KR20220152540A - 안정성이 증진된 액상 약제학적 조성물 - Google Patents

Abstract

안정성이 증진된 액상의 약제학적 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 단백질을 포함하는 안정한 액상의 약제학적 조성물이 제공된다.

Description

안정성이 증진된 액상 약제학적 조성물

안정성이 증진된 액상의 약제학적 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 단백질을 포함하는 안정한 액상의 약제학적 조성물에 관한 것이다.

종양괴사인자-알파(TNF-α)관련 자가면역 질환, 예컨대 예컨대 류머티스 관절염, 건선 및 기타 자가면역 질환의 치료가 FDA-승인 약물 예컨대 아달리무맙(휴미라(HUMIRA)®, 애브비 코포레이션(Abbvie Corporation))의 사용을 통해 달성되었다. 아달리무맙은 인간 TNF-α 활성을 억제하여 이것이 TNF 수용체를 활성화시키는 것을 방지함으로써, 자가면역 질환과 연관된 염증성 반응을 하향-조절하는 인간 모노클로날 항체이다. 아달리무맙에 대한 승인된 의학적 적응증은 류머티스 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 크론병, 궤양성 결장염, 중등도 내지 중증의 만성 건선, 및 소아 특발성 관절염을 포함한다.

아달리무맙은 체내에서 TNF-α에 선택적으로 결합하여 종양괴사인자-알파에 의한 면역반응을 저해하는 재조합 인간 면역글로불린 G1 단일클론성 항체이다. 이러한 항체는 또한 D2E7로서 공지되어 있다. 아달리무맙은 1330개의 아미노산으로 이루어지고, 대략 148킬로달톤의 분자량을 갖는다. 아달리무맙은 미국 특허 제6,090,382호에 개시되고 특허청구되어 있으며, 이러한 개시는 본원에 이의 전문이 인용에 의해 포함되어 있다.

항체와 같은 단백질 의약품의 경우, 저장 및/또는 보관기간 동안 그 생리활성을 잃지 않고, 단백질이 단편화 및/또는 응집이나 입자화되지 않고, 산화/환원 등의 변성이 일어나지 않도록 적절한 제형으로 제조하는 것이 매우 중요하다. 따라서 여러 단백질 의약품의 제형에 대한 연구가 활발하게 일어나고 있다.

본 발명에서는 아달리무맙(Adalimumab) 바이오시밀러(biosimilar) 개발 시, 항체 단백질의 불안정성을 감소시킬 수 있는 안정한 제형을 개발하는 것을 목적으로 한다.

이에, 본 발명에서는 단백질 약물의 안정성을 증진시키기 위한 수성(aqueous) 액상 조성물, 구체적으로는 단백질 약물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

일 예는

항-TNFα 항체;

히스티딘

; 및

폴리소르베이트 20

을 포함하고,

pH가 pH가 약 4.0 내지 약 8.0 또는 약 5.0 내지 약 5.5인, 약제학적 조성물을 제공한다.

상기 약제학적 조성물은 다음 중 하나 이상의 특징을 갖는 것일 수 있다:

(i) 히스티딘을 포함하지 않는(Histidine-free) 조성물과 비교하여 광 안정성이 개선; 및

(ii) 폴리소르베이트 20 대신 폴리소르베이트 80을 포함하는(polysorbate 80-containing) 조성물과 비교하여 열 안정성, 동결 용융 안정성, 또는 이들 모두가 개선.

상기 히스티딘을 포함하지 않는(Histidine-free)은 히스티딘을 검출 가능한 양으로 포함하지 않거나 유의미한 효과를 나타낼 정도의 양으로 포함하지 않음을 의미하는 것으로, 히스티딘을 완전히 포함하지 않거나(약 0 mM), 실질적으로 포함하지 않는 것(예컨대 약 50 nM 이하, 약 40 nM 이하, 약 30 nM 이하, 약 20 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 5 nM 이하, 약 1 nM 이하)을 의미한다.

다른 예는 상기 약제학적 조성물을 포함하고, 상기 약제학적 조성물은 온도 변화에 대한 안정성을 갖는, 컨테이너를 제공한다.

본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은 완충액을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 완충액은 pH가 약 4.0 내지 약 8.0 또는 pH 약 5.0 내지 약 5.5인 것일 수 있다. 상기 완충액은 시트레이트, 포스페이트, 아세테이트, 및 숙시네이트로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상 또는 2종 이상 (예컨대, 1종, 2종, 3종, 또는 4종)일 수 있다. 일 예에서, 상기 완충액은, 시트레이트를 포함하는 것일 수 있다. 다른 예에서, 상기 완충액은 포스페이트, 숙시네이트, 및 아세테이트로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다. 이 때, 상기 완충액은 시트레이트를 포함하지 않는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 완충액은 포스페이트를 포함하는 것일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 완충액은 포스페이트를 포함하고 시트레이트를 포함하지 않는 것일 수 있다. 다른 구체예에서 상기 완충액은 (1) 포스페이트 및, (2) 숙시네이트 또는 아세테이트를 포함하는 것일 수 있다. 다른 예에서, 상기 완충액은 (1) 포스페이트 및, (2) 숙시네이트 또는 아세테이트를 포함하고, 시트레이트를 포함하지 않는 것일 수 있다.

본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은 폴리올을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 본 발명에서 상기 폴리올은 등장화제(Tonicity Agent) 또는 안정화제(stabilizer)인 것일 수 있다. 상기 폴리올은 당 및 당알코올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 구체적으로, 솔비톨, 만니톨, 메글루민, 트레할로오스, 슈크로오스, 말토오스, 락토오스, 글루코오스, 자일리톨, 아라비톨, 에리트리톨, 락티톨, 말티톨, 이노시톨 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 일 예에서, 상기 폴리올은 솔비톨, 만니톨, 또는 이의 조합일 수 있다. 일 예에서, 상기 폴리올은 솔비톨을 포함하고, 솔비톨을 제외한 당 및 당알코올 (예컨대, 만니톨, 메글루민, 트레할로오스, 슈크로오스, 말토오스, 락토오스, 글루코오스, 자일리톨, 아라비톨, 에리트리톨, 락티톨, 말티톨, 이노시톨 등) 중 선택된 하나 이상 또는 이들 모두를 포함하지 않는 것, 예컨대, 만니톨을 포함하지 않는 것일 수 있다. 다른 예에서, 상기 폴리올은 만니톨을 포함하고, 만니톨을 제외한 당 및 당알코올 (예컨대, 솔비톨, 메글루민, 트레할로오스, 슈크로오스, 말토오스, 락토오스, 글루코오스, 자일리톨, 아라비톨, 에리트리톨, 락티톨, 말티톨, 이노시톨 등) 중 선택된 하나 이상 또는 이들 모두를 포함하지 않는 것, 에컨대, 솔비톨을 포함하지 않는 것일 수 있다.

본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은 폴리소르베이트 20을 제외한 폴리소르베이트류 (예컨대, 폴리소르베이트 80)을 포함하지 않는 것일 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 완충액 및 폴리올을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 완충액 및 폴리올은 앞서 설명한 바와 같다.

일 예에서, 상기 약제학적 조성물은 시트레이트 및 솔비톨을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 다른 예에서, 상기 약제학적 조성물은 시트레이트 및 솔비톨을 추가로 포함하고, 솔비톨을 제외한 당 및 당알코올 중 선택된 하나 이상 또는 이들 모두를 포함하지 않는 것일 수 있다.

다른 예에서, 상기 약제학적 조성물은 포스페이트 및 만니톨을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 다른 예에서, 상기 약제학적 조성물은 포스페이트 및 만니톨을 추가로 포함하고, 시트레이트를 포함하지 않는 것일 수 있다. 다른 예에서, 상기 약제학적 조성물은 포스페이트 및 만니톨을 추가로 포함하고, 만니톨을 제외한 당 및 당알코올 중 선택된 하나 이상 또는 이들 모두를 포함하지 않는 것일 수 있다. 다른 예에서, 상기 약제학적 조성물은 포스페이트 및 만니톨을 추가로 포함하고, 시트레이트를 포함하지 않고, 만니톨을 제외한 당 및 당알코올 중 선택된 하나 이상 또는 이들 모두를 포함하지 않는 것일 수 있다.

다른 예에서, 상기 약제학적 조성물은 (1) 포스페이트, (2) 숙시네이트 또는 아세테이트, 및 (3) 만니톨을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 다른 예에서, 상기 약제학적 조성물은 (1) 포스페이트, (2) 숙시네이트 또는 아세테이트, 및 (3) 만니톨을 추가로 포함하고, 시트레이트를 포함하지 않는 것일 수 있다. 다른 예에서, 상기 약제학적 조성물은 (1) 포스페이트, (2) 숙시네이트 또는 아세테이트, 및 (3) 만니톨을 추가로 포함하고, 만니톨을 제외한 당 및 당알코올 중 선택된 하나 이상 또는 이들 모두를 포함하지 않는 것일 수 있다. 다른 예에서, 상기 약제학적 조성물은 (1) 포스페이트, (2) 숙시네이트 또는 아세테이트, 및 (3) 만니톨을 추가로 포함하고, 시트레이트를 포함하지 않고, 만니톨을 제외한 당 및 당알코올 중 선택된 하나 이상 또는 이들 모두를 포함하지 않는 것일 수 있다.

다른 예는 상기 약제학적 조성물을 포함하는 디바이스 또는 컨테이너를 제공한다.

다른 예는 질병 치료를 위한, 상기 약제학적 조성물을 포함하는 디바이스 또는 컨테이너를 제공한다. 상기 질병은 항-TNFα 항체, 예컨대, 아달리무맙이 치료, 개선, 및/또는 예방 효과를 갖는 질병일 수 있다.

다른 예는 항-TNFα 항체, 예컨대, 아달리무맙의 투여를 필요로 하는 대상에게 상기 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 질병의 치료 방법을 제공한다. 상기 투여하는 단계는 상기 약제학적 조성물을 포함하는 디바이스 또는 컨테이너 사용하여 수행되는 것일 수 있다.

본 발명에서는 단백질 약물의 안정성을 증진시키기 위한 수성(aqueous) 액상 조성물, 구체적으로는 단백질 약물을 포함하는 액상 약제학적 조성물을 제공한다. 상기 수성 액상 조성물(액상 약제학적 조성물)은 하기 기재된 성분 및 잔량의 수성 매질 (물 (정제수), 생리식염수, 주사 용수 등)을 포함하는 것일 수 있다.

용어의 정의

용어 "약(about)" 또는 "대략(approximately)"은 일반적으로 주어진 값 또는 범위의 상하 20% 이내, 10% 이내, 5% 이내, 4% 이내, 3% 이내, 2% 이내 또는 1% 이내의 값 또는 범위를 포함하는 의미로 해석될 수 있다.

용어 "장기간 저장 안정성" 또는 "장기간 안정성"은 약제학적 조성물이 3개월 이상 동안, 6개월 이상 동안, 1년 이상 동안, 2년 이상 동안 안정한 상태로 저장할 수 있음을 의미할 수 있다. 일 예에서, 상기 "저장"은 약제학적 조성물을 액체로서 2 내지 8℃에서 저장하거나, -20℃에서 또는 더 낮은 온도로 냉동시키거나, 1회 이상 냉동되고 해동되는 등의 가혹 조건에서 수행되는 되는 경우를 모두 포함하는 개념으로 이해될 수 있다.

용어 "안정한 상태"는, 저장 기간 동안의 약제학적 조성물에 함유된 단백질(예컨대, 아달리무맙)의 생물학적 활성의 손실 및/또는 구조적 안정성의 손실 (예, 응집, 분해, 변성 (산성 또는 염기성), 산화 등) 정도가, 저장 초기와 비교하여, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 또는 5% 이하인 것을 의미하는 것으로 이해될 수 있다.

용어 "A를 포함하지 않는(free)" 또는 "A를 실질적으로 포함하지 않는(substantially free)"은 물질 A가 전혀 존재하지 않거나, 조성물의 특성에 실질적으로 어떠한 영향을 미치지 않으면서 미량으로 존재하는 것을 의미하는 것일 수 있다. 물질 A의 함량의 언급이 없는 경우, "검출 불가능한 양"을 의미하는 것으로 이해될 수 있다. 본 명세서에서 특별히 구별되어 기재되지 않는 한, "A를 포함하지 않는(free)"은 A가 전혀 존재하지 않는 경우를 포함하여 "A를 실질적으로 포함하지 않는(substantially free)" 경우를 포괄하는 의미로 해석될 수 있다.

(1) 항-TNFα 항체

본 발명에서 항-TNFα 항체는, TNFα에 결합하여 이의 생물학적 활성을 조절하는 항체를 말한다. 종양괴사인자-알파 (TNF alpha, TNFα)는 엔도톡신 등의 자극에 의해 단핵백혈구 및 대식세포 등의 다양한 종류의 세포에 의해 만들어지는 사이토카인이다. TNFα는 TNF 수용체를 활성화시켜 T-세포 활성화, 흉선세포 증식 등의 반응을 유도하는 역할을 하는 주요 염증성, 면역성, 병리생리학적 반응의 주요 매개체이다.

상기 항-TNF 알파 항체는 전장 항체 또는 이의 항원 결합 부위를 포함하는 항체 단편의 형태일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 상기 항-TNFα 항체는, 인간 면역글로불린 G1 단일클론성 항체일 수 있으며, 보다 구체적으로는 아달리무맙(adalimumab)일 수 있다.

아달리무맙은 의약품으로 개발된 최초의 완전 인간항체로 파아지 디스플레이 기술을 적용하여 개발되었고 CDR에 돌연변이를 일으켜 친화력이 증강되었다. 아달리무맙은 D2E7이라고도 불리며, 1330개의 아미노산으로 이루어진 약 148kD의 분자량을 가지고 있다. 아달리무맙은 휴미라라는 상품명으로 판매되고 있으며, 휴미라는 류마티스 관절염 치료제로 판매허가를 받은 후 크론병, 강직성 척추염, 건선성 관절염, 궤양성 대장염 등의 치료에 사용되고 있으며, 상기 아달리무맙에 대한 더 자세한 정보는 공지의 데이터베이스에서 당업자가 용이하게 입수할 수 있다.

본 명세서에 사용된 바로서, 용어 "아달리무맙"은 또한, 폴리펩타이드 기능에 영향을 주지 않는 범위에서, 아미노산 구조가 변형되거나 (아미노산의 결실, 첨가, 및/또는 치환), 및/또는 당화 특성이 변형된 아달리무맙을 포함하는 의미로 해석될 수 있다.

본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물 내의 항-TNF 알파 항체는 치료학적 유효량으로 포함될 수 있다. 구체적으로, 약 25 내지 약 200 mg/ml, 약 25 내지 약 175 mg /ml, 약 25 내지 약 150 mg/ml, 약 25 내지 약 125 mg/ml, 약 25 내지 약 100 mg/ml, 약 25 내지 약 75 mg/ml, 약 25 내지 약 50 mg/ml, 약 30 내지 약 200 mg/ml, 약 30 내지 약 175 mg /ml, 약 30 내지 약 150 mg/ml, 약 30 내지 약 125 mg/ml, 약 30 내지 약 100 mg/ml, 약 30 내지 약 75 mg/ml, 약 30 내지 약 50 mg/ml, 약 50 내지 약 200 mg/ml, 약 50 내지 약 175 mg /ml, 약 50 내지 약 150 mg/ml, 약 50 내지 약 125 mg/ml, 약 50 내지 약 100 mg/ml, 약 75 내지 약 200 mg/ml, 약 75 내지 약 175 mg/ml, 약 75 내지 약 150 mg/ml, 약 75 내지 약 125 mg/ml, 약 75 내지 약 100 mg/ml, 약 100 내지 약 200 mg/ml, 약 100 내지 약 175 mg/ml, 약 100 내지 150 mg/ml, 약 100 내지 약 125 mg/ml, 약 150 내지 약 200 mg/ml, 약 150 내지 약 175 mg/ml, 약 50 mg/ml, 약 100 mg/ml, 또는 약 200 mg/ml일 수 있다.

(2) 아미노산

본 발명에서 제공되는 약제학적 조성물에 포함된 히스티딘은, 안정화제 또는 완충액의 기능을 할 수 있으며, 전체 약제학적 조성물 기준으로, 약 50 mM 이상, 약 51 mM 이상, 약 52 mM 이상, 또는 약 59 mM 이상의 농도, 예컨대 약 50 mM 내지 약 100 mM, 약 50 mM 내지 약 89 mM, 약 50 mM 내지 약 80 mM, 약 50 mM 내지 약 69 mM, 약 50 mM 내지 약 65 mM, 약 50 mM 내지 약 62 mM, 약 50 mM 내지 약 59 mM, 약 51 mM 내지 약 100 mM, 약 51 mM 내지 약 89 mM, 약 51 mM 내지 약 80 mM, 약 51 mM 내지 약 69 mM, 약 51 mM 내지 약 65 mM, 약 51 mM 내지 약 62 mM, 약 51 mM 내지 약 59 mM, 약 52 mM 내지 약 100 mM, 약 52 mM 내지 약 89 mM, 약 52 mM 내지 약 80 mM, 약 52 mM 내지 약 69 mM, 약 52 mM 내지 약 65 mM, 약 52 mM 내지 약 62 mM, 약 52 mM 내지 약 59 mM, 약 54 mM 내지 약 100 mM, 약 54 mM 내지 약 89 mM, 약 54 mM 내지 약 80 mM, 약 54 mM 내지 약 69 mM, 약 54 mM 내지 약 64 mM, 약 54 mM 내지 약 62 mM, 약 54 mM 내지 약 59 mM, 약 56 mM 내지 약 100 mM, 약 56 mM 내지 약 89 mM, 약 56 mM 내지 약 80 mM, 약 56 mM 내지 약 69 mM, 약 56 mM 내지 약 65 mM, 약 56 mM 내지 약 62 mM, 약 56 mM 내지 약 59 mM, 약 59 mM 내지 약 100 mM, 약 59 mM 내지 약 89 mM, 약 59 mM 내지 약 80 mM, 약 59 mM 내지 약 69 mM, 약 59 mM 내지 약 65 mM, 약 59 mM 내지 약 62 mM, 또는 약 59 mM의 농도로 포함될 수 있다.

상기 히스티딘은 히스티딘 및/또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 형태 (예컨대, 염산염 등) 및/또는 수화물 형태 (예컨대, 모노하이드레이트 등) (예컨대, 히스티딘 하이드로클로라이드 모노하이드레이트(Histidine hydrochloride monohydrate) 등)로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에서, 별도의 언급이 없는 한, 용어 "히스티딘"은 히스티딘, 이의 약학적으로 허용가능한 염 형태 (예컨대, 염산염 등), 및 이의 수화물 형태 (예컨대, 모노하이드레이트 등) (예컨대, 히스티딘 하이드로클로라이드 모노하이드레이트(Histidine hydrochloride monohydrate) 등)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것으로 해석될 수 있다.

본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물에 있어서, 상기 히스티딘은 항산화제(anti-oxidant agent), 항응집제(anti-aggregation agent), 또는 이들 모두로서 기능하는 것일 수 있다.

본 발명에서 제공되는 약제학적 조성물은 히스티딘을 제외한 아미노산 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 (예컨대, 이들 모두)을 포함하지 않거나 실질적으로 포함하지 않는 것일 수 있다. 일 예에서, 본 발명에서 제공되는 약제학적 조성물은 아르기닌, 라이신, 프롤린, 글라이신, 메티오닌, 글루타민, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염 (예컨대, 염산염, 수화물 등)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상 (예컨대, 이들 모두)을 포함하지 않거나 실질적으로 포함하지 않는 것일 수 있다.

(3) 계면활성제

본 발명에서 계면활성제는, 단백질을 액상 조성물 매질에 고르게 분산시킬 수 있는 약학적으로 허용 가능한 모든 계면활성제들로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 계면활성제는 비이온성 계면활성제일 수 있으며, 구체적으로, 폴리소르베이트류(예컨대, polysorbate 20(polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate), polysorbate 40(polyoxyethylene (20) sorbitan monopalmitate), polysorbate 60(polyoxyethylene (20) sorbitan monostearate), polysorbate 65(polyoxyethylene (20) sorbitan tristearate), polysorbate 80(polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate), polysorbate 85(polyoxyethylene 20 sorbitan trioleate)(상기 폴리옥시에틸렌 뒤의 수치 (20)은 옥시에틸렌기(-(CH₂CH₂O)-)의 총 개수를 의미함), 폴록사머(PEO-PPO-PEO 공중합체; PEO: poly(ethylene oxide), PPO: poly(propylene oxide)), 소르비탄 에스테르(예컨대, 소르비탄 폴리에톡시레이트(sorbitan polyethoxylates) 등), 폴리에틸렌-폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 화합물(예컨대, 폴리옥시에틸렌-스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르(알킬: C1-C30), 폴리옥시에틸렌 모노라이릴 에테르, 알킬페닐 폴리옥시에틸렌 코폴리머(알킬: C1-C30) 등), 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulphate, SDS) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 보다 구체적으로, 보다 우수한 제형 안정성을 달성하기 위하여, 상기 계면활성제는 폴리소르베이트 20일 수 있다. 일 예에서, 본 발명의 제형은 폴리소르베이트 20을 포함하고, 폴리소르베이트 80을 포함하지 않는 것일 수 있다.

본 발명의 제형에서의 단백질의 안정성을 보다 증진시키기 위하여, 상기 약제학적 조성물에 포함된 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 20의 함량은, 전체 약제학적 조성물 기준으로, 약 0.01%(w/v) 내지 약 0.2%(w/v), 약 0.01%(w/v) 내지 약 0.1%(w/v), 약 0.01%(w/v) 내지 약 0.08%(w/v), 약 0.03%(w/v) 내지 약 0.2%(w/v), 약 0.03%(w/v) 내지 약 0.1%(w/v), 약 0.03%(w/v) 내지 약 0.08%(w/v), 약 0.04%(w/v) 초과 및 약 0.2%(w/v) 이하, 약 0.04%(w/v) 초과 및 약 0.1%(w/v) 이하, 약 0.04%(w/v) 초과 및 약 0.08%(w/v) 이하, 약 0.05%(w/v) 내지 약 0.2%(w/v), 약 0.05%(w/v) 내지 약 0.1%(w/v), 약 0.05%(w/v) 내지 약 0.08%(w/v), 약 0.01%(w/v), 약 0.03%(w/v), 약 0.04%(w/v), 약 0.05%(w/v), 약 0.08%(w/v), 약 0.1%(w/v) 또는 약 0.2%(w/v)일 수 있다.

(4) 완충액

본 발명에서 완충액은, 제형의 pH를 조절하는 기능을 하는 것으로, 단백질 제형 제조에 통상적으로 사용되는 모든 완충액을 제한없이 사용할 수 있다. 구체적으로, 시트레이트, 포스페이트, 아세테이트, 숙시네이트, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염 및/또는 수화물(예컨대, 모노하이드레이트(monohydrate) 등)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상 또는 2종 이상을 포함하는 것일 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 염은 나트륨염, 칼륨염, 숙신산염, 인산염 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 별도의 언급이 없는 한, 용어 "시트레이트"는 시트레이트, 이의 약학적으로 허용 가능한 염(예컨대, 시트르산나트륨(sodium citrate)), 및 이의 수화물 (예컨대, 시트르산모노하이드레이트(citric acid monohydrate))로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 예컨대, 시트레이트, 시트르산나트륨, 및 시트르산모노하이드레이트로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상 (예컨대, 1종, 2종 또는 3종)을 의미하는 것으로 해석될 수 있다.

본 명세서에서 별도의 언급이 없는 한, 용어 "포스페이트"는 포스페이트, 이의 약학적으로 허용 가능한 염(예컨대, 나트륨염), 및 이의 수화물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 의미하는 것으로 해석될 수 있다.

본 명세서에서 별도의 언급이 없는 한, 용어 "숙시네이트"는 숙시네이트, 이의 약학적으로 허용 가능한 염(예컨대, 나트륨염), 및 이의 수화물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 의미하는 것으로 해석될 수 있다.

본 명세서에서 별도의 언급이 없는 한, 용어 "아세테이트"는 아세테이트, 이의 약학적으로 허용 가능한 염(예컨대, 나트륨염), 및 이의 수화물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 의미하는 것으로 해석될 수 있다.

본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물에 포함되는 항-TNF 알파 항체 단백질의 안정성을 증진시키기 위하여, 상기 완충액은 pH가 약 4.0 내지 약 8.0인 것일 수 있으며, pH가 약 4.0 내지 약 7.5, 약 4.0 내지 약 7, 약 4.0 내지 약 6.5, 약 4.0 내지 약 6, 약 4.0 내지 약 5.5, 약 4.5 내지 약 7.5, 약 4.5 내지 약 7, 약 4.5 내지 약 6.5, 약 4.5 내지 약 6, 약 4.5 내지 약 5.5, 약 4.8 내지 약 7.5, 약 4.8 내지 약 7, 약 4.8 내지 약 6.5, 약 4.8 내지 약 6, 약 4.8 내지 약 5.6, 약 5.0 내지 약 7.5, 약 5.0 내지 약 7, 약 5.0 내지 약 6.5, 약 5.0 내지 약 6, 약 5.0 내지 약 5.5, 약 5.2 내지 약 7.5, 약 5.2 내지 약 7.2, 약 5.2 내지 약 7, 약 5.2 내지 약 6.8, 약 5.2 내지 약 6.6, 약 5.2 내지 약 6.5, 약 5.5 내지 약 7.5, 약 5.5 내지 약 7.2, 약 5.5 내지 약 7, 약 5.5 내지 약 6.8, 약 5.5 내지 약 6.6, 약 5.5 내지 약 6.5, 약 6.0 내지 약 7.5, 약 6.0 내지 약 7.2, 약 6.0 내지 약 7, 약 6.0 내지 약 6.8, 약 6.0 내지 약 6.6, 약 6.0 내지 약 6.5, 약 6.4 내지 약 7.5, 약 6.4 내지 약 7.2, 약 6.4 내지 약 7, 약 6.4 내지 약 6.8, 약 6.4 내지 약 6.6, 약 6.4 내지 약 6.5, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 또는 약 6.5인 것일 수 있다.

상기 완충액은, 전체 약제학적 조성물 기준으로, 약 0.1 mM 내지 약 50 mM, 약 0.1 mM 내지 약 40 mM, 약 0.1 mM 내지 약 30 mM, 약 0.1 mM 내지 약 20 mM, 약 0.1 mM 내지 약 12 mM, 약 0.1 mM 내지 약 10 mM, 약 0.1 mM 내지 약 7.8 mM, 약 0.1 mM 내지 약 6 mM, 약 0.1 mM 내지 약 4 mM, 약 0.1 mM 내지 약 3 mM, 약 0.1 mM 내지 약 2.7 mM, 약 1 mM 내지 약 50 mM, 약 1 mM 내지 약 40 mM, 약 1 mM 내지 약 30 mM, 약 1 mM 내지 약 20 mM, 약 1 mM 내지 약 12 mM, 약 1 mM 내지 약 10 mM, 약 1 mM 내지 약 7.8 mM, 약 1 mM 내지 약 6 mM, 약 1 mM 내지 약 4 mM, 약 1 mM 내지 약 3 mM, 약 1 mM 내지 약 2.7 mM, 약 2 mM 내지 약 50 mM, 약 2 mM 내지 약 40 mM, 약 2 mM 내지 약 30 mM, 약 2 mM 내지 약 20 mM, 약 2 mM 내지 약 12 mM, 약 2 mM 내지 약 10 mM, 약 2 mM 내지 약 7.8 mM, 약 2 mM 내지 약 6 mM, 약 2 mM 내지 약 2.7 mM, 약 2.5 mM 내지 약 50 mM, 약 2.5 mM 내지 약 40 mM, 약 2.5 mM 내지 약 30 mM, 약 2.5 mM 내지 약 20 mM, 약 2.5 mM 내지 약 12 mM, 약 2.5 mM 내지 약 10 mM, 약 2.5 mM 내지 약 7.8 mM, 약 2.5 mM 내지 약 6 mM, 약 2.7 mM 내지 약 50 mM, 약 2.7 mM 내지 약 40 mM, 약 2.7 mM 내지 약 30 mM, 약 2.7 mM 내지 약 20 mM, 약 2.7 mM 내지 약 12 mM, 약 2.7 mM 내지 약 10 mM, 약 2.7 mM 내지 약 7.8 mM, 약 2.7 mM 내지 약 6 mM, 약 2.7 mM 내지 약 5.4 mM, 약 3 mM 내지 약 50 mM, 약 3 mM 내지 약 40 mM, 약 3 mM 내지 약 30 mM, 약 3 mM 내지 약 20 mM, 약 3 mM 내지 약 12 mM, 약 3 mM 내지 약 10 mM, 약 3 mM 내지 약 7.8 mM, 약 3 mM 내지 약 6 mM, 약 3 mM 내지 약 5.4 mM, 약 1 mM, 약 2.5 mM, 약 2.6 mM, 약 2.7 mM, 약 2.8 mM, 약 2.9 mM, 약 4.8 mM, 약 4.9 mM, 약 5 mM, 약 5.1 mM, 약 5.2 mM, 약 5.3 mM, 약 5.4 mM, 약 7.2 mM, 약 7.3 mM, 약 7.4 mM, 약 7.5 mM, 약 7.6 mM, 약 7.7 mM, 약 7.8 mM, 약 9.8 mM, 또는 약 10 mM의 농도로 포함될 수 있다.

일 예에서, 상기 완충액은 시트레이트를 포함하고, 전체 약제학적 조성물 기준으로, 약 0.1 mM 내지 약 50 mM, 약 0.1 mM 내지 약 40 mM, 약 0.1 mM 내지 약 30 mM, 약 0.1 mM 내지 약 20 mM, 약 0.1 mM 내지 약 12 mM, 약 0.1 mM 내지 약 10 mM, 약 1 mM 내지 약 50 mM, 약 1 mM 내지 약 40 mM, 약 1 mM 내지 약 30 mM, 약 1 mM 내지 약 20 mM, 약 1 mM 내지 약 12 mM, 약 1 mM 내지 약 10 mM, 약 2 mM 내지 약 50 mM, 약 2 mM 내지 약 40 mM, 약 2 mM 내지 약 30 mM, 약 2 mM 내지 약 20 mM, 약 2 mM 내지 약 12 mM, 약 2 mM 내지 약 10 mM, 약 2.5 mM 내지 약 50 mM, 약 2.5 mM 내지 약 40 mM, 약 2.5 mM 내지 약 30 mM, 약 2.5 mM 내지 약 20 mM, 약 2.5 mM 내지 약 12 mM, 약 2.5 mM 내지 약 10 mM, 약 3 mM 내지 약 50 mM, 약 3 mM 내지 약 40 mM, 약 3 mM 내지 약 30 mM, 약 3 mM 내지 약 20 mM, 약 3 mM 내지 약 12 mM, 약 3 mM 내지 약 10 mM, 약 9.8 mM, 또는 약 10 mM의 농도로 포함될 수 있다.

다른 예에서, 상기 완충액은 포스페이트, 숙시네이트, 및 아세테이트로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상 (예컨대, 1종, 2종 또는 3종)을 포함할 수 있다.

일 예에서, 상기 완충액은 포스페이트를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 상기 완충액은 포스페이트를 포함하고 시트레이트를 포함하지 않거나 실질적으로 포함하지 않는 것일 수 있다. 다른 예에서 상기 완충액은 (1) 포스페이트 및, (2) 숙시네이트 또는 아세테이트를 포함하는 것일 수 있다. 다른 예에서, 상기 완충액은 (1) 포스페이트 및, (2) 숙시네이트 또는 아세테이트를 포함하고, 시트레이트를 포함하지 않거나 실질적으로 포함하지 않는 것일 수 있다.

상기 포스페이트 함량은, 전체 약제학적 조성물 기준으로, 약 0.1 mM 내지 약 10 mM, 약 0.1 mM 내지 약 7.8 mM, 약 0.1 mM 내지 약 6 mM, 약 0.1 mM 내지 약 4 mM, 약 0.1 mM 내지 약 3 mM, 약 0.1 mM 내지 약 2.7 mM, 약 1 mM 내지 약 10 mM, 약 1 mM 내지 약 7.8 mM, 약 1 mM 내지 약 6 mM, 약 1 mM 내지 약 4 mM, 약 1 mM 내지 약 3 mM, 약 1 mM 내지 약 2.7 mM, 약 2 mM 내지 약 10 mM, 약 2 mM 내지 약 7.8 mM, 약 2 mM 내지 약 6 mM, 약 2 mM 내지 약 2.7 mM, 약 2.5 mM 내지 약 10 mM, 약 2.5 mM 내지 약 7.8 mM, 약 2.5 mM 내지 약 6 mM, 약 2.5 mM 내지 약 2.7 mM, 약 1 mM, 약 2.5 mM, 약 2.6 mM, 약 2.7 mM, 약 2.8 mM, 또는 약 2.9 mM일 수 있다.

상기 숙시네이트 및/또는 아세테이트의 함량은, 전체 약제학적 조성물 기준으로, 약 0.1 mM 내지 약 20 mM, 약 0.1 mM 내지 약 12 mM, 약 0.1 mM 내지 약 10 mM, 약 0.1 mM 내지 약 7.8 mM, 약 0.1 mM 내지 약 6 mM, 약 0.1 mM 내지 약 5.4 mM, 약 1 mM 내지 약 20 mM, 약 1 mM 내지 약 12 mM, 약 1 mM 내지 약 10 mM, 약 1 mM 내지 약 7.8 mM, 약 1 mM 내지 약 6 mM, 약 1 mM 내지 약 5.4 mM, 약 2 mM 내지 약 20 mM, 약 2 mM 내지 약 12 mM, 약 2 mM 내지 약 10 mM, 약 2 mM 내지 약 7.8 mM, 약 2 mM 내지 약 6 mM, 약 2 mM 내지 약 5.4 mM, 약 2.5 mM 내지 약 20 mM, 약 2.5 mM 내지 약 12 mM, 약 2.5 mM 내지 약 10 mM, 약 2.5 mM 내지 약 7.8 mM, 약 2.5 mM 내지 약 6 mM, 약 2.5 mM 내지 약 5.4 mM, 약 3 mM 내지 약 20 mM, 약 3 mM 내지 약 12 mM, 약 3 mM 내지 약 10 mM, 약 3 mM 내지 약 7.8 mM, 약 3 mM 내지 약 6 mM, 약 3 mM 내지 약 5.4 mM, 약 4.8 mM, 약 4.9 mM, 약 5 mM, 약 5.1 mM, 약 5.2 mM, 약 5.3 mM, 또는 약 5.4 mM일 수 있다.

(5) 폴리올

본 발명에서 폴리올은, 당 및 당알코올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 예컨대, 솔비톨, 만니톨, 메글루민, 트레할로오스, 슈크로오스, 말토오스, 락토오스, 글루코오스, 자일리톨, 아라비톨, 에리트리톨, 락티톨, 말티톨, 이노시톨 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 본 발명에서 상기 폴리올, 예컨대 솔비톨은 등장화제(Tonicity Agent) 또는 안정화제(stabilizer) 로서 사용되는 것일 수 있다. 다른 예에서, 상기 폴리올, 예컨대, 만니톨은 등장화제(Tonicity Agent) 또는 안정화제(stabilizer)로서 사용되는 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 폴리올은 솔비톨, 만니톨, 또는 이의 조합일 수 있다. 일 예에서, 상기 폴리올은 솔비톨을 포함하고, 솔비톨을 제외한 당 및 당알코올 중 선택된 하나 이상 또는 이들 모두를 포함하지 않거나 실질적으로 포함하지 않는 것일 수 있다.

다른 예에서, 상기 폴리올은 만니톨을 포함하고 만니톨을 제외한 당 및 당알코올 중 선택된 하나 이상 또는 이들 모두를 포함하지 않거나 실질적으로 포함하지 않는 것일 수 있다.

본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물에서 단백질의 안정성을 보다 증진시키거나, 등장화제로서 작용하기 위하여, 상기 폴리올의 함량은, 전체 약제학적 조성물 기준으로, 약 0.01 내지 약 10 %(w/v), 약 0.01 내지 약 8 %(w/v), 약 0.01 내지 약 6 %(w/v), 약 0.01 내지 약 4 %(w/v), 약 0.01 내지 약 3.5 %(w/v), 약 0.01 내지 약 3.3 %(w/v), 약 0.01 내지 약 2.6 %(w/v), 약 0.01 내지 약 2 %(w/v), 약 0.01 내지 약 1 %(w/v), 약 0.05 내지 약 10 %(w/v), 약 0.05 내지 약 8 %(w/v), 약 0.05 내지 약 6 %(w/v), 약 0.05 내지 약 4 %(w/v), 약 0.05 내지 약 3.5 %(w/v), 약 0.05 내지 약 3.3 %(w/v), 약 0.05 내지 약 2.6 %(w/v), 약 0.05 내지 약 2 %(w/v), 약 0.05 내지 약 1 %(w/v), 약 0.1 내지 약 10 %(w/v), 약 0.1 내지 약 8 %(w/v), 약 0.1 내지 약 6 %(w/v), 약 0.1 내지 약 4 %(w/v), 약 0.1 내지 약 3.5 %(w/v), 약 0.01 내지 약 3.3 %(w/v), 약 0.01 내지 약 2.6 %(w/v), 약 0.1 내지 약 2 %(w/v), 약 0.1 내지 약 1 %(w/v), 약 1 내지 약 10 %(w/v), 약 1 내지 약 8 %(w/v), 약 1 내지 약 6 %(w/v), 약 1 내지 약 4 %(w/v), 약 1 내지 약 3.5 %(w/v), 약 1 내지 약 3.3 %(w/v), 약 1 내지 약 2.6 %(w/v), 약 1 내지 약 2 %(w/v), 약 1.5 내지 약 10 %(w/v), 약 1.5 내지 약 8 %(w/v), 약 1.5 내지 약 6 %(w/v), 약 1.5 내지 약 4 %(w/v), 약 1.5 내지 약 3.5 %(w/v), 약 1.5 내지 약 3.3 %(w/v), 약 1.5 내지 약 2.6 %(w/v), 약 2 내지 약 10 %(w/v), 약 2 내지 약 8 %(w/v), 약 2 내지 약 6 %(w/v), 약 2 내지 약 4 %(w/v), 약 2 내지 약 3.5 %(w/v), 약 2 내지 약 3.3 %(w/v), 약 2 내지 약 2.6 %(w/v), 약 2.3 내지 약 10 %(w/v), 약 2.3 내지 약 8 %(w/v), 약 2.3 내지 약 6 %(w/v), 약 2.3 내지 약 4 %(w/v), 약 2.3 내지 약 3.5 %(w/v), 약 2.3 내지 약 3.3 %(w/v), 약 2.3 내지 약 2.6 %(w/v), 약 2.5 내지 약 10 %(w/v), 약 2.5 내지 약 8 %(w/v), 약 2.5 내지 약 6 %(w/v), 2.5 내지 약 4 %(w/v), 약 2.5 내지 약 3.5 %(w/v), 약 2.5 내지 약 3.3 %(w/v), 약 2.5 내지 약 3 %(w/v), 약 2.3%(w/v), 약 2.4%(w/v), 약 2.5%(w/v), 약 2.6%(w/v), 약 2.7%(w/v), 약 2.8%(w/v), 약 2.9%(w/v), 약 3%(w/v), 약 3.1%(w/v), 약 3.2%(w/v), 또는 약 3.3%(w/v)일 수 있다.

(6) pH

본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물의 pH는 약 4 내지 약 8인 것일 수 있으며, 구체적으로, pH가 약 4.0 내지 약 7.5, 약 4.0 내지 약 7, 약 4.0 내지 약 6.5, 약 4.0 내지 약 6, 약 4.0 내지 약 5.5, 약 4.5 내지 약 7.5, 약 4.5 내지 약 7, 약 4.5 내지 약 6.5, 약 4.5 내지 약 6, 약 4.5 내지 약 5.5, 약 4.8 내지 약 7.5, 약 4.8 내지 약 7, 약 4.8 내지 약 6.5, 약 4.8 내지 약 6, 약 4.8 내지 약 5.6, 약 5.0 내지 약 7.5, 약 5.0 내지 약 7, 약 5.0 내지 약 6.5, 약 5.0 내지 약 6, 약 5.0 내지 약 5.5, 약 5.2 내지 약 7.5, 약 5.2 내지 약 7.2, 약 5.2 내지 약 7, 약 5.2 내지 약 6.8, 약 5.2 내지 약 6.6, 약 5.2 내지 약 6.5, 약 5.5 내지 약 7.5, 약 5.5 내지 약 7.2, 약 5.5 내지 약 7, 약 5.5 내지 약 6.8, 약 5.5 내지 약 6.6, 약 5.5 내지 약 6.5, 약 6.0 내지 약 7.5, 약 6.0 내지 약 7.2, 약 6.0 내지 약 7, 약 6.0 내지 약 6.8, 약 6.0 내지 약 6.6, 약 6.0 내지 약 6.5, 약 6.4 내지 약 7.5, 약 6.4 내지 약 7.2, 약 6.4 내지 약 7, 약 6.4 내지 약 6.8, 약 6.4 내지 약 6.6, 약 6.4 내지 약 6.5, 약 5.0, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 약 5.5 또는 약 6.5인 것일 수 있다.

(7) 기타 첨가제

본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은 암모늄염, 예컨대, 염화암모늄, 황산암모늄, 탄산암모늄, 질산암모늄 등으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하지 않거나 실질적으로 포함하지 않는 것일 수 있다. 다른 예에서, 본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은 염화나트륨, 황산나트륨, 염화칼륨, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 에틸렌다이아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA), 또는 이들 모두를 포함하지 않거나 실질적으로 포함하지 않는 것일 수 있다.

또한, 상기 약제학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 및/또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용되는 담체는 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 슈크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물(예컨대, 정제수), 생리식염수, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

(8) 물성

본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은 히스티딘을 포함하지 않는 조성물, 폴리소르베이트 20 대신 폴리소르베이트 80을 포함하는 조성물, 또는 이들 모두와 비교하여 안정성이 우수한 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 히스티딘을 포함하지 않는 조성물은 히스티딘을 완전히 포함하지 않거나(약 0 mM), 실질적으로 포함하지 않는 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 폴리소르베이트 20 대신 (폴리소르베이트 20을 대체하여) 폴리소르베이트 80을 포함하는 조성물은 폴리소르베이트 80를, 전체 약제학적 조성물을 기준으로, 0.01 내지 0.2%(w/v), 0.01 내지 0.15%(w/v), 0.01 내지 0.12%(w/v), 0.01 내지 0.1%(w/v), 0.04 내지 0.2%(w/v), 0.04 내지 0.15%(w/v), 0.04 내지 0.12%(w/v), 0.04 내지 0.1%(w/v), 0.08 내지 0.2%(w/v), 0.08 내지 0.15%(w/v), 0.08 내지 0.12%(w/v), 또는 0.08 내지 0.1%(w/v)의 양으로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

안정성

본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은 안정성이 우수한 것을 특징으로 한다. 본 명세서에서 "안정성이 우수하다" 또는 "안정하게 유지된다" 함은 보관 시에 조성물 내의 단백질의 구조, 및/또는 물리적, 화학적, 및/또는 생물학적 특성이 유지됨을 의미할 수 있다(예컨대, 보관 중의 낮은 단백질 중합체 형성률, 낮은 단백질 응집률, 낮은 단백질 분해율, 높은 단백질(약물) 함유율, 낮은 변성률, 낮은 아미노산(예컨대, 메티오닌 잔기) 산화 수준 등).

본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은 다음 중 하나 이상의 특징을 갖는 것일 수 있다:

(i) 히스티딘을 포함하지 않는(Histidine-free) 조성물과 비교하여 광 안정성이 개선; 및

(ii) 폴리소르베이트 20 대신 폴리소르베이트 80을 포함하는(polysorbate 80-containing) 조성물과 비교하여 열 안정성, 동결 용융 안정성, 또는 이들 모두가 개선.

상기 광 안정성은 광 부하(photo stress) 조건에서의 조성물 내의 단백질의 구조, 및/또는 물리적, 화학적, 및/또는 생물학적 특성이 유지됨을 의미할 수 있다(예컨대, 보관 중의 낮은 단백질 중합체 형성률, 낮은 단백질 응집률, 낮은 단백질 분해율, 높은 단백질(약물) 함유율, 낮은 변성률, 낮은 아미노산(예컨대, 메티오닌 잔기) 산화 수준 등). 일 예에서, 상기 광 안정성은 광 노출 조건에서의 낮은 아미노산(예컨대, 메티오닌 잔기) 산화 수준으로 측정(또는 결정 또는 확인 또는 분석)될 수 있다.

일 예에서, 상기 광 안정성의 개선은 광 부하 조건에서 상기 항체의 아미노산 잔기의 산화 수준이 감소된 것(항산화)을 의미할 수 있다. 일 예에서, 상기 아미노산 잔기는 항체 (항-TNFα 항체, 예컨대, 아달리무맙)의 중쇄 및/또는 경쇄에 존재하는 하나 이상의 메티오닌일 수 있으며, 예컨대, 상기 항체의 중쇄의 256번째 위치의 메티오닌일 수 있다. 이와 같은 광 부하 조건에서의 약제학적 조성물 내 항체의 아미노산 잔기에 대한 항산화 효과는 상기 약제학적 조성물에 포함된 히스티딘의 작용에 의한 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 광 부하 조건은, 의약품규제조화위원회(ICH) 가이드라인 'Q1B 안정성 시험 신규 원료의약품 및 신규완제의약품의 광안정성 시험'의 기준을 따르는 것일 수 있으며 (참고예 2 참조; 기저군(base), 암대조군 (Dark control), 광 노출(Light-exposured), 예컨대, 1.2 million lux hours 이상 및 200 Wh/m² (watt hours/square meter) 이상의 조건을 의미할 수 있다.

일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은, 상기 광 노출 조건에서 측정된 항체 중쇄의 256번째 메티오닌 잔기의 산화율(%Met₂₅₆)이 약 64% 이하, 약 63% 이하, 약 62% 이하, 약 61% 이하, 약 60% 이하, 약 59% 이하, 약 58% 이하, 약 57% 이하, 약 56% 이하, 약 55% 이하, 약 54% 이하, 약 53% 이하, 약 52% 이하, 약 51% 이하, 약 50% 이하, 약 49% 이하, 약 48% 이하, 약 47% 이하, 약 46% 이하, 약 45% 이하, 약 44% 이하, 약 43% 이하, 약 42% 이하, 또는 약 41% 이하(하한값은 0% 초과 및 41% 이하의 범위 중에서 선택된 수치, 예컨대, 약 0%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 또는 약 40%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님)일 수 있다.

다른 예에서, 본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은, 상기 광 노출 조건에서 측정된 항체 중쇄의 256번째 메티오닌 잔기의 산화율(%Met₂₅₆)이, 히스티딘을 포함하지 않는 조성물의 광 노출 조건에서 측정된 %Met₂₅₆와 비교하여, 약 10% 이상, 약 11% 이상, 약 12% 이상, 약 13% 이상, 약 14% 이상, 약 15% 이상, 약 16% 이상, 약 17% 이상, 약 18% 이상, 약 19% 이상, 약 20% 이상, 약 21% 이상, 약 22% 이상, 약 23% 이상, 약 24% 이상 또는 약 25% 이상 (상한값은 25% 내지 100% 범위 중에서 선택된 수치, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45% 또는 약 50%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님) 낮은 것일 수 있다.

다른 예에서, 본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은, 상기 광 노출 조건에서 측정된 항체 중쇄의 256번째 메티오닌 잔기의 산화율(%Met₂₅₆)의 기저군 (광 노출 적용 없음, 5±3℃) 또는 암대조군(동일한 광 노출 조건에서 빛을 차단한 상태(예컨대, 호일로 차단)로 처리됨)의 %Met₂₅₆에 대한 차이값(Δ%Met₂₅₆)이 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 54% 이하, 53% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 29% 이하, 28% 이하, 27% 이하, 26% 이하, 25% 이하, 또는 24% 이하(하한값은 0% 초과 및 24% 이하의 범위 중에서 선택된 수치, 예컨대, 약 0%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 또는 약 20%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님)일 수 있다.

다른 예에서, 본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은, 히스티딘을 포함하지 않는 조성물과 비교하여, 상기 광 노출 조건에서 측정된 항체 중쇄의 256번째 메티오닌 잔기의 산화율(%Met₂₅₆)의 기저군 (광 노출 적용 없음, 5±3℃) 또는 암대조군(동일한 광 노출 조건에서 빛을 차단한 상태(예컨대, 호일로 차단)로 처리됨)의 %Met₂₅₆에 대한 차이값(Δ%Met₂₅₆)이 약 10% 이상, 약 11% 이상, 약 12% 이상, 약 13% 이상, 약 14% 이상, 약 15% 이상, 약 16% 이상, 약 17% 이상, 약 18% 이상, 약 19% 이상, 약 20% 이상, 약 21% 이상, 약 22% 이상, 약 23% 이상, 약 24% 이상 또는 약 25% 이상 (상한값은 25% 내지 100% 범위 중에서 선택된 수치, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45% 또는 약 50%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님) 적은 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 광 안정성의 개선은 광 부하 조건에서 상기 조성물 내 상기 항체의 응집률이 감소된 것(항응집)을 의미할 수 있다. 이와 같은 광 부하 조건에서의 항체의 응집률 감소(항응집) 효과는 상기 약제학적 조성물에 포함된 히스티딘의 작용에 의한 것일 수 있다.

상기 단백질 응집률은 조성물 내 응집물(aggregate)의 함량비를 의미할 수 있고, 상기 '응집물(aggregate)'은 본 발명의 조성물에 포함된 항-TNFα 항체 단백질이 응집되어 형성된 고분자 생성물(High Molecular Weight; HMW)을 의미하고, 다른 말로 응집체라고도 할 수 있다.

상기 광 안정성에 있어서, 단백질 응집률은 상기와 같은 광 부하 조건에서 측정된 조성물 내 응집물의 함량(%HMW 또는 HMW%) 또는 응집물의 함량의 변화량 또는 차이값 (Δ%HMW 또는 ΔHMW%)으로 표현될 수 있다.

일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은, 상기 광 노출 조건에서 측정된 조성물 내 응집물의 함량(%HMW)(예컨대, SE-HPLC로 측정)이 약 15% 이하, 약 14% 이하, 약 13% 이하, 약 12% 이하, 약 11% 이하, 약 10% 이하, 약 9.5% 이하, 약 9% 이하, 또는 약 8.5% 이하(하한값은 0% 초과 및 8.5% 이하의 범위 중에서 선택된 수치, 예컨대, 약 0%, 약 0.1%, 약 0.5%, 약 1%, 또는 약 2%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님)일 수 있다.

일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은, 히스티딘을 포함하지 않는 조성물과 비교하여, 상기 광 노출 조건에서 측정된 응집물의 함량(%HMW)(예컨대, SE-HPLC로 측정)이 약 4% 이상, 약 5% 이상, 약 6% 이상, 약 7% 이상, 약 8% 이상, 약 9% 이상, 또는 약 10% 이상 (상한값은 10% 내지 100% 범위 중에서 선택된 수치, 약 11%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45% 또는 약 50%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님) 적은 것일 수 있다.

일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은, 상기 광 부하 조건에서 측정된 조성물 내 응집물의 함량의 변화량 또는 차이값(Δ%HMW), 즉 광 노출 조건에서의 응집물 함량과 기저군 또는 암대조군 조건에서의 응집률 함량과의 차이값 [Δ%HMW = (광 노출 조건에서의 %HMW) - (기저군 또는 암대조군 조건에서의 %HMW)]이 약 15% 이하, 약 14% 이하, 약 13% 이하, 약 12% 이하, 약 11% 이하, 약 10% 이하, 약 9.5% 이하, 약 9% 이하, 약 8.8% 이하, 약 8.6% 이하, 약 8.5% 이하, 또는 약 8% 이하(하한값은 0% 초과 및 8% 이하의 범위 중에서 선택된 수치, 예컨대, 약 0%, 약 0.1%, 약 0.5%, 약 1%, 또는 약 2%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님)일 수 있다.

일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은, 히스티딘을 포함하지 않는 조성물과 비교하여, 상기 광 부하 조건에서 측정된 조성물 내 응집물의 함량의 변화량 또는 차이값[Δ%HMW= (광 노출 조건에서의 %HMW) - (기저군 또는 암대조군 조건에서의 %HMW)]이 약 3% 이상, 약 4% 이상, 약 5% 이상, 약 5.5% 이상, 약 6% 이상, 약 7% 이상, 약 8% 이상, 약 9% 이상, 약 10% 이상, 약 11% 이상, 또는 약 12% 이상 (상한값은 12% 내지 100% 범위 중에서 선택된 수치, 약 13%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45% 또는 약 50%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님) 적은 것일 수 있다.

상기 열 안정성 및/또는 동결 용융 안정성은 열 가혹 조건(Heat stress Condition; 예컨대, 40±2℃에서 0 내지 8주 또는 0 내지 4주 (예, 0주, 1주, 2주, 3주, 4주 또는 8주)) 및/또는 동결 용융 조건(Freeze/thaw condition; 예컨대, '-70℃±10℃에서 18시간 이상 냉동(Freeze)' 및 '상온(25℃)에서 1시간 이상 해동(thaw)'의 3~5 cycles)에서 저장 또는 보관시 조성물 내의 단백질의 구조, 및/또는 물리적, 화학적, 및/또는 생물학적 특성이 유지됨을 의미할 수 있다 (예컨대, 저장 또는 보관 기간 중 선택된 하나 이상의 시점에서의 낮은 단백질 중합체 형성률, 낮은 단백질 응집률, 낮은 단백질 분해율, 높은 단백질(약물) 함유율, 낮은 변성률, 낮은 아미노산(예컨대, 메티오닌 잔기) 산화 수준 등).

일 예에서, 상기 열 안정성 및/또는 동결 용융 안정성은 열 가혹 조건 및/또는 동결 용융 조건에서 측정된 단백질 응집률, 단백질 변성률, 또는 이들의 조합으로 측정(또는 결정 또는 확인 또는 분석)될 수 있다. 일 예에서, 상기 열 안정성 및/또는 동결 용융 안정성의 개선은 열 가혹 조건 및/또는 동결 용융 조건에서 단백질 응집률, 단백질 변성률, 또는 이들 모두가 낮아진 것을 의미할 수 있다.

상기 열 안정성 및/또는 동결 용융 안정성에 있어서, 단백질 응집률은,

- 보관(또는 저장) 개시 시점을 포함하여 보관(또는 저장) 기간 중 선택된 임의의 시점에서의 조성물 내 응집물의 함량(%HMW 또는 HMW%),

- 보관(또는 저장) 개시 시점을 포함하여 보관(또는 저장) 기간 중 선택된 임의의 구간에서의 조성물 내 응집물의 함량의 변화량 또는 차이값(Δ%HMW)

- -70±10℃/25℃ 조건에서 동결-용융 5 사이클 후의 조성물 내 응집물의 함량(%HMW 또는 HMW%), 및/또는

- -70±10℃/25℃ 조건에서 동결-용융 5 사이클 수행 전후의 조성물 내 응집물의 함량의 변화량 또는 차이값(Δ%HMW)

으로 표현될 수 있다.

본 명세서에 사용된 바로서, 용어 '변성률'은 본 발명의 조성물에 포함된 항-TNFα 항체 단백질이 원래의 성질과 다르게 산성을 띠게 되는 정도(산성 변이체(acidic variants)의 함량; %Acidic 또는 Acidic%) 또는 염기성을 띠게 되는 정도(염기성 변이체(basic variants)의 함량; %Basic 또는 Basic%)를 의미하는 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 단백질 변성률은,

- 보관(또는 저장) 개시 시점을 포함하여 보관(또는 저장) 기간 중 선택된 임의의 시점에서의 조성물 내 산성 변이체의 함량 (%Acidic 또는 Acidic%),

- 보관(또는 저장) 개시 시점을 포함하여 보관(또는 저장) 기간 중 선택된 임의의 구간에서의 조성물 내 산성 변이체의 함량의 변화량 또는 차이값(Δ%Acidic),

- -70±10℃/25℃ 조건에서 동결-용융 5 사이클 후의 조성물 내 산성 변이체의 함량(%Acidic 또는 Acidic%), 및/또는

- -70±10℃/25℃ 조건에서 동결-용융 5 사이클 수행 전후의 조성물 내 산성 변이체의 함량의 변화량 또는 차이값(Δ%Acidic = (FT5 %Acidic) - (Initial %Acidic))

으로 표현될 수 있다.

일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은, 40±2℃의 온도에서 0주 내지 8주, 0주 내지 4주, 또는 0주 내지 2주 동안의 기간(보관 개시시부터 보관 종료시까지의 기간) 중 선택된 임의의 시점(예컨대, 0주, 1주, 2주, 4주 또는 8주) 또는 전체 기간에 걸쳐서, 조성물 내 응집물 함량(%HMW)(예컨대, SE-HPLC로 측정)이 약 1.0% 이하, 약 0.97% 이하, 약 0.94% 이하, 약 0.91% 이하, 약 0.87% 이하, 약 0.84% 이하, 약 0.81% 이하, 약 0.79% 이하, 약 0.76% 이하, 약 0.72% 이하, 약 0.70% 이하, 약 0.69% 이하 또는 약 0.68% 이하일 수 있고, 그 하한값은 0을 초과하는 수치, 예컨대, 약 0.0001%, 약 0.0005%, 약 0.001%, 약 0.004%, 약 0.007%, 또는 약 0.01%일 수 있다.

일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은, 폴리소르베이트 20 대신 폴리소르베이트 80을 (예컨대, 동일 농도로) 포함하는 조성물과 비교하여, 40±2℃의 온도에서 0주 내지 8주, 0주 내지 4주, 또는 0주 내지 2주 동안의 기간(보관 개시시부터 보관 종료시까지의 기간) 중 선택된 임의의 시점(예컨대, 0주, 1주, 2주, 4주 또는 8주) 또는 전체 기간에서의 조성물 내 응집물 함량(%HMW)(예컨대, SE-HPLC로 측정)이 약 0.005% 이상, 약 0.01% 이상, 약 0.015% 이상, 약 0.02% 이상, 약 0.04% 이상, 약 0.06% 이상, 또는 약 0.08% 이상 (상한값은 0.08% 내지 100% 범위 중에서 선택된 수치, 약 0.1%, 약 1%, 약 1.5%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40% 또는 약 50%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님) 적은 것일 수 있다.

일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은, 히스티딘을 포함하지 않고 폴리소르베이트 20 대신 폴리소르베이트 80을 포함하는 조성물과 비교하여, 40±2℃의 온도에서 0주 내지 8주, 0주 내지 4주, 또는 0주 내지 2주 동안의 기간(보관 개시시부터 보관 종료시까지의 기간) 중 선택된 임의의 시점(예컨대, 0주, 1주, 2주, 4주 또는 8주) 또는 전체 기간에서의 조성물 내 응집물 함량(%HMW)(예컨대, SE-HPLC로 측정)이 약 0.1% 이상, 약 0.15% 이상, 약 0.2% 이상, 약 0.25% 이상, 약 0.3% 이상, 약 0.35% 이상, 약 0.4% 이상, 약 0.45% 이상, 약 0.5% 이상, 또는 약 0.55% 이상 (상한값은 0.55% 내지 100% 범위 중에서 선택된 수치, 약 0.6%, 약 1%, 약 1.5%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40% 또는 약 50%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님) 적은 것일 수 있다.

일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은, 40±2℃의 온도에서 0주 내지 8주, 0주 내지 4주, 또는 0주 내지 2주 동안(예컨대, 0주, 1주, 2주, 4주 또는 8주)의 조성물 내 응집물 함량의 변화량(Δ%HMW)이 약 1.0% 이하, 약 0.97% 이하, 약 0.94% 이하, 약 0.91% 이하, 약 0.87% 이하, 약 0.84% 이하, 약 0.81% 이하, 약 0.79% 이하, 약 0.76% 이하, 약 0.72% 이하, 약 0.70% 이하, 약 0.68% 이하, 약 0.66% 이하, 약 0.64% 이하, 약 0.62% 이하, 약 0.60% 이하, 약 0.58% 이하, 약 0.56% 이하, 약 0.54% 이하, 약 0.52% 이하, 약 0.50% 이하, 약 0.48% 이하, 약 0.46% 이하, 약 0.44% 이하, 약 0.42% 이하, 약 0.40% 이하, 약 0.38% 이하, 약 0.36% 이하, 약 0.34% 이하, 약 0.32% 이하, 약 0.30% 이하, 약 0.28% 이하, 또는 약 0.26% 이하일 수 있고, 그 하한값은 0을 초과하는 수치, 예컨대, 약 0.0001%, 약 0.0005%, 약 0.001%, 약 0.005%, 약 0.01%, 약 0.05%, 또는 약 0.1%일 수 있다.

일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은, 히스티딘을 포함하지 않고 폴리소르베이트 20 대신 폴리소르베이트 80을 포함하는 조성물과 비교하여, 40±2℃의 온도에서 0주 내지 8주, 0주 내지 4주, 또는 0주 내지 2주 동안(예컨대, 0주, 1주, 2주, 4주 또는 8주)의 조성물 내 응집물 함량의 변화량(Δ%HMW)이 약 0.02% 이상, 약 0.04% 이상, 약 0.06% 이상, 약 0.08% 이상, 약 0.1% 이상, 약 0.15% 이상, 약 0.2% 이상, 약 0.25% 이상, 약 0.3% 이상, 약 0.35% 이상, 또는 약 0.38% 이상 (상한값은 0.38% 내지 100% 범위 중에서 선택된 수치, 약 0.4%, 약 1%, 약 1.5%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40% 또는 약 50%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님) 적은 것일 수 있다.

일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은 40±2℃의 온도에서 0주 내지 8주, 0주 내지 4주, 또는 0주 내지 2주 동안의 기간(보관 개시시부터 보관 종료시까지의 기간) 중 선택된 임의의 시점(예컨대, 0주, 1주, 2주 4주 또는 8주) 또는 전체 기간에서의 조성물 내 산성 변이체 함량(%Acidic)(예컨대, CEX-HPLC 또는 icIEF 로 측정)이 약 45% 이하, 약 43% 이하, 약 40% 이하, 약 38% 이하, 약 36% 이하, 약 34% 이하, 약 32% 이하, 약 30% 이하, 약 28% 이하, 또는 약 26% 이하일 수 있고, 그 하한값은 0을 초과하는 수치, 예컨대, 약 0.0001%, 약 0.0005%, 약 0.001%, 약 0.005%, 약 0.01%, 약 0.05%, 또는 약 0.1%일 수 있다.

일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은, 히스티딘을 포함하지 않고 폴리소르베이트 20 대신 폴리소르베이트 80을 포함하는 조성물과 비교하여, 40±2℃의 온도에서 0주 내지 8주, 0주 내지 4주, 또는 0주 내지 2주 동안의 기간(보관 개시시부터 보관 종료시까지의 기간) 중 선택된 임의의 시점(예컨대, 0주, 1주, 2주 4주 또는 8주) 또는 전체 기간에서의 조성물 내 산성 변이체 함량(%Acidic)(예컨대, CEX-HPLC 또는 icIEF 로 측정)이 약 1% 이상, 약 2% 이상, 약 3% 이상, 약 4% 이상, 약 5% 이상, 약 6% 이상, 약 7% 이상, 약 8% 이상, 약 9% 이상, 또는 약 10% 이상 (상한값은 10% 내지 100% 범위 중에서 선택된 수치, 약 11%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45% 또는 약 50%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님) 적은 것일 수 있다.

일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은, 40±2℃의 온도에서 0주 내지 8주, 0주 내지 4주, 또는 0주 내지 2주 동안(예컨대, 1주, 2주, 4주 또는 8주)의 조성물 내 산성 변이체 함량의 변화량(Δ%Acidic)이 약 25% 이하, 약 24% 이하, 약 23% 이하, 약 22% 이하, 약 21% 이하, 약 20% 이하, 약 19% 이하, 약 18% 이하, 약 17.5% 이하, 약 17% 이하, 약 16.5% 이하, 약 16% 이하, 약 15.5% 이하, 약 15% 이하, 약 14.5% 이하, 약 14% 이하, 약 13.5% 이하, 약 13% 이하, 약 12.5% 이하, 약 12% 이하, 약 11.5% 이하, 약 11% 이하, 약 10.5% 이하, 약 10% 이하, 약 9.5% 이하, 또는 약 9% 이하일 수 있고, 그 하한값은 0을 초과하는 수치, 예컨대, 약 0.0001%, 약 0.0005%, 약 0.001%, 약 0.005%, 약 0.01%, 약 0.05%, 또는 약 0.1%일 수 있다.

일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은, 히스티딘을 포함하지 않고 폴리소르베이트 20 대신 폴리소르베이트 80을 포함하는 조성물과 비교하여, 40±2℃의 온도에서 0주 내지 8주, 0주 내지 4주, 또는 0주 내지 2주 동안(예컨대, 1주, 2주, 4주 또는 8주)의 조성물 내 응집물 함량의 변화량(Δ%HMW)이 약 1% 이상, 약 1.5% 이상, 약 2% 이상, 약 3% 이상, 약 4% 이상, 약 5% 이상, 약 6% 이상, 약 7% 이상, 약 8% 이상, 약 9% 이상, 약 10% 이상, 약 11% 이상, 약 12% 이상, 또는 약 13% 이상 (상한값은 13% 내지 100% 범위 중에서 선택된 수치, 약 14%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45% 또는 약 50%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님) 적은 것일 수 있다.

일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은, -70±10℃/25℃ 조건에서 동결-용융 5 사이클 후의 조성물 내 응집물 함량(%HMW)(예컨대, SE-HPLC로 측정)이 약 1.0% 이하, 약 0.97% 이하, 약 0.94% 이하, 약 0.91% 이하, 약 0.87% 이하, 약 0.84% 이하, 약 0.81% 이하, 약 0.79% 이하, 약 0.76% 이하, 약 0.72% 이하, 약 0.70% 이하, 약 0.68% 이하, 약 0.66% 이하, 약 0.64% 이하, 약 0.62% 이하, 약 0.60% 이하, 약 0.58% 이하, 약 0.57% 이하, 약 0.56% 이하, 약 0.55% 이하, 약 0.54% 이하, 약 0.53% 이하, 약 0.52% 이하, 약 0.51% 이하, 약 0.50% 이하, 약 0.49% 이하, 또는 약 0.48% 이하일 수 있고, 그 하한값은 0을 초과하는 수치, 예컨대, 약 0.0001%, 약 0.0005%, 약 0.001%, 약 0.005%, 약 0.01%, 약 0.05%, 또는 약 0.1%일 수 있다.

일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은, 폴리소르베이트 20 대신 폴리소르베이트 80을 (예컨대, 동일 농도로) 포함하는 조성물과 비교하여, -70±10℃/25℃ 조건에서 동결-용융 5 사이클 후의 조성물 내 응집물 함량(%HMW)(예컨대, SE-HPLC로 측정)이 약 0.005% 이상, 약 0.01% 이상, 약 0.015% 이상, 약 0.02% 이상, 약 0.04% 이상, 약 0.06% 이상, 약 0.08% 이상, 또는 약 0.1% 이상 (상한값은 0.1% 내지 100% 범위 중에서 선택된 수치, 약 0.2%, 약 0.5%, 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 40%, 약 45% 또는 약 50%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님) 적은 것일 수 있다.

일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은, -70±10℃/25℃ 조건에서 동결-용융 5 사이클 후의 조성물 내 산성 변이체 함량(%Acidic)(예컨대, icIEF로 측정)이 약 27% 이하, 약 26.91% 이하 또는 약 26.85% 이하일 수 있고, 그 하한값은 0을 초과하는 수치, 예컨대, 약 0.0001%, 약 0.0005%, 약 0.001%, 약 0.005%, 약 0.01%, 약 0.05%, 또는 약 0.1%일 수 있다.

일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은, 폴리소르베이트 20 대신 폴리소르베이트 80을 (예컨대 동일 농도로) 포함하는 조성물과 비교하여, -70±10℃/25℃ 조건에서 동결-용융 5 사이클 후의 조성물 내 산성 변이체 함량(%Acidic)(예컨대, icIEF로 측정)이 약 0.005% 이상, 약 0.01% 이상, 약 0.1% 이상, 약 0.12% 이상, 약 0.15% 이상, 약 0.2% 이상, 약 0.5% 이상, 약 0.7% 이상, 또는 약 1% 이상 (상한값은 1% 내지 100% 범위 중에서 선택된 수치, 약 1.1%, 약 1.5%, 약 2%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 40%, 약 45%, 또는 약 50%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님) 적은 것일 수 있다.

일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은, -70±10℃/25℃ 조건에서 동결-용융 5 사이클 수행 전후의 조성물 내 산성 변이체의 함량의 변화량 또는 차이값(Δ%Acidic) (예컨대, icIEF로 측정)이 약 3% 이하, 약 2.6% 이하, 약 2.5% 이하, 약 2.45% 이하, 약 2% 이하, 약 1.9% 이하, 약 1.8% 이하, 약 1.7% 이하, 약 1.6% 이하, 약 1.5% 이하, 약 1.4% 이하, 약 1.3% 이하, 약 1.2% 이하, 약 1.1% 이하, 또는 약 1.0% 이하일 수 있고, 그 하한값은 0을 초과하는 수치, 예컨대, 약 0.0001%, 약 0.0005%, 약 0.001%, 약 0.005%, 약 0.01%, 약 0.05%, 또는 약 0.1%일 수 있다.

일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은, 폴리소르베이트 20 대신 폴리소르베이트 80을 (예컨대, 동일 농도로) 포함하는 조성물과 비교하여, -70±10℃/25℃ 조건에서 동결-용융 5 사이클 수행 전후의 조성물 내 산성 변이체의 함량의 변화량 또는 차이값(Δ%Acidic)이 약 0.1% 이상, 약 0.2% 이상, 약 0.3% 이상, 약 0.4% 이상, 약 0.5% 이상, 약 0.6% 이상, 약 0.7% 이상, 약 0.8% 이상, 약 0.9% 이상, 약 1% 이상, 약 1.5% 이상, 또는 약 2% 이상 (상한값은 2% 내지 100% 범위 중에서 선택된 수치, 약 2.1%, 약 2.5%, 약 3%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 40%, 약 45% 또는 약 50%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님) 적은 것일 수 있다.

일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물 또는 그를 포함하는 컨테이너는, 5±3℃ 온도에서 약 32개월 내지 약 52개월, 약 34개월 내지 약 50개월, 약 36개월 내지 약 48개월, 약 36개월, 또는 약 48개월 보관된 이후, 30±2℃의 실온 및 60±5%의 상대 습도(Relative humidity, RH)에서 약 28일 내지 약 35일, 약 28일 내지 약 32일, 약 28일 내지 약 30일, 약 28일 또는 약 30일 저장한 경우 안정성이 유지되는 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 실온 저장 안정성은, 투명도, 색, pH, 단백질 농도, TNFα 결합 활성, TNFα 중화 활성, 순도, 단백질 응집률, 전하 변이체, 미립자 개수로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 측정(또는 결정 또는 확인 또는 분석)되는 것일 수 있다.

구체적으로, 본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물 또는 그를 포함하는 컨테이너는, 5±3℃ 온도에서 32개월 내지 52개월, 구체적으로는 36개월 내지 48개월, 36개월 또는 48개월 저장된 이후, 30±2℃의 온도에서 28일 내지 35일, 구체적으로는 30일 보관된 경우, 다음 중에서 선택된 하나 이상의 특징을 갖는 것일 수 있다:

탁도가 약 30 NTU(nephelometric turbidity unit) 이하, 약 25 NTU 이하, 약 22 NTU 이하, 약 20 NTU 이하, 약 19 NTU 이하, 약 18 NTU 이하, 또는 약 17 NTU 이하일 수 있고, 그 하한값은 0 내지 10 NTU 중에서 선택된 수치일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

TNFα 결합 활성이 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 100% 이상, 약 102% 이상, 약 104% 이상, 또는 약 106% 이상일 수 있고, 그 상한값은 107% 내지 125% 범위에서 선택된 수치일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

TNFα 중화 활성이 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 86% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 약 100% 이상, 약 101% 이상, 약 102% 이상, 약 103% 이상, 약 104% 이상, 또는 약 105% 이상일 수 있고, 그 상한값은 105% 내지 133% 범위에서 선택된 수치일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

전체 순도(Total purity) 가 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 또는 약 97% 이상일 수 있고, 그 상한값은 97% 내지 100% 범위에서 선택된 수치일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

응집물의 함량(%HMW)(예컨대, SE-HPLC로 측정)이 약 5%이하, 약 4%이하, 약3%이하, 약 2%이하, 약 1%이하, 약 0.9%이하일 수 있고, 그 하한값은 0%를 초과하는 수치, 예컨대, 약 0%, 약 0.001%, 약 0.01%, 약 0.1%, 약 1%일 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다.

산성 변이체 함량(%Acidic)(예컨대, icIEF 로 측정)이 약 45% 이하, 약 43% 이하, 약 40% 이하, 약 38% 이하, 약 36% 이하, 약 34% 이하, 약 33% 이하일 수 있고, 그 하한값은 0을 초과하는 수치, 예컨대, 약 0%, 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15% 또는 약 16%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

Main 단백질의 함량(%Main)(예컨대, icIEF 로 측정)이 약 50% 이상, 약 51% 이상, 약 52% 이상, 약 53% 이상, 약 54% 이상, 약 55% 이상, 약 55% 이상, 또는 약 56% 이상이고, 그 상한값은 50% 내지 100% 범위 중에서 선택된 수치, 예컨대, 약 95%, 약 93%, 약 93%, 약 90%, 약 87%, 약 85%, 약 83%, 약 80%, 약 78%, 약 75% 또는 약 74%일 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다.

염기성 변이체 함량(%basic)(예컨대, icIEF 로 측정)이 약 20% 이하, 약 19% 이하, 약 18% 이하, 약 17% 이하, 약 16% 이하, 약 15% 이하, 또는 약 14% 이하일 수 있고, 그 하한값은 0을 초과하는 수치, 예컨대, 약 0%, 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 또는 약 6%일 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다.

조성물 0.8mL 내의 평균 입경이 10 um 이상인 입자수가 6000개 이하, 5000개 이하, 4000개 이하, 3000개 이하, 2500개 이하, 2000개 이하, 1900개 이하, 1800개 이하, 1700개 이하, 1600개 이하, 1500개 이하, 1400개 이하, 1300개 이하, 1200개 이하, 1100개 이하, 또는 1000개 이하,

조성물 0.8mL 내의 평균 입경이 25 um 이상인 입자수가 600개 이하, 500개 이하, 400개 이하, 300개 이하, 200개 이하, 100개 이하, 70개 이하, 50개 이하, 40개 이하, 30개 이하, 또는 20개 이하.

삼투압

본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은 생체와 등장성인 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 액상 조성물은 삼투압이 약 200 mOsm/kg 내지 약 400 mOsm/kg, 약 250 mOsm/kg 내지 약 400 mOsm/kg, 약 200 mOsm/kg 내지 약 350 mOsm/kg, 약 250 mOsm/kg 내지 약 350 mOsm/kg, 약 200 내지 약 300 mOsm/kg 또는 약 250 내지 약 300 mOsm/kg 인 것일 수 있다. 한편, 이와 같은 삼투압은 폴리올 및/또는 아미노산 등에 의하여 조절될 수 있다.

(9) 디바이스, 키트, 또는 컨테이너

일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물을 포함하는 디바이스, 키트, 또는 컨테이너가 제공된다. 상기 디바이스, 키트, 또는 컨테이너는, 주로 비경구 투여(예컨대, 피하 투여)를 위한 용도로 사용될 수 있으며, 상기 약제학적 조성물이 충진된 바이알, 팩(pack), 시린지 (syringe; 예컨대, 미리 충진된 주사기(pre-filled syringe; PFS); 바늘 사이즈: 20 내지 40G, 예컨대, 25G, 26G, 27G, 28G, 29G, 또는 30G), 미리 충진된 펜(pre-filled pen; PFP) 등의 형태일 수 있으며, 상기 충진된 약제학적 조성물은, 활성 성분인 항-TNFα 항체 (예컨대, 아달리무맙) 함량을 기준으로, 하나 이상의 단위 용량 형태(unit dosage form)를 포함하는 것일 수 있다.

일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은, 목적하는 경우, 바이알, 팩 또는 활성 성분을 포함하는 하나 이상의 단위 용량 형태를 함유할 수 있는 디스펜서 장치 내에 포함될 수 있다. 하나의 양태에서, 디스펜서 장치는 주사용으로 준비된 상기 약제학적 조성물의 액체 제형의 단일 용량(single dose; 1회 투여량)을 포함하는 시린지를 포함할 수 있다. 시린지는 투여를 위한 지시서를 동반할 수 있다. 다른 예에서, 상기 디바이스는 Inject-ease®, Genject®, 주사기 펜 (예켠대, GenPen®), 바늘없는 장치 (예를 들면, MediJector®, BioJector® 등) 등에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물을 포함하는 디바이스, 키트, 또는 컨테이너에서, 상기 포함된 약제학적 조성물이 온도 변화에 대한 안정성을 갖는 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 온도 변화는 고온 조건 (예, 30±2℃) 노출 후 저온 조건 (예, -5±3℃) 노출을 1회 이상, 예컨대, 3 cycle 수행하는 것을 의미할 수 있다. 일 예에서, 상기 온도 변화에 대한 안정성은, TNFα 결합 활성, TNFα 중화 활성, 미립자 개수, 아미노산 잔기의 산화, 투명도, pH, 단백질 농도, 단백질 응집률, 순도, 전하 변이체, 및 내독소로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 측정(또는 결정 또는 확인 또는 분석)되는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 디바이스, 키트, 또는 컨테이너는, 48시간 동안 30±2℃의 고온 조건(with 65±5% RH) 노출 후 48시간 동안 -5±3℃ 저온 조건 노출을 1 cycle로 하여 총 3 cycle 수행 후 (총 144시간의 고온 조건 노출 및 144시간의 저온 조건 노출), 포함된 약제학적 조성물이 다음 중에서 선택된 하나 이상의 특징을 갖는 것일 수 있다:

TNFα 결합 활성이 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 또는 약 98% 이상 (상한값은 100% 내지 125% 범위에서 선택된 수치일 수 있음),

TNFα 중화 활성이 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 약 100% 이상, 약 101% 이상, 약 102% 이상, 약 103% 이상, 약 104% 이상, 또는 약 105% 이상 (상한값은 100% 내지 133% 범위에서 선택된 수치일 수 있음),

항체 중쇄의 34번째 위치의 메티오닌의 산화율이 약 1.5% 이하, 약 1.4% 이하, 약 1.3% 이하, 약 1.2% 이하, 약 1.1% 이하, 약 1.0% 이하, 약 0.9% 이하, 약 0.8% 이하, 약 0.7% 이하, 또는 약 0.6% 이하 (하한값은 0을 초과하는 수치, 예컨대, 약 0.0001%, 약 0.0005%, 약 0.001%, 약 0.005%, 약 0.01%, 약 0.05%, 또는 약 0.1%일 수 있음),

항체 중쇄의 83번째 위치의 메티오닌의 산화율이 약 1.3% 이하, 약 1.2% 이하, 약 1.1% 이하, 약 1.0% 이하, 약 0.9% 이하, 약 0.8% 이하, 약 0.7% 이하, 약 0.6% 이하, 약 0.5% 이하, 또는 약 0.4% 이하 (하한값은 0을 초과하는 수치, 예컨대, 약 0.0001%, 약 0.0005%, 약 0.001%, 약 0.005%, 약 0.01%, 약 0.05%, 또는 약 0.1%일 수 있음),

항체 중쇄의 256번째 위치의 메티오닌의 산화율이 약 6.0% 이하, 약 5.7% 이하, 약 5.5% 이하, 약 5.4% 이하, 약 5.3% 이하, 약 5.2% 이하, 약 5.1% 이하, 약 5.0% 이하, 약 4.9% 이하, 약 4.8% 이하, 또는 약 4.9% 이하 (하한값은 0을 초과하는 수치, 예컨대, 약 0.01%, 약 0.05%, 약 0.1%, 약 0.5%, 또는 약 1%일 수 있음),

항체 중쇄의 432번째 위치의 메티오닌의 산화율이 약 0.5% 이하, 약 0.4% 이하, 약 0.3% 이하, 약 0.2% 이하, 약 0.1% 이하, 약 0.05% 이하, 또는 측정되지 않음 (미검출; 산화된 432번째 위치의 메티오닌이 검출 가능한 수준으로 산화되지 않음) (하한값은 0을 포함하는 수치 중에서 선택됨),

항체 경쇄의 4번째 위치의 메티오닌의 산화율이 약 1.5% 이하, 약 1.3% 이하, 약 1.2% 이하, 약 1.1% 이하, 약 1.0% 이하, 약 0.9% 이하, 약 0.8% 이하, 약 0.7% 이하, 약 0.6% 이하, 또는 약 0.5% 이하 (하한값은 0을 초과하는 수치, 예컨대, 약 0.0001%, 약 0.0005%, 약 0.001%, 약 0.005%, 약 0.01%, 약 0.05%, 또는 약 0.1%일 수 있음),

탁도가 25 NTU(nephelometric turbidity unit) 이하, 22 NTU 이하, 20 NTU 이하, 19 NTU 이하, 18 NTU 이하, 또는 17 NTU 이하 (하한값은 0 내지 10 NTU 중에서 선택됨),

전체 순도(Total purity) 가 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 또는 96% 이상,

조성물 0.8mL 내의 평균 입경이 10 um 이상인 입자수가 5000개 이하, 4000개 이하, 3000개 이하, 2500개 이하, 2000개 이하, 1900개 이하, 1800개 이하, 1700개 이하, 1600개 이하, 또는 1500개 이하,

조성물 0.8mL 내의 평균 입경이 25 um 이상인 입자수가 500개 이하, 400개 이하, 300개 이하, 200개 이하, 100개 이하, 70개 이하, 50개 이하, 40개 이하, 30개 이하, 또는 20개 이하, 및

내독소 함량이 10 EU/mL 이하, 9 EU/mL 이하, 8 EU/mL 이하, 7 EU/mL 이하, 6 EU/mL 이하, 5.5 EU/mL 이하, 또는 5 EU/mL 이하.

(10) 질병의 치료

일 예에서, 상기 약제학적 조성물 또는 이를 포함하는 디바이스를 포함하는 질병 치료를 위한 약학 조성물이 제공된다. 다른 예에서, 항-TNFα 항체, 예컨대, 아달리무맙의 투여를 필요로 하는 대상에게 상기 약제학적 조성물의 약학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 질병의 치료 방법을 제공한다. 상기 치료 방법은, 상기 투여하는 단계 이전에, 항-TNFα 항체, 예컨대, 아달리무맙의 투여를 필요로 하는 대상을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 질병은 항-TNFα 항체, 예컨대, 아달리무맙의 투여에 의하여 치료 효과를 볼 수 있는 질병 중에서 선택된 것일 수 있다. 상기 질병은 면역 관련 질병일 수 있으며, 예를 들어, 관절염 (예컨대, 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 특발성 관절염, 골부착부위염 관련 관절염 등), 축성 척추관절염 (예컨대, 강직성 척추염, 강직성 척추염 이외의 중증 축성 척추관절염 등), 크론병 (예컨대, 성인(18세 이상) 크론병, 소아 (6~17세) 크론병 등), 건선 (예컨대, 성인 (18세 이상) 또는 소아 (4~17세) 판상 건선), 궤양성 대장염, 베체트 장염, 화농성 한선염, 포도막염 (예컨대, 비-감염성 중간 포도막염, 후포도막염, 전체포도막염 등) 등으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

상기 항-TNFα 항체, 예컨대, 아달리무맙의 투여를 필요로 하는 대상은 항-TNFα 항체, 예컨대, 아달리무맙의 투여에 의하여 유의미하게 치료 (증상의 제거, 감경, 완화, 또는 개선 등)될 수 있는 질환 또는 장애를 갖는 대상일 수 있다. 상기 질병 또는 장애는 앞서 설명한 질병 중에서 선택될 수 있다.

(11) 투여경로, 투여량, 제형화

본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은 비경구적 경로로 투여되는 것일 수 있다. 비경구 투여 (예컨대, 주사)인 경우에는 정맥내 투여, 또는 피하 투여으로 투여할 수 있다. 비경구 투여는 볼루스(bolus) 주사 또는 연속 주입에 의한 것일 수 있다.

본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은 상기 투여 경로에 적합한 제형으로 제형화된 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 약제학적 조성물은 주사제, 주사 가능한 즉시사용형 (ready-to-use) 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 예에서, 상기 약제학적 조성물은 포함된 항-TNFα 항체, 예컨대, 아달리무맙의 전량 또는 약학적 유효량이 하나의 제형에 포함되도록 제형화되거나, 2개 이상 (예컨대, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개)의 제형에 나누어 포함되도록 제형화된 것일 수 있다. 상기 제형화된 조성물은 앞서 설명한 디바이스의 단위 투여형태에 포함될 수 있다.

다른 예에서, 상기 약제학적 조성물은 하나의 제형에 포함된 항-TNFα 항체, 예컨대, 아달리무맙의 전량이 일시(예컨대, 1분 이내, 30초 이내, 20초 이내, 또는 10초 이내)에 체내 투여되거나; 5분 이상, 10분 이상, 30분 이상, 60분 이상, 90분 이상, 120분 이상, 150분 이상, 180분 이상, 210분 이상, 또는 240분 이상 동안 서서히 체내에 투여되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 약제학적 조성물의 투여 대상은 영장류 (인간 등), 설치류 (마우스, 래트, 기니아 피그, 햄스터, 토끼 등), 고양이, 개, 돼지, 소, 말 등을 포함하는 포유동물 중에서 선택될 수 있다.

본 명세서에서 제공된 약제학적 조성물 또는 여기에 포함된 항-TNFα 항체 (예컨대, 아달리무맙)의 약학적 유효량은 소망하는 약리적 효과, 예컨대, 증상의 제거, 감경, 완화, 또는 개선에 효과를 타나낼 수 있는 조성물 내 함량 또는 투여량을 의미할 수 있으며, 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태(상태의 중증도), 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도, 반응 감응성, 이전 요법, 임상 이력 등과 같은 요인들에 의해 다양하게 정해질 수 있다. 용량은 담당 의사의 판단에 따라 조절될 수 있다. 상기 약학적 유효량은 1회에 투여되거나, 분량하여 2 이상 다회에 걸쳐 투여될 수 있다.

일 예에서, 상기 약제학적 조성물은, 항-TNFα 항체 (예컨대, 아달리무맙)의 함량이 소망하는 유효량, 예를 들어, 약 200mg 이하, 약 150mg 이하, 약 100mg 이하, 약 50mg, 또는 40mg이 되도록 하는 용량 (예를 들어, 항체의 유효량이 40mg인 경우 항체 농도 50mg/ml인 조성물 0.8mL 또는 항체 농도 100mg/ml인 조성물 0.4mL)으로 3주 이상의 기간에 걸쳐 1주당 1회 내지 3회 투여될 수 있다. 다른 예에서, 상기 약제학적 제형은 일반적인 벌크 제형으로 제조될 수 있고, 약제학적 조성물의 성분은 투여에 요구되는 농도보다 고농도로 조절되고, 투여 전에 적합하게 희석되어 사용될 수 있다.

본 발명은 단백질, 예컨대, 항-TNFα 항체가 물리적, 화학적, 및/또는 생물학적 효능을 안정적으로 유지할 수 있도록 하는 수성 액상 조성물, 구체적으로 약제학적 조성물을 제공함으로써, 단백질의 보관 중 발생할 수 있는 중합체 및/또는 응집체(Aggregate) 생성, 분해물(Fragment)의 생성, 전하 변이체(charged variants) 로의 변성, 아미노산 잔기의 산화를 억제하여 단백질의 약리 효과를 안정적으로 유지시킬 수 있다.

도 1은 일 실시예에 따른 단백질(아달리무맙: 100 mg/mL) 제형의 광 부하시 단백질 내 아미노산(Met₂₅₆)의 산화율(평균값: n=3)을 아미노산 종류 및 농도에 따라 보여주는 그래프이다.
도 2a는 일 실시예에 따른 항체 제형의 아미노산 종류 및 농도에 따른 광 부하 조건에서의 제형 내 단백질의 %HMW를 보여주는 그래프이다.
도 2b는 일 실시예에 따른 항체 제형의 아미노산 종류 및 농도에 따른 광 부하 조건에서의 제형 내 단백질의 %Monomer를 보여주는 그래프이다.
도 2c는 일 실시예에 따른 항체 제형의 아미노산 종류 및 농도에 따른 광 부하 조건에서의 제형 내 단백질의 %LMW를 보여주는 그래프이다.
도 3은 일 실시예에 따른 단백질(아달리무맙: 50 mg/mL) 제형의 광 부하시 단백질 내 아미노산(Met₂₅₆)의 산화율(평균값: n=2)을 히스티딘 포함 여부에 따라 보여주는 그래프이다.
도 4는 SE-HPLC 분석법으로 측정한, 일 실시예에 따른 단백질(아달리무맙: 50 mg/mL) 제형의 40±2℃에서 2주 동안 보관시의 제형 내 단백질의 %HMW(High molecular weight%)(평균값: n=3)를 계면활성제 종류 및 농도에 따라 보여주는 그래프이다.
도 5는 SE-HPLC 분석법으로 측정한, 일 실시예에 따른 단백질(아달리무맙: 50 mg/mL) 제형의 동결/용융 조건(Freeze/thaw, 5 cycle)에서의 제형 내 단백질의 %HMW(평균값: n=3)를 계면활성제 종류 및 농도에 따라 보여주는 그래프이다.
도 6은 SE-HPLC 분석법으로 측정한, 일 실시예에 따른 단백질(아달리무맙; 50 mg/mL) 제형의 40±2℃에서 4주 동안 보관시의 제형 내 단백질의 %HMW(평균값: n=3)를 히스티딘 포함 여부 및 계면활성제 종류에 따라 보여주는 그래프이다.
도 7은 SE-HPLC 분석법으로 측정한, 일 실시예에 따른 단백질(아달리무맙; 100 mg/mL) 제형의 40±2℃에서 4주 동안 보관시의 제형 내 단백질의 %HMW(평균값: n=3)를 히스티딘 포함 여부 및 계면활성제 종류에 따라 보여주는 그래프이다.
도 8은 일 실시예에 따른 단백질(아달리무맙; 50 mg/mL) 제형의 40±2℃에서 4주 동안 보관시의 제형 내 단백질의 %Acidic (산성 변이체(Acidic variants)의 함량비)(평균값: n=3)를 히스티딘 포함 여부 및 계면활성제 종류에 따라 보여주는 그래프이다.
도 9는 일 실시예에 따른 단백질(아달리무맙; 100 mg/mL) 제형의 40±2℃에서 4주 동안 보관시의 제형 내 단백질의 %Acidic(평균값: n=3)를 히스티딘 포함 여부 및 계면활성제 종류에 따라 보여주는 그래프이다.
도 10은 icIEF 분석법으로 측정한, 일 실시예에 따른 단백질(아달리무맙: 50 mg/mL) 제형의 동결/용융 조건(Freeze/thaw, 5 cycle)에서의 제형 내 단백질의 %Acidic(평균값: n=3)를 계면활성제 종류 및 농도에 따라 보여주는 그래프이다.
도 11a 내지 11d는 온도 이탈(Temperature excursions)로 시험한 일 실시예에 따른 단백질(아달리무맙; 50 mg/mL) 제형이 미리 충진된 prefilled syringe의 품질 평가 결과(11a: %HMW, 11b: %Total purity, 11c: TNFα 결합활성, 11d: TNFα 중화활성)를 보여준다.
도 12a 내지 도 12e는 실온에서의 저장 안정성을 시험한 일 실시예에 따른 단백질(아달리무맙; 50 mg/mL) 제형이 미리 충진된 prefilled syringe의 품질 평가 결과(12a: %HMW, 12b: %Total purity, 12c: %Main, 12d: TNFα 결합활성, 12e: TNFα 중화활성)를 보여준다.

이하 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 아니된다.

참고예

참고예 1. SE-HPLC 분석

SE-HPLC(Size Exclusion-High Performance Liquid Chromatography) 분석법은 Waters社의 HPLC system을 사용하여 제조사 매뉴얼에 따라서 수행하였다. 머무름시간(Retention time) (단백질의 분자량)에 따라 총 3개의 피크(peak)로 분리 되며, 이 3 개의 peak는 Retention time이 짧은 (단백질의 분자량이 큰) 순서대로 HMW peak (단백질 응집), Monomer peak, 및 LMW peak (단백질 분해)에 해당된다.

- %HMW (High molecular weight%) = {area of HMW/area of (HMW + monomer + LMW)}*100)

- %Monomer (Monomer weight%) = {area of monomer/area of (HMW + monomer + LMW)}*100)

- %LMW(Low molecular weight%) = {area of LMW/area of (HMW + monomer + LMW)}*100)

참고예 2. 광 부하 (Photo-stress)

제형을 다음의 표 1의 조건으로 광 부하(Photo-stress)에 대한 샘플 안정성 실험을 수행하였다.

기저군 (Base, initial)	암대조군 (Dark control) *	광노출군 (Light-exposured)
N/A (Not applicable)	백색 형광 램프(Cool White Fluorescent Lamp) : ≥1.2 M lux hours	백색 형광 램프(Cool White Fluorescent Lamp) : ≥1.2 M lux hours
N/A (Not applicable)	근자외선 램프(Near Ultraviolet Lamp) : ≥ 200 Watt hours/square meter	근자외선 램프(Near Ultraviolet Lamp) : ≥ 200 Watt hours/square meter
챔버 환경 조건(Chamber Environmental Conditions) : 5 ±3℃	챔버 환경 조건(Chamber Environmental Conditions) : 25±2℃/60±5% RH(relative humidity)	챔버 환경 조건(Chamber Environmental Conditions) : 25±2℃/60±5% RH(relative humidity)

* 암대조군 (Dark control)은 샘플을 호일에 싼 후 상기 조건으로 실험 수행하였다.

- 의약품규제조화위원회(ICH) 가이드라인 'Q1B 안정성 시험 신규 원료의약품 및 신규완제의약품의 광안정성 시험'

참고예 3. 아미노산 잔기 %산화율(%oxidation level) 측정

제형에 포함된 단백질 내의 아미노산 잔기의 %산화율을 Waters社의 액체크로마토그래피-질량분석법(liquid-chromatography-mass spectrometry, LC-MS)를 사용하여 아달리무맙 중쇄(Adalimumab heavy chain)의 256번째 메티오닌(methionine) 아미노산 잔기의 질량(mass)을 측정하였다. LC-MS 실험 수행 후 MassLynx™ 프로그램을 이용하여 상대 %산화(relative %Oxidation) 값을 분석하였다.

상대 %산화 = (산화 펩타이드의 컨트롤 강도*100)/{(비산화 펩타이드의 컨트롤 강도)+(산화 펩타이드의 컨트롤 강도)}

참고예 4. CEX-HPLC 분석

CEX-HPLC (Cation Exchange-High Performance Liquid Chromatography) 분석법은 Waters社의 HPLC system을 사용하여 제조사 매뉴얼에 따라서 수행하였다. Retention time (단백질의 전하)에 따라 총 3개의 peak로 분리되며, 이 3개의 peak는 Retention time이 짧은 순서대로 Acidic peak, Main peak, 및 Basic peak에 해당된다.

- Acidic%(Acidic variants의 함량비, %Acidic) = {area of acidic/area of (acidic + main + basic)}*100)

- Main%(Main 단백질의 함량비, %Main) = {area of main/area of (acidic + main + basic)} *100)

- Basic%(Basic variants의 함량비, %Basic) = {area of basic/area of (acidic + main + basic)}*100)

참고예 5. icIEF 분석

icIEF (imaged capillary isoelectric focusing) 분석법은 양쪽 성 전해질을 함유하는 모세관의 등전위 점 (pI)에 따라 단백질의 전하 변이체(charge variant)를 확인하는 것으로써, icIEF instrument (ProteinSimple, iCE3)을 사용하여, 제조사의 매뉴얼에 따라서 acidic isoform, main isoform, 및 basic isoform을 분석하여 수행하였다.

참고예 6. 항체 함유 제품(pre-filled syringe) 품질 (안정성) 시험

항체 함유 제품 샘플의 안정성을 하기 표 2에 정리된 방법으로 평가하였다:

카테고리	제형 안정성 평가 항목	방법	설명
가시적 특징	색(color)	육안 조사 (Visual inspection)	Brown standard B1-B8을 이용하여 샘플의 색 평가
	투명도(clarity)	탁도 측정 (HACH Model 2100AN)	샘플의 투명도 평가
	가시 입자 (visible particles)	육안 조사	샘플 내 가시 입자 개수 측정
pH	pH	pH 측정 (Thermo Scientific Orion star A211)	샘플의 pH 평가
화학적 분석	단백질 농도	A280 측정 (UV-VIS spectrophotometer)	샘플 내 단백질(항체) 농도 평가
물리화학적 분석	HMW 불순물	SE-HPLC	샘플 내 고분자량 (HMW) 불순물 함량비 측정
	전체적 순도	CE-SDS	샘플 내 전체 불순물 측정
	LMW 불순물	CE-SDS	샘플 내 저분자량 (LMW) 불순물 (예, NGHC) 함량비 측정
	전하 아이소폼(Charge isoforms)	CEX-HPLC, icIEF	Acidic, main, basic variants를 포함하는 전하 변이체 측정
미립자 (subvisible particles)	미립자	HIAC 9703 + HRLD-400	평균 입경 25um 이상, 10um 이상, 8um 이상, 5um 이상, 2um 이상인 입자 개수 측정
생물학적 활성	TNF-alpha 결합 활성	FRET	Reference standard에 대한 상대적 결합 정도 측정
	TNF-alpha 중화 활성	Luciferase reporter gene system assay	Reference standard에 대한 상대적 potency 측정

6.1. 가시 미립자의 존재 여부, 색, 및 투명도

육안 검사를 통하여, 제형 내의 가시 미립자의 존재 여부 및 색 (Brown standard: B1-B8)을 평가하였다. 제형의 투명도는 Turbidimeter (HACH Model 2100AN)를 이용하여 측정하였다.

6.2. pH

샘플의 pH는 사용 전 pH 4, 7, 및 10으로 조정된 Thermo Scientific Orion star A211 (pH electrode 및 temperature probe의 조합; Thermo Scientific)를 이용하여 측정하였다.

6.3. 단백질 농도

단백질 농도는 280nm 파장에서의 흡광도를 이용하여 측정하였다. 구체적으로, 시험된 모든 샘플을, 0.9%(w/v) NaCl 용액에서의 각 샘플의 기대 농도를 기준으로, 1 mg/mL 농도로 희석하고, 280 nm에서의 흡광도(A280)를 UV-VIS spectrophotometer (Agilent)로 측정하고, 얻어진 결과는 0.9%(w/v) NaCl 용액을 블랭크 용액(blank solution)으로 사용하여 정규화(normalization)하였다.

6.4. 고분자량(High molecular weight; HMW) 불순물

샘플 내의 고분자량 불순물은 크기 배제-고성능액체크로마토그래피(SE-HPLC)을 사용하여 측정하였다 (참고예 1).

6.5. 전체 순도(Total purity)

샘플의 전체 순도는 비환원 조건에서 모세관 SDS 전기영동법(capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfate, CE-SDS)을 사용하여 비글리코실화 중쇄(non-glycosylated heavy chain; NGHC)의 출현율(prevalence)을 측정하여 평가하였다.

6.6. 전하 변이체 (Charge variants)

샘플 내의 전하 변이체 수준을 CEX-HPLC (참고예 4) 및 icIEF (참고예 5)를 이용하여 측정하였다.

6.7. TNF-α 결합 활성 (TNF-α binding affinity)

샘플에 포함된 항체(아달리무맙)의 TNF-α 결합 활성을 FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)를 이용한 CIBA(competitive inhibition binding assay)으로 측정하였다. TNF-α 결합은 TR-FRET(time-resolved fluorescence resonance energy transfer)에 의하여 측정하였다. 아달리무맙을 형광 유로퓸(fluorescent europium (Eu)) 킬레이트 (PerkinElmer)로 표지하고 인간 TNF-α를 Cy5 형광단(fluorophore)으로 표지하여 분석에 사용하였다. Cy5-표지 TNF-α와 결합한 Eu-표지 아달리무맙은 형광 신호를 발생시킨다. 여기에 형광 비표지된 샘플 내 항체(아달리무맙)을 첨가하면, 상기 비표지된 항체가 Cy5-표지 TNF-α와 결합에 있어서 Eu-표지 아달리무맙과 경쟁한다. 따라서, 샘플 내 항체가 Cy5-표지 TNF-α와 결합할수록 형광 발생이 저해되어, 측정된 형광 신호 수준은 샘플 내 비표지된 항체의 TNF-α와의 결합 수준과 반비례한다. 표준품 (reference standard) 및 샘플을 넣은 분석 플레이트(assay plate)에 정해진 농도 및 부피의 Eu-표지 아달리무맙 및 Cy5-표지 TNF-α를 순서대로 첨가하고, 실온에서 약하게 교반하면서 배양하고, 발생한 형광 신호 수준을 시간 분해 형광측정법(time-resolved fluorimetry) (EnVision™, PerkinElmer)으로 측정하였다. 샘플 내 아달리무맙의 TNF-α 결합 활성은 Parallel Line Analysis (PLA) software (Stegmann Systems)를 이용하여 표준품 (reference standard)에 대한 상대값(%relative binding activity)으로 계산하였다. 상기 표준품(reference standard)은 100%로 부여(assign)된 기준값을 가지는 기준 물질을 의미하고, 샘플과 표준품의 선량 곡선(dose curves)을 PLA 프로그램을 통해 비교 분석하여 %상대 결합 활성(%relative binding activity)을 계산할 수 있다.

6.8. TNF-α 중화 활성 (TNF-α neutralization)

샘플에 포함된 항체(아달리무맙)의 TNF-α 중화 활성을 루시퍼라제 리포터 유전자(luciferase reporter gene system)를 이용하여 측정하였다. 샘플을 TNF-α와 함께 미리-배양한 후, 루시퍼라제 리포터 유전자를 포함하도록 조작된 세포주 (293-NF-κB-luc cell line(CVCL_KS34)을 루시퍼라제 리포터 유전자(luciferase reporter gene) 상류에 인간 NF-κB 반응요소(response element)를 포함하도록 조작한 세포주, TNF-α가 세포 표면의 TNFR에 결합함으로써 NF-κB 시그널링이 활성화되고, 루시퍼라제 리포터 유전자 발현이 촉진됨)와 함께 배양하였다. 96-웰 조직 배양 플레이트에서 샘플을 인간 TNF-α와 1:1(v/v) 비율로 혼합하고 실온에서 30-90분간 배양하였다. 그 후, 상기 준비된 세포를 상기 96-웰 플레이트에 넣어주고 24시간 배양 후, microplate reader (EnVision™, PerkinElmer) 상에서 Steady-Glo® Luciferase Assay System (Promega)을 이용하여 발광 신호를 측정함으로써, 아달리무맙의 TNF-α 중화 역가(neutralization potency)를 측정하였다. 아달리무맙의 TNF-α 중화 활성은 Parallel Line Analysis (PLA) software (Stegmann Systems)를 이용하여 표준품 (reference standard)에 대한 상대값(%relative potency)으로 계산하였다. 상기 표준품(reference standard)은 100%로 부여(assign)된 기준값을 가지는 기준 물질을 의미한다.

6.9. 크기 별 입자 개수

평균 입경 2 μm 이상, 5 μm 이상, 8 μm 이상, 10 μm 이상, 및 25 μm 이상인 입자를 HIAC 9703+ 및 HRLD 400 instrument (Beckman Coulter, Inc.)로 계수하였다.

6.10. 내독소 (Endotoxin)

내독소(Endotoxin)가 LAL (Limulus Amebocyte Lysate)을 활성화시켜 겔화(gelation)를 일으키는 반응에 기초하여, Bio Tek Elx808 IU Microplate Reader System (Bio Tek Instruments)를 사용하여 내독소의 검출 및 정량화하였다.

실시예 1. 아미노산 스크리닝

1-1. 고농도 단백질 함유하는 제형의 광부하 조건에서의 광 안정성

아미노산 종류 및 농도에 따른 단백질 제형의 안정성을 평가하여, 단백질 제형 안정성에 유리한 효과를 가지는 아미노산의 종류 및 농도 범위를 확인하였다. 구체적으로 고농도 단백질 함유하는 제형에 대해 광부하 조건에서의 광 안정성을 항산화 효과 및 항응집 효과 측면에서 확인하였다.

1-1-1. 고농도 단백질 함유 제형의 준비

단백질로서 항-TNFα 항체 (아달리무맙(Adalimumab); anti-TNFα monoclonal antibody; CAS Registry Number:　331731-18-1) 100mg/mL를 포함하고, 다음의 표 3의 조성을 갖는 수성 액상 제형을 준비하였다:

Sample No.	단백질 농도 (mg/mL)	pH	버퍼 (Buffer)	부형제 1 (Excipient 1)	부형제 2 (Excipient 2)	계면활성제 (Surfactant)
1	100	5.2	2.6 mM Na-phosphate	59 mM His	3.0% mannitol	0.08% PS 20
2			2.6 mM Na-phosphate + 5 mM Na-succinate
3				N/A	5.0% mannitol
4				59 mM Arg-HCl	3.0% mannitol
5				10 mM His	4.5% mannitol
6				80 mM His	2.0% mannitol
7*			N/A	N/A	4.2% mannitol	0.1% PS80

(^*: Humira®의 100 mg/mL 아달리무맙을 포함하는 제형과 제형 성분이 동일한 샘플;

PS 20: polysorbate 20, PS 80: polysorbate 80;

N/A: not applicable;

%: %(w/v))

1-1-2. 항산화(anti-Oxidation) 효과

상기 표 3에서 준비된 제형들에 대하여, 광 부하 시의 단백질의 내 Met₂₅₆ (256번째 메티오닌 잔기)의 산화율(%Met₂₅₆)을 측정하였다. 광 부하 조건은 참고예 2를 참조하고, 단백질의 내 Met₂₅₆의 산화율(%Met₂₅₆)은 참고예 3을 참조하여 측정하였다.

상기 산화율 측정은 3회 반복(N=3) 수행되었으며, 얻어진 결과의 평균값을 하기의 표 4 및 도 1에 나타내었다:

광 부하 조건에서의 아미노산 (Met₂₅₆) 산화율 (%Met₂₅₆) 및 아미노산 산화율의 변화량 (Δ%Met₂₅₆)

Sample No.	%Met256			Δ%Met256
	Base	Dark-control	Light-exposured	[Light-exposured %Met256] - [Base %Met256]	[Light-exposured %Met256] - [Dark-control %Met256]
1	4.23	4.43	55.80	51.57	51.37
SD	0.06	0.31	1.04	1.08	1.34
2	4.67	4.57	57.07	52.40	52.50
SD	0.42	0.32	0.49	0.10	0.66
3	4.37	4.57	77.77	73.40	73.20
SD	0.12	0.40	2.99	3.04	3.35
4	4.23	4.57	80.83	76.60	76.27
SD	0.21	0.32	4.03	3.82	3.72
5	4.07	4.57	70.23	66.17	65.67
SD	0.21	0.25	0.35	0.38	0.31
6	4.20	4.80	57.63	53.43	52.83
SD	0.26	0.46	3.51	3.62	3.88
7	4.13	4.43	73.27	69.13	68.83
SD	0.21	0.35	2.11	1.92	1.76

상기 결과에서 확인되는 바와 같이, 광 노출 조건에서의 아미노산 종류에 따른 Met₂₅₆ 산화율 및 그 변화량이 Arg-HCl > Amino acid-free > His 순서로 나타나, 제형의 광 안정성에는 아미노산 불포함 제형 및 Arg-HCl 포함 제형보다 히스티딘 포함 제형이 더 적합한 것으로 확인되었다. 또한, 히스티딘 포함 제형은 시판되는 Humira® 100 mg/mL (pH 5.2, 4.2% mannitol, 0.1% PS 80)와 동일한 조성을 갖는 Amino acid-free 제형 (샘플 No. 7)과 비교하여도 아미노산 (Met₂₅₆) 산화율 및 그 변화량이 현저히 낮아, 항산화 효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다.

또한, 히스티딘의 농도 별 분석 결과, 아미노산 산화율 변화량이 10 mM His > 59 mM His ≒ 80 mM His 순서로 확인되었으며, 이는 His이 59 mM 이상의 농도로 포함된 제형에서, 보다 우수한 항산화 효과가 있다는 것을 보여준다.

위와 같이, 히스티딘이 항산화제로서의 활성을 가지는 것을 확인하였다. 특히, 항체 제형 내 히스티딘 함량이 10mM 이상 또는 초과이고 80mM 이하인 경우(예컨대, 약 59mM)에 항산화 효과가 가장 우수한 것으로 나타났다.

1-1-3. 항응집(anti-Aggregation) 효과

상기 표 3에서 준비된 제형들에 대하여, 참고예 2의 광 부하 조건에서의 단백질의 %HMW(High molecular weight%), %monomer(monomer weight%), 및 %LMW(Low molecular weight%)를 참고예 1에 따라서 SE-HPLC 분석법으로 측정하였다. 상기 시험을 3회 반복(N=3)하여 얻어진 결과의 평균값을 하기의 표 5 내지 표 7 및 도 2a 내지 2c에 나타내었다.

광 부하 조건에서의 %HMW

Sample No.	%HMW			Δ%HMW
	Base	Dark-control	Light-exposured	[Light-exposured %HMW]- [Base %HMW]	[Light-exposured %HMW] - [Dark-control %HMW]
1	0.35	0.46	8.92	8.57	8.46
SD	0.01	0.02	0.15	0.14	0.13
2	0.33	0.43	8.19	7.86	7.76
SD	0.00	0.01	0.12	0.12	0.12
3	0.65	0.79	18.13	17.49	17.34
SD	0.02	0.03	0.61	0.60	0.58
4	0.40	0.50	20.79	20.39	20.29
SD	0.00	0.01	0.85	0.85	0.86
5	0.47	0.58	14.53	14.07	13.96
SD	0.01	0.01	0.34	0.34	0.34
6	0.31	0.40	7.45	7.14	7.05
SD	0.00	0.01	0.20	0.20	0.20
7	0.77	0.95	19.14	18.38	18.20
SD	0.01	0.01	0.26	0.26	0.26

광 부하 조건에서의 %Monomer

Sample No.	%Monomer			Δ%Monomer
	Base	Dark-control	Light-exposured	[Light-exposured %Monomer] - [Base %Monomer]	[Light-exposured %Monomer] - [Dark-control %Monomer]
1	99.40	99.29	89.62	-9.77	-9.66
SD	0.01	0.02	0.17	0.16	0.15
2	99.42	99.31	90.37	-9.05	-8.94
SD	0.00	0.01	0.11	0.11	0.12
3	99.10	98.95	79.97	-19.13	-18.98
SD	0.01	0.03	0.62	0.61	0.60
4	99.35	99.25	77.40	-21.95	-21.85
SD	0.00	0.01	0.83	0.83	0.84
5	99.28	99.17	83.73	-15.56	-15.44
SD	0.01	0.02	0.35	0.34	0.35
6	99.44	99.40	91.15	-8.29	-8.25
SD	0.02	0.11	0.23	0.25	0.30
7	98.98	98.80	78.93	-20.05	-19.88
SD	0.01	0.01	0.24	0.24	0.24

광 부하 조건에서의 %LMW

Sample No.	%LMW			Δ%LMW
	Base	Dark-control	Light-exposured	[Light-exposured %LMW] - [Base %LMW]	[Light-exposured %LMW] - [Dark-control %LMW]
1	0.25	0.25	1.46	1.21	1.21
SD	0.00	0.00	0.02	0.02	0.02
2	0.25	0.25	1.44	1.19	1.19
SD	0.00	0.01	0.02	0.02	0.02
3	0.25	0.26	1.89	1.64	1.64
SD	0.01	0.01	0.02	0.03	0.03
4	0.25	0.26	1.81	1.56	1.55
SD	0.00	0.01	0.02	0.02	0.02
5	0.25	0.26	1.74	1.49	1.48
SD	0.00	0.01	0.02	0.02	0.02
6	0.25	0.20	1.40	1.15	1.20
SD	0.01	0.10	0.03	0.04	0.11
7	0.25	0.25	1.93	1.68	1.68
SD	0.01	0.00	0.03	0.03	0.03

상기 결과에서 확인되는 바와 같이, 광 노출 조건에서의 %HMW 및 %HMW 변화량을 확인한 결과, Arg-HCl > Amino acid-free > His 순서로 나타나, 아미노산 불포함 제형 또는 Arg-HCl 포함 제형보다 히스티딘 포함 제형이 항응집 효과가 더욱 개선됨을 확인할 수 있었고, 이러한 효과는 아미노산 불포함 제형인 Humira® 100 mg/mL (pH 5.2, 4.2% mannitol, 0.1% PS 80)와 동일한 조성을 갖는 샘플 7과 비교하였을 때도 유사한 경향성을 보인다.

또한, His 농도별 광 노출 조건에서의 %HMW 및 %HMW 변화량 크기가 10 mM His > 59 mM His ≒ 80 mM His 순서로 나타나, 59 mM 내지 80 mM His 함유 제형이 10 mM His 함유 제형보다 항응집 효과가 우수함이 확인되었다.

이는 His 농도가 59 mM 이상인 경우 보다 우수한 항응집 효과를 가짐을 보여준다. 또한, %Monomer 및 %LMW 결과 역시 히스티딘을 포함하는 제형 (샘플 번호 1, 2, 5, 및 6)이 아미노산을 포함하지 않거나 히스티딘 이외의 아미노산 (예, 아르기닌)을 포함하는 제형과 비교하여, 항응집 효과가 우수함을 보여준다.

1-2. 저농도 단백질을 함유하는 제형의 광 부하 조건에서의 광 안정성

상기 실시예 1-1에서 광 안정성 효과가 우수한 것으로 확인된 히스티딘을 함유하고, 저농도 단백질을 함유하는 제형의 광 부하 조건에서의 광 안정성을 평가하였다.

단백질로서 항-TNFα 항체 (아달리무맙(Adalimumab); anti-TNFα monoclonal antibody; CAS Registry Number:　331731-18-1) 50mg/mL를 포함하고, 다음의 표 8의 조성을 갖는 수성 액상 제형을 준비하였다:

Sample No.	단백질 농도 (mg/mL)	pH	버퍼 (Buffer)	부형제 1 (Excipient 1)	부형제 2 (Excipient 2)	계면활성제 (Surfactant)
1	50	5.2	10 mM Na-citrate	59 mM His	2.5% sorbitol	0.08% PS 20
2				N/A

(N/A: not applicable; %: %(w/v))

상기 준비된 히스티딘(His)-포함 제형 및 히스티딘-free 제형에 대하여, 광 부하 조건에서의 단백질 내의 주요 산화 부위(Main oxidized site)로 알려진 Met₂₅₆ (256번째 메티오닌 잔기)의 산화율(%Met₂₅₆)을 측정하였다. 광 부하 조건은 참고예 2를 참조하고, 단백질 내의 Met₂₅₆의 산화율(%Met₂₅₆)은 참고예 3을 참조하여 측정하였다.

상기 산화율 측정은 2회 반복(N=2) 수행되었으며, 얻어진 결과의 평균값을 하기의 표 9 및 도 3에 나타내었다:

광 부하 조건에서의 아미노산 (Met₂₅₆) 산화율 (%Met₂₅₆) 및 아미노산 산화율의 변화량 (Δ%Met₂₅₆)

Sample No.		%Met256			Δ%Met256
		Base	Dark-control	Light-exposured	[Light-exposured %Met256] - [Base %Met256]	[Light-exposured %Met256] - [Dark-control %Met256]
1	Average	16.50	17.10	40.40	23.90	23.30
	SD (N=2)	0.14	0.42	0.57	0.42	0.99
2	Average	15.10	16.35	64.90	49.80	48.55
	SD (N=2)	0.28	0.07	4.95	4.67	4.88

상기 표 9에서 보는 바와 같이, 광 노출 조건에서 단백질 농도가 낮은 제형에서도 히스티딘-포함 제형이 히스티딘-불포함 (His-free) 제형보다 %Met₂₅₆가 24.50% 낮은 것을 확인하였다. 또한, 히스티딘 포함 여부에 따른 기저군(Base) 및 암대조군(Dark control) 대비 광 노출군의 아미노산 산화율의 변화량 (Δ%Met₂₅₆) 분석 결과, 히스티딘-포함 제형이 히스티딘-불포함 제형보다 Δ%Met₂₅₆가 25.90% (기저군 대비 Δ%Met₂₅₆) 및 25.25% (암대조군 대비 Δ%Met₂₅₆) 낮은 것을 확인하였다. 이러한 결과는 상기 실시예 1-1의 고농도 단백질 포함 제형에서의 실험 결과와 동일한 경향성을 보여주는 것으로 확인되어, 결국 히스티딘-포함 제형이 히스티딘-불포함 제형과 비교하여 단백질 중의 아미노산 잔기의 항산화 효과가 우수함을 보여주며, 단백질 제형에서의 히스티딘의 항산화제로서의 기능을 입증한다.

실시예 2. 계면활성제 스크리닝

2-1. 계면활성제의 종류에 따른 단백질 제형의 안정성

계면활성제의 종류에 따른 단백질 제형의 안정성을 평가하기 위하여, 단백질로서 항-TNFα 항체 (아달리무맙(Adalimumab); anti-TNFα monoclonal antibody; CAS Registry Number:　331731-18-1) 50mg/mL를 포함하고, 다음의 표 10의 조성을 갖는 수성 액상 제형을 준비하였다:

sample No.	단백질 농도 (mg/mL)	pH	버퍼 (Buffer)	부형제 1 (Excipient 1)	부형제 2 (Excipient 2)	계면활성제 (Surfactant)
1	50	5.2	10 mM Na-citrate	59 mM His	2.5% sorbitol	0.04% PS 20
2						0.08% PS 20
3						0.1% PS 20
4						0.2% PS 20
5						0.04% PS 80
6						0.08% PS 80
7						0.1% PS 80
8						0.2% PS 80

(PS 20: polysorbate 20, PS 80: polysorbate 80;

%: %(w/v))

2-1-1. 열 가혹 조건 (Heat stress Condition)에서의 제형 안정성

상기 실시예 2-1에서 준비된 제형들을 40±2℃에서 2주간 저장 후, 0주(initial), 1주, 및 2주차의 제형 내 단백질의 %HMW (High molecular weight%)를 참고예 1에 따라서 SE-HPLC 분석법으로 측정하였다. 상기 측정은 3회 반복(n=3)하였으며, 얻어진 결과의 평균값을 하기의 표 11 및 도 4에 나타내었다.

40℃에서 2주간 저장 시 %HMW

Sample No.		%HMW
		Initial	1 Wk	2 Wk
1	Average	0.48	0.62	0.67
	SD (N=3)	0.00	0.01	0.00
2	Average	0.49	0.62	0.67
	SD (N=3)	0.00	0.00	0.00
3	Average	0.49	0.63	0.68
	SD (N=3)	0.00	0.01	0.00
4	Average	0.51	0.64	0.69
	SD (N=3)	0.01	0.01	0.00
5	Average	0.49	0.62	0.67
	SD (N=3)	0.00	0.00	0.01
6	Average	0.51	0.63	0.68
	SD (N=3)	0.01	0.01	0.01
7	Average	0.57	0.67	0.70
	SD (N=3)	0.01	0.01	0.01
8	Average	0.68	0.79	0.78
	SD (N=3)	0.01	0.01	0.02

표 11 및 도 4에 나타난 바와 같이, 폴리소르베이트 20을 포함하는 제형(샘플 1~4)은, 농도 증가 시, initial %HMW가 0.48-0.51%를 유지되는 반면, 폴리소르베이트 80을 포함하는 제형(샘플 5~8) 은 농도 증가 시, initial %HMW가 0.49%에서 시작하여 0.68%까지 증가하는 것으로 나타났다. 특히, 0.2% 폴리소르베이트 20 포함 제형(샘플 4)의 initial %HMW 값은 0.2% 폴리소르베이트 80 포함 제형(샘플 8) 대비 0.17% 낮게 나타나고, 0.2% 폴리소르베이트 20 포함 제형의 2주차 %HMW 값은 0.2% 폴리소르베이트 80 포함 제형 대비 0.09% 낮게 나타났다.

2-1-2. 동결 용융 조건 (Freeze/thaw condition)에서의 제형 안정성

상기 실시예 2-1에서 준비된 제형들에 대하여, 동결 용융 조건 (Freeze/thaw, 5 cycle; FT5; 각 cycle: '-70℃±10℃에서 18시간 이상 냉동(Freeze)' + '상온(25℃)에서 1시간 이상 해동(thaw)')에서의 단백질의 %HMW (High molecular weight%)를 참고예 1에 따라서 SE-HPLC 분석법으로 측정하였다. 상기 시험을 3회 반복(n=3)하여 얻어진 결과의 평균값을 하기의 표 12 및 도 5에 나타내었다.

FT5 (Freeze/thaw, 5 cycle) 조건에서의 %HMW

Sample No.		%HMW
		Initial	FT5
1	Average	0.48	0.48
	SD (N=3)	0.00	0.00
2	Average	0.49	0.48
	SD (N=3)	0.00	0.00
3	Average	0.49	0.48
	SD (N=3)	0.00	0.01
4	Average	0.51	0.49
	SD (N=3)	0.01	0.00
5	Average	0.49	0.49
	SD (N=3)	0.00	0.01
6	Average	0.51	0.49
	SD (N=3)	0.01	0.00
7	Average	0.57	0.50
	SD (N=3)	0.01	0.01
8	Average	0.68	0.59
	SD (N=3)	0.01	0.02

표 12 및 도 5에 나타난 바와 같이, 폴리소르베이트 20을 포함하는 제형(샘플 1~4)은, 농도 증가 시, initial %HMW가 0.48-0.51%로 유지되는 반면, 폴리소르베이트 80을 포함하는 제형(샘플 5~8)은 농도 증가 시, initial %HMW가 0.49%에서 시작하여 0.68%까지 증가하는 것으로 나타났다. 특히, 0.2% 폴리소르베이트 20 포함 제형(샘플 4)은, 0.2% 폴리소르베이트 80 포함 제형(샘플 8) 대비, Initial %HMW 값과 F5 수행 후 %HMW 값이 각각 0.17% 및 0.1% 낮게 나타나서, 안정성 우수한 것으로 확인되었다.

2-2. 히스티딘 및 폴리소르베이트 20 함유 제형의 안정성 평가

2-2-1. 제형의 준비

상기 실시예 1 및 2-1에서 제형 안정성이 우수한 것으로 확인된 히스티딘과 폴리소르베이트 20을 포함한 단백질 제형을 다양한 제형 실시예와 열 안정성을 평가하였다.

이를 위하여, 다음과 같은 조성의 시험 제형과 대조 제형을 준비하였다:

- 시험 제형 1: 아달리무맙 50 mg/ml, pH 5.2, 10mM Na-시트레이트, 59mM 히스티딘, 2.5%(w/v) 솔비톨, 0.08%(w/v) 폴리소르베이트 20;

- 시험 제형 2: 아달리무맙 100 mg/ml, pH 5.2, 2.5mM Na-시트레이트, 59mM 히스티딘, 2.5%(w/v) 솔비톨, 0.08%(w/v) 폴리소르베이트 20;

- 대조 제형 1 (Cyltezo®와 동일 조성의 제형): 아달리무맙 50 mg/ml, pH 5.2, 24.7 mM Na-아세테이트, 8.1% 트레할로오스, 0.1% 폴리소르베이트 80;

- 대조 제형 2 (Amgevita®와 동일 조성의 제형): 아달리무맙 50 mg/ml, pH 5.2, 10 mM 아세트산, 9.0% 슈크로오스, 0.1% 폴리소르베이트 80

- 대조 제형 3 (아달리무맙 50 mg/ml 대신 100 mg/ml를 포함한 것을 제외하고 Cyltezo®와 동일 조성의 제형): 아달리무맙 100 mg/ml, pH 5.2, 24.7 mM Na-아세테이트, 8.1% 트레할로오스, 0.1% 폴리소르베이트 80;

- 대조 제형 4 (아달리무맙 50 mg/ml 대신 100 mg/ml를 포함한 것을 제외하고 Amgevita®와 동일 조성의 제형): 아달리무맙 100 mg/ml, pH 5.2, 10 mM 아세트산, 9.0% 슈크로오스, 0.1% 폴리소르베이트 80;

- 대조 제형 5 (Humira® (100 mg/mL) 제형과 동일 조성의 제형): 아달리무맙 100 mg/ml, pH 5.2, 4.2%(w/v) 만니톨, 0.1%(w/v) 폴리소르베이트 80.

2-2-2. 열가혹 조건에서의 제형 안정성

%HMW

상기 실시예 2-2-1에서 준비된 시험 제형들과 대조 제형들을 40±2℃에서 4주 동안 저장 후, 0주, 1주, 2주, 및 4주차의 제형 내 단백질의 %HMW(High Molecular Weight(%): %HMW)을 참고예 1에 따라서 SE-HPLC 분석법으로 측정하였다. 또한, 상기 측정된 %HMW 값을 이용하여, 1주, 2주, 및 4주 동안의 %HMW 변화량(Δ%HMW = (해당 주차의 %HMW) - (0주차 %HMW))을 계산하였다.

상기 얻어진 %HMW와 Δ%HMW 결과의 평균값(N=3)을 표 13 및 도 6 (단백질 농도 50 mg/mL 제형), 및 표 14 및 도 7 (단백질 농도 100 mg/mL 제형)에 나타내었다:

제형		%HMW				Δ%HMW
		0주차	1주차	2주차	4주차	1주차	2주차	4주차
시험 제형 1	Average	0.20	0.35	0.43	0.57	0.15	0.23	0.37
	SD (N=3)	0.00	0.01	0.01	0.01
대조 제형 1	Average	0.48	0.70	0.82	1.07	0.22	0.34	0.60
	SD (N=3)	0.01	0.04	0.05	0.06
대조 제형 2	Average	0.46	0.68	0.79	1.05	0.24	0.32	0.59
	SD (N=3)	0.02	0.03	0.03	0.05

제형		%HMW				Δ%HMW
		0주차	1주차	2주차	4주차	1주차	2주차	4주차
시험 제형 2	Average	0.27	0.55	0.69	0.95	0.27	0.41	0.68
	SD (N=3)	0.01	0.03	0.03	0.02
대조 제형 3	Average	0.59	1.01	1.19	1.56	0.43	0.60	0.98
	SD (N=3)	0.05	0.05	0.03	0.06
대조 제형 4	Average	0.58	1.10	1.28	1.68	0.52	0.72	1.10
	SD (N=3)	0.02	0.01	0.01	0.04
대조 제형 5	Average	0.53	0.90	1.33	1.60	0.37	0.80	1.07
	SD (N=3)	0.01	0.01	0.02	0.05

표 13 및 14과 도 6 및 7의 결과로부터, 히스티딘과 폴리소르베이트 20을 포함하는 시험 제형들은, 단백질 농도 50 mg/mL 및 100 mg/mL인 경우 모두에서, 히스티딘과 폴리소르베이트 20을 포함하지 않는 대조 제형들과 비교하여, 각 측정 시점에서의 %HMW 및 Δ%HMW 이 모두 현저하게 낮게 나타나서, 안정성이 우수함이 확인되었다.

%Acidic

또한, 상기 실시예 2-2-1에서 준비된 시험 제형들과 대조 제형들을 40±2℃에서 4주간 저장 후, 0주, 2주, 및 4주차의 제형 내 단백질의 %Acidic (Acidic variants의 함량비)을 참고예 4의 CEX-HPLC 분석법 (대조 제형 1, 2, 3, 및 4) 또는 참고예 5의 icIEF 분석법(시험 제형 1 및 2, 및 대조 제형 5)으로 측정하였다. 또한, 상기 측정된 %Acidic 값을 이용하여 %Acidic의 변화량 (Δ%Acidic = (해당 주차의 %Acidic) - (0주차 %Acidic))를 계산하였다.

상기 얻어진 %Acidic과 Δ%Acidic 결과(평균값: N=3)를 표 15 및 도 8 (단백질 농도 50 mg/mL 제형), 및 표 16 및 도 9 (단백질 농도 100 mg/mL 제형)에 나타내었다:

제형		%Acidic			Δ%Acidic
		0주차	2주차	4주차	2주차	4주차
시험 제형 1	Average	25.32	35.33	42.40	10.01	17.08
	SD (N=3)	0.62	1.64	0.66
대조 제형 1	Average	26.50	40.65	55.02	14.16	28.52
	SD (N=3)	0.89	0.75	1.34
대조 제형 2	Average	25.93	41.35	56.23	15.42	30.30
	SD (N=3)	0.30	0.61	1.00

제형		%Acidic			Δ%Acidic
		0주차	2주차	4주차	2주차	4주차
시험 제형 2	Average	24.79	33.79	39.28	8.99	14.49
	SD (N=3)	0.41	0.41	0.80
대조 제형 3	Average	25.26	38.37	51.46	13.11	26.20
	SD (N=3)	1.39	0.78	1.23
대조 제형 4	Average	24.58	39.19	52.84	14.61	28.26
	SD (N=3)	0.44	0.30	0.62
대조 제형 5	Average	25.08	35.87	45.07	10.78	19.98
	SD (N=3)	1.99	0.78	0.92

표 15 및 16와 도 8 및 도 9의 결과로부터, 히스티딘과 폴리소르베이트 20을 포함하는 시험 제형들은, 단백질 농도 50 mg/mL 및 100 mg/mL인 경우 모두에서, 히스티딘과 폴리소르베이트 20을 포함하지 않는 대조 제형들과 비교하여, 각 측정 시점에서의 %Acidic 및 Δ%Acidic이 모두 현저하게 낮게 나타나서, 안정성이 우수함이 확인되었다.

실시예 3. 계면활성제(폴리소르베이트 20) 농도 최적화

상기 실시예 2-1에서 준비된 제형들에 대하여, 동결 용융 조건 (Freeze/thaw, 5 cycle; FT5; 각 cycle: '-70℃±10℃에서 18시간 이상 냉동(Freeze)' + '상온(25℃)에서 1시간 이상 해동(thaw)')에서의 단백질의 %Acidic을 참고예 5에 따라서 icIEF 분석법으로 측정하였다. 또한, 상기 측정된 %Acidic 값을 이용하여, FT5 수행 전후의 %Acidic 변화량 (Δ%Acidic)을 측정하였다 [Δ%Acidic = (FT5 %Acidic) - (Initial %Acidic)]. 상기 시험을 3회 반복(n=3)하여 얻어진 결과의 평균값을 하기의 표 17 및 도 10에 나타내었다:

FT5 (Freeze/thaw, 5 cycle) 조건에서의 %Acidic

Formulation		%Acidic		Δ%Acidic [(FT5 %Acidic) - (Initial %Acidic)]
		Initial	FT5
0.04% PS 20	Average	23.92	26.91	2.99
	SD (N=3)	0.28	0.22	0.46
0.08% PS 20	Average	24.40	26.82	2.42
	SD (N=3)	0.46	0.43	0.88
0.1% PS 20	Average	24.79	25.62	0.83
	SD (N=3)	0.34	0.85	0.83
0.2% PS 20	Average	24.93	25.72	0.79
	SD (N=3)	0.39	0.79	1.09
0.04% PS 80	Average	24.22	26.92	2.70
	SD (N=3)	0.31	0.36	0.10
0.08% PS 80	Average	23.82	26.97	3.15
	SD (N=3)	0.32	0.05	0.28
0.1% PS 80	Average	23.64	26.94	3.29
	SD (N=3)	0.34	0.19	0.20
0.2% PS 80	Average	23.74	27.37	3.63
	SD (N=3)	0.58	0.31	0.43

표 17 및 도 10에 나타난 바와 같이, 계면활성제로서 폴리소르베이트 20을 포함하는 제형은, 폴리소르베이트 80을 포함하는 제형과 비교하여, 전반적으로 Δ%Acidic 값이 낮게 나타났다. 특히, 농도가 0.08% 이상인 경우에, 폴리소르베이트 20 포함 제형의 Δ%Acidic 값이 약 2.5% 이하로, 폴리소르베이트 80 포함 제형과 비교하여, 현저하게 낮은 것으로 나타났다. 구체적으로, 계면활성제 농도가 0.08% 이상인 범위에서, 폴리소르베이트 20를 포함하는 제형은 폴리소르베이트 20의 농도가 높아질수록 Δ%Acidic 값이 감소하는 반면, 폴리소르베이트 80을 포함하는 제형은 폴리소르베이트 80의 농도가 높아질수록 Δ%Acidic 값이 증가하는 경향을 보이는 것으로 확인되었다. 이러한 결과로부터 폴리소르베이트 20 포함 제형이 폴리소르베이트 80 포함 제형보다 안정성이 우수할 뿐 아니라, 폴리소르베이트 20의 농도가 0.08% 이상인 경우 특히 안정성이 우수함을 확인할 수 있다.

실시예 4. 항체 함유 제품의 품질 평가 - 온도 이탈 (Temperature excursions) 시험

항체를 함유하는 제형의 제품화, 저장, 유통 과정, 및 임상 시험 동안에, 제형의 권장 온도를 벗어나는 온도 이탈(Temperature excursions)이 발생하여, 적절한 처방에 장애가 될 수 있다. 본 실시예에서는 상기 실시예 1 내지 3에서 안정성이 우수한 것으로 확인된 항체 (아달리무맙) 제형의 저장 안정성을 확인하기 위하여, 고온 및 저온 조건에 단시간 노출시킨 후의 pre-filled syringe (PFS) 제품에서의 제형 안정성을 평가하였다.

본 실시예에 사용된 항체 제형(샘플)의 조성은 다음과 같다:

아달리무맙 50 mg/ml, pH 5.2, 10mM Na-시트레이트, 59mM 히스티딘, 2.5%(w/v) 솔비톨, 0.08%(w/v) 폴리소르베이트 20.

상기 항체 (아달리무맙) 제형이 단일 용량 (0.8mL)으로 미리 충진된 시린지 (pre-filled syringe)를 준비하고 (n=132), 충진된 시린지를 이용하여 동결/해동을 3 사이클 수행하였다. 각 사이클은 고온(30±2℃ 및 65±5% relative humidity (RH))에 48시간 노출 후 저온(-5±3℃)에 48시간 노출시켜 수행하였다 (3 사이클: 총 144시간 고온(30±2℃) 노출 및 총 144 시간 저온(-5±3℃) 노출). 그 후, 다음과 같은 다양한 항목들에 대한 평가 방법으로 분석을 수행하였다: 외관, pH, 단백질 농도, 용기 밀폐 정도(container closure integrity), 단백질 응집률(%HMW), 순도, 전하 변이체(charge variants; 예, %Acidic, %Main, %Basic), 아미노산 잔기의 산화, 내독소(endotoxin), 미립자(particulates), 및 생물학적 활성.

상기 동결/해동 처리(3 thermal cycles)가 항체 제형 제품(pre-filled syringe)의 품질에 미치는 영향을 baseline(5℃에서 보관된 항체 제형)과 비교하여 다음의 표 18에 나타내고, 이 중에서 %HMW, %Total purity, TNFα 결합활성, 및 TNFα 중화활성을 각각 도 11a 내지 도 11d (11a: %HMW, 11b: %Total purity, 11c: TNFα 결합 활성, 11d: TNFα 중화 활성)에 나타내었다:

극한 온도 사이클링 조건(Extreme temperature cycling conditions)에서의 항체 제형 제품(3 cycled sample)의 품질

시험 항목(Test Item)	시험 방법(Test method)	기준치(Baseline)	Temperature Cycle 3
색(Color)	참고예 6.1	무색(Colourless)	B8 ≤ Sample < B7
투명도(Clarity)	참고예 6.1 (Nephelometric Turbidity Unit; NTU)	18 NTU	17 NTU
가시 입자(Visuable particles)	참고예 6.1	입자가 거의 없음(Practically free from particles)	입자가 거의 없음(Practically free from particles)
pH	참고예 6.2	5.3	5.3
단백질 농도 (mg/mL)	참고예 6.3	51.6	49.7
고분자 응집물 (불순물) (%HMW)	참고예 6.4 및 참고예 1	0.2%	0.2%
전체 순도(Total purity)	참고예 6.5 (CE-SDS; Capillary Electrophoresis-Sodium Dodecyl Sulfate, Non-reducing)	96.8%	96.6%
단일 최고 불순물(Single highest impurity)		2.1	2.0
Main peak	icIEF (참고예 6.6 및 참고예 5)	8.6	8.6
%Acidic		21.8	25.0
%Main		67.1	64.5
%Basic		11.2	10.5
TNFα 결합 활성 (%relative binding activity)	Competitive Binding Assay (FRET) (참고예 6.7)	92%	98%
TNFα 중화 활성(%relative potency)	Cell-based, NF-κB Reporter Gene assay (참고예 6.8)	94%	105%
10 um 이상 입자수 (particles /syringe)	참고예 6.9	1521	1494
25 um 이상 입자수 (particles /syringe)		15	18
2 um 이상 입자수 (particles /syringe)		12217	13111
5 um 이상 입자수 (particles /syringe)		6257	6882
8 um 이상 입자수 (particles /syringe)		2476	2579
내독소(Endotoxin)	Endotoxin Units per ml (EU/mL) (참고예 6.10)	< 5 EU/mL	< 5 EU/mL
%acidic	CEX-HPLC (참고예 6.6 및 참고예 4)	23.5	24.0
%main		67.2	65.2
%basic		9.3	10.9
중쇄 Met34의 %산화	참고예 3	0.6	0.6
중쇄 Met83의 %산화		0.3	0.4
중쇄 Met256의 %산화		5.8	4.7
중쇄 Met432의 %산화		Not detected	Not detected
경쇄 Met4의 %산화		0.2	0.5

상기 표 18 및 도 11a-11d에서 확인되는 바와 같이, 본 실시예에서 시험된 항체 제형이 충진되고 3 cycles (각 cycle: 고온(30±2℃) 노출 및 저온(-5±3℃) 노출) 처리된 미리 충진된 시린지(pre-filled syringes)는, SE-HPLC에 의한 %HMW, 비환원(non-reducing) CE-SDS에 의한 %전체 순도(%Total purity), TNF-α 결합 분석(binding assay)에 의한 %상대 결합 활성(%relative binding activity) 및 세포 기반(cell based) TNF-α 중화 분석(neutralization assay)에 의한 %상대 역가(%relative potency)에 관한 4개의 주요 품질 속성(critical quality attributes, CQA) 면에서 기준치(baseline)와 비교하여, 유의미한 변화가 관찰되지 않았으며, 안정성 허용 기준(stability acceptance criteria)을 만족하는 결과를 나타내었다.

그 외에도, 본 실시예에서 시험된 항체 제형 제품(prefilled syringe) 내의 항체의 전하 변이체, 아미노산 잔기의 산화 정도, 내독성 수준, 외관 (투명도, 육안 관찰 가능한 입자 등), pH, 단백질 농도, 및 미립자 수준 역시, reference와 비교하여 유의미한 차이를 보이지 않았으며, 안정성 허용 기준 (stability acceptance criteria)를 만족하는 결과를 나타내었다.

또한 시험된 미리 충진된 시린지(pre-filled syringe)들 중 어느 것도 용기의 밀폐 저하(closure breaches)가 관찰되지 않았다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 실시예에서 시험된 항체 제형이 제품화 직후에 수 차례의 동결/해동 사이클 (thermal cycles)에 노출된 경우에도 제품 내 안정성이 우수함이 확인되었다. 이러한 결과는 항체 제형 제품의 선적 또는 보관 동안의 온도 이탈(temperature excursions)의 영향을 예측 가능하게 하여, 항체 처방에 도움을 줄 수 있을 것으로 기대된다.

실시예 5. 실온에서의 저장 안정성 평가 - 환자 편의 안정성 연구(Patient Convenience Stability Study)

장기간 저장 조건(5±3℃)에서 48개월 동안 보관된 실시예 4의 제형 샘플에 대하여, 실온 조건(30±2℃ 및 60±5% RH) 하에서 30일 동안 보관하면서 0일, 15일, 30일 시점에 표 19의 물성을 측정하였다. 구체적인 측정 방법은 실시예 4에서 수행한 바와 같다.

실온 저장 조건에서의 안정성 결과(30 ± 2ºC/65 ± 5% RH)

시험 항목(Test Item)		시점(Time Point)
		0 Day	15 Days	30 Days
외관(Appearance)	색(Color)	B8 < sample < B7	N/A	B9 < sample < B8
	투명도(Clarity)	17		17
	가시 입자(Visible particles)	입자가 거의 없음(Practically free from particles)		입자가 거의 없음(Practically free from particles)
pH		5.3		5.3
단백질 함량(Protein content) (A280)		50.1		50.7
Size exclusion chromatography (SE-HPLC)		0.7	0.8	0.9
CE-SDS (non-reducing)		96.9	95.6	96.1
		1.9	1.9	1.7
icIEF		29	31	33
		62	59	56
		9	10	11
FRET에 의한 TNF-α에 대한 CIBA(Competitive inhibition binding assay)		102	100	106
NF-κB 리포터 유전자에 의한 TNF-α 중화 분석		93	100	86
입자상 물질(Particulate matter)		6	N/S	12
		1,231		923

N/A: not applicable

상기 표 19 및 도 12a-12e에서 확인되는 바와 같이, 본 실시예에서 시험된 항체 제형 샘플은 장기간 저장 조건 (5±3℃)에서 48개월 동안 보관된 이후, 실온 조건(30±2℃ 및 60±5% RH) 하에서 30일 동안 시험한 결과, SE-HPLC에 의한 %HMW, 비환원(non-reducing) CE-SDS에 의한 %전체 순도(%Total purity), TNF-α 결합 분석(binding assay)에 의한 %상대 결합 활성(%relative binding activity) 및 세포 기반(cell based) TNF-α 중화 분석(neutralization assay)에 의한 %상대 역가(%relative potency)에 관한 4개의 주요 품질 속성(critical quality attributes, CQA) 면에서 기준치(baseline)(0일)와 비교하여, 유의미한 변화가 관찰되지 않았으며, 안정성 허용 기준(stability acceptance criteria)을 만족하는 결과를 나타내었다.

또한 icIEF에 의한 %Main 역시 기준치(baseline)(0일)와 비교하여, 유의미한 변화가 관찰되지 않았으며, 안정성 허용 기준(stability acceptance criteria)을 만족하는 결과를 나타내었다.

따라서, 본 발명의 약제학적 조성물은 오리지널 및 그의 바이오시밀러 대비 현저히 개선된 환자들의 저장 편의성(Patient Convenience), 더 긴 상용 기간 특성을 나타낸다.

Claims (46)

1. 항-TNFα 항체, 히스티딘 및 폴리소르베이트 20을 포함하고,
   pH는 5.0 내지 5.5 이고,
   다음 중 선택된 하나 이상의 특징을 갖는 약제학적 조성물;
   (i) 히스티딘을 포함하지 않는 조성물(Histidine-free)과 비교하여 광 안정성이 개선; 및
   (ii) 폴리소르베이트 20 대신 폴리소르베이트 80을 포함하는 조성물(polysorbate 80-containing)과 비교하여 열 안정성, 동결 용융 안정성, 또는 이들 모두가 개선.
2. 제1항에 있어서,
   상기 광 안정성의 개선은 광 노출 조건에서 항체의 아미노산 잔기의 산화율 및/또는 응집물의 함량(%High Molecular Weight; %HMW)이 감소된 것인, 약제학적 조성물
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 조성물은, 히스티딘을 포함하지 않는 조성물과 비교하여, 광 노출 조건에서 상기 항체의 아미노산 잔기의 산화율 및/또는 응집물의 함량(%High Molecular Weight; %HMW)이 적은 것인, 약제학적 조성물
4. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 광 노출 조건은 1.2 million lux hours 이상 및 200 watt hours/square meter 이상인 것인, 약제학적 조성물.
5. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 항체의 아미노산 잔기는 항체 중쇄의 256번째 위치의 메티오닌 잔기인 것인 약제학적 조성물.
6. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 아미노산 잔기의 산화율은 광 노출 조건에서의 항체 중쇄의 256번째 위치의 메티오닌 잔기의 산화율(%Met₂₅₆)로 측정되며, %Met₂₅₆이 64% 이하인, 약제학적 조성물.
7. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 아미노산 잔기의 산화율은 광 노출 조건에서의 항체 중쇄의 256번째 위치의 메티오닌 잔기의 산화율(%Met₂₅₆)로 측정되며, 히스티딘을 포함하지 않는 조성물의 광 노출 조건에서의 %Met₂₅₆와 비교하여 15% 이상 적은 것인, 약제학적 조성물.
8. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 아미노산 잔기의 산화율의 변화량은 광 노출 조건에서의 항체 중쇄의 256번째 위치의 메티오닌 잔기의 산화율(%Met₂₅₆)과 기저군 또는 암대조군의 %Met₂₅₆에 대한 차이값(Δ%Met₂₅₆)으로 측정되며, Δ%Met₂₅₆이 55% 이하인, 약제학적 조성물.
9. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 아미노산 잔기의 산화율의 변화량은 광 노출 조건에서의 항체 중쇄의 256번째 위치의 메티오닌 잔기의 산화율(%Met₂₅₆)과 기저군 또는 암대조군의 %Met₂₅₆에 대한 차이값(Δ%Met₂₅₆)으로 측정되며,
   히스티딘을 포함하지 않는 조성물과 비교하여, Δ%Met₂₅₆이 10% 이상 적은 것인, 약제학적 조성물.
10. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 응집물의 함량(%High Molecular Weight; %HMW)은 광 노출 조건에서의 응집물의 함량으로 측정되며, %HMW이 15% 이하인, 약제학적 조성물.
11. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 응집물의 함량은 광 노출 조건에서의 응집물의 함량으로 측정되며, 히스티딘을 포함하지 않는 조성물의 광 노출 조건에서의 %HMW 와 비교하여 5% 이상 적은 것인, 약제학적 조성물.
12. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 응집물의 함량의 변화량은 광 노출 조건에서의 응집물의 함량과 기저군 또는 암대조군의 응집물의 함량에 대한 차이값(Δ%HMW)으로 측정되며, Δ%HMW 이 15% 이하인, 약제학적 조성물.
13. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 응집물의 함량의 변화량은 광 노출 조건에서의 응집물의 함량과 기저군 또는 암대조군의 응집물의 함량에 대한 차이값(Δ%HMW)으로 측정되며, 히스티딘을 포함하지 않는 조성물과 비교하여, 3% 이상 적은 것인, 약제학적 조성물.
14. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 히스티딘은 항산화제(anti-oxidant agent), 항응집제(anti-aggregation agent), 또는 이들 모두로서 기능하는 것인, 약제학적 조성물.
15. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 열 안정성의 개선은 40±2℃에서 2주 보관 동안의 응집물의 함량(%High Molecular Weight; %HMW)으로 측정되는 것인, 약제학적 조성물.
16. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은, 폴리소르베이트 20 대신 폴리소르베이트 80을 포함하는 조성물(polysorbate 80-containing)과 비교하여, 40±2℃에서 2주 보관 후의 응집물의 함량(%High Molecular Weight; %HMW)이 적은 것인, 약제학적 조성물
17. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 40±2℃에서 2주 보관 동안의 응집물의 함량(%High Molecular Weight; %HMW)이 0.70% 이하인 것인, 약제학적 조성물.
18. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 동결 용융 안정성의 개선은 -70±10℃/25℃ 조건에서 동결-용융 5 사이클 후 응집물의 함량(%High Molecular Weight; %HMW)으로 측정되는 것인, 약제학적 조성물.
19. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은, 폴리소르베이트 20 대신 폴리소르베이트 80을 포함하는 조성물(polysorbate 80-containing)과 비교하여, -70±10℃/25℃에서 동결-용융 5 cycle 후(Freeze-thaw 5 cycle)의 응집물의 함량(%High Molecular Weight; %HMW)이 적은 것인, 약제학적 조성물
20. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 -70±10℃/25℃에서 동결-용융 5 cycle 후의 응집물의 함량(%High Molecular Weight; %HMW)이 0.49% 이하인 것인, 약제학적 조성물.
21. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 동결 용융 안정성의 개선은 -70±10℃/25℃ 조건에서 동결-용융 5 사이클 후 산성 변이체의 함량(%Acidic)으로 측정되는 것인, 약제학적 조성물.
22. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은, 폴리소르베이트 20 대신 폴리소르베이트 80을 포함하는 조성물(polysorbate 80-containing)과 비교하여, -70±10℃/25℃에서 동결-용융 5 cycle 후(Freeze-thaw 5 cycle)의 산성 변이체의 함량(%Acidic) 또는 -70±10℃/25℃에서 동결-용융 5 cycle 수행 전후의 %Acidic 변화량(Δ%Acidic)이 적은 것인, 약제학적 조성물
23. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 -70±10℃/25℃에서 동결-용융 5 cycle 후의 산성 변이체의 함량(%Acidic)이 27% 이하인 것인, 약제학적 조성물.
24. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은, 폴리소르베이트 20 대신 폴리소르베이트 80을 포함하는 조성물과 비교하여, -70±10℃/25℃에서 동결-용융 5 cycle 후의 산성 변이체의 함량(%Acidic)이 0.1% 이상 낮은 것인, 약제학적 조성물.
25. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 -70±10℃/25℃에서 동결-용융 5 cycle 수행 전후의 %Acidic 변화량(Δ%Acidic)이 2.5% 이하인 것인, 약제학적 조성물.
26. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은, 폴리소르베이트 20 대신 폴리소르베이트 80을 포함하는 조성물과 비교하여, -70±10℃/25℃에서 동결-용융 5 cycle 수행 전후의 %Acidic 변화량(Δ%Acidic)이 0.2% 이상 낮은 것인, 약제학적 조성물.
27. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 5±3℃ 온도에서 32개월 내지 52개월 저장된 이후, 30±2℃의 온도에서의 보관 기간이 28일 내지 35일인 것인, 약제학적 조성물.
28. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 5±3℃ 온도에서 36개월 내지 48개월 저장된 이후, 30±2℃의 온도에서의 보관 기간이 30일인 것인, 약제학적 조성물.
29. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 5±3℃ 온도에서 32개월 내지 52개월 저장된 이후, 30±2℃의 온도에서 28일 내지 35일 보관된 경우, 다음 중에서 선택된 하나 이상의 특징을 갖는 것인, 약제학적 조성물:
    탁도가 20 NTU(nephelometric turbidity unit) 이하,
    TNFα 결합 활성이 약 90% 이상,
    TNFα 중화 활성이 약 80% 이상,
    전체 순도(Total purity) 가 93% 이상,
    응집물의 함량(%HMW)이 2% 이하,
    산성 변이체 함량(%Acidic)이 33% 이하,
    Main 단백질의 함량(%Main)이 55% 이상,
    염기성 변이체 함량(%basic)이 14% 이하,
    조성물 0.8mL 내의 평균 입경이 10 um 이상인 입자수가 1500개 이하,
    조성물 0.8mL 내의 평균 입경이 25 um 이상인 입자수가 40개 이하, 및
    내독소 함량이 8 EU/mL 이하.
30. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-TNFα 항체는 아달리무맙인 것인, 약제학적 조성물.
31. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-TNFα 항체는 약 50mg/mL 또는 약 100mg/mL의 농도인 것인 약제학적 조성물.
32. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 히스티딘은 50 mM 내지 89 mM 인 것인, 약제학적 조성물.
33. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 히스티딘은 약 59 mM 인 것인, 약제학적 조성물.
34. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 히스티딘을 제외한 아미노산은 포함하지 않는 것인, 약제학적 조성물.
35. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리소르베이트 20은 0.04%(w/v) 초과 0.2%(w/v)이하의 농도로 포함되는 것인, 약제학적 조성물.
36. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리소르베이트 20은 약 0.08%(w/v) 인 것인 약제학적 조성물.
37. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 폴리소르베이트 80을 포함하지 않는 것인, 약제학적 조성물.
38. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 솔비톨, 만니톨, 메글루민, 트레할로오스, 슈크로오스, 말토오스, 락토오스, 글루코오스, 자일리톨, 아라비톨, 에리트리톨, 락티톨, 말티톨 및 이노시톨로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
39. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 시트레이트를 더 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
40. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 포스페이트, 숙시네이트 및 아세테이트로 이루어진 군에서 1종 이상을 더 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
41. 제40항에 있어서,
    상기 조성물은 시트레이트를 포함하지 않는 것인, 약제학적 조성물.
42. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 염화암모늄, 황산암모늄, 탄산암모늄, 질산암모늄, 염화나트륨, 황산나트륨, 염화칼륨, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 및 에틸렌다이아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하지 않는 것인, 약제학적 조성물.
43. 제1항 내지 42항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 포함하고,
    상기 약제학적 조성물은, 48시간 동안 30±2℃의 고온 조건 노출 및 48시간 동안 -5±3℃ 저온 조건 노출을 3 cycle 수행시 온도 변화에 대한 안정성을 갖는 것인, 컨테이너.
44. 제43항에 있어서,
    상기 온도 변화에 대한 안정성은, TNFα 결합 활성, TNFα 중화 활성, 미립자 개수, 아미노산 잔기의 산화, 투명도, pH, 단백질 농도, 단백질 응집률, 순도, 전하 변이체, 및 내독소로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 측정되는 것인, 컨테이너.
45. 제43항 또는 제44항에 있어서, 48시간 동안 30±2℃의 고온 조건 노출 및 48시간 동안 -5±3℃ 저온 조건 노출을 3 cycle 수행 후, 상기 약제학적 조성물은 다음 중에서 선택된 하나 이상의 특징을 갖는 것인, 컨테이너:
    TNFα 결합 활성이 약 90% 이상,
    TNFα 중화 활성이 약 90% 이상,
    항체 중쇄의 34번째 위치의 메티오닌의 산화율이 약 1.1% 이하,
    항체 중쇄의 83번째 위치의 메티오닌의 산화율이 약 0.9% 이하,
    항체 중쇄의 256번째 위치의 메티오닌의 산화율이 약 6.0% 이하,
    항체 중쇄의 432번째 위치의 메티오닌의 산화율이 약 0.5% 이하,
    항체 경쇄의 4번째 위치의 메티오닌의 산화율이 약 0.9% 이하,
    탁도가 20 NTU(nephelometric turbidity unit) 이하,
    전체 순도(Total purity) 가 94%(w/v) 이상,
    조성물 0.8mL 내의 평균 입경이 10 um 이상인 입자수가 2500개 이하,
    조성물 0.8mL 내의 평균 입경이 25 um 이상인 입자수가 100개 이하, 및
    내독소 함량이 8 EU/mL 이하.
46. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 컨테이너는 바이알, PFS(pre-filled syringe), 또는 PFP(pre-filled pen)를 포함하는 것인, 컨테이너.

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