TWI738632B - 穩定的含有高濃度抗vegf抗體之蛋白質溶液調配物 - Google Patents

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Abstract

本發明提供調配成高濃度水性醫藥組合物的抗VEGF抗體，該等組合物適合用於注射，較佳用於玻璃體內注射。該等水性醫藥組合物可用於向患者遞送高濃度的該抗體活性成分而無高含量的抗體聚集且無高含量的次可見微粒物質。本發明之水性組合物包含具有至少50mg/ml之濃度的抗體。本發明之水性醫藥組合物包括糖、緩衝劑、及界面活性劑。

Description

穩定的含有高濃度抗VEGF抗體之蛋白質溶液調配物
本發明係關於抗VEGF抗體之水性醫藥調配物、其製備方法、及該等調配物之用途。
血管內皮生長因子(VEGF)為一種已知的血管生成及新生血管形成之調節物，且已展示為與腫瘤及眼內病症相關聯的新血管形成之關鍵介導物(Ferrara等人Endocr.Rev.18：4-25(1997))。VEGF mRNA過度表現於許多人類腫瘤中，且眼睛流體中VEGF之濃度與患有糖尿病及其他局部缺血相關的視網膜病的患者中血管活躍增生之存在高度相關(Berkman等人，J Clin Invest 91：153-159(1993)；Brown等人Human Pathol.26：86-91(1995)；Brown等人Cancer Res.53：4727-4735(1993)；Mattern等人Brit.J.Cancer.73：931-934(1996)；及Dvorak等人Am J.Pathol.146：1029-1039(1995)；Aiello等人N.Engl.J.Med.331：1480-1487(1994))。此外，最近研究已展示受AMD影響的患者中脈絡膜新生血管膜中局部性VEGF的存在(Lopez等人Invest.Ophtalmo.Vis.Sci.37：855-868(1996))。抗VEGF中和抗體可用於抑制裸鼠中各種人類腫瘤細胞株的生長，其亦抑制缺血性視網膜病症之模型中的眼內血管生成(Kim等人Nature 362：841-844(1993)；Warren等人J.Clin.Invest 95：1789-1797(1995)；Borgstrom等人Cancer Res.56：4032-4039(1996)；及Melnyk等人Cancer Res.56：921-924(1996))(Adamis等人Arch.Opthalmol.114：66-71(1996))。
許多抗體經批准用於人類及其他哺乳動物的治療用途，包括抗VEGF抗體。液體醫藥調配物中治療抗體之濃度取決於例如投與途徑而廣泛變化。當需要小體積時常常存在對抗體之高濃度調配物之需要。舉例 而言，高濃度調配物對於玻璃體內注射或皮下投與而言可為合意的。
然而，具有高濃度抗體之調配物可具有短的儲存壽命，且經調配之抗體可能損失生物活性，其由儲存期間化學及物理不穩定性引起。已知聚集、脫醯胺及氧化為抗體降解之最普遍的原因。具體而言，聚集可潛在地引起患者中提高的免疫反應，從而引起安全性擔憂。因此，其必須被降至最低程度或防止。
生物治療調配物中微粒之形成亦為主要的品質考慮，因為數十微米至至次毫米及毫米大小範圍中的微粒大體上可由人類裸眼看到(參見Das,2012,AAPS PharmSciTech,13：732-746)。治療性眼用製劑中之微粒可造成對眼睛的損傷。因此，存在規定標準以確保眼用調配物中之次可見微粒物質內容物在一定限度內。舉例而言，美國藥典委員會(USP)已設置對於眼用溶液中微粒物質的要求，諸如
Figure 104135105-A0202-12-0002-78
10μm直徑之粒子的最大數目為50/mL，
Figure 104135105-A0202-12-0002-69
25μm直徑之粒子的最大數目為5/mL，且
Figure 104135105-A0202-12-0002-70
50μm直徑之粒子的最大數目為2/mL，其藉由顯微鏡方法微粒計數確定(參見USP通則<789>)。
已知用於產生高濃度抗體調配物的方法。然而，不存在克服在各種醫藥賦形劑、緩衝劑等之存在下抗體之胺基酸序列對其傾向於形成聚集體或降解的無法預期的影響的通用方法。此外，製備具有高濃度蛋白質(諸如抗體)含有可接受含量的次可見粒子的眼用調配物具有挑戰性且為不可預測的。
本發明之目的為提供另外的且改良的具有高濃度抗VEGF抗體以及低含量抗體聚集物及次可見粒子的調配物，其適於向人類，尤其向人類眼睛投與。
因此，本發明係關於一種水性醫藥組合物，其包含合適用於眼用注射的高濃度抗VEGF抗體。在某些態樣中，本發明之水性醫藥組合物展現低至不可偵測含量的抗體聚集或降解，其中在製造、製備、運輸及長期儲存期間極少至不損失生物活性，抗VEGF抗體之濃度為至少約50mg/ml、60mg/ml、80mg/ml、100mg/ml、120mg/ml、140mg/ml、160mg/ml、180mg/ml、或200mg/ml。
本發明提供水性醫藥組合物，其包含抗VEGF抗體、穩定劑、緩衝劑、及界面活性劑。在某些態樣中，水性醫藥組合物包含：(i)至少50mg/ml抗VEGF抗體，(ii)作為穩定劑的蔗糖或海藻糖，(iii)檸檬酸鹽或組胺酸緩衝劑，(iv)作為界面活性劑的聚山梨醇酯80。
在某些態樣中，水性醫藥組合物包含約4.5%-11% w/v蔗糖或5%-10%海藻糖、0.006%至0.012%檸檬酸(w/v)、0.2%至0.6%二水合檸檬酸三鈉(w/v)、及約0.01%至0.1%聚山梨醇酯80(w/v)，其中調配物之pH為6.3至7.3。
根據以下某些較佳實施例之更詳細描述及申請專利範圍，本發明之特定較佳實施例將變得明顯。
圖1展示對以不同pH調配的1008的濁度分析之結果之圖。x軸展示在55℃下的培育時間；同時y軸展示在350nm下監測的光密度。
圖2A及圖2B展示監測在55℃下培育180min的不同1008調配物之OD360的改變的濁度分析(圖ZA)。將在60min內獲得的OD360曲線展開且展示於(圖2B)中。圖2A及2B中的樣本編號對應於表13中的調配物編號。
圖3展示具有為了簡單起見在0至90分鐘之間收集的資料的濁度分析。整個實驗為180分鐘。監測在55℃下培育的不同1008調配物之OD360的改變。圖中的樣本編號對應於表15中的調配物編號。
圖4為展示在40℃下儲存6週期間八種所選的調配物中主峰之SEC結果的圖。
本發明提供水性醫藥組合物，其包含高濃度抗VEGF抗體。在某些實施例中，本發明之水性醫藥組合物在2-8℃下穩定至少18個月，且合適用於眼部投與，包括注射或輸注。在具體實施例中，本發明之水性醫藥組合物滿足USP<789>相對於微粒物質之存在的要求。因此，在某些實施例中，本發明之水性醫藥組合物中
Figure 104135105-A0202-12-0003-79
10μm直徑之粒子的最大數目為50/mL，本發明之水性醫藥組合物中
Figure 104135105-A0202-12-0003-80
25μm直徑之粒子的最大數目為 5/mL，且本發明之水性醫藥組合物中
Figure 104135105-A0202-12-0004-73
50μm直徑之粒子的最大數目為2/mL，該等粒子數目藉由光線遮蔽(light obscuration)及/或顯微鏡粒子技術方法如美國藥典委員會通則<789>所要求來確定。
如本文所用，「水性」醫藥組合物為合適用於醫藥用途的組合物，其中水性載體為蒸餾水。合適用於醫藥用途的組合物可為無菌的、均質的及/或等滲的。水性醫藥組合物可以水性形式例如於準備使用的預填充的注射器中直接製備(「水性調配物」)，或呈在使用之前不久復原的凍乾物形式製備。如本文所用，術語「水性醫藥組合物」係指液體調配物或復原凍乾調配物。在某些實施例中，本發明之水性醫藥組合物合適用於向人類受試者眼用投與。在特定實施例中，本發明之水性醫藥組合物合適用於玻璃體內投與。在另一實施例中，本發明之水性醫藥組合物合適用於藉由玻璃體內輸注投與。
本發明提供新的醫藥調配物，具體而言提供活性成分包含人類VEGF抗體的新的醫藥調配物。在一個態樣中，本發明係關於具有高濃度抗VEGF抗體之水性醫藥組合物。本發明之調配物中較佳抗VEGF抗體描述於WO 2009/155724中，其全部內容以引用之方式併入本文。
如本文所用之術語「抗體」包括全抗體及其任何抗原結合片段(亦即，「抗原結合部分」、「抗原結合多肽」、或「免疫結合劑」)或單鏈。「抗體」包括包含藉由二硫鍵互連的至少兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈的醣蛋白，或其抗原結合部分。各重鏈包含重鏈可變區(本文中縮寫為VH)及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含三個結構域，即CH1、CH2及CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。VH區及VL區可進一步再分成稱為互補決定區(CDR)之高變區，穿插有稱為構架區(FR)之較保守區。各VH及VL由三個CDR及四個FR構成，該等區域依以下順序自胺基端至羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈可變區含有與抗原相互作用之結合域。抗體之恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子之結合，該等宿主組織或因子包括免疫系統之各種細胞(例如，效應細胞)及經典補體系統之第一組分(Clq)。
術語抗體之「抗原結合部分」(或簡言之「抗體部分」)係指保留對抗原(例如，VEGF)特異性結合的能力的抗體之一或多個片段。已展示，抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段執行。涵蓋在術語抗體之「抗原結合部分」內的結合片段之實例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL及CH1結構域組成之單價片段；(ii)F(ab')2片段，包含藉由鉸鏈區之二硫橋連接之兩個Fab片段之二價片段；(iii)由VH及CH1結構域組成之Fd片段；(iv)由抗體單臂之VL及VH結構域組成之Fv片段；(V)單結構域或dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)，其由VH結構域組成；及(vi)分離之互補決定區(CDR)；或(vii)兩種或兩種以上分離之CDR之組合，該等CDR可視情況藉由合成連接子連接。此外，儘管Fv片段之兩個結構域VL及VH由單獨的基因編碼，但是其可使用重組方法藉由合成連接子連接，該連接子使其能夠製造成單蛋白質鏈，在該單蛋白質鏈中VL及VH區成對形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv)；參見例如，Bird等人(1988)Science 242：423-426；及Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。該等單鏈抗體亦意欲涵蓋於術語抗體之「抗原結合部分」內。此等抗體片段係使用熟習此項技術者已知之習知技術獲得，且該等片段經篩選以與完整抗體相同之方式應用。抗原結合部分可藉由重組DNA技術或藉由完整免疫球蛋白之酶促或化學裂解製造。抗體可為不同的同種型，例如，IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4亞型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE、或IgM抗體。
在較佳實施例中，本發明之水性醫藥組合物包含具有如SEQ ID NO：1中所闡述的序列的可變重鏈及如SEQ ID NO：2中所闡述的序列的可變輕鏈。
VH：SEQ ID NO：1
Figure 104135105-A0202-12-0005-1
VL：SEQ ID NO：2
Figure 104135105-A0202-12-0005-3
Figure 104135105-A0202-12-0006-4
在另一較佳實施例中，抗VEGF抗體為單鏈Fv(scFv)抗體片段，其包含序列：
Figure 104135105-A0202-12-0006-5
Figure 104135105-A0202-12-0006-6
(SEQ ID NO：3)
本發明之水性醫藥組合物中抗VEGF抗體可例如如WO 2009/155724中所述產生。scFv可使用表現載體產生，如本文所述。來源於表現載體中起始密碼子的甲硫胺酸在其未轉譯後裂解之情況下存在於最終蛋白質中(參見實例中之SEQ ID NO：4)。
在某些實施例中，本發明之水性醫藥組合物中抗VEGF抗體包含如SEQ ID NO：5、6、及7中所闡述的重鏈CDR1、CDR2及CDR3，及如SEQ ID NO：8、9、及10中所闡述的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3。
SEQ ID NO：5 GFSLTDYYYMT
SEQ ID NO：6 FIDPDDDPYYATWAKG
SEQ ID NO：7 GDHNSGWGLDI
SEQ ID NO：8 QASEIIHSWLA
SEQ ID NO：9 LASTLAS
SEQ ID NO：10 QNVYLASTNGAN
在一個實施例中，本發明之水性醫藥組合物中抗VEGF抗體之濃度為至少50mg/ml。較佳地，本發明之水性醫藥組合物包含約50mg/ml、約60mg/ml、約70mg/ml、約80mg/ml、約90mg/ml、約100mg/ml、約110mg/ml、約120mg/ml、約130mg/ml、約140mg/ml、約150mg/ml、約160mg/ml、約170mg/ml、約180mg/ml、約190mg/ml、約200mg/ml、約210mg/ml、約220mg/ml、約230mg/ml、約240mg/ml、約250mg/ml或約300mg/ml抗VEGF抗體。
在某些實施例中，本發明之水性醫藥組合物包含在60mg/ml與120mg/ml之間的抗VEGF抗體，例如包含SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2的抗體。
在一個實施例中，本發明之水性醫藥組合物包含60mg/ml抗VEGF抗體，其包含SEQ ID NO：3。
在另一實施例中，本發明之水性醫藥組合物包含120mg/ml抗VEGF抗體，其包含SEQ ID NO：3。
本發明之水性醫藥組合物除抗VEGF抗體之外亦包括另外的組分，諸如以下中之一或多者：(i)穩定劑；(ii)緩衝劑；(iii)界面活性劑；及(iv)游離胺基酸。包括此類另外組分之各者可得到具有抗VEGF抗體之低聚集的組合物。較佳地，本發明之水性醫藥組合物除抗VEGF抗體之外亦包括：(i)穩定劑；(ii)緩衝劑；及(iii)界面活性劑。
用於與本發明一起使用的合適的穩定劑可例如充當例如增黏劑、增積劑、助溶劑、及/或其類似物。穩定劑可為離子的或非離子的(例如糖)。作為糖其可包括但不限於單醣，例如，果糖、麥芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖及其類似物；雙醣，例如，乳糖、蔗糖、海藻糖、纖維雙塘、及其類似物；多醣，例如棉子糖、松三糖、麥芽糊精、葡聚糖、澱粉、及其類似物；及醛醣醇諸如甘露糖醇、木糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨醇(葡萄糖醇)及其類似物。舉例而言，糖可為蔗糖、海藻糖、棉子糖、麥芽糖、山梨醇或甘露糖醇。糖可為糖醇或胺基糖。蔗糖及海藻糖為較佳的。最佳的為蔗糖。作為離子穩定劑，其可包括鹽諸如NaCl或胺基酸組分諸如精胺酸-HCl。
用於與本發明一起使用的合適的緩衝劑包括但不限於有機酸鹽諸如檸檬酸鹽、抗壞血酸鹽、葡萄糖酸鹽、碳酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、乙酸鹽或酞酸鹽；Tris、鹽酸胺基丁三醇(thomethamine hydrochloride)、或磷酸鹽緩衝劑。此外，胺基酸組分亦可用作緩衝劑。檸檬酸鹽或組胺酸緩衝劑為尤其可用的，包括10-20mM組胺酸緩衝劑，例如0.13%至0.26%(w/v)組胺酸及0.03%-0.07%(w/v)三水合組胺酸鹽酸鹽，或10-20mM檸檬酸鹽緩衝劑，例如0.006%至0.012%檸檬酸(w/v)及0.2%至0.6%二水合檸檬 酸三鈉(w/v)。用於本發明之調配物的檸檬酸可為任何水合形式，例如無水或單水合。
水性醫藥組合物包括此類緩衝劑或pH調節劑以得到改良的pH控制。在某些實施例中，本發明之水性醫藥組合物具有在5.0與8.0之間、在5.0與7.0之間、在6.0與8.0之間、或在6.0與7.0之間的pH。在一個實施例中，本發明之水性醫藥組合物之pH為約6.3至約7.3。在特定實施例中，本發明之水性醫藥組合物具有約6.8的pH。
如本文所用，本文中術語「界面活性劑」係指具有兩親結構的有機物質；亦即，其由相反溶解傾向之群，通常油溶性烴鏈及水溶性離子基團組成。針對生物材料之各種醫藥組合物及製劑，界面活性劑可視界面活性部分之電荷而分類成陰離子、陽離子及分散劑。
用於與本發明一起使用的合適的界面活性劑包括但不限於非離子界面活性劑、離子界面活性劑及兩性離子界面活性劑。用於與本發明一起使用的典型的界面活性劑包括但不限於去水山梨醇脂肪酸酯(例如單辛酸去水山梨醇酯、單月桂酸去水山梨醇酯、單棕櫚酸去水山梨醇酯)、三油酸去水山梨醇酯、甘油脂肪酸酯(例如單辛酸甘油酯、單肉豆蔻酸甘油酯、單硬脂酸甘油酯)、聚甘油脂肪酸酯(例如單硬脂酸十甘油酯、二硬脂酸十甘油酯、單亞油酸十甘油酯)、聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯(例如聚氧乙烯去水山梨醇單月桂酸酯、聚氧乙烯去水山梨醇單油酸酯、聚氧乙烯去水山梨醇單硬脂酸酯、聚氧乙烯去水山梨醇單棕櫚酸酯、聚氧乙烯去水山梨醇三油酸酯、聚氧乙烯去水山梨醇三硬脂酸酯)、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(例如聚氧乙烯梨糖醇四硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨醇四油酸酯)、聚氧乙烯甘油脂肪酸酯(例如聚氧乙烯甘油單硬脂酸酯)、聚乙二醇脂肪酸酯(例如聚乙二醇二硬脂酸酯)、聚氧乙烯烷基醚(例如聚氧乙烯月桂醚)、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚(例如聚氧乙烯聚氧丙烯二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯丙醚、聚氧乙烯聚氧丙烯十六醚)、聚氧乙烯烷基苯基醚(例如聚氧乙烯壬基苯基醚)、聚氧乙烯氫化蓖麻油(例如聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氫化蓖麻油)、聚氧乙烯蜂蠟衍生物(例如聚氧乙烯山梨醇蜂蠟)、聚氧乙烯羊毛脂衍生物(例如聚氧乙烯羊毛脂)、及聚氧乙烯脂肪酸胺(例如聚氧乙烯硬脂酸胺)；C10-C18烷基硫酸 鹽(例如十六烷基硫酸鈉、月桂基硫酸鈉、油烯基硫酸鈉)、增加平均2至4莫爾環氧乙烷單元的聚氧乙烯C10-C18烷基醚硫酸鹽(例如聚氧乙烯月桂基硫酸鈉)、及C1-C18烷基磺基琥珀酸酯鹽(例如月桂基磺基琥珀酸酯鈉)；及天然界面活性劑諸如卵磷脂、甘油磷脂、鞘磷脂(例如神經鞘磷脂)、及C12-18脂肪酸之蔗糖酯。組合物可包括此等界面活性劑中之一或多者。較佳界面活性劑為聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯例如聚山梨醇酯20、40、60或80。聚山梨醇酯80為尤其較佳的。
用於與本發明一起使用的合適的游離胺基酸包括但不限於精胺酸、離胺酸、組胺酸、鳥胺酸、異白胺酸、白胺酸、丙胺酸、甘胺酸、麩胺酸或天冬胺酸。包括鹼性胺基酸為較佳的，亦即精胺酸、離胺酸及/或組胺酸。若組合物包括組胺酸則其可充當緩衝劑及游離胺基酸兩者，但當使用組胺酸緩衝劑時，包括非組胺酸游離胺基酸例如包括組胺酸緩衝劑及離胺酸為典型的。胺基酸可以D-及/或L-形式存在，但L-形式為典型的。胺基酸可呈任何合適的鹽例如鹽酸鹽存在，諸如精胺酸-HCl。在一個較佳實施例中，本發明之水性醫藥組合物不包含任何此類游離胺基酸。
在較佳實施例中，糖以例如凍乾物於水中復原之後，3%與11%(w/v)之間的濃度存在於本發明之水性醫藥組合物中。在某些實施例中，糖為在約4.5%至約11%之濃度下的蔗糖、或在約5%至約10%之濃度下的海藻糖。6.75%(w/v)之濃度的蔗糖為較佳的。
在較佳實施例中，緩衝劑以例如凍乾物於水中復原之後，在1mM與60mM之間，例如10-40mM、15-30mM、15-25mM之濃度存在於本發明之水性醫藥組合物中。在某些實施例中，緩衝劑為檸檬酸鹽或組胺酸。15mM之濃度的檸檬酸鹽緩衝劑為較佳的。
在較佳實施例中，界面活性劑以例如凍乾物於水中復原之後，至多0.2%(按體積計)例如0.01-0.1%、0.03-0.08%、0.04-0.08%之濃度存在於本發明之水性醫藥組合物中。0.05%之濃度的聚山梨醇酯80為較佳的。
可用於本發明之水性醫藥組合物中的其他預期賦形劑包括例如抗微生物劑、抗氧化劑、抗靜電劑、脂質諸如磷脂或脂肪酸、類固醇 諸如膽固醇、蛋白質賦形劑諸如血清白蛋白(人類血清白蛋白)、重組人類白蛋白、明膠、酪蛋白、成鹽相對離子諸如鈉及其類似物。合適用於本發明之調配物中之此等及另外已知的醫藥賦形劑及/或添加劑為此項技術中已知的，例如，如以下中所列舉：The Handbook of Pharmaceutical Excipients，第4版，Rowe等人，編，American Pharmaceuticals Association(2003)；及Remington：the Science and Practice of Pharmacy，第21版，Gennaro，編，Lippincott Williams & Wilkins(2005)。
本發明之較佳調配物示出於以下實例中之表40中。
在某些實施例中，預期抗VEGF抗體之凍乾得到用於治療患者的本發明之水性醫藥組合物。
用於抗體之凍乾的技術為此項技術中已知的，例如參見John F.Carpenter及Michael J.Pikal,1997(Pharm.Res.14,969-975)；Xialin(Charlie)Tang及Michael J.Pikal,2004(Pharm.Res.21,191-200)。
在可將凍乾物向患者投與之前，應將其用水性復原劑復原。此步驟允許凍乾物中之抗體及其他組分重新溶解以得到合適用於向患者注射的溶液。
用於復原的水性材料之體積決定所得醫藥組合物中抗體之濃度。用體積小於預凍乾體積的復原劑復原得到比凍乾之前更濃縮的組合物。復原倍數(凍乾之後調配物之體積：凍乾之前調配物之體積)可為1：0.5至1：6。1：3之復原倍數為可用的。如上文所提及，可將本發明之凍乾物復原以得到具有至少50mg/ml(亦即至少60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml、110mg/ml、120mg/ml、或130mg/ml)至抗VEGF抗體濃度之水性組合物，且可相應地選擇復原物之體積。需要時，在向患者投與之前適當時，可將復原調配物稀釋，以遞送預計劑量。
凍乾抗體之典型復原物包括無菌水或緩衝劑，視情況含有防腐劑。若凍乾物包括緩衝劑，則復原物可進一步包括緩衝劑(其可與凍乾物之緩衝劑相同或不同)，或其可替代地不包括緩衝劑(例如WFI(注射用水)、或生理鹽水)。
包含抗VEGF抗體的本發明之水性醫藥組合物可用於治療 各種疾病或病症。包含抗VEGF抗體的醫藥組合物尤其可用於治療受試者之新生血管眼部疾病。
可使用本發明之水性醫藥組合物治療的「新生血管眼部疾病」包括與眼部新生血管形成相關聯之病狀、疾病、或病症，其包括但不限於異常的血管生成、脈絡膜新生血管形成(CNV)、視網膜血管透過性、視網膜水腫、糖尿病性視網膜病(具體而言增生性糖尿病性視網膜病)、糖尿病性黃斑水腫、新生血管(滲出性)年齡相關的黃斑變性(AMD)、包括與nAMD(新生血管AMD)相關聯的CNV、與視網膜局部缺血相關聯的後遺症、中心視網膜靜脈阻塞(CRVO)、及後段新生血管形成。
本發明之水性醫藥組合物可進一步包括除抗VEGF抗體之外的活性成分。另外的藥理學試劑可包括例如可用於治療眼部疾病的其他抗體。
本發明之水性醫藥組合物可向患者投與。如本文所用，術語「受試者」或「患者」係指人類及非人類哺乳動物，包括但不限於靈長類、兔、豬、馬、狗、貓、綿羊、及母牛。較佳地，受試者或患者為人類。
投與將通常經由注射器。因此，本發明提供一種遞送裝置(例如注射器)，其包括本發明之醫藥組合物(例如，預填充的注射器)。患者將接受作為主要活性成分(亦即，足以達成或至少部分地達成所要效應的量)的有效量的抗VEGF抗體。治療有效劑量為足夠的，若其可甚至產生與疾病相關聯的症狀或病狀的增加的改變。治療有效劑量不必完全治癒疾病或完全消除症狀。較佳地，治療有效劑量可至少部分地遏制已罹患該疾病之患者之疾病及其併發症。有效用於此用途的量將取決於正在治療的病症之嚴重程度及患者之自身免疫系統之一般狀態。
劑量用量可由具有治療該疾病或病狀的一般技術的醫師使用已知的劑量調整技術容易地確定。舉例而言，本發明之水性醫藥組合物中所用的治療有效量的抗VEGF抗體藉由考慮到所要的劑量體積及投與方式來確定。通常，治療有效的組合物係以在0.001mg/ml至約200mg/ml每劑量範圍內的劑量投與。較佳地，本發明之方法中所用的劑量為約60mg/ml至約120mg/ml(亦即，約60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100 mg/ml、110mg/ml、或120mg/ml)。在較佳實施例中，本發明之方法中所用的抗VEGF抗體之劑量為60mg/ml或120mg/ml。
在某些實施例中，將劑量直接向患者之眼睛投與。在一個實施例中，每只眼睛的劑量為至少約0.5mg至約6mg。較佳的每只眼睛的劑量包括約0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg、1.0mg、1.2mg、1.4mg、1.6mg、1.8mg、2.0mg、2.5mg、3.0mg、3.5mg、4.0mg、4.5mg、5.0mg、5.5mg、及6.0mg。劑量可以合適用於眼用投與的各種體積投與，諸如50μl或100μl，例如，包括3mg/50μl或6mg/50μl。亦可使用較小體積，包括10μl或更小，例如約10μl或約8.0μl。在某些實施例中，將1.2mg/10μl或1mg/8.0μl(例如，1mg/8.3μl)之劑量遞送至患者之眼睛用於治療或改善上文所述之疾病及病症中之一或多者。可例如藉由玻璃體內注射或輸注遞送。
本發明亦提供用作藥物的本發明之調配物(亦即，水性醫藥組合物)，例如用於向患者遞送抗體，或用於治療或改善上文所述之疾病及病症中之一或多者。
本發明進一步提供一種用於向患者遞送抗VEGF抗體之方法，其包含向患者投與本發明之水性醫藥組合物之步驟。
在某些實施例中，本發明之向患者遞送抗VEGF抗體之方法包含以下步驟：(i)將本發明之凍乾物復原以得到水性調配物，及(ii)向患者投與水性調配物。步驟(ii)理想地發生在步驟(i)之24小時內(例如，在12小時內、在6小時內、在3小時內、或在1小時內)。
如下文所標號描述本發明之某些特定實施例：
1. 一種水性醫藥組合物，其包含(i)至少50mg/ml抗VEGF抗體，其包括分別SEQ ID NO：5、6、及7之重鏈CDR1、CDR2及CDR3，及分別SEQ ID NO：8、9、及10之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3，(ii)蔗糖或海藻糖，(iii)檸檬酸鹽或組胺酸緩衝劑，及(iv)作為界面活性劑的聚山梨醇酯80。
2. 如實施例1之水性醫藥組合物，其包含4.5%至11%(w/v)蔗糖或5%至10%海藻糖、0.006%至0.012%檸檬酸(w/v)、0.2%至0.6%二水合檸檬酸三鈉(w/v)、及0.01%至0.1%聚山梨醇酯80(w/v)，其中該組合物之pH為約 6.3至約7.3。
3. 如實施例2之水性醫藥組合物，其中蔗糖之濃度為6.75%(w/v)，檸檬酸之濃度為約0.01%(w/v)，二水合檸檬酸三鈉之濃度為約0.428%(w/v)，聚山梨醇酯80之濃度為約0.05%(w/v)，且pH為約6.8。
4. 如實施例1-3中任一項之水性醫藥組合物，其中該抗VEGF抗體之濃度為至少60mg/ml、至少70mg/ml、至少80mg/ml、至少90mg/ml、至少100mg/ml、至少110mg/ml、至少120mg/ml、至少130mg/ml、至少140mg/ml、或至少150mg/ml。
5. 如實施例1-4中任一項之水性醫藥組合物，其中該抗VEGF抗體之濃度為約60mg/ml、約70mg/ml、約80mg/ml、約90mg/ml、約100mg/ml、約110mg/ml、約120mg/ml、約130mg/ml、約140mg/ml、或約150mg/ml。
6. 如實施例1-5中任一項之水性醫藥組合物，其中該抗VEGF抗體包含SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2之序列。
7. 如實施例1-6中任一項之水性醫藥組合物，其中該抗VEGF抗體包含SEQ ID NO：3之序列。
8. 如實施例1-7中任一項之水性醫藥組合物，其中該抗VEGF抗體之濃度為約60mg/ml或約120mg/ml。
9. 一種遞送裝置，其包括實施例1-8中任一項之水性醫藥組合物。
10. 如實施例9之遞送裝置，其為預填充的注射器。
11. 一種用於向受試者遞送抗VEGF抗體之方法，其包含向該受試者投與實施例1-8中任一項之水性醫藥組合物之步驟。
12. 一種治療由VEGF介導的眼部疾病或病症之方法，其包含向受試者投與實施例1-8中任一項之水性醫藥組合物。
13. 如實施例12之方法，其中該眼部疾病或病症為眼部新生血管疾病。
14. 一種凍乾調配物，其藉由將實施例1-8中任一項之水性醫藥組合物凍乾而製備。
15. 一種用於製備凍乾物之方法，其包含以下步驟：(i)製備抗VEGF抗體、蔗糖或海藻糖、檸檬酸鹽或組胺酸緩衝劑、及界面活性劑之水溶液；及(ii)將該水溶液凍乾。
16. 如實施例15之方法，其中該抗VEGF抗體包括分別SEQ ID NO：5、6、及7之重鏈CDR1、CDR2及CDR3，及分別SEQ ID NO：8、9、及10之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3。
17. 如實施例16之方法，其中該抗VEGF抗體包含SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2之序列。
18. 如實施例16-17中任一項之方法，其中該抗VEGF抗體包含SEQ ID NO：3之序列。
19. 一種用於向受試者遞送抗VEGF抗體的實施例1-8中任一項之水性醫藥組合物，其包含向受試者投與該水性醫藥組合物之步驟。
20. 一種用於治療由VEGF介導的眼部疾病或病症的實施例1-8中任一項之水性醫藥組合物，其包含向受試者投與該水性醫藥組合物。
21. 如實施例20之用途，其中該眼部疾病或病症為眼部新生血管疾病。
除非另外說明，否則如本所用，所有百分比為重量百分比。
如本文所用且除非另外指明，否則術語「一個」及「一種」用於意謂「一個(種)」、「至少一個(種)」或「一或多個(種)」。除非另外為上下文所需，否則本文所用之單數術語將包括複數且複數術語將包括單數。
本說明書中通篇所引用的任何專利、專利申請案、及參考文獻之內容以全文引用之形式併入本文。
自本文所揭露之本發明之說明書及實施之考慮，本發明之其他實施例對熟習此項技術者將為顯而易見的。意欲本發明說明書及實例被視為僅具有示範性，且本發明之真實範疇及精神由以下申請專利範圍及其等效物指示。
實例
以下實例描述調配物開發成果，其經設計以鑑別合適的穩定方法及組合物以得到包含抗體1008的穩定的、高度濃縮的溶液，從而使得滿足對眼用產品的規定要求具有在冷凍儲存條件下至少18個月儲存壽命的IVT調配物成為可能。
1008抗體為單鏈抗體，其結合至人類血管內皮生長因子A(VEGF-A)且抑制人類血管內皮生長因子A之生物活性。表現的1008之胺基 酸序列為：
Figure 104135105-A0202-12-0015-7
Figure 104135105-A0202-12-0015-8
(SEQ ID NO：4)
當將1008調配成於pH 6.25下具有0.001%聚山梨醇酯20的15mM檸檬酸鹽緩衝液中之等滲溶液時，在60mg/ml 1008之濃度下觀察到顯著量的次可見微粒。在此起始調配物之情況下的主要問題為即使當在-20℃下儲存時，微粒物質超過眼用注射用溶液之規定限制(USP<789>)。
以下實例概述在2-8℃下儲存至少18個月穩定的60mg/ml及120mg/ml 1008玻璃體內(IVT)溶液之調配物開發。調配物開發成果集中於次可見粒子之形成之抑制及滿足針對含量、純度及效力的USP要求。
分析方法
如所指明實例通篇使用以下方法。
微血流成像(MFI)方法
用於賦形劑篩選的MFI方法，針對60mg/ml最佳化研究的研究1及研究2如下：所用的總樣本體積0.50mL
沖洗體積：0.20mL
分析體積：0.26mL
用純化的經過濾的不含粒子的水進行最佳化照明步驟。
用於分析120mg/ml 1008研究3及研究4的MFI方法：所用的總樣本體積0.80mL
沖洗體積：0.23mL
分析體積：0.48mL
用純化的經過濾的不含粒子的水進行最佳化照明步驟。
SEC方法
SE-HPLC(粒徑排阻層析法)根據蛋白質之大小分離蛋白質。藉由樣本分子在其穿過多孔粒子固定相時的微分排阻、或納入達成分離。高效液相層析系統能夠保持0.25ml/分鐘之流動速率及4℃之樣本溫度，裝備有TOSOH SuperSW3000柱(Tosoh Bioscience LLC,King of Prussia,PA)，且能夠同時在214nm及280nm下操作。此方法用於純度測試。
IEX-HPLC方法
AIEX-HPLC(陰離子交換高效液相層析法)根據蛋白質之淨電荷分離蛋白質。此過程使用高效液相層析法(HPLC)進行，其能夠保持0.8ml/分鐘之流動速率，具有含有強陰離子交換柱的溫控柱隔室(設置在25℃下)、自動取樣器(設置在4℃下)、及能夠在280nm下操作的可變波長UV偵測器。
CGE方法
藉由SDS凝膠毛細管電泳進行毛細管凝膠電泳方法用於確定在10kDa與225kDa之分子量之間的蛋白質之同一性及純度。毛細管動態地填充有Beckman Coulter 0.2% SDS凝膠緩衝劑，pH 8，專屬調配物。藉由分子篩電泳進行蛋白質之分離。蛋白質分子量之對數與其倒數的電泳移動率成線性關係。藉由將蛋白質之遷移與分子量標準比較確定蛋白質之同一性。藉由母峰及雜質之面積百分比分析確定純度。光電二極體陣列偵測器(PDA)用以在220nm下分析樣本。
效力分析
競爭ELISA用於效力測定。量測競爭ELISA，1008與VEGFR2/Fc針對生物素化的VEGF競爭之能力。所觀察到的訊號與1008之濃度成反比，因為遞增量的1008有效地阻止生物素化的VEGF與其受體VEGFR2/Fc之結合。於96孔微量滴定板中相對於1008參考標準分析各樣本，且報導相對於參考標準之效力的樣本之效力。
實例1 賦形劑篩選
於pH 6.25之檸檬酸鹽緩衝劑中調配1008。調配物組成示出於表1中。
Figure 104135105-A0202-12-0017-9
於上文調配物中觀察到顯著數目的次可見微粒。甚至在-20℃之儲存下，微粒物質超過對於眼用注射用水的規定限制USP<789>。
研究各種賦形劑對次可見微粒之形成的作用以開發1008之更穩定的液體溶液。將在60mg/ml下含有不同賦形劑的蛋白質溶液儲存在40℃下且藉由MFI分析大小為1-100μm之微粒。實驗資料證明，所測試的大部分賦形劑，包括精胺酸、葡聚糖、抗壞血酸、甲硫胺酸、及乙酸銨，並不降低微粒之形成。僅在非還原糖，諸如蔗糖及海藻糖之存在下，微粒形成顯著降低。
進行另外的賦形劑篩選。於~60mg/ml 1008溶液中評估賦形劑對1008穩定性的作用。將含有0.1%人類血清白蛋白(HSA)、0.1%泊洛沙姆(poloxamer)407、0.1%玻雷吉(Brij)35、3%甘油、50mM甘胺酸之蛋白質溶液儲存在40℃下，且在儲存8日、21日、及28日之後藉由MFI、SEC及IEX分析樣本。結果示出於表2中。實驗資料證明在所測試的賦形劑之存在下蛋白質之不穩定性。
Figure 104135105-A0202-12-0017-12
Figure 104135105-A0202-12-0018-13
於pH 6.25的20mM磷酸鹽緩衝劑中研究57mg/ml 1008之穩定性。在40℃下儲存6日、14日及27日之後分析含有9%蔗糖及0.1% PS80的調配物。結果列舉於表3中。
Figure 104135105-A0202-12-0018-15
實例2 新調配物開發
研究1
賦形劑篩選
將於pH 6.25的含有0.001%聚山梨醇酯20及0.73% NaCl的20mM檸檬酸鹽緩衝劑中之60mg/ml 1008之蛋白質溶液用於樣本製備。為了移除原始蛋白質溶液中之界面活性劑，首先使用不含聚山梨醇酯20的媒劑進行使用NAP-25柱的緩衝劑交換。隨後使用具有10kDa MWCO的Vivaspin過濾器將交換的蛋白質溶液濃縮至約60mg/ml。個別地摻入(spike)HSA、甘胺酸、甘油、泊洛沙姆407、及玻雷吉35之賦形劑。隨後將所製備的樣本經0.2um PVDF膜注射器過濾至4mL透明玻璃小瓶中。將約100μL樣本用於初始 分析，同時將剩餘樣本在40℃下儲存。在40℃下儲存8日、21日、及28日將各調配物之一毫升樣本取出(pull)用於藉由MFI、SEC及IEX分析。
緩衝劑、糖及界面活性劑之組分選擇
基於在內部進行的賦形劑篩選研究，選擇兩種緩衝劑(檸檬酸鹽及組胺酸)、糖(蔗糖及海藻糖)、及界面活性劑(聚山梨醇酯20及聚山梨醇酯80)用於調配物組分選擇。選擇20mM之緩衝劑強度、264mM之糖濃度、及0.1%之界面活性劑濃度用於研究。如以下表中所示設計全因子實驗研究。
Figure 104135105-A0202-12-0019-16
所用的全設計示出於以下表5中：
Figure 104135105-A0202-12-0019-17
其他參數：濃度/pH 在pH 6.25下50-60mg/ml 1008
緩衝劑交換 NAP25柱，用Vivaspin 10kDa MWCO濃縮
樣本大小/Pkg 2-2.5mL於具有螺旋蓋的4mL透明玻璃小瓶中
儲存/取出 40℃/0、1週、2週及4週
分析 MFI、SEC及IEX
將於含有0.001%聚山梨醇酯20的原始緩衝劑中之60mg/ml 1008之蛋白質溶液用於樣本製備。製備具有不同的緩衝劑/糖組合(20mM檸檬酸鹽/264mM海藻糖、20mM檸檬酸鹽/264mM蔗糖、20mM組胺酸/264mM海藻糖、20mM組胺酸/264mM蔗糖)的四種新的媒劑緩衝劑。首先使用Illustra NAP-25柱(GE Healthcare)將1008藥物物質(DS)交換至媒劑緩衝劑中。用25mL檸檬酸鹽緩衝劑將柱平衡。隨後將2mL 1008 DS裝載至柱上。在DS溶液完全移動至柱中之後，將柱用2mL平衡柱所用的相同緩衝劑洗滌。於Vivaspin 6濃縮器(10KD MWCO，GE Healthcare)中收集6mL自柱溶離的溶液。隨後使用Beckman GS-15R離心機在9384×g及4℃下將6mL溶離溶液濃縮至約2mL。隨後使用OD280用NanoDrop 1000分光光度計量測蛋白質之濃度。將聚山梨醇酯20(PS20)或聚山梨醇酯80(PS80)摻入至調配物中至0.1%之最終濃度。隨後將所製備的樣本經0.2um PVDF注射器過濾器過濾且填充至4mL透明玻璃小瓶中。將約100uL樣本用於初始分析，同時將剩餘樣本在40℃下儲存。在40℃下儲存1週、2週及4週之後將一毫升樣本取出用於藉由MFI、SEC及IEX分析。
進行定性研究以選擇調配物之最佳糖/界面活性劑/緩衝劑組成。如上文所討論將兩種緩衝劑(檸檬酸鹽及組胺酸)、糖(蔗糖及海藻糖)、界面活性劑(聚山梨醇酯20及聚山梨醇酯80)用於研究設計。在加速的條件(40℃)下進行四週穩定性研究。藉由SEC、IEX及MFI分析樣本穩定性。表6示出藉由SEC、IEX的穩定性結果及藉由μDSC的熔點(Tm)。
Figure 104135105-A0202-12-0020-18
使用Minitab(Minitab公司，State College PA)分析穩定性結果。因為SEC及IEX示出相同趨勢，所以僅藉由Minitab分析且報導SEC資料。SEC結果證明，界面活性劑為唯一顯著因子；似乎影響反應的其他因子包括緩衝劑選擇及在緩衝劑與糖之間的相互作用(程度較低)。SEC資料表明最佳調配物組分為作為緩衝劑的檸檬酸鹽、作為界面活性劑的聚山梨醇酯80及作為糖的蔗糖。
亦藉由Minitab分析藉由MFI對微粒的實驗結果。所評估的所有三個因子(糖、界面活性劑、及緩衝劑)似乎為無意義的(α=0.05)。比較對微粒的主要作用，檸檬酸鹽優於組胺酸；PS80優於PS20；蔗糖類似於或略優於海藻糖。因此，選擇檸檬酸鹽作為緩衝劑、聚山梨醇酯80作為界面活性劑及蔗糖作為糖用於進一步研究。
研究2
緩衝劑、糖及界面活性劑之濃度的最佳化
分別於檸檬酸鹽及組胺酸緩衝劑中進行在具有兩個中心點的兩個水平下含有三種因子的全因子研究，以確定各所選的調配物組分之最佳濃度。三種因子為緩衝劑(檸檬酸鹽或組胺酸)、聚山梨醇酯80及蔗糖。因子及設計空間列表於表7中且詳細的實驗設計示出於表8及9中。
Figure 104135105-A0202-12-0021-19
Figure 104135105-A0202-12-0021-20
Figure 104135105-A0202-12-0022-21
Figure 104135105-A0202-12-0022-22
為製備個別的調配物，使用於pH 6.25的含有0.001%聚山梨醇酯20/0.73% NaCl的檸檬酸鹽緩衝劑中之60mg/ml 1008之蛋白質溶液。首先使用NAP-25柱將蛋白質溶液緩衝劑交換成媒劑。此媒劑含有在其目標濃度下的緩衝劑及蔗糖。使用Vivaspin 10kDa MWCO將交換的蛋白質溶液濃縮至約60mg/ml之濃度。
隨後添加一批量的聚山梨醇酯80及氯化鈉以製造最終調配物組合物。使用藉由在280nm下的UV所量測的吸光度，各樣本中之蛋白質濃度隨理論消光係數而變化。
隨後將所製備的調配物經0.2μm PVDF注射器過濾器過濾至4mL透明玻璃小瓶中。藉由SEC及IEX將約100μL樣本用於初始分析，同時將約2-2.5mL樣本在40℃下儲存。在40℃下儲存11週、20週及27週之後將約600μL樣本取出用於藉由MFI、SEC及IEX分析。
基於研究1結果，分別於檸檬酸鹽及組胺酸緩衝劑中進行在具有兩個中心點的兩個水平下含有三種因子的全因子研究，以確定各所選的調配物組分之最佳濃度。將所測試的樣本在40℃下儲存，且在0、1.6週、2.9週及4週取出用於MFI、SEC及IEX分析。結果列表於表10及11中。
Figure 104135105-A0202-12-0023-24
Figure 104135105-A0202-12-0024-25
Figure 104135105-A0202-12-0024-26
Figure 104135105-A0202-12-0025-27
Figure 104135105-A0202-12-0026-28
藉由Minitab分析實驗資料。對於檸檬酸鹽緩衝劑中之SEC結果，界面活性劑為影響蛋白質聚集的主要因子，同時蔗糖、在蔗糖與聚山梨醇酯80之間的相互作用、及緩衝劑強度起較不顯著的作用。較高蔗糖 濃度及較低聚山梨醇酯80濃度有利於蛋白質穩定性。蛋白質穩定性略微影響聚集，且較高檸檬酸鹽緩衝劑強度促進略優良的蛋白質穩定性。
對於檸檬酸鹽緩衝劑中之MFI結果，蔗糖及聚山梨醇酯80之因子以及蔗糖與山梨醇酯80之相互作用在微粒形成中起相等重要的作用。高蔗糖及高聚山梨醇酯80顯著地抑制微粒形成，同時在10-20mM範圍內的緩衝劑強度略微影響微粒形成，較低緩沖劑強度為較佳的。
藉由組胺酸緩衝劑溶液之Minitab分析的結果展示，界面活性劑聚山梨醇酯80為影響蛋白質聚集的主要因子，同時在緩衝劑強度與聚山梨醇酯80之間的相互作用以及蔗糖起較不顯著的作用。較少聚山梨醇酯80有利於蛋白質穩定性。緩衝劑強度及蔗糖濃度似乎並不影響蛋白質聚集。
對於組胺酸緩衝劑中的MFI結果，聚山梨醇酯80、蔗糖、及蔗糖與山梨醇酯80之相互作用在微粒形成中起顯著作用。高蔗糖及低聚山梨醇酯80、及低緩沖劑強度為抑制微粒形成較佳的。
pH最佳化
於含有0.1% NaCl、6.75%蔗糖及0.05% PS80的15mM檸檬酸鹽緩衝劑中在六個pH條件(5.0、6.0、6.25、6.50、6.75及7.0)下研究pH對1008之聚集行為的影響。首先使用Illustra NAP-10柱(GE Healthcare)將1008藥物物質交換至具有不同pH之媒劑(不含PS80)中。首先用15mL檸檬酸鹽緩衝劑將柱平衡。隨後將1mL 1008 DS裝載至柱上。在DS溶液完全移動至柱中之後，將柱用2mL平衡柱所用的相同檸檬酸鹽緩衝劑洗滌。於Vivaspin 2濃縮器(10KD MWCO，GE Healthcare)中收集2mL自柱溶離的溶液。隨後使用Beckman GS-15R離心機在9384×g及4℃下將2mL溶離溶液濃縮至約1mL。隨後用NanoDrop 1000分光光度計量測蛋白質之濃度。確定此研究之最終1008濃度為約70mg/ml。將PS80摻入至調配物中至0.05%之最終目標濃度。使用具有兩位槽架及用於溫度調節的水浴的PerkinElmer Lambda 35分光光度計進行動力學濁度分析。於具有1cm路徑長度的Starna次微體積石英槽(Starna Scientific公司，英國)中，添加250μL 1008調配物或對應的媒劑。將槽置於預加熱至55℃的槽架中。監測1008調配物中OD350之改變120分鐘。隨後將不同pH的調配之所獲得的OD350資料對時間繪圖用於比較。
使用基於濁度的動力學分析，用含有約70mg/ml 1008之pH 5.0至7.0的調配物研究pH對1008之聚集行為的影響。對於濁度分析，OD350之急劇增大與蛋白質之主要聚集事件相關聯。因此，各調配物之OD350增大所需的培育時間中的差異可反映出調配物中之蛋白質之不同的物理穩定性。如圖1中所示，在所測試調配物條件下1008似乎在pH 6.75下最穩定，因為其在OD350之急劇增大之前具有最長的培育時間。重複實驗具有類似結果證實所測試調配物在pH 6.75下最穩定。
研究3
賦形劑及高活性濃度之影響
進行半因子研究(表12)以研究主要調配物條件之影響，包括蛋白質(60-120mg/ml)、蔗糖(4.5-9.0%)、檸檬酸鹽緩衝劑(10至20mM)及聚山梨醇酯80(0.01-0.1%)之濃度。
Figure 104135105-A0202-12-0028-30
為製備上文調配物，首先製備在pH 6.5下的20%檸檬酸鹽緩衝劑及於pH 6.5的20mM檸檬酸鹽緩衝劑中的30%蔗糖儲備液。隨後將檸檬酸鹽緩衝劑、蔗糖儲備液及注射用水以適當比率混合以得到具有PS80的五種緩衝劑，其為4.5%蔗糖於10mM檸檬酸鹽中、9%蔗糖於10mM檸檬酸鹽中、4.5%蔗糖於20mM檸檬酸鹽中、9%蔗糖於20mM檸檬酸鹽中及6.75%蔗糖於15mM檸檬酸鹽中。隨後使用Illustra NAP-25柱(GE Healthcare)將1008 DS交換至此等五種緩衝劑中，接著用Vivaspin 6濃縮器(5 KD MWCO, GE Healthcare)在8000×下在5℃下濃縮。在離心期間用NanoDrop 2000分光光度計確定各樣本中之蛋白質濃度。對於前四種緩衝劑中之樣本，當1008濃度達到~70mg/ml時，將樣本之一部分自濃縮器移除且用於藉由添加適當量的對應緩衝劑且摻入於10% PS80中用60mg/mlAPI製備調配物(表12中之#1、3、5及7)。將剩餘樣本進一步濃縮至高於130mg/ml且隨後添加緩衝劑及10% PS80以獲得最終調配物(表12中之#2、4、6及8)。藉由將交換至緩衝劑#5中之1008樣本濃縮至約108mg/ml且隨後與緩衝劑及10% PS80混合以達到最終調配物濃度來製備表12中之調配物#9及10。量測所有最終調配物之pH值且調節至6.5。
自上文所述之分析改良的濁度分析用作評估的分析工具。在此改良的濁度分析中，使用12槽位Cary 100 UV-Vis分光光度計。此分析中所使用之光析管為具有塞子的1mm石英光析管。於各光析管中，添加300μL樣本用於測試。對在55℃下培育的調配物監測在360nm下的光密度改變。
賦形劑及高活性濃度之影響
研究3之所有調配之所量測的1008濃度及最終pH概述於表13中。在55℃下培育具有低、中及高1008濃度(表4.3.1.-1)具有不同蔗糖、PS80濃度及緩衝劑強度的調配物且監測OD360之改變。如圖2中所示，對於調配物觀察到不同的聚集傾向。當培育開始時不久便幾乎聚集的兩種調配物為調配物2及6，其含有相對較高的1008濃度(~120mg/ml)及較低的蔗糖濃度(4.5%)。另一方面，含有相對較低的1008濃度(~60mg/ml)及較高的蔗糖濃度(9%)的調配3及7聚集慢於其他調配物。培養基1008及蔗糖濃度之其他組合之聚集傾向在上文兩組之間。
Figure 104135105-A0202-12-0029-31
Figure 104135105-A0202-12-0030-32
使用各調配物之OD360達到0.25之時間作為標準，比較不同調配物因子之影響。結果表明，蔗糖對1008的聚集影響最大，接著為API濃度。蔗糖及API濃度之影響為相反的，指明對於較優的調配物穩定性，較高蔗糖及較低API濃度為較佳的。其他兩個因子，緩衝劑強度及PS80展示影響較小。
研究4
活性及蔗糖濃度之進一步研究
基於上文研究3之結果，進行研究4以進一步研究於pH6.50的含有0.05% PS80的15mM檸檬酸鹽緩衝劑中之蛋白質濃度(60-120mg/ml)及蔗糖濃度(在6%至9%之較窄範圍之情況下)之影響。研究設計展示於下表中。
Figure 104135105-A0202-12-0030-33
為製備調配物，將約80g 1008藥物物質裝載至TFF系統中 且隨後用在約5倍藥物物質之體積下含有6%蔗糖的15mM檸檬酸緩衝劑進行緩衝劑交換。在緩衝劑交換之後，使用TFF系統將蛋白質溶液之體積減小至初始體積之約一半。將約44g濃縮的1008溶液回收，且藉由NanoDrop 2000分光光度計量測所濃縮的蛋白質為約112mg/ml。隨後將濃縮的1008溶液用於製備調配物#1、3、5、7-12，其藉由與適當量的10% PS80及含有0、6%及/或40%蔗糖的15mM檸檬酸鹽緩衝劑混合以獲得此等調配物中之各者之對應的最終API、蔗糖及PS80濃度。將剩餘1008溶液進一步濃縮至約132mg/ml以相同方式製備調配物#2及4。最後，藉由將1008溶液濃縮至約171mg/ml製備調配物#6，且用10% PS80及含有0、6%及/或40%蔗糖的15mM檸檬酸鹽緩衝劑調節蛋白質、蔗糖及PS80之濃度。各調配物中1008之最終濃度用NanoDrop 2000分光光度計確定且將pH調節至6.5。
使用上文所述的濁度分析來分析樣本。亦將八種所選的調配物(#1-4及#7-10)於40℃探索性培育箱中儲存6週且在不同時間點用MIF、IEX及SEC分析。
研究如表15中所列舉的十二種調配物。
Figure 104135105-A0202-12-0031-35
在55℃下的濁度分析用以監測調配物之聚集。如圖3中所示，藉由在相同熱應力下的調配物展示不同的聚集度。具有相對較高1008及較低蔗糖濃度的調配物(諸如表15中之調配物#2及6)為在培育之後快速聚集的調配物。具有相對較低1008及高蔗糖濃度的調配物(表15中之調配 物#3及5)聚集慢於所有剩餘調配物。將根據各種調配物之濁度分析所獲得的曲線擬合至S形曲線函數。將培育時間對應於轉變之中點記錄為各調配物之Tm(轉變中點時間)。結果列舉於表15中。相對於蔗糖及1008濃度的Tm值展示出蔗糖及1008濃度對蛋白質聚集的相反作用。
除了使用在55℃下的濁度分析的研究，亦藉由MFI、SEC及IEX經6週監測在40℃下八種所選的調配物之穩定性。調配物及結果列舉於表16至23中。與濁度分析抑制，MFI結果展示，與具有較低API濃度的調配物相比較，具有高1008濃度(~120mg/ml)的調配物形成更多粒子，特定言之大於25μm的粒子。MFI結果不展示對於具有類似量1008的調配物(調配物#7至10)而言蔗糖濃度的清晰的影響。如圖4中所示，在40℃下儲存6週之後，具有高1008濃度的兩種調配物(#2及4)降低最大，其中具有~60mg/ml 1008的調配物降低小於所有其他調配物。至於具有~90mg/ml 1008的調配物，在較高蔗糖濃度(調配物#8)觀察到比較低蔗糖濃度(調配物#7)略微較小的降低。IEX結果展示與SEC相同的趨勢。
Figure 104135105-A0202-12-0032-36
Figure 104135105-A0202-12-0032-37
Figure 104135105-A0202-12-0033-38
Figure 104135105-A0202-12-0033-39
Figure 104135105-A0202-12-0033-40
Figure 104135105-A0202-12-0033-41
Figure 104135105-A0202-12-0034-42
Figure 104135105-A0202-12-0034-43
Figure 104135105-A0202-12-0034-44
實例3 探索性穩定性研究
對照調配物
對在pH 6.25下於20mM檸檬酸、0.001% PS20中之60mg/ml 1008溶液的調配物作為對照進行探索性穩定性。將對照調配物經0.2um注射器過濾器過濾且在40℃下、環境室溫、及冰箱中儲存。對於40℃樣本在0、2週及5週取出樣本，且對於儲存在環境室溫及冰箱的樣本在26週取出樣本。藉由A280、SEC、IEX CGE及ELISA測試所選的穩定性樣本之pH、滲透壓、含量。結果示出於表24中。
Figure 104135105-A0202-12-0035-45
對於在pH 6.25下於20mM檸檬酸鹽、0.001% PS20及0.73% NaCl中之60mg/ml 1008溶液進行對照調配物之另一研究。將調配物經0.2μm注射器過濾器過濾且於40℃中儲存。在1週、2週、3週、及4週將樣本取出用於MFI分析。結果示出於表25中。
Figure 104135105-A0202-12-0035-46
具有9%蔗糖及0.5%聚山梨醇酯80的60mg/ml 1008之探索性穩定性研究
對含有9%蔗糖及0.5% PS80的60mg/ml 1008調配物進行探索性穩定性。將調配物經0.2μm注射器過濾器過濾且在40℃下儲存。在1.6週、2.9週及4週將樣本取出且藉由MFI、SEC及IEX分析。結果列表於表26中。
Figure 104135105-A0202-12-0036-47
在pH 6.25下60mg/ml 1008、9%蔗糖、20mM檸檬酸鹽、0.1% PS80之試驗性穩定性研究
對如表27中所示的在pH 6.25下含有9%蔗糖、20mM檸檬酸鹽、0.1% PS80的調配物進行60mg/ml 1008溶液之即時穩定性研究。將穩定性樣本儲存在2-8℃、25℃、40℃及光箱(LC)下；亦使其經歷三個循環的凍融(FT)。根據表28中所示的方案取出樣本，且藉由各種分析方法諸如pH、滲透壓、MFI、含量、SEC、IEX、CGE及效力分析。
Figure 104135105-A0202-12-0036-48
Figure 104135105-A0202-12-0037-49
在早期階段，開始60mg/ml 1008溶液之即時穩定性研究。如表29中所示，調配物含有在pH 6.25下9%蔗糖、20mM檸檬酸鹽、0.1% PS80。將樣本儲存在2-8℃、25℃、40℃及光箱(LC)下；亦使其經歷三個循環的凍融(FT)。根據表30中所示的方案取出樣本，且藉由各種分析方法分析。穩定性結果列表於表31-33中。
Figure 104135105-A0202-12-0037-50
Figure 104135105-A0202-12-0037-51
Figure 104135105-A0202-12-0038-52
Figure 104135105-A0202-12-0038-53
Figure 104135105-A0202-12-0039-54
檸檬酸緩衝劑中：60mg/ml 1008於15mm檸檬酸鹽/6.75%蔗糖/0.05% PS80/pH 6.75的探索性穩定性
對60mg/ml1008於15mM檸檬酸鹽/6.75%蔗糖/0.05% PS80/pH6.75之調配物進行檸檬酸鹽緩衝劑中的探索性穩定性。將穩定性樣本儲存在5℃及25℃下，以及經歷凍融循環。根據下表中所示的方案取出樣本，且分析外觀、pH、滲透壓、MFI、含量、SEC、及IEX。
Figure 104135105-A0202-12-0039-55
類似地，對60mg/ml 1008於15mM組胺酸/6.75%蔗糖/0.05% PS80/pH6.75之調配物進行組胺酸緩衝劑中的探索性穩定性。將穩定性樣本儲存在5℃及25℃下。亦使樣本經歷凍融循環。根據下表中所示的方案取出 樣本，且分析外觀、pH、滲透壓、MFI、含量、SEC、及IEX。
Figure 104135105-A0202-12-0040-56
實驗資料列表於下表中。
Figure 104135105-A0202-12-0040-57
Figure 104135105-A0202-12-0040-58
Figure 104135105-A0202-12-0041-59
Figure 104135105-A0202-12-0041-60
Figure 104135105-A0202-12-0041-61
Figure 104135105-A0202-12-0042-62
實驗資料指明，相較於在60mg/ml之蛋白質濃度下的對照調配物之穩定性，所測試的調配物之穩定性顯著提高，特定言之在抑制微粒物質之形成中。
如表40中所示，經鑑定穩定溶液調配物含有15mM檸檬酸鹽/6.75%蔗糖/0.0505% PS80。
Figure 104135105-A0202-12-0042-63
已詳細描述本發明及其實施例。然而，本發明之範疇並不意欲限制說明書中所述的製程、製造、物質之組成、化合物、方式、方法、及/或步驟之具體實施例。可對所揭露的材料做出各種修改、替代、及變化而不背離本發明之精神及/或基本特徵。因此，所屬技術之一般技藝人士根據本揭露將容易地理解，可根據本發明之此類相關實施例使用隨後的修改、替代、及/或變化，所述修改、替代、及/或變化進行與本文所述之實施例實質上相同的功能或達成與本文所述之實施例實質上相同的結果。因此，以下申請專利範圍意欲在其範疇內涵蓋對本文所揭露之製程、製造、物質之組成、化合物、方式、及/或步驟的修改、替代、及變化。除非對其 作用另有說明，否則申請專利範圍不應理解為限制所述順序或元件。應理解，可對形式及細節做出各種變化而不背離所附申請專利範圍之範疇。

Claims (14)

  1. 一種水性眼用醫藥組合物，其包含(i)至少60mg/ml抗VEGF抗體，該抗VEGF抗體包含SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2之序列，(ii)蔗糖或海藻糖，(iii)檸檬酸鹽或組胺酸緩衝劑，及(iv)作為界面活性劑的聚山梨醇酯80，其中在該水性眼用醫藥組合物中
    Figure 104135105-A0305-02-0046-1
    10μm直徑之粒子的最大數目為50/mL。
  2. 如請求項1之水性眼用醫藥組合物，其包含約4.5%至11%(w/v)蔗糖或約5%至10%(w/v)海藻糖、0.006%至0.012%檸檬酸(w/v)、0.2至0.6二水合檸檬酸三鈉(w/v)、及0.01%至0.1%聚山梨醇酯80(w/v)，其中該組合物之pH為約6.3至約7.3。
  3. 如請求項2之水性眼用醫藥組合物，其中該組合物之pH為約6.8。
  4. 如請求項1之水性眼用醫藥組合物，其中該抗體包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4之序列。
  5. 如請求項1之水性眼用醫藥組合物，其中該抗VEGF抗體之濃度為約60mg/ml，蔗糖之濃度為約6.75%(w/v)，檸檬酸之濃度為約0.01%(w/v)，二水合檸檬酸三鈉之濃度為約0.428%(w/v)，且聚山梨醇酯80之濃度為約0.05%(w/v)。
  6. 如請求項5之水性眼用醫藥組合物，其中該抗VEGF抗體包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4之序列，且pH為約6.8。
  7. 如請求項1之水性眼用醫藥組合物，其中該抗VEGF抗體之濃度為約120mg/ml，蔗糖之濃度為約6.8%(w/v)，檸檬酸之濃度為約0.01%(w/v)，二水合檸檬酸三鈉之濃度為約0.428%(w/v)，且聚山梨醇酯80之濃度為約0.05%(w/v)。
  8. 如請求項7之水性眼用醫藥組合物，其中該抗VEGF抗體包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4之序列，且pH為約6.8。
  9. 一種遞送裝置，其包括如請求項1至8中任一項之水性眼用醫藥組合物。
  10. 如請求項9之遞送裝置，其為預填充的注射器。
  11. 一種如請求項1至8中任一項之水性醫藥組合物於製備藥劑之用途，該藥劑供用於治療由VEGF介導的眼部疾病或病症。
  12. 如請求項11之用途，其中該眼部疾病或病症為眼部新生血管疾病。
  13. 如請求項12之用途，其中該眼部新生血管疾病係選自於由下列組成之群組：異常的血管生成、脈絡膜新生血管形成(CNV)、視網膜血管透過性、視網膜水腫、糖尿病性視網膜病(具體而言增生性糖尿病性視網膜病)、糖尿病性黃斑水腫、新生血管(滲出性)年齡相關的黃斑變性(AMD)、包括與nAMD(新生血管AMD)相關聯的CNV、與視網膜局部缺血相關聯的後遺症、中心視網膜靜脈阻塞(CRVO)、及後段新生血管形成。
  14. 一種凍乾調配物，其係藉由將如請求項1至8中任一項之水性眼用醫藥組合物凍乾而製備。
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