KR20210113202A - 배위자, 스페이서, 펩티드 링커 및 생물 분자를 포함하는 복합체 - Google Patents
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Abstract
[과제] 금속이나 형광 색소 등에 의한 표지에 의해서도 결합 활성이 감약되지 않는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트를 사용한, 체내 진단약 및 방사선 내용 요법에 유용한 배위자, 스페이서, 및 펩티드 링커를 포함하는 복합체의 제공. [해결수단] 3arm DOTA, 특정한 스페이서, 특정한 펩티드 링커 및 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트 포함하는 생물 분자를 포함하는 복합체는, 금속이나 형광 색소 등에 의한 표지에 의해서도 결합 활성이 감약되지 않고, 진단용 조성물 및/또는 의약 조성물로서 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트 혹은 인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트, 및 배위자를 포함하는 복합체에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 복합체를 포함하는 진단용 조성물 및/또는 의약 조성물, 그리고, 당해 복합체를 사용한 암의 진단 및/또는 치료 방법 등에 관한 것이다. 또한, 배위자, 스페이서, 펩티드 링커 및 생물 분자를 포함하는 복합체, 당해 복합체를 포함하는 진단용 조성물 및/또는 의약 조성물, 그리고, 당해 복합체를 사용한 당해 생물 분자에 관련한 질환의 진단 및/또는 치료 방법 등에 관한 것이다. 또한, 당해 배위자와 금속으로 형성된 착체 및 당해 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트 혹은 당해 인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트를 포함하는 복합체에 관한 것이다. 또한, 당해 착체, 스페이서, 펩티드 링커 및 생물 분자를 포함하는 복합체에 관한 것이다.
CEA(Carcinoembryonic antigen(암배아성 항원)) 또는 CEACAM(Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule(암배아성 항원-관련 세포 부착 분자))은 1965년에 발견된 종양 마커이며(J.Exp.Med.; 1965; 121: 439-462, PNAS; 1969; 64: 161-167), 현재까지 23개의 CEA 관련 분자가 밝혀져 있다(Bio Med Central Biology; 2010; 8: 12-33). 그 중, CEACAM5는 정상 조직에서 거의 발현이 보이지 않지만, 태아의 소화관이나 대장암에서 발현되고 있다(BBA; 1990; 1032: 177-189, J.Clin.Mol.Pathol.; 1999; 52: 174-178). 또한, CEACAM5는 유방암, 폐암, 갑상선암에서도 발현되고 있는 것이 알려져 있다(Diagn.Cytopathol.; 1993; 9: 377-382, Cancer Res.; 1990; 50: 6987-6994, Histopathology; 2000; 37: 530-535).
대장암 환자에서는 건강인에 비해 혈중 CEACAM5의 농도가 높아(J.Exp.Med.; 1965; 121: 439-462), CEACAM5는 종양 마커로서 사용되고 있다. 대장암 환자의 조직학적인 검토에서는 90％ 이상의 조직에서 CEACAM5가 고발현되고 있다(British J.Cancer; 2013; 108: 662-667).
대장암의 조기의 전이는 간장에 국한되어 있기 때문에, 조기에 간 전이를 발견하여 치료할 수 있다면, 재발률을 저하시킬 수 있다(Cell Mol.Gastroenterol.Hepatol.; 2017; 3: 163-173).
뮤신 1(Mucin1: MUC1)은 유선, 기관 및 소화관 등의 상피 조직을 구성하는 상피 세포의 내강측에 발현하는 막 결합형 당 단백질이다(Nat. Rev. Cancer, 2004 Jan; 4(1): 45-60). MUC1은 유방암(Mod. Pathol., 2005 Oct; 18(10): 1295-304), 폐암(Hum. Pathol., 2008 Jan; 39(1): 126-36), 대장암(Int. J. Oncol., 2000 Jan; 16(1): 55-64), 방광암(PLoS One, 2014 Mar; 9(3): e92742), 피부암(Histopathology, 2000 Sep; 37(3): 218-23), 갑상선암(J. Pathol., 2003 Jul; 200(3): 357-69), 위암(J. Pathol., 2000 Mar; 190(4): 437-43), 췌장암(Int. J. Oncol., 2004 Jan; 24(1): 107-13), 신장암(Mod. Pathol., 2004 Feb; 17(2): 180-8), 난소암(Gynecol. Oncol., 2007 Jun; 105(3): 695-702) 및 자궁경암(Am. J. Clin. Pathol., 2004 Jul; 122(1): 61-9) 등의 암세포에서 과잉으로 발현되고 있고, MUC1은 암 병소를 검출하기 위한 표적 분자로서 유용하다(Nat. Rev. Cancer, 2004 Jan; 4(1): 45-60, Pathol. Res. Pract., 2010 Aug15; 206(8): 585-9).
MUC1은 세포외 도메인에 존재하는 20아미노산의 탠덤 리피트 서열인 HGVTSAPDTRPAPGSTAPPA(본원 서열표의 서열 번호 19)의 9번째의 트레오닌이 O-글리코실화된다. 암세포에서는 이 O-글리코실화가 불완전해서, T(Galβ1-3GalNAcα1-O-Ser/Thr), Tn(GalNAcα1-O-Ser/Thr) 및 2,3ST(Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcα-O-Ser/Thr) 등의 O-글리코실화가 암 특이적으로 일어나는 것이 알려져 있다(특허문헌 1, 비특허문헌 1). 정상 조직의 MUC1은, 이들 암 특이적인 O-글리코실화는 받지 않기 때문에, 인간 암 특이적 MUC1은 인간에서의 각종 암을 치료하기 위한 표적 분자로서 특히 유용하다. 이러한 항인간 암 특이적 MUC1 항체로서, 예를 들어 1B2 항체(특허문헌 1), PankoMab 항체(비특허문헌 2), 5E5 항체(특허문헌 2) 등이 알려져 있다. 이들 항체 중, 1B2 항체는 PankoMab 항체에 비하여 인간 암 특이적 MUC1에 대한 특이성이 높은 것이 보고되어 있다(특허문헌 1).
간 전이의 진단에는 CT(컴퓨터 단층 촬영)나 MRI(핵자기 공명 화상법), FDG-PET(Fluorodeoxyglucose-positron emission tomography)가 사용되고 있다. CT나 MRI, FDG-PET의 검출 감도는 각각 74.4, 80.3, 81.4％이며, 1㎝ 이하의 종양에서는 검출 감도는 CT에서 47.3％, MRI에서 60.2％로 저하된다(Radiology; 2010; 257: 674-684). 간 특이성 조영제 MRI도 사용되고 있지만, 1㎝ 이하의 종양에서는 그의 검출 감도는 29 내지 38％이다(Radiology; 2005; 237: 89-98).
암을 진단, 치료하기 위해서, 항암제나 금속 방사성 동위 원소를 결합시킨 항체가 사용되고 있다. 항체를 사용한 타겟팅은 종양 세포에 대한 특이성이 높고, 부작용이 적다. 현재까지 몇 가지의 금속 방사성 동위 원소로 표지된 모노클로날 항체가 진단 및 치료에 임상 응용되고 있다(Cancer Control; 2012; 19: 196-203).
한편, 일반적으로 항체는 혈중 반감기가 길어, 체내에 투여 후, 암을 가시화하기에 충분한 시그널을 부여하는 종양 대 혈액비에 달하는 데 4일 내지 5일의 긴 기간을 필요로 한다(Clin.Pharmacol.Ther.; 2010; 87: 586-592). 또한 항체의 Fc 영역은, 항체 의존성 세포 장애(Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity: ADCC)나 보체 의존성 세포 장애(Complement-Dependent Cytotoxicity: CDC)의 약리 작용을 일으킨다(Glycoconj.J.; 2013; 30: 227-236, Curr.Opin.Biotechnol.; 2002; 13: 609-614). 또한 항체는 간장에서 대사되기 때문에 표적에 관계없이 간장에 고집적되지만, 대장암의 조기의 전이는 간장에 국한되어 있기 때문에, 항체로 간 전이의 병소를 검출하는 것은 어렵다(Clin.Pharmacol.Ther.; 2010; 87: 586-592).
Fab, scFv, 디아바디와 같은 저분자화된 재조합 항체 프래그먼트는, 조직 침투성이 높기 때문에 병소에 도착하기 쉽고, 대장균이나 효모에서의 발현계를 사용한 저비용의 생산을 기대할 수 있는 것으로부터 치료용 항체로서 이용되는 한편, 혈중 반감기가 짧고, 신장 배설되는 특징을 갖는 것으로부터, 진단약으로서의 이용도 보고되어 있다(Nat.Biotechnol.; 2005; 23: 1126-1136).
진단약으로서 응용되고 있는 항인간 CEACAM5 항체로서는, 마우스 모노클로날 항체 T84.66의 인간화 항체인 M5A(특허문헌 3)가 알려져 있다. 64Cu로 표지한 M5A는, 피하에 암세포를 이식한 마우스를 사용한 시험에서, 양호한 PET 이미지를 얻기 위해서는 투여 후 22시간 이상 경과할 필요가 있는 것(비특허문헌 3), 또한, 간 전이의 모델 마우스를 사용한 시험에 있어서, 간장의 정상 조직과 간장의 병소 부위에의 도입은 투여 후 3시간에서는 동일한 정도이고, 24시간 경과 후에는 유의차가 있는 것(비특허문헌 4)이 보고되어 있다.
항인간 CEACAM5 항체의 프래그먼트에서는, 마우스 모노클로날 항체의 NP-4의 Fab'를 99mTc로 표지한 CEA-Scan을 대장암의 진단에 이용할 수 있음이 보고되어 있다(비특허문헌 5). 그러나, CEA-Scan의 병소 부위에의 도입은 정상적인 간장에의 도입을 상회하지 않고, 또한, 간 전이의 검출 감도는 FDG-PET보다 낮다(비특허문헌 6). CEA-Scan은, 1999년에 FDA에 대장암의 진단약으로서 인가되었지만, 이제는 판매되고 있지 않다(비특허문헌 7).
DOTA(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산)는 방사성 금속의 킬레이터로서 임상 실적이 있고 또한 널리 사용되고 있다. 근년 DOTA를 사용하여 금속 표지를 행하고, 펩티드나 항체와 결합시켜, 타겟팅하는 연구가 보고되어 있다 (비특허문헌 8).
암 치료에서는, DOTA를 갖는 의약으로서, Satoreotide tetraxetan(비특허문헌 9)이 페이즈 I 개발 중으로서 보고되어 있다. 90Y-epratuzumab tetraxetan를 혈액계 종양을 갖는 환자에게 투여한 것이 보고되어 있다(비특허문헌 10).
일반적으로, DOTA 등의 킬레이트제 및 저분자화 항체나 펩티드가 결합한 복합체는, 신장에서 고도로 도입되고, 보유되거나 또는 집적된다(비특허문헌 1 1,12).
이와 같이, 당해 복합체의 신장의 집적은 정확한 진단이나 치료에 있어서 문제가 발생한다(비특허문헌 13).
예를 들어 [111In] DOTA-리툭산 Fab의 복합체를 투여한 마우스에서의 시험에 있어서, 신장에 고도로 집적한 보고가 되어 있다(비특허문헌 11).
이렇게 신장에서 고도로 집적되는 것을 회피하기 위해서, 첫번째로 항체의 프래그먼트, 예를 들어 Fab, scFV, Fab', dsFV 등으로 개변한 복합체에서의 검토를 들 수 있고, 두번째로 킬레이트와 항체 사이에 특이적으로 신장 내에서 절단되는 링커(펩티드 링커라고도 함)를 갖는 복합체에서의 검토를 들 수 있다(비특허문헌 12).
당초, 펩티드 링커가 Gly(글리신)-Lys(리신)인 요오드히푸르산-Gly-Lys-Fab가 신장 쇄자 연막 효소에 의해 절단되어 요오드히푸르산이 대사물로서 오줌 중에 포함되어 배출되는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 14). 또한, 펩티드 링커가 Gly-Tyr(티로신)인 요오드히푸르산-Gly-Tys-Fab가 보고되어 있다(비특허문헌 13).
한편, 히푸르산 대신에 유기 레늄 착체 CpTR-COOH에 펩티드 링커의 Gly-Lys를 결합시킨 [188Re]CpTR-Gly-Lys-Fab가 보고되어 있다(비특허문헌 15).
또한, 펩티드 링커가 Gly-Phe(페닐알라닌)-Lys인 99mTc-PGGFML-IT-Fab가 보고되어 있다(특허문헌 4).
또한, 킬레이트로서 NOTA에 착안하여, 당해 NOTA가 펩티드 링커를 포함하는 복합체가 보고되어 있다(특허문헌 5).
상기 펩티드 링커를 갖는 복합체가 창제되었지만, 킬레이트제의 종류에 따라서는 당해 효소에 의해 절단되지 않는 과제가 발생하고, 킬레이트제와 펩티드 링커 사이에 특정 구조의 연결부(-CH2-Ph-CO-NH-)를 도입함으로써 해결하고자 한 복합체가 보고되어 있다(특허문헌 6). 방사성 동위체로서 범용되고 있는 인듐 등의 비교적 큰 원자 반경을 갖는 원자를 배위할 수 있는 배위자를 갖는 복합체를 얻는 것을 목표로 삼고 있다. 킬레이트와 펩티드 링커를 개재하는 스페이서로서 특허문헌 5에 기재된 티오우레아 구조를 갖는 것을 도입했지만 신장 쇄자 연막 효소에 의한 분해가 진행하지 않는 것을 언급하고 있다.
리소좀에 의한 절단을 목표로 한 펩티드 링커가 Met(메티오닌)-Ile(이소류신)인, 복합체 67Ga-NOTA-Met-Ile-Fab가 이하의 지견에 기초하여 보고되어 있다(비특허문헌 16).
펩티드 링커를 갖고 있지 않은 복합체 NOTA-(p-SCN-Bz)-dsFv의 리소좀 절단에서 발생하는 대사물 67Ga-NOTA-Bn-Met가 오줌 배설되는 것이 보고된 것(비특허문헌 17), 상기 복합체 NOTA-(p-SCN-Bz)-dsFv의 dsFv의 경쇄 N 말단으로부터 2번째가 Ile인 것으로부터, 복합체 67Ga-NOTA-Met-Ile-Her2(헤르셉틴) Fab를 설계했다(비특허문헌 19).
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1가의 Fab 프래그먼트는, 분자량 약 50kDa이며, 약 150kDa의 항체보다 작고, 신장 배설되고, 혈중 반감기도 짧다. 그 때문에, 투여 후 2 내지 32시간 이내에 암을 가시화하기에 충분한 시그널을 부여하는 종양 대 혈액비에 달한다. Fc 영역이 없기 때문에 ADCC이나 CDC를 야기하는 일도 없다. Fab 프래그먼트는, 주로 신장 배설이기 때문에, 간 전이의 검출 방해가 되는 일도 없다. 이러한 특장으로부터, 항체와 비교하여, Fab 프래그먼트는, 체내 진단약으로서 보다 유효할 것을 기대할 수 있다.
그러나 Fab 프래그먼트에서는, 항체의 2가로부터 1가로 되기 때문에, 그 결합 활성이 감약되는 경우가 많다. 또한 항체를 체내 진단약이나 광면역 요법에서 사용하는 약제로서 이용하기 위해서는, 금속이나 형광 색소 등으로 표지해야 하는데, 그러한 물질로 표지됨으로써, 그 항체의 결합 활성이 감약된다는 과제가 있다.
본 발명의 과제는, 금속이나 형광 색소 등에 의한 표지에 의해서도 결합 활성이 감약되지 않는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트를 사용한, 체내 진단약 및 방사선 내용 요법에 유용한 표지화된 복합체를 제공하는 데 있다.
항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트(특허문헌 7)와 펩티드 링커 및 배위자를 포함하는 복합체, 그리고 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트와 배위자를 포함하는 복합체를 제공하는 데 있다. 또한, 본 발명의 다른 과제는, 상기 복합체를 포함하는 진단용 조성물 및 그것을 이용한 진단 방법을 제공하는 것, 그리고, 상기 복합체를 포함하는 의약 조성물 및 그것을 이용한 치료 방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 과제는, 신장에 집적하는 킬레이터 및 생물 분자를 갖는 복합체가 보다 빠르게 배설되는 복합체를 제공하는 데 있다.
본 발명자들은, 먼저 인간 CEACAM5에 대한 양호한 친화성을 갖는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트를 제작했다(국제 출원PCT/JP2018/025618). 또한 예의 검토를 거듭한 결과, 당해 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트에, 표지에 사용하는 배위자 및 펩티드 링커를 통하여(혹은 통하지 않고) 결합시킨 복합체를 제작하고, 당해 복합체가 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트 자체와 동등한 인간 CEACAM5에 대한 친화성을 갖는 것, 즉, 표지부와 Fab 프래그먼트의 결합에 의해서도 결합 활성이 감약되지 않음을 알아내고, 본 발명을 완성하였다. 즉, 본 발명은 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트와 펩티드 링커 및 배위자를 포함하는 복합체, 그리고 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트와 특정한 배위자를 포함하는 복합체를 제공한다. 당해 복합체가, 표지부와 Fab 프래그먼트의 결합에 의해서도 인간 CEACAM5에 대한 결합 활성이 감약되지 않고, 양호한 인간 CEACAM5에 대한 결합 활성을 유지하고 있음을 확인하고 있어, 이들 결과에 기초하여, 본 발명의 복합체를 사용한 진단 수단 및 치료 수단을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명자들은, 인간 암 특이적 MUC1에 대한 양호한 친화성을 갖는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트를 제작하고, 또한 예의 검토를 거듭한 결과, 당해 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트에, 배위자를 펩티드 링커를 통하여(혹은 통하지 않고) 결합시킨 복합체를 제작하였다. 당해 복합체는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트 자체와 동등한 인간 암 특이적 MUC1에 대한 친화성을 갖는다. 즉, 본 발명은 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트와 펩티드 링커 및 배위자를 포함하는 복합체, 그리고 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트와 특정한 배위자를 포함하는 복합체를 제공한다. 또한, 당해 복합체가, 표지부의 결합에 의해서도 인간 암 특이적 MUC1에 대한 결합 활성이 감약되지 않고, 양호한 인간 암 특이적 MUC1에 대한 결합 활성을 유지하고 있음을 확인하고 있어, 이들 결과에 기초하여, 본 발명의 복합체를 사용한 진단 수단 및 치료 수단을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명자들은, 조영제나 항암제 등의 의약으로서 유용한 항체 등의 배위자와 금속으로 형성된 착체(금속 착체라고도 함), 스페이서, 펩티드 링커 및 생물 분자를 포함하는 복합체가 신장에 집적될 우려가 있기 때문에, 보다 빠르게 배설되는 복합체에 대하여 검토하였다. 그 결과, 방사성 금속의 킬레이터로서 임상 실적이 있고 또한 널리 사용되고 있는 DOTA(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산)에 착안하여, 3arm DOTA, 특정한 스페이서, 특정한 펩티드 링커 및 생물 분자를 포함하는 복합체가 신장 내에서 분해되어 배출됨을 알아냈다.
이상으로부터, 본 발명은 이하의 CEACAM5의 Fab 항체를 포함하는 복합체 및 당해 복합체를 포함하는 진단용 조성물 및/또는 의약 조성물, 그리고, 당해 복합체를 사용한 암의 진단 및/또는 치료 방법 등에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이하의 MUC1의 Fab 항체를 포함하는 복합체 및 당해 복합체를 포함하는 진단용 조성물 및/또는 의약 조성물, 그리고, 당해 복합체를 사용한 암의 진단 및/또는 치료 방법 등에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 신장으로부터 빠르게 배출되는 DOTA, 스페이서, 펩티드 링커 및 생물 분자를 포함하는 복합체, 당해 복합체의 중간체, 그리고, 당해 복합체를 사용한 생물 분자에 관련한 질환의 진단 및/또는 치료 방법 등에 관한 것이다.
[1] 하기 식 (I):
(Y-S1-X)p-Fab1 (I)
[식 중,
Fab1은,
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 112까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트, 및
(b) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역이며, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1의 글루탐산이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 112까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트,
로 이루어지는 군에서 선택되는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트이며, 해당 Fab1은 해당 Fab1 중에 어느 p개의 아미노기 또는 티올기를 통하여 X에 결합하고 있고;
X는, 펩티드 링커 또는 결합이며;
S1은, 스페이서 또는 결합이며;
Y는, 배위자이며; 그리고,
p는, 1 내지 25의 자연수이며, Fab1에 결합하고 있는 기(Y-S1-X)의 수를 나타내고;
단, X가 결합일 때는, S1이 -CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)- 또는 결합이며, 또한, Y는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(이하, DOTA라고 약기하는 경우가 있다)이다]
로 표시되는 복합체.
[2] Fab1이,
(a) 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트, 및
(b) 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1의 글루탐산이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트,
로 이루어지는 군에서 선택되는, 상기 [1]에 기재된 복합체.
[3] Fab1이, 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, Fab 프래그먼트(이하 Fab2라고도 함)를 포함하는, 상기 [2]에 기재된 복합체.
[4] X가, 신장 쇄자 연막 효소 또는 리소좀 효소로 절단되는 아미노산 서열을 갖는, 2 내지 4개의 아미노산을 포함하는 펩티드를 포함하는 펩티드 링커인, 상기 [1] 내지 [3]의 어느 것에 기재된 복합체.
[5] S1이,
-C(=O)-CH2O-(1,3-페닐렌)-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2O)4-(1,3-페닐렌)-C(=O)-,
-C(=O)-(1,3-페닐렌)-C(=O)-,
-NH-CH2-(1,3-페닐렌)-C(=O)-,
-NH-(CH2)2-C(=O)-,
-CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-, -NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-페닐렌)-C(=O)-,
-NH-CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=O)-,
-NH-(CH2)3-C(=O)-,
-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-,
-NH-CH2-(1,4-페닐렌)-C(=O)-,
-CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-NH-CH2-(1,3-페닐렌)-C(=O)-,
-CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-페닐렌)-C(=O)-,
하기 식 (a) 내지 (q)로 표시되는 스페이서 또는 결합이며,
상기 식 중, R1은 수소 원자, 할로겐 또는 C1-6 알킬을 의미한다. 이하 마찬가지임. X가,
(1) -Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(2) -Gly-Lys*-Z2-,
(3) -Gly-Phe-Lys*-Z2-,
(4) -Met-Val-Lys*-Z2-,
(5) -Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-,
(6) -Gly-Lys-Lys*-Z2-,
(7) -Gly-Arg-Lys*-Z2-,
(8) -Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-,
(9) -Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-,
(10) -Asp-Gly-Lys*-Z2-,
(11) -Met-Gly-Lys*-Z2-,
(12) -Met-Ile-Lys*-Z2-,
(13) -Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-Lys*-Z2-,
(14) -Val-NH-(CH2)2-Z1-,
(15) -Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(16) -Gly-Val-NH-(CH2)2-Z1-,
(17) -Gly-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(18) -Met-Phe-Lys*-Z2-,
(19) -Gly-Tyr-Lys*-Z2-,
(20) -Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-,
(21) -Gly-(3-(2-나프틸)알라닌)-Lys*-Z2-,
(22) -Gly-디페닐알라닌-Lys*-Z2-,
(23) -Gly-Tyr-NH-(CH2)5-Z1-,
(24) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-,
(25) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-,
(26) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-,
(27) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)- 및
(28) -Met-Gly-Lys*-Z3-으로 이루어지는 군에서 선택되는 펩티드 링커, 또는
(29) 결합,
이고, 여기에, Met는 메티오닌을, Ile은 이소류신을, Gly는 글리신을, Lys는 리신을, Phe는 페닐알라닌을, Val은 발린을, Tyr은 티로신을, Arg는 아르기닌을, Asp는 아스파르트산을, Z1은 하기 식 (II-I) 또는 (II-II)로 표시되는 기를, -Lys*-Z2-은 하기 식 (III-I) 또는 (III-II)로 표시되는 기를, -Tyr*-CH2-은 하기 식 (IV)로 표시되는 기를, -Lys*-C(=S)-은 하기 식 (V)로 표시되는 기를, -Lys*-Z3-은 하기 식 (III-III)으로 표시되는 기를 각각 나타내는, 기 (A-3), (A-4) 또는 (A-5)는 하기 식과 같으며, 상기 [1] 내지 [4]의 어느 것에 기재된 복합체.
[6] S1이 -C(=O)-CH2O-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2O)4-(1,3-페닐렌)-C(=O)- 또는 -C(=O)-(1,3-페닐렌)-C(=O)-이며,
X가
(1) -Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(2) -Gly-Lys*-Z2-,
(3) -Gly-Phe-Lys*-Z2-,
(5) -Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-,
(6) -Gly-Lys-Lys*-Z2-, 및
(8) -Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-
로 이루어지는 군에서 선택되는 펩티드 링커인, 상기 [1] 내지 [5]의 어느 것에 기재된 복합체.
[7-1] S1이 -C(=O)-CH2O-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2O)4-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, -NH-CH2-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, -NH-CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=O)-, -NH-CH2-(1,4-페닐렌)-C(=O)-, -C(=O)-(1,3-페닐렌)-C(=O)-이거나 또는 하기 식
X가
(1) -Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(2) -Gly-Lys*-Z2-,
(3) -Gly-Phe-Lys*-Z2-,
(5) -Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-,
(6) -Gly-Lys-Lys*-Z2-,
(8) -Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-,
(24) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-,
(25) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-,
(26) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-,
(27) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)- 및
(28) -Met-Gly-Lys*-Z3-으로 이루어지는 군에서 선택되는 펩티드 링커인,
상기 [1] 내지 [5]의 어느 것에 기재된 복합체.
[7-2] S1이, -NH-CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=O)-이거나 또는 하기 식
X가
(1) -Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(24) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-,
(25) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-,
(26) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-,
(27) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)- 및
(28) -Met-Gly-Lys*-Z3-으로 이루어지는 군에서 선택되는 펩티드 링커인, 상기 [7-1]에 기재된 복합체.
[8] S1이 -NH-CH2-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, -NH-(CH2)2-C(=O)-, -CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-, -NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, -NH-CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=O)-, -NH-(CH2)3-C(=O)-, -NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-, -NH-CH2-(1,4-페닐렌)-C(=O)-, -CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-NH-CH2-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, -CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, 하기 식 (a) 내지 (q)로 표시되는 스페이서 또는 결합이며,
X가,
(1) -Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(2) -Gly-Lys*-Z2-,
(3) -Gly-Phe-Lys*-Z2-,
(4) -Met-Val-Lys*-Z2-,
(5) -Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-,
(7) -Gly-Arg-Lys*-Z2-,
(8) -Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-,
(9) -Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-,
(10) -Asp-Gly-Lys*-Z2-,
(11) -Met-Gly-Lys*-Z2-,
(12) -Met-Ile-Lys*-Z2-,
(13) -Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-Lys*-Z2-,
(14) -Val-NH-(CH2)2-Z1-,
(15) -Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(16) -Gly-Val-NH-(CH2)2-Z1-,
(17) -Gly-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(18) -Met-Phe-Lys*-Z2-,
(19) -Gly-Tyr-Lys*-Z2-,
(20) -Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-,
(21) -Gly-(3-(2-나프틸)알라닌)-Lys*-Z2-,
(22) -Gly-디페닐알라닌-Lys*-Z2-,
(23) -Gly-Tyr-NH-(CH2)5-Z1-
(24) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-,
(25) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-,
(26) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-,
(27) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)- 및
(28) -Met-Gly-Lys*-Z3-으로 이루어지는 군에서 선택되는 펩티드 링커인, 상기 [1] 내지 [5]의 어느 것에 기재된 복합체.
[9] S1이 -NH-CH2-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, -CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-, -NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, -CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-NH-CH2-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, -NH-CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=O)-, 하기 식 (e) 내지 (i) 혹은 (k)로 표시되는 스페이서 또는 결합이며,
X가
(1) -Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(2) -Gly-Lys*-Z2-,
(3) -Gly-Phe-Lys*-Z2-,
(9) -Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-,
(10) -Asp-Gly-Lys*-Z2-,
(11) -Met-Gly-Lys*-Z2-,
(12) -Met-Ile-Lys*-Z2-,
(21) -Gly-(3-(2-나프틸)알라닌)-Lys*-Z2-,
(24) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-,
(25) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-,
(26) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-,
(27) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)- 및
(28) -Met-Gly-Lys*-Z3-으로 이루어지는 군에서 선택되는 펩티드 링커인, 상기 [1] 내지 [5]의 어느 것에 기재된 복합체..
[10] S1이 -NH-CH2-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, -CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-, -NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, -CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-NH-CH2-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, -NH-CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=O)-, 하기 식 (f) 혹은 (g)로 표시되는 스페이서 또는 결합으로 이루어지는 군에서 선택되는 기이며,
X가,
(1) -Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(4) -Met-Val-Lys*-Z2-,
(9) -Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-,
(11) -Met-Gly-Lys*-Z2-,
(12) -Met-Ile-Lys*-Z2-,
(18) -Met-Phe-Lys*-Z2-,
(24) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-,
(25) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-,
(26) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-,
(27) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)- 및
(28) -Met-Gly-Lys*-Z3-으로 이루어지는 군에서 선택되는 펩티드 링커인, 상기 [1] 내지 [5]의 어느 것에 기재된 복합체.
[11] X가,
(1) -Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(9) -Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-,
(12) -Met-Ile-Lys*-Z2-,
(24) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-,
(25) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-,
(26) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-, 및
(27) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-으로 이루어지는 군에서 선택되는 펩티드 링커인, 상기 [1] 내지 [5]의 어느 것에 기재된 복합체.
[12] X가,
(4) -Met-Val-Lys*-Z2-,
(11) -Met-Gly-Lys*-Z2-,
(18) -Met-Phe-Lys*-Z2-, 및
(28) Met-Gly-Lys*-Z3-
로 이루어지는 군에서 선택되는 펩티드 링커인, 상기 [1] 내지 [5]의 어느 것에 기재된 복합체.
[13] X가,
(11) -Met-Gly-Lys*-Z2-, 및
(28) -Met-Gly-Lys*-Z3-
로 이루어지는 군에서 선택되는 펩티드 링커인 상기 [1] 내지 [5]의 어느 것에 기재된 복합체.
[14] 하기 식으로 표시되는 화합물로 이루어지는 군에서 선택되는 복합체이며, Fab1이 해당 Fab1 중에 어느 p개의 아미노기 또는 티올기를 통하여, 인접하는 탄소 원자에 결합하고 있는, 상기 [1] 내지 [5]의 어느 것에 기재된 복합체.
[15] Y가 데페록사민(이하, DFO라고 약기하는 경우가 있다), 또는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산인(이하, DOTA라고 약기하는 경우가 있다), 상기 [1] 내지 [14]의 어느 것에 기재된 복합체.
[16] Y가 DFO인, 상기 [15]에 기재된 복합체.
[17] Y가 DOTA인, 상기 [15]에 기재된 복합체.
[18] Y가 3arm DOTA 또는 4arm DOTA인, 상기 [17]에 기재된 복합체.
[19] Y가 3arm DOTA인, 상기 [18]에 기재된 복합체.
[20] Y가 4arm DOTA인, 상기 [18]에 기재된 복합체.
[21] 하기 식으로 표시되는 화합물로 이루어지는 군에서 선택되는 복합체이며, Fab1이 해당 Fab1 중에 어느 p개의 아미노기 또는 티올기를 통하여, 인접하는 탄소 원자에 결합하고 있는, 상기 [15] 또는 [17] 내지 [20]의 어느 것에 기재된 복합체.
또한, 본 발명 복합체는, 하기 2가지 복합체의 혼합물이어도 된다.
[22] 하기 식으로 표시되는 화합물로 이루어지는 군에서 선택되는 복합체이며, Fab1이 해당 Fab1 중에 어느 p개의 아미노기 또는 티올기를 통하여, 인접하는 탄소 원자에 결합하고 있는, 상기 [15] 또는 [17] 내지 [20]의 어느 것에 기재된 복합체.
[23] p가 1 내지 5의 자연수인, 상기 [1] 내지 [22]의 어느 것에 기재된 복합체.
[24] Y에 금속이 배위한, 상기 [1] 내지 [20]의 어느 것에 기재된 복합체.
[25] 금속이 배위한, 상기 [21] 내지 [22]의 어느 1항에 기재된 복합체
[26] 금속이 금속 방사성 동위 원소인, 상기 [24] 또는 [25]에 기재된 복합체.
[27] 금속이 89Zr인, 상기 [26]에 기재된 복합체.
[28] 금속이 상자성 금속 이온인, 상기 [24] 또는 [25]에 기재된 복합체.
[29] 금속이 Gd3+인, 상기 [28]에 기재된 복합체.
[30] PET 트레이서인, 상기 [24] 내지 [29]의 어느 것에 기재된 복합체.
[31] 상기 [24] 내지 [30]의 어느 것에 기재된 1종류 이상의 복합체, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 진단용 조성물.
[32] 조기 진단약, 또는 병기 진단약으로서 사용되는, 상기 [31]에 기재된 진단용 조성물.
[33] 인간 CEACAM5를 발현하는 암의 진단에 사용되는, 상기 [31] 또는 [32]의 어느 것에 기재된 진단용 조성물.
[34] 암이, 대장암, 유방암, 폐암, 갑상선암 또는 이들이 전이된 암인, 상기 [33]에 기재된 진단용 조성물.
[35] 상기 [24] 내지 [29]의 어느 것에 기재된 1종류 이상의 복합체, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 의약 조성물.
[36] 인간 CEACAM5를 발현하는 암을 치료하기 위한 의약 조성물인, 상기 [35]에 기재된 의약 조성물.
[37] 암이, 대장암, 유방암, 폐암, 갑상선암 또는 이들이 전이된 암인, 상기 [36]에 기재된 의약 조성물.
[38] 암의 진단용 조성물, 및/또는 암의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한, 상기 [24] 내지 [29]의 어느 것에 기재된 1종류 이상의 사용.
[39] 암의 진단, 및/또는 암의 치료에 사용되는, 상기 [24] 내지 [30]의 어느 것에 기재된 복합체.
[40] 상기 [24] 내지 [30]의 어느 것에 기재된 1종류 이상의 복합체를 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 암의 진단 방법.
[41] 상기 [24] 내지 [30]]의 어느 것에 기재된 복합체의 치료 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료 방법.
[42]
하기 식 (Ia):
[식 중,
DOTA1: 3arm DOTA,
U: 결합 또는 -NH(CH2)2O(CH2)2O(CH2)2OCH2C(=O)-
Q: -C(=O)-, -NH-C(=O)- 또는 -NH-C(=S)-
X: C 또는 N
R1a, R1b: 동일하거나 또는 다르고, H 또는 C1-6 알킬,
또한, R1a 및 R1b는, 합쳐져서 C1-6 알킬렌을 형성할 수 있다.
p는, 1 내지 25의 자연수이며, Biomolecule1 중에 어느 p개의 아미노기 또는 티올기를 통하여, 인접하는 탄소 원자에 결합하고 있다.
R1: H, 할로겐, C1-6 알킬 또는 할로 C1-6 알킬,
R2: C1-6 알킬 또는 할로 C1-6 알킬,
L2: Ile, Gly, Ala, Val, Phe, -NHCH(CHCH3NR3R4)C(=O)-, -NHCH(CHCH3N3)C(=O)- 또는 -NHCH(CHCH3CH2CH2CH3)C(=O)-,
R3: H, C1-6 알킬,
R4: H, C1-6 알킬,
L3: 결합, Arg 또는 His,
L4: -NH-(CH2)2-, -NHCH(C(=O)OH)(CH2)4- 또는 결합,
V1: 하기 식 (A-1) 내지 (A-5)로 표시되는 기,
또는, 기 -L3-L4-V1-이 합쳐져서 하기 식
이고,
Biomolecule1: 생물 분자
로 표시되는 복합체.
[43] L3, L4 및 V1이 이하의 기인 [42]에 기재된 복합체.
L3: 결합, Arg 또는 His,
L4: -NH-(CH2)2-, -NHCH(C(=O)OH)(CH2)4- 또는 결합,
V1: 하기 식 (A-1) 내지 (A-5)의 어느 것에 기재된 기,
[44] 기 -L3-L4-V1-이 합쳐져서 하기 식
인 [43]에 기재된 복합체.
[45] 하기 식 (Ib):
[식 중,
DOTA1: 3arm DOTA,
U: 결합 또는 -NH(CH2)2O(CH2)2O(CH2)2OCH2C(=O)-
Q: -C(=O)-, -NH-C(=O)- 또는 -NH-C(=S)-
X: C 또는 N
R1a, R1b: 동일하거나 또는 다르고, H 또는 C1-6 알킬
또한, R1a 및 R1b는, 합쳐져서 C1-6 알킬렌을 형성할 수 있다.
p는, 1 내지 25의 자연수이며, Biomolecule2 중에 어느 p개의 아미노기 또는 티올기를 통하여, 인접하는 탄소 원자에 결합하고 있다.
R1: H, 할로겐, C1-6 알킬 또는 할로 C1-6 알킬,
R2: C1-6 알킬 또는 할로 C1-6 알킬,
L2: Ile, Gly, Ala, Val, Phe, -NHCH(CHCH3NR3R4)C(=O)-, -NHCH(CHCH3N3)C(=O)- 또는 -NHCH(CHCH3CH2CH2CH3)C(=O)-,
R3: H, C1-6 알킬,
R4: H, C1-6 알킬,
L3: 결합, Arg 또는 His,
L4: -NH-(CH2)2-, -NHCH(C(=O)OH)(CH2)4- 또는 결합,
V1: 하기 식 (A-1) 내지 (A-5)의 어느 것에 기재된 기,
또는, 기 -L3-L4-V1-이 합쳐져서 하기 식
이고,
Biomolecule2: 항체 Fab 프래그먼트,
로 표시되는 복합체.
[46-1]
하기 식 (Ic):
[식 중,
L3: 결합,
L4: -NH-(CH2)2- 또는 -NHCH(C(=O)OH)(CH2)4-,
Biomolecule: Biomolecule1 또는 Biomolecule2이다]
인 상기 [42] 내지 [45]의 어느 것에 기재된 복합체.
[46-2]
상기 [46-1]의 복합체에 있어서, 식 (Ic) 중,
L3이 결합이며,
L4가 -NH-(CH2)2-인 복합체.
[47-1] 하기 식 (Id)로 표시되는 상기 [42] 내지 [46-2]에 기재된 복합체.
[식 중,
L3: 결합,
L4: -NH-(CH2)2- 또는 -NHCH((C=O)OH)(CH2)4-,
Biomolecule: Biomolecule1 또는 Biomolecule2이다]
인 상기 [42] 내지 [45]의 어느 것에 기재된 복합체.
[47-2] 상기 [47-1]의 복합체에 있어서, 식 (Id) 중,
L3이 결합이며,
L4가 -NH-(CH2)2-인 복합체.
[48]
V1이, 하기 식 (A-3) 내지 (A-5)
의 어느 것인 상기 [42] 내지 [47-2]의 어느 것에 기재된 복합체.
[49]
식 (Ia) 또는 (Ib) 중의 기 (B)가
하기 식 (B-1) 내지 (B-7)의 군에서 선택된 기인 [42] 내지 [48]의 어느 것에 기재된 복합체.
[50] 하기 식으로 표시되는 화합물로 이루어지는 군에서 선택되는 [42] 내지 [49]의 어느 것에 기재된 복합체.
[51-1]
Biomolecule1 및 Biomolecule2에 있어서, 이하의 항체 Fab 프래그먼트를 제외하는 생물 분자 또는 항체 Fab 프래그먼트인 [42] 내지 [50]의 어느 것에 기재된 복합체:
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 112까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트, 및
(b) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역이며, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1의 글루탐산이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 112까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트로 이루어지는 군에서 선택되는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트.
[51-2]
Biomolecule1 및 Biomolecule2에 있어서, 이하의 항체 Fab 프래그먼트를 제외하는 생물 분자 또는 항체 Fab 프래그먼트인 [51-1]에 기재된 복합체:
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 112까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트,
(b) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역이며, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1의 글루탐산이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 112까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트,
(c) 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트, 또는,
(b) 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1의 글루탐산이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 4에 나타나는 경쇄를 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트.
[52] Biomolecule1 또는 Biomolecule2가, 이하의 (a) 및 (b)의 군에서 선택되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트인 [42] 내지 [51-2]의 어느 것에 기재된 복합체:
(a) 서열 번호 12 또는 서열 번호 14에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 16에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트,
및
(b) 서열 번호 12 또는 서열 번호 14에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역이며, 서열 번호 12 또는 서열 번호 14의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 16에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트로 이루어지는 군에서 선택되는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트.
[53] Biomolecule1 또는 Biomolecule2가, 이하 (a) 및 (b)로부터의 군에서 선택되는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트인 [52]에 기재된 복합체:
(a) 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트; 및
(b) 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 8의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트.
[54] Biomolecule1 또는 Biomolecule2가, 이하의 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트인 [53]에 기재된 복합체:
서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 8의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트.
[55] p가 1 내지 4의 자연수인, 상기 [42] 내지 [54]의 어느 것에 기재된 복합체.
[56] DOTA1에 금속이 배위한, 상기 [42] 내지 [55]의 어느 것에 기재된 복합체.
[57] 금속이 금속 방사성 동위 원소인, 상기 [56]에 기재된 복합체.
[58] 금속이 89Zr인, 상기 [57]에 기재된 복합체.
[59] 금속이 상자성 금속 이온인, 상기 [56]에 기재된 복합체.
[60] 금속이 Gd3+인, 상기 [59]에 기재된 복합체.
[61] PET 트레이서인, 상기 [56] 내지 [60]의 어느 것에 기재된 복합체.
[62] 상기 [56] 내지 [61]의 어느 것에 기재된 1종류 이상의 복합체, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 진단용 조성물.
[63] 조기 진단약, 또는 병기 진단약으로서 사용되는, 상기 [62]에 기재된 진단용 조성물.
[64] Biomolecule1 또는 Biomolecule2에 관련한 질환의 진단에 사용되는, 상기 [62] 또는 [63]의 어느 것에 기재된 진단용 조성물.
[65] Biomolecule1 또는 Biomolecule2에 관련한 질환이 MUC1에 관련한 질환인, 상기 [64]에 기재된 진단용 조성물.
[66] MUC1을 발현하는 암의 진단에 사용되는, 상기 [65]에 기재된 진단용 조성물.
[67] 암이, 유방암, 폐암, 대장암, 방광암, 피부암, 갑상선암, 위암, 췌장암, 신장암, 난소암 또는 자궁경암인, 상기 [66]에 기재된 진단용 조성물.
[68] 상기 [56] 내지 [60]의 어느 것에 기재된 1종류 이상의 복합체, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 의약 조성물.
[69] Biomolecule1 또는 Biomolecule2에 관련한 질환의 진단에 사용되는, 상기 [68]에 기재된 의약 조성물.
[70] Biomolecule1 또는 Biomolecule2에 관련한 질환이 MUC1에 관련한 질환인, 상기 [69]에 기재된 의약 조성물.
[71] MUC1을 발현하는 암을 치료하기 위한 의약 조성물인, 상기 [70]에 기재된 의약 조성물.
[72] 암이, 유방암, 폐암, 대장암, 방광암, 피부암, 갑상선암, 위암, 췌장암, 신장암, 난소암 또는 자궁경암인, 상기 [71]에 기재된 의약 조성물.
[73] 암의 진단용 조성물, 및/또는 암의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한, 상기 [56] 내지 [60]의 어느 것에 기재된 1종류 이상의 사용.
[74] 암의 진단, 및/또는 암의 치료에 사용되는, 상기 [56] 내지 [60]의 어느 것에 기재된 복합체.
[75] 상기 [56] 내지 [60]의 어느 것에 기재된 1종류 이상의 복합체를 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 암의 진단 방법.
[76] 상기 [56] 내지 [60]의 어느 것에 기재된 복합체의 치료 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료 방법.
본 발명에 기재된 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트, 펩티드 링커 및 배위자를 포함하는 복합체, 그리고, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트와 특정한 배위자를 포함하는 복합체는, 인간 CEACAM5에 대한 우수한 결합 활성을 갖는다. 그 때문에, 추가로 금속을 포함하는 본 발명의 복합체는, 암의 진단 및/또는 치료에 유용할 것이 기대된다. 또한, 본 발명에 기재된 인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트, 펩티드 링커 및 배위자를 포함하는 복합체는, 인간 MUC1에 대한 우수한 결합 활성을 갖는다. 본 발명에 기재된 3arm DOTA, 스페이서, 펩티드 링커 및 생체 분자를 포함하는 복합체가 신장으로부터 보다 빠르게 배설된다. 그 때문에, 추가로 금속을 포함하는 본 발명의 복합체는, 암의 진단 및/또는 치료에 유용할 것이 기대된다.
도 1은 64Cu-단백 복합체 용액 (A)를 포함하는 PBS 용액을 투여하여 약 3시간 후에 얻어진 PET/CT 화상을 나타낸다.
도 2는 64Cu-단백 복합체 용액 (B)를 포함하는 PBS 용액을 투여하여 약 3시간 후에 얻어진 PET/CT 화상을 나타낸다.
도 3은 SUV를 나타낸다.
도 2는 64Cu-단백 복합체 용액 (B)를 포함하는 PBS 용액을 투여하여 약 3시간 후에 얻어진 PET/CT 화상을 나타낸다.
도 3은 SUV를 나타낸다.
이하에, 본 발명에 대하여 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 명세서에서 특별히 정의되지 않는 한, 본 발명에 관련하여 사용되는 과학 용어 및 기술 용어는, 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 것으로 한다.
「알킬」이란, 모두 직쇄 또는 분지상의 포화 탄화수소쇄를 의미하고, 1가 기를 의미한다.
「C1-6 알킬」이란, 탄소수가 1 내지 6인 알킬, 예를 들어 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, n-헥실 등이다. 어떤 양태로서는 C1-4 알킬이며, 어떤 양태로서는 메틸 또는 에틸이며, 어떤 양태로서는 메틸이다.
「C1-6 알킬렌」이란, 상기 C1-6 알킬의 수소를 제외한 2가기이다. 어떤 양태로서는 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌 또는 메틸메틸렌 등이다.
「할로겐」은, F, Cl, Br, I를 의미한다.
「할로 C1-6 알킬」이란, 1개 이상의 할로겐으로 치환된 C1-6 알킬이다. 어떤 양태로서는 1 내지 5개의 할로겐으로 치환된 C1-6 알킬이며, 어떤 양태로서는 CF3이다.
1-1. 본 발명의 복합체
본 발명의 복합체는, 하기 식 (I):
(Y-S1-X)p-Fab1 (I)
[식 중,
Fab1은, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트이며, 해당 Fab1은 해당 Fab1 중에 어느 p개의 아미노기 또는 티올기를 통하여 X에 결합하고 있고,
X는, 펩티드 링커 또는 결합이며,
S1은, 스페이서 또는 결합이며,
Y는, 배위자이며, 그리고,
p는, 1 내지 25의 자연수이며, Fab1에 결합하고 있는 (Y-S1-X)의 수를 나타내고,
단, X가 결합일 때는, S1이 -CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)- 또는 결합이며, 또한, Y는 하기 식
로 표시되는 기이다.]
로 표시되는 복합체이다.
항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트(Fab1)
상기 식 (I)에 있어서 「Fab1」로 나타나는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트에 대하여 설명한다.
항체 분자의 기본 구조는, 각 클래스 공통으로, 분자량 5만 내지 7만의 중쇄와 2 내지 3만의 경쇄로 구성된다. 중쇄는, 통상적으로 약 440개의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드쇄로 이루어지며, 클래스마다 특징적인 구조를 갖고, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE에 대응하여 γ, μ, α, δ, ε쇄라고 불린다. 또한 IgG에는, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4가 존재하고, 각각 γ1, γ2, γ3, γ4라고 불리고 있다. 경쇄는, 통상적으로 약 220개의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드쇄로 이루어지며, L형과 K형의 2종이 알려져 있고, 각각 λ, κ쇄라고 불린다. 항체 분자의 기본 구조의 펩티드 구성은, 각각 상동인 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄가, 디술피드 결합(S-S 결합) 및 비공유 결합에 의해 결합되고, 분자량 15만 내지 19만이다. 2종의 경쇄는, 어느 중쇄와도 쌍을 이룰 수 있다. 개개의 항체 분자는, 항상 동일한 경쇄 2개와 동일한 중쇄 2개로 이루어질 수 있다.
쇄 내 S-S 결합은, 중쇄에 4개(μ, ε쇄에는 5개), 경쇄에는 2개 있고, 아미노산 100 내지 110 잔기마다 하나의 루프를 이루고, 이 입체 구조는 각 루프 간에 유사하고, 구조 단위 혹은 도메인이라고 불린다. 중쇄, 경쇄 모두 N 말단에 위치하는 도메인은, 동종 동물의 동일 클래스(서브클래스)로부터의 표품이어도, 그 아미노산 서열이 일정하지 않아, 가변 영역이라고 불리며, 각 도메인은, 각각, 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)이라고 불리고 있다. 이것으로부터 C 말단측의 아미노산 서열은, 각 클래스 혹은 서브클래스마다 거의 일정하여 정상 영역이라고 불리며, 각 도메인은, 각각, CH1, CH2, CH3 혹은 CL로 표시된다.
항체와 항원의 결합의 특이성은, VH 및 VL에 의해 구성되는 부분의 아미노산 서열에 의한다. 한편, 보체나 각종 세포와의 결합과 같은 생물학적 활성은 각 클래스 Ig의 정상 영역의 구조의 차를 반영하고 있다. 중쇄와 경쇄의 가변 영역의 가변성은, 어느 쇄에든 존재하는 3개의 작은 초가변 영역에 거의 한정됨을 알고 있으며, 이들 영역을 상보성 결정 영역(CDR; 각각 N 말단측으로부터 CDR1, CDR2, CDR3)이라고 부르고 있다. 가변 영역의 나머지 부분은 프레임워크 영역(FR)이라고 불리고, 비교적 일정하다.
항체의 중쇄 정상 영역의 CH1 도메인과 CH2 도메인 사이에 있는 영역은 힌지 영역이라고 불리고, 이 영역은, 프롤린 잔기를 많이 포함하고, 2개의 중쇄를 연결하는 복수의 쇄 간 S-S 결합을 포함한다. 예를 들어, 인간의 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 각 힌지 영역에는, 중쇄 간의 S-S 결합을 구성하고 있는, 각각, 2개, 4개, 11개, 2개의 시스테인 잔기를 포함한다. 힌지 영역은, 파파인이나 펩신 등의 단백질 분해 효소에 대한 감수성이 높은 영역이다. 항체를 파파인으로 소화한 경우, 힌지 영역의 중쇄 간 S-S 결합보다도 N 말단측의 위치에서 중쇄가 절단되어, 2개의 Fab 프래그먼트와 1개의 Fc 프래그먼트로 분해된다. Fab 프래그먼트는, 경쇄와, 중쇄 가변 영역(VH), CH1 도메인과 힌지 영역의 일부를 포함하는 중쇄 프래그먼트로 구성된다. Fab 프래그먼트는 가변 영역을 포함하고, 항원 결합 활성을 갖는다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트는, 이하의 특징을 갖는 Fab 프래그먼트이다:
서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 112까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트.
본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 정상 영역으로서는, Igγ1, Igγ2, Igγ3 또는 Igγ4 등 중 어느 정상 영역이든 선택 가능하다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 정상 영역은, 인간 Igγ1 정상 영역이다.
본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄 정상 영역으로서는, Igλ 또는 Igκ 중의 어느 정상 영역이든 선택 가능하다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄 정상 영역은, 인간 Igκ 정상 영역이다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트는, 이하의 Fab2 프래그먼트이다:
서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트(Fab2라고도 함).
Fab 프래그먼트를 포함하고, 항체를 세포에서 발현시키는 경우, 항체가 번역 후에 수식을 받는 것이 알려져 있다. 번역 후 수식의 예로서는, 중쇄 C 말단의 리신의 카르복시펩티다아제에 의한 절단, 중쇄 및 경쇄 N 말단의 글루타민 또는 글루탐산의 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 수식, 글리코실화, 산화, 탈아미드화, 당화 등을 들 수 있고, 여러가지 항체에 있어서, 이러한 번역 후 수식이 발생하는 것이 알려져 있다(J.Pharm.Sci.; 2008; 97: 2426-2447).
본 발명의 복합체에 포함되는 항CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트에는, 번역 후 수식에 의해 발생한 Fab 프래그먼트도 포함될 수 있다. 번역 후 수식에 의해 발생할 수 있는 본 발명의 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 예로서는, 중쇄 N 말단이 피로글루타밀화된 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트를 들 수 있다. 이러한 N 말단의 피로글루타밀화에 의한 번역 후 수식은, 항체의 활성에 영향을 미치는 것은 아님은 당해 분야에서 알려져 있다(Anal.Biochem.; 2006; 348: 24-39).
하나의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트는, 하기 특징을 갖는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트이다:
서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역이며, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1의 글루탐산이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 112까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트.
어떤 실시 형태에 있어서, 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트는, 하기 특징을 갖는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트이다:
서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1의 글루탐산이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트.
다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 복합체에 포함되는 항CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트는, 하기 특징을 갖는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트이다:
서열 번호 2의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 50부터 66까지의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 99부터 110까지의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 그리고, 서열 번호 4의 아미노산 번호 24부터 38까지의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 번호 54부터 60까지의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 93부터 101까지의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트.
본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트는, 인간 CEACAM5에 결합한다. 얻어진 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 인간 CEACAM5에 대한 결합 활성을 측정하는 방법으로서는, 표면 플라스몬 공명(Surface Plasmon Resonance; SPR)법에 의한 해석이나 ELISA 등의 방법이 있다. 예를 들어, SPR법에 의한 해석을 사용하는 경우, Biacore T200(GE 헬스케어 재팬사)을 사용하여, 센서 칩에 Biotin CAPture Kit(GE 헬스케어 재팬사)와 비오틴화한 인간 CEACAM5를 고상화하고, 단계 희석한 Fab 프래그먼트를 첨가함으로써 결합 속도 상수(ka), 해리 속도 상수(kd), 및 해리 상수(KD)를 측정할 수 있다.
본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트는, 본 명세서에 개시되는, 본 발명의 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트 및 경쇄의 서열 정보에 기초하여, 당해 분야에서 공지된 방법을 사용하여, 당업자에 의해 용이하게 제작될 수 있다. 본 발명의 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 후술하는 <본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 생산 방법>에 기재된 방법에 따라서 생산할 수 있다.
1-2. 배위자에 대해서
「배위자」란, 복합체에 있어서, 금속과 킬레이트 착체를 형성할 수 있는 부분이며, 킬레이트제로 구성되는 기를 의미한다. 구성되는 기란, 킬레이트제로부터 프로톤이 제거되어서, 결합손을 갖는 기이다. 당해 킬레이트제로 구성되는 기는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트와 직접, 혹은, 스페이서 및/또는 펩티드 링커를 통하여 결합하는 것이다.
「킬레이트제」란, 금속과 배위 결합할 수 있는 화합물을 말한다. 본 명세서에 있어서의 「킬레이트제」로서는, 사이드로포어와, 비사이드로포어를 들 수 있다. 사이드로포어로서는, 히드록삼산형, 카테콜형 또는 혼합 배위자형을 들 수 있다. 히드록삼산형 사이드로포어로서는, 예를 들어, 페리크롬, 하기 식:
으로 표시되는 데페록사민(DFO), 푸사리닌 C, 오르니박틴, 로도토룰산을 들 수 있다. 카테콜형 사이드로포어로서는, 예를 들어, 엔테로박틴, 바실리박틴, 비브리오박틴을 들 수 있다. 혼합 배위자형 사이드로포어로서는, 예를 들어, 아조토박틴, 파이오베르딘, 예르시니아박틴을 들 수 있다. 또한, 상기 사이드로포어의 경우, DFO는 그 반응성 관능기인 -NH2를 통하여 스페이서 또는 펩티드 링커와 반응시킬 수 있고, DFO 이외의 사이드로포어의 경우에는, 카르복실기, 수산기, 아미노기 등의 반응성 관능기를 통하여, 당업자가 통상적으로 사용하는 방법으로 스페이서 또는 펩티드 링커와 반응시킬 수도 있다.
비사이드로포어로서는, 예를 들어, 하기 식:
으로 표시되는 DOTA(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산, CAS 번호: 60239-18-1), DTPA(디에틸렌트리아민오아세트산, CAS 번호: 67-43-6), DTPA-BMA(1,7-비스(메틸카르바모일메틸)-1,4,7-트리아자헵탄-1,4,7-삼아세트산, CAS 번호: 119895-95-3), EOB-DTPA(N-[(2S)-2-[비스(카르복시메틸)아미노]-3-(4-에톡시페닐)프로필]-N-[2-[비스(카르복시메틸)아미노]에틸]글리신, CAS 번호: 158599-72-5), TTHA(트리에틸렌테트라민육아세트산, CAS 번호: 869-52-3), DO3A(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7-삼아세트산, CAS 번호: 217973-03-0), HP-DO3A(10-(2-히드록시프로필)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7-삼아세트산, CAS 번호: 120041-08-9), 및 이들의 공지된 반응성 유도체를 들 수 있다.
DOTA는 그 반응성 관능기인 카르복실산의 하나를 통하여 스페이서 또는 펩티드 링커와 반응시킬 수 있다(이하, 이렇게 결합한 3개의 카르복실산을 갖는 DOTA를 3arm DOTA라고 기재하는 경우가 있다(PLoS One. 2019 Mar 22; 14(3): e0213397).).
DOTA 중, 3arm DOTA로서, 예를 들어 이하의 것을 들 수 있다.
혹은 하기 식의 시약 p-SCN-Bn-DOTA를 사용하여 4개의 카르복실산을 유지한 DOTA(이하, 4arm-DOTA라고 기재하는 경우가 있다)로서, 스페이서 또는 펩티드 링커와 반응시킬 수도 있다.
본 발명의 복합체에 포함되는 배위자를 형성하는 「킬레이트제」의 어떤 양태로서는, DFO, DOTA, DTPA, DTPA-BMA, EOB-DTPA, DO3A, HP-DO3A를 들 수 있다. 어떤 양태로서는, DFO, DOTA를 들 수 있다.
또한, 본 명세서 중의 화합물 및 복합체는, 특별히 기재가 없는 한 프리체 및 그의 염도 포함한다. 여기에 「그의 염」이란, 그의 화합물 및 복합체의 치환기의 종류에 따라, 산부가염 또는 염기와의 염을 형성하는 경우가 있고, 그의 화합물 및 복합체를 형성할 수 있는 염이다. 구체적으로는, 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산, 질산, 인산 등의 무기산이나, 포름산, 아세트산, 프로피온산, 옥살산, 말론산, 숙신산, 푸마르산, 말레산, 락트산, 말산, 만델산, 타르타르산, 디벤조일타르타르산, 디톨루오일타르타르산, 시트르산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산, 아스파르트산, 글루탐산 등의 유기산과의 산부가염, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘, 알루미늄 등의 무기 염기, 메틸아민, 에틸아민, 에탄올아민, 리신, 오르니틴 등의 유기 염기와의 염, 아세틸류신 등의 각종 아미노산 및 아미노산 유도체와의 염이나 암모늄염 등을 들 수 있다. 예를 들어, DFO는, 데페록사민메탄술폰산염으로서도 존재하고, 다른 염으로서도 존재한다. DTPA는, 프리체와 함께 DTPA 나트륨염으로서도 존재한다.
금속을 포함하는 본 발명의 복합체는, 각종 조영제 및/또는 암의 치료제에 사용할 수 있고, 예를 들어, MRI 조영제, PET 트레이서에 사용되는 약제 등에 사용된다.
MRI 조영제에 사용하는 경우의 「킬레이트제」의 어떤 양태로서는, 상기 사이드로포어 및 비사이드로포어 킬레이트제이다.
PET 트레이서에 사용하는 경우의 「킬레이트제」의 어떤 양태로서는, 상기 사이드로포어 및 비사이드로포어 킬레이트제이며, 어떤 양태로서는, DFO 또는 DOTA이다.
본 발명의 복합체에 있어서, 킬레이트제는 금속을 포함하고 있어도 된다. 본 명세서에 있어서, 「금속」은, 상자성 금속 이온 또는 금속 방사성 동위 원소를 의미한다. 금속으로서는, 각 킬레이트제에 배위 결합하는 금속이면 특별히 제한은 없다. 복합체의 사용 목적에 따라, 적절한 킬레이트제와 금속의 조합이 선택된다.
상자성 금속 이온은 MRI 조영제에 적합하게 사용된다. 상자성 금속 이온의 양태로서는, Fe2+, Fe3+, Cu2+, Ni2+, Rh2+, Co2+, Gd3+, Eu3+, Dy3+, Tb3+, Pm3+, Nd3+, Tm3+, Ce3+, Y3+, Ho3+, Er3+, La3+, Yb3+, Mn3+, 또는 Mn2+를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 어떤 양태로서는, Gd3+, Mn3+, Mn2+, Fe2+, 또는 Fe3+를 들 수 있다. 어떤 양태로서는, Gd3+를 들 수 있다. 어떤 양태로서는, Mn3+ 또는 Mn2+를 들 수 있다. 이 경우, 복합체에는 카운터 음이온으로서 할로겐 등을 사용할 수 있다. 또한, 카운터 음이온은 배위자의 C(=O)O-여도 되고, 또한 복합체는, Na+ 등의 카운터 양이온을 갖고 있어도 된다.
금속 방사성 동위 원소는 PET 트레이서 등에 사용된다. 금속 방사성 동위 원소의 어떤 양태로서는, 89Zr, 52Mn, 52Fe, 64Cu, 67Ga, 68Ga, 72As, 90Y, 99mTc, 111In 또는 177Lu를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. PET 트레이서나 SPECT 트레이서 등에 사용되는 금속 방사성 동위 원소의 어떤 양태로서는, 89Zr, 64Cu, 67Ga, 68Ga, 99mTc, 또는 111In을 들 수 있다. 어떤 양태로서는, 지르코늄(Zr)의 방사 동위체를 들 수 있다. 어떤 양태로서는 89Zr을 들 수 있다. 암의 치료에 사용되는 금속 방사성 동위 원소의 어떤 양태로서는, 90Y 또는 177Lu를 들 수 있다.
본 발명의 복합체의 어떤 양태로서는, Y가 89Zr이 배위 결합하고 있는 DFO인 복합체이다. 다른 양태로서는, Y가 90Y, 67Ga, 68Ga 및 177Lu를 포함하는 금속 방사성 동위 원소가 배위 결합하고 있는 DOTA인 복합체이다. 또다른 양태로서는, Y가 Gd3+ 및 Y3+를 포함하는 상자성 금속 이온이 배위 결합하고 있는 DOTA인 복합체이다. 또다른 양태로서는, Y가 Gd3+이 배위 결합하고 있는 DOTA인 복합체이다.
1-3. 펩티드 링커 또는 결합
본 발명의 복합체는, 배위자(Y) 또는 스페이서(S1)와 Fab1이, 직접 결합(즉, X가 결합)하고 있어도 되고, 혹은 펩티드 링커(즉, X가 펩티드 링커)를 통하여 결합하고 있어도 된다.
본 명세서에 있어서 「펩티드 링커」란, 2 내지 4개의 아미노산을 포함하는 펩티드를 포함하는 링커이며, 원한다면 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트와의 결합에 적합한 어태치먼트 Z1 내지 Z3 등을 갖고 있어도 된다. 여기에, 펩티드 링커에 포함되는 펩티드로서는, 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 글리신(Gly), 리신(Lys), 메티오닌(Met), 이소류신(Ile), 페닐알라닌(Phe), 발린(Val), 티로신(Tyr), 아르기닌(Arg), 알라닌(Ala), 글루타민(Gln), 글루탐산(Glu), 아스파라긴(Asn), 아스파르트산(Asp), 히스티딘(His) 및 류신(Leu), 3-(2-나프틸)알라닌, 및 디페닐알라닌으로 이루어지는 군에서 각각 선택되는, 2 내지 4개의 아미노산을 포함하는 펩티드, 보다 바람직하게는 글리신, 리신, 메티오닌, 이소류신, 페닐알라닌, 발린, 티로신, 아스파르트산, 아르기닌, 3-(2-나프틸)알라닌, 및 디페닐알라닌으로 이루어지는 군에서 각각 선택되는 2 내지 4개의 아미노산을 포함하는 펩티드이다. 또한, 특별히 언급하지 않는 한 글리신 이외의 아미노산 잔기의 입체는 L-체로 한다.
펩티드 링커의 어떤 양태로서는, 신장 쇄자 연막 효소 또는 리소좀 효소로 절단되는 아미노산 서열을 갖는, 2 내지 4개의 아미노산을 포함하는 펩티드를 포함하고, 또한 당해 펩티드 링커와 생물 분자나 항체 Fab 프래그먼트 사이를 개재하는 어태치먼트를 갖고 있어도 되는 펩티드 링커이다. 신장 쇄자 연막 효소 또는 리소좀 효소로 절단되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 링커는, 신장에 존재하는 이들 효소에 의해 특이적으로 절단되기 때문에, 표지부의 신장에의 집적이 저감되어, 신장의 피폭이나 신장 장애의 우려의 저감이 기대할 수 있음이 보고되어 있다. 예를 들어, Adv Drug Deliv Rev. 2008 Sep; 60(12): 1319-28., Bioconjug Chem. 2005 Nov-Dec; 16(6): 1610-6., 및 Cancer Res. 1999 Jan 1; 59(1): 128-34.에는, 글리신-리신 링커가 신장에 존재하는 신장 쇄자 연막 효소에 의해 특이적으로 절단되는 것이 기재되어 있다. 일본 특허 제6164556호 공보에는, 글리신-페닐알라닌-리신 링커가 신장에서 신장 쇄자 연막 효소에 의해 특이적으로 절단되는 것이 기재되어 있고, 또한, Bioconjug Chem. 2002 Sep-Oct; 13(5): 985-95.에는, 글리신-류신-글리신-리신 서열을 포함하는 링커가, 또한, Bioconjug Chem. 2013 Feb 20; 24(2): 291-9.에는 글리신-티로신 링커가, 신장 쇄자 연막 효소에 의해 특이적으로 절단되는 것이 기재되어 있다. 또한, Bioconjug Chem. 2014 Nov 19; 25(11): 2038-45.에는, 메티오닌-이소류신 서열을 포함하는 링커가, 신장에 존재하는 리소좀 효소에 의해 특이적으로 절단되는 것이 기재되어 있다. 펩티드 링커의 어떤 양태로서는, 메티오닌-이소류신, 글리신-리신, 글리신-페닐알라닌-리신, 메티오닌-발린-리신, 글리신-티로신, 글리신-리신-리신, 및 글리신-아르기닌-리신, 아스파르트산-글리신-리신, 메티오닌-글리신-리신, 메티오닌-이소류신-리신, 글리신-티로신-리신, 글리신-발린, 글리신-이소류신, 메티오닌-페닐알라닌-리신, 글리신-(3-(2-나프틸)알라닌)-리신, 및 글리신-디페닐알라닌-리신으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 링커이다. 어떤 양태로서는, 메티오닌-이소류신 아스파르트산-글리신-리신, 글리신-페닐알라닌-리신, 메티오닌-글리신-리신, 글리신-리신, 및 글리신-(3-(2-나프틸)알라닌)-리신으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 링커이다.
「펩티드 링커」는, 임의로 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트와의 결합에 적합한 어태치먼트를 갖고 있어도 되고, 여기에, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트와의 결합에 적합한 어태치먼트란, 펩티드 링커부와 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 아미노기 또는 티올기 간을 유기 화학적으로 결합시키는 기이며, 어떤 양태로서는, 말단에 말레이미드 유래의 기(예를 들어, 하기 식 (II-I) 또는 (II-II)로 표시되는 기) 또는 이소티오시아네이트 유래의 기(-NH-C(=S)-)를 포함하는 기이다. 어떤 양태로서는, -NH-(CH2)2-Z1-, -CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-, -C(=S)-NH-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-, 또는 -NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-이며, 여기서 Z1은 하기 식 (II-I) 또는 (II-II)로 표시된다. 또한, 하기 식 (II-I)을 -Z1(#N)-, 하기 식 (II-II)를 -Z1(#S)-라고 기재하는 경우가 있다.
어태치먼트는 펩티드 말단의 아미노산의 아미노기 또는 카르복실기와, 혹은, 아미노산의 측쇄 중의 아미노기(예를 들어 리신)나 수산기(예를 들어 티로신)와 결합하여 펩티드 링커를 형성하고 있다. 펩티드 말단의 아미노산의 측쇄 중의 관능기에 어태치먼트가 결합하여 펩티드 링커를 형성한 예로서는, 예를 들어, Lys와 일체로 된 어태치먼트로서 하기 식 (III-I) 또는 (III-II)로 표시되는 기를 들 수 있고, 본 명세서에 있어서는 이들 2개를 합쳐서 -Lys*-Z2-로 기재한다. 하기 식 (III-I)을 -Lys*-Z2(#N)-, 하기 식 (III-II)를 -Lys*-Z2(#S)-라고 기재하는 경우가 있다. 하기 식 (III-III)을 -Lys*-Z3―으로 기재하는 경우가 있다.
또한, 본 명세서 중에서는, 마찬가지로 말단 아미노산의 측쇄 중의 관능기와 어태치먼트가 결합한 구조를 갖는 하기 식 (IV)로 표시되는 기를 -Tyr*-CH2-, 하기 식 (V)로 표시되는 기를 -Lys*-C(=S)-로, 각각 기재한다.
「X」의 펩티드 링커의 어떤 양태로서는, 어태치먼트를 포함하는 펩티드 링커이다. 어떤 양태로서는,
(1) -Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(2) -Gly-Lys*-Z2-,
(3) -Gly-Phe-Lys*-Z2-,
(4) -Met-Val-Lys*-Z2-,
(5) -Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-,
(6) -Gly-Lys-Lys*-Z2-,
(7) -Gly-Arg-Lys*-Z2-,
(8) -Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-,
(9) -Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-,
(10) -Asp-Gly-Lys*-Z2-,
(11) -Met-Gly-Lys*-Z2-,
(12) -Met-Ile-Lys*-Z2-,
(13) -Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-Lys*-Z2-,
(14) -Val-NH-(CH2)2-Z1-,
(15) -Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(16) -Gly-Val-NH-(CH2)2-Z1-,
(17) -Gly-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(18) -Met-Phe-Lys*-Z2-,
(19) -Gly-Tyr-Lys*-Z2-,
(20) -Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-,
(21) -Gly-(3-(2-나프틸)알라닌)-Lys*-Z2-,
(22) -Gly-디페닐알라닌-Lys*-Z2-,
(23) -Gly-Tyr-NH-(CH2)5-Z1-,
(24) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-,
(25) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-,
(26) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-,
(27) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)- 및
(28) -Met-Gly-Lys*-Z3-으로 이루어지는 군에서 선택되는 펩티드 링커이다.
또한 「X」의 펩티드 링커의 어떤 양태로서는,
(1) -Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(2) -Gly-Lys*-Z2-,
(3) -Gly-Phe-Lys*-Z2-,
(4) -Met-Val-Lys*-Z2-,
(5) -Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-,
(6) -Gly-Lys-Lys*-Z2-,
(7) -Gly-Arg-Lys*-Z2-,
(8) -Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-, 및
(9) -Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-로 이루어지는 군에서 선택되는 펩티드 링커이다.
어떤 양태로서는,
(1) -Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(2) -Gly-Lys*-Z2-,
(3) -Gly-Phe-Lys*-Z2-,
(10) -Asp-Gly-Lys*-Z2-,
(11) -Met-Gly-Lys*-Z2-,
(21) -Gly-(3-(2-나프틸)알라닌)-Lys*-Z2-,
(24) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-,
(25) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-,
(26) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-,
(27) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)- 및
(28) -Met-Gly-Lys*-Z3-으로 이루어지는 군에서 선택되는 펩티드 링커이다.
「X」의 펩티드 링커의 어떤 양태로서는,
(1) -Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(2) -Gly-Lys*-Z2-,
(3) -Gly-Phe-Lys*-Z2-,
(4) -Met-Val-Lys*-Z2-,
(5) -Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-,
(7) -Gly-Arg-Lys*-Z2-,
(8) -Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-,
(9) -Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-,
(10) -Asp-Gly-Lys*-Z2-,
(11) -Met-Gly-Lys*-Z2-,
(12) -Met-Ile-Lys*-Z2-,
(13) -Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-Lys*-Z2-,
(14) -Val-NH-(CH2)2-Z1-,
(15) -Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(16) -Gly-Val-NH-(CH2)2-Z1-,
(17) -Gly-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(18) -Met-Phe-Lys*-Z2-,
(19) -Gly-Tyr-Lys*-Z2-,
(20) -Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-,
(21) -Gly-(3-(2-나프틸)알라닌)-Lys*-Z2-,
(22) -Gly-디페닐알라닌-Lys*-Z2-,
(23) -Gly-Tyr-NH-(CH2)5-Z1-,
(24) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-,
(25) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-,
(26) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-,
(27) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)- 및
(28) -Met-Gly-Lys*-Z3-으로 이루어지는 군에서 선택되는 펩티드 링커이다.
「X」의 펩티드 링커의 어떤 양태로서는,
(1) -Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(2) -Gly-Lys*-Z2-,
(3) -Gly-Phe-Lys*-Z2-,
(5) -Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-,
(6) -Gly-Lys-Lys*-Z2-,
(7) -Gly-Arg-Lys*-Z2-, 및
(8) -Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-로 이루어지는 군에서 선택되는 펩티드 링커이다.
「X」의 펩티드 링커의 어떤 양태로서는,
(2) -Gly-Lys*-Z2-,
(3) -Gly-Phe-Lys*-Z2-,
(10) -Asp-Gly-Lys*-Z2-,
(11) -Met-Gly-Lys*-Z2-, 및
(21) -Gly-(3-(2-나프틸)알라닌)-Lys*-Z2-로 이루어지는 군에서 선택되는 펩티드 링커이다.
「X」의 펩티드 링커의 어떤 양태로서는,
(1) -Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(2) -Gly-Lys*-Z2-,
(3) -Gly-Phe-Lys*-Z2-,
(5) -Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-,
(6) -Gly-Lys-Lys*-Z2-, 및
(8) -Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-
로 이루어지는 군에서 선택되는 펩티드 링커이다.
「X」의 펩티드 링커의 어떤 양태로서는,
(1) -Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(2) -Gly-Lys*-Z2-,
(3) -Gly-Phe-Lys*-Z2-,
(5) -Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-,
(6) -Gly-Lys-Lys*-Z2-,
(8) -Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-,
(24) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-,
(25) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-,
(26) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-,
(27) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)- 및
(28) -Met-Gly-Lys*-Z3-으로 이루어지는 군에서 선택되는 펩티드 링커이다.
「X」의 펩티드 링커의 어떤 양태로서는,
(1) -Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(2) -Gly-Lys*-Z2-,
(3) -Gly-Phe-Lys*-Z2-,
(9) -Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-,
(10) -Asp-Gly-Lys*-Z2-,
(11) -Met-Gly-Lys*-Z2-,
(12) -Met-Ile-Lys*-Z2-,
(21) -Gly-(3-(2-나프틸)알라닌)-Lys*-Z2- 및
(24) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-,
(25) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-,
(26) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-,
(27) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)- 및
(28) -Met-Gly-Lys*-Z3-으로 이루어지는 군에서 선택되는 펩티드 링커이다.
「X」의 펩티드 링커의 어떤 양태로서는,
(1) -Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(4) -Met-Val-Lys*-Z2-,
(9) -Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-,
(11) -Met-Gly-Lys*-Z2-,
(12) -Met-Ile-Lys*-Z2-,
(18) -Met-Phe-Lys*-Z2-,
(24) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-,
(25) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-,
(26) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-,
(27) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)- 및
(28) -Met-Gly-Lys*-Z3-
로 이루어지는 군에서 선택되는 펩티드 링커이다.
「X」의 펩티드 링커의 어떤 양태로서는,
(1) -Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(9) -Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-,
(12) -Met-Ile-Lys*-Z2-,
(24) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-,
(25) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-,
(26) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-, 및
(27) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-,
로 이루어지는 군에서 선택되는 펩티드 링커이다.
「X」의 펩티드 링커의 어떤 양태로서는,
(4) -Met-Val-Lys*-Z2-,
(11) -Met-Gly-Lys*-Z2-,
(18) -Met-Phe-Lys*-Z2-, 및
(28) -Met-Gly-Lys*-Z3-
로 이루어지는 군에서 선택되는 펩티드 링커이다.
「X」의 펩티드 링커의 어떤 양태로서는,
(11) -Met-Gly-Lys*-Z2-, 및
(28) -Met-Gly-Lys*-Z3-으로 이루어지는 군에서 선택되는 펩티드 링커이다.
1-4. 스페이서 또는 결합(S1)
본 발명의 복합체는, 배위자(Y)와 펩티드 링커(X)가 직접 결합(즉, S1은 결합)하거나 또는 스페이서(즉, S1은 스페이서)를 통하여 결합하고 있다.
본 명세서에 있어서 S1의 「스페이서」는, 배위자와, 펩티드 링커 또는 Fab1 간에 일정한 거리를 만들기 위해서, 혹은, 배위자와, 펩티드 링커의 결합을 위해서 도입하는 기이며, 어떤 양태로서는, -C(=O)-CH2O-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2O)4-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, -C(=O)-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, -NH-CH2-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, -NH-(CH2)2-C(=O)-, -CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-, -NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, -NH-CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=O)-, -NH-(CH2)3-C(=O)-, -NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-, -NH-CH2-(1,4-페닐렌)-C(=O)-, -CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-NH-CH2-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, -CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, 하기 식 (a) 내지 (q)로 표시되는 스페이서 등을 들 수 있다.
어떤 양태로서는, S1은 -C(=O)-CH2O-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2O)4-(1,3-페닐렌)-C(=O)- 또는 -C(=O)-(1,3-페닐렌)-C(=O)-이다. 어떤 양태로서는, S1은, -NH-CH2-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, -NH-(CH2)2-C(=O)-, -CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-, -NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, -NH-CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=O)-, -NH-(CH2)3-C(=O)-, -NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-, -NH-CH2-(1,4-페닐렌)-C(=O)-, -CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-NH-CH2-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, -CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-페닐렌)-C(=O)- 또는 상기 식 (a) 내지 (q)로 표시되는 스페이서이다. 어떤 양태로서는, S1은, -NH-CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=O)-, 상기 식 (g), (i), (k)로 표시되는 스페이서이다.
어떤 양태로서는, S1이 -C(=O)-CH2O-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2O)4-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, -NH-CH2-(1,3-페닐렌)-C(=O)-, -NH-CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=O)-, -NH-CH2-(1,4-페닐렌)-C(=O)-, -C(=O)-(1,3-페닐렌)-C(=O)-이거나 또는 하기 식
이다.
어떤 양태로서는, S1은, 결합이다.
또한, 본 발명의 Y가 DOTA인 복합체는, DOTA와 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트(Fab1)가 직접 결합 또는 스페이서(-CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-)를 통하여 결합하고 있어도 된다. 단, DOTA와 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트(Fab1)가 스페이서인 -CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=S)-을 통하여 결합한 복합체는, 하기 식 (VI)로 표시되는 복합체이다.
또한, 본원 명세서에 기재된 S1의 스페이서에는 신규의 스페이서, 상기 식 (g) 및 (l)로 표시되는 스페이서가 포함되어 있고, 이들은, 특히, DOTA에, 신장 쇄자 연막 효소 또는 리소좀 효소로 절단되는 아미노산 서열을 갖는, 2 내지 4개의 아미노산을 포함하는 펩티드를 포함하는 펩티드 링커와 결합하는 경우의 스페이서로서 유용하다. 후기 실시예 4의 신장의 집적성 평가 시험에 나타내는 바와 같이, DOTA와 상기 식 (g)로 표시되는 스페이서에 효소로 절단되는 펩티드 링커를 조합한 복합체에 있어서, 표지부의 신장에의 집적성 저감이 확인되어 있다. 어떤 양태로서는, S1은 상기 식 (g) 및 (l)로 표시되는 스페이서이다.
본 발명의 복합체의 어떤 양태로서는, Y가 DOTA이며, S1이 식 (g) 및 (l)로 표시되는 스페이서이며, 또한, X가, 신장 쇄자 연막 효소 또는 리소좀 효소로 절단되는 아미노산 서열을 갖는, 2 내지 4개의 아미노산을 포함하는 펩티드를 포함하는, 펩티드 링커인 복합체이다.
어떤 양태로서는, Y가 DOTA이며, S1이 식 (g) 및 (l)로 표시되는 스페이서이며, 또한, X가
(2) -Gly-Lys*-Z2-,
(3) -Gly-Phe-Lys*-Z2-,
(10) -Asp-Gly-Lys*-Z2-,
(11) -Met-Gly-Lys*-Z2-, 및
(21) -Gly-(3-(2-나프틸)알라닌)-Lys*-Z2-로 이루어지는 군에서 선택되는 펩티드 링커인 복합체이다.
어떤 양태로서는, Y가 DOTA이며, S1이 -NH-CH2-(1,4-페닐렌)-NH-C(=O)-, 상기 식 (g), (i), (k)로 표시되는 스페이서이며, 또한 X가
(1) -Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(11) -Met-Gly-Lys*-Z2-,
(12) -Met-Ile-Lys*-Z2-,
(24) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-,
(25) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-,
(26) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-,
(27) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-, 및
(28) -Met-Gly-Lys*-Z3-으로 이루어지는 군에서 선택되는 펩티드 링커이다.
어떤 양태로서는, Y가 DOTA이며, S1이 식 (g)로 표시되는 스페이서이며, 또한 X가,
(11) -Met-Gly-Lys*-Z2-, 및
(28) -Met-Gly-Lys*-Z3-으로 이루어지는 군에서 선택되는 펩티드 링커이다.
본 발명의 복합체는, 상기 양태의 조합을 포함한다.
본 발명의 복합체의 구체적인 양태는 이하와 같다.
식 중, Fab2는, 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 Fab 프래그먼트이다.
p는, 1 내지 25의 자연수이다. Fab2가 해당 Fab2 중에 어느 p개의 아미노기 또는 티올기를 통하여, 인접하는 탄소 원자에 결합하고 있다.
또한, Y가 DOTA이며, S1이 식 (g) 및 (l)로 표시되는 스페이서이며, 또한, X가 신장 쇄자 연막 효소 또는 리소좀 효소로 절단되는 아미노산 서열을 갖는, 2 내지 4개의 아미노산을 포함하는 펩티드를 포함하는 펩티드 링커인 조합의 표지부는, 본 발명의 Fab1과의 조합에 한하지 않고, 각종 Fab 항체를 사용한 같은 복합체에 있어서의, 신장 독성 등의 저감이 기대되는 표지부로서 유용하고, 본 발명에는 당해 표지부 자체의 발명도 포함된다.
본 발명의 복합체 제조에 있어서, 항CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트와, 배위자, 스페이서 및/또는 펩티드 링커의 결합, 및 배위자와 스페이서 및/또는 펩티드 링커의 결합은, 공지된 방법에 의해, 당업자가 적절히 행할 수 있다.
본 명세서에서 「표지부」란, 예를 들어 식 (I)에 있어서는, Fab1 이외의 부분을, 식 (Ia) 또는 (Ib)에서는, Biomolecule1 또는 Biomolecule2 이외의 부분을 의미한다. (i) 배위자 및 펩티드 링커(Y-S1-X: 단, S1이 결합이며, X가 펩티드 링커이다.), (ii) 배위자(Y-S1-X: 단, S1 및 X가 각각 결합이다.), 또는 (iii) 배위자, 스페이서 및 펩티드 링커(Y-S1-X: 단, S1이 스페이서이며, X가 펩티드 링커이다.)이다. 어떤 양태로서는, (ii) 배위자를 들 수 있다. 어떤 양태로서는, (i) 배위자 및 펩티드 링커, 또는 (iii) 배위자, 스페이서 및 펩티드 링커를 들 수 있다. 여기에, 「표지부」의 배위자는 추가로 금속을 포함하고 있어도 되고, 어떤 양태로서는, 금속을 포함하는 (i) 배위자 및 펩티드 링커, (ii) 배위자, 또는 (iii) 배위자, 스페이서 및 펩티드 링커이며, 바꾸어 말하면, (i) 금속과 킬레이트 착체를 형성한 배위자 및 펩티드 링커, (ii) 금속과 킬레이트 착체를 형성한 배위자, 또는 (iii) 금속과 킬레이트 착체를 형성한 배위자, 스페이서 및 펩티드 링커이다. 또한 (iv) 상기 펩티드 링커에 추가로 스페이서를 포함한 펩티드 링커의 경우가 있다. 또한 식 (Ia) 또는 (Ib)에 있어서는, Biomolecule1 또는 Biomolecule2 이외의 부분을 의미한다.
1-5. 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트(Fab1)에 대한 표지부(Y-S1-X)의 결합수(p) 및 식 (Ia) 또는 (Ib)의 Biomolecule1 및 Biomolecule2에 대한 표지부의 결합수(p)
본 발명의 복합체는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트(Fab1) 중의 1 이상의 아미노기 또는 티올기를 통하여 1 이상의 표지부(Y-S1-X)가 결합한 복합체이다. 또한, 본 발명의 복합체는, 식 (Ia) 또는 (Ib)의 Biomolecule1 및 biomolecule2 중 1 이상의 아미노기 또는 티올기를 통하여 1 이상의 표지부가 결합한 복합체이다. 본 발명의 복합체는 결합하는 표지부의 수가 서로 상이한 복합체의 혼합물이어도 되고, 식 (I)에 있어서, Fab1에 1 내지 25의 표지부(Y-S1-X)가 결합한 복합체의 어느 것 또는 그들의 혼합물인 것을 나타낸다. 어떤 양태로서는, 본 발명의 복합체는, 하나의 Fab1에 대하여 1 내지 25의 표지부(Y-S1-X)를 포함하고, 어떤 양태로서는, 1 내지 23의 표지부(Y-S1-X)를 포함하고, 어떤 양태로서는 1 내지 15의 표지부(Y-S1-X)를 포함하고, 어떤 양태로서는 1 내지 11의 표지부(Y-S1-X)를 포함하고, 어떤 양태로서는 1 내지 9의 표지부(Y-S1-X)를 포함하고, 어떤 양태로서는 1 내지 7의 표지부(Y-S1-X)를 포함하고, 어떤 양태로서는 1 내지 5의 표지부(Y-S1-X)를 포함하고, 또한, 어떤 양태로서는 1 내지 4의 표지부(Y-S1-X)를 포함한다.
식 (Ia) 또는 (Ib)에 있어서, Biomolecule1 및 Biomolecule2는 1 내지 25의 당해 표지부가 결합한 Fab1의 어느 것 또는 그들의 혼합물인 것을 나타낸다. 어떤 양태로서는, 본 발명의 복합체는, 하나의 Biomolecule1 및 Biomolecule2에 대하여 1 내지 25의 당해 표지부를 포함하고, 어떤 양태로서는, 1 내지 23의 당해 표지부를 포함하고, 어떤 양태로서는 1 내지 15의 당해 표지부를 포함하고, 어떤 양태로서는 1 내지 11의 당해 표지부를 포함하고, 어떤 양태로서는 1 내지 9의 당해 표지부를 포함하고, 어떤 양태로서는 1 내지 7의 당해 표지부를 포함하고, 어떤 양태로서는 1 내지 5의 당해 표지부를 포함하고, 또한, 어떤 양태로서는 1 내지 4의 당해 표지부를 포함한다.
즉, 하나의 Fab1에 대한 표지부(Y-S1-X)의 결합수를 나타내는 「p」 및 하나의 Biomolecule1 및 Biomolecule2에 대한 당해 표지부의 결합수를 나타내는 「p」는, 동일하거나 또는 다르고, 어떤 양태로서는 1 내지 25의 자연수이며, 어떤 양태로서는 1 내지 23의 자연수이며, 어떤 양태로서는 1 내지 15의 자연수이며, 어떤 양태로서는 1 내지 11의 자연수이며, 어떤 양태로서는 1 내지 9의 자연수이며, 어떤 양태로서는 1 내지 7의 자연수이며, 어떤 양태로서는 1 내지 6의 자연수이며, 어떤 양태로서는 1 내지 5의 자연수이며, 어떤 양태로서는 1 내지 4의 자연수이며, 또한, 어떤 양태로서는 1 내지 3의 자연수이다.
2. 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드
본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트는, 어떤 양태에서는, 당해 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 당해 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
어떤 양태에 있어서, 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1 내지 121에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 서열 번호 4의 아미노산 번호 1 내지 112에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다.
서열 번호 2의 아미노산 번호 1 내지 121에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서는, 예를 들어, 서열 번호 1의 염기 번호 1부터 363까지의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다. 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 112까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서는, 예를 들어, 서열 번호 3의 염기 번호 1부터 336까지의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다.
서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서는, 예를 들어, 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다. 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서는, 예를 들어, 서열 번호 3에 나타나는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.
본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 당해 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트 및 경쇄의 아미노산 서열에 기초하여 디자인된 염기 서열에 기초하여, 당해 기술 분야에서 공지된 유전자 합성 방법을 이용하여 합성하는 것이 가능하다. 이러한 유전자 합성 방법으로서는, 국제 공개 제90/07861호에 기재된 항체 유전자의 합성 방법 등의 당업자에게 공지된 다양한 방법이 사용될 수 있다.
3. 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현 벡터
본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현 벡터에는, 당해 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 당해 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 그리고 당해 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 당해 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터가 포함된다.
바람직한 발현 벡터로서는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1 내지 121에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1 내지 112에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 그리고 서열 번호 2의 아미노산 번호 1 내지 121에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1 내지 112에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 들 수 있다.
바람직한 발현 벡터에는, 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 그리고 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터가 포함된다.
이들 발현 벡터는, 원핵 세포 및/또는 진핵 세포의 각종 숙주 세포 중에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 코딩되는 폴리펩티드를 산생할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 이러한 발현 벡터로서는, 예를 들어, 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스, 레트로바이러스) 등을 들 수 있고, 바람직하게는, pEE6.4나 pEE12.4(Lonza사)를 사용할 수 있다.
또한, 이들 발현 벡터는, 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 중쇄 프래그먼트 및/또는 경쇄를 코딩하는 유전자에 기능 가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 숙주 세포 중에서 Fab 프래그먼트를 발현시키기 위한 프로모터로서는, 숙주 세포가 에세리키아속균인 경우, 예를 들어, Trp 프로모터, lac 프로모터, recA 프로모터, λPL 프로모터, lpp 프로모터, tac 프로모터 등을 들 수 있다. 효모 중에서의 발현용 프로모터로서는, 예를 들어, PH05 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터를 들 수 있고, 바실러스속균에서의 발현용 프로모터로서는, SL01 프로모터, SP02 프로모터, penP 프로모터 등을 들 수 있다. 또한, 숙주가 포유 동물 세포 등의 진핵 세포일 경우, CMV, RSV, SV40 등의 바이러스 유래의 프로모터, 레트로바이러스의 프로모터, 액틴 프로모터, EF(elongation factor) 1α 프로모터, 히트 쇼크 프로모터 등을 들 수 있다.
이들 발현 벡터는, 숙주 세포로서 세균, 특히 대장균을 사용하는 경우, 개시 코돈, 종지 코돈, 터미네이터 영역 및 복제 가능 단위를 더 포함할 수 있다. 한편, 숙주로서 효모, 동물 세포 또는 곤충 세포를 사용하는 경우, 발현 벡터는, 개시 코돈, 종지 코돈을 포함할 수 있다. 또한, 이 경우, 인핸서 서열, 본 발명의 중쇄 프래그먼트 및/또는 경쇄를 코딩하는 유전자의 5'측 및 3'측의 비번역 영역, 분비 시그널 서열, 스플라이싱 접합부, 폴리아데닐레이션 부위, 또는 복제 가능 단위 등을 포함하고 있어도 된다. 또한, 목적에 따라 통상 사용되는 선택 마커(예를 들어, 테트라사이클린 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 디히드로엽산 환원 효소 유전자)를 포함하고 있어도 된다.
4. 발현 벡터로 형질 전환되는 숙주 세포
발현 벡터로 형질 전환되는 숙주 세포에는, 이하의 (a) 내지 (d)로 이루어지는 군에서 선택되는 숙주 세포가 포함된다:
(a) 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(c) 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 그리고
(d) 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
하나의 실시 형태에 있어서, 발현 벡터로 형질 전환되는 숙주 세포는, 이하의 (a) 내지 (d)로 이루어지는 군에서 선택되는, 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포이다:
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1 내지 121에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) 서열 번호 4의 아미노산 번호 1 내지 112에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(c) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1 내지 121에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1 내지 112에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 그리고
(d) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1 내지 121에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1 내지 112에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
하나의 실시 형태에 있어서, 발현 벡터로 형질 전환되는 숙주 세포는, 이하의 (a) 내지 (d)로 이루어지는 군에서 선택되는, 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포이다:
(a) 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(c) 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 그리고
(d) 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
바람직한 발현 벡터로 형질 전환되는 숙주 세포는, 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 그리고, 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포를 들 수 있다.
발현 벡터로 형질 전환되는 숙주 세포로서는, 사용하는 발현 벡터에 적합하고, 해당 발현 벡터로 형질 전환되어서, Fab 프래그먼트를 발현할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않고 본 발명의 기술 분야에 있어서 통상적으로 사용되는 천연 세포 또는 인공적으로 수립된 세포 등 여러가지의 세포(예를 들어, 세균(에세리키아속균, 바실러스속균), 효모(사카로마이세스속, 피키아속 등), 동물 세포 또는 곤충 세포(예를 들어, Sf9) 등), 포유 동물 세포주(예를 들어, CHO-K1SV 세포, CHO-DG44 세포, 293 세포 등의 배양 세포)가 예시된다. 형질 전환 자체는, 예를 들어, 인산칼슘법, 일렉트로포레이션법 등, 공지된 방법에 의해 행하여질 수 있다.
5. 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 생산 방법
본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 생산은, 상기 형질 전환된 숙주 세포를 배양하고, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트를 발현시키는 공정을 포함한다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 생산에 있어서 배양하는 형질 전환된 숙주 세포는, 이하의 (a) 내지 (c)로 이루어지는 군에서 선택된다:
(a) 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 그리고
(c) 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 및 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
어떤 양태로서는, 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 생산에 있어서 배양하는 형질 전환된 숙주 세포는, 이하의 (a) 내지 (c)로 이루어지는 군에서 선택된다:
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1 내지 121에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1 내지 112에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1 내지 121에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1 내지 112에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 그리고
(c) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1 내지 121에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1 내지 112에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
어떤 양태로서는, 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 생산에 있어서 배양하는 형질 전환된 숙주 세포는, 이하의 (a) 내지 (c)로 이루어지는 군에서 선택된다:
(a) 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 그리고
(c) 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
바람직하게는, 사용되는 형질 전환된 숙주 세포는, 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 혹은, 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포이다.
본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 생산에 있어서, 형질 전환된 숙주 세포는, 영양 배지 중에서 배양될 수 있다. 영양 배지는, 형질 전환된 숙주 세포의 생육에 필요한 탄소원, 무기 질소원 혹은 유기 질소원을 포함하고 있는 것이 바람직하다. 탄소원으로서는, 예를 들어, 글루코오스, 덱스트란, 가용성 전분, 자당 등이, 무기 질소원 혹은 유기 질소원으로서는, 예를 들어, 암모늄염류, 질산염류, 아미노산, 옥수수 침지액, 펩톤, 카제인, 육추출물, 대두박, 감자 추출액 등이 예시된다. 또한 원한다면 기타의 영양소(예를 들어, 무기염(예를 들어, 염화칼슘, 인산이수소나트륨, 염화마그네슘), 비타민류, 항생 물질(예를 들어, 테트라사이클린, 네오마이신, 암피실린, 카나마이신 등) 등)를 포함하고 있어도 된다.
형질 전환된 숙주 세포의 배양 자체는, 공지된 방법에 의해 행하여진다. 배양 조건, 예를 들어, 온도, 배지의 pH 및 배양 시간은, 적절히 선택된다. 예를 들어, 숙주가 동물 세포인 경우, 배지로서는, 약 5 내지 20％의 태아소혈청을 포함하는 MEM 배지(Science; 1955; 122: 501.), DMEM 배지(Virology; 1959; 8: 396-97.), RPMI1640 배지(J.Am.Med.Assoc.; 1967; 199: 519-24.), 199 배지(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.; 1950; 73: 1-8.) 등을 사용할 수 있다. 배지의 pH는 약 6 내지 8인 것이 바람직하고, 배양은 통상적으로 약 30 내지 40℃에서 약 15 내지 336시간 행하여지고, 필요에 따라 통기나 교반을 행할 수도 있다. 숙주가 곤충 세포인 경우, 예를 들어, 태아소혈청을 포함하는 Grace's 배지(PNAS; 1985; 82: 8404-8.) 등을 들 수 있고, 그 pH는 약 5 내지 8인 것이 바람직하다. 배양은 통상적으로 약 20 내지 40℃에서 15 내지 100시간 행하여지고, 필요에 따라 통기나 교반을 행할 수도 있다. 숙주가 세균, 방선균, 효모, 사상균인 경우, 예를 들어, 상기 영양원을 함유하는 액체 배지가 적당하다. 바람직하게는, pH가 5 내지 8인 배지이다. 숙주가 E.coli인 경우, 바람직한 배지로서 LB 배지, M9 배지(Miller 등, Exp.Mol.Genet,Cold Spring Harbor Laboratory; 1972: 431.) 등이 예시된다. 이러한 경우, 배양은, 필요에 따라 통기, 교반하면서, 통상적으로 14 내지 43℃, 약 3 내지 24시간 행할 수 있다. 숙주가 Bacillus속균인 경우, 필요에 따라 통기, 교반을 하면서, 통상적으로 30 내지 40℃, 약 16 내지 96시간 행할 수 있다. 숙주가 효모인 경우, 배지로서, 예를 들어, Burkholder 최소 배지(PNAS; 1980; 77: 4505-4508.)를 들 수 있고, pH는 5 내지 8인 것이 바람직하다. 배양은 통상적으로 약 20 내지 35℃에서 약 14 내지 144시간 행하여지고, 필요에 따라 통기나 교반을 행할 수도 있다.
본 발명의 복합체에 포함되는 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 생산에 있어서는, 상기 형질 전환된 숙주 세포를 배양하고, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트를 발현시키는 공정에 추가로, 발현시킨 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트를 회수, 바람직하게는 단리, 정제하는 공정을 포함해도 된다. 단리, 정제 방법으로서는, 예를 들어, 염석, 용매 침전법 등의 용해도를 이용하는 방법, 투석, 한외 여과, 겔 여과, 도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 등 분자량의 차를 이용하는 방법, 이온 교환 크로마토그래피나 히드록실아파타이트 크로마토그래피 등의 하전을 이용하는 방법, 친화성 크로마토그래피 등의 특이적 친화성을 이용하는 방법, 역상 고속 액체 크로마토그래피 등의 소수성의 차를 이용하는 방법, 등전점 전기 영동 등의 등전점의 차를 이용하는 방법 등을 들 수 있다.
6. 본 발명의 복합체를 생산하는 방법
본 발명의 복합체를 생산하는 방법에는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트를, 표지부(Y-S1-X)와 공유 결합시키는 공정을 포함할 수 있다. 상기 표지부(Y-S1-X)에 있어서의 각 구성 요소 간의 결합은, 공지된 방법에 의해, 당업자가 적절히 행할 수 있다. 반응예로서는, 배위자(Y)를 직접 또는 스페이서(S1)를 통하여 펩티드 링커(X)에 결합시킨 후에, 상기 펩티드 링커와 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트를 결합시킬 수 있다. 또한, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트를 펩티드 링커(X)에 결합시킨 후에, 상기 펩티드 링커와 배위자(Y)를 직접 또는 스페이서(S1)를 통하여 결합시킬 수도 있다. 또한, 원료로서 미리 배위자와 스페이서(S1)가 결합한 화합물을 사용할 수도 있다.
본 발명의 복합체를 생산하는 방법은 또한, 상기 형질 전환된 숙주 세포를 배양하고, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트를 발현시키는 공정, 및 당해 Fab 프래그먼트와 표지부(Y-S1-X)를 공유 결합시키는 공정을 포함하고 있어도 된다. 본 발명의 복합체를 생산하는 방법은 또한, 상기 형질 전환된 숙주 세포를 배양하고, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트를 발현시키는 공정, 발현시킨 당해 Fab 프래그먼트를 회수하는 공정, 및 당해 Fab 프래그먼트와 표지부(Y-S1-X)를 공유 결합시키는 공정을 포함하고 있어도 된다. 본 발명의 복합체를 생산하는 방법은, 또한, 금속을 첨가하는 공정을 포함해도 된다. 사용되는 킬레이트제, 펩티드 링커, 스페이서, 표지부의 수, 금속 등은, 본 명세서에 기재된 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 복합체를 생산하는 방법은, 상기에서 특정하는 2개 이상의 공정을 일련의 공정으로서 포함하는 방법으로서 실시할 수도 있고, 상기에서 특정하는 적어도 하나의 공정을 포함하는 방법으로서 실시할 수도 있다. 예를 들어, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트를 표지부(Y-S1-X)와 결합시키는 공정을 포함하는 방법, 및 표지부(Y-S1-X)를 결합시킨 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트에 금속을 배위시키는 공정을 포함하는 방법도 또한, 본 발명의 복합체를 생산하는 방법에 포함된다. 또한, 본 발명의 복합체를 생산하는 방법에는, 공정의 순번이 다른 방법도 포함된다. 예를 들어, 배위자에 금속을 배위시킨 표지부(Y-S1-X)에, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트와 공유 결합시키는 방법도, 본 발명의 복합체를 생산하는 방법에 포함된다.
또한, 상기 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트 대신에, 본 발명에 기재된 생물 분자로도 마찬가지로 생산하는 것이 가능하다.
7. 배위자, 스페이서, 펩티드 링커 및 생물 분자를 포함하는 복합체
하기 식으로 표시되는 본 발명의 배위자, 스페이서, 펩티드 링커 및 생물 분자를 포함하는 복합체에 대하여 설명한다.
스페이서에 상당하는 하기 식 (S2)
의 양태로서,
를 들 수 있다.
다른 양태로서, 식 S2가,
인 기를 들 수 있다.
다른 양태로서, 식 S2가
인 기를 들 수 있다.
다른 양태로서, 식 S2가
인 기를 들 수 있다.
식 (S2) 중의 기 Q의 양태로서, -C(=O)-, -NH-C(=O)- 또는 -NH-C(=S)-를 들 수 있다.
식 (S2) 중의 기 Q의 양태로서, -C(=O)- 또는 -NH-C(=O)-를 들 수 있다.
식 (S2) 중의 기 Q의 양태로서, -NH-C(=O)-를 들 수 있다.
식 (Ia) 또는 (Ib) 중의 기 L2의 양태로서, Ile, Phe,Gly를 들 수 있다.
식 (Ia) 또는 (Ib) 중의 기 L2의 양태로서, Ile을 들 수 있다.
식 (Ia) 또는 (Ib) 중의 기 L2의 양태로서, Phe를 들 수 있다.
식 (Ia) 또는 (Ib) 중의 기 L2의 양태로서, Gly를 들 수 있다.
식 (Ia) 또는 (Ib) 중의 기 L3의 양태로서, 결합, Arg, His를 들 수 있다.
식 (Ia) 또는 (Ib) 중의 기 L3의 양태로서, 결합을 들 수 있다.
식 (Ia) 또는 (Ib) 중의 기 L3의 양태로서, Arg를 들 수 있다.
식 (Ia) 또는 (Ib) 중의 기 L3의 양태로서, His를 들 수 있다.
식 (Ia) 또는 (Ib) 중의 기 L4의 양태로서, -NH-(CH2)2-, -NHCH(C(=O)OH)(CH2)4- 또는 결합을 들 수 있다.
식 (Ia) 또는 (Ib) 중의 기 L4의 양태로서, -NH-(CH2)2-를 들 수 있다.
식 (Ia) 또는 (Ib) 중의 기 L4의 양태로서, -NHCH(C(=O)OH)(CH2)4-를 들 수 있다.
식 (Ia) 또는 (Ib) 중의 기 L4의 양태로서, 결합을 들 수 있다.
식 (Ia) 또는 (Ib) 중의 기 V1의 양태로서, 하기 식 (A-1) 내지 (A-5)로 표시되는 기,
를 들 수 있다.
식 (Ia) 또는 (Ib) 중의 기 V1의 양태로서, 하기 식 (A-1)로 표시되는 기,
를 들 수 있다.
식 (Ia) 또는 (Ib) 중의 기 V1의 양태로서, 하기 식 (A-2)로 표시되는 기,
를 들 수 있다.
식 (Ia) 또는 (Ib) 중의 기 V1의 양태로서, 하기 식 (A-3)로 표시되는 기,
를 들 수 있다.
식 (Ia) 또는 (Ib) 중의 기 V1의 양태로서, 하기 식 (A-4)로 표시되는 기,
를 들 수 있다.
식 (Ia) 또는 (Ib) 중의 기 V1의 양태로서, 하기 식 (A-5)로 표시되는 기,
를 들 수 있다.
식 (Ia) 또는 (Ib) 중의 하기 식 (B)는 스페이서 및 펩티드 링커를 포함하는 기이다.
하기 식 (B-1) 내지 (B-7)의 군에서 선택된 기를 들 수 있다.
어떤 양태로서, 하기 식의 화합물로 이루어지는 군에서 선택되는 복합체이며, p는, 1 내지 25의 자연수이며, Biomolecule1 중에 어느 p개의 아미노기 또는 티올기를 통하여, 인접하는 탄소 원자에 결합하고 있는, 상기 식 (Ia)에 기재된 복합체를 들 수 있다.
본 발명의 양태는, 하기 식으로 표시되는 복합체.
「식 중, Fab5는 이하의 항체 Fab 프래그먼트이다:
서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 8의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트.]
본 발명의 양태는, 하기 식으로 표시되는 복합체.
「식 중, Fab5는 이하의 항체 Fab 프래그먼트이다:
서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 8의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트.]
본 발명의 양태는, 하기 식으로 표시되는 복합체.
「식 중, Fab5는 이하의 항체 Fab 프래그먼트이다:
서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 8의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트.]
본 발명의 양태는, 하기 식으로 표시되는 복합체.
「식 중, Fab5는 이하의 항체 Fab 프래그먼트이다:
서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 8의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트.]
본 발명의 양태는, 하기 식으로 표시되는 복합체.
「식 중, Fab5는 이하의 항체 Fab 프래그먼트이다:
서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 8의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트.]
본 발명의 양태는, 하기 식으로 표시되는 복합체.
「식 중, Fab5는 이하의 항체 Fab 프래그먼트이다:
서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 8의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트.]
본 발명의 양태는, 하기 식으로 표시되는 복합체.
「식 중, Fab5는 이하의 항체 Fab 프래그먼트이다:
서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 8의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트.]
또한 본 발명의 양태로서, 하기 식 (Ie) 및 (If)를 들 수 있다.
본 발명 복합체는, 기하 이성체나 호변 이성체가 존재하는 경우가 있다. 또한, 본 발명 화합물은 비대칭 탄소를 갖는 경우가 있다. 본 발명에는, 이들 이성체의 분리한 것, 혹은 그들의 혼합물이 포함된다. 또한, 라벨체, 즉, 본 발명 화합물의 1개 이상 원자를 방사성 동위 원소 혹은 비방사성 동위 원소로 치환한 화합물도 본 발명에 포함된다.
생물 분자의 양태로서는, 생리 활성을 갖는 것이면 어느 것이어도 되고, 펩티드, 단백질, 호르몬, 약물, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 핵산, 다당류 등을 들 수 있다. 단백질의 경우, 항체, 효소, 수용체 및 그들의 단편이 포함된다.
다른 생물 분자의 양태로서는, 펩티드, 단백질을 들 수 있다.
다른 생물 분자의 양태로서는, 단백질을 들 수 있다.
다른 생물 분자의 양태로서는, 단백질 중, Fab 프래그먼트, 효소, 수용체, 그들의 단편을 들 수 있다. 예를 들어 소마토스타틴, PSMA 리간드, RGD(Arg-Gly-Asp)펩티드, ATSM(디아세틸-bis(N4-메틸티오세미카르바존)), 211At-AITM(4-211At-아스타토-N-[4-(6-(이소프로필아미노)피리딘-4-일)-1,3-티아졸-2-일]-N-메틸벤즈아미드)가 그에 해당한다.
다른 생물 분자의 양태로서, 출시되어 있는 항체 또는 그 Fab 프래그먼트를 들 수 있다.
예를 들어 nivolumab, pembrolizumab, bevacizumab, rituximab, pertuzumab, daratumumab, denosumab, cetuximab, ipilimumab, panitumumab, brentuximab, ramucirumab, atezolizumab, obinutuzumab, elotuzumab, avelumab, ibritumomab, alemtuzumab, gemtuzumab, necitumumab 등을 들 수 있다.
또한, 다른 생물 분자의 양태로서, 알파선 치료나 베타선 치료에 기대할 수 있는 것을 들 수 있다.
예를 들어, Octreoscan, 131I-MIBG(I-131 metaiodobenzylguanidine), 211 At-MABG(211 At-astato-benzylguanidine), Trastuzumab, Humanized antibody A33(Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 2005 Oct; 20(5): 514-23.), Omburtamab, Tenatumomab, CD45 antibody(ClinicalTrials.gov Identifier: NCT03128034; 9595; NCI-2017-00452), Ibritumomab, Actimab를 들 수 있다.
또한, 다른 생물 분자의 양태로서, Cancer studies and molecular medicine에 기재된 HuM195, MX35-F(ab')2 monoclonal antibodies, Murine 9.2.27, Proteoglycan(MCSP) antigen, CD20 antigen, CD30 antigen 등을 들 수 있다(Cancer studies and molecular medicine(2004),1,1,1-7).
또한, 다른 생물 분자의 양태로서, CD19, GD2, VE cadherin 등을 들 수 있다.
어떤 생물 분자의 양태로서는, MUC1 항체 Fab 프래그먼트(Fab3, Fab4 또는 Fab5라고도 함)이며, 국제 공개 WO2018/092885에 기재된 것을 들 수 있다.
[1M] 구체적으로 당해 Fab3 또는 Fab4는, 이하의 (a) 및 (b)로 이루어지는 군에서 선택되는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트이며, 또한 서열 번호 12에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 갖는 Fab 프래그먼트를 Fab3, 서열 번호 14에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트를 갖는 Fab 프래그먼트를 Fab4라고도 한다:
(a) 서열 번호 12 또는 서열 번호 14에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 16에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트; 및
(b) 서열 번호 12 또는 서열 번호 14에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역이며, 서열 번호 12 또는 서열 번호 14의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 16에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트.
[2M] 어떤 양태로서, 이하의 (a) 및 (b)로 이루어지는 군에서 선택되는, 상기 [1M]에 기재된 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트:
(a) 서열 번호 6 또는 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트; 및
(b) 서열 번호 6 또는 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 6 또는 서열 번호 8의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트.
[3M] 어떤 양태로서, 이하의 (a) 및 (b)로 이루어지는 군에서 선택되는, 상기 [1M]에 기재된 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트:
(a) 서열 번호 14에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 16에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트; 및
(b) 서열 번호 14에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역이며, 서열 번호 10의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 16에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트.
[4M] 어떤 양태로서 이하의 (a) 및 (b)로 이루어지는 군에서 선택되는, 상기 [3M]에 기재된 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트:
(a) 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트; 및
(b) 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 8의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트.
[5M] 어떤 양태로서, 서열 번호 6에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트인, 상기 [4M]에 기재된 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트.
[6M] 어떤 양태로서 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 8의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트인, 상기 [4M]에 기재된 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트.
[7M] 국제 공개 WO2018/092885에 기재된 항MUC1 항체 Fab 프래그먼트인 P10-1 또는 P10-2(Fab5라고도 함)이다.
또한 본 발명 복합체는, 상기 개개의 양태 조합으로 구성할 수 있다.
7. 진단용 조성물·진단 방법
본 발명은 금속을 포함하는 본 발명의 복합체(이하, 검출 가능한 본 발명의 복합체라고 칭한다.)를 포함하는, 진단용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 진단용 조성물은, 본 발명의 복합체를 1종류 이상 포함하는 것이어도 된다. 즉, 본 발명의 진단용 조성물은, 본 발명의 복합체를 1종류 포함하는 것이어도 되고, 또는 2종류 이상의 본 발명의 복합체의 조합을 포함하는 것이어도 된다. 검출 가능한 본 발명의 복합체는, 통상의 방법에 따라서 제제화되어, 조기 진단약, 또는 병기 진단약(특히 암의 진단약)으로서 이용할 수 있다.
조기 진단약이란, 병상이 관찰되지 않거나, 또는 병기가 이른 단계에서 진단을 행하는 것을 목적으로 하는 진단약을 의미한다. 예를 들어, 암에 있어서는, 병상이 관찰되지 않거나, 스테이지0 또는 스테이지1의 단계에서 사용하는 진단약을 의미한다.
병기 진단약이란, 병상이 어느 정도 진행되어 있는지를 검사하는 것이 가능한 진단약을 의미한다. 예를 들어, 암에 대해서는, 그의 스테이지를 검사하는 것이 가능한 진단약을 의미한다.
본 발명의 진단용 조성물에 의해 진단할 수 있을 것이 기대되는 암은, 인간 CEACAM5를 발현하는 암이다. 어떤 양태로서는, 대장암, 유방암, 폐암, 갑상선암 및 이들이 전이된 암을 들 수 있다. 어떤 양태로서, 당해 암은 대장암 또는 대장암이 전이된 암이다. 보다 바람직하게는, 당해 암은 대장암이 전이된 암이며, 그러한 암에는 전이성 간암이 포함된다. 또한, 인간 MUC1을 발현하는 암이다. 어떤 양태로서는, 유방암, 폐암, 대장암, 방광암, 피부암, 갑상선암, 위암, 췌장암, 신장암, 난소암 또는 자궁경암을 들 수 있다. 어떤 양태는, 당해 암은 유방암 또는 방광암이다.
본 발명의 진단용 조성물의 제제화 시에 본 발명의 복합체의 첨가량은, 환자의 증상의 정도나 연령, 사용하는 제제의 제형, 혹은 Fab 프래그먼트 또는 생물 분자의 결합 역가 등에 따라 다르지만, 예를 들어, 환자의 단위 체중당 Fab 프래그먼트 또는 생물 분자의 질량 베이스로 0.001mg/kg 내지 100mg/kg 정도를 사용하면 된다.
본 발명의 진단용 조성물의 제형의 예로서는, 주사제, 점적용제 등의 비경구제를 들 수 있고, 정맥내 주사, 표적 조직 국소에의 근육내 주사, 피하 주사, 방광내 투여 등에 의해 투여할 수 있다. 또한, 제제화 시에는, 약학적으로 허용되는 범위에서, 이들 제형에 따른 담체나 첨가제를 사용할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체나 첨가제의 종류는 특별히 한정되지 않고 당업자에게 주지된 담체나 첨가제를 사용할 수 있다.
본 발명은 또한, 암의 조기 진단용 조성물, 병기 진단용 조성물의 제조를 위한, 검출 가능한 본 발명의 복합체의 사용에 관한 것이다. 본 발명은 암의 조기 진단, 병기 진단에 있어서 사용하기 위한, 검출 가능한 본 발명의 복합체에 관한 것이기도 하다.
그리고, 본 발명은 검출 가능한 본 발명의 복합체를, 대상에게 투여하는 것을 포함하는 암의 진단 방법에 관한 것이기도 하다. 여기에 있어서, 「대상」이란, 그 진단을 받을 필요가 있는 인간 또는 기타의 포유 동물이다. 어떤 양태로서는, 그 진단을 받을 필요가 있는 인간이다. 본 발명의 진단 방법에 있어서의 검출 가능한 본 발명의 복합체의 유효량은 상기 제제화 시에 본 발명의 복합체의 유효량과 동일한 양이어도 된다. 본 발명의 진단 방법에 있어서, 검출 가능한 본 발명의 복합체는, 표적 조직 국소에의 근육내 주사, 피하 주사 등에 의해 투여하는 것을 들 수 있다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트, 펩티드 링커 및/또는 배위자를 포함하는 복합체의 제조를 위한, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 사용에 관한 것이기도 하다. 어떤 양태로서는, 본 발명은 본 발명의 복합체를 포함하는 진단용 조성물의 제조를 위한, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 사용에 관한 것이기도 하다.
또한, 금속 방사성 동위 원소를 포함하는 본 발명의 진단용 조성물이 제공될 때의 양태로서는, 당해 조성물의 사용 직전에 금속 방사성 동위 원소로 표지되어도 되고, 금속 방사성 동위 원소를 포함하는 진단용 조성물로서 제공되어도 된다.
8. 의약 조성물·치료 방법
본 발명에는, 90Y 또는 177Lu 등의 금속 방사성 동위 원소를 포함하는 1종류 이상의 본 발명의 복합체 Fab 프래그먼트의 질량 베이스로 0.001mg/kg 내지 100mg/kg 정도를 사용할 수 있다.
본 발명의 복합체를 포함하는 의약 조성물은, 암의 치료를 위하여 사용할 수 있다. 본 발명의 복합체를 포함하는 의약 조성물에 의해 치료할 수 있을 것이 기대되는 암은, 인간 CEACAM5를 발현하는 암이며, 예를 들어, 대장암, 유방암, 폐암, 갑상선암 및 이들이 전이된 암을 들 수 있다. 또는 본 발명의 복합체를 포함하는 의약 조성물에 의해 치료할 수 있을 것이 기대되는 암은, 인간 MUC1을 발현하는 암이며, 예를 들어, 유방암, 폐암, 대장암, 방광암, 피부암, 갑상선암, 위암, 췌장암, 신장암, 난소암 또는 자궁경암을 들 수 있다. 어떤 양태는, 당해 암은 유방암 또는 방광암이다.
본 발명에는, 본 발명의 복합체를 포함하는, 대장암 또는 대장암이 전이된 암을 치료하기 위한 의약 조성물이 포함된다. 또한, 본 발명에는, 본 발명의 복합체의 치료 유효량을 투여하는 공정을 포함하는, 대장암 또는 대장암이 전이된 암을 치료하는 방법이 포함된다. 또한, 본 발명에는, 본 발명의 복합체의 치료 유효량을 투여하는 공정을 포함하는, 대장암 또는 대장암이 전이된 암의 암세포 세포사를 유도하는 방법이 포함된다.
암을 치료하기 위한 의약 조성물은, 암의 진단에도 사용할 수 있다. 예를 들어, 대장암 또는 대장암이 전이된 암을 치료하기 위한 의약 조성물을, 당해 암의 진단에도 사용할 수도 있다.
또한, 본 발명에는, 대장암 또는 대장암이 전이된 암의 치료에 사용하기 위한, 본 발명의 복합체가 포함된다. 또한, 본 발명에는, 대장암 또는 대장암이 전이된 암을 치료하기 위한 의약 조성물의 제조를 위한, 본 발명의 복합체의 사용이 포함된다.
다른 실시 형태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 복합체를 포함하는 의약 조성물의 제조를 위한, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 사용에 관한 것이기도 하다.
상기 실시 형태 혹은 양태에 있어서, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트 대신에 생물 분자로 행하는 것이 가능하다. 본 발명의 복합체는, 생물 분자에 관련한 질환의 진단용 조성물 또는 의약 조성물로서 제공될 수 있다.
본 발명에 대하여 전반적으로 기재했지만, 더욱 이해를 얻기 위하여 참조하는 특정한 실시예를 여기에 제공한다. 그러나, 이들은 예시를 목적으로 하는 것으로서, 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
실시예
이하의 실시예 그리고 후기 표에 있어서, 이하의 약호를 사용하는 경우가 있다.
Gd/DOTA: Gd으로 표지된 3arm DOTA, Gd/4arm DOTA: Gd으로 표지된 4arm DOTA, MS: 질량 분석, ESI+: m/z값(이온화법 ESI, 특별히 언급이 없는 경우 [M+H]+), ESI-: m/z값(이온화법 ESI, 특별히 언급이 없는 경우 [M-H]-), APCI/ESI+: m/z값(이온화법 APCI/ESI, APCI/ESI는 APCI와 ESI의 동시 측정을 의미한다. 특별히 언급이 없는 경우 [M+H]+), APCI/ESI-: m/z값(이온화법 APCI/ESI, 특별히 언급이 없는 경우 [M+H]-), Ex-No: 복합체 번호, SNo: 제조예 번호, Str: 화학 구조식, Me: 메틸, Et: 에틸, tBu: tert-부틸, 1,3-Ph: 1,3-페닐렌, 1,4-Ph: 1,4-페닐렌, diph-Ala: 디페닐알라닌, 및 naph-Ala: 3-(2-나프틸)알라닌.
(실시예 1: 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트의 제작)
마우스 유래의 항인간 CEACAM5 항체인 T84.66을 문헌(Protein Eng.Des.Sel.; 2004; 17: 481-489)에 기재된 방법을 참고로 하여 인간화 후, 문헌(Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics; 2014; 82: 1624-1635)에 준하여 구축한 인간화 항체의 분자 모델을 사용하여, 표지부를 결합시켜도 친화성이 감약되지 않을 것이 기대되는 가변 영역을 갖는 항체를 설계하였다.
상기 항체의 중쇄 가변 영역 유전자의 5'측에 시그널 서열(Protein Engineering; 1987; 1: 499-505)을 코딩하는 유전자를, 그리고 3'측에 인간 Igγ1의 Fab 영역 유전자(서열 번호 1의 염기 번호 364부터 678까지의 염기 서열을 포함한다)를 각각 연결시키고, 이 중쇄 프래그먼트 유전자를 GS 벡터 pEE6.4(Lonza사)에 삽입하였다. 또한, 항체의 경쇄 가변 영역 유전자의 5'측에 시그널 서열을 코딩하는 유전자를, 그리고 3'측에 인간 Igκ의 정상 영역 유전자(서열 번호 3의 염기 번호 337부터 657까지의 염기 서열을 포함한다)를 각각 연결시키고, 이 경쇄 유전자를 GS 벡터 pEE12.4(Lonza사)에 삽입하였다. 항체의 중쇄 프래그먼트와 경쇄의 유전자가 각각 삽입된 전술한 pEE 벡터를 NotI와 PvuI로 제한 효소 절단하고, 라이게이션용 키트 TAKARA Ligation Kit Ver2.1(Takara사)을 사용하여 라이게이션을 행하여, 중쇄 프래그먼트와 경쇄의 양쪽 유전자가 삽입된 GS 벡터를 구축하였다.
전술한 중쇄 프래그먼트와 경쇄의 양쪽 유전자가 삽입된 GS 벡터를 사용하여, 일과성 발현 및 항상적 발현의 2종류의 방법으로 항체 발현을 행하였다. 일과성 발현에 대해서는, Expi293 Expression Medium(Thermo Fisher Scintific사)에서 약 300만개/mL로 배양된 Expi293F 세포(Thermo Fisher Scientific사)에 대하여 전술한 중쇄 프래그먼트와 경쇄의 양쪽 유전자가 삽입된 GS 벡터를 ExpiFectamine 293 Transfection Kit(Thermo Fisher Scientific사)를 사용하여 형질 감염시키고, 5 내지 7일간 배양하였다. 배양 상청을 KappaSelect(GE 헬스케어 재팬사)를 사용하여 정제하여, Fab 프래그먼트를 얻었다. 항상적 발현에 대해서는, CHOK1SV 세포(Lonza사)에 PvuI로 직쇄로 한 전술한 중쇄 프래그먼트와 경쇄의 양쪽 유전자가 삽입된 GS 벡터를 Gene Pulser(Bio-Rad사)를 사용한 일렉트로포레이션법으로 형질 감염시켰다. 형질 감염 다음날에 메티오닌술폭시민을 첨가하고, 5 내지 7일간 배양하였다. 메틸셀룰로오스 함유 반고형 배지에 세포를 파종하고, 콜로니 형성 후에 ClonePix FL(Molecular Devices사)을 사용하여 Fab 프래그먼트의 발현량이 많은 세포를 취득하였다. 당해 세포의 배양 상청을 Capto L(GE 헬스케어 재팬사), Q Sepharose Fast Flow(GE 헬스케어 재팬사), 및 BioPro S75(YMC사)를 사용하여 정제하여, Fab 프래그먼트를 얻었다.
제작한 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트(PB009-01 또는 Fab2라고 칭한다.)의 중쇄 프래그먼트를 코딩하는 염기 서열을 서열 번호 1에, 그것에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 서열 번호 2에, PB009-01의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 서열 번호 3에, 그것에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 서열 번호 4에 각각 나타낸다. PB009-01의 중쇄 가변 영역은, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄의 CDR1, CDR2, CDR3은, 각각 서열 번호 2의 아미노산 번호 31로부터 35, 50로부터 66, 99부터 110까지의 아미노산 서열을 포함한다. PB009-01의 경쇄 가변 영역은, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 112까지의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄의 CDR1, CDR2, CDR3은, 각각 서열 번호 4의 아미노산 번호 24부터 38, 54부터 60, 93부터 101까지의 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 가변 영역 및 CDR 서열은 Kabat 번호 부여에 따라서 결정했다(Kabat 등, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda).
(실시예 2: 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트 복합체의 제작)
본 실시예는 복합체의 제조 실시예를 개시한다. 본 실시예 중의 각 제조 실시예에서는 「실시예 2」에 하이픈을 개재하여 「복합체의 번호」를 기재한다. 예를 들어, 「실시예 2-11」은, 본 실시예에 있어서의 복합체 11의 제조 실시예인 것을 나타낸다. 또한, 본 실시예에 있어서의 Fab2는 실시예 1에서 얻어진 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트(PB009-01/Fab2)이며, 「p-Fab」는 Fab2가 그의 p개의 아미노기를 통하여 p개의 [ ] 또는 ( ) 중에 기재된 표지부에 결합하여 복합체를 형성하고 있는 것을 나타낸다. 또한, 이하의 몇가지 실시예에 있어서, MS 해석에 의해 확인할 수 있었던 각 복합체의 Fab2가 결합하는 표지부(Y-S1-X)의 수를 기재하고 있지만, 그 결과는 그 이외의 결합수를 갖는 복합체를 포함하지 않는 것을 나타내는 것은 아니다. MS 해석 기기의 정밀도의 관계에서 그 존재를 확인할 수 없었던 결합수의 복합체가 존재하고 있을 가능성이 남는 것은 용이하게 이해될 것이다. 또한, 본 실시예 중의 구조식에 있어서, Gd이 결합한 DOTA의 구조식은, Gd으로 표지된 DOTA를 모식적으로 도시한 것이다.
(실시예 2-11. ([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(=O)-Asp-Gly-Lys*-Z2(#N)]p-Fab2)의 합성)
(i) O4-tert-부틸-N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-α-아스파르틸글리실-N6-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리신 tert-부틸에스테르의 합성
N-(tert-부톡시카르보닐)글리실-N6-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리신 tert-부틸에스테르(1.00g)의 디클로로메탄(6mL) 용액에 빙랭 하에서 트리플루오로아세트산(이하 TFA라고 약칭)(3mL)을 첨가하고, 동일 온도에서 2시간 교반하였다. 감압 농축한 후, 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 디클로로메탄으로 2회 추출하였다. 합친 유기층을 포화 염화나트륨 수용액으로 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과한 후, 농축하였다. 이 잔사에 N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-아스파르트산수소O4-tert-부틸에스테르(920mg), 디클로로메탄(10mL), 디이소프로필에틸아민(이하 DIPEA라고 약칭)(2mL), 헥사플루오라이드인산(1-)1-(디메틸아미노)-N,N-디메틸-1-[(3H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피리딘-3-일)옥시]메탄이미늄(이하 HATU라고 약칭)(1.2g)을 첨가하고, 실온에서 16시간 교반하였다. 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 디클로로메탄으로 2회 추출하였다. 합친 유기층을 포화 염화나트륨 수용액으로 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과한 후, 농축함으로써 표제 화합물(2.86g)을 얻었다. MS(ESI+); 809.5 [M+Na]+
(ii) O4-tert-부틸-L-α-아스파르틸글리실-N6-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리신 tert-부틸에스테르의 합성
O4-tert-부틸-N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-α-아스파르틸글리실-N6-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리신 tert-부틸에스테르(2.86g)의 테트라히드로푸란(이하 THF라고 약칭)(10mL) 용액에 모르폴린(6mL)을 첨가하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 빙욕 하에서 냉각한 후, 발생한 고체를 여과하고, 잔사를 메탄올로 세정하였다. 여액을 감압 농축한 후, 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(용매 구배; 0→4％ 메탄올/클로로포름)로 정제함으로써 표제 화합물(1.04g)을 얻었다. MS(ESI+); 565.5
(iii) N-(3-{[(tert-부톡시카르보닐)아미노]메틸}벤조일)-O4-tert-부틸-L-α-아스파르틸글리실-N6-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리신 tert-부틸에스테르의 합성
O4-tert-부틸-L-α-아스파르틸글리실-N6-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리신 tert-부틸에스테르(570mg), 디클로로메탄(6mL), 3-{[(tert-부톡시카르보닐)아미노]메틸} 벤조산(305mg), DIPEA(520μL), HATU(575mg)의 혼합물을 실온에서 43시간 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 농축한 후, 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(용매 구배; 0→80％ 아세트산에틸/헥산)로 정제함으로써 표제 화합물(712mg)을 얻었다. MS(ESI+); 798.6
(iv) N-[3-(아미노메틸)벤조일]-O4-tert-부틸-L-α-아스파르틸글리실-N6-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리신 tert-부틸에스테르의 합성
N-(3-{[(tert-부톡시카르보닐)아미노]메틸}벤조일)-O4-tert-부틸-L-α-아스파르틸글리실-N6-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리신 tert-부틸에스테르(712mg)의 디클로로메탄(2mL) 용액에 빙랭 하에서 TFA(2mL)를 첨가하고, 동일 온도에서 7시간 교반하였다. 트리에틸아민, 아미노실리카겔을 첨가하고 감압 하 농축한 후, 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(아미노실리카겔, 용매 구배; 0→2％ 메탄올/클로로포름)로 정제함으로써 표제 화합물(495mg)을 얻었다. MS(ESI+); 698.4
(v) O4-tert-부틸-N-[3-({2-[4,7,10-트리스(2-tert-부톡시-2-옥소에틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세트아미드}메틸)벤조일]-L-α-아스파르틸글리실-N6-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리신 tert-부틸에스테르의 합성
N-[3-(아미노메틸)벤조일]-O4-tert-부틸-L-α-아스파르틸글리실-N6-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리신 tert-부틸에스테르(495mg), N,N-디메틸포름아미드(이하 DMF라고 약칭)(5mL), [4,7,10-트리스(2-tert-부톡시-2-옥소에틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세트산(이하 DOTA-tris(t-Bu)에스테르라고 약칭)(446mg), DIPEA(400μL), HATU(404mg)의 혼합물을 실온에서 66시간 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 농축한 후, 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(용매 구배; 0→20％ 메탄올/클로로포름)로 정제함으로써 표제 화합물(387mg)을 얻었다. MS(ESI+); 1275.5 [M+Na]+
(vi) O4-tert-부틸-N-[3-({2-[4,7,10-트리스(2-tert-부톡시-2-옥소에틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세트아미드}메틸)벤조일]-L-α-아스파르틸글리실-L-리신 tert-부틸에스테르의 합성
O4-tert-부틸-N-[3-({2-[4,7,10-트리스(2-tert-부톡시-2-옥소에틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세트아미드}메틸)벤조일]-L-α-아스파르틸글리실-N6-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리신 tert-부틸에스테르(387mg), 10％ 팔라듐 담지 탄소(50％ 함수, 65mg), 에탄올(4mL)의 혼합물을 수소 분위기 하(1atm) 실온에서 5시간 교반하였다. 셀라이트를 사용하여 그의 혼합물을 여과, 농축하였다. 잔사에 10％ 팔라듐 담지 탄소(50％ 함수, 650mg), 에탄올(8mL)을 첨가하고, 이 혼합물을 수소 분위기 하(1atm) 실온에서 20시간 교반하였다. 그의 혼합물을, 셀라이트를 사용하여 여과 후, 농축함으로써 표제 화합물(336mg)을 얻었다. MS(ESI+); 1140.5 [M+Na]+
(vii) O4-tert-부틸-N-[3-({2-[4,7,10-트리스(2-tert-부톡시-2-옥소에틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세트아미드}메틸)벤조일]-L-α-아스파르틸글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신 tert-부틸에스테르의 합성
O4-tert-부틸-N-[3-({2-[4,7,10-트리스(2-tert-부톡시-2-옥소에틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세트아미드}메틸)벤조일]-L-α-아스파르틸글리실-L-리신 tert-부틸에스테르(336mg), 포화 탄산수소나트륨 수용액(2.5mL)의 혼합물에 2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-카르복실산메틸에스테르(56mg), THF(5mL)의 용액을 빙랭 하에서 첨가하고, 이 혼합물을 동일 온도에서 2시간 교반하였다. 빙랭 하, 1M 수산화나트륨 수용액(60μL)을 첨가한 후, 실온에서 1시간 교반하였다. 아세트산에틸, 10％ 시트르산 수용액을 첨가한 후, 유기층을 분리하였다. 수층을 10％ 메탄올/클로로포름으로 추출하고, 모은 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하였다. 여액을 감압 농축한 후, 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(용매 구배; 0→20％ 메탄올/클로로포름)로 정제함으로써 표제 화합물(341mg)을 얻었다. MS(ESI+); 1198.5
(viii) N-[3-({2-[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세트아미드}메틸)벤조일]-L-α-아스파르틸글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신의 합성
O4-tert-부틸-N-[3-({2-[4,7,10-트리스(2-tert-부톡시-2-옥소에틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세트아미드}메틸)벤조일]-L-α-아스파르틸글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신tert-부틸에스테르(341mg), 노디클로로메탄(2mL) 용액에 TFA(2mL)를 첨가하고, 실온에서 5시간 교반하였다. 감압 농축한 후, 잔사를 역상 칼럼 크로마토그래피(용매 구배; 0→20％ 아세토니트릴/0.1％ TFA 수용액)로 정제함으로써 표제 화합물(99.6mg)을 얻었다. MS(ESI+); 918.3
(ix) [N-{3-[(2-{4,7,10-트리스[(카르복시-κO)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일-κ4N1,N4,N7,N10}아세트아미드-κO)메틸]벤조일}-L-α-아스파르틸글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류시나토(3-)]가돌리늄의 합성
N-[3-({2-[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세트아미드}메틸)벤조일]-L-α-아스파르틸글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신(20.0mg), 물(2mL), 염화가돌리늄(6mg)의 혼합물에 탄산수소나트륨 수용액(0.1 M, 800μL)을 첨가하고, 실온에서 10분간 교반하였다. 탄산수소나트륨 수용액(0.1 M, 60μL)을 첨가하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 에틸렌디아민사아세트산(이하 EDTA라고 약칭) 수용액(0.5 M, 300μL)을 첨가하고, 실온에서 10분간 교반하였다. 반응 혼합물을 역상 칼럼 크로마토그래피(용매 구배; 0→25％ 아세토니트릴/0.1％ TFA 수용액)로 정제함으로써 표제 화합물(12.0mg)을 얻었다. MS(ESI-); 1071.4
(x) 복합체 No.11의 합성
[N-{3-[(2-{4,7,10-트리스[(카르복시-κO)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일-κ4N1,N4,N7,N10}아세트아미드-κO)메틸]벤조일}-L-α-아스파르틸글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류시나토(3-)]가돌리늄(1mg)을 DMSO(40μL)에 용해시켰다. 그 용액 40μL를 분주하고, 0.1M 붕산 완충액(40μL)을 첨가하고, pH6.6이 되도록 0.1M 탄산나트륨 수용액을 첨가하였다.
4.45mg/mL Fab2의 붕산 완충액(160μL)에, 앞서 조제한 용액을 첨가하고, 30℃에서 2시간 인큐베이트하였다. 0.05M EDTA 수용액(40μL)을 첨가한 후, 30℃에서 10분간 인큐베이트하였다. PD-10 칼럼으로 정제하고, 아미콘 울트라-0.5mL 원심식 필터(머크 밀리포아사)를 사용하여 회수하였다. 회수한 용액을 인산 완충 생리 식염수로 세정을 7회 반복하고 마지막에 농축 후, 멤브레인 필터로 여과하여, 복합체를 얻었다. 당해 복합체는, 분자량 47.9kDa의 Fab2 1개에 대하여 분자량 1073의 [Gd/DOTA-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(=O)-Asp-Gly-Lys*-Z2(#N)]이 1개 결합한 복합체, 2개 결합한 복합체 및 3개 결합한 복합체의 혼합물임을 MS 해석에 의해 확인하였다.
(실시예 2-12. ([Gd/4arm-DOTA-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=S)-Gly-Phe-Lys*-Z2(#N)]p-Fab2)의 합성)
(i) N-(tert-부톡시카르보닐)-L-페닐알라닐-N6-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리신tert-부틸에스테르의 합성
N-(tert-부톡시카르보닐)-L-페닐알라닌(1.5g)의 디클로로메탄(30ml) 혼합액에, N6-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리신tert-부틸에스테르일염산염(2.1g), Et3N(2.4mL)과 HATU(2.5g)를 차례로 첨가하고, 실온에서, 밤새 반응시켰다.
반응 혼합물을 농축 후, 실리카겔 칼럼(용매 구배; 10→50％ 아세트산에틸/헥산)로 정제하여, 표제 화합물(3.16g)을 얻었다. MS(ESI+): 606.4 [M+Na]+
(ii) N-(tert-부톡시카르보닐)-L-페닐알라닐-L-리신tert-부틸에스테르의 합성
N-(tert-부톡시카르보닐)-L-페닐알라닐-N6-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리신tert-부틸에스테르(3150mg)의 에탄올(60ml), 10％ 팔라듐 담지 탄소(50％ 함수, 1000mg)의 혼합물을, 수소 분위기 하(1atm) 실온에서 4시간반 교반하였다. 원료가 잔존하고 있었기 때문에, 계 내를 아르곤 치환 후, 혼합물을 셀라이트 여과하고, 여액을 농축하였다. 잔사를 메탄올(60ml)에 녹이고, 10％ 팔라듐 담지 탄소(50％ 함수, 1000mg) 첨가한 혼합물을, 수소 분위기 하(1atm) 실온에서 5시간 교반하였다. 원료 소실을 확인 후, 계 내를 아르곤 치환하고, 혼합물을 셀라이트 여과하고, 여액을 농축하여, 표제 화합물(2520mg)을 얻었다. MS(ESI+): 450.4
(iii) N-(tert-부톡시카르보닐)-L-페닐알라닐-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신tert-부틸에스테르의 합성
N-(tert-부톡시카르보닐)-L-페닐알라닐-L-리신tert-부틸에스테르(825mg)의 포화 탄산수소나트륨 수용액(6ml) 현탁액에, 2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-카르복실산메틸에스테르(340mg)의 THF(12ml) 용액을 빙랭 하, 첨가하였다. 동일 온도에서, 2시간 교반 후, 1M 수산화나트륨 수용액(0.36ml)을 첨가하고, 1시간 실온에서 교반하였다. 혼합물을 아세트산에틸과 물로 희석 후, 10％ 시트르산 수용액으로 산성으로 하였다. 유기층을 분리하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 세정하고, 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과 후, 여액을 감압 농축하였다. 잔사를 실리카겔 칼럼(용매 구배; 0→8％ 메탄올/클로로포름)로 정제하여, 표제 화합물(743mg)을 얻었다. MS(ESI+): 552.4 [M+Na]+
(iv) L-페닐알라닐-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신tert-부틸에스테르모노(트리플루오로아세트산)염의 합성
N-(tert-부톡시카르보닐)-L-페닐알라닐-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신tert-부틸에스테르(325mg)의 디클로로메탄(4ml) 용액에, 빙랭 하, TFA(2ml)를 적하하였다. 혼합물을 동일 온도에서, 1시간 교반하였다. 혼합물을 감압 농축하여, 표제 화합물(418mg)의 조생성물을 얻었다. MS(ESI+): 430.4
(v) N-(tert-부톡시카르보닐)글리실-L-페닐알라닐-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신tert-부틸에스테르의 합성
L-페닐알라닐-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신tert-부틸에스테르모노(트리플루오로아세트산)염(415mg)의 디클로로메탄(10ml) 혼합물에, N-(tert-부톡시카르보닐)글리신(118mg), 트리에틸아민(이하 TEA라고 약칭)(0.26ml), HATU(256mg)를 순서대로 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 감압 농축 후, 실리카겔 칼럼(용매 구배; 0→30％ 아세톤/클로로포름)로 정제하여, 표제 화합물(206mg)을 얻었다. MS(ESI+): 609.4 [M+Na)+
(vi) 글리실-L-페닐알라닐-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신tert-부틸에스테르모노(트리플루오로아세트산)염의 합성
N-(tert-부톡시카르보닐)글리실-L-페닐알라닐-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신tert-부틸에스테르(205mg)를 사용하여, 상기 실시예 2-12(iv)와 마찬가지로 하여, 표제 화합물(223mg)의 조생성물을 얻었다. MS(ESI+): 487.4
(vii) 글리실-L-페닐알라닐-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신모노(트리플루오로아세트산)염의 합성
글리실-L-페닐알라닐-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신tert-부틸에스테르모노(트리플루오로아세트산)염(9mg)의 디클로로메탄(1ml) 혼합물에, TFA(1ml)를 첨가하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 혼합물을 감압 농축하여, 표제 화합물(8mg)의 조생성물을 얻었다. MS(ESI+): 431.3
(viii) N-[(4-{[1,4,7,10-테트라키스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-2-일]메틸}페닐)카르바모티오일]글리실-L-페닐알라닐-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신의 합성
글리실-L-페닐알라닐-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신모노(트리플루오로아세트산)염(8mg)과 2,2',2'',2'''-{2-[(4-이소티오시아나토페닐)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라일}사아세트산(p-SCN-Bn-DOTA라고 약칭)(8mg)의 DMF(1ml) 혼합물에, DIPEA(35μL)를 첨가하고, 실온에서, 1.5시간 교반하였다. 혼합물을 1％ TFA 수용액(약 5ml)으로 희석하고, 역상 칼럼 크로마토그래피(용매 구배 5-50％ 아세토니트릴/0.1％ TFA 수용액)로 정제하여, 표제 화합물(13mg)을 얻었다. MS(ESI+): 982.3
(ix) 히드로겐=[N-{[4-({1,4,7,10-테트라키스[(카르복시-κO)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-2-일-κ4N1,N4,N7,N10}메틸)페닐]카르바모티오일}글리실-L-페닐알라닐-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류시나토(4-)]가돌리네이트(1-)의 합성
N-[(4-{[1,4,7,10-테트라키스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-2-일]메틸}페닐)카르바모티오일]글리실-L-페닐알라닐-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신(12mg)을 물(5ml)로 희석하고, 염화가돌리늄(4mg)을 첨가하였다. 0.1M 탄산수소나트륨으로, 혼합물의 pH를 5-6으로 조절하고, 실온에서, 1시간 교반하였다. 혼합물에 0.5M EDTA 수용액(80μL)을 첨가하고, 실온에서 5분 교반하였다. TFA(10μL)를 첨가한 후, 역상 칼럼 크로마토그래피(용매 구배 5-50％ 아세토니트릴/0.1％ TFA 수용액)로 정제하여, 표제 화합물(5mg)을 얻었다. MS(ESI+): 1137.0
(x) 복합체 No.12의 합성
히드로겐=[N-{[4-({1,4,7,10-테트라키스[(카르복시-κO)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-2-일-κ4N1,N4,N7,N10}메틸)페닐]카르바모티오일}글리실-L-페닐알라닐-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류시나토(4-)]가돌리네이트(1-)를 사용하여, 상기 실시예 2-11의 공정 (x)과 마찬가지로 하여, 복합체를 얻었다. 당해 복합체는, 분자량 47.9kDa의 Fab2 1개에 대하여 분자량 1136의 [Gd/4arm-DOTA-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=S)-Gly-Phe-Lys*-Z2(#N)]이 1개 결합한 복합체, 2개 결합한 복합체 및 3개 결합한 복합체의 혼합물임을 MS 해석에 의해 확인하였다.
(실시예 2-13. ([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(=O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#N)]p-Fab2)의 합성)
(i) N-(tert-부톡시카르보닐)-L-메티오닐글리실-N6-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리신tert-부틸에스테르의 합성
N-(tert-부톡시카르보닐)글리실-N6-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리신tert-부틸에스테르(1.00g)의 디클로로메탄(6mL) 용액에 빙랭 하에서 TFA(3mL)를 첨가하고, 동일 온도에서 2시간 교반하였다. 감압 농축한 후, 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 디클로로메탄으로 2회 추출하였다. 합친 유기층을 포화 염화나트륨 수용액으로 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과한 후, 농축하였다. 이 잔사에 N-(tert-부톡시카르보닐)-L-메티오닌(556mg), 디클로로메탄(10mL), DIPEA(2mL), HATU(1.16g)을 첨가하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 반응 용액을 농축 후, 잔사에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 디클로로메탄으로 2회 추출하였다. 합친 유기층을 1M 수산화나트륨 수용액 및 포화 염화나트륨 수용액으로 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과한 후, 농축함으로써 표제 화합물(1.70g)을 얻었다. MS(ESI+); 625.5
(ii) L-메티오닐글리실-N6-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리신 tert-부틸에스테르의 합성
N-(tert-부톡시카르보닐)-L-메티오닐글리실-N6-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리신 tert-부틸에스테르(1.70g)의 디클로로메탄(10mL) 용액에 빙랭 하에서 TFA(4mL)를 첨가하고, 동일 온도에서 7시간 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 농축한 후, 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(아미노실리카겔, 용매 구배; 0→4％ 메탄올/클로로포름)로 정제함으로써 표제 화합물(663mg)을 얻었다. MS(ESI+); 525.4
(iii) N-(3-{[(tert-부톡시카르보닐)아미노]메틸}벤조일)-L-메티오닐글리실-N6-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리신 tert-부틸에스테르의 합성
L-메티오닐글리실-N6-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리신tert-부틸에스테르(663mg), 디클로로메탄(6mL), 3-{[(tert-부톡시카르보닐)아미노]메틸} 벤조산(480mg), DIPEA(700μL), HATU(960mg)의 혼합물을 실온에서 39시간 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 농축한 후, 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(용매 구배; 0→100％ 아세트산에틸/헥산)로 정제함으로써 표제 화합물(935mg)을 얻었다. MS(ESI+); 758.5
(iv) N-[3-(아미노메틸)벤조일]-L-메티오닐글리실-N6-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리신 tert-부틸에스테르의 합성
N-(3-{[(tert-부톡시카르보닐)아미노]메틸}벤조일)-L-메티오닐글리실-N6-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리신 tert-부틸에스테르(935mg)의 디클로로메탄(2mL) 용액에 빙랭 하에서 TFA(2mL)를 첨가하고, 동일 온도에서 1시간 교반하였다. Et3N, 아미노실리카겔을 첨가하여 감압 농축한 후, 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(아미노실리카겔, 용매 구배; 0→10％ 메탄올/클로로포름)로 정제함으로써 표제 화합물(260mg)을 얻었다. MS(ESI+); 658.5
(v) N-[3-({2-[4,7,10-트리스(2-tert-부톡시-2-옥소에틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세트아미드}메틸)벤조일]-L-메티오닐글리실-N6-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리신 tert-부틸에스테르의 합성
N-[3-(아미노메틸)벤조일]-L-메티오닐글리실-N6-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리신 tert-부틸에스테르(260mg)를 사용하여, 상기 실시예 2-11의 공정 (v)와 마찬가지로 하여, 표제 화합물(353mg)을 얻었다. MS(ESI-): 1210.4
(vi) N-[3-({2-[4,7,10-트리스(2-tert-부톡시-2-옥소에틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세트아미드}메틸)벤조일]-L-메티오닐글리실-L-리신 tert-부틸에스테르의 합성
N-[3-({2-[4,7,10-트리스(2-tert-부톡시-2-옥소에틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세트아미드}메틸)벤조일]-L-메티오닐글리실-N6-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리신 tert-부틸에스테르(353mg)를 사용하여, 상기 실시예 2-11의 공정 (vi)과 마찬가지로 하여, 표제 화합물(245mg)을 얻었다. MS(ESI+): 1078.8
(vii) N-[3-({2-[4,7,10-트리스(2-tert-부톡시-2-옥소에틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세트아미드}메틸)벤조일]-L-메티오닐글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신 tert-부틸에스테르의 합성
N-[3-({2-[4,7,10-트리스(2-tert-부톡시-2-옥소에틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세트아미드}메틸)벤조일]-L-메티오닐글리실-L-리신 tert-부틸에스테르(245mg)를 사용하여, 상기 실시예 2-11의 공정 (vii)과 마찬가지로 하여, 표제 화합물(139mg)을 얻었다. MS(ESI+): 1158.8
(viii) N-[3-({2-[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세트아미드}메틸)벤조일]-L-메티오닐글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신의 합성
N-[3-({2-[4,7,10-트리스(2-tert-부톡시-2-옥소에틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세트아미드}메틸)벤조일]-L-메티오닐글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신 tert-부틸에스테르(341mg)를 사용하여, 상기 실시예 2-11의 공정 (viii)과 마찬가지로 하여, 표제 화합물(38.2mg)을 얻었다. MS(ESI+): 934.4
(ix) [N-{3-[(2-{4,7,10-트리스[(카르복시-κO)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일-κ4N1,N4,N7,N10}아세트아미드-κO)메틸]벤조일}-L-메티오닐글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류시나토(3-)]가돌리늄의 합성
N-[3-({2-[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세트아미드}메틸)벤조일]-L-메티오닐글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신(28mg)를 사용하여, 상기 실시예 2-11의 공정 (ix)와 마찬가지로 하여, 표제 화합물(13.8mg)을 얻었다. MS(ESI+): 1089.2
(x) 복합체 No.13의 합성
[N-{3-[(2-{4,7,10-트리스[(카르복시-κO)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일-κ4N1,N4,N7,N10}아세트아미드-κO)메틸]벤조일}-L-메티오닐글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류시나토(3-)]가돌리늄을 사용하여, 상기 실시예 2-11의 공정 (x)과 마찬가지로 하여, 복합체를 얻었다. 당해 복합체는, 분자량 47.9kDa의 Fab2 1개에 대하여 분자량 1089의 [Gd/DOTA-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(=O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#N)]이 1개 결합한 복합체, 2개 결합한 복합체, 및 3개 결합한 복합체의 혼합물임을 MS 해석에 의해 확인하였다.
(실시예 2-15. ([Gd/DOTA-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(=O)-Gly-Lys*-Z2(#N)]p-Fab2)의 합성)
(i) 글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신tert-부틸에스테르모노(트리플루오로아세트산)염의 합성
N-(tert-부톡시카르보닐)글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신tert-부틸에스테르(400mg)의 디클로로메탄(4mL) 용액에 빙랭 하에서 TFA(4mL)를 첨가하고, 빙랭 하에서 1시간 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 농축함으로써 표제 화합물(642mg)을 얻었다. MS(ESI+); 340.4
(ii) N-(3-{[(tert-부톡시카르보닐)아미노]메틸}벤조일)글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신 tert-부틸에스테르의 합성
글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신 tert-부틸에스테르모노(트리플루오로아세트산)염(642mg), 디클로로메탄(6mL)의 혼합물에 빙랭 하에서 3-{[(tert-부톡시카르보닐)아미노]메틸} 벤조산(228mg), DIPEA(1.5mL), HATU(345mg)를 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 2시간 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 농축한 후, 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(용매 구배; 0→4％ 메탄올/클로로포름)로 정제함으로써 표제 화합물(489mg)을 얻었다. MS(ESI+); 573.4
(iii) N-[3-(17,17-디메틸-3,15-디옥소-5,8,11,16-테트라옥사-2,14-디아자옥타데칸-1-일)벤조일]글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신tert-부틸에스테르의 합성
N-(3-{[(tert-부톡시카르보닐)아미노]메틸}벤조일)글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신 tert-부틸에스테르(489mg), 아니솔(280μL), 디클로로메탄(5mL)의 혼합물에 빙랭 하에서 TFA(2mL)를 첨가하고, 동일 온도에서 1시간 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 농축한 후, 디클로로메탄(7mL)을 첨가하고, 빙랭 하에서 2,2-디메틸-4-옥소-3,8,11,14-테트라옥사-5-아자헥사데칸-16-산(289mg), DIPEA(1.5mL), HATU(487mg)를 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 2시간 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 농축한 후, 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(용매 구배; 0→1％ 메탄올/클로로포름)로 정제함으로써 표제 화합물(427mg)을 얻었다. MS(ESI+); 762.5
(iv) N-(3-{3,15-디옥소-16-[4,7,10-트리스(2-tert-부톡시-2-옥소에틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]-5,8,11-트리옥사-2,14-디아자헥사데칸-1-일}벤조일)글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신 tert-부틸에스테르의 합성
N-[3-(17,17-디메틸-3,15-디옥소-5,8,11,16-테트라옥사-2,14-디아자옥타데칸-1-일)벤조일]글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신 tert-부틸에스테르(427mg), 아니솔(200μL), 디클로로메탄(4mL)의 혼합물에 빙랭 하에서 TFA(1.3mL)를 첨가하고, 동일 온도에서 1시간 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 농축한 후, DMF(6mL)를 첨가하고, 빙랭 하에서 DOTA-tris(t-Bu)에스테르(353mg), DIPEA(0.96mL), HATU(320mg)를 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 2시간 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 농축한 후, 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(용매 구배; 0→10％ 메탄올/클로로포름)로 정제함으로써, 표제 화합물(863mg)을 얻었다. MS(ESI+): 1238.9 [M+Na]+
(v) N-(3-{3,15-디옥소-16-[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]-5,8,11-트리옥사-2,14-디아자헥사데칸-1-일}벤조일)글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신의 합성
N-(3-{3,15-디옥소-16-[4,7,10-트리스(2-tert-부톡시-2-옥소에틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]-5,8,11-트리옥사-2,14-디아자헥사데칸-1-일}벤조일)글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신 tert-부틸에스테르(863mg)를 사용하여, 상기 실시예 2-11의 공정 (viii)과 마찬가지로 하여, 표제 화합물(40.0mg)을 얻었다. MS(ESI+): 992.5
(vi) [N-{3-[3-옥소-15-(옥소-κO)-16-{4,7,10-트리스[(카르복시-κO)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일-κ4N1,N4,N7,N10}-5,8,11-트리옥사-2,14-디아자헥사데칸-1-일]벤조일}글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류시나토(3-)]가돌리늄의 합성
N-(3-{3,15-디옥소-16-[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]-5,8,11-트리옥사-2,14-디아자헥사데칸-1-일}벤조일)글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신(40mg)를 사용하여, 상기 실시예 2-11의 공정 (ix)와 마찬가지로 하여, 표제 화합물(15.9mg)을 얻었다. MS(ESI-): 1145.0
(vii) 복합체 No.15의 합성
[N-{3-[3-옥소-15-(옥소-κO)-16-{4,7,10-트리스[(카르복시-κO)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일-κ4N1,N4,N7,N10}-5,8,11-트리옥사-2,14-디아자헥사데칸-1-일]벤조일}글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류시나토(3-)]가돌리늄을 사용하여, 상기 실시예 2-11의 공정 (x)과 마찬가지로 하여, 복합체를 얻었다. 당해 복합체는, 분자량 47.9kDa의 Fab2 1개에 대하여 분자량 1147의 [Gd/DOTA-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(=O)-Gly-Lys*-Z2(#N)]이 1개 결합한 복합체, 2개 결합한 복합체, 및 3개 결합한 복합체의 혼합물임을 MS 해석에 의해 확인하였다.
(실시예 2-24. ([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(=O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#S)]p-Fab2)의 합성)
복합체 No.24의 합성(이미노티올란 경유 콘주게이션)
4.45mg/mL Fab2의 붕산 완충액(160μL)에 2mg/mL2-이미노티올란(이하, 2-IT라고 약칭)의 0.1M 붕산 완충액(5μL)을 첨가하고, 37℃에서 40분간 인큐베이트하였다. 과잉의 2-IT는 아미콘 울트라-0.5mL 원심식 필터를 사용하여, 인산 완충 생리 식염수로 세정을 3회 반복하고, 마지막에 농축하였다.
실시예 2-13(ix)에서 합성한 [N-{3-[(2-{4,7,10-트리스[(카르복시-κO)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일-κ4N1,N4,N7,N10}아세트아미드-κO)메틸]벤조일}-L-메티오닐글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류시나토(3-)]가돌리늄(1mg)을 DMSO(40μL)에 용해시켰다. 그 용액에 0.1M 붕산 완충액(40μL)을 첨가하고, pH6.0이 되도록 0.1M 탄산나트륨 수용액을 첨가하였다.
항체를 포함하는 얻어진 여액에 조제한 링커 용액을 첨가하고, 30℃에서 2시간 인큐베이트하였다. EDTA 함유 인산 완충 생리 식염수(pH6.0)를 첨가한 후, 30℃에서 10분간 인큐베이트하였다. PD-10 칼럼을 사용하여 정제하고, 아미콘 울트라-0.5mL 원심식 필터로 회수하였다. 회수한 용액을 인산 완충 생리 식염수로 7회 세정하고 마지막에 농축 후, 멤브레인 필터로 여과하여, 복합체를 얻었다. 당해 복합체는, 분자량 47.9kDa의 Fab2 1개에 대하여 분자량 1190의 [Gd/DOTA-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(=O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#S)]이 1개 결합한 복합체 및 2개 결합한 복합체의 혼합물임을 MS 해석에 의해 확인하였다.
(실시예 2-29. ([Gd/DOTA-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(=O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#N)]p-Fab2)의 합성)
(i) 3-(17,17-디메틸-3,15-디옥소-5,8,11,16-테트라옥사-2,14-디아자옥타데칸-1-일)벤조산메틸에스테르의 합성
2,2-디메틸-4-옥소-3,8,11,14-테트라옥사-5-아자헥사데칸-16-산(396mg)의 디클로로메탄(10mL) 용액에 3-(아미노메틸) 벤조산메틸에스테르일염산염(286mg), HATU(590mg), Et3N(900μL)을 첨가하고, 실온에서 2시간 교반하였다. 반응 혼합물을 농축하고, 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(용매 구배; 2→6％ 메탄올/클로로포름)로 정제함으로써 표제 화합물(598mg)을 얻었다. MS(ESI+); 455.2
(ii) 3-(17,17-디메틸-3,15-디옥소-5,8,11,16-테트라옥사-2,14-디아자옥타데칸-1-일)벤조산의 합성
3-(17,17-디메틸-3,15-디옥소-5,8,11,16-테트라옥사-2,14-디아자옥타데칸-1-일)벤조산메틸에스테르(597mg)의 THF(15mL) 용액에 1M 수산화나트륨 수용액(4mL) 및 물(5mL)을 첨가하고, 실온에서 5시간 교반하였다. 반응 용액을 물로 희석하고, 10％ 시트르산을 첨가한 후, 아세트산에틸로 추출하고, 모은 유기층을 포화 식염수로 세정하였다. 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과 후, 여액을 감압 농축함으로써 표제 화합물(662mg)을 얻었다. MS(ESI+); 441.1
(iii) N-(tert-부톡시카르보닐)-L-메티오닐글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신 tert-부틸에스테르의 합성
N-(tert-부톡시카르보닐)글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신 tert-부틸에스테르(1.63g), 디클로로메탄(5mL)의 혼합물에 빙랭 하에서 TFA(3mL)를 첨가하고, 동일 온도에서 1시간 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 농축하였다. N-(tert-부톡시카르보닐)-L-메티오닌(1.11g), 디클로로메탄(8mL), HATU(2.12g)의 혼합물에 DIPEA(5mL)을 첨가하고, 실온에서 5분간 교반하였다. 이 반응 혼합물에, 앞선 반응에서 얻어진 잔사의 디클로로메탄(4mL) 용액을 첨가하고, 실온에서 20시간 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 농축한 후, 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(용매 구배; 0→5％ 메탄올/클로로포름)로 정제함으로써 표제 화합물(1.63g)을 얻었다. MS(APCI/ESI+); 571.3
(iv) N-[3-(17,17-디메틸-3,15-디옥소-5,8,11,16-테트라옥사-2,14-디아자옥타데칸-1-일)벤조일]-L-메티오닐글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신 tert-부틸에스테르의 합성
N-(tert-부톡시카르보닐)-L-메티오닐글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신 tert-부틸에스테르(150mg), 디클로로메탄(2mL)의 혼합물에 빙랭 하에서 TFA(2mL)를 첨가하고, 동일 온도에서 1시간 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 농축하였다. 3-(17,17-디메틸-3,15-디옥소-5,8,11,16-테트라옥사-2,14-디아자옥타데칸-1-일)벤조산(120mg), 디클로로메탄(3mL), HATU(150mg)의 혼합물에 DIPEA(360μL)을 첨가하고, 실온에서 5분간 교반하였다. 이 반응 혼합물에, 앞선 반응에서 얻어진 잔사의 디클로로메탄(2mL) 용액을 첨가하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 농축한 후, 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(용매 구배; 0→5％ 메탄올/클로로포름)로 정제함으로써 표제 화합물(113mg)을 얻었다. MS(ESI+); 893.4
(v) N-(3-{3,15-디옥소-16-[4,7,10-트리스(2-tert-부톡시-2-옥소에틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]-5,8,11-트리옥사-2,14-디아자헥사데칸-1-일}벤조일)-L-메티오닐글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신tert-부틸에스테르테트라키스(트리플루오로아세트산)염의 합성
N-[3-(17,17-디메틸-3,15-디옥소-5,8,11,16-테트라옥사-2,14-디아자옥타데칸-1-일)벤조일]-L-메티오닐글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신tert-부틸에스테르(113mg)와 디클로로메탄(2mL)의 혼합물에 빙랭 하에서 TFA(2mL)를 첨가하고, 동일 온도에서 1시간 교반 후, 감압 농축하여, 조생성물을 얻었다. DOTA-tris(t-Bu)에스테르(80mg)와 HATU(80mg) 및 디메틸아세트아미드(이하 DMAc라고 약칭)(1mL)의 혼합물에 DIPEA(0.22mL)를 실온에서 첨가하고 10분 교반한 후, 먼저 얻어진 조생성물의 DMAc(1mL) 혼합물을 첨가하고, 동일 온도에서 2시간 교반하였다. 반응 혼합물은 역상 칼럼 크로마토그래피(용매 구배; 0→50％ 아세토니트릴/0.1％ TFA 수용액)로 정제함으로써 표제 화합물(178mg)을 얻었다. MS(ESI-): 1345.8
(vi) N-(3-{3,15-디옥소-16-[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]-5,8,11-트리옥사-2,14-디아자헥사데칸-1-일}벤조일)-L-메티오닐글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신의 합성
N-(3-{3,15-디옥소-16-[4,7,10-트리스(2-tert-부톡시-2-옥소에틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]-5,8,11-트리옥사-2,14-디아자헥사데칸-1-일}벤조일)-L-메티오닐글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신 tert-부틸에스테르테트라키스(트리플루오로아세트산)염(178mg)를 사용하여, 상기 실시예 2-11의 공정 (viii)과 마찬가지로 하여, 표제 화합물(60.0mg)을 얻었다. MS(APCI/ESI+): 1123.4
(vii) [N-{3-[3-옥소-15-(옥소-κO)-16-{4,7,10-트리스[(카르복시-κO)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일-κ4N1,N4,N7,N10}-5,8,11-트리옥사-2,14-디아자헥사데칸-1-일]벤조일}-L-메티오닐글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류시나토(3-)]가돌리늄의 합성
N-(3-{3,15-디옥소-16-[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]-5,8,11-트리옥사-2,14-디아자헥사데칸-1-일}벤조일)-L-메티오닐글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신(40mg)를 사용하여, 상기 실시예 2-11의 공정 (ix)와 마찬가지로 하여, 표제 화합물(10.3mg)을 얻었다. MS(ESI+): 1278.3
(viii) 복합체 No.29의 합성
[N-{3-[3-옥소-15-(옥소-κO)-16-{4,7,10-트리스[(카르복시-κO)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일-κ4N1,N4,N7,N10}-5,8,11-트리옥사-2,14-디아자헥사데칸-1-일]벤조일}-L-메티오닐글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류시나토(3-)]가돌리늄을 사용하여, 상기 실시예 2-11의 공정 (x)과 마찬가지로 하여, 복합체를 얻었다. 당해 복합체는, 분자량 47.9kDa의 Fab2 1개에 대하여 분자량 1278의 [Gd/DOTA-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(=O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#N)]이 1개 결합한 복합체 및 2개 결합한 복합체의 혼합물임을 MS 해석에 의해 확인하였다.
(실시예 2-33. ([Gd/DOTA-[2,5-(1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린)]-C(=O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#N)]p-Fab2)의 합성)
(i) N-[2-(tert-부톡시카르보닐)-1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-5-카르보닐]-L-메티오닐글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신 tert-부틸에스테르의 합성
N-(tert-부톡시카르보닐)-L-메티오닐글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신 tert-부틸에스테르(150mg), 디클로로메탄(2mL)의 혼합물에 빙랭 하에서 TFA(2mL)를 첨가하고, 동일 온도에서 1시간 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 농축하였다. 2-(tert-부톡시카르보닐)-1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-5-카르복실산(88mg), 디클로로메탄(2mL), HATU(150mg), DIPEA(360μL)의 혼합물에, 앞선 반응에서 얻어진 잔사의 디클로로메탄(2mL) 용액을 첨가하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 농축한 후, 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(용매 구배; 0→6％ 메탄올/클로로포름)로 정제함으로써 표제 화합물(231mg)을 얻었다. MS(APCI/ESI+); 752.2 [M+Na]+
(ii) N-(2-{[4,7,10-트리스(2-tert-부톡시-2-옥소에틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세틸}-1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-5-카르보닐)-L-메티오닐글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신tert-부틸에스테르테트라키스(트리플루오로아세트산)염의 합성
N-[2-(tert-부톡시카르보닐)-1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-5-카르보닐]-L-메티오닐글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신 tert-부틸에스테르(231mg)를 사용하여, 상기 실시예 2-29의 공정 (v)와 마찬가지로 하여, 표제 화합물(222mg)을 얻었다. MS(ESI-): 1182.7
(iii) N-(2-{[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세틸}-1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-5-카르보닐)-L-메티오닐글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신의 합성
N-(2-{[4,7,10-트리스(2-tert-부톡시-2-옥소에틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세틸}-1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-5-카르보닐)-L-메티오닐글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신tert-부틸에스테르테트라키스(트리플루오로아세트산)염(222mg)를 사용하여, 상기 실시예 2-11의 공정 (viii)과 마찬가지로 하여, 표제 화합물(53mg)을 얻었다. MS(APCI/ESI+): 960.2
(iv) {N-[2-({4,7,10-트리스[(카르복시-κO)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일-κ4N1,N4,N7,N10}아세틸-κO)-1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-5-카르보닐]-L-메티오닐글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류시나토(3-)}가돌리늄의 합성
N-(2-{[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세틸}-1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-5-카르보닐)-L-메티오닐글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신(22mg)를 사용하여, 상기 실시예 2-11의 공정 (ix)와 마찬가지로 하여, 표제 화합물(7.0mg)을 얻었다. MS(ESI+): 1115.3
(v) 복합체 No.33의 합성
(iv)의 화합물을 사용하여, 상기 실시예 2-11의 공정 (x)과 마찬가지로 하여, 복합체를 얻었다. 당해 복합체는, 분자량 47.9kDa의 Fab2 1개에 대하여 분자량 1115의 [Gd/DOTA-[2,5-(1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린)]-C(=O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#N)]이 1개 결합한 복합체 및 2개 결합한 복합체의 혼합물임을 MS 해석에 의해 확인하였다.
(실시예 2-35. ([Gd/DOTA-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(=O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#S)]p-Fab2)의 합성)
복합체 No.35의 합성
실시예 2-29(vii)에서 합성한 [N-{3-[3-옥소-15-(옥소-κO)-16-{4,7,10-트리스[(카르복시-κO)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일-κ4N1,N4,N7,N10}-5,8,11-트리옥사-2,14-디아자헥사데칸-1-일]벤조일}-L-메티오닐글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류시나토(3-)]가돌리늄을 사용하여, 상기 실시예 2-24의 공정과 마찬가지로 하여, 복합체를 얻었다. 당해 복합체는, 분자량 47.9kDa의 Fab2 1개에 대하여 분자량 1380의 [Gd/DOTA-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(=O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#S)]이 1개 결합한 복합체인 것을 MS 해석에 의해 확인하였다.
(실시예 2-40. ([Gd/4arm-DOTA-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=S)-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(=O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#S)]p-Fab2)의 합성)
(i) N-(3-{[(tert-부톡시카르보닐)아미노]메틸}벤조일)-L-메티오닐글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신 tert-부틸에스테르의 합성
N-(tert-부톡시카르보닐)-L-메티오닐글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신 tert-부틸에스테르(690mg)를 사용하여, 상기 실시예 2-33의 공정 (i)과 마찬가지로 하여, 표제 화합물(710mg)을 얻었다. MS(ESI+): 726.5 [M+Na]+
(ii) N-[3-(아미노메틸)벤조일]-L-메티오닐글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신 tert-부틸에스테르모노(트리플루오로아세트산)염의 합성
N-(3-{[(tert-부톡시카르보닐)아미노]메틸}벤조일)-L-메티오닐글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신 tert-부틸에스테르(41mg)를 사용하여, 상기 실시예 2-12(iv)와 마찬가지로 하여, 표제 화합물(42mg)의 조생성물을 얻었다. MS(ESI+): 604.3
(iii) N-[3-(아미노메틸)벤조일]-L-메티오닐글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신모노(트리플루오로아세트산)염의 합성
N-[3-(아미노메틸)벤조일]-L-메티오닐글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신tert-부틸에스테르모노(트리플루오로아세트산)염(41mg)의 디클로로메탄(4ml) 혼합물에, TFA(2ml)를 첨가하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 혼합물을 감압 농축 후, 톨루엔 공비하여 조생성물(43mg)을 얻었다. 그 중 16mg을 역상 칼럼 크로마토그래피(용매 구배; 5→50％ 아세토니트릴/0.1％ TFA 수용액)로 정제하여, 표제 화합물(11mg)을 얻었다. MS(ESI+): 548.2
(iv) N-[3-({[(4-{[1,4,7,10-테트라키스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-2-일]메틸}페닐)카르바모티오일]아미노}메틸)벤조일]-L-메티오닐글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신의 합성
N-[3-(아미노메틸)벤조일]-L-메티오닐글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신모노(트리플루오로아세트산)염(11mg)을 사용하여, 실시예 2-12의 공정 (viii)과 마찬가지로 하여, 표제 화합물(17mg)을 얻었다. MS(ESI+): 1099.5
(v) 히드로겐=[N-{3-[({[4-({1,4,7,10-테트라키스[(카르복시-κO)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-2-일-κ4N1,N4,N7,N10}메틸)페닐]카르바모티오일}아미노)메틸]벤조일}-L-메티오닐글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류시나토(4-)]가돌리네이트(1-)의 합성
N-[3-({[(4-{[1,4,7,10-테트라키스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-2-일]메틸}페닐)카르바모티오일]아미노}메틸)벤조일]-L-메티오닐글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신(16mg)을 사용하여, 실시예 2-12의 공정 (ix)와 마찬가지로 하여, 표제 화합물(6mg)을 얻었다. MS(ESI+): 1254.6
(vi) 복합체 No.40의 합성
히드로겐=[N-{3-[({[4-({1,4,7,10-테트라키스[(카르복시-κO)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-2-일-κ4N1,N4,N7,N10}메틸)페닐]카르바모티오일}아미노)메틸]벤조일}-L-메티오닐글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류시나토(4-)]가돌리네이트(1-)를 사용하여, 상기 실시예 2-24의 공정과 마찬가지로 하여, 복합체를 얻었다. 당해 복합체는, 분자량 47.9kDa의 Fab2 1개에 대하여 분자량 1355의 [Gd/4arm-DOTA-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=S)-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(=O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#S)]이 1개 결합한 복합체 및 2개 결합한 복합체의 혼합물임을 MS 해석에 의해 확인하였다.
(실시예 2-47: ([Gd/DOTA]p-Fab2)의 합성)
1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA)(16mg) 및 물(810μL)의 혼합 용액에, 빙랭 하, 1M 수산화나트륨 수용액(80μL)을 첨가하여 pH6으로 조제하였다. 얻어진 용액(239μL)에, 빙랭 하, 물(117μL)에 용해시킨 1-히드록시-2,5-디옥소피롤리딘-3-술폰산나트륨(2.3mg)을 첨가하였다. 그 후, 3-{[(에틸이미노)메틸리덴]아미노}-N,N-디메틸프로판-1-아민일염산염(이하 EDC HCl이라고 약칭) 수용액(8.3μL, 25mg/mL)을 첨가하고, 빙랭 하 30분 교반하여, N-히드록시술포숙신이미딜 DOTA 용액을 조제하였다. Fab2 첨가 전에 0.2M 인산수소이나트륨 수용액(pH9)(40μL)을 첨가하여 pH7로 조제하였다.
(i) 17.8mg/mL Fab2(60μL)의 0.1M 인산수소이나트륨 수용액(390μL)으로 조제한 N-히드록시술포숙신이미딜 DOTA 용액(200μL)을 첨가하고, 4℃에서 23시간 인큐베이트하였다. 과잉의 링커는 아미콘 울트라-0.5mL 원심식 필터를 사용하여 10mM 인산 완충액으로 세정을 3회 반복하고, 0.3M의 아세트산 암모늄 완충액으로 세정하고 마지막에 농축 후, 멤브레인 필터로 여과하여, 복합체를 얻었다.
(ii) (i)에서 제작한 복합체를 포함하는 0.3M의 아세트산 암모늄 완충액을 마찬가지의 완충액으로 희석하고, 0.25M Acetate buffer를 사용하여 pH6.62로 조절하였다. 이 2.8mg/ml로 조제한 Fab2 용액에, 0.057M로 조제한 GdCl3 수용액(35μL)을 첨가하고, 37℃에서 0.5시간 인큐베이트하였다. 반응 후, 0.05M EDTA(525μL)를 첨가하고, 그 후 PD-10 칼럼을 사용하여 정제하고, 아미콘 울트라-0.5mL 원심식 필터로 회수하였다. 회수한 용액을 인산 완충 생리 식염수로 5회 세정하고, 마지막에 농축 후, 멤브레인 필터로 여과하여, 복합체를 얻었다. 당해 복합체는, 분자량 47.9kDa의 Fab2 1개에 대하여 분자량 542의 [Gd/DOTA]이 1개 또는 2개 결합한 복합체의 혼합물임을 MS 해석에 의해 확인하였다.
(실시예 2-48: ([Gd/4arm-DOTA-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=S)]p-Fab2)의 합성)
(i) 킬레이트제인 DOTA의 Fab2에의 결합에는, p-SCN-Bn-DOTA(Macrocyclics사)를 사용하였다. 인산 완충 생리 식염수(pH7.4) 및 글리세린으로 2.54mg/mL로 조제한 Fab2 용액에, 0.1M 탄산나트륨 용액(pH9.0)을 첨가하여 pH8.8-9.5로 조절하였다. 이것에 p-SCN-Bn-DOTA를 첨가하고, 37℃에서 2시간 인큐베이트하였다. 반응 후, 아미콘 울트라-0.5mL 원심식 필터로 회수하고, 복합체를 정제하였다. 당해 복합체는, 분자량 47.9kDa의 Fab2 1개에 대하여 분자량 553의 [4arm-DOTA-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=S)]이 1개 또는 2개 결합한 복합체인 것을 MS 해석에 의해 확인하였다.
(ii) (i)에서 제작한 복합체를 사용하여 상기 실시예 2-47의 공정 (ii)와 마찬가지로 하여 복합체를 얻었다. 당해 복합체는, 분자량 47.9kDa의 Fab2 1개에 대하여 분자량 706의 [Gd/4arm-DOTA-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=S)]이 1개 결합한 복합체인 것을 MS 해석에 의해 확인하였다.
(실시예 2-60: ([DFO-C(=O)-CH2O-(1,3-Ph)-C(=O)-Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1(#S)]p-Fab2)의 합성)
(i) 3-[2-(벤질옥시)-2-옥소에톡시]벤조산의 합성
(3-포르밀페녹시)아세트산벤질에스테르(2.90g), 2-메틸프로판-2-올(60mL) 및 물(30mL)의 혼합물에, 실온에서 2-메틸부트-2-엔(6mL), 인산이수소나트륨이수화물(3.35g) 및 아염소산나트륨(3.64g)을 첨가하고, 2시간 교반하였다. 반응액에 아세트산에틸과 1M 염산(60mL)을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 물 및 포화 염화나트륨 수용액으로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조, 여과하였다. 여액을 농축함으로써 표제 화합물(2.93g)을 얻었다. MS(ESI-); 285.1
(ii) N-[(벤질옥시)카르보닐]글리실-O-(2-에톡시-2-옥소에틸)-L-티로신 tert-부틸에스테르의 합성
N-[(벤질옥시)카르보닐]글리실-L-티로신 tert-부틸에스테르(2.49g)를 아세톤(50mL)에 용해하고, 브로모아세트산에틸에스테르(2.05g), 탄산칼륨(2.41g)을 첨가하고, 실온에서 4시간 교반하였다. 불용물을 여과 제거하고, 여액을 농축하고, 얻어진 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(아세트산에틸:헥산=30:70-60:40)로 정제하여, 표제 화합물(2.99g)을 얻었다. MS(ESI+): 537.4 [M+Na]+
(iii) N-{3-[2-(벤질옥시)-2-옥소에톡시]벤조일}글리실-O-(2-에톡시-2-옥소에틸)-L-티로신 tert-부틸에스테르의 합성
N-[(벤질옥시)카르보닐]글리실-O-(2-에톡시-2-옥소에틸)-L-티로신 tert-부틸에스테르(2.75g)를 에탄올(55mL)에 용해하고, 아르곤 분위기 하에서, 10％ 팔라듐 담지 탄소(50％ 함수, 550mg)를 첨가하고, 수소 분위기 하(1atm) 실온에서 철야 교반하였다. 계 내를 아르곤 치환 후, 불용물을 여과 제거, 여액을 농축하고, 잔사를 디클로로메탄(55mL)에 용해하고, 3-[2-(벤질옥시)-2-옥소에톡시]벤조산(1.99g), HATU(2.84g), Et3N(1.5mL)을 첨가하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 반응액을 농축하고, 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(아세트산에틸:헥산=30:70-70:30)로 정제하여, 표제 화합물(3.07g)을 얻었다. MS(ESI-): 647.4
(iv) N-[3-(카르복시메톡시)벤조일]글리실-O-(2-에톡시-2-옥소에틸)-L-티로신 tert-부틸에스테르의 합성
N-{3-[2-(벤질옥시)-2-옥소에톡시]벤조일}글리실-O-(2-에톡시-2-옥소에틸)-L-티로신 tert-부틸에스테르(3282mg)를 THF(66mL)에 용해하고, 아르곤 분위기 하에서, 10％ 팔라듐 담지 탄소(50％ 함수, 328mg)를 첨가하고, 수소 분위기 하에서, 실온에서 철야 교반하였다. 반응액을 셀라이트 여과하고, 여액을 농축하여, 표제 화합물(2.54g)을 얻었다. MS(ESI-): 557.4
(v) N-{3-[(9,20,31-트리히드록시-2,10,13,21,24,32-헥사옥소-3,9,14,20,25,31-헥사아자트리트리아콘탄-1-일)옥시]벤조일}글리실-O-(2-에톡시-2-옥소에틸)-L-티로신 tert-부틸에스테르의 합성
N4-{5-[아세틸(히드록시)아미노]펜틸}-N1-(5-{4-[(5-아미노펜틸)(히드록시)아미노]-4-옥소부탄아미드}펜틸)-N1-히드록시부탄디아미드모노메탄술폰산염(DF0.MeSO3H)(500mg), N-[3-(카르복시메톡시)벤조일]글리실-O-(2-에톡시-2-옥소에틸)-L-티로신 tert-부틸에스테르(446mg), EDC HCl(175mg), 1H-벤조트리아졸-1-올(이하 HOBt라고 약칭)(123mg)에 DMF(5mL), Et3N(0.16mL)을 첨가하고, 실온에서 철야 교반하였다. 반응액에 0.1％ TFA 수용액(1ml), TFA(0.03mL)를 첨가하고, 역상 칼럼 크로마토그래피(0.1％ TFA 수용액:아세토니트릴=95:5-0:100)로 정제하여, 표제 화합물(548mg)을 얻었다. MS(ESI-): 1099.7
(vi) N-{3-[(9,20,31-트리히드록시-2,10,13,21,24,32-헥사옥소-3,9,14,20,25,31-헥사아자트리트리아콘탄-1-일)옥시]벤조일}글리실-O-(카르복시메틸)-L-티로신 tert-부틸에스테르의 합성
N-{3-[(9,20,31-트리히드록시-2,10,13,21,24,32-헥사옥소-3,9,14,20,25,31-헥사아자트리트리아콘탄-1-일)옥시]벤조일}글리실-O-(2-에톡시-2-옥소에틸)-L-티로신 tert-부틸에스테르(500mg)에 메탄올(5mL) 및 DMF(5mL)를 첨가하고, 조금 가열하여 용해하고, 1M 수산화나트륨 수용액(600μL)을 첨가하고, 실온에서 철야 교반하였다. 1M 수산화나트륨 수용액(600μL)을 추가하고, 실온에서 철야 교반하였다. 빙랭 하에서 TFA(90μL)를 첨가하고, 감압 하 메탄올을 증류 제거하고, 얻어진 용액을 역상 칼럼 크로마토그래피(0.1％ TFA 수용액:아세토니트릴=95:5-0:100)로 정제함으로써 표제 화합물(315mg)을 얻었다. MS(ESI-): 1071.6
(vii) N-{3-[(9,20,31-트리히드록시-2,10,13,21,24,32-헥사옥소-3,9,14,20,25,31-헥사아자트리트리아콘탄-1-일)옥시]벤조일}글리실-O-(2-{[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸]아미노}-2-옥소에틸)-L-티로신 tert-부틸에스테르의 합성
N-{3-[(9,20,31-트리히드록시-2,10,13,21,24,32-헥사옥소-3,9,14,20,25,31-헥사아자트리트리아콘탄-1-일)옥시]벤조일}글리실-O-(카르복시메틸)-L-티로신 tert-부틸에스테르(269mg), EDC HCl(58mg), HOBt(41mg)의 혼합물에 DMF(4mL)를 첨가하고, 또한 1-(2-아미노에틸)-1H-피롤-2,5-디온일염산염(44mg), Et3N(35μL)을 첨가하고, 실온에서 4시간 교반하였다. 반응액에 0.1％ TFA 수용액(1mL)을 첨가하고, 역상 칼럼 크로마토그래피(0.1％ TFA 수용액:아세토니트릴=95:5-0:100)로 정제하여, 원료 카르복실산과 표제 화합물의 혼합물(155mg, 약 6:4)을 얻었다. 이것을 DMSO(1mL) 및 DMF(2mL)에 용해시키고, EDC HCl(22mg), HOBt(15mg)을 첨가하고, 실온에서 5분간 교반 후, 1-(2-아미노에틸)-1H-피롤-2,5-디온일염산염(15.5mg), Et3N(12μL)을 첨가하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 반응액에 0.1％ TFA수(1mL)를 첨가하고, 역상 칼럼 크로마토그래피(0.1％ TFA 수용액:아세토니트릴=95:5-10:90)로 정제함으로써, 표제 화합물(118mg)을 얻었다. MS(ESI-): 1193.6
(viii) N-{3-[(9,20,31-트리히드록시-2,10,13,21,24,32-헥사옥소-3,9,14,20,25,31-헥사아자트리트리아콘탄-1-일)옥시]벤조일}글리실-O-(2-{[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸]아미노}-2-옥소에틸)-L-티로신의 합성
N-{3-[(9,20,31-트리히드록시-2,10,13,21,24,32-헥사옥소-3,9,14,20,25,31-헥사아자트리트리아콘탄-1-일)옥시]벤조일}글리실-O-(2-{[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸]아미노}-2-옥소에틸)-L-티로신 tert-부틸에스테르(118mg)를 TFA(1.2mL)에 용해하고, 실온에서 1.5시간 교반하였다. 반응액을 농축하고, DMF(1.5ml), 물(0.5ml)을 첨가하고, 역상 칼럼 크로마토그래피(0.1％ TFA 수용액:아세토니트릴=95:5-10:90)로 정제함으로써, 표제 화합물(82mg)을 얻었다. MS(ESI-): 1137.5
(ix) 복합체 No.60의 합성
0.1M 붕산 완충액으로 4.45mg/mL로 조제한 Fab2 용액에 0.1M 붕산 완충액으로 조제한 2-IT 용액을 첨가하고, 37℃에서 30분간 인큐베이트하였다. 과잉의 2-IT는 아미콘 울트라-0.5mL 원심식 필터를 사용하여 EDTA 함유 인산 완충 생리 식염수(pH6.0)로 세정하고, 마지막에 농축 후, 멤브레인 필터로 여과하였다. 얻어진 여액에, DMF에 용해시킨 N-{3-[(9,20,31-트리히드록시-2,10,13,21,24,32-헥사옥소-3,9,14,20,25,31-헥사아자트리트리아콘탄-1-일)옥시]벤조일}글리실-O-(2-{[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸]아미노}-2-옥소에틸)-L-티로신을 첨가하고, 0.1M 붕산 완충액(pH8.5)으로 희석하고, 실온에서 2시간 인큐베이트하였다. 과잉의 시약은 아미콘 울트라-0.5mL 원심식 필터를 사용하여 EDTA 함유 인산 완충 생리 식염수(pH6.0)로 세정하고, 그것을 3회 반복하고, 마지막에 농축 후, 멤브레인 필터로 여과하였다.
계속해서, 얻어진 상청에, 인산 완충 생리 식염수(pH6.0)로 10mg/mL로 조제한 2-요오도 아세트아미드 용액을 첨가한 후, 37℃에서 30분간 인큐베이트하였다. 과잉의 요오드아세트아미드는 아미콘 울트라-0.5mL 원심식 필터를 사용하여 인산 완충 생리 식염수로 세정을 3회 반복하고, 마지막에 농축 후, 멤브레인 필터로 여과하여, Fab2가 결합한 복합체를 정제하였다. 당해 복합체는, 분자량 47.9kDa의 Fab2 1개에 대하여 분자량 1241의 [DFO-C(=O)-CH2O-(1,3-Ph)-C(=O)-Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1(#S)]이 1개 결합한 복합체의 혼합물임을 MS 해석에 의해 확인하였다.
(실시예 2-61: ([DFO-C(=O)-(CH2CH2O)4-(1,3-Ph)-C(=O)-Gly-Lys*-Z2(#S)]p-Fab2)의 합성)
(i) N-(3-히드록시벤조일)글리신tert-부틸에스테르의 합성
3-히드록시벤조산(1.0g)과 글리신tert-부틸에스테르일염산염(1.2g)의 DMF(10mL) 혼합물에 빙랭 하 HATU(3.3g) 및 DIPEA(3mL)을 첨가하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 혼합물에 물 및 아세트산에틸을 첨가하여 2회 분액 추출하고, 유기층을 물 및 포화 염화나트륨 수용액으로 세정 후, 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과한 후, 여액을 감압 농축하고, 얻어진 고체에 아세트산에틸을 첨가하고 실온에서 교반한 뒤 불용물을 여과취출하고, 여액을 농축하였다. 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(헥산/아세트산에틸=95/5-50/50)로 정제하고 목적물의 프랙션을 모아서 농축하고, 감압 건조하여, 표제 화합물(1.23g)을 얻었다. MS(ESI+): 274.2 [M+Na]+
(ii) 3-{2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에톡시}프로판산벤질에스테르의 합성
빙랭 하 3-{2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에톡시}프로판산 tert-부틸에스테르(3.0g)에 4M 염화수소/디옥산(10mL)을 첨가한 뒤, 그의 혼합물을 실온에서 1시간 교반하였다. 농축 후, 톨루엔으로 2번 공비 건조를 행한 후, 실온에서 메탄올(20mL)과 1M 수산화나트륨 수용액(13mL)을 첨가하고, 동일 온도에서 1시간반 교반하였다. 혼합물을 농축한 후, THF(10mL), 메탄올(10mL) 및 브롬화 벤질(1.8mL)을 첨가하고, 실온에서 3일간 교반하였다. 혼합물을 농축하고, 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제(헥산/아세트산에틸=95/5-0/100 → 클로로포름/메탄올=90/10)하여, 표제 화합물(2.19g)을 얻었다. MS(ESI+): 313.2
(iii) N-{3-[(3-옥소-1-페닐-2,6,9,12-테트라옥사테트라데칸-14-일)옥시]벤조일}글리신 tert-부틸에스테르의 합성
N-(3-히드록시벤조일)글리신 tert-부틸에스테르(915mg), 3-{2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에톡시}프로판산벤질에스테르(1.38g), 아조디카르복실산디에틸(40％ 톨루엔 용액, 약 2.2M, 3.4mL), THF(20mL)를 첨가하고, 그 후 실온에서 트리페닐포스핀(2.0g)을 조금씩 첨가한 후, 배스 온도 60℃에서 철야 교반하였다. 염화마그네슘(1.5g) 및 톨루엔(20mL)을 첨가하고, 배스 온도 60℃에서 2시간 가열 교반하였다. 실온까지 방랭한 뒤, 석출된 고체를 여과로 제거하고, 용매를 증류 제거하였다. 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제(실리카겔; 헥산/아세트산에틸=95/5-20/80)한 후, 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 다시 정제(아미노실리카겔; 헥산/아세트산에틸=95/5-50/50)하여, 표제 화합물(1.12g)을 얻었다. MS(ESI+): 546.4
(iv) N-{3-[(3-옥소-1-페닐-2,6,9,12-테트라옥사테트라데칸-14-일)옥시]벤조일}글리신의 합성
실온에서 N-{3-[(3-옥소-1-페닐-2,6,9,12-테트라옥사테트라데칸-14-일)옥시]벤조일}글리신 tert-부틸에스테르(1.11g)를 4M 염화수소/디옥산(5mL)에 용해시키고, 동일 온도에서 2시간 교반하였다. 혼합물을 농축하고, 감압 건조하여 표제 화합물(1.12g)을 얻었다. MS(ESI+): 490.3
(v) N-{3-[(3-옥소-1-페닐-2,6,9,12-테트라옥사테트라데칸-14-일)옥시]벤조일}글리실-N6-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리신 tert-부틸에스테르의 합성
N-{3-[(3-옥소-1-페닐-2,6,9,12-테트라옥사테트라데칸-14-일)옥시]벤조일}글리신(1300mg), N6-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리신 tert-부틸에스테르일염산염(1.0g)의 DMF(20mL) 용액에 빙랭 하 HATU(1.2g) 및 DIPEA(1.4mL)을 첨가하고, 실온에서 2시간 교반하였다. 혼합물에 물 및 아세트산에틸을 첨가하여 분액 추출하고, 유기층을 물 및 포화 식염수로 세정 후, 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과한 후, 여액을 감압 농축하였다. 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제(아미노실리카겔; 헥산/아세트산에틸=90/10-0/100)하여, 표제 화합물(1.14g)을 얻었다. MS(ESI+): 808.5
(vi) N-[3-(2-{2-[2-(2-카르복시에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)벤조일]글리실-L-리신 tert-부틸에스테르의 합성
N-{3-[(3-옥소-1-페닐-2,6,9,12-테트라옥사테트라데칸-14-일)옥시]벤조일}글리실-N6-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리신 tert-부틸에스테르(1.12g), Et3N(20μL) 및 에탄올(20mL)의 혼합물에, 10％ 팔라듐 담지 탄소(50％ 함수, 200mg)를 실온에서 첨가하고, 수소 분위기 하에서, 동일 온도에서 철야 교반하였다. 개방계로 하여 30분 이상 실온 교반 후, 반응액을 셀라이트 여과하고, 여액을 농축하여, 표제 화합물(825mg)을 얻었다. MS(ESI+): 584.5
(vii) N-[3-(2-{2-[2-(2-카르복시에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)벤조일]글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신 tert-부틸에스테르의 합성
N-[3-(2-{2-[2-(2-카르복시에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)벤조일]글리실-L-리신 tert-부틸에스테르(350mg), THF(3mL) 및 DMF(1mL)의 혼합물에 실온에서 2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-카르복실산메틸에스테르(150mg) 및 Et3N(500μL)을 첨가하고, 배스 온도 60℃에서 4일간 교반하였다. 혼합물을 실온까지 냉각 후, TFA(300μL) 및 물(500μl)을 첨가해서 중화하였다. 그의 혼합물에 물과 DMF를 적량 첨가하고, 역상 칼럼 크로마토그래피(0.1％ TFA 수용액:아세토니트릴=95:5-0:100)로 정제하였다. 목적물의 프랙션을 모아서 농축하고, 감압 건조하여, 표제 화합물(250mg)을 얻었다. MS(ESI+): 664.5
(viii) N-{3-[(19,30,41-트리히드록시-12,20,23,31,34,42-헥사옥소-3,6,9-트리옥사-13,19,24,30,35,41-헥사아자트리테트라콘탄-1-일)옥시]벤조일}글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신tert-부틸에스테르의 합성
N4-{5-[아세틸(히드록시)아미노]펜틸}-N1-(5-{4-[(5-아미노펜틸)(히드록시)아미노]-4-옥소부탄아미드}펜틸)-N1-히드록시부탄디아미드모노메탄술폰산염(DF0.MeSO3H)(240mg), N-[3-(2-{2-[2-(2-카르복시에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)벤조일]글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신 tert-부틸에스테르(243mg)의 DMF(3mL) 및 DMSO(1mL)의 혼합물에 빙랭 하 EDC HCl(140mg), HOBt(100mg) 및 DIPEA(200μL)를 첨가하고, 실온에서 3시간 교반하였다. TFA(100μL) 및 물(500μL)을 첨가하고, 그 용액을 역상 칼럼 크로마토그래피(0.1％ TFA 수용액:아세토니트릴=95:5-10:90)로 정제하여, 동결 건조하여 표제 화합물(207mg)을 얻었다. MS(ESI+): 1228.5 [M+Na]+
(ix) N-{3-[(19,30,41-트리히드록시-12,20,23,31,34,42-헥사옥소-3,6,9-트리옥사-13,19,24,30,35,41-헥사아자트리테트라콘탄-1-일)옥시]벤조일}글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신의 합성
실온에서 N-{3-[(19,30,41-트리히드록시-12,20,23,31,34,42-헥사옥소-3,6,9-트리옥사-13,19,24,30,35,41-헥사아자트리테트라콘탄-1-일)옥시]벤조일}글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신 tert-부틸에스테르(202mg)에 TFA(1mL)를 첨가하고, 동일 온도에서 1시간 교반하였다. 혼합물을 농축하고, DMF(4ml) 및 물(500μL)을 첨가한 혼합물을 역상 칼럼 크로마토그래피(0.1％ TFA 수용액:아세토니트릴=95:5-10:90)로 정제하여, 동결 건조하여 표제 화합물(137mg)을 얻었다. MS(ESI-): 1148.7
(x) 복합체 No.61의 합성
N-{3-[(19,30,41-트리히드록시-12,20,23,31,34,42-헥사옥소-3,6,9-트리옥사-13,19,24,30,35,41-헥사아자트리테트라콘탄-1-일)옥시]벤조일}글리실-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-L-노르류신을 사용하여, 상기 실시예 2-60의 공정 (ix)와 마찬가지로 하여, 복합체를 얻었다. 당해 복합체는, 분자량 47.9kDa의 Fab2 1개에 대하여 분자량 1252의 [DFO-C(=O)-(CH2CH2O)4-(1,3-Ph)-C(=O)-Gly-Lys*-Z2(#S)]이 1개 결합한 복합체 및 2개 결합한 복합체의 혼합물임을 MS 해석에 의해 확인하였다.
(실시예 2-18. ([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1(#N)]p-Fab2)의 합성)
(i) (4-{[(tert-부톡시카르보닐)아미노]메틸}페닐)카르밤산4-니트로페닐에스테르의 합성
질소 분위기 하에서, 카르보노클로라이드산4-니트로페닐에스테르(952mg)의 디클로로메탄(10ml) 용액을 빙랭하고, [(4-아미노페닐)메틸]카르밤산tert-부틸에스테르(1000mg) 및 피리딘(430μL)의 디클로로메탄(10mL) 혼합 용액을 적하한 후, 동일 온도에서 1시간 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 농축하고, 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(용매 구배; 10→100％ 아세트산에틸/헥산)로 정제하여, 조생성물을 얻었다. 조생성물에 아세트산에틸을 첨가하고 교반하여 고체를 분쇄하였다. 고체를 여과취출하고, 아세트산에틸로 세정 후, 감압 건조시킴으로써 표제 화합물(861mg)을 얻었다. MS(ESI+): 410.3 [M+Na]+
(ii) L-메티오닐-N1-[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸]-L-이소류신아미드모노(트리플루오로아세트산)염의 합성
N-(tert-부톡시카르보닐)-L-메티오닐-N1-[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸]-L-이소류신아미드(257mg)의 디클로로메탄(4ml) 용액에, 빙랭 하, TFA(2ml)를 적하하였다. 혼합물을 동일 온도에서, 1시간 교반하였다. 혼합물을 감압 농축하고, 디이소프로필에테르를 첨가하고, 데칸테이션을 2회 행하여 침전한 고체를 세정하여, 표제 화합물(248mg)의 조생성물을 얻었다. MS(ESI+): 385.3
(iii) N-[(4-{[(tert-부톡시카르보닐)아미노]메틸}페닐)카르바모일]-L-메티오닐-N1-[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸]-L-이소류신아미드의 합성
(4-{[(tert-부톡시카르보닐)아미노]메틸}페닐)카르밤산4-니트로페닐에스테르(54mg)와 L-메티오닐-N1-[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸]-L-이소류신아미드모노(트리플루오로아세트산)염(70mg)의 디클로로메탄(5ml) 혼합 용액에 TEA(59μL)을 첨가하고, 실온에서 30분간 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 농축하고, 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(용매 구배; 2→6％ 메탄올/클로로포름)로 정제하여, 표제 화합물(55mg)을 얻었다. MS(ESI+): 633.5
(iv) N-{[4-(아미노메틸)페닐]카르바모일}-L-메티오닐-N1-[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸]-L-이소류신아미드모노(트리플루오로아세트산)염의 합성
N-[(4-{[(tert-부톡시카르보닐)아미노]메틸}페닐)카르바모일]-L-메티오닐-N1-[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸]-L-이소류신아미드(54mg)의 디클로로메탄(4ml) 용액에, 빙랭 하, TFA(2ml)를 적하하고, 동일 온도에서 1시간 교반하였다. 혼합물을 감압 농축하고, 디이소프로필에테르를 첨가하고 데칸테이션을 2회 행하여 침전한 고체를 세정하여, 표제 화합물(65mg)의 조생성물을 얻었다. MS(ESI+): 555.4 [M+Na]+
(v) N-{[4-({2-[4,7,10-트리스(2-tert-부톡시-2-옥소에틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세트아미드}메틸)페닐]카르바모일}-L-메티오닐-N1-[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸]-L-이소류신아미드테트라키스(트리플루오로아세트산)염의 합성
N-{[4-(아미노메틸)페닐]카르바모일}-L-메티오닐-N1-[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸]-L-이소류신아미드모노(트리플루오로아세트산)염(64mg), DOTA-tris(t-Bu)에스테르(50mg)의 DMAc(2mL) 혼합 용액에 HATU(66mg), DIPEA(45μL)을 첨가하고, 실온에서 2시간 교반하였다. 반응 혼합물에 1％ TFA 수용액(약 4ml) 및 아세토니트릴(약 1ml)을 첨가한 후, 그 희석 용액을 역상 칼럼 크로마토그래피(용매 구배; 20→100％ 0.1％ TFA 아세토니트릴/0.1％ TFA 수용액)로 정제함으로써 표제 화합물(92mg)을 얻었다. MS(ESI+): 1109.4 [M+Na]+
(vi) N-{[4-({2-[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세트아미드}메틸)페닐]카르바모일}-L-메티오닐-N1-[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸]-L-이소류신아미드테트라키스(트리플루오로아세트산)염의 합성
N-{[4-({2-[4,7,10-트리스(2-tert-부톡시-2-옥소에틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세트아미드}메틸)페닐]카르바모일}-L-메티오닐-N1-[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸]-L-이소류신아미드테트라키스(트리플루오로아세트산)염(90mg)의 디클로로메탄(4mL) 용액에 TFA(4mL)을 첨가하고, 실온에서 철야 교반하였다. 감압 농축한 후, 잔사를 역상 칼럼 크로마토그래피(용매 구배; 5→50％ 아세토니트릴/0.1％ TFA 수용액)로 정제함으로써 표제 화합물(57mg)을 얻었다. MS(ESI+): 919.4
(vii) [N-({4-[(2-{4,7,10-트리스[(카르복시-κO)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일-κ4N1,N4,N7,N10}아세트아미드-κO)메틸]페닐}카르바모일)-L-메티오닐-N1-[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸]-L-이소류신아미다토(3-)]가돌리늄의 합성
N-{[4-({2-[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세트아미드}메틸)페닐]카르바모일}-L-메티오닐-N1-[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸]-L-이소류신아미드테트라키스(트리플루오로아세트산)염(22mg), 물(3mL)의 혼합물에 염화가돌리늄(8mg)을 첨가하고, 0.1M 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하여 pH5-6으로 조정하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 반응 혼합물에 TFA(10μL)를 첨가한 후, 그 용액을 역상 칼럼 크로마토그래피(용매 구배; 5→50％ 아세토니트릴/0.1％ TFA 수용액)로 정제함으로써 표제 화합물(16mg)을 얻었다. MS(ESI-): 1072.1
(viii) 복합체 No.18의 합성
실시예 2-18(vii)에서 합성한 [N-({4-[(2-{4,7,10-트리스[(카르복시-κO)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일-κ4N1,N4,N7,N10}아세트아미드-κO)메틸]페닐}카르바모일)-L-메티오닐-N1-[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸]-L-이소류신아미다토(3-)]가돌리늄(1mg)을 DMSO(40μL)에 용해시켰다. 그 용액에 0.1M 붕산 완충액(40μL)을 첨가하고, 0.1M 탄산나트륨 수용액 및 0.25M 아세트산 완충액을 사용하여 pH7.3으로 조정하였다.
4.45mg/mL Fab2의 붕산 완충액(160μL)에, 앞서 조제한 용액을 40μL 첨가하고, 30℃에서 2시간 인큐베이트하였다. PD-10 칼럼을 사용하여 정제하고, 아미콘 울트라-0.5mL 원심식 필터로 회수하였다. 회수한 용액을 인산 완충 생리 식염수로 7회 세정하고 마지막에 농축 후, 멤브레인 필터로 여과하여, 복합체를 얻었다. 당해 복합체는, 분자량 47.9kDa의 Fab2 1개에 대하여 분자량 1074의 [Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1(#N)]이 1개 결합한 복합체, 2개 결합한 복합체 및 3개 결합한 복합체의 혼합물임을 MS 해석에 의해 확인하였다.
(실시예 2-66. ([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4 and/or A-5)]p-Fab2)의 합성)
(i) 복합체 No.66의 합성
실시예 2-18(vii)에서 합성한 [N-({4-[(2-{4,7,10-트리스[(카르복시-κO)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일-κ4N1,N4,N7,N10}아세트아미드-κO)메틸]페닐}카르바모일)-L-메티오닐-N1-[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸]-L-이소류신아미다토(3-)]가돌리늄(1mg)을 DMSO(40μL)에 용해시켰다. 그 용액에 0.1M 붕산 완충액(40μL)을 첨가하고, 0.1M 탄산나트륨 수용액을 사용하여 pH6.5로 조정하였다.
4.45mg/mL Fab2의 붕산 완충액(320μL)에, 앞서 조제한 용액을 첨가하고, 30℃에서 2시간 인큐베이트하였다. 0.05M의 EDTA를 10μL 첨가하고, 30℃에서 10분간 인큐베이트하였다. 아미콘 울트라-15mL 원심식 필터를 사용하여, 인산 완충 생리 식염수로 2회 세정하고, 용액을 회수하였다.
회수한 용액에 20mM 비스트리스프로판 완충 용액(pH9.5)을 첨가하여 5배량으로 희석하고, 5mL HiTrap Q column(GE Healthcare)에 담지시키고, 실온에서 6시간 정치하였다. 20mM 비스트리스프로판 완충 용액(pH9.5) 및 1M 염화나트륨 수용액을 사용하여 칼럼을 세정하고, 담지 용액을 회수하였다. 아미콘 울트라-15mL 원심식 필터를 사용하여 인산 완충 생리 식염수에 완충 용액 교환을 행한 후, 그 용액을 PD-10 칼럼을 사용하여 정제하고, 아미콘 울트라-15mL 원심식 필터로 회수하였다. 회수한 용액을 인산 완충 생리 식염수로 2회 세정하고 마지막에 농축 후, 멤브레인 필터로 여과하여, 복합체를 얻었다. 당해 복합체는, 분자량 47.9kDa의 Fab2 1개에 대하여 분자량 1092의 [Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4 and/or A-5)]이 1개 결합한 복합체, 2개 결합한 복합체, 3개 결합한 복합체 및 4개 결합한 복합체의 혼합물임을 MS 해석에 의해 확인하였다.
(실시예 2-67. ([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1(#S)]p-Fab2)의 합성)
(i) 복합체 No.67의 합성
실시예 2-18(vii)에서 합성한 [N-({4-[(2-{4,7,10-트리스[(카르복시-κO)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일-κ4N1,N4,N7,N10}아세트아미드-κO)메틸]페닐}카르바모일)-L-메티오닐-N1-[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸]-L-이소류신아미다토(3-)]가돌리늄(2mg)을 DMSO(80μL)에 용해시키고 0.1M 붕산 완충액(80μL)을 첨가한 후 0.1M 탄산나트륨 수용액을 사용하여 pH7.3으로 조정하였다.
4.45mg/mL Fab2의 붕산 완충액(320μL)에 0.1M 붕산 완충액으로 조제한 2mg/mL의 2-IT 용액(10μL)을 첨가하고, 37℃에서 40분간 인큐베이트하였다. 과잉의 2-IT는 아미콘 울트라-15mL 원심식 필터를 사용하여 인산 완충 생리 식염수로 세정, 200μL까지 농축한 후, 앞서 조정한 용액을 첨가하고, 30℃에서 2시간 인큐베이트하였다. 0.05M의 EDTA(10μL)를 첨가하고, 30℃에서 10분간 인큐베이트한 후, PD-10 칼럼을 사용하여 정제하고, 아미콘 울트라-15mL 원심식 필터로 회수하였다. 회수한 용액을 인산 완충 생리 식염수로 2회 세정하고 마지막에 농축 후, 멤브레인 필터로 여과하여, 복합체를 얻었다.
당해 복합체는, 분자량 47.9kDa의 Fab2 1개에 대하여 분자량 1175의 [Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1(#S)]이 1개 결합한 복합체, 2개 결합한 복합체 및 3개 결합한 복합체의 혼합물임을 MS 해석에 의해 확인하였다.
(실시예 2-68. [Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)]p-Fab2)의 합성)
(i) N1-(2-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}에틸)-N2-(tert-부톡시카르보닐)-L-이소류신아미드의 합성
N-(tert-부톡시카르보닐)-L-이소류신(3.00g)과 HATU(5.92g)의 디클로로메탄(30ml) 혼합 용액에 DIPEA(6.6mL), (2-아미노에틸)카르밤산벤질에스테르일염산염(3.29g)을 차례로 첨가하고, 실온에서, 1시간 교반하였다. 반응 혼합물에, 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 디클로로메탄으로 2회 추출하였다. 합친 유기층을 포화 염화나트륨 수용액으로 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과한 후, 농축하였다. 잔사에 아세트산에틸/디클로로메탄(1:2) 용액을 200mL를 첨가한 후, 농축하여 100mL 용액으로 한 후, 빙랭하였다. 석출된 고체를 여과취출하고, 아세트산에틸/디클로로메탄(1:1) 용액으로 세정하여 고체를 얻었다. 여액을 다시 농축 후, 빙랭하고, 석출된 고체를 여과취출하고 아세트산에틸/디클로로메탄(1:1) 용액으로 세정하여 고체를 얻었다. 얻어진 고체를 합치고, 감압 건조시킴으로써 표제 화합물(4.10g)을 얻었다. MS(ESI+): 408.3
(ii) N-(tert-부톡시카르보닐)-L-메티오닐-N1-(2-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}에틸)-L-이소류신아미드의 합성
N1-(2-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}에틸)-N2-(tert-부톡시카르보닐)-L-이소류신아미드(2.00g)의 디클로로메탄(10mL) 용액에 빙랭 하에서 TFA(7.51mL)를 첨가하고, 동일 온도에서 1시간 교반하였다. 감압 농축한 후, 이 잔사에 N-(tert-부톡시카르보닐)-L-메티오닌(1.35g), DIPEA(4.2mL), 디클로로메탄(20mL) 및 HATU(2.24g)을 첨가하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 석출된 고체를 여과취출하고 디클로로메탄 및 메탄올로 세정 후, 감압 건조시킴으로써 표제 화합물(1.58g)을 얻었다. MS(ESI+): 539.4
(iii) L-메티오닐-N1-(2-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}에틸)-L-이소류신아미드의 합성
N-(tert-부톡시카르보닐)-L-메티오닐-N1-(2-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}에틸)-L-이소류신아미드(1.05g)의 디클로로메탄(6ml) 용액에, 빙랭 하, TFA(3ml)를 적하하였다. 혼합물을 동일 온도에서, 2시간 교반하였다. 혼합물을 감압 농축하고, 디클로로메탄 및 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 디클로로메탄으로 2회 추출하였다. 합친 유기층을 포화 염화나트륨 수용액으로 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과한 후, 농축함으로써 표제 화합물(690mg)의 조생성물을 얻었다. MS(ESI+): 439.4
(iv) N-[(4-{[(tert-부톡시카르보닐)아미노]메틸}페닐)카르바모일]-L-메티오닐-N1-(2-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}에틸)-L-이소류신아미드의 합성
아르곤 분위기 하에서, 4-{[(tert-부톡시카르보닐)아미노]메틸} 벤조산(395mg), TEA(660μL) 및 톨루엔(20mL)의 혼합 용액에 포스포로아지드산디페닐에스테르(680μL)을 첨가하고, 실온에서 1시간 교반 후, 배스 온도 100℃에서 2시간 교반하였다. 반응 용액을 실온까지 방랭하고, L-메티오닐-N1-(2-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}에틸)-L-이소류신아미드(690mg)의 THF(7mL) 용액을 첨가하고, 실온에서 3시간 교반하였다. 반응 용액을 감압 농축하고, 탄산수소나트륨 수용액 및 아세트산에틸을 첨가하고, 발생한 고체를 여과, 아세트산에틸로 세정 후, 감압 건조시킴으로써 표제 화합물(790mg)을 얻었다. MS(ESI+): 687.5
(v) N-{[4-(아미노메틸)페닐]카르바모일}-L-메티오닐-N1-(2-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}에틸)-L-이소류신아미드의 합성
N-[(4-{[(tert-부톡시카르보닐)아미노]메틸}페닐)카르바모일]-L-메티오닐-N1-(2-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}에틸)-L-이소류신아미드(790mg)의 디클로로메탄(3ml) 용액에, 빙랭 하, TFA(2ml)를 적하하였다. 혼합물을 동일 온도에서, 1시간 교반하였다. 혼합물을 감압 농축하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하였다. 석출된 고체를 여과취출하고, 물로 세정 후, 감압 건조시킴으로써 표제 화합물(720mg)의 조생성물을 얻었다. MS(ESI+): 587.6
(vi) N-{[4-({2-[4,7,10-트리스(2-tert-부톡시-2-옥소에틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세트아미드}메틸)페닐]카르바모일}-L-메티오닐-N1-(2-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}에틸)-L-이소류신아미드의 합성
N-{[4-(아미노메틸)페닐]카르바모일}-L-메티오닐-N1-(2-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}에틸)-L-이소류신아미드(360mg), DOTA-tris(t-Bu)에스테르(386mg), DIPEA(320μL)의 DMAc(2mL) 혼합 용액에 HATU(280mg)을 첨가하고, 실온에서 2시간 교반하였다. 반응 혼합물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(용매 구배; 0→20％ 메탄올/클로로포름)로 정제함으로써 표제 화합물(683mg)을 얻었다. MS(ESI+); 1141.9
(vii) N-{[4-({2-[4,7,10-트리스(2-tert-부톡시-2-옥소에틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세트아미드}메틸)페닐]카르바모일}-L-메티오닐-N1-(2-아미노에틸)-L-이소류신아미드의 합성
N-{[4-({2-[4,7,10-트리스(2-tert-부톡시-2-옥소에틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세트아미드}메틸)페닐]카르바모일}-L-메티오닐-N1-(2-{[(벤질옥시)카르보닐]아미노}에틸)-L-이소류신아미드(683mg), 10％ 팔라듐 담지 탄소(50％ 함수, 382mg) 및 메탄올(10mL)의 혼합물을 수소 분위기 하(1atm) 실온에서 18시간 교반하였다. 그의 혼합물을, 여과하여 불용물을 제거 후, 농축하였다. 잔사에 10％ 팔라듐 담지 탄소(50％ 함수, 382mg) 및 메탄올(10mL)을 첨가하고, 이 혼합물을 수소 분위기 하(1atm) 실온에서 2시간 교반하였다. 그의 혼합물을, 여과하여 불용물을 제거 후, 농축함으로써 표제 화합물(417mg)을 얻었다. MS(ESI+); 1007.7
(viii) N-{[4-({2-[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세트아미드}메틸)페닐]카르바모일}-L-메티오닐-N1-(2-아미노에틸)-L-이소류신아미드펜타키스(트리플루오로아세트산)염의 합성
N-{[4-({2-[4,7,10-트리스(2-tert-부톡시-2-옥소에틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세트아미드}메틸)페닐]카르바모일}-L-메티오닐-N1-(2-아미노에틸)-L-이소류신아미드(417mg), 물(210μL), 트리(프로판-2-일)실란(210μL) 및 TFA(8mL)의 혼합 용액을, 실온에서 3시간 교반하였다. 감압 농축한 후, 잔사를 역상 칼럼 크로마토그래피(용매 구배; 0→33％ 아세토니트릴/0.1％ TFA 수용액)로 정제함으로써 표제 화합물(255mg)을 얻었다. MS(ESI+); 839.7
(ix) N-{[4-({2-[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세트아미드}메틸)페닐]카르바모일}-L-메티오닐-N1-(2-{[(4-이소티오시아나토페닐)카르바모티오일]아미노}에틸)-L-이소류신아미드테트라키스(트리플루오로아세트산)염의 합성
N-{[4-({2-[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세트아미드}메틸)페닐]카르바모일}-L-메티오닐-N1-(2-아미노에틸)-L-이소류신아미드펜타키스(트리플루오로아세트산)염(255mg)의 DMAc(2mL) 용액에 빙랭 하 TEA(200μL)를 첨가하고, 동일 온도에서 10분간 교반하였다. 그 용액에 1,4-디이소티오시아나토벤젠(174mg)의 DMAc(2mL) 용액을 첨가하고, 동일 온도에서 1시간 교반하였다. 그 반응 용액을 역상 칼럼 크로마토그래피(용매 구배; 0→50％ 아세토니트릴/0.1％ TFA 수용액)로 정제함으로써 표제 화합물(136mg)을 얻었다. MS(ESI+); 1031.4
(x) [N-({4-[(2-{4,7,10-트리스[(카르복시-κO)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일-κ4N1,N4,N7,N10}아세트아미드-κO)메틸]페닐}카르바모일)-L-메티오닐-N1-(2-{[(4-이소티오시아나토페닐)카르바모티오일]아미노}에틸)-L-이소류신아미다토(3-)]가돌리늄의 합성
N-{[4-({2-[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세트아미드}메틸)페닐]카르바모일}-L-메티오닐-N1-(2-{[(4-이소티오시아나토페닐)카르바모티오일]아미노}에틸)-L-이소류신아미드테트라키스(트리플루오로아세트산)염(36mg), 물(1.8mL)의 혼합물에 염화가돌리늄(10mg), 0.1M 탄산수소나트륨 수용액(1.7mL)을 첨가하여 pH5.4로 조정하고, 실온에서 30분간 교반하였다. 반응 혼합물을 역상 칼럼 크로마토그래피(용매 구배; 0→50％ 아세토니트릴/0.1％ TFA 수용액)로 정제함으로써 표제 화합물(33.0mg)을 얻었다. MS(ESI-); 1184.3
(xi) 복합체 No.68의 합성
실시예 2-68(x)에서 합성한 [N-({4-[(2-{4,7,10-트리스[(카르복시-κO)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일-κ4N1,N4,N7,N10}아세트아미드-κO)메틸]페닐}카르바모일)-L-메티오닐-N1-(2-{[(4-이소티오시아나토페닐)카르바모티오일]아미노}에틸)-L-이소류신아미다토(3-)]가돌리늄(1mg)을 DMSO(310μL)에 용해시켰다.
4.45mg/mL Fab2의 인산 완충 생리 식염수 용액(320μL)에, 앞서 조제한 용액을 30μL 첨가하고, 0.1M 탄산나트륨 수용액을 사용하여 약 pH9.0로 조정하고, 37℃에서 24시간 인큐베이트하였다. PD-10 칼럼을 사용하여 정제하고, 아미콘 울트라-15mL 원심식 필터로 회수하였다. 회수한 용액을 인산 완충 생리 식염수로 2회 세정하고 마지막에 농축 후, 멤브레인 필터로 여과하여, 복합체를 얻었다. 당해 복합체는, 분자량 47.9kDa의 Fab2 1개에 대하여 분자량 1187의 [Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)]이 1개 결합한 복합체, 2개 결합한 복합체 및 3개 결합한 복합체의 혼합물임을 MS 해석에 의해 확인하였다.
(실시예 2-69. ([Gd/DOTA-[2,5-(1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린)]-C(=O)-Met-Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-Ph)-NH-C(=S)]p-Fab2)의 합성)
(i) N-[2-(tert-부톡시카르보닐)-1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-5-카르보닐]-L-메티오닐글리실-N6-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리신tert-부틸에스테르의 합성
L-메티오닐글리실-N6-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리신tert-부틸에스테르(303mg)와 2-(tert-부톡시카르보닐)-1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-5-카르복실산(160mg)의 디클로로메탄(10mL) 혼합 용액에 TEA(0.24mL) 및 HATU(241mg)을 첨가하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 농축한 후, 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(용매 구배; 0→4％ 메탄올/클로로포름)로 정제함으로써 표제 화합물(191mg)을 얻었다. MS(ESI+); 784.4
(ii) N-(1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-5-카르보닐)-L-메티오닐글리실-N6-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리신tert-부틸에스테르모노(트리플루오로아세트산)염의 합성
N-[2-(tert-부톡시카르보닐)-1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-5-카르보닐]-L-메티오닐글리실-N6-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리신tert-부틸에스테르(190mg)의 디클로로메탄(3ml) 용액에, 빙랭 하, TFA(1ml)를 적하하였다. 혼합물을 동일 온도에서, 1시간 교반한 후, 감압 농축함으로써 표제 화합물(262mg)의 조생성물을 얻었다. MS(ESI+): 684.5
(iii) N-(2-{[4,7,10-트리스(2-tert-부톡시-2-옥소에틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세틸}-1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-5-카르보닐)-L-메티오닐글리실-N6-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리신tert-부틸에스테르테트라키스(트리플루오로아세트산)염의 합성
DOTA-tris(t-Bu)에스테르(138mg)의 DMAc(1mL) 용액에 HATU(184mg) 및 DIPEA(124μL)을 첨가하고, 실온에서 5분 교반하였다. 그 반응 용액에 N-(1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-5-카르보닐)-L-메티오닐글리실-N6-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리신tert-부틸에스테르모노(트리플루오로아세트산)염(261mg)의 DMAc(1mL) 용액을 첨가하고, 실온에서 2시간 교반하였다. 반응 혼합물을 1％ TFA 수용액(약 1ml)으로 희석 후, 그 용액을 역상 칼럼 크로마토그래피(용매 구배; 20→100％ 아세토니트릴/0.1％ TFA 수용액)로 정제함으로써 표제 화합물(231mg)을 얻었다. MS(ESI+); 1260.7 [M+Na]+
(iv) N-(2-{[4,7,10-트리스(2-tert-부톡시-2-옥소에틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세틸}-1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-5-카르보닐)-L-메티오닐글리실-L-리신tert-부틸에스테르테트라키스(트리플루오로아세트산)염의 합성
N-(2-{[4,7,10-트리스(2-tert-부톡시-2-옥소에틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세틸}-1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-5-카르보닐)-L-메티오닐글리실-N6-[(벤질옥시)카르보닐]-L-리신tert-부틸에스테르테트라키스(트리플루오로아세트산)염(230mg), 10％ 팔라듐 담지 탄소(50％ 함수, 300mg), 메탄올(10mL)의 혼합물을 실온에서 10분간 교반하였다. 그의 혼합물을 여과하여 불용물을 제거한 후, 여액을 농축하였다. 그 잔사에 10％ 팔라듐 담지 탄소(50％ 함수, 300mg), 메탄올(10mL)을 첨가한 후, 수소 분위기 하(3atm) 실온에서 18시간 교반하였다. 그의 혼합물을 여과하여 불용물을 제거한 후, 농축함으로써 표제 화합물(152mg)을 얻었다. MS(ESI+); 1104.5
(v) N-(2-{[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세틸}-1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-5-카르보닐)-L-메티오닐글리실-L-리신펜타키스(트리플루오로아세트산)염의 합성
N-(2-{[4,7,10-트리스(2-tert-부톡시-2-옥소에틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세틸}-1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-5-카르보닐)-L-메티오닐글리실-L-리신tert-부틸에스테르테트라키스(트리플루오로아세트산)염(152mg)의 디클로로메탄(1mL) 용액에 TFA(1.5mL)을 첨가하고, 실온에서 4시간 교반하였다. 감압 농축한 후, 잔사를 역상 칼럼 크로마토그래피(용매 구배; 0→33％ 아세토니트릴/0.1％ TFA 수용액)로 정제함으로써 표제 화합물(76mg)을 얻었다. MS(ESI+); 880.4
(vi) N-(2-{[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세틸}-1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-5-카르보닐)-L-메티오닐글리실-N6-[(4-이소티오시아나토페닐)카르바모티오일]-L-리신테트라키스(트리플루오로아세트산)염의 합성
N-(2-{[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세틸}-1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-5-카르보닐)-L-메티오닐글리실-L-리신펜타키스(트리플루오로아세트산)염(76mg),1,4-디이소티오시아나토벤젠(50mg)의 DMAc(1mL) 용액에 빙랭 하 TEA(60μL)를 첨가하고, 동일 온도에서 1시간 교반하였다. 그 반응 용액을 역상 칼럼 크로마토그래피(용매 구배; 0→50％ 아세토니트릴/0.1％ TFA 수용액)로 정제함으로써 표제 화합물(46mg)을 얻었다. MS(ESI-); 1070.6
(vii) {N-[2-({4,7,10-트리스[(카르복시-κO)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일-κ4N1,N4,N7,N10}아세틸-κO)-1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-5-카르보닐]-L-메티오닐글리실-N6-[(4-이소티오시아나토페닐)카르바모티오일]-L-리시나토(3-)}가돌리늄의 합성
N-(2-{[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세틸}-1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-5-카르보닐)-L-메티오닐글리실-N6-[(4-이소티오시아나토페닐)카르바모티오일]-L-리신테트라키스(트리플루오로아세트산)염(16mg), 물(800μL)의 혼합물에 염화가돌리늄(8mg), 0.1M 탄산수소나트륨 수용액(700μL)을 첨가하고, 실온에서 30분간 교반하였다. 반응 혼합물을 역상 칼럼 크로마토그래피(용매 구배; 0→40％ 아세토니트릴/0.1％ TFA 수용액)로 정제함으로써 표제 화합물(7.4mg)을 얻었다. MS(ESI-); 1225.3
(viii) 복합체 No.69의 합성
실시예 2-69(vii)에서 합성한 {N-[2-({4,7,10-트리스[(카르복시-κO)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일-κ4N1,N4,N7,N10}아세틸-κO)-1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-5-카르보닐]-L-메티오닐글리실-N6-[(4-이소티오시아나토페닐)카르바모티오일]-L-리시나토(3-)}가돌리늄(1mg)을 DMSO(310μL)에 용해시켰다.
4.45mg/mL Fab2의 인산 완충 생리 식염수 용액(320μL)에, 앞서 조제한 용액을 30μL 첨가하고, 0.1M 탄산나트륨 수용액을 사용하여 약 pH9.0로 조정하고, 37℃에서 24시간 인큐베이트하였다. PD-10 칼럼을 사용하여 정제하고, 아미콘 울트라-15mL 원심식 필터로 회수하였다. 회수한 용액을 인산 완충 생리 식염수로 2회 세정하고 마지막에 농축 후, 멤브레인 필터로 여과하여, 복합체를 얻었다. 당해 복합체는, 분자량 47.9kDa의 Fab2 1개에 대하여 분자량 1228의 [Gd/DOTA-[2,5-(1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린)]-C(=O)-Met-Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-Ph)-NH-C(=S)]이 1개 결합한 복합체, 2개 결합한 복합체, 3개 결합한 복합체, 4개 결합한 복합체 및 5개 결합한 복합체의 혼합물임을 MS 해석에 의해 확인하였다.
상기 제조 실시예에서 얻어진 복합체를 표 1 내지 2에 나타내었다.
또한, 상기 표 그리고 후기 표 15 내지 18에 있어서, -은 결합을 나타내고, S1란의 기호 (a) 내지 (q)는 각각 하기 식 (a) 내지 (q)로 표시되는 스페이서를 나타낸다.
상기 제조 실시예와 마찬가지의 방법, 또는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여, 표 3 내지 14의 제조예 번호 A1 내지 A43 및 B1 내지 B4의 화합물을 합성하고, 이들을 사용하여 후기 표 15 내지 18에 나타내는 복합체를 얻었다.
표 15 내지 18에 기재된 실시예 화합물의 MS 해석을 하기 표 19 내지 23에 나타내었다.
실시예 3-1: CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트 복합체의 결합 활성 평가
실시예 2에서 제작한 각 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트 복합체에 대해서, CEACAM5에 대한 결합 활성을 평가하기 위하여 ELISA를 행하였다. 본 시험에서는, 항원 고상화액의 용매로서, 증류수로 10배로 희석하여 10mM로 조제한 인산 완충액(나카라이테스크, 0.1mol/L-인산 완충액(pH7.2))을, 세정액으로서, 증류수로 20배로 희석한 20X PBS/Tween 20 버퍼(Thermo사, 28352)를 사용하였다. 또한, 본 시험 중에 사용하는 소혈청 알부민(BSA)은 30％ Bovine Serum Albumin solution(SIGMA사, A9576-50ML)을 적절한 비율이 되도록 첨가하여 사용하였다. CEACAM5(R&D Systems사, 4128-CM-050)를 10mM 인산 완충액(pH7.2)으로 0.1μg/mL이 되도록 희석하고, 눈크 맥시소프 백색 384 플레이트(Nunc사, 460372)에 1웰당 30μL 첨가하고, 4℃에서 밤새 플레이트를 인큐베이트함으로써 고상화하였다. CEACAM5 고상화액을 역원심으로 제거한 후에, 5.0％ BSA를 함유하는 PBS/Tween 20 버퍼를 첨가함으로써 블로킹하였다. 그 후, 역원심에 의해 블로킹 용액을 제거하고, 1.0％ BSA를 함유하는 PBS/Tween 20 버퍼를 사용하여, 상기 각 CEACAM5 항체 Fab2 프래그먼트 복합체, 혹은 대조로서 표지부를 갖지 않는 Fab2 프래그먼트(PB009-01)를 10000 ng/mL 정도의 용액을 3배 희석으로 14단계 희석하고, 1웰당 30μL 첨가하고, 실온에서 60분간 인큐베이트하였다. 플레이트를 PBS/Tween 20 버퍼로 3회 세정하고, 5.0％ BSA를 함유하는 PBS/Tween 20 버퍼를 사용하여 1000배로 희석한 서양 고추냉이 퍼옥시다아제(Horseradish Peroxidase: HRP) 표지 염소 항인간 IgG(H+L chain) 항체(MBL 라이프 사이언스사, 206)를 1웰당 30μL 첨가하고, 실온에서 30분간 인큐베이트하였다. 플레이트를 PBS/Tween 20 버퍼로 3회 세정하고, 기질로서 ECL Prime Western Blotting DETECTION Reagent(GE Healthcare사, RPN2232)를 1웰당 30μL 첨가하였다. 실온에서 15분간 인큐베이트한 후에, 그 시그널값을 Envision 카운터(퍼킨 엘머사)로 측정하였다.
각 항체의 시험을 듀플리키트로 행하고, 4 파라미터 로지스틱 곡선 모델에 의해 EC50값을 산출하였다. PB009-01에 관한, 9 시행의 EC50값(nM)의 기하 평균(Geometric mean), 표준 편차(Geometric SD factor), 95％ 신뢰 구간(95％ CI of geo. mean)의 하한값(Lower)과 상한값(Upper)을 표 24에 나타내었다. 또한, 듀플리키트로 시행한 각 복합체의 EC50값을 표 25에 나타내었다. 또한, 표 중 Ex-No는 실시예 2에 있어서의 복합체 번호를 나타낸다.
실시예 3-2:
실시예 2에서 제작한 각 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트 복합체에 대해서, CEACAM5에 대한 결합 활성을 평가하기 위하여 ELISA를 행하였다. 본 시험에서는, 항원 고상화액의 용매로서, 증류수로 10배로 희석하여 10mM로 조제한 인산 완충액(나카라이테스크, 0.1mol/L-인산 완충액(pH7.2))을, 세정액으로서, 증류수로 20배로 희석한 20X PBS/Tween 20 버퍼(Thermo사, 28352)를 사용하였다. 또한, 본 시험 중에 사용하는 소혈청 알부민(BSA)은 30％ Bovine Serum Albumin solution(SIGMA사, A9576-50ML)을 적절한 비율이 되도록 첨가하여 사용하였다. CEACAM5(R&D Systems사, 4128-CM-050)를 10mM 인산 완충액(pH7.2)으로 0.1μg/mL이 되도록 희석하고, 눈크 맥시소프 백색 384 플레이트(Nunc사, 460372)에 1웰당 30μL 첨가하고, 4℃에서 밤새 플레이트를 인큐베이트함으로써 고상화하였다. CEACAM5 고상화액을 역원심으로 제거한 후에, 5.0％ BSA를 함유하는 PBS/Tween 20 버퍼를 첨가함으로써 블로킹하였다. 그 후, 역원심에 의해 블로킹 용액을 제거하고, 1.0％ BSA를 함유하는 PBS/Tween 20 버퍼를 사용하여, 상기 각 CEACAM5 항체 Fab2 프래그먼트 복합체, 혹은 대조로서 표지부를 갖지 않는 Fab2 프래그먼트(PB009-01)를 10000 ng/mL 정도의 용액을 3배 희석으로 14단계 희석하고, 1웰당 30μL 첨가하고, 실온에서 60분간 인큐베이트하였다. 플레이트를 PBS/Tween 20 버퍼로 3회 세정하고, 5.0％ BSA를 함유하는 PBS/Tween 20 버퍼를 사용하여 1000배로 희석한 서양 고추냉이 퍼옥시다아제(Horseradish Peroxidase: HRP) 표지 염소 항인간 IgG(H+L chain) 항체(MBL 라이프 사이언스사, 206)를 1웰당 30μL 첨가하고, 실온에서 30분간 인큐베이트하였다. 플레이트를 PBS/Tween 20 버퍼로 3회 세정하고, 기질로서 ECL Prime Western Blotting DETECTION Reagent(GE Healthcare사, RPN2232)를 1웰당 30μL 첨가하였다. 실온에서 15분간 인큐베이트한 후에, 그 시그널값을 Envision 카운터(퍼킨 엘머사)로 측정하였다.
각 항체의 시험을 듀플리키트로 행하고, 4 파라미터 로지스틱 곡선 모델에 의해 EC50값을 산출하였다. PB009-01에 관한, 2 시행 각각의 EC50값(nM)을 표 26에 나타내었다. 또한, 듀플리키트로 시행한 각 복합체의 EC50값을 표 27에 나타내었다. 또한, 표 중 Ex-No는 실시예 2에 있어서의 복합체 번호를 나타낸다.
실시예 4-1: Gd 표지 복합체의 신장의 집적성 평가 시험(정상 마우스)
복합체에는, 「X」의 펩티드 링커로서, 신장 쇄자 연막 효소 또는 리소좀 효소로 절단되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 링커를 갖는 것이 포함된다. 이들 링커를 갖는 본 발명의 복합체는, 당해 링커 부분에 있어서, 신장에 존재하는 이들 효소에 의해 특이적으로 절단되기 때문에, 표지부의 신장에의 집적성이 저감될 것이 기대된다. 이하에, 본 발명의 이러한 복합체의 신장의 집적성의 평가 결과를 나타낸다.
(시험 방법)
상기 실시예에서 제조한 펩티드 링커를 포함하는 복합체의 Gd 표지 복합체를, 단백질량으로서 한마리당 0.02mg(100μL)이 되도록, 마우스(BALB/c 또는 BALB/c nu/nu)의 미정맥으로부터 투여하였다. 약 24시간 후에 도살하여 신장을 적출하고, 신장 중의 Gd량을 ICP-MS를 사용하여 측정하였다. 각 군 3예에서 실시하고, 3예의 평균값을 산출하고, 투여 후의 신장 1개당에 포함되는 Gd량을, 전체 투여 Gd량에 대한 백분율(％ of dose/tissue)로 나타냈다. 결과를 후기 표 28에 나타내었다. 표 중, Ex-No는 실시예 2의 복합체 번호를 나타낸다. 또한, 대조 복합체로서 펩티드 링커를 포함하지 않는, 상기 제조 실시예 2-47에서 제조한 Ex-No.47([Gd/DOTA]p-Fab)을 사용하여 마찬가지로 시험을 행하고, 5 시행의 기하 평균(Geometric mean), 표준 편차(Geometric SD factor), 95％ 신뢰 구간(95％ CI of geo. mean)의 하한값(Lower)과 상한값(Upper)을 산출하였다.
(결과)
결과를 후기 표 29에 나타내었다. 당해 대조 복합체의 백분율(％ of dose/tissue)을 기준으로 하여, 상기 펩티드 링커를 갖는 각 복합체의 신장에 포함되는 Gd량의 저하 비율을 구하고, 표 28에 나타냈다. 표 28에 나타내는 바와 같이, 대조 복합체에 대하여 상기 펩티드 링커를 갖는 각 복합체에서는 표지부의 신장에의 집적성이 39.6 내지 82.9％ 포인트 낮았다.
실시예 4-2: Gd 표지 복합체의 신장의 집적성 평가 시험(정상 마우스)
(시험 방법)
상기 실시예에서 제조한 펩티드 링커를 포함하는 복합체의 Gd 표지 복합체를, 단백질량으로서 한마리당 0.02mg(100μL)이 되도록, 마우스(BALB/c 또는 BALB/c nu/nu)의 미정맥으로부터 투여하였다. 약 24시간 후에 도살하여 신장을 적출하고, 신장 중의 Gd량을 ICP-MS를 사용하여 측정하였다. 각 군 3예에서 실시하고, 3예의 평균값을 산출하고, 투여 후의 신장 1개당에 포함되는 Gd량을, 전체 투여 Gd량에 대한 백분율(％ of dose/tissue)로 나타냈다. 결과를 후기 표 30에 나타내었다. 표 중, Ex-No는 실시예 2의 복합체 번호를 나타낸다. 또한, 대조 복합체로서 펩티드 링커를 포함하지 않는, 상기 제조 실시예 2에서 제조한 Ex-No 47([Gd/DOTA]p-Fab)을 사용하여 마찬가지로 시험을 행하였다.
(결과)
결과를 후기 표 30에 나타내었다. 당해 대조 복합체의 백분율(％ of dose/tissue)을 기준으로 하여, 상기 펩티드 링커를 갖는 각 복합체의 신장에 포함되는 Gd량의 저하 비율을 구하고, 표 30에 나타냈다. 표 30에 나타내는 바와 같이, 대조 복합체 47에 대하여 상기 펩티드 링커를 갖는 각 복합체에서는 표지부의 신장에의 집적성이 92.15 내지 95.38％ 포인트 낮았다.
실시예 4-3: Gd 표지 복합체의 신장의 집적성 평가 시험(정상 마우스)
(시험 방법)
상기 실시예에서 제조한 펩티드 링커를 포함하는 복합체의 Gd 표지 복합체를, 단백질량으로서 한마리당 0.02mg(100μL)이 되도록, 마우스(BALB/c 또는 BALB/c nu/nu)의 미정맥으로부터 투여하였다. 약 24시간 후에 도살하여 신장을 적출하고, 신장 중의 Gd량을 ICP-MS를 사용하여 측정하였다. 각 군 3예에서 실시하고, 3예의 평균값을 산출하고, 투여 후의 신장 1개당에 포함되는 Gd량을, 전체 투여 Gd량에 대한 백분율(％ of dose/tissue)로 나타냈다. 대조 복합체로서 펩티드 링커를 포함하지 않는, 상기 제조 실시예 2에서 제조한 Ex-No.47을 사용하여 마찬가지로 시험을 행하고, Ex-No.47에 관한, 5 시행의 신장 잔존량의 평균을 표 31에 나타내었다.
(결과)
당해 대조 복합체의 백분율(％ of dose/tissue)을 기준으로 하여, 상기 펩티드 링커를 갖는 각 복합체의 신장에 포함되는 Gd량의 저하 비율(％)을 구하고, 표 32에 나타냈다. 표 32에 나타내는 바와 같이, 대조 복합체에 대하여 상기 펩티드 링커를 갖는 각 복합체에서는 표지부의 신장에의 집적성이 21.00 내지 94.66％ 포인트 저하되었다.
실시예 4-4: Gd 표지 복합체의 신장의 집적성 평가 시험(담암 마우스)
(시험 방법)
상기 실시예에서 제조한 펩티드 링커를 포함하는 복합체의 Gd 표지 복합체를, 단백질량으로서 한마리당 0.02mg(100μL)이 되도록 담암 마우스의 미정맥으로부터 투여하였다. 본 실시예에서 사용하는 담암 마우스는, 검체를 투여하기 전에 인간 대장암 세포주 LS174T 세포(ATCC(등록 상표); CL-188)를 2.0 내지 5.0×106개/개체를 배부(背部) 피하에 이식하여 담암 상태로 한 마우스(BALB/cnu/nu)를 사용하였다. 검체를 투여하고 24시간 후에 도살하여 신장 그리고 종양을 적출하고, 신장 중 그리고 종양 중의 Gd량을 ICP-MS를 사용하여 측정하였다. 본 시험은 각 군 3예에서 실시하고, 3예의 평균값을 산출하였다. 투여 후의 신장 1개당에 포함되는 Gd량을 투여 Gd량에 대한 백분율(％ of dose/tissue), 또한, 종양 조직 1g당에 포함되는 Gd량을, 전체 투여 Gd량에 대한 백분율(％ of dose/g)로 나타냈다. 결과를 표 35, 36에 나타내었다. 표 중, Ex-No는 실시예 2의 복합체 번호를 나타낸다. 또한, 대조 복합체로서 펩티드 링커를 포함하지 않는, 제조 실시예 2-47에서 제조한 Ex-No.47을 사용하여 마찬가지로 시험을 행하였다. Ex-No.47에 관한, 2 시행의 평균을 표 33, 34에 나타내었다.
(결과)
표 35, 36에 나타내는 바와 같이, 대조 복합체에 대하여 펩티드 링커를 갖는 각 복합체에서는 표지부의 신장에의 집적성이 52.26 내지 77.68％ 포인트 저하되었다.
(실시예 5-1: 항인간 MUC1 항체 Fab5 프래그먼트 복합체의 제작)
본 실시예는 복합체의 제조 실시예를 개시한다. 본 실시예 중의 각 제조 실시예에서는 「실시예 5」에 하이픈을 개재하여 「복합체의 번호」를 기재한다. 예를 들어, 「실시예 5-101」은, 본 실시예에 있어서의 복합체 101의 제조 실시예인 것을 나타낸다. 또한, 본 실시예에 있어서의 Fab5는 국제 공개 WO2018/092885에 기재된 (P10-2)를 사용하였다. 「p-Fab5」은 Fab5가 그의 p개의 아미노기를 통하여 p개의 [ ] 또는 ( ) 중에 기재된 표지부에 결합하여 복합체를 형성하고 있는 것을 나타낸다. 또한, 이하의 몇가지 실시예에 있어서, MS 해석에 의해 확인할 수 있었던 각 복합체의 Fab5가 결합하는 표지부)의 수를 기재하고 있지만, 그 결과는 그 이외의 결합수를 갖는 복합체를 포함하지 않는 것을 나타내는 것은 아니다. MS 해석 기기의 정밀도의 관계에서 그 존재를 확인할 수 없었던 결합수의 복합체가 존재하고 있을 가능성이 남는 것은 용이하게 이해될 것이다. 또한, 본 실시예 중의 구조식에 있어서, Gd이 결합한 DOTA의 구조식은, Gd으로 표지된 DOTA를 모식적으로 도시한 것이다.
(실시예 5-101. ([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1(#N)]p-Fab5)의 합성)
(i) 복합체 No.101의 합성
실시예 2-18(vii)에서 합성한 [N-({4-[(2-{4,7,10-트리스[(카르복시-κO)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일-κ4N1,N4,N7,N10}아세트아미드-κO)메틸]페닐}카르바모일)-L-메티오닐-N1-[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸]-L-이소류신아미다토(3-)]가돌리늄(1mg)을 DMSO(40μL)에 용해시켰다. 그 용액에 0.1M 붕산 완충액(40μL)을 첨가하고, 0.25M 아세트산 완충액을 사용하여 pH6.6으로 조정하였다.
5.2mg/mLFab5의 붕산 완충액(240μL)에, 앞서 조제한 용액을 80μL 첨가하고, 30℃에서 2시간 인큐베이트하였다. 0.05M의 EDTA를 15μL 첨가하고, 30℃에서 10분간 인큐베이트하였다. PD-10 칼럼을 사용하여 정제하고, 아미콘 울트라-0.5mL 원심식 필터로 회수하였다. 회수한 용액을 인산 완충 생리 식염수로 7회 세정하고 마지막에 농축 후, 멤브레인 필터로 여과하여, 복합체를 얻었다. 당해 복합체는, 분자량 47.5kDa의 Fab5 1개에 대하여 분자량 1074의 [Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1(#N)]이 1개 결합한 복합체 및 2개 결합한 복합체의 혼합물임을 MS 해석에 의해 확인하였다.
(실시예 5-104. ([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4 and/or A-5)]p-Fab5)의 합성)
(i) 복합체 No.104의 합성
실시예 2-18(vii)에서 합성한 [N-({4-[(2-{4,7,10-트리스[(카르복시-κO)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일-κ4N1,N4,N7,N10}아세트아미드-κO)메틸]페닐}카르바모일)-L-메티오닐-N1-[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸]-L-이소류신아미다토(3-)]가돌리늄(1mg)을 DMSO(40μL)에 용해시켰다. 그 용액에 0.1M 붕산 완충액(40μL)을 첨가하고, 0.1M 탄산나트륨 수용액을 사용하여 pH10.2로 조정하였다.
5.2mg/mLFab5의 붕산 완충액(240μL)에, 앞서 조제한 용액을 모두 첨가하고, 30℃에서 2시간 인큐베이트하였다. 아미콘 울트라-15mL 원심식 필터로 회수하고, 인산 완충 생리 식염수로 세정하였다.
3mL의 HEPES-NaOH buffer(pH=4.5)를 사용하여 완충 용액 교환을 2회 행하고, 농축하여, pH=4.52의 100μL 용액으로 한 후, 그 용액을 45℃에서 30분간 인큐베이트하였다.
PD-10 칼럼을 사용하여 정제하고, 아미콘 울트라-15mL 원심식 필터로 회수하였다. 회수한 용액을 인산 완충 생리 식염수로 3회 세정하고 마지막에 농축 후, 멤브레인 필터로 여과하여, 복합체를 얻었다. 당해 복합체는, 분자량 47.5kDa의 Fab5 1개에 대하여 분자량 1092의 [Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4 and/or A-5)]이 1개 결합한 복합체, 2개 결합한 복합체 및 3개 결합한 복합체의 혼합물임을 MS 해석에 의해 확인하였다.
(실시예 5-107. ([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1(#S)]p-Fab5)의 합성)
(i) 복합체 No.107의 합성
실시예 2-18(vii)에서 합성한 [N-({4-[(2-{4,7,10-트리스[(카르복시-κO)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일-κ4N1,N4,N7,N10}아세트아미드-κO)메틸]페닐}카르바모일)-L-메티오닐-N1-[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸]-L-이소류신아미다토(3-)]가돌리늄(0.75mg)을 DMSO(40μL)에 용해시키고 0.1M 붕산 완충액(40μL)을 첨가한 후 0.1M 탄산나트륨 수용액 및 0.25M 아세트산 완충액을 사용하여 pH8.2로 조정하였다.
5.2mg/mLFab5의 붕산 완충액(240μL)에 0.1M 붕산 완충액으로 조제한 2mg/mL의 2-IT 용액(7.5μL)을 첨가하고, 37℃에서 40분간 인큐베이트하였다. 과잉의 2-IT는 아미콘 울트라-0.5mL 원심식 필터를 사용하여 인산 완충 생리 식염수로 세정, 농축한 후, 앞서 조정한 용액을 첨가하고, 30℃에서 2시간 인큐베이트하였다. PD-10 칼럼을 사용하여 정제하고, 아미콘 울트라-15mL 원심식 필터로 회수하였다. 회수한 용액을 인산 완충 생리 식염수로 2회 세정하고 마지막에 농축 후, 멤브레인 필터로 여과하여, 복합체를 얻었다.
당해 복합체는, 분자량 47.5kDa의 Fab5 1개에 대하여 분자량 1175의 [Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1(#S)]이 1개 결합한 복합체, 2개 결합한 복합체 및 3개 결합한 복합체의 혼합물임을 MS 해석에 의해 확인하였다.
(실시예 5-112. [Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)]p-Fab5)의 합성)
(i) 복합체 No.112의 합성
실시예 2-68(x)에서 합성한 [N-({4-[(2-{4,7,10-트리스[(카르복시-κO)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일-κ4N1,N4,N7,N10}아세트아미드-κO)메틸]페닐}카르바모일)-L-메티오닐-N1-(2-{[(4-이소티오시아나토페닐)카르바모티오일]아미노}에틸)-L-이소류신아미다토(3-)]가돌리늄(0.46mg)을 DMSO(155μL)에 용해시켰다.
붕산 완충액 및 글리세린 용액으로 5.2mg/mL로 조제한 Fab5 용액(240μL)에 0.1M 탄산나트륨 수용액 및 앞서 조제한 용액을 30μL 첨가하여, pH8.8로 하고, 37℃에서 2시간 인큐베이트하였다. PD-10 칼럼을 사용하여 정제하고, 아미콘 울트라-15mL 원심식 필터로 회수하였다. 회수한 용액을 인산 완충 생리 식염수로 2회 세정하고 마지막에 농축 후, 멤브레인 필터로 여과하여, 복합체를 얻었다. 당해 복합체는, 분자량 47.5kDa의 Fab5 1개에 대하여 분자량 1187의 [Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)]이 1개 결합한 복합체 및 2개 결합한 복합체의 혼합물임을 MS 해석에 의해 확인하였다.
(실시예 5-113. ([Gd/DOTA-[2,5-(1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린)]-C(=O)-Met-Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-Ph)-NH-C(=S)]p-Fab5)의 합성)
(i) 복합체 No.113의 합성
실시예 2-69(vii)에서 합성한 {N-[2-({4,7,10-트리스[(카르복시-κO)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일-κ4N1,N4,N7,N10}아세틸-κO)-1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-5-카르보닐]-L-메티오닐글리실-N6-[(4-이소티오시아나토페닐)카르바모티오일]-L-리시나토(3-)}가돌리늄(0.22mg)을 DMSO(72μL)에 용해시켰다.
붕산 완충액 및 글리세린 용액으로 5.2mg/mL로 조제한 Fab5 용액(240μL)에 0.1M 탄산나트륨 수용액 및 앞서 조제한 용액을 30μL 첨가하여, pH9.3으로 하고, 37℃에서 2시간 인큐베이트하였다. PD-10 칼럼을 사용하여 정제하고, 아미콘 울트라-15mL 원심식 필터로 회수하였다. 회수한 용액을 인산 완충 생리 식염수로 2회 세정하고 마지막에 농축 후, 멤브레인 필터로 여과하여, 복합체를 얻었다. 당해 복합체는, 분자량 47.5kDa의 Fab5 1개에 대하여 분자량 1228의 [Gd/DOTA-[2,5-(1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린)]-C(=O)-Met-Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-Ph)-NH-C(=S)]이 1개 결합한 복합체 및 2개 결합한 복합체의 혼합물임을 MS 해석에 의해 확인하였다.
상기 제조 실시예에서 얻어진 복합체의 화학 구조식 (Str)을 표 37 및 38에 나타내었다.
상기 제조 실시예와 마찬가지의 방법, 또는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여, 표 39의 제조예 번호 C1, C2의 화합물을 합성하고 이들을 사용하여, 혹은 실시예 2에서 합성한 화합물을 사용하여 후기 표 40 및 41에 나타내는 Fab5와의 복합체를 얻었다.
표 40 내지 41에 기재된 상기 실시예 화합물의 MS 해석을 하기 표에 나타내었다.
상기 제조 실시예와 마찬가지의 방법, 또는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여, 표 43의 실시예 화합물을 얻었다.
표 43에 기재된 상기 실시예 화합물의 MS 해석을 하기 표 44에 나타내었다.
또한 상기 제조 실시예와 마찬가지의 방법, 또는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여, 표 45 내지 50의 복합체를 얻을 수 있다.
실시예 6-1: 항인간 MUC1 항체 Fab5 프래그먼트 복합체의 결합 활성 평가
실시예 5의 방법으로 제작한 각 항인간 MUC1 항체 Fab5 프래그먼트 복합체에 대해서, 인간 암 특이적 MUC1에 대한 결합 활성을 평가하기 위하여 ELISA를 행하였다. 본 시험에서는, 세정액으로서, 증류수로 20배로 희석한 20X PBS/Tween 20 버퍼(Thermo사, 28352)를 사용하였다. 또한, 본 시험 중에 사용하는 소혈청 알부민(BSA)은 30％ Bovine Serum Albumin solution(SIGMA사, A9576-50ML)을 적절한 비율이 되도록 첨가하여 사용하였다. 인간 암 특이적 MUC1 펩티드(특허문헌 1)를 0.5μmol/L로 눈크 맥시소프 백색 384 플레이트(Nunc사, 460372)에 1웰당 30μL 첨가하고, 4℃에서 밤새 플레이트를 인큐베이트함으로써 고상화하였다. MUC1 펩티드를 역원심으로 제거한 후에, 5.0％ BSA를 함유하는 PBS/Tween 20 버퍼를 첨가함으로써 블로킹하였다. 그 후, 역원심에 의해 블로킹 용액을 제거하고, 1.0％ BSA를 함유하는 PBS/Tween 20 버퍼를 사용하여, 상기 각 항인간 MUC1 항체 Fab5 프래그먼트 복합체(Ex-No.104, 108, 112)를 10000 ng/mL 정도의 용액을 3배 희석으로 14단계 희석하고, 1웰당 30μL 첨가하고, 실온에서 60분간 인큐베이트하였다. 플레이트를 PBS/Tween 20 버퍼로 3회 세정하고, 5.0％ BSA를 함유하는 PBS/Tween 20 버퍼를 사용하여 10000배로 희석한 서양 고추냉이 퍼옥시다아제 표지 염소 항인간 Igκ 항체(Southern Biotechnology Associates사)를 1웰당 30μL 첨가하고, 실온에서 30분간 인큐베이트하였다. 플레이트를 PBS/Tween 20 버퍼로 3회 세정하고, 기질로서 ECL Prime Western Blotting DETECTION Reagent(GE Healthcare사, RPN2232)를 1웰당 30μL 첨가하였다. 실온에서 15분간 인큐베이트한 후에, 그 시그널값을 Envision 카운터(퍼킨 엘머사)로 측정하였다.
각 항체의 시험을 듀플리키트로 행하고, 4 파라미터 로지스틱 곡선 모델에 의해 EC50값을 산출하였다. P10-2에 관한, 3시행 각각의 EC50값(nM)을 표 51에 나타내었다. 또한, 듀플리키트로 시행한 각 복합체의 EC50값을 표 52에 나타내었다.
실시예 6-2: 항인간 MUC1 항체 Fab5 프래그먼트 복합체의 결합 활성 평가
실시예 5의 방법으로 제작한 각 항인간 MUC1 항체 Fab5 프래그먼트 복합체에 대해서, 인간 암 특이적 MUC1에 대한 결합 활성을 평가하기 위하여 ELISA를 행하였다. 본 시험에서는, 세정액으로서, 증류수로 20배로 희석한 20X PBS/Tween 20 버퍼(Thermo사, 28352)를 사용하였다. 또한, 본 시험 중에 사용하는 소혈청 알부민(BSA)은 30％ Bovine Serum Albumin solution(SIGMA사, A9576-50ML)을 적절한 비율이 되도록 첨가하여 사용하였다. 인간 암 특이적 MUC1 펩티드(특허문헌 1)를 0.5μmol/L로 눈크 맥시소프 백색 384 플레이트(Nunc사, 460372)에 1웰당 30μL 첨가하고, 4℃에서 밤새 플레이트를 인큐베이트함으로써 고상화하였다. MUC1 펩티드를 역원심으로 제거한 후에, 5.0％ BSA를 함유하는 PBS/Tween 20 버퍼를 첨가함으로써 블로킹하였다. 그 후, 역원심에 의해 블로킹 용액을 제거하고, 1.0％ BSA를 함유하는 PBS/Tween 20 버퍼를 사용하여, 상기 각 항인간 MUC1 항체 Fab5 프래그먼트 복합체(Ex-No.101-113)를 10000 ng/mL 정도의 용액을 3배 희석으로 14단계 희석하고, 1웰당 30μL 첨가하고, 실온에서 60분간 인큐베이트하였다. 플레이트를 PBS/Tween 20 버퍼로 3회 세정하고, 5.0％ BSA를 함유하는 PBS/Tween 20 버퍼를 사용하여 10000배로 희석한 서양 고추냉이 퍼옥시다아제 표지 염소 항인간 Igκ 항체(Southern Biotechnology Associates사)를 1웰당 30μL 첨가하고, 실온에서 30분간 인큐베이트하였다. 플레이트를 PBS/Tween 20 버퍼로 3회 세정하고, 기질로서 ECL Prime Western Blotting DETECTION Reagent(GE Healthcare사, RPN2232)를 1웰당 30μL 첨가하였다. 실온에서 15분간 인큐베이트한 후에, 그 시그널값을 Envision 카운터(퍼킨 엘머사)로 측정하였다.
각 항체의 시험을 듀플리키트로 행하고, 4 파라미터 로지스틱 곡선 모델에 의해 EC50값을 산출하였다. P10-2에 관한, 3시행 각각의 EC50값(nM)을 표 53에 나타내었다. 또한, 듀플리키트로 시행한 각 복합체의 EC50값을 표 54에 나타내었다.
실시예 7: Gd 표지 복합체의 신장의 집적성 평가 시험(정상 마우스)
(시험 방법)
상기 실시예에서 제조한 펩티드 링커를 포함하는 복합체의 Gd 표지 복합체를, 단백질량으로서 한마리당 0.02mg(100μL)이 되도록, 마우스(BALB/c or BALB/c nu/nu)의 미정맥으로부터 투여하였다. 약 24시간 후에 도살하여 신장을 적출하고, 신장 중의 Gd량을 ICP-MS를 사용하여 측정하였다. 각 군 3예에서 실시하고, 3예의 평균값을 산출하고, 투여 후의 신장 1개당에 포함되는 Gd량을, 전체 투여 Gd량에 대한 백분율(％ of dose/tissue)로 나타냈다. 대조 복합체로서 펩티드 링커를 포함하지 않는, 상기 제조 실시예 5에서 제조한 Ex-No 108을 사용하여 마찬가지로 시험을 행하였다. Ex-No 108에 관한 2 시행의 평균을 표 55에 나타내었다.
(결과)
결과를 표 56에 나타내었다. 당해 대조 복합체의 신장에 포함되는 Gd량을 기준으로 하여, 상기 펩티드 링커를 갖는 각 복합체의 신장에 포함되는 Gd량의 저하 비율을 구하였다. 표 56에 나타내는 바와 같이, 대조 복합체에 대하여 상기 펩티드 링커를 갖는 각 복합체에서는 표지부의 신장에의 집적성이 91.52 내지 93.03％ 포인트 낮았다.
실시예 8: Gd 표지 복합체의 신장의 집적성 평가 시험(담암 마우스)
(시험 방법)
상기 실시예에서 제조한 펩티드 링커를 포함하는 복합체의 Gd 표지 복합체를, 단백질량으로서 한마리당 0.02mg(100μL)이 되도록 담암 마우스의 미정맥으로부터 투여하였다. 본 실시예에서 사용하는 담암 마우스는, 검체를 투여하기 전에 인간 유방암 세포주 MDA-MB-468(ATCC(등록 상표); HTB-132)을 5.0×106개/개체를 배부(背部) 피하에 이식하여 담암 상태로 한 마우스(BALB/cnu/nu)를 사용하였다. 검체를 투여하고 24시간 후에 도살하여 신장 그리고 종양을 적출하고, 신장 중 그리고 종양 중의 Gd량을 ICP-MS를 사용하여 측정하였다. 본 시험은 각 군 3예에서 실시하고, 3예의 평균값을 산출하였다. 투여 후의 신장 1개당에 포함되는 Gd량을 투여 Gd량에 대한 백분율(％ of dose/tissue), 또한, 종양 조직 1g당에 포함되는 Gd량을, 전체 투여 Gd량에 대한 백분율(％ of dose/g)로 나타냈다. 결과를 표 59, 60에 나타내었다. 표 중, Ex-No는 실시예 5의 복합체 번호를 나타낸다. 또한, 대조 복합체로서 펩티드 링커를 포함하지 않는, 상기 제조 실시예 5에서 제조한 Ex-No.108을 사용하여 마찬가지로 시험을 행하였다. Ex-No.108에 관한, 2 시행의 평균을 표 57, 58에 나타내었다.
(결과)
결과를 표 57 내지 60에 나타내는 바와 같이, 대조 복합체에 대하여 상기 펩티드 링커를 갖는 각 복합체에서는 표지부의 신장에의 집적성이 88.08 내지 90.87％ 포인트 저하되었다.
실시예 9: 항인간 MUC1 항체 Fab5 프래그먼트 복합체의 제작
(실시예 9-115. [DOTA]p-Fab5의 합성)
1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA)(16mg) 및 물(810μL)의 혼합 용액에, 빙랭 하, 1M 수산화나트륨 수용액(80μL)을 첨가하여 pH5.5 내지 6으로 조제하였다. 얻어진 용액(239μL)에, 빙랭 하, 물(117μL)에 용해시킨 1-히드록시-2,5-디옥소피롤리딘-3-술폰산나트륨(2.3mg)을 첨가하였다. 그 후, EDC HCl 수용액(8.3μL, 25mg/mL)을 첨가하고, 빙랭 하 30분 교반하여, N-히드록시술포숙신이미딜 DOTA 용액을 조제하였다. Fab5 첨가 전에 0.2M 인산수소이나트륨 수용액(pH9)(40μL)을 첨가하여 pH7로 조제하였다.
20.8mg/mLFab5(90μL)의 0.1M 인산수소이나트륨 수용액(585μL)에, 조제한 N-히드록시술포숙신이미딜 DOTA 용액(300μL)을 첨가하고, 4℃에서 23시간 인큐베이트하였다. 과잉의 링커는 아미콘 울트라-15mL 원심식 필터를 사용하여 10mM 인산 완충액으로 세정을 2회 반복하고, 0.3M의 아세트산 암모늄 완충액으로 세정하고 마지막에 농축 후, 멤브레인 필터로 여과하여, 복합체 Ex-No.115를 얻었다. 당해 복합체는, 분자량 47.5kDa의 Fab5 1개에 대하여 분자량 387의 [DOTA]이 1개 결합한 복합체, 2개 결합한 복합체, 3개 결합한 복합체 및 4개 결합한 복합체의 혼합물임을 MS 해석에 의해 확인하였다.
(실시예 9-116. [DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)]p-Fab5의 합성
실시예 2-68(ix)에서 합성한 N-{[4-({2-[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세트아미드}메틸)페닐]카르바모일}-L-메티오닐-N1-(2-{[(4-이소티오시아나토페닐)카르바모티오일]아미노}에틸)-L-이소류신아미드테트라키스(트리플루오로아세트산)염(1mg)을 DMSO(336μL)에 용해시켰다.
5.2mg/mLFab5의 인산 완충 생리 식염수 용액(240μL)에, 앞서 조제한 용액을 30μL 첨가하고, 0.1M 탄산나트륨 수용액을 사용하여 약 pH8.0로 조정하고, 30℃에서 2시간 인큐베이트하였다. PD-10 칼럼을 사용하여 정제하고, 아미콘 울트라-15mL 원심식 필터로 회수하였다. 회수한 용액을 인산 완충 생리 식염수로 2회 세정하고 마지막에 농축 후, 멤브레인 필터로 여과하여, 복합체 Ex-No.116을 얻었다. 마찬가지의 조작을 다시 행하고, 얻어진 복합체 Ex-No.116을 혼합하였다. 당해 복합체는, 분자량 47.5kDa의 Fab5 1개에 대하여 분자량 1032의 [DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-lle-NH-(CH2)2-(A-3)]이 1개 결합한 복합체, 2개 결합한 복합체, 3개 결합한 복합체 및 4개 결합한 복합체의 혼합물임을 MS 해석에 의해 확인하였다.
실시예 10: 금속 착체 화합물의 커먼 마모셋 체내 동태의 검토
64Cu 표지 단백의 조제예 1
[64Cu]CuCl2의 0.05mol/L 염산 용액 10μL(19.8MBq, 후지 필름 도야마 가가쿠)에 0.1mol/L 아세트산나트륨 완충액(pH6.5) 139μL를 첨가하여 혼화하였다. 또한 실시예 9-115로 조제한 단백 복합체를 51μL 첨가하고, 이것을 실온에서 60분간 인큐베이트하고, 반응시켰다. 반응액을 한외 여과막(Amicon Ultra 10K, Millipore)에 첨가하고, 또한 50 mmol/L 아세트산나트륨 완충액을 첨가하여 한외 여과 정제를 행함으로써, 목적으로 하는 64Cu-단백 복합체 용액 (A)를 얻었다. 얻어진 용액에 단백 복합체 140μL와 PBS 용액 145μL를 혼합하고, 시린지 필터(Millex-GV 0.22㎛, Millipore)를 사용하여 여과함으로써, 64Cu-단백 복합체(A) 함유 PBS 용액(11.5MBq,19.17MBq/mg)을 조제하였다.
64Cu 표지 단백의 조제예 2
[64Cu]CuCl2의 0.05mol/L 염산 용액 20μL(37.1MBq, 후지 필름 도야마 가가쿠)에 0.1mol/L 아세트산나트륨 완충액(pH6.5)285μL를 첨가하여 혼화하였다. 또한 실시예 9-116에서 조제한 단백 복합체를 94.7μL 첨가하고, 이것을 실온에서 60분간 인큐베이트하고, 반응시켰다. 반응액을 한외 여과막(Amicon Ultra 10K, Millipore)에 첨가하고, 또한 50 mmol/L 아세트산나트륨 완충액을 첨가하여 한외 여과 정제를 행함으로써, 목적으로 하는 64Cu-단백 복합체 용액 (B)를 얻었다. 얻어진 용액에 단백 복합체 260μL와 PBS 용액 377μL를 혼합하고, 시린지 필터(Millex-GV 0.22㎛, Millipore)를 사용하여 여과함으로써, 64Cu-단백 복합체(B) 함유 PBS 용액(31.5MBq,26.27MBq/mg)을 조제하였다.
PET/CT 촬상
커먼 마모셋(2세 나이)을 이소플루란으로 마취하고, 64Cu-단백 복합체 용액 (A) 또는 (B)를 포함하는 PBS 용액 175-185μL를 미정맥으로부터 투여하였다. 투여 후에 마취 하, PET/CT 촬상 장치(PET: Clairvivo PET, 시마즈 세이사쿠쇼제, CT: Aquilion, TOSHIBA제)로 화상을 취득하였다.
64Cu-단백 복합체 용액 (A)를 포함하는 PBS 용액을 투여하여 약 3시간 후에 얻어진 PET/CT 화상이 도 1이다. 또한, 64Cu-단백 복합체 용액 (B)를 포함하는 PBS 용액을 투여하여 약 3시간 후에 얻어진 PET/CT 화상이 도 2이다. 도 3은 SUV를 나타낸다. SUV란 조직 1g당의 방사능을 체중 1g당의 투여 방사능으로 나눈 값, 즉, SUV=조직 1g당의 방사능/체중 1g당의 투여 방사능으로 표현되는 값이다. 또한, 방사능은 감쇠 보정한 값을 사용한다. 도 1에 비해, 도 2쪽이 신장에의 집적이 낮은 것이 관찰되었다.
본 발명은 인간 CEACAM5에 대한 우수한 결합 활성을 갖는 복합체를 포함하여, 인간 CEACAM5가 관여하는 암의 진단 및/또는 치료에 유용할 것이 기대된다.
또한, 본 발명은 MUC1에 대한 우수한 결합 활성을 갖는 복합체를 포함하여, MUC1이 관여하는 암의 진단 및/또는 치료에 유용할 것이 기대된다.
또한 본 발명 복합체 3arm DOTA, 특정한 스페이서, 특정한 펩티드 링커 및 생물 분자를 포함하는 복합체가 신장 내에서 분해되어 배출되는 것으로부터, 생물 분자에 관련하는 질환의 진단 및/또는 치료에 유용할 것이 기대된다.
서열표 프리텍스트
이하의 서열표의 숫자 표제 <223>에는, 대표적인 「Artificial Sequence」의 설명을 기재한다. 구체적으로는 서열표의 서열 번호 1 및 3으로 나타나는 염기 서열은, 각각의 PB009-01의 중쇄 프래그먼트 및 경쇄의 염기 서열이며, 서열 번호 2 및 4로 나타나는 아미노산 서열은, 각각 서열 번호 1 및 3에 의해 코딩되는 중쇄 프래그먼트 및 경쇄의 아미노산 서열이다. 또한 서열표의 서열 번호 5 및 9로 나타나는 염기 서열은, 각각의 P10-1의 중쇄 프래그먼트 및 경쇄의 염기 서열이며, 서열 번호 6 및 10으로 나타나는 아미노산 서열은, 각각 서열 번호 5 및 9에 의해 코딩되는 중쇄 프래그먼트 및 경쇄의 아미노산 서열이다. 서열 번호 7 및 9로 나타나는 염기 서열은, 각각의 P10-2의 중쇄 프래그먼트 및 경쇄의 염기 서열이며, 서열 번호 8 및 10으로 나타나는 아미노산 서열은, 각각 서열 번호 7 및 9에 의해 코딩되는 중쇄 프래그먼트 및 경쇄의 아미노산 서열이다. 서열 번호 11 및 15는, 각각의 P10-1의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이며, 서열 번호 12 및 16으로 나타나는 아미노산 서열은, 각각 서열 번호 11 및 15에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다. 서열 번호 13 및 15는, 각각의 P10-2의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이며, 서열 번호 14 및 16으로 나타나는 아미노산 서열은, 각각 서열 번호 13 및 15에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
SEQUENCE LISTING
<110> Astellas Pharma Inc.
<120> A conjugate comprising a ligand, a spacer, a peptide linker and a biomolecule
<130> A20002A00
<150> JP 2019-000530
<151> 2019-01-07
<150> JP 2019-206560
<151> 2019-11-14
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 678
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA encoding PB009-01 Fab heavy chain
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(678)
<400> 1
gaa gtg cag ctg gtg gaa tct ggc ggc gga ctg gtg cag cct ggc gga 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
tct ctg aga ctg agc tgt gcc gcc agc ggc ttc aac atc cgg gac acc 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Arg Asp Thr
20 25 30
tac atg cac tgg gtg cgc cag gcc cct ggc aag gga ctg gaa tgg gtg 144
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
gcc aga atc gac ccc gcc aac ggc aac agc aga tac gtg ccc aag ttc 192
Ala Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Arg Tyr Val Pro Lys Phe
50 55 60
cag ggc cgg ttc acc atc agc gcc gac acc agc aga aac acc gcc tac 240
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Arg Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
ctg cag atg aac agc ctg cgg gcc gag gac acc gcc gtg tac tac tgt 288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcc ccc ttc ggc tac tac gtg tcc gac tac gcc atg gcc tat tgg ggc 336
Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
cag ggc acc ctc gtg aca gtg tcc tca gcc tcc acc aag ggc cca tcg 384
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc aca gcg 432
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg 480
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct 528
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctt agt agc gtg gtg acc gtg 576
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac 624
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa tct tgt 672
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
gac tga 678
Asp
225
<210> 2
<211> 225
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Arg Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Arg Tyr Val Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Arg Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp
225
<210> 3
<211> 657
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA encoding PB009-01 light chain
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(657)
<400> 3
gac atc cag ctg acc cag agc cct agc agc ctg tct gcc agc gtg ggc 48
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
gac aga gtg acc atc acc tgt aga gcc ggc gag agc gtg gac atc ttc 96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe
20 25 30
ggc gtg gga ttt ctg cac tgg tat cag cag aag ccc ggc aag gcc ccc 144
Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
aag ctg ctg atc tac aga gcc agc aac ctg gaa agc ggc atc ccc agc 192
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ser
50 55 60
aga ttc agc ggc agc ggc tcc aga acc gac ttc acc ctg acc atc agc 240
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
agc ctg cag ccc gag gac ttc gcc acc tac tac tgc cag cag acc aac 288
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn
85 90 95
gag gac ccc tac acc ttt ggc cag ggc acc aag gtg gaa atc aag cgt 336
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
acg gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag cag 384
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat 432
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg 480
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc 528
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
tac agc ctg agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa 576
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc 624
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tag 657
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 4
<211> 218
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 4
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe
20 25 30
Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 5
<211> 669
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA encoding P10-1 Fab heavy chain fragment
<400> 5
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggcc tgagctgggt gcgccaggct 120
cctggacagg gactggaatg gatgggcgag aaccaccctg gcagcggcat catctaccac 180
aacgagaagt tccggggcag agtgaccctg accgccgacc ggagcaccag caccgcctac 240
atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc cagaagcagc 300
ggcaccagag gctttgccta ttggggacag ggcaccctcg tgaccgtgtc ctcagcctcc 360
accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420
gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540
tactccctta gtagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660
tgtgactga 669
<210> 6
<211> 222
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P10-1 Fab heavy chain fragment
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Asn His Pro Gly Ser Gly Ile Ile Tyr His Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ser Gly Thr Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
<210> 7
<211> 669
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA encoding P10-2 Fab heavy chain fragment
<400> 7
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggcc tgagctgggt gcgccaggct 120
cctggacagg gactggaatg gatgggcgag aaccaccctg gcagcggcat catctaccac 180
aacgagaagt tccggggcag agtgaccctg accgccgacc ggagcaccag caccgcctac 240
atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc cagaagcagc 300
ggcaccagag gctttgacta ttggggacag ggcaccctcg tgaccgtgtc ctcagcctcc 360
accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420
gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540
tactccctta gtagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660
tgtgactga 669
<210> 8
<211> 222
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P10-2 Fab heavy chain fragment
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Asn His Pro Gly Ser Gly Ile Ile Tyr His Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ser Gly Thr Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
<210> 9
<211> 660
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA encoding antibody light chain
<400> 9
gacgtcgtga tgacccagac ccctctgagc ctgagcgtga cacctggaca gcctgccagc 60
atcagctgca gatccagcca gagcatcgtg cacagcaacg gcaacaccta cctggaatgg 120
tatctgcaga agcccggcca gagcccccag ctgctgatct acagggtgtc caaccggttc 180
agcggcgtgc ccgacagatt ttctggcagc ggctccggca ccgacttcac cctgaagatc 240
tcccgggtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgtt ttcaaggcag ccacggcccc 300
tggacctttg gccagggaac aaagctggaa atcaagcgta cggtggctgc accatctgtc 360
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctg 540
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 660
<210> 10
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antibody light chain
<400> 10
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Gly Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 11
<211> 354
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA encoding P10-1 Fab heavy chain variable region
<400> 11
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggcc tgagctgggt gcgccaggct 120
cctggacagg gactggaatg gatgggcgag aaccaccctg gcagcggcat catctaccac 180
aacgagaagt tccggggcag agtgaccctg accgccgacc ggagcaccag caccgcctac 240
atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc cagaagcagc 300
ggcaccagag gctttgccta ttggggacag ggcaccctcg tgaccgtgtc ctca 354
<210> 12
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P10-1 Fab heavy chain variable region
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Asn His Pro Gly Ser Gly Ile Ile Tyr His Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ser Gly Thr Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 13
<211> 354
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA encoding P10-2 Fab heavy chain variable region
<400> 13
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggcc tgagctgggt gcgccaggct 120
cctggacagg gactggaatg gatgggcgag aaccaccctg gcagcggcat catctaccac 180
aacgagaagt tccggggcag agtgaccctg accgccgacc ggagcaccag caccgcctac 240
atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc cagaagcagc 300
ggcaccagag gctttgacta ttggggacag ggcaccctcg tgaccgtgtc ctca 354
<210> 14
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P10-2 Fab heavy chain variable region
<400> 14
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Asn His Pro Gly Ser Gly Ile Ile Tyr His Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ser Gly Thr Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 15
<211> 339
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA encoding antibody light chain variable region
<400> 15
gacgtcgtga tgacccagac ccctctgagc ctgagcgtga cacctggaca gcctgccagc 60
atcagctgca gatccagcca gagcatcgtg cacagcaacg gcaacaccta cctggaatgg 120
tatctgcaga agcccggcca gagcccccag ctgctgatct acagggtgtc caaccggttc 180
agcggcgtgc ccgacagatt ttctggcagc ggctccggca ccgacttcac cctgaagatc 240
tcccgggtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgtt ttcaaggcag ccacggcccc 300
tggacctttg gccagggaac aaagctggaa atcaagcgt 339
<210> 16
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antibody light chain variable region
<400> 16
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Gly Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 17
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Heavy chain signal sequence
<400> 17
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 18
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Light chain signal sequence
<400> 18
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1 5 10 15
Asp Ala Arg Cys
20
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<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tandem repeat sequence of an extracellular domain of MUC1
<400> 19
His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr
1 5 10 15
Ala Pro Pro Ala
20
Claims (35)
- 하기 식 (Ia):
[식 중,
DOTA1: 3arm DOTA,
U: 결합 또는 -NH(CH2)2O(CH2)2O(CH2)2OCH2C(=O)-
Q: -C(=O)-, -NH-C(=O)- 또는 -NH-C(=S)-
X: C 또는 N
R1a, R1b: 동일하거나 또는 다르고, H 또는 C1-6 알킬
또한, R1a 및 R1b는, 합쳐져서 C1-6 알킬렌을 형성할 수 있다.
p: 1 내지 25의 자연수이며, Biomolecule1 중에 어느 p개의 아미노기 또는 티올기를 통하여, 인접하는 탄소 원자에 결합하고 있다.
R1: H, 할로겐, C1-6 알킬 또는 할로 C1-6 알킬,
R2: C1-6 알킬 또는 할로 C1-6 알킬,
L2: Ile, Gly, Ala, Val, Phe, -NHCH(CHCH3NR3R4)C(=O)-, -NHCH(CHCH3N3)C(=O)- 또는 -NHCH(CHCH3CH2CH2CH3)C(=O)-,
R3: H, C1-6 알킬,
R4: H, C1-6 알킬,
L3: 결합, Arg 또는 His,
L4: -NH-(CH2)2-, -NHCH(C(=O)OH)(CH2)4- 또는 결합,
V1: 하기 식 (A-1) 내지 (A-5)로 표시되는 기,
또는, 식 -L3-L4-V1-이 합쳐져서 하기 식
이고,
Biomolecule1: 생물 분자
로 표시되는 복합체. - 하기 식 (Ib):
[식 중,
DOTA1: 3arm DOTA,
U: 결합 또는 -NH(CH2)2O(CH2)2O(CH2)2OCH2C(=O)-
Q: -C(=O)-, -NH-C(=O)- 또는 -NH-C(=S)-
X: C 또는 N
R1a, R1b: 동일하거나 또는 다르고, H 또는 C1-6 알킬
또한, R1a 및 R1b는, 합쳐져서 C1-6 알킬렌을 형성할 수 있다.
p: 1 내지 25의 자연수이며, Biomolecule2 중에 어느 p개의 아미노기 또는 티올기를 통하여, 인접하는 탄소 원자에 결합하고 있다.
R1: H, 할로겐, C1-6 알킬 또는 할로 C1-6 알킬,
R2: C1-6 알킬 또는 할로 C1-6 알킬,
L2: Ile, Gly, Ala, Val, Phe, -NHCH(CHCH3NR3R4)C(=O)-, -NHCH(CHCH3N3)C(=O)- 또는 -NHCH(CHCH3CH2CH2CH3)C(=O)-,
R3: H, C1-6 알킬,
R4: H, C1-6 알킬,
L3: 결합, Arg 또는 His,
L4: -NH-(CH2)2-, -NHCH(C(=O)OH)(CH2)4- 또는 결합,
V1: 하기 식 (A-1) 내지 (A-5)로 표시되는 기,
또는, 기 -L3-L4-V1-: 합쳐져서 하기 식 (III-I), (III-II) 또는 (III-III)
식
Biomolecule2: 항체 Fab 프래그먼트,
로 표시되는 복합체. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 하기 식 (Ic)로 표시되는 복합체인 복합체.
[식 중,
L3: 결합,
L4: -NH-(CH2)2- 또는 -NHCH(C(=O)OH)(CH2)4-,
Biomolecule: Biomolecule1 또는 Biomolecule2이다] - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 식 (Id)로 표시되는 복합체.
[식 중, Biomolecule는, Biomolecule1 또는 Biomolecule2이다.] - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 식 (Id) 중 V1이, 하기 식 (A-3) 내지 (A-5)의 어느 것인 복합체.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 식으로 표시되는 화합물로 이루어지는 군에서 선택되는 복합체.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, Biomolecule1 및 Biomolecule2에 있어서, 이하의 항체 Fab 프래그먼트를 제외하는 생물 분자 또는 항체 Fab 프래그먼트인 복합체:
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 112까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트,
(b) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역이며, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1의 글루탐산이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 112까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트,
(c) 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트, 또는,
(b) 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1의 글루탐산이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 4에 나타나는 경쇄를 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 CEACAM5 항체 Fab 프래그먼트. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, Biomolecule1 또는 Biomolecule2가,
(a) 서열 번호 12 또는 서열 번호 14에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 16에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트,
및
(b) 서열 번호 12 또는 서열 번호 14에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역이며, 서열 번호 12 또는 서열 번호 14의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 16에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트로 이루어지는 군에서 선택되는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트이며, 해당 프래그먼트는 해당 프래그먼트 중에 어느 p개의 아미노기 또는 티올기를 통하여 V1에 결합하고 있는 복합체. - 제8항에 있어서, Biomolecule1 또는 Biomolecule2가,
(a) 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트; 및
(b) 서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 8의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트 복합체. - 제9항에 있어서, Biomolecule1 또는 Biomolecule2가,
서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 8의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트인 복합체. - 하기 식으로 표시되는 복합체.
「식 중, Fab5는 이하의 항체 Fab 프래그먼트이다:
서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 8의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트.
p는, 1 내지 25의 자연수이다. Fab5가 해당 Fab5 중에 어느 p개의 아미노기 또는 티올기를 통하여, 인접하는 탄소 원자에 결합하고 있다.] - 하기 식으로 표시되는 복합체.
「식 중, Fab5는 이하의 항체 Fab 프래그먼트이다:
서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 8의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트.
p는, 1 내지 25의 자연수이다. Fab5가 해당 Fab5 중에 어느 p개의 아미노기 또는 티올기를 통하여, 인접하는 탄소 원자에 결합하고 있다.] - 하기 식으로 표시되는 복합체.
「식 중, Fab5는 이하의 항체 Fab 프래그먼트이다:
서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 8의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트.
p는, 1 내지 25의 자연수이다. Fab5가 해당 Fab5 중에 어느 p개의 아미노기 또는 티올기를 통하여, 인접하는 탄소 원자에 결합하고 있다.] - 하기 식으로 표시되는 복합체.
「식 중, Fab5는 이하의 항체 Fab 프래그먼트이다:
서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 8의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트.
p는, 1 내지 25의 자연수이다. Fab5가 해당 Fab5 중에 어느 p개의 아미노기 또는 티올기를 통하여, 인접하는 탄소 원자에 결합하고 있다.] - 하기 식으로 표시되는 복합체.
「식 중, Fab5는 이하의 항체 Fab 프래그먼트이다:
서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 8의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트.
p는, 1 내지 25의 자연수이다. Fab5가 해당 Fab5 중에 어느 p개의 아미노기 또는 티올기를 통하여, 인접하는 탄소 원자에 결합하고 있다.] - 하기 식으로 표시되는 복합체.
「식 중, Fab5는 이하의 항체 Fab 프래그먼트이다:
서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 8의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트.
p는, 1 내지 25의 자연수이다. Fab5가 해당 Fab5 중에 어느 p개의 아미노기 또는 티올기를 통하여, 인접하는 탄소 원자에 결합하고 있다.] - 하기 식으로 표시되는 복합체.
「식 중, Fab5는 이하의 항체 Fab 프래그먼트이다:
서열 번호 8에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 프래그먼트이며, 서열 번호 8의 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 중쇄 프래그먼트, 및 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항인간 MUC1 항체 Fab 프래그먼트.
p는, 1 내지 25의 자연수이다. Fab5가 해당 Fab5 중에 어느 p개의 아미노기 또는 티올기를 통하여, 인접하는 탄소 원자에 결합하고 있다.] - 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, p가 1 내지 4의 자연수인, 복합체.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 3arm DOTA에 금속이 배위한, 복합체.
- 제19항에 있어서, 금속이 금속 방사성 동위 원소인, 복합체.
- 제20항에 있어서, 금속이 89Zr인, 복합체.
- 제19항에 있어서, 금속이 상자성 금속 이온인, 복합체.
- 제22항에 있어서, 금속이 Gd3+인, 복합체.
- 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, PET 트레이서인, 복합체.
- 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 기재된 1종류 이상의 복합체, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 진단용 조성물.
- 제25항에 있어서, 조기 진단약, 또는 병기 진단약으로서 사용되는, 진단용 조성물.
- 제25항 또는 제26항에 있어서, 인간 MUC1을 발현하는 암의 진단에 사용되는, 진단용 조성물.
- 제27항에 있어서, 암이, 유방암, 폐암, 대장암, 방광암, 피부암, 갑상선암, 위암, 췌장암, 신장암, 난소암 또는 자궁경암인, 진단용 조성물.
- 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 기재된 1종류 이상의 복합체, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 의약 조성물.
- 제29항에 있어서, 인간 MUC1을 발현하는 암을 치료하기 위한 의약 조성물인, 의약 조성물.
- 제30항에 있어서, 암이, 유방암, 폐암, 대장암, 방광암, 피부암, 갑상선암, 위암, 췌장암, 신장암, 난소암 또는 자궁경암인, 의약 조성물.
- 암의 진단용 조성물, 및/또는 암의 치료용 의약 조성물의 제조를 위한, 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 기재된 복합체의 사용.
- 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 진단, 및/또는 암의 치료에 사용되는, 복합체.
- 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 기재된 복합체를 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 암의 진단 방법.
- 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 기재된 복합체의 치료 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료 방법.
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