ES2913401T3 - Nuevo fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana - Google Patents
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- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
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Abstract
Fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana seleccionado del grupo que consiste en lo siguiente (a) y (b): (a) un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que comprende un fragmento de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 10 y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 12; y (b) un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que comprende un fragmento de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada derivada de una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 10 mediante la modificación de glutamina en la posición de aminoácido 1 de SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 10 en ácido piroglutámico, y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 12.
Description
DESCRIPCIÓN
Nuevo fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana
Campo técnico
La presente invención se refiere a un nuevo fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana. La presente invención también se refiere a una composición para el diagnóstico y/o para su uso en el tratamiento que comprende el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana, y a un método para su uso en el diagnóstico y/o tratamiento de un cáncer usando el fragmento Fab.
Antecedentes de la técnica
La mucina 1 (MUC1) es una glicoproteína unida a la membrana que se expresa en el lado de la luz de las células epiteliales que constituyen los tejidos epiteliales de la glándula mamaria, la tráquea y el tracto gastrointestinal, etc. (Nat. Rev. Cancer, enero de 2004; 4 (1): 45-60). La MUC1 se sobreexpresa en las células cancerosas del cáncer de mama (Mod. Pathol., octubre de 2005; 18 (10): 1295-304), cáncer de pulmón (Hum. Pathol., enero de 2008; 39 (1): 126-36), cáncer colorrectal (Int. J. Oncol., enero de 2000; 16 (1): 55-64), cáncer de vejiga (PLoS One, marzo de 2014; 9 (3): e92742), cáncer de piel (Histopathology, septiembre de 2000; 37 (3): 218-23), cáncer de glándula tiroides (J. Pathol., julio de 2003; 200 (3): 357-69), cáncer de estómago (J. Pathol., marzo de 2000; 190 (4): 437-43), cáncer de páncreas (Int. J. Oncol., enero de 2004; 24 (1): 107-13), cáncer de riñón (Mod. Pathol., febrero de 2004; 17 (2): 180 8), cáncer de ovario (Gynecol. Oncol., junio de 2007; 105 (3): 695-702) y cáncer de cuello uterino (Am. J. Clin. Pathol., julio de 2004; 122 (1): 61-9), etc. MUC1 es útil como molécula diana para detectar un foco de cáncer (Nat. Rev. Cancer, enero de 2004; 4 (1): 45-60; y Pathol. Res. Pract., 15 de agosto de 2010; 206 (8): 585-9).
La MUC1 experimenta la O-glicosilación de la treonina en la posición 9 de una secuencia repetida en tándem de 20 aminoácidos HGVTSAPDTRPAPGSTAPPA (SEQ ID NO: 15) presente en un dominio extracelular. En las células cancerosas, esta O-glicosilación es incompleta, y se sabe que se produce una O-glicosilación tal como T(Galp1-3GalNAca1-O-Ser/Thr), Tn(GalNAca1-O-Ser/Thr) y 2,3ST(Neu5Aca2-3Galp1-3GalNAca-O-Ser/Thr) de manera específica de cáncer (PTL 1 y NPL 1). Dado que la MUC1 en los tejidos normales no experimenta tal O-glicosilación específica de cáncer, la MUC1 humana específica de cáncer es particularmente útil como molécula diana para el tratamiento de diversos cánceres en humanos.
Por ejemplo, un anticuerpo 1B2 (PTL 1), un anticuerpo PankoMab (NPL 2) y un anticuerpo 5E5 (PTL 2) son conocidos como anticuerpos contra tal MUC1 humana específica de cáncer. Entre estos anticuerpos, se ha informado de que el anticuerpo 1B2 tiene una alta especificidad para la MUC1 humana específica de cáncer en comparación con el anticuerpo PankoMab (PTL 1). También se ha informado de que la constante de disociación del anticuerpo 1B2 es de 3,7 x 10'10 M (PTL 1), y la constante de disociación del anticuerpo 5E5 es de 1,7 * 10'9 M (NPL 1).
Mientras tanto, también hay grandes necesidades para la visualización de la lesión cancerosa. En primer lugar, es necesario detectar precozmente la lesión cancerosa. Las modalidades de diagnóstico actuales, tales como la radiografía, la ecografía, la tomografía computarizada (TC), la resonancia magnética (RM), la tomografía por emisión de positrones (PET) y la tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT), no pueden detectar con sensibilidad los microcánceres. Si pueden detectarse los microcánceres, un cáncer primario puede curarse mediante una operación o radioterapia, o incluso un cáncer metastásico es curable de manera vital mediante una intervención farmacéutica temprana. Además, hay que diferenciar entre una lesión cancerosa y una benigna. Las modalidades de diagnóstico actuales a menudo diagnosticar erróneamente una lesión benigna como una lesión cancerosa. Si puede diferenciarse entre una lesión cancerosa y una benigna, pueden reducirse las biopsias innecesarias. Además, se necesita la visualización intraoperatoria de la lesión cancerosa. En la actualidad, la posición o la extensión de una lesión cancerosa no puede determinarse con precisión durante la operación de cánceres incluyendo cáncer de mama, cáncer de vejiga y cáncer de piel. Por tanto, la lesión cancerosa no puede extirparse completamente, y existe el riesgo de terminar la operación dejando las células cancerosas. Además, es necesario determinar correctamente las posiciones de la lesión cancerosa. Aunque se sospeche de una recidiva postoperatoria y de una metástasis debido a la elevación de un marcador tumoral en sangre, las modalidades de diagnóstico actuales no pueden visualizar un microcáncer metastásico. Por tanto, no puede seleccionarse el tratamiento óptimo porque no puede determinarse si el cáncer ha metastatizado o a qué órgano ha metastatizado. Por tanto, también es útil visualizar la lesión cancerosa mediante técnicas de obtención de imágenes moleculares, tales como la obtención de imágenes fluorescentes y la obtención de imagen de rayos y (PET y SPECT), usando un anticuerpo que se une específicamente a MUC1 humana específica de cáncer como fármaco de diagnóstico in vivo. Sin embargo, no se conoce ningún caso anterior en el que se haya usado un anticuerpo frente a MUC1 humana específica de cáncer como fármaco de diagnóstico in vivo.
Existe la necesidad adicional de un fármaco terapéutico contra el cáncer, tal como el fármaco conjugado con un anticuerpo. Se espera que el fármaco con anticuerpo sea un método para tratar un cáncer con menos reacciones adversas debido a la administración específica a una lesión cancerosa. Se ha informado de la radioinmunoterapia que usa un anticuerpo unido a un radioisótopo (Takashi Tsuruo, “Molecular Target Therapy of Cancer”, NANZANDo Co., Ltd., publicado el 15 de septiembre de 2008, págs. 332-336 ; J. Nucl. Med., julio de 2016; 57 (7): 1105-1111 ; y Nucl.
Med. Biol., noviembre de 2010; 37 (8): 949-955), fotoinmunoterapia que usa un anticuerpo unido a IRDye700DX (Nat. Med., diciembre de 2011; 17 (12): 1685-91), y similares. El IRDye700DX es un colorante fluorescente en el infrarrojo cercano que también puede usarse en el diagnóstico. Se ha informado de que puede inducirse la muerte de las células de manera específica de cáncer a través del efecto fototóxico del IRDye700DX uniendo este a un anticuerpo contra un antígeno expresado en la membrana de una célula cancerosa, y permitiendo que el resultante se acumule específicamente en los tejidos cancerosos, seguido de la irradiación con luz infrarroja cercana (Nat. Med., diciembre de 2011; 17 (12): 1685-91). Sin embargo, no se conoce ningún caso anterior de aplicación clínica de un anticuerpo anti-MUC1 humana específica del cáncer unido a un fármaco terapéutico contra el cáncer.
En general, los anticuerpos tienen una larga semivida en sangre y requieren un periodo tan largo como de 4 días a 5 días para alcanzar una razón tumor-sangre que confiere una relación señal-fondo suficiente para visualizar un cáncer, después de su administración en el organismo (Clin. Pharmacol. Ther., mayo de 2010; 87 (5): 586-92). Además, las regiones Fc de los anticuerpos provocan un efecto farmacológico tal como citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) (NPL 1; y Curr. Opin. Biotechnol., diciembre de 2002; 13 (6): 609-14). Además, los anticuerpos se acumulan mucho en el hígado, independientemente de su diana, y las células cancerosas, tales como cáncer de mama, tienen una gran tendencia a metastatizar en el hígado. La acumulación en el hígado interfiere con la detección de la metástasis hepática en el momento del diagnóstico de la lesión cancerosa sistémica (Clin. Pharmacol. Ther., mayo de 2010; 87 (5): 586-92).
Por ejemplo, se espera que los fragmentos de anticuerpos recombinantes de bajo peso molecular, tales como Fab, scFv, diacuerpo y minicuerpo, se usen como anticuerpos terapéuticos debido a su fácil acceso a los focos con su alta penetración en los tejidos y su bajo coste de producción mediante el uso de un sistema de expresión en E. coli o levadura. Además, se ha informado de que pueden utilizarse como fármacos de diagnóstico debido a su corta semivida en la sangre y a la característica de excreción renal (Nat. Biotechnol., septiembre de 2005; 23 (9): 1126-36).
Lista de referencias
Bibliografía de patentes
PTL 1: documento WO2010/050528
PTL 2: documento WO2008/040362
Bibliografía no de patentes
NPL 1: Glycoconj. J., abril de 2013; 30 (3): 227-36
NPL 2: Cancer Immunol Immunother, noviembre de 2006; 55 (11): 1337-47
Sumario de la invención
Problema técnico
Los fragmentos Fab monovalentes tienen un peso molecular de aproximadamente 50 kDa, que es más pequeño que el de los anticuerpos que tienen un peso molecular de aproximadamente 150 kDa, se eliminan por excreción renal y también tienen una semivida corta en la sangre. Por tanto, alcanzan una razón tumor-sangre que confiere una relación señal-fondo suficiente para visualizar un cáncer, en el plazo de 2 a 32 horas después de su administración. Carecen de una región Fc y, por tanto, no provocan ni ADCC ni CDC. Los fragmentos Fab se eliminan normalmente por excreción renal y, por tanto, no interfieren en la detección de metástasis hepática. A partir de estas características, cabe esperar que los fragmentos Fab sean más eficaces como fármacos de diagnóstico in vivo en comparación con los anticuerpos.
Sin embargo, la actividad de unión de los fragmentos Fab está a menudo atenuada por ser monovalentes, no divalentes. Los anticuerpos deben marcarse con una sustancia detectable, tal como un colorante fluorescente o un medio de contraste, para su utilización como fármacos de diagnóstico in vivo o como fármacos para su uso en métodos de fotoinmunoterapia. Un problema adicional es la atenuación de su actividad de unión debido al marcaje con una sustancia de este tipo.
Un objeto de la presente invención es proporcionar un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que tenga una excelente actividad de unión y que se espere que se acumule en un foco de cáncer en el plazo de un tiempo determinado (por ejemplo, 24 horas) después de la administración. Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición para su uso en un método de diagnóstico que comprende el fragmento Fab y proporcionar una composición para su uso en un método de tratamiento que comprende el fragmento Fab.
Solución al problema
Los presentes inventores han llevado a cabo considerables estudios diligentes sobre la preparación de un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que tiene una excelente actividad de unión contra MUC1 humana específica de cáncer, y por consiguiente han preparado un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 10, y una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 12 (ejemplo 1) y han encontrado que: el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana tiene una excelente actividad de unión contra MUC1 humana específica de cáncer (ejemplo 3) y está libre de la atenuación de la actividad de unión contra MUC1 humana específica de cáncer mediante el marcaje fluorescente y el marcaje con un agente quelante (ejemplo 5 y ejemplo 7); y un conjugado que comprende el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana es útil en el diagnóstico de cánceres (ejemplo 8, ejemplo 12 y ejemplo 13) y presenta un efecto antitumoral en modelos que portan cáncer de manera subcutánea (ejemplo 15).
Como resultado, se proporcionan un enfoque de diagnóstico y un enfoque de tratamiento usando el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana y el conjugado que comprende el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana.
Efectos ventajosos de la invención
El fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención tiene una excelente actividad de unión contra MUC1 humana específica de cáncer y se espera que sea útil en el diagnóstico y/o tratamiento de cánceres tales como cáncer de mama.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un gráfico y una tabla que muestran la actividad de unión de Fab P10-1, Fab P10-2 y Fab 1B2 del ejemplo comparativo contra MUC1 humana específica de cáncer.
La figura 2 es un gráfico y una tabla que muestran la actividad de unión del Fab P10-1 con colorante, el Fab P10-2 con colorante y el Fab 1B2 con colorante del ejemplo comparativo contra MUC1 humana específica de cáncer.
La figura 3 es un gráfico y una tabla que muestran la actividad de unión de Fab P10-2 con DFO y Fab P10-2 contra MUC1 humana específica de cáncer.
La figura 4 es un gráfico que muestra la actividad de unión de Fab P10-2 contra las células de la línea celular de cáncer de mama MDA-MB-468 (también denominadas células MM-468) y las células de la línea celular de cáncer de vejiga 647-V que expresan MUC1 humana específica de cáncer. El eje horizontal representa la concentración (Log(mg/ml)) de Fab P10-2, y el eje vertical representa la luminiscencia.
La figura 5A son fotografías representativas tomadas con una cámara habitual (izquierda) y con una cámara de fluorescencia en el infrarrojo cercano (centro y derecha) 6 horas después de la administración del Fab P10-2 con colorante que se administró por vía intravenosa a 3 mg/kg a modelos que portan cáncer de manera subcutánea.
La figura 5B es un gráfico que cuantifica la relación tumor/fondo de un sitio tumoral y un sitio de fondo peritumoral e indica la media el error estándar. El eje horizontal representa la dosis y el tiempo después de la administración del Fab P10-2 con colorante.
La figura 6 es un gráfico que cuantifica la luminiscencia de los sitios tumorales al administrar Fab P10-2 con IR700 a ratones trasplantados con células MM-468, eutanasiar a los animales 2 horas después de la administración, extirpar el tumor y tomar fotografías con IVIS SPECTRUM. El eje vertical representa la luminiscencia.
La figura 7 es un gráfico que muestra los resultados de la medición de la citotoxicidad de la reacción del Fab P10-2 con IR700 a las células MM-468, las células 647-V o las células CHO-K1 con la luz de irradiación del ejemplo comparativo. La columna superior del eje horizontal de cada gráfico representa la concentración de Fab P10-2 con IR700, y la columna inferior representa la exposición de la luz. El eje vertical representa la luminiscencia e indica la media el error estándar.
La figura 8 es un gráfico que muestra los resultados de la medición del efecto antitumoral en función de la presencia o ausencia de irradiación de luz (0 J o 200 J) en el momento de la administración de Fab P10-2 con IR700 usando ratones desnudos trasplantados con células MM-468. El eje horizontal representa el número de días donde el día en el que el volumen del tumor llegó a ser de 300 mm3 se definió como día 1. El eje vertical representa el volumen del tumor (mm3) e indica la media el error estándar.
Descripción de las realizaciones
A continuación en el presente documento, la presente invención se describirá con detalle. Sin embargo, la presente invención no está limitada por ello. Los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente invención tienen significados generalmente entendidos por los expertos en la técnica, a menos que se especifique lo contrario
en el presente documento.
Los presentes inventores han llevado a cabo considerables estudios diligentes sobre la preparación de un anticuerpo anti-MUC1 humana específica de cáncer o de un fragmento de unión a antígeno del mismo y, por consiguiente, han preparado con éxito un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que tiene la capacidad de unirse fuertemente a MUC1 específica de cáncer.
La estructura básica de una molécula de anticuerpo es común entre las clases y está constituida por cadenas pesadas que tienen un peso molecular de 50000 a 70000 y cadenas ligeras que tienen un peso molecular de 20000 a 30000. La cadena pesada consiste habitualmente en una cadena polipeptídica que comprende aproximadamente 440 aminoácidos, tiene una estructura característica de cada clase y se denomina cadenas y, |i, a, 8 y e, que corresponden a IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. La IgG tiene además IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, que se denominan y1, y2, y3 y y4, respectivamente. La cadena ligera consiste habitualmente en una cadena polipeptídica que comprende aproximadamente 220 aminoácidos y se conoce como dos tipos, los tipos L y K, que se denominan cadenas X y k , respectivamente. En cuanto a la configuración peptídica de la estructura básica de la molécula de anticuerpo, dos cadenas pesadas homólogas y dos cadenas ligeras homólogas están ligadas mediante enlaces disulfuro (enlaces S-S) y enlaces no covalentes para formar un peso molecular de 150000 a 190000. Las dos cadenas ligeras pueden emparejarse con cualquiera de las cadenas pesadas. Una molécula de anticuerpo individual está formada constantemente por dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas.
Cuatro (o cinco para las cadenas |i y e) y dos enlaces S-S intracadena están presentes en la cadena pesada y la cadena ligera, respectivamente, y cada una constituye un bucle por cada 100 a 110 residuos de aminoácidos. Esta conformación es similar entre los bucles y se denomina unidad estructural o dominio. Tanto para la cadena pesada como para la cadena ligera, un dominio situado en el extremo N-terminal no tiene una secuencia de aminoácidos constante incluso entre las preparaciones de las mismas clases (subclases) de animales de la misma especie, por tanto, se denomina región variable. Los dominios respectivos se denominan región variable de cadena pesada (dominio VH) y región variable de cadena ligera (dominio VL). Una secuencia de aminoácidos en el extremo C-terminal de la misma es casi constante en una clase o subclase y se denomina región constante. Los dominios respectivos están representados por CH1, CH2, CH3 y CL.
La especificidad de unión del anticuerpo a un antígeno depende de la secuencia de aminoácidos de un resto constituido por la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera. Por otro lado, la actividad biológica, tal como la unión a complementos o a diversas células, refleja la diferencia de estructura entre las regiones constantes de las Ig de las respectivas clases. Se sabe que la variabilidad de las regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera está limitada sustancialmente por tres pequeñas regiones hipervariables presentes en ambas cadenas. Estas regiones se denominan regiones determinantes de complementariedad (CDR; CDR1, CDR2 y CDR3 en orden desde el extremo N-terminal). Los restos restantes de la región variable se denominan regiones de entramado (FR) y son relativamente constantes.
Una región entre el dominio CH1 y el dominio CH2 de la región constante de cadena pesada de un anticuerpo se denomina región bisagra. Esta región es rica en residuos de prolina y contiene una pluralidad de enlaces S-S entre cadenas que conectan dos cadenas pesadas. Por ejemplo, las regiones bisagra de las IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas contienen 2, 4, 11 y 2 residuos de cisteína, respectivamente, que constituyen enlaces S-S entre las cadenas pesadas. La región bisagra es una región muy sensible a una enzima proteolítica tal como la papaína o la pepsina. En el caso de la digestión de un anticuerpo con papaína, las cadenas pesadas se escinden en una posición del extremo N-terminal de los enlaces S-S entre cadenas pesadas de la región bisagra y se descomponen así en dos fragmentos Fab y un fragmento Fc. El fragmento Fab está constituido por una cadena ligera y un fragmento de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada (VH), un dominio CH1 y una parte de la región bisagra. El fragmento Fab comprende regiones variables y tiene actividad de unión a antígeno.
<Fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención>
El fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención es un fragmento Fab que tiene la siguiente característica:
un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que comprende un fragmento de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 10 y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 12.
En una realización, el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención es un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que comprende un fragmento de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 10 y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 12.
Cualquier región constante de Igy1, Igy2, Igy3 o Igy4, etc. puede ser seleccionable como región constante de cadena pesada del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención. En una realización, la región constante de cadena pesada del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención es una región constante de Igy1 humana.
Cualquier región constante de IgA o IgK puede ser seleccionable como la región constante de cadena ligera del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención. En una realización, la región constante de cadena ligera del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención es una región constante de IgK humana.
En una realización, el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención es el siguiente fragmento Fab:
un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que comprende un fragmento de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6.
En una realización, el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención es un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que comprende un fragmento de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6.
En el caso de expresar un anticuerpo que incluya un fragmento Fab en las células, se sabe que el anticuerpo experimenta una modificación postraduccional. Los ejemplos de la modificación postraduccional incluyen la escisión de la lisina C-terminal de la cadena pesada por la carboxipeptidasa, la modificación de la glutamina o ácido glutámico N-terminal de la cadena pesada y de la cadena ligera en ácido piroglutámico por piroglutamilación, glicosilación, oxidación, desamidación y glicación. Se sabe que esta modificación postraduccional se produce en diversos anticuerpos (J. Pharm. Sci., 2008; 97: 2426-2447).
El fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención también puede incluir un fragmento Fab resultante de la modificación postraduccional. Los ejemplos del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención resultante de la modificación postraduccional incluyen un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que tiene una cadena pesada que se somete a piroglutamilación N-terminal. Es conocido en la técnica que una modificación postraduccional de este tipo por piroglutamilación N-terminal no influye en la actividad del anticuerpo (Anal. Biochem., 2006; 348: 24-39).
En una realización, el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención es un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que tiene la siguiente característica:
un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que comprende un fragmento de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada derivada de una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 10 mediante la modificación de glutamina en la posición de aminoácido 1 de SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 10 en ácido piroglutámico, y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 12. En una determinada realización, el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención es un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que tiene la siguiente característica:
un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que comprende un fragmento de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada derivada de una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 10 mediante la modificación de glutamina en la posición de aminoácido 1 de SEQ ID NO: 10 en ácido piroglutámico, y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 12.
En una realización alternativa, el fragmento Fab del anticuerpo anti-MUC1 de la presente invención es un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que tiene la siguiente característica:
un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que comprende un fragmento de cadena pesada derivado de un fragmento de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 mediante la modificación de glutamina en la posición de aminoácido 1 de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 en ácido piroglutámico, y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6.
En una determinada realización, el fragmento Fab del anticuerpo anti-MUC1 de la presente invención es un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que tiene la siguiente característica:
un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que comprende un fragmento de cadena pesada derivado de un fragmento de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 mediante la modificación de glutamina en la posición de aminoácido 1 de SEQ ID NO: 4 en ácido piroglutámico, y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6.
El fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención se une a MUC1 humana específica de cáncer. La MUC1 específica de cáncer se expresa en cánceres tales como cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de vejiga, cáncer de piel, cáncer de glándula tiroidea, cáncer de estómago, cáncer de páncreas, cáncer de riñón, cáncer de ovario o cáncer de cuello uterino. Un método para medir la actividad de unión del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana obtenido contra MUC1 humana específica de cáncer incluye métodos tales como ELISA y FACS. En el caso de usar, por ejemplo, ELISA, las células positivas para MUC1 humana específica de cáncer (por ejemplo, células T-47D) se inmovilizan en una placa de ELISA, a la que se añade entonces el fragmento Fab y se hace reaccionar, y luego, se hace reaccionar un anticuerpo anti-IgK o similar marcado con peroxidasa de rábano picante o similar. A continuación, la unión del anticuerpo secundario se identifica mediante la medición de la actividad usando un reactivo para detectar la actividad del mismo (por ejemplo, un sustrato quimioluminiscente de peroxidasa de rábano picante para el marcador de peroxidasa de rábano picante) o similar.
El fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención puede prepararse fácilmente por los expertos en la técnica usando un método conocido en la técnica basándose en la información de la secuencia del fragmento de cadena pesada y la cadena ligera del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención divulgado en el presente documento. El fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención puede producirse según, pero sin limitarse particularmente a, un método descrito en, por ejemplo, <Método para producir fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la presente invención> mencionado más adelante.
<Conjugado de la presente invención>
El conjugado de la presente invención es un conjugado que comprende un resto de marcaje y el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención.
El “resto de marcaje” es (i) un ligando y un ligador, (ii) un ligando, (iii) un colorante fluorescente y un ligador, o (iv) un colorante fluorescente. Una determinada realización es (i) un ligando y un ligador, o (ii) un ligando. Una determinada realización es (i) un colorante fluorescente y un ligador, o (ii) un colorante fluorescente. El ligando del “resto de marcaje” puede comprender además un metal. Una determinada realización es (i) un ligando y un ligador o (ii) un ligando que comprende un metal, y en otras palabras, es (i) un ligando que ha formado un complejo de quelato con un metal, y un ligador, o (ii) un ligando que ha formado un complejo de quelato con un metal.
El conjugado de la presente invención que comprende un metal o un colorante fluorescente puede usarse en diversos medios de contraste y/o agentes terapéuticos contra el cáncer y se usa, por ejemplo, en un medio de contraste de resonancia magnética, un trazador de PET, un agente de obtención de imágenes moleculares marcado con fluorescencia y un fármaco para su uso en métodos de fotoinmunoterapia.
En la presente memoria descriptiva, el “metal” significa un ion metálico paramagnético o un radioisótopo metálico.
El ion metálico paramagnético se usa adecuadamente en un medio de contraste de resonancia magnética. Los ejemplos de la realización del ion metálico paramagnético incluyen, pero no se limitan a, Fe2+, Fe3+, Cu2+, Ni2+, Rh2+, Co2+, Gd3+, Eu3+, Dy3+, Tb3+, Pm3+, Nd3+, Tm3+, Ce3+, Y3+, Ho3+, Er3+, La3+, Yb3+, Mn3+ y Mn2+. Una determinada realización es Gd3+, Mn3+, Mn2+, Fe2+ o Fe3+. Una determinada realización es Mn3+ o Mn2+. En este caso, el halógeno o similar puede usarse como contraanión en el conjugado. Alternativamente, el contraanión puede ser C(=O)O- del ligando. El conjugado puede tener además un contracatión tal como Na+.
El radioisótopo metálico se usa, por ejemplo, en un trazador de PET. Los ejemplos de una determinada realización incluyen, pero no se limitan a, 89Zr, 51Mn, 52Fe, 60Cu, 67Ga, 68Ga, 72As, 99mTc y 111In. Una determinada realización es 89Zr, 60Cu, 67Ga, 68Ga, 99mTc o 111In. Una determinada realización es un radioisótopo de circonio. Una determinada realización es 89Zr.
El “ ligando” es un resto capaz de formar un complejo de quelato con un metal en el conjugado y significa un grupo constituido por un agente quelante. El grupo constituido es un grupo que tiene un enlace por la eliminación de un protón del agente quelante.
El “agente quelante” es un compuesto que puede formar un enlace de coordenadas con un metal.
Los ejemplos del “agente quelante” incluyen sideróforo y no sideróforo. Los ejemplos del sideróforo incluyen el tipo de ácido hidroxámico, el tipo de catecol y el tipo de ligando mixto. Los ejemplos del sideróforo de tipo ácido hidroxámico incluyen ferricromo, deferoxamina (DFO) representada por la siguiente fórmula:
[Fórmula química 5]
fusarinina C, ornibactina y ácido rodotorúlico. Los ejemplos del sideróforo de tipo catecol incluyen enterobactina, bacilibactina y vibriobactina. Los ejemplos del sideróforo de tipo ligando mixto incluyen azotobactina, pioverdina y yersiniabactina. En el caso del sideróforo, puede hacerse reaccionar DFO a través de su grupo funcional reactivo -NH2 con el ligador o el fragmento Fab, y el sideróforo distinto de DFO también puede hacerse reaccionar a través de su grupo funcional reactivo, tal como un grupo carboxilo, un grupo hidroxilo o un grupo amino, con el ligador o el fragmento Fab mediante un método habitualmente usado por los expertos en la técnica.
Los ejemplos del no sideróforo incluyen DTPA (ácido dietilentriaminopentaacético, n.° de CAS: 67-43-6), DTPA-BMA (ácido 1,7-bis(metilcarbamoilmetil)-1,4,7-triazaheptano-1,4,7-triacético, n.° de CAS: 119895-95-3), EOB-Dt PA (DTPA unido a un grupo etoxibencilo, n.° de CAS: 158599-72-5), TTHA (ácido trietilentetraminohexacético, n.° de CAS: 869 52-3), DO3A (ácido 1,4,7,10-tetrazaciclododecano-1,4,7-triacético, n.° de CAS: 217973-03-0), HP-DO3A (ácido 10-(2-hidroxipropil)-1,4,7,10-tetrazaciclododecano-1,4,7-triacético, n.° de CAS: 120041-08-9), DOTA (ácido 1,4,7,10-tetrazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético, n.° de CAS: 60239-18-1), y derivados reactivos conocidos de los mismos. Los compuestos y conjugados descritos en el presente documento también abarcan las formas libres y las sales de los mismos, a menos que se especifique lo contrario. En este contexto, la “sal del mismo” es una sal que puede formarse por el compuesto o el conjugado que puede formar una sal de adición de ácido o una sal con una base dependiendo del tipo de sustituyente en el compuesto o el conjugado. Los ejemplos específicos de las mismas incluyen: sales de adición de ácido con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido yodhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico y ácido fosfórico, o con ácidos orgánicos tales como ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido oxálico, ácido malónico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido láctico, ácido málico, ácido mandélico, ácido tartárico, ácido dibenzoiltartárico, ácido ditoluiltartárico, ácido cítrico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido aspártico y ácido glutámico; sales con bases inorgánicas tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y aluminio, o con bases orgánicas tales como metilamina, etilamina, etanolamina, lisina y ornitina; sales con diversos aminoácidos y derivados de aminoácidos, tales como acetil-leucina; y sales de amonio. Por ejemplo, DFO existe como metanosulfonato de deferoxamina o existe como otras sales. DTPA existe tanto en forma libre como en forma de sal de sodio.
Una determinada realización del “agente quelante” para su uso en un medio de contraste de resonancia magnética es el agente quelante sideróforo o no sideróforo descrito anteriormente.
Una determinada realización del “agente quelante” para su uso en un trazador de PET es el agente quelante sideróforo o no sideróforo descrito anteriormente. Una determinada realización es MAG3 (mercapto-acetil-glicina-glicina-glicina, n.° de CAS: 66516-09-4). Una determinada realización es DFO.
Los ejemplos de una determinada realización del “agente quelante” que constituye el ligando contenido en el conjugado de la presente invención incluyen DFO, DTPA, DTPA-BMA, e Ob -DTPA, DO3A, HP-DO3A, y DOTA. Una determinada realización es DFO, DTPA o DOTA. Una determinada realización es DFO.
El “ligador” es un grupo que crea una distancia entre el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana y el ligando. Los ejemplos de una determinada realización del “ligador” en el conjugado incluyen la siguiente fórmula:
[Fórmula química 6]
(a continuación en el presente documento, denominados -C(=S)-NH-(1,4-fenilen)-NH-C(=S)-), -CH2-(1,4-fenilen)-NH-C(=S)-, y -C(=O)-(alquilen C i-20)-C(=O)-. En este contexto, “alquileno C i-20” es un alquileno lineal o ramificado que tiene de 1 a 20 átomos de carbono. Una determinada realización del alquileno C1-20 es alquileno C1-10 o alquileno C1-2. Una determinada realización del alquileno C1-20 es etileno. Una determinada realización es -C(=S)-NH-(1,4-fenilen)-NH-C(=S)-. Una determinada realización es -C(=O)-C2H4-C(=O)-. Los ejemplos de un reactivo que puede usarse como
ligador incluyen HO-C(=O)-(alquilen C i -20)-C(=O)-OH, ácido succínico y p-di-NCS-benceno(p-diisocianobenceno).
El conjugado de la presente invención que comprende un colorante fluorescente puede usarse como agente de obtención de imágenes moleculares marcado con fluorescencia, un fármaco para su uso en métodos de fotoinmunoterapia, o un agente de obtención de imágenes moleculares marcado con fluorescencia y un fármaco para su uso en métodos de fotoinmunoterapia.
Un colorante que tiene un máximo de absorción y un máximo de emisión a una longitud de onda en el infrarrojo cercano (de 650 a 1o0o nm) usado habitualmente en la obtención de imágenes fotográficas puede usarse como colorante fluorescente para su uso en el conjugado de la presente invención. Los ejemplos de una determinada realización del colorante fluorescente incluyen compuestos de cianina e indocianina. Los ejemplos de una determinada realización incluyen IRDye800CW e IRDye700DX (LI-COR Bioscience, Inc.), Cy (Molecular Probes, Inc.), Alexa Fluor, BODIPY y DyLight (Thermo Fisher Scientific Inc.), CF790 (Biotium, Inc.), Dy (Dyomics GmbH), HiLyte Fluor 680 y HiLyte Fluor 75o (AnaSpec Inc.), y PULSAR650 y QUASAR670 (LGC Biosearch Technologies). Una determinada realización es IRDye80oCW representado por la siguiente fórmula:
[Fórmula química 7]
El colorante fluorescente puede reaccionar a través de su grupo carboxilo, grupo hidroxilo, grupo amino, o similares, o a través de un grupo activo introducido por un método habitualmente usado por los expertos en la técnica con el fragmento Fab o el ligador. Una determinada realización del colorante fluorescente que tiene un grupo activo
introducido es un colorante fluorescente esterificado con un grupo N-hidroxisuccinimida (NHS). Por ejemplo, los ésteres de NHS del IRDye800CW y del IRDye700DX mencionados anteriormente están disponibles comercialmente, y pueden utilizarse.
La unión del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención al resto de marcaje puede realizarse adecuadamente por los expertos en la técnica usando un enfoque conocido. Por ejemplo, el resto de marcaje puede unirse a uno o más grupos amino (por ejemplo, un grupo amino N-terminal y un grupo amino de una cadena lateral de aminoácidos), uno o más grupos tiol (por ejemplo, un grupo tiol de una cadena lateral de aminoácidos), o uno o más grupos carboxilo (por ejemplo, grupos carboxilo del extremo C-terminal y una cadena lateral de aminoácidos) del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención. Una determinada realización del conjugado de la presente invención es un conjugado en el que el resto de marcaje está unido a uno o más grupos amino del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención.
Cuando el resto de marcaje es un ligando y un ligador, el conjugado de la presente invención puede producirse haciendo reaccionar el agente quelante con una sustancia obtenida mediante la reacción del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención con el ligador. Puede producirse haciendo reaccionar el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención con una sustancia obtenida mediante la reacción del agente quelante con el ligador. Como ejemplo de reacción, puede hacerse reaccionar una sustancia obtenida mediante la reacción del grupo amino del agente quelante con el ligador con uno o más grupos aminos (por ejemplo, un grupo amino N-terminal y un grupo amino de una cadena lateral de lisina) del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención. La reacción de síntesis de tiourea mediante la adición de isotiocianato a la amina, la reacción de síntesis de amida mediante la adición de amina y ácido carboxílico, o similares, pueden usarse en la producción del conjugado. La reacción puede realizarse mediante la aplicación de un método conocido por los expertos en la técnica. Un compuesto del agente quelante unido al ligador por adelantado puede usarse como material de partida. Los ejemplos del compuesto del agente quelante unido al ligador incluyen p-SCN-Bn-DFO (DFO unido a un grupo p-isotiocianofenilaminotiocarbonilo, n.° de CAS: 1222468-90-7) representado por la siguiente fórmula: [Fórmula química 9]
DTPA unido a un grupo p-isotiocianobencilo (p-NCS-Bn-DTPA, n.° de CAS: 102650-30-6), DOTA unido a un grupo pisotiocianobencilo (p-NCS-Bn-DOTA, n.° CAS 127985-74-4) y p-SCN-Bn-CHX-A”-DTPA (ácido [(R)-2-amino-3-(4-isotiocianotofenil)propil]-trans-(S,S)—ciclohexano-1,2-diamina-pentaacético, n.° de CAS: 157380-45-5).
El metal (ion metálico paramagnético o radioisótopo metálico) puede añadirse al fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención unido a uno o más restos de marcaje así producidos mediante el método de producción para obtener el conjugado de la presente invención que comprende el metal.
Además, el conjugado de la presente invención puede producirse como un conjugado que es un fragmento Fab unido a través de un grupo amino del mismo a uno o más restos de marcaje mediante la reacción de uno o más grupos aminos (por ejemplo, un grupo amino N-terminal y un grupo amino de una cadena lateral de aminoácidos) del fragmento Fab con el resto de marcaje que tiene un grupo carboxilo o un grupo ácido isotiociánico activado con N-hidroxisuccinimida (NHS).
El conjugado de la presente invención es un conjugado que comprende uno o más restos de marcaje y el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención. Una determinada realización es el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana unido a de 1 a 27 restos de marcaje. Una determinada realización es el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana unido a de 1 a 23 restos de marcaje. Una determinada realización es el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana unido a de 1 a 15 restos de marcaje. Una determinada realización es el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana unido a de 1 a 11 restos de marcaje. Una determinada realización es el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana unido a de 1 a 9 restos de marcaje. Una determinada realización es el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana unido a de 1 a 7 restos de marcaje. Una determinada realización es el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana unido a de 1 a 5 restos de marcaje. Una determinada realización es el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana unido a de 1 a 4 restos de marcaje. Una determinada realización es el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana unido a uno o más restos de marcaje que comprenden además un metal.
En una realización, el conjugado de la presente invención es un conjugado en el que el resto de mareaje es (i) un ligando y un ligador, (ii) un ligando, (iii) un colorante fluorescente y un ligador, o (iv) un colorante fluorescente.
En una determinada realización, los ejemplos del conjugado de la presente invención incluyen los siguientes:
(1) un conjugado en el que el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana es un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que comprende un fragmento de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 10 y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por s Eq ID NO: 12;
(2) el conjugado del punto (1), en el que el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana es un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que comprende un fragmento de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6;
(3) un conjugado en el que el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana es un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que comprende un fragmento de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada derivada de una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 10 mediante la modificación de glutamina en la posición de aminoácido 1 de SEQ ID NO: 1o en ácido piroglutámico, y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 12;
(4) el conjugado del punto (2), en el que el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana es un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que comprende un fragmento de cadena pesada derivado de un fragmento de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 mediante la modificación de glutamina en la posición de aminoácido 1 de SEQ ID NO: 4 en ácido piroglutámico, y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6;
(5) el conjugado de cualquiera de los puntos (1) a (4), en el que el resto de marcaje es (i) un ligando y un ligador, o (ii) un ligando;
(6) el conjugado de cualquiera de los puntos (1) a (4), en el que el ligando es un grupo constituido por un agente quelante seleccionado del grupo que consiste en DFO, DTPA, DTPA-BMA, EOB-DTPA, DO3A HP-DO3A y DOTA, y el ligador es un ligador seleccionado del grupo que consiste en -C(=S)-NH-(1,4-fenilen)-NH-C(=S)-, -CH2-(1,4-fenilen)-NH-C(=S)- y -C(=O)-(alquilen C-, .2o)-C(=O)-;
(7) el conjugado del punto (6), en el que el ligando es un grupo constituido por un agente quelante seleccionado del grupo que consiste en DFO, DTPA y DOTA;
(8) el conjugado del punto (6), en el que el ligando es un grupo constituido por DFO, y el ligador es - C(=S)-NH-(1,4-fenilen)-NH-C(=S)-;
(9) el conjugado según cualquiera de los puntos (5) a (8), que comprende además un metal;
(10) el conjugado del punto (9), en el que el metal es un radioisótopo metálico; y
(11) el conjugado del punto (10), en el que el metal es 89Zr.
En una determinada realización, el conjugado de la presente invención es un conjugado en el que el resto de marcaje es (i) un ligando y un ligador, o (ii) un ligando.
En una determinada realización, el conjugado de la presente invención es un conjugado en el que el ligando es un ligando representado por la siguiente fórmula (A):
[Fórmula química 10]
en la que la línea ondulada representa la unión al fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana o al ligador. En una determinada realización, el conjugado de la presente invención en el que el ligando es un ligando representado por la fórmula (A) es un conjugado en el que el resto de marcaje es un ligando y un ligador representados por la siguiente fórmula (A’):
[Fórmula química 11]
el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana se une a través de un grupo amino del mismo al átomo de carbono de un grupo C(=S) terminal del resto de marcaje.
En una determinada realización, el conjugado de la presente invención es un conjugado en el que el resto de marcaje es (i) un ligando y un ligador, o (ii) un ligando, comprendiendo el conjugado además un metal. Una determinada realización del metal es un radioisótopo metálico. Una determinada realización del radioisótopo metálico es 89Zr. En una realización alternativa, el conjugado de la presente invención es un conjugado en el que el resto de marcaje es (i) un colorante fluorescente y un ligador, o (ii) un colorante fluorescente.
En una determinada realización, el conjugado de la presente invención en el que el resto de marcaje comprende un colorante fluorescente es un conjugado en el que el colorante fluorescente es un colorante fluorescente seleccionado del grupo que consiste en la siguiente fórmula (B) y la siguiente fórmula (C):
[Fórmula química 12]
en las que la línea ondulada representa la unión al fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana o al ligador. En una determinada realización, el conjugado de la presente invención en el que el resto de marcaje es un colorante fluorescente representado por la fórmula (B) es un conjugado en el que la línea ondulada representa la unión al fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana, y el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana se une a través de un grupo amino del mismo al átomo de carbono de un grupo C(=O) terminal del resto de marcaje.
En una determinada realización, el conjugado de la presente invención en el que el resto de marcaje es un colorante fluorescente representado por la fórmula (C) es un conjugado en el que la línea ondulada representa la unión al fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana, y el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana se une a través de un grupo amino del mismo al átomo de carbono de un grupo C(=O) terminal del resto de marcaje.
A continuación se mostrarán determinadas realizaciones del conjugado de la presente invención:
(1) un conjugado en el que el resto de marcaje es un ligando y un ligador representados por la fórmula (A’), y el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana es un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que comprende un fragmento de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 10 y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por s Eq ID NO: 12;
(2) el conjugado del punto (1), en el que el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana es un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que comprende un fragmento de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6;
(3) un conjugado en el que el resto de marcaje es un ligando y un ligador representados por la fórmula (A'), y el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana es un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que comprende un fragmento de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada derivada de una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 10 mediante la modificación de glutamina en la posición de aminoácido 1 de SEQ ID NO: 10 en ácido piroglutámico, y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 12;
(4) el conjugado del punto (3), en el que el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana es un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que comprende un fragmento de cadena pesada derivado de un fragmento de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 mediante la modificación de glutamina en la posición de aminoácido 1 de SEQ ID NO: 4 en ácido piroglutámico, y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6;
(5) el conjugado del punto (2) o (4) que es el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana unido a de 1 a 11 restos de marcaje;
(6) el conjugado del punto (2) o (4) que es el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana unido a de 1 a 4 restos de marcaje;
(7) el conjugado de cualquiera de los puntos (1) a (6), que comprende además un metal;
(8) el conjugado del punto (7), en el que el metal es un radioisótopo metálico;
(9) el conjugado del punto (8), en el que el metal es 89Zr;
(10) un conjugado en el que el resto de marcaje es un colorante fluorescente representado por la fórmula (B) o la fórmula (C), y el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana es un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que comprende un fragmento de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 10 y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 12;
(11) el conjugado del punto (10), en el que el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana es un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que comprende un fragmento de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6;
(12) un conjugado en el que el resto de marcaje es un colorante fluorescente representado por la fórmula (B) o la fórmula (C), y el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana es un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que comprende un fragmento de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada derivada de una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 10 mediante la modificación de glutamina en la posición de aminoácido 1 de SEQ ID NO: 10 en ácido piroglutámico, y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 12;
(13) el conjugado del punto (12), en el que el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana es un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que comprende un fragmento de cadena pesada derivado de un fragmento de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 mediante la modificación de glutamina en la posición de aminoácido 1 de SEQ ID NO: 4 en ácido piroglutámico, y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6;
(14) el conjugado de cualquiera de los puntos (10) a (13), en el que el resto de marcaje es un colorante fluorescente representado por la fórmula (C);
(15) el conjugado del punto (14) que es el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana unido a de 1 a 11 restos de marcaje;
(16) el conjugado del punto (15), que es el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana unido a de 1 a 5 restos de marcaje;
(17) el conjugado de cualquiera de los puntos (10) a (13), en el que el resto de mareaje es un colorante fluorescente representado por la fórmula (B);
(18) el conjugado del punto (17) que es el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana unido a de 1 a 11 restos de marcaje; y
(19) el conjugado del punto (18), que es el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana unido a de 1 a 5 restos de marcaje.
En una realización alternativa, el conjugado de la presente invención es un conjugado representado por la siguiente fórmula (I):
[Fórmula química 14]
(L-X)p-Ab (I)
en la que Ab representa el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana,
L representa (i) un ligando o (ii) un colorante fluorescente,
X representa un ligador o un enlace, y
p es un número natural de 1 a 27. Una determinada realización de p es un número natural de 1 a 23. Una determinada realización es un número natural de 1 a 15. Una determinada realización es un número natural de 1 a 11. Una determinada realización es un número natural de 1 a 9. Una determinada realización es un número natural de 1 a 7. Una determinada realización es un número natural de 1 a 5. Una determinada realización es un número natural de 1 a 4.
En una determinada realización, el conjugado de la presente invención es un conjugado de fórmula (I), el conjugado comprende además un metal. Una determinada realización del metal es un radioisótopo metálico. Una determinada realización del radioisótopo metálico es 89Zr.
En una determinada realización, el conjugado de fórmula (I) es el conjugado de la presente invención en el que el resto de marcaje es un ligando y un ligador representados por la fórmula (A’). En una determinada realización, este conjugado es un conjugado representado por la siguiente fórmula (II):
[Fórmula química 15]
en la que Ab representa el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana, y p es un número natural de 1 a 27. Una determinada realización de p es un número natural de 1 a 23. Una determinada realización es un número natural de 1 a 15. Una determinada realización es un número natural de 1 a 11. Una determinada realización es un número natural de 1 a 9. Una determinada realización es un número natural de 1 a 7. Una determinada realización es un número natural de 1 a 5. Una determinada realización es un número natural de 1 a 4.
Ab se une a través de un grupo amino del mismo al átomo de carbono de un grupo C(=S) terminal del resto de marcaje.
En una determinada realización, el conjugado de la presente invención es un conjugado de fórmula (II), el conjugado comprende además un metal. Una determinada realización del metal es un radioisótopo metálico. Una determinada realización del radioisótopo metálico es 89Zr.
En una determinada realización, el conjugado de fórmula (I) es el conjugado de la presente invención en el que el resto de marcaje es un colorante fluorescente representado por la fórmula (B). En una determinada realización, el conjugado es un conjugado representado por la siguiente fórmula (III):
[Fórmula química 16]
en la que Ab representa el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana, y p es un número natural de 1 a 27. Una determinada realización de p es un número natural de 1 a 23. Una determinada realización es un número natural de 1 a 15. Una determinada realización es un número natural de 1 a 11. Una determinada realización es un número natural de 1 a 9. Una determinada realización es un número natural de 1 a 7. Una determinada realización es un número natural de 1 a 5. Una determinada realización es un número natural de 1 a 4.
Ab se une a través de un grupo amino del mismo al átomo de carbono de un grupo C(=O) terminal del resto de marcaje. En una determinada realización, el conjugado de fórmula (I) es el conjugado de la presente invención en el que el resto de marcaje es un colorante fluorescente representado por la fórmula (C). En una determinada realización, este conjugado es un conjugado representado por la siguiente fórmula (IV):
[Fórmula química 17]
en la que Ab representa el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana, y p es un número natural de 1 a 27. Una determinada realización de p es un número natural de 1 a 23. Una determinada realización es un número natural de 1 a 15. Una determinada realización es un número natural de 1 a 11. Una determinada realización es un número natural de 1 a 9. Una determinada realización es un número natural de 1 a 7. Una determinada realización es un número natural de 1 a 5. Una determinada realización es un número natural de 1 a 4.
Ab se une a través de un grupo amino del mismo al átomo de carbono de un grupo C(=O) terminal del resto de marcaje. En una determinada realización, el conjugado de la presente invención es el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención marcado con una molécula detectable. El fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención marcado con una molécula detectable es el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención y la molécula detectable unidos mediante un enlace covalente directamente o a través de un ligador apropiado. En la presente memoria descriptiva, la molécula detectable significa cualquier resto detectable en una técnica de diagnóstico por obtención de imágenes conocida en la técnica. Cuando la técnica de diagnóstico por obtención de imágenes es, por ejemplo, obtención de imágenes de fluorescencia, la molécula detectable es un colorante fluorescente. Cuando la técnica de diagnóstico por obtención de imágenes es PET, la molécula detectable es un compuesto del cual pueden obtenerse imágenes mediante PET. Una determinada realización es un compuesto que comprende un ligando marcado con un radionúclido, o un residuo de azúcar marcado con un radionúclido no metálico. Una determinada realización del compuesto que comprende un ligando marcado con un radionúclido es un ligando que ha formado un complejo de quelato con un radioisótopo metálico. Cuando la técnica de diagnóstico por obtención de imágenes es resonancia magnética, la molécula detectable es un compuesto detectable por la técnica de resonancia magnética. Una determinada realización es un compuesto que comprende un ligando marcado que tiene un ion metálico paramagnético. Una determinada realización del compuesto que comprende un ligando marcado que tiene un ion metálico paramagnético es un ligando que ha formado un complejo de quelato con un ion metálico paramagnético.
Cuando el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención marcado con una molécula detectable se usa en el contexto de una molécula detectable, el compuesto del cual pueden obtenerse imágenes mediante PET se denomina trazador de PET, y el compuesto detectable mediante la técnica de resonancia magnética se denomina medio de contraste de resonancia magnética.
Los ejemplos de determinadas realizaciones del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención marcado con una molécula detectable incluyen los siguientes:
(1) un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana en el que la molécula detectable es un colorante fluorescente, un trazador de PET o un medio de contraste de resonancia magnética;
(2) el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana del punto (1), en el que la molécula detectable es un colorante fluorescente;
(3) el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana del punto (2), en el que la molécula detectable es un colorante fluorescente representado por la fórmula (B);
(4) el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana del punto (2), en el que la molécula detectable es un colorante
fluorescente representado por la fórmula (C);
(5) el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana del punto (1), en el que la molécula detectable es un trazador de PET o un medio de contraste de resonancia magnética;
(6) un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana en el que la molécula detectable es un medio de contraste de resonancia magnética que comprende un ligando representado por la fórmula (A) y un ion metálico paramagnético, o un trazador de PET que comprende el ligando y un radioisótopo metálico; y
(7) el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana del punto (6), en el que la molécula detectable y el ligador son un medio de contraste de resonancia magnética que comprende un ligando y un ligador representados por la fórmula (A') y un ion metálico paramagnético, o un trazador de PET que comprende el ligando y el ligador y un radioisótopo metálico.
El método mencionado anteriormente puede emplearse para la unión del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención a la molécula detectable.
El conjugado de la presente invención también incluye un conjugado que es una mezcla de una pluralidad de conjugados de la presente invención. Por ejemplo, un conjugado que es una mezcla de un conjugado que comprende un resto de marcaje y un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana no modificado postraduccionalmente de la presente invención, y un conjugado que comprende un resto de marcaje y el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención resultante de la modificación postraduccional del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana también se incluye en el conjugado de la presente invención.
A continuación se mostrarán determinadas realizaciones del conjugado de la presente invención que es una mezcla de una pluralidad de conjugados de la presente invención:
(1) un conjugado que es una mezcla de un conjugado en el que el resto de marcaje es un ligando y un ligador representados por la fórmula (A'), y el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana es un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que comprende un fragmento de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6, y un conjugado en el que el resto de marcaje es un ligando y un ligador representados por la fórmula (A'), y el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana es un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que comprende un fragmento de cadena pesada derivado de un fragmento de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 mediante la modificación de glutamina en la posición de aminoácido 1 de SEQ ID NO: 4 en ácido piroglutámico, y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6;
(2) el conjugado del punto (1), que comprende además un metal;
(3) el conjugado del punto (2), en el que el metal es un radioisótopo metálico;
(4) el conjugado del punto (3), en el que el metal es 89Zr;
(5) un conjugado que es una mezcla de un conjugado en el que el resto de marcaje es un colorante fluorescente representado por la fórmula (B), y el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana es un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que comprende un fragmento de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6, y un conjugado en el que el resto de marcaje es un colorante fluorescente representado por la fórmula (B), y el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana es un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que comprende un fragmento de cadena pesada derivado de un fragmento de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 mediante la modificación de glutamina en la posición de aminoácido 1 de SEQ ID NO: 4 en ácido piroglutámico, y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6; y
(6) un conjugado que es una mezcla de un conjugado en el que el resto de marcaje es un colorante fluorescente representado por la fórmula (C), y el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana es un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que comprende un fragmento de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6, y un conjugado en el que el resto de marcaje es un colorante fluorescente representado por la fórmula (C), y el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana es un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que comprende un fragmento de cadena pesada derivado de un fragmento de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 mediante la modificación de glutamina en la posición de aminoácido 1 de SEQ ID NO: 4 en ácido piroglutámico, y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6.
<Polinucleótido de la presente invención>
El polinucleótido de la presente invención incluye un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el fragmento de cadena pesada del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención, y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena ligera del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención.
En una realización, el polinucleótido de la presente invención es un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un fragmento de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 8, o un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un fragmento de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 10.
Los ejemplos del polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un fragmento de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 8 incluyen un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 7. Los ejemplos del polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un fragmento de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 10 incluyen un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 9.
En una realización, el polinucleótido de la presente invención es un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un fragmento de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 o un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un fragmento de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4.
Los ejemplos del polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un fragmento de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 incluyen un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 1. Los ejemplos del polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un fragmento de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 incluyen un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 3.
En una realización, el polinucleótido de la presente invención es un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 12.
Los ejemplos del polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 12 incluyen un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 11.
En una realización, el polinucleótido de la presente invención es un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6.
Los ejemplos del polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6 incluyen un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 5.
El polinucleótido de la presente invención puede sintetizarse mediante el uso de un método de síntesis de genes conocido en la técnica basándose en secuencias de nucleótidos diseñadas a partir de las secuencias de aminoácidos del fragmento de cadena pesada y la cadena ligera del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención. Diversos métodos conocidos por los expertos en la técnica, tales como los métodos para sintetizar un gen de anticuerpo descritos en la publicación internacional n.° WO 90/07861 pueden usarse como tales métodos de síntesis de genes.
<Vector de expresión de la presente invención>
El vector de expresión de la presente invención incluye un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el fragmento de cadena pesada del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena ligera del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención.
El vector de expresión de la presente invención incluye preferiblemente un vector de expresión que comprende un
polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un fragmento de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID n O: 6.
El vector de expresión de la presente invención no está particularmente limitado siempre que un polipéptido codificado por el polinucleótido de la presente invención pueda producirse en diversas células huésped de células procariotas y/o eucariotas. Los ejemplos de un vector de expresión de este tipo incluyen vectores de plásmidos y vectores de virus (por ejemplo, adenovirus y retrovirus). Preferiblemente, puede usarse pEE6.4 o pEE12.4 (Lonza Ltd.).
El vector de expresión de la presente invención puede comprender un promotor ligado operativamente a un gen que codifica para el fragmento de cadena pesada y/o la cadena ligera en el polinucleótido de la presente invención. Los ejemplos del promotor para expresar el fragmento Fab de la presente invención en una célula huésped incluyen el promotor Trp, el promotor lac, el promotor recA, el promotor XPL, el promotor lpp y el promotor tac cuando la célula huésped es una bacteria del género Escherichia. Los ejemplos del promotor para la expresión en levaduras incluyen el promotor PH05, el promotor PGK, el promotor GAP y el promotor ADH. Los ejemplos del promotor para la expresión en bacterias del género Bacillus incluyen el promotor SL01, el promotor SP02 y el promotor penP. Los ejemplos de los mismos incluyen promotores derivados de virus tales como CMV, RSV y SV40, promotor de retrovirus, promotor de actina, promotor de EF (factor de elongación) 1a y promotor de choque térmico cuando el huésped es una célula eucariota tal como una célula de mamífero.
En el caso de usar una bacteria, en particular, E. coli, como célula huésped, el vector de expresión de la presente invención puede comprender además un codón de iniciación, un codón de parada, una región terminadora y una unidad replicable. Por otra parte, en el caso de usar una levadura, una célula animal o una célula de insecto como huésped, el vector de expresión de la presente invención puede comprender un codón de iniciación y un codón de parada. En este caso, puede contener una secuencia potenciadora, regiones no traducidas 5' y 3' de un gen que codifica para el fragmento de cadena pesada y/o la cadena ligera de la presente invención, una secuencia de señal de secreción, una zona de corte y empalme, un sitio de poliadenilación o una unidad replicable, etc. Además, puede contener un marcador selectivo usado habitualmente (por ejemplo, el gen de resistencia a la tetraciclina, el gen de resistencia a la ampicilina, el gen de resistencia a la kanamicina, el gen de resistencia a la neomicina, el gen de la dihidrofolato reductasa) según el propósito.
<Célula huésped transformada de la presente invención>
La célula huésped transformada de la presente invención incluye una célula huésped transformada con el vector de expresión de la presente invención, seleccionada del grupo que consiste en lo siguiente (c) a (d):
(c) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el fragmento de cadena pesada del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena ligera del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención; y
(d) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el fragmento de cadena pesada del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención y un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena ligera del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención.
En una realización, la célula huésped transformada de la presente invención es una célula huésped transformada con el vector de expresión de la presente invención, seleccionada del grupo que consiste en lo siguiente (c) a (d):
(c) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un fragmento de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6; y
(d) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un fragmento de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 y un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6.
La célula huésped que va a transformarse no está particularmente limitada siempre que sea compatible con el vector de expresión usado y pueda transformarse con el vector de expresión para expresar el fragmento Fab. Los ejemplos de las mismas incluyen diversas células, tales como células naturales y células establecidas artificialmente que se usan habitualmente en el campo técnico de la presente invención (por ejemplo bacterias (bacterias del género
Escherichia y bacterias del género Bacillus), levaduras (el género Saccharomyces, el género Pichia, etc.), células animales y células de insectos (por ejemplo, Sf9)), y líneas celulares de mamíferos (por ejemplo, células cultivadas tales como células CHO-K1SV, células CHO-DG44 y células 293). La transformación en sí puede realizarse mediante un método conocido, por ejemplo, un método de fosfato de calcio o un método de electroporación.
<Método para producir un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la presente invención>
El método para producir un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la presente invención comprende la etapa de cultivar la célula huésped transformada de la presente invención para expresar el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana.
En una realización, la célula huésped transformada de la presente invención que va a cultivarse en el método para producir un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la presente invención se selecciona del grupo que consiste en lo siguiente (a) a (c):
(a) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el fragmento de cadena pesada del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena ligera del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención;
(b) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el fragmento de cadena pesada del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención y un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena ligera del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención; y
(c) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el fragmento de cadena pesada del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención, y una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena ligera del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención.
Una determinada forma de la célula huésped transformada de la presente invención que va a cultivarse en el método para producir un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la presente invención se selecciona del grupo que consiste en lo siguiente (a) a (c):
(a) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un fragmento de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6;
(b) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un fragmento de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 y un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6; y
(c) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un fragmento de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4, y una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6.
Preferiblemente, la célula huésped transformada de la presente invención usada es una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el fragmento de cadena pesada del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena ligera del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención, o una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el fragmento de cadena pesada del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención y un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena ligera del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención.
En el método para producir un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la presente invención, la célula huésped transformada puede cultivarse en un medio nutritivo. El medio nutritivo contiene preferiblemente una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno inorgánico o una fuente de nitrógeno orgánico necesarias para el crecimiento de
la célula huésped transformada. Los ejemplos de la fuente de carbono incluyen glucosa, dextrano, almidón soluble y sacarosa. Los ejemplos de la fuente de nitrógeno inorgánico o de la fuente de nitrógeno orgánico incluyen sales de amonio, nitratos, aminoácidos, licor de maíz, peptona, caseína, extractos de carne, harina de soja y extractos de patata. También pueden contener otros nutrientes (por ejemplo, sales inorgánicas (por ejemplo, cloruro de calcio, dihidrogenofosfato de sodio y cloruro de magnesio), vitaminas y antibióticos (por ejemplo, tetraciclina, neomicina, ampicilina y kanamicina)), si se desea.
El propio cultivo de la célula huésped transformada se realiza mediante un método conocido. Las condiciones de cultivo, por ejemplo, la temperatura, el pH del medio y el tiempo de cultivo, se seleccionan adecuadamente. Cuando el huésped es, por ejemplo, una célula animal, puede usarse, como medio, medio MEM (Science; 1952; 122: 501), medio DMEM (Virology; 1959; 8: 396-97), medio RPMI1640 (J. Am. Med. Assoc.; 1967; 199: 519-24), medio 199 (Proc. Soc. Exp. Biol. Med.; 1950; 73:1-8), o similares que contengan aproximadamente del 5 al 20% de suero fetal bovino. El pH del medio es preferiblemente de aproximadamente 6 a 8. El cultivo se realiza habitualmente a aproximadamente 30 a 40°C durante aproximadamente de 15 a 336 horas, y también puede realizarse la aireación o agitación, si es necesario. Cuando el huésped es una célula de insecto, algunos ejemplos de los mismos incluyen el medio de Grace (PNAS; 1985; 82: 8404-8) que contiene suero fetal bovino. Su pH es preferiblemente de aproximadamente 5 a 8. El cultivo se realiza habitualmente a aproximadamente de 20 a 40°C durante de 15 a 100 horas, y también puede realizarse una aireación o agitación, si es necesario. Cuando el huésped es una bacteria, un actinomiceto, una levadura o un hongo filamentoso, por ejemplo, es apropiado un medio líquido que contenga la fuente de nutrientes descrita anteriormente. Se prefiere un medio de pH 5 a 8. Cuando el huésped es E. coli, los ejemplos preferidos del medio incluyen el medio LB y el medio M9 (Miller et al., Exp. Mol. Genet, Cold Spring Harbor Laboratory; 1972: 431). En este caso, el cultivo puede realizarse normalmente a de 14 a 43°C durante aproximadamente de 3 a 24 horas con aireación o agitación, si es necesario. Cuando el huésped es una bacteria del género Bacillus, normalmente puede realizarse a 30-40°C durante aproximadamente de 16 a 96 horas con aireación o agitación, si es necesario. Cuando el huésped es una levadura, los ejemplos del medio incluyen el medio mínimo de Burkholder (PNAS; 1980; 77: 4505 8). Su pH es deseablemente de 5 a 8. El cultivo se realiza habitualmente a aproximadamente de 20 a 35°C durante aproximadamente de 14 a 144 horas, y también puede realizarse una aireación o agitación, si es necesario.
El método para producir un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la presente invención puede comprender la etapa de recuperar, preferiblemente aislar o purificar, el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana expresado, además de la etapa de cultivar la célula huésped transformada de la presente invención para expresar el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana. Los ejemplos del método de aislamiento o purificación incluyen: métodos que aprovechan la solubilidad, tales como la salazón y un método de precipitación con disolvente; métodos que aprovechan la diferencia de peso molecular, tales como la diálisis, la ultrafiltración, la filtración en gel y la electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio y poliacrilamida; métodos que aprovechan la carga, tales como la cromatografía de intercambio iónico y la cromatografía de hidroxilapatita; métodos que aprovechan la afinidad específica, tales como la cromatografía de afinidad; métodos que aprovechan la diferencia de hidrofobia, tales como la cromatografía de líquidos de alto rendimiento en fase inversa; y métodos que aprovechan la diferencia de punto isoeléctrico, tales como el enfoque isoeléctrico.
<Método para producir el conjugado según la presente invención>
El método para producir un conjugado según la presente invención comprende la etapa de unir covalentemente el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención a un resto de marcaje. El método para producir un conjugado según la presente invención también puede comprender las etapas de: cultivar la célula huésped transformada de la presente invención para expresar el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana; y unir covalentemente el fragmento Fab a un resto de marcaje. El método para producir un conjugado según la presente invención también puede comprender las etapas de: cultivar la célula huésped transformada de la presente invención para expresar el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana; recuperar el fragmento Fab expresado; y unir covalentemente el fragmento Fab a un resto de marcaje. El método para producir un conjugado según la presente invención puede comprender además la etapa de añadir un metal. El ligador, el agente quelante, el metal, o el colorante fluorescente, etc., y el método de ligación usados pueden emplear los descritos en <Conjugado de la presente invención>.
En una realización, el método para producir un conjugado según la presente invención es un método que comprende las etapas de: cultivar la célula huésped transformada de la presente invención para expresar el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana; y unir covalentemente el fragmento Fab a un resto de marcaje. Una determinada realización del método para producir un conjugado según la presente invención es un método que comprende las etapas de: cultivar la célula huésped transformada de la presente invención para expresar el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana; recuperar el fragmento Fab expresado; y unir covalentemente el fragmento Fab a un resto de marcaje.
Una determinada realización del método para producir un conjugado según la presente invención es un método que comprende las etapas de: cultivar la célula huésped transformada de la presente invención para expresar el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana; y i) unir el fragmento Fab mediante un ligador a un ligando o ii) unir covalentemente el fragmento Fab directamente a un ligando. Una determinada realización del método para producir
un conjugado según la presente invención es un método que comprende las etapas de: cultivar la célula huésped transformada de la presente invención para expresar el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana; recuperar el fragmento Fab expresado; y i) unir el fragmento Fab mediante un ligador a un ligando o ii) unir covalentemente el fragmento Fab directamente a un ligando.
Una determinada realización del método para producir un conjugado según la presente invención es un método que comprende las etapas de: cultivar la célula huésped transformada de la presente invención para expresar el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana; i) unir el fragmento Fab mediante un ligador a un ligando o ii) unir covalentemente el fragmento Fab directamente a un ligando; y marcar el ligando del conjugado con un metal (es decir, formar un complejo de quelato). Una determinada realización del método para producir un conjugado según la presente invención es un método que comprende las etapas de: cultivar la célula huésped transformada de la presente invención para expresar el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana; recuperar el fragmento Fab expresado; i) unir el fragmento Fab mediante un ligador a un ligando o ii) unir covalentemente el fragmento Fab directamente a un ligando; y marcar el ligando del conjugado con un metal.
Una determinada realización del método para producir un conjugado según la presente invención es un método que comprende las etapas de: cultivar la célula huésped transformada de la presente invención para expresar el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana; i) unir el fragmento Fab a través de un ligador a un ligando o ii) unir covalentemente el fragmento Fab directamente a un ligando; y marcar el ligando del conjugado con un radioisótopo metálico (es decir, formar un complejo de quelato). Una determinada realización del método para producir un conjugado según la presente invención es un método que comprende las etapas de: cultivar la célula huésped transformada de la presente invención para expresar el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana; recuperar el fragmento Fab expresado; i) unir el fragmento Fab mediante un ligador a un ligando o ii) unir covalentemente el fragmento Fab directamente a un ligando; y marcar el ligando del conjugado con un radioisótopo metálico.
Una determinada realización del método para producir un conjugado según la presente invención es un método que comprende las etapas de: cultivar la célula huésped transformada de la presente invención para expresar el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana; y i) unir el fragmento Fab mediante un ligador a un colorante fluorescente o ii) unir covalentemente el fragmento Fab directamente a un colorante fluorescente. Una determinada realización del método para producir un conjugado según la presente invención es un método que comprende las etapas de: cultivar la célula huésped transformada de la presente invención para expresar el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana; recuperar el fragmento Fab expresado; y i) unir el fragmento Fab mediante un ligador a un colorante fluorescente o ii) unir covalentemente el fragmento Fab directamente a un colorante fluorescente.
Una determinada realización del método para producir un conjugado según la presente invención es un método que comprende las etapas de: cultivar la célula huésped transformada de la presente invención para expresar el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana; y marcar el fragmento Fab con una molécula detectable. Una determinada realización del método para producir un conjugado según la presente invención es un método que comprende las etapas de: cultivar la célula huésped transformada de la presente invención para expresar el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana; recuperar el fragmento Fab expresado; y marcar el fragmento Fab con una molécula detectable.
El método para producir un conjugado según la presente invención puede llevarse a cabo como un método que comprende dos o más de las etapas definidas anteriormente como una serie de etapas o puede llevarse a cabo como un método que comprende al menos una de las etapas definidas anteriormente. Por ejemplo, también se incluyen en el método para producir un conjugado según la presente invención un método que comprende la etapa de unir el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención a un resto de marcaje, y un método que comprende la etapa de marcar el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención unido al resto de marcaje con un metal. Además, el método para producir un conjugado según la presente invención incluye un método que tiene un orden de pasos diferente. Por ejemplo, también se incluye en el método para producir un conjugado según la presente invención un método que comprende marcar un agente quelante con un metal, y luego unir covalentemente el agente quelante al fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención.
<Composición para el diagnóstico y método de diagnóstico>
La presente invención se refiere a una composición para el diagnóstico que comprende el conjugado de la presente invención que comprende un metal o un colorante fluorescente (a continuación en el presente documento, denominado conjugado detectable de la presente invención). La composición para el diagnóstico de la presente invención puede comprender uno o más conjugados de la presente invención. Específicamente, la composición para el diagnóstico de la presente invención puede comprender un conjugado de la presente invención, o puede comprender dos o más conjugados de la presente invención en combinación. El conjugado detectable de la presente invención puede formularse según un método rutinario y usarse como un fármaco de diagnóstico precoz, un fármaco de estadificación o un fármaco de diagnóstico intraoperatorio (en particular, un fármaco de diagnóstico de cáncer). El fármaco de diagnóstico intraoperatorio significa un fármaco de diagnóstico capaz de identificar un sitio de lesión durante una operación, tal como una operación quirúrgica o endoscópica, y examinar su naturaleza. En el caso de usar la composición para el diagnóstico de la presente invención como un fármaco de diagnóstico intraoperatorio, la
composición para el diagnóstico se administra a un paciente, por ejemplo, de 2 a 32 horas, de 6 a 24 horas en una determinada realización, o 2 horas en otra realización, antes de la operación.
El fármaco de diagnóstico precoz es un fármaco de diagnóstico destinado a realizar un diagnóstico cuando no se observa ninguna afección o en un estadio temprano. Por ejemplo, en el caso de cánceres, significa un fármaco de diagnóstico que se usa cuando no se observa ninguna afección o en estadio 0 o estadio 1.
El fármaco de estadificación significa un fármaco de diagnóstico capaz de examinar el grado de evolución de una afección. Por ejemplo, en el caso de cánceres, significa un fármaco de diagnóstico capaz de examinar el estadio de los mismos.
El cáncer que se espera que pueda ser diagnosticado por la composición para el diagnóstico de la presente invención es un cáncer que expresa MUC1 humana. Los ejemplos de una determinada realización incluyen cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de vejiga, cáncer de piel, cáncer de glándula tiroidea, cáncer de estómago, cáncer de páncreas, cáncer de riñón, cáncer de ovario y cáncer de cuello uterino. Preferiblemente, el cáncer es cáncer de mama o cáncer de vejiga.
La cantidad del conjugado de la presente invención añadida para la formulación de la composición para el diagnóstico de la presente invención difiere según el grado de los síntomas o la edad de un paciente, la forma de dosificación de un preparado usado, o el título de unión del fragmento Fab, etc. Por ejemplo, pueden usarse aproximadamente de 0,001 mg/kg a 100 mg/kg basándose en la masa del fragmento Fab por unidad de peso corporal de un paciente.
Los ejemplos de la forma de dosificación de la composición para el diagnóstico de la presente invención pueden incluir agentes parenterales tales como inyecciones y agentes para infusión por goteo. La administración puede realizarse mediante inyección intravenosa, inyección intramuscular local en un tejido diana, inyección subcutánea, administración intravesical o similares. Para la formulación, puede usarse un portador o un aditivo adecuado para estas formas de dosificación en un intervalo farmacéuticamente aceptable. El tipo de portador o aditivo farmacéuticamente aceptable no está particularmente limitado, y puede usarse un portador o un aditivo bien conocido por los expertos en la técnica.
La presente invención también se refiere al uso del conjugado detectable de la presente invención para la producción de una composición para el diagnóstico precoz, una composición para la estadificación o una composición para el diagnóstico intraoperatorio de un cáncer. La presente invención también se refiere al conjugado detectable de la presente invención para su uso en el diagnóstico precoz, la estadificación o el diagnóstico intraoperatorio de un cáncer.
Además, la presente invención también se refiere a un método para diagnosticar un cáncer, que comprende la administración preoperatoria o intraoperatoria del conjugado detectable de la presente invención a un sujeto. En este contexto, el “sujeto” es un humano o cualquier otro mamífero que necesita recibir el diagnóstico. Una determinada realización es un humano que necesita recibir el diagnóstico. La cantidad eficaz del conjugado detectable de la presente invención en el método de diagnóstico de la presente invención puede ser la misma cantidad que la cantidad eficaz del conjugado de la presente invención para la formulación descrita anteriormente. En el método de diagnóstico de la presente invención, el conjugado detectable de la presente invención se administra preferiblemente por inyección intramuscular local a un tejido diana, inyección subcutánea o similar. En el método de diagnóstico de la presente invención, en el caso de la administración preoperatoria del conjugado de la presente invención, el conjugado se administra a un paciente, por ejemplo, de 2 a 48 horas, de 6 a 24 horas en una determinada realización, y 2 horas en otra realización antes de la operación.
En una realización alternativa, la presente invención también se refiere al uso del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención para la producción del conjugado de la presente invención. En una determinada realización, la presente invención también se refiere al uso del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención para la producción de una composición para el diagnóstico que comprende el conjugado de la presente invención.
En cuanto a una realización en la que se proporciona la composición para el diagnóstico de la presente invención que comprende un radioisótopo metálico, puede marcarse con el radioisótopo metálico inmediatamente antes de su uso o puede proporcionarse como una composición para el diagnóstico que comprende el radioisótopo metálico.
<Composición para su uso en un método de tratamiento>
La presente invención incluye una composición farmacéutica que comprende uno o más conjugados de la presente invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Específicamente, la composición para su uso en un método de tratamiento de la presente invención puede comprender un conjugado de la presente invención, o puede comprender dos o más conjugados de la presente invención en combinación. El conjugado de la presente invención puede usarse en la preparación de una composición farmacéutica mediante un método habitualmente usado usando un excipiente habitualmente usado en la técnica, es decir, un excipiente farmacéutico, un portador farmacéutico o similar. Los ejemplos de formas de dosificación de estas composiciones farmacéuticas incluyen agentes parenterales tales como inyecciones y agentes para infusión por goteo. La administración puede realizarse mediante inyección
intravenosa, inyección subcutánea, administración intravesical o similares. Para la formulación, puede usarse un excipiente, un portador, un aditivo o similar adecuado para estas formas de dosificación en un intervalo farmacéuticamente aceptable.
La cantidad del conjugado de la presente invención añadida para la formulación descrita anteriormente difiere según el grado de los síntomas o la edad de un paciente, la forma de dosificación de un preparado usado, o el título de unión del fragmento Fab, etc. Por ejemplo, pueden usarse aproximadamente de 0,001 mg/kg a 100 mg/kg basándose en la masa del fragmento Fab por unidad de peso corporal de un paciente.
La composición farmacéutica que comprende el conjugado de la presente invención puede usarse para el tratamiento de un cáncer. El cáncer que se espera que pueda ser tratado por la composición farmacéutica que comprende el conjugado de la presente invención es un cáncer que expresa MUC1 humana. Los ejemplos de los mismos incluyen cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de vejiga, cáncer de piel, cáncer de glándula tiroidea, cáncer de estómago, cáncer de páncreas, cáncer de riñón, cáncer de ovario y cáncer de cuello uterino.
Una determinada realización de la composición farmacéutica que comprende el conjugado de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende el conjugado que comprende un colorante fluorescente y puede usarse en el tratamiento de un cáncer mediante la aplicación en un método de fotoinmunoterapia. El método de fotoinmunoterapia es un método que permite que el conjugado que comprende un colorante fluorescente se acumule específicamente en los tejidos cancerosos, seguido de la irradiación con luz que tiene una longitud de onda que excita el colorante fluorescente contenido en el conjugado para inducir la muerte celular de una manera específica de cáncer a través del efecto fototóxico del colorante fluorescente. En el caso de usar el conjugado de la presente invención que comprende un colorante fluorescente en el método de fotoinmunoterapia, la longitud de onda de la luz para la irradiación puede ser una longitud de onda cercana al infrarrojo (de 650 a 1000 nm).
La presente invención incluye una composición farmacéutica para tratar cáncer de mama o cáncer de vejiga, que comprende el conjugado de la presente invención. La presente invención también incluye el conjugado de la presente invención para su uso en un método para tratar cáncer de mama o cáncer de vejiga, que comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del conjugado de la presente invención, que puede comprender la etapa de realizar la irradiación con luz que tiene una longitud de onda cercana al infrarrojo (de 650 a 1000 nm, por ejemplo, de 660 a 740 nm, por ejemplo, 680 nm), además de la etapa descrita anteriormente. Una determinada realización de la dosis de irradiación de luz es al menos de 1 J/cm2. Una determinada realización es al menos de 10 J/cm2. Una determinada realización es al menos de 100 J/cm2. Una determinada realización es de 1 a 500 J/cm2. Una determinada realización es de 50 a 200 J/cm2. En una determinada realización, la irradiación puede llevarse a cabo una pluralidad de veces después de la administración del conjugado de la presente invención. La presente invención también incluye el conjugado de la presente invención para su uso en un método para inducir la muerte celular de células cancerosas de cáncer de mama o cáncer de vejiga, que comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del conjugado de la presente invención.
La composición farmacéutica para tratar un cáncer también puede usarse en el diagnóstico de un cáncer. Por ejemplo, la composición farmacéutica para tratar cáncer de mama o cáncer de vejiga puede usarse también en el diagnóstico del cáncer.
La presente invención también incluye el conjugado de la presente invención para su uso en el tratamiento de cáncer de mama o cáncer de vejiga. La presente invención incluye además el uso del conjugado de la presente invención para la producción de una composición farmacéutica para el tratamiento de cáncer de mama o cáncer de vejiga.
En una realización alternativa, la presente invención también se refiere al uso del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención para la producción de una composición farmacéutica que comprende el conjugado de la presente invención.
La presente invención se ha descrito de manera general anteriormente. A modo de referencia, se proporcionarán ejemplos particulares para lograr una mayor comprensión. Sin embargo, se dan con fines ilustrativos y no limitan la presente invención.
Ejemplos
(Ejemplo 1: preparación del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana)
Se prepararon dos fragmentos Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana designados como Fab P10-1 y Fab P10-2.
Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y las regiones variables de cadena ligera de Fab P10-1 y Fab P10-2 se diseñaron específicamente como secuencias que se esperaba que mejorasen la afinidad y no atenuasen la afinidad incluso por la unión de un resto de marcaje, usando un modelo molecular de un anticuerpo humanizado construido según la bibliografía (Proteins, agosto de 2014; 82 (8): 1624-35) después de la humanización de un anticuerpo 1B2, que es un anticuerpo anti-MUC1 humana específica de cáncer derivado de ratón, con referencia
al método descrito en la bibliografía (Front Biosci., 1 de enero de 2008; 13: 1619-33).
Se preparó el vector GS pEE6.4 (Lonza Ltd.) que tenía un inserto de un gen de fragmento de cadena pesada formado por la conexión de un gen que codifica para una secuencia de señal (MEWSWVFLLSVTTGVHS (SEQ ID NO: 13) al lado 5' del gen de la región variable de cadena pesada de Fab P10-1 o Fab P10-2 y la conexión de un gen de la región constante de Igy1 humana (que consiste en una secuencia de nucleótidos desde las posiciones de nucleótidos 355 hasta 669 de s Eq ID NO: 1 ó 3) al lado 3' del mismo. En este caso, para expresar cada fragmento Fab, se insertó un codón de parada en el sentido de 3' de un codón de Asp en la posición 221 basándose en el índice UE proporcionado por Kabat et al. (correspondiente a Asp en la posición 222 en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 2 y 4 mencionadas posteriormente) en el gen de la región constante de cadena pesada. Además, se preparó el vector GS pEE12.4 (Lonza Ltd.) que tenía un inserto de un gen de cadena ligera formado por la conexión de un gen que codifica para una secuencia de señal (MSVPTQVLGLLWLTDARC (SEQ ID NO: 14) al lado 5' del gen de la región variable de cadena ligera común de Fab P10-1 y Fab P10-2 y la conexión de un gen de la región constante de cadena k humana (que consiste en una secuencia de nucleótidos desde las posiciones de nucleótidos 340 hasta 660 de SEQ ID NO: 5) al lado 3' del mismo.
La expresión de cada fragmento Fab se realizó mediante el método de expresión transitoria. Las células Expi293F (Thermo Fisher Scientific Inc.) cultivadas en aproximadamente 2500000 células/ml en medio de expresión Expi293 (Thermo Fisher Scientific Inc.) se transfectaron con los vectores GS del fragmento de cadena pesada y la cadena ligera mencionados anteriormente usando el kit de transfección ExpiFectamine 293 (Thermo Fisher Scientific Inc.), y se cultivaron durante 8 días. Después de la expresión, el sobrenadante del cultivo se purificó usando KappaSelect (GE Healthcare Japan Corp.) para obtener cada fragmento Fab.
La secuencia de nucleótidos del fragmento de cadena pesada de Fab P10-1 se muestra en SEQ ID NO: 1, y la secuencia de aminoácidos codificada por la misma se muestra en SEQ ID NO: 2. La secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena pesada de Fab P10-1 se muestra en SEQ ID NO: 7. La secuencia de aminoácidos codificada por la misma se muestra en SEQ ID NO: 8.
La secuencia de nucleótidos del fragmento de cadena pesada de Fab P10-2 se muestra en SEQ ID NO: 3. La secuencia de aminoácidos codificada por la misma se muestra en SEQ ID NO: 4. La secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena pesada de Fab P10-2 se muestra en SEQ ID NO: 9. La secuencia de aminoácidos codificada por la misma se muestra en SEQ ID NO: 10.
La cadena ligera es común en Fab P10-1 y Fab P10-2. La secuencia de nucleótidos de la misma se muestra en SEQ ID NO: 5. La secuencia de aminoácidos codificada por la misma se muestra en SEQ ID NO: 6. La secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena ligera de Fab P10-1 y Fab P10-2 se muestra en SEQ ID NO: 11. La secuencia de aminoácidos codificada por la misma se muestra en SEQ ID NO: 12.
(Ejemplo 2: análisis de la modificación de aminoácidos del fragmento Fab)
Como resultado del análisis de la modificación de aminoácidos del Fab P10-2 purificado, se sugirió que la glutamina N-terminal de la cadena pesada se modificó en ácido piroglutámico en una gran mayoría de anticuerpos purificados.
(Ejemplo 3: evaluación de la actividad de unión del fragmento Fab)
Se comparó la actividad de unión contra MUC1 humana específica de cáncer en cuanto a Fab P10-1 y Fab P10-2 expresados mediante el método mencionado anteriormente con un fragmento Fab del anticuerpo 1B2 quimérico (a continuación en el presente documento, denominado Fab 1B2; preparado ligando un dominio CH1 de IgG1 humana y un dominio CL de cadena k al dominio VH y al dominio VL (la información de su secuencia se citó del documento de patente 1), respectivamente, del anticuerpo 1B2 (documento de patente 1); para la comodidad de ligar el dominio CH1 y el dominio CL, se sustituyó un residuo de alanina en la posición 113 basándose en el índice EU (Kabat et al.) en el dominio VH por un residuo de serina, y se sustituyó un residuo de alanina en la posición 109 basándose en el índice UE (Kabat et al.) en el dominio VL por un residuo de treonina) mediante ELISA celular. Específicamente, las células de la línea celular de cáncer de mama T-47D (adquiribles de ATCC; HTB-133) que expresan MUC1 humana específica de cáncer se inocularon a 0,75 * 104 células por pocillo en una placa de ELISA de 96 pocillos recubierta de colágeno I, y se cultivaron durante la noche. A continuación, se fijaron las células en formol y se hizo reaccionar con ellas Fab P10-1, Fab P10-2 o Fab 1B2 descritos anteriormente. A continuación, se hizo reaccionar un anticuerpo de cabra anti-IgK humana marcado con peroxidasa de rábano picante (Southern Biotechnology Associates, Inc.) como anticuerpo secundario. Se añadió el reactivo de detección de inmunotransferencia de tipo Western ECL Prime (GE Healthcare Japan Corp.) para la luminiscencia, y se examinó el grado de luminiscencia. Como resultado, tal como se muestra en la figura 1, se confirmó que el Fab P10-1 y el Fab P10-2 tienen aproximadamente 10 o más veces la actividad de unión contra MUC1 humana específica de cáncer en comparación con Fab 1B2.
(Ejemplo 4: marcaje fluorescente del fragmento Fab)
Posteriormente, los presentes inventores marcaron Fab P10-1, Fab P10-2 y Fab 1B2 con un colorante fluorescente
mencionado anteriormente.
Específicamente, cada disolución de fragmentos Fab ajustada a aproximadamente 1 mg/ml con solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4) se ajustó a pH 8,5 mediante la adición de una cantidad 1/10 de una disolución de hidrogenofosfato de dipotasio 1 M (pH 9). Se añadió el éster de NHS IRDye800CW (LI-COR Bioscience, Inc.) a una concentración final de 310,8 |ig/ml, y el resultante se agitó a temperatura ambiente bajo sombra durante 2 horas. El éster de NHS IRDye800CW tiene un grupo N-hidroxisuccinimida y, por tanto, reacciona inmediatamente con la Lys del fragmento Fab. Este se recuperó a través del filtro centrífugo Amicon Ultra 3K-0,5 ml (Merck Millipore) para purificar un fragmento Fab marcado con fluorescencia. Los Fab P10-1, Fab P10-2 y Fab 1B2 que albergaban este colorante fluorescente se designaron como Fab P10-1 con colorante, Fab P10-2 con colorante y Fab 1B2 con colorante.
(Ejemplo 5: Evaluación de la actividad de unión del fragmento Fab marcado con fluorescencia)
La actividad de unión contra MUC1 humana específica de cáncer se comparó en cuanto al Fab P10-1 con colorante y al Fab P10-2 con colorante marcados mediante el método mencionado anteriormente con el Fab 1B2 con colorante mediante ELISA celular. Específicamente, las células de la línea celular de cáncer de mama T-47D que expresan MUC1 humana específica de cáncer se inocularon a 0,75 * 104 células por pocillo en una placa de ELISA de 96 pocillos recubierta con colágeno I, y se cultivaron durante la noche. A continuación, se fijaron las células en formol y se hizo reaccionar con ellas el Fab P10-1 con colorante, el Fab P10-2 con colorante o el Fab 1B2 con colorante descritos anteriormente. A continuación, se hizo reaccionar un anticuerpo de cabra anti-IgK humana marcado con HRP (Southern Biotechnology Associates, Inc.) como anticuerpo secundario. Se añadió el reactivo de detección de inmunotransferencia de tipo Western ECL Prime (GE Healthcare Japan Corp.) para la luminiscencia, y se examinó el grado de luminiscencia. Como resultado, tal como se muestra en la figura 2, la actividad de unión del Fab 1B2 con colorante se atenuó mediante marcaje, mientras que se confirmó que la actividad de unión del Fab P10-1 con colorante y el Fab P10-2 con colorante no se atenuó mediante marcaje.
(Ejemplo 6: marcaje del fragmento Fab con agente quelante)
Posteriormente, los presentes inventores marcaron Fab P10-2 con un agente quelante mencionado anteriormente.
Específicamente, una disolución de fragmentos Fab ajustada a 12,5 mg/ml con solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4) se ajustó a pH 9,0 mediante la adición de una disolución de carbonato de sodio 100 M a 10 mM. Se añadió a la misma p-SCN-Bn-deferoxamina (Macrocyclics, Inc.) a una concentración final de 1 mM, y el resultante se hizo reaccionar a 37°C durante 2 horas. La p-SCN-Bn-deferoxamina tiene un grupo isotiocianato y, por tanto, reacciona inmediatamente con la Lys del fragmento Fab. Este se recuperó a través de un filtro centrífugo Amicon Ultra 10K-0,5 ml para purificar un fragmento Fab marcado con agente quelante. Este Fab P10-2 marcado con agente quelante se designó como Fab P10-2 con DFO.
(Ejemplo 7: evaluación de la actividad de unión del fragmento Fab marcado con un agente quelante)
La actividad de unión contra MUC1 humana específica de cáncer se comparó en cuanto a Fab P10-2 con DFO marcado mediante el método mencionado anteriormente con el Fab P10-2 mediante ELISA celular. Específicamente, se inocularon células T-47D que expresaban MUC1 humana específica de cáncer a 0,75 * 104 células en una placa de ELISA de 96 pocillos recubierta con colágeno I, y se cultivaron durante la noche. A continuación, se fijaron las células en formol y se hizo reaccionar con ellas la Fab P10-2 con DFO o el Fab P10-2 descritos anteriormente. A continuación, se hizo reaccionar un anticuerpo de cabra anti-IgK humana marcado con HRP (Southern Biotechnology Associates, Inc.) como anticuerpo secundario. Se añadió el reactivo de detección de inmunotransferencia de tipo Western ECL Prime (GE Healthcare Japan Corp.) para la luminiscencia, y se examinó el grado de luminiscencia. Como resultado, tal como se muestra en la figura 3, Fab P10-2 con DFO y Fab P10-2 tenían una actividad de unión equivalente. Se confirmó que la actividad de unión del Fab P10-2 no se atenuó mediante marcaje con un agente quelante.
(Ejemplo 8: reactividad de P10-2 en una muestra de tejido de cáncer de vejiga humano)
Con el fin de estudiar la reactividad de Fab P10-2 en el cáncer de vejiga humano, el estudio se realizó mediante inmunotinción usando una matriz de tejidos de cáncer de vejiga humano (US Biomax, Inc., BC1201 1b). Cuando se usa Fab P10-2 como anticuerpo primario, un anticuerpo anti-IgG humana usado como anticuerpo secundario presenta reacciones cruzadas con los tejidos humanos. Por tanto, se preparó una IgG quimérica de ratón P10-2 (anticuerpo en el que el dominio VH y el dominio VL de Fab P10-2 se fusionaron con los dominios CH1 a CH3 de IgG2a de ratón y un dominio CL de cadena k de ratón, respectivamente) y se usó como anticuerpo primario. La muestra de matriz de tejidos de cáncer de vejiga humano se hizo reaccionar con una disolución de peróxido de hidrógeno al 3% durante 5 minutos y luego se lavó con solución salina tamponada con fosfato de pH 7,4. A continuación, se hizo reaccionar la IgG quimérica de ratón P10-2 (0,25 |ig/ml) y, después, se hizo reaccionar el anticuerpo One-Step Polymer-HRP (BioGenex) como anticuerpo secundario. Para el desarrollo del color se añadió a DAB super sensible (BioGenex). La reacción positiva de la tinción para los tejidos cancerosos se determinó como ±: muy ligeramente positiva, : positiva,
++: moderadamente positiva, y ++: altamente positiva, y se excluyó un caso cuyos tejidos cancerosos no eran claros. Como resultado, se encontró una reacción positiva en 57 de los 59 casos estudiados, con 11 casos para ±, 24 casos para , 17 casos para + y 5 casos para ++ (tasa de positividad: 97%).
(Ejemplo 9: marcaje del fragmento Fab quelado con 89Zr)
Se disolvió 89Zr usado en una disolución acuosa de ácido oxálico y se produjo como oxalato de 89Zr (Universidad de Okayama). Se neutralizaron 20 |il de oxalato de 89Zr (21,4 MBq) con 10 |il de una disolución acuosa de carbonato de sodio 2 M. A continuación, se añadieron 70 |il de una disolución de 5 mg/ml de ácido gentísico disuelto en una disolución acuosa de acetato de sodio 250 mM. Además, se añadieron 200 |il de una disolución acuosa de HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinotanosulfónico) 500 mM que contenía polisorbato 80 al 0,1% y glicerol al 20%. A esta disolución que contenía 89Zr, se le añadieron 100 |il de Fab P10-2 con DFO 9,5 mg/ml y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos. La mezcla de reacción obtenida se purificó usando un filtro centrífugo Amicon Ultra 10K-0,5 ml (Merck Millipore) y se filtró además a través de un filtro de membrana (Millex-GV 0,22 |im 13 mm; Merck Millipore) para obtener Fab P10-2 con DFO marcado con 89Zr (16,1 MBq) de interés. Esta Fab P10-2 con DFO marcado con 89Zr se designó como Fab P10-2 con DFO con 89Zr. La disolución de Fab P10-2 con DFO con 89Zr obtenida se analizó mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento (serie 20AD; Shimadzu Corp.). El tiempo de retención (UV: 10,192 min) de Fab P10-2 con DFO se comparó con el tiempo de retención (UV: 10,178 min, RI: 10,515 min) de Fab P10-2 con DFO con 89Zr. Los tiempos de retención respectivos fueron equivalentes, lo que confirma que Fab P10-2 con DFO se marcó con 89Zr. El análisis por HPLC se realizó en las siguientes condiciones: columna: BioSep SEC s3000300 * 7,8 mm (Phenomenex Inc.), temperatura de la columna: temperatura ambiente, longitud de onda del detector UV: 280 nm, fase móvil: disolución tampón de fosfato (Gibco, 10010-023), velocidad de flujo: 1 ml/min.
(Ejemplo 10: marcaje del fragmento Fab con IRDye700DX)
Se usó el éster de NHS IRDye700DX (LI-COR Bioscience, Inc.) para marcar el Fab P10-2 con IRDye700DX.
Específicamente, una disolución de Fab P10-2 ajustada a 1 mg/ml con solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4) se complementó con una cantidad 1/10 de una disolución de hidrogenofosfato de dipotasio 1 M (pH 9). Se añadió el éster de NHS IRDye700DX a una concentración final de 154 |ig/ml, y el resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de la reacción, el Fab P10-2 marcado con IRDye700DX se purificó mediante recuperación a través del filtro centrífugo Amicon Ultra 10K-15 ml (Merck Millipore). Este Fab P10-2 marcado con IRDye700DX se designó como Fab P10-2 con IR700.
(Ejemplo 11: evaluación de la actividad de unión del fragmento Fab contra una línea celular de cáncer de mama y una línea celular de cáncer de vejiga)
Se estudió la actividad de unión del Fab P10-2 en el cáncer de mama y el cáncer de vejiga humanos.
Específicamente, se inocularon células de la línea celular de cáncer de mama humano MDA-MB-468 (adquiribles de ATCC; HTB-132; a continuación en el presente documento, denominadas células MM-468) o células de la línea celular de cáncer de vejiga humano 647-V (adquiribles de DSMZ; ACC 414) que expresaban MUC1 humana específica de cáncer a 1 * 104 células por pocillo en una placa de ELISA de 96 pocillos y se cultivaron durante la noche. A continuación, se hizo reaccionar el Fab P10-2 descrito anteriormente a una concentración de 0,0000003 a 0,001 mg/ml. A continuación, se hizo reaccionar un anticuerpo de cabra anti-IgG humana marcado con peroxidasa de rábano picante (Medical & Biological Laboratories Co., Ltd.) como anticuerpo secundario. Se añadió el reactivo de detección de inmunotransferencia de tipo Western ECL Prime (GE Healthcare Japan Corp.) para la luminiscencia, y se examinó el grado de luminiscencia. Como resultado, tal como se muestra en la figura 4, se encontró que el Fab P10-2 tenía actividad de unión contra las células de la línea celular de cáncer de mama humano MM-468 y las células de la línea celular de cáncer de vejiga humano 647-V.
(Ejemplo 12: evaluación de contraste del fragmento Fab marcado con fluorescencia en un modelo que porta cáncer de manera subcutánea)
Se trasplantaron por vía subcutánea 3 * 106 células de la línea celular de cáncer de mama humano MM-468 como células positivas para MUC1 humana específica de cáncer en el dorso derecho de cada ratón inmunodeficiente (ratón SCID; Charles River Laboratories Japan, Inc.). Los ratones con tumorigénesis se seleccionaron aproximadamente un mes después del trasplante. Se administró por vía intravenosa el Fab P10-2 con colorante disuelto en solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4) a una dosis de 0,1, 0,3, 1 ó 3 mg/kg (N = 2 para el grupo de administración de 0,1 mg/kg, y N = 3 para los grupos de administración de 0,3, 1 y 3 mg/kg). Se tomaron fotografías con una cámara habitual y una cámara de fluorescencia en el infrarrojo cercano (Fluobeam (filtro de 800 nm); Fluoptics) 6 horas y 24 horas después de la administración del Fab P10-2 con colorante. Se midió el brillo fluorescente de un sitio tumoral y de un sitio peritumoral de fondo en la imagen tomada con la cámara de fluorescencia en el infrarrojo. Como resultado, tal como se muestra en la figura 5A, se encontró que el Fab P10-2 con colorante se acumulaba en el sitio tumoral de MM468 positivas para MUC1 humana específica de cáncer y era claramente visible en la imagen fluorescente 6 horas después de la administración. Tal como se muestra en la figura 5B, se encontró que la relación tumor/fondo se elevó de manera dependiente de la dosis de Fab P10-2 con colorante en el intervalo de 0,1 a 3 mg/kg. Además, era evidente que el efecto se mantenía incluso 24 horas después de la administración. Estos resultados demostraron que Fab P10-2 con colorante permite la detección de células cancerosas positivas para MUC1 humana desde 6 horas hasta 24 horas después de la administración.
(Ejemplo 13: detección de un tumor con un fragmento Fab marcado con IRDye700DX)
Se trasplantaron 5 * 106 células MM-468 por vía subcutánea en la espalda derecha de cada ratón inmunodeficiente (ratón desnudo; Charles River Laboratories Japan, Inc.). Esta prueba se llevó a cabo con N = 2. Se administró por vía intravenosa Fab P10-2 con IR700 (3 mg/kg) o un vehículo (solución salina tamponada con fosfato) 40 días después del trasplante. Los animales se eutanasiaron 2 horas después de la administración de Fab P10-2 con IR700. Se extirpó el tumor y se midió la luminiscencia de los sitios tumorales mediante excitación a una longitud de onda de 675 nm y detección a una longitud de onda de 740 nm en IVIS SPECTRUM (PerkinElmer, Inc.). Como resultado, tal como se muestra en la figura 6, se encontró que Fab P10-2 con IR700 se acumulaba en las células MM-4682 horas después de su administración.
(Ejemplo 14: evaluación de la citotoxicidad del fragmento Fab marcado con IRDye700DX)
Con el fin de estudiar la utilización de Fab P10-2 con IR700 en el tratamiento del cáncer, se evaluó la citotoxicidad en fotoinmunoterapia.
Específicamente, se inocularon las células de la línea celular de cáncer de mama humano MM-468, las células de la línea celular de cáncer de vejiga humano 647-V o las células CHO-K1 del ejemplo comparativo (adquiribles de ATCC; CCL-61) a 5 * 103 células por pocillo en una placa blanca de 384 pocillos y se cultivaron durante la noche. A continuación, se hizo reaccionar el Fab P10-2 con IR700 a 0, 0,01, 0,1 ó 1 |ig/ml y luego se irradió con de 0 a 30 J/cm2 de luz con una longitud de onda de 680 nm. Después de la irradiación de luz, se realizó cultivo durante la noche. Se añadió CellTiter-Glo (Promega Corp.) para la luminiscencia, y se midió la luminiscencia para medir el número de células vivas. Este ensayo se realizó usando 3 pocillos en cada condición. Como resultado, tal como se muestra en la figura 7, fue evidente que Fab P10-2 con IR700 presenta citotoxicidad de manera específica para la expresión de MUC1 humana específica de cáncer por irradiación de luz.
(Ejemplo 15: evaluación de la actividad antitumoral del fragmento Fab marcado con IRDye700DX)
Se trasplantaron 5 * 106 células MM-468 por vía subcutánea en la espalda derecha de cada ratón inmunodeficiente (ratón desnudo; Charles River Laboratories Japan, Inc.). Esta prueba se llevó a cabo con N = 4. Después de que el volumen del tumor alcanzara 300 mm3, se administró por vía intravenosa Fab P10-2 con IR700 (0,3, 1 ó 3 mg/kg) en los días 1, 5, 8, 12 y 15. De manera similar, se administró una solución salina tamponada con fosfato a un grupo con vehículo. Al día siguiente de la administración del fármaco, se realizó una irradiación con 0 ó 200 J/cm2 de luz que tenía una longitud de onda de 680 nm, y se midió el volumen del tumor a lo largo del tiempo. Como resultado, tal como se muestra en la figura 8, fue evidente que el Fab P10-2 con IR700 mostró un efecto antitumoral de manera dependiente de la dosis y de la irradiación de luz.
Aplicabilidad industrial
Se espera que el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana de la presente invención sea útil en el diagnóstico y/o tratamiento de cánceres tales como cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de vejiga, cáncer de piel, cáncer de glándula tiroidea, cáncer de estómago, cáncer de páncreas, cáncer de riñón, cáncer de ovario o cáncer de cuello uterino.
Texto libre de la lista de secuencias
SEQ ID NO: 1: Secuencia de nucleótidos de ADN que codifica para un fragmento de cadena pesada Fab P10-1
SEQ ID NO: 2: Secuencia de aminoácidos del fragmento de cadena pesada Fab P10-1
SEQ ID NO: 3: Secuencia de nucleótidos de ADN que codifica para un fragmento de cadena pesada Fab P10-2
SEQ ID NO: 4: Secuencia de aminoácidos del fragmento de cadena pesada Fab P10-2
SEQ ID NO: 5: Secuencia de nucleótidos de ADN que codifica para una cadena ligera del anticuerpo
SEQ ID NO: 6: Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del anticuerpo
SEQ ID NO: 7: Secuencia de nucleótidos de ADN que codifica para una región variable de cadena pesada de Fab
Claims (1)
- REIVINDICACIONES1. Fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana seleccionado del grupo que consiste en lo siguiente (a) y (b):(a) un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que comprende un fragmento de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 10 y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 12; y(b) un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que comprende un fragmento de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada derivada de una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 10 mediante la modificación de glutamina en la posición de aminoácido 1 de SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 10 en ácido piroglutámico, y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 12.2. Fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la reivindicación 1, que se selecciona del grupo que consiste en lo siguiente (a) y (b):(a) un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que comprende un fragmento de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6; y(b) un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que comprende un fragmento de cadena pesada derivado de un fragmento de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 mediante la modificación de glutamina en la posición de aminoácido 1 de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 en ácido piroglutámico, y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6.3. Fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la reivindicación 1, que se selecciona del grupo que consiste en lo siguiente (a) y (b):(a) un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que comprende un fragmento de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 10 y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 12; y(b) un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que comprende un fragmento de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada derivada de una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 10 mediante la modificación de glutamina en la posición de aminoácido 1 de SEQ ID NO: 10 en ácido piroglutámico, y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 12;opcionalmente, en el que el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana se selecciona del grupo que consiste en lo siguiente (a') y (b'):(a') un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que comprende un fragmento de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6; y(b') un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que comprende un fragmento de cadena pesada derivado de un fragmento de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 mediante la modificación de glutamina en la posición de aminoácido 1 de SEQ ID NO: 4 en ácido piroglutámico, y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6.4. Fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la reivindicación 3, que es un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que comprende un fragmento de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6.5. Fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la reivindicación 3, que es un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que comprende un fragmento de cadena pesada derivado de un fragmento de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 mediante la modificación de glutamina en la posición de aminoácido 1 de SEQ ID NO: 4 en ácido piroglutámico, y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6.Conjugado que comprende uno o más restos de marcaje y el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5,opcionalmente, en el que el resto de marcaje es (i) un ligando y un ligador, (ii) un ligando, (iii) un colorante fluorescente y un ligador, o (iv) un colorante fluorescente.Conjugado según la reivindicación 6, en el que el resto de marcaje es (i) un ligando y un ligador o (ii) un ligando,y en el que el ligando es un ligando representado por la siguiente fórmula (A):[Fórmula química 1]en la que la línea ondulada representa la unión al fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana o al ligador.Conjugado según la reivindicación 7, en el que el resto de marcaje es un ligando y un ligador representados por la siguiente fórmula (A’):[Fórmula química 2]Conjugado según la reivindicación 8, en el que el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana se une a través de un grupo amino del mismo al átomo de carbono de un grupo C(=S) terminal del resto de marcaje.Conjugado seleccionado del grupo que consiste en lo siguiente (a) a (c):(a) el conjugado según la reivindicación 9, en el que el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana es el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la reivindicación 4;(b) el conjugado según la reivindicación 9, en el que el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana es el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la reivindicación 5; y(c) un conjugado que es una mezcla de (a) y (b).Conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, que comprende además un metal, opcionalmente, en el que el metal es un radioisótopo metálico,y además, opcionalmente, en el que el metal es 89Zr.Conjugado según la reivindicación 6, en el que el resto de marcaje es (i) un colorante fluorescente y un ligador o (ii) un colorante fluorescente,y en el que el colorante fluorescente es un colorante fluorescente seleccionado del grupo que consiste en la siguiente fórmula (B) y la siguiente fórmula (C):[Fórmula química 3][Fórmula química 4]en la que la línea ondulada representa la unión al fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana o al ligador.13. Conjugado según la reivindicación 12, en el que la línea ondulada representa la unión al fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana, y el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana se une a través de un grupo amino del mismo al átomo de carbono de un grupo C(=O) terminal del resto de marcaje.14. Conjugado seleccionado del grupo que consiste en lo siguiente (a) a (c):(a) el conjugado según la reivindicación 13, en el que el resto de marcaje es un colorante fluorescente representado por la fórmula (B) y en el que el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana es el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la reivindicación 4;(b) el conjugado según la reivindicación 13, en el que el resto de marcaje es un colorante fluorescente representado por la fórmula (B) y en el que el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana es el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la reivindicación 5; y(c) un conjugado que es una mezcla de (a) y (b).15. Conjugado seleccionado del grupo que consiste en lo siguiente (a) a (c):(a) el conjugado según la reivindicación 13, en el que el resto de marcaje es un colorante fluorescente representado por la fórmula (C) y en el que el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana es el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la reivindicación 4;(b) el conjugado según la reivindicación 13, en el que el resto de marcaje es un colorante fluorescente representado por la fórmula (C) y en el que el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana es el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la reivindicación 5; y(c) un conjugado que es una mezcla de (a) y (b).16. Polinucleótido que comprende lo siguiente (a) y (b) o que comprende lo siguiente (a') y (b'):(a) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el fragmento de cadena pesada del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la reivindicación 1; y(b) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena ligera del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la reivindicación 1; o(a') un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el fragmento de cadena pesada del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la reivindicación 4; y(b') un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena ligera del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la reivindicación 4.17. Vector de expresión que comprende lo siguiente (a) y (b) o que comprende lo siguiente (a') y (b'):(a) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el fragmento de cadena pesada del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la reivindicación 1; y(b) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena ligera del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la reivindicación 1; o(a') un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el fragmento de cadena pesada del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la reivindicación 4; y(b') un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena ligera del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la reivindicación 4.18. Célula huésped seleccionada del grupo que consiste en lo siguiente (c), (d), (c') y (d'):(c) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el fragmento de cadena pesada del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la reivindicación 1 y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena ligera del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la reivindicación 1; y(d) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinudeótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el fragmento de cadena pesada del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la reivindicación 1 y un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena ligera del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la reivindicación 1; y(c') una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el fragmento de cadena pesada del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la reivindicación 4 y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena ligera del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la reivindicación 4; y(d') una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el fragmento de cadena pesada del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la reivindicación 4 y un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena ligera del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la reivindicación 4.Método para producir un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana que comprende la etapa de cultivar una célula huésped seleccionada del grupo que consiste en lo siguiente (a) a (c) y (a') a (c') para expresar el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana:(a) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el fragmento de cadena pesada del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la reivindicación 1 y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena ligera del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la reivindicación 1;(b) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el fragmento de cadena pesada del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la reivindicación 1 y un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena ligera del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la reivindicación 1; y(c) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica para el fragmento de cadena pesada del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la reivindicación 1, y una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena ligera del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la reivindicación 1; y(a') una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el fragmento de cadena pesada del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la reivindicación 4 y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena ligera del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la reivindicación 4;(b') una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el fragmento de cadena pesada del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la reivindicación 4 y un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena ligera del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la reivindicación 4; y(c') una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el fragmento de cadena pesada del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la reivindicación 4, y una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena ligera del fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana según la reivindicación 4.Método para producir un conjugado que comprende un resto de marcaje y un fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana, que comprende las etapas de: producir el fragmento Fab de anticuerpo anti-MUC1 humana mediante el método según la reivindicación 19; y unir covalentemente el fragmento Fab al resto de marcaje.Método para producir un conjugado según la reivindicación 20, en el que la etapa de unir covalentemente el fragmento Fab al resto de mareaje es la etapa de i) de unir el fragmento Fab mediante un ligador a un ligando o ii) unir covalentemente el fragmento Fab directamente a un ligando,comprendiendo el método además opcionalmente la etapa de marcar el ligando del conjugado con un radioisótopo metálico.22. Método para producir un conjugado según la reivindicación 20, en el que la etapa de unir covalentemente el fragmento Fab al resto de marcaje es la etapa de i) de unir el fragmento Fab mediante un ligador a un colorante fluorescente o ii) unir covalentemente el fragmento Fab directamente a un colorante fluorescente.23. Composición para su uso en un método de diagnóstico que comprende uno o más conjugados según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 15, y un portador farmacéuticamente aceptable.Composición para su uso según la reivindicación 23, en la que el diagnóstico es el diagnóstico de un cáncer que expresa MUC1 humana,opcionalmente, en la que el cáncer es cáncer de mama o cáncer de vejiga.Composición farmacéutica que comprende uno o más conjugados según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 15, y un portador farmacéuticamente aceptable.26. Composición farmacéutica según la reivindicación 25, para su uso en un método de tratamiento de un cáncer que expresa MUC1 humana,opcionalmente en la que el cáncer es cáncer de mama o cáncer de vejiga.27. Conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 15, para su uso en un método para diagnosticar cáncer de mama o cáncer de vejiga, comprendiendo el método opcionalmente la administración preoperatoria o intraoperatoria del conjugado a un sujeto.28. Conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 15, para su uso en un método para tratar cáncer de mama o cáncer de vejiga, comprendiendo el método opcionalmente la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del conjugado.
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