JP7209498B2 - B型肝炎ウイルスコア抗体の免疫測定方法 - Google Patents
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Description
(1) 非イオン性界面活性剤
(2) 両性界面活性剤
から選択される少なくとも1種の界面活性剤と、170 mM~443 mMの塩とが共存する条件下で、HBc抗原又は抗免疫グロブリン抗体若しくはその抗原結合性断片を含む試薬と検体を接触させて一次反応を行なうことを含む、方法を提供する。
(1) 非イオン性界面活性剤
(2) 両性界面活性剤
(1) HBc抗原結合粒子の作製
リコンビナントHBc抗原結合粒子を、次の通り調製した。
磁性フェライト粒子とリコンビナントHBc抗原とを重量比500:1の割合で、0.1Mリン酸緩衝液中で混合し、25℃で1時間ゆるやかに攪拌しながらインキュベートした。反応後、フェライト粒子を磁石で集めて反応液から分離し、粒子を50 mM Tris緩衝液(150mM NaCl、0.1%アジ化ナトリウム、2%BSA、pH7.2)にて洗浄し、HBc抗原結合粒子を得た。
マウス抗ヒトIgGモノクローナル抗体とウシ小腸由来アルカリホスファターゼ(オリエンタル酵母社製)とをヨシタケらの方法(Yoshitakeet al., J.Biochem. 1982, 92(5), p1413-1424)により結合させ、アルカリホスファターゼ標識抗体を調製した。通例行われる通り、脱塩処理したマウス抗ヒトIgGモノクローナル抗体とペプシンを0.1Mクエン酸緩衝液(pH3.5)中で混合し、37℃で1時間静置してペプシン消化を行った。反応を停止させた後にゲルろ過精製を行い、Fc領域を除去した抗ヒトIgG抗体を得た。次に2-メルカプトエチルアミン塩酸塩を添加して、チオール化を行った。更に脱塩処理し、抗ヒトIgG抗体のFabを得た。
検体、陰性コントロール又は陽性コントロール10μLと検体希釈液190μLを混合した。
検体としては、ProMedDx社から購入した陰性血清検体(HBs抗原陰性、HBcAb陰性)を使用した。以下の実施例で用いた検体1~6は、詳細検討を実施し、何れも陰性検体であることを確認している。陰性コントロールと陽性コントロールは、B型肝炎ウイルスコア抗体測定キット「ルミパルスプレスト(登録商標)HBcAb-III」(富士レビオ社製)に付属された「HBcAb-III用標準陰性溶液」と「HBcAb-III用標準陽性溶液」を用いた。検体希釈液としては、50mM Tris緩衝液(150mM NaCl、1mM EDTA・2Na、pH7.2)に所定濃度となるように各界面活性剤を添加したものを使用した。
非特異反応低減率(%)=X/Y×100
X:界面活性剤を添加した検体希釈液を用いた場合のカウント数
Y:界面活性剤を添加していない検体希釈液を用いた場合のカウント数
(1) 陽性コントロールの非特異反応低減率が85%以上
(2) 2以上の検体で非特異反応低減率が90%未満
参考例1に記載の測定方法に従って、検体1~6の抗HBc抗体を測定した。検体希釈液としては、非イオン性界面活性剤であるTritonX-405(ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、HLB値17.9)を各濃度で添加した希釈液を用いた。
他の非イオン性界面活性剤についても検討するため、各種非イオン性界面活性剤を添加した検体希釈液を用いて、実施例1と同様に抗HBc抗体を測定した。
さらに、両性界面活性剤についても検討するため、両性界面活性剤を添加した検体希釈液を用いて、実施例1と同様に抗HBc抗体を測定した。
塩濃度と界面活性剤の組合せについて検討した。50mM Tris緩衝液(1mM EDTA・2Na、0.5% TritonX-405、pH7.2)に各濃度になるように塩を添加した検体希釈液を用い、実施例1と同様に抗HBc抗体を測定した。塩としては、塩化ナトリウムを用いた。また、実施例1と同様に非特異反応低減率を求めるため、界面活性剤を添加していない検体希釈液(150mM NaCl、1mM EDTA・2Na、pH7.2)を用いた場合についても同様に抗HBc抗体を測定した。
高濃度の塩と界面活性剤の組み合わせについて検討した。検体としては、ProMedDx社から購入した陰性血清検体(HBs抗原陰性、HBcAb陰性)である検体7~12を用いた。検体7~12は参考例1と同様に詳細検討を実施し、何れも陰性検体であることを確認している。検体希釈液としては、445mM塩化ナトリウムと0.24% TritonX-705を含む50 mM Tris緩衝液(445mM NaCl、1mM EDTA・2Na、0.24% TritonX-705、pH7.2)を用いた。また、HBc抗原結合粒子としては、445mM塩化ナトリウムと0.24% TritonX-705を含む50 mM Tris緩衝液(445mM NaCl、0.1%アジ化ナトリウム、2%BSA、0.24% TritonX-705、pH7.2)に懸濁したHBc抗原結合粒子を用いて、実施例1と同様に抗HBc抗体を測定した。さらに、実施例1と同様に非特異反応低減率を求めるため、検体希釈液として界面活性剤を添加していない50 mM Tris緩衝液(150mM NaCl、1mM EDTA・2Na、pH7.2)と、50 mM Tris緩衝液(150mM NaCl、0.1%アジ化ナトリウム、2%BSA、pH7.2)に懸濁したHBc抗原結合粒子を用いた場合についても同様に抗HBc抗体を測定した。
検体量を増やした場合の、塩および界面活性剤の添加効果について検討した。検体、陰性コントロール又は陽性コントロール10μLと検体希釈液190μLを混合した。検体としては、ProMedDx社から購入した陰性血清検体(HBs抗原陰性、HBcAb陰性)である検体13~18を用いた。検体13~18は参考例1と同様に詳細検討を実施し、何れも陰性検体であることを確認している。界面活性剤の添加効果を検討するため、検体希釈液として、0.25% TritonX-705を含む50 mM Tris緩衝液(150mM NaCl、1 mM EDTA・2Na、0.25% TritonX-705、pH7.2)を用いた。次に、0.25% TritonX-705を含む50 mM Tris緩衝液(150mM NaCl、0.1%アジ化ナトリウム、2%BSA、0.25% TritonX-705、pH7.2)に懸濁したHBc抗原結合粒子50μLと、希釈した検体20μLを反応槽に分注し、実施例1と同様に抗HBc抗体を測定した。このとき、一次反応液中のTritonX-705濃度は0.246%となる。また、塩および界面活性剤の添加効果を検討するため、検体希釈液として、200mM塩化ナトリウムと0.25% TritonX-705を含む50 mM Tris緩衝液(200mM NaCl、1 mM EDTA・2Na、0.25% TritonX-705、pH7.2)を用い、HBc抗原結合粒子の懸濁液として、200mM塩化ナトリウムと0.25% TritonX-705を含む50 mM Tris緩衝液(200mM NaCl、0.1%アジ化ナトリウム、2%BSA、0.25% TritonX-705、pH7.2)に懸濁したHBc抗原結合粒子50μLを用い、同様に抗HBc抗体を測定した。このとき、一次反応液中の塩濃度は199 mM、TritonX-705濃度は0.246%となる。
一次反応液への界面活性剤の添加効果について検討した。検体としては、ProMedDx社から購入した陰性血清検体(HBs抗原陰性、HBcAb陰性)である検体19~24を用いた。検体19~24は参考例1と同様に詳細検討を実施し、何れも陰性検体であることを確認している。検体希釈液としては、50 mM Tris緩衝液(150mM NaCl、1mM EDTA・2Na、pH7.2)を用いた。また、HBc抗原結合粒子としては、TritonX-305、TritonX-405およびTrironX-705をそれぞれ0.5%の濃度で含む50 mM Tris緩衝液(150mM NaCl、0.1%アジ化ナトリウム、2%BSA、pH7.2)に懸濁したHBc抗原結合粒子を用いて、実施例1と同様に抗HBc抗体を測定し、非特異反応低減率を求めた。
Claims (16)
- 検体中の抗HBc抗体の2ステップサンドイッチ法による免疫測定方法であって、下記(1)及び(2):
(1) 非イオン性界面活性剤
(2) 両性界面活性剤
から選択される少なくとも1種の界面活性剤と、170 mM~443 mMの塩とが共存する条件下で、HBc抗原又は抗免疫グロブリン抗体若しくはその抗原結合性断片を含む試薬と検体を接触させて一次反応を行なうことを含む、方法。 - 検体と、前記(1)及び(2)から選択される少なくとも1種の界面活性剤を含有する前記試薬とを混合して前記一次反応を行なうことを含み、前記試薬が、一次反応の反応系内の塩濃度が170 mM~443 mMとなるように前記塩を含む、請求項1記載の方法。
- 検体と、前記(1)及び(2)から選択される少なくとも1種の界面活性剤を含む溶液と、前記試薬とを混合して前記一次反応を行なうことを含み、前記溶液が、一次反応の反応系内の塩濃度が170 mM~443 mMとなるように前記塩を含む、請求項1記載の方法。
- 検体と、前記(1)及び(2)から選択される少なくとも1種の界面活性剤を含む溶液と、前記(1)及び(2)から選択される少なくとも1種の界面活性剤を含む前記試薬とを混合して前記一次反応を行なうことを含み、前記溶液及び前記試薬が、一次反応の反応系内の塩濃度が170 mM~443 mMとなるように前記塩を含む、請求項1記載の方法。
- 前記(1)及び(2)から選択される少なくとも1種の界面活性剤を含む溶液及び検体を、HBc抗原又は抗免疫グロブリン抗体若しくはその抗原結合性断片を含む試薬に添加して前記一次反応を行なうことを含み、前記溶液及び前記試薬が、一次反応の反応系内の塩濃度が170 mM~443 mMとなるように前記塩を含む、請求項1記載の方法。
- 前記(1)の非イオン性界面活性剤は、HLB値が10~20のエーテル型及びエステルエーテル型の非イオン性界面活性剤から選択される界面活性剤である、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記エーテル型の非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤から選択される界面活性剤であり、前記エステルエーテル型の非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系界面活性剤である、請求項6記載の方法。
- 前記(2)の両性界面活性剤が、スルホベタイン型界面活性剤である、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記一次反応系内の前記界面活性剤の濃度が0.040 w/v%~1.27 w/v%である、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記塩が塩化ナトリウム及び塩化カリウムから選択される少なくとも1種である、請求項1~9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗HBc抗体が、IgG型抗体を含む、請求項1~10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記一次反応が、前記界面活性剤と前記170 mM~443 mMの塩との共存下で行われる、固相担体上に固定化されたHBc抗原と検体との反応であり、二次反応が、B/F分離及び洗浄後の固相担体と、標識物質を結合させた抗免疫グロブリン抗体又はその抗原結合性断片との反応である、請求項1~11のいずれか1項に記載の方法。
- 標識物質を結合させた抗免疫グロブリン抗体又はその抗原結合性断片は、標識物質を結合させた抗ヒトIgG抗体又はその抗原結合性断片を含む、請求項12記載の方法。
- 前記一次反応系内の前記塩の濃度が180 mM~443 mMである、請求項1~13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記一次反応系内の前記塩の濃度が190 mM~443 mMである、請求項14記載の方法。
- 前記一次反応系内の前記塩の濃度が200 mM~443 mMである、請求項15記載の方法。
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