CN108330105B - 抗人IgM单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及应用 - Google Patents

抗人IgM单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及杂交瘤细胞株及其所分泌单克隆抗体，所述抗体能与人IgM特异性结合，并可用于人IgM的体外检测，尤其适合用于巨细胞病毒感染的早期诊断。本发明还涉及包括所述杂交瘤细胞株或单克隆抗体的试剂盒。

Description

抗人IgM单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及应用
技术领域
本发明涉及一种单克隆抗体，特别涉及一种抗人IgM的单克隆抗体。
背景技术
免疫诊断试剂是体外诊断试剂的主要类型之一。其利用抗原与抗体互相结合的特异性反应来进行定性或定量的诊断，无论是技术还是市场，此类试剂在目前所有诊断试剂产品中发展最快。
病原微生物感染人体后，在刺激诱导体液免疫应答的过程中IgM型抗体最先产生，感染性疾病的早期诊断是进行早期、有效治疗的前提，特别是对于起病急，病情凶险的感染性疾病，早期诊断尤为重要，由于感染后机体最先出现的抗体为IgM型抗体，故检测发病初期患者血液中特异性IgM抗体在临床早期诊断中具有重要的意义。
近年来，存在一些关于抗人IgM单克隆抗体的研究，如专利文献WO 2010026758 A1中公开了一种抗人IgM单克隆抗体，该专利旨在解决多克隆抗体特异性低的问题，并着重考察了单克隆抗体诱导人IgM之间凝集的性质并验证了其抑制非特异反应的效应，但并未关注于该抗人IgM单克隆抗体用于体外诊断试剂时的系统性评价(如、抗体效价、交叉反应性、稳定性、检测灵敏度及特异性等)，因而，该抗体是否适于制备体外诊断试剂是不明确的。
又例如，厦门波生生物抗人IgM单克隆抗体是常见的商品化抗人IgM单克隆抗体，但是其稳定性欠佳，从而在用于免疫诊断抗体时存在不足。
实际上，筛选用于制备体外诊断试剂的单克隆抗体是一个复杂的过程，首先要获得很好的抗原，来制备足够多的抗体，然后对抗体进行系统的评价，获得具有临床相关性的候选抗体，再开发成检测试剂。其中，抗体效价、交叉反应性、稳定性和临床效果等均是重要的评价因素，如抗体效价高低反映了一定浓度下与抗原反应的最低滴度，滴度越低效价越高；抗体交叉反应性可影响该抗体的特异性；抗体的稳定性会直接影响最终结果的可靠性，而稳定性较差的抗体对保存条件、操作条件要求更高，从而降低了其作为诊断试剂的实用性及结果的可靠性，并不可避免地引起成本的上升；临床试验则用来说明抗体在诊断某种特定疾病时的效果。
因此，为了在体外诊断方面的应用，本领域急需系统性评价结果较佳，且尤适用于病原感染的早期诊断的单克隆抗体。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗人IgM单克隆抗体、分泌该抗体的杂交瘤细胞株、含上述单克隆抗体或杂交瘤细胞株的试剂盒以及它们在检测人IgM中的用途。通过系统性评价，所述抗体在各方面均有较佳表现，从而适合作为免疫诊断试剂用于制备体外诊断试剂盒，尤其适合制备巨细胞病毒早期诊断试剂盒。
为此，本发明人进行了大量研究，通过人IgM来免疫小鼠，细胞融合后经有限稀释法克隆至少4次，直到达到单克隆，从得到的众多克隆中筛选到1株能稳定分泌抗体的新型杂交瘤细胞株(Hybridoma)IgM-3，并于2018年3月8日将其保藏于中国典型培养物保藏中心，湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:C201845，从而完成了本发明。
在第一个方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞株，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201845。
在第二个方面，本发明提供了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体能够与人IgM特异性结合。
在一个实施方式中，所述单克隆抗体不与人IgG、鼠IgG、兔IgG或牛IgG结合。
在另一个实施方式中，所述单克隆抗体的中值效价为131600且在反复冻融、长期保存、热加速恶劣条件下具有更优的稳定性和可靠性。
在一个优选的实施方式中，所述单克隆抗体是由本发明的杂交瘤细胞株分泌的抗体。
在第三个方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明的杂交瘤细胞株或单克隆抗体。
在一个具体实施方式中，所述试剂盒为胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒或荧光免疫试剂盒。
在一个优选的实施方式中，所述试剂盒为化学发光试剂盒。
在另一个实施方式中，所述试剂盒为微流体芯片。
在第四个方面，提供了本发明的杂交瘤细胞株或单克隆抗体在制备试剂盒中的用途。
在一个实施方式中，所述试剂盒是基于免疫检测的试剂盒，优选的，所述试剂盒为胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒或荧光免疫试剂盒。
在一个优选的实施方式中，所述试剂盒为化学发光试剂盒。
在另一个实施方式中，所述试剂盒是微流体芯片，优选的，所述微流体芯片所基于免疫检测的。
在一个实施方式中，所述试剂盒用于检测人IgM。
在一个优选的实施方式中，所述人IgM为病原感染初期产生的人IgM。
在一个具体的实施方式中，所述病原为巨细胞病毒。
此外，还提供了本发明的杂交瘤细胞株或本发明的单克隆抗体在制备用于巨细胞病毒诊断的试剂盒中的用途，优选用于巨细胞病毒早期诊断的试剂盒。
本发明的单克隆抗体的有益效果在于，首先，其抗体效价比体外诊断中通常使用的商购人IgM抗体至少高一个数量级，有着更佳的免疫效果；其次，本发明的抗体与人IgG、鼠IgG、兔IgG、牛IgG***无交叉反应，具有很好的特异性结合能力；再次，其具有比商购的人IgM抗体更优的长期与热稳定性，也就是说延长了使用期限并能接受相对宽松的储存条件和操作条件，从而大大节约了成本；最后，临床实验表明本发明的单克隆抗体可用于巨细胞病毒IgM抗体检测的化学发光试剂盒，检测灵敏度可达100％，检测特异性可达100％。
也就是说，本发明的单克隆抗体在抗体效价、交叉反应性、稳定性和检测效果等多个方面均展现出了很好的性能，从而本发明提供了一种经系统性评价可用于体外诊断且综合能力突出的抗人IgM单克隆抗体。
附图说明
图1示出了本发明的抗体IgM-Ab3的SDS-PAGE电泳图；
图2为示出了本发明的抗体IgM-Ab3与两种商业化抗人IgM抗体的抗体效价测定结果，其中横坐标为Log(稀释倍数)，纵坐标为OD450。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
抗体
如本文所使用的，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子，包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体、全人源抗体、CDR移植抗体和抗体构建体，如单链Fv(scFv)或抗体融合蛋白；此外，还涉及重组地或合成地产生/合成的抗体。
在优选的实施方式中，抗体是指产生自保藏编号为CCTCC NO:C201845的杂交瘤细胞株的抗体。
“抗体片段”通常包括亲代抗体的抗原结合区，轻链和/或重链可变区，一个或多个(如六个)CDR的至少一部分，其保留亲代抗体的至少一定的结合特异性。特别地，在本文中亲代抗体是指产生自保藏编号为CCTCC NO:C201845的杂交瘤细胞株的抗体。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体分子；线性抗体；单链抗体分子，例如，sc-Fv；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。通常，当基于摩尔来表达活性时，片段保留至少50％的对人IgM的结合活性。优选地，和亲代抗体相比，片段保留至少60％、70％、80％、90％、95％或100％的对人IgM的结合活性。
优选的，抗体片段是指抗体的抗原结合区、轻链和重链可变区或六个CDR。
“抗体衍生物”指可以包括抗体的保守氨基酸替代物(称为“保守变异体”)，它的生物学活性与亲代抗体相比基本不发生改变。
本发明提供了抗体的单克隆形式。
如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”是指获自基本上同种抗体的群体的抗体，即，除可能的可以少量存在的自然发生的突变之外，构成群体的个体抗体是相同的。针对单抗原位点，单克隆抗体是高度特异的。单克隆抗体是有利的，因为它们可以通过杂交瘤细胞株培养获得，并且基本上不受其他免疫球蛋白的污染。
试剂盒
本发明的检测试剂盒可采用多种形式，例如，试纸、含有各种测试所需试剂的测试盒、微流体芯片等，可以按照本领域技术人员已知的标准步骤来制造试剂盒。
本发明的试剂盒根据需要可包括容器、芯片、使用说明书、缓冲剂、免疫助剂和/或用于进行诊断/检测所需的其他材料、结构和/或试剂。
实施例中采用化学发光测定为例对本发明的试剂盒进行说明，但不应理解为本发明的试剂盒仅限于化学发光测定。
本发明的试剂盒包括产生自保藏编号为CCTCC NO:C201845的杂交瘤细胞株的抗体，其可以以本领域常规的方式存在，例如，以溶解或干燥形式存在于容器中，包被在固相载体上(例如，膜、板、珠、粒子(如磁粒子)等)，以溶解或干燥形式存在于芯片的腔室中，但本发明不限于此。
由于运输及使用地点等客观因素，试剂盒往往需要适合在各类复杂环境中进行现场检测，因此，原料的稳定性是制约试剂盒结果的重要因素之一。如下文实施例9中所示出的，本发明的抗体IgM-Ab3作为化学发光试剂盒的原料在极端条件下较常规IgM抗体拥有更好的稳定性，从而使试剂盒的结果可靠性增强并变相地降低了成本。
本发明的抗体可以1～100μg/mg的浓度来包被，优选为10～50μg/mg，更优选为25μg/mg。
本发明的试剂盒中用于进行诊断/检测所需的其他材料包括但不限于，除本发明的抗体外的其他抗人IgM抗体、与人IgM抗体结合的抗原和/或人IgM。上述其他材料可以以本领域常规的方式存在，例如，以溶解或干燥形式存在于容器中，包被在固相载体上(例如，膜、板、珠、粒子(如磁粒子)等)，以溶解或干燥形式存在于芯片的腔室中，但本发明不限于此。
本发明的试剂盒中用于进行诊断/检测所需的其他结构包括但不限于用于取样结构、用于进行对照结构和/或用于观察检测过程或结果的结构。
本发明的试剂盒中用于进行诊断/检测所需的其他试剂包括但不限于、洗涤剂、显色剂和/或终止剂。
在一个实施方式中，在本发明试剂盒中的抗体是可检测地标记的。可以使用本领域技术人员已知的任何标记物和标记方法。例如，在本发明中可以使用的标记物包括酶、放射性同位素、胶态金属、荧光化合物、化学发光化合物和生物发光化合物，但本发明不限于此。
常用的标记物可包括酶(如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶等)、放射性同位素(如32P或125I)等、生物素、地高辛、胶态金属(如胶体金等)、荧光染料(如荧光素、罗丹明、德克萨斯红等)、化学发光化合物或生物发光化合物(如二氧杂环丁烷、鲁米诺或吖啶鎓等)。可以使用任何本领域众所周知的标记步骤，如酶或生物素基团的共价偶联、碘化、磷酸化、生物素化等。
在一些实施方式中，用于进行诊断/检测所需的其他材料中的一种或多种也可以为可检测地标记的。
在一个优选的实施方式中，本发明的试剂盒是用于病原早期诊断的试剂盒。
用途
本发明的抗人IgM抗体或杂交瘤细胞株可用于与人IgM的特异性反应相关的任何目的。优选的，本发明的抗体或杂交瘤细胞株可用于检测人IgM。
本发明的抗体或杂交瘤细胞株可对来源于人类的生物样品进行检测。
如本文中所使用的，“生物样品”是指精液、淋巴、血清、血浆、尿、滑液或脊髓液。在优选的实施方式中，生物样品是指血液、血清或血浆。
优选的，使用来自于人的发病初期的生物样品。
可以使用免疫测定的方法定量或定性检测人IgM的存在，所述免疫测定通常包括将生物样品与本发明的抗体和/或检测所需的其他材料一同孵育或依次接触，并通过多种本领域熟知的技术检测结合的抗体。
检测方法包括但不限于放射自显影、荧光显微镜检术、直接和间接的酶促反应、放射性同位素法或非放射性同位素法等。这些方法尤其包括Western印迹、重叠测定、RIA(放射免疫测定)和IRMA(免疫放射免疫测定)、GIA(胶体金免疫测定)、EIA(酶免疫测定)、ELISA(酶联免疫吸附测定)、FIA(荧光免疫测定)、以及CLIA(化学发光免疫测定)。
抗人IgM单克隆抗体可以与各种病原感染产生的人IgM结合，但在制备体外诊断试剂时，由于检测体系不同或抗体自身的性质差异，其诊断效果难免会有所差异。如下文中实施例8中所示，本发明的抗体在检测巨细胞病毒(CMV)引起的IgM时效果优于目前常见的市售检试剂盒。
因此，在一个优选的实施方式中，本发明的抗体或杂交瘤细胞株尤其适用于检测巨细胞病毒感染初期产生的人IgM，从而诊断个体是否感染巨细胞病毒。
下面将结合实施例对本发明的实施方式进行详细描述，实施例中未注明具体条件的，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产产商的，为可以通过商购获得的常规产品。
实施例1小鼠的免疫
将血源提取的人IgM(四川迈克生物新材料技术有限公司，批号150127)用生理盐水稀释到3.0mg/ml，与弗氏完全佐剂(Sigma公司，货号SLBF-9338V)等体积混合，用1ml注射器乳化为油状乳液，直至滴入水中的油状乳液不分散方可停止乳化，将该乳液以120μl/只的剂量四肢腋窝皮下施给BALB/c小鼠(成都达硕实验动物中心，6周龄雌性，2只)第一次免疫21天后增强免疫，取人IgM与弗氏不完全佐剂(Sigma公司，货号SLBM9367V)等体积混合后乳化，免疫剂量为60μl/只，以后每隔一周增强免疫一次，每次免疫之前采尾血，分离血清，用间接ELISA法测定效价。免疫5次后，所有小鼠血清效价大于1:106，即可用于融合。融合前3天，取人IgM用生理盐水稀释到3.0mg/ml，再与生理盐水等体积混合尾静脉追加免疫，剂量为60μl/只。
实施例2杂交瘤细胞系的制备
2-1饲养细胞的制备
以正常的10周龄BALB/c鼠腹腔巨噬细胞作饲养细胞。在融合前1天，BALB/c取眼血拉颈处死，0.1％新洁尔灭浸泡1分钟，转入75％酒精浸泡1分钟，超净台内无菌操作下用剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器腹腔注入RPMI1640基础培养液4ml，后以滴管取出，再加入6ml RPMI1640基础培养液反复冲洗，回收冲洗液，1000rpm，离心5分钟留沉淀，用已加入20％新生牛血清的RPMI1640培养液重悬，调整细胞浓度为2.7×105个/ml，加入96孔板，100μl/孔，37℃、5％CO2培养。
2-2免疫脾细胞的制备
实施例1中的小鼠追加免疫三天后，分别在无菌条件下取出脾脏，置于平皿中，RPMI1640基础培养液冲洗一次，剪碎、研磨、过滤后得到分散的脾细胞，1000rpm，离心5分钟留沉淀离心，RPMI1640基础培养液重悬，3％乙酸稀释计数。
2-3骨髓瘤细胞的制备
小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0(四川迈克生物新材料技术有限公司保存)经8-氮鸟嘌呤筛选后，培养至对数生长期，取6大瓶(75cm2)制成细胞悬液，1000rpm离心5分钟留沉淀，用RPMI1640基础培养液重悬、计数，按0.5×105个/ml的细胞浓度进行分瓶培养(一般情况每1～2天更换一次15～30ml完全1640培养基)。
2-4细胞融合及HAT选择培养杂交瘤
将骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1:4的比例混合，在50ml锥形离心管内用RPMI1640基础培养液洗1次，1000rpm离心5分钟留沉淀。将细胞混匀，缓慢加入0.8ml 50％的PEG4000融合，融合1分钟后加入30ml的RPMI1640基础培养液终止细胞融合。700rpm离心5分钟后重悬于含有1％HAT与20％新生牛血清的1640培养基中，平均滴入16套96孔细胞培养板。37℃，5％CO2培养，次日补加含有1％HAT与20％新生牛血清的1640培养基至孔满。5天后半换培养基，7天后再次半换培养基。
2-5阳性细胞株的筛选
用0.06M pH9.6碳酸缓冲溶液稀释人IgM(四川迈克生物新材料技术有限公司，批号150127)至5μg/ml，96孔酶标板中每孔包被100μl，用于检测细胞培养上清。放置于冰箱中2～8℃过夜，第二天抛弃孔中液体，ELISA洗液洗板三次，拍干，用含10％小牛血清的0.01MpH7.2的PBS，150μl/孔，37℃封闭2小时，拍干，真空封装待用。脾细胞融合后第九天，取细胞上清100μl于上述96孔检测板中，37℃孵育40分钟，ELISA洗板机洗五次后加入8000倍稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG(四川迈克生物新材料技术有限公司生产)100μL，37℃孵育30分钟同上洗后，每孔加入100μL含0.1％(M/V)邻苯二胺，0.1％(V/V)双氧水，pH5.0柠檬酸磷酸缓冲液，37℃孵育10分钟，每孔加入50μL 2M硫酸溶液终止反应，测450nm吸收值。以融合时小鼠血清稀释至100倍为阳性对照，RPMI1640完全培养液作为阴性对照，阴性对照OD值＜0.2，阳性对照OD值＞1.8为检测系统有效，样本OD值≥2×阴性对照OD值时，为阳性，反之为阴性。分泌抗体阳性细胞孔以1个细胞/孔在96孔培养板上用有限稀释法克隆，筛选阳性孔依上法连续克隆四次，使其达到100％单克隆，转入24孔继续培养，待细胞长满80％时转入细胞瓶扩大培养后，待细胞长满细胞瓶80％时分瓶传代，传代的细胞生长至对数期时，用适量无血清RPMI-1640培养基分散细胞瓶内细胞，收集细胞悬液于锥形离心管中，记录细胞悬液体积V，取适量细胞悬液进行细胞计数，得到细胞悬液密度(个/ml)，其余1000rpm离心5min后弃上清液，根据细胞密度和离心前体积算出沉淀的细胞数，向细胞沉淀中加入适量冻存液调整细胞密度至4～8×106个/ml(取适量进行计数确认，如果细胞数未在范围内，则重新离心按照细胞计数总量，重新加入适量冻存液，最终使细胞浓度在4～8×106个/ml)，然后分装于无菌冻存管中，每只冻存管加细胞液0.5ml。细胞融合获得17株能稳定分泌抗鼠抗人IgM单克隆抗体抗体的杂交瘤细胞株，见下表1。其中，杂交瘤细胞株16H9-F10-H6-F11-E3所分泌的抗体在用于检测巨细胞病毒感染早期的IgM抗体时效果最优，此杂交瘤细胞株记作IgM-3，于2018年3月8日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201845。
表1筛选得到的稳定分泌抗人IgM单克隆抗体的杂交瘤细胞株
杂交瘤细胞 杂交瘤细胞 杂交瘤细胞
16H9-F10-H6-F11-E3 15B10-F11-H2-F12-G5 13E11-E1-D12-B11-G6
16D11-G8-D7-G4-C8 15D1-D6-D6-G3-F3 12D12-C5-H7-C4-F9
16H2-A7-C9-B3-E1 14C6-D4-D9-D2-D5 11E1-C10-D8-C12-E6
10A1-D7-H7-E1-G7 10E11-E10-G5-D9-F11 9H7-C1-C9-A8-D4
8C7-A1-D8-F10-B9 10F2-E4-D6-B11-G2 6D2-D1-E12-G1-C9
7E5-C8-H12-E11-G9 5C12-D1-G9-E12-E12
实施例3单克隆抗体的制备
选6～8周健康的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5ml液体石蜡(天津科密欧)，7天后每只小鼠腹腔注射1.2×106个杂交瘤细胞。接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠濒死之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一只小鼠可获1～5ml腹水。收集的腹水离心取上清，取小样放于-20℃冰箱保存。腹水分别用硫酸氨饱和沉淀后，再用蛋白A亲合层析柱纯化，SDS-PAGE检测此抗体(记作IgM-Ab3)纯度大于90％，电泳结果如图1所示。
实施例4杂交瘤细胞培养上清效价检测
用0.06M pH9.6碳酸缓冲溶液稀释人IgM(四川迈克生物新材料技术有限公司，批号150127)至5μg/ml，96孔酶标板中每孔包被100μl。放置于冰箱中2～8℃过夜，第二天抛弃孔中液体，ELISA洗板机洗三次，拍干，用含10％小牛血清的0.01M pH7.2的PBS，150μl/孔，37℃封闭2小时弃液体，拍干，用于检测杂交瘤细胞培养上清、腹水及抗体效价。杂交瘤细胞培养上清效价检测第一孔为原倍上清培养液，从第二孔至第四孔以0.01M pH7.2的PBS缓冲液10倍逐级稀释，第五孔至第十孔以2倍逐级稀释。第十一孔以融合时小鼠血清稀释至100倍作阳性对照，第十二孔以RPMI 1640完全培养液作阴性对照，每孔样本体积为100μl。37℃孵育40分钟，ELISA洗板机洗五次后加入12000倍稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG(四川迈克生物新材料技术有限公司生产)100μL，37℃孵育30分钟同上洗后，每孔加入100μL含0.1％(M/V)邻苯二胺，0.1％(V/V)双氧水，pH5.0柠檬酸磷酸缓冲液，37℃孵育10分钟，每孔加入50μL 2M硫酸溶液终止反应，测450nm吸收值。阴性对照OD值＜0.2，阳性对照OD值＞1.8为检测系统有效，当OD值≥2×阴性对照OD值时，为阳性，反之为阴性。检测值最低阳性孔所对应的稀释比例即为杂交瘤细胞培养上清效价，此杂交瘤细胞培养上清抗体效价大于1:8×103，见表2。
表2培养上清效价结果
酶标孔编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
稀释倍数 1 10 100 1000 2000 4000 8000 16000 32000 64000 阳性对照 阴性对照
IgM-3上清 3.33 3.23 2.11 1.68 1.23 0.70 0.26 0.05 0.05 0.06 2.65 0.04
实施例5腹水效价检测
ELISA检测方法同实施例4。稀释方法不同，具体为：第一孔为原倍腹水，以0.01MpH7.2的PBS缓冲液从第二孔至第七孔10倍逐级稀释，从第八孔至第十孔以2倍逐级稀释。检测值最低阳性孔所对应的稀释比例即为腹水效价，表3为腹水效价，此杂交瘤细胞IgM-3所制备的腹水效价大于1:4×106。
表3腹水效价
酶标孔编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
稀释倍数 1 10 100 1000 10000 100000 1000000 2000000 4000000 8000000 阳性对照 阴性对照
IgM-3腹水 3.53 3.31 3.11 2.68 2.23 1.30 0.76 0.55 0.25 0.06 2.66 0.04
实施例6抗体效价检测
先将实施例3中制备的纯化后的抗体IgM-Ab3以0.01M pH7.2的PBS缓冲液统一稀释为1mg/ml，后再稀释100倍作为初始第一孔，从第二孔开始至第十孔作5倍逐级稀释，第十一孔以融合时小鼠血清稀释至100倍作阳性对照，第十二孔以PBS作阴性对照，每孔样本体积为100μl。37℃孵育50分钟，ELISA洗板机洗五次后加入8000倍稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG(四川迈克生物新材料技术有限公司生产)100μL，37℃孵育1h同上洗后，每孔加入100μL含0.1％(M/V)邻苯二胺，0.1％(V/V)双氧水，pH5.0柠檬酸磷酸缓冲液，37℃孵育15分钟，每孔加入50μL 2M硫酸溶液终止反应，检测450nm吸收值多功能读数仪，厂商Thermo，型号Varioskan Flas)，重复3次取OD平均值。阴性对照OD值＜0.2，阳性对照OD值＞1.8为检测系统有效。抗体效价判定标准：以LOG(稀释度)为横坐标，以抗体OD平均值为纵坐标作曲线，曲线方程为y＝min+(max-min)/(1+10^((logEC50-x)×Hillslope))，通过sigmaplot数据处理软件拟合曲线，取中值效价＝10logEC50。结果显示本抗体IgM-Ab3中值效价为131600的中值效价大于1×105。商业化的抗人IgM抗体B(购自厦门波生生物技术有限公司)和C(洛阳市佰泰科生物技术有限公司)纯度均大于90％，将浓度统一调整为1mg/ml以上述同样方法对照检测B、C效价，通过拟合，B抗体中值效价为13600，C抗体中值效价为8793，低于本发明的杂交瘤细胞分泌的抗体。表4与图2示出了效价测定结果。
表4抗体效价检测
Figure BDA0001618609420000131
实施例7交叉反应测定
用0.06M pH9.6碳酸缓冲溶液稀释人IgG(四川迈克生物新材料技术有限公司，批号111304)、鼠IgG(四川迈克生物新材料技术有限公司，批号121418)、兔IgG(四川迈克生物新材料技术有限公司，批号121411)和牛IgG(四川迈克生物新材料技术有限公司，批号121404)至2.5μg/ml，96孔酶标板中每孔包被100μl。放置于冰箱中2～8℃过夜，第二天抛弃孔中液体，ELISA洗板机洗三次，拍干，用含10mM Tris-HCl(7.4)的0.5％酪蛋白作封闭液，150μl/孔，37℃封闭2小时弃液体，拍干备用。将本发明的抗人IgM单克隆抗体IgM-Ab3用HRP标记后稀释至相同浓度(0.5mg/ml)，再稀释500倍、1000倍、2000倍、4000倍、8000倍，加入上述包被好的酶标板孔中，每孔50μl分别与四种IgG进行反应，37℃孵育30分钟后ELISA洗板机洗五次，拍干，每孔加入100μL含0.1％(M/V)邻苯二胺，0.1％(V/V)双氧水，pH5.0柠檬酸磷酸缓冲液，37℃孵育10分钟，每孔加入50μL 2M硫酸溶液终止反应，测450nm吸收值(多功能读数仪，厂商Thermo，型号Varioskan Flas)。下表为IgM-Ab3的交叉反应测定结果，与四种IgG未有交叉反应。在表5中列出了检测结果。
表5交叉反应测定
Figure BDA0001618609420000132
Figure BDA0001618609420000141
实施例8病原的临床诊断
(1)检测试剂制备
试剂盒采用磁粒子化学发光免疫分析法，利用捕获法原理，将抗人IgM单克隆抗体IgM-Ab3与生物素1:4标记，用含磷酸二氢钠的0.02M PH为7.2的PBS缓冲液(含0.5％BSA)包被磁珠，包被量为25μg/mg，37℃孵育30min，PBS缓冲液洗涤3次后以1:25稀释，配置成R1。HRP标记的巨细胞病毒抗原以适当比例(1：1000-1：5000)PBS缓冲液(含0.5％BSA)稀释后配置成R2。将配置好的试剂用IS1200全自动化学发光仪测定(迈克生物股份有限公司)。采用两步法，加样量为50μL，R1为50μL，R2为100μL。通过校准品校准，计算样本相对发光值与临界值(Cut off值)的倍比，对结果进行定性判断，判断样本中是否检出巨细胞病毒IgM抗体。
(2)灵敏度检测
用上述方法制备的检测试剂盒分别检200例阳性样品与300例阴性样品。表6列出了本发明的单克隆抗体IgM-Ab3制备的试剂盒与商业化试剂盒(深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司)的比较实验，检验结果表明本发明的单克隆抗体IgM-Ab3制备的检测试剂盒其灵敏度及特异性均高于商业化试剂盒，在表6中列出了检测结果。
表6阳性与阴性样品检验
Figure BDA0001618609420000142
实施例9稳定性验证
本发明单克隆抗体在恶劣环境下的稳定性将本发明的单克隆抗体IgM-Ab3在以下条件下处理：a-20℃反复冻融2次；b-20℃反复冻融3次；c-20℃反复冻融4次；d-20℃反复冻融5次；e-20℃保存7个月；f 37℃热加速7天；g 37℃热加速14天，其他条件不变，按上述方法制备成检测试剂分别检验15份阳性参考品与15份阴性参考品，符合率为100％。表明本抗体稳定性良好，且利用本抗体制备的检测试剂精密性良好。选取效价较高的商业化抗人IgM单克隆抗体B(厦门波生)，以上述同样条件处理后制备成检测试剂分别检测15份阳性参考品与15份阴性参考品，结果显示其反复冻融5次或-20℃保存7个月或37℃热加速14天后已开始部分降解，检验结果与参考品不完全符合。在表7中列出了检测结果。
表7稳定性结果
Figure BDA0001618609420000151
由此可见，本发明的单克隆抗体稳定性高，由其制成的巨细胞病毒IgM抗体检测试剂在较为恶劣的环境条件下还能保持很高的稳定性与可靠性，这一点在临床以及实验室应用中均是非常宝贵的进步。

Claims (13)

1.一种杂交瘤细胞株IgM-3，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO: C201845。
2.一种单克隆抗体，所述单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株所分泌。
3.一种试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的杂交瘤细胞或权利要求2所述的单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，所述试剂盒为胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒或荧光免疫试剂盒，或者所述试剂盒是微流体芯片。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中，所述试剂盒为化学发光试剂盒。
6.权利要求1所述的杂交瘤细胞株或权利要求2所述的单克隆抗体在制备试剂盒中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，所述试剂盒是基于免疫检测的试剂盒。
8.根据权利要求7所述的用途，其中，所述试剂盒为胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒或荧光免疫试剂盒，或者所述试剂盒是微流体芯片。
9.根据权利要求8所述的用途，其中，所述试剂盒为化学发光试剂盒。
10.根据权利要求6所述的用途，所述试剂盒用于检测人IgM。
11.根据权利要求10所述的用途，所述人IgM为病原感染初期产生的人IgM。
12.根据权利要求11所述的用途，所述病原为巨细胞病毒。
13.权利要求1所述的杂交瘤细胞株或权利要求2所述的单克隆抗体在制备用于巨细胞病毒诊断的试剂盒中的用途。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DD268162A1 (de) * 1988-01-12 1989-05-24 Staatliches Inst Fuer Immunpra Verfahren zur herstellung von monoklonalen antikoerpern gegen humanes immunglobulin m (igm)
BR102015032238A2 (pt) * 2015-12-22 2017-06-27 Universidade Federal De Goiás Hybridomas murinos producers of human anti-igm antibodies

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DD268162A1 (de) * 1988-01-12 1989-05-24 Staatliches Inst Fuer Immunpra Verfahren zur herstellung von monoklonalen antikoerpern gegen humanes immunglobulin m (igm)
BR102015032238A2 (pt) * 2015-12-22 2017-06-27 Universidade Federal De Goiás Hybridomas murinos producers of human anti-igm antibodies

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
人巨细胞病毒IgM抗体国家参考品的研制;范行良 等;《微生物学免疫学进展》;20120620;第40卷(第3期);第32-33页 *
孙瑛勋 等.抗人IgM（μ链）单克隆IgM的制备.《军事医学科学院院刊》.1990,第14卷(第2期),第123-128页. *
抗人IgM（μ链）单克隆IgM的制备;孙瑛勋 等;《军事医学科学院院刊》;19900501;第14卷(第2期);第123-128页 *

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