JP2018004371A - 免疫複合体転移法により被検物質を検出するための抗体試薬及びその製造方法、並びにその抗体試薬の利用 - Google Patents
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Abstract
Description
本実施形態の抗体試薬(以下、単に「抗体試薬」ともいう)は、被検物質に結合可能な標識抗体を含み、免疫複合体転移法により試料中の被検物質を検出するのに適した試薬である。ここで、免疫複合体転移法(以下、「ICT法」ともいう)は、本実施形態の抗体試薬に含まれる標識抗体と、被検物質と、該被検物質に結合可能な捕捉物質とを少なくとも含む免疫複合体を固相上に形成した後、この免疫複合体を別の固相に転移させる工程を含む。
本実施形態の抗体試薬は、該抗体試薬を収容した容器を箱に梱包した試薬キットの形態でユーザに提供されてもよい。この箱には、試薬の添付文書を同梱していてもよい。この添付文書には、例えば、抗体試薬の組成、被検物質の検出プロトコールなどが記載されることが好ましい。試薬キットの形態で提供される抗体試薬の一例を、図2Aに示す。図2Aにおいて、20は、試薬キットを示し、21は、本実施形態の抗体試薬を収容した第1容器を示し、22は、添付文書を示し、23は、梱包箱を示す。
本実施形態の抗体試薬を製造する方法(以下、単に「製造方法」ともいう)について、以下に説明する。本実施形態の製造方法では、まず、被検物質に結合可能な抗体を含む抗体溶液と、免疫複合体転移法に用いられる固相とを接触させる。上述のとおり、抗体溶液には、固相に非特異的に吸着する抗体が一定量含まれ得る。抗体溶液と固相とを接触させた後、固相と抗体溶液とを分離し、溶液成分を回収することにより、固相に非特異的に吸着する抗体を除去することができる。この溶液成分を抗体試薬として用いてICT法を行うことにより、非特異シグナルを低減することができる。
本実施形態の製造方法は、ICT法において非特異的シグナルを低減可能な抗体試薬を得るための、抗体溶液を前処理する方法とも解釈できる。よって、本発明の範囲には、試料中の被検物質に結合可能な抗体を含む抗体溶液の前処理方法(以下、単に「前処理方法」ともいう)が含まれる。ここで、抗体溶液の前処理とは、ICT法により試料中の被検物質の検出を行う前に、抗体溶液を処理して本実施形態の抗体試薬を調製することを意図する。
(式中、aは、被検物質の非存在下の非特異的シグナルの値であり、
bは、1回の検出に用いられる量の抗体試薬に含まれる標識抗体に基づくシグナルの値である)
(式中、aは、被検物質の非存在下の非特異的シグナルの値であり、
cは、転移工程を行わない場合の被検物質の非存在下の非特異的シグナルの値である)
実施例1では、検出用標識抗体を含む溶液を固相と接触させることによって前処理し、検出用標識抗体を含む試薬を調製した。得られた試薬について、検出用標識抗体の固相への非特異的反応が低減されているかを検討した。
検出用標識抗体として、アルカリホスファターゼ(ALP)で標識された抗HBs抗体フラグメントを2種類用いた(以下、それぞれ「ALP標識HBs149Fab'」及び「ALP標識HBs85Fab'」という)。ALP標識HBs149Fab'は、受託番号FERM BP-10583で2006年3月27日に独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター(郵便番号292-0818、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8)に寄託したハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体から作製した。ALP標識HBs85Fab'は、受託番号NITE BP-1483で2012年12月13日に独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(郵便番号292-0818、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8)に寄託したハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体から作製した。具体的な検出用標識抗体の作製手順は、次のとおりである。各モノクローナル抗体をペプシン消化及び還元して、Fab'フラグメントを得た。また、ALP(オリエンタル酵母株式会社)をEMCS(N-(6-マレイミドカプロイルオキシ)スクシンイミド)(株式会社同仁化学研究所)を用いてマレイミド化した。そして、得られたFab'フラグメントと、マレイミド化したALPとを混合して反応させることで、検出用標識抗体(Fab'-ALP)を得た。得られた検出用標識抗体を、希釈液(0.1 M MES (pH6.5)、0.15 M NaCl、1.0% BSA、0.1% NaN3、10 mM MgCl2及び1mM ZnCl2)で希釈した。各検出用標識抗体の希釈液を1:1で混合して、検出用標識抗体を含む溶液(ALP濃度10 pmol/mL)を調製した。以下、得られた溶液を「前処理なしの抗体試薬」ともいう。
磁性粒子(Micromer M、Micromod社)の表面に抗DNP抗体(DNP-1753)を固定して、第1固相を得た。得られた第1固相を希釈液(0.1 M MES(pH6.5)、0.15 M NaCl、0.25% BSA及び0.1% NaN3)で希釈して、抗DNP抗体固定磁性粒子を含む溶液(粒子濃度1.0%)を得た。ここで、磁性粒子への抗体の固定はSulfo-SMCC(ピアス社)を用いて行った。上記のDNP-1753抗体は、受託番号NITE P-845で2009年11月25日に独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託したハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体である。
上記(1)で得た検出用標識抗体を含む溶液500μL当たり、上記(2)で得た抗DNP抗体固定磁性粒子を含む溶液を10μL加え、4℃で一晩、転倒攪拌した。その後、磁石を用いて溶液中の磁性粒子を集磁して、上清のみを回収することにより、溶液から磁性粒子を取り除いた。以下、得られた上清を、検出用標識抗体を含む試薬(以下、「前処理した抗体試薬」ともいう)として用いた。
実施例1の検出用標識抗体では、抗体フラグメントと標識物質(ALP)とが共有結合している。したがって、前処理した抗体試薬におけるALPの量は、該試薬に含まれる検出用標識抗体の分子数を反映する。ALPと基質との反応により発生する化学発光のシグナル値は、基質の量が一定であるとき、その反応に使用したALPの量を反映する。そこで、非特異的反応に関与した検出用標識抗体の分子数の割合をシグナル値に基づいて算出するために、検出用標識抗体を含む試薬におけるALPのモル数とシグナル値との関係を表す係数(以下、「変換係数」ともいう)を、以下のようにして算出した。なお、この係数は、本実施形態の抗体試薬の説明で述べた変換係数に当たる。
・r3試薬:上記(3)で得た検出用標識抗体を含む試薬
・ALP活性用バッファー:0.1 M MES (pH6.5)、0.15 M NaCl、0.25% BSA及び0.1% NaN3
・発光基質用バッファー:HISCL R4試薬 (シスメックス株式会社)
・発光基質:HISCL R5試薬(CDP-Star(登録商標))(シスメックス株式会社)
・測定装置:全自動免疫測定装置HISCL-800(シスメックス株式会社)
以下の操作は、HISCL-800(シスメックス株式会社)により行った。r3試薬をALP活性用バッファーで1/1000の濃度となるよう希釈した(1000倍希釈)。HISCL-800をALP活性モードに設定して、希釈したr3試薬(20μL)、HISCL R4試薬(50μL)及びHISCL R5試薬(100μL)を混合した。そして、HISCL-800をICT測定モードに設定して、得られた混合液を42℃で5分間インキュベートして、シグナル値として発光強度を測定した。
上記の測定により得られた発光強度は、3,997,991カウントであった。この値は、1000倍希釈したr3試薬(20μL)に含まれる検出用標識抗体のALPと、基質との反応から得られた値である。この値に希釈率(1000倍)を乗じて、3,997,991,000カウントを算出した。算出した値は、希釈前のr3試薬(20μL)に含まれる全ての検出用標識抗体のALPが基質と反応したときに得られる発光強度の理論値である。次に、希釈前のr3試薬(20μL)中のALPのモル数を次のようにして算出した。上記(3)で得た検出用標識抗体を含む試薬のALP濃度は、上記(1)で得た検出用標識抗体を含む溶液のALP濃度と同じ10 pmol/mLとした。よって、r3試薬(20μL)に含まれるALPのモル数は200 fmolである(10 pico mol/mL×20μL = 200 femto mol)。上記のシグナル値をALPのモル数で除して、変換係数として「20カウント/zmol」を算出した(3,997,991,000カウント/200 fmol = 約20カウント/zepto mol)。
(5-1) 試料、試薬及び測定装置
・試料:HISCL HBsAgキャリブレーター(HBs抗原濃度0IU/mL)(シスメックス株式会社)
・試料処理用バッファー:0.1 M MES (pH6.5)、1.0% BSA、10 mM MgCl2及び1mM ZnCl2
・r3試薬:上記(3)で得た検出用標識抗体を含む試薬
・r5 試薬(第1固相):上記(2)で得た抗DNP抗体固定磁性粒子を含む溶液
・洗浄液:HISCL洗浄液(シスメックス株式会社)
・基質用バッファー:HISCL R4試薬(シスメックス株式会社)
・発光基質:HISCL R5試薬(CDP-Star(登録商標))(シスメックス株式会社)
・測定装置:全自動免疫測定装置HISCL-800プロトタイプ(シスメックス株式会社)
以下の操作は、HISCL-800プロトタイプ(シスメックス株式会社)により行った。試料(70μL)と試料処理用バッファー(60μL)とを混合し、42℃で72秒間インキュベートした。得られた混合液にr3試薬(20μL)を加えて、42℃で584秒間インキュベートした。得られた混合液にr5試薬(20μL)を加えて、42℃で720秒間インキュベートした。得られた混合液中の磁性粒子を集磁して上清を除き、HISCL洗浄液(300μL)を加えて磁性粒子を洗浄した(B/F分離)。B/F分離をさらに3回行った。上清を除き、磁性粒子にHISCL R4試薬(50μL)及びHISCL R5試薬(100μL)を加えた。得られた混合液を42℃で300秒間インキュベートして、発光強度を測定した。また、r3試薬を加えなかったこと以外は上記と同様にして、試薬ブランクの値を測定した。比較のため、r3試薬に代えて、上記(1)で得た検出用標識抗体を含む溶液(20μL)を用いたこと以外は上記と同様にして、前処理なしの抗体試薬を用いたときの発光強度を測定した。
測定されたシグナル値から試薬ブランクの値(360カウント)を差し引いて、正味のシグナル値を得た。実施例1で用いた試料は、被検物質であるHBs抗原を含まないので、得られた値は、第1固相に非特異的に結合した検出用標識抗体に由来する発光強度を示す。正味のシグナル値を変換係数(20カウント/zmol)で除して、第1固相に非特異的に結合した検出用標識抗体のALPのモル数を算出した。ここで、r3試薬及び前処理なしの抗体試薬におけるALP濃度はいずれも10 pmol/mLである。よって、1アッセイ分(20μL)の抗体試薬中のALPのモル数は200 fmolである。ALPのモル数は、検出用標識抗体の分子数を反映する値である。これらの値を用いて、検出用抗体を含む試薬に含まれる検出用標識抗体の分子数に占める、第1固相に非特異的に反応する検出用標識抗体の分子数の割合を、ALPのモル比として算出した。各値を表1に示す。表1中、「Ave.」は、2つの値の平均値を示す。
実施例1で調製した検出用標識抗体を含む試薬(前処理した抗体試薬)を用いて、HBs抗原をICT-EIA法により測定した。比較のため、実施例1で調製した前処理なしの抗体試薬を用いて、同様にHBs抗原を測定した。
・試料:HISCL HBsAgキャリブレーター(HBs抗原濃度0IU/mL及び0.25 IU/mL)(シスメックス株式会社)
・試料前処理液:0.3 N NaOH、5 mM NaH2PO4、25 mM Na2HPO4、2.4 M尿素及び0.8% Brij(登録商標)35
・中和液:0.1 Mクエン酸、20 mMメルカプトエチルアミン、20 mM NaCl及び0.1% NaN3
・r3試薬(検出用抗体):実施例1で得た検出用標識抗体を含む試薬
・r4試薬(捕捉用抗体):ビオチン及びDNPで修飾した抗HBs Ag抗体フラグメント(Fab’-BSA-Bio-DNP)を含む試薬(この試薬は、WO 2014/115878 A1に記載の手順で調製した。)
・r5試薬(第1固相):実施例1で得た抗DNP抗体固定磁性粒子を含む溶液
・r6試薬(遊離剤):5 mM N-(2, 4-ジニトロフェニル)-L-リジン(DNP-Lys)、0.1 M MES (pH6.5)、2%カゼインナトリウム及び0.1% NaN3
・r7試薬(第2固相):ストレプトアビジンを固定した磁性粒子(MAG2201、JSR株式会社)を含む溶液
・洗浄液:HISCL洗浄液(シスメックス株式会社)
・基質用バッファー:HISCL R4試薬(シスメックス株式会社)
・発光基質:HISCL R5試薬(CDP-Star(登録商標))(シスメックス株式会社)
・測定装置:全自動免疫測定装置HISCL-800(シスメックス株式会社)
以下の操作は、HISCL-800(シスメックス株式会社)により行った。試料(70μL)と試料前処理液(20μL)とを混合し、42℃で504秒間インキュベートした。ここに中和液(20μL)を加え、42℃で72秒間インキュベートした。得られた混合液にr4試薬(20μL)を加え、42℃で216秒間インキュベートした。得られた混合液にr3試薬(20μL)を加え、42℃で584秒間インキュベートして、HBs抗原と検出用標識抗体と捕捉用抗体とを含む免疫複合体を形成した。ここにr5試薬(20μL)を加え、42℃で720秒間インキュベートして、免疫複合体を第1固相上に捕捉した。得られた混合液中の磁性粒子を集磁して上清を除き、HISCL洗浄液(300μL)を加えて磁性粒子を洗浄した(B/F分離)。B/F分離をさらに3回行った。上清を除き、磁性粒子にr6試薬(41μL)を加え、42℃で144秒間インキュベートして、第1固相上に捕捉された免疫複合体を溶液中に遊離した。上清(30μL)を回収して別のキュベットに移した。ここにr7試薬(30μL)を加え、42℃で288秒間インキュベートして、免疫複合体を第2固相上に捕捉した(免疫複合体の転移)。得られた混合液中の磁性粒子を集磁して上清を除き、HISCL洗浄液(300μL)を加えて磁性粒子を洗浄した(B/F分離)。B/F分離をさらに3回行った。上清を除き、磁性粒子にHISCL R4試薬(50μL)及びHISCL R5試薬(100μL)を加えた。得られた混合液を42℃で300秒間インキュベートして、発光強度を測定した。比較のため、r3試薬に代えて、実施例1で得た検出用標識抗体を含む溶液(20μL)を用いたこと以外は上記と同様にして、前処理なしの抗体試薬を用いたときの発光強度を測定した。また、r7試薬(30μL)、HISCL R4試薬(50μL)及びHISCL R5試薬(100μL)を混合し、発光強度を測定して試薬ブランクの値を得た。
測定されたシグナル値から試薬ブランクの値(434カウント)を差し引いて、正味のシグナル値を得た。ここで、HBs抗原濃度が0IU/mLの試料を測定して得られたシグナル値は、被検物質を含まない試料の測定値であり、検出用標識抗体の非特異的反応によるノイズに当たる。得られたシグナル値から、下記の式によりS/N比を算出した。正味のシグナル値(counts)及びS/N比を、表2に示す。
本実施形態の被検物質の検出方法による非特異的シグナルの低減効果を、シグナル値に基づいて評価した。具体的には、実施例1及び2で得たシグナル値を用いて第1の比を算出し、算出した値に基づいて非特異的シグナルの低減効果を評価した。第1の比とは、1回の検出に用いられる量(1アッセイ分)の検出用抗体試薬に含まれる検出用標識抗体に基づくシグナル値に対する、被検物質を含まない試料を測定したときのシグナル値の比である。以下、第1の比を「非特異レシオ(X)」とも呼ぶ。実施例3において、非特異レシオ(X)は、下記の式により算出した
免疫複合体の転移工程を含まない測定法(サンドイッチ免疫測定法)に、前処理した抗体試薬を用いた場合に、ICT-EIA法と同様に、非特異的シグナルの低減効果が認められるかを検討した。
・試料:HISCL HBsAgキャリブレーター(HBs抗原濃度0IU/mL及び0.25 IU/mL)(シスメックス株式会社)
・試料前処理液:0.3 N NaOH、5 mM NaH2PO4、25 mM Na2HPO4、2.4 M尿素及び0.8% Brij(登録商標)35
・中和液:0.1 Mクエン酸、20 mMメルカプトエチルアミン、20 mM NaCl、及び0.1% NaN3
・r3試薬(検出用抗体):実施例1で得た検出用標識抗体を含む試薬
・r4試薬(捕捉用抗体):実施例2と同じ試薬(Fab’-BSA-Bio-DNPを含む試薬)
・r5試薬(第1固相):実施例1で得た抗DNP抗体固定磁性粒子を含む溶液
・洗浄液:HISCL洗浄液(シスメックス株式会社)
・基質用バッファー:HISCL R4試薬(シスメックス株式会社)
・発光基質:HISCL R5試薬(CDP-Star(登録商標))(シスメックス株式会社)
・測定装置:全自動免疫測定装置HISCL-800(シスメックス株式会社)
以下の操作は、HISCL-800(シスメックス株式会社)により行った。試料(70μL)と試料前処理液(20μL)とを混合し、42℃で504秒間インキュベートした。ここに中和液(20μL)を加え、42℃で72秒間インキュベートした。得られた混合液にr4試薬(20μL)を加え、42℃で216秒間インキュベートした。得られた混合液にr3試薬(20μL)を加え、42℃で584秒間インキュベートして、HBs抗原と検出用標識抗体と捕捉用抗体とを含む免疫複合体を形成した。ここにr5試薬(20μL)を加え、42℃で720秒間インキュベートして、免疫複合体を第1固相上に捕捉した。得られた混合液中の磁性粒子を集磁して上清を除き、HISCL洗浄液(300μL)を加えて磁性粒子を洗浄した(B/F分離)。B/F分離をさらに3回行った。上清を除き、磁性粒子にHISCL R4試薬(50μL)及びHISCL R5試薬(100μL)を加えた。得られた混合液を42℃で300秒間インキュベートして、発光強度を測定した。比較のため、r3試薬に代えて、実施例1で得た検出用標識抗体を含む溶液(20μL)を用いたこと以外は上記と同様にして、前処理なしの抗体試薬を用いたときの発光強度を測定した。また、r5試薬(20μL)、HISCL R4試薬(50μL)及びHISCL R5試薬(100μL)を混合し、発光強度を測定して試薬ブランクの値を得た。
測定されたシグナル値から試薬ブランクの値を差し引いて、正味のシグナル値を得た。得られたシグナル値から、実施例2と同様にしてS/N比を算出した。正味のシグナル値(counts)及びS/N比を、表3に示す。
本実施形態の被検物質の検出方法による非特異的シグナルの低減効果を、免疫複合体の転移工程を含まない測定法で得た非特異的シグナルの値との比較に基づいて評価した。具体的には、実施例2及び参考例で得たシグナル値を用いて第2の比を算出し、算出した値に基づいて非特異的シグナルの低減効果を評価した。第2の比とは、免疫複合体の転移工程を含まない測定法で得られた非特異的シグナルの値に対する、被検物質を含まない試料を測定したときのシグナル値の比である。以下、第2の比を「非特異レシオ(Y)」とも呼ぶ。実施例4において、非特異レシオ(Y)は、下記の式により算出した
20、30、40: 試薬キット
22、36、47: 添付文書
23、37、48: 梱包箱
32、42: 第2容器
33、43: 第3容器
34、44: 第4容器
35、45: 第5容器
46: 第6容器
Claims (18)
- 免疫複合体転移法により試料中の被検物質を検出するための抗体試薬であって、
前記被検物質に結合可能な標識抗体を含み、
前記抗体試薬に含まれる標識抗体の分子数に占める、前記免疫複合体転移法に用いられる固相と非特異的に結合する標識抗体の分子数の割合が、約3.34×10-7以下である、
前記抗体試薬。 - 免疫複合体転移法により試料中の被検物質を検出するための試薬キットであって、
請求項1に記載の抗体試薬と、前記被検物質に結合可能な捕捉物質を含む試薬と、遊離剤と、第1固相と、第2固相とを含み、
前記第1固相上に、第1結合物質が固定されており、
前記第2固相上に、第2結合物質が固定されており、
前記捕捉物質が、前記第1結合物質に結合可能な第1結合パートナーと、前記第2結合物質に結合可能な第2結合パートナーとを有し、
前記遊離剤が、前記第1結合物質と前記第1結合パートナーとの結合を解離させる、
前記試薬キット。 - 前記捕捉物質が、前記被検物質に結合可能な抗体である請求項2に記載の試薬キット。
- 前記被検物質が、HBs抗原であり、
前記標識抗体が、標識された抗HBs抗体であり、
前記捕捉物質が、前記HBs抗原において前記標識抗体が結合する部位とは異なる部位に結合する抗HBs抗体である、
請求項2又は3に記載の試薬キット。 - 前記標識抗体の標識が、酵素及び蛍光物質からなる群より選択される少なくとも1つである請求項1〜4のいずれか1項に記載の試薬キット。
- 前記酵素が、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、チロシナーゼ、酸性ホスファターゼ及びルシフェラーゼから選択される少なくとも1つであり、
前記試薬キットが、前記酵素に対する基質をさらに含む、
請求項5に記載の試薬キット。 - 前記第1結合物質が、ジニトロフェニル(DNP)基に特異的に結合する抗体であり、前記第1結合パートナーが、DNP基である請求項2〜6のいずれか1項に記載の試薬キット。
- 前記第2結合物質が、アビジン及びアビジン様タンパク質から選択される少なくとも1つであり、前記第2結合パートナーが、ビオチンである請求項2〜7のいずれか1項に記載の試薬キット。
- 前記遊離剤が、DNP誘導体及びビオチンから選択される少なくとも1つである請求項2〜8のいずれか1項に記載の試薬キット。
- 免疫複合体転移法により試料中の被検物質を検出するための抗体試薬の製造方法であって、
前記被検物質に結合可能な抗体を含む抗体溶液と、前記免疫複合体転移法に用いられる固相とを接触させる工程と、
前記固相と、前記固相に接触した抗体溶液とを分離して、前記固相に接触した抗体溶液から前記抗体試薬を調製する工程と
を含み、
前記抗体が標識を有し、
前記固相が結合物質を有し、
前記免疫複合体転移法において、前記被検物質に特異的に結合する捕捉抗体が用いられ、
前記捕捉抗体が、前記結合物質に結合可能な結合パートナーを有する、
前記製造方法。 - 前記接触工程及び前記調製工程が、前記試料と前記抗体試薬との混合前に行われる請求項10に記載の方法。
- 前記結合物質が、ジニトロフェニル(DNP)基に特異的に結合する抗体であり、前記結合パートナーが、DNP基である請求項10又は11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記被検物質が、HBs抗原であり、
前記抗体溶液に含まれる抗体が、抗HBs抗体であり、
前記捕捉物質が、前記HBs抗原において前記抗体溶液に含まれる抗体が結合する部位とは異なる部位に結合する抗HBs抗体である、
請求項10〜12のいずれか1項に記載の方法。 - 前記標識が、酵素及び蛍光物質からなる群より選択される少なくとも1つである請求項10〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記酵素が、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、チロシナーゼ、酸性ホスファターゼ及びルシフェラーゼから選択される少なくとも1つである請求項14に記載の方法。
- 請求項10〜15のいずれか1項に記載の製造方法によって調製された抗体試薬と、被検物質を含む試料と、前記被検物質に結合可能な捕捉物質を含む試薬と、第1固相とを混合して、前記抗体試薬に含まれる標識抗体と、前記被検物質と、前記捕捉物質とを含む免疫複合体を前記第1固相上に固定する工程と、
前記固定工程で得られた混合物から、前記免疫複合体に含まれていない遊離成分を除去する工程と、
前記免疫複合体を前記第1固相から遊離させる工程と、
遊離した前記免疫複合体を、前記第1固相とは異なる第2固相上に転移する工程と、
前記第2固相上の免疫複合体に含まれる前記標識抗体に基づくシグナルを検出し、前記シグナルに基づいて前記被検物質を検出する工程と
を含む、被検物質の検出方法。 - 被検物質を含まない試料を請求項16に記載の方法に付して、前記被検物質の非存在下の非特異的シグナルを測定し、
1回の検出に用いられる量の前記抗体試薬に含まれる標識抗体に基づくシグナルを測定し、
下記の式(1):
第1の比 = a/b ・・・(1)
(式中、aは、前記被検物質の非存在下の非特異的シグナルの値であり、
bは、1回の検出に用いられる量の前記抗体試薬に含まれる標識抗体に基づくシグナルの値である)
により取得される第1の比の値が、約1.02×10-7以下である、
請求項16に記載の方法。 - 被検物質を含まない試料を請求項16に記載の方法に付して、前記被検物質の非存在下の非特異的シグナルを測定し、
被検物質を含まない試料を、請求項16に記載の方法における固定工程及び遊離成分の除去工程に付して、転移工程を行わない場合の前記被検物質の非存在下の非特異的シグナルを測定し、
下記の式(2):
第2の比 = a/c ・・・(2)
(式中、aは、前記被検物質の非存在下の非特異的シグナルの値であり、
cは、転移工程を行わない場合の前記被検物質の非存在下の非特異的シグナルの値である)
により取得される第2の比の値が、約4.68×10-2以下である、
請求項16又は17に記載の方法。
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