BR112021013266A2 - Conjugados compreendendo ligante, espaçador, conector de peptídeo e biomolécula, composição de diagnóstico e composição farmacêutica compreendendo os ditos conjugados, bem como uso dos mesmos para diagnosticar ou tratar câncer - Google Patents

Conjugados compreendendo ligante, espaçador, conector de peptídeo e biomolécula, composição de diagnóstico e composição farmacêutica compreendendo os ditos conjugados, bem como uso dos mesmos para diagnosticar ou tratar câncer Download PDF

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conjugate
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amino acid
cancer
fab fragment
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BR112021013266-0A
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Michinori AKAIWA
Junya Ishida
Hiroki Toya
Toru Asano
Tomoaki Yoshikawa
Yorikata Sano
Yukihito SUGANO
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Astellas Pharma Inc.
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Abstract

conjugados compreendendo ligante, espaçador, conector de peptídeo e biomolécula, composição de diagnóstico e composição farmacêutica compreendendo os ditos conjugados, bem como uso dos mesmos para diagnosticar ou tratar câncer. é fornecido um conjugado compreendendo um ligante, um espaçador e um conector de peptídeo útil para um fármaco de diagnóstico in vivo e terapia de radiação interna, usando um fragmento fab de anticorpo anti-muc1 humano cuja atividade de ligação não é atenuada mesmo por marcação com um metal, um corante fluorescente ou semelhantes. um conjugado compreendendo 3arm dota, um espaçador específico, um conector de peptídeo específico e uma biomolécula incluindo um fragmento fab de anticorpo anti-muc1 humano, em que a atividade de ligação deste não é atenuada mesmo por marcação com um metal, um corante fluorescente ou semelhantes, pode ser usado como uma composição de diagnóstico e/ou uma composição farmacêutica.

Description

“CONJUGADOS COMPREENDENDO LIGANTE, ESPAÇADOR, CONECTOR DE PEPTÍDEO E BIOMOLÉCULA, COMPOSIÇÃO DE DIAGNÓSTICO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDENDO OS DITOS CONJUGADOS, BEM COMO USO DOS MESMOS PARA DIAGNOSTICAR OU TRATAR CÂNCER” CAMPO TÉCNICO
[001] A presente invenção se refere a um conjugado compreendendo um fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano ou um fragmento Fab de anticorpo MUC1 humano e um ligante. A presente invenção também se refere a uma composição de diagnóstico e/ou uma composição farmacêutica compreendendo o conjugado, um método para diagnosticar e/ou tratar um câncer usando o conjugado, e semelhantes. Além disso, um conjugado compreendendo um ligante, um espaçador, um conector de peptídeo e uma biomolécula, uma composição de diagnóstico e/ou uma composição farmacêutica compreendendo o conjugado, um método para diagnosticar e/ou tratar uma doença associada à biomolécula usando o conjugado, e semelhantes. Além disso, a presente invenção se refere a um conjugado compreendendo um complexo formado a partir do ligante e um metal e o fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano ou o fragmento Fab de anticorpo MUC1 humano. Além disso, a presente invenção se refere a um conjugado compreendendo o complexo, um espaçador, um conector de peptídeo e uma biomolécula.
FUNDAMENTOS DA TÉCNICA
[002] Um CEA (antígeno carcino-embrionário) ou uma CEACAM (molécula de adesão celular relacionada ao antígeno carcino-embrionário) é um marcador de tumor descoberto em 1965 (J. Exp. Med.; 1965; 121: 439-462, PNAS; 1969; 64: 161-167), e 23 moléculas relacionadas ao CEA foram identificadas até agora (BioMed Central Biology; 2010; 8: 12-33). Destas, a CEACAM5 é raramente expressada em tecidos normais, mas é expressada no trato digestivo fetal e câncer colorretal (BBA; 1990; 1032: 177-189, J. Clin. Mol. Pathol.; 1999; 52: 174-178). Além disso, a CEACAM5 é conhecida também por ser expressada em câncer de mama, câncer de pulmão e câncer da tireoide (Diagn. Cytopathol.; 1993; 9: 377-382, Cancer Res.; 1990; 50: 6987-
6994, Histopathology; 2000; 37: 530-535).
[003] A concentração de CEACAM5 no sangue é maior em pacientes com câncer colorretal que em sujeitos saudáveis (J. Exp. Med.; 1965; 121: 439-462), e a CEACAM5 é usada como um marcador de tumor. Em um estudo histológico de pacientes com câncer colorretal, a CEACAM5 é altamente expressada em 90 % ou mais dos tecidos (British J. Cancer; 2013; 108: 662-667).
[004] A metástase precoce de câncer colorretal está localizada no fígado e, portanto, a taxa de recorrência pode ser reduzida se a metástase hepática puder ser detectada e tratada em um estágio inicial (Cell Mol. Gastroenterol. Hepatol.; 2017; 3: 163-173).
[005] A mucina 1 (Mucina 1: MUC1) é uma glicoproteína ligada à membrana expressada no lado do lúmen de células epiteliais que constitui os tecidos epiteliais de glândulas mamárias, traqueias, trato digestivo e semelhantes (Nat. Rev. Cancer, 2004 Jan; 4(1): 45-60). A MUC1 é superexpressada em células de câncer de câncer de mama (Mod. Pathol., 2005 Oct; 18(10): 1295-304), câncer de pulmão (Hum. Pathol., 2008 Jan; 39(1): 126-36), câncer colorretal (Int. J. Oncol., 2000 Jan; 16(1): 55-64), câncer de bexiga (PLoS One, 2014 Mar; 9(3): e92742), câncer de pele (Histopathology, 2000, Sep; 37(3): 218-23), câncer da tireoide; (J. Pathol., 2003 Jul; 200(3): 357-69.), câncer gástrico (J. Pathol., 2000 Mar; 190(4): 437-43), câncer pancreático (Int. J. Oncol., 2004 Jan; 24(1): 107-13), câncer de rim (Mod. Pathol., 2004 Feb; 17(2): 180-8), câncer ovariano (Gynecol. Oncol., 2007 Jun; 105(3): 695-702), câncer cervical (Am. J. Clin. Pathol., 2004 Jul; 122(1): 61-9) e semelhantes, e a MUC1 é útil como uma molécula alvo para detectar lesões de câncer (Nat. Rev. Cancer, 2004 Jan; 4(1): 45-60, Pathol. Res. Pract., 2010 Aug15; 206(8): 585-9).
[006] A MUC1 é O-glicosilada na treonina 9 de HGVTSAPDTRPAPGSTAPPA (SEQ ID NO: 19 na listagem de sequências do presente pedido), que é uma sequência de repetição em tandem de 20 aminoácidos presente no domínio extracelular. Sabe-
se que essa O-glicosilação é incompleta em células de câncer e que O-glicosilações, tais como T (Galβ1-3GalNAcα1-O-Ser/Thr), Tn (GalNAcα1-O-Ser/Thr) e 2,3ST (Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcα-O-Ser/Thr) ocorrem de uma maneira específica do câncer (PTL 1 e NPL 1). A MUC1 em tecidos normais não sofre essas O-glicosilações específicas de câncer e, portanto, a MUC1 específica de câncer humana é particularmente útil como uma molécula alvo para tratar vários cânceres em humanos. Como tal, um anticorpo MUC1 anti-humano específico de câncer, por exemplo, anticorpo 1B2 (PTL 1), anticorpo PankoMab (NPL 2) e anticorpo 5E5 (PTL 2), é conhecido. Dentre esses anticorpos, o anticorpo 1B2 foi relatado como tendo maior especificidade para a MUC1 específica de câncer humana que o anticorpo PankoMab (PTL 1).
[007] CT (tomografia computadorizada), MRI (imagem de ressonância magnética nuclear) e FDG-PET (tomografia de emissão de fluorodesoxiglucose- pósitron) são usados para os diagnósticos de metástase hepática. As sensibilidades de detecção de CT, MRI e FDG-PET são 74,4, 80,3 e 81,4 %, respectivamente, e para tumores de 1 cm ou menos, a sensibilidade de detecção é reduzida para 47,3 % para CT e 60,2 % para MRI. (Radiology; 2010; 257: 674-684). Uma MRI aprimorada com contraste específica do fígado também é usada e a sensibilidade de detecção da mesma é 29 a 38 % para tumores de 1 cm ou menos (Radiology; 2005; 237: 89-98).
[008] Agentes anticâncer e anticorpos ligados aos radioisótopos de metal são usados para diagnosticar e tratar cânceres. O alvejamento usando um anticorpo é altamente específico para células tumorais e tem poucos efeitos colaterais. Até o momento, vários anticorpos monoclonais marcados com radioisótopos de metal foram clinicamente aplicados em diagnósticos e tratamento (Cancer Control; 2012; 19: 196- 203).
[009] Por outro lado, os anticorpos geralmente têm uma meia-vida longa no sangue e, depois de serem administrados no corpo, levam um longo período de 4 dias a 5 dias para atingir uma razão de tumor para sangue que fornece um sinal suficiente para visualizar um câncer (Clin. Pharmacol. Ther.; 2010; 87: 586-592). Além disso, a região Fc de um anticorpo causa a ação farmacológica de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) (Glycoconj. J.; 2013; 30: 227-236, Curr. Opin. Biotechnol.; 2002; 13: 609-614). Além disso, os anticorpos são metabolizados no fígado e, portanto, eles são altamente acumulados no fígado independente do alvo, mas a metástase precoce de câncer colorretal está localizada no fígado e, portanto, é difícil detectar lesões de metástase hepática usando um anticorpo (Clin. Pharmacol. Ther.; 2010; 87: 586-592).
[010] Os fragmentos de anticorpos recombinantes de baixo peso molecular, tais como Fab, scFv e um diabody são altamente penetrantes no tecido e atingem facilmente as lesões, e pode-se esperar que sejam produzidos a baixo custo usando um sistema de expressão com Escherichia coli ou uma levedura e, assim, sejam usados como anticorpos para tratamento, enquanto que são caracterizados por terem uma meia-vida curta no sangue e serem excretados pelo rins e, portanto, foram relatados para serem usados como fármacos de diagnóstico (Nat. Biotechnol.; 2005; 23: 1126-1136).
[011] Como um anticorpo Anti-CEACAM5 humano aplicado como um fármaco de diagnóstico, o M5A (PTL 3), que é um anticorpo humanizado do anticorpo monoclonal de camundongo T84.66, é conhecido. Para M5A marcado com 64Cu, em um teste usando camundongos com células de câncer transplantadas por via subcutânea, foi relatado que um lapso de 22 horas ou mais é necessário após a administração de modo a obter uma boa imagem de PET (NPL 3) e, além disso, em um teste usando um modelo de camundongo de metástase hepática, foi relatado que a captação nos tecidos normais do fígado e a captação nos locais de lesão do fígado foram aproximadamente as mesmas 3 horas após a administração e que houve uma diferença significativa depois de 24 horas (NPL 4).
[012] Para um fragmento de anticorpo anti-CEACAM5 humano, foi relatado que CEA-Scan, que é um anticorpo monoclonal de camundongo NP-4 Fab’ marcado com 99mTc, pode ser usado para os diagnósticos de câncer colorretal (NPL 5). Entretanto, a captação de CEA-Scan em locais de lesão não excede a captação no fígado normal e a sensibilidade de detecção de metástase hepática é menor que a de FDG-PET (NPL 6). CEA-Scan foi aprovado pela FDA como um fármaco de diagnóstico para câncer colorretal em 1999, mas não é mais vendido (NPL 7).
[013] DOTA (ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-1,4,7,10-tetra-acético) tem resultados clínicos e é amplamente usado como um quelante para um metal radioativo. Nos últimos anos, um estudo foi relatado em que a marcação de metal é realizada usando DOTA, seguida por ligação a um peptídeo e um anticorpo e alvejamento (NPL 8).
[014] No tratamento de câncer, foi relatado que Satoreotida tetraxetana (NPL 9) está em desenvolvimento na fase I como um fármaco tendo DOTA. Foi relatado que 90Y-epratuzumabe tetraxetana foi administrado a um paciente tendo um tumor hematológico (NPL 10).
[015] Em geral, um conjugado ao qual um agente quelante, tal como DOTA, e um anticorpo ou peptídeo de baixo peso molecular está ligado é altamente capturado, retido ou acumulado nos rins (NPLs 11 e 12).
[016] Como descrito acima, o acúmulo do conjugado nos rins causa inconveniência em diagnósticos e tratamentos precisos (NPL 13).
[017] Por exemplo, em um teste em camundongos que receberam um conjugado de [111In]DOTA-Rituxan Fab, foi relatado que foi altamente acumulado nos rins (NPL 11).
[018] De modo a evitar tal acúmulo elevado nos rins, o primeiro estudo de um conjugado modificado para um fragmento de anticorpo, tal como Fab, scFV, Fab’ ou dsFV, e o segundo estudo de um conjugado tendo um conector (também referido como um conector de peptídeo) especificamente clivado nos rins entre o quelato e o anticorpo pode ser mencionado (NPL 12).
[019] Foi relatado que, inicialmente, ácido iodo-hipúrico-Gli-Lis-Fab em que o conector de peptídeo é Gli (glicina)-Lis (lisina) é clivado por uma enzima de membrana renal de borda em escova, e o ácido iodo-hipúrico é contido na urina como um metabólito e excretado (NPL 14). Além disso, o ácido iodo-hipúrico-Gli-Tis-Fab, em que o conector de peptídeo é Gli-Tir (tirosina), foi relatado (NPL 13).
[020] Por outro lado, [188Re]CpTR-Gli-Lis-Fab, em que o conector de peptídeo Gli-Lis está ligado ao complexo organorrênio CpTR-COOH em vez de ácido hipúrico, foi relatado (NPL 15).
[021] Além disso, 99mTc-PGGFML-IT-Fab, em que o conector de peptídeo é Gli-Phe (fenilalanina)-Lis, foi relatado (PTL 4).
[022] Além disso, com foco em NOTA como um quelato, um conjugado composto de NOTA e um conector de peptídeo foi relatado (PTL 5).
[023] O conjugado tendo um conector de peptídeo foi criado, mas dependendo do tipo de agente quelante, ocorre o problema de não ser clivado pela enzima, e um conjugado intencionado a resolver o problema introduzindo uma porção de ligação (- CH2-Ph-CO-NH-) tendo uma estrutura específica entre o agente quelante e o conector de peptídeo foi relatado (PTL 6). O objetivo é obter um conjugado tendo um ligante que pode coordenar um átomo tendo um raio atômico relativamente grande, tal como índio, que é geralmente usado como um radioisótopo. Como um espaçador através de um quelato e um conector de peptídeo, um espaçador tendo uma estrutura de tioureia divulgado em PTL 5 foi introduzido, mas é mencionado que a decomposição por uma enzima de membrana renal de borda em escova does não ocorre.
[024] O conjugado 67Ga-NOTA-Met-Ile-Fab, em que o conector de peptídeo que visa a clivagem por um lisossoma é Met (metionina)-Ile (isoleucina), foi relatado com base nas seguintes descobertas (NPL 16).
[025] Foi relatado que o metabólito 67Ga-NOTA-Bn-Met produzido pela clivagem lisossômica do conjugado NOTA-(p-SCN-Bz)-dsFv não tendo nenhum conector de peptídeo é excretado na urina (NPL 17), e o segundo a partir do terminal N da cadeia leve do dsFv do conjugado NOTA-(p-SCN-Bz)-dsFv acima é Ile e, por causa disso, o conjugado 67Ga-NOTA-Met-Ile-Her2 (Herceptin) Fab foi projetado (NPL 19).
LISTA DE CITAÇÃO LITERATURA NÃO PATENTE
[026] NPL 1: Glycoconj. J., 2013 Apr; 30(3): 227-36. NPL 2: Cancer Immunol Immunother, 2006 Nov; 55(11): 1337-47 NPL 3: Bioconjug. Chem.; 2008; 19: 89-96 NPL 4: PLOS ONE; 2014; 9(9): e106921 NPL 5: Ann. Surg.; 1997; 226: 621-631 NPL 6: J. Nucl. Med.; 2000; 41: 1657-1663 NPL 7: Kenneth T.Cheng, “99mTc-Arcitumomab”, [online], Update: March 17,
2008., Molecular Imaging and Contrast Agent Database, [pesquisado em 17 de maio de 2017], Internet <URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK23676/> NPL 8: Bioorg. Med. Chem.; 2019; 27: 3248-3253 NPL 9: Clinical Trials. gov Identifier: NCT02592707 NPL 10: Eur J Haematol. 2013 Dec; 91(6): 552-6 NPL 11: Bioconjugate Chem. 2001, 12, 264-270 NPL 12: Bioconjugate Chem. 2002, 13, 985-995 NPL 13: Bioconjugate Chem. 2013, 24, 291-299 NPL 14: Cancer Res. 1999, 59, 128-134 NPL 15: Bioconjugate Chem. 2007, 18, 190-198 NPL 16: Bioconjugate Chem. 2014, 25, 2038-2045 NPL 17: Bioconjugate Chem. 1997, 8, 365-369
LITERATURA DE PATENTE
[027] PTL 1: Publicação Internacional No WO2010/050528 PTL 2: Publicação Internacional No WO2008/040362 PTL 3: Publicação Internacional No WO2005/086875 PTL 4: Publicação Internacional No WO2013/081091 PTL 5: Publicação Internacional No WO2017/150549 PTL 6: Publicação Internacional No WO2019/065774 PTL 7: Publicação Internacional No WO2018/092885
SUMÁRIO DA INVENÇÃO PROBLEMA TÉCNICO
[028] Um fragmento Fab monovalente tem um peso molecular de cerca de 50 kDa, é menor que um anticorpo que tem um peso molecular de cerca de 150 kDa, é excretado pelos rins e tem uma meia-vida curta no sangue. Por causa disso, dentro de 2 a 32 horas após a administração, uma razão de tumor para sangue que fornece um sinal suficiente para visualizar um câncer é atingida. O fragmento Fab não tem região Fc e, assim, não causa ADCC ou CDC. O fragmento Fab é principalmente excretado pelos rins e, assim, não interfere na detecção de metástase hepática. A partir dessas características, pode-se esperar que o fragmento Fab seja mais eficaz como um fármaco de diagnóstico in vivo que um anticorpo.
[029] Entretanto, no fragmento Fab, a atividade de ligação do fragmento Fab é frequentemente atenuada por causa de ser monovalente, não divalente como um anticorpo. Além disso, de modo a usar um anticorpo como um fármaco de diagnóstico in vivo ou um agente usado em fotoimunoterapia, o anticorpo deve ser marcado com um metal, um corante fluorescente ou semelhantes, mas um problema é que pela marcação com tal substância, a atividade de ligação do anticorpo é atenuada.
[030] Um objetivo da presente invenção é fornecer um conjugado marcado útil para um fármaco de diagnóstico in vivo e terapia de radiação interna usando um fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano cuja atividade de ligação não é atenuada mesmo pela marcação com um metal, um corante fluorescente ou semelhantes. Um objetivo da presente invenção é fornecer um conjugado compreendendo um fragmento Fab de anticorpo MUC1 anti-humano (PTL 7), um conector de peptídeo e um ligante e um conjugado compreendendo um fragmento Fab de anticorpo MUC1 anti-humano e um ligante. Além disso, outro objetivo da presente invenção é fornecer uma composição de diagnóstico compreendendo o conjugado acima e um método para diagnósticos usando a mesma, e fornecer uma composição farmacêutica compreendendo o conjugado acima e um método para tratamento usando a mesma.
[031] Além disso, um objetivo da presente invenção é fornecer um conjugado tendo um quelante e uma biomolécula que se acumula nos rins e excretada mais rapidamente.
SOLUÇÃO PARA O PROBLEMA
[032] Os presentes inventores previamente prepararam um fragmento Fab de anticorpo Anti-CEACAM5 humano tendo uma boa afinidade para CEACAM5 humano (Pedido Internacional PCT/JP2018/025618). Como um resultado de outros estudos diligentes, os presentes inventores prepararam um conjugado em que um ligante usado para marcação está ligado ao fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano via (ou sem) um conector de peptídeo, e descobriram que o conjugado tem a mesma afinidade para CEACAM5 humano que o fragmento Fab de anticorpo anti- CEACAM5 humano em si, isto é, a atividade de ligação não é atenuada mesmo pela ligação entre a porção de marcação e o fragmento Fab, levando à conclusão da presente invenção. Isto é, a presente invenção fornece um conjugado compreendendo um fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano, um conector de peptídeo e um ligante e um conjugado compreendendo um fragmento Fab de anticorpo anti- CEACAM5 humano e um ligante específico. Foi confirmado que o conjugado não atenua a atividade de ligação ao CEACAM5 humano mesmo pela ligação entre a porção de marcação e o fragmento Fab e mantém uma boa atividade de ligação ao CEACAM5 humano e, com base nesses resultados, um meio para diagnósticos e um meio para tratamento usando o conjugado da presente invenção são fornecidos.
[033] Além disso, os presentes inventores prepararam um fragmento Fab de anticorpo MUC1 anti-humano tendo uma boa afinidade para MUC1 específica de câncer humana e, como um resultado de outros estudos diligentes, prepararam um conjugado em que um ligante está ligado ao fragmento Fab de anticorpo MUC1 anti- humano via (ou sem) um conector de peptídeo. O conjugado tem a mesma afinidade para MUC1 específica de câncer humana que o fragmento Fab de anticorpo MUC1 anti-humano em si. Isto é, a presente invenção fornece um conjugado compreendendo um fragmento Fab de anticorpo MUC1 anti-humano, um conector de peptídeo e um ligante e um conjugado compreendendo um fragmento Fab de anticorpo MUC1 anti- humano e um ligante específico. Além disso, foi confirmado que o conjugado não atenua a atividade de ligação à MUC1 específica de câncer humana mesmo pela ligação da porção de marcação e mantém uma boa atividade de ligação à MUC1 específica de câncer humana e, com base nesses resultados, um meio para diagnósticos e um meio para tratamento usando o conjugado da presente invenção são fornecidos.
[034] Além disso, os presentes inventores estudaram um conjugado que é excretado mais rapidamente porque um conjugado que consiste em um complexo formado a partir de um ligante e um metal (também referido como um complexo metálico, um espaçador, um conector de peptídeo e uma biomolécula, tal como um anticorpo útil como um medicamento, tal como um agente de contraste ou um agente anticâncer, pode se acumular nos rins. Como um resultado, os presentes inventores focaram em DOTA (ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-1,4,7,10-tetra-acético), que tem resultados clínicos e é amplamente usado como um quelante para um metal radioativo, e descobriram que um conjugado que consiste em 3arm DOTA, um espaçador específico, um conector de peptídeo específico e uma biomolécula é decomposto nos rins e excretado.
[035] Com base no acima exposto, a presente invenção se refere ao seguinte conjugado compreendendo um anticorpo CEACAM5 Fab, uma composição de diagnóstico e/ou uma composição farmacêutica compreendendo o conjugado, um método para diagnosticar e/ou tratar um câncer usando o conjugado e semelhantes. Além disso, a presente invenção se refere ao seguinte conjugado compreendendo um anticorpo MUC1 Fab, uma composição de diagnóstico e/ou uma composição farmacêutica compreendendo o conjugado, um método para diagnosticar e/ou tratar um câncer usando o conjugado e semelhantes. Além disso, a presente invenção se refere a um conjugado compreendendo DOTA, um espaçador, um conector de peptídeo e uma biomolécula, rapidamente excretado pelos rins, um intermediário do conjugado e um método para diagnosticar e/ou tratar uma doença associada com uma biomolécula usando o conjugado e semelhantes.
[036] [1] Um conjugado representado pela seguinte fórmula (I): (Y-S1-X)p-Fab1 (I) em que Fab1 é um fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano selecionado do grupo que consiste em (a) um fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada incluindo uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos de aminoácidos 1 a 121 da SEQ ID NO: 2 e uma cadeia leve incluindo uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos de aminoácidos 1 a 112 da SEQ ID NO: 4, e (b) um fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada incluindo uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos de aminoácidos 1 a 121 da SEQ ID NO: 2 e em que ácido glutâmico de aminoácido 1 da SEQ ID NO: 2 é modificado para ácido piroglutâmico, e uma cadeia leve incluindo uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos de aminoácidos 1 a 112 da SEQ ID NO: 4, o Fab1 está ligado a X através de grupos p amino ou grupos tiol no Fab1; X é um conector de peptídeo ou uma ligação; S1 é um espaçador ou uma ligação; Y é um ligante; e p é um número natural de 1 a 25 e representa a número de um grupo (Y-S1- X) ligado a Fab1; desde que quando X for uma ligação, S1 é -CH2-(1,4-fenileno)-NH-C(=S)- ou uma ligação, e Y é ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-1,4,7,10-tetra-acético (em seguida, algumas vezes abreviado como DOTA).
[037] [2] O conjugado de acordo com [1], em que Fab1 é selecionado do grupo que consiste em (a) um fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2 e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4, e (b) um fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2 e em que ácido glutâmico de aminoácido 1 da SEQ ID NO: 2 é modificado para ácido piroglutâmico, e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4.
[038] [3] O conjugado de acordo com [2], em que Fab1 compreende um fragmento Fab compreendendo um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2 e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4 (em seguida, referido como Fab2).
[039] [4] O conjugado de acordo com qualquer um de [1] a [3], em que X é um conector de peptídeo incluindo um peptídeo que consiste em 2 a 4 aminoácidos tendo uma sequência de aminoácidos clivada por uma enzima de membrana renal de borda em escova ou uma enzima lisossômica.
[040] [5] O conjugado de acordo com qualquer um de [1] a [4], em que S1 é -C(=O)-CH2O-(1,3-fenileno)-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2O)4-(1,3-fenileno)-C(=O)-, -C(=O)-(1,3-fenileno)-C(=O)-, -NH-CH2-(1,3-fenileno)-C(=O)-, -NH-(CH2)2-C(=O)-, -CH2-(1,4-fenileno)-NH-C(=S)-, -NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3- fenileno)-C(=O)-, -NH-CH2-(1,4-fenileno)-NH-C(=O)-, -NH-(CH2)3-C(=O)-, -NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-, -NH-CH2-(1,4-fenileno)-C(=O)-, -CH2-(1,4-fenileno)-NH-C(=S)-NH-CH2-(1,3-fenileno)-C(=O)-, -CH2-(1,4-fenileno)-NH-C(=S)-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3- fenileno)-C(=O)-, um espaçador representado por qualquer uma das seguintes fórmulas (a) a (q), ou uma ligação, [Fórmula Química 1]
or ou em que R1 significa um átomo de hidrogênio, um halogênio ou alquila C1-6, e o mesmo se aplica abaixo; e X é um conector de peptídeo selecionado do grupo que consiste em (1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-, (2)-Gli-Lis*-Z2-, (3)-Gli-Phe-Lis*-Z2-, (4)-Met-Val-Lis*-Z2-, (5)-Gli-Tir*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-, (6)-Gli-Lis-Lis*-Z2-, (7)-Gli-Arg-Lis*-Z2-, (8)-Gli-Lis*-C(=S)-NH-(1,4-fenileno)-NH-C(=S)-,
(9)-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-fenileno)-NH-C(=S)-, (10)-Asp-Gli-Lis*-Z2-, (11)-Met-Gli-Lis*-Z2-, (12)-Met-Ile-Lis*-Z2-, (13)-Gli-Tir*-CH2-C(=O)-Lis*-Z2-, (14)-Val-NH-(CH2)2-Z1-, (15)-Ile-NH-(CH2)2-Z1-, (16)-Gli-Val-NH-(CH2)2-Z1-, (17)-Gli-Ile-NH-(CH2)2-Z1-, (18)-Met-Phe-Lis*-Z2-, (19)-Gli-Tir-Lis*-Z2-, (20)-Gli-Tir*-CH2-C(=O)-NH-(CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-, (21)-Gli-(3-(2-naftil)alanina)-Lis*-Z2-, (22)-Gli-difenilalanina-Lis*-Z2-, (23)-Gli-Tir-NH-(CH2)5-Z1-, (24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-, (25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-, (26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-, (27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-, e (28)-Met-Gli-Lis*-Z3-, ou (29) uma ligação, em que Met representa metionina, Ile representa isoleucina, Gli representa glicina, Lis representa lisina, Phe representa fenilalanina, Val representa valina, Tir representa tirosina, Arg representa arginina, Asp representa ácido aspártico, Z1 representa um grupo representado pela seguinte fórmula (II-I) ou (II-II), e -Lis*-Z2- representa um grupo representado pela seguinte fórmula (III-I) ou (III-II), Tir*-CH2- representa um grupo representado pela seguinte fórmula (IV), -Lis*-C(=S)- representa um grupo representado pela seguinte fórmula (V), -Lis*-Z3- representa um grupo representado pela seguinte fórmula (III-III), e grupo (A-3), (A-4) ou (A-5) é como representado pelas seguintes fórmulas. [Fórmula Química 2]
[041] [6] O conjugado de acordo com qualquer um de [1] a [5], em que S1 é -
C(=O)-CH2O-(1,3-fenileno)-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2O)4-(1,3-fenileno)-C(=O)- ou - C(=O)-(1,3-fenileno)-C(=O)-, e X é um conector de peptídeo selecionado do grupo que consiste em (1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-, (2)-Gli-Lis*-Z2-, (3)-Gli-Phe-Lis*-Z2-, (5)-Gli-Tir*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-, (6)-Gli-Lis-Lis*-Z2-, e (8)-Gli-Lis*-C(=S)-NH-(1,4-fenileno)-NH-C(=S)-.
[042] [7-1] O conjugado de acordo com qualquer um de [1] a [5], em que S1 é -C(=O)-CH2O-(1,3-fenileno)-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2O)4-(1,3-fenileno)-C(=O)-, -NH- CH2-(1,3-fenileno)-C(=O)-, -NH-CH2-(1,4-fenileno)-NH-C(=O)-, -NH-CH2-(1,4- fenileno)-C(=O)-, -C(=O)-(1,3-fenileno)-C(=O)-, ou a seguinte fórmula [Fórmula Química 3] or ,e X é um conector de peptídeo selecionado do grupo que consiste em (1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-, (2)-Gli-Lis*-Z2-, (3)-Gli-Phe-Lis*-Z2-, (5)-Gli-Tir*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-, (6)-Gli-Lis-Lis*-Z2-,
(8)-Gli-Lis*-C(=S)-NH-(1,4-fenileno)-NH-C(=S)-, (24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-, (25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-, (26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-, (27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-, e (28)-Met-Gli-Lis*-Z3-.
[043] [7-2] O conjugado de acordo com [7-1], em que S1 é -NH-CH2-(1,4- fenileno)-NH-C(=O)-, ou a seguinte fórmula [Fórmula Química 4] ,e X é um conector de peptídeo selecionado do grupo que consiste em (1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-, (24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-, (25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-, (26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-, (27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-, e (28)-Met-Gli-Lis*-Z3-.
[044] [8] O conjugado de acordo com qualquer um de [1] a [5], em que S1 é - NH-CH2-(1,3-fenileno)-C(=O)-, -NH-(CH2)2-C(=O)-, -CH2-(1,4-fenileno)-NH-C(=S)-, - NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-fenileno)-C(=O)-, -NH-CH2-(1,4-fenileno)- NH-C(=O)-, -NH-(CH2)3-C(=O)-, -NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-, -NH-CH2-(1,4- fenileno)-C(=O)-, -CH2-(1,4-fenileno)-NH-C(=S)-NH-CH2-(1,3-fenileno)-C(=O)-, -CH2-
(1,4-fenileno)-NH-C(=S)-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-fenileno)-C(=O)-, um espaçador representado por qualquer uma das seguintes fórmulas (a) a (q), ou uma ligação [Fórmula Química 5]
or ou
,e X é um conector de peptídeo selecionado do grupo que consiste em (1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-, (2)-Gli-Lis*-Z2-, (3)-Gli-Phe-Lis*-Z2-, (4)-Met-Val-Lis*-Z2-,
(5)-Gli-Tir*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-, (7)-Gli-Arg-Lis*-Z2-, (8)-Gli-Lis*-C(=S)-NH-(1,4-fenileno)-NH-C(=S)-, (9)-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-fenileno)-NH-C(=S)-, (10)-Asp-Gli-Lis*-Z2-, (11)-Met-Gli-Lis*-Z2-, (12)-Met-Ile-Lis*-Z2-, (13)-Gli-Tir*-CH2-C(=O)-Lis*-Z2-, (14)-Val-NH-(CH2)2-Z1-, (15)-Ile-NH-(CH2)2-Z1-, (16)-Gli-Val-NH-(CH2)2-Z1-, (17)-Gli-Ile-NH-(CH2)2-Z1-, (18)-Met-Phe-Lis*-Z2-, (19)-Gli-Tir-Lis*-Z2-, (20)-Gli-Tir*-CH2-C(=O)-NH-(CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-, (21)-Gli-(3-(2-naftil)alanina)-Lis*-Z2-, (22)-Gli-difenilalanina-Lis*-Z2-, (23)-Gli-Tir-NH-(CH2)5-Z1- (24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-, (25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-, (26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-, (27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-, e (28)-Met-Gli-Lis*-Z3-.
[045] [9] O conjugado de acordo com qualquer um de [1] a [5], em que S1 é - NH-CH2-(1,3-fenileno)-C(=O)-, -CH2-(1,4-fenileno)-NH-C(=S)-, -NH-(CH2CH2O)3-CH2- C(=O)-NH-CH2-(1,3-fenileno)-C(=O)-, -CH2-(1,4-fenileno)-NH-C(=S)-NH-CH2-(1,3- fenileno)-C(=O)-, -NH-CH2-(1,4-fenileno)-NH-C(=O)-, um espaçador representado por qualquer uma das seguintes fórmulas (e) a (i) ou (k), ou uma ligação [Fórmula Química 6]
,e X é um conector de peptídeo selecionado do grupo que consiste em (1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-, (2)-Gli-Lis*-Z2-, (3)-Gli-Phe-Lis*-Z2-, (9)-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-fenileno)-NH-C(=S)-, (10)-Asp-Gli-Lis*-Z2-, (11)-Met-Gli-Lis*-Z2-, (12)-Met-Ile-Lis*-Z2-, (21)-Gli-(3-(2-naftil)alanina)-Lis*-Z2-, (24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-, (25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-, (26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-,
(27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-, e (28)-Met-Gli-Lis*-Z3-.
[046] [10] O conjugado de acordo com qualquer um de [1] a [5], em que S1 é um grupo selecionado do grupo que consiste em -NH-CH2-(1,3-fenileno)-C(=O)-, - CH2-(1,4-fenileno)-NH-C(=S)-, -NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-fenileno)- C(=O)-, -CH2-(1,4-fenileno)-NH-C(=S)-NH-CH2-(1,3-fenileno)-C(=O)-, -NH-CH2-(1,4- fenileno)-NH-C(=O)-, um espaçador representado pela seguinte fórmula (f) ou (g), ou uma ligação [Fórmula Química 7] ,e X é um conector de peptídeo selecionado do grupo que consiste em (1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-, (4)-Met-Val-Lis*-Z2-, (9)-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-fenileno)-NH-C(=S)-, (11)-Met-Gli-Lis*-Z2-, (12)-Met-Ile-Lis*-Z2-, (18)-Met-Phe-Lis*-Z2-, (24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-, (25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-, (26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-, (27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-, e
(28)-Met-Gli-Lis*-Z3-.
[047] [11] O conjugado de acordo com qualquer um de [1] a [5], em que X é um conector de peptídeo selecionado do grupo que consiste em (1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-, (9)-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-fenileno)-NH-C(=S)-, (12)-Met-Ile-Lis*-Z2-, (24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-, (25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-, (26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-, e (27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-.
[048] [12] O conjugado de acordo com qualquer um de [1] a [5], em que X é um conector de peptídeo selecionado do grupo que consiste em (4)-Met-Val-Lis*-Z2-, (11)-Met-Gli-Lis*-Z2-, (18)-Met-Phe-Lis*-Z2-, e (28)-Met-Gli-Lis*-Z3-.
[049] [13] O conjugado de acordo com qualquer um de [1] a [5], em que X é um conector de peptídeo selecionado do grupo que consiste em (11)-Met-Gli-Lis*-Z2-, e (28)-Met-Gli-Lis*-Z3-.
[050] [14] O conjugado de acordo com qualquer um de [1] a [5], em que o conjugado é um conjugado selecionado do grupo que consiste dos compostos representados pelas seguintes fórmulas, e Fab1 está ligado a um átomo de carbono adjacente através de grupos p amino ou grupos tiol no Fab1. [Fórmula Química 8]
[Fórmula Química 9]
[Fórmula Química 10]
[Fórmula Química 11]
[Fórmula Química 12] [Fórmula Química 13]
[051] [15] O conjugado de acordo com qualquer um de [1] a [14], em que Y é deferoxamina (em seguida, algumas vezes abreviada como DFO) ou ácido 1,4,7,10- tetra-azaciclododecano-1,4,7,10-tetra-acético (em seguida, algumas vezes abreviado como DOTA).
[052] [16] O conjugado de acordo com [15], em que Y é DFO.
[053] [17] O conjugado de acordo com [15], em que Y é DOTA.
[054] [18] O conjugado de acordo com [17], em que Y é 3arm DOTA ou 4arm DOTA.
[055] [19] O conjugado de acordo com [18], em que Y é 3arm DOTA.
[056] [20] O conjugado de acordo com [18], em que Y é 4arm DOTA.
[057] [21] O conjugado de acordo com qualquer um de [15] ou [17] a [20], em que o conjugado é um conjugado selecionado do grupo que consiste dos compostos representados pelas seguintes fórmulas, e Fab1 está ligado a um átomo de carbono adjacente através de grupos p amino ou grupos tiol no Fab1. [Fórmula Química 14]
, [Fórmula Química 15]
,
[Fórmula Química 16]
, [Fórmula Química 17]
, [Fórmula Química 18]
, [Fórmula Química 19]
, [Fórmula Química 20]
,
[Fórmula Química 21]
, [Fórmula Química 22]
, [Fórmula Química 23]
, [Fórmula Química 24]
[Fórmula Química 25]
[Fórmula Química 26]
[Fórmula Química 27]
[Fórmula Química 28]
[Fórmula Química 29]
[Fórmula Química 30]
[Fórmula Química 31]
.
[058] Além disso, o conjugado da presente invenção pode ser uma mistura dos dois conjugados a seguir. [Fórmula Química 27] [Fórmula Química 28]
[059] [22] O conjugado de acordo com qualquer um de [15] ou [17] a [20], em que o conjugado é um conjugado selecionado do grupo que consiste dos compostos representados pelas seguintes fórmulas, e Fab1 está ligado a um átomo de carbono adjacente através de grupos p amino ou grupos tiol no Fab1. [Fórmula Química 32] e
[060] [23] O conjugado de acordo com qualquer um de [1] a [22], em que p é um número natural de 1 a 5.
[061] [24] O conjugado de acordo com qualquer um de [1] a [20], em que um metal é coordenado a Y.
[062] [25] O conjugado de acordo com qualquer um de [21] a [22], em que um metal é coordenado.
[063] [26] O conjugado de acordo com [24] ou [25], em que o metal é um radioisótopo de metal.
[064] [27] O conjugado de acordo com [26], em que o metal é 89Zr.
[065] [28] O conjugado de acordo com [24] ou [25], em que o metal é um íon de metal paramagnético.
[066] [29] O conjugado de acordo com [28], em que o metal é Gd3+.
[067] [30] O conjugado de acordo com qualquer um de [24] a [29], em que o conjugado é um traçador de PET.
[068] [31] Uma composição de diagnóstico compreendendo um ou mais conjugados de acordo com qualquer um de [24] a [30] e um portador farmaceuticamente aceitável.
[069] [32] A composição de diagnóstico de acordo com [31], em que a composição de diagnóstico é usada como um fármaco de diagnóstico precoce ou um fármaco de estadiamento.
[070] [33] A composição de diagnóstico de acordo com qualquer um de [31] ou [32], em que a composição de diagnóstico é usada para diagnosticar um câncer que expressa CEACAM5 humano.
[071] [34] A composição de diagnóstico de acordo com [33], em que o câncer é câncer colorretal, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer da tireoide ou um câncer que resulta a partir de metástase do mesmo.
[072] [35] Uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais conjugados de acordo com qualquer um de [24] a [29] e um portador farmaceuticamente aceitável.
[073] [36] A composição farmacêutica de acordo com [35], em que a composição farmacêutica é uma composição farmacêutica para tratar um câncer que expressa CEACAM5 humano.
[074] [37] A composição farmacêutica de acordo com [36], em que o câncer é câncer colorretal, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer da tireoide ou um câncer que resulta a partir de metástase do mesmo.
[075] [38] Uso de um ou mais de acordo com qualquer um de [24] a [29] para produzir uma composição de diagnóstico para um câncer e/ou uma composição farmacêutica para tratar um câncer.
[076] [39] O conjugado de acordo com qualquer um de [24] a [30], em que o conjugado é usado para diagnosticar um câncer e/ou tratar um câncer.
[077] [40] Um método para diagnosticar um câncer, compreendendo administrar um ou mais conjugados de acordo com qualquer um de [24] a [30] a um sujeito.
[078] [41] Um método para tratar um câncer, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do conjugado de acordo com qualquer um de [24] a [30] a um sujeito.
[079] [42] Um conjugado representado pela seguinte fórmula (Ia) [Fórmula Química 33] Biomoléluca1 em que
DOTA1: 3arm DOTA, U: uma ligação ou -NH(CH2)2O(CH2)2O(CH2)2OCH2C(=O)- Q: -C(=O)-, -NH-C(=O)- ou -NH-C(=S)- X: C ou N R1a, R1b: idênticos ou diferentes, H ou alquila C1-6, desde que R1a e R1b juntos possam formar alquileno C1-6; p é um número natural de 1 a 25 e está ligado a um átomo de carbono adjacente através de grupos p amino ou grupos tiol na Biomolécula1; R1: H, um halogênio, alquila C1-6 ou halo alquila C1-6, R2: alquila C1-6 ou halo alquila C1-6, L2: Ile, Gli, Ala, Val, Phe, -NHCH(CHCH3NR3R4)C(=O)-, - NHCH(CHCH3N3)C(=O)- ou -NHCH(CHCH3CH2CH2CH3)C(=O)-, R3: H, alquila C1-6, R4: H, alquila C1-6, L3: uma ligação, Arg ou His, L4: -NH-(CH2)2-, -NHCH(C(=O)OH)(CH2)4- ou uma ligação, V1: um grupo representado por qualquer uma das seguintes fórmulas (A-1) a (A-5), [Fórmula Química 34]
ou, grupos -L3-L4-V1- juntos formam a seguinte fórmula [Fórmula Química 35] Biomolécula1: uma biomolécula [Fórmula Química 36] linha pontilhada — ▪ ▪ — ▪: Q está ligado a qualquer um dos dois átomos de carbono no anel; linha pontilhada ▪▪▪▪▪▪▪▪▪: uma ligação simples ou uma ligação dupla.
[080] [43] O conjugado de acordo com [42], em que L3, L4 e V1 são os seguintes grupos. L3: uma ligação, Arg ou His, L4: -NH-(CH2)2-, -NHCH(C(=O)OH)(CH2)4- ou uma ligação, V1: um grupo representado por qualquer uma das seguintes fórmulas (A-1) a (A-5), [Fórmula Química 37]
[081] [44] O conjugado de acordo com [43], em que os grupos -L3-L4-V1- juntos formam a seguinte fórmula. [Fórmula Química 38]
[082] [45]Um conjugado representado pela seguinte fórmula (Ib) [Fórmula Química 39] Biomoléluca2 em que DOTA1: 3arm DOTA, U: uma ligação ou -NH(CH2)2O(CH2)2O(CH2)2OCH2C(=O)- Q: -C(=O)-, -NH-C(=O)- ou -NH-C(=S)-
X: C ou N R1a, R1b: idênticos ou diferentes, H ou alquila C1-6, desde que R1a e R1b juntos possam formar alquileno C1-6; p é um número natural de 1 a 25 e está ligado a um átomo de carbono adjacente através de grupos p amino ou grupos tiol na Biomolécula2; R1: H, um halogênio, alquila C1-6 ou halo alquila C1-6, R2: alquila C1-6 ou halo alquila C1-6, L2: Ile, Gli, Ala, Val, Phe, -NHCH(CHCH3NR3R4)C(=O)-, - NHCH(CHCH3N3)C(=O)- ou -NHCH(CHCH3CH2CH2CH3)C(=O)-, R3: H, alquila C1-6, R4: H, alquila C1-6, L3: uma ligação, Arg ou His, L4: -NH-(CH2)2-, -NHCH(C(=O)OH)(CH2)4- ou uma ligação, V1: um grupo representado por qualquer uma das seguintes fórmulas (A-1) a (A-5), [Fórmula Química 40]
ou, grupos -L3-L4-V1- juntos formam a seguinte fórmula [Fórmula Química 41]
Biomolécula2: um fragmento Fab de anticorpo [Fórmula Química 42] linha pontilhada — ▪ ▪ — ▪: Q está ligada a qualquer um dos dois átomos de carbono no anel; linha pontilhada ▪▪▪▪▪▪▪▪▪: uma ligação simples ou uma ligação dupla.
[083] [46-1] O conjugado de acordo com qualquer um de [42] a [45], em que o conjugado tem a seguinte fórmula (Ic): [Fórmula Química 43] Biomoléluca em que L3: uma ligação, L4: -NH-(CH2)2- ou -NHCH(C(=O)OH)(CH2)4-, Biomolécula: Biomolécula1 ou Biomolécula2.
[084] [46-2] O conjugado de acordo com [46-1], em que na fórmula (Ic), L3 é uma ligação, e
L4 é -NH-(CH2)2-.
[085] [47-1] O conjugado de acordo com qualquer um de [42] a [46-2], em que o conjugado é representado pela seguinte fórmula (Id): [Fórmula Química 44] Biomoléluca em que L3: uma ligação, L4: -NH-(CH2)2- ou -NHCH(C(=O)OH)(CH2)4-, Biomolécula: Biomolécula1 ou Biomolécula2 o conjugado de acordo com qualquer um de [42] a [45].
[086] [47-2] O conjugado de acordo com [47-1], em que na fórmula (Id), L3 é uma ligação, e L4 é -NH-(CH2)2-.
[087] [48] O conjugado de acordo com qualquer um de [42] a [47-2], em que V1 é qualquer uma das seguintes fórmulas (A-3) a (A-5). [Fórmula Química 45]
[088] [49] O conjugado de acordo com qualquer um de [42] a [48], em que grupo (B) na fórmula (Ia) ou (Ib) [Fórmula Química 46]
é um grupo selecionado do grupo que consiste em as seguintes fórmulas (B- 1) a (B-7). [Fórmula Química 47]
[Fórmula Química 48]
[089] [50] O conjugado de acordo com qualquer um de [42] a [49], em que o conjugado é selecionado do grupo que consiste dos compostos representados pelas seguintes fórmulas. [Fórmula Química 49]
Biomoléluca1
[Fórmula Química 50]
Biomoléluca1
[Fórmula Química 51]
Biomoléluca1
[Fórmula Química 52]
Biomoléluca1
[Fórmula Química 53] Biomoléluca1 [Fórmula Química 54] Biomoléluca1 [Fórmula Química 55] Biomoléluca1
[090] [51-1] O conjugado de acordo com qualquer um de [42] a [50], em que a Biomolécula1 e Biomolécula2 são, cada uma, uma biomolécula ou um fragmento Fab de anticorpo exceto os seguintes fragmentos Fab de anticorpo: (a) um fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada incluindo uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos de aminoácidos 1 a 121 da SEQ ID NO: 2 e uma cadeia leve incluindo uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos de aminoácidos 1 a 112 da SEQ ID NO: 4, e (b) um fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano selecionado do grupo que consiste em um fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada incluindo uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos de aminoácidos 1 a 121 da SEQ ID NO: 2 e em que ácido glutâmico de aminoácido 1 da SEQ ID NO: 2 é modificado para ácido piroglutâmico, e uma cadeia leve incluindo uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos de aminoácidos 1 a 112 da SEQ ID NO: 4.
[091] [51-2] O conjugado de acordo com [51-1], em que a Biomolécula1 e Biomolécula2 são, cada uma, uma biomolécula ou um fragmento Fab de anticorpo exceto os seguintes fragmentos Fab de anticorpo: (a) um fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada incluindo uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos de aminoácidos 1 a 121 da SEQ ID NO: 2 e uma cadeia leve incluindo uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos de aminoácidos 1 a 112 da SEQ ID NO: 4, e (b) um fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada incluindo uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos de aminoácidos 1 a 121 da SEQ ID NO: 2 e em que ácido glutâmico de aminoácido 1 da SEQ ID NO: 2 é modificado para ácido piroglutâmico, e uma cadeia leve incluindo uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos de aminoácidos 1 a 112 da SEQ ID NO: 4, (c) um fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2 e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4, ou
(d) um fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2 e em que ácido glutâmico de aminoácido 1 da SEQ ID NO: 2 é modificado para ácido piroglutâmico, e uma cadeia leve incluindo a cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 4.
[092] [52] O conjugado de acordo com qualquer um de [42] a [51-2], em que a Biomolécula1 ou Biomolécula2 é um fragmento Fab de anticorpo MUC1 anti-humano selecionado do grupo que consiste nos seguintes (a) e (b): (a) um fragmento Fab de anticorpo MUC1 anti-humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada incluindo uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14 e uma cadeia leve incluindo uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 16, e (b) um fragmento Fab de anticorpo MUC1 anti-humano selecionado do grupo que consiste em um fragmento Fab de anticorpo MUC1 anti-humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada incluindo uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14 e em que a glutamina do aminoácido 1 da SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14 é modificada para ácido piroglutâmico, e uma cadeia leve incluindo uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:
16.
[093] [53] O conjugado de acordo com [52], em que a Biomolécula1 ou Biomolécula2 é um fragmento Fab de anticorpo MUC1 anti-humano selecionado do grupo que consiste nos seguintes (a) e (b): (a) um fragmento Fab de anticorpo MUC1 anti-humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na
SEQ ID NO: 8 e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 10; e (b) um fragmento Fab de anticorpo MUC1 anti-humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 8 e em que a glutamina do aminoácido 1 da SEQ ID NO: 8 é modificada para ácido piroglutâmico, e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 10.
[094] [54] O conjugado de acordo com [53], em que a Biomolécula1 ou Biomolécula2 é o seguinte fragmento Fab de anticorpo MUC1 anti-humano: um fragmento Fab de anticorpo MUC1 anti-humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 8 e em que a glutamina do aminoácido 1 da SEQ ID NO: 8 é modificada para ácido piroglutâmico, e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 10.
[095] [55] O conjugado de acordo com qualquer um de [42] a [54], em que p é um número natural de 1 a 4.
[096] [56] O conjugado de acordo com qualquer um de [42] a [55], em que um metal é coordenado a DOTA1.
[097] [57] O conjugado de acordo com [56], em que o metal é um radioisótopo de metal.
[098] [58] O conjugado de acordo com [57], em que o metal é 89Zr.
[099] [59] O conjugado de acordo com [56], em que o metal é um íon de metal paramagnético.
[0100] [60] O conjugado de acordo com [59], em que o metal é Gd3+.
[0101] [61] O conjugado de acordo com qualquer um de [56] a [60], em que o conjugado é um traçador de PET.
[0102] [62] Uma composição de diagnóstico compreendendo um ou mais conjugados de acordo com qualquer um de [56] a [61] e um portador farmaceuticamente aceitável.
[0103] [63] A composição de diagnóstico de acordo com [62], em que a composição de diagnóstico é usada como um fármaco de diagnóstico precoce ou um fármaco de estadiamento.
[0104] [64] A composição de diagnóstico de acordo com qualquer um de [62] ou [63], em que a composição de diagnóstico é usada para diagnosticar uma doença associada com a Biomolécula1 ou Biomolécula2.
[0105] [65] A composição de diagnóstico de acordo com [64], em que a doença associada com a Biomolécula1 ou Biomolécula2 é uma doença associada com MUC1.
[0106] [66] A composição de diagnóstico de acordo com [65], em que a composição de diagnóstico é usada para diagnosticar um câncer que expressa MUC1.
[0107] [67] A composição de diagnóstico de acordo com [66], em que o câncer é câncer de mama, câncer de pulmão, câncer colorretal, câncer de bexiga, câncer de pele, câncer da tireoide, câncer gástrico, câncer pancreático, câncer de rim, câncer ovariano ou câncer cervical.
[0108] [68] Uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais conjugados de acordo com qualquer um de [56] a [60] e um portador farmaceuticamente aceitável.
[0109] [69] A composição farmacêutica de acordo com [68], em que a composição farmacêutica é usada para diagnosticar uma doença associada com a Biomolécula1 ou Biomolécula2.
[0110] [70] A composição farmacêutica de acordo com [69], em que a doença associada com a Biomolécula1 ou Biomolécula2 é uma doença associada com MUC1.
[0111] [71] A composição farmacêutica de acordo com [70], em que a composição farmacêutica é uma composição farmacêutica para tratar um câncer que expressa MUC1.
[0112] [72] A composição farmacêutica de acordo com [71], em que o câncer é câncer de mama, câncer de pulmão, câncer colorretal, câncer de bexiga, câncer de pele, câncer da tireoide, câncer gástrico, câncer pancreático, câncer de rim, câncer ovariano ou câncer cervical.
[0113] [73] Uso de um ou mais de acordo com qualquer um de [56] a [60] para produzir uma composição de diagnóstico para um câncer e/ou uma composição farmacêutica para tratar um câncer.
[0114] [74] O conjugado de acordo com qualquer um de [56] a [60], em que o conjugado é usado para diagnosticar um câncer e/ou tratar um câncer.
[0115] [75] Um método para diagnosticar um câncer, compreendendo administrar um ou mais conjugados de acordo com qualquer um de [56] a [60] a um sujeito.
[0116] [76] Um método para tratar um câncer, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do conjugado de acordo com qualquer um de [56] a [60] a um sujeito.
EFEITOS VANTAJOSOS DA INVENÇÃO
[0117] O conjugado incluindo um fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano, um conector de peptídeo e um ligante, e o conjugado incluindo um fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano e um ligante específico descrito na presente invenção têm excelente atividade de ligação ao CEACAM5 humano. Por causa disso, espera-se que o conjugado da presente invenção incluindo ainda um metal seja útil para diagnósticos e/ou tratamento de um câncer. Além disso, o conjugado incluindo um fragmento Fab de anticorpo MUC1 humano, um conector de peptídeo e um ligante descrito na presente invenção tem excelente atividade de ligação a MUC1 humana. O conjugado que consiste em 3arm DOTA, um espaçador, um conector de peptídeo e uma biomolécula, descrito na presente invenção, é excretado pelos rins mais rapidamente. Por causa disso, espera-se que o conjugado da presente invenção incluindo ainda um metal seja útil para os diagnósticos e/ou tratamento de um câncer.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0118] [Fig. 1] A Fig. 1 mostra uma imagem de PET/CT obtida cerca de 3 horas após a administração de uma solução PBS contendo solução de conjugado 64Cu- proteína (A).
[0119] [Fig. 2] A Fig. 2 mostra uma imagem de PET/CT obtida cerca de 3 horas após a administração de uma solução PBS contendo solução de conjugado 64Cu- proteína (B).
[0120] [Fig. 3] A Fig. 3 mostra SUV.
DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES
[0121] A presente invenção será descrita em detalhes abaixo, mas a presente invenção não está limitada a isso. A menos que de outro modo aqui definido, os termos científicos e técnicos usados no contexto da presente invenção devem ter os mesmos significados como comumente entendidos pelo técnico no assunto.
[0122] “Alquila” significa uma cadeia de hidrocarboneto saturada linear ou ramificada e significa um grupo monovalente.
[0123] “Alquila C1-6” se refere à alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono, tal como metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, sec-butila, terc-butila, n- pentila ou n-hexila. Em uma modalidade, alquila C1-6 é alquila C1-4, em uma modalidade, alquila C1-6 é metila ou etila e, em uma modalidade, alquila C1-6 é metila.
[0124] “Alquileno C1-6” é um grupo divalente obtido removendo hidrogênio da alquila C1-6 acima. Em uma modalidade, alquileno C1-6 é metileno, etileno, propileno, metilmetileno ou semelhantes.
[0125] “Halogênio” significa F, Cl, Br ou I.
[0126] “Halo alquila C1-6” é alquila C1-6 substituída com um ou mais halogênios. Em uma modalidade, halo alquila C1-6 é alquila C1-6 substituída com 1 a 5 halogênios e, em uma modalidade, halo alquila C1-6 é CF3. 1-1. Conjugado da presente invenção
[0127] O conjugado da presente invenção é um conjugado representado pela seguinte fórmula (I): (Y-S1-X)p-Fab1 (I) em que Fab1 é um fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano, e o Fab1 está ligado a X através de grupos p amino ou grupos tiol no Fab1, X é um conector de peptídeo ou uma ligação, S1 é um espaçador ou uma ligação, Y é um ligante, e p é um número natural de 1 a 25 e representa a número de (Y-S1-X) ligado a Fab1, desde que quando X for uma ligação, S1 é -CH2-(1,4-fenileno)-NH-C(=S)- ou uma ligação, e Y é um grupo representado pela seguinte fórmula [Fórmula Química 56] or ou . Fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano (Fab1)
[0128] O fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano representado por “Fab1” na fórmula (I) será descrito.
[0129] A estrutura básica de uma molécula de anticorpo é comum a cada classe e é composta por uma cadeia pesada tendo um peso molecular de 50.000 a
70.000 e uma cadeia leve tendo um peso molecular de 20.000 a 30.000. A cadeia pesada usualmente consiste em uma cadeia polipeptídica incluindo cerca de 440 aminoácidos, tem uma estrutura característica para cada classe, e é chamada de cadeia γ, µ, α, δ ou ε, correspondendo a IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE, respectivamente. Além disso, IgG inclui IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, que são chamadas γ1, γ2, γ3 e γ4, respectivamente. A cadeia leve usualmente consiste em uma cadeia polipeptídica incluindo cerca de 220 aminoácidos e dois tipos, tipo L e tipo K, são conhecidos e são chamados de cadeias λ e Ϗ, respectivamente. A configuração peptídica da estrutura básica de uma molécula de anticorpo é tal que duas cadeias pesadas homólogas e duas cadeias leves homólogas estão ligadas por ligações dissulfeto (ligações S-S) e ligações não covalentes, e o peso molecular é de 150.000 a 190.000. As duas cadeias leves podem ser pareadas com qualquer cadeia pesada. Cada molécula de anticorpo é sempre composta de duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas.
[0130] Existem quatro ligações S-S intracadeia em uma cadeia pesada (cinco para cadeias µ e ε) e duas ligações S-S intracadeia em uma cadeia leve; um loop é formado a cada 100 a 110 resíduos de aminoácido e essa estrutura estérica é semelhante entre os loops e é chamada de unidade ou domínio estrutural. Os domínios localizados no terminal N de uma cadeia pesada e uma cadeia leve são chamados de regiões variáveis porque as sequências de aminoácidos dos mesmos não são constantes, mesmo em uma amostra autêntica da mesma classe (subclasse) da mesma espécie de animal, e seus respectivos domínios são chamados de região variável de cadeia pesada (VH) e região variável de cadeia leve (VL). A sequência de aminoácidos localizada mais próxima ao lado do terminal C que do terminal N é quase constante para cada classe ou subclasse e é chamada de região constante, e cada um dos domínios é representado por CH1, CH2, CH3 ou CL.
[0131] A especificidade de ligação anticorpo-antígeno depende da sequência de aminoácidos da porção composta por VH e VL. Por outro lado, atividades biológicas, tais como ligação a complementos e várias células refletem as diferenças na estrutura da região constante entre as classes de Ig. Descobriu-se que a variabilidade nas regiões variáveis de uma cadeia pesada e uma cadeia leve é mais limitada às três regiões hipervariáveis pequenas presentes em ambas as cadeias, e essas regiões são chamadas regiões determinantes de complementaridade (CDRs; CDR1, CDR2 e CDR3 partindo do lado terminal N). A parte remanescente da região variável é chamada de região de estrutura (FR) e é relativamente constante.
[0132] Uma região entre o domínio CH1 e o domínio CH2 da região constante de cadeia pesada de um anticorpo é chamada de região de dobradiça, e esta região inclui muitos resíduos de prolina e inclui uma pluralidade de ligações S-S intercadeia conectando duas cadeias pesadas. Por exemplo, as regiões de dobradiça de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humana incluem 2, 4, 11 e 2 resíduos de cisteína, respectivamente, que constituem as ligações S-S entre cadeias pesadas. A região de dobradiça é uma região altamente sensível a uma enzima proteolítica, tal como papaína ou pepsina. Quando um anticorpo é digerido com papaína, sua cadeia pesada é clivada em uma posição mais próxima ao lado do terminal N que à ligação S-S entre cadeias pesadas da região de dobradiça, e o anticorpo é quebrado em dois fragmentos Fab e um fragmento Fc. O fragmento Fab é composto por uma cadeia leve e um fragmento de cadeia pesada incluindo uma região variável de cadeia pesada (VH), o domínio CH1 e uma porção da região de dobradiça. O fragmento Fab inclui a região variável e tem atividade de ligação ao antígeno.
[0133] Em uma modalidade, o fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano incluído no conjugado da presente invenção é um fragmento Fab tendo as seguintes características:
[0134] um fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada incluindo uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos de aminoácidos 1 a 121 da SEQ ID NO: 2 e uma cadeia leve incluindo uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos de aminoácidos 1 a 112 da SEQ ID NO: 4.
[0135] Como a região constante de cadeia pesada do fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano incluído no conjugado da presente invenção, qualquer região constante, tal como Igγ1, Igγ2, Igγ3 ou Igγ4 pode ser selecionada. Em uma modalidade, a região constante de cadeia pesada do fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano incluído no conjugado da presente invenção é a região constante de Igγ1 humana.
[0136] Como a região constante de cadeia leve do fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano incluído no conjugado da presente invenção, a região constante de Igλ ou IgϏ pode ser selecionada. Em uma modalidade, a região constante de cadeia leve do fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano incluído no conjugado da presente invenção é a região constante de IgϏ1humana.
[0137] Em uma modalidade, o fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano incluído no conjugado da presente invenção é o seguinte fragmento Fab2:
[0138] um fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano incluindo um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2 e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4 (referido como Fab2).
[0139] É conhecido que quando um anticorpo, incluindo um fragmento Fab, é expressado em uma célula, o anticorpo sofre uma modificação pós-tradução. Exemplos da modificação pós-tradução incluem clivagem de lisina no terminal C da cadeia pesada por uma carboxipeptidase, modificação de glutamina ou ácido glutâmico no terminal N da cadeia pesada e cadeia leve para ácido piroglutâmico por piroglutamilação, glicosilação, oxidação, desamidação e glicosilação, e é conhecido que essa modificação pós-tradução ocorre em vários anticorpos (J. Pharm. Sci.; 2008; 97: 2426-2447).
[0140] O fragmento Fab de anticorpo de anti-CEACAM5 incluído no conjugado da presente invenção também pode incluir um fragmento Fab produzido por uma modificação pós-tradução. Exemplos do fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano da presente invenção que podem ser produzidos por uma modificação pós- tradução incluem um fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano piroglutamilado no terminal N da cadeia pesada. É conhecido na técnica que essa modificação pós-tradução por poliglutamilação de terminal N não afeta a atividade do anticorpo (Anal. Biochem.; 2006; 348: 24-39).
[0141] Em uma modalidade, o fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano incluído no conjugado da presente invenção é um fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano tendo as seguintes características: um fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada incluindo uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos de aminoácidos 1 a 121 da SEQ ID NO: 2 e em que ácido glutâmico de aminoácido 1 da SEQ ID NO: 2 é modificado para ácido piroglutâmico, e uma cadeia leve incluindo uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos de aminoácidos 1 a 112 da SEQ ID NO: 4.
[0142] Em uma modalidade, o fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano incluído no conjugado da presente invenção é um fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano tendo as seguintes características: um fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2 e em que ácido glutâmico de aminoácido 1 da SEQ ID NO: 2 é modificado para ácido piroglutâmico, e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4.
[0143] Em outra modalidade, o fragmento Fab de anticorpo de anti-CEACAM5 incluído no conjugado da presente invenção é um fragmento Fab de anticorpo anti- CEACAM5 humano tendo as seguintes características: um fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada incluindo uma região variável de cadeia pesada incluindo CDR1 que consiste na sequência de aminoácidos de aminoácidos 31 a 35 da SEQ ID NO: 2, CDR2 que consiste na sequência de aminoácidos de aminoácidos 50 a 66 da SEQ ID NO: 2 e CDR3 que consiste na sequência de aminoácidos de aminoácidos 99 a 110 da SEQ ID NO: 2, e uma cadeia leve incluindo uma região variável de cadeia leve incluindo CDR1 que consiste na sequência de aminoácidos de aminoácidos 24 a 38 da SEQ ID NO: 4, CDR2 que consiste na sequência de aminoácidos de aminoácidos 54 a 60 da SEQ ID NO: 4 e CDR3 que consiste na sequência de aminoácidos de aminoácidos 93 a 101 da SEQ ID NO: 4.
[0144] O fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano incluído no conjugado da presente invenção se liga ao CEACAM5 humano. Exemplos de um método para medir a atividade de ligação do fragmento Fab de anticorpo anti- CEACAM5 humano obtido ao CEACAM5 humano incluem métodos, tais como análise por um método de ressonância plasmônica superfície (SPR) e ELISA. Por exemplo, quando a análise pelo método de SPR é usada, a constante da taxa de ligação (ka), a constante de taxa de dissociação (kd) e a constante de dissociação (KD) podem ser medidas imobilizando o Biotin CAPture Kit (GE Healthcare Japan Corporation) e CEACAM5 humano biotinilado em um chip sensor usando Biacore T200 (GE Healthcare Japan Corporation) e adicionando um fragmento Fab diluído em série.
[0145] O fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano incluído no conjugado da presente invenção pode ser facilmente preparado pelo técnico no assunto usando um método conhecido na técnica com base na informação de sequência do fragmento de cadeia pesada e de cadeia leve do fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano da presente invenção aqui divulgado. O fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano da presente invenção não é particularmente limitado, e pode ser produzido, por exemplo, de acordo com o método descrito em <Método para produzir o fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano incluído no conjugado da presente invenção> descrito posteriormente. 1-2. Ligante
[0146] O “ligante” é uma porção de um conjugado que pode formar um complexo de quelato com um metal e significa um grupo composto por um agente quelante. O grupo composto se refere a um grupo que tem uma ligação devido à remoção de um próton do agente quelante. O grupo composto por um agente quelante se liga ao fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano diretamente ou através de um espaçador e/ou um conector de peptídeo.
[0147] O “agente quelante” se refere a um composto que pode coordenar com um metal. Exemplos do “agente quelante” como aqui usado, incluem um sideróforo e um não sideróforo. Exemplos do sideróforo incluem um tipo ácido hidroxâmico, um tipo catecol e um tipo ligante misto. Exemplos do sideróforo do tipo ácido hidroxâmico incluem ferricromo, deferoxamina (DFO) representada pela seguinte fórmula: [Fórmula Química 57] , fusarinina C, ornibactina e ácido rodotorúlico. Exemplos de sideróforo do tipo catecol incluem enterobactina, bacilibactina e Vibriobactina. Exemplos de sideróforo do tipo ligante misto incluem azotobactina, pioverdina e iersiniabactina. No caso dos sideróforos descritos acima, a DFO pode ser reagida com um espaçador ou um conector de peptídeo via -NH2, que é um grupo funcional reativo do mesmo, e no caso dos sideróforos exceto DFO, eles também podem ser reagidos com um espaçador ou um conector de peptídeo através de um grupo funcional reativo, tal como um grupo carboxila, um grupo hidroxila ou um grupo amino por um método comumente usado pelo técnico no assunto. Exemplos de não sideróforo incluem
[0148] DOTA (ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-1,4,7,10-tetra-acético, número CAS: 60239-18-1) representado pela seguinte fórmula: [Fórmula Química 58]
[0149] DTPA (ácido dietilenotriamina pentacético, número CAS: 67-43-6), DTPA-BMA (ácido 1,7-bis(metilcarbamoilmetil)-1,4,7-triaza-heptano-1,4,7-triacético, número CAS: 119895-95-3), EOB-DTPA (N-[(2S)-2-[bis(carboximetil)amino]-3-(4- etoxifenil)propil]-N-[2-[bis(carboximetil)amino]etil]glicina, número CAS: 158599-72-5), TTHA (ácido trietilenotetramina hexa-acético, número CAS: 869-52-3), DO3A (ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-1,4,7-triacético, número CAS: 217973-03-0), HP- DO3A (ácido 10-(2-hidroxipropil)-1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-1,4,7-triacético, número CAS: 120041-08-9) e derivados reativos conhecidos dos mesmos.
[0150] DOTA pode ser reagido com um espaçador ou um conector de peptídeo por meio de um ácido carboxílico, que são grupos funcionais reativos do mesmo (em seguida, DOTA tendo três ácidos carboxílicos assim ligados são algumas vezes escritos como 3arm DOTA (PLoS One. 2019 Mar 22; 14(3): e0213397)).
[0151] Entre os DOTA, exemplos de 3arm DOTA incluem os seguintes. [Fórmula Química 59] and e
[0152] Alternativamente, o DOTA em que quatro ácidos carboxílicos são mantidos (em seguida, algumas vezes escritos como 4arm-DOTA) usando o reagente p-SCN-Bn-DOTA da seguinte fórmula também pode ser reagido com um espaçador ou um conector de peptídeo. [Fórmula Química 60]
[0153] Exemplos de uma modalidade do “agente quelante” que forma o ligante incluído no conjugado da presente invenção incluem DFO, DOTA, DTPA, DTPA-BMA, EOB-DTPA, DO3A e HP-DO3A. Em uma modalidade, o agente quelante é DFO ou DOTA.
[0154] Os compostos e conjugados aqui também incluem formas livres e sais dos mesmos, a menos que de outro modo estabelecido. Aqui, os “sais dos mesmos” são sais que, quando um sal de adição de ácido ou um sal com uma base pode ser formado dependendo do tipo de um substituinte de um composto e um conjugado do mesmo, pode ser formado pelo composto e o conjugado. Exemplos específicos dos mesmos incluem sais de adição de ácidos com ácidos inorgânicos, tais como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido hidroiódico, ácido sulfúrico, ácido nítrico e ácido fosfórico, e com ácidos orgânicos, tais como ácido fórmico, ácido acético, ácido propiônico, ácido oxálico, ácido malônico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido láctico, ácido málico, ácido mandélico, ácido tartárico, ácido dibenzoiltartárico, ácido ditoluoiltartárico, ácido cítrico, ácido metanossulfônico, ácido etanossulfônico, ácido benzenossulfônico, ácido p-toluenossulfônico, ácido aspártico e ácido glutâmico, sais com bases inorgânicas, tais como sódio, potássio, magnésio, cálcio e alumínio, e com bases orgânicas, tais como metilamina, etilamina, etanolamina, lisina e ornitina, sais com vários aminoácidos e derivados de aminoácidos, tais como acetileucina e sais de amônio. Por exemplo, a DFO também existe como metanossulfonato de deferoxamina e como outro sal. O DTPA existe como um sal de sódio de DTPA bem como uma forma livre.
[0155] O conjugado da presente invenção incluindo um metal pode ser usado para vários agentes de contraste e/ou agentes terapêuticos para cânceres, e é usado, por exemplo, para um agente de contraste de MRI, e um agente usado para um traçador de PET.
[0156] Exemplos de uma modalidade do “agente quelante” quando usado para um agente de contraste de MRI incluem os agentes quelantes sideróforos e não sideróforos descritos acima.
[0157] Exemplos de uma modalidade do “agente quelante” quando usado para um traçador de PET incluem os agentes quelantes sideróforos e não sideróforos descritos acima e, em uma modalidade, o agente quelante é DFO ou DOTA.
[0158] No conjugado da presente invenção, o agente quelante pode incluir um metal. Como aqui usado, o “metal” significa um íon de metal paramagnético ou um radioisótopo de metal. O metal não é particularmente limitado desde que seja um metal que é coordenado a cada agente quelante. Uma combinação apropriada de um agente quelante e um metal é selecionada de acordo com o uso intencionado do conjugado.
[0159] Um íon de metal paramagnético é preferivelmente usado para um agente de contraste de MRI. Exemplos de uma modalidade do íon de metal paramagnético incluem, mas não são limitados a Fe2+, Fe3+, Cu2+, Ni2+, Rh2+, Co2+,
Gd3+, Eu3+, Dy3+, Tb3+, Pm3+, Nd3+, Tm3+, Ce3+, Y3+, Ho3+, Er3+, La3+, Yb3+, Mn3+ ou Mn2+. Em uma modalidade, o íon de metal paramagnético é Gd3+, Mn3+, Mn2+, Fe2+ ou Fe3+. Em uma modalidade, o íon de metal paramagnético é Gd3+. Em uma modalidade, o íon de metal paramagnético é Mn3+ ou Mn2+. Neste caso, um halogênio, ou semelhantes, pode ser usado como um contra-ânion no conjugado. Além disso, o contra-ânion pode ser o ligante C(=O)O- e, além disso, o conjugado pode ter um contra-cátion, tal como Na+.
[0160] Um radioisótopo de metal é usado para um traçador de PET e semelhantes. Exemplos de uma modalidade do radioisótopo de metal incluem, mas não são limitados a 89Zr, 52Mn, 52Fe, 64Cu, 67Ga, 68Ga, 72As, 90Y, 99mTc, 111In ou 177Lu. Exemplos de uma modalidade do radioisótopo de metal usado para um traçador de PET, um traçador SPECT e semelhantes incluem 89Zr, 64Cu, 67Ga, 68Ga, 99mTc ou 111In. Em uma modalidade, o radioisótopo de metal é um radioisótopo de zircônio (Zr). Em uma modalidade, o radioisótopo de metal é 89Zr. Exemplos de uma modalidade do radioisótopo de metal usado para tratamento de um câncer incluem 90Y ou 177Lu.
[0161] Uma modalidade do conjugado da presente invenção é um conjugado em que Y é DFO para a qual 89Zr é coordenado. Outra modalidade é um conjugado em que Y é DOTA para o qual um radioisótopo de metal que consiste em 90Y, 67Ga, 68Ga e 177Lu é coordenado. Ainda outra modalidade é um conjugado em que Y é DOTA para o qual um íon de metal paramagnético que consiste em Gd3+ e Y3+ é coordenado. Ainda outra modalidade é um conjugado em que Y é DOTA para o qual Gd3+ é coordenado. 1-3. Conector de peptídeo ou ligação
[0162] No conjugado da presente invenção, um ligante (Y) ou um espaçador (S1) e Fab1 podem estar diretamente ligados (isto é, X é uma ligação), ou podem estar ligados através de um conector de peptídeo (isto é, X é um conector de peptídeo).
[0163] Como aqui usado, o “conector de peptídeo” é um conector incluindo um peptídeo que consiste em 2 a 4 aminoácidos e, se desejado, tem fixações Z1 a Z3 ou semelhantes adequados para ligação a um fragmento Fab de anticorpo anti- CEACAM5 humano. Aqui, o peptídeo incluído no conector de peptídeo não é particularmente limitado, e é preferivelmente um peptídeo que consiste em 2 a 4 aminoácidos, cada um selecionado do grupo que consiste em glicina (Gli), lisina (Lis), metionina (Met), isoleucina (Ile), fenilalanina (Phe), valina (Val), tirosina (Tir), arginina (Arg), alanina (Ala), glutamina (Gln), ácido glutâmico (Glu), asparagina (Asn), ácido aspártico (Asp), histidina (His) e leucina (Leu), 3-(2-naftil)alanina e difenilalanina e, mais preferivelmente, um peptídeo que consiste em 2 a 4 aminoácidos, cada um selecionado do grupo que consiste em glicina, lisina, metionina, isoleucina, fenilalanina, valina, tirosina, ácido aspártico, arginina, 3-(2-naftil)alanina e difenilalanina. A menos que de outro modo especificado, a configuração dos resíduos de aminoácido exceto glicina é a forma L.
[0164] Uma modalidade do conector de peptídeo é um conector de peptídeo que inclui um peptídeo que consiste em 2 a 4 aminoácidos tendo uma sequência de aminoácidos clivada por uma enzima de membrana renal de borda em escova ou uma enzima lisossômica e ainda pode ter uma intervenção de fixação entre o conector de peptídeo e uma biomolécula ou um fragmento Fab de anticorpo. Foi relatado que o conector de peptídeo tendo uma sequência de aminoácidos clivada por uma enzima de membrana renal de borda em escova ou uma enzima lisossômica é especificamente clivado pelas enzimas presentes nos rins, reduzindo assim o acúmulo de uma porção de marcação nos rins e cuja redução no risco de exposição dos rins e transtorno renal pode ser esperada. Por exemplo, Adv Drug Deliv Rev. 2008 Sep; 60(12): 1319-28., Bioconjug Chem. 2005 Nov-Dec; 16(6): 1610-6. e Cancer Res. 1999 Jan 1; 59(1): 128-34. divulgam que um conector de glicina-lisina é especificamente clivado por uma enzima de membrana renal de borda em escova presente nos rins. A Patente Japonesa No 6164556 divulga que um conector de glicina-fenilalanina-lisina é especificamente clivado nos rins por uma enzima de membrana renal de borda em escova; além disso, Bioconjug Chem. 2002 Sep-Oct; 13(5): 985-95. divulga que um conector incluindo uma sequência de glicina-leucina-glicina-lisina é especificamente clivado nos rins por uma enzima de membrana renal de borda em escova; e além disso, Bioconjug Chem. 2013 Feb 20; 24(2): 291-9. divulga que um conector de glicina- tirosina é especificamente clivado por uma enzima de membrana renal de borda em escova. Além disso, Bioconjug Chem. 2014 Nov 19; 25(11): 2038-45. divulga que um conector incluindo uma sequência de metionina-isoleucina é especificamente clivado por uma enzima lisossômica presente nos rins. Uma modalidade do conector de peptídeo é um conector de peptídeo incluindo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em metionina-isoleucina, glicina-lisina, glicina- fenilalanina-lisina, metionina-valina-lisina, glicina-tirosina, glicina-lisina-lisina e glicina- arginina-lisina, ácido aspártico-glicina-lisina, metionina-glicina-lisina, metionina- isoleucina-lisina, glicina-tirosina-lisina, glicina-valina, glicina-isoleucina, metionina- fenilalanina-lisina, glicina-(3-(2-naftil)alanina)-lisina e glicina-difenilalanina-lisina. Uma modalidade é um conector de peptídeo incluindo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em metionina-isoleucina ácido aspártico-glicina- lisina, glicina-fenilalanina-lisina, metionina-glicina-lisina, glicina-lisina e glicina-(3-(2- naftil)alanina)-lisina.
[0165] O “conector de peptídeo” pode ter opcionalmente uma fixação adequada para ligação a um fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano, em que a fixação adequada para ligação a um fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano é um grupo que forma organoquimicamente uma ligação entre a porção de conector de peptídeo e um grupo amino ou um grupo tiol do fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano e, uma modalidade do mesmo, é um grupo incluindo um grupo derivado de maleimida (por exemplo, um grupo representado pela seguinte fórmula (II-I) ou (II-II)) ou um grupo derivado de isotiocianato (-NH-C(=S)-)
em uma extremidade. Uma modalidade é -NH-(CH2)2-Z1-, -CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1- , -C(=S)-NH-(1,4-fenileno)-NH-C(=S)- ou -NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-fenileno)- NH-C(=S)-, em que Z1 é representado pela seguinte fórmula (II-I) ou (II-II). Além disso, a seguinte fórmula (II-I) pode ser escrita como -Z1(#N)-, e a seguinte fórmula (II-II) pode ser escrita como -Z1(#S)-.
[0166] A fixação forma um conector de peptídeo pela ligação a um grupo amino ou um grupo carboxila do aminoácido em uma extremidade do peptídeo, ou a um grupo amino (por exemplo, lisina) ou um grupo hidroxila (por exemplo, tirosina) em uma cadeia lateral do aminoácido. Exemplos da fixação que forma um conector de peptídeo pela ligação a um grupo funcional em uma cadeia lateral do aminoácido em uma extremidade do peptídeo incluem um grupo representado pela seguinte fórmula (III-I) ou (III-II) como uma fixação integrada com Lis, e aqui, esses dois são escritos coletivamente como -Lis*-Z2-. A seguinte fórmula (III-I) pode ser escrita como -Lis*- Z2(#N)-, e a seguinte fórmula (III-II) pode ser escrita como -Lis*-Z2(#S)-. A seguinte fórmula (III-III) pode ser escrita como -Lis*-Z3-. [Fórmula Química 61]
[0167] Além disso, aqui, de forma semelhante, o grupo representado pela seguinte fórmula (IV) e o grupo representado pela seguinte fórmula (V) que têm uma estrutura em que um grupo funcional em uma cadeia lateral do aminoácido terminal e uma fixação estão ligados são escritos como -Tir*-CH2- e -Lis*-C(=S)-, respectivamente. [Fórmula Química 62]
[0168] Uma modalidade do conector de peptídeo “X” é um conector de peptídeo que inclui uma fixação. Uma modalidade é um conector de peptídeo selecionado do grupo que consiste em (1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-, (2)-Gli-Lis*-Z2-,
(3)-Gli-Phe-Lis*-Z2-, (4)-Met-Val-Lis*-Z2-, (5)-Gli-Tir*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-, (6)-Gli-Lis-Lis*-Z2-, (7)-Gli-Arg-Lis*-Z2-, (8)-Gli-Lis*-C(=S)-NH-(1,4-fenileno)-NH-C(=S)-, (9)-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-fenileno)-NH-C(=S)-, (10)-Asp-Gli-Lis*-Z2-, (11)-Met-Gli-Lis*-Z2-, (12)-Met-Ile-Lis*-Z2-, (13)-Gli-Tir*-CH2-C(=O)-Lis*-Z2-, (14)-Val-NH-(CH2)2-Z1-, (15)-Ile-NH-(CH2)2-Z1-, (16)-Gli-Val-NH-(CH2)2-Z1-, (17)-Gli-Ile-NH-(CH2)2-Z1-, (18)-Met-Phe-Lis*-Z2-, (19)-Gli-Tir-Lis*-Z2-, (20)-Gli-Tir*-CH2-C(=O)-NH-(CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-, (21)-Gli-(3-(2-naftil)alanina)-Lis*-Z2-, (22)-Gli-difenilalanina-Lis*-Z2-, (23)-Gli-Tir-NH-(CH2)5-Z1-, (24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-, (25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-, (26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-, (27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-, e (28)-Met-Gli-Lis*-Z3-.
[0169] Além disso, uma modalidade do conector de peptídeo “X” é um conector de peptídeo selecionado do grupo que consiste em (1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-, (2)-Gli-Lis*-Z2-, (3)-Gli-Phe-Lis*-Z2-, (4)-Met-Val-Lis*-Z2-, (5)-Gli-Tir*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-, (6)-Gli-Lis-Lis*-Z2-, (7)-Gli-Arg-Lis*-Z2-, (8)-Gli-Lis*-C(=S)-NH-(1,4-fenileno)-NH-C(=S)-, e (9)-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-fenileno)-NH-C(=S)-.
[0170] Uma modalidade é um conector de peptídeo selecionado do grupo que consiste em (1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-, (2)-Gli-Lis*-Z2-, (3)-Gli-Phe-Lis*-Z2-, (10)-Asp-Gli-Lis*-Z2-, (11)-Met-Gli-Lis*-Z2-, (21)-Gli-(3-(2-naftil)alanina)-Lis*-Z2-, (24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-, (25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-, (26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-, (27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-, e (28)-Met-Gli-Lis*-Z3-.
[0171] Uma modalidade do conector de peptídeo “X” é um conector de peptídeo selecionado do grupo que consiste em (1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-, (2)-Gli-Lis*-Z2-,
(3)-Gli-Phe-Lis*-Z2-, (4)-Met-Val-Lis*-Z2-, (5)-Gli-Tir*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-, (7)-Gli-Arg-Lis*-Z2-, (8)-Gli-Lis*-C(=S)-NH-(1,4-fenileno)-NH-C(=S)-, (9)-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-fenileno)-NH-C(=S)-, (10)-Asp-Gli-Lis*-Z2-, (11)-Met-Gli-Lis*-Z2-, (12)-Met-Ile-Lis*-Z2-, (13)-Gli-Tir*-CH2-C(=O)-Lis*-Z2-, (14)-Val-NH-(CH2)2-Z1-, (15)-Ile-NH-(CH2)2-Z1-, (16)-Gli-Val-NH-(CH2)2-Z1-, (17)-Gli-Ile-NH-(CH2)2-Z1-, (18)-Met-Phe-Lis*-Z2-, (19)-Gli-Tir-Lis*-Z2-, (20)-Gli-Tir*-CH2-C(=O)-NH-(CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-, (21)-Gli-(3-(2-naftil)alanina)-Lis*-Z2-, (22)-Gli-difenilalanina-Lis*-Z2-, (23)-Gli-Tir-NH-(CH2)5-Z1-, (24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-, (25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-, (26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-, (27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-, e (28)-Met-Gli-Lis*-Z3-.
[0172] Uma modalidade do conector de peptídeo “X” é um conector de peptídeo selecionado do grupo que consiste em
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-, (2)-Gli-Lis*-Z2-, (3)-Gli-Phe-Lis*-Z2-, (5)-Gli-Tir*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-, (6)-Gli-Lis-Lis*-Z2-, (7)-Gli-Arg-Lis*-Z2-, e (8)-Gli-Lis*-C(=S)-NH-(1,4-fenileno)-NH-C(=S)-.
[0173] Uma modalidade do conector de peptídeo “X” é um conector de peptídeo selecionado do grupo que consiste em (2)-Gli-Lis*-Z2-, (3)-Gli-Phe-Lis*-Z2-, (10)-Asp-Gli-Lis*-Z2-, (11)-Met-Gli-Lis*-Z2-, e (21)-Gli-(3-(2-naftil)alanina)-Lis*-Z2-.
[0174] Uma modalidade do conector de peptídeo “X” é um conector de peptídeo selecionado do grupo que consiste em (1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-, (2)-Gli-Lis*-Z2-, (3)-Gli-Phe-Lis*-Z2-, (5)-Gli-Tir*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-, (6)-Gli-Lis-Lis*-Z2-, e (8)-Gli-Lis*-C(=S)-NH-(1,4-fenileno)-NH-C(=S)-.
[0175] Uma modalidade do conector de peptídeo “X” é um conector de peptídeo selecionado do grupo que consiste em (1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-, (2)-Gli-Lis*-Z2-, (3)-Gli-Phe-Lis*-Z2-,
(5)-Gli-Tir*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-, (6)-Gli-Lis-Lis*-Z2-, (8)-Gli-Lis*-C(=S)-NH-(1,4-fenileno)-NH-C(=S)-, (24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-, (25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-, (26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-, (27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-, e (28)-Met-Gli-Lis*-Z3-.
[0176] Uma modalidade do conector de peptídeo “X” é um conector de peptídeo selecionado do grupo que consiste em (1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-, (2)-Gli-Lis*-Z2-, (3)-Gli-Phe-Lis*-Z2-, (9)-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-fenileno)-NH-C(=S)-, (10)-Asp-Gli-Lis*-Z2-, (11)-Met-Gli-Lis*-Z2-, (12)-Met-Ile-Lis*-Z2-, (21)-Gli-(3-(2-naftil)alanina)-Lis*-Z2-, (24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-, (25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-, (26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-, (27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-, e (28)-Met-Gli-Lis*-Z3-.
[0177] Uma modalidade do conector de peptídeo “X” é um conector de peptídeo selecionado do grupo que consiste em (1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-, (4)-Met-Val-Lis*-Z2-,
(9)-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-fenileno)-NH-C(=S)-, (11)-Met-Gli-Lis*-Z2-, (12)-Met-Ile-Lis*-Z2-, (18)-Met-Phe-Lis*-Z2-, (24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-, (25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-, (26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-, (27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-, e (28)-Met-Gli-Lis*-Z3-.
[0178] Uma modalidade do conector de peptídeo “X” é um conector de peptídeo selecionado do grupo que consiste em (1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-, (9)-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-fenileno)-NH-C(=S)-, (12)-Met-Ile-Lis*-Z2-, (24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-, (25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-, (26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-, e (27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-.
[0179] Uma modalidade do conector de peptídeo “X” é um conector de peptídeo selecionado do grupo que consiste em (4)-Met-Val-Lis*-Z2-, (11)-Met-Gli-Lis*-Z2-, (18)-Met-Phe-Lis*-Z2-, e (28)-Met-Gli-Lis*-Z3-.
[0180] Uma modalidade do conector de peptídeo “X” é um conector de peptídeo selecionado do grupo que consiste em (11)-Met-Gli-Lis*-Z2-, e
(28)-Met-Gli-Lis*-Z3-. 1-4. Espaçador ou ligação (S1)
[0181] No conjugado da presente invenção, um ligante (Y) e um conector de peptídeo (X) estão diretamente ligados (isto é, S1 é uma ligação) ou estão ligados através de um espaçador (isto é, S1 é um espaçador).
[0182] Como aqui usado, o “espaçador” S1 é um grupo introduzido para criar um certa distância entre o ligante e o conector de peptídeo ou Fab1 ou para ligação entre o ligante e o conector de peptídeo, e exemplos de uma modalidade deste incluem -C(=O)-CH2O-(1,3-fenileno)-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2O)4-(1,3-fenileno)- C(=O)-, -C(=O)-(1,3-fenileno)-C(=O)-, -NH-CH2-(1,3-fenileno)-C(=O)-, -NH-(CH2)2- C(=O)-, -CH2-(1,4-fenileno)-NH-C(=S)-, -NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3- fenileno)-C(=O)-, -NH-CH2-(1,4-fenileno)-NH-C(=O)-, -NH-(CH2)3-C(=O)-, -NH- (CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-, -NH-CH2-(1,4-fenileno)-C(=O)-, -CH2-(1,4-fenileno)-NH- C(=S)-NH-CH2-(1,3-fenileno)-C(=O)-, -CH2-(1,4-fenileno)-NH-C(=S)-NH-(CH2CH2O)3- CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-fenileno)-C(=O)- e os espaçadores representados pelas seguintes fórmulas (a) a (q). [Fórmula Química 63]
or ou
[0183] Em uma modalidade, S1 é -C(=O)-CH2O-(1,3-fenileno)-C(=O)-, -C(=O)- (CH2CH2O)4-(1,3-fenileno)-C(=O)- ou -C(=O)-(1,3-fenileno)-C(=O)-. Em uma modalidade, S1 é -NH-CH2-(1,3-fenileno)-C(=O)-, -NH-(CH2)2-C(=O)-, -CH2-(1,4- fenileno)-NH-C(=S)-, -NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-fenileno)-C(=O)-, - NH-CH2-(1,4-fenileno)-NH-C(=O)-, -NH-(CH2)3-C(=O)-, -NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)- , -NH-CH2-(1,4-fenileno)-C(=O)-, -CH2-(1,4-fenileno)-NH-C(=S)-NH-CH2-(1,3- fenileno)-C(=O)-, -CH2-(1,4-fenileno)-NH-C(=S)-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH- CH2-(1,3-fenileno)-C(=O)-, ou um espaçador representado por qualquer uma das fórmulas acima (a) a (q). Em uma modalidade, S1 é -NH-CH2-(1,4-fenileno)-NH-C(=O)- ou um espaçador representado pela fórmula acima (g), (i) ou (k).
[0184] Em uma modalidade, S1 é -C(=O)-CH2O-(1,3-fenileno)-C(=O)-, -C(=O)-
(CH2CH2O)4-(1,3-fenileno)-C(=O)-, -NH-CH2-(1,3-fenileno)-C(=O)-, -NH-CH2-(1,4- fenileno)-NH-C(=O)-, -NH-CH2-(1,4-fenileno)-C(=O)- ou -C(=O)-(1,3-fenileno)-C(=O)-, ou é [Fórmula Química 64] or .
[0185] Em uma modalidade, S1 é uma ligação.
[0186] Além disso, no conjugado em que Y é DOTA de acordo com a presente invenção, DOTA e o fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano (Fab1) podem estar diretamente ligados ou ligados através de um espaçador (-CH2-(1,4- fenileno)-NH-C(=S)). Entretanto, o conjugado em que DOTA e o fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano (Fab1) estão ligados através de -CH2-(1,4-fenileno)- NH-C(=S)-, que é um espaçador, é um conjugado representado pela seguinte fórmula (VI). [Fórmula Química 65]
[0187] Além disso, o espaçador S1 descrito aqui inclui um espaçador inovador e espaçadores representados pelas fórmulas (g) e (l), que são particularmente úteis como um espaçador quando DOTA está ligado a um conector de peptídeo incluindo um peptídeo que consiste em 2 a 4 aminoácidos tendo uma sequência de aminoácidos clivada por uma enzima de membrana renal de borda em escova ou uma enzima lisossômica. Como mostrado no teste de avaliação de acúmulo renal do Exemplo 4 descrito posteriormente, em um conjugado em que um conector de peptídeo clivado por uma enzima é combinado com DOTA e um espaçador representado pela fórmula (g), foi confirmado que o acúmulo da porção de marcação nos rins é reduzido. Em uma modalidade, S1 é um espaçador representado pela fórmula (g) ou (l).
[0188] Uma modalidade do conjugado da presente invenção é um conjugado em que Y é DOTA, S1 é um espaçador representado pela fórmula (g) ou (l), e X é um conector de peptídeo incluindo um peptídeo que consiste em 2 a 4 aminoácidos tendo uma sequência de aminoácidos clivada por uma enzima renal de borda em escova ou uma enzima lisossômica.
[0189] Uma modalidade deste é um conjugado em que Y é DOTA, S1 é um espaçador representado pela fórmula (g) ou (l), e X é um conector de peptídeo selecionado do grupo que consiste em (2)-Gli-Lis*-Z2-, (3)-Gli-Phe-Lis*-Z2-, (10)-Asp-Gli-Lis*-Z2-, (11)-Met-Gli-Lis*-Z2-, e (21)-Gli-(3-(2-naftil)alanina)-Lis*-Z2-.
[0190] Uma modalidade é um conjugado em que Y é DOTA, S1 é -NH-CH2- (1,4-fenileno)-NH-C(=O)- ou um espaçador representado por qualquer uma das fórmulas (g), (i) ou (k), e X é um conector de peptídeo selecionado do grupo que consiste em
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-, (11)-Met-Gli-Lis*-Z2-, (12)-Met-Ile-Lis*-Z2-, (24)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-, (25)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-, (26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-, (27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-, e (28)-Met-Gli-Lis*-Z3-.
[0191] Uma modalidade é um conjugado em que Y é DOTA, S1 é um espaçador representado pela fórmula (g), e X é um conector de peptídeo selecionado do grupo que consiste em (11)-Met-Gli-Lis*-Z2-, e (28)-Met-Gli-Lis*-Z3-.
[0192] O conjugado da presente invenção consiste em uma combinação das modalidades acima.
[0193] Modalidades específicas do conjugado da presente invenção são como se segue.
[0194] Nas fórmulas, Fab2 é um fragmento Fab compreendendo um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2 e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4.
[0195] p é um número natural de 1 a 25. Fab2 está ligado a um átomo de carbono adjacente através de grupos p amino ou grupos tiol no Fab2. [Fórmula Química 66]
[Fórmula Química 67]
[Fórmula Química 68]
[Fórmula Química 69]
[Fórmula Química 70]
[Fórmula Química 71]
[Fórmula Química 72]
[0196] A porção de marcação de uma combinação em que Y é DOTA, S1 é um espaçador representado pela fórmula (g) ou (l), e X é um conector de peptídeo incluindo um peptídeo que consiste em 2 a 4 aminoácidos tendo uma sequência de aminoácidos clivada por uma enzima de membrana renal de borda em escova ou uma enzima lisossômica é útil como uma porção de marcação que se espera que reduza a nefrotoxicidade e semelhantes em conjugados similares usando vários anticorpos Fab sem estar limitado à combinação com Fab1 da presente invenção, e a presente invenção também inclui a invenção da própria porção de marcação.
[0197] Na produção do conjugado da presente invenção, a ligação do fragmento Fab de anticorpo de anti-CEACAM5 ao ligante, espaçador e/ou conector de peptídeo, e a ligação do ligante ao espaçador e/ou conector de peptídeo pode ser apropriadamente realizada pelo técnico no assunto por um método conhecido.
[0198] Como aqui usado, a “porção de marcação” significa, por exemplo, uma porção exceto Fab1 na fórmula (I) e uma porção exceto Biomolécula1 ou Biomolécula2 na fórmula (Ia) ou (Ib). A porção de marcação é (i) um ligante e um conector de peptídeo (Y-S1-X: em que S1 é uma ligação e X é um conector de peptídeo), (ii) um ligante (Y-S1-X: em que S1 e X são, cada uma, uma ligação) ou (iii) um ligante, um espaçador e um conector de peptídeo (Y-S1-X: em que S1 é um espaçador e X é um conector de peptídeo). Em uma modalidade, a porção de marcação é (ii) um ligante. Em uma modalidade, a porção de marcação é (i) um ligante e um conector de peptídeo ou (iii) um ligante, um espaçador e um conector de peptídeo. Aqui, o ligante da “porção de marcação” pode incluir ainda um metal, e algumas modalidades são (i) um ligante incluindo um metal e um conector de peptídeo, (ii) um ligante ou (iii) um ligante, um espaçador e um conector de peptídeo, e também são (i) um ligante formando um complexo de quelato com um metal e um conector de peptídeo, (ii) um ligante formando um complexo de quelato com um metal ou (iii) um ligante formando um complexo de quelato com um metal, um espaçador e um conector de peptídeo. Além disso, existe o caso de (iv) um conector de peptídeo em que um espaçador é adicionalmente incluído no conector de peptídeo. Além disso, na fórmula (Ia) ou (Ib), a porção de marcação significa uma porção exceto Biomolécula1 ou Biomolécula2. 1-5. O número (p) da porção de marcação (Y-S1-X) ligada ao fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano (Fab1) e o número (p) da porção de marcação ligada à Biomolécula1 e Biomolécula2 da fórmula (Ia) ou (Ib)
[0199] O conjugado da presente invenção é um conjugado em que uma ou mais porções de marcação (Y-S1-X) estão ligadas através de um ou mais grupos amino ou grupos tiol no fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano (Fab1). Além disso, o conjugado da presente invenção é um conjugado em que uma ou mais porções de marcação estão ligadas através de um ou mais grupos amino ou grupos tiol na Biomolécula1 e Biomolécula2 da fórmula (Ia) ou (Ib). O conjugado da presente invenção pode ser uma mistura de conjugados em que o número de porções de marcação ligadas é diferente um do outro, e isso mostra que o conjugado é qualquer um dos conjugados em que 1 a 25 porções de marcação (Y-S1-X) são ligadas a Fab1 na fórmula (I) ou uma mistura das mesmas. Para um Fab1, o conjugado da presente invenção inclui 1 a 25 porções de marcação (Y-S1-X) em uma modalidade, inclui 1 a 23 porções de marcação (Y-S1-X) em uma modalidade, inclui 1 a 15 porções de marcação (Y-S1-X) em uma modalidade, inclui 1 a 11 porções de marcação (Y-S1-X) em uma modalidade, inclui 1 a 9 porções de marcação (Y-S1-X) em uma modalidade,
inclui 1 a 7 porções de marcação (Y-S1-X) em uma modalidade, inclui 1 a 5 porções de marcação (Y-S1-X) em uma modalidade e, além disso, inclui 1 a 4 porções de marcação (Y-S1-X) em uma modalidade.
[0200] É mostrado que na fórmula (Ia) ou (Ib), Biomolécula1 e Biomolécula2 são qualquer um de Fab1 em que 1 a 25 porções de marcação estão ligadas ou uma mistura das mesmas. Para uma Biomolécula1 e Biomolécula2, o conjugado da presente invenção inclui 1 a 25 porções de marcação em uma modalidade, inclui 1 a 23 porções de marcação em uma modalidade, inclui 1 a 15 porções de marcação em uma modalidade, inclui 1 a 11 porções de marcação em uma modalidade, inclui 1 a 9 porções de marcação em uma modalidade, inclui 1 a 7 porções de marcação em uma modalidade, inclui 1 a 5 porções de marcação em uma modalidade e, além disso, inclui 1 a 4 porções de marcação em uma modalidade.
[0201] Isto é, “p” que representa o número de uma porção de marcação (Y- S1-X) ligada a um Fab1 e “p” que representa o número da porção de marcação ligada a uma Biomolécula1 e Biomolécula2 são idênticos ou diferentes e cada um é um número natural de 1 a 25 em uma modalidade, é um número natural de 1 a 23 em uma modalidade, é um número natural de 1 a 15 em uma modalidade, é um número natural de 1 a 11 em uma modalidade, é um número natural de 1 a 9 em uma modalidade, é um número natural de 1 a 7 em uma modalidade, é um número natural de 1 a 6 em uma modalidade, é um número natural de 1 a 5 em uma modalidade, é um número natural de 1 a 4 em uma modalidade e, além disso, é um número natural de 1 a 3 em uma modalidade.
2. Polinucleotídeo que codifica o fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano incluído no conjugado da presente invenção
[0202] Em uma modalidade, o fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano incluído no conjugado da presente invenção é codificado por um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica o fragmento de cadeia pesada do fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano e um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica a cadeia leve do fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano.
[0203] Em uma modalidade, o polinucleotídeo que codifica o fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano incluído no conjugado da presente invenção é um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica um fragmento de cadeia pesada incluindo uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada pelos aminoácidos 1 a 121 da SEQ ID NO: 2, ou um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia leve incluindo uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada pelos aminoácidos 1 a 112 da SEQ ID NO: 4.
[0204] Exemplos do polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica um fragmento de cadeia pesada incluindo uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada pelos aminoácidos 1 a 121 da SEQ ID NO: 2 incluem um polinucleotídeo incluindo a sequência de nucleotídeos de nucleotídeos 1 a 363 da SEQ ID NO: 1. Exemplos do polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia leve incluindo uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos de aminoácidos 1 a 112 da SEQ ID NO: 4 incluem um polinucleotídeo incluindo a sequência de nucleotídeos de nucleotídeos 1 a 336 da SEQ ID NO: 3.
[0205] Em uma modalidade, o polinucleotídeo que codifica o fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano incluído no conjugado da presente invenção é um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2, ou um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4.
[0206] Exemplos do polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2 incluem um polinucleotídeo incluindo a sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 1. Exemplos do polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4 incluem um polinucleotídeo incluindo a sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 3.
[0207] O polinucleotídeo que codifica o fragmento Fab de anticorpo anti- CEACAM5 humano incluído no conjugado da presente invenção pode ser sintetizado usando um método de síntese gênica conhecido na técnica com base na sequência de nucleotídeos projetada com base nas sequências de aminoácidos do fragmento de cadeia pesada e de cadeia leve do fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano. Como tal método de síntese gênica, vários métodos conhecidos pelo técnico no assunto, tal como o método para sintetizar um gene de anticorpo divulgado na Publicação Internacional No 90/07861, podem ser usados.
3. Vetor de expressão de um polinucleotídeo que codifica o fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano incluído no conjugado da presente invenção
[0208] O vetor de expressão de um polinucleotídeo que codifica o fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano incluído no conjugado da presente invenção inclui um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica o fragmento de cadeia pesada do fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano, um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica a cadeia leve do fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano e um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica o fragmento de cadeia pesada do fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano e um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica a cadeia leve do fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano.
[0209] Exemplos de vetores de expressão preferíveis incluem um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica um fragmento de cadeia pesada incluindo uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada pelos aminoácidos 1 a 121 da SEQ ID NO: 2, um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia leve incluindo uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada pelos aminoácidos 1 a 112 da SEQ ID NO: 4, e um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica um fragmento de cadeia pesada incluindo uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada pelos aminoácidos 1 a 121 da SEQ ID NO: 2 e um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia leve incluindo uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada pelos aminoácidos 1 a 112 da SEQ ID NO: 4.
[0210] Vetores de expressão preferíveis incluem um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2, um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4 e um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2 e um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4.
[0211] Esses vetores de expressão não são particularmente limitados, desde que possam produzir um polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo da presente invenção em várias células hospedeiras de células procarióticas e/ou células eucarióticas. Exemplos de tais vetores de expressão incluem um vetor de plasmídeo e um vetor viral (por exemplo, um adenovírus ou um retrovírus) e, preferivelmente, pEE6.4 ou pEE12.4 (Lonza) pode ser usado.
[0212] Além disso, esses vetores de expressão podem incluir um promotor ligado de maneira operável a um gene que codifica um fragmento de cadeia pesada e/ou uma cadeia leve de um polinucleotídeo que codifica o fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano incluído no conjugado da presente invenção. Exemplos do promotor para expressar um fragmento Fab em uma célula hospedeira incluem, quando a célula hospedeira é uma bactéria do gênero Escherichia, um promotor Trp, um promotor lac, um promotor recA, um promotor λPL, um promotor lpp e um promotor tac. Exemplos de um promotor para expressão em uma levedura incluem um promotor PH05, um promotor PGK, um promotor GAP e um promotor ADH, e exemplos de um promotor para expressão em uma bactéria do gênero Bacillus incluem um promotor SL01, um promotor SP02 e um promotor penP. Além disso, exemplos dos mesmos incluem, quando o hospedeiro é uma célula eucariótica, tal como uma célula de mamífero, um promotor derivado de um vírus, tal como CMV, RSV ou SV40, um promotor de retrovírus, um promotor de actina, um promotor de EF (fator de elongação) 1α e um promotor de choque térmico.
[0213] Esses vetores de expressão podem ainda incluir, quando uma bactéria, particularmente E. coli, é usada como uma célula hospedeira, um códon de partida, um códon de parada, uma região terminadora e uma unidade replicável. Por outro lado, quando uma levedura, uma célula animal ou uma célula de inseto é usada como o hospedeiro, os vetores de expressão podem incluir um códon de partida e um códon de parada. Além disso, neste caso, os vetores de expressão podem incluir uma sequência realçadora, regiões não traduzidas 5’ e 3’ de um gene que codifica o fragmento de cadeia pesada e/ou a cadeia leve da invenção, uma sequência de sinal secretor, uma junção de splicing, um sítio de poliadenilação, uma unidade replicável ou semelhantes. Além disso, os vetores de expressão podem incluir um marcador de seleção comumente usado dependendo do propósito intencionado (por exemplo, um gene de resistência a tetraciclina, um gene de resistência a ampicilina, um gene de resistência a canamicina, um gene de resistência a neomicina ou um gene di- hidrofolato redutase).
4. Célula hospedeira transformada com um vetor de expressão
[0214] As células hospedeiras transformadas com um vetor de expressão incluem uma célula hospedeira selecionada do grupo que consiste nos seguintes (a) a (d): (a) uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica o fragmento de cadeia pesada do fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano; (b) uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica a cadeia leve do fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano; (c) uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica o fragmento de cadeia pesada do fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano e um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica a cadeia leve do fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano; e (d) uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica o fragmento de cadeia pesada do fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano e um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica a cadeia leve do fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano.
[0215] Em uma modalidade, a célula hospedeira transformada com um vetor de expressão é uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão selecionado do grupo que consiste nos seguintes (a) a (d): (a) uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica um fragmento de cadeia pesada incluindo uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada pelos aminoácidos 1 a 121 da SEQ ID NO: 2; (b) uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia leve incluindo uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em aminoácidos 1 a 112 da SEQ ID NO: 4; (c) uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica um fragmento de cadeia pesada incluindo uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada pelos aminoácidos 1 a 121 da SEQ ID NO: 2 e um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia leve incluindo uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada pelos aminoácidos 1 a 112 da SEQ ID NO: 4; e (d) uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica um fragmento de cadeia pesada incluindo uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada pelos aminoácidos 1 a 121 da SEQ ID NO: 2 e um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia leve incluindo uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada pelos aminoácidos 1 a 112 da SEQ ID NO: 4.
[0216] Em uma modalidade, a célula hospedeira transformada com um vetor de expressão é uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão selecionado do grupo que consiste nos seguintes (a) a (d): (a) uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2; (b) uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4; (c) uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2 e um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4; e (d) uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2 e um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4.
[0217] Exemplos de uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão preferível incluem uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica o fragmento de cadeia pesada do fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano incluído no conjugado da presente invenção e um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica a cadeia leve do fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano incluído no conjugado da presente invenção, e uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica o fragmento de cadeia pesada do fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano incluído no conjugado da presente invenção e um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica a cadeia leve do fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano incluído no conjugado da presente invenção.
[0218] A célula hospedeira transformada com um vetor de expressão não é particularmente limitada, desde que seja compatível com o vetor de expressão usado e pode ser transformada com o vetor de expressão para expressar o fragmento Fab, e exemplos das mesmas incluem várias células, tais como uma célula natural ou uma célula estabelecida artificialmente (por exemplo, uma bactéria (uma bactéria do gênero Escherichia ou uma bactéria do gênero Bacillus), uma levedura (do gênero Saccharomyces, o gênero Pichia ou semelhantes), e uma célula animal ou uma célula de inseto (por exemplo, Sf9)), uma linhagem de células de mamífero (por exemplo, uma célula cultivada, tal como uma célula CHO-K1SV, uma célula CHO-DG44 ou uma célula 293) comumente usada no campo técnico da presente invenção. A transformação em si pode ser realizada por um método conhecido, tal como um método de fosfato de cálcio ou um método de eletroporação.
5. Método para produzir o fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano incluído no conjugado da presente invenção
[0219] A produção do fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano incluído no conjugado da presente invenção inclui a etapa de cultivar a célula hospedeira transformada descrita acima para expressar o fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano.
[0220] Em uma modalidade, a célula hospedeira transformada cultivada na produção do fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano incluído no conjugado da presente invenção é selecionada do grupo que consiste nos seguintes (a) a (c): (a) uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica o fragmento de cadeia pesada do fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano incluído no conjugado da presente invenção e um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica a cadeia leve do fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano incluído no conjugado da presente invenção; (b) uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica o fragmento de cadeia pesada do fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano incluído no conjugado da presente invenção e um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica a cadeia leve do fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano incluído no conjugado da presente invenção; e (c) uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo contendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um fragmento de cadeia pesada do fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano incluído no conjugado da presente invenção, e uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica a cadeia leve do fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano incluído no conjugado da presente invenção.
[0221] Em uma modalidade, a célula hospedeira transformada cultivada na produção do fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano incluído no conjugado da presente invenção é selecionada do grupo que consiste nos seguintes (a) a (c):
(a) uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica um fragmento de cadeia pesada incluindo uma região variável de cadeia pesada que consiste nas sequências de aminoácidos mostradas pelos aminoácidos 1 a 121 da SEQ ID NO: 2 e um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia leve incluindo uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada pelos aminoácidos 1 a 112 da SEQ ID NO: 4; (b) uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica um fragmento de cadeia pesada incluindo uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada pelos aminoácidos 1 a 121 da SEQ ID NO: 2, e um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia leve incluindo uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada pelos aminoácidos 1 a 112 da SEQ ID NO: 4; e (c) uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica um fragmento de cadeia pesada incluindo uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada pelos aminoácidos 1 a 121 da SEQ ID NO: 2, e uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia leve incluindo uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada pelos aminoácidos 1 a 112 da SEQ ID NO: 4.
[0222] Em uma modalidade, a célula hospedeira transformada cultivada na produção do fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano incluído no conjugado da presente invenção é selecionada do grupo que consiste nos seguintes (a) a (c):
(a) uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2 e um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4; (b) uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2 e um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4; e (c) uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2, e uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4.
[0223] A célula hospedeira transformada usada é preferivelmente uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica o fragmento de cadeia pesada do fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano incluído no conjugado da presente invenção e um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica a cadeia leve do fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano incluído no conjugado da presente invenção, ou uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica o fragmento de cadeia pesada do fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano incluído no conjugado da presente invenção e um vetor de expressão que inclui um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica a cadeia leve do fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano incluído no conjugado da presente invenção.
[0224] Na produção do fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano incluído no conjugado da presente invenção, uma célula hospedeira transformada pode ser cultivada em um meio nutritivo. O meio nutritivo preferivelmente inclui uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio inorgânico ou uma fonte de nitrogênio orgânico, necessários para o crescimento da célula hospedeira transformada. Exemplos da fonte de carbono incluem glicose, dextrano, amido solúvel e sacarose, e exemplos da fonte de nitrogênio inorgânico ou da fonte de nitrogênio orgânico incluem um sal de amônio, um nitrato, um aminoácido, licor de maceração de milho, peptona, caseína, extrato de carne, amido de soja e extrato de batata. Além disso, o meio nutritivo pode, se desejado, incluir outro nutriente (por exemplo, um sal inorgânico (por exemplo, cloreto de cálcio, di-hidrogenofosfato de sódio ou cloreto de magnésio), uma vitamina e um antibiótico (por exemplo, tetraciclina, neomicina, ampicilina ou canamicina).
[0225] A própria cultura de uma célula hospedeira transformada é realizada por um método conhecido. As condições de cultura, tais como temperatura, pH do meio e tempo de cultura, são apropriadamente selecionadas. Por exemplo, quando o hospedeiro é uma célula animal, como o meio, meio MEM (Science; 1955; 122: 501.) contendo cerca de 5 a 20 % de soro fetal bovino, meio DMEM (Virology; 1959; 8: 396-
97.), meio RPMI 1640 (J. Am. Med. Assoc.; 1967; 199: 519-24.), meio 199 (Proc. Soc. Exp. Biol. Med.; 1950; 73: 1-8.) ou semelhantes podem ser usados. O pH do meio é preferivelmente cerca de 6 a 8, e a cultura é usualmente realizada a cerca de 30 a 40 °C por cerca de 15 a 336 horas e, se necessário, aeração e agitação também podem ser realizadas. Quando o hospedeiro é uma célula de inseto, exemplos do meio incluem meio de Grace (PNAS; 1985; 82: 8404-8.) contendo soro fetal bovino, e o pH do mesmo é preferivelmente cerca de 5 a 8. A cultura é usualmente realizada a cerca de 20 a 40 °C por 15 a 100 horas e, se necessário, aeração e agitação também podem ser realizadas. Quando o hospedeiro é uma bactéria, um actinomiceto, uma levedura ou um fungo filamentoso, por exemplo, um meio líquido contendo as fontes de nutrientes acima é adequado. Um meio tendo um pH de 5 a 8 é preferível. Quando o hospedeiro é E. coli, exemplos de um meio preferível incluem meio LB e meio M9 (Miller et al., Exp. Mol. Genet, Cold Spring Harbor Laboratory; 1972: 431.). Nesse caso, a cultura pode ser usualmente realizada a 14 a 43 °C por cerca de 3 a 24 horas, sob aeração e agitação, se necessário. Quando o hospedeiro é uma bactéria do gênero Bacillus, a cultura pode ser realizada a 30 a 40 °C por cerca de 16 a 96 horas, sob aeração e agitação, se necessário. Quando o hospedeiro é uma levedura, exemplos do meio incluem meio mínimo de Burkholder (PNAS; 1980; 77: 4505-4508.), e o pH do mesmo é desejavelmente de 5 a 8. A cultura é usualmente realizada a cerca de 20 a 35 °C por 14 a 144 horas e, se necessário, aeração e agitação também podem ser realizadas.
[0226] A produção do fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano incluído no conjugado da presente invenção pode incluir, além da etapa de cultivar a célula hospedeira transformada descrita acima para expressar o fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano, a etapa de recuperar e, preferivelmente, isolar e purificar o fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano expressado. Exemplos de métodos de isolamento e purificação incluem um método usando solubilidade, tal como método salting out ou precipitação com solvente, um método usando diferença no peso molecular, tal como diálise, ultrafiltração, filtração em gel ou eletroforese em gel com dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida, um método usando carga, tal como cromatografia de troca iônica ou cromatografia de hidroxilapatita, um método usando afinidade específica, tal como cromatografia de afinidade, um método usando diferença na hidrofobicidade, tal como cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa e um método usando diferença no ponto isoelétrico, tal como focalização isoelétrica.
6. Método para produzir o conjugado da presente invenção
[0227] O método para produzir o conjugado da presente invenção pode incluir a etapa de ligar covalentemente o fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano a uma porção de marcação (Y-S1-X). O técnico no assunto pode apropriadamente realizar a ligação entre os componentes na porção de marcação (Y- S1-X) por um método conhecido. Como um exemplo de reação, após um ligante (Y) estar ligado a um conector de peptídeo (X) diretamente ou através de um espaçador (S1), o conector de peptídeo pode estar ligado ao fragmento Fab de anticorpo anti- CEACAM5 humano. Além disso, após o fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano estar ligado a um conector de peptídeo (X), o conector de peptídeo também pode estar ligado a um ligante (Y) diretamente ou através de um espaçador (S1). Como um material de partida, um composto em que um ligante e um espaçador (S1) estão ligados antecipadamente também pode ser usado.
[0228] O método para produzir o conjugado da presente invenção também pode incluir a etapa de cultivar a célula hospedeira transformada descrita acima para expressar o fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano e a etapa de ligar covalentemente o fragmento Fab e uma porção de marcação (Y-S1-X). O método para produzir o conjugado da presente invenção também pode incluir a etapa de cultivar a célula hospedeira transformada descrita acima para expressar o fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano, a etapa de recuperar o fragmento Fab expressado e a etapa de ligar covalentemente o fragmento Fab e uma porção de marcação (Y-S1- X). O método para produzir o conjugado da presente invenção pode incluir ainda a etapa de adicionar um metal. Como o agente quelante, o conector de peptídeo, o espaçador, o número de porções de marcação, o metal e semelhantes usados,
aqueles aqui descritos podem ser usados.
[0229] O método para produzir o conjugado da presente invenção pode ser realizado como um método incluindo duas ou mais etapas especificadas acima como uma série de etapas, ou pode ser realizado como um método incluindo pelo menos uma etapa especificada acima. Por exemplo, um método incluindo a etapa de ligar o fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano a uma porção de marcação (Y- S1-X) e um método incluindo a etapa de coordenar um metal ao fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano ao qual uma porção de marcação (Y-S1-X) está ligada também estão incluídos no método para produzir o conjugado da presente invenção. Além disso, o método para produzir o conjugado da presente invenção também inclui um método em que a ordem das etapas é diferente. Por exemplo, um método para ligar covalentemente o fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano a uma porção de marcação (Y-S1-X) em que um metal é coordenado a um ligante também está incluído no método para produzir o conjugado da presente invenção.
[0230] Além disso, o conjugado da presente invenção pode ser produzido da mesma maneira, também com a biomolécula descrita na presente invenção em vez do fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano descrito acima.
7. Conjugado que consiste em um ligante, um espaçador, um conector de peptídeo e uma biomolécula
[0231] O conjugado que consiste em um ligante, um espaçador, um conector de peptídeo e uma biomolécula de acordo com a presente invenção representado pela seguinte fórmula será descrito. [Fórmula Química 73]
Biomoléluca1
[0232] Uma modalidade da seguinte fórmula (S2) correspondendo a um espaçador [Fórmula Química 74] é [Fórmula Química 75]
.
[0233] Outra modalidade é um grupo em que a fórmula (S2) é [Fórmula Química 76] .
[0234] Outra modalidade é um grupo em que a fórmula (S2) é [Fórmula Química 77] .
[0235] Outra modalidade é um grupo em que a fórmula (S2) é
[Fórmula Química 78] .
[0236] Uma modalidade do grupo Q na fórmula (S2) é -C(=O)-, -NH-C(=O)- ou -NH-C(=S)-.
[0237] Uma modalidade do grupo Q na fórmula (S2) é -C(=O)- ou -NH-C(=O)- .
[0238] Uma modalidade do grupo Q na fórmula (S2) é -NH-C(=O)-.
[0239] Uma modalidade do grupo L2 na fórmula (Ia) ou (Ib) é Ile, Phe ou Gli.
[0240] Uma modalidade do grupo L2 na fórmula (Ia) ou (Ib) é Ile.
[0241] Uma modalidade do grupo L2 na fórmula (Ia) ou (Ib) é Phe.
[0242] Uma modalidade do grupo L2 na fórmula (Ia) ou (Ib) é Gli.
[0243] Uma modalidade do grupo L3 na fórmula (Ia) ou (Ib) é uma ligação, Arg ou His.
[0244] Uma modalidade do grupo L3 na fórmula (Ia) ou (Ib) é uma ligação.
[0245] Uma modalidade do grupo L3 na fórmula (Ia) ou (Ib) é Arg.
[0246] Uma modalidade do grupo L3 na fórmula (Ia) ou (Ib) é His.
[0247] Uma modalidade do grupo L4 na fórmula (Ia) ou (Ib) é -NH-(CH2)2-, - NHCH(C(=O)OH)(CH2)4- ou uma ligação.
[0248] Uma modalidade do grupo L4 na fórmula (Ia) ou (Ib) é -NH-(CH2)2-.
[0249] Uma modalidade do grupo L4 na fórmula (Ia) ou (Ib) é - NHCH(C(=O)OH)(CH2)4-.
[0250] Uma modalidade do grupo L4 na fórmula (Ia) ou (Ib) é uma ligação.
[0251] Uma modalidade do grupo V1 na fórmula (Ia) ou (Ib) é um grupo representado por qualquer uma das seguintes fórmulas (A-1) a (A-5) [Fórmula Química 79]
.
[0252] Uma modalidade do grupo V1 na fórmula (Ia) ou (Ib) é um grupo representado pela seguinte fórmula (A-1) [Fórmula Química 80] .
[0253] Uma modalidade do grupo V1 na fórmula (Ia) ou (Ib) é um grupo representado pela seguinte fórmula (A-2) [Fórmula Química 81] .
[0254] Uma modalidade do grupo V1 na fórmula (Ia) ou (Ib) é um grupo representado pela seguinte fórmula (A-3) [Fórmula Química 82] .
[0255] Uma modalidade do grupo V1 na fórmula (Ia) ou (Ib) é um grupo representado pela seguinte fórmula (A-4) [Fórmula Química 83] .
[0256] Uma modalidade do grupo V1 na fórmula (Ia) ou (Ib) é um grupo representado pela seguinte fórmula (A-5) [Fórmula Química 84] .
[0257] A seguinte fórmula (B) na fórmula (Ia) ou (Ib) é um grupo que consiste em um espaçador e um conector de peptídeo. [Fórmula Química 85]
[0258] Exemplos dos mesmos incluem um grupo selecionado do grupo que consiste em as seguintes fórmulas (B-1) a (B-7). [Fórmula Química 86] [Fórmula Química 87] [Fórmula Química 88]
[Fórmula Química 89]
[Fórmula Química 90]
[Fórmula Química 91]
[Fórmula Química 92]
[0259] Uma modalidade é o conjugado representado pela fórmula (Ia) em que o conjugado é um conjugado selecionado do grupo que consiste nos compostos das seguintes fórmulas, p é um número natural de 1 a 25 e a Biomolécula1 está ligada a um átomo de carbono adjacente através de grupos p amino ou grupos tiol na Biomolécula1. [Fórmula Química 93]
Biomoléluca1
[Fórmula Química 94]
Biomoléluca1
[Fórmula Química 95]
Biomoléluca1 [Fórmula Química 96] Biomoléluca1 [Fórmula Química 97] Biomoléluca1
[0260] Uma modalidade da presente invenção é um conjugado representado pela seguinte fórmula. [Fórmula Química 98]
em que Fab5 é o seguinte fragmento Fab de anticorpo: um fragmento Fab de anticorpo MUC1 anti-humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 8 e em que a glutamina do aminoácido 1 da SEQ ID NO: 8 é modificada para ácido piroglutâmico, e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 10.
[0261] Uma modalidade da presente invenção é um conjugado representado pela seguinte fórmula. [Fórmula Química 99] em que Fab5 é o seguinte fragmento Fab de anticorpo: um fragmento Fab de anticorpo MUC1 anti-humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 8 e em que a glutamina do aminoácido 1 da SEQ ID NO: 8 é modificada para ácido piroglutâmico, e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 10.
[0262] Uma modalidade da presente invenção é um conjugado representado pela seguinte fórmula. [Fórmula Química 100] em que Fab5 é o seguinte fragmento Fab de anticorpo: um fragmento Fab de anticorpo MUC1 anti-humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 8 e em que a glutamina do aminoácido 1 da SEQ ID NO: 8 é modificada para ácido piroglutâmico, e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 10.
[0263] Uma modalidade da presente invenção é um conjugado representado pela seguinte fórmula. [Fórmula Química 101] em que Fab5 é o seguinte fragmento Fab de anticorpo: um fragmento Fab de anticorpo MUC1 anti-humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 8 e em que a glutamina do aminoácido 1 da SEQ ID NO: 8 é modificada para ácido piroglutâmico, e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 10.
[0264] Uma modalidade da presente invenção é um conjugado representado pela seguinte fórmula. [Fórmula Química 102] em que Fab5 é o seguinte fragmento Fab de anticorpo: um fragmento Fab de anticorpo MUC1 anti-humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 8 e em que a glutamina do aminoácido 1 da SEQ ID NO: 8 é modificada para ácido piroglutâmico, e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 10.
[0265] Uma modalidade da presente invenção é um conjugado representado pela seguinte fórmula. [Fórmula Química 103] em que Fab5 é o seguinte fragmento Fab de anticorpo:
um fragmento Fab de anticorpo MUC1 anti-humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 8 e em que a glutamina do aminoácido 1 da SEQ ID NO: 8 é modificada para ácido piroglutâmico, e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 10.
[0266] Uma modalidade da presente invenção é um conjugado representado pela seguinte fórmula. [Fórmula Química 104] em que Fab5 é o seguinte fragmento Fab de anticorpo: um fragmento Fab de anticorpo MUC1 anti-humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 8 e em que a glutamina do aminoácido 1 da SEQ ID NO: 8 é modificada para ácido piroglutâmico, e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 10.
[0267] Além disso, exemplos de uma modalidade da presente invenção incluem as seguintes fórmulas (Ie) e (Se). [Fórmula Química 105] Biomoléluca1
[Fórmula Química 106] Biomoléluca2
[0268] O conjugado da presente invenção pode ter um isômero e um tautômero geométrico. Além disso, o composto da presente invenção pode ter um carbono assimétrico. Versões separadas desses isômeros ou misturas dos mesmos estão incluídas na presente invenção. Além disso, uma forma marcada, isto é, um composto em que um ou mais átomos do composto da presente invenção são substituídos com um radioisótopo ou um isótopo não radioativo também está incluído na presente invenção.
[0269] A modalidade da biomolécula pode ser qualquer biomolécula, desde que ela tenha atividade fisiológica, e exemplos das mesmas incluem um peptídeo, uma proteína, um hormônio, um fármaco, um nucleotídeo, um oligonucleotídeo, um ácido nucleico e um polissacarídeo. No caso de uma proteína, um anticorpo, uma enzima, um receptor e um fragmento do mesmo, estão incluídos.
[0270] Outra modalidade da biomolécula é um peptídeo e uma proteína.
[0271] Outra modalidade da biomolécula é uma proteína.
[0272] Outra modalidade da biomolécula é um fragmento Fab, uma enzima, um receptor ou um fragmento do mesmo, de proteínas. Por exemplo, somatostatina, um ligante PSMA, um Peptídeo RGD (Arg-Gli-Asp), ATSM (Diacetil-bis(N4-metil- tiosemicarbazona)) ou 211At-AITM (4-211At-astato-N-[4-(6-(isopropilamino)piridina-4- il)-1,3-tiazol-2-il]-N-metilbenzamida) corresponde ao acima.
[0273] Outra modalidade da biomolécula é um anticorpo comercializado ou fragmento Fab do mesmo.
[0274] Exemplos dos mesmos incluem nivolumabe, pembrolizumabe, bevacizumabe, rituximabe, pertuzumabe, daratumumabe, denosumabe, cetuximabe, ipilimumabe, panitumumabe, brentuximabe, ramucirumabe, atezolizumabe, obinutuzumabe, elotuzumabe, avelumabe, ibritumomabe, alentuzumabe, gemtuzumabe e necitumumabe.
[0275] Além disso, outra modalidade da biomolécula é uma que pode ser esperada para terapia com partículas alfa ou terapia com partículas beta.
[0276] Exemplos dos mesmos incluem Octreoscan, 131I-MIBG (I-131 metaiodobenzilguanidina), 211At-MABG (211At-astato-benzilguanidina), Trastuzumabe, Anticorpo humanizado A33 (Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 2005 Oct; 20(5): 514-23.), Omburtamabe, Tenatumomabe, anticorpo CD45 (ClinicalTrials. Identificador gov: NCT03128034; 9595; NCI-2017-00452), Ibritumomabe e Actimabe.
[0277] Além disso, outra modalidade da biomolécula é HuM195, MX35-F(ab’)2 anticorpos monoclonais, 9.2.27 Murino, antígeno Proteoglicano (MCSP), antígeno CD20, antígeno CD30 ou semelhantes divulgados em estudos de câncer e medicina molecular (Cancer studies and molecular medicine (2004), 1, 1, 1-7).
[0278] Além disso, outra modalidade da biomolécula é CD19, GD2, caderina VE ou semelhantes.
[0279] Uma modalidade da biomolécula é um fragmento Fab de anticorpo MUC1 (referido como Fab3, Fab4 ou Fab5), e exemplos incluem o que é divulgado na Publicação Internacional WO2018/092885.
[0280] [1M] Especificamente, o Fab3 ou Fab4 é um fragmento Fab de anticorpo MUC1 anti-humano selecionado do grupo que consiste nos seguintes (a) e (b), e um fragmento Fab tendo um fragmento de cadeia pesada incluindo uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 12 é referido como Fab3, e um fragmento Fab tendo um fragmento de cadeia pesada incluindo uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 14 é referido como Fab4: (a) um fragmento Fab de anticorpo MUC1 anti-humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada incluindo uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14 e uma cadeia leve incluindo uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 16; e (b) um fragmento Fab de anticorpo MUC1 anti-humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada incluindo uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14 e em que a glutamina do aminoácido 1 da SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14 é modificada para ácido piroglutâmico, e uma cadeia leve incluindo uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:
16.
[0281] [2M] Uma modalidade é o fragmento Fab de anticorpo MUC1 anti- humano de acordo com [1M], que é selecionado do grupo que consiste nos seguintes (a) e (b): (a) um fragmento Fab de anticorpo MUC1 anti-humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 8 e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 10; e (b) um fragmento Fab de anticorpo MUC1 anti-humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 8 e em que a glutamina do aminoácido 1 da SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 8 é modificada para ácido piroglutâmico, e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 10.
[0282] [3M] Uma modalidade é o fragmento Fab de anticorpo MUC1 anti- humano de acordo com [1M], que é selecionado do grupo que consiste nos seguintes
(a) e (b): (a) um fragmento Fab de anticorpo MUC1 anti-humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada incluindo uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 14 e uma cadeia leve incluindo uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 16; e (b) um fragmento Fab de anticorpo MUC1 anti-humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada incluindo uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 14 e em que a glutamina do aminoácido 1 da SEQ ID NO: 10 é modificada para ácido piroglutâmico, e uma cadeia leve incluindo uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 16.
[0283] [4M] Uma modalidade é o fragmento Fab de anticorpo MUC1 anti- humano de acordo com [3M], que é selecionado do grupo que consiste nos seguintes (a) e (b): (a) um fragmento Fab de anticorpo MUC1 anti-humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 8 e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 10; e (b) um fragmento Fab de anticorpo MUC1 anti-humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 8 e em que a glutamina do aminoácido 1 da SEQ ID NO: 8 é modificada para ácido piroglutâmico, e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 10.
[0284] [5M] Uma modalidade é o fragmento Fab de anticorpo MUC1 anti- humano de acordo com [4M], que é um fragmento Fab de anticorpo MUC1 anti- humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 6 e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 10.
[0285] [6M] Uma modalidade é o fragmento Fab de anticorpo MUC1 anti- humano de acordo com [4M], que é um fragmento Fab de anticorpo MUC1 anti- humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 8 e em que a glutamina do aminoácido 1 da SEQ ID NO: 8 é modificada para ácido piroglutâmico, e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 10.
[0286] [7M] P10-1 ou P10-2 (referido como Fab5), que é o fragmento Fab de anticorpo anti-MUC1 divulgado na Publicação Internacional WO2018/092885.
[0287] Além disso, o conjugado da presente invenção pode ser composto por uma combinação das modalidades individuais descritas acima.
7. Composição de diagnóstico e método para diagnósticos
[0288] A presente invenção se refere a uma composição de diagnóstico compreendendo um conjugado da presente invenção incluindo um metal (em seguida, referido como um conjugado detectável da presente invenção). A composição de diagnóstico da presente invenção pode incluir um ou mais conjugados da presente invenção. Isto é, a composição de diagnóstico da presente invenção pode incluir um conjugado da presente invenção, ou pode incluir uma combinação de dois ou mais conjugados da presente invenção. O conjugado detectável da presente invenção pode ser formulado de acordo com um método convencional e usado como um fármaco de diagnóstico precoce ou um fármaco de estadiamento (particularmente um fármaco de diagnóstico para um câncer).
[0289] O fármaco de diagnóstico precoce significa um fármaco de diagnóstico cujo propósito é fazer um diagnóstico em um estágio onde nenhuma condição da doença seja observada ou em um estágio inicial da doença. Por exemplo, no caso de um câncer, o fármaco de diagnóstico precoce significa um fármaco de diagnóstico usado em um estágio onde nenhuma condição da doença seja observada ou no estágio 0 ou estágio 1.
[0290] O fármaco de estadiamento significa um fármaco de diagnóstico que pode examinar até que ponto a condição da doença progrediu. Por exemplo, no caso de um câncer, o fármaco de estadiamento significa um fármaco de diagnóstico que pode examinar o estágio do mesmo.
[0291] O câncer que se espera que seja capaz de ser diagnosticado pela composição de diagnóstico da presente invenção é um câncer que expressa CEACAM5 humano. Em uma modalidade, exemplos dos mesmos incluem câncer colorretal, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer da tireoide e um câncer resultante de metástase dos mesmos. Em uma modalidade, o câncer é câncer colorretal ou um câncer resultante de metástase de câncer colorretal. Mais preferivelmente, o câncer é um câncer resultante de metástase de câncer colorretal, e esse câncer inclui câncer metastático de fígado. Além disso, o câncer é um câncer que expressa MUC1 humana. Em uma modalidade, exemplos do câncer incluem câncer de mama, câncer de pulmão, câncer colorretal, câncer de bexiga, câncer de pele, câncer da tireoide, câncer gástrico, câncer pancreático, câncer de rim, câncer ovariano ou câncer cervical. Em uma modalidade, o câncer é câncer de mama ou câncer de bexiga.
[0292] A quantidade do conjugado da presente invenção adicionada na formulação da composição de diagnóstico da presente invenção varia dependendo do grau de um sintoma e a idade do paciente, a forma de dosagem da formulação usada, a potência de ligação do fragmento Fab ou da biomolécula e semelhantes e, por exemplo, cerca de 0,001 mg/kg a 100 mg/kg podem ser usados com base na massa do fragmento Fab ou Biomolécula por unidade peso corpóreo do paciente.
[0293] Exemplos da forma de dosagem da composição de diagnóstico da presente invenção incluem uma preparação parenteral, tal como um injeção ou uma infusão, e pode ser administrada por injeção intravenosa, injeção intramuscular em um tecido alvo local, injeção subcutânea, administração intravesical ou semelhantes. Além disso, na formulação, um portador e um aditivo de acordo com essas formas de dosagem podem ser usados dentro de uma faixa farmaceuticamente aceitável. Os tipos de um portador e aditivo farmaceuticamente aceitável não são particularmente limitados, e um portador e um aditivo bem conhecido pelo técnico no assunto podem ser usados.
[0294] A presente invenção também se refere ao uso de um conjugado detectável da presente invenção para a produção de uma composição para diagnósticos precoces ou uma composição para estadiamento de um câncer. A presente invenção também se refere a um conjugado detectável da presente invenção para o uso em diagnósticos precoces e estadiamento de um câncer.
[0295] Além disso, a presente invenção também se refere a um método para diagnosticar um câncer, compreendendo administrar um conjugado detectável da presente invenção a um sujeito. Aqui, o “sujeito” se refere a um humano ou outro animal mamífero que precisa ser diagnosticado. Em uma modalidade, o sujeito é um humano que precisa ser diagnosticado. A quantidade eficaz do conjugado detectável da presente invenção no método para diagnósticos da presente invenção pode ser a mesmo quantidade que a quantidade eficaz do conjugado da presente invenção na formulação acima. No método para diagnósticos da presente invenção, o conjugado detectável da presente invenção pode ser administrado por injeção intramuscular em um tecido alvo local, injeção subcutânea ou semelhantes.
[0296] Em outra modalidade, a presente invenção também se refere ao uso de um fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano para a produção de um conjugado incluindo o fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano da presente invenção, um conector de peptídeo e/ou um ligante. Em uma modalidade, a presente invenção também se refere ao uso de um fragmento Fab de anticorpo anti-
CEACAM5 humano para a produção de uma composição de diagnóstico incluindo o conjugado da presente invenção.
[0297] Além disso, em uma modalidade, quando a composição de diagnóstico da presente invenção incluindo um radioisótopo de metal é fornecida, pode ser marcada com o radioisótopo de metal imediatamente antes do uso da composição e pode ser fornecida como uma composição de diagnóstico incluindo o radioisótopo de metal.
8. Composição farmacêutica e método para tratamento
[0298] Na presente invenção, cerca de 0,001 mg/kg a 100 mg/kg podem ser usados com base na massa de um ou mais fragmentos Fab conjugados da presente invenção incluindo um radioisótopo de metal, tal como 90Y ou 177Lu.
[0299] Uma composição farmacêutica incluindo o conjugado da presente invenção pode ser usada para o tratamento de um câncer. Um câncer que se espera que seja capaz de ser tratado com uma composição farmacêutica incluindo o conjugado da presente invenção é um câncer que expressa CEACAM5 humano, e exemplos dos mesmos incluem câncer colorretal, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer da tireoide e um câncer resultante de metástase dos mesmos. Alternativamente, um câncer que se espera que seja capaz de ser tratado com uma composição farmacêutica incluindo o conjugado da presente invenção é um câncer que expressa MUC1 humana, e exemplos dos mesmos incluem câncer de mama, câncer de pulmão, câncer colorretal, câncer de bexiga, câncer de pele, câncer da tireoide, câncer gástrico, câncer pancreático, câncer de rim, câncer ovariano ou câncer cervical. Em uma modalidade, o câncer é câncer de mama ou câncer de bexiga.
[0300] A presente invenção inclui uma composição farmacêutica incluindo o conjugado da presente invenção para tratar câncer colorretal ou um câncer resultante de metástase de câncer colorretal. Além disso, a presente invenção inclui um método para tratar câncer colorretal ou um câncer resultante de metástase de câncer colorretal, compreendendo uma etapa de administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do conjugado da presente invenção. Além disso, a presente invenção inclui um método para induzir a morte celular de uma célula de câncer do câncer colorretal ou um câncer resultante de metástase de câncer colorretal, compreendendo uma etapa de administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do conjugado da presente invenção.
[0301] A composição farmacêutica para tratar um câncer também pode ser usada nos diagnósticos de um câncer. Por exemplo, a composição farmacêutica para tratar câncer colorretal ou um câncer resultante de metástase de câncer colorretal também pode ser usada para os diagnósticos do câncer.
[0302] Além disso, a presente invenção inclui um conjugado da presente invenção para o uso no tratamento de câncer colorretal ou um câncer resultante de metástase de câncer colorretal. Além disso, a presente invenção inclui o uso de um conjugado da presente invenção para a produção de uma composição farmacêutica para tratar câncer colorretal ou um câncer resultante de metástase de câncer colorretal.
[0303] Em outra modalidade, a presente invenção também se refere ao uso de um fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano para a produção de uma composição farmacêutica incluindo o conjugado da presente invenção.
[0304] Nas modalidades acima, uma biomolécula pode ser usada em vez de um fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano. O conjugado da presente invenção pode ser fornecido como uma composição de diagnóstico ou uma composição farmacêutica para uma doença associada com uma biomolécula.
[0305] A presente invenção foi descrita em geral, e os exemplos específicos referidos para obter melhor entendimento serão fornecidos aqui. Entretanto, estes são para fins de ilustração e não são intencionados a limitar a presente invenção.
EXEMPLOS
[0306] As seguintes abreviações podem ser usadas nos seguintes exemplos e nas tabelas fornecidas posteriormente.
[0307] Gd/DOTA: 3arm DOTA marcado com Gd, Gd/4arm DOTA: 4arm DOTA marcado com Gd, MS: espectrometria de massa, ESI+: valor m/z (método de ionização ESI, a menos que de outro modo especificado [M+H]+), ESI-: valor m/z (método de ionização ESI, a menos que de outro modo especificado [M-H]-), APCI/ESI+: valor m/z (método de ionização APCI/ESI, APCI/ESI significa medição simultânea de APCI e ESI. A menos que de outro modo especificado [M+H]+), APCI/ESI-: valor m/z (método de ionização APCI/ESI, a menos que de outro modo especificado [M+H]-), Ex-No: número do conjugado, SNo: número do Exemplo de Produção, Str: fórmula estrutural química, Me: metila, Et: etila, tBu: terc-butila, 1,3-F: 1,3-fenileno, 1,4-F: 1,4-fenileno, dif-Ala: difenilalanina e naf-Ala: 3-(2-naftil)alanina. (Exemplo 1: Preparação de fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano)
[0308] T84.66, que é um anticorpo anti-CEACAM5 humano derivado de um camundongo, foi humanizado com referência ao método divulgado na literatura (Protein Eng. Des. Sel.; 2004; 17: 481-489), e depois um modelo molecular do anticorpo humanizado construído de acordo com a literatura (Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics; 2014; 82: 1624-1635) foi usado para projetar um anticorpo tendo uma região variável onde se esperava que a afinidade não fosse atenuada, mesmo pela ligação de uma porção de marcação.
[0309] Um gene do fragmento de cadeia pesada foi formado conectando-se um gene que codifica uma sequência sinal (Protein Engineering; 1987; 1: 499-505) ao lado 5’ do gene da região variável de cadeia pesada do anticorpo, e um gene da região Fab de Igγ1 humano (que consiste na sequência de nucleotídeos de nucleotídeos 364 a 678 de SEQ ID NO: 1) ao lado 3’, e este gene do fragmento de cadeia pesada foi inserido no vetor GS pEE6.4 (Lonza). Além disso, um gene de cadeia leve foi formado conectando-se um gene que codifica uma sequência sinal ao lado 5’ do gene da região variável de cadeia leve do anticorpo, e um gene da região constante de IgϏ humano (que consiste na sequência de nucleotídeos de nucleotídeos 337 a 657 de SEQ ID NO: 3) ao lado 3’, e este gene de cadeia leve foi inserido no vetor GS pEE12.4 (Lonza). Os vetores pEE descritos acima nos quais o gene do fragmento de cadeia pesada e o gene de cadeia leve do anticorpo, respectivamente, foram inseridos foram submetidos à clivagem da enzima de restrição com NotI e PvuI, e ligação foi realizada usando o kit de ligação TAKARA Ligation Kit Ver2.1 (Takara Bio Inc.) para construir um vetor GS no qual tanto o gene do fragmento de cadeia pesada quanto o gene de cadeia leve foram inseridos.
[0310] Usando o vetor GS descrito acima, no qual o gene do fragmento de cadeia pesada e o gene de cadeia leve foram inseridos, a expressão do anticorpo foi realizada por dois métodos, expressão transiente e expressão constitutiva. Para a expressão transiente, células Expi293F (Thermo Fisher Scientific Inc.) cultivadas em cerca de 3 milhões de células/mL em meio de expressão Expi293 (Thermo Fisher Scientific Inc.) foram transfectadas com o vetor GS descrito acima no qual tanto o gene do fragmento de cadeia pesada quanto o gene de cadeia leve foram inseridos, usando o Kit de Transfecção ExpiFectamine 293 (Thermo Fisher Scientific Inc.), e cultivados por 5 a 7 dias. O sobrenadante da cultura foi purificado usando KappaSelect (GE Healthcare Japan Corporation) para obter um fragmento Fab. Para a expressão constitutiva, as células CHOK1SV (Lonza) foram transfectadas com o vetor GS descrito acima, no qual tanto o gene do fragmento de cadeia pesada quanto o gene de cadeia leve foram inseridos linearizados com PvuI, por um método de eletroporação usando Gene Pulser (Bio-Rad Laboratories, Inc.). No dia seguinte à transfecção, foi adicionada metionina sulfoximina e as células foram cultivadas durante 5 a 7 dias. As células foram semeadas em um meio semissólido contendo metilcelulose e, após a colonização, as células com um alto nível de expressão de fragmento Fab foram obtidas usando ClonePix FL (Molecular Devices, LLC). O sobrenadante da cultura das células foi purificado usando Capto L (GE Healthcare Japan Corporation), Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare Japan Corporation) e BioPro S75 (YMC Co., Ltd.) para obter um fragmento Fab.
[0311] A sequência de nucleotídeos que codifica o fragmento de cadeia pesada do fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano preparado (referido como PB009-01 ou Fab2) é mostrada na SEQ ID NO: 1, e a sequência de aminoácidos codificada desse modo é mostrada na SEQ ID NO: 2, a sequência de nucleotídeos que codifica a cadeia leve de PB009-01 é mostrada na SEQ ID NO: 3, e a sequência de aminoácidos codificada desse modo é mostrada na SEQ ID NO: 4. A região variável de cadeia pesada de PB009-01 consiste na sequência de aminoácidos de aminoácidos 1 a 121 de SEQ ID NO: 2 e CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada consiste das sequências de aminoácidos de aminoácidos 31 a 35, 50 a 66, e 99 a 110, respectivamente, de SEQ ID NO: 2. A região variável de cadeia leve de PB009-01 consiste na sequência de aminoácidos de aminoácidos 1 a 112 de SEQ ID NO: 4 e CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve consiste das sequências de aminoácidos de aminoácidos 24 a 38, 54 a 60, e 93 a 101, respectivamente, de SEQ ID NO: 4.
[0312] As regiões variáveis e sequências de CDR foram determinadas de acordo com a numeração de Kabat (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., United States Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda). (Exemplo 2: Preparação de conjugado de fragmento Fab de anticorpo anti- CEACAM5 humano)
[0313] O presente exemplo divulga Exemplos de Produção do conjugado. Na apresentação de cada Exemplo de Produção no presente Exemplo, “Exemplo 2” é seguido por um hífen seguido por um “número de conjugado”. Por exemplo, “Exemplo
2-11” mostra que é o Exemplo de Produção do conjugado 11 no presente Exemplo.
Além disso, Fab2 no presente Exemplo é o fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano (PB009-01/Fab2) obtido no Exemplo 1, e “p-Fab” mostra que Fab2 está ligado a porções de marcação p incluídas por []) através de seus grupos p amino para formar um conjugado.
Em alguns dos exemplos a seguir, o número de porções de marcação (Y-S1-X) ligadas a Fab2 de cada conjugado que foi confirmado por análise de MS é descrito, mas o resultado não mostra que um conjugado tendo uma série de porções de marcação limite diferente do número acima não está incluído.
Será fácil entender que ainda pode haver um conjugado com várias porções de marcação ligadas, cuja presença não foi capaz de ser confirmada devido à precisão do equipamento de análise de MS.
Além disso, nas fórmulas estruturais no presente exemplo, a fórmula estrutural de DOTA ao qual Gd está ligado mostra esquematicamente DOTA marcado com Gd. (Exemplo 2-11. Síntese de ([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,3-F)-C(=O)-Asp-Gli-Lis*- Z2(#N)]p-Fab2)) [Fórmula Química 107]
(i) Síntese de O4-terc-butil-N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L-α- aspartilglicil-N6-[(benzilóxi)carbonil]-L-lisinato de terc-butila
[0314] Ácido trifluoroacético (em seguida, abreviado como TFA) (3 mL) foi adicionado a uma solução de N-(terc-butoxicarbonil)glicil-N6-[(benzilóxi)carbonil]-L-
lisinato de terc-butila (1,00 g) em diclorometano (6 mL) sob resfriamento em gelo, e a mistura resultante foi agitada na mesma temperatura por 2 horas. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida, depois uma solução aquosa saturada de hidrogenocarbonato de sódio foi adicionada, e a mistura resultante foi extraída duas vezes com diclorometano. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com uma solução aquosa saturada de cloreto de sódio, e depois seca sobre sulfato de sódio anidro, filtrada e depois concentrada. A este resíduo, hidrogeno-N-[(9H-fluoren- 9-ilmetóxi)carbonil]-L-aspartato de O4-terc-butila (920 mg), diclorometano (10 mL), di- isopropilaetilamina (em seguida, abreviado como DIPEA) (2 mL), 1-(Dimetilamino)- N,N-dimetil-1-[(3H-[1,2,3]triazolo[4,5-b]piridin-3-il)óxi]metanimínio hexafluoridofosfato(1-) (em seguida, abreviado como HATU) (1,2 g) foi adicionado, e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 16 horas. Uma solução aquosa saturada de hidrogenocarbonato de sódio foi adicionada, e a mistura resultante foi extraída duas vezes com diclorometano. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com uma solução aquosa saturada de cloreto de sódio, e depois seca sobre sulfato de sódio anidro, filtrada e depois concentrada para obter o composto do título (2,86 g). MS (ESI+); 809,5 [M+Na]+ (ii) Síntese de O4-terc-butil-L-α-aspartilglicil-N6-[(benzilóxi)carbonil]-L-lisinato de terc-butila
[0315] Morfolina (6 mL) foi adicionada a uma solução de O4-terc-butil-N-[(9H- fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L-α-aspartilglicil-N6-[(benzilóxi)carbonil]-L-lisinato de terc- butila (2,86 g) em tetra-hidrofurano (em seguida, abreviado como THF) (10 mL), e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 1 hora. A mistura foi esfriada em um banho de gelo, depois o sólido resultante foi filtrado, e o resíduo foi lavado com metanol. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida, e depois o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (gradiente de solvente; 0 → 4 % metanol/clorofórmio) para obter o composto do título (1,04 g). MS
(ESI+); 565,5 (iii) Síntese de N-(3-{[(terc-butoxicarbonil)amino]metil}benzoil)-O4-terc-butil-L- α-aspartilglicil-N6-[(benzilóxi)carbonil]-L-lisinato de terc-butila
[0316] Uma mistura de O4-terc-butil-L-α-aspartilglicil-N6-[(benzilóxi)carbonil]- L-lisinato de terc-butila (570 mg), diclorometano (6 mL), ácido 3-{[(terc- butoxicarbonil)amino]metil}benzoico (305 mg), DIPEA (520 µL) e HATU (575 mg) foi agitada na temperatura ambiente por 43 horas. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida, e depois o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (gradiente de solvente; 0 → 80 % acetato de etila/hexano) para obter o composto do título (712 mg). MS (ESI+); 798,6 (iv) Síntese de N-[3-(aminometil)benzoil]-O4-terc-butil-L-α-aspartilglicil-N6- [(benzilóxi)carbonil]-L-lisinato de terc-butila
[0317] TFA (2 mL) foi adicionado a uma solução de N-(3-{[(terc- butoxicarbonil)amino]metil}benzoil)-O4-terc-butil-L-α-aspartilglicil-N6- [(benzilóxi)carbonil]-L-lisinato de terc-butila (712 mg) em diclorometano (2 mL) sob resfriamento em gelo, e a mistura resultante foi agitada na mesma temperatura por 7 horas. Trietilamina e gel de sílica com amino foram adicionados, a mistura resultante foi concentrada sob pressão reduzida, e depois o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (gel de sílica com amino, gradiente de solvente; 0 → 2 % metanol/clorofórmio) para obter o composto do título (495 mg). MS (ESI+); 698,4 (v) Síntese de O4-terc-butil-N-[3-({2-[4,7,10-tris(2-terc-butóxi-2-oxoetil)- 1,4,7,10-tetra-azaciclododecan-1-il]acetamido}metil)benzoil]-L-α-aspartilglicil-N6- [(benzilóxi)carbonil]-L-lisinato de terc-butila
[0318] Uma mistura de N-[3-(aminometil)benzoil]-O4-terc-butil-L-α- aspartilglicil-N6-[(benzilóxi)carbonil]-L-lisinato de terc-butila (495 mg), N,N- dimetilformamida (em seguida, abreviado como DMF) (5 mL), ácido [4,7,10-tris(2-terc-
butóxi-2-oxoetil)-1,4,7,10-tetra-azaciclododecan-1-il]acético (em seguida, abreviado como DOTA-tris(t-Bu) éster) (446 mg), DIPEA (400 µL) e HATU (404 mg) foi agitada na temperatura ambiente por 66 horas. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida, e depois o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (gradiente de solvente; 0 → 20 % metanol/clorofórmio) para obter o composto do título (387 mg). MS (ESI+); 1275,5 [M+Na]+ (vi) Síntese de O4-terc-butil-N-[3-({2-[4,7,10-tris(2-terc-butóxi-2-oxoetil)- 1,4,7,10-tetra-azaciclododecan-1-il]acetamido}metil)benzoil]-L-α-aspartilglicil-L- lisinato de terc-butila
[0319] Uma mistura de O4-terc-butil-N-[3-({2-[4,7,10-tris(2-terc-butóxi-2- oxoetil)-1,4,7,10-tetra-azaciclododecan-1-il]acetamido}metil)benzoil]-L-α-aspartilglicil- N6-[(benzilóxi)carbonil]-L-lisinato de terc-butila (387 mg), paládio a 10 % em carbono (teor de água de 50 %, 65 mg) e etanol (4 mL) foi agitada sob uma atmosfera de hidrogênio (1 atm) na temperatura ambiente por 5 horas. A mistura foi filtrada usando Celite e concentrada. Paládio a 10 % em carbono (50 % úmido com água, 650 mg) e etanol (8 mL) foram adicionados ao resíduo, e a mistura resultante foi agitada sob uma atmosfera de hidrogênio (1 atm) na temperatura ambiente por 20 horas. A mistura foi filtrada usando Celite e depois concentrada para obter o composto do título (336 mg). MS (ESI+); 1140,5 [M+Na]+ (vii) Síntese de O4-terc-butil-N-[3-({2-[4,7,10-tris(2-terc-butóxi-2-oxoetil)- 1,4,7,10-tetra-azaciclododecan-1-il]acetamido}metil)benzoil]-L-α-aspartilglicil-6-(2,5- dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato de terc-butila
[0320] Uma solução de 2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-carboxilato de metila (56 mg) e THF (5 mL) foi adicionada a uma mistura de O4-terc-butil-N-[3-({2- [4,7,10-tris(2-terc-butóxi-2-oxoetil)-1,4,7,10-tetra-azaciclododecan-1- il]acetamido}metil)benzoil]-L-α-aspartilglicil-L-lisinato de terc-butila (336 mg) e uma solução aquosa saturada de hidrogenocarbonato de sódio (2,5 mL) sob resfriamento em gelo, e a mistura resultante foi agitada na mesma temperatura por 2 horas. Uma solução aquosa de hidróxido de sódio 1 M (60 µL) foi adicionada sob resfriamento em gelo, e depois a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 1 hora. Acetato de etila e uma solução aquosa de ácido cítrico a 10 % foram adicionados, e depois a camada orgânica foi separada. A camada aquosa foi extraída com metanol a 10 %/clorofórmio, e a camada orgânica coletada foi seca sob sulfato de sódio anidro e filtrada. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida, e depois o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (gradiente de solvente; 0 → 20 % metanol/clorofórmio) para obter o composto do título (341 mg). MS (ESI+); 1198,5 (viii) Síntese de N-[3-({2-[4,7,10-tris(carboximetil)-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-1-il]acetamido}metil)benzoil]-L-α-aspartilglicil-6-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucina
[0321] TFA (2 mL) foi adicionado a uma solução de O4-terc-butil-N-[3-({2- [4,7,10-tris(2-terc-butóxi-2-oxoetil)-1,4,7,10-tetra-azaciclododecan-1- il]acetamido}metil)benzoil]-L-α-aspartilglicil-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L- norleucinato de terc-butila (341 mg) em diclorometano (2 mL), e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 5 horas. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida, e depois o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em fase reversa (gradiente de solvente; 0 → 20 % acetonitrila/solução aquosa de TFA a 0,1 %) para obter o composto do título (99,6 mg). MS (ESI+); 918,3 (ix) Síntese de [N-{3-[(2-{4,7,10-tris[(carbóxi-ϏO)metil]-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-1-il-Ϗ4N1,N4,N7,N10}acetamido-ϏO)metil]benzoil}-L-α-aspartilglicil-6- (2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato(3-)]gadolínio
[0322] Uma solução aquosa de hidrogenocarbonato de sódio (0,1 M, 800 µL) foi adicionada a uma mistura de N-[3-({2-[4,7,10-tris(carboximetil)-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-1-il]acetamido}metil)benzoil]-L-α-aspartilglicil-6-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucina (20,0 mg), água (2 mL) e cloreto de gadolínio (6 mg),
e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 10 minutos. Uma solução aquosa de hidrogenocarbonato de sódio (0,1 M, 60 µL) foi adicionada, e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 1 hora. Uma solução aquosa de ácido etilenodiaminatetra-acético (em seguida, abreviado como EDTA) (0,5 M, 300 µL) foi adicionada, e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 10 minutos. A mistura de reação foi purificada por cromatografia em coluna em fase reversa (gradiente de solvente; 0 → 25 % acetonitrila/solução aquosa de TFA a 0,1 %) para obter o composto do título (12,0 mg). MS (ESI-); 1071,4 (x) Síntese de conjugado No 11
[0323] [N-{3-[(2-{4,7,10-tris[(carbóxi-ϏO)metil]-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-1-il-Ϗ4N1,N4,N7,N10}acetamido-ϏO)metil]benzoil}-L-α-aspartilglicil-6- (2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato(3-)]gadolínio (1 mg) foi dissolvido em DMSO (40 µL). 40 µL da solução resultante foram dispensados, um tampão de borato 0,1 M (40 µL) foi adicionado, e uma solução aquosa de carbonato de sódio 0,1 M foi adicionada de modo a fornecer um pH de 6,6.
[0324] A solução previamente preparada foi adicionada a um tampão de borato Fab2 de 4,45 mg/mL (160 µL), e a mistura resultante foi incubada a 30 °C por 2 horas. Uma solução aquosa de EDTA 0,05 M (40 µL) foi adicionada, e depois a mistura resultante foi incubada a 30 °C por 10 minutos. A mistura foi purificada através de uma coluna PD-10, e a solução resultante foi recuperada usando um filtro centrífugo Amicon Ultra de 0,5 mL (Merck Millipore). A solução recuperada foi lavada com solução salina tamponada com fosfato 7 vezes repetidamente, finalmente concentrada e depois filtrada através de um filtro de membrana para obter um conjugado. Foi confirmado pela análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual um [Gd/DOTA-NH-CH2-(1,3-F)-C(=O)-Asp-Gli-Lis*-Z2(#N)] tendo um peso molecular de 1073 foi ligado a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa, um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele e um conjugado no qual três de tais moléculas foram ligadas a ele. (Exemplo 2-12. Síntese de ([Gd/4arm-DOTA-CH2-(1,4-F)-NH-C(=S)-Gli-Phe- Lis*-Z2(#N)]p-Fab2)) [Fórmula Química 108]
(i) Síntese de N-(terc-butoxicarbonil)-L-fenilalanil-N6-[(benzilóxi)carbonil]-L- lisinato de terc-butila
[0325] Monocloridreto de N6-[(benzilóxi)carbonil]-L-lisinato de terc-butila (2,1 g), Et3N (2,4 mL) e HATU (2,5 g) foram sequencialmente adicionados a uma mistura líquida de N-(terc-butoxicarbonil)-L-fenilalanina (1,5 g) em diclorometano (30 ml), e a mistura resultante foi reagida durante a noite na temperatura ambiente.
[0326] A mistura de reação foi concentrada e depois purificada através de uma coluna de gel de sílica (gradiente de solvente; 10 → 50 % acetato de etila/hexano) para obter o composto do título (3,16 g). MS (ESI+): 606,4 [M+Na]+ (ii) Síntese de N-(terc-butoxicarbonil)-L-fenilalanil-L-lisinato de terc-butila
[0327] Uma mistura de etanol (60 ml) de N-(terc-butoxicarbonil)-L-fenilalanil- N6-[(benzilóxi)carbonil]-L-lisinato de terc-butila (3150 mg) e paládio a 10 % em carbono (teor de água de 50 %, 1000 mg) foi agitada sob uma atmosfera de hidrogênio (1 atm) na temperatura ambiente por 4 horas e meia. Os materiais de partida permaneceram e, portanto, o sistema foi purgado com argônio, depois a mistura foi filtrada através de Celite, e o filtrado foi concentrado. O resíduo foi dissolvido em metanol (60 ml), paládio a 10 % em carbono (50 % úmido com água, 1000 mg) foi adicionado, e a mistura resultante foi agitada sob uma atmosfera de hidrogênio (1 atm) na temperatura ambiente por 5 horas. O desaparencimento do material de partida foi confirmado, depois o sistema foi purgado com argônio, a mistura foi filtrada através de Celite, e o filtrado foi concentrado para obter o composto do título (2520 mg). MS (ESI+): 450,4 (iii) Síntese de N-(terc-butoxicarbonil)-L-fenilalanil-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro- 1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato de terc-butila
[0328] Uma solução de 2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-carboxilato de metila (340 mg) em THF (12 ml) foi adicionada a uma suspensão de N-(terc- butoxicarbonil)-L-fenilalanil-L-lisinato de terc-butila (825 mg) em uma solução aquosa saturada de hidrogenocarbonato de sódio (6 ml) sob resfriamento em gelo. A mistura resultante foi agitada na mesma temperatura por 2 horas, e depois uma solução aquosa de hidróxido de sódio 1 M (0,36 ml) foi adicionada, e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 1 hora. A mistura foi diluída com acetato de etila e água, e depois acidificada com uma solução aquosa de ácido cítrico a 10 %. A camada orgânica foi separada, lavada com uma solução aquosa saturada de hidrogenocarbonato de sódio e salmoura saturada, seca sobre sulfato de magnésio, e filtrada, e depois o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado através de uma coluna de gel de sílica (gradiente de solvente; 0 → 8 % metanol/clorofórmio) para obter o composto do título (743 mg). MS (ESI+): 552,4 [M+Na]+ (iv) Síntese de mono(trifluoroacetato) de L-fenilalanil-6-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato de terc-butila
[0329] TFA (2 ml) foi adicionado às gotas a uma solução de N-(terc- butoxicarbonil)-L-fenilalanil-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato de terc-butila (325 mg) em diclorometano (4 ml) sob resfriamento em gelo. A mistura resultante foi agitada na mesma temperatura por 1 hora. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida obter um produto bruto do composto do título (418 mg). MS (ESI+): 430,4 (v) Síntese de N-(terc-butoxicarbonil)glicil-L-fenilalanil-6-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato de terc-butila
[0330] N-(terc-butoxicarbonil)glicina (118 mg), trietilamina (em seguida, abreviado como TEA) (0,26 ml) e HATU (256 mg) foram sequencialmente adicionados a uma mistura de mono(trifluoroacetato) de L-fenilalanil-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H- pirrol-1-il)-L-norleucinato de terc-butila (415 mg) em diclorometano (10 ml), e a mistura resultante foi agitada durante a noite na temperatura ambiente. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida e depois purificada através de uma coluna de gel de sílica (gradiente de solvente; 0 → 30 % acetona/clorofórmio) para obter o composto do título (206 mg). MS (ESI+): 609,4 [M+Na)+ (vi) Síntese de mono(trifluoroacetato) de glicil-L-fenilalanil-6-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato de terc-butila
[0331] Usando N-(terc-butoxicarbonil)glicil-L-fenilalanil-6-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato de terc-butila (205 mg), um produto bruto do composto do título (223 mg) foi obtido na mesma maneira como no Exemplo 2-12 (iv) acima. MS (ESI+): 487,4 (vii) Síntese de mono(trifluoroacetato) de glicil-L-fenilalanil-6-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucina
[0332] TFA (1 ml) foi adicionado a uma mistura de mono(trifluoroacetato) de glicil-L-fenilalanil-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato de terc-butila (9 mg) em diclorometano (1 ml), e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 1 hora. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida para obter um produto bruto do composto do título (8 mg). MS (ESI+): 431,3 (viii) Síntese de N-[(4-{[1,4,7,10-tetracis(carboximetil)-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-2-il]metil}fenil)carbamotioil]glicil-L-fenilalanil-6-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucina
[0333] DIPEA (35 µL) foi adicionado a uma mistura de mono(trifluoroacetato) de glicil-L-fenilalanil-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucina (8 mg) e ácido 2,2’,2’’,2’’’-{2-[(4-isotiocianatofenil)metil]-1,4,7,10-tetra-azaciclododecano- 1,4,7,10-tetrail}tetra-acético (abreviado como p-SCN-Bn-DOTA) (8 mg) em DMF (1 ml), e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 1,5 horas. A mistura foi diluída com uma solução aquosa de TFA a 1 % (cerca de 5 ml) e purificada por cromatografia em coluna em fase reversa (gradiente de solvente 5 → 50 % acetonitrila/solução aquosa de TFA a 0,1 %) para obter o composto do título (13 mg). MS (ESI+): 982,3 (ix) Síntese de [N-{[4-({1,4,7,10-tetracis[(carbóxi-ϏO)metil]-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-2-il-Ϗ4N1,N4,N7,N10}metil)fenil]carbamotioil}glicil-L-fenilalanil-6-(2,5- dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato(4-)]gadolinato(1-) de hidrogênio
[0334] N-[(4-{[1,4,7,10-tetracis(carboximetil)-1,4,7,10-tetra-azaciclododecan-
2-il]metil}fenil)carbamotioil]glicil-L-fenilalanil-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L- norleucina (12 mg) foi diluída com água (5 ml) e cloreto de gadolínio (4 mg) foi adicionado. O pH da mistura foi ajustado para 5 a 6 com hidrogenocarbonato de sódio 0,1 M, e a mistura foi agitada na temperatura ambiente por 1 hora. Uma solução aquosa de EDTA 0,5 M (80 µL) foi adicionada à mistura, e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 5 minutos. TFA (10 µL) foi adicionado, e depois a mistura resultante foi purificada por cromatografia em coluna em fase reversa (gradiente de solvente 5 → 50 % acetonitrila/solução aquosa de TFA a 0,1 %) para obter o composto do título (5 mg). MS (ESI+): 1137,0 (x) Síntese de conjugado No 12
[0335] Usando [N-{[4-({1,4,7,10-tetracis[(carbóxi-ϏO)metil]-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-2-il-Ϗ4N1,N4,N7,N10}metil)fenil]carbamotioil}glicil-L-fenilalanil-6-(2,5- dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato(4-)]gadolinato(1-) de hidrogênio, um conjugado foi obtido na mesma maneira como na etapa (x) do Exemplo 2-11 acima. Foi confirmado pela análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual um [Gd/4arm-DOTA-CH2-(1,4-F)-NH-C(=S)-Gli-Phe-Lis*-Z2(#N)] tendo um peso molecular de 1136 foi ligado a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa, um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele e um conjugado no qual três de tais moléculas foram ligadas a ele. (Exemplo 2-13. Síntese de ([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,3-F)-C(=O)-Met-Gli-Lis*- Z2(#N)]p-Fab2)) [Fórmula Química 109]
(i) Síntese de N-(terc-butoxicarbonil)-L-metionilglicil-N6-[(benzilóxi)carbonil]-L- lisinato de terc-butila
[0336] TFA (3 mL) foi adicionado a uma solução de N-(terc-
butoxicarbonil)glicil-N6-[(benzilóxi)carbonil]-L-lisinato de terc-butila (1,00 g) em diclorometano (6 mL) sob resfriamento em gelo, e a mistura resultante foi agitada na mesma temperatura por 2 horas. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida, depois uma solução aquosa saturada de hidrogenocarbonato de sódio foi adicionada, e a mistura resultante foi extraída duas vezes com diclorometano. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com uma solução aquosa saturada de cloreto de sódio, e depois seca sobre sulfato de sódio anidro, filtrada e depois concentrada. N-(terc-butoxicarbonil)-L-metionina (556 mg), diclorometano (10 mL), DIPEA (2 mL) e HATU (1,16 g) foram adicionados a este resíduo, e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 1 hora. A solução de reação foi concentrada, depois uma solução aquosa saturada de hidrogenocarbonato de sódio foi adicionada ao resíduo, e a mistura resultante foi extraída duas vezes com diclorometano. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com uma solução aquosa de hidróxido de sódio 1 M e uma solução aquosa saturada de cloreto de sódio, e depois seca sobre sulfato de sódio anidro, filtrada e depois concentrada para obter o composto do título (1,70 g). MS (ESI+); 625,5 (ii) Síntese de L-metionilglicil-N6-[(benzilóxi)carbonil]-L-lisinato de terc-butila
[0337] TFA (4 mL) foi adicionado a uma solução de N-(terc-butoxicarbonil)-L- metionilglicil-N6-[(benzilóxi)carbonil]-L-lisinato de terc-butila (1,70 g) em diclorometano (10 mL) sob resfriamento em gelo, e a mistura resultante foi agitada na mesma temperatura por 7 horas. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida, e depois o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (gel de sílica com amino, gradiente de solvente; 0 → 4 % metanol/clorofórmio) para obter o composto do título (663 mg). MS (ESI+); 525,4 (iii) Síntese de N-(3-{[(terc-butoxicarbonil)amino]metil}benzoil)-L-metionilglicil- N6-[(benzilóxi)carbonil]-L-lisinato de terc-butila
[0338] Uma mistura de L-metionilglicil-N6-[(benzilóxi)carbonil]-L-lisinato de terc-butila (663 mg), diclorometano (6 mL), ácido 3-{[(terc- butoxicarbonil)amino]metil}benzoico (480 mg), DIPEA (700 µL) e HATU (960 mg) foi agitada na temperatura ambiente por 39 horas. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida, e depois o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (gradiente de solvente; 0 → 100 % acetato de etila/hexano) para obter o composto do título (935 mg). MS (ESI+); 758,5 (iv) Síntese de N-[3-(aminometil)benzoil]-L-metionilglicil-N6- [(benzilóxi)carbonil]-L-lisinato de terc-butila
[0339] TFA (2 mL) foi adicionado a uma solução de N-(3-{[(terc- butoxicarbonil)amino]metil}benzoil)-L-metionilglicil-N6-[(benzilóxi)carbonil]-L-lisinato de terc-butila (935 mg) em diclorometano (2 mL) sob resfriamento em gelo, e a mistura resultante foi agitada na mesma temperatura por 1 hora. Et3N e gel de sílica com amino foram adicionados, a mistura resultante foi concentrada sob pressão reduzida, e depois o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (gel de sílica com amino, gradiente de solvente; 0 → 10 % metanol/clorofórmio) para obter o composto do título (260 mg). MS (ESI+); 658,5 (v) Síntese de N-[3-({2-[4,7,10-tris(2-terc-butóxi-2-oxoetil)-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-1-il]acetamido}metil)benzoil]-L-metionilglicil-N6-[(benzilóxi)carbonil]- L-lisinato de terc-butila
[0340] Usando N-[3-(aminometil)benzoil]-L-metionilglicil-N6- [(benzilóxi)carbonil]-L-lisinato de terc-butila (260 mg), o composto do título (353 mg) foi obtido na mesma maneira como na etapa (v) do Exemplo 2-11 acima. MS (ESI-); 1210,4 (vi) Síntese de N-[3-({2-[4,7,10-tris(2-terc-butóxi-2-oxoetil)-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-1-il]acetamido}metil)benzoil]-L-metionilglicil-L-lisinato de terc-butila
[0341] Usando N-[3-({2-[4,7,10-tris(2-terc-butóxi-2-oxoetil)-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-1-il]acetamido}metil)benzoil]-L-metionilglicil-N6-[(benzilóxi)carbonil]-
L-lisinato de terc-butila (353 mg), o composto do título (245 mg) foi obtido na mesma maneira como na etapa (vi) do Exemplo 2-11 acima. MS (ESI+): 1078,8 (vii) Síntese de N-[3-({2-[4,7,10-tris(2-terc-butóxi-2-oxoetil)-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-1-il]acetamido}metil)benzoil]-L-metionilglicil-6-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato de terc-butila
[0342] Usando N-[3-({2-[4,7,10-tris(2-terc-butóxi-2-oxoetil)-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-1-il]acetamido}metil)benzoil]-L-metionilglicil-L-lisinato de terc-butila (245 mg), o composto do título (139 mg) foi obtido na mesma maneira como na etapa (vii) do Exemplo 2-11 acima. MS (ESI+): 1158,8 (viii) Síntese de N-[3-({2-[4,7,10-tris(carboximetil)-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-1-il]acetamido}metil)benzoil]-L-metionilglicil-6-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucina
[0343] Usando N-[3-({2-[4,7,10-tris(2-terc-butóxi-2-oxoetil)-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-1-il]acetamido}metil)benzoil]-L-metionilglicil-6-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato de terc-butila (341 mg), o composto do título (38,2 mg) foi obtido na mesma maneira como na etapa (viii) do Exemplo 2-11 acima. MS (ESI+): 934,4 (ix) Síntese de [N-{3-[(2-{4,7,10-tris[(carbóxi-ϏO)metil]-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-1-il-Ϗ4N1,N4,N7,N10}acetamido-ϏO)metil]benzoil}-L-metionilglicil-6- (2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato(3-)]gadolínio
[0344] Usando N-[3-({2-[4,7,10-tris(carboximetil)-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-1-il]acetamido}metil)benzoil]-L-metionilglicil-6-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucina (28 mg), o composto do título (13,8 mg) foi obtido na mesma maneira como na etapa (ix) do Exemplo 2-11 acima. MS (ESI+): 1089,2 (x) Síntese de conjugado No 13
[0345] Usando [N-{3-[(2-{4,7,10-tris[(carbóxi-ϏO)metil]-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-1-il-Ϗ4N1,N4,N7,N10}acetamido-ϏO)metil]benzoil}-L-metionilglicil-6-
(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato(3-)]gadolínio, um conjugado foi obtido na mesma maneira como na etapa (x) do Exemplo 2-11 acima.
Foi confirmado pela análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual um [Gd/DOTA-NH-CH2-(1,3-F)-C(=O)-Met-Gli-Lis*-Z2(#N)] tendo um peso molecular de 1089 foi ligado a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa, um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele e um conjugado no qual três de tais moléculas foram ligadas a ele. (Exemplo 2-15. Síntese de ([Gd/DOTA-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2- (1,3-F)-C(=O)-Gli-Lis*-Z2(#N)]p-Fab2)) [Fórmula Química 110]
(i) Síntese de mono(trifluoroacetato) de glicil-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H- pirrol-1-il)-L-norleucinato de terc-butila
[0346] TFA (4 ml) foi adicionado a uma solução de N-(terc-butoxicarbonil)glicil- 6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato de terc-butila (400 mg) em diclorometano (4 mL) sob resfriamento em gelo, e a mistura resultante foi agitada sob resfriamento em gelo por 1 hora. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida para obter o composto do título (642 mg). MS (ESI+); 340,4
(ii) Síntese de N-(3-{[(terc-butoxicarbonil)amino]metil}benzoil)glicil-6-(2,5- dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato de terc-butila
[0347] Ácido 3-{[(terc-butoxicarbonil)amino]metil}benzoico (228 mg), DIPEA (1,5 mL) e HATU (345 mg) foram adicionados a uma mistura de mono(trifluoroacetato) de glicil-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato de terc-butila (642 mg) e diclorometano (6 mL) sob resfriamento em gelo, e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 2 horas. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida, e depois o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (gradiente de solvente; 0 → 4 % metanol/clorofórmio) para obter o composto do título (489 mg). MS (ESI+); 573,4 (iii) Síntese de N-[3-(17,17-dimetil-3,15-dioxo-5,8,11,16-tetraoxa-2,14- diazaoctadecan-1-il)benzoil]glicil-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L- norleucinato de terc-butila
[0348] TFA (2 ml) foi adicionado a uma mistura de N-(3-{[(terc- butoxicarbonil)amino]metil}benzoil)glicil-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L- norleucinato de terc-butila (489 mg), anisol (280 µL) e diclorometano (5 mL) sob resfriamento em gelo, e a mistura resultante foi agitada na mesma temperatura por 1 hora. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida, e depois diclorometano (7 mL) foi adicionado, e ácido 2,2-dimetil-4-oxo-3,8,11,14-tetraoxa-5- aza-hexadecan-16-oico (289 mg), DIPEA (1,5 mL) e HATU (487 mg) foram adicionados sob resfriamento em gelo, e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 2 horas. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida, e depois o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (gradiente de solvente; 0 → 1 % metanol/clorofórmio) para obter o composto do título (427 mg). MS (ESI+); 762,5 (iv) Síntese de N-(3-{3,15-dioxo-16-[4,7,10-tris(2-terc-butóxi-2-oxoetil)- 1,4,7,10-tetra-azaciclododecan-1-il]-5,8,11-trioxa-2,14-diaza-hexadecan-1-
il}benzoil)glicil-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato de terc-butila
[0349] TFA (1,3 mL) foi adicionado a uma mistura de N-[3-(17,17-dimetil-3,15- dioxo-5,8,11,16-tetraoxa-2,14-diazaoctadecan-1-il)benzoil]glicil-6-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato de terc-butila (427 mg), anisol (200 µL) e diclorometano (4 mL) sob resfriamento em gelo, e a mistura resultante foi agitada na mesma temperatura por 1 hora. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida, e depois DMF (6 mL) foi adicionado, e DOTA-tris(t-Bu) éster (353 mg), DIPEA (0,96 mL) e HATU (320 mg) foram adicionados sob resfriamento em gelo, e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 2 horas. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida, e depois o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (gradiente de solvente; 0 → 10 % metanol/clorofórmio) para obter o composto do título (863 mg). MS (ESI+): 1238,9 [M+Na]+ (v) Síntese de N-(3-{3,15-dioxo-16-[4,7,10-tris(carboximetil)-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-1-il]-5,8,11-trioxa-2,14-diaza-hexadecan-1-il}benzoil)glicil-6-(2,5- dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucina
[0350] Usando N-(3-{3,15-dioxo-16-[4,7,10-tris(2-terc-butóxi-2-oxoetil)- 1,4,7,10-tetra-azaciclododecan-1-il]-5,8,11-trioxa-2,14-diaza-hexadecan-1- il}benzoil)glicil-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato de terc-butila (863 mg), o composto do título (40,0 mg) foi obtido na mesma maneira como na etapa (viii) do Exemplo 2-11 acima. MS (ESI+): 992,5 (vi) Síntese de [N-{3-[3-oxo-15-(oxo-ϏO)-16-{4,7,10-tris[(carbóxi-ϏO)metil]- 1,4,7,10-tetra-azaciclododecan-1-il-Ϗ4N1,N4,N7,N10}-5,8,11-trioxa-2,14-diaza- hexadecan-1-il]benzoil}glicil-6-(2,5-dioxo-2,5)-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato(3- )]gadolínio
[0351] Usando N-(3-{3,15-dioxo-16-[4,7,10-tris(carboximetil)-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-1-il]-5,8,11-trioxa-2,14-diaza-hexadecan-1-il}benzoil)glicil-6-(2,5-
dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucina (40 mg), o composto do título (15,9 mg) foi obtido na mesma maneira como na etapa (ix) do Exemplo 2-11 acima. MS (ESI-); 1145,0 (vii) Síntese de conjugado No 15
[0352] Usando [N-{3-[3-oxo-15-(oxo-ϏO)-16-{4,7,10-tris[(carbóxi-ϏO)metil]- 1,4,7,10-tetra-azaciclododecan-1-il-Ϗ4N1,N4,N7,N10}-5,8,11-trioxa-2,14-diaza- hexadecan-1-il]benzoil}glicil-6-(2,5-dioxo-2,5)-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato(3- )]gadolínio, um conjugado foi obtido na mesma maneira como na etapa (x) do Exemplo 2-11 acima. Foi confirmado pela análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual um [Gd/DOTA-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-F)- C(=O)-Gli-Lis*-Z2(#N)] tendo um peso molecular de 1147 foi ligado a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa, um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele e um conjugado no qual três de tais moléculas foram ligadas a ele. (Exemplo 2-24. Síntese de ([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,3-F)-C(=O)-Met-Gli-Lis*- Z2(#S)]p-Fab2)) Síntese de conjugado No 24 (conjugação através de iminotiolano)
[0353] Um tampão de borato 0,1 M (5 µL) de 2 mg/mL de 2-iminotiolano (em seguida, abreviado como 2-IT) foi adicionado a um tampão de borato Fab2 de 4,45 mg/mL (160 µL), e a mistura resultante foi incubada a 37 °C por 40 minutos. O excesso de 2-IT foi lavado com solução salina tamponada com fosfato usando um filtro centrífugo Amicon Ultra de 0,5 mL 3 vezes repetidamente, e finalmente concentrado.
[0354] [N-{3-[(2-{4,7,10-tris[(carbóxi-ϏO)metil]-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-1-il-Ϗ4N1,N4,N7,N10}acetamido-ϏO)metil]benzoil}-L-metionilglicil-6- (2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato(3-)]gadolínio (1 mg) sintetizado no Exemplo 2-13 (ix) foi dissolvido em DMSO (40 µL). Um tampão de borato 0,1 M (40 µL) foi adicionado à solução resultante, e uma solução aquosa de carbonato de sódio 0,1 M foi adicionada de modo a fornecer um pH de 6,0.
[0355] Uma solução conectora preparada foi adicionada ao filtrado obtido contendo um anticorpo, e a mistura resultante foi incubada a 30 °C por 2 horas.
Uma solução salina tamponada com fosfato contendo EDTA (pH 6,0) foi adicionada, e depois a mistura resultante foi incubada a 30 °C por 10 minutos.
A mistura foi purificada usando uma coluna PD-10, e a solução resultante foi recuperada usando um filtro centrífugo Amicon Ultra de 0,5 mL.
A solução recuperada foi lavada com solução salina tamponada com fosfato 7 vezes, finalmente concentrada e depois filtrada através de um filtro de membrana para obter um conjugado.
Foi confirmado pela análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual um [Gd/DOTA-NH-CH2-(1,3-F)-C(=O)-Met-Gli-Lis*-Z2(#S)] tendo um peso molecular de 1190 foi ligado a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa e um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele. (Exemplo 2-29. Síntese de ([Gd/DOTA-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2- (1,3-F)-C(=O)-Met-Gli-Lis*-Z2(#N)]p-Fab2)) [Fórmula Química 111]
(i) Síntese de 3-(17,17-dimetil-3,15-dioxo-5,8,11,16-tetraoxa-2,14- diazaoctadecan-1-il)benzoato de metila
[0356] Monocloridreto de 3-(aminometil)benzoato de (286 mg), HATU (590 mg) e Et3N (900 µL) foram adicionados a uma solução de ácido 2,2-dimetil-4-oxo- 3,8,11,14-tetraoxa-5-aza-hexadecan-16-oico (396 mg) em diclorometano (10 mL), e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 2 horas. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida, e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (gradiente de solvente; 2 → 6 %
metanol/clorofórmio) para obter o composto do título (598 mg). MS (ESI+); 455,2 (ii) Síntese de ácido 3-(17,17-dimetil-3,15-dioxo-5,8,11,16-tetraoxa-2,14- diazaoctadecan-1-il)benzoico
[0357] Uma solução aquosa de hidróxido de sódio 1 M (4 mL) e água (5 mL) foram adicionados a uma solução de 3-(17,17-dimetil-3,15-dioxo-5,8,11,16-tetraoxa- 2,14-diazaoctadecan-1-il)benzoato de metila (597 mg) em THF (15 mL), e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 5 horas. A solução de reação foi diluída com água, ácido cítrico a 10 % foi adicionado, depois a mistura resultante foi extraída com acetato de etila, e a camada orgânica coletada foi lavada com salmoura saturada. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de magnésio anidro e filtrada, e depois o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para obter o composto do título (662 mg). MS (ESI+); 441,1 (iii) Síntese de N-(terc-butoxicarbonil)-L-metionilglicil-6-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato de terc-butila
[0358] TFA (3 ml) foi adicionado a uma mistura de N-(terc-butoxicarbonil)glicil- 6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato de terc-butila (1,63 g) e diclorometano (5 mL) sob resfriamento em gelo, e a mistura resultante foi agitada na mesma temperatura por 1 hora. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida. DIPEA (5 mL) foi adicionado a uma mistura de N-(terc-butoxicarbonil)-L- metionina (1,11 g), diclorometano (8 mL) e HATU (2,12 g), e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 5 minutos. Uma solução do resíduo obtido na reação anterior em diclorometano (4 mL) foi adicionada a esta mistura de reação, e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 20 horas. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida, e depois o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (gradiente de solvente; 0 → 5 % metanol/clorofórmio) para obter o composto do título (1,63 g). MS (APCI/ESI+); 571,3 (iv) Síntese de N-[3-(17,17-dimetil-3,15-dioxo-5,8,11,16-tetraoxa-2,14-
diazaoctadecan-1-il)benzoil]-L-metionilglicil-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L- norleucinato de terc-butila
[0359] TFA (2 ml) foi adicionado a uma mistura de N-(terc-butoxicarbonil)-L- metionilglicil-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato de terc-butila (150 mg) e diclorometano (2 ml) sob resfriamento em gelo, e a mistura resultante foi agitada na mesma temperatura por 1 hora. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida. DIPEA (360 µL) foi adicionado a uma mistura de ácido 3-(17,17-dimetil-3,15- dioxo-5,8,11,16-tetraoxa-2,14-diazaoctadecan-1-il)benzoico (120 mg), diclorometano (3 mL) e HATU (150 mg), e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 5 minutos. Uma solução do resíduo obtido na reação anterior em diclorometano (2 mL) foi adicionada a esta mistura de reação, e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 1 hora. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida, e depois o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (gradiente de solvente; 0 → 5 % metanol/clorofórmio) para obter o composto do título (113 mg). MS (ESI+); 893,4 (v) Síntese de tetracis(trifluoroacetato) de N-(3-{3,15-dioxo-16-[4,7,10-tris(2- terc-butóxi-2-oxoetil)-1,4,7,10-tetra-azaciclododecan-1-il)]-5,8,11-trioxa-2,14-diaza- hexadecan-1-il}benzoil)-L-metionilglicil-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L- norleucinato de terc-butila
[0360] TFA (2 mL) foi adicionado a uma mistura de N-[3-(17,17-dimetil-3,15- dioxo-5,8,11,16-tetraoxa-2,14-diazaoctadecan-1-il)benzoil]-L-metionilglicil-6-(2,5- dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato de terc-butila (113 mg) e diclorometano (2 mL) sob resfriamento em gelo, e a mistura resultante foi agitada na mesma temperatura por 1 hora e depois concentrada sob pressão reduzida para obter um produto bruto. DIPEA (0,22 mL) foi adicionado a uma mistura de DOTA-tris(t-Bu) éster (80 mg), HATU (80 mg) e dimetilacetamida (em seguida, abreviado como DMAc) (1 mL) na temperatura ambiente, a mistura resultante foi agitada por 10 minutos,
depois uma mistura do produto bruto previamente obtido em DMAc (1 mL) foi adicionada, e a mistura resultante foi agitada na mesma temperatura por 2 horas. A mistura de reação foi purificada por cromatografia em coluna em fase reversa (gradiente de solvente; 0 → 50 % acetonitrila/solução aquosa de TFA a 0,1 %) para obter o composto do título (178 mg). MS (ESI-); 1345,8 (vi) Síntese de N-(3-{3,15-dioxo-16-[4,7,10-tris(carboximetil)-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-1-il]-5,8,11-trioxa-2,14-diaza-hexadecan-1-il}benzoil)-L- metionilglicil-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucina
[0361] Usando tetracis(trifluoroacetato) de N-(3-{3,15-dioxo-16-[4,7,10-tris(2- terc-butóxi-2-oxoetil)-1,4,7,10-tetra-azaciclododecan-1-il]-5,8,11-trioxa-2,14-diaza- hexadecan-1-il}benzoil)-L-metionilglicil-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L- norleucinato de terc-butila (178 mg), o composto do título (60,0 mg) foi obtido na mesma maneira como na etapa (viii) do Exemplo 2-11 acima. MS (APCI/ESI+); 1123,4 (vii) Síntese de [N-{3-[3-oxo-15-(oxo-ϏO)-16-{4,7,10-tris[(carbóxi-ϏO)metil]- 1,4,7,10-tetra-azaciclododecan-1-il-Ϗ4N1,N4,N7,N10}-5,8,11-trioxa-2,14-diaza- hexadecan-1-il]benzoil}-L-metionilglicil-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L- norleucinato(3-)]gadolínio
[0362] Usando N-(3-{3,15-dioxo-16-[4,7,10-tris(carboximetil)-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-1-il]-5,8,11-trioxa-2,14-diaza-hexadecan-1-il}benzoil)-L- metionilglicil-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucina (40 mg), o composto do título (10,3 mg) foi obtido na mesma maneira como na etapa (ix) do Exemplo 2-11 acima. MS (ESI+): 1278,3 (viii) Síntese de conjugado No 29
[0363] Usando [N-{3-[3-oxo-15-(oxo-ϏO)-16-{4,7,10-tris[(carbóxi-ϏO)metil]- 1,4,7,10-tetra-azaciclododecan-1-il-Ϗ4N1,N4,N7,N10}-5,8,11-trioxa-2,14-diaza- hexadecan-1-il]benzoil}-L-metionilglicil-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L- norleucinato(3-)]gadolínio, um conjugado foi obtido na mesma maneira como na etapa
(x) do Exemplo 2-11 acima. Foi confirmado pela análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual um [Gd/DOTA-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)- NH-CH2-(1,3-F)-C(=O)-Met-Gli-Lis*-Z2(#N)] tendo um peso molecular de 1278 foi ligado a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa e um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele. (Exemplo 2-33. Síntese de ([Gd/DOTA-[2,5-(1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolina)]- C(=O)-Met-Gli-Lis*-Z2(#N)]p-Fab2)) [Fórmula Química 112] (i) Síntese de N-[2-(terc-butoxicarbonil)-1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolina-5- carbonil]-L-metionilglicil-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato de terc-butila
[0364] TFA (2 mL) foi adicionado a uma mistura de N-(terc-butoxicarbonil)-L- metionilglicil-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato de terc-butila (150 mg) e diclorometano (2 mL) sob resfriamento em gelo, e a mistura resultante foi agitada na mesma temperatura por 1 hora. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida. Uma solução do resíduo obtido na reação anterior em diclorometano (2 mL) foi adicionada a uma mistura de ácido 2-(terc-butoxicarbonil)- 1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolina-5-carboxílico (88 mg), diclorometano (2 mL), HATU (150 mg) e DIPEA (360 µL), e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 1 hora. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida, e depois o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (gradiente de solvente; 0 → 6 % metanol/clorofórmio) para obter o composto do título (231 mg). MS (APCI/ESI+); 752,2 [M+Na]+ (ii) Síntese de tetracis(trifluoroacetato) de N-(2-{[4,7,10-tris(2-terc-butóxi-2- oxoetil)-1,4,7,10-tetra-azaciclododecan-1-il]acetil}-1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolina-5- carbonil)-L-metionilglicil-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato de terc-butila
[0365] Usando N-[2-(terc-butoxicarbonil)-1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolina-5- carbonil]-L-metionilglicil-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato de terc-butila (231 mg), o composto do título (222 mg) foi obtido na mesma maneira como na etapa (v) do Exemplo 2-29 acima. MS (ESI-); 1182,7 (iii) Síntese de N-(2-{[4,7,10-tris(carboximetil)-1,4,7,10-tetra-azaciclododecan- 1-il]acetil}-1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolina-5-carbonil)-L-metionilglicil-6-(2,5-dioxo-2,5- di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucina
[0366] Usando tetracis(trifluoroacetato) de N-(2-{[4,7,10-tris(2-terc-butóxi-2- oxoetil)-1,4,7,10-tetra-azaciclododecan-1-il]acetil}-1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolina-5- carbonil)-L-metionilglicil-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato de terc-butila (222 mg), o composto do título (53 mg) foi obtido na mesma maneira como na etapa (viii) do Exemplo 2-11 acima. MS (APCI/ESI+); 960,2 (iv) Síntese de {N-[2-({4,7,10-tris[(carbóxi-ϏO)metil]-1,4,7,10-tetra-
azaciclododecan-1-il-Ϗ4N1,N4,N7,N10}acetil-ϏO)-1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolina-5- carbonil]-L-metionilglicil-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato(3- )}gadolínio
[0367] Usando N-(2-{[4,7,10-tris(carboximetil)-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-1-il]acetil}-1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolina-5-carbonil)-L-metionilglicil- 6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucina (22 mg), o composto do título (7,0 mg) foi obtido na mesma maneira como na etapa (ix) do Exemplo 2-11 acima. MS (ESI+): 1115,3 (v) Síntese de conjugado No 33
[0368] Usando o composto de (iv), um conjugado foi obtido na mesma maneira como na etapa (x) do Exemplo 2-11 acima. Foi confirmado pela análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual um [Gd/DOTA-[2,5- (1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolina)]-C(=O)-Met-Gli-Lis*-Z2(#N)] tendo um peso molecular de 1115 foi ligado a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa e um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele. (Exemplo 2-35. Síntese de ([Gd/DOTA-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2- (1,3-F)-C(=O)-Met-Gli-Lis*-Z2(#S)]p-Fab2)) Síntese de conjugado No 35
[0369] Usando [N-{3-[3-oxo-15-(oxo-ϏO)-16-{4,7,10-tris[(carbóxi-ϏO)metil]- 1,4,7,10-tetra-azaciclododecan-1-il-Ϗ4N1,N4,N7,N10}-5,8,11-trioxa-2,14-diaza- hexadecan-1-il]benzoil}-L-metionilglicil-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L- norleucinato(3-)]gadolínio sintetizado no Exemplo 2-29 (vii), um conjugado foi obtido na mesma maneira como na etapa do Exemplo 2-24 acima. Foi confirmado pela análise de MS que o conjugado foi um conjugado no qual um [Gd/DOTA-NH- (CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-F)-C(=O)-Met-Gli-Lis*-Z2(#S)] tendo um peso molecular de 1380 foi ligado a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa. (Exemplo 2-40. Síntese de [Gd/4arm-DOTA-CH2-(1,4-F)-NH-C(=S)-NH-CH2-
(1,3-F)-C(=O)-Met-Gli-Lis*-Z2(#S)]p-Fab2)) [Fórmula Química 113] (i) Síntese de N-(3-{[(terc-butoxicarbonil)amino]metil}benzoil)-L-metionilglicil- 6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato de terc-butila
[0370] Usando N-(terc-butoxicarbonil)-L-metionilglicil-6-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato de terc-butila (690 mg), o composto do título (710 mg) foi obtido na mesma maneira como na etapa (i) do Exemplo 2-33 acima. MS (ESI+): 726,5 [M+Na]+ (ii) Síntese de mono(trifluoroacetato) de N-[3-(aminometil)benzoil]-L- metionilglicil-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato de terc-butila
[0371] Usando N-(3-{[(terc-butoxicarbonil)amino]metil}benzoil)-L- metionilglicil-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato de terc-butila (41 mg), um produto bruto do composto do título (42 mg) foi obtido na mesma maneira como no Exemplo 2-12 (iv) acima. MS (ESI+): 604,3 (iii) Síntese de mono(trifluoroacetato) de N-[3-(aminometil)benzoil]-L- metionilglicil-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucina
[0372] TFA (2 ml) foi adicionado a uma mistura de mono(trifluoroacetato) de N-[3-(aminometil)benzoil]-L-metionilglicil-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L- norleucinato de terc-butila (41 mg) em diclorometano (4 ml), e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 1 hora. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida e depois azeotropicamente seca com tolueno para obter um produto bruto (43 mg). 16 mg do produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna em fase reversa (gradiente de solvente; 5 → 50 % acetonitrila/solução aquosa de TFA a 0,1 %) para obter o composto do título (11 mg). MS (ESI+): 548,2 (iv) Síntese de N-[3-({[(4-{[1,4,7,10-tetracis(carboximetil)-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-2-il]metil}fenil)carbamotioil]amino}metil)benzoil]-L-metionilglicil-6- (2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucina
[0373] Usando mono(trifluoroacetato) de N-[3-(aminometil)benzoil]-L- metionilglicil-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucina (11 mg), o composto do título (17 mg) foi obtido na mesma maneira como na etapa (viii) do Exemplo 2-12 acima. MS (ESI+): 1099,5 (v) Síntese de [N-{3-[({[4-({1,4,7,10-tetracis[(carbóxi-ϏO)metil]-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-2-il-Ϗ4N1,N4,N7,N10}metil)fenil]carbamotioil}amino)metil]benzoil}-L- metionilglicil-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato(4-)]gadolinato(1-) de hidrogênio
[0374] Usando N-[3-({[(4-{[1,4,7,10-tetracis(carboximetil)-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-2-il]metil}fenil)carbamotioil]amino}metil)benzoil]-L-metionilglicil-6- (2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucina (16 mg), o composto do título (6 mg) foi obtido na mesma maneira como na etapa (ix) do Exemplo 2-12 acima. MS (ESI+):
1254,6 (vi) Síntese de conjugado No 40
[0375] Usando [N-{3-[({[4-({1,4,7,10-tetracis[(carbóxi-ϏO)metil]-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-2-il-Ϗ4N1,N4,N7,N10}metil)fenil]carbamotioil}amino)metil]benzoil}-L- metionilglicil-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato(4-)]gadolinato(1-) de hidrogênio, um conjugado foi obtido na mesma maneira como na etapa do Exemplo 2-24 acima. Foi confirmado pela análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual um [Gd/4arm-DOTA-CH2-(1,4-F)-NH-C(=S)-NH-CH2-(1,3-F)- C(=O)-Met-Gli-Lis*-Z2(#S)] tendo um peso molecular de 1355 foi ligado a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa e um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele. (Exemplo 2-47: Síntese de ([Gd/DOTA]p-Fab2)) [Fórmula Química 114]
[0376] Uma solução aquosa de hidróxido de sódio 1 M (80 µL) foi adicionada a uma solução mista de ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-1,4,7,10-tetra-acético (DOTA) (16 mg) e água (810 µL) sob resfriamento em gelo para ajustar o pH para 6. 1-Hidróxi-2,5-dioxopirrolidina-3-sulfonato de sódio (2,3 mg) dissolvido em água (117 µL) foi adicionado à solução obtida (239 µL) sob resfriamento em gelo. Depois disso, uma solução aquosa de monocloridreto de 3-{[(etilimino)metilideno]amino}-N,N- dimetilpropan-1-amina (em seguida, abreviado como EDC HCl) (8,3 µL, 25 mg/mL) foi adicionada, e a mistura resultante foi agitada por 30 minutos sob resfriamento em gelo para preparar uma solução de N-hidroxissulfossuccinimidil DOTA. Antes da adição de
Fab2, uma solução aquosa de hidrogenfosfato de dissódio 0,2 M (pH 9) (40 µL) foi adicionada para ajustar o pH para 7.
[0377] A solução de N-hidroxissulfossuccinimidil DOTA preparada (200 µL) foi adicionada a uma solução aquosa de hidrogenofosfato de dissódio 0,1 M (390 µL) de 17,8 mg/mL de Fab2 (60 µL), e a mistura resultante foi incubada a 4 °C por 23 horas. O excesso de conector foi lavado com um tampão de fosfato 10 mM usando um filtro centrífugo Amicon Ultra de 0,5 mL 3 vezes repetidamente, lavado com um tampão de acetato de amônio 0,3 M, finalmente concentrado, e depois filtrado através de um filtro de membrana para obter um conjugado. [Fórmula Química 115] (ii) Um tampão de acetato de amônio 0,3 M contendo o conjugado preparado em (i) foi diluído com o mesmo tampão, e o pH foi ajustado para 6,62 usando um tampão de acetato 0,25 M. Uma solução aquosa de GdCl3 (35 µL) preparada a 0,057 M foi adicionada à solução de Fab2 preparada a 2,8 mg/ml, e a mistura resultante foi incubada a 37 °C por 0,5 horas. Depois da reação, EDTA 0,05 M (525 µL) foi adicionado e, depois disso, a mistura resultante foi purificada usando uma coluna PD- 10, e a solução resultante foi recuperada usando um filtro centrífugo Amicon Ultra de 0,5 mL. A solução recuperada foi lavada com solução salina tamponada com fosfato 5 vezes, finalmente concentrada e depois filtrada através de um filtro de membrana para obter um conjugado. Foi confirmado pela análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual um ou dois [Gd/DOTA] tendo um peso molecular de 542 foram ligados a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa.
(Exemplo 2-48. Síntese de ([Gd/4arm-DOTA-CH2-(1,4-F)-NH-C(=S)]p-Fab2)) [Fórmula Química 116]
(i) Para ligação de DOTA, que é um agente quelante, a Fab2, p-SCN-Bn-DOTA (Macrocyclics, Inc.) foi usado.
Uma solução de carbonato de sódio 0,1 M (pH 9,0) foi adicionado a uma solução de Fab2 preparada a 2,54 mg/mL com solução salina tamponada com fosfato (pH 7,4) e glicerina para ajustar o pH para 8,8 a 9,5. P-SCN- Bn-DOTA foi adicionado a esta, e a mistura resultante foi incubada a 37 °C por 2 horas.
Depois da reação, o produto de reação foi recuperado usando um filtro centrífugo Amicon Ultra de 0,5 mL para purificar um conjugado.
Foi confirmado pela análise de MS que o conjugado foi um conjugado no qual um ou dois [4arm-DOTA- CH2-(1,4-F)-NH-C(=S)] tendo um peso molecular de 553 foram ligados a um de Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa. [Fórmula Química 117]
(ii) Usando o conjugado preparado em (i), um conjugado foi obtido na mesma maneira como na etapa (ii) do Exemplo 2-47 acima.
Foi confirmado pela análise de MS que o conjugado foi um conjugado no qual um [Gd/4arm-DOTA-CH2-(1,4-F)-NH-
C(=S)] tendo um peso molecular de 706 foi ligado a um de Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa. (Exemplo 2-60. Síntese de ([DFO-C(=O)-CH2O-(1,3-F)-C(=O)-Gli-Tir*-CH2- C(=O)-NH-(CH2)2-Z1(#S)]p-Fab2)) [Fórmula Química 118]
(i) Síntese de ácido 3-[2-(benzilóxi)-2-oxoetóxi]benzoico
[0378] 2-Metilbut-2-eno (6 mL), di-hidrogenofosfato de sódio di-hidratado (3,35 g) e clorito de sódio (3,64 g) foram adicionados a uma mistura de (3- formilfenóxi)acetato de benzila (2,90 g), 2-metilpropan-2-ol (60 mL) e água (30 mL) na temperatura ambiente, e a mistura resultante foi agitada por 2 horas. Acetato de etila e ácido clorídrico 1 M (60 mL) foram adicionados ao líquido de reação, e a mistura resultante foi extraída com acetato de etila. A camada orgânica foi lavada com água e uma solução aquosa saturada de cloreto de sódio, seca sobre sulfato de magnésio anidro e filtrada. O filtrado foi concentrado para obter o composto do título (2,93 g). MS (ESI-); 285,1 (ii) Síntese de N-[(benzilóxi)carbonil]glicil-O-(2-etóxi-2-oxoetil)-L-tirosinato de terc-butila
[0379] N-[(Benzilóxi)carbonil]glicil-L-tirosinato de terc-butila (2,49 g) foi dissolvido em acetona (50 mL) e bromoacetato de etila (2,05 g), e carbonato de potássio (2,41 g) foram adicionados, e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 4 horas. A matéria insolúvel foi separada por filtração, o filtrado foi concentrado, e o resíduo obtido foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (acetato de etila: hexano = 30:70 → 60:40) para obter o composto do título (2,99 g). MS (ESI+): 537,4 [M+Na]+ (iii) Síntese de N-{3-[2-(benzilóxi)-2-oxoetóxi]benzoil}glicil-O-(2-etóxi-2- oxoetil)-L-tirosinato de terc-butila
[0380] N-[(Benzilóxi)carbonil]glicil-O-(2-etóxi-2-oxoetil)-L-tirosinato de terc- butila (2,75 g) foi dissolvido em etanol (55 mL), paládio a 10 % em carbono (teor de água de 50 %, 550 mg) foi adicionado sob uma atmosfera de argônio, e a mistura resultante foi agitada sob uma atmosfera de hidrogênio (1 atm) durante a noite na temperatura ambiente. O sistema foi purgado com argônio, depois a matéria insolúvel foi separada por filtração, o filtrado foi concentrado, o resíduo foi dissolvido em diclorometano (55 mL), ácido 3-[2-(benzilóxi)-2-oxoetóxi]benzoico (1,99 g), HATU (2,84 g) e Et3N (1,5 mL) foram adicionados, e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 1 hora. O líquido de reação foi concentrado e purificada por cromatografia em coluna de gel de sílica (acetato de etila: hexano = 30:70 → 70:30)
para obter o composto do título (3,07 g). MS (ESI-); 647,4 (iv) Síntese de N-[3-(carboximetóxi)benzoil]glicil-O-(2-etóxi-2-oxoetil)-L- tirosinato de terc-butila
[0381] N-{3-[2-(Benzilóxi)-2-oxoetóxi]benzoil}glicil-O-(2-etóxi-2-oxoetil)-L- tirosinato de terc-butila (3282 mg) foi dissolvido em THF (66 mL), paládio a 10 % em carbono (50 % úmido com água, 328 mg) foi adicionado sob uma atmosfera de argônio, e a mistura resultante foi agitada sob uma atmosfera de hidrogênio durante a noite na temperatura ambiente. O líquido de reação foi filtrado através de Celite, e o filtrado foi concentrado para obter o composto do título (2,54 g). MS (ESI-); 557,4 (v) Síntese de N-{3-[(9,20,31-tri-hidróxi-2,10,13,21,24,32-hexaoxo- 3,9,14,20,25,31-hexa-azatritriacontan-1-il)óxi]benzoil}glicil-O-(2-etóxi-2-oxoetil)-L- tirosinato de terc-butila
[0382] DMF (5 mL) e Et3N (0,16 mL) foram adicionados a monometanossulfonato de N4-{5-[acetil(hidróxi)amino]pentil}-N1-(5-{4-[(5- aminopentil)(hidróxi)amino]-4-oxobutanamido}pentil)-N1-hidroxibutanodiamida (DFO.MeSO3H) (500 mg), N-[3-(carboximetóxi)benzoil]glicil-O-(2-etóxi-2-oxoetil)-L- tirosinato de terc-butila (446 mg), EDC HCl (175 mg) e 1H-benzotriazol-1-ol (em seguida, abreviado como HOBt) (123 mg), e a mistura resultante foi agitada durante a noite na temperatura ambiente. Uma solução aquosa de TFA a 0,1 % (1 ml) e TFA (0,03 mL) foram adicionados ao líquido de reação, e a mistura resultante foi purificada por cromatografia em coluna em fase reversa (solução aquosa de TFA a 0,1 %: acetonitrila = 95:5 → 0:100) para obter o composto do título (548 mg). MS (ESI-); 1099,7 (vi) Síntese de N-{3-[(9,20,31-tri-hidróxi-2,10,13,21,24,32-hexaoxo- 3,9,14,20,25,31-hexa-azatritriacontan-1-il)óxi]benzoil}glicil-O-(carboximetil)-L- tirosinato de terc-butila
[0383] Metanol (5 mL) e DMF (5 mL) foram adicionados a N-{3-[(9,20,31-tri-
hidróxi-2,10,13,21,24,32-hexaoxo-3,9,14,20,25,31-hexa-azatritriacontan-1- il)óxi]benzoil}glicil-O-(2-etóxi-2-oxoetil)-L-tirosinato de terc-butila (500 mg) e levemente aquecido para dissolução, uma solução aquosa de hidróxido de sódio 1 M (600 µL) foi adicionada, e a mistura resultante foi agitada durante a noite na temperatura ambiente. Uma solução aquosa de hidróxido de sódio 1 M (600 µL) foi adicionada, e a mistura resultante foi agitada durante a noite na temperatura ambiente. TFA (90 µL) foi adicionado sob resfriamento em gelo, metanol foi destilado sob pressão reduzida, e a solução obtida foi purificada por cromatografia em coluna em fase reversa (solução aquosa de TFA a 0,1 %: acetonitrila = 95:5 → 0:100) para obter o composto do título (315 mg). MS (ESI-); 1071,6 (vii) Síntese de N-{3-[(9,20,31-tri-hidróxi-2,10,13,21,24,32-hexaoxo- 3,9,14,20,25,31-hexa-azatritriacontan-1-il)óxi]benzoil}glicil-O-(2-{[2-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)etil]amino}-2-oxoetil)-L-tirosinato de terc-butila
[0384] DMF (4 mL) foi adicionado a uma mistura de N-{3-[(9,20,31-tri-hidróxi- 2,10,13,21,24,32-hexaoxo-3,9,14,20,25,31-hexa-azatritriacontan-1- il)óxi]benzoil}glicil-O-(carboximetil)-L-tirosinato de terc-butila (269 mg), EDC HCl (58 mg) e HOBt (41 mg), além disso, monocloridreto de 1-(2-aminoetil)-1H-pirrol-2,5-diona (44 mg) e Et3N (35 µL) foram adicionados, e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 4 horas. Uma solução aquosa de TFA a 0,1 % (1 mL) foi adicionada ao líquido de reação, e a mistura resultante foi purificada por cromatografia em coluna em fase reversa (solução aquosa de TFA a 0,1 %: acetonitrila = 95:5 → 0:100) para obter uma mistura do ácido carboxílico como material de partida e do composto do título (155 mg, cerca de 6: 4). Esta mistura foi dissolvida em DMSO (1 mL) e DMF (2 mL), EDC HCl (22 mg) e HOBt (15 mg) foram adicionados, a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 5 minutos, depois monocloridreto de 1-(2-aminoetil)-1H-pirrol-2,5-diona (15,5 mg) e Et3N (12 µL) foram adicionados, e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 1 hora. Uma solução aquosa de TFA a 0,1 % (1 mL) foi adicionada ao líquido de reação, e a mistura resultante foi purificada por cromatografia em coluna em fase reversa (solução aquosa de TFA a 0,1 %: acetonitrila = 95:5 → 10:90) para obter o composto do título (118 mg). MS (ESI-); 1193,6 (viii) Síntese de N-{3-[(9,20,31-tri-hidróxi-2,10,13,21,24,32-hexaoxo- 3,9,14,20,25,31-hexa-azatritriacontan-1-il)óxi]benzoil}glicil-O-(2-{[2-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)etil]amino}-2-oxoetil)-L-tirosina
[0385] N-{3-[(9,20,31-Tri-hidróxi-2,10,13,21,24,32-hexaoxo-3,9,14,20,25,31- hexa-azatritriacontan-1-il)óxi]benzoil}glicil-O-(2-{[2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)etil]amino}-2-oxoetil)-L-tirosinato de terc-butila (118 mg) foi dissolvido em TFA (1,2 mL), e a solução resultante foi agitada na temperatura ambiente por 1,5 hora. O líquido de reação foi concentrado, DMF (1,5 ml) e água (0,5 ml) foram adicionadas, e a mistura resultante foi purificada por cromatografia em coluna em fase reversa (solução aquosa de TFA a 0,1 %: acetonitrila = 95:5 → 10:90) para obter o composto do título (82 mg). MS (ESI-); 1137,5 (ix) Síntese de conjugado No 60
[0386] Uma solução de 2-IT preparada com um tampão de borato 0,1 M foi adicionada a uma solução de Fab2 preparada a 4,45 mg/mL com um tampão de borato 0,1 M, e a mistura resultante foi incubada a 37 °C por 30 minutos. O excesso de 2-IT foi lavado com solução salina tamponada com fosfato contendo EDTA (pH 6,0) usando um filtro centrífugo Amicon Ultra de 0,5 mL, finalmente concentrado, e depois filtrado através de um filtro de membrana. N-{3-[(9,20,31-tri-hidróxi-2,10,13,21,24,32- hexaoxo-3,9,14,20,25,31-hexa-azatritriacontan-1-il)óxi]benzoil}glicil-O-(2-{[2-(2,5- dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)etil)]amino}-2-oxoetil)-L-tirosina dissolvida em DMF foi adicionada ao filtrado obtido, e a mistura resultante foi diluída com um tampão de borato 0,1 M (pH 8,5) e incubada na temperatura ambiente por 2 horas. O excesso de reagente foi lavado com solução salina tamponada com fosfato contendo EDTA (pH
6,0) usando um filtro centrífugo Amicon Ultra de 0,5 mL, que foi repeido 3 vezes, finalmente concentrado, e depois filtrado através de um filtro de membrana.
[0387] Subsequentemente, uma solução de 2-iodoacetamida preparada a 10 mg/mL com solução salina tamponada com fosfato (pH 6,0) foi adicionada ao sobrenadante obtido, e depois a mistura resultante foi incubada a 37 °C por 30 minutos. O excesso de iodoacetamida foi lavado com solução salina tamponada com fosfato usando um filtro centrífugo Amicon Ultra de 0,5 mL 3 vezes repetidamente, finalmente concentrado, e depois filtrado através de um filtro de membrana para purificar um conjugado ligado a Fab2. Foi confirmado pela análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual um [DFO-C(=O)-CH2O-(1,3-F)- C(=O)-Gli-Tir*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1(#S)] tendo um peso molecular de 1241 foi ligado a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa. (Exemplo 2-61. Síntese de ([DFO-C(=O)-(CH2CH2O)4-(1,3-F)-C(=O)-Gli-Lis*- Z2(#S)]p-Fab2)) [Fórmula Química 119]
(i) Síntese de N-(3-hidroxibenzoil)glicinato de terc-butila
[0388] HATU (3,3 g) e DIPEA (3 mL) foram adicionados a uma mistura de ácido 3-hidroxibenzoico (1,0 g) e monocloridreto de glicinato de terc-butila (1,2 g) em DMF (10 mL) sob resfriamento em gelo, e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 1 hora. Água e acetato de etila foram adicionados à mistura, a mistura resultante foi submetida à separação de camada e extração duas vezes, a camada orgânica foi lavada com água e uma solução aquosa saturada de cloreto de sódio, depois seca sobre sulfato de magnésio anidro, e filtrada, depois o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida, acetato de etila foi adicionado ao sólido obtido, a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente, depois a matéria insolúvel foi coletada por filtração, e o filtrado foi concentrado. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (hexano/acetato de etila = 95/5 → 50/50), frações do produto desejado foram coletadas, concentradas e secas sob pressão reduzida para obter o composto do título (1,23 g). MS (ESI+): 274,2 [M+Na]+ (ii) Síntese de 3-{2-[2-(2-hidroxietóxi)etóxi]etóxi}propanoato de benzila
[0389] Cloreto de hidrogênio/dioxano 4 M (10 mL) foi adicionado a 3-{2-[2-(2- hidroxietóxi)etóxi]etóxi}propanoato de terc-butila (3,0 g) sob resfriamento em gelo, e depois a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 1 hora. A mistura foi concentrada e depois azeotropicamente seca duas vezes com tolueno, depois metanol (20 mL) e uma solução aquosa de hidróxido de sódio 1 M (13 mL) foram adicionados na temperatura ambiente, e a mistura resultante foi agitada na mesma temperatura por 1 hora e meia. A mistura foi concentrada, depois THF (10 mL), metanol (10 mL) e brometo de benzila (1,8 mL) foram adicionados, e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 3 dias. A mistura foi concentrada, e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (hexano/acetato de etila = 95/5 → 0/100 → clorofórmio/metanol = 90/10) para obter o composto do título (2,19 g). MS (ESI+): 313,2 (iii) Síntese de N-{3-[(3-oxo-1-fenil-2,6,9,12-tetraoxatetradecan-14- il)óxi]benzoil}glicinato de terc-butila
[0390] N-(3-Hidroxibenzoil)glicinato de terc-butila (915 mg), 3-{2-[2-(2- hidroxietóxi)etóxi]etóxi}propanoato de benzila (1,38 g), azodicarboxilato de dietila (solução de tolueno a 40 %, cerca de 2,2 M, 3,4 mL) e THF (20 mL) foram adicionados, depois trifenilfosfina (2,0 g) foi adicionada em porções na temperatura ambiente, e depois a mistura resultante foi agitada durante a noite a uma temperatura de banho de 60 °C. Cloreto de magnésio (1,5 g) e tolueno (20 mL) foram adicionados, e a mistura resultante foi aquecida e agitada a uma temperatura de banho de 60 °C por 2 horas. A mistura foi deixada resfriar até a temperatura ambiente, depois o sólido precipitado foi removido por filtração, e o solvente foi destilado. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (gel de sílica; hexano/acetato de etila = 95/5 → 20/80) e depois purificada novamente por cromatografia em coluna de gel de sílica (gel de sílica com amino; hexano/acetato de etila = 95/5 → 50/50) para obter o composto do título (1,12 g). MS (ESI+): 546,4 (iv) Síntese de N-{3-[(3-oxo-1-fenil-2,6,9,12-tetraoxatetradecan-14- il)óxi]benzoil}glicina
[0391] N-{3-[(3-Oxo-1-fenil-2,6,9,12-tetraoxatetradecan-14- il)óxi]benzoil}glicinato de terc-butila (1,11 g) foi dissolvido em cloreto de hidrogênio 4 M/dioxano (5 mL) na temperatura ambiente, e a solução resultante foi agitada na mesma temperatura por 2 horas. A mistura foi concentrada e seca sob pressão reduzida para obter o composto do título (1,12 g). MS (ESI+): 490,3 (v) Síntese de N-{3-[(3-oxo-1-fenil-2,6,9,12-tetraoxatetradecan-14- il)óxi]benzoil}glicil-N6-[(benzilóxi)carbonil]-L-lisinato de terc-butila
[0392] HATU (1,2 g) e DIPEA (1,4 mL) foram adicionados a uma solução de N-{3-[(3-oxo-1-fenil-2,6,9,12-tetraoxatetradecan-14-il)óxi]benzoil}glicina (1300 mg), monocloridreto de N6-[(benzilóxi)carbonil]-L-lisinato de terc-butila (1,0 g) em DMF (20 mL) sob resfriamento em gelo, e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 2 horas. Água e acetato de etila foram adicionados à mistura para separação de camada e extração, a camada orgânica foi lavada com água e salmoura saturada, depois seca sobre sulfato de magnésio anidro e filtrada, e depois o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (gel de sílica com amino; hexano/acetato de etila = 90/10 → 0/100) para obter o composto do título (1,14 g). MS (ESI+): 808,5 (vi) Síntese de N-[3-(2-{2-[2-(2-carboxietóxi)etóxi]etóxi}etóxi)benzoil]glicil-L- lisinato de terc-butila
[0393] Paládio a 10 % em carbono (50 % úmido com água, 200 mg) foi adicionado a uma mistura de N-{3-[(3-oxo-1-fenil-2,6,9,12-tetraoxatetradecan-14- il)óxi]benzoil}glicil-N6-[(benzilóxi)carbonil]-L-lisinato de terc-butila (1,12 g), Et3N (20 µL) e etanol (20 mL) na temperatura ambiente, e a mistura resultante foi agitada sob uma atmosfera de hidrogênio durante a noite na mesma temperatura. A mistura foi agitada na temperatura ambiente por 30 minutos ou mais em um sistema aberto, depois o líquido de reação foi filtrado através de Celite, e o filtrado foi concentrado para obter o composto do título (825 mg). MS (ESI+): 584,5 (vii) Síntese de N-[3-(2-{2-[2-(2-carboxietóxi)etóxi]etóxi}etóxi)benzoil]glicil-6- (2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato de terc-butila
[0394] 2,5-Dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-carboxilato de metila (150 mg) e Et3N (500 µL) foram adicionados a uma mistura de N-[3-(2-{2-[2-(2- carboxietóxi)etóxi]etóxi}etóxi)benzoil]glicil-L-lisinato de terc-butila (350 mg), THF (3 mL) e DMF (1 mL) na temperatura ambiente, e a mistura resultante foi agitada a uma temperatura de banho de 60 °C por 4 dias. A mistura foi esfriada até a temperatura ambiente, e depois TFA (300 µL) e água (500 µl) foram adicionados para neutralizar a mistura. Quantidades apropriadas de água e DMF foram adicionados à mistura, e a mistura resultante foi purificada por cromatografia em coluna em fase reversa (solução aquosa de TFA a 0,1 %: acetonitrila = 95:5 → 0: 100). Frações do produto desejado foram coletadas, concentradas e secas sob pressão reduzida para obter o composto do título (250 mg). MS (ESI+): 664,5 (viii) Síntese de N-{3-[(19,30,41-tri-hidróxi-12,20,23,31,34,42-hexaoxo-3,6,9- trioxa-13,19,24,30,35,41-hexa-azatritetracontan-1-il)óxi]benzoil}glicil-6-(2,5-dioxo- 2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato de terc-butila
[0395] EDC HCl (140 mg), HOBt (100 mg) e DIPEA (200 µL) foram adicionados a uma mistura de N4-{5-[acetil(hidróxi)amino]pentil}-N1-(5-{4-[(5- aminopentil)(hidróxi)amino]-4-oxobutanoamido}pentil)-N1-hidroxibutanodiamida monometanossulfonato (DFO.MeSO3H) (240 mg), N-[3-(2-{2-[2-(2-
carboxietóxi)etóxi]etóxi}etóxi)benzoil]glicil-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L- norleucinato de terc-butila (243 mg) em DMF (3 mL) e DMSO (1 mL) sob resfriamento em gelo, e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 3 horas. TFA (100 µL) e água (500 µL) foram adicionados, e a solução resultante foi purificada por cromatografia em coluna em fase reversa (solução aquosa de TFA a 0,1 %: acetonitrila = 95:5 → 10:90) e seca no congelador para obter o composto do título (207 mg). MS (ESI+): 1228,5 [M+Na]+ (ix) Síntese de N-{3-[(19,30,41-tri-hidróxi-12,20,23,31,34,42-hexaoxo-3,6,9- trioxa-13,19,24,30,35,41-hexa-azatritetracontan-1-il)óxi]benzoil}glicil-6-(2,5-dioxo- 2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucina
[0396] TFA (1 mL) foi adicionado a N-{3-[(19,30,41-tri-hidróxi- 12,20,23,31,34,42-hexaoxo-3,6,9-trioxa-13,19,24,30,35,41-hexa-azatritetracontan-1- il)óxi]benzoil}glicil-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucinato de terc-butila (202 mg) na temperatura ambiente, e a mistura resultante foi agitada na mesma temperatura por 1 hora. A mistura foi concentrada, DMF (4 ml) e água (500 µL) foram adicionados a esta, e a mistura resultante foi purificada por cromatografia em coluna em fase reversa (solução aquosa de TFA a 0,1 %: acetonitrila = 95:5 → 10:90) e seca no congelador para obter o composto do título (137 mg). MS (ESI-); 1148,7 (x) Síntese de conjugado No 61
[0397] Usando N-{3-[(19,30,41-tri-hidróxi-12,20,23,31,34,42-hexaoxo-3,6,9- trioxa-13,19,24,30,35,41-hexa-azatritetracontan-1-il)óxi]benzoil}glicil-6-(2,5-dioxo- 2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-L-norleucina, um conjugado foi obtido na mesma maneira como na etapa (ix) do Exemplo 2-60 acima. Foi confirmado pela análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual um [DFO-C(=O)-(CH2CH2O)4- (1,3-F)-C(=O)-Gli-Lis*-Z2(#S)] tendo um peso molecular de 1252 foi ligado a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa e um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele.
(Exemplo 2-18. Síntese de ([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-F)-NH-C(=O)-Met-Ile- NH-(CH2)2-Z1(#N)]p-Fab2)) [Fórmula Química 120] (i) Síntese de (4-{[(terc-butoxicarbonil)amino]metil}fenil)carbamato de 4- nitrofenila
[0398] Uma solução de carbonocloridato de 4-nitrofenila (952 mg) em diclorometano (10 ml) foi esfriada em gelo sob uma atmosfera de nitrogênio, uma solução mista de [(4-aminofenil)metil]carbamato de terc-butila (1000 mg) e piridina (430 µL) em diclorometano (10 mL) foi adicionada às gotas, e depois a mistura resultante foi agitada na mesma temperatura por 1 hora. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida, e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (gradiente de solvente; 10 → 100 % acetato de etila/hexano) para obter um produto bruto. Acetato de etila foi adicionado ao produto bruto, e a mistura resultante foi agitada para triturar o sólido. O sólido foi coletado por filtração, lavado com acetato de etila e depois seco sob pressão reduzida para obter o composto do título (861 mg). MS (ESI+): 410,3 [M+Na]+ (ii) Síntese de mono(trifluoroacetato) de L-metionil-N1-[2-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)etil]-L-isoleucinamida
[0399] TFA (2 ml) foi adicionado às gotas a uma solução de N-(terc- butoxicarbonil)-L-metionil-N1-[2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)etil]-L- isoleucinamida (257 mg) em diclorometano (4 ml) sob resfriamento em gelo. A mistura resultante foi agitada na mesma temperatura por 1 hora. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida, éter di-isopropílico foi adicionado, decantação foi realizada duas vezes, e o sólido precipitado foi lavado para obter um produto bruto do composto do título (248 mg). MS (ESI+): 385,3 (iii) Síntese de N-[(4-{[(terc-butoxicarbonil)amino]metil}fenil)carbamoil]-L- metionil-N1-[2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)etil]-L-isoleucinamida
[0400] TEA (59 µL) foi adicionado a uma solução mista de (4-{[(terc- butoxicarbonil)amino]metil}fenil)carbamato de 4-nitrofenila (54 mg) e mono(trifluoroacetato) de L-metionil-N1-[2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro)-1H-pirrol-1-il)etil]-L- isoleucinamida (70 mg) em diclorometano (5 ml), e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 30 minutos. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida, e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (gradiente de solvente; 2 → 6 % metanol/clorofórmio) para obter o composto do título (55 mg). MS (ESI+): 633,5 (iv) Síntese de mono(trifluoroacetato) de N-{[4-(aminometil)fenil]carbamoil}-L- metionil-N1-[2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)etil]-L-isoleucinamida
[0401] TFA (2 ml) foi adicionado às gotas a uma solução de N-[(4-{[(terc-
butoxicarbonil)amino]metil}fenil)carbamoil]-L-metionil-N1-[2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro- 1H-pirrol-1-il)etil]-L-isoleucinamida (54 mg) em diclorometano (4 ml) sob resfriamento em gelo, e a mistura resultante foi agitada na mesma temperatura por 1 hora. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida, éter di-isopropílico foi adicionado, decantação foi realizada duas vezes, e o sólido precipitado foi lavado para obter um produto bruto do composto do título (65 mg). MS (ESI+): 555,4 [M+Na]+ (v) Síntese de tetracis(trifluoroacetato) de N-{[4-({2-[4,7,10-tris(2-terc-butóxi- 2-oxoetil)-1,4,7,10-tetra-azaciclododecan-1-il]acetamido}metil)fenil]carbamoil}-L- metionil-N1-[2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)etil]-L-isoleucinamida
[0402] HATU (66 mg) e DIPEA (45 µL) foram adicionados a uma solução mista de mono(trifluoroacetato) de N-{[4-(aminometil)fenil]carbamoil}-L-metionil-N1-[2-(2,5- dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)etil]-L-isoleucinamida (64 mg) e DOTA-tris(t-Bu) éster (50 mg) em DMAc (2 mL), e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 2 horas. Uma solução aquosa de TFA a 1 % (cerca de 4 ml) e acetonitrila (cerca de 1 ml) foram adicionados à mistura de reação, depois uma solução diluída desta foi purificada por cromatografia em coluna em fase reversa (gradiente de solvente; 20 → 100 % acetonitrila de TFA a 0,1 %/solução aquosa de TFA a 0,1 %) para obter o composto do título (92 mg). MS (ESI+): 1109,4 [M+Na]+ (vi) Síntese de tetracis(trifluoroacetato) de N-{[4-({2-[4,7,10-tris(carboximetil)- 1,4,7,10-tetra-azaciclododecan-1-il]acetamido}metil)fenil]carbamoil}-L-metionil-N1-[2- (2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)etil]-L-isoleucinamida
[0403] TFA (4 mL) foi adicionado a uma solução de tetracis(trifluoroacetato) de N-{[4-({2-[4,7,10-tris(2-terc-butóxi-2-oxoetil)-1,4,7,10-tetra-azaciclododecan-1- il]acetamido}metil)fenil]carbamoil}-L-metionil-N1-[2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)etil]-L-isoleucinamida (90 mg) em diclorometano (4 mL), e a mistura resultante foi agitada durante a noite na temperatura ambiente. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida, e depois o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em fase reversa (gradiente de solvente; 5 → 50 % acetonitrila/solução aquosa de TFA a 0,1 %) para obter o composto do título (57 mg). MS (ESI+): 919,4 (vii) Síntese de N-({4-[(2-{4,7,10-tris[(carbóxi-ϏO)metil]-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-1-il-Ϗ4N1,N4,N7,N10}acetamido-ϏO)metil]fenil}carbamoil)-L-metionil- N1-[2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)etil]-L-isoleucinamidato(3-)]gadolínio
[0404] Cloreto de gadolínio (8 mg) foi adicionado a uma mistura de tetracis(trifluoroacetato) de N-{[4-({2-[4,7,10-tris(carboximetil)-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-1-il]acetamido}metil)fenil]carbamoil}-L-metionil-N1-[2-(2,5-dioxo-2,5- di-hidro-1H-pirrol-1-il)etil]-L-isoleucinamida (22 mg) e água (3 mL), uma solução aquosa de hidrogenocarbonato de sódio 0,1 M foi adicionada para ajustar o pH para 5 a 6, e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 1 hora. TFA (10 µL) foi adicionado à mistura de reação, e depois a solução desta foi purificada por cromatografia em coluna em fase reversa (gradiente de solvente 5 → 50 % acetonitrila/solução aquosa de TFA a 0,1 %) para obter o composto do título (16 mg). MS (ESI-); 1072,1 (viii) Síntese de conjugado No 18
[0405] [N-({4-[(2-{4,7,10-tris[(carbóxi-ϏO)metil]-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-1-il-Ϗ4N1,N4,N7,N10}acetamido-ϏO)metil]fenil}carbamoil)-L-metionil- N1-[2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)etil]-L-isoleucinamidato(3-)]gadolínio (1 mg) sintetizado no Exemplo 2-18 (vii) foi dissolvido em DMSO (40 µL). Um tampão de borato 0,1 M (40 µL) foi adicionado à solução resultante, e o pH foi ajustado para 7,3 usando uma solução aquosa de carbonato de sódio 0,1 M e um tampão de acetato 0,25 M.
[0406] 40 µL da solução previamente preparada foram adicionados a um tampão de borato Fab2 de 4,45 mg/mL (160 µL), e a mistura resultante foi incubada a 30 °C por 2 horas. A mistura foi purificada usando uma coluna PD-10, e a solução resultante foi recuperada usando um filtro centrífugo Amicon Ultra de 0,5 mL. A solução recuperada foi lavada com solução salina tamponada com fosfato 7 vezes, finalmente concentrada e depois filtrada através de um filtro de membrana para obter um conjugado. Foi confirmado pela análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual um [Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-F)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH- (CH2)2-Z1(#N)] tendo um peso molecular de 1074 foi ligado a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa, um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele e um conjugado no qual três de tais moléculas foram ligadas a ele. (Exemplo 2-66. Síntese de ([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-F)-NH-C(=O)-Met-Ile- NH-(CH2)2-(A-4 e/ou A-5)]p-Fab2)) Síntese de conjugado No 66
[0407] [N-({4-[(2-{4,7,10-tris[(carbóxi-ϏO)metil]-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-1-il-Ϗ4N1,N4,N7,N10}acetamido-ϏO)metil]fenil}carbamoil)-L-metionil- N1-[2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)etil]-L-isoleucinamidato(3-)]gadolínio (1 mg) sintetizado no Exemplo 2-18 (vii) foi dissolvido em DMSO (40 µL). Um tampão de borato 0,1 M (40 µL) foi adicionado à solução resultante, e o pH foi ajustado para 6,5 usando uma solução aquosa de carbonato de sódio 0,1 M.
[0408] A solução previamente preparada foi adicionada a um tampão de borato Fab2 de 4,45 mg/mL (320 µL), e a mistura resultante foi incubada a 30 °C por 2 horas. 10 µL de EDTA 0,05 M foram adicionados, e a mistura resultante foi incubada a 30 °C por 10 minutos. Usando um filtro centrífugo Amicon Ultra de 15 mL, a mistura foi lavada duas vezes com solução salina tamponada com fosfato, e a solução resultante foi recuperada.
[0409] Uma solução tampão de bis tris propano 20 mM (pH 9,5) foi adicionada à solução recuperada, diluída a uma quantidade de 5 vezes, sustentada em uma coluna HiTrap Q de 5 mL (GE Healthcare), e deixada repousar na temperatura ambiente por 6 horas. A coluna foi lavada usando uma solução tampão de bis tris propano 20 mM (pH 9,5) e um solução aquosa de cloreto de sódio 1 M, e a solução de suporte foi recuperada. A solução tampão foi trocada com solução salina tamponada com fosfato usando um filtro centrífugo Amicon Ultra de 15 mL, depois a solução foi purificada usando uma coluna PD-10, e a solução resultante foi recuperada usando um filtro centrífugo Amicon Ultra de 15 mL. A solução recuperada foi lavada duas vezes com solução salina tamponada com fosfato, finalmente concentrada e depois filtrada através de um filtro de membrana para obter um conjugado. Foi confirmado pela análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual um [Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-F)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4 e/ou A-5)] tendo um peso molecular de 1092 foi ligado a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa, um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele, um conjugado no qual três de tais moléculas foram ligadas a ele e um conjugado no qual quatro de tais moléculas foram ligadas a ele. (Exemplo 2-67. Síntese de ([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-F)-NH-C(=O)-Met-Ile- NH-(CH2)2-Z1(#S)]p-Fab2)) Síntese de conjugado No 67
[0410] [N-({4-[(2-{4,7,10-tris[(carbóxi-ϏO)metil]-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-1-il-Ϗ4N1,N4,N7,N10}acetamido-ϏO)metil]fenil}carbamoil)-L-metionil- N1-[2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)etil]-L-isoleucinamidato(3-)]gadolínio (2 mg) sintetizado no Exemplo 2-18 (vii) foi dissolvido em DMSO (80 µL), um tampão de borato 0,1 M (80 µL) foi adicionado, e depois o pH foi ajustado para 7,3 usando uma solução aquosa de carbonato de sódio 0,1 M.
[0411] Uma solução de 2-IT de 2 mg/mL (10 µL) preparada usando um tampão de borato 0,1 M foi adicionada a um tampão de borato Fab2 de 4,45 mg/mL (320 µL), e a mistura resultante foi incubada a 37 °C por 40 minutos. O excesso de 2-IT foi lavado com solução salina tamponada com fosfato usando um filtro centrífugo Amicon Ultra de 15 mL e concentrado a 200 µL, depois a solução previamente preparada foi adicionada e a mistura resultante foi incubada a 30 °C por 2 horas. EDTA 0,05 M (10 µL) foi adicionado, a mistura resultante foi incubada a 30 °C por 10 minutos, depois a mistura foi purificada usando uma coluna PD-10, e a solução resultante foi recuperada usando um filtro centrífugo Amicon Ultra de 15 mL. A solução recuperada foi lavada duas vezes com solução salina tamponada com fosfato, finalmente concentrada e depois filtrada através de um filtro de membrana para obter um conjugado.
[0412] Foi confirmado pela análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual um [Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-F)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2- Z1(#S)] tendo um peso molecular de 1175 foi ligado a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa, um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele e um conjugado no qual três de tais moléculas foram ligadas a ele. (Exemplo 2-68. Síntese de ([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-F)-NH-C(=O)-Met-Ile- NH-(CH2)2-(A-3)]p-Fab2)) [Fórmula Química 121]
(I) Síntese de N1-(2-{[(benzilóxi)carbonil]amino}etil)-N2-(terc-butoxicarbonil)-L- isoleucinamida
[0413] DIPEA (6,6 mL) e monocloridreto de carbamato de benzil (2-aminoetila) (3,29 g) foram sequencialmente adicionados a uma solução mista de N-(terc-
butoxicarbonil)-L-isoleucina (3,00 g) e HATU (5,92 g) em diclorometano (30 ml), e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 1 hora. Uma solução aquosa saturada de hidrogenocarbonato de sódio foi adicionada à mistura de reação, e a mistura resultante foi extraída duas vezes com diclorometano. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com uma solução aquosa saturada de cloreto de sódio, e depois secas sobre sulfato de sódio anidro, filtradas e depois concentradas. 200 mL de uma solução de acetato de etila/diclorometano (1:2) foram adicionados ao resíduo, e depois a mistura resultante foi concentrada para fornecer uma solução de 100 mL, que depois foi esfriada em gelo. O sólido precipitado foi coletado por filtração e lavado com uma solução de acetato de etila/diclorometano (1:1) para obter um sólido. O filtrado foi concentrado novamente e depois esfriado em gelo, e o sólido precipitado foi coletado por filtração e lavado com uma solução de acetato de etila/diclorometano (1:1) para obter um sólido. Os sólidos obtidos foram combinados e secos sob pressão reduzida para obter o composto do título (4,10 g). MS (ESI+): 408,3 (ii) Síntese de N-(terc-butoxicarbonil)-L-metionil-N1-(2- {[(benzilóxi)carbonil]amino}etil)-L-isoleucinamida
[0414] TFA (7,51 mL) foi adicionado a uma solução de N1-(2- {[(benzilóxi)carbonil]amino}etil)-N2-(terc-butoxicarbonil)-L-isoleucinamida (2,00 g) em diclorometano (10 mL) sob resfriamento em gelo, e a mistura resultante foi agitada na mesma temperatura por 1 hora. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida, depois N-(terc-butoxicarbonil)-L-metionina (1,35 g), DIPEA (4,2 mL), diclorometano (20 mL) e HATU (2,24 g) foram adicionados a este resíduo, e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 1 hora. O sólido precipitado foi coletado por filtração, lavado com diclorometano e metanol, e depois seco sob pressão reduzida para obter o composto do título (1,58 g). MS (ESI+): 539,4 (iii) Síntese de L-metionil-N1-(2-{[(benzilóxi)carbonil]amino}etil)-L-
isoleucinamida
[0415] TFA (3 ml) foi adicionado às gotas a uma solução de N-(terc- butoxicarbonil)-L-metionil-N1-(2-{[(benzilóxi)carbonil]amino}etil)-L-isoleucinamida (1,05 g) em diclorometano (6 ml) sob resfriamento em gelo. A mistura resultante foi agitada na mesma temperatura por 2 horas. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida, diclorometano e uma solução aquosa saturada de hidrogenocarbonato de sódio foram adicionados, e a mistura resultante foi extraída duas vezes com diclorometano. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com uma solução aquosa saturada de cloreto de sódio, e depois secas sobre sulfato de sódio anidro, filtradas e depois concentradas obter um produto bruto do composto do título (690 mg). MS (ESI+): 439,4 (iv) Síntese de N-[(4-{[(terc-butoxicarbonil)amino]metil}fenil)carbamoil]-L- metionil-N1-(2-{[(benzilóxi)carbonil]amino}etil)-L-isoleucinamida
[0416] Fosforaziato de difenila (680 µL) foi adicionado a uma solução mista de ácido 4-{[(terc-butoxicarbonil)amino]metil}benzoico (395 mg), TEA (660 µL) e tolueno (20 mL) sob uma atmosfera de argônio, e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 1 hora e depois agitada a uma temperatura de banho de 100 °C por 2 horas. A solução de reação foi deixada resfriar até a temperatura ambiente, uma solução de L-metionil-N1-(2-{[(benzilóxi)carbonil]amino}etil)-L- isoleucinamida (690 mg) em THF (7 mL) foi adicionada, e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 3 horas. A solução de reação foi concentrada sob pressão reduzida, uma solução aquosa de hidrogenocarbonato de sódio e acetato de etila foram adicionados, e o sólido resultante foi filtrado, lavado com acetato de etila e depois seco sob pressão reduzida para obter o composto do título (790 mg). MS (ESI+): 687,5 (v) Síntese de N-{[4-(aminometil)fenil]carbamoil}-L-metionil-N1-(2- {[(benzilóxi)carbonil]amino}etil)-L-isoleucinamida
[0417] TFA (2 ml) foi adicionado às gotas a uma solução de N-[(4-{[(terc- butoxicarbonil)amino]metil}fenil)carbamoil]-L-metionil-N1-(2- {[(benzilóxi)carbonil]amino}etil)-L-isoleucinamida (790 mg) em diclorometano (3 ml) sob resfriamento em gelo. A mistura resultante foi agitada na mesma temperatura por 1 hora. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida, e uma solução aquosa saturada de hidrogenocarbonato de sódio foi adicionada. O sólido precipitado foi coletado por filtração, lavado com água e depois seco sob pressão reduzida para obter um produto bruto do composto do título (720 mg). MS (ESI+): 587,6 (vi) Síntese de N-{[4-({2-[4,7,10-tris(2-terc-butóxi-2-oxoetil)-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-1-il]acetamido}metil)fenil]carbamoil}-L-metionil-N1-(2- {[(benzilóxi)carbonil]amino}etil)-L-isoleucinamida
[0418] HATU (280 mg) foi adicionado a uma solução mista de N-{[4- (aminometil)fenil]carbamoil}-L-metionil-N1-(2-{[(benzilóxi)carbonil]amino}etil)-L- isoleucinamida (360 mg), DOTA-tris(t-Bu) éster (386 mg) e DIPEA (320 µL) em DMAc (2 mL), e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 2 horas. A mistura de reação foi purificada por cromatografia em coluna de gel de sílica (gradiente de solvente; 0 → 20 % metanol/clorofórmio) para obter o composto do título (683 mg). MS (ESI+); 1141,9 (vii) Síntese de N-{[4-({2-[4,7,10-tris(2-terc-butóxi-2-oxoetil)-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-1-il]acetamido}metil)fenil]carbamoil}-L-metionil-N1-(2-aminoetil)-L- isoleucinamida
[0419] Uma mistura de N-{[4-({2-[4,7,10-tris(2-terc-butóxi-2-oxoetil)-1,4,7,10- tetra-azaciclododecan-1-il]acetamido}metil)fenil]carbamoil}-L-metionil-N1-(2- {[(benzilóxi)carbonil]amino}etil)-L-isoleucinamida (683 mg), paládio a 10 % em carbono (50 % úmido com água, 382 mg) e metanol (10 mL) foi agitada sob uma atmosfera de hidrogênio (1 atm) na temperatura ambiente por 18 horas. A mistura foi filtrada para remover a matéria insolúvel e depois concentrada. Paládio a 10 % em carbono (teor de água de 50 %, 382 mg) e metanol (10 mL) foram adicionados ao resíduo, e a mistura resultante foi agitada sob uma atmosfera de hidrogênio (1 atm) na temperatura ambiente por 2 horas. A mistura foi filtrada para remover a matéria insolúvel e depois concentrada para obter o composto do título (417 mg). MS (ESI+); 1007,7 (viii) Síntese de pentacis(trifluoroacetato) de N-{[4-({2-[4,7,10- tris(carboximetil)-1,4,7,10-tetra-azaciclododecan-1- il]acetamido}metil)fenil]carbamoil}-L-metionil-N1-(2-aminoetil)-L-isoleucinamida
[0420] Uma solução mista de N-{[4-({2-[4,7,10-tris(2-terc-butóxi-2-oxoetil)- 1,4,7,10-tetra-azaciclododecan-1-il]acetamido}metil)fenil]carbamoil}-L-metionil-N1-(2- aminoetil)-L-isoleucinamida (417 mg), água (210 µL), tri(propan-2-il)silano (210 µL) e TFA (8 mL) foi agitada na temperatura ambiente por 3 horas. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida, e depois o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em fase reversa (gradiente de solvente; 0 → 33 % acetonitrila/solução aquosa de TFA a 0,1 %) para obter o composto do título (255 mg). MS (ESI+); 839,7 (ix) Síntese de tetracis(trifluoroacetato) de N-{[4-({2-[4,7,10-tris(carboximetil)- 1,4,7,10-tetra-azaciclododecan-1-il]acetamido}metil)fenil]carbamoil}-L-metionil-N1-(2- {[(4-isotiocianatofenil)carbamotioil]amino}etil)-L-isoleucinamida
[0421] TEA (200 µL) foi adicionado a uma solução de pentacis(trifluoroacetato) de N-{[4-({2-[4,7,10-tris(carboximetil)-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-1-il]acetamido}metil)fenil]carbamoil}-L-metionil-N1-(2-aminoetil)-L- isoleucinamida (255 mg) em DMAc (2 mL) sob resfriamento em gelo, e a mistura resultante foi agitada na mesma temperatura por 10 minutos. Uma solução de 1,4-di- isotiocianatobenzeno (174 mg) em DMAc (2 mL) foi adicionada à solução, e a mistura resultante foi agitada na mesma temperatura por 1 hora. A solução de reação foi purificada por cromatografia em coluna em fase reversa (gradiente de solvente; 0 → 50 % acetonitrila/solução aquosa de TFA a 0,1 %) para obter o composto do título
(136 mg). MS (ESI+); 1031,4 (x) Síntese de N-({4-[(2-{4,7,10-tris[(carbóxi-ϏO)metil]-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-1-il-Ϗ4N1,N4,N7,N10}acetamido-ϏO)metil]fenil}carbamoil)-L-metionil- N1-[2-{[(4-isotiocianatofenil)carbamotioil]amino}etil]-L-isoleucinamidato(3-)]gadolínio
[0422] Cloreto de gadolínio (10 mg) e uma solução aquosa de hidrogenocarbonato de sódio 0,1 M (1,7 mL) foram adicionados a uma mistura de tetracis(trifluoroacetato) de N-{[4-({2-[4,7,10-tris(carboximetil)-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-1-il]acetamido}metil)fenil]carbamoil}-L-metionil-N1-[2-{[(4- isotiocianatofenil)carbamotioil]amino}etil]-L-isoleucinamida (36 mg) e água (1,8 mL) para ajustar o pH para 5,4, e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 30 minutos. A mistura de reação foi purificada por cromatografia em coluna em fase reversa (gradiente de solvente; 0 → 50 % acetonitrila/solução aquosa de TFA a 0,1 %) para obter o composto do título (33,0 mg). MS (ESI-); 1184,3 (xi) Síntese de conjugado No 68
[0423] [N-({4-[(2-{4,7,10-tris[(carbóxi-ϏO)metil]-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-1-il-Ϗ4N1,N4,N7,N10}acetamido-ϏO)metil]fenil}carbamoil)-L-metionil- N1-[2-{[(4-isotiocianatofenil)carbamotioil]amino}etil]-L-isoleucinamidato(3-)]gadolínio (1 mg) sintetizado no Exemplo 2-68 (x) foi dissolvido em DMSO (310 µL).
[0424] 30 µL da solução previamente preparada foram adicionados a uma solução salina tamponada com fosfato Fab2 de 4,45 mg/mL (320 µL), o pH foi ajustado para cerca de 9,0 usando uma solução aquosa de carbonato de sódio 0,1 M, e a mistura resultante foi incubada a 37 °C por 24 horas. A mistura foi purificada usando uma coluna PD-10, e a solução resultante foi recuperada usando um filtro centrífugo Amicon Ultra de 15 mL. A solução recuperada foi lavada duas vezes com solução salina tamponada com fosfato, finalmente concentrada e depois filtrada através de um filtro de membrana para obter um conjugado. Foi confirmado pela análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual um [Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-
F)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)] tendo um peso molecular de 1187 foi ligado a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa, um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele e um conjugado no qual três de tais moléculas foram ligadas a ele. (Exemplo 2-69. Síntese de ([Gd/DOTA-[2,5-(1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolina)]- C(=O)-Met-Gli-Lis*-C(=S)-NH-(1,4-F)-NH-C(=S)]p-Fab2)) [Fórmula Química 122]
(i) Síntese de N-[2-(terc-butoxicarbonil)-1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolina-5- carbonil]-L-metionilglicil-N6-[(benzilóxi)carbonil]-L-lisinato de terc-butila
[0425] TEA (0,24 mL) e HATU (241 mg) foram adicionados a uma solução mista de L-metionilglicil-N6-[(benzilóxi)carbonil]-L-lisinato de terc-butila (303 mg) e ácido 2-(terc-butoxicarbonil)-1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolina-5-carboxílico (160 mg) em diclorometano (10 mL), e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 1 hora. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida, e depois o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (gradiente de solvente; 0 → 4 % metanol/clorofórmio) para obter o composto do título (191 mg). MS (ESI+); 784,4 (ii) Síntese de mono(trifluoroacetato) de N-(1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolina-5- carbonil)-L-metionilglicil-N6-[(benzilóxi)carbonil]-L-lisinato de terc-butila
[0426] TFA (1 ml) foi adicionado às gotas a uma solução de N-[2-(terc- butoxicarbonil)-1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolina-5-carbonil]-L-metionilglicil-N6- [(benzilóxi)carbonil]-L-lisinato de terc-butila (190 mg) em diclorometano (3 ml) sob resfriamento em gelo. A mistura resultante foi agitada na mesma temperatura por 1 hora e depois concentrada sob pressão reduzida para obter um produto bruto do composto do título (262 mg). MS (ESI+): 684,5 (iii) Síntese de tetracis(trifluoroacetato) de N-(2-{[4,7,10-tris(2-terc-butóxi-2- oxoetil)-1,4,7,10-tetra-azaciclododecan-1-il]acetil}-1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolina-5- carbonil)-L-metionilglicil-N6-[(benzilóxi)carbonil]-L-lisinato de terc-butila
[0427] HATU (184 mg) e DIPEA (124 µL) foram adicionados a uma solução de DOTA-tris(t-Bu) éster (138 mg) em DMAc (1 mL), e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 5 minutos. Uma solução de mono(trifluoroacetato) de N- (1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolina-5-carbonil)-L-metionilglicil-N6-[(benzilóxi)carbonil]-L- lisinato de terc-butila (261 mg) em DMAc (1 mL) foi adicionado à solução de reação, e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 2 horas. A mistura de reação foi diluída com uma solução aquosa de TFA a 1 % (cerca de 1 ml), e depois a solução resultante foi purificada por cromatografia em coluna em fase reversa (gradiente de solvente; 20 → 100 % acetonitrila/solução aquosa de TFA a 0,1 %) para obter o composto do título (231 mg). MS (ESI+); 1260,7 [M+Na]+ (iv) Síntese de tetracis(trifluoroacetato) de N-(2-{[4,7,10-tris(2-terc-butóxi-2- oxoetil)-1,4,7,10-tetra-azaciclododecan-1-il]acetil}-1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolina-5- carbonil)-L-metionilglicil-L-lisinato de terc-butila
[0428] Uma mistura de tetracis(trifluoroacetato) de N-(2-{[4,7,10-tris(2-terc- butóxi-2-oxoetil)-1,4,7,10-tetra-azaciclododecan-1-il]acetil}-1,2,3,4-tetra- hidroisoquinolina-5-carbonil)-L-metionilglicil-N6-[(benzilóxi)carbonil]-L-lisinato de terc- butila (230 mg), paládio a 10 % em carbono (50 % úmido com água, 300 mg), e metanol (10 mL) foi agitada na temperatura ambiente por 10 minutos. A mistura foi filtrada para remover a matéria insolúvel, e depois o filtrado foi concentrado. Paládio a 10 % em carbono (50 % úmido com água, 300 mg) e metanol (10 mL) foram adicionados ao resíduo, e depois a mistura resultante foi agitada sob uma atmosfera de hidrogênio (3 atm) na temperatura ambiente por 18 horas. A mistura foi filtrada para remover a matéria insolúvel e depois concentrada para obter o composto do título (152 mg). MS (ESI+); 1104,5 (v) Síntese de pentacis(trifluoroacetato) de N-(2-{[4,7,10-tris(carboximetil)- 1,4,7,10-tetra-azaciclododecan-1-il]acetil}-1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolina-5-carbonil)- L-metionilglicil-L-lisina
[0429] TFA (1,5 mL) foi adicionado a uma solução de tetracis(trifluoroacetato) de N-(2-{[4,7,10-tris(2-terc-butóxi-2-oxoetil)-1,4,7,10-tetra-azaciclododecan-1- il]acetil}-1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolina-5-carbonil)-L-metionilglicil-L-lisinato de terc- butila (152 mg) em diclorometano (1 mL), e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 4 horas. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida, e depois o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em fase reversa (gradiente de solvente; 0 → 33 % acetonitrila/solução aquosa de TFA a 0,1 %) para obter o composto do título (76 mg). MS (ESI+); 880,4 (vi) Síntese de tetracis(trifluoroacetato) de N-(2-{[4,7,10-tris(carboximetil)-
1,4,7,10-tetra-azaciclododecan-1-il]acetil}-1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolina-5-carbonil)- L-metionilglicil-N6-[(4-isotiocianatofenil)carbamotioil]-L-lisina
[0430] TFA (60 µL) foi adicionado a uma solução de pentacis(trifluoroacetato) de N-(2-{[4,7,10-tris(carboximetil)-1,4,7,10-tetra-azaciclododecan-1-il]acetil}-1,2,3,4- tetra-hidroisoquinolina-5-carbonil)-L-metionilglicil-L-lisina (76 mg) e 1,4-di- isotiocianatobenzeno (50 mg) em DMAc (1 mL) sob resfriamento em gelo, e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 1 hora. A solução de reação foi purificada por cromatografia em coluna em fase reversa (gradiente de solvente; 0 → 50 % acetonitrila/solução aquosa de TFA a 0,1 %) para obter o composto do título (46 mg). MS (ESI-); 1070,6 (vii) Síntese de {N-[2-({4,7,10-tris[(carbóxi-ϏO)metil]-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-1-il-Ϗ4N1,N4,N7,N10}acetil-ϏO)-1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolina-5- carbonil]-L-metionilglicil-N6-[(4-isotiocianatofenil)carbamotioil]-L-lisinato(3-)}gadolínio
[0431] Cloreto de gadolínio (8 mg) e uma solução aquosa de hidrogenocarbonato de sódio 0,1 M (700 µL) foram adicionados a uma mistura de tetracis(trifluoroacetato) de N-(2-{[4,7,10-tris(carboximetil)-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-1-il]acetil}-1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolina-5-carbonil)-L-metionilglicil- N6-[(4-isotiocianatofenil)carbamotioil]-L-lisina (16 mg) e água (800 µL), e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente por 30 minutos. A mistura de reação foi purificada por cromatografia em coluna em fase reversa (gradiente de solvente; 0 → 40 % acetonitrila/solução aquosa de TFA a 0,1 %) para obter o composto do título (7,4 mg). MS (ESI-); 1225,3 (viii) Síntese de conjugado No 69
[0432] {N-[2-({4,7,10-tris[(carbóxi-ϏO)metil]-1,4,7,10-tetra-azaciclododecan- 1-il-Ϗ4N1,N4,N7,N10}acetil-ϏO)-1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolina-5-carbonil]-L- metionilglicil-N6-[(4-isotiocianatofenil)carbamotioil]-L-lisinato(3-)}gadolínio (1 mg) sintetizado no Exemplo 2-69 (vii) foi dissolvido em DMSO (310 µL).
[0433] 30 µL da solução previamente preparada foram adicionados a uma solução salina tamponada com fosfato Fab2 de 4,45 mg/mL (320 µL), o pH foi ajustado para cerca de 9,0 usando uma solução aquosa de carbonato de sódio 0,1 M, e a mistura resultante foi incubada a 37 °C por 24 horas. A mistura foi purificada usando uma coluna PD-10, e a solução resultante foi recuperada usando um filtro centrífugo Amicon Ultra de 15 mL. A solução recuperada foi lavada duas vezes com solução salina tamponada com fosfato, finalmente concentrada e depois filtrada através de um filtro de membrana para obter um conjugado. Foi confirmado pela análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual um [Gd/DOTA-[2,5-(1,2,3,4- tetra-hidroisoquinolina)]-C(=O)-Met-Gli-Lis*-C(=S)-NH-(1,4-F)-NH-C(=S)] tendo um peso molecular de 1228 foi ligado a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa, um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele, um conjugado no qual três de tais moléculas foram ligadas a ele, um conjugado no qual quatro de tais moléculas foram ligadas a ele e um conjugado no qual cinco de tais moléculas foram ligadas a ele.
[0434] Os conjugados obtidos nos Exemplos de Produção acima são mostrados nas Tabelas 1 e 2. [Tabela 1]
[Tabela 2]
e/ou
[0435] Nas tabelas acima e Tabelas 15 a 18 fornecidas posteriormente, - representa uma ligação, e símbolos (a) a (q) na coluna S1 representa espaçadores representados pelas seguintes fórmulas (a) a (q), respectivamente. [Fórmula Química 123]
or
[0436] Os compostos do Exemplo de Produção Nos A1 a A43 e B1 a B4 nas Tabelas 3 a 14 foram sintetizados usando os mesmos métodos como nos Exemplos de Produção acima ou métodos conhecidos aos técnicos no assunto, e estes compostos foram usados para obter os conjugados mostrados nas Tabelas 15 a 18 abaixo. [Tabela 3]
[Tabela 4]
[Tabela 5]
[Tabela 6]
[Tabela 7]
[Tabela 8]
[Tabela 9]
[Tabela 10]
[Tabela 11]
[Tabela 12]
[Tabela 13]
[Tabela 14]
[Tabela 15]
[Tabela 16]
[Tabela 17]
[Tabela 18]
[0437] As análises de MS dos compostos do Exemplo mostrados nas Tabelas 15 a 18 são mostradas nas Tabelas 19 a 23 abaixo. [Tabela 19] Ex-No MS Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um 1 conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso molecular de 937 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa e um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele. Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 2 molecular de 838 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa e um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele. Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 3 molecular de 852 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa, um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele, e um conjugado no qual três de tais moléculas foram ligadas a ele. Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 4 molecular de 1046 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa, um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele, e um conjugado no qual três de tais moléculas foram ligadas a ele. Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 5 molecular de 926 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa e um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele. Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 6 molecular de 1059 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa e um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele. Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 7 molecular de 1061 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa, um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele, e um conjugado no qual três de tais moléculas foram ligadas a ele. Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 8 molecular de 1027 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa e um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele. Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 9 molecular de 958 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa, um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele, e um conjugado no qual três de tais moléculas foram ligadas a ele. Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 10 molecular de 1012 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa e um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele. Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 14 molecular de 1093 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa, um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele, e um conjugado no qual três de tais moléculas foram ligadas a ele. Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 17 molecular de 1149 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa e um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele.
[Tabela 20]
Ex-No MS Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 18 molecular de 1074 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa, um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele, e um conjugado no qual três de tais moléculas foram ligadas a ele.
Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso molecular de 988 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa, 19 um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele, um conjugado no qual três de tais moléculas foram ligadas a ele, e um conjugado no qual quatro de tais moléculas foram ligadas a ele.
Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 20 molecular de 825 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa, um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele, e um conjugado no qual três de tais moléculas foram ligadas a ele.
Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso molecular de 960 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa, 21 um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele, um conjugado no qual três de tais moléculas foram ligadas a ele, e um conjugado no qual quatro de tais moléculas foram ligadas a ele.
Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 22 molecular de 896 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa, um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele, e um conjugado no qual três de tais moléculas foram ligadas a ele.
Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 23 molecular de 936 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa, um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele, e um conjugado no qual três de tais moléculas foram ligadas a ele.
Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 25 molecular de 1248 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa e um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele.
Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 26 molecular de 954 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa, um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele, e um conjugado no qual três de tais moléculas foram ligadas a ele.
Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 27 molecular de 950 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa, um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele, e um conjugado no qual três de tais moléculas foram ligadas a ele.
Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 28 molecular de 908 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa, um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele, e um conjugado no qual três de tais moléculas foram ligadas a ele.
Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 30 molecular de 1149 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa, um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele, e um conjugado no qual três de tais moléculas foram ligadas a ele.
[Tabela 21] Ex-No MS Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 31 molecular de 1123 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa e um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele. Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 32 molecular de 1095 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa e um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele. Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 34 molecular de 1101 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa e um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele. Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 36 molecular de 1045 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa, um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele, e um conjugado no qual três de tais moléculas foram ligadas a ele. Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 37 molecular de 1045 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa, um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele, e um conjugado no qual três de tais moléculas foram ligadas a ele. Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 38 molecular de 1190 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa, um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele, e um conjugado no qual três de tais moléculas foram ligadas a ele. Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 39 molecular de 1384 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa, um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele, e um conjugado no qual três de tais moléculas foram ligadas a ele. Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso molecular de 1145 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa, 41 um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele, um conjugado no qual três de tais moléculas foram ligadas a ele, e um conjugado no qual quatro de tais moléculas foram ligadas a ele. Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi um conjugado no qual 42 uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso molecular de 1107 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa. Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um 43 conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso molecular de 1090 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa e um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele. Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 44 molecular de 1259 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa, um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele, e um conjugado no qual três de tais moléculas foram ligadas a ele.
[Tabela 22] Ex-No MS Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 45 molecular de 1296 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa e um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele. Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 46 molecular de 1296 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa e um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele. Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 49 molecular de 1203 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa e um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele. Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 50 molecular de 1280 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa e um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele. Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um 51 conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso molecular de 1443 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa. Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 52 molecular de 984 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa, um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele, e um conjugado no qual três de tais moléculas foram ligadas a ele. Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 53 molecular de 1148 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa e um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele. Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um 54 conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso molecular de 1121 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa. Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 55 molecular de 1187 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa e um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele. Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 56 molecular de 1153 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa e um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele. Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 57 molecular de 1079 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa, um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele, e um conjugado no qual três de tais moléculas foram ligadas a ele. Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um 58 conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso molecular de 1244 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa.
[Tabela 23] Ex-No MS Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 59 molecular de 1304 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa e um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a isso Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi um conjugado no qual 62 uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso molecular de 1106 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa. Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 63 molecular de 1253 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa e um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele. Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 64 molecular de 1076 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa, um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele, e um conjugado no qual três de tais moléculas foram ligadas a ele. Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 65 molecular de 1234 foi ligada a um Fab2 tendo um peso molecular de 47,9 kDa e um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele.
Exemplo 3-1: Avaliação da atividade de ligação de conjugado de fragmento Fab de anticorpo CEACAM5
[0438] Cada conjugado de fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano preparado no Exemplo 2 foi submetido a ELISA para avaliar a atividade de ligação deste a CEACAM5. No presente teste, um tampão de fosfato (Nacalai Tesque Inc., tampão de Solução de Fosfato de 0,1 mol/L (pH 7,2)) preparado a 10 mM diluindo-se 10 vezes com água destilada foi usado como um solvente para um líquido de imobilização de antígeno, e Tampão de PBS 20X/Tween 20 (Thermo Fisher Scientific Inc., 28352) diluído 20 vezes com água destilada foi usado como um líquido de lavagem. Além disso, para albumina de soro bovino (BSA) usada no presente teste, solução de albumina de soro bovino a 30 % (Sigma-Aldrich, Inc., A9576-50ML) foi adicionada em uma proporção apropriada para o uso. CEACAM5 (R&D Systems, 4128-CM-050) foi diluído com um tampão de fosfato 10 mM (pH 7,2) a 0,1 µg/mL, e adicionado a uma placa Nunc MaxiSorp White 384 (Nunc, 4603272) a 30 µL por poço, e a placa foi incubada durante a noite a 4 °C por imobilização. O líquido de imobilização de CEACAM5 foi removido por centrifugação reversa, e depois o bloqueio foi realizado adicionando-se um tampão de PBS/Tween 20 contendo BSA a 5,0 %. Depois disso, a solução de bloqueio foi removida por centrifugação reversa, uma solução de cada conjugado de fragmento Fab2 de anticorpo CEACAM5 descrita acima ou um fragmento Fab2 não tendo nenhuma porção de marcação (PB009-01) como um controle a cerca de 10000 ng/mL foi diluído em 14 etapas por diluição de 3 vezes usando um tampão de PBS/Tween 20 contendo BSA a 1,0 %, e 30 µL foram adicionados por poço e incubados na temperatura ambiente por 60 minutos. A placa foi lavada 3 vezes com um tampão de PBS/Tween 20, e anticorpo IgG anti-humano de cabra marcado com peroxidase de raiz forte (HRP) (cadeia H + L) (MBL Life Sciences, 206) diluído 1000 vezes usando um tampão de PBS/Tween 20 contendo BSA a 5,0 % foi adicionado a 30 µL por poço e incubado na temperatura ambiente por 30 minutos. A placa foi lavada 3 vezes com um tampão de PBS/Tween 20, e reagente de detecção ECL Prime Western Blotting (GE Healthcare, RPN2232) como um substrato foi adicionado a 30 µL por poço. O substrato foi incubado na temperatura ambiente por 15 minutos, e depois um valor de sinal deste foi medido usando um contador Envision (PerkinElmer, Inc.).
[0439] O teste para cada anticorpo foi realizado em duplicata, e um valor de EC50 foi calculado usando um modelo de curva logística de 4 parâmetros. A média geométrica (Média geométrica), o padrão desvio (Fator de SD geométrico), e o limite inferior (Inferior) e o limite superior (Superior) do intervalo de confiança de 95 % (CI a 95 % de média geométrica) dos valores de EC50 (nM) para 9 rodadas para PB009-01 são mostrados na Tabela 24. Além disso, o valor de EC50 de cada conjugado conduzido em duplicata é mostrado na Tabela 25. Ex-No na tabela mostra um número do conjugado no Exemplo 2.
[Tabela 24] PB009-01 Média geométrica (nM) 0,20 Fator SD geométrico 1,45 CI a 95 % inferior à média geométrica (nM) 0,15 CI a 95 % superior à média geométrica 0,27 (nM) [Tabela 25] Ex-No EC50 Ex-No EC50 Ex-No EC50 (nM) (nM) (nM) 1 0,16 20 0,22 39 0,20 2 0,14 21 0,27 40 0,22 3 0,13 22 0,32 41 0,21 4 0,15 23 0,33 42 0,21 5 0,14 24 0,25 43 0,23 6 0,14 25 0,32 44 0,29 7 0,17 26 0,30 45 0,23 8 0,11 27 0,46 46 0,22 9 0,10 28 0,36 47 0,25 10 0,11 29 0,30 48 0,21 11 0,14 30 0,31 54 0,23 12 0,11 31 0,30 55 0,26 13 0,14 32 0,37 56 0,26 14 0,13 33 0,33 57 0,29 15 0,13 34 0,38 58 0,28 17 0,23 35 0,43 59 0,30 18 0,24 36 0,38 60 0,18 19 0,26 37 0,23 61 0,18 38 0,18 64 0,20 Exemplo 3-2:
[0440] Cada conjugado de fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano preparado no Exemplo 2 foi submetido a ELISA para avaliar a atividade de ligação deste a CEACAM5. No presente teste, um tampão de fosfato (Nacalai Tesque Inc., tampão de Solução de Fosfato de 0,1 mol/L (pH 7,2)) preparado a 10 mM diluindo-se 10 vezes com água destilada foi usado como um solvente para um líquido de imobilização de antígeno, e tampão de PBS 20X/Tween 20 (Thermo Fisher Scientific Inc., 28352) diluído 20 vezes com água destilada foi usado como um líquido de lavagem. Além disso, para albumina de soro bovino (BSA) usada no presente teste, solução de albumina de soro bovino a 30 % (Sigma-Aldrich, Inc., A9576-50ML) foi adicionada em uma proporção apropriada para o uso. CEACAM5 (R&D Systems,
4128-CM-050) foi diluído com um tampão de fosfato 10 mM (pH 7,2) a 0,1 µg/mL, e adicionado a uma placa Nunc MaxiSorp White 384 (Nunc, 4603272) a 30 µL por poço, e a placa foi incubada durante a noite a 4 °C por imobilização. O líquido de imobilização de CEACAM5 foi removido por centrifugação reversa, e depois o bloqueio foi realizado adicionando-se um tampão de PBS/Tween 20 contendo BSA a 5,0 %. Depois disso, a solução de bloqueio foi removida por centrifugação reversa, uma solução de cada conjugado de fragmento Fab2 de anticorpo CEACAM5 descrita acima ou um fragmento Fab2 não tendo nenhuma porção de marcação (PB009-01) como um controle a cerca de 10000 ng/mL foi diluído em 14 etapas por diluição de 3 vezes usando um tampão de PBS/Tween 20 contendo BSA a 1,0 %, e 30 µL foram adicionados por poço e incubados na temperatura ambiente por 60 minutos. A placa foi lavada 3 vezes com um tampão de PBS/Tween 20, e anticorpo IgG anti-humano de cabra marcado com peroxidase de raiz forte (HRP) (cadeia H + L) (MBL Life Sciences, 206) diluído 1000 vezes usando um tampão de PBS/Tween 20 contendo BSA a 5,0 % foi adicionado a 30 µL por poço e incubado na temperatura ambiente por 30 minutos. A placa foi lavada 3 vezes com um tampão de PBS/Tween 20, e reagente de detecção ECL Prime Western Blotting (GE Healthcare, RPN2232) como um substrato foi adicionado a 30 µL por poço. O substrato foi incubado na temperatura ambiente por 15 minutos, e depois um valor de sinal deste foi medido usando um contador Envision (PerkinElmer, Inc.).
[0441] O teste para cada anticorpo foi realizado em duplicata, e o valor de EC50 foi calculado usando um modelo de curva logística de 4 parâmetros. O valor de EC50 (nM) para cada uma de 2 rodadas para PB009-01 é mostrado na Tabela 26. Além disso, o valor de EC50 de cada conjugado conduzido em duplicata é mostrado na Tabela 27. Ex-No na tabela mostra um número do conjugado no Exemplo 2. [Tabela 26] PB009-01 (nM) 0,14 0,21
[Tabela 27] Ex-No EC50 (nM) 66 0,16 68 0,31 Exemplo 4-1: Teste de avaliação de acúmulo renal de conjugados marcados com Gd (camundongos normais)
[0442] O conjugado inclui um tendo um conector de peptídeo tendo uma sequência de aminoácidos clivada por uma enzima de membrana renal de borda em escova ou uma enzima lisossômica como um conector de peptídeo de “X.” O conjugado da presente invenção tendo tal conector é especificamente clivado na porção de conector por qualquer uma destas enzimas presentes nos rins e, portanto, espera-se que o acúmulo da porção de marcação nos rins seja reduzido. Resultados de avaliação do acúmulo renal de tal conjugado da presente invenção são mostrados abaixo. (Método de teste)
[0443] Um conjugado marcado com Gd do conjugado contendo um conector de peptídeo produzido em um dos Exemplos acima foi administrado a partir da veia da calda de camundongos (BALB/c ou BALB/c nu/nu) de modo que a massa de proteína fosse de 0,02 mg (100 µL) por animal. Depois de cerca de 24 horas, os camundongos foram sacrificados e os rins foram removidos, e a quantidade de Gd nos rins foi medida usando ICP-MS. O presente teste foi realizado em 3 casos em cada grupo, o valor médio dos 3 casos foi calculado, e a quantidade de Gd contida por rim após à administração foi mostrada como uma porcentagem (% de dose/tecido) da quantidade total de Gd administrado. Os resultados são mostrados na Tabela 28 abaixo. Ex-No na tabela mostra um número do conjugado no Exemplo 2. Além disso, o mesmo teste foi realizado usando Ex-No 47 ([Gd/DOTA]p-Fab) produzido no Exemplo de Produção 2-47, que não contêm um conector de peptídeo, como um conjugado controle, e a média geométrica (Média geométrica), o padrão desvio (Fator de SD geométrico), e o valor de limite inferior (Inferior) e o valor de limite superior
(Superior) do intervalo de confiança de 95 % (CI a 95 % de média geométrica) para 5 rodadas foram calculados. (Resultados)
[0444] Os resultados são mostrados na Tabela 29 abaixo. Com base na porcentagem do conjugado controle (% de dose/tecido), a proporção de diminuição na quantidade de Gd contida nos rins de cada um dos conjugados tendo um conector de peptídeo foi determinada e mostrada na Tabela 28. Como mostrado na Tabela 28, o acúmulo da porção de marcação nos rins foi de 39,6 a 82,9 % pontos mais baixo nos conjugados tendo um conector de peptídeo do que no conjugado controle. [Tabela 28] Ex-No % de dose/tecido Proporção de diminuição (%) 11 14,8 52,2 12 9,9 68,0 13 15,4 50,3 15 17,1 44,8 24 12,9 58,3 25 14,2 54,1 29 6,8 78,0 31 18,7 39,6 33 5,3 82,9 34 11,9 61,6 35 7,0 77,4 40 8,4 72,9 [Tabela 29] Ex-No 47 Média geométrica (% de dose/tecido) 31,0 Fator SD geométrico 1,2 CI a 95 % inferior à média geométrica 25,3 (% de dose/tecido) CI a 95 % superior à média geométrica 37,9 (% de dose/tecido) Exemplo 4-2: Teste de avaliação de acúmulo renal de conjugados marcados com Gd (camundongos normais) (Método de teste)
[0445] Um conjugado marcado com Gd do conjugado contendo um conector de peptídeo produzido em um dos Exemplos acima foi administrado a partir da veia da calda de camundongos (BALB/c ou BALB/c nu/nu) de modo que a massa de proteína fosse de 0,02 mg (100 µL) por animal. Depois de cerca de 24 horas, os camundongos foram sacrificados e os rins foram removidos, e a quantidade de Gd nos rins foi medida usando ICP-MS. O presente teste foi realizado em 3 casos em cada grupo, o valor médio dos 3 casos foi calculado, e a quantidade de Gd contida por rim após à administração foi mostrada como uma porcentagem (% de dose/tecido) da quantidade total de Gd administrado. Os resultados são mostrados na Tabela 30 abaixo. Ex-No na tabela mostra um número do conjugado no Exemplo 2. Além disso, o mesmo teste foi realizado usando Ex-No 47 ([Gd/DOTA]p-Fab) produzido no Exemplo de Produção 2, que não contêm um conector de peptídeo, como um conjugado controle. (Resultados)
[0446] Os resultados são mostrados na Tabela 30 abaixo. Com base na porcentagem do conjugado controle (% de dose/tecido), a proporção de diminuição na quantidade de Gd contida nos rins de cada um dos conjugados tendo um conector de peptídeo foi determinada e mostrada na Tabela 30. Como mostrado na Tabela 30, o acúmulo da porção de marcação nos rins foi de 92,15 a 95,38 % pontos mais baixo nos conjugados tendo um conector de peptídeo do que no conjugado controle 47. [Tabela 30] Ex-No % de dose/tecido Proporção de diminuição (%) 66 2,43 92,15 68 1,43 95,38 47 31,33 - Exemplo 4-3: Teste de avaliação de acúmulo renal de conjugados marcados com Gd (camundongos normais)
(Método de teste)
[0447] Um conjugado marcado com Gd do conjugado contendo um conector de peptídeo produzido em um dos Exemplos acima foi administrado a partir da veia da calda de camundongos (BALB/c ou BALB/c nu/nu) de modo que a massa de proteína fosse de 0,02 mg (100 µL) por animal. Depois de cerca de 24 horas, os camundongos foram sacrificados e os rins foram removidos, e a quantidade de Gd nos rins foi medida usando ICP-MS. O presente teste foi realizado em 3 casos em cada grupo, o valor médio dos 3 casos foi calculado, e a quantidade de Gd contida por rim após à administração foi mostrada como uma porcentagem (% de dose/tecido) da quantidade total de Gd administrado. O mesmo teste foi realizado usando Ex-No 47 produzido no Exemplo de Produção 2 acima, que não contêm um conector de peptídeo, como um conjugado controle, e a média das quantidades residuais renais para 5 rodadas para Ex-No 47 é mostrada na Tabela 31. (Resultados)
[0448] Com base na porcentagem do conjugado controle (% de dose/tecido), a proporção (%) da diminuição na quantidade de Gd contida nos rins de cada um dos conjugados tendo um conector de peptídeo foi determinada e mostrada na Tabela 32. Como mostrado na Tabela 32, o acúmulo da porção de marcação nos rins foi de 21,00 a 94,66 % pontos mais baixo nos conjugados tendo um conector de peptídeo do que no conjugado controle. [Tabela 31] Quantidade residual renal (camundongos normais) Quantidade residual renal (% de dose/tecido) Média 29,33 [Tabela 32] Quantidade residual renal (camundongos normais) Ex-No % de dose/tecido Proporção de diminuição
(%) 8 23,17 21,00 10 20,10 31,46 18 2,60 91,13 32 10,10 65,56 38 13,33 54,54 41 21,67 26,12 43 8,97 69,42 45 12,00 59,08 46 11,33 61,35 67 1,57 94,66 69 7,13 75,68 Exemplo 4-4: Teste de avaliação de acúmulo renal de conjugados marcados com Gd (camundongos portadores de tumor) (Método de teste)
[0449] Um conjugado marcado com Gd do conjugado contendo um conector de peptídeo produzido em um dos Exemplos acima foi administrado a partir da veia da calda de camundongos portadores de tumor de modo que a massa de proteína fosse de 0,02 mg (100 µL) por animal. Como os camundongos portadores de tumor usados no presente Exemplo, os camundongos (BALB/c nu/nu) que estavam em um estado portador de tumor provocado pelo transplante de células LS174T de linhagem de células de câncer colorretal humano (ATCC (marca registrada); CL-188) a 2,0 a 5,0 x 106 células/camundongo por via subcutânea no dorso antes da administração da amostra foram usados. 24 horas após à administração da amostra, os camundongos foram sacrificados, os rins e o tumor foram removidos, e as quantidades de Gd nos rins e no tumor foram medidas usando ICP-MS. O presente teste foi realizado em 3 casos em cada grupo, e o valor médio dos 3 casos foi calculado. A quantidade de Gd contida por rim após à administração foi mostrada como uma porcentagem da quantidade de Gd administrada (% de dose/tecido), e a quantidade de Gd contida por g de tecido de tumor foi mostrada como uma porcentagem da quantidade total de Gd administrada (% de dose/g). Os resultados são mostrados nas Tabelas 35 e 36. Ex- No nas tabelas mostra um número do conjugado no Exemplo 2. Além disso, o mesmo teste foi realizado usando Ex-No 47 produzido no Exemplo de Produção 2-47, que não contêm um conector de peptídeo, como um conjugado controle. As médias para 2 rodadas para Ex-No 47 são mostradas nas Tabelas 33 e 34. (Resultados)
[0450] Como mostrado nas Tabelas 35 e 36, o acúmulo da porção de marcação nos rins foi de 52,26 a 77,68 % pontos mais baixo nos conjugados tendo um conector de peptídeo do que no conjugado controle. [Tabela 33] Quantidade residual renal (camundongos portadores de tumor) Quantidade residual renal (% de dose/tecido) Média 25,83 [Tabela 34] Acumulação de tumor Quantidade de acumulação de tumor (% de dose/g) Média 4,92 [Tabela 35] Quantidade residual renal (camundongos portadores de tumor) Ex-No % de dose/tecido Proporção de diminuição (%) 18 5,77 77,68 24 12,33 52,26 29 8,40 67,48 33 7,30 71,74 35 9,40 63,61
[Tabela 36] Quantidade de acumulação de tumor (camundongos portadores de tumor) Ex-No % de dose/g 18 10,63 24 10,50 29 4,37 33 4,53 35 6,90 (Exemplo 5-1: Preparação de conjugado de fragmento Fab5 de anticorpo MUC1 anti-humano)
[0451] O presente Exemplo divulga Exemplos de Produção do conjugado. Na apresentação de cada Exemplo de Produção no presente Exemplo, “Exemplo 5” é seguido por um hífen seguido por um “número de conjugado”. Por exemplo, “Exemplo 5-101” mostra que é o Exemplo de Produção do conjugado 101 no presente Exemplo. Além disso, como Fab5 no presente Exemplo, (P10-2) divulgado na Publicação Internacional WO2018/092885 foi usado. “p-Fab5” mostra que Fab5 está ligado às porções de marcação p incluídas por [] ou () através de seus grupos p amino para formar um conjugado. Em alguns dos exemplos a seguir, o número de porções de marcação) ligadas a Fab5 de cada conjugado que pode ser confirmado por análise de MS é descrito, mas o resultado não mostra que um conjugado tendo um número de porções de marcação ligadas diferente do número acima não está incluído. Será fácil entender que ainda pode haver um conjugado com várias porções de marcação ligadas, cuja presença não foi capaz de ser confirmada devido à precisão do equipamento de análise de MS. Além disso, nas fórmulas estruturais no presente exemplo, a fórmula estrutural de DOTA ao qual Gd está ligado mostra esquematicamente DOTA marcado com Gd. (Exemplo 5-101. Síntese de ([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-F)-NH-C(=O)-Met-Ile- NH-(CH2)2-Z1(#N)]p-Fab5))
Síntese de conjugado No 101
[0452] [N-({4-[(2-{4,7,10-tris[(carbóxi-ϏO)metil]-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-1-il-Ϗ4N1,N4,N7,N10}acetamido-ϏO)metil]fenil}carbamoil)-L-metionil- N1-[2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)etil]-L-isoleucinamidato(3-)]gadolínio (1 mg) sintetizado no Exemplo 2-18 (vii) foi dissolvido em DMSO (40 µL). Um tampão de borato 0,1 M (40 µL) foi adicionado à solução resultante, e o pH foi ajustado para 6,6 usando um tampão de acetato 0,25 M.
[0453] 80 µL da solução previamente preparada foram adicionados a um tampão de borato Fab5 de 5,2 mg/mL (240 µL), e a mistura resultante foi incubada a 30 °C por 2 horas. 15 µL de EDTA 0,05 M foram adicionados, e a mistura resultante foi incubada a 30 °C por 10 minutos. A mistura foi purificada usando uma coluna PD- 10, e a solução resultante foi recuperada usando um filtro centrífugo Amicon Ultra de 0,5 mL. A solução recuperada foi lavada com solução salina tamponada com fosfato 7 vezes, finalmente concentrada e depois filtrada através de um filtro de membrana para obter um conjugado. Foi confirmado pela análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual um [Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-F)-NH-C(=O)-Met-Ile- NH-(CH2)2-Z1(#N)] tendo um peso molecular de 1074 foi ligado a um Fab5 tendo um peso molecular de 47,5 kDa e um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele. (Exemplo 5-104. Síntese de ([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-F)-NH-C(=O)-Met-Ile- NH-(CH2)2-(A-4 e/ou A-5)]p-Fab5)) Síntese de conjugado No 104
[0454] [N-({4-[(2-{4,7,10-tris[(carbóxi-ϏO)metil]-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-1-il-Ϗ4N1,N4,N7,N10}acetamido-ϏO)metil]fenil}carbamoil)-L-metionil- N1-[2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)etil]-L-isoleucinamidato(3-)]gadolínio (1 mg) sintetizado no Exemplo 2-18 (vii) foi dissolvido em DMSO (40 µL). Um tampão de borato 0,1 M (40 µL) foi adicionado à solução resultante, e o pH foi ajustado para 10,2 usando uma solução aquosa de carbonato de sódio 0,1 M.
[0455] Toda a solução previamente preparada foi adicionada a um tampão de borato Fab5 de 5,2 mg/mL (240 µL), e a mistura resultante foi incubada a 30 °C por 2 horas. A mistura foi recuperada usando um filtro centrífugo Amicon Ultra de 15 mL e lavada com solução salina tamponada com fosfato.
[0456] A troca da solução tampão foi realizada duas vezes usando 3 mL de um tampão de HEPES-NaOH (pH = 4,5) e a concentração foi realizada para fazer uma solução de 100 µL com pH = 4,52, e depois a solução foi incubada a 45 °C por 30 minutos.
[0457] A solução foi purificado usando uma coluna PD-10, e a solução resultante foi recuperada usando um filtro centrífugo Amicon Ultra de 15 mL. A solução recuperada foi lavada com solução salina tamponada com fosfato 3 vezes, finalmente concentrada e depois filtrada através de um filtro de membrana para obter um conjugado. Foi confirmado pela análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual um [Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-F)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2- (A-4 e/ou A-5)] tendo um peso molecular de 1092 foi ligado a um Fab5 tendo um peso molecular de 47,5 kDa, um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele e um conjugado no qual três de tais moléculas foram ligadas a ele. (Exemplo 5-107. Síntese de ([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-F)-NH-C(=O)-Met-Ile- NH-(CH2)2-Z1(#S)]p-Fab5)) Síntese de conjugado No 107
[0458] [N-({4-[(2-{4,7,10-tris[(carbóxi-ϏO)metil]-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-1-il-Ϗ4N1,N4,N7,N10}acetamido-ϏO)metil]fenil}carbamoil)-L-metionil- N1-[2-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)etil]-L-isoleucinamidato(3-)]gadolínio (0,75 mg) sintetizado no Exemplo 2-18 (vii) foi dissolvido em DMSO (40 µL), um tampão de borato 0,1 M (40 µL) foi adicionado, e depois o pH foi ajustado para 8,2 usando uma solução aquosa de carbonato de sódio 0,1 M e um tampão de acetato 0,25 M.
[0459] Uma solução de 2-IT de 2 mg/mL (7,5 µL) preparada usando um tampão de borato 0,1 M foi adicionada a um tampão de borato Fab5 de 5,2 mg/mL (240 µL), e a mistura resultante foi incubada a 37 °C por 40 minutos. O excesso de 2- IT foi lavado com solução salina tamponada com fosfato usando um filtro centrífugo Amicon Ultra de 0,5 mL e concentrado, depois a solução previamente preparada foi adicionada e a mistura resultante foi incubada a 30 °C por 2 horas. A mistura foi purificada usando uma coluna PD-10, e a solução resultante foi recuperada usando um filtro centrífugo Amicon Ultra de 15 mL. A solução recuperada foi lavada duas vezes com solução salina tamponada com fosfato, finalmente concentrada e depois filtrada através de um filtro de membrana para obter um conjugado.
[0460] Foi confirmado pela análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual um [Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-F)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2- Z1(#S)] tendo um peso molecular de 1175 foi ligado a um Fab5 tendo um peso molecular de 47,5 kDa, um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele e um conjugado no qual três de tais moléculas foram ligadas a ele. (Exemplo 5-112. Síntese de ([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-F)-NH-C(=O)-Met-Ile- NH-(CH2)2-(A-3)]p-Fab5)) Síntese de conjugado No 112
[0461] [N-({4-[(2-{4,7,10-tris[(carbóxi-ϏO)metil]-1,4,7,10-tetra- azaciclododecan-1-il-Ϗ4N1,N4,N7,N10}acetamido-ϏO)metil]fenil}carbamoil)-L-metionil- N1-[2-{[(4-isotiocianatofenil)carbamotioil]amino}etil]-L-isoleucinamidato(3-)]gadolínio (0,46 mg) sintetizado no Exemplo 2-68 (x) foi dissolvido em DMSO (155 µL).
[0462] 30 µL de uma solução aquosa de carbonato de sódio 0,1 M e a solução previamente preparada foram adicionados a uma solução de Fab5 (240 µL) preparada a 5,2 mg/mL usando um tampão de borato e uma solução de glicerina para ajustar o pH para 8,8, e a mistura resultante foi incubada a 37 °C por 2 horas. A mistura foi purificada usando uma coluna PD-10, e a solução resultante foi recuperada usando um filtro centrífugo Amicon Ultra de 15 mL. A solução recuperada foi lavada duas vezes com solução salina tamponada com fosfato, finalmente concentrada e depois filtrada através de um filtro de membrana para obter um conjugado. Foi confirmado pela análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual um [Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-F)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)] tendo um peso molecular de 1187 foi ligado a um Fab5 tendo um peso molecular de 47,5 kDa e um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele. (Exemplo 5-113. Síntese de ([Gd/DOTA-[2,5-(1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolina)]- C(=O)-Met-Gli-Lis*-C(=S)-NH-(1,4-F)-NH-C(=S)]p-Fab5)) Síntese de conjugado No 113
[0463] {N-[2-({4,7,10-tris[(carbóxi-ϏO)metil]-1,4,7,10-tetra-azaciclododecan- 1-y-Ϗ4N1,N4,N7,N10}acetil-ϏO)-1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolina-5-carbonil]-L- metionilglicil-N6-[(4-isotiocianatofenil)carbamotioil]-L-lisinato(3-)}gadolínio (0,22 mg) sintetizado no Exemplo 2-69 (vii) foi dissolvido em DMSO (72 µL).
[0464] 30 µL de uma solução aquosa de carbonato de sódio 0,1 M e a solução previamente preparada foram adicionados a uma solução de Fab5 (240 µL) preparada a 5,2 mg/mL usando um tampão de borato e uma solução de glicerina para ajustar o pH para 9,3, e a mistura resultante foi incubada a 37 °C por 2 horas. A mistura foi purificada usando uma coluna PD-10, e a solução resultante foi recuperada usando um filtro centrífugo Amicon Ultra de 15 mL. A solução recuperada foi lavada duas vezes com solução salina tamponada com fosfato, finalmente concentrada e depois filtrada através de um filtro de membrana para obter um conjugado. Foi confirmado pela análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual um [Gd/DOTA-[2,5-(1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolina)]-C(=O)-Met-Gli-Lis*-C(=S)-NH-(1,4- F)-NH-C(=S)] tendo um peso molecular de 1228 foi ligado a um Fab5 tendo um peso molecular de 47,5 kDa e um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele.
[0465] As fórmulas estruturais químicas (Str) dos conjugados obtidos nos Exemplos de Produção acima são mostradas nas Tabelas 37 e 38. [Tabela 37]
[Tabela 38]
[0466] Os compostos do Exemplo de Produção No C1 e C2 na Tabela 39 foram sintetizados usando os mesmos métodos como nos Exemplos de Produção acima, ou métodos conhecidos aos técnicos no assunto, e estes compostos foram usados ou os compostos sintetizados no Exemplo 2 foram usados para obter os conjugados com Fab5 mostrados nas Tabelas 40 e 41 abaixo. [Tabela 39]
Mesmo método de produção
Como no Ex Nos 68 e 69
Como no Ex Nos 68 e 69
[Tabela 40]
[Tabela 41]
[0467] As análises de MS dos compostos do Exemplo mostrados nas Tabelas 40 e 41 são mostradas na tabela abaixo. [Tabela 42] Ex-No MS Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 102 molecular de 1278 foi ligada a um Fab5 tendo um peso molecular de 47,5 kDa e um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele. 103 Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso molecular de 1115 foi ligada a um Fab5 tendo um peso molecular de 47,5 kDa e um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele. Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 105 molecular de 1190 foi ligada a um Fab5 tendo um peso molecular de 47,5 kDa, um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele, e um conjugado no qual três de tais moléculas foram ligadas a ele. Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 106 molecular de 1380 foi ligada a um Fab5 tendo um peso molecular de 47,5 kDa, um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele, e um conjugado no qual três de tais moléculas foram ligadas a ele. Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 108 molecular de 542 foi ligada a um Fab5 tendo um peso molecular de 47,5 kDa, um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele, e um conjugado no qual três de tais moléculas foram ligadas a ele. Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 109 molecular de 1216 foi ligada a um Fab5 tendo um peso molecular de 47,5 kDa e um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele. Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 110 molecular de 1201 foi ligada a um Fab5 tendo um peso molecular de 47,5 kDa e um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele. Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo um peso 111 molecular de 1391 foi ligada a um Fab5 tendo um peso molecular de 47,5 kDa e um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele.
[0468] O composto do Exemplo na Tabela 43 foi obtido usando o mesmo método como nos Exemplos de Produção acima ou um método conhecido aos técnicos no assunto. [Tabela 43] Mesmo método de produção Como no Ex Nos 15 e 18
[0469] A análise de MS do composto do Exemplo mostrado na Tabela 43 é mostrada na Tabela 44 abaixo.
[Tabela 44] Ex-No MS Foi confirmado por análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual uma molécula de baixo peso molecular tendo 114 um peso molecular de 1059 foi ligada a um Fab5 tendo um peso molecular de 47,5 kDa.
[0470] Além disso, os conjugados nas Tabelas 45 a 50 podem ser obtidos usando os mesmos métodos como nos Exemplos de Produção acima ou métodos conhecidos aos técnicos no assunto. [Tabela 45]
[Tabela 46]
[Tabela 47]
[Tabela 48]
[Tabela 49]
[Tabela 50] Exemplo 6-1: Avaliação da atividade de ligação de conjugado de fragmento Fab5 de anticorpo MUC1 anti-humano
[0471] Cada conjugado de fragmento Fab5 de anticorpo MUC1 anti-humano preparado pelo método do Exemplo 5 foi submetido a ELISA para avaliar a atividade de ligação deste a MUC1 específico de câncer humano. No presente teste, tampão de PBS 20X/Tween 20 (Thermo Fisher Scientific Inc., 28352) diluído 20 vezes com água destilada foi usado como um líquido de lavagem. Além disso, para albumina de soro bovino (BSA) usada no presente teste, solução de albumina de soro bovino a 30 % (Sigma-Aldrich, Inc., A9576-50ML) foi adicionada em uma proporção apropriada para o uso. Um peptídeo de MUC1 específico de câncer humano (PTL 1) a 0,5 µmol/L foi adicionado a uma placa Nunc MaxiSorp White 384 (Nunc, 460372) a 30 µL por poço, e a placa foi incubada durante a noite a 4 °C por imobilização. O peptídeo de MUC1 foi removido por centrifugação reversa, e depois o bloqueio foi realizado adicionando-se um tampão de PBS/Tween 20 contendo BSA a 5,0 %. Depois disso, a solução de bloqueio foi removida por centrifugação reversa, uma solução de cada conjugado de fragmento Fab5 de anticorpo MUC1 anti-humano (Ex-No 104, 108 ou 112) descrito acima a cerca de 10000 ng/mL foi diluída em 14 etapas por diluição de 3 vezes usando um tampão de PBS/Tween 20 contendo BSA a 1,0 %, e 30 µL foram adicionados por poço e incubados na temperatura ambiente por 60 minutos. A placa foi lavada 3 vezes com um tampão de PBS/Tween 20, e anticorpo IgϏ anti-humano de cabra marcado com peroxidase de raiz forte (Southern Biotechnology Associates, Inc.) diluído 10000 vezes usando um tampão de PBS/Tween 20 contendo BSA a 5,0 % foi adicionado a 30 µL por poço e incubado na temperatura ambiente por 30 minutos. A placa foi lavada 3 vezes com um tampão de PBS/Tween 20, e reagente de detecção ECL Prime Western Blotting (GE Healthcare, RPN2232) como um substrato foi adicionado a 30 µL por poço. O substrato foi incubado na temperatura ambiente por 15 minutos, e depois um valor de sinal deste foi medido usando um contador Envision (PerkinElmer, Inc.).
[0472] O teste para cada anticorpo foi realizado em duplicata, e o valor de EC50 foi calculado usando um modelo de curva logística de 4 parâmetros. O valor de
EC50 (nM) para cada uma das 3 rodadas para P10-2 é mostrado na Tabela 51. Além disso, o valor de EC50 de cada conjugado conduzido em duplicata é mostrado na Tabela 52. [Tabela 51] P10-2 (nM) 0,06 0,06 0,14 [Tabela 52] Ex-No EC50 (nM) 104 0,08 112 0,15 108 0,07 Exemplo 6-2: Avaliação da atividade de ligação de conjugado de fragmento Fab5 de anticorpo MUC1 anti-humano
[0473] Cada conjugado de fragmento Fab5 de anticorpo MUC1 anti-humano preparado pelo método do Exemplo 5 foi submetido a ELISA para avaliar a atividade de ligação deste a MUC1 específico de câncer humano. No presente teste, tampão de PBS 20X/Tween 20 (Thermo Fisher Scientific Inc., 28352) diluído 20 vezes com água destilada foi usado como um líquido de lavagem. Além disso, para albumina de soro bovino (BSA) usada no presente teste, solução de albumina de soro bovino a 30 % (Sigma-Aldrich, Inc., A9576-50ML) foi adicionada em uma proporção apropriada para o uso. Um peptídeo de MUC1 específico de câncer humano (PTL 1) a 0,5 µmol/L foi adicionado a uma placa Nunc MaxiSorp White 384 (Nunc, 460372) a 30 µL por poço, e a placa foi incubada durante a noite a 4 °C por imobilização. O peptídeo de MUC1 foi removido por centrifugação reversa, e depois o bloqueio foi realizado adicionando-se um tampão de PBS/Tween 20 contendo BSA a 5,0 %. Depois disso, a solução de bloqueio foi removida por centrifugação reversa, uma solução de cada conjugado de fragmento Fab5 de anticorpo MUC1 anti-humano (Ex-No 101-113) descrito acima a cerca de 10000 ng/mL foi diluído em 14 etapas por diluição de 3 vezes usando um tampão de PBS/Tween 20 contendo BSA a 1,0 %, e 30 µL foram adicionados por poço e incubados na temperatura ambiente por 60 minutos. A placa foi lavada 3 vezes com um tampão de PBS/Tween 20, e anticorpo IgϏ anti-humano de cabra marcado com peroxidase de raiz forte (Southern Biotechnology Associates, Inc.) diluído 10000 vezes usando um tampão de PBS/Tween 20 contendo BSA a 5,0 % foi adicionado a 30 µL por poço e incubado na temperatura ambiente por 30 minutos. A placa foi lavada 3 vezes com um tampão de PBS/Tween 20, e reagente de detecção ECL Prime Western Blotting (GE Healthcare, RPN2232) como um substrato foi adicionado a 30 µL por poço. O substrato foi incubado na temperatura ambiente por 15 minutos, e depois um valor de sinal deste foi medido usando um contador Envision (PerkinElmer, Inc.).
[0474] O teste para cada anticorpo foi realizado em duplicata, e o valor de EC50 foi calculado usando um modelo de curva logística de 4 parâmetros. O valor de EC50 (nM) para cada uma das 3 rodadas pata P10-2 é mostrado na Tabela 53. Além disso, o valor de EC50 de cada conjugado conduzido em duplicata é mostrado na Tabela 54. [Tabela 53] P10-2 (nM) 0,06 0,06 0,14 [Tabela 54] Ex-No EC50 (nM) 101 0,08 102 0,07 103 0,08 105 0,11
106 0,10 107 0,09 108 0,07 109 0,08 110 0,19 111 0,16 113 0,19 Exemplo 7: Teste de avaliação de acúmulo renal de conjugados marcados com Gd (camundongos normais) (Método de teste)
[0475] Um conjugado marcado com Gd do conjugado contendo um conector de peptídeo produzido em um dos Exemplos acima foi administrado a partir da veia da calda de camundongos (BALB/c ou BALB/c nu/nu) de modo que a massa de proteína fosse de 0,02 mg (100 µL) por animal. Depois de cerca de 24 horas, os camundongos foram sacrificados e os rins foram removidos, e a quantidade de Gd nos rins foi medida usando ICP-MS. O presente teste foi realizado em 3 casos em cada grupo, o valor médio dos 3 casos foi calculado, e a quantidade de Gd contida por rim após à administração foi mostrada como uma porcentagem (% de dose/tecido) da quantidade total de Gd administrada. O mesmo teste foi realizado usando Ex-No 108 produzido no Exemplo de Produção 5, que não contêm um conector de peptídeo, como um conjugado controle. A média para 2 rodadas para Ex-No 108 é mostrada nas Tabelas 55. (Resultados)
[0476] Os resultados são mostrados na Tabela 56. Com base na quantidade de Gd contida nos rins do conjugado controle, a proporção de diminuição na quantidade de Gd contida nos rins de cada um dos conjugados tendo um conector de peptídeo foi determinada. Como mostrado na Tabela 56, o acúmulo da porção de marcação nos rins foi de 91,52 a 93,03 % pontos mais baixo nos conjugados tendo um conector de peptídeo do que no conjugado controle. [Tabela 55] Quantidade residual renal (camundongos normais) Ex-No 108 Média (% de dose/tecido) 33,00 [Tabela 56] Quantidade residual renal (camundongos normais) Ex-No % de dose/tecido Proporção de diminuição (%) 104 2,30 93,03 112 2,80 91,52 Exemplo 8: Teste de avaliação de acúmulo renal de conjugados marcados com Gd (camundongos portadores de tumor) (Método de teste)
[0477] Um conjugado marcado com Gd do conjugado contendo um conector de peptídeo produzido em um dos Exemplos acima foi administrado a partir da veia da calda dos camundongos portadores de tumor de modo que a massa de proteína fosse de 0,02 mg (100 µL) por animal. Como os camundongos portadores de tumor usados no presente Exemplo, os camundongos (BALB/c nu/nu) que estavam em um estado portador de tumor provocado pelo transplante de MDA-MB-468 de linhagem de células de câncer de mama humano (ATCC (marca registrada); HTB-132) a 5,0 x 106 células/camundongo por via subcutânea no dorso antes da administração da amostra foram usados. 24 horas após à administração da amostra, os camundongos foram sacrificados, os rins e o tumor foram removidos, e as quantidades de Gd nos rins e no tumor foram medidas usando ICP-MS. O presente teste foi realizado em 3 casos em cada grupo, e o valor médio dos 3 casos foi calculado. A quantidade de Gd contida por rim após à administração foi mostrada como uma porcentagem da quantidade de Gd administrada (% de dose/tecido), e a quantidade de Gd contida por g de tecido de tumor foi mostrada como uma porcentagem da quantidade total de Gd administrada (% de dose/g). Os resultados são mostrados nas Tabelas 59 e 60. Ex- No nas tabelas mostra um número do conjugado no Exemplo 5. Além disso, o mesmo teste foi realizado usando Ex-No 108 produzido no Exemplo de Produção 5, que não contêm um conector de peptídeo, como um conjugado controle. As médias para 2 rodadas para Ex-No 108 são mostradas nas Tabelas 57 e 58. (Resultados)
[0478] Como mostrado nas Tabelas 57 a 60, o acúmulo da porção de marcação nos rins foi de 88,08 a 90,87 % pontos mais baixo nos conjugados tendo um conector de peptídeo do que no conjugado controle. [Tabela 57] Quantidade residual renal Quantidade residual renal (% de dose/tecido) Média 34,67 [Tabela 58] Acumulação de tumor Quantidade de acumulação de tumor (% de dose/g) Média 0,92 [Tabela 59] Quantidade residual renal (camundongos portadores de tumor) Ex-No % de dose/tecido Proporção de diminuição (%) 104 3,17 90,87 112 4,13 88,08 [Tabela 60] Quantidade de acumulação de tumor (camundongos portadores de tumor) Ex-No % de dose/g
104 1,04 112 1,27 Exemplo 9: Preparação de conjugado de fragmento Fab5 de anticorpo MUC1 anti-humano (Exemplo 9-115: Síntese de [Gd/DOTA]p-Fab5) [Fórmula Química 124]
[0479] Uma solução aquosa de hidróxido de sódio 1 M (80 µL) foi adicionada a uma solução mista de ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-1,4,7,10-tetra-acético (DOTA) (16 mg) e água (810 µL) sob resfriamento em gelo para ajustar o pH para 5,5 a 6. 1-Hidróxi-2,5-dioxopirrolidina-3-sulfonato de sódio (2,3 mg) dissolvido em água (117 µL) foi adicionado à solução obtida (239 µL) sob resfriamento em gelo. Depois disso, uma solução aquosa de EDC HCl (8,3 µL, 25 mg/mL) foi adicionada, e a mistura resultante foi agitada sob resfriamento em gelo por 30 minutos para preparar um N- solução de hidroxissulfossuccinimidil DOTA. Antes da adição de Fab5, uma solução aquosa de hidrogenfosfato de dissódio 0,2 M (pH 9) (40 µL) foi adicionada para ajustar o pH para 7.
[0480] A solução de N-hidroxissulfossuccinimidil DOTA preparada (300 µL) foi adicionada a uma solução aquosa de hidrogenofosfato de dissódio 0,1 M (585 µL) de Fab5 de 20,8 mg/mL (90 µL), e a mistura resultante foi incubada a 4 °C por 23 horas. O excesso de conector foi lavado com um tampão de fosfato 10 mM usando um filtro centrífugo Amicon Ultra de 15 mL duas vezes repetidamente, lavado com um tampão de acetato de amônio 0,3 M, finalmente concentrado e depois filtrado através de um filtro de membrana para obter conjugado Ex-No 115. Foi confirmado pela análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual um [DOTA] tendo um peso molecular de 387 foi ligado a um Fab5 tendo um peso molecular de 47,5 kDa, um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele, um conjugado no qual três de tais moléculas foram ligadas a ele e um conjugado no qual quatro de tais moléculas foram ligadas a ele. (Exemplo 9-116. Síntese de [DOTA-NH-CH2-(1,4-F)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH- (CH2)2-(A-3)]p-Fab5) [Fórmula Química 125]
[0481] Tetracis(trifluoroacetato) de N-{[4-({2-[4,7,10-tris(carboximetil)- 1,4,7,10-tetra-azaciclododecan-1-il]acetamido}metil)fenil]carbamoil}-L-metionil-N1-(2- {[(4-isotiocianatofenil)carbamotioil]amino}etil)-L-isoleucinamida (1 mg) sintetizado no Exemplo 2-68 (ix) foi dissolvido em DMSO (336 µL).
[0482] 30 µL da solução previamente preparada foram adicionados a uma solução salina tamponada com fosfato Fab5 de 5,2 mg/mL (240 µL), o pH foi ajustado para cerca de 8,0 usando uma solução aquosa de carbonato de sódio 0,1 M, e a mistura resultante foi incubada a 30 °C por 2 horas. A mistura foi purificada usando uma coluna PD-10, e a solução resultante foi recuperada usando um filtro centrífugo Amicon Ultra de 15 mL. A solução recuperada foi lavada duas vezes com solução salina tamponada com fosfato, finalmente concentrada e depois filtrada através de um filtro de membrana para obter conjugado Ex-No 116. A mesma operação foi realizada novamente, e o conjugado obtido Ex-No 116 foi misturado. Foi confirmado pela análise de MS que o conjugado foi uma mistura de um conjugado no qual um [DOTA-NH-CH2- (1,4-F)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)] tendo um peso molecular de 1032 foi ligado a um Fab5 tendo um peso molecular de 47,5 kDa, um conjugado no qual duas de tais moléculas foram ligadas a ele, um conjugado no qual três de tais moléculas foram ligadas a ele e um conjugado no qual quatro de tais moléculas foram ligadas a ele. Exemplo 10: Estudo de farmacocinética de sagui comum de compostos metálicos complexos Exemplo de Preparação 1 de proteína marcada com 64Cu
[0483] 139 µL de um tampão de acetato de sódio de 0,1 mol/L (pH 6,5) foram adicionados a 10 µL (19,8 MBq, FUJIFILM Toyama Chemical Co., Ltd.) de uma solução de ácido clorídrico de 0,05 mol/L de [64Cu]CuCl2 e misturados. Além disso, 51 µL do conjugado de proteína preparado no Exemplo 9-115 foram adicionados, e esta mistura foi incubada na temperatura ambiente por 60 minutos para reação. O líquido de reação foi adicionado a uma membrana de ultrafiltração (Amicon Ultra 10K, Millipore) e além disso, um tampão de acetato de sódio de 50 mmol/L foi adicionado para realizar a purificação por ultrafiltração para obter solução de conjugado da proteína 64Cu (A) de interesse. 140 µL do conjugado de proteína e 145 µL de uma solução PBS foram misturados na solução obtida, e a mistura resultante foi filtrada usando um filtro de seringa (Millex-GV 0,22 µm, Millipore) para preparar uma solução PBS contendo conjugado de proteína 64Cu (A) (11,5 MBq, 19,17 MBq/mg).
Exemplo de Preparação 2 de proteína marcada com 64Cu
[0484] 285 µL de um tampão de acetato de sódio de 0,1 mol/L (pH 6,5) foram adicionados a 20 µL (37,1 MBq, FUJIFILM Toyama Chemical Co., Ltd.) de uma solução de ácido clorídrico de 0,05 mol/L de [64Cu]CuCl2 e misturados. Além disso, 94,7 µL do conjugado de proteína preparado no Exemplo 9-116 foram adicionados, e esta mistura foi incubada na temperatura ambiente por 60 minutos para reação. O líquido de reação foi adicionado a uma membrana de ultrafiltração (Amicon Ultra 10K, Millipore) e além disso, um tampão de acetato de sódio de 50 mmol/L foi adicionado para realizar a purificação por ultrafiltração para obter solução de conjugado de proteína 64Cu (B) de interesse. 260 µL do conjugado de proteína e 377 µL de uma solução PBS foram misturados na solução obtida, e a mistura resultante foi filtrada usando um filtro de seringa (Millex-GV 0,22 µm, Millipore) para preparar uma solução PBS contendo conjugado de proteína 64Cu (B) (31,5 MBq, 26,27 MBq/mg). Imagem de PET/CT
[0485] Um sagui comum (2 anos de idade) foi anestesiado com isoflurano, e 175 a 185 µL de uma solução PBS contendo solução de conjugado de proteína 64Cu (A) ou (B) foram administrados a partir da veia da cauda. Após à administração, sob anestesia, as imagens foram adquiridas usando um aparelho de imagem de PET/CT (PET: Clairvivo PET, fabricado por Shimadzu Corporation, CT: Aquilion, fabricado por TOSHIBA).
[0486] A Fig. 1 mostra uma imagem de PET/CT obtida cerca de 3 horas após à administração de uma solução PBS contendo solução de conjugado de proteína 64Cu (A). Além disso, a Fig. 2 mostra uma imagem de PET/CT obtida cerca de 3 horas após à administração de uma solução PBS contendo solução de conjugado de proteína 64Cu (B). A Fig. 3 mostra SUV. SUV é um valor obtido dividindo-se a radioatividade por g de tecido pela radioatividade administrada por g de peso corpóreo, isto é, um valor representado por SUV = radioatividade por g de tecido/radioatividade administrada por g de peso corpóreo. Como a radioatividade, um valor corrigido para atenuação é usado. Foi observado que o acúmulo nos rins foi mais baixo na FIG. 2 do que na FIG. 1.
APLICABILIDADE INDUSTRIAL
[0487] A presente invenção inclui um conjugado tendo excelente atividade de ligação ao CEACAM5 humano e espera-se que seja útil para diagnósticos e/ou tratamento de um câncer envolvendo CEACAM5 humano.
[0488] Além disso, a presente invenção inclui um conjugado tendo excelente atividade de ligação à MUC1 e espera-se que seja útil para diagnósticos e/ou tratamento de um câncer envolvendo MUC1.
[0489] Além disso, um conjugado que consiste em 3arm DOTA, um espaçador específico, um conector de peptídeo específico e uma biomolécula, que é um conjugado da presente invenção, é decomposto nos rins e excretado e, portanto, espera-se que seja útil para diagnósticos e/ou tratamento de uma doença associada à biomolécula.
TEXTO LIVRE DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0490] No cabeçalho numérico <223> da listagem de sequências a seguir, é fornecida uma descrição de uma “Sequência Artificial” típica. Especificamente, as sequências de nucleotídeos representadas por SEQ ID NOs: 1 e 3 na listagem de sequências são as sequências de nucleotídeos do fragmento de cadeia pesada e de cadeia leve de PB009-01, respectivamente, e as sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID NOs: 2 e 4 são as sequências de aminoácidos do fragmento de cadeia pesada e de cadeia leve codificadas pelas SEQ ID NOs: 1 e 3, respectivamente. Além disso, as sequências de nucleotídeos representadas por SEQ ID NOs: 5 e 9 na listagem de sequências são as sequências de nucleotídeos do fragmento de cadeia pesada e de cadeia leve de P10-1, respectivamente, e as sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID NOs: 6 e 10 são as sequências de aminoácidos do fragmento de cadeia pesada e de cadeia leve codificadas pelas SEQ ID NOs: 5 e 9, respectivamente.
As sequências de nucleotídeos representadas por SEQ ID NOs: 7 e 9 na listagem de sequências são as sequências de nucleotídeos do fragmento de cadeia pesada e de cadeia leve de P10-2, respectivamente, e as sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID NOs: 8 e 10 são as sequências de aminoácidos do fragmento de cadeia pesada e de cadeia leve codificadas pelas SEQ ID NOs: 7 e 9, respectivamente.
SEQ ID NOs: 11 e 15 são a região variável pesada e a região variável de cadeia leve de P10-1, respectivamente, e as sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID NOs: 12 e 16 são as sequências de aminoácidos da região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve codificada pelas SEQ ID NOs: 11 e 15, respectivamente.
SEQ ID NOs: 13 e 15 são a região variável pesada e a região variável de cadeia leve de P10-2, respectivamente, e as sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID NOs: 14 e 16 são as sequências de aminoácidos da região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve codificada pelas SEQ ID NOs: 13 e 15, respectivamente.

Claims (33)

REIVINDICAÇÕES
1. Conjugado CARACTERIZADO pelo fato de que é representado pela seguinte fórmula (Ia): [Fórmula Química 126] Biomolécula1 , em que: DOTA1: 3arm DOTA, U: uma ligação ou -NH(CH2)2O(CH2)2O(CH2)2OCH2C(=O)-, Q: -C(=O)-, -NH-C(=O)- ou -NH-C(=S)-, X: C ou N, R1a, R1b: idênticos ou diferentes, H ou alquila C1-6, desde que R1a e R1b juntos possam formar alquileno C1-6; p é um número natural de 1 a 25 e está ligado a um átomo de carbono adjacente através de grupos p amino ou grupos tiol na Biomolécula1; R1: H, um halogênio, alquila C1-6 ou halo alquila C1-6, R2: alquila C1-6 ou halo alquila C1-6, L2: Ile, Gli, Ala, Val, Phe, -NHCH(CHCH3NR3R4)C(=O)-, - NHCH(CHCH3N3)C(=O)-, ou -NHCH(CHCH3CH2CH2CH3)C(=O)-, R3: H, alquila C1-6, R4: H, alquila C1-6, L3: uma ligação, Arg ou His, L4: -NH-(CH2)2-, -NHCH(C(=O)OH)(CH2)4- ou uma ligação, V1: um grupo representado por qualquer uma das seguintes fórmulas (A-1) a
(A-5): [Fórmula Química 127] , ou, fórmula -L3-L4-V1- juntos formam a seguinte fórmula: [Fórmula Química 128] , Biomolécula1: uma biomolécula [Fórmula Química 129] linha pontilhada — ▪ ▪ — ▪: Q está ligado a qualquer um dos dois átomos de carbono no anel; linha pontilhada ▪▪▪▪▪▪▪▪▪: uma ligação simples ou uma ligação dupla.
2. Conjugado CARACTERIZADO pelo fato de que é representado pela seguinte fórmula (Ib): [Fórmula Química 130]
Biomolécula2
,
em que:
DOTA1: 3arm DOTA,
U: uma ligação ou -NH(CH2)2O(CH2)2O(CH2)2OCH2C(=O)-,
Q: -C(=O)-, -NH-C(=O)- ou -NH-C(=S)-,
X: C ou N,
R1a, R1b: idênticos ou diferentes, H ou alquila C1-6,
desde que R1a e R1b juntos possam formar alquileno C1-6;
p é um número natural de 1 a 25 e está ligado a um átomo de carbono adjacente através de grupos p amino ou grupos tiol na Biomolécula2;
R1: H, um halogênio, alquila C1-6 ou halo alquila C1-6,
R2: alquila C1-6 ou halo alquila C1-6,
L2: Ile, Gli, Ala, Val, Phe, -NHCH(CHCH3NR3R4)C(=O)-, -
NHCH(CHCH3N3)C(=O)-, ou -NHCH(CHCH3CH2CH2CH3)C(=O)-,
R3: H, alquila C1-6,
R4: H, alquila C1-6,
L3: uma ligação, Arg ou His,
L4: -NH-(CH2)2-, -NHCH(C(=O)OH)(CH2)4- ou uma ligação,
V1: um grupo representado por qualquer uma das seguintes fórmulas (A-1) a
(A-5):
[Fórmula Química 131]
, ou, grupos -L3-L4-V1- juntos formam a seguinte fórmula (III-I), (III-II) ou (III-III): Fórmula [Fórmula Química 132] , Biomolécula2: um fragmento Fab de anticorpo [Fórmula Química 133] linha pontilhada — ▪ ▪ — ▪: Q está ligado a qualquer um dos dois átomos de carbono no anel; linha pontilhada ▪▪▪▪▪▪▪▪▪: uma ligação simples ou uma ligação dupla.
3. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o conjugado é um conjugado representado pela seguinte fórmula (Ic): [Fórmula Química 134]
Biomolécula , em que: L3: uma ligação, L4: -NH-(CH2)2- ou -NHCH(C(=O)OH)(CH2)4-, e Biomolécula: Biomolécula1 ou Biomolécula2.
4. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que é representado pela seguinte fórmula (Id): [Fórmula Química 135] Biomolécula , em que a Biomolécula é Biomolécula1 ou Biomolécula2.
5. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que V1 na fórmula (Id) é qualquer uma das seguintes fórmulas (A-3) a (A-5): [Fórmula Química 136] .
6. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5,
CARACTERIZADO pelo fato de que o conjugado é selecionado a partir do grupo que consiste nos compostos representados pelas seguintes fórmulas:
[Fórmula Química 137]
Biomolécula1
, [Fórmula Química 138]
Biomolécula1
,
[Fórmula Química 139]
Biomolécula1
,
[Fórmula Química 140]
Biomolécula1 , [Fórmula Química 141] Biomolécula1 , [Fórmula Química 142] Biomolécula1 , [Fórmula Química 143] Biomolécula1 .
7. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que a Biomolécula1 e a Biomolécula2 são, cada uma, uma biomolécula ou um fragmento Fab de anticorpo diferente dos seguintes fragmentos Fab de anticorpo: (a) um fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada incluindo uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos de aminoácidos 1 a 121 de SEQ ID NO: 2 e uma cadeia leve incluindo uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos de aminoácidos 1 a 112 de SEQ ID NO: 4, (b) um fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada incluindo uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos de aminoácidos 1 a 121 de SEQ ID NO: 2 e em que o ácido glutâmico do aminoácido 1 de SEQ ID NO: 2 é modificado para ácido piroglutâmico, e uma cadeia leve incluindo uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos de aminoácidos 1 a 112 de SEQ ID NO: 4, (c) um fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2 e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4, ou (d) um fragmento Fab de anticorpo anti-CEACAM5 humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2 e em que o ácido glutâmico do aminoácido 1 de SEQ ID NO: 2 é modificado para ácido piroglutâmico, e uma cadeia leve incluindo a cadeia leve apresentada na SEQ ID NO: 4.
8. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a Biomolécula1 ou a Biomolécula2 é um fragmento Fab de anticorpo anti-MUC1 humano selecionado a partir do grupo que consiste em: (a) um fragmento Fab de anticorpo anti-MUC1 humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada incluindo uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14 e uma cadeia leve incluindo uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16, e (b) um fragmento Fab de anticorpo anti-MUC1 humano selecionado a partir do grupo que consiste em um fragmento Fab de anticorpo anti-MUC1 humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada incluindo uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14 e em que a glutamina do aminoácido 1 de SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14 é modificada para ácido piroglutâmico, e uma cadeia leve incluindo uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16, e o fragmento está ligado a V1 através de grupos p amino ou grupos tiol no fragmento.
9. Conjugado, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que a Biomolécula1 ou a Biomolécula2 é um fragmento Fab de anticorpo anti-MUC1 humano selecionado a partir do grupo que consiste em: (a) um fragmento Fab de anticorpo anti-MUC1 humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8 e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 10; e (b) um fragmento Fab de anticorpo anti-MUC1 humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8 e em que a glutamina do aminoácido 1 de SEQ ID NO: 8 é modificada para ácido piroglutâmico, e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 10.
10. Conjugado, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a Biomolécula1 ou Biomolécula2 é:
um fragmento Fab de anticorpo anti-MUC1 humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8 e em que a glutamina do aminoácido 1 de SEQ ID NO: 8 é modificada para ácido piroglutâmico, e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 10.
11. Conjugado CARACTERIZADO pelo fato de que é representado pela seguinte fórmula: [Fórmula Química 144] , em que Fab5 é o seguinte fragmento Fab de anticorpo: um fragmento Fab de anticorpo anti-MUC1 humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8 e em que a glutamina do aminoácido 1 de SEQ ID NO: 8 é modificada para ácido piroglutâmico, e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 10; p é um número natural de 1 a 25; e Fab5 está ligado a um átomo de carbono adjacente através de grupos p amino ou grupos tiol no Fab5.
12. Conjugado CARACTERIZADO pelo fato de que é representado pela seguinte fórmula: [Fórmula Química 145]
, em que Fab5 é o seguinte fragmento Fab de anticorpo: um fragmento Fab de anticorpo anti-MUC1 humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8 e em que a glutamina do aminoácido 1 de SEQ ID NO: 8 é modificada para ácido piroglutâmico, e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 10; p é um número natural de 1 a 25; e Fab5 está ligado a um átomo de carbono adjacente através de grupos p amino ou grupos tiol no Fab5.
13. Conjugado CARACTERIZADO pelo fato de que é representado pela seguinte fórmula: [Fórmula Química 146] , em que Fab5 é o seguinte fragmento Fab de anticorpo: um fragmento Fab de anticorpo anti-MUC1 humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8 e em que a glutamina do aminoácido 1 de SEQ ID NO: 8 é modificada para ácido piroglutâmico, e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 10; p é um número natural de 1 a 25; e Fab5 está ligado a um átomo de carbono adjacente através de grupos p amino ou grupos tiol no Fab5.
14. Conjugado CARACTERIZADO pelo fato de que é representado pela seguinte fórmula: [Fórmula Química 147] , em que Fab5 é o seguinte fragmento Fab de anticorpo: um fragmento Fab de anticorpo anti-MUC1 humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8 e em que a glutamina do aminoácido 1 de SEQ ID NO: 8 é modificada para ácido piroglutâmico, e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 10; p é um número natural de 1 a 25; e Fab5 está ligado a um átomo de carbono adjacente através de grupos p amino ou grupos tiol no Fab5.
15. Conjugado CARACTERIZADO pelo fato de que é representado pela seguinte fórmula: [Fórmula Química 148]
, em que Fab5 é o seguinte fragmento Fab de anticorpo: um fragmento Fab de anticorpo anti-MUC1 humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8 e em que a glutamina do aminoácido 1 de SEQ ID NO: 8 é modificada para ácido piroglutâmico, e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 10; p é um número natural de 1 a 25; e Fab5 está ligado a um átomo de carbono adjacente através de grupos p amino ou grupos tiol no Fab5.
16. Conjugado CARACTERIZADO pelo fato de que é representado pela seguinte fórmula: [Fórmula Química 149] , em que Fab5 é o seguinte fragmento Fab de anticorpo: um fragmento Fab de anticorpo anti-MUC1 humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8 e em que a glutamina do aminoácido 1 de SEQ ID NO: 8 é modificada para ácido piroglutâmico, e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 10; p é um número natural de 1 a 25; e Fab5 está ligado a um átomo de carbono adjacente através de grupos p amino ou grupos tiol no Fab5.
17. Conjugado CARACTERIZADO pelo fato de que é representado pela seguinte fórmula: [Fórmula Química 150] , em que Fab5 é o seguinte fragmento Fab de anticorpo: um fragmento Fab de anticorpo anti-MUC1 humano compreendendo um fragmento de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8 e em que a glutamina do aminoácido 1 de SEQ ID NO: 8 é modificada para ácido piroglutâmico, e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 10; p é um número natural de 1 a 25; e Fab5 está ligado a um átomo de carbono adjacente através de grupos p amino ou grupos tiol no Fab5.
18. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, CARACTERIZADO pelo fato de que p é um número natural de 1 a 4.
19. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, CARACTERIZADO pelo fato de que um metal é coordenado ao 3arm DOTA.
20. Conjugado, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que o metal é um radioisótopo de metal.
21. Conjugado, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que o metal é 89Zr.
22. Conjugado, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que o metal é um íon de metal paramagnético.
23. Conjugado, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que o metal é Gd3+.
24. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 23, CARACTERIZADO pelo fato de que o conjugado é um marcador PET.
25. Composição de diagnóstico CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um ou mais conjugados, como definidos em qualquer uma das reivindicações 19 a 24, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
26. Composição de diagnóstico, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADA pelo fato de que é usada como um fármaco de diagnóstico precoce ou um fármaco de estadiamento.
27. Composição de diagnóstico, de acordo com a reivindicação 25 ou 26, CARACTERIZADA pelo fato de que é usada para diagnosticar um câncer que expressa MUC1 humano.
28. Composição de diagnóstico, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADA pelo fato de que o câncer é câncer de mama, câncer de pulmão, câncer colorretal, câncer de bexiga, câncer de pele, câncer da tireoide, câncer gástrico, câncer pancreático, câncer de rim, câncer ovariano ou câncer cervical.
29. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um ou mais conjugados, como definidos em qualquer uma das reivindicações 19 a 23, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
30. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 29, CARACTERIZADA pelo fato de que é uma composição farmacêutica para tratar um câncer que expressa MUC1 humano.
31. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 30, CARACTERIZADA pelo fato de que o câncer é câncer de mama, câncer de pulmão, câncer colorretal, câncer de bexiga, câncer de pele, câncer da tireoide, câncer gástrico, câncer pancreático, câncer de rim, câncer ovariano ou câncer cervical.
32. Uso do conjugado, como definido em qualquer uma das reivindicações 19 a 23, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a produção de uma composição para diagnosticar um câncer e/ou de uma composição farmacêutica para tratar um câncer.
33. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 23, CARACTERIZADO pelo fato de que é usado para diagnosticar um câncer e/ou tratar um câncer.
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