CN109266620B - 抗人IgG单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及杂交瘤细胞株及其所分泌的单克隆抗体，所述抗体能与人IgG特异性结合。本发明还涉及包括所述杂交瘤细胞株或单克隆抗体的试剂盒。本发明的单克隆抗体在抗体纯度、可重复性、抗体效价和稳定性方面均展现出很好的性能。

Description

抗人IgG单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及应用

技术领域

本发明涉及一种单克隆抗体，特别涉及一种抗人IgG的单克隆抗体，分泌所述单克隆抗体的杂交瘤细胞，以及所述单克隆抗体的应用。

背景技术

单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)，是一类有包膜、基因组为双链DNA的病毒，广泛存在于自然界中，能感染人和许多动物，尤其对人体皮肤组织具有较强的嗜性，是皮肤病和性病的常见病原体。单纯疱疹病毒有两个血清型，包括：单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus-1，HSV-1)，单纯疱疹病毒2型(herpes simplex virus-2，HSV-2)。HSV-1和HSV-2引起的生殖器疱疹已造成越来越严重的社会和公共卫生问题。

目前检测单纯疱疹病毒常用的实验室方法有直接免疫荧光或组化染色、病毒分离培养、抗原乳胶凝集实验、血清抗体检测以及PCR技术。上述方法各有优势和不足。免疫荧光染色或免疫组化染色是直接检测细胞内的HSV特异性抗原，可做为确诊性实验。不过病损皮肤粘膜的脱落细胞采集环节比较困难，降低了灵敏度。病毒分离培养是HSV感染实验室最敏感的诊断方法，可对HSV病毒分离株进行分型。但细胞培养费时、费事，限制了在临床检验中的应用。抗原乳胶凝集试验是利用特异性的单克隆抗体与乳胶分子颗粒结合成复合物，当血清中有HSV抗原存在时，就会形成抗原－抗体－胶乳聚合物，出现肉眼可见的凝集现象。该方法优点是不需要特殊仪器，操作简便快速，适用于大批量标本的筛查。不过敏感性差，检出率只有50％。PCR技术检测灵敏度高，可检测到小至3个PFU的病毒量，已初步显出在临床病毒检验中的优越性。但是PCR方法灵敏度高，操作技术要求高，易污染而致假阳性，还需要人才技术培训、特殊仪器和进口试剂，目前在普及和推广方面仍有困难。检测HSV血清学抗体仍是临床上最常用的判断HSV感染的方法，目前HSV特异性抗体主要有IgG和IgM两类。血清中HSV–IgG浓度较高，检测准确度较高。因此研发出经系统性评价结果较好的抗人IgG单克隆抗体在体外诊断试剂领域具有非常广泛的应用。

然而，筛选用于制备体外诊断试剂的单克隆抗体是一个复杂的过程，首先要获得很好的抗原，来制备足够多的抗体，然后对抗体进行系统的评价，获得具有临床相关性的候选抗体，再开发成检测试剂。其中，抗体效价、交叉反应性、稳定性等均是重要的评价因素，如抗体效价高低反映了一定浓度下与抗原反应的最低滴度，滴度越低效价越高；抗体交叉反应性可影响该抗体的特异性；抗体的稳定性会直接影响最终结果的可靠性，而稳定性较差的抗体对保存条件、操作条件要求更高，从而降低了其作为诊断试剂的实用性及结果的可靠性，并不可避免地引起成本的上升；临床试验则用来说明抗体在诊断相应疾病或病毒感染时的实际效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗人IgG单克隆抗体、分泌该抗体的杂交瘤细胞株、含上述单克隆抗体或杂交瘤细胞株的试剂盒以及它们在检测人IgG中的用途。通过系统性评价，所述抗体在各方面均有较佳表现，从而适合作为免疫诊断试剂用于制备体外诊断试剂盒。

为此，本发明人进行了大量研究，通过人IgG来免疫小鼠，细胞融合后经有限稀释法克隆至少4次，直到达到单克隆，从得到的众多克隆中筛选到1株能稳定分泌抗体的新型杂交瘤细胞株(Hybridoma)，此杂交瘤细胞株记作杂交瘤细胞株6B5，并于2018年8月23日将其保藏于中国典型培养物保藏中心，中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:C2018173，从而完成了本发明。

在第一个方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞株，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2018173。

在第二个方面，本发明提供了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体能够与人IgG特异性结合。

在一个实施方式中，所述单克隆抗体不与人IgG、鼠IgG、兔IgG、牛IgG或人IgM结合。

在另一个实施方式中，所述单克隆抗体在反复冻融、长期保存、热加速恶劣条件下具有更优的稳定性和可靠性。

在一个优选的实施方式中，所述单克隆抗体是由本发明的杂交瘤细胞株分泌的抗体。

在第三个方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明的杂交瘤细胞株或单克隆抗体。

在一个具体实施方式中，所述试剂盒为胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒或荧光免疫试剂盒。

在一个优选的实施方式中，所述试剂盒为化学发光试剂盒。

在另一个实施方式中，所述试剂盒为微流体芯片。

在第四个方面，提供了本发明的杂交瘤细胞株或单克隆抗体在制备试剂盒中的用途。

在一个实施方式中，所述试剂盒是基于免疫检测的试剂盒，优选的，所述试剂盒为胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒或荧光免疫试剂盒。

在一个优选的实施方式中，所述试剂盒为化学发光试剂盒。

在另一个实施方式中，所述试剂盒是微流体芯片，优选的，所述微流体芯片所基于免疫检测的。

在一个实施方式中，所述试剂盒用于检测人IgG。

在一个优选的实施方式中，所述人IgG为2型单纯疱疹病毒IgG。

此外，还提供了本发明的杂交瘤细胞株或本发明的单克隆抗体在制备用于2型单纯疱疹病毒检测的试剂盒中的用途。

本发明的单克隆抗体的有益效果在于，首先，其抗体效价显著高于体外诊断中通常使用的商购人IgG抗体，有着更佳的免疫效果；其次，本发明的抗体与人IgG、鼠IgG、兔IgG、牛IgG或人IgM无交叉反应，具有很好的特异性结合能力；再次，其具有比商购的人IgG抗体更优的长期与热稳定性，也就是说延长了使用期限并能接受相对宽松的储存条件和操作条件，从而大大节约了成本；最后，临床实验表明本发明的单克隆抗体可用于制备2型单纯疱疹病毒IgG抗体检测的化学发光试剂盒，检测灵敏度可达100％，检测特异性可达100％。

也就是说，本发明的单克隆抗体在抗体效价、交叉反应性和稳定性等多个方面均展现出了很好的性能，从而本发明提供了一种经系统性评价可用于体外诊断且综合能力突出的抗人IgG单克隆抗体。

附图说明

图1示出了本发明的抗体人IgG-Ab的纯化后SDS-PAGE电泳图；

图2示出了本发明的抗体人IgG-Ab与两种商业化(B、C)抗人IgG抗体的抗体效价测定结果，其中横坐标为Log(稀释倍数)，纵坐标为OD₄₅₀；

图3示出了本发明的抗体人IgG-Ab在恶劣环境下的稳定性；

图4示出了商购的抗体在恶劣环境下的稳定性。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术人员的一本理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

抗体

如本文所使用的，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子，包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体、全人源抗体、CDR移植抗体和抗体构建体，如单链Fv(scFv)或抗体融合蛋白；此外，还涉及重组地或合成地产生/合成的抗体。

在优选的实施方式中，抗体是指产生自保藏编号为CCTCC NO:C2018173的杂交瘤细胞株的抗体。

“抗体片段”通常包括亲代抗体的抗原结合区，轻链和/或重链可变区，一个或多个(如六个)CDR的至少一部分，其保留亲代抗体的至少一定的结合特异性。特别地，在本文中亲代抗体是指产生自保藏编号为CCTCC NO:C2018173的杂交瘤细胞株的抗体。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体分子；线性抗体；但链抗体分子，例如，sc-Fv；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。通常，当基于摩尔来表达活性时，片段保留至少50％的对C-反应蛋白的结合活性。优选地，和亲代抗体相比，片段保留至少60％、70％、80％、90％、95％或100％的对2型单纯疱疹病毒I gG的结合活性。

优选的，抗体片段是指抗体的抗原结合区、轻链和重链可变区或六个CDR。

“抗体衍生物”指抗原包括抗体的保守氨基酸替代物(称为“保守变异体”)，它的生物学活性与亲代抗体相比基本不发生改变。

本发明提供了抗体的单克隆形式。

如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”是指获自基本上通知抗体的群体的抗体，即，除可能的可以少量存在的自然发生的突变之外，构成群体的个体抗体是相同的。针对单抗原位点，单克隆抗体是高度特异的。单克隆抗体是有利的，因为它们可以通过杂交瘤细胞朱培养获得，并且基本上不受其他免疫球蛋白的污染。

试剂盒

本发明的检测试剂盒可采用多种形式，例如，试纸、含有各种测试所需试剂的试剂盒、微流体芯片等，可以按照本领域技术人员已知的标准步骤来制造试剂盒。

本发明的试剂盒根据需要可包括容器、芯片、使用说明书、缓冲剂、免疫助剂和/或用于进行诊断/检测所需的其他材料、结构和/或试剂。

实施例中采用荧光免疫测定为例对本发明的试剂盒进行说明，但不应理解为本发明的试剂盒仅限于荧光免疫测定。

本发明的试剂盒包括产生自保藏编号为CCTCC NO:C2018173的杂交瘤细胞株的抗体，其可以以本领域常规的方式存在，例如，以溶解或干燥形式存在于容器中，包被在固相载体上(例如，膜、板、珠、粒子(如磁粒子)等)，以溶解或干燥形式存在于芯片的腔室中，但本发明不限于此。

由于运输及使用地点等客观因素，试剂盒往往需要适合在各类复杂环境中进行现场检测，因此，原料的稳定性是制约试剂盒结果的重要因素之一。如下文实施例10中所示出的，本发明的抗体抗人IgG单克隆抗体作为化学发光试剂盒的原料在极端条件下较常规抗人IgG单克隆抗体拥有更好的稳定性，从而使试剂盒的结果可靠性增强并变相地降低了成本。

本发明的抗体可以0.1～10μg/ml的浓度来使用，优选为1～5μg/ml，更优选为2.5μg/ml。

本发明的试剂盒中用于进行诊断/检测所需的其他材料包括但不限于，除本发明的抗体外的其他抗人IgG抗体、与人IgG抗体结合的抗原和/或人IgG。上述其他材料可以以本领域常规的方式存在，例如，以溶解或干燥形式存在于容器中，包被在固相载体上(例如，膜、板、珠、粒子(如磁粒子)等)，以溶解或干燥形式存在于芯片的腔室中，但本发明不限于此。

本发明的试剂盒中用于进行诊断/检测所需的其他结构包括但不限于用于取样结构、用于进行对照结构和/或用于观察检测过程或结构的结果。

本发明的试剂盒中用于进行诊断/检测所需的其他试剂包括但不限于洗涤剂、显色剂和/或终止剂。

在一个实施方式中，在本发明试剂盒中的抗体是可检测地标记的。可以使用本领域技术人员已知的任何标记物和标记方法。例如，在本发明中可以使用的标记物包括酶、放射性同位素、胶态金属、荧光化合物、化学发光化合物和生物发光化合物，但本发明不限于此。

常用的标记物可包括酶(如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶等)、放射性同位素(如³²P或¹²⁵I)等、生物素、地高辛、胶态金属(如胶体金等)、荧光染料(如荧光素、罗丹明、德克萨斯红等)、化学发光化合物或生物发光化合物(如二氧杂环丁烷、鲁米诺或吖啶鎓等)。可以使用任何本领域众所周知的标记步骤，如酶或生物素基团的共价偶联、碘化、磷酸化、生物素化等。

在一些实施方式中，用于进行诊断/检测所需的其他材料中的一种或多种也可以为可检测地标记的。

在一个优选的实施方式中，本发明的试剂盒是用于检测2型单纯疱疹病毒的试剂盒。

用途

本发明的抗人IgG单克隆抗体或杂交瘤细胞株可用于与人IgG的特异性反应相关的任何目的。优选的，本发明的抗体或杂交瘤细胞株可用于检测2型单纯疱疹病毒。

本发明的抗体或杂交瘤细胞株可对来源于人类的生物样品进行检测。

如本文中所使用的，“生物样品”是指精液、淋巴、血清、血浆、尿、滑液或脊髓液。在优选的实施方式中，生物样品是指血清或血浆。

可以使用免疫测定的方法定量或定性检测人IgG的存在，所述免疫测定通常包括将生物样品与本发明的抗体和/或检测所需的其他材料一同孵育或依次接触，并通过多种本领域熟知的技术检测结合的抗原。

检测方法包括但不限于放射自显影、荧光显微镜检术、直接和间接的酶促反应、放射性同位素法或非放射性同位素法等。这些方法尤其包括Western印迹、重叠测定、RIA(放射免疫测定)和IRMA(免疫放射免疫测定)、GIA(胶体金免疫测定)、EIA(酶免疫测定)、ELISA(酶联免疫吸附测定)、FIA(荧光免疫测定)、以及CLIA(化学发光免疫测定)。

在一个实施方式中，本发明的抗体或杂交瘤细胞株适用于检测人IgG，从而诊断个体是否感染2型单纯疱疹病毒。

下面将结合实施例对本发明的实施方式进行详细描述，实施例中未注明具体条件的，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商的，为可以通过商购获得的常规产品。

实施例1小鼠的免疫

将人血源IgG抗原(四川迈克生物新材料技术有限公司，批号051519)用生理盐水稀释到3.0mg/ml，与弗氏完全佐剂(Sigma公司，货号SLBF-9338V)等体积混合(50μg/只BALB/c小鼠)，用1ml注射器乳化为油状乳液，直至滴入水中的油状乳液不分散方可停止乳化，将该乳液以100μl/只的剂量四肢腋窝皮下施给BALB/c小鼠(成都达硕实验动物中心，5周龄雌性，4只)第一次免疫7天后增强免疫，取人IgG(四川迈克生物新材料技术有限公司，批号051519)与弗氏不完全佐剂(Sigma公司，货号SLBM9367V)等体积混合(25μg/只BALB/c小鼠)后乳化，免疫剂量为100μl/只，以后每隔一周增强免疫一次，每次免疫之前采尾血，分离血清，用间接ELISA法测定效价。免疫3次后，所有小鼠血清效价大于1：10⁶，即可用于融合。融合前3天，取人IgG用生理盐水稀释到3.0mg/ml，再与生理盐水等体积混合(100μg/只BALB/c小鼠)尾静脉追加免疫，剂量为100μl/只。表1示出了4只小鼠免疫3次后血清效价，检测方法同实施例6，结果显示头红和背红小鼠达到融合要求。

表1

血清稀释倍数	1×10<sup>2</sup>	1×10<sup>3</sup>	1×10<sup>4</sup>	1×10<sup>5</sup>	1×10<sup>6</sup>	2×10<sup>6</sup>	4×10<sup>6</sup>	8×10<sup>6</sup>	1.6×10<sup>7</sup>	3.2×10<sup>7</sup>
														免疫小鼠标号	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	阴性	阳性
头红	4.694	3.763	2.712	2.711	2.718	2.067	1.402	0.926	0.50113	0.27022	0.179	0.038	4.782
														背红	4.671	3.72	3.062	3.013	2.908	2.115	1.621	1.001	0.61107	0.33427	0.203	0.044	4.523
尾红	4.258	3.559	2.363	0.628	0.151	0.099	0.045	0.061	0.0429	0.04498	0.046	0.039	4.681
														白	4.129	2.919	0.785	0.199	0.06	0.05	0.039	0.045	0.0469	0.04216	0.046	0.037	4.68

实施例2杂交瘤细胞系的制备

2-1饲养细胞的制备

以正常的12周龄BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞作饲养细胞。在融合前1天，BALB/c取眼血拉颈处死，0.1％新洁尔灭浸泡1分钟，转入75％酒精浸泡1分钟，于超净台内用消毒剪镊从后腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射2ml RPMI1640培养液至腹腔，注意避免穿入肠管。右手固定注射器，使针头留置在腹腔内，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部1分钟，随后吸出注入的培养液。1000r/min离心5-10分钟，弃上清。用已加入20％新生牛血清、1％双抗的RPMI1640培养液重悬，调整细胞浓度为2-5×10⁵个/ml，加入96孔板，100μl/孔，37℃、5％CO₂培养。

2-2免疫脾细胞的制备

取实施例1中免疫血清效价达到1：10⁶的BALB/c小鼠摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。同时通过颈脱位致死小鼠，0.1％新洁尔灭浸泡1分钟，转入75％酒精浸泡1分钟，在超净台内，于无菌的平皿上掀开左侧腹部皮肤，可看到脾脏，换剪镊，用无菌剪剪开腹膜，取出脾脏置于已盛有10ml RPMI1640培养液的平皿中，轻轻洗涤，并细心剥去周围结缔组织。将脾脏移入另一盛有10ml RPMI1640培养液的平皿中，用弯头镊子或装在1ml注射器上的弯针头轻轻挤压脾脏(也可用注射器内芯挤压脾脏)，使脾细胞进入平皿中的RPMI1640培养液。用吸管吹打数次，制成单细胞悬液。为了除去脾细胞悬液中的大团块，可用200目铜网过滤。收获脾细胞悬液，1000r/min离心5-10分钟，用RPMI1640培养液离心洗涤1-2次，然后将细胞重悬于10mlRPMI1640培养液混匀，取上述悬液，加台酚蓝染液作活细胞计数后备用。通常每只小鼠1×10⁸-2.5×10⁸个脾细胞。

2-3骨髓瘤细胞的制备

融合前骨髓瘤细胞维持的方式，对成功地得到杂交瘤细胞是至关重要。目标是使细胞处于对数生长的时间尽可能长，融合前肯定不能少于1周。冻存的细胞在复苏后要2周时间才能处于适合于融合的状态，长过了的骨髓瘤细胞至少5天才可能恢复。在培养过程中处于对数生长的骨髓瘤细胞维持在含10％小牛血清的培养基中，方法是用10个装5ml培养基的培养瓶，接种10倍系列稀释的骨髓瘤细胞。1周后到细胞相当密而又未长过的一瓶重新分瓶培养。典型的倍增时间为14-16小时。骨髓瘤细胞悬液制备方法：于融合前48-36小时，将骨髓瘤细胞扩大培养(一般按一块96孔板的融合实验约需2-3瓶25cm2培养瓶培养的细胞进行准备)。融合当天，用玻璃滴管将细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于50ml离心管内。1000r/min离心5-10分钟，弃去上清。加入30ml RPMI1640培养液，同法离心洗涤一次。然后将细胞重悬浮于30ml RPMI1640培养液，混匀。取骨髓瘤细胞悬液，加0.4％胎酚蓝作活细胞计数后备用。细胞计数时，取细胞悬液0.1ml加入0.9ml中，混匀，用血球计数板计数。细胞密度(个/ml)＝(4大格细胞总数÷4)×10⁴×稀释倍数。

2-4细胞融合及杂交瘤细胞株的选择性培养

将脾细胞与骨髓瘤细胞按1：8的比例混合于50ml离心管中，补加RPMI1640培养液至40ml，充分混匀。1000r/min离心5-10分钟，将上清尽量吸净。在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀；置37℃水浴中预热。用1ml吸管在1分钟左右(最佳时间为45秒)加预热至40℃的50％PEG(PH 7.4)1ml，边加边轻轻晃动混匀。用玻璃滴管在90秒内加20-30ml预热至37℃的RPMI1640培养液；20-37℃静置10分钟。700r/min离心5-10分钟，弃上清。重悬于含有1％HAT与20％新生牛血清的RPMI1640培养液中，平均分装入20个96孔细胞培养板。37℃，5％CO2培养，次日补加含有1％HAT与20％新生牛血清的RPMI1640培养液至孔体积的90％。5天后用HAT培养基换出孔内1/2培养基，7天后再次换出孔内1/2培养基。

2-5阳性杂交瘤细胞株的筛选

用0.06M pH9.6碳酸缓冲溶液稀释人血源IgG至1.5μg/ml，96孔酶标板中每孔包被100μl，用于检测融合后细胞培养上清。放置于2-8℃冰箱中过夜，第二天弃去孔中液体，ELISA洗液洗板三次，拍干，用含10％小牛血清的0.01M pH7.2的PBS，150μl/孔，37℃封闭2小时，拍干，真空封装待用。细胞融合后第九天，取细胞上清100μl于上述96孔酶标检测板中，37℃孵育40min，ELISA洗液洗板五次后加入10000倍稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG(四川迈克生物新材料技术有限公司生产，批号111518)100μL/孔，37℃孵育30min同上洗板后，每孔加入100μL含0.1％(M/V)邻苯二胺，0.1％(V/V)双氧水，pH5.0柠檬酸磷酸缓冲液，37℃孵育10min，每孔加入50μL 2M硫酸溶液终止反应，多功能读数仪检测450nm吸收值。以融合时小鼠血清稀释至100倍为阳性对照，RPMI 1640完全培养液作为阴性对照，阴性对照OD值＜0.2，阳性对照OD值＞2.0为检测系统有效，样本OD值≥2×阴性对照OD值时，为阳性，反之为阴性。

2-6阳性杂交瘤细胞株的克隆化

按照实施例2 2-1中制备饲养细胞的方法铺板饲养细胞，制备阳性杂交瘤细胞悬液，用含20％血清的HT培养基稀释至每毫升含1个细胞的稀释度，筛选阳性孔同同实施例22-5方法连续克隆4次及以上，直至达到100％单克隆。

2-7阳性杂交瘤细胞株的冻存

将实施例2 2-6中克隆到100％单克隆且间接法检测为阳性的细胞，转入24孔继续培养，待细胞长满80％时转入细胞瓶扩大培养后，待细胞长满细胞瓶80％时分瓶传代，传代的细胞生长至对数期时，用适量无血清RPMI-1640培养基分散细胞瓶内细胞，收集细胞悬液于锥形离心管中，记录细胞悬液体积V，取适量细胞悬液进行细胞计数，得到细胞悬液密度(个/ml)，其余1000rpm离心5min后弃上清液，根据细胞密度和离心前体积算出沉淀的细胞数，向细胞沉淀中加入适量冻存液调整细胞密度至1-3×10⁶个/ml(取适量进行计数确认，如果细胞数未在范围内，则重新离心按照细胞计数总量，重新加入适量冻存液，最终使细胞浓度在4-8×10⁶个/ml)，然后分装于无菌冻存管中，每只冻存管分装重悬细胞冻存液0.5ml。细胞融合一次共获得1株能稳定分泌抗人IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞株，记作杂交瘤细胞株6B5，于2018年8月23日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO.C2018173。

实施例3单克隆抗体的制备

选12-14周健康的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5ml液体石蜡(天津科密欧)，7天后每只小鼠腹腔注射1.8×10⁶个杂交瘤细胞。接种细胞7-10天后可产生腹水，每天观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可拉颈处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一只小鼠可获1-5ml腹水。收集的腹水离心取上清，取小样放于-20℃冰箱保存。腹水分别用硫酸氨饱和沉淀后，再用蛋白A亲合层析柱纯化，SDS-PAGE检测抗体(记作人IgG-Ab)纯度大于90％。

实施例4单克隆抗体的纯化

将-20℃以下冻存人IgG-Ab腹水提前一天置于2-8℃冰箱中解冻过夜。第二天，将腹水混合，2-8℃、12000rpm离心20分钟，去油脂和沉淀，上清用Mab Loading Buffer稀释10倍，再用0.22μm滤膜过滤。将上述滤后液上样5mL-mabselectsure介质，使用AKTA纯化仪，收集穿透。上样完成后用平衡液平衡层析柱至基线平稳，使用洗脱液洗脱目的蛋白，收集大于100mAu的洗脱峰，洗脱完成后层析柱用0.1M氢氧化钠进行清洗，然后保存层析柱。对洗脱的目的蛋白进行中和，每ml洗脱液滴加0.1ml中和液。混匀中和后，将蛋白置于3L透析液中透析，每两个小时换一次液，换液至少3次。将透析好的目的蛋白12000rpm离心20分钟，上清即为最终成品。

实施例5单克隆抗体的纯度检测

组装好电泳玻璃板，配制下层12％的分离胶和上层5％的浓缩胶的SDS-PAGE胶。组装好凝胶电泳槽，加入适量的1×电泳缓冲液。在测定抗体浓度后，取少量抗体用10mM PBS稀释到大约1mg/mL浓度，取40μl稀释后的抗体加入10μl的5×样品缓冲液，混匀后煮沸10分钟，再以5000rpm离心10分钟，备用。去上清10μl上样，先以70V电泳至浓缩胶与分离胶分界线处(约15分钟)，以140V电泳直至溴酚蓝即将跑出凝胶停止电泳。电泳完成后，从电泳玻璃板上将SDS-PAGE胶剥离下来，放入染色液中，清洗玻璃板，晾干备用。现用考马斯亮蓝染液浸染SDS-PAGE胶30分钟，再用考马斯亮蓝脱色液将胶洗脱至背景无色(可适当热脱色)。用凝胶成像仪对PAGE胶进行拍照，通过软件对图像灰度进行分析，估算抗体纯度。检测抗体电泳图各条带的分子量和蛋白带型是否正确。电泳如图1所示。

实施例6杂交瘤细胞株培养上清效价检测

用0.06M pH9.6碳酸缓冲溶液稀释人血源IgG(四川迈克生物新材料技术有限公司，批号051519)至1.5μg/ml，96孔酶标板中每孔包被100μl。放置于冰箱中2-8℃过夜，第二天弃掉孔中液体，ELISA洗板机洗三次，拍干，用含10％小牛血清的0.01M pH7.2的PBS，150μl/孔，37℃封闭2h弃液体，拍干，用于检测细胞培养上清、腹水及抗体效价。细胞上清效价检测，从第1孔至第10孔以0.01M pH7.2的PBS缓冲液2倍逐级稀释。第11孔以融合时小鼠血清稀释至100倍作阳性对照，第12孔以RPMI 1640完全培养液作阴性对照，阴性对照OD值＜0.2，阳性对照OD值＞1.8为检测系统有效，当OD值≥2×阴性对照OD值时，为阳性，反之为阴性。检测结果见表2，检测值最低阳性孔所对应的稀释比例即为细胞培养上清效价，此杂交瘤细胞株培养上清效价可达1：4096。

表2细胞上清效价检测

实施例7腹水效价检测

ELISA检测方法同实施例6。具体方法为：第1孔为原倍腹水，以0.01M pH7.2的PBS缓冲液从第2孔至第7孔10倍逐级稀释，从第8孔至第10孔以2倍逐级稀释。第11孔以融合时小鼠血清稀释至100倍作阳性对照，第12孔以RPMI1640完全培养液作阴性对照，阴性对照OD值＜0.2，阳性对照OD值＞1.8为检测系统有效，当OD值≥2×阴性对照OD值时，为阳性，反之为阴性。检测结果见表3，检测值最低阳性孔所对应的稀释比例即为腹水效价，此杂交瘤细胞株(记作杂交瘤细胞株6B5)所制备的抗人IgG单克隆抗体(记作人IgG-Ab)腹水效价可达1：4×10⁶。

表3腹水抗体效价检测

酶标孔编号	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													腹水稀释倍数	0	10	100	1×10<sup>3</sup>	1×10<sup>4</sup>	1×10<sup>5</sup>	1×10<sup>6</sup>	2×10<sup>6</sup>	4×10<sup>6</sup>	8×10<sup>6</sup>	阳性对照	阴性对照
腹水抗体	3.929	3.012	1.895	1.258	0.707	0.413	0.354	0.263	0.21	0.188	3.1325	0.0453

实施例8抗体效价检测

先将实施例4中制备的纯化后的抗体以0.01M pH7.2的PBS缓冲液统一稀释为1mg/ml，后从第1孔开始至第3孔做10倍逐级稀释，第4孔至第11孔做2倍稀释，第12孔为阴性对照。抗体效价判定标准：以log(稀释度)为横坐标，以OD值为纵坐标作曲线，曲线方程为y＝min+(max-min)/(1+10^((logEC50-x)×Hillslope))，采用sigmaplot软件拟合曲线，取效价＝10logEC50。结果显示此杂交瘤细胞株(5A3)所分泌的抗体效价大于1×10⁵。以同样方法对照检测两种商业化抗人IgG单克隆抗体B和C，通过拟合，中值效价均低于1×10⁴，低于本发明的杂交瘤细胞分泌的抗体。表4与图2列出了效价测定结果。

表4抗体效价检测

实施例9交叉反应性检测

(1)HRP标记人IgG-Ab

溶液配制：

a.2mg/ml HRP:1mgHRP溶于0.5ml纯化水中(现配现用)

b.60mM偏高碘酸钠：80.2mg偏高碘酸钠溶于6.25ml纯化水中(现配现用)

c.160mM乙二醇：8.93ul乙二醇加入1ml纯化水中(现配现用)

d.1mg/ml硼氢化钠：1mg硼氢化钠溶于1ml纯化水(现配现用)

e.饱和硫酸铵

f.0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)：碳酸钠1.59g/L，碳酸氢钠2.93g/L

取0.5ml偏高碘酸钠缓慢滴加入0.5ml HRP中，边加边混匀，2-8度避光放置30min，取0.5ml乙二醇缓慢低加入上述溶液，边加边混匀，室温避光反应30min，活化的HRP缓慢加入0.5mg抗体中(标记比为1：2)，0.05M CB透析过夜，期间换液一次，取出透析带中的抗体，计算体积，每毫克抗体加入0.2ml硼氢化钠(硼氢化钠与水反应开始产生气泡时加入)，2-8度反应2h，上述溶液中加入等体积的饱和硫酸铵溶液，2-8度放置2h，10000rpm离心10min，弃去上清，沉淀用20mM PBS复溶，20mM PBS透析过夜，取出标记好的人IgG-Ab-HRP，根据体积计算相应浓度，加入等体积甘油保存。

(2)包被人IgG，鼠IgG，兔IgG，牛IgG和人IgM(2.5ug/ml)每孔100ul，4度过夜。10mMTris-HCl(7.4)+0.5％酪蛋白封闭，每孔150ul，37度2h。按上述方法标记抗人IgG-Ab，将标记好的酶标抗体分别进行1000，2000，4000倍稀释，分别与五种包被抗原进行反应，酶标抗体加量为50ul，37度孵育30min，洗板，显色，检测结果见表5，结果显示人IgG-Ab与五种抗原均无交叉反应。

表5交叉反应检测

酶标稀释倍数	1000倍	2000倍	4000倍
				人IgG	0.618	0.349	0.204
鼠IgG	0.061	0.059	0.048
				兔IgG	0.134	0.103	0.112
牛IgG	0.076	0.064	0.067
				人IgM	0.021	0.031	0.042

实施例10稳定性验证

本发明抗体人IgG-Ab在恶劣环境下的稳定性

将本发明抗体人IgG-Ab在以下条件下处理：d₁-20℃反复冻融1次；d₂-20℃

反复冻融3次；d₃-20℃反复冻融5次；d₄-20℃反复冻融7次；d₅-20℃保存5个月；d₆37℃热加速7天；d₇ 37℃热加速14天，将上述条件下的抗体按实施例5进行纯度检测，检测结果如图3，结果显示纯度无改变。其他条件不变，按实施例9进行HRP标记，再制备成检测试剂分别检验15份阳性参考品与15份阴性参考品，结果见表6，显示符合率均为100％。表明本抗体稳定性良好，且利用本抗体制备的检测试剂精密性良好。选取效价较高的商业化抗人IgG单克隆抗体B，以上述同样条件处理后按实施例5进行纯检测，

结果如图4，结果显示其37℃热加速14天后已开始部分降解，后再制备成检测试剂分别检测15份阳性参考品与15份阴性参考品，结果见表6，，检验结果与参考品不完全符合。

表6稳定性检测

由此可见，本发明的单克隆抗体稳定性高，由其制成的2型单纯疱疹病毒IgG抗体检测试剂及试纸条在较为恶劣的环境条件下还能保持很高的稳定性与可靠性，这一点在临床以及实验室应用中均是非常宝贵的进步。

应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。

本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。

Claims (10)

1.一种杂交瘤细胞株6B5，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2018173。

2.一种单克隆抗体，所述单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株所分泌。

3.一种试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的杂交瘤细胞株或权利要求2所述的单克隆抗体。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，所述试剂盒为胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒、荧光免疫试剂盒或者微流体芯片。

5.权利要求1所述的杂交瘤细胞株或权利要求2所述的单克隆抗体在制备试剂盒中的用途。

6.根据权利要求5所述的用途，所述试剂盒是基于免疫检测的试剂盒。

7.根据权利要求6所述的用途，所述试剂盒为胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒、荧光免疫试剂盒或者微流体芯片。

8.根据权利要求5所述的用途，所述试剂盒用于检测人IgG。

9.根据权利要求8所述的用途，所述人IgG为2型单纯疱疹病毒IgG。

10.权利要求1所述的杂交瘤细胞株或权利要求2所述的单克隆抗体在制备用于2型单纯疱疹病毒检测的试剂盒中的用途。

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