JP7153494B2 - 生体粒子の測定方法、非特異シグナルの検出方法、生体粒子測定方法及び生体粒子を検出するための試薬キット - Google Patents
生体粒子の測定方法、非特異シグナルの検出方法、生体粒子測定方法及び生体粒子を検出するための試薬キット Download PDFInfo
- Publication number
- JP7153494B2 JP7153494B2 JP2018141524A JP2018141524A JP7153494B2 JP 7153494 B2 JP7153494 B2 JP 7153494B2 JP 2018141524 A JP2018141524 A JP 2018141524A JP 2018141524 A JP2018141524 A JP 2018141524A JP 7153494 B2 JP7153494 B2 JP 7153494B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- bioparticles
- measuring
- antibody
- solid phase
- substance
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 57
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 85
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 72
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 68
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 40
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 34
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 26
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 23
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 16
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 claims description 16
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 claims description 16
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 13
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 11
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical group [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 9
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 claims description 8
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 8
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 8
- AUTOLBMXDDTRRT-JGVFFNPUSA-N (4R,5S)-dethiobiotin Chemical compound C[C@@H]1NC(=O)N[C@@H]1CCCCCC(O)=O AUTOLBMXDDTRRT-JGVFFNPUSA-N 0.000 claims description 7
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 7
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 claims description 7
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 claims description 6
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 claims description 5
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 claims description 5
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 claims description 5
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 claims description 5
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 claims description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 3
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 2
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 claims 1
- 210000004880 lymph fluid Anatomy 0.000 claims 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 74
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 34
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 25
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 25
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 25
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 24
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 22
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 description 19
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 15
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 14
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 12
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 11
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 5
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 4
- 239000012117 Alexa Fluor 700 Substances 0.000 description 3
- 102100035716 Glycophorin-A Human genes 0.000 description 3
- 101001074244 Homo sapiens Glycophorin-A Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 3
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- -1 lecticans Proteins 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- JLDSMZIBHYTPPR-UHFFFAOYSA-N Alexa Fluor 405 Chemical compound CC[NH+](CC)CC.CC[NH+](CC)CC.CC[NH+](CC)CC.C12=C3C=4C=CC2=C(S([O-])(=O)=O)C=C(S([O-])(=O)=O)C1=CC=C3C(S(=O)(=O)[O-])=CC=4OCC(=O)N(CC1)CCC1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JLDSMZIBHYTPPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 2
- 101150040283 HIR2 gene Proteins 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 150000001615 biotins Chemical class 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical class O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 2
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 2
- JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine thiocyanate Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=C(SC#N)C=C1C(O)=O JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YICAEXQYKBMDNH-UHFFFAOYSA-N 3-[bis(3-hydroxypropyl)phosphanyl]propan-1-ol Chemical compound OCCCP(CCCO)CCCO YICAEXQYKBMDNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- 239000012110 Alexa Fluor 594 Substances 0.000 description 1
- 239000012114 Alexa Fluor 647 Substances 0.000 description 1
- 239000012118 Alexa Fluor 750 Substances 0.000 description 1
- 102000000412 Annexin Human genes 0.000 description 1
- 108050008874 Annexin Proteins 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000004405 Collectins Human genes 0.000 description 1
- 108090000909 Collectins Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000018700 F-Box Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010066805 F-Box Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007563 Galectins Human genes 0.000 description 1
- 108010046569 Galectins Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 101001078143 Homo sapiens Integrin alpha-IIb Proteins 0.000 description 1
- 101000693970 Homo sapiens Scavenger receptor class A member 3 Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102100025306 Integrin alpha-IIb Human genes 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 241000237502 Ostreidae Species 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 208000002151 Pleural effusion Diseases 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100027192 Scavenger receptor class A member 3 Human genes 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700043492 SprD Proteins 0.000 description 1
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GYDJEQRTZSCIOI-UHFFFAOYSA-N Tranexamic acid Chemical compound NCC1CCC(C(O)=O)CC1 GYDJEQRTZSCIOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 210000002583 cell-derived microparticle Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N dithioerythritol Chemical compound SC[C@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N iron(II,III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]O[Fe]=O SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 230000005389 magnetism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 235000020636 oyster Nutrition 0.000 description 1
- VYNDHICBIRRPFP-UHFFFAOYSA-N pacific blue Chemical compound FC1=C(O)C(F)=C2OC(=O)C(C(=O)O)=CC2=C1 VYNDHICBIRRPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001991 pathophysiological effect Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 229920002454 poly(glycidyl methacrylate) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000193 polymethacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229920002689 polyvinyl acetate Polymers 0.000 description 1
- 239000011118 polyvinyl acetate Substances 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical class [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005060 rubber Substances 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920003048 styrene butadiene rubber Polymers 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 102000013498 tau Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010026424 tau Proteins Proteins 0.000 description 1
- WGTODYJZXSJIAG-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine chloride Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O WGTODYJZXSJIAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000013026 undiluted sample Substances 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
はじめに本開示において使用される用語について説明する。特に断りがない限り本明細書、特許請求の範囲、図面において使用される用語の解釈は、本項の説明に従う。
[2-1.第1の測定方法]
本開示における第1の測定方法は、阻害物質を使用して非特異シグナルを検出することを含む、生体粒子の測定方法に関する。
図1に示す(1)において、生体粒子を含む同一検体から第1試料と第2試料を独立して分取する。独立して分取するとは、第1試料と第2試料を別の容器の分取することをいう。
i.第1試料と阻害物質を混合してから一定時間インキュベーションした後に、検出抗体を添加すること、
ii.検出体と阻害物質を混合してから、これらの混合液と第1試料を混合すること、
iii.第1試料と阻害物質を混合してから検出体を添加すること
iv.第1試料と検出体を混合してから阻害物質を添加すること。
第2の測定方法は、固相上で生体粒子と検出体との複合体を形成した後に生体粒子と検出体との複合体を固相から解離し、解離した生体粒子と検出体との複合体を測定試料として用いる生体粒子の測定方法である。
図2の(1)に示すように、第2の測定方法では、はじめに固相上で生体粒子と検出体との複合体を形成する。例えば、第2の測定方法では、固定化物質を固定化した固相に捕捉体を添加し、一定時間接触させる。接触の後にB/F分離を行い固定化物質に結合しなかった未反応の捕捉体を除去してもよい。次に検体の原液、又は検体をPBS等で希釈した希釈液を試料として固定化物質と結合した捕捉体と一定時間接触させ、固相上に固定化された捕捉体で試料中の生体粒子を捕捉する。接触の後にB/F分離を行い捕捉体に結合しなかった試料成分を除去してもよい。次に捕捉体に捕捉された粒子と検出体を一定時間接触させる。接触の後にB/F分離を行い生体粒子に結合しなかった未反応の検出体を除去してもよい。B/F分離は未反応成分を除去する目的で行う。
第3の測定方法は、第1の測定方法と第2の測定方法を合わせた測定方法である。
図3を用いて第3の測定方法の概略を説明する。
図3の(1)に示すように、第3の測定方法では、検体から分取された生体粒子を含む第i試料と、捕捉体と、検出体を混合する際に、阻害物質の存在下で混合し、固相上に、前記生体粒子と、前記捕捉体と、前記阻害物質と、の第i複合体を形成する(調製工程a-1)。
本開示は、非特異シグナルの検出方法を含む。非特異シグナルの検出方法は、上記2-1.で説明した、検体から分取された生体粒子を含む試料と、検出体とを、生体粒子に結合可能であり前記標識物質を含まない阻害物質の存在下で混合することにより調製された測定試料から検出されたシグナルを非特異シグナルと判定し、前記測定試料に含まれる標識物質に由来するシグナルを、粒子分析装置により検出する検出工程こととを含む。
[4-1.装置の構成]
粒子測定装置10は、少なくとも処理部101と記憶部を備える。記憶部は、主記憶部102及び/又は補助記憶部104から構成される。装置10は、請求項1から13に記載の方法を実現するための装置であってもよい。装置10及び装置10の動作に係る説明において、上記2-1.で説明されている用語と共通する用語については、上記2-1.の説明をここに援用する。
次に、図6を用いて、装置10の動作の例について説明する。装置10の動作は、後述する生体粒子の検出結果を算出するためのステップをコンピュータに実行させるコンピュータプログラムに従って、装置10の処理部101が制御する。
コンピュータプログラムは、コンピュータに上記ステップS1~S3を実行させる。前記コンピュータプログラムは、コンピュータを粒子測定装置10として機能させる。
[6-1.第1の検査キット]
検査キットは、検出体及び阻害物質を含む。図7に、キット150の概略図を示す。
検査キットは、上記2-1.、上記2-3.、上記3.に記載の方法を実施するために使用される。
検査キットは、検出体及び捕捉体を含む。図7に、キット150の概略図を示す。
検査キットは、上記2-2.、上記2-3.、に記載の方法を実施するために使用される。
(1)抗体
今回の検討には下記表1に示す抗体を使用した。阻害物質として未標識抗体を用い、検出体として蛍光標識した未標識抗体と同じクローンの抗体を使用した。
ProMedDx社(代理店:株式会社サンフコ)より、以下のプロトコルで調製した血漿を購入した。
健常人の6検体を流水で融解後に混合し、解析に用いた。
モデル細胞としてHUVECを使用した。HUVECは2%牛胎児血清添加内皮成長培地(EGM)で培養した。細胞が80%コンフルエントに達したときに細胞外小胞を含む培養上清を回収した。20 ml相当の上記培養上清を1,500 RCFで15 分遠心して上清を回収し、さらに20,000 RCFで30分遠心して培養細胞由来細胞外小胞を調製した。
分析用のサンプルは、上記血漿 100μlと1 mlの培養上清から回収した培養細胞由来細胞外小胞を混合することにより調製した。
フローサイトメトリーは、FACS Verse (Becton Dickinson)を用いて行った。PBSで希釈した各反応液を表2に示す条件で測定し、蛍光強度とFSCのスキャッタグラムを取得した。表2においてFSCは前方散乱光を、SSCは側方散乱光を示す。また、測定時の流速は、12 μl/minとし、測定時間は1分間とした。
1.従来法による粒子の検出
APC標識抗CD235a抗体を検出体として使用した。アイソタイプコントロール(陰性抗体コントロール)として、APC標識 Isotype control IgG2bを使用した。
図8にフローサイトメータで取得した結果を示す。図8Aは、APC標識抗CD235a抗体を使って検出したシグナルを示す。図8Bは、APC標識アイソタイプコントロール抗体を使って検出したシグナルを示す。図8Aに示す陽性領域の枠内が、本来細胞外小胞上のCD235aに由来する陽性シグナルが検出される陽性領域である。図8Bではこの領域内に本来検出されるはずのないシグナルが検出されていた。このことから、本発明者らは、従来法により判別した陽性領域に非特異シグナルが含まれると考えた。
1.実施例1
阻害物質を検出体に先立ってサンプル中の細胞外小胞と反応させ、阻害効果を検討した。
阻害物質である未標識抗体存在下で検出抗体とサンプルとを反応させ、阻害の効果を検討した。
上記[材料及び方法]の(1)抗CD61抗体、(2)血漿検体、(3)モデル細胞の培養、(4)分析用サンプル、(5)フローサイトメトリーについては、本項でも同様である。
上記1-1.(4)で調製したサンプルを10μlずつ4本のチューブに分注した。それぞれのチューブに表1に示す未標識の抗CD61抗体を0μg(未標識抗体無添加)、0.5μg(未標識抗体5倍量)、1μg(未標識抗体10倍量)、10μg(未標識抗体100倍量)のそれぞれと、蛍光標識した抗CD61抗体を0.1μgを混合した溶液を添加し1時間インキュベーションした。
インキュベーションが終了した各反応液をPBSで14倍希釈してフローサイトメトリーに供した。
抗CD61抗体を使った細胞外小胞のフローサイトメトリーの結果を図11に示す。
図11の左上図(未標識抗体無し)において点線で囲まれた部分のシグナルが、図11の右上図(未標識抗体5倍量)、左下図(未標識抗体10倍量)、右下図(未標識抗体100倍量)では、消失した。このことから、未標識抗体と検出抗体を競合させることにより阻害効果が得られることが示された。
本実施例では、いったん固相に細胞外小胞を固定化し、検出抗体と細胞外小胞を反応させた後で、固相から検出抗体と細胞外小胞の複合体を解離した測定サンプルを用いてフローサイトメトリーによる解析を行った。
APC標識抗CD235a抗体(クローン:HIR2、BioLegend、306608)を検出体として使用した。アイソタイプコントロール(陰性抗体コントロール)として、APC標識 Isotype control IgG2b(クローン:MPC-11、BioLegend、400320)を使用した。捕捉体として、デスビオチン標識抗CD235a抗体(クローン:HIR2、BioLegend、306602)を使用した。
細胞外小胞と検出抗体との反応は以下の手順にしたがって行った。
i. デスチオビオチン標識した抗CD235a抗体またはアイソタイプコントロール抗体のPBS溶液を2μg/mlとなるように調製し、ストレプトアビジンを固相した96ウェルプレートに100μl/ウェルで添加して1時間インキュベーションした。
ii. 96ウェルプレート内の抗体溶液を捨て、96ウェルプレートをPBSで3回洗浄し、血漿を100μl/ウェルで添加して1時間インキュベーションし、血漿中の細胞外小胞を96ウェルプレート上に捕捉した。
iii. 96ウェルプレート内の血漿を捨て、96ウェルプレートをPBSで3回洗浄し、APC標識した抗CD235a抗体又はアイソタイプコントロール抗体を1μg/ml濃度で、100μl/ウェルで1時間インキュベーションすることにより免疫複合体を形成した。
iv. 96ウェルプレート内の抗体溶液を捨て、96ウェルマイクロプレートをPBSで3回洗浄し、1 mM ビオチン溶液を100μl/ウェルで添加して1時間接触させることにより免疫複合体を溶出し、ウェル内の溶液を回収し、測定サンプルとした。
フローサイトメトリーは、上記参考例に記載の条件にしたがって行った。
図12にフローサイトメータで取得した結果を示す。図12Aは、本開示の方法によりAPC標識抗CD235a抗体を使って検出したシグナルを示す。図12Bは、本開示の方法によりAPC標識アイソタイプコントロール抗体を使って検出したシグナルを示す。図12Aに示す陽性領域の枠内が、本来細胞外小胞上のCD235aに由来するシグナルが検出される領域である。図8Bではこの領域内に非特異的なシグナルが検出されていた。これに対して、図12Bでは、非特異的なシグナルが顕著に減少していた。このことから本開示における方法は細胞外小胞をフローサイトメータを使って検出する際に、非特異的なシグナルを減少させるために有効であることが示された。
101 処理部
Claims (8)
- 検体から分取された生体粒子を含む試料と、固相に解離可能に結合するタグを含み且つ前記生体粒子に結合可能な捕捉体と、前記生体粒子に結合可能であり蛍光物質を含む検出体と、を含む複合体を固相上に形成する工程と、
前記複合体の一部又は全部を前記固相から解離し、前記複合体の一部又は全部を含む測定試料を調製する工程と、
測定試料に含まれる前記複合体の一部又は全部をフローサイトメータに導入し、前記複合体の一部又は全部から生じる前方散乱光および蛍光を検出し、前記前方散乱光及び前記蛍光に基づいて前記複合体の一部又は全部の数を測定する工程と、
を含み、
前記生体粒子が、エクソソーム、マイクロパーティクル、アポトーシス小体、及びタンパク質凝集体より選択される少なくとも一種である、
生体粒子を測定する方法。 - 前記解離は、前記固相上に形成された前記複合体に解離剤を加えることにより行われる、請求項1に記載の生体粒子を測定する方法。
- 前記固相上での前記複合体の形成が、固相上に固定化された固定化物質を介して行われ、固定化物質が、タグよりも解離剤に対して強い親和性を有する、請求項2に記載の生体粒子を測定する方法。
- 前記タグがデスチオビオチンであり、固定化物質がアビジン又はストレプトアビジンであり、解離剤がビオチンであるか;
前記タグが、ヒスチジンタグであり、固定化物質がニッケルであり、解離剤がイミダゾールであるか;又は
前記タグがグルタチオン-S-トランスフェラーゼであり、固定化物質がグルタチオンであり、解離剤が還元型グルタチオンである、
請求項3に記載の生体粒子を測定する方法。 - 前記検体が、全血、血漿、血清、脳脊髄液、リンパ液、及び細胞間質液から選択される、請求項1から4のいずれか一項に記載の生体粒子の測定方法。
- 前記固相上に複合体を形成した後、前記解離前に、反応液中の未反応成分を除去する工程を含む、請求項1から5のいずれかに記載の方法。
- 前記生体粒子の大きさが、30nm以上、かつ1,000nm以下である、請求項1から6のいずれか一項に記載の生体粒子の測定方法。
- 生体粒子結合可能であり蛍光物質を含む検出体と、
固相に解離可能に結合するタグを含み、前記生体粒子を捕捉可能な捕捉体と、を含み、
前記生体粒子が、エクソソーム、マイクロパーティクル、アポトーシス小体、及びタンパク質凝集体より選択される少なくとも一種である、請求項1から7のいずれか一項に記載の生体粒子の測定方法を実施するための試薬キット。
Priority Applications (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2018141524A JP7153494B2 (ja) | 2018-07-27 | 2018-07-27 | 生体粒子の測定方法、非特異シグナルの検出方法、生体粒子測定方法及び生体粒子を検出するための試薬キット |
US16/522,063 US11525824B2 (en) | 2018-07-27 | 2019-07-25 | Bioparticle measuring method |
US16/522,026 US11592440B2 (en) | 2018-07-27 | 2019-07-25 | Bioparticle measuring method |
CN201910681647.8A CN110779852A (zh) | 2018-07-27 | 2019-07-26 | 生物体粒子的测定方法、及用于检测生物体粒子的试剂盒 |
EP19188490.7A EP3599466B1 (en) | 2018-07-27 | 2019-07-26 | Bioparticle measuring method |
EP19188491.5A EP3599467B1 (en) | 2018-07-27 | 2019-07-26 | Bioparticle measuring method |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2018141524A JP7153494B2 (ja) | 2018-07-27 | 2018-07-27 | 生体粒子の測定方法、非特異シグナルの検出方法、生体粒子測定方法及び生体粒子を検出するための試薬キット |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2020016614A JP2020016614A (ja) | 2020-01-30 |
JP7153494B2 true JP7153494B2 (ja) | 2022-10-14 |
Family
ID=69384127
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018141524A Active JP7153494B2 (ja) | 2018-07-27 | 2018-07-27 | 生体粒子の測定方法、非特異シグナルの検出方法、生体粒子測定方法及び生体粒子を検出するための試薬キット |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP7153494B2 (ja) |
CN (1) | CN110779852A (ja) |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007093336A (ja) | 2005-09-28 | 2007-04-12 | Sysmex Corp | 被検物質の測定方法 |
WO2011034115A1 (ja) | 2009-09-17 | 2011-03-24 | Jsr株式会社 | アビジンとビオチン誘導体の解離方法及び解離剤 |
JP2013500725A (ja) | 2009-07-31 | 2013-01-10 | プログノシス バイオサイエンシズ インコーポレイテッド | アッセイツールおよびその使用方法 |
WO2016147825A1 (ja) | 2015-03-13 | 2016-09-22 | シスメックス株式会社 | 被検物質の検出方法およびその方法に用いられる試薬キット |
JP2018004371A (ja) | 2016-06-30 | 2018-01-11 | シスメックス株式会社 | 免疫複合体転移法により被検物質を検出するための抗体試薬及びその製造方法、並びにその抗体試薬の利用 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH05172815A (ja) * | 1991-12-26 | 1993-07-13 | Hitachi Ltd | 免疫分析方法及びその分析装置 |
JP2002267672A (ja) * | 2000-12-28 | 2002-09-18 | Internatl Reagents Corp | 新規抗dnpモノクローナル抗体および超高感度測定法 |
EP2952894B1 (en) * | 2006-01-17 | 2017-08-30 | Somalogic, Inc. | Kits comprising aptamers |
US10338080B2 (en) * | 2008-12-01 | 2019-07-02 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods and compositions for detection of complement fixing antibodies |
WO2011064910A1 (ja) * | 2009-11-25 | 2011-06-03 | パナソニック株式会社 | 免疫測定方法 |
PL2783216T3 (pl) * | 2011-11-21 | 2019-03-29 | Abay Sa | Testy immunologiczne ze wzmocnionym sygnałem |
EP3289359A1 (en) * | 2015-04-28 | 2018-03-07 | Orphidia Limited | Analyte detection and methods therefor |
EP3093664A1 (en) * | 2015-05-13 | 2016-11-16 | Miltenyi Biotec GmbH | A method for analysing markers on the surface of vesicles |
-
2018
- 2018-07-27 JP JP2018141524A patent/JP7153494B2/ja active Active
-
2019
- 2019-07-26 CN CN201910681647.8A patent/CN110779852A/zh active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007093336A (ja) | 2005-09-28 | 2007-04-12 | Sysmex Corp | 被検物質の測定方法 |
JP2013500725A (ja) | 2009-07-31 | 2013-01-10 | プログノシス バイオサイエンシズ インコーポレイテッド | アッセイツールおよびその使用方法 |
WO2011034115A1 (ja) | 2009-09-17 | 2011-03-24 | Jsr株式会社 | アビジンとビオチン誘導体の解離方法及び解離剤 |
WO2016147825A1 (ja) | 2015-03-13 | 2016-09-22 | シスメックス株式会社 | 被検物質の検出方法およびその方法に用いられる試薬キット |
JP2018004371A (ja) | 2016-06-30 | 2018-01-11 | シスメックス株式会社 | 免疫複合体転移法により被検物質を検出するための抗体試薬及びその製造方法、並びにその抗体試薬の利用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN110779852A (zh) | 2020-02-11 |
JP2020016614A (ja) | 2020-01-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Morales-Kastresana et al. | Flow cytometric analysis of extracellular vesicles | |
Wang et al. | Human CD4+ lymphocytes for antigen quantification: characterization using conventional flow cytometry and mass cytometry | |
EP2972348B1 (en) | Methods of detecting donor-specific antibodies | |
EP3009844B1 (en) | Method for measuring lipoprotein's capacity to accept cholesterol and reagent kit | |
JP2013520664A (ja) | 合成基材及び細胞基材に結合した抗体の同時検出による疾病診断のための方法及びシステム | |
JP2019191187A (ja) | 標的物質の検出用試薬、検出方法および標的物質を検出するために用いられる担体ならびにその製造方法 | |
JP2023082015A (ja) | 免疫チェックポイント阻害剤の奏効性の判定を補助する方法、試薬キット、装置及びコンピュータプログラム | |
JP7141405B2 (ja) | 検体検出イムノアッセイ | |
CN108780086B (zh) | 靶分析物的亚细胞定位 | |
JP7376021B2 (ja) | ヒト血液からのマイクロベシクルの分離方法及び分析方法 | |
JP7153493B2 (ja) | 生体粒子の測定方法、非特異シグナルの検出方法、生体粒子測定方法及び生体粒子を検出するための試薬キット | |
CN108463724B (zh) | 癌的判断方法、癌的判断用装置及计算机程序 | |
US9632086B2 (en) | Method and kit for determining-antibody sensitivity and clone cell strain | |
JP7153494B2 (ja) | 生体粒子の測定方法、非特異シグナルの検出方法、生体粒子測定方法及び生体粒子を検出するための試薬キット | |
US11525824B2 (en) | Bioparticle measuring method | |
CN111175488A (zh) | 一种应用流式细胞术检测血小板抗体特异性的方法及检测试剂盒 | |
CN112986575B (zh) | 一种串联式验证dna编码苗头化合物修饰抗体的方法 | |
US11085922B2 (en) | Method of measuring auto-antibodies in bodily fluids | |
US11029311B2 (en) | Method for determining a concentration of epithelial cells in a blood sample or aspirate sample | |
KR20140019823A (ko) | 종양 세포를 검출하는 스테로이드 수용체 분석법 | |
US20170248587A1 (en) | Polymeric Dye Specific Binding Members and Methods of Making and Using the Same |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210611 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20220408 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220510 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220708 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20220906 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20221003 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7153494 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |