CN106999581A

CN106999581A - 含有高浓度抗vegf抗体的稳定蛋白质溶液剂型

Info

Publication number: CN106999581A
Application number: CN201580060665.4A
Authority: CN
Inventors: 张惠湘; C·博灵; A·库尔诗瑞施塔; 曾宇红; 万里; L·埃兰尼
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2014-11-07
Filing date: 2015-11-06
Publication date: 2017-08-01
Also published as: IL280087A; AU2018278870B2; RU2017119647A; EP3215123A1; TWI738632B; SG11201702954XA; PE20170780A1; CO2017004596A2; SG10201913565RA; AU2015342818B2; KR102588846B1; IL265497A; TWI705827B; JP6667519B2; AU2020220210B2; AU2020244614B2; RU2020114917A; AU2018274882B2; JP2017538674A; US20210340242A1

Abstract

本发明提供配制成高浓度水性医药组合物的抗VEGF抗体，这些组合物适合用于注射，优选用于玻璃体内注射。这些水性医药组合物可用于向患者递送高浓度的该抗体活性成分，而没有高水平的抗体聚集且无高含量的亚可见颗粒物质。本发明的水性组合物包含具有至少50mg/ml浓度的抗体。本发明的水性医药组合物包括糖、缓冲剂和表面活性剂。

Description

含有高浓度抗VEGF抗体的稳定蛋白质溶液剂型

本申请要求2014年12月5日提交的序列号为62/088,061的美国临时申请和2014年11月7日提交的序列号为62/076,770的美国临时申请的优先权，所述公开内容明确并入本文。

技术领域

本发明关于抗VEGF抗体的水性医药剂型、其制备方法和这些剂型的用途。

背景技术

血管内皮生长因子(VEGF)为一种已知的血管生成和新血管形成的调节子，且已展示为与肿瘤和眼内病症相关联的新血管形成的关键介导子(Ferrara等Endocr.Rev.18:4-25(1997))。VEGF mRNA在许多人类肿瘤中过表达，且眼液中VEGF浓度与患有糖尿病和其他缺血相关的视网膜病的患者中血管活跃增生的存在高度相关(Berkman等,J Clin Invest91:153-159(1993)；Brown等Hμman Pathol.26:86-91(1995)；Brown等Cancer Res.53:4727-4735(1993)；Mattern等Brit.J.Cancer.73:931-934(1996)；和Dvorak等AmJ.Pathol.146:1029-1039(1995)；Aiello等N.Engl.J.Med.331:1480-1487(1994))。此外，最近研究已展示受AMD影响的患者中脉络膜新生血管膜中局部性VEGF的存在(Lopez等Invest.Ophtalmo.Vis.Sci.37:855-868(1996))。抗VEGF中和抗体可用于抑制裸鼠中各种人类肿瘤细胞系的生长，也抑制缺血性视网膜病症模型中的眼内血管生成(Kim等Nature362:841-844(1993)；Warren等J.Clin.Invest 95:1789-1797(1995)；Borgstrom等CancerRes.56:4032-4039(1996)；和Melnyk等Cancer Res.56:921-924(1996))(Adamis等Arch.Opthalmol.114:66-71(1996))。

许多抗体经批准用于人类和其他哺乳动物的治疗用途，包括抗VEGF抗体。液体医药剂型中治疗抗体的浓度根据例如施用途径而广泛变化。当需要小体积时，通常需要抗体的高浓度剂型。例如，高浓度剂型对于玻璃体内注射或皮下施用而言可以令人满意。

然而，具有高浓度抗体的剂型可能保质期较短，且经调配的抗体可能由于储存期间化学和物理不稳定性损失生物活性。已知聚集、脱酰胺和氧化是抗体降解最普遍的原因。具体地，聚集可潜在地引起患者中免疫反应增加，从而引起安全性担忧。因此，必须将聚集降至最低程度或防止。

生物治疗剂型中颗粒的形成也是主要的质量考虑，因为人类裸眼大体上可看到数十微米至亚毫米和毫米尺寸范围内的颗粒(参见Das,2012,AAPS PharmSciTech,13:732-746)。治疗性眼用制剂中的颗粒可造成对眼睛的损伤。因此，存在规定标准以确保眼用剂型中的亚可见(sub-visible)颗粒物质内容物在一定限度内。例如，美国药典委员会(USP)已设置对于眼用溶液中颗粒物质的要求，诸如通过显微镜法颗粒计数确定的≥10μm直径的粒子的最大数目为50/mL，≥25μm直径的粒子的最大数目为5/mL，以及≥50μm直径的粒子的最大数目为2/mL(参见USP通则<789>)。

已知用于产生高浓度抗体剂型的方法。然而，抗体的氨基酸序列对抗体在各种医药赋形剂、缓冲液等的存在下形成聚集体或降解的趋势有无法预期的影响，尚不存在能克服这一影响的通用方法。此外，制备含可接受水平亚可见粒子的高浓度蛋白质(诸如抗体)的眼用剂型具有挑战性且不可预测。

本发明的一个目的是提供其他改良的具有高浓度抗VEGF抗体以及低水平抗体聚集物和亚可见粒子的剂型，其适于向人类施用，尤其向人眼施用。

发明内容

因此，本发明是关于一种水性医药组合物，其包含适合用于眼用注射的高浓度抗VEGF抗体。在某些方面，本发明的水性医药组合物显示出低至不可检测水平的抗体聚集或降解，其中在制造、制备、运输和长期储存期间极少损失甚至不损失生物活性，抗VEGF抗体的浓度为至少约50mg/ml、60mg/ml、80mg/ml、100mg/ml、120mg/ml、140mg/ml、160mg/ml、180mg/ml或200mg/ml。

本发明提供包含抗VEGF抗体、稳定剂、缓冲剂和表面活性剂的水性医药组合物。在某些方面，水性医药组合物包含：(i)至少50mg/ml抗VEGF抗体，(ii)作为稳定剂的蔗糖或海藻糖，(iii)柠檬酸盐或组氨酸缓冲剂，(iv)作为表面活性剂的聚山梨醇酯80。

在某些方面，水性医药组合物包含约4.5％-11％w/v蔗糖或5％-10％海藻糖、0.006％至0.012％柠檬酸(w/v)、0.2％至0.6％二水合柠檬酸三钠(w/v)和约0.01％至0.1％聚山梨醇酯80(w/v)，其中所述剂型的pH为6.3至7.3。

根据以下某些优选实施方式的更详细描述和权利要求书，本发明具体的优选实施方式是显见的。

附图说明

图1展示以不同pH调配的1008的浊度分析结果图。x轴展示在55℃下的培育时间；同时y轴展示在350nm下监测的光密度。

图2A和图2B展示监测在55℃下培育180min的不同1008剂型中OD₃₆₀改变的浊度分析(图2A)。将在60min内获得的OD₃₆₀曲线展开并示于(图2B)中。图2A和2B中的样本编号对应于表13中的剂型编号。

为了简便起见，图3展示了在0至90分钟之间收集数据的浊度分析。整个实验为180分钟。监测在55℃下培育的不同1008剂型的OD₃₆₀改变。图中的样本编号对应于表15中的剂型编号。

图4展示在40℃下储存6周期间8种所选剂型中主峰的SEC结果的图。

具体实施方式

本发明提供包含高浓度抗VEGF抗体的水性医药组合物。在某些实施方式中，本发明的水性医药组合物在2-8℃下稳定至少18个月，且适合用于眼部施用，包括注射或输注。在一个具体的实施方式中，本发明的水性医药组合物满足USP<789>相对于颗粒物质存在的要求。因此，在某些实施方式中，本发明水性医药组合物中≥10μm直径粒子的最大数目为50/mL，本发明水性医药组合物中≥25μm直径粒子的最大数目为5/mL，且本发明水性医药组合物中≥50μm直径粒子的最大数目为2/mL，这些粒子数目如美国药典委员会通则<789>所要求是通过光透和/或显微镜粒子计数方法来确定的。

如本文所用，“水性”医药组合物是适合用于医药用途的组合物，其中水性载体是蒸馏水。适合用于医药用途的组合物可为无菌的、均质的和/或等渗的。水性医药组合物可以直接制备入水性形式(例如在即用的预填充注射器中)(“水性剂型”)，或以制备为使用前短时内复原的冻干物形式。如本文所用，术语“水性医药组合物”是指液体剂型或复原冻干剂型。在某些实施方式中，本发明的水性医药组合物适合用于向人类对象眼用施用。在一个特定的实施方式中，本发明的水性医药组合物适合用于玻璃体内施用。在另一实施方式中，本发明的水性医药组合物适合用于通过玻璃体内输注施用。

本发明提供新型医药剂型，特别是活性成分包含人类VEGF抗体的新型医药剂型。在一个方面中，本发明关于具有高浓度抗VEGF抗体的水性医药组合物。本发明剂型中优选的抗VEGF抗体描述于WO 2009/155724中，其全部内容以引用的方式并入本文。

如本文所用的术语“抗体”包括全抗体和其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”、“抗原结合多肽”或“免疫结合剂”)或单链。“抗体”包括包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白或其抗原结合部分。各重链包含重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含CH1、CH2和CH3三个结构域。各轻链包含轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH区和VL区可进一步再分成被称为互补决定区(CDR)的超变区，穿插有被称为构架区(FR)的较保守区。各VH和VL由三个CDR和四个FR构成，这些区域依以下顺序自氨基端至羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链可变区含有与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，这些宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。

术语抗体的“抗原结合部分”(或简言之“抗体部分”)是指保留对抗原(例如VEGF)特异性结合能力的抗体的一或多个片段。已表明抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段执行。涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含通过铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的单结构域或dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341：544-546)；和(vi)分离的互补决定区(CDR)；或(vii)两种或两种以上分离的CDR的组合，这些CDR可任选地通过合成接头连接。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是其可使用重组方法通过合成接头连接，该接头使其能够制造成单蛋白质链，在该单蛋白质链中VL和VH区成对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等(1988)Science 242：423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这些单链抗体也涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体片段可从本领域技术人员已知的常规技术获得，且这些片段经筛选以与完整抗体相同的方式应用。抗原结合部分可通过重组DNA技术或通过完整免疫球蛋白的酶促或化学裂解生成。抗体可为不同的同种型，例如IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗体。

在一个优选实施方式中，本发明的水性医药组合物包含具有如SEQ ID NO：1中所示序列的可变重链和如SEQ ID NO：2中所示序列的可变轻链。

VH：SEQ ID NO：1

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLTDYYYMTWVRQAPGKGLEWVGFIDPDDDPYYATWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGDHNSGWGLDIWGQGTLVTVSS

VL：SEQ ID NO：

EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASEIIHSWLAWYQQKPGKAPKLLIYLASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNVYLASTNGANFGQGTKLTVLG

在另一优选实施方式中，抗VEGF抗体为单链Fv(scFv)抗体片段，其包含序列：

EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASEIIHSWLAWYQQKPGKAPKLLIYLASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNVYLASTNGANFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLTDYYYMTWVRQAPGKGLEWVGFIDPDDDPYYATWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGDHNSGWGLDIWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：3)

本发明的水性医药组合物中抗VEGF抗体可如例如WO 2009/155724中所述产生。如本文所述，scFv可使用表达载体产生。在其未转译后裂解的情况下，来源于表达载体中起始密码子的甲硫氨酸存在于最终蛋白质中(参见实施例中的SEQ ID NO:4)。

在某些实施方式中，本发明的水性医药组合物中抗VEGF抗体包含如SEQ ID NO:5、6和7中所示的重链CDR1、CDR2和CDR3，和如SEQ ID NO:8、9和10中所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3。

SEQ ID NO:5GFSLTDYYYMT

SEQ ID NO:6FIDPDDDPYYATWAKG

SEQ ID NO:7GDHNSGWGLDI

SEQ ID NO:8QASEIIHSWLA

SEQ ID NO:9LASTLAS

SEQ ID NO:10QNVYLASTNGAN

在一个实施方式中，本发明的水性医药组合物中抗VEGF抗体的浓度为至少50mg/ml。优选地，本发明的水性医药组合物包含约50mg/ml、约60mg/ml、约70mg/ml、约80mg/ml、约90mg/ml、约100mg/ml、约110mg/ml、约120mg/ml、约130mg/ml、约140mg/ml、约150mg/ml、约160mg/ml、约170mg/ml、约180mg/ml、约190mg/ml、约200mg/ml、约210mg/ml、约220mg/ml、约230mg/ml、约240mg/ml、约250mg/ml或约300mg/ml抗VEGF抗体。

在某些实施方式中，本发明的水性医药组合物包含60mg/ml-120mg/ml的抗VEGF抗体，例如包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的抗体。

在一个实施方式中，本发明的水性医药组合物包含60mg/ml抗VEGF抗体，其包含SEQ ID NO:3。

在另一实施方式中，本发明的水性医药组合物包含120mg/ml抗VEGF抗体，其包含SEQ ID NO:3。

本发明的水性医药组合物除抗VEGF抗体外也包括其他组分，诸如下列一或多个：(i)稳定剂；(ii)缓冲剂；(iii)表面活性剂；和(iv)游离氨基酸。包含各所述其他组分可得抗VEGF抗体低聚集的组合物。优选地，本发明的水性医药组合物除抗VEGF抗体外也包括：(i)稳定剂；(ii)缓冲液；和(iii)表面活性剂。

用于与本发明一起使用的合适稳定剂可充当例如增黏剂、增容剂、增溶剂等。稳定剂可为离子的或非离子的(例如糖)。作为糖，其可包括但不限于单糖，例如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；双糖，例如，乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，例如棉子糖、松三糖、麦芽糊精、葡聚糖、淀粉等；和醛醇，例如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨醇(葡萄糖醇)等。例如，糖可为蔗糖、海藻糖、棉子糖、麦芽糖、山梨醇或甘露醇。糖可为糖醇或氨基糖。优选蔗糖和海藻糖。最优选蔗糖。作为离子稳定剂，其可包括盐诸如NaCl或氨基酸组分诸如精氨酸-HCl。

用于与本发明一起使用的合适缓冲剂包括但不限于有机酸盐诸如柠檬酸盐、抗坏血酸盐、葡萄糖酸盐、碳酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、乙酸盐或邻苯二甲酸盐；Tris、盐酸氨基丁三醇或磷酸盐缓冲剂。此外，氨基酸组分也可用作缓冲剂。柠檬酸盐或组氨酸缓冲剂特别有用，包括10-20mM组氨酸缓冲液，例如0.13％至0.26％(w/v)组氨酸和0.03％-0.07％(w/v)一水合组氨酸盐酸盐，或10-20mM柠檬酸盐缓冲液，例如0.006％至0.012％柠檬酸(w/v)和0.2％至0.6％二水合柠檬酸三钠(w/v)。用于本发明剂型的柠檬酸可为任何水合形式，例如无水或一水。

水性医药组合物包括这类缓冲剂或pH调节剂以提供改良的pH控制。在某些实施方式中，本发明的水性医药组合物的pH在5.0与8.0之间、5.0与7.0之间、6.0与8.0之间或6.0与7.0之间。在一个实施方式中，本发明的水性医药组合物的pH为约6.3至约7.3。在一个特定的实施方式中，本发明的水性医药组合物具有约6.8的pH。

如本文所用，本文中术语“表面活性剂”是指具有两亲结构的有机物质；即其由溶解趋势相反的基团组成，通常是油溶性烃链和水溶性离子基团。对于生物材料的各种医药组合物和制剂，表面活性剂可根据界面活性部分的电荷而分类成阴离子、阳离子和分散剂。

用于与本发明一起使用的合适表面活性剂包括但不限于非离子表面活性剂、离子表面活性剂和两性离子表面活性剂。用于与本发明一起使用的典型表面活性剂包括但不限于去水山梨醇脂肪酸酯(例如单辛酸去水山梨醇酯、单月桂酸去水山梨醇酯、单棕榈酸去水山梨醇酯)、三油酸去水山梨醇酯、甘油脂肪酸酯(例如单辛酸甘油酯、单肉豆蔻酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯)、聚甘油脂肪酸酯(例如单硬脂酸十甘油酯、二硬脂酸十甘油酯、单亚油酸十甘油酯)、聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯(例如聚氧乙烯去水山梨醇单月桂酸酯、聚氧乙烯去水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯去水山梨醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯去水山梨醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯去水山梨醇三油酸酯、聚氧乙烯去水山梨醇三硬脂酸酯)、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(例如聚氧乙烯梨糖醇四硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨醇四油酸酯)、聚氧乙烯甘油脂肪酸酯(例如聚氧乙烯甘油单硬脂酸酯)、聚乙二醇脂肪酸酯(例如聚乙二醇二硬脂酸酯)、聚氧乙烯烷基醚(例如聚氧乙烯月桂醚)、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚(例如聚氧乙烯聚氧丙烯二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯丙醚、聚氧乙烯聚氧丙烯十六醚)、聚氧乙烯烷基苯基醚(例如聚氧乙烯壬基苯基醚)、聚氧乙烯氢化蓖麻油(例如聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油)、聚氧乙烯蜂蜡衍生物(例如聚氧乙烯山梨醇蜂蜡)、聚氧乙烯羊毛脂衍生物(例如聚氧乙烯羊毛脂)和聚氧乙烯脂肪胺(例如聚氧乙烯硬脂胺)；C10-C18烷基硫酸盐(例如十六烷基硫酸钠、月桂基硫酸钠、油烯基硫酸钠)、平均加有2至4摩尔环氧乙烷单元的聚氧乙烯C10-C18烷基醚硫酸盐(例如聚氧乙烯月桂基硫酸钠)和C1-C18烷基磺基琥珀酸酯盐(例如月桂基磺基琥珀酸酯钠)；和天然表面活性剂诸如卵磷脂、甘油磷脂、鞘磷脂(例如神经鞘磷脂)和C12-18脂肪酸的蔗糖酯。组合物可包括这些表面活性剂中的一或多个。优选表面活性剂为聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯，例如聚山梨醇酯20、40、60或80。尤其优选聚山梨醇酯80。

用于与本发明一起使用的合适游离氨基酸包括但不限于精氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸或天冬氨酸。优选包括碱性氨基酸，即精氨酸、赖氨酸和/或组氨酸。若组合物包括组氨酸，则其可既充当缓冲剂也充当游离氨基酸，但当使用组氨酸缓冲液时，通常包括非组氨酸游离氨基酸，例如包括组氨酸缓冲液和赖氨酸。氨基酸可以D-和/或L-形式存在，但通常是L-形式。氨基酸可以任何合适的盐存在，例如盐酸盐，诸如精氨酸-HCl。在一个优选实施方式中，本发明的水性医药组合物不包含任何这类游离氨基酸。

在一个优选实施方式中，糖以3％与11％(w/v)之间的浓度存在于本发明的水性医药组合物中(例如冻干物在水中复原后)。在某些实施方式中，糖是浓度约4.5％至约11％的蔗糖或浓度约5％至约10％的海藻糖。优选6.75％(w/v)浓度的蔗糖。

在一个优选实施方式中，缓冲剂以1mM与60mM之间的浓度存在于本发明的水性医药组合物中(例如冻干物在水中复原后)，例如10-40mM、15-30mM、15-25mM。在某些实施方式中，缓冲剂为柠檬酸盐或组氨酸。优选15mM浓度的柠檬酸盐缓冲液。

在一个优选实施方式中，表面活性剂以至多0.2％(按体积计)的浓度存在于本发明的水性医药组合物中(例如冻干物在水中复原后)，例如0.01-0.1％、0.03-0.08％、0.04-0.08％。优选0.05％浓度的聚山梨醇酯80。

可用于本发明水性医药组合物中的其他预期赋形剂包括例如抗微生物剂、抗氧化剂、抗静电剂、脂质诸如磷脂或脂肪酸、类固醇诸如胆固醇、蛋白质赋形剂诸如血清白蛋白(人类血清白蛋白)、重组人类白蛋白、明胶、酪蛋白、成盐抗衡离子诸如钠等。这些和其他已知的适合用于本发明剂型中的医药赋形剂和/或添加剂为本领域所知，例如如以下所列：The Handbook of Pharmaceutical Excipients,第4版,Rowe等编,AmericanPharmaceuticals Association(2003)；和Remington:the Science and Practice ofPharmacy,第21版,Gennaro编,Lippincott Williams&Wilkins(2005)。

本发明的优选剂型示于以下实施例的表40中。

在某些实施方式中，考虑冻干抗VEGF抗体来得到用于治疗患者的本发明水性医药组合物。

本领域已知抗体冻干技术，例如参见John F.Carpenter和Michael J.Pikal,1997(Pharm.Res.14,969-975)；Xialin(Charlie)Tang和Michael J.Pikal,2004(Pharm.Res.21,191-200)。

在将冻干物向患者施用之前，应将其用水性复原剂复原。该步骤允许冻干物中的抗体和其他组分重新溶解以得到适合用于向患者注射的溶液。

用于复原的水性材料体积决定所得医药组合物中抗体的浓度。用体积小于冻干前体积的复原剂复原得到比冻干之前更浓缩的组合物。复原因子(冻干之后剂型的体积:冻干之前剂型的体积)可为1:0.5至1:6。1:3的复原因子是可用的。如上文所提及，可将本发明的冻干物复原以得到抗VEGF抗体浓度至少50mg/ml(即至少60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml、110mg/ml、120mg/ml或130mg/ml)的水性组合物，且可相应地选择复原物的体积。当需要时，可在向患者施用之前酌情将复原剂型稀释以递送预计剂量。

冻干抗体的典型复原剂包括无菌水或缓冲液，可任选含有防腐剂。若冻干物包括缓冲剂，则复原剂可包括额外缓冲剂(其可与冻干物的缓冲剂相同或不同)，或反之，其可不包括缓冲剂(例如WFI(注射用水)或生理盐水)。

包含抗VEGF抗体的本发明水性医药组合物可用于治疗不同疾病或病症。包含抗VEGF抗体的医药组合物尤其可用于治疗对象的新生血管眼部疾病。

可使用本发明水性医药组合物治疗的“新生血管眼部疾病”包括与眼部新生血管形成相关联的病状、疾病或病症，其包括但不限于异常的血管生成、脉络膜新生血管(CNV)、视网膜血管通透性、视网膜水肿、糖尿病性视网膜病(特别是增生性糖尿病性视网膜病)、糖尿病性黄斑水肿、新生血管(渗出性)老年性黄斑变性(AMD)、包括与nAMD(新生血管AMD)相关联的CNV、与视网膜缺血相关的后遗症、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)和后节新生血管形成。

本发明的水性医药组合物可包括除抗VEGF抗体外的其他活性成分。其他的药理学试剂可包括例如可用于治疗眼部疾病的其他抗体。

本发明的水性医药组合物可向患者施用。如本文所用，术语“对象”或“患者”指人类和非人类哺乳动物，包括但不限于灵长类、兔、猪、马、狗、猫、羊和牛。对象或患者优选为人类。

施用通常经由注射器。因此，本发明提供一种包括本发明医药组合物的递送装置(例如注射器)，例如预填充的注射器。患者将接受有效量的抗VEGF抗体作为主要活性成分(即足以达成或至少部分达成所需效果的量)。治疗有效量若能使基本相关症状或病症产生(即便)量变就已充分。治疗有效剂量不必完全治愈疾病或完全消除症状。优选地，治疗有效剂量可至少部分遏制正罹患该疾病患者的疾病和其并发症。有效用于该用途的量将取决于正在治疗的病症的严重程度和患者自身免疫系统的综合状态。

剂量可由具有治疗该疾病或病状的一般技术的医师使用已知的剂量调整技术容易地确定。例如，本发明水性医药组合物中所用的治疗有效量的抗VEGF抗体通过考量所需的剂量体积和施用方式来确定。通常，治疗有效的组合物是以每剂0.001mg/ml至约200mg/ml范围内的剂量施用。优选地，本发明方法中所用的剂量为约60mg/ml至约120mg/ml(即约60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml、110mg/ml或120mg/ml)。在一个优选的实施方式中，本发明方法中所用的抗VEGF抗体的剂量为60mg/ml或120mg/ml。

在某些实施方式中，直接向患者的眼睛施用剂量。在一个实施方式中，每眼的剂量为至少约0.5mg至约6mg。优选的每眼剂量包括约0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg、1.0mg、1.2mg、1.4mg、1.6mg、1.8mg、2.0mg、2.5mg、3.0mg、3.5mg、4.0mg、4.5mg、5.0mg、5.5mg和6.0mg。剂量可以各种适合用于眼部施用的体积施用，诸如50μl或100μl，例如包括3mg/50μl或6mg/50μl。也可使用较小体积，包括10μl或更小，例如约10μl或约8.0μl。在某些实施方式中，将1.2mg/10μl或1mg/8.0μl(例如1mg/8.3μl)的剂量递送至患者眼睛用于治疗或改善上文所述的一或多个疾病和病症。例如可通过玻璃体内注射或输注递送。

本发明也提供用作药物的本发明剂型(即水性医药组合物)，例如用于向患者递送抗体，或用于治疗或改善上述一或多个疾病和病症。

本发明进一步提供一种用于向患者递送抗VEGF抗体的方法，其包含向患者施用本发明水性医药组合物的步骤。

在某些实施方式中，本发明向患者递送抗VEGF抗体的方法包含以下步骤：(i)将本发明的冻干物复原得到水性剂型，和(ii)向患者施用水性剂型。步骤(ii)理想地发生在步骤(i)的24小时内(例如在12小时内、在6小时内、在3小时内或在1小时内)。

本发明的某些特定实施方式如下文编号所述：

1.一种水性医药组合物，包含(i)至少50mg/ml抗VEGF抗体，其包括SEQ ID NO:5、6和7所示的重链CDR1、CDR2和CDR3，和SEQ ID NO:8、9和10所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3，(ii)蔗糖或海藻糖，(iii)柠檬酸盐或组氨酸缓冲剂，和(iv)作为表面活性剂的聚山梨醇酯80。

2.如实施方式1的水性医药组合物，包含4.5％至11％(w/v)蔗糖或5％至10％海藻糖、0.006％至0.012％柠檬酸(w/v)、0.2％至0.6％二水合柠檬酸三钠(w/v)和0.01％至0.1％聚山梨醇酯80(w/v)，其中该组合物的pH为约6.3至约7.3。

3.如实施方式2的水性医药组合物，其中蔗糖的浓度为6.75％(w/v)，柠檬酸的浓度为约0.01％(w/v)，二水合柠檬酸三钠的浓度为约0.428％(w/v)，聚山梨醇酯80的浓度为约0.05％(w/v)，且pH为约6.8。

4.如实施方式1-3中任一项的水性医药组合物，其中该抗VEGF抗体的浓度为至少60mg/ml、至少70mg/ml、至少80mg/ml、至少90mg/ml、至少100mg/ml、至少110mg/ml、至少120mg/ml、至少130mg/ml、至少140mg/ml或至少150mg/ml。

5.如实施方式1-4中任一项的水性医药组合物，其中该抗VEGF抗体的浓度为约60mg/ml、约70mg/ml、约80mg/ml、约90mg/ml、约100mg/ml、约110mg/ml、约120mg/ml、约130mg/ml、约140mg/ml或约150mg/ml。

6.如实施方式1-5中任一项的水性医药组合物，其中该抗VEGF抗体包含SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2的序列。

7.如实施方式1-6中任一项的水性医药组合物，其中该抗VEGF抗体包含SEQ IDNO:3的序列。

8.如实施方式1-7中任一项的水性医药组合物，其中该抗VEGF抗体的浓度为约60mg/ml或约120mg/ml。

9.一种递送装置，其包括实施方式1-8中任一项的水性医药组合物。

10.如实施方式9的递送装置，其为预填充的注射器。

11.一种用于向对象递送抗VEGF抗体的方法，其包含向该对象施用实施方式1-8中任一项的水性医药组合物的步骤。

12.一种治疗由VEGF介导的眼部疾病或病症的方法，其包含向对象施用实施方式1-8中任一项的水性医药组合物。

13.如实施方式12的方法，其中该眼部疾病或病症为眼部新生血管疾病。

14.一种通过将实施方式1-8中任一项的水性医药组合物冻干而制备的冻干剂型。

15.一种用于制备冻干物的方法，其包含以下步骤：(i)制备抗VEGF抗体、蔗糖或海藻糖、柠檬酸盐或组氨酸缓冲剂和表面活性剂的水溶液；和(ii)将该水溶液冻干。

16.如实施方式15的方法，其中该抗VEGF抗体包括SEQ ID NO:5、6和7所示的重链CDR1、CDR2和CDR3，和SEQ ID NO:8、9和10所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3。

17.如实施方式16的方法，其中该抗VEGF抗体包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的序列。

18.如实施方式16-17中任一项的方法，其中该抗VEGF抗体包含SEQ ID NO:3的序列。

19.用于向对象递送抗VEGF抗体的实施方式1-8中任一项的水性医药组合物，所述递送包含向对象施用该水性医药组合物的步骤。

20.用于治疗由VEGF介导的眼部疾病或病症的实施方式1-8中任一项的水性医药组合物，包含向对象施用该水性医药组合物。

21.如实施方式20的用途，其中该眼部疾病或病症为眼部新生血管疾病。

如本文所用且除非另外说明，所有百分比为重量百分比。

如本文所用且除非另外指明，术语“一个”和“一种”用于表示“一个(种)”、“至少一个(种)”或“一或多个(种)”。除非与上下文相反，本文所用的单数术语将包括复数且复数术语将包括单数。

本说明书中通篇所引用的任何专利、专利申请和参考文献的内容以全文引用的形式并入本说明书。

从本文所公开的本发明说明书和实施来考虑，本发明的其他实施方式会对本领域技术人员显见。本发明说明书和实施例仅具有示范性，且本发明的真实范畴和精神由权利要求书和其等效范围指示。

实施例

以下实施例描述剂型开发工作，其经设计以鉴别合适的稳定化方法和组合物以得到包含抗体1008的稳定且高度浓缩的溶液，从而能提供在冷藏储存条件下具有至少18个月保质期的IVT剂型，符合眼用产品的规定要求。

1008抗体为单链抗体，其结合至人类血管内皮生长因子A(VEGF-A)并抑制人类血管内皮生长因子A的生物活性。所表达1008的氨基酸序列为：

将1008调配成在pH 6.25下具有0.001％聚山梨醇酯20的15mM柠檬酸盐缓冲液中的等渗溶液时，在60mg/ml 1008的浓度下观察到显著量的亚可见颗粒。该初始剂型的主要问题为：即使在-20℃下储存时，颗粒物质也超过眼用注射用溶液的规定限制(USP<789>)。

以下实施例概括了在2-8℃下储存至少18个月稳定的60mg/ml和120mg/ml 1008玻璃体内(IVT)溶液的剂型开发。剂型开发工作的重点在于抑制亚可见粒子形成和达到USP对含量、纯度和效力的要求。

分析方法

如所示，实施例通篇使用以下方法。

微流成像(MFI)方法

赋形剂筛选，针对60mg/ml优化研究的研究1和研究2所用MFI方法如下：

所用的总样本体积0.50mL

冲洗体积：0.20mL

分析体积：0.26mL

用纯化的经过滤的不含粒子的水进行照明步骤优化。

分析120mg/ml 1008的研究3和研究4所用MFI方法：

所用的总样本体积0.80mL

冲洗体积：0.23mL

分析体积：0.48mL

用纯化的经过滤的不含粒子的水进行照明步骤优化。

SEC方法

SE-HPLC(体积排阻色谱)根据体积分离蛋白质。通过样本分子在其穿过多孔粒子固定相时的区分排阻(differential exclusion)或纳入而实现分离。高效液相层析系统能够保持0.25ml/分钟的流动速率和4℃的样本温度，装备有TOSOH SuperSW3000柱(TosohBioscience LLC,King of Prussia,PA)和能够同时在214nm和280nm下运行的检测器。该方法用于纯度测试。

IEX-HPLC方法

AIEX-HPLC(阴离子交换高效液相层析法)根据净电荷分离蛋白质。该过程使用高效液相层析法(HPLC)进行，其能够保持0.8ml/分钟的流动速率，具有含有强阴离子交换柱的温控柱室(设定在25℃)、自动取样器(设定在4℃)和能够在280nm下运行的可变波长UV检测器。

CGE方法

通过SDS凝胶毛细管电泳进行毛细管凝胶电泳方法，以确定在10kDa与225kDa的分子量之间的蛋白质的同一性和纯度。毛细管动态地填充有pH 8的Beckman Coulter 0.2％SDS凝胶缓冲液这一专有制剂。通过分子筛电泳进行蛋白质的分离。蛋白质分子量的对数与其电泳移动率的倒数成线性关系。通过比较蛋白质的迁移与分子量标准确定蛋白质的同一性。通过母峰和杂质的面积百分比分析确定纯度。用光电二极管阵列检测器(PDA)在220nm下分析样品。

效力分析

用竞争ELISA测定效力。竞争ELISA测量1008与VEGFR2/Fc竞争生物素化VEGF的能力。所观察到的信号与1008的浓度反相关，因为增加量的1008有效地阻止生物素化VEGF与其受体VEGFR2/Fc结合。在96孔微量滴定板中相对于1008参考标准分析各样本，并报道样品相对于参考标准的效力。

实施例1

赋形剂筛选

在pH 6.25的柠檬酸盐缓冲液中配制1008。剂型组成示于表1中。

表1

在上述剂型中观察到显著数目的亚可见颗粒。即使在-20℃储存下，颗粒物质超过眼用注射溶液的规定限制USP<789>。

研究各种赋形剂对可见颗粒形成的作用以开发更稳定的1008的液体溶液。将含有不同赋形剂的60mg/ml蛋白质溶液储存在40℃下且通过MFI分析大小为1-100μm的颗粒。实验数据证明，大部分所测试的赋形剂并不减少颗粒形成，包括精氨酸、葡聚糖、抗坏血酸、甲硫氨酸和乙酸胺。仅在非还原糖诸如蔗糖和海藻糖的存在下，颗粒形成显著减少。

进一步进行赋形剂筛选。在～60mg/ml 1008溶液中评估赋形剂对1008稳定性的作用。将含有0.1％人类血清白蛋白(HSA)、0.1％泊洛沙姆407、0.1％玻雷吉35、3％甘油、50mM甘氨酸的蛋白质溶液储存在40℃下，且在储存8日、21日和28日之后通过MFI、SEC和IEX分析样品。结果示于表2中。实验数据证明在所测试赋形剂的存在下蛋白质的不稳定性。

表2

赋形剂筛选的结果

在pH 6.25的20mM磷酸盐缓冲液中研究57mg/ml 1008的稳定性。在40℃下储存6日、14日和27日后分析含有9％蔗糖和0.1％PS80的剂型。结果列于表3中。

表3

20mM磷酸盐缓冲液中57mg/ml 1008的稳定性

在40℃下的时间(日)	6	14	27
				≥10μm通过MFI(#/mL)	43	42	11
≥25μm通过MFI(#/mL)	3	13	3
				≥50μm通过MFI(#/mL)	1	4	0
总计通过MFI(#/mL)	1418	1650	425
				SEC(初始％)	97.3	91.9	82.1
IEX(初始％)	98.3	92.2	79.2

实施例2

新剂型开发

研究1

赋形剂筛选

将pH 6.25且含有0.001％聚山梨醇酯20和0.73％NaCl的20mM柠檬酸盐缓冲液中的60mg/ml 1008的蛋白质溶液用于样品制备。为了移除原始蛋白质溶液中的表面活性剂，首先使用不含聚山梨醇酯20的载剂用NAP-25柱进行缓冲液交换。随后使用具有10kDa MWCO的Vivaspin过滤器将交换后的蛋白质溶液浓缩至约60mg/ml。分别掺入(spike)赋形剂HSA、甘氨酸、甘油、泊洛沙姆407和玻雷吉35。随后将所制备的样品经0.2μm PVDF膜用注射器过滤至4mL透明玻璃小瓶中。将约100μL样品用于初始分析，同时将剩余样品在40℃下储存。在40℃下储存8日、21日和28日时，取出各剂型的一毫升样品用于通过MFI、SEC和IEX分析。

缓冲剂、糖和表面活性剂的组分选择

基于在内部进行的赋形剂筛选研究，选择两种缓冲剂(柠檬酸盐和组氨酸)、糖(蔗糖和海藻糖)和表面活性剂(聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80)用于剂型组分选择。选择20mM的缓冲剂强度、264mM的糖浓度和0.1％的表面活性剂浓度用于研究。如下表所示设计全因子实验研究。

表4

研究1的因子和设计

因子	设计
		缓冲剂	20mM柠檬酸盐或20mM组氨酸
糖	264mM(9％)蔗糖或264mM(9％)海藻糖
		表面活性剂	0.1％聚山梨醇酯20或0.1％聚山梨醇酯80

所用的全设计示于下表5中：

表5

研究1的三因素全因子设计

编号	缓冲液(mM)	糖	表面活性剂
				1	20mM柠檬酸盐	264mM海藻糖	0.1％PS 20
2	20mM柠檬酸盐	264mM海藻糖	0.1％PS 80
				3	20mM柠檬酸盐	264mM蔗糖	0.1％PS 20
4	20mM柠檬酸盐	264mM蔗糖	0.1％PS 80
				5	20mM组氨酸	264mM海藻糖	0.1％PS 20
6	20mM组氨酸	264mM海藻糖	0.1％PS 80
				7	20mM组氨酸	264mM蔗糖	0.1％PS 20
8	20mM组氨酸	264mM蔗糖	0.1％PS 80

其他参数：

浓度/pH 在pH 6.25下50-60mg/ml 1008

缓冲液交换 NAP25柱，用Vivaspin 10kDa MWCO浓缩

样品大小/Pkg 2-2.5mL在具有螺旋盖的4mL透明玻璃小瓶中

储存/取出 40℃/0、1周、2周和4周

分析 MFI、SEC和IEX

用含有0.001％聚山梨醇酯20的原始缓冲液中的60mg/ml 1008的蛋白质溶液进行样品制备。制备四种新的载剂缓冲液，其具有不同缓冲液/糖组合(20mM柠檬酸盐/264mM海藻糖、20mM柠檬酸盐/264mM蔗糖、20mM组氨酸/264mM海藻糖、20mM组氨酸/264mM蔗糖)。首先使用Illustra NAP-25柱(GE Healthcare)将1008药物物质(DS)交换至载剂缓冲液中。用25mL柠檬酸盐缓冲液将柱平衡。随后将2mL 1008DS加载到柱上。在DS溶液完全移动到柱中之后，将柱用平衡柱所用的2mL相同缓冲液洗涤。在Vivaspin 6浓缩器(10KD MWCO，GEHealthcare)中收集6mL自柱洗脱的溶液。随后使用Beckman GS-15R离心机在9384×g、4℃下将6mL洗脱溶液浓缩至约2mL。随后使用OD280用NanoDrop 1000分光光度计测量蛋白质的浓度。在剂型中掺入聚山梨醇酯20(PS20)或聚山梨醇酯80(PS80)到最终浓度为0.1％。随后将所制备的剂型经0.2μm PVDF注射器过滤器过滤并装至4mL透明玻璃小瓶中。将约100uL样品用于初始分析，同时将剩余样品在40℃下储存。在40℃下储存1周、2周和4周之后取出一毫升样品用于MFI、SEC和IEX分析。

进行定性研究以选择剂型最优的糖/表面活性剂/缓冲液组成。如上文所讨论用两种缓冲剂(柠檬酸盐和组氨酸)、糖(蔗糖和海藻糖)、表面活性剂(聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80)进行研究设计。在加速条件(40℃)下进行四周稳定性研究。通过SEC、IEX和MFI分析样品稳定性。表6示出通过SEC、IEX测得的稳定性结果和通过μDSC测得的熔点(Tm)。

表6

在40℃下60mg/ml 1008的因子定性分析

*通过相对峰面积的损失％

使用Minitab(Minitab公司，State College PA)分析稳定性结果。因为SEC和IEX示出相同趋势，所以仅用Minitab分析并报告SEC数据。SEC结果证明表面活性剂是唯一显著因子；似乎影响反应的其他因子包括缓冲剂选择和缓冲剂与糖之间的相互作用(程度较低)。SEC数据表明优选剂型组分是柠檬酸盐为缓冲液、聚山梨醇酯80为表面活性剂和蔗糖为糖。

进一步通过Minitab分析MFI所得颗粒的实验结果。所评估的全部三个因子(糖、表面活性剂和缓冲剂)似乎为不显著的(α＝0.05)。比较对颗粒的主要作用，柠檬酸盐优于组氨酸；PS80优于PS20；蔗糖类似于或略优于海藻糖。因此，选择柠檬酸盐作为缓冲剂、聚山梨醇酯80作为表面活性剂和蔗糖作为糖用于进一步研究。

研究2

缓冲剂、糖和表面活性剂的浓度的优化

分别在柠檬酸盐和组氨酸缓冲液中进行在具有两个中心点的二水平三因素的全因子研究，以确定各所选剂型组分的优选浓度。三种因子为缓冲剂(柠檬酸盐或组氨酸)、聚山梨醇酯80和蔗糖。因子和设计空间列于表7中且详细的实验设计示于表8和9中。

表7

因子和设计研究2

表8

柠檬酸盐缓冲液中的全因子设计

操作顺序	缓冲液(mM)	蔗糖(％)	聚山梨醇酯80(％)
				C1	10	4.5	0.001
C2	20	4.5	0.001
				C3	10	9	0.001
C4	20	9	0.001
				C5	10	4.5	0.1
C6	20	4.5	0.1
				C7	10	9	0.1
C8	20	9	0.1
				C9	15	6.75	0.0505
C10	15	6.75	0.0505

表9

组氨酸缓冲液中的全因子设计

(具有2个中心点的二水平三因素)

操作顺序	缓冲液(mM)	蔗糖(％)	聚山梨醇酯80(％)
				H1	10	4.5	0.001
H2	20	4.5	0.001
				H3	10	9	0.001
H4	20	9	0.001
				H5	10	4.5	0.1
H6	20	4.5	0.1
				H7	10	9	0.1
H8	20	9	0.1
				H9	15	6.75	0.0505
H10	15	6.75	0.0505

为制备各剂型，使用pH 6.25、含有0.001％聚山梨醇酯20/0.73％NaCl的柠檬酸盐缓冲液中的60mg/ml 1008的蛋白质溶液。首先使用NAP-25柱将蛋白质溶液缓冲液交换成载剂。该载剂含有其目标浓度的缓冲剂和蔗糖。使用Vivaspin 10kDa MWCO将经交换的蛋白质溶液浓缩至约60mg/ml的浓度。

随后添加批量的聚山梨醇酯80和氯化钠以制造最终剂型组合物。用280nm UV所测吸光度以理论消光系数验证各样品中的蛋白质浓度。

随后将所制备的剂型经0.2μm PVDF注射器过滤器过滤至4mL透明玻璃小瓶中。将约100μL样品用SEC和IEX进行初始分析，同时将约2-2.5mL样品在40℃下储存。在40℃下储存11、20和27天后取出约600μL样品通过MFI、SEC和IEX分析。

基于研究1的结果，分别在柠檬酸盐和组氨酸缓冲液中进行具有两个中心点的二水平三因素的全因子研究，以确定各所选剂型组分的优选浓度。所测试的样品在40℃下储存，且在0、1.6周、2.9周和4周取出用MFI、SEC和IEX分析。结果列于表10和11中。

表10

柠檬酸盐缓冲溶液的稳定性结果

表11

组氨酸缓冲溶液的稳定性结果

用Minitab分析实验数据。对于柠檬酸盐缓冲液中的SEC结果，表面活性剂是影响蛋白质聚集的主要因子，而蔗糖、蔗糖与聚山梨醇酯80之间的相互作用和缓冲液强度的作用较不显著。较高蔗糖浓度和较低聚山梨醇酯80浓度有利于蛋白质稳定性。蛋白质稳定性略影响聚集，且较高的柠檬酸盐缓冲液强度稍促进蛋白质稳定性。

对于柠檬酸盐缓冲液中的MFI结果，蔗糖和聚山梨醇酯80的因子以及蔗糖与山梨醇酯80的相互作用在颗粒形成中起同样重要的作用。高蔗糖和高聚山梨醇酯80显著地抑制颗粒形成，而在10-20mM范围内的缓冲液强度略影响颗粒形成，优选较低的缓冲液强度。

组氨酸缓冲液溶液的Minitab分析结果展示，表面活性剂聚山梨醇酯80是影响蛋白质聚集的主要因子，而缓冲液强度与聚山梨醇酯80之间的相互作用以及蔗糖起较不显著的作用。较少聚山梨醇酯80有利于蛋白质稳定性。缓冲液强度和蔗糖浓度似乎并不影响蛋白质聚集。

对于组氨酸缓冲液中的MFI结果，聚山梨醇酯80、蔗糖和蔗糖与山梨醇酯80的相互作用在颗粒形成中起显著作用。优选高蔗糖和低聚山梨醇酯80以及低缓冲液强度来抑制颗粒形成。

pH优化

在含有0.1％NaCl、6.75％蔗糖和0.05％PS80的15mM柠檬酸盐缓冲液中、六个pH条件(5.0、6.0、6.25、6.50、6.75和7.0)下研究pH对1008的聚集行为的影响。首先使用Illustra NAP-10柱(GE Healthcare)将1008药物物质交换至具有不同pH的载剂(不含PS80)中。首先用15mL柠檬酸盐缓冲液将柱平衡。随后将1mL 1008DS加载到柱上。在DS溶液完全移动至柱中之后，将柱用2mL平衡柱所用的相同柠檬酸盐缓冲液洗涤。在Vivaspin 2浓缩器(10KD MWCO，GE Healthcare)中收集2mL自柱洗脱的溶液。随后使用Beckman GS-15R离心机在9384×g、4℃下将2mL洗脱溶液浓缩至约1mL。随后用NanoDrop 1000分光光度计测量蛋白质的浓度。确定该研究的最终1008浓度为约70mg/ml。将PS80掺入剂型，直至0.05％的最终目标浓度。使用有两位池架和温度调节水浴的PerkinElmer Lambda 35分光光度计进行动力学浊度分析。在具有1cm光程的Starna亚微米体积石英池(Starna Scientific公司，英国)中，加入250μL1008剂型或对应的载剂。将池置于已经预加热至55℃的池架中。持续120分钟监测1008剂型中OD350的改变。随后将不同pH下剂型所获得的OD350数据对时间绘图，以用于比较。

使用基于浊度的动力学分析，用含有约70mg/ml 1008的pH 5.0至7.0的剂型研究pH对1008聚集行为的影响。对于浊度分析，OD350的急剧增大与蛋白质的主要聚集事件相关。因此，各剂型的OD350增大所需的培育时间差异可反映出剂型中不同蛋白质的物理稳定性。如图1中所示，在所测试剂型条件下1008似乎在pH 6.75下最稳定，因为其在OD350的急剧增大之前的培育时间最长。重复实验具有类似结果，证实所测试剂型在pH 6.75下最稳定。

研究3

赋形剂和高活性浓度的影响

进行半因子研究(表12)以研究主要剂型条件的影响，包括蛋白质浓度(60-120mg/ml)、蔗糖浓度(4.5-9.0％)、柠檬酸盐缓冲剂浓度(10至20mM)和聚山梨醇酯80浓度(0.01-0.1％)。

表12

研究3的研究设计

为制备上述剂型，首先制备pH 6.5的20％柠檬酸盐缓冲液和pH 6.5的在20mM柠檬酸盐缓冲液中的30％蔗糖储备溶液。随后将柠檬酸盐缓冲液、蔗糖储备溶液和注射用水以适当比率混合以得到有PS80的五种缓冲液：4.5％蔗糖于10mM柠檬酸盐中、9％蔗糖于10mM柠檬酸盐中、4.5％蔗糖于20mM柠檬酸盐中、9％蔗糖于20mM柠檬酸盐中和6.75％蔗糖于15mM柠檬酸盐中。随后使用Illustra NAP-25柱(GE Healthcare)将1008DS交换至这五种缓冲液中，接着用Vivaspin 6浓缩器(5KD MWCO,GE Healthcare)在8000×、5℃下浓缩。在离心期间用NanoDrop 2000分光光度计确定各样品中的蛋白质浓度。对于前四种缓冲液中的样品，当1008浓度达到～70mg/ml时将自浓缩器移出样品的一部分，并通过添加适当量的对应缓冲液并掺入10％PS80中将其用于制备有60mg/ml API的剂型(表12中的#1、3、5和7)。将剩余样品进一步浓缩至高于130mg/ml，随后添加缓冲液和10％PS80以获得最终剂型(表12中的#2、4、6和8)。通过将交换至缓冲液#5中的1008样品浓缩至约108mg/ml并随后与缓冲液和10％PS80混合以达到最终剂型浓度来制备表12中的剂型#9和10。测量所有最终剂型的pH值，并调节至6.5。

用改良自上述的浊度分析作为用于评估的分析工具。在这一改良的浊度分析中，使用12池位Cary 100UV-Vis分光光度计。该分析中所使用的比色皿为带塞子的1mm石英比色皿。在各比色皿中都添加300μL样品用于测试。监测55℃下培育剂型在360nm下的光密度改变。

赋形剂和高活性浓度的影响

研究3所有剂型的测得的1008浓度和最终pH概述于表13中。在55℃下培育具有不同蔗糖、PS80浓度和缓冲液强度的低、中和高1008浓度剂型(表4.3.1.-1)，并监测OD₃₆₀的改变。如图2所示，这些剂型观察到不同的聚集倾向。培育开始后几乎立即聚集的两种剂型是剂型2和6，其含有相对较高的1008浓度(～120mg/ml)和较低的蔗糖浓度(4.5％)。另一方面，含有相对较低的1008浓度(～60mg/ml)和较高的蔗糖浓度(9％)的剂型3和7的聚集慢于其他剂型。培养基1008和蔗糖浓度的其他组合的聚集倾向介于以上两组之间。

表13

研究3的最终剂型条件

用各剂型OD₃₆₀达到0.25的时间作为标准，比较不同剂型因子的影响。结果表明，蔗糖对1008的聚集影响最大，其次为API浓度。蔗糖和API浓度的影响是相反的，表明为获得更好的剂型稳定性优选较高蔗糖和较低的API浓度。其他两个因子缓冲液强度和PS80显示影响较小。

研究4

活性和蔗糖浓度的进一步研究

基于以上研究3的结果，进行研究4以进一步研究pH6.50下含有0.05％PS80的15mM柠檬酸盐缓冲液中的蛋白质浓度(60-120mg/ml)和蔗糖浓度(在6％至9％的较窄范围)的影响。研究设计示于下表中。

表14

研究4的研究设计

为制备剂型，将约80g 1008药物物质加载到TFF系统中，且随后用约5倍药物物质的体积、含6％蔗糖的15mM柠檬酸缓冲液进行缓冲液交换。在缓冲液交换后，使用TFF系统将蛋白质溶液的体积减小至初始体积的约一半。回收到约44g浓缩的1008溶液，且通过NanoDrop 2000分光光度计测量所浓缩的蛋白质为约112mg/ml。随后通过与适当量的10％PS80和含0、6％和/或40％蔗糖的15mM柠檬酸盐缓冲液混合，用浓缩的1008溶液制备剂型#1、3、5、7-12，以获得这些剂型中每一个所对应的最终API、蔗糖和PS80浓度。将剩余1008溶液进一步浓缩至约132mg/ml以用相同方式制备剂型#2和4。最后，通过将1008溶液浓缩至约171mg/ml制备剂型#6，并用10％PS80和含0、6％和/或40％蔗糖的15mM柠檬酸盐缓冲液调节蛋白质、蔗糖和PS80的浓度。各剂型中1008的最终浓度用NanoDrop 2000分光光度计确定，并将pH调节至6.5。

使用上述的浊度分析来分析样品。也将8种所选剂型(#1-4和#7-10)在40℃探索性培育箱中储存6周，并在不同时间点用MIF、IEX和SEC分析。

研究如表15中所列的12种剂型。

表15

研究4的最终剂型浓度和浊度分析的Tm

剂型#	蔗糖浓度	最终1008(mg/ml)	最终pH	T_m(分钟)
					1	6％	61.6	6.49	62.0
2	6％	122.8	6.49	27.4
					3	9％	60.0	6.50	86.3
4	9％	119.0	6.51	34.2
					5	7.5％	47.7	6.50	97.0
6	7.5％	134.5	6.50	24.2
					7	5.38％	94.6	6.50	33.1
8	9.62％	86.2	6.50	49.4
					9	7.5％	91.7	6.50	41.2
10	7.5％	89.5	6.50	44.5
					11	7.5％	88.4	6.48	38.6
12	7.5％	90.1	6.52	40.0

用55℃下的浊度分析监测剂型的聚集。如图3所示，在相同热应力下这些剂型展示出不同的聚集度。具有相对较高1008和较低蔗糖浓度的剂型(诸如表15中的剂型#2和6)是在培育之后快速聚集的剂型。具有相对较低1008和高蔗糖浓度的剂型(表15中的剂型#3和5)聚集慢于其他所有剂型。将不同剂型的浊度分析所获得的曲线拟合至Sigmoid函数。将对应于转变中点的培育时间记录为各剂型的Tm(转变中点时间)。结果列于表15中。相对于蔗糖和1008浓度的Tm值展示出与蔗糖和1008浓度对蛋白质聚集相反的作用。

除了使用55℃下浊度分析的研究，也通过MFI、SEC和IEX经6周监测40℃下8种所选剂型的稳定性。剂型和结果列于表16至23中。与浊度分析一致的是，MFI结果展示：与具有较低API浓度的剂型相比较，具有高1008浓度(～120mg/ml)的剂型形成更多粒子，特别是大于25μm的粒子。MFI结果未显示蔗糖浓度对于具有相似量1008的剂型(剂型#7至10)的清晰的影响。如图4所示，在40℃下储存6周之后，具有高1008浓度的两种剂型(#2和4)降解最多，其中具有～60mg/ml 1008的剂型降解少于其他所有剂型。至于具有～90mg/ml 1008的剂型，在较高蔗糖浓度下(剂型#8)观察到稍少于较低蔗糖浓度(剂型#7)的降解。IEX结果展示与SEC相同的趋势。

表16

研究4剂型#1在40℃下加速稳定性研究的结果

表17

研究4剂型#2在40℃下加速稳定性研究的结果

表18

研究4剂型#3在40℃下加速稳定性研究的结果

表19

研究4剂型#4在40℃下加速稳定性研究的结果

表20

研究4剂型#7在40℃下加速稳定性研究的结果

表21

研究4剂型#8在40℃下加速稳定性研究的结果

表22

研究4剂型#9在40℃下加速稳定性研究的结果

表23

研究4剂型#10在40℃下加速稳定性研究的结果

实例3

探索性稳定性研究

对照剂型

作为对照，对在pH 6.25下在20mM柠檬酸、0.001％PS20中的60mg/ml 1008溶液的剂型进行稳定性探索。将对照剂型经0.2μm注射器过滤器过滤并在40℃下、环境室温和冰箱中储存。对于40℃样品在0、2周和5周取出样品，对于储存在环境室温和冰箱的样品则在26周取出样品。通过A280、SEC、IEX CGE和ELISA测试所选稳定性样品的pH、渗透压、含量。结果示于表24。

表24

对照剂型的探索性稳定性结果

(在pH6.25下60mg/ml 1008在20mM柠檬酸盐、0.001％PS20中)

*目测观察到样品混浊且具有白色沉淀。

对于在pH 6.25下在20mM柠檬酸盐、0.001％PS20和0.73％NaCl中的60mg/ml 1008溶液进行另一项对照剂型的研究。将剂型经0.2μm注射器过滤器过滤且在40℃储存。在1周、2周、3周和4周时将样品取出用于MFI分析。结果示于表25。

表25

在40℃下POC剂型的稳定性结果

(在pH 6.25下60mg/ml 1008在20mM柠檬酸盐、0.001％PS20中)

时间(周)	0	1	2	3	4
						≥10μm通过MFI(#/mL)	na	172	894	2946	3183
≥25μm通过MFI(#/mL)	na	23	157	539	1189
						≥50μm通过MFI(#/mL)	na	4	19	92	248
粒子总计通过MFI(#/mL)	na	2381	8954	29716	17705

具有9％蔗糖和0.5％聚山梨醇酯80的60mg/ml 1008的探索性稳定性研究

对含有9％蔗糖和0.5％PS80的60mg/ml 1008剂型进行稳定性探索。将剂型经0.2μm注射器过滤器过滤并在40℃下储存。在1.6周、2.9周和4周将样品取出并用于MFI、SEC和IEX分析。结果列于表26。

表26

在40℃下60mg/ml 1008剂型的稳定性结果

(在pH 6.25下60mg/ml 1008在20mM柠檬酸盐、9％蔗糖和0.5％PS80中)

时间(周)	0	1.6	2.9	4
					≥10μm通过MFI(#/mL)	-	12	80	130
≥25μm通过MFI(#/mL)	-	4	12	12
					≥50μm通过MFI(#/mL)	-	0	4	0
粒子总计通过MFI(#/mL)	-	688	2900	4876
					SEC(初始％)	98.4	93.3	88.6	84.1
IEX(初始％)	97.0	91.3	83.9	78.9

在pH 6.25下60mg/ml 1008、9％蔗糖、20mM柠檬酸盐、0.1％PS80的试验性稳定性研究

对如表27中所示的在pH 6.25下含有9％蔗糖、20mM柠檬酸盐、0.1％PS80的剂型进行60mg/ml 1008溶液的实时稳定性研究。将稳定性样品储存在2-8℃、25℃、40℃和光室(LC)下；也使其经历三个循环的冻融(FT)。根据表28中所示的方案取出样品，并通过各种分析方法诸如pH、渗透压、MFI、含量、SEC、IEX、CGE和效力来分析。

表27

试验性稳定性剂型的组成

表28

试验性稳定性研究的储存条件和取出方案

在早期阶段，开始60mg/ml 1008溶液的实时稳定性研究。如表29所示，剂型在pH6.25下含有9％蔗糖、20mM柠檬酸盐、0.1％PS80。将样品储存在2-8℃、25℃、40℃和光室(LC)下；也使其经历三个循环的冻融(FT)。根据表30所示的方案取出样品，且通过不同分析方法分析。稳定性结果列于表31-33中。

表29

试验性稳定性剂型的组成

60mg/ml 1008(1008)溶液

表30

试验性稳定性研究的储存条件和取出方案

条件	取出
		2-8℃(冰箱)	0、4周、6.9周、8周、12周和26周
25℃	2周、4周、6.9周、8周、12周和26周
		40℃	1.1周、2周和4周
光室(LC)	6周
		冻融(FT)	3个循环

表31

试验性稳定性研究的结果(部分1/3)

在pH 6.25下6％1008、9％蔗糖、20mM柠檬酸盐、0.1％PS80

表32

试验性稳定性研究的结果(部分2/3)

在pH 6.25下6％1008、9％蔗糖、20mM柠檬酸盐、0.1％PS80

表33

试验性稳定性研究的结果(部分3/3)

在pH 6.25下6％1008、9％蔗糖、20mM柠檬酸盐、0.1％PS80

柠檬酸缓冲液中的稳定性探索：60mg/ml 1008在15mm柠檬酸盐/6.75％蔗糖/0.05％PS80/pH 6.75

对60mg/ml 1008在15mM柠檬酸盐/6.75％蔗糖/0.05％PS80/pH6.75的剂型进行柠檬酸盐缓冲液中的稳定性探索。稳定性样品储存在5℃和25℃下，以及经历冻融循环。根据下表所示的方案取出样品，并分析外观、pH、渗透压、MFI、含量、SEC和IEX。

表34

临时稳定性研究的储存条件和取出方案

条件	取出
		25℃	0、1个月、3个月、6个月和9个月
5℃	3个月、6个月和9个月
		冻融(FT)	3个循环

类似地，对60mg/ml 1008在15mM组氨酸/6.75％蔗糖/0.05％PS80/pH6.75的剂型进行组氨酸缓冲液中的稳定性探索。将稳定性样品储存在5℃和25℃下。也使样品经历冻融循环。根据下表所示的方案取出样品，并分析外观、pH、渗透压、MFI、含量、SEC和IEX。

表35

临时稳定性研究的储存条件和取出方案

条件	取出
		25℃	0、1个月、3个月和6个月
5℃	3个月和6个月
		冻融(FT)	3个循环

实验数据列于下面各表中。

表36在25℃下的临时稳定性研究的结果(部分1/2)

60mg/ml 1008在15mM柠檬酸盐/6.75％蔗糖/0.05％PS80/pH6.75中

表37

临时稳定性研究的结果(部分2/2)

60mg/ml 1008在15mM柠檬酸盐/6.75％蔗糖/0.05％PS80/pH6.75中

表38

在25℃下临时稳定性研究的结果(部分1/2)

60mg/ml 1008在15mM组氨酸/6.75％蔗糖/0.05％PS80/pH6.75中

表39

临时稳定性研究的结果(部分2/2)

60mg/ml 1008在15mM组氨酸/6.75％蔗糖/0.05％PS80/pH6.75中

实验数据表明，相较于60mg/ml蛋白质浓度下的对照剂型，所测试剂型的稳定性显著提高，特别是在抑制颗粒物质的形成中显著提高。

如表40所示，经鉴定稳定溶液剂型含有15mM柠檬酸盐/6.75％蔗糖/0.0505％PS80。

表40

已详细描述本发明及其实施方式。然而，本发明的范畴并不限于说明书中所述的方法、制造、物质组成、化合物、方式、方法和/或步骤的具体实施方式。可对所公开材料做出各种修改、替代和变化而不背离本发明的精神和/或基本特征。因此，本领域技术人员根据本公开将容易地理解，可根据本发明的相关实施方式运用随后的修改、替代和/或变化，所述修改、替代和/或变化进行与本文所述实施方式实质上相同的功能或达成与本文所述实施方式实质上相同的结果。因此，权利要求书在其范畴内涵盖对本文所公开的方法、制造、物质组成、化合物、方式和/或步骤的修改、替代和变化。除非对其作用另有说明，否则权利要求书不应理解为限制所述顺序或部件。应理解，可对形式和细节做出不同变化而不背离所附权利要求书的范畴。

Claims

1.一种水性医药组合物，其包含(i)至少50mg/ml包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的序列的抗VEGF抗体，(ii)蔗糖或海藻糖，(iii)柠檬酸盐或组氨酸缓冲液，和(iv)作为表面活性剂的聚山梨醇酯80。

2.如权利要求1的水性医药组合物，其包含约4.5％至11％(w/v)蔗糖或约5％至10％(w/v)海藻糖、0.006％至0.012％柠檬酸(w/v)、0.2至0.6二水合柠檬酸三钠(w/v)和0.01％至0.1％聚山梨醇酯80(w/v)，其中所述组合物的pH为约6.3至约7.3。

3.如权利要求2的水性医药组合物，其中所述组合物的pH为约6.8。

4.如权利要求1的水性医药组合物，其中所述抗体包含SEQ ID NO:3的序列。

5.如权利要求1的水性医药组合物，其中所述抗VEGF抗体的浓度为约60mg/ml，蔗糖的浓度为约6.75％(w/v)，柠檬酸的浓度为约0.01％(w/v)，二水合柠檬酸三钠的浓度为约0.428％(w/v)，且聚山梨醇酯80的浓度为约0.05％(w/v)。

6.如权利要求5的水性医药组合物，其中所述抗VEGF抗体包含SEQ ID NO:3的序列，且pH为约6.8。

7.如权利要求1的水性医药组合物，其中所述抗VEGF抗体的浓度为约120mg/ml，蔗糖的浓度为约6.8％(w/v)，柠檬酸的浓度为约0.01％(w/v)，二水合柠檬酸三钠的浓度为约0.428％(w/v)，且聚山梨醇酯80的浓度为约0.05％(w/v)。

8.如权利要求7的水性医药组合物，其中所述抗VEGF抗体包含SEQ ID NO:3的序列，且pH为约6.8。

9.一种包括如权利要求1所述水性医药组合物的递送装置。

10.如权利要求9的递送装置，其为预填充的注射器。

11.一种包括如权利要求2所述水性医药组合物的递送装置。

12.如权利要求11的递送装置，其为预填充的注射器。

13.一种包括如权利要求7所述水性医药组合物的递送装置。

14.如权利要求13的递送装置，其为预填充的注射器。

15.一种向对象递送抗VEGF抗体的方法，其包含向该对象施用权利要求1的水性医药组合物的步骤。

16.一种治疗由VEGF介导的眼部疾病或病症的方法，其包含向对象施用如权利要求1的水性医药组合物。

17.如权利要求16的方法，其中所述眼部疾病或病症为眼部新生血管疾病。

18.一种通过将如权利要求1的水性医药组合物冻干而制备的冻干剂型。

19.一种向对象递送抗VEGF抗体的方法，其包含向该对象施用如权利要求2的水性医药组合物的步骤。

20.一种治疗由VEGF介导的眼部疾病或病症的方法，其包含向对象施用如权利要求2的水性医药组合物。

21.如权利要求20的方法，其中所述眼部疾病或病症为眼部新生血管疾病。

22.一种通过将如权利要求2的水性医药组合物冻干而制备的冻干剂型。

23.一种向对象递送抗VEGF抗体的方法，其包含向该对象施用如权利要求7的水性医药组合物的步骤。

24.一种治疗由VEGF介导的眼部疾病或病症的方法，其包含向对象施用如权利要求7的水性医药组合物。

25.如权利要求24的方法，其中所述眼部疾病或病症为眼部新生血管疾病。

26.一种通过将如权利要求7的水性医药组合物冻干而制备的冻干剂型。