CN107635581A

CN107635581A - 用于单克隆抗体的稳定液体制剂

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Publication number: CN107635581A
Application number: CN201680021283.5A
Authority: CN
Inventors: T·布塞默尔; A·皮珀; D·萨希; N·施特雷贝; A·尤斯夫
Original assignee: Sanofi Aventis France
Current assignee: Sanofi SA; Sanofi Aventis France
Priority date: 2015-02-13
Filing date: 2016-02-12
Publication date: 2018-01-26
Also published as: US20180008707A1; TW201632203A; EP3256160A1; SG11201706505PA; RU2017131618A; JP2018507202A; AU2016217806A1; CA2976298A1; WO2016128564A1; KR20170117166A; MX2017010400A; BR112017016636A2

Abstract

本发明涉及用于单克隆抗体，例如IgG抗体的稳定的药物组合物。本发明还涉及使用本发明的药物组合物的药物和治疗。此外，本发明涉及包含至少一种本发明的药物组合物的试剂盒和用于减少抗体聚集的方法。

Description

用于单克隆抗体的稳定液体制剂

本发明涉及单克隆抗体，例如IgG抗体的稳定的药物组合物。本发明还涉及使用本发明的药物组合物的药物和治疗。此外，本发明涉及包含至少一种本发明的药物组合物的试剂盒和用于减少抗体聚集的方法。

抗体的不稳定性是抗体药物商业开发的主要障碍之一。例如，某些现有的抗体制备物的货架期短，抗体在储存过程中可能由于化学和物理不稳定性而丧失生物活性。化学不稳定性可能由于脱酰胺、消旋化、水解、氧化、beta消除或二硫键交换所导致，而物理不稳定性可能由于抗体变性、聚集、沉淀或吸附所致。在这些之中，聚集、脱酰胺和氧化已知是抗体降解的最常见原因(Cleland et al.,1993,Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems 10(4):307-377)。因此，存在对结合感兴趣抗原的抗体的稳定组合物的需求，这样的稳定组合物表现出例如增加的稳定性、低水准乃至不可检出水平的聚集，以及低水平乃至不可检出水平的抗体片段化/降解。此外，由于所述稳定组合物的改善的物理和化学稳定性，它们还极少有或没有抗体生物活性丧失，即使在长期储存中亦是如此。

研发了人抗TNFAlpha单克隆抗体D2E7，命名为阿达木单抗(Adalimumab)，来治疗例如类风湿性关节炎和克罗恩氏病，如国际专利申请WO199729131所述。阿达木单抗是一种IgG1类单克隆抗体，由艾伯维(Abbvie)以名为修美乐的商品化制剂的形式销售。该抗体现在普遍用于斑块状干癣(plaque psoriasis)、克罗恩氏病(crohn'sdisease)、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)、干癣性关节炎(psoriatic arthritis)、强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、多发性和幼年型特发性关节炎的治疗。

的商品制剂在国际专利申请WO2004/016286和EMA颁发的上市许可的附件I中有描述。其包含抗-TNFAlpha抗体、甘露醇、柠檬酸一水合物、柠檬酸钠、二水合磷酸二氢钠(sodium dihydrogen phosphate dehydrate)、氯化钠、聚山梨醇酯80和氢氧化钠。

本发明人发现，的市售制剂对机械胁迫的稳定性有限。

本发明人开发了包含阿达木单抗的生物仿制药的新组合物，并证明本发明的组合物可改善抗TNFAlpha抗体对机械和热胁迫的稳定性。

进一步显示，本发明的包含乙酸盐或组氨酸缓冲液、甘氨酸和/或甘露醇、以及表面活性剂(例如聚山梨醇酯)的组合物可最小化抗体聚集物和颗粒物的形成。与市售的制剂(如WO 2004/016286中所述的制剂)相比，当组合物例如在55℃下储存1周后(见实施例部分的表15和表23)，本发明的组合物展示例如更高的单体抗体含量，更少的聚集物和片段。

具体地，尺寸排阻层析(SEC)分析证实，在55℃下1周后，受测的组合物的抗体单体含量超过总峰面积的95％，而制剂中的抗体单体含量仅为总峰面积的89％。

本发明人进一步在长期研究中证实，包含至少一种乙酸盐或组氨酸缓冲液、甘氨酸和/或甘露醇、以及表面活性剂(例如聚山梨醇酯)的组合物即使在40℃下3个月后仍然具有超过总峰面积90％的单体量，因此在测试的条件下是稳定的。此外，本发明人在稳定性研究中显示，本发明的组合物在暴露于机械胁迫，例如200rpm下3小时之后，仍然具有占总峰面积超过99％的单体量，因此在测试的条件下是稳定的。

此外，所述的组合物在测试的条件下对冻融所致的胁迫有抗性，相应地，即使在第5次循环之后单体的量仍然超过总峰面积的99％，因此在测试的条件下是稳定的。

在另一个实例中，本发明的组合物在例如颗粒形成方面显示更高的机械稳定性，例如与市售制剂(如WO 2004/016286所描述的制剂)相比，观察到较少量的不可见粒度(>1μm但<10μm)的小聚集物，如实施例6，表24所示。如实施例中进一步显示的，这些效果尤其与缓冲液的选择(乙酸盐或组氨酸)、pH范围、甘露醇或甘氨酸的添加，以及去污剂如聚山梨醇酯的添加等有关。本发明人进一步证明天冬酰胺和谷氨酰胺具有可与甘氨酸实现的稳定化效果相比拟的稳定化效果。

因此本发明限定了用于抗体，如IgG抗体，例如抗hTNFAlpha抗体的合适的药物组合物，其包含：抗体；乙酸盐或组氨酸缓冲液；至少一种氨基酸，其中氨基酸选自甘氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺，例如甘氨酸和天冬酰胺，和/或选自海藻糖和甘露醇的至少一种赋形剂；以及表面活性剂，例如聚山梨醇酯。

发明内容

因此本发明涉及一种药物组合物，包含：

a)抗体；

b)选自乙酸盐和组氨酸的至少一种缓冲剂；

c)选自甘氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺的至少一种氨基酸，例如谷氨酰胺和天冬酰胺，和/或选自海藻糖和甘露醇的至少一种赋形剂；以及

d)表面活性剂，

其中该组合物的pH为5.0至6.5。

在一个实施方案中，所述至少一种赋形剂为甘露醇。

在一进一步的实施方案中，所述至少一种氨基酸为甘氨酸。

所述抗体为治疗性抗体。在一个实施方案中，所述治疗性抗体为IgG抗体。在一个进一步的实施方案中，所述IgG抗体为抗hTNFAlpha抗体。

本发明基于一项惊人的发现，即具有5.0-6.5的pH值、包含乙酸盐或组氨酸缓冲液、甘氨酸和/或甘露醇、以及表面活性剂如聚山梨醇酯的药物组合物可改善抗体的稳定性。此外，本发明人已显示，添加氯化钠并不有利于抗hTNF抗体的稳定性。添加氯化钠甚至对抗体的变性温度(T_M)有负面影响。

由此，在一个实施方案中，本发明的组合物包含少于10mg/ml氯化钠，例如，少于7mg/ml氯化钠。在一个实施方案中，所述组合物包含2mg/ml或更少的氯化钠。在另一个实施方案中，组合物不包含氯化钠。

在一个实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇酯，例如聚山梨醇酯80或20。组合物可包含0.01％w/v至1％w/v表面活性剂(重量比组合物的总体积)。

本发明的组合物可包含例如0.01％w/v的聚山梨醇酯20。在另一实例中，组合物可包含0.1％w/v的聚山梨醇酯80。

在一个实施方案中，组合物可包含1至100mM的至少一种缓冲剂，例如5-50mM、5-20mM，例如5-15mM，例如10mM。

本发明的组合物可包含30-70mg/ml的抗体，例如50mg/ml。

本发明的组合物可包含1-30mg/ml的至少一种氨基酸。

在一个实施方案中，该至少一种氨基酸是甘氨酸。组合物可包含5-30mg/ml的甘氨酸，例如15mg/ml的甘氨酸。

在另一个实施方案中，该至少一种氨基酸是天冬酰胺。所述组合物可包含1-10mg/ml的天冬酰胺，例如2mg/ml的天冬酰胺。

在一个实施方案中，该至少一种赋形剂是海藻糖。组合物可包含1-70mg/ml的海藻糖，例如50mg/ml的海藻糖。

在另一个实施方案中，该至少一种赋形剂是甘露醇。组合物可包含1-60mg/ml的甘露醇，例如20mg/ml的甘露醇。

在一个实施方案中，本发明涉及药物组合物，其包含：

a)40至50mg/ml抗体，

b)5至15mM乙酸盐缓冲液或组氨酸缓冲液，

c)15至25mg/ml甘露醇和/或10至20mg/ml甘氨酸，和

d)0.08至0.12％w/v聚山梨醇酯80或0.008至0.012％w/v聚山梨醇酯20,其中该组合物的pH为5.0至6.5。

在一个进一步的实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，其包含：

a)50mg/ml抗体，

b)5至15mM乙酸盐缓冲液或组氨酸缓冲液，

c)15至25mg/ml甘露醇和/或10至20mg/ml甘氨酸，和

d)0.08至0.12％w/v聚山梨醇酯80或0.008至0.012％w/v聚山梨醇酯20，其中该组合物的pH为5.0至6.5。

在一个实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，其包含：

a)40至50mg/ml抗体，

b)5至15mM乙酸盐缓冲液或组氨酸缓冲液，

c)20mg/ml甘露醇和/或15mg/ml甘氨酸，和

d)0.1％w/v聚山梨醇酯80或0.01％w/v聚山梨醇酯20，其中该组合物的pH为5.0至6.5。

在一具体实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，其包含：

a)50mg/ml抗体，和

b)5至15mM乙酸盐缓冲液或组氨酸缓冲液，和

c)20mg/ml甘露醇，和/或15mg/ml甘氨酸，和

本发明人已开发出一种抗TNFAlpha抗体的药物组合物，该抗TNFAlpha抗体与相同抗TNFAlpha抗体存在于市售制剂中时相比稳定性改善。因此，在一个实施方案中，与相同抗TNFAlpha抗体的参考组合物相比，所述药物组合物可提供具有改善的稳定性的抗TNFAlpha抗体。

改善的稳定性是指，例如，当暴露于胁迫(stress)时增加的物理和/或化学稳定性，其中所述的胁迫可以为机械胁迫、热胁迫和/或冻融胁迫(freeze and thaw stress)。由此，本发明的新开发的药物组合物相比参考组合物可更好地耐受胁迫条件，尤其是热胁迫和/或机械胁迫。

发明详述

抗体

“抗体”可以是天然或常规抗体，其中两条重链通过二硫键彼此连接，且每一重链通过二硫键与轻链连接。存在两种类型的轻链，lambda(λ)和kappa(κ)。有五个决定抗体分子功能活性的主要重链类别(或同型)：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每种链含有独特的序列结构域。轻链包含两个域或区：可变域(VL)和恒定域(CL)。重链包含四个域：一个可变域(VH)和三个恒定域(CH1、CH2和CH3，统称为CH)。轻链(VL)和重链(VH)二者的可变区决定对抗原的结合识别和特异性。IgM、IgD、IgG、IgA和IgE亚类在重链的恒定区中有氨基酸序列差异。某一给定类别之内的所有免疫球蛋白将具有非常类似的重链恒定区。轻链(CL)和重链(CH)的各恒定区域赋予重要的生物特性，如抗体链联合、分泌、透胎盘活动性、补体结合和与Fc受体(FcR)的结合。Fv片段是免疫球蛋白Fab片段的N端部分，由一条轻链与一条重链的可变部分组成。抗体的特异性存在于抗体结合位点与抗原决定区之间的结构互补性之中。抗体结合位点由主要来自超变或互补决定区(CDR)的残基构成。有时，来自非超变或框架区(FR)的残基影响总体域结构，且因此影响结合位点。

如本文中使用的，术语“抗体”指代常规抗体及其片段，以及其单域抗体及其片段，例如单域抗体的可变重链，以及嵌合、人源化、双特异性或多特异性抗体。

本发明人示明，本发明的药物组合物可在胁迫条件，比如机械胁迫和/或热胁迫下稳定化抗TNFAlpha抗体。在实例中使用的抗TNFAlpha抗体是IgG抗体。因此，在一实施方案中治疗性抗体是单克隆抗体，例如IgG抗体。

术语“IgG抗体”涵盖，除其他事项外，不同的IgG亚类(例如IgG1、2、3、4)。IgG抗体可以基于重链的恒定区中氨基酸序列的微小差异而分为多个亚类。IgG抗体是约150kDa的分子，由四条肽链构成。它含有两条相同的约50kDa的γ重链，和两条相同的约25kDa的轻链，从而具有四聚体四级结构。两条重链通过二硫键相互连接，并各自与一条轻链连接。所成的四聚体具有相同的两半，二者形成叉型或者类似Y的形状。叉的每一端含有一个相同的抗原结合位点。

“互补决定区”或“CDR”指共同定义天然免疫球蛋白结合位点的天然Fv区之结合亲和性及特异性的氨基酸序列。免疫球蛋白的轻链和重链各具有三个CDR，分别称为CDR1-L、CDR2-L、CDR3-L和CDR1-H、CDR2-H、CDR3-H。因此，常规抗体抗原结合位点包含六个CDR，包括分别来自重链和轻链V区的CDR集合。

“框架区”(FR)指插入各CDR之间的氨基酸序列，即指免疫球蛋白轻链和重链可变区中在单一物种的不同免疫球蛋白之间相对保守的那些部分。免疫球蛋白的轻链和重链各具有四个FR，分别称为FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L，和FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。

在一个实施方案中，本发明语境下的抗体是治疗性抗体。

如本文中使用的，术语“治疗性抗体”或“治疗用抗体”或“供治疗用的抗体”包括人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和鼠抗体。它还包括从人、哺乳动物、脊椎动物或脊索动物分离的天然抗体，以及诱变的或基因工程的抗体。

在一个实施方案中，抗体指结合人TNFAlpha(hTNFAlpha)的抗体。在本发明的语境下的抗体进一步具有下述特征：结合hTNFAlpha而不结合hTNFBeta(淋巴毒素)，并且除结合人TNFAlpha之外，还具有结合其他灵长类TNFAlpha和非灵长类TNFAlpha的能力。

术语“人TNFAlpha”(本文中缩写为hTNFAlpha，或直接为hTNF)，如本文中使用的，意指一种人细胞激素，作为17kD分泌型和26kD膜结合型存在，其生物活性形式由非共价结合的17kD分子所成的三聚体构成。hTNFAlpha的结构在例如Pennica,D.et al.,1984(Nature 312:724-729),Davis,J.M.,et al.1987(Biochemistry 26:1322-1326)和Jones,E.Y.,et al.,1989(Nature 338:225-228)中有进一步描述。TNF alpha的至少一个表位的结合即可抑制受体结合反应，由此开启了治疗如下所述的病症的机制。在一个实施方案中，所述抗体抑制或对抗有害的hTNFAlpha活性。

在一个实施方案中，将在本发明的框架内使用的抗体可以是称为D2E7或阿达木单抗(Abbvie)的抗TNFAlpha抗体，或通过表面重构技术获得的它们的衍生物。上述抗体的蛋白质序列是公众可获得的，例如在WO2004/016286(阿达木单抗/D2E7)或WO97/29131(D2E7)中有述及。

在一个进一步的实施方案中，如上所述的药物组合物包含结合靶物CXCR5、LAMP 1或VLA-2的治疗性抗体。

术语“CXCR5”，如本文中使用的，指一种非杂泛性(non-promiscuous)受体。CXCL13是CXCR5的一种配体，在基质细胞(例如滤泡树突细胞)中，以及淋巴组织中组成型表达。此外，活化的T细胞诱导或正向调控CXCR5表达。由于CXCR5在成熟B细胞上选择性表达，成熟B细胞与类风湿性关节炎有联系，因此阻断这种受体将会在受影响的个体中调变致关节炎性应答。

在一具体实施方案中，将在本发明的框架内使用的抗体可以是抗CXCR5抗体，例如在WO2009/032661中公开的抗CXCR5抗体，或其通过表面重塑技术获得的衍生物。这样的抗体的蛋白质序列是公众可获得的，例如在WO2009/032661中有述及。

如本文中使用的，术语“表面重塑技术”指一种人源化技术，其中非人来源的非表面暴露的残基被保留，而表面残基被改变为人残基。表面重塑技术使用分子模拟、统计分析和诱变的组合来改变抗体可变区的非CDR表面以模仿目标宿主的已知抗体的表面，同时维持抗体的完整抗原结合亲和力和特异性。当目标宿主为人时，表面重塑技术相应地减少异种基因抗体(例如鼠抗体)的免疫原性，以便于导入人体。用于表面重塑抗体的策略和方法，以及其他用于降低抗体在不同宿主中的免疫原性的方法，公开于美国专利号5,639,641中。简单而言，在一优选方法中，(1)生成一抗体重链和轻链可变区池的位置比对，得出一组重链和轻链可变区框架表面暴露位置，其中所有可变区的对齐位置至少有98％是相同的；(2)为啮齿类动物抗体(或其片段)定义一组重链和轻链可变区框架表面暴露氨基酸残基；(3)鉴定出与该组啮齿类表面暴露氨基酸残基最接近相同的一组重链和轻链可变区框架表面暴露氨基酸残基；(4)用步骤(3)所鉴定出的一组重链和轻链可变区框架表面暴露氨基酸残基替换步骤(2)所定义的一组重链和轻链可变区框架表露氨基酸残基，但距离该啮齿类动物抗体的互补决定区任何残基之内的那些氨基酸残基除外；以及(5)制备具有结合特异性的人源化啮齿类动物抗体。因此，在一个实施方案中“表面重塑”抗体也可以称为人源化抗体，反之亦然。

在一个实施方案中，要在本发明的框架内使用的抗体是与D2E7或阿达木单抗(Abbvie)或其生物仿制药包含相同的重链和轻链序列的抗TNFAlpha抗体。

在一个进一步的实施方案中，要在本发明的框架内使用的抗体是阿达木单抗的生物仿制药或者可与阿达木单抗互换者。

如本文中使用的，(某种已获批准的参照产品/生物药，例如蛋白质治疗剂、抗体等等的)“生物仿制药”指这样的生物产品，基于从下述(a)和/或(b)和/或(c)获得的数据，其与参照产品是相似的：(a)分析研究，证明该生物产品与参照产品高度相似、即使在无临床活性的组分上有细微差异；和/或(b)动物研究(包括毒性评估)；和/或(c)足以证明在一种或多种合适的使用条件(参照产品已得到许可用于并意图用于该使用条件、且该生物产品寻求获得该使用条件的许可)下的安全性、纯度和功效的临床研究(包括免疫原性的评估，和药动学或药效学)。在一个实施方案中，针对在拟定标签(proposed labeling)中规定、推荐或建议的症状，生物仿制药生物产品与参照产品采用相同的作用机制，但仅以该作用机制就该参照样品而言是已知的为限。在一个实施方案中，在该生物产品的拟定标签中规定、推荐或建议的症状既往在参照产品中已得到批准。在一个实施方案中，该生物产品的施用途径、剂型和/或规格(strength)与参照产品相同。在一个实施方案中，制造、加工、包装或存放该生物产品的设施符合旨在保证该生物产品保持安全、纯质、强力的标准。参照产品可在美国、欧洲或日本之中至少一处获得批准。

在一个实施方案中，本发明语境下的抗体的重链包含阿达木单抗的重链CDR(CDR1-H、CDR2-H、CDR3-H)，且轻链包含阿达木单抗的轻链CDR(CDR1-L、CDR2-L和CDR3-L)。

在一个进一步的实施方案中，本发明语境下的抗体的重链包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中存在的重链CDR(CDR1-H、CDR2-H、CDR3-H)，且轻链包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中存在的轻链CDR(CDR1-L、CDR2-L和CDR3-L)。

在一个进一步的实施方案中，本发明语境下的抗体的重链包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中存在的重链可变域，且轻链包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中存在的轻链可变域。

在一个进一步的实施方案中，本发明语境下的抗体包含由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的重链，和由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的轻链。

关于免疫球蛋白轻链或重链的CDR/FR定义可基于Kabat定义(http://www.bioinf.org.uk/abs/)或IMGT定义(Lefranc et al.Dev.Comp.Immunol.,2003,27(1):55-77；www.imgt.org)给出。这两种定义都是本领域技术人员已知的，因此本领域技术人员能够基于那些定义确定给定的轻链和重链氨基酸序列的CDR和FR。如上文提到的，上述抗体的蛋白质序列是公众可获得的，例如在WO2004/016286(阿达木单抗/D2E7)或WO97/29131(D2E7)中述及。

本发明的语境中还公开了包含与本文中公开的序列至少85％相同，更具体地说至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列的抗体。

“与参照序列至少85％相同”的序列是在其全长上与参照序列的全长有85％序列同一性，或者更多，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。

“序列同一性”的百分比可以通过比较两个序列来确定，两个序列在比较窗口上以最优方式对齐，其中为了使两条序列以最优方式对齐，多核苷酸或多肽序列处于比较窗口内的部分与参照序列(其不包含添加或缺失)相比可以包含添加或缺失(即缺口)。百分比如下计算：确定在两条序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目，得到匹配位置的数目；用匹配位置的数目除以比较窗口中位置的总数，结果乘以100得到序列同一性百分比。用于比较的最优比对通过全域成对比对来进行，例如利用Needleman和WunschJ.Mol.Biol.48:443(1970)的算法。序列同一性的百分比可以利用例如Needle程式，使用BLOSUM62矩阵及下列参数容易地求出：缺口产生(gap-open)＝10,缺口延(gap-extend)＝0.5。

在一具体实施方案中，依照本发明使用的抗体是裸抗体，即其不与任何药物连接以形成抗体-药物缀合物。

药物组合物

如本文中使用的，术语“药物组合物”指这样的液体制备物，其处于容许活性成分的生物活性明确地发挥作用的形式，并且不含有任何对该组合物要施用的受试者有显著毒性的其他组分。这样的组合物是无菌的。“药学可接受的”赋形剂(溶媒、添加剂)是适合于施用给受试者的那些。

“药物制剂”或“制剂”指活性药物与化学物质组合以产生最终的药物产品的过程，亦指该过程的产物，因此最终制剂指例如胶囊、丸剂、片剂、乳液或组合物等药物产品。因此，在一个实施方案中，药物制剂是药物组合物。

在一个实施方案中，本发明的药物组合物是稳定的。

“稳定性”指化学稳定性和物理稳定性，可以使用各种分析技术来定性和/或定量评估，这些分析技术在现有技术中有描述，并且在例如Peptide and Protein DrugDelivery,247-301,Vincent Lee Ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)及Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90(1993)中有综述。那些方法包括聚集物形成的评估(例如利用尺寸排阻层析、通过测量浊度，和/或通过目视检查)；通过使用阳离子交换层析或毛细管区域电泳评估电荷异质性；氨基-末端或羧基-末端序列分析；质谱法分析；SDS-PAGE分析以比较经还原的和完整的抗体；肽图(例如胰蛋白酶或LYS-C)分析；评估抗体的生物活性或抗原结合功能；等等。不稳定性可涉及下列中的任一或多项：聚集、脱酰胺(例如Asn脱酰胺)，氧化(例如Met氧化)，异构化(例如Asp异构化)，剪切/水解/片段化(例如铰链区片段化)，琥珀酰亚胺形成，不成对的半胱氨酸，N-末端延伸，C-末端加工，糖基化改变，等等。在本文中，“脱酰胺”的单克隆抗体是这样的抗体，其中一个或多个天冬酰胺残基已经被修饰，例如通过转译后修饰作用而修饰成为天门冬氨酸或异天门冬氨酸。为了测量稳定性，可以在稳定性研究中测试本发明组合物的样品，其中将样品暴露于胁迫条件一段选定的时间，然后利用适当的分析技术对化学和物理稳定性加以定量和定性的分析。

因此，可以在选定的温度下经过一段选定的时间来测量稳定性，例如通过将样品储存在-80℃、-20℃、5、25及55℃历时长达1个月，并利用例如SEC、WCX、光阻法、浊度和DLS进行定性和定量分析。

如上所述，“稳定的组合物”是这样的组合物，其中抗体是物理稳定且化学稳定的，和/或在储存中保持其生物活性。

“化学稳定性”可以通过检测和定量抗体的化学改变形式来评价。化学改变可涉及大小变更(例如剪切)，大小变更可以通过，例如，利用尺寸排阻层析、SDS-PAGE和/或基质辅助的激光解吸离子化/飞行时间层析法(MALDI/TOF MS)来评估。其他化学改变类型包括电荷改变(例如作为脱酰胺的结果而发生的)，它可以通过例如离子交换层析来评估。在本发明的语境中，化学稳定性通过例如弱阳离子交换层析(WCX)来测量，其中2-3％的改变可视为显著。

“物理稳定性”在本发明的语境下主要指抗体没有聚集、沉淀和/或变性的征象。评价物理稳定性的方法有，例如，尺寸排阻层析(SEC)、动态光散射(DLS)、不透光度(LO)、以及颜色和澄清度。对于尺寸排阻层析(SEC)，1％的含量差异在本发明的语境中可以视为在测试的条件下有显著差异，取决于所用的柱、操作压力、缓冲液的速度。

如果某种抗体在药物组合物中对其预定目的而言是生物活性的，则该抗体在药物组合物中“保留其生物活性”。例如，如果药物组合物中抗体的生物活性在该药物组合物制成时显示的生物活性(例如，通过抗原结合测定法测定的)的约30％，约20％，或约10％之内(在测定法的误差之内)，则生物活性被保留。如本领域技术人员所知的，对于适宜的药学活性组合物而言，配制在溶液中的单体型抗体的量是至关重要的。由于聚集物可能是造成若干严重副作用的原因，所以单体的含量可表现药物(即抗体或其抗体片段)的真实药学活性量。

术语“胁迫”或“胁迫条件”在本发明的语境下指机械胁迫、热胁迫或冻融(freezing and thawing)导致的胁迫。激发机械胁迫、热胁迫、或冻融导致的胁迫的方法和条件多种多样，并且是本领域技术人员知晓的。机械胁迫可以是，例如，200rpm 2-3小时。热胁迫指，例如，在降低或升高的温度下储存一定量的时间，在一实例中，可以将样品储存在-80℃、-20℃、5℃、25℃和40℃，其中，例如，-80℃、-20℃和40℃指胁迫条件。可以通过将样品暴露于数个-80℃冷冻24小时而后室温下融化90min的循环来使样品暴露于冻融所致的胁迫，其中上述循环重复5次，且其中第5个循环在例如-80℃保持更长时间，历时72小时。

在一个实施方案中，所述组合物具有增加的针对机械胁迫的稳定性。相应地，该组合物可以接受，例如，200rpm下至少2小时或3小时的胁迫，例如通过在管形瓶中搅动样品，例如利用Variomag Multipoint HP。

在一个实施方案中，所述组合物具有增加的热稳定性。相应地，该组合物可以在40℃、50℃或55℃接受胁迫至少1周或多至1个月。该组合物还可在40℃接受胁迫多至3个月或6个月。

在一个进一步的实施方案中，所述组合物具有增加的针对冻融所致的胁迫的稳定性。相应地，可以将该组合物在-80℃冷冻24小时，然后在室温融化90min，其中该循环例如重复5次。第5次循环可以例如在-80℃保持72小时。

“减少的”、“更高的/较高的”、“更少的/较少的”、“更小的/较小的”、“增加的”、“更低的/较低的”、或“更少的”之类的术语指示两个状态的数量差异，并且指两个状态之间的至少统计学显著的差异。

在一个实施方案中，所述组合物在55℃稳定1周。

在一个进一步的实施方案中，所述组合物在40℃稳定1、3或6个月。

在一个进一步的实施方案中，所述组合物在200rpm搅动3小时后是稳定的。

在又一个实施方案中，所述组合物在冻融后是稳定的，其中冻融指在-80℃冷冻该组合物24小时，然后在室温融化90min，其中该循环重复5次，且在第5次循环中温度保持在-80℃ 72小时。

在相同的实施方案中，稳定是指当通过SEC测量时，组合物具有相对于全部峰的总面积的多于90％、多于91％、多于92％、多于93％、多于94％、多于95％、多于96％、多于97％，或多于98％的％单体含量。

或者，稳定是指组合物具有多于90％、多于91％、多于92％、多于93％、多于94％、多于95％、多于96％、多于97％、多于98％或多于99％的单体％含量(当通过体积分析时)和/或强度(当通过DLS测量时)。

在一个实施方案中，本发明的组合物具有改善的稳定性。

在一个进一步的实施方案中，本发明的组合物具有改善的针对胁迫的稳定性，其中所述胁迫选自机械胁迫、热胁迫或冻融所致的胁迫。

“改善的稳定性”和/或“增加的稳定性”在本发明的语境下是指：已经过如上所述的定性和/或定量评估，而且与相同抗体的参照组合物的物理和/或化学稳定性相比得到了增加的物理和/或化学稳定性。

在特定的实施方案中，参照组合物是WO2004/016286的市售阿达木单抗制剂，其含有阿达木单抗、氯化钠、二水合磷酸二氢钠、二水合磷酸氢二钠、柠檬酸钠、柠檬酸一水合物、甘露醇、聚山梨醇酯80和注射用水。

根据前述，在一个实施方案中，本发明的药物组合物具有选自下组的至少一个特征：

与参照组合物相比，

(a)如藉由尺寸排阻层析(SEC)测量的，在约55℃储存1周之后聚集物的量减少；

(b)如藉由SEC测量的，在约55℃储存1周之后单体的量更高；

(c)如藉由SEC测量的，在约55℃储存1周之后片段更少。

此外，根据前述，在一个实施方案中，本发明的药物组合物具有选自下组的至少一个特征：

(a)该组合物对55℃下1周的热胁迫是稳定的，

(b)该组合物对55℃下搅动3小时的机械胁迫是稳定的，和/或

(c)该组合物对冻融所致的胁迫是稳定的，其中冻融是指将组合物在-80℃冷冻24小时，然后在室温融化90min，其中该循环重复5次，且在第5次循环中温度保持在-80℃ 72小时，

其中稳定性指下述特征中至少一项：

i)当通过SEC测量时，该组合物具有相对于全部峰的总面积多于90％、多于91％、多于92％、多于93％、多于94％、多于95％、多于96％、多于97％或多于98％的％单体含量，

ii)当通过SEC测量时，该组合物具有相对于全部峰的总面积少于3％、少于2％、少于1.5％、少于1.4％、少于1.3％、少于1.2％、少于1.1％、少于1.0％的％聚集物含量，和/或

iii)当通过SEC测量时，该组合物具有相对于全部峰的总面积少于3％、少于2％、少于1.5％、少于1.4％、少于1.3％、少于1.2％、少于1.1％、少于1.0％的％片段含量。

此外，根据前述，在一个实施方案中，本发明的药物组合物具有选自下组的至少一项特征：

与参照组合物相比，

(a)如藉由动态光散射(DLS)测量的，在约40℃下储存3个月后单体的量更高，和

(b)如藉由光阻/不透光度(LO)测量的，在40℃下储存1至6个月之后不可见颗粒(subvisible particles)的量减少。

此外，根据前述，在一个实施方案中，本发明的药物组合物对40℃下1至6个月，特别是1、3或6个月的热胁迫是稳定的，其中稳定指下述特征中的至少一项：

i)当按照藉由DLS测量的体积分析时，该组合物以％计的单体含量多于90％、多于91％、多于92％、多于93％、多于94％、多于95％、多于96％、多于97％、多于98％或多于99％，

ii)当按照藉由DLS测量的强度分析时，该组合物以％计的单体含量多于90％、多于91％、多于92％、多于93％、多于94％、多于95％、多于96％、多于97％、多于98％或多于99％，

iii)当用LO测量时，该组合物有少于6000个颗粒>10μm，少于600个颗粒>25μm，且少于10000个颗粒>1μm。

本发明人已示明，添加氯化钠并不有利于抗hTNF抗体的稳定性。此外，添加氯化钠对抗体的变性温度(T_M)有负面影响。

因此，在一个实施方案中，组合物包含少于7mg/ml氯化钠，少于6mg/ml、少于5mg/ml、少于2mg/ml氯化钠，例如不含氯化钠。

当组合物不包含氯化钠时，该组合物实质上没有氯酸钠。

如本文中使用的，术语“实质上”表示这样的组合物，其中没有主动，即，没有意图要添加氯酸钠分子。可以存在痕量的氯酸钠，浓度为低于5mg/ml、3mg/ml、2mg/ml、1mg/ml，例如低于0.5mg/ml，更优选低于0.05mg/ml。

在一个实施方案中，所述组合物中以治疗有效量包含抗体。

在药理学意义上，在本发明的语境中，抗体的“治疗有效量”或“有效量”是指对于该抗体可有效治疗的某种病症而言，在该病症的预防或治疗中有效的量。相应地，该组合物可包含1-150mg/ml的该抗体，1至140mg/ml，10至130mg/ml，15至110mg/ml，20至100mg/ml，25至90mg/ml，30至80mg/ml，30至70mg/ml，40至70mg/ml，40至60mg/ml的所述抗体，例如45至55mg/ml，例如45，56，47，48，49，50，51，52，53，54，55mg/ml的该抗体。上述各浓度之间的范围也应属本发明之一部分。例如，利用任何上述的值作为上限和/或下限之数值范围也应包括在本发明中。

如本文中使用的，“缓冲液(buffer)”指通过其酸-碱共轭组分的作用抵抗pH变化的缓冲溶液。本文中的“pH”指组合物在25℃的酸性或碱性。测量组合物的pH的标准方法是本领域技术人员知晓的。在一个实例中，典型地在25℃利用pH计来测量pH。典型地，测量pH包括校正仪器、将电极放入充分混合的样品中，然后直接从pH计读取pH。本发明人在筛选研究中示明，在较高的缓冲剂浓度下，组合物中包含的抗体的去折叠(unfolding)温度较低。

因此，该组合物包含1至100mM的至少一种缓冲剂,1至50mM的至少一种缓冲剂,1至30mM的至少一种缓冲剂,1至15mM的至少一种缓冲剂,例如5至15mM，如5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM的至少一种缓冲剂。在一个实施方案中，该组合物包含10mM的至少一种缓冲剂。

本发明人示明，乙酸盐和组氨酸缓冲剂与其他缓冲系统相比，可强力改善抗hTFN抗体的稳定性。他们进一步示明，抗CXCR5抗体在乙酸盐缓冲剂中40℃下稳定长达6个月。

因此，在本发明的语境下至少一种缓冲剂是乙酸盐或组氨酸。

在一个实施方案中，所述至少一种缓冲剂可以是2种、3种或更多种缓冲剂。因此，在一个实施方案中，所述至少一种缓冲剂是两种缓冲剂。在一个实例中，所述两种缓冲剂可以是乙酸盐和组氨酸，其中所得的缓冲液是乙酸盐-组氨酸缓冲液或组氨酸-乙酸盐缓冲液。

在一个实施方案中，所述至少一种缓冲液是乙酸盐，在同一个实施方案中所述组合物的pH为5至6.5,例如5.0至6.0，例如5.2至5.8，例如5.4至5.6，例如5.4、5.5、5.6。

如本领域技术人员所知的，乙酸盐缓冲液由乙酸盐的混合物，例如作为碱的乙酸钠和作为酸的乙酸构成。为了制备特定浓度及pH的乙酸盐缓冲液，本领域技术人员必须计算，例如，必须与乙酸混合的乙酸钠或乙酸钠三水合物的量。例如，对于1ml pH5.5的10mM乙酸盐缓冲液，将1.17mg乙酸钠三水合物与0.08mg乙酸混合，其中乙酸通常用于pH调节。相应地，在一具体实施方案中，组合物可包含1.17mg/ml乙酸钠三水合物与0.08mg/ml乙酸，从而使得该组合物包含10mM乙酸盐缓冲液，且pH为5.5。

在一个实施方案中，所述的至少一种缓冲液是组氨酸，在同一个实施方案中该组合物的pH为5至6.5，例如5.5至6.5，例如5.7至6.3，例如5.9至6.1，例如5.9、6.0、6.1。

组氨酸(pK 5.97)是对于皮下、肌肉内及腹膜注射而言优选的缓冲液。

本发明人进一步测试了不同赋形剂，例如糖类和多元醇类的稳定化作用。他们出人预料地发现，海藻糖和甘露醇在μDSC实验中显示出最高的T_m温度。

因此本发明的组合物在一个实施方案中包含选自海藻糖和甘露醇的至少一种赋形剂，例如甘露醇。

在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含1至70mg/ml的赋形剂，例如1至60mg/ml的赋形剂，10至50mg/ml的所述至少一种赋形剂。

海藻糖是一种非还原糖，是通过两个α-葡萄糖单元之间的α,α-1,1-糖苷键形成的α-连接双糖(α-D-吡喃葡萄糖苷基-(1→1)-α-D-吡喃葡萄糖苷)。在一个实施方案中，所述组合物包含1至70mg/ml海藻糖，例如10至70mg/ml海藻糖，例如20至70mg/ml海藻糖，例如20、25、30、35、40、45、50、55、60、65和70mg/ml海藻糖，例如50mg/ml海藻糖。

在一个实施方案中所述组合物可包含1至60mg/ml的甘露醇、1至50mg/ml，例如1至40mg/ml，例如7.5至40mg/ml的甘露醇，例如7.5至30mg/ml的甘露醇，例如15至25mg/ml的甘露醇，例如7.5、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30mg/ml，例如12mg/ml或20mg/ml。在一个实施方案中，所述至少一种赋形剂可以为2种、3种或更多种赋形剂。因此，在一个实施方案中，所述至少一种赋形剂为甘露醇与海藻糖。

本发明人进一步测试了氨基酸的稳定化作用，其中甘氨酸、L-天冬酰胺和谷氨酰胺在μDSC实验中显示了对抗体而言最高的变性温度。

如本文所用的，术语“氨基酸”指一种药学上可接受的有机分子，其具有位于相对于羧基基团在α位置的氨基部分。氨基酸的例子包括：天冬酰胺、甘氨酸、鸟氨酸、离氨酸、组氨酸、谷氨酸、天门冬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸和丙氨酸。所用的氨基酸任选地可为L-型。

在一个实施方案中，所述组合物包含1至50mg/ml、1至40mg/ml、例如1至30mg/ml的至少一种氨基酸。

在一个实施方案中，所述至少一种氨基酸是甘氨酸。该组合物可包含5至30mg/ml的甘氨酸，例如10至20mg/ml的甘氨酸，例如12至16mg/ml的甘氨酸，例如12、13、14、15、16，例如15mg/ml。

在一个进一步的实施方案中，所述至少一种氨基酸可以是天冬酰胺。该组合物可包含1至20mg/ml的天冬酰胺，例如1至10mg/ml的天冬酰胺，比如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，例如2mg/ml。

术语“表面活性剂”和“去污剂”在本文中可以互换使用。示例性的去污剂包括非离子型去污剂，比如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20、80等)或泊洛沙姆(poloxamers)(例如泊洛沙姆188)。去污剂的添加量使得其可减少配制的抗体的聚集和/或最小化组合物中颗粒物的形成和/或减少吸附。

在一个实施方案中，所述表面活性剂是聚山梨醇酯。聚山梨醇酯是一种从用脂肪酸酯化的PEG化山梨聚糖(山梨醇的一种衍生物)获得的乳化剂。此类作用剂包括，除其他者之外，聚山梨醇酯20、21、40、60、61、65、80、81、85和120。

在一个进一步的实施方案中，所述组合物包含表面活性剂聚山梨醇酯20(常见的商品名包括Alkest TW 20和Tween 20)和/或聚山梨醇酯80(常见的商品名包括Alkest TW80、Canarcel、Poegasorb 80、Tween 80)。该组合物可包含0.001％w/v至1％w/v的表面活性剂，例如0.001％w/v至0.15％w/v的表面活性剂，例如0.01％w/v至0.15％w/v的表面活性剂。

在一个实施方案中，所述组合物包含0.001％w/v至0.15％w/v的聚山梨醇酯80，例如0.01％w/v至0.15％w/v，例如0.05％w/v至0.15％w/v，例如0.08％w/v至0.12％w/v，例如0.08、0.085、0.09、0.095、0.1、0.115、0.12％w/v的聚山梨醇酯80。例如，本发明的组合物包含约0.1％w/v聚山梨醇酯80。

在另一个实施方案中，所述组合物包含0.001％w/v至0.15％w/v的聚山梨醇酯20，例如0.005％w/v至0.1％w/v，例如0.008％w/v至0.05％w/v，例如0.008％w/v至0.015％w/v，例如0.008％w/v至0.012％w/v，例如0.008、0.009、0.01、0.011、0.012、0.013、0.014、0.015％w/v。例如，本发明的组合物包含0.01％w/v聚山梨醇酯20。

根据一个实例，本发明的组合物包含50mg/ml抗体，pH 5.5的10mM乙酸盐缓冲液，20mg/ml甘露醇，15mg/ml甘氨酸和0.1％w/v聚山梨醇酯80(PS80)。更具体地，根据一个实例，本发明的组合物包含50mg/ml抗体，1.17mg/ml乙酸钠三水合物，0.08mg/ml乙酸，20mg/ml甘露醇，15mg/ml甘氨酸和0.1％w/v PS80，该组合物的pH为5.5。

根据另一个实例，本发明的组合物包含50mg/ml抗体，pH 5.5的10mM乙酸盐缓冲液,20mg/ml甘露醇，15mg/ml甘氨酸和0.01％w/v聚山梨醇酯20(PS20)。更具体地，根据本发明的另一个实例，本发明的组合物包含50mg/ml抗体，1.17mg/ml乙酸钠三水合物，0.08mg/ml乙酸，20mg/ml甘露醇，15mg/ml甘氨酸和0.01％w/v PS20，该组合物的pH为5.5。

根据另一个实例，本发明的组合物包含41mg/ml抗体，pH 5.5的10mM乙酸盐缓冲液，20mg/ml甘露醇，15mg/ml甘氨酸和0.1％w/v PS80。

根据又一个实例，本发明的组合物包含50mg/ml抗体，pH 5.5的10mM乙酸盐缓冲液，20mg/ml甘露醇，15mg/ml甘氨酸，0.1％w/v PS80和2mg/ml NaCl。

根据又一个实例，本发明的组合物包含50mg/ml抗体，pH 5.5的10mM乙酸盐缓冲液，15mg/ml甘氨酸和0.01％w/v PS20。

根据又一个实例，本发明的组合物包含50mg/ml抗体，pH 5.5的10mM乙酸盐缓冲液，12mg/ml甘露醇，0.1％w/v PS80和6.165mg/ml NaCl。

根据又一个实例，本发明的组合物包含50mg/ml抗体，pH 6.0的7.45mM组氨酸缓冲液，12mg/ml甘露醇，0.1％w/v PS80和6.165mg/ml NaCl。

在一个实施方案中，在组合物中可包括一种或多种其他药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂，比如Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)中描述的那些，只要它们不会对该组合物的期望特性产生显著影响。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，且包括：另外的缓冲剂；共溶剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；螯合剂，比如EDTA；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；生物可降解聚合物，比如聚酯；和/或成盐反离子，比如钠。

本发明的组合物还可以根据要治疗的具体适应证的需要与一种或多种其他治疗剂组合，尤其是那些具有不对该组合物的抗体产生不良影响的互补活性的治疗剂。此类治疗剂以对意图的目的有效的量适宜地存在于组合中。

使用药物组合物的药物和治疗

在一个实施方案中，本发明提供一种治疗或预防疾病或病症的方法，包括对有此需要的受试者施用治疗有效量的本发明的药物组合物。

本发明还涉及供用作药物的本发明的药物组合物。本发明还涉及本发明的药物组合物在制备用于治疗受试者中的疾病或病症的药物方面的用途。在一个实施方案中，本发明涉及本发明的药物组合物用于治疗受试者中的疾病或病症的用途。

术语“受试者”或“个体”可以互换使用，且可为，例如，人或非人哺乳动物。例如，受试者是蝙蝠；雪貂；兔；猫类(家猫)；犬类(家犬)；灵长类(猴)；马类(马)；人类，包括男人、女人和儿童。在一个实施方案中，“受试者”指人类。

在本发明的语境中，术语“治疗”或“处理”指治疗性应用(即，用于患有特定疾病的受试者)，且意指逆转、缓解此类病症或状况的一种或多种症状，抑制此类病症或状况的一种或多种症状的进展。因此，“治疗”不仅指导致疾病完全痊愈的治疗，还指延缓疾病的进展和/或延长受试者的生存的治疗。

“预防”意指预防性应用(即用于容易发生特定疾病的受试者)。

“疾病”或“病症”是任何会从使用该抗体治疗受益的状况。这包括慢性和急性的疾病或病症，包括那些使得受试者易于罹患所讨论的病症的病理状况。

术语“需要治疗”是指已经患有病症的受试者，亦指要预防病症的受试者。

在一个实施方案中，“病症”指其中TNFAlpha活性有害的病症。

如本文中使用的，术语“其中TNFAlpha活性有害的病症”包括这样的疾病和病症：其中已经证明或者有怀疑在罹患该病症的受试者中TNFAlpha的存在是该病症的病理生理的原因，抑或是促成该病症恶化的因素。相应地，其中TNFAlpha活性有害的病症是这样的病症：抑制TNFAlpha活性预期可缓解该病症的症状和/或进展。这样的病症的证据可以是，例如，患有该病症的受试者的生物流体中TNFAlpha的浓度增加(例如，受试者的血清、血浆、滑膜液等中TNFAlpha浓度的增加)，其可利用，例如，如上所述的抗TNFAlpha抗体来检测。其中TNFAlpha活性有害的病症的实例有很多。其中TNFAlpha活性有害的病症的实例在美国申请60/397275中有描述，该申请通过提述并入本文。其中TNFAlpha活性有害的病症的实例还在：美国专利6,015,557、6,177,077、6,379,666、6,419,934、6,419,944、6,423,321和6,428,787；美国专利申请US2001/0016195、US2001/0004456和US2001/026801；WO 00/50079和WO 01/49321中有描述，每一文献均通过提述并入本文。

在一个实施方案中，所述疾病或病症为斑块状干癣、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、干癣性关节炎、强直性脊柱炎、类风湿性关节炎、多发性和幼年型特发性关节炎。

在另一个实施方案中，病症指与非典型的或异常的CXCR5生物学和功能相关的病症。

如本文中使用的，术语“与非典型的或异常的CXCR5生物学和功能相关的病症”指以CXCL13或其他CXCR5配体的过表达或水平升高、B细胞水平升高、B细胞活性水平升高、CXCR5水平升高，或CXCR5的代谢与活性反常为特征或原因的病症。此类病症包括自身免疫病症，比如狼疮、干燥综合征(Sjoren's syndrome)、重症肌无力和多发性硬化；结肠炎，类风湿性关节炎或干癣性关节炎。

“有效量”是指在必要的剂量和时程下，可有效实现期望的治疗或预防结果的量。

本发明的药物组合物的“治疗有效量”可根据个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及本发明语境下的抗体引发期望的治疗结果的能力等因素而改变。治疗有效量涵盖这样的量，其中抗体的治疗有益作用的权重超过任何毒性或有害作用。治疗有效量还涵盖足以给予效益，例如临床效益的量。

具备本领域普通技艺的医师或兽医能够容易地确定本发明的药物组合物所需的有效量并开具处方。例如，医师或兽医可以以较实现期望的治疗效果所需的水平低的水平开始使用本发明的组合物的剂量，并逐渐增加剂量直到实现期望的治疗效果。

在成人中，组合物的剂量可为，例如，每2周给予40mg。对于患有例如克罗恩氏病和例如干癣的成人，初始(导入)剂量可为80mg，然后在例如1周之后例如每2周40mg。对于溃疡性结肠炎，例如，最先两剂通常为160mg和80mg，间隔例如2周给药，然后例如每2周40mg。

在一个实施方案中，药物组合物的有效量是对抑制TΝFAlpha活性(例如，防止某种有害的TΝFAlpha活性相关状态的各种形态和躯体症状)而言必要或充分的量。

药物组合物依照已知的方法施用给受试者，例如静脉内施用，例如以推注的形式或者通过经历一段时间的连续输注，通过肌肉内、腹膜内、脑脊液内、皮下、关节内、滑膜内或鞘内施用，例如通过肌肉内或皮下施用。

在一个实施方案中，所述施用是皮下施用。因此，在本发明的一个实施方案中，使所述药物组合物适合于皮下施用。在药物的皮下施用，或者注射中，药物作为推注输送到位于皮肤的真皮和表皮(合称“皮”(cutis))的直接下方的皮下层中。在胰岛素等药物的施用中，皮下注射是高度有效的，且已确立成习，这是因为皮下注射可以由没有医学技艺的人实施，只要他们接受了相应的训练即可，因为感染的风险低且施用容易。因此皮下施用适合于佩带式施用(ambulant administration)，在基础设施条件差的地区施用，例如在由没有医学技艺的人负责药物施用的地方，或者在家使用。

皮下施用在例如需要重复治疗的治疗方案中是重要的，此类情形可出现在许多慢性疾病，如自身免疫病(例如类风湿性关节炎或强直性脊柱炎)中，或者出现在许多由于靶向疗法而变成慢性或接近慢性的癌症类型中。

然而，需要指出的是，由于上述的原因，适用于皮下施用的药物组合物有更高的风险遭普通人暴露于未达最佳的储存条件，例如，冷链被中断，或者组合物被暴露于光照或温度突变。此外，皮下施用的组合物需要相对高浓度的治疗剂，这是因为一次注射所施用的体积相当有限(0.1至最大2.0mL)。另外，为了减少注射过程中针头刺痛，针头要细，这就要求被注射的溶液的粘度低。最后，皮下注射可导致注射部位的疼痛，甚至在针头移出之后亦然。这很可能受蛋白质溶液的组分的影响，例如缓冲分子的种类和渗透压，并且可能显著地影响受试者对相应疗法的顺应性。因此，依照本发明的组合物，由于其改善的稳定性和改善的受试者顺应性，适用于皮下施用。

对于预防或治疗疾病，抗体的合适剂量会取决于要治疗的疾病类型(如上文所限定的)、疾病的严重性和过程、是为了预防还是治疗目的而施用单克隆抗体、既往疗法、受试者的临床史及对单克隆抗体的响应、以及主治医师的自由裁量。抗体对受试者适当地一次施用或经过一系列治疗施用。根据疾病的类型和严重性，约1μg/kg至50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)的抗体是供施用给受试者(或是例如通过一次或多次各别的施用，或是通过连续输注)的初始候选剂量。抗体的剂量一般会在约0.05mg/kg至约10mg/kg。

若施用另一种治疗剂，则它通常以当时已知的剂量施用，或者任选地由于药物的联合作用或由于可归因于该治疗剂的不良副作用以减少的剂量施用。此类治疗剂的制备和剂量给药日程表可以依照制造商的说明书使用，或如熟练从业人员凭经验确定的那样使用。

制品

本申请的方法还涉及包含本发明的药物组合物的装置。这样的装置可容纳0.1ml到2ml之间(单次使用)或0.5到1.5ml之间的液体体积。在一个实施方案中，所述体积为约0.8或约1.0ml。

在一个实施方案中，该装置用于皮下递送。对于皮下递送，组合物可以通过注射器(例如预填充的注射器)、自动注射器、注射装置(例如INJECT-EASE^TM和GENJECT^TM装置)、注射笔(例如GENPEN^TM)或其他适用于皮下施用悬液组合物的装置。在一个实施方案中，本文中的装置是预填充的注射器。

在一个相关的方面，本发明提供一种制造制品的方法，包括用本发明的药物组合物填充容器。

制品中的容器的实施方案包括：注射器(包括预填充注射器)、自动注射器、瓶、管形瓶(例如双室管形瓶)、以及试管等等。容器容纳悬液组合物，而容器之上或与容器相伴随的标签可标示使用说明。制品还可包括其他从商业和使用者角度看有用的材料，包括其他缓冲液、稀释剂、滤器、针头、注射器和带有如前述部分提到的说明的包装插页。

试剂盒

根据本发明的另一个方面，提供试剂盒；所述试剂盒包括：至少一个包含至少一种如上所述的药物组合物的容器，以及注射装置。在一个实施方案中，所述试剂盒或注射装置适用于肌肉内或皮下施用，例如用于皮下施用。在一个实施方案中，试剂盒还包括关于施用该组合物的说明，例如关于皮下施用的说明。

根据本发明的又一个实施方案，提供包含所述药物组合物的装置的用途，或者依照本发明的试剂盒的用途。在一个进一步的实施方案中，本发明涉及包含所述药物组合物的装置或者本发明语境下的试剂盒用于治疗至少一种如上所述的疾病的用途。

减少聚集的方法

鉴于上述，本发明还涉及通过使用依照本发明的组合物来减少抗体聚集和/或片段化的方法。本领域技术人员会理解，将容易聚集或较不稳定的治疗活性抗体配制在依照本发明的组合物中，可导致抗体相比于参照组合物聚集量减少和稳定化。

因此，在一个方面中，本发明提供一种减少抗体的聚集的方法，包括在组合物中配制抗体，所述组合物包括：

b)选自乙酸盐或组氨酸的至少一种缓冲剂，

c)至少一种氨基酸，其中氨基酸选自甘氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺，例如甘氨酸和天冬酰胺，和/或选自海藻糖和甘露醇的至少一种赋形剂，和

d)表面活性剂，

其中pH为5.0至6.5。

在一个进一步的方面，本发明涉及一种稳定化抗体的方法，包括在本发明的组合物中配制抗体。

“容易聚集”的抗体已有发现与其他的抗体分子聚集，特别是在冷冻、搅动时，和/或在升高的温度例如40℃或55℃下。容易聚集的抗体可以是，例如，在约55℃储存一周之后通过SEC测量具有少于94％、少于93％、少于92％、少于90％的单体的抗体。容易聚集的抗体可以是，例如，在约40℃下储存3个月之后通过DLS测量具有少于94％、少于93％、少于92％、少于90％的单体的抗体。

“容易片段化”的抗体是这样的抗体，已有发现该抗体可被裂解成两个或更多个片段，例如在其铰链区被裂解。

“减少聚集或片段化”意指相对于参照组合物，如市售制剂防止聚集或片段化或降低聚集或片段化的量。

前述实施方案的任何组合均构成本发明的一部分。

在本申请全文中，术语“包括/包含”应解释为涵盖所有明确提到的特征，以及可选的、更多的、未明确提到的特征。如本文中使用的，术语“包括/包含”的使用还公开了除具体体积的特征之外不存在其他特征的实施方案(即，“由……组成”)。此外，不定冠词“某/一”(“a”或者“an”)不排除复数。某些措施在相互不同的从属权利要求中被述及这一事实本身并不意味着不能为了实现更好的效果而采用这些措施的组合。

下面将援引下述的实施例来更详细地描述本发明。在此通过提述将本文中引用的所有文献和专利文献并入本申请。在前面的描述中已经详细例示并说明了本发明，但实例应视为示例性的或例示性的，而非限制性的。

序列的简要说明

SEQ ID NO:1显示抗TNFAlpha抗体的重链序列。

SEQ ID NO:2显示抗TNFAlpha抗体的轻链序列。

实施例

1.方法

1.1.样品制备

首先使用抗TNFAlpha抗体筛选不同的缓冲液。这通过利用viva spin(15R；Membran:30,000MWCO HY)将抗TNFAlpha抗体对表1中所列的缓冲液进行透析来进行。为了比较，也对市售的阿达木单抗抗体实施了该缓冲液筛选。

表1：抗TNFAlpha抗体III期组合物开发研究中筛选的缓冲液和pH值

为了进行如2.1.6所述的赋形剂筛选，将赋形剂如蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、甘油、L-精氨酸HCl、L-甘氨酸、L-天冬酰胺一水合物、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、氯化钠、聚山梨醇酯20(PS 20)和聚山梨醇酯80(PS 80)以粉末形式(例如甘露醇和氯化钠)添加到抗TNFAlpha抗体，或者以液体形式添加(例如Tween 80作为储液)。所有样品、溶液和缓冲液用Sartopore-2膜无菌过滤(0.22μm)。将样品过滤到无菌的瓶或管形瓶中，在超净工作台内的无菌条件下密封以防止微生物污染。

1.2分析方法

在大多数筛选研究(缓冲液筛选、离子强度、赋形剂筛选)中使用微量差示扫描量热(μDSC)以便在进入胁迫研究之前进行预选择。进入了胁迫研究(在第1.3节进一步描述)的组合物则进一步用分析方法，如尺寸排阻层析(SEC)、弱阳离子交换层析(WCX)、光阻和/或动态光散射(DLS)，或下文中描述的其他分析方法加以分析。

1.2.1微量差示扫描量热(μDSC)

在所有筛选研究中利用微量差示扫描量热(μDSC)以便在进入胁迫研究之前进行预选择。所有测量均使用来自GE Healthcare的VP CapillaryμDSC进行。要言之，将每个样品以90℃/小时的加热速度从30℃加热到100℃。主要用去折叠温度(Tm)作为参数来选择最有前景的组合物。特别地，使用Fc1域的Tm作为分级的参数，因为它是热分析图中第一个去折叠事件。

1.2.2尺寸排阻层析(SEC)

用尺寸排阻层析(SEC)来确定单体以及高分子量变体(HMW)和低分子量变体(LMW)的相对量。尺寸排阻层析用于根据抗体、可溶性聚集物(HMW)以及抗体片段(LMW)的大小分离蛋白质。聚集物在完整抗体之前洗脱，而片段在完整抗体之后洗脱。用主峰的百分比面积相对于所有峰以百分比计的总面积进行评估。

1.2.3弱阳离子交换层析(WCX)

利用弱阳离子交换层析来测量带电荷的同种型的水平。层析分离在与UV检测器耦联的弱阳离子交换柱上进行。弱阳离子交换层析(WCX)基于电荷异质性分离抗体的不同亚型。较酸性的亚型比碱性亚型显示较少的离子相互作用，因而在WCX层析图中较先洗脱。该方法的目标是确定带电亚型的相对量。设酸性、中性和碱性亚型的总和为100％，相对地计算主峰面积、酸性亚型的面积和碱性亚型的面积。

1.2.4动态光散射(DLS)：

使用来自Malvern的Zetasizer Nano-ZS测量纳米范围内的聚集物和颗粒的存在。按照强度和按照体积来测量颗粒尺寸分布。此外，测量流体动力学直径和多分散系数。此种测量需要250–300μl。

1.2.5光阻/不透光度(LO)

实施不透光度测量来评估含有抗TNFAlpha抗体的组合物中不可见颗粒的尺寸和浓度。测量用颗粒计数器(HACH LANGE,Düsseldorf,Germany)实施。此测量需要800–1000μl。

1.2.6微流成像

在一些情况下使用该方法以更深入地考察所形成的颗粒的形式。在其他情况下，使用该方法作为光阻的替代。

1.2.7差示扫描量热(DSF)

测量使用CFX96BioRad进行。温度扫描的范围为20℃至90℃，使用1℃/分钟的加热速率和SyproOrange荧光报告染料：Invitrogen，稀释于水中，5X终浓度。将21种不同的组合物在5mg/ml浓度下针对安慰剂进行测试。将9μl样品加到1μl SyproOrange荧光染料，生成4.5mg/ml最终抗TNFAlpha抗体浓度。每种组合物测量两次。

1.2.8第二维里渗透压系数(B₂₂)

渗透压第二维里系数，A₂或B₂₂，是蛋白质-蛋白质相互作用以及蛋白质-溶剂相互作用的一种量度。维里系数表示分子之间的整体吸引或排斥，提供一种由溶剂介导的分子间势能(intermolecular potential)的通用量度。在生物技术应用中，维里系数可有助于通过评估缓冲液中pH、离子强度和多种赋形剂浓度的变化来确定对于组合物的稳定性、纯化和结晶而言最优的条件。自使用静态光散射方法学从每种组合物的一系列浓度生成的Debye作图(K_c/R^θ对c)的斜率计算B₂₂值，并以mol mL g^-2为单位报告。正的B₂₂值表示较多的排斥，因而也表示较少的聚集物形成，而负的B₂₂值表示较多的吸引力，因而也表示较高的聚集倾向。因此，高的正B₂₂是有利的。

1.3胁迫研究

1.3.1加速稳定性研究

本研究中应用了不同的加速稳定性研究，其中使组合物暴露于不同种类的胁迫。

机械胁迫：根据本研究的机械胁迫为在200rpm下最多6小时的搅动。该条件在每个实验中相应地调整。在本实验中，利用在管形瓶中的搅动对样品施加胁迫，这里使用Variomag Multipoint HP搅拌器。

短等温胁迫：在短等温胁迫研究中，将样品在40℃下根据所应用的测试储存7-14天。

长等温胁迫：在长等温胁迫研究中，将样品在40℃下储存1、3或6个月，根据所应用的测试。

加速热胁迫：在加速热胁迫研究中，样品在50和55℃储存多至1月。这些条件适用于例如不同组合物的最后选择。

冻融：在该研究中，样品在-80℃冷冻24小时，然后于室温融化90min。重复5个循环。第5个循环保持在-80℃下72小时。

1.3.2探索性稳定性研究

为了最终选择最终的组合物，用本发明的组合物实施了更长的等温稳定性研究。因此，将包含抗TNFAlpha抗体的组合物在不同温度下(-80、-20、5、25和40℃)储存最多达6个月。然后，检查样品的稳定性。

1.4组合物选择方法/评级

为了避免对上文1.2节下提到的不同分析方法的误导性解释，基于每种方法的重要性建立了一种评级方法。在一组组合物中根据每个稳定性研究中的每种分析方法所获得的结果实施最先评级。然后通过计算自所有分析方法得到不同评级的平均来获得最终评级。根据所应用的胁迫，评估每种分析方法的重要性，并在评级过程中予以考虑。

1.4.1物理稳定性评级

基于来自下述所有方法的平均评级来计算总物理稳定性评级。方法的重要性根据所应用的胁迫而变化。例如，对于储存胁迫而言，SEC评级被认为比颗粒分析更重要，而对机械胁迫和冻融所致的胁迫，颗粒分析被认为比SEC更重要。

尺寸排阻层析(SEC):不同的组合物均有稳定化作用，因此在此评级内单体含量仅0.5％的差异即认为是显著差异。

动态光散射(DLS)：使用4种评级参数：第一评级参数是按体积分析的单体含量(第1)，第二评级参数是按强度分析的单体含量(第2)，Z-平均是第三评级参数，第四评级参数是多分散系数(PDI)。评级按以上顺序通过下面的方式进行：如果组合物未能通过第1评级参数，那么在其余参数中则不再考虑，对第2、第3和第4评级参数也类似。

不透光度(LO):根据在组合物中观察到的大小分布来对组合物评级。有少于6000个颗粒>10μm、少于600个颗粒>25μm、和少于10000个颗粒>1μm的组合物评级为1。所有少于6000个颗粒>10μm、少于600个颗粒>25μm、和少于100000个颗粒>1μm的组合物评级为2。所有少于6000个颗粒>10μm、少于600个颗粒>25μm、且多于100000个颗粒>1μm的组合物评级为3。所有突破了>10μm和>25μm的颗粒的界限的组合物，不论>1μm的颗粒计数，均评级为4。

颜色和澄清度：评级简单地基于福尔马肼浊度单位(FNU)单位数，且显著的改变是指导致标准数目改变(例如自<I至<II)的FNU改变。

1.4.2化学稳定性评级

弱阳离子交换层析(WCX)：酸性、中性和碱性同型的百分比的改变是评级参数。2-3％的改变视为显著。

1.4.3总体稳定性评级

总体稳定性评级由物理稳定性评级和化学稳定性评级二者的平均得来，其中物理稳定性和化学稳定性视为具有相等的重要性。

2结果和讨论

2.1缓冲液筛选(实施例1)

2.1.1初始缓冲液筛选

在不同的缓冲液(10mM)和pH值中测试阿达木单抗及其生物仿制药(此处称为抗TNFAlpha抗体BS)的稳定性。为了分析，使用如上文1.2.1节所述的微差示扫描量热(μDSC)作为分析方法。抗TNFAlpha抗体BS去折叠曲线显示了4个独立去折叠的域(Fab,Fc1,Fc2,Fc3)的存在，焓最大的峰为Fab片段，另外三个为Fc片段(数据未显示)。为了评级的目的使用Fc1片段峰，因为它是最先发生的去折叠事件。抗TNFAlpha抗体BS和阿达木单抗给出了相似的结果(相似的T_M值)。在大多数缓冲液中，对两种分子确定的最优pH范围均为pH 5.5至6.5。表2显示了抗TNFAlpha抗体BS所得的去折叠温度。

表2:在不同的缓冲系统中抗TNFAlpha抗体的T_M值

¹于10mM缓冲液中，²Exc.＝制剂的赋形剂

选择了8种最佳的缓冲系统，并实施机械胁迫研究以选择最佳的缓冲系统。另外测试了原研缓冲液和原研组合物(市售制剂)作为参照。选择机械稳定性研究作为加速稳定性研究，以监测缓冲液和pH值是否能够改善抗TNFAlpha抗体的机械稳定性，因为已确定机械不稳定性是所述抗体的主要缺点。为了监测机械稳定性，选择了如尺寸排阻层析(SEC)、不透光度(LO)和动态光散射(DLS)等分析技术(如1.2节所描述的)。基于1.3节所描述的评级系统对机械胁迫的结果进行了评估，并示于表3。

表3：用于抗TNFAlpha抗体BS的不同缓冲液组合物的机械稳定性研究之后的最终评级

¹于10mM缓冲液中²Exc.＝制剂的赋形剂

根据该评级，pH 5.5的乙酸盐缓冲液和pH 6的组氨酸缓冲液显示了测试抗体的最佳机械稳定性，选择它们供进一步的稳定性研究。此外，为了使稳定性研究中有组合缓冲液，选择了pH 6的tris-柠檬酸盐缓冲液。

2.1.2DS稳定性研究

对选定的三种缓冲液(pH 5.5的乙酸盐缓冲液，pH 6的组氨酸缓冲液，及pH 6的tris-柠檬酸缓冲液)，在一项短期探索性稳定性研究中在-80、-20、5、25和40℃下进一步测试(见1.3.2节)。在1个月之后进行了最终缓冲液的预选择(数据未显示)，并在3个月之后加以确认(数据未显示)。在6个月后进一步分析了该研究。为此分析研究，使用了WCX、DLS、UV、外观、LO、SDS-PAGE和ELISA等分析方法。基于结果，选择了pH 5.5的10mM乙酸盐缓冲液作为抗TNFAlpha抗体BS的最终缓冲液组成。作为备用，选择pH 6的组氨酸缓冲液作为第二选择。pH 6的Tris-柠檬酸盐缓冲液相比于其他选定的缓冲系统未显示好处，故将其排除，因为在表3所示的机械稳定性研究中观察到抗TNFAlpha抗体BS的机械稳定性低。

2.1.4表面活性剂筛选(实施例2)

PS 20和PS 80二者均首先在pH 5.5乙酸盐缓冲液中以三种不同浓度(0.001％w/v、0.01％w/v和0.1％w/v)加以测试。因为预计表面活性剂的主要效果是保护抗TNFAlpha抗体BS免受机械胁迫，因此仅实施了搅动实验，如BS一节下所述。样品通过：SEC、WCX、不透光度和DLS加以分析。基于表4中所示的结果可以得出结论：0.01％w/v PS 20、0.1％w/v PS80和0.01％w/v PS 80是最优浓度。

表4:聚山梨醇酯机械稳定性最终评级

¹在乙酸盐缓冲液pH 5.5中

然而，存在一种趋势，即在较高的PS80浓度0.1％，颗粒较少。相应地，为了进一步测试赋形剂组合，考虑了0.01％w/v(0.1mg/ml)的PS 20或0.1％w/v(1mg/ml)的PS 80。

2.1.5组合物的离子强度(实施例3)

针对不同缓冲液浓度和不同NaCl浓度测试了组合物的离子强度。对10和100mM缓冲液浓度、以及对2mg/ml和20mg/ml NaCl浓度进行了μDSC筛选。所得的去折叠温度在表5中列出。

表5：不同离子强度下抗TNFAlpha抗体BS的去折叠温度

T_m筛选研究显示，缓冲液浓度越高，去折叠温度越低，例外是Tris-柠檬酸盐缓冲液。此外，从所得的T_m值可得出结论，即添加NaCl并不有利于抗TNFAlpha抗体BS的稳定性。此外，增加NaCl的浓度对T_m有强烈的负面影响。如上所述，在2.1.2中描述的DS稳定性研究的1个月数据之后，选择了乙酸盐缓冲液作为依照本发明的组合物的优选缓冲液，因此加速稳定性研究利用乙酸盐缓冲液实施。然后实施了短等温稳定性研究(40℃ 7天)和机械稳定性研究(200rpm搅动2小时)。在胁迫之前和之后使用下述分析技术分析样品：SEC、WCX、光阻和DLS。

为了进行加速稳定性研究，在存在与不存在2mg/ml NaCl的条件下将较低的5mM缓冲液浓度与10mM缓冲液浓度比较。表6显示了热胁迫和机械胁迫之后组合物的最终评级。表6中显示的最终评级表明10mM的缓冲液浓度有更好的稳定性，且0至2mg/ml的NaCl浓度没有显著差异。相应地，将缓冲液浓度固定为10mM，并随后为赋形剂组合研究考虑NaCl(2mg/ml)的有无。

表6：离子强度稳定性一般评级(物理和化学)

2.1.6赋形剂筛选(实例4):

糖和多元醇：

利用μDSC测试不同的糖和多元醇在乙酸盐缓冲液(10mM,pH 5.5)中对抗TNFAlpha抗体BS稳定性的影响。该研究的结果示于表7。海藻糖和甘露醇显示了最高的去折叠温度。此处(以及所有μDSC筛选研究中)的评级基于Fc1域的T_m，因为它是热分析图中第一个去折叠事件。蔗糖、山梨醇和甘油显示了最低的T_m值。

表7：包含不同糖和多元醇的组合物的去折叠温度

¹在10mM乙酸盐缓冲液pH 5.5中。

相应地，在加速稳定性研究(短等温稳定性研究(40℃7天)和机械稳定性研究(200rpm搅动2小时)中，在乙酸盐缓冲液(10mM,pH 5.5)中测试了2个不同浓度的甘露醇和海藻糖。此外，在加速研究中测试了山梨醇作为阴性对照，以验证基于T_m值的选择。在胁迫之前和之后利用下述分析技术分析了投入加速稳定性研究的样品：SEC、WCX、光阻和DLS。所得的最终评级显示甘露醇作为赋形剂有更好的稳定性，如表8所示。相应地，选择了不同浓度的甘露醇进行进一步的研究。

表8：糖和多元醇稳定性一般评级(物理及化学)

¹在10mM乙酸盐缓冲液pH 5.5中。

氨基酸：

此外，利用μDSC在10mM乙酸盐缓冲液(pH 5.5)中测试了不同的氨基酸。所得的T_m在表9中列出。

表9：不同氨基酸作为赋形剂的抗TNFAlpha抗体BS的去折叠温度

¹在10mM乙酸盐缓冲液pH 5.5中。

T_m筛选研究显示：甘氨酸、L-天冬酰胺和谷氨酰胺显示了最高的T_m。另一方面，精氨酸、L-赖氨酸和精氨酸/谷氨酸显示了最低的T_m值。为加速稳定性研究，测试了2个不同浓度的甘氨酸、L-天冬酰胺及谷氨酰胺。表10中显示的最终评级表明当使用甘氨酸和天冬酰胺时稳定性较好。

表10：氨基酸稳定一般评级(物理和化学)

¹在10mM乙酸盐缓冲液pH 5.5中。

2.2原型组合物选择(实施例5):

2.2.1实验设计(DOE)

在选择了最好的条件(缓冲液、pH值和离子强度)和最好的稳定剂之后，利用了实验设计(DOE)手段以选择最终的组合物。使用了高通量预测性方法，例如上文1.2节所述的微差示扫描量热(μDSC)、差示扫描荧光(DSF)和第二维里渗透压系数(B₂₂)。表11中列出了DOE中包括的组合物和每种预测性方法的结果。

表11:DOE组合物¹和三种预测性高通量方法的结果

¹所有组合物均在pH 5.5的10mM乙酸盐缓冲液中²PS 20浓度为0.1mg/ml，且PS 80为1mg/ml

通过μDSC从DOE获得的结果显示：i)NaCl的显著负面影响；ii)甘氨酸的显著正面影响，iii)甘露醇的正面影响；iv)PS20和PS80之间无差异。

通过DSF从DOE获得的结果显示：i)NaCl的显著负面影响；ii)甘露醇的显著正面影响，iii)PS80的显著正面影响；和iv)PS20的显著负面影响。

根据DOE通过B₂₂获得的结果显示了NaCl的显著负面影响。

根据统计学DOE，基于μDSC T_m和DSF T_m，选择了2种组合物，与其他2种组合物(一种含NaCl，另一种仅有甘氨酸)一起进行探索性稳定性研究，如表12所示。

表12：新开发的4种原型组合物的组成

该探索性实验被设计为历时至多达24个月，使用1.4节中描述的评级方法根据3个月数据进行选择。在不同的时间点使用下述分析技术分析样品：SEC、WCX、光阻、浊度和DLS。SEC三个月的数据示于表13。基于三个月的数据决定最终的组合物。

表13：源自四种抗TNFAlpha抗体BS的探索性稳定性的原始SEC数据

¹所有组合物均在pH 5.5的10mM乙酸盐缓冲液中

最终的决定基于用到的全部分析技术(SEC、WCX、光阻、浊度和DLS)得出的评级。将3个月后评级最佳的两种组合物定义为最有前景的候选者(见表14)。

14-对新开发的组合物的3个月稳定性之后的一般评级

¹所有组合物均在pH 5.5的10mM乙酸盐缓冲液中

2.2.2等温稳定性研究：

为了支持基于3个月数据(表14)选择的组合物，实施了短期加速稳定性研究。表15显示了将组合物暴露于55℃下1周的等温胁迫之后获得的SEC原始数据，以例示用于评级的参数之一。该研究的最终评级在表16中示出，其更清楚地显示了4种组合物之间的差异；因此，具有20mg/ml甘露醇(20mg/ml)、15mg/ml甘氨酸和0.1％w/v PS80的组合物是在测试的条件下最好的组合物之一(表16)。

表15–等温胁迫之前和之后对4种原型组合物的SEC

¹所有组合物均在pH 5.5的10mM乙酸盐缓冲液中

表16–等温胁迫之后的一般评级

¹所有组合物均在pH 5.5的10mM乙酸盐缓冲液中

2.2.3加速稳定性研究

对如表16所示的4种选定的组合物进一步与两种备选组合物(组氨酸缓冲液(7.45mM,pH 6)，甘露醇12，PS80 0.1％w/v，NaCl 6.165mg/ml和乙酸盐缓冲液(10mM,pH5.5)，甘露醇12，PS80 0.1％w/v，NaCl 6.165mg/ml)一起实施进一步的加速稳定性研究。对该6种组合物测试了机械稳定性和冻/融稳定性，并在胁迫之前和之后使用下述分析技术分析样品：SEC、光阻和DLS。在表17中显示了在施加200rpm 3小时的机械胁迫之后获得的SEC原始数据，以例示评级中使用的参数之一。

表17:6种组合物在机械胁迫(200rpm，3小时)之前和之后的SEC原始数据

表18中示出了冻/融胁迫的第5个循环之后获得的SEC原始数据，以例示用于评级的参数之一。

表18：冻/融胁迫之前和之后的6种组合物的SEC原始数据

根据机械稳定性和冻/融稳定性获得的最终评级在表19和20中示出。表19-机械胁迫之后的一般评级

机械稳定性显示，包含乙酸盐缓冲液(10mM,pH 5.5)、甘露醇20mg/ml、甘氨酸15mg/ml、PS80 0.1％w/v的组合物的稳定性显著好于所有其它组合物。

表20–冻/融胁迫之后的一般评级

-80℃的冻/融研究显示，组合物乙酸盐缓冲液(10mM,pH 5.5)、甘露醇20mg/ml、甘氨酸15mg/ml、PS20 0.01％w/v有较好的稳定性，其次是乙酸盐缓冲液(10mM,pH 5.5)、甘露醇20mg/ml、甘氨酸15mg/ml、PS80 0.1％w/v。然而，考虑所得的原始数据(未显示)，冻/融稳定性研究获得的差异不显著。

为了得出最终结论，在3个月之后进一步比较了6种组合物。最终的总体稳定性评级在此处的表21中给出。

表21：在不同温度下储存3个月之后组合物的最终评级

相应地，选择了一种如表22中定义的最终组合物(FC)，用于进一步与市售制剂比较。

表22：用于3期的抗TNFAlpha抗体BS组合物的组成

¹乙酸用于在加入所有赋形剂之后调节pH(如果需要)

²注射用水根据欧洲药典通过蒸馏制造，根据美国药典常规测试

3用于III期的抗TNFAlpha抗体BS组合物与原研组合物(OC)的比较(实施例6)

3.1等温加速稳定性研究

将如表22定义的最终组合物(FC)与原研组合物(OC)置于55℃下1周。将对最终组合物进行如1.3中所述的等温加速稳定性研究所得的数据与对在原研组成中制备的原研组合物进行的类似研究比较。在此情形下仅有SEC和WCX数据可用于比较。该比较分析的结果示于表23。

表23：选择的组合物与市售组合物就55℃下1周的稳定性的比较

结果显示选定的最终组合物(FC)相比于市售组合物(OC)稳定性显著更好。

此外，比较表23与表15所示的数据表明，其他被测定的本发明组合物，如表1中报告的，也为抗TNFAlpha抗体BS提供了与市售制剂相比改善的稳定性。因此，与市售制剂相比，全部6种组合物均能够增加热稳定性，因为全部6种组合物的活性单体量相比于总峰面积均多于94％，而市售制剂所含的单体量仅为约88％。

3.2机械稳定性

在该研究中利用抗TNFAlpha抗体BS将最终组合物(FC)的机械稳定性与市售组合物(OC)的机械稳定性比较，其中将最终组合物在200rpm搅动下搅动3小时，市售组合物则为2小时。评价使用：SEC、DLS和光阻(HIAD)(表24)。

对于可溶性聚集物未见差异。差异主要在于不可见颗粒形成和更小的聚集物，如通过光阻和动态光散射(DLS)二者可见的。尽管最终组合物(FC)比市售组合物(OC)承受更多胁迫(3小时对2小时)，但最终组合物显示更高的机械稳定性，尤其就颗粒形成而言。

表24:选定的组合物(FC)与市售组合物(OC)关于机械稳定性的比较

4.结论

发明人利用了抗TNFAlpha抗体BS作为示例分子来开发一种可改善抗体稳定性的组合物。发明人最初想要针对机械胁迫稳定化抗体，但通过使用不同的筛选方法并比较不同的缓冲液、赋形剂如多元醇、糖、氨基酸，盐的存在以及不同的去污剂，发明人成功开发了不但能保护抗体抵抗机械胁迫，还能增加抗体对热胁迫的稳定性的组合物。

因此，基于抗TNFAlpha抗体BS，发明人成功开发了与参照市售制剂相比可改善抗体的机械稳定性和热稳定性的组合物。这些不同的组合物在许多不同的胁迫条件下(例如高的温度和剪切速率)显示非常好的结果，且非常适合于期望的储存温度(2-8℃)。由于被测试的抗体抗TNFAlpha抗体BS是一种IgG抗体，和其他IgG抗体的氨基酸组成有较高相似性，因此开发的组合物还可能改善其他抗体的稳定性。

此外，与市场上的组合物相比，全部开发的组合物均改善了抗TNFAlpha抗体BS的机械稳定性和热稳定性。这些组合物在55℃下1周后含有多于94％的功能性单体形式的抗体，最终选定的组合物甚至含有98.15％，而原研组合物仅含有88.30％的功能性单体。对于一种造价昂贵的分子而言，功能性单体增加10％是可观的增益。

5.一种处于本发明的组合物形式的抗CXCR5抗体的稳定性研究(实施例7)

将如下面的表25定义的包含抗CXCR5抗体的组合物置于5℃或40℃历时1至6个月。

表25：用于稳定性测试的抗CXCR5抗体的组合物

¹乙酸用于在加入所有赋形剂之后调节pH(如果需要)

²注射用水根据欧洲药典通过蒸馏制备，根据美国药典常规测试

在该研究中，通过将组合物在40℃下存储1个月、3个月和6个月，并将其与在5℃下储存相同期间的相同组合物比较，来测定该组合物的长期等温稳定性。为了评估，使用DLS(表26)和光阻(HIAC，表27)。

结果明显显示，使用本发明的制剂，抗CXCR5抗体在长时间内是稳定的，即使在加速的条件下。

表26：通过DLS测定的抗CXCR5抗体组合物的蛋白质聚集的测量

表27：通过光阻测定的抗CXCR5抗体组合物的不可见颗粒

因此，这些结果确认了本发明的制剂可以实现单克隆抗体的稳定性增加。

序列表

<110> 赛诺菲

<120> 用于单克隆抗体的稳定液体制剂

<130> FR2015/003-PCT

<150> EP15305218.8

<151> 2015-02-13

<160> 2

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗TNFAlpha抗体的重链序列

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 2

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗TNFAlpha抗体的轻链序列

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

Claims

1.一种药物组合物，其包含：

a)抗体，

b)选自由乙酸盐和组氨酸组成的组的至少一种缓冲剂，

c)选自由甘氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺组成的组的至少一种氨基酸，和/或选自由海藻糖和甘露醇组成的组的至少一种赋形剂，和

d)表面活性剂，

其中该组合物的pH为5.0至6.5。

2.如权利要求1的组合物，其中所述抗体为IgG抗体。

3.如权利要求3的组合物，其中所述组合物包括5至15mM的至少一种缓冲剂。

4.如权利要求1-3中任一项的组合物，其中至少一种缓冲剂为乙酸盐。

5.如权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述至少一种缓冲剂为组氨酸。

6.如权利要求1-5中任一项的组合物，其中所述组合物包括1-70mg/ml的至少一种赋形剂。

7.如权利要求1-6中任一项的组合物，其中所述至少一种赋形剂为甘露醇。

8.如权利要求1-7中任一项的组合物，其中所述组合物包括少于7mg/ml氯化钠。

9.如权利要求1-8中任一项的组合物，其中所述表面活性剂为聚山梨醇酯。

10.如权利要求1-9中任一项的组合物，其中所述组合物包括0.001％w/v至0.15％w/v表面活性剂。

11.如权利要求1-10中任一项的组合物，其中所述组合物包括1mg/ml至30mg/ml的至少一种氨基酸。

12.如权利要求1-11中任一项的组合物，其中所述至少一种氨基酸是甘氨酸。

13.如权利要求1-12中任一项的组合物，包括

a)40至50mg/ml抗体，和

b)5至15mM乙酸盐缓冲液或组氨酸缓冲液，和

c)20mg/ml甘露醇，和/或15mg/ml甘氨酸，和

d)0.1％w/v聚山梨醇酯80或0.01％w/v聚山梨醇酯20，

其中pH为5.0至6.5。

14.如权利要求1-13中任一项的组合物，包括

a)50mg/ml抗体，和

b)5至15mM乙酸盐缓冲液或组氨酸缓冲液，和

c)20mg/ml甘露醇，和/或15mg/ml甘氨酸，和

d)0.1％w/v聚山梨醇酯80或0.01％w/v聚山梨醇酯20，

其中pH为5.0至6.5。

15.如权利要求1-14中任一项的组合物，包括

a)50mg/ml抗体，和

b)10mM乙酸盐缓冲液，和

c)20mg/ml甘露醇，及15mg/ml甘氨酸，和

d)0.1％w/v聚山梨醇酯80，

其中pH为5.5。

16.如权利要求15的组合物，包括

a)50mg/ml抗体，和

b)1.17mg/ml乙酸钠三水合物及0.08mg/ml乙酸，和

c)20mg/ml甘露醇，及15mg/ml甘氨酸，和

d)0.1％w/v聚山梨醇酯80,

其中pH为5.5。

17.如权利要求1-16中任一项的组合物，其中该组合物用于静脉内施用，肌肉内，腹膜内，脑脊髓内，皮下，关节内，滑膜内或鞘内施用。

18.如权利要求1-17中任一项的组合物，其中该组合物具有选自下组的至少一个特征：

与参照组合物相比，

(a)如藉由尺寸排阻层析(SEC)测量的，在约55℃下储存1周后聚集物的量减少，

(b)如藉由SEC测量的，在约55℃下储存1周后单体的量较高，

(c)如藉由SEC测量的，在约55℃下储存1周后片段较少。

19.如权利要求1-17中任一项的组合物，其中该组合物具有选自下组的至少一个特征：

(a)该组合物对55℃下1周的热胁迫是稳定的，

(b)该组合物对55℃下搅动3小时的机械胁迫是稳定的，和/或

(c)该组合物对冻融所致的胁迫是稳定的，其中冻融是指将组合物在-80℃冷冻24小时后在室温融化90min，其中该循环重复5次，且在第5次循环中温度保持在-80℃72小时。

20.如权利要求19的组合物，其中稳定指下述特征中至少一项：

i)当通过SEC测量时，该组合物具有相对于全部峰之总面积多于90％的％单体含量，

ii)当通过SEC测量时，该组合物具有相对于全部峰的总面积少于3％的％聚集物含量，和/或

iii)当通过SEC测量时，该组合物具有相对于全部峰的总面积少于3％的％片段含量。

21.如权利要求1-17中任一项的组合物，其中该组合物具有选自下组的至少一个特征：

(a)如藉由光阻/不透光度(LO)测量的，在约40℃下储存1至6个月之后聚集物的量减少，和

(b)如藉由动态光散射(DLS)测量的，在约40℃下储存3个月后单体的量较高。

22.如权利要求1-17中任一项的组合物，其中该组合物对40℃下1至6个月的热胁迫是稳定的。

23.如权利要求22的组合物，其中稳定指下述至少一个特征

i)当按照藉由DLS测量的体积分析时，该组合物的以％计的单体含量多于90％，

ii)当按照藉由DLS测量的强度分析时，该组合物的以％计的单体含量多于90％，

24.如权利要求1-23中任一项的组合物，其中该抗体包含由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的重链以及由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的轻链。

25.如权利要求1-23中任一项的药物组合物，其中该抗体为阿达木单抗(Adalimumab)。

26.如权利要求1-25中任一项的药物组合物作为药物的应用。

27.供作为药物使用的如权利要求1-25中任一项的药物组合物。

28.一种治疗或预防疾病或病症的方法，包括对有此需要的受试者施用治疗有效量的如权利要求1-25中任一项限定的药物组合物。

29.一种试剂盒，包括：包含如权利要求1-25中任一项限定的药物组合物的至少一个容器，以及注射装置。

30.使用如权利要求1-25中任一项定义的组合物来减少治疗性单克隆抗体的聚集和/或片段化的方法。