TWI771335B

TWI771335B - 穩定藥學調配物

Info

Publication number: TWI771335B
Application number: TW106137110A
Authority: TW
Inventors: 李晙源; 韓元鎔; 金水晶; 吳俊錫; 金昭英; 金廣佑; 申姸暻
Original assignee: 南韓商賽特瑞恩股份有限公司
Priority date: 2016-10-28
Filing date: 2017-10-27
Publication date: 2022-07-21
Also published as: WO2018080196A2; US20190248871A1; WO2018080196A3; TW201825109A; US11236146B2; KR20180046888A; EP3533441A2; EP3533441A4

Abstract

在此揭示的是一種穩定藥學調配物，其包含一融合蛋白及一琥珀酸鹽緩衝劑，不含一穩定劑；其中在該融合蛋白內一人類p75腫瘤壞死因子受體之一細胞外配體結合結構域係被融合至一人類IgG之Fc結構域。該穩定藥學調配物使能夠長期貯存TNFR-Fc融合蛋白調配物，且能在不需要嚴格的貯存條件下展現優越的貯存穩定性，以及其為一簡單的調配物，因為其中不含穩定劑，因此比其它含穩定劑之調配物更經濟。

Description

穩定藥學調配物

發明領域

本發明有關一種穩定藥學調配物。

相關技藝之說明

藉由將人類p75腫瘤壞死因子受體(TNFR)之細胞外配體結合結構域融合至人類IgG1之Fc結構域所製得之TNFR-Fc融合蛋白，包括依那西普(etanercept)。依那西普含有467個胺基酸，且具有約150kDa之表觀分子量。其是Amgen Inc.於2002年上市之商品，商品名為“恩博(Enbrel)”。作為TNF-α抑制劑之依那西普已被用於治療類風濕性關節炎、牛皮癬、僵直性脊椎炎等等，而將其應用於血管炎、阿滋海默症及克隆氏症之臨床研究正在進行中。

通常，抗體藥物以及蛋白藥物含有半衰期很短且容易因不當的溫度、剪切應力、振動、冷凍-解凍、UV曝露、pH過度變化、有機溶劑及微生物污染而發生化學與物理變性之活性成份。化學變性包含二聚體解離、氧化、脫醯胺、異構化及多聚化，其等會受到抗體之胺基酸組成及含該抗體之溶劑之條件(鹽、pH及溫度)的影響。物理變性包含失去三級結構，及單體共價/非共價凝集及吸附，其等會受到含抗體之周遭環境如溶劑、複合蛋白結構如電荷分佈及熱穩定性，改變蛋白表面上之疏水性斑塊之影響。

含抗體之蛋白之物理或化學變性，意味著失去其生理活性。此外，因為此變性是不可逆的，很難恢復變性抗體原有的特性，所以會降低治療效率。再者，已有報告提出單體之凝集會引起免疫反應之現象，故已針對無此凝集之生理有效量進行仔細的研究(Ishikawa et al.,Biol.Pharm.Bull.,33(8)：1413-1417,2010)。

據此，為了防止抗體藥物變性，已經研究了許多的方法以及嘗試添加賦形劑或調整pH或緩衝劑組成。在抗體蛋白之疏水性基團曝露於分子表面因此彼此結合而發生凝集之情況下，可使用能夠穩定該曝露的疏水性基團之賦形劑以防止凝集之方法。其等有例如胺基酸，如精胺酸、離胺酸、脯胺酸、組胺酸、甘胺酸等等(US4362661A、US7648702)、聚山梨醇酯系界面活性劑、兩親聚合物，如聚乙二醇(PEG)或聚乙烯吡咯啶酮(PVP)；多醣類，如葡聚糖及單醣類；或雙醣類，如蔗糖、麥芽糖、海藻糖等等(US5945098A)。

雖然已經研究了許多可用於製備蛋白藥物穩定調配物之穩定劑，但仍有適合針對個別活性成份之物理及化學特性之穩定劑之需求。假如穩定劑的濃度控制失敗，則存在歸因於穩定劑與藥物間之副作用之問題(如不同於藥物之預期功效之不利作用)。此外，當添加胺基酸作為穩定劑時，很容易因加熱而變性，此是不希望有的。在某些醣類於貯存過程中降解而產生雜質或還原糖之情況下，會發生醣化作用，此不利地影響蛋白的穩定性。當界面活性劑在貯存期間因外在環境條件而分解時，可能會形成過氧化物，以及可能成為氧化蛋白之因子(Kamerzell,Tim.J.,et al.Advanced drug delivery reviews 63.13(2011)：1118-1159)。

美國專利案第7,648,702號揭示一種包含依那西普及10~200mM之L-精胺酸之藥學組成物。然而該藥學組成物中所含之磷酸鹽緩衝液，在凝集形成方面之穩定作用不足，且蔗糖會促進聚合物雜質的形成，其可能會不利地影響蛋白的穩定性。

韓國專利案第10-1482304號揭示一種依那西普溶液調配物，其包含依那西普及0.1~250mM之至少一種選自於由下列所構成之群組之穩定劑：甲硫胺酸、離胺酸、組胺酸及其藥學上可接受之鹽類。然而，該依那西普調配物中所含之磷酸鹽緩衝液之穩定作用不足，且所含之作為穩定劑的組胺酸可能形成聚合物雜質，其可能引起蛋白穩定性之問題。

韓國專利案第10-1419884號揭示一種用於治療關節炎之組成物，其包含依那西普、銨鹽及琥珀酸鹽。然而，該含依那西普之組成物可能會引起安全的問題，因為除了硫酸銨外，諸如氯化銨、碳酸銨及硝酸鹽之銨鹽並未經美國食品藥物管理局(FDA)核准作為注射劑之賦形劑。

韓國專利申請公開案2014-0027274號揭示一種藥學組成物，其包含依那西普、檸檬酸鹽緩衝劑及選自於由下列所構成群組之胺基酸：離胺酸、脯胺酸及其藥學上可接受之鹽類，其中該檸檬酸鹽緩衝劑具有25mM至120mM之濃度，而該胺基酸具有15mM至100mM之濃度。然而，在以該依那西普調配物中所含之檸檬酸鹽作為緩衝劑之情況下，蛋白氧化之抑制作用不足，且在注射時會產生疼痛。

因此，本發明研究在不含穩定劑之情況下能夠穩定地維持TNFR-Fc融合蛋白之活性之藥學調配物，且最後本發明確認了，即使不含任何的穩定劑，包含琥珀酸鹽緩衝劑之調配物在穩定TNFR-Fc融合蛋白方面仍非常有效。

發明概要

據此，本發明旨在提供一種穩定藥學調配物，其包含一TNFR-Fc融合蛋白及琥珀酸鹽緩衝劑，不含一穩定劑。

此外，本發明旨在提供一種穩定藥學調配物，其包含一TNFR-Fc融合蛋白、琥珀酸緩衝劑及預定濃度之一等張劑，不含一穩定劑。

此外，本發明旨在提供一種用於皮下投與之穩定藥學調配物，其包含一TNFR-Fc融合蛋白、琥珀酸鹽緩衝劑及預定濃度之一等張劑，不含一穩定劑。

為達到以上之目的，本發明提供一種穩定藥學調配物，其包含一融合蛋白及一琥珀酸鹽緩衝劑，不含一穩定劑；其中在該融合蛋白內一人類p75腫瘤壞死因子受體之一細胞外配體結合結構域係被融合至一人類IgG之Fc結構域。

本發明提供一種穩定藥學調配物，其包含一融合蛋白及一琥珀酸鹽緩衝劑，不含作為一穩定劑之胺基酸、銨鹽、醣或其等之混合物；其中在該融合蛋白內一人類p75腫瘤壞死因子受體之一細胞外配體結合結構域係被融合至一人類IgG之Fc結構域。

在本發明之一實施例中，該融合蛋白可包含序列辨識編號：1之胺基酸序列。

在本發明之一實施例中，該融合蛋白可包含序列辨識編號：2之胺基酸序列。

在本發明之一實施例中，其中該融合蛋白可以1至100mg/mL的一濃度被包含。

在本發明之一實施例中，該琥珀酸鹽緩衝劑可包含濃度為1至200mM之琥珀酸鹽。

在本發明之一實施例中，本發明之穩定藥學調配物可進一步包含一等張劑。

在本發明之一實施例中，該等張劑可以是濃度為1至1000mM之氯化鈉。

在本發明之一實施例中，該穩定藥學調配物之pH範圍可從5.5至6.5。

在本發明之一實施例中，該銨鹽可為氯化銨、硫酸銨、碳酸銨、硝酸銨或其等之混合物。

在本發明之一實施例中，該胺基酸可為精胺酸、甲硫胺酸、離胺酸、組胺酸、甘胺酸、脯胺酸、丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸、天冬醯胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸或其等之混合物。

在本發明之一實施例中，該醣可為蔗糖。

在本發明之一實施例中，當在40℃±2℃下貯存12週後使用粒徑篩析高效液相層析法(SE-HPLC)測量時，該穩定藥學調配物可包含12%或更少的高分子量組份。

在本發明之一實施例中，當在40℃±2℃下貯存12週後使用疏水交互作用高效液相層析法(HI-HPLC)測量時，該穩定藥學調配物可包含24%或更少的高分子量組份。

在本發明之一實施例中，該穩定藥學調配物可包含1~100mg/mL之含序列辨識編號：2之胺基酸序列之融合蛋白、1~200mM之琥珀酸鹽緩衝劑及1~1000mM之氯化鈉，不含穩定劑，其中該琥珀酸鹽緩衝劑與該氯化鈉之濃度調節在該調配物之滲透壓為200至400mOsm之範圍內。

本發明之穩定藥學調配物可包含45~55mg/mL之含序列辨識編號：2之胺基酸序列之融合蛋白、5~45mM之琥珀酸鹽緩衝劑及100mM或更多之氯化鈉，不含穩定劑。

根據本發明，不含穩定劑之穩定藥學調配物使得TNFR-Fc融合蛋白調配物能夠長期貯存，且可在不需要嚴格的貯存條件下展現極佳的貯存穩定性。本發明之調配物是一簡單的調配物，因為其中不含穩定劑，因此比其它含穩定劑之調配物更經濟。

較佳實施例之詳細說明 [穩定藥學調配物]

根據本發明，穩定藥學調配物包含一融合蛋白及一琥珀酸鹽緩衝劑，不含一穩定劑；其中在該融合蛋白內一人類p75腫瘤壞死因子受體之一細胞外配體結合結構域係被融合至一人類IgG之Fc結構域。

根據本發明，穩定藥學調配物包含一融合蛋白及一琥珀酸鹽緩衝劑，不含作為一穩定劑之胺基酸、銨鹽、醣或其等之混合物；其中在該融合蛋白內一人類p75腫瘤壞死因子受體之一細胞外配體結合結構域係被融合至一人類IgG之Fc結構域。

在本發明之一實施例中，本發明之穩定藥學調配物可進一步包含不會實質地不利影響抗體之活性或調配物之穩定性及其低黏度之範圍內的添加物，其是本領域已知的。例如，可進一步包含一水性載體、一抗氧化劑或其二或多種之混合物。該水性載體是藥學上可接受的(投與至人類身上時安全且無毒性)且可用於製備藥學調配物之載體。該水性載體之例子可包含，但不限於，無菌注射用水(SWFI)、抑菌注射用水(BWFI)、無菌生理食鹽水、林格氏液、葡萄糖等等。該抗氧化劑之例子可包含，但不限於，抗壞血酸等等。

在此所使用之詞句“不含”意指完全不含相應的組份。且，以上之詞句意指實質上不含相應的組份，即包含不會影響抗體之活性或藥學調配物之穩定性之範圍內之相應的組份，以該藥學調配物之總重量計，量為例如0至1%(w/v)、0至1ppm(w/v)或0至1ppb(w/v)。

(A)融合蛋白

在本發明之一實施例中，其中一人類p75腫瘤壞死因子受體之一細胞外配體結合結構域被融合至一人類IgG之Fc結構域的融合蛋白，可包含序列辨識編號：1之胺基酸序列。在本發明之一實施例中，該融合蛋白可包含序列辨識編號：2之胺基酸序列。

在本發明之一實施例中，該融合蛋白可為通過對序列辨識編號：2之胺基酸序列進行胺基酸取代、刪除或插入處理之修飾融合蛋白，或可為具有與依那西普之活性相似的活性之胜肽類似物。

在本發明中，該融合蛋白之濃度可在不會實質地不利影響本發明之穩定藥學調配物之穩定性之範圍內自由地調整。

在本發明之一實施例中，該TNFR-Fc融合蛋白之濃度為1mg/mL或更高。在另一實施例中，該TNFR-Fc融合蛋白之濃度可為1至100mg/mL。在另一實施例中，該TNFR-Fc融合蛋白之濃度可為20至80mg/mL。在另一實施例中，該TNFR-Fc融合蛋白之濃度可為40至60mg/mL。在另一實施例中，該TNFR-Fc融合蛋白之濃度可為50mg/mL。當該TNFR-Fc融合蛋白之濃度落在以上之範圍內時，可根據融合蛋白的量增加投與劑量及週期之自由選擇性，及可改善長期穩定性。

且，本發明之穩定藥學調配物在‘融合蛋白’方面，而不是在‘抗體’如英夫利昔單抗(infliximab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)或依庫珠單抗(eculizumab)方面展現優越的穩定作用。

(B)琥珀酸鹽緩衝劑

該琥珀酸鹽緩衝劑之例子可包含，但不限於，琥珀酸鈉、琥珀酸鋅、琥珀酸鋁、琥珀酸鉀等等。該琥珀酸鹽緩衝劑可經由混合琥珀酸鹽與琥珀酸製得。

在本發明之一實施例中，該琥珀酸鹽緩衝劑可包含琥珀酸鈉。

在本發明之一實施例中，該琥珀酸鹽緩衝劑中琥珀酸鹽的量，可在不會實質地不利影響本發明之藥學調配物之穩定性之範圍內自由地調整。例如，該琥珀酸鹽緩衝劑中琥珀酸鹽的量可在1至200mM之間。在本發明之另一實施例中，該琥珀酸鹽的量可在3至100mM之間。在另一實施例中，該琥珀酸鹽的量可在5至45mM之間。在另一實施例中，該琥珀酸鹽的量可在15至35mM之間。在另一實施例中，該琥珀酸鹽的量可在5至24mM之間。當琥珀酸鹽的量落在以上之範圍內時，可展現出優越的長期穩定性。假如琥珀酸鹽的量小於1mM，則作為緩衝劑之作用可能會不足。相反地，假如其量超過200mM，則所產生的調配物之黏度可能會增加，因此可能不適合使用。

琥珀酸鹽的量，可為貯存於單一容器中之調配物中之琥珀酸鹽含量。在供多次分配或多次投與之容器中，琥珀酸鹽的量可根據分配或投與之次數增加數倍。相反的，當使用小容器時，可減少琥珀酸鹽的量以便適合該容器。

(C)穩定劑

根據本發明，該穩定藥學調配物不包含穩定劑，及在本發明之一實施例中，該不被包含的穩定劑可為胺基酸、銨鹽、醣或其等之混合物。

在本發明之一實施例中，該不被包含的銨鹽可為，但不限於，氯化銨、硫酸銨、碳酸銨、硝酸銨或其等之混合物。除硫酸銨以外之銨鹽，未被註冊在美國FDA核准可供人類投與之賦形劑資料庫中之非活性成份資料庫(IID)中，因此不適合通過注射投與至人體內(www.fda.gov)。

在本發明之一實施例中，該不含的胺基酸可為，但不限於，精胺酸、甲硫胺酸、離胺酸、組胺酸、甘胺酸、脯胺酸、丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸、天冬醯胺酸、酥胺酸、麩醯胺酸或其等之混合物。

在本發明之一實施例中，該不含的糖可為，但不限於，蔗糖。

在本發明之一實施例中，該不含的穩定劑可為界面活性劑，且該界面活性劑可為，但不限於，聚山梨糖醇酯20、聚山梨糖醇酯80、泊洛沙姆(poloxamer)或其等之混合物。

在本發明之一實施例中，該不含的穩定劑可為聚合物，其之例子可包含，但不限於，聚乙二醇、聚乙烯吡咯啶酮、羧甲基纖維素、透明質酸、環糊精及其等之混合物。

在本發明之一實施例中，該不含的穩定劑可為醣，該醣之例子為，但不限於，多醣類，如葡聚醣、蔗糖、麥芽糖、海藻糖及其等之混合物。

(D)等張劑

本發明之穩定藥學調配物可包含一等張劑，該等張劑之例子可包含，但不限於，氯化鈉、氯化鉀、硼酸、硼酸鈉及其等之混合物。

在本發明之一實施例中，這些等張劑可單獨使用或二或多種合併使用。在本發明之另一實施例中，該等張劑可起維持該調配物之滲透壓在200至400mOsm之功能。

在本發明之一實施例中，該等張劑可為氯化鈉。該等張劑的量可在不會實質地不利影響本發明之藥學調配物之穩定性之範圍內自由地調整。該等張劑的量落在1至1000mM之範圍內。在本發明之另一實施例中，該等張劑的量可在50至800mM之間。在另一實施例中，該等張劑的量可在80至700mM之間。在另一實施例中，該等張劑的量可在90至600mM之間。在另一實施例中，該等張劑的量可在100至500mM之間。在另一實施例中，該等張劑的量可在110至400mM之間。在進一步的實施例中，該等張劑的量可在115至300mM之間。在再進一步的實施例中，該等張劑的量可在120至200mM之間。在再進一步的實施例中，該等張劑的量可在120至180mM之間。在再進一步的實施例中，該等張劑的量可在120至160mM之間。在再進一步的實施例中，該等張劑的量可在130至150mM之間。

(E)pH

本發明之藥學調配物之pH可調整至落在5.5至6.5的範圍內。在本發明之一實施例中，該藥學調配物之pH在5.7至6.3之間。在本發明之一實施例中，該藥學調配物之pH在6.0至6.5之間。在本發明之一實施例中，該藥學調配物之pH在5.5至6.0之間。在另一實施例中，該藥學調配物之pH可調整至6.0。假如其pH低於5.5或超過6.5，則會增加融合蛋白凝集的發生。因此，該藥學調配物之pH較佳地落在以上之範圍內。

(F)“穩定”藥學調配物

在本發明之“穩定”藥學調配物中，術語 “穩定”意指本發明之融合蛋白在其製備過程期間和/或其貯存期間，實質上保留物理穩定性、化學穩定性和/或生物活性。許多用於測量融合蛋白之穩定性之分析技術，在本技藝中很容易進行。

物理穩定性可透過任何此技藝中已知之方法評估，包含測量樣本之明顯的光衰減(吸收或光學密度)。

此光衰減之測量與調配物之濁度有關。在物理穩定性方面，可測量高分子量組份含量、低分子量組份含量、完整的蛋白含量、不溶性雜質顆粒之數目等等。

在此使用之術語“高分子量組份”指的是其保留時間位在主波峰(完整的融合蛋白)之前之波峰。典型地，高分子量組份是一具有分子量大於呈治療單體形式之TNFR-Fc融合蛋白之分子量之複合物，例如，分子量超過約150kDa。

在此使用之術語“低分子量組份”指的是其保留時間位在主波峰(完整的融合蛋白)之後之波峰。典型地，低分子量組份是一具有分子量低於治療性TNFR-Fc融合蛋白之複合物，例如，分子量低於約150kDa。

化學穩定性可透過檢測與量化經化學改變的抗體進行評估。化學穩定性包含，例如，可利用離子交換色層分析法評估之電荷改變(如，導因於脫醯胺或氧化)。在化學穩定性方面，可測量電荷變化(酸性或鹼性波峰)。

該生物活性可透過任何此技藝中已知之方法評估，包含，例如，使用ELISA測量抗原結合親和力。

在本發明之一實施例中，該藥學調配物可長時間穩定。

在本發明之一實施例中，術語“穩定”藥學調配物指的是滿足下列標準中之至少一個之藥學調配物。

主組份含量(主波峰)

-穩定藥學調配物，在40℃±2℃溫度下貯存12週後，其主組份含量經SE-HPLC測量為65%至100%。

-穩定藥學調配物，在40℃±2℃溫度及75±5%相對濕度下貯存12週後，其主組份含量經SE-HPLC測量為65%至100%。

-穩定藥學調配物，在40℃±2℃溫度下貯存12週後，其主組份含量經HI-HPLC測量為64%至100%。

-穩定藥學調配物，在40℃±2℃溫度及75±5%相對濕度下貯存12週後，其主組份含量經HI-HPLC測量為64%至100%。

高分子量組份

-穩定藥學調配物，在40℃±2℃溫度下貯存12週後，其高分子量組份含量經SE-HPLC測量為12%或更低。

-穩定藥學調配物，在40℃±2℃溫度及75±5%相對濕度下貯存12週後，其高分子量組份含量經SE-HPLC測量為12%或更低。

-穩定藥學調配物，在40℃±2℃溫度下貯存12週後，其高分子量組份含量經HI-HPLC測量為24%或更低。

-穩定藥學調配物，在溫度40℃±2℃及75±5%相對濕度下貯存12週後，其高分子量組份含量經HI-HPLC測量為24%或更低。

氧化率

-藥學調配物，在40℃±2℃溫度下貯存12週後，其重鏈Met 272之氧化率經LS-MS測量為小於3.0%。

-藥學調配物，在40℃±2℃溫度及75±5%相對濕度下貯存12週後，其重鏈Met272之氧化率經LS-MS測量為小於3.0%。

[製備穩定藥學調配物之方法]

本發明之穩定藥學調配物可使用任何已知的方法製備，且不限定至特定的方法。例如，本發明之穩定藥學調配物可經由混合TNFR-Fc融合蛋白與不含穩定劑之琥珀酸鹽緩衝液及含等張劑之溶液製得。

在本發明之一實施例中，所製得之本發明之藥學調配物可在經過如滅菌處理或相似處理後立即置於氣密容器中。

[使用穩定藥學調配物之方法]

本發明之穩定藥學調配物可用於治療TNF-α之活性是有害的疾病。TNF-α之活性是有害的疾病之例子可包含，但不限於，敗血症、自體免疫疾病、感染疾病、移植、惡性腫瘤、肺病、腸道疾病、心臟疾病等等。

本發明之穩定藥學調配物可作為可用依那西普治療之疾病的治療劑。因為依那西普可作用為生物發炎調節劑，其參與體內抑制與TNF-α相關之免疫反應之作用，所以本發明之調配物可用於治療風濕性關節炎、牛皮癬、僵直性脊椎炎、血管炎、阿滋海默症、克隆氏症等等，但不限於此。

本發明之穩定藥學調配物可透過口服投與或腸道外投與體內投藥，如皮下、肌肉、腹腔、胸骨內、經皮及靜脈注射及輸注，但不限於此。較佳地，本發明之穩定藥學調配物以注射之形式投與。

本發明之藥學調配物投與之量與時程，視疾病之類型、疾病之嚴重度與病程、病人的健康與治療方案及治療醫生的判斷而定，且不限於特定值。例如，一週二次各投與25mg的量或每週投與50mg的量；或一週二次各投與50mg的量，進行12週(或3個月)，接著一週二次各投與25mg的量或每週投與50mg、一週二次0.4mg/kg(最大單一劑量不超過25mg)或每週一次0.8mg/kg(最大單一劑量不超過50mg)。

[治療方法及穩定方法]

本發明提出一種治療TNF-α之活性是有害的疾病之方法，其包含對罹患TNF-α之活性是有害的疾病之病人投與一穩定藥學調配物，該藥學調配物包含一融合蛋白及一琥珀酸鹽緩衝劑，不含一穩定劑；其中在該融合蛋白內一人類p75腫瘤壞死因子受體之一細胞外配體結合結構域係被融合至一人類IgG之Fc結構域。

此外，本發明提出一種穩定藥學調配物，其包含一融合蛋白及一琥珀酸鹽緩衝劑，不含作為一穩定劑之胺基酸、銨鹽、醣或其等之混合物；其中在該融合蛋白內一人類p75腫瘤壞死因子受體之一細胞外配體結合結構域係被融合至一人類IgG之Fc結構域。

此外，本發明提供一種穩定藥學調配物中之融合蛋白之方法，其包含製備一穩定藥學調配物，該藥學調配物包含一融合蛋白及一琥珀酸鹽緩衝劑，不含一穩定劑；其中在該融合蛋白內一人類p75腫瘤壞死因子受體之一細胞外配體結合結構域係被融合至一人類IgG之Fc結構域。

在該治療方法或該穩定方法之一實施例中，該融合蛋白可包含序列辨識編號：1之胺基酸序列。

在該治療方法或該穩定方法之一實施例中，該融合蛋白可包含序列辨識編號：2之胺基酸序列。

在該治療方法或該穩定方法之一實施例中，該融合蛋白之濃度可為1至100mg/mL。

在該治療方法或該穩定方法之一實施例中，該琥珀酸鹽緩衝劑可包含濃度1至200mM之琥珀酸鹽。

在該治療方法或該穩定方法之一實施例中，該藥學調配物可進一步包含一等張劑。

在該治療方法或該穩定方法之一實施例中，該等張劑可以是濃度為1至1000mM之氯化鈉。

在該治療方法或該穩定方法之一實施例中，該藥學調配物可具有5.5至6.5的pH。

在該治療方法或該穩定方法之一實施例中，該穩定劑可為胺基酸、銨鹽、醣或其等之混合物。

在該治療方法或該穩定方法之一實施例中，該銨鹽可為氯化銨、硫酸銨、碳酸銨、硝酸銨或其等之混合物。

在該治療方法或該穩定方法之一實施例中，該胺基酸可為精胺酸、甲硫胺酸、離胺酸、組胺酸、甘胺酸、脯胺酸、丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸、天冬醯胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸或其等之混合物。

在該治療方法或該穩定方法之一實施例中，該糖可為蔗糖。

在該治療方法或該穩定方法之一實施例中，調配物當在40℃±2℃下貯存12週後使用SE-HPLC測量時，該藥學調配物可包含12%或更少的高分子量組份。

在該治療方法或該穩定方法之一實施例中，調配物當在40℃±2℃下貯存12週後使用HI-HPLC測量時，該藥學調配物可包含24%或更少的高分子量組份。

[產物]

本發明提出一種產物，其包含該穩定藥學調配物及一容器，該容器以氣密狀態容納該藥學調配物。

該穩定藥學調配物如上所述。

在本發明之一實施例中，該容器可由玻璃、聚合物(塑膠)、金屬等等形成，但不限於此。在本發明之一實施例中，該容器是瓶子、小瓶、針筒或管子，但不限於此。在本發明之一實施例中，該容器可為由玻璃或聚合物製成之小瓶，或由玻璃或聚合物製成之預充填針筒。在本發明之一實施例中，該容器之內表面不可塗矽油。若塗矽油，則可能會減損穩定性。該容器可為單一劑量或多劑量容器。

在本發明之一實施例中，該產物可進一步包含使用該穩定藥學調配物之方法及貯存該穩定藥學調配物之方法中之一者或二者之說明書。該使用方法包含治療TNF-α之活性是有害的疾病，且可包含投與途徑、劑量及時程。

在本發明之一實施例中，該產物可包含其它從商業目的及使用者之觀點所需之工具，諸如針頭、注射器、自動注射器等等。

下列範例將提供對本發明更多的理解，其等是為例示說明本發明，不能被解釋為限制本發明之範疇。

[測試調配物之製備]

為了製備及評估針對TNFR-Fc融合蛋白優化之穩定調配物，依照下列製備範例1至8及比較例1至3中各別的調配物。

將TNFR-Fc融合蛋白以50mg/mL之數量加至5mM琥珀酸鹽溶液中，然後添加140mM之氯化鈉作為等張劑，不添加穩定劑，製得範例1中pH為6.0之調配物。

將TNFR-Fc融合蛋白以50mg/mL之數量加至25mM琥珀酸鹽溶液中，然後各自添加140mM之氯化鈉及120mM之氯化鈉作為等張劑，不添加穩定劑，製得範例2及3中pH為6.0之調配物。

將TNFR-Fc融合蛋白以50mg/mL之數量加至10mM琥珀酸鹽溶液中，然後添加140mM之氯化鈉作為等張劑，不添加穩定劑，製得範例4、5及6中pH分別為6.0、5.5及6.5之調配物。

將TNFR-Fc融合蛋白以50mg/mL之數量加至10mM琥珀酸鹽溶液中，然後各自添加120mM之氯化鈉及160mM之氯化鈉作為等張劑，不添加穩定劑，製得範例7及8中pH為6.0之調配物。

且，為製備與從Amgen Inc.,U.S.A.獲得之Enbrel產品相同的劑型之溶液，將TNFR-Fc融合蛋白以50mg/mL之數量加至25mM磷酸鹽溶液中，然後添加100mM之氯化鈉作為等張劑，然後添加1%之蔗糖及25mM之精胺酸作為穩定劑，製得比較例1中pH為6.3之調配物。

將TNFR-Fc融合蛋白以50mg/mL之數量加至25mM組胺酸緩衝劑中，然後添加140mM之氯化鈉作為等張劑，製得比較例2中pH為6.0之調配物。

將TNFR-Fc融合蛋白以50mg/mL之數量加至10mM檸檬酸鹽緩衝劑中，然後添加140mM之氯化鈉作為等張劑，製得比較例3中pH為6.0之調配物。

將以上所製得之各個調配物以1.0mL之數量置於1.0mL之玻璃針筒中、密封、貯存於40℃之嚴苛條件下12週，然後比較及評估TNFR-Fc融合蛋白凝集及氧化之程度。

[分析方法]

SE-HPLC分析法

為評估表1中範例調配物之穩定性，用SE-HPLC進行分析。使用TSK-凝膠管柱，在磷酸鹽及氯化鈉之移動相條件下檢測214nm處之蛋白波峰，測量TNFR-Fc融合蛋白之凝集程度。TNFR-Fc融合蛋白凝集物會比主波峰還早從管柱中洗出，計算凝集物相對於總波峰面積之波峰面積，據此評估凝集之程度。主波峰表示TNFR-Fc融合蛋合不含雜質之數量，及計算與評估其相對於總波峰面積之面積比。

HI-HPLC分析法

TNFR-Fc融合蛋白結構改變之程度是用HI-HPLC評估。使用丁基-NPR管柱，於硫酸銨及磷酸鹽之移動相條件下檢測218nm處之蛋白波峰。主波峰表示TNFR-Fc融合蛋白，比該主波峰早被洗出之波峰表示與TNFR-Fc融合蛋白相關的低分子量產物，而比該主波峰晚洗出之波峰表示與該TNFR-Fc融合蛋白相關之凝集。計算凝集物相對於總波峰面積之波峰面積，以評估凝集之程度。且，主波峰表示該TNFR-Fc融合蛋白不含雜質之數量，及計算與評估其相對於總波峰面積之面積比。

氧化(M272)分析

為評估TNFR-Fc融合蛋白在氧化程度方面之穩定作用，用LC/MS系統進行胜肽圖譜之分析。使用甲酸與丙腈製備移動相緩衝液。在分析方面，使用C18管柱，及使用ESIQ-TOF質譜儀檢測波峰。

1.測試範例1：含琥珀酸鹽緩衝劑，不含穩定劑之TNFR-Fc融合蛋白溶液調配物之穩定性之評估。

(1)SE-HPLC分析法

以下表2示出不含穩定劑之琥珀酸鹽調配物(範例1至4、範例7與8)及含蔗糖與精胺酸之Amgen Inc.的Enbrel調配物(比較例1)的SE-HPLC高分子量組份(比主波峰早被洗出之凝集物)之量。

不含穩定劑之琥珀酸鹽調配物(範例1至4、範例7與8)之凝集物之數量為11.1%或更少，然而含蔗糖與精胺酸穩定劑之Enbrel調配物(比較例1)具14.1%之凝集物含量。

與含蔗糖與精胺酸穩定劑之Amgen Inc.的Enbrel調配物(比較例1)相比，不含穩定劑之琥珀酸鹽調配物(範例1至4、範例7與8)在凝集物形成方面，展現出優越的穩定作用。

因此，相較於含穩定劑之磷酸鹽調配物，不含穩定劑之琥珀酸鹽調配物表現出極佳的穩定性。

(2)HI-HPLC分析法

以下表3示出不含穩定劑之琥珀酸鹽調配物(範例1至4、範例7與8)及含蔗糖與精胺酸之Amgen Inc.之Enbrel調配物(比較例1)的高分子量組份(比主波峰晚洗出之凝集物)之量。

表3中之HI-HPLC結果與表2中之SE-HPLC 結果相似。不含穩定劑之琥珀酸鹽調配物(範例1至4、範例7與8)顯示23.3%或更低之凝集物含量，然而含穩定劑之Enbre1調配物(比較例1)顯示25.1%之凝集物含量。

因此，相較於含穩定劑之磷酸鹽調配物，不含穩定劑之琥珀酸鹽調配物顯示出極佳的穩定性。

2.測試範例2：含琥珀酸鹽緩衝劑之TNFR-Fc融合蛋白調配物之穩定性之評估

(1)琥珀酸鹽緩衝劑之高穩定性

1)HI-HPLC分析法

為了評估緩衝劑在穩定TNFR-Fc融合蛋白上之重要性，將琥珀酸鹽緩衝劑調配物(範例4)、磷酸鹽緩衝劑調配物(比較例1)、組胺酸緩衝劑調配物(比較例2)及檸檬酸鹽緩衝劑調配物(比較例3)貯存在40℃下12週，之後分析其等之HI-HPLC高分子量組份(比主波峰晚洗出之凝集物)的量。結果示於以下表4中。

從表4之結果可明顯的看出，就凝集物之形成而言，與磷酸鹽緩衝劑調配物(比較例1)及組胺酸緩衝劑調配物(比較例2)相比，琥珀酸鹽緩衝劑調配物(範例4)展現較優越的穩定作用。且，就凝集物之形成而言，與檸檬酸鹽緩衝劑調配物(比較例3)相比，琥珀酸鹽緩衝劑調配物 (範例4)顯示出相似的穩定作用。在TNFR-Fc融合蛋白調配物中，檸檬酸鹽緩衝劑調配物有引起疼痛之問題(US6150331 A、US 20110070231 A1)，因此含琥珀酸鹽之TNFR-Fc融合蛋白調配物是較佳的。

因此，與習知的TNFR-Fc融合蛋白調配物相比，含琥珀酸鹽之調配物係穩定，且與其它緩衝劑相比，展現出更優越或相似的穩定性。

2)氧化(M272)分析

為了根據緩衝劑種類比較氧化抑制作用，將含琥珀酸鹽緩衝劑調配物(範例4)、含磷酸鹽緩衝劑調配物(比較例1)、含組胺酸緩衝劑調配物(比較例2)及含檸檬酸鹽緩衝劑調配物(比較例3)貯存在40℃下12週，之後進行胜肽圖譜之分析。

從表5之結果可明顯看出，與含磷酸鹽、含組胺酸及含檸檬酸鹽之調配物(比較例1至3)相比，含琥珀酸鹽之調配物(範例4)展現出抑制氧化程度增加之作用。

因此，就抑制TNFR-Fc融合蛋白之氧化程度而言，與含磷酸鹽、組胺酸及檸檬酸緩衝劑相比，琥珀酸鹽顯示出較高的穩定作用。

3.測試範例3：根據琥珀酸鹽及氯化鈉濃度 評估穩定性

(1)SE-HPLC分析法

透過測試範例1及2，證明了含琥珀酸鹽調配物可使TNFR-Fc融合蛋白穩定。為了根據琥珀酸鹽濃度測試調配物之穩定作用，比較5mM琥珀酸鹽之調配物(範例1)、10mM琥珀酸鹽之調配物(範例4)及25mM琥珀酸鹽之調配物(範例2)。此外，為了根據NaCl濃度測試調配物之穩定作用，比較120mM NaCl之調配物(範例7)、140mM NaCl之調配物(範例4)及160mM NaCl之調配物(範例8)。將各別的調配物貯存在40℃下12週，之後透過SE-HPLC比較其等之穩定作用。

表6顯示TNFR-Fc融合蛋白(主波峰)不含雜質之數量。在含140mM NaCl與5mM、10mM及25mM各別濃度之琥珀酸鹽之範例1、4及2中，TNFR-Fc融合蛋白之數量與琥珀酸鹽濃度成比例增加。

且，在含10mM琥珀酸鹽與120mM、140mM及160mM分別濃度之氯化鈉之範例7、4及8中，TNFR-Fc融合蛋白之數量與氯化鈉濃度成比例增加。

因此，TNFR-Fc融合蛋白之穩定性隨著琥珀酸鹽含量之增加而進一步改善，且在存在25mM琥珀酸鹽時最出色。

且，TNFR-Fc融合蛋白之穩定性隨著氯化鈉含量之增加而進一步改善，及含120mM或更高濃度之氯化鈉的所有調配物均展現穩定作用。

再者，含25mM琥珀酸鹽與140mM或更高濃度之氯化鈉之調配物顯示出最佳的穩定作用。

(2)HI-HPLC分析法

HI-HPLC結果與以上測試範例3之SE-HPLC結果相似。

表7顯示TNFR-Fc融合蛋白不含雜質之數量。在含140mM NaCl與5mM、10mM及25mM各別濃度之琥珀酸鹽之範例1、4及2中，TNFR-Fc融合蛋白之數量與琥珀酸鹽濃度成比例增加。且，在含10mM琥珀酸鹽與120mM、140mM及160mM各別濃度之氯化鈉之範例7、4及8中，TNFR-Fc融合蛋白之數量與氯化鈉濃度成比例增加。

再者，從測試範例3之結果明顯看出，含25mM琥珀酸鹽與140mM或更高濃度之氯化鈉之調配物顯示出最佳的穩定作用。

4.測試範例4：根據氯化鈉濃度評估滲透壓

為了根據氯化鈉濃度評估TNFR-Fc融合蛋白之穩定性及滲透壓，對範例7、4及8進行SE-HPLC分析及滲透壓測量。將各別的調配物貯存在40℃下12週，之後進行SE-HPLC，然後比較其等之穩定作用。使用Wescor Vapro 5520蒸氣壓力滲透計測量滲透壓。結果示於以下表8中。

表8顯示根據氯化鈉濃度之TNFR-Fc融合蛋白(主波峰)不含雜質之滲透壓及數量之結果。如測試範例4所示，在含10mM琥珀酸鹽與120mM、140mM及160mM各別濃度之氯化鈉之範例7、4及8中，TNFR-Fc融合蛋白之數量與氯化鈉濃度成比例增加。此外，其滲透壓與氯化鈉濃度成比例增加。

在此技術領域中，作為人體內注射劑之藥學調配物通常以滲透壓250mOsm至350mOsm之範圍投與，此與體內之滲透壓相似。在人體內投與具有滲透壓落在以上範圍外之藥學調配物時，會發生疼痛。因此，根據測試範例4之結果，含120至160mM氯化鈉之調配物展現極佳的穩定作用以及滲透作用。

5.測試範例5：根據含琥珀酸鹽緩衝劑之TNFR-Fc融合蛋白調配物之pH評估穩定性

(1)SE-HPLC分析法

為了根據pH評估含琥珀酸鹽之液態調配物之穩定作用，將各含10mM琥珀酸鹽及140mM NaCl之pH 5.5調配物(範例5)、pH 6調配物(範例4)及pH 6.5調配物(範例6)貯存在40℃下12週，然後進行SE-HPLC處理。

從顯示透過SE-HPLC獲得的TNFR-Fc融合蛋白不含雜質之數量之表9中可明顯看到，在pH 6.0下產生較優越的穩定作用。

(2)HI-HPLC分析法

如以上範例5之SE-HPLC結果，在HI-HPLC中展現出相似的結果。

從顯示透過HI-HPLC所獲得的TNFR-Fc融合蛋白不含雜質之數量之表10中可明顯看到，在pH 6.0下產生較優越的穩定作用。

<110> 賽特瑞恩股份有限公司<120> 穩定的藥學配方<130> CPO2017050TW<150> KR 10-2016-0142184<151> 2016-10-28<160> 2<170> KoPatentIn 3.0<210> 1<211> 467<212> PRT<213> 人工序列<220><223> TNFR-Fc<400> 1Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser 1 5 10 15 Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys 20 25 30 Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr 35 40 45 Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu 50 55 60 Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser 65 70 75 80 Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys 85 90 95 Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys 100 105 110 Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala 115 120 125 Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro 130 135 140 Gly Thr Phe Ser Asp Thr Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His145 150 155 160 Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly Asp Ala Ser Met Asp Ala 165 170 175 Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val 180 185 190 His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr 195 200 205 Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly 210 215 220 Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly Asp Glu Pro Lys Ser Cys225 230 235 240 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 245 250 255 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 260 265 270 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 275 280 285 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 290 295 300 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asp Ser Thr Tyr305 310 315 320 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 325 330 335 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 340 345 350 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 355 360 365 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 370 375 380 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu385 390 395 400 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 405 410 415 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 420 425 430 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 435 440 445 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 450 455 460 Pro Gly Lys465 <210> 2<211> 235<212> PRT<213> 人工序列<220><223> TNFR-Fc_TNF-�結合結構域<400> 2Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser 1 5 10 15 Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys 20 25 30 Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr 35 40 45 Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu 50 55 60 Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser 65 70 75 80 Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys 85 90 95 Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys 100 105 110 Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala 115 120 125 Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro 130 135 140 Gly Thr Phe Ser Asp Thr Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His145 150 155 160 Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly Asp Ala Ser Met Asp Ala 165 170 175 Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val 180 185 190 His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr 195 200 205 Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly 210 215 220 Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly Asp225 230 2352

(無)

Claims

一種穩定藥學調配物，其包含一融合蛋白及一琥珀酸鹽緩衝劑，不含作為一穩定劑的胺基酸、銨鹽、醣或其等之混合物；其中在該融合蛋白內一人類p75腫瘤壞死因子受體之一細胞外配體結合結構域係被融合至一人類IgG之Fc結構域，其中該醣為多醣類、蔗糖、麥芽糖、海藻糖及其等之混合物。
如請求項1之穩定藥學調配物，其中該融合蛋白包含序列辨識編號：1之胺基酸序列。
如請求項1之穩定藥學調配物，其中該融合蛋白包含序列辨識編號：2之胺基酸序列。
如請求項1至3中任一項之穩定藥學調配物，其中該融合蛋白係以1至100mg/mL的一濃度被包含。
如請求項1至3中任一項之穩定藥學調配物，其中該琥珀酸鹽緩衝劑包含濃度為1至200mM的一琥珀酸鹽。
如請求項1至3中任一項之穩定藥學調配物，其進一步包含一等張劑。
如請求項6之穩定藥學調配物，其中該等張劑係濃度為1至1000mM之氯化鈉。
如請求項1至3中任一項之穩定藥學調配物，其中該穩定藥學調配物具有範圍為從5.5至6.5的一pH。
如請求項1至3中任一項之穩定藥學調配物，其中該銨鹽為氯化銨、硫酸銨、碳酸銨、硝酸銨或其等之混合物。
如請求項1至3中任一項之穩定藥學調配物，其中該胺基酸為精胺酸、甲硫胺酸、離胺酸、組胺酸、甘胺酸、脯胺酸、丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸、天冬醯胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸或其等之混合物。
如請求項1至3中任一項之穩定藥學調配物，其中在40℃±2℃下貯存12週後，使用粒徑篩析高效液相層析法(SE-HPLC)所測得之高分子量組份含量為12%或更少。
如請求項1至3中任一項之穩定藥學調配物，其中在40℃±2℃下貯存12週後，使用疏水交互作用高效液相層析法(HI-HPLC)所測得之高分子量組份含量為24%或更少。