet al., J.Biochem. 1982, 92(5), p1413-1424）により結合させ、ＡＬＰ酵素標識抗体を調製した。

具体的には、脱塩処理したマウス抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体（終濃度3 mg/mL）とペプシン（終濃度6μg/mL）を0.1Mクエン酸バッファー（pH3.5）中で混合し、３７℃で１時間静置してペプシン消化を行った。反応を停止させた後にゲルろ過精製を行い、ＦＣ領域を除去した抗ヒトＩｇＧ抗体を得た。次に、２−メルカプトエタノール（終濃度10 mM）を添加して３７℃にて３時間静置し、チオール化を行った。更に脱塩処理し、抗ヒトＩｇＧ抗体のＦａｂを得た。

一方、脱塩したアルカリホスファターゼとＮ−（４−マレイミドブチリロキシ）−スクシンイミド（ＧＭＢＳ）（終濃度0.3 mg/mL）を混合し、３０℃で１時間静置してマレイミド化を行った。

脱塩した後、Ｆａｂとマレイミド化アルカリホスファターゼをモル比１：１の割合で混合し、２５℃にて３０分静置してカップリングを行った。カップリング液に２−メルカプトエタノール（終濃度１０ｍＭ）を添加して４℃にて一晩静置し、反応を停止させた。濃縮および脱塩後、1％BSA、1mM NaCl、0.1mM ZnCl₂を含有する100mM MES（pH6.8）を加えて200μg/mLに調製し、ＡＬＰ標識抗ＩｇＧ抗体溶液とした。

(３) ＩｇＧ型抗ヒトＨＢｃ抗体の測定
標準曲線の作成に用いる基準試料は、抗ＨＢｃ抗体用ＷＨＯ第１国際標準品（WHO International Standard First International Standard for anti-Hepatitis B core antigen (anti-HBc), plasma, human NIBSC code: 95/522）を基にＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体濃度（ＩＵ／ｍｌ）を決定したＢ型慢性肝炎患者由来検体を適宜希釈して準備した。

抗ＨＢｃ抗体用ＷＨＯ第１国際標準品相当で0、1、20、50、100、200、400、600、800、1000 IU/mlの抗ＨＢｃ抗体（ＩｇＧ型）濃度に調整した基準試料をルミパルス（登録商標）検体希釈液（富士レビオ社製）で１９倍希釈した。希釈した各基準試料の10μLを、(１)で作製したＨＢｃ抗原結合粒子溶液0.25 mLに添加し、３７℃で１０分間反応させた。磁石を用いてＢ／Ｆ分離し、洗浄後、(２)で調製したＡＬＰ標識抗ＩｇＧ抗体溶液を0.25 mL加え、再び３７℃で１０分間反応させた。磁石を用いてＢ／Ｆ分離し、洗浄後、化学発光基質である３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスホリルオキシ）フェニル−１、２−ジオキセタン・２ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ（登録商標））を含むルミパルス（登録商標）基質液（富士レビオ社製）２００μＬを加え、３７℃、５分反応させて、発光量をルミノメーターで測定した。実際の測定は全自動化学発光酵素免疫測定システム（ルミパルス（登録商標）Ｇ１２００（富士レビオ社製））にて行った。

抗ＨＢｃ抗体用ＷＨＯ第１国際標準品の各濃度に相当する基準試料の測定結果から、スプライン曲線を作成し、標準曲線とした。

(４) 検体測定
(３)に記載した測定方法に従って検体を測定した。測定対象は、長崎医療センターにて臨床症状および各種血液検査所見よりＢ型急性肝炎と診断された３０例、Ｂ型慢性肝炎と診断された１３０例、およびＨＢｓ抗原・抗体ともに陰性である非Ｂ型肝炎の３０例であった。検体として、−２０℃にて保管した上記１９０例の血清を測定前に溶解して用いた。

(３)に記載した方法により検体を測定し、(３)で作成した標準曲線に基づいて各抗体濃度（IU/mL）を求めた。結果を図１及び表１に示す。なお、図１では、1000 IU/mL以上の濃度の検体は、1000 IU/mLとして表した。

その結果、驚くべきことに、ＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体の測定値は、急性肝炎患者が低値領域、慢性肝炎患者が高値領域に分布する傾向がみられた。

図１および表１に示すように、40〜470 IU/mLの範囲の値をカットオフ値としたとき、正診率85.0％以上でＢ型急性肝炎とＢ型慢性肝炎を鑑別することが可能であることが明らかとなった。また、80〜320 IU/mLの範囲の値をカットオフ値としたときの正診率は90.0％以上、100〜200 IU/mLの範囲の値をカットオフ値としたときの正診率は93.8％以上と、非常に高い正診率でＢ型急性肝炎とＢ型慢性肝炎を鑑別できることが明らかとなった。

これらの結果から、検体中のＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体の濃度を測定することによって、高精度にＢ型急性肝炎患者とＢ型慢性肝炎患者とを鑑別することが可能であることが示された。本発明の方法によれば、簡便かつ高い精度でＢ型慢性肝炎か否かを判定することができる。具体的には、検体中のＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体の濃度を測定し、測定されたＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体濃度を、Ｂ型慢性肝炎とＢ型急性肝炎および非Ｂ型肝炎とを鑑別することができるカットオフ値と比較して、抗体濃度が該カットオフ値以上である場合は、検体はＢ型慢性患者由来であると判定することができる。

さらに、図１に示すように、ＨＢｓ抗原・抗体ともに陰性である非Ｂ型肝炎患者由来の検体において、ＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体はほとんど検出されず、その測定値を上記標準曲線に当てはめると、0.4 IU/mL以下の数値となった。一方、Ｂ型肝炎患者由来の検体におけるＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体の測定値は、18 IU/mL以上の数値となり、0.5〜17 IU/mLの範囲の値、例えば、0.7〜0.9 IU/mLの値を第２のカットオフ値とすることにより、ＨＢｓ抗原・抗体ともに陰性である非Ｂ型肝炎患者と、Ｂ型肝炎患者とを識別することができた。本結果から、ＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体濃度における、上記の第２のカットオフ値は、非Ｂ型肝炎とＢ型肝炎とを識別するための指標となりうることが示唆された。

参考例：総ＨＢｃ抗体の測定によるＢ型肝炎の鑑別
検体中のＩｇＧ型抗ヒトＨＢｃ抗体およびＩｇＭ型抗ヒトＨＢｃ抗体を含む抗ヒトＨＢｃ抗体の総量を測定し、高力価、低力価判定を利用することにより、Ｂ型急性肝炎とＢ型慢性肝炎とを従来法で鑑別した。なお、総ＨＢｃ抗体は、ルミパルスプレスト（登録商標）ＨＢｃＡｂ（富士レビオ社製）を用いて競合法により測定した。検体は、上記(４)で用いた検体と同一検体を用いた。

その結果、総ＨＢｃ抗体が50 INH％の場合、最も高い正診率でＢ型急性肝炎とＢ型慢性肝炎とを鑑別することができ、その正診率は71.3％であった。このことから、従来法である抗ヒトＨＢｃ抗体の総量を用いたＢ型慢性肝炎とＢ型急性肝炎の鑑別方法に比べて、ＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体の量のみに基づく本発明の方法では、非常に高い正診率でＢ型急性肝炎患者とＢ型慢性肝炎患者とを鑑別できることがわかった。

本発明の方法を用いることにより、簡便かつ高精度にＢ型急性肝炎とＢ型慢性肝炎とを鑑別し、Ｂ型慢性肝炎か否かを判定することができる。そのため、本発明はＨＢＶ感染の予防、診断および治療に有用である。

Claims (12)

1. 被検個体から分離された検体中のＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体量を測定することを含む、Ｂ型慢性肝炎の検出方法であって、ＩｇＧ型抗ＨＢｃ抗体量の測定値が予め定められたカットオフ値以上である場合にＢ型慢性肝炎が検出される、方法。
2. 前記カットオフ値が40 IU/mL以上の数値から選択される値である、請求項１に記載の方法。
3. 前記カットオフ値が40〜470 IU/mLの範囲から選択される値である、請求項２記載の方法。
4. 前記カットオフ値が80〜320 IU/mLの範囲から選択される値である、請求項３記載の方法。
5. 前記カットオフ値が100〜200 IU/mLの範囲から選択される値である、請求項４記載の方法。
6. 前記被検個体がヒトである請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記被検個体がＢ型肝炎の疑いのある患者である請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記被検個体が肝炎を患っている患者である請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記検体が血液、血清又は血漿である請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
10. ＨＢｃ抗原と、抗ＩｇＧ抗体又はその抗原結合性断片とを含む、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法によりＢ型慢性肝炎を検出するためのＢ型慢性肝炎検出キット。
11. 抗ＩｇＭ抗体及びその抗原結合性断片のいずれも含まない請求項１０記載のキット。
12. Ｂ型慢性肝炎検出の指標となる前記カットオフ値が記載された指示書をさらに含む請求項１０又は１１記載のキット。

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