JP2002267672A - 新規抗ｄｎｐモノクローナル抗体および超高感度測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】本発明は、被検物質（修飾あるいは標識された
被検物質を含む）とその特異結合物質（修飾あるいは標
識された特異結合物質を含む）との複合体を固相上に形
成、固定した後、該複合体を固相から溶出する少なくと
も１の工程を含む工程により被検物質を測定する測定法
を迅速化、高感度化することを課題とする。 【解決手段】上記の課題に記載の複合体を固相からより
迅速により完全に固相から溶出しうるような少なくとも
１の結合、特にモノクローナル抗ハプテン抗体−ハプテ
ン結合を該複合体と固相の間に介在させることにより課
題を解決する。この目的に適合するモノクローナル抗ハ
プテン抗体、殊にモノクローナル抗ジニトロフェニル基
抗体を選別して課題を解決する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明が属する技術分野】本発明は、ヒトの臨床検査、
獣医検査、食品衛生検査など多くの分野で利用される技
術に関する。詳しくは、被検物質をその特異結合物質と
固相を用いて測定する迅速高感度測定法、さらに詳しく
は、少なくとも披検物質とその特異結合物質の両者を含
む複合体を固相上に形成、固定あるいはトラップした
後、該複合体を固相から溶出する工程を少なくとも１つ
含む工程により被検物質を測定する新規な迅速高感度測
定法、そのための新規なモノクローナル抗体、そのため
の試薬あるいは／および固相の少なくとも１を含むキッ
ト、そのための試薬、固相および自動化ソフトを含む測
定システムに関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、ヒトの臨床検査をはじめとして、
獣医検査、食品検査など多くの分野で、被検物質に対す
る特異結合物質と固相を用いて実施する測定法が広く普
及している。例えば、抗原、抗体、ＤＮＡ、生理作用物
質などの被検物質に対して、それぞれ抗体、抗原、被検
ＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ断片、受容体などの
特異結合物質との複合体を固相上に形成させて、固相上
の複合体を測定する測定法が広く使われている。特異結
合物質と固相を使用する上記の測定法を高感度化する方
法も開発されている（E.Ishikawa, Ultrasensitive and
Rapid Enzyme Immunoassay, Laboratory Techniques i
n Biochemistry and Molecular Biology vol.27, S.Pil
lai, P.C.van der Vliet eds., Elsevier, Amsterdam,
pp79-191, 1999）。つまり、被検物質と特異結合物質と
の複合体を固相（第一固相）上に形成させた後、複合体
を第一固相から溶出して別の固相（第二固相）へ移しか
えて、第二固相上の複合体を測定することにより被検物
質を測定する方法（以下非競合的転移測定法と記載）で
ある。しかし、非競合的転移測定法も種々の欠点をもっ
ている。欠点の１つは複合体の溶出に長い時間を要する
ことである。また、一般に、被検物質とその特異結合物
質との複合体を固相上に形成、固定した後、該複合体を
固相から溶出する工程を含む固相測定法においては、該
溶出に長い時間を要する。複合体の固相からの溶出を、
１０分間以内あるいは１分間以内で完了するとする特許
申請（特開平６−８２４５３）はあるが、被検物質の迅
速測定のために、溶出時間を短時間とし、かつ被検物質
の高感度測定のために溶出率を高水準に維持した報告、
特許（申請を含む）、実施例はない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】被検物質（修飾あるい
は標識された被検物質を含む）とその特異結合物質（修
飾あるいは標識された特異結合物質を含む）との複合体
を固相上に形成、固定、あるいはトラップした後、該複
合体を固相から溶出する少なくとも１つの工程を含む工
程により被検物質を測定する測定法、その中でも主とし
て被検物質（修飾あるいは標識された被検物質を含む）
とその特異結合物質（修飾あるいは標識された特異結合
物質を含む）との複合体を固相（第一固相）上に形成さ
せた後、該複合体を第一固相から溶出して別の固相（第
二固相）へ移しかえ、第二固相上の該複合体を第二固相
上に固定した状態であるいは再び溶出して測定すること
により被検物質を測定する測定法において、測定時間を
短縮して迅速高感度測定法を提供することが、本発明の
課題である。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者は、被検物質と
その特異結合物質との複合体をより迅速に、しかもより
完全に固相から溶出できるような結合、特にモノクロー
ナル抗ハプテンーハプテン（ハプテン誘導体を含む）結
合により固相上に形成、固定して該複合体の固相からの
溶出時間を短縮する方法により、課題を解決することに
成功し、本発明を完成させた。すなわち本発明は、 １．Ｂ工程において、該複合体の固相からの溶出時間を
３分間とした際に６０％以上溶出されるような結合を該
複合体と固相との間に少なくとも１つ介在させることを
特徴とする以下のＡ工程およびＢ工程を含む工程により
被検物質を測定する測定法。 Ａ工程：被検物質（修飾あるいは標識された被検物質を
含む）とその特異結合物質(修飾あるいは標識された特
異結合物質を含む）の複合体を固相上に形成、固定ある
いはトラップする工程。 Ｂ工程：Ａ工程において固相上に形成、固定あるいはト
ラップした該複合体を溶出する工程。 ２．前項１に記載の結合が抗ハプテン抗体−ハプテン
(ハプテン誘導体を含む）結合である前項１の測定法。 ３．抗ハプテン抗体がモノクローナル抗ハプテン抗体で
ある前項２の測定法。 ４．該複合体を溶出するための物質としてハプテン（ハ
プテン誘導体を含む）を使用する前項２または３の測定
法。 ５．モノクローナル抗ハプテン抗体がモノクローナル抗
ニトロフェニル基抗体である前項３または４の測定法。 ６．該複合体を溶出するための物質としてニトロフェニ
ル基を有する物質を使用する前項５の測定法。 ７．モノクローナル抗ニトロフェニル基抗体がモノクロ
ーナル抗２，４−ジニトロフェニル基抗体であり、かつ
ニトロフェニル基を有する物質が２，４−ジニトロフェ
ニル誘導体である前項５または６の測定法。 ８．２，４−ジニトロフェニル誘導体がεＮ−２，４−
ジニトロフェニル−リジンである前項７の測定法。 ９．ハプテン（ハプテン誘導体を含む）との結合が、ハ
プテン（ハプテン誘導体を含む）による解離時間を３分
間とした際に６０％以上解離しうるような性能を有する
抗ハプテン抗体。 １０．前項９に記載の性能を有するモノクローナル抗ハ
プテン抗体。 １１．前項９に記載の性能を有するモノクローナル抗ニ
トロフェニル基抗体。 １２．前項９に記載の性能を有するモノクローナル抗
２．４−ジニトロフェニル基抗体。 １３．ハプテンがεＮ−２，４−ジニトロフェニル−リ
ジンである前項１２に記載のモノクローナル抗２，４−
ジニトロフェニル基抗体。 １４．寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８０７９のハイブリド
ーマ細胞が産生するモノクローナル抗体。 １５．前項９〜１４のいずれか１に記載の抗体を使用す
る前項２〜８のいずれか１に記載の測定法。 １６．複合体の固相からの溶出時間が１０秒間以上３分
間以下であることを特徴とする前項１〜８、１５のいず
れか１に記載の測定法。 １７．寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８０７９のハイブリド
ーマ細胞。 １８．前項１〜８、１５、１６のいずれか１に記載の測
定法のために使用しうる少なくとも１の試薬あるいは／
および固相を含むキット。 １９．前項１〜８、１５、１６のいずれか１に記載の測
定を実施するための試薬、固相、自動化ソフトを含むシ
ステム。からなる。

【０００５】

【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。本発明は、被検物質(修飾あるいは標識された被
検物質を含む）とその特異結合物質（修飾あるいは標識
された特異結合物質を含む）の両者を含む複合体を固相
上に形成、固定、あるいはトラップした後、該複合体を
固相から溶出する少なくとも１つの工程を含む工程によ
り被検物質を測定する測定法、その中でも主として被検
物質（修飾あるいは標識された被検物質を含む）とその
特異結合物質（修飾あるいは標識された特異結合物質を
含む）との複合体を固相（第一固相）上に形成させた
後、該複合体を溶出して別の固相（第二固相）に移しか
えて、第二固相上の該複合体を第二固相上に固定した状
態であるいは再び溶出して測定することにより被検物質
を測定する測定法に適用することができる。

【０００６】本発明における被検物質は、特異結合物質
が存在しうる全ての物質である。その特異結合物質の種
類によって分類すると、被検物質は、抗原、抗体、レセ
プター、リガンド、レクチン、糖鎖化合物、ＲＮＡ、Ｄ
ＮＡ、ハプテンなどが挙げられる。被検物質の機能から
分類すると、ホルモン、イムノグロブリン、凝固因子、
酵素、薬剤などと呼ばれるものを含む。物質名では、血
清アルブミン、マクログロブリン、フェリチン、α−フ
ェトプロテイン、ＣＥＡ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、
Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、ＨＩＶ−１
ｐ２４などが被検物質の例として挙げられる。これらの
被検物質は、血液、唾液、尿、鼻汁、涙液、糞便、組織
抽出液、培養液などに含まれる場合も多い。被検物質
は、天然物、人工合成物、遺伝子組換産物などのいずれ
でもよく、その由来、存在状態などにより限定されるも
のではないと同時に例示によっても限定されない。

【０００７】本発明における特異結合物質は、被検物質
と特異的に結合する物質をいう。抗原に対しては、抗
体、抗体に対しては抗原、ハプテンに対しては抗ハプテ
ン抗体、抗ハプテン抗体に対してはハプテン、ＤＮＡに
対してはハイブリダイズすることができるＤＮＡ、ビオ
チンに対してはアビジンあるいはストレプトアビジン、
アビジンあるいはストレプトアビジンに対してはビオチ
ンあるいはビオチン化タンパク、ホルモン受容体（例え
ばインスリン受容体）に対してはホルモン（例えばイン
スリン）、ホルモン（例えばインスリン）に対してはホ
ルモン受容体（例えばインスリン受容体）、レクチンに
対しては対応する糖鎖、糖鎖に対しては対応するレクチ
ンなどがそれぞれ特異結合物質の例として挙げられる。
また、特異結合物質は、特異的結合能を有するそれらの
フラグメントあるいはサブユニット、修飾あるいは標識
された特異結合物質、修飾あるいは標識された特異的結
合能を有するそれらのフラグメントあるいはサブユニッ
トなどをも含む。例えば、ビオチン化抗原、ビオチン化
抗体、ビオチン化Ｆａｂ'、酵素標識抗原、酵素標識抗
体、酵素標識Ｆａｂ'、ハプテン化抗原、ハプテン化抗
体、ハプテン化Ｆａｂ'、ビオチン化レセプター、ビオ
チン化ホルモン、ビオチン化ホルモン受容体、酵素標識
ホルモンレセプターなどが例示されるが、これらに限定
されるものではない。

【０００８】本発明における固相は、従来の固相測定法
で使用されてきたものでも、あるいは新しいものでもよ
く、材質、形状、大きさなどによって限定されない。例
えば、種々の大きさのポリスチレン球、ナイロン球、ガ
ラス球、ポリスチレン試験管内面、ポリスチレンマイク
ロプレート、ラテックス粒子、各種磁性粒子などいずれ
でもよい。本発明において固相上に形成、固定あるいは
トラップされる、あるいは固相から溶出される被検物質
（修飾あるいは標識された被検物質を含む）とその特異
結合物質（修飾あるいは標識された特異結合物質を含
む）との複合体は、両者の特異結合により形成される。
複合体の形成方法は限定されないので、種々の方法ある
いは種々の反応順序で形成させることができる。つま
り、固相、特異結合物質、被検物質を種々の順序で順次
反応させてもよく、また、これらの一部あるいはすべて
を同時に反応させてもよい。また、複合体に含まれる両
者の分子数は、限定されるものではないが、それぞれ１
分子以上多くの場合数分子以下である。複合体に含まれ
る両者の分子数の比も限定されるものではないが、１以
上で１０以下のことが多い。上記のように固相上に形
成、固定あるいはトラップされる、あるいは固相から溶
出される複合体を構成する被検物質あるいは／および特
異結合物質は、必ずしも修飾あるいは標識される必要は
ない。例えば、物理的吸着により固相上に固定した特異
結合物質に被検物質と酵素標識特異結合物質を結合して
固相上に複合体を形成させ、該複合体を界面活性剤によ
り固相から溶出することができる。しかし、それらは、
特に特異結合物質は修飾あるいは標識されることが多
い。このように被検物質あるいは／およびその特異結合
物質を修飾あるいは標識する目的は２つである。その１
は、両者を含む複合体を固相上に固定あるいはトラップ
あるいは固相から溶出するためであり、他の１つは、両
者を含む複合体を測定するためである。上記のような両
者を含む複合体を固相上に固定あるいはトラップ、ある
いは固相から溶出することができる限り、あるいは迅速
に高感度で測定ができる限り、両者の修飾あるいは標識
の方法、そのために使用する物質の種類、両者の分子に
導入する分子数などに制限はない。両者を含む複合体を
固相上に固定あるいはトラップ、あるいは固相から溶出
するために、例えば、ハプテン、抗ハプテン抗体、荷電
物質、ＤＮＡ、チオール基を含む物質、チオピリジール
基を含む物質、リガンド、レセプター、レクチン、糖鎖
ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンなどが、修飾
あるいは標識に使用されるが、このように修飾あるいは
標識された物質を含む複合体は、それぞれ、抗ハプテン
抗体、ハプテン、荷電物質、ＤＮＡ、チオピリジール基
を含む物質、チオール基を含む物質、レセプター、リガ
ンド、糖鎖、レクチンなどを不溶化した固相上に、ハプ
テン−抗ハプテン抗体結合、イオン結合、ＤＮＡハイブ
リッド結合、ジスルフィド結合、リガンド−レセプター
結合、レクチン−糖鎖結合、ビオチン−アビジン結合、
ビオチン−ストレプトアビジン結合などを介して固定あ
るいはトラップされ、ハプテン、イオン、高温、置元
剤、リガンド、糖質、ビオチンなどにより固相から溶出
される。これらの２以上の結合を固相と複合体の間に介
在させて、複合体を固相に固定あるいはトラップし、２
以上の物質あるいは／および方法を組み合わせて複合体
を溶出することもできる。ただし、ビオチン−アビジン
結合、ビオチン−ストレプトアビジンは複合体の溶出の
ためには使われることは殆どない。上記のような両者を
含む複合体の高感度測定法のために、例えば、酵素、ラ
ジオアイソトープ、蛍光物質、発光物質、金属など、具
体的には、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダー
ゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、
フルオレセイン、エクオリン、アクリジニウム、ユーロ
ピューム、金コロイドが測定用修飾物質あるいは測定用
標識物質として使われる。上記のように、種々に修飾あ
るいは標識され、両者の複合体が種々に形成、固定され
るので、両者を含む複合体の構成は様々であるが、具体
例として、次のような例を挙げることができる。2,4-ジ
ニトロフェニル化ビオチン化特異結合物質−被検物質−
酵素標識特異結合物質、2,4-ジニトロフェニル化特異結
合物質−被検物質−酵素標識特異結合物質などである。
2,4-ジニトロフェニル基、ビオチンは、上記の荷電物
質、ＤＮＡ、チオール基などで、また酵素は、上記のラ
ジオアイソトープ、蛍光物質、発光物質、金属などで、
それぞれ置きかえることができる。

【０００９】本発明における溶出液とは、上記のような
両者を含む複合体を固相から溶出するための溶液であ
る。溶液の組成は、該複合体が固相上に固定されている
状態により異なる。例えば、該複合体が固相上に固定さ
れている結合が物理的吸着の場合には、界面活性剤を含
む溶液、ハプテン−抗ハプテン抗体の結合の場合には、
ハプテンあるいはハプテン誘導体を含む溶液、イオン結
合の場合には、イオンを含む溶液、ジスルフィド結合の
場合には、還元剤を含む溶液、ＤＮＡハイブリッドの場
合には、温度の高い液などであるが、これらに限定され
ない。固相から溶出される両者を含む複合体は多くの場
合解離しないが一部あるいはすべて解離しても支障がな
い場合もある。例えば、ハプテン化抗原−抗体−標識抗
原が溶出されて抗体−標識抗原となっても抗イムノグロ
ブリン抗体不溶化固相にトラップすることができるので
支障はない。また、該複合体を固相から溶出して標識を
測定する場合には、標識の測定に支障がない限り、どの
ように解離してもよい。

【００１０】本発明における上記のような両者を含む複
合体の溶出方法は、種々の方法で実施される。通常は、
溶出液と該複合体を固定している固相とを振とうあるい
は撹拌などにより接触あるいは混合させ、一定時間後に
両者を分離する。両者を分離する方法も公知の種々の方
法がある。単なる溶出液の吸引除去をはじめとして、遠
心力、磁気力、フィルターなどによる粒子固相の分離な
どである。従来の公知方法に限定されない。

【００１１】被検物質とその特異結合物質との複合体を
固相上に形成させた後、該複合体を固相から溶出する工
程を含む固相測定法を、より迅速により高感度で実施す
るためには、該複合体を固相からより迅速にしかもより
完全に溶出する必要がある。該複合体が溶出過程で構成
要素に、一部あるいはすべて解離しても被検物質の測定
に支障ない場合もあるが、非競合的転移測定法を、より
迅速に、しかもより高感度で実施するためには、多くの
場合第一固相上に形成、固定した、被検物質とその特異
結合物質（修飾あるいは標識された特異結合物質を含
む）との複合体を第一固相から、より迅速にしかもより
完全に解離させることなく溶出することが必要である。
本発明においては、溶出時間を３分間、さらには２分
間、１分間のように短時間とした際の該複合体の固相か
らの溶出量が、溶出前の第一固相上の該複合体の総量(1
00%とする)の60%以上、好ましくは70%以上、より好まし
くは80%以上、最も好ましくは90%以上となるような少な
くとも１の結合を固相と該複合体の間に少なくとも１つ
介在させる。該複合体の固相からの溶出の速さおよび／
あるいは程度は、該複合体を固相に固定するために使わ
れた結合の性質に依存する。本発明においては、該複合
体を固相に固定するために、均一な性質をもち、しかも
より迅速で、より完全な溶出を可能にする結合を使用す
る。モノクローナル抗体は均一な性質をもち、かつ１つ
のエピトープに対して均一な結合能力をもっているの
で、モノクローナル抗体−エピトープの結合は均一な性
質をもっている。なかでも、モノクローナル抗ハプテン
抗体−ハプテンの結合は、過剰のハプテンあるいはハプ
テン誘導体により切り離すことができるので、被検物質
と特異結合物質の複合体を固相上に形成、固定した後、
該複合体を固相から溶出する工程を含む測定法におい
て、該複合体と固相との間に介在させて、該複合体を固
相上に固定するために使用する結合として好適である。
なかでも、モノクローナル抗ジニトロフェニル基（以下
ＤＮＰと記載）抗体−ジニトロフェニル化合物の結合が
好適である。以下、具体例としてモノクローナル抗ＤＮ
Ｐ抗体の取得と利用について詳しく説明する。しかし、
本発明はこの例示に限定されるものではない。

【００１２】（モノクロナール抗体の調製法）感作抗原
としては、ＤＮＰ誘導体をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）等の
適当な緩衝液中に溶解あるいは懸濁したものが用いられ
る。抗原液は通常抗原物質として５０〜５００μｇ／ｍ
Ｌ程度の濃度に調製すればよい。抗原性を高めるため、
キャリアータンパク質としてアルブミンやキーホールリ
ンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等を選択することが好
ましい。該抗原を免疫感作させる動物としては、マウ
ス、ラット、ウマ、ヤギ、ウサギなどが例示される。好
ましくはマウス、より好ましくはＢＡＬＢ／ｃマウスで
ある。

【００１３】このとき、被免疫動物の抗原への応答性を
高めるため、当該抗原溶液をアジュバントと混合して投
与することが出来る。本発明において用いられるアジュ
バントとしては、フロイント完全アジュバント（FC
A）、フロイント不完全アジュバント（FIA）、Ribi（MP
L）、Ribi（TDM）、Ribi（MPL+TDM）。百日咳ワクチン
（Bordetella pertussis vaccine）、ムラミルジペプチ
ド（MDP）、アルミニウムアジュバント（ALUM）、及び
こららの組合せが例示されるが、初回免疫時にFCA、追
加免疫時にFIAやRibiアジュバントを使用する組合せが
特に好ましい。

【００１４】免疫方法は、使用する抗原の種類やアジュ
バント混合の有無等により、注射部位、スケジュ−ルな
どを適宜変化させることができるが、例えば、被免疫動
物としてマウスを用いる場合は、アジュバント混合抗原
液０．０５〜１ｍＬ（抗原物質１０〜２００μｇ）を腹
腔内、皮下、筋肉内または（尾）静脈内に注射し、初回
免疫から約４〜２１日毎に１〜４回追加免疫を行い、更
に約１〜４週間後に最終免疫を行う。該抗原溶液をアジ
ュバントを使用せずに投与する場合には、抗原量を多く
して、腹腔内注射してもよい。抗体価は追加免疫の約５
〜６日後に採血して調べる。抗体価の測定は、後述の抗
体価アッセイに準じ、通常行われる方法で行う事ができ
る。最終免疫より約３〜５日後、該免疫動物から脾細胞
を分離して抗体産生細胞を得る。

【００１５】骨髄腫細胞としては、マウス、ラット、ヒ
ト等由来のものが使用される。例えばマウスミエロ−マ
Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１、Ｐ３
ＮＳ１−Ａｇ４、ＳＰ２／ｏ−Ａｇ１４、Ｐ３Ｘ６３−
Ａｇ８・６５３等が例示さるが、抗体産生細胞と骨髄腫
細胞とは同種動物、特に同系統の動物由来であることが
好ましい。骨髄腫は凍結保存するか、ウマ、ウサギまた
はウシ胎児血清を添加した一般的な培地で継代培養して
維持することができる。細胞融合には対数増殖期の細胞
を用いるのが好ましい。

【００１６】抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させて
ハイブリドーマ細胞を形成させる方法としては、ポリエ
チレングリコ−ル（ＰＥＧ）を用いる方法、センダイウ
イルスを用いる方法、電気融合装置を用いる方法等が例
示される。例えばＰＥＧ法の場合、約３０〜６０％のＰ
ＥＧ（平均分子量１０００〜６０００）を含む適当な培
地または緩衝液中に脾細胞と骨髄腫細胞を１〜１０：
１、好ましくは５〜１０：１の混合比で懸濁し、温度約
２５〜３７℃、ｐＨ６〜８の条件下で、約３０秒〜３分
間程度反応させればよい。反応終了後、ＰＥＧ溶液を除
いて培地に再懸濁し、マイクロタイタープレート中に播
種して培養を続ける。

【００１７】融合操作後の細胞を選択培地で培養して、
ハイブリドーマ細胞の選択を行う。選択培地は、親細胞
株が死滅し、融合細胞のみが増殖しえる培地であり、通
常ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡ
Ｔ）培地が使用される。ハイブリドーマ細胞の選択は、
通常融合操作の１〜７日後に、培地の一部、好ましくは
約半量を選択培地と交換することによって開始し、さら
に２、３日毎に同様の培地交換を繰り返しながら培養す
ることにより行う。顕微鏡観察によりコロニーが生育し
ているウェルを確認する。

【００１８】生育しているハイブリドーマ細胞が所望の
抗体を産生しているかどうかを知るには、培養上清を採
取して抗体アッセイを行えばよい。抗体価は、例えば固
相化した抗原タンパク質に該上清を加えて反応させ、さ
らに蛍光物質、酵素、ＲＩ等で標識した二次抗体（抗グ
ロブリン、抗ＩｇＧ、抗ＩｇＭ抗体等）を反応させて測
定することができる。

【００１９】さらに限界希釈法、軟寒天法、蛍光励起セ
ルソーターを用いた方法等により単一クローンを分離す
る。例えば限界希釈法の場合、ハイブリドーマ細胞のコ
ロニーを１細胞／ウェル前後となるように培地で段階希
釈し、培養することにより目的とするモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマ細胞クローンを単離するこ
とができる。

【００２０】抗ＤＮＰモノクローナル抗体のうち、本発
明の目的のＤＮＰを有する物質との抗原抗体反応による
結合が、ＤＮＰ誘導体により解離される能力の高い性質
を有する抗体を得るようなハイブリドーマ細胞の選別を
おこなう。選別方法としては、例えば固相化したＤＮＰ
−ＢＳＡに培養上清を加えて反応させ、さらに蛍光物
質、酵素、ＲＩ等で標識した二次抗体（抗グロブリン、
抗ＩｇＧ、抗ＩｇＭ抗体等）を反応させて測定した結果
と、同様の反応を行ったのち、ＤＮＰ誘導体を反応さ
せ、溶出されうる抗ＤＮＰモノクローナル抗体−二次抗
体の免疫複合体を除去したのち、測定した結果を比較
し、溶出率の大きいものを選択する方法がある。さら
に、ＤＮＰ誘導体により解離される能力の高い性質を有
する抗体を得るためにはＤＮＰ誘導体の解離時間の短縮
や、ＤＮＰ誘導体をＰＢＳなどの適当なリン酸緩衝液で
希釈して用いる等の方法により、非解離処理結果との差
がなお大きいハイブリドーマ細胞を選別すればよい。

【００２１】得られた抗体産生ハイブリドーマ細胞は、
約１０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）
あるいはグリセリン等の凍結保護剤の共存下に凍結させ
て−７０〜−１９６℃で保存すると、約半年〜半永久的
に保存可能である。細胞は用時３７℃前後の恒温槽中で
急速に融解して使用する。凍結保護剤の細胞毒性が残存
しないようによく洗浄してから使用するのが望ましい。

【００２２】上記の方法で得られる本発明のモノクロ−
ナル抗体は、具体的には、例えばマウス由来かつＩｇＧ
クラスのモノクロ−ナル抗体であって、ＤＮＰ−６４
９，ＤＮＰ−１３２１，ＤＮＰ−１４０２，ＤＮＰ−１
６２３，ＤＮＰ−１７５３と命名されたものである。

【００２３】ハイブリドーマ細胞が産生する抗体のサブ
クラスを調べるためには、該ハイブリドーマ細胞を一般
的な条件で培養し、その培養上清中に分泌された抗体の
クラスを市販の抗体クラス・サブクラス判定用キットな
どを用いて分析することにより知ることができる。

【００２４】モノクロ−ナル抗体の取得は、その必要量
やハイブリドーマ細胞の性状等によってマウス腹水から
取得するか、細胞培養によるか適宜選択できる。マウス
腹腔内で増殖可能なハイブリドーマ細胞は腹水から数ｍ
ｇ／ｍＬの高濃度で得ることができる。インビボで増殖
できないハイブリドーマ細胞は細胞培養の培養上清から
取得する。細胞培養によれば、抗体産生量はインビボよ
り低いが、腹腔内に含まれる免疫グロブリンや他の夾雑
物質の混入が少なく、精製が容易であるという利点があ
る。

【００２５】マウス腹腔内から取得する場合、例えば、
予めプリスタン（２、６、１０、１４−テトラメチルペ
ンタデカン）等の免疫抑制作用を有する物質を投与した
ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内へハイブリドーマ細胞（約
１０^６個以上）を移植し、約１〜３週間後に貯留した腹
水を採取する。異種ハイブリドーマ細胞（例えばマウス
とラット）の場合には、ヌードマウス、放射線処理マウ
スを使用することが好ましい。

【００２６】一方、細胞培養上清から抗体を取得する場
合、例えば、細胞維持に用いられる静置培養法の他に、
高密度培養方法あるいはスピンナーフラスコ培養方法等
の培養法を用い、当該ハイブリドーマ細胞を培養し抗体
を含有する培養上清を得る。血清には、他の抗体やアル
ブミン等の夾雑物が含まれ、抗体精製に不便なことが多
いので培養液への添加は少なくすることが望ましい。

【００２７】腹水、培養上清からのモノクローナル抗体
の精製は、免疫グロブリンの精製法として従来既知の硫
酸アンモニウムや硫酸ナトリウムを用いた塩析による分
画法、ポリエチレングリコール分画法、エタノール分画
法、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー法、ゲル濾
過法等を応用することで、容易に達成される。

【００２８】さらに、本発明の抗ＤＮＰモノクローナル
抗体が、マウスＩｇＧである場合には、プロテインＡ結
合単体あるいは抗マウスイムノグロブリン結合単体を用
いたアフィニティークロマトグラフィー法により精製す
ることが可能である。

【００２９】（被検物質測定の態様）この抗体を利用す
る測定法の基本原理は、抗ＤＮＰ抗体不溶化固相表面
に、ＤＮＰ基を有する特異結合物質、被検物質、標識特
異結合物質あるいは標識被検物質からなる複合体を形
成、固定した後、該複合体を固相から溶出し、溶出液中
の該複合体あるいは溶出液中から別の固相にトラップし
た該複合体を測定する工程を含む。

【００３０】本発明において、ＤＮＰ基を有する物質と
はＤＮＰ基が結合しており抗ＤＮＰモノクローナル抗体
と反応しうるものであれば特に限定されないが、たとえ
ばＤＮＰ基により修飾した免疫グロブリン、レセプタ
ー、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ等が挙げられる。

【００３１】本発明による測定は、例えば以下のように
行なわれるが、本方法に限定されるものではない。マイ
クロプレートに固定した抗ＤＮＰ抗体に、ＤＮＰとビオ
チンにより修飾した抗被検物質抗体を反応させ、さらに
被検物質抗原、ついで標識抗被検物質抗体を反応させ
る。ＤＮＰ・ビオチン修飾抗被検物質抗体−被検物質−
標識抗被検物質抗体からなる免疫複合体をεＮ−２，４
−ＤＮＰ−Ｌ−リジンによりマイクロプレートから溶出
する。溶出液中の複合体の標識あるいは溶出液中から別
のストレプトアビジン不溶化固相上にトラップした免疫
複合体の標識を測定することにより、被検物質を測定す
る。また、他の方法として、被検物質としてのハプテン
は次に示す方法により測定することも可能である。ここ
では、ハプテンは被検物質としてのハプテンをいう。マ
イクロプレートに抗ＤＮＰ抗体を固定し、抗ＤＮＰ抗体
にＤＮＰにより修飾した抗ハプテン抗体を反応させ、ハ
プテンおよび標識化ハプテンを競合させて反応させ、固
相にトラップする。トラップしたＤＮＰ修飾抗ハプテン
抗体−標識化ハプテンからなる免疫複合体をεＮ−２，
４−ＤＮＰ−Ｌ−リジンによりマイクロプレートから溶
出する。溶出した該免疫複合体の標識物質を溶出した状
態かあるいは別の固相上にトラップして測定することに
より、被検物質を測定する。

【００３２】ＤＮＰとしては、２，４−ＤＮＰ、２，５
−ＤＮＰ、２，６−ＤＮＰが例示され、好適には２，４
−ＤＮＰが用いられる。

【００３３】被検物質（修飾あるいは標識された被検物
質を含む）とその特異結合物質（修飾または標識された
特異結合物質を含む）との該複合体の固相からの溶出時
間を３分間、さらには２分間、１分間、0.5分間という
短時間にした際の溶出量が、溶出前の固相上の該複合体
の総量(100%とする)の60%以上、好ましくは70%以上、よ
り好ましくは80%以上、最も好ましくは90%以上となるよ
うなモノクローナル抗ハプテン抗体を選択することがで
きる。これにより一層の迅速な高感度測定法を提供する
ことができる。該複合体の固相からの溶出時間は、固相
と溶出液との混合または接触をはじめてから、両者を分
離し、固相と洗浄液との混合または接触をはじめるまで
の時間とする。これらの溶出操作は、すべて技術的に可
能な限り迅速に行うものとする。また、これらの溶出操
作が、該複合体の固相からの溶出率を計測する場合と、
被検物質を測定する場合とで異なることを妨げない。被
検物質を測定する際の該複合体の固相からの溶出時間
は、１０秒間以上３分間以下が好ましい。上記の溶出液
は、該複合体を固相から溶出しうる組成をもつ溶液であ
る。例えば、該複合体が抗ＤＮＰ抗体−ＤＮＰ誘導体の
結合により固相上に固定されている場合には、種々の濃
度の種々のＤＮＰ誘導体を含む溶液が溶出液として使わ
れる。ＤＮＰ化特異結合物質を含む複合体を抗ＤＮＰ抗
体不溶化固相から溶出するためにＤＮＰ誘導体が使用さ
れる。ＤＮＰ誘導体として、ＤＮＰ−グリシン、ＤＮＰ
−アラニン、ＤＮＰ−βアラニンなどＤＮＰ−アミノ
酸、特にεＮ−２，４−ＤＮＰ−Ｌ−リジンが使用され
るが、これらに限定されるものではない。これらのＤＮ
Ｐ誘導体は、多くの場合1ｍＭ〜5ｍＭの溶液で使用され
るが、その濃度に制約はない。溶出温度は、多くの場合
室温〜37℃であるが、限定されるものではない。

【００３４】

【実施例】以下に示す実施例は本発明を具体的に説明す
るものであるが、これによって本発明の範囲を制限する
ものではない。

【００３５】

【実施例１】モノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマの作製 （１）免疫原の調製 ２，４−ジニトロフェニル化キーホールリンペットヘモ
シアニン（ＤＮＰ−ＫＬＨ）（株式会社エル・エス・エル
製）をリン酸緩衝生理食塩液ｐＨ７．０（ＰＢＳ）でＫ
ＬＨ当たりの濃度で１ｍｇ／ｍＬに調製して免疫原とし
た。

【００３６】（２）被免疫動物 ５乃至８週令の近交系ＢＡＬＢ／ｃ系マウス雌を、動物
飼育チェンバー内（２３＋１℃、湿度７０％）で、標準
ペレットを使用して飼育し、任意に給水して飼育した。

【００３７】（３）免疫方法 上記（２）で調製した抗原、すなわちＤＮＰ−ＫＬＨを
１００μｇ／０．５ｍＬとなる様にＰＢＳで調製し、同
量（０．５ｍＬ）のフロイント不完全アジュバント（Fr
eund's Incomplete adjuvant）（ＰＩＥＲＣＥ社製）を
混合して乳化した。この乳化状の抗原を、５週令の５匹
の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔に１匹あたり２００μ
ｇを投与した。さらに３週間毎に、ＲＩＢＩアジュバン
ト（Adjuvant MPL + TDH Emulsion）（RIBI Immuno Che
m Research, Inc製）で１００μｇ／ｍＬとなるように
調製した上記抗原をマウスあたり２０μｇずつ３回投
与、マウスの抗体価を測定した。抗体価の高いマウスは
さらに３週間後にＰＢＳで１００μｇ／ｍＬに調製した
ＤＮＰ−ＫＬＨを、マウス尾静脈より注射して最終免疫
とした。

【００３８】（４）細胞融合 最終免疫から３日後にＢＡＬＢ／ｃマウスの摘脾を行
い、ＥＭＥＭ培養液中で脾細胞を浮遊させて、脾細胞の
浮遊液を作製した。ついで、脾細胞をＥＭＥＭ培養液で
４回洗浄した後、細胞数を算定し、５．９×１０^８個の
脾細胞を得た。細胞融合は、2−アミノ-6-オキシ-8-ア
ザプリン（8-アザグアニン）[2-amino-6-oxy-8-azapuin
e（8-Azaguanine）] 耐性のＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫
由来培養細胞株（P3-X63-Ag8・653、以下、「Ｘ６３細
胞」という。）を親細胞株として用いた。

【００３９】Ｘ６３細胞は、非働化した牛胎児血清（fe
tal calf serum:FCS）を１０％を含むＲＰＭＩ−１６４
０培養液（２０μｇ／ｍＬ，8-azaguanine含有）で継代
培養し、対数増殖期のＸ６３細胞を用いた。細胞融合の
３日前より8-azaguanineを含有しない１０％ＦＣＳ含有
ＲＰＭＩ−１６４０培養液でさらに培養し、対数増殖期
の細胞を用いた。Ｘ６３細胞はＲＰＭＩ−１６４０培養
液で３回洗浄した後、細胞数を算定し、７×１０^７個の
生細胞を得た。

【００４０】ＲＰＭＩ−１６４０培養液で、ポリエチレ
ングリコール−４０００が５０ｗ／ｖ％濃度となるよう
に溶解し、上記の脾細胞とＸ６３細胞の比が１０：１と
なるように混合し、ケーラー及びミルシュタイン共著:
（Nature） 第256卷、第495-497項, 1975年及び ヨ−ロ
ピアン ジャ−ナル オブ イムノロジ−（Eur. J. Im
muno.第 6巻、第511-519項、1976年）の方法に準じて細
胞融合を行った。

【００４１】その後、１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ
−１６４０培養液に、１×１０^−４Ｍ のヒポキサンチ
ン４×１０^−７Ｍのアミノプテリン及びおよび１．６×
１０ ^−５Ｍ のチミジンを含有するＨＡＴ選択培地に、
脾細胞が２．０×１０^６個／ｍＬとなるように浮遊させ
た。ついで、この細胞浮遊液の５０μＬを、９６ウエル
のマイクロテストプレートの各ウエルに分注した後、CO
₂無菌培養器において温度３７℃、湿度９５％、８％のC
O₂雰囲気で培養を行なった。培養開始後、１日目と２日
目にＨＡＴ培地を各ウエルに１滴ずつ、また培養開始後
７日目と９日目にＨＡＴ培地を、各ウエルに２滴ずつ添
加してさらに培養を行った。その後、ＨＡＴを含まない
培養液で育成させ、約１０日〜２週間後に、目的のＤＮ
Ｐモノクロ−ナル抗体を産生するクローンをＤＮＰ−Ｂ
ＳＡを固相に吸着させたマイクロプレ−トを用いたエラ
イザ法によるスクリーニングによって検索した。

【００４２】（５）スクリーニング 上記ハイブリドーマ細胞の培養上清を用いて、抗ＤＮＰ
−ＢＳＡ抗体価酵素免疫測定法及びε−Ｎ−２，４−ジ
ニトロフェニル−Ｌ−リジン（以下「ＤＮＰ−リジン」
と略す。）による解離抗体価測定法により行った。すな
わち、ハイブリドーマ細胞系の培養上清をＤＮＰ−ＢＳ
Ａ固定化エライザプレートとの反応と、ＤＮＰ−リジン
添加による免疫複合体解離能力により選択した。

【００４３】抗原液として、２，４−ジニトロフェニル
化ウシ血清アルブミン（ＤＮＰ−ＢＳＡ）（株式会社エ
ル・エス・エル製）を１μｇ／ｍＬの濃度に調製し、１ウ
ェル当たり５０μＬずつマイクロタイタープレートに添
加し、一晩吸着させた後、Tween-20を０．０５％含むリ
ン酸緩衝液（以下「洗浄液」と略す。）で３回洗浄し、
さらに０．０５％ＢＳＡを含むリン酸緩衝液でブロッキ
ングし、ＤＮＰ−ＢＳＡ抗原固相化プレートを調製し
た。

【００４４】ホースラディッシュペルオキシダーゼ（以
下「ＨＲＰ」と略す。）標識抗マウスイムノグロブリン
抗体（ヤギ由来）を添加した当該固相化プレートに、上
記で得られたハイブリドーマ細胞系の培養上清を添加
し、室温で３０分間反応させた。この反応の後、洗浄液
で３回洗浄し、基質液（ｏ−フェニレンジアミン２ｍｇ
／ｍＬ及び４ｍＭ H₂O₂を含む）を室温で５分間反応さ
せた後、この反応を２Ｎ硫酸で停止させ、主波長４９２
ｎｍ，副波長６９０ｎｍでエライザプレートにて吸光度
を測定した。

【００４５】さらに、ＤＮＰ−ＢＳＡ抗原固相化プレー
ト上に形成された免疫複合体の解離能力を調べるため
に、下記のスクリーニングを行った。すなわち、ＨＲＰ
標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ヤギ由来）を添加
した当該固相化プレートに、上記で得られたハイブリド
ーマ細胞系の培養上清を添加し、室温で３０分間反応さ
せた。この反応の後、洗浄液で３回洗浄し、ＤＮＰ−リ
ジン溶液を添加し、室温で５分間反応させた。この反応
の後、洗浄液で３回洗浄し、基質液（ｏ−フェニレンジ
アミン２ｍｇ／ｍＬ及び４ｍＭ H₂O₂を含む）を室温で
５分間反応させた後、この反応を２Ｎ硫酸で停止させ、
主波長492nm，副波長 690nmでエライザプレートにて吸
光度を測定した。

【００４６】ＤＮＰ−リジン添加による免疫複合体解離
能力の高い抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選別し
た。

【００４７】（６）モノクローナル抗体産生ハイブリド
ーマ細胞系の樹立 上記（５）のスクリーニングにより得られたハイブリド
ーマ細胞を限界希釈法によりクローニングした。その結
果、ＤＮＰ−ＢＳＡ抗原固相化プレートに対する反応性
が高く、かつＤＮＰ−リジン添加による免疫複合体解離
能力の高い抗体を産生するハイブリドーマ細胞系クロー
ンを８クローンを選択した。このハイブリドーマのうち
１クローン（DNP-1402）を樹立株とし、受託番号ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１８０７９ 号として通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所に寄託した。

【００４８】（７）マウスイムノグロブリンサブクラス
の同定 上記クローニングにより単一クローンとして得られたハ
イブリドーマ ８クローンの産生するモノクローナル抗
体のマウスイムノグロブリンサブクラスをザイメッド
（Ｚｙｍｅｄ）社製 モノアブタイピングキット（MonoA
b typing kit）を使用して同定した。

【００４９】

【実施例２】この実施例では、免疫複合体を抗ＤＮＰ抗
体不溶化磁性ビーズに結合させ、その溶出率の時間経過
を示す。 （材料と方法） ・抗ＤＮＰポリクローナル抗体，Seikagaku Corporatio
n,Tokyo,Japan ・抗ＤＮＰモノクローナル抗体 ＤＮＰ−６４９ ・抗ＤＮＰモノクローナル抗体 ＤＮＰ−１３２１ ・抗ＤＮＰモノクローナル抗体 ＤＮＰ−１４０２ ・抗ＤＮＰモノクローナル抗体 ＤＮＰ−１６２３ ・抗ＤＮＰモノクローナル抗体 ＤＮＰ−１７５３ 抗ＤＮＰモノクローナル抗体はProtein Aを用いて精製
した。 ・ブロッキング液 0.15M NaCl、2.5mM EDTA、2.5g/L ウシ血清アルブミ
ン、10g/Lシュークロース、1g/L NaN3を含む10mM リン
酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ7.0 ・アルカリホスファターゼ（ALP）用洗浄液 0.15M NaCl、0.1％ Tween 20、0.1％NaＮ3を含む20mMト
リス・HCｌ緩衝液、pH7.4 ・トリエタノラミン（ＴＥＡ）緩衝液 0.1mM ZnCl₂、1mM MgCl₂、1g/L ウシ血清アルブミン、
0.05%NaN₃を含む0.1Mトリエタノラミン・HCｌ緩衝液、p
H7.6 ・ＡＬＰ Oriental Yeast Co., Ltd.,Tokyo,Japan ・モノクローナル抗HBs Ag（ヒトＢ型肝炎ウイルス表面
抗原）抗体-740および85，International Reagents Cor
poration,Kobe,Japan ・磁性ビーズ MG205、直径880nm、比重1.3、JSR Corporation,Tokyo,J
apan ビーズを球として計算した磁性ビーズ１mgの表面積は、
52.45cm²である。 ・ＡＬＰ蛍光基質液 Attophos^TM Test kit、JBL Scientific Inc.,San Luis
Obispo,CA ・マイクロプレート Fluoro Nunc^TM Module Plate、F16 Maxisorp Black、Nu
nc A/S,DK-4000 Roskilde,Denmark ・ＤＮＰ-ビオチン−抗HBs Ag Fab'とＡＬＰ−抗HBs Ag
Fab' ＤＮＰ化ビオチン化ウシ血清アルブミン−抗HBs Ag Fa
b'-740（ＤＮＰ-ビオチン-抗HBs Ag Fab'）とＡＬＰ−
抗HBs Ag Fab'-85（ＡＬＰ−抗HBs Ag Fab'）をマレイ
ミド基とチオール基の反応を使う公知の方法（E. Ishik
awa, Ultrasensitive and Rapid Enzyme Immunoassay,
Laboratory Techniques in Biochemistryand Molecular
Biology Vol.27, S. Pillai, P.C. van der Vliet ed
s., pp.177-302, 1999)により調製した。 ・抗ＤＮＰ IgG不溶化磁性ビーズ 磁性ビーズにモノクローナルおよびポリクローナル抗Ｄ
ＮＰIgGをJSR Corporationの指示書にしたがって不溶
化し、ブロッキング液で洗浄した後、４℃で同液中に保
存した。 ・ＤＮＰ Ｌｙｓ液 3mM εＮ−ジニトロフェニル−Ｌ−リジンを含むＴＥ
Ａ緩衝液 ・蛍光光度計 CytoFluor^TM4000 Multiwell Fluorescent Plate Reade
r,PerSeptive Biosystems, Inc.,Framingham,MA

【００５０】・HBs Ag、ＤＮＰ−ビオチン−抗HBs Ag
Fab'およびＡＬＰ−抗HBs Ag Fab'の溶解液および
希釈液 ＴＥＡ緩衝液。 ・免疫複合体の形成 12×75mmカルチャーチューブ２本のそれぞれに90μLの4
8pmol/mL ALP-抗HBsAg Fab'と90μLの100pmol/mL Ｄ
ＮＰ・ビオチン・抗HBs Ag Fab'を加え混合した。一
方に陽性検体として900μLの5IU/mL HBs Agを加え、
他方に陰性検体として900μLのTEA緩衝液を加え、混合
した。10分間室温で静置し免疫複合体反応液を調製し
た。

【００５１】・免疫複合体の抗ＤＮＰ抗体不溶化磁性ビ
ーズへの結合 この間に別途12×75mmカルチャーチューブ２本を用意
し、これに900μLの1％抗ＤＮＰ抗体不溶化磁性ビーズ
を分注した。それぞれ磁気分離し、上清を吸引除去し
た。一方のカルチャーチューブに1080μLの上記陽性免
疫複合体反応液を加え、他方に同量の陰性反応液を加え
て混合し10分間室温で静置した。ついで上清を除去し
た。次に3.6mLのALP用洗浄液により2回洗浄した。さら
に3.6mLのALP用洗浄液を加えて撹拌し、粒子を懸濁さ
せ、この懸濁液を400μLずつ7×50mm PSチューブ8本に
分注した。磁気分離し、上清を吸引除去した。

【００５２】・免疫複合体の溶出 上記抗ＤＮＰ抗体不溶化磁性ビーズを含む各チューブに
100μLの3mM DNP-Lys液を加え混合し、種々の時間静置
した後、20秒間磁気分離した。各チューブについて上清
を吸引除去し、0.4mLのALP用洗浄液で3回洗浄した。

【００５３】・ＡＬＰ活性の蛍光測定法 上記の洗浄した抗DNPIgG不溶化磁性ビーズにALP蛍光基
質液200μLを加え、37℃、30分間インキュベートした
後、磁性ビーズを磁気分離した上清全量の蛍光強度をマ
イクロプレート中で励起波長450nm、分析波長580nmによ
り測定した。

【００５４】（結果）実施例２の結果を表１に示す。抗
ＤＮＰモノクローナル抗体を使用した場合の免疫複合体
の溶出率は、3mM ＤＮＰ−Ｌｙｓ添加後40秒間で86.1〜
89.8％、１分間で87.0%〜91.0%、２分間では88.5〜92.5
%であった。一方、抗ＤＮＰポリクローナル抗体を使用
した場合の溶出率は40秒間で26.9%、１分間で31.2%、２
分間では40.5%であった。

【００５５】実施例１と２により示された発明の効果 本発明による抗ＤＮＰモノクローナル抗体を使用すれ
ば、被検物質を含む免疫複合体をより迅速により完全に
固相から溶出することができ、被検物質の測定をより迅
速により高感度で実施することができる。

【００５６】表１

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/58 Ａ 33/577 Ｚ 33/58 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:91） 5/00 Ｂ (72)発明者 梶田 忠宏 兵庫県神戸市西区室谷１丁目１−２ 国際 試薬株式会社研究開発センター内 Ｆターム(参考） 2G045 CA25 CB01 CB03 CB04 CB07 CB11 DA12 DA13 DA14 DA20 DA36 DA54 FB03 FB07 FB15 4B024 AA11 BA53 GA03 HA01 HA15 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA13 4B065 AA91X AA92X AB05 AC14 BA08 CA25 CA46 4H045 AA11 AA20 AA30 DA76 DA86 EA50 FA72

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】Ｂ工程において、該複合体の固相からの溶
   出時間を３分間とした際に６０％以上溶出されるような
   結合を該複合体と固相との間に少なくとも１つ介在させ
   ることを特徴とする以下のＡ工程およびＢ工程を含む工
   程により被検物質を測定する測定法。 Ａ工程：被検物質（修飾あるいは標識された被検物質を
   含む）とその特異結合物質(修飾あるいは標識された特
   異結合物質を含む）の複合体を固相上に形成、固定ある
   いはトラップする工程。 Ｂ工程：Ａ工程において固相上に形成、固定あるいはト
   ラップした該複合体を溶出する工程。
2. 【請求項２】請求項１に記載の結合が抗ハプテン抗体−
   ハプテン(ハプテン誘導体を含む）結合である請求項１
   の測定法。
3. 【請求項３】抗ハプテン抗体がモノクローナル抗ハプテ
   ン抗体である請求項２の測定法。
4. 【請求項４】該複合体を溶出するための物質としてハプ
   テン（ハプテン誘導体を含む）を使用する請求項２また
   は３の測定法。
5. 【請求項５】モノクローナル抗ハプテン抗体がモノクロ
   ーナル抗ニトロフェニル基抗体である請求項３または４
   の測定法。
6. 【請求項６】該複合体を溶出するための物質としてニト
   ロフェニル基を有する物質を使用する請求項５の測定
   法。
7. 【請求項７】モノクローナル抗ニトロフェニル基抗体が
   モノクローナル抗２，４−ジニトロフェニル基抗体であ
   り、かつニトロフェニル基を有する物質が２，４−ジニ
   トロフェニル誘導体である請求項５または６の測定法。
8. 【請求項８】２，４−ジニトロフェニル誘導体がεＮ−
   ２，４−ジニトロフェニル−リジンである請求項７の測
   定法。
9. 【請求項９】ハプテン（ハプテン誘導体を含む）との結
   合が、ハプテン（ハプテン誘導体を含む）による解離時
   間を３分間とした際に６０％以上解離しうるような性能
   を有する抗ハプテン抗体。
10. 【請求項１０】請求項９に記載の性能を有するモノクロ
    ーナル抗ハプテン抗体。
11. 【請求項１１】請求項９に記載の性能を有するモノクロ
    ーナル抗ニトロフェニル基抗体。
12. 【請求項１２】請求項９に記載の性能を有するモノクロ
    ーナル抗２．４−ジニトロフェニル基抗体。
13. 【請求項１３】ハプテンがεＮ−２，４−ジニトロフェ
    ニル−リジンである請求項１２に記載のモノクローナル
    抗２，４−ジニトロフェニル基抗体。
14. 【請求項１４】寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８０７９のハ
    イブリドーマ細胞が産生するモノクローナル抗体。
15. 【請求項１５】請求項９〜１４のいずれか１に記載の抗
    体を使用する請求項２〜８のいずれか１に記載の測定
    法。
16. 【請求項１６】複合体の固相からの溶出時間が１０秒間
    以上３分間以下であることを特徴とする請求項１〜８、
    １５のいずれか１に記載の測定法。
17. 【請求項１７】寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８０７９のハ
    イブリドーマ細胞。
18. 【請求項１８】請求項１〜８、１５、１６のいずれか１
    に記載の測定法のために使用しうる少なくとも１の試薬
    あるいは／および固相を含むキット。
19. 【請求項１９】請求項１〜８、１５、１６のいずれか１
    に記載の測定を実施するための試薬、固相、自動化ソフ
    トを含むシステム。