KR102390761B1 - HBsAg의 정량적 검출을 위한 키트 및 방법 - Google Patents

HBsAg의 정량적 검출을 위한 키트 및 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102390761B1
KR102390761B1 KR1020207018464A KR20207018464A KR102390761B1 KR 102390761 B1 KR102390761 B1 KR 102390761B1 KR 1020207018464 A KR1020207018464 A KR 1020207018464A KR 20207018464 A KR20207018464 A KR 20207018464A KR 102390761 B1 KR102390761 B1 KR 102390761B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
hbsag
antibody
amount
kit
urea
Prior art date
Application number
KR1020207018464A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20200094761A (ko
Inventor
슌후아 웬
??후아 웬
리우웨이 쏭
쭈싱 웡
하이준 린
페이하이 쉬
쉬동 쑨
셩시앙 끄어
Original Assignee
시아먼 이노디엑스 바이오테크 컴퍼니 리미티드
시아먼 유니버시티
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 시아먼 이노디엑스 바이오테크 컴퍼니 리미티드, 시아먼 유니버시티 filed Critical 시아먼 이노디엑스 바이오테크 컴퍼니 리미티드
Publication of KR20200094761A publication Critical patent/KR20200094761A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102390761B1 publication Critical patent/KR102390761B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • G01N33/5761—Hepatitis B
    • G01N33/5764—Hepatitis B surface antigen
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Abstract

HBsAg를 정량적으로 검출하기 위한 키트 및 HBsAg를 포함하는 샘플에서 HBsAg함량을 정량적으로 검출하기 위한 방법. 상기 키트는 HBsAg에 특이적으로 결합하는 제1항체 및 시약 조성물을 포함한다. 상기 시약 조성물은 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 염산염(TCEP) 및 우레아로 구성된다.

Description

HBsAg의 정량적 검출을 위한 키트 및 방법
본 발명은 바이러스학 및 면역학 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 HBsAg를 정량적으로 검출하기 위한 키트에 관한 것이다. 추가적으로, 본 발명은 또한 HBsAg를 포함하는 샘플에서 HBsAg의 양을 정량적으로 검출하는 방법에 관한 것이다.
B형 간염 바이러스 (Hepatitis B virus; HBV) 감염, 특히 만성 B형 간염 바이러스 감염은, 가장 심각한 세계 공중 보건 문제 중 하나이다. 현재, 전 세계적으로 만성 B형 감염 바이러스에 감염된 사람은 3억 5천만명이 넘는다. 만성 B형 간염 바이러스 감염은 만성 B형 간염 (chronic hepatitis B; CHB), 간경변 (Liver cirrhosis, LC), 및 1차 간세포 암종 (hepatocellular carcinoma; HCC)과 같은 간 질환을 유발할 수 있다. 만성 B형 간염 바이러스 감염으로 인한 사망 및 그로 인한 질병은 매년 전 세계적으로 백만명이 넘는다 (Dienstag JL. Hepatitis B virus infection. N Engl J Med 2008; 359: 1486-1500).
B형 간염 바이러스 표면 항원 (Hepatitis B virus surface antigen; HBsAg)은 HBV의 외막 단백질이다. HBsAg는 임상적으로 HBV 감염의 가장 중요한 진단 마커이다. HBsAg의 장기간 존재는 만성 HBV 감염을 나타낸다. 최근에, HBsAg 정량적 검출의 임상적 중요성이 점차 밝혀지고 검출이 널리 사용된다.
뉴클레오시드 유사체로 처리하는 동안 HBsAg의 감소는 HBV DNA의 감소와 일치한다 (Chen Xiangsheng, Liao Wenjun. Clinical diagnostic significance of quantitative detection of hepatitis B HBsAg, [J]. Journal of Hubei College of Traditional Chinese Medicine, 2009, 11 (2): 21-23.). 약물 내성 균주가 나타났을 때, 혈청 HBsAg 수준은 증가하고 종종 HBV DNA 리바운드 및 생화학적 돌파구 (ALT 수준의 증가)보다 우선한다 (Chen Xiangsheng, Liao Wenjun. Clinical diagnostic significance of quantitative detection of hepatitis B HBsAg, [J]. Journal of Hubei College of Traditional Chinese Medicine, 2009, 11(2): 21-23; and Chen Ruilie, et al. Relationship between serum HBV DNA level and liver function and immune parameters in patients with severe hepatitis B, [J]. China Journal of Primary Medicine, 2006, 13 (9): 1449-1450.).
인터페론 요법에 대한 반응의 검출 및 예측에서, 치료 초기 단계에서 HBsAg의 정량적 수준이 현저히 감소한 빠른 어피어런스 (appearance), 또는 치료 전 더 낮은 기준 수준의 HBsAg (lower baseline level of HBsAg)는, 지속적인 바이러스 반응 (SVR) 및 HBeAg 혈청 전환을 얻는데 도움이 된다(Luo Weimin, Wang Chaohui, Liu Zhongjing. The relationship and significance of HBV DNA and its five detection indexes, [J]. Qilu Journal of Medicine, 2009, 24 (1): 4-5; and Liu Can, Weng Yirui, Chen Yongdong. Comparative study of HBsAg quantification with HBV-DNA and hepatitis B marker patterns in patients with hepatitis B, [J]. Fujian Journal of Medicine, 2006, 28 (4): 124-125.). PEG-IFN으로 HBeAg 양성 환자를 치료하는 동안, 치료 12주차에 HBsAg 정량화가 <1500 IU/mL인 것이 HBeAg 혈청 전환에 대한 중요한 예측 지표이며, 반면 치료 12주차에 HBsAg 정량이 >20,000 IU/mL 인 것은 무반응에 대한 강력한 예측 지표이다 (Piratvisuth T, et al. Hepatol Int. 2013 Jun; 7(2): 429-36.; and Sonneveld MJ, et al. Hepatology. 2010; 52: 1251-1257.). PEG-IFN으로 HBeAg 음성 환자를 치료하는 동안, 2 Log10 IU/mL 미만의 HBV DNA 감소에 의한 HBsAg 농도의 감소 없음은 치료에 대한 비-반응에 대한 강력한 예측 지표이며, 치료를 중단하고 다른 약물로 대체할 수 있음을 나타낸다 (Rijckborst V, et al. Hepatology 2010, 52: 454-461; and Rijckborst V, et al. Journal of hepatology 2012, 56: 1006-1011).
현재의 HBsAg 정량 시약은 "코팅된 항체-항원-표지된 항체"의 "샌드위치"검출 방법을 사용한다. 상이한 시약들의 차이는 주로 코팅 매체 및 표지의 차이에 있다. 추가적으로, 상이한 시약의 정량적 범위는 또한 어느 정도 상이하다. 예를 들어, 로슈 (Roche) 시약은 비오틴 및 희귀 금속 "루테늄"을 사용하여 항원을 검출하기 위해 두 항체에 각각 표지를 붙이며, 그리고 나서 시료를 희석하지 않은 상태에서 시약의 검출 범위가 0 내지 130 IU/mL 인 경우의 전기 화학적 신호를 검출하기 위해 아비딘-표지된 자성 입자를 통하여 항원과 항체 간의 반응에 의하여 형성된 이중 항체 샌드위치 복합체를 포획한다; 애보트 시약의 경우, 항체는 자성 입자에 직접 코팅되며, 다른 항체는 아크리디늄 에스테르로 표지되고, 이중-항체 샌드위치 복합체는 샘플과 반응하여 형성되고, 화학 발광 신호가 검출되며, 여기서 시약의 검출 범위는 샘플을 희석하지 않는 조건 하에서 0 내지 250 IU/mL이다.
하지만, 만성 B형 간염 환자 대부분은 현재 100 IU/mL 이상의 HBsAg 정량 수준을 가지고 있다 (Jaroszewicz J, et al. Journal of Hepatology, 2010, 52 (4): 514-522; and Nguyen T, et al. Journal of Hepatology, 2010 52 (4): 508-513.). 따라서, 대부분의 임상 샘플의 경우, 샘플이 시험 전에 희석될 때만 기존의 상업적 시약을 사용하여 샘플의 정량적 값을 검출할 수 있다. 그러나, 희석 배수가 크기 때문에, 샘플을 희석시키기 위해 희석 조작을 여러 번 반복해야 하고, 희석 공정은 시간이 걸린다. 애보트 시약을 예로 들어 보면, 500 배 희석액을 수동으로 제조할 때, 샘플 25 ul을 먼저 희석 용액 475 ul에 첨가하여 20 배 희석하고, 그후 1:20 희석된 샘플 20 ul를 희석 용액 480 ul에 첨가하여 500 배 희석을 달성하고, 수동 희석은 정확도를 감소시킨다. 완전 자동 장비에 의한 자동 희석도 여러 번의 희석 작업이 필요하며, 희석 배수가 클수록, 기기의 검출 처리량이 낮아지며, 검출 정확도가 떨어진다.
따라서, 당 업계에서는 임상 시료에서의 HBsAg 함량을 보다 간단하고 빠르고 정확하게 측정하기 위해 시료 희석이 필요하지 않고 검출 상한이 더 높은 HBsAg 정량 검출 방법을 개발할 필요가 있다.
당 업계에서는 임상 시료에서의 HBsAg 함량을 보다 간단하고 빠르고 정확하게 측정하기 위해 시료 희석이 필요하지 않고 검출 상한이 더 높은 HBsAg 정량 검출 방법을 개발할 필요가 있다.
많은 실험적인 연구 후에, 본 발명자들은 예기치 않게 HBsAg의 정량적 검출 동안, 특정 시약 조성물을 사용하여 시험할 샘플을 희석하지 않은 경우, 검출 상한을 100,000 IU/mL로 크게 증가시켜서, 대부분의 임상 샘플이 검출 범위에 속할 수 있다는 것을 발견하였다.
많은 실험적인 연구 후에, 본 발명자들은 예기치 않게 HBsAg의 정량적 검출 동안, 특정 시약 조성물을 사용하여 시험할 샘플을 희석하지 않은 경우, 검출 상한을 100,000 IU/mL로 크게 증가시켜서, 대부분의 임상 샘플이 검출 범위에 속할 수 있다는 것을 발견하였다. 이러한 발견에 기초하여, 본 발명자들은 새로운 HBsAg 정량 검출 키트 및 검출 방법을 개발하였다.
키트
따라서, 본 발명의 첫번째 양태는 HBsAg에 특이적으로 결합할 수 있는 제1항체 및 시약 조성물을 포함하고, 상기 시약 조성물은 트리스(2-카르복실에틸)포스핀 히드로클로라이드 (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride; 이하, TCEP) 및 우레아를 포함하는 것인 키트에 관한 것이다.
특정 바람직한 실시예에서, 시약 조성물은 비이온성 계면활성제 (non-ionic surfactant), 무기염 (ignorganic salt) 및 완충제 (buffer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함한다.
특정 바람직한 실시예에서, 비이온성 계면활성제 (non-ionic surfactant)는 챕스 (Chaps), 설포베타인 (sulfobetaine) 타입 계면활성제, 트리톤 (triton)형 디터전트 (detergent), 트윈 (Tween)형 디터전트 (detergent), 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다. 특정 바람직한 실시예에서, 비이온성 계면활성제는 SB14, SB16, 트윈-20, 트윈-40, 트리톤 X-100, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다. 특정 바람직한 실시예에서, 비이온성 계면활성제는 트리톤 X-100 및/또는 트윈-20 인 것이다.
특정 바람직한 실시예에서, 무기염은 NH4SO4 및 NaCl 등으로부터 선택된다.
특정 바람직한 실시예에서, 완충제는 탄산염 완충제인 것이다.
특정 바람직한 실시예에서, 시약 조성물은 TCEP, 우레아, 및 잔량의 물 (a balance of water)을 포함하는 것이다.
특정 바람직한 실시예에서, 시약 조성물은 TCEP, 우레아, 무기염 (예를 들어, NaCl), 및 잔량의 물을 포함하는 것이다.
특정 바람직한 실시예에서, 시약 조성물은 TCEP, 우레아, 무기염 (예를 들어, NaCl), 비이온성 계면활성제 (예를 들어, 트윈-20), 및 잔량의 물을 포함하는 것이다.
특정 바람직한 실시예에서, 시약 조성물은 TCEP, 우레아, 무기염 (예를 들어, NaCl), 비이온성 계면활성제 (예를 들어, 트윈-20), 완충제 (예를 들어, 탄산염 완충제 (carbonate buffer)), 및 잔량의 물을 포함하는 것이다.
특정 바람직한 실시예에서, 시약 조성물에서, TCEP는 1 내지 100 mM (예를 들어, 1 내지 50 mM, 10 내지 50 mM, 20 내지 50 mM, 또는 30 내지 50 mM; 예를 들어, 40 mM)의 양으로 존재하는 것이고; 우레아는 0.5 내지 8 M (예를 들어, 1 내지 8 M, 1 내지 6 M, 또는 2 내지 6 M; 예를 들어, 2 M)의 양으로 존재하는 것이고; 비이온성 계면활성제는 0 내지 10% (v/v) (예를 들어, 0.1 내지 1%, 예를 들어 0.1%)의 양으로 존재하는 것이고; 무기염은 0.5 내지 8 M (예를 들어, 0.5 내지 1 M, 예를 들어, 0.6 mM)의 양으로 존재하는 것이고; 및 완충제는 0 내지 200 mM (예를 들어, 50 내지 200 mM, 또는 50 내지 150 mM; 예를 들어, 100 mM)의 양으로 존재하는 것이다.
특정 바람직한 실시예에서, 시약 조성물은 40 mM TCEP및 2 M 우레아를 포함하는 것이다. 특정 예시적인 실시예에서, 시약 조성물은 다음 성분으로 구성된다: 40 mM TCEP, 2 M 우레아, 600 mM NaCl, 100 mM 탄산염 완충액 (pH 9.6), 0.1% 트윈-20 (v/v) 및 잔량의 물 (예를 들어, 탈이온수 (deionized water)).
특정 바람직한 실시예에서, 제1항체는 단일 클론 항체이다. 특정 예시적인 실시예에서, 제1항체는 모두 Xiamen Wantai Canghai Biotechnology Co.,Ltd으로부터의, 15D1 (M1056), 42B6 (M1058), 6C10 (M10510), 2C1 (M1057), SF (M10517), 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 바람직한 실시예에서, 키트는 HBsAg를 인식 및 이에 결합할 수 있는 검출 시약을 추가로 포함한다. 이러한 검출 시약은 당 업계에 잘 알려져 있으며 다음을 포함하며, HBsAg에 특이적으로 결합할 수 있는 항체, 표적화 폴리펩타이드, 또는 앱타머에 한정되지 않는다. 특정 예시적인 실시예에서, 검출 시약은 HBsAg에 특이적으로 결합할 수 있는 이차 항체 (secondary antibody)이다. 특정 예시적인 실시예에서, 제2항체는 다클론 항체이다.
특정 바람직한 실시예에서, 검출 시약은 효소 (예를 들어, 호스래디 퍼옥시다제 (horseradish peroxidase) 또는 알칼리성 포스파타제 (alkaline phosphatase)), 화학발광 (chemiluminescent) 시약 (예를 들어, 아크리디늄 에스터 화합물 (acridinium ester compound)) 또는 형광 염료와 같은 검출 가능한 표지를 가지고 있다. 특정 예시적인 실시예에서, 검출 가능한 표지가 효소인 경우, 키트는 오-페닐렌디아민 (o-phenylenediamine; 이하, OPD), 테트라메틸벤지딘 (tetramethylbenzidine; 이하, TMB), ABTS 또는 호스래디 퍼옥시다제용 루미놀 화합물 (luminol compound), 또는 피-니트로페닐 포스테이트 (p-nitrophenyl phosphate; 이하, p-NPP) 또는 알카리성 포스파타제용 AMPPD와 같은 착색 용액을 추가로 포함할 수 있다.
특정 바람직한 실시예에서, 키트는 고체 지지체를 추가로 포함하며, 고체 지지체에 제1항체를 코팅하기 위한 코팅 완충제 (예를 들어, 탄산염 완충제 추가로 포함, 인산염 완충액 (phosphate buffer), 트리스-HCL 완충액 (Tris-HCL buffer), 또는 붕산염 완충액 (borate buffer))과 같은 코팅 시약을 선택적으로 추가로 포함하는 것이다. 특정 바람직한 실시예에서, 고체 지지체는 웰 (well), 튜브, 입자 (예를 들어, 라텍스 입자 (latex particle))이 있는 플레이트 (Plate) 또는 폴리머 재료 (예를 들어, 염화 폴리비닐 (polyvinyl chloride), 폴리스티렌 (polystyrene), 폴리아크릴아미드 (polyacrylamide), 또는 셀룰로오스(cellulose))로 만들어 지거나 코팅된 막 (예를 들어, 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)), 또는 작용기 (예를 들어, 아미노, 카르복실, 비오틴, 또는 아비딘)로 미리 코팅된 자기 비드를 포함하는 것이다. 특정 예시적인 실시예에서, 고체 지지체는 마이크로타이터 플레이트 (microtiter plate) (예를 들어, 마이크로웰 플레이트 또는 ELISA 플레이트)이다. 특정 예시적인 실시예에서, 고체 지지체는 자기 비드이다. 고체 지지체에 단백질 또는 폴리펩타이드를 코팅하는 방법은 당 업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 물리적 흡착, 아미노기 또는 카르복실기와의 표면을 통한 공유 커플링, 또는 아비딘-비오틴 시스템, 폴리리신이 사전-코팅된 표면 (polylysine pre-coated surface), 단백질 A 또는 단백질 G가 사전-코팅된 표면 (protein A or protein G pre-coated surface) 에 의하여 달성되는 매개 결합이다.
특정 바람직한 실시예에서, 제1항체는 고체 지지체의 표면에 코팅된다. 특정 예시적인 실시예에서, 제1항체는 마이크로타이터 플레이트 (예를 들어, 마이크로웰 플레이트 또는 ELISA 플레이트)의 표면에 코팅된다. 특정 예시적인 실시예에서, 제1항체는 자기 비드의 표면에 코팅된다.
특정 바람직한 실시예에서, 키트는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 시약 또는 장치를 추가로 포함하는 것이다: 표준 (예를 들어, 다른 알려진 양의 HBsAg를 포함하는 일련의 샘플들); 양성 대조군 샘플 (예를 들어, 알려진 양의 HBsAg를 포함하는 샘플); 음성 대조군 샘플 (예를 들어, HBsAg를 포함하지 않는 샘플); 효소에 의해 촉매된 기질의 색 반응을 정지시키기 위한 정지 용액 (예를 들어, 황산, 염산 또는 수산화 나트륨 용액); 비-특이적 결합을 억제하기 위한 차단 용액; 및, 혈액 수집 장치 (예를 들어, 발열원이 없는 (pyrogen-free) 진공 채혈 튜브).
반응 시스템
다른 측면에서, 본 발명은 HBsAg를 포함하는 반응 시스템, HBsAg에 특이적으로 결합할 수 있는 제1항체, 및 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드 (TCEP) 및 우레아를 포함하는 시약 조성물을 제공한다.
특정 바람직한 실시예에서, 시약 조성물은 비이온성 계면활성제, 무기염 및, 완충제로 이루어진 군으로부터 선택된 선택된 1종 이상이 추가로 포함된다.
특정 바람직한 실시예에서, 비이온성 계면활성제는 챕스, 설포베타인 타입 계면활성제, 트리톤 형 디터전트 (detergent), 트윈 형 디터전트 (detergent), 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다. 특정 바람직한 실시예에서, 비이온성 계면활성제는 SB14, SB16, 트윈-20, 트윈-14, 트리톤 X-100, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다. 특정 바람직한 실시예에서, 비이온성 계면활성제는 트리톤-100 및/또는 트윈-20인 것이다.
특정 바람직한 실시예에서, 무기염은 NH4SO4 및 NaCl 등으로부터 선택된다.
특정 바람직한 실시예에서, 완충제는 탄산염 완충제인 것이다.
특정 바람직한 실시예에서, 시약 조성물은 TCEP, 우레아, 및 잔량의 물 (a balance of water)을 포함하는 것이다.
특정 바람직한 실시예에서, 시약 조성물은 TCEP, 우레아, 무기염 (예를 들어, NaCl), 및 잔량의 물을 포함하는 것이다.
특정 바람직한 실시예에서, 시약 조성물은 TCEP, 우레아, 무기염 (예를 들어, NaCl), 비이온성 계면활성제 (예를 들어, Tween-20), 및 잔량의 물을 포함하는 것이다.
특정 바람직한 실시예에서, 시약 조성물은 TCEP, 우레아, 무기염 (예를 들어, NaCl), 비이온성 계면활성제 (예를 들어, Tween-20), 완충제 (예를 들어, 탄산염 완충제 (carbonate buffer)), 및 잔량의 물을 포함하는 것이다.
특정 바람직한 실시예에서, 시약 조성물에서, TCEP는 1 내지 100 mM (예를 들어, 1 내지 50 mM, 10 내지 50 mM, 20 내지 50 mM, 또는 30 내지 50 mM; 예를 들어, 40 mM)의 양으로 존재하는 것이고; 우레아는 0.5 내지 8 M (예를 들어, 1 내지 8 M, 1 내지 6 M, 또는 2 내지 6 M; 예를 들어, 2 M)의 양으로 존재하는 것이고; 비이온성 계면활성제는 0 내지 10% (v/v) (예를 들어, 0.1 내지 1%, 예를 들어 0.1%)의 양으로 존재하는 것이고; 무기염은 0.5 내지 8 M (예를 들어, 0.5 내지 1 M, 예를 들어, 0.6 mM)의 양으로 존재하는 것이고; 및 완충제는 0 내지 200 mM (예를 들어, 50 내지 200 mM, 또는 50 내지 150 mM; 예를 들어, 100 mM)의 양으로 존재하는 것이다.
특정 바람직한 실시예에서, 시약 조성물은 40 mM TCEP및 2M 우레아를 포함하는 것이다. 특정 예시적인 실시예에서, 시약 조성물은 다음 성분으로 구성된다: 40 mM TCEP, 2M 우레아, 600 mM NaCl, 100 mM 탄산염 완충액 (pH 9.6), 0.1% 트윈-20 (v/v) 및 잔량의 물 (예를 들어, 탈이온수).
특정 바람직한 실시예에서, 제1항체는 단일 클론 항체이다. 특정 예시적인 실시예에서, 제1항체는 모두 Xiamen Wantai Canghai Biotechnology Co.,Ltd 으로부터의, 15D1 (M1056), 42B6 (M1058), 6C10 (M10510), 2C1 (M1057), SF (M10517), 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
검출 방법 및 사용
다른 측면에서, 본 발명은 HBsAg를 포함하는 샘플에서 HBsAg의 양을 정량적으로 검출하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 다음 단계를 포함한다:
(1) 시약 조성물에서 HBsAg에 특이적으로 결합할 수 있는 제1항체와 샘플을 접촉시켜 면역 복합체를 얻는 단계;
(2) 단계 (1)에서 수득된 면역 복합체의 양을 결정하는 단계;
상기, 단계 (1)에서, 시약 조성물은 TCEP 및 우레아를 포함한다.
특정 바람직한 실시예에서, 본 발명의 방법은 비-진단의 목적으로 사용된다. 이러한 실시예에서, 시험할 샘플은 HBsAg를 포함하는 것으로 알려져 있기 때문에, 즉, 본 발명의 방법이 시험에 사용되기 전에 샘플의 대상체는 이미 진단 결과를 가지고 있고 본 발명의 방법은 샘플의 진단 단계에 도움이 되지 않는다. 본 발명의 방법의 직접적인 목적은 샘플의 대상의 진단 결과를 얻는 것이 아니라, 알려진 진단 정보를 갖는 샘플에 대해 더욱 정확한 정량을 수행하는 것임을 알 수 있다.
특정 바람직한 실시예에서, 샘플은 전혈, 혈장 또는 혈청과 같은 혈액 샘플이다.
특정 바람직한 실시예에서, 단계 (1)에서, 시약 조성물은 비이온성 계면활성제, 무기염 및 완충제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상이 추가로 포함된다.
특정 바람직한 실시예에서, 비이온성 계면활성제는 챕스, 설포베타인 타입 계면활성제, 트리톤 형 디터전트 (detergent), 트윈 형 디터전트 (detergent), 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다. 특정 바람직한 실시예에서, 비이온성 계면활성제는 SB14, SB16, 트윈-20, 트윈-14, 트리톤 X-100, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다. 특정 바람직한 실시예에서, 비이온성 계면활성제는 트리톤-100 및/또는 트윈-20 인 것이다.
특정 바람직한 실시예에서, 무기염은 NH4SO4 및 NaCl 등으로부터 선택된다.
특정 바람직한 실시예에서, 완충제는 탄산염 완충제인 것이다.
특정 바람직한 실시예에서, 시약 조성물은 TCEP, 우레아 및 잔량의 물 (a balance of water)을 포함하는 것이다.
특정 바람직한 실시예에서, 시약 조성물은 TCEP, 우레아, 무기염 (예를 들어, NaCl), 및 잔량의 물을 포함하는 것이다.
특정 바람직한 실시예에서, 시약 조성물은 TCEP, 우레아, 무기염 (예를 들어, NaCl), 비이온성 계면활성제 (예를 들어, Tween-20), 및 잔량의 물을 포함하는 것이다.
특정 바람직한 실시예에서, 시약 조성물은 TCEP, 우레아, 무기염 (예를 들어, NaCl), 비이온성 계면활성제 (예를 들어, Tween-20), 완충제 (예를 들어, 탄산염 완충제 (carbonate buffer)), 및 잔량의 물을 포함하는 것이다.
특정 바람직한 실시예에서, 시약 조성물에서, TCEP는 1 내지 100 mM (예를 들어, 1 내지 50 mM, 10 내지 50 mM, 20 내지 50 mM, 또는 30 내지 50 mM; 예를 들어, 40 mM)의 양으로 존재하는 것이고; 우레아는 0.5 내지 8 M (예를 들어, 1 내지 8 M, 1 내지 6 M, 또는 2 내지 6 M; 예를 들어, 2 M)의 양으로 존재하는 것이고; 비이온성 계면활성제는 0 내지 10% (v/v) (예를 들어, 0.1 내지 1%, 예를 들어 0.1%)의 양으로 존재하는 것이고; 무기염은 0.5 내지 8 M (예를 들어, 0.5 내지 1 M, 예를 들어, 0.6 mM)의 양으로 존재하는 것이고; 및 완충제는 0 내지 200 mM (예를 들어, 50 내지 200 mM, 또는 50 내지 150 mM; 예를 들어, 100 mM)의 양으로 존재하는 것이다.
특정 바람직한 실시예에서, 시약 조성물은 40 mM TCEP및 2 M 우레아를 포함하는 것이다. 특정 예시적인 실시예에서, 시약 조성물은 다음 성분으로 구성된다: 40 mM TCEP, 2 M 우레아, 600 mM NaCl, 100 mM 탄산염 완충액 (pH 9.6), 0.1% 트윈-20 (v/v) 및 잔량의 물 (예를 들어, 탈이온수).
특정 바람직한 실시예에서, 단계 (2)에서, 면역 복합체의 양은 면역학적 검출에 의하여 결정된다. 특정 바람직한 실시예에서, 면역학적 검출은 효소 면역 분석 또는 화학 발광 면역 분석이다. 특정 예시적인 실시예에서, 면역학적 검출은 CLEIA 및 CLIA 방법으로부터 선택되는 것이다. 특정 예시적인 실시예에서, 단계 (2)에서, 면역 복합체의 양은 HBsAg에 특이적으로 결합할 수 있는 제2항체를 사용하여 검출되는 것이며, 제2항체는 효소 (예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제), 화학 발광 시약 (예를 들어, 아크리디늄 에스터 화합물) 또는 형광 염료와 같은 검출 가능한 표지를 갖는다. 이러한 실시예에서, 제2항체 및 단계 (1)에서 수득된 면역 복합체는 "항체-항원-항체"샌드위치 복합체를 형성할 수 있다.
일부 바람직한 실시예에서, 단계 (2)전에 미반응 물질을 제거하기 위해 면역 복합체를 세척하는 단계가 추가로 포함된다.
특정 바람직한 실시예에서, 제1항체는 고체 지지체의 표면에 코팅된다. 특정 바람직한 실시예에서, 고체 지지체는 웰, 튜브, 입자 (예를 들어, 라텍스 입자)이 있는 플레이트 또는 폴리머 재료 (예를 들어, 염화 폴리비닐, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 또는 셀룰로오스)로 만들어 지거나 코팅된 막 (예를 들어, 니트로셀룰로오스 막), 또는 작용기 (예를 들어, 아미노, 카르복실, 비오틴, 또는 아비딘)로 미리 코팅된 자기 비드를 포함하는 것이다. 특정 예시적인 실시예에서, 제1항체는 마이크로타이터 플레이트 (예를 들어, 마이크로웰 플레이트 또는 ELISA 플레이트)의 표면에 코팅된다. 특정 예시적인 실시예에서, 제1항체는 자기 비드의 표면에 코팅된다.
다른 측면에서, 본 발명은 대상체의 혈액 샘플에서 HBsAg의 양을 검출하기 위한 키트의 제조에서 시약 조성물의 용도에 관한 것으로, 상기 시약 조성물은 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드 (TCEP) 및 우레아를 포함한다.
특정 바람직한 실시예에서, 시약 조성물은 비이온성 계면활성제, 무기염 및 완충제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 추가로 포함된다.
특정 바람직한 실시예에서, 비이온성 계면활성제는 챕스, 설포베타인 타입 계면활성제, 트리톤 형 디터전트 (detergent), 트윈 형 디터전트 (detergent), 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다. 특정 바람직한 실시예에서, 비이온성 계면활성제는 SB14, SB16, 트윈-20, 트윈-40, 트리톤 X-100, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다. 특정 바람직한 실시예에서, 비이온성 계면활성제는 트리톤 X-100 및/또는 트윈-20 인 것이다.
특정 바람직한 실시예에서, 무기염은 NH4SO4 및 NaCl 등으로부터 선택된다.
특정 바람직한 실시예에서, 완충제는 탄산염 완충제인 것이다.
특정 바람직한 실시예에서, 시약 조성물은 TCEP, 우레아, 및 잔량의 물을 포함하는 것이다.
특정 바람직한 실시예에서, 시약 조성물은 TCEP, 우레아, 무기염 (예를 들어, NaCl), 및 잔량의 물을 포함하는 것이다.
특정 바람직한 실시예에서, 시약 조성물은 TCEP, 우레아, 무기염 (예를 들어, NaCl), 비이온성 계면활성제 (예를 들어, 트윈-20), 및 잔량의 물을 포함하는 것이다.
특정 바람직한 실시예에서, 시약 조성물은 TCEP, 우레아, 무기염 (예를 들어, NaCl), 비이온성 계면활성제 (예를 들어, 트윈-20), 완충제 (예를 들어, 탄산염 완충제), 및 잔량의 물을 포함하는 것이다.
특정 바람직한 실시예에서, 시약 조성물에서, TCEP는 1 내지 100 mM (예를 들어, 1 내지 50 mM, 10 내지 50 mM, 20 내지 50 mM, 또는 30 내지 50 mM; 예를 들어, 40 mM)의 양으로 존재하는 것이고; 우레아는 0.5 내지 8 M (예를 들어, 1 내지 8 M, 1 내지 6 M, 또는 2 내지 6 M; 예를 들어, 2 M)의 양으로 존재하는 것이고; 비이온성 계면활성제는 0 내지 10% (v/v) (예를 들어, 0.1 내지 1%, 예를 들어 0.1%)의 양으로 존재하는 것이고; 무기염은 0.5 내지 8 M (예를 들어, 0.5 내지 1 M, 예를 들어, 0.6 mM)의 양으로 존재하는 것이고; 및 완충제는 0 내지 200 mM (예를 들어, 50 내지 200 mM, 또는 50 내지 150 mM; 예를 들어, 100 mM)의 양으로 존재하는 것이다.
특정 바람직한 실시예에서, 시약 조성물은 40 mM TCEP및 2 M 우레아를 포함하는 것이다. 특정 예시적인 실시예에서, 시약 조성물은 다음 성분으로 구성된다: 40 mM TCEP, 2M 우레아, 600 mM NaCl, 100 mM 탄산염 완충액 (pH 9.6), 0.1% 트윈-20 (v/v) 및 잔량의 물 (예를 들어, 탈이온수).
특정 바람직한 실시예에서, 키트는 HBsAg에 특이적으로 결합할 수 있는 제1항체를 추가로 포함한다. 특정 바람직한 실시예에서, 제1항체는 단일 클론 항체이다. 특정 예시적인 실시예에서, 제1항체는 제1항체는 모두 Xiamen Wantai Canghai Biotechnology Co.,Ltd 으로부터의 15D1 (M1056), 42B6 (M1058), 6C10 (M10510), 2C1 (M1057), SF (M10517), 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 바람직한 실시예에서, 본 발명은 대상체의 혈액 샘플에서 HBsAg의 양을 검출하기 위한 키트의 제조에서 시약 조성물 및 제1항체의 용도에 관한 것이다.
특정 바람직한 실시예에서, 키트는 HBsAg를 인식 및 이에 결합할 수 있는 검출 시약을 추가로 포함한다. 이러한 검출 시약은 당 업계에 잘 알려져 있으며 다음을 포함하며, HBsAg에 특이적으로 결합할 수 있는 항체, 표적화 폴리펩타이드, 또는 앱타머에 한정되지 않는다. 특정 예시적인 실시예에서, 검출 시약은 HBsAg에 특이적으로 결합할 수 있는 이차 항체 (secondary antibody)이다. 특정 예시적인 실시예에서, 제2항체는 다클론 항체이다.
특정 바람직한 실시예에서, 검출 시약은 효소 (예를 들어, 호스래디 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제), 화학발광 시약 (예를 들어, 아크리디늄 에스터 화합물) 또는 형광 염료와 같은 검출 가능한 표지를 가지고 있다. 특정 에시적인 실시예에서, 검출 가능한 표지가 효소인 경우, 키트는 오-페닐렌디아민 (OPD), 테트라메틸벤지딘 (TMB), ABTS 또는 호스래디 퍼옥시다제용 루미놀 화합물, 또는 피-니트로페닐 포스테이트 (p-NPP) 또는 알카리성 포스파타제용 AMPPD와 같은 착색 용액을 추가로 포함할 수 있다.
특정 바람직한 실시예에서, 키트는 고체 지지체를 추가로 포함하며, 고체 지지체에 제1항체를 코팅하기 위한 코팅 완충제 (예를 들어, 탄산염 완충제 추가로 포함, 인산염 완충액, 트리스-HCL 완충액, 또는 붕산염 완충액)과 같은 코팅 시약을 선택적으로 추가로 포함하는 것이다. 특정 바람직한 실시예에서, 고체 지지체는 웰, 튜브, 입자 (예를 들어, 라텍스 입자)이 있는 플레이트 (Plate) 또는 폴리머 재료 (예를 들어, 염화 폴리비닐, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 또는 셀룰로오스)로 만들어 지거나 코팅된 막 (예를 들어, 니트로셀룰로오스 막), 또는 작용기 (예를 들어, 아미노, 카르복실, 비오틴, 또는 아비딘)로 미리 코팅된 자기 비드를 포함하는 것이다. 특정 예시적인 실시예에서, 고체 지지체는 마이크로타이터 플레이트 (예를 들어, 마이크로웰 플레이트 또는 ELISA 플레이트)이다. 특정 예시적인 실시예에서, 고체 지지체는 자기 비드이다. 고체 지지체에 단백질 또는 폴리펩타이드를 코팅하는 방법은 당 업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 물리적 흡착, 아미노기 또는 카르복실기와의 표면을 통한 공유 커플링, 또는 아비딘-비오틴 시스템, 폴리리신이 사전-코팅된 표면 (polylysine pre-coated surface), 단백질 A 또는 단백질 G 가 사전-코팅된 표면 (protein A or protein G pre-coated surface) 에 의하여 달성되는 매개 결합이다.
특정 바람직한 실시예에서, 제1항체는 고체 지지체의 표면에 코팅된다. 특정 예시적인 실시예에서, 제1항체는 마이크로타이터 플레이트 (예를 들어, 마이크로웰 플레이트 또는 ELISA 플레이트)의 표면에 코팅된다. 특정 예시적인 실시예에서, 제1항체는 자기 비드의 표면에 코팅된다.
특정 바람직한 실시예에서, 키트는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 시약 또는 장치를 추가로 포함하는 것이다: 표준 (예를 들어, 다른 알려진 양의 HBsAg를 포함하는 일련의 샘플들); 양성 대조군 샘플 (예를 들어, 알려진 양의 HBsAg를 포함하는 샘플); 음성 대조군 샘플 (예를 들어, HBsAg를 포함하지 않는 샘플); 효소에 의해 촉매된 기질의 색 반응을 정지시키기 위한 정지 용액 (예를 들어, 황산, 염산 또는 수산화 나트륨 용액); 비-특이적 결합을 억제하기 위한 차단 용액; 및, 혈액 수집 장치 (예를 들어, 발열원이 없는 (pyrogen-free) 진공 채혈 튜브).
특정 바람직한 실시예에서, 키트는 다음 단계를 포함하는 방법에 의해 대상체의 혈액 샘플에서 HBsAg의 양을 검출한다:
(1) 혈액 샘플을 시약 조성물에서 제1항체와 접촉시켜 면역 복합체를 얻는 단계;
(2) 단계 (1)에서 수득된 면역 복합체의 양을 결정하는 단계;
상기, 단계 (1)에서, 혈액 샘플은 희석되지 않는 것이다.
특정 바람직한 실시예에서, 단계 (2)에서, 면역 복합체의 양은 면역학적 검출에 의하여 결정된다. 특정 바람직한 실시예에서, 면역학적 검출은 효소 면역 분석 또는 화학 발광 면역 분석이다. 특정 예시적인 실시예에서, 면역학적 검출은 CLEIA 및 CLIA 방법으로부터 선택되는 것이다. 특정 예시적인 실시예에서, 단계 (2)에서, 면역 복합체의 양은 HBsAg에 특이적으로 결합할 수 있는 제2항체를 사용하여 검출되는 것이며, 제2항체는 효소 (예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제), 화학 발광 시약 (예를 들어, 아크리디늄 에스터 화합물) 또는 형광 염료와 같은 검출 가능한 표지를 갖는다. 이러한 실시예에서, 제2항체 및 단계 (1)에서 수득된 면역 복합체는 "항체-항원-항체"샌드위치 복합체를 형성할 수 있다.
일부 바람직한 실시예에서, 단계 (2)전에 미반응 물질을 제거하기 위해 면역 복합체를 세척하는 단계가 추가로 포함된다.
특정 바람직한 실시예에서, 대상체는 HBV 감염 또는 HBV 감염 (예를 들어, B형 감염)과 관련된 질환을 가지고 있다.
특정 바람직한 실시예에서, 특정 바람직한 실시예에서, 샘플은 전혈, 혈장 또는 혈청과 같은 혈액 샘플이다.
용어 정의
본 발명에서, 달리 언급되지 않는 한, 본 발명에 사용된 과학적 및 기술 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 갖는다. 또한, 본 발명에 사용된 바이러스학적, 생화학적, 및 면역학적 실험 절차는 해당 분야에서 널리 사용되는 모든 일상적인 절차이다. 한편, 본 발명을 보다 잘 이해하기 위해, 관련 용어의 정의 및 설명이 하기와 같이 제공된다.
본 발명에서 사용된, 용어 "HBsAg"는 B형 간염 바이러스 (HBV)의 표면 항원 주요 단백질을 지칭하며, 이는 당업자에게 널리 공지되어 있다 (예를 들어, NCBI GENBANK database accession number: AAF24729.1를 참조한다 ).
본 발명에서 사용된, 용어 "특이적 결합 (specifically bind)" 또는 "특이적인 결합"은 두 분자 (예를 들면, 결합 분자 및 표적 분자) 사이의 비-무작위 결합 반응, 예를 들어 항체 및 항원사이의 직접적인 반응을 지칭한다. 두 분자 사이의 결합 친화력은 KD 값으로 설명될 수 있다. KD값은 kd (특이적 결합 분자-표적 분자 상호 작용의 해리 속도; 또한 코프 (koff) 라고도 알려짐)대 ka (특이적 결합 분자-표적 분자 상호 작용의 회합률; 또한 콘 (kon)이라고도 알려짐)의 비로부터 수득된 해리 상수를 지칭하거나, 몰 농도 (M)로 표현된 kd/ka를 지칭한다. KD 값이 작을수록, 두 분자가 더 가깝게 결합하고 친화력이 높아진다. 일부 바람직한 실시예에서, 항원에 특이적으로 결합하는 항체 (또는 항원에 특이적인 항체)는 항체가 약 10-5 M 미만, 예를 들어, 10-6 M 미만, 10-7 M 미만, 10-8 M 미만, 10-9 M 미만, 또는 10-10 M 미만 또는 그 미만의 친화도 (KD)로 항원에 결합함을 의미한다. KD 값은 당 업계에 공지된 방법, 예를 들어 BIACORE 기기에서 표면 플라즈몬 공명 (surface plasmon resonance; SPR)에 의해 결정될 수 있다.
본 발명에서 사용된, 용어 "면역학적 검출 (immunological detection)"은 항원-항체 사이의 특이적 상호 작용/결합 친화도를 사용하는 분석 방법을 지칭하며, 이는 일반적으로 샘플에서 특이적 항원 또는 항체의 존재 또는 수준을 검출하는데 유용하다. 이러한 면역학적 검출은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 효소 면역 분석 (enzyme immunoassay; EIA), 화학 발광 면역 분석 (chemiluminescence immunoassay; CLIA), 방사선 면역 분석 (radioimmunoassay; RIA), 형광 면역 분석 (fluorescence immunoassay; FIA), 웨스턴 블롯팅 (Western blotting), 면역 투과법 (immunoturbidimetry), 표면 플라즈몬 공명 (surface plasmon resonance) 등으로 한정되지는 않는다. 특정 실시예에서, 면역학적 검출은 ELISA, Elispot 또는 CLEIA와 같은 효소 면역 분석 (EIA)이다. 면역학에 대한 자세한 설명은, 예를 들어, 기본 면역학 (Fundamental Immunology), Ch. 7 Paul, W., ed., 2nd edition, Raven Press, N.Y. (1989)을 참조한다.
본 발명에서 사용된, 용어 "검출가능한 표지 (detectable label)"는 형광, 분광, 광화학, 생화학적, 면역학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단에 의해 검출될 수 있는 임의의 조성물을 지칭한다. 본 발명에서, 이러한 표지는 면역학적 검출 (예를 들어, 효소-결합 면역 분석, 방사성 면역 분석, 형광 면역 분석, 화학 발광 면역 분석 등)에 적합할 수 있는 것이 특히 바람직하다. 이러한 표지는 당 업계에서 잘 알려져 있으며, 효소 (예를 들어, 호스래디 퍼옥시다제 (horseradish peroxidase), 알칼리성 포스파타제 (alkaline phosphatase), β-갈락토시다제 (β-galactosidase), 우레아제 (urease), 글루코스 옥시다제 (glucose oxidase) 등등) , 방사성핵종 (radionuclide) (e.g., 3H, 125I, 35S, 14C, or 32P), 형광 염료 (fluorescent dye) (플루오레세인 이소티오시아네이트 (fluorescein isothiocyanate) (FITC)), 플루오레세인 (fluorescein), 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트 (tetramethylrhodamine isothiocyanate; 이하, TRITC), 피코에리트린 (phycoerythrin; PE), 텍사스 레드 (Texas Red), 로다민 (Rhodamine), 양자점 (quantum dot) 또는 시아닌 염료 유도체 (cyanine dye derivatives) (예를 들어, Cy7, 알렉사 (Alexa) 750), 아크리디늄 에스터 화합물 (acridinium ester compound), 자기 비드 (magnetic bead) (예를 들어, 다이나비드 (Dynabeads)®), 콜로이드 금 또는 유색 유리 또는 플라스틱 비드와 같은 열량 레이블 (예를 들어, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등등), 및 상기 표지에 의하여 변형된 아비딘 (예를 들어, 스테렙타비딘)에 결합하는데 사용되는 비오틴을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 표지의 사용을 설명한 특허는 미국 특허 817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149; 및 4,366,241 (모두 본 발명에 참조로 포함됨)이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 포함된 표지는 당 업계에 공지된 방법에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 방사성 표지는 사진 필름 또는 섬광 카운터를 사용하여 검출될 수 있고, 형광 표지는 방출된 빛을 검출하기 위한 광 검출기를 사용하여 검출될 수 있다. 효소 표지는 일반적으로 효소에 기질을 제공하고 기질에 대한 효소의 효과에 의해 생성된 반응 생성물을 검출함으로써 검출되고, 열량 표지는 색채화된 표지를 시각화함으로써 검출된다.
본 발명에서 사용된, 표현 "HBsAg를 인식하고 결합할 수 있는 검출 시약 (detection reagent capable of recognizing and binding to HBsAg)"은 HBsAg에 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 지칭한다. 이러한 물질은 당 업계에 공지되어 있거나, 또는 예를 들어, 표적화 폴리펩타이드 또는 앱타머를 포함하여, 당 업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 시약은 면역학적 검출에 의해 샘플의 HBsAg의 양을 결정할 수 있는 것이 특히 바람직하다. 면역학적 검출의 사용은 항원-항체 사이의 특이적 상호작용/결합친화성을 이용하기 때문에 특히 유리하다. 따라서, 시약이 HBsAg에 특이적으로 결합하는 반응성을 유지하는 한, 시약은 면역학적 검출에 의해 샘플에서 HBsAg의 양을 결정하는데 사용될 수 있다 (즉, 시약은 HBsAg를 인식하고 이에 결합할 수 있는 검출 시약으로서 사용될 수 있다). HBsAg에 특이적으로 결합하는 반응성을 유지하는 다양한 시약은 쉽게 생각 할 수 있고 당업자에게 이용 가능하고, 항-HBsAg 다가 클론 항체 또는 다가 클론 항체와 같은 항-HBsAg 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 사용된, 용어 "항체 (antibody)"는 전형적으로 2개의 쌍의 폴리펩타이드 쇄로 구성되는 면역 글로불린 분자를 지칭하며, 각 쌍은 하나의 "경"(light; L)쇄 및 하나의 "중"(heavy; H)쇄를 갖는다. 항체 경쇄는 κ 및 λ 경쇄로 분류될 수 있다. 중쇄는 μ,δ,γ,α 또는 ε으로 분류될 수 있으며, 항체의 이소 타입은 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 정의된다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J"영역에 의해 연결되고, 및 중쇄는 또한 약 3개 이상의 아미노산의 "D"영역을 함유한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 중쇄 불변 영역 (CH)으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 (CH1, CH2 및 CH3)으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (VL) 및 경쇄 불변 영역 (CL)으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 구성된다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전적보체 시스템의 제1성분 (C1q)을 포함하는 면역 글로불린의 숙주 조직 또는 인자에 대한 결합을 매개할 수 있다. VH 및 VL 영역은 또한 높은 변성을 갖는 영역 (상보 결정 영역 (CDR)으로 지칭되는)으로 세분화될 수 있으며, 프레임워크 영역 (FRs)이라고 불리는 상대적으로 보수적인 영역과 간격을 두고 있다. 각각의 VH 및 VL은 다음 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FRs로 구성된다: 아미노 말단에서 카르복시 말단으로의 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4. 각각의 중쇄/경쇄쌍의 가변 영역 (VH 및 VL)은 각각 항체 결합 부위를 형성한다. 영역 또는 도메인에 아미노산의 할당은 면역학적 관심 단백질의 Kabat 서열의 정의를 따른다 (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)), 또는 Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901 -917; Chothia et al. (1989) Nature 342: 878-883. 용어 "항체"는 항체를 생산하는 임의의 특정 방법에 의해 제한되지 않는다. 예를 들어, 이는 특히 재조합 항체, 단일 클론 항체 및 폴리 클로 날 항체를 포함한다. 항체는 상이한 이소 타입의 항체, 예를 들어, IgG (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서브 타입), IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM 항체 일 수 있다.
본 발명에서 사용된, 용어 "앱타머 (Aptamer)"는 관심있는 표적 단백질 (예를 들어, HBsAg) 또는 다른 생물학적 표적 분자에 높은 친화도 및 높은 특이도로 결합할 수 있는 단일 가닥의 뉴클레오티드를 지칭한다. 앱타머는 스템루프 (stemloop), 머리핀, 유사매듭 (pseudoknot), 또는 G-테트라머 (G-tetramer)와 같은 열역학적으로 안정적인 3차원 공간 구조를 형성하기 위해 접힐 수 있으며, 그리고 앱타머는 구조적 상보성 (structural complementarity), 염기 적층력 (base stacking force), 반 데르 발스 힘 (van der Waals force), 수소 결합 (hydrogen bonding), 또는 정전기적 상호작용 (electrostatic interaction)을 통해 관심 있는 표적 단백질 또는 다른 생물학적 표적 분자에 특이적으로 결합한다. 앱타머는 DNA 또는 RNA일 수 있고, 핵산 유사체 (예를 들어, 잠금 핵산 (locked nucleic acid ; LNA), 펩피트 핵산 (peptide nucleic acid; PNA), 글리콜 핵산 (glycol nucleic acid; GNA), 또는 쓰레오즈 핵산 (threose nucleic acid; TNA))를 포함한다. 특정 표적 단백질에 결합하는 앱타머를 얻는 방법, 예를 들어, SELEX (Systematic evolution of ligands by exponential enrichment) (지수적 농축에 의한 리간드의 체계적인 진화) 스크리닝 기술과 같은 기술이 공지되어 있다.
본 발명에서 사용된, 용어 "타겟팅 폴리펩타이드 (targeting polypeptide)"는 관심 있는 표적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩타이드 분자 (예를 들어, HBsAg)를 지칭한다. 본 발명에서, 표적화 폴리펩타이드는 천연 아미노산, 합성 아미노산, 또는 천연 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 모방체를 포함할 수 있다. 자연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 암호화된 것뿐만 아니라 나중에 변형되는 아미노산, 예를 들어 히드록시프롤린 (hydroxyproline), γ-히드록시글루타메이트 (γ-hydroxyglutamate), O-포스포세린 (O-phosphoserine), 포스포쓰레오닌 (phosphothreonine), 또는 포스포티로신 (phosphotyrosine)이다. 본 발명에서, 표적화 폴리펩타이드와 목적하는 표적 단백질 사이의 "특이성 (specificity)"은 친화도에 기초하여 결정될 수 있고, 친화도는 표적화 폴리??타이드 및 이것이 결합하는 관심있는 표적 단백질의 해리 평형 상수 (즉, KD값)에 의해 기술될 수 있다. KD 값이 낮을수록, 표적화 폴리펩타이드와 이것이 결합하는 관심있는 표적 단백질 사이의 결합 강도가 더 강하다. 약 10-3 M보다 큰 KD 값은 일반적으로 비결합 또는 비특이적 결합을 나타내는 것으로 간주된다는 것이 당 업계에 일반적으로 알려져 있다. 관심있는 특정 표적 단백질에 따라, 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 표적화 폴리펩타이드는 파지 디스플레이 기술 또는 단백질 어레이 기술에 의한 스크리닝과 같이 당업자에게 공지된 방법에 의해 수득 될 수 있다.
본 발명에서 사용된, 표현 "혈액 샘플이 희석되지 않은 (blood sample is undiluted)"은 혈액 샘플이 대상체로부터 수득된 후에 어떠한 희석 처리도 받지 않았다는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용된, 용어 "대상체 (subject)"라는 용어는 다양한 동물, 특히 포유 동물, 예컨대 소, 말, 양, 돼지, 개, 고양이, 토끼, 설치류 (예를 들어, 마우스 또는 래트), 비인간 영장류 (예를 들어, 원숭이 또는 시노몰구스 원숭이 (cynomolgus monkeys)) 또는 인간을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
임상 실습에서, 대부분의 HBsAg 감염 또는 B형 간염 환자의 HBsAg 수준은 기존의 상업적 HbsAg 정량 시약의 검출 상한보다 훨씬 높기 때문에, 종종 시험 샘플에서 반복적인 희석 조작이 요구된다. 하지만, 희석 공정은 시간 소모적일 뿐만 아니라 완전 자동 기기에 의한 수동 희석이든 자동 희석이든 검출의 정확성을 감소시키기 쉽다.
본 발명은 특정 시약 조성물을 포함하는 HBsAg 정량 검출 키트 및 시약 조성물에 기초한 HBsAg 정량 검출 방법을 제공한다. 종래 기술과 비교하여, 본 발명의 기술 솔루션은 검출의 정확성을 보장할 수 있고, 그 검출 범위는 대부분의 임상 샘플의 혈청/혈장 HBsAg 농도의 분포 범위를 커버할 수 있으며, 따라서 희석하지 않고 테스트 샘플을 직접 감지할 수 있으므로, 작업 단계가 크게 간소화된다.
이하 도면 및 실시예를 참조하여 본 발명의 실시 형태를 상세하게 설명하며, 당업자는 하기 도면 및 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니라 본 발명을 설명하기 위해서만 사용됨을 이해할 것이다. 본 발명의 다양한 목적 및 유리한 양태는 첨부 도면 및 바람직한 실시예의 다음과 같은 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이다.
도 1은 제조예 2의 키트를 사용하여 실시예 1에서 수득된 HBsAg 정량에 대한 표준 곡선을 보여준다.
도 2는 제조예 2의 키트를 사용하여 실시예 1에서 얻은 HBsAg 정량적 검출 결과와 상용 시약 (Roche)의 검출 결과 사이의 상관 관계 분석을 보여준다.
도 3은 제조예 2의 키트를 사용하여 실시예 1에서 얻은 HBsAg 정량적 검출 결과와 상용 시약 (Abbott)의 검출 결과 사이의 상관 관계 분석을 보여준다.
도 4는 비교예 1에서 상이한 제형의 해리 용액을 사용한 HBsAg 정량적 검출 곡선을 보여준다.
본 발명은 이제 본 발명을 제한하지 않고 예시하기 위한 하기 실시예를 참조하여 설명될 것이다.
달리 명시되지 않는 한, 본 발명에서 사용된 분자 생물학적 실험 방법 및 면역 분석은 기본적으로 J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, and FM Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., 1995을 따랐으며; 제한 효소의 사용은 제품 제조업체가 권장하는 조건에 따른 것이다. 당업자는 실시예가 본 발명을 예시적으로 설명하고 청구된 본 발명의 청구 범위를 제한하려는 것이 아님을 알고 있다.
제조예 1: 해리 용액의 제조
제형: 40 mM TCEP (tris(2-carboxylethyl)phosphine hydrochloride) + 2 M 우레아 (urea) + 600 mM NaCl + 100 mM CB9.6 + 0.1% 트윈-20.
시약: TCEP (Cat. No. 68957), 트윈-20 (Tween-20) (Cat. No. P1379), NaCl (Cat. No. V900058), 중탄산 나트륨 (sodium bicarbonate) (Cat. No. S5761-500g), 요소 (V800441) 및 나트륨 탄산염 (sodium carbonate) (V800371) 은 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich) 로부터 구입 하였다.
준비 단계:
1. 탄산나트륨 31.8g 및 중탄산 나트륨 58.6g을 칭량하고, 탈이온수에 1000mL 부피로 용해시켜, pH 값이 9.6 인 1M 탄산염 완충제 (carbonate buffer; CB)를 제조하였다.
2. NaCl 87.66 g을 칭량하고, 탈이온수에 500 mL의 부피로 용해시켜 3M NaCl 용액을 제조하였다.
3. 240.24 g의 우레아를 칭량하고, 탈이온수에 500 mL의 부피로 용해시켜, 8M 우레아 용액을 제조하였다.
4. TCEP 5.733g을 칭량하고 100mL의 탈이온수에 용해시킨 후, 50mL의 1M 탄산염 완충액 (pH 9.6), 125mL의 8M 우레아, 100mL의 3M NaCl 용액 및 0.5mL의 트윈 -20을 잘 혼합한 후 탈이온수를 500 mL의 부피로 첨가하였다.
제조예 2: 화학 발광 효소-결합 면역 분석 (CLEIA)을 위한 HBsAg 검출 키트의 제조
1. 고정화된 항체의 제조
(1-1) 마우스 항-HBsAg 단일 클론 항체 (Mouse anti-HBsAg monoclonal antibody) (Xiamen Wantai Canghai Biotechnology Co., Ltd.에서 구입)를 pH 9.6에서 50 mM CB 완충액 (carbonate buffer) (NaHCO3 / Na2CO3 완충액, 최종 농도 50 mM, pH 9.6)으로 4 ug/ml의 최종 농도로 희석하여 코팅 용액을 제조하였다.
(1-2) 이전 단계 (1)에서 제조된 코팅 용액 100 uL을 화학 발광 반응을 위해 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하여 2 내지 8 ℃에서 16 내지 24 시간동안 코팅을 수행하였다.
(1-3) 코팅되지 않은 마우스 항-HBsAg 단일 클론 항체를 제거하기 위해 PBST 세척 용액 (20mM PB7.4, 150mM NaCl, 0.1 % 트윈 20)으로 1회 세척을 수행하였다. 이어서, 200 ul 차단 용액 (pH 7.4를 가지며 20 % 유아 (infant) 소 혈청, 1 % BSA 및 1 % 카세인을 함유한 20 mM Na2HPO4 / NaH2PO4 완충액)을 각 웰에 첨가하여 37 ℃에서 2시간 동안 차단을 수행하고; 그리고 차단 용액을 버렸다. 건조 후, 플레이트를 알루미늄 호일백에 넣고 나중에 사용하기 위해 2 내지 8 ℃에서 보관하였다.
2. 표지된 항체의 제조
항-HBsAg 폴리 클로날 항체 (polyclonal antibody )의 HRP (Horseradish Peroxidase) 표지는 변형된 요오드 산 나트륨 방법을 사용하여 수행되었다. 하기 제조예는 10 mg의 항-HBsAg 폴리 클로날 항체를 표지하기 위해 수행되었다.
(2-1) 2mg / mL 농도의 염소 항 -HBsAg 폴리 클로날 항체 (5mL)( Xiamen Wantai Canghai Biotechnology Co., Ltd., 카탈로그 번호 G1051에서 구입)를 투석백에 넣고, 4 ℃에서 4시간 동안 20mM CB 완충액에 대해 투석하여 투석 완충액을 2시간마다 교체하였다.
(2-2) 40 mg의 호스래디 퍼옥시다제 (HRP)(시그마-알드리치 / 77332)를 정확하게 칭량하고 2 mL의 ddH2O에 용해시킨 후, 이어서 2 ml의 20 mg/mL NaIO4를 첨가하고 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 40 μL의 에틸렌 글리콜 (ethylene glycol)을 첨가하고 4 ℃에서 30분 동안 반응시켜 HRP 활성화 용액 (10 mg/mL, 4 mL)을 제조하였다.
(2-3) 단계 (2-2)에서 제조된 HRP 활성화 용액을 염소 항-HBsAg 폴리 클로날 항체를 함유하는 투석백에 첨가하고, 잘 혼합하고 20 mM CB 완충액에 대한 투석은 6 내지 8 시간 동안 암실에서 4 ℃에서 계속되었고, 투석 완충액은 공정 동안 2 시간마다 변경되었다.
(2-4) 0.5 mL의 NaBH4 용액 (20mg/mL)을 제조하고, 단계 (2-3)에서 제조된 표지 반응 용액을 첨가하고 잘 혼합하였다. 혼합물을 어둠 속에서 4 ℃에서 2 시간 동안 반응시키고 30 분마다 잘 혼합하였다.
(2-5) 단계 (2-4) 가 완료된 후, 표지 반응 용액을 새로운 투석백에 다시 로딩하고, 4 ℃에서 4 시간 동안 PBS 완충제에 대해 투석하였다.
(2-6) 단계 (2-5) 가 완료된 후, 50 % 포화 황산 암모늄 (50%는 투석백에서 황산 암모늄의 농도를 나타내었고, 주요 목적은 염소 폴리클로날 항체-HRP 표지된 생성물을 침전시키는 것이었다). 12000 rpm에서 10 분 동안 원심 분리한 후, 상청액을 버리고, 침전물을 위아래로 피펫팅하여 50% 글리세롤 + 10% NBS (최종 농도) (NBS는 신생아 소 혈청의 약칭)에 용해시키고, 잘 혼합하고, 나중에 사용하기 위해 -20 ℃에서 보관 하였다.
(2-7) 단계 (2-6)에서 수득된 염소 폴리클로날 항체-HRP 표지된 생성물을 부피당 1/4000의 희석 속도로 효소 표지 희석 완충액 (pH 7.4를 가지며 20 % 태아 소 혈청, 1 % 카세인, 10 % 슈크로스 및 0.05 % 아미노피린을 함유하는 20mM Na2HPO4 / NaH2PO4 완충액)으로 희석하여, 효소 표지 반응 용액을 제조하고, 혼합 후, 나중에 사용하기 위해 2 내지 8 ℃에서 보관하였다.
3. 정량 표준
중간 및 고농도 HBsAg 샘플의 정량적 검출을 위한 정량 표준은 상이한 농도의 B형 간염 바이러스 표면 항원을 함유하는 일련의 샘플이었다. 총 8가지 표준이 포함되었으며, 농도는 100,000 IU/mL, 50,000 IU/mL, 10,000 IU/mL, 5,000 IU/mL, 1,000 IU/mL, 500 IU/mL, 100 IU/mL, 20 IU/mL이고, 각각, 튜브당 500 μl의 부피로 포함된다. 표면 항원은 Xiamen Wantai Kairui Biotechnology Co., Ltd.에 의해 제공되었으며, NIBSC에서 발행 한 WHO 표준 (코드: 00/588)으로 추적할 수 있다. 표준 희석에 사용된 용액은 HBsAg 및 HBsAb 음성 건강한 혈액 기증자의 혈장 또는 혈청이거나 20 % 신생아 소 혈청을 함유 한 PBS용액 일 수 있다.
4. 해리 솔루션
해리 솔루션은 제조예 1에서 제조하였다.
제조예 3: 튜브 내의 미세 입자에 기초한 화학 발광 면역 분석 (CLIA)을 위한 HBsAg 검출 키트의 제조
1. 항체-표지된 자성 입자의 제조
(1-1) 4 mg의 자성 비드 (JSR 사의 Magnosphere MS300/카르복실, 일본, 입자크기는 3 um)를 1mL의 활성화 완충 시스템 (50mM MES 5.0)으로 2 회 세척하고, 상청액을 버렸다. 4mg의 EDC 및 4mg의 NHS 시약 (둘 다 50mM MES 5.0으로 10mg/mL로 제제화 됨)을 첨가하고, 잘 혼합한 후, 실온에서 20 분 동안 진탕 시키면서 활성화시켰다;
(1-2) 활성화된 자성 비드를 1 mL의 활성화 완충 시스템 (50 mM MES 5.0)으로 3 회 세척하여 과량의 EDC 및 NHS를 제거하고, 상청액을 버렸다. pH 6.0의 1 mL의 50 mM 포스페이트 완충액 및 160 μg의 마우스 항-HBsAg 모노클로날 항체를 첨가하고 잘 혼합한 다음, 실온에서 3 시간 동안 진탕 시키면서 반응시켰다;
(1-3) (1-2)에서 수득된 자성 비드는 1 mL의 PBST 세척 용액 (20 mM PB7.4, 150 mM NaCl, 0.1 % 트윈 20)으로 3 회 세척되고, 이어서 1 ml의 차단 완충제 (20 mM PB7.4, 1 % 글리신, 0.1 % BSA, 0.05 % 트윈-20)를 첨가하고, 잘 혼합한 후, 실온에서 3 시간 동안 진탕하면서 반응시키고;
(1-4) 단계 (1-3)에서 수득된 차단된 자성 입자를 PBST 세척 용액 (20mM PB7.4, 150mM NaCl, 0.1 % 트윈 20)으로 3회 세척하고, 이어서 1 ml의 저장 완충제 (20mM 트리스-HCl 완충제 pH 8.0, 0.5 % BSA, 150mM NaCl, 0.5 % 카세인, 0.1 % 보존제)를 첨가하고, 나중에 사용하기 위해 2 내지 8 ℃에서 저장하고;
(1-5) 코팅된 자성 입자를 저장 완충제(20mM Tris-HCl 완충제 pH 8.0, 0.5 % BSA, 150mM NaCl, 0.5 % 카세인, 0.1 % 보존제)로 10회 희석하고, 나중에 사용하기 위해 2 내지 8 ℃에서 보관하였다.
2. 염소 항-HBsAg 폴리클로날 항체의 아크리디늄 에스테르 표지
(2-1) 100 ug의 염소 항-HBsAg 폴리 클로날 항체 (goat anti-HBsAg polyclonal antibody )를 300 ul의 표지 완충 시스템 (50 mM 포스페이트 완충액, pH 8.0)에 참가하고, 12 ul의 아크리디늄 에스테르 (5 mM NHS-SAE)를 첨가하고, 암실에서 30분 동안 실온에서 반응시켰다.
(2-2) 200 uL의 정지 완충제 (stopping buffer) (100 mM 글리신을 함유하는 포스페이트 완충제 (phosphate buffer), pH 8.0)에 단계 (2-1)에서 제조된 표지된 생성물을 첨가하고, 암실에서 30분 동안 실온에서 반응시켰다.
(2-3) 단계 (2-2)로부터 표지된 생성물을 투석백 (dialysis bag)에 로딩하고, 암실에서 4 ℃에서 6 내지 8 시간 동안 투석 완충액 (20 mM 인산 완충액, pH 7.4)에 대해 투석하고, 투석 완충액은 2시간 마다 교체되었다.
(2-4) 단계 (2-3)에서 수득된 표지된 생성물을 저장 튜브로 옮기고, 2 % BSA 및 50 % 글리세롤을 첨가하고, 나중에 사용하기 위해 -20 ℃에서 저장하였다.
(2-5) 단계 (2-4)에서 제조된 아크리디늄 에스테르 표지된 생성물은 아크리디늄 에스테르 표지 희석 완충액에 1/3000의 부피비로 희석하여 발광 표지 반응 용액을 제조하고, 이어서 혼합 후 나중에 사용하기 위해 2 내지 8 ℃에서 보관하였다.
3. 정량 표준
본 제조예의 키트의 정량 표준은 제조예 2의 단계 3에서와 동일하였다.
4. 해리 솔루션
제조예 1과 같이 제조하였다.
실시예 1: 임상 시료에서 HBsAg의 정량적 검출
1.실험 시약/ 키트
제조예 2의 키트
2. 실험 방법
만성 B 형 간염 환자 (P1 내지 P38로 번호 붙여진)의 38 개의 혈청 샘플을 다음 단계에 따라 HBsAg 정량적 검출에 적용하였다.
(1) 샘플 반응: 코팅된 화학 발광 반응 플레이트 각 웰에, 90 μL의 해리 용액을 첨가하고, 10 μL의 샘플 또는 표준을 교반 한 후, 37 ℃ 인큐베이터에서 30 분 동안 진탕 및 반응시키면서 혼합하였다.
(2) 효소 표지 반응: 단계 (1)이 완료된 후, 화학 발광 반응 플레이트를 PBST (Phosphate Buffered Saline with Tween 20) 세척 용액 (20mM PB7.4, 150mM NaCl, 0.1 % 트윈20)으로 5회 세척하여 반응 해리 용액 및 미반응 샘플을 제거하였다. 제조예 2의 단계 (2-7)에서 제조된 효소 표지 반응 용액 100 uL를 각각의 웰에 첨가하고, 37 ℃ 인큐베이터에서 30 분 동안 반응시켰다.
(3) 발광 반응 및 측정: 단계 (2)가 완료된 후, 화학 발광 반응 플레이트를 PBST 세척 용액 (20mM PB7.4, 150mM NaCl, 0.1 % 트윈 20)으로 5회 세척하여 과량의 효소 표지 반응 용액을 제거하였다. 피어스 사 (Pierce Company)에 의해 생성된 100 uL의 PICO 화학 발광 기판을 각 웰에 첨가하고, 각 반응 웰의 발광값 (RLU)을 오린 II (Orin II) 화학 발광 검출기로 즉시 판독하였다.
(4) 정량을 위한 표준 곡선의 생성: 단계 (3)이 완료된 후, 선형 회귀 분석은 8 개의 정량 표준의 측정 값과 해당 농도에 대해 수행되어 표준 곡선을 얻었다. 결과는 도 1에 나타내었다. 결과는 상기 검출 방법의 정확도에 의한 정량의 상한이 100,000 IU/mL이고, 하한이 20 IU/mL이며, 이의 선형 동적 범위는 3.5 배였다.
RLU 측정 값으로부터 HBsAg 농도를 계산하기 위한 공식은 다음과 같다 : Conc. HBsAg (IU/mL) = 10(Log10(RLU) - 2.7252)/×0.8668.
(5) 시험 될 샘플의 HBsAg 농도를 수득 함 : 샘플 P1 내지 P38을 단계 (1) 내지 (4)를 통해 측정한 후, 샘플의 상응하는 RLU 값을 수득 하였다. 측정된 값을 단계 (4)에서 얻은 HBsAg 농도를 계산하기 위한 공식으로 대체하여 샘플에서 B형 간염 바이러스 표면 항원의 농도를 계산하였다.
동시에, 로슈의 B형 간염 바이러스 표면 항원에 대한 정량적 검출 키트 (100 tests/box, Cat. No.: 07143737190) 및 애보트의 B형 간염 바이러스 표면 항원에 대한 정량적 검출 키트 (100 tests/box, Cat. No.: 6C36) 은 동일한 배치에서 샘플을 탐지하는데 사용되었고, 키트의 지침에 따라 작업이 수행되었으며, 로슈 및 애보트 키트는 해당 회사의 전자동 화학 발광 장치와 함께 사용되었으며, 샘플의 희석 및 감지는 장치에 의하여 자동으로 수행되었다.
3. 실험 결과
제조예 2의 키트를 사용하여 동일한 배치로부터의 샘플의 검출 결과, 로슈 키트 (100 tests/box, Cat. No.: 07143737190) 및 애보트 키트는 표 1에 나타내었다.
표 1: 샘플 P1 내지 P38에서 B 형 간염 바이러스 표면 항원의 농도 결정
샘플 번호 애보트
(IU/mL)		 로슈
(IU/mL)		 본 발명
(IU/mL)		 샘플 번호 애보트
(IU/mL)		 로슈
(IU/mL)		 본 발명
(IU/mL)
P1 444 1240 439.99 P20 12360 18142 15281.08
P2 794 1173 1584.89 P21 424 738 807.52
P3 501 1034 994.78 P22 6284 10602 15878.31
P4 3162 11407 11416.55 P23 964 1778 1232.46
P5 631 3074 1376.94 P24 80 137 158.49
P6 7943 14211 18805.41 P25 10300 28063 14426.89
P7 32 100 125.89 P26 16 25 31.62
P8 6310 19686 15738.38 P27 17856 20136 21193.46
P9 63 100 125.89 P28 500 1130 591.92
P10 8188 7930 9004.31 P29 176 177 139.06
P11 288 445 198.27 P30 8116 15300 12414.66
P12 1348 1541 2110.13 P31 8192 10217 9340.80
P13 12696 11977 18575.77 P32 1224 2920 2492.14
P14 1872 9794 3391.13 P33 6284 9276 8587.02
P15 208 1170 677.70 P34 292 688 829.49
P16 2868 8123 4306.91 P35 7928 12090 11518.21
P17 9740 15792 12752.08 P36 4704 3489 4590.60
P18 12656 14364 11261.68 P37 14672 16810 21535.62
P19 4528 3287 7654.29 P38 612 429 458.12
표 1의 검출 결과에 대해 정량 상관 분석을 수행하였고, 그 결과를 각각 도 2 및 3에 나타내었다. 도 2는 제조예 2 키트의 검출 결과 및 38개의 임상 시료에 대한 로슈 시약 사이의 상관 분석 결과를 나타내며, 그 결과인 둘의 상관 계수 R2는 0.9448 인 것으로 나타났다. 도 3은 제조 예 2 키트의 검출 결과와 애보트 시약의 상관 관계 분석 결과를 나타내었으며, 그 결과인 둘의 상관계수 R2는 0.95인 것으로 나타났다. 상기 결과는 본 발명의 키트가 우수한 검출 정확도를 가짐을 입증하였다.
또한, 본 발명자들은 제조예 2의 키트를 사용하여 747개의 임상 HBsAg 양성 샘플을 검출하고, 샘플의 농도 분포 범위를 계산하였다. 결과를 표 2에 나타내었으며, 본 발명의 키트의 20 내지 100,000 IU/mL의 검출 범위 내의 농도를 갖는 임상 샘플의 92.1%가 존재하였고; 대조적으로, 통상적인 HBsAg 정량적 검출 시약의 검출 범위 (0.05 to 250 IU/mL)내의 농도를 갖는 샘플은 단지 25.97% 존재하였다.
표 2: 임상 HBsAg 양성 샘플의 농도 분포 범위
IU/mL 샘플 수 (n=747) 전체의 %
<20 55 7.4
20<250 139 8.4
250<1000 160 31.6
1000<10000 248 33.2
10000<100000 141 18.9
100000< 4 0.5
비교예 1: 검출 상한에 대한 다른 식의 해리 용액의 효과
1. 시험 시약: B 형 간염 바이러스 표면 항원 분석 키트 (화학 발광 미세 입자 면역 분석법) (Xiamen Wantai Kairui Biotechnology Co., Ltd.에서 구입); 제조 예 1의 해리 용액, 40 mM TCEP (tris(2-carboxylethyl)phosphine hydrochloride) 용액, 600 mM NaCl 용액, 2M 우레아 용액 및 6M 우레아.
2. 실험 샘플: HBsAg 농도가 100,000 IU/mL 인 샘플을 HBsAg 및 HBsAb 모두에 대해 음성인 샘플로 0.03 IU/mL까지 3배 연속 희석하였다.
3. 실험 단계 :
(1) 샘플 반응: 샘플 20 μL를 반응 튜브에 첨가하고, 제조예 1, 2M 우레아, 6M 우레아, 600 mM NaCl 및 40 mM TCEP 용액에서 각기 제조된 100 ul의 해리 용액을 첨가하였다. Xiamen Wantai Kairui Biotechnology Co., Ltd.에서 제조한 B 형 간염 바이러스 표면 항원 결정 키트 (화학 발광 미립자 면역 분석법) 의 50 μl의 자성 입자 시약을 첨가하고, 진탕하여 잘 혼합한 후, 37 ℃ 인큐베이터에서 15 분 동안 반응시켰다.
(2) 발광성 라벨 반응: 단계 (1)이 완료된 후, 화학 발광 반응 튜브를 PBST 세척 용액 (20mM PB7.4, 150mM NaCl, 0.1 % 트윈-20)으로 2 회 세척하고; Xiamen Wantai Kairui Biotechnology Co., Ltd.에 의해 제조된 B 형 간염 바이러스 표면 항원 분석 키트 (화학 발광 미립자 면역 분석법)의 아크리디늄 에스테르 라벨 시약 50 μL를 각 웰에 첨가하고, 37 ℃ 인큐베이터에서 10 분 동안 반응시켰다.
(3) 발광 반응의 측정 : 단계 (2)가 완료된 후, 화학 발광 반응 튜브를 PBST 세척 용액 (20mM PB7.4, 150mM NaCl, 0.1 % 트윈-20)으로 4회 세척하였다. Sirius-L 단일 튜브 화학 발광 검출기를 사용하고, 여기 용액을 인-시츄 주사에 의해 첨가하고, 동시에 광도 검출이 수행되었다.
(4) 정량을 위한 표준 곡선 생성: 단계 (3)이 완료된 후, 100,000 IU/mL HBsAg 샘플의 3 배 구배 희석에 의해 수득된 일련의 샘플의 측정된 값 및 상응하는 농도에 대해 선형 회귀를 수행하여 정량을 위한 표준 곡선을 수득 하였다.
결과를 도 4에 나타냈다. 40 mM TCEP 또는 2M 요소가 해리 용액으로 사용된 경우, 검출 결과는 근접하고, 검출 상한은 약 3700 IU/mL로, 이는 종래의 HBsAg 검출 방법보다 10 배 높았다. 이에 비해, 제조예 1의 해리 용액을 사용한 경우, 검출 상한은 100,000 IU/mL에 도달할 수 있으며, 이는 종래의 HBsAg 검출 방법보다 400 배 높았다. 상기 결과는 본 발명의 해리 용액이 검출의 정확성을 보장하면서 검출의 상한을 상당히 증가시킬 수 있음을 보여주며, 단일 검출에 의해 정확하게 정량화 될 수 있는 선형 동적 범위는 3.5 배의 크기에 도달할 수 있어서, 대부분의 임상 시료에 지루한 희석 처리가 더 이상 필요하지 않아 검출 효율을 향상시킨다.
비록 본 발명의 특정 실시예가 상세하게 설명되었지만, 당업자는 개시된 모든 교시에 따라, 세부 사항에 대한 다양한 수정 및 변경이 이루어질 수 있으며, 이러한 변경은 모두 본 발명의 범위 내에 있다. 본 발명의 전체 범위는 첨부된 청구범위 및 그의 등가물에 의해 주어진다.

Claims (21)

  1. HBsAg에 특이적으로 결합할 수 있는 제1항체; 및
    (a) 트리스(2-카르복실에틸)포스핀 히드로클로라이드 (tris(2-carboxylethyl)phosphine hydrochloride; 이하, TCEP), (b) 우레아 (urea), (c) 비이온성 계면활성제 (non-ionic surfactant), 무기염 (ignorganic salt) 및 완충제 (buffer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 및 (d) 잔량의 물 (a balance of water)로 이루어진 시약 조성물;
    을 포함하는 키트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 시약 조성물은 다음 특성 중 하나 이상을 갖는 것인, 키트:
    (i) 비이온성 계면활성제는 챕스 (Chaps), 설포베타인 (sulfobetaine) 타입 계면활성제, 트리톤 (triton)형 세제, 트윈 (Tween)형 세제 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것;
    (ii) 무기염은 NH4SO4 및 NaCl로부터 선택되는 것;
    (iii) 완충제는 탄산염 완충제인 것.
  3. 제2항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 SB14, SB16, 트윈-20, 트윈-40, 트리톤 X-100, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 키트.
  4. 제1항에 있어서, 상기 시약 조성물은 다음으로 이루어진 것인, 키트:
    (1) TCEP, 우레아 및 잔량의 물;
    (2) TCEP, 우레아, 무기염 및 잔량의 물;
    (3) TCEP, 우레아, 무기염, 비이온성 계면활성제 및 잔량의 물; 또는,
    (4) TCEP, 우레아, 무기염, 비이온성 계면활성제, 완충제, 및 잔량의 물.
  5. 제1항에 있어서, 상기:
    TCEP는 1 내지 100 mM의 양으로 존재하는 것이고;
    우레아는 0.5 내지 8 M의 양으로 존재하는 것이고;
    비이온성 계면활성제는 0 내지 10% (v/v)의 양으로 존재하는 것이고,
    무기염은 0.5 내지 8 M의 양으로 존재하는 것이고, 및
    완충제는 0 내지 200 mM의 양으로 존재하는 것이다.
  6. 제1항에 있어서, 상기 TCEP는 10 내지 50 mM의 양으로 존재하는 것이고, 및/또는, 우레아는 1 내지 8 M의 양으로 존재하는 것인, 키트.
  7. 제1항에 있어서, 상기 키트는 HBsAg에 특이적으로 결합할 수 있는 제2항체를 추가로 포함하는 것이고;
    선택적으로, 제2항체는 검출 가능한 표지를 갖는 것인, 키트.
  8. 제7항에 있어서, 상기 검출 가능한 표지는 효소, 화학발광 (chemiluminescent) 시약, 또는 형광 염료에서 선택되는 것인, 키트.
  9. 제1항에 있어서, 상기 키트는 고체 지지체를 추가로 포함하는 것이고, 선택적으로 이의 표면이 제1항체로 코팅된 것인, 키트.
  10. 제9항에 있어서, 상기 고체 지지체는 마이크로타이터 플레이트 (microtiter plate) 또는 자기 비드인 것인, 키트.
  11. 제1항에 있어서, 상기 키트는 다음으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 시약 또는 장치를 추가로 포함하는 것인, 키트:
    표준;
    양성 대조군 샘플;
    음성 대조군 샘플;
    효소에 의해 촉매된 기질의 색 반응을 정지시키기 위한 정지 용액;
    비-특이적 결합을 억제하기 위한 차단 용액; 및
    혈액 수집 장치.
  12. 하기의 단계를 포함하는 HBsAg를 포함하는 샘플에서 HBsAg의 양을 정량적으로 검출하는 방법:
    (1) 시약 조성물에서 HBsAg에 특이적으로 결합할 수 있는 제1항체 및 샘플을 접촉시켜 면역 복합체를 얻는 단계;
    (2) 단계 (1)에서 수득된 면역 복합체의 양을 결정하는 단계;
    상기, 단계 (1)에서, 시약 조성물은 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 것이고, 샘플은 혈액 샘플이다.
  13. 제12항에 있어서, 상기 방법은 다음 특성 중 하나 또는 그 이상을 갖는 것인, 방법;
    (i) 혈액 샘플은 전혈, 혈장 또는 혈청에서 선택되는 것인;
    (ii) 혈액은 희석되지 않은 것인;
    (iii) 제1항체는 고체 지지체의 표면에 코팅된 것인;
    (iv) 단계 (2)전에 미반응 물질을 제거하기 위해 면역 복합체를 세척하는 단계가 추가로 포함된다.
  14. 제13항에 있어서, 상기 제1항체는 마이크로타이터 플레이트 또는 자기 비드의 표면에 코팅된 것인, 방법.
  15. 제12항에 있어서, 상기 단계 (2)에서, 면역 복합체의 양은 면역학적 검출에 의하여 결정되는 것인, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 면역학적 검출은 효소 면역 분석 또는 화학 발광 면역 분석인 것인, 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 면역학적 검출은 CLEIA 방법 및 CLIA 방법으로부터 선택되는 것인, 방법.
  18. 제15항에 있어서, 단계 (2)에서, 면역 복합체의 양은 HBsAg에 특이적으로 결합할 수 있는 제2항체를 사용하여 검출되는 것이며, 제2항체는 검출 가능한 표지를 갖는 것인, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 검출 가능한 표지는 효소, 화학 발광 시약 또는 형광 염료인 것인, 방법.
  20. 삭제
  21. 삭제
KR1020207018464A 2017-12-04 2018-11-30 HBsAg의 정량적 검출을 위한 키트 및 방법 KR102390761B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711258416.3 2017-12-04
CN201711258416.3A CN109870581B (zh) 2017-12-04 2017-12-04 一种定量检测HBsAg的试剂盒及方法
PCT/CN2018/118494 WO2019109864A1 (zh) 2017-12-04 2018-11-30 一种定量检测HBsAg的试剂盒及方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200094761A KR20200094761A (ko) 2020-08-07
KR102390761B1 true KR102390761B1 (ko) 2022-04-25

Family

ID=66750800

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020207018464A KR102390761B1 (ko) 2017-12-04 2018-11-30 HBsAg의 정량적 검출을 위한 키트 및 방법

Country Status (8)

Country Link
US (1) US11543413B2 (ko)
EP (1) EP3722811A4 (ko)
JP (1) JP7194746B2 (ko)
KR (1) KR102390761B1 (ko)
CN (1) CN109870581B (ko)
AU (1) AU2018378517B2 (ko)
CA (1) CA3084683C (ko)
WO (1) WO2019109864A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110954692A (zh) * 2019-12-20 2020-04-03 蓝怡科技集团股份有限公司 一种还原剂缓冲液及其制备方法和应用
WO2023057823A1 (en) * 2021-10-10 2023-04-13 Alipour Elias Detecting an antigen of a virus using electrochemical analysis

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008525423A (ja) 2004-12-24 2008-07-17 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル 糖結合体ワクチン
KR100916992B1 (ko) * 2004-09-22 2009-09-14 가부시끼가이샤 센단세메이가가꾸겐큐죠 Ｂ형 간염 바이러스 ｓ 항원의 검출법
US20090280474A1 (en) 2008-05-08 2009-11-12 Abbott Laboratories Method for detecting a virus
JP2013500326A (ja) 2009-07-30 2013-01-07 ファイザー バクシーンズ エルエルシー 抗原性タウペプチドおよびその使用

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3817837A (en) 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US3939350A (en) 1974-04-29 1976-02-17 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescent immunoassay employing total reflection for activation
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4277437A (en) 1978-04-05 1981-07-07 Syva Company Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4366241A (en) 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
US4847080A (en) * 1984-03-07 1989-07-11 New York Blood Center, Inc. Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipide vesicle carriers
CN1197927A (zh) * 1997-04-25 1998-11-04 武汉市第七医院 一种直接检测血清乙肝病毒核心抗原试剂
CN1305589A (zh) 1998-04-17 2001-07-25 基因创新有限公司 采用还原剂的改进型免疫诊断分析
GB0224688D0 (en) 2002-10-23 2002-12-04 Glaxosmithkline Biolog Sa Method
ATE493659T1 (de) 2004-05-19 2011-01-15 Advanced Life Science Inst Inc Verfahren zum nachweis von hepatitis-b-virus
JP4913587B2 (ja) * 2006-12-28 2012-04-11 雪印メグミルク株式会社 ペプチドおよびタンパク質定量法
US20090098531A1 (en) 2007-09-13 2009-04-16 Abbott Laboratories Detecting hepatitis b virus
CN102081018A (zh) 2009-11-30 2011-06-01 希森美康株式会社 样品的预处理方法及hcv的免疫测定方法
CN106443000B (zh) * 2013-01-28 2019-08-16 希森美康株式会社 用于检测HBs抗原的样品的预处理方法及其利用
JOP20200096A1 (ar) * 2014-01-31 2017-06-16 Children’S Medical Center Corp جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها
JP6041824B2 (ja) * 2014-03-22 2016-12-14 日本特殊陶業株式会社 スパークプラグ、および、点火システム
CN106153935B (zh) * 2015-03-26 2018-05-08 广州瑞博奥生物科技有限公司 一种定量检测CD79α的酶联免疫试剂盒
US11454632B2 (en) 2017-11-30 2022-09-27 Fujirebio Inc. Assay method and assay kit for hepatitis B virus S antigen

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100916992B1 (ko) * 2004-09-22 2009-09-14 가부시끼가이샤 센단세메이가가꾸겐큐죠 Ｂ형 간염 바이러스 ｓ 항원의 검출법
JP2008525423A (ja) 2004-12-24 2008-07-17 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル 糖結合体ワクチン
US20090280474A1 (en) 2008-05-08 2009-11-12 Abbott Laboratories Method for detecting a virus
JP2013500326A (ja) 2009-07-30 2013-01-07 ファイザー バクシーンズ エルエルシー 抗原性タウペプチドおよびその使用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2019109864A1 (zh) 2019-06-13
KR20200094761A (ko) 2020-08-07
EP3722811A1 (en) 2020-10-14
AU2018378517A1 (en) 2020-06-25
AU2018378517B2 (en) 2022-07-14
CA3084683A1 (en) 2019-06-13
JP2021505906A (ja) 2021-02-18
US11543413B2 (en) 2023-01-03
US20210164981A1 (en) 2021-06-03
EP3722811A4 (en) 2021-07-21
CA3084683C (en) 2023-08-01
CN109870581B (zh) 2021-05-04
CN109870581A (zh) 2019-06-11
JP7194746B2 (ja) 2022-12-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK165381B (da) Immunoanalysemetode til bestemmelse af ligander ved hjaelp af biotin og antibiotin
JP7060510B2 (ja) 腫瘍マーカーの測定方法及び測定試薬
Matsumoto et al. Novel and highly sensitive immunoassay for total hepatitis B surface antigen, including that complexed with hepatitis B surface antibody
JP6850254B2 (ja) 干渉を減少させるための方法
JP2019502110A (ja) イムノアッセイにおける干渉を低減するための方法
JP7320492B2 (ja) Ｂ型肝炎ウイルス抗原の免疫測定方法
JP5808808B2 (ja) 非特異反応抑制剤、非特異反応抑制方法及びキット
JP2018525637A (ja) Ｐｅｇ化分析物特異的結合剤を用いた粒子に基づくイムノアッセイ
KR102390761B1 (ko) HBsAg의 정량적 검출을 위한 키트 및 방법
JP2018004371A (ja) 免疫複合体転移法により被検物質を検出するための抗体試薬及びその製造方法、並びにその抗体試薬の利用
JP7209498B2 (ja) Ｂ型肝炎ウイルスコア抗体の免疫測定方法
JP6832160B2 (ja) 多重分析法を実行するための対照
US11768209B2 (en) Method and reagent for measuring thyroglobulin
WO2009084369A1 (ja) Ｈｉｖ－１抗原の検出用試薬及び検出方法
JP7315965B2 (ja) ウィルス性肝癌の検出方法
JPH03225277A (ja) 多項目の免疫化学的測定法
JP6697314B2 (ja) 可溶性インターロイキン２受容体の免疫学的測定法
JP2021099243A (ja) 免疫学的測定法
JP4359416B2 (ja) 微小粒子固相上に固定化された物質の測定法
JP2002196000A (ja) 類縁体に起因する非特異反応を抑制した新規測定法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant