KR102588846B1 - 고농도의 항-vegf 항체를 포함하는 안정한 단백질 용액 제제 - Google Patents

고농도의 항-vegf 항체를 포함하는 안정한 단백질 용액 제제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 주사, 바람직하게는 유리체내 주사에 적합한 고농도 수성 제약 조성물로서 제제화된 항-VEGF 항체를 제공한다. 수성 제약 조성물은 높은 수준의 항체 응집 없이 및 높은 수준의 육안으로 보이지 않는 미립자 물질 없이 환자에게 고농도의 항체 활성 성분을 전달하기에 유용하다. 본 발명의 수성 조성물은 적어도 50 mg/ml의 농도를 갖는 항체를 포함한다. 본 발명의 수성 제약 조성물은 당, 완충제 및 계면활성제를 포함한다.

Description

고농도의 항-VEGF 항체를 포함하는 안정한 단백질 용액 제제{STABLE PROTEIN SOLUTION FORMULATION CONTAINING HIGH CONCENTRATION OF AN ANTI-VEGF ANTIBODY}
본원은 2014년 12월 5일 출원된 미국 특허 가출원 62/088,061 및 2014년 11월 7일 출원된 미국 특허 가출원 62/076,770에 대한 우선권을 주장하고, 그 개시 내용은 본원에 참고로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 항-VEGF 항체의 수성 제약 제제, 이의 제조 방법 및 상기 제제의 용도에 관한 것이다.
혈관 내피 성장 인자 (VEGF)는 혈관형성 (angiogenesis) 및 혈관신생 (neovascularization)의 공지된 조절인자이고, 종양 및 안내 장애와 관련된 혈관 신생의 핵심 매개체인 것으로 밝혀졌다 (Ferrara et al. Endocr. Rev. 18:4-25 (1997)). VEGF mRNA는 많은 인간 종양에서 과다발현되고, 안구 유체 내의 VEGF의 농도는 당뇨병 및 다른 허혈 관련 망막병증 환자에서 혈관의 활성 증식의 존재와 높은 상관관계가 있다 ([Berkman et al., J Clin Invest 91:153-159 (1993)]; [Brown et al. Human Pathol. 26:86-91 (1995)]; [Brown et al. Cancer Res. 53:4727-4735 (1993)]; [Mattern et al. Brit. J. Cancer. 73:931-934 (1996)]; [Dvorak et al. Am J. Pathol. 146:1029-1039 (1995)]; 및 [Aiello et al. N. Engl. J. Med. 331:1480-1487 (1994)]). 게다가, 최근의 연구에 의하면, AMD에 의해 영향을 받는 환자의 맥락막 신생혈관막에 국소 VEGF가 존재함이 밝혀졌다 (Lopez et al. Invest. Ophtalmo. Vis. Sci. 37:855-868 (1996)). 항-VEGF 중화 항체는 누드 마우스에서 다양한 인간 종양 세포주의 성장을 억제하고 또한 허혈성 망막 장애 모델에서 안내 혈관형성을 억제하는데 사용될 수 있다 ([Kim et al. Nature 362:841-844 (1993)]; [Warren et al. J. Clin. Invest 95:1789-1797 (1995)]; [Borgstrom et al. Cancer Res. 56:4032-4039 (1996)]; [Melnyk et al. Cancer Res. 56:921-924 (1996)]; 및 [Adamis et al. Arch. Opthalmol. 114:66-71 (1996)]).
다수의 항체가 항-VEGF 항체를 비롯한 인간 및 다른 포유동물에서 치료용으로 승인되었다. 액체 제약 제제에서 치료 항체의 농도는 예를 들어 투여 경로에 따라 광범위하게 상이하다. 작은 부피가 필요할 때, 종종 고농도 항체 제제의 필요성이 존재한다. 예를 들어, 고농도 제제는 유리체내 주사 또는 피하 투여에 바람직할 수 있다.
그러나, 항체 농도가 높은 제제는 보관 수명이 짧을 수 있고, 제제화된 항체는 보관 동안 화학적 및 물리적 불안정성에 의해 생물학적 활성을 잃을 수 있다. 응집, 탈아미드화 및 산화는 항체 분해의 가장 흔한 원인으로 알려져 있다. 특히, 응집은 잠재적으로 환자의 면역 반응을 증가시켜 안전 문제를 일으킬 수 있다. 따라서, 응집은 최소화하거나 예방되어야 한다.
수십 마이크로미터에서 밀리미터 미만 및 밀리미터 크기 범위의 미립자가 일반적으로 인간의 육안으로 볼 수 있기 때문에, 생물학적 치료 제제에서 미립자의 형성은 중요한 품질 문제이다 (Das, 2012, AAPS PharmSciTech, 13:732-746). 치료용 안과 제제의 미립자는 눈에 손상을 줄 수 있다. 따라서, 안과 제제의 육안으로 보이지 않는 미립자 물질 함량이 특정 범위 내에 있음을 보장하는 규제 기준이 있다. 예를 들어, US 약전 (USP)은 현미경 입자 계수 방법 (USP General Chapter <789> 참고)에 의해 결정될 때, 직경이 10 ㎛ 이상인 입자의 최대 수가 mL당 50개이고, 직경이 25 ㎛ 이상인 입자의 최대 수가 mL당 5개이고, 직경이 50 ㎛ 이상인 입자의 최대 수가 mL당 2개일 것과 같은 안과 용액 내의 미립자 물질에 대한 요건을 설정하였다.
고농도 항체 제제를 제조하는 방법은 공지되어 있다. 그러나, 항체의 아미노산 서열이 각종 제약 부형제, 완충제 등의 존재 하에 응집체를 형성하거나 분해되는 경향에 대한 예측할 수 없는 영향을 극복하기 위한 보편적인 방법은 존재하지 않는다. 또한, 허용되는 수준의 육안으로 보이지 않는 입자를 함유하는 고농도의 단백질 (예컨대, 항체 등)을 갖는 안과 제제의 제조는 어렵고 예측할 수 없다.
본 발명의 목적은 인간, 특히 인간의 눈에 투여하기 적합한 고농도의 항-VEGF 항체 및 저 수준의 항체 응집 및 육안으로 보이지 않는 입자를 갖는 추가의 개선된 제제를 제공하는 것이다.
발명의 요약
따라서, 본 발명은 눈 주사에 적합한 고농도의 항-VEGF 항체를 포함하는 수성 제약 조성물에 관한 것이다. 특정 측면에서, 본 발명의 수성 제약 조성물은 생산, 제조, 수송 및 장시간 동안의 보관 동안 생물학적 활성을 거의 또는 전혀 잃지 않으면서도 낮은 수준 내지 검출할 수 없는 수준의 항체 응집 또는 분해를 나타내고, 항-VEGF 항체의 농도는 적어도 약 50 mg/ml, 60 mg/ml, 80 mg/ml, 100 mg/ml, 120 mg/ml, 140 mg/ml, 160 mg/ml, 180 mg/ml 또는 200 mg/ml이다.
본 발명은 항-VEGF 항체, 안정화제, 완충제 및 계면활성제를 포함하는 수성 제약 조성물을 제공한다. 특정 측면에서, 수성 제약 조성물은 (i) 적어도 50 mg/ml의 항-VEGF 항체, (ii) 안정화제로서의 수크로스 또는 트레할로스, (iii) 시트레이트 또는 히스티딘 완충제, 및 (iv) 계면활성제로서의 폴리소르베이트 80을 포함한다.
특정 측면에서, 수성 제약 조성물은 약 4.5% 내지 11% w/v 수크로스 또는 5% 내지 10% 트레할로스, 0.006% 내지 0.012% 시트르산 (w/v), 0.2% 내지 0.6% 시트르산 삼나트륨 이수화물 (w/v), 및 약 0.01% 내지 0.1% 폴리소르베이트 80 (w/v)을 포함하고, 제제의 pH는 6.3 내지 7.3이다.
본 발명의 바람직한 특정 실시양태는 바람직한 특정 실시양태에 대한 아래의 보다 상세한 설명 및 청구범위으로부터 명백해질 것이다.
도 1은 상이한 pH로 제제화된 1008에 대한 탁도 검정 결과의 그래프를 보여준다. x축은 55℃에서의 인큐베이션 시간을 보여주고; y축은 350 nm에서 모니터링된 광학 밀도를 나타낸다.
도 2a 및 도 2b는 55℃에서 180분 동안 인큐베이팅된 상이한 1008 제제에 대한 OD360의 변화를 모니터링하는 탁도 검정을 보여준다 (도 2a). 60분에 얻어진 OD360 곡선을 확대하여 도 2b에 제시한다. 도 2a 및 2b에서 샘플 번호는 표 13의 제제 번호에 대응한다.
도 3은 간략화를 위해 0 내지 90분 동안 수집된 데이터를 사용하여 탁도 검정을 보여준다. 전체 실험은 180분이었다. OD360의 변화는 55℃에서 인큐베이팅된 상이한 1008 제제에 대해 모니터링되었다. 도면에서 샘플 번호는 표 15의 제제 번호에 대응한다.
도 4는 40℃에서 6주의 보관 동안 8개의 선택된 제제에서 주 피크에 대한 SEC 결과를 보여주는 그래프이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 고농도의 항-VEGF 항체를 포함하는 수성 제약 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 수성 제약 조성물은 2 내지 8℃에서 적어도 18개월 동안 안정하고 주사 또는 주입을 포함하는 안내 투여에 적합하다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 수성 제약 조성물은 미립자 물질의 존재와 관련하여 USP <789> 요건을 충족한다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명의 수성 제약 조성물 내의 직경이 10 ㎛ 이상인 입자의 최대 수는 mL당 50개이고, 본 발명의 수성 제약 조성물 내의 직경이 25 ㎛ 이상인 입자의 최대 수는 mL당 5개이고, 본 발명의 수성 제약 조성물 내의 직경이 50 ㎛ 이상인 입자의 최대 수는 mL당 2개이고, 상기 입자 수는 US 약전 (U.S. Pharmacopeial Convention General Chapter <789>)에 의해 요구되는 광 차폐 및/또는 현미경 입자 계수 방법에 의해 결정된다.
본원에서 사용되는 "수성" 제약 조성물은 수성 담체가 증류수인 제약 용도에 적합한 조성물이다. 제약 용도에 적합한 조성물은 멸균, 균질 및/또는 등장성일 수 있다. 수성 제약 조성물은 예를 들어 사용 준비가 된 미리 충전된 주사기 내의 수성 형태 ("액체 제제")로, 또는 사용 직전에 재구성되는 동결건조물로서 제조될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "수성 제약 조성물"은 액체 제제 또는 재구성되는 동결건조된 제제를 의미한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 수성 제약 조성물은 인간 대상체에게 안내 투여하기에 적합하다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 수성 제약 조성물은 유리체내 투여에 적합하다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 수성 제약 조성물은 유리체내 주입에 의한 투여에 적합하다.
본 발명은 신규한 제약 제제, 특히 활성 성분이 인간 VEGF에 대한 항체를 포함하는 신규한 제약 제제를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 고농도의 항-VEGF 항체를 갖는 수성 제약 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 제제에서 바람직한 항-VEGF 항체는 WO 2009/155724에 기재되어 있고, 그 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 전체 항체 및 임의의 항원 결합 단편 (즉, "항원 결합 부분", "항원 결합 폴리펩티드" 또는 "면역결합제") 또는 그의 단일쇄를 포함한다. "항체"는 디술피드 결합에 의해 상호 연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L) 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 당단백질을 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, 즉 CH1, CH2 및 CH3으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서는 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, 즉 CL로 이루어진다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 보다 잘 보존된 영역이 산재된, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는 초가변 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로, 아미노 말단으로부터 카르복시 말단으로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어진다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 전통적인 보체계의 제1 성분 (C1q)을 비롯하여 숙주 조직 또는 인자에 대한 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있다
항체의 "항원 결합 부분" (또는 간단히 "항체 부분")이라는 용어는 항원 (예를 들어, VEGF)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 의미한다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있음이 밝혀졌다. 항체의 "항원 결합 부분"이라는 용어 내에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디술피드 다리에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진 단일 도메인 또는 dAb 단편 (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 (vii) 합성 링커에 의해 임의로 연결될 수 있는 2개 이상의 단리된 CDR의 조합을 포함한다. 또한, Fv 단편의 두 도메인 VL 및 VH가 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자 (단일쇄 Fv (scFv)로 알려짐; 예를 들어 문헌 [Bird et al. (1988) Science 242:423-426]; 및 [Huston et al. (1988) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:5879-5883] 참조)를 형성하는 단일 단백질 사슬로서 제조되도록 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 연결될 수 있다. 이러한 단일쇄 항체는 또한 항체의 "항원 결합 부분"이라는 용어 내에 포함되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 얻고, 단편을 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝한다. 항원 결합 부분은 재조합 DNA 기술에 의해, 또는 무손상 이뮤노글로불린의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성될 수 있다. 항체는 상이한 이소형, 예를 들어 IgG (IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서브타입), IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM 항체일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 수성 제약 조성물은 서열식별번호 (SEQ ID NO): 1에 제시된 서열을 갖는 가변 중쇄 및 서열식별번호: 2에 제시된 서열을 갖는 가변 경쇄를 포함한다.
VH: 서열식별번호: 1
VL: 서열식별번호: 2
다른 바람직한 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 하기 서열을 포함하는 단일쇄 Fv (scFv) 항체 단편이다:
본 발명의 수성 제약 조성물 내의 항-VEGF 항체는 예를 들어 WO 2009/155724에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. scFv는 상기 출원 공개에서 설명된 바와 같이 발현 벡터를 사용하여 생산될 수 있다. 발현 벡터에서 출발 코돈으로부터 유래된 메티오닌은 번역 후 절단되지 않는 경우에 최종 단백질 내에 존재한다 (실시예의 서열식별번호: 4 참조).
특정 실시양태에서, 본 발명의 수성 제약 조성물 내의 항-VEGF 항체는 각각 서열식별번호: 5, 6 및 7에 제시된 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 서열식별번호: 8, 9 및 10에 제시된 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다.
서열식별번호: 5 GFSLTDYYYMT
서열식별번호: 6 FIDPDDDPYYATWAKG
서열식별번호: 7 GDHNSGWGLDI
서열식별번호: 8 QASEIIHSWLA
서열식별번호: 9 LASTLAS
서열식별번호: 10 QNVYLASTNGAN
한 실시양태에서, 본 발명의 수성 제약 조성물 내의 항-VEGF 항체의 농도는 적어도 50 mg/ml이다. 바람직하게는, 본 발명의 수성 제약 조성물은 약 50 mg/ml, 약 60 mg/ml, 약 70 mg/ml, 약 80 mg/ml, 약 90 mg/ml, 약 100 mg/ml, 약 110 mg/ml, 약 120 mg/ml, 약 130 mg/ml, 약 140 mg/ml, 약 150 mg/ml, 약 160 mg/ml, 약 170 mg/ml, 약 180 mg/ml, 약 190 mg/ml, 약 200 mg/ml, 약 210 mg/ml, 약 220 mg/ml, 약 230 mg/ml, 약 240 mg/ml, 약 250 mg/ml 또는 약 300 mg/ml의 항-VEGF 항체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 수성 제약 조성물은 60 mg/ml 내지 120 mg/ml의 항-VEGF 항체, 예를 들어 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2를 포함하는 항체를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 수성 제약 조성물은 60 mg/ml의 서열식별번호: 3을 포함하는 항-VEGF 항체를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 수성 제약 조성물은 120 mg/ml의 서열식별번호: 3을 포함하는 항-VEGF 항체를 포함한다.
본 발명의 수성 제약 조성물은 항-VEGF 항체 이외에, 하기 성분 중 하나 이상과 같은 추가 성분을 포함한다: (i) 안정화제; (ii) 완충제; (iii) 계면활성제; 및 (iv) 자유 아미노산. 각각의 상기 추가의 성분의 포함은 항-VEGF 항체의 낮은 응집도를 갖는 조성물을 제공할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 수성 제약 조성물은 항-VEGF 항체 이외에, (i) 안정화제; (ii) 완충제; 및 (iii) 계면활성제를 포함한다.
본 발명에 사용하기에 적합한 안정화제는 예를 들어 점도 향상제, 증량제 (bulking agent), 가용화제 등으로서 작용할 수 있다. 안정화제는 이온성 또는 비이온성 (예를 들어, 당)일 수 있다. 당은 단당류, 예를 들어 프럭토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 소르보스 등; 이당류, 예를 들어 락토스, 수크로스, 트레할로스, 셀로비오스 등; 다당류, 예를 들어 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분 등; 및 알디톨, 예를 들어 만니톨, 크실리톨, 말티톨, 락티톨, 크실리톨 소르비톨 (글루시톨) 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 당은 수크로스, 트레할로스, 라피노스, 말토스, 소르비톨 또는 만니톨일 수 있다. 당은 당 알콜 또는 아미노 당일 수 있다. 수크로스 및 트레할로스가 바람직하다. 가장 바람직한 것은 수크로스이다. 이온 안정화제로서, 이들은 NaCl과 같은 염 또는 아르기닌-HCl과 같은 아미노산 성분을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 완충제는 시트르산, 아스코르브산, 글루콘산, 탄산, 타르타르산, 숙신산, 아세트산 또는 프탈산의 염과 같은 유기산 염; 트리스, 토메타민 히드로글로라이드 또는 포스페이트 완충제를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 또한, 아미노산 성분은 완충제로서도 사용될 수 있다. 예를 들어 10-20 mM의 히스티딘 완충제, 예를 들어 0.13% 내지 0.26% (w/v) 히스티딘 및 0.03% 내지 0.07% (w/v) 히스티딘 히드로클로라이드 일수화물 또는 10-20 mM 시트레이트 완충제, 예를 들어 0.006% 내지 0.012% 시트르산 (w/v) 및 0.2% 내지 0.6% 시트르산 삼나트륨 이수화물 (w/v)을 포함하는 시트레이트 또는 히스티딘 완충제가 특히 유용하다. 본 발명의 제제에 사용되는 시트르산은 임의의 수화 형태, 예를 들어 무수물 또는 일수화물일 수 있다.
수성 제약 조성물은 개선된 pH 조절을 제공하는 완충제 또는 pH 조절제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 수성 제약 조성물의 pH는 5.0 내지 8.0, 5.0 내지 7.0, 6.0 내지 8.0, 또는 6.0 내지 7.0이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 수성 제약 조성물의 pH는 약 6.3 내지 약 7.3이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 수성 제약 조성물의 pH는 약 6.8이다.
본원에 사용되는 용어 "계면활성제"는 양친매성 구조를 갖는 유기 물질을 의미하고; 즉, 이들은 일반적으로 지용성 탄화수소 사슬 및 수용성 이온성 기인 반대 용해 경향의 기로 이루어진다. 계면활성제는 표면 활성 모이어티 (moiety)의 전하에 따라 다양한 제약 조성물 및 생물학적 물질의 제제를 위한 음이온성, 양이온성 및 분산성 작용제로 분류할 수 있다.
본 발명에 사용하기에 적합한 계면활성제는 비이온성 계면활성제, 이온성 계면활성제 및 쯔비터이온성 계면활성제를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 본 발명에 사용하기 위한 일반적인 계면활성제는 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 소르비탄 지방산 에스테르 (예를 들어, 소르비탄 모노카프릴레이트, 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노팔미테이트), 소르비탄 트리올레에이트, 글리세린 지방산 에스테르 (예를 들어, 글리세린 모노카프릴레이트, 글리세린 모노미리스테이트, 글리세린 모노스테아레이트), 폴리글리세린 지방산 에스테르 (예를 들어, 데카글리세릴 모노스테아레이트, 데카글리세릴 디스테아레이트, 데카글리세릴 모노리놀레이트), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 트리올레에이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 트리스테아레이트), 폴리옥시에틸렌 소르비톨 지방산 에스테르 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 테트라스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 테트라올레에이트), 폴리옥시에틸렌 글리세린 지방산 에스테르 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리세릴 모노스테아레이트), 폴리에틸렌 글리콜 지방산 에스테르 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 디스테아레이트), 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르), 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 알킬 에테르 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 프로필 에테르, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 세틸 에테르), 폴리옥시에틸렌 알킬페닐 에테르 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 노닐페닐 에테르), 폴리옥시에틸렌 수소화 피마자유 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 피마자유, 폴리옥시에틸렌 수소화 피마자유), 폴리옥시에틸렌 밀랍 유도체 (폴리옥시에틸렌 소르비톨 밀랍), 폴리옥시에틸렌 라놀린 유도체 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 라놀린) 및 폴리옥시에틸렌 지방산 아미드 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 스테아르산 아미드); C10-C18 알킬 술페이트 (예를 들어, 세틸황산나트륨, 라우릴황산나트륨, 올레일황산나트륨), 평균 2 내지 4몰의 에틸렌 옥시드 단위가 첨가된 폴리옥시에틸렌 C10-C18 알킬 에테르 술페이트 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 라우릴 황산나트륨) 및 C1-C18 알킬술포숙시네이트 에스테르 염 (예를 들어, 나트륨 라우릴 술포숙시네이트 에스테르); 및 천연 계면활성제, 예컨대 레시틴, 글리세로인지질, 스핑고인지질 (예를 들어, 스핑고미엘린) 및 C12-C18 지방산의 수크로스 에스테르. 조성물은 하나 이상의 상기 계면활성제를 포함할 수 있다. 바람직한 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 예를 들어 폴리소르베이트 20, 40, 60 또는 80이다. 폴리소르베이트 80이 특히 바람직하다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 아미노산은 아르기닌, 라이신, 히스티딘, 오르니틴, 이소류신, 류신, 알라닌, 글리신, 글루탐산 또는 아스파르트산을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 염기성 아미노산, 즉 아르기닌, 라이신 및/또는 히스티딘을 포함하는 것이 바람직하다. 조성물이 히스티딘을 포함하는 경우, 이는 완충제 및 자유 아미노산 둘 모두로서 작용할 수 있지만, 히스티딘 완충제가 사용되는 경우에는, 비-히스티딘 자유 아미노산을 포함하는 것, 예를 들어 히스티딘 완충제 및 라이신을 포함하는 것이 일반적이다. 아미노산은 그의 D- 및/또는 L-형태로 존재할 수 있지만, L-형태가 일반적이다. 아미노산은 임의의 적합한 염, 예를 들어 아르기닌-HCl과 같은 히드로클로라이드 염으로 존재할 수 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 수성 제약 조성물은 임의의 상기 자유 아미노산을 포함하지 않는다.
바람직한 실시양태에서, 당은 본 발명의 수성 제약 조성물에, 동결건조물을 물에 재구성한 후, 예를 들어 3 내지 11% (w/v)의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 당은 약 4.5% 내지 약 11%의 농도의 수크로스 또는 약 5% 내지 약 10%의 농도의 트레할로스이다. 6.75% (w/v) 수크로스의 농도가 바람직하다.
바람직한 실시양태에서, 완충제는 본 발명의 수성 제약 조성물에, 동결건조물을 물에 재구성한 후, 예를 들어 1 내지 60 mM, 예를 들어 10-40 mM, 15-30 mM, 15-25 mM의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 완충제는 시트레이트 또는 히스티딘이다. 15 mM 시트레이트 완충제의 농도가 바람직하다.
바람직한 실시양태에서, 계면활성제는 본 발명의 수성 제약 조성물에, 예를 들어 동결건조물을 물에 재구성한 후, 0.2% (부피 기준) 이하, 예를 들어 0.01% 내지 0.1%, 0.03 내지 0.08%, 0.04-0.08%의 농도로 존재한다. 0.05% 폴리소르베이트 80의 농도가 바람직하다.
본 발명의 수성 제약 조성물에 사용될 수 있은 다른 고려되는 부형제는 예를 들어 항균제, 항산화제, 정전기 방지제, 지질, 예컨대 인지질 또는 지방산, 스테로이드, 예컨대 콜레스테롤, 단백질 부형제, 예컨대 혈청 알부민 (인간 혈청 알부민), 재조합 인간 알부민, 젤라틴, 카제인, 염 형성 반대 이온, 예컨대 나트륨 등을 포함한다. 본 발명의 제제에 사용하기 적합한 상기 및 추가의 공지된 제약 부형제 및/또는 첨가제는 예를 들어 문헌 [The Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4th edition, Rowe et al., Eds., American Pharmaceuticals Association (2003)]; 및 [Remington: the Science and Practice of Pharmacy, 21st edition, Gennaro, Ed., Lippincott Williams & Wilkins (2005)]에 제시된 바와 같이 관련 기술 분야에 공지되어 있다.
본 발명의 바람직한 제제는 하기 실시예의 표 40에 제시되어 있다.
특정 실시양태에서, 항-VEGF 항체의 동결건조는 환자를 치료하기 위한 본 발명의 수성 제약 조성물을 제공하기 위해 고려된다.
항체의 동결건조 기술은 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어 문헌 [John F. Carpenter and Michael J. Pikal, 1997 (Pharm . Res. 14, 969-975)]; [Xialin (Charlie) Tang and Michael J. Pikal, 2004 (Pharm. Res. 21, 191-200)]을 참조한다.
동결건조물은 환자에게 투여하기 전에, 수성 재구성제로 재구성해야 한다. 이 단계는 동결건조물 내의 항체 및 다른 성분을 재용해시켜 환자에게 주사하기 적합한 용액을 제공할 수 있게 한다.
재구성을 위해 사용되는 수성 물질의 부피는 생성된 제약 조성물 내의 항체의 농도를 결정한다. 동결건조 전 부피보다 작은 부피의 재구성제를 사용한 재구성은 동결건조 전보다 더 농축된 조성물을 제공한다. 재구성 인자 (동결건조 후의 제제의 부피:동결건조 전 제제의 부피)는 1:0.5 내지 1:6일 수 있다. 1:3의 재구성 인자가 유용하다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 동결건조물은 재구성되어 적어도 50 mg/ml (즉, 적어도 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120 또는 130 mg/ml)의 항-VEGF 항체 농도를 갖는 수성 조성물을 제공할 수 있고, 재구성제의 부피는 이에 따라 선택될 것이다. 필요한 경우, 재구성된 제제는 의도된 투여량을 전달하기에 적절할 때 환자에게 투여하기 전에 희석될 수 있다.
동결건조된 항체에 대한 통상적인 재구성제는 임의로 보존제를 함유하는 멸균 수 또는 완충제를 포함한다. 동결건조물이 완충제를 포함하는 경우, 재구성제는 추가의 완충제 (동결건조물의 완충제와 동일하거나 상이할 수 있음)를 포함할 수 있거나 완충제 (예를 들어, WFI (주사용수) 또는 생리 염수)를 포함하지 않을 수 있다.
항-VEGF 항체를 포함하는 본 발명의 수성 제약 조성물은 다양한 질병 또는 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 항-VEGF 항체를 포함하는 제약 조성물은 대상체에서 신생혈관성 안 질환을 치료하는데 특히 유용하다.
본 발명의 수성 제약 조성물을 사용하여 치료할 수 있는 "신생혈관성 안 질환"은 비정상적인 혈관형생, 맥락막 혈관신생 (CNV), 망막 혈관 투과성, 망막 부종, 당뇨병성 망막병증 (특히 증식성 당뇨병성 망막병증), 당뇨 황반 부종, nAMD (신생혈관성 연령 관련 황반 변성 (AMD))와 관련된 CNV를 포함하는 신생혈관성 (삼출성) 연령 관련 황반 변성 (AMD), 망막 허혈과 연관된 후유증, 중심성 망막 정맥 폐색 (CRVO) 및 후안부 혈관신생 (posterior segment neovascularization)을 포함하고 이로 제한되지 않는, 안 혈관신생과 관련된 병태, 질환 또는 장애를 포함한다.
본 발명의 수성 제약 조성물은 항-VEGF 항체 이외에 추가의 활성 성분을 포함할 수 있다. 추가의 약리학적 작용제는 예를 들어 안 질환 치료에 유용한 다른 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 수성 제약 조성물은 환자에게 투여될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "대상체" 또는 "환자"라는 용어는 영장류, 토끼, 돼지, 말, 개, 고양이, 양 및 소를 포함하고 이로 제한되지 않는 인간 및 비-인간 포유동물을 지칭한다. 바람직하게는, 대상체 또는 환자는 인간이다.
투여는 일반적으로 주사기를 통해 이루어진다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 제약 조성물을 포함하는 전달 장치 (예를 들어, 주사기) (예를 들어, 미리 충전된 주사기)를 제공한다. 환자는 주요 활성 성분으로 유효량 (즉, 원하는 효과를 달성하거나 적어도 부분적으로 달성하기에 충분한 양)의 항-VEGF 항체를 투여할 것이다. 치료 유효 용량은 심지어 질환과 관련된 증상 또는 상태의 점진적 변화를 일으킬 수 있다면 충분하다. 치료 유효 용량은 질환을 완전히 치유하거나 증상을 완전히 제거할 필요는 없다. 바람직하게는, 치료 효과 용량은 이미 질환으로 고통받는 환자에서 질환 및 그의 합병증을 적어도 부분적으로 억제할 수 있다. 상기 사용에 효과적인 양은 치료되는 장애의 중증도 및 환자 자신의 면역계의 일반적인 상태에 따라 달라질 것이다.
용량은 질환 또는 병태 치료시에 통상적인 의사에 의해 공지된 투여량 조절 기술을 사용하여 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 수성 제약 조성물에 사용되는 항-VEGF 항체의 치료 유효량은 예를 들어 원하는 투여 부피 및 투여 방식(들)을 고려하여 결정된다. 전형적으로, 치료상 효과적인 조성물은 용량당 0.001 mg/ml 내지 약 200 mg/ml 범위의 투여량으로 투여된다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에 사용되는 투여량은 약 60 mg/ml 내지 약 120 mg/ml (즉, 약 60, 70, 80, 90, 100, 110 또는 120 mg/ml)이다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 항-VEGF 항체의 투여량은 60 mg/ml 또는 120 mg/ml이다.
특정 실시양태에서, 투여량은 환자의 눈에 직접 투여된다. 한 실시양태에서, 눈당 투여량은 적어도 약 0.5 mg 내지 약 6 mg이다. 눈당 바람직한 투여량은 약 0.5 mg, 0.6 mg, 0.7 mg, 0.8 mg, 0.9 mg, 1.0 mg, 1.2 mg, 1.4 mg, 1.6 mg, 1.8 mg, 2.0 mg, 2.5 mg, 3.0 mg, 3.5 mg, 4.0 mg, 4.5 mg, 5.0 mg, 5.5 mg 및 6.0 mg을 포함한다. 투여량은 안내 투여에 적합한 다양한 부피, 예컨대 3 mg/50 ㎕ 또는 6 mg/50 ㎕를 포함하는 50 ㎕ 또는 100 ㎕로 투여될 수 있다. 10 ㎕ 이하, 예를 들어 약 10 ㎕ 또는 약 8.0 ㎕를 포함하는 더 작은 부피가 또한 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 1.2 mg/10 ㎕ 또는 1 mg/8.0 ㎕ (예를 들어, 1 mg/8.3 ㎕)의 투여량이 상기한 하나 이상의 질환 및 장애를 치료 또는 개선하기 위해 환자의 눈에 전달된다. 전달은 예를 들어 유리체내 주사 또는 주입에 의해 시행될 수 있다.
본 발명은 또한 의약으로서 사용하기 위한, 예를 들어 환자에게 항체를 전달하는데 사용하기 위해 또는 상기한 하나 이상의 질환 및 장애를 치료 또는 개선하는 데 사용하기 위한 본 발명의 제제 (즉, 수성 제약 조성물)를 제공한다.
본 발명은 또한 환자에게 본 발명의 수성 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 환자에게 항-VEGF 항체를 전달하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 환자에게 발명의 항-VEGF 항체를 전달하는 방법은 (i) 본 발명의 동결건조물을 재구성하여 수성 제제를 제공하는 단계 및 (ii) 수성 제제를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 단계 (ii)는 이상적으로는 단계 (i)로부터 24시간 이내에 (예를 들어, 12시간 이내에, 6시간 이내에, 3시간 이내에, 또는 1시간 이내에) 수행한다.
본 발명의 구체적인 특정 실시양태는 아래에서 번호를 부여한 바와 같이 설명된다:
1. i) 적어도 50 mg/ml의 각각 서열식별번호: 5, 6 및 7의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 각각 서열식별번호: 8, 9 및 10의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항-VEGF 항체, (ii) 수크로스 또는 트레할로스, (iii) 시트레이트 또는 히스티딘 완충제, 및 (iv) 계면활성제로서의 폴리소르베이트 80을 포함하는 수성 제약 조성물.
2. 실시양태 1에 있어서, 4.5% 내지 11% (w/v) 수크로스 또는 5% 내지 10% 트레할로스, 0.006% 내지 0.012% 시트르산 (w/v), 0.2% 내지 0.6% 시트르산 삼나트륨 이수화물 (w/v), 및 0.01% 내지 0.1% 폴리소르베이트 80 (w/v)를 포함하고, pH가 약 6.3 내지 약 7.3인 수성 제약 조성물.
3. 실시양태 2에 있어서, 수크로스의 농도가 6.75% (w/v)이고, 시트르산의 농도가 약 0.01% (w/v)이고, 시트르산 삼나트륨 이수화물의 농도가 약 0.428% (w/v)이고, 폴리소르베이트 80의 농도가 약 0.05% (w/v)이고, pH가 약 6.8인 수성 제약 조성물.
4. 실시양태 1 내지 3 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항-VEGF 항체의 농도가 적어도 60 mg/ml, 적어도 70 mg/ml, 적어도 80 mg/ml, 적어도 90 mg/ml, 적어도 100 mg/ml, 적어도 110 mg/ml, 적어도 120 mg/ml, 적어도 130 mg/ml, 적어도 140 mg/ml 또는 적어도 150 mg/ml인 수성 제약 조성물.
5. 실시양태 1 내지 4 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항-VEGF 항체의 농도가 약 60 mg/ml, 약 70 mg/ml, 약 80 mg/ml, 약 90 mg/ml, 약 100 mg/ml, 약 110 mg/ml, 약 120 mg/ml, 약 130 mg/ml, 약 140 mg/ml 또는 약 150 mg/ml인 수성 제약 조성물.
6. 실시양태 1 내지 5 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항-VEGF 항체가 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2의 서열을 포함하는 것인 수성 제약 조성물.
7. 실시양태 1 내지 6 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항-VEGF 항체가 서열식별번호: 3의 서열을 포함하는 것인 수성 제약 조성물.
8. 실시양태 1 내지 7 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항-VEGF 항체의 농도가 약 60 mg/ml 또는 약 120 mg/ml인 수성 제약 조성물.
9. 실시양태 1 내지 8 중 어느 한 실시양태의 수성 제약 조성물을 포함하는 전달 장치.
10. 실시양태 9에 있어서, 미리 충전된 주사기인 전달 장치.
11. 실시양태 1 내지 8 중 어느 한 실시양태의 수성 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에게 항-VEGF 항체를 전달하는 방법.
12. 실시양태 1 내지 8 중 어느 한 실시양태의 수성 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, VEGF에 의해 매개되는 안 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
13. 실시양태 12에 있어서, 상기 안 질환 또는 장애가 신생혈관성 안 질환인 방법.
14. 실시양태 1 내지 8 중 어느 한 실시양태의 수성 제약 조성물을 동결건조함으로써 제조된 동결건조 제제.
15. (i) 항-VEGF 항체, 수크로스 또는 트레할로스, 시트레이트 또는 히스티딘 완충제 및 계면활성제의 수용액을 제조하는 단계; 및 (ii) 수용액을 동결건조하는 단계를 포함하는, 동결건조물의 제조 방법.
16. 실시양태 15에 있어서, 항-VEGF 항체가 각각 서열식별번호: 5, 6 및 7의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 각각 서열식별번호: 8, 9 및 10의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 것인 방법.
17. 실시양태 16에 있어서, 항-VEGF 항체가 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2의 서열을 포함하는 것인 방법.
18. 실시양태 16 또는 17에 있어서, 항-VEGF 항체가 서열식별번호: 3의 서열을 포함하는 것인 방법.
19. 실시양태 1 내지 8 중 어느 한 실시양태에 있어서, 수성 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에게 항-VEGF 항체의 전달에 사용하기 위한 수성 제약 조성물.
20. 실시양태 1 내지 8 중 어느 한 실시양태에 있어서, 수성 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, VEGF에 의해 매개되는 안 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 수성 제약 조성물.
21. 실시양태 20에 있어서, 상기 안 질환 또는 장애가 신생혈관성 안 질환인 용도.
본원에서 사용되는 바와 같이, 모든 백분율은 달리 언급되지 않는 한, 중량%이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 달리 지시되지 않는 한, 용어 "a" 및 "an"은 "하나", "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 의미하는 것으로 해석된다. 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 본원에서 사용되는 단수 용어는 복수를 포함하고, 복수 용어는 단수를 포함한다.
본원 명세서 전반에 걸쳐 인용된 임의의 특허, 특허 출원 및 참고문헌의 내용은 그 전부가 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 다른 실시양태는 본 명세서를 고려하고 본원에 개시된 본 발명을 실시함으로써 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 본원 명세서 및 실시예는 단지 예시적인 것으로 고려되고, 본 발명의 진정한 범위 및 사상은 첨부되는 청구범위 및 그의 균등물에 의해 표시되는 것이 의도된다.
실시예
하기 실시예는 안과용 제품에 대한 규제 요건을 충족하는, 냉장 보관 조건에서 적어도 18개월의 유효 기간을 갖는 IVT 제제를 제조할 수 있게 하는, 항체 1008을 포함하는 안정한 고농축 용액을 제공하기 위한 적합한 안정화 방법 및 조성물을 확인하기 위해 고안된 제제 개발 노력을 설명한다.
1008 항체는 인간 혈관 내피 성장 인자 A (VEGF-A)에 결합하고 이의 생물학적 활성을 억제하는 단일쇄 항체이다. 표현된 1008의 아미노산 서열은 다음과 같다:
1008을 pH 6.25에서 0.001% 폴리소르베이트 20을 함유한 15 mM 시트레이트 완충제에서 등장 용액으로 제제화할 때 60 mg/ml의 1008의 농도에서 현저한 양의 육안으로 보이지 않는 미립자가 관찰되었다. 이러한 초기 제제의 주요 문제점은 -20℃에서 보관한 경우에도 주사용 안과 용액의 규제 기준 (USP<789>)을 초과하는 미립자 물질이었다.
다음 실시예는 적어도 18개월 동안 2-8℃에서 보관할 때 안정한 60 및 120 mg/ml의 1008의 유리체내 (IVT) 용액의 제제 개발을 요약한 것이다. 제제 개발 노력은 육안으로 보이지 않는 입자의 형성을 억제하고 함량, 순도 및 효능에 대한 USP 요건을 충족하는 데 중점을 두었다.
분석 방법
나타낸 바와 같이 실시예 전체에 걸쳐 하기 방법을 사용하였다.
미세 유동 영상화 (Micro-Flow Imaging) ( MFI ) 방법
부형제 스크리닝의 분석, 60 mg/ml 최적화 연구를 위한 연구 1 및 연구 2에 사용된 MFI 방법은 다음과 같았다:
사용된 총 샘플 부피: 0.50 mL
퍼지 (purge) 부피: 0.20 mL
분석 부피: 0.26 mL
최적 조명 단계는 정제 및 여과된 입자 미함유 물로 수행되었다.
120 mg/ml의 1008 연구 3 및 연구 4의 분석에 사용된 MFI 방법:
사용된 총 샘플 부피: 0.80 mL
퍼지 부피: 0.23 mL
분석 부피: 0.48 mL
최적 조명 단계는 정제 및 여과된 입자 미함유 물로 수행되었다.
SEC 방법
SE-HPLC (크기 배제 크로마토그래피)는 단백질을 그 크기에 따라 분리한다. 분리는 샘플 분자가 다공성 입자 고정상을 통과할 때 샘플 분자의 차등 배제 또는 포함에 의해 달성되었다. TOSOH SuperSW3000 컬럼 (토소 바이오사이언스 엘엘씨 (Tosoh Bioscience LLC), 미국 펜실베니아주 킹 오브 프러시아) 및 214 nm 및 280 nm에서 동시에 작동될 수 있는 검출기가 장착된, 0.25 ml/분의 유속 및 4℃의 샘플 온도를 유지할 수 있는 고성능 액체 크로마토그래피 시스템을 사용하였다. 이 방법은 순도 시험에 사용되었다.
IEX - HPLC 방법
AIEX-HPLC (음이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피)는 단백질을 그의 순 전하 (net charge)에 따라 분리한다. 이 절차는 강한 음이온 교환 컬럼을 보유하는 온도 제어 컬럼 구획 (25℃로 설정), 자동 샘플 추출기 (4℃로 설정) 및 가변 파장 UV 검출기 (280 nm에서 작동 가능)가 포함된, 0.8 ml/분의 유속을 유지할 수 있는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 사용하여 수행하였다.
CGE 방법
모세관 겔 전기영동 방법은 SDS 겔 모세관 전기영동에 의해 분자량 10 kDa 내지 225 kDa의 단백질의 종류 및 순도를 결정하기 위해 수행되었다. 모세관을 베크먼 코울터 (Beckman Coulter) 0.2% SDS 겔 완충제 (pH 8) 독점 (proprietary) 제제로 동적으로 채웠다. 단백질의 분리는 분자체 전기영동에 의해 수행되었다. 단백질 분자량의 대수 (logarithm)는 그의 전기영동 이동도의 역수와 선형이었다. 단백질의 종류는 그의 이동을 분자량 표준물질과 비교하여 결정되었다. 순도는 모 피크 및 불순물의 면적 퍼센트 분석에 의해 결정되었다. 광다이오드 어레이 검출기 (PDA)를 사용하여 220 nm에서 샘플을 분석하였다.
효능 분석
경쟁 ELISA는 효능 시험을 위해 사용되었다. 경쟁적 ELISA는 비오티닐화된 VEGF에 대해 VEGFR2/Fc와 경쟁하는 1008의 능력을 측정하였다. 관찰된 신호는 1008의 양이 증가함에 따라 비오티닐화된 VEGF와 그의 수용체 VEGFR2/Fc의 결합을 효과적으로 차단하기 때문에, 1008의 농도와 반비례 관계에 있었다. 각각의 샘플을 96-웰 미량역가 플레이트에서 1008 참조 표준물질에 대해 분석하고, 샘플의 참조 표준물질에 대한 상대적인 효능을 보고하였다.
실시예 1
부형제 스크리닝
1008을 pH 6.25의 시트레이트 완충제 내에 제제화하였다. 제제의 조성을 표 1에 나타낸다.
<표 1>
Figure 112017052362965-pct00005
유의한 수의 육안으로 보이지 않는 미립자가 상기 제제에서 관찰되었다. 미립자 물질은 -20℃ 보관시에도 USP<789>의 주사용 안과 용액에 대한 규제 기준을 초과하였다.
1008의 보다 안정한 액체 용액을 개발하기 위해 육안으로 보이지 않는 미립자의 형성에 대한 다양한 부형제의 효과가 조사되었다. 다른 부형제를 함유하는 60 mg/ml의 단백질 용액을 40℃에서 보관하고 MFI에 의해 1 - 100 ㎛의 크기로 미립자를 분석하였다. 실험 데이터는 아르기닌, 덱스트란, 아스코르브산, 메티오닌 및 아세트산암모늄을 포함하는 시험된 대부분의 부형제가 미립자의 형성을 감소시키지 않는다는 것을 입증하였다. 수크로스 및 트레할로스와 같은 비-환원 당의 존재 하에서만, 미립자 형성이 유의하게 감소되었다.
추가의 부형제 스크리닝을 수행하였다. 1008 안정성에 대한 부형제의 효과를 ~60 mg/ml의 1008 용액에서 평가하였다. 0.1% 인간 혈청 알부민 (HSA), 0.1% 폴록사머 407, 0.1% 브리즈 (Brij) 35, 3% 글리세린, 50 mM 글리신을 함유하는 단백질 용액을 40℃에서 보관하고, 8일, 21일 및 28일의 보관 후에 MFI, SEC 및 IEX에 의해 샘플을 분석하였다. 결과를 표 2에 나타내었다. 실험 데이터는 시험된 부형제의 존재 하에서 단백질의 불안정성을 입증하였다.
<표 2>
부형제 스크리닝 결과
Figure 112017052362965-pct00006
57 mg/ml의 1008의 안정성을 pH6.25의 20 mM 포스페이트 완충제 내에서 조사하였다. 9% 수크로스 및 0.1% PS80을 함유하는 제제를 40℃에서 6, 14, 27일 보관한 후에 검정하였다. 결과는 표 3에 제시된다.
<표 3>
20 mM 포스페이트 완충제 내에서 57 mg/ml의 1008의 안정성
Figure 112017052362965-pct00007
실시예 2
새로운 제제 개발
연구 1
부형제 스크리닝
pH 6.25에서 0.001% 폴리소르베이트 20 및 0.73% NaCl을 함유하는 20 mM 시트레이트 완충제 중 60 mg/ml 1008의 단백질 용액을 샘플 준비에 사용하였다. 원래의 단백질 용액에서 계면활성제를 제거하기 위해, NAP-25 컬럼을 사용한 완충제 교환을 폴리소르베이트 20이 없는 비히클을 사용하여 먼저 수행하였다. 교환된 단백질 용액을 이어서 10 kDa MWCO의 비바스핀 (Vivaspin) 필터를 사용하여 약 60 mg/ml로 농축하였다. HSA, 글리신, 글리세린, 폴록사머 407 및 브리즈 35의 부형제를 개별적으로 첨가하였다. 준비된 샘플을 이어서 주사기를 사용하여 0.2 um PVDF 막을 통해 4 ml의 투명 유리 바이알로 여과하였다. 약 100 μL의 샘플을 초기 검정에 사용하고, 나머지 샘플은 40℃에서 보관하였다. 각각의 제제의 1 밀리리터 샘플을 MFI, SEC 및 IEX에 의한 분석을 위해 40℃에서 8, 21 및 28일 보관한 후 채취하였다.
완충제 , 당 및 계면활성제의 성분 선택
내부적으로 수행된 부형제 스크리닝 연구에 기초하여, 제제 성분 선택을 위해 2개의 완충제 (시트레이트 및 히스티딘), 당 (수크로스 및 트레할로스) 및 계면활성제 (폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80)를 선택하였다. 연구를 위해 20 mM의 완충제 농도, 264 mM의 당 농도 및 0.1%의 계면활성제 농도가 선택되었다. 완전 인자 실험 연구는 아래 표와 같이 설계되었다.
<표 4>
인자 및 연구 1을 위한 설계
Figure 112017052362965-pct00008
사용된 전체 설계는 아래 표 5에 제시된다.
<표 5>
연구 1을 위한 3개 인자 완전 인자 설계
Figure 112017052362965-pct00009
다른 파라미터:
농도/pH 50 - 60 mg/ml 1008, pH 6.25
완충제 교환 NAP25 컬럼, 비바스핀 10 kDa MWCO로 농축
샘플 크기/Pkg 나사 마개가 있는 4 mL 투명 유리 바이알 내의 2-2.5 mL
보관/채취 40℃/0, 1, 2 및 4주
분석 MFI, SEC 및 IEX
샘플 준비를 위해 0.001% 폴리소르베이트 20을 함유한 원래의 완충제 내의 60 mg/ml 1008의 단백질 용액을 사용하였다. 상이한 완충제/당 조합물 (20 mM 시트레이트/264 mM 트레할로스, 20 mM 시트레이트/264 mM 수크로스, 20 mM 히스티딘/264 mM 트레할로스, 20 mM 히스티딘/264 mM 수크로스)을 갖는 4개의 새로운 비히클 완충제를 제조하였다. 1008 약물 물질 (DS)을 일러스트라 (Illustra) NAP-25 컬럼 (지이 헬쓰케어 (GE Healthcare))을 사용하여 비히클 완충제로 먼저 교환하였다. 컬럼을 25 mL의 시트레이트 완충제로 평형화하였다. 이어서, 2 mL의 1008 DS를 컬럼에 로딩하였다. DS 용액이 완전히 컬럼으로 이동한 후, 컬럼을 평형화하는데 사용된 것과 동일한 완충제 2 mL로 컬럼을 세척하였다. 컬럼으로부터 용리된 6 mL 용액을 비바스핀 6 농축기 (10 KD MWCO, 지이 헬쓰케어)에서 수집하였다. 이어서, 6 mL의 용리된 용액을 베크먼 GS-15R 원심분리기를 사용하여 9384 xg 및 4℃에서 약 2 mL로 농축하였다. OD280을 사용하여 NanoDrop 1000 분광광도계로 단백질 농도를 측정하였다. 폴리소르베이트 20 (PS20) 또는 폴리소르베이트 80 (PS80)을 최종 농도 0.1%로 제제에 첨가하였다. 이어서, 제조된 제제를 0.2 ㎛ PVDF 주사기 필터를 통해 여과하고, 4 mL의 투명 유리 바이알에 충전하였다. 약 100 ㎕의 샘플을 초기 검정에 사용하고, 샘플의 나머지는 40℃에서 보관하였다. 1밀리리터 샘플을 MFI, SEC 및 IEX로 분석하기 위해 40℃에서 1, 2 및 4주 동안 보관한 후 채취하였다.
정성적 연구는 제제를 위한 최적의 당/계면활성제/완충제 성분을 선택하기 위해 수행되었다. 2개의 완충제 (시트레이트 및 히스티딘), 당 (수크로스 및 트레할로스), 계면활성제 (폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80)를 상기 논의한 연구 설계에 사용하였다. 가속 조건 (40℃) 하에서 4주 안정성 연구를 수행하였다. 안정성 샘플은 SEC, IEX 및 MFI로 검정하였다. 표 6은 SEC, IEX 및 μDSC에 의한 융점 (Tm)에 의한 안정성 결과를 나타낸다.
<표 6>
40℃에서 60 mg/ml 1008에 대한 인자의 정성적 분석
Figure 112017052362965-pct00010
*상대 피크 면적을 사용한 % 손실
안정성 결과는 미니탭 (미니탭 인크. (Minitab Inc.), 미국 펜실베니아 주립 대학)을 사용하여 분석하였다. SEC 및 IEX가 같은 추세를 보였으므로, SEC 데이터만 분석하고, 미니탭에 의해 보고되었다. SEC 결과는 계면활성제가 유일한 중요한 요소임을 입증하였고, 반응에 영향을 미치는 것으로 보이는 다른 인자는 완충제 선택 및 완충제와 당 사이의 상호작용 (보다 작은 정도의)을 포함하였다. SEC 데이터는 최적 제제 성분이 완충제로서의 시트레이트, 계면활성제로서의 폴리소르베이트 80, 및 당으로서의 수크로스임을 제시하였다.
MFI에 의한 미립자에 대한 실험 결과도 미니탭에 의해 분석하였다. 평가된 3개의 인자 (당, 계면활성제 및 완충제)는 모두 유의하지 않은 것으로 나타났다 (α=0.05). 미립자에 대한 주요 효과를 비교하면, 시트레이트는 히스티딘보다 양호하고; PS80은 PS20보다 양호하고; 수크로스는 트레할로스와 유사하거나 약간 더 양호하였다. 따라서, 완충제으로서의 시트레이트, 계면활성제로서의 폴리소르베이트 80 및 당으로서의 수크로스가 추가 연구를 위해 선택되었다.
연구 2
완충제 , 당 및 계면활성제의 농도 최적화
각각의 선택된 제제 성분에 대한 최적 농도를 결정하기 위해, 2개의 중심점을 갖는 2가지 수준에서 3개 인자를 포함하는 완전 인자 연구를 각각 시트레이트 및 히스티딘 완충제에서 수행하였다. 3개 인자는 완충제 (시트레이트 또는 히스티딘), 폴리소르베이트 80 및 수크로스이다. 인자 및 설계 공간은 표 7에 요약되어 있고, 자세한 실험 설계는 표 8 및 표 9에 나와 있다.
<표 7>
인자 및 설계 연구 2
Figure 112017052362965-pct00011
<표 8>
시트레이트 완충제의 완전 인자 설계
Figure 112017052362965-pct00012
<표 9>
히스티딘 완충제의 완전 인자 설계
(2개의 중심점이 있는 2가지 수준에서 3개의 인자)
Figure 112017052362965-pct00013
개별 제제를 제조하기 위해, pH 6.25의 0.001% 폴리소르베이트 20/0.73% NaCl 을 함유하는 시트레이트 완충제 중 60 mg/ml 1008의 단백질 용액을 사용하였다. 단백질 용액을 NAP-25 컬럼을 사용하여 비히클로 먼저 완충제 교환하였다. 이 비히클은 완충제 및 수크로스를 그의 목표 농도로 함유하였다. 교환된 단백질 용액을 비바스핀 10 kDa MWCO를 사용하여 약 60 mg/ml의 농도로 농축하였다.
이어서, 폴리소르베이트 80 및 염화나트륨의 배치 양 (batch amount)을 첨가하여 최종 제제 조성물을 제조하였다. 각각의 샘플 내의 단백질 농도는 280 nm에서 UV로 측정한 흡광도를 사용하여 이론적 소광 계수로 확인하였다.
이어서, 제조된 제제를 0.2 ㎛ PVDF 주사기 필터를 통해 4 ml의 깨끗한 투명 유리 바이알로 여과하였다. 약 100 μL의 샘플을 SEC 및 IEX에 의한 초기 검정에 사용하고, 약 2-2.5 mL의 샘플을 40℃에서 보관하였다. 약 600 μL 샘플을 MFI, SEC 및 IEX에 의한 분석을 위해 40℃에서 11, 20 및 27일 보관한 후 채취하였다.
연구 1 결과에 기초하여, 각각의 선택된 제제 성분에 대한 최적 농도를 결정하기 위해, 2개의 중심점을 갖는 2가지 수준에서 3개 인자를 포함하는 완전 인자 연구를 각각 시트레이트 및 히스티딘 완충제에서 수행하였다. 시험된 샘플을 40℃에서 보관하고, MFI, SEC 및 IEX 분석을 위해 0, 1.6, 2.9 및 4주에 채취하였다. 그 결과를 표 10 및 표 11에 제시하였다.
<표 10>
시트레이트 완충 용액에 대한 안정성 결과
Figure 112017052362965-pct00014
Figure 112017052362965-pct00015
Figure 112017052362965-pct00016
Figure 112017052362965-pct00017
<표 11>
히스티딘 완충 용액의 안정성 결과
Figure 112017052362965-pct00018
Figure 112017052362965-pct00019
Figure 112017052362965-pct00020
실험 데이터는 미니탭에 의해 분석하였다. 시트레이트 완충제에서 SEC 결과의 경우, 계면활성제가 단백질 응집에 영향을 미치는 주요 인자인 반면, 수크로스, 수크로스와 폴리소르베이트 80 사이의 상호작용 및 완충제 농도는 덜 유의한 역할을 하였다. 수크로스 농도가 높고 폴리소르베이트 80 농도가 낮을수록 단백질 안정성이 좋아졌다. 단백질 안정성은 응집에 약간 영향을 주고, 보다 높은 시트레이트 완충제 농도는 약간 더 양호한 단백질 안정성을 촉진하였다.
시트레이트 완충제에서 MFI 결과의 경우, 수크로스 및 폴리소르베이트 80의 인자뿐만 아니라 수크로스와 폴리소르베이트 80의 상호작용이 미립자 형성에서 유의한 역할을 하였다. 높은 수크로스 및 높은 폴리소르베이트 80은 미립자 형성을 유의하게 억제하였고, 10-20 mM 범위의 완충제 농도는 미립자 형성에 약간 영향을 미치고, 보다 낮은 완충제 농도가 바람직하였다.
히스티딘 완충제 용액에 대한 미니탭 분석에 의한 결과는 단백질 응집에 영향을 주는 주요 인자는 계면활성제 폴리소르베이트 80이었고, 완충제 농도와 폴리소르베이트 80 사이의 상호작용 및 수크로스는 덜 유의한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다.
폴리소르베이트 80이 적으면 단백질 안정성이 좋아졌다. 완충제 농도 및 수크로스 농도는 단백질 응집에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
히스티딘 완충제에서의 MFI 결과에 있어서, 폴리소르베이트 80, 수크로스 및 수크로스와 폴리소르베이트 80 사이의 상호작용은 미립자 형성에 유의한 역할을 하였다. 높은 수크로스 및 낮은 폴리소르베이트 80 및 낮은 완충제 농도가 미립자 형성을 억제하기에 바람직하였다.
pH 최적화
0.1% NaCl, 6.75% 수크로스 및 0.05% PS80을 함유한 15 mM 시트레이트 완충제에서 6개의 pH 조건 (5.0, 6.0, 6.25, 6.50, 6.75 및 7.0) 하에서 1008의 응집 거동에 대한 pH의 영향을 조사하였다. 1008 약물 물질을 일러스트라 NAP-10 컬럼 (지이 헬쓰케어)을 사용하여 다른 pH의 비히클 (PS80 없음)로 먼저 교환하였다. 컬럼을 15 mL의 시트레이트 완충제로 먼저 평형화하였다. 이어서, 1 mL의 1008 DS를 컬럼에 로딩하였다. DS 용액이 완전히 컬럼으로 이동한 후, 컬럼을 평형화하는데 사용된 것과 동일한 시트레이트 완충제 2 mL로 컬럼을 세척하였다. 컬럼으로부터 용리된 2 mL 용액을 비바스핀 2 농축기 (10 KD MWCO, 지이 헬쓰케어)에서 수집하였다. 이어서, 2 mL의 용리된 용액을 베크먼 GS-15R 원심분리기를 사용하여 9384 xg 및 4℃에서 약 1 mL로 농축하였다. 이어서, NanoDrop 1000 분광광도계로 단백질 농도를 측정하였다. 이 연구의 최종 1008 농도는 약 70 mg/ml로 결정되었다. PS80을 최종 표적 농도 0.05%로 제제에 첨가하였다. 동적 탁도 검정은 온도 조절을 위한 2-위치 셀 고정기 (cell holder) 및 물 배치 (batch)를 갖는 퍼킨엘머 (PerkinElmer) 람다 (Lambda) 35 분광광도계를 사용하여 수행되었다. 경로 길이가 1 cm인 스타나 (Starna) 서브마이크로 (submicro) 부피 석영 셀 (스타나 사이언티픽 엘티디., (Starna Scientific Ltd.), 영국)에서, 250 ㎕의 1008 제제 또는 대응하는 비히클을 첨가하였다. 세포를 55℃로 예열한 셀 고정기에 넣었다. 1008 제제 중 OD350의 변화를 120분 동안 모니터링하였다. 상이한 pH의 제제에 대해 수득된 OD350 데이터를 비교를 위해 시간에 대해 플로팅하였다.
탁도에 근거한 동역학적 검정을 사용하여, 1008의 응집 거동에 대한 pH 효과를 약 70 mg/ml의 1008을 함유하는 pH 5.0 내지 7.0의 제제를 사용하여 연구하였다. 탁도 검정에서, OD350의 급격한 증가는 단백질의 주요 응집 사건과 관련되었다. 따라서, 각각의 제제의 OD350 증가에 필요한 인큐베이팅 시간의 차이는 제제 내의 단백질의 상이한 물리적 안정성을 반영할 수 있다. 도 1에 도시된 바와 같이, 1008은 OD350의 급격한 증가 전에 가장 긴 인큐베이팅 시간을 갖기 때문에, 시험된 제제화 조건 하에서 pH 6.75에서 가장 안정한 것으로 나타났다. 유사한 결과를 갖는 반복된 실험을 통해, 시험된 제제가 pH 6.75에서 가장 안정하다는 것을 확인하였다.
연구 3
부형제 및 고활성 농도의 영향
단백질 (60-120 mg/ml), 수크로스 (4.5-9.0%), 시트레이트 완충제 (10-20 mM) 및 폴리소르베이트 80 (0.01-0.1%)의 농도를 포함하는 주요 제제화 조건의 효과를 조사하기 위해 1/2 인자 연구 (표 12)를 수행하였다.
<표 12>
연구 3을 위한 연구 설계
Figure 112017052362965-pct00021
상기 제제를 제조하기 위해, pH 6.5의 20% 시트레이트 완충제 및 pH 6.5의 20 mM 시트레이트 완충제 중의 30% 수크로스 원액 용액을 먼저 제조하였다. 이어서, 시트레이트 완충제, 수크로스 원액 및 주사용수를 적당한 비율로 혼합하여 10 mM 시트레이트 내의 4.5% 수크로스, 10 mM 시트레이트 내의 9% 수크로스, 20 mM 시트레이트 내의 4.5% 수크로스, 20 mM 시트레이트 내의 9% 수크로스 및 15 mM 시트레이트 내의 6.75% 수크로스인 PS80을 함유한 5개의 완충제를 생성하였다. 이어서, 1008 DS를 일러스트라 NAP-25 컬럼 (지이 헬쓰케어)을 사용하여 상기 5개의 완충제로 교환한 후, 비바스핀 6 농축기 (5 KD MWCO, 지이 헬쓰케어)로 5℃에서 8000x로 농축하였다. 원심분리 동안 NanoDrop 2000 분광광도계로 각각의 샘플의 단백질 농도를 결정하였다. 처음 4개의 완충제 내의 샘플의 경우, 1008 농도가 ~70 mg/ml에 도달했을 때 샘플의 일부를 농축기에서 채취하여, 적절한 양의 상응하는 완충제를 첨가하고 10% PS80에 첨가함으로써 60 mg/ml API를 함유하는 제제 (표 12의 #1, 3, 5 및 7)를 제조하기 위해 사용하였다. 나머지 샘플을 130 mg/ml 초과로 추가 농축한 후, 완충제 및 10% PS80을 첨가하여 최종 제제 (표 12의 #2, 4, 6 및 8)를 얻었다. 표 12의 제제 #9 및 10은 완충제 #5로 교환된 1008 샘플을 약 108 mg/ml로 농축한 후, 완충제 및 10% PS80과 혼합하여 최종 제제 농도에 도달시킴으로써 제조하였다. 모든 최종 제제의 pH 값을 측정하고, 6.5로 조정하였다.
상기한 것으로부터 변형된 탁도 검정을 평가용 분석 도구로 사용하였다. 이 수정된 탁도 검정에서, 12-셀 위치 Cary 100 UV-Vis 분광광도계가 사용되었다. 이 검정에 사용된 큐벳은 마개가 있는 1mm 석영 큐벳이었다. 각각의 큐벳에, 300 μL의 샘플을 시험을 위해 첨가하였다. 360 nm에서의 광학 밀도 변화를 55℃에서 인큐베이팅된 제제에 대해 모니터링하였다.
부형제 및 고활성 농도의 영향
연구 3의 모든 제제의 측정된 1008 농도 및 최종 pH는 표 13에 요약되어 있다. 상이한 수크로스, PS80 농도 및 완충제 농도를 갖는 저, 중 및 고 1008 농도 (표 4.3.1.-1)를 갖는 제제를 55℃에서 인큐베이팅하고, OD360 변화를 모니터링하였다. 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 다른 응집 경향이 제제에서 관찰되었다. 인큐베이팅이 시작될 때 거의 즉시 응집된 2개의 제제는 비교적 더 높은 1008 농도 (~120 mg/ml) 및 더 낮은 수크로스 농도 (4.5%)를 함유하는 제제 2 및 6이었다. 다른 한편으로, 비교적 더 낮은 1008 농도 (~60 mg/ml) 및 더 높은 수크로스 농도 (9%)를 함유하는 제제 3 및 7은 다른 제제보다 느리게 응집되었다. 중간 1008 및 수크로스 농도의 다른 조합의 응집 경향은 상기 두 군 사이에 해당하였다.
<표 13>
연구 3에 대한 최종 제제화 조건
Figure 112017052362965-pct00022
각각의 제제의 OD360이 0.25에 도달하기 위한 시간을 기준으로 사용하여, 다른 제제 인자의 효과를 비교하였다. 결과는 수크로스가 1008의 응집에 가장 큰 영향을 미쳤고 API 농도가 그 다음으로 영향을 준다는 것을 시사하였다. 수크로스 및 API 농도의 효과는 반대였고, 이것은 보다 높은 수크로스 및 보다 낮은 API 농도가 더 우수한 제제 안정성에 바람직하다는 것을 나타냈다. 다른 두 가지 인자, 즉 완충제 농도 및 PS80은 더 적은 영향을 나타냈다.
연구 4
활성 및 수크로스 농도에 대한 추가 연구
상기 연구 3의 결과에 기초하여, pH 6.50의 0.05% PS 80을 함유하는 15 mM 시트레이트 완충제 내의 단백질 농도 (60 내지 120 mg/ml) 및 수크로스 농도 (6 내지 9%의 보다 좁은 범위의)의 영향을 추가로 조사하기 위해 연구 4를 수행하였다. 연구 설계는 아래 표에 제시된다.
<표 14>
연구 4를 위한 연구 설계
Figure 112017052362965-pct00023
제제를 제조하기 위해, 약 80 g의 1008 약물 물질을 TFF 시스템에 로딩한 다음, 약물 물질 부피의 약 5배의 6% 수크로스를 함유하는 15 mM 시트레이트 완충제로 완충제 교환을 수행하였다. 완충제 교환 후, 단백질 용액의 부피를 TFF 시스템을 사용하여 초기 부피의 약 절반으로 감소시켰다. 약 44 g의 농축된 1008 용액이 회수되었고, 농축된 단백질은 NanoDrop 2000 분광광도계에 의해 측정된 약 112 mg/ml이었다. 이어서, 농축된 1008 용액은 각각의 제제 내에 상응하는 최종 API, 수크로스 및 PS80 농도를 얻기 위해 적절한 양의 10% PS80 및 0, 6% 및/또는 40% 수크로스를 함유하는 15 mM 시트레이트 완충제와 혼합함으로써 제제 #1, 3, 5, 7-12를 제조하기 위해 사용하였다. 1008 용액의 나머지는 약 132 mg/ml로 추가로 농축되어 제제 #2 및 #4를 동일한 방식으로 제조하였다. 마지막으로, 제제 #6은 1008 용액을 약 171 mg/ml로 농축함으로써 제조하였고, 단백질, 수크로스 및 PS80의 농도는 10% PS80 및 0, 6% 및/또는 40% 수크로스를 함유하는 15 mM 시트레이트 완충제로 조절하였다. 각각의 제제 중 1008의 최종 농도를 NanoDrop 2000 분광광도계로 측정하고, pH를 6.5로 조정하였다.
상기한 탁도 검정을 이용하여 샘플을 분석하였다. 8개의 선택된 제제 (#1-4 및 #7-10)를 40℃의 예비 인큐베이터에서 6주 동안 보관하고, MIF, IEX 및 SEC 방법으로 상이한 시점에서 분석하였다.
표 15에 열거된 12개의 제제를 조사하였다.
<표 15>
연구 4에 대한 탁도 검정의 최종 제제 조건 및 Tm
Figure 112017052362965-pct00024
55℃에서의 탁도 검정을 사용하여 제제의 응집을 모니터링하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, 응집의 상이한 정도는 동일한 열 응력 하에서의 제제화에 의해 제시되었다. 상대적으로 더 높은 1008 및 낮은 수크로스 농도를 갖는 제제 (예컨대, 표 15의 제제 #2 및 6)는 인큐베이팅시 빠르게 응집된 것이었다. 비교적 더 낮은 1008 및 높은 수크로스 농도를 갖는 제제 (표 15의 제제 #3 및 5)는 모든 나머지 제제보다 더 느리게 응집되었다. 다양한 제제에 대한 탁도 검정으로부터 수득된 곡선을 시그모이드 (sigmoidal) 함수에 피팅하였다. 전이 중간에 대응하는 인큐베이팅 시간을 각각의 제제에 대해 Tm (전이 중간점 시간)으로 기록하였다. 결과는 표 15에 제시된다. 수크로스 및 1008 농도에 대한 Tm 값은 단백질 응집에 대한 수크로스 및 1008 농도의 반대되는 효과를 보여주었다.
55℃에서 탁도 검정을 사용하는 연구 이외에, 40℃에서 8개의 선택된 제제의 안정성을 MFI, SEC 및 IEX에 의해 6주에 걸쳐 모니터링하였다. 제제 및 결과는 표 16 내지 23에 나타내었다. 탁도 검정과 일치하게, MFI 결과는 1008 농도가 높은 제제 (~120 mg/ml)가 API 농도가 보다 낮은 제제에 비해 더 많은 입자, 특히 25 ㎛보다 큰 입자를 형성한다는 것을 보여주었다. MFI 결과는 유사한 양의 1008을 갖는 제제 (제제 #7 내지 #10)에 대한 수크로스 농도의 명확한 효과를 보여주지 않았다. 도 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 40℃에서 6주간 보관한 후에, 1008 농도가 높은 2개의 제제 (#2 및 4)가 가장 많이 분해되었고, ~60 mg/ml 1008을 갖는 제제는 다른 모든 제제보다 덜 분해되었다. ~90 mg/ml 1008을 갖는 제제의 경우, 보다 낮은 수크로스 농도 (제제 #7)에서보다는 더 높은 수크로스 농도 (제제 #8)에서 약간 더 적은 분해가 관찰되었다. IEX 결과는 SEC와 동일한 추세를 보여주었다.
<표 16>
연구 4의 제제 #1에 대한 40℃에서의 가속 안정성 연구의 결과
Figure 112017052362965-pct00025
<표 17>
연구 4의 제제 #2에 대한 40℃에서의 가속 안정성 연구의 결과
Figure 112017052362965-pct00026
<표 18>
연구 4의 제제 #3에 대한 40℃에서의 가속 안정성 연구의 결과
Figure 112017052362965-pct00027
<표 19>
연구 4의 제제 #4에 대한 40℃에서의 가속 안정성 연구의 결과
Figure 112017052362965-pct00028
<표 20>
연구 4의 제제 #7에 대한 40℃에서의 가속 안정성 연구의 결과
Figure 112017052362965-pct00029
<표 21>
연구 4의 제제 #8에 대한 40℃에서의 가속 안정성 연구의 결과
Figure 112017052362965-pct00030
<표 22>
연구 4의 제제 #9에 대한 40℃에서의 가속 안정성 연구의 결과
Figure 112017052362965-pct00031
<표 23>
연구 4의 제제 #10에 대한 40℃에서의 가속 안정성 연구의 결과
Figure 112017052362965-pct00032
실시예 3
예비 안정성 연구
대조군 제제
예비 안정성은 대조군으로서 pH 6.25의 20 mM 시트레이트, 0.001% PS20 내의 60 mg/ml 1008 용액의 제제에 대해 조사하였다. 대조군 제제를 0.2 ㎛ 주사기 필터를 통해 여과하고, 40℃, 주변 실온 및 냉장고에 보관하였다. 샘플은 40℃ 샘플의 경우 0, 2 및 5주에, 실내 온도 및 냉장고에 보관된 샘플의 경우 26주에 채취하였다. 선택된 안정성 샘플을 pH, 오스몰랄농도, A280에 의한 함량, SEC, IEX CGE 및 ELISA에 대해 시험하였다. 그 결과를 표 24에 나타낸다.
<표 24>
대조군 제제에 대한 예비 안정성 결과
(pH 6.25의 20 mM 시트레이트, 0.001% PS20 내의 60 mg/ml 1008)
Figure 112017052362965-pct00033
*샘플은 흰색 침전과 함께 흐린 것으로 가시적으로 관찰되었다.
대조군 제제에 대한 또 다른 연구를 pH6.25의 20 mM 시트레이트, 0.001% PS20 및 0.73% NaCl 내의 60 mg/ml 1008 용액에 대해 수행하였다. 제제를 0.2 ㎛ 주사기 필터로 여과하고 40℃에서 보관하였다. MFI 분석을 위해 1, 2, 3, 및 4주에 샘플를 채취하였다. 그 결과를 표 25에 나타낸다.
<표 25>
40℃에서 POC 제제에 대한 안정성 결과
(pH 6.25의 20 mM 시트레이트, 0.001% PS20 내의 60 mg/ml 1008)
Figure 112017052362965-pct00034
9% 수크로스 및 0.5% 폴리소르베이트 80을 함유한 60 mg /ml 1008에 대한 예비 안정성 연구
예비 안정성 연구를 9% 수크로스 및 0.5% PS80을 함유하는 60 mg/ml 1008 제제에 대해 수행하였다. 제제를 0.2 ㎛ 주사기 필터를 통해 여과하고 40℃에서 보관하였다. 샘플을 1.6, 2.9 및 4주에 채취하여 MFI, SEC 및 IEX로 분석하였다. 결과는 표 26에 요약되어 있다.
<표 26>
40℃에서 60 mg/ml 1008 제제에 대한 안정성 결과
(pH 6.25의 20 mM 시트레이트, 9% 수크로스 및 0.5% PS80 내의 60 mg/ml 1008)
Figure 112017052362965-pct00035
pH 6.25의 60 mg /ml 1008, 9% 수크로스 , 20 mM 시트레이트 , 0.1% PS80에 대한 파일럿 안정성 연구
표 27에서와 같이 pH6.25의 9% 수크로스, 20 mM 시트레이트, 0.1% PS80을 함유하는 제제에 대해 60 mg/ml 1008 용액의 실시간 안정성 연구를 수행하였다. 안정성 샘플을 2-8℃, 25℃, 40℃ 및 조명 캐비넷 (LC)에서 보관하고; 또한 3 사이클의 동결-해동 (FT)을 실시하였다. 샘플을 표 28에 제시된 스케쥴에 따라 채취하고, pH, 삼투압, MFI, 함량, SEC, IEX, CGE 및 효능과 같은 다양한 분석 방법에 의해 분석하였다.
<표 27>
파일럿 안정성 제제의 조성
Figure 112017052362965-pct00036
<표 28>
파일럿 안정성 연구를 위한 보관 조건 및 채취 스케쥴
Figure 112017052362965-pct00037
초기 단계에서, 60 mg/ml 1008 용액의 실시간 안정성 연구가 시작되었다. 표 29에 나타낸 바와 같이, 제제는 pH6.25에서 9% 수크로스, 20 mM 시트레이트, 0.1% PS80을 함유하였다. 샘플은 2-8℃, 25℃, 40℃ 및 조명 캐비넷 (LC)에 보관하였고; 또한 3 사이클의 동결-해동 (FT)을 실시하였다. 샘플을 표 30에 제시된 스케쥴에 따라 채취하고, 다양한 분석 방법에 의해 분석하였다. 안정성 결과는 표 31-33에 요약되어 있다.
<표 29>
파일럿 안정성 제제의 조성
60 mg/ml 1008 (1008) 용액
Figure 112017052362965-pct00038
<표 30>
파일럿 안정성 연구를 위한 보관 조건 및 채취 스케쥴
Figure 112017052362965-pct00039
<표 31>
pH6.25의 6% 1008, 9% 수크로스, 20 mM 시트레이트, 0.1% PS80에 대한 파일럿 안정성 연구의 결과 (파트 1/3)
Figure 112017052362965-pct00040
<표 32>
pH6.25의 6% 1008, 9% 수크로스, 20 mM 시트레이트, 0.1% PS80에 대한 파일럿 안정성 연구의 결과 (파트 2/3)
Figure 112017052362965-pct00041
<표 33>
pH6.25의 6% 1008, 9% 수크로스, 20 mM 시트레이트, 0.1% PS80에 대한 파일럿 안정성 연구의 결과 (파트 3/3)
Figure 112017052362965-pct00042
시트레이트 완충제에서의 예비 안정성: 15 mM 시트레이트 /6.75% 수크로 스/0.05% PS80/pH 6.75 내의 60 mg/ml 1008
시트레이트 완충제에서의 예비 안정성은 15 mM 시트레이트/6.75% 수크로스/0.05% PS80/pH6.75 내의 60 mg/ml 1008의 제제에 대해 조사되었다. 안정성 샘플은 5℃ 및 25℃에서 보관하고, 동결-해동 사이클을 실시하였다. 샘플을 하기 표에 제시된 스케쥴에 따라 채취하고, 외관, pH, 오스몰랄농도, MFI, 함량, SEC 및 IEX에 대해 분석하였다.
<표 34>
임시 안정성 연구를 위한 보관 조건 및 채취 스케쥴
Figure 112017052362965-pct00043
유사하게, 히스티딘 완충제 내에서의 예비 안정성은 15 mM 히스티딘/6.75% 수크로스/0.05% PS80/pH6.75 내의 60 mg/ml 1008의 제제에 대해 조사되었다. 안정성 샘플은 5℃ 및 25℃에서 보관하였다. 샘플에 대해 또한 동결-해동 사이클을 실시하였다. 샘플을 하기 표에 제시된 스케쥴에 따라 채취하고, 외관, pH, 오스몰랄농도, MFI, 함량, SEC 및 IEX에 대해 분석하였다.
<표 35>
임시 안정성 연구를 위한 보관 조건 및 채취 스케쥴
Figure 112017052362965-pct00044
실험 데이터는 아래 표에 제시되어 있다.
<표 36>
25℃에서 임시 안정성 연구의 결과 (파트 1/2)
15 mM 시트레이트/6.75% 수크로스/0.05% PS80/pH6.75 내의 60 mg/ml 1008
Figure 112017052362965-pct00045
<표 37>
임시 안정성 연구의 결과 (파트 2/2)
15 mM 시트레이트/6.75% 수크로스/0.05% PS80/pH6.75 내의 60 mg/ml 1008
Figure 112017052362965-pct00046
<표 38>
25℃에서 임시 안정성 연구의 결과 (파트 1/2)
15 mM 히스티딘/6.75% 수크로스/0.05% PS80/pH6.75 내의 60 mg/ml 1008
Figure 112017052362965-pct00047
<표 39>
임시 안정성 연구의 결과 (파트 2/2)
15 mM 히스티딘/6.75% 수크로스/0.05% PS80/pH6.75 내의 60 mg/ml 1008
Figure 112017052362965-pct00048
실험 데이터는 시험된 제제의 안정성이 60 mg/ml의 단백질 농도에서의 대조군 제제의 안정성에 비해, 특히 미립자 물질의 형성을 억제할 때 유의하게 향상되었음을 나타냈다.
확인된 안정한 용액 제제는 표 40에 나타낸 바와 같이 15 mM 시트레이트/6.75% 수크로스/0.0505% PS80을 함유하였다.
<표 40>
Figure 112017052362965-pct00049
본 발명 및 그 실시양태가 상세하게 설명되었다. 그러나, 본 발명의 범위는 명세서에서 설명된 임의의 과정, 제조, 물질의 조성, 화합물, 수단, 방법 및/또는 단계의 특정 실시양태로 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명의 사상 및/또는 본질적인 특징을 벗어나지 않으면서 개시된 물질에 대한 다양한 변형, 대체 및 변경이 이루어질 수 있다. 따라서, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 본원에서 설명된 실시양태와 실질적으로 동일한 기능을 수행하거나 실질적으로 동일한 결과를 달성하는 추후 변형, 대체 및/또는 변경이 본 발명의 상기 관련 실시양태에 따라 이용될 수 있음을 본 개시내용으로부터 용이하게 이해할 것이다. 따라서, 다음 청구범위는 본원에 개시된 과정, 제조, 물질의 조성, 화합물, 수단, 방법 및/또는 단계의 변형, 대체 및 변경을 그 범위 내에 포함하는 것이 의되된다. 청구범위는 명시된 경우를 제외하고는 설명된 순서 또는 요소로 제한되는 것으로 해석되지 않아야 한다. 첨부된 청구범위의 범주를 벗어나지 않으면서 형태 및 세부 내용에 대한 다양한 변경이 이루어질 수 있음을 이해해야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Novartis AG Zhang, Huixiang Boring, Charles Kulshreshtha, Alok Zeng, Yuhon Wan, Li Alani, Laman <120> STABLE PROTEIN SOLUTION FORMULATION CONTAINING HIGH CONCENTRATION OF AN ANTI-VEGF ANTIBODY <130> PAT056450-WO-PCT <140> US 14/934,666 <141> 2015-11-06 <150> US 62/088,061 <151> 2014-12-05 <150> US 62/076,770 <151> 2014-11-07 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Gly Phe Ile Asp Pro Asp Asp Asp Pro Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Gly Gly Asp His Asn Ser Gly Trp Gly Leu Asp Ile Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain <400> 2 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ile Ile His Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Tyr Leu Ala Ser Thr 85 90 95 Asn Gly Ala Asn Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 3 <211> 251 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic antibody construct <400> 3 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ile Ile His Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Tyr Leu Ala Ser Thr 85 90 95 Asn Gly Ala Asn Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 130 135 140 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu 145 150 155 160 Thr Asp Tyr Tyr Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 165 170 175 Leu Glu Trp Val Gly Phe Ile Asp Pro Asp Asp Asp Pro Tyr Tyr Ala 180 185 190 Thr Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 195 200 205 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 210 215 220 Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Asp His Asn Ser Gly Trp Gly Leu Asp Ile 225 230 235 240 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 4 <211> 252 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic antibody construct <400> 4 Met Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ile Ile His Ser 20 25 30 Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Tyr Leu Ala Ser 85 90 95 Thr Asn Gly Ala Asn Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 130 135 140 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser 145 150 155 160 Leu Thr Asp Tyr Tyr Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 165 170 175 Gly Leu Glu Trp Val Gly Phe Ile Asp Pro Asp Asp Asp Pro Tyr Tyr 180 185 190 Ala Thr Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys 195 200 205 Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 210 215 220 Val Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Asp His Asn Ser Gly Trp Gly Leu Asp 225 230 235 240 Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR H1 <400> 5 Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr Tyr Tyr Met Thr 1 5 10 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR H2 <400> 6 Phe Ile Asp Pro Asp Asp Asp Pro Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR H3 <400> 7 Gly Asp His Asn Ser Gly Trp Gly Leu Asp Ile 1 5 10 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR L1 <400> 8 Gln Ala Ser Glu Ile Ile His Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR L2 <400> 9 Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR L3 <400> 10 Gln Asn Val Tyr Leu Ala Ser Thr Asn Gly Ala Asn 1 5 10

Claims (32)

  1. 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4의 서열로 이루어진 60 mg/ml 내지 120 mg/ml의 항-VEGF 항체, 및 4.5% 내지 9% (w/v) 수크로스 또는 5% 내지 10% (w/v) 트레할로스, 0.006% 내지 0.012% 시트르산 (w/v), 0.2% 내지 0.6% 시트르산 삼나트륨 이수화물 (w/v), 및 0.01% 내지 0.1% 폴리소르베이트 80 (w/v)을 포함하고, 조성물의 pH가 6.3 내지 7.3인 수성 안과용 제약 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 조성물의 pH가 6.8인 수성 안과용 제약 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 항체가 단일쇄 Fv (scFv) 항체 단편인 수성 안과용 제약 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 항-VEGF 항체의 농도가 60 mg/ml이고, 수크로스의 농도가 6.75% (w/v)이고, 시트르산의 농도가 0.01% (w/v)이고, 시트르산 삼나트륨 이수화물의 농도가 0.428% (w/v)이고, 폴리소르베이트 80의 농도가 0.05% (w/v)인 수성 안과용 제약 조성물.
  5. 제4항에 있어서, pH가 6.8인 수성 안과용 제약 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 항-VEGF 항체의 농도가 120 mg/ml이고, 수크로스의 농도가 6.8% (w/v)이고, 시트르산의 농도가 0.01% (w/v)이고, 시트르산 삼나트륨 이수화물의 농도가 0.428% (w/v)이고, 폴리소르베이트 80의 농도가 0.05% (w/v)인 수성 안과용 제약 조성물.
  7. 제6항에 있어서, pH가 6.8인 수성 안과용 제약 조성물.
  8. 제1항의 수성 안과용 제약 조성물을 포함하는 전달 장치이며, 여기서 전달 장치는 미리 충전된 주사기인 전달 장치.
  9. 제4항의 수성 안과용 제약 조성물을 포함하는 전달 장치이며, 여기서 전달 장치는 미리 충전된 주사기인 전달 장치.
  10. 제6항의 수성 안과용 제약 조성물을 포함하는 전달 장치이며, 여기서 전달 장치는 미리 충전된 주사기인 전달 장치.
  11. 제1항에 있어서, 항-VEGF 항체를 대상체에게 전달하기 위해 사용되는 수성 안과용 제약 조성물.
  12. 제1항에 있어서, VEGF에 의해 매개되는 안 질환 또는 장애의 치료에서 사용하기 위한 수성 안과용 제약 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 안 질환 또는 장애가 신생혈관성 안 질환인 수성 안과용 제약 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 신생혈관성 안 질환이 맥락막 혈관신생 (CNV), 망막 혈관 투과성, 망막 부종, 당뇨병성 망막병증, 증식성 당뇨병성 망막병증, 당뇨 황반 부종, 신생혈관성 (삼출성) 연령 관련 황반 변성 (AMD), nAMD (신생혈관성 AMD)와 관련된 CNV, 중심성 망막 정맥 폐색 (CRVO) 또는 후안부 혈관신생 (posterior segment neovascularization)인 수성 안과용 제약 조성물.
  15. 제1항의 수성 안과용 제약 조성물을 동결건조시켜 제조된 동결건조 제제.
  16. 제4항에 있어서, 항-VEGF 항체를 대상체에게 전달하기 위해 사용되는 수성 안과용 제약 조성물.
  17. 제4항에 있어서, VEGF에 의해 매개되는 안 질환 또는 장애의 치료에서 사용하기 위한 수성 안과용 제약 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 안 질환 또는 장애가 신생혈관성 안 질환인 수성 안과용 제약 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 신생혈관성 안 질환이 맥락막 혈관신생 (CNV), 망막 혈관 투과성, 망막 부종, 당뇨병성 망막병증, 증식성 당뇨병성 망막병증, 당뇨 황반 부종, 신생혈관성 (삼출성) 연령 관련 황반 변성 (AMD), nAMD (신생혈관성 AMD)와 관련된 CNV, 중심성 망막 정맥 폐색 (CRVO) 또는 후안부 혈관신생인 수성 안과용 제약 조성물.
  20. 제4항의 수성 안과용 제약 조성물을 동결건조시켜 제조된 동결건조 제제.
  21. 제6항에 있어서, 항-VEGF 항체를 대상체에게 전달하기 위해 사용되는 수성 안과용 제약 조성물.
  22. 제6항에 있어서, VEGF에 의해 매개되는 안 질환 또는 장애의 치료에서 사용하기 위한 수성 안과용 제약 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 안 질환 또는 장애가 신생혈관성 안 질환인 수성 안과용 제약 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 신생혈관성 안 질환이 맥락막 혈관신생 (CNV), 망막 혈관 투과성, 망막 부종, 당뇨병성 망막병증, 증식성 당뇨병성 망막병증, 당뇨 황반 부종, 신생혈관성 (삼출성) 연령 관련 황반 변성 (AMD), nAMD (신생혈관성 AMD)와 관련된 CNV, 중심성 망막 정맥 폐색 (CRVO) 또는 후안부 혈관신생인 수성 안과용 제약 조성물.
  25. 제6항의 수성 안과용 제약 조성물을 동결건조시켜 제조된 동결건조 제제.
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