KR20180046888A - 안정한 약제학적 제제 - Google Patents

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KR20180046888A
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한원용
김수정
오준석
김소영
김광우
신연경
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(주)셀트리온
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Abstract

본 발명에 따른 안정한 약제학적 제제는 인간 p75 종양괴사인자 수용체의 세포외 리간드 결합부가 인간 IgG의 Fc 도메인에 융합된 융합 단백질 및 숙신산염 완충제를 포함하고, 안정화제를 포함하지 않은 안정한 약제학적 제제이다. 본 발명에 따른 안정한 약제학적 제제는 TNFR-Fc 융합 단백질 제제를 장기간 보관 가능하게 하고, 보관 조건을 까다롭게 유지하지 않아도 되는 우수한 저장 안정성을 제공한다. 본 발명은 안정화제를 포함하지 않는 간단한 제제로 다른 안정화 포함 제제에 비해 경제적이다.

Description

안정한 약제학적 제제{Stable Pharmaceutical Formulation}
본 발명은 안정한 약제학적 제제에 관한 것이다.
인간 p75 종양괴사인자 수용체(TNFR)의 세포외 리간드 결합부를 인간 IgG1의 Fc 도메인에 융합하여 제조된 TNFR-Fc 융합 단백질은 에타너셉트를 포함한다. 에타너셉트는 467개의 아미노산으로 이루어지고, 약 150 kDa의 겉보기 분자량을 갖는다. 이는 2002년에 암젠 사에 의해 엔브렐이라는 상품명으로 출시되었다. 에타너셉트는 TNF-α 저해제로 류마티스 관절염, 건선, 강직성 척추염 등에 사용되고 있으며, 혈관염, 알츠하이머병 및 크론병에 적용하기 위한 임상 연구가 진행 중에 있다
일반적으로, 항체 의약품은 단백질 의약품과 마찬가지로 유효성분의 반감기가 무척 짧으며 적당하지 않은 온도, 전단 응력(Shear stress), 진동, 냉해동(Freeze-thawing), UV 노출, 과도한 pH 변화, 유기용매 및 미생물에 의한 오염 등에 의해 화학적 및 물리적으로 변성이 쉽게 일어난다. 화학적 변성으로는 이합체의 해리, 산화, 탈아미드화, 이성화 및 다량체화 등이 포함되고, 이들은 항체의 아미노산 조성과 항체를 포함하는 용매의 상태(염, pH 및 온도)에 영향을 받는다. 물리적 변성으로는 3차 구조의 손실, 단량체의 공유/비공유적 응집, 흡착 등이 포함되고, 이들은 용매 등과 같은 항체를 포함하고 있는 주변 환경에 의해 변하게 되는 단백질 표면에 있는 소수성 부분(Hydrophobic patchs), 전하 분포(Charge distribution)와 같은 단백질의 복잡한 구조와 열 안정성에 영향을 받는다.
항체를 비롯한 단백질의 물리적 또는 화학적 변성은 생리활성 효과를 소실시키며, 이러한 변성은 비가역적이기 때문에, 일단 변성된 항체는 원래의 특성을 거의 회복할 수 없어 치료학적 효능이 떨어지게 된다. 또한, 단량체의 응집과 같은 현상은 면역 반응을 일으킨다는 보고가 꾸준히 제기되고 있어 이러한 응집을 포함하지 않고, 생리학적 유효량을 가지는 제형에 관한 연구가 많이 진행되고 있다(Ishikawa et al., Biol. Pharm. Bull., 33(8): 1413-1417, 2010).
따라서, 항체 의약품의 변성을 방지하기 위하여 여러 방법들이 연구되어 왔으며, 부형제를 첨가하거나 pH 또는 완충액 조성을 조절하는 방법이 시도된 예가 있다. 항체 단백질의 소수성 그룹이 분자의 표면으로 노출되어 소수성 그룹끼리 결합을 함으로써 발생하는 경우, 응집을 방지하는 부형제로는 노출된 소수성 그룹을 안정화할 수 있는 방법이 활용된다. 예를 들면, 아르기닌, 라이신, 프롤린, 히스티딘, 글라이신 등과 같은 아미노산(US4362661A, US7648702), 폴리소르베이트 기반 계면활성제, 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜(PEG)이나 폴리비닐피롤리돈(PVP)과 같은 양친매성 고분자, 덱스트란과 같은 다당체, 수크로오스, 말토즈, 트레할로즈 등의 단당 또는 이당류(US5945098A)가 사용된 예가 있다.
이와 같이 단백질 의약품의 안정화 제제를 제조하기 위하여 여러 안정화제가 연구되어 왔으나, 유효 성분 각각의 물리화학적 특성에 따라 적절한 안정화제가 필요하다. 다만, 안정화제의 농도 조절에 실패할 경우 안정화제와 약물 상호간 부작용으로 약물이 목적하는 바와 다른 역효과를 가져오는 등 어려움이 있다. 또한, 안정화제로써 아미노산을 첨가하는 경우 열에 의한 변성에 취약한 문제가 있다. 일반적으로 특정한 당류는 저장 과정 중에 분해되면서 불순물을 유발하거나 환원당을 생성하게 될 경우 당화반응(Glycation)이 발생하면서 단백질의 안정성에 악영향을 미칠 수 있다. 계면활성제의 경우 저장 중 외부 환경에 의해 분해되면 과산화물을 생성하여 단백질을 산화시키는 요인으로 작용할 수 있다(Kamerzell, Tim. J., et al. Advanced drug delivery reviews 63.13 (2011): 1118-1159.).
미국 등록특허 제7,648,702호는 에타너셉트 및 L-아르기닌을 10mM 내지 200mM 포함하는 약학 조성물을 개시한다. 그러나, 이 약학 조성물의 경우, 포함된 인산염 완충액은 응집물 형성 측면에서 안정화 효과가 미비하고, 수크로즈는 고분자 불순물 생성을 촉진하여 단백질 안정성에 악영향을 미칠 수 있다.
한국 등록특허공보 제10-1482304호는 에타너셉트 및 메티오닌, 라이신, 히스티딘, 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 안정화제를 0.1 내지 250mM의 양으로 포함하는 에타너셉트의 용액 제형을 개시한다. 그러나, 이 에타너셉트 제형에 포함된 인산염 완충액은 안정성 효과가 미비하고, 안정화제로 포함된 히스티딘은 오히려 고분자 불순물을 형성하여 단백질 안정성에 문제를 발생 시킬 수 있다.
한국 등록특허공보 제10-1419884호는 에타너셉트와 암모늄염 및 숙신산염을 함유하는 관절염 치료용 조성물을 개시한다. 그러나, 이 에타너셉트 함유 조성물의 경우, 암모늄염 중 황산암모늄을 제외한 염화암모늄, 탄산암모늄, 질산암모늄은 미국 식약처에서 허가하고 있는 주사제의 부형제로서 등록이 되어있지 않은 바 안전성 측면에서 잠재적 문제를 발생 시킬 수 있다.
한국 공개특허공보 제2014-0027274호는 에타너셉트, 시트레이트 완충제, 및 리신 및 프롤린 및 그의 제약상 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 포함하며, 여기서 시트레이트 완충제가 25mM 내지 120mM의 농도를 갖고, 아미노산이 15mM 내지 100mM의 농도를 갖는 제약 조성물을 개시한다. 그러나, 이 에타너셉트 제형에 포함된 시트레이트를 완충액으로 사용할 경우, 단백질 산화 억제 효과가 미비하고, 체내 투여 시 통증을 유발할 수 있다는 문제점이 있다.
이에 본 발명자들은 안정화제 없이 TNFR-Fc 융합 단백질의 활성을 안정하게 유지할 수 있는 약제학적 제제에 대해 연구한 결과, 숙신산염 완충액을 포함하는 제제가 안정화제를 포함하지 않고도 TNFR-Fc 융합 단백질의 안정화에 현저한 효과가 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 TNFR-Fc 융합 단백질 및 숙신산염 완충제를 포함하고, 안정화제를 포함하지 않은 안정한 약제학적 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 TNFR-Fc 융합 단백질, 숙신산염 완충제 및 등장화제를 특정 농도로 포함하고, 안정화제를 포함하지 않은 안정한 약제학적 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 TNFR-Fc 융합 단백질, 숙신산염 완충제 및 등장화제를 특정 농도로 포함하고, 안정화제를 포함하지 않은 안정한 피하 투여용 약제학적 제제를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 안정한 약제학적 제제는 인간 p75 종양괴사인자 수용체의 세포외 리간드 결합부가 인간 IgG의 Fc 도메인에 융합된 융합 단백질 및 숙신산염 완충제를 포함하고, 안정화제를 포함하지 않는다.
본 발명의 안정한 약제학적 제제는 인간 p75 종양괴사인자 수용체의 세포외 리간드 결합부가 인간 IgG의 Fc 도메인에 융합된 융합 단백질 및 숙신산염 완충제를 포함하고, 아미노산, 암모늄염, 당 또는 이의 혼합물인 안정화제를 포함하지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 융합 단백질은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 융합 단백질은 서열 번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 융합 단백질은 1 내지 100mg/mL 농도로 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 숙신산염 완충제는 1 내지 200mM 농도의 숙신산염을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 안정한 약제학적 제제는 등장화제가 추가로 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 등장화제는 1 내지 1000mM 농도의 염화나트륨일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 안정한 약제학적 제제의 pH 범위는 5.5 내지 6.5일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 암모늄염은 염화암모늄, 황산암모늄, 탄산암모늄, 질산암모늄 또는 이의 혼합물인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 아미노산은 아르기닌, 메티오닌, 라이신, 히스티딘, 글라이신, 프롤린, 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 시스테인, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 아스파라긴, 트레오닌, 글루타민 또는 이의 혼합물인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 당은 수크로즈인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 안정한 약제학적 제제는 온도 40±2℃에서 12주 동안 보관한 후 SE-HPLC로 측정한 고분자량 성분의 함량이 12% 이하일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 안정한 약제학적 제제는 온도 40±2℃에서 12주 동안 보관한 후 HI-HPLC로 측정한 고분자량 성분의 함량이 24% 이하일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 안정한 약제학적 제제는 서열 번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 1 내지 100mg/mL 농도의 융합 단백질, 1 내지 200mM 농도의 숙신산염 완충액, 및 1 내지 1000mM 농도의 염화나트륨을 포함하고, 안정화제를 포함하지 않는, 숙신산염 완충액 및 염화나트륨의 농도가 제제의 삼투압 200 내지 400mOsm 범위 내에서 조절되는 것을 특징으로 하는 제제일 수 있다.
본 발명의 안정한 약제학적 제제는 서열 번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 45 내지 55mg/mL 농도의 융합 단백질, 5 내지 45mM 농도의 숙신산염 완충액, 및 100mM 농도 이상의 염화나트륨을 포함하고, 안정화제를 포함하지 않은 제제일 수 있다.
본 발명에 따른 안정화제를 포함하지 않는 안정한 약제학적 제제는 TNFR-Fc 융합 단백질 제제를 장기간 보관 가능하게 하고, 보관 조건을 까다롭게 유지하지 않아도 되는 우수한 저장 안정성을 제공한다. 본 발명은 안정화제를 포함하지 않는 간단한 제제로 다른 안정화 포함 제제에 비해 경제적이다.
[안정한 약제학적 제제]
본 발명에 따른 안정한 약제학적 제제는 인간 p75 종양괴사인자 수용체의 세포외 리간드 결합부가 인간 IgG의 Fc 도메인에 융합된 융합 단백질 및 숙신산염 완충제를 포함하고, 안정화제를 포함하지 않는다.
본 발명에 따른 안정한 약제학적 제제는 인간 p75 종양괴사인자 수용체의 세포외 리간드 결합부가 인간 IgG의 Fc 도메인에 융합된 융합 단백질 및 숙신산염 완충제를 포함하고, 아미노산, 암모늄염, 당 또는 이의 혼합물인 안정화제를 포함하지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 안정한 약제학적 제제는 항체의 활성, 제제의 안정성 및 저점도에 악영향을 실질적으로 미치지 않는 범위 내에서 당해 기술분야에서 공지된 첨가제를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 수성 담체, 산화방지제, 또는 이들 중 2 이상의 혼합물을 더 포함할 수 있다. 수성 담체는 제약상 허용되고(인간에게 투여시 안전하고 무독성이고), 약제학적 제제의 제조에 유용한 담체이다. 수성 담체의 예로는 멸균 주사용수(SWFI), 정균성 주사용수(BWFI), 멸균 염수 용액, 링거 용액, 덱스트로스 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다. 산화방지제는 아스코르브산 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 명세서에서 용어 "포함하지 않은"은 해당 성분을 전혀 포함하지 않는 것을 의미한다. 또한, 해당 용어는 해당 성분을 실질적으로 포함하지 않는 것, 즉 항체의 활성, 약제학적 제제의 안정성에 영향을 주지 않는 범위로 포함하는 것, 예를 들어 약제학적 제제의 전체 중량을 기준으로 0 내지 1 %(w/v), 0 내지 1 ppm(w/v) 또는 0 내지 1 ppb(w/v)로 포함하는 것을 의미한다.
(A) 융합 단백질
인간 p75 종양괴사인자 수용체의 세포외 리간드 결합부가 인간 IgG의 Fc 도메인에 융합된 융합 단백질은 본 발명의 일 구현예에서, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 융합 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열에서 아미노산 치환, 제거 또는 삽입 등에 의해 변이된 융합 단백질 또는 에타너셉트와 유사한 활성을 나타내는 펩타이드 유사체일 수 있다.
본 발명에서 융합 단백질의 농도는 본 발명에 따른 안정한 약제학적 제제의 안정성에 악영향을 실질적으로 미치지 않는 범위 내에서 자유롭게 조절할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, TNFR-Fc 융합 단백질의 농도는 1mg/mL 이상이다. 본 발명의 다른 구현예에서, TNFR-Fc 융합 단백질의 농도는 1 내지 100mg/mL일 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현에에서, TNFR-Fc 융합 단백질의 농도는 20 내지 80mg/mL일 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, TNFR-Fc 융합 단백질의 농도가 40 내지 60mg/mL일 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, TNFR-Fc 융합 단백질의 농도가 50mg/mL일 수 있다. TNFR-Fc 융합 단백질의 농도가 이 범위 내인 경우, 융합 단백질의 함량에 따라 투여 용량 및 투여 주기의 자유도를 높일 수 있고, 장기간 안정성을 우수하게 나타낼 수 있다.
한편, 본 발명에서 제공하는 안정한 약제학적 제제는 인플릭시맙(Infliximab), 트라스트주맙(Trastuzumab) 또는 에쿨리주맙(Eculizumab)과 같은 '항체' 보다 '융합 단백질'에서 우수한 안정화 효과를 보인다.
(B) 숙신산염 완충액
숙신산염 완충액의 예로는 숙신산나트륨, 숙신산아연, 숙신산알루미늄, 숙신산칼륨 등이 있으며 이에 제한되지 않는다. 숙신산염 완충액은 상기 숙신산염과 숙신산을 혼합하여 제조할 수 있다.
발명의 일 구현예에서, 숙신산염 완충액은 숙신산나트륨을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 숙신산염 완충액 내의 숙신산염의 함량은 본 발명에 따른 약제학적 제제의 안정성에 악영향을 실질적으로 미치지 않는 범위 내에서 자유롭게 조절할 수 있다. 예를 들어, 숙신산염 완충액 내 숙신산염의 함량은 1 내지 200mM일 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 숙신산염의 함량은 3 내지 100mM일 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 숙신산염의 함량은 5 내지 45mM일 수 있다. 본 발명이 또 다른 구현예에서, 숙신산염은 15 내지 35mM일 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 숙신산염은 5 내지 24mM일 수 있다. 숙신산염의 함량이 이 범위 내인 경우, 장기간 안정성이 우수하게 나타날 수 있다. 숙신산염의 함량이 1mM 보다 낮을 경우, 버퍼로써의 작용이 원활하지 않을 수 있고, 200mM 보다 높을 경우, 점도가 증가되어 제제로 사용되기에 효과적이지 않을 수 있다.
한편, 상기 숙신산염의 함량은 1개의 용기 내에 보관된 제제 내의 숙신산염의 함량으로써, 분배 또는 복수회의 투여를 목적으로 하는 용기의 경우 해당 분배수 또는 해당 투여수에 따라 숙신산염의 함량이 수배 증가할 수 있다. 반대로 소형 용기의 경우 이에 맞춰 숙신산염의 함량이 감소할 수 있다.
(C) 안정화제
본 발명에 따른 안정한 약제학적 제제는 안정화제를 포함하지 않으며, 포함되지 않는 안정화제는 본 발명의 일 구현예에서 아미노산, 암모늄염, 당 또는 이의 혼합물일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 포함되지 않는 암모늄염은 염화암모늄, 황산암모늄, 탄산암모늄, 질산암모늄 또는 이의 혼합물일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 황산암모늄을 제외한 암모늄염의 경우, 미국 FDA가 인체투여목적으로 승인한 의약품의 부형제 데이터 베이스 IID (Inactive Ingredient Database) 에 등록되어 있지 않아 인체에 투여하기 위한 주사제로 사용하기 부적합하다(www.fda.gov).
본 발명의 일 구현예에서, 포함되지 않는 아미노산은 아르기닌, 메티오닌, 라이신, 히스티딘, 글라이신, 프롤린, 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 시스테인, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 아스파라긴, 트레오닌, 글루타민 또는 이의 혼합물일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 포함되지 않는 당은 수크로즈일 수 있으며 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 포함되지 않는 안정화제는 계면활성제일 수 있으며, 상기 계면활성제는 폴리솔베이트 20, 폴리솔베이트 80, 폴록사머로 또는 이의 혼합물일 수 있으며 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 포함되지 않는 안정화제는 고분자일 수 있으며, 상기 고분자는 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 카르복실메틸셀룰로스, 히아루론산, 사이클로덱스트린 또는 이의 혼합물일 수 있으며 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 포함되지 않는 안정화제는 당일 수 있으며, 상기 당은 덱스트란과 같은 다당체, 수크로오스, 말토즈, 트레할로즈 또는 이의 혼합물일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
(D) 등장화제
본 발명에 따른 안정한 약제학적 제제는 등장화제를 포함할 수 있으며, 등장화제의 예로는 염화나트륨, 염화칼륨, 붕산, 붕산나트륨, 또는 이의 혼합물일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서 등장화제는 1종 단독으로 사용되거나 2종 이상을 임의로 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에서 등장화제는 제제의 삼투압을 200 내지 400mOsm으로 유지하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서 등장화제는 염화나트륨일 수 있다. 등장화제의 함량은 본 발명에 따른 약제학적 제제의 안정성에 악영향을 실질적으로 미치지 않는 범위 내에서 자유롭게 조절할 수 있다. 등장화제의 함량은 1 내지 1000mM이다. 본 발명의 다른 구현예에서 등장화제의 함량은 50 내지 800mM 일 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에서,등장화제의 함량은 80 내지 700mM일 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 등장화제의 함량은 90 내지 600mM일 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 등장화제의 함량은 100 내지 500mM일 수 있다. 본 발명의 또다른 구현예에서, 등장화제의 함량은 110 내지 400mM일 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 등장화제의 함량은 115 내지 300mM일 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 등장화제의 함량은 120 내지 200mM일 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 등장화제의 함량은 120 내지 180mM일 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 등장화제의 함량은 120 내지 160mM일 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 등장화제의 함량은 130 내지 150mM일 수 있다.
(E) pH
본 발명에 따른 약제학적 제제는 pH가 5.5 내지 6.5가 되도록 조절할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서 약제학적 제제는 pH가 5.7 내지 6.3이다. 본 발명의 일 구현예에서 약제학적 제제는 pH가 6.0 내지 6.5이다. 본 발명의 일 구현예에서 약제학적 제제는 pH가 5.5 내지 6.0이다 본 발명의 다른 구현예에서 약제학적 제제는 pH가 6.0이 되도록 조절할 수 있다. pH가 5.5 이하가 되거나 6.5 이상이 되면 융합 단백질의 응집이 증가하므로, 상기 범위 내에서 이루어지는 것이 바람직하다.
(F) "안정한" 약제학적 제제
본 발명의 "안정한" 약제학적 제제에서 용어 "안정한"은 본 발명에 따른 융합 단백질이 제조 공정 동안 및/또는 보관/저장 시에 이의 물리적 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 실질적으로 보유하는 것을 의미한다. 융합 단백질의 안정성을 측정하는 다양한 분석학적 기술은 당해 기술분야에서 용이하게 이용할 수 있다.
물리적 안정성은 당해 기술분야에 공지된 방법으로 평가할 수 있으며, 이러한 방법은 광(흡광 또는 광학 밀도)의 샘플 겉보기 감쇠 측정을 포함한다.
이러한 광 감쇠 측정은 제제의 탁도와 관련된다. 또한, 물리적 안정성에 대해 고분자량 성분 함량, 저분자량 성분 함량, 온전한 단백질량, 불용성 이물 입자 수 등을 측정할 수 있다.
본 발명에서 용어 "고분자량 성분"은 메인 피크(온전한 융합 단백질)를 기준으로 체류 시간(Retention time)이 앞쪽인 피크를 지칭한다. 전형적으로, 고분자량 성분은 치료학적 단량체 형태의 TNFR-Fc 융합 단백질 보다 큰 분자량을 갖는 복합체로, 이들은 약 150 kDa을 초과하는 분자량을 가질 것이다.
본 발명에서 용어 "저분자량 성분"은 메인 피크(온전한 융합 단백질)를 기준으로 체류 시간(Retention time)이 뒤쪽인 피크를 지칭한다. 전형적으로, 저분자 생성물은 치료학적 TNFR-Fc 융합 단백질 보다 적은 분자량을 갖는 복합체로, 이들은 약 150 kDa 미만의 분자량을 가질 것이다.
화학적 안정성은, 예를 들어, 화학적으로 변화된 형태의 항체를 검출하고 정량함으로써 평가할 수 있다. 화학적 안정성은, 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피에 의해 평가될 수 있는 하전 변화(예: 탈아미드화 또는 산화의 결과로서 발생)를 포함한다. 화학적 안정성에 대해 전하 변형체(산성 또는 염기성 피크) 등을 측정할 수 있다.
생물학적 활성은 당해 기술분야에 공지된 방법으로 평가할 수 있으며, 예를 들어, ELISA를 통해 항원 결합 친화도를 측정할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 약제학적 제제는 장기간 동안 안정할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 용어 "안정한" 약제학적 제제는 다음 중 하나 이상을 만족하는 약제학적 제제를 의미한다.
주성분 함량(메인 피크)
-온도 40±2℃에서 12주 동안 보관한 후 SE-HPLC로 측정한 주성분이 65% 내지 100% 인 안정한 약제학적 제제.
-온도 40±2℃, 상대습도 75±5%, 및 밀폐 조건에서 12주 동안 보관한 후 SE-HPLC로 측정한 주성분이 65% 내지 100% 인 안정한 약제학적 제제.
-온도 40±2℃에서 12주 동안 보관한 후 HI-HPLC로 측정한 주성분이 64% 내지 100% 인 안정한 약제학적 제제.
-온도 40±2℃, 상대습도 75±5%, 및 밀폐 조건에서 12주 동안 보관한 후 HI-HPLC로 측정한 주성분이 64% 내지 100% 인 안정한 약제학적 제제.
고분자량 성분
-온도 40±2℃에서 12주 동안 보관한 후 SE-HPLC로 측정한 고분자량 성분의 함량이 12% 이하인 안정한 약제학적 제제.
-온도 40±2℃, 상대습도 75±5%, 및 밀폐 조건에서 12주 동안 보관한 후 SE-HPLC로 측정한 고분자량 성분의 함량이 12% 이하인 안정한 약제학적 제제.
-온도 40±2℃에서 12주 동안 보관한 후 HI-HPLC로 측정한 고분자량 성분의 함량이 24% 이하인 안정한 약제학적 제제.
-온도, 상대습도 75±5%, 및 밀폐 조건에서 12주 동안 보관한 후 HI-HPLC로 측정한 고분자량 성분의 함량이 24% 이하인 안정한 약제학적 제제.
산화율
-온도 40±2℃에서 12주 동안 보관한 후 LS-MS로 측정한 중쇄 Met 272의 산화율이 3.0% 미만인 약제학적 제제.
-온도 40±2℃ 상대습도 75±5%, 및 밀폐 조건에서 LS-MS로 측정한 중쇄 Met 272의 산화율이 3.0% 미만인 약제학적 제제.
[안정한 약제학적 제제의 제조방법]
본 발명의 안정한 약제학적 제제는 공지된 방법을 이용하여 제조할 수 있으며, 특정 방법으로 제한되지 않는다. 예를 들어, TNFR-Fc 융합 단백질을 안정화제가 포함되지 않은 숙신산염 완충액 및 등장화제를 포함하는 용액과 혼합하는 단계를 통하여 제조할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 제조된 약제학적 제제는 멸균 등의 처리 후 바로 밀폐 용기에 담을 수 있다.
[안정한 약제학적 제제의 사용방법]
본 발명에 따른 안정한 약제학적 제제는 TNF-α의 활성이 유해한 질병을 치료하는데 사용될 수 있다. TNF-α의 활성이 유해한 질병의 예로는 패혈증, 자가면역 질환, 감염성 질환, 이식, 악성 암, 폐 장애, 장 장애, 심장 장애 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 안정한 약제학적 제제는 에타너셉트가 치료할 수 있는 질병의 치료제로 사용될 수 있다. 에타너셉트는 체내에서 TNF-α와 관계된 면역반응을 억제하는 역할을 하는 생물학적 염증 조절제로 작용할 수 있으므로, 본 발명의 제형은 류마티스 관절염, 건선, 강직성 척추염, 혈관염, 알츠하이머병 또는 크론병 등에 사용될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 안정한 약제학적 제제는 경구 투여, 또는 피하, 근육내, 복강내, 흉골내, 경피, 및 정맥내 주사 및 주입을 포함하는 비경구 투여에 의해 체내에 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 본 발명의 안정한 약제학적 제제는 주사제로 투여되는 것일 수 있다.
상기 약제학적 제제의 투여량 및 투여시기는 질병의 종류, 질병의 중증도 및 경과상태, 환자의 건강 및 치료에 대한 반응, 및 치료하는 의사의 판단에 따라 달라질 수 있으며, 특정 투여량 및 투여시기로 제한되지 않는다. 예를 들어, 1주 2회 25mg씩 투여, 주 당 50mg의 용량으로 투여, 1주 2회 50mg씩 투여를 12주(또는 3개월)간 지속한 뒤 1주 2회 25mg 또는 주 당 50mg으로 투여, 1주 2회 0.4mg/kg 용량(1회 최대 투여용량 25mg을 넘지 않도록 함), 또는 1주 1회 0.8mg/kg 용량(1회 최대 투여용량 50mg을 넘지 않도록 함)으로 투여될 수 있다.
[치료 방법 및 안정화 방법]
본 발명은 또한 TNF-α의 활성이 유해한 질병을 갖는 환자에게 인간 p75 종양괴사인자 수용체의 세포외 리간드 결합부가 인간 IgG의 Fc 도메인에 융합된 융합 단백질 및 숙신산염 완충제를 포함하고, 안정화제를 포함하지 않은 안정한 약제학적 제제를 투여하는 것을 포함하는 TNF-α의 활성이 유해한 질병을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 인간 p75 종양괴사인자 수용체의 세포외 리간드 결합부가 인간 IgG의 Fc 도메인에 융합된 융합 단백질 및 숙신산염 완충제를 포함하고, 아미노산, 암모늄염, 당 또는 이의 혼합물인 안정화제를 포함하지 않은 안정한 약제학적 제제를 제공한다.
본 발명은 또한 인간 p75 종양괴사인자 수용체의 세포외 리간드 결합부가 인간 IgG의 Fc 도메인에 융합된 융합 단백질 및 숙신산염 완충제를 포함하고, 안정화제를 포함하지 않은 안정한 약제학적 제제를 제조하는 것을 포함하는 융합 단백질을 약제학적 제제 내에서 안정화하는 방법을 제공한다.
상기 치료방법 또는 안정화 방법의 일 구현예에서, 융합 단백질은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 치료방법 또는 안정화 방법의 일 구현예에서, 융합 단백질은 서열 번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 치료방법 또는 안정화 방법의 일 구현예에서, 융합 단백질의 농도는 1 내지 100mg/mL일 수 있다
상기 치료방법 또는 안정화 방법의 일 구현예에서, 숙신산염 완충제는 1 내지 200mM 농도의 숙신산염을 포함할 수 있다.
상기 치료방법 또는 안정화 방법의 일 구현예에서, 상기 약제학적 제제는 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 치료방법 또는 안정화 방법의 일 구현예에서, 등장화제는 1 내지 1000mM 농도의 염화나트륨일 수 있다.
상기 치료방법 또는 안정화 방법의 일 구현예에서, 상기 약제학적 제제의 pH 범위가 5.5 내지 6.5일 수 있다.
상기 치료방법 또는 안정화 방법의 일 구현예에서, 안정화제는 아미노산, 암모늄염, 당 또는 이의 혼합물인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 치료방법 또는 안정화 방법의 일 구현예에서, 암모늄염은 염화암모늄, 황산암모늄, 탄산암모늄, 질산암모늄 또는 이의 혼합물인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 치료방법 또는 안정화 방법의 일 구현예에서, 아미노산은 아르기닌, 메티오닌, 라이신, 히스티딘, 글라이신, 프롤린, 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 시스테인, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 아스파라긴, 트레오닌, 글루타민 또는 이의 혼합물인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 치료방법 또는 안정화 방법의 일 구현예에서, 당은 수크로즈인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 치료방법 또는 안정화 방법의 일 구현예에서, 상기 약제학적 제제는 온도 40±2℃에서 12주 동안 보관한 후 SE-HPLC로 측정한 고분자량 성분의 함량이 12% 이하일 수 있다.
상기 치료방법 또는 안정화 방법의 일 구현예에서, 상기 약제학적 제제는 온도 40±2℃에서 12주 동안 보관한 후 HI-HPLC로 측정한 고분자량 성분의 함량이 24% 이하일 수 있다.
[제품]
본 발명은 또한 상기 안정한 약제학적 제제; 및 상기 안정한 약제학적 제제를 밀폐된 상태로 수용하는 용기를 포함하는 제품을 제공한다.
상기 안정한 약제학적 제제는 상술한 바와 같다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 용기는 유리, 폴리머(플라스틱), 금속 등의 물질로부터 형성될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 용기는 병, 바이알, 주사기, 또는 튜브이며, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 용기는 유리 또는 폴리머 바이알, 또는 유리 또는 폴리머 프리필드시린지일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 용기의 내부에 실리콘 오일이 코팅되어 있지 않을 수 있다. 실리콘 오일이 코팅되어 있는 경우 안정성이 저하될 수 있다. 상기 용기는 1회 투여용 또는 수회 투여용 용기일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 제품은 상기 안정한 약제학적 제제의 사용방법, 보관방법 또는 이들 모두를 제공하는 지시사항을 더 포함할 수 있다. 상기 사용방법은 TNF-α의 활성이 유해한 질병의 치료법을 포함하고, 투여경로, 투여량 및 투여시기를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 제품은 상업적 및 사용자 관점에서 필요한 기타 도구, 예를 들어 바늘, 주사기, 자동-주사기(Auto-Injector) 등을 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[실험 대상 제형의 제조]
TNFR-Fc 융합 단백질에 최적화된 안정화 제형의 제조 및 확인을 위하여, 하기 방법에 의해 실시예 1 내지 8 및 비교예 1 내지 3을 제조하였다.
5mM 숙신산염 용액에 TNFR-Fc 융합 단백질을 50mg/mL 이 되도록 첨가한 후, 별도의 안정화제는 첨가하지 않고 등장화제로 140mM 염화나트륨을 첨가하여 pH 6.0 의 실시예 1을 제조하였다.
25mM 숙신산염 용액에 TNFR-Fc 융합 단백질을 50mg/mL 이 되도록 첨가한 후, 별도의 안정화제는 첨가하지 않고 등장화제로 140mM 염화나트륨 및 120mM 염화나트륨을 각각 첨가하여 pH 6.0 의 실시예 2 및 실시예 3을 제조하였다.
10mM 숙신산염 용액에 TNFR-Fc 융합 단백질을 50mg/mL 이 되도록 첨가한 후, 별도의 안정화제는 첨가하지 않고 등장화제로 140mM 염화나트륨을 첨가한 후, pH 6.0, pH 5.5, pH 6.5 의 실시예 4 내지 실시예 6을 제조하였다.
10mM 숙신산염 용액에 TNFR-Fc 융합 단백질을 50mg/mL 이 되도록 첨가한 후, 별도의 안정화제는 첨가하지 않고 등장화제로 120mM 염화나트륨 및 160mM 염화나트륨을 각각 첨가하여, pH 6.0 의 실시예 7 및 실시예 8을 제조하였다.
그리고, 미국 Amgen 사의 Enbrel 제품과 동일한 제형의 용액을 만들기 위하여, 25mM 인산염 용액에 TNFR-Fc 융합 단백질을 50mg/mL 이 되도록 첨가하고 등장화제로 100mM 염화나트륨을 첨가한 후, 안정화제로 1% 수크로즈, 25mM 아르기닌을 첨가한 pH 6.3 의 비교예를 제조하였다.
25mM 히스티딘 완충액에 TNFR-Fc 융합 단백질을 50mg/mL 이 되도록 첨가한 후, 등장화제로 140mM 염화나트륨을 첨가한 pH 6.0의 비교예 2를 제조하였다.
10mM 시트레이트 완충액에 TNFR-Fc 융합 단백질을 50mg/mL 이 되도록 첨가한 후, 등장화제로 140mM 염화나트륨을 첨가한 pH 6.0 의 비교예 3을 제조하였다.
구분 완충용액 pH NaCl 안정화제
실시예 1 5mM 숙신산염 6.0 140mM NaCl -
실시예 2 25mM 숙신산염 6.0 140mM NaCl -
실시예 3 25mM 숙신산염 6.0 120mM NaCl -
실시예 4 10mM 숙신산염 6.0 140mM NaCl -
실시예 5 10mM 숙신산염 5.5 140mM NaCl -
실시예 6 10mM 숙신산염 6.5 140mM NaCl -
실시예 7 10mM 숙신산염 6.0 120mM NaCl -
실시예 8 10mM 숙신산염 6.0 160mM NaCl -
비교예 1 25mM 인산염 6.3 100mM NaCl 1% sucrose
25mM Arginine
비교예 2 25mM 히스티딘 6.0 140mM NaCl -
비교예 3 10mM 시트레이트 6.0 140mM NaCl -
상기 방법으로 제조된 각각의 제형을 1.0mL 용량의 유리 주사기에 1.0 mL씩 담은 후 밀봉하여 가혹 조건인 40에서 12주 동안 보관한 후, TNFR-Fc 융합 단백질의 응집현상 및 산화의 정도를 제형 간 비교 평가하였다.
[분석 방법]
SE-HPLC 분석법
상기 표 1 실시예 제형의 안정성 확인을 위해 크기배제-고성능 크로마토그래피(Size-exclusion HPLC; SE-HPLC)를 사용하여 분석을 진행하였다. TNFR-Fc 융합 단백질의 응집 정도를 측정하기 위하여, 인산염과 염화나트륨의 이동상 조건하에서 TSK-gel 컬럼을 이용하여 214nm 에서 단백질 피크를 검출하였다. TNFR-Fc 융합 단백질의 응집체는 메인피크보다 먼저 컬럼에서 용출이 되며, 전체 피크면적에서 응집체의 피크 면적을 상대적으로 계산하여 응집 정도를 평가하였다. 또한, 불순물을 제외한 TNFR-Fc 융합 단백질의 함량은 메인피크로 나타내어 지며 전체 피크 면적 대비 차지하는 면적 비율을 상대적으로 계산하여 평가하였다.
HI-HPLC 분석법
소수성 상호작용 크로마토그래피(Hydrophobic Interaction HPLC; HI-HPLC)를 이용하여 TNFR-Fc 융합 단백질의 구조적 변화 정도를 평가하였다. 황산암모늄과 인산염의 이동상 조건하에서 Butyl-NPR 컬럼을 이용하여 218nm 에서 단백질 피크를 검출하였다. 메인 피크는 TNFR-Fc 융합 단백질을 의미하고, 메인 피크보다 먼저 용출되는 피크는 TNFR-Fc 융합 단백질 관련 저분자 생성물이고, 주 피크보다 늦게 용출되는 피크는 TNFR-Fc 융합 단백질 관련 응집물을 나타낸다. 전체 피크면적에서 응집체의 피크 면적을 상대적으로 계산하여 응집정도를 평가하였다. 또한, 불순물을 제외한 TNFR-Fc 융합 단백질의 함량은 메인 피크로 나타내어 지며 전체 피크 면적 대비 차지하는 면적 비율을 상대적으로 계산하여 평가하였다.
Oxidation (M272) 분석법
TNFR-Fc 융합 단백질의 산화정도에 대한 안정성 효과를 확인하기 위해 LC/MS 장비를 사용하여 펩타이드 맵핑분석을 진행하였다. 포름산과 아세토니트릴을 이용하여 이동상 완충액을 조제하였다. 분석을 위해 C18 컬럼을 사용하였고, 피크는 ESI Q-TOF 방식의 질량분석기를 통해서 검출되었다.
1. 실험예 1: 안정화제 무첨가 숙신산염 완충제 포함 TNFR-Fc 융합 단백질 용액 제형의 안정성 조사
(1) SE-HPLC 분석법
안정화제를 포함하지 않는 숙신산염 제형 (실시예 1 내지 4, 실시예 7 및 8) 과 수크로즈와 아르기닌 안정화제를 포함하는 Amgen 의 Enbrel 제형 (비교예 1) 의 SE-HPLC 고분자량 성분 (메인 피크보다 먼저 용출되는 응집물)의 함량을 하기 표 2에 나타내었다.
구분 0 time (%) 12 주 (%)
실시예 1 0.71 11.06
실시예 2 0.71 10.25
실시예 3 0.73 10.35
실시예 4 0.71 10.49
실시예 7 0.70 11.01
실시예 8 0.69 9.75
비교예 1 0.73 14.07
안정화제를 포함하지 않는 숙신산염 제형(실시예 1 내지 4, 실시예 7 및 8)의 응집물 함량은 11.1% 이하인 반면, 수크로즈와 아르기닌 안정화제를 포함한 Enbrel 제형(비교예 1)는 14.1 % 의 응집물 함량을 나타냈다.
안정화제를 포함하지 않는 숙신산염 제형(실시예 1 내지 4, 실시예 7 및 8) 이 수크로즈와 아르기닌 안정화제를 포함하는 Amgen 의 Enbrel 제형(비교예 1) 보다 응집물 형성 측면에서 안정화 효과가 뛰어남을 알 수 있었다.
이로써, 안정화제를 포함하지 않은 숙신산염 제형이 안정화제를 포함하고 있는 인산염 제형보다 안정성 측면에서 탁월한 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
(2) HI-HPLC 분석법
안정화제를 포함하지 않는 숙신산염 제형(실시예 1 내지 4, 실시예 7 및 8) 과 수크로즈와 아르기닌 안정화제를 포함하는 Amgen 의 Enbrel 제형(비교예 1) 의 HI-HPLC 고분자량 성분(메인 피크보다 늦게 용출되는 응집물)의 함량을 하기 표 3에 나타내었다.
구분 0 time (%) 12 주 (%)
실시예 1 16.7 23.0
실시예 2 16.6 22.8
실시예 3 16.6 23.0
실시예 4 16.6 22.5
실시예 7 16.5 23.3
실시예 8 16.7 22.1
비교예 1 16.7 25.1
표 3의 HI-HPLC 결과는 표 2의 SE-HPLC 결과와 유사하였다. 안정화제를 포함하고 있지 않은 숙신산염 제형(실시예 1 내지 4, 실시예 7 및 8) 에서는 23.3% 이하의 응집물 함량을 보인 반면에, 안정화제를 포함하는 Enbrel 제형(비교예 1)은 25.1% 의 응집물 함량을 나타냈다.
따라서, 안정화제를 포함하고 있는 인산염 제형보다 안정화제를 포함하지 않은 숙신산염 제형이 안정성 측면에서 탁월한 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
2. 실험예 2: 숙신산염 완충제 포함 TNFR-Fc 융합 단백질 제형의 안정성 조사
(1) 숙신산염 완충액의 높은 안정성
1) HI-HPLC 분석법
TNFR-Fc 융합 단백질을 안정화시키는데 있어서 완충액의 중요도를 확인하기 위하여, 숙신산염 완충액 제형(실시예 4), 인산염 완충액 제형(비교예 1), 히스티딘 완충액 제형(비교예 2), 시트레이트 완충액 제형(비교예 3)을 40에서 12주간 보관한 후, HI-HPLC 고분자량 성분(메인 피크보다 늦게 용출되는 응집물)의 함량 분석을 수행하였으며, 결과는 표 4에 나타내었다.
구분 완충액 0 time (%) 12 주 (%)
실시예 4 숙신산염 16.6 22.5
비교예 1 인산염 16.7 25.1
비교예 2 히스티딘 16.3 25.1
비교예 3 시트레이트 16.7 22.6
상기 표 4 결과에서 알 수 있듯이 숙신산염 함유 제형(실시예 4)이 인산염 함유 제형(비교예 1) 및 히스티딘 함유 제형(비교예 2) 보다 응집물 형성 측면에서 안정화 효과가 뛰어남을 알 수 있었다. 또한, 숙신산염 함유 제형(실시예 4)은 시트레이트 완충액 함유 제형(비교예 3)에 비해 응집물 형성 측면에서 유사한 안정화 효과를 보였다. 다만, TNFR-Fc 융합 단백질 제형에서 시트레이트 완충액 함유 제형은 통증을 유발하는 단점이 있으므로(US6150331, US 20110070231), 숙신산염을 포함한 TNFR-Fc 융합 단백질 제형이 바람직하다.
따라서, 숙신산염을 포함한 제형이 기존 TNFR-Fc 융합 단백질 제형보다 안정한 제형이며, 타 완충액과 비교하였을 때에도 우수하거나 유사한 수준의 안정성 개선 효과가 있음을 입증하였다
2) Oxidation (M272) 분석법
완충액의 종류에 따른 산화정도 억제 효과를 비교하기 위해 숙신산염 함유 제형(실시예 4), 인산염 함유 제형(비교예 1), 히스티딘 함유 제형(비교예 2) 및 시트레이트 함유 제형(비교예 3)을 40에서 12주간 보관 후, 펩타이드 맵핑 분석을 수행하였다.
구분 완충액 0 time (%) 12 주 (%)
실시예 4 숙신산염 1.7 2.6
비교예 1 인산염 1.7 3.5
비교예 2 히스티딘 1.6 3.0
비교예 3 시트레이트 1.7 3.2
상기 표 5에서 확인할 수 있듯이 숙신산염 함유 제형(실시예 4)이 인산염, 히스티딘, 시트레이트 완충액을 함유하는 제형(비교예 1 내지 3)에 비해 산화 정도의 증가 경향이 억제되는 효과가 있었다.
따라서 숙신산염이 TNFR-Fc 융합 단백질의 산화정도를 억제하는데 있어서 안정화제를 포함하는 인삼염 및 히스티딘 및 시트레이트 완충액에 비하여 산화 정도의 측면에서 우수한 안정화 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
3. 실험예 3: 숙신산염 및 염화나트륨 농도에 따른 안정성 평가
(1) SE-HPLC 분석법
상기 실험예 1 및 2를 통해서 TNFR-Fc 융합 단백질의 안정성이 숙신산염 함유 제형에 의해서 입증되었다. 숙신산염의 조성 비율에 따른 제제의 안정화 효과를 실험하기 위해 숙신산염 농도 5mM 제형(실시예 1), 10mM 제형(실시예 4) 및 25mM 제형(실시예 2)을 비교하였다. 이와 함께, NaCl 조성 비율에 따른 제제의 안정화 효과를 실험하기 위해 NaCl 농도 120mM 제형(실시예 7), 140mM 제형(실시예 4), 160mM 제형(실시예 8)을 비교하였다. 각각의 제형은 40에서 12주간 보관 후, SE-HPLC를 수행하여 안정성 효과를 비교하였다.
구분 숙신산염 농도(mM) NaCl 농도(mM) 12주 40(%)
실시예 1 5 140 71.67
실시예 2 25 140 73.68
실시예 3 25 120 73.23
실시예 4 10 140 72.47
실시예 7 10 120 71.58
실시예 8 10 160 73.01
상기 표 6은 불순물을 제외한 TNFR-Fc 융합 단백질의 함량(메인 피크)을 의미하며, 140mM 의 동일한 NaCl을 포함하고 숙신산염 농도가 각각 5mM, 10mM, 25mM 을 포함하는 실시예 1, 4 및 2에서 숙신산염의 농도에 비례하여 TNFR-Fc 융합 단백질의 함량이 증가함을 알 수 있었다.
또한, 10mM 의 동일한 숙신산염을 포함하고, 각각 120mM, 140mM, 160mM 의 염화나트륨을 포함하는 실시예 7, 4 및 8에서 염화나트륨의 농도에 비례하여 TNFR-Fc 융합 단백질의 함량이 증가함을 알 수 있었다.
이로써, 숙신산염의 함량이 증가할수록 TNFR-Fc 융합 단백질의 안정성이 보다 개선됨을 알 수 있었고, 25mM 숙신산염에서 안정성이 좋음을 확인할 수 있었다.
또한, 염화나트륨의 함량이 증가할수록 TNFR-Fc 융합 단백질의 안정성이 보다 개선됨을 알 수 있었고, 염화나트륨이 120mM 이상인 제형에서 모두 안정화 효과를 확인하였다.
더 나아가, 25mM 숙신산염 및 140mM 이상의 염화나트륨 제형에서 안정화 효과가 가장 탁월함을 확인할 수 있었다.
(2) HI-HPLC 분석법
HI-HPLC 결과에서도 상기 실시예 2의 SE-HPLC 결과와 유사한 경향을 보였다.
구분 숙신산염 농도(mM) NaCl 농도(mM) 12주 40(%)
실시예 1 5 140 65.7
실시예 2 25 140 66.7
실시예 3 25 120 66.2
실시예 4 10 140 66.4
실시예 7 10 120 65.7
실시예 8 10 160 66.5
상기 표 7은 불순물을 제외한 TNFR-Fc 융합 단백질의 함량을 의미하며, 140mM 의 동일한 NaCl을 포함하고 5mM, 10mM, 25mM 농도의 숙신산염을 각각 포함하는 실시예 1, 4 및 2에서 숙신산염의 농도에 비례하여 TNFR-Fc 융합 단백질의 함량이 증가함을 알 수 있었다. 또한, 10mM 의 동일한 숙신산염을 포함하고, 각각 120mM, 140mM, 160mM 농도의 염화나트륨을 포함하는 실시예 7, 4 및 8 에서 염화나트륨의 농도에 비례하여 TNFR-Fc 융합 단백질의 함량이 증가함을 알 수 있었다.
이로써, 숙신산염의 함량이 증가할수록 TNFR-Fc 융합 단백질의 안정성이 보다 개선됨을 알 수 있었고, 25mM 숙신산염에서 안정성이 좋음을 확인할 수 있었다.
또한, 염화나트륨의 함량이 증가할수록 TNFR-Fc 융합 단백질의 안정성이 보다 개선됨을 알 수 있었고, 염화나트륨이 120mM 이상인 제형에서 모두 안정화 효과가 우수하였다.
더 나아가, 실험예 3의 결과를 보았을 때, 25mM 숙신산염 및 140mM 이상의 염화나트륨 제형에서 안정화 효과가 가장 탁월함을 확인할 수 있었다.
4. 실험예 4: 염화나트륨 농도에 따른 삼투압 평가
염화나트륨 농도에 따른 TNFR-Fc 융합 단백질의 안정성 및 삼투압 평가를 위해 실시예 7, 4, 및 8을 제조하여 SE-HPLC 분석 및 삼투압을 측정하였다. 각각의 제형은 40에서 12주간 보관 후, SE-HPLC를 수행하여 안정성 효과를 비교하였다. 삼투압은 Wescor Vapro 5520 Vapor Pressure Osmometer를 사용하여 측정하였다. 그 결과는 표 8에 나타내었다.
구분 NaCl 농도(mM) 12주 40(%) 삼투압(mOsm)
실시예 7 120 71.58 241
실시예 4 140 72.47 280
실시예 8 160 73.01 333
상기 표 8은 염화나트륨 농도에 따른 삼투압 및 불순물을 제외한 TNFR-Fc 융합 단백질의 함량(메인 피크)을 의미한다. 상기 실험예 4에 나타난 바와 같이, 10mM의 동일한 숙신산염을 포함하고, 각각 120mM, 140mM, 160mM 농도의 염화나트륨을 포함하는 실시예 7, 4 및 8 에서 염화나트륨의 농도에 비례하여 TNFR-Fc 융합 단백질의 함량이 증가함을 알 수 있었다. 또한, 삼투압 측정 결과 역시, 염화나트륨의 농도에 비례하여 삼투압이 증가함을 알 수 있었다.
통상적으로 인체에 주사제로 사용되는 약학적 제제의 경우 삼투압이 체내 삼투압과 유사한 250mOsm 이상 350mOsm 이하로 투여되는 것이 당 업계에서 일반적으로 통용되며, 그 범위를 벗어나는 삼투압을 갖는 약학적 제제를 인체 내에 투여할 경우, 통증을 유발시킬 수 있다. 따라서, 실험예 4의 결과를 보았을 때, 120 내지 160mM의 염화나트륨 제형에서 안정화 효과 및 삼투압 효과가 탁월함을 확인할 수 있다.
5. 실험예 5: 숙신산염 완충제 포함 TNFR-Fc 융합 단백질 제형의 pH에 따른 안정성 조사
(1) SE-HPLC 분석법
숙신산염을 포함한 액상 제형에서 pH에 따른 안정화 효과를 확인 하기 위해 SE-HPLC 분석을 통해 10mM의 숙신산염 및 140mM의 NaCl을 동일 농도로 포함한 pH 5.5 제형(실시예 5), pH 6 제형(실시예 4), pH 6.5 제형(실시예 6)을 비교하기 위하여 40에서 12주간 보관 후 SE-HPLC를 수행하였다.
구분 pH 12주 40(%)
실시예 5 5.5 66.13
실시예 4 6 72.47
실시예 6 6.5 71.87
상기 표 9는 SE-HPLC 에서 불순물을 제외한 TNFR-Fc 융합 단백질의 함량을 의미하며, pH 6.0 에서 안정화 효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다.
(2) HI-HPLC 분석법
상기 실험예 5의 SE-HPLC 결과와 마찬가지로 HI-HPLC 결과에서도 유사한 경향을 보였다.
구분 pH 12주 40(%)
실시예 5 5.5 64.3
실시예 4 6 66.4
실시예 6 6.5 64.5
상기 표 10은 HI-HPLC 에서 불순물을 제외한 TNFR-Fc 융합 단백질의 함량을 의미하며, pH 6.0에서 안정화 효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다.
<110> Celltrion <120> Stable Pharmaceutical Formulation <130> CPD2017048KR <150> KR 10-2016-0142184 <151> 2016-10-28 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFR-Fc <400> 1 Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser 1 5 10 15 Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys 20 25 30 Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr 35 40 45 Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu 50 55 60 Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser 65 70 75 80 Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys 85 90 95 Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys 100 105 110 Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala 115 120 125 Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro 130 135 140 Gly Thr Phe Ser Asp Thr Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His 145 150 155 160 Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly Asp Ala Ser Met Asp Ala 165 170 175 Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val 180 185 190 His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr 195 200 205 Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly 210 215 220 Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly Asp Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 235 240 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 245 250 255 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 260 265 270 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 275 280 285 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 290 295 300 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asp Ser Thr Tyr 305 310 315 320 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 325 330 335 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 340 345 350 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 355 360 365 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 370 375 380 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 385 390 395 400 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 405 410 415 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 420 425 430 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 435 440 445 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 450 455 460 Pro Gly Lys 465 <210> 2 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFR-Fc_TNF-alpha binding domain <400> 2 Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser 1 5 10 15 Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys 20 25 30 Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr 35 40 45 Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu 50 55 60 Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser 65 70 75 80 Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys 85 90 95 Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys 100 105 110 Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala 115 120 125 Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro 130 135 140 Gly Thr Phe Ser Asp Thr Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His 145 150 155 160 Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly Asp Ala Ser Met Asp Ala 165 170 175 Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val 180 185 190 His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr 195 200 205 Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly 210 215 220 Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly Asp 225 230 235

Claims (14)

  1. 인간 p75 종양괴사인자 수용체의 세포외 리간드 결합부가 인간 IgG의 Fc 도메인에 융합된 융합 단백질 및 숙신산염 완충제를 포함하고, 안정화제를 포함하지 않은 안정한 약제학적 제제.
  2. 인간 p75 종양괴사인자 수용체의 세포외 리간드 결합부가 인간 IgG의 Fc 도메인에 융합된 융합 단백질 및 숙신산염 완충제를 포함하고, 아미노산, 암모늄염, 당 또는 이의 혼합물인 안정화제를 포함하지 않은 안정한 약제학적 제제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인 안정한 약제학적 제제.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열 번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 안정한 약제학적 제제.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 융합 단백질은 1 내지 100mg/mL 농도로 포함되는 안정한 약제학적 제제.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 숙신산염 완충제는 1 내지 200mM 농도로 숙신산염을 포함하는 것인 안정한 약제학적 제제.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 등장화제가 추가로 포함되는 안정한 약제학적 제제.
  8. 제7항에 있어서, 상기 등장화제는 1 내지 1000mM 농도의 염화나트륨인 안정한 약제학적 제제.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 안정한 약제학적 제제의 pH 범위가 5.5 내지 6.5인 안정한 약제학적 제제.
  10. 제2항에 있어서, 상기 암모늄염은 염화암모늄, 황산암모늄, 탄산암모늄, 질산암모늄 또는 이의 혼합물인 것을 특징으로 하는 안정한 약제학적 제제.
  11. 제2항에 있어서, 상기 아미노산은 아르기닌, 메티오닌, 라이신, 히스티딘, 글라이신, 프롤린, 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 시스테인, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 아스파라긴, 트레오닌, 글루타민 또는 이의 혼합물인 것을 특징으로 하는 안정한 약제학적 제제.
  12. 제2항에 있어서, 상기 당은 수크로즈인 것을 특징으로 하는 안정한 약제학적 제제.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 온도 40±2℃에서 12주 동안 보관한 후 SE-HPLC로 측정한 고분자량 성분의 함량이 12% 이하인 안정한 약제학적 제제.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 온도 40±2℃에서 12주 동안 보관한 후 HI-HPLC로 측정한 고분자량 성분의 함량이 24% 이하인 안정한 약제학적 제제.
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